CN106479973B

CN106479973B - 一种体外iak免疫细胞培养方法

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Publication number: CN106479973B
Application number: CN201610914086.8A
Authority: CN
Inventors: 杨黎; 张毅
Original assignee: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Priority date: 2016-10-20
Filing date: 2016-10-20
Publication date: 2019-10-01
Anticipated expiration: 2036-10-20
Also published as: CN106479973A

Abstract

本发明属于肿瘤预防和治疗技术领域，具体涉及一种优化的体外IAK免疫细胞培养方法。该方法包括：提取外周血单个核细胞，然后随培养时间不同分步骤、分批次加入特殊设计的A、B、C、D试剂，并培养至特定时间等步骤。本发明通过对IAK免疫细胞体外培养体系进行优化，使得该技术在细胞扩增能力、效应细胞表型及比例、杀伤能力等指标方面保持一致或有了较好改进，尤其是效应细胞比例、效应细胞的杀伤能力有了明显改善，从而使得该技术能够更好的用于肿瘤治疗，因而具有较好的实用价值和推广应用意义。

Description

一种体外IAK免疫细胞培养方法

技术领域

本发明属于肿瘤预防和治疗技术领域，具体涉及一种优化的体外IAK（Inducedactivated killer cell，诱导活化杀伤细胞）免疫细胞培养方法。

背景技术

自体细胞免疫疗法，是通过采血提取肿瘤患者体内不成熟的免疫细胞，在实验室中进行活化培养使其具有高效识别和杀伤肿瘤细胞的能力后，再回输给肿瘤患者体内。

目前，体外细胞因子活化杀伤（Cytokine-induced killer cell，CIK）免疫细胞的培养方法属于自体细胞免疫疗法的一种，用于治疗广谱的肿瘤患者。CIK疗法的技术原理为：将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞；这群异质细胞中存在一类同时表达CD3⁺和CD56⁺两种膜蛋白分子的细胞，即NK细胞样T淋巴细胞（NKT细胞），是对肿瘤细胞具有杀伤作用的主要效应细胞。由于CIK细胞具有增殖速度快、对正常的细胞无毒性作用、杀瘤谱广、安全性高等特点。因此，应用CIK细胞被认为是抗肿瘤过继细胞免疫治疗的重要方案之一。

然而，现有培养方法所制备的CIK细胞中，NKT细胞（效应细胞）比例较低，一般在10~30%左右，对杀伤肿瘤细胞的能力较为有限，因此，有必要进一步优化CIK细胞的培养方法，以提高免疫效应细胞的比例及杀瘤能力。

发明内容

本发明目的在于提供一种优化的体外诱导活化杀伤的IAK免疫细胞培养方法，从而便于恶性肿瘤的预防和治疗。

本发明所采取的技术方案详述如下。

一种体外IAK免疫细胞培养方法，具体包括如下步骤：

（1）提取外周血单个核细胞，具体为：

采集肿瘤患者5mL外周血；1500 rpm/min离心10 min，上清液灭活后-20℃保存备用；

将沉淀细胞用30 mL生理盐水重悬后置于15mL淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心，收集单个核细胞并用生理盐水冲洗三次；

所述密度梯度离心为2500 rpm/min条件下，离心25 min；

（2）体外细胞培养，具体为：

第0天：将步骤（1）所获得的外周血的单个核细胞平铺于24孔板中，每孔铺2×10⁶个细胞，每孔加淋巴细胞培养基1mL；

所述淋巴细胞培养基具体例如为Takara公司的GT-T551无血清培养基；

然后加入A试剂，加入量（即终浓度）为10 μL/mL，勿剧烈晃动培养板，按体积比5%比例加入自体血清（步骤（1）中离心灭活后上清液）；置于37℃、5% CO₂的培养箱中进行培养；

所述A试剂为溶解有IL-2和GM-CSF的GT-T551培养基，IL-2的浓度为100U/μL，GM-CSF的浓度为100U/μL；

第2天：再次加入A试剂，加入量为10μL/mL，勿剧烈晃动培养板；

第4天：吹打细胞并扩增至两个孔中（24孔板），淋巴细胞培养基1mL/孔，加入A试剂，加入量（即终浓度）为10μL/mL，自体血清5%；

第5天：加入B和C试剂，加入量（即终浓度）均为10μL/mL，B试剂注意避光；

所述B试剂为溶解有7DW8-5的GT-T551培养基，其中7DW8-5的浓度为1ng/μL；

所述C试剂为溶解有IFN-γ、IL-2 和CD3单抗的GT-T551培养基，其中IFN-γ的浓度为100U/μL，IL-2的浓度为200U/μL，CD3单抗的浓度为5ng/μL；

第7天：吹打细胞并扩增至6孔板中，GT-T551培养基3~5mL/孔，视细胞量而定，加入D试剂，加入量（即终浓度）为10μL/mL，自体血清5%；

所述D试剂为溶解有IL-2的GT-T551培养基，其中IL-2的浓度为100U/μL；

第10天：吹打细胞并进一步扩增，视细胞量而定具体扩增体积，加入D试剂，加入量为10μL/mL，自体血清5%；

第13~14天：收集细胞，检测细胞免疫表型和杀伤功能，从而对培养结果做出准确评价。

培养结束后，对细胞免疫表型的检测，可采用流式细胞技术对细胞表面CD3、CD4、CD8、CD56的表达水平进行具体检测，由于NKT、NK细胞是非特异性免疫细胞培养体系中主要的效应细胞，因而通过CD3、CD4、CD8、CD56表达水平来表明体外诱导培养的IAK细胞中NKT、NK等细胞的比例情况；对细胞杀伤功能的检测，主要是利用流式细胞术检测细胞表面CD107a的表达水平，通过CD107a的表达水平来表明体外诱导培养的IAK细胞的杀伤功能情况。

与传统的CIK培养方法相比，本发明通过对IAK免疫细胞体外培养体系进行优化，使得该技术在细胞扩增能力、效应细胞表型及比例、杀伤能力等指标方面保持一致或有了较好改进，具体而言如下：

1. 细胞扩增能力保持了一致：传统CIK培养方法大约可扩增细胞100~1000倍左右，本发明所提供的培养方法中的细胞增殖能力与传统CIK培养方法保持了一致，细胞扩增倍数保持在大约100~1000倍左右，因而使得该方法具备了潜在的应用前景；

2. 效应细胞表型及比例有明显改善：CIK细胞以NK细胞样T细胞（NKT细胞，即CD3⁺CD56⁺细胞）为主要效应细胞来杀伤肿瘤细胞，但比例一般在10~30%之间；本发明的IAK细胞中效应细胞以NKT细胞（CD3⁺CD56⁺细胞）和NK细胞（CD3^-CD56⁺细胞）为主，其中NKT细胞比例为（46.5±17.8）%，NK细胞比例为（28.1±17.5）%，两群细胞比例之和最高可达90%以上，不论是单独的NKT或NK细胞比例，还是NKT与NK细胞比例之和，均较传统CIK法中的相应效应细胞比例明显提高；另外，在大样本实验中观察到，IAK细胞中CD8⁺/CD3⁺T细胞比例较传统CIK细胞明显增高；因而使得本发明具有潜在的更好的杀伤肿瘤效果；

3. 细胞伤杀能力改善明显：免疫效应细胞对肿瘤靶细胞进行攻击的时候，会分泌CD107a蛋白（溶酶体相关膜蛋白），从而释放穿孔素、颗粒酶以对靶细胞进行杀伤，因此CD107a 的表达水平情况可以代表效应细胞杀伤肿瘤细胞的能力；我们研究发现，传统CIK细胞中CD107a⁺细胞比例一般为（17.9±7.6）%左右，而本发明的IAK细胞中CD107a⁺细胞比例为（28.4±6.9）%左右；本发明的IAK细胞CD107a表达水平明显高于现有技术，即，本发明的IAK细胞的杀瘤能力明显强于传统的CIK细胞。

总体而言，本发明通过IAK免疫细胞体外培养体系进行优化，使得效应细胞比例、效应细胞的杀伤能力有了明显改善，从而使得该技术能够更好的用于肿瘤治疗，因而具有较好的实用价值和推广应用意义。

附图说明

图1为IAK细胞培养流程图；

图2为实验组与对照组NKT细胞比例情况对比；

图3为实验组与对照组NK细胞比例情况对比；

图4为实验组与对照组CD107a细胞比例情况对比；

图5为一例大样本实验组与对照组流式细胞图对比；

图6为 IAK1、IAK2组与对照组NKT细胞比例情况对比；

图7为 IAK1、IAK2组与对照组NK细胞比例情况对比。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，对本发明中部分实验试剂、实验设备等情况简要介绍如下。

样品患者来源：外周血样品来源于随机抽取的肿瘤患者（包括但不限于肺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌等，肿瘤患者不限制年龄、性别、TNM分期等临床参数）自愿者，实验过程中，将同一患者的外周血平均分为两份，其中一份采用现有的CIK培养方法作为对照。

主要试剂：

本发明中所述A、B、C、D试剂，具体配方及配制方法如下：

A试剂：IL-2 + GM-CSF + GT-T551；配制时，将IL-2和GM-CSF各1000U溶于10μLGT-T551中即可，因此IL-2和GM-CSF的使用浓度均为100U/μL；

B试剂：7DW8-5+ GT-T551；配制时，将10ng 7DW8-5溶于10μL GT-T551中即可，因此7DW8-5的使用浓度为1ng/μL；

C试剂：IFN-γ+ IL-2 + CD3单抗 + GT-T551；配制时，将IFN-γ1000U、IL-22000U、CD3单抗50ng依次分别溶于分别10μL GT-T551中即可，因此IFN-γ、IL-2、CD3单抗的使用浓度分别为100U/μL、200U/μL、5ng/μL；

D试剂：IL-2+ GT-T551；配制时，将IL-2 1000U溶于10μL GT-T551中即可，因此IL-2的使用浓度为100U/μL；

上述A、B、C、D试剂中：

IL-2采用北京双鹭公司产品；GM-CSF购自厦门特宝生物；GT-T551购自日本Takara公司；7DW8-5购自日本Funakoshi公司；IFN-γ为美国Peprotech公司产品；CD3单抗为以色列Prospec公司产品；

主要设备：

台式离心机，美国Thermo Scientific，MULTIFUGE X3R；

CO₂培养箱，美国Thermo Scientific，3111；

显微镜，德国 Leica，11090137008；

流式细胞仪，美国BD，FACScantoII。

实施例1

利用本发明所提供体外IAK免疫细胞培养方法，本发明人首先进行了小样本实验，具体实验过程如图1所示，具体介绍如下。

（1）提取单个核细胞，具体为：

所述密度梯度离心为2500 rpm/min条件下，离心25 min。

（2）体外细胞培养，培养流程如图1所示，具体为：

第0天：将步骤（1）获得的外周血单个核细胞铺于24孔板中，每孔铺2×10⁶ 个细胞，每例样本铺两个孔，每孔加淋巴细胞培养基1mL；

所述淋巴细胞培养基为Takara公司的GT-T551无血清培养基；

然后加入A试剂，加入量为10 μL/mL，勿剧烈晃动培养板，按体积比5%比例加入自体血清（步骤（1）中离心灭活后上清液）；置于37℃ 5% CO₂的培养箱中进行培养；

第2天：加入A试剂，加入量为10 μL /mL，勿剧烈晃动培养板；

第4天：吹打细胞并扩增至两个孔中（24孔板），培养基1mL/孔，加入A试剂，加入量为10μL/mL，自体血清5%；

第5天：加入B和C试剂，加入量均为10μL/mL，B试剂注意避光；

第7天：吹打细胞并扩增至6孔板中，培养基3~5mL/孔，视细胞量而定，加入D试剂，加入量为10μL/mL，自体血清5%；

上述培养过程中，同时采用现有CIK培养方法进行细胞培养作为对照，具体为：

提取5mL外周血单个核细胞，将其按2×10⁶个/mL的浓度悬浮于GT-T551培养基中，加入1000 U/mL 的重组人IFN-γ，加入体积比5%比例灭活后自体血清，37℃、5%CO₂培养箱中培养；

24h 后加入50ng/mL 的CD3 单抗和1000 U/mL的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；

每3d扩孔一次，并在扩孔后加入重组人IL-2，IL-2加入量为1000 U/mL；

在培养的第13~14d收获CIK细胞。

收获细胞后，采用利用流式细胞技术分别对细胞表型检测（CD3、CD56的表达水平）和细胞杀伤功能（CD107a表达水平）检测，具体为：

细胞表型检测：检测结果表明，实验组IAK细胞中NKT细胞（CD3⁺CD56⁺细胞）比例明显高于对照组细胞[（46.5±17.8）% vs.（28.9±17.0）%，P<0.05，见图2]；

实验组IAK细胞中NK细胞（CD3^-CD56⁺细胞）比例明显高于对照组细胞[（28.1±17.5）% vs.（15.9±19.6）%，P<0.05，见图3]；

细胞杀伤功能检测：实验组IAK细胞的杀伤功能（CD107⁺细胞比例，CD107a代表免疫效应细胞的杀伤功能）明显高于对照组细胞[（28.4±6.9）% vs.（17.9±7.6）%，P<0.05，见图4）。

实施例2

在实施例1小样本基础上，发明人进一步进行了大样本实验。具体过程如下：

（1）提取外周血单个核细胞，具体为：

采集肿瘤患者60mL外周血；1500 rpm/min离心10 min，上清液灭活后-20℃保存备用；

将沉淀细胞用生理盐水稀释至50 mL，分别置于4个15mL淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心，收集单个核细胞并用生理盐水冲洗三次；

所述密度梯度离心为2500 rpm/min条件下，离心25 min。

（2）体外细胞培养，具体为：

将上述（1）中提取到的淋巴细胞一分为二，一份进行IAK细胞培养，培养流程同实施例1；另一份进行传统CIK细胞培养，培养流程同实施例1中所述。

最后，收集细胞，检测细胞免疫表型和杀伤功能，从而对培养结果做出准确评价。

培养结束后，流式细胞检测结果表明，IAK实验组的NKT、NK细胞比例均较CIK对照组明显升高（NKT: 61.6% vs. 49.9%，NK: 30.7% vs. 11.9%），IAK实验组效应细胞总和（NKT+NK细胞）比例明显高于CIK对照组（92.3% vs. 61.8%）；同时，IAK实验组CD3⁺T细胞以CD8⁺T细胞为主（90.2%），明显高于CIK对照组（59.2%）（见图5）。

这一结果表明，IAK细胞中效应细胞以NKT和NK细胞为主，且两者比例之和明显高于传统CIK细胞，IAK细胞中T细胞以CD8⁺细胞为主，比例明显高于传统CIK细胞。

在此基础上，对其他肿瘤患者自愿者的外周血培养实验表明，应用本发明后，IAK实验组在NKT（CD3⁺CD56⁺细胞）、NK细胞（CD3^-CD56⁺细胞）比例及CD107a⁺细胞比例均较现有技术有明显升高。因而，IAK免疫细胞培养方法具有较好的临床肿瘤治疗应用前景。

实施例3

本实施例所提供的体外IAK免疫细胞培养方法，具体过程同实施例1，仅就B试剂中7DW8-5的加入量做了适当调整，具体实验情况如下所述。

（1）提取单个核细胞，具体同实施例1中所述。

（2）体外细胞培养，具体为：

将上述（1）中提取到的淋巴细胞一分为三：

其中一份进行IAK细胞培养，培养流程同实施例1（命名为IAK1）；

其中一份进行IAK细胞培养（命名为IAK2）时，培养流程同实施例1，但调整B试剂加入量减半，即，B试剂的加入量为5μL/mL；

最后一份进行传统CIK细胞培养，培养流程同实施例1所述。

培养结束后，流式细胞检测结果表明：

IAK1实验组的NKT、NK细胞比例均较CIK对照组明显升高[NKT:（45.69±13.12）%vs.（27.86±7.0）%，NK:（28.46±6.87）% vs.（18.84±7.28）%，P<0.05]；

IAK2实验组的NKT、NK细胞比例均较CIK对照组明显升高[NKT:（42.13±16.48）%vs.（27.86±7.0）%，NK:（27.6±12.83）% vs.（18.84±7.28）%，P<0.05]；

IAK1实验组效应细胞比例与IAK2组效应细胞比例相比无差别[NKT:（45.69±13.12）% vs. （42.13±16.48）%，NK:（28.46±6.87）% vs.（27.6±12.83）%，P>0.05]。（见图6、图7）。

这一结果表明，B试剂中7DW8-5加入量调整后的IAK2效应细胞仍以NKT和NK细胞为主，且比例与IAK1效应细胞比例无差别；因此B试剂加入量可调整为（5-10）μL/mL。

Claims

1.一种体外IAK免疫细胞培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）提取外周血单个核细胞，具体为：

采集肿瘤患者外周血，离心，取沉淀细胞，同时将上清液，即自体血清，灭活备用；

沉淀细胞用生理盐水重悬后置于淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心，收集单个核细胞并用生理盐水冲洗干净备用；

（2）体外细胞培养，具体为：

第0天：将步骤（1）所获得的单个核细胞，按每2×10⁶个细胞加淋巴细胞培养基1mL的比例，加入淋巴细胞培养基；

然后加入A试剂，再加入步骤（1）中灭活后上清液，进行培养；

所述A试剂为溶解有IL-2和GM-CSF的淋巴细胞培养基，IL-2的浓度为100U/μL，GM-CSF的浓度为100U/μL；

第2天：再次加入A试剂；

第4天：吹打细胞并进行扩增，加入淋巴细胞培养基后，再加入A试剂及步骤（1）中灭活后上清液；

第5天：加入B和C试剂；

所述B试剂为溶解有7DW8-5的淋巴细胞培养基，其中7DW8-5的浓度为1ng/μL；

所述C试剂为溶解有IFN-γ、IL-2 和CD3单抗的淋巴细胞培养基，其中IFN-γ的浓度为100U/μL，IL-2的浓度为200U/μL，CD3单抗的浓度为5ng/μL；

第7天：吹打细胞进行扩增，加入淋巴细胞培养基后，然后加入D试剂，再加入步骤（1）中灭活后上清液；

所述D试剂为溶解有IL-2的淋巴细胞培养基，其中IL-2的浓度为100U/μL；

第10天：重复“第7天”的操作步骤，以对细胞进行进一步扩增；

第13~14天：收集细胞，检测细胞免疫表型和杀伤功能，从而对培养结果做出评价；

A试剂加入量10μL/mL；B试剂加入量5~10μL/mL；C试剂加入量10μL/mL；D试剂加入量10μL/mL；

所述淋巴细胞培养基为GT-T551无血清培养基；

自体血清加入量为5%体积比。