KR20180030027A - 수지-백금 복합체 및 그 이용 - Google Patents
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Abstract
수지-백금 복합체(100)는 수지 입자(10)와, 백금 입자(20)를 구비하고, 수지 입자(10)에 백금 입자(20)가 고정화되어 있다. 수지-백금 복합체(100)는 백금 입자(20)의 일부가 수지 입자(10)의 표층부(60)에 있어서 3차원적으로 분포되어 있어도 좋다. 이 경우, 3차원적으로 분포된 백금 입자(20)의 일부가 부분적으로 수지 입자(10) 외로 노출되어 있어도 좋고, 나머지의 일부가 수지 입자(10)에 내포되어 있어도 좋다. 백금 입자(20)에는 수지 입자(10)에 완전히 내포된 내포 입자(30), 수지 입자(10) 내에 포매된 부위 및 수지 입자(10) 외로 노출된 부위를 갖는 일부 노출 입자(40) 및 수지 입자(10)의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 입자(50)가 존재하고 있는 것이 바람직하다.
Description
본 발명은, 예를 들면 면역학적 측정 등의 용도에 바람직하게 사용 가능한 수지-백금 복합체, 그것을 이용한 표지 물질, 면역학적 측정법, 면역학적 측정용 시약, 분석물의 측정 방법, 분석물 측정용 키트, 및 래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립에 관한 것이다.
생체 내에는 무수한 화학물질이 존재하는 점에서 생체 내의 특정 미량 성분을 정성적, 정량적으로 분석하는 것은 매우 중요한 기술이다. 의료, 제약, 건강식품, 바이오테크놀로지, 환경 등의 분야에 있어서 생체 내의 특정 개소(화학물질)에만 작용하는 약품 및 식품, 생체의 약간의 변화를 검출하는 분석 장치 및 진단 약 등은 상기 기술과 함께 발전해 왔다.
상기 분석 기술 중 하나로 이뮤노어세이가 있다. 이것은 면역학적 측정법이라고도 불리며, 면역 반응 중 하나인 항원-항체간에 있어서의 특이적인 반응을 이용하여 미량 성분을 정성적, 정량적으로 분석하는 방법이다. 항원-항체간 반응은 감도나 반응의 선택성이 높기 때문에 상기 분야에서 널리 사용되어 있다. 이뮤노어세이는 그 측정 원리에 의해 여러 가지 측정법이 있다. 예를 들면, 효소 면역 측정법(EIA), 방사성 면역 측정법(RIA), 화학발광 면역 측정법(CLIA), 형광 면역 측정법(FIA), 라텍스 등의 응집법(LIA, PA), 이뮤노 크로마토그래피법(ICA), 적혈구 응집법(HA), 적혈구 응집 억제법(HI) 등을 들 수 있다. 또한, 이뮤노어세이 이외에는 물리·화학적 측정법, 생물학적 측정법 등이 있다.
이뮤노어세이는 항원 및 항체가 반응하여 복합체를 형성했을 때의 변화(항원, 항체 또는 복합체의 농도 변화)로부터 항원 또는 항체를 정성적 또는 정량적으로 검출한다. 이들을 검출할 때에 항체, 항원 또는 복합체에 표지 물질을 결합시킴으로써 검출 감도가 증대한다.
그 때문에 표지 물질의 표지 능력은 이뮤노어세이에 있어서의 검출 능력을 좌우하는 중요한 요소라고 할 수 있다. 상기에 예시한 이뮤노어세이에 있어서도 표지 물질로서 적혈구(HA의 경우), 라텍스 입자(LIA의 경우), 형광 색소(FIA의 경우), 방사성 원소(RIA의 경우), 효소(EIA의 경우), 화학 발광 물질(CLIA의 경우) 등이 사용되어 있다.
그런데, 표지 물질로서 착색한 미립자를 사용했을 경우, 특별한 분석 장치를 사용하는 일 없이 육안에 의해 검출을 확인할 수 있기 때문에 보다 간편한 측정이 가능한 것이 기대된다. 이러한 착색한 미립자로서는 금속 및 금속 산화물의 콜로이드형상 입자, 색소로 착색한 라텍스 입자 등을 들 수 있다(특허문헌 1, 특허문헌 4 등). 그러나, 상기 콜로이드형상 입자는 입자 지름 및 조제 조건에 의해 색조가 결정되어 버리기 때문에 소망의 선명한 짙은 색조의 것을 얻기 어려운, 즉 시인성이 불충분하다는 문제가 있다.
또한, 상기 착색한 라텍스 입자는 색소에 의한 착색의 효과가 낮아 육안 판정성이 불충분하다는 문제가 있다. 또한, 이 문제를 해소하기 위해서 색소의 착색량을 늘리고자 하면, 색소가 라텍스의 표면을 덮어 라텍스 입자 본래의 표면 상태가 손상되기 때문에 항원 또는 항체를 결합시키는 것이 곤란해진다는 문제가 있었다. 또한, 멤브레인 필터 등의 크로마토그래피 매체의 세공 내에 막히거나, 라텍스 입자가 비특이 응집을 일으키거나 해서 색소의 착색료를 늘림으로써 짙게 착색되는 것이 반드시 성능의 향상에 결부되지 않는다는 문제도 있었다.
상기 표지 물질의 시인성을 향상시키기 위해서 표지 물질이 결합한 항체(표지 항체)와 항원이 반응하여 복합체를 형성한 후에 이들의 표지 물질에 대하여 또 다른 금속을 수식시킴으로써 표지 물질의 검출 감도를 증폭시키는 이뮤노 크로마토그래프 방법이 개시되어 있다(특허문헌 2 및 5). 그러나, 이 방법에서는 조작이 번잡하여 안정된 증폭이 어렵다. 또한, 특별한 장치가 필요한 등 측정 비용이 드는 점에서 적용 가능한 용도 및 사용 환경은 한정되는 것으로 생각된다.
또한, 폴리머계 라텍스 입자의 표면이 결합한 금 나노 입자로 이루어지는 착색 라텍스가 개시되어 있다(특허문헌 3).
폴리머계 라텍스 입자의 표면에 금 나노 입자를 결합시킴으로써 상기 금 나노 입자 자신이 착색제로서 육안 판정성이나 검출 감도의 향상에 도움이 되는 한편, 금 나노 입자 자신이 항원 또는 항체에 대한 결합성도 우수한 점에서 충분한 짙은 색이 되는 정도까지 금 나노 입자를 결합시켜도 충분한 양의 항원 또는 항체를 결합시킬 수 있다고 되어 있다.
상기 착색 라텍스는 스티렌-아크릴산 공중합체 라텍스 및 금 나노 입자의 전구체인 HAuCl의 분산액에 감마선을 조사함으로써 상기 라텍스의 표면에 금 나노 입자를 결합시킨 것이다. 그러나, 상기 착색 라텍스는 금 나노 입자가 라텍스의 표면에만 결합되는 점에서 표면 플라즈몬 공명이 발현하는 금 입자의 담지량에 제한이 있고, 또한 금 나노 입자가 탈리되기 쉽다. 그 결과, 면역학적 측정용 시약으로서의 시인성이나 감도가 충분하지 않을 우려가 있다. 또한, 감마선 등의 전자 방사선을 조사하기 위해서 라텍스에 대미지를 부여할 우려가 있다. 또한, 특허문헌 3의 명세서 중에는 상기 라텍스 지름이나 금 나노 입자 지름의 바람직한 범위를 개시하고 있지만, 실시예에 있어서 이들의 바람직한 범위에서 검증되어 있는지 명확하지 않아 바람직한 범위의 규정의 근거가 없다.
또한, 특허문헌 4에서는 금속금으로 피복된 폴리머 라텍스 입자가 개시되고, 현미경 검사법 및 이뮤노어세이법에 이용 가능한 시약으로의 적용이 시사되어 있다.
그러나, 상기 금속금으로 피복된 폴리머 라텍스 입자는 폴리머 라텍스 입자의 재질이나 입경의 개시가 없다. 또한, 이뮤노어세이법에 이용 가능한 시약으로서의 효과에 대해서 검증이 없다. 그 때문에 금속금 및 폴리머 라텍스 입자에 있어서의 시약으로서의 효과는 불분명하다.
또한, 비특허문헌 1에서는 폴리-2-비닐피리딘 라텍스 입자에 금 나노 입자를 운반시킨 마이크로 겔이 개시되고, 마이크로 겔의 입경의 pH 응답성을 금 나노 입자의 국재형 표면 플라즈몬 공명의 거동의 변화로부터 확인하고 있다. 그러나, 상기 마이크로 겔은 금 나노 입자가 상기 라텍스 입자의 표층 부근에 단층에서 담지되어 있다. 그 때문에 금 나노 입자의 담지량이 적어 이뮤노어세이에 유효한 짙은 색조가 얻어지지 않는 것으로 생각된다. 또한, 마이크로 겔의 재질, 구조, 조성 등의 검토는 행하고 있지 않아 면역학적 측정 시약 등의 구체적인 용도로의 효과는 불분명하다.
이상으로부터 금 나노 입자가 결합 또는 피복된 라텍스 입자는 면역학적 측정용의 시약으로서 기대되는 것이지만, 종래기술에서는 내구성이나 시인성이 충분하지 않았다. 또한, 시인성이 높은 것이어도 적용 가능한 용도 및 사용 환경은 한정되는 것이었다.
K. Akamatsu, M. Shimada, T. Tsuruoka, H. Nawafune, S. Fujii and Y. Nakamura; Langmuir 2010, 26, 1254-1259.
수지-금속 복합체를 면역학적 측정에 있어서의 표지 물질로서 사용하기 위해서는 항체 등의 리간드에 안정적으로 결합시키는 것이 필요하다. 그러나, 리간드를 수지-금속 복합체에 의해 표지할 경우, 안정적인 결합 상태를 형성할 수 있었다고 해도 반드시 우수한 검출 감도가 얻어진다고는 할 수 없다. 예를 들면, 미세한 수지-금속 복합체는 응집이 생기기 쉽다. 응집이 생기면, 핸들링성이 대폭으로 저하될 뿐만 아니라 표지 물질인 수지-금속 복합체의 농도에 불균일이 생겨 검출 감도가 크게 저하되는 경우가 있다.
본 발명의 목적은 항체 등의 리간드와 결합시킨 상태로 응집이 생기기 어렵고, 핸들링성이 우수한 수지-금속 복합체를 제공하는 것이며, 예를 들면 면역학적 측정에 있어서 고감도한 판정을 가능하게 하는 면역학적 측정용 수지-금속 복합체를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 예의 연구를 행한 결과, 수지 입자에 복수의 백금 입자가 고정화된 수지-백금 복합체에 의해 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명의 수지-백금 복합체는 수지 입자와, 상기 수지 입자보다 상대적으로 작은 복수의 백금 입자를 구비하고, 복수의 상기 백금 입자가 상기 수지 입자에 고정화되어 있다.
본 발명의 수지-백금 복합체는 상기 백금 입자 중 적어도 일부 입자가 상기 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있어도 좋다. 이 경우, 복수의 상기 백금 입자의 60wt%~100wt%가 상기 표층부에 존재하고 있어도 좋다.
본 발명의 수지-백금 복합체에 있어서 상기 백금 입자는 상기 수지 입자의 지름 방향으로 서로 겹치는 일 없이 상기 수지 입자의 표면에 고정되어 있어도 좋다.
본 발명의 수지-백금 복합체는 상기 백금 입자의 평균 입자 지름이 1~80㎚의 범위 내이어도 좋다. 이 경우, 수지-백금 복합체는 평균 입자 지름이 50~1000㎚의 범위 내이어도 좋다.
본 발명의 수지-백금 복합체는 상기 백금 입자의 평균 입자 지름이 1~50㎚의 범위 내인 것이 바람직하고, 1~30㎚의 범위 내가 보다 바람직하고, 1~15㎚의 범위 내가 가장 바람직하다. 이들의 경우, 수지-백금 복합체의 평균 입자 지름은 100~600㎚의 범위 내인 것이 바람직하다.
본 발명의 수지-백금 복합체는 상기 백금 입자의 담지량이 수지-백금 복합체의 중량에 대하여 5wt%~70wt%의 범위 내이어도 좋다.
본 발명의 수지-백금 복합체는 상기 수지 입자가 백금 이온을 흡착하는 것이 가능한 치환기를 구조에 갖는 폴리머 입자이어도 좋다.
본 발명의 표지 물질은 상기 어느 하나의 수지-백금 복합체를 구비하고 있다. 이 경우, 상기 수지-백금 복합체의 표면에 항원 또는 항체를 흡착시켜서 사용하는 것이어도 좋다.
본 발명의 면역학적 측정법은 상기 어느 하나의 표지 물질을 사용하는 것이다.
본 발명의 면역학적 측정용 시약은 상기 어느 하나의 수지-백금 복합체를 구비하고 있다.
본 발명의 분석물의 측정 방법은 시료 중에 포함되는 분석물을 검출 또는 정량하는 방법이다. 이 분석물의 측정 방법은 멤브레인 및 상기 멤브레인에 상기 분석물과 특이적으로 결합하는 포착 리간드가 고정되어 이루어지는 판정부를 포함하는 래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립을 사용하여 하기 공정(I)~(III);
공정(I): 시료에 포함되는 상기 분석물과, 상기 분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 상기 어느 하나의 수지-백금 복합체로 표지한 표지 항체를 접촉시키는 공정,
공정(II): 상기 판정부에서 공정(I)에 있어서 형성된 분석물과 표지 항체를 포함하는 복합체를 포착 리간드에 접촉시키는 공정,
공정(III): 상기 수지-백금 복합체의 국재형 표면 플라즈몬 공명 및 전자 천이에 의한 광 에너지 흡수로부터 유래되는 발색 강도를 측정하는 공정
을 포함하는 공정을 행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 분석물 측정용 키트는 래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립을 사용하여 시료 중에 포함되는 분석물을 검출 또는 정량하기 위한 분석물 측정용 키트이다. 이 분석물 측정용 키트는 멤브레인 및 상기 멤브레인에 상기 분석물이 특이적으로 결합하는 포착 리간드가 고정되어 이루어지는 판정부를 포함하는 래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립과, 상기 분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 상기 어느 하나의 수지-백금 복합체로 표지한 표지 항체를 포함하는 검출 시약을 포함한다.
본 발명의 래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립은 시료 중에 포함되는 분석물을 검출 또는 정량하기 위한 것이다. 이 래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립은 멤브레인과, 상기 멤브레인에 상기 시료가 전개하는 방향에 있어서, 상기 분석물과 특이적으로 결합하는 포착 리간드가 고정되어 이루어지는 판정부와, 상기 판정부보다 상류측에 상기 분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 상기 어느 하나의 수지-백금 복합체로 표지한 표지 항체가 포함되는 반응부를 포함한다.
(발명의 효과)
본 발명의 수지-백금 복합체는, 예를 들면 항체 등의 리간드에 결합시킨 상태에서의 분산성이 우수하여 응집이 생기기 어렵다. 또한, 본 발명의 수지-백금 복합체는 수지 입자에 복수의 백금 입자가 고정화된 구조를 갖기 위해서 백금 입자의 담지량이 많고, 또한 백금 입자가 수지 입자로부터 탈리되기 어렵다. 또한, 백금 입자는 국재형 표면 플라즈몬 공명에 추가하여 전자 천이에 의한 광 에너지 흡수를 발현한다. 따라서, 본 발명의 수지-백금 복합체는 핸들링성, 내구성, 시인성, 육안 판정성, 검출 감도가 우수한 재료로서, 예를 들면 EIA, RIA, CLIA, FIA, LIA, PA, ICA, HA, HI 등의 면역학적 측정용 표지 물질, 면역학적 측정용 시약, 의약, 고체 촉매, 안료, 도료, 도전성 재료, 전극, 센서 소자 등의 목적으로 바람직하게 적용할 수 있다. 본 발명의 수지-백금 복합체를 면역학적 측정에 사용할 경우에는 핸들링성, 내구성 및 시인성이 우수하며, 또한 특별한 장치나 작업 공정의 추가를 필요로 하지 않고 고감도한 판정이 가능하게 된다.
도 1은 본 발명의 일실시형태에 의한 수지-백금 복합체의 단면 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2a는 수지-백금 복합체의 일실시형태의 단면 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2b는 수지-백금 복합체의 다른 실시형태의 단면 구조를 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일실시형태에 의한 래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립을 사용한 분석물의 측정 방법의 개요를 나타내는 설명도이다.
도 4는 수지-금속 복합체 표지 항체의 분산성 평가의 결과의 일례를 나타내는 사진이다.
도 5는 실시예 2에서 얻어진 수지-백금 복합체의 주사형 전자현미경(SEM) 사진이다.
도 6은 실시예 2에서 얻어진 수지-백금 복합체의 단면의 주사형 투과 전자현미경(STEM) 사진이다.
도 2a는 수지-백금 복합체의 일실시형태의 단면 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2b는 수지-백금 복합체의 다른 실시형태의 단면 구조를 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일실시형태에 의한 래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립을 사용한 분석물의 측정 방법의 개요를 나타내는 설명도이다.
도 4는 수지-금속 복합체 표지 항체의 분산성 평가의 결과의 일례를 나타내는 사진이다.
도 5는 실시예 2에서 얻어진 수지-백금 복합체의 주사형 전자현미경(SEM) 사진이다.
도 6은 실시예 2에서 얻어진 수지-백금 복합체의 단면의 주사형 투과 전자현미경(STEM) 사진이다.
이하, 적당히 도면을 참조하면서 본 발명의 실시형태에 대해서 상세하게 설명한다. 도 1은 본 발명의 일실시형태에 의한 수지-백금 복합체의 단면 모식도이다. 수지-백금 복합체(100)는 수지 입자(10)와, 백금 입자(20)를 구비하고 있다. 수지-백금 복합체(100)는 수지 입자(10)에 백금 입자(20)가 고정화되어 있다. 수지 입자(10)는 백금 입자(20)보다 상대적으로 큰 입자이다. 즉, 수지-백금 복합체(100)에서는 큰 수지 입자(10)에 상대적으로 작은 다수의 백금 입자(20)가 고정되어 있다. 도 1에 나타내는 바와 같이 수지-백금 복합체(100) 전체의 입자 지름(D1)과, 수지 입자(10)의 입자 지름(D2)과 백금 입자(20)의 입자 지름(D3)의 관계는 D1＞D2＞D3이다.
또한, 수지-백금 복합체(100)는 백금 입자(20)의 일부가 수지 입자(10)의 표층부(60)에 있어서 3차원적으로 분포되어 있어도 좋다. 이 경우, 3차원적으로 분포된 백금 입자(20)의 일부가 부분적으로 수지 입자(10) 밖으로 노출되어 있어도 좋고, 나머지 일부가 수지 입자(10)에 내포되어 있어도 좋다. 구체적으로는 도 1에 나타내는 바와 같이 백금 입자(20)에는 수지 입자(10)에 완전히 내포된 백금 입자(이하, 「내포 입자(30)」라고도 함), 수지 입자(10) 내에 포매된 부위 및 수지 입자(10) 밖으로 노출된 부위를 갖는 백금 입자(이하, 「일부 노출 입자(40)」라고도 함) 및 수지 입자(10)의 표면에 흡착하고 있는 백금 입자(이하, 「표면 흡착 입자(50)」라고도 함)가 존재하고 있는 것이 바람직하다.
예를 들면, 수지-백금 복합체(100)를 면역학적 측정용 표지 물질 또는 면역학적 측정용 시약에 사용할 경우, 수지 입자(10)의 표면 또는 일부 노출 입자(40) 또는 표면 흡착 입자(50)의 표면에 항체 또는 항원을 고정화하여 사용한다. 그때, 일부 노출 입자(40) 및 표면 흡착 입자(50)에는 상기 항체 또는 항원이 고정화되는 한편, 내포 입자(30)에는 고정화되지 않는다. 그러나, 일부 노출 입자(40), 표면 흡착 입자(50) 및 내포 입자(30) 모두 국재형 표면 플라즈몬 공명에 추가하여 전자 천이에 의한 광 에너지 흡수를 발현하는 점에서 일부 노출 입자(40) 및 표면 흡착 입자(50)뿐만 아니라 내포 입자(30)도 면역학적 측정용 표지 물질 및 면역학적 측정용 시약의 시인성 향상에 기여한다. 또한, 일부 노출 입자(40) 및 내포 입자(30)는 표면 흡착 입자(50)에 비교하여 수지 입자(10)와의 접촉 면적이 큰 것에 추가하여 포매 상태에 의한 앵커 효과 등이 나타나기 때문에 물리적 흡착력이 강해 수지 입자(10)로부터 탈리되기 어렵다. 그 때문에 수지-백금 복합체(100)를 사용한 면역학적 측정용 표지 물질 및 면역학적 측정용 시약의 내구성, 안정성을 우수한 것으로 할 수 있다.
이하, 수지-백금 복합체(100)를 면역학적 측정용 표지 물질(이하, 간단히 「표지 물질」라고도 함) 또는 면역학적 측정용 시약(이하, 간단히 「시약」이라고도 함)에 적용하는 경우를 예로서 설명한다.
내포 입자(30)는 그 표면의 전체가 수지 입자(10)를 구성하는 수지에 덮여 있는 것이다. 또한, 일부 노출 입자(40)는 그 표면적의 5% 이상 100% 미만이 수지 입자(10)를 구성하는 수지에 덮여 있는 것이다. 면역학적 측정용 표지 물질 및 면역학적 측정용 시약의 내구성의 관점으로부터 그 하한은 표면적의 20% 이상인 것이 바람직하고, 30% 이상인 것이 보다 바람직하다. 또한, 표면 흡착 입자(50)는 그 표면적의 0%를 초과하고 5% 미만이 수지 입자(10)를 구성하는 수지에 덮여 있는 것이 바람직하다.
또한, 수지-백금 복합체(100)로의 백금 입자(20)(내포 입자(30), 일부 노출 입자(40) 및 표면 흡착 입자(50)의 합계)의 담지량은 수지-백금 복합체(100)의 중량에 대하여 5wt%~70wt%인 것이 바람직하다. 이 범위이면, 수지-백금 복합체(100)는 표지 물질로서의 시인성, 육안 판정성 및 검출 감도가 우수하다. 백금 입자(20)의 담지량이 5wt% 미만에서는 항체 또는 항원의 고정화량이 적어져 검출 감도가 저하되는 경향이 있다. 백금 입자(20)의 담지량은 보다 바람직하게는 15wt%~70wt%, 더 바람직하게는 15wt%~60wt%이다. 또한, 백금 입자(20)를 갖는 수지-백금 복합체(100)는 다른 금속 입자(예를 들면, 금 입자를 갖는 수지-금 복합체)에 비해 보다 적은 담지량이어도 표지 물질로서 우수한 시인성, 육안 판정성 및 검출 감도가 얻어진다.
또한, 백금 입자(20)의 10wt%~90wt%가 일부 노출 입자(40) 및 표면 흡착 입자(50)인 것이 바람직하다. 이 범위이면, 백금 입자(20) 위로의 항체 또는 항원의 고정화량을 충분히 확보할 수 있기 때문에 표지 물질로서의 감도가 높다. 백금 입자(20)의 20wt%~80wt%가 일부 노출 입자(40) 및 표면 흡착 입자(50)인 것이 보다 바람직하고, 면역학적 측정용 표지 물질 및 면역학적 측정용 시약의 내구성의 관점으로부터 표면 흡착 입자(50)가 20wt% 이하인 것이 더 바람직하다.
또한, 수지-백금 복합체(100)를 면역학적 측정에 사용하는 경우에 우수한 검출 감도를 얻기 위해서는 백금 입자(20)의 60wt%~100wt%, 바람직하게는 75~100wt%가, 보다 바람직하게는 85~100wt%가 표층부(60)에 존재하는 것이 좋고, 보다 바람직하게는 수지 입자(10)의 표면으로부터 깊이 방향으로 입자 반경의 40%의 범위에 존재하는 것이 좋다. 또한, 표층부(60)에 존재하는 백금 입자(20)의 5wt%~90wt%가 일부 노출 입자(40) 또는 표면 흡착 입자(50)인 것이 백금 입자(20) 위로의 항체 또는 항원의 고정화량을 충분히 확보할 수 있기 때문에 표지 물질로서의 감도가 높아져 바람직하다. 바꾸어 말하면, 표층부(60)에 존재하는 백금 입자(20)의 10wt%~95wt%가 내포 입자(30)인 것이 좋다.
여기에서, 상기 「표층부」란 수지-백금 복합체(100)의 가장 외측의 위치(즉, 일부 노출 입자(40) 또는 표면 흡착 입자(50)의 돌출단부)를 기준으로 하여 수지 입자(10)의 표면으로부터 깊이 방향으로 입자 반경의 50%의 범위를 의미한다. 또한, 상기 「3차원적으로 분포」란 백금 입자(20)가 수지 입자(10)의 면방향뿐만 아니라 깊이 방향으로도 분산되어 있는 것을 의미한다.
상기와 같이 내포 입자(30)도 국재형 표면 플라즈몬 공명에 추가하여 전자 천이에 의한 광 에너지 흡수를 발현하는 점에서 일부 노출 입자(40) 및 표면 흡착 입자(50)뿐만 아니라 내포 입자(30)도 면역학적 측정용 표지 물질 및 면역학적 측정용 시약의 시인성 향상에 기여한다. 이러한 시인성 향상이라는 관점에서는 수지-백금 복합체(100)는, 예를 들면 도 2a에 나타내는 바와 같이 내포 입자(30)가 수지 입자(10)의 표면으로부터 깊이 방향으로 일정 범위 내에 집중해서 분포되고, 수지 입자(10)의 중심 부근에는 내포 입자(30)가 존재하지 않는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는 내포 입자(30)에 의한 국재형 표면 플라즈몬 공명에 추가하여 전자 천이에 의한 광 에너지 흡수를 효과적으로 발현시키기 위해서는, 예를 들면 수지 입자(10)의 입자 지름(D2)이 800㎚일 때, 수지 입자(10)의 표면으로부터 깊이 방향으로, 예를 들면 0~200㎚의 범위 내에 내포 입자(30)의 70wt% 이상, 바람직하게는 80wt% 이상, 보다 바람직하게는 90~100wt%가 존재하고 있는 것이 좋다. 특히, 내포 입자(30) 전체(100wt%)가 분포하는 영역(내포 입자 분포 영역)이 수지 입자(10)의 표면으로부터, 예를 들면 0~100㎚의 범위 내인 경우에는 내포 입자(30)에 의한 국재형 표면 플라즈몬 공명에 추가하여 전자 천이에 의한 광 에너지 흡수의 발현을 최대화할 수 있으므로 바람직하다.
또한, 수지-백금 복합체(100)는 내포 입자(30)를 갖지 않아도 좋다. 예를 들면, 도 2b에 나타내는 바와 같이 수지-백금 복합체(100)에 있어서 백금 입자(20) 전부가 수지 입자(10)의 지름 방향으로 서로 겹치는 일 없이 수지 입자(10)의 표면에 고정되어 있어도 좋다. 이 경우, 백금 입자(20)는 일부 노출 입자(40)와 표면 흡착 입자(50)로 구성된다.
수지 입자(10)는 백금 이온을 흡착하는 것이 가능한 치환기를 구조에 갖는 폴리머 입자인 것이 바람직하다. 특히, 함질소 폴리머 입자인 것이 바람직하다. 함질소 폴리머 중의 질소 원자는 시인성이 우수하며, 항원 또는 항체의 고정화가 용이한 백금 입자(20)의 전구체인 [PtCl6]2- 등의 음이온성 이온을 화학 흡착하기 쉽기 때문에 바람직하다. 본 실시형태에서는 함질소 폴리머 중에 흡착한 백금 이온을 환원하고, 백금 입자(20)를 형성하기 위해서 생성한 백금 입자(20)의 일부는 내포 입자(30) 또는 일부 노출 입자(40)가 된다. 또한, 아크릴산 중합체와 같은 카르복실산기 함유 폴리머 및 폴리스티렌술폰산과 같은 술폰산기 함유 폴리머(이하, 함께 「양이온성 이온을 흡착 가능한 폴리머」라고 함)는 함유하는 카르복실산기 및 술폰산기에 의해 Pt2 +와 같은 양이온성 이온을 화학 흡착할 수 있기 때문에 바람직하다. 예를 들면, 화학 흡착한 Pt2 +를 환원하여 백금 입자(20)를 형성함으로써 상기 함질소 폴리머 입자와 마찬가지인 구조를 제작하는 것이 가능하다. 또한, 예를 들면 은, 니켈, 구리 등의 금속의 전구체인 양이온성 이온을 흡착하기 쉽고, 이들을 사용함으로써 백금과의 합금을 제작하는 것도 가능하기 때문에 바람직하다.
한편, 백금 이온을 흡착하는 것이 가능한 치환기를 구조로 갖는 함질소 폴리머 이외의 수지 입자, 예를 들면 폴리스티렌 등의 경우 상기 백금 이온을 수지 내부에 흡착하기 어렵다. 그 결과, 생성한 백금 입자(20)의 대부분은 표면 흡착 입자(50)가 된다. 상기와 같이 표면 흡착 입자(50)는 수지 입자(10)와의 접촉 면적이 작기 때문에 수지와 금속의 접착력이 작아 수지 입자(10)로부터 백금 입자(20)가 탈리될 영향이 큰 경향이 있다.
상기 함질소 폴리머는 주쇄 또는 측쇄에 질소 원자를 갖는 수지이며, 예를 들면 폴리아민, 폴리아미드, 폴리펩티드, 폴리우레탄, 폴리요소, 폴리이미드, 폴리이미다졸, 폴리옥사졸, 폴리피롤, 폴리아닐린 등이 있다. 바람직하게는 폴리-2-비닐피리딘, 폴리-3-비닐피리딘, 폴리-4-비닐피리딘 등의 폴리아민이다. 또한, 측쇄에 질소 원자를 갖는 경우에는, 예를 들면 아크릴 수지, 페놀 수지, 에폭시 수지 등 폭넓게 이용하는 것이 가능하다.
또한, 상기 양이온성 이온을 흡착 가능한 폴리머는 주쇄 또는 측쇄에 카르복실산기, 술폰산기 등을 갖는 수지이며, 예를 들면 폴리아크릴산, 카르복실산비닐, 폴리아세트산비닐, 폴리비닐술폰산, 폴리스티렌술폰산 등 폭넓게 이용할 수 있다.
상기 함질소 폴리머 및 양이온성 이온을 흡착 가능한 폴리머는 공지의 중합성 모노머와의 공중합체이어도 좋다. 여기에서, 공중합체는 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 교호 공중합체, 중합체끼리가 가교한 것이 예시된다. 또한, 2종류 이상의 모노머를 공중합시켜서 수지 입자(10)를 형성해도 좋고, 수지 입자(10)의 표면에 존재하는 관능기에 모노머를 반응시키고, 그것을 중합 활성 말단으로서 더 중합시켜도 좋다. 그 공중합 조성은 한정되지 않지만, 상기 백금 이온을 흡착하는 것이 가능한 치환기를 함유하는 모노머가 10mol% 이상인 것이 바람직하다.
백금 입자(20)를 갖는 수지-백금 복합체(100)는 다른 금속종의 입자를 갖는 수지 복합체와 비교하여 항체 등의 리간드와 결합시킨 상태에서 응집을 발생하기 어려워 분산성이 매우 우수하다. 또한, 백금 입자(20)는 산화 등의 변질에 강해 보존 안정성도 우수하다. 또한, 백금 입자(20)는, 예를 들면 250㎚~900㎚까지의 범위의 폭넓은 파장에서 국재형 표면 플라즈몬 공명으로부터 유래되는 흡수를 발현하고, 또한 전자 천이에 의한 광 에너지 흡수의 발현에 의해 흑색에 가까운 강한 발색을 나타내므로 수지-백금 복합체(100)를 표지 물질로서 사용함으로써 면역학적 측정에 있어서 높은 시인성이 얻어지고, 분석물의 검출 감도도 높일 수 있다. 이 경우, 백금 입자(20)를 사용함으로써 다른 금속(예를 들면, 금)의 입자에 비해 적은 담지량으로 우수한 검출 감도가 얻어진다. 따라서, 가령 평균 입자 지름이 동등하면 수지-백금 복합체(100)는 다른 금속종의 입자를 갖는 수지 복합체에 비해 유의하게 높은 검출 감도를 나타낸다.
백금 입자(20)는 백금만으로 이루어지는 것이어도 좋고, 백금과 다른 금속과의 합금이어도 좋다. 백금 합금은 백금과 백금 이외의 금속종으로 이루어지고, 백금을 1중량% 이상 함유하는 합금을 의미한다. 여기에서, 백금과 합금을 형성하는 다른 금속종으로서는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 은, 니켈, 구리, 금, 팔라듐 등이 바람직하고, 보존 안정성, 시인성이 우수한 금, 팔라듐 등이 보다 바람직하다.
또한, 주사형 전자현미경(SEM) 관찰에 의해 측장되는 백금 입자(20)의 평균 입자 지름(즉, 도 1에 있어서의 입자 지름(D3)의 평균)은, 예를 들면 1~80㎚인 것이 바람직하다. 백금 입자(20)의 평균 입자 지름이 1㎚ 미만인 경우나 80㎚를 초과할 경우에는 국재형 표면 플라즈몬 공명 및 전자 천이에 의한 광 에너지 흡수가 발현되기 어려워지기 때문에 감도가 저하되는 경향이 있다. 백금 입자(20)의 평균 입자 지름은 수지-백금 복합체(100)를 면역학적 측정에 사용할 경우에 높은 검출 감도를 얻는 관점으로부터 바람직하게는 1㎚ 이상 50㎚ 이하이며, 보다 바람직하게는 1㎚ 이상 30㎚ 이하이며, 더 바람직하게는 1㎚ 이상 20㎚ 이하이며, 가장 바람직하게는 1㎚ 이상 15㎚ 이하이다. 특히, 백금 입자(20)의 평균 입자 지름이 15㎚ 이하인 경우, 수지-백금 복합체(100)를 이뮤노 크로마토그래프의 표지 물질로서 사용하는 경우에 특히 우수한 검출 감도가 얻어진다.
또한, 수지-백금 복합체(100)의 평균 입자 지름(즉, 도 1에 있어서의 입자 지름(D1)의 평균)은, 예를 들면 50~1000㎚인 것이 바람직하다. 수지-백금 복합체(100)의 평균 입자 지름이 50㎚ 미만에서는, 예를 들면 백금 입자의 담지량이 적어지는 경향이 있기 때문에 같은 사이즈의 백금 입자보다 착색이 약해지는 경향이 있고, 1000㎚를 초과하면, 표지 물질 또는 시약으로 했을 때에 멤브레인 필터 등의 크로마토그래프 매체의 세공 내에 막히기 쉬운 경향이나, 분산성이 저하되는 경향이 있다. 수지-백금 복합체(100)의 평균 입자 지름은 표지 물질 또는 시약으로 했을 때의 분산성을 향상시킴과 아울러, 수지-백금 복합체(100)를 면역학적 측정에 사용할 경우에 높은 검출 감도를 얻는 관점으로부터 바람직하게는 100㎚ 이상 600㎚ 이하이며, 보다 바람직하게는 250㎚ 이상 600㎚ 이하이며, 가장 바람직하게는 300㎚ 이상 600㎚ 이하이다. 특히, 수지-백금 복합체(100)의 평균 입자 지름이 300㎚ 이상이면 수지-백금 복합체(100)를 이뮤노 크로마토그래프의 표지 물질로서 사용하는 경우에 안정되게 우수한 검출 감도가 얻어진다. 여기에서, 수지-백금 복합체(100)의 입자 지름은 수지 입자(10)의 입자 지름에 일부 노출 입자(40) 또는 표면 흡착 입자(50)의 돌출 부위의 길이를 더한 값을 의미하고, 레이저 회절/산란법, 동적 광산란법 또는 원심 침강법에 의해 측정할 수 있다.
[수지-백금 복합체의 제조 방법]
수지-백금 복합체(100)의 제조 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 유화 중합법에 의해 제조한 수지 입자(10)의 분산액에 백금 이온을 함유하는 용액을 첨가하여 백금 이온을 수지 입자(10)에 흡착시킨다(이하, 「백금 이온 흡착 수지 입자」라고 함). 또한, 상기 백금 이온 흡착 수지 입자를 환원제 용액 중에 첨가함으로써 백금 이온을 환원하여 백금 입자(20)를 생성시켜 수지-백금 복합체(100)를 얻는다.
또한, 예를 들면 백금 이온을 함유하는 용액으로서는 염화백금산(H2PtCl6) 수용액, 염화백금(PtCl2) 용액 등을 들 수 있다. 또한, 백금 이온 대신에 백금 착체를 사용해도 좋다.
또한, 백금 이온을 함유하는 용액의 용매로서 물 대신에 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, t-부탄올 등의 함수 알코올 또는 알코올, 염산, 황산, 질산 등의 산 등을 사용해도 좋다.
또한, 상기 용액에 필요에 따라, 예를 들면 폴리비닐알코올 등의 수용성 고분자 화합물, 계면활성제, 알코올류; 테트라히드로푸란, 디에틸에테르, 디이소프로필에테르 등의 에테르류; 알킬렌글리콜, 폴리알킬렌글리콜, 이들의 모노알킬에테르 또는 디알킬에테르, 글리세린 등의 폴리올류; 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤류 등의 각종 수혼화성 유기 용매 등의 첨가제를 첨가해도 좋다. 이러한 첨가제는 백금 이온의 환원 반응 속도를 촉진하고, 또한 생성되는 백금 입자(20)의 크기를 제어하는데에 유효하게 된다.
또한, 환원제는 공지의 물질을 사용할 수 있다. 예를 들면, 수소화붕소나트륨, 디메틸아민보란, 시트르산, 차아인산나트륨, 포수 히드라진, 염산히드라진, 황산히드라진, 포름알데히드, 수크로오스, 포도당, 아스코르브산, 에리소르브산, 포스핀산나트륨, 하이드로퀴논, 로셸염 등을 들 수 있다. 이 중, 수소화붕소나트륨 또는 디메틸아민보란, 시트르산이 바람직하다.
환원제 용액에는 필요에 따라 계면활성제를 첨가하거나, 용액의 pH를 조정할 수 있다. pH 조정에는 붕산이나 인산 등의 완충제, 염산, 황산 등의 산, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리를 사용하여 행할 수 있다.
또한, 환원제 용액의 온도에 따라 백금 이온의 환원 속도를 조정함으로써 형성하는 백금 입자(20)의 입경을 컨트롤할 수 있다.
또한, 상기 백금 이온 흡착 수지 입자 중의 백금 이온을 환원하여 백금 입자(20)를 생성시킬 때 상기 백금 이온 흡착 수지 입자를 환원제 용액에 첨가해도 좋고, 환원제를 상기 백금 이온 흡착 수지 입자에 첨가해도 좋지만, 내포 입자(30) 및 일부 노출 입자(40)의 생성하기 용이함의 관점으로부터 전자가 바람직하다.
또한, 수지-백금 복합체(100)의 물로의 분산성을 유지하기 위해서, 예를 들면 시트르산, 폴리-L-리신, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐피리딘, 폴리비닐알코올, DISPERBYK194, DISPERBYK180, DISPERBYK184(BYK Japan KK제) 등의 분산제를 첨가해도 좋다.
또한, 붕산이나 인산 등의 완충제, 염산, 황산 등의 산, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리에 의해 pH를 조정하여 분산성을 유지할 수 있다.
이상의 구성을 갖는 수지-백금 복합체(100)는 특히 백금 입자(20)의 표면에 항원 또는 항체를 흡착시킴으로써 표지 물질로서, 예를 들면 EIA, RIA, CLIA, FIA, LIA, PA, ICA, HA, HI 등의 면역학적 측정법에 바람직하게 적용할 수 있다. 또한, 특히 저농도역(고감도 영역)에서의 육안 판정성이 우수한 면역학적 측정용 표지 물질 또는 면역학적 측정용 시약의 재료로서 바람직하게 적용할 수 있다. 또한, 면역학적 측정용 표지 물질 또는 면역학적 측정용 시약의 형태에 특별히 한정은 없지만, 예를 들면 수지-백금 복합체(100)를 물 또는 pH를 조정한 완충액 중에 분산시킨 분산액으로서 사용할 수 있다.
상기 백금 입자(20)의 표면에 항원 또는 항체를 흡착시키는 방법으로서는 특별히 한정되지 않고, 공지의 물리 흡착 및 화학 흡착에 의한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 항원 또는 항체를 포함하는 완충액 중에 수지-백금 복합체(100)를 침지시켜 인큐베이트하는 등의 물리 흡착이나, 항원 또는 항체에 SH기를 도입하여 수지-백금 복합체(100)와 반응시켜서 Pt-SH 결합을 형성하는 등의 화학 흡착을 들 수 있다. 그 중에서도 백금 입자(20)와 항원 또는 항체와의 결합이 강고해지는 점에서 화학 흡착이 바람직하다.
이어서, 수지-백금 복합체(100)를 표지 물질로서 사용한 분석물의 측정 방법, 래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립 및 분석물 검출·정량 키트에 대하여 설명한다.
[래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립]
우선, 도 3을 참조하면서 본 발명의 일실시형태에 의한 래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립(이하, 간단히 「테스트 스트립」이라고 기재하는 경우가 있음)에 대하여 설명한다. 이 테스트 스트립(200)은 후술하는 바와 같이 본 발명의 일실시형태의 분석물의 측정 방법에 바람직하게 사용할 수 있는 것이다.
테스트 스트립(200)은 멤브레인(110)을 구비하고 있다. 멤브레인(110)에는 시료의 전개 방향에 있어서 순서대로 시료 첨가부(120), 판정부(130) 및 흡액부(140)가 설치되어 있다.
<멤브레인>
테스트 스트립(200)에 사용되는 멤브레인(110)으로서는 일반적인 테스트 스트립에 있어서 멤브레인 재료로서 사용되는 것을 적용할 수 있다. 멤브레인(110)은, 예를 들면 모관 현상을 나타내고, 시료를 첨가함과 동시에 시료가 전개하는 미세 다공성 물질로 이루어지는 불활성 물질(분석물(160), 각종 리간드 등과 반응하지 않는 물질)로 형성되어 있는 것이다. 멤브레인(110)의 구체예로서는 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리염화비닐, 폴리불화비닐리덴, 나일론, 셀룰로오스 유도체 등으로 구성되는 섬유상 또는 부직 섬유상 매트릭스, 막, 여과지, 유리 섬유 여과지, 포, 면 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 바람직하게는 셀룰로오스 유도체나 나일론으로 구성되는 막, 여과지, 유리 섬유 여과지 등이 사용되고, 보다 바람직하게는 니트로셀룰로오스막, 혼합 니트로셀룰로오스에스테르(니트로셀룰로오스와 아세트산셀룰로오스의 혼합물)막, 나일론막, 여과지가 사용된다.
테스트 스트립(200)은 조작을 보다 간편하게 하기 위해서 멤브레인(110)을 지지하는 지지체를 구비하는 것이 바람직하다. 지지체로서는, 예를 들면 플라스틱 등을 사용할 수 있다.
<시료 첨가부>
테스트 스트립(200)은 분석물(160)을 포함하는 시료를 첨가하기 위한 시료 첨가부(120)를 갖고 있어도 좋다. 시료 첨가부(120)는 테스트 스트립(200)에 분석물(160)을 포함하는 시료를 받아들이기 위한 부위이다. 시료 첨가부(120)는 시료가 전개하는 방향에 있어서 판정부(130)보다 상류측의 멤브레인(110)에 형성 되어 있어도 좋고, 또는, 예를 들면 셀룰로오스 여과지, 유리 섬유, 폴리우레탄, 폴리아세테이트, 아세트산셀룰로오스, 나일론, 면포 등의 재료로 구성된 시료 첨가 패드가 멤브레인(110)에 설치되어 시료 첨가부(120)를 구성하고 있어도 좋다.
<판정부>
판정부(130)에는 분석물(160)과 특이적으로 결합하는 포착 리간드(131)가 고정되어 있다. 포착 리간드(131)는 분석물(160)과 특이적인 결합을 형성하는 것이면 특별히 제한 없이 사용할 수 있고, 예를 들면 분석물(160)에 대한 항체 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 포착 리간드(131)는 테스트 스트립(200)에 시료를 제공했을 경우에 있어서도 판정부(130)로부터 이동하는 일이 없도록 부동화되어 있다. 포착 리간드(131)는 물리적 또는 화학적인 결합이나 흡착 등에 의해 멤브레인(110)에 직접적 또는 간접적으로 고정되어 있으면 좋다.
또한, 판정부(130)는 표지 항체(150)와 분석물(160)을 포함하는 복합체(170)가 분석물(160)과 특이적으로 결합하는 포착 리간드(131)에 접촉하는 구성인 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 멤브레인(110)에 직접 포착 리간드(131)가 고정되어 있어도 좋고, 또는 멤브레인(110)에 고정된 셀룰로오스 여과지, 유리 섬유, 부직포 등으로 이루어지는 패드에 포착 리간드(131)가 고정되어 있어도 좋다.
<흡액부>
흡액부(140)는, 예를 들면 셀룰로오스 여과지, 부직포, 천, 셀룰로오스아세테이트 등의 흡수성 재료의 패드에 의해 형성된다. 첨가된 시료의 전개 전선(프론트 라인)이 흡액부(140)에 도달하고 나서의 시료의 이동 속도는 흡액부(140)의 재질, 크기 등에 따라 상이한 것이 된다. 따라서, 흡액부(140)의 재질, 크기 등의 선정에 의해 분석물(160)의 검출·정량에 최적인 속도를 설정할 수 있다. 또한, 흡액부(140)는 임의의 구성이며, 생략해도 좋다.
테스트 스트립(200)은 필요에 따라 반응부, 컨트롤부 등의 임의의 부위를 더 포함하고 있어도 좋다.
<반응부>
도면에 나타내는 것은 생략하지만, 테스트 스트립(200)에는 멤브레인(110)에 표지 항체(150)를 포함하는 반응부가 형성되어 있어도 좋다. 반응부는 시료가 흐르는 방향에 있어서 판정부(130)보다 상류측에 설치할 수 있다. 또한, 도 3에 있어서의 시료 첨가부(120)를 반응부로서 이용해도 좋다. 테스트 스트립(200)이 반응부를 가질 경우, 분석물(160)을 포함하는 시료를 반응부 또는 시료 첨가부(120)에 제공하면 반응부에 있어서 시료에 포함되는 분석물(160)과 표지 항체(150)를 접촉시킬 수 있다. 이 경우, 시료를 단순히 반응부 또는 시료 첨가부(120)에 제공함으로써 분석물(160)과 표지 항체(150)를 포함하는 복합체(170)를 형성시킬 수 있으므로, 소위 1스텝형의 이뮤노 크로마토그래프가 가능하게 된다.
반응부는 분석물(160)과 특이적으로 결합하는 표지 항체(150)를 포함하는 한 특별히 한정되지 않지만, 멤브레인(110)에 직접 표지 항체(150)가 도포되어 이루어지는 것이어도 좋다. 또는 반응부는, 예를 들면 셀룰로오스 여과지, 유리 섬유, 부직포 등으로 이루어지는 패드(콘주게이트 패드)에 표지 항체(150)를 함침한 것을 멤브레인(110)에 고정하여 이루어지는 것이어도 좋다.
<컨트롤부>
도시는 생략하지만 테스트 스트립(200)은 멤브레인(110)에 시료가 전개하는 방향에 있어서 표지 항체(150)와 특이적으로 결합하는 포착 리간드가 고정되어 이루어지는 컨트롤부가 형성되어 있어도 좋다. 판정부(130)와 함께 컨트롤부에서도 발색 강도가 측정됨으로써 테스트 스트립(200)에 제공한 시료가 전개되어 반응부 및 판정부(130)에 도달하고, 검사가 정상적으로 행해진 것을 확인할 수 있다. 또한, 컨트롤부는 포착 리간드(131) 대신에 표지 항체(150)와 특이적으로 결합하는 별도의 종류의 포착 리간드를 사용하는 것을 제외하고는 상술한 판정부(130)와 마찬가지로 하여 제작되며, 마찬가지의 구성을 채용할 수 있다.
[분석물의 측정 방법]
이어서, 테스트 스트립(200)을 사용해서 행해지는 본 발명의 일실시형태의 분석물(160)의 측정 방법에 대하여 설명한다.
본 실시형태의 분석물(160)의 측정 방법은 시료 중에 포함되는 분석물(160)을 검출 또는 정량하는 분석물(160)의 측정 방법이다. 본 실시형태의 분석물(160)의 측정 방법은 멤브레인(110) 및 상기 멤브레인(110)에 분석물(160)과 특이적으로 결합하는 포착 리간드(131)가 고정되어 이루어지는 판정부(130)를 포함하는 테스트 스트립(200)을 사용한다. 그리고, 본 실시형태의 분석물(160)의 측정 방법은 하기 공정(I)~(III);
공정(I): 시료에 포함되는 상기 분석물(160)과, 상기 분석물(160)에 특이적으로 결합하는 항체를 수지 입자(10)에 복수의 백금 입자(20)가 고정화된 구조를 갖는 수지-백금 복합체(100)로 표지한 표지 항체(150)를 접촉시키는 공정,
공정(II): 판정부(130)에서 공정(I)에 있어서 형성된 분석물(160)과 표지 항체(150)를 포함하는 복합체(170)를 포착 리간드(131)에 접촉시키는 공정,
공정(III): 수지-백금 복합체(100)의 국재형 표면 플라즈몬 공명 및 전자 천이에 의한 광 에너지 흡수로부터 유래되는 발색 강도를 측정하는 공정을 포함할 수 있다.
공정(I):
공정(I)은 시료에 포함되는 분석물(160)을 표지 항체(150)에 접촉시키는 공정이다. 분석물(160)과 표지 항체(150)를 포함하는 복합체(170)를 형성하는 한 접촉의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 테스트 스트립(200)의 시료 첨가부(120) 또는 반응부(도시 생략)에 시료를 제공하여 상기 반응부에 있어서 분석물(160)을 표지 항체(150)에 접촉시켜도 좋고, 테스트 스트립(200)에 시료를 제공하기 전에 시료 중의 분석물(160)을 표지 항체(150)에 접촉시켜도 좋다.
공정(I)에서 형성된 복합체(170)는 테스트 스트립(200) 상에서 전개되어 이동하고, 판정부(130)에 도달한다.
공정(II):
공정(II)은 테스트 스트립(200)의 판정부(130)에 있어서 공정(I)에 있어서 형성된 분석물(160)과 표지 항체(150)를 포함하는 복합체(170)를 포착 리간드(131)에 접촉시킨다. 복합체(170)를 포착 리간드(131)에 접촉시키면 포착 리간드(131)는 복합체(170)의 분석물(160)에 특이적으로 결합한다. 그 결과, 복합체(170)가 판정부(130)에 있어서 포착된다.
또한, 포착 리간드(131)는 표지 항체(150)에는 특이적으로 결합하지 않기 때문에 분석물(160)과 미결합의 표지 항체(150)가 판정부(130)에 도달했을 경우, 상기 분석물(160)과 미결합의 표지 항체(150)는 판정부(130)를 통과한다. 여기에서, 테스트 스트립(200)에 표지 항체(150)에 특이적으로 결합하는 별도의 포착 리간드가 고정된 컨트롤부(도시 생략)가 형성되어 있을 경우, 판정부(130)를 통과한 표지 항체(150)는 전개를 계속하여 컨트롤부에서 상기 별도의 포착 리간드와 결합한다. 그 결과, 분석물(160)과 복합체(170)를 형성하지 않는 표지 항체(150)는 컨트롤부에서 포착된다.
공정(II) 후 필요에 따라 공정(III) 전에, 예를 들면 물, 생리 식염수, 인산완충액 등의 생화학 검사에서 범용되는 완충액으로 테스트 스트립(200)을 세정하는 세정 공정을 실시해도 좋다. 세정 공정에 의해 판정부(130) 또는 판정부(130) 및 컨트롤부에 포착되지 않은 표지 항체(150)(분석물(160)과 결합하고 있지 않고, 복합체(170)를 형성하지 않는 표지 항체(150))를 제거할 수 있다.
세정 공정을 실시함으로써 공정(III)에 있어서 판정부(130) 또는 판정부(130) 및 컨트롤부에 있어서의 수지-백금 복합체(100)의 국재형 표면 플라즈몬 공명 및 전자 천이에 의한 광 에너지 흡수에 의한 발색을 측정할 때에 백그라운드의 발색 강도를 저감시킬 수 있고, 시그널/백그라운드 비를 높여 한층 더 검출 감도나 정량성을 향상시킬 수 있다.
공정(III):
공정(III)은 수지-백금 복합체(100)의 국재형 표면 플라즈몬 공명 및 전자 천이에 의한 광 에너지 흡수로부터 유래되는 발색 강도를 측정하는 공정이다. 상기 공정(II) 또는 필요에 따라 세정 공정을 실시한 후, 테스트 스트립(200)에 있어서 수지-백금 복합체(100)의 국재형 표면 플라즈몬 공명 및 전자 천이에 의한 광 에너지 흡수로부터 유래되는 발색 강도를 측정한다.
또한, 테스트 스트립(200)에 컨트롤부가 형성되어 있을 경우, 공정(II)에 의해 컨트롤부에서 표지 항체(150)가 별도의 포착 리간드에 의해 포착되어 복합체가 형성된다. 그 때문에 공정(III)에서는 테스트 스트립(200)에 있어서, 판정부(130)뿐만 아니라 컨트롤부에 있어서도 국재형 표면 플라즈몬 공명 및 전자 천이에 의한 광 에너지 흡수에 의한 발색을 발생시킬 수 있다. 이와 같이, 판정부(130)와 함께 컨트롤부에 있어서도 발색 강도를 측정함으로써 테스트 스트립(200)에 제공한 시료가 정상적으로 전개되어 반응부 및 판정부(130)에 도달했는지의 여부를 확인할 수 있다.
<시료 및 분석물>
본 실시형태의 분석물의 측정 방법에 있어서의 시료는 분석물(160)로서 단백질 등의 항원이 될 수 있는 물질을 포함하는 것인 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 목적의 분석물(160)을 포함하는 생체 시료(즉, 전혈, 혈청, 혈장, 요, 타액, 객담, 비강 또는 인두 와이핑액, 골수액, 양수, 유두 분비액, 눈물, 땀, 피부로부터의 침출액, 조직이나 세포 및 변으로부터의 추출액 등)나 식품의 추출액 등을 들 수 있다. 필요에 따라, 표지 항체(150) 및 포착 리간드(131)와 분석물(160)의 특이적인 결합 반응이 생기기 쉽게 하기 위해서 상기 공정(I)에 앞서 시료에 포함되는 분석물(160)을 전처리해도 좋다. 여기에서, 사전 처리로서는 산, 염기, 계면활성제 등의 각종 화학 약품 등을 사용한 화학적 처리나, 가열·교반·초음파 등을 사용한 물리적 처리를 들 수 있다. 특히, 분석물(160)이 인플루엔자 바이러스 NP 항원 등의 통상은 표면에 노출되지 않는 물질일 경우, 계면활성제 등에 의한 처리를 행하는 것이 바람직하다. 이 목적으로 사용되는 계면활성제로서 특이적인 결합 반응, 예를 들면 항원항체 반응 등의 포착 리간드(131)와 분석물(160)의 결합 반응성을 고려하여 비이온성 계면활성제를 사용할 수 있다.
또한, 상기 시료는 일반적인 면역학적 분석법에서 사용되는 용매(물, 생리 식염수 또는 완충액 등)나 수 혼화 유기 용매로 적당히 희석되어 있어도 좋다.
상기 분석물(160)로서는, 예를 들면 종양 마커, 시그널 전달 물질, 호르몬 등의 단백질(폴리펩티드, 올리고펩티드 등을 포함함), 핵산(단일쇄 또는 이중쇄의 DNA, RNA, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, PNA(펩티드 핵산) 등을 포함함) 또는 핵산을 갖는 물질, 당(올리고당, 다당류, 당쇄 등을 포함함) 또는 당쇄를 갖는 물질, 지방질 등 그 밖의 분자를 들 수 있고, 표지 항체(150) 및 포착 리간드(131)에 특이적으로 결합하는 것인 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 암 태아성 항원(CEA), HER2단백, 전립선 특이 항원(PSA), CA19-9, α-페토프로테인(AFP), 면역억제 산성단백(IAP), CA15-3, CA125, 에스트로겐 리셉터, 프로게스테론 리셉터, 변 잠혈, 트로포닌I, 트로포닌T, CK-MB, CRP, 인간 융모성 고나드트로핀(HCG), 황체형성호르몬(LH), 난포자극호르몬(FSH), 매독 항체, 인플루엔자바이러스인간헤모글로빈, 클라미디아항원, A군 β용련균 항원, HBs항체, HBs항원, 로타바이러스, 아데노바이러스, 알부민, 당화알부민 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 비이온성 계면활성제에 의해 가용화되는 항원이 바람직하고, 바이러스의 핵 단백질과 같이 자기 집합체를 형성하는 항원이 보다 바람직하다.
<표지 항체>
표지 항체(150)는 공정(I)에 있어서, 시료에 포함되는 분석물(160)에 접촉시켜 분석물(160)과 표지 항체(150)를 포함하는 복합체(170)를 형성하기 위해서 사용된다. 표지 항체(150)는 분석물(160)에 특이적으로 결합하는 항체를 수지 입자(10)에 복수의 백금 입자(20)가 고정화된 구조를 갖는 수지-백금 복합체(100)로 표지화하여 이루어지는 것이다. 여기에서, 「표지화」란 공정(I)~(III)에 있어서 표지 항체(150)로부터 수지-백금 복합체(100)가 탈리하지 않을 정도로 항체에 수지-백금 복합체(100)가 직접적으로 또는 간접적으로 화학적 또는 물리적인 결합이나 흡착 등에 의해 고정되어 있는 것을 의미한다. 예를 들면, 표지 항체(150)는 항체에 수지-백금 복합체(100)가 직접 결합하여 이루어지는 것이어도 좋고, 항체와 수지-백금 복합체(100)가 임의의 링커 분자를 개재하여 결합하여 이루어지는 것이나, 각각이 불용성 입자에 고정되어 이루어지는 것이어도 좋다.
또한, 본 실시형태에 있어서, 「항체」로서는 특별히 제한은 없고, 예를 들면 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 유전자재조합에 의해 얻어진 항체 이외에 항원과 결합능을 갖는 항체 단편[예를 들면, H쇄, L쇄, Fab, F(ab')2 등] 등을 사용할 수 있다. 또한, 면역 글로블린으로서 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 중 어느 것이어도 좋다. 항체의 생산 동물종으로서는 인간을 비롯하여 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 말 등)이어도 좋다. 항체의 구체예로서는 항 PSA 항체, 항 AFP 항체, 항 CEA 항체, 항 아데노바이러스 항체, 항 인플루엔자 바이러스 항체, 항 HCV 항체, 항 IgG 항체, 항 인간IgE 항체 등을 들 수 있다.
<표지 항체의 바람직한 제작 방법>
이어서, 표지 항체(150)의 바람직한 제작 방법을 열거하여 설명한다. 표지 항체(150)의 제조는 적어도 다음의 공정 A;
공정 A) 수지-백금 복합체(100)를 제 1 pH 조건에서 항체와 혼합해서 결합시킴으로써 표지 항체(150)를 얻는 공정
을 포함하고, 바람직하게는 공정 B;
공정 B) 표지 항체(150)를 제 2 pH 조건에서 처리하는 공정
을 더 포함할 수 있다.
[공정 A]
공정 A에서는 수지-백금 복합체(100)를 제 1 pH 조건에서 항체와 혼합하여 표지 항체(150)를 얻는다. 공정 A는 고체상의 수지-백금 복합체(100)를 액상 중에 분산시킨 상태로 항체와 접촉시키는 것이 바람직하다.
제 1 pH 조건은 수지-백금 복합체(100)의 분산과 항체의 활성을 유지한 채 수지-백금 복합체(100)와 항체를 균일하게 접촉시키는 관점으로부터 pH 2~10의 범위 내의 조건이 바람직하고, 또한 예를 들면 pH 5~9의 범위 내가 보다 바람직하다. 수지-백금 복합체(100)와 항체를 결합시킬 때의 조건이 pH 2 미만에서는 강산성에 의해 항체가 변질되어 실활되는 경우가 있고, pH 10을 초과하면 수지-백금 복합체(100)와 항체를 혼합했을 때에 응집하여 분산이 곤란해진다. 단, 강산성에 의해 항체가 실활되지 않는 경우에는 pH 2 미만에 있어서도 처리가 가능하다.
공정 A는 제 1 pH 조건에 조정한 결합용 완충액(Binding Buffer) 중에서 행하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기 pH로 조정한 결합용 완충액에 소정량의 수지-백금 복합체(100)를 혼합하여 충분히 혼화한다. 결합용 완충액으로서는, 예를 들면 소정 농도로 조정한 붕산 용액 등을 사용할 수 있다. 결합용 완충액의 pH의 조정은, 예를 들면 염산, 수산화나트륨 등을 사용하여 행할 수 있다.
이어서, 얻어진 혼합액에 소정량의 항체를 첨가하고, 충분히 교반, 혼합함으로써 표지 항체 함유액을 얻을 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 표지 항체 함유액은, 예를 들면 원심분리 등의 고액 분리 수단에 의해 고형 부분으로서 표지 항체(150)만을 분취할 수 있다.
[공정 B]
공정 B에서는 공정 A에서 얻어진 표지 항체(150)를 제 2 pH 조건에서 처리함으로써 표지 항체(150)로의 비특이적인 흡착을 억제하는 블록킹을 행한다. 이 경우, 고액 분리 수단에 의해 분취해 둔 표지 항체(150)를 제 2 pH 조건에서 액상 중에 분산시킨다.
제 2 pH 조건은 항체의 활성을 유지하며 또한 표지 항체(150)의 응집을 억제하는 관점으로부터, 예를 들면 pH 2~10의 범위 내가 바람직하고, 표지 항체(150)의 비특이적인 흡착을 억제하는 관점으로부터 pH 5~9의 범위 내가 보다 바람직하다. 블록킹의 조건이 pH 2 미만에서는 강산성에 의해 항체가 변질되어 실활되는 경우가 있고, pH 10을 초과하면 표지 항체(150)가 응집해버려 분산이 곤란해진다.
공정 B는 제 2 pH 조건으로 조정한 블록용 완충액(Blocking Buffer)을 사용하여 행하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 소정량의 표지 항체(150)에 상기 pH로 조정한 블록용 완충액을 첨가하고, 블록용 완충액 중에서 표지 항체(150)를 균일하게 분산시킨다. 블록용 완충액으로서는, 예를 들면 피검출물과 결합하지 않는 단백질의 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 블록용 완충액에 사용 가능한 단백질로서는, 예를 들면 소혈청 알부민, 난백 알부민, 카제인, 젤라틴 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 소정 농도로 조정한 소혈청 알부민 용액 등을 사용하는 것이 바람직하다. 블록용 완충액의 pH의 조정은, 예를 들면 염산, 수산화나트륨 등을 사용하여 행할 수 있다. 표지 항체(150)의 분산에는, 예를 들면 초음파 처리 등의 분산 수단을 사용하는 것이 바람직하다. 이렇게 하여 표지 항체(150)가 균일 분산된 분산액이 얻어진다.
상기 공정 A 및 공정 B에 있어서, 백금 입자(20)를 갖는 수지-백금 복합체(100)는 pH에 의한 응집이 일어나기 어렵고, 산성~알칼리성까지 넓은 범위의 pH에서 처리가 가능하다. 한편, 예를 들면, 금 입자를 갖는 수지-금 복합체의 경우에는 공정 A에 있어서, pH 7 초과의 조건에서는 수지-금 복합체끼리 응집하는 경향이 있고, 또한 공정 B에 있어서 pH 9 초과의 조건에서는 수지-금 복합체끼리 응집하는 경향이 있다. 따라서, 본 발명에서 사용하는 수지-백금 복합체(100)는 표지 항체의 제작 조건의 제한을 받기 어렵다는 이점도 있다.
이상과 같이 해서 표지 항체(150)의 분산액이 얻어진다. 이 분산액으로부터 예를 들면 원심 분리 등의 고액 분리 수단에 의해 고형 부분으로서 표지 항체(150)만을 분취할 수 있다. 또한, 필요에 따라 세정 처리, 보존 처리 등을 실시할 수 있다. 이하, 세정 처리, 보존 처리에 대하여 설명한다.
(세정 처리)
세정 처리는 고액 분리 수단에 의해 분취한 표지 항체(150)에 세정용 완충액을 첨가하고, 세정용 완충액 중에서 표지 항체(150)를 균일하게 분산시킨다. 분산에는, 예를 들면 초음파 처리 등의 분산 수단을 사용하는 것이 바람직하다. 세정용 완충액으로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 pH 8~9의 범위 내로 조정한 소정 농도의 트리스(Tris) 완충액, 글리신아미드 완충액, 아르기닌 완충액 등을 사용할 수 있다. 세정용 완충액의 pH의 조정은, 예를 들면 염산, 수산화나트륨 등을 사용하여 행할 수 있다. 표지 항체(150)의 세정 처리는 필요에 따라 복수회 반복하여 행할 수 있다.
(보존 처리)
보존 처리는 고액 분리 수단에 의해 분취한 표지 항체(150)에 보존용 완충액을 첨가하고, 보존용 완충액 중에서 표지 항체(150)를 균일하게 분산시킨다. 분산에는, 예를 들면 초음파 처리 등의 분산 수단을 사용하는 것이 바람직하다. 보존용 완충액으로서는, 예를 들면 세정용 완충액에 소정 농도의 응집 방지제 및/또는 안정제를 첨가한 용액 등을 사용할 수 있다. 응집 방지제로서는, 예를 들면 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 트레할로스로 대표되는 당류나, 글리세린, 폴리비닐알코올로 대표되는 다가 알코올 등을 사용할 수 있다. 안정제로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 소혈청 알부민, 난백 알부민, 카제인, 젤라틴 등의 단백질을 사용할 수 있다. 이렇게 하여 표지 항체(150)의 보존 처리를 행할 수 있다.
이상의 각 공정에서는 필요에 따라 계면활성제나, 아지드화나트륨, 파라옥시벤조산에스테르 등의 방부제를 더 사용할 수 있다.
[분석물 측정용 키트]
본 발명의 일실시형태에 의한 분석물 측정용 키트는, 예를 들면 테스트 스트립(200)을 사용해서 본 실시형태의 분석물의 측정 방법에 의거하여 시료 중에 포함되는 분석물(160)의 검출 또는 정량하기 위한 키트이다.
본 실시형태의 분석물 측정용 키트는,
멤브레인(110)과
멤브레인(110)에 상기 분석물(160)과 특이적으로 결합하는 포착 리간드(131)가 고정되어 이루어지는 판정부(130)를 포함하는 테스트 스트립(200)과,
분석물(160)에 특이적으로 결합하는 항체를 수지 입자(10)에 복수의 백금 입자(20)가 고정화된 구조를 갖는 수지-백금 복합체(100)로 표지한 표지 항체(150)를 포함하는 검출 시약
을 포함하고 있다. 본 실시형태의 분석물 측정용 키트는 필요에 따라 그 밖의 구성 요소를 더 포함하는 것이어도 좋다.
본 실시형태에 의한 분석물 측정용 키트를 사용함에 있어서는 시료 중의 분석물(160)과 검출 시약 중의 표지 항체(150)를 접촉시켜서 공정(I)을 실시한 후, 테스트 스트립(200)의 반응부 또는 시료 첨가부(120)에 시료를 제공하여 공정(II), 공정(III)을 순차적으로 실시해도 좋다. 또는 테스트 스트립(200)의 판정부(130)보다 상류측에 검출 시약을 도포하고, 적당히 건조시켜 반응부를 형성한 후, 형성된 반응부 또는 상기 반응부보다 상류측의 위치(예를 들면, 시료 첨가부(120))에 시료를 첨가하여 공정(I)~(III)을 순차적으로 실시해도 좋다.
실시예
이어서, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 의해 조금도 한정되는 것은 아니다. 이하의 실시예, 비교예에 있어서 특별히 언급이 없는 한, 각종 측정, 평가는 하기에 의한 것이다.
<수지-금속 복합체의 흡광도 측정>
수지-금속 복합체의 흡광도는 광학용 백판 유리제 셀(광로 길이 10㎜)에 0.01wt%로 조제한 수지-금속 복합체 분산액(분산매: 물)을 넣고, 순간 멀티 측광 시스템(Otsuka Electronics Co., Ltd.제, MCPD-3700)을 사용하여 금의 경우 570㎚, 백금의 경우 700㎚의 흡광도를 측정했다. 금의 경우 570㎚에서의 흡광도가 0.9 이상을 ○(양호), 0.5~0.9 미만을 △(가), 0.5 미만을 ×(불가)로 했다. 백금의 경우 700㎚에서의 흡광도가 0.6 이상을 ○(양호), 0.1~0.6 미만을 △(가), 0.1 미만을 ×(불가)로 했다. 또한, 착색 라텍스에 대해서도 상기 금 및 백금과 마찬가지의 기준으로 평가했다.
<고형분 농도 측정 및 금속 담지량의 측정>
자석제 도가니에 농도 조정 전의 분산액 1g을 넣고, 70℃, 3시간 열처리를 행했다. 열처리 전후의 중량을 측정하고, 하기 식에 의해 고형분 농도를 산출했다.
고형분 농도(wt%)=[건조 후의 중량(g)/건조 전의 중량(g)]×100
또한, 상기 열처리 후의 샘플을 500℃, 5시간 가열 처리를 더 행하여 가열 처리 전후의 중량을 측정하고, 하기 식으로부터 금속 담지량을 산출했다.
금속 담지량(wt%)=[500℃ 가열 처리 후의 중량(g)/500℃ 가열 처리 전의 중량(g)]×100
<수지-금속 복합체의 평균 입자 지름의 측정>
디스크 원심식 입도 분포 측정 장치(CPS Disc Centrifuge DC24000 UHR, CPS instruments, Inc.제)를 사용하여 측정했다. 측정은 수지-금속 복합체를 물에 분산시킨 상태로 행했다.
<이뮤노 크로마토그래프에 의한 평가>
각 실시예 등에 의해 제작한 수지-금속 복합체 표지 항체 분산액을 사용하여 하기에 나타내는 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 수지-금속 복합체 분산액의 성능을 평가했다.
(평가 방법)
평가는 인플루엔자 A형 평가용 모노크롬 스크린(ADTEC Corporation제)을 사용하여 5분 후, 10분 후, 15분 후의 발색 레벨을 비교했다. 성능 평가에 있어서, 항원은 인플루엔자 A형 양성 컨트롤(APC)의 2배 희석계열(1배~1024배)을 사용했다(APC 희석 전의 바이러스의 농도는 5000FFU/㎖).
(평가 순서)
96웰 플레이트의 각 웰에 수지-금속 복합체 표지 항체 분산액을 3㎕씩 넣고, APC의 2배 희석계열(1배~1024배) 및 음성 컨트롤을 각각 100㎕를 혼화했다. 이어서, 인플루엔자 A형 평가용 모노크롬 스크린에 50㎕ 첨가하고, 5분 후, 10분 후, 15분 후의 발색 레벨을 평가했다. 발색 레벨은 금 콜로이드 판정용 색 견본(ADTEC Corporation제)을 사용하여 판정했다.
<금속 입자의 평균 입자 지름의 측정>
금속 입자의 평균 입자 지름의 측정은 수지-금속 복합체 분산액을 카본 지지막이 부착된 금속성 메쉬에 적하해서 제작한 기판을 전계 방출형 주사 전자현미경(STEM; Hitachi High-Technologies Corporation제, SU-9000)에 의해 관측한 화상으로부터 금속 입자의 면적 평균 지름을 측정했다.
<분산성의 평가>
1wt%의 수지-금속 복합체 0.1mL에 결합용 완충액 0.9mL를 첨가하고, 충분히 혼합했다. 또한, 항 인플루엔자 A형 모노클로날 항체 100㎍을 첨가하고, 실온에서 3시간 걸쳐 전도 교반을 행하고, 얻어진 수지-금속 복합체 표지 항체의 분산성을 육안으로 판정했다. 결합용 완충액은 이하의 3종류에서 평가를 행했다.
결합용 완충액 a: 100mM 붕산 용액을 HCl로 pH≒3으로 조정했다.
결합용 완충액 b: 100mM 붕산 용액 pH≒6.5
결합용 완충액 c: 100mM 붕산 용액을 NaOH로 pH≒8.5로 조정했다.
분산성의 판정은 수지-금속 복합체 표지 항체가 응집하지 않고 침강하지 않을 경우에는 ○(양호), 수지-금속 복합체 표지 항체가 응집하여 침강할 경우에는 ×(불량)로 했다. 분산성 평가의 예를 도 4에 나타냈다. 도 4에 있어서, 마주보고 좌측은 수지-금속 복합체 표지 항체가 응집하지 않고 침강하고 있지 않은 경우를 나타내고, 우측은 응집하여 침강한 상태를 나타내고 있다. 또한, 도 4는 수지-금 복합체 표지 항체에 대한 결과를 고려해서 게재한 것이다.
[실시예 1]
<수지 입자의 합성>
Aliquat 336[Aldrich Company제](3.00g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 10.00g)를 300g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 49.50g) 및 디비닐벤젠(DVB, 0.50g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후, 18.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.250g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 370㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 45분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후, 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(90㎖)에 순수 245㎖를 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(90㎖)을 첨가하여 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후, 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분의 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 3825㎖에 상기 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(55㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 20분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 382㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후, 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체 분산액의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.70이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 5㎚, 백금의 담지량은 38.5wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
얻어진 수지-백금 복합체를 사용하여 상기 「분산성의 평가」에 따라 항체를 결합시켰을 때의 분산성을 평가한 결과, 결합용 완충액 a, b, c 전체에서 ○이었다. 따라서, 이하의 이뮤노크로마토의 평가에서는 인플루엔자 항체의 결합 및 소혈청 알부민에서의 블록을 pH 8.5(결합용 완충액 c)에서 행했다.
<이뮤노크로마토의 평가>
얻어진 수지-백금 복합체 분산액 1㎖(0.1wt%)에 인플루엔자 항체를 100㎍ 혼합하고, 실온에서 약 3시간 교반해서 수지-백금 복합체에 항체를 결합시켰다. 최후 농도가 1%가 되도록 소혈청 알부민 용액을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반해서 수지-백금 복합체 표면을 블록했다. 12000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리를 행하여 회수하고, 0.2% 소혈청 알부민을 포함하는 완충액에 현탁하여 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 제작했다.
제작한 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 사용하여 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 상기 수지-백금 복합체 분산액의 성능을 평가했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 1로부터 수지-백금 복합체 표지 항체는 512배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
[실시예 2]
<수지 입자의 합성>
Aliquat 336[Aldrich Company제](1.50g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 10.00g)를 300g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 49.50g) 및 디비닐벤젠(DVB, 0.50g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후, 18.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.50g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 430㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 45분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(90㎖)에 순수 245㎖를 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(90㎖)을 첨가하고, 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 3825㎖에 상기 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(55㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 20분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 454㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체 분산액의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.70이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 5㎚, 백금의 담지량은 37.7wt%이었다. 얻어진 수지-백금 복합체의 표면의 주사형 전자현미경(SEM) 사진을 도 5에, 그 단면의 주사형 투과 전자현미경(STEM) 사진을 도 6에 각각 나타냈다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다. 또한, 백금 입자의 98wt%가 수지 입자의 표면으로부터 깊이 방향으로 입자 반경의 40%의 범위 내에 존재했다.
얻어진 수지-백금 복합체를 사용하여 상기 「분산성의 평가」에 따라 항체를 결합시켰을 때의 분산성을 평가한 결과, 결합용 완충액 a, b, c 전부 ○이었다. 따라서, 이하의 이뮤노크로마토의 평가에서는 인플루엔자 항체의 결합 및 소혈청 알부민에서의 블록을 pH 8.5(결합용 완충액 c)에서 행했다.
<이뮤노크로마토의 평가>
실시예 1과 마찬가지의 조작을 행하여 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 제작했다.
제작한 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 사용하여 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 상기 수지-백금 복합체 분산액의 성능을 평가했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 2로부터 수지-백금 복합체 표지 항체는 1024배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
[실시예 3]
<수지 입자의 합성>
Aliquat 336[Aldrich Company제](2.00g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 10.00g)를 300g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 48.00g) 및 디비닐벤젠(DVB, 2.00g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 18.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.50g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 380㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 45분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(90㎖)에 순수 245㎖를 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(90㎖)을 첨가하고, 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 3825㎖에 상기 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(55㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 20분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 393㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체 분산액의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.74이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 6㎚, 백금의 담지량은 38.0wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다. 또한, 백금 입자의 93wt%가 수지 입자의 표면으로부터 깊이 방향으로 입자 반경의 40%의 범위 내에 존재하고 있었다.
얻어진 수지-백금 복합체를 사용하여 상기 「분산성의 평가」에 따라 항체를 결합시켰을 때의 분산성을 평가한 결과, 결합용 완충액 a, b, c 전부 ○이었다. 따라서, 이하의 이뮤노크로마토의 평가에서는 인플루엔자 항체의 결합 및 소혈청 알부민에서의 블록을 pH 8.5(결합용 완충액 c)에서 행했다.
<이뮤노크로마토의 평가>
실시예 1과 마찬가지의 조작을 행하여 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 제작했다.
제작한 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 사용하여 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 상기 수지-백금 복합체 분산액의 성능을 평가했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 3으로부터 수지-백금 복합체 표지 항체는 512배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
[실시예 4]
<수지 입자의 합성>
Aliquat 336[Aldrich Company제](1.00g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 10.00g)를 300g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 48.00g) 및 디비닐벤젠(DVB, 2.00g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 18.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.50g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 420㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 45분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(90㎖)에 순수 245㎖를 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(90㎖)을 첨가하고, 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 3825㎖에 상기 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(55㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 20분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 432㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체 분산액의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.77이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 5㎚, 백금의 담지량은 38.2wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다. 또한, 백금 입자의 97wt%가 수지 입자의 표면으로부터 깊이 방향으로 입자 반경의 40%의 범위 내에 존재하고 있었다.
얻어진 수지-백금 복합체를 사용하여 상기 「분산성의 평가」에 따라 항체를 결합시켰을 때의 분산성을 평가한 결과, 결합용 완충액 a, b, c 전부 ○이었다. 따라서, 이하의 이뮤노크로마토의 평가에서는 인플루엔자 항체의 결합 및 소혈청 알부민에서의 블록을 pH 8.5(결합용 완충액 c)에서 행했다.
<이뮤노크로마토의 평가>
실시예 1과 마찬가지의 조작을 행하여 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 제작했다.
제작한 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 사용하여 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 상기 수지-백금 복합체 분산액의 성능을 평가했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 4로부터 수지-백금 복합체 표지 항체는 1024배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
[실시예 5]
<수지 입자의 합성>
Aliquat 336[Aldrich Company제](5.00g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 10.00g)를 389.5g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 48.00g) 및 디비닐벤젠(DVB, 2.00g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 50.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.50g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 200㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 45분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(90㎖)에 순수 245㎖를 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(90㎖)을 첨가하고, 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 3825㎖에 상기 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(55㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 20분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 215㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체 분산액의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.57이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 6㎚, 백금의 담지량은 37.1wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다. 또한, 백금 입자의 83wt%가 수지 입자의 표면으로부터 깊이 방향으로 입자 반경의 40%의 범위 내에 존재하고 있었다.
얻어진 수지-백금 복합체를 사용하여 상기 「분산성의 평가」에 따라 항체를 결합시켰을 때의 분산성을 평가한 결과, 결합용 완충액 a, b, c 전부 ○이었다. 따라서, 이하의 이뮤노크로마토의 평가에서는 인플루엔자 항체의 결합 및 소혈청 알부민에서의 블록을 pH 8.5(결합용 완충액 c)에서 행했다.
<이뮤노크로마토의 평가>
실시예 1과 마찬가지의 조작을 행하여 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 제작했다.
제작한 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 사용하여 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 상기 수지-백금 복합체 분산액의 성능을 평가했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 5로부터 수지-백금 복합체 표지 항체는 128배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
[실시예 6]
<수지 입자의 합성>
Aliquat 336[Aldrich Company제](2.50g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 5.00g)를 400g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 24.75g) 및 디비닐벤젠(DVB, 0.25g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 22.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.25g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 140㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 45분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(90㎖)에 순수 245㎖를 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(90㎖)을 첨가하고, 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 3825㎖에 상기 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(55㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 20분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 154㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체 분산액의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.48이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 3㎚, 백금의 담지량은 34.5wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
얻어진 수지-백금 복합체를 사용하여 상기 「분산성의 평가」에 따라 항체를 결합시켰을 때의 분산성을 평가한 결과, 결합용 완충액 a, b, c 전부 ○이었다. 따라서, 이하의 이뮤노크로마토의 평가에서는 인플루엔자 항체의 결합 및 소혈청 알부민에서의 블록을 pH 8.5(결합용 완충액 c)에서 행했다.
<이뮤노크로마토의 평가>
실시예 1과 마찬가지의 조작을 행하여 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 제작했다.
제작한 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 사용하여 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 상기 수지-백금 복합체 분산액의 성능을 평가했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 6으로부터 수지-백금 복합체 표지 항체는 64배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
[실시예 7]
<수지 입자의 합성>
Aliquat 336[Aldrich Company제](0.25g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 5.00g)를 325g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 24.75g) 및 디비닐벤젠(DVB, 0.25g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 18.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.25g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 260㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 45분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(90㎖)에 순수 245㎖를 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(90㎖)을 첨가하고, 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 3825㎖에 상기 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(55㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 20분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 265㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체 분산액의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.83이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 3㎚, 백금의 담지량은 35.8wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
얻어진 수지-백금 복합체를 사용하여 상기 「분산성의 평가」에 따라 항체를 결합시켰을 때의 분산성을 평가한 결과, 결합용 완충액 a, b, c 전부 ○이었다. 따라서, 이하의 이뮤노크로마토의 평가에서는 인플루엔자 항체의 결합 및 소혈청 알부민에서의 블록을 pH 8.5(결합용 완충액 c)에서 행했다.
<이뮤노크로마토의 평가>
실시예 1과 마찬가지의 조작을 행하여 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 제작했다.
제작한 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 사용하여 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 상기 수지-백금 복합체 분산액의 성능을 평가했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 7로부터 수지-백금 복합체 표지 항체는 128배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
[실시예 8]
<수지 입자의 합성>
Aliquat 336[Aldrich Company제](0.50g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 10.00g)를 300g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 49.50g) 및 디비닐벤젠(DVB, 0.50g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 18.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.50g)을 1분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 512㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 45분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(90㎖)에 순수 245㎖를 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(90㎖)을 첨가하고, 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 3825㎖에 상기 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(55㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 20분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 537㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체 분산액의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.75이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 6㎚, 백금의 담지량은 39.0wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
얻어진 수지-백금 복합체를 사용하여 상기 「분산성의 평가」에 따라 항체를 결합시켰을 때의 분산성을 평가한 결과, 결합용 완충액 a, b, c 전부 ○이었다. 따라서, 이하의 이뮤노크로마토의 평가에서는 인플루엔자 항체의 결합 및 소혈청 알부민에서의 블록을 pH 8.5(결합용 완충액 c)에서 행했다.
<이뮤노크로마토의 평가>
실시예 1과 마찬가지의 조작을 행하여 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 제작했다.
제작한 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 사용하여 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 상기 수지-백금 복합체 분산액의 성능을 평가했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 8로부터 수지-백금 복합체 표지 항체는 1024배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
[실시예 9]
<수지 입자의 합성>
Aliquat 336[Aldrich Company제](1.00g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 10.00g)를 300g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 48.00g) 및 디비닐벤젠(DVB, 2.00g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 18.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.50g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 420㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 45분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(90㎖)에 순수 245㎖를 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(90㎖)을 첨가하고, 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 3825㎖에 상기 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(55㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 120분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 432㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체 분산액의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.72이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 28㎚, 백금의 담지량은 38.2wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
얻어진 수지-백금 복합체를 사용하여 상기 「분산성의 평가」에 따라 항체를 결합시켰을 때의 분산성을 평가한 결과, 결합용 완충액 a, b, c 전부 ○이었다. 따라서, 이하의 이뮤노크로마토의 평가에서는 인플루엔자 항체의 결합 및 소혈청 알부민에서의 블록을 pH 8.5(결합용 완충액 c)에서 행했다.
<이뮤노크로마토의 평가>
실시예 1과 마찬가지의 조작을 행하여 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 제작했다.
제작한 수지-백금 복합체 표지 항체 분산액을 사용하여 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 상기 수지-백금 복합체 분산액의 성능을 평가했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 9로부터 수지-백금 복합체 표지 항체는 512배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
[비교예 1]
<이뮤노크로마토의 평가>
착색 라텍스(Merck Millipore제, 착색 Estapor 기능성 입자, K1030, 평균 입자 지름; 392㎚, 570㎚에서의 흡광도는 0.83, 700㎚에서의 흡광도는 0.36) 1㎖(0.1wt%)에 인플루엔자 항체를 100㎍ 혼합하고, 실온에서 약 3시간 교반해서 착색 라텍스에 항체를 결합시켰다. 최종 농도가 1%가 되도록 소혈청 알부민 용액을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반해서 착색 라텍스를 블록했다. 12000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리를 행하여 회수하고, 0.2% 소혈청 알부민을 포함하는 완충액에 현탁하여 착색 라텍스 표지 항체를 제작했다.
제작한 착색 라텍스 표지 항체를 사용하여 하기에 나타내는 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 착색 라텍스의 성능을 평가했다.
(평가 방법)
평가는 인플루엔자 A형 평가용 모노크롬 스크린(ADTEC Corporation제)을 사용하여 5분 후, 10분 후, 15분 후의 발색 레벨을 비교했다. 성능 평가에 있어서, 항원은 인플루엔자 A형 양성 컨트롤(APC)의 2배 희석계열(1배~1024배)을 사용했다(APC 희석 전의 바이러스의 농도는 5000FFU/㎖).
(평가 순서)
96웰 플레이트의 각 웰에 착색 라텍스 표지 항체를 3㎕씩 넣고, APC의 2배 희석계열(1배~1024배) 및 음성 컨트롤을 각각 100㎕를 혼화했다. 이어서, 인플루엔자 A형 평가용 모노크롬 스크린에 50㎕ 첨가하고, 5분 후, 10분 후, 15분 후의 발색 레벨을 평가했다. 발색 레벨은 금 콜로이드 판정용 색 견본(ADTEC Corporation제)을 사용하여 판정했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 10으로부터 착색 라텍스 표지 항체는 16배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
이상의 실시예 1~9, 비교예 1에 있어서의 700㎚에서의 흡광도의 측정 결과를 정리하여 표 11 및 표 12에 나타냈다.
[비교예 2]
<금 콜로이드의 합성>
500㎖ 3구 둥근바닥 플라스크에 1mM 염화금산 수용액을 250㎖ 넣고, 가열 환류 장치를 사용하여 격렬하게 교반하면서 비등시키고, 비등 후 38.8mM 시트르산 나트륨 수용액을 25㎖ 첨가하고, 용액이 담황색으로부터 농황색으로 변화되는 것을 확인했다. 교반하면서 10분간 가열을 계속한 후, 실온에서 30분 정도 교반 방랭을 행했다. 구멍 지름 2㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 용액을 여과하고, 삼각 플라스크에 옮겨 냉암소에서 보존했다. 제작한 금 콜로이드의 평균 입경은 12.3㎚이었다. 또한, 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 1.32이었다.
<이뮤노크로마토의 평가>
얻어진 금 콜로이드 1㎖(OD=10)에 인플루엔자 항체를 100㎍ 혼합하고, 실온에서 약 3시간 교반하여 금 콜로이드에 항체를 결합시켰다. 최종 농도가 1%가 되도록 소혈청 알부민 용액을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하여 금 콜로이드 표면을 블록했다. 12000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리를 행하여 회수하고, 0.2% 소혈청 알부민을 포함하는 완충액에 현탁하여 금 콜로이드 표지 항체를 제작했다.
제작한 금 콜로이드 표지 항체를 사용하여 하기에 나타내는 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 금 콜로이드의 성능을 평가했다.
(평가 방법)
평가는 비교예 1과 마찬가지로 하여 행했다.
(평가 순서)
96웰 플레이트의 각 웰에 금 콜로이드 표지 항체를 3㎕씩 넣고, APC의 2배 희석계열(1배~1024배) 및 음성 컨트롤을 각각 100㎕를 혼화했다. 이어서, 인플루엔자 A형 평가용 모노크롬 스크린에 50㎕ 첨가하고, 5분 후, 10분 후, 15분 후의 발색 레벨을 평가했다. 발색 레벨은 금 콜로이드 판정용 색 견본(ADTEC Corporation제)을 사용하여 판정했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 13으로부터 금 콜로이드 표지 항체는 32배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
[비교예 3]
<수지 입자의 합성>
Aliquat 336[Aldrich Company제](1.00g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 10.00g)를 300g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 48.00g) 및 디비닐벤젠(DVB, 2.00g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 18.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.500g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 420㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(50㎖)에 순수 1233㎖를 첨가한 후, 30mM 염화금산 수용액(100㎖)을 첨가하고, 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 2.5wt% 금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 1580㎖에 상기 2.5wt% 금 이온 흡착 수지 입자 분산액(42.4㎖)을 첨가하고, 160rpm, 20℃에서 교반하면서 528mM의 디메틸아민보란 수용액(10㎖)을 2분간 걸쳐 적하한 후, 실온에서 2시간 교반함으로써 평균 입자 지름 438㎚의 수지-금 복합체를 얻었다. 상기 수지-금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제, 농도 조정함으로써 1wt%의 수지-금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-금 복합체의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.98이었다. 또한, 형성한 금 입자의 평균 입자 지름은 25.0㎚, 금의 담지량은 54.7wt%이었다. 이 수지-금 복합체에 있어서, 금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
얻어진 수지-금 복합체를 사용하여 상기 「분산성의 평가」에 따라 항체를 결합시켰을 때의 분산성을 평가한 결과, 결합용 완충액 a, b는 ○이었지만, c에서는 ×이었다. 따라서, 이하의 이뮤노크로마토의 평가에서는 인플루엔자 항체의 결합 및 소혈청 알부민에서의 블록을 pH 3.0(결합용 완충액 a)에서 행했다.
<이뮤노크로마토의 평가>
얻어진 수지-금 복합체 분산액 1㎖(0.1wt%)에 인플루엔자 항체를 100㎍ 혼합하고, 실온에서 약 3시간 교반하여 수지-금 복합체에 항체를 결합시켰다. 최종 농도가 1%가 되도록 소혈청 알부민 용액을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반해서 수지-금 복합체 표면을 블록했다. 12000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리를 행하여 회수하고, 0.2% 소혈청 알부민을 포함하는 완충액에 현탁하여 수지-금 복합체 표지 항체 분산액을 제작했다.
제작한 수지-금 복합체 표지 항체 분산액을 사용하여 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 상기 수지-금 복합체 분산액의 성능을 평가했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 14로부터 수지-금 복합체 표지 항체는 256배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
[비교예 4]
<수지 입자의 합성>
Aliquat 336[Aldrich Company제](2.00g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 10.00g)를 300g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 48.00g) 및 디비닐벤젠(DVB, 2.00g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 18.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.500g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 380㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(50㎖)에 순수 1233㎖를 첨가한 후, 30mM 염화금산 수용액(100㎖)을 첨가하고, 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 2.5wt% 금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 1580㎖에 상기 2.5wt% 금 이온 흡착 수지 입자 분산액(42.4㎖)을 첨가하고, 160rpm, 20℃에서 교반하면서 528mM의 디메틸아민보란 수용액(10㎖)을 2분간 걸쳐 적하한 후, 실온에서 2시간 교반함으로써 평균 입자 지름 399㎚의 수지-금 복합체를 얻었다. 상기 수지-금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제, 농도 조정함으로써 1wt%의 수지-금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-금 복합체의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.96이었다. 또한, 형성한 금 입자의 평균 입자 지름은 25.0㎚, 금의 담지량은 53.2wt%이었다. 이 수지-금 복합체에 있어서, 금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다. 또한, 금 입자는 표층부에 100% 존재하고 있었다.
얻어진 수지-금 복합체를 사용하여 상기 「분산성의 평가」에 따라 항체를 결합시켰을 때의 분산성을 평가한 결과, 결합용 완충액 a, b는 ○이었지만, c에서는 ×이었다. 따라서, 이하의 이뮤노크로마토의 평가에서는 인플루엔자 항체의 결합 및 소혈청 알부민에서의 블록을 pH 3.0(결합용 완충액 a)에서 행했다.
<이뮤노크로마토의 평가>
비교예 3와 마찬가지의 조작을 행하여 수지-금 복합체 표지 항체 분산액을 제작했다.
제작한 수지-금 복합체 표지 항체 분산액을 사용하여 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 상기 수지-금 복합체 분산액의 성능을 평가했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 15로부터 수지-금 복합체 표지 항체는 256배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
[비교예 5]
<수지 입자의 합성>
Aliquat 336[Aldrich Company제](3.00g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 10.00g)를 300g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 49.50g) 및 디비닐벤젠(DVB, 0.50g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 18.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.250g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 370㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(50㎖)에 순수 1233㎖를 첨가한 후, 30mM 염화금산 수용액(100㎖)을 첨가하고, 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 2.5wt% 금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 1580㎖에 상기 2.5wt% 금 이온 흡착 수지 입자 분산액(42.4㎖)을 첨가하고, 160rpm, 20℃에서 교반하면서 528mM의 디메틸아민보란 수용액(10㎖)을 2분간 걸쳐 적하한 후, 실온에서 2시간 교반함으로써 평균 입자 지름 393㎚의 수지-금 복합체를 얻었다. 상기 수지-금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제, 농도 조정함으로써 1wt%의 수지-금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-금 복합체의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.92이었다. 또한, 형성한 금 입자의 평균 입자 지름은 14.9㎚, 금의 담지량은 55.8wt%이었다. 이 수지-금 복합체에 있어서, 금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다. 또한, 금 입자는 표층부에 71% 존재하고 있었다.
얻어진 수지-금 복합체를 사용하여 상기 「분산성의 평가」에 따라 항체를 결합시켰을 때의 분산성을 평가한 결과, 결합용 완충액 a, b는 ○이었지만, c에서는 ×이었다. 따라서, 이하의 이뮤노크로마토의 평가에서는 인플루엔자 항체의 결합 및 소혈청 알부민에서의 블록을 pH 3.0(결합용 완충액 a)에서 행했다.
<이뮤노크로마토의 평가>
비교예 3와 마찬가지의 조작을 행하여 수지-금 복합체 표지 항체 분산액을 제작했다.
제작한 수지-금 복합체 표지 항체 분산액을 사용하여 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 상기 수지-금 복합체 분산액의 성능을 평가했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 16으로부터 수지-금 복합체 표지 항체는 64배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
[비교예 6]
<수지 입자의 합성>
450g의 순수에 2-비닐피리딘(2-VP, 9.945g) 및 디비닐벤젠(DVB, 0.097g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 10.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.100g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 290㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(50㎖)에 순수 1233㎖를 첨가한 후, 30mM 염화금산 수용액(100㎖)을 첨가하고, 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 2.5wt% 금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 1580㎖에 상기 2.5wt% 금 이온 흡착 수지 입자 분산액(42.4㎖)을 첨가하고, 160rpm, 20℃에서 교반하면서 528mM의 디메틸아민보란 수용액(10㎖)과 528mM의 붕산 수용액(10㎖)의 혼합 용액을 4분간 걸쳐 적하한 후, 실온에서 2시간 교반함으로써 평균 입자 지름 295㎚의 수지-금 복합체를 얻었다. 상기 수지-금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제, 농도 조정함으로써 1wt%의 수지-금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-금 복합체의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 1.35이었다. 또한, 형성한 금 입자의 평균 입자 지름은 9.0㎚, 금의 담지량은 50.4wt%이었다. 이 수지-금 복합체에 있어서, 금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
얻어진 수지-금 복합체를 사용하여 상기 「분산성의 평가」에 따라 항체를 결합시켰을 때의 분산성을 평가한 결과, 결합용 완충액 a, b는 ○이었지만, c에서는 ×이었다. 따라서, 이하의 이뮤노크로마토의 평가에서는 인플루엔자 항체의 결합 및 소혈청 알부민에서의 블록을 pH 3.0(결합용 완충액 a)에서 행했다.
<이뮤노크로마토의 평가>
비교예 3과 마찬가지의 조작을 행하여 수지-금 복합체 표지 항체 분산액을 제작했다.
제작한 수지-금 복합체 표지 항체 분산액을 사용하여 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 상기 수지-금 복합체 분산액의 성능을 평가했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 17로부터 수지-금 복합체 표지 항체는 64배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
[비교예 7]
<수지 입자의 합성>
450g의 순수에 2-비닐피리딘(2-VP, 9.90g) 및 디비닐벤젠(DVB, 0.10g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 10.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.100g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 110㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 120분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(50㎖)에 순수 1233㎖를 첨가한 후, 30mM 염화금산 수용액(100㎖)을 첨가하고, 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 2.5wt% 금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 1580㎖에 상기 2.5wt% 금 이온 흡착 수지 입자 분산액(42.4㎖)을 첨가하고, 160rpm, 20℃에서 교반하면서 528mM의 디메틸아민보란 수용액(10㎖)과 528mM의 붕산 수용액(10㎖)의 혼합 용액을 4분간 걸쳐 적하한 후, 실온에서 2시간 교반함으로써 평균 입자 지름 120㎚의 수지-금 복합체를 얻었다. 상기 수지-금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제, 농도 조정함으로써 1wt%의 수지-금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-금 복합체의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 1.14이었다. 또한, 형성한 금 입자의 평균 입자 지름은 13.0㎚, 금의 담지량은 52.0wt%이었다. 이 수지-금 복합체에 있어서, 금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
얻어진 수지-금 복합체를 사용하여 상기 「분산성의 평가」에 따라 항체를 결합시켰을 때의 분산성을 평가한 결과, 결합용 완충액 a, b는 ○이었지만, c에서는 ×이었다. 따라서, 이하의 이뮤노크로마토의 평가에서는 인플루엔자 항체의 결합 및 소혈청 알부민에서의 블록을 pH 3.0(결합용 완충액 a)에서 행했다.
<이뮤노크로마토의 평가>
비교예 3과 마찬가지의 조작을 행하여 수지-금 복합체 표지 항체 분산액을 제작했다.
제작한 수지-금 복합체 표지 항체 분산액을 사용하여 이뮤노크로마토법에 의한 측정을 행하여 상기 수지-금 복합체 분산액의 성능을 평가했다. 그 결과를 이하에 나타냈다.
상기 표 18로부터 수지-금 복합체 표지 항체는 32배 희석의 항원에 대하여 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
이상의 비교예 1~7에 있어서의 570㎚에서의 흡광도의 측정 결과를 정리해서 표 19에 나타냈다.
[실시예 10]
Aliquat 336[Aldrich Company제](1.00g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 10.00g)를 300g의 순수에 용해한 후, 4-비닐피리딘(4-VP, 48.00g) 및 디비닐벤젠(DVB, 2.00g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 18.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.500g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 438㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 45분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 물에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(90㎖)에 순수 245㎖를 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(90㎖)을 첨가하고, 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 3825㎖에 상기 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(55㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 20분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 447㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정함으로써 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.80이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 5㎚, 백금의 담지량은 37.5wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
[실시예 11]
Aliquat 336[Aldrich Company제](1.00g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 10.00g)를 300g의 순수에 용해한 후, 3-비닐피리딘(3-VP, 48.00g) 및 디비닐벤젠(DVB, 2.00g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 18.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.500g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 429㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 45분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(90㎖)에 순수 245㎖를 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(90㎖)을 첨가하고, 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 3825㎖에 상기 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(55㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 20분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 436㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정함으로써 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.81이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 5㎚, 백금의 담지량은 38.1wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
[실시예 12]
2-(디이소프로필아미노)에틸메타크릴레이트(DPA, 10.3g), 폴리(프로필렌글리콜)디아크릴레이트(0.2g)와 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 2.0g)를 85g의 순수에 용해한 후, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 70℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 2.00g의 순수에 용해한 퍼옥소2황산암모늄(ASP, 0.10g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 70℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 338㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 45분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(90㎖)에 순수 245㎖를 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(90㎖)을 첨가하고, 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 3825㎖에 상기 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(55㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 20분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후에 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 351㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정함으로써 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.75이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 6㎚, 백금의 담지량은 37.9wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
[실시예 13]
실시예 9에서 제작한 1wt% 수지-백금 복합체 분산액(45㎖)에 400mM 염화백금산 수용액(36㎖)을 첨가하고, 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(2500rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하고, 10wt%의 백금 이온을 흡착한 수지-백금 복합체 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 383㎖에 상기 10wt%의 백금 이온을 흡착한 수지-백금 복합체 분산액(5.5㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 120분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 454㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(2500rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정함으로써 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 1.02이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 38㎚, 백금의 담지량은 51.0wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
[실시예 14]
Aliquat 336[Aldrich Company제](0.50g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 10.00g)를 300g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 48.00g) 및 디비닐벤젠(DVB, 2.00g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 18.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.500g)을 0.5분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 613㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 40분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(90㎖)에 순수 245㎖를 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(90㎖)을 첨가하고, 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 3825㎖에 상기 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(55㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 20분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 675㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(3100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정함으로써 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.85이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 7㎚, 백금의 담지량은 38.2wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
[실시예 15]
<수지 입자의 합성>
Aliquat 336[Aldrich Company제](5.00g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 10.00g)를 389.5g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 48.00g) 및 디비닐벤젠(DVB, 2.00g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 50.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.500g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 200㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(80㎖)에 순수 308㎖를 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(12㎖)을 첨가하고, 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(5100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 3825㎖에 상기 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(55㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 20분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후, 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 205㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(5100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정함으로써 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.17이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 5㎚, 백금의 담지량은 7.1wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
[실시예 16]
<수지 입자의 합성>
Aliquat 336[Aldrich Company제](5.00g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 10.00g)를 389.5g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 48.00g) 및 디비닐벤젠(DVB, 2.00g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 150rpm, 30℃에서 50분간, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 50.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.500g)을 2분간 걸쳐 적하하고, 150rpm, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자 지름 200㎚의 수지 입자를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 조작을 3회 행한 후, 투석 처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 10wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
상기 수지 입자 분산액(80㎖)에 순수 296㎖를 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(12㎖)을 첨가하고, 60rpm, 30℃에서 3시간 교반 후 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(5100rpm, 30분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거하는 작업을 3회 반복함으로써 여분인 염화백금산을 제거했다. 그 후 농도 조정을 행하여 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다.
이어서, 순수 3825㎖에 상기 5wt% 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(55㎖)을 첨가하고, 160rpm, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(110㎖)을 20분간 걸쳐 적하한 후, 160rpm, 3℃에서 1시간 교반했다. 그 후에 160rpm, 25℃에서 3시간 교반함으로써 평균 입자 지름 210㎚의 수지-백금 복합체를 얻었다. 상기 수지-백금 복합체를 원심분리(5100rpm, 60분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시키는 작업을 3회 반복한 후, 투석 처리에 의해 정제함으로써 불순물을 제거했다. 그 후 농도 조정함으로써 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 제작한 수지-백금 복합체의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.33이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 5㎚, 백금의 담지량은 15.4wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
[실시예 17]
실시예 3에서 얻은 수지-백금 복합체에 대하여 상기 백금 이온을 흡착시키는 공정 및 디메틸아민보란 수용액에 의한 환원 공정을 또한 1회(통산 2회) 행함으로써 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 이렇게 해서 제작한 수지-백금 복합체 분산액의 흡광도를 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 1.07이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 9㎚, 백금의 담지량은 51.0wt%, 수지-백금 복합체의 평균 입자 지름은 399㎚이었다.
또한, 상기 백금 이온을 흡착시키는 공정 및 디메틸아민보란 수용액에 의한 환원 공정을 2회(통산 4회) 더 행함으로써 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 이렇게 해서 제작한 수지-백금 복합체의 1wt% 분산액의 흡광도를 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 1.24이었다. 또한, 형성한 백금 입자의 평균 입자 지름은 11㎚, 백금의 담지량은 59.1wt%, 수지-백금 복합체의 평균 입자 지름은 403㎚이었다.
이상의 실시예 10~17에 있어서의 700㎚에서의 흡광도의 측정 결과를 정리해서 표 20 및 표 21에 나타냈다.
[표지 항체의 제작에 관한 시험예]
[제작예 1]
<수지 입자의 합성>
Aliquat 336[Aldrich Company제](1.00g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에틸에테르메타크릴레이트(PEGMA, 2.00g)를 80g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(2-VP, 9.90g) 및 디비닐벤젠(DVB, 0.100g)을 첨가하고, 질소 기류하에 있어서 250rpm, 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후 9.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(AIBA, 0.100g)을 5분간 걸쳐 적하하고, 250rpm, 60℃에서 6시간 교반함으로써 평균 입자 지름 0.36㎛의 수지 입자를 얻었다. 수지 입자를 원심분리(9000rpm, 10분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 순수에 다시 분산시켜 2.1wt%의 수지 입자 분산액을 얻었다.
<수지-백금 복합체의 합성>
2.1wt%의 수지 입자 분산액(7.62g)에 30mM 염화백금산 수용액(42.7g)을 첨가하고, 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3000rpm, 10분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거함으로써 여분인 염화백금산을 제거한 후, 16g의 순수에 다시 분산시켜 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다. 백금 이온 흡착 수지 입자 분산액(16g)을 3.3mM의 디메틸아민보란 수용액(640㎖)에 2분간 걸쳐 적하한 후, 3℃에서 1시간 교반하고, 실온에서 3시간 더 교반함으로써 평균 입자 지름 0.37㎛의 수지-백금 복합체를 얻었다. 이 수지-백금 복합체를 원심분리(3000rpm, 120분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 적당량의 순수를 첨가하고, 다시 분산시켜 한외 여과막에 의해 정제함으로써 1wt%의 수지-백금 복합체 분산액을 얻었다. 이 수지-백금 복합체 분산액 중의 수지-백금 복합체의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 0.70이었다. 또한, 상기 수지-백금 복합체 분산액 중의 수지-백금 복합체에 있어서의 백금 입자의 평균 입자 지름은 3㎚, 백금의 담지량은 33.3wt%이었다. 이 수지-백금 복합체에 있어서, 백금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 백금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 백금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 백금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 백금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
[제작예 2]
<수지-금 복합체의 합성>
제작예 1에서 합성한 2.1wt%의 수지 입자 분산액(19.09g)에 30mM 염화금산 수용액(106.6g)을 첨가하고, 실온에서 24시간 방치했다. 그 후 원심분리(3000rpm, 10분간)에 의해 수지 입자를 침전시켜 상청액을 제거함으로써 여분인 염화금산을 제거한 후, 40g의 순수에 다시 분산시켜 금 이온 흡착 수지 입자 분산액을 조제했다. 금 이온 흡착 수지 입자 분산액(20g)을 3.3mM의 디메틸아민보란 수용액(600㎖)에 4분간 걸쳐 적하한 후, 8℃에서 1시간 교반하고, 실온에서 5시간 더 교반함으로써 평균 입자 지름 0.38㎛의 수지-금 복합체를 얻었다. 수지-금 복합체를 원심분리(3000rpm, 120분간)에 의해 침전시켜 상청액을 제거한 후 적당량의 순수를 첨가하고, 다시 분산시켜 한외 여과막에 의해 정제함으로써 1wt%의 수지-금 복합체 분산액을 얻었다. 이 수지-금 복합체 분산액 중의 수지-금 복합체의 흡광도는 상기 방법에 따라서 측정한 결과, 1.0이었다. 또한, 수지-금 복합체에 있어서의 금 입자의 평균 입자 지름은 22.0㎚, 금의 담지량은 49.1wt%이었다. 이 수지-금 복합체에 있어서, 금 입자는 수지 입자에 완전히 내포된 내포 금 입자와, 수지 입자 내에 포매된 부위 및 수지 입자 외로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 금 입자와, 수지 입자의 표면에 흡착하고 있는 표면 흡착 금 입자를 포함하고 있으며, 적어도 일부의 금 입자가 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
[시약 등]
시험예, 참고 시험예에서는 이하의 시약 등을 사용했다.
항 인플루엔자 A형 모노클로날 항체(7.15mg/mL/PBS): ADTEC Corporation제
결합용 완충액 a: 100mM 붕산 용액을 NaOH로 pH≒8.5로 조정했다.
결합용 완충액 b: 100mM 붕산 용액을 NaOH로 pH≒7.5로 조정했다.
블록용 완충액 a: 1중량% 소혈청 알부민 용액을 HCl로 pH≒8.5로 조정했다.
블록용 완충액 b: 1중량% 소혈청 알부민 용액을 HCl로 pH≒ 9.5로 조정했다.
세정용 완충액: 5mM 트리스 용액을 HCl로 pH≒8.5로 조정했다.
보존용 완충액: 세정용 완충액에 수크로오스를 10중량% 농도가 되도록 첨가했다.
인플루엔자 A형 양성 컨트롤(APC): 인플루엔자 A형 바이러스 부활화 항원(ADTEC Corporation제)을 검체 처리액(ADTEC Corporation제)을 사용하여 100배 희석해서 조제했다. APC의 항원 농도는 5000FFU/㎖에 상당한다.
음성 컨트롤: 검체 처리액(ADTEC Corporation제)
PtNCP 비즈: 제작예 1에서 얻은 수지-백금속 복합체(1중량%; 평균 입자 지름 370㎚)
AuNCP 비즈: 제작예 2에서 얻은 수지-금 복합체(1중량%; 평균 입자 지름 380㎚)
[시험예 1]
(결합 공정)
마이크로 튜브[아이비스(등록상표; AS ONE Corporation제) 2mL]에 수지-금속 복합체로서 PtNCP 비즈 0.1mL를 투입하고, 결합용 완충액 a 0.9mL를 첨가했다. 전도 혼화에 의해 충분히 혼합한 후, 항 인플루엔자 A형 모노클로날 항체 100㎍을 첨가하고, 실온에서 3시간 걸쳐 전도 교반을 행하고, 수지-백금 복합체로 표지한 항 인플루엔자 A형 모노클로날 항체를 포함하는 표지 항체 함유액 A-1을 얻었다.
(블록 공정)
이어서, 표지 항체 함유액 A-1을 빙랭 후, 12000rpm으로 5분간 걸쳐 원심분리를 행하여 상청액을 제거한 후, 고형분 잔사에 블록용 완충액 a 1mL를 첨가하고, 10~20초간 걸쳐 초음파 분산 처리를 행하고, 실온에서 2시간 걸쳐 전도 교반을 더 행하여 표지 항체 함유액 B-1을 얻었다.
(세정 처리)
이어서, 표지 항체 함유액 B-1을 빙랭 후, 12000rpm으로 5분간 걸쳐 원심분리를 행하여 상청액을 제거한 후, 고형분 잔사에 세정용 완충액 1mL를 첨가하고, 10~20초간 걸쳐 초음파 분산 처리를 행했다. 이 조작을 3회 반복하여 세정 처리로 했다.
(보존 처리)
이어서, 빙랭 후, 12000rpm으로 5분간 걸쳐 원심분리를 행하여 상청액을 제거한 후, 고형분 잔사에 보존용 완충액 1mL를 첨가하고, 10~20초간 걸쳐 초음파 분산 처리를 행함으로써 표지 항체 함유액 C-1을 얻었다.
<성능 평가>
96웰 플레이트의 12웰에 표지 항체 함유액 C-1을 3㎕씩 넣고, APC의 2배 희석계열(1배~1024배 희석, 각각 APC×1~APC×1024로 나타냄) 및 음성 컨트롤을 각각 100㎕를 혼화했다. 이어서, 인플루엔자 A형 평가용 모노크롬 스크린에 50㎕ 첨가하고, 5분 후, 10분 후, 15분 후의 발색 레벨을 평가했다. 그 결과를 표 22에 나타냈다. 또한, 표 22에 있어서의 수치가 클수록 발색 레벨이 높은(발색이 강한) 것을 의미한다.
표 22로부터 표지 항체 함유액 C-1은 256배 희석의 항원에 대해서도 양호한 발색을 나타내고, 우수한 표지 성능을 갖는 것이 확인되었다.
[참고 시험예 1]
시험예 1의 결합 공정에서 PtNCP 비즈 대신에 AuNCP 비즈를 사용하고, 결합용 완충액 a 대신에 결합용 완충액 b를 사용했을 경우, 수지-금 복합체가 응집해버리기 때문에 표지 항체 함유액을 얻는 것이 곤란했다.
[참고 시험예 2]
시험예 1의 결합 공정에서 PtNCP 비즈 대신에 AuNCP 비즈를 사용했을 경우, 수지-금 복합체가 응집해버리기 때문에 표지 항체 함유액을 얻는 것이 곤란했다.
[참고 시험예 3]
시험예 1의 결합 공정에서 PtNCP 비즈 대신에 AuNCP 비즈를 사용하고, 블록 공정에서 블록용 완충액 a의 대신에 블록용 완충액 b를 사용한 결과, 수지-금 복합체가 응집해버리기 때문에 표지 항체 함유액을 얻는 것이 곤란했다.
이상, 본 발명의 실시형태를 예시의 목적에서 상세하게 설명했지만, 본 발명은 상기 실시형태에 제약되는 일은 없다. 예를 들면, 상기 실시형태에서는 본 발명의 수지-백금 복합체를 면역학적 측정에 적용하는 경우에 대해서 상세하게 설명했다. 그러나, 본 발명의 수지-백금 복합체는 면역학적 측정에 한정되지 않고, 다른 용도로의 적용도 가능하다. 특히, 본 발명의 수지-백금 복합체는 항원이나 항체 등의 리간드와 결합시킨 상태에서 우수한 분산성을 발휘하기 때문에 의약 등의 용도로의 이용에 적합하다.
10 : 수지 입자
20 : 백금 입자
30 : 내포 입자 40 : 일부 노출 입자
50 : 표면 흡착 입자 60 : 표층부
100 : 수지-백금 복합체 110 : 멤브레인
120 : 시료 첨가부 130 : 판정부
131 : 포착 리간드 140 : 흡액부
150 : 표지 항체 160 : 분석물
170 : 복합체 200 : 테스트 스트립
30 : 내포 입자 40 : 일부 노출 입자
50 : 표면 흡착 입자 60 : 표층부
100 : 수지-백금 복합체 110 : 멤브레인
120 : 시료 첨가부 130 : 판정부
131 : 포착 리간드 140 : 흡액부
150 : 표지 항체 160 : 분석물
170 : 복합체 200 : 테스트 스트립
Claims (19)
- 수지 입자와,
상기 수지 입자보다 상대적으로 작은 복수의 백금 입자를 구비하고,
복수의 상기 백금 입자가 상기 수지 입자에 고정화되어 있는 수지-백금 복합체. - 제 1 항에 있어서,
상기 백금 입자 중 적어도 일부의 입자가 상기 수지 입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있는 수지-백금 복합체. - 제 2 항에 있어서,
복수의 상기 백금 입자의 60wt%~100wt%가 상기 표층부에 존재하는 수지-백금 복합체. - 제 1 항에 있어서,
상기 백금 입자는 상기 수지 입자의 지름 방향으로 서로 겹치는 일 없이 상기 수지 입자의 표면에 고정되어 있는 수지-백금 복합체. - 제 1 항에 있어서,
상기 백금 입자의 평균 입자 지름이 1~80㎚의 범위 내인 수지-백금 복합체. - 제 5 항에 있어서,
평균 입자 지름이 50~1000㎚의 범위 내인 수지-백금 복합체. - 제 1 항에 있어서,
상기 백금 입자의 평균 입자 지름이 1~50㎚의 범위 내인 수지-백금 복합체. - 제 1 항에 있어서,
상기 백금 입자의 평균 입자 지름이 1~30㎚의 범위 내인 수지-백금 복합체. - 제 1 항에 있어서,
상기 백금 입자의 평균 입자 지름이 1~15㎚의 범위 내인 수지-백금 복합체. - 제 7 항에 있어서,
평균 입자 지름이 100~600㎚의 범위 내인 수지-백금 복합체. - 제 1 항에 있어서,
상기 백금 입자의 담지량이 수지-백금 복합체의 중량에 대하여 5wt%~70wt%의 범위 내인 수지-백금 복합체. - 제 1 항에 있어서,
상기 수지 입자가 백금 이온을 흡착하는 것이 가능한 치환기를 구조로 갖는 폴리머 입자인 수지-백금 복합체. - 제 1 항에 기재된 수지-백금 복합체를 구비한 표지 물질.
- 제 13 항에 있어서,
상기 수지-백금 복합체의 표면에 항원 또는 항체를 흡착시켜 사용하는 것인 표지 물질. - 제 13 항에 기재된 표지 물질을 사용하는 면역학적 측정법.
- 제 1 항에 기재된 수지-백금 복합체를 구비한 면역학적 측정용 시약.
- 시료 중에 포함되는 분석물을 검출 또는 정량하는 분석물의 측정 방법으로서,
멤브레인 및 상기 멤브레인에 상기 분석물이 특이적으로 결합하는 포착 리간드가 고정되어 이루어지는 판정부를 포함하는 래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립을 사용하여 하기 공정(I)~(III)을 포함하는 공정을 행하는 것을 특징으로 하는 분석물의 측정 방법.
공정(I): 시료에 포함되는 상기 분석물과, 상기 분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 제 1 항에 기재된 수지-백금 복합체로 표지한 표지 항체를 접촉시키는 공정,
공정(II): 상기 판정부에서 공정(I)에 있어서 형성된 분석물과 표지 항체를 포함하는 복합체를 포착 리간드에 접촉시키는 공정,
공정(III): 상기 수지-백금 복합체의 국재형 표면 플라즈몬 공명 및 전자 천이에 의한 광 에너지 흡수로부터 유래되는 발색 강도를 측정하는 공정 - 래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립을 사용하여 시료 중에 포함되는 분석물을 검출 또는 정량하기 위한 분석물 측정용 키트로서,
멤브레인 및 상기 멤브레인에 상기 분석물과 특이적으로 결합하는 포착 리간드가 고정되어 이루어지는 판정부를 포함하는 래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립과,
상기 분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 제 1 항에 기재된 수지-백금 복합체로 표지한 표지 항체를 포함하는 검출 시약을 포함하는 분석물을 검출 또는 정량하기 위한 분석물 측정용 키트. - 시료 중에 포함되는 분석물을 검출 또는 정량하기 위한 래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립으로서,
멤브레인과,
상기 멤브레인에 상기 시료가 전개하는 방향에 있어서 상기 분석물과 특이적으로 결합하는 포착 리간드가 고정되어 이루어지는 판정부와,
상기 판정부보다 상류측에 상기 분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 제 1 항에 기재된 수지-백금 복합체로 표지한 표지 항체가 포함되는 반응부를 포함하는 래터럴 플로우형 크로마토용 테스트 스트립.
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