JP7458583B2 - プロゾーン現象の抑制方法 - Google Patents
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Description
本発明は、イムノクロマトグラフィーに関する技術である。
食物アレルギーは、皮膚炎、喘息、アナフィラキシーショックなどの有害な免疫応答を誘発し、死亡事故につながる危険性もはらんでいる。実際米国では年間約１５０人もの人が食物アレルギーにより亡くなっていると報告されている。このような状況に鑑み、食物中のアレルゲンを検出するための技術が多数提案されている。
現在、アレルゲンの検出方法としては、抗体を用いたイムノアッセイが一般的に使用されている。例えば特許文献１にはＥＬＩＳＡやイムノクロマト法によってそばアレルゲンを検出する方法が開示されている。
また、特許文献２には、金コロイドで標識したモノクローナル抗体を用いた、イムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法が開示されている。
また、特許文献２には、金コロイドで標識したモノクローナル抗体を用いた、イムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法が開示されている。
ところで、イムノクロマトグラフィーにおいては、サンプル中に抗原が過剰に存在することが原因で、見かけの測定値が減少する、プロゾーン現象が確認されることがある。
食品検査において、検査溶液中に高濃度のアレルゲン物質が含まれる場合に、プロゾーン現象による偽陰性判定が生じると、重大な事故につながる可能性がある。
しかし、上記特許文献１や特許文献２に開示されているアレルゲン検出方法のうち、イムノクロマトグラフィーを用いた検出方法では、プロゾーン現象を抑制することができず、プロゾーン現象の発生に起因する偽陰性判定であることが疑われる場合には、サンプルを希釈して再検査する必要がある。
食品検査において、検査溶液中に高濃度のアレルゲン物質が含まれる場合に、プロゾーン現象による偽陰性判定が生じると、重大な事故につながる可能性がある。
しかし、上記特許文献１や特許文献２に開示されているアレルゲン検出方法のうち、イムノクロマトグラフィーを用いた検出方法では、プロゾーン現象を抑制することができず、プロゾーン現象の発生に起因する偽陰性判定であることが疑われる場合には、サンプルを希釈して再検査する必要がある。
上記状況に鑑み、本発明は、プロゾーン現象の抑制のための新規の技術を提供することを課題とする。
上記課題を解決する、本発明に係るプロゾーン現象の抑制方法は、食品中に含まれる食物アレルゲンと標識抗体との抗原抗体反応を含む、イムノクロマトグラフィーによる免疫学的検査方法におけるプロゾーン現象の抑制方法であって、
上記標識抗体として、樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した標識抗体を用いることを特徴とする、プロゾーン現象の抑制方法である。
上記構成とすることによって、プロゾーン現象を抑制することができる。
上記標識抗体として、樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した標識抗体を用いることを特徴とする、プロゾーン現象の抑制方法である。
上記構成とすることによって、プロゾーン現象を抑制することができる。
本発明の好ましい形態では、上記免疫学的検査方法に供する被検サンプルが、上記食物アレルゲンの最大シグナル値が得られる濃度以上の濃度範囲で上記食物アレルゲンを含む試料である。
通常、最大シグナル値が得られる濃度以上に抗原を含む場合にはプロゾーン現象の影響を強く受けるが、本発明の適用によりこれを抑制することができる。
通常、最大シグナル値が得られる濃度以上に抗原を含む場合にはプロゾーン現象の影響を強く受けるが、本発明の適用によりこれを抑制することができる。
本発明の好ましい形態では、上記食物アレルゲンが、タンパク質であり、上記免疫学的検査方法に供する被検サンプルに含まれる総タンパク質濃度が、１００ｎｇ／ｍＬ以上である。
１００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度のような高濃度で抗原を含む場合にはプロゾーン現象の影響を強く受けるが、本発明の適用によりこれを抑制することができる。
１００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度のような高濃度で抗原を含む場合にはプロゾーン現象の影響を強く受けるが、本発明の適用によりこれを抑制することができる。
また、上記課題を解決する、本発明に係る免疫学的検査方法は、食品中に含まれる食物アレルゲンと標識抗体との抗原抗体反応を含む、イムノクロマトグラフィーによる免疫学的検査方法であって、
上記標識抗体が、樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した標識抗体であり、
上記食物アレルゲンの最大シグナル値が得られる濃度以上の濃度範囲で上記対象成分を含む可能性のある試料を被検サンプルとして供することを特徴とする、免疫学的検査方法である。
通常、最大シグナル値が得られる濃度以上の濃度範囲で抗原を含む可能性がある場合、陰性の結果が得られたとしてもこれが偽陰性である可能性が非常に高い。
しかし、本発明の適用により、上述したような高濃度で抗原を含む可能性がある場合において、プロゾーン現象による偽陰性判定が生じる可能性を低減することができる。
上記標識抗体が、樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した標識抗体であり、
上記食物アレルゲンの最大シグナル値が得られる濃度以上の濃度範囲で上記対象成分を含む可能性のある試料を被検サンプルとして供することを特徴とする、免疫学的検査方法である。
通常、最大シグナル値が得られる濃度以上の濃度範囲で抗原を含む可能性がある場合、陰性の結果が得られたとしてもこれが偽陰性である可能性が非常に高い。
しかし、本発明の適用により、上述したような高濃度で抗原を含む可能性がある場合において、プロゾーン現象による偽陰性判定が生じる可能性を低減することができる。
本発明の好ましい形態では、上記食物アレルゲンがタンパク質であり、
上記被検サンプルに含まれる総タンパク質濃度が、１００ｎｇ／ｍＬ以上である。
上記構成とすることによって、検出対象のタンパク質を高濃度で含む可能性がある被検サンプルでも、偽陰性の判定をすることなく、検査することができる。
上記被検サンプルに含まれる総タンパク質濃度が、１００ｎｇ／ｍＬ以上である。
上記構成とすることによって、検出対象のタンパク質を高濃度で含む可能性がある被検サンプルでも、偽陰性の判定をすることなく、検査することができる。
また、上記課題を解決する、本発明に係る免疫学的検査方法は、食品中に含まれる食物アレルゲンと標識抗体との抗原抗体反応を含む、イムノクロマトグラフィーによる免疫学的検査方法であって、
上記標識抗体が、樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した標識抗体であり、
食品組成物の抽出液を希釈せずに、被検サンプルとして供することを特徴とする、免疫学的検査方法である。
食品組成物の抽出液を希釈せずに、被検サンプルとして供する場合、抗原が多量に含まれていることによりプロゾーン現象が生じて偽陰性判定がなされる可能性が高い。
本発明はこのような場合に適用することにより、プロゾーン現象を抑制し偽陰性判定がなされることを抑止することができる。
上記標識抗体が、樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した標識抗体であり、
食品組成物の抽出液を希釈せずに、被検サンプルとして供することを特徴とする、免疫学的検査方法である。
食品組成物の抽出液を希釈せずに、被検サンプルとして供する場合、抗原が多量に含まれていることによりプロゾーン現象が生じて偽陰性判定がなされる可能性が高い。
本発明はこのような場合に適用することにより、プロゾーン現象を抑制し偽陰性判定がなされることを抑止することができる。
また、上記課題を解決する、本発明に係る免疫学的検査方法は、食品中に含まれる食物アレルゲンと標識抗体との抗原抗体反応を含む、イムノクロマトグラフィーによる免疫学的検査方法であって、
上記標識抗体が、樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した標識抗体であり、
食品組成物の抽出液又はその希釈物を被検サンプルとして供することを特徴とする、免疫学的検査方法である。
本発明によれば、製造過程において誤って食物アレルゲンを含む原料を規定以上に添加した食品組成物を、被検サンプルとして検査に供することができる。
上記標識抗体が、樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した標識抗体であり、
食品組成物の抽出液又はその希釈物を被検サンプルとして供することを特徴とする、免疫学的検査方法である。
本発明によれば、製造過程において誤って食物アレルゲンを含む原料を規定以上に添加した食品組成物を、被検サンプルとして検査に供することができる。
また、上記課題を解決する、本発明に係るイムノクロマトグラフィー装置は、食品中に含まれる食物アレルゲンと標識抗体との抗原抗体反応を含む、イムノクロマトグラフィーによる免疫学的検査方法に用いるイムノクロマトグラフィー装置であって、
樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した、上記食物アレルゲンに特異的に結合する標識抗体が、抗体保持部に溶出可能に保持されている、イムノクロマトグラフィー装置である。
上記構成とすることによって、プロゾーン現象を抑制したイムノクロマトグラフィー装置を提供することができる。
樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した、上記食物アレルゲンに特異的に結合する標識抗体が、抗体保持部に溶出可能に保持されている、イムノクロマトグラフィー装置である。
上記構成とすることによって、プロゾーン現象を抑制したイムノクロマトグラフィー装置を提供することができる。
また、上記課題を解決する、本発明に係る免疫学的検査方法は、第１標識抗体（但し、下記第２標識抗体とは異なる）が抗体保持部に保持された、第１イムノクロマトグラフィー装置を用いた一次免疫学的検査工程と、
樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した第２標識抗体が抗体保持部に保持された、第２イムノクロマトグラフィー装置を用いた二次免疫学的検査工程と、を含み、
上記一次免疫学的検査工程において陰性と判断された被検サンプルを、二次免疫学的検査工程に供することを特徴とする、免疫学的検査方法である。
一次免疫学的検査工程による陰性の検査結果はプロゾーン現象による偽陰性判定を含んでいる可能性がある。本発明は、一次免疫学的検査工程における陰性の判定結果が偽陰性でないことを二次免疫学的検査工程により確認する構成を採るため、非常に精度の高い検査結果を提供することができる。
樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した第２標識抗体が抗体保持部に保持された、第２イムノクロマトグラフィー装置を用いた二次免疫学的検査工程と、を含み、
上記一次免疫学的検査工程において陰性と判断された被検サンプルを、二次免疫学的検査工程に供することを特徴とする、免疫学的検査方法である。
一次免疫学的検査工程による陰性の検査結果はプロゾーン現象による偽陰性判定を含んでいる可能性がある。本発明は、一次免疫学的検査工程における陰性の判定結果が偽陰性でないことを二次免疫学的検査工程により確認する構成を採るため、非常に精度の高い検査結果を提供することができる。
本発明の好ましい形態では、上記第１標識抗体が、金属コロイドにより標識された標識抗体である。
上記構成とすることによって、従来の免疫学的検査方法で陰性と判定された被検サンプルに対して、プロゾーン現象の発生が抑制された免疫学的検査方法で、検査することができる。
上記構成とすることによって、従来の免疫学的検査方法で陰性と判定された被検サンプルに対して、プロゾーン現象の発生が抑制された免疫学的検査方法で、検査することができる。
本発明によれば、イムノクロマトグラフィーにおけるプロゾーン現象を抑制することができる。
本発明において、「食品組成物」には、液体の食品組成物及び固体の食品組成物のいずれも含まれる。
本発明において、「被検サンプル」とは、実際にイムノクロマトグラフィー装置に滴下するサンプルを意味し、食品組成物、食品組成物の抽出液及びこれらの希釈物のいずれも含まれる。
本発明において、「被検サンプル」とは、実際にイムノクロマトグラフィー装置に滴下するサンプルを意味し、食品組成物、食品組成物の抽出液及びこれらの希釈物のいずれも含まれる。
本発明は食品中に含まれる食物アレルゲンと標識抗体との抗原抗体反応を含む、イムノクロマトグラフィーに関する。本発明の特徴は、樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した標識抗体を用いる点にある。かかる特徴を有することにより、プロゾーン現象を抑制することができ、より信頼性の高いイムノクロマトグラフィー技術を提供することができる。
上記樹脂－金属複合体について、図１を参照して説明する。
樹脂－金属複合体１０は、樹脂粒子１１と、樹脂粒子１１に固定化された複数の白金粒子１２からなる複合体である。特に、本発明に係るプロゾーン現象の抑制方法には、特開２０１７－１２０２４２号公報に記載の複合体を好適に用いることができる。
金属として白金を用いることで、高いプロゾーン現象の抑制効果を得ることができる。
樹脂－金属複合体１０は、樹脂粒子１１と、樹脂粒子１１に固定化された複数の白金粒子１２からなる複合体である。特に、本発明に係るプロゾーン現象の抑制方法には、特開２０１７－１２０２４２号公報に記載の複合体を好適に用いることができる。
金属として白金を用いることで、高いプロゾーン現象の抑制効果を得ることができる。
樹脂粒子１１は、含窒素モノマーと多価ビニル化合物の共重合体である。含窒素モノマーは例えば芳香族アミン、脂肪族アミンが挙げられ、好ましくは、ビニルピリジンである。
また多価ビニル化合物は、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、ジビニルビフェニル等が挙げられ、好ましくはｏ－ジビニルベンゼン、ｍ－ジビニルベンゼン、ｐ－ジビニルベンゼンである。
白金粒子１２は、樹脂粒子１１に内包されていても、その一部が樹脂粒子１１から露出していても、また樹脂粒子１１の表面に吸着していてもよい。
また多価ビニル化合物は、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、ジビニルビフェニル等が挙げられ、好ましくはｏ－ジビニルベンゼン、ｍ－ジビニルベンゼン、ｐ－ジビニルベンゼンである。
白金粒子１２は、樹脂粒子１１に内包されていても、その一部が樹脂粒子１１から露出していても、また樹脂粒子１１の表面に吸着していてもよい。
樹脂－金属複合体１０は、特開２０１７－１２０２４２号公報に記載の方法で製造することができる。具体的には、まず、乳化重合法により樹脂粒子１１を製造する。次に、樹脂粒子１１に白金イオンを吸着させる。最後に、白金イオンが吸着した樹脂粒子１１を還元剤溶液に入れ、白金粒子１２を生成し、樹脂－金属複合体１０を得る。
上記樹脂－金属複合体１０で標識する抗体は、検出対象の食物アレルゲンを検出することができれば、特に制限されない。
また、標識抗体は、例えば特開２０１７－１２０２４２号公報に記載の方法で得られる。
具体的には、まず、樹脂－金属複合体１０を、結合用緩衝液に分散させ、複合体分散液を得る。このとき、上記結合用緩衝液のｐＨは、ｐＨ２～１０の範囲が好ましく、ｐＨ５～９の範囲内がより好ましい。
次に、上記複合体分散液に抗体を添加し、十分に攪拌、混合し、標識抗体分散液を得る。該標識抗体分散液を、遠心分離等の固液分離手段で処理することにより、標識抗体を得ることができる。
また、上記方法は、好ましくは、上記とは異なるｐＨ条件で処理するブロッキング工程を含む。また、より好ましくは、洗浄処理や保存処理を行う。
また、その他本発明の属する分野で通常行われている方法によっても、標識抗体を得ることができる。
また、標識抗体は、例えば特開２０１７－１２０２４２号公報に記載の方法で得られる。
具体的には、まず、樹脂－金属複合体１０を、結合用緩衝液に分散させ、複合体分散液を得る。このとき、上記結合用緩衝液のｐＨは、ｐＨ２～１０の範囲が好ましく、ｐＨ５～９の範囲内がより好ましい。
次に、上記複合体分散液に抗体を添加し、十分に攪拌、混合し、標識抗体分散液を得る。該標識抗体分散液を、遠心分離等の固液分離手段で処理することにより、標識抗体を得ることができる。
また、上記方法は、好ましくは、上記とは異なるｐＨ条件で処理するブロッキング工程を含む。また、より好ましくは、洗浄処理や保存処理を行う。
また、その他本発明の属する分野で通常行われている方法によっても、標識抗体を得ることができる。
本発明は、プロゾーン現象が起こる可能性がある濃度、すなわち、イムノクロマトグラフィーにおいて最大シグナル値が得られる濃度以上の濃度で、抗原である食物アレルゲンを含む可能性がある被検サンプルをイムノクロマトグラフィーに供する場合に特に有効である。本発明の適用によりプロゾーン現象を抑制することができる。
具体的には、本発明は、食物アレルゲンの濃度が、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ以上である被検サンプルを検査する場合に特に有効である。
例えば、上記食物アレルゲンがオボアルブミンの場合、被験サンプル中のオボアルブミンの濃度が、好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１２０ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１８０ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは２４０ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは３６０ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは３９０ｎｇ／ｍＬ以上である場合に、特に有効である。
また、上記食物アレルゲンがカゼインの場合、被験サンプル中のカゼインの濃度が、好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１２０ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１６０ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは２４０ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは３２０ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは４８０ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは５６０ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは６４０ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは７２０ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは８００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは９６０ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬ以上である場合に、特に有効である。
本発明において、検出対象となる食物アレルゲンは、特に制限されない。例えば、国際食品規格（ＣＯＤＥＸ）委員会の包装食品の表示に関するコーデックス一般規格（CODEX STAN 1-1985）の表示の対象であるグルテンを含む穀類・甲殻類・卵・魚・ピーナッツ・大豆・乳・木の実・亜硫酸塩、日本の消費者庁の食品表示基準（平成２７年３月３０日消食表第１３９号）の表示の対象である卵・乳・小麦・そば・落花生・えび・かに・あわび・いか・いくら・オレンジ・キウイフルーツ・牛肉・くるみ・さけ・さば・大豆・鶏肉・豚肉・まつたけ・もも・やまいも・りんご・ゼラチン・バナナ・ごま・カシューナッツ、米国のFDAの食品アレルゲン表示および消費者保護法（FALCPA）の表示の対象である牛乳・卵・魚・甲殻類・ナッツ類・小麦・ピーナッツ・大豆などの食品に含まれるアレルゲンを例示することができる。
本発明は、特に卵アレルゲン及び牛乳アレルゲンの検出時に有効である。
本発明は、特に卵アレルゲン及び牛乳アレルゲンの検出時に有効である。
食物アレルゲンがタンパク質である場合、被検サンプルに含まれる総タンパク質量が多いと、それに比例するようにプロゾーン現象が生じる可能性が高まる。そのため、被検サンプルの総タンパク質量が多い場合に、本発明を適用することが好ましい。
具体的には、本発明は、被検サンプルに含まれる総タンパク質の濃度が、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１４０ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは６００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは６５０ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは７００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは８００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは９００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１．２μｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１．３μｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１．４μｇ／ｍＬである場合に特に有効である。
具体的には、本発明は、被検サンプルに含まれる総タンパク質の濃度が、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１４０ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは６００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは６５０ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは７００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは８００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは９００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１．２μｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１．３μｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１．４μｇ／ｍＬである場合に特に有効である。
上記検出対象の食物アレルゲンが卵アレルゲンの場合、被検サンプル中の卵総タンパク質の濃度が、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは６００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらにより好ましくは６５０ｎｇ／ｍＬ以上であるときに本発明を適用することが有効である。
なお、卵総タンパク質のうち、約６０％が卵アレルゲン（オボアルブミン）である。
なお、卵総タンパク質のうち、約６０％が卵アレルゲン（オボアルブミン）である。
また、上記検出対象の食物アレルゲンが牛乳アレルゲンの場合、被検サンプル中の牛乳総タンパク質の濃度が、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１４０ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは６００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは７００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは８００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは９００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１．２μｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１．３μｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１．４μｇ／ｍＬであるときに本発明を適用することが有効である。
なお、牛乳総タンパク質のうち、約８０％が牛乳アレルゲン（カゼイン）である。
なお、牛乳総タンパク質のうち、約８０％が牛乳アレルゲン（カゼイン）である。
上記の場合、検出対象の食物アレルゲンが多量に被検サンプル中に含まれるため、プロゾーン現象による偽陰性判定が起こる確率が高まる。この場合に本発明を適用することで、偽陰性判定の発生を抑制することができる。
なお、本明細書でいう「濃度（ｇ／ｍＬ）」は、溶質を秤量して溶液を調製した場合には、当該溶質の質量と溶液の体積に基づく計算値を含む。
また、溶質がタンパク質である場合、「濃度（ｇ／ｍＬ）」には、比色法や吸光度測定による測定値が含まれる。
また、溶質がタンパク質である場合、「濃度（ｇ／ｍＬ）」には、比色法や吸光度測定による測定値が含まれる。
本来はプロゾーン現象の抑制のため、検査対象である食品組成物の抽出液を相当程度希釈したものを被検サンプルとしてイムノクロマトグラフィーに供する必要がある。しかし、本発明はイムノクロマトグラフィーにおけるプロゾーン現象を抑制することができるため、検査対象である食品組成物の抽出液を希釈せずに被検サンプルとして検査に供することもできる。
上記形態にすることによって、食品組成物の抽出液を希釈する手間が省け、より簡便に検査を行うことができる。
上記形態にすることによって、食品組成物の抽出液を希釈する手間が省け、より簡便に検査を行うことができる。
食品の試験ないし製造の現場においては、食物アレルゲンを含む原料を誤って規定以上に添加してしまうケースがまれにみられる。この場合、イムノクロマトグラフィーにより当該食物アレルゲンを検出しようと試みても、プロゾーン現象により偽陰性判定が出る可能性が高い。
本発明はこのような問題を解消するものである。食品組成物又はその希釈物を被検サンプルとして供するような食品検査に本発明を適用することが有効である。
本発明はこのような問題を解消するものである。食品組成物又はその希釈物を被検サンプルとして供するような食品検査に本発明を適用することが有効である。
従来の免疫学的検査方法による陰性の検査結果は、プロゾーン現象による偽陰性判定を含んでいる可能性がある。本発明は、従来の免疫学的検査方法による陰性の結果が、プロゾーン現象による偽陰性判定を含んでいるか否かを確認する手段として利用することができる。
すなわち、本発明は、一次免疫学的検査工程と、二次免疫学的検査工程と、を含み、一次免疫学的検査工程において陰性と判断された食品組成物を、二次免疫学的検査工程に供する、免疫学的検査方法にも関する。
すなわち、本発明は、一次免疫学的検査工程と、二次免疫学的検査工程と、を含み、一次免疫学的検査工程において陰性と判断された食品組成物を、二次免疫学的検査工程に供する、免疫学的検査方法にも関する。
上記一次免疫学的検査工程では、第１標識抗体が抗体保持部に保持された、第１イムノクロマトグラフィー装置を用いる。この第１標識抗体は後述する第２標識抗体とは異なる。
第１標識抗体としては公知の標識抗体を制限なく用いることができるが、金コロイドなどの金属コロイドにより標識された抗体を挙げることができる。
第１標識抗体としては公知の標識抗体を制限なく用いることができるが、金コロイドなどの金属コロイドにより標識された抗体を挙げることができる。
また、上記二次免疫学的検査工程では、樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した第２標識抗体が抗体保持部に保持された、第２イムノクロマトグラフィー装置を用いる。
一次免疫学的検査工程による陰性の検査結果はプロゾーン現象による偽陰性判定を含んでいる可能性がある。本発明は、一次免疫学的検査工程における陰性の判定結果が偽陰性でないことを二次免疫学的検査工程により確認する構成を採るため、非常に精度の高い検査結果を提供することができる。
別の観点で評価すれば、本発明は、プロゾーン現象が抑制された免疫学的検査方法（上記二次免疫学的検査工程）に供するべき食品組成物を、上記一次免疫学的検査工程によって、スクリーニングするものであるともいえる。本形態は、食品組成物が大量である場合に特に有用である。
本発明を実現するためのイムノクロマトグラフィー装置の構成は特に限定されない。以下、一例として本発明を適用したイムノクロマトグラフィー装置２０を、図２を参照して説明する。
本発明のイムノクロマトグラフィー装置２０は、メンブレン２１を備え、メンブレン２１上には、試料の展開する方向に、滴下部２２、抗体保持部２３、及び判定部２４を備える。また、必須ではないが、吸水部２５及び、コントロール部２６を備えていてもよい。
メンブレン２１は、イムノクロマトグラフィー装置において一般的に用いられる素材であれば、特に制限されない。例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、セルロース、誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。中でも、ニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル（ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物）膜、ナイロン膜、又は濾紙が好ましく用いられる。
滴下部２２は、実際に被検サンプルを添加する部分である。滴下部２２は、イムノクロマトグラフィー装置において一般的に用いられる素材であれば、特に制限されない。
抗体保持部２３には、標識抗体２３１が、溶出可能に保持されている。ここで、標識抗体２３１は、検出対象の食物アレルゲンを検出する抗体を、上記樹脂－金属複合体で標識したものである。
抗体保持部２３は、標識抗体２３１を、乾燥によりグラスファイバー上に担持させて、作製する。
また抗体は、検出対象のアレルゲン物質を検出できるものを、適宜選択する。また、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でもよい。
抗体保持部２３は、標識抗体２３１を、乾燥によりグラスファイバー上に担持させて、作製する。
また抗体は、検出対象のアレルゲン物質を検出できるものを、適宜選択する。また、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でもよい。
判定部２４には、検出対象の食物アレルゲンを捕捉することができる、捕捉抗体２４１が、メンブレン２１上に、直接的に又は間接的に担持されている。捕捉抗体２４１は、物理的な結合により担持されていても、化学的な結合で担持されていてもよい。
捕捉抗体２４１の、メンブレンへの担持方法は、公知の方法を適宜選択することができる。
捕捉抗体２４１の、メンブレンへの担持方法は、公知の方法を適宜選択することができる。
吸液部２５を備える場合、吸液部２５は、吸水性材料からなり、展開された試料を吸収する。例えば、セルロース濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等が挙げられる。
コントロール部２６を備える場合、コントロール部２６には、検出対象のアレルゲン物質を捕捉することができる、第二捕捉抗体２６１が、メンブレン２１上に、直接的に又は間接的に担持されている。第二捕捉抗体２６１は、物理的な結合により担持されていても、化学的な結合で担持されていてもよい。なお、第二捕捉抗体２６１は、上記捕捉抗体２４１とは異なる抗体である。
コントロール部２６を備えることで、検査が正常に終了したことを確認することができる。
コントロール部２６を備えることで、検査が正常に終了したことを確認することができる。
なお、コントロール部２６における、検査が正常に終了したことを確認する確認方法は、上記第二補足抗体２６１をメンブレン上に担持する方法以外の、本発明が属する分野で公知の方法を用いることもできる。
この場合、コントロール部２６には、採用した確認方法に適した試薬等が、常法によって担持されている。
この場合、コントロール部２６には、採用した確認方法に適した試薬等が、常法によって担持されている。
以下、実施例及び試験例により本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、以下の実施形態に限定されない。
＜実施例＞イムノクロマトグラフィー装置の作製
以下の方法で、本発明に係る卵アレルゲン検出イムノクロマトグラフィー装置及び、牛乳アレルゲン検出イムノクロマトグラフィー装置を作製した。
以下の方法で、本発明に係る卵アレルゲン検出イムノクロマトグラフィー装置及び、牛乳アレルゲン検出イムノクロマトグラフィー装置を作製した。
（１）抗体及び標識試薬
抗体は、卵アレルゲン特異的ポリクローナル抗体、及び、牛乳アレルゲン特異的ポリクローナル抗体（いずれも株式会社森永生科学研究所製）を用いた。
標識試薬は、樹脂－金粒子複合体、樹脂－白金粒子複合体（いずれも日鉄ケミカル＆マテリアル株式会社製）、及び、金ナノコロイド（直径４０ｎｍ、田中貴金属工業株式会社製）を用いた。
抗体は、卵アレルゲン特異的ポリクローナル抗体、及び、牛乳アレルゲン特異的ポリクローナル抗体（いずれも株式会社森永生科学研究所製）を用いた。
標識試薬は、樹脂－金粒子複合体、樹脂－白金粒子複合体（いずれも日鉄ケミカル＆マテリアル株式会社製）、及び、金ナノコロイド（直径４０ｎｍ、田中貴金属工業株式会社製）を用いた。
上記樹脂－金複合体粒子は、直径３５０ｎｍのラテックス微粒子に、直径約２５ｎｍの金粒子が固定化されており、全体の直径（図１中Ｄで示した長さ）は、３７０ｎｍである。
上記樹脂－白金複合体粒子は、直径４３０ｎｍのラテックス微粒子に、直径約５ｎｍの白金微粒子が固定化されており、全体の直径（図１中Ｄで示した長さ）は、４５０ｎｍである。
いずれの複合体も、特開２０１７－１２０２４２号公報に記載の方法で調製した。
上記樹脂－白金複合体粒子は、直径４３０ｎｍのラテックス微粒子に、直径約５ｎｍの白金微粒子が固定化されており、全体の直径（図１中Ｄで示した長さ）は、４５０ｎｍである。
いずれの複合体も、特開２０１７－１２０２４２号公報に記載の方法で調製した。
（２）標識抗体の調製
上記各抗体を、上記各標識試薬によって標識し、標識抗体を得た。
樹脂－金粒子複合体及び樹脂－白金粒子複合体は、各１．０ｗｔ％の濃度のもの、金ナノコロイドは、ＯＤ５２３＝１．０の濃度のものをそれぞれ用い、常法に従って抗体を標識した。
上記各抗体を、上記各標識試薬によって標識し、標識抗体を得た。
樹脂－金粒子複合体及び樹脂－白金粒子複合体は、各１．０ｗｔ％の濃度のもの、金ナノコロイドは、ＯＤ５２３＝１．０の濃度のものをそれぞれ用い、常法に従って抗体を標識した。
（３）イムノクロマトグラフィー装置の作製
まず、上記（２）で調製した各標識抗体を、それぞれ乾燥によりグラスファイバー上に担持させて、抗体保持部２３を作製した。
次に、各抗体保持部２３を用いて、図２に示す構成のイムノクロマトグラフィー装置を作製した（下記表１参照）。
まず、上記（２）で調製した各標識抗体を、それぞれ乾燥によりグラスファイバー上に担持させて、抗体保持部２３を作製した。
次に、各抗体保持部２３を用いて、図２に示す構成のイムノクロマトグラフィー装置を作製した（下記表１参照）。
＜試験例１＞卵タンパク質の検出
上記実施例で作製した卵タンパク質検出イムノクロマトグラフィー装置Ａ１～Ａ３の、検出感度を試験した。
（１）サンプルの調製
サンプルは、検体抽出液（卵総タンパク質０ｎｇ／ｍＬ、株式会社森永生科学研究所製）、卵標準溶液（卵総タンパク濃度２５０ｎｇ／ｍＬ、株式会社森永生科学研究所製）、及び卵抽出液をサンプル原液として、下記表２の濃度となるように調製した。
上記卵抽出液は、まず全卵（タンパク質濃度１２％（日本食品標準成分表より））から、上記検体抽出液を用いて、卵タンパク質を２０倍抽出した。これを、上記検体抽出液を用いて、更に１倍、１０倍、１０２倍、１０３倍、１０４倍に段階希釈した。
上記検体抽出液、卵標準溶液、各種濃度の卵抽出液を、検体希釈液（株式会社森永生科学研究所製）でそれぞれ１０倍希釈し、サンプルとして用いた（表２参照）。
上記実施例で作製した卵タンパク質検出イムノクロマトグラフィー装置Ａ１～Ａ３の、検出感度を試験した。
（１）サンプルの調製
サンプルは、検体抽出液（卵総タンパク質０ｎｇ／ｍＬ、株式会社森永生科学研究所製）、卵標準溶液（卵総タンパク濃度２５０ｎｇ／ｍＬ、株式会社森永生科学研究所製）、及び卵抽出液をサンプル原液として、下記表２の濃度となるように調製した。
上記卵抽出液は、まず全卵（タンパク質濃度１２％（日本食品標準成分表より））から、上記検体抽出液を用いて、卵タンパク質を２０倍抽出した。これを、上記検体抽出液を用いて、更に１倍、１０倍、１０２倍、１０３倍、１０４倍に段階希釈した。
上記検体抽出液、卵標準溶液、各種濃度の卵抽出液を、検体希釈液（株式会社森永生科学研究所製）でそれぞれ１０倍希釈し、サンプルとして用いた（表２参照）。
各サンプル中の卵総タンパク質濃度は、２－D Quant Kit（GEヘルスケア社）を用いて、キットの指示に従って測定した。
（２）試験
上記（１）で調製した各サンプル２００μＬを、上記実施例で作成した卵タンパク質検出イムノクロマトグラフィー装置Ａ１～Ａ３の滴下部に滴下し、１５分間室温で静置した。１５分後、目視で陽性又は陰性であるかの判定を行った。
また、イムノクロマトリーダ（Ｃ１００６６、浜松ホトニクス株式会社製）による測定も行った。これを３回繰り返した。
結果を下記表３及び図３に示す。なお、表３及び後述する表４中、「＋」は陽性判定であることを表し、「－」は陰性判定であることを表す。また、吸光度のリーダ値の単位はｍABSである。
上記（１）で調製した各サンプル２００μＬを、上記実施例で作成した卵タンパク質検出イムノクロマトグラフィー装置Ａ１～Ａ３の滴下部に滴下し、１５分間室温で静置した。１５分後、目視で陽性又は陰性であるかの判定を行った。
また、イムノクロマトリーダ（Ｃ１００６６、浜松ホトニクス株式会社製）による測定も行った。これを３回繰り返した。
結果を下記表３及び図３に示す。なお、表３及び後述する表４中、「＋」は陽性判定であることを表し、「－」は陰性判定であることを表す。また、吸光度のリーダ値の単位はｍABSである。
（３）結果
表３及び図３に示すように、樹脂－金粒子複合体で抗体を標識したイムノクロマトグラフィー装置（Ａ１）では、サンプル中のアレルゲン濃度が６５μｇ／ｍＬを超えると、目視では陰性の判定となった。また、リーダ値は顕著に低下した。
また、従来のイムノクロマトで標識物質として用いられてきた金ナノコロイド粒子で抗体を標識したイムノクロマトグラフィー装置（Ａ３）では、サンプル中の卵総タンパク質濃度が６５０μｇ／ｍＬの場合に、目視で陰性の判定となった。また、リーダ値は顕著に低下した。
一方、樹脂－白金粒子複合体で抗体を標識したイムノクロマトグラフィー装置（Ａ２）では、サンプル中の卵総タンパク質濃度が６５０μｇ／ｍＬでも、目視で陽性の判定となった。リーダ値も、陽性判定がでる程度にしか低下していない。
表３及び図３に示すように、樹脂－金粒子複合体で抗体を標識したイムノクロマトグラフィー装置（Ａ１）では、サンプル中のアレルゲン濃度が６５μｇ／ｍＬを超えると、目視では陰性の判定となった。また、リーダ値は顕著に低下した。
また、従来のイムノクロマトで標識物質として用いられてきた金ナノコロイド粒子で抗体を標識したイムノクロマトグラフィー装置（Ａ３）では、サンプル中の卵総タンパク質濃度が６５０μｇ／ｍＬの場合に、目視で陰性の判定となった。また、リーダ値は顕著に低下した。
一方、樹脂－白金粒子複合体で抗体を標識したイムノクロマトグラフィー装置（Ａ２）では、サンプル中の卵総タンパク質濃度が６５０μｇ／ｍＬでも、目視で陽性の判定となった。リーダ値も、陽性判定がでる程度にしか低下していない。
＜試験例２＞牛乳タンパク質の検出
サンプル原液を、検体抽出液、牛乳標準品溶液（株式会社森永生科学研究所製）、及び牛乳抽出液とした以外は、試験例１と同様にして、上記実施例で作製した牛乳タンパク質検出イムノクロマトグラフィー装置Ｂ１～Ｂ３の、検出感度を試験した。
なお、牛乳抽出液は、牛乳（タンパク質濃度約３％（日本食品成分表より））を用いて、上記卵抽出液と同様に抽出した。
また、牛乳標準品の希釈前の牛乳総タンパク質濃度は２５０ｎｇ／ｍＬである。
各サンプルの牛乳総タンパク質濃度を、下記表４に示す。
結果を表５及び図４に示す。
サンプル原液を、検体抽出液、牛乳標準品溶液（株式会社森永生科学研究所製）、及び牛乳抽出液とした以外は、試験例１と同様にして、上記実施例で作製した牛乳タンパク質検出イムノクロマトグラフィー装置Ｂ１～Ｂ３の、検出感度を試験した。
なお、牛乳抽出液は、牛乳（タンパク質濃度約３％（日本食品成分表より））を用いて、上記卵抽出液と同様に抽出した。
また、牛乳標準品の希釈前の牛乳総タンパク質濃度は２５０ｎｇ／ｍＬである。
各サンプルの牛乳総タンパク質濃度を、下記表４に示す。
結果を表５及び図４に示す。
表５及び図４に示す通り、樹脂－金粒子複合体で抗体を標識したイムノクロマトグラフィー装置（Ｂ１）は、牛乳総タンパク質の濃度が１４０μｇ／ｍＬの時に、目視で陰性判定となった。また、リーダ値は顕著に低下した。
また、従来のイムノクロマトで標識物質として用いられてきた金ナノコロイド粒子で抗体を標識したイムノクロマトグラフィー装置（Ｂ３）では、サンプル中の牛乳総タンパク質濃度が１４０μｇ／ｍＬのとき、３回中１回、目視で陰性判定となった。また、リーダ値は顕著に低下した。目視で陽性判定となった２回もリーダ値は顕著に低下している。
一方、樹脂－白金粒子複合体で抗体を標識したイムノクロマトグラフィー装置（Ｂ２）では、サンプル中の牛乳総タンパク質濃度が１４０μｇ／ｍＬでも、目視で陽性の判定となった。リーダ値も、陽性判定がでる程度にしか低下していない。
また、従来のイムノクロマトで標識物質として用いられてきた金ナノコロイド粒子で抗体を標識したイムノクロマトグラフィー装置（Ｂ３）では、サンプル中の牛乳総タンパク質濃度が１４０μｇ／ｍＬのとき、３回中１回、目視で陰性判定となった。また、リーダ値は顕著に低下した。目視で陽性判定となった２回もリーダ値は顕著に低下している。
一方、樹脂－白金粒子複合体で抗体を標識したイムノクロマトグラフィー装置（Ｂ２）では、サンプル中の牛乳総タンパク質濃度が１４０μｇ／ｍＬでも、目視で陽性の判定となった。リーダ値も、陽性判定がでる程度にしか低下していない。
以上より、樹脂－白金粒子複合体で抗体を標識することで、プロゾーン現象を抑制することができることがわかった。
また、樹脂－白金粒子複合体で抗体を標識したイムノクロマトグラフィー装置を用いることで、高濃度に抗原を含有するサンプルに対しても、正確に判定することができることがわかった。
また、樹脂－白金粒子複合体で抗体を標識したイムノクロマトグラフィー装置を用いることで、高濃度に抗原を含有するサンプルに対しても、正確に判定することができることがわかった。
本発明は、食品のアレルギー検査に応用することができる。特に、抗原が高濃度で含まれる可能性のある食品に対して、正確に試験を実施することができる。
１０ 樹脂－金属複合体
１１ 樹脂粒子
１２ 白金粒子
２０ イムノクロマトグラフィー装置
２１ メンブレン
２２ 滴下部
２３ 抗体保持部
２３１ 標識抗体
２４ 判定部
２４１ 補足抗体
２５ 吸水部
２６ コントロール部
２６１ 第二補足抗体
Ｄ 樹脂－金属複合体の全体の直径
１１ 樹脂粒子
１２ 白金粒子
２０ イムノクロマトグラフィー装置
２１ メンブレン
２２ 滴下部
２３ 抗体保持部
２３１ 標識抗体
２４ 判定部
２４１ 補足抗体
２５ 吸水部
２６ コントロール部
２６１ 第二補足抗体
Ｄ 樹脂－金属複合体の全体の直径
Claims (7)
- 食品中に含まれる食物アレルゲンと標識抗体との抗原抗体反応を含む、イムノクロマトグラフィーによる免疫学的検査方法におけるプロゾーン現象の抑制方法であって、 前記標識抗体として、樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した標識抗体を用いることを特徴とする、プロゾーン現象の抑制方法。
- 前記免疫学的検査方法に供する被検サンプルが、前記食物アレルゲンの最大シグナル値が得られる濃度以上の濃度範囲で前記食物アレルゲンを含む試料であることを特徴とする、請求項１に記載のプロゾーン現象の抑制方法。
- 前記食物アレルゲンがタンパク質であり、前記免疫学的検査方法に供する被検サンプルに含まれる総タンパク質濃度が、１００ｎｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のプロゾーン現象の抑制方法。
- 食品中に含まれる食物アレルゲンと標識抗体との抗原抗体反応を含む、イムノクロマトグラフィーによる免疫学的検査において、前記食物アレルゲンの最大シグナル値が得られる濃度以上の濃度範囲で前記食物アレルゲンを含む可能性のある試料を被検サンプルとして供する場合における偽陰性判定の発生を抑制する方法であって、 前記標識抗体として、樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した標識抗体を用いることを特徴とする、免疫学的検査における偽陰性判定の発生を抑制する方法。
- 前記食物アレルゲンがタンパク質であり、 前記被検サンプルに含まれる総タンパク質濃度が、１００ｎｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする、請求項４に記載の免疫学的検査における偽陰性判定の発生を抑制する方法。
- 第１標識抗体（但し、下記第２標識抗体とは異なる）が抗体保持部に保持された、第１イムノクロマトグラフィー装置を用いた一次免疫学的検査工程と、 樹脂粒子に複数の白金粒子が固定化された構造を有する樹脂－金属複合体で標識した第２標識抗体が抗体保持部に保持された、第２イムノクロマトグラフィー装置を用いた二次免疫学的検査工程と、を含み、 前記一次免疫学的検査工程において陰性と判断された被検サンプルを、二次免疫学的検査工程に供し、 前記一次免疫学的検査工程による陰性の結果が、プロゾーン現象による偽陰性判定を含んでいるか否かを前記二次免疫学的検査工程により確認することを特徴とする、免疫学的検査方法。
- 前記第１標識抗体が、金属コロイドにより標識された標識抗体であることを特徴とする、請求項６に記載の免疫学的検査方法。
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| JP2017120242A (ja) | 2015-12-29 | 2017-07-06 | 新日鉄住金化学株式会社 | 樹脂−金属複合体、標識物質、免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、アナライトの測定方法、アナライト測定用キット、及び、ラテラルフロー型クロマト用テストストリップ |
| WO2019005694A1 (en) | 2017-06-28 | 2019-01-03 | Becton, Dickinson And Company | SANDWICH-TYPE ASSAYS USING PARTS OF DOSE RESPONSE DECRYPING SIGNAL SIGNAL TO MEASURE ANALYTES, PARTICULARLY HIGH-CONCENTRATION ANALYTES |
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-
2019
- 2019-08-27 JP JP2019154388A patent/JP7458583B2/ja active Active
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