KR20180029262A

KR20180029262A - 인자 ix 융합 단백질 및 이의 제조 방법 및 사용 방법

Info

Publication number: KR20180029262A
Application number: KR1020187006241A
Authority: KR
Inventors: 지쳰 류; 데르 플리에르 아르얀 판; 데이비드 알 라이트; 엑타 세스 차브라; 통야오 류; 로버트 티 피터스; 존 컬맨; 아이만 이스마일
Original assignee: 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크.
Priority date: 2015-08-03
Filing date: 2016-08-03
Publication date: 2018-03-20
Also published as: IL257231A; JP2022171790A; KR102659212B1; EP3331608A4; CN108472337B; US20210032616A1; MX2018001497A; CA2994547A1; UA126016C2; HK1248162A1; US20180355341A1; EA201890423A1; CL2018000302A1; CN108472337A; TW201716433A; JP2018522563A; AU2016301303A1; JP6909203B2; TWI741992B; US10745680B2

Abstract

본 발명은 적어도 하나의 이종 모이어티, 예컨대, XTEN을 포함하는 인자 IX(FIX) 융합 단백질을 제공한다. 본 발명은 추가로 상기 FIX 융합 단백질의 제조 방법 및 사용 방법을 개시한다.

Description

인자 IX 융합 단백질 및 이의 제조 방법 및 사용 방법

전자 파일로 제출된 서열 목록에 대한 참조

본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일(파일명: 2159_466PC03_SeqListing_ST25.txt; 크기: 688,154바이트; 및 생성일: 2016년 8월 2일)의 전자 파일로 제출된 서열 목록의 내용은 이의 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.

혈우병 B(크리스마스병(Christmas disease)이라고도 알려짐)는 전세계에서 가장 일반적인 유전 질환 중 하나이다. 이것은 감소된 생체내 및 시험관내 혈액 응고 활성을 유발하며, 병이 있는 개인의 생애 전체에서 집중적인 의학적 모니터링을 필요로 한다. 중재의 부재 하에서, 고통을 받는 개인은 관절에서의 자연 출혈을 겪을 것이고, 이는 상당한 통증 및 쇠약해지는 이동성을 생성하며; 근육 내에서의 출혈은 이들 조직에서 혈액의 축적을 유발하고; 인후 및 목에서의 자연 출혈은 즉시 치료되지 않으면 질식을 유발할 수 있고; 신장 출혈; 및 수술, 경미한 우발적인 부상 또는 발치 후 심각한 출혈이 또한 우세하다.

최소한의 정상 생체내 혈액 응집은 세린 프로테아제 인자 II(프로트롬빈), VII, IX, X 및 XI(가용성 혈장 단백질); 막관통 단백질 조직 인자 및 혈장 단백질 인자 V 및 VIII을 비롯한 보조인자; 피브리노겐, 트랜스글루타미나제 인자 XIII, 인지질(활성화 혈소판 포함), 및 칼슘을 필요로 한다. 칼리크레인, 고분자량 키니노겐, 및 인자 XII를 비롯한 추가 단백질이 일부 시험관내 응고 시험에서 요구되며, 생리 조건 하에서 생체내에서 역할을 할 수 있다.

혈우병에서, 혈액 응고는 특정 혈장 혈액 응고 인자의 부족으로 인해서 방해 받는다. 혈우병 B는 FIX 단백질의 감소된 합성 또는 부재 또는 감소된 활성을 갖는 결함 분자로부터 유발될 수 있는 인자 IX(FIX)의 결핍에 의해서 기인된다. 혈우병의 치료는 FIX가 상당히 풍부한 외인성 인자 농축물에 의해서 누락된 응고 인자를 대체함으로써 수행된다. 그러나, 혈액으로부터의 이러한 농축물의 생성은 하기에 기술된 바와 같이 기술적 어려움에 직면한다.

혈장으로부터의 FIX(혈장 유래된 FIX; pdFIX)의 정제는 거의 독점적으로 완전-γ-카복실화 FIX를 산출한다. 그러나, 혈장으로부터의 이러한 FIX의 정제는 매우 어려운데, 그 이유는 FIX가 혈장 중에 단지 매우 낮은 농도(5㎍/㎖)로 존재하기 때문이다(문헌[Andersson, Thrombosis Research 7: 451 459 (1975)]). 추가로, 혈액으로부터의 정제는 감염원, 예컨대 HIV 및 HCV의 제거 또는 불활성화를 필요로 한다. 또한, pdFIX는 짧은 반감기를 갖고, 따라서 빈번한 투여가 필요하다. 재조합 인자 IX(rFIX)가 또한 사용 가능하지만, 동일한 짧은 반감기 및 pdFIX로서의 빈번한 투여(예를 들어, 예방을 위해서 주당 2회 내지 3회) 필요성으로부터 고통을 받고 있다.

사망률 감소, 관절 손상의 예방 및 삶의 질 개선은 혈장-유래된 재조합 FIX의 개발로 인해서 중요하게 성취되었다. 출혈로부터의 장기간 보호는 혈우병 B 대상체의 치료에서 또 다른 중요한 개선을 나타낼 것이다. 따라서, 효과적인 활성을 유지시키면서, 더 긴 반감기를 갖는 개선된 재조합 FIX에 대한 필요성이 존재한다.

적어도 하나의 XTEN을 포함하는 특이적인 인자 IX 융합 단백질이 개시된다. 일 양상에서, 본 발명은 FIX 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 103, 서열번호 2의 아미노산 105, 서열번호 2의 아미노산 142, 서열번호 2의 아미노산 149, 서열번호 2의 아미노산 162, 서열번호 2의 아미노산 166, 서열번호 2의 아미노산 174, 서열번호 2의 아미노산 224, 서열번호 2의 아미노산 226, 서열번호 2의 아미노산 228, 서열번호 2의 아미노산 413, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된 적어도 하나의 XTEN을 포함하는 인자 IX(FIX) 융합 단백질을 제공하며, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성(procoagulant activity)을 나타낸다.

본 발명은 또한 FIX 폴리펩타이드 및 XTEN을 포함하는 이종 모이어티를 포함하는 FIX 융합 단백질을 제공하며, 여기서 XTEN은 FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합되고, 길이가 42개 아미노산보다 더 길고 144개 아미노산보다 더 짧은 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 FIX 융합 단백질은 응고 질환 또는 병태의 예방, 치료, 개선 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 응고 질환 또는 병태를 예방, 치료, 개선 또는 관리하는 방법을 제공하는 것을 비롯한 몇몇 용도를 갖는다. 일 실시형태에서, 방법은 유효량의 본 명세서에 기술된 FIX 융합 단백질을 (예를 들어, 피하 투여에 의해서) 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 서열번호 2의 아미노산 103, 서열번호 2의 아미노산 105, 서열번호 2의 아미노산 142, 서열번호 2의 아미노산 149, 서열번호 2의 아미노산 162, 서열번호 2의 아미노산 166, 서열번호 2의 아미노산 174, 서열번호 2의 아미노산 224, 서열번호 2의 아미노산 226, 서열번호 2의 아미노산 228, 서열번호 2의 아미노산 413, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 XTEN을 삽입하고, 이에 의해서 FIX 융합 단백질을 작제하는 단계를 포함하는, FIX 폴리펩타이드의 반감기를 연장시키는 방법을 제공하며, 여기서 FIX 단백질은 응혈촉진 활성을 나타낸다.

추가 본 발명의 실시형태는 하기 설명 및 도면으로부터 자명할 것이다.

참고 문헌의 포함

본 명세서에 개시된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 및 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되었다고 제시되는 것과 동일한 정도로 참고로 포함된다.

도 1은 다양한 삽입 부위에서(예를 들어, 서열번호 2의 아미노산에 상응하는 아미노산 52, 아미노산 59, 아미노산 66, 아미노산 80, 아미노산 85, 아미노산 89, 아미노산 103, 아미노산 105, 아미노산 113, 아미노산 129, 아미노산 142, 아미노산 149, 아미노산 162, 아미노산 166, 아미노산 174, 아미노산 188, 아미노산 202, 아미노산 224, 아미노산 226, 아미노산 228, 아미노산 230, 아미노산 240, 아미노산 257, 아미노산 265, 아미노산 277, 아미노산 283, 아미노산 292, 아미노산 316, 아미노산 341, 아미노산 354, 아미노산 392, 아미노산 403, 및 아미노산 413에서) 삽입되거나 FIX 폴리펩타이드의 C-말단(C-말단)에 융합된 42개 아미노산의 XTEN(예를 들어, AE42)을 포함하는 FIX 융합 단백질의 활성을 도시한 그래프. C-말단 융합된 XTEN 서열은 FIX와 C-말단 융합부 사이에 트롬빈-절단 가능한 부위를 함유한다. Y-축은 발색 검정법에 의한 컨디셔닝된 배지 중에서의 기본 작제물(FIX-R338L)의 활성의 백분율로서의 FIX 활성을 나타낸다. X-축은 (서열번호 2에 상응하는) 아미노산 번호로서의 구체적인 삽입 부위 및 단-문자 아미노산 약어를 나타낸다. FIX의 상응하는 도메인(예를 들어, GLA, EGF1, EGF2, 링커, AP, 및 촉매 도메인), 링커 영역, 및 C-말단("C-말단")이 X-축 아래에 제시되어 있다.
도 2는 다양한 삽입 부위에서(예를 들어, 서열번호 2의 아미노산에 상응하는, 아미노산 103, 아미노산 105, 아미노산 142, 아미노산 149, 아미노산 162, 아미노산 166, 아미노산 174, 아미노산 224, 및 아미노산 413에서) 삽입되거나 FIX 폴리펩타이드의 C-말단(C-말단, 아미노산 415)에 융합된 42개 아미노산(AE42), 72개 아미노산(AE72), 144개 아미노산(AE144), 288개 아미노산(AE288), 및 864개 아미노산(AE864)의 XTEN을 포함하는 FIX 융합 단백질의 활성을 도시한 그래프. Y-축은 발색 검정법에 의한 컨디셔닝된 배지 중에서의 기본 작제물(FIX-R338L)의 활성의 백분율로서의 FIX 활성을 나타낸다. X-축은 각각의 삽입 부위의 도메인(예를 들어, EGF2, AP, 및 촉매 도메인) 또는 영역(예를 들어, 링커 및 C-말단) 및 아미노산 번호(서열번호 2에 상응함)로서의 구체적인 삽입 부위를 나타낸다. 화살표는 추가 실험을 위해서 선택된 삽입 부위를 나타낸다(도 3A 및 3B 참고).
도 3A는 R338L FIX 변이체의 영역 및 도메인의 개략도. 구체적인 아미노산 잔기(예를 들어, N105, D166, 및 E224) 및 C-말단이 잠재적인 이종 모이어티, 예를 들어, XTEN, 삽입 부위로서 강조되어 있다. 도 3B는 3개의 상이한 각도로부터의 돼지 FIX(PDB:1PFX)의 3-차원 구조의 도면. 삽입 부위 N105, D166, 및 E224, C-말단, 및 R338L 돌연변이(예를 들어, R338L FIX 변이체에서)가 표지되어 있다.
도 4는 1개 또는 2개의 XTEN(예를 들어, 42, 72, 144, 및 288개의 아미노산의 XTEN)을 포함하거나, 또는 1개의 XTEN 및 1개의 Fc 도메인, 또는 FIXFc를 포함하는 FIX 융합 단백질의 상대적인 활성의 요약. Y-축은 발색 검정법에 의한 컨디셔닝된 배지 중에서의 기본 작제물(FIX-R338L)의 활성의 백분율로서의 FIX 활성을 나타낸다. X-축은 작제물 번호를 나타내고, X-축 아래의 표는 시험된 각각의 작제물에 대한 XTEN 및 Fc의 조성을 나타낸다. EGF2(105), AP(166), 60 루프(224), 및 C-말단 XTEN 또는 Fc는 XTEN 또는 Fc가 삽입 또는 융합된 위치를 나타낸다. X-축 아래의 표의 각각의 박스에서 숫자(예를 들어, 42, 72, 144, 및 288, XTEN의 크기를 나타냄) 및 "Fc"는 어느 모이어티가 삽입되거나 FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 삽입되는지를 나타낸다.
도 5A는 혈우병-B 마우스에서의 단일 볼러스(bolus) 정맥내 투여 후에 측정된 바와 같은, rFIX 및 rFIXFc와 비교된, 다양한 길이의 트롬빈-절단 가능한 C-말단 XTEN 융합을 갖는 다양한 FIX 융합 단백질(예를 들어, FIX-CT.288(288개 아미노산의 XTEN, 예를 들어, AE288) 및 FIX-CT.864(864개 아미노산의 XTEN, 예를 들어, AE864))의 시간에 대한 투여된 FIX 응고 활성의 혈장 백분율을 도시한 그래프. 도 5B는 혈우병-B 마우스에서의 단일 볼러스 정맥내 투여 후에 측정된 바와 같은, rFIX 및 rFIXFc와 비교된, 활성화 펩타이드(AP) 도메인 내에 삽입된 다양한 길이의 XTEN 융합을 갖는 다양한 FIX 융합 단백질(예를 들어, FIX-AP.144, FIX-AP.72, 및 FIX-AP.42)의 시간에 대한 투여된 FIX 응고 활성의 혈장 백분율을 도시한 그래프. 도 5C는 도 5A 및 도 5B에 도시된 단일 정맥내 볼러스 투여된 FIX 융합 단백질의 약동학 파라미터의 계산치의 그래프 세부도. Y-축 상에는 제시된 분자 각각에 대한 혈장 활성 회수율이 제시되어 있다. X-축은 평균 체류 시간 계산치(MRT, 시간 단위)를 나타내고, 점의 면적은 투여당 곡선하 면적의 상대적 계산치(AUC/D, h/㎏/㎖ 단위)를 나타낸다.
도 6A는 혈우병-B 마우스에서의 단일 볼러스 정맥내 투여 후에 측정된 바와 같은, rFIX 및 rFIXFc와 비교된, 활성화 펩타이드(AP) 도메인 내에 삽입된 다양한 길이의 XTEN 융합을 갖는 다양한 FIX 융합 단백질(예를 들어, FIXFc-AP.72 및 FIXFc-AP.42) 또는 EGF2 도메인(예를 들어, FIXFc-EGF.42)의 시간에 대한 투여된 FIX 응고 활성의 혈장 백분율을 도시한 그래프. 도 6B는 도 6A에 도시된 단일 정맥내 볼러스 투여된 FIX 융합 단백질의 약동학 파라미터의 계산치의 그래프 세부도. Y-축 상에는 제시된 분자 각각에 대한 혈장 활성 회수율이 제시되어 있다. X-축은 평균 체류 시간 계산치(MRT, 시간 단위)를 나타낸다. 점의 면적은 투여당 곡선하 면적의 상대적 계산치(AUC/D, h/㎏/㎖ 단위)를 나타낸다.
도 7A는 혈우병-B 마우스에서의 단일 볼러스 피하 투여 후에 측정된 바와 같은, rFIX 및 rFIXFc와 비교된 FIX 폴리펩타이드의 C 말단에 융합된 288개 아미노산의 트롬빈-절단 가능한 XTEN을 포함하는 FIX 융합 단백질(rFIX-CT.288), FIX 폴리펩타이드의 AP 도메인 내에 삽입된 72개 아미노산의 XTEN을 포함하는 FIX 융합 단백질(rFIXFc-AP.72), 및 FIX 폴리펩타이드의 EGF2 도메인 내에 삽입된 42개 아미노산의 XTEN을 포함하는 FIX 융합 단백질(rFIXFc-EGF2.42)의 시간에 대한 투여된 FIX 응고 활성의 혈장 백분율을 도시한 그래프. 도 7B는 도 7A에 도시된 단일 피하 볼러스 투여된 FIX 융합 단백질의 약동학 파라미터의 계산치의 그래프 세부도. Y-축 상에는 제시된 분자 각각에 대한 생체이용률이 제시되어 있다. X-축은 평균 체류 시간 계산치(MRT, 시간 단위)를 나타낸다. 점의 면적은 투여당 곡선하 면적의 상대적 계산치(AUC/D, h/㎏/㎖ 단위)를 나타낸다.
도 8A는 인간 혈우병 B 혈액에서 rFIXFc 및 FIX의 AP 도메인 내에 삽입된 72개 아미노산의 XTEN을 포함하는 FIX 융합 단백질(예를 들어, rFIXFc-AP-XTEN.72)의 회전식 트롬보엘라스토메트리(rotational thromboelastometry: ROTEM)에 의해서 측정된 초 단위의 응고 시간의 그래프 도면. 도 8B는 인간 혈우병 B 혈액에서 rFIXFc 및 FIX 융합 단백질(예를 들어, rFIXFc-AP-XTEN.72)의 도 단위의 알파 각도의 그래프 도면. 도 8C는 인간 혈우병 B 혈액에서 rFIXFc 및 FIX 융합 단백질(예를 들어, rFIXFc-AP-XTEN.72)의 ㎜ 단위의 최대 응고 견고성(maximum clot firmness: MCF)의 그래프 도면.
도 9는 꼬리 클립 출혈 모델에서 rFIXFc와 비교된 rFIXFc-AP.72의 급성 효능을 나타낸 그래프. 제공된 결과는 제시된 바와 같은 치료 및 투여를 위한 30분에 걸친, 투여 후 5분에서의 개인의 중간 혈액 손실(㎕)이다. 별표는 비히클 대 모든 다른 치료에 대한 유의한 p 값을 나타낸다. 데이터는 rFIXFc와 비교할 때 rFIXFc-AP.72가 투여된 마우스에서 유사하거나 개선된 효능을 나타낸다.
도 10은 꼬리 정맥 횡절단 후 시간 단위의 시간(X-축)에 대해서 플로팅된 HemB 마우스 생존(Y-축)의 백분율을 나타낸 그래프. 꼬리 정맥 횡절단 전 72시간에 모든 마우스에게 제공된 IU/㎏(FIXFc-AP.72: 100IU/㎏(채워진 흑색 원), 50IU/㎏(채워진 회색 삼각형), 및 15IU/㎏(채워진 회색 역삼각형); rFIXFc: 100IU/㎏(빈 원), 50IU/㎏(빈 삼각형), 및 15IU/㎏(빈 역삼각형); 및 비히클(폐쇄된 회색 원))으로 FIXFc(점선)를 정맥내로 또는 FIXFc-AP.72를 피하로 미리 투여하였다. rFIXFc 또는 FIXFc-AP.72가 투여된 마우스에 대한 생존 플롯은 비히클 치료된 마우스와 비교할 때 모두 상당히 상이하다(p < 0.0001, 로그-랭크(만텔-콕스(Mantel-Cox)) 시험).
도 11A는 rFIX(회색) 또는 rFIXFc-AP.72 융합 단백질(흑색)의 단일 볼러스(200IU/㎏)를 사용한 정맥내 주사(점선) 또는 피하 주사(실선)에 의해서 투여된, 혈우병 B 마우스에 대해서 시간에 따라서 플로팅된 1-단계 혈장 검정법에 의해서 측정된 바와 같은 FX 활성의 혈장 수준을 나타낸 그래프. 도 11B는 포에닉스 윈논린(포에닉스 윈논린) 6.2.1 소프트웨어(파사이트(Pharsight), 서타라(Certara))를 사용한 비-구획적 분석(NCA)을 사용하여 측정된 바와 같은 약동학 파라미터.
도 12A는 rFIXFc-AP.72 단일 쇄 Fc의 도메인 구조를 도시한 개략도. 도 12B는 rFIXFc-AP.72 이중 쇄 Fc의 도메인 구조를 나타낸 개략도. "FIX HC"는 FIX의 중쇄를 지칭하고; "FIX LC"는 FIX의 경쇄를 지칭하며, 이것은 FIX의 EGF 및 GLA 도메인을 포함하고; AP는 FIX의 활성화 펩타이드를 지칭한다.
도 13은 서열 식별 번호, 설명 및 플라스미드 코드를 매칭한 실시예에서 사용된 바와 같은 FIX-XTEN 작제물을 요약한 표.

본 개시 내용은 FIX 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 이종 모이어티를 포함하는 FIX 융합 단백질 및 이의 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다. 특정 양상에서, FIX 융합 단백질은 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되거나, FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합되거나, 둘 모두인 적어도 하나의 이종 모이어티를 포함하며, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 나타낸다. 특별한 양상에서, 이종 모이어티는 XTEN이다.

I. 정의

본 개시 내용 전체에서, 단수 실체는 하나 이상의 실체를 지칭하며; 예를 들어, "폴리뉴클레오타이드"는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 단수, "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.

추가로, "및/또는"는 본원에서 사용되는 경우, 다른 특징 또는 성분과 함께 또는 그것 없이 2 개의 명시된 특징 또는 성분 각각의 구체적인 개시 내용으로서 간주된다. 따라서, 본 명세서에서 구, 예컨대, "A 및/또는 B"에서 사용된 바와 같이 용어 "및/또는"은 "A와 B", "A 또는 B", "A(단독)", 그리고 "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 구, 예컨대 "A, B, 및/또는 C"에서 시용된 바와 같이 용어 "및/또는"은 하기 양상 각각을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(및); 및 C(단독).

양상이 본 명세서에서 언어 "포함하는"으로 설명될 때는 언제나, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"과 관련하여 기술된 다른 유사한 양상이 또한 제공되는 것으로 이해된다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 개시 내용이 관련되는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; [The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 [Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 개시 내용에서 사용되는 많은 용어의 일반적인 사전을 통상의 기술자에게 제공한다.

단위, 접두사, 그리고 부호는 그들의 국제 단위계(Syst

me International de Unites: SI) 허용된 형태로 표시된다. 수치 범위는 범위를 규정하는 숫자를 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재된다. 본 명세서에서 제공된 표제는 본 개시 내용의 다양한 양상의 제한이 아니며, 이들은 전체로서 본 명세서에 참조될 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 전체적으로 본 명세서를 참조함으로써 보다 더 충분하게 정의된다.

용어 "약"은 대략, 거의, 쯤, 또는 영역 내를 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용될 때, 이것은 언급된 수치 값 위아래로 경계를 확장함으로써 그 범위를 수식한다. 일반적으로, 용어 "약"은 예를 들어, 위로 또는 아래로(더 높은 또는 더 낮은) 10 퍼센트의 차이에 의해 언급된 값 위 아래의 수치 값을 수식할 수 있다.

용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드"는 단수 핵산뿐만 아니라 복수 핵산을 포함하는 것으로 의도되고, 단리된 핵산 분자 또는 작제물, 예를 들면, 전령 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 종래의 포스포다이에스터 결합 또는 비-종래의 결합(예를 들어, 예컨대 펩타이드 핵산(PNA) 내에서 발견되는 아마이드 결합)을 포함한다. 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드 내에 존재하는 임의의 1개 이상의 핵산 분절, 예를 들어, DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 이의 네이티브 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA이도록 의도된다. 예를 들어, 벡터 내에 함유된 FIX 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 목적을 위해서 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오타이드의 추가 예는 이종 숙주 세포 내에 유지되거나 또는 용액 중에서 다른 폴리뉴클레오타이드로부터 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 발명의 폴리뉴클레오타이드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 합성적으로 생산된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대 프로모터, 증강인자, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결 신호를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "암호 영역" 또는 "암호 서열"은 아미노산으로 번역 가능한 코돈으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드의 부분이다. "종결 코돈"(TAG, TGA, 또는 TAA)은 전형적으로 아미노산으로 번역되지 않지만, 이것은 암호 영역의 부분인 것으로 간주될 수 있고, 그러나 임의의 측면 서열(flanking sequence), 예를 들어, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론 등은 암호 영역의 부분이 아니다. 암호 영역의 경계는 전형적으로 생성된 폴리펩타이드의 아미노 말단을 암호화하는 5' 말단에서의 개시 코돈, 및 생성된 폴리펩타이드의 카복실 말단을 암호화하는 3' 말단에서의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 본 발명의 2개 이상의 암호 영역이 단일 폴리뉴클레오타이드 작제물 내에, 예를 들어 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드 작제물 내에, 예를 들어, 별개의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 따라서, 단일 벡터는 단지 단일 암호 영역을 함유하거나, 또는 2개 이상의 암호 영역을 포함할 수 있다는 결론이 나오며, 예를 들면, 단일 벡터는 하기에 기술된 바와 같이 결합 도메인-A 및 결합 도메인-B를 별개로 암호화할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오타이드, 또는 핵산은 본 발명의 결합 도메인을 암호화하는 핵산에 융합되거나 융합되지 않은 이종 암호 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호 영역은 제한 없이 전문 요소 또는 모티프, 예컨대 분비성 신호 펩타이드 또는 이종 기능 도메인을 포함한다.

포유동물 세포에 의해서 분비된 특정 단백질은, 조면 소포체(rough endoplasmic reticulum)를 지나서 성장 단백질 쇄의 이출이 시작되면 성숙 단백질로부터 절단되는, 분비성 신호 펩타이드와 연관된다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 신호 펩타이드가 일반적으로 폴리펩타이드의 N-말단에 융합되고, 완전한 또는 "전장" 폴리펩타이드로부터 절단되어 폴리펩타이드의 분비된 또는 "성숙" 형태를 생산한다는 것을 인식한다. 특정 실시형태에서, 네이티브 신호 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 분비를 주도하는 능력을 보유하는 서열의 기능적 유도체는 이것과 작동가능하게 연관된다. 대안적으로, 이종 포유동물 신호 펩타이드, 예를 들어, 인간 조직 플라스미노겐 활성인자(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제 신호 펩타이드, 또는 이들의 기능적 유도체가 사용될 수 있다.

용어 "하류"는 참조 뉴클레오타이드 서열에 대해서 3'에 위치된 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 하류 뉴클레오타이드 서열은 전사의 출발점을 뒤따르는 서열에 관련된다. 예를 들어, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사의 시작 부위의 하류에 위치된다. "하류"는 또한 참조 펩타이드 서열에 대해서 C-말단에 위치된 펩타이드 서열을 지칭할 수 있다.

용어 "상류"는 참조 뉴클레오타이드 서열에 대해서 5'에 위치된 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 상류 뉴클레오타이드 서열은 전사의 암호 영역 또는 출발점의 5' 측면 상에 위치된 서열에 관련된다. 예를 들어, 대부분의 프로모터는 전사의 시작 부위의 상류에 위치된다. "상류"는 또한 참조 펩타이드 서열에 대해서 N-말단에 위치된 펩타이드 서열을 지칭할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 영역"은 암호 영역의 상류(5' 비-암호 서열), 그 내, 또는 하류(3' 비-암호 서열)에 위치된 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고, 그것은 연관된 암호 영역의 전사, RNA 처리, 안정성, 또는 번역에 영향을 준다. 조절 영역은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 처리 부위, 효과기 결합 부위 및 줄기-루프 구조를 포함할 수 있다. 암호 영역이 진핵 세포에서 발현에 의도되면, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 통상적으로 암호 서열의 3'에 위치될 것이다.

유전자 산물, 예를 들어, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 암호 영역과 작동 가능하게 연관된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소를 포함할 수 있다. 작동 가능한 연관에서 유전자 산물, 예를 들어, 폴리펩타이드에 대한 암호 영역은 유전자 산물의 발현을 조절 영역(들)의 영향 또는 제어 하에 두는 방식으로 하나 이상의 조절 영역과 연관된다. 예를 들어, 암호 영역 및 프로모터는 프로모터 기능의 유도가 암호 영역에 의해 암호화된 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 유발하면, 그리고 프로모터 및 암호 영역 사이에 링키지의 본성이 유전자 산물의 발현을 주도하는 프로모터의 능력을 간섭하지 않거나 또는 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않으면, "작동 가능하게 연관된다". 프로모터에 더하여 다른 전사 제어 요소, 예를 들어, 인핸서, 오퍼레이터, 억제인자, 및 전사 종결 신호가 또한 유전자 산물 발현을 주도하기 위해 암호영역과 작동 가능하게 연관될 수 있다.

다양한 전사 제어 영역이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이들은 제한 없이, 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대, 하지만 제한 없이, 시토메갈로바이러스(극초기 프로모터, 인트론-A와 함께), 유인원 바이러스 40(초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예컨대, 라우스 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 분절을 포함한다. 다른 전사 제어 영역은 척추동물 유전자로부터 유래된 것, 예컨대, 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈, 뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가 적합한 전사 제어 영역은 조직-특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 림포카인-유도성 프로모터(예를 들어, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도 가능한 프로모터)를 포함한다.

유사하게, 다양한 번역 제어 요소는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이들은 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 피코르나바이러스로부터 유래된 요소(특히, CITE 서열로서 또한 지칭되는 내부 리보솜 유입 부위, 또는 IRES)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.

용어 "발현"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 폴리뉴클레오타이드가 유전자 산물, 예를 들어, RNA 또는 폴리펩타이드를 생산하는 과정을 지칭한다. 이것은 제한 없이, 폴리뉴클레오타이드의 전령 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 산물로의 전사, 및 mRNA의 폴리펩타이드로의 번역을 포함한다. 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 유전자 산물은 핵산, 예를 들어, 유전자의 전사에 의해 생산된 전령 RNA, 또는 전사체로부터 번역된 폴리펩타이드일 수 있다. 본 명세서에 기술된 유전자 산물은 전사 후 변형, 예를 들어, 폴리아데닐화 또는 스플라이싱을 갖는 핵산, 또는 번역 후 변형, 예를 들어, 메틸화, 글리코실화, 지질의 첨가, 다른 단백질 소단위와의 연관, 또는 단백질분해 절단을 갖는 폴리펩타이드를 추가로 포함한다.

"벡터"는 핵산의 클로닝 및/또는 핵산의 숙주 세포 내로의 전달을 위한 임의의 비히클를 지칭한다. 벡터는 부착된 분절의 복제를 야기하도록 또 다른 핵산 분절이 부착될 수 있는 레플리콘일 수도 있다. "레플리콘"은 생체내에서 복제의 자율적인 단위로서 기능하는, 즉, 자체 제어 하에 복제할 수 있는 임의의 유전자 요소(예를 들어, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 지칭한다. 용어 "벡터"는 시험관내에서, 생체외에서, 또는 생체내에서 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 비히클 둘 모두를 포함한다. 예를 들어, 플라스미드, 변형된 진핵 바이러스, 또는 변형된 박테리아 바이러스를 비롯한 다수의 벡터가 관련 기술 분야에서 공지되어 있고, 사용된다. 폴리뉴클레오타이드의 적합한 벡터 내로의 삽입은 적절한 폴리뉴클레오타이드 단편을 상보성 결속(cohesive) 말단을 갖는 선택된 벡터 내로 결찰시킴으로써 달성될 수 있다.

벡터는 벡터를 혼입한 세포의 선택 또는 식별을 제공하는 선택 마커 또는 리포터를 암호화하도록 가공될 수 있다. 선택 마커 또는 리포터의 발현은 벡터 상에 함유된 다른 암호 영역을 혼입하고 발현시키는 숙주 세포의 식별 및/또는 선택을 허용한다. 관련 기술 분야에 공지되고 사용되는 선택 마커 유전자의 예는 다음을 포함한다: 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 히그로마이신, 네오마이신, 푸로마이신, 비알라포스 제초제, 설폰아마이드 등에 내성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉, 안토시아닌 조절 유전자, 아이소펜탄일 트랜스퍼라제 유전자, 등. 관련 기술 분야에 공지되고 사용되는 리포터의 예는 다음을 포함한다: 루시퍼라제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), -갈락토시다제(LacZ), -글루쿠로니다제(Gus) 등. 선택 마커는 리포터인 것으로 또한 간주될 수 있다.

용어 "플라스미드"는 세포의 중심 대사의 부분이 아니고, 통상적으로 환상 이중-가닥 DNA 분자의 형태인 종종 유전자를 운반하는 염색체외 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래되는 자율적으로 복제하는 서열, 유전체 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오타이드 서열, 선형, 환상, 또는 초나선의 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA일 수 있고, 여기서 다수의 뉴클레오타이드 서열은 적절한 3' 미번역 서열과 함께 선택된 유전자 산물에 대한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 작제 내에서 연결되거나 또는 재조합되어 있다.

사용될 수 있는 진핵 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터, 및 천연두바이러스, 예를 들어, 우두 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 또는 허피스바이러스 벡터를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 비-바이러스 벡터는 플라스미드, 리포솜, 전기적으로 하전된 지질(사이토펙틴), DNA-단백질 복합체, 및 바이오폴리머를 포함한다.

"클로닝 벡터"는 순차적으로 복제하는 핵산의 단위 길이이고, 복제 기원을 포함하는 "레플리콘", 예컨대, 플라스미드, 파지 또는 코스미드를 지칭하고, 여기에 부착된 분절의 복제를 야기하도록 또 다른 핵산 분절이 부착될 수 있다. 특정 클로닝 벡터는 하나의 세포 유형, 예를 들어, 박테리아에서 복제하고 또 다른 세포 유형, 예를 들어, 진핵 세포에서 발현할 수 있다. 클로닝 벡터는 전형적으로, 이러한 벡터를 포함하는 세포의 선택에 사용될 수 있는 하나 이상의 서열 및/또는 관심 핵산 서열의 삽입을 위한 하나 이상의 다수의 클로닝 부위를 포함한다.

용어 "발현 벡터"는 숙주 세포 내로의 삽입 이후에, 삽입된 핵산 서열의 발현을 가능하게 하도록 설계된 비히클을 지칭한다. 삽입된 핵산 서열은 상기에 기술된 바와 같이 조절 영역과 작동 가능한 연관 상태로 배치된다.

벡터는 관련 기술 분야에서 널리 공지된 방법, 예를 들어, 형질감염, 전기천공, 미세주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 리포펙션(리소좀 융합), 유전자 총의 사용, 또는 DNA 벡터 전달인자에 의해 숙주 세포 내로 도입된다.

"배양하다", "배양하기 위한" 및 "배양하는"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 세포 성장 또는 분열을 허용하거나 또는 세포를 살아있는 상태에서 유지시키는 시험관내 조건 하에 세포를 인큐베이션시키는 것을 의미한다. "배양된 세포"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 시험관내에서 증식된 세포를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 단수 "폴리펩타이드"뿐만 아니라 복수 "폴리펩타이드"를 포괄하는 것으로 의도되고, 아마이드 결합(펩타이드 결합으로서 또한 공지됨)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 지칭하고, 구체적인 길이의 산물을 지칭하지 않는다. 따라서, 펩타이드, 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 쇄", 또는 2개 이상 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 지칭하는데 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩타이드"는 이들 용어 대신에, 또는 이들 용어와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩타이드"는 제한 없이, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아마이드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 또는 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형을 비롯하여, 폴리펩타이드의 발현-후 변형의 산물을 지칭하는 것으로 또한 의도된다. 폴리펩타이드는 자연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 지정된 핵산 서열로부터 반드시 번역되는 것은 아니다. 이것은 화학적 합성을 비롯한 임의의 방식으로 생성될 수 있다.

"단리된" 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체는 자연 환경에 존재하지 않는 폴리펩타이드를 지칭한다. 특정 수준의 정제가 필요한 것은 아니다. 예를 들어, 단리된 폴리펩타이드는 단순히, 이의 네이티브 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합 방식으로 생산된 폴리펩타이드 및 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 분리되거나, 분별되거나, 또는 부분적으로 또는 실제적으로 정제된 네이티브 또는 재조합 폴리펩타이드와 같이, 본 발명의 목적을 위해서 위해 단리된 것으로 간주된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 재조합 핵산을 보유하거나 또는 보유할 수 있는 세포 또는 세포의 집단을 지칭한다. 숙주 세포는 원핵 세포(예를 들어, 이. 콜라이)일 수 있거나, 또는 대안적으로, 숙주 세포는 진핵생물, 예를 들어 진균 세포(예를 들어, 효모 세포, 예컨대 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae ), 피히아 파스토리스(Pichia pastoris), 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)), 및 다양한 동물 세포, 예컨대 곤충 세포(예를 들어, Sf-9) 또는 포유동물 세포(예를 들어, HEK293F, CHO, COS-7, NIH-3T3)일 수 있다.

또한 폴리펩타이드의 단편 또는 변이체, 및 이들의 임의의 조합물이 본 발명에 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드 결합 도메인 또는 결합 분자를 지칭하는 경우 용어 "단편" 또는 "변이체"는 참조 폴리펩타이드의 특성(예를 들어, FcRn 결합 도메인 또는 Fc 변이체에 대한 FcRn 결합 친화도, 또는 FIX 변이체에 대한 응고 활성) 중 적어도 일부를 보유하는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드의 단편은 본 명세서의 다른 곳에서 논의된 특이적 항체 단편에 더하여 단백질분해 단편뿐만 아니라 결손 단편을 포함하지만, 자연 발생 전장 폴리펩타이드(또는 성숙 폴 리펩타이드)를 포함하지 않는다. 본 발명의 폴리펩타이드 결합 도메인 또는 결합 분자의 변이체는 상기에 기술된 바와 같은 단편을 포함하고, 또한, 아미노산 치환, 결손, 또는 삽입으로 인해서 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 변이체는 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. 비-자연 발생 변이체는 공지된 돌연변이유발 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩타이드는 보존성 또는 비-보존성 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 특정 한 FIX 변이체는 R338L FIX(파두아(Padua)) 변이체(서열번호 2)이다(예를 들어, 본 명세서에 전문이 참고로 포함된, 문헌[Simioni, P., et al., "X-Linked Thrombophilia with a Mutant Factor IX (Factor IX Padua)", NEJM 361:1671-75 (October 2009)] 참고)

"보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지화 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 비롯한, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 관련 기술 분야에서 정의되어 있다. 따라서, 폴리펩타이드에서 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산으로 대체되면, 치환은 보존성인 것으로 고려된다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 보존성으로 대체될 수 있다.

용어 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 사이의 "서열 동일성"은 두 서열의 최적의 정렬을 위해서 도입되어야 하는 부가 또는 결손(즉, 갭)을 고려하여, 비교 윈도우 전체에서 서열에 의해서 공유된 동일한 매칭된 위치의 수를 지칭한다. 매칭된 위치는 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 표적 및 참조 서열 둘 모두에 존재한다. 표적 서열에 존재하는 갭은 카운팅되지 않는데, 그 이유는 갭은 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 아니기 때문이다. 마찬가지로, 참조 서열에 존재하는 갭은 카운팅되지 않는데, 그 이유는 참조 서열로부터의 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 아닌 표적 서열 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 카운팅되기 때문이다.

서열 동일성 백분율은 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산 염기가 두 서열에서 발생하는 위치의 수를 측정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교 창에서의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 서열의 비교 및 두 서열 간의 백분율을 서열 동일성의 측정은 온라인 사용 및 다운로드 둘 모두로 쉽게 입수 가능한 소프트웨어를 사용하여 성취될 수 있다. 적합한 소프트웨어 프로그램은 다양한 공급원으로부터 그리고 단백질 및 뉴클레오타이드 서열 둘 모두의 정렬에 대해서 입수 가능하다. 백분율 서열 동일성을 측정하기에 적합한 한 프로그램은 생명공학 정보를 위한 미국 정부의 국제 센터(U.S. government's National Center for Biotechnology Information) BLAST 웹 사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 입수 가능한 프로그램의 BLAST 묶음의 일부인 bl2seq이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘 중 하나를 사용하여 두 서열 간의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는 데 사용되는 반면, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는 데 사용된다. 다른 적합한 프로그램은 예를 들어, Needle, Stretcher, Water, 또는 Matcher, 생물정보학 프로그램의 EMBOSS 묶음의 일부 및 또한 www.ebi.ac.uk/Tools/psa의 유럽 생물정보학 연구소(European Bioinformatics Institute: EBI)로부터 입수 가능하다.

폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 참조 서열과 정렬된 단일 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 표적 서열 내의 상이한 영역은 각각 그 자신의 백분율 서열 동일성을 가질 수 있다. 백분율 서열 동일성 값은 가장 가까운 10번째 값으로 반올림됨이 주목된다. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13, 및 80.14는 80.1로 반올림되는 반면, 80.15, 80.16, 80.17, 80.18, 및 80.19는 80.2로 반올림된다. 길이 값은 항상 정수일 것임이 또한 주목된다.

관련 기술 분야의 통상의 기술자는 백분율 서열 동일성의 계산을 위한 서열 정렬의 생성이 일차 서열 데이터에 의해서 배타적으로 구동되는 이진 서열-서열 비교에 제한되지 않는다는 것을 인식할 것이다. 서열 정렬은 다중 서열 정렬로부터 유래될 수 있다. 다중 서열 정렬을 생성하기에 적합한 다른 프로그램은 www.clustal.org로부터 입수 가능한 Clustal(클러스탈)W2이다. 또 다른 적합한 프로그램은 www.drive5.com/muscle/로부터 입수 가능한 MUSCLE이다. 클러스탈W2 및 MUSCLE은 대안적으로 예를 들어, EBI로부터 입수 가능하다.

서열 정렬은 서열 데이터를 이종 소스, 예컨대 구조 데이터(예를 들어, 결정학적 단백질 구조), 기능 데이터(예를 들어, 돌연변이의 위치) 또는 계통발생 데이터로부터의 데이터와 통합함으로써 생성될 수 있음이 또한 인식될 것이다. 이종 데이터를 통합하여 다중 서열 정렬을 생성하는 적합한 프로그램은 www.tcoffee.org에서 입수 가능하고, 대안적으로는 예를 들어, EBI로부터의 T-커피(Coffee)이다. 백분율 서열 동일성을 계산하는 데 사용되는 최종 정렬은 자동 방식으로 또는 수동 방식으로 선별될 수 있음이 또한 인식될 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 인자 IX 단백질 서열에서 "에 상응하는 아미노산", "에 상응하는 부위" 또는 "동등한 아미노산"은 제1 FIX 서열과 제2 FIX　서열 사이에서 동일성 또는 유사성을 최대화하는 정렬에 의해 식별된다. 제2 FIX　서열에서 동등한 아미노산을 식별하는 데 사용되는 번호는 제1 FIX 서열에서 상응하는 아미노산을 식별하는 데 사용되는 번호를 기반으로 한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "삽입 부위"는 이종 모이어티가 삽입될 수 있는 위치의 즉시 상류인, aFIX 폴리펩타이드(전형적으로 성숙 FIX 폴리펩타이드), 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체 내의 아미노산 잔기 번호를 지칭한다. "삽입 부위"는 번호로서 특정되고, 번호는 삽입의 위치에 대한 즉시 N 말단인, 삽입 부위가 상응하는 R338L FIX(파두아) 변이체(서열번호 2) 내의 아미노산의 번호이다. 예를 들어, 구 "EGF2 도메인은 서열번호 2의 아미노산 105에 상응하는 삽입 부위에서 XTEN을 포함한다"는 이종 모이어티가 서열번호 2의 아미노산 105와 아미노산 106에 상응하는 2개의 아미노산 사이에 위치된다는 것을 나타낸다. 그러나, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 임의의 FIX 변이체에서 상응하는 위치를 쉽게 식별할 수 있을 것이고, 본 개시 내용은 R338L FIX(파두아) 변이체에서만 만들어진 삽입에 제한되지 않는다. 오히려, 본 명세서에 개시된 삽입은 R338L FIX 변이체의 위치에 상응하는 위치에서 응혈촉진 활성을 갖는 임의의 FIX 변이체 또는 단편에서 제조될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 구 "아미노산의 즉시 하류"는 아미노산의 말단 카복실 기의 바로 다음 위치를 지칭한다. 유사하게, 구 "아미노산의 즉시 상류"는 아미노산의 말단 아민 기의 바로 다음 위치를 지칭한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 구 "삽입 부위의 2개의 아미노산 사이에"는 XTEN 또는 임의의 다른 폴리펩타이드가 2개의 인접한 아미노산 사이에 삽입되는 위치를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "삽입된", "삽입된다", "내로 삽입된" 또는 문법적으로 관련된 용어는 R338L FIX(파두아) 변이체(서열번호 2) 내의 유사한 위치에 비교된 융합 폴리펩타이드 내의 XTEN의 위치를 지칭한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 다른 FIX 폴리펩타이드 서열, 예컨대 서열번호 1로서 제시된 것과 관련하여 상응하는 삽입 위치를 식별하는 방법을 이해할 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 이들 용어는 R338L FIX(파두아) 변이체와 비교되는 재조합 FIX 폴리펩타이드의 특징을 지칭하고, 융합 폴리펩타이드가 만들어진 임의의 방법 또는 과정을 지시하거나, 암시하거나 또는 의미하지 않는다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 융합 폴리펩타이드와 관련하여, 구 "XTEN이 FIX 폴리펩타이드의 잔기 105의 즉시 하류에서 EGF2 도메인 내에 삽입된다"는 융합 폴리펩타이드가 예를 들어, R338L FIX 변이체의 아미노산 105 및 106에 상응하는 아미노산에 의해서 결합된, R338L FIX 변이체(서열번호 2) 내의 아미노산 105에 상응하는 아미노산의 즉시 하류에 XTEN을 포함한다는 것을 의미한다.

"융합" 또는 "키메릭" 단백질은 자연에서 자연적으로 연결되지 않는 제2 아미노산 서열에 연결된 제1 아미노산 서열을 포함한다. 별개의 단백질 내에 정상적으로 존재하는 아미노산 서열이 융합 폴리펩타이드 내에서 합쳐질 수 있거나, 또는 동일한 단백질 내에 정상적으로 존재하는 아미노산 서열이 융합 폴리펩타이드, 예를 들어, 본 발명의 FIX 도메인과 Ig Fc 도메인의 융합부 내에서 새로운 배열로 배치될 수 있다. 융합 단백질은 예를 들어, 화학적 합성에 의해서, 또는 펩타이드 영역이 목적하는 관계로 암호화되는 폴리뉴클레오타이드를 생성하고 번역함으로써 생성된다. 융합 단백질은 공유, 비-펩타이드 결합 또는 비-공유 결합에 의해서 제1 아미노산 서열과 연관된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.

용어 "이종" 및 "이종 모이어티"는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 또는 다른 모이어티가 그것과 비교되는 실체의 것과 상이한 실체로부터 유래되는 것을 의미한다. 예를 들어, 이종 폴리펩타이드는 합성된 것일 수 있거나, 상이한 종, 개체의 상이한 세포 유형, 또는 다른 개체의 동일하거나 상이한 세포 유형일 수 있다. 일 양상에서, 이종 모이어티는 융합 폴리펩타이드 또는 단백질을 생산하기 위한 또 다른 폴리펩타이드에 융합된 폴리펩타이드이다. 또 다른 양상에서, 이종 모이어티는 비-폴리펩타이드, 예컨대 폴리펩타이드 또는 단백질에 접합된 PEG이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "반감기"는 생체내에서 특정 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 지칭한다. 반감기는 대상체에 투여된 양의 절반이 동물 내에서 순환 및/또는 다른 조직으로부터 소실되는데 필요한 시간에 의해 표현될 수 있다. 주어진 폴리펩타이드의 소실(clearance) 곡선이 시간의 함수로서 구축될 때, 곡선은 통상적으로 급속한 α-상 및 더욱 긴 β-상을 갖는 이상(biphasic)이다. α-상은 전형적으로 혈관내 및 혈관외 공간 사이에 투여된 폴리 펩타이드의 평형화를 나타내고, 부분적으로, 폴리펩타이드의 크기에 의해 결정된다. β-상은 전형적으로 혈관내 공간에서 폴리펩타이드의 이화작용(catabolism)을 나타낸다. 일부 실시형태에서, FIX 및 FIX를 포함하는 융합 단백질은 단상이고, 따라서 알파 상을 갖지 않고, 단지 단일 베타 상을 갖는다. 따라서, 특정 실시형태에서, 용어 반감기는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 β-상에서 폴리펩타이드의 반감기를 지칭한다. 인간에서 인간 항체의 전형적인 β-상 반감기는 21일이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "연결된"은 각각, 제2 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 공유 또는 비공유 결합된 제1 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 제1 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열이 제2 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열에 직접적으로 결합되거나 또는 병치될 수 있거나, 또는 대안으로, 개재 서열이 제1 서열을 제2 서열에 공유적 결합할 수 있다. 용어 "연결된"은 C-말단 또는 N-말단에서 제2 아미노산 서열에 대한 제1 아미노산 서열의 융합을 의미할 뿐만 아니라 제2 아미노산 서열(또는 제1 아미노산 서열, 각각) 내의 임의의 2개의 아미노산 내로의 전체 제1 아미노산 서열(또는 제2 아미노산 서열)의 삽입을 포함한다. 일 실시형태에서, 제1 아미노산 서열은 펩타이드 결합 또는 링커에 의해 제2 아미노산 서열에 연결될 수 있다. 제1 뉴클레오타이드 서열은 포스포다이에스터 결합 또는 링커에 의해 제2 뉴클레오타이드 서열에 연결될 수 있다. 링커는 펩타이드 또는 폴리펩타이드(폴리펩타이드 사슬의 경우) 또는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쇄(뉴클레오타이드 쇄의 경우) 또는 임의의 화학적 모이어티(폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 쇄 둘 모두의 경우)일 수 있다. 용어 "연결된"은 또한, 하이픈(-)에 의해 지시된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "와 연관된"은 제1 아미노산 쇄 및 제2 아미노산 쇄 사이에 형성된 공유 또는 비공유 결합을 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "와 연관된"은 공유, 비-펩타이드 결합 또는 비-공유 결합을 의미한다. 이러한 연관은 콜론, 즉, (:)에 의해 지시될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 이것은 펩타이드 결합을 제외한 공유 결합을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 시스테인은 제2 시스테인 잔기 상에서 싸이올기와 다이설파이드 결합 또는 가교를 형성할 수 있는 싸이올기를 포함한다. 대부분의 자연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 다이설파이드 결합에 의해 연관되고, 2개의 중쇄는 카바트 넘버링 시스템을 사용하여 239 및 242에 상응하는 위치(위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템)에서 2개의 다이설파이드 결합에 의해 연관된다. 공유 결합의 예는 펩타이드 결합, 금속 결합, 수소 결합, 다이설파이드 결합, 시그마 결합, 파이 결합, 델타 결합, 글리코시드 결합, 애그노스틱 결합(agnostic bond), 굽은 결합, 배위 결합, 파이 골격, 이중 결합, 삼중 결합, 사중 결합, 오중 결합, 육중 결합, 접합, 과접합, 방향성(aromaticity), 햅티시티(hapticity), 또는 항결합을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 비-공유 결합의 비-제한적인 예는 이온 결합(예를 들어, 양이온-파이 결합 또는 염 결합), 금속 결합, 수소 결합(예를 들어, 이수소 결합, 이수소 복합체, 낮은-장벽 수소 결합, 또는 대칭적 수소 결합), 반 데르 발스 힘, 런던 분산력, 기계적 결합, 할로겐 결합, 아우로필리시티(aurophilicity), 개재, 스태킹, 엔트로피 힘, 또는 화학적 극성을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "절단 부위" 또는 "효소 절단 부위"는 효소에 의해서 인식되는 부위를 지칭한다. 특정 효소 절단 부위는 세포내 처리 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 이러한 부위의 절단이 혈병 형성의 부위에서 발생하도록, 응고 캐스케이드 동안 활성화되는 효소에 의해 절단된 효소 절단 부위를 갖는다. 예시적인 이러한 부위는 예를 들어, 트롬빈, 인자 XIa 또는 인자 Xa에 의해 인식된 것들을 포함한다. 예시적인 FXIa 절단 부위는 예를 들어, TQSFNDFTR(서열번호 166) 및 SVSQTSKLTR(서열번호 167)을 포함한다. 예시적인 트롬빈 절단 부위는 예를 들어, DFLAEGGGVR(서열번호 168), TTKIKPR(서열번호 169), LVPRG(서열번호 170) 및 ALRPR(서열번호 171)를 포함한다. 다른 효소 절단 부위는 관련 기술 분야에 공지되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "처리 부위" 또는 "세포내 처리 부위"는 폴리펩타이드의 번역 후에 기능하는 효소에 대한 표적인 폴리펩타이드 내의 효소 절단 부위의 유형을 지칭한다. 일 실시형태에서, 이러한 효소는 골지 내강(Golgi lumen)으로부터 트랜스-골지 구획으로의 수송 동안 기능한다. 세포내 처리 효소는 세포로부터의 단백질의 분비 이전에 폴리펩타이드를 절단한다. 이러한 처리 부위의 예는 예를 들어, 엔도펩티다제의 PACE/퓨린(여기서 PACE는 쌍을 이룬 염기성 아미노산 절단 효소에 대한 약어임) 패밀리에 의해 표적화된 것을 포함한다. 이들 효소는 골지막에 국지화되고, 서열 모티프 Arg-[임의의 잔기]-(Lys 또는 Arg)-Arg의 카복시말단 측면 상에서 단백질을 절단한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 효소의 "퓨린" 패밀리는 예를 들어, PCSK1(PC1/Pc3이라고도 공지됨), PCSK2(PC2라고도 공지됨), PCSK3(퓨린 또는 PACE라고도 공지됨), PCSK4(PC4라고도 공지됨), PCSK5(PC5 또는 PC6이라고도 공지됨), PCSK6(PACE4라고도 공지됨), 또는 PCSK7(PC7/LPC, PC8, 또는 SPC7이라고도 공지됨)을 포함한다. 다른 처리 부위는 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 본 명세서에서 지칭된 용어 "처리 가능한 링커"는 본 명세서에서 세포내 처리 부위를 포함하는 링커를 의미한다.

하나를 초과하는 처리 또는 절단 부위를 포함하는 작제물에서, 이러한 부위는 동일하거나 상이할 수 있음이 이해될 것이다.

"처리 가능한 링커"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 본 명세서의 다른 곳에서 기술된, 적어도 하나의 세포내 처리 부위를 포함하는 링커를 지칭한다.

"기준선"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 투여 전에 대상체에서 측정된 최저 혈장 FIX 수준이다. FIX 혈장 수준은 투여 전 두 시간 지점: 스크리닝 방문 시에 그리고 투여 직전에 측정될 수 있다. 대안적으로, (a) 예비치료 FIX 활성이 1% 미만이고, 검출 가능한 FIX 항원을 갖지 않고, 넌센스(nonsense) 유전형을 갖는 대상체에서의 기준선은 0%로서 정의될 수 있고, (b) 예비치료 FIX 활성이 1% 미만이고, 검출 가능한 FIX 항원을 갖는 대상체에 대한 기준선은 0.5%로 설정될 수 있고, (c) 예비치료 FIX 활성이 1 내지 2%인 대상체에 대한 기준선은 C최소(PK 연구 전체에서의 최저 활성)이고, (d) 예비치료 FIX 활성이 2% 이상인 대상체에 대한 기준선은 2%로 설정될 수 있다.

"대상체"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 인간을 의미한다. 대상체는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 제어되지 않는 출혈 에피소드의 적어도 하나의 사건을 갖는다고 알려지거나, 제어되지 않는 출혈 에피소드와 연관된 질환 또는 장애, 예를 들어 혈우병 B를 갖는 것으로 진단되거나, 제어되지 않는 출혈 에피소드, 예를 들어 혈우병에 민감하거나, 또는 이들의 임의의 조합인 개인을 포함한다. 대상체는 또한 특정 활동, 예를 들어, 수술, 운동 활동, 또는 임의의 격렬한 활동 전에 하나 이상의 제어되지 않는 출혈 에피소드의 위험이 있는 개인을 포함할 수 있다. 대상체는 1% 미만, 0.5% 미만, 2% 미만, 2.5% 미만, 3% 미만, 또는 4% 미만의 기준선 FIX 활성을 가질 수 있다. 대상체는 또한 소아 인간을 포함한다. 소아 인간 대상체는 출생 20년, 바람직하게는 출생 18년, 출생 16년, 출생 15년, 출생 12년, 출생 11년, 출생 6년, 출생 5년, 출생 2년, 2살 내지 11살이다.

치료하다, 치료하는, 치료는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 예를 들어, 질환 또는 병태의 심각도 감소; 질환 과정의 기간의 감소; 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상의 개선; 질환 또는 병태를 반드시 치료할 필요 없이, 질환 또는 병태를 앓는 대상체에 이로운 한 효과의 제공, 또는 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상의 예방을 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 본 발명의 융합 단백질을 투여함으로써 대상체에서 FIX 트로프(trough) 수준을 적어도 약 1IU/㎗, 2IU/㎗, 3IU/㎗, 4IU/㎗, 5IU/㎗, 6IU/㎗, 7IU/㎗, 8IU/㎗, 9IU/㎗, 10IU/㎗, 11IU/㎗, 12IU/㎗, 13IU/㎗, 14IU/㎗, 15IU/㎗, 16IU/㎗, 17IU/㎗, 18IU/㎗, 19IU/㎗, 또는 20IU/㎗로 유지시키는 것을 의미한다. 또 다른 실시형태에서, 치료하는 또는 치료는 FIX 트로프 수준을 약 1 내지 약 20IU/㎗, 약 2 내지 약 20IU/㎗, 약 3 내지 약 20IU/㎗, 약 4 내지 약 20IU/㎗, 약 5 내지 약 20IU/㎗, 약 6 내지 약 20IU/㎗, 약 7 내지 약 20IU/㎗, 약 8 내지 약 20IU/㎗, 약 9 내지 약 20IU/㎗, 또는 약 10 내지 약 20IU/㎗로 유지시키는 것을 의미한다. 질환 또는 병태의 치료 또는 치료하는은 또한 대상체에서 FIX 활성을 비-혈우병 대상체에서의 FIX 활성의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%에 대등한 수준으로 유지시키는 것을 포함한다. 치료에 필요한 최소 트로프 수준은 하나 이상의 공지된 방법에 의해서 측정될 수 있고, 각각의 사람에 대해서 조정(증가 또는 감소)될 수 있다.

지혈 장애는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 자발적으로 또는 외상의 결과로서, 섬유소 혈병을 형성하는 능력 손상 또는 능력 없음으로 인한 대출혈(hemorrhage)의 경향성을 특징으로 하는 유전적으로 유전된 또는 후천성 병태를 의미한다. 이러한 장애의 예는 혈우병을 포함한다. 3가지 주요 형태는 A형 혈우병(인자 VIII 결핍), B형 혈우병(인자 IX 결핍 또는 "크리스마스병") 및 C형 혈우병(인자 XI 결핍, 경미한 출혈 경향)이다. 다른 지혈 장애는 예를 들어, 폰 빌레브란트병(Von Willebrand disease), 인자 XI 결핍(PTA 결핍), 인자 XII 결핍, 피브리노겐, 프로트롬빈, 인자 V, 인자 VII, 인자 X 또는 인자 XIII에서의 결핍 또는 구조적 비정상, GPIb에서의 결함 또는 결핍인 베르나르 술리에 증후군(Bernard-Soulier syndrome)을 포함한다. VWF에 대한 수용체인 GPIb는 결함성이고 1차 혈병 형성(1차 지혈)의 결여 및 증가된 출혈 경향성, 및 글란즈만 네겔리 혈소판무력증(thrombasthenia of Glanzman and Naegeli)(글란츠만 혈소판기능저하증(Glanzmann thrombasthenia)))을 야기할 수 있다. 간부전(급성 형태 및 만성 형태)에서, 간에 의한 응고 인자의 생산이 불충분하고; 이것은 출혈 위험을 증가시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "급성 출혈"은 근원적인 원인에 상관없이 출혈 에피소드를 지칭한다. 예를 들어, 대상체는 외상, 요독증, 유전성 출혈 장애(예를 들어, 인자 VII 결핍), 혈소판 장애, 또는 응고 인자에 대한 항체의 발생으로 인한 내성을 가질 수 있다.

II. FIX 융합 단백질

본 발명은 FIX 폴리펩타이드 및 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되거나, FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합되거나, 또는 둘 모두인 적어도 하나의 이종 모이어티를 포함하는 FIX 융합 단백질에 관한 것이다. FIX 융합 단백질은, 이종 모이어티의 삽입 또는 이것에 대한 융합 이후에 하나 이상의 FIX 활성을 보유할 수 있다. 일 실시형태에서, FIX 활성은 응혈촉진 활성이다. 용어 "응혈촉진 활성"은 네이티브 FIX를 대체하여, 혈액에서 응고 캐스케이드에 참여하는 본 발명의 FIX 단백질의 능력을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 FIX 단백질은, 그것이 예를 들어, 발색 검정법으로 시험되는 경우, 인자 VIII(FVIII)의 존재 하에서 인자 X(FX)을 활성화된 인자 X(FXa)로 전환시킬 수 있을 때 응혈촉진 활성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, FIX 활성은 테나제 복합체를 생성하는 능력이다. 다른 실시형태에서, FIX 활성은 트롬빈(또는 혈병)을 생성하는 능력이다.

본 발명의 재조합 FIX 단백질은 네이티브 성숙 인간 FIX의 응혈촉진 활성의 100%를 나타낼 필요가 없다. 사실, 특정 양상에서, 본 발명의 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된 이종 모이어티는 단백질의 반감기 또는 안정성을 상당히 증가시킬 수 있어서, 더 낮은 활성이 완전하게 허용 가능하다. 따라서, 특정 양상에서, 본 발명의 FIX 융합 단백질은 네이티브 FIX의 응혈촉진 활성의 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 100%를 갖는다. 그러나, 일부 본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 재조합 FIX 단백질은 FIX 파두아 R338L 고활성 변이체를 함유하는 단백질에 대한 네이티브 FIX 활성의 100%초과, 그 활성의 적어도 약 105%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200% 또는 그 초과를 가질 수 있다.

용혈촉진 활성은 임의의 적합한 시험관내 또는 생체내 검정법에 의해서 측정될 수 있다. FIX의 활성은 혈병의 생성의 모니터링(응고 검정법)에 의해서 응집 캐스케이드의 하류에서 또는 FVIII-FIX 복합체에 의한 활성화 후 FX의 효소 활성의 직접 측정(발색 검정법)에 의해서 상류에서 측정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Barrowcliffe et al., Semin . Thromb . Haemost. 28: 247-56 (2002)]; [Lee et al., Thromb . Haemost. 82: 1644-47 (1999)]; [Lippi et al., Clin . Chem . Lab. Med. 45: 2-12 (2007)]; [Matsumoto et al., J. Thromb . Haemost. 4: 377-84 (2006)] 참고). 따라서, 응혈촉진 활성은 발색 기질 검정법, 응고 검정법(예를 들어, 1단계 또는 2단계 응고 검정법), 또는 둘 모두를 사용하여 측정될 수 있다. 발색 검정법 기전은 혈액 응집 캐스케이드의 원칙을 기초로 하며, 여기서 활성화된 FIX는 FVIII, 인지질 및 칼슘 이온의 존재 하에서 FX를 FX_a로 전환시킨다. FX_a 활성은 FX_a에 특이적인 p-나이트로아닐리드(pNA) 기질의 가수분해에 의해서 평가된다. 405nM에서 측정된 p-나이트로아닐란의 초기 방출 속도는 FX_a 활성에 정비례하고, 따라서 샘플에서 FIX 활성에 정비례한다. 발색 검정법은 국제 혈전 및 지혈 학회의 과학 및 표준화 위원회(Scientific and Standardization Committee(SSC) of the International Society on Thrombosis and Hemostasis(ISTH))의 인자 VIII 및 인자 IX 소위원회에 의해서 제안된다.

응혈촉진 활성을 측정하기에 유용한 다른 적합한 검정법은 예를 들어, 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2010/0022445호(쉐이플린저(Scheiflinger) 및 독칼(Dockal)에 개시된 것을 포함한다.

특정 양상에서 본 발명의 재조합 FIX 단백질의 응혈촉진 활성은 네이티브 성숙 FIX에 대등하고, 특정 양상에서 그것은 국제 표준에 대등하다.

하기에 보다 상세히 기술된 바와 같이, 적어도 하나의 이종 모이어티는 임의의 이종 모이어티를 포함할 수 있거나, 또는 FIX 단백질에게 개선된 특성을 제공할 수 있는 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 일 양상에서, 본 발명에 유용한 이종 모이어티는 FIX 단백질의 반감기를 연장시킬 수 있는 모이어티 또는 FIX 단백질의 안정성을 개선시킬 수 있는 모이어티일 수 있다. 본 발명의 FIX 융합 단백질은 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되거나 그것에 융합된 하나 초과의 이종 모이어티를 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 하나 초과의 이종 모이어티는 동일하다. 또 다른 실시형태에서, 하나 초과의 이종 모이어티는 상이하다. 다른 실시형태에서, 이종 모이어티는 XTEN, 알부민, 알부민 결합 펩타이드, 알부민 소 결합 분자, Fc 도메인, FcRn 결합 파트너, PAS, CTP, PEG, HES, PSA, 또는 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티는 도메인들 사이가 아니라 FIX 폴리펩타이드의 도메인 내에 삽입된다. FIX 폴리펩타이드는 다수의 도메인, 예를 들어, γ-카복시글루탐산(GLA) 도메인, 표피 성장 인자-유사 1(EGF1) 도메인, 표피 성장 인자-유사 2(EGF2) 도메인, 활성화 펩타이드(AP) 도메인, EGF2 도메인과 AP 도메인 사이의 링커, 및 촉매 도메인(예를 들어, 세린 프로테아제 도메인)을 포함한다. FIX 지모겐은 461개의 아미노산을 포함하는데: 아미노산 1 내지 28(서열번호 3에 상응함)은 신호 펩타이드이고; 아미노산 29 내지 46(서열번호 3에 상응함)은 프로펩타이드이고; 그 다음 415개의 아미노산은 FIX 단백질 서열이다. 이러한 415개의 처리된 FIX는 아미노산 1 내지 145(서열번호 1 또는 서열번호 2에 상응함)를 포함하고, FIX 경쇄이고; 아미노산 146 내지 180은 활성화 펩타이드이고; 아미노산 181 내지 415(서열번호 1 또는 서열번호 2에 상응함)는 촉매 FIX 중쇄이다. 경쇄 및 중쇄 내에서, GLA 도메인은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 1 내지 46에 상응하고; EGF1 도메인은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 47 내지 84에 상응하고; EGF2 도메인은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 85 내지 127에 상응하고; EGF2 도메인과 AP 도메인 사이의 링커는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 128 내지 145에 상응하고; AP 도메인은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 146 내지 180에 상응하고; 촉매 도메인은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 181 내지 415에 상응한다.

특정 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티는 FIX 폴리펩타이드의 하나 이상의 도메인 내에 삽입된다. 예를 들어, 적어도 하나의 이종 모이어티, 예를 들어, XTEN은 GLA 도메인, EGF1 도메인, EGF2 도메인, AP 도메인, EGF2 도메인과 AP 도메인 사이의 링커, 촉매 도메인, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 도메인 내에 삽입될 수 있다. 특별한 일 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티, 예를 들어, XTEN은 GLA 도메인, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 1 내지 46 내에 삽입된다. 특별한 일 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티, 예를 들어, XTEN은 EGF1 도메인, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 47 내지 83 내에 삽입된다. 특별한 일 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티, 예를 들어, XTEN은 EGF2 도메인, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 84 내지 125 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티, 예를 들어, XTEN은 EGF2 도메인과 AP 도메인 사이의 링커, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 132 내지 145 내에 삽입된다. 특별한 일 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티, 예를 들어, XTEN은 AP 도메인, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 146 내지 180 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티, 예를 들어, XTEN은 촉매 도메인, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 181 내지 415 내에 삽입된다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 이종 모이어티가 다양한 삽입 부위 내에 삽입될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 부위 중 하나 이상에서 적어도 하나의 이종 모이어티, 예를 들어, XTEN의 삽입은 FIX 활성의 손실을 유발하지 않고/않거나 FIX 단백질의 개선된 특성을 유도한다. 예를 들어, 적어도 하나의 이종 모이어티는 서열번호 2의 아미노산 103(즉, 서열번호 2의 아미노산 103에 상응하는 아미노산의 즉시 하류), 서열번호 2의 아미노산 105(즉, 서열번호 2의 아미노산 105에 상응하는 아미노산의 즉시 하류), 서열번호 2의 아미노산 142(즉, 서열번호 2의 아미노산 142에 상응하는 아미노산의 즉시 하류), 서열번호 2의 아미노산 149(즉, 서열번호 2의 아미노산 149에 상응하는 아미노산의 즉시 하류), 서열번호 2의 아미노산 162(즉, 서열번호 2의 아미노산 162에 상응하는 아미노산의 즉시 하류), 서열번호 2의 아미노산 166(즉, 서열번호 2의 아미노산 166에 상응하는 아미노산의 즉시 하류), 서열번호 2의 아미노산 174(즉, 서열번호 2의 아미노산 174에 상응하는 아미노산의 즉시 하류), 서열번호 2의 아미노산 224(즉, 서열번호 2의 아미노산 224에 상응하는 아미노산의 즉시 하류), 서열번호 2의 아미노산 226 (즉, 서열번호 2의 아미노산 226에 상응하는 아미노산의 즉시 하류), 서열번호 2의 아미노산 228(즉, 서열번호 2의 아미노산 228에 상응하는 아미노산의 즉시 하류), 서열번호 2의 아미노산 413(즉, 서열번호 2의 아미노산 413에 상응하는 아미노산의 즉시 하류) 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입될 수 있고, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 나타낸다.

일 실시형태에서, 이종 모이어티, 예를 들어, XTEN은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 149, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 162, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 166, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 174 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된다. 일 실시형태에서, 이종 모이어티, 예를 들어, XTEN은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 224, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 226, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 228, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 413 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된다. 다른 실시형태에서, 이종 모이어티, 예를 들어, XTEN은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 103, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 105, 및 들 모두로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된다. 또 다른 실시형태에서, 이종 모이어티, 예를 들어, XTEN은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 142에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된다.

하기에 보다 상세하게 논의된 바와 같이, 이종 모이어티는 다양한 길이를 가질 수 있는 XTEN일 수 있다. 예를 들어, XTEN은 적어도 약 42개의 아미노산, 적어도 약 72개의 아미노산, 적어도 약 144개의 아미노산, 적어도 약 288개의 아미노산, 또는 적어도 약 864개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, XTEN은 AE42, AG42, AE72, AG72, AE144, AG144, AE288, AG288, AE864, 및 AG864로 이루어진 군으로부터 선택된다. FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되거나 그것에 융합될 수 있는 XTEN의 비제한적인 예는 본 명세서 다른 곳에 포함된다.

일부 실시형태에서, 42개의 아미노산을 포함하는 XTEN, 예를 들어, AE42 또는 AG42는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 103, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 105, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 142, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 149, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 162, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 166, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 174, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 224, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 226, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 228, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 413, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되고, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 72개의 아미노산을 포함하는 XTEN, 예를 들어, AE72 또는 AG72는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 149, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 162, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 166, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 174, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 224, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 226, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 228, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 413 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되거나, XTEN은 C-말단에 융합되고, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 144개의 아미노산을 포함하는 XTEN, 예를 들어, AE144 또는 AG144는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 149, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 162, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 166, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 174, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 224, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 226, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 228, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 413 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되고, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 288개의 아미노산을 포함하는 XTEN, 예를 들어, AE288 또는 AG288은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 149, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 162, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 166, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 174, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 224, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 226, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 228, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 413 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되고, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 나타낸다.

또 다른 실시형태에서, 864개의 아미노산을 포함하는 XTEN, 예를 들어, AE864 또는 AG8648은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 149, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 162, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 166, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 174, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 224, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 224, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 226, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 228, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 413 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되고, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 나타낸다.

본 발명의 FIX 융합 단백질은 제2 이종 모이어티, 예를 들어, FIX 내에 삽입되거나, FIX의 C-말단에 융합되거나, 또는 둘 다인 제2 XTEN을 추가로 포함할 수 있다. 제2 이종 모이어티는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 103, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 105, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 142, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 149, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 162, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 166, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 174, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 224, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 226, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 228, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 413, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입될 수 있거나, 여기서 제2 XTEN은 FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제1 XTEN 및 제2 XTEN은 각각 서열번호 1 또는 2의 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되고/되거나 서열번호 1 또는 2의 아미노산 105 및 서열번호 1 또는 2의 아미노산 166; 서열번호 1 또는 2의 아미노산 105 및 서열번호 1 또는 2의 아미노산 224; 서열번호 1 또는 2의 아미노산 105 및 C-말단에 융합된 것; 서열번호 1 또는 2의 아미노산 166 및 서열번호 1 또는 2의 아미노산 224; 서열번호 1 또는 2의 아미노산 166 및 C-말단에 융합된 것; 및 서열번호 1 또는 2의 아미노산 224 및 C-말단에 융합된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합된다. 일 실시형태에서, 제1 XTEN은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 166에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되고, 제2 XTEN은 FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합된다.

제2 XTEN은 적어도 약 6개의 아미노산, 적어도 약 12개의 아미노산, 적어도 약 36개의 아미노산, 적어도 약 42개의 아미노산, 적어도 약 72개의 아미노산, 적어도 약 144개의 아미노산, 또는 적어도 약 288개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 XTEN은 6개의 아미노산, 12개의 아미노산, 36개의 아미노산, 42개의 아미노산, 72개의 아미노산, 144개의 아미노산, 또는 288개의 아미노산을 포함한다. 제2 XTEN은 AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, AG144, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특별한 일 실시형태에서, 제2 XTEN은 AE72 또는 AE144이다.

특별한 일 실시형태에서, 제2 XTEN은 서열번호 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 제3, 제4, 제5 및/또는 제6 XTEN을 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 신호 펩타이드 및 프로펩타이드 서열이 없는 서열번호 54 내지 서열번호 153으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 신호 펩타이드 및 프로펩타이드 서열이 없는 서열번호 54 내지 서열번호 153으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 신호 펩타이드 및 프로펩타이드 서열이 없는 서열번호 119, 120, 121, 및 123으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 신호 펩타이드 및 프로펩타이드 서열이 없는 서열번호 119, 120, 123, 121 및 226 또는 122로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 신호 펩타이드 및 프로펩타이드 서열이 없는 FIX-AP.72, FIX-AP.144, FIX-CT.72, FIX-CT.144, FIX-AP.288, 및 FIX-CT.288로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 2개의 상이한 유형의 이종 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 FIX 폴리펩타이드, XTEN, 및 Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너) 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, XTEN은 FIX 내에 삽입되고, Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너) 또는 이의 단편은 FIX의 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, XTEN은 표 3에 열거된 삽입 부위로부터 선택된 하나 이상의 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된다. 일 실시형태에서, XTEN은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 103, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 105, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 142, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 149, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 162, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 166, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 174, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 224, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 226, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 228, 및 서열번호 1 또는 2의 아미노산 413으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되고; Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너) 또는 이의 단편은 FIX의 C-말단에 융합된다. 특정 실시형태에서, XTEN은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 105, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 166, 및 서열번호 1 또는 2의 아미노산 224로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되고; Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너) 또는 이의 단편은 FIX의 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, XTEN은 AE42, AE72, 및 AE144로부터 선택된다.

본 발명의 특정 양상에서, FIX 융합 단백질은 1개 또는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 일 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드 쇄는 Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너)에 융합된 FIX 폴리펩타이드를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 쇄는 제2 Fc 도메인을 포함하고, 여기서 제1 Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너) 및 제2 Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너)는 공유 결합에 의해서 연관된다.

또 다른 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 FIX 폴리펩타이드 및 Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너)을 포함하는 단일 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 특별한 일 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 FIX 폴리펩타이드와 Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너)을 연결하는 링커를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 FIX 폴리펩타이드, Fc 도메인, 및 제2 Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너)을 포함한다. 특별한 일 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너)과 제2 Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너)을 연결하는 링커를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 FIX 폴리펩타이드, Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너), 및 제2 Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너)을 포함하고, 여기서 FIX 폴리펩타이드는 링커에 의해서 Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너)에 연결된다. 또 다른 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 FIX 폴리펩타이드, Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너), 및 제2 Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너)를 포함하고, 여기서 FIX 폴리펩타이드는 제1 링커에 의해서 Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너)에 연결되고, 여기서 Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너)은 링커에 의해서 제2 Fc 도메인(또는 FcRn 결합 파트너)에 연결된다. 특정 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식을 포함하고:

(i) FIX(X)-F1;

(ii) FIX(X)-L1-F1;

(iii) FIX(X)-F1-F2;

(iv) FIX(X)-L1-F1-F2;

(v) FIX(X)-L1-F1-L2-F2;

(vi) FIX(X)-F1-L1-F2;

(vii) FIX(X)-F1:F2;

(viii FIX(X)-L1-F1:F2; 및

(ix) 이들의 임의의 조합,

여기서 FIX(X)는 본 명세서에 기술된 XTEN이 삽입된 하나 이상의 삽입 부위를 갖는 FIX 폴리펩타이드이고; L1 및 L2 각각은 링커이고; F1은 Fc 도메인 또는 FcRn 결합 파트너이고; F2는 제2 Fc 도메인 또는 제2 FcRn 결합 파트너이고, (-)는 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산이고; (:)는 공유 결합, 예를 들어, 다이설파이드 결합이다.

링커(L1 및 L2)는 동일하거나 상이할 수 있다. 링커는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않을 수 있고, 링커는 하나 이상의 세포내 처리 부위를 포함할 수 있다. 링커의 비제한적인 예는 본 명세서 다른 부분에 기술되어 있다. 링커 중 임의의 것을 사용하여 FIX를 이종 모이어티(예를 들어, XTEN 또는 Fc)와 조합할 수 있거나 제1 이종 모이어티(예를 들어, 제1 Fc)를 제2 이종 모이어티(예를 들어, 제2 Fc)와 조합할 수 있다.

특정 실시형태에서, 링커는 트롬빈 절단 부위를 포함한다. 특별한 일 실시형태에서, 트롬빈 절단 부위는 XVPR을 포함하고, 여기서 X는 임의의 지방족 아미노산(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 아이소류신)이다. 특별한 일 실시형태에서, 트롬빈 절단 부위는 LVPR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 SFLLRN(서열번호 190)을 포함하는, PAR1 엑소사이트(exosite) 상호작용 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, PAR1 엑소사이트 상호작용 모티프는 P, PN, PND, PNDK(서열번호 191), PNDKY(서열번호 192), PNDKYE(서열번호 193), PNDKYEP(서열번호 194), PNDKYEPF(서열번호 195), PNDKYEPFW(서열번호 196), PNDKYEPFWE(서열번호 197), PNDKYEPFWED(서열번호 198), PNDKYEPFWEDE(서열번호 199), PNDKYEPFWEDEE(서열번호 200), PNDKYEPFWEDEES(서열번호 201), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서 링커는 FXIa 절단 부위 LDPR을 포함한다.

특별한 일 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 FIX 폴리펩타이드 및 XTEN을 포함하는 이종 모이어티를 포함하며, 여기서 XTEN은 링커(링커는 절단 가능하거나 가능하지 않을 수 있음)를 사용하거나 사용하지 않고 FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합되고, 길이가 42개 아미노산보다 길고 864개 아미노산보다 짧은, 바람직하게는 길이가 144개 아미노산보다 짧은 아미노산 서열을 포함한다. XTEN은 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 또는 71개 아미노산보다 더 길고 140, 139, 138, 137, 136, 135, 134, 133, 132, 131, 130, 129, 128, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 114, 113, 112, 111, 110, 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 76, 75, 74, 또는 73개 등의 아미노산 또는 이들의 임의의 조합보다 더 짧은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, XTEN은 72개 아미노산 길이이다. 특별한 일 실시형태에서, XTEN은 AE72이다. 또 다른 실시형태에서, XTEN은 서열번호 35에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 적어도 하나의 삽입된 XTEN 서열 및 XTEN을 포함하는 이종 모이어티를 함유하는 FIX 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 XTEN은 링커(링커는 절단 가능하거나 가능하지 않을 수 있음)를 사용하거나 사용하지 않고 FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, XTEN은 길이가 864개 아미노산보다 더 짧고, 바람직하게는 길이가 144개 아미노산보다 더 짧다. 다른 실시형태에서, XTEN은 길이가 244, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 또는 75개 아미노산보다 더 짧은 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식을 포함하고:

(i) FIX-X

(ii) FIX-L1-X

(iii) FIX(X)-X

(iv) FIX(X)-L1-X

(v) FIX(X)-L1:X

(vi) 이들의 임의의 조합,

여기서 FIX는 FIX 폴리펩타이드이고; FIX(X)는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 삽입 부위 내에 삽입된 적어도 하나의 XTEN을 갖는 FIX 폴리펩타이드이고; (X)는 42개 아미노산보다 더 길고 144개 아미노산보다 더 짧은 XTEN이고; X는 42개 아미노산보다 더 길고 864개 아미노산, 예컨대 288개 아미노산보다 더 짧은, 바람직하게는 144개 아미노산보다 더 짧은 XTEN(예를 들어, 72개 아미노산을 갖는 XTEN)이고; L1은 링커이고; (-)는 펩타이드 결합 또는 하나 이상의 아미노산이고; (:)는 공유 결합, 예를 들어, 다이설파이드 결합이다.

링커(L1)는 동일하거나 상이할 수 있다. 링커는 필요에 따라서 절단 가능하거나 절단 가능하지 않을 수 있고, 링커는 하나 이상의 세포내 처리 부위를 포함할 수 있다. 링커의 비제한적인 예는 본 명세서 다른 부분에 기술되어 있다. 링커 중 임의의 것을 사용하여 FIX를 이종 모이어티(예를 들어, XTEN 또는 Fc)와 조합할 수 있다. 하기는 본 발명의 많은 실시형태에 적합한 링커의 비제한적인 예이다:

a) GPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHHHH(서열번호 219, 트롬빈);

b) GAGSPGAETALVPRGAGSPGAETAG(서열번호 220, 트롬빈-PAR1);

c) GAGSPGAETALVPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEESGAGSPGAETA(서열번호 221);

d) GPEGPSKLTRAETGAGSPGAETA(서열번호 222)

e) GGGGALRPRVVGGAGSPGAETA(서열번호 223)

f) GGGGTLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEKGGAGSPGAETA(서열번호 224)

g) GGAGSPGAETA(서열번호 225).

특정 다른 실시형태에서, 링커는 트롬빈 절단 부위를 포함한다. 특별한 일 실시형태에서, 트롬빈 절단 부위는 XVPR을 포함하고, 여기서 X는 임의의 지방족 아미노산(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 아이소류신)이다. 특별한 일 실시형태에서, 트롬빈 절단 부위는 LVPR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 SFLLRN(서열번호 190)을 포함하는, PAR1 엑소사이트 상호작용 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, PAR1 엑소사이트 상호작용 모티프는 P, PN, PND, PNDK(서열번호 191), PNDKY(서열번호 192), PNDKYE(서열번호 193), PNDKYEP(서열번호 194), PNDKYEPF(서열번호 195), PNDKYEPFW(서열번호 196), PNDKYEPFWE(서열번호 197), PNDKYEPFWED(서열번호 198), PNDKYEPFWEDE(서열번호 199), PNDKYEPFWEDEE(서열번호 200), PNDKYEPFWEDEES(서열번호 201), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 특정 다른 실시형태에서 링커는 PAR1 엑소사이트 상호작용 모티프와 조합될 수 있는, LDPR을 포함하는 FXIa 절단 부위를 포함한다.

특정 실시형태에서, C-말단에서 XTEN에 융합된 FIX 폴리펩타이드는 제2 XTEN을 추가로 포함할 수 있다. 제2 XTEN은 본 명세서에 개시된 삽입 부위를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, FIX 융합 단백질의 임의의 부분에 융합되거나 그 내에 삽입될 수 있다. FIX 융합 단백질은 제3 XTEN, 제4 XTEN, 제5 XTEN, 또는 제6 XTEN을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 FIX 융합 단백질은 네이티브 FIX와 비교할 때 활성의 수준을 유지한다. 일부 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 네이티브 FIX의 응혈촉진 활성의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 100%를 갖는다. 용혈촉진 활성은 발색 기질 검정법, 1단계 응고 검정법, 또는 둘 모두를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해서 측정될 수 있다.

II.A . 인자 IX

인간 인자 IX(FIX)는 혈액 응집 캐스케이드의 내인성 경로의 중요한 성분인 세린 프로테아제이다. "인자 IX" 또는 "FIX"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 응집 인자 단백질 및 이의 종 및 서열 변이체를 지칭하고, 인간 FIX 전구체 폴리펩타이드("프리프로(prepro)")의 461 단일-쇄 아미노산 서열, 성숙 인간 FIX의 415 단일-쇄 아미노산 서열(서열번호 1), 및 R338L FIX(파두아) 변이체(서열번호 2)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.. FIX는 혈액 응집 FIX의 전형적인 특징을 갖는 FIX 분자의 임의의 형태를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "인자 IX" 및 "FIX"는 도메인 Gla(γ-카복시글루탐산 잔기를 함유하는 영역), EGF1 및 EGF2(인간 표피 성장 인자에 상동성인 서열을 함유하는 영역), 활성화 펩타이드("AP", 성숙 FIX의 잔기 R136-R180에 의해서 형성됨), 및 C-말단 프로테아제 도메인("Pro"), 또는 관련 기술 분야에 공지된 이들 도메인의 동의체를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하도록 의도되거나, 네이티브 단백질의 생물학적 활성의 적어도 일부를 보유하는 절두된 단편 또는 서열 변이체일 수 있다. FIX 또는 서열 변이체는 미국 특허 제4,770,999호 및 제7,700,734호에 기술된 바와 같이 클로닝되었고, 인간 인자 IX에 대한 cDNA 암호는 단리되고, 특징 규명되고, 발현 벡터 내에서 클로닝되었다(예를 들어, 문헌[Choo et al., Nature 299:178-180 (1982)]; [Fair et al., Blood 64:194-204 (1984)]; 및 [Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 79:6461-6464 (1982)] 참고). 문헌[Simioni et al, 2009]에 의해서 특징 규명된 FIX의 특별한 한 변이체, R338L FIX(파두아) 변이체(서열번호 2)는 기능 획득(gain-of-function) 돌연변이를 포함하고, 이것은 네이티브 FIX에 비해서 파두아 변이체의 활성의 거의 8배 증가와 관련된다(표 1). FIX 변이체는 또한 FIX 폴리펩타이드의 FIX 활성에 영향을 주지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환을 갖는 임의의 FIX 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

FIX 폴리펩타이드는 55 kDa이고, 3개의 영역: 28개 아미노산의 신호 펩타이드(서열번호 3의 아미노산 1 내지 28), 글루탐산 잔기의 감마-카복실화에 필요한 18개 아미노산의 프로펩타이드(아미노산 29 내지 46), 및 415 아미노산의 성숙 인자 IX(서열번호 1 또는 2)로 구성된 프리프로폴리펩타이드 쇄(서열번호 1)로서 합성된다. 프로펩타이드는 감마-카복시글루타메이트 도메인에 대한 N-말단인 18-아미노산 잔기 서열이다. 프로펩타이드는 비타민 K-의존형 감마 카복실라제에 결합하고, 이어서 내인성 프로테아제, 가장 가능하게는 퓨린 또는 PCSK3이라고도 공지된 PACE(쌍을 이룬 염기성 아미노산 절단 효소)에 의해서 FIX의 전구체 폴리펩타이드로부터 절단된다. 감마 카복실화가 없으면, Gla 도메인은 칼슘에 결합할 수 없어서 음으로 하전된 인지질 표면에 단백질을 고정시키는 데 필요한 올바른 컨포메이션을 취할 수 없고, 이에 의해서 인자 IX가 기능하지 않게 된다. 그것이 카복실화되더라도, Gla 도메인은 또한 적절한 기능을 위해서 프로펩타이드의 절단에 좌우되는데, 그 이유는 보유된 프로펩타이드가 칼슘 및 인지질에 대한 최적의 결합을 위해서 필요한 Gla 도메인의 컨포메이션 전하를 방해하기 때문이다. 인간에서, 생성된 성숙 인자 IX는 간 세포에 의해서 불활성 지모겐, 중량 기준으로 대략 17%의 탄수화물을 함유하는 415 아미노산 잔기의 단일 쇄 단백질로서 혈류 내로 분비된다(문헌[Schmidt, A. E., et al. (2003) Trends Cardiovasc Med, 13: 39]).

성숙 FIX는 N-말단 내지 C-말단 구성에서 GLA 도메인, EGF1 도메인, EGF2 도메인, 활성화 펩타이드(AP) 도메인, 및 프로테아제(또는 촉매) 도메인인 몇몇 도메인으로 구성된다. 짧은 링커는 EGF2 도메인을 AP 도메인과 연결한다. FIX는 각각 R145-A146 및 R180-V181에 의해서 형성된 2개의 활성화 펩타이드를 함유한다. 활성화 이후에, 단일-쇄 FIX는 2-쇄 분자가 되고, 여기서 2개의 쇄는 다이설파이드 결합에 의해서 연결된다. 응고 인자는 이의 활성화 펩타이드를 대체하여 변경된 활성화 특이성을 생성함으로써 조작될 수 있다. 포유동물에서, 성숙 FIX는 활성화된 인자 XI에 의해서 활성화되어 인자 IXa를 산출해야 한다. 프로테아제 도메인은 FIX의 FIXa로의 활성화 시, FIX의 촉매 활성을 제공한다. 활성화된 인자 VIII(FVIIIa)는 FIXa 활성의 완전 발현을 위한 특이적 보조인자이다.

다른 실시형태에서, FIX 폴리펩타이드는 혈장 유래된 인자 IX의 Thr148 대립형질 형태(allelic form)를 포함하고, 내인성 인자 IX에 유사한 구조적 특징 및 기능적 특징을 갖는다.

상당히 많은 기능적 FIX 변이체가 공지되어 있다. 국제 특허 공개 제WO 02/040544 A3호에는 4면 9줄 내지 30줄 및 15면, 6줄 내지 31줄에서 헤파린에 의한 저해에 대해서 증가된 내성을 나타내는 돌연변이체가 개시되어 있다. 국제 공개 WO 03/020764 A2호에는 표 2 및 표 3(14 내지 24면), 및 12면, 1줄 내지 27줄에서 감소된 T 세포 면역원성을 갖는 FIX 돌연변이체가 개시되어 있다. 국제 특허 공개 제WO 2007/149406 A2호에는 4면, 1줄 내지 19면, 11줄에서 증가된 단백질 안정성, 증가된 생체내 및 시험관내 반감기 및 프로테아제에 대한 증가된 내성을 나타내는 기능적 돌연변이체 FIX 분자가 개시되어 있다. 국제 특허 제WO 2007/149406 A2호에는 또한 19면, 12줄 내지 20면, 9줄에서 키메릭 및 다른 변이체 FIX 분자가 개시되어 있다. 국제 특허 공개 제WO 08/118507 A2호에는 5면, 14줄 내지 6면, 5줄에서 증가된 응고 활성을 나타내는 FIX 돌연변이체가 개시되어 있다. 국제 특허 공개 제WO 09/051717 A2호에는 9면, 11줄 내지 20면, 2줄에서 증가된 반감기 및/또는 회수율을 유발하는 증가된 수의 N-연결된 및/또는 O-연결된 글리코실화 부위를 갖는 FIX 돌연변이체가 개시되어 있다. 국제 특허 공개 제WO 09/137254 A2호에는 또한 2면, 단락 [006] 내지 5면, 단락 [011] 및 16면, 단락 [044] 내지 24면, 단락 [057]에서 증가된 수의 글리코실화 부위를 갖는 인자 IX 돌연변이체가 개시되어 있다. 국제 특허 공개 제WO 09/130198 A2호에는 4면, 26줄 내지 12면, 6줄에서 증가된 반감기를 유발하는 증가된 수의 글리코실화 부위를 갖는 기능적 돌연변이체 FIX 분자가 개시되어 있다. 국제 특허 공개 제WO 09/140015 A2호에는 11면, 단락 [0043] 내지 13면, 단락 [0053]에서 중합체(예를 들어, PEG) 접합을 위해서 사용될 수 있는 증가된 수의 Cys 잔기를 갖는 FIX 돌연변이체가 개시되어 있다. 2011년 7월 11일자로 출원된 국제 출원 제PCT/US2011/043569호에 기술되고 2012년 1월 12일자의 국제 특허 공개 제WO 2012/006624호로서 공개된 FIX 폴리펩타이드는 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.

또한, FIX에서의 수백개의 비-기능적 돌연변이가 혈우병 대상체에서 식별되어 있고, 이들 중 다수는 국제 특허 공개 제WO 09/137254 A2호의 11 내지 14면의 표 5에 개시되어 있다. 이러한 비-기능적 돌연변이는 본 발명에 포함되지 않지만, 돌연변이가 기능적 FIX 폴리펩타이드를 초래할 가능성이 다소 있는 추가 지침을 제공한다.

일 실시형태에서, FIX 폴리펩타이드(또는 융합 폴리펩타이드의 인자 IX 부분)는 서열번호 1 또는 2에 제시된 서열(서열번호 1 또는 2의 아미노산 1 내지 415) 또는 대안적으로는 프로펩타이드 서열을 갖는 서열, 또는 프로펩타이드와 신호 서열을 갖는 서열(전장 FIX)에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, FIX 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 서열에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

인자 IX 응고 활성은 국제 단위(들)(IU)로서 표현된다. FIX 활성 1IU는 정상 인간 혈장 1밀리리터 중의 FIX의 양에 대략적으로 상응한다. 1단계 응고 검정법(활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간; aPTT), 트롬빈 생성 시간(TGA) 및 회전식 트롬보엘라스토메트리(ROTEM(등록상표))를 비롯한, 몇몇 검정법이 인자 IX 활성을 측정하기 위해서 사용 가능하다. 본 발명은 FIX의 생물학적 활성 또는 생물학적 기능의 적어도 일부를 보유하고/하거나 응집 인자-관련된 질환, 결핍, 장애 또는 병태(예를 들어, 응집 인자 결핍의 외상, 수술에 관련된 출혈 에피소드)를 예방, 치료, 매개, 또는 개선시키기에 유용한, 예컨대 인간, 비-인간 영장류, 포유동물(가축 포함) 및 비-자연 서열 변이체로부터의 자연적인 FIX 서열, 서열 단편에 상동성을 갖는 서열을 고려한다. 인간 FIX에 상동성을 갖는 서열은 표준 상동성 탐색 기술, 예컨대 NCBI BLAST에 의해서 발견될 수 있다.

II.B . 이종 모이어티

본 발명의 FIX 융합 단백질은 FIX 폴리펩타이드 내의 하나 이상의 부위에 삽입되거나, C-말단에 융합되거나, 또는 둘 다인 적어도 하나의 이종 모이어티를 포함할 수 있고, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 갖고, 숙주 세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현될 수 있다. "이종 모이어티"는 이종 폴리펩타이드, 또는 비-폴리펩타이드 모이어티, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 이종 모이어티는 XTEN이다. 일부 양상에서, 본 발명의 FIX 융합 단백질은 FIX 폴리펩타이드 내의 하나 이상의 부위 내에 삽입된 적어도 하나의 XTEN을 포함한다. 다른 양상에서, FIX 융합 단백질은 FIX 폴리펩타이드 내의 하나 이상의 부위 내에 삽입된 적어도 하나의 이종 모이어티를 포함하며, 여기서 이종 모이어티는 반감기 연장 모이어티(예를 들어, 생체내 반감기 연장 모이어티)이다.

삽입 부위의 발견(여기서, FIX는 이의 응혈촉진 활성의 적어도 일부를 보유함)은 또한 이들 동일한 부위 중 하나 이상에서 FIX 단백질에 융합되는 경우 반감기의 연장과 연관된 비구조적 또는 구조적 특징을 갖는 다른 펩타이드 및 폴리펩타이드의 삽입을 허용할 것이라고 여겨진다. 이종 모이어티(예를 들어, 반감기 연장 모이어티)의 비제한적인 예는 특히, 알부민, 알부민 단편, 면역글로불린의 Fc 단편, FcRn 결합 파트너, 인간 융모막 생식선 자극 호르몬의 β 소단위의 C-말단 펩타이드(CTP), HAP 서열, 트랜스페린, 미국 특허 출원 제20100292130호의 PAS 폴리펩타이드, 폴리글리신 링커, 폴리세린 링커, 펩타이드 및 50% 미만 내지 50% 초과의 다양한 2차 구조를 갖는 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로부터 선택된 두 유형의 아미노산의 6 내지 40개 아미노산의 짧은 폴리펩타이드가 FIX의 식별된 활성 삽입 부위에서의 삽입에 적합할 것이다.

특정 양상에서 이종 모이어티는 FIX 융합 단백질의 생체내 또는 시험관내 반감기를 증가시킨다. 다른 양상에서 이종 모이어티는 FIX 융합 단백질의 가시화 및 국지화를 가능하게 한다. FIX 융합 단백질의 가시화 및/또는 위치는 생체내, 시험관내, 생체외, 또는 이들의 조합일 수 있다. 다른 양상에서 이종 모이어티는 FIX 융합 단백질의 안정성을 증가시킨다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안정성"은 환경 조건(예를 들어, 온도 증가 또는 온도 감소)에 반응하여 FIX 융합 단백질의 하나 이상의 물성을 유지하는 관련 기술 분야에서 인식되는 척도를 지칭한다. 특정 양상에서, 물성은 FIX 융합 단백질의 공유 구조의 유지(예를 들어, 단백질분해 절단, 원치않는 산화 또는 탈아마이드화의 부재)이다. 다른 양상에서, 물성은 또한 적절하게 접힌 상태(예를 들어, 가용성 또는 불용성 응집물 또는 침전물의 부재)의 FIX 융합 단백질의 존재에서의 것일 수 있다. 일 양상에서, FIX 융합 단백질의 안정성은 FIX 융합 단백질의 생물리학적 특성, 예를 들어, 열 안정성 pH 비접힘 프로파일, 글리칸의 안정한 제거, 용해도, 생화학적 기능(예를 들어, 또 다른 단백질에 결합하는 능력) 등 및/또는 이들의 조합을 검정함으로써 측정된다. 또 다른 양상에서, 생화학적 기능은 상호작용의 결합 친화도에 의해서 입증된다. 일 양상에서, 단백질 안정성의 척도는 열 안정성, 즉 열 도전에 대한 내성이다. 안정성은 관련 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), SEC(크기 배재 크로마토그래피), DLS(동적 광 산란) 등을 사용하여 측정될 수 있다. 열 안정성을 측정하는 방법은 시차 주사 열량법(DSC), 시차 주사 형광법(DSF), 원편광 이색성(circular dichroism: CD), 및 열 도전 검정법(thermal challenge assay)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

구체적인 양상에서, FIX 융합 단백질에서 하나 이상의 삽입 부위에 삽입된 이종 모이어티는 FIX 융합 단백질의 생화학적 활성을 유지시킨다. 특정 실시형태에서, 이종 모이어티는 XTEN이다. 일 실시형태에서, 생화학적 활성은 FIX 활성이며, 이것은 발색 검정법에 의해서 측정될 수 있다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티는 이종 모이어티의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 둘 모두에 위치된 링커를 통해서 삽입 부위에서 직접 삽입된다. 이종 모이어티의 N-말단 및 C-말단에서 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 몇몇 링커는 이종 모이어티의 하나의 말단 또는 두 말단에 일렬로 측면에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 "Gly-Ser 펩타이드 링커"이다. 용어 "Gly-Ser 펩타이드 링커"는 글리신및 세린 잔기를 포함하는 펩타이드를 지칭한다.

예시적인 Gly/Ser 펩타이드 링커는 아미노산 서열(Gly₄Ser)_n(서열번호161)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 46, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 또는 100 이상인 정수이다. 일 실시형태에서, n은 1, 즉, 링커는 (Gly₄Ser)(서열번호 161)이다. 일 실시형태에서, n은 2, 즉, 링커는 (Gly₄Ser)₂(서열번호 162)이다. 또 다른 실시형태에서, n은 3, 즉, 링커는 (Gly₄Ser)₃(서열번호 172)이다. 또 다른 실시형태에서, n은 4, 즉, 링커는 (Gly₄Ser)₄(서열번호 173)이다. 또 다른 실시형태에서, n은 5, 즉, 링커는 (Gly₄Ser)₅(서열번호 174)이다. 추가의 또 다른 실시형태에서, n은 6, 즉, 링커는 (Gly₄Ser)₆(서열번호 175)이다. 또 다른 실시형태에서, n은 7, 즉, 링커는 (Gly₄Ser)₇(서열번호 176)이다. 추가의 또 다른 실시형태에서, n은 8, 즉, 링커는 (Gly₄Ser)₈(서열번호 177)이다. 또 다른 실시형태에서, n은 9, 즉, 링커는 (Gly₄Ser)₉(서열번호 178)이다. 추가의 또 다른 실시형태에서, n은 10, 즉, 링커는 (Gly₄Ser)₁₀(서열번호 179)이다.

또 다른 예시적인 Gly/Ser 펩타이드 링커는 아미노산 서열 Ser(Gly₄Ser)_n(서열번호 180)을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 46, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 또는 100 이상의 정수이다. 일 실시형태에서, n은 1, 즉, 링커는 Ser(Gly₄Ser)(서열번호 180)이다. 일 실시형태에서, n은 2, 즉, 링커는 Ser(Gly₄Ser)₂(서열번호 181)이다. 또 다른 실시형태에서, n 은3, 즉, 링커는 Ser(Gly₄Ser)₃(서열번호 182)이다. 또 다른 실시형태에서, n은 4, 즉, 링커는 Ser(Gly₄Ser)₄(서열번호 183)이다. 또 다른 실시형태에서, n은 5, 즉, 링커는 Ser(Gly₄Ser)₅(서열번호 184)이다. 추가의 또 다른 실시형태에서, n은 6, 즉, 링커는 Ser(Gly₄Ser)₆(서열번호 185)이다. 추가의 또 다른 실시형태에서, n은 7, 즉, 링커는 Ser(Gly₄Ser)₇(서열번호 186)이다. 추가의 또 다른 실시형태에서, n은 8, 즉, 링커는 Ser(Gly₄Ser)₈(서열번호 187)이다. 추가의 또 다른 실시형태에서, n은 9, 즉, 링커는 Ser(Gly₄Ser)₉(서열번호 188)이다. 추가의 또 다른 실시형태에서, n은 10, 즉, 링커는 Ser(Gly₄Ser)₁₀(서열번호 189)이다.

특정 양상에서, FIX 융합 단백질은 표 7에 열거된 삽입 부위에서 삽입된 하나의 이종 모이어티를 포함한다. 다른 양상에서, FIX 융합 단백질은 표 7에 열거된 2개의 삽입 부위에서 삽입된 2개의 이종 모이어티를 포함한다. 특별한 실시형태에서, 2개의 이종 모이어티는 표 8에 열거된 2개의 삽입 부위 내에 삽입된다. 특정 양상에서, FIX 융합 단백질은 표 7에 열거된 3개의 삽입 부위에서 삽입된 3개의 이종 모이어티를 포함한다. 특정 양상에서, FIX 융합 단백질은 표 7에 열거된 4개의 삽입 부위에서 삽입된 4개의 이종 모이어티를 포함한다. 특정 양상에서, FIX 융합 단백질은 표 7에 열거된 5개의 삽입 부위에서 삽입된 5개의 이종 모이어티를 포함한다. 특정 양상에서, FIX 융합 단백질은 표 7에 열거된 6개의 삽입 부위에서 삽입된 6개의 이종 모이어티를 포함한다. 일부 양상에서, 모든 삽입된 이종 모이어티는 동일하다. 다른 양상에서, 삽입된 이종 모이어티 중 적어도 하나는 삽입된 이종 모이어티의 나머지와 상이하다.

FIX 폴리펩타이드의 적어도 하나의 이종 모이어티, 예를 들어, XTEN에 대한 융합은 본 발명의 융합 단백질 물성 또는 화학 특성, 예를 들어 약동학에 영향을 줄 수 있다. 구체적인 실시형태에서, FIX 단백질에 연결된 이종 모이어티는 적어도 하나의 약동학 특성, 예를 들어 증가된 후반 반감기 또는 증가된 곡선하 면적(AUC)을 증가시켜서, 본 명세서에 기술된 융합 단백질은 야생형 FIX 또는 이종 모이어티가 결여된 상응하는 FIX와 비교할 때 증가된 시간 기간 동안 생체내에서 유지된다. 추가 실시형태에서, 본 발명에서 사용되는 XTEN 서열은 적어도 하나의 약동학 특성, 예를 들어 증가된 후반 반감기, 증가된 회수율 및/또는 피하 투여를 위한 증가된 생체이용률, 증가된 곡선하 면적(AUC)을 증가시켜서, FIX 단백질은 야생형 FIX 또는 이종 모이어티가 결여된 상응하는 FIX와 비교할 때 증가된 시간 기간 동안 생체내에서 유지된다

특정 양상에서, 본 발명의 FIX 융합 단백질의 반감기를 증가시키는 이종 모이어티는 제한 없이 이종 폴리펩타이드, 예컨대 알부민, 면역글로불린 Fc 영역, XTEN 서열, 인간 융모막 생식선 자극 호르몬의 β 소단위의 C-말단 펩타이드(CTP), PAS 서열, HAP 서열, 트랜스페린, 알부민-결합 모이어티, 또는 이들 펩타이드의 임의의 단편, 유도체, 변이체, 또는 조합물을 포함한다. 특정 양상에서 본 발명의 FIX 융합 단백질은 반감기를 증가시키는 이종 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 이종 폴리펩타이드는 XTEN 서열이다. 다른 관련된 양상에서 이종 모이어티는 비-폴리펩타이드 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리시알산, 또는 이들 모이어티의 임의의 유도체, 변이체 또는 조합물을 위한 부착 부위를 포함할 수 있다.

다른 실시형태에서, 본 발명의 FIX 융합 단백질은 하나 이상의 중합체에 접합된다. 중합체는 수용성 또는 수불용성일 수 있다. 중합체는 FIX에 또는 FIX에 접합된 다른 모이어티에 공유 또는 비공유 부착될 수 있다. 중합체의 비제한적인 예는 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 또는 폴리(아크릴로일모르폴린)일 수 있다.

특정 양상에서, 본 발명의 FIX 융합 단백질은 각각 동일하거나 상이한 분자일 수 있는 1개, 2개, 3개 또는 그 초과의 이종 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 하나 이상의 XTEN을 포함한다. 다른 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 하나 이상의 XTEN 및 하나 이상의 Fc 도메인을 포함한다. 특별한 일 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 FIX 내에 삽입된 XTEN 및 FIX의 C-말단에 융합된 Fc를 포함할 수 있다.

본 발명의 FIX 융합 단백질은 네이티브 FIX, rFIXFc, 또는 FIX R338L과 비교할 때 증가된 생체내 반감기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 이종 모이어티가 결여된 네이티브 FIX와 비교하거나 또는 이종 모이어티가 결여된 FIX R338L과 비교할 때 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배 더 큰 생체내 반감기를 가질 수 있다. 특별한 일 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 이종 모이어티가 없는 FIX 폴리펩타이드보다 2배 초과가 더 큰 생체내 반감기를 갖는다.

다른 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 이종 모이어티가 결여된 FIX 폴리펩타이드의 생체내 반감기보다 적어도 약 5시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 7시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 9시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 11시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 13시간, 적어도 약 14시간, 적어도 약 15시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 26시간, 적어도 약 27시간, 적어도 약 28시간, 적어도 약 29시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 31시간, 적어도 약 32시간, 적어도 약 33시간, 또는 적어도 약 34시간 더 긴 생체내 반감기를 가질 수 있다.

II.B .1. XTEN

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티는 XTEN이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "XTEN 서열"은 작은 친수성 아미노산으로 주로 구성되는 비-자연 발생, 실질적으로 비-반복 서열을 갖는 연장된 길이 폴리펩타이드를 지칭하는데, 이 서열은 생리 조건 하에서 2차 또는 3차 구조를 낮은 정도로 갖거나 또는 갖지 않는다. 융합 단백질 파트너로서, XTEN은 담체로서 역할을 할 수 있고, 융합 단백질을 생성하기 위해서 본 발명의 FIX 서열에 연결될 때 특정 바람직한 약동학적, 물리화학적 및 약제학적 특성을 부여한다. 이러한 바람직한 특성은 향상된 약동학 파라미터 및 용해도 특징을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "XTEN"은 항체 또는 항체 단편, 예컨대, 경쇄 또는 중쇄의 단일-쇄 항체 또는 Fc 단편을 구체적으로 배제한다.

특정 양상에서, 본 발명의 FIX 융합 단백질은 FIX 내에 삽입된 적어도 하나의 XTEN 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하며, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 갖고, 숙주 세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현될 수 있다. 특정 양상에서, 이종 모이어티 중 2개는 XTEN 서열이다. 일부 양상에서, 이종 모이어티 중 3개는 XTEN 서열이다. 일부 양상에서, 이종 모이어티 중 4개는 XTEN 서열이다. 일부 양상에서, 이종 모이어티 중 5개는 XTEN 서열이다. 일부 양상에서, 이종 모이어티 중 6개 이상은 XTEN 서열이다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 유용한 XTEN 서열은 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 또는 2000개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, XTEN은 약 20개 초과 내지 약 3000개 아미노산 잔기, 30개 초과 내지 약 2500개 잔기, 40개 초과 내지 약 2000개 잔기, 50개 초과 내지 약 1500개 잔기, 60개 초과 내지 약 1000개 잔기, 70개 초과 내지 약 900개 잔기, 80개 초과 내지 약 800개 잔기, 90개 초과 내지 약 700개 잔기, 100개 초과 내지 약 600개 잔기, 110개 초과 내지 약 500개 잔기, 또는 120개 초과 내지 약 400 잔기를 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 특별한 일 실시형태에서, XTEN은 길이가 42개 아미노산보다 길고, 144개 아미노산보다 짧은 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 XTEN 서열은 5 내지 14개(예를 들어, 9 내지 14개) 아미노산 잔기의 하나 이상의 서열 모티프 또는 이러한 서열 모티프에 적어도 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 이 모티프는 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로 이루어진 군으로부터 선택된 4 내지 6개 유형의 아미노산(예를 들어, 5개 아미노산)을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진다(미국 특허 제US 2010-0239554 A1호 참고).

일부 실시형태에서, XTEN은 서열의 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 약 91%, 또는 약 92%, 또는 약 93%, 또는 약 94%, 또는 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 또는 약 100%가 표 2A로부터 선택되는 단일 모티프 패밀리로부터 선택되는 비-중첩 서열의 복수 단위로 이루어지며, 이것이 패밀리 서열을 유발하는 비-중첩 서열 모티프를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "패밀리"는 XTEN이 단지 표 2A로부터의 단일 모티프 카테고리; 즉, AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC, 또는 BD XTEN으로부터 선택된 모티프를 갖고, 패밀리 모티프로부터가 아닌 XTEN 내에 임의의 다른 아미노산이 필요한 특성을 달성하기 위해, 예컨대, 암호화 뉴클레오타이드에 의한 제한 부위의 혼입을 허용하거나, 절단 서열의 혼입을 허용하거나, 또는 FIX에 더 양호한 링키지를 달성하기 위해 선택된다는 것을 의미한다. XTEN 패밀리의 일부 실시형태에서, XTEN 서열은 AD 모티프 패밀리, 또는 AE 모티프 패밀리, 또는 AF 모티프 패밀리, 또는 AG 모티프 패밀리, 또는 AM 모티프 패밀리, 또는 AQ 모티프 패밀리, 또는 BC 패밀리, 또는 BD 패밀리의 비-중첩 서열 모티프의 복수 단위를 포함하고, 생성된 XTEN은 상기에 기술된 상동성 범위를 나타낸다. 다른 실시형태에서, XTEN은 표 2A의 모티프 패밀리 중 2개 이상으로부터 모티프 서열의 복수 단위를 포함한다. 이들 서열은 하기에 더욱 충분히 설명된, 순 전하, 친수성, 2차 구조의 결여, 또는 모티프의 아미노산 조성에 의해 부여되는 반복성의 결여와 같은 특성을 비롯한, 목적하는 물성/화학적 특성을 달성하도록 선택될 수 있다. 본 단락에서 앞서 기술된 실시형태에서, XTEN 내로 혼입된 모티프는 약 36 내지 약 3000개 아미노산 잔기의 XTEN을 달성하기 위해, 본 명세서에서 기술된 방법을 사용하여 선택되고 조립될 수 있다.

[표 2A]

XTEN은 FIX 내로의 삽입 또는 이것에 대한 링키지를 위해서 다양한 길이를 가질 수 있다. 일 실시형태에서, XTEN 서열(들)의 길이는 융합 단백질에서 달성되고자 하는 특성 또는 기능을 기초로 선택된다. 의도되는 특성 및 기능에 따라서, XTEN은 담체로서 제공될 수 있는 짧거나 중간 길이인 서열 또는 더 긴 서열일 수 있다. 특정 실시형태에서, XTEN은 약 6 내지 약 99개 아미노산 잔기의 짧은 분절, 약 100 내지 약 399개 아미노산 잔기의 중간 길이, 및 약 400 내지 약 1000 및 최대 약 3000개 아미노산 잔기의 더 긴 길이를 포함한다. 따라서, FIX 내에 삽입되거나 이것에 연결된 XTEN은 약 6, 약 12, 약 36, 약 40, 약 42, 약 72, 약 96, 약 144, 약 288, 약 400, 약 500, 약 576, 약 600, 약 700, 약 800, 약 864, 약 900, 약 1000, 약 1500, 약 2000, 약 2500, 또는 최대 약 3000개 길이의 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, XTEN 서열은 약 6 내지 약 50, 약 50 내지 약 100, 약 100 내지 150, 약 150 내지 250, 약 250 내지 400, 약 400 내지 약 500, 약 500 내지 약 900, 약 900 내지 1500, 약 1500 내지 2000, 또는 약 2000 내지 약 3000개 아미노산 잔기 길이이다. FIX 내에 삽입되거나 이것에 연결된 XTEN의 정확한 길이는 FIX의 활성에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 달라질 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 사용되는 XTEN 중 하나 이상은 42개 아미노산, 72개 아미노산, 144개 아미노산, 288개 아미노산, 576개 아미노산, 또는 864개 아미노산 길이를 갖고, XTEN 패밀리 서열; 즉, AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC 또는 BD 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용되는 XTEN 서열은 AE42, AG42, AE48, AM48, AE72, AG72, AE108, AG108, AE144, AF144, AG144, AE180, AG180, AE216, AG216, AE252, AG252, AE288, AG288, AE324, AG324, AE360, AG360, AE396, AG396, AE432, AG432, AE468, AG468, AE504, AG504, AF504, AE540, AG540, AF540, AD576, AE576, AF576, AG576, AE612, AG612, AE624, AE648, AG648, AG684, AE720, AG720, AE756, AG756, AE792, AG792, AE828, AG828, AD836, AE864, AF864, AG864, AM875, AE912, AM923, AM1318, BC864, BD864, AE948, AE1044, AE1140, AE1236, AE1332, AE1428, AE1524, AE1620, AE1716, AE1812, AE1908, AE2004A, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908, AG2004, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다(미국 특허 제US 2010-0239554 A1호 참고). 특별한 일 실시형태에서, XTEN은 AE42, AE72, AE144, AE288, AE576, AE864, AG 42, AG72, AG144, AG288, AG576, AG864, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일 실시형태에서, XTEN 서열은 AE36(서열번호 217), AE42(서열번호 34), AE72(서열번호 35), AE78(서열번호 218), AE144(서열번호 36), AE144_2A(서열번호 37), AE144_3B(서열번호 38), AE144_4A(서열번호 39), AE144_5A(서열번호 40), AE144_6B(서열번호 41), AG144(서열번호 42), AG144_A(서열번호 43), AG144_B(서열번호 44), AG144_C(서열번호 45), AG144_F(서열번호 46), AE288(서열번호 47), AE288_2(서열번호 48), AG288(서열번호 49), AE576(서열번호 50), AG576(서열번호 51), AE864(서열번호 52), AG864(서열번호 53), XTEN_AE72_2A_1(서열번호202), XTEN_AE72_2A_2(서열번호203), XTEN_AE72_3B_1(서열번호204), XTEN_AE72_3B_2(서열번호205), XTEN_AE72_4A_2(서열번호 206), XTEN_AE72_5A_2(서열번호207), XTEN_AE72_6B_1(서열번호 208), XTEN_AE72_6B_2(서열번호 209), XTEN_AE72_1A_1(서열번호 210), XTEN_AE72_1A_2(서열번호 211), XTEN_AE144_1A(서열번호 212), AE150(서열번호 213), AG150(서열번호 214), AE294(서열번호 215), AG294(서열번호216), 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.

일부 실시형태에서, XTEN의 아미노산의 100% 미만은 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로부터 선택되거나, 이 서열의 100% 미만은 표 2A로부터의 서열 모티프 또는 표 2B의 XTEN 서열로 이루어진다. 이러한 실시형태에서, XTEN의 나머지 아미노산 잔기는 다른 14종의 자연 L-아미노산 중 임의의 것으로부터 선택되지만, 이것은 XTEN 서열이 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99%의 친수성 아미노산을 함유하도록 친수성 아미노산으로부터 우선적으로 선택될 수 있다. 접합 작제물에서 사용되는 XTEN 내의 소수성 아미노산의 함량은 5% 미만, 또는 2% 미만, 또는 1% 미만의 소수성 아미노산 함량일 수 있다. XTEN의 작제에서 덜 선호되는 소수성 잔기는 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신, 류신, 아이소류신, 발린, 및 메티오닌을 포함한다. 추가로, XTEN 서열은 다음 아미노산: 메티오닌(예를 들어, 산화를 회피하기 위함), 또는 아스파라긴 및 글루타민(아마이드화를 회피하기 위함)을 5% 미만 또는 4% 미만 또는 3% 미만 또는 2% 미만 또는 1% 미만 함유하거나 전혀 함유하지 않을 수 있다.

일 실시형태에서, XTEN 서열은 AE36(서열번호 217), AE42(서열번호 34), AE72(서열번호 35), AE78(서열번호 218), AE144(서열번호 36), AE144_2A(서열번호 37), AE144_3B(서열번호 38), AE144_4A(서열번호 39), AE144_5A(서열번호 40), AE144_6B(서열번호 41), AG144(서열번호 42), AG144_A(서열번호 43), AG144_B(서열번호 44), AG144_C(서열번호 45), AG144_F(서열번호 46), AE288(서열번호 47), AE288_2(서열번호 48), AG288(서열번호 49), AE576(서열번호 50), AG576(서열번호 51), AE864(서열번호 52), AG864(서열번호 53), XTEN_AE72_2A_1(서열번호202), XTEN_AE72_2A_2(서열번호203), XTEN_AE72_3B_1(서열번호204), XTEN_AE72_3B_2(서열번호205), XTEN_AE72_4A_2(서열번호 206), XTEN_AE72_5A_2(서열번호207), XTEN_AE72_6B_1(서열번호 208), XTEN_AE72_6B_2(서열번호 209), XTEN_AE72_1A_1(서열번호 210), XTEN_AE72_1A_2(서열번호 211), XTEN_AE144_1A(서열번호 212), AE150(서열번호 213), AG150(서열번호 214), AE294(서열번호 215), AG294(서열번호 216), 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에서, XTEN 서열은 AE72, AE144, 및 AE288로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 특정 XTEN 서열을 위한 아미노산 서열을 표 2B에 나타낸다.

[표 2B]

추가 실시형태에서, 본 발명에서 사용되는 XTEN 서열은 본 발명의 융합 단백질 물성 또는 화학 특성, 예를 들어 약동학에 영향을 준다. 본 발명에서 사용되는 XTEN 서열은 하기 이로운 특성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 컨포메이션 유연성, 향상된 수성 용해도, 높은 정도의 프로테아제 내성, 낮은 면역원성, 포유동물 수용체에 대한 낮은 결합, 또는 증가된 수력학적(또는 스트로크스(Stokes)) 반경. 구체적인 실시형태에서, 본 발명에서 FIX 단백질에 연결된 XTEN 서열은 약동학적 특성, 예컨대 더 긴 후반 반감기, 증가된 생체이용률, 또는 증가된 곡선하 면적(AUC)을 증가시켜서, 본 명세서에 기술된 단백질은 야생형 FIX와 비교할 때 증가된 시간 기간 동안 생체내에서 유지된다. 추가 실시형태에서, 본 발명에서 사용되는 XTEN 서열은 약동학적 특성, 예컨대 더 긴 후반 반감기, 또는 증가된 곡선하 면적(AUC)을 증가시켜서, FIX 단백질은 야생형 FIX와 비교할 때 증가된 시간 기간 동안 생체내에서 유지된다.

일부 실시형태에서, FIX 단백질은 네이티브 FIX, rFIXFc, FIX R338L, 또는 XTEN이 결여된 상응하는 FIX 단백질보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배 더 큰 생체내 반감기를 나타낸다. 특별한 일 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 이종 모이어티가 없는 FIX 폴리펩타이드보다 2배 초과가 더 큰 생체내 반감기를 가질 수 있다.

다른 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 이종 모이어티가 결여된 FIX 폴리펩타이드의 생체내 반감기보다 적어도 약 5시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 7시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 9시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 11시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 13시간, 적어도 약 14시간, 적어도 약 15시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 26시간, 적어도 약 27시간, 적어도 약 28시간, 적어도 약 29시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 31시간, 적어도 약 32시간, 적어도 약 33시간, 또는 적어도 약 34시간 더 긴 생체내 반감기를 나타낸다.

다양한 방법 및 검정법이 XTEN 서열을 포함하는 단백질의 물성/화학적 특성을 측정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 분석적 원심분리, EPR, HPLC-이온 교환, HPLC-크기 배제, HPLC-역상, 광 산란, 모세관 전기영동, 원편광 이색성, 시차 주사 열량측정법, 형광, HPLC-이온 교환, HPLC-크기 배제, IR, NMR, 라만 분광법, 굴절측정법, 및 UV/가시 분광법을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 추가 방법은 문헌[Amau et al., Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006)]에 개시되어 있다.

본 발명에 따라서 사용될 수 있는 XTEN 서열의 추가 예는 미국 특허 공개 제2010/0239554 A1호, 제2010/0323956 A1호, 제2011/0046060 A1호, 제2011/0046061 A1호, 제2011/0077199 A1호, 또는 제2011/0172146 A1호, 또는 국제 특허 공개 제WO 2010091122 A1호, 제WO 2010144502 A2호, 제WO 2010144508 A1호, 제WO 2011028228 A1호, 제WO 2011028229 A1호, 제WO 2011028344 A2호, 제WO 2014/011819 A2호, 또는 제WO 2015/023891호에 개시되어 있다.

일부 양상에서, FIX 융합 단백질은 FIX 내에 삽입되거나, FIX의 C-말단에 융합되거나, 또는 둘 다인 하나 이상의 XTEN 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 XTEN 서열이 GLA 도메인 내에 삽입된다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 XTEN 서열이 EGF1 도메인 내에 삽입된다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 XTEN 서열이 EGF2 도메인 내에 삽입된다. 추가로 다른 실시형태에서, 하나 이상의 XTEN 서열이 AP 내에 삽입된다. 추가의 다른 실시형태에서, 하나 이상의 XTEN 서열이 촉매 도메인 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 XTEN 서열이 FIX의 C-말단에 융합된다.

특정 양상에서, FIX 융합 단백질은 표 7에 열거된 삽입 부위에서 삽입된 하나의 XTEN 서열을 포함한다. 다른 양상에서, FIX 융합 단백질은 표 7에 열거된 2개의 삽입 부위에서 삽입된 2개의 XTEN 서열을 포함한다. 특별한 실시형태에서, 2개의 XTEN 서열은 표 8에 열거된 2개의 삽입 부위 내에 삽입된다. 특정 양상에서, FIX 융합 단백질은 표 7에 열거된 3개의 삽입 부위에서 삽입된 3개의 XTEN 서열을 포함한다. 특정 양상에서, FIX 융합 단백질은 표 7에 열거된 4개의 삽입 부위에서 삽입된 4개의 XTEN 서열을 포함한다. 특정 양상에서, FIX 융합 단백질은 표 7에 열거된 5개의 삽입 부위에서 삽입된 5개의 XTEN 서열을 포함한다. 특정 양상에서, FIX 융합 단백질은 표 7에 열거된 6개의 삽입 부위에서 삽입된 6개의 XTEN 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 모든 삽입된 XTEN 서열은 동일하다. 다른 양상에서, 삽입된 XTEN 서열 중 적어도 하나는 삽입된 XTEN 서열의 나머지와 상이하다.

일부 양상에서, FIX 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 103, 서열번호 2의 아미노산 105, 서열번호 2의 아미노산 142, 서열번호 2의 아미노산 149, 서열번호 2의 아미노산 162, 서열번호 2의 아미노산 166, 서열번호 2의 아미노산 174, 서열번호 2의 아미노산 224, 서열번호 2의 아미노산 226, 서열번호 2의 아미노산 228, 서열번호 2의 아미노산 413, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된 하나의 XTEN 서열을 포함하며, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 나타낸다. 일부 양상에서, FIX 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 103, 서열번호 2의 아미노산 105, 서열번호 2의 아미노산 142, 서열번호 2의 아미노산 149, 서열번호 2의 아미노산 162, 서열번호 2의 아미노산 166, 서열번호 2의 아미노산 174, 서열번호 2의 아미노산 224, 서열번호 2의 아미노산 226, 서열번호 2의 아미노산 228, 서열번호 2의 아미노산 413, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 제2 XTEN 서열을 포함하거나, 여기서 제2 XTEN은 FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합되고, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 나타낸다. 특별한 일 양상에서, FIX 융합 단백질은 FIX의 C-말단에 융합된 하나의 XTEN 서열을 포함하고, XTEN은 길이가 42개 아미노산보다 길고, 144개 아미노산보다 짧은 아미노산 서열을 포함한다.

II.B .2. Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티는 Fc 영역(예를 들어, FcRn 결합 파트너) 또는 이의 단편이다. 특정 양상에서, 본 발명의 FIX 융합 단백질은 FIX 내에 삽입되거나, FIX의 C-말단에 융합되거나, 또는 둘 다인 적어도 하나의 Fc 영역(예를 들어, FcRn 결합 파트너)을 포함하며, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 갖고, 숙주 세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현될 수 있다. "Fc" 또는 "Fc 영역"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한 Fc 도메인, 이의 변이체, 또는 단편을 포함하는 기능적 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 파트너일 수 있다. FcRn 결합 파트너는 알부민을 포함하지만 이에 제한되지 않는, FcRn 결합 파트너의 FcRn 수용체에 의한 후속 능동 수송을 갖는 FcRn 수용체에 의해서 특이적으로 결합될 수 있는 임의의 분자이다. 따라서, 용어 Fc는 기능적인 IgG Fc의 임의의 변이체를 포함한다. FcRn 수용체에 결합하는 IgG의 Fc 부분의 영역은X선 결정학을 기초로 기술되었다(본 명세서에 전문이 참고로 포함된 문헌[Burmeister et al., Nature 372:379 (1994)]). Fc의 FcRn과의 주요 접촉 면적은 CH2 및 CH3 도메인의 접합부에 근접한다. Fc-FcRn 접촉은 모두 단일 Ig 중쇄 이내이다. FcRn 결합 파트너는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편, 및 FcRn의 완전한 결합 영역을 포함하는 IgG의 다른 단편을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. Fc는 면역글로불린의 힌지 영역을 갖거나 갖지 않는 면역글로불린의 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 융합 단백질에서 Fc 영역의 목적하는 특성, 예를 들어 반감기, 예를 들어, 생체내 반감기의 증가을 유지시키는 Fc 단편, 변이체, 또는 유도체가 또한 포함된다. 매우 많은 돌연변이체, 단편, 변이체, 및 유도체는 예를 들어, PCT 공개 제WO 2011/069164 A2호, 제WO 2012/006623 A2호, 제WO 2012/006635 A2호, 또는 제WO 2012/006633 A2호에 기술되어있고, 이들 전부는 이들의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.

하나 이상의 Fc 도메인이 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되거나, 폴리펩타이드의 C-말단에 융합되거나, 둘 다일 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 FIX 폴리펩타이드에 융합된다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 FIX 내에 삽입되거나 XTEN의 C-말단에 융합된 또 다른 이종 모이어티, 예컨대 XTEN에 융합된다. 일부 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 제2 Fc 도메인을 포함한다. 제2 Fc 도메인은 제1 Fc 도메인과, 예를 들어, 하나 이상의 공유 결합을 통해서 연관될 수 있다.

II.B .3. 알부민

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티는 알부민, 알부민 결합 도메인, 또는 알부민 결합 소분자, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 단편이다. 특정 양상에서, 본 발명의 FIX 융합 단백질은 FIX 내에 삽입되거나, FIX의 C-말단에 융합되거나 또는 둘 다인 적어도 하나의 알부민 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하고, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 갖고, 숙주 세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현될 수 있다. 이의 전장 형태에서 609개 아미노산의 단백질인 인간 혈청 알부민(HSA, 또는 HA)은 혈청의 삼투압의 상당한 비율에 책임이 있고, 또한 내인성 리간드 및 외인성 리간드의 담체로서 기능한다. 용어 "알부민"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 전장 알부민 또는 이의 기능적 단편, 변이체, 유도체, 또는 유사체를 포함한다. 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체는 미국 특허 공개 제2008/0194481A1호, 제2008/0004206 A1호, 제2008/0161243 A1호, 제2008/0261877 A1호, 또는 제2008/0153751 A1호 또는 PCT 출원 공개 제2008/033413 A2호, 제2009/058322 A1호, 또는 제2007/021494 A2호에 개시되어 있으며, 이들은 이들의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.

알부민-결합 폴리펩타이드(ABP)는 제한 없이 박테리아 알부민-결합 도메인, 알부민-결합 펩타이드, 또는 알부민에 결합할 수 있는 알부민-결합 항체 단편을 손상시킬 수 있다. 문헌[Kraulis et al., FEBS Lett. 378:190-194 (1996)] 및 [Linhult et al., Protein Sci. 11:206-213 (2002)]에 개시된 바와 같은 스트렙토코칼(streptococcal) 단백질 G로부터의 도메인 3이 박테리아 알부민-결합 도메인의 예이다. 알부민-결합 펩타이드의 예는 중심 서열 DICLPRWGCLW(서열번호 163)를 갖는 일련의 펩타이드를 포함한다(예를 들어, 문헌[Dennis et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002) 참고]. 알부민-결합 항체 단편의 예는 문헌[Muller and Kontermann, Curr . Opin . Mol . Ther. 9:319-326 (2007)]; [Roovers et al., Cancer Immunol . Immunother. 56:303-317 (2007)], 및 [Holt et al., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008)]에 개시되어 있고, 이들은 이들의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.

특정 양상에서, 본 발명의 FIX 융합 단백질은 FIX 내에 삽입되거나, FIX의 C-말단에 융합되거나, 둘 다인 알부민(예를 들어, 알부민 결합 소분자)에 결합할 수 있는 비-폴리펩타이드 소분자, 이의 변이체, 또는 유도체를 위한 적어도 하나의 부착 부위를 포함하며, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 갖고, 숙주 세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 FIX 융합 단백질은 FIX 내의 하나 이상의 삽입 부위에 부착되거나, FIX의 C-말단에 융합되거나, 둘 다인 하나 이상의 유기 알부민-결합 모이어티를 포함할 수 있으며, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 갖고, 숙주 세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현될 수 있다. 이러한 알부민-결합 모이어티의 예는 문헌[Trussel et al., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009)]에 개시된 바와 같은 2-(3-말레이미도프로판아미도)-6-(4-(4-아이오도페닐)부탄아미도)헥산오에이트("Albu" 태그)이다.

일부 실시형태에서, 알부민-결합 폴리펩타이드 서열은 C-말단, N-말단, 또는 두 말단에서 Gly-Ser 펩타이드 링커 서열에 의해서 측면에 존재한다. 일부 실시형태에서, Gly-Ser 펩타이드 링커는 Gly₄Ser(서열번호 161)이다. 다른 실시형태에서, Gly-Ser 펩타이드 링커는 (Gly₄Ser)₂(서열번호 162)이다.

II.B .4. CTP

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티는 인간 융모막 생식선 자극 호르몬 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체의 β 소단위의 C-말단 펩타이드(CTP)이다. 특정 양상에서, 본 발명의 FIX 융합 단백질은 FIX 내에 삽입되거나, FIX의 C-말단에 융합되거나 또는 둘 다인 적어도 하나의 CTP 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하고, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 갖고, 숙주 세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현될 수 있다. 재조합 단백질 내에 삽입된 하나 이상의 CTP 펩타이드는 이 단백질의 반감기를 증가시킨다고 공지되어 있다(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,712,122호 참고). 예시적인 CTP 펩타이드는 DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(서열번호 164) 또는 SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(서열번호 165)를 포함한다(예를 들어, 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제US 2009/0087411 A1호 참고). 일부 실시형태에서, CTP 서열은 C-말단, N-말단, 또는 두 말단에서 Gly-Ser 펩타이드 링커 서열에 의해서 측면에 존재한다. 일부 실시형태에서, Gly-Ser 펩타이드 링커는 Gly₄Ser(서열번호 161)이다. 다른 실시형태에서, Gly-Ser 펩타이드 링커는 (Gly₄Ser)₂(서열번호 162)이다.

II.B .5. PAS

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티는 PAS 펩타이드이다. 특정 양상에서, 본 발명의 FIX 융합 단백질은 FIX 내에 삽입되거나, FIX의 C-말단에 융합되거나 또는 둘 다인 적어도 하나의 PAS 펩타이드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하고, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 갖고, 숙주 세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현될 수 있다. "PAS 펩타이드" 또는 "PAS 서열"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 주로 알라닌 및 세린 잔기를 포함하거나, 주로 알라닌, 세린, 및 프롤린 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 의미하고, 이 아미노산 서열은 생리 조건 하에서 랜덤 코일 컨포메이션을 형성한다. 따라서, PAS 서열은 융합 단백질에서 이종 모이어티의 부분으로서 사용될 수 있는 알라닌, 세린, 및 프롤린을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진 빌딩 블록, 아미노산 중합체, 또는 서열 카세트이다. 아미노산 중합체는 또한 알라닌, 세린, 및 프롤린이 아닌 잔기가 PAS 서열 내에서 소량의 구성 성분으로서 첨가되는 경우 랜덤 코일 컨포메이션을 형성할 수 있다. "소량의 구성 성분"은 알라닌, 세린, 및 프롤린이 아닌 아미노산이 PAS 서열에서 특정 정도, 예를 들어 아미노산의 최대 약 12%, 즉 PAS 서열의 100개 아미노산 중 약 12개, 최대 약 10%, 최대 약 9%, 최대 약 8%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 즉. 약 2%, 또는 약 1%로 첨가될 수 있다는 것을 의미한다. 알라닌, 세린 및 프롤린과 상이한 아미노산은 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 생리 조건 하에서, PAS 펩타이드는 랜덤 코일 컨포메이션을 형성하고, 이에 의해서 본 발명의 재조합 단백질에 대한 증가된 생체내 및/또는 시험관내 안정성을 매개할 수 있고, 응혈촉진 활성을 갖는다.

PAS 펩타이드의 비제한적인 예는 ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(서열번호 154), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(서열번호 155), APSSPSPSAPSSPSPASPSS(서열번호 156), APSSPSPSAPSSPSPASPS(서열번호 157), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(서열번호 158), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(서열번호 159), ASAAAPAAASAAASAPSAAA(서열번호 160) 또는 이들의 임의의 변이체, 유도체, 단편, 또는 조합물을 포함한다. PAS 서열의 추가 예는 예를 들어, 미국 특허 공개 제2010/0292130 A1호 및 PCT 출원 공개 제WO 2008/155134 A1호, 유럽 등록 특허 제EP2173890호로부터 공지되어 있다.

일부 실시형태에서, PAS 서열은 C-말단, N-말단, 또는 두 말단에서 Gly-Ser 펩타이드 링커 서열에 의해서 측면에 존재한다. 일부 실시형태에서, Gly-Ser 펩타이드 링커는 Gly₄Ser(서열번호 161)이다. 다른 실시형태에서, Gly/Ser 펩타이드 링커는 (Gly₄Ser)₂(서열번호 162)이다.

II.B .6. HAP

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티는 호모-아미노산 중합체 (HAP) 펩타이드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체이다. 특정 양상에서, 본 발명의 FIX 융합 단백질은 FIX 내에 삽입되거나, FIX의 C-말단에 융합되거나 또는 둘 다인 적어도 하나의 호모-아미노산 중합체(HAP) 펩타이드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하고, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 갖고, 숙주 세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현될 수 있다. HAP 펩타이드는 적어도 50개의 아미노산, 적어도 100개의 아미노산, 120개의 아미노산, 140개의 아미노산, 160개의 아미노산, 180개의 아미노산, 200개의 아미노산, 250개의 아미노산, 300개의 아미노산, 350개의 아미노산, 400개의 아미노산, 450개의 아미노산, 또는 500개의 아미노산 길이를 갖는 글리신의 반복 서열을 포함할 수 있다. HAP 서열은 HAP 서열에 융합되거나 연결된 모이어티의 반감기를 연장시킬 수 있다. HAP 서열의 비제한적인 예는 (Gly)_n, (Gly₄Ser)_n 또는 S(Gly₄Ser)_n을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20이다. 일 실시형태에서, n은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40이다. 또 다른 실시형태에서, n은 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200이다(예를 들어, 문헌[Schlapschy M et al., Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007)] 참고).

II.B .7. 유기 중합체

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 이종 모이어티는 유기 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리시알산, 또는 하이드록시에틸 전분이다. 특정 양상에서, 본 발명의 FIX 융합 단백질은 FIX 내에 삽입되거나, FIX의 C-말단에 융합되거나 또는 둘 다인 비-폴리펩타이드 이종 모이어티 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 위한 적어도 하나의 삽입 부위를 포함하고, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 갖고, 숙주 세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 FIX 융합 단백질은 FIX 서열 내에 부착되거나, FIX의 C-말단에 부착되거나, 둘 다인 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 포함할 수 있으며, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 갖고, 숙주 세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현될 수 있다.

페길화된 FIX는 FIX와 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자 사이에 형성된 접합체를 지칭할 수 있다. PEG는 매우 다양한 분자량 및 평균 분자량 범위로 상업적으로 입수 가능하다. PEG 평균 분자량 범위의 전형적인 예는 약 200, 약 300, 약 400, 약 600, 약 1000, 약 1300 내지 1600, 약 1450, 약 2000, 약 3000, 약 3000 내지 3750, 약 3350, 약 3000 내지 7000, 약 3500 내지 4500, 약 5000 내지 7000, 약 7000 내지 9000, 약8000, 약 10000, 약 8500 내지 11500, 약 16000 내지 24000, 약 35000, 약 40000, 약 60000, 및 약 80000달톤을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이들 평균 분자량은 단지 예로서 제공되며, 어떤 방식으로도 제한으로서 의미되지 않는다.

본 발명의 FIX 융합 단백질은 모노- 또는 폴리-(예를 들어, 2 내지 4개) PEG 모이어티를 포함하도록 페길화될 수 있다. 페길화는 관련 기술 분야에 공지된 페길화 반응 중 임의의 것에 의해서 수행될 수 있다. 페길화된 단백질 산물의 제조 방법은 일반적으로 (i) 폴리펩타이드를 조건 하에서 폴리에틸렌 글리콜(예컨대 PEG의 반응성 에스터 또는 알데하이드 유도체)과 반응시키고, 이에 의해서 본 발명의 펩타이드가 하나 이상의 PEG기에 부착되는 단계; 및 (ii) 반응 산물(들)을 수득하는 단계를 포함할 것이다. 일반적으로, 반응을 위한 최적의 반응 조건은 공지된 파라미터 및 목적하는 결과를 기초로 사례별로 결정될 것이다.

관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 입수 가능한 다수의 PEG 부착 방법(예를 들어 문헌[Malik F et al., Exp . Hematol. 20:1028-35 (1992)]; [Francis, Focus on Growth Factors 3(2):4-10 (1992)]; 유럽 특허 공개 제EP0401384호, 제EP0154316호, 및 제EP0401384호; 및 국제 특허 출원 공개 제WO92/16221호 및 제WO95/34326호)이 존재한다. 비제한적인 예로서, FIX 변이체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 삽입 부위에서 또는 그 부근에서 시스테인 치환을 함유할 수 있고, 시스테인은 PEG 중합체에 추가로 접합될 수 있다(전문이 참고로 본 명세서에 포함된 문헌[Mei et al., Blood 116:270-279 (2010)] 및 미국 특허 제7,632,921호 참고).

다른 실시형태에서, 유기 중합체 폴리시알산(PSA)이다. PSA는 특정 박테리아 균주에 의해서 그리고 포유동물에서 특정 세포에서 생산되는 시알산의 자연 발생 비분지형 중합체이다(문헌[Roth J. et al. (1993) in Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds. Roth J.,　Rutishauser　U., Troy F. A. (

, Basel, Switzerland), pp. 335-348] 참고). PSA는 제한된 산 가수분해에 의해서 또는 뉴라미다제로의 소화에 의해서 또는 중합체의 자연 박테리아 유래된 형태의 분별에 의해서 n이 약 80 이상인 시알산 잔기로부터 n이 2인 것까지의 다양한 중합도로 생산될 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 입수 가능한 다수의 PSA 부착 방법, 예를 들어, 상기에 기술된 것과 동일한 PEG 부착 방법이 존재한다. 특정 양상에서, 활성화된 PSA가 FIX 상의 시스테인 아미노산 잔기에 부착될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5846951호 참고).

다른 실시형태에서, 유기 중합체는 하이드록시에틸 전분(HES) 중합체이다. 특정 양상에서, 본 발명의 FIX 융합 단백질은 FIX 내의 하나 이상의 부위에서 접합되거나, FIX의 C-말단에 융합되거나, 또는 둘 다인 적어도 하나의 HES 중합체를 포함하며, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 갖고, 숙주 세포에서 생체내 또는 시험관내에서 발현될 수 있다.

III. 폴리뉴클레오타이드 , 벡터, 숙주 세포, 및 제조 방법

본 발명은 본 명세서에 기술된 FIX 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포, 또는 FIX 융합 단백질의 제조 방법을 추가로 제공한다.

FIX 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 단일 뉴클레오타이드 서열, 2개의 뉴클레오타이드 서열, 3개의 뉴클레오타이드 서열, 또는 그 초과일 수 있다. 일 실시형태에서, 단일 뉴클레오타이드 서열은 FIX 폴리펩타이드 및 이종 모이어티(예를 들어, XTEN)를 포함하는 FIX 융합 단백질, 예를 들어 FIX 폴리펩타이드 및 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된 XTEN, FIX 폴리펩타이드의 C 말단에 융합된 Fc 도메인, 및 임의적인 링커에 의해서 FIX 폴리펩타이드에 융합된 제2 Fc 도메인을 포함하는 FIX 융합 단백질을 암호화한다. 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 2개의 뉴클레오타이드 서열, FIX 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된 XTEN 및 이종 모이어티, 예를 들어, Fc를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 2개의 뉴클레오타이드 서열, FIX 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된 XTEN, 및 FIX 폴리펩타이드에 융합된 Fc 도메인, 및 제2 Fc 도메인을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 암호화된 Fc 도메인은 발현 후 공유 결합을 형성할 수 있다.

일부 실시형태에서, FIX 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈-최적화된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 때, 삽입된 암호 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소, 또는 RNA 바이러스 벡터의 경우에, 복제 및 번역에 필요한 요소를 함유하는 임의의 핵산 작제물을 지칭한다. 발현 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바이러스, 및 이들의 유도체를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 유전자 발현 제어 서열은 임의의 조절 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 프로모터 서열 또는 프로모터-인핸서 조합물이고, 이것은 그것이 작동 가능하게 연결된 암호 핵산의 효율적인 전사 및 번역을 가능하게 한다. 유전자 발현 제어 서열은 예를 들어 포유동물 또는 바이러스 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 구성적 포유동물 프로모터는 하기 유전자를 위한 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다: 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 카이나제, 베타-액틴 프로모터, 및 다른 구성적 프로모터. 진핵 세포에서 구성적으로 기능하는 예시적인 바이러스 프로모터는 예를 들어, 시토메갈로바이러스(CMV), 유인원 바이러스(예를 들어, SV40), 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 라우스 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 몰로니 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복부(LTR), 및 다른 레트로바이러스로부터의 프로모터, 및 단순 허피스 바이러스의 티미딘 키나아제 프로모터를 포함한다. 다른 구성적 프로모터는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 본 발명의 유전자 발현 서열로서 유용한 프로모터는 또한 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는 유도제의 존재 하에서 발현된다. 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터는 특정 금속 이온의 존재 하에서 전사 및 번역을 향상시키도록 유도된다. 다른 유도성 프로모터는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

본 발명의 추가 목적을 위해서, 다수의 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다.　이들 발현 벡터는 전형적으로 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 숙주 유기체 내에서 복제 가능하다.　발현 벡터는 프로모터(예를 들어, 자연-연관 또는 이종 프로모터), 인핸서, 신호 서열, 스플라이스 신호, 인핸서 요소, 및 전사 종결 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않은 발현 제어 서열을 포함할 수 있다.　바람직하게는, 발현 제어 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템이다.　발현 벡터는 또한 동물 바이러스, 예컨대소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 박시나 바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV), 시토메갈로바이러스(CMV), 또는 SV40 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 사용할 수 있다.　다른 것은 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 폴리시스트론 시스템의 사용을 포함한다.

일반적으로, 발현 벡터는 목적하는 DNA 서열로 형질전환된 이들 세포의 검출을 허용하도록 선택 마커(예를 들어, 암피실린-내성, 하이그로마이신-내성, 테트라사이클린-내성 또는 네오마이신 내성)를 포함한다(예를 둘어 이타쿠라(Itakura) 등의 미국 특허 제4,704,362호 참고). 　염색체 내에 DNA가 통합된 세포는 형질감염된 숙주 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선택될 수 있다.　마커는 자기영양생물에 영양 요구 숙주, 살생물 내성(예를 들어, 항생제) 또는 중금속, 예컨대 구리에 대한 내성을 제공할 수 있다.　이들 선택 마커 유전자는 동시형질전환(cotransformation)에 의해서 동일한 세포 내에서 발현 또는 도입될 DNA 서열에 직접 연결될 수 있다.

최적화된 FIX 서열을 발현시키는 데 유용한 벡터의 예는 NEOSPLA(미국 특허 제6,159,730호)이다.　이러한 벡터는 시토메갈로바이러스 프로모터/인핸서, 마우스 베타 글로빈 주 프로모터, SV40 복제 기원, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 엑손 1 및 엑손 2, 다이하이드로폴레이트 리덕타제 유전자 및 리더 서열을 함유한다.　이러한 벡터는 세포에서 가변 영역 유전자 및 불변 영역 유전자의 혼입, 세포 내에서의 형질감염, 그 다음 G418 함유 배지 및 메토트렉세이트 증폭에서의 선택 시 매우 높은 수준의 항체 발현을 유발하는 것으로 밝혀졌다.　벡터 시스템은 또한 미국 특허 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,736,137호 및 제5,658,570호에 교시되어 있다.　이러한 시스템은 높은 발현 수준, 예를 들어 30pg/세포/일 초과의 발현 수준을 제공한다.　다른 예시적인 벡터 시스템은 미국 특허 제6,413,777호에 개시되어 있다.

다른 실시형태에서 본 발명의 폴리펩타이드는 폴리시스트론성 작제물을 사용하여 발현된다. 이들 발현 시스템에서, 복수의 관심 유전자 산물, 예컨대 멀티머 결합 단백질의 복수의 폴리펩타이드는 단일 폴리시스트론성 작제물로부터 생산될 수 있다. 이들 시스템은 유리하게는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하여 진핵 숙주 세포에서 비교적 높은 수준의 폴리 펩타이드를 제공한다. 상용성 IRES 서열은 본 명세서에 또한 포함된 미국 특허 제6,193,980호에 개시되어 있다.

보다 일반적으로, 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터 또는 DNA 서열이 제조되면, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포 내에 도입될 수 있다.　즉, 숙주 세포는 형질전환될 수 있다.　플라스미드의 숙주 세포 내로의 도입은 상기에 논의된 바와 같이, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다양한 기술에 의해서 성취될 수 있다.　형질전환된 세포는 FIX 폴리펩타이드의 생산에 적절한 조건 하에서 성장되고, FIX 폴리펩타이드 합성에 대해서 검정된다. 예시적인 검정법 기술은 효소-연결 면역흡착 검정법(ELISA), 방사선면역검정법(RIA), 또는 형광-활성화 세포 분류기 분석법(FACS), 면역조직화학 등을 포함한다.

재조합 숙주로부터 폴리펩타이드를 단리하기 위한 방법의 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은 그것이 달리 명백하게 명시되지 않는 한 폴리펩타이드의 기원을 의미하는 것으로 상호 교환 가능하게 사용된다. 즉, "세포"로부터의 폴리펩타이드의 회수는 전체 세포의 스피닝으로부터 유래되는 것 또는 배지 및 현탁된 세포 둘 모두를 함유하는 세포 배양물로부터 유래되는 것을 의미할 수 있다.

단백질 발현을 위해서 사용되는 숙주 세포주는 바람직하게는 포유동물 기원; 가장 바람직하게는 인간 또는 마우스 기원이다.　예시적인 숙주 세포주는 상기에 기술된 바와 같다.　FIX 활성을 갖는 폴리펩타이드의 생산 방법의 일 실시형태에서, 숙주 세포는 HEK293 세포이다.　FIX 활성을 갖는 폴리펩타이드의 생산 방법의 또 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.

본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 또한 비-포유동물 세포, 예컨대 박테리아 또는 효모 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다.　이와 관련하여, 다양한 단세포 비-포유동물 미생물, 예컨대 박테리아가 또한 형질전환될 수 있다는 것이 인지될 것이고; 즉, 배양물 또는 발효물에서 성장될 수 있는 것이다.　형질전환에 민감한 박테리아는 엔테로박테리아케아에(enterobacteriaceae)의 구성원, 예컨대 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살모넬라의 균주; 바실라케아에( Bacillaceae), 예컨대 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis); 페누모코쿠스(Pneumococcus); 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 및 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilusinfluenzae)를 포함한다.　박테리아에서 발현될 때, 폴리펩타이드는 전형적으로 봉입체(inclusion body)의 부분이 된다는 것이 추가로 인식될 것이다. 폴리펩타이드는 단리되고, 정제되고, 이어서 기능적 분자로 조립되어야 한다.

대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 유전자이식(transgenic) 동물의 게놈 내로의 도입 및 그 다음 유전자이식 동물의 우유에서의 발현을 위해서 이식유전자에 혼입될 수 있다(예를 들어, 델보어(Deboer) 등의 미국 특허 제US 5,741,957호, 로젠(Rosen)의 미국 특허 제US 5,304,489호 및 매드(Meade) 등의 미국 특허 제US 5,849,992호 참고).　적합한 이식유전자는 유선 특이적 유전자, 예컨대 카제인 또는 베타 락토글로불린으로부터의 프로모터 및 인핸서와 작동 가능하게 연결된 폴리펩타이드에 대한 암호 서열을 포함한다.

시험관내 생산은 많은 양의 목적하는 폴리펩타이드를 제공하도록 규모 확대를 허용한다.　조직 배양 조건 하에서의 포유동물 세포 재배를 위한 기술은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 에어리프트 반응기(airlift reactor) 중에서 또는 연속 교반기 반응기 중에서의 균질 현탁 배양, 또는 예를 들어 중공 섬유 중에서, 마이크로캡슐 중에서, 아가로스 마이크로비드 상에서 또는 세라믹 카트리지 상에서의 고정화 또는 포획 세포 배양을 포함한다.　필요하고/하거나 목적하는 경우, 예를 들어, 합성 힌지 영역 폴리펩타이드의 우선적 생합성 후에 또는 본 명세서에 기술된 HIC 크로마토그래피 단계 전에 또는 후에, 폴리펩타이드의 용액을 통상의 크로마토그래피 방법, 예를 들어 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로스 상에서의 크로마토그래피 또는 (면역-)친화도 크로마토그래피에 의해서 정제할 수 있다. 하류 정제를 용이하게 하기 위해서 친화도 태그 서열(예를 들어, His(6) 태그)이 폴리펩타이드 서열 내에 임의로 부착 또는 포함될 수 있다.

발현 후, FIX　단백질을 황산암모늄 침전, 친화도 칼럼 크로마토그래피, HPLC 정제, 겔 전기영동 등을 비롯한 관련 기술 분야의 표준 절차에 따라서 정제할 수 있다(일반적으로 문헌[Scopes, Protein Purification(Springer-Verlag, N.Y., (1982)] 참고).　약제학적 용도를 위해서, 적어도 약 90% 내지 95% 동질성의 실질적으로 순수한 단백질이 바람직하고, 98% 내지 99% 또는 그 초과의 동질성이 가장 바람직하다.

일 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 진핵 세포는 최종 핵을 갖는 임의의 동물 또는 식물 세포를 지칭한다. 동물의 진핵 세포는 척추동물, 예를 들어, 포유동물의 세포, 및 무척추동물, 예를 들어 곤충의 세포를 포함한다. 진핵 세포의 식물은 구체적으로 제한 없이 효모 세포를 포함할 수 있다. 진핵 세포는 원핵 세포, 예를 들어, 박테리아와 구별된다.

특정 실시형태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포이다. 포유동물 세포는 포유동물로부터 유래된 임의의 세포이다. 포유동물 세포는 구체적으로 포유동물 세포주를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일 실시형태에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 포유동물 세포는 인간 배아 신장 세포주인 HEK 293 세포이다. HEK 293 세포는 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(미국 버지니아주 머내서스 소재)로부터 CRL-1533로서 입수 가능하고, 인비트로젠(Invitrogen)(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)로부터 293-H 세포, 카탈로그 번호 11631-017 또는 293-F 세포, 카탈로그 번호 11625-019로서 입수 가능하다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 망막으로부터 유래된 인간 세포주인 PER.C6(등록상표) 세포이다. PER.C6(등록상표) 세포는 크루셀(Crucell)(네덜란드 라이덴 소재)로부터 입수 가능하다. 다른 실시형태에서, 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. CHO 세포는 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(미국 버지니아주 머내서스 소재)로부터 입수 가능하다(예를 들어, CHO-K1; CCL-61). 추가의 다른 실시형태에서, 포유동물 세포는 아기 햄스터 신장(BHK) 세포이다. BHK 세포는 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(미국 버지니아주 머내서스 소재)로부터 입수 가능하다(예를 들어, CRL-1632). 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 HEK293 세포와 인간 B 세포주의 혼성 세포주인 HKB11 세포이다(문헌[Mei et al., Mol. Biotechnol. 34(2): 165-78 (2006)]).

추가의 다른 실시형태에서, 형질감염된 세포는 안정적으로 형질감염된다. 이들 세포는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 종래의 기술을 사용하여, 안정한 세포주로서 선택 및 유지될 수 있다.

단백질의 DNA 작제물을 함유하는 숙주 세포를 적절한 성장 배지 중에서 성장시킨다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "적절한 성장 배지"는 세포의 성장을 위해서 필요한 영양분을 함유하는 배지를 의미한다. 세포 성장에 필요한 영양분은 탄소 공급원, 질소 공급원, 필수 아미노산, 비타민, 미네랄 및 성장 인자를 포함할 수 있다. 임의로, 배지는 1종 이상의 선택 인자를 함유할 수 있다. 임의로 배지는 우태아 혈청 또는 소태아 혈청(fetal calf serum)(FCS)을 함유할 수 있다. 일 실시형태에서, 배지는 실질적으로 어떤 IgG도 함유하지 않는다. 성장 배지는 일반적으로 예를 들어, DNA 작제물 상에서 선택 마커에 의해서 보완되거나 또는 DNA 작제물로 동시-형질감염되는 필수 영양분에서 약물 선택 또는 결핍에 의해서, DNA 작제물을 함유하는 세포에 대해서 선택할 것이다. 배양된 포유동물 세포는 일반적으로 상업적으로 입수가능한 혈청-함유 또는 혈청-무함유 배지(예를 들어, MEM, DMEM, DMEM/F12) 중에서 성장된다. 일 실시형태에서, 배지는 CD293(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)이다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 CD17(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)이다. 사용되는 특정 세포주에 적절한 배지의 선택은 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 수준 범위이다.

일부 실시형태에서, 핵산, 벡터, 또는 숙주 세포는 단백질 전환효소를 암호화하는 추가 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 단백질 전환효소는 전구단백질 전환효소(proprotein convertase) 서브틸리신/켁신 유형 5(PCSK5 또는 PC5), 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 7(PCSK7 또는 PC5), 효모 켁스 2, 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 3(PACE 또는 PCSK3), 및 이들의 2종 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 전환효소는 PACE, PC5, 또는 PC7이다. 구체적인 실시형태에서, 단백질 전환효소는 PC5 또는 PC7이다(본 명세서에 참고로 포함된 국제 출원 공개 제WO 2012/006623호 참고). 또 다른 실시형태에서, 단백질 전환효소는 PACE/퓨린이다.

특정 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 방법에 의해서 생산된 FIX 융합 단백질에 관한 것이다.

특정 양상에서, 본 발명의 숙주 세포는 생체내 또는 시험관내에서 FIX 융합 단백질을 발현시킬 수 있다. 시험관내 생산은 본 발명의 다량의 목적하는 변경된 폴리펩타이드를 제공하도록 규모 확대를 허용한다. FIX 융합 단백질은 본 명세서에 기술된 숙주 세포를 FIX 융합 단백질이 발현되는 조건 하에서 배양함으로써 생산될 수 있다. 조직 배양 조건 하에서의 포유동물 세포 재배를 위한 기술은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 에어리프트 반응기 중에서 또는 연속 교반기 반응기 중에서의 균질 현탁 배양, 또는 예를 들어 중공 섬유 중에서, 마이크로캡슐 중에서, 아가로스 마이크로비드 상에서 또는 세라믹 카트리지 상에서의 고정화 또는 포획 세포 배양을 포함한다. 필요하고/하거나 목적하는 경우, 폴리펩타이드의 용액을 통상의 크로마토그래피 방법, 예를 들어 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), DEAE-셀룰로스 상에서의 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피에 의해서 정제할 수 있다. 다른 양상에서, 숙주 세포는 생체내에서 FIX 융합 단백질을 발현시킬 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같이 삽입 부위 내에 이종 모이어티를 삽입하거나, FIX의 C-말단에 이종 모이어티를 융합시키거나, 둘 다를 포함하는 FIX 융합 단백질의 제조 방법을 포함하며, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 나타낸다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같이 삽입 부위 내에 이종 모이어티를 삽입하거나, FIX의 C-말단에 이종 모이어티를 융합시키거나, 둘 다를 포함하는, FIX 단백질 응혈촉진 활성을 제거 또는 감소시키지 않으면서 FIX 단백질의 반감기를 증가시키는 방법을 포함하며, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 나타내고, 이종 모이어티가 없는 FIX 단백질과 비교할 때 반감기가 증가된다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같이 삽입 부위 내이거나, FIX의 C-말단에 융합되거나 또는 둘 다인 적어도 하나의 이종 모이어티를 포함하는 FIX 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 설계하는 단계를 포함하는 FIX 융합 단백질의 작제 방법을 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같이 삽입 부위 내에 이종 모이어티를 삽입하거나, FIX의 C-말단에 이종 모이어티를 융합시키거나, 둘 다를 포함하는 FIX 융합 단백질의 발현을 증가시키는 방법을 포함하며, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 나타낸다.

추가의 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같이 삽입 부위 내에 이종 모이어티를 삽입하거나, FIX의 C-말단에 이종 모이어티를 융합시키거나, 둘 다를 포함하는, FIX 융합 단백질의 용혈촉진 활성을 보유하는 방법을 제공하며, 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 나타낸다.

IV. 약제학적 조성물 및 치료 방법

본 발명은 응고 질환 또는 병태 또는 출혈 병태의 예방, 치료, 개선 또는 관리를 필요로 하는 인간 대상체에서 본 발명의 FIX 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 사용하여 응고 질환 또는 병태 또는 출혈 병태를 예방, 치료, 개선 또는 관리 방법을 추가로 제공한다. 예시적인 방법은 본 발명의 FIX 융합 단백질을 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 조성물/제형을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 특정 양상에서, 본 발명의 FIX 융합 단백질을 발현시키는 세포가 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 특정 양상에서, 약제학적 조성물은 (i) FIX 융합 단백질, (ii) FIX 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산, (iii) FIX 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, (iv) FIX 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산을 포함하는 세포 및/또는 FIX 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (v) 이들의 조합물을 포함하고, 약제학적 조성물은 허용 가능한 부형제 또는 담체를 추가로 포함한다.

본 발명의 FIX 융합 단백질은 환자에게 정맥내로, 피하로, 또는 경구로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 대상체에게 정맥내 주사에 의해서 투여된다. 다른 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 대상체에게 피하 주사에 의해서 투여된다. 주사는 단일 볼러스를 포함할 수 있다. 대상체에게 1회 초과의 주사가 제공될 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 예방적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "예방적 치료"는 출혈 에피소드 이전의 분자의 투여를 지칭한다. 일 실시형태에서, 일반적인 지혈제를 필요로 하는 대상체는 수술을 받고 있거나, 수술을 받을 준비중이다. 본 발명의 융합 단백질은 예방제로서 수술 전 또는 수술 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 급성 출혈 에피소드를 제어하기 위해서 수술 전 또는 수술 후에 투여될 수 있다. 수술은 간 이식, 간 절제, 치과 절차 또는 줄기 세포 이식을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 융합 단백질은 또한 주문형(on-demand) 치료를 위해서 사용된다. 용어 "주문형 치료"는 출혈 에피소드의 증상에 반응하여 또는 출혈을 유발할 수 있는 활동 전에 융합 단백질을 투여하는 것을 지칭한다. 일 양상에서, 주문형 치료는 출혈이 시작될 때, 예컨대 부상 후에 또는 출혈이 예상될 때, 예컨대 수술 전에 대상체에게 제공된다. 또 다른 양상에서, 주문형 치료는 출혈 위험을 증가시키는 활동, 예컨대 접촉 스포츠 이전에 제공된다.

다른 실시형태에서, 융합 단백질은 급성 출혈 에피소드를 제어, 개선 또는 치료하는 데 사용된다. 다른 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 이종 모이어티가 없는 상응하는 FIX 단백질과 비교할 때 하나 이상의 약동학 파라미터를 나타낸다. PK 파라미터는 FIX 항원 수준(흔히 본 명세서에서 "항원"으로서 부가적으로 표현됨) 또는 FIX 활성 수준(흔히 본 명세서에서 "활성"으로서 부가적으로 표현됨")을 기초로 할 수 있다. 문헌에서, PK 파라미터는 흔히 FIX에 대한 항체를 사용하여 투여된(즉, 외인성) FIX를 측정하는 능력을 방해하는, 내인성 불활성 FIX의 일부 대상체의 혈장 중의 존재로 인해서 FIX 활성을 수준을 기초로 한다. 그러나, FIX가 본 명세서에 제공된 바와 같이 Fc 융합 단백질의 부분으로서 투여된 경우, 투여된(즉, 외인성) FIX 항원은 이종 폴리펩타이드에 대한 항체를 사용하여 정확하게 측정될 수 있다. 또한, 특정 PK 파라미터는 모델 예측 데이터(흔히 본 명세서에서 "모델 예측치"로서 부가적으로 표현됨) 또는 관찰 데이터(흔히 본 명세서에서 "관찰치"로서 부가적으로 표현됨)를 기초로 하며, 바람직하게는 관찰 데이터를 기초로 한다.

FIX 융합 단백질은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 수단을 통해서 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, FIX 융합 단백질은 국소(예를 들어, 경피 또는 눈), 경구, 볼, 비강, 질, 직장 또는 비경구(예를 들어, 피하, 피내, 혈관내/정맥내, 근육내, 척추, 두개내, 척추강내, 안내, 안주위, 안와내, 활액내(intrasynovial), 및 복강내 주사) 투여를 통해서 투여될 수 있다. 특별한 일 실시형태에서, FIX 융합 단백질은 피하 주사를 통해서 투여된다. 피하 주사는 예를 들어, FIX 융합 단백질의 용량의 단일 볼러스를 비롯한, 하나 이상의 볼러스를 포함할 수 있다. 대안적으로, FIX 융합 단백질은 정맥내 주사를 통해서 투여될 수 있다.

FIX 융합 단백질의 용량은 특정 융합 단백질 및 대상체의 병태의 본성에 따라서 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, FIX 융합 단백질의 용량은 FIX 융합 단백질 1 내지 1000IU/㎏을 포함할 수 있다

출혈 병태는 혈액 응집 장애에 의해서 유발될 수 있다. 혈액 응집 장애는 또한 응고장애(coagulopathy)로서 지칭될 수 있다. 일례에서, 본 개시 내용의 약제학적 조성물로 치료될 수 있는 혈액 응집 장애는 혈우병이다. 또 다른 예에서, 본 개시 내용의 약제학적 조성물로 치료될 수 있는 혈액 응집 장애는 혈우병 B이다.

일부 실시형태에서, 출혈 병태와 연관된 출혈의 유형은 관절혈종(hemarthrosis), 근육 출혈, 구강 출혈, 대출혈, 근육 내 대출혈, 구강 대출혈, 외상, 두부 외상(trauma capitis), 위장관출혈, 두개내 대출혈, 복강내 대출혈, 흉내 대출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두 후강 내의 출혈, 후복막 공간 내의 출혈, 및 장요근 부위(illiopsoas sheath) 내의 출혈로부터 선택된다.

다른 실시형태에서, 출혈 병태를 앓고 있는 대상체는 예를 들어, 수술적 예방 또는 수술 전후 관리(peri-operative management)를 비롯한, 수술을 위한 치료를 필요로 한다. 일례에서, 수술은 경미한 수술 및 주요 수술로부터 선택된다. 예시적인 수술 절차는 발치, 편도선 절제술, 서혜부 헤르니아 절제술, 활막 절제술, 두개 절제술, 골접합술, 외상 수술, 두개내 수술, 복강내 수술, 흉내 수술, 관절 치환 수술(예를 들어, 전슬관절 치환술, 고관절 치환술 등), 심장 수술 및 제왕절개술을 포함한다.

또 다른 예에서, 대상체는 인자 VIII로 부수적으로 치료된다. 본 발명의 화합물은 FIXa를 활성화시킬 수 있기 때문에, 이것은 FIXa를 대상체에 투여하기 전에 FIXa 폴리펩타이드를 미리-활성화시키는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 예방적 치료 또는 주문형 치료를 필요로 하는 대상체 상에서 실시될 수 있다.

본 발명의 FIX 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 예를 들어, 국소(예를 들어, 경피 또는 눈), 경구, 볼, 비강, 질, 직장 또는 비경구 투여를 비롯한, 임의의 적절한 투여 방식을 위해서 제형화될 수 있다.

용어 비경구는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 피하, 피내, 혈관내(예를 들어, 정맥내), 근육내, 척추, 두개내, 척추강내, 안내, 안주위, 안와내, 활액내 및 복강내 주사, 뿐만 아니라 임의의 유사한 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 특히, 본 발명의 FIX 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 피하 투여를 위해서 제형화될 수 있다. 조성물은 예를 들어, 현탁물, 에멀전, 지속 방출 제형, 크림, 겔 또는 분말일 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체, 예컨대 트라이글리세라이드와 함께, 좌약으로서 제형화될 수 있다.

일례에서, 약제학적 제형은 액체 제형, 예를 들어 완충 등장성 수성 용액이다. 또 다른 예에서, 약제학적 조성물은 생리 조건 또는 생리 조건에 근접한 pH를 갖는다. 다른 예에서, 수성 제형은 생리 조건 또는 생리 조건에 근접한 삼투도 및 염도를 갖는다. 그것은 염화나트륨 및/또는 아세트산나트륨을 함유할 수 있다. 일부 예에서, 본 발명의 조성물은 동결건조된다.

본 발명의 이의 융합 단백질은 포유동물, 예를 들어, 인간 환자에서 생체내에서 생산될 수 있고, 출혈 응고 장애, 관절혈종, 근육 출혈, 구강 출혈, 대출혈, 근육 내 대출혈, 구강 대출혈, 외상, 두부 외상, 위장관출혈, 두개내 대출혈, 복강내 대출혈, 흉내 대출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 인두 후강 내의 출혈, 후복막 공간 내의 출혈, 및 장요근 부위 내의 출혈로 이루어진 군으로부터 선택된 출혈 질환 또는 장애의 치료에 대한 유전자 요법 접근법을 사용하는 것은 치료적으로 이로울 것이다. 일 실시형태에서, 출혈 질환 또는 장애는 혈우병이다. 또 다른 실시형태에서, 출혈 질환 또는 장애는 혈우병 B이다. 이것은 적합한 발현 제어 서열 작동 가능하게 연결된 적합한 융합 단백질-암호화 핵산의 투여를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이들 서열은 바이러스 벡터 내에 혼입된다. 이러한 유전자 요법에 적합한 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바쿨로바이러스 벡터, 엡스타인 바르 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 박시니아 바이러스 벡터, 허피스 심플렉스 바이러스 벡터, 및 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는 복제-결함 바이러스 벡터일 수 있다. 다른 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터는 이의 E1 유전자 또는 E3 유전자 내에서 결손을 갖는다. 아데노바이러스 벡터가 사용되는 경우, 포유동물은 선택 마커 유전자를 암호화하는 핵산에 노출될 수 없다. 다른 실시형태에서, 서열은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 비-바이러스 벡터 내에 혼입된다.

본 발명의 실시는 달리 제시되지 않는 한, 세포 생물학, 세포 배양학, 분자 생물학, 유전자이식 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 종래의 기술을 사용할 것이고, 이것은 관련 기술 분야의 기술에 포함된다. 이러한 기술은 하기 문헌에 자세하게 설명된다. 예를 들어, 하기 문헌을 참고하기 바란다:

면역학의 일반적인 원칙에 언급된 표준 참고 문헌은 하기 문헌을 포함한다:

본 발명을 이제 상세하게 기술하였기 때문에, 하기 실시예를 참고로 본 발명은 보다 명확하게 이해될 것이며, 이는 단지 설명의 목적으로 본 명세서에 포함되는 것이며, 본 발명의 제한을 의도하지 않는다.

실시예

실시예 1: 활성 FIX-XTEN 변이체의 식별

FIX 단백질의 특성을 개선시키기 위해서 하나 이상의 XTEN 삽입을 갖는 FIX 폴리펩타이드를 포함하는 FIX 융합 단백질을 작제하였다. 그러나, XTEN 변형의 위치, 길이, 조성 및 수를 용이하게 변화시킬 수 있고, FIX의 활성 및 소실에 대한 이들 변형의 영향을 평가할 수 있다.

본 실시예는 FIX 활성을 폐기하지 않고 XTEN의 도입을 수용할 수 있는 FIX 내의 부위를 식별하고, 이러한 접근법을 달리 비-변형된 FIX 및 재조합 FIX-Fc 융합 단백질 둘 모두에 적용하는 것을 목표로 한다.

방법

FIX 폴리펩타이드 암호 서열을 출발 Met 잔기를 암호화하는 ATG 코돈의 바로 5'의 코작 번역 개시 서열(GCCGCCACC)의 도입 이후에 BsiWI와 PmeI 부위 사이에서 발현 벡터 pcDNA4/myc-His C(인비트로젠(상표명), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 내에 결찰시켰다.

HEK293F 세포(인비트로젠(상표명), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 폴리에틸렌이민(PEI, 폴리사이언시스 인크.(Polysciences Inc.), 미국 펜실베니아주 워링톤 소재)을 사용하여 플라스미드로 형질감염시켰다. 일시적으로 형질감염된 세포를 프리스타일(FREESTYLE)(상표명) 293 배지 또는 프리스타일(상표명) 293과 씨디 옵티코(CD OPTICHO)(상표명) 배지의 혼합물(인비트로젠(상표명), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 중에서 성장시켰다. 세포 배양 배지를 형질감염 5일 후에 수확하고, 발색 또는 aPTT FIX 활성 검정법에 의해서 FIX 활성에 대해서 분석하였다.

발색 FIX 활성을 아니아라(Aniara)로부터의 BIOPHEN 인자 IX 키트를 사용하여 측정하였고, 모든 인큐베이션은 진탕 하에서 37℃ 플레이트 가열기 상에서 수행하였다. 6웰 플레이트로부터의 FIX-XTEN 변이체의 일시적 형질감염 배지로부터의 세포 배양물 수확물을 트리스(Tris)-BSA 희석 완충제(R4)를 사용하여 목적하는 FIX 활성 범위로 희석시켰다. FIX 표준품을 또한 트리스-BSA 희석 완충제 중에서 제조하였다. 표준품, 희석된 세포 배양 샘플, 및 풀링된 정상 인간 혈장 검정법 대조군(50㎕/웰)을 이물론(IMMULON)(등록상표) 2HB 96-웰 플레이트에 복제하여 첨가하였다. 인간 인자 X, FVIII:C 및 피브린 중합 저해제(50㎕), 50㎕의 인자 XIa와 트롬빈, 인지질 및 칼슘의 혼합물, 및 50㎕의 인자 Xa 특이적 발색 기질(SXa-11)을 각각의 웰에 순차적으로 첨가하였고, 각각의 첨가들 사이에서 2분 인큐베이션시켰다. 기질과의 인큐베이션 후, 50㎕의 20% 아세트산을 첨가하여 색상 반응을 중단시키고, 스펙트라맥스(SPECTRAMAX)(등록상표) 플러스(몰레큘라 디바이시스(MOLECULAR DEVICES)(등록상표)) 장비를 사용하여 405nm에서의 흡광도를 측정하였다. 소프트맥스(SOFTMAX)(등록상표) 프로 소프트웨어(버전 5.2)을 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.

1단계 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 응집 검정법을 사용하여 FIX 활성을 평가하였다. 시스멕스(SYSMEX)(등록상표) CA-1500 장비(지멘스 헬쓰케어 디아그노스틱스 인크.(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.), 미국 뉴욕주 태리타운 소재)를 사용하여 FIX-XTEN aPTT 활성을 측정하였다. 검정법에 대한 표준 곡선을 생성하기 위해서, WHO 인자 IX 표준품을 시험 샘플로서 배양 배지 농도를 매칭시킨 모크 형질감염 배지(mock transfection media)로 희석시켰다. 6웰 플레이트로부터의 FIX-XTEN 변이체의 일시적 형질감염 배지로부터의 세포 배양물 수확물을 모크 형질감염 배지를 사용하여 목적하는 FIX 활성 범위로 희석시켰다. 희석 후, 시스멕스 장비를 사용하여 하기와 같이 aPTT 검정법을 수행하였다: 50㎕의 희석된 표준품 및 샘플을 50㎕의 지멘스(Siemens) 인간 FIX 결손 혈장과 혼합하고, 이어서 50㎕의 지멘스 액틴(Siemens Actin) FSL(엘라그산) 활성화제와 혼합하였다. 혼합물을 1분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음 50㎕의 지멘스 CaCl₂를 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 240초 동안 인큐베이션시켰다. 응고 시간을 이 인큐베이션 직후에 측정하였다. 시험 샘플 FIX 활성을 측정하기 위해서, 로그 스케일을 사용하여 표준품의 응고 시간을 플롯팅하여 응고 시간과 FIX 활성 간의 식을 외삽하고, 이어서 FIX-XTEN 활성을 표준 곡선에 대해서 계산하였다.

삽입 부위의 선택

프로테인 데이터 뱅크(Protein Data Bank)로부터의 FIX 구조물, 1PFX, 1IXA, 1CFI, 1CFH,1EDM, 3LC3, 3LC5, 1RFN, 1X7A 및 3KCG를 분석하여 XTEN 삽입을 위한 FIX 내의 부위를 선택하였다. GLA 도메인 내의 XTEN 삽입은, FIX를 인지질 표면 및 내피하 유형 IV 콜라겐(subendothelial type IV collagen)에 고정시키는 GLA 도메인의 본질적인 역할로 인해서 회피하였다. XTEN 삽입 부위를 하기 기준과 함께 프로테인 데이터 뱅크에서 입수 가능한 FIX 구조물의 분석에 의해서 선택하였다: 1) 알고리즘 소프트웨어 ASA 뷰(ASA View)(http://www.abren.net/asaview/) 및 겟 에어리어(Get Area)(http://curie.utmb.edu/getarea.html)에 의해서 접근 가능한 표면 면적 계산, 2) 수소/중수소 교환 질량 분석법(H/DX-MS)에 의해서 평가된 용매 접근 가능성, 3) 규정된 2차 구조 요소 내의 부위의 배제, 4) 유의한 종간 단백질 서열 변동성을 갖는 위치에 대한 선호, 및 5) 알고 있는 혈우병 B 돌연변이에 가까운 부위의 배제.

EGF1 도메인 내의 4개 부위, EGF2 도메인 내의 5개 부위, AP 도메인과 EGF2 도메인 사이의 링커 영역 내의 2개 부위, AP(활성화 펩타이드) 도메인 내의 4개 부위 및 촉매 도메인 내의 18개 부위를 XTEN의 삽입을 위해서 선택하였다(표 6).

42-아미노산 XTEN 삽입 및 C-말단 융합의 활성 스크린

XTEN의 도입에 의해서 유발되는 감소된 활성으로 인해서 반대의 잠재적인 FIX 활성 손실에 대한 스캐폴드로서 고활성 FIX 파두아 변이체(R338L)를 사용하였다. 42-잔기 XTEN 요소(AE42)를 상기 기준을 사용함으로써 선택된 부위에서 삽입하거나 FIX의 C-말단에서 융합시켰다. 이들 변이체의 FIX 활성을 상기에 기술된 바와 같이 형질감염된 HEK293 세포의 컨디셔닝된 배지 중에서 평가하였다. FIX-AE42s의 FIX 활성을 XTEN이 없는 기본 작제물, FIX-R338L의 백분율로서 나타낸다(도 1).

XTEN 삽입은 FIX 발색 검정법에 의해서 측정된 바와 같이 제한된 부위에서 허용되었다(도 1 및 표 7). FIX 내의 총 33개 부위를 선택하였고, AE-42의 삽입에 의해서 평가하였다. 이들 중에서, EGF2 도메인에서 2개, EGF2 도메인과 AP 도메인 사이의 링커 영역에서 1개, AP 도메인에서 1개, 및 촉매 도메인에서 4개(C 말단 포함)가 FIX 활성 검정법에 의해서 허용되는 부위로서 식별되었다(도 1 및 표 7).

더 긴 XTEN 삽입 및 C-말단 융합의 활성

이어서 더 긴 XTEN(AE-72, -144 및 -288)을 AE42 삽입에 대해서 허용되는 것으로 나타난 부위에서 유사하게 시험하였다. FIX 활성을 상기에 기술된 바와 같이 측정하였고, XTEN이 없는 기본 작제물, FIX-R338L의 백분율로서 나타낸다(도 2).

단지 AP 내의 부위 및 FIX의 C-말단에서의 부위 또는 그 근처에서의 부위가 더 긴 XTEN(AE144, AE288 또는 AE864)에 대해서 허용되었다(도 2). 컨디셔닝된 배지 중에서 검출된 FIX 활성은 도입된 XTEN의 길이와 역의 상관관계가 있었다(도 2, 표 7). FIX의 상이한 도메인에서 4개의 삽입 허용 부위를 선택하여 조합 라이브러리를 생성하였다.

복수의 XTEN 삽입

단일 XTEN 변이체를 사용하여 수득된 결과를 기초로, 다양한 길이 및 4개의 상이한 위치에서의 복수의 XTEN 삽입(도 4 및 표 8 참고)을 aPTT 검정법에 의해서, 형질감염된 HEK293 세포의 컨디셔닝된 배지 중에서의 FIX 활성에 대해서 평가하였다(표 8 내지 표 10). FIX 활성을 XTEN이 없는 기본 작제물, FIX-R338L의 백분율로서 나타낸다(도 4).

3개의 군, 단일 XTEN을 갖는 FIX, 이중 XTEN 삽입을 갖는 FIX 및 단일 XTEN 삽입을 갖는 FIX-Fc는 검출 가능한 활성을 나타낸 반면, 3개 이상의 부위에서의 삽입/융합의 조합물은 FIX 활성이 손실되었다(도 4).

결론적으로, XTEN 삽입에 대해서 몇몇 허용되는 부위가 FIX에 존재하지만, XTEN 삽입 변이체의 선택적 조합물이 FIX 활성을 보유한다. 본 실험에서 식별된 활성 FIX-XTEN 변이체는 혈우병 B 마우스에서 약동학적 특징 규명을 위한 후보물질이다.

실시예 2: FIX 융합 단백질 및 이의 혈장 회수율 및 AUC/D

인자 IX 결핍(HemB, B6.129P2-F9tm1Dws/J, MGI:1932297) 마우스(문헌[Lin. et al., 1997])를 다렐 스타포드 박사(Dr. Darrel Stafford)(노쓰 캐롤라이나 대학교, 채플 힐 소재)로부터 그대로 획득하였다. 수컷/암컷 HemB 마우스에게 50 또는 200IU/㎏의 FIX 융합 단백질(예를 들어, FIX-CT.288(FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합된 AE288 XTEN), FIX-CT.864(FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합된 AE864 XTEN), FIX-AP.144(FIX 폴리펩타이드의 AP 도메인 내의 D166 이후에 삽입된 AE144 XTEN), FIX-AP.72(FIX 폴리펩타이드 AP 도메인 내의 D166 이후에 삽입된 AE72 XTEN), FIX-AP.42(FIX 폴리펩타이드의 AP 도메인 내의 D166 이후에 삽입된 AE42 XTEN), FIXFc, 및 FIX)을 단일 정맥내 볼러스 주사로 t = 0시간에 10㎖/㎏의 투여 부피로 각각 정맥내로 투여하였다. 혈액을 투여 후 5분에서 투여 후 168시간(7일)까지 수집하였다. 각각의 제시된 시간 지점에 대해서, 시간 지점당 3 내지 4마리의 마우스로부터 안와후방(retroorbital) 또는 말단 하대 정맥 출혈에 의해서 약 100㎕의 구연산 처리된 혈액(citrated blood)을 수집하였다. 마우스당 최대 3개의 시간 지점을 생성하였다. 5000rpm으로 8분 동안의 원심분리에 의해서 혈장을 단리하고, 혈장 샘플을 드라이-아이스 에탄올욕 중에서 스냅 동결시키고, 활성화제로서의 액틴 FSL 및 데이드 베링 시약(Dade Behring reagent) 및 활성 표준품으로서의 투여 물질을 사용하여, 시스멕스-CA1500 응집 분석기 상에서 이들을 1단계 활성화 트롬보플라스틴 시간(aPTT)-검정법으로 분석할 때까지 80℃에서 저장하였다. 도 5A 및 도 5B에서 혈장 활성을 주사된 용량의 %로서 플롯팅한다. 평균 체류 시간(MRT) 및 다른 약동학(PK) 파라미터를 포에닉스 윈논린 6.2.1(파사이트, NCA 분석에 의한 세테라(Certera))을 사용하여 비-구획 모델을 사용하여 계산하였다. 도 5C는 상대적인 혈장 회수율(Y-축) 대 MRT(X-축)를 도시한다. 점의 면적은 용량당 곡선하 면적(AUC/D, h/㎏/㎖ 단위)을 나타내고, FIX 혈장 활성 회수율 및 AUC/D가 XTEN 길이 증가에 따라서 증가함을 나타낸다(도 5C). 도면은 증가된 XTEN 길이를 갖는 FIX 융합 단백질(C-말단의 288 및 864 또는 AP 도메인 내의 144, 72, 및 42)이 정맥내 볼러스 투여 후에 최대 60%의 혈장 회수율의 크기-의존적인 증가 및 증가된 AUC/D를 나타낸다는 것을 보여준다.

실시예 3: FIX 융합 단백질 및 이들의 반감기

FIX 결핍 마우스에게 하기 FIX 융합 단백질 50 또는 200IU/㎏을 정맥내 투여하였다: 288개 아미노산을 갖는 XTEN(예를 들어, AE288)에 융합된 FIX; FIX-Fc(여기서 72개 아미노산을 갖는 XTEN(예를 들어, AE72)이 D166 이후에 AP 도메인에서 삽입됨); FIX-Fc(여기서 42개 아미노산을 갖는 XTEN(예를 들어, AE42)이 D166 이후에 AP 도메인에서 삽입됨); 및 대조군(예를 들어, FIXFc 및 FIX). 혈장을 수집하고, 실시예 5에 기술된 방법과 동일하게 FIX 활성 및 PK 분석을 수행하였다. 도 6은 혈장 활성을 주사된 용량의 %로서 플롯팅한다. 윈논린 6.2.1(파사이트, NCA 분석에 의한 세테라)을 사용하여 약동학(PK) 파라미터를 계산하였고, 도 6B는 상대적인 혈장 회수율(Y-축) 대 MRT(X-축)를 도시한다. 점의 면적은 용량당 곡선하 면적(AUC/D, h/㎏/㎖ 단위)을 나타내고, FIXFc의 활성화 펩타이드(AP) 도메인 내로의 XTEN 서열의 삽입이 FIX와 비교할 때 rFIXFc 단독의 것보다 평균 체류 시간을 더 길게 연장시킨다는 것을 보여준다(도 6B). 또한, 혈장 활성 회수율 및 AUC/D은 XTEN 길이 증가에 따라서 개선된다(도 6A 및 도 6B). rFIX-CT.288(서열번호 226) 및 rFIXFc-AP.72(서열번호 151)에 대한 AUC/D는 rFIXFc과의 비교 시 각각 3.4 및 4.5배 개선되었다(도 6A 및 도 6B). 이는 정맥내 투여된 rFIX와 비교할 때 각각 AUC/D의 8.5배 및 14.5배 개선에 동등하다(도 6A 및 도 6B). 따라서, rFIXFc-R338L에서 AP 도메인 내의 XTEN 삽입과 Fc-매개된 반감기 연장의 조합은 rFIX 및 rFIXFc의 것과 비교할 때 반감기를 연장시키고, 혈장 회수율 및 AUC/용량을 증가시킨다.

실시예 4: 피하 전달에 의한 FIX 융합 단백질의 개선된 약동학

FIX 결핍 마우스에게 t=0에서 하기 FIX 융합 단백질 50 또는 200IU/㎏을 피하로 투여하였다: C 말단에서 288개 아미노산의 XTEN(예를 들어, AE288)에 융합된 FIX(FIX-CT.288); AP 도메인에서 72개 아미노산의 XTEN(예를 들어, AE72)을 갖는 FIXFc(FIXFc-AP.72); EGF2 도메인 내에 42개 아미노산의 XTEN(예를 들어, AE42)을 갖는 FIXFc(예를 들어, FIXFc-EGF.42); 및 대조군(FIXFc 및 FIX). 혈장을 수집하고, 실시예 1에 기술된 방법과 동일하게 FIX 활성 및 PK 분석을 수행하였다.. 도 7A는 혈장 활성을 주사된 용량의 %로서 플롯팅한다. 윈논린 6.2.1(파사이트, NCA 분석에 의한 세테라)을 사용하여 약동학(PK) 파라미터를 계산하였고, 도 7B는 상대적인 생체이용률(Y-축) 대 MRT(X-축)를 도시한다. 점의 면적은 용량당 곡선하 면적(AUC/D, h/㎏/㎖ 단위)을 나타내고, 이는 rFIX의 카복시-말단에서의 XTEN 폴리펩타이드 서열의 융합 또는 FIXFc의 활성화 펩타이드(AP) 도메인 또는 EGF2 도메인 내로의 XTEN 서열의 삽입이 FIX 융합 단백질의 피하 투여 프로파일을 상당히 개선시킨다는 것을 보여준다(도 7B). rFIXFc-AP.72 및 rFIX-CT.288은 피하 투여에 대해서 HemB 마우스에서의 rFIXFc와 비교할 때 6 내지 9배 개선된 AUC/D, 1.5 내지 2배 개선된 생체이용률 및 3 내지 10배 개선된 C_최대/D를 갖는다. rFIX와 비교하는 경우, 각각 FIXFc-AP.72 및 rFIX-CT.288에 대해서 rFIX와 비교할 때 약동학 파라미터의 개선은 28 내지 40배 개선된 AUC/D, 3배 증가된 생체이용률 및 15 내지 30배 개선된 C_최대/D이다(도 7A 및 도 7B).

총괄하면, FIX 융합 단백질(예를 들어, rFIX-CT.288 및 rFIXFc-AP.72)은 rFIXFc의 정맥내 투여와 비교하는 경우 피하 투여에 대해서 2.6배 및 1.9배 개선된 AUC/D를 나타내었고, 후자는 예방을 위해서 인간에서 주 1회 또는 덜 빈번한 정맥 투여를 지지한다.

실시예 5: FIX 융합 단백질의 시험관내 효능

인간 혈우병-B 혈액을 3, 10 및 30IU/㎗의 제시된 용량의 rFIXFc(빈 원, 점선) 또는 FIX 융합 단백질(예를 들어, rFIXFc-AP.72)(채워진 점, 실선) 또는 비히클(빈 삼각형)(도 8A 내지 도 8C)과 스파이킹시켰다. 회전식 트롬보엘라스토메트리(ROTEM)를 사용하여 전체 혈액 응고 특징을 측정하고, 혈액(NATEM)의 칼슘 재가(recalcification)에 의해서 응집을 개시시켰다. rFIXFc-AP.72는 응고 시간(초 단위의 CT), 알파 각도(도 단위) 및 최대 응고 견고성(㎜ 단위의 MCF)과 관련하여 혈우병-B 혈액에서 rFIXFc와 비교할 때 유사한 활성을 나타내었다(도 8A 내지 도 8C). 각각의 시간 지점에서의 데이터는 4 내지 5개의 복제 샘플의 평균 +/- 표준 편차이다(도 8A 내지 도 8C).

rFIXFc-AP.72 및 rFIX-CT.288은 rFIX 및 rFIXFc 둘 모두와 비교할 때 HemB 마우스에서 상당히 개선된 피하 약동학을 나타낸다. 전임상 동물 모델에서 효능 및 상대 성장 척도(allometric scaling)를 다루기 위한 추가 연구가 진행중이다.

실시예 6: 급성 뮤린 꼬리 클립 출혈 모델(Acute MurineTail Clip Bleeding Model)에서의 rFIXFc-AP.72의 생체내 효능

급성 효능을 맹검 뮤린 꼬리-클립 출혈 모델로 연구하였는데, 여기서는 이미 기술된 바와 같이 꼬리 끝 절단 후에 투여된 마우스에서 총 혈액 손실을 측정한다(문헌[Dumont et al., Blood, 119(13):3024-3030, 2012]). 간략하면, 8 내지 15주령의 수컷 혈우병 B 마우스(문헌[Lin et al., Blood (1997) 90: 3962-3966])를 50㎎/㎏ 케타민과 0.5㎎/㎏ 덱스메데토미딘의 칵테일로 마취시켰다. 꼬리를 37℃ 염수 중에 10분 동안 담궈서, 측정맥을 팽창시키고 그 다음 비히클(3.88g/L의 L-히스티딘, 23.8g/L의 만니톨, 11.9g/L의 수크로스, 3.25g/L의 염화나트륨, 0.01%(w/v)의 폴리소르베이트 20(pH 7.1), 3% 인간 혈청 알부민), rFIXFc-AP.72, 또는 rFIXFc를 50, 100, 및 200IU/㎏으로 정맥내 꼬리 정맥 주사하였다. 투여 5분 후에, 꼬리의 5㎜ 원위 끝을 클립핑시키고, 13㎖의 염수를 함유하는 미리 칭량된 튜브 중에 30분의 기간 동안 담궜다. 혈액 손실을 중량 단위로 정량분석하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 6에서 비-쌍 양측 t-시험(unpaired two-tailed t-test)을 사용하여 통계학적 유의성을 계산하였다. 이러한 양측 t-시험은 50, 100, 및 200IU/㎏ 용량의 rFIXFc-AP.72가 비히클과 상당히 상이하였음을 나타내었다(p-값 < 0.0001). 또한, 데이터는 저용량, 예를 들어 50IU/㎏의 rFIXFc-AP.72가 동일한 저용량, 즉 50IU/㎏의 rFIXFc와 비교할 때 상당히 더 낮은 혈액 손실을 유발함을 나타낸다. 이들 시험은 이러한 출혈 모델에서 rFIXFc에 비해서 rFIXFc-AP.72의 동등하거나 또는 개선된 급성 효능을 입증한다.

실시예 7: 예방적 뮤린 꼬리 정맥 횡절단 출혈 모델에서의 FIXFc-AP.72의 생체내 효능

연장된 효능을 맹검 뮤린 꼬리 정맥 횡절단(TVT) 출혈 모델로 연구하였는데, 여기서는 투여된 혈우병-B 마우스의 생존 시간을 이미 기술된 바와 같이 하나의 측 꼬리 정맥을 횡절단한 후에 측정한다(문헌[Toby et al., PLOS One, DOI:10.1371/journal.pone.0148255, 2016; Pan et al., Blood114:2802-2822 (2009)]). 간략하면, 8 내지 15주령의 수컷 혈우병 B 마우스(문헌[Lin et al., Blood 90: 3962-3966 (1997)])를 15, 50, 100IU/㎏ FIX 활성의 rFIXFc로 정맥내로 미리 투여하거나 또는 매칭된 피하 용량의 FIXFc-AP.72로 미리 투여하고, 비히클의 볼러스 용량이 제공된 마우스와 비교하였다. 투여 후 72시간에, 모든 마우스를 마취시키고, 하나의 측 꼬리 정맥을 2.7㎜ 꼬리 직경으로 횡절단하였다. TVT 직후 9 내지 11시간 동안, 이어서 24시간에서의 하룻밤 시간 지점에서, 정성적 종말점을 모니터링하고, 재출혈 및 사망 시간(동물이 반사 상태인 경우 결정된 바와 같은 안락사 시간으로서 정의된 바와 같음)을 시간 단위로 기록하였다. 모든 마우스를 24시간 연구 마지막에 마취시키고, 죽지 않거나 반사 상태가 아닌 동물은 24시간에 생존한 것으로 결정하였다.

그래프패드 프리즘 6을 사용하여 TVT 후 생존 백분율로서 데이터를 플롯팅하였다. 마우스에게 비히클을 피하로(점선), FIXFc-AP.72을 피하로(실선, 폐쇄된 상징) 또는 FIXFc를 정맥내로(점선, 빈 상징)(15IU/㎏, 50IU/㎏, 100IU/㎏ n = 20/용량, 비히클에 대한 용량의 경우; n = 30) 투여하였다(도 10). 매칭된 IU/㎏ 용량의 피하 투여된 FIXFc-AP.72 대 정맥내 투여된 rFIXFc로 치료된 마우스에 대한 생존 곡선은 시험된 모든 용량에서 동등한 정맥내 투여된 rFIXFc에 비해서 FIXFc-AP.72가 피하 투여된 HemB 마우스의 개선된 생존을 나타내었다(도 10).

실시예 8: HemB 마우스에서 rFIX에 비해서 개선된 FIXFc-AP.72(FIX-216, 이중 쇄 Fc)에 대한 정맥내 및 피하 약동학 파라미터

혈우병-B 마우스에게 200IU/㎏의 FIXFc-AP.72(FIX-216, 이중 쇄 Fc) 또는 rFIX를 투여하였다. 제시된 시간에서 안와 후방 출혈에 의해서 혈액을 수집하였다. 활성 표준품으로서의 투여 물질을 사용하여 1-단계 응고 검정법 활성에 의해서 FIX의 혈장 수준을 측정하였다. 도 11A에서 혈장 활성을 주사된 용량의 %로서 플롯팅한다. 도 11B는 NCA(비-구획) 분석에 의해서 포에닉스 윈논린 6.2.1(파사이트, 서타라)을 사용하여 계산된 약동학 파라미터의 표를 나타낸다. rFIX에 대한 FIX-216에 대해서 밝혀진 개선된 약동학 파라미터는 평균 체류 시간(MRT), AUC/용량 및 다른 파라미터를 포함한다.

FIXFc-AP.72의 피하 투여는 마우스에서 투여 후 대략 20시간에서 t_최대를 나타내고, 유사한(IU/㎏) 정맥내 투여된 rFIX 또는 rFIXFc에 비해서 개선된 혈장 활성 수준을 나타낸다. HemB 마우스에서 TVT 출혈 모델의 사용에서, 본 발명자들은 투여 후 72시간에서, 피하 투여된 FIXFc-AP.72가 모든 시험된 용량에서 정맥내 투여된 rFIXFc에 비해서 개선된 생체내 효능을 가짐을 나타낸다. 유사하게, HemB 마우스 꼬리-클립 출혈 모델에서 시험된 급성 효능은 rFIXFc와 비교할 때 정맥내 투여된 FIXFc-AP.72의 개선된 효능을 나타내었다. 이들 데이터는 인간에서 FIXFc-AP.72의 주 1회 또는 덜 빈번한 예방적 피하 투여의 가능성을 지지한다.

구체적인 실시형태의 상기 설명은 다른 사람들이 관련 기술 분야의 기술 내의 지식을 적용함으로써 이러한 구체적인 실시형태를 본 발명의 일반적인 개념으로부터 벗어나지 않으면서, 과도한 실험 없이 쉽게 변형시키고/변형시키거나 다양한 응용을 위해서 개작할 수 있는 본 발명의 일반적인 본질을 이렇게 완전히 드러낼 것이다. 따라서, 이러한 개작 및 변형은 본 명세서에 제시된 교시 및 지침을 기초로, 개시된 실시형태의 의미 및 등가물의 범위에 포함되는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 어구 또는 용어는 설명의 목적을 위한 것이지 제한이 아니며, 본 명세서의 용어 또는 어구는 교시 및 지침에 비추어 통상의 기술자에 의해 해석되도록 이해되어야 한다.

본 발명의 다른 실시형태는 본 명세서에 개시된 본 발명의 명세서 및 실시를 고려하여 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시인 것으로서 간주되며, 본 발명의 범주 및 사상은 하기 청구범위에 의해서 제시되는 것으로 의도된다.

본 출원은 2015년 8월 3일자로 출원된 미국 가출원 제62/200,590호 및 2016년 1월 22일자로 출원된 제62/281,993호에 대한 이익을 주장하며, 이들은 이들의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.

실시형태

E1. 인자 IX(FIX) 융합 단백질로서, FIX 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 103, 서열번호 2의 아미노산 105, 서열번호 2의 아미노산 142, 서열번호 2의 아미노산 149, 서열번호 2의 아미노산 162, 서열번호 2의 아미노산 166, 서열번호 2의 아미노산 174, 서열번호 2의 아미노산 224, 서열번호 2의 아미노산 226, 서열번호 2의 아미노산 228, 서열번호 2의 아미노산 413, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된 적어도 하나의 XTEN을 포함하되, 응혈촉진 활성을 나타내는, 인자 IX(FIX) 융합 단백질.

E2. E1에 있어서, 삽입 부위는 서열번호 2의 아미노산 149, 서열번호 2의 아미노산 162, 서열번호 2의 아미노산 166, 서열번호 2의 아미노산 174 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는, FIX 융합 단백질.

E3. E1 또는 E2에 있어서, 삽입 부위는 서열번호 2의 아미노산 224, 서열번호 2의 아미노산 226, 서열번호 2의 아미노산 228; 서열번호 2의 아미노산 413, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는, FIX 융합 단백질.

E4. E1 내지 E3 중 어느 하나에 있어서, 삽입 부위는 서열번호 2의 아미노산 103, 서열번호 2의 아미노산 105, 및 둘 모두로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는, FIX 융합 단백질.

E5. E1 내지 E4 중 어느 하나에 있어서, 삽입 부위는 서열번호 2의 아미노산 142에 상응하는, FIX 융합 단백질.

E6. E1 내지 E5 중 어느 하나에 있어서, XTEN은 적어도 약 6개의 아미노산, 적어도 약 12개의 아미노산, 적어도 약 36개의 아미노산, 적어도 약 42개의 아미노산, 적어도 약 72개의 아미노산, 적어도 약 144개의 아미노산, 또는 적어도 약 288개의 아미노산을 포함하는, FIX 융합 단백질.

E7. E1 내지 E6 중 어느 하나에 있어서, XTEN은 AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, AG144, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, FIX 융합 단백질.

E8. E1 내지 E7 중 어느 하나에 있어서, XTEN은 서열번호 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, FIX 융합 단백질.

E9. E7 또는 E8에 있어서, 상기 XTEN은 AE72 또는 AE144를 포함하는, FIX 융합 단백질.

E10. E1 내지 E9 중 어느 하나에 있어서, 제2 XTEN을 더 포함하는, FIX 융합 단백질.

E11. E10에 있어서, 제2 XTEN은 서열번호 2의 아미노산 103, 서열번호 2의 아미노산 105, 서열번호 2의 아미노산 142, 서열번호 2의 아미노산 149, 서열번호 2의 아미노산 162, 서열번호 2의 아미노산 166, 서열번호 2의 아미노산 174, 서열번호 2의 아미노산 224, 서열번호 2의 아미노산 226, 서열번호 2의 아미노산 228, 서열번호 2의 아미노산 413, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되고, 제2 XTEN은 FIX 폴리펩타이드의 C-말단 또는 FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합된 링커에 융합된, FIX 융합 단백질.

E12. E10 또는 E11에 있어서, XTEN 및 제2 XTEN은 각각 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되고/삽입되거나 FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합된, FIX 융합 단백질:

i. 서열번호 2의 아미노산 105 및 서열번호 2의 아미노산 166;

ii. 서열번호 2의 아미노산 105 및 서열번호 2의 아미노산 224;

iii. 서열번호 2의 아미노산 105 및 C-말단에 융합됨;

iv. 서열번호 2의 아미노산 166 및 서열번호 2의 아미노산 224;

v. 서열번호 2의 아미노산 166 및 C-말단에 융합됨; 및

vi. 서열번호 2의 아미노산 224 및 C-말단에 융합됨.

E13. E10 또는 E11에 있어서, XTEN은 서열번호 2의 아미노산 166에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되고, 제2 XTEN은 FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합된, FIX 융합 단백질.

E14. E10 내지 E13 중 어느 하나에 있어서, 제2 XTEN은 적어도 약 6개의 아미노산, 적어도 약 12개의 아미노산, 적어도 약 36개의 아미노산, 적어도 약 42개의 아미노산, 적어도 약 72개의 아미노산, 적어도 약 144개의 아미노산, 또는 적어도 약 288개의 아미노산을 포함하는, FIX 융합 단백질.

E15. E10 내지 E14 중 어느 하나에 있어서, 제2 XTEN은 AE42, AE72, AE864, AE576, AE288, AE144, AG864, AG576, AG288, AG144, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, FIX 융합 단백질.

E16. E15에 있어서, 제2 XTEN은 AE72 또는 AE144인, FIX 융합 단백질.

E17. E10 내지 E16 중 어느 하나에 있어서, 제2 XTEN은 서열번호 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, FIX 융합 단백질.

E18. E10 내지 E17 중 어느 하나에 있어서, 제3, 제4, 제5 또는 제6 XTEN을 더 포함하는, FIX 융합 단백질.

E19. FIX 융합 단백질로서, FIX 폴리펩타이드 및 XTEN을 포함하는 이종 모이어티를 포함하되, XTEN은 FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합되고, 길이가 42개 아미노산보다 길고, 144개 아미노산보다 짧은 아미노산 서열을 포함하는, FIX 융합 단백질.

E20. E19에 있어서, XTEN은 50, 55, 60, 65, 또는 70개 아미노산보다 더 길고, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 또는 80개 아미노산보다 짧거나, 또는 이들의 임의의 조합인 아미노산 서열을 포함하는, FIX 융합 단백질.

E21. E20에 있어서, XTEN은 72개 아미노산 길이인, FIX 융합 단백질.

E22. E21에 있어서, XTEN은 AE72인, FIX 융합 단백질.

E23. E19에 있어서, XTEN은 서열번호 35에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, FIX 융합 단백질.

E24. E1 내지 E23 중 어느 하나에 있어서, Fc 도메인을 더 포함하는, FIX 융합 단백질.

E25. E24에 있어서, Fc 도메인은 FIX 폴리펩타이드 또는 XTEN에 융합된, FIX 융합 단백질.

E26. E24 또는 E25에 있어서, 제2 Fc 도메인을 포함하는, FIX 융합 단백질.

E27. E26에 있어서, 제2 Fc 도메인은 제1 Fc 도메인에 연관된, FIX 융합 단백질.

E28. E26 또는 E27에 있어서, 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하되, 제1 폴리펩타이드 쇄는 Fc 도메인에 융합된 FIX 폴리펩타이드를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 쇄는 제2 Fc 도메인을 포함하고, 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 공유 결합에 의해서 연관된, FIX 융합 단백질.

E29. E26 또는 E27에 있어서, FIX 폴리펩타이드, Fc 도메인, 제2 Fc 도메인, 및 Fc 도메인과 제2 Fc 도메인을 연결하는 링커를 포함하는 단일 폴리펩타이드 쇄인, FIX 융합 단백질.

E30. E29에 있어서, 링커는 하나 이상의 세포내 처리 부위를 더 포함하는, FIX 융합 단백질.

E31. E29 또는 E30에 있어서, 링커는 (Gly₄Ser)_n을 포함하되, 식 중 n은 1 내지 100으로부터 선택된 정수인, FIX 융합 단백질.

E32. E1 내지 E31에 있어서, 신호 펩타이드 및 프로펩타이드 서열이 없는 서열번호 54 내지 서열번호 153으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, FIX 융합 단백질.

E33. E1 내지 E32 중 어느 하나에 있어서, 네이티브 FIX의 응혈촉진 활성의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 100%를 갖는, FIX 융합 단백질.

E34. E33에 있어서, 응혈촉진 활성은 발색 기질 검정법, 1단계 응고 검정법, 또는 둘 모두에 의해서 측정된, FIX 융합 단백질.

E35. E1 내지 E34 중 어느 하나에 있어서, FIX 폴리펩타이드는 R338L FIX 변이체인, FIX 융합 단백질.

E36. E35에 있어서, R338L FIX 변이체는 서열번호 2에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, FIX 융합 단백질.

E37. E1 내지 E36 중 어느 하나의 FIX 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.

E38. E37의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.

E39. E37의 폴리뉴클레오타이드 또는 E38의 벡터를 포함하는 숙주 세포.

E40. E39에 있어서, FIX 융합 단백질은 생체내에서 발현되는, 숙주 세포.

E41. E39에 있어서, FIX 융합 단백질은 시험관내에서 발현되는, 숙주 세포.

E42. E39의 숙주 세포를 FIX 융합 단백질이 발현되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, FIX 융합 단백질의 생산 방법.

E43. E1 내지 E36 중 어느 하나의 FIX 융합 단백질, E37의 폴리뉴클레오타이드, E38의 발현 벡터, 또는 E39 내지 E41 중 어느 하나의 숙주 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.

E44. 유효량의 E1 내지 E36 중 어느 하나의 FIX 융합 단백질, E37의 폴리뉴클레오타이드, E38의 발현 벡터, E39 내지 E41 중 어느 하나의 숙주 세포, 또는 E43의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 응고 질환 또는 병태의 예방, 치료, 개선 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 응고 질환 또는 병태를 예방, 치료, 개선 또는 관리하는 방법.

E45. E44에 있어서, 투여는 환자에 대한 피하 투여를 포함하는, 방법.

E46. E1 내지 E36 중 어느 하나의 FIX 융합 단백질, E37의 폴리뉴클레오타이드, E38의 발현 벡터, 또는 E39 내지 E41 중 어느 하나의 숙주 세포를 대상체의 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 응고 질환 또는 병태를 진단 또는 영상화하는 방법.

E47. FIX 폴리펩타이드의 반감기를 연장시키는 방법으로서, FIX 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 103, 서열번호 2의 아미노산 105, 서열번호 2의 아미노산 142, 서열번호 2의 아미노산 149, 서열번호 2의 아미노산 162, 서열번호 2의 아미노산 166, 서열번호 2의 아미노산 174, 서열번호 2의 아미노산 224, 서열번호 2의 아미노산 226, 서열번호 2의 아미노산 228, 서열번호 2의 아미노산 413, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 XTEN을 삽입하고, 이에 의해서 FIX 융합 단백질을 작제하는 단계를 포함하되, FIX 단백질은 응혈촉진 활성을 나타내는, FIX 폴리펩타이드의 반감기를 연장시키는 방법.

E48. 인자 IX(FIX) 융합 단백질로서, 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함하되:

a. 제1 쇄는

i. FIX 폴리펩타이드;

ii. 적어도 하나의 XTEN(여기서 적어도 하나의 XTEN은 서열번호 2의 아미노산 166에 상응하는 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되고, 여기서 적어도 하나의 XTEN은 적어도 약 72개 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함함); 및

iii. 제1 Fc 도메인(여기서 제1 Fc 도메인은 적어도 하나의 XTEN의 FIX 폴리펩타이드에 융합됨)을 포함하고;

b. 제2 쇄는 제2 Fc 도메인을 포함하고,

여기서 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 공유 결합에 의해서 연관되고; 여기서 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 나타내는, 인자 IX(FIX) 융합 단백질.

E49. E48에 있어서, 적어도 하나의 XTEN은 서열번호 35의 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, FIX 융합 단백질.

E50. E48 또는 E49에 있어서, FIX 융합 단백질의 제1 쇄는 서열번호 227의 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; FIX 융합 단백질의 제2 쇄는 서열번호 228의 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, FIX 융합 단백질.

E51. E48 내지 E50 중 어느 하나에 있어서, FIX 융합 단백질의 제1 쇄는 서열번호 227의 아미노산 서열을 포함하고; FIX 융합 단백질의 제2 쇄는 서열번호 228의 아미노산 서열을 포함하는, FIX 융합 단백질.

하기 벡터 서열이 상기 실시예 및 본 출원의 다른 곳에서 참고된다. 하기 기호 설명은 정보를 이해하는 데 도움이 될 것이다:

SEQUENCE LISTING <110> BIOVERATIV THERAPEUTICS INC. <120> FACTOR IX FUSION PROTEINS AND METHODS OF MAKING AND USING SAME <130> WO/2017/024060 <140> PCT/US2016/045401 <141> 2016-08-03 <150> US 62/281,993 <151> 2016-01-22 <150> US 62/200,590 <151> 2015-08-03 <160> 228 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 415 <212> PRT <213> Human FIX polypeptide <400> 1 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30 Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly 35 40 45 Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60 Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys 65 70 75 80 Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu 85 90 95 Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr 100 105 110 Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val 115 120 125 Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr 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Lys Val Ser Arg Tyr Val Asn 515 520 525 Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 530 535 540 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 545 550 555 560 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 565 570 575 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 580 585 590 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 595 600 605 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 610 615 620 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 625 630 635 640 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 645 650 655 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 660 665 670 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 675 680 685 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 690 695 700 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 705 710 715 720 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 725 730 735 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 740 745 750 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 755 760 <210> 228 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pSYN-FIX-216-Fc <400> 228 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225

Claims

인자 IX(FIX) 융합 단백질로서, FIX 폴리펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 103, 서열번호 2의 아미노산 105, 서열번호 2의 아미노산 142, 서열번호 2의 아미노산 149, 서열번호 2의 아미노산 162, 서열번호 2의 아미노산 166, 서열번호 2의 아미노산 174, 서열번호 2의 아미노산 224, 서열번호 2의 아미노산 226, 서열번호 2의 아미노산 228, 서열번호 2의 아미노산 413, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 상기 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된 적어도 하나의 XTEN을 포함하되, 응혈촉진 활성(procoagulant activity)을 나타내는, FIX 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 삽입 부위는 서열번호 2의 아미노산 149, 서열번호 2의 아미노산 162, 서열번호 2의 아미노산 166, 서열번호 2의 아미노산 174 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상응하는, FIX 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 XTEN은 적어도 약 5개의 아미노산, 적어도 약 6개의 아미노산, 적어도 약 12개의 아미노산, 적어도 약 36개의 아미노산, 적어도 약 42개의 아미노산, 적어도 약 72개의 아미노산, 적어도 약 144개의 아미노산, 또는 적어도 약 288개의 아미노산을 포함하는, FIX 융합 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 XTEN을 더 포함하는, FIX 융합 단백질.
제4항에 있어서, 상기 XTEN은 서열번호 2의 아미노산 166에 상응하는 삽입 부위에서 상기 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되고, 그리고 상기 제2 XTEN은 상기 FIX 폴리펩타이드의 C-말단에 융합된, FIX 융합 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인을 더 포함하는, FIX 융합 단백질.
제6항에 있어서, 제2 Fc 도메인을 포함하는, FIX 융합 단백질.
제7항에 있어서, 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하되, 제1 폴리펩타이드 쇄는 상기 Fc 도메인에 융합된 상기 FIX 폴리펩타이드를 포함하고, 그리고 제2 폴리펩타이드 쇄는 상기 제2 Fc 도메인을 포함하며, 상기 제1 Fc 도메인 및 상기 제2 Fc 도메인은 공유 결합에 의해서 연관된, FIX 융합 단백질.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FIX 폴리펩타이드는 R338L FIX 변이체인, FIX 융합 단백질.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 FIX 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
제10항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
제10항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제11항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 FIX 융합 단백질, 제10항의 폴리뉴클레오타이드, 제11항의 발현 벡터, 또는 제12항의 숙주 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 FIX 융합 단백질, 제10항의 폴리뉴클레오타이드, 제11항의 발현 벡터, 제12항의 숙주 세포, 또는 제13항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 응고 질환 또는 병태의 예방, 치료, 개선 또는 관리를 필요로 하는 환자에서 응고 질환 또는 병태를 예방, 치료, 개선 또는 관리하는 방법.
인자 IX(FIX) 융합 단백질로서, 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함하되:
a. 상기 제1 쇄는
i. FIX 폴리펩타이드;
ii. 적어도 하나의 XTEN으로서, 서열번호 2의 아미노산 166에 상응하는 삽입 부위에서 상기 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입되고, 그리고 적어도 약 72개 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 상기 적어도 하나의 XTEN; 및
iii. 제1 Fc 도메인으로서, 상기 적어도 하나의 XTEN의 상기 FIX 폴리펩타이드에 융합된, 상기 제1 Fc 도메인을 포함하고;
b. 상기 제2 쇄는 제2 Fc 도메인을 포함하고,
상기 제1 Fc 도메인 및 상기 제2 Fc 도메인은 공유 결합에 의해서 연관되고; 그리고 상기 FIX 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 나타내는, FIX 융합 단백질.