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KR20170102167A - 항-pd-l1 항체 - Google Patents

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KR20170102167A
KR20170102167A KR1020177021198A KR20177021198A KR20170102167A KR 20170102167 A KR20170102167 A KR 20170102167A KR 1020177021198 A KR1020177021198 A KR 1020177021198A KR 20177021198 A KR20177021198 A KR 20177021198A KR 20170102167 A KR20170102167 A KR 20170102167A
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쳉-아이 왕
슈에 링 제니스 오
시옥 핑 여
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에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
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Abstract

항-PD-L1 항체가 기술된다. 이러한 항체를 포함하는 약제학적 조성물, 용도 및 이를 사용하는 방법이 또한 기술된다.

Description

항-PD-L1 항체
본 발명은 프로그램된 사멸-리간드 1 (programmed death-ligand-1: PD-L1)에 결합하는 항체에 관한 것이다.
T-세포 고갈은 다수의 만성 감염 및 암의 도중에 발생하는 T-세포 기능이상의 상태이다. 이는 불량한 T-세포 효과기 기능, 억제 수용체의 지속적 발현 및 기능적 효과기 또는 메모리 T-세포와 구별되는 전사 상태로 정의된다. 고갈은 감염 및 종양의 최적 조절을 방해한다 (E John Wherry, Nature Immunology 12, 492-499 (2011)).
T-세포 고갈은 T-세포 기능의 단계적이고 점진적인 손실을 특징으로 한다. 고갈은 만성 림프구성 맥락수막염 (choriomeningitis) 바이러스 감염 동안에 잘 정의되며, 일반적으로 종양 전이 동안뿐만 아니라 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스 감염을 비롯한 다수의 만성 감염 이후에 일어나는, 항원-지속성 조건하에서 발생한다. 고갈은 표현형 및 기능적 결함의 점차적 이행이 나타날 수 있기 때문에 균일하게 비활성화된 설정은 아니고, 이들 세포는 프로토타입 효과기, 메모리 및 또한 아네르기성 (anergic) T 세포와 구별된다. 고갈된 T 세포는 높은 등급의 만성 감염 동안에 대부분 일반적으로 나타나고, 항원 자극의 수준 및 지속기간은 이 과정의 중요한 결정요인이다 (Yi et al., Immunology Apr 2010; 129(4): 474-481).
순환성 인간 종양-특이적 CD8+ T 세포는 세포독성이고 생체 내에서 사이토카인을 생산할 수 있는데, 이는 자가- 및 종양-특이적 인간 CD8+ T 세포가 펩티드, 불완전 프로인트 보조제 (incomplete Freund's adjuvant, IFA), 및 CpG를 사용한 백신접종과 같은 강력한 면역요법 후 또는 입양 전달 후 기능적 적격에 도달할 수 있음을 나타낸다. 말초 혈액과는 달리, T-세포 침윤성 종양 부위는 비정상적으로 낮은 사이토카인 생산 및 억제성 수용체 PD-1, CTLA-4, 및 TIM-3의 상향조절과 함께, 종종 기능적으로 결함이 있다. 흑색종 조직으로부터 단리된 T-세포가 종종 단기간의 시험관 내 배양 후 IFN-γ 생산을 회복시킬 수 있기 때문에 기능적 결함은 가역적이다. 그러나, 이 기능적 손상이 동물 모델에서 정의된 바와 같은 T-세포 고갈 또는 아네르기와 유사할 수 있는, 추가의 분자적 경로를 포함하는지 여부에 대한 결정이 여전히 남아 있다 (Baitsch et al., J Clin Invest. 2011; 121(6): 2350-2360).
CD279로도 불리는, 프로그램된 세포 사멸 1 (programmed cell death 1, PD-1)은 PDCD1 유전자에 의해 인간에서 인코딩되는 타입 I 막 단백질이다. 이는 2종의 리간드, PD-L1 및 PD-L2를 갖는다. CD274 또는 B7 동족체 1 (B7-H1)로도 불리는, PD-L1은 CD274 유전자에 의해 인간에서 인코딩되는 40 kDa 타입 I 막투과 단백질이다.
PD-1은 활성화된 T 세포의 표면에서 발현되고, PD-L1은 수지상 세포 및 대식세포와 같은, 항원 제시 세포 (APCs)의 표면에서 발현된다. PD-L1은 또한 유방암, 폐암, 방광암, 두경부암, 및 다른 암을 비롯한 여러 종양에서 과발현된다. PD-L1 또는 PD-L2가 PD-1에 결합하면, 억제 신호가 T 세포 내로 전달되고, 이는 사이토카인 생산을 감소시키고 T-세포 증식을 저해한다.
PD-1 경로는 T-세포 고갈의 중요한 면역-억제 매개체이다. PD-1은 자가면역을 제한하기 위해 염증 반응 동안에 말초에서 이미 활성화된 T 세포의 활성을 제한하는 기능을 한다. 이 경로의 차단은 T-세포 활성화, 증대, 및 증강된 효과기 기능을 초래할 수 있다. 따라서, PD-1은 T 세포 반응을 부정적으로 조절한다. PD-1은 만성 질환 상태에서 고갈된 T 세포의 마커로서 동정되고 있고, PD-1:PD-L1 상호작용의 차단은 T 세포 기능을 부분적으로 회복시키는 것으로 나타났다 (Sakuishi et al., JEM Vol. 207, September 27, 2010, pp2187-2194).
PD-1 경로를 억제함으로써 지속성 감염 및 암의 치료를 위한 방법 및 조성물이 WO 2006/133396에 기술되어 있다. PD-L1에 대한 인간 단일클론 항체가 WO 2007/005874, US 2011/209230, US 8,217,149 및 WO 2014/055897에 기술되어 있다.
본 발명은 PD-L1에 결합하는 항체, 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다. 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드가 또한 기술된다. 항체, 항원 결합 단편 및 폴리펩티드는 단리되고/되거나 정제된 형태로 제공될 수 있고 연구, 요법 및 진단에 사용하기에 적합한 조성물로 제형화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체, 또는 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드는 T-세포 고갈 또는 T-세포 아네르기를 나타내는 T-세포, 예컨대 CD8+ T-세포에서 T-세포 기능을 회복시키는데 효과적일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 항체, 또는 항원 결합 단편이 제공되고, 항체의 아미노산 서열은 아미노산 서열 i) 내지 iii), 또는 아미노산 서열 iv) 내지 vi), 또는 바람직하게는 아미노산 서열 i) 내지 vi), 또는 서열 (i) 내지 (vi)에서 1개 또는 2개 또는 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 대체되는 이의 변이체를 포함할 수 있다:
i) LC-CDR1: SGRSSNIASHDVF (서열번호 9), GGDNIGRKSVH (서열번호 12), SGSSSNIGNNYVS (서열번호 15), 또는 TGSSSNIGAGYDVH (서열번호 18) 중의 하나;
ii) LC-CDR2: ETNKRPW (서열번호 10), DDGDRPS (서열번호 13), DNNERLS (서열번호 16), 또는 GNSNRPS (서열번호 19) 중의 하나;
iii) LC-CDR3: GAWDSGLTGML (서열번호 11), QAWDSTVV (서열번호 14), GTWDSSLSVVV (서열번호 17), 또는 QSYDSSLSGSYVV (서열번호 20) 중의 하나;
iv) HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21);
v) HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22);
vi) HC-CDR3: X1X2X3X4X5X6SX7X8AFDX9 (서열번호 26);
여기서 X1 = 부재 (즉, 아미노산 없음) 또는 G이고, X2 = G 또는 S이고, X3 = G 또는 Y이고, X4 = S, G 또는 H이고, X5 = Y 또는 G이고, X6 = G, N 또는 Y이고, X7 = L 또는 Y이고, X8 = Y 또는 G이고, X9 = I 또는 Y임.
일부 실시양태에서, HC-CDR3은 GGSYGSLYAFDI (서열번호 23), GGYGGNSLYAFDI (서열번호 24), 또는 SGHGYSYGAFDY (서열번호 25) 중의 하나이다.
일부 실시양태에서, 항체, 또는 항원 결합 단편은 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다:
LC-CDR1: SGRSSNIASHDVF (서열번호 9)
LC-CDR2: ETNKRPW (서열번호 10)
LC-CDR3: GAWDSGLTGML (서열번호 11)
일부 실시양태에서, 항체, 또는 항원 결합 단편은 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다:
LC-CDR1: GGDNIGRKSVH (서열번호 12)
LC-CDR2: DDGDRPS (서열번호 13)
LC-CDR3: QAWDSTVV (서열번호 14)
일부 실시양태에서, 항체, 또는 항원 결합 단편은 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다:
LC-CDR1: SGSSSNIGNNYVS (서열번호 15)
LC-CDR2: DNNERLS (서열번호 16)
LC-CDR3: GTWDSSLSVVV (서열번호 17)
일부 실시양태에서, 항체, 또는 항원 결합 단편은 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다:
LC-CDR1: TGSSSNIGAGYDVH (서열번호 18)
LC-CDR2: GNSNRPS (서열번호 19)
LC-CDR3: QSYDSSLSGSYVV (서열번호 20)
일부 실시양태에서, 항체, 또는 항원 결합 단편은 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다:
HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22)
HC-CDR3: X1X2X3X4X5X6SX7X8AFDX9 (서열번호 26)
여기서 X1 = 부재 또는 G이고, X2 = G 또는 S이고, X3 = G 또는 Y이고, X4 = S, G 또는 H이고, X5 = Y 또는 G이고, X6 = G, N 또는 Y이고, X7 = L 또는 Y이고, X8 = Y 또는 G이고, X9 = I 또는 Y임.
일부 실시양태에서, 항체, 또는 항원 결합 단편은 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다:
HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22)
HC-CDR3: GGSYGSLYAFDI (서열번호 23)
일부 실시양태에서, 항체, 또는 항원 결합 단편은 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다:
HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22)
HC-CDR3: GGYGGNSLYAFDI (서열번호 24)
일부 실시양태에서, 항체, 또는 항원 결합 단편은 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다:
HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22)
HC-CDR3: SGHGYSYGAFDY (서열번호 25)
항체는 도 1 또는 3에 나타낸 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체는 도 2 또는 3에 나타낸 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
항체는 서열번호 1, 9, 10, 11; 또는 2, 12, 13, 14; 또는 3, 15, 16, 17; 또는 4, 18, 19, 20 중의 하나의 아미노산 서열, 또는 도 1에 나타낸 아미노산 서열 중의 하나, 또는 서열번호 1, 9, 10, 11; 또는 2, 12, 13, 14; 또는 3, 15, 16, 17; 또는 4, 18, 19, 20 중의 하나에, 또는 도 1에 나타낸 VL 쇄 아미노산 서열의 아미노산 서열에 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 적어도 하나의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함할 수 있다.
항체는 서열번호 5, 21, 22, 23; 또는 6, 21, 22, 23; 또는 7, 21, 22, 24; 또는 8, 21, 22, 25; 또는 35, 21, 22, 25 중의 하나의 아미노산 서열, 또는 도 2에 나타낸 아미노산 서열 중의 하나, 또는 서열번호 5, 21, 22, 23; 또는 6, 21, 22, 23; 또는 7, 21, 22, 24; 또는 8, 21, 22, 25; 또는 35, 21, 22, 25 중의 하나에 또는 도 2에 도시된 VH 쇄 아미노산 서열의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중의 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 적어도 하나의 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함할 수 있다.
항체는 서열번호 1, 9, 10, 11; 또는 2, 12, 13, 14; 또는 3, 15, 16, 17; 또는 4, 18, 19, 20 중의 하나의 아미노산 서열, 또는 도 1에 나타낸 아미노산 서열의 하나 (또는 서열번호 1, 9, 10, 11; 또는 2, 12, 13, 14; 또는 3, 15, 16, 17; 또는 4, 18, 19, 20 중의 하나에, 또는 도 1에 나타낸 VL 쇄 아미노산 서열의 아미노산 서열 중의 하나에 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중의 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열)를 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 5, 21, 22, 23; 또는 6, 21, 22, 23; 또는 7, 21, 22, 24; 또는 8, 21, 22, 25; 또는 35, 21, 22, 25 중의 하나의 아미노산 서열, 또는 도 2에 나타낸 아미노산 서열 중의 하나 (또는 서열번호 5, 21, 22, 23; 또는 6, 21, 22, 23; 또는 7, 21, 22, 24; 또는 8, 21, 22, 25; 또는 35, 21, 22, 25 중의 하나에, 또는 도 2에 도시된 VH 쇄 아미노산 서열의 아미노산 서열 중의 하나에 대해 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중의 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열)를 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
항체는 선택적으로 PD-L1, 선택적으로 인간 또는 뮤린 PD-L1에 결합할 수 있다. 항체는 선택적으로 상기에 기술된 바와 같은 아미노산 성분을 가질 수 있다. 항체는 IgG일 수 있다. 일 실시양태에서, PD-L1에 결합된, 본원에 기술된 바와 같은 항체, 또는 항원 결합 단편의, 선택적으로 단리된, 시험관 내 복합체가 제공된다.
항체는 인간 PD-1과 인간 PD-L1 사이, 또는 뮤린 PD-1과 뮤린 PD-L1 사이의 상호작용 또는 기능적 연합을 선택적으로 억제 또는 차단할 수 있다. PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용 또는 기능적 연합의 이러한 억제 또는 차단은 PD-1 또는 PD-L1/PD-1 신호전달의 PD-L1-매개 활성화를 억제 또는 차단할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 단리된 중쇄 가변 영역 폴리펩티드가 제공되는데, 중쇄 가변 영역 폴리펩티드는 하기 CDR들을 포함한다:
HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22)
HC-CDR3: X1X2X3X4X5X6SX7X8AFDX9 (서열번호 26)
여기서 X1 = 부재 또는 G이고, X2 = G 또는 S이고, X3 = G 또는 Y이고, X4 = S, G 또는 H이고, X5 = Y 또는 G이고, X6 = G, N 또는 Y이고, X7 = L 또는 Y이고, X8 = Y 또는 G이고, X9 = I 또는 Y임.
일부 실시양태에서, HC-CDR3은 GGSYGSLYAFDI (서열번호 23), GGYGGNSLYAFDI (서열번호 24) 또는 SGHGYSYGAFDY (서열번호 25) 중의 하나이다.
본 발명의 일 측면에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 또는 항원 결합 단편이 제공되는데, 여기서:
중쇄는 HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21), HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22), HC-CDR3: X1X2X3X4X5X6SX7X8AFDX9 (서열번호 26) 또는 GGSYGSLYAFDI (서열번호 23) 또는 GGYGGNSLYAFDI (서열번호 24) 또는 SGHGYSYGAFDY (서열번호 25) 중의 하나 (여기서 X1 = 부재 또는 G이고, X2 = G 또는 S이고, X3 = G 또는 Y이고, X4 = S, G 또는 H이고, X5 = Y 또는 G이고, X6 = G, N 또는 Y이고, X7 = L 또는 Y이고, X8 = Y 또는 G이고, X9 = I 또는 Y임)에 각각 적어도 85% 전체 서열 동일성을 갖는 HC-CDR1, HC-CDR2, HC-CDR3을 포함하고,
경쇄는 LC-CDR1: SGRSSNIASHDVF (서열번호 9), GGDNIGRKSVH (서열번호 12), SGSSSNIGNNYVS (서열번호 15), 또는 TGSSSNIGAGYDVH (서열번호 18) 중의 하나, LC-CDR2: ETNKRPW (서열번호 10), DDGDRPS (서열번호 13), DNNERLS (서열번호 16), 또는 GNSNRPS (서열번호 19) 중의 하나, LC-CDR3: GAWDSGLTGML (서열번호 11), QAWDSTVV (서열번호 14), GTWDSSLSVVV (서열번호 17), 또는 QSYDSSLSGSYVV (서열번호 20) 중의 하나에 적어도 85% 전체 서열 동일성을 갖는 LC-CDR1, LC-CDR2, LC-CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열 동일성의 정도는 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중의 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 선택적으로 단리된, 항체, 또는 항원 결합 단편이 제공되는데, 여기서:
중쇄 서열은 서열번호 5, 6, 7, 8 또는 35 (도 2)의 중쇄 서열에 적어도 85% 서열 동일성을 갖고,
경쇄 서열은 서열번호 1, 2, 3 또는 4 (도 1)의 경쇄 서열에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성의 정도는 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중의 하나일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드는 배열 HCFR1:HC-CDR1:HCFR2:HC-CDR2:HCFR3:HC-CDR3:HCFR4에 따라 CDRs 사이에 가변 영역 중쇄 프레임워크 서열을 추가로 포함한다. 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유래할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 선택적으로 본원에 기술된 바와 같은 경쇄 가변 영역 폴리펩티드와 조합된, 단리된 중쇄 가변 영역 폴리펩티드가 제공되고, 중쇄 가변 영역 폴리펩티드는 하기 CDR들을 포함한다:
HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22)
HC-CDR3: X1X2X3X4X5X6SX7X8AFDX9 (서열번호 26)
여기서 X1 = 부재 또는 G이고, X2 = G 또는 S이고, X3 = G 또는 Y이고, X4 = S, G 또는 H이고, X5 = Y 또는 G이고, X6 = G, N 또는 Y이고, X7 = L 또는 Y이고, X8 = Y 또는 G이고, X9 = I 또는 Y임.
일부 실시양태에서, HC-CDR3은 GGSYGSLYAFDI (서열번호 23) 또는 GGYGGNSLYAFDI (서열번호 24) 또는 SGHGYSYGAFDY (서열번호 25) 중의 하나이다.
일부 실시양태에서, 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드는 배열 LCFR1:LC-CDR1:LCFR2:LC-CDR2:LCFR3:LC-CDR3:LCFR4에 따라 CDRs 사이에 가변 영역 경쇄 프레임워크 서열을 추가로 포함한다. 프레임워크 서열은 인간 공통 프레임워크 서열로부터 유래될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체, 또는 항체 결합 단편은 인간 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중의 하나로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항체, 또는 항체 결합 단편은 뮤린 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 IgG1, IgG2A, IgG2B 및 IgG3 중의 하나로부터 선택된다.
본 발명의 다른 측면에서, PD-L1에 결합할 수 있고, 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편인, 선택적으로 단리된, 항체 또는 항원 결합 단편이 제공된다. 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 본원에 기술된 바와 같은 PD-L1에 결합할 수 있는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드, 및 (ii) PD-L1 이외의 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, PD-L1 이외의 표적 단백질은 세포 표면 수용체, 예컨대 T 세포의 세포 표면에서 발현된 수용체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 수용체는 면역 체크포인트 수용체, 예컨대, 동시-자극 수용체 또는 억제 수용체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 동시-자극 수용체는 CD27, CD28, ICOS, CD40, CD122, OX40, 4-1BB 및 GITR로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제 수용체는 LAG-3, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, A2AR, VISTA, TIM-3, PD-1, 및 KIR로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, PD-L1 이외의 표적 단백질은 그의 발현이 암과 연관되는 암 마커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 마커는 세포 표면에서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 마커는 HER-2, HER-3, EGFR, EpCAM, CD30, CD33, CD38, CD20, CD24, CD90, CD15, CD52, CA-125, CD34, CA-15-3, CA-19-9, CEA, CD99, CD117, CD31, CD44, CD123, CD133, ABCB5 및 CD45로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 조성물, 예컨대 약제학적 조성물 또는 의약품이 제공된다. 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드 및 적어도 하나의 약제학적으로-허용가능한 담체, 부형제, 보조제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은, 단리된 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드가 제공된다. 핵산은 서열번호 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 36 (도 4) 중의 하나의 서열, 또는 유전 코드의 결과로서 퇴화되는 코딩 서열을 가질 수 있거나, 또는 그에 적어도 70%, 선택적으로 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중의 하나의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 본원에 기술된 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 본 발명의 다른 측면에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 예를 들어, 숙주 세포는 진핵, 또는 포유류, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), 또는 인간일 수 있거나 원핵 세포, 예컨대 대장균 (E. coli)일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터의 발현에 적합한 조건하에서 본원에 기술된 바와 같은 숙주 세포를 배양하고, 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에서, 요법에 또는 의학적 치료의 방법에 사용하기 위한 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드가 제공된다. 본 발명의 다른 측면에서, T-세포 기능이상 장애의 치료에 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드가 제공된다. 본 발명의 다른 측면에서, T-세포 기능이상 장애의 치료에 사용하기 위한 의약품 또는 약제학적 조성물의 제조에 있어 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드의 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 기능이상 T-세포에 투여하는 단계를 포함하는, T-세포 기능을 개선하는 방법이 제공된다. 방법은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 T-세포 기능이상 장애를 앓고 있는 환자에 투여하는 단계를 포함하는, T-세포 기능이상 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에서, 암의 치료에 사용하기 위한 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드가 제공된다. 본 발명의 다른 측면에서, 암의 치료에 사용하기 위한 의약품 또는 약제학적 조성물의 제조에 있어 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드의 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 종양 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포를 사멸하는 방법이 제공된다. 방법은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 종양 세포의 사멸은 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 보체 의존성 세포독성 (CDC)의 결과로서, 또는 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드에 접합된 약물의 작용을 통해서일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 암을 앓고 있는 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 제공된다.
암은 PD-L1을 과발현하는 암일 수 있거나, 또는 PD-L1을 과발현하는 세포를 포함할 수 있다. 암은 결장직장암종 또는 흑색종일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 개체에서 면역 반응이 조정되도록 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 조정하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포의 성장을 억제하는 방법이 제공된다. 방법은 시험관 내 또는 생체 내일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에서, PD-L1을 함유하거나 이를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계, 및 항체, 또는 항원 결합 단편과 PD-L1의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 방법에 제공된다.
본 발명의 다른 측면에서, 시험관 내에서, 개체로부터의 샘플을 본원에 기술된 바와 같은 항체, 또는 항원 결합 단편을 접촉시키는 단계, 및 항체, 또는 항원 결합 단편과 PD-L1의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 개체에서 질환 또는 병태를 진단하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에서, PD-L1의 시험관 내 검출을 위한, 본원에 기술된 바와 같은 항체, 또는 항원 결합 단편의 용도가 제공된다. 본 발명의 다른 측면에서, 시험관 내 진단제로서, 본원에 기술된 바와 같은 항체, 또는 항원 결합 단편의 용도가 제공된다.
본 발명의 방법에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물로서 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드가 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 본원에 기술된 바와 같은 클론 A1, C2, C4, H12 또는 H12_GL일 수 있다.
설명
항체
본 발명에 따른 항체는 선택적으로 0.1 내지 4 nM 범위의 KD를 가지며, 바람직하게는 PD-L1 (항원), 바람직하게는 인간 또는 뮤린 PD-L1에 결합한다.
본 발명에 따른 항체는 단리된 형태로 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 하기 특성들 중 적어도 하나를 발휘할 수 있다:
a) 1 μM 이하, 바람직하게는 ≤10 nM, ≤1 nM ≤500 pM, ≤400 pM 또는 ≤300 pM 중의 하나의 KD 로, 인간, 마우스 또는 사이노몰구스 마카크 (cynomolgus macaque) PD-L1에 결합함;
b) 인간 PD-1, PD-L2, TIM-3, LAG3, ICOS, CTLA-4, BTLA 또는 CD28에는 실질적으로 결합하지 않음;
c) 인간 PD-1과 인간 PD-L1 사이의 상호작용을 억제 또는 차단하거나 또는 뮤린 PD-1과 뮤린 PD-L1 사이의 상호작용을 억제 또는 차단함;
d) 혼합 림프구 반응 (MLR) 어세이에서 T-세포 증식을 증가시킴 (예컨대, Bromelow et al J. Immunol Methods, 2001 Jan 1; 247(1-2): 1-8 참조);
e) MLR 어세이에서 인터페론-감마 생산을 증가시킴;
f) 생체 외에서 종양 침윤성 림프구에 의한 인터페론-감마 생산을 증가시킴;
g) 감염에 대한 반응으로 림프구에 의한 인터페론-감마 생산을 증가시킴;
h) 선택적으로 생체 내에서, 종양 성장을 억제함;
i) 아테졸리주맙 (atezolizumab) (MPDL3280A; RG7446)에 의한 결합의 친화도보다 더 큰 친화도, 또는 그와 유사한 친화도로 PD-L1 (선택적으로 인간 PD-L1)에 결합함;
j) 아테졸리주맙에 의한 결합의 결합력 (avidity)보다 더 큰 결합력으로, 또는 그와 유사한 결합력으로 PD-L1 (선택적으로 인간 PD-L1)에 결합함;
k) 아테졸리주맙에 의한 상호작용의 억제/차단보다 더 큰 정도로, 또는 그와 유사한 정도로 PD-L1과 PD-1 (선택적으로 인간 PD-L1과 인간 PD-1) 사이의 상호작용을 억제 또는 차단함.
"항체"에 의해 본 발명은 이의 단편 또는 유도체, 또는 합성 항체 또는 합성 항체 단편을 포함한다.
모노클로날 항체 기술과 관련하여 오늘날의 기법을 고려할 때, 항체는 대부분의 항원에 대해 제조될 수 있다. 항원-결합 부분은 항체의 일부 (예를 들어, Fab 단편) 또는 합성 항체 단편 (예를 들어, 일본쇄 Fv 단편 [ScFv])일 수 있다. 선택된 항원에 대한 적합한 모노클로날 항체는 공지된 기법, 예를 들어, 문헌 ["Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) 및 "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)]에 기재된 기법에 의해 제조될 수 있다. 키메라 항체는 문헌 [Neuberger et al (1988, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799)]에 논의된다.
모노클로날 항체 (mAbs)는 본 발명의 방법에 유용하고, 항원 상의 단일 에피토프를 특이적으로 표적하는 항원의 균질한 집단이다.
폴리클로날 항체가 본 발명의 방법에 유용하다. 단일특이적 폴리클로날 항체가 바람직하다. 적합한 폴리클로날 항체는 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
항체의 항원 결합 단편, 예컨대 Fab 및 Fab2 단편도 또한 유전적으로 조작된 항체 및 항체 단편과 같이 사용되고/제공될 수 있다. 항체의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 도메인은 초기 프로테아제 소화 실험에 의해 최초로 인식된 사실인, 항원 인식에 관련된다. 추가의 확인은 설치류 항체의 "인간화"에 의해 발견되었다. 설치류 기원의 가변 도메인은 결과로서 생기는 항체가 설치류 부모 항체의 항원 특이성을 보유하도록 인간 기원의 불변 도메인에 융합될 수 있다 [Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 81, 6851-6855].
그 항원 특이성은 가변 도메인에 의해 부여되고 불변 도메인과는 독립적이며, 이는 모두 하나 이상의 가변 도메인을 함유하는 항체 단편의 세균성 발현을 포함하는 실험으로부터 공지되어 있다. 이들 분자는 Fab-유사 분자 [Better et al (1988) Science 240, 1041); Fv 분자 [Skerra et al (1988) Science 240, 1038]; 일본쇄 Fv (ScFv) 분자를 포함하고, 여기서 VH 및 VL 파트너 도메인은 가요성 올리고펩티드 [Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 85, 5879] 및 단리된 V 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체 (dAbs) [Ward et al (1989) Nature 341, 544]를 통해 연결된다. 이들의 특이적 결합 부위를 보유하는 항체 단편의 합성에 관련되는 기법의 일반적인 검토를 문헌 [Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299]에서 확인할 수 있다.
"ScFv 분자"에 의해 본 발명은 VH 및 VL 파트너 도메인이, 예를 들어 가요성 올리고펩티드에 의해 공유 결합되는 분자를 의미한다.
Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편은 모두 대장균에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있으며, 따라서 다량의 상기 단편을 용이하게 생산할 수 있도록 한다.
전체 항체 및 F(ab')2 단편은 "2가"이다. "2가"에 의해 본 발명은 상기 항체 및 F(ab')2 단편이 두 개의 항원 결합 부위를 갖는다는 것을 의미한다. 대조적으로, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 단편은 단지 하나의 항원 조합 부위 (antigen combining sites)를 갖는 1가이다. PD-1에 결합하는 합성 항체는 또한 당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같은 파지 디스플레이 기법을 이용하여 제조될 수 있다.
본 출원은 또한 PD-L1에 결합할 수 있고, 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편인, 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편은 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 본 발명에 따른 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 PD-L1에 결합할 수 있는 항원 결합 단편을 포함하고, PD-L1에 결합할 수 있는 항원 결합 단편은 본 발명에 따른 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 포함하거나 이로 구성된다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 PD-L1에 결합할 수 있는 항원 결합 단편, 및 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 단편을 포함한다.
다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 단편은 PD-L1 이외의 다른 단백질에 결합할 수 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 단백질은 세포 표면 수용체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 면역 세포, 예컨대 T 세포의 세포 표면에서 발현되는 세포 표면 수용체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 수용체는 면역 체크포인트 (checkpoint) 수용체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 수용체는 공자극 수용체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 공자극 수용체는 CD27, CD28, ICOS, CD40, CD122, OX40, 4-1BB 및 GITR로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 수용체는 억제 수용체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제 수용체는 LAG-3, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, A2AR, VISTA, TIM-3, PD-1, 및 KIR로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 단백질은 암 마커일 수 있다. 즉, 표적 단백질은 그의 발현 (예컨대, 상향조절된 발현)이 암과 연관된 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 마커는 세포 표면에서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 마커는 수용체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 마커는 HER-2, HER-3, EGFR, EpCAM, CD30, CD33, CD38, CD20, CD24, CD90, CD15, CD52, CA-125, CD34, CA-15-3, CA-19-9, CEA, CD99, CD117, CD31, CD44, CD123, CD133, ABCB5 및 CD45로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, CD27에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD27 항체 클론 0323 (Millipore) 또는 바를리루맙 (varlilumab) (Celldex Therapeutics)의 다른 CD27 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD28에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD28 항체 클론 CD28.6 (eBioscience), 클론 CD28.2, 클론 JJ319 (Novus Biologicals), 클론 204.12, 클론 B-23, 클론 10F3 (Thermo Scientific Pierce Antibodies), 클론 37407 (R&D Systems), 클론 204-12 (Abnova Corporation), 클론 15E8 (EMD Millipore), 클론 204-12, 클론 YTH913.12 (AbD Serotec), 클론 B-T3 (Acris Antibodies), 클론 9H6E2 (Sino Biological), 클론 C28/77 (MyBioSource.com), 클론 KOLT-2 (ALPCO), 클론 152-2E10 (Santa Cruz Biotechnology), 또는 클론 XPH-56 (Creative Diagnostics)의 다른 CD28 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ICOS에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-ICOS 항체 클론 ISA-3 (eBioscience), 클론 SP98 (Novus Biologicals), 클론 1G1, 클론 3G4 (Abnova Corporation), 클론 669222 (R&D Systems), 클론 TQ09 (Creative Diagnostics), 또는 클론 C398.4A (BioLegend)의 다른 ICOS 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD40에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD40 항체 클론 82111 (R&D Systems), 또는 ASKP1240 (Okimura et al., AM J Transplant (2014) 14(6) 1290-1299)의 다른 CD40 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD122에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD122 항체 클론 mikβ2 (PharMingen)의 다른 CD122 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, OX40에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 US 20130280275, US 8283450 또는 WO 2013038191에 기술된 항-OX40 항체, 예컨대 클론 12H3 또는 클론 20E5의 다른 OX40 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 4-1BB에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-4-1BB 항체 PF-05082566 (Fisher et al., Cancer Immunol Immunother (2012) 61: 1721-1733), 또는 우렐루맙 (urelumab) (BMS-665513; Bristol-Myers Squibb; Li and Liu, Clin Pharmacol (2013); 5: 47-53)의 다른 4-1BB 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, GITR에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-GITR 항체 TRX-518 (TolerxR; Schaer et al., (2010) 11(12): 1378-1386), 또는 클론 AIT 518D (LifeSpan Biosciences)의 다른 GITR 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, LAG3에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-LAG3 항체 클론 17B4 (Enzo Life Sciences), 클론 333210 (R&D Systems), 또는 클론 14L676 (United States Biological)의 다른 LAG3 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, B7-H3에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 US 20130078234, WO 2014160627 또는 WO 2011109400에 기술된 항-B7-H3 항체 클론의 다른 B7-H3 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, B7-H4에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 WO 2013067492, WO 2009073533 또는 EP 2934575에 기술된 항-B7-H4 항체 클론, 예를 들어 클론 2H9의 다른 B7-H4 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, BTLA에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-BTLA 항체 클론 1B7, 클론 2G8, 클론 4C5 (Abnova Corporation), 클론 4B8 (Antibody-online), 클론 MIH26 (Thermo Scientific Pierce Antibody), 클론 UMAB61 (OriGene Technologies), 클론 330104 (R&D Systems), 클론 1B4 (LifeSpan BioSciences), 클론 440205, 클론 5E7 (Creative Diagnostics)의 다른 BTLA 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CTLA4에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CTLA4 항체 클론 2F1, 클론 1F4 (Abnova Corporation), 클론 9H10 (EMD Millipore), 클론 BNU3 (GeneTex), 클론 1E2, 클론 AS32 (LifeSpan BioSciences) 클론 A3.4H2.H12 (Acris Antibodies), 클론 060 (Sino Biological), 클론 BU5G3 (Creative Diagnostics), 클론 MIH8 (MBL International), 클론 A3.6B10.G1, 또는 클론 L3D10 (BioLegend)의 다른 CTLA4 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, A2AR에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-A2AR 항체 클론 7F6 (Millipore; Koshiba et al. Molecular Pharmacology (1999); 55: 614-624)의 다른 A2AR 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, VISTA에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예들 들어 WO 2015097536 또는 US 20140105912에 기술된 항-VISTA 항체, 예컨대 클론 13F3의 다른 VISTA 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, TIM-3에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-TIM-3 항체 클론 F38-2E2 (BioLegend), 클론 2E2 (Merck Millipore; Pires da Silva et al., Cancer Immunol Res (2014) 2(5): 410-422), 클론 6B6E2, 클론 024 (Sino Biological) 클론 344801 (R&D Systems), 클론 E-18, 클론 H-191 (Santa Cruz Biotechnology), 또는 클론 13A224 (United States Biological)의 다른 TIM-3 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, PD-1에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-PD-1 항체 클론 J116, 클론 MIH4 (eBioscience), 클론 7A11B1 (Rockland Immunochemicals Inc.), 클론 192106 (R&D Systems), 클론 J110, 클론 J105 (MBL International), 클론 12A7D7, 클론 7A11B1 (Abbiotec), 클론 #9X21 (MyBioSource.com), 클론 4H4D1 (Proteintech Group), 클론 D3W4U, 클론 D3O4S (Cell Signaling Technology), 클론 RMP1-30, 클론 RMP1-14 (Merck Millipore), 클론 EH12.2H7 (BioLegend), 클론 10B1227 (United States Biological), 클론 UMAB198, 클론 UMAB197 (Origene Technologies), 니볼루맙 (nivolumab) (BMS-936558), 람브롤리주맙 (lambrolizumab), 또는 WO 2010/077634 또는 WO 2006/121168에 기술된 항-PD-1 항체의 다른 PD-1 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, KIR에 대한 항원 결합 단편은 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-KIR 항체 클론 1-7F9 (Romagne et al., Blood (2009) 114(13): 2667-2677), 리릴루맙 (lirilumab) (BMS-986015; Sola et al., J Immunother Cancer (2013); 1:P40) 또는 US 2015/0344576 또는 WO 2014/066532에 기술된 항-KIR 항체의 다른 KIR 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, HER-2에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-HER-2 항체 트라스트주맙 (trastuzumab) (Herceptin), 또는 WO 2003/006509 또는 WO 2008/019290에 기술된 항-HER-2 항체의 다른 HER-2 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, HER-3에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-HER-3 항체 클론 MM-121 (Lyu et al., Int. J Clin Exp Pathol (2015) 8(6): 6143-6156), MEHD7945A (Schaefer et al., Cancer Cell (2011) 20(4): 472-486), AMG 888 (U3-1287; Aurisicchio et al., Oncotarget (2012) 3(8): 744-758) 또는 WO 2008/100624 또는 WO 2013048883에 기술된 항-HER-3 항체의 다른 HER-3 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, EGFR에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-EGFR 항체 파니투무맙 (panitumumab) (ABX-EGF; Vectibix), 세툭시맙 (cetuximab) (Erbitux), 니모투주맙 (nimotuzumab), 마타주맙 (matazumab) (EMD 7200) 또는 항체 클론 048-006 (Sogawa et al., Nucl Med Comm (2012) 33(7): 719-725)의 다른 EGFR 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, EpCAM에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-EpCAM 항체 에드레콜로맙 (edrecolomab), ING-1, 3622W4, 또는 아데카투무맙 (adecatumumab) (Munz et al., Cancer Cell Int (2010) 10:44)의 다른 EpCAM 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD30에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD30 항체 브렌툭시맙 (brentuximab) (cAC10), 클론 SGN-30 (Wahl et al., Cancer Res 2002 62(13):3736-3742), 클론 5F11 (Borchmann et al., Blood (2003) 102(1): 3737-3742), 또는 WO 1993024135 또는 WO 2003059282에 기술된 항-CD30 항체의 다른 CD30 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD33에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD33 항체 린투주맙 (lintuzumab) (SGN-33), 겜투주맙 (gemtuzumab) (Mylotarg), 또는 클론 hP67.7 (Sievers et al., Blood (1999) 93(11): 3678-3684)의 다른 CD33 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD38에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD38 항체 다라투무맙 (daratumumab) (Darzalex), SAR650984 (Martin et al., J Clin Oncol (2014) 32:5s, (suppl; abstr 8532) 또는 MOR202 (MorphoSys AG), 또는 WO 2006099875 또는 US 20100285004에 기술된 항-CD38 항체의 다른 CD38 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD20에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD20 항체 리툭시맙 (rituximab), 오크렐리주맙 (ocrelizumab), 오파투무맙 (ofatumumab), 오비누투주맙 (obinutuzumab) 또는 BM-ca (Kobayashi et al., Cancer Med (2013) 2(2): 130-143)의 다른 CD20 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD24에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD24 항체 클론 eBioSN3 (eBioscience), 클론 ML5 (BD Biosciences), 또는 WO 2008059491에 기술된 항-CD24 항체의 다른 CD24 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD90에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD90 항체 클론 5E10 (BD Biosciences)의 다른 CD90 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD15에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD15 항체 클론 C3D-1, Carb-3 (DAKO A/S), MMA (Roche) 또는 BY87 (Abcam)의 다른 CD15 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD52에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD52 항체 알렘투주맙 (alemtuzumab), 클론 HI186, 또는 클론 YTH34.5 (AbD Serotec)의 다른 CD52 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CA-125에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CA-125 항체 오레고보맙 (oregovomab)의 다른 CA-125 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD34에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD34 항체 클론 561 (BioLegend), 클론 581 (Beckton Dickinson), 또는 클론 5F3 (Sigma Aldrich)의 다른 CD34 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CA-15-3에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CA-15-3 항체 클론 2F16 (USBiological), 클론 TA998 (ThermoFisher Scientific), 클론 1D1 (Sigma Aldrich), 또는 Mab AR20.5 (Qi et al., Hybrid Hybridomics (2001) 20(5-6): 313-324)의 다른 CA-15-3 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CA-19-9에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CA-19-9 항체 클론 116-NS-19-9 (DAKO A/S), 클론 SPM110, 또는 클론 121SLE (ThermoFisher Scientific)의 다른 CA-19-9 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CEA에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CEA 항체 라베투주맙 (labetuzumab), C2-45 (Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd.) 또는 문헌 [Imakiire et al., Int J Cancer (2004) 108: 564-570] 또는 WO 2011034660에 기술된 항-CEA 항체의 다른 CEA 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD99에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD99 항체 클론 C7A (Moricoli et al., J Immunol Methods (2014) 408: 35-45) 또는 클론 12E7 (DAKO A/S)의 다른 CD99 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD117에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD117 항체 클론 CK6 (Lebron et al., Cancer Biol Ther (2014) 15(9): 1208-1218), 또는 클론 104D2 (Sigma Aldrich)의 다른 CD117 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD31에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD31 항체 클론 JC70A (DAKO A/S)의 다른 CD31 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD44에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD44 항체 PF-03475952 (Runnels et al., Adv Ther (2010); 27(3): 168-180), RG7356 (Vugts et al., MAbs (2014) 6(2): 567-575), 클론 IM7, 또는 클론 A3D8 (Sigma Aldrich)의 다른 CD44 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD123에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD123 항체 CSL362 (Nievergall et al., Blood (2014) 123(8):1218-1228), CSL360 (He et al., Leuk Lymphoma (2015) 56(5): 1406-1415) 73G (Jin et al., Cell Stem Cell (2009) 5(1): 31-42) 클론 6H6 (AbD Serotec) 또는 WO 2014130635에 기술된 항-CD123 항체의 다른 CD123 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD133에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD133 항체 클론 6B3, 클론 9G4, 클론 AC141 (Wang et al., Hybridoma (Larchmt) (2010) 29(3): 241-249), 클론 6B6 (Chen et al., Hybridoma (Larchmt) (2010) 29(4): 305-310, 클론 AC113 (Miltenyi Biotec), 또는 WO 2011149493에 기술된 항-CD133 항체의 다른 CD133 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ABCB5에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-ABCB5 항체 클론 5H3C6 (Thermo Fisher Scientific)의 다른 ABCB5 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD45에 대한 항원 결합 단편은 상기 CDRs, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는, 예를 들어 항-CD45 항체 YAML568 (Glatting et al., J Nucl Med (2006) 47(8): 1335-1341) 또는 클론 BRA-55 (Sigma Aldrich)의 다른 CD45 결합 단편을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편의 항원 결합 단편은 항원에 결합할 수 있는 폴리펩티드의 임의의 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 함께 항체 또는 항원 결합 단편의 항원 결합 영역을 정의하는, 적어도 3개의 경쇄 CDRs (즉, LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3) 및 3개의 중쇄 CDRs (즉, HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄 폴리펩티드 및 중쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은, 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는, 문헌 [Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-197]에 기술된 바와 같은 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편은 이중특이적 항체 접합체 (예컨대, IgG2, F(ab')2 또는 CovX-Body), 이중특이적 IgG 또는 IgG-유사 분자 (예컨대, IgG, scFv4-Ig, IgG-scFv, scFv-IgG, DVD-Ig, IgG-sVD, sVD-IgG, 2 인 (in) 1-IgG, mAb2, 또는 Tandemab common LC), 비대칭 이중특이적 IgG 또는 IgG-유사 분사 (예컨대, kih IgG, kih IgG common LC, CrossMab, kih IgG-scFab, mAb-Fv, 전하쌍 또는 SEED-바디), 소형 이중특이적 항체 분자 (예컨대, 디아바디 (Db), dsDb, DART, scDb, tandAbs, 탠덤 scFv (taFv), 탠덤 dAb/VHH, 트리플 바디, 트리플 헤드, Fab-scFv, 또는 F(ab')2-scFv2), 이중특이적 Fc 및 CH3 융합 단백질 (예컨대, taFv-Fc, 디-디아바디, scDb-CH3, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, scFv-kih-Fc, 또는 scFv-kih-CH3), 또는 이중특이적 융합 단백질 (예컨대, scFv2-알부민, scDb-알부민, taFv-독소, DNL-Fab3, DNL-Fab4-IgG, DNL-Fab4-IgG-사이토카인2)일 수 있다. 특히, 문헌 [Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-19]의 도 2를 참조한다.
당업자는 본 발명에 따른 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편을 설계하고 제조할 수 있다.
이중특이적 항체를 생산하는 방법은, 예를 들어 그 전체가 참조로서 본원에 포함되는, 문헌 [Segal and Bast, 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16]에 기술된 바와 같이, 예컨대, 환원성 이황화 또는 비-환원성 티오에테르 결합을 갖는, 항체 또는 항체 단편의 화학적 가교결합을 포함한다. 예를 들어, N-석시니미딜-3-(-2-피리딜디티오)-프로피오네이트 (SPDP)는 이황화-연결된 이중특이적 F(ab)2 헤테로다이머를 생성하기 위해, 예컨대 힌지 영역 SH- 기를 통해 Fab 단편을 화학적으로 가교결합시키는데 사용될 수 있다.
이중특이적 항체를 생산하는 다른 방법은, 예를 들어 문헌 [D. M. and Bast, B. J. 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16]에 기술된 바와 같이, 이중특이적 항체를 스크리닝할 수 있는 쿼드로마 (quadroma) 세포를 생산하기 위해, 항체-생산 하이브리도마를, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜과 융합하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 또한, 둘 다 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는, 예를 들어 문헌 [Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition (Humana Press, 2012), at Chapter 40: Production of Bispecific Antibodies: Diabodies and Tandem scFv (Hornig and Faber-Schwarz)] 또는 문헌 [French, How to make Bispecific Antibodies, Methods Mol. Med. 2000; 40: 333-339]에 기술된 바와 같이, 예컨대 항원 결합 분자에 대한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 작제물로부터의 발현에 의해, 재조합적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 2개의 항원 결합 단편을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 (즉, PD-L1에 결합할 수 있는 항원 결합 단편을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 및 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 단편을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인)을 인코딩하고, 항원 결합 단편들 사이의 적합한 링커 또는 이량체화 도메인을 인코딩하는 서열을 포함하는 DNA 작제물이 분자 클로닝 기법에 의해 제조될 수 있다. 그 후에 재조합 이중특이적 항체가 적합한 숙주 세포 (예컨대, 포유류 숙주 세포)에서 작제물의 (예컨대, 시험관 내) 발현에 의해 생산될 수 있고, 이어서 발현된 재조합 이중특이적 항체는 선택적으로 정제될 수 있다.
항체는, 비변형된 부모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도가 개선된 변형된 항체가 생성되는 친화도 성숙화 공정에 의해 생성될 수 있다. 친화도 성숙 항체는 당해 기술 분야, 예를 들어 문헌 [Marks et al., Rio/Technology 10: 779-783 (1992); Barbas et al. Proc Nat. Acad . Sci . USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol . 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol . 154(7): 331 0-15 9 (1995); 및 Hawkins et al, J. Mol . Biol . 226: 889-896 (1992)]에 공지된 절차에 의해 생산될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 PD-1에 대해 특이적 결합을 나타낸다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 바람직하게는 다른 표적에 결합하는 것보다 더 큰 친화도 및/또는 더 긴 지속 기간으로 표적에 결합한다. 본 발명의 항체는 CD28 패밀리의 다른 멤버보다 PD-L1에 더 큰 친화도로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 PD-L2, TIM-3, LAG-3, ICOS, BTLA, CD28 또는 CTLA-4 중의 하나 이상에 대해서보다 PD-L1에 더 큰 친화도로 결합할 수 있다. 일 실시양태에서, 비관련 표적에 대한 항체의 결합 정도는, 예컨대 ELISA, 또는 방사면역검정 (RIA)에 의해 측정되는 바와 같이, 표적에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 대안적으로, 결합 특이성은 본 발명의 항-PD-1 항체가 다른 표적 분자, 예컨대 CD28 패밀리의 다른 구성원을 향한 항체의 KD보다 더 큰 크기의 적어도 0.1 차수 (즉, 0.1×10n, 여기서 n은 크기의 차수를 나타내는 정수임)인 KD로 PD-1에 결합하는 결합 친화도의 측면에서 반영될 수 있다. 이는 선택적으로 적어도 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5 또는 2.0 중의 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 ≤10 nM, ≤1 nM, ≤500 pM, ≤400 pM 또는 ≤300 pM 중 하나의 해리 상수 (KD)를 갖는다. KD는 약 0.1 내지 약 4 nM의 범위일 수 있다. 그의 표적에 대한 항체의 결합 친화도는 종종 이의 해리 상수 (KD)의 측면에서 기재된다. 결합 친화도는 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 또는 항체 및 항원 분자의 Fab 버전으로 수행된 방사선표지 항원 결합 어세이 (RIA)에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 아테졸리주맙 (MPDL3280A; RG7446)에 의한 결합의 친화도보다 더 큰 친화도, 또는 그와 유사한 친화도로 PD-L1 (예컨대, 인간 PD-L1)에 대한 결합을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 참조 항체에 비해 소정의 표적 분자에 대해 '더 큰 친화도'를 나타내는 항체는 표적 분자에 대한 참조 항체의 결합 강도에 비해 더 큰 강도로 표적 분자에 결합한다. 소정의 표적 분자에 대한 항체의 친화도는 정량적으로 결정될 수 있다.
아테졸리주맙에 비해 PD-L1에 대한 본 발명에 따른 항체의 결합의 상대적 친화도는 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 PD-L1에 대한 아테졸리주맙의 해리 상수 (KD) 미만이거나 이와 동등한 PD-L1에 대한 KD를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 소정의 어세이에서, PD-L1에 대한 아테졸리주맙의 친화도보다 1.01배 이상, 1.05배 이상, 1.1배 이상, 1.15배 이상, 1.2배 이상, 1.25배 이상, 1.3배 이상, 1.35배 이상, 1.4배 이상, 1.45배 이상, 1.5배 이상인 PD-L1에 대한 친화도를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 소정의 어세이에서, PD-L1에 대한 아테졸리주맙의 친화도의 0.99배 이하, 0.95배 이하, 0.9배 이하, 0.85배 이하, 0.8배 이하, 0.75배 이하, 0.7배 이하, 0.65배 이하, 0.6배 이하, 0.55배 이하, 0.5배 이하인 KD로 PD-L1에 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 아테졸리주맙에 의한 결합력보다 더 큰 결합력, 또는 그와 유사한 결합력으로 PD-L1 (예컨대, 인간 PD-L1)에의 결합을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 참조 항체에 비해 소정의 표적 분자에 대해 '더 큰 결합력'을 나타내는 항체는 표적 분자에 결합하여 표적 분자에 대한 참조 항체의 결합에 의해 형성된 항체:표적 복합체에 비해 더 강한 항체:표적 복합체 (예컨대, 더 안정한 항체:표적 복합체)를 형성한다. 소정의 표적 분자에 대한 항체의 결합력은 정량적으로 결정될 수 있다.
아테졸리주맙 대비 PD-L1에 대한 본 발명에 따른 항체의 결합의 상대적 결합력은, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이, ELISA에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 PD-L1에 대한 아테졸리주맙의 결합의 결합력보다 더 크거나 그와 동등한 PD-L1에 대한 결합의 결합력을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 소정의 어세이에서 PD-L1에 대한 아테졸리주맙의 결합의 결합력보다 1.01배 이상, 1.05배 이상, 1.1배 이상, 1.15배 이상, 1.2배 이상, 1.25배 이상, 1.3배 이상, 1.35배 이상, 1.4배 이상, 1.45배 이상, 1.5배 이상인 PD-L1에 대한 결합의 결합력을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 아테졸리주맙에 의한 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용의 억제/차단보다 더 큰 정도로, 또는 그와 유사한 정도로 PD-L1과 PD-1 (예컨대, 인간 PD-L1과 인간 PD-1) 사이의 상호작용을 억제하거나 차단할 수 있다. 아테졸리주맙 대비 PD-L1에 대한 본 발명에 따른 항체의 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용의 상대적 억제/차단은, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이, ELISA에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 아테졸리주맙에 의한 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용의 억제/차단보다 더 크거나 또는 그와 동등한 정도로 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용을 억제/차단할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 소정의 어세이에서 아테졸리주맙에 의한 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용의 억제/차단보다 1.01배 이상, 1.05배 이상, 1.1배 이상, 1.15배 이상, 1.2배 이상, 1.25배 이상, 1.3배 이상, 1.35배 이상, 1.4배 이상, 1.45배 이상, 1.5배 이상인 정도로 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용을 억제/차단할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 아테졸리주맙에 의한 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용의 억제에 대한 IC50 값보다 더 낮은 상호작용의 최대 억제의 절반 값 (즉, PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용의 억제를 위한 IC50 값)으로 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용을 억제/차단할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 소정의 어세이에서 아테졸리주맙에 의한 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용의 억제를 위한 IC50 값의 0.99배 이하, 0.95배 이하, 0.9배 이하, 0.85배 이하, 0.8배 이하, 0.75배 이하, 0.7배 이하, 0.65배 이하, 0.6배 이하, 0.55배 이하, 0.5배 이하인 IC50 값으로 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용을 억제/차단할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 그것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 "길항제" 항체일 수 있다. PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 차단하는 것은 PD-1에 의해 매개되는 면역-억제 신호전달 경로를 억제함으로써 T-세포 기능의 회복을 지원한다.
PD-L1은 또한 B7-1 (CD80)에 결합하는 것으로 나타났고, 이 상호작용은 또한 T-세포 증식 및 사이토카인 생산을 억제한다.
일부 측면에서, 항체는 클론 A1, 또는 A1의 변이체이다. A1은 하기 CDR 서열을 포함한다:
경쇄:
LC-CDR1: SGRSSNIASHDVF (서열번호 9)
LC-CDR2: ETNKRPW (서열번호 10)
LC-CDR3: GAWDSGLTGML (서열번호 11)
중쇄:
HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22)
HC-CDR3: GGSYGSLYAFDI (서열번호 23).
카바트 (Kabat) 정의에 의해 결정된 CDR 서열.
일부 측면에서, 항체는 클론 C2, 또는 C2의 변이체이다. C2는 하기 CDR 서열을 포함한다:
경쇄:
LC-CDR1: GGDNIGRKSVH (서열번호 12)
LC-CDR2: DDGDRPS (서열번호 13)
LC-CDR3: QAWDSTVV (서열번호 14)
중쇄:
HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22)
HC-CDR3: GGSYGSLYAFDI (서열번호 23).
카바트 정의에 의해 결정된 CDR 서열.
일부 측면에서, 항체는 클론 C4, 또는 C4의 변이체이다. C4는 하기 CDR 서열을 포함한다:
경쇄:
LC-CDR1: SGSSSNIGNNYVS (서열번호 15)
LC-CDR2: DNNERLS (서열번호 16)
LC-CDR3: GTWDSSLSVVV (서열번호 17)
중쇄:
HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22)
HC-CDR3: GGYGGNSLYAFDI (서열번호 24).
카바트 정의에 의해 결정된 CDR 서열.
일부 측면에서, 항체는 클론 H12, 또는 H12의 변이체이다. 일부 측면에서, 항체는 클론 H12_GL, 또는 H12_GL의 변이체이다. H12 및 H12_GL은 각각 하기 CDR 서열을 포함한다:
경쇄:
LC-CDR1: TGSSSNIGAGYDVH (서열번호 18)
LC-CDR2: GNSNRPS (서열번호 19)
LC-CDR3: QSYDSSLSGSYVV (서열번호 20)
중쇄:
HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22)
HC-CDR3: SGHGYSYGAFDY (서열번호 25).
카바트 정의에 의해 결정된 CDR 서열.
본 발명에 따른 항체는 A1, C2, C4, H12, 또는 H12_GL의 CDRs 또는 서열번호 1 및 5; 2 및 6; 3 및 7; 4 및 8; 또는 4 및 35 중의 하나를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 항체에서 6개 CDR 서열의 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개가 달라질 수 있다. 변이체는 6개 CDR 서열의 1개 또는 2개에서 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 가질 수 있다.
항-PD-L1 클론의 VH 및 VL 쇄의 아미노산 서열이 도 1 및 2에 나타나 있다. 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 도 4에 나타나 있다.
경쇄 및 중쇄 CDRs는 또한 다수의 상이한 프레임워크 영역과 관련하여 특히 유용할 수 있다. 따라서, LC-CDR1-3 또는 HC-CDR1-3을 갖는 경쇄 및/또는 중쇄는 대안적인 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 적합한 프레임워크 영역은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 참조로서 본원에 포함되는, 문헌 [M. Lefranc & G. Le:franc (2001) "The Immunoglobulin FactsBook", Academic Press]에 기술되어 있다.
본 명세서에서, 항체는 서열번호 1 및 5; 2 및 6; 3 및 7; 4 및 8; 또는 4 및 35의 VH 및/또는 VL 아미노산 서열의 하나 이상에, 또는 도 1 및 2에 나타난 아미노산 서열의 하나에 대해 높은 퍼센트 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 및/또는 VL 쇄를 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 항체는 PD-L1에 결합하고 서열번호 1 내지 8 및 35의 하나의 VH 또는 VL 쇄 아미노산 서열에, 또는 도 1 및 2에 나타난 아미노산 서열의 하나에 대해 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중의 하나의 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열을 포함하는 VH 또는 VL 쇄를 갖는 항체를 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 검출가능하게 표지될 수 있거나, 또는 적어도 검출될 수 있다. 예를 들어, 항체는 방사성 원자 또는 유색 분자 또는 형광 분자 또는 임의의 다른 방식으로 용이하게 검출될 수 있는 분자로 표지될 수 있다. 적합한 검출가능한 분자에는 형광 단백질, 루시퍼라제, 효소 기질 및 방사성표지가 포함된다. 결합 모이어티는 검출가능한 표지로 직접적으로 표지될 수 있거나, 또는 이는 간접적으로 표지될 수 있다. 예를 들어, 결합 모이어티는 자체 표지된 다른 항체에 의해 검출될 수 있는 비표지된 항체일 수 있다. 대안적으로, 2차 항체는 비오틴에 결합되어 있을 수 있고, 비오틴에 대한 표지된 스트렙타비딘의 결합은 1차 항체를 간접적으로 표지하는데 사용된다.
검출 방법
본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편은 PD-L1에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 결합을 포함하는 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 항체 또는 항원 결합 단편과 PD-L1의 결합된 복합체의 검출을 포함할 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, PD-L1을 함유하거나 이를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계, 및 항체 또는 항원 결합 단편과 PD-L1의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
샌드위치 어세이, 예를 들어 ELISA와 같은 면역어세이를 포함하는 적합한 방법 포맷이 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다. 방법은 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 PD-L1, 또는 둘 다를 검출가능한 표지, 예컨대 형광성, 발광성 또는 방사성-표지로 표지하는 단계를 포함할 수 있다. PD-L1 발현은, 예를 들어 생검에 의해 수득된 조직 샘플의 면역조직화학 (IHC)에 의해 측정될 수 있다.
이러한 종류의 방법은 PD-L1 또는 PD-1의 검출 또는 정량을 요구하는 질환 또는 병태를 진단하는 방법의 기초를 제공할 수 있다. 이러한 방법은 환자 샘플 상에서 시험관 내로 또는 환자 샘플의 처리 후에 수행될 수 있다. 일단 샘플이 수집되면, 환자는 시험관 내 진단 방법을 위해 참석할 필요가 없고, 따라서 방법은 인간 또는 동물 신체에서 수행되지 않는 것일 수 있다.
이러한 방법은 환자 샘플에 존재하는 PD-L1의 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 진단에 도달하는 과정의 일부로서 표준 또는 참조 값에 대해 결정된 양을 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 진단 또는 예후의 정확성을 증가시키기 위해 또는 본원에 기술된 시험을 사용하여 수득된 결과를 확인하기 위해 본원에 기술된 것들과 함께 다른 진단 시험이 사용될 수 있다.
암세포는 PD-L1 및/또는 PD-1의 발현을 상향조절하여, 종양 미세환경을 침윤하는 임의의 T 세포에 대한 억제 PD-1 수용체의 활성화를 가능케 하고 그로써 이들의 활성을 억제함으로써, 면역억제 환경을 조성하도록 PD-1 경로를 활용한다. PD-L1 및/또는 PD-1 발현의 상향조절이 다수의 상이한 암 유형에서 입증되어 왔고, PD-L1 / PD-1 고발현은 또한 불량한 임상 결과와 연관되어 있다.
환자 샘플에 존재하는 PD-L1 또는 PD-1의 수준은 환자가 항-PD1 항체를 이용한 치료에 반응할 수 있음을 나타낼 수 있다. 샘플 내 높은 수준의 PD-L1 또는 PD-1의 존재는 항-PD1 항체를 이용한 치료를 위해 환자를 선택하는데 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 항체는 항-PD-L1 요법을 이용한 치료를 위해 환자를 선택하는데 사용될 수 있다.
샘플 내 PD-L1 또는 PD-1의 검출은 환자에서 T-세포 기능이상 장애 또는 암성 상태의 진단, 또는 암성 상태에 대한 소인의 진단 또는 암성 상태의 예후를 제공할 (예측할) 목적을 위해 사용될 수 있다. 진단 또는 예후는 양성 또는 악성일 수 있는, 기존의 (이전에 진단된) 암성 상태에 관련될 수 있고, 의심되는 암성 상태에 관련될 수 있거나 (이전에 진단되지 않았을 수 있는) 환자의 암성 상태에 대한 스크리닝에 관련될 수 있다.
일 실시양태에서, CD8+ T 세포 상에서 PD-1 발현의 수준을 T-세포 고갈의 정도 및 질환 상태의 증중도를 나타내기 위해 검출할 수 있다.
일 실시양태에서, 예컨대 항원 제시 세포 또는 종양 세포 상에서 PD-L1 발현의 수준을 질환 상태, 예를 들어 조직 침윤 또는 암의 존재 또는 중증도를 나타내기 위해 검출할 수 있다.
샘플은 임의의 조직 또는 체액으로부터 채취할 수 있다. 샘플은 하기를 포함할 수 있거나 이들로부터 유래될 수 있다: 상당량의 혈액; 피브린 응고 및 혈액 세포의 제거 후에 수득된 혈액의 유체 부분을 포함할 수 있는 개인의 혈액으로부터 유래된 상당량의 혈청; 조직 샘플 또는 생검; 또는 상기 개인으로부터 단리된 세포.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 시험관 내에서 수행된다. 용어 "시험관 내"는 배양액 중의 세포를 사용한 실험을 포함하는 것으로 의도되는 반면, 용어 "생체 내"는 온전한 다세포 유기체를 사용한 실험을 포함하는 것으로 의도된다.
치료적 적용
본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 및 폴리펩티드 및 이러한 제제를 포함하는 조성물은 의학적 치료의 방법에 사용하기 위해 제공될 수 있다. 치료는 치료를 필요로 하는 질환 또는 병태를 갖는 개체에 제공될 수 있다. 질환 또는 병태는 암과 연관된 T-세포 기능이상 장애, 또는 암, 또는 감염과 연관된 T-세포 기능이상 장애, 또는 감염을 포함하는 T-세포 기능이상 장애의 하나일 수 있다.
T-세포 기능이상 장애는 정상 T-세포 기능이 손상되어, 예컨대 미생물, 세균 및 바이러스와 같은 외인성 제제에 의한 감염에 의해 생성되거나, 또는 (예컨대, 종양 연관 항원의 형태로) 일부 암 형태와 같은 일부 질환 상태에서 숙주에 의해 생성되는 병원성 항원에 대한 개체의 면역 반응의 하향조절을 야기한다.
T-세포 기능이상 장애는 T-세포 고갈 또는 T-세포 아네르기를 포함할 수 있다. T-세포 고갈은 CD8+ T-세포가 증식하지 못하거나 항원 자극에 대해 세포독성 및 사이토카인 (예컨대, IFNγ)과 같은 T-세포 효과기 기능을 발휘하는 상태를 포함한다. 고갈된 T-세포는 또한 PD-1의 지속적인 발현을 특징으로 할 수 있는데, 여기서 PD-1:PD-L1 상호작용의 차단은 T-세포 고갈을 역전시키고 항원-특이적 T 세포 반응을 회복시킬 수 있다.
T-세포 기능이상 장애는 감염으로서, 또는 감염에 대한 효과적인 면역 반응의 유도에 대한 무능력으로서 나타날 수 있다. 감염은 만성, 지속성, 잠재성 또는 지연성일 수 있고, 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염의 결과일 수 있다. 따라서, 치료는 세균, 바이러스 또는 진균 감염을 갖는 환자에 제공될 수 있다. 세균 감염의 예시에는 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori)로의 감염이 포함된다. 바이러스 감염의 예시에는 HIV, B형 간염 또는 C형 간염 바이러스로의 감염이 포함된다.
T-세포 기능이상 장애는 종양 면역 탈출 (tumor immune escape)과 같이, 암과 연관될 수 있다. 다수의 인간 종양은 T 세포에 의해 인식된 종양-연관된 항원을 발현하고 면역 반응을 유도할 수 있다. 그러나, 면역 회피 (immune evasion)는 일반적이고 PD-L1을 비롯한, 수많은 가용성 인자에 의해 매개되는 것으로 여겨진다. 따라서, PD-1과 PD-L1의 상호작용의 차단은 종양 세포에 대한 이러한 음성적 면역조절 신호를 억제할 수 있고 종양-특이적 CD8+ T-세포 면역을 증강시킬 수 있다.
T-세포 고갈과 같은 T-세포 기능이상 장애의 징후가 없지만 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드의 사용이 개체에서 PD-1 신호전달의 억제 및 종양 면역 탈출의 제한된 손상, 회피 또는 유도로 효과적인 면역 반응의 유도를 가능케 하는 경우에 암이 또한 치료될 수 있다. 이러한 치료에서, 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드는 종양 면역 탈출의 발생의 예방을 포함하는 암에 대한 치료를 제공할 수 있다.
PD-L1을 과발현하는 암이 또한 치료될 수 있다. 예를 들어, PD-L1을 과발현하는 이러한 종양 세포는 항-PD-L1 항체를 이용한 치료에 의해, 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 보체 의존적 세포독성 (CDC)에 의해, 또는 항-PD-L1 항체-약물 접합체의 사용에 의해 직접적으로 사멸될 수 있다.
치료는 T-세포 기능이상 장애의 예방, 예컨대 감염 또는 암의 발생 또는 진행의 예방을 목적으로 할 수 있다. 따라서, 항체, 항원 결합 단편 및 폴리펩티드는 약제학적 조성물 또는 의약물을 제제화하는데 사용될 수 있고 개체는 질환 상태의 발생에 대해 예방적으로 처치될 수 있다. 이는 질환 상태의 증상이 나타나기 전에 일어날 수 있고/있거나, 감염 또는 암 발생의 위험이 더 큰 것으로 생각되는 개체에게 제공될 수 있다.
치료는 백신, 예컨대 T-세포 백신을 이용한 동시-요법을 포함할 수 있는데, 이는 동시, 별개의, 또는 연속 요법을 포함할 수 있거나, 또는 단일 조성물 내 백신 및 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드의 조합된 투여를 포함할 수 있다. 이 맥락에서, 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드는 백신에 대한 보조제로서 제공될 수 있다. 고갈된 T 세포의 제한된 증식능이 T-세포 면역요법의 실패의 주된 원인으로 생각되고 있고, T 세포 고갈을 차단하거나 역전시킬 수 있는 제제의 조합은 T-세포 면역요법의 효능을 개선하기 위한 잠재적 전략이다 (Barber et al., Nature Vol 439, No. 9 p682-687 Feb 2006).
항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드는 바람직하게는 "치료학적 유효량"으로 투여되는데, 이는 개인에게 이익을 나타내기에 충분하다. 실제 투여량, 및 투여 속도 및 시간-경과는 치료되는 질환의 특성 및 중증도에 의존할 것이다. 치료의 처방, 예컨대 용량 등에 대한 결정은 일반 개업의 및 다른 의사의 책임하에 있으며, 전형적으로 치료되는 장애, 개인 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 공지된 다른 요인들을 고려한다. 상기에 언급된 기법 및 프로토콜의 예시를 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins]에서 확인할 수 있다.
약제학적으로 유용한 조성물 및 의약품의 제형화
본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 및 폴리펩티드는 임상적 사용을 위한 약제학적 조성물로 제형화될 수 있고 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 약제학적으로 유용한 조성물의 생산을 위한 방법이 또한 제공되는데, 이러한 생산 방법은 하기로부터 선택되는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다: 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 단리하는 단계; 및/또는 단리된 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 약제학적으로 허용가능한 담체, 보조제, 부형제 또는 희석제와 혼합하는 단계.
예를 들어, 본 발명의 추가의 측면은 T-세포 기능이상 장애의 치료에 사용하기 위한 의약품 또는 약제학적 조성물을 제형화하거나 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 약제학적으로 허용가능한 담체, 보조제, 부형제 또는 희석제와 혼합함으로써 약제학적 조성물 또는 의약품을 제형화하는 것을 포함한다.
감염
감염은 임의의 감염 또는 감염성 질환, 예컨대 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염일 수 있다. 일부 실시양태에서, 만성/지속성 감염, 예컨대 이러한 감염이 T 세포 기능이상 또는 T 세포 고갈과 연관되는 감염을 치료하는 것이 특히 바람직할 수 있다.
T 세포 고갈이 다수의 만성 감염 (바이러스, 세균 및 기생충 감염 포함) 동안 뿐만 아니라, 암에서 발생하는 T 세포 기능이상의 상태임은 잘 확립되어 있다 (Wherry Nature Immunology Vol.12, No.6, p492-499, June 2011).
감염 또는 감염성 질환은 PD-1이 상향조절되고 (예컨대, 문헌 [Radziewicz H, et al., J Virol. 2007; 81(6): 2545-2553 및 Golden-Mason L et al., J Virol. 2007; 81(17): 9249-9258]에 보고된 바와 같음), 그로써 또한 질환 상태의 일부로서 PD-1:PD-L1 상호작용이 관련된 것일 수 있다.
치료될 수 있는 세균 감염의 예시에는 바실러스 속 (Bacillus spp .), 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis), 클로스트리디움 속 (Clostridium spp .), 코리네박테리움 속 (Corynebacterium spp .), 비브리오 콜레라 (Vibrio chloerae), 스타필로코커스 속 (Staphylococcus spp .), 스트렙토코커스 속 (Streptococcus spp .), 에스케리치아 (Escherichia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 예르시니아 (Yersinia), 어위니아 (Erwina), 살모넬라 리스테리아 속 (Salmonella, Listeria sp), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori), 미코박테리아 (mycobacteria) (예컨대, 미코박테리움 튜베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)) 및 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)가 포함된다. 예를 들어, 세균 감염은 폐혈증 또는 결핵일 수 있다.
야오 등 (Yao et al.) (PD-1 on dendritic cells impedes innate immunity against bacterial infection. Blood 113(23): 5811-5818 Jun 4 2009)은 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes)에 의한 감염에 대한 선천적 면역 반응 동안 DC 기능의 음성 조절에서의 PD-1을 확립하였다. 브라맘담 등 (Brahmamdam et al) (Delayed administration of anti-PD-1 antibody reverses immune dysfunction and improves survival during sepsis. Journal of Leukocyte Biology vo.88, no. 2: 233-240, August 2010)은 패혈증 24시간 후에 투여된 항-PD-1 항체가 림프구 및 DC의 패혈증-유도 고갈을 예방하고, Bcl-xL을 증가시키고, 아폽토시스를 차단하고, 생존율을 향상시켰음을 보고하였다. Tim3:갈렉틴-9 상호작용은 T 세포 고갈을 매개하고, 미코박테리움 투베르쿨로시스에 의한 감염에 대한 선천적 및 적응 면역 반응을 매개하는 것으로 보고된바 있다 (Jayaraman et al., The Journal of Immunology 2012, 188, 70.6).
치료될 수 있는 바이러스 감염의 예시에는 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 단순 포진 바이러스 및 인간 유두종 바이러스에 의한 감염이 포함된다.
HCV, HBV 및 HIV에 의해 야기되는 것들과 같은 만성 바이러스 감염은 일반적으로 면역 소거 (immune clearance)를 회피하기 위한 메커니즘을 포함한다. PD-1 및 TIM-3의 발현은 C형 간염 바이러스 (HCV)에 대한 결함 T 세포 반응과 상관관계가 있는 것으로 확인되었다 (McMahan et al., The Journal of Clinical Investigation Vol. 120, No. 12 p4546-4557, December 2010). HCV에서, 맥마한 등 (McMahan et al) (상동)은 HCV-특이적 CTL 상에서 이중 TIM-3 및 PD-1 발현의 수준이 바이러스 지속성의 발달에 선행함을 발견하였고, 이는 예후 정보를 제공한다. 바버 등 (Barber et al.) (Nature Vol 439, No. 9 p682-687 Feb 2006)은 PD-1이 만성 바이러스 감염 동안 상향조절됨을 보고하였다. LCMV로 감염된 마우스에서, 그들은 PD-1/PD-L1 억제 경로의 차단이 CD8 T 세포에 대해 유리한 효과를 가져, 증식을 거치고, 사이토카인을 분비하고, 감염된 세포를 사멸시키고, 바이러스 부하를 감소시키는 이들의 능력을 회복시킴을 보고하였다. PD-1은 또한 HIV 감염에서 상향조절된다 (Said et al., Nature Medicine Vol. 16, No.4 p452-460 April 2010). PD-1과 PD-L1의 상호작용의 차단은 만성 바이러스 감염 동물 모델에서 바이러스 소거 및 개선된 T 세포 기능에 기여하였다 (Said et al., 상동).
치료될 수 있는 진균 감염의 예시에는 알터나리아 속 (Alternaria sp), 아스페르길루스 속 (Aspergillus sp), 칸디다 속 (Candida sp) 및 히스토플라스마 속 (Histoplasma sp)에 의한 감염이 포함된다. 진균 감염은 진균성 패혈증 또는 히스토플라스마증일 수 있다.
창 등 (Chang et al) (Blockade of the negative co-stimulatory molecules PD-1 and CTLA-4 improves survival in primary and secondary fungal sepsis. Critical Care 2013, 17: R85)은 항-PD1 항체가 1차 및 2차 진균성 패혈증에서 생존율을 향상시키는데 매우 효과적이었음을 보고하였다. 라자르-몰나르 등 (Lazar-Molnar et al) (The PD-1/PD-L costimulatory pathway critically affects host resistance to the pathogenic fungus Histoplasma capsulatum PNAS vol. 105, no.7, p2658-2663, 19 Feb 2008)은 항-PD-1 항체가 히스토플라스마 캡술라툼 (Histoplasma capsulatum)으로 감염된 마우스의 생존율을 상당히 증가시켰음을 보고하였다. 따라서, 진균 감염을 매개하는데 있어서 T 세포 고갈의 중요성은 충분히 확립되어 있다.
치료될 수 있는 기생충 감염의 예시에는 플라스모듐 종 (예컨대, 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 플라스모듐 요엘리 (Plasmodium yoeli), 플라스모듐 오발 (Plasmodium ovale), 플라스모듐 비박스 (Plasmodium vivax) 또는 플라스모듐 샤바우디 샤바우디 (Plasmodium chabaudi chabaudi)에 의한 감염이 포함된다. 기생충 감염은 말라리아, 리슈만편모충증 (leishmaniasis) 및 톡소플라스마증과 같은 질환일 수 있다.
플라스모듐 팔시파룸에 의한 인간의 감염은 마우스에서 PD-1의 더 높은 발현 및 T 세포 고갈을 유도하는 것으로 나타났다 (Butler et al., Nature Immunology Vol.13, No.12, p 188-195 February 2012). 생체 내에서 항-PD-L1 및 항-LAG-3 모노클로날 항체를 사용한 PD-L1 및 LAG-3의 차단은 CD4+ T-세포 기능의 회복, 여포성 헬퍼 T 세포, 배-중심 B 세포 및 형질모세포의 수의 증폭, 증강된 보호 항체 및 마우스에서 신속하게 소거된 혈액 단계 말라리아에 기여하였다. 이는 또한 만성 감염의 발생을 차단하는 것으로 나타났다 (Butler et al., 상동).
암
암은 임의의 원치 않는 세포 증식 (또는 그 자체로 원치 않는 세포 증식을 나타내는 임의의 질환), 신생물 또는 종양일 수 있거나 원치 않는 세포 증식, 신생물 또는 종양의 위험 또는 소인을 증가시킬 수 있다. 암은 양성 또는 악성일 수 있고, 1차 또는 2차 (전이성)일 수 있다. 신생물 또는 종양은 세포의 임의의 비정상적 성장 또는 증식일 수 있고 임의의 조직에 위치할 수 있다. 조직의 예시에는 부신, 부신 수질, 항문, 맹장, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 맹장, 중추 신경계 (뇌를 포함하거나 제외), 소뇌, 자궁경부, 결장, 십이지장, 자궁 내막, 상피 세포 (예컨대, 신장 상피), 담낭, 식도, 신경아교세포, 심장, 회장, 공장, 신장, 눈물샘, 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 림프아구, 상악골, 종격동, 장간막, 자궁내막, 비인두, 장막, 구강, 난소, 췌장, 이하선, 말초 신경계, 복막, 흉막, 전립선, 타액선, S상 결장, 피부, 소장, 연조직, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 혀, 편도선, 기관, 자궁, 외음부, 백혈구가 포함된다.
치료되는 종양은 신경 또는 비-신경계 종양일 수 있다. 신경계 종양은 중추 또는 말초 신경계 중 하나, 예컨대, 신경교종, 수모세포종, 수막종, 신경섬유종, 상직근종, 신경초종, 신경섬유육종, 성상세포종 및 희소돌기아교종에서 기원할 수 있다. 비-신경계 암/종양은 임의의 다른 비-신경 조직에서 기원할 수 있고, 예시에는 흑색종, 중피종, 림프종, 골수종, 백혈병, 비호지킨 림프종 (NHL), 호지킨 림프종, 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 골수성 백혈병 (AML), 골수이형성 증후군 (MDS), 피부 T-세포 림프종 (CTCL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 간암, 표피 암종, 전립선 암종, 유방암, 폐암, 결장암, 난소암, 췌장암, 흉선 암종, NSCLC, 혈액암 및 육종이 포함된다.
입양 T 세포 전달 요법
입양 T 세포 전달 요법은 일반적으로, 전형적으로 백혈구가 분리되는 혈액 샘플을 인출함으로써 개체로부터 백혈구가 제거되고, 시험관 내 또는 생체 외에서 확장되고, 동일한 개체 또는 상이한 개체에게 반환되는 과정을 의미한다. 치료는 전형적으로 개체에서 필요한 T 세포 집단의 활성 형태의 양/농도를 증가시키는 것을 목표로 한다. 이러한 치료는 T 세포 고갈을 경험하는 개체에게 유익할 수 있다.
T 세포 고갈의 메카니즘을 차단하거나 이를 역전시킬 수 있는 항체는 T 세포 활성을 증강시키고 T 세포 확장을 촉진시키는 수단을 제공한다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면에서, T 세포 집단을 증대시키는 방법이 제공되고, 여기서 T 세포는 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드와 시험관 내 또는 생체 외에서 접촉된다.
상기 방법은 선택적으로 하기 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 개체로부터 혈액 샘플을 채취하는 단계; 혈액 샘플로부터 T 세포를 단리하는 단계; 시험관 내 또는 생체 외 세포 배양물에서 T 세포를 배양하는 단계 (여기서, 이들은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드와 접촉될 수 있음), 증대된 T 세포 집단을 수집하는 단계; T 세포를 보조제, 희석제 또는 담체와 혼합하는 단계; 증대된 T 세포를 개체에 투여하는 단계.
따라서, 본 발명의 일부 측면에서, T-세포 기능이상 장애를 갖는 개체의 치료 방법이 제공되고, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 개체로부터 혈액 샘플을 수득하는 단계, 혈액 샘플로부터 수득된 T 세포를 T 세포 집단을 증대시키기 위해 본 발명에 따른 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드의 존재하에 배양하는 단계, 증대된 T 세포를 수집하는 단계, 및 증대된 T 세포를 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
T 세포는 치료를 필요로 하는 개체로부터 수득될 수 있고, 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 이들은 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포 집단일 수 있다. T-세포는 T 세포 고갈을 경험하는 집단을 나타낼 수 있고, 선택적으로 상향조절된 PD-1 및/또는 PD-L1의 발현을 가질 수 있다.
배양 동안, T 세포는 목적하는 수의 세포로 T 세포의 증대를 허용하기에 적합한 조건하 및 시간 동안 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드와 접촉될 수 있다. 적합한 시간 후에, T 세포를 수거하고, 선택적으로 농축시킬 수 있고, 적합한 담체, 보조제 또는 희석제와 혼합하고 개체의 신체로 반환시킬 수 있다. 개체는 이러한 요법을 1회 이상 받을 수 있다.
문헌 [Kalamasz et al., J Immunother 2004 Sep-Oct; 27(5): 405-18; Monies et al., Clin Exp Immunol 2005 Nov; 142(2): 292-302; Wolfl and Greenburg Nature Protocols 9 p950-966 27 March 2014; Trickett and Kwan Journal of Immunological Methods Vol. 275, Issues 1-2, 1 April 2003, p251-255; Butler et al PLoSONE 7(1) 12 Jan 2012)에 기술된 것들과 같은 T 세포 증대 방법이 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
동시 또는 순차적 투여
조성물은 치료되는 상태에 의존하여 동시에 또는 순차적으로 단독으로 또는 다른 치료와 함께 투여될 수 있다.
본 명세서에서, 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드 및 항감염제 또는 화학요법제 (치료제)가 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 이용한 치료는 화학요법을 수반할 수 있다.
동시 투여는, 예를 들어 두 제제 모두를 함유하는 약제학적 조성물 (조합된 제제)로서 또는 서로의 직후에, 선택적으로 동일한 투여 경로를 통해, 예컨대 동일한 동맥, 정맥 또는 다른 혈관에 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드 및 치료제를 함께 투여함을 지칭한다.
순차적 투여는 소정의 시간 간격 후에 다른 제제의 개별 투여가 이어지는 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드 또는 치료제 중의 하나의 투여를 지칭한다. 두 제제가 동일한 경로에 의해 투여될 필요는 없지만, 이는 일부 실시양태에서는 그러하다. 시간 간격은 임의의 시간 간격일 수 있다.
항감염제
감염을 치료하는데 있어서, 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드는 상기에 기술된 바와 같이, 항감염제와 함께 투여될 수 있다. 항감염제는 감염의 원인이 되는 미생물 또는 바이러스에 대한 작용을 갖는 것으로 공지된 제제일 수 있다.
적합한 항감염제에는 항생제 (예컨대, 페니실린, 세팔로스포린, 리파마이신, 리피아르마이신, 퀴놀론, 설폰아미드, 마크롤리드, 린코사미드, 테트라사이클린, 사이클릭 리포펩티드, 글리실사이클린, 옥사졸리디논 및 리피아르마이신), 항바이러스제 (예컨대, 역전사 효소 억제제, 인테그라제 억제제, 전사 인자 억제제, 안티센스 및 siRNA 제제 및 프로테아제 억제제), 항진균제 (예컨대, 폴리엔, 이미디아졸, 트리아졸, 티아졸, 알릴아민 및 에치노칸딘) 및 항기생충제 (예컨대, 항선충제, 항촌충제, 항흡충제, 항아메바제 및 항원충제)가 포함된다.
화학요법
화학요법은 약물 또는 이온화 방사선 (예컨대, X-선 또는 γ-선을 사용하는 방사선치료)에 의한 암의 치료를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 화학요법은 약물을 이용한 치료를 지칭한다. 약물은 화학 물질, 예컨대 소분자 약제, 항생제, DNA 인터칼레이터, 단백질 억제제 (예컨대, 키나제 억제제) 또는 생물학적 제제, 예컨대, 항체, 항체 단편, 핵산 또는 펩티드 앱타머, 핵산 (예컨대, DNA, RNA), 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질일 수 있다. 약물은 약제학적 조성물 또는 의약품으로서 제형화될 수 있다. 제형은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체와 함께 하나 이상의 약물 (예컨대, 하나 이상의 활성제)을 포함할 수 있다.
치료는 하나 이상의 약물의 투여를 포함할 수 있다. 약물은 치료되는 상태에 의존하여 동시에 또는 순차적으로 단독으로 또는 다른 치료와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 화학요법은 두 가지 약물의 투여를 포함하는 공동-요법일 수 있고, 그 중 하나 이상은 암을 치료하는 것으로 의도될 수 있다.
화학요법은 하나 이상의 투여 경로, 예컨대, 비경구, 정맥내 주사, 경구, 피하, 피내 또는 종양내로 투여될 수 있다.
화학요법은 치료 섭생에 따라서 투여될 수 있다. 치료 섭생은 의사 또는 의료 종사자에 의해 작성될 수 있는 화학요법 투여의 사전-결정된 시간표, 계획, 기획 또는 스케줄일 수 있고, 치료를 필요로 하는 환자에게 적합하도록 맞춤화될 수 있다.
치료 섭생은 환자에게 투여할 화학요법의 종류; 각 약물 또는 방사선의 용량; 투여 사이의 시간 간격; 각 치료의 길이; 만약에 있다면, 임의의 치료 휴일의 수 및 성질 등 중 하나 이상을 나타낼 수 있다. 공동-요법의 경우, 각각의 약물이 어떻게 투여되는지를 나타내는 단일 치료 섭생이 제공될 수 있다.
화학요법 약물 및 생물학제는 하기로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00001
알킬화제, 예를 들어 시스플라틴, 카보플라틴, 메클로르에타민, 사이클로포스파미드, 클로람부실, 이포스파미드;
Figure pct00002
퓨린 또는 피리미딘 항대사산물, 예를 들어 아자티오퓨린 또는 머캅토퓨린;
Figure pct00003
알칼로이드 및 터페노이드, 예를 들어 빈카 알칼로이드 (예컨대, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신), 포도필로톡신, 에토포시드, 테니포시드, 탁산, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔™), 도세탁셀;
Figure pct00004
토포아이소머라제 억제제, 예를 들어 타입 I 토포아이소머라제 억제제 캠프토테신 이리노테칸 및 토포테칸, 또는 타입 II 토포아이소머라제 억제제 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 테니포시드;
Figure pct00005
항종양 항생물질 (예컨대, 안트라사일린 항생물질), 예를 들어 닥티노마이신, 독소루비신 (아드리아마이신™), 에피루비신, 블레오마이신, 라파마이신;
Figure pct00006
항체 기반 제제, 예를 들어 항-TIM-3 항체, 항-CTLA-4, 항-LAG-3, 항-4-1BB, 항-GITR, 항-CD27, 항-BLTA, 항-OX40, 항-VEGF, 항-TNFα, 항-IL-2, 항GpIIb/IIIa, 항-CD-52, 항-CD20, 항-RSV, 항-HER2/neu (erbB2), 항-TNF 수용체, 항-EGFR 항체, 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 예는 세툭시맙, 파니투무맙, 인플릭시맙, 바실릭시맙, 베바시주맙 (아바스틴®), 압식시맙, 다클리주맙, 겜투주맙, 알렘투주맙, 리툭시맙 (맙테라®), 팔리비주맙, 트라스투주맙, 에타네르셉트, 아달리무맙, 니모투주맙을 포함함;
Figure pct00007
EGFR 억제제, 예를 들어 에를로티닙, 세툭시맙 및 게피티닙;
Figure pct00008
항혈관신생제, 예를 들어 베바시주맙 (아바스틴®);
Figure pct00009
암 백신, 예를 들어 시풀류셀 (Sipuleucel)-T (프로벤지®)
일 실시양태에서, 화학요법제는 항-TIM-3 항체, 항-CTLA-4, 항-LAG3, 항-41BB, 항-GITR, 항-CD27, 항-BLTA, 항-OX40, 항-VEGF, 항-TNFα, 항-IL2, 항-GpIIb/IIIa, 항-CD-52, 항-CD20, 항-RSV, 항-HER2/neu(erbB2), 항-TNF 수용체, 항-EGFR 또는 다른 항체이다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 면역 체크포인트 억제제 또는 공자극 분자이다.
추가의 화학요법 약물은 다음으로부터 선택될 수 있다: 13-시스-레티노산, 2-클로로데옥시아데노신, 5-아자시티딘 5-플루오로우라실, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 아브락산, 아쿠탄®, 악티노마이신-D 아드리아마이신®, 아드루실®, 아피니토르®, 아그릴린®, 알라-코르트®, 알데스류킨, 알렘투주맙, ALIMTA, 알리트레티노인, 알카반-AQ®, 알케란®, AII-트랜스레티노산, 알파 인터페론, 알트레타민, 아메토프테린, 아미포스틴, 아미노글루테티미드, 아나그렐리드, 아난드론®, 아나스트로졸, 아라비노실시토신, 아라네스프®, 아레디아®, 아리미덱스®, 아로마신®, 아라논®, 삼산화비소, 아스파라기나제, ATRA 아바스틴®, 아자시티딘, BCG, BCNU, 벤다무스틴, 베바시주맙, 벡사로텐, 벡사르®, 비칼루타미드, BiCNU, 블레녹산®, 블레오마이신, 보르테조미브, 부설판, 부설펙스®, 칼슘 류코보린, 캠파스®, 캠프토사르®, 캠프토테신-11, 카펙시타빈, 카락™, 카보플라틴, 카르무스틴, 카소덱스®, CC-5013, CCI-779, CCNU, CDDP, CeeNU, 세루비딘®, 세툭시맙, 클로람부실, 시스플라틴, 시트로보룸 인자, 클라드리빈, 코르티손, 코스메겐®, CPT-11, 사이클로포스파미드, 시타드렌®, 시타라빈 시토사르-U®, 시톡산®, 다코겐, 닥티노마이신, 다르베포에틴 알파, 다사티닙, 다우노마이신, 다우노루비신, 다우노루비신 하이드로클로라이드, 다우노루비신 리포솜, 다우노솜®, 데카드론, 데시타빈, 델타-코르테프®, 델타손®, 데니류킨, 디프티톡스, DepoCyt™, 덱사메타손, 덱사메타손 아세테이트, 덱사메타손 인산나트륨, 덱사손, 덱스라족산, DHAD, DIC, 디오덱스, 도세탁셀, 독실®, 독소루비신, 독소루비신 리포솜, 드록시아™, DTIC, DTIC-돔®, 두랄론®, 엘리가드™, 엘렌스™, 엘록사틴™, 엘스파르®, 엠시트®, 에피루비신, 에포에틴 알파, 에르비툭스, 에를로티닙, 에르위니아 L-아스파라기나제, 에스트라무스틴, 에티올 에토포포스®, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 유렉신®, 에베롤리무스, 에비스타®, 엑세메스탄, 파슬로덱스®, 페마라®, 필그라스팀, 플록수리딘, 플루다라®, 플루다라빈, 플루오로플렉스®, 플루오로우라실, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 폴린산, FUDR®, 풀베스트란트, 게피티닙, 겜시타빈, 겜투주맙 오조가미신, 글리벡™, 글리아델® 웨이퍼, 고세렐린, 과립구-콜로니 자극 인자, 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자, 헤르셉틴®, 헥사드롤, 헥살렌®, 헥사메틸멜라민, HMM, 하이캄틴®, 하이드레아®, 하이드로코르트 아세테이트®, 하이드로코르티손, 하이드로코르티손 나트륨 포스페이트, 하이드로코르티손 나트륨 석시네이트, 하이드로코르티손 포스페이트, 하이드록시우레아, 이브리투모맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 이다마이신®, 이다루비신, 이펙스®, IFN-알파, 이포스파미드, IL-11, IL-2, 이마티닙 메실레이트, 이미다졸 카복스아미드, 인터페론 알파, 인터페론 알파-2b (PEG 접합체), 인터류킨-2, 인터류킨-11, 인트론 A® (인터페론 알파-2b), 이레싸®, 이리노테칸, 이소트레티오닌, 익사베필론, 익셈프라™, 키드롤라제, 라나코르트®, 라파티닙, L-아스파라기나제, LCR, 레날리도미드, 레트로졸, 류코보린, 류케란, 류킨™, 류프롤리드, 류로크리스틴, 류스타틴™, 리포솜 Ara-C, 리퀴드 프레드®, 로무스틴, L-PAM, L-사르콜리신, 루프론®, 루프론 데포트®, 마툴란®, 막시덱스, 메클로르에타민, 메클로르에타민 하이드로클로라이드, 메드랄론®, 메드롤®, 메가세®, 메게스트롤, 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메스나, 메스넥스™, 메토트렉세이트, 메토트렉세이트 나트륨, 메틸프레드니솔론, 메티코르텐®, 미토마이신, 미토마이신-C, 미토크산트론, M-프레드니솔®, MTC, MTX, 무스타르겐®, 무스틴, 무타마이신®, 밀레란®, 밀로셀™, 밀로타르그®, 나벨빈®, 넬라라빈, 네오사르®, 뉴라스타™, 뉴메가®, 뉴포겐®, 넥사바르®, 닐란드론®, 닐루타미드, 니펜트®, 질소 머스타드, 노발덱스®, 노반트론®, 옥트레오티드, 옥트레오티드 아세테이트, 온코스파르®, 온코빈®, 온택®, 온살™, 오프레벨킨, 오라프레드®, 오라손®, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파클리탁셀 단백질 결합, 파미드로네이트, 파니투무맙, 판레틴®, 파라플라틴®, 페디아프레드®, PEG 인터페론, 페가스파르가세, 페그필그라스팀, PEG-INTRON™, PEG-L-아스파라기나제, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 페닐알라닌 머스타드, 플라티놀®, 플라티놀-AQ®, 프레드니솔론, 프레드니손, 프렐론®, 프로카바진, 프로크릿트®, 프로류킨®, 카무스틴 임플란트 퓨리네톨®을 갖는 프롤리페프로스판 20, 랄록시펜, 레블리미드®, 류마트렉스®, 리툭산®, 리툭시맙, 로페론-A® (인터페론 알파-2a), 루벡스®, 루비도마이신 하이드로클로라이드, 산도스타틴® 산도스타틴 LAR®, 사르그라모스팀, 솔루-코르테프®, 솔루-메드롤®, 소라페닙, SPRYCEL™, STI-571, 스트렙토족신, SU11248, 수니티닙, 수텐트®, 타목시펜, 타르세바®, 타르그레틴®, 탁솔®, 탁소테르®, 테모다르®, 테모졸로미드, 템시롤리무스, 테니포시드, TESPA, 탈리도미드, 탈로미드®, TheraCys®, 티오구아닌, 티오구아닌 타블로이드®, 티오포스포아미드, 티오플렉스®, 티오테파, TICE®, 토포사르®, 토포테칸, 토레미펜, 토리셀®, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레안다®, 트레티노인, 트렉살™, 트리세녹스®, TSPA, TYKERB®, VCR, 벡티빅™, 벨반®, 벨카드®, 베페시드®, 베사노이드®, 비아두르™, 비다자®, 빈블라스틴, 빈블라스틴 설페이트, 빈카사르 Pfs®, 빈크리스틴, 비노렐빈, 비노렐빈 타르트레이트, VLB, VM-26, 보리노스타트, VP-16, 부몬®, 셀로다®, 자노사르®, 제발린™, 지네카드®, 졸라덱스®, 졸레드론산, 졸린자, 조메타®.
투여 경로
본 발명의 측면에 따르는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드 및 다른 치료제, 의약품 및 약제학적 조성물은, 이로 제한되는 것은 아니지만, 비경구, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 피내, 종양내 및 경구를 포함하는 다수의 경로에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다. 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드 및 다른 치료제는 유체 또는 고체 형태로 제형화될 수 있다. 유체 제형은 인간 또는 동물 신체의 선택된 영역으로의 주사에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다.
투여 섭생
항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드의 다중 용량이 제공될 수 있다. 용량 중 하나 이상, 또는 각각은 다른 치료제의 동시 또는 순차 투여가 동반될 수 있다.
다중 용량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일, 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 중의 하나인 것으로 선택될 수 있는, 소정의 시간 간격으로 분리될 수 있다. 예시로서, 용량은 7일, 14일, 21일 또는 28일 (+ 또는 - 3일, 2일 또는 1일)마다 1회 제공될 수 있다.
키트
본 발명의 일부 측면에서, 부품들의 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 소정량의 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 갖는 적어도 하나의 용기를 가질 수 있다. 키트는 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 의약품 또는 약제학적 조성물의 형태로 제공할 수 있고, 특정 질환 또는 병태를 치료하기 위해 환자에게 투여하기 위한 지침서와 함께 제공될 수 있다. 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드는 종양 또는 혈액에의 주사 또는 주입용으로 적합하도록 제형화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 소정량의 다른 치료제 (예컨대, 항감염제 또는 화학요법제)를 갖는 적어도 하나의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 키트는 또한 2종의 의품약 또는 약제학적 조성물이 특정 질환 또는 병태를 위한 병용 치료를 제공하기 위해 동시에 또는 별도로 투여될 수 있도록 하는 제2 의약 또는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 치료제는 또한 종양 또는 혈액에의 주사 또는 주입용으로 적합하도록 제형화될 수 있다.
개체
치료되는 개체는 임의의 동물 또는 인간일 수 있다. 개체는 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간이다. 개체는 비인간 포유동물일 수 있지만, 더욱 바람직하게는 인간이다. 개체는 남성 또는 여성일 수 있다. 개체는 환자일 수 있다. 개체는 치료를 필요로 하는 질환 또는 병태를 진단 받았거나 이러한 질환 또는 병태를 가질 것으로 의심 받을 수 있다.
단백질 발현
문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 개시된 것들과 같은, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 생산하기에 적합한 분자 생물학 기법이 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다.
폴리펩티드는 뉴클레오티드 서열로부터 발현될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 세포에 존재하는 벡터에 함유될 수 있거나 세포의 게놈에 도입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "벡터"는 외인성 유전 물질을 세포 내로 전달하기 위한 비히클로서 사용된 올리고뉴클레오티드 분자 (DNA 또는 RNA)이다. 벡터는 세포 중의 유전 물질을 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 발현되는 유전자 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 종결 코돈 및 발현 인핸서를 포함할 수 있다. 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 종결 코돈이 본 발명에 따른 벡터로부터 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 적합한 벡터에는 플라스미드, 바이너리 (binary) 벡터, 바이러스 벡터 및 인공 염색체 (예컨대, 효모 인공 염색체)가 포함된다.
본 명세서에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 선택된 뉴클레오티드 서열 및 조절 뉴클레오티드 서열 (예컨대, 프로모터 및/또는 인핸서)이 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절 서열의 영향 또는 조절하에 배치하는 (그로써 발현 카세트를 형성하는) 방식으로 공유적으로 결합되는 상황을 포함할 수 있다. 따라서, 조절 서열이 뉴클레오티드 서열의 전사를 수행할 수 있는 경우, 조절 서열은 선택된 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 적절한 경우에, 생성되는 전사물은 이어서 목적하는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있다.
폴리펩티드의 발현에 적합한 임의의 세포가 본 발명에 따른 펩티드를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 세포는 원핵 생물 또는 진핵 생물일 수 있다. 적합한 원핵 세포는 대장균 (E. coli)을 포함한다. 진핵 세포의 예시에는 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포가 포함된다. 일부 경우에는, 일부 원핵 세포가 진핵 생물과 동일한 번역후 변형을 가능하게 하지 않기 때문에, 세포는 원핵 세포가 아니다. 또한, 매우 높은 발현 수준이 진핵 생물에서 가능하고, 단백질은 적합한 태그를 사용하여 진핵 생물로부터 정제하기가 더 용이할 수 있다. 배지로의 단백질의 분비를 향상시키는 특정 플라스미드가 또한 사용될 수 있다.
목적하는 폴리펩티드를 생산하는 방법은 폴리펩티드를 발현하도록 변형된 세포의 배양 또는 발효를 포함할 수 있다. 배양 또는 발효는 영양분, 공기/산소 및/또는 성장 인자의 적절한 공급이 제공되는 생물반응기에서 수행될 수 있다. 분비된 단백질은, 세포로부터 배양 배지/발효액을 분배하고, 단백질 함량을 추출하고, 개별 단백질을 분리하여 분비된 폴리펩티드를 단리시킴으로써 수집할 수 있다. 배양, 발효 및 분리 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
생물반응기는 세포가 배양될 수 있는 하나 이상의 용기를 포함한다. 생물반응기에서의 배양은 반응기로의 반응물의 연속적인 유동 및 반응기로부터 배양된 세포의 연속적인 유동으로 연속적으로 일어날 수 있다. 대안적으로, 배양은 배치로 일어날 수 있다. 생물반응기는 배양되는 세포에 최적의 조건이 제공되도록 pH, 산소, 유입 및 유출 속도, 및 용기 내부의 진탕과 같은 환경적 조건을 모니터링하고 조절한다.
목적하는 폴리펩티드를 발현하는 세포의 배양 후, 그 폴리펩티드는 바람직하게는 단리된다. 당해 기술 분야에 공지된 세포 배양물로부터 폴리펩티드/단백질을 분리하기 위한 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 배양물로부터 목적하는 폴리펩티드/단백질을 단리시키기 위해, 먼저 배양된 세포를 목적하는 폴리펩티드/단백질을 함유하는 배지로부터 분리하는 것이 필요할 수 있다. 목적하는 폴리펩티드/단백질이 세포로부터 분비되면, 세포는 원심분리에 의해 분비된 폴리펩티드/단백질을 함유하는 배양 배지로부터 분리할 수 있다. 목적하는 폴리펩티드/단백질이 세포 내에서 수집되면, 원심분리 전에, 예를 들어 초음파 처리, 급속 동결-해동 또는 삼투성 용해를 사용하여 세포를 파괴하는 것이 필요할 것이다. 원심분리는 배양 세포, 또는 배양 세포의 세포 파편을 함유하는 펠릿, 및 배양 배지 및 목적하는 폴리펩티드/단백질을 함유하는 상청액을 생산할 것이다.
이어서, 다른 단백질 및 비-단백질 성분을 함유할 수 있는 상청액 또는 배양 배지로부터 목적하는 폴리펩티드/단백질을 단리시키는 것이 바람직할 수 있다. 상청액 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드/단백질 성분을 분리하기 위한 일반적인 접근법은 침전에 의해서이다. 상이한 용해도의 폴리펩티드/단백질은 황산암모늄과 같은 침전제의 상이한 농도에서 침전된다. 예를 들어, 침전제의 저농도에서, 수용성 단백질이 추출된다. 따라서, 침전제의 농도를 증가시키며 첨가함으로써, 상이한 용해도의 단백질을 구별할 수 있다. 투석이 분리된 단백질로부터 황산암모늄을 제거하기 위해 후속적으로 사용될 수 있다.
상이한 폴리펩티드/단백질을 구별하는 다른 방법, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피 및 크기 크로마토그래피가 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 이들은 침전에 대한 대안으로서 사용될 수 있거나 침전에 후속적으로 수행될 수 있다.
목적하는 폴리펩티드/단백질이 배양물로부터 단리되면, 단백질을 농축시킬 필요가 있을 수 있다. 목적하는 단백질을 농축시키는 다수의 방법, 예를 들어 한외여과 또는 동결건조가 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
서열 동일성
퍼센트 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업자에게 공지된 다양한 방식으로, 예를 들어 ClustalW 1.82. T-coffee 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 소프트웨어를 사용할 경우, 예를 들어 갭 페널티 및 확장 패널티를 위한 디폴트 파라미터가 바람직하게 사용된다. ClustalW 1.82의 디폴트 파라미터는 다음과 같다: 단백질 갭 개방 페널티 = 10.0, 단백질 갭 확장 패널티 = 0.2, 단백질 매트릭스 = Gonnet, 단백질/DNA ENDGAP = -1, 단백질/DNA GAPDIST = 4.
본 발명은 조합이 명백하게 허용되지 않거나 명시적으로 회피되는 경우를 제외하고 기재된 측면 및 바람직한 특징의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 항목 제목은 단지 조직적인 목적을 위한 것이며, 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 측면 및 실시양태는 첨부되는 도면을 참조로 하여 예시로서 설명될 것이다. 추가의 측면 및 실시양태는 당업자에게 자명할 것이다. 본 명세서에 언급된 모든 문서는 본원에 참조로 포함된다.
이하 청구범위를 포함하는 본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥이 다르게 필요로 하지 않는 한, 용어 "포함하다", 및 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥히 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값으로부터 및/또는 "약" 다른 특정 값으로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 다른 실시양태는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 근사값으로 표현될 때, 선행하는 "약"의 사용으로, 특정 값이 또 다른 실시양태를 형성한다는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 원리를 설명하는 실시양태 및 실험은 하기의 첨부되는 도면을 참조하여 이하 논의될 것이다:
도 1. 항-PD-L1 항체 클론 A1, C2, C4, H12 및 H12_GL에 대한 경쇄 가변 도메인 서열. CDRs은 밑줄이 그어지고 별도로 나타낸다.
도 2. 항-PD-L1 항체 클론 A1, C2, C4, H12 및 H12_GL에 대한 중쇄 가변 도메인 서열. CDRs은 밑줄이 그어지고 별도로 나타낸다.
도 3. 항-PD-L1 항체 클론 A1, C2, C4, H12 및 H12_GL에 대한 경쇄 및 중쇄 CDR의 서열을 나타내는 표.
도 4. 항-PD-L1 항체 클론 A1, C2, C4, H12 및 H12_GL에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열의 뉴클레오티드 및 인코딩된 아미노산 서열.
도 5. 항-PD-L1, 인간 Fc 접합된 항체 A1, C2, C4 및 H12와 대조군 항체 A3 (뮤린이 아닌 인간 PD-L1에 결합함) 및 E3 (인간 또는 뮤린 PD-L1에 결합하지 않음)의 결합을 나타내는 막대 차트.
도 6. ELISA에 의해 결정되는 바와 같은, 인간 Fc 접합된 항체 A1, C2, C4 및 H12에 의한 인간 PD-1/인간 PD-L1 상호작용의 억제를 나타내는 차트.
도 7. ELISA에 의해 결정되는 바와 같은, 인간 Fc 접합된 항체 A1, C2, C4 및 H12에 의한 뮤린 PD-1/뮤린 PD-L1 상호작용의 억제를 나타내는 차트.
도 8. H12 (IgG1) 및 상업적 항-마우스 PD-L1 항체에 의한 뮤린 PD-1/뮤린 PD-L1 상호작용의 억제를 나타내는 차트.
도 9. 항체 H12, 니볼루맙 (상업적 항-PD-1 항체), 및 이소형 및 비 항체 대조군에 대한 반응으로 고갈된 T 세포의 IFNγ 분비를 나타내는 차트.
도 10. 항체 항-PD-L1 H12, 니볼루맙, 이소형 및 비 항체 대조군에 대한 반응으로 고갈된 T 세포의 IFNγ 분비를 나타내는 차트.
도 11. 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 결정되는 바와 같은, 인간 PD-L1에 대한 항-PD-L1 H12의 친화도를 나타내는 센소그램 (Sensorgram). KD = 3.13×10-10 M.
도 12. 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 결정되는 바와 같은, 뮤린 PD-L1에 대한 항-PD-L1 H12의 친화도를 나타내는 센소그램. KD = 3.04×10-9 M.
도 13. 니볼루맙, 라브롤리주맙 (둘 다 상업적 항-PD-1 항체), 항체 H12, 및 이소형 및 비 항체 대조군에 대한 반응으로, 혼합 림프구 반응 (MLR)에서 (A) 분리된 폐 종양 조직 및 (B) 동종이형 수지상 세포 (DC)와 동시-배양된 분리된 폐 종양 조직의 IFNγ 분비를 나타내는 막대 차트.
도 14. 니볼루맙, 라브롤리주맙, 항체 H12-IgG4, 항체 H12-IgG1, 및 이소형 및 비 항체 대조군의 존재하에서 인플루엔자와 PBMC의 배양 후 IFNγ 분비를 나타내는 막대 차트.
도 15. 상이한 항원에 대한 H12를 이용한 ELISA를 나타내는 막대 차트: 인간 (hu) PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG-3, CTL-A4, BLTA, ICOS 및 CD28, 및 사이노몰구스 (cy) 및 마우스 (mo) PD-L1.
도 16. (A) CT26 세포주를 사용한 마우스 결장암 모델 및 (B) B16F10 세포주를 사용한 마우스 흑색종 모델에서 항체 H12에 의한 종양 성장의 억제를 나타내는 그래프.
도 17. 인간 PD-L1로 형질감염된 HEK293-6E 세포를 사용한 차단 어세이 (blocking assay)에 의해 결정되는 바와 같은, 항체 H12-IgG1, H12-IgG4, H12_GL-IgG1, 및 H12_GL-IgG4에 의한 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용의 차단 효율을 나타내는 그래프.
도 18. 마우스 모델에서 종양 성장을 제어하는 항-PD-L1 항체 H12의 생체 내 효율을 나타내는 그래프. MC38 세포를 마우스 내로 접종하고, 동물당 지시된 항체의 200 μg의 5 용량을 8일째부터 복강 내로 투여하였다. (A) 및 (B)는 2회의 독립적 실험에 대한 종양 성장의 결과를 나타낸다 (평균 ± SEM).
도 19. 인간 PD-L1에 대한 항체 H12, C4 및 아테졸리주맙의 결합, 및 결합의 결합력을 나타내는 그래프. (A) 인간 PD-L1에 대한 H12, C4, 아테졸리주맙 및 이소형 대조군 항체의 결합 (중복의 평균 ± SD). (B) 인간 PD-L1에 대한 H12, C4, 아테졸리주맙 및 이소형 대조군 항체의 결합의 결합력 (중복의 평균 ± SD).
도 20. MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 H12 IgG1, C4 IgG1, 아테졸리주맙 및 DEN IgG1 항체의 결합을 나타내는 그래프. 평균 형광 지수 (MFI)가 나타난다 (중복의 평균 ± SD).
도 21. H12, C4, 아테졸리주맙 및 이소형 대조군 항체의 존재하에서 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 나타내는 그래프. 그래프는 그의 수용체 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단하는 항체의 능력을 나타낸다 (중복의 평균 ± SD).
실시예
본 발명자들은 인간 및 뮤린 PD-L1에 특이적으로 결합하고, PD-1 경로를 차단하고 고갈된 T 세포 활성을 회복시키는, 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합 부분의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 동정을 하기 실시예에 기술한다.
실시예 1: 항-인간 PD-L1 항체의 단리
항-PD-L1 항체를 시험관 내 선택을 통해 인간 항체 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 분리하였다.
스트렙타비딘-자기 비드를 비오틴화된 인간 PD-L1로 코팅하고 자기 선별 (magnetic sorting)을 이용하여 항-PD-L1-특이적 파아지를 골라내는데 (fish-out) 사용하였다. 잠재적 항-비오틴 항체를 제거하기 위한 일부 단계가 선택 과정에 부가되었다.
특이적 Fab 항체는 원래 항원으로서 인간-PD-L1을 사용한 ELISA에 의해 동정되었다. 인간 PD-L1로부터 이들의 둔화된 해리를 근거로 4종의 클론: 클론 A1, C2, C4 및 H12을 추가의 특성화를 위해 유지하였다. 첫 번째 클론성 스크리닝을 DNA 핑거프린팅 (fingerprinting)에 의해 수행하였고; 이어서 클론성을 서열분석으로 확인하였다.
실시예 2: 인간 및 뮤린 PD-L1에의 결합
인간 및 뮤린 PD-L1을 인간 Fc에 커플링시키고 항체 결합의 조사를 위해 ELISA 플레이트 상에서 코팅된 항원으로 사용하였다.
간략히는, ELISA 플레이트를 탄산염 완충제 중에서 인간 또는 뮤린 PD-L1-Fc로 코팅하고, 이어서 플레이트를 카제인 용액으로 차단하고 PBS Tween-20 중에서의 충분한 세척 후, Fab 형태의 항-PD-L1 항체를 PBS 중의 7% 우유의 존재하에서 ELISA 내로 첨가하였다. 진탕 및 충분한 세척하의 실온에서 90분 후, HRP에 결합된 염소 항-인간 Fab 항체를 첨가하였다. 1시간 후, 플레이트를 세척하고 TMB 기질을 첨가하였다. 반응을 1 M HCl로 중지시키고 광학 밀도를 670 nm에서의 기준으로 450 nm에서 측정하였다.
결과를 도 5에 나타내었다. A1, C2, C4 및 H12 항체는 커플링된 Fc 부분 (투명 막대)이 아닌 인간 및 뮤린 PD-L1 둘 다 (각각 불투명 막대 및 빗금 쳐진 막대)를 인식할 수 있는 것으로 나타났다. 뮤린이 아닌, 인간 PD-L1을 인식하는 클론 A3, 및 인간 또는 뮤린 PD-L1 중 하나를 인식하는 클론 E3이 대조군으로 포함되었다.
항체 클론 A1, C2, C4 및 H12는 각각 인간 PD-L1 및 뮤린 PD-L1에 대해 교차 반응성인 것으로 나타났다. H12는 인간 PD-L1 및 뮤린 PD-L1에 대해 유사한 결합을 입증하였다.
실시예 3: PD-1/PD-L1 상호작용의 시험관 내 차단
항원으로서 인간 Fc에 커플링된 PD-1을 사용하는 ELISA 어세이에 의해 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단하는 항-PD-L1 항체의 능력을 조사하였다. 비오틴화된 인간 또는 뮤린 PD-L1을 PD-1에의 첨가 전에 A1, C4, C2 또는 H12 Fab의 존재하에서 사전-인큐베이션하였다. PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 스트렙타비딘-HRP/TMB 기질을 사용하여 결정하였다.
이 조사의 결과를 도 6 및 7에 나타내었다.
Fab으로서 발현된 항체 A1, C2, C4 및 H12 모두가 용량-의존적 방식으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1의 결합을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다 (도 6). 클론 A1, C2 및 C4는 유사한 효능으로 이 상호작용을 억제하는 것으로 나타난 반면, H12는 A1, C2 및 C4보다 약간 더 효과적인 것으로 나타났다 (도 6).
Fab으로서 발현된 항체 A1, C2, C4 및 H12는 또한 뮤린 PD-1에 대한 뮤린 PD-L1의 결합을 차단할 수 있는 것으로 나타났다 (도 7). 항체 A1, C2 및 C4는 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1의 결합을 차단하는데 요구되는 농도보다 더 높은 농도에서 뮤린 PD-L1과 뮤린 PD-1 사이의 상호작용을 파괴하는 것으로 나타난 반면, H12는 인간 PD-L1과 인간 PD-1 사이의 상호작용을 차단하는데 요구되는 것과 유사한 농도에서 결합을 중화시킬 수 있는 것으로 나타났다 (도 7).
뮤린 PD-L1과 뮤린 PD-1 사이의 결합 억제를 또한 IgG1 형태로 발현된 항체 H12에 의해 조사하였고, 상업적으로 이용가능한 항-뮤린 PD-L1 IgG 항체 [10F.9G2 (BioLegend, Inc, San Diego, CA, USA)]에 의한 억제와 비교하였다. 결과를 도 8에 나타내었다. 항체 H12는 상업적으로 이용가능한 항-뮤린 PD-L1 IgG 항체에 비해 더 낮은 항체 농도에서 뮤린 PD-L1과 뮤린 PD-1 사이의 상호작용을 억제하는데 유의미하게 더욱 효과적인 것으로 나타났다.
실시예 4: 고갈된 T 세포 활성의 회복
고갈된 T 세포 활성을 회복시키는 항-PD-L1 항체의 능력을 조사하였다.
간략히는, T 세포를 건강한 공여자로부터 분리하고, 동종이계 반응으로 다른 공여자로부터 수득된 단핵구-유래 수지상 세포와 함께 7일간 배양하였다 (50,000 T 세포 / 5,000 DCs). T 세포는 2회의 자극을 거치면서 고갈이 달성되었다. 상청액 내 IFN-γ의 측정 및 삼중수소화 티미딘을 사용한 증식의 정량 전에, 고갈된 T 세포를 2회 라운드 자극 시에 항체 H12 또는 항-PD-1 항체 니볼루맙의 존재하에서 배양하였다.
결과를 도 9 및 10에 나타내었다. 항체 H12는 T 세포 고갈을 억제하여, IFN-γ의 분비 (도 9) 및 T 세포의 증식 (도 10) 둘 다를 회복시키는 것으로 나타났다. 증식 및 IFN-γ 분비는 1000 ng/㎖로의 H12를 이용한 치료에 의해 1000 ng/㎖로의 니볼루맙을 이용한 치료와 유사한 수준으로 회복되었다. 특히, 증식 IFN-γ 분비는 200 ng/㎖ 및 40 ng/㎖ 농도에서 니볼루맙보다 H12 항체로 처리된 T 세포에서 더 높았다.
실시예 5: PD-L1에 대한 항체 친화도
인간 PD-L1 및 뮤린 PD-L1에 대한 항체 H12의 친화도를 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석으로 조사하였다. 간략히는, Fc에 커플링된 인간 또는 마우스 PD-L1을 Proteon XPR36 생물분석기 (Bioanalyser) (BioRad)와 호환가능한 센서 칩 상에 고정시켰다. 이어서 H12 Fab 조추출물을 칩 상에서 유동시킨 후, 회합/해리를 기록하고 친화도 (KD)를 계산하였다.
결과를 도 11 및 12에 나타내었다. H12는 PD-L1에 대해 KD = 0.313 nM의 높은 친화도를 갖고, 뮤린 PD-L1DP에 대해 KD = 3.04 nM의 친화도를 갖는 것으로 나타났다.
실시예 6: 종양을 치료하기 위한 항-PD-L1 항체의 사용: 종양 침윤성 림프구의 생체 외 활성화
폐 종양 샘플을 승인 후 싱가포르 국립 암센터로부터 입수하였다. 샘플을 인간 종양 해리 키트 및 조직 해리 장치를 사용하여 해리시켰다.
종양 해리된 혼합물을 ELISA에 의한 상청액 내 IFN-γ의 측정 전에 7일간 항-PDL-1 IgG1 클론 H12와 함께 배양하였다. 니볼루맙 및 람브롤리주맙을 어세이에서 양성 대조군 (둘 다 항-PD-1 항체임)으로 사용하였고, 이소형 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 13A는 항체의 존재하에서 7일간의 배양 후 종양 침윤성 림프구에 의한 IFN-γ의 분비를 나타낸다. H12는 림프구를 재-활성화시켜 용량 의존적 방식으로 IFN-γ를 분비한다.
해리된 혼합물의 또 다른 분획을 동종이계 수지상 세포 (DC)와 함께 공동 배양하여 혼합 림프구 반응 (MLR)을 개시하였다. 세포를 먼저 항체 없이 7일간 배양한 후 H12 또는 대조군 항체의 존재하에서 7일간 배양하였다. 이들 2회 라운드 후, IFN-γ를 ELISA에 의해 상청액에서 검정하였다.
도 13B는 항체의 존재하에서 MLR 후 IFN-γ의 분비를 나타낸다. H12는 용량-의존적 방식으로 IFN-γ을 분비시키는 종양 림프구의 능력을 회복시켰다.
실시예 7: 감염을 치료하기 위한 항-PD-L1 항체의 사용: 인플루엔자의 존재하에서 T 세포의 자가유래 활성화
혈액을 인플루엔자-양성 공여자로부터 수집하였다. 단핵구-유래 DC를 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 (H1N1)로 감염시켰다. 감염된 DC를 5일 배양의 제1 라운드를 위해 동일한 공여자로부터의 PBMC에 혼합하였다. 이어서, 세포를 H12 또는 대조군 항체의 존재하에 5일간의 제2 라운드 동안 배양했다. 이러한 2회 라운드 후, 배양물 중의 세포의 대부분은 인플루엔자 특이적 T 세포이다. 2회 라운드의 배양 종료시, IFN-γ를 ELISA에 의해 상청액에서 검정하였다. 본 어세이에서, H12를 IgG1 항체 또는 IgG4 항체 중의 하나로서 시험하였다.
도 14는 항체의 존재하에서 PBMC의 인플루엔자와의 배양 후 분비된 IFN-γ를 나타낸다. H12-IgG1 및 H12-IgG4는 둘 다 용량-의존적 방식으로 바이러스 자극 시 IFN-γ를 분비하는 림프구의 능력을 회복시킬 수 있었다.
실시예 8: H12의 특이성/교차-반응성
H12에 의한 CD28 패밀리의 다양한 멤버의 인식을 ELISA에 의해 시험하였다.
도 15는 다음의 상이한 항원에 대한 H12로의 ELISA를 나타낸다: 인간 (hu) PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG-3, CTL-A4, BLTA, ICOS 및 CD28, 및 사이노몰구스 (cy) 및 마우스 (mo) PD-L1. H12는 PD-L1 분자에 대해 특이성을, 종들 사이에서 교차-반응성을 나타내었다.
실시예 9: H12 항체의 예비적 생체 내 효능
H12를 다음 2종의 종양 모델에서 시험하였다: CT26 세포주를 사용한 결장암 모델 및 B16F10 세포주를 사용한 흑색종 모델.
Balb/C 또는 C57BL/6 마우스의 좌측 옆구리에 0일째에 각각 0.5×106 CT26 또는 0.2×106 B16F10 종양 세포를 접종하고, 7, 11, 14, 18 및 21일째에 250 ㎍의 H12 또는 이소형 IgG1을 복강 내로 주입하였다. 이어서 종양 성장을 분석하고, 크기를 칼리퍼로 측정하고 용적을 다음과 같이 계산하였다: V= I2×L/2 (I = 더 짧은 측면 및 L= 더 긴 측면).
도 16A 및 16B는 두 모델에서 종양 접종 후의 종양 성장을 나타낸다. H12는 두 모델에서 종양 성장을 억제하였다.
실시예 10: 조작된 H12 항체를 이용한 데이터
H12 클론을 그의 프레임워크를 생식계-유사 프레임워크로 되돌리도록 조작하였는데; 새로운 클론 H12_GL의 중쇄는 약간 변경되었고 경쇄는 H12 최초 클론의 것과 동일하게 유지되었다.
H12_GL을 차단 어세이에서 시험하였다. 간략히는, HEK 293 세포를 제조사의 프로토콜에 따라서 293tfectin (Invitrogen)을 사용하여 인간 PD-L1 단백질을 발현하는 pcDNA3.1 플라스미드로 형질감염시켰다. PD-L1 발현을 PECy7 (Biolegend)에 접합된 상업적 항-마우스 또는 항-인간 PD-L1을 사용하여 확인하였다. 피코에리쓰린 (PE)으로 표지된 50 내지 100 nM의 재조합 인간 PD-1을 형질감염된 세포 상에서 발현된 PD-L1을 결합하는데 사용하였다. 연속 희석된 항체 (항-PD-L1 H12, H12_GL 또는 이소형 대조군)를 PD-L1 형질감염된 세포에 첨가하기 전에 30분간 인간 PD-1-PE와 혼합하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 모든 데이터를 BD FACSCanto II (BD Bioscience) 상에서 수집하고 BD FACSDiva 소프트웨어 (BD Bioscience)로 분석하였다.
도 17은 H12_GL이 H12만큼 효율적으로 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하였음을 나타낸다.
실시예 11: 항-PD-L1 항체 H12의 생체 내 효능: 마우스 모델에서 종양 성장의 제어
H12가 마우스 PD-L1과 교차-반응하는 것으로 나타났기 때문에, 이 항체를 대장암 MC38 세포를 사용한 마우스 모델에서 종양 성장을 제어하는 능력에 대해 평가하였다.
2백만 개의 MC38 세포를 0일째에 마우스에 피하 접종하고, 5회 용량의 동물 당 200 ㎍의 항-PD-L1 H12 IgG1 또는 이소형 대조군 항체를 8일째에 시작하여, 복강 내로 주입하였다. 종양 크기를 실험 기간 전반에 걸쳐서 측정하였다.
2회의 독립적 실험의 결과를 도 18A 및 18B에 나타내었다. 그래프는 항-PD-L1 항체 H12 또는 음성 이소형 대조군의 존재하에서 MC38 종양 성장 모델에서의 종양 성장 (평균 ± SEM)을 나타낸다. 두 실험 모두에서, H12는 종양 성장을 제어할 수 있었다.
실시예 12: 표적에 대한 항-PD-L1 mAbs의 결합 및 아테졸리주맙과의 비교
인간 PD-L1에 대한 항-PD-L1 클론 H12 및 C4의 결합을 상업적으로 이용가능한 항-PD-L1 IgG1 항체인, 아테졸리주맙의 것과 비교하였다.
항체를 플레이트에 코팅하고 다양한 농도의 비오틴화된 PD-L1을 첨가하였다. 결합을 ELISA로 측정하였다. 항체를 코팅 완충제 중에 2 ㎍/㎖로 maxisorp 플레이트 상에 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음날, 플레이트를 세척 완충제 (PBS + 0.05% Tween-20)로 세척하고, 1시간 동안 실온에서 카세인으로 차단하였다. 이어서 플레이트를 다시 세척 완충제로 세척하였다. 그 다음에 다양한 농도의 비오틴화된 인간 PD-L1을 플레이트에 첨가한 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 다시 세척 완충제로 세척하였다. 그 다음에 스트렙타비딘-HRP를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 상이한 항체에 결합된 비오틴화된 인간 PD-L1을 검출하였다. 이어서 플레이트를 세척 완충제로 다시 세척하였다. 마지막으로, TMB를 첨가하여 ELISA를 발색시키고; HRP에 의한 TMB 전환을 1 M H-Cl을 사용하여 중지시켰다.
단일 농도로 플레이트 위에 결합된 PD-L1과 다양한 농도의 항체의 첨가를 이용한, ELISA에 의해 결합력을 또한 평가하였다. 이차 항체를 사용하여 항원에 착화된 항-PD-L1 항체를 검출하였다. 코팅 완중체 중의 2 ㎍/㎖의 뉴트라비딘으로 maxisorp 플레이트 위를 코팅하여 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음날, 플레이트를 세척 완충제 (PBS + 0.05% Tween-20)로 세척하고, 실온에서 1시간 동안 카제인으로 차단하였다. 이어서 플레이트를 다시 세척 완충제로 세척하였다. 그 후에 비오틴화된 인간 PD-L1을 0.2 ㎍/㎖로 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 다시 세척 완충제로 세척하였다. 그 후에 상이한 항체를 다양한 농도로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 다시 세척 완충제로 세척하였다. 그 후에 항-인간 Fc-HRP를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 다시 세척 완충제로 세척하였다. 마지막으로, TMB를 첨가하여 ELISA를 발색시키고; HRP에 의한 TMB 전환을 1 M H-Cl을 사용하여 중지시켰다.
도 19A는 PD-L1에 대한 항체 (및 이소형 대조군)의 결합을 나타낸다 (중복의 평균 ± SD). H12는 PD-L1에 대해 아테졸리주맙과 유사한 결합 곡선을 나타낸다. PD-L1에 대한 H12의 친화도는 PD-L1에 대한 아테졸리주맙의 친화도보다 더 높다.
도 19B는 그들의 표적에 대한 항체의 결합력을 나타낸다 (중복의 평균 ± SD). H12는 아테졸리주맙과 유사하게 PD-L1에 대해 높은 결합력을 나타낸 반면, C4는 중간 결합력을 나타낸다. PD-L1에 대한 H12의 결합력은 PD-L1에 대한 아테졸리주맙의 결합력보다 더 높다.
PD-L1에 대한 결합을 또한 세포막에서 PD-L1을 구성적으로 발현하는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포주에 대한 결합을 조사함으로써 시험하였다. 항체의 결합을 유세포 분석으로 측정하였다.
도 20은 상이한 농도의 항체에 대한 평균 형광 지수 (MFI)를 나타낸다 (중복의 평균 ± SD). 항-PD-L1 항체 H12 IgG1 및 C4 IgG1은 PD-L1을 발현하는 세포에 효율적으로 결합한다.
실시예 13: 항-PD-L1 항체의 시험관 내 활성: PD-1에 대한 PD-L1 결합의 차단
그의 수용체인 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단하는 항체의 능력을 ELISA로 평가하였다. 간략히는, 항체를 PD-L1과 사전-인큐베이션한 후 그 위에 PD-1이 코팅되어 있는 ELISA 플레이트 위에 첨가하였다. 세척 후, PD-1-결합된 PD-L1의 존재를 항체를 이용해 검출하였다.
도 21은 항-PD-L1 항체 (또는 이소형 대조군)의 존재 또는 부재하에서 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 조사한 실험의 결과를 나타낸다 (중복의 평균 ± SD). 항-PD-L1 항체 H12 및 C4는 그의 수용체 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단할 수 있었다. H12 및 C4는 둘 다 아테졸리주맙보다 더 큰 효율로 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용을 차단할 수 있었다.
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Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Asn Ser Leu Tyr Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly His Gly Tyr Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu 115 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ser Gly Arg Ser Ser Asn Ile Ala Ser His Asp Val Phe 1 5 10 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Thr Asn Lys Arg Pro Trp 1 5 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Ala Trp Asp Ser Gly Leu Thr Gly Met Leu 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gly Gly Asp Asn Ile Gly Arg Lys Ser Val His 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Asp Asp Gly Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Ala Trp Asp Ser Thr Val Val 1 5 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Asp Asn Asn Glu Arg Leu Ser 1 5 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Val Val Val 1 5 10 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Tyr Val Val 1 5 10 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gly Gly Ser Tyr Gly Ser Leu Tyr Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gly Gly Tyr Gly Gly Asn Ser Leu Tyr Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ser Gly His Gly Tyr Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain CDR3 consensus <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa = absent or Gly <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa = Gly or Ser <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa = Gly or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Xaa = Ser, Gly or His <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa = Tyr or Gly <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> Xaa = Gly, Asn or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa = Leu or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> Xaa = Tyr or Gly <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> Xaa = Ile or Tyr <400> 26 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Ala Phe Asp Xaa 1 5 10 <210> 27 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 cagtctgtgt tgacgcagcc tccctcagtg tctgcggccc caggacagag agtctccatc 60 tcctgctctg ggaggagctc caacattgcc agtcatgatg ttttctggta ccagcaactc 120 ccaggaacag cccccaaaat cgtcatgtat gaaactaata aacgtccctg ggggattcct 180 gaccgattct ccggctccaa gtctggcacg tccgccaccc tggacatcgc cggactccag 240 actggggacg aggccgacta ttactgcgga gcatgggata gcggcctgac tggtatgctg 300 ttcggcggag ggaccaaggt gaccgtccta 330 <210> 28 <211> 315 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 tcctatgagc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggaaagac gaccaggatt 60 acctgtgggg gagacaacat tggacgtaaa agtgtccatt ggtatcagca gaggccaggc 120 caggcccctc tcctcctcgt ctatgatgat ggcgaccggc cctcagggat ccctgaccga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240 gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg gacagcaccg tggtattcgg cggagggacc 300 agactgaccg tcctg 315 <210> 29 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagtagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataatg agcgactctc agggattcct 180 gaccgattct ctggttccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcag cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcggc acatgggata gtagcctgag tgtcgtggta 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 30 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca gcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttct 300 tatgtggtat tcggcggagg gaccaagctg accgtccta 339 <210> 31 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 caggtacagc tgcagcagtc aggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggc 300 agctatggtt ctctctatgc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360 agc 363 <210> 32 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 caggtacagc tgcagcagtc aggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggc 300 agctatggtt ctctctatgc ttttgatatc tggggccaag ggaccagggt caccgtctca 360 agc 363 <210> 33 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 caggtacagc tgcagcagtc aggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagggggggc 300 tacggtggta actccttgta tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 34 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 gaagtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaggtcaggg 300 catggataca gctatggagc ttttgactac tggggccagg gcaccctg 348 <210> 35 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly His Gly Tyr Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaggtcaggg 300 catggataca gctatggagc ttttgactac tggggccagg gcaccctggt caccgtctca 360 agc 363

Claims (45)

  1. 아미노산 서열 i) 내지 vi), 또는 서열 i) 내지 vi)의 하나 이상에서 1개 또는 2개 또는 3개 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체를 갖는, 선택적으로 단리된, PD-L1에 결합할 수 있는 항체, 또는 항원 결합 단편:
    i) LC-CDR1: TGSSSNIGAGYDVH (서열번호 18), SGRSSNIASHDVF (서열번호 9), GGDNIGRKSVH (서열번호 12), 또는 SGSSSNIGNNYVS (서열번호 15) 중의 하나;
    ii) LC-CDR2: GNSNRPS (서열번호 19), ETNKRPW (서열번호 10), DDGDRPS (서열번호 13), 또는 DNNERLS (서열번호 16) 중의 하나;
    iii) LC-CDR3: QSYDSSLSGSYVV (서열번호 20), GAWDSGLTGML (서열번호 11), QAWDSTVV (서열번호 14), 또는 GTWDSSLSVVV (서열번호 17) 중의 하나;
    iv) HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21);
    v) HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22);
    vi) HC-CDR3: X1X2X3X4X5X6SX7X8AFDX9 (서열번호 26)
    여기서, X1 = 부재 또는 G이고, X2 = G 또는 S이고, X3 = G 또는 Y이고, X4 = S, G 또는 H이고, X5 = Y 또는 G이고, X6 = G, N 또는 Y이고, X7 = L 또는 Y이고, X8 = Y 또는 G이고, X9 = I 또는 Y임.
  2. 제1항에 있어서, HC-CDR3이 SGHGYSYGAFDY (서열번호 25), GGSYGSLYAFDI (서열번호 23), 또는 GGYGGNSLYAFDI (서열번호 24) 중의 하나인 것인, 항체, 또는 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 갖는, 항체, 또는 항원 결합 단편:
    LC-CDR1: TGSSSNIGAGYDVH (서열번호 18)
    LC-CDR2: GNSNRPS (서열번호 19)
    LC-CDR3: QSYDSSLSGSYVV (서열번호 20).
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 갖는, 항체, 또는 항원 결합 단편:
    LC-CDR1: SGRSSNIASHDVF (서열번호 9)
    LC-CDR2: ETNKRPW (서열번호 10)
    LC-CDR3: GAWDSGLTGML (서열번호 11).
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 갖는, 항체, 또는 항원 결합 단편:
    LC-CDR1: GGDNIGRKSVH (서열번호 12)
    LC-CDR2: DDGDRPS (서열번호 13)
    LC-CDR3: QAWDSTVV (서열번호 14).
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 갖는, 항체, 또는 항원 결합 단편:
    LC-CDR1: SGSSSNIGNNYVS (서열번호 15)
    LC-CDR2: DNNERLS (서열번호 16)
    LC-CDR3: GTWDSSLSVVV (서열번호 17).
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 갖는, 항체, 또는 항원 결합 단편:
    HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21)
    HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22)
    HC-CDR3: X1X2X3X4X5X6SX7X8AFDX9 (서열번호 26)
    여기서, X1 = 부재 또는 G이고, X2 = G 또는 S이고, X3 = G 또는 Y이고, X4 = S, G 또는 H이고, X5 = Y 또는 G이고, X6 = G, N 또는 Y이고, X7 = L 또는 Y이고, X8 = Y 또는 G이고, X9 = I 또는 Y임.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 갖는, 항체, 또는 항원 결합 단편:
    HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21)
    HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22)
    HC-CDR3: SGHGYSYGAFDY (서열번호 25).
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 갖는, 항체, 또는 항원 결합 단편:
    HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21)
    HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22)
    HC-CDR3: GGSYGSLYAFDI (서열번호 23).
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 CDR들을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 갖는, 항체, 또는 항원 결합 단편:
    HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21)
    HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22)
    HC-CDR3: GGYGGNSLYAFDI (서열번호 24).
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 뮤린 PD-L1에 특이적으로 결합하는, 항체, 또는 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 PD-1과 인간 PD-L1 사이의 상호작용을 억제하거나, 또는 뮤린 PD-1과 뮤린 PD-L1 사이의 상호작용을 억제하는, 항체, 또는 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, T-세포 고갈 또는 T-세포 아네르기 (anergy)를 나타내는 T-세포에서 T-세포 기능을 회복시키는데 효과적인, 항체, 또는 항원 결합 단편.
  14. PD-L1에 결합된 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 항원 결합 단편을 포함하는, 선택적으로 단리된, 시험관 내 복합체.
  15. 하기 CDR들을 포함하는, PD-L1에 결합할 수 있는 단리된 경쇄 가변 영역 폴리펩티드:
    LC-CDR1: TGSSSNIGAGYDVH (서열번호 18), SGRSSNIASHDVF (서열번호 9), GGDNIGRKSVH (서열번호 12), 또는 SGSSSNIGNNYVS (서열번호 15) 중의 하나;
    LC-CDR2: GNSNRPS (서열번호 19), ETNKRPW (서열번호 10), DDGDRPS (서열번호 13), 또는 DNNERLS (서열번호 16) 중의 하나;
    LC-CDR3: QSYDSSLSGSYVV (서열번호 20), GAWDSGLTGML (서열번호 11), QAWDSTVV (서열번호 14), 또는 GTWDSSLSVVV (서열번호 17) 중의 하나.
  16. 하기 CDR들을 포함하는, PD-L1에 결합할 수 있는 단리된 중쇄 가변 영역 폴리펩티드:
    HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21);
    HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22);
    HC-CDR3: X1X2X3X4X5X6SX7X8AFDX9 (서열번호 26);
    여기서, X1 = 부재 또는 G이고, X2 = G 또는 S이고, X3 = G 또는 Y이고, X4 = S, G 또는 H이고, X5 = Y 또는 G이고, X6 = G, N 또는 Y이고, X7 = L 또는 Y이고, X8 = Y 또는 G이고, X9 = I 또는 Y임.
  17. 제16항에 있어서, HC-CDR3이 SGHGYSYGAFDY (서열번호 25), GGSYGSLYAFDI (서열번호 23), 또는 GGYGGNSLYAFDI (서열번호 24) 중의 하나인 것인, 단리된 중쇄 가변 영역 폴리펩티드.
  18. 제16항 또는 제17항에 따른 중쇄 가변 영역 폴리펩티드와 조합된 제15항의 단리된 경쇄 가변 영역 폴리펩티드.
  19. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, PD-L1에 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편으로서, 여기서:
    중쇄가 HC-CDR1: SYAIS (서열번호 21), HC-CDR2 RIIPILGIANYAQKFQG (서열번호 22), HC-CDR3: X1X2X3X4X5X6SX7X8AFDX9 (서열번호 26) (여기서 X1 = 부재 또는 G이고, X2 = G 또는 S이고, X3 = G 또는 Y이고, X4 = S, G 또는 H이고, X5 = Y 또는 G이고, X6 = G, N 또는 Y이고, X7 = L 또는 Y이고, X8 = Y 또는 G이고, X9 = I 또는 Y임) 각각에 적어도 85% 전체 서열 동일성을 갖는, HC-CDR1, HC-CDR2, HC-CDR3을 포함하고,
    경쇄가 LC-CDR1: TGSSSNIGAGYDVH (서열번호 18), SGRSSNIASHDVF (서열번호 9), GGDNIGRKSVH (서열번호 12), 또는 SGSSSNIGNNYVS (서열번호 15) 중의 하나; LC-CDR2: GNSNRPS (서열번호 19), ETNKRPW (서열번호 10), DDGDRPS (서열번호 13), 또는 DNNERLS (서열번호 16) 중의 하나; LC-CDR3: QSYDSSLSGSYVV (서열번호 20), GAWDSGLTGML (서열번호 11), QAWDSTVV (서열번호 14), 또는 GTWDSSLSVVV (서열번호 17) 중의 하나에 적어도 85% 전체 서열 동일성을 갖는, LC-CDR1, LC-CDR2, LC-CDR3을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  20. 선택적으로 단리된, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, PD-L1에 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편으로서, 여기서:
    중쇄 서열이 서열번호 8, 35, 5, 6 또는 7의 중쇄 서열 (도 2)에 적어도 85% 서열 동일성을 갖고,
    경쇄 서열이 서열번호 4, 1, 2 또는 3의 경쇄 서열 (도 1)에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  21. PD-L1에 결합할 수 있는, 선택적으로 단리된, 항체 또는 항원 결합 단편으로서, (i) 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드, 및 (ii) PD-L1 이외의 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  22. 제21항에 있어서, PD-L1 이외의 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 단편이 CD27, CD28, ICOS, CD40, CD122, OX40, 4-1BB, GITR, LAG-3, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, A2AR, VISTA, TIM-3, PD-1, KIR, HER-2, HER-3, EGFR, EpCAM, CD30, CD33, CD38, CD20, CD24, CD90, CD15, CD52, CA-125, CD34, CA-15-3, CA-19-9, CEA, CD99, CD117, CD31, CD44, CD123, CD133, ABCB5 및 CD45 중의 하나에 결합할 수 있는 것인, 항체, 또는 항원 결합 단편.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드 및 적어도 하나의 약제학적으로-허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산.
  25. 제24항의 핵산을 포함하는 벡터.
  26. 제25항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  27. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터의 발현에 적합한 조건하에서 제26항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 요법에, 또는 의학적 치료 방법에 사용하기 위한 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드.
  29. T-세포 기능이상 (dysfunctional) 장애의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드.
  30. 암의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드.
  31. 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드.
  32. T-세포 기능이상 장애의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드의 용도.
  33. 암의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드의 용도.
  34. 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드의 용도.
  35. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 기능이상 T-세포에 투여하는 단계를 포함하는, T-세포 기능을 개선하는, 시험관 내 또는 생체 내 방법.
  36. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 T-세포 기능이상 장애를 앓고 있는 환자에 투여하는 단계를 포함하는, T-세포 기능이상 장애를 치료하는 방법.
  37. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 암을 앓고 있는 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  38. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 감염성 질환을 앓고 있는 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 감염성 질환을 치료하는 방법.
  39. PD-L1을 함유하거나, 또는 이를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계, 및 항체, 또는 항원 결합 단편과 PD-L1의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  40. 개체로부터의 샘플을 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 항원 결합 단편과, 시험관 내에서, 접촉시키는 단계, 및 항체, 또는 항원 결합 단편과 PD-L1의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 개체에서 질환 또는 병태를 진단하는 방법.
  41. 개체로부터의 샘플을 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 항원 결합 단편과, 시험관 내에서, 접촉시키는 단계, 및 항체, 또는 항원 결합 단편과 PD-L1의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, PD-1 또는 PD-L1 표적화 제제를 사용한 치료를 위해 개체를 선택하거나 계층화하는 방법.
  42. PD-L1의 시험관 내 검출을 위한 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 항원 결합 단편의 용도.
  43. 시험관 내 진단제로서 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 항원 결합 단편의 용도.
  44. T 세포가 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드와 시험관 내 또는 생체 외 접촉되는, T 세포의 집단을 증대시키는 방법.
  45. T-세포 기능이상 장애를 갖는 개체의 치료 방법으로서, T 세포 집단을 증대시키기 위해 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드의 존재하에서 개체로부터의 혈액 샘플로부터 수득된 T 세포를 배양하는 단계, 증대된 T 세포를 수집하는 단계, 및 증대된 T 세포를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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