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KR20170081253A - 항-il-1베타 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

항-il-1베타 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20170081253A
KR20170081253A KR1020177015590A KR20177015590A KR20170081253A KR 20170081253 A KR20170081253 A KR 20170081253A KR 1020177015590 A KR1020177015590 A KR 1020177015590A KR 20177015590 A KR20177015590 A KR 20177015590A KR 20170081253 A KR20170081253 A KR 20170081253A
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올라프 문디글
가이 조지스
랄프 슈마허
구이도 하르트만
사비네 그뤼너
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

뮤린 항-IL-1베타 항체 H34의 인간화된 변이체인 인간화된 항-IL-1베타 항체가 본원에 보고된다. 특이적 인간화된 항체는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.

Description

항-IL-1베타 항체 및 이의 사용 방법{ANTI-IL-1BETA ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
본 발명은 항-IL-1베타 항체 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
림포카인, 예컨대 IL-1은 다세포 기원의 것이고, 이들의 다면적인 조절 작용을 통해 이들은 감염에 대한 숙주 반응 동안 많은 표적 세포에 영향을 미친다. 감염 부위의 IL-1은 림프구, 과립구 및 섬유아세포를 활성화시킨다. 또한, IL-1은 급성기 반응의 매개체로서 작용할 수 있고 구조적 단백질 및 매트릭스의 이화작용을 촉진할 수 있고 과열된 반응을 조절할 수 있다.
인간 인터류킨-1(IL-1) 활성을 공유하나 구조적으로 구별되는 분자인 2개의 단백질이 확인되었다. IL-1알파 및 IL-1베타로 지칭되는 이들 단백질은 IL-1 수용체에 대한 결합을 위해 서로 경쟁하고 유사한 생물학적 활성에 영향을 준다. 둘 다의 분자는 큰 전구체(MW 약 30,000 Da)로서 합성되고, 이는 보다 적은 생물학적으로 활성화 형태(MW 약 17,500 Da)로 처리된다. 그러나, 이들은 2개의 구별되는 상보적 DNA에 의해 암호화되고, 단지 26%의 아미노산 상동성을 나타내고 각각 5 및 7의 pI(등전위 pH)를 갖는다.
US 4,935,343에서, IL-1베타에 결합하나 IL-1알파에는 결합하지 않는 단일클론 항체가 개시되어 있다(또한, 문헌[Kenney et al., J. Immunol. 138 (1987) 4236-4242] 참조). 항체는 IL-1베타에 결합하고 IL-1베타에 대한 수용체 결합 및 이의 생물학적 활성을 차단한다.
WO 2004/067568은 인간 IL-1베타 길항제를 보고한다.
본 발명은 항-IL-1베타 항체 및 이의 사용 방법을 제공한다. 구체적 실시양태에서, 항체는 인간화된 항체이다. 인간화된 항체 중 일부에서, 저하 핫스팟(degradation hotspot)이 제거되어 대규모 생산을 위해 항체의 개발가능성의 개선을 보장하였다.
본원에 보고된 하나의 양상은 인간 및 사이노몰구스 IL-1베타에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 2의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 뮤린 항체의 인간화된 변이체이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 인간 및 사이노몰구스 IL-1베타에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체이되, 인간화된 항체는 (a) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
본원에 보고된 하나의 양상은 인간 및 사이노몰구스 IL-1베타에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체이되, 인간화된 항체는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
본원에 보고된 하나의 양상은 인간 및 사이노몰구스 IL-1베타에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체이되, 인간화된 항체는 (a) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 실시양태에서, 인간화된 항체는 (a) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다.
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 실시양태에서, 인간화된 항체는 위치 48의 중쇄 가변 도메인에 이소류신 아미노산 잔기, 위치 67의 중쇄 가변 도메인에 알라닌 아미노산 잔기, 위치 69의 중쇄 가변 도메인에 페닐알라닌 아미노산 잔기 및 위치 93의 중쇄 가변 도메인에 발린 아미노산 잔기, 및 위치 36의 경쇄 가변 도메인에 세린 아미노산 잔기를 추가로 포함한다(카바트(Kabat)에 따른 넘버링).
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 실시양태에서, 인간화된 항체는 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열, (b) 서열번호 6의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열, 또는 (c) (a)와 같은 VH 서열 및 (b)와 같은 VL 서열을 포함한다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 인간화된 항체는 서열번호 4의 VH 서열 및 서열번호 6의 VL 서열을 포함한다.
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 실시양태에서, 인간화된 항체는 인간 서브클래스 IgG1 또는 인간 서브클래스 IgG4의 것이다.
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 실시양태에서, 인간화된 항체는 카파 경쇄를 갖는 인간 서브클래스 IgG1의 것이다.
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 실시양태에서, 인간화된 항체는 단일클론 항체이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 서열번호 4의 VH 서열 및 서열번호 6의 VL 서열을 포함하는 항체이다.
하나의 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다.
모든 양상의 하나의 실시양태에서, 인간화된 항체는 인간 IL-1베타에 특이적으로 결합하나 인간 IL-1알파에는 결합하지 않는다.
모든 양상의 하나의 실시양태에서, 인간화된 항체는 인간 IL-1 수용체에 대한 인간 IL-1베타의 결합을 억제함으로써 인간 IL-1베타의 생물학적 활성을 차단한다.
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 실시양태에서, 본원에 보고된 인간화된 항체는 IL-1베타의 수용체 결합 부위 상에 또는 그와 가까운 2개의 결정 인자 부위에 특이적으로 결합한다.
모든 양상의 하나의 바람직한 실시양태에서, 본원에 보고된 인간화된 항체는 IL-1R1 및 IL-1RAcP와 IL-1베타의 상호작용을 차단한다.
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 바람직한 실시양태에서, 본원에 보고된 인간화된 항체는 IL-1 베타 신호화 복합체의 형성을 이의 조립의 제1 단계에서 차단한다(즉, 이는 IL-1 베타 및 IL-1R1의 결합을 차단한다).
본원에 보고된 하나의 양상은 본원에 보고된 항체를 암호화하는 (단리된) 핵산이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 본원에 보고된 핵산을 포함하는 숙주 세포이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 본원에 보고된 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 단계 및 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 본원에 보고된 항체의 생산 방법에 관한 것이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 본원에 보고된 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형이다.
하나의 실시양태에서, 약학 제형은 추가적 치료제를 추가로 포함한다. 하나의 실시양태에서, 추가적 치료제는 항-ANG2 항체 또는 항-VEGF 항체이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 약제로서 사용하기 위한 본원에 보고된 항체이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 눈 혈관 질환의 치료, 바람직하게는 황반 변성의 치료에서 사용하기 위한 본원에 보고된 항체이다.
본원에 보고된 항체는 IL-1베타와 IL-1 수용체 I 및 II 사이의 상호작용을 억제하기 위한 것이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 약제의 제조에서 본원에 보고된 항체의 용도이다.
하나의 실시양태에서, 약제는 눈 혈관 질환의 치료, 바람직하게는 황반 변성의 치료를 위한 것이다.
하나의 실시양태에서, 약제는 IL-1베타와 IL-1 수용체 I 및 II 사이의 상호작용을 억제하기 위한 것이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 눈 혈관 질환, 바람직하게는 황반 변성을 앓는 개체에게 유효량의 본원에 보고된 항체를 투여하는 단계를 포함하는 눈 혈관 질환, 바람직하게는 황반 변성을 앓는 개체의 치료 방법이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 유효량의 본원에 보고된 항체를 투여하는 단계 및 IL-1베타와 IL-1 수용체 I 및 II 사이의 상호작용을 억제하는 단계를 포함하는 개체에서 IL-1베타와 IL-1 수용체 I 및 II 사이의 상호작용을 억제하는 방법이다.
I. 정의
용어 "결합하지 않는다"는 항체가 IL-1알파 또는 섬유아세포 성장 인자와 결합할 때 배경 상의 유의미한 결합이 ELISA 또는 표면 플라스몬 공명 기반 방법으로 측정시 관찰되지 않음을 의미한다.
본원의 목적상 "수용자 인간 골격"은 하기에 정의된 바와 같이 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격으로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 골격 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 골격의 아미노산 서열을 포함하는 골격이다. 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격으로부터 유래된 수용자 인간 골격은 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 골격은 VL 인간 면역글로불린 골격 서열 또는 인간 컨센서스 골격 서열과 서열 면에서 동일하다.
"친화성"은 분자의 단일 결합 부위(예를 들어 항체)와 이의 결합 파트너(예를 들어 항원) 사이의 비-공유 결합성 상호작용의 총 합의 강도를 나타낸다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍(예를 들어 항체 및 항원)의 구성원 사이의 1:1 상호작용을 나타내는 고유 결합 친화성을 나타낸다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수(kd)로 나타낼 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 것을 포함한 당분야에 공지된 통상적 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 구체적 예 및 예시적 실시양태가 하기에 기재된다.
"친화성 성숙된" 항체는 변경을 보유하지 않는 모 항체에 비해 하나 이상의 초가변 영역(HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭하고, 이러한 변경은 항원에 대한 항체의 친화성의 개선을 야기한다.
용어 "항-IL-1베타 항체" 및 "항-IL-1베타에 결합하는 항체"는 충분한 친화성으로 IL-1베타에 결합할 수 있는 항체를 나타내고, 이러한 항체는 IL-1베타를 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료제로서 유용하다. 하나의 실시양태에서, 관련되지 않은 비-IL-1베타 단백질에 대한 항-IL-1베타 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 ELISA 또는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 IL-1베타에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, IL-1베타에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM 또는 ≤ 0.1 nM(예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 내지 10-10 M, 예를 들어 10-9 내지 10-10 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-IL-1베타 항체는 상이한 종의 IL-1베타 사이에 보존되는 IL-1베타의 에피토프에 결합한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 비제한적으로 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들어 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함하는 다양한 항체 구조물을 포괄한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합한 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 나타낸다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자(예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
기준 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 기준 항체로서 적어도 동일한 아미노산 잔기와의 상호작용을 갖는 항체를 나타낸다. 이들 상호작용은 예를 들어 대전된 아미노산 잔기 사이의 이온성 상호작용 또는 소수성 아미노산 잔기 사이의 소수성 상호작용이다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면에, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
항체의 "클래스"는 이의 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5종의 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스(동종형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로서 지칭된다.
용어 "면역접합체"는 항체와 비-항체 모이어티 사이의 공유 결합성 접합체를 의미한다. 이러한 비-항체 모이어티는 검출가능한 표지, 이펙터 분자 또는 세포독성제일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포사 또는 세포 파괴를 야기하는 물질을 나타낸다. 세포독성제는 비제한적으로 방사성 동위원소(예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물(예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입성 제제); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예컨대 핵산 분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소(이의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 하기에 기재되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함한다.
"이펙터 기능"은 항체 클래스에 따라 달라지는, 항체의 Fc-영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예에는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.
제제, 예를 들어 약학 제형의 "유효량"은 필요한 시간 동안 필요한 용량에서 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc-영역"은 불변 영역의 적어도 부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 용어는 원래 서열 Fc-영역 및 변이체 Fc-영역을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복시 말단으로 연장된다. 그러나, Fc-영역의 C-말단 리신(Lys447) 또는 C-말단 글리실-리신 다이펩티드(Gly446Lys447)는 존재하지 않거나 존재할 수 있다. 달리 본원에 명시되지 않는 한, Fc-영역 또는 불변 영역 내 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]에 기재된 바와 같이, EU 지수로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"골격" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인으로 구성된다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에 정의된 Fc-영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타내는데 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 외래 핵산이 도입되어 있는 세포(이러한 세포의 자손을 포함함)를 지칭한다. 숙주 세포는 일차 형질전환된 세포, 및 계대배양의 수와 관계없이 이로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량 면에서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나 돌연변이를 함유할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 여기에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 인간 항체의 이 정의는 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특히 배제한다.
"인간 컨센서스 골격"은 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격 서열의 선택에서 가장 흔히 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 골격이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터의 선택이다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3]에 기재된 바와 같은 하위군이다. 하나의 실시양태에서, VL의 경우 하위군은 상기 문헌(Kabat et al.)에 기재된 바와 같은 하위군 카파 I이다. 하나의 실시양태에서, VH의 경우 하위군은 상기 문헌(Kabat et al.)에 기재된 바와 같은 하위군 III이다.
"인간화된 항체"는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화된 항체는 하나 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 HVR(예를 들어 CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열 면에서 초가변성(상보성 결정 영역 또는 CDR)을 갖고/갖거나 구조적으로 정의된 루프(초가변 루프)를 형성하고/하거나 항원 접촉 잔기(항원 접촉부)를 함유하는 항체 가변 도메인의 영역 각각을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR을 포함한다: VH에서 3개(H1, H2 및 H3), 및 VL에서 3개(L1, L2 및 L3).
본원에서 HVR은 (a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에 존재하는 초가변 루프(문헌[Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917]); (b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)에 존재하는 CDR(문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]); (c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2) 및 93-101(H3)에 존재하는 항원 접촉부(문헌[MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]); 및 (d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3) 및 94-102(H3)를 포함하는, (a), (b) 및/또는 (c)의 조합을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, 가변 도메인 내 HVR 잔기 및 다른 잔기(예를 들어 FR 잔기)는 상기 카바트 등의 문헌에 따라 넘버링된다.
"면역접합체"는 하나 이상의 이종기원 분자에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 사육 동물(예를 들어 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리되어 있는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동(예를 들어 SDS-PAGE, 등전점 포커싱(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정될 때 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해서는 예를 들어 문헌[Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리되어 있는 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 염색체 외부에 존재하거나 이의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-IL-1베타 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이들의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자(단일 벡터 또는 별개의 벡터 내의 이러한 핵산 분자 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자를 포함함)를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 즉, 예를 들어, 천연 돌연변이를 함유하거나 단일클론 항체 제제의 제조 동안 발생되는 가능한 변이체 항체(이러한 변이체는 일반적으로 미미한 양으로 존재함)를 제외하고 상기 집단을 구성하는 개별 항체는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정 인자(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정 인자에 대해 유도된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 특성을 항체들의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 것으로서 표시하고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 요구하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환 동물을 사용하는 방법을 포함하는 다양한 기법들에 의해 제조될 수 있고, 이러한 방법 및 단일클론 항체의 다른 예시적인 제조 방법은 본원에 기재되어 있다.
"네이키드 항체"는 이종기원 모이어티(예를 들어 세포독성 모이어티) 또는 방사성 표지에 접합되지 않는 항체를 나타낸다. 네이키드 항체는 약학 제형에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 상이한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 중쇄는 N-말단부터 C-말단까지 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로서도 지칭되는 가변 영역(VH)에 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, 각각의 경쇄는 N-말단부터 C-말단까지 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로서도 지칭되는 가변 영역(VL)에 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여 카파(κ) 및 람다(λ)로서 지칭되는 두 유형 중 하나로 배정될 수 있다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 상업적 포장물 내에 통상적으로 포함되는 설명서로서, 적응증, 용법, 용량, 투여, 병용 치료, 사용금지 사유 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고에 대한 정보를 함유하는 설명서를 지칭하기 위해 사용된다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요에 따라 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입하고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후 기준 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬은 당분야의 기술 내에 있는 다양한 방식, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2의 사용을 통해 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 만들어졌고, 소스 코드는 미국 저작권 협회(U.S. Copyright Office, 미국 워싱톤 디씨 20559 소재)에 사용자 문서로 출원되었고, 상기 코드는 상기 미국 저작권 협회에서 미국 저작권 등록 번호 TXU510087하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)로부터 공개적으로 입수될 수 있거나 상기 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 작동 시스템 상에서의 사용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변형되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 × X/Y
여기서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 정렬에서 이 프로그램에 의해 동일한 일치(match)로서 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 존재하는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동등하지 않을 것임이 인식될 것이다. 달리 구체적으로 명시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램의 사용을 통해 바로 이전 단락에 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형"은 그 내부에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 하는 형태로 존재하고 이 제형이 투여되는 대상체에게 허용되지 않는 독성을 나타내는 추가적 성분을 함유하지 않는 제형을 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 대상체에게 독성을 나타내지 않는, 약학 제형 중의 활성 성분 이외의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체는 비제한적으로 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "IL-1베타"는 인간 IL-1베타를 나타낸다. 용어는 "전장" 미처리된 IL-1베타 뿐만 아니라 세포 내 처리로부터 야기된 임의의 형태의 IL-1베타를 포괄한다. 또한, 용어는 IL-1베타의 자연 발생한 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다. 인간 IL-1베타의 아미노산 서열은 서열번호 46으로 나타난다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(및 이의 문법적 어미변화, 예컨대, "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연 경과를 변형시키기 위한 시도에서의 임상 중재를 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 비제한적으로 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 경감, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체와 항원의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 골격 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들어 문헌[Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 나아가, 특정 항원에 결합하는 항체는 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다(예를 들어 문헌[Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887]; 및 [Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628)] 참조).
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 그 자신에 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어는 자가 복제 핵산 구조물로서의 벡터뿐만 아니라 그 자신이 도입되어 있는 숙주 세포의 게놈 내로 삽입된 벡터도 포함한다. 특정 벡터는 이들에 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
II. 조성물 및 방법
본 발명의 단일클론 인간화된 항체는 ILB1-H34로 지칭되는 뮤린 항체의 인간화된 형태이다(짧은 H34). 이는 IL-1베타의 수용체 결합 및 증식성 활성에 수반되는 IL-1베타 분자의 결정 인자 부위에 특이적으로 결합한다. 단일클론 인간화된 항체는 IL-1알파에 결합하지 않고 산성 또는 염기성 섬유아세포 성장 인자에도 결합하지 않는다. 항체 ILB1-H34는 마우스 3T3 섬유아세포 상의 IL-1 수용체에 대한 요오드 125 표지된 IL-1베타의 결합 및 IL-1베타-유도된 흉선 세포 증식을 차단한다. 이러한 항체는 IgG1 카파 동종형의 것이다. 뮤린 HLB1-H34 항체는 ILB1-H34 뮤린 하이브리도마에 의해 생산된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 특정 위치에서 뮤린 항-인간 IL-1베타 항체 H34 복귀돌연변이의 인간화가, 항체의 개발가능성을 개선학 대규모 생산에 대한 적합성을 보장하기 위해 필요한 HVR-H2에서 시스테인 잔기의 제거에 기인한 친화성의 손실을 보상하기 위해 도입되어야 한다는 결과를 부분적으로 기반으로 한다. 특정 실시양태에서, 인간 IL-1베타에 결합하는 인간화된 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는 예를 들어 눈 혈관 질환, 예컨대 황반 변성의 치료에 유용하다.
A. 예시적 항-IL- 1베타 항체
4개의 신규한 항-인간 IL-1베타 항체가 본원에 제공된다.
제1 항-IL-1베타 항체는 서열번호 9의 VH 및 서열번호 10의 VL을 갖는 신규한 뮤린 항-인간 IL-1베타 항체이다. 이러한 항체는 하기에 mumAb로 지칭된다. 이러한 항체는 인간, 사이노몰구스, 토끼, 래트 및 뮤린 IL-1베타에 결합하고 IL-1베타와 인간 IL-1 수용체 I 및 II 사이의 상호작용을 억제한다.
항체는 하기 특성을 갖는다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
상기 데이터는 비아코어(BIAcore)에 의해 결정되었다.
Figure pct00006
상기 데이터는 ELISA에 의해 결정되었다.
IL-1 수용체 I 및 II에 대한 IL-1베타의 결합의 억제:
Figure pct00007
상기 데이터는 ELISA에 의해 결정되었다.
자극 실험에서, 본원에 보고된 뮤린 항체가 A549 세포의 IL-1β 자극시 ICAM-1 발현을 억제할 수 있음이 나타날 수 있다(하기 표 참조).
Figure pct00008
하기 표에서, HUVEC 세포의 IL-1베타 자극시 ICAM-1 발현의 억제에 대한 IC50 값을 나타냈다.
Figure pct00009
자극 실험에서, 본원에 보고된 인간화된 항체가 A549 세포의 IL-1베타 자극시 IL-6 발현을 감소시킴이 나타날 수 있다(하기 표 참조).
Figure pct00010
또한, 뮤린 항체는 스트레스 시험에서 안정성을 나타냈다. 결합 활성은 표면 플라스몬 공명을 사용하여 결정하였다(하기 표 참조).
Figure pct00011
고분자량 함량이 결정되었을 때 동일한 안정성이 관찰될 수 있다(하기 표 참조).
Figure pct00012
동일한 안정성이 CE-SDS 분석에서 나타날 수 있다(하기 표 참조).
Figure pct00013
뮤린 항체의 열적 안정성을 응집 개시 온도(Tagg) 및 융점(Tm)을 측정함으로써 평가하였다(하기 표 참조).
Figure pct00014
다른 3개의 항체는 뮤린 항-IL-1-베타 항체 H34: huH34-1(서열번호 3, 6 및 18 내지 24), huH34-2(서열번호 4, 6 및 25 내지 31) 및 huH34-3(서열번호 5, 6 및 32 내지 38)의 인간화된 변이체이다.
인간화된 항-IL-1베타 항체가 본원에 보고된다. 이러한 항체는 뮤린 항-IL-1베타 항체 H34로부터 유래된다.
본원에 보고된 하나의 양상은 뮤린 항-IL-1베타 항체 H34의 인간화된 변이체인 단일클론 항체이다. 이러한 항체는 US 4,935,343에 보고되어 있다.
뮤린 H34 항체(서열번호 1 및 2)의 아미노산 서열에 근거하여, 상응하는 인간화된 항-IL-1β 항체를 생성하였다(huH34-2). 인간화된 변이체 VH는 인간 VBase_VH1_1 및 인간 IGHJ4-01-3 생식 세포주의 J-요소를 기반으로 한다(huH34-1). 친화성을 회복하기 위해, 하나의 복귀돌연변이를 골격 영역 2의 위치 48에 도입하였다(M48I). 골격 영역 3에서, 4개의 위치가 복귀돌연변이를 일으켰다: V67A, M69F, R71V 및 A93V. 또한, HVR-H2의 위치 52a의 시스테인은 세린으로 교체되었다. VL이 경우, 인간화된 변이체는 IGKJ2-01 J-요소를 갖는 인간 IMGT_hVK_3_11 생식 세포주를 기반으로 한다. 하나의 복귀돌연변이는 골격 영역 2의 위치 36에 도입되었다(Y36S). 인간화된 VH의 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타나 있고, 인간화된 VL의 아미노산 서열은 서열번호 6에 나타나 있다.
뮤린 항-IL-1베타 항체 H34는 대규모로 생산될 수 있는 치료적 후보자로서 개발을 위해 제거되어야 할 시스테인을 HVR-H2에 함유한다(C52a, 카바트 넘버링). 뮤린 항체에서 이러한 Cys를 C52aS 돌연변이에 의해 제거함은 약 6 내지 7배만큼 IL-1베타에 대한 감소된 친화성을 야기한다(하기 표 참조).
Figure pct00015
상기 데이터는 비아코어에 의해 결정되었다.
H34의 인간화된 버전의 경우(huH34-2), C52aS 돌연변이시 친화성의 손실은 보상되고, 이러한 항체는 뮤린 모 항체 H34와 비슷한 친화성(및 세포 분석에서 비슷한 기능적 효능)을 갖는다.
이러한 보상 효과는 인간화를 위해 선택된 생식 세포주 서열 및 골격 IGHJ4-01-3 및 IMGT_hVK_3_11 내 복귀돌연변이의 선택에 책임이 있다. 추가적 변이체는 동일한 인간 생식 세포주(각각 VH(IGHJ4-01-3) VL(IMGT_hVK_3_11))를 기반으로 고안되었다. huH34-2에 대해 기재된 복귀돌연변이는 VH 및 VL 서열(서열번호 7 및 8)로부터 제외된다.
Figure pct00016
상기 데이터는 비아코어에 의해 결정되었다.
하나의 실시양태에서, 인간화된 항-IL-1베타 항체는 인간 및 사이노몰구스 IL-1베타에 결합한다.
인간 IL-1베타의 존재하에, 고정된 IL-1 수용체 I을 사용하는 표면 플라스몬 공명 실험에서 결합 신호는 제보키주맙의 경우 증가하였다. 따라서, 항체-결합된 IL-1b는 여전히 IL-1 수용체 I에 결합한다. 따라서, 제보키주맙에 대한 작용 모드는 IL-1RAc 결합 알로스테릭 억제이다(알로스테릭 항체).
카나키누맙의 경우, IL-1 수용체 I에 결합하는 H34 및 mumAb IL-1베타는 항체 결합 후에 방지된다. 따라서, 작용 모드는 카나키누맙, H34 및 mumAb의 경우 수용체 차단이다(경쟁적 항체).
Figure pct00017
자극 실험에서, 본원에 보고된 인간화된 항체가 뮤린 모 항체와 동일한 활성을 가짐이 나타날 수 있다. 하기 표에서, A549 세포의 IL-1베타 자극시 ICAM-1 발현의 억제에 대한 IC50 값을 상이한 항체에 대하여 나타냈다.
Figure pct00018
하기 표에서, HUVEC 세포의 IL-1베타 자극시 ICAM-1 발현의 억제에 대한 IC50 값을 나타냈다.
Figure pct00019
자극 실험에서, 본원에 보고된 인간화된 항체가 A549 세포의 IL-1베타 자극시 IL-6 발현을 감소시킴이 나타날 수 있다(하기 표 참조).
Figure pct00020
증식 억제 실험에서, 본원에 보고된 인간화된 항체는 D10 세포의 증식을 억제하는 것으로 나타날 수 있다(하기 표 참조).
Figure pct00021
하기 표에서, THP1 세포의 MSU 자극시 TNF알파 발현의 억제에 대한 IC50 값을 상이한 항체에 대하여 나타냈다.
Figure pct00022
또한, 인간화된 항체는 스트레스 시험에서 뮤린 H34 모 항체과 비교하여 개선된 안정성을 나타낸다. 결합 활성을 표면 플라스몬 공명을 사용하여 결정하였다(하기 표 참조).
Figure pct00023
고분자량 함량이 결정되었을 때 동일한 안정성이 관찰될 수 있다(하기 표 참조).
Figure pct00024
동일한 안정성이 CE-SDS 분석에서 관찰될 수 있다(하기 표 참조).
Figure pct00025
상이한 인간화된 항체의 열적 안정성을 응집 개시 온도(Tagg) 및 융점(Tm)을 측정함으로써 평가하였다(하기 표 참조).
Figure pct00026
인간 IL-1베타에 결합된 huH34-2 Fab 단편의 고해상도 결정 구조는 이러한 항체의 기능적 에피토프에 대한 상세한 정보를 보여주었다. 구조를 삼원 IL-1b 신호화 복합체의 구조와 비교하였다(IL-1 수용체 1(IL-1R1) 및 IL-1 액세서리 단백질(IL-1RAcP)에 결합된 인간 IL-1b, PDB 코드 4DEP). huH34의 에피토프는 IL-1R1 및 IL-1RAcP 둘 다의 상호작용 부위에 중첩하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 항체는 IL-1베타 및 IL-1R1의 결합인 이의 어셈블리의 제1 단계에서 IL-1베타 신호화 복합체의 형성을 차단한다.
항체 0031은 IL-1베타 결합 특이성으로서 huH34-2의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 이중특이적 항-ANG2/IL-1베타 항체이다.
항체 0032는 IL-1베타 결합 특이성으로서 huH34-2의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 이중특이적 항-VEGF/IL-1베타 항체이다.
동적 결합 값의 결정을 위해, 실시예 26에 보고된 분석을 사용하였다.
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
모든 이중특이적 항체는 이의 둘 다의 항원에 대한 동시적 결합의 특성을 가짐이 SPR 분석에 의해 밝혀졌다.
ANG2 특이적 pTie2-ELISA에서, 항체 0031은 WO 2014/09465에 보고된 항-ANG2/VEGF 항체보다 6배 더 활성이다.
하나의 실시양태에서, 인간화된 항-IL-1베타 항체는 인간 및 사이노몰구스 IL-1베타에 결합한다.
하기 표에서, A549 세포의 IL-1베타 자극시 ICAM-1 발현의 억제에 대한 IC50 값을 나타냈다.
Figure pct00030
하기 표에서, HUVEC 세포의 IL-1베타 자극시 ICAM-1 발현의 억제에 대한 IC50 값을 나타냈다.
Figure pct00031
자극 실험에서, 본원에 보고된 인간화된 항체가 A549 세포의 IL-1베타 자극시 IL-6 발현을 감소시킴을 나타낼 수 있다(하기 표 참조).
Figure pct00032
상이한 이중특이적 항체의 열적 안정성을 응집 개시 온도(Tagg) 및 융점(Tm)의 측정에 의해 평가하였다(하기 표 참조).
Figure pct00033
항체 huH34-2는 서열번호 4, 6 및 25 내지 31의 서열로 기재된다(결합 부위, HVR, VH, VL). 항체 huH34-2의 이중특이적 포맷은 서열번호 49 내지 52 및 57 내지 60의 서열로 기재된다. 모든 이들 서열은 단독으로 및 본 발명의 조합된 양상으로 구성된다.
본원에 보고된 하나의 양상은 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 인간화된 항-인간 IL-1베타 항체이다. 하나의 실시양태에서, 항체는 (d) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 본원에 보고된 인간화된 항-인간 IL-1베타 항체는 인간 및 사이노몰구스 IL-1베타에 특이적으로 결합하고 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 본원에 보고된 인간화된 항-인간 IL-1베타 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 본원에 보고된 인간화된 항-인간 IL-1베타 항체는 이중특이적 항체이다.
본원에 보고된 하나의 양상은 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 인간화된 항-인간 IL-1베타 항체이다. 하나의 실시양태에서, 항체는 (d) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다.
본원에 보고된 하나의 양상은 (a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항-인간 IL-1베타 항체이다. 하나의 실시양태에서, 항체는 (d) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-IL-1베타 항체를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 항체는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가적 실시양태에서, 항체는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가적 실시양태에서, 항체는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 항체는 (a) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 양상에서, 항-IL-1베타 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-IL-1베타 항체는 IL-1베타에 대한 결합 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 4에서 치환되고/되거나 삽입되고/되거나 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부(즉, FR 내부) 영역에서 발생한다. 임의적으로, 항-IL-1베타 항체는 서열번호 4의 VH 서열(이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-IL-1베타 항체가 제공되되, 항체는 서열번호 6의 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-IL-1베타 항체는 IL-1베타에 대한 결합 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열번호 6에서 치환되고/되거나 삽입되고/되거나 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부(즉, FR 내부) 영역에서 발생한다. 임의적으로, 항-IL-1베타 항체는 서열번호 6의 VL 서열(이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-IL-1베타 항체가 제공되되, 항체는 상기에 제공된 임의의 실시양태의 VH 및 상기에 제공된 임의의 실시양태의 VL을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항체는 각각 서열번호 4 및 서열번호 6의 VH 및 VL 서열(이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.
본 발명의 추가적 양상에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-IL-1베타 항체는 단일클론 항체이다. 하나의 실시양태에서, 항-IL-1베타 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 다이아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 온전한 IgG1 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 본원에 정의된 동종형이다.
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 실시양태에서, 항-IL-1베타 항체는 이펙터 침묵 항-IL-1베타 항체이다. 본원에 보고된 모든 양상의 하나의 실시양태에서, 항-IL-1베타 항체는 이펙터 침묵 항-IL-1베타 항체이고 인간 FcRn에 결합하지 않는다. 본원에 보고된 모든 양상의 하나의 실시양태에서, 항체는 인간 서브클래스 IgG1의 항-IL-1베타 항체이고, 둘 다의 중쇄에 돌연변이 L234A, L235A, P329G, I253A, H310A 및 H434A를 갖는다(카바트 지수에 따른 넘버링).
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 실시양태에서, 항-IL-1베타 항체는 이중특이적 항체이다.
본원에 보고된 하나의 양상은
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄(이때, 제2 경쇄 및 제2 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체됨)
를 포함하는 2가의 이중특이적 항체로서, 이때, 제1 항원 또는 제2 항원은 인간 IL-1베타이다.
a)의 항체는 b)에 보고된 변형을 함유하지 않고, a)의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄이다.
b)의 항체에서, 경쇄 내에, 가변 경쇄 도메인 VL은 상기 항체의 가변 중쇄 도메인 VH로 교체되고; 중쇄 내에, 가변 중쇄 도메인 VH는 상기 항체의 가변 경쇄 도메인 VL로 교체된다.
하나의 실시양태에서,
i) a)의 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은(카바트에 따른 넘버링) 양전하의 아미노산으로 치환되고, a)의 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은(카바트 EU 지수에 따른 넘버링) 음전하의 아미노산으로 치환되거나,
ii) b)의 제2 경쇄의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은(카바트에 따른 넘버링) 양전하의 아미노산으로 치환되고, b)의 제2 중쇄의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은(카바트 EU 지수에 따른 넘버링) 음전하의 아미노산으로 치환된다.
하나의 바람직한 실시양태에서,
i) a)의 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로(카바트에 따른 넘버링)(하나의 바람직한 실시양태에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로) 치환되고, a)의 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로(카바트 EU 지수에 따른 넘버링) 치환되거나,
ii) b)의 제2 경쇄의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로(카바트에 따른 넘버링)(하나의 바람직한 실시양태에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로) 치환되고, b)의 제2 중쇄의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로(카바트 EU 지수에 따른 넘버링) 치환된다.
하나의 실시양태에서, 제2 중쇄의 불변 도메인 CL에서, 위치 124 및 123의 아미노산은 K로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 실시양태에서, 제2 경쇄의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147 및 213의 아미노산은 E로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 바람직한 실시양태에서, 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서, 위치 124 및 123의 아미노산은 K로 치환되고, 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147 및 213의 아미노산은 E로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 실시양태에서, 제2 중쇄의 불변 도메인 CL에서, 위치 124 및 123의 아미노산은 K로 치환되고, 제2 경쇄의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147 및 213의 아미노산은 E로 치환되고, 제1 경쇄의 가변 도메인 VL에서, 위치 38의 아미노산은 K로 치환되고, 제1 중쇄의 가변 도메인 VH에서, 위치 39의 아미노산은 E로 치환되고, 제2 중쇄의 가변 도메인 VL에서, 위치 38의 아미노산은 K로 치환되고, 제2 경쇄의 가변 도메인 VH에서, 위치 39의 아미노산은 E로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
본원에 보고된 하나의 양상은
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄(이때, 제2 경쇄 및 제2 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되고, 제2 경쇄 및 제2 중쇄의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체됨)
를 포함하는 2가의 이중특이적 항체로서, 이때, 제1 항원 또는 제2 항원은 인간 IL-1베타이다.
a)의 항체는 b)에 보고된 변형을 함유하지 않고, a)의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄이다.
b)의 항체에서, 경쇄 내에, 가변 경쇄 도메인 VL은 상기 항체의 가변 중쇄 도메인 VH로 교체되고, 불변 경쇄 도메인 CL은 상기 항체의 불변 중쇄 도메인 CH1로 교체되고; 중쇄 내에, 가변 중쇄 도메인 VH는 상기 항체의 가변 경쇄 도메인 VL로 교체되고, 불변 중쇄 도메인 CH1은 상기 항체의 불변 경쇄 도메인 CL로 교체된다.
본원에 보고된 하나의 양상은
a) 제1 항원에특이적으로 결합하는 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄(이때, 제2 경쇄 및 제2 중쇄의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체됨)
를 포함하는 2가의 이중특이적 항체로서, 이때, 제1 항원 또는 제2 항원은 인간 IL-1베타이다.
a)의 항체는 b)에 보고된 변형을 함유하지 않고, a)의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄이다.
b)의 항체에서, 경쇄 내에, 불변 경쇄 도메인 CL은 상기 항체의 불변 중쇄 도메인 CH1로 교체되고; 중쇄 내에, 불변 중쇄 도메인 CH1은 상기 항체의 불변 경쇄 도메인 CL로 교체된다.
본원에 보고된 하나의 양상은
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체, 및
b) 1 내지 4개의 항원(즉, 제2 및/또는 제3 및/또는 제4 및/또는 제5 항원, 바람직하게는 하나의 추가적 항원, 즉, 제2 항원)에 특이적으로 결합하는 1, 2, 3 또는 4개의 단일 쇄 Fab 단편
을 포함하는 다중특이적 항체로서, 이때, b)의 상기 단일 쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C- 또는 N-말단에서 펩티드성 링커를 통해 a)의 상기 전장 항체에 융합되고, 제1 항원 또는 추가적 항원 중 하나는 인간 IL-1베타이다.
하나의 실시양태에서, 제2 항원에 결합하는 1 또는 2개의 동일한 단일 쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체에 융합된다.
하나의 실시양태에서, 제2 항원에 결합하는 1 또는 2개의 동일한 단일 쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 중쇄의 C-말단에서 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체에 융합된다.
하나의 실시양태에서, 제2 항원에 결합하는 1 또는 2개의 동일한 단일 쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 경쇄의 C-말단에서 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체에 융합된다.
하나의 실시양태에서, 제2 항원에 결합하는 2개의 동일한 단일 쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 각각의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체에 융합된다.
하나의 실시양태에서, 제2 항원에 결합하는 2개의 동일한 단일 쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 각각의 중쇄의 C-말단에서 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체에 융합된다.
하나의 실시양태에서, 제2 항원에 결합하는 2개의 동일한 단일 쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 각각의 경쇄의 C-말단에서 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체에 융합된다.
본원에 보고된 하나의 양상은
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체;
b) ba) 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 또는
bb) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 불변 도메인 1(CH1)
로 이루어진 제1 폴리펩티드(이때, 상기 제1 폴리펩티드는 이의 VH 도메인의 N-말단을 사용하여 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 중쇄의 C-말단에 융합됨); 및
c) ca) 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 또는
cb) 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)
으로 이루어진 제2 폴리펩티드(이때, 상기 제2 폴리펩티드는 VL 도메인의 N-말단을 사용하여 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 나머지 하나의 중쇄의 C-말단에 융합됨)
를 포함하는 3가의 이중특이적 항체로서, 이때, 제1 폴리펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)은 함께 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 형성하고, 제1 항원 또는 제2 항원은 인간 IL-1베타이다.
하나의 실시양태에서, b)의 폴리펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 c)의 폴리펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)은 하기 위치 사이의 다이설파이드 결합의 도입에 의해 쇄간 다이설파이드 가교를 통해 연결되고 안정화된다:
i) 중쇄 가변 도메인 위치 44 내지 경쇄 가변 도메인 위치 100, 또는
ii) 중쇄 가변 도메인 위치 105 내지 경쇄 가변 도메인 위치 43, 또는
iii) 중쇄 가변 도메인 위치 101 내지 경쇄 가변 도메인 위치 100(항상 카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
안정화를 위한 부자연스러운 다이설파이드 가교 도입의 기술은 예를 들어 WO 94/029350, 문헌[Rajagopal, V., et al., Prot. Eng. (1997) 1453-59]; [Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, (1998) 387-393]; 또는 [Schmidt, M., et al., Oncogene (1999) 18 1711-1721]에 기재되어 있다. 하나의 실시양태에서, b) 및 c)의 폴리펩티드의 가변 도메인 사이의 임의적 다이설파이드 결합은 중쇄 가변 도메인 위치 44와 경쇄 가변 도메인 위치 100 사이에 존재한다. 하나의 실시양태에서, b) 및 c)의 폴리펩티드의 가변 도메인 사이의 임의적 다이설파이드 결합은 중쇄 가변 도메인 위치 105와 경쇄 가변 도메인 위치 43 사이에 존재한다(항상 카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 하나의 실시양태에서, 단일 쇄 Fab 단편의 가변 도메인 VH와 VL 사이의 상기 임의적 다이설파이드 안정화가 부재하는 3가의 이중특이적 항체가 바람직하다.
본원에 보고된 하나의 양상은
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄,
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 제2 (변형된) 경쇄 및 제2 (변형된) 중쇄(이때, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체됨), 및
c) 펩티드성 링커를 통해 a) 및/또는 b)의 경쇄 또는 중쇄의 C- 또는 N-말단에 융합되는, 1 또는 2개의 추가적 항원(즉, 제3 및/또는 제4 항원)에 특이적으로 결합하는 1 내지 4개의 항원 결합 펩티드
를 포함하는 삼중특이적 또는 사중특이적 항체로서, 이때, 제1 항원 또는 제2 항원, 또는 추가적 항원 중 하나는 인간 IL-1베타이다.
a)의 항체는 b)에 보고된 변형을 함유하지 않고, a)의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄이다.
하나의 실시양태에서, 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 c)하에 1 또는 2개의 추가적 항원에 특이적으로 결합하는 1 또는 2개의 항원 결합 펩티드를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 펩티드는 scFv 단편 및 scFab 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 펩티드는 scFv 단편이다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 펩티드는 scFab 단편이다.
하나의 실시양태에서, 항원 결합 펩티드는 a) 및/또는 b)의 중쇄의 C-말단에 결합된다.
하나의 실시양태에서, 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 c)하에 하나의 추가적 항원에 특이적으로 결합하는 1 또는 2개의 항원 결합 펩티드를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 c)하에 제3 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 동일한 항원 결합 펩티드를 포함한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 이러한 2개의 동일한 항원 결합 펩티드는 동일한 펩티드성 링커를 통해 a) 및 b)의 중쇄의 C-말단에 융합된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 2개의 동일한 항원 결합 펩티드는 scFv 단편 또는 scFab 단편이다.
하나의 실시양태에서, 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 c)하에 제3 및 제4 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 항원 결합 펩티드를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 2개의 항원 결합 펩티드는 둘 다 동일한 펩티드 연결자를 통해 a) 및 b)의 중쇄의 C-말단에 융합된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 상기 2개의 항원 결합 펩티드는 scFv 단편 또는 scFab 단편이다.
본원에 보고된 하나의 양상은
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체(2개의 Fab 단편을 포함함)의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 2개의 추가적 Fab 단편(이때, 상기 추가적 Fab 단편은 둘 다 펩티드성 링커를 통해 a)의 중쇄의 C- 또는 N-말단에 융합됨)
을 포함하는 4가의 이중특이적 항체로서, 이때, Fab 단편에서 하기 변형이 수행되고, 제1 항원 또는 제2 항원은 인간 IL-1베타이다:
i) a)의 둘 다의 Fab 단편 또는 b)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체되거나,
ii) a)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되고, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체되고, b)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되거나, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체되거나,
iii) a)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되거나, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체되고, b)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되고, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체되거나,
iv) a)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되고, b)의 Fab 단편에서, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체되거나,
v) a)의 둘 다의 Fab 단편에서, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체되고, b)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체된다.
하나의 실시양태에서, 상기 추가적 Fab 단편은 둘 다 펩티드성 링커를 통해 a)의 중쇄의 C-말단 또는 a)의 중쇄의 N-말단에 융합된다.
하나의 실시양태에서, 상기 추가적 Fab 단편은 둘 다 펩티드성 링커를 통해 a)의 중쇄의 C-말단에 융합된다.
하나의 실시양태에서, 상기 추가적 Fab 단편은 둘 다 펩티드 커넥터를 통해 a)의 중쇄의 N-말단에 융합된다.
하나의 실시양태에서, Fab 단편에서 하기 변형이 수행된다:
i) a)의 둘 다의 Fab 단편 또는 b)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체된다.
하나의 실시양태에서, Fab 단편에서 하기 변형이 수행된다:
i) a)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체된다.
하나의 실시양태에서, Fab 단편에서 하기 변형이 수행된다:
i) a)의 둘 다의 Fab 단편에서, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체된다.
하나의 실시양태에서, Fab 단편에서 하기 변형이 수행된다:
i) b)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체된다.
하나의 실시양태에서, Fab 단편에서 하기 변형이 수행된다:
i) b)의 둘 다의 Fab 단편에서, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체된다.
본원에 보고된 하나의 양상은
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 제1 VH-CH1 도메인 쌍을 포함하는 제1 항체의 (변형된) 중쇄(이때, 상기 제1 항체의 제2 VH-CH1 도메인 쌍의 N-말단은 펩티드성 링커를 통해 상기 중쇄의 C-말단에 융합됨),
b) a)의 상기 제1 항체의 2개의 경쇄,
c) 제2 항원에 특이적으로 결합하고 제1 VH-CL 도메인 쌍을 포함하는 제2 항체의 (변형된) 중쇄(이때, 상기 제2 항체의 제2 VH-CL 도메인 쌍의 N-말단은 펩티드성 링커를 통해 상기 중쇄의 C-말단에 융합됨), 및
d) 각각 CL-CH1 도메인 쌍을 포함하는 c)의 상기 제2 항체의 2개의 (변형된) 경쇄
를 포함하는 4가의 이중특이적 항체로서, 이때, 1 항원 또는 제2 항원은 인간 IL-1베타이다.
본원에 보고된 하나의 양상은
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄(이때, 중쇄의 N-말단은 펩티드성 링커를 통해 경쇄의 C-말단에 연결됨)
를 포함하는 이중특이적 항체로서, 이때, 제1 항원 또는 제2 항원은 인간 IL-1베타이다.
a)의 항체는 b)에 보고된 변경을 함유하지 않고, 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄이다.
본원에 보고된 하나의 양상은
a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체, 및
b) VH2 도메인 및 VL2 도메인을 포함하는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 단편(이때, 둘 다의 도메인은 다이설파이드 가교를 통해 서로 연결됨)
을 포함하는 이중특이적 항체로서, 이때, VH2 도메인 또는 VL2 도메인 중 하나 만이 펩티드성 링커를 통해 제1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄에 융합되고, 제1 항원 또는 제2 항원은 인간 IL-1베타이다.
이중특이적 항체에서, a)의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄이다.
하나의 실시양태에서, VH2 도메인 또는 VL2 도메인 중 나머지 하나는 제1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄에 펩티드 링커를 통해 융합되지 않는다.
본원에 보고된 모든 양상에서, 제1 경쇄는 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 제1 중쇄는 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지(hinge) 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
모든 양상의 하나의 실시양태에서, 본원에 보고된 항체는 다중특이적 항체이되, 이는 2개 이상의 중쇄 폴리펩티드의 이종이량체화를 요구하고, 항체는 인간 IL-1베타 및 제2 비-IL-1베타 항원에 특이적으로 결합한다.
이종이량체화를 지지하기 위한 CH3-변형에 대한 여러 접근법은 예를 들어 본원에 참고로 포함된 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 및 WO 2013/096291에 기재되어 있다. 전형적으로, 당분야에 공지된 접근법에서, 제1 중쇄의 CH3 도메인 및 제2 중쇄의 CH3 도메인은, 하나의 조작된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄가 동일한 구조의 또 다른 구조와 더 이상 동종이량체화할 수 없도록(예를 들어 CH3-조작된 제1 중쇄는 또 다른 CH3-조작된 제1 중쇄와 더 이상 동종이량체화할 수 없고; CH3-조작된 제2 중쇄는 또 다른 CH3-조작된 제2 중쇄와 더 이상 동종이량체화할 수 없도록) 상보적 방법으로 둘 다 조작된다. 그렇게 함으로써, 하나의 조작된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄는 CH3 도메인을 포함하는 또 다른 중쇄와 이종이량체화하도록 강요받고, 이는 상보적 방식으로 조작된다. 본 발명의 이러한 실시양태의 경우, 제1 중쇄의 CH3 도메인 및 제2 중쇄의 CH3 도메인은, 제1 중쇄 및 제2 중쇄가 이종이량체화를 강요받는 반면에, 제1 중쇄 및 제2 중쇄가 더 이상 동종이량체화할 수 없도록(예를 들어 입체적 이유로) 아미노산 치환에 의해 상보적 방식으로 조작된다.
상기에 언급되고 포함된, 당분야에 공지된 중쇄 이종이량체화를 지지하기 위한 상이한 접근법은 본 발명에 따른 다중특이적 항체에 사용된 상이한 대안으로서 고려되고, 이는 본 발명에 대해 상기에 기재된 특정 아미노산 치환과 조합되어, 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항체로부터 유도된 "크로스되지 않은 Fab 영역", 및 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항체로부터 유도된 "크로스된 Fab 영역"을 포함한다.
본원에 보고된 다중특이적 항체의 CH3 도메인은 예를 들어 WO 96/027011, 문헌[Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621]; 및 [Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681]에 여러 예로 상세히 기재되어 있는 "놉-인투-홀(knob-into-hole)" 기술에 의해 변경될 수 있다. 이 방법에서, 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면은 이 2개의 CH3 도메인을 함유하는 2개의 중쇄의 이종이량체화를 증가시키도록 변경된다. (2개의 중쇄의) 2개의 CH3 도메인 각각은 "놉"일 수 있는 반면에, 나머지 CH3 도메인은 "홀"이다. 다이설파이드 가교의 도입은 이종이량체를 보다 안정화시키고(문헌[Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681]; [Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35]) 수율을 증가시킨다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 본원에 보고된 다중특이적 항체는 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 T366W 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 또한, CH3 도메인 사이의 추가적 쇄간 다이설파이드 가교가 예를 들어 "놉 쇄"의 CH3 도메인 내로의 Y349C 돌연변이의 도입 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내로의 E356C 돌연변이 또는 S354C 돌연변이의 도입에 의해 사용될 수 있다(문헌[Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681]). 따라서, 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본원에 보고된 다중특이적 항체는 둘 중 하나의 CH3 도메인에 Y349C 및 T366W 돌연변이를, 둘 중 나머지 하나의 CH3 도메인에 E356C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하거나, 본원에 보고된 다중특이적 항체는 둘 중 하나의 CH3 도메인에 Y349C 및 T366W 돌연변이를, 둘 중 나머지 하나의 CH3 도메인에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다(쇄간 다이설파이드 가교를 형성하기 위해 하나의 CH3 도메인에 추가적 Y349C 돌연변이 및 나머지 하나의 CH3 도메인에 E356C 또는 S354C 돌연변이) (카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
그러나, EP 1 870 459 A1에 기재된 다른 놉-인투-홀 기술도 대안적으로 또는 부가적으로 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본원에 보고된 다중특이적 항체는 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 R409D 및 K370E 돌연변이를, "홀 쇄"의 CH3 도메인에 D399K 및 E357K 돌연변이를 포함한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 실시양태에서, 본원에 보고된 다중특이적 항체는 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 T366W 돌연변이를, "홀 쇄"의 CH3 도메인에 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하고 부가적으로 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 R409D 및 K370E 돌연변이를 포함하고 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 D399K 및 E357K 돌연변이를 포함한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 실시양태에서, 본원에 보고된 다중특이적 항체는 둘 중 하나의 CH3 도메인에 Y349C 및 T366W 돌연변이를, 둘 중 나머지 하나의 CH3 도메인에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하거나, 본원에 보고된 다중특이적 항체는 둘 중 하나의 CH3 도메인에 Y349C 및 T366W 돌연변이를, 둘 중 나머지 하나의 CH3 도메인에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하고 부가적으로 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 R409D 및 K370E 돌연변이를, "홀 쇄"의 CH3 도메인에 D399K 및 E357K 돌연변이를 포함한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
"놉-인투-홀 기술"을 제외하고, 이종이량체화를 수행하기 위해 다중특이적 항체의 중쇄의 CH3 도메인을 변형하는 다른 기술이 당분야에 공지되어 있다. 이들 기술, 특히 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 및 WO 2013/096291에 기재된 것은 본원에 보고된 다중특이적 항체와 조합되어 "놉-인투-홀 기술"에 대한 대안으로서 본원에서 고려된다.
본원에 보고된 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, EP 1870459에 기재된 접근법은 다중특이적 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지하는데 사용된다. 이러한 접근법은 제1 중쇄와 제2 중쇄 둘 다의 사이의 CH3/CH3-도메인-인터페이스에서 구체적 아미노산 위치에서 반대 전하를 갖는 대전된 아미노산의 도입을 기반으로 한다.
따라서, 이러한 실시양태는 본원에 보고된 다중특이적 항체에 관한 것이되, 이때, 항체의 삼차 구조에서 제1 중쇄의 CH3 도메인 및 제2 중쇄의 CH3 도메인이 각각의 항체 CH3 도메인 사이에 위치되는 인터페이스를 형성하되, 제1 중쇄의 CH3 도메인 및 제2 중쇄의 CH3 도메인의 각각의 아미노산 서열은 각각 항체의 삼차 구조 내의 상기 인터페이스 내에 위치되고, 하나의 중쇄의 CH3 도메인 내 인터페이스에 위치된 아미노산의 세트로부터, 제1 아미노산은 양전하의 아미노산으로 치환되고, 나머지 중쇄의 CH3 도메인 내 인터페이스에 위치된 아미노산의 세트로부터, 제2 아미노산은 음전하의 아미노산으로 치환된다. 본 실시양태에 따른 다중특이적 항체는 "CH3(+/-)-조작된 다중특이적 항체"로도 지칭된다(이때, 약어 "+/-"는 각각의 CH3 도메인에 도입된 반대로 대전된 아미노산을 의미한다).
본원에 보고된 상기 CH3(+/-)-조작된 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, 양전하의 아미노산은 K, R 및 H로부터 선택되고, 음전하의 아미노산은 E 또는 D로부터 선택된다.
본원에 보고된 상기 CH3(+/-)-조작된 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, 양전하의 아미노산은 K 및 R로부터 선택되고, 음전하의 아미노산은 E 또는 D로부터 선택된다.
본원에 보고된 상기 CH3(+/-)-조작된 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, 양전하의 아미노산은 K이고, 음전하의 아미노산은 E이다.
본원에 보고된 상기 CH3(+/-)-조작된 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 409의 아미노산 R은 D로 치환되고 위치의 아미노산 K는 E로 치환되고, 나머지 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 399의 아미노산 D는 K로 치환되고 위치 357의 아미노산 E는 K로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
본원에 보고된 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, WO 2013/157953에 기재된 접근법은 다중특이적 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지하는데 사용된다. 본원에 보고된 상기 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 K로 치환되고, 나머지 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 351의 아미노산 L은 D로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 본원에 보고된 상기 다중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 K로 치환되고 위치 351의 아미노산 L은 K로 치환되고, 나머지 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 351의 아미노산 L은 D로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
본원에 보고된 상기 다중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 K로 치환되고 위치 351의 아미노산 L은 K로 치환되고, 나머지 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 351의 아미노산 L은 D로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 추가적으로 하기 치환 중 하나 이상이 나머지 하나의 중쇄의 CH3 도메인에 포함된다: 위치 349의 아미노산 Y는 E로 치환되고, 위치 349의 아미노산 Y는 D로 치환되고, 위치 368의 아미노산 L은 E로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 하나의 실시양태에서, 위치 368의 아미노산 L은 E로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
본원에 보고된 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, WO 2012/058768에 기재된 접근법은 다중특이적 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지하는데 사용된다. 본원에 보고된 상기 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 351의 아미노산 L은 Y로 치환되고 위치 407의 아미노산 Y는 A로 치환되고, 나머지 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 A로 치환되고 위치 409의 아미노산 K는 F로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 또 다른 실시양태에서, 전술된 치환에 더하여, 나머지 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 411(원래 T), 399(원래 D), 400(원래 S), 405(원래 F), 390(원래 N) 및 392(원래 K)의 아미노산 중 하나 이상이 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 하기 치환이 바람직하다:
- 위치 399의 아미노산 D를 R, W, Y 및 K로부터 선택된 아미노산으로 치환함(카바트 EU 지수에 따른 넘버링),
- 위치 400의 아미노산 S를 E, D, R 및 K로부터 선택된 아미노산으로 치환함(카바트 EU 지수에 따른 넘버링),
- 위치 405의 아미노산 F를 I, M, T, S, V 및 W로부터 선택된 아미노산으로 치환함(카바트 EU 지수에 따른 넘버링);
- 위치 390의 아미노산 N을 R, K 및 D로부터 선택된 아미노산으로 치환함(카바트 EU 지수에 따른 넘버링); 및
- 위치 392의 아미노산 K를 V, M, R, L, F 및 E로부터 선택된 아미노산으로 치환함(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
(WO 2012/058768에 따라 조작된) 본원에 보고된 상기 다중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 351의 아미노산 L은 Y로 치환되고 위치 407의 아미노산 Y는 A로 치환되고, 나머지 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 V로 치환되고 위치 409의 아미노산 K는 F로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 본원에 보고된 상기 다중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 407의 아미노산 Y는 A로 치환되고, 나머지 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 A로 치환되고 위치 409의 아미노산 K는 F로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 상기 마지막으로 전술된 실시양태에서, 상기 나머지 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 392의 아미노산 K는 E로 치환되고 위치 411의 아미노산 T는 E로 치환되고 위치 399의 아미노산 D는 R로 치환되고 위치 400의 아미노산 S는 R로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
본원에 보고된 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, WO 2011/143545에 기재된 접근법은 다중특이적 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지하는데 사용된다. 본원에 보고된 상기 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, 둘 다의 중쇄의 CH3 도메인에서 아미노산 변형은 위치 368 및/또는 409에 도입된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
본원에 보고된 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, WO 2011/090762에 기재된 접근법은 다중특이적 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지하는데 사용된다. WO 2011/090762는 "놉-인투-홀" 기술에 따른 아미노산 변형에 관한 것이다. 본원에 보고된 상기 CH3(KiH)-조작된 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 W로 치환되고, 나머지 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 407의 아미노산 Y는 A로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 본원에 보고된 상기 CH3(KiH)-조작된 다중특이적 항체의 또 다른 실시양태에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366의 아미노산 T는 Y로 치환되고, 나머지 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 407의 아미노산 Y는 T로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
본원에 보고된 IgG2 동종형의 것인 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, WO 2011/090762에 기재된 접근법은 다중특이적 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지하는데 사용된다.
본원에 보고된 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, WO 2009/089004에 기재된 접근법은 다중특이적 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지하는데 사용된다. 본원에 보고된 상기 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 392의 아미노산 K 또는 N은 음전하의 아미노산(하나의 바람직한 실시양태에서 E 또는 D, 하나의 바람직한 실시양태에서 D)으로 치환되고, 나머지 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 399의 아미노산 D, 위치 356의 아미노산 E 또는 D 또는 위치 357의 아미노산 E는 양전하의 아미노산(하나의 바람직한 실시양태에서 K 또는 R, 하나의 바람직한 실시양태에서 K)으로 치환된다(하나의 바람직한 실시양태에서, 위치 399 또는 356의 아미노산이 K로 치환됨)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 하나의 추가적 실시양태에서, 전술된 치환에 부가적으로, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 409의 아미노산 K 또는 R은 음전하의 아미노산(하나의 바람직한 실시양태에서 E 또는 D, 하나의 바람직한 실시양태에서 D)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 하나의 추가적 실시양태에서, 전술된 치환에 부가적으로 또는 대안적으로, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 439의 아미노산 K 및/또는 위치 370의 아미노산 K는 서로 독립적으로 음전하의 아미노산(하나의 바람직한 실시양태에서 E 또는 D, 하나의 바람직한 실시양태에서 D)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
본원에 보고된 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, WO 2007/147901에 기재된 접근법은 다중특이적 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지하는데 사용된다. 본원에 보고된 상기 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 253의 아미노산 K는 E로 치환되고 위치 282의 아미노산 D는 K로 치환되고 위치 322의 아미노산 K는 D로 치환되고, 나머지 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 239의 아미노산 D는 K로 치환되고 위치 240의 아미노산 E는 K로 치환되고 위치 292의 아미노산 K는 D로 치환된다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
본원에 보고된 다중특이적 항체의 하나의 실시양태에서, WO 2007/110205에 기재된 접근법은 다중특이적 항체의 제1 중쇄 및 제2 중쇄의 이종이량체화를 지지하는데 사용된다.
본원에 보고된 모든 양상의 실시양태에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체 또는 삼중특이적 항체이다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다.
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 실시양태에서, 항체는 2가 또는 3가 항체이다. 하나의 실시양태에서, 항체는 2가 항체이다.
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 실시양태에서, 다중특이적 항체는 IgG 유형 항체의 불변 도메인 구조를 갖는다. 본원에 보고된 모든 양상의 하나의 추가적 실시양태에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 인간 서브클래스 IgG1의 것, 또는 돌연변이 L234A 및 L235A를 갖는 인간 서브클래스 IgG1의 것임을 특징으로 한다. 본원에 보고된 모든 양상의 하나의 추가적 실시양태에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 인간 서브클래스 IgG2의 것임을 특징으로 한다. 본원에 보고된 모든 양상의 하나의 추가적 실시양태에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 인간 서브클래스 IgG3의 것임을 특징으로 한다. 본원에 보고된 모든 양상의 하나의 추가적 실시양태에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 인간 서브클래스 IgG4의 것, 또는 추가적 돌연변이 S228P를 갖는 인간 서브클래스 IgG4의 것임을 특징으로 한다. 본원에 보고된 모든 양상의 하나의 추가적 실시양태에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 인간 서브클래스 IgG1 또는 인간 서브클래스 IgG4의 것임을 특징으로 한다. 본원에 보고된 모든 양상의 하나의 추가적 실시양태에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 돌연변이 L234A 및 L235A를 갖는 인간 서브클래스 IgG1의 것임을 특징으로 한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 본원에 보고된 모든 양상의 하나의 추가적 실시양태에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 인간 서브클래스 IgG1의 것임을 특징으로 한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 본원에 보고된 모든 양상의 하나의 추가적 실시양태에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 돌연변이 S228P 및 L235E를 갖는 인간 서브클래스 IgG4의 것임을 특징으로 한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링). 본원에 보고된 모든 양상의 하나의 추가적 실시양태에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖는 인간 서브클래스 IgG4의 것임을 특징으로 한다(카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
본원에 보고된 모든 양상의 하나의 실시양태에서, 본원에 명시된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 추가적 C-말단 글리신-리신 다이펩티드(G446 및 K447, 카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 본원에 보고된 모든 양상의 하나의 실시양태에서, 본원에 명시된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 추가적 C-말단 글리신 잔기(G446, 카바트 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다.
추가적 양상에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-IL-1베타 항체는 하기 섹션 1 내지 5에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합으로 혼입할 수 있다.
1. 항체 친화성
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM 또는 ≤ 0.1 nM(예를 들어 10-8 M 미만, 예를 들어 10-8 M 내지 10-10 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-10 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
KD 값의 결정 방법은 하기 실시예에 요약되어 있다.
비아코어(등록상표) 표면 플라스몬 공명 분석을 사용하여 KD를 하기와 같이 대안적으로 측정할 수 있다: 약 10 반응 유닛(RU)에서 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(등록상표)-2000 또는 비아코어(등록상표)-3000(비아코어 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용한 분석을 수행한다. 하나의 실시양태에서, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어 인코포레이티드)을 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 약 10 반응 유닛(RU)의 커플링된 단백질을 달성하기 위해 5 ㎕/분의 유속으로 주입하기 전에 항원을 10 mM 아세트산 나트륨(pH 4.8)으로 5 ㎍/㎖(약 2 μM)까지 희석한다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응된 기를 차단한다. 동력학적 측정을 위해, 0.05% 폴리소르베이트 20(트윈-20(상표)) 계면활성제를 갖는 PBS(PBST) 중의 Fab의 2배 연속 희석물(0.78 내지 500 nM)을 25℃에서 약 25 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 결합 센서그램 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1-대-1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 결합 속도(ka) 및 해리 속도(kd)를 계산한다. 평형 해리 상수(KD)를 비 kd/ka로서 계산한다(예를 들어 문헌[Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881] 참조). 상기 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정된 결합 속도가 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 분광계, 예컨대, 정지-유동 장착된 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반된 큐빗을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO(상표) 분광광도계(써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정된 증가하는 농도의 항원의 존재하에 25℃에서 PBS(pH 7.2) 중의 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 형광 방사 강도의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기법을 사용함으로써 결합 속도를 측정할 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 비제한적으로 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, scFv 단편, 및 하기에 기재된 다른 단편을 포함한다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어 문헌[Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; US 5,571,894 및 US 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의를 위해, US 5,869,046을 참조한다.
다이아바디는 2가이거나 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 0 404 097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]; 및 [Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448]을 참조한다. 또한, 트라이아바디 및 테트라바디가 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인 중 전부 또는 일부 또는 항체의 경쇄 가변 도메인 중 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc., 미국 매사추세츠주 월탐 소재); 예를 들어 US 6,248,516 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이 비제한적으로 온전한 항체의 단백질 가수분해 소화 및 재조합 숙주 세포(예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하는 다양한 기술에 의해 제조된다.
3. 키메라 항체 및 인간화된 항체
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 US 4,816,567 및 문헌[Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855)]에 기재되어 있다. 하나의 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가적 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모 항체의 클래스 또는 서브클래스로부터 변형되어 있는 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들어 CDR(또는 이의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 이의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 또한, 인간화된 항체는 임의적으로 인간 불변 영역의 적어도 부분을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화된 항체의 일부 FR 잔기는 예를 들어 항체 특이성 또는 친화성을 회복시키거나 개선하기 위해 비-인간 항체(예를 들어 HVR 잔기의 기원이 되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화된 항체 및 이의 제조 방법은 예를 들어 문헌[Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633]에서 검토되어 있고, 예를 들어 하기 문헌에 추가로 기재되어 있다: 문헌[Riechmann, I., et al., Nature 332 (1988) 323-329]; 문헌[Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]; US 5,821,337; US 7,527,791; US 6,982,321; US 7,087,409; 문헌[Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34](특이성 결정 영역(SDR) 이식이 기재됨); 문헌[Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498]("재표면화"가 기재됨); 문헌[Dall'Acqua, W.F., et al., Methods 36 (2005) 43-60]("FR 셔플링"이 기재됨); 문헌[Osbourn, J., et al., Methods 36 (2005) 61-68]; 및 문헌[Klimka, A., et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260](FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 방법이 기재됨).
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 골격 영역은 비제한적으로 "베스트-피트(best-fit)" 방법을 사용함으로써 선택된 골격 영역(예를 들어 문헌[Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 골격 영역(예를 들어 문헌[Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289] 및 [Presta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632] 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 골격 영역 또는 인간 생식세포주 골격 영역(예를 들어 문헌[Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633] 참조); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 골격 영역(예를 들어 문헌[Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684] 및 문헌[Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)] 참조)을 포함한다.
4. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 IL-1베타에 대한 결합 특이성이고, 나머지 하나는 임의의 다른 항원에 대한 결합 특이성이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 IL-1베타의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 또한, 이중특이적 항체는 세포독성제를, IL-1베타를 발현하는 세포에 위치시키는데에 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하는 기법은 비제한적으로 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현(문헌[Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540], WO 93/08829, 및 문헌[Traunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659] 참조), 및 "놉-인-홀" 조작(예를 들어 US 5,731,168 참조)을 포함한다. 다중특이적 항체는 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 조종 효과의 조작(WO 2009/089004); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교연결(예를 들어 US 4,676,980 및 문헌[Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83] 참조); 이중특이적 항체를 제조하기 위한 류신 지퍼의 사용(예를 들어 문헌[Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553] 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "다이아바디" 기술의 사용(예를 들어 문헌[Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448] 참조); 단일 쇄 Fv(scFv) 이량체의 사용(예를 들어 문헌[Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374] 참조); 및 예를 들어 문헌[Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수도 있다.
3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체("옥토퍼스(Octopus) 항체"를 포함함)도 본원에 포함된다(예를 들어 US 2006/0025576 참조).
또한, 본원의 항체 또는 단편은 IL-1베타 및 또 다른 상이한 항원에 결합하는 결합 부위를 갖는 항원을 포함하는 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF"도 포함한다(예를 들어 US 2008/0069820 참조).
또한, 본원의 항체 또는 단편은 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2010/145793에 기재된 다중특이적 항체를 포함한다.
5. 항체 변이체
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 변형을, 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내로 도입하거나 펩티드를 합성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기의 결실, 이러한 서열 내로의 잔기의 삽입 및/또는 이러한 서열 내의 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들어 항원 결합을 보유하는 한, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합으로 최종 구축물에 도달할 수 있다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이 유발을 위한 관심있는 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이라는 표제하에 하기 표에 제시되어 있다. 보다 더 실질적인 변형은 "예시적인 치환"이라는 표제하에 하기 표 1에 제공되어 있고 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 하기에 추가로 기재되어 있다. 아미노산 치환은 관심있는 항체 내로 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
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아미노산은 공통 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스의 구성원으로 교체하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 하나의 유형은 모 항체(예를 들어 인간화된 항체 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로, 추가적 연구를 위해 선택된 생성된 변이체는 모 항체에 비해 일부 생물학적 성질의 변형(예를 들어 개선)(예를 들어 증가된 친화성, 감소된 면역원성)을 가질 것이고/이거나, 모 항체의 실질적으로 보유된 일부 생물학적 성질을 가질 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 파지 디스플레이-기초 친화성 성숙 기법, 예컨대, 본원에 기재된 기법을 사용함으로써 편리하게 생성될 수 있는 친화성 성숙된 항체이다. 요약하건대, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체가 파지 상에서 디스플레이되고 특정 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화성)에 대해 스크리닝된다.
변경(예를 들어 치환)은 예를 들어 항체 친화성을 개선하기 위해 HVR에서 만들어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스폿(hotspot)", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이되는 코돈에 의해 암호화된 잔기(예를 들어 문헌[Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196] 참조), 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 만들어질 수 있고, 이때 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 시험된다. 이차 라이브러리를 구축하고 이 라이브러리로부터 재선택함으로써 달성되는 친화성 성숙은 예를 들어 문헌[Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37]에 기재되어 있다. 친화성 성숙의 일부 실시양태에서, 다양성은 다양한 방법(예를 들어 오류 유발 PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드-지정된 돌연변이 유발) 중 임의의 방법에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 도입된다. 그 다음, 이차 라이브러리가 생성된다. 그 다음, 상기 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-지정된 방법을 포함하고, 이때 여러 HVR 잔기(예를 들어 한번에 4개 내지 6개의 잔기)가 무작위화된다. 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 또는 모델링을 사용하여 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기를 구체적으로 확인할 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 자주 표적화된다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 HVR 내에서 치환, 삽입 또는 결실이 일어날 수 있되, 이러한 변경은 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않아야 한다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어 본원에서 제공된 보존적 치환)이 HVR에서 만들어질 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어 HVR 내의 항원 접촉 잔기의 외부에 존재할 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이 유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 확인하는 유용한 방법은 문헌[Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085]에 기재된 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로서 지칭된다. 이 방법에서, 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지를 확인하기 위해 잔기 또는 표적 잔기의 군(예를 들어 대전된 잔기, 예컨대, arg, asp, his, lys 및 glu)을 확인하고 중성 또는 음으로 대전된 아미노산(예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 교체한다. 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에서 추가적 치환을 도입할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 사용할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기를 치환 후보로서 표적화할 수 있거나 제거할 수 있다. 변이체가 원하는 성질을 함유하는지를 확인하기 위해 변이체를 스크리닝할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기의 길이 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 길이를 갖는 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 융합뿐만 아니라, 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입도 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 N-말단 또는 C-말단에서 효소(예를 들어 ADEPT) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드와 융합된 융합체를 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 항체에의 글리코실화 부위의 추가 또는 항체로부터의 글리코실화 부위의 결실을 편리하게 달성할 수 있다.
항체가 Fc-영역을 포함하는 경우, 그에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 N-연결에 의해 일반적으로 Fc-영역의 CH2 도메인의 Asn297에 부착되어 있는 분지된 바이안테나리(biantennary) 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들어 문헌[Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32] 참조). 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐만 아니라 바이안테나리 올리고사카라이드 구조물의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스도 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 개선된 성질을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본원의 항체에서 올리고사카라이드를 변형시킬 수 있다.
하나의 실시양태에서, Fc-영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스를 결여하는 탄수화물 구조물을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1 내지 80%, 1 내지 65%, 5 내지 65%, 또는 20 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정에 의해 측정될 때 Asn297에 부착된 모든 당구조물(예를 들어 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조물)의 합계에 비해 Asn297에서 당쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 측정된다. Asn297은 Fc-영역 내의 위치 약 297(Fc-영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치하는 아스파라긴 잔기를 지칭하나; Asn297은 항체에서의 미미한 서열 변이로 인해 위치 297의 약 ± 3개 아미노산 업스트림 또는 다운스트림, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수도 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, US 2003/0157108 및 US 2004/0093621를 참조한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스 결핍" 항체와 관련된 공개문헌들의 예에는 하기 문헌이 포함된다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; 문헌[Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249]; 및 문헌[Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622]. 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화 결핍 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545]; US 2003/0157108; 및 WO 2004/056312, 특히 실시예 11), 및 넉아웃(knockout) 세포주, 예컨대, α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8 넉아웃 CHO 세포(예를 들어 문헌[Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622]; 문헌[Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688]; 및 WO 2003/085107 참조)가 포함된다.
예를 들어, 항체의 Fc-영역에 부착된 바이안테나리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분되어 있는 이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체도 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는 예를 들어 WO 2003/011878; US 6,602,684; 및 US 2005/0123546에 기재되어 있다. Fc-영역에 부착된 올리고사카라이드에서 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체도 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 기재되어 있다.
c) Fc-영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본원에서 제공된 항체의 Fc-영역 내로 도입하여 Fc-영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc-영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc-영역 서열(예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc-영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 일부 이펙터 기능을 보유하되 모든 이펙터 기능을 보유하지는 않아 생체내 항체의 반감기가 중요하지만 일부 이펙터 기능(예컨대, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 적용분야를 위한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, 항체가 FcγR 결합을 결여하되(따라서 ADCC 활성을 결여할 가능성이 있음) FcRn 결합 능력을 보유한다는 것을 보장하기 위해 Fc 수용체(FcR) 결합 분석을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcRIII만을 발현하는 반면에, 단핵세포는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포 상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch, J.V., and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492]의 제464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적인 예는 US 5,500,362(예를 들어 문헌[Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063]; 및 [Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502] 참조); 및 US 5,821,337(문헌[Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 분석 방법을 사용할 수 있다(예를 들어 유동세포 측정을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc., 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)) 참조). 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 관심있는 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 동물 모델, 예컨대, 문헌[Clynes, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656]에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다. C1q 결합 분석을 수행하여 항체가 C1q에 결합할 수 없으므로 CDC 활성을 결여한다는 것을 확인할 수도 있다(예를 들어 WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에 기재된 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조). 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171]; 문헌[Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052]; 및 문헌[Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743] 참조). 당분야에서 공지되어 있는 방법을 사용하여 FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정도 수행할 수 있다(예를 들어 문헌[Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc-영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 Fc-영역 잔기의 치환을 갖는 항체를 포함한다(US 6,737,056 참조). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환되어 있는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상의 아미노산 위치에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(US 7,332,581).
FcR과의 개선되거나 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어 있다(예를 들어 US 6,737,056; WO 2004/056312; 및 문헌[Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604] 참조).
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc-영역의 위치 298, 333 및/또는 334(잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc-영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 US 6,194,551, WO 99/51642 및 문헌[Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184]에 기재된 바와 같이 C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 변경시키도록(즉, 개선하거나 감소시키도록) Fc-영역을 변경시킨다.
증가된 반감기를 갖고 태아로의 모체 IgG의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)(문헌[Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, and Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434])와의 개선된 결합을 갖는 항체는 US 2005/0014934에 기재되어 있다. 이 항체는 Fc-영역과 FcRn의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 그 내부에 갖는 Fc-영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc-영역 잔기 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 및 434 중 하나 이상의 Fc-영역 잔기에서 치환, 예를 들어 Fc-영역 잔기 434의 치환을 갖는 Fc-영역 변이체를 포함한다(US 7,371,826).
또한, Fc-영역 변이체의 다른 예에 대해서는 문헌[Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740]; US 5,648,260; US 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환되어 있는 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "thioMAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에 존재한다. 이러한 잔기가 시스테인으로 치환됨으로써 반응성 티올 기는 항체의 접근가능한 부위에 위치하고, 본원에 추가로 기재된 바와 같이 항체를 다른 모이어티, 예컨대, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기 중 임의의 하나 이상의 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카바트 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc-영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는 예를 들어 US 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 당분야에서 공지되어 있고 용이하게 입수할 수 있는 추가적 비-단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서의 이의 안정성으로 인해 제조에서 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 갖는 중합체일 수 있고, 분지되지 않거나 분지될 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 달라질 수 있고, 1개 초과의 중합체가 부착되는 경우 이들은 동일한 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 비제한적으로 개선될 항체의 구체적인 성질 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건하에 치료에서 사용될 것인지 여부 등을 포함하는 고려사항에 근거하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비-단백질성 모이어티와 항체의 접합체가 제공된다. 하나의 실시양태에서, 비-단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605]). 방사선은 임의의 파장의 방사선일 수 있고, 비제한적으로 통상의 세포에게 유해하지 않으나 항체-비-단백질성 모이어티에 인접한 세포가 사멸되는 온도까지 비-단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함한다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는 예를 들어 US 4,816,567에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물의 사용을 통해 제조될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본원에 기재된 항-IL-1베타 항체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 암호화할 수 있다. 추가적 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어 발현 벡터)가 제공된다. 추가적 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 하나의 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들어 상기 (1) 또는 (2)의 벡터로 형질전환되어 있다). 하나의 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프 세포(예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 하나의 실시양태에서, 항-IL-1베타 항체를 제조하는 방법으로서, 상기 제공된 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및 임의적으로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
항-IL-1베타 항체의 재조합 제조를 위해, 예를 들어 전술된 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고 추가적 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어 항체의 또는 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 이러한 핵산을 용이하게 단리할 수 있고 서열 결정할 수 있다.
항체 암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우 항체를 세균에서 제조할 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는 예를 들어 US 5,648,237, US 5,789,199 및 US 5,840,523을 참조한다(또한, 이 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌[Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254] 참조). 발현 후, 항체를 가용성 분획 중의 세균 세포 페이스트로부터 단리할 수 있고 추가로 정제할 수 있다.
원핵세포 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 있어 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생성하는 진균 및 효모 균주를 포함하는 진핵 미생물, 예컨대, 사상 진균 또는 효모가 항체 암호화 벡터를 위한 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 문헌[Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414]; 및 [Li, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215]을 참조한다.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터도 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 세포 및 곤충 세포가 포함된다. 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 확인되어 있다.
식물 세포 배양물도 숙주로서 사용될 수 있다(예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US 6,417,429(형질전환 식물에서 항체를 제조하는 PLANTIBODIES(상표) 기술이 기재되어 있음)를 참조).
척추동물 세포도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 생장하도록 개조된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들어 문헌[Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74]에 기재된 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들어 문헌[Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252]에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유선 종양(MMT 060562); 예를 들어 문헌[Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68]에 기재된 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포(문헌[Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220])를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대, Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 제조에 적합한 일부 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는 예를 들어 문헌[Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268]을 참조한다.
C. 분석
본원에 제공된 항-IL-1베타 항체는 당분야에 공지된 다양한 분석에 의해 이의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대하여 확인되거나 스크리닝되거나 특징 규명될 수 있다. 예시적 분석은 실시예에 보고되어 있다.
D. 면역접합체
또한, 본 발명은 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학치료제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위원소와 접합된 본원에 보고된 항-IL-1베타 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
하나의 실시양태에서, 면역접합체는 비제한적으로 하기를 포함하는 하나 이상의 약물과 접합된 항체인 항체-약물 접합체(ADC)이다: 마이탄시노이드(US 5,208,020, US 5,416,064 및 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸 아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(US 5,635,483, US 5,780,588 및 US 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 이의 유도체(US 5,712,374, US 5,714,586, US 5,739,116, US 5,767,285, US 5,770,701, US 5,770,710, US 5,773,001 및 US 5,877,296; 문헌[Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342]; 및 [Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928)] 참조); 안트라사이클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌[Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523]; [Jeffrey, S.C., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362]; [Torgov, M.Y., et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721]; [Nagy, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834]; [Dubowchik, G.M., et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532]; [King, H.D., et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343]; 및 US 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁센, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트티코테센; 및 CC1065.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는, 비제한적으로 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 기인), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우라이츠 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디아틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 큐르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하는 효소 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에 기재된 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사접합체를 형성하는 방사성 원소에 접합된 본원에 기재된 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사접합체의 제조에 이용가능하다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사접합체가 검출을 위해 사용되는 경우, 이는 신티그래프(scintigraphic) 연구용 방사성 원소, 예를 들어 TC99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명(NMR) 이미지(자기 공명 이미지(MRI)로도 공지됨)용 스핀 표지, 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리미딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복시레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예컨대 다이메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스터(예컨대 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대 비스 (p-다이조벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이이소시아네이트(예컨대 톨루엔 2,6-다이이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌[Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 대한 방사성 뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적 킬레이트화제이다. WO 94/11026을 참조한다. 링커는 세포독성 약물을 세포 내에 방출할 수 있는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광-불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌[Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131]; US 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC가 명확이 고려되지만, 가교-링커 시약(비제한적으로 (예를 들어 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc., 미국 일리노이주 락포드 소재)로부터) 상업적으로 입수가능한 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 설포-SMPB 및 SVSB(석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 포함함)을 사용하여 제조된 접합체에 제한되지 않는다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항-IL-1베타 항체는 생물학적 샘플 내 IL-1베타의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출함"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다.
하나의 실시양태에서, 진단 또는 검출의 방법에서 사용하기 위한 항-IL-1베타 항체가 제공된다. 추가적 양상에서, 생물학적 샘플 내 IL-1베타의 존재의 검출 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플을 IL-1베타에 대한 항-IL-1베타 항체의 결합을 허용하는 조건하에 본원에 기재된-IL-1베타 항체에 접촉시킴, 및 항-복합체가 IL-1베타 항체와 IL-1베타 사이에 형성되는지 여부를 검출함을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 항-IL-1베타 항체는 IL-1베타가 환자의 선택을 위한 바이오마커인 경우 항-IL-1베타 항체를 사용하는 치료법에 자격이 있는 개체를 선택하는데 사용된다.
특정 실시양태에서, 표지된 항-IL-1베타 항체가 제공된다. 표지는 비제한적으로 직접 검출되는 표지 또는 모이어티(예컨대 형광성, 색소생산성, 전자-밀집성, 화학발광성 및 방사성 표지), 뿐만 아니라 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함한다. 예시적 표지는 비제한적으로 방사성 동위원소, 즉, 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 엄벨리페론, 루시퍼라제, 예를 들어 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제(US 4,737,456), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토즈 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제, 과산화수소를 사용하여 염료 전구체를 산화시키는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 잔틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함한다.
F. 약학 제형
본원에 기재된 항-IL-1베타 항체의 약학 제형은 원하는 순도를 갖는 이러한 항체를 임의적으로 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)]). 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 독성을 나타내지 않고, 비제한적으로 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실 다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들어 Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 간질 약물 분산제, 예컨대, 가용성 중성-활성 하이알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예컨대, rhuPH20(HYLENEX(등록상표, 박스터 인터내셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rhuPH20을 포함하는 일부 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968에 기재되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가적 글리코스아미노글리카나제, 예컨대, 콘드로이티나제와 병용된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형은 US 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 US 6,171,586 및 WO 2006/044908에 기재된 수성 항체 제형을 포함하고, 이때 후자 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원의 제형은 치료되는 구체적인 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 활성 성분도 함유할 수 있다. 예를 들어, 항-ANG2 항체 또는 항-VEGF 항체를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 적절하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유화액, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로유화액 중의 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)]에 개시되어 있다.
지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 상기 매트릭스는 성형된 제품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제형은 일반적으로 멸균 상태이다. 멸균성은 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본원에서 제공된 임의의 항-IL-1베타 항체가 치료 방법에서 사용될 수 있다.
하나의 양상에서, 약제로서 사용되는 항-IL-1베타 항체가 제공된다. 추가적 양상에서, 눈 혈관 질환, 바람직하게는 황반 변성의 치료에 사용되는 항-IL-1베타 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에서 사용되는 항-IL-1베타 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 유효량의 항-IL-1베타 항체를, 눈 혈관 질환, 바람직하게는 황반 변성을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에서 사용되는 항-IL-1베타 항체가 제공된다. 이러한 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들어 하기에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가적 치료제를 상기 개체에게 유효량으로 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가적 실시양태에서, 본 발명은 혈관신생을 억제하는데 사용되는 항-IL-1베타 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 항-IL-1베타 항체를 개체에게 투여하여 혈관신생을 억제하는 단계를 포함하는, 개체에서 혈관신생을 억제하는 방법에서 사용되는 항-IL-1베타 항체를 제공한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가적 양상에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에 있어서 항-IL-1베타 항체의 용도를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 약제는 눈 혈관 질환, 바람직하게는 황반 변성의 치료를 위한 약제이다. 추가적 실시양태에서, 약제는, 유효량의 약제를 눈 혈관 질환, 바람직하게는 황반 변성을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 눈 혈관 질환, 바람직하게는 황반 변성의 치료 방법에서 사용되는 약제이다. 이러한 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들어 하기에 기재되는 바와 같은 하나 이상의 추가적 치료제를 상기 개체에게 유효량으로 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가적 실시양태에서, 약제는 혈관신생의 억제를 위한 약제이다. 추가적 실시양태에서, 약제는 유효량의 약제를 개체에게 투여하여 혈관신생을 억제하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 혈관신생을 억제하는 방법에서 사용되는 약제이다. 상기 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가적 양상에서, 본 발명은 눈 혈관 질환, 바람직하게는 황반 변성을 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 항-IL-1베타 항체를, 이러한 눈 혈관 질환, 바람직하게는 황반 변성을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 후술된 바와 같이 유효량의 하나 이상의 추가적 치료제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가적 양상에서, 본 발명은 개체의 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 항-IL-1베타 항체를 개체에게 투여하여 혈관신생을 억제하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
추가적 양상에서, 본 발명은 예를 들어 상기 치료 방법 중 임의의 치료 방법에서 사용되는, 본원에서 제공된 임의의 항-IL-1베타 항체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 약학 제형은 본원에서 제공된 임의의 항-IL-1베타 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 제형은 본원에서 제공된 임의의 항-IL-1베타 항체, 및 예를 들어 하기에 기재되는 바와 같은 하나 이상의 추가적 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체는 치료에서 단독으로 사용될 수 있거나 다른 약제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 하나 이상의 추가적 치료제와 공동-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가적 치료제는 항-VEGF 항체 또는 항-ANG2 항체이다.
상기에 언급된 이러한 병용 요법은 병용 투여(2개 이상의 치료제가 동일하거나 별개의 제형에 포함되는 경우), 별개의 투여(이 경우, 본 발명의 항체의 투여가 추가적 치료제의 투여 전, 그와 동시에 및/또는 그 후에 발생할 수 있음)를 포괄한다. 하나의 실시양태에서, 항-IL-1베타 항체의 투여 및 추가적 치료제의 투여는 약 1개월 이내에, 또는 약 1, 2 또는 3주 이내에, 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 이내에 발생한다.
본 발명의 항체(및 임의의 추가적 치료제)는 비경구 투여, 폐내 투여 및 비내 투여, 및 국소 치료가 요구되는 경우 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 관주는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 부분적으로 투여가 단기 투여인지 아니면 장기 투여인지에 따라 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예컨대, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 달성될 수 있다. 비제한적으로 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다회 투여, 볼루스 투여 및 펄스 관주를 포함하는 다양한 투약 스케쥴이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체는 우수한 의학적 관행에 일치하는 방식으로 제형화되고 조제되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려될 인자는 치료될 구체적인 장애, 치료될 구체적인 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴 및 의료인에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 상기 항체는 해당 장애의 예방 또는 치료를 위해 현재 사용되는 하나 이상의 약제와 함께 제형화될 필요는 없지만 임의적으로 이러한 약제와 함께 제형화된다. 이러한 다른 약제의 유효량은 제형에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 다른 인자에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 용량 및 투여 경로와 동일한 용량 및 투여 경로로 사용되거나, 본원에 기재된 용량의 약 1 내지 99%의 용량으로 사용되거나, 적절한 용량 및 경로인 것으로 실험적으로/임상적으로 확인된 임의의 용량 및 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, (단독으로 사용되거나 하나 이상의 다른 추가적 치료제와 함께 사용될 때) 본 발명의 항체의 적절한 용량은 치료되는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되는지, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의해 좌우될 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어 0.5 내지 10 mg/kg)의 항체가 예를 들어 1회 이상의 분리 투여에 의해 또는 연속 관주에 의해 환자에게 투여될 초기 후보 용량일 수 있다. 한 전형적인 1일 용량은 상기 언급된 인자들에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 것이다. 수일 또는 이보다 오랜 시간에 걸친 반복된 투여의 경우, 상태에 따라 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 항체의 하나의 예시적인 용량은 약 0.05 내지 약 10 mg/kg의 범위 내에 있을 것이다. 따라서, 약 0.5, 2.0, 4.0 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합)의 용량이 환자에게 1회 이상 투여될 수 있다. 이러한 용량은 (예를 들어 환자가 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체를 제공받도록) 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다. 보다 더 높은 초기 적재 용량에 이어서 보다 더 낮은 용량이 1회 이상 투여될 수 있다. 그러나, 다른 용량 양생법이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법이, 항-IL-1베타 항체를 대신하거나 이에 부가하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행 될 수 있음이 이해된다.
III. 제품
본 발명의 또 다른 양상에서, 전술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기; 및 용기 상에 존재하거나 용기와 연결되어 있는 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 그 자체로 존재하거나 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합되어 있는 조성물을 보유하고, 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들어 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 하나 이상의 활성 성분은 본 발명의 항체이다. 상기 표지 또는 포장 삽입물은 상기 조성물이 선택된 질환의 치료에 사용된다는 것을 표시한다. 나아가, 제품은 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 그 내부에 함유하는 제1 용기; 및 (b) 추가적 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 그 내부에 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 실시양태에서 제품은 상기 조성물이 특정 질환의 치료에 사용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제품은 약학적으로 허용되는허용되는컨대, 정균 주사용수(BWFI), 포스페이트 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제품이, 항-IL-1베타 항체 대신에 또는 이에 부가하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있음이 이해된다.
IV. 구체적 실시양태
1. 인간 IL-1베타에 특이적으로 결합하는, 서열번호 1의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 2의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 뮤린 항체의 인간화된 변이체인 항체.
2. (a) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는, 인간 IL-1베타에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체.
3. (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는, 인간 IL-1베타에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체.
4. (a) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는, 인간 IL-1베타에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체.
5. (a) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 실시양태 1 내지 4 중 임의의 하나에 따른 인간화된 항체.
6. 위치 48의 중쇄 가변 도메인에 이소류신 아미노산 잔기, 위치 67의 중쇄 가변 도메인에 알라닌 아미노산 잔기, 위치 69의 중쇄 가변 도메인에 페닐알라닌 아미노산 잔기 및 위치 93의 중쇄 가변 도메인에 발린 아미노산 잔기, 및 위치 36의 경쇄 가변 도메인에 세린 아미노산 잔기를 포함하는(카바트에 따른 넘버링), 실시양태 1 내지 5 중 임의의 하나에 따른 인간화된 항체.
7. (a) 서열번호 4의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열, (b) 서열번호 6의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열, 또는 (c) (a)와 같은 VH 서열 및 (b)와 같은 VL 서열을 포함하는, 실시양태 1 내지 6 중 임의의 하나에 따른 인간화된 항체.
8. 서열번호 4의 VH 서열 및 서열번호 6의 VL 서열을 포함하는, 실시양태 1 내지 7 중 임의의 하나에 따른 인간화된 항체.
9. 인간화된 항체인 실시양태 1 내지 8 중 임의의 하나에 따른 항체.
10. (a) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는, 인간 IL-1베타에 특이적으로 결합하는 항체.
11. (d) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함하는, 실시양태 10에 따른 항체.
12. 인간 서브클래스 IgG1의 것 또는 인간 서브클래스 IgG4의 것인, 실시양태 1 내지 11중 임의의 하나에 따른 항체.
13. 카파 경쇄를 갖는 인간 서브클래스 IgG1의 것인, 실시양태 1 내지 12 중 임의의 하나에 따른 항체.
14. 단일클론 항체인, 실시양태 1 내지 13 중 임의의 하나에 따른 항체.
15. 서열번호 4의 VH 서열 및 서열번호 6의 VL 서열을 포함하는 항체.
16. 이중특이적 항체인 실시양태 1 내지 15 중 임의의 하나에 따른 항체.
17. 인간 IL-1베타에 특이적으로 결합하나 인간 IL-1알파에는 결합하지 않는, 실시양태 1 내지 16 중 임의의 하나에 따른 항체.
18. 인간 IL-1 수용체에 대한 인간 IL-1베타의 결합을 억제함으로써 인간 IL-1베타의 생물학적 활성을 차단하는, 실시양태 1 내지 17 중 임의의 하나에 따른 항체.
19. IL-1베타의 수용체 결합 부위 상에 또는 가까이 있는 2개의 결정 인자에 특이적으로 결합하는 실시양태 1 내지 18 중 임의의 하나에 따른 항체.
20. a) 제1 항원에특이적으로 결합하는 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄(이때, 제2 경쇄 및 제2 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체됨)
를 포함하는 2가의 이중특이적 항체로서, 이때, 제1 항원 또는 제2 항원이 인간 IL-1베타인, 실시양태 1 내지 19 중 임의의 하나에 따른 항체.
21. i) a)의 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)(하나의 바람직한 실시양태에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R))으로 치환되고, a)의 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)으로 치환되거나,
ii) b)의 제2 경쇄의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)(하나의 바람직한 실시양태에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R))으로 치환되고, b)의 제2 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)으로 치환되는, 실시양태 20에 따른 항체.
22. 제2 중쇄의 불변 도메인 CL에서 위치 124 및 123의 아미노산이 K로 치환되는(카바트 EU 지수에 따른 넘버링), 실시양태 20 또는 21에 따른 항체.
23. 제2 경쇄의 불변 도메인 CH1에서 위치 147 및 213의 아미노산이 E로 치환되는(카바트 EU 지수에 따른 넘버링), 실시양태 20 내지 22 중 임의의 하나에 따른 항체.
24. 제1 경쇄의 불변 도메인 CL에서 위치 124 및 123의 아미노산이 K로 치환되고, 제1 중쇄의 불변 도메인 CH1에서 위치 147 및 213의 아미노산이 E로 치환되는(카바트 EU 지수에 따른 넘버링), 실시양태 20 내지 23 중 임의의 하나에 따른 항체.
25. 제2 중쇄의 불변 도메인 CL에서 위치 124 및 123의 아미노산이 K로 치환되고, 제2 경쇄의 불변 도메인 CH1에서 위치 147 및 213의 아미노산이 E로 치환되고, 제1 경쇄의 가변 도메인 VL에서 위치 38의 아미노산이 K로 치환되고, 제1 중쇄의 가변 도메인 VH에서 위치 39의 아미노산이 E로 치환되고, 제2 중쇄의 가변 도메인 VL에서 위치 38의 아미노산이 K로 치환되고, 제2 경쇄의 가변 도메인 VH에서 위치 39의 아미노산이 E로 치환되는(카바트 EU 지수에 따른 넘버링), 실시양태 20 내지 24 중 임의의 하나에 따른 항체.
26. a) 제1 항원에특이적으로 결합하는 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄(이때, 제2 경쇄 및 제2 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되고, 제2 경쇄 및 제2 중쇄의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체됨)
를 포함하는 2가의 이중특이적 항체로서, 이때, 제1 항원 또는 제2 항원이 인간 IL-1베타인, 실시양태 1 내지 19 중 임의의 하나에 따른 항체.
27. a) 제1 항원에특이적으로 결합하는 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제2 경쇄 및 제2 중쇄(이때, 제2 경쇄 및 제2 중쇄의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체됨)
를 포함하는 2가의 이중특이적 항체로서, 이때, 제1 항원 또는 제2 항원이 인간 IL-1베타인, 실시양태 1 내지 19 중 임의의 하나에 따른 항체.
28. a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체, 및
b) 1 내지 4개의 항원(즉, 제2 및/또는 제3 및/또는 제4 및/또는 제5 항원, 바람직하게는 하나의 추가적 항원, 즉, 제2 항원)에 특이적으로 결합하는 1, 2, 3 또는 4개의 단일 쇄 Fab 단편
을 포함하는 다중특이적 항체로서, 이때 b)의 상기 단일 쇄 Fab 단편이 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C- 또는 N-말단에서 펩티드성 링커를 통해 a)의 상기 전장 항체에 융합되고, 제1 항원 또는 추가적 항원 중 하나가 인간 IL-1베타인, 실시양태 1 내지 19 중 임의의 하나에 따른 항체.
29. a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체,
b) ba) 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 또는
bb) 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 불변 도메인 1(CH1)
로 이루어진 제1 폴리펩티드(이때, 상기 제1 폴리펩티드는 이의 VH 도메인의 N-말단을 사용하여 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 하나의 중쇄의 C-말단에 융합됨), 및
c) ca) 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 또는
cb) 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)
으로 이루어진 제2 폴리펩티드(이때, 상기 제2 폴리펩티드는 VL 도메인의 N-말단을 사용하여 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체의 2개의 중쇄 중 나머지 하나의 중쇄의 C-말단에 융합됨)
를 포함하는 3가의 이중특이적 항체로서, 이때, 제1 폴리펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 제2 폴리펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)이 함께 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 형성하고, 제1 항원 또는 제2 항원이 인간 IL-1베타인, 실시양태 1 내지 19 중 임의의 하나에 따른 항체.
30. b)의 폴리펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 c)의 폴리펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)이 하기 위치 사이에 다이설파이드 결합의 도입에 의한 쇄간 다이설파이드 가교를 통해 연결되고 안정화되는, 실시양태 29에 따른 항체:
i) 중쇄 가변 도메인 위치 44 내지 경쇄 가변 도메인 위치 100, 또는
ii) 중쇄 가변 도메인 위치 105 내지 경쇄 가변 도메인 위치 43, 또는
iii) 중쇄 가변 도메인 위치 101 내지 경쇄 가변 도메인 위치 100(항상 카바트 EU 지수에 따른 넘버링).
31. a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 제1 경쇄 및 제1 중쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 제2 (변형된) 경쇄 및 제2 (변형된) 중쇄(이때, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체됨), 및
c) 펩티드성 링커를 통해 a) 및/또는 b)의 경쇄 또는 중쇄의 C- 또는 N-말단에 융합되는, 1 또는 2개의 추가적 항원(즉, 제3 및/또는 제4 항원)에 특이적으로 결합하는 1 내지 4개의 항원 결합 펩티드
를 포함하는 삼중특이적 또는 사중특이적 항체로서, 이때, 제1 항원 또는 제2 항원, 또는 추가적 항원 중 하나가 인간 IL-1베타인, 실시양태 1 내지 19 중 임의의 하나에 따른 항체.
32. a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체(2개의 Fab 단편을 포함함)의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 2개의 추가적 Fab 단편(이때, 상기 추가적 Fab 단편은 둘 다 펩티드성 링커를 통해 a)의 중쇄의 C- 또는 N-말단에 융합됨)
을 포함하는 3가의 이중특이적 항체로서, Fab 단편에서 하기 변형이 수행되고, 제1 항원 또는 제2 항원이 인간 IL-1베타인, 실시양태 1 내지 19 중 임의의 하나에 따른 항체:
i) a)의 둘 다의 Fab 단편 또는 b)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체되거나,
ii) a)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되고 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체되고,
b)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되거나 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체되거나,
iii) a)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되거나 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체되고,
b)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되거나 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체되거나,
iv) a)의 둘 다의 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체되고 b)의 둘 다의 Fab 단편에서 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체되거나,
v) a)의 둘 다의 Fab 단편에서, 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 교체되고 b)의 둘 다의 Fab 단편에서 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 교체된다.
33. a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 제1 VH-CH1 도메인 쌍을 포함하는 제1 항체의 (변형된) 중쇄(이때, 상기 제1 항체의 제2 VH-CH1 도메인 쌍의 N-말단은 펩티드성 링커를 통해 상기 중쇄의 C-말단에 융합됨),
b) a)의 상기 제1 항체의 2개의 경쇄,
c) 제2 항원에 특이적으로 결합하고 제1 VH-CL 도메인 쌍을 포함하는 제2 항체의 (변형된) 중쇄(이때, 상기 제2 항체의 제2 VH-CL 도메인 쌍의 N-말단은 펩티드성 링커를 통해 상기 중쇄의 C-말단에 융합됨), 및
d) 각각 CL-CH1 도메인 쌍을 포함하는 c)의 상기 제2 항체의 2개의 (변형된) 경쇄
를 포함하는 4가의 이중특이적 항체로서, 이때, 제1 항원 또는 제2 항원이 인간 IL-1베타인, 실시양태 1 내지 19 중 임의의 하나에 따른 항체.
34. a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 전장 항체의 중쇄 및 경쇄, 및
b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 전장 항체의 중쇄 및 경쇄(이때, 중쇄의 N-말단은 펩티드성 링커를 통해 경쇄의 C-말단에 연결됨)
를 포함하는 이중특이적 항체로서, 이때, 제1 항원 또는 제2 항원이 인간 IL-1베타인, 실시양태 1 내지 19 중 임의의 하나에 따른 항체.
35. a) 제1 항원에 특이적으로 결합하고 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체, 및
b) VH2 도메인 및 VL2 도메인을 포함하는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 단편(이때, 둘 다의 도메인은 다이설파이드 가교를 통해 서로 연결됨)
을 포함하는 이중특이적 항체로서, 이때, VH2 도메인 또는 VL2 도메인 중 하나 만이 펩티드성 링커를 통해 제1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄에 융합되고, 제1 항원 또는 제2 항원이 인간 IL-1베타인, 실시양태 1 내지 19 중 임의의 하나에 따른 항체.
36. 제1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 항체로서,
i) 제1 Fc-영역 폴리펩티드가
- 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 인간 IgG2 Fc-영역 폴리펩티드,
- 인간 IgG3 Fc-영역 폴리펩티드,
- 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 L234A, L235A를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 S354C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 L234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 L234A, L235A, S354C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 P329G를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 L234A, L235A, P329G를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 P329G, S354C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 L234A, L235A, P329G, S354C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 S228P, L235E를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 S228P, L235E, P329G를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 S354C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 S228P, L235E, Y349C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 S228P, L235E, S354C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 P329G를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 P329G, S354C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 S228P, L235E, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 S228P, L235E, P329G, S354C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 K392D를 갖는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4,
- 돌연변이 N392D를 갖는 인간 IgG3
으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
ii) 제2 Fc-영역 폴리펩티드가
- 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 인간 IgG2 Fc-영역 폴리펩티드,
- 인간 IgG3 Fc-영역 폴리펩티드,
- 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 L234A, L235A를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 S354C, T366W를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 Y349C, T366W를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 L234A, L235A, S354C, T366W를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 L234A, L235A, Y349C, T366W를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 P329G를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 L234A, L235A, P329G를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 P329G, S354C, T366W를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 P329G, Y349C, T366W를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 L234A, L235A, P329G, S354C, T366W를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 L234A, L235A, P329G, Y349C, T366W를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 S228P, L235E를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 S228P, L235E, P329G를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 S354C, T366W를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 Y349C, T366W를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 S228P, L235E, S354C, T366W를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
돌연변이 S228P, L235E, Y349C, T366W를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 P329G를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 P329G, S354C, T366W를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 P329G, Y349C, T366W를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 S228P, L235E, P329G, S354C, T366W를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 S228P, L235E, P329G, Y349C, T366W를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드,
- 돌연변이 D399K, D356K 및/또는 E357K를 갖는 인간 IgG1, 및
- 돌연변이 D399K, E356K 및/또는 E357K를 갖는 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시양태 1 내지 35 중 임의의 하나에 따른 항체.
37. 제1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 항체로서,
i) 제1 Fc-영역 폴리펩티드가 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이고 제2 Fc-영역 폴리펩티드가 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이거나,
ii) 제1 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 L234A, L235A를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이고 제2 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 L234A, L235A를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이거나,
iii) 제1 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 L234A, L235A, P329G를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이고 제2 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 L234A, L235A, P329G를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이거나,
iv) 제1 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 L234A, L235A, S354C, T366W를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이고 제2 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 L234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이거나,
v) 제1 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 L234A, L235A, P329G, S354C, T366W를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이고 제2 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이거나,
vi) 제1 Fc-영역 폴리펩티드가 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이고 제2 Fc-영역 폴리펩티드가 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이거나,
vii) 제1 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 S228P, L235E를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이고 제2 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 S228P, L235E를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이거나,
viii) 제1 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 S228P, L235E, P329G를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이고 제2 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 S228P, L235E, P329G를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이거나,
ix) 제1 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 S228P, L235E, S354C, T366W를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이고 제2 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 S228P, L235E, Y349C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이거나,
x) 제1 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 S228P, L235E, P329G, S354C, T366W를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이고 제2 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 S228P, L235E, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드인,
실시양태 1 내지 35 중 임의의 하나에 따른 항체.
38. 제1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 항체로서,
제1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드에 하기 돌연변이의 조합을 포함하는, 실시양태 1 내지 37 중 임의의 하나에 따른 항체:
i) I253A, H310A 및 H435A, 또는
ii) H310A, H433A 및 Y436A, 또는
iii) L251D, L314D 및 L432D, 또는
iv) i) 내지 iii)의 조합.
39. 제1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 항체로서,
a) 제1 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드가 둘 다 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 서브클래스(인간 기원으로부터 유래됨)의 것이고, i) 군 I253A, H310A 및 H435A, ii) 군 H310A, H433A 및 Y436A, 또는 iii) 군 L251D, L314D 및 L432D(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링)로부터 선택된 1 또는 2개의 돌연변이를 제1 Fc-영역 폴리펩티드에 포함하고, 돌연변이 L251D, I253A, H310A, L314D, L432D, H433A, H435A 및 Y436A(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 또는 2개의 돌연변이를 제2 Fc-영역 폴리펩티드에 포함하여, 제1 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드 내 모든 돌연변이가 함께 취해질 때 돌연변이 i) I253A, H310A 및 H435A, ii) H310A, H433A 및 Y436A, 또는 iii) L251D, L314D 및 L432D가 변이체 (인간) IgG 클래스 Fc-영역에 포함됨을 야기하거나,
b) 제1 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드가 둘 다 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 서브클래스(인간 기원으로부터 유래됨)의 것이고, 둘 다 돌연변이 I253A/H310A/H435A, H310A/H433A/Y436A, L251D/L314D/L432D 또는 이들의 조합을 Fc-영역(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링)에 포함하여, 모든 돌연변이가 제1 또는 제2 Fc-영역 폴리펩티드에 존재하거나, 하나 또는 둘의 돌연변이가 제1 Fc-영역 폴리펩티드에 존재하고 하나 또는 둘의 돌연변이가 제2 Fc-영역 폴리펩티드에 존재하여, 제1 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드 내 모든 돌연변이가 함께 취해져 돌연변이 i) I253A, H310A 및 H435A, ii) H310A, H433A 및 Y436A, 또는 iii) L251D, L314D 및 L432D가 Fc-영역에 포함됨을 야기하거나,
c) 제1 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드가 둘 다 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 서브클래스(즉, 인간 기원으로부터 유래됨)의 것이고, 돌연변이 I253A/H310A/H435A, H310A/H433A/Y436A 또는 L251D/L314D/L432D를 제1 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링)에 포함하거나, 돌연변이 I253A/H310A/H435A의 조합을 제1 Fc-영역 폴리펩티드에 포함하고 돌연변이 H310A/H433A/Y436A의 조합을 제2 Fc-영역 폴리펩티드에 포함하는(카바트 EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링),
실시양태 1 내지 37 중 임의의 하나에 따른 항체.
40. 제1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 항체로서,
a) 제1 변이체 Fc-영역 폴리펩티드는 제1 모 IgG 클래스 Fc-영역 폴리펩티드로부터 유래되고, 제2 변이체 Fc-영역 폴리펩티드는 제2 모 IgG 클래스 Fc-영역 폴리펩티드로부터 유래되어, 제1 모 IgG 클래스 Fc-영역 폴리펩티드는 제2 모 IgG 클래스 Fc-영역 폴리펩티드와 동일하거나 상이하고,
b) 제1 변이체 Fc-영역 폴리펩티드는, 제1 모 IgG 클래스 Fc-영역 폴리펩티드가 제2 모 IgG 클래스 Fc-영역 폴리펩티드와 상이한 아미노산 잔기 이외의 하나 이상의 아미노산 잔기에서 제2 변이체 Fc-영역 폴리펩티드와 상이하고,
c) 제1 변이체 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 변이체 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 IgG 클래스 Fc-영역은 a)의 제1 모 IgG 클래스 Fc-영역 폴리펩티드 및 a)의 제2 모 IgG 클래스 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 IgG 클래스 Fc-영역의 것과 상이한 인간 Fc-수용체에 대한 친화성을 갖고,
제1 Fc-영역 폴리펩티드 또는 제2 Fc-영역 폴리펩티드, 또는 둘 다의 Fc-영역 폴리펩티드는 하기 돌연변이 또는 돌연변이의 조합 중 하나 이상을 서로 독립적으로 포함하는, 실시양태 1 내지 37 중 임의의 하나에 따른 항체:
- T307H, 또는
- Q311H, 또는
- E430 H, 또는
- N434H, 또는
- T307H 및 Q311H, 또는
- T307H 및 E430H, 또는
- T307H 및 N434A, 또는
- T307H 및 N434H, 또는
- T307Q 및 Q311H, 또는
- T307Q 및 E430H, 또는
- T307Q 및 N434H, 또는
- T307H 및 Q311H 및 E430H 및 N434A, 또는
- T307H 및 Q311H 및 E430H 및 N434H, 또는
- T307H 및 Q311H 및 E430H 및 N434Y, 또는
- T307Q 및 Q311H 및 E430H 및 N434A, 또는
- T307Q 및 Q311H 및 E430H 및 N434H, 또는
- T307Q 및 Q311H 및 E430H 및 N434Y, 또는
- T307Q 및 V308P 및 N434Y 및 Y436H, 또는
- T307H 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- T307Q 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- Q311H 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- E430 H 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- N434H 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- T307H 및 Q311H 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- T307H 및 E430H 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- T307H 및 N434A 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- T307H 및 N434H 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- T307Q 및 Q311H 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- T307Q 및 E430H 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- T307Q 및 N434H 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- T307H 및 Q311H 및 E430H 및 N434A 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- T307H 및 Q311H 및 E430H 및 N434H 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- T307H 및 Q311H 및 E430H 및 N434Y 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- T307Q 및 Q311H 및 E430H 및 N434A 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- T307Q 및 Q311H 및 E430H 및 N434H 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- T307Q 및 Q311H 및 E430H 및 N434Y 및 M252Y 및 S254T 및 T256E, 또는
- T307Q 및 V308P 및 N434Y 및 Y436H 및 M252Y 및 S254T 및 T256E.
41. 제1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 항체로서,
제1 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V(홀 쇄)를 포함하고, 제2 Fc-영역 폴리펩티드가 돌연변이 S354C 및 T366W(놉 쇄)를 포함하고,
제1 Fc-영역 폴리펩티드(홀 쇄)는 돌연변이
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D
를 포함하고,
제1 Fc-영역 폴리펩티드 및 제2 Fc-영역 폴리펩티드는 하나 이상의 다이설파이드 가교로 연결되고,
제1 폴리펩티드의 CH3-도메인 및 제2 폴리펩티드의 CH3-도메인 둘 다는 단백질 A에 결합하거나 둘 다 결합하지 않는(카바트 EU 지수에 따른 넘버링), 실시양태 1 내지 37 중 임의의 하나에 따른 항체.
42. 돌연변이
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D, 및
iii) T250Q, 및/또는
iv) T256E 또는 T256A
를 포함하는, 실시양태 41에 다른 항체.
43. 돌연변이
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D, 및
iii) 임의적으로 a) T250Q, 및/또는 T256E 또는 T256A, 및
iv) a) L251A 또는 L251G 또는 L251D, 및/또는 b) H310A 또는 H310G
를 포함하는, 실시양태 41 또는 42에 따른 항체.
44. 돌연변이
i) I253A 또는 I253G, 및
ii) L314A 또는 L314G 또는 L314D, 및
iii) a) T250Q, 및/또는 T256E 또는 T256A, 및
iv) a) L251A 또는 L251G 또는 L251D, 및/또는 b) H310A 또는 H310G
v) 임의적으로 a) T307A 또는 T307H 또는 T307Q 또는 T307P, 및/또는 b) Q311H, 및/또는 c) M252Y, 및/또는 d) S254T
를 포함하는, 실시양태 41 내지 43 중 임의의 하나에 따른 항체.
45. 돌연변이
i) T250Q, 및/또는
ii) M252Y, 및/또는
iii) S254T, 및/또는
iv) T256E 또는 T256A, 및/또는
v) T307A 또는 T307H 또는 T307Q 또는 T307P, 및/또는
vi) Q311H
를 포함하는, 실시양태 41 내지 44 중 임의의 하나에 따른 항체.
46. 약제로서 사용하기 위한 실시양태 1 내지 45 중 임의의 하나에 따른 항체.
47. 눈 혈관 질환의 치료에 사용하기 위한 실시양태 1 내지 45 중 임의의 하나에 따른 항체.
48. 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료를 위한 실시양태 1 내지 45 중 임의의 하나에 따른 항체의 용도.
49. 눈 질환의 치료에 사용하기 위한 실시양태 1 내지 45 중 임의의 하나에 따른 항체.
50. 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료에 사용하기 위한 실시양태 1 내지 45 중 임의의 하나에 따른 항체.
51. 실시양태 1 내지 45 중 임의의 하나에 따른 항체의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 눈 혈관 질환을 갖는 개체의 치료 방법.
52. 실시양태 1 내지 45 중 임의의 하나에 따른 항체를 포함하는 약학 제형.
53. 눈 혈관 질환의 치료에 사용하기 위한 실시양태 1 내지 45 중 임의의 하나에 따른 항체를 포함하는 약학 제형.
54. 눈 혈관 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 실시양태 1 내지 45 중 임의의 하나에 따른 항체의 용도.
55. 실시양태 1 내지 45 중 임의의 하나에 따른 항체를 눈 혈관 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써, 눈 혈관 질환을 갖는 환자의 치료 방법.
56. 항체가 유리체내 적용을 통해 투여되는, 실시양태 52 또는 53에 따른 약학 제형.
57. 투여가 유리체내 적용인, 실시양태 55 또는 56에 따른 투여.
58. 실시양태 1 내지 45 중 임의의 하나에 따른 항체를 암호화하는 핵산.
59. 실시양태 1 내지 45 중 임의의 하나에 따른 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 세포.
60. a) 임의적으로 포유동물 세포를, 실시양태 1 내지 45 중 임의의 하나에 따른 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산으로 형질감염시키는 단계,
b) 세포를 배양하여 항체를 발현시키는 단계, 및
c) 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하여 항체를 제조하는 단계
를 포함하는, 실시양태 1 내지 45 중 임의의 하나에 따른 항체의 제조 방법.
V. 실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기에 제공된 일반적 기재를 고려하여 다양한 다른 실시양태가 실행될 수 있음이 이해된다.
실시예 1: 뮤린 항-IL- 1베타 항체 H34 의 본래의 생성 및 특징 규명
재료: BALB/c 암컷 마우스를 밴팅 앤드 킹맨(Banting and Kingman, 미국 캘리포니아주 프리몬트 소재)으로부터 입수하였다. 완전 및 불완전 프로인드 보조제(CFA 및 IFA)를 디프코(Difco, 미국 미시간주 디트로이트 소재)로부터 입수하였다. HB101을 한나 바이오틱스 인코포레이티드(Hana Biologics, Inc., 미국 캘리포니아주 버클리 소재)로부터 입수하였다. 칼슘 및 마그네슘이 부재하는 둘베코(Dulbecco) 인산염 완충된 염수(PBS) 및 글루타민을 깁코 랩스(GIBCO Labs, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)로부터 입수하였다. 소 태아 혈청을 하이클론 랩스(Hyclone Labs, 미국 유타주 로건 소재)로부터 입수하고, 하이포잔틴-아미놉테린-티미딘(HAT) 및 하이포잔틴-티미딘(HT) 보충제 및 50% 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 1450을 베데스다 리처시 랩스(Bethesda Research Labs, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)로부터 입수하였다. 토끼 항-마우스 IgG+A+M 퍼옥시다제 접합체, 스트렙타비딘 퍼옥시다제, 마우스 Ig 동종형 식별 키트 및 오쏘페닐렌 다이아민(OPD)을 자임드 랩스(Zymed Labs, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재)로부터 입수하였다. 세파로스 단백질-A 및 세파덱스 G-25를 파마시아(Pharmacia, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)로부터 입수하였다. 프리스탄(2,6,10,14-테트라메틸 펜타데칸)을 알드리치 켐 컴패니(Aldrich Chem. Co., 미국 위스콘신주 밀워키 소재)로부터 입수하였다. 125I 볼튼-헌터(Bolton-Hunter) 시약을 뉴 잉글랜드 뉴클리어(New England Nuclear, 미국 매사추세츠주 보스턴 소재)로부터 입수하였다. 모든 다른 화학물질은 시그마로부터 입수한 분석 등급의 것이였다.
하이브리도마 생산: IL-1베타에 대한 하이브리도마를, 문헌[Lerner, (1981) Yale J. Biol. Med., 54: 347]에 기재된 바와 같이 콜러 및 밀스테인(Kohler and Milstein) 방법을 사용하여 생산하였다. 12주령의 암컷 BALB/c 마우스를 CFA 중 정제된 MW 17,500 형태의 IL-1베타 5 μg으로 복강내 및 뒷 발바닥에 접종하였다. 불완전 프로인드 보조제(IFA)의 5회의 추가 접종이 3 내지 4주의 간격으로 제공되었다. 혈청 항체 역가를 주기적으로 ELISA에 의해 결정하고, 5회의 접종 후에, 역가를 알아낼 수 있었다. 융합을 위해 선택한 동물에게 멸균 PBS 중 IL-1베타 10 μg의 정맥내(IV) 추가 접종을 제공하였다. 비장을 4일 후에 제거하고, 비장 세포를 50% PEG 1450을 사용하여 P3X63-Ag8.653 골수종 세포와 융합하였다. 세포를 HAT 배지 중 96-웰 플레이트(1*106 세포/웰)에서 배양하였다. 하이브리도마 상청액을 고체-상 항원 ELISA, 125IIL-1베타를 사용하는 고체-상 항체 RIA 및 IL-1베타-유도된 흉선 세포 증식의 억제에 의해 항-IL-1베타 활성에 대해 분석하였다(하기 참조). 하이브리도마를 흉선 세포(5 * 105 /웰)를 갖는 HAT 배지 중 3회 이상으로 희석을 제한함으로써 클로닝하였다.
항체 생산 및 정제: 단일클론 항체를, 2 * 106 하이브리도마 세포를 프리스탄-처리된 마우스에 복강내 주입함으로써 복수 중에 생산하였다(상기 콜러 등의 문헌). 복수액을 채취하고, 항체를 세파로스-단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다(문헌[Goding, J. Immunol. Methods 20 (1978) 241]).
단일클론 항체 ILB1-H34를 상응하는 세포주로부터 상기에 기재된 바와 같이 제조하였다.
IL-1베타 항체의 ELISA: 비닐 분석 플레이트(코스타(Costar))를 PBS 중 희석된 50 μL/웰의 항원의 5 μg/mL 용액으로 코팅하고 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 웰을 5% 무지 분유/0.05% 티메로살/PBS를 사용하여 1시간 동안 실온에서 카운터코팅하였다. 웰을 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)/0.05% 티메로살/PBS로 세척하고, 50 μL/웰의 항-IL-1베타 항체를 2시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 항체를 토끼 항-마우스 IgG+A+M 퍼옥시다제 접합체 및 OPD 기질 용액을 사용하는 간접 ELISA에 의해 검출하였다. 대안적으로, 정제된 단일클론 항체를 바이오티닐화시키고(문헌[Geusdon et al., J. Histochem. Cytochem. 27 (1979) 1131]) 스트렙타비딘 퍼옥시다제 및 OPD 기질 용액을 사용하여 검출하였다. 단일클론 항체의 동종형을 마우스 Ig 동종형 식별 키트를 사용하는 간접 ELISA에 의해 식별하였다.
흉선 세포 증식 분석: IL-1베타 및 PHA(10 μg/ml)를 MEM/5% 소 태아 혈청 (FBS)/100 μg/ml 젠타마이신, 2-머캅토에탄올(2 * 10-5 M), 25 mM Hepes 배지 중 C3H/HeJ 마우스 흉선 세포(1 * 106 /웰)의 배양물에 첨가하였다. 37℃에서 48시간 후에, 0.5 μCi/웰의 3H 티미딘을 첨가하고, 배양물을 밤새 항온처리하였다. 세포를 세포 채취기를 사용하여 유리 섬유 필터 상에 채취하고 섬광 계수를 위해 처리하였다.
수용체 결합 분석: 17,500 형태의 IL-1베타를 다이요오도 125I 볼튼-헌터 시약을 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 표지하였다. 10 μL의 PBS 중의 1 μg의 IL-1베타를 1 mCi의 시약과 4시간 동안 4℃에서 반응시켰다; 500 μL의 PBS/0.2% 젤라틴을 첨가하고, 표지된 IL-1베타를 PBS/0.2% 젤라틴을 갖는 세파덱스 G-25의 20 * 1 cm 컬럼 상에 크로마토그래피에 의해 유리 볼튼-헌터 시약으로부터 분리하였다. 125IIL-1베타를 24-웰 배양 플레이트에서 DMEM/1% BSA/0.1% 나트륨 아지드/0.01% 트리톤 X-100 중의 BALB/c 3T3 섬유아세포의 합류 단일층에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 후에, 단일층을 표지된 IL-1베타가 부재한 배지에서 대대적으로 세척하였다. 단일층을 0.1 N NaOH를 사용하여 감마 게수를 위해 제거하였다. 125IIL-1베타의 비-특이적 결합을 200배 몰 초과의 표지되지 않은 IL-1베타의 존재하에 항온처리함으로써 측정하였다.
항체 친화성의 결정: 단일클론 항체 친화성을 면역침전 방사 면역 분석을 사용하여 수득된 데이터로부터 결정하였다. 간략히, 5000 cpm/튜브의 125IIL-1베타를 0.3 ml의 1% 무지 분유/0.5% 티메로살/PBS 중의 정제된 단일클론 항체의 희석과 함께 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 항원-항체 복합체를 100 μL/튜브의 PBS 중의 각각의 10% 정상 마우스 혈청/PBS 및 4 mg/ml 염소 항 마우스 IgG 혈청의 첨가에 의해 침전시켰다. 4℃에서 4시간 후에, 1/ml 튜브의 빙냉된 2% 폴리에틸렌 글리콜-6000을 첨가하고, 튜브를 3000 * g에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 흡입하고, 펠릿을 감마 계수기에서 계수하였다. 친화성 상수를 항체의 상이한 농도에서 결합/유리 비로부터 계산하였다(문헌[Berson et al., Clin. Chim. Acta. 22 (1969) 51-69]).
친화성 상수를 상기에 기재된 바와 같이 상이한 항체 농도의 125IIL-1베타 결합의 면역침전 방사 면역 분석(RIA)으로부터 수득된 데이터를 사용하여 계산하였다. 항-IL-1베타 항체 H34는 IL-1베타에 대하여 64 *109 L/mol의 친화성을 갖는다.
실시예 2: 마우스의 면역화
NMRI 마우스의 면역화를 위해, RIMMS(신속한 면역화, 다중 부위) 스케쥴을 사용하였다.
실시예 3: 항-IL- 1베타 항체 혈청 역가의 결정
인간 재조합 IL-1베타를 96-웰 NUNC Maxisorb 플레이트 상에 2.5 μg/ml, 100 μl/웰로 PBS 중에 고정한 후에, 하기가 뒤이었다: 플레이트를 PBS 중 2% 크로테인씨(CroteinC)로 차단함(200 μl/웰); 항혈청의 연속 희석을 이중으로 PBS 중 0.5% 크로테인씨 중에 적용함(100 μl/웰); PBS 중 0.5% 크로테인씨 중에 1:16,000으로 희석된 HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체(잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch))로 검출함(100 μl/웰). 모든 단계의 경우, 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 모든 단계 사이에, 플레이트를 PBS 중 0.05% 트윈으로 3회 세척하였다. 신호를 BM 블루 POD 서브스트레이트 솔루블(BM Blue POD Substrate soluble)(로슈 다이애그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH, 독일 만하임 소재))(100 μl/웰)의 첨가로 발달시키고; 1 M HCl(100 μl/웰)의 첨가로 중단하였다. 흡광도를 690 nm 기준과 비교하여 450 nm에서 판독하였다. 역가를 반-최고치 신호를 야기하는 항혈청의 희석으로서 정의하였다.
실시예 4: 인간 IL- 1베타 결합 ELISA
변이체 1
결합 분석을 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)-기반 기술을 사용하여 수행하였다. 항원 인간 IL-1베타(페프로테크(Peprotech) 카탈로그 번호 200-01B)를 PBS 중에 25 μL 중에 500 ng/mL의 농도로 384 웰 마이크로티터 플레이트(써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 카탈로그 번호 464718) 상에 고정시켰다. 매 하기 단계 후에 제거 및 흡인과 함께 90 μL PBS로 3회 세척의 순서가 뒤이었다: 1) 차단 단계: 미결합된 표면을 포화시킴(1시간, 2% BSA); 2) 1시간 동안 항-IL-1베타 항체의 농도를 증가시킴; 3) 검출 항체, 희석 = 1:2000(당나귀 F(ab)2 항-토끼 IgG POD, 아머샴(Amersham), NA9340V 또는 양 IgG 항-마우스 IgG POD, 아머샴 RPN4201). 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB, 로슈 다이애그노스틱스 게엠베하(독일 만하임 소재), 카탈로그 번호 11835033001)의 첨가 후 20 내지 30분에, 광학 밀도를 370 nm에서 결정하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 6.0 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 로지스틱 모델을 사용하여 EC50을 계산하였다.
변이체 2
결합 분석을 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)-기반 기술을 사용하여 수행하였다. 항원 His-태그된 인간 IL-1베타(시노 바이오틱스(Sino Biologics), 카탈로그 번호 10139-H07E)를 PBS 중에 25 μL 중에 0.25 μg/mL의 농도로 384 웰 마이크로티터 플레이트(써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 464718) 상에 고정시켰다. 매 하기 단계 후에 제거 및 흡인과 함께 90 μL PBS, 0.5% BSA, 0.05% 트윈으로 3회 세척의 순서가 뒤이었다: 1) 차단 단계: 미결합된 표면을 포화시킴(1시간, 2% BSA); 2) 1시간 동안 항-IL-1베타 항체의 농도를 증가시킴; 3) 검출 항체, 희석 = 1:2000(당나귀 F(ab)2 항-토끼 IgG POD, 아머샴, NA9340V 또는 양 IgG 항-마우스 IgG POD, 아머샴 RPN4201). 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB, 로슈 다이애그노스틱스 게엠베하(독일 만하임 소재), 카탈로그 번호 11835033001)의 첨가 후 20 내지 30분에, 광학 밀도를 370 nm에서 결정하였다. 그래프패드 프리즘 6.0 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 로지스틱 모델을 사용하여 EC50을 계산하였다.
실시예 5: 사이노몰구스 IL- 1베타 결합 ELISA
결합 분석을 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)-기반 기술을 사용하여 수행하였다. 항원 인간 IL-1베타(시노 바이오틱스, 카탈로그 번호 90010CNAE)를 PBS 중에 25 μL 중에 0.5 μg/mL의 농도로 384 웰 마이크로티터 플레이트(써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 464718) 상에 고정시켰다. 매 하기 단계 후에 제거 및 흡인과 함께 90 μL PBS, 0.5% BSA, 0.05% 트윈으로 3회 세척의 순서가 뒤이었다: 1) 차단 단계: 미결합된 표면을 포화시킴(1시간, 2% BSA); 2) 1시간 동안 항-IL-1베타 항체의 농도를 증가시킴; 3) 검출 항체, 희석 = 1:2000 (당나귀 F(ab)2 항-토끼 IgG POD, 아머샴, NA9340V 또는 양 IgG 항-마우스 IgG POD, 아머샴 RPN4201). 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB, 로슈 다이애그노스틱스 게엠베하(독일 만하임 소재), 카탈로그 번호 11835033001)의 첨가 후 20 내지 30분에, 광학 밀도를 370 nm에서 결정하였다. 그래프패드 프리즘 6.0 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 로지스틱 모델을 사용하여 EC50을 계산하였다.
실시예 6: 뮤린 IL- 1베타 결합 ELISA
결합 분석을 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)-기반 기술을 사용하여 수행하였다. 항원 뮤린 IL-1베타(시노 바이오틱스, 카탈로그 번호 50101-MNAE)를 PBS 중에 25 μL 중에 0.5 μg/mL의 농도로 384 웰 마이크로티터 플레이트(써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 464718) 상에 고정시켰다. 매 하기 단계 후에 제거 및 흡인과 함께 90 μL PBS, 0.5% BSA, 0.05% 트윈으로 3회 세척의 순서가 뒤이었다: 1) 차단 단계: 미결합된 표면을 포화시킴(1시간, 2% BSA); 2) 1시간 동안 항-IL-1베타 항체 농도를 증가시킴; 3) 검출 항체, 희석 = 1:2000(당나귀 F(ab)2 항-토끼 IgG POD, 아머샴, NA9340V or 양 IgG 항-마우스 IgG POD, 아머샴 RPN4201). 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB, 로슈 다이애그노스틱스 게엠베하(독일 만하임 소재), 카탈로그 번호 11835033001)의 첨가 후 20 내지 30분에, 광학 밀도를 370 nm에서 결정하였다. 그래프패드 프리즘 6.0 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 로지스틱 모델을 사용하여 EC50을 계산하였다.
실시예 7: 단백질-단백질 상호작용 억제 분석(인간 IL- 1베타 :인간 IL-1 수용체 유형 1)
인간 IL-1 수용체 유형 I에 대한 인간 IL-1베타의 단백질-단백질 상호작용 억제 분석을 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)-기반 기술을 사용하여 수행하였다. 인간 His-태그된 IL-1베타 단백질(시노 바이오틱스, 카탈로그 번호 10139-H07E)을 PBS, 0.5 % BSA 및 0.05 % 트윈 중에 25 μL 중에 1 μg/mL의 농도로 384 웰 마이크로티터 플레이트(써모 사이언티픽 카탈로그 번호 464718) 상에 고정시켰다. 매 하기 단계 후에 제거 및 흡인과 함께 90 μL PBS로 3회 세척의 순서가 뒤이었다: 1) 차단 단계: 미결합된 표면을 포화시킴(1시간, 2% BSA); 2) 증가하는 농도의 12.5 μL 항-IL-1베타 항체를 12.5 μL Fc-태그된 인간 IL-1베타 수용체(시노 바이오틱스, 카탈로그 번호 10126-H02H)와 함께 300 ng/mL에서 250 μL의 부피에서 1시간 동안 항온처리함; 3) 검출을 퍼옥시다제-표지된 항 huFc 항체(염소 F(ab2) 항-인간 FC POD, 잭슨, 카탈로그 번호 109-036-098)를 사용하여 수행함. 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB, 로슈 다이애그노스틱스 게엠베하, 카탈로그 번호 11835033001)의 첨가 후 10 내지 30분에 광학 밀도를 370 nm에서 결정하였다. 그래프패드 프리즘 6.0 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 로지스틱 모델을 사용하여 IC50을 계산하였다.
실시예 8: 단백질-단백질 상호작용 억제 분석(인간 IL- 1베타 :인간 IL-1 수용체 유형 2)
인간 IL-1 수용체 유형 II에 대한 인간 IL-1베타의 단백질-단백질 상호작용 억제 분석을 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)-기반 기술을 사용하여 수행하였다. 인간 His-태그된 IL-1베타 단백질(시노 바이오틱스, 카탈로그 번호 10139-H07E)을 PBS, 0.5 % BSA 및 0.05 % 트윈 중에 25 μL 중에 1 μg/mL의 농도로 384 웰 마이크로티터 플레이트(써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 464718) 상에 고정시켰다. 매 하기 단계 후에 제거 및 흡인과 함께 90 μL PBS로 3회 세척의 순서가 뒤이었다: 1) 차단 단계: 미결합된 표면을 포화시킴(1시간, 2% BSA); 2) 증가하는 농도의 12.5 μL 항-IL-1베타 항체를 12.5 μL Fc-태그된 인간 IL-1베타 수용체(RnD, 카탈로그 번호 663-2R-50)와 함께 30 ng/mL에서 250 μL의 부피에서 1시간 동안 항온처리함; 3) 검출을 퍼옥시다제-표지된 항-huFc 항체(염소 F(ab2) 항-인간 FC POD, 잭슨, 카탈로그 번호 109-036-098)를 사용하여 수행함. 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB, 로슈 다이애그노스틱스 게엠베하(독일 만하임 소재), 카탈로그 번호 11835033001)의 첨가 후 10 내지 30분에 광학 밀도를 370 nm에서 결정하였다. 그래프패드 프리즘 6.0 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 로지스틱 모델을 사용하여 IC50을 계산하였다.
실시예 9: 하이브리도마를 생산하는 마우스 하이브리도마 H34 뮤린 항-IL- 1 베타 항체의 발현
배지는 하기 시약을 함유하였다: RPMI(PAN), 20% 소 태아 혈청, 2 mM 글루타민(PAN), 1x 나트륨 피루베이트(PAN), 1x NEAS(PAN).
냉동된 세포 함유 바이알을 37℃ 수욕 중의 튜브에 60초 동안 두어 미리 해동시켰다. 2 ml 예열된(37℃) 배지를 사용하여, 세포를 빠르게 재현탁화시키고 바이알로부터 이미 8 ml 배지를 함유하는 10 ml 플라스크(셀스타(CellStar))로 옮겼다. 플라스크를 5분 동안 1000 rpm(25℃)에서 원심분리하였다. 이어서, 상청액을 폐기하고 10 ml 예열된(37℃) 배지에서 세포-펠릿을 상하 피펫질에 의해 부드럽게 재현탁화시켰다. 전체 용액을 T25-플라스크에 충전하고 플라스크를 항온처리기(37℃, 7% CO2, 85% 습도)에 2일 동안 두었다.
다음 5일 동안 2 내지 3일 마다 새로운 배지에 1 내지 2 x 105 세포/ml의 밀도로 희석하여 세포를 분할하였다. 이어서, 다음날 소 태아 혈청의 부분을 제1 단계의 20%에서 10%로 감소시킴을 개시하였다. 10% 소 태아 혈청으로 2개의 분할물을 생성한 후에, 배지(RPMI(PAN), 10% 소 태아 혈청, 2 mM 글루타민(PAN), 1x 나트륨 피루베이트(PAN), 1x NEAS(PAN))를 1:1로 하이클론-ADCF-MAb 배지(써모 사이언티픽)와 혼합하고 이러한 배지를 또 다른 2개의 분할물을 위해 사용하였다. 이어서, 하이클론 : RPMI-및-10% 소 태아 혈청의 비를 3:1로 상승시키고, 세포를 2 내지 3 x 105 세포/ml의 보다 높은 밀도로 시딩하였다. 뉴트리도마(Nutridoma) CS(로슈 다이애그노스틱스 게엠베하(독일 만하임 소재))에 의해 첨가된 100% 하이클론 배지 중에 세포를 적어도 분할하였다.
이어서, 세포-용액의 부피를 5개의 분할물에 대하여 20 ml(T75 플라스크)로 확장하였다. 항체 생산을 위해, 15 ml 세포를 2.0 x 106 세포/ml의 밀도로 셀라인 CL1000 반응기에 충전하고 8 내지 9일 동안(37℃, 7% CO2, 85% 습도) 항온처리하였다. 채취를 위해, 상청액을 50 ml 팔콘(falcon)에 충전하고 4000 rpm으로 4회 원심분리하였다(각각의 주기 후에, 상청액을 새로운 50 ml 팔콘에 충전함). 마지막으로, 무세포 상청액을 -20℃에서 냉동시켰다.
실시예 10: 뮤린 하이브리도마로부터 항체 정제
항체 함유 H34하이브리도마 상청액을 여과하고 2개의 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다. 항체를 PBS(1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)(pH 7.4)와 평형을 이룬 하이트랩(HiTrap) 프로트(Prot) G(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))를 사용하는 친화성 크로마토그래피로 포착하였다. 미결합된 단백질을 평형 완충제로 세척함으로써 제거하고, 항체를 25 mM 시트르산 염 완충제(pH 3.0)로 회수하고, 용리 직후에 1 M 트리스-염기(pH 9.0)를 사용하여 pH 6.0으로 중화시켰다. 슈퍼덱스(Superdex) 200(상표, 지이 헬쓰케어) 상의 크기 배제 크로마토그래피를 제2 정제 단계로 사용하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 20 mM 히스티딘 완충제, 0.14 M NaCl(pH 6.0) 중에서 수행하였다. 항체 함유 용액을 바이오맥스(Biomax)-SK 막을 갖춘 울트라프리(Ultrafree)-CL 원심분리 필터 유닛(밀리포어(Millipore, 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재))을 사용하여 농축하고 -80℃에서 저장하였다.
항체 함유 하이브리도마 상청액을 여과하고 2개의 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다. 상청액을 50% v/v 2 M 글리신(pH 8.6), 600 mM NaCl과 혼합하고 1 M 글리신(pH 8.6), 300 mM NaCl과 평형을 이룬 하이트랩 MabSelectSuRe(지이 헬쓰케어)를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 포착하였다. 미결합된 단백질을 평형 완충제로 세척함으로써 제거하고, 항체를 100 mM 시트르산 염 완충제(pH 2.8)로 회수하고, 용리 직후에 1 M 트리스-염기(pH 8.5)를 사용하여 pH 6.0으로 중화시켰다. 슈퍼덱스 200(상표, 지이 헬쓰케어) 상의 크기 배제 크로마토그래피를 제2 정제 단계로 사용하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 20 mM 히스티딘 완충제, 0.14 M NaCl(pH 6.0) 중에서 수행하였다. 항체 함유 용액을 바이오맥스-SK 막을 갖춘 울트라프리-CL 원심분리 필터 유닛(밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재)을 사용하여 농축하고 -80℃에서 저장하였다.
실시예 11: HEK 세포에서 인간화된 항체의 형질감염 및 일과성 발현
형질감염 시약 293-프리(노바겐(Novagen))를 사용한 현탁액-적합화된 HEK293F(프리스타일(FreeStyle) 293-F 세포; 인비트로겐(Invitrogen)) 세포에서 항체의 일과성 발현을 수행하였다.
125 ml 진탕 플라스크(37℃, 7% CO2, 85% 습도, 135 rpm에서 항온처리/진탕)에서 해동한 후에, 세포를 4회 이상(부피 30 ml) 연속 희석시켰다.
세포를 250 ml 부피에서 3x105 세포/ml로 확장시켰다. 3일 후에, 세포를 분할하고 1 리터 진탕 플라스크 중에서 250 ml 부피에서 7*105 세포/ml의 밀도로 새로이 시딩하였다. 형질감염을 24시간 후에 약 1.4 내지 2.0x106 세포/ml의 세포 밀도로 수행하였다.
형질감염 전에, 250 μg 플라스미드-DNA(122 μg 경쇄 및 128 μg 중쇄)를 예열된(수욕; 37℃) Opti-MEM(깁코)을 사용하여 10 ml의 최종 부피로 희석하였다. 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 5분 이하 동안 항온처리하였다. 이어서, 333.3 μl 293-프리 형질감염 시약을 DNA-OptiMEM-용액에 첨가하였다. 부드럽게 혼합하고 실온에서 15 내지 20분 동안 항온처리하였다. 전체 부피의 혼합물을 250 ml HEK-세포-배양-부피를 갖는 1 L 진탕 플라스크에 첨가하였다.
37℃, 7% CO2, 85% 습도, 135 rpm에서, 6 또는 7일 동안 항온처리/진탕하였다.
2,000 rpm, 4℃에서, 10분 동안 제1 원심분리 단계에 의해 상청액을 채취하였다. 이어서, 상청액을 4,000 rpm, 4℃에서, 20분 동안의 제2 원심분리를 위한 새로운 원심분리 플라스크에 이동시켰다. 이후, 무세포 상청액을 0.22 μm 보틀-탑-필터를 통해 여과하고 냉동고(-20℃)에 저장하였다.
실시예 12: HEK 상청액으로부터 항체 정제
항체 함유 배양 상청액을 여과하고 2개의 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다. 항체를 PBS(1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)(pH 7.4)와 평형을 이룬 하이트랩 MabSelectSuRe(지이 헬쓰케어)를 사용하는 친화성 크로마토그래피로 포착하였다. 미결합된 단백질을 평형 완충제로 세척함으로써 제거하고, 항체를 50 mM 시트르산 염 완충제(pH 2.8)로 회수하고, 용리 직후에 1 M 트리스-염기(pH 9.0)를 사용하여 pH 6.0으로 중화시켰다. 슈퍼덱스 200(상표, 지이 헬쓰케어) 상의 크기 배제 크로마토그래피를 제2 정제 단계로 사용하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 20 mM 히스티딘 완충제, 0.14 M NaCl(pH 6.0) 중에서 수행하였다. 항체 함유 용액을 바이오맥스-SK 막을 갖춘 울트라프리-CL 원심분리 필터 유닛(밀리포어(미국 매사추세츠주 빌레리카 소재))을 사용하여 농축하고 -80℃에서 저장하였다.
실시예 13: 항체 제제의 분석
항체 제제의 단백질 농도를 아미노산 서열을 기반으로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 결정하였다.
항체의 순도 및 일체성을 단백질 발현 칩 및 HT 단백질 발현 시약 키트를 갖는 랩칩(LabChip) GX II(퍼킨 엘머(PerkinElmer))를 사용하여 CE-SDS에 의해 분석하였다.
항체 제제의 응집 함량을 러닝 완충제로서 2 x PBS(pH 7.4)를 사용하는 TSK-GEL QC-PAK GFC 300을 사용하는 고성능 SEC에 의해, 또는 러닝 완충제로서 200 mM K2HPO4/KH2PO4, 250 mM KCl(pH 7.0)을 사용하는 바이오수트(BioSuite) 고해상도 SEC, 250 Å, 5 μm 분석적 크기 배재 컬럼(워터스 게엠베하(Waters GmbH))을 사용하는 고성능 SEC에 의해 결정하였다.
실시예 14: 항체로부터 Fab 단편의 제조 및 분석
12 mg 항체(20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl 중 1 mg/ml, pH 6.0)를 240 μl L-시스테인 용액(메르크 밀리포어; 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl 중 250 mM, pH 6.0) 및 327 μl 파파인(로슈 라이프 사이언스(Roche Life Science); 0.001 U/mg 항체)과 함께 120분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 절단 후에, PBS(1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)(pH 7.4)와 평형을 이루는 하이트랩 MabSelectSuRe(지이 헬쓰케어)를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 온전한 IgG 및 Fc 단편의 제거에 사용하였다. 이어서, MabSelectSuRe 크로마토그래피의 통과액을 제2 정제 단계로서 슈퍼덱스 200(상표, 지이 헬쓰케어) 상에 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 20 mM 히스티딘 완충제, 0.14 M NaCl(pH 6.0) 중에서 수행하였다. Fab 단편 함유 용액을 바이오맥스-SK 막(밀리포어(미국 매사추세츠주 빌레리카))을 갖춘 울트라프리-CL 원심분리 필터 유닛으로 농축하고 -80℃에서 저장하였다.
Fab 단편의 단백질 농도를 아미노산 서열을 기반으로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 결정하였다.
Fab 단편의 순도 및 일체성을 환원제(5 mM, 1,4-다이티오트레이톨) 및 심플리 블루 세이프 스테인(Simply Blue Safe Stain)(인비트로겐) 염색의 존재 및 부재하에 SDS-PAGE(NuPAGE 4-12% 비스-트리스 겔, 인비트로겐)에 의해 분석하였다.
Fab 제제의 응집 함량을 러닝 완충제로서 200 mM K2HPO4/KH2PO4, 250 mM KCl(pH 7.0)을 사용하는 바이오수트 고해상도 SEC, 250 Å, 5 μm 분석적 크기 배재 컬럼(워터스 게엠베하)을 사용하는 고성능 SEC에 의해 결정하였다.
실시예 15: A549 세포의 IL- 1베타 자극 후 ICAM -1 발현
A549 세포(10,000/웰)를 10% FCS로 보충된 RPMI 1640에서 밤새 성장시켰다. 이후, 배지를 0.5% 혈청으로 보충된 헝거(Hunger) 배지로 교체하였다.
항-IL-1베타 항체를 2시간 동안 250 pg/ml의 IL-1베타 및 상이한 농도의 항체(1000, 100, 10, 1, 0.1, 0 ng/ml)와 함께 항온처리하였다. 이후, A549 세포를 밤새 IL-1베타/항체 혼합물과 함께 4중으로 항온처리하였다.
세포를 4회 매우 찬 PBS로 세척한 후에, PFA로 20분 동안 고정시켰다. 이후, 세포를 GSDB로 차단하였다(비-투과성). 2시간 동안 항-ICAM-1 항체(알앤디 시스템즈(R&D Systems), 5 μg/ml)와 함께 항온처리한 후에, 샘플을 4회 PBS로 세척하였다. 염색을 위해, 샘플을 1시간 동안 1:1000 희석된 항-마우스 항체-HRP 접합체(아머샴)와 함께 항온처리하였다. 이후, 샘플을 4회 PBS로 세척하고 2시간 동안 ABTS와 함께 항온처리하였다. 흡수를 495 nm 기준과 비교하여 405 nm에서 측정하였다.
실시예 16: A549 세포의 IL- 1베타 자극 후 IL-6 결정( 퀀티카인 ( Quantikine ) ELISA, 알앤디 시스템즈 )
A549 세포(10,000/웰)를 10% FCS로 보충된 RPMI 1640에서 밤새 성장시켰다. 이후, 배지를 0.5% 혈청으로 보충된 헝거 배지로 교체하고, 배양을 96시간 동안 계속하였다.
항-IL-1베타 항체(1 μg/ml)를 2시간 동안 250 pg/ml의 IL-1베타와 함께 항온처리하였다. 이후, A549 세포를 밤새 IL-1베타/항체 혼합물과 함께 이중으로 항온처리하였다.
100 μl의 배양 상청액 중 샘플을 추가적 분석을 위해 채취하였다.
단일클론 항-인간 IL-6 항체로 코팅된 96 웰 플레이트를 15분 동안 분석 희석제 RD1W로 차단하였다. 이후, 상청액 샘플을 첨가하고 2시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 웰을 4회 각각 200 μl 세척 완충제로 세척하였다. 이후, 웰을 HRP에 접합된 다중클론 항-인간 IL-6 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 웰을 4회 각각 200 μl 세척 완충제로 세척하였다. 이후, 웰을 20분 동안 테트라메틸 벤지딘 및 H2O2와 함께 항온처리하였다. 20분 후에, 반응을 2 N 황산의 첨가에 의해 중단하였다. 흡수를 570 nm의 기준 파장과 비교하여 450 nm에서 측정하였다.
실시예 17: 생물활성 분석
D10 세포가 IL-1 또는 배양 보조 세포의 부재하에 con A로 최소한으로만 증식하기 때문에, 뮤린 헬퍼 T 림프구(Th-2) D10.G4.1 세포주를 IL-1(인터류킨-1) 생물활성에 대한 믿을 수 있고 민감한 분석으로서 광범위하게 사용하였다(문헌[Symons, J.A., et al. in Lymphokines and Interferons, a Practical Approach. Clemens, M.J. et al. (Eds): IRL Press. 272 (1987)] 참조). 이러한 효과에 대한 ED50은 전형적으로 12 pg/mL 미만이다.
35,000 D10.G4.1 T-세포/웰(갓 해동됨)을 72시간 동안 IL-1베타(1 ng/ml)를 함유하는 배지(RPMI/2.5μg/ml ConA/10% FCS)에서 자극하였다.
판독을 제조업자의 설명서에 따라 셀티터글로(CellTiterGlo, 등록상표) 발광 세포 생존능 분석에 의해 결정하였다.
실시예 18: IL- 1베타에 의해 유도된 HUVEC 세포에 대한 I- CAM1 상향조절
상응하는 배지 EBM/EGM(카탈로그 번호 CC-4176) 중 HUVEC 세포(론자(Lonza), 카탈로그 번호 00191027)를 96 웰 배양 플레이트(코스타, 카탈로그 번호 3596)에서 EBM+2% BSA 200 μl/웰 중 40,000 세포/웰로 시딩 아웃하였다. 세포를 회수하기 위해 5% CO2 항온처리기에서 37℃에서 24시간 동안 항온처리하였다. 최종적으로 40배 농축을 요구하는 2개의 희석 시리즈를 수행하였다: 하나는 항-IL-1b 항체 huH34-2를 사용한 것이고, 나머지 하나는 EBM+2% BSA 중 재조합 인간 IL-1베타(알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 201-LB)를 사용한 것이다. 2개의 시리즈를 서로 1:1로 혼합하고 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 10 μl의 IL-1베타/항-IL-1베타 항체 혼합물을 세포에 첨가하고 부드럽게 혼합하였다. 항온처리를 5% CO2 항온처리기에서 37℃에서 20시간 동안 수행하였다. 이후, 모든 매질을 세포로부터 제거하고, 세포를 2회 PBS로 세척하였다. 하나를 세포 해리 용액(비-효소성)(시그마(Sigma), 카탈로그 번호 C5914)으로 세척한 후에, 100 μl의 세포 해리 용액과 함께 37℃에서 항온처리하였다. 탈리를 5분 마다 현미경으로 관찰하여 확인하였다. 80%의 세포가 구형이되었을 때, 세포를 FACS-플레이트(96 웰, 340 μl 저장소, PP, V-바닥 플레이트(팔콘 카탈로그 번호 353263))에 옮겼다. 나머지 세포를 100 μl PBS+1% BSA를 갖는 배양 플레이트로부터 4회 흡인에 의해 탈리시키고 FACS-플레이트에 첨가하였다. 300xg로 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 폐기하였다. 펠릿을 100 μl PBS+1% BSA+10 μg/ml 인간 IgG(시그마; 카탈로그 번호 I2511)에 재현탁화시키고 15분 동안 실온에서 항온처리하였다. 10 μl의 항-인간 ICAM-1 플루오레세인 접합체(CD54)(알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 BBA20)를 첨가한 후에, 4℃에서 30 내지 45분 동안 항온처리하였다. 300xg로 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 폐기하였다. 펠릿을 110 μl PBS+1% BSA에 재현탁화시키고 LSRII 상에 측정하였다.
실시예 19: THP1 세포에서 MSU 유도된 TNF 알파 생산
THP1 세포(인비트로겐, 카탈로그 번호 thp-null)를 10% FBS(열 불활성화됨)가 보충된 성장 배지, RPMI 1640(깁코(깁코, 카탈로그 번호 A10491)에서 1x106 세포/ml의 밀도까지 성장시키고 팔콘 튜브에 옮겼다. PMA(포르볼 미리스테이트 아세테이트, 인비트로겐, 카탈로그 번호 tlrl-pma)를 300 ng/ml의 최종 농도로 첨가하고 5% CO2 항온처리기에서 37℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 세포를 1회 PBS로 세척하고(300xg에서 5분 원심분리, 상청액 폐기함) 2 mM L-글루타민 및 10% FBS(열 불활성화됨)로 보충된 헝거 RPMI(깁코, 카탈로그 번호 31870-025) 중에 1.33x106 세포/ml의 밀도로 재현탁화시켰다. 150 μl/웰의 세포 현탁액을 96 웰 배양 플레이트(코스타, 카탈로그 번호 3596)에서 2x105 세포/웰로 시딩 아웃하였다. 밤새 항온처리를 5% CO2 항온처리기에서 37℃에서 수행하였다. 헝거 배지 중 최종 농도 250 μg/ml의 50 μl의 4배 농축된 MSU 현탁액(모노나트륨 우레이트 결정, 인비트로겐, 카탈로그 번호 tlrl-msu)을 첨가하고 5% CO2 항온처리기에서 37℃에서 6시간 동안 항온처리하였다. 항-IL-1베타 항체의 희석 시리즈를 성장 배지에서 수행하였다. THP1 세포의 상청액을 폐기하고, 웰을 1회 PBS로 세척하였다. 이어서, 제조한 항-IL-1b 항체 희석 시리즈를 웰에 첨가하였다. 밤새 항온처리를 5% CO2 항온처리기에서 37℃에서 수행하였다. 상청액을 채취하고 TNF알파 싱글플렉스로 분석하였다.
실시예 20: 화학적 분해 시험
샘플을 3개의 분액으로 분할하고 20 mM His/His*HCl, 140 mM NaCl(pH 6.0) 또는 PBS 내에 각각 재완충시키고 40℃(His/NaCl) 또는 37℃(PBS)에서 저장하였다. 대조군 샘플을 -80℃에서 저장하였다.
항온처리를 종료한 후에, 샘플을 상대 활성 농도(바아코어), 응집(SEC) 및 단편화(모세관 전기이동 또는 SDS-PAGE)에 대하여 분석하고 미처리된 대조군과 비교하였다.
실시예 21: 열적 안정성
샘플을 20 mM 히스티딘/히스티딘 클로라이드, 140 mM NaCl(pH 6.0) 중에서 1 mg/mL의 농도로 제조하고, 0.4 μm 필터 플레이트를 통한 원심분리에 의해 광학 384-웰 플레이트 내로 이동시키고 파라핀 오일로 덮었다. 샘플을 0.05℃/분의 속도로 25℃에서 80℃로 가열하면서, 수력학적 반경을 동적 광산란에 의해 다이나프로(DynaPro) 플레이트 리더(와트(Wyatt)) 상에 반복적으로 측정하였다.
대안적으로, 샘플을 10 μL 마이크로-큐벳 어레이 내로 이동시키고, 이를 0.1℃/분의 속도로 25℃에서 90℃로 가열하면서 고정적 광산란 데이터 및 266 nm 레이저를 사용한 여기시 형광 데이터를 옵팀(Optim)1000 기구(아박타 인코포레이티드(Avacta Inc.))로 기록하였다.
응집 개시 온도는 수력학적 반경(DLS) 또는 산란광 강도(옵팀1000)가 증가하기 시작하는 온도로서 정의된다.
용융 온도는 형광 강도 대 파장 그래프에서 변곡점으로서 정의된다.
전술한 본 발명은 이해의 명확성을 위해 예시 및 실시예로서 다소 상세하게 설명되었지만, 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시는 그 전체가 참조로 명확히 포함된다.
실시예 22: 항-IL- 1베타 항체의 결합 동력학 및 교차 반응성
인간, 사이노몰구스, 래트 및 뮤린 IL-1베타에 대한 항-IL-1베타 항체의 결합 동력학, 및 인간 IL-1베타 및 인간 IL-1알파에 대한 교차 반응성을 바아코어 T200 기구(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 조사하였다. 모든 실험을 25℃에서 러닝 완충제 및 희석 완충제로서 HBS-P(10 mM His, 140 mM NaCl, 0.05% 트윈 20 pH 7.4)를 사용하여 수행하였다. 항-인간 또는 항-마우스 Fc 항체를 시리즈 S CM5 센서 칩(지이 헬쓰케어) 상에 표준 아민 커플링 화학 반응을 사용하여 고정시켰다. 항-IL-1베타 항체를 표면 상에 포착하여 100 내지 200 RU의 포착 응답을 야기하였다. IL-1베타 분자를, 표면 상에 90초 동안 0.74 내지 60 nM(1:3 희석 시리즈)의 농도로 주입하였다(결합 상). 해리 상을 600초 동안 러닝 완충제로 세척함으로써 모니터링하였다. 인간 IL-1베타 및 인간 IL-1α에 대한 교차 반응성을 상기에 기재된 조건에 따라 100 nM 항원의 단일 주입에 의해 결정하였다. 표면을, 5 μl/분의 유속으로 3 M MgCl2 용액으로(항-인간 Fc 항체의 경우) 또는 10 mM 글리신(pH 1.5)(항-마우스 Fc 항체의 경우)으로 주입하여 재생하였다. 벌크 굴절률 차이를 모크 표면으로부터 수득된 반응을 감함으로써 보정하였다. 또한, 블랭크 주입을 감하였다(이중 참조). 유도된 곡선을 BIA 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합 모델에 피팅시켰다.
실시예 23: 항-IL- 1베타 Fab 와 비교한 항-IL- 1베타의 결합 동력학
인간 IL-1베타에 대한 항-IL-1베타 IgG 및 Fab의 결합을 바아코어 T200 기구(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 조사하였다. 모든 실험을 25℃에서 러닝 완충제 및 희석 완충제로서 HBS-P(10 mM His, 140 mM NaCl, 0.05% 트윈 20 pH 7.4)를 사용하여 수행하였다. 항-인간 Fc 또는 항-인간 Fab 항체를 시리즈 S CM5 센서 칩(지이 헬쓰케어) 상에 표준 아민 커플링 화학 반응을 사용하여 고정시켰다. 항-IL-1베타 IgG 및 Fab를 표면 상에 포착하여 각각 약 100 및 50 RU의 포착 응답을 야기하였다. 인간 IL-1베타를, 표면 상에 90초 동안 0.74 내지 60 nM(1:3 희석 시리즈)의 농도로 30 μl/분의 유속으로 주입하였다(결합 상). 해리 상을 600초 동안 러닝 완충제로 세척함으로써 모니터링하였다. 표면을, 5 μl/분의 유속으로 3 M MgCl2 용액으로(항-인간 Fc 항체의 경우) 또는 10 mM 글리신(pH 1.5)(항-마우스 Fc 항체의 경우)으로 주입하여 재생하였다. 벌크 굴절률 차이를 모크 표면으로부터 수득된 반응을 감함으로써 보정하였다. 또한, 블랭크 주입을 감하였다(이중 참조). 유도된 곡선을 BIA 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합 모델에 피팅시켰다.
실시예 24: 항-IL- 1베타 항체 작용 분석의 모드
인간 IL-1RI에 대한 항-IL-1베타의 결합 억제를 바아코어 T200 기구(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 조사하였다. 모든 실험을 25℃에서 러닝 완충제 및 희석 완충제로서 HBS-P(10 mM His, 140 mM NaCl, 0.05% 트윈 20 pH 7.4)를 사용하여 수행하였다. 인간 IL-1RI를 시리즈 S CM5 센서 칩(지이 헬쓰케어) 상에 표준 아민 커플링 화학 반응을 사용하여 고정시켰다. 10 nM의 인간 IL-1베타를 100 nM 내지 0.098 nM(1:2 희석 시리즈) 농도의 항-IL-1베타 항체와 함께 미리 항온처리하였다. IL-1베타/항-IL-1베타 항체 혼합물을 5 μl/분의 유속으로 유동 세포에 주입하고 60초 후에 결합 응답(RU)을 사용하여 억제를 모니터링하였다. 표면을, 5 μl/분의 유속으로 60초 동안 10 mM NaOH의 주입으로 재생하였다. 벌크 굴절률 차이를 모크 표면으로부터 수득된 반응을 감함으로써 보정하였다.
실시예 25: 이중특이적 항체의 제조 및 정제
형질감염 시약 293-프리(노바겐)를 사용한 형질감염 후에, 현탁액-적합화된 HEK293F(프리스타일 293-F 세포; 인비트로겐) 세포에서 이중특이적 항체의 일과성 발현을 수행하였다.
125 ml 진탕 플라스크(37℃에서, 7% CO2, 85% 습도, 135 rpm에서 항온처리/진탕)에서 해동한 후에, 3 또는 4일 마다 세포를 4회 이상(부피 30 ml) 연속 희석시켰다. 세포를 250 ml 배지에서 3x105 세포/ml의 세포 밀도로 세포를 시딩함으로써 확장시켰다. 3일 후에, 세포를 분할하고 500 ml 배지 중에서 2*105 세포/ml의 밀도로 새로이 시딩하였다. 4일 후에, 세포를 분할하고 1 리터 배지(37℃에서, 7% CO2, 85% 습도, 110 rpm에서 항온처리/진탕)에서 7*105 세포/ml의 밀도로 새로이 시딩하였다. 형질감염을 24시간 후에 약 1.4 내지 2.0x106 세포/ml의 세포 밀도로 수행하였다.
형질감염 전에, 1000 μg 플라스미드-DNA(2x 250 μg 경쇄 암호화 플라스미드 DNA 및 2x 250 μg 중쇄 암호화 플라스미드 DNA)를 예열된(수욕; 37℃) Opti-MEM(깁코)을 사용하여 40 ml의 최종 부피로 희석하였다. 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 5분 이하 동안 항온처리하였다. 이어서, 1333 μl 293-프리 형질감염 시약을 DNA-OptiMEM-용액에 첨가하였다. 혼합물을 부드럽게 혼합하고 실온에서 15 내지 20분 동안 항온처리하였다. 전체 부피의 혼합물을 1 리터 HEK-세포-배양물에 첨가하였다. 세포를 110 rpm 37℃, 7% CO2, 85% 습도에서, 7일 동안 진탕하면서 추가로 항온처리하였다.
7일 후에 2,000 rpm, 4℃에서, 10분 동안 제1 원심분리 단계에 의해 상청액을 채취하였다. 이어서, 상청액을 4,000 rpm, 4℃에서, 20분 동안의 제2 원심분리 단계를 위한 새로운 원심분리 플라스크에 이동시켰다. 이후, 무세포 상청액을 0.22 μm 필터(밀리포어)를 통해 여과하고 정제 절차가 시작될 때까지 냉동고(-20℃)에 저장하였다.
항체 함유 배양 상청액을 여과하고 2개 이상의 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다. 항체를 PBS(1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)(pH 7.4)와 평형을 이룬 캡쳐셀렉트 프리-팩트(CaptureSelect Pre-packed) 컬럼 IgG-CH1(라이프 테크놀로지스, #494320005)을 사용하는 친화성 크로마토그래피로 포착하였다. 미결합된 단백질을 평형 완충제로 세척함으로써 제거하고, 항체를 25 mM 시트르산 염 완충제(pH 3.0)로 회수하고, 용리 직후에 1 M 트리스-염기(pH 9.0)를 사용하여 pH 6.0으로 중화시켰다.
슈퍼덱스 200(상표, 지이 헬쓰케어) 상의 크기 배제 크로마토그래피를 제2 정제 단계로 사용하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 20 mM 히스티딘 완충제, 0.14 M NaCl(pH 6.0) 중에서 수행하였다. 항체 함유 용액을 바이오맥스-SK 막을 갖춘 울트라프리-CL 원심분리 필터 유닛(밀리포어(미국 매사추세츠주 빌레리카 소재))을 사용하여 농축하고 -80℃에서 저장하였다.
항체 제제의 단백질 농도를 아미노산 서열을 기반으로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 결정하였다.
항체의 순도 및 일체성을 단백질 발현 칩 및 HT 단백질 발현 시약 키트를 갖는 랩칩 GX II(퍼킨 엘머)를 사용하여 CE-SDS에 의해 분석하였다.
항체 제제의 응집 함량을 러닝 완충제로서 200 mM K2HPO4/KH2PO4, 250 mM KCl(pH 7.0)을 사용하는 바이오수트 고해상도 SEC, 250 Å, 5 μm 분석적 크기 배재 컬럼(워터스 게엠베하)을 사용하는 고성능 SEC에 의해 결정하였다.
Figure pct00035
항체 0031은 서열번호 4(VH) 및 서열번호 6(VL)의 IL-1베타 결합 부위 및 서열번호 53(VH) 및 서열번호 54(VL)의 ANG2 결합 부위를 포함하는 크로스맙 항체이다.
항체 0032는 서열번호 55(VH) 및 서열번호 56(VL)의 VEGF 결합 부위 및 서열번호 4(VH) 및 서열번호 6(VL)의 IL-1베타 결합 부위를 포함하는 크로스맙 항체이다.
실시예 26: 이중특이적 항체 동적 특징 규명
IL- 1베타
인간 IL-1베타에 대한 항-IL-1베타 항체의 결합 동력학을 바아코어 T200 기구(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 조사하였다. 모든 실험을 25℃에서 러닝 및 희석 완충제로서 HBS-P(10 mM His, 140 mM NaCl, 0.05% 트윈 20 pH 7.4)를 사용하여 수행하였다. 항-인간 Fc 항체를 표준 아민 커플링 화학 반응을 사용하여 시리즈 S CM5 센서 칩(지이 헬쓰케어) 상에 고정시켰다. 이중특이적 항체를 표면 상에 포착하여 100 내지 200 RU의 포착 응답을 야기하였다. 인간 IL-1베타를, 표면 상에 90초 동안 0.74 내지 60 nM(1:3 희석 시리즈)의 농도로 주입하였다(결합 상). 해리 상을 600초 동안 러닝 완충제로 세척함으로써 모니터링하였다. 표면을, 5 μl/분의 유속으로 3 M MgCl2 용액으로(항-인간 Fc 항체의 경우) 또는 10 mM 글리신(pH 1.5)(항-마우스 Fc 항체의 경우)으로 주입하여 재생하였다. 벌크 굴절률 차이를 모크(mock) 표면으로부터 수득된 반응을 감함으로써 보정하였다. 또한, 블랭크 주입을 감하였다(이중 참조). 유도된 곡선을 BIA 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합 모델에 피팅시켰다.
ANG2
인간 ANG2-RBD-마우스 Fc-영역 융합에 대한 이중특이적 항체의 결합을 바아코어 T200 기구(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 조사하였다. 약 4000 RU의 항-마우스 Fc-영역 항체(10 μg/ml 항-마우스 (Fc) 항체)를 시리즈 S CM5 칩(지이 헬쓰케어 BR-1005-30) 상에 pH 5.0에서 지이 헬쓰케어가 공급하는 아민 커플링 키트를 사용하여 커플링하였다. HBS-N(10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7.4, 지이 헬쓰케어)을 고정 절차 동안 러닝 완충제로서 사용하였다. 하기 동적 특징 규명을 위해, 샘플 및 러닝 완충제는 HBS-P(10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7.4, 0.05% 계면활성제 P20; 지이 헬쓰케어)였다. 유동 세포를 25℃로 설정하고 - 샘플 블록을 12℃로 설정하고 - 동적 특징 규명 전에 러닝 완충제로 2회 프라이밍하였다.
인간 ANG2-RBD-뮤린 Fc-영역 융합을 1 μg/ml 용액을 30초 동안 5 μl/분의 속도로 주입함으로써 포착하였다. 결합을, 300 nM로 출발하여 연속 1:3 희석하면서 용액 중 다양한 농도로 90초 동안 90 μl/분의 유속으로 이중특이적 항체의 주입에 의해 측정하였다. 해리 상을 600초 이하 동안 모니터링하고 샘플 용액에서 러닝 완충제로 스위칭함으로써 촉발하였다. 모든 표면을, 60초 동안 5 μl/분의 유속으로 3 M MgCl2 용액으로 세척하여 재생하였다. 벌크 굴절률 차이를 항-마우스 IgG 항체(Fc) 표면으로부터 수득된 반응을 감함으로써 보정하였다. 또한, 블랭크 주입을 감하였다(= 이중 참조). KD 및 다른 동적 파라미터의 계산을 위해, 랭뮤어 1:1 모델을 사용하였다.
VEGF
인간 VEGF 동형 121에 대한 이중특이적 항체의 결합을 바아코어 T200 기구(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 조사하였다. 항-헥사-히스티딘 항체를 지이 헬쓰케어가 공급하는 아민 커플링 키트를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 CM5 칩(지이 헬쓰케어 BR-1005-30) 상에 커플링하였다. HBS-N(10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7.4, 지이 헬쓰케어)을 고정 절차 동안 러닝 완충제로서 사용하였다. 하기 동적 특징 규명을 위해, 샘플 및 러닝 완충제는 HBS-P(10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7.4, 0.05% 계면활성제 P20; 지이 헬쓰케어)였다. 유동 세포를 25℃로 설정하고 - 샘플 블록을 12℃로 설정하고 - 동적 특징 규명 전에 러닝 완충제로 2회 프라이밍하였다.
히스티딘-태그를 포함하는 인간 VEGF 동형 121을 30초 동안 5 μl/분의 속도로 용액을 주입함으로써 포착하였다. 결합을, 300 nM로 출발하여 연속 1:3 희석하면서 용액 중 다양한 농도로 90초 동안 90 μl/분의 유속으로 이중특이적 항체의 주입에 의해 측정하였다. 해리 상을 600초 이하 동안 모니터링하고 샘플 용액에서 러닝 완충제로 스위칭함으로써 촉발하였다. 모든 표면을 60초 동안 3 M MgCl2 용액으로 5 μl/분의 유속으로 세척함으로써 재생하였다. 벌크 굴절률 차이를 항 항-헥사-히스티딘 항체 표면으로부터 수득된 반응을 감함으로써 보정하였다. 또한, 블랭크 주입을 감하였다(= 이중 참조). KD 및 다른 동적 파라미터의 계산을 위해, 랭뮤어 1:1 모델을 사용하였다.
실시예 27: X-선 구조 결정
Apo Fab 단편 H34
Fab 단편 H34에 대한 결정화 스크리닝을 32 mg/ml의 농도에서 수행하였다. 결정화 액적을, 증기 확산 좌적(vapor diffusion sitting drop) 실험에서 0.1 μl의 단백질 용액을 0.1 μl의 저장 용액과 혼합함으로써 21℃로 설정하였다. 결정은 침전제로서 PEG를 함유하는 다양한 조건에서 생성되었다. 결정을 사용하여, 0.1 M HEPES pH 7.0, 20% PEG 4000 및 0.1M 나트륨 카코딜레이트, 15% PEG4000로부터 2일 이내에 생성된 H34의 구조를 결정하였다.
결정을 건조된 동결보호제로서 파라핀 오일을 사용하여 채취한 후에, 액체 N2에서 플래쉬-냉각하였다. 확산 이미지를 스위스 라이트 소스(Swiss Light Source)의 빔 라인 X10SA에서 100K에서 필라터스(Pilatus) 6M 검출기로 수득하고 XDS 패키지로 처리하였다(문헌[Kabsch, W. Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J. Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800]). 2개의 결정으로부터 수득된 데이터를 병합하여 결정학적 비대칭 유닛 당 공간군 P1 및 2개의 Fab의 1.64 Å 분해능 데이터 세트를 산출하였다(하기 표 참조).
구조를, 서치 모델로서 로슈 인터널 PDB-ID 1htfr의 Fab 577을 사용하여 분자 재배치에 의해 결정하였다. Fab를 불변 도메인 및 가변 도메인으로 분할하고, 둘 다를 CCP4 프로그램 PHASER CCP4(문헌[CCP4 (Collaborative Computational Project, N. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr. D, (1994) 760-763])에서 별개의 서치를 위해 사용하여 팔꿈치 각도의 가능한 변화를 설명하였다. 모델을 COOT(문헌[Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG. & Cowtan, K. Features and development of COOT. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60 (2010) 486-501])에서 재구성하고 CCP4 프로그램으로 보정하였다.
Figure pct00036
인간 IL- 1베타를 갖는 복합 Fab 단편 H34
결정화 스크리닝 전에 Fab 단편 H34를 1.2:1의 몰비로 IL-1베타(페프로테크)와 혼합하였다. 단백질 혼합물을 21℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 결정화 실험에서 사용된 단백질 농도는 32 mg/ml이었다. 결정화 액적을, 증기 확산 좌적 실험에서 0.1 μl의 단백질을 0.1 μl의 저장 용액과 혼합함으로써 21℃로 설정하였다. 결정은 0.1 M 트리스 pH 8.0, 20% PEG 4000으로부터 2일 이내에 생성되었고 4일 이내에 0.15 mm x 0.06 mm x 0.01 mm의 최종 크기로 성장하였다.
결정을 건조된 동결보호제의 첨가없이 채취한 후에, 액체 N2에서 플래쉬-냉각하였다. 확산 이미지를 스위스 라이트 소스의 빔 라인 X10SA에서 100K에서 필라터스 6M 검출기로 수득하고 XDS 패키지로 처리하였다(문헌[Kabsch, W. Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J. Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800 (1993)]). 데이터 수집 및 처리는 H34 apo 결정의 경우와 동일한 방법을 따랐다(상기 참조). 통계 수집을 상기 표에 나타냈다. 2개의 결정으로부터 수득된 데이터를 병합하여 보다 완전한 데이터 세트를 산출하였다. 분자 재배치를 서치 모델과 같이 H34 Fab 구조 및 인터류킨-1베타(PDB-ID 1l2h)를 사용하여 성공하였다. 모델 구성 및 보정을 상기에 기재된 바와 같이 수행하였다.
Figure pct00037
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> ANTI-IL-1beta ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> P32414 <140> PCT/EP2015/075875 <141> 2015-11-06 <150> EP14192523.0 <151> 2014-11-10 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Thr Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Phe Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 105 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Ser Gln Gln Lys Ser Gly Ser Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Asn Tyr Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> huH34-1 VH <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Gly Phe Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> huH34-2 VH <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> huH34-3 VH <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> huH34 VK <400> 6 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Ser Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Asn Tyr Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> huH34 test 1 VH <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Phe Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> huH34 test 1 VK <400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Asn Tyr Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ser Pro Thr Arg Tyr Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys His His Phe Tyr Asn Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 1 5 <210> 12 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Tyr Asn Ala 1 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Arg Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Ser Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 16 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Ser Thr Ser 1 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Trp Ser Asn Tyr Tyr 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> huH34-1-HVR-H1 <400> 18 Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 1 5 <210> 19 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> huH34-1-HVR-H2s <400> 19 Tyr Ser Gly 1 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> huH34-1-HVR-H2 <400> 20 Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Gly Phe Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Ser Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 23 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Ser Thr Ser 1 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Trp Ser Asn Tyr Tyr 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 1 5 <210> 26 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Tyr Asn Ala 1 <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> huH34-2-HVR-H2 <400> 27 Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu 1 5 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Ser Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 30 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Ser Thr Ser 1 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Trp Ser Asn Tyr Tyr 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 1 5 <210> 33 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> huH34-3-HVR-H2s <400> 33 Tyr Ser Ala 1 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> huH34-3-HVR-H2 <400> 34 Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu 1 5 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 Ser Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 37 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Ser Thr Ser 1 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Trp Ser Asn Tyr Tyr 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 1 5 <210> 40 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40 Tyr Tyr Gly 1 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41 Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 Gly Ser Pro Thr Arg Tyr Tyr Val Met Asp 1 5 10 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 1 5 <210> 44 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Ala Ala Thr 1 <210> 45 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Phe Tyr Asn Thr Pro Trp 1 5 <210> 46 <211> 269 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser 1 5 10 15 Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Gln Met 20 25 30 Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile 35 40 45 Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala 50 55 60 Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro 65 70 75 80 Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe 85 90 95 Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala 100 105 110 Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp 115 120 125 Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala 130 135 140 Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met 145 150 155 160 Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu 165 170 175 Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp 180 185 190 Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys 195 200 205 Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn 210 215 220 Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr 225 230 235 240 Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly 245 250 255 Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 260 265 <210> 47 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 48 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 49 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CrossMab Ang2mut4 + huH34-2 HC1 <400> 49 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser 100 105 110 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 115 120 125 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 130 135 140 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 145 150 155 160 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 180 185 190 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 195 200 205 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 210 215 220 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 225 230 235 240 Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 245 250 255 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 260 265 270 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 275 280 285 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln 290 295 300 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 305 310 315 320 Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 325 330 335 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr 340 345 350 Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 355 360 365 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 370 375 380 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 385 390 395 400 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 405 410 415 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys 420 425 430 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 50 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CrossMab Ang2mut4 + huH34-2 HC2 <400> 50 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys 355 360 365 Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 51 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CrossMab Ang2mut4 + huH34-2 LC1 <400> 51 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Pro Gly Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Pro Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 52 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CrossMab Ang2mut4 + huH34-2 LC2 <400> 52 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Ser Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Asn Tyr Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 110 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 140 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 145 150 155 160 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 165 170 175 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 180 185 190 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 195 200 205 Arg Gly Glu Cys 210 <210> 53 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Ang2 LC10 wt + G114A, S360P, T28N, T30A (HC) + D50T (LC) VH <400> 53 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Pro Gly Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Pro Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 54 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Ang2 LC10 wt + G114A, S360P, T28N, T30A (HC) + D50T (LC) VL <400> 54 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser 100 105 110 <210> 55 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VEGF_LC VHVL cross LC kappa <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 56 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VEGF_LC10 VHVL cross IgG HC LALAPGAAA knob <400> 56 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 57 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CrossMab Ang2mut5 + huH34-2 HC1 <400> 57 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser 100 105 110 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 115 120 125 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 130 135 140 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 145 150 155 160 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 180 185 190 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 195 200 205 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 210 215 220 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 225 230 235 240 Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 245 250 255 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 260 265 270 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 275 280 285 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln 290 295 300 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 305 310 315 320 Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 325 330 335 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr 340 345 350 Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 355 360 365 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 370 375 380 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 385 390 395 400 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 405 410 415 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys 420 425 430 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 58 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CrossMab Ang2mut5 + huH34-2 HC2 <400> 58 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys 355 360 365 Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 59 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CrossMab Ang2mut5 + huH34-2 LC1 <400> 59 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ser Ser Pro Gly Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Pro Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 60 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CrossMab Ang2mut5 + huH34-2 LC2 <400> 60 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Ser Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Asn Tyr Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 110 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 140 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 145 150 155 160 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 165 170 175 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 180 185 190 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 195 200 205 Arg Gly Glu Cys 210

Claims (11)

  1. (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 인간 및 사이노몰구스 IL-1베타에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체로서,
    위치 48의 중쇄 가변 도메인이 이소류신 아미노산 잔기이고, 위치 67의 중쇄 가변 도메인이 알라닌 아미노산 잔기이고, 위치 69의 중쇄 가변 도메인이 페닐알라닌 아미노산 잔기이고, 위치 93의 중쇄 가변 도메인이 발린 아미노산 잔기이고, 위치 36의 경쇄 가변 도메인이 세린 아미노산 잔기인(카바트에 따른 넘버링), 인간화된 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 서열번호 4의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열, (b) 서열번호 6의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열, 또는 (c) (a)와 같은 VH 서열 및 (b)와 같은 VL 서열을 포함하는 인간화된 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    서열번호 4의 VH 서열 및 서열번호 6의 VL 서열을 포함하는 인간화된 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 서브클래스 IgG1의 것 또는 인간 서브클래스 IgG4의 것인 인간화된 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 IL-1 수용체에 대한 인간 IL-1베타의 결합을 억제함으로써 인간 IL-1베타의 생물학적 활성을 차단하는 인간화된 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 임의적으로 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형.
  7. 제6항에 있어서,
    항-ANG2 항체 및 항-VEGF 항체로부터 선택된 추가적 치료제를 추가로 포함하는 약학 제형.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한 인간화된 항체.
  9. 약제의 제조에서 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 인간화된 항체의 용도.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    약제가 눈 혈관 질환의 치료, 바람직하게는 황반 변성의 치료를 위한 것인, 용도.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제가 IL-1베타와 IL-1 수용체 I 및 II 사이의 상호작용을 억제하기 위한 것인, 용도.
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