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CN107074942A - 抗‑IL‑1β抗体和使用方法 - Google Patents

抗‑IL‑1β抗体和使用方法 Download PDF

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CN107074942A CN201580060880.4A CN201580060880A CN107074942A CN 107074942 A CN107074942 A CN 107074942A CN 201580060880 A CN201580060880 A CN 201580060880A CN 107074942 A CN107074942 A CN 107074942A
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彼得·迈克尔·许尔斯曼
克里斯蒂安·加斯纳
塞巴斯蒂安·布罗伊尔
奥拉夫·蒙迪戈
盖伊·乔治
拉尔夫·舒马赫
古伊多·哈特曼
扎比内·格吕纳
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

本文提供人源化抗‑IL‑1β抗体，其是鼠抗‑IL‑1β抗体H34的人源化变体。一种具体的人源化抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR‑H1，(b)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR‑H2，和(c)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR‑H3。

Description

抗-IL-1β抗体和使用方法
发明领域
本发明涉及抗-IL-1β抗体和使用其的方法。
背景技术
淋巴因子，如IL-1，是多细胞来源的，并且通过它们的多面性调节作用，它们在宿主响应感染期间影响多种不同的靶细胞。在炎症部位的IL-1激活淋巴细胞、粒细胞和成纤维细胞。并且，IL-1还作用为急性期反应的介质，促进结构蛋白和基质的分解代谢并调节发热反应。
已经鉴定了两种共有人白介素-1(IL-1)活性但是为结构迥异的分子的蛋白。这些蛋白称为IL-1α和IL-1β，彼此竞争与IL-1受体结合并介导类似的生物学活性。两种分子合成为大的前体(MW约为30,000Da)，该前体被加工成较小的生物学活性形式(MW约为17,500Da)。然而，它们由两种不同的互补DNA编码，仅表现出26％的氨基酸同源性，并且分别具有5和7的pI(等电pH)。
在US 4,935,343中记载了结合IL-1β而不结合IL-1α的单克隆抗体(还参见Kenney等人，J.Immunol.138(1987)4236-4242)。所述抗体结合IL-1β并且阻断与IL-1β的受体结合和IL-1β的生物学活性。
WO 2004/067568报道了人IL-1β拮抗剂。
概述
本发明提供抗-IL-1β抗体和使用其的方法。在具体的实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些人源化抗体中，已经去除降解热点，以确保用于大规模生产的抗体的可开发性的改善。
本文报道的一方面是结合人和食蟹猴IL-1β的分离的抗体，其中所述抗体是鼠抗体的人源化变体，其中所述鼠抗体包含SEQ ID NO:01的重链可变结构域和SEQ ID NO:02的轻链可变结构域。
本文报道的一方面是特异性结合人和食蟹猴IL-1β的人源化抗体，其中所述人源化抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H3。
本文报道的一方面是特异性结合人和食蟹猴IL-1β的人源化抗体，其中所述人源化抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3。
本文报道的一方面是特异性结合人和食蟹猴IL-1β的人源化抗体，其中所述人源化抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-H3。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述人源化抗体还包含：(a)包含SEQID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L3。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述人源化抗体在重链可变结构域进一步包含位置48的异亮氨酸氨基酸残基，位置67的丙氨酸氨基酸残基，位置69的苯丙氨酸氨基酸残基和位置93的缬氨酸氨基酸残基，并且在轻链可变结构域中包含位置36的氨基酸残基丝氨酸(按照Kabat编号)。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述人源化抗体包含：(a)与SEQ IDNO:04的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列，(b)与SEQ ID NO:06的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列，或(c)(a)中的VH序列与(b)中的VL序列。
在一个优选的实施方案中，所述人源化抗体包含SEQ ID NO:04的VH序列和SEQ IDNO:06的VL序列。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述人源化抗体是人IgG1亚类的或人IgG4亚类的人源化抗体。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述人源化抗体是具有κ轻链的人IgG1亚类的人源化抗体。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述人源化抗体是单克隆抗体。
本文报道的一方面是包含SEQ ID NO:04的VH序列和SEQ ID NO:06的VL序列的抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是双特异性抗体。
在所有方面的一个实施方案中，所述人源化抗体特异性结合人IL-1β但不结合人IL-1α。
在所有方面的一个实施方案中，所述人源化抗体通过抑制人IL-1β与人IL-1受体的结合而阻断人IL-1β的生物学活性。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，本文报道的人源化抗体特异性结合IL-1β受体结合位点上的两个决定簇或邻近IL-1β受体结合位点的两个决定簇。
在所有方面的一个优选的实施方案中，本文报道的人源化抗体阻断IL-1R1和IL-1RAcP与IL-1β的相互作用。
在本文报道的所有方面的一个优选的实施方案中，本文报道的人源化抗体在其组装的第一步阻断IL-1β信号传导复合物的形成(即，其阻断IL-1β与IL-1R1的缔合)。
本文报道的一方面是编码本文报道的抗体的(分离的)核酸。
本文报道的一方面是包含本文报道的核酸的宿主细胞。
本文报道的一方面是制备本文报道的抗体的方法，所述方法包括培养本文报道的宿主细胞，从而产生所述抗体，并且从所述宿主细胞或培养基中回收所述抗体。
本文报道的一方面是包含本文报道的抗体和药用载体的药物制剂。
在一个实施方案中，所述药物制剂进一步包含另外的治疗剂。在一个实施方案中，所述另外的治疗剂是抗-ANG2抗体或抗-VEGF抗体。
本文报道的一方面是本文报道的抗体，其用作药物。
本文报道的一方面是本文报道的抗体，其用于治疗眼血管疾病，优选用于治疗黄斑变性。
本文报道的抗体用于抑制IL-1β与IL-1受体I和II之间的相互作用。
本文报道的一方面是本文报道的抗体在制备药物中的应用。
在一个实施方案中，所述药物用于治疗眼血管疾病，优选用于治疗黄斑变性。
在一个实施方案中，所述药物用于抑制IL-1β与IL-1受体I和II之间的相互作用。
本文报道的一方面是治疗患有眼血管疾病、优选患有黄斑变性的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文报道的抗体。
本文报道的一方面是抑制个体中IL-1β与IL-1受体I和II之间的相互作用的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文报道的抗体，从而抑制IL-1β与IL-1受体I和II之间的相互作用。
发明实施方案详述
I.定义
术语“不结合”意指，如以基于ELISA或表面等离子体共振的方法确定的，当将抗体与IL-1α或与成纤维细胞生长因子组合时没有观察到高于背景的显著结合。
用于本文的目的的“接纳体人框架”是包含如下文定义的源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的接纳体人框架可以包含其相同氨基酸序列，或其可以含有氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸改变的数量为10个或更少，9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，或2个或更少。在一些实施方案中，VL接纳体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力”表示分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本文中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。通过本领域已知的常见方法(包括本文描述的那些)，可以测量亲和力。在下面描述了用于测量结合亲和力的具体举例性和示例性的实施方案。
“亲和力成熟的”抗体表示，与不具有这种改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，这种改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。
术语“抗-IL-1β抗体”和“结合IL-1β的抗体”表示这样的抗体：其能够以足够的亲和力结合IL-1β，使得所述抗体可用作靶向IL-1β的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，如例如通过ELISA或表面等离子体共振所测得的，抗-IL-1β抗体与无关的、非-IL-1β蛋白结合的程度小于所述抗体与IL-1β的结合的约10％。在某些实施方案中，结合IL-1β的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM(例如，10-8M或更低，例如，10-8M至10-10M，例如，10-9M至10-10M)的解离常数(KD)。在某些实施方案中，抗-IL-1β抗体结合在来自不同物种的IL-1β之间保守的IL-1β的表位。
本文中的术语“抗体”以最宽泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括，但不限于，单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”表示除了完整抗体以外的分子，所述分子包含完整抗体的一部分，所述部分结合所述完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于：Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；直链抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由多个抗体片段形成的多特异性抗体。
与参比抗体“结合相同表位的抗体”是指与所述参比抗体一样具有与至少一些相同的氨基酸残基相互作用的抗体。例如，这些相互作用是带电荷氨基酸残基之间的离子相互作用或疏水氨基酸残基之间的疏水相互作用。
术语“嵌合的”抗体表示这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，同时重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种。
抗体的“类型”表示其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要的抗体类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“免疫缀合物”表示抗体与非抗体结构部分之间的共价缀合物。所述非抗体结构部分可以是检测标记、效应分子或细胞毒性剂。
本文中使用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括，但不限于：放射性同位素(例如，At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段诸如溶核酶；抗生素；毒素诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和下面公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“效应子功能”表示可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，其随抗体种类改变。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B-细胞活化。
试剂(例如，药物制剂)的“有效量”表示在必要的剂量和持续必要的时间段，有效地实现期望的治疗或预防结果的量。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-端区域，该区域含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。但是，Fc区的C-端赖氨酸(Lys447)或C端甘氨酰-赖氨酸二肽(Gly446Lys447)可以存在或可以不存在。除非在本文中另外指出，在Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如在Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication 91-3242中所述。
“框架”或“FR”表示除了高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以下述顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完整的抗体”在本文中互换地用于表示这样的抗体：其具有与天然抗体结构基本上类似的结构或具有含有如本文中定义的Fc区的重链。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”互换使用，且表示其中已经引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和由其来源的后代(不考虑传代次数)。后代在核酸内容物方面可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。针对最初转化的细胞筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代包括在本文中。
“人抗体”是这样的抗体：其氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体或源自利用人抗体组库(repertoires)或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。该人抗体的定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常出现的氨基酸残基的框架。通常，从可变结构域序列的亚组选择人免疫球蛋白VL或VH序列。通常，序列的亚组是如Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版,Bethesda MD(1991)，NIH Publication 91-3242，第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，所述亚组是如在Kabat等人(出处同上)中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，所述亚组是如在Kabat等人(出处同上)中的亚组III。
“人源化”抗体表示包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个和通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”表示已经经历人源化的抗体。
本文中使用的术语“高变区”或“HVR”表示抗体可变结构域的在序列上高变(“互补性决定区”或“CDR”)和/或形成在结构上确定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的每个区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL(L1、L2、L3)中。
本文的HVR包括：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处存在的高变环(Chothia，C.和Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处存在的CDR(Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242.)；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处存在的抗原接触点(MacCallum等人J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，其包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)，和94-102(H3)。
除非另有说明，可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人(出处同上)编号。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，驯养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物诸如猴)，兔，和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已经与它的天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)来确定。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman，S.等人，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。
“分离的”核酸表示已经与它的天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但是所述核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置。
“分离的编码抗-IL-1β抗体的核酸”表示编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单个载体或分开的载体中的这样的核酸分子、以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置的这样的核酸分子。
本文中使用的术语“单克隆抗体”表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括，但不限于，杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其他示例性的制备单克隆抗体的方法。
“裸(naked)抗体”表示没有与异源结构部分(例如，细胞毒性的结构部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”表示具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N-端至C-端，每个重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N-端至C-端，每个轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，接着是恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列归入两种类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。
术语“包装说明书”用于表示治疗性产品的商业包装中通常包括的使用说明，其含有关于这样的治疗性产品的使用的适应证、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌和/或告诫的信息。
相对于参比多肽序列而言的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为，比对所述序列，如果必要的话引入间隙以实现最大序列同一性百分比，且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分，候选序列中与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术中的多种方式实现，例如，使用公众可得到的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括实现在要对比的序列的全长上的最大比对所需的任何算法。但是，为了本文的目的，使用序列对比计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列对比计算机程序由Genentech,Inc.创造，并且源代码已经在美国版权局(U.S.Copyright Office，Washington D.C.，20559)与用户文档一起提交，其在美国版权登记号TXU510087下登记。ALIGN-2程序可以从Genentech，Inc.，South San Francisco，California公开获得，或可以从源代码编译。应该编译ALIGN-2程序以在UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列对比参数由ALIGN-2程序设定并且不改变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列对比的情况下，按下述计算给定氨基酸序列A相对、与、或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以可替换地叙述为相对、与、或针对给定氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)：
100×分数X/Y
其中X是通过序列比对程序ALIGN-2(在该程序的A和B的比对中)评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A相对B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别说明，本文使用的所有％氨基酸序列同一性值如在紧邻的上一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”表示这样的制品：其呈使得包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式，并且所述制剂不含有对所述制剂要施用的受试者有不可接受的毒性的额外组分。
“药学上可接受的载体”表示药物制剂中除了活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的载体包括，但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
用在本文中的术语“IL-1β”是指人IL-1β。该术语包括“全长”、未加工的IL-1β以及由于在细胞内加工导致的任何形式的IL-1β。该术语还包括天然存在的IL-1β变体，例如，剪接变体或等位基因变体。人IL-1β的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:46中。
本文中使用的“治疗(treatment)”(和其语法变体诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)表示试图改变治疗的个体的天然进程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学进程中执行。期望的治疗效果包括，但不限于：防止疾病的发生或复发，缓解症状，减少疾病的任何直接或间接病理学后果，防止转移，降低疾病进展的速度，改善或减轻疾病状态，以及减轻或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与所述抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有类似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见，例如，Kindt，T.J.等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman&Co.，N.Y.(2007)，第91页)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原-结合特异性。此外，使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分别筛选互补VL或VH结构域的文库，可以分离结合特定抗原的抗体(参见，例如，Portolano，S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson，T.等人，Nature 352(1991)624-628)。
本文中使用的术语“载体”表示能够扩增与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合进它已经引入其中的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文称为“表达载体”。
II.组合物和方法
本发明的单克隆人源化抗体是命名为ILB1-H34(短H34)的鼠抗体的人源化形式。其特异性结合IL-1β分子上参与IL-1β的受体结合和增殖活性的决定簇位点。所述单克隆人源化抗体不结合IL-1α，并且不结合酸性或碱性成纤维细胞生长因子。抗体ILB1-H34阻断碘125标记的IL-1β与小鼠3T3成纤维细胞上的IL-1受体的结合和IL-1β诱导的胸腺细胞增殖。该抗体是IgG1κ同种型的。鼠HLB1-H34抗体由ILB1-H34鼠杂交瘤细胞产生。
在一方面中，本发明是部分基于这样的发现：对于鼠抗-人IL-1β抗体H34的人源化，必须在某些位置引入回复突变，从而补偿由于去除HVR-H2中的半胱氨酸残基(这是改善抗体的可开发性(developability)和确保大规模生产的适宜性所需要的)导致的亲和力损失。在某些实施方案中，提供结合人IL-1β的人源化抗体。例如，本发明的抗体可用于治疗眼血管疾病，诸如黄斑变性。
A.示例性的抗-IL-1β抗体
本文提供四种新型的抗-人IL-1β抗体。
第一种抗-IL-1β抗体是新型的鼠抗-人IL-1β抗体，其具有SEQ ID NO:09的VH和SEQ ID NO:10的VL。该抗体在下文中称为mumAb。该抗体结合人、食蟹猴、兔、大鼠和鼠IL-1β，并且抑制IL-1β与人IL-1受体I和II之间的相互作用。
该抗体具有下述特性：
上述数据是通过BIAcore确定的。
上述数据是通过ELISA确定的。
对IL-1β与IL-1受体I和II结合的抑制：
上述数据是通过ELISA确定的。
在刺激实验中，其可以表明，当用IL-1β刺激A549细胞时，本文报道的鼠抗体能够抑制ICAM-1表达(见下表)。
在下表中，显示了当用IL-1β刺激HUVEC细胞时抑制ICAM-1表达的IC50值。
在刺激实验中，其可以表明，当用IL-1β刺激A549细胞时，本文报道的人源化抗体减少IL-6表达(见下表)。
另外，鼠抗体在应激试验中表现出稳定性。结合活性使用表面等离子体共振确定(见下表)。
100％＝保存在-80℃的样品
当确定高分子量内容物时，可以观察到相同的稳定性(见下表)。
在CE-SDS分析中可以观察到相同的稳定性(见下表)。
通过确定聚集开始温度(Tagg)和解链温度(Tm)评价鼠抗体的热稳定性(见下表)。
抗体 Tagg[℃] Tm[℃]
mumAb 约60 约64
其余三种抗体是鼠抗-IL1-β抗体H34的人源化变体：huH34-1(SEQ ID NO:3，6，和18-24)，huH34-2(SEQ ID NO:4，6和25-31)以及huH34-3(SEQ ID NO:5，6和32-38)。
本文报道了人源化抗-IL-1β抗体。该抗体衍生自鼠抗-IL-1β抗体H34。
本文报道的一方面是鼠抗-IL-1β抗体H34的人源化变体。US 4,935,343报道了该抗体。
基于鼠H34抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO:01和02)，产生相对应的人源化抗-IL-1β抗体(huH34-2)。人源化变体VH是基于人VBase_VH1_1和人IGHJ4-01-3种系的J-元件(huH34-1)。为了恢复亲和力，在框架区2的位置48引入一个回复突变(M48I)。在框架区3中，4个位置被回复突变：V67A，M69F，R71V和A93V。另外，HVR-H2的位置52a的半胱氨酸被替换为丝氨酸。对于VL，人源化变体是基于具有IGKJ2-01J-元件的人IMGT_hVK_3_11种系。在框架区2的位置36引入一个回复突变(Y36S)。人源化VH的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:04中，人源化VL的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:06中。
鼠抗-IL-1β抗体H34在HVR-H2中包含半胱氨酸(C52a，Kabat编号)，为了开发能够大规模生产的治疗剂候选物，该半胱氨酸需要被去除。通过在鼠抗体中的C52aS突变去除该Cys导致针对IL-1β的亲和力降低约6-7倍(见下表)。
上述数据通过BIAcore确定。
对于H34(huH34-2)的人源化形式，在C52aS突变时亲和力丧失得到补偿，并且该抗体具有与鼠亲本抗体H34相当的亲和力(以及在细胞测定中相当的功能性功效)。
该补偿作用可归因于选择用于人源化的种系序列和在框架IGHJ4-01-3与IMGT_hVK_3_11内的回复突变的选择。基于相同的人种系分别为VH(IGHJ4-01-3)和VL(IMGT_hVK_3_11)设计另外的变体。从VH和VL序列(SEQ ID NO:7和8)中省略为huH34-2所述的回复突变。
上述数据通过BIAcore确定。
在一个实施方案中，所述人源化抗-IL-1β抗体结合人和食蟹猴IL-1β。
在人IL-1β的存在下，对于Gevokizumab，在使用固定的IL-1受体I的表面等离子体共振实验中的结合信号增加。因此，抗体结合的IL-1b仍然结合IL-1受体I。因此，Gevokizumab的作用模式是对IL-1RAc结合的别构抑制(别构抗体)。
对于Canakinumab，在抗体结合后，防止了H34和mumAb IL-1β与IL-1受体I的结合。因此，对于Canakinumab、H34和mumAb，作用模式是受体阻断(竞争性抗体)。
在刺激实验中，可以显示本文报道的人源化抗体具有与鼠亲本抗体相同的活性。在下表中，显示了不同抗体在用IL-1β刺激A549细胞时抑制ICAM-1表达的IC50值。
在下表中，显示了在用IL-1β刺激HUVEC细胞时抑制ICAM-1表达的IC50值。
在刺激实验中，可以显示本文报道的人源化抗体在用IL-1β刺激A549细胞时减少IL-6表达(见下表)。
在增殖抑制实验中，可以显示本文报道的人源化抗体抑制D10细胞的增殖(见下表)。
在下表中，显示了对于不同抗体在用MSU刺激THP1细胞时对TNFα表达抑制的IC50值。
另外，与鼠H34亲本抗体相比，在应激试验中，人源化抗体表现出改善的稳定性。结合活性使用表面等离子体共振确定(见下表)。
100％＝保存在-80℃的样品
当确定高分子量内容物时，可以观察到相同的稳定性(见下表)。
在CE-SDS分析中可以观察到相同的稳定性(见下表)。
通过确定聚集开始温度(Tagg)和解链温度(Tm)评价不同人源化抗体的热稳定性(见下表)。
抗体 Tagg[℃] Tm[℃]
huH34-1 61.5 69.1
huH34-2 63.0 72.0
huH34-3 63.0 70.6
与人IL-1β结合的huH34-2Fab-片段的高分辨率晶体结构表现出关于该抗体的功能性表位的详细信息。将该结构与三元IL-1b信号传导复合物(与IL-1受体1(即IL-1R1)和IL-1辅助蛋白IL-1RAcP结合的人IL-1b，PDB编号为4DEP)的结构相比。发现huH34的表位与IL-1R1和IL-1RAcP二者的相互作用位点重合。因此，所述抗体在其组装的第一步阻断IL-1β信号传导复合物的形成，该第一步是IL-1β和IL-1R1的缔合。
抗体0031是一种双特异性抗-ANG2/IL-1β抗体，其包含huH34-2的VH和VL结构域作为IL-1β结合特异性。
抗体0032是一种双特异性抗-VEGF/IL-1β抗体，其包含huH34-2的VH和VL结构域作为IL-1β结合特异性。
为了确定动力学结合值，使用实施例26中报道的测定。
ANG2 ka[1/Ms] kd[1/s] KD*[nM] t1/2[s]
抗体-0031 1.45E+05 1.15E-03 8 604
VEGF ka[1/Ms] kd[1/s] KD*[nM] t1/2[s]
抗体-0032 2.77E+04 <1E-06 <0.1 -
通过SPR分析已经证明所有的双特异性抗体具有同时与其两个抗原结合的特性。
在ANG2特异性pTie2-ELISA中，抗体0031的活性是WO 2014/09465中报道的抗-ANG2/VEGF抗体的6倍。
在一个实施方案中，所述人源化抗-IL-1β抗体结合人和食蟹猴IL-1β。
在下表中，显示当用IL-1β刺激A549细胞时对ICAM-1表达抑制的IC50值。
在下表中，显示当用IL-1β刺激HUVEC细胞时对ICAM-1表达抑制的IC50值。
在刺激实验中，可以显示本文报道的人源化抗体在用IL-1β刺激A549细胞时减少IL-6表达(见下表)。
通过确定聚集开始温度(Tagg)和解链温度(Tm)评价不同双特异性抗体的热稳定性(见下表)。
抗体 Tagg[℃] Tm[℃]
0031 61 67.5
0032 55 62.5
记载抗体huH34-2具有SEQ ID NO:04，06和25-31的序列(结合位点，HVRs，VH，VL)。在序列SEQ ID NO:49-52和57-60中记载了抗体huH34-2的双特异性形式。所有这些序列单独地或组合地组成本发明的各个方面。
本文报道的一方面是包含下述的人源化抗-人IL-1β抗体：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-L3。在一个优选的实施方案中，本文报道的人源化抗-人IL-1β抗体特异性结合人和食蟹猴IL-1β，并且包含：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-L2，和(f)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-L3。在一个优选的实施方案中，本文报道的人源化抗-人IL-1β抗体具有具有SEQ ID NO:04的氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:06的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一个优选的实施方案中，本文报道的人源化抗-人IL-1β抗体是一种双特异性抗体。
本文报道的一方面是包含下述的人源化抗-人IL-1β抗体：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-L3。
本文报道的一方面是包含下述的抗-人IL-1β抗体：(a)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ IDNO:45的氨基酸序列的HVR-L3。
在一方面中，本发明提供一种抗-IL-1β抗体，其包含选自下述的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQID NO:29的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-L3。
在一方面中，本发明提供包含选自下述的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列的抗体：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-L3。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3，含有SEQID NO:31的氨基酸序列的HVR-L3，和含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-H2。在另一个实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面中，本发明提供包含选自下述的至少一个、至少两个或全部三个VLHVR序列的抗体：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面中，本发明的抗体包含：(a)包含选自下述的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列的VH结构域：(i)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)包含选自下述的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列的VL结构域：(i)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面中，本发明提供包含下述的抗体：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面中，抗-IL-1β抗体包含与SEQ ID NO:04的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-IL-1β抗体保留结合IL-1β的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:04中总共1-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-IL-1β抗体包含SEQ ID NO:04中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个具体的实施方案中，VH包含选自下述的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3。
在另一方面中，提供一种抗-IL-1β抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:06具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-IL-1β抗体保留结合IL-1β的能力。在某些实施方案中，SEQ IDNO:06中总共1-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-IL-1β抗体包含SEQ ID NO:06中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个具体的实施方案中，VL包含选自下述的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一方面中，提供一种抗-IL-1β抗体，其中所述抗体包含在上文提供的任一个实施方案中的VH和在上文提供的任一个实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体包含分别处在SEQ ID NO:04和SEQ ID NO:06中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在本发明的另一方面中，按照上述任一实施方案所述的抗-IL-1β抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，抗-IL-1β抗体是抗体片段，例如，Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，所述抗体是全长抗体，例如，完整的IgG1抗体或本文定义的其他抗体种类或同种型。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述抗-IL-1β抗体是效应子沉默的抗-IL-1β抗体。在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述抗-IL-1β抗体是效应子沉默的抗-IL-1β抗体并且不结合人FcRn。在本文报道的所有方面的一个实施方案中是人IgG1亚类的抗-IL-1β抗体并且在两条重链中都具有突变L234A、L235A、P329G、I253A、H310A和H434A(按照Kabat索引编号)。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述抗-IL-1β抗体是双特异性抗体。
本文报道的一方面是二价的双特异性抗体，其包含：
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH彼此替换，
其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
a)中的抗体不包含b)中报道的修饰，并且a)中重链和轻链是分离的链。
在b)中的抗体中，
在所述轻链中
可变轻链结构域VL替换为所述抗体的可变重链结构域VH，并且
在所述重链中
可变重链结构域VH替换为所述抗体的可变轻链结构域VL。在一个实施方案中，
i)在a)中第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(按照Kabat编号)被置换为带正电荷的氨基酸，并且，其中在a)中第一重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸(按照Kabat EU索引编号)被置换为带负电荷的氨基酸，
或
ii)在b)中第二轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(按照Kabat编号)被置换为带正电荷的氨基酸，并且，其中在b)中第二重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸(按照Kabat EU索引编号)被置换为带负电荷的氨基酸。
在一个优选的实施方案中，
i)在a)中第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸独立地被置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(按照Kabat编号)(在一个优选的实施方案中，独立地被置换为赖氨酸(K)或精氨酸(R))，并且，其中在a)中第一重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸独立地被置换为谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(按照Kabat EU索引编号)，
或
ii)在b)中第二轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸独立地被置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(按照Kabat编号)(在一个优选的实施方案中，独立地被置换为赖氨酸(K)或精氨酸(R))，并且，其中在b)中第二重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸独立地被置换为谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(按照Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸被置换为K(按照Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸被置换为E(按照Kabat的EU索引编号)。
在一个优选的实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸被置换为K，并且，在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸被置换为E(按照Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸被置换为K，并且，其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸被置换为E，并且在第一轻链的结构域VL中，位置38的氨基酸被置换为K，在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸被置换为E，在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸被置换为K，并且在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸被置换为E(按照Kabat EU索引编号)。
本文报道的一方面是二价的双特异性抗体，其包含:
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH彼此替换，并且，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替换，
其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
a)中的抗体不包含b)中报道的修饰，并且a)中的重链和轻链是分离的链。
在b)中的抗体中
在轻链中
可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替换，并且恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替换；
并且
在重链中
可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL替换，并且恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL替换。
本文报道的一方面是二价的双特异性抗体，其包含：
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替换，
其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
a)中的抗体不包含b)中报道的修饰，并且a)中的重链和轻链是分离的链。
在b)中的抗体中
在轻链中
恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替换；并且在重链中
恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL替换。
本文报道的一方面是多特异性抗体，其包含：
a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，和
b)一个、两个、三个或四个单链Fab片段，其特异性结合一至四种其他抗原(即，第二和/或第三和/或第四和/或第五抗原，优选地，特异性结合一种其他抗原，即第二抗原)，
其中b)中所述的单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链或轻链的
C-或N-端的肽接头融合到a)中所述的全长抗体上，
其中第一抗原或所述其他抗原中的一种是人IL-1β。
在一个实施方案中，与第二抗原结合的一个或两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链或轻链的C-端的肽接头融合到所述全长抗体上。
在一个实施方案中，与第二抗原结合的一个或两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链的C-端的肽接头融合到所述全长抗体上。
在一个实施方案中，与第二抗原结合的一个或两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的轻链的C-端的肽接头融合到所述全长抗体上。
在一个实施方案中，与第二抗原结合的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每个重链或轻链的C-端的肽接头融合到所述全长抗体上。
在一个实施方案中，与第二抗原结合的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每个重链的C-端的肽接头融合到所述全长抗体上。
在一个实施方案中，与第二抗原结合的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每个轻链的C-端的肽接头融合到所述全长抗体上。
本文报道的一方面是三价的双特异性抗体，其包含：
a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗
体轻链组成，
b)第一多肽，其由下述组成：
ba)抗体重链可变结构域(VH)，
或
bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，
其中所述第一多肽通过肽接头以其VH结构域的N-端融合到所述全长抗体的两条重链中的一条的C-端，
c)第二多肽，其由下述组成：
ca)抗体轻链可变结构域(VL)，
或
cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)，
其中所述第二多肽通过肽接头以VL结构域的N-端融合到所述全长抗体的两条重链中的另一条的C-端，
并且
其中第一多肽的抗体重链可变结构域(VH)和第二多肽的抗体轻链可变结构域(VL)一起形成特异性结合第二抗原的抗原-结合位点，
并且
其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
在一个实施方案中，b)中多肽的抗体重链可变结构域(VH)与c)中多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过在下述位置之间引入二硫键而经由链间二硫键桥连接起来并稳定：
i)重链可变结构域位置44与轻链可变结构域位置100，或
ii)重链可变结构域位置105与轻链可变结构域位置43，或
iii)重链可变结构域位置101与轻链可变结构域位置100(总是按照Kabat EU索引编号)。
引入二硫键桥用于稳定的技术在例如WO 94/029350，Rajagopal，V.，等人，Prot.Eng.(1997)1453-59；Kobayashi，H.，等人，Nuclear Medicine&Biology，Vol.25，(1998)387-393；或Schmidt，M.，等人，Oncogene(1999)18 1711-1721中描述。在一个实施方案中，在b)和c)的多肽的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置44与轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，在b)和c)的多肽的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置105与轻链可变结构域位置43之间(总是按照Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，优选在单链Fab片段的可变结构域VH与VL之间不具有所述任选的二硫化物稳定的三价双特异性抗体。
本文报道的一方面是三特异性或四特异性的抗体，其包含：
a)特异性结合第一抗原的全长抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性结合第二抗原的全长抗体的第二(修饰的)轻链和第二(修饰的)重链，其中可变结构域VL和VH彼此替换，和/或其中恒定结构域CL和CH1彼此替换，和
c)其中特异性结合一种或两种其他抗原(即，第三和/或第四抗原)的一至四种抗原结合肽经由肽接头融合到a)和/或b)的轻链或重链的C-或N-端，
其中第一抗原或第二抗原或所述其他抗原中的一种是人IL-1β。
a)中的抗体不包含b)中报道的修饰，并且a)中的重链和轻链是分离的链。
在一个实施方案中，所述三特异性或四特异性的抗体在c)中包含特异性结合一种或两种其他抗原的一种或两种抗原结合肽。
在一个实施方案中，所述抗原结合肽选自scFv片段和scFab片段的组。
在一个实施方案中，所述抗原结合肽是scFv片段。
在一个实施方案中，所述抗原结合肽是scFab片段。
在一个实施方案中，所述抗原结合肽融合在a)和/或b)的重链的C-端。
在一个实施方案中，所述三特异性或四特异性的抗体在c)中包含一种或两种特异性结合一种其他抗原的抗原结合肽。
在一个实施方案中，所述三特异性或四特异性的抗体在c)中包含两个特异性结合第三抗原的相同的抗原结合肽。在一个优选的实施方案中，所述两个相同的抗原结合肽均经由相同的肽接头融合在a)和b)的重链的C-端。在一个优选的实施方案中，所述两个相同的抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。
在一个实施方案中，所述三特异性或四特异性的抗体在c)中包含特异性结合第三和第四抗原的两个抗原结合肽。在一个实施方案中，所述两个抗原结合肽均经由相同的肽连接体融合在a)和b)的重链的C-端。在一个优选的实施方案中，所述两个抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。
本文报道的一方面是双特异性的四价抗体，其包含：
a)抗体的两条轻链和两条重链，其特异性结合第一抗原(并且包含两个Fab片段)，
b)抗体的两个另外的Fab片段，其特异性结合第二抗原，其中所述另外的Fab片段均经由肽接头分别融合到a)的重链的C-或N-端，
并且
其中在所述Fab片段中进行下述修饰：
i)在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，和/或恒定结构域CL和CH1彼此替换，
或
ii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，并且恒定结构域CL和CH1彼此替换，
并且
在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，或
者恒定结构域CL和CH1彼此替换，
或
iii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，或恒定结构域CL和CH1彼此替换，
并且
在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，并且恒定结构域CL和CH1彼此替换，
或
iv)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，并且在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换，
或
v)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换，并且在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，
其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
在一个实施方案中，所述另外的Fab片段均经由肽接头融合在a)的重链的C-端或融合在a)的重链的N-端。
在一个实施方案中，所述另外的Fab片段均经由肽接头融合在a)的重链的C-端。
在一个实施方案中，所述另外的Fab片段均经由肽连接体融合在a)的重链的N-端。
在一个实施方案中，在所述Fab片段中进行下述修饰：
i)在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，
和/或
恒定结构域CL和CH1彼此替换。
在一个实施方案中，在所述Fab片段中进行下述修饰：
i)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，
和/或
恒定结构域CL和CH1彼此替换。
在一个实施方案中，在所述Fab片段中进行下述修饰：
i)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换。
在一个实施方案中，在所述Fab片段中进行下述修饰：
i)在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，
和/或
恒定结构域CL和CH1彼此替换。
在一个实施方案中，在所述Fab片段中进行下述修饰：
i)在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换。
本文报道的一方面是双特异性的四价抗体，其包含：
a)第一抗体的(修饰的)重链，所述第一抗体特异性结合第一抗原并且包含第一VH-CH1结构域对，其中所述第一抗体的第二VH-CH1结构域对的N-端经由肽接头融合在所述重链的C-端，
b)a)所述的第一抗体的两条轻链，
c)第二抗体的(修饰的)重链，所述第二抗体特异性结合第二抗原并且包含第一VH-CL结构域对，其中所述第二抗体的第二VH-CL结构域对的N-端经由肽接头融合在所述重链的C-端，并且
d)c)所述的第二抗体的两条(修饰的)轻链，它们分别包含CL-CH1结构域对，
其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
本文报道的一方面是包含下述的双特异性抗体：
a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链，和
b)特异性结合第二抗原的第二全长抗体的重链和轻链，其中所述重链的N-端经由肽接头连接在所述轻链的C-端，
其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
a)中的抗体不包含b)中报道的修饰，并且所述重链和轻链是分离的链。
本文报道的一方面是包含下述的双特异性抗体：
a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，和
b)Fv片段，其特异性结合第二抗原并包含VH2结构域和VL2结构域，其中两个结构域通过二硫键桥彼此连接，
其中仅有VH2结构域和VL2结构域中的一个经由肽接头融合到特异
性结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链，
其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
在所述双特异性中，a)中的重链和轻链是分离的链。
在一个实施方案中，VH2结构域和VL2结构域中的另一个没有经由肽接头融合到特异性结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链。
在本文报道的所有方面中，第一轻链包含VL结构域和CL结构域，第一重链包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在所有方面的一个实施方案中，本文报道的抗体是多特异性抗体，其需要至少两个重链多肽的异二聚化，并且其中所述抗体特异性结合人IL-1β和第二非-人IL-1β抗原。
已经记载了一些用于CH3-修饰的方法，以支持异二聚化，例如，记载在WO 96/27011，WO 98/050431，EP 1870459，WO 2007/110205，WO2007/147901，WO 2009/089004，WO2010/129304，WO 2011/90754，WO2011/143545，WO 2012/058768，WO 2013/157954，WO2013/096291中，它们通过引用包括在本文中。典型地，在本领域已知的方法中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域都是以互补方式改造的，使得包含一个改造的CH3结构域的重链不再与相同结构的另一条重链同型二聚化(例如，CH3-改造的第一重链可能不再与另一条CH3-改造的第一重链同型二聚化；并且CH3-改造的第二重链可能不再与另一条CH3-改造的第二重链同型二聚化)。由此，包含一个改造的CH3结构域的重链被迫使与另一条包含以互补方式改造的CH3结构域的重链异二聚化。对于本发明的这个实施方案，第一重链的CH3结构域与第二重链的CH3结构域通过氨基酸置换以互补方式改造，从而迫使第一重链和第二重链异二聚化，而第一重链和第二重链不再能够同型二聚化(例如，由于空间原因)。
考虑将上文引用并包括的本领域已知的支持重链异二聚化的不同的方法作为用于本发明的多特异性抗体的不同的备选方案，所述多特异性抗体包含来源于特异性结合第一抗原的第一抗体的“非交叉的Fab区”和来源于特异性结合第二抗原的第二抗体的“交叉的Fab区”连同上文描述的用于本发明的特定的氨基酸置换。
本文报道的多特异性抗体的CH3结构域可以通过“凸起-进入-孔洞”技术改变，该技术以一些实例详细记载在，例如WO 96/027011，Ridgway，J.B.，等人，Protein Eng.9(1996)617-621；和Merchant，A.M.，等人，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中。在这种方法中，两个CH3结构域的相互作用表面被改变，以增加包含这两个CH3结构域的两个重链的异二聚化。(这两个重链的)这两个CH3结构域中的每一个都可以是“凸起”，而另一个是“孔洞”。引入二硫键桥进一步稳定该异二聚体(Merchant，A.M.，等人，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell，S.，等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并且增加产量。
在一个优选的实施方案中，本文报道的多特异性抗体包含在“凸起链”的CH3结构域中的T366W突变和在“孔洞链”的CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V突变(按照Kabat EU索引编号)。也可以使用CH3结构域之间的另外的链间二硫键桥(Merchant，A.M.，等人，Nature Biotech.16(1998)677-681)，例如，通过向“凸起链”的CH3结构域中引入Y349C突变，和向“孔洞链”的CH3结构域中引入E356C突变或S354C突变。由此，在另一个优选的实施方案中，本文报道的多特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C和T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含E356C、T366S、L368A和Y407V突变，或本文报道的多特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C和T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变(一个CH3结构域中的额外的Y349C突变和另一个CH3结构域中的额外的E356C或S354C突变形成链间二硫键桥)(根据Kabat EU索引编号)。
但是，还可以备选地或另外应用EP 1 870 459A1所述的其他凸起-入-孔洞技术。在一个实施方案中，本文报道的多特异性抗体包含在“凸起链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变，和在“孔洞链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(按照Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，本文报道的多特异性抗体包含在“凸起链”的CH3结构域中的T366W突变，和在“孔洞链”的CH3结构域中的T366S、L368A和Y407V突变，和另外的在“凸起链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变以及在“孔洞链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(按照Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，本文报道的多特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C和T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变，或本文报道的多特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C和T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变，以及另外包含在“凸起链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变和在“孔洞链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(按照Kabat EU索引编号)。
除了“凸起-进入-孔洞技术”之外，其他用于修饰多特异性抗体的重链的CH3结构域从而实施异二聚化的技术在本领域中是已知的。在本文中考虑将这些技术，尤其是记载在WO 96/27011，WO 98/050431，EP 1870459，WO 2007/110205，WO 2007/147901，WO 2009/089004，WO 2010/129304，WO 2011/90754，WO 2011/143545，WO 2012/058768，WO 2013/157954和WO 2013/096291中的那些，作为“凸起-进入-孔洞技术”的备选方案与本文报道的多特异性抗体联用。
在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用EP 1870459中记载的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。这一方法是基于在两条重链，即，第一和第二重链之间的CH3/CH3-结构域-界面中的特定氨基酸位置引入带相反电荷的带电荷氨基酸。
因此，该实施方案涉及本文报道的多特异性抗体，其中在所述抗体的三级结构中，第一重链的CH3结构域与第二重链的CH3结构域形成位于各自抗体CH3结构域之间的界面，其中第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域各自的氨基酸序列分别包含位于抗体三级结构中的所述界面内的一组氨基酸，其中来自位于一条重链的CH3结构域中的界面内的该组氨基酸中的第一氨基酸被置换为带正电荷的氨基酸，并且来自位于另一条重链的CH3结构域中的界面内的该组氨基酸中的第二氨基酸被置换为带负电荷的氨基酸。该实施方案所述的多特异性抗体在本文中还称为“CH3(+/-)-改造的多特异性抗体”(其中缩写“+/-”表示被引入到各自的CH3结构域中的带相反电荷的氨基酸)。
在本文报道的所述CH3(+/-)-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，所述带正电荷的氨基酸选自K、R和H，并且所述带负电荷的氨基酸选自E或D。
在本文报道的所述CH3(+/-)-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，所述带正电荷的氨基酸选自K和R，并且所述带负电荷的氨基酸选自E或D。
在本文报道的所述CH3(+/-)-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，所述带正电荷的氨基酸是K，并且所述带负电荷的氨基酸是E。
在本文报道的所述CH3(+/-)-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置409的氨基酸R被置换为D，并且位置的氨基酸K被置换为E，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置399的氨基酸D被置换为K，并且位置357的氨基酸E被置换为K(按照Kabat EU索引编号)。
在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO 2013/157953中记载的方法支持多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为K，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L被置换为D(按照Kabat EU索引编号)。在本文报道的所述多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为K，位置351的氨基酸L被置换为K，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L被置换为D(按照Kabat EU索引编号)。
在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为K，位置351的氨基酸L被置换为K，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L被置换为D(按照Kabat EU索引编号)。另外，在另一条重链的CH3结构域中包含下述置换中的至少一个：位置349的氨基酸Y被置换为E，位置349的氨基酸Y被置换为D并且位置368的氨基酸L被置换为E(按照Kabat EU索引编号)。在一个实施方案中，位置368的氨基酸L被置换为E(按照Kabat EU索引编号)。
在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO 2012/058768中记载的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L被置换为Y并且位置407的氨基酸Y被置换为A，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为A，并且位置409的氨基酸K被置换为F(按照Kabat EU索引编号)。在另一个实施方案中，除了前述置换之外，在另一条重链的CH3结构域中，在下述位置的氨基酸中的至少一个被置换：位置411(初始是T)，399(初始是D)，400(初始是S)，405(初始是F)，390(初始是N)和392(初始是K)(按照Kabat EU索引编号)。优选的置换为：
-位置411的氨基酸T被选自N，R，Q，K，D，E和W的氨基酸置换(按照Kabat EU索引编号)，
-位置399的氨基酸D被选自R，W，Y和K的氨基酸置换(按照Kabat EU索引编号)，
-位置400的氨基酸S被选自E，D，R和K的氨基酸置换(按照Kabat EU索引编号)，
-位置405的氨基酸F被选自I，M，T，S，V和W的氨基酸置换(按照Kabat EU索引编号)；
-位置390的氨基酸N被选自R，K和D的氨基酸置换(按照KabatEU索引编号)；和
-位置392的氨基酸K被选自V，M，R，L，F和E的氨基酸置换(按照Kabat EU索引编号)。
在本文报道的所述多特异性抗体的另一个实施方案中(按照WO 2012/058768所述改造)，在一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L被置换为Y并且位置407的氨基酸Y被置换为A，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为V并且位置409的氨基酸K被置换为F(按照Kabat EU索引编号)。在本文报道的所述多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置407的氨基酸Y被置换为A，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为A并且位置409的氨基酸K被置换为F(按照KabatEU索引编号)。在所述最后一个前述的实施方案中，在所述另一条重链的CH3结构域，位置392的氨基酸K被置换为E，位置411的氨基酸T被置换为E，位置399的氨基酸D被置换为R并且位置400的氨基酸S被置换为R(按照Kabat EU索引编号)。
在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO2011/143545中记载的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在两条重链的CH3结构域中在位置368和/或409引入氨基酸修饰(按照Kabat EU索引编号)。
在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO2011/090762中记载的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。WO 2011/090762涉及按照“凸起-进入-孔洞”技术进行的氨基酸修饰。在本文报道的所述CH3(KiH)-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为W，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置407的氨基酸Y被置换为A(按照Kabat EU索引编号)。在本文报道的所述CH3(KiH)-改造的多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为Y，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置407的氨基酸Y被置换为T(按照Kabat EU索引编号)。
在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，其是IgG2同种型的，使用WO2011/090762中记载的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。
在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO2009/089004中记载的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置392的氨基酸K或N被置换为带负电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，被置换为E或D，在一个优选的实施方案中，被置换为D)，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置399的氨基酸D、位置356的氨基酸E或D或位置357的氨基酸E被置换为带正电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，被置换为K或R，在一个优选的实施方案中，被置换为K，在一个优选的实施方案中，位置399或356的氨基酸被置换为K)(按照Kabat EU索引编号)。在另一个实施方案中，除了前述置换之外，在一条重链的CH3结构域，位置409的氨基酸K或R被置换为带负电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，被置换为E或D，在一个优选的实施方案中，被置换为D)(按照Kabat EU索引编号)。在甚至另一个实施方案中，除了或备选地前述置换之外，在一条重链的CH3结构域，位置439的氨基酸K和/或位置370的氨基酸K彼此独立地被置换为带负电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，被置换为E或D，在一个优选的实施方案中，置换为D)(按照Kabat EU索引编号)。
在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO2007/147901中所述的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置253的氨基酸K被置换为E，位置282的氨基酸D被置换为K，并且位置322的氨基酸K被置换为D，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置239的氨基酸D被置换为K，位置240的氨基酸E被置换为K，并且位置292的氨基酸K被置换为D(按照Kabat EU索引编号)。
在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO2007/110205中记载的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。
在本文报道的所有方面和实施方案的一个实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。在本发明的一个优选的实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述抗体是二价或三价抗体。在一个实施方案中，所述抗体是二价抗体。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述多特异性抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体是人IgG1亚类的或是具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类的。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体是人IgG2亚类的。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于所述多特异性抗体是人IgG3亚类的。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体是人IgG4亚类的，或是具有另外的突变S228P的人IgG4亚类的。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体是人IgG1亚类的或人IgG4亚类的。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体是具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类的(按照Kabat EU索引编号)。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体是具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的(按照Kabat EU索引编号)。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体是具有突变S228P和L235E的人IgG4亚类的(按照KabatEU索引编号)。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体是具有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类的(按照Kabat EU索引编号)。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，包含含有本文指定的CH3结构域的重链的抗体包含另外的C-端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，按照Kabat EU索引编号)。在本文报道的所有方面的一个实施方案中，包含含有本文指定的CH3结构域的重链的抗体包含另外的C-端甘氨酸残基(G446，按照Kabat EU索引编号)。
在另一方面中，按照上述实施方案中任一个所述的抗-IL-1β抗体可以结合单独的或组合的如在下文1-5节中所述的任意特征。
1.抗体亲和性
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM(例如10-8M或更少，例如10-8M-10-10M，例如，10-9M-10-10M)的解离常数(KD)。
用于确定KD值的方法在下文的实施例中描述。
当使用表面等离体子共振测定时，备选地，KD值可以按下文所述进行测量：使用-2000或-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)的测定在25℃以～10个响应单位(RU)的固定的抗原CM5芯片进行。在一个实施方案中，按照供应商的使用说明，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠(pH 4.8)稀释为5μg/mL(～0.2μM)，之后以5μL/分钟的流速注入，获得大约10个响应单位(RU)的偶联的蛋白。注入抗原之后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了动力学测量，在25℃，以大约25μL/min的流速注入在具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。使用简单的一对一朗缪尔(Langmuir)结合模型(评价软件形式3.2)，通过同时匹配结合和解离传感图，计算结合速率(ka)和解离速率(kd)。平衡解离常数(KD)计算为比率kd/ka(参见，例如，Chen，Y.等人.，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。通过上述表面等离子共振测定，如果结合速率(on-rate)超过106M-1s-1，那么解离速率可以通过使用荧光淬灭技术确定，所述荧光淬灭技术在以光谱仪，如装有停流(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌的比色皿的8000-系列SLM-AMINCO TM分光光度计(ThermoSpectronic)测量的增加的抗原浓度的存在下，在25℃测量在PBS(pH 7.2)中20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括，但不限于：Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv和scFv片段，以及下面描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson，P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134。关于scFv片段的综述，参见，例如，Plueckthun，A.，在：The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学)中，Vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约(1994)，第269-315页；也参见WO 93/16185；US 5,571,894和US 5,587,458。关于包含结合补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见US 5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson，P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448。三抗体和四抗体也描述在Hudson，P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134)中。
单结构域抗体是这样的抗体片段：其包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或者轻链可变结构域的全部或部分。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，US 6,248,516)。
可以通过多种技术制备抗体片段，所述技术包括，但不限于，如本文中所述的完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)的生产。
3.嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述在，例如，US4,816,567；和Morrison，S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855)中。在一个实施例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物诸如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实施例中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中所述类或亚类已经从亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对于人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含这样的一个或多个可变结构域：其中HVR例如CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地也包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人抗体(例如，HVR残基所来源的抗体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法综述在，例如，Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，且进一步描述在，例如，Riechmann，I.等人，Nature332(1988)323-329；Queen，C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US5，821,337，US 7,527,791，US 6,982,321，和US 7,087,409；Kashmiri，S.V.等人，Methods36(2005)25-34(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan，E.A.，Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述了“表面再建”)；Dall’Acqua，W.F.等人，Methods 36(2005)43-60(描述了“FR改组”)；和Osbourn，J.等人，Methods 36(2005)61-68以及Klimka，A.等人，Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述了用于FR改组的“指导选择”方案)中。
可以用于人源化的人框架区包括，但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims，M.J.等人，J.Immunol.151(1993)2296-2308)；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Presta，L.G.等人，J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和从筛选FR文库来源的框架区(参见，例如，Baca，M.等人，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok，M.J.等人，J.Biol.Chem.271(19969 22611-22618)。
4.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，所述结合特异性之一是针对IL-1β，且另一种是针对任意其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合IL-1β的两个不同表位。双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位至表达IL-1β的细胞。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein，C.和Cuello，A.C.，Nature 305(1983)537-540，WO 93/08829，和Traunecker，A.等人，EMBO J.10(1991)3655-3659)，和“凸起-入-孔洞”工程改造(参见，例如，US 5,731,168)。也可以通过以下方式制备多特异性抗体：改造静电转向效应(engineering electrostatic steering effects)用于制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(参见，例如，US 4,676,980，和Brennan，M.等人，Science 229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链生产双特异性抗体(参见，例如，Kostelny，S.A.等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双抗体”技术以制备双特异性抗体片段(参见，例如，Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如，Gruber，M等人，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt，A.等人，J.Immunol.147(1991)60-69中所述。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的经工程改造的抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibodies)”(参见，例如，US 2006/0025576)。
本文中的抗体或片段也包括“双重作用Fab”或“DAF”，其包含结合IL-1β以及另一种不同抗原的抗原结合位点(参见，例如US 2008/0069820)。
本文的抗体或片段还包括在WO 2009/080251，WO 2009/080252，WO 2009/080253，WO 2009/080254，WO 2010/112193，WO 2010/115589，WO 2010/136172，WO 2010/145792，和WO 2010/145793中所述的多特异性抗体。
5.抗体变体
在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能合乎需要的是，改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成，可以制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如，从抗体的氨基酸序列删除残基和/或插入残基和/或置换残基。可以制备缺失、插入和置换的任意组合以获得最终构建体，条件是，所述最终构建体具有期望的特征，例如，抗原结合。
a)置换、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目标位点包括HVR和FR。在下表中在“优选的置换”的标题下显示了保守置换。在表1中在“示例性置换”的标题下提供了更实质性的变化，并且参考氨基酸侧链类别在下面进一步描述。可以将氨基酸置换引入目标抗体中并且针对期望的活性(例如，保留的/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC)来筛选产物。
表
氨基酸可以根据共同的侧链特性分组：
(1)疏水的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守置换需要将这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。
一类置换变体涉及置换亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体在某些生物学特性上具有改进(例如，改善)(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)，和/或具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。一种示例性的置换变体是亲和力成熟的抗体，所述抗体可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(诸如本文描述的那些)方便地产生。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示并针对特定生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可以在HVR中做出改变(例如，置换)，例如，以改善抗体亲和力。这类改变可以在HVR“热点”(即，在体细胞成熟过程中以高频率经历突变的密码子所编码的残基(参见，例如，Chowdhury，P.S.，Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)，和/或接触抗原的残基中做出，并对得到的变体VH或VL试验结合亲和力。通过构建次级文库并从中重新选择而实现的亲和力成熟已经描述在，例如，Hoogenboom，H.R.等人.在Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)178(2002)1-37中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易出错的PCR、链改组或寡核苷酸-定向的诱变)的任一种，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。随后建立次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR-定向的方案，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别地经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以出现在一个或多个HVR内部，只要这类改变不实质上降低抗体的结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出不实质上降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文中提供的保守置换)。这类改变可以例如在HVR的抗原接触残基的外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR未改变或含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
一种用于鉴定可以被靶向以便诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham，B.C.和Wells，J.A.，Science 244(1989)1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如，带电荷残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)，并且用中性的或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对初始置换显示出功能敏感性的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，可以使用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以靶向或消除这类接触残基和邻近残基作为置换的候选物。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度在从一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基端和/或羧基端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-或C-端与酶(例如针对ADEPT的酶)或增加所述抗体的血清半衰期的多肽的融合体。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体被糖基化的程度。通过改变氨基酸序列从而建立或移除一个或多个糖基化位点，可以方便地实现对抗体添加或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之连接的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分枝的双天线寡糖，所述寡糖通常借助N-键连接至Fc区的CH2结构域的Asn297(参见，例如，Wright，A.和Morrison，S.L.，TIBTECH 15(1997)26-32)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双天线寡糖结构的“茎部”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰本发明的抗体中的寡糖以便产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有碳水化合物结构的抗体变体，所述碳水化合物结构缺少与Fc区(直接地或间接地)连接的岩藻糖。例如，这类抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％、或20％至40％。通过以下方式确定岩藻糖的量：相对于如通过MALDI-TOF质谱法(例如，如WO 2008/077546中所述)所测量的与Asn 297连接的全部糖结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算糖链内在Asn297处的岩藻糖的平均量。Asn297表示位于Fc区中约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；但是，由于抗体中的微小序列变异，所以Asn297也可以位于位置297的上游或下游±3个氨基酸处，即，在位置294和300之间。这样的岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，US2003/0157108；US 2004/0093621。与“去岩藻糖基化的”或“岩藻糖-缺陷型”抗体变体相关的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki，A.等人，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki，N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够生产去岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括在蛋白岩藻糖基化方面有缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka，J.等人，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，特别是实施例11)，和敲除的细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki，N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO 2003/085107)。
还可以为抗体变体提供双分的寡糖，例如，其中与抗体的Fc区连接的双天线寡糖由GlcNAc对分。这样的抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。这样的抗体变体的例子例如描述在WO2003/011878；US 6,602,684；和US 2005/0123546中。还提供了在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。这样的抗体变体例如描述在WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764中。
c)Fc-区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。该Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处含有氨基酸修饰(例如，置换)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明预见到具有一些但并非全部效应子功能的抗体变体，这使所述抗体变体成为下述应用的合乎需要的候选物：其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应子功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定以证实CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以实施Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞(即NK细胞)仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch，J.V.和Kinet，J.P.，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性例子描述在US 5,500,362(参见，例如，Hellstrom，I.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83(1986)7059-7063；和Hellstrom，I.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann，M.等人.，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。备选地，可以采用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性的细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox 非放射性的细胞毒性测定(Promega，Madison，WI)。用于这样的测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可以在体内评估目标分子的ADCC活性，例如，在动物模型中，诸如在Clynes，R.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656公开的动物模型中。也可以实施C1q结合测定以证实抗体不能结合C1q且因此缺少CDC活性(参见，例如，WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA)。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro，H.等人.，J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg，M.S.等人.，Blood101(2003)1045-1052；以及Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood 103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期确定(参见，例如，Petkova，S.B.等人.，Int.Immunol.18(2006:1759-1769))。
具有减少的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的置换的那些(US 6,737,056)。这样的Fc突变体包括具有在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置处的置换的Fc突变体，包括将残基265和297置换成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(US 7,332,581)。
描述了具有改善的或减少的与FcR的结合的某些抗体变体(参见，例如，US 6,737,056；WO 2004/056312，和Shields，R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸置换(例如，在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处的置换)的Fc区。
在一些实施方案中，在Fc区中做出导致改变的(即，改善的或减少的)C1q结合和/或补体依赖性的细胞毒性(CDC)的改变，例如，如在US 6,194,551，WO 99/51642，和Idusogie，E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述。
在US 2005/0014934中描述了具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体，所述新生儿Fc受体负责母体IgG向胎儿的转移(Guyer，R.L.等人.，J.Immunol.117(1976)587-593，和Kim，J.K.等人.，J.Immunol.24(1994)2429-2434)。那些抗体包含其中具有一个或多个改善Fc区与FcRn的结合的置换的Fc区。这样的Fc变体包括在下述Fc区残基中一个或多个处具有置换的那些：238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，例如，Fc区残基434的置换(US 7,371,826)。
关于Fc区变体的其他例子，也参见Duncan，A.R.和Winter，G.，Nature322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；和WO 94/29351。
d)半胱氨酸改造的抗体变体
在某些实施方案中，可能合乎需要的是，建立半胱氨酸改造的抗体，例如，“硫代MAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在特定实施方案中，置换的残基出现在抗体的可接触位点处。通过用半胱氨酸置换那些残基，由此使反应性巯基位于抗体的可接触位点处并且可以用于将抗体缀合至其他结构部分(诸如药物结构部分或接头-药物结构部分)以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以如例如US 7,521,541中所述产生半胱氨酸改造的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域已知的且容易得到的额外非蛋白性结构部分。适合用于抗体衍生的结构部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、亚乙基/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。由于它在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点。所述聚合物可以具有任何分子量，并可以是分支或不分支的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接超过一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍生的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项确定：包括、但不限于，待改善的抗体的特定特性或功能，抗体衍生物是否将用在确定条件下的疗法中等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和非蛋白性结构部分的缀合物，所述非蛋白性结构部分可以通过暴露于辐射而选择性地加热。在一个实施方案中，非蛋白性结构部分是碳纳米管(Kam，N.W.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以具有任何波长，并包括，但不限于这样的波长：其不伤害普通细胞，但是其将非蛋白性结构部分加热至杀伤在抗体-非蛋白性结构部分附近的细胞的温度。
B.重组方法和组合物
使用重组方法和组合物(例如，如在US 4,816,567中所述)可以生产抗体。在一个实施方案中，提供了分离的核酸，其编码本文描述的抗-IL-1β抗体。所述核酸可以编码包含所述抗体的VL的氨基酸序列和/或包含所述抗体的VH的氨基酸序列(例如，所述抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了一种或多种包含所述核酸的载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含所述核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含以下载体(例如，已经用以下载体转化)：(1)包含编码包含所述抗体的VL的氨基酸序列和包含所述抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含所述抗体的VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含所述抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗-IL-1β抗体的方法，其中所述方法包括在适合表达所述抗体的条件下培养上述提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，和任选地，从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组生产抗-IL-1β抗体，将编码抗体的核酸(例如，如上所述)分离，并将其插入到一种或多种载体中用以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法容易地对这样的核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。
适用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文中所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中制备，尤其是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，US 5,648,237，US 5,789,199，和US 5,840,523。(也参见Charlton，K.A.，在:Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，B.K.C.(编)，HumanaPress，Totowa，NJ(2003)，第245-254页中，其描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以分离自可溶级分中的细菌细胞糊，并且可以被进一步纯化。
除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经被“人源化”的真菌和酵母菌株，从而导致具有部分地或完全地人糖基化模式的抗体的生产。参见Gerngross，T.U.，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li，H.等人.，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
适合用于表达糖基化抗体的宿主细胞也来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴别出众多可以与昆虫细胞结合使用的杆状病毒毒株，特别用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可以用作宿主(参见，例如，US 5,959,177，US 6,040,498，US6,420,548，US 7,125,978，和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术))。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适合悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，其描述在例如Graham，F.L.等人.，J.Gen Virol.36(1977)59-74中)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(TM4细胞，其描述在例如Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，其描述在例如Mather，J.P.等人.，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，B.K.C.(编)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，第255-268页。
C.测定
通过本领域已知的各种测定，可以针对它们的物理/化学性能和/或生物学活性鉴别、筛选或表征本文中提供的抗-IL-1β抗体。示例性的测定在实施例中报道。
D.免疫缀合物
本发明还提供了免疫缀合物，其包含与一个或多个细胞毒性剂诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素缀合的本文报道的抗-IL-1β抗体。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中将抗体与一个或多个药物缀合，所述药物包括，但不限于，美登素类(maytansinoid)(参见US 5,208,020，US5,416,064和EP 0 425 235B1)；澳瑞他汀(auristatin)诸如单甲基澳瑞他汀药物结构部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见US 5,635,483，US 5,780,588，和US 7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见US 5,712,374，US 5,714,586，US 5,739,116，US 5,767,285，US 5,770,701，US 5,770,710，US 5,773,001，和US 5,877,296；Hinman，L.M.等人，Cancer Res.53(1993)3336-3342；和Lode，H.N.等人，CancerRes.58(1998)2925-2928)；蒽环类抗生素(anthracycline)诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz，F.等人，Curr.Med.Chem.13(2006)477-523；Jeffrey，S.C.，等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)358-362；Torgov，M.Y.，等人，Bioconjug.Chem.16(2005)717-721；Nagy，A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834；Dubowchik，G.M.，等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12(2002)1529-1532；King，H.D.，等人，J.Med.Chem.45(2002)4336-4343；和US 6,630,579)；甲氨蝶呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉罗他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；单端孢霉烯(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括、但不限于，白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲毒蛋白(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂蛋白(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌毒素(tricothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合的如本文中所述的抗体，从而形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当将放射性缀合物用于检测时，它可以包括用于闪烁法研究的放射性原子，例如TC99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也被称作磁共振成像，MRI)的自旋标记，诸如碘-123(再次出现)、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以用多种双官能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚胺酯的双官能衍生物(诸如盐酸二亚胺代己二酸二甲酯(dimethyl adipimidate HCl))、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、二-叠氮基化合物(诸如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮基衍生物(诸如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以按照Vitetta，E.S.等人.，Science 238(1987)1098-1104中所述制备蓖麻蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸酯(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸敏感接头、肽酶敏感接头、光敏感接头、二甲基接头或含有二硫化物的接头(Chari，R.V.等人.，Cancer Res.52(1992)127-131；US 5,208,020)。
本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用包括、但不限于如下的市售交联剂(例如来自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)制备的这类缀合物：BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，磺基-EMCS，磺基-GMBS，磺基-KMUS，磺基-MBS，磺基-SIAB，磺基-SMCC，和磺基-SMPB，和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任何抗-IL-1β抗体可用于检测IL-1β在生物样品中的存在。本文中使用的术语“检测”包括定量或定性检测。
在一个实施方案中，提供了用在诊断或检测方法中的抗-IL-1β抗体。在另一个方面，提供了检测IL-1β在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：在允许抗-IL-1β抗体与IL-1β结合的条件下使生物样品与如本文中所述的抗-IL-1β抗体接触，并且检测在抗-IL-1β抗体和IL-1β之间是否形成复合物。这样的方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗-IL-1β抗体来选择适合于使用抗-IL-1β抗体的疗法的受试者，例如在IL-1β是用于患者选择的生物标志物的情况下。
在某些实施方案中，提供了标记的抗-IL-1β抗体。标记包括，但不限于，直接检测的标记或结构部分(诸如荧光标记、生色标记、电子密度标记、化学发光标记和放射性标记)，以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接检测的结构部分(诸如酶或配体)。示例性的标记包括，但不限于：放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团，如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(US 4,737,456))，荧光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，其与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶(诸如HRP，乳过氧化物酶，或微氧化酶)偶联，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基等。
F.药物制剂
通过将具有期望纯度的这类抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编)(1980))混合，可以以冻干制剂或水溶液的形式制备如本文中所述的抗-IL-1β抗体的药物制剂。药学上可接受的载体在采用的剂量和浓度对接受者而言通常是无毒的，且包括，但不限于：缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其他碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。示例性的药学上可接受的载体在本文中还包括间质(insterstitial)药物分散剂，诸如可溶性的中性活性的透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性的PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rhuPH20(Baxter International，Inc.)。包括rhuPH20在内的某些示例性sHASEGP和使用方法描述在US 2005/0260186和US 2006/0104968中。在一方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
在US 6,267,958中描述了示例性的冻干的抗体制剂。水性抗体制剂包括在US 6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后者制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的制剂还可以含有超过一种正在治疗的特定适应证所需的活性成分，优选地具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些。例如，可能合乎需要的是，进一步提供抗-ANG2抗体或抗-VEGF抗体。这样的活性成分适当地以对于预期目的而言有效的量联合存在。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(分别例如，羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或大乳剂中。这样的技术公开在Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编)(1980)中。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适的例子包括含有所述抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形制品(例如薄膜或微胶囊)的形式。
要用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以容易地实现无菌度，例如，通过穿过无菌过滤膜过滤。
G.治疗方法和组合物
本文提供的任何抗-IL-1β抗体可以用在治疗方法中。
在一方面中，提供了用作药物的抗-IL-1β抗体。在其他方面，提供了用于治疗眼血管疾病、优选是黄斑变性的抗-IL-1β抗体。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的抗-IL-1β抗体。在某些实施方案中，本发明提供用在治疗患有眼血管疾病、优选黄斑变性的个体的方法中的抗-IL-1β抗体，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗-IL-1β抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。在其他实施方案中，本发明提供用于抑制血管发生的抗-IL-1β抗体。在某些实施方案中，本发明提供用在抑制个体的血管发生的方法中的抗-IL-1β抗体，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗-IL-1β抗体，从而抑制血管发生。按照上述任意实施方案所述的“个体”优选是人。
在另一方面中，本发明提供抗-IL-1β抗体在药物的生产或制备中的应用。在一个实施方案中，所述药物用于治疗眼血管疾病，优选是黄斑变性。在另一个实施方案中，药物用在治疗眼血管疾病、优选黄斑变性的方法中，所述方法包括向患有眼血管疾病、优选黄斑变性的个体施用有效量的所述药物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。在另一个实施方案中，所述药物用于抑制血管形成。在另一个实施方案中，所述药物用在抑制个体血管发生的方法中，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述药物，从而抑制血管发生。按照上述任意实施方案所述的“个体”可以是人。
在另一方面中，本发明提供用于治疗眼血管疾病、优选黄斑变性的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有这样的眼血管疾病、优选黄斑变性的个体施用有效量的抗-IL-1β抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下文所述。按照上述任意实施方案所述的“个体”可以是人。
在另一方面中，本发明提供用于抑制个体中血管发生的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗-IL-1β抗体，从而抑制血管发生。在一个实施方案中，“个体”是人。
在另一方面中，本发明提供包含本文提供的任一种抗-IL-1β抗体的药物制剂，例如，用在上述任一种治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任一种抗-IL-1β抗体和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任一种抗-IL-1β抗体和至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。
本发明的抗体可以单独地或与其他药剂联合地用在治疗中。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂一起共同施用。在某些实施方案中，另外的治疗剂是抗-VEGF抗体或抗-ANG2抗体。
上面指出的这样的联合治疗包括组合施用(其中将两种或更多种治疗剂包括在同一制剂或分开的制剂中)和分开施用，在后一种情况下，本发明的抗体的施用可以发生在一种或多种另外的治疗剂的施用之前、同时和/或之后。在一个实施方案中，抗-IL-1β抗体的施用和另外的治疗剂的施用发生在彼此的约一个月内，或在约一、二或三周内，或在约一天、两天、三天、四天、五天或六天内。
本发明的抗体(和任何另外的治疗剂)可以通过任意合适的方式施用，包括胃肠外、肺内和鼻内施用，并且，如果需要，用于局部治疗，病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。定量给药可以是通过任意适当的途径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行，部分地取决于施用是短暂的还是长期的。各种定量给药时间方案包括但不限于在不同时间点单次或多次施用，推注施用，并且在本文中考虑脉冲输注。
以与良好医学实践一致的方式，配制、定量给药和施用本发明的抗体。在该背景下考虑的因素包括正在治疗的特定病症、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、药剂的递送位点、施用方法、施用的时间方案和医学从业人员已知的其他因素。抗体不需要、但任选地与一种或多种当前用于预防或治疗讨论的病症的药剂一起配制。这样的其他药剂的有效量取决于存在于所述制剂中的抗体的量，病症或治疗的类型，和上文讨论的其他因素。这些通常以相同剂量并且以本文所述的施用途径使用，或以本文所述的剂量的约1至99％、或以经验上/临床上确定为合适的任意剂量和任意途径使用。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独地或与一种或多种其他另外的治疗剂联合使用时)的适当剂量将取决于要治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和进程、施用抗体是为了预防还是治疗目的、以前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、以及主治医师的判断。适当地一次性地或在一系列治疗中将抗体施用给患者。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.5mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于施用给患者的最初候选剂量，例如，不论通过一次或多次分开施用，还是通过连续输注。一个典型的日剂量可能是在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内，取决于上面提及的因素。对于在几天或更长时间内的重复施用，取决于病症，所述治疗通常持续至发生期望的疾病症状抑制作用。抗体的一种示例性剂量是在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因而，可以将一剂或多剂约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任意组合)的剂量施用给患者。可以间歇地(例如，每周或每三周)施用这样的剂量(例如，使得患者接受约两剂至约二十剂、或例如约六剂抗体)。可以施用最初的较高负荷剂量(loading dose)，继之以一个或多个较低剂量。但是，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定容易地监测该治疗的进展。
应当理解，使用本发明的免疫缀合物替代抗-IL-1β抗体或者在抗-IL-1β抗体之外还使用本发明的免疫缀合物，可以实现以上制剂或治疗方法中的任一种。
III.制品
在发明的另一方面，提供了制品，其含有用于治疗、预防和/或诊断上文所述的病症的材料。所述制品包含容器和贴在容器上或与容器结合的标签或包装说明书。适当的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、静脉内(IV)溶液袋等。容器可以由多种材料制成，如玻璃或塑料。所述容器容纳单独的组合物或与另一种有效地治疗、预防和/或诊断病症的组合物组合的组合物，且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。组合物内的至少一种活性剂是本发明的抗体。所述标签或包装说明书指示，所述组合物用于治疗选择的病症。此外，制品可以包含：(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性治疗剂或其他的治疗剂。本发明的该实施方案中的制品还可以包含包装说明书，所述包装说明书指示所述组合物可以用于治疗特定病症。备选地，或另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，所述容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑制细菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其可以进一步包含从商业和使用者观点看合乎需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
应当理解，以上制品中的任一种可以包括本发明的免疫缀合物以替代抗-IL-1β抗体或者与抗-IL-1β抗体组合。
IV.具体的实施方案
1.特异性结合人IL-1β的抗体，其中所述抗体是包含SEQ ID NO:01的重链可变结构域和SEQ ID NO:02的轻链可变结构域的鼠抗体的人源化变体。
2.特异性结合人IL-1β的人源化抗体，其中所述人源化抗体包含：(a)包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HVR-H3。
3.特异性结合人IL-1β的人源化抗体，其中所述人源化抗体包含：(a)包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3。
4.特异性结合人IL-1β的人源化抗体，其中所述人源化抗体包含：(a)包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-H3。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的人源化抗体，其中所述人源化抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L3。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的人源化抗体，其中所述人源化抗体在重链可变结构域中包含位置48的异亮氨酸氨基酸残基，位置67的丙氨酸氨基酸残基，位置69的苯丙氨酸氨基酸残基和位置93的缬氨酸氨基酸残基，并且在轻链可变结构域中包含位置36的氨基酸残基缬氨酸(按照Kabat编号)。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的人源化抗体，其中所述人源化抗体包含：(a)与SEQ ID NO:04的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列，(b)与SEQ ID NO:06的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列，或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的人源化抗体，其中所述人源化抗体包含SEQID NO:04的VH序列和SEQ ID NO:06的VL序列。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
10.特异性结合人IL-1β的抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-H3。
11.根据实施方案10所述的抗体，其中所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-L2，和(f)包含SEQID NO:45的氨基酸序列的HVR-L3。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人IgG1亚类的抗体或是人IgG4亚类的抗体。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的抗体，其中所述抗体是具有κ轻链的人IgG1亚类的抗体。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
15.包含SEQ ID NO:04的VH序列和SEQ ID NO:06的VL序列的抗体。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的抗体，其中所述抗体特异性结合人IL-1β但是不结合人IL-1α。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的抗体，其中所述抗体通过抑制人IL-1β与人IL-1受体的结合而阻断人IL-1β的生物学活性。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的抗体，其中所述抗体特异性结合IL-1β受体结合位点上的两个决定簇或邻近IL-1β受体结合位点的两个决定簇。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的二价的双特异性抗体：
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH彼此替换，
其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
21.根据实施方案20所述的抗体，其中所述抗体包含：
i)在a)中第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸独立地被置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(按照Kabat编号)(在一个优选的实施方案中，独立地被置换为赖氨酸(K)或精氨酸(R))，并且，其中在a)中第一重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸独立地被置换为谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(按照Kabat EU索引编号)，
或
ii)在b)中第二轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸独立地被置换为赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)(按照Kabat编号)(在一个优选的实施方案中，独立地被置换为赖氨酸(K)或精氨酸(R))，并且，其中在b)中第二重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸独立地被置换为谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(按照Kabat EU索引编号)。
22.根据实施方案20-21中任一项所述的抗体，其中所述抗体在第二重链的恒定结构域CL中包含置换为K的位置124和123的氨基酸(按照Kabat EU索引编号)。
23.根据实施方案20-22中任一项所述的抗体，其中所述抗体在第二轻链的恒定结构域CH1中包含置换为E的位置147和213的氨基酸(按照Kabat的EU索引编号)。
24.根据实施方案20-23中任一项所述的抗体，其中所述抗体在第一轻链的恒定结构域CL中包含置换为K的位置124和123的氨基酸，并且在第一重链的恒定结构域CH1中包含置换为E的位置147和213的氨基酸(按照Kabat EU索引编号)。
25.根据实施方案20-24中任一项所述的抗体，其中所述抗体在第二重链的恒定结构域CL中包含置换为K的位置124和123的氨基酸，并且，其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸被置换为E，并且，在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸被置换为K，在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸被置换为E，在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸被置换为K，并且在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸被置换为E(按照Kabat EU索引编号)。
26.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的二价的双特异性抗体：
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH彼此替换，并且，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替换，
其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
27.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的二价双特异性抗体：
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替换，
其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
28.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的多特异性抗体：
a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，和
b)一个、两个、三个或四个单链Fab片段，其特异性结合一至四种其他抗原(即，第二和/或第三和/或第四和/或第五抗原，优选地，特异性结合一种其他抗原，即第二抗原)，
其中b)中所述的单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链或轻链的C-或N-端的肽接头融合到a)中所述的全长抗体上，
其中第一抗原或所述其他抗原中的一种是人IL-1β。
29.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的三价双特异性抗体：
a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，
b)第一多肽，其由下述组成：
ba)抗体重链可变结构域(VH)，
或
bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，其中所述第一多肽通过肽接头以其VH结构域的N-端融合到所述全长抗体的两条重链中的一条的C-端，
c)第二多肽，其由下述组成：
ca)抗体轻链可变结构域(VL)，
或
cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)，其中所述第二多肽通过肽接头以VL结构域的N-端融合到所述全长抗体的两条重链中的另一条的C-端，
并且
其中第一多肽的抗体重链可变结构域(VH)和第二多肽的抗体轻链可变结构域(VL)一起形成特异性结合第二抗原的抗原-结合位点，
并且
其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
30.根据实施方案29所述的抗体，其中b)中多肽的抗体重链可变结构域(VH)与c)中多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过在下述位置之间引入二硫键而经由链间二硫键桥连接起来并稳定：
i)重链可变结构域位置44与轻链可变结构域位置100，或
ii)重链可变结构域位置105与轻链可变结构域位置43，或
iii)重链可变结构域位置101与轻链可变结构域位置100(总是按照Kabat EU索引编号)。
31.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的三特异性或四特异性的抗体：
a)特异性结合第一抗原的全长抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性结合第二抗原的全长抗体的第二(修饰的)轻链和第二(修饰的)重链，其中可变结构域VL和VH彼此替换，和/或其中恒定结构域CL和CH1彼此替换，和
c)其中特异性结合一种或两种其他抗原(即，第三和/或第四抗原)的一至四种抗原结合肽经由肽接头融合到a)和/或b)的轻链或重链的C-或N-端，
其中第一抗原或第二抗原或所述其他抗原中的一种是人IL-1β。
32.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的双特异性的四价抗体：
a)抗体的两条轻链和两条重链，其特异性结合第一抗原(并且包含两个Fab片段)，
b)抗体的两个另外的Fab片段，其特异性结合第二抗原，其中所述另外的Fab片段均经由肽接头分别融合到a)的重链的C-或N-端，
并且
其中在所述Fab片段中进行下述修饰：
i)在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，和/或恒定结构域CL和CH1彼此替换，
或
ii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，并且恒定结构域CL和CH1彼此替换，
并且
在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，或恒定结构域CL和CH1彼此替换，
或
iii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，或恒定结构域CL和CH1彼此替换，
并且
在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，并且恒定结构域CL和CH1彼此替换，
或
iv)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，并且在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换，
或
v)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换，并且在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
33.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的双特异性的四价抗体：
a)第一抗体的(修饰的)重链，所述第一抗体特异性结合第一抗原并且包含第一VH-CH1结构域对，其中所述第一抗体的第二VH-CH1结构域对的N-端经由肽接头融合在所述重链的C-端，
b)a)所述的第一抗体的两条轻链，
c)第二抗体的(修饰的)重链，所述第二抗体特异性结合第二抗原并且包含第一VH-CL结构域对，其中所述第二抗体的第二VH-CL结构域对的N-端经由肽接头融合在所述重链的C-端，和
d)c)所述的第二抗体的两条(修饰的)轻链，它们分别包含CL-CH1结构域对，
其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
34.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的双特异性抗体：
a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链，和
b)特异性结合第二抗原的第二全长抗体的重链和轻链，其中所述重链的N-端经由肽接头连接在所述轻链的C-端，
其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
35.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的双特异性抗体：
a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，和
b)Fv片段，其特异性结合第二抗原并包含VH2结构域和VL2结构域，其中两个结构域通过二硫键桥彼此连接，
其中仅有VH2结构域和VL2结构域中的一个经由肽接头融合到特异性结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链，
其中第一抗原或第二抗原是人IL-1β。
36.根据实施方案1-35中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽，并且
其中
i)第一Fc-区多肽选自包括下述的组：
-人IgG1Fc-区多肽，
-人IgG2Fc-区多肽，
-人IgG3Fc-区多肽，
-人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366S、L368A，Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变K392D的人IgG1，IgG2或IgG4，和
-具有突变N392D的人IgG3，
并且
ii)第二Fc-区多肽选自包括下述的组：
-人IgG1Fc-区多肽，
-人IgG2Fc-区多肽，
-人IgG3Fc-区多肽，
-人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变Y349C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、Y349C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变Y349C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、Y349C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G、S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变P329G、Y349C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变S228P、L235E、P329G、Y349C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，
-具有突变D399K、D356K和/或E357K的人IgG1，和
-具有突变D399K、E356K和/或E357K的人IgG2，IgG3或IgG4。
37.根据实施方案1-35中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽，并且
其中
i)第一Fc-区多肽是人IgG1Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是人IgG1Fc-区多肽，或
ii)第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A的人IgG1Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A的人IgG1Fc-区多肽，或
iii)第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1Fc-区多肽，或
iv)第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，或
v)第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366W的人IgG1Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1Fc-区多肽，或
vi)第一Fc-区多肽是人IgG4Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是人IgG4Fc-区多肽，或
vii)第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E的人IgG4Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E的人IgG4Fc-区多肽，或
viii)第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4Fc-区多肽，或
ix)第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽，或
x)第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G、S354C、T366W的人IgG4Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4Fc-区多肽。
38.根据实施方案1-37中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽，并且
其中所述抗体在第一Fc-区多肽中和在第二Fc-区多肽中包含下述突变组合：
i)I253A，H310A，和H435A，或
ii)H310A，H433A，和Y436A，或
iii)L251D，L314D，和L432D，或
iv)i)至iii)的组合。
39.根据实施方案1-37中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽，并且其中
a)第一和第二Fc-区多肽均为人IgG1或人IgG4亚类的(来源于人起源的)，并且在第一Fc-区多肽中包含选自下述突变中的一个或两个：i)I253A，H310A和H435A的组，或ii)H310A，H433A和Y436A的组，或iii)L251D，L314D和L432D的组(按照Kabat EU索引编号系统编号)以及在第二Fc-区多肽中包含选自包括突变L251D、I253A、H310A、L314D、L432D、H433A、H435A和Y436A的组(按照Kabat EU索引编号系统编号)中的一个或两个突变，从而使得第一和第二Fc-区多肽中的所有突变在一起发生时导致在变体(人)IgG种类Fc-区中包含下述突变：i)I253A，H310A和H435A，或ii)H310A，H433A和Y436A，或iii)L251D，L314D和L432D，
或
b)第一和第二Fc-区多肽均为人IgG1或人IgG4亚类的(即来源于人起源的)，并且都在所述Fc-区中包含突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或它们的组合(按照Kabat EU索引编号系统编号)，由此在第一或第二Fc-区多肽中存在所有突变，或在第一Fc-区多肽中存在一个或两个突变并且在第二Fc-区多肽中存在一个或两个突变，从而使得当第一和第二Fc-区多肽中的所有突变在同时发生时导致在所述Fc-区中包含下述突变：i)I253A，H310A和H435A，或ii)H310A，H433A和Y436A，或iii)L251D，L314D和L432D，
或
c)第一和第二Fc-区多肽均为人IgG1或人IgG4亚类的(即来源于人起源的)，并且在第一以及第二Fc-区多肽中包含突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D(按照Kabat EU索引编号系统编号)，或在第一Fc-区多肽中包含突变组合I253A/H310A/H435A并且在第二Fc-区多肽中包含突变组合H310A/H433A/Y436A(按照KabatEU索引编号系统编号)。
40.根据实施方案1-37中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽，并且其中
a)第一变体Fc-区多肽衍生自第一亲本IgG种类Fc-区多肽，并且第二变体Fc-区多肽衍生自第二亲本IgG种类Fc-区多肽，其中第一亲本IgG种类Fc-区多肽与第二亲本IgG种类Fc-区多肽相同或不同，并且
b)除了第一亲本IgG种类Fc-区多肽与第二亲本IgG种类Fc-区多肽不同的那些氨基酸残基之外，第一变体Fc-区多肽与第二变体Fc-区多肽还在一个或多个氨基酸残基处不同，并且
c)包含第一变体Fc-区多肽和第二变体Fc-区多肽的IgG种类Fc-区具有的针对人Fc-受体的亲和力不同于包含a)中第一亲本IgG种类Fc-区多肽和a)中第二亲本IgG种类Fc-区多肽的IgG种类Fc-区的亲和力，
其中第一Fc-区多肽或第二Fc-区多肽或这两个Fc-区多肽彼此独立地包含下述突变或突变组合中的一个：
-T307H，或
-Q311H，或
-E430H，或
-N434H，或
-T307H和Q311H，或
-T307H和E430H，或
-T307H和N434A，或
-T307H和N434H，或
-T307Q和Q311H，或
-T307Q和E430H，或
-T307Q和N434H，或
-T307H和Q311H和E430H和N434A，或
-T307H和Q311H和E430H和N434H，或
-T307H和Q311H和E430H和N434Y，或
-T307Q和Q311H和E430H和N434A，或
-T307Q和Q311H和E430H和N434H，或
-T307Q和Q311H和E430H和N434Y，或
-T307Q和V308P和N434Y和Y436H，或
-T307H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和M252Y和S254T和T256E，或
-Q311H和M252Y和S254T和T256E，或
-E430H和M252Y和S254T和T256E，或
-N434H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307H和Q311H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307H和E430H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307H和N434A和M252Y和S254T和T256E，或
-T307H和N434H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和Q311H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和E430H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和N434H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307H和Q311H和E430H和N434A和M252Y和S254T和T256E，或
-T307H和Q311H和E430H和N434H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307H和Q311H和E430H和N434Y和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和Q311H和E430H和N434A和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和Q311H和E430H和N434H和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和Q311H和E430H和N434Y和M252Y和S254T和T256E，或
-T307Q和V308P和N434Y和Y436H和M252Y和S254T和T256E。
41.根据实施方案1-37中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽，
并且其中第一Fc-区多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V(孔洞-链)，并且第二Fc-区多肽包含突变S354C和T366W(凸起-链)，并且其中第一Fc-区多肽(孔洞-链)包含下述突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，
并且其中第一Fc-区多肽与第二Fc-区多肽通过一个或多个二硫键桥连接，
并且其中第一多肽的CH3-结构域与第二多肽的CH3-结构域都结合蛋白质A或不都结合蛋白质A(按照Kabat EU索引编号)。
42.根据实施方案41所述的抗体，其中所述抗体包含下述突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，和
iii)T250Q，和/或
iv)T256E或T256A。
43.根据实施方案41-42中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含下述突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，和
iii)任选地，a)T250Q，和/或T256E或T256A，和
iv)a)L251A或L251G或L251D，和/或b)H310A或H310G。
44.根据实施方案41-43中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含下述突变：
i)I253A或I253G，和
ii)L314A或L314G或L314D，和
iii)a)T250Q，和/或T256E或T256A，和
iv)a)L251A或L251G或L251D，和/或b)H310A或H310G.
v)任选地，a)T307A或T307H或T307Q或T307P，和/或b)Q311H，和/或c)M252Y，和/或d)S254T。
45.根据实施方案41-44中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含下述突变：
i)T250Q，和/或
ii)M252Y，和/或
iii)S254T，和/或
iv)T256E或T256A，和/或
v)T307A或T307H或T307Q或T307P，和/或
vi)Q311H。
46.根据实施方案1-45中任一项所述的抗体，其用作药物。
47.根据实施方案1-45中任一项所述的抗体，其用于治疗眼血管疾病。
48.实施方案1-45中任一项所述的抗体用于治疗眼部疾病、尤其是眼血管疾病的应用。
49.实施方案1-45中任一项所述的抗体，其用于治疗眼部疾病。
50.根据实施方案1-45中任一项所述的抗体，其用于治疗眼部疾病、尤其是眼血管疾病。
51.一种治疗患有眼血管疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的实施方案1-45中任一项所述的抗体。
52.一种药物制剂，其包含实施方案1-45中任一项所述的抗体。
53.一种用于治疗眼血管疾病的药物制剂，其包含实施方案1-45中任一项所述的抗体。
54.实施方案1-45中任一项所述的抗体在制备用于治疗眼血管疾病的药物中的应用。
55.一种治疗患有眼血管疾病的患者的方法，所述方法通过向需要所述治疗的患者施用实施方案1-45中任一项所述的抗体进行。
56.根据实施方案52-53中任一项所述的药物制剂，其中所述抗体通过玻璃体内应用进行施用。
57.根据实施方案55-56中任一项所述的施用，其中所述施用是玻璃体内应用。
58.编码实施方案1-45中任一项所述的抗体的核酸。
59.包含一种或多种编码实施方案1-45中任一项所述的抗体的核酸的细胞。
60.用于制备实施方案1-45中任一项所述的抗体的方法，其中所述方法包括下述步骤：
a)任选地用一种或多种编码实施方案1-45中任一项所述的抗体的核酸转染哺乳动物细胞，
b)培养所述细胞，从而表达所述抗体，和
c)从所述细胞或培养基回收所述抗体，由此制备所述抗体。
V.实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，考虑到有上文提供的一般描述，可以实行各种其他实施方案。
实施例1
鼠抗-IL-1β抗体H34的最初的产生和表征
材料--BALB/c雌性小鼠获自Banting&Kingman(Freemont,CA)。完全和不完全弗氏佐剂(CFA和IFA)来自Difco(Detroit,MI)。HB101来自Hana Biologics,Inc.(Berkeley,CA)。不含钙和镁的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水(PBS)和谷氨酰胺来自GIBCO Labs(GrandIsland,NY)。胎牛血清来自Hyclone Labs(Logan,UT)，并且次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)和次黄嘌呤-胸苷(HT)补充剂，和50％聚乙二醇(PEG)1450来自Bethesda Research Labs(Gaithersburg,MD)。兔抗-小鼠IgG+A+M过氧化物酶缀合物、链霉抗生物素蛋白过氧化物酶、小鼠Ig同种型鉴定试剂盒和原次苯基二胺(orthophenylene diamine，OPD)来自ZymedLabs(South San Francisco,CA)。琼脂糖蛋白质-A和Sephadex G-25来自Pharmacia(Piscataway,NJ)。降植烷(2,6,10,14-四甲基十五烷)来自Aldrich Chem.Co.(Milwaukee,WI)。125I Bolton-Hunter试剂来自New England Nuclear(Boston,MA)。所有其他的化学剂是来自Sigma的分析级试剂。
杂交瘤制备--使用Kohler和Milstein的方法(出处同上)制备针对IL-1β的杂交瘤，如Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.,54:347所述。将十二周龄的雌性BALB/c小鼠腹膜内注射和在后足垫注射在CFA中的5μg纯化的MW 17,500形式的IL-1β。以3-4周的时间间隔给予五次在不完全弗氏佐剂(IFA)中的加强注射。通过ELISA定期地确定血清抗体效价，并且在5次注射后，效价是可检测到的。选择用于融合的动物接受在无菌PBS中的10μg IL-1β的静脉内(IV)加强。4天后，摘下脾，并且使用50％PEG1450将脾细胞与P3X63-Ag8.653骨髓瘤细胞融合。将细胞在96孔平板(1*106个细胞/孔)中的HAT培养基中培养。通过固相抗原ELISA、使用125IIL-1β的固相抗体RIA和IL-1β诱导的胸腺细胞增殖抑制，测定杂交瘤上清的抗-IL-1β活性(参见下文)。通过在具有胸腺细胞(5*105/孔)的HAT培养基中有限稀释至少3次而克隆杂交瘤。
抗体制备和纯化--通过向降植烷处理的小鼠腹膜内注射2*106个杂交瘤细胞而在腹水中产生单克隆抗体(Kohler等人，出处同上)。收集腹水液并且通过琼脂糖-蛋白质A层析纯化抗体(Goding,J.Immunol.Methods,20(1978)241)。
如上文所述，由相应的细胞系制备单克隆抗体ILB1-H34。
IL-1β抗体的ELISA--将乙烯基测定平板(Costar)用50μL/孔的5μg/mL稀释在PBS中的抗原溶液包被，并且在4(度)C温育过夜。将孔用5％脱脂干奶粉/0.05％乙基汞硫代水杨酸钠/PBS在室温下复包被(countercoat)一小时。将孔用0.1％牛血清白蛋白(BSA)/0.05％乙基汞硫代水杨酸钠/PBS清洗，并且将50μL/孔的抗-IL-1β抗体在室温温育2小时。使用兔抗-小鼠IgG+A+M过氧化物酶缀合物和OPD底物溶液，通过间接ELISA检测抗体。备选地，将纯化的单克隆抗体生物素酰化(Geusdon等人,J.Histochem.Cytochem.27(1979)1131)并使用链霉抗生物素蛋白过氧化物酶和OPD底物溶液检测。使用小鼠Ig同种型鉴定试剂盒，通过间接ELISA鉴定单克隆抗体的同种型。
胸腺细胞增殖测定--向在MEM/5％胎牛血清(FBS)/100μg/ml庆大霉素、2-巯基乙醇(2*10-5M)、25mM Hepes培养基中的C3H/HeJ小鼠胸腺细胞(1*106/孔)中添加IL-1β和PHA(10μg/ml)。在37℃48小时后，加入0.5μCi/孔的3H胸苷，并且将培养物培养过夜。使用细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤器上并且处理用于闪烁计数。
受体结合测定--将17,500形式的IL-1β用二碘代125I Bolton-Hunter试剂按照制造商的使用说明进行标记。在10μL PBS中的1μg IL-1β与1mCi试剂在4℃反应4小时；加入500μL PBS/0.2％明胶，并且通过在20*1cm的Sephadex G-25柱上以PBS/0.2％明胶的层析，将标记的IL-1β与游离的Bolton-Hunter试剂分离。向24孔培养平板中在DMEM/1％BSA/0.1％叠氮化钠/0.01％Triton X-100中的BALB/c 3T3成纤维细胞汇合的单层中添加125IIL-1β。在37℃1小时后，将单层在不含标记的IL-1β的培养基中彻底清洗。将所述单层用0.1N NaOH取下用于γ计数。通过在存在200倍摩尔过量的未标记的IL-1β的条件下温育，测量125IIL-1β的非特异性结合。
抗体亲和力的确定--从使用免疫沉淀放射性免疫测定获得的数据确定单克隆抗体亲和力。简言之，将5000cpm/管的125IIL-1β与在0.3ml 1％脱脂干奶粉/0.5％乙基汞硫代水杨酸钠/PBS中的纯化的单克隆抗体的稀释液在4℃温育过夜。通过分别加入100μL/管的10％正常小鼠血清/PBS和在PBS中的4mg/ml山羊抗小鼠IgG血清，沉淀抗原-抗体复合物。在4℃4小时后，添加1/ml管冰冷的2％聚乙二醇-6000并将管在4℃以3000*g离心20分钟。吸出上清，并将沉淀物在γ计数仪中计数。由在不同抗体浓度的结合的/游离的比例计算亲和力常数(Berson等人,Clin.Chim.Acta.22(1969)51-69)。
如上文所述，使用从不同抗体浓度的125IIL-1β结合的免疫沉淀放射性免疫测定(RIA)获得的数据，计算亲和力常数。抗-IL-1β抗体H34具有64*109L/mol的针对IL-1β的亲和力。
实施例2
小鼠免疫
对于NMRI小鼠的免疫，使用RIMMS(“快速免疫，多个位点”(“Rapid IMmunization,Multiple Sites”))时刻表。
实施例3
确定抗-IL-1β抗体的血清效价
将人重组IL-1β以在PBS中2.5μg/ml固定在96-孔NUNC Maxisorb平板上(100μl/孔)，然后：用200μl/孔在PBS中的2％CroteinC封闭所述平板；以100μl/孔一式两份应用在含0.5％CroteinC的PBS中的抗血清的系列稀释液；用在含0.5％CroteinC的PBS中1:16,000稀释的HRP-缀合的山羊抗-小鼠IgG抗体(Jackson Immunoresearch)检测(100μl/孔)。对于所有步骤，将平板在37℃温育1小时。在所有步骤之间，将平板用含0.05％吐温20的PBS清洗3次。通过加入100μl/孔的可溶性BM Blue POD底物(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国)来显色信号；并且通过加入100μl/孔的1M HCl终止。以690nm作为参比，在450nm读取吸光度。效价定义为导致半最大信号的抗血清的稀释度。
实施例4
人IL-1β结合ELISA
变体1
使用基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的技术进行结合分析。将抗原人IL-1β(Peprotech Cat.No 200-01B)以500ng/mL的浓度(25μL，在PBS中)固定在384孔微量滴定平板(Thermo Scientific,Cat.No.464718)上。下述每个步骤之后是3次常规清洗(90μL PBS，进行分配和抽吸)：1)封闭步骤：使未结合的表面饱和(1小时，2％BSA)；2)增加浓度的抗-IL-1β抗体，持续1小时；3)检测抗体，稀释度＝1:2000(驴F(ab)2抗-兔IgG POD,Amersham,NA9340V或绵羊IgG抗-小鼠IgG POD,Amersham RPN4201)。加入底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB,Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国,Cat.No 11835033001)后20-30分钟，在370nm确定光密度。使用GraphPad Prism 6.0软件，利用四参数逻辑(logistic)模型计算EC50。
变体2
使用基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的技术进行结合分析。将抗原His-标记的人IL-1β(Sino Biologics,Cat.No.10139-H07E)以0.25μg/mL的浓度(25μL，在PBS中)固定在384孔微量滴定平板(Thermo Scientific,Cat.No.464718)上。下述每个步骤之后是3次常规清洗(90μL PBS，0.5％BSA,0.05％吐温，进行分配和抽吸)：1)封闭步骤：使未结合的表面饱和(1小时，2％BSA)；2)增加浓度的抗-IL-1β抗体，持续1小时；3)检测抗体，稀释度＝1:2000(驴F(ab)2抗-兔IgG POD,Amersham,NA9340V或绵羊IgG抗-小鼠IgG POD,AmershamRPN4201)。加入底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB,Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国,Cat.No11835033001)后20-30分钟，在370nm确定光密度。使用GraphPad Prism6.0软件利用四参数逻辑模型计算EC50。
实施例5
食蟹猴IL-1β结合ELISA
使用基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的技术进行结合分析。将抗原人IL-1β(SinoBiologics,Cat.No.90010CNAE)以0.5μg/mL的浓度(25μL，在PBS中)固定在384孔微量滴定平板(Thermo Scientific,Cat.No.464718)上。下述每个步骤之后是3次常规清洗(90μLPBS，0.5％BSA，0.05％吐温，进行分配和抽吸)：1)封闭步骤：使未结合的表面饱和(1小时，2％BSA)；2)增加浓度的抗-IL-1β抗体，持续1小时；3)检测抗体，稀释度＝1:2000(驴F(ab)2抗-兔IgG POD,Amersham,NA9340V或绵羊IgG抗-小鼠IgG POD,Amersham RPN4201)。加入底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB,Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国,Cat.No11835033001)后20-30分钟，在370nm确定光密度。使用GraphPad Prism 6.0软件利用四参数逻辑模型计算EC50。
实施例6
鼠IL-1β结合ELISA
使用基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的技术进行结合分析。将抗原鼠IL-1β(SinoBiologics,Cat.No.50101-MNAE)以0.5μg/mL的浓度(25μL，在PBS中)固定在384孔微量滴定平板(Thermo Scientific,Cat.No.464718)上。下述每个步骤之后是3次常规清洗(90μLPBS，0.5％BSA，0.05％吐温，进行分配和抽吸)：1)封闭步骤：使未结合的表面饱和(1小时，2％BSA)；2)增加浓度的抗-IL-1β抗体，持续1小时；3)检测抗体，稀释度＝1:2000(驴F(ab)2抗-兔IgG POD,Amersham,NA9340V或绵羊IgG抗-小鼠IgG POD,Amersham RPN4201)。加入底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB,Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国,Cat.No11835033001)后20-30分钟，在370nm确定光密度。使用GraphPad Prism 6.0软件利用四参数逻辑模型计算EC50。
实施例7
蛋白-蛋白相互作用抑制测定：人IL-1β:1型人IL-1受体
使用基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的技术进行人IL-1β与I型人IL-1受体的蛋白-蛋白相互作用抑制分析。将人His-标记的IL-1β蛋白(Sino Biologics,Cat.No.10139-H07E)以1μg/mL的浓度(25μL，在PBS，0.5％BSA和0.05％吐温中)固定在384孔微量滴定平板(Thermo Scientific Cat.No.464718)上。下述每个步骤之后是3次常规清洗(90μL PBS，进行分配和抽吸)：1)使未结合的表面饱和的封闭步骤(1小时，2％BSA)；2)将12.5μL增加浓度的抗-IL-1β抗体与12.5μL 300ng/mL的Fc-标记的人IL-1β受体(Sino Biologics,Ca.No10126-H02H)在250μL的体积中温育1小时；3)使用过氧化物酶-标记的抗huFc抗体(山羊F(ab2)抗-人FC POD,Jackson,Cat.No 109-036-098)实现检测。加入底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB,Roche Diagnostics GmbH,Cat.No.11835033001)后10-30分钟，在370nm确定光密度。使用GraphPad Prism 6.0软件利用四参数逻辑模型计算IC50。
实施例8
蛋白-蛋白相互作用抑制测定：人IL-1β:2型人IL-1受体
使用基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的技术进行人IL-1β与II型人IL-1受体的蛋白-蛋白相互作用抑制分析。将人His-标记的IL-1β蛋白(Sino Biologics,Cat.No.10139-H07E)以1μg/mL的浓度(25μL，在PBS，0.5％BSA和0.05％吐温中)固定在384孔微量滴定平板(Thermo Scientific Cat.No.464718)上。下述每个步骤之后是3次常规清洗(90μL PBS，进行分配和抽吸)：1)封闭步骤：使未结合的表面饱和(1小时，2％BSA)；2)将12.5μL增加浓度的抗-IL-1β抗体与12.5μL 30ng/mL的Fc-标记的人IL-1β受体(RnD,Ca.No.663-2R-50)在250μL的体积中温育1小时；3)使用过氧化物酶-标记的抗-huFc抗体(山羊F(ab2)抗-人FCPOD,Jackson,Cat.No 109-036-098)实现检测。加入底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB,Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国,Cat.No.11835033001)后10-30分钟，在370nm确定光密度。使用GraphPad Prism 6.0软件利用四参数逻辑模型计算IC50。
实施例9
由产生鼠抗-IL-1β抗体的杂交瘤表达小鼠杂交瘤H34
培养基包含下述试剂：RPMI(PAN),20％胎牛血清,2mM谷氨酰胺(PAN),1x丙酮酸钠(PAN),1x NEAS(PAN)
通过将试管在37℃水浴中放置60秒而将冷冻的包含细胞的小瓶预先解冻。用2ml预热的(37℃)培养基将细胞快速悬浮，并且从小瓶中转移到10ml烧瓶(CellStar)(已经含有8ml培养基)中。将烧瓶以1000rpm(25℃)离心5分钟。然后弃掉上清，并通过在10ml预热的(37℃)培养基中上下吹吸而轻轻重悬浮细胞沉淀物。将全部溶液填装到T25-烧瓶中，并将烧瓶在培养箱(37℃,7％CO2,85％湿度)中放置2天。
接下来的5天，通过以1-2x 105个细胞/ml的密度在新培养基中稀释，每2-3天分传(split)细胞。然后在接下来的日子里开始减少一部分胎牛血清，即从第一步中的20％减为10％。在10％胎牛血清中分传两次后，1:1混合培养基(RPMI(PAN),10％胎牛血清,2mM谷氨酰胺(PAN),1x丙酮酸钠(PAN),1x NEAS(PAN))与Hyclone-ADCF-MAb-培养基(Thermo-Scientific)，并且使用该培养基进行另外两次分传。然后，将Hyclone:RPMI(具有10％胎牛血清)的比例提高至3:1，并且以2-3x 105个细胞/ml的更高的密度接种细胞。至少在添加了Nutridoma CS(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国)的100％Hyclone-培养基中分传细胞。
然后，将细胞-溶液体积扩大到20ml(T75烧瓶)用于5次分传。对于抗体产生，在Celline CL1000反应器中装入15ml的细胞，密度为2.0x 106个细胞/ml，并且温育8-9天(37℃,7％CO2,85％湿度)。对于收集，将上清装入50ml falcon中，并且以4000rpm离心4次(每次循环后，将上清转入新的50ml falcon中)。最后将不含细胞的上清在-20℃冷冻。
实施例10
从鼠杂交瘤进行抗体纯化
将包含抗体的H34杂交瘤上清过滤，并通过两个层析步骤纯化。使用用PBS(1mMKH2PO4,10mM Na2HPO4,137mM NaCl,2.7mM KCl)(pH 7.4)平衡的HiTrap Prot G(GEHealthcare)，通过亲和层析捕获抗体。通过用平衡缓冲液清洗，去除未结合的蛋白，并且用25mM柠檬酸缓冲液(pH 3.0)回收抗体，并在洗脱后立即用1M Tris-碱(pH 9.0)中和至pH6.0。使用在Superdex 200TM(GE Healthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤。所述大小排阻层析在20mM组氨酸缓冲液，0.14M NaCl，pH 6.0中进行。将包含抗体的溶液用配备Biomax-SK膜(Millipore,Billerica,MA)的Ultrafree-CL离心过滤器部件浓缩并保存在-80℃。
将包含抗体的杂交瘤上清过滤，并通过两个层析步骤纯化。将上清与50％v/v 2M甘氨酸，pH 8.6，600mM NaCl混合，并且使用用1M甘氨酸，pH 8.6，300mM NaCl平衡的HiTrapMabSelectSuRe(GE Healthcare)通过亲和层析捕获。通过用平衡缓冲液清洗，去除未结合的蛋白，并且用100mM柠檬酸缓冲液(pH 2.8)回收抗体，并在洗脱后立即用1M Tris-碱(pH8.5)中和至pH 6.0。使用在Superdex 200TM(GE Healthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤。所述大小排阻层析在20mM组氨酸缓冲液，0.14M NaCl，pH 6.0中进行。将包含抗体的溶液用配备Biomax-SK膜(Millipore,Billerica,MA)的Ultrafree-CL离心过滤器部件浓缩并保存在-80℃。
实施例11
在HEK细胞中，人源化抗体的转染和瞬时表达
使用转染剂293-free(Transfection Reagent 293-free，Novagen)，在混悬适应的HEK293F(FreeStyle 293-F细胞；Invitrogen)细胞中进行抗体的瞬时表达。
在125ml摇瓶(在37℃,7％CO2,85％湿度，135rpm温育/摇动)中解冻后，细胞已经通过稀释传代至少四次(体积为30ml)。
将细胞在250ml体积中增殖至3x105个细胞/ml。三天后，将细胞分传，并且以7*105个细胞/ml的密度新接种到1升摇瓶中的250ml体积中。转染将在细胞密度约为1.4–2.0x106个细胞/ml后24小时进行。
在转染之前，用预热的(水浴；37℃)Opti-MEM(Gibco)将250μg质粒-DNA(122μg轻链和128μg重链)稀释在10ml的终体积中。轻轻混合溶液并且在室温温育不超过5分钟。然后，向DNA-OptiMEM-溶液中加入333.3μl 293-free转染剂。轻轻混合并且在室温温育15-20分钟。将全部体积的混合物加入到具有250ml HEK-细胞-培养体积的1L摇瓶中。
在37℃，7％CO2，85％湿度，135rpm温育/摇动6或7天。
通过以2,000rpm，4℃，10分钟的第一离心步骤收集上清。然后将上清转移到新的离心瓶中，以4,000rpm，4℃第二次离心20分钟。然后，将不含细胞的上清通过0.22μm瓶顶滤器(bottle-top-filter)过滤并保存在冰箱中(-20℃)。
实施例12
从HEK上清纯化抗体
将包含抗体的培养物上清过滤，并通过两个层析步骤纯化。使用用PBS(1mMKH2PO4，10mM Na2HPO4，137mM NaCl，2.7mM KCl)(pH7.4)平衡的HiTrap MabSelectSuRe(GEHealthcare)，通过亲和层析捕获抗体。通过用平衡缓冲液清洗，去除未结合的蛋白，并且用50mM柠檬酸缓冲液(pH 2.8)回收抗体，并在洗脱后立即用1M Tris-碱(pH 9.0)中和至pH6.0。使用在Superdex 200TM(GE Healthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤。所述大小排阻层析在20mM组氨酸缓冲液，0.14M NaCl，pH 6.0中进行。将包含抗体的溶液用配备Biomax-SK膜(Millipore,Billerica,MA)的Ultrafree-CL离心过滤器部件浓缩并保存在-80℃。
实施例13
抗体制剂的分析
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm的光密度(OD)，而确定抗体制剂的蛋白浓度。
使用具有蛋白表达芯片(Protein Express Chip)和HT蛋白表达试剂盒(HTProtein Express Reagents Kit)的LabChip GX II(PerkinElmer)，通过CE-SDS分析抗体的纯度和完整性。
通过使用TSK-GEL QC-PAK GFC 300用2x PBS，pH 7.4作为运行缓冲液的高效SEC，或通过使用BioSuite高分辨率SEC，5μm分析级大小排阻柱(Waters GmbH)用200mMK2HPO4/KH2PO4,250mM KCl,pH 7.0作为运行缓冲液的高效SEC，来确定抗体制剂的聚集物含量。
实施例14
从抗体制备Fab片段并分析：
将12mg抗体(1mg/ml，在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中)与240μl L-半胱氨酸溶液(Merck Millipore；250mM，在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中)和327μl木瓜蛋白酶(Roche Life Science；0.001U/mg抗体)在37℃温育120分钟。切割后，使用用PBS(1mMKH2PO4,10mM Na2HPO4,137mM NaCl,2.7mM KCl)(pH 7.4)平衡的HiTrap MabSelectSuRe(GEHealthcare)的亲和层析去除完整的IgG和Fc片段。随后，使用在Superdex 200TM(GEHealthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤，进一步纯化MabSelectSuRe层析的流过液。所述大小排阻层析在20mM组氨酸缓冲液，0.14M NaCl，pH 6.0中进行。将包含Fab片段的溶液用装配Biomax-SK膜(Millipore，Billerica，MA)的Ultrafree-CL离心过滤器部件浓缩并保存在-80℃。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm的光密度(OD)，确定Fab-片段的蛋白浓度。
在存在和不存在还原剂(5mM 1.4-二硫苏糖醇)的条件下，通过SDS-PAGE(NuPAGE4-12％Bis-Tris凝胶，Invitrogen)并用Simply Blue Safe Stain(Invitrogen)染色分析Fab-片段的纯度和完整性。
使用BioSuite高分辨率SEC,5μm分析级大小排阻柱(Waters GmbH)，使用200mM K2HPO4/KH2PO4,250mM KCl,pH 7.0作为运行缓冲液，通过高效SEC确定Fab制剂的聚集物含量。
实施例15
在用IL-1β刺激A549细胞后的ICAM-1表达
将A549细胞(10,000/孔)在补充了10％FCS的RPMI 1640中生长过夜。然后，将培养基更换为补充了0.5％血清的饥饿培养基(Hunger medium)。
将抗-IL-1β抗体与250pg/ml的IL-1β与不同浓度的抗体(1000,100,10,1,0.1,0ng/ml)温育2小时。然后，一式四份，将A549细胞用IL-1β/抗体混合物温育过夜。
将细胞用冰冷的PBS洗涤四次，然后用PFA固定20分钟。然后，将细胞用GSDB封闭，未进行透化处理。在用抗-ICAM-1抗体(R&D Systems,5μg/ml)温育2小时后，将样品用PBS清洗四次。对于染色，将样品用1:1000稀释的抗-小鼠抗体-HRP缀合物(Amersham)温育1小时。然后，将样品用PBS清洗四次，并且用ABTS温育2小时。以495nm为参比，测量405nm处的吸光度。
实施例16
在用IL-1β刺激A549细胞后的IL-6确定(Quantikine ELISA，R&D Systems)
将A549细胞(10,000/孔)在补充了10％FCS的RPMI 1640中生长过夜。然后，将培养基更换为补充了0.5％血清的饥饿培养基并继续培养96小时。
将抗-IL-1β抗体(1μg/ml)与250pg/ml的IL-1β温育2小时。然后，将A549细胞用IL-1β/抗体混合物培养过夜，一式两份。
取出100μl的培养上清样品用于进一步的分析。
将用单克隆抗-人IL-6抗体包被的96孔平板用测定稀释剂RD1W封闭15分钟。然后，加入上清样品并在室温(RT)温育2小时。将孔分别用200μl洗涤缓冲液清洗四次。然后，将孔用与HRP缀合的多克隆抗-人IL-6抗体在室温(RT)温育两个小时。将孔分别用200μl洗涤缓冲液清洗四次。之后，将孔用四甲基联苯胺和H2O2温育20分钟。20分钟后通过加入2N硫酸终止反应。以570nm作为参比波长，确定450nm处的吸光度。
实施例17
生物活性测定
由于D10细胞在不存在IL-1或饲养细胞的条件下针对con A仅最低限度地增殖，因此，鼠辅助T淋巴细胞(Th-2)D10.G4.1系已经广泛用作IL-1(白介素-1)生物活性的可靠且灵敏的测定(参见Symons,J.A.,等人，在Lymphokines and Interferons,a PracticalApproach(淋巴因子和干扰素，实践方法)中.Clemens,M.J.等人(编):IRL Press.272(1987))。这一效应的ED50典型地<12pg/mL。
将35,000个D10.G4.1T-细胞/孔(刚解冻的)在含有IL-1β(1ng/ml)的培养基(RPMI/2.5μg/ml ConA/10％FCS)中刺激72小时。
按照供应商的使用说明，通过发光细胞生存力测定(Luminescent Cell Viability Assay)确定读数。
实施例18
IL-1β诱导的HUVEC细胞上的I-CAM1上调
将在相应的培养基EBM/EGM(Cat#CC-4176)中的HUVEC细胞(Lonza,Cat#00191027)以40,000个细胞/孔接种在96孔培养平板(Costar,Cat#3596)中的EBM+2％BSA(200μl/孔)中。将细胞在5％-CO2培养箱中在37℃培养复苏24小时。进行按最后的需要40倍浓缩液的两次连续稀释：一次用抗-IL-1b抗体huH34-2，另一次用重组人IL-1β(R&D Systems,Cat#201-LB)，均在EBM+2％BSA中。将两次连续稀释液彼此1:1混合，并在室温(RT)温育一小时。向细胞中加入10μl的这种IL-1β/抗-IL-1β抗体混合物并轻轻混合。在5％-CO2培养箱中在37℃进行培养20小时。然后，从细胞去除所有的培养基，并将细胞用PBS清洗两次。在用非酶促细胞解离液(Cell Dissociation Solution Non-enzymatic)1x(Sigma,Cat#C5914)清洗一次后，用100μl细胞解离液在37℃进行温育。每5分钟通过显微镜观察检查解离。当80％的细胞变为球状时，将细胞转移到FACS-平板中(96孔，340μl储量，PP，V-底平板(Falcon Cat#353263))。使用100μl PBS+1％BSA，通过吹吸4次，将其余的细胞从培养平板上解离下来，并且也加入到FACS-平板中。5分钟后，以300xg离心，弃掉上清。将沉淀物重悬在100μl PBS+1％BSA+10μg/ml人IgG(Sigma；Cat#I2511)中，并在室温(RT)温育15分钟。添加10μl抗-人ICAM-1荧光素缀合物(CD54)(R&D Systems,Cat#BBA20)，然后在4℃温育30-45分钟。5分钟后，以300xg离心，弃掉上清。将沉淀物重悬在110μl PBS+1％BSA中并在LSRII上测量。
实施例19
在THP1细胞中MSU诱导TNFα产生
将THP1细胞(Invitrogen,Cat.No.thp-null)在作为生长培养基的补充了10％FBS(热灭活)的RPMI 1640(Gibco,Cat#A10491)中生长至1x106个细胞/ml的密度，并且转移到Falcon管中。添加PMA(佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbol myristate acetate)，Invitrogen,Cat#tlrl-pma)至300ng/ml的终浓度，并且在5％-CO2培养箱中在37℃温育3小时。将细胞用PBS清洗一次(以300xg离心5分钟，弃掉上清)，并且以1.33x106个细胞/ml的密度重悬在补充了2mM L-谷氨酰胺和10％FBS(热灭活的)的Hunger RPMI(Gibco,Cat#31870-025)中。将150μl/孔的细胞混悬液以2x105个细胞/孔接种在96孔培养平板(Costar,Cat#3596)中。在5％-CO2培养箱中在37℃进行过夜培养。添加50μl 4倍浓缩的MSU混悬液(尿酸单钠晶体，Invitrogen,Cat#tlrl-msu)(在饥饿培养基中终浓度为250μg/ml)，并且在5％-CO2培养箱中在37℃温育6小时。在生长培养基中进行抗-IL-1β抗体的连续稀释。弃掉THP1细胞的上清，并且将孔用PBS清洗一次。然后，向孔中添加制备好的抗-IL-1b抗体连续稀释液。在5％-CO2培养箱中在37℃进行过夜培养。收集上清并且通过TNFαsingleplex进行分析。
实施例20
化学降解试验
将样品分成三份等分试样，并且分别重新缓冲在20mM His/His*HCl，140mM NaCl，pH 6.0中或在PBS中，保存在40℃(His/NaCl)或37℃(PBS)。对照样品保存在-80℃。
在温育结束后，分析样品的相对活性浓度(BIAcore)，聚集(SEC)和断裂(毛细管电泳或SDS-PAGE)并与未处理的对照进行比较。
实施例21
热稳定性
在20mM组氨酸/盐酸组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中制备浓度为1mg/mL的样品，经由0.4μm滤板离心转移到光学384孔平板中，并且用石蜡油覆盖。在DynaPro平板读取仪(Wyatt)上通过动态光散射重复测量水力半径，同时以0.05℃/min的速率将样品从25℃加热至80℃。
备选地，将样品转移到10μL微量比色皿阵列中，并且用Optim1000仪器(AvactaInc.)记录静态光散射数据以及用266nm激光激发时的荧光数据，同时以0.1℃/min的速率将它们从25℃加热至90℃。
聚集开始温度定义为水力半径(DLS)或散射的光强度(Optim1000)开始增加时的温度。
解链温度定义为荧光强度相对于波长的图中的拐点。
尽管出于清楚理解的目的，通过举例说明和实施例详细地描述了前述的发明，但是所述说明和实施例不应该解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用明确地整体结合在本文中。
实施例22
抗-IL-1β抗体的结合动力学和交叉反应性
使用BIACORE T200仪器(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振研究抗-IL-1β抗体与人、食蟹猴、大鼠和小鼠IL-1β的动力学结合以及与人IL-1β和人IL-1α的交叉反应性。所有的实验使用HBS-P(10mM His,140mM NaCl,0.05％吐温20pH 7.4)作为运行和稀释缓冲液在25℃进行。使用标准的胺偶联化学，将抗-人或抗-小鼠Fc抗体固定在S系列CM5传感器芯片(GE Healthcare)上。抗-IL-1β抗体被捕获在表面上，导致100–200RU的捕获响应。向表面上注入IL-1β分子90秒，浓度从0.74至60nM(1:3连续稀释)(缔合期)。通过用运行缓冲液清洗，监测解离期达600秒。按照上述条件，通过单次注入100nM抗原，确定针对人IL-1β和人IL-1α的交叉反应性。通过以5μl/min的流速注入3M MgCl2(用于抗-人Fc抗体)或10mM甘氨酸pH 1.5(用于抗-小鼠Fc抗体)达60秒使表面再生。通过减去由模拟表面(mocksurface)得到的反应而校正本体(bulk)折射率差异。还减去空白注射液(双重参比)。使用BIAevaluation软件将衍生的曲线针对1:1朗缪尔结合模型拟合。
实施例23
抗-IL-1βIgG与抗-IL-1βFab相比较的结合动力学
使用BIACORE T200仪器(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振研究抗-IL-1βIgG和Fab与人IL-1β的结合。所有的实验使用HBS-P(10mM His,140mM NaCl,0.05％吐温20pH 7.4)作为运行和稀释缓冲液在25℃进行。使用标准的胺偶联化学，将抗-人Fc或抗-人Fab抗体固定在S系列CM5传感器芯片(GE Healthcare)上。抗-IL-1βIgG和Fab被捕获在表面上，分别导致大约100和50RU的捕获响应。向表面上以30μl/min的流速注入人IL-1β90秒，浓度从0.74至60nM(1:3连续稀释)(缔合期)。通过用运行缓冲液清洗，监测解离期600秒。通过以5μl/min的流速注入3M MgCl2(用于抗-人Fc抗体)或10mM甘氨酸pH 1.5(用于抗-小鼠Fc抗体)60秒使表面再生。通过减去由模拟表面得到的反应而校正本体折射率差异。还减去空白注射液(双重参比)。使用BIAevaluation软件将衍生的曲线针对1:1朗缪尔结合模型拟合。
实施例24
抗-IL-1β抗体的作用模式分析
使用BIACORE T200仪器(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振研究抗-IL-1β与人IL-1RI的结合抑制。所有的实验使用HBS-P(10mM His,140mM NaCl,0.05％吐温20pH7.4)作为运行和稀释缓冲液在25℃进行。使用标准的胺偶联化学，将人IL-1RI固定在S系列CM5传感器芯片(GE Healthcare)上。将10nM人IL-1β与浓度从100nM降至0.098nM(1:2连续稀释)的抗-IL-1β抗体预先温育。将IL-1β/抗-IL-1β抗体混合物以5μl/min注入流动池，60秒后的结合反应(RU)用于监测抑制。通过以5μl/min的流速注入10mM NaOH 60秒使表面再生。通过减去由模拟表面得到的反应而校正本体折射率差异。
实施例25
双特异性抗体的制备和纯化
在用转染试剂293-free(Novagen)转染DNA后，在混悬适应的HEK293F(FreeStyle293-F细胞；Invitrogen)细胞中进行双特异性抗体的瞬时表达。
在125ml摇瓶中解冻(在37℃，7％CO2，85％湿度，135rpm温育/摇动)后，每逢第三天或第四天通过稀释将细胞传代，至少传代四次(体积为30ml)。通过将细胞以3x105个细胞/ml的细胞密度接种在250ml培养基中而扩增细胞。三天后，将细胞分传，并且以2*105个细胞/ml的密度新接种在500ml培养基中。四天后，将细胞分传，并且以7*105个细胞/ml的密度新接种在1升培养基中(在37℃，7％CO2，85％湿度，110rpm温育/摇动)。在24小时后，在大约1.4–2.0x106个细胞/ml的细胞密度进行转染。
在转染之前，将1000μg质粒-DNA(2x 250μg轻链编码质粒DNA和2x 250μg重链编码质粒DNA)稀释在终体积为40ml的预热的(水浴；37℃)Opti-MEM(Gibco)中。将溶液轻轻混合，并且在室温温育不超过5分钟。然后，向DNA-Opti-MEM-溶液中加入1333μl 293-free转染剂。将混合物轻轻混合，并且在室温温育15-20分钟。小心地将全部体积的混合物添加到1升HEK-细胞培养物中。将细胞在37℃，7％CO2，85％湿度下以110rpm摇动进一步培养7天。
7天后，通过以2000rpm，4℃离心10分钟的第一离心步骤收集上清。然后，将上清转移到新的离心瓶中用于以4000rpm，4℃离心20分钟的第二离心步骤。将不含细胞的上清通过0.22μm滤器(Millipore)过滤并且在开始纯化步骤之前保存在冰箱中(-20℃)。
将含有抗体的培养上清过滤并通过至少两个层析步骤纯化。使用用PBS(1mMKH2PO4，10mM Na2HPO4，137mM NaCl，2.7mM KCl)(pH7.4)平衡的CaptureSelect预装柱IgG-CH1(life technologies,#494320005)，通过亲和层析捕获抗体。通过用平衡缓冲液清洗去除未结合的蛋白，并且用25mM柠檬酸缓冲液(pH 3.0)回收抗体，并在洗脱后立即用1MTris-碱(pH 9.0)中和至pH 6.0。
使用在Superdex 200TM(GE Healthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤。所述大小排阻层析在20mM组氨酸缓冲液，0.14M NaCl，pH 6.0中进行。将含有抗体的溶液用装配Biomax-SK膜(Millipore，Billerica，MA)的Ultrafree-CL离心过滤器部件浓缩并保存在-80℃。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm的光密度(OD)确定抗体制剂的蛋白浓度。
使用具有蛋白表达芯片和HT蛋白表达试剂盒的LabChip GX II(PerkinElmer)，通过CE-SDS分析抗体的纯度和完整性。
使用BioSuite高分辨率SEC，5μm分析级大小排阻柱(Waters GmbH)，使用200mM K2HPO4/KH2PO4，250mM KCl，pH 7.0作为运行缓冲液，通过高效SEC确定抗体制剂的聚集物含量。
抗体0031是包含SEQ ID NO:04(VH)与SEQ ID NO:06(VL)的IL-1β结合位点和SEQID NO:53(VH)与SEQ ID NO:54(VL)的ANG2结合位点的CrossMab抗体。
抗体0032是包含SEQ ID NO:55(VH)与SEQ ID NO:56(VL)的VEGF结合位点和SEQID NO:04(VH)与SEQ ID NO:06(VL)的IL-1β结合位点的CrossMab抗体。
实施例26
双特异性抗体动力学表征
IL-1β：
使用BIACORE T200仪器(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振研究抗-IL-1β抗体与人IL-1β的结合动力学。所有的实验使用HBS-P(10mM His,140mM NaCl,0.05％吐温20pH 7.4)作为运行和稀释缓冲液在25℃进行。使用标准的胺偶联化学，将抗-人Fc抗体固定在S系列CM5传感器芯片(GE Healthcare)上。双特异性抗体被捕获在表面上，导致100–200RU的捕获响应。向表面上注入人IL-1β90秒，浓度从0.74至60nM(1:3连续稀释)(缔合期)。通过用运行缓冲液清洗，监测解离期600秒。通过以5μl/min的流速注入3M MgCl2(用于抗-人Fc抗体)或10mM甘氨酸pH1.5(用于抗-小鼠Fc抗体)60秒使表面再生。通过减去由模拟表面得到的反应而校正本体折射率差异。还减去空白注射液(双重参比)。使用BIAevaluation软件将衍生的曲线针对1:1朗缪尔结合模型拟合。
ANG2：
使用BIACORE T200仪器(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振研究双特异性抗体与人ANG2-RBD-小鼠Fc-区融合体的结合。使用GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒，在pH 5.0将大约4000RU的抗-小鼠Fc-区抗体(10μg/ml抗-小鼠(Fc)抗体)偶联到S系列CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上。在固定步骤过程中使用HBS-N(10mM HEPES，150mMNaCl pH 7.4，GE Healthcare)作为运行缓冲液。对于下述动力学表征，样品和运行缓冲液为HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，0.05％表面活性剂P20；GE Healthcare)。流动池设置为25℃–并且样品区组设置为12℃–并在动力学表征之前用运行缓冲液致敏两次。
通过以5μl/min的流速注入1μg/ml溶液30秒而捕获人ANG2-RBD-鼠Fc-区融合体。通过以90μl/min的流速注入在溶液中的不同浓度(以300nM起始，连续1:3稀释)的双特异性抗体90秒而测量缔合。监测解离期直至600秒，并且解离期通过由样品溶液转换为运行缓冲液而引发。通过以5μl/min的流速用3M MgCl2溶液清洗60秒而使所有表面再生。通过减去由抗-小鼠IgG抗体(Fc)表面得到的反应而校正本体折射率差异。还减去空白注射液(＝双重参比)。为了计算KD和其他动力学参数，使用朗缪尔1:1模型进行。
VEGF：
使用BIACORE T200仪器(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振研究双特异性抗体与人VEGF同种型121的结合。使用GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒，按照制造商的使用说明，将抗-六-组氨酸抗体偶联到CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上。在固定步骤过程中使用HBS-N(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，GE Healthcare)作为运行缓冲液。对于下述动力学表征，样品和运行缓冲液为HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，0.05％表面活性剂P20；GE Healthcare)。流动池设置为25℃–并且样品区组设置为12℃–并在动力学表征之前用运行缓冲液致敏两次。
通过以5μl/min的流速注入溶液30秒捕获包含组氨酸标记的人VEGF同种型121。通过以90μl/min的流速注入在溶液中的不同浓度(以300nM起始，连续1:3稀释)的双特异性抗体90秒而测量缔合。监测解离期直至600秒，并且解离期通过由样品溶液转换为运行缓冲液而引发。通过以5μl/min的流速用3M MgCl2溶液清洗60秒而使所有表面再生。通过减去由抗-六-组氨酸抗体表面得到的反应而校正本体折射率差异。还减去空白注射液(＝双重参比)。为了计算KD和其他动力学参数，使用朗缪尔1:1模型进行。
实施例27
X-射线结构确定
Apo Fab片段H34
在32mg/ml的浓度进行Fab片段H34的结晶筛选。在蒸汽扩散坐滴实验(vapordiffusion sitting drop experiments)中，通过混合0.1μl蛋白溶液和0.1μl储备溶液，将结晶微滴设置为21℃。在包含PEG作为沉淀剂的不同条件下，晶体析出。用于确定H34的结构的晶体在2天内从0.1M HEPES pH 7.0,20％PEG 4000中析出和从0.1M二甲基胂酸钠，15％PEG4000中析出。
用无水石蜡油(作为冷冻保护剂)收集晶体，然后在液氮(liquid N2)中快速冷却。以Swiss光源的光束线X10SA在100K的温度用Pilatus 6M检测器采集衍射图像，并且用XDS包处理(Kabsch,W.Automatic processing of rotation diffraction data fromcrystals of initially unknown symmetry and cell constants(来自初始未知对称性和晶胞常数的晶体的旋转衍射的自动处理).J.Appl.Cryst.26(1993)795-800)。将来自两种晶体的数据合并，产生分辨率的数据组(在空间群P1中，且两个Fab/晶体学不对称单位)(见下表)。
使用来自Roche-内部PDB-ID 1htfr的Fab 577作为检索模型，通过分子替换确定结构。Fab分成恒定和可变结构域，并且都用于在CCP4程序PHASER CCP4(CCP4(Collaborative Computational Project(合作计算项目),N.The CCP4suite:programsfor protein crystallography(CCP4套件：用于蛋白晶体学的程序).ActaCrystallogr.D,(1994)760-763)中分开的检索，以解释弯角(elbow angle)中可能的变化。该模型在COOT(Emsley,P.,Lohkamp,B.,Scott,WG.&Cowtan,K.Features and developmentof COOT(COOT的特征和发展).Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.60(2010)486-501)中重建并且用CCP4程序精修。
表：关于H34Fab apo-晶体的数据采集和结构精修统计
所有数据用Phenix计算。
1括号中的值表示最高分辨率库(highest resolution bins)。
2R合并＝Σ|I-<I>|/ΣI，其中I是强度。
3R工作＝Σ|Fo-<Fc>|/ΣFo，其中Fo是观察到的且Fc是计算的结构因子幅度。
4R无是基于在精修过程中忽略的5％的总数据计算的。
具有人Il-1β的复合Fab片段H34
在结晶筛选前，将Fab片段H34与IL-1β(Peprotech)以1.2:1的摩尔比混合。将蛋白混合物在21℃温育2小时。用于结晶实验的蛋白浓度为32mg/ml。在蒸汽扩散坐滴实验中，通过混合0.1μl蛋白和0.1μl储备溶液，将结晶微滴设置为21℃。在2天内晶体从0.1M Tris pH8.0,20％PEG4000中析出，并在4天内生长至0.15mm x 0.06mm x 0.01mm的最终尺寸。
不添加冷冻保护剂，收集晶体，然后在液氮(liquid N2)中快速冷冻。以Swiss光源的光束线X10SA在100K的温度用Pilatus 6M检测器采集衍射图像，并且用XDS包处理(Kabsch,W.Automatic processing of rotation diffraction data from crystals ofinitially unknown symmetry and cell constants(来自初始未知对称性和晶胞常数的晶体的旋转衍射的自动处理).J.Appl.Cryst.26(1993)795-800(1993))。数据采集和处理按照与用于H34apo晶体相同的途径(见上文)进行。统计数据收集在上表中。将来自两种晶体的数据合并以得到更完整的数据组。使用H34Fab结构和白介素-1β(PDB-ID 1l2h)作为检索模型，分子替换是成功的。模型构建和精修如上文所述进行。
表：H34Fab IL-1β复合物晶体的数据采集和结构精修统计
所有数据用Phenix计算。
1括号中的值表示最高分辨率库(highest resolution bins)。
2R合并＝Σ|I-<I>|/ΣI，其中I是强度。
3R工作＝Σ|Fo-<Fc>|/ΣFo，其中Fo是观察到的且Fc是计算的结构因子幅度。
4R无是基于在精修过程中忽略的5％的总数据计算的。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> 抗-IL-1β抗体和使用方法
<130> P32414
<150> EP14192523.0
<151> 2014-11-10
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Thr Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 105
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 2
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Ser Gln Gln Lys Ser Gly Ser Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Asn Tyr Tyr Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huH34-1 VH
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Gly Phe Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huH34-2 VH
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huH34-3 VH
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huH34 VK
<400> 6
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Ser Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Asn Tyr Tyr Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huH34 test 1 VH
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Phe Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huH34 test 1 VK
<400> 8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Asn Tyr Tyr Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 9
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ser Pro Thr Arg Tyr Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys His His Phe Tyr Asn Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 11
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
1 5
<210> 12
<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 12
Tyr Asn Ala
1
<210> 13
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 13
Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Arg Phe Arg
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Gly
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 14
Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu
1 5
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 15
Ser Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 16
<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 16
Ser Thr Ser
1
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<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 17
Trp Ser Asn Tyr Tyr
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huH34-1-HVR-H1
<400> 18
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huH34-1-HVR-H2s
<400> 19
Tyr Ser Gly
1
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huH34-1-HVR-H2
<400> 20
Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Gly Phe Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 21
Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 22
Ser Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 23
<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 23
Ser Thr Ser
1
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 24
Trp Ser Asn Tyr Tyr
1 5
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
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Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
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Tyr Asn Ala
1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huH34-2-HVR-H2
<400> 27
Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
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<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 28
Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 29
Ser Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 30
<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 30
Ser Thr Ser
1
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 31
Trp Ser Asn Tyr Tyr
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 32
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
1 5
<210> 33
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huH34-3-HVR-H2s
<400> 33
Tyr Ser Ala
1
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huH34-3-HVR-H2
<400> 34
Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 35
Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu
1 5
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 36
Ser Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 37
<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 37
Ser Thr Ser
1
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 38
Trp Ser Asn Tyr Tyr
1 5
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 39
Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
1 5
<210> 40
<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 40
Tyr Tyr Gly
1
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 41
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 42
Gly Ser Pro Thr Arg Tyr Tyr Val Met Asp
1 5 10
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 43
Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
1 5
<210> 44
<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 44
Ala Ala Thr
1
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 45
Phe Tyr Asn Thr Pro Trp
1 5
<210> 46
<211> 269
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser
1 5 10 15
Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Gln Met
20 25 30
Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile
35 40 45
Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala
50 55 60
Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro
65 70 75 80
Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe
85 90 95
Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala
100 105 110
Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp
115 120 125
Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala
130 135 140
Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met
145 150 155 160
Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu
165 170 175
Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp
180 185 190
Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys
195 200 205
Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn
210 215 220
Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr
225 230 235 240
Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly
245 250 255
Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
260 265
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 47
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 48
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 49
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CrossMab Ang2mut4 + huH34-2 HC1
<400> 49
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
305 310 315 320
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 50
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CrossMab Ang2mut4 + huH34-2 HC2
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 51
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CrossMab Ang2mut4 + huH34-2 LC1
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Pro Gly Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Pro Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 52
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CrossMab Ang2mut4 + huH34-2 LC2
<400> 52
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Ser Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Asn Tyr Tyr Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
100 105 110
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala
115 120 125
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130 135 140
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
145 150 155 160
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
180 185 190
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
195 200 205
Arg Gly Glu Cys
210
<210> 53
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ang2 LC10 wt + G114A, S360P, T28N, T30A (HC) + D50T (LC) VH
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Pro Gly Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Pro Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 54
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ang2 LC10 wt + G114A, S360P, T28N, T30A (HC) + D50T (LC) VL
<400> 54
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser
100 105 110
<210> 55
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGF_LC VHVL交叉LC kappa
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGF_LC10 VHVL交叉IgG HC LALAPGAAA knob
<400> 56
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 57
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CrossMab Ang2mut5 + huH34-2 HC1
<400> 57
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
305 310 315 320
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 58
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CrossMab Ang2mut5 + huH34-2 HC2
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 59
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CrossMab Ang2mut5 + huH34-2 LC1
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ser Ser Pro Gly Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Pro Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 60
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CrossMab Ang2mut5 + huH34-2 LC2
<400> 60
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Ser Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Asn Tyr Tyr Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
100 105 110
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala
115 120 125
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130 135 140
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
145 150 155 160
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
180 185 190
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
195 200 205
Arg Gly Glu Cys
210

Claims (11)

1.特异性结合人和食蟹猴IL-1β的人源化抗体，其中所述人源化抗体包含：(a)包含SEQID NO:25的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L2，和(f)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L3，
其中在重链可变结构域中，位置48是异亮氨酸氨基酸残基，位置67是丙氨酸氨基酸残基，位置69是苯丙氨酸氨基酸残基和位置93是缬氨酸氨基酸残基，并且在轻链可变结构域中，位置36是氨基酸残基丝氨酸(按照Kabat编号)。
2.根据权利要求1所述的人源化抗体，其包含：(a)与SEQ ID NO:04的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列，(b)与SEQ ID NO:06的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列，或(c)(a)中的VH序列与(b)中的VL序列。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的人源化抗体，其包含SEQ ID NO:04的VH序列和SEQID NO:06的VL序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的人源化抗体，其中所述人源化抗体是人IgG1亚类的或人IgG4亚类的人源化抗体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的人源化抗体，其中所述人源化抗体通过抑制人IL-1β与人IL-1受体的结合而阻断人IL-1β的生物学活性。
6.一种药物制剂，其包含权利要求1-5中任一项所述的抗体和任选地药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的药物制剂，其还包含选自抗-ANG2抗体和抗-VEGF抗体的另外的治疗剂。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的人源化抗体，其用作药物。
9.权利要求1-5中任一项所述的人源化抗体在制备药物中的应用。
10.根据权利要求8和9中任一项所述的应用，其中所述药物用于治疗眼血管疾病，优选用于治疗黄斑变性。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的应用，其中所述药物用于抑制IL-1β与IL-1受体I和II之间的相互作用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020034941A1 (zh) * 2018-08-14 2020-02-20 中山康方生物医药有限公司 抗IL-1β的抗体、其药物组合物及其用途
CN111662381A (zh) * 2019-03-07 2020-09-15 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 人IL-1β蛋白结合分子及其编码基因和应用
CN117126278A (zh) * 2023-10-26 2023-11-28 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种单克隆抗体及其应用

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2417156T3 (en) 2009-04-07 2015-03-02 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
CA2963723A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-pdgf-b antibodies and methods of use
MX2017005977A (es) 2014-11-10 2017-06-29 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos y metodos de uso en oftalmologia.
EP3218402A1 (en) 2014-11-10 2017-09-20 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-il-1beta antibodies and methods of use
CN107001456A (zh) 2014-11-10 2017-08-01 豪夫迈·罗氏有限公司 抗ang2 抗体及使用方法
EP3227332B1 (en) 2014-12-03 2019-11-06 F.Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
AR111761A1 (es) * 2017-05-16 2019-08-14 Cj Healthcare Corp Un método para purificar un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de este usando cromatografía de afinidad
WO2018212556A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Cj Healthcare Corporation A method for purifying an antibody or an antibody fragment thereof using affinity chromatography
CN110997725B (zh) 2017-06-12 2024-08-09 蓝鳍生物医药公司 抗-il1rap抗体和抗体药物缀合物
TW201940512A (zh) * 2018-01-26 2019-10-16 美商健臻公司 具有與ＦｃＲｎ增進的結合及延長的半衰期之Ｆｃ變異體
KR102652720B1 (ko) 2018-12-21 2024-03-29 에프. 호프만-라 로슈 아게 Vegf 및 il-1베타에 결합하는 항체 및 이의 사용 방법
AU2020292304B2 (en) 2019-06-11 2023-03-30 Bioatla, Inc. Conditionally active anti-EpCam antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
CN114524875B (zh) * 2021-11-11 2023-07-25 江苏莱森生物科技研究院有限公司 偶联IL-1β单克隆抗体的纳米硅球及应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4935343A (en) * 1986-08-08 1990-06-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Monoclonal antibodies for interleukin-1β
WO2004067568A2 (en) * 2003-01-24 2004-08-12 Applied Molecular Evolution, Inc Human il-1 beta antagonists
WO2005052002A2 (en) * 2003-11-20 2005-06-09 Massachusetts Institute Of Technology Single-domain antibodies and uses thereof
CN102369217A (zh) * 2009-01-29 2012-03-07 雅培制药有限公司 Il-1结合蛋白
CN102655880A (zh) * 2009-10-15 2012-09-05 雅培制药有限公司 Il-1结合蛋白
CN103517921A (zh) * 2010-12-21 2014-01-15 Abbvie公司 IL-1-α和-β双特异性双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
US20140271458A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1 and/or IL-17
WO2014177460A1 (en) * 2013-04-29 2014-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Human fcrn-binding modified antibodies and methods of use

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005518802A (ja) * 2002-02-28 2005-06-30 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 抗インターロイキン−１ベータ類縁体
JP2006512895A (ja) 2002-06-28 2006-04-20 ドマンティス リミテッド リガンド
US20050282233A1 (en) 2004-03-05 2005-12-22 Ludwig Institute For Cancer Research Multivalent antibody materials and methods for VEGF/PDGF family of growth factors
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
WO2012021773A1 (en) * 2010-08-13 2012-02-16 Genentech, Inc. Antibodies to il-1beta and il-18, for treatment of disease
RU2013115927A (ru) * 2010-09-10 2014-10-20 Апексиджен, Инк. АНТИТЕЛА ПРОТИВ ИЛ-1β И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
JP6069312B2 (ja) 2011-06-29 2017-02-01 アムジェン インコーポレイテッド 腎細胞癌の治療における生存の予測バイオマーカー
JP2015522576A (ja) 2012-06-28 2015-08-06 モレキュラー・パートナーズ・アーゲーＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ａｇ 血小板由来成長因子に結合する設計アンキリンリピートタンパク質
HRP20211641T1 (hr) 2012-07-13 2022-02-04 Roche Glycart Ag Bispecifična protutijela anti-vegf/anti-ang-2 i njihova primjena u liječenju vaskularnih očnih bolesti
KR20150060687A (ko) 2012-09-28 2015-06-03 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 이중 안지오포이에틴-2/Dll4 결합제 및 항-VEGF-R 제제를 포함하는 약제학적 조합물
EA201500371A1 (ru) 2012-09-28 2015-08-31 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМБИНАЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДВОЙНЫЕ АНГИПОЭТИН-2/Dll4 СВЯЗЫВАЮЩИЕ АГЕНТЫ И АНТИ-VEGF АГЕНТЫ
CA2890471C (en) 2012-11-08 2021-07-27 Clearside Biomedical, Inc. Methods and devices for the treatment of ocular diseases in human subjects
KR20150082503A (ko) 2012-11-09 2015-07-15 화이자 인코포레이티드 혈소판 유래 성장 인자 b 특이적 항체, 및 그의 조성물 및 용도
JO3405B1 (ar) 2013-01-09 2019-10-20 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها
CN105611944A (zh) 2013-12-20 2016-05-25 豪夫迈·罗氏有限公司 抗ang2抗体和cd40激动剂的组合疗法
EP3094647A1 (en) 2014-01-15 2016-11-23 F. Hoffmann-La Roche AG Fc-region variants with modified fcrn- and maintained protein a-binding properties
CA2963723A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-pdgf-b antibodies and methods of use
CN107001456A (zh) 2014-11-10 2017-08-01 豪夫迈·罗氏有限公司 抗ang2 抗体及使用方法
EP3218402A1 (en) 2014-11-10 2017-09-20 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-il-1beta antibodies and methods of use
MX2017005977A (es) 2014-11-10 2017-06-29 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos y metodos de uso en oftalmologia.
US20190004048A1 (en) 2015-06-26 2019-01-03 Amgen Inc. Biomarker of Survival in the Treatment of Renal Cell Carcinoma with a VEGFR Inhibitor and an Ang2 Inhibitor
WO2018220169A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-cancer combination therapy

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4935343A (en) * 1986-08-08 1990-06-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Monoclonal antibodies for interleukin-1β
WO2004067568A2 (en) * 2003-01-24 2004-08-12 Applied Molecular Evolution, Inc Human il-1 beta antagonists
WO2005052002A2 (en) * 2003-11-20 2005-06-09 Massachusetts Institute Of Technology Single-domain antibodies and uses thereof
CN102369217A (zh) * 2009-01-29 2012-03-07 雅培制药有限公司 Il-1结合蛋白
CN102655880A (zh) * 2009-10-15 2012-09-05 雅培制药有限公司 Il-1结合蛋白
CN103517921A (zh) * 2010-12-21 2014-01-15 Abbvie公司 IL-1-α和-β双特异性双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
US20140271458A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1 and/or IL-17
WO2014177460A1 (en) * 2013-04-29 2014-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Human fcrn-binding modified antibodies and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUAN C. ALMAGRO等: ""Humanization of antibodies"", 《FRONTIERS IN BIOSCIENCE》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020034941A1 (zh) * 2018-08-14 2020-02-20 中山康方生物医药有限公司 抗IL-1β的抗体、其药物组合物及其用途
CN112654640A (zh) * 2018-08-14 2021-04-13 中山康方生物医药有限公司 抗IL-1β的抗体、其药物组合物及其用途
CN111662381A (zh) * 2019-03-07 2020-09-15 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 人IL-1β蛋白结合分子及其编码基因和应用
CN111662381B (zh) * 2019-03-07 2022-06-07 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 人IL-1β蛋白结合分子及其编码基因和应用
CN115028723A (zh) * 2019-03-07 2022-09-09 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 人IL-1β蛋白结合分子及其编码基因和应用
CN115028723B (zh) * 2019-03-07 2023-08-29 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 人IL-1β蛋白结合分子及其编码基因和应用
CN117126278A (zh) * 2023-10-26 2023-11-28 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种单克隆抗体及其应用
CN117126278B (zh) * 2023-10-26 2024-01-05 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种单克隆抗体及其应用

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DENGL et al. Patent 2963719 Summary

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