KR20170005854A

KR20170005854A - 엑소솜과 관련된 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20170005854A
Application number: KR1020167034964A
Authority: KR
Inventors: 에스. 알렉산더 미셜리스; 스텔라 쿠어렘바나스; 콘스탄티노스 스드리마스
Original assignee: 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션
Priority date: 2014-05-18
Filing date: 2015-05-15
Publication date: 2017-01-16
Also published as: IL249011B; CN113817672A; IL249011A0; EP3145493A4; US11759481B2; JP2021020908A; US20200281983A1; CN106714781A; CN106714781B; EP3145493A1; AU2015264519A1; EP3145493B1; US20170258840A1; AU2015264519B2; CA2949083C; WO2015179227A1; CA2949083A1; US10624929B2; ES2929725T3; JP6773563B2

Abstract

본 개시내용은 엑소솜 하위집단을 포함하는 조성물, 및 폐 장애, 심혈관 장애, 신장 장애 및 허혈성 신경 장애를 비롯한 특정 장애를 갖는 대상체에서의 그의 사용 방법을 제공한다. 본 개시내용은 엑소솜을 포함하는 조성물, 및 다양한 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방에 있어서의 그의 사용 방법을 제공한다. 따라서, 본 개시내용의 한 측면은 단리된 엑소솜을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하고/거나, 단리된 엑소솜은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8종의 마커를 포함한다.

Description

엑소솜과 관련된 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS RELATING TO EXOSOMES}

관련 출원

이 출원은 2014년 5월 18일에 출원된, 발명의 명칭이 "엑소솜과 관련된 방법 및 조성물"인 미국 가출원 일련 번호 제61/994,974호의 35 U.S.C. § 119(e) 하의 우선권을 주장하며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

엑소솜은 혈액, 뇨, 및 세포 배양물로부터의 조건화 배지를 비롯한 많은 및 아마도 모든 생물학적 유체에 존재하는 세포-유래된 소포이다. 엑소솜의 보고된 직경은 전형적으로 30 내지 100 nm이며, 이는 비교를 위해 LDL보다 크지만, 적혈구보다는 상당히 더 작다. 엑소솜은 다소포체가 형질막과 융합되는 경우 또는 이들이 형질 막으로부터 직접 방출되는 경우 세포로부터 방출되는 것으로 공지되어 있다. 엑소솜은 특화된 기능을 가지며, 예를 들어, 응고, 세포간 신호전달, 및 노폐물 처리에서 주요 역할을 함이 점점 더 명확해지고 있다. 결과적으로, 세포-유래된 엑소솜의 측면을 개괄하는 합성 엑소솜을 비롯한 엑소솜의 임상적 적용에 관심이 증가하고 있다. 엑소솜은 잠재적으로 건강 및 질환에 대한 예후, 요법, 및 바이오마커에 사용될 수 있다.

발명의 요약

본 개시내용은 엑소솜을 포함하는 조성물, 및 다양한 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방에 있어서의 그의 사용 방법을 제공한다.

따라서, 본 개시내용의 한 측면은 단리된 엑소솜을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하고/거나, 단리된 엑소솜은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8종의 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 마커 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7종의 마커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 마커 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 투과 전자 현미경검사에서 음성 염색 시 구상 형태를 가지며, 방사선투과성을 나타내고/거나, 단리된 엑소솜은 음성 염색 투과 전자 현미경검사에서 컵 형상 형태를 갖지 않는다. 단리된 엑소솜은 약 10 내지 150 nm의 직경을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 약 30 내지 100 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 중간엽 줄기 세포 (MSC), 섬유모세포, 또는 대식세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, MSC, 섬유모세포, 또는 대식세포는 인간 MSC, 인간 섬유모세포, 또는 인간 대식세포이다. 일부 실시양태에서, MSC는 와튼 젤리, 제대혈, 태반, 말초 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 조성물에 포함된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약 조성물이다.

본 개시내용의 또 다른 측면에 따르면, 단리된 엑소솜이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하고/거나, 단리된 엑소솜은 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7종의 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 마커 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, 및 AKT1 및 AKT2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8종의 마커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 마커 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5, 및 CD105를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 음성 염색 투과 전자 현미경검사에서 컵 형상 형태를 갖고/거나, 음성 염색 투과 전자 현미경검사에서 구상 형태를 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 약 10 내지 250 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 약 30 내지 200 nm의 직경을 갖는다.

또 다른 측면에 따르면, 폐 장애, 심혈관 장애, 신장 장애, 또는 허혈성 신경 장애의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 폐 장애, 심혈관 장애, 신장 장애, 또는 허혈성 신경 장애를 갖거나 또는 가질 위험성이 있는 대상체에게 단리된 엑소솜의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하고/거나, 단리된 엑소솜은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8종의 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 마커 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7종의 마커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 마커 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 투과 전자 현미경검사에서 음성 염색 시 구상 형태를 가지며, 방사선투과성을 나타내고/거나, 단리된 엑소솜은 음성 염색 투과 전자 현미경검사에서 컵 형상 형태를 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 약 10 내지 150 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 약 30 내지 100 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 중간엽 줄기 세포 (MSC), 섬유모세포, 또는 대식세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, MSC, 섬유모세포, 또는 대식세포는 인간 MSC, 인간 섬유모세포, 또는 인간 대식세포이다. 일부 실시양태에서, MSC는 와튼 젤리, 제대혈, 태반, 말초 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 치료되는 폐 장애는 염증성 폐 질환, 폐 혈관 질환, 또는 급성 폐 손상이다. 일부 실시양태에서, 염증성 폐 질환은 저산소증-유발 폐 염증, 폐 고혈압, 천식, 기관지폐 이형성증 (BPD), 알레르기, 또는 특발성 폐 섬유증이다. 일부 실시양태에서, 급성 폐 손상은 패혈증과 연관되거나, 인공호흡기-유발 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)이다. 일부 실시양태에서, 방법에 따라 치료되는 심혈관 장애는 심근 경색, 심혈관 질환, 고혈압, 아테롬성동맥경화증, 또는 심부전이다. 신장 장애의 치료를 포함하는 일부 실시양태에서, 신장 장애는 허혈성 신장 손상, 급성 신부전, 또는 신장 섬유증이다. 허혈성 신경 장애의 치료를 포함하는 방법의 실시양태에서, 장애는 저산소성 허혈성 뇌병증 또는 허혈성 졸중이다.

본 개시내용의 더 또 다른 측면에 따르면, 폐 장애, 심혈관 장애, 신장 장애, 또는 허혈성 신경 장애의 치료를 위한 단리된 엑소솜의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하고/거나, 단리된 엑소솜은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8종의 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 마커 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7종의 마커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 마커 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 투과 전자 현미경검사에서 음성 염색 시 구상 형태를 가지며, 방사선투과성을 나타내고/거나, 단리된 엑소솜은 음성 염색 투과 전자 현미경검사에서 컵 형상 형태를 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 약 10 내지 150 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 약 30 내지 100 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 중간엽 줄기 세포 (MSC), 섬유모세포, 또는 대식세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, MSC, 섬유모세포, 또는 대식세포는 인간 MSC, 인간 섬유모세포, 또는 인간 대식세포이다. 일부 실시양태에서, MSC는 와튼 젤리, 제대혈, 태반, 말초 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 폐 장애는 염증성 폐 질환, 폐 혈관 질환, 또는 급성 폐 손상이다. 일부 실시양태에서, 염증성 폐 질환은 저산소증-유발 폐 염증, 폐 고혈압, 천식, 기관지폐 이형성증 (BPD), 알레르기, 또는 특발성 폐 섬유증이다. 일부 실시양태에서, 급성 폐 손상은 패혈증과 연관되거나, 인공호흡기-유발 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)이다. 일부 실시양태에서, 심혈관 장애는 심근 경색, 심혈관 질환, 고혈압, 아테롬성동맥경화증, 또는 심부전이다. 일부 실시양태에서, 신장 장애는 허혈성 신장 손상, 급성 신부전, 또는 신장 섬유증이다. 일부 실시양태에서, 허혈성 신경 장애는 저산소성 허혈성 뇌병증 또는 허혈성 졸중이다.

또 다른 측면에 따르면, 폐 장애, 심혈관 장애, 신장 장애, 또는 허혈성 신경 장애의 치료용 의약의 제조에 있어서의 단리된 엑소솜의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하고/거나, 단리된 엑소솜은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8종의 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 마커 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7종의 마커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 마커 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 투과 전자 현미경검사에서 음성 염색 시 구상 형태를 가지며, 방사선투과성을 나타내고/거나; 단리된 엑소솜은 음성 염색 투과 전자 현미경검사에서 컵 형상 형태를 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 약 10 내지 150 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 약 30 내지 100 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 중간엽 줄기 세포 (MSC), 섬유모세포, 또는 대식세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, MSC, 섬유모세포, 또는 대식세포는 인간 MSC, 인간 섬유모세포, 또는 인간 대식세포이다. 일부 실시양태에서, MSC는 와튼 젤리, 제대혈, 태반, 말초 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 단리된다. 폐 장애의 치료용 의약의 제조를 위한 엑소솜의 용도를 포함하는 일부 실시양태에서, 장애는 염증성 폐 질환, 폐 혈관 질환, 또는 급성 폐 손상이다. 일부 실시양태에서, 염증성 폐 질환은 저산소증-유발 폐 염증, 폐 고혈압, 천식, 기관지폐 이형성증 (BPD), 알레르기, 또는 특발성 폐 섬유증이다. 일부 실시양태에서, 급성 폐 손상은 패혈증과 연관되거나, 인공호흡기-유발 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)이다. 일부 실시양태에서, 심혈관 장애의 치료용 의약의 제조를 위한 엑소솜의 용도가 제공되며, 장애는 심근 경색, 심혈관 질환, 고혈압, 아테롬성동맥경화증, 또는 심부전이다. 신장 장애의 치료용 의약의 제조를 위한 엑소솜의 용도를 포함하는 일부 실시양태에서, 신장 장애는 허혈성 신장 손상, 급성 신부전, 또는 신장 섬유증이다. 허혈성 신경 장애의 치료용 의약의 제조를 위한 엑소솜의 용도를 포함하는 일부 실시양태에서, 장애는 저산소성 허혈성 뇌병증 또는 허혈성 졸중이다.

본 개시내용의 더 또 다른 측면에 따르면, 엑소솜(들)의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 조건화 배지를 제조하기 위해 세포를 배양하고, 조건화 배지로부터 엑소솜을 단리하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하고/거나, 단리된 엑소솜은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8종의 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 마커 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7종의 마커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 마커 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 투과 전자 현미경검사에서 음성 염색 시 구상 형태를 가지며, 방사선투과성을 나타내고/거나, 단리된 엑소솜은 음성 염색 투과 전자 현미경검사에서 컵 형상 형태를 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 약 10 내지 150 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 약 30 내지 100 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜은 중간엽 줄기 세포 (MSC), 섬유모세포, 또는 대식세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, MSC, 섬유모세포, 또는 대식세포는 인간 MSC, 인간 섬유모세포, 또는 인간 대식세포이다. 일부 실시양태에서, MSC는 와튼 젤리, 제대혈, 태반, 말초 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 배양은 2-차원 (2D) 또는 3-차원 (3D) 배양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 3D 배양은 현적 배양, 매트릭스 상 배양, 미세담체 상 배양, 합성 세포외 스캐폴드 상 배양, 키토산 막 상 배양, 자기 부상 하 배양, 회전 생물반응기 중 현탁 배양, 또는 비-접촉 억제 조건 하 배양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 배양은 TGFβ 슈퍼패밀리 (TGFβ1, 액티빈 (Activin), BMP, GDF, GDNF, 인히빈 (Inhibin), 노달 (Nodal), 레프티 (Lefty), MIS) EGF, PDGF, 및 FGF로부터 선택되는 1종 이상의 성장 인자의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하는 엑소솜에 비해 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하는 엑소솜의 생성을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 향상은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하는 엑소솜에 비해 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하는 엑소솜의 제조의 1.5배, 2.0배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배, 또는 5.0배, 6.0배, 7.0배, 8.0배, 9.0배, 또는 10.0배 이상 증가를 포함한다.

본 개시내용의 이들 및 다른 측면 및 실시양태는 본원에서 보다 상세하게 설명될 것이다.

도 1. 중간엽 줄기 세포 엑소솜 (MEX) 제제의 정맥내 주사에 의한 마우스의 처리는 혈관 재형성 및 폐 고혈압과 연관된 신호전달의 저산소성 활성화를 하향-조절하며, 저산소증-유발 폐 염증을 개선시킨다. (a) 연령-매칭된 FVB/n 마우스를 인간 MEX (200억개 입자/마우스)로 주사하고, 저산소에 2.5일 동안 노출시켰다. AKT 및 그의 하류 표적 mTOR의 저산소-유도된 인산화는 MEX 처리에 의해 감소된다. BMPR2의 직접 SMAD-표적화된 유전자 및 하류 신호인 DNA-결합/분화 단백질 ID1의 억제제의 폐 단백질 수준은 저산소에 의해 억제되지만, MEX로는 증가된다. 알파 튜불린은 정규화 대조군으로서 기능한다. (b) 초기 염증 마커인 CCL2의 mRNA 수준은 MEX 처리로 억제된다. RNA 수준은 RPS9에 대해 정규화된다.
도 2. a-MEX 및 f-MEX에 대해 풍부화된 엑소솜 하위집단의 단리. WJ-MSC의 단층 배양물에 의해 조건화된 배지를 농축시키고, 45％ 수크로스로 조정하였다. 이 제제를 60％ 수크로스 쿠션 상에 층상화하고, 35％ - 5％ 수크로스의 단계 구배로 중첩층상화하였다. 제제를 180k xg에서 20시간 동안 원심분리하였다. 구배물을 14 x 1 ml 분획에서 수집하였다. 각각의 분획 중의 입자 수를 나노사이트 (Nanosight)에 의해 측정하였다. 각각의 분획으로부터의 20 μL를 웨스턴 (Western)에 의해 ALIX, FLOT1, CAV1 및 SMAD 2/3의 존재에 대해 분석하였다. 소포의 2가지 별개의 집단을 상기 마커에 기초하여 상이한 침강 속도 (f-MEX 및 a-MEX) 및 상이한 마커 조성으로 확인하였다.
도 3. a-MEX 및 f-MEX를 나타내는 WJ-MSC 제제를 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 엑소솜 생물발생 마커, 예컨대 Alix 및 Tsg101은 a-MEX에 우선적으로 풍부화되는 반면, 테트라스파닌 CD9 및 CD81 및 지질 뗏목 마커, 예컨대 플로틸린 1 및 카베올린 1은 f-MEX에 풍부화된다. 또한, a-MEX에 대해 특이적인 것은 TGFBR2 뿐만 아니라 CD105 및 SMAD 패밀리의 구성원 (여기에 도시하지 않음)이다. EGF 수용체 및 AKT 패밀리의 구성원 (여기에 도시하지 않음)은 f-MEX에 대해 특이적이다.
도 4. 음성 염색 전자 현미경검사는 a-MEX 및 f-MEX 엑소솜 하위집단 사이의 크기, 형상 및 방사선투과성의 차이를 나타낸다. 배율: 30,000X.
도 5. FVB/n 마우스를 도 1에서와 같이 저산소에 노출시키고, a-MEX 또는 f-MEX 중 어느 하나가 풍부화된 WJ-MSC 엑소솜 제제로 처리하였다. 폐를 저산소에서 2.5일 후에 수확하고, 저산소-유도된 염증 마커의 mRNA 수준을 RT-PCR에 의해 RPS9를 정규화인자로서 사용하여 결정하였다. a-MEX로의 처리는 CCL2, IL6 및 ADM의 mRNA 수준의 감소를 초래하지만, f-MEX는 그렇지 않다.
도 6. 구상체 형성의 과정의 개략도. 단층 배양물에의 TGFβb (10 ng/ml)의 첨가는 구상체 형성을 가속화한다. 삽도는 톨루이딘 블루로 염색된 WJ-MSC의 구상체의 단면을 나타낸다.
도 7. WJ-MSC 구상체는 a-MEX를 우세하게 분비한다. 표준 단층 배양으로의 WJ-MSC를 트립신처리하고, 단일 세포 현탁액을 각각 1500만개 세포를 함유하는 2개의 동등한 부분으로 나누었다. 하나의 부분은 표준 배지 및 용기에서 단층으로서 증식되었다 (2D 배양물). 다른 부분은 현적 방법에 의해 구상체 형성 (3D 배양물)으로 유도되었다 (각각 500,000개 세포를 함유하는 30개의 구상체). 2가지 배양물에 의해 조건화된 동등한 부피의 정화된 배지를 웨스턴 블롯팅에 의해 상기 마커의 존재에 대해 검정하였다. a-MEX에 대해 특이적인 마커 (SMAD 2/3, ALIX)는 구상체에 의해 조건화된 배지에 풍부화되며, f-MEX에 대해 특이적인 FLOT1은 단층에 의해 조건화된 배지에서 우세하게 관찰된다.
도 8. 독립적인 공여자로부터의 MSC에 의해 분비된 f-MEX 대 a-MEX 비율은 구상체-형성 효율과 역으로 상관된다. 2가지 상이한 공여자 (클론 D 및 클론 C)로부터 단리된 WJ-MSC를 비-부착 조건 (현적 기법) 하에서 24시간 동안 배양하였다. (a) 각각의 클론의 단층 배양물에 의해 조건화된 동등한 양의 배지를 웨스턴 블롯에 의해 a-MEX 마커 SMAD 2/3 및 f-MEX 마커 FLOT1에 대해 검정하였다. SMAD 대 FLOT1 비율은 클론 D는 f-MEX를 우세하게 생성하는 반면, 클론 C의 엑소솜 생성은 a-MEX 및 f-MEX 둘 다의 유의한 양을 포함함을 지시하였다. (b) 클론 D의 단일 세포 현탁액은 광 현미경검사에 의해 검사할 때 클론 C WJ-MSC의 동일하게 처리된 현탁액이 24시간 후 치밀한 구상체를 형성할 수 있는 조건 하에서 구상체 형성 능력을 나타내지 않았다. 생존도는 트리판 블루에 의해 평가할 때 24시간 후에 95％ 초과였다. 조건화 배지를 현적물로부터 수집하고, 엑소솜을 단리하였다 (방법에 기재된 바와 같음). 클론 A 엑소솜은 플로틸린 1이 풍부화된 반면, 클론 B는 Alix이 풍부화되었으며, 이는 CM에서 엑소솜 하위집단의 차등적 풍부화를 반영한다.
도 9. WJ-MSC의 단층 배양물에의 TGFβ (10 ng/ml)의 첨가는 구상체 형성의 과정을 가속화하고, a-MEX 마커 (예컨대 SMAD 2/3) 대 f-MEX 마커 (예컨대 FLOT1)의 비율의 증가를 초래하며, 이는 분비된 모집단에서 a-MEX의 증가된 비율을 지시한다.
도 10. a-MEX는 TGF 신호전달의 기능적 모듈을 갖는다. (a) PBS "C", TGFβ, FGF 또는 PDGF (10 ng/ml)를 a-MEX 제제의 동등한 분취액에 첨가한 후, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 제제를 용해시키고, 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 엑소솜-회합된 SMAD 2/3의 증가된 인산화는 기능적 TGFB2R 수용체 복합체를 지시한다. 그의 1차 신호전달에서 SMAD 경로를 채용하지 않는 성장 인자인 FGF 또는 PDGF로의 처리에 의해서는 효과가 관찰되지 않는다. (b) a-MEX 또는 f-MEX 제제를 상기와 같이 TGFβ (10 ng/ml)로 처리하고, 인큐베이션하고, 분석하였다. SMAD 인산화는 a-MEX에서 특이적으로 관찰되었다.
도 11. a-MEX는 TGFβ-유도된 섬유모세포를 근섬유모세포 전이 및 LPS-매개된 섬유모세포 활성화에 대해 억제하지만, f-MEX는 그렇지 않다. (a) 인간 폐 섬유모세포를 혈청 고갈 (0.1％ FBS) 3일 후 TGFβ로 자극시켜 근섬유모세포 분화를 겪게 하였으며, 이는 증가된 알파-평활근 액틴 (SMA) 발현에 의해 표시되었다. hMEX (2 ug/ml)로의 예비처리는 알파-SMA 단백질 수준에 대한 TGFβ의 효과를 철폐한다. (b) 인간 폐 섬유모세포를 24시간 혈청 고갈 후 TGFβ로 자극시켜 근섬유모세포 마커인 PAI1을 유도하였다. a-MEX로의 처리는 PAI1 상향조절을 방지하였으며, f-MEX 처리로는 효과가 관찰되지 않았다. (c) a-MEX 처리는 시험관내에서 인간 폐 섬유모세포 중의 기준선 MCP-1 및 IL1β mRNA 수준을 하향 조절한다.

본 개시내용은 부분적으로 2가지 유형의 엑소솜이 세포, 예컨대 중간엽 줄기 세포로부터 유래되고, 엑소솜은 분자 마커, 크기, 형태, 및 기능에 기초하여 구별될 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 예를 들어, 2가지 하위집단 중 하나는 별개의 마커를 포함하며, 특정 장애의 치료에 있어서 치료 효능을 갖는 반면, 다른 하위집단은 독립적인 별개의 군의 마커를 포함하며, 특정 장애의 치료에 있어서 치료 효능이 결여된다.

본 개시내용은 광범위하게는 단리된 엑소솜의 조성물, 및 폐 장애, 심혈관 장애, 신장 장애, 및 허혈성 신경 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방에 있어서의 그의 사용 방법에 관한 것이다.

엑소솜 및 엑소솜 제제

본 개시내용의 엑소솜은 세포, 예컨대 중간엽 줄기 세포 (MSC), 섬유모세포, 및 대식세포로부터 방출되는 막 (예를 들어, 지질 이중층) 소포이다. 전자 현미경검사에 의하면, 엑소솜은 전형적으로 컵-형상 형태를 갖는 것으로 기재되었다. 그러나, 본 개시내용의 측면은 주어진 제제 내의 일부 엑소솜 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 치료 효능을 갖는 것들)이 컵-형상과 반대되는 구상 형태를 나타내며, 또한 음성 염색 투과 전자 현미경검사에 의해 측정된 바로 방사선투과성 (예를 들어, 반투명성)이라는 신규한 발견에 관한 것이다. 엑소솜은 약 100,000 x g에서 침강하며, 약 1.10 내지 약 1.21 g/ml의 수크로스 중에서 부력 밀도를 갖는다. 엑소솜은 미세소포 또는 나노소포로 지칭될 수 있다.

본 개시내용의 일부 측면은 단리된 엑소솜에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 단리된 엑소솜은 그의 자연 환경으로부터 물리적으로 분리된 것이다. 단리된 엑소솜은, 전체적으로 또는 부분적으로, MSC, 섬유모세포, 및 대식세포를 비롯한 이것이 자연적으로 존재하는 조직 또는 세포로부터 물리적으로 분리될 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 단리된 엑소솜의 조성물은 세포, 예컨대 MSC, 섬유모세포, 및 대식세포가 없을 수 있거나, 이는 조건화 배지가 없거나 실질적으로 없을 수 있다. 전형적으로, 단리된 엑소솜은 비조작된 조건화 배지에 존재하는 엑소솜보다 높은 농도로 제공된다.

엑소솜은 MSC, 섬유모세포, 및 대식세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 세포의 배양물로부터의 조건화 배지로부터 단리될 수 있다. MSC로부터의 엑소솜의 수확 방법은 실시예에 제공된다. 간략하게, 이러한 방법은 먼저 MSC를 표준 조건 하에서 이들이 약 70％ 전면생장률에 도달할 때까지 배양한 후, 세포를 혈청-무함유 배지에서 24시간 동안 배양하는 것을 포함하며, 그 후 조건화 배지를 수집하고, 세포 및 세포 데브리스를 제거하기 위해 400 xg에서 10분 동안 및 12000 xg에서 10분 동안 차등적 원심분리한다. 그 후, 정화된 조건화 배지를 100 kDa MWCO 필터 (밀리포어 (Millipore))를 사용한 한외여과에 의해 농축시킨 후, 다시 12000 xg에서 10분 동안 원심분리한다. 그 후, 엑소솜을 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 농축된 조건화 배지를 PBS-평형화된 크로마 (Chroma) S-200 컬럼 (클론테크 (Clontech)) 상에 적하하고, PBS로 용리하고, 350 내지 550 μL의 분획을 수집함으로써 단리한다. 엑소솜을 함유하는 분획을 확인하고, 잠재적으로 풀링한다. 단백질 농도를 표준 브래드포드 (Bradford) 검정 (바이오-래드 (Bio-Rad))을 사용하여 측정한다. 풍부화된 엑소솜 제제의 분취액을 -80℃에서 저장할 수 있다.

엑소솜은 또한 100,000 x g에서의 정화된 조건화 배지의 초원심분리에 의해 정제될 수 있다. 이는 또한 수크로스 쿠션 내로의 초원심분리에 의해 정제될 수 있다. 수지상 세포로부터의 엑소솜 정제를 위한 GMP 방법은 문헌 [J Immunol Methods. 2002;270:211-226]에 기재되었다.

엑소솜은 또한 한정된 공극 크기의 나일론 막 필터를 통한 차등적 여과에 의해 정제될 수 있다. 큰 공극 크기를 통한 제1 여과는 세포 단편 및 데브리스를 보유할 것이다. 보다 작은 공극 크기를 통한 후속 여과는 엑소솜을 보유하고, 이를 보다 작은 크기 오염물로부터 정제할 것이다.

일부 실시양태에서, 엑소솜은 본원에 기재된 특정 마커에 대해 풍부화된 2가지 하위집단으로 분획화된다. 2가지 하위집단의 분획화 방법은 실시예에 기재되어 있으며, 예를 들어, 수크로스 (5％-60％), 아이오딕사놀 (옵티프렙 (Optiprep)TM, 0％-60％) 또는 유사한 단리 배지의 단계 구배로의 속도 초원심분리를 들 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 분자 마커, 크기, 형태, 및 기능에 기초하여 구별되는 2가지 별개의 유형의 엑소솜을 제공한다. 2가지 별개의 유형은 본 개시내용 전반에 걸쳐 "a-유형" 및 "f-유형"으로 지칭되며, MSC로부터 유래되는 경우 호환적으로 "a-MEX" ("a" 유형 MSC 유래된 엑소솜에 대해) 또는 "f-MEX" ("f" 유형 MSC 유래된 엑소솜에 대해)로 지칭된다. 놀랍게도, 특정 장애, 예를 들어 폐 장애의 치료에 있어서 치료 효능을 나타내는 것은 a-유형 엑소솜인 반면; f-유형 엑소솜은 동일한 치료 패러다임에서 임의의 치료 효능을 나타내지 않는다. 임의의 특정 메커니즘에 구애되는 것은 아니지만, 각각의 유형의 엑소솜의 분자적 특징은 표적 세포 또는 조직에 대한 그의 효과 또는 기능을 특정화하는 것으로 믿어진다.

예를 들어, 일부 실시양태에서, a-유형의 단리된 엑소솜은 ALIX ("프로그래밍된 세포 사멸 6 상호작용 단백질" 또는 PDCD6IP로도 공지됨; 호몰로진 (HomoloGene):22614; 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_001155901.1), TSG101 (종양 감수성 유전자 101; 호몰로진:4584; 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_006283.1), TGFBR2 (전환 성장 인자, 베타 수용체 II; 호몰로진:2435; 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_001020018.1), SMAD1 (SMAD 패밀리 구성원 1; 호몰로진:21196; 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_001003688.1), SMAD2 (SMAD 패밀리 구성원 2; 호몰로진:21197; 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_001003652.1), SMAD3 (SMAD 패밀리 구성원 3; 호몰로진:55937; 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_001138574.1), SMAD5 (SMAD 패밀리 구성원 5; 호몰로진:4313; 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_001001419.1) 및 CD105 (엔도글린 (Endoglin) 또는 ENG로도 공지됨; 호몰로진:92; 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_000109.1; NP_001108225.1; NP_001265067.1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커 (예를 들어, 단백질)를 포함한다. 일부 실시양태에서, a-유형은 이들 마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 엑소솜이 특정 마커를 "포함하는" 경우, 이는 엑소솜이 검출가능한 수준 (예를 들어, 웨스턴 블롯팅에 의해 측정된 바로)의 마커, 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법의 맥락에서 표적 세포 또는 조직에서 특정 반응을 유발하거나, 대상체에서 특정 반응을 유발하기에 충분한 수준을 함유함을 의미한다. a-유형 엑소솜에서 발견될 수 있는 이들 마커 (예를 들어, 단백질)의 일부는 TGF/BMP 슈퍼패밀리의 성장 인자의 일부를 포함하며, 이는 그의 기능 및 치료 효과에 기여하는 것으로 믿어진다. 일부 실시양태에서, a-유형의 단리된 엑소솜은 FLOT1 (플로틸린 1; 호몰로진:31337; 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_005794.1), CD9 (CD9 분자; 호몰로진:20420; 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_001760.1), CD81 (CD81 분자; 호몰로진:20915; 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_004347.1), CAV1 (카베올린 1; 호몰로진:1330; 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_001166366.1), EGFR (표피 성장 인자 수용체; 호몰로진:74545; 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_005219.2; NP_958439.1; NP_958440.1; NP_958441.1), AKT1 (v-akt 뮤린 흉선종 바이러스 종양유전자 상동체 1; 호몰로진:3785; 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_001014431.1) 및 AKT2 (v-akt 뮤린 흉선종 바이러스 종양유전자 상동체 2; 호몰로진:48773; 예를 들어, NCBI 참조 서열: NP_001229956.1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, a-유형은 이들 마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7종을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 엑소솜이 특정 마커를 "포함하지 않는" 경우, 이는 엑소솜이 특정 마커를 전혀 함유하지 않거나, 단지 비유의한 양만을 함유함을 의미한다. 예를 들어, 비유의한 양은 검출불가능한 양, 또는 단지 흔적량으로만 검출가능한 양일 수 있다.

일부 실시양태에서, a-유형 엑소솜은 형태에 기초하여 f-유형 엑소솜과 구별될 수 있다. 엑소솜은 전형적으로 컵-형상 형태를 갖는 것으로 기재되었다. 놀랍게도, 본 개시내용은 컵-형상 형태와 반대되는 구상을 갖는 엑소솜 (a-유형)을 제공한다. 엑소솜 형태의 평가 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 투과 전자 현미경검사 및 투과 전자 현미경검사에서의 음성 염색을 들 수 있다. 또한, a-유형 엑소솜은 투과 전자 현미경검사에서의 음성 염색을 사용하여 방사선투과성 (예를 들어, 반투명성)인 것으로 밝혀졌다. 반대로, f-유형 엑소솜은 투과 전자 현미경검사에서 음성 염색에 의해 측정된 바로 컵-형상 형태를 나타내며, 방사선투과성이 아니다.

일부 실시양태에서, a-유형 엑소솜은 크기에 기초하여 f-유형 엑소솜과 구별된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, a-유형 엑소솜은 약 10 내지 150 nm, 약 20 내지 120 nm, 또는 약 30 내지 100 nm의 직경을 갖는다.

다른 측면에서, 본 개시내용은 f-유형의 단리된 엑소솜을 제공한다. 일부 실시양태에서, f-유형의 단리된 엑소솜은 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커 (예를 들어, 단백질)를 포함한다. 일부 실시양태에서, f-유형의 단리된 엑소솜은 이들 마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 엑소솜이 특정 마커를 "포함하는" 경우, 이는 엑소솜이 검출가능한 수준 (예를 들어, 웨스턴 블롯팅에 의해 측정된 바로)의 마커, 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법의 맥락에서 표적 세포 또는 조직에서 특정 반응을 유발하거나, 대상체에서 특정 반응을 유발하기에 충분한 수준을 함유함을 의미한다. f-유형 엑소솜에서 발견될 수 있는 이들 마커 (예를 들어, 단백질)의 일부는 FGF/PDGF 슈퍼패밀리의 성장 인자의 일부를 포함한다. FGF/PDGF 신호전달 경로는 혈관신생에 관여한다. 따라서, f-유형 엑소솜 (예를 들어, 그의 조성물)은 혈관신생의 증강에 유용한 것으로 믿어진다. 일부 실시양태에서, 단리된 f-유형 엑소솜은 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, f-유형 엑소솜은 이들 마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8종을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 엑소솜이 특정 마커를 "포함하지 않는" 경우, 이는 엑소솜이 특정 마커를 전혀 함유하지 않거나, 단지 비유의한 양만을 함유함을 의미한다. 예를 들어, 비유의한 양은 검출불가능한 양, 또는 단지 흔적량으로만 검출가능한 양일 수 있다.

상기 및 실시예에 기재된 바와 같이, f-유형 엑소솜은 음성 염색 투과 전자 현미경검사에 의해 측정된 바로 컵-형상 형태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, f-유형 엑소솜은 약 10 내지 250 nm, 약 20 내지 230 nm, 또는 약 30 내지 200 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, f-유형 엑소솜은 100 nm 이상의 직경을 갖는다.

a-유형 및 f-유형 엑소솜 둘 다를 비롯한 엑소솜은 MSC, 섬유모세포, 및 대식세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 상이한 세포 유형에 의해 생성된다. 이러한 세포의 수득 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. MSC의 공급원은 본원에 보다 상세하게 기재된다.

본 개시내용은 또한 본원에 기재된 단리된 엑소솜의 일부 또는 모든 특징을 갖는 합성 엑소솜의 사용을 고려한다. 이들 합성 엑소솜은 시험관내에서 합성될 것이다 (세포 또는 조건화 배지로부터 유래되며 단리되기 보다는). 이는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8종 이상을 비롯한 1종 이상의 본원에서 제공된 단백질을 갖는 합성 리포좀일 수 있다. 이는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8종 이상을 비롯한 1종 이상의 이들 단백질을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있거나, 포함하지 않을 수 있다. 리포좀 합성은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 리포좀은 상업적 공급원으로부터 구입할 수 있다. 세포 (또는 세포로부터의 조건화 배지), 예컨대 MSC, 섬유모세포, 또는 대식세포로부터 유래되며 단리된 엑소솜과 관련된 본원에 기재된 다양한 조성물, 제제, 방법 및 용도는 또한 합성 엑소솜의 맥락에서도 고려되는 것으로 이해되어야 한다.

본 개시내용은 엑소솜의 즉시 사용, 또는 대안적으로 예를 들어, 사용 전에 냉동보존된 상태로의 엑소솜의 단기 및/또는 장기 저장을 고려한다. 프로테이나제 억제제는 전형적으로 이들이 장기 저장 동안 엑소솜 완전성을 제공하기 때문에 동결 배지에 포함된다. -20℃에서의 저장은 이것이 엑소솜 활성의 증가된 상실과 연관되기 때문에 바람직하지 않다. -80℃에서의 급속 동결은 이것이 활성을 보존하기 때문에 보다 바람직하다 (예를 들어, 문헌 [Kidney International (2006) 69, 1471-1476] 참조). 동결 배지에의 첨가제는 엑소솜 생물학적 활성의 보존을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 첨가제는 무손상 세포의 냉동보존에 사용되는 것과 유사할 것이며, DMSO, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

세포

중간엽 줄기 세포 (MSC)는 신경 세포, 지방세포, 연골세포, 골모세포, 근세포, 심장 조직, 및 다른 내피 및 상피 세포로 분화하는 능력을 갖는 선조 세포이다 (예를 들어, 문헌 [Wang, Stem Cells 2004;22(7);1330-7]; [McElreavey;1991 Biochem Soc Trans (1);29s]; [Takechi, Placenta 1993 March/April; 14 (2); 235-45]; [Takechi, 1993; Kobayashi; Early Human Development;1998; July 10; 51 (3); 223-33]; [Yen; Stem Cells; 2005; 23 (1) 3-9] 참조). 이들 세포는 유전자 또는 단백질 발현에 의해 표현형적으로 정의될 수 있다. 이들 세포는 CD13, CD29, CD44, CD49a, b, c, e, f, CD51, CD54, CD58, CD71, CD73, CD90, CD102, CD105, CD106, CDw119, CD120a, CD120b, CD123, CD124, CD126, CD127, CD140a, CD166, P75, TGF-bIR, TGF-bIIR, HLA-A, B, C, SSEA-3, SSEA-4, D7 및 PD-L1 중 1종 이상을 발현하는 (및 따라서 이에 대해 양성인) 것으로 특징화되었다. 이들 세포는 또한 CD3, CD5, CD6, CD9, CD10, CD11a, CD14, CD15, CD18, CD21, CD25, CD31, CD34, CD36, CD38, CD45, CD49d, CD50, CD62E, L, S, CD80, CD86, CD95, CD117, CD133, SSEA-1, 및 ABO를 발현하지 않는 (및 따라서 이에 대해 음성인) 것으로 특징화되었다. 따라서, MSC는 그의 분화적 잠재성에 따라 표현형적으로 및/또는 기능적으로 특징화될 수 있다.

MSC는 골수, 혈액, 골막, 진피, 제대혈 및/또는 기질 (예를 들어, 와튼 젤리), 및 태반을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 공급원으로부터 수확될 수 있다. MSC의 수확 방법은 실시예에 보다 상세하게 기재된다. 또한, 본 개시내용에 사용될 수 있는 다른 수확 방법에 대해서는 미국 특허 제5486359호를 참조할 수 있다.

섬유모세포는 동물 조직에 대한 구조적 골조 (예를 들어, 간질)인 세포외 기질 및 콜라겐을 합성하는 세포의 유형이며, 상처 치유에 있어서 중요한 역할을 한다. 섬유모세포는 동물에서 결합 조직의 가장 흔한 세포이다. 섬유모세포는 전형적으로 2개 이상의 핵소체를 갖는 타원형의 얼룩덜룩한 핵을 둘러싸는 분기된 세포질을 갖는다. 활성 섬유모세포는 그의 풍부한 조면 세포질 세망에 의해 인식될 수 있다. 섬유세포로도 지칭되는 불활성 섬유모세포는 보다 작고 방추형이다. 이는 감소된 조면 세포질 세망을 갖는다.

섬유모세포의 공급원으로는 결합 조직, 예컨대 성긴, 치밀한, 탄성, 망상, 및 지방 결합 조직을 들 수 있다. 또한, 배아 결합 조직, 뿐만 아니라 특수화된 결합 조직이 있으며, 이로는 골, 연골, 및 혈액을 들 수 있다. 다른 공급원으로는 피부를 들 수 있다. 섬유모세포의 단리 및 배양 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Weber et al., "Isolation and Culture of Fibroblasts, Vascular Smooth Muscle, and Endothelial Cells From the Fetal Rat Ductus Arteriosus." Pediatric Research. 2011; 70, 236-241]; [Huschtscha et al., "Enhanced isolation of fibroblasts from human skin explants." Biotechniques. 2012;53(4):239-44]을 참조하며; 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨).

일부 실시양태에서, 섬유모세포, 또는 섬유모세포 조건화 배지는 본원에 기재된 바와 같은 엑소솜의 제조 및 단리에 사용된다. 섬유모세포로부터의 엑소솜의 제조 및 단리 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Luga et al., "Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration." Cell. 2012;151(7):1542-56]; [Bang et al., "Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy." J Clin Invest. 2014;124(5):2136-46]; [Hoffman, "Stromal-cell and cancer-cell exosomes leading the metastatic exodus for the promised niche." Breast Cancer Research, 2013; 15:310]을 참조하며; 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨).

대식세포는 조직에서 단핵구의 분화에 의해 생성되는 세포이다. 대식세포는 척추 동물의 비-특이적 방어 (선천 면역)에서 기능할 뿐만 아니라, 특이적 방어 메커니즘 (적응 면역)을 개시하는 것을 돕는다. 이는 파괴 및 섭취를 통해 외래 물질, 감염성 미생물 및 암 세포를 공격하는 특수화된 포식 세포이다. 이는 모든 살아있는 조직에 존재하며, 재생에서 기능을 갖는다. 대식세포는 유동 세포측정법, 면역조직화학 염색, 또는 다른 적합한 방법에 의해 CD14, CD40, CD11b, CD64, F4/80 (마우스)/EMR1 (인간), 리소자임 M, MAC-1/MAC-3 및 CD68을 비롯한 다수의 단백질의 특이적 발현에 의해 확인될 수 있다.

대식세포의 공급원으로는 거의 임의의 조직을 들 수 있으며, 혈액 및 골수로부터 용이하게 공급된다. 대식세포의 단리 및 배양 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Bennet, "Isolation and cultivation in vitro of macrophages from various sources in the mouse." Am J Pathol. Jan 1966; 48(1): 165-181]; [Davies and Gordon, "Isolation and culture of murine macrophages." Methods Mol Biol. 2005;290:91-103]; [Weischenfeldt and Porse, "Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications." CSH Protoc. 2008:pdb.prot5080. doi: 10.1101/pdb.prot5080]을 참조하며; 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨).

일부 실시양태에서, 대식세포, 또는 대식세포 조건화 배지는 본원에 기재된 바와 같은 엑소솜의 제조 및 단리에 사용된다. 대식세포로부터의 엑소솜의 제조 및 단리 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Lee et al., "Exosomes derived from human macrophages suppress endothelial cell migration by controlling integrin trafficking." Eur J Immunol. 2014; 44(4):1156-69]; [Yang et al., "Microvesicles secreted by macrophages shuttle invasion-potentiating microRNAs into breast cancer cells." Mol Cancer . 2011; 10:117]; [Lee et al., "Exosome release of ADAM15 and the functional implications of human macrophage-derived ADAM15 exosomes." FASEB J. 2012;26(7):3084-95]을 참조하며; 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨).

본 개시내용의 방법에 사용하기 위해 고려되는 MSC, 섬유모세포, 및/또는 대식세포, 및 따라서 그로부터 유래된 엑소솜은 치료되는 동일한 대상체로부터 유래될 수 있거나 (및 따라서 대상체에 대해 자가인 것으로 지칭될 것임), 이는 바람직하게는 동일한 종의 상이한 대상체로부터 유래될 수 있다 (및 따라서 대상체에 대해 동종이형으로 지칭될 것임).

본원에 사용된 바와 같이, 본 개시내용의 측면 및 실시양태는 달리 지시되지 않는다면 세포 뿐만 아니라 세포 집단에 관한 것임이 이해되어야 한다. 따라서, 세포가 언급되는 경우, 달리 지시되지 않는다면 세포 집단이 또한 고려됨이 이해되어야 한다.

본원에 사용된 바와 같은 단리된 세포 (예를 들어, MSC, 섬유모세포, 및/또는 대식세포)는 그의 자연 환경의 하나 이상의 성분으로부터의 물리적 분리를 비롯한, 그의 자연 환경으로부터 물리적으로 분리된 세포이다. 따라서, 단리된 세포 또는 세포 집단은 시험관내에서 또는 생체외에서 조작된 세포 또는 세포 집단을 포함한다. 예로서, 단리된 세포 (예를 들어, MSC, 섬유모세포, 및/또는 대식세포)는 세포가 수확되는 조직 중의 세포의 적어도 50％, 바람직하게는 적어도 60％, 보다 바람직하게는 적어도 70％, 및 보다 더욱 바람직하게는 적어도 80％로부터 물리적으로 분리된 세포일 수 있다. 일부 예에서, 단리된 세포는 본원에서 표현형적으로 및/또는 기능적으로 정의된 바와 같이 적어도 40％, 적어도 50％, 적어도 60％, 적어도 70％, 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 90％, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％, 적어도 99％, 또는 100％ 세포인 집단에 존재한다. 바람직하게는, MSC, 섬유모세포 및/또는 대식세포 대 다른 세포의 비율은 세포의 출발 집단에 비해 단리된 제제에서 증가된다.

MSC는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 골수 단핵 세포, 제대혈, 지방 조직, 태반 조직으로부터, 조직 배양 플라스틱에의 그의 부착에 기초하여 단리될 수 있다. 예를 들어, MSC는 시판되는 골수 흡인물로부터 단리될 수 있다. 세포의 집단 내의 MSC의 풍부화는 FACS를 포함하나 이에 제한되지 않는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 달성될 수 있다.

시판되는 배지는 MSC, 섬유모세포, 및 대식세포의 성장, 배양 및 유지에 사용될 수 있다. 이러한 배지로는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. MSC, 섬유모세포, 및 대식세포의 성장, 배양 및 유지에 유용한 이러한 배지의 성분으로는 아미노산, 비타민, 탄소 공급원 (천연 및 비-천연), 염, 당, 식물 유래된 가수분해물, 피루브산나트륨, 계면활성제, 암모니아, 지질, 호르몬 또는 성장 인자, 완충제, 비-천연 아미노산, 당 전구체, 지시제, 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드, 부티레이트 또는 유기물, DMSO, 동물 유래된 생성물, 유전자 유도제, 비-천연 당, 세포내 pH의 조절제, 베타인 또는 삼투보호제, 미량 원소, 광물, 비-천연 비타민을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 시판되는 조직 배양 배지를 보충하는 데 사용될 수 있는 추가의 성분으로는 예를 들어, 동물 혈청 (예를 들어, 소 태아 혈청 (FBS), 송아지 태아 혈청 (FCS), 말 혈청 (HS)), 항생제 (예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신, 네오마이신 술페이트, 암포테리신 B, 블라스티시딘, 클로람페니콜, 아목시실린, 바시트라신, 블레오마이신, 세팔로스포린, 클로르테트라시클린, 제오신, 및 푸로마이신을 포함하나 이에 제한되지 않음), 및 글루타민 (예를 들어, L-글루타민)을 들 수 있다. 중간엽 줄기 세포 생존 및 성장은 또한 적절한 호기성 환경, pH, 및 온도의 유지에 의존한다. MSC는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 유지될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Pittenger et al., Science, 284:143-147 (1999)] 참조).

본 개시내용의 특정 측면은 배양 조건이 엑소솜 유형의 생성을 편향시킬 수 있다는 예상치 않은 발견에 관한 것이다. 예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같이, 배양 조건은 f-유형 엑소솜 대비 a-유형 엑소솜의 생성을 편향시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 3-차원 (3D) 배양은 전통적인 2-차원 (예를 들어, 단층) 배양에 비해, f-유형 엑소솜에 비해 a-유형 엑소솜의 생성을 향상시킨다. 3D 배양 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 현적 배양, 매트릭스 상 배양, 미세담체 상 배양, 합성 세포외 스캐폴드 상 배양, 키토산 막 상 배양, 자기 부상 하 배양, 회전 생물반응기 중 현탁 배양, 또는 비-접촉 억제 조건 하 배양을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Haycock JW. (2011). "3D cell culture: a review of current approaches and techniques.". Methods Mol Biol . 695: 1-15]; [Lee, J; Cuddihy MJ, Kotov NA. (14 March 2008). Three - dimensional cell culture matrices : state of the art.. doi:10.1089/teb.2007.0150]; [Pampaloni, Francesco (October 2007). "The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue". Nature Reviews 8: 839-845]; 및 [Souza, Glauco (14 March 2010). "Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation". Nature Nanotechnology: 291-296]을 참조하며; 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 추가적으로, 또한, 특정 성장 인자의 첨가는 f-유형 엑소솜에 비해 a-유형 엑소솜의 생성을 향상시킨다. 예를 들어, TGFβ 슈퍼패밀리 (TGFβ1, 액티빈, BMP, GDF, GDNF, 인히빈, 노달, 레프티, MIS) EGF, PDGF, 또는 FGF로부터 선택되는 1종 이상의 성장 인자의 첨가는 f-유형 엑소솜에 비해 a-유형 엑소솜의 생성을 향상시킨다.

일부 실시양태에서, 향상 (예를 들어, 3D 배양 및/또는 성장 인자 첨가의 맥락에서)은 f-유형 엑소솜에 비해 a-유형 엑소솜의 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 10.0배, 12.0배, 15.0배, 또는 20.0배 이상 증가를 포함한다.

대상체

본 개시내용의 방법은 인간 대상체, 농업 가축 (예를 들어, 소, 돼지 등), 상품화된 동물 (예를 들어, 말), 반려 동물 (예를 들어, 개, 고양이 등) 등을 비롯한, 그로부터 유익을 도출할 가능성이 있는 임의의 대상체에 대해 수행될 수 있다. 본 개시내용의 다양한 측면에서, 인간 대상체가 바람직하다. 일부 측면에서, 인간 대상체 및 인간 MSC 엑소솜이 사용된다.

대상체는 이 개시내용에 기재된 엑소솜을 사용한 치료를 받아들일 수 있는 본원에 기재된 질환 (또는 상태)을 갖는 것들일 수 있거나, 이는 이러한 질환 (또는 상태)를 발달시킬 위험이 있는 것들일 수 있다. 이러한 대상체는 신생아, 및 특히 낮은 임신 나이에서 태어난 신생아를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 인간 신생아는 출생시부터 약 4주령까지의 인간을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 인간 유아는 약 4주령 내지 약 3세의 인간을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 낮은 임신 나이는 주어진 종에 대해 정상적인 임신 기간 전에 일어나는 출산 (또는 분만)을 지칭한다. 인간에서, 완전한 임신 기간은 약 40주이며, 37주 내지 40주 초과의 범위일 수 있다. 인간에서 조기 출산과 유사한 낮은 임신 나이는 임신 37주 전에 일어나는 출산으로 정의된다. 따라서, 본 개시내용은 훨씬 더 짧은 임신 기간 (예를 들어, 임신 36주 전, 35주 전, 34주 전, 33주 전, 32주 전, 31주 전, 30주 전, 29주 전, 28주 전, 27주 전, 26주 전, 또는 25주 전)에 태어난 이들을 비롯한, 임신 37주 전에 태어난 대상체의 예방 및/또는 치료를 고려한다. 전형적으로, 이러한 미성숙 유아는 신생아로서 치료될 것이지만, 본 개시내용은 신생아 단계를 훨씬 넘는 및 아동기 및/또는 성인기로의 그의 치료를 고려한다. 특정 대상체는 예를 들어 폐 고혈압과 같은 본원에 기재된 질환 (또는 상태)의 특정 형태에 대해 유전적 소인을 가질 수 있으며, 이들 대상체는 또한 본 개시내용에 따라 치료될 수 있다.

질환의 예방 및 치료 방법

본 개시내용은 특정 질환 또는 장애의 예방 및 치료를 고려한다. 질환의 예방은 질환이 나타날 가능성의 감소 및/또는 질환의 발병의 지연을 의미한다. 질환의 치료는 질환의 증상의 감소 또는 제거를 의미한다. 본원에 기재된 바와 같이, a-유형의 엑소솜은 TGF/BMP 경로의 기능적 신호전달 성분을 포함하며, 이 경로를 포함하는 장애의 치료에 치료학적으로 유효하다. 이러한 장애로는 본원에 기재된 바와 같은 특정 폐 및 혈관 장애를 들 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Cai et al., "BMP signaling in vascular diseases" FEBS Lett. 2012 (14):1993-2002.]; [Davies et al., "TGF-β/BMP Signaling in Pulmonary Vascular Disease." Vascular Complications in Human Disease. Springer, 2008, pp 46-59]; [Alejandre-Alcazar et al., "Hyperoxia modulates TGF-beta/BMP signaling in a mouse model of bronchopulmonary dysplasia." Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol . 2007; 292(2):L537-49]; [Stumm et al., "Lung Remodeling in a Mouse Model of Asthma Involves a Balance between TGF-β1 and BMP-7." PLoS One. 2014; DOI: 10.1371/journal.pone.0095959]을 참조하며; 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). 사실, 실시예에서 입증된 바와 같이, a-유형 엑소솜 제제의 정맥내 주사에 의한 마우스의 처리는 혈관 재형성 및 폐 고혈압과 연관된 신호전달의 저산소성 활성화를 하향-조절하며, 저산소증-유발 폐 염증을 개선시킨다.

따라서, 본 개시내용의 측면은 다수의 폐 (lung) (또는 폐 (pulmonary)) 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이들 질환으로는 염증성 폐 질환, 예컨대 폐동맥 고혈압 (PAH)으로도 지칭되는 폐 고혈압 (PH), 천식, 기관지폐 이형성증 (BPD), 알레르기, 사르코이드증, 및 특발성 폐 섬유증을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 질환으로는 또한 염증성 성분을 갖지 않을 수 있는 폐 혈관 질환을 들 수 있다. 본 개시내용에 따라 치료될 수 있는 더 다른 폐 상태로는 패혈증과 또는 환기와 연관될 수 있는 급성 폐 손상을 들 수 있다. 이 후자의 상태의 예는 나이 많은 아동 및 성인에서 일어나는 급성 호흡 곤란 증후군이다.

폐 고혈압은 정상 수준 훨씬 초과인 폐동맥의 혈압을 특징으로 하는 폐 질환이다. 증상으로는 숨참, 특히 신체 활동 동안의 흉통, 쇠약, 피로, 졸도, 특히 운동 동안의 경증 어지러움, 현기증, 비정상적 심음 및 잡음, 목정맥의 충혈, 복부, 다리 및 발목 중의 유체의 체류, 및 손발톱 바닥의 청색빛 착색을 들 수 있다.

기관지폐 이형성증은 산소가 주어진 또는 환기기 상에 있는 신생아, 또는 조기에 태어난 신생아, 특히 매우 조기에 태어난 이들 (예를 들어, 임신 32주 전에 태어난 이들)을 괴롭히는 병태이다. 이는 또한 신생아 만성 폐 질환으로 지칭된다. BPD의 원인으로는 예를 들어 환기의 결과로서의 기계적 손상, 예를 들어 산소 요법의 결과로서의 산소 독성, 및 감염을 들 수 있다. 질환은 비-염증성으로부터 시간에 따라 염증성까지 진행할 수 있다. 증상으로는 청색빛 피부, 만성 기침, 빠른 호흡, 및 숨참을 들 수 있다. BPD를 갖는 대상체는 감염, 에컨대 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대해 보다 감수성이다. BPD를 갖는 대상체는 폐 고혈압을 발생시킬 수 있다.

호흡 곤란 증후군 (RDS) 또는 성인 호흡 곤란 증후군으로도 알려진 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)은 폐에 대한 손상 또는 급성 질병의 결과로서 발생하는 상태이다. 폐에 대한 손상은 환기, 외상, 화상, 및/또는 흡인의 결과일 수 있다. 급성 질병은 감염성 폐렴 또는 패혈증일 수 있다. 이는 급성 폐 손상의 중증 형태로 간주되며, 이는 종종 치명적이다. 이는 폐 염증, 손상된 기체 교환, 및 염증성 매개체의 방출, 저산소혈증, 및 복합 장기 부전을 특징으로 한다. ARDS는 또한 흉부 x-선 상의 양측 침윤물의 존재 하에서 200 mmHg 미만의 흡입 산소의 분율 (FiO₂)로서의 동맥 부분 산소 분압 (PaO₂)의 비율로 정의될 수 있다. 양측 침윤물을 갖는 300 mmHg 미만의 PaO₂/FiO₂ 비율은 급성 폐 손상을 지시하며, 이는 종종 ARDS에 대한 전조이다. ARDS의 증상으로는 숨참, 빈호흡, 및 낮은 산소 수준으로 인한 정신 착란을 들 수 있다.

특발성 폐 섬유증은 알려진 원인이 없는 폐의 흉터형성 또는 비후를 특징으로 한다. 이는 50 내지 70세의 사람에서 가장 흔히 일어난다. 그의 증상으로는 숨참, 규칙적 기침 (전형적으로 마른 기침), 흉통, 및 감소된 활동 수준을 들 수 있다.

알레르기는 충혈눈, 가려움, 및 코감기, 습진, 두드러기, 또는 천식 발작을 비롯한 증상을 갖는 면역계의 과민 장애이다. 알레르기는 천식과 같은 상태에서 주요한 역할을 한다. 환경적 또는 식이적 알레르겐에 대한 또는 의약에 대한 중증 알레르기는 아나필락시스로 지칭되는 생명을 위협하는 반응을 초래할 수 있다. 알레르기 반응은 사람의 면역계가 종종 환경에서 보통은 무해한 물질인 것과 반응할 경우 일어날 수 있다. 알레르기는 과민증의 4가지 형태 중 하나이며, 때로 유형 I (또는 즉시) 과민증으로 지칭된다. 알레르기 반응은 이뮤노글로불린 E (IgE)에 의한 특정 백혈구 (비만 세포 및 호염기구)의 과도한 활성화 때문에 독특하다. 이 반응은 가벼운 불쾌감 내지 위험의 범위일 수 있는 염증 반응을 초래한다. 알레르기 상태를 진단하기 위한 다양한 시험이 존재한다. 시험은 가능한 알레르겐을 피부 상에 정치하고, 반응, 예컨대 팽창 및 혈액 시험을 조사하여 알레르겐-특이적 IgE를 찾는 것을 포함한다.

저산소증-유발 폐 염증은 종종 급성 폐 손상 및/또는 ARDS로부터 초래됨으로써, 염증 반응이 저산소성 상태에의 장기간 노출로부터 초래되는 상태이다. 이러한 염증 반응으로는 저압 저산소에 노출된 인간의 기관지폐포 세척액 중의 증가된 대식세포, 호중구, 및 IL-1β, IL-6, IL-8, 및 TNF-α를 비롯한 염증성 시토카인을 들 수 있다.

예를 들어, TGF/BMP 경로의 증강에 의한 a-유형 엑소솜을 사용한 치료를 받아들일 수 있는 다른 장애로는 심혈관 장애, 예를 들어 심근 경색, 심혈관 질환, 고혈압, 아테롬성동맥경화증, 및 심부전을 들 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Pardali et al., "TGFβ Signaling and Cardiovascular Diseases." Int J Biol Sci 2012; 8(2):195-213]; [Garside et al., "Coordinating Notch, BMP, and TGF-β signaling during heart valve development." Cell Mol Life Sci. 2013; 70(16):2899-917]; [Wang et al., "Bmp Signaling in Congenital Heart Disease: New Developments and Future Directions." Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2011; 91(6): 441-448]; [Ruiz-Ortega et al., "TGF-beta signaling in vascular fibrosis." Cardiovasc Res. 2007; 1;74(2):196-206]; [Bujak et al., "The role of TGF-β Signaling in Myocardial Infarction and Cardiac Remodeling." Cardiovasc Res . 2007; 74(2): 184-195]; [Chang et al., "Impact of myocardial infarct proteins and oscillating pressure on the differentiation of mesenchymal stem cells: effect of acute myocardial infarction on stem cell differentiation." Stem Cells. 2008; 26(7):1901-12]; [Koitabashi et al., "Pivotal role of cardiomyocyte TGF-β signaling in the murine pathological response to sustained pressure overload." J Clin Invest. 2011;121(6):2301-2312]; 및 [Blann et al., "Serum levels of the TGF-beta receptor are increased in atherosclerosis." Atherosclerosis. 1996;120(1-2):221-6]을 참조하며; 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨).

심근 경색은 통상적으로 심장 발작으로 알려진 사건에 대한 의학적 용어이다. 심근 경색은 혈액이 심장의 부분으로 적절하게 유동하기를 중단하고, 심장 근육이 충분한 산소를 받지 못함으로 인해 손상되는 경우 일어난다. 이는 통상적으로 혈액을 심장에 공급하는 관상 동맥 중 하나가 백혈구의 불안정한 형성, 콜레스테롤 및 지방으로 인해 폐색을 발달시키는 경우 유발된다. 사건은 이것이 돌발적이며 심각한 경우 "급성"으로 지칭된다. 급성 심근 경색의 증상으로는 흉골 뒤에서 느껴지고, 때로 좌측 팔 또는 목의 좌측으로 주행하는 돌발 흉통을 들 수 있다. 추가적으로, 개체는 숨참, 발한, 구역, 구토, 비정상적 심박동, 및 불안을 가질 수 있다. 여성은 남성보다 이들 증상을 보다 적게 경험하지만, 통상적으로 숨참, 쇠약, 소화불량의 느낌, 및 피로를 갖는다.

심혈관 질환은 심혈관계에 영향을 미치는 임의의 질환, 주로 심장 질환, 뇌 및 신장의 혈관 질환, 및 말초 동맥 질환을 지칭한다. 심혈관 질환의 원인은 다양하지만, 아테롬성동맥경화증 및/또는 고혈압이 가장 통상적이다. 또한, 나이가 들어감에 따라, 심지어 건강한 무증상 개체에서도 심혈관 기능을 변경하고, 심혈관 질환의 증가된 위험을 초래하는 다수의 생리학적 및 형태학적 변화가 발생한다.

아테롬성동맥경화증은 동맥벽이 백혈구의 침입 및 축적의 결과로서 비후되며, 최외각이며 가장 오래된 플라크 내에 살아있는 활성 WBC (염증), 및 콜레스테롤 및 트리글리세리드, 결국 칼슘 및 다른 결정화된 물질을 비롯한 죽은 세포의 나머지 둘 다를 함유하는 동맥경화증의 특수한 형태이다. 이들 변화는 동맥벽의 탄성을 감소시키지만, 동맥 근육벽이 플라크의 위치에서 확장되기 때문에 수십 년 동안 혈액 유동에 영향을 미치지 않는다. 그러나, 벽 강직은 결국 맥박압을 증가시킬 수 있으며; 넓어진 맥박압은 주요 동맥 내의 진행된 질환의 하나의 가능한 결과이다. 증상은 산소화된 혈액을 심장으로 도입하는 것을 담당하는 관상 동맥에서의 현저한 협착화로부터 초래될 수 있으며, 이는 협심증의 흉통 및 숨참, 발한, 구역, 현기증 또는 경증-어지러움, 숨가쁨 또는 심계항진과 같은 증상을 생성한다. 목동맥의 현저한 협착화는 또한 쇠약감, 명쾌하게 생각할 수 없음, 말하기 곤란함, 어지러워짐 및 걷거나 똑바로 서있기 곤란함, 흐려 보임, 안면, 팔, 및 다리의 저림, 중증 두통 및 의식 소실과 같은 증상과 함께 존재할 수 있다. 이들 증상은 또한 뇌졸중, 즉, 뇌 세포의 사멸과 관련된다. 뇌졸중은 뇌로 가는 동맥의 현저한 협착화/폐쇄에 의해 유발되며; 적당한 혈액 공급의 결여는 영향을 받은 조직의 세포의 사멸을 초래한다. 혈액을 다리, 팔, 및 골반으로 공급하는 말초 동맥은 또한 플라크 파열 및 응고로 인해 현저한 협착화를 경험한다. 현저한 협착화에 대한 증상은 팔 또는 다리 내의 저림, 뿐만 아니라 통증이다. 플라크 형성에 대한 또 다른 유의한 위치는 혈액을 신장으로 공급하는 신장 동맥이다. 플라크 발생 및 축적은 감소된 신장 혈액 유동 및 만성 신장 질환을 초래하며, 이는 모든 다른 영역과 같이, 전형적으로 후기 단계까지 무증상이다.

때로 동맥 고혈압으로 지칭되는 고혈압 또는 높은 혈압은 동맥에서 혈압이 상승되는 만성 의학적 상태이다. 고혈압은 원발성 (필수) 고혈압 또는 2차 고혈압 중 어느 하나로 분류되며; 약 90 내지 95％의 경우는 명백한 근본적인 의학적 원인을 갖지 않는 높은 혈압을 의미하는 "원발성 고혈압"으로 범주화된다. 나머지 5 내지 10％의 경우 (2차 고혈압)는 신장, 동맥, 심장 또는 내분비계에 영향을 미치는 다른 상태에 의해 유발된다. 고혈압은 심장에 부담을 가하여, 치료되지 않을 경우 고혈압성 심장 질환 및 관상 동맥 질환을 초래한다. 고혈압은 또한 뇌졸중, 동맥의 동맥류 (예를 들어 대동맥류), 말초 동맥 질환에 대한 주요한 위험 인자이며, 만성 신장 질환의 원인이다. 고혈압은 임의의 증상을 수반하는 경우가 드물며, 그의 확인은 통상적으로 스크리닝을 통해, 또는 비관련된 문제 때문에 의료를 추구하는 경우이다. 높은 혈압을 갖는 사람의 대부분은 두통 (특히 후두부에서 및 아침에), 뿐만 아니라 경증 어지러움, 현기증, 이명 (귀에서의 윙윙거림 또는 쉿소리), 변화된 시력 또는 졸도 에피소드를 보고한다.

종종 만성 심부전을 의미하기 위해 사용되는 심부전은 심장이 신체의 필요를 충족시키기 위한 혈액 유동을 유지하는 데 충분한 펌프 작용을 제공할 수 없는 경우 일어난다. 부종이 상기에 추가로 존재하는 경우, 이는 울혈성 심부전 (congestive heart failure) (CHF) 또는 울혈성 심장 부전 (congestive cardiac failure) (CCF)으로 지칭된다. 심부전은 숨참, 다리 부기, 및 운동 불내성을 비롯한 다수의 증상을 유발할 수 있다. 심부전의 통상적인 원인으로는 심근 경색 (심장 발작) 및 다른 형태의 관상 동맥 질환, 고혈압, 판막성 심장 질환, 및 심근병증을 들 수 있다. 심부전이라는 용어는 때로 부정확하게 심근 경색에 대해 (심부전을 유발할 수 있지만, 심부전 그 자체는 아님) 또는 심장 정지 (혈액 유동이 완전히 유효하게 정지됨)에 대해 사용된다.

예를 들어, TGF/BMP 경로의 증강에 의한 a-유형 엑소솜을 사용한 치료를 받아들일 수 있는 더 다른 장애로는 신장 장애, 예를 들어 허혈성 신장 손상, 급성 신부전, 및 신장 섬유증을 들 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Meng et al., "Role of the TGF-β/BMP-7/Smad pathways in renal diseases." Clin Sci ( Lond ). 2013;124(4):243-54]; [Zerisberg et al., "BMP-7 counteracts TGF-beta1-induced epithelial-to-mesenchymal transition and reverses chronic renal injury." Nat Med. 2003 ;9(7):964-8]; 및 [Yanagita, "Inhibitors/antagonists of TGF-β system in kidney fibrosis." Nephrol Dial Transplant. 2012; 27(10):3686-91]을 참조하며; 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨).

허혈성 신장 손상 또는 허혈성 신장병증은 신장으로의 부적당한 혈액 유동 (관류저하)가 있는 경우 일어난다. 관류저하는 신장 기능의 상실 및 신장 위축증 (수축)을 초래할 수 있다. 신부전은 이 과정이 양쪽 신장에 손상을 줄 경우 초래된다. 하기 임상적 상황 중 하나는 종종 허혈성 신장병증에 존재한다: 양측 신장 동맥 협착증 (RAS; 양쪽 신장을 공급하는 큰 동맥의 협착화); 단지 하나의 기능하는 신장을 갖는 사람에서의 편측 RAS; 또는 다른 신장에 대한 고혈압성 (높은 혈압) 손상을 갖는 편측 RAS. 허혈성 신장 손상의 증상으로는 요독증 (단백질 부산물, 예컨대 우레아의 높은 혈액 수준); 폐 중의 유체의 돌발적 축적에 의해 유발되는 호흡곤란의 급성 에피소드 (고통스럽거나 곤란한 호흡)를 들 수 있으며; 손상의 중증도에 따라 고혈압이 존재할 수 있다. 동맥 내의 혈액 와류에 의해 유발되는 잡음 (청진기로 들리는 소리 또는 잡음)은 목 (목동맥 잡음), 복부 (신장 동맥의 협착화를 반영할 수 있음), 및 서혜부 (대퇴 동맥 잡음)에서 검출될 수 있다.

급성 신부전 또는 급성 신장 손상 (AKI)은 전형적으로 7일 내에 발달하는 신장 기능의 돌연적 상실이다. 이는 일반적으로 임의의 원인 (예를 들어 낮은 혈압), 신장에 유해한 물질에의 노출, 신장에서의 염증성 과정, 또는 뇨의 유동을 저해하는 요로의 폐색으로부터의 감소된 신장 혈액 유동 (신장 허혈)에 의해 유발되는 신장 조직에 대한 손상의 결과로서 일어난다. 급성 신부전은 특징적인 검사 소견, 예컨대 상승된 혈액 뇨 질소 및 크레아티닌, 또는 충분한 양의 뇨를 생성하는 신장의 불능에 기초하여 진단된다. 급성 신부전은 대사 산증, 높은 칼륨 수준, 요독증, 체액 균형의 변화, 및 다른 기관계에 대한 효과를 비롯한 다수의 합병증을 초래할 수 있다. 급성 신장 손상의 증상으로는 뇨의 축적을 들 수 있으며, 혈류 중의 다른 질소-함유 물질은 다수의 증상, 예컨대 피로, 식욕의 상실, 두통, 구역 및 구토를 초래한다. 칼륨 수준의 증가는 심박동의 불규칙을 초래할 수 있으며, 이는 중증이며 생명을 위협할 수 있다. 유체 균형은 종종 영향을 받지만, 고혈압은 드물다. 옆구리의 통증은 일부 상태 (예를 들어, 신장 혈관의 혈전증 또는 신장의 염증)에서 직면하며; 이는 신장을 둘러싸는 섬유성 조직 캡슐의 신전의 결과이다. 신장 손상이 탈수의 결과인 경우, 갈증 뿐만 아니라 신체 검사 시 유체 고갈의 증거가 있을 수 있다. 신체 검사는 또한 신장 문제의 근본적인 원인, 예컨대 간질 신장염 및 촉지성 방광의 빈발에 대한 다른 단서를 제공할 수 있다. 신체로부터 충분한 유체를 배설하는 감소된 능력은 팔다리 (말초 부종) 및 폐 (폐 부종) 중의 유체의 축적, 뿐만 아니라 유체 삼출의 결과로서 심장 눌림증을 유발할 수 있다.

신장 섬유증은 사실상 모든 유형의 만성 신장 질환에서 일어나는 세포외 기질의 과도한 축적으로부터 초래된다. 신장 섬유증의 발병기전은 전형적으로 말기 신부전을 초래하는 진행성 과정이다. 일부 측면에서, 신장 섬유증은 만성의 지속된 손상 후 신장 조직의 실패한 상처-치유 과정을 나타낸다. 많은 세포 경로, 예를 들어, 혈관사이 및 섬유모세포 활성화 뿐만 아니라 관상 상피-중간엽 전이는 질환에 걸린 상태에서의 기질-생성 세포의 생성에 대한 주요한 원인으로 확인되었다. 신장 섬유화 과정을 조절하는 섬유형성 인자, 예컨대 전환 성장 인자 (TGF)는 상태에 기여한다. 내인성 항섬유화 인자에 대한 최근의 발견은 TGF-/Smad 신호전달의 섬유형성 작용의 길항화를 목표로 하는 신규한 전략을 진화시켰다.

예를 들어, TGF/BMP 경로의 증강에 의한 a-유형 엑소솜을 사용한 치료를 받아들일 수 있는 더 다른 장애로는 허혈성 신경 장애, 예컨대 저산소성 허혈성 뇌병증 또는 허혈성 졸중을 들 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Harvey et al., "Stroke and TGF-beta proteins: glial cell line-derived neurotrophic factor and bone morphogenetic protein." Pharmacol Ther. 2005;105(2):113-25]; [Krampert et al., "Smad7 regulates the adult neural stem/progenitor cell pool in a transforming growth factor beta- and bone morphogenetic protein-independent manner." Mol Cell Biol. 2010; 30(14):3685-94]; 및 [Yin et al., "Effect of hyperbaric oxygen on neurological recovery of neonatal rats following hypoxic-ischemic brain damage and its underlying mechanism." Int J Clin Exp Pathol. 2013; 6(1): 66-75]을 참조하며; 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨).

저산소성 허혈성 뇌병증 (HIE) 또는 주산기 질식은 질식으로 인한 급성 또는 아-급성 뇌 손상의 임상적 및 실험 증거를 특징으로 한다. 이 상태의 일차적 원인은 전신 저산소혈증 및/또는 감소된 뇌 혈액 유동이다. 출생시 질식은 전세계적으로 840,000명 또는 모든 신생아 사망의 23％를 유발한다. 경도 저산소성-허혈성 뇌병증의 징후 및 증상으로는 약간 증가된 근육 긴장을 들 수 있으며; 일과성 행동 이상 (예컨대 섭식 부진, 과민성, 또는 과다한 울음 또는 졸림)이 관찰될 수 있다. 중등도 중증 저산소성-허혈성 뇌병증의 증상으로는 유의한 근육긴장저하 및 감소된 심부건 반사와 함께 유아의 기면성을 들 수 있으며; 쥐기 반사, 모로 반사, 및 빨기 반사가 부진하거나 부재할 수 있고; 유아는 간헐적 무호흡 기간을 경험할 수 있고; 발작이 출생 후 최초 24시간 내에 초기에 일어날 수 있다. 중증 저산소성-허혈성 뇌병증의 증상으로는, 지연되고 중증이며 통상적인 치료에 대해 초기에 저항성일 수 있는 발작을 들 수 있다. 발작은 통상적으로 전신화되고, 그의 빈도는 발생 후 24 내지 48시간 동안 증가할 수 있으며, 이는 재관류 손상의 단계와 상관된다. 다른 증상으로는 혼미 또는 혼수 (유아는 가장 유독한 것을 제외하고 임의의 신체적 자극에 반응하지 않을 수 있음); 불규칙 호흡: 전신화된 근육긴장저하 및 저하된 심부건 반사; 신생아 반사 결여 (예를 들어, 빨기, 연하, 쥐기, 모로); 안구 운동의 교란 (예를 들어, 눈의 사편시, 눈떨림, 보빙 (bobbing)); 동공 확대, 빛에 대한 고정된, 또는 빈약한 반응성; 및 심박수 및 혈압의 불규칙을 들 수 있다.

허혈성 졸중은 뇌로의 혈액 공급의 교란으로 인한 뇌 기능의 상실이다. 허혈은 혈전증 또는 동맥 색전증을 통한 혈관의 폐색에 의해, 또는 뇌 관류저하에 의해 유발된다. 그 결과, 뇌의 영향을 받은 영역은 정상적으로 기능할 수 없으며, 이는 신체의 한쪽 측 상의 하나 이상의 팔다리 운동 불능, 말을 이해하거나 표현하는 것의 실패, 또는 시야의 한쪽 측의 시각 손상을 초래할 수 있다.

예방 및/또는 치료는 일부 예에서 단독으로 또는 1종 이상의 2차 제제와 함께 a-유형 엑소솜의 사용을 포함할 수 있다. 대상체는 또한 기계적 개입, 예컨대 외인성 산소 투여가 있거나 없는 환기로 처리될 수 있다.

신생아, 및 특히 낮은 임신 나이 신생아에 관해, 본 개시내용은 출생 4주, 3주, 2주, 1주, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일, 1일, 12시간, 6시간, 3시간, 또는 1시간 내의 a-유형 엑소솜의 투여를 고려한다. 일부 중요한 예에서, a-유형 엑소솜은 출생 1시간 내에 투여된다.

본 개시내용은 또한 심지어 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애의 지시제인 증상의 부재 하에서의 a-유형 엑소솜의 투여를 고려한다.

본 개시내용은 또한 a-유형 엑소솜의 2, 3, 4, 5회 이상의 투여를 비롯한 a-유형 엑소솜의 반복된 투여를 고려한다. 일부 예에서, a-유형 엑소솜은 연속적으로 투여될 수 있다. 반복된 또는 연속적 투여는 치료되는 상태의 중증도에 따라 수 시간 (예를 들어, 1 내지 2시간, 1 내지 3시간, 1 내지 6시간, 1 내지 12시간, 1 내지 18시간, 또는 1 내지 24시간), 수 일 (예를 들어, 1 내지 2일, 1 내지 3일, 1 내지 4일, 1 내지 5일, 1 내지 6일, 또는 1 내지 7일) 또는 수 주 (예를 들어, 1 내지 2주, 1 내지 3주, 또는 1 내지 4주)의 기간에 걸쳐 일어날 수 있다. 투여가 반복되지만 연속적이지 않은 경우, 투여 사이의 시간은 시간 (예를 들어, 4시간, 6시간, 또는 12시간), 일 (예를 들어, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 또는 6일), 또는 주 (예를 들어, 1주, 2주, 3주, 또는 4주)일 수 있다. 투여 사이의 시간은 동일할 수 있거나, 이는 상이할 수 있다. 예로서, 질환의 증상이 악화되고 있는 것으로 보이는 경우, a-유형 엑소솜은 보다 빈번히 투여될 수 있으며, 그 후 증상이 안정화되거나 감소되면, a-유형 엑소솜은 보다 덜 빈번하게 투여될 수 있다.

일부 중요한 예에서, a-유형 엑소솜은 출생 24시간 내에 적어도 1회, 그 후 출생 1주 내에 적어도 1회 더 투여된다. 보다 더욱 바람직하게는, a-유형 엑소솜은 출생 1시간 내에 적어도 1회, 그 후 출생 3 내지 4일 내에 적어도 1회 더 투여된다.

일부 예에서, 낮은 용량의 a-유형 엑소솜의 반복된 정맥내 투여가 일어날 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 높은 투여량 형태의 a-유형 엑소솜의 단일 투여 뿐만 아니라 낮은 투여량 형태의 a-유형 엑소솜의 반복된 투여를 고려한다. 낮은 투여량 형태는 제한 없이 kg 당 1 내지 50 μg의 범위일 수 있는 반면, 높은 투여량 형태는 제한 없이 kg 당 51 내지 1000 μg의 범위일 수 있다. 그 중에서도 질환의 중증도, 대상체의 건강, 및 투여 경로에 따라, 낮은 또는 높은 용량 a-유형 엑소솜의 단일 또는 반복된 투여가 본 개시내용에 의해 고려됨이 이해될 것이다.

투여, 제약 조성물, 유효량

a-유형 엑소솜은 전형적으로 제약학적으로 허용되는 담체와 조합되는 경우, 제약학적으로 허용되는 제제 (또는 제약학적으로 허용되는 조성물)에 사용될 (예를 들어, 투여될) 수 있다. 이러한 제제는 통상적으로 제약학적으로 허용되는 농도의 염, 완충제, 보존제, 혼화성 담체를 함유할 수 있으며, 임의로 다른 (즉, 2차) 치료제를 포함할 수 있다.

제약학적으로 허용되는 담체는 예방학적 또는 치료학적 활성제의 운반 또는 수송에 관여하는 제약학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질이다. 각각의 담체는 제제의 다른 성분과 혼화성이며 대상체에게 유해하지 않은 의미에서 "허용되어야" 한다. 제약학적으로 허용되는 담체로서 기능할 수 있는 물질의 일부 예로는 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 발열원-무함유수; 등장성 염수; 링거 용액; 에틸 알콜; 포스페이트 완충 용액; 및 제약 제제에 채용되는 다른 비-독성 상용성 물질을 들 수 있다.

2차 치료제. 엑소솜은 1종 이상의 2차 치료제와 함께 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 치료제는 폐 질환, 예컨대 본원에서 논의된 것들의 예방, 치료 및/또는 관리에 사용될 수 있는 임의의 제제를 지칭한다. 이들로는 계면활성제, 흡입된 산화질소, 알미트린 비스메실레이트, 면역조정제, 및 항산화제를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 면역조정제의 예로는 스테로이드 및 코르티코스테로이드, 예컨대 메틸프레드니솔론을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 항산화제의 예로는 수퍼옥시드 디스무타제를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

폐 고혈압을 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 폐 및 혈관 질환의 치료 또는 관리에 사용되는 특정 2차 치료제로는 산소, 항응고제, 예컨대 와르파린 (코우마딘 (Coumadin)); 이뇨제, 예컨대 푸로세미드 (라식스 (Lasix)^®) 또는 스피로날락톤 (알닥톤 (Aldactone)^®); 칼슘 채널 차단제; 칼륨, 예컨대 K-두르 (K-dur)^®; 수축촉진제, 예컨대 디곡신; 혈관확장제, 예컨대 니페디핀 (프로카르디아 (Procardia)^®) 또는 딜티아젬 (카르디젬 (Cardizem)^®); 엔도텔린 수용체 길항제, 예컨대 보센탄 (트라클리어 (Tracleer)^®) 및 암브리센탄 (레타이리스 (Letairis)^®); 프로스타시클린 유사체, 예컨대 에포프로스테놀 (플롤란 (Flolan)^®), 트레프로스티닐 소듐 (레모둘린 (Remodulin)^®, 티바소 (Tyvaso)^®), 및 일로프로스트 (벤타비스 (Ventavis)^®); 및 PDE-5 억제제, 예컨대 실데나필 (레바티오 (Revatio)^®) 및 타달라필 (아드시르카 (Adcirca)^®)를 들 수 있다.

계면활성제. a-유형 엑소솜은 폐 계면활성제와 함께 투여될 수 있다. 폐 계면활성제는 폐 기도 개방의 유지 (예를 들어, 폐포벽의 서로에의 부착을 방지함으로써)에 유용한 지질단백질 혼합물이다. 폐 계면활성제는 인지질, 예컨대 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 포스포티딜콜린 (PC), 포스포티딜글리세롤 (PG); 콜레스테롤; 및 단백질, 예컨대 SP-A, B, C 및 D로 구성될 수 있다. 폐 계면활성제는 천연 발생 공급원, 예컨대 소 또는 돼지 폐 조직으로부터 유래될 수 있다. 예로는 알베오팍트 (Alveofact)™ (소 폐 세척으로부터), 큐로서프 (Curosurf)™ (분쇄된 돼지 폐로부터), 인파서프 (Infasurf)™ (송아지 폐 세척으로부터), 및 서반타 (Survanta)™ (분쇄된 소 폐로부터, DPPC, 팔미트산, 및 트리팔미틴을 비롯한 추가의 성분을 가짐)를 들 수 있다. 폐 계면활성제는 또한 합성일 수 있다. 예로는 엑소서프 (Exosurf)™ (헥사데칸올 및 틸록사폴을 갖는 DPPC로 구성됨), 푸막탄트 (Pumactant)™ 또는 인공 폐 확장 화합물 (Artificial Lung Expanding Compound) (ALEC) (DPPC 및 PG로 구성됨), KL-4 (DPPC, 팔미토일-올레오일 포스파티딜글리세롤, 팔미트산, 및 SP-B를 모방하는 합성 펩티드로 구성됨), 벤티큐트 (Venticute)™ (DPPC, PG, 팔미트산, 및 재조합 SP-C로 구성됨)를 들 수 있다. 폐 계면활성제는 상업적 공급자로부터 얻어질 수 있다.

유효량. 본 개시내용의 제제는 유효량으로 투여된다. 유효량은 단독으로 바람직한 결과를 자극하는 제제의 양이다. 절대량은 투여를 위해 선택되는 물질, 투여가 단일 또는 다중 용량으로인지 여부, 및 연령, 신체 조건, 크기, 체중, 및 질환의 단계를 비롯한 개별적 환자 파라미터를 비롯한 다양한 인자에 의존할 것이다. 이들 인자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 통상적인 실험 이하로 다루어질 수 있다.

투여 경로. a-유형 엑소솜은 폐 또는 다른 조직으로의 전달을 실행하는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 전신 투여 경로, 예컨대 정맥내 볼루스 주사 또는 연속 주입이 적합하다. 보다 직접적인 경로, 예컨대 비내 투여, 기관내 투여 (예를 들어, 삽관을 통해), 및 흡입 (예를 들어, 입 또는 코를 통한 에어로졸을 통해)은 또한 본 개시내용에 의해 고려되며, 일부 예에서, 특히 빠른 작용이 필요한 경우 보다 적절할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 에어로졸은 기체 중에 작은 입자로서 분산된 액체의 현탁액이며, 이는 이러한 입자를 함유하는 미세한 미스트 또는 스프레이를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 에어로졸화는 액체 현탁액을 작은 입자 또는 소적으로 전환시킴으로써 에어로졸을 생성하는 과정이다. 이는 에어로졸 전달 시스템, 예컨대 가압된 팩 또는 네불라이저를 사용하여 수행될 수 있다. 네불라이저로는 예를 들어 적합한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체 (그러나 이에 제한되지 않음)를 사용하는 공기-분사 (즉, 공기압), 초음파, 및 진동-메쉬 네불라이저를 들 수 있다. 네불라이저 외에, 폐 전달을 위한 다른 장치로는 계량 용량 흡입기 (MDI) 및 건조 분말 흡입기 (DPI)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 동결건조된 엑소솜 및 적합한 분말 베이스, 예컨대 락토스 또는 전분을 함유하여 제제화될 수 있다.

엑소솜은 이를 전신적으로 전달하는 것이 바람직할 경우, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해서를 비롯한, 주사에 의한 비경구 투여용으로 제제화될 수 있다. 주사용 제제는 단위 투여량 형태로, 예를 들어, 첨가된 보존제가 있거나 없는 앰풀로 또는 다중-용량 용기로 제공될 수 있다.

조성물은 수용성 현탁액, 용액 또는 오일성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 제제화제, 예컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 적합한 친지질성 용매 또는 비히클로는 지방 오일, 예컨대 참깨유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드를 들 수 있다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 용해도를 증가시키는 제제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 엑소솜은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균 발열원-무함유수로의 재구성을 위한 동결건조된 또는 다른 분말 또는 고체 형태로일 수 있다.

본 개시내용에 따라 치료되는 대상체에게 투여되는 다른 제제는 경구 투여, 비내 투여, 기관내 투여, 흡입, 정맥내 투여 등을 비롯한 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있음이 이해되어야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이러한 2차 제제에 대한 투여의 통상적인 경로를 알고 있을 것이다.

키트

본 개시내용은 또한 패키징되고 표지된 제약 제품을 포함한다. 이 제조품 또는 키트는 적절한 단위 투여량 형태를 적절한 통 또는 용기, 예컨대 유리 바이알 또는 플라스틱 앰풀 또는 기밀하게 밀봉된 다른 용기 중에 포함한다. 단위 투여량 형태는 예를 들어 에어로졸에 의한 폐 전달에 적합해야 한다. 바람직하게는, 제조품 또는 키트는 제약 제품을 투여하는 방법을 비롯한 사용 방법에 대한 지시서를 더 포함한다. 지시서는 해당 질환 또는 장애를 적절하게 예방 또는 치료하는 방법에 대해 의료 실무자, 기술자 또는 대상체에게 조언하는 정보 자료를 더 함유할 수 있다. 즉, 제조품은 실제 용량, 모니터링 절차, 및 다른 모니터링 정보를 포함하나 이에 제한되지 않는 사용을 위한 투약 처방을 지시하거나 제안하는 지시서를 포함한다.

임의의 제약 제품과 같이, 패키징 물질 및 용기는 저장 및 수송 동안 제품의 안정성을 보호하도록 설계된다.

키트는 직접적으로 사용될 수 있는 멸균 수성 현탁액 중에 엑소솜을 포함할 수 있거나, 정맥내 주사 또는 네불라이저에 사용하기 위해 생리 식염수로 희석될 수 있거나, 기관내 투여를 위해 계면활성제로 희석되거나 그와 조합될 수 있다. 따라서, 키트는 또한 희석 용액 또는 희석제, 예컨대 염수 또는 계면활성제를 함유할 수 있다. 키트는 또한 폐 전달 장치, 예컨대 네불라이저 또는 일회용 성분, 따라서, 예컨대 마우스피스, 노우즈피스, 또는 마스크를 포함할 수 있다.

실시예

물질 및 방법

인간 제대 와튼 젤리로부터의 인간 MSC의 단리. 인간 제대 와튼 젤리 유래된 MSC (hUC-MSC)를 공개된 방법 (문헌 [Mitchell, K. E. et al., 2003, Stem Cells 21:50-60]; 및 [Penolazzi, L. et al., 2011, J Cell Physiol])에 따라 약간의 변형으로 단리하였다. 제대를 차가운 멸균 PBS로 2회 세정하고, 세로로 커팅하고, 동맥 및 정맥을 제거하였다. 연질 겔 조직을 오려내고, 미세하게 자르고 (2 내지 3 mm²), 10％ 소 태아 혈청 (하이클론 (Hyclone)), 2 mM L-글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 DMEM/F12 (1:1) (인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 100 mm 디쉬 (디쉬 당 15조각) 상에 직접 정치하고, 5％ CO₂의 가습된 분위기에서 37℃에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 조직 및 배지의 제거 후, 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 부착된 세포를 배양하고, 신선한 배지를 주 당 3회 교체하였다. 70 내지 80％ 전면생장률에서, 세포를 수집하고, PE 접합된 항체로 CD34 (밀트니바이오테크 (Miltenybiotec)) 및 CD45 (밀트니바이오테크)에 대해 염색하였다. 면역고갈을 항-PE-마이크로비드 (밀트니바이오테크) 및 MSCS 컬럼 (밀트니바이오테크)을 사용하여 제조자의 지시서에 따라 수행하였다. CD34 및 CD45 음성 집단을 추가로 증식시키고, MSC 마커 (CD105, CD90, CD44, 및 CD73)의 발현 및 CD11b, CD19, 및 HLA-DR의 부재에 대해 모플로 (MoFlo) 유동 세포측정법 (베크만 코울터 (Beckman Coulter))을 사용한 인간 MSC (비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences))의 특징화에 특이적인 형광-표지된 항체의 세트를 사용함으로써 선택하였다.

조건화 배지의 제조. 혈청-유래된 미세소포로부터의 오염을 배제하기 위해, 세포 배양물의 증식 및 조건화 배지의 수집에 사용된 혈청을 100,000 x g에서 18시간 동안 초원심분리에 의해 정화하였다. MSC를 10％ (v/v) 소 태아 혈청 (FBS, 하이클론), 10％ (v/v) 말 혈청 (하이클론) 및 5 mM L-글루타민 (지브코 (Gibco))으로 보충된 α-MEM 배지에서 배양하였다. 70％ 전면생장률에서의 배양물을 PBS로 2회 세척하고, 2 mM L-글루타민으로 보충된 혈청-무함유 배지로 24시간 동안 표준 배양 조건 하에서 인큐베이션하였다. 조건화 배지를 인간 MSC의 거의 포화된 배양물로부터 24 내지 48시간에 걸쳐 또는 3 내지 4일의 기간에 걸쳐 (미세입자-고갈된 FBS 배양물에서) 수집하고, 세포 및 데브리스를 400 x g에서 5분 동안, 2,000 x g에서 10분 동안, 및 13,000 x g에서 30분 동안의 차등적 원심분리에 의해 제거하였다. 이어서, 정화된 조건화 배지를 0.2 μm 필터 유닛을 통해 여과하고, 100kD 또는 300kD 또는 500kD 컷오프를 사용한 접선 유동 여과 시스템을 사용하여 적어도 10배 농축시켰다. 조건화 배지 중의 단백질 수준을 브래드포드 검정 (바이오-래드)을 사용하여 측정하였다.

엑소솜의 단리. MSC 엑소솜을 100k xg에서 3.5시간 동안 원심분리에 의해 아이오딕사놀 (Iodixanol)의 10％ 내지 60％ 단계 구배에 밴딩시킴으로써 농축된 조건화 배지로부터 단리하였다. 엑소솜을 차등적 원심분리에 의해, 간혹 그 후 30％ 수크로스 쿠션 또는 수크로스 속도 구배에 의해 조건화 배지로부터 추가로 단리하였다. 단리된 엑소솜 제제의 입자 수를 나노사이트에 의해 측정하였다.

엑소솜의 웨스턴 블롯. 엑소솜 제제를 12％ 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리한 후, 0.45 μm PVDF 막 (밀리포어) 상으로 옮겼다. 염소 폴리클로날 항-CD63 (1:1,000; 산타 크루즈 (Santa Cruz) 항체, 폴리클로날 토끼 항-CD81 (1:1,000, 산타 크루즈), 및 모노클로날 항-다이서 (anti-Dicer) (1:1,000, 앱캠 (Abcam))를 사용하였다. ALIX, FLOT-1, TSG101, TGFβR2, SMAD, CD105, CD9, CD81, CAV1, EFGR 및 AKT에 대한 1차 항체를 또한 사용하여 엑소솜의 하위집단을 확인하였다. 페록시다제-접합된 항-토끼 2차 항체 (산타 크루즈)를 1:20,000 희석으로 사용하여 향상된 화학발광 시약 (피어스 (Pierce)) 또는 루미-라이트플러스 (Lumi-LightPLUS) (로슈 (Roche)) 중 어느 하나에 의해 면역반응성 밴드를 가시화하였다. NIH로부터의 이미지제이 (ImageJ) 프로그램을 적절한 배경 제함 후 농도계측 분석을 통해 정량화에 사용하였다.

마이크로RNA의 정량화. 총 엑소솜 RNA를 촘크진스키 및 사키 (Chomczynski & Sacchi) (1987 Anal Biochem 162:156-159)의 방법에 의해 추출하고, 750 ng을 각각의 표적 마이크로RNA에 대한 특이적 프라이머를 갖는 역전사효소에 대한 주형으로서 사용하였다 (태크맨 역전사 키트 (TaqMan Reverse Transcription Kit), 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티). 각각의 역전사 반응은 또한 내부 대조군으로서 사용된 소핵 RNA sno202에 대한 프라이머를 포함하였다. 37.5 ng cDNA를 지시된 마이크로RNA 및 내부 대조군에 대해 특이적인 프로브 (태크맨 마이크로RNA 검정, 어플라이드 바이오시스템즈)의 존재 하에서 UNG (어플라이드 바이오시스템즈)를 갖지 않는 태크맨 유니버셜 마스터 믹스 II로의 각각의 20 μl qPCR 반응에 사용하였다. 증폭을 스텝원 플러스 (StepOne Plus) 플랫폼 (어플라이드 바이오시스템즈) 상에서 50℃에서 2분 동안, 95℃에서 10분 동안, 그 후 95℃에서 15초 동안, 60℃에서 1분 동안의 40 주기로 수행하였다.

동물 및 저산소 노출. 8주령 FVB 수컷 마우스를 찰스 리버 래버러토리즈 (Charles River Laboratories) (미국 메사추세츠주)로부터 얻거나, 보스톤 아동 병원 동물 시설 (Animal Facility at Children's Hospital Boston)에서 사육하였다. 각각의 군의 마우스를 플렉시글라스 (Plexiglas) 챔버 (옥시사이클러 (OxyCycler), 바이오스페릭스 (BioSpherix), 미국 뉴욕주 레드필드)에서 다양한 실험 기간 동안 8.5％ 산소에 노출시켰다. 환기를 조정하여 CO₂를 5,000 ppm (0.5％)을 초과하지 않도록 제거하였다 (평균 범위 1,000 내지 3,000 ppm). 암모니아를 환기 및 공기 정제기를 통한 활성탄 여과에 의해 제거하였다. 모든 동물 프로토콜은 아동 병원 동물 관리 및 사용 위원회 (Children's Hospital Animal Care and Use Committee)로부터 승인되었다.

실시예 1

중간엽 줄기 세포 - 유래된 엑소솜의 2가지 별개의 집단의 확인 및 특징화

축적된 증거는 폐 항상성 및 복구에 있어서의 MSC에 대한 중요한 역할을 뒷받침한다. MSC 엑소솜 (MEX)은 저산소-유도된 폐 고혈압에 대한 중간엽 줄기 세포의 세포보호 효과를 매개하는 것으로 이전에 보고되었다. 정맥내 마우스 MEX 전달은 대식세포의 저산소성 폐 유입 및 염증유발 및 증식유발 매개인자의 유도를 억제하였으며, 결국 뮤린 PH 모델에서 혈관 재형성 및 저산소성 폐 고혈압을 억제하였다.

이 연구의 목표는 인간 제대 간질로부터 단리된 MSC가 유사한 보호 특성을 나타내는 미세소포를 분비하는지 여부를 조사하고, 치료제 MSC 엑소솜의 생화학적 특성을 특징화하고, 폐 혈관 재형성을 개시하는 신호에 의해 촉발되는 혈관 세포 표현형적 변화에 대한 그의 효과를 연구하는 것이었다.

MEX의 단리

엑소솜 (MEX)을 인간 중간엽 줄기 세포 (MSC)에 의해 조건화된 조직 배양 배지로부터 단리하였다. 여기서, 인간 MSC의 공급원은 와튼 젤리 (WJ)이지만, 다른 가능한 공급원은 제대혈, 골수, 지방 또는 다른 조직이다. MSC를 단리하고, 면역선택하고, 배양하고, 그의 분화 잠재성을 평가하였다. 인간 WJ-MSC에 대한 음성 선택은 CD34 및 CD45를 포함하였다. MSC는 CD90, CD73, CD105 및 CD44에 대해 양성이었다.

MEX로의 마우스의 처리

MEX의 하나의 용량을 꼬리 정맥 주사를 통해 동물에게 전달하고, 수용자 마우스를 정상산소 저산소 (8 내지 10％ O2)에 2.5일 동안 노출시켰다. 저산소-유도된 염증 마커 (예를 들어 CCL2, IL6)의 감소를 제조의 유효성에 대한 계량으로서 사용하였다. 사용된 투여량은 나노사이트에 의해 측정된 바로 대략 100억 내지 200억개 입자와 동등하거나, 1000만 내지 2000만개 MSC에 의해 단층 배양물에서 24시간에 걸쳐 생성된 총 엑소솜과 대략 동등하였다.

결과

MEX 제제의 정맥내 주사에 의한 마우스의 처리는 혈관 재형성 및 폐 고혈압과 연관된 신호전달의 저산소성 활성화를 하향-조절하였으며 (도 1a), 저산소증-유발 폐 염증을 개선시켰다 (도 1b). 도 1a는 AKT 및 그의 하류 표적 mTOR의 저산소-유도된 인산화가 WJ-MEX 처리에 의해 감소됨을 나타낸다. 도 1b에서 입증된 바와 같이, BMPR2의 직접 SMAD-표적화된 유전자 및 하류 신호인 DNA-결합/분화 단백질 ID1의 억제제의 폐 단백질 수준은 저산소에 의해 억제되었지만, MEX로는 증가되었다. 알파 튜불린은 정규화 대조군으로서 기능한다.

MEX 하위유형의 하나 초과의 집단의 존재를 밀도 및 속도 초원심분리에 의해 조사하였다. 밀도 및 속도 초원심분리를 통한 MEX 제제의 분석은 MSC에 의해 생성된 세포외 미세소포의 집단이 분자 마커에 기초하여 2가지 유형에 의해 구성됨을 나타내었다 (도 2 및 도 3). 2가지 유형은 a-MEX 및 f-MEX로 용어화되었다. 엑소솜 생물발생 마커, 예컨대 ALIX 및 TSG101은 분획 12 내지 14 (a-MEX)에 우선적으로 풍부화된 반면, 테트라스파닌 CD9 및 CD81 및 지질 뗏목 마커, 예컨대 플로틸린 1 (FLOT1) 및 카베올린 1 (CAV1)은 분획 5 내지 8 (f-MEX)에 풍부화되었다. 표 1은 a-MEX 및 f-MEX 특이적 마커를 나타낸다:

<표 1>

a-MEX 또는 f-MEX의 제제는 EM에 의해 별개의 형태를 나타낸다 (도 4). f-MEX는 직경이 30 내지 200 nm이며, 전형적인 깊은 컵 형상 형태의 엑소솜을 나타내는 반면, a-MEX는 30 내지 100 nm이고, 반투명성 및 구상 형태를 갖는다.

단층 배양물에서 성장된 MSC로부터 얻어진 벌크 엑소솜 제제로부터 a-MEX 또는 f-MEX에 매우 풍부화된 엑소솜 하위집단을 제조하기 위해, 벌크 엑소솜 제제를 45％ 수크로스로 조정하고, 60％ 수크로스 쿠션 상에 층상화하고, 35％ 내지 5％ 수크로스의 단계 구배로 중첩층상화하였다. 제제를 180k xg에서 20시간 동안 원심분리하여 a-MEX 및 f-MEX 하위집단을 분리하였다. a-MEX 또는 f-MEX를 함유하는 구배 분획을 초원심분리 (100k xg, 3시간)를 통해 농축시키고, PBS에 또는 접선 유동 여과를 통해 재현탁시켰다.

저산소에 노출된 마우스에의 단리된 a-MEX 또는 f-MEX의 투여는 MEX의 면역억제 특성이 배타적으로 a-MEX 유형에 있음을 나타내었다 (도 5). a-MEX로의 처리는 CCL2, IL6 및 ADM을 비롯한 저산소-유도된 염증 마커의 mRNA 수준의 유의한 감소를 유발하였다.

a- MEX의 생성은 3-D 배양물에서 증강된다.

MSC 및 특정 다른 세포 유형은 구상체로 용어화되는 세포 응집체를 형성할 수 있다. 도 6은 2-D 및 3D 배양 조건 둘 다로부터의 MSC 구상체의 형성을 나타내는 현미경검사 화상을 제공한다. 구상체 형성은 2-차원 단층 배양물보다 더 생리학적 조건을 나타내는 것으로 가정된다. MSC에 대해, 구상체 상태는 보다 비분화된 줄기-유사 상태를 나타내는 것으로 가정된다. 구상체를 형성하는 경향을 향상시키는 3-차원 배양 시스템은 시판된다 (특이적 막). MSC는 자발적으로 높은 밀도에서 단층 배양물로부터 과다성장하는 구상체를 형성할 것이며, 배양 배지에 현탁되는 경우 (현적 기법), 구상체를 형성하도록 유도될 수 있다.

현적 기법은 많은 세포 유형에 대한 널리 공지된 배양 방법이다. 간략하게, 단층 배양으로 성장한 MSC를 트립신처리하여 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 500,000개 세포를 함유하는 이 현탁액 30 μL를 페트리 디쉬 커버의 내표면에 가하고, 커버를 습도를 보존하기 위해 소량의 PBS를 함유하는 디쉬 상에 정치하였다. 현적물을 갖는 디쉬를 조직 배양 인큐베이터 내로 1 내지 2일 동안 정치하였으며, 그 동안 MSC가 구상체로 응집하였다. 전형적인 구상체 제제는 30 소적으로 나누어진 1500만개 세포로 이루어졌다.

데이터는 3D 배양으로 성장한 MSC (구상체)가 동일한 통로에서 2D 배양 (단층)으로 성장한 동일한 MSC 클론과 비교하여 유의하게 더 많은 a-MEX를 생성하였음을 지시한다 (도 7). a-MEX 생성의 증가는 도 7에 나타난 바와 같이, FLOT1은 그렇지 않지만, SMAD 2/3 및 ALIX 항체에 대한 샘플의 강한 면역반응성에 의해 증명된다.

또한, a-MEX의 생성은 상이한 MSC 클론 사이에서 가변적이며, 생성 세포는 3D 배양 및/또는 성장 인자 보충을 통해 풍부화될 수 있음이 밝혀졌다. 다양한 독립적으로 유래된 MSC 클론을 그의 상대적 a-MEX 생성에 대해 특징화하였다 (2D 배양 동안 그의 조건화 배지 중의 FLOT1 대 ALIX (또는 SMAD) 마커의 비율을 측정하고, 실질적 변동을 주목함) (도 8a). 특정 클론, 예컨대 클론 D는 유의한 양의 SMAD (FLOT1 (f-MEX 마커)에 비해 a-MEX 마커)를 생성하지 않았다. 클론 D의 이 특성은 현적 기법을 사용한 매우 비효율적인 구상체 형성과 연관된다 (도 8b).

유의하게, 클론 D 세포에 의해 형성된 드문 구상체를 단층에서 팽창시키는 경우, 결과의 2D-배양은 a-MEX를 높은 비율로 생성하며, 구상체를 높은 효율로 형성하였다. 이들 관찰은 구상체 형성을 통한 선택이 그의 줄기성을 보유하며 a-MEX를 높은 비율로 생성하는 세포의 하위집단에 대한 비효율적 MSC 클론을 풍부화하는 도구로서 사용될 수 있음을 지시한다. 이 목표를 향해, 성장 인자, 예컨대 TGFβ1의 농도의 조작은 구상체 형성을 가속화하고, a-MEX 생성을 향상시킬 수 있는 것으로 관찰되었다 (도 9). TGFβ1 자극은 10 ng/ml의 농도에서 달성되었다.

a- MEX 및 f- MEX는 특이적 성장 인자에 대한 별개의 신호 전달 모듈을 운반한다.

a-MEX는 TGF 수용체 및 하류 전사 인자 SMAD를 갖는다 (도 2 및 도 3). a-MEX의 단리된 제제에의 TGFβ1의 첨가는, a-MEX 내의 SMAD 분자가 시험관내에서 효율적으로 및 특이적으로 인산화되기 때문에, 신호전달 모듈이 기능적임을 나타낸다 (도 10a). 이 특성은 a-MEX에 대해 특이적이다 (도 10b). f-MEX는 EGF 수용체를 함유하며, 시험관내에서 내인성 AKT를 인산화할 수 있다 (도시하지 않음).

데이터는 MSC가 2개의 별개의 유형의 엑소솜을 생성함을 지시한다: a-MEX 유형은 TGF/BMP 슈퍼패밀리의 성장 인자에 대한 기능적 신호전달 모듈을 운반하는 반면, f-MEX는 FGF/PDGF 슈퍼패밀리에 대한 상응하는 모듈을 운반한다. 이들 엑소솜은 모듈을 표적 세포로 전달하고, 상응하는 신호전달 경로를 향상시키며, 그의 상대적 분비 비율은 이를 생성하는 MSC 집단의 프로그래밍에 의존한다.

더욱이, f-MEX는 그렇지 않지만 a-MEX는 도 11에 나타낸 바와 같이 인간 폐 세포에서 TGFβ-유도된 섬유모세포-근섬유모세포 전이를 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 인간 폐 섬유모세포를 3일 혈청 고갈 (0.1％ FBS) 후, TGFβ로 자극시켜 근섬유모세포 분화를 겪게 하고, 이는 증가된 알파-평활근 액틴 (SMA) 발현에 의해 표시되었다. 도 11a는 hMEX (2 ug/ml)로의 예비-처리가 알파-SMA 단백질 수준에 대한 TGFβ의 효과를 철폐함을 입증한다. 이 발견을 추가로 조사하기 위해, 인간 폐 섬유모세포를 24시간 혈청 고갈 후, TGFβ로 자극시켜 근섬유모세포 마커인 PAI1을 유도하였다. a-MEX로의 처리는 PAI1 상향-조절을 방지하였으며, f-MEX 처리로는 효과가 관찰되지 않았다 (도 11b). 또한, a-MEX 처리는 시험관내에서 인간 폐 섬유모세포 중의 기준선 MCP-1 및 IL1β mRNA 수준을 하향-조절하는 것으로 밝혀졌다 (도 11c).

등가물

이 개시내용은 그의 적용에 있어서 하기 설명에 설명되거나 도면에 예시된 구성의 상세사항 및 성분의 배열에 제한되지 않는다. 본 개시내용은 다른 실시양태가 가능하며, 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본원에 사용된 어구 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이며, 제한으로서 간주되지 않아야 한다. "포함하는 (including)", "포함하는 (comprising)", 또는 "갖는", "함유하는", "포함하는 (involving)", 및 본원에서 그의 변형어의 사용은 그 후에 열거되는 항목 및 그의 등가물 뿐만 아니라 추가의 항목을 포함하는 것을 의미한다.

이 개시내용의 적어도 하나의 실시양태의 몇몇 측면을 이와 같이 설명하였지만, 다양한 변경, 변형, 및 개선이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 일어날 것임이 인식되어야 한다. 이러한 변경, 변형, 및 개선은 이 개시내용의 일부인 것으로 의도되며, 본 개시내용의 정신 및 범위 내인 것으로 의도된다. 따라서, 상기 설명 및 도면은 단지 예로서일 뿐이다.

Claims

(i) 단리된 엑소솜이 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하고/거나;
(ii) 단리된 엑소솜이 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하지 않는 것인 단리된 엑소솜.
제1항에 있어서, 엑소솜이 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8종의 마커를 포함하는 것인 단리된 엑소솜.
제2항에 있어서, 엑소솜이 마커 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105를 포함하는 것인 단리된 엑소솜.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7종의 마커를 포함하지 않는 것인 단리된 엑소솜.
제4항에 있어서, 엑소솜이 마커 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2를 포함하지 않는 것인 단리된 엑소솜.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 투과 전자 현미경검사에서 음성 염색 시 구상 형태를 가지며, 방사선투과성을 나타내는 것인 단리된 엑소솜.
제6항에 있어서, 엑소솜이 음성 염색 투과 전자 현미경검사에서 컵 형상 형태를 갖지 않는 것인 단리된 엑소솜.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 약 10 내지 150 nm의 직경을 갖는 것인 단리된 엑소솜.
제8항에 있어서, 엑소솜이 약 30 내지 100 nm의 직경을 갖는 것인 단리된 엑소솜.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 중간엽 줄기 세포 (MSC), 섬유모세포, 또는 대식세포로부터 단리된 것인 단리된 엑소솜.
제10항에 있어서, MSC, 섬유모세포, 또는 대식세포가 인간 MSC, 인간 섬유모세포, 또는 인간 대식세포인 단리된 엑소솜.
제10항 또는 제11항에 있어서, MSC가 와튼 젤리, 제대혈, 태반, 말초 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 단리된 것인 단리된 엑소솜.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 엑소솜을 포함하는 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 엑소솜의 치료학적 유효량을 포함하는 제약 조성물.
(i) 단리된 엑소솜이 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하고/거나;
(ii) 단리된 엑소솜이 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하지 않는 것인 단리된 엑소솜.
제15항에 있어서, 엑소솜이 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7종의 마커를 포함하는 것인 단리된 엑소솜.
제16항에 있어서, 엑소솜이 마커 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2를 포함하는 것인 단리된 엑소솜.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8종의 마커를 포함하지 않는 것인 단리된 엑소솜.
제18항에 있어서, 엑소솜이 마커 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5, 및 CD105를 포함하지 않는 것인 단리된 엑소솜.
제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 음성 염색 투과 전자 현미경검사에서 컵 형상 형태를 갖는 것인 단리된 엑소솜.
제20항에 있어서, 엑소솜이 음성 염색 투과 전자 현미경검사에서 구상 형태를 갖지 않는 것인 단리된 엑소솜.
제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 약 10 내지 250 nm의 직경을 갖는 것인 엑소솜.
제22항에 있어서, 엑소솜이 약 30 내지 200 nm의 직경을 갖는 것인 엑소솜.
폐 장애, 심혈관 장애, 신장 장애, 또는 허혈성 신경 장애를 갖거나 또는 가질 위험성이 있는 대상체에게 단리된 엑소솜의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서
(i) 단리된 엑소솜이 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SAMD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하고/거나;
(ii) 단리된 엑소솜이 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하지 않는 것인, 폐 장애, 심혈관 장애, 신장 장애, 또는 허혈성 신경 장애의 치료 방법.
제24항에 있어서, 엑소솜이 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8종의 마커를 포함하는 것인 방법.
제25항에 있어서, 엑소솜이 마커 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105를 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7종의 마커를 포함하지 않는 것인 방법.
제27항에 있어서, 엑소솜이 마커 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2를 포함하지 않는 것인 방법.
제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 투과 전자 현미경검사에서 음성 염색 시 구상 형태를 가지며, 방사선투과성을 나타내는 것인 방법.
제29항에 있어서, 엑소솜이 음성 염색 투과 전자 현미경검사에서 컵 형상 형태를 갖지 않는 것인 방법.
제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 약 10 내지 150 nm의 직경을 갖는 것인 방법.
제31항에 있어서, 엑소솜이 약 30 내지 100 nm의 직경을 갖는 것인 방법.
제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 중간엽 줄기 세포 (MSC), 섬유모세포, 또는 대식세포로부터 단리된 것인 방법.
제33항에 있어서, MSC가 인간 MSC, 인간 섬유모세포, 또는 인간 대식세포인 방법.
제33항 또는 제34항에 있어서, MSC가 와튼 젤리, 제대혈, 태반, 말초 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 단리된 것인 방법.
제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 폐 장애가 염증성 폐 질환, 폐 혈관 질환, 또는 급성 폐 손상인 방법.
제36항에 있어서, 염증성 폐 질환이 저산소증-유발 폐 염증, 폐 고혈압, 천식, 기관지폐 이형성증 (BPD), 알레르기, 또는 특발성 폐 섬유증인 방법.
제36항에 있어서, 급성 폐 손상이 패혈증과 연관되거나, 인공호흡기-유발 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)인 방법.
제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 심혈관 장애가 심근 경색, 심혈관 질환, 고혈압, 아테롬성동맥경화증, 또는 심부전인 방법.
제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 신장 장애가 허혈성 신장 손상, 급성 신부전, 또는 신장 섬유증인 방법.
제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 허혈성 신경 장애가 저산소성 허혈성 뇌병증 또는 허혈성 졸중인 방법.
(i) 단리된 엑소솜이 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SAMD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하고/거나;
(ii) 단리된 엑소솜이 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하지 않는 것인, 폐 장애, 심혈관 장애, 신장 장애, 또는 허혈성 신경 장애의 치료를 위한 단리된 엑소솜의 용도.
제42항에 있어서, 엑소솜이 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8종의 마커를 포함하는 것인 용도.
제43항에 있어서, 엑소솜이 마커 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105를 포함하는 것인 용도.
제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7종의 마커를 포함하지 않는 것인 용도.
제45항에 있어서, 엑소솜이 마커 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2를 포함하지 않는 것인 용도.
제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 투과 전자 현미경검사에서 음성 염색 시 구상 형태를 가지며, 방사선투과성을 나타내는 것인 용도.
제47항에 있어서, 엑소솜이 음성 염색 투과 전자 현미경검사에서 컵 형상 형태를 갖지 않는 것인 용도.
제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 약 10 내지 150 nm의 직경을 갖는 것인 용도.
제49항에 있어서, 엑소솜이 약 30 내지 100 nm의 직경을 갖는 것인 용도.
제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 중간엽 줄기 세포 (MSC), 섬유모세포, 또는 대식세포로부터 단리된 것인 용도.
제51항에 있어서, MSC가 인간 MSC, 인간 섬유모세포, 또는 인간 대식세포인 용도.
제51항 또는 제52항에 있어서, MSC가 와튼 젤리, 제대혈, 태반, 말초 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 단리된 것인 용도.
제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 폐 장애가 염증성 폐 질환, 폐 혈관 질환, 또는 급성 폐 손상인 용도.
제54항에 있어서, 염증성 폐 질환이 저산소증-유발 폐 염증, 폐 고혈압, 천식, 기관지폐 이형성증 (BPD), 알레르기, 또는 특발성 폐 섬유증인 용도.
제54항에 있어서, 급성 폐 손상이 패혈증과 연관되거나, 인공호흡기-유발 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)인 용도.
제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 심혈관 장애가 심근 경색, 심혈관 질환, 고혈압, 아테롬성동맥경화증, 또는 심부전인 용도.
제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 신장 장애가 허혈성 신장 손상, 급성 신부전, 또는 신장 섬유증인 용도.
제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 허혈성 신경 장애가 저산소성 허혈성 뇌병증 또는 허혈성 졸중인 용도.
(i) 단리된 엑소솜이 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SAMD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하고/거나;
(ii) 단리된 엑소솜이 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하지 않는 것인, 폐 장애, 심혈관 장애, 신장 장애, 또는 허혈성 신경 장애의 치료용 의약의 제조에 있어서의 단리된 엑소솜의 용도.
제60항에 있어서, 엑소솜이 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8종의 마커를 포함하는 것인 용도.
제61항에 있어서, 엑소솜이 마커 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105를 포함하는 것인 용도.
제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7종의 마커를 포함하지 않는 것인 용도.
제63항에 있어서, 엑소솜이 마커 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2를 포함하지 않는 것인 용도.
제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 투과 전자 현미경검사에서 음성 염색 시 구상 형태를 가지며, 방사선투과성을 나타내는 것인 용도.
제65항에 있어서, 엑소솜이 음성 염색 투과 전자 현미경검사에서 컵 형상 형태를 갖지 않는 것인 용도.
제60항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 약 10 내지 150 nm의 직경을 갖는 것인 용도.
제67항에 있어서, 엑소솜이 약 30 내지 100 nm의 직경을 갖는 것인 용도.
제60항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 중간엽 줄기 세포 (MSC), 섬유모세포, 또는 대식세포로부터 단리된 것인 용도.
제69항에 있어서, MSC가 인간 MSC, 인간 섬유모세포, 또는 인간 대식세포인 용도.
제69항 또는 제70항에 있어서, MSC가 와튼 젤리, 제대혈, 태반, 말초 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 단리된 것인 용도.
제60항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 폐 장애가 염증성 폐 질환, 폐 혈관 질환, 또는 급성 폐 손상인 용도.
제72항에 있어서, 염증성 폐 질환이 저산소증-유발 폐 염증, 폐 고혈압, 천식, 기관지폐 이형성증 (BPD), 알레르기, 또는 특발성 폐 섬유증인 용도.
제72항에 있어서, 급성 폐 손상이 패혈증과 연관되거나, 인공호흡기-유발 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)인 용도.
제60항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 심혈관 장애가 심근 경색, 심혈관 질환, 고혈압, 아테롬성동맥경화증, 또는 심부전인 용도.
제60항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 신장 장애가 허혈성 신장 손상, 급성 신부전, 또는 신장 섬유증인 용도.
제60항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 허혈성 신경 장애가 저산소성 허혈성 뇌병증 또는 허혈성 졸중인 용도.
조건화 배지를 제조하기 위해 세포를 배양하고;
조건화 배지로부터 엑소솜을 단리하는 것을 포함하며;
(i) 단리된 엑소솜이 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하고/거나;
(ii) 단리된 엑소솜이 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하지 않는 것인, 엑소솜(들)의 제조 방법.
제78항에 있어서, 엑소솜이 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8종의 마커를 포함하는 것인 방법.
제79항에 있어서, 엑소솜이 마커 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105를 포함하는 것인 방법.
제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 7종의 마커를 포함하지 않는 것인 방법.
제81항에 있어서, 엑소솜이 마커 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2를 포함하지 않는 것인 방법.
제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 투과 전자 현미경검사에서 음성 염색 시 구상 형태를 가지며, 방사선투과성을 나타내는 것인 방법.
제83항에 있어서, 엑소솜이 음성 염색 투과 전자 현미경검사에서 컵 형상 형태를 갖지 않는 것인 방법.
제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 약 10 내지 150 nm의 직경을 갖는 것인 방법.
제85항에 있어서, 엑소솜이 약 30 내지 100 nm의 직경을 갖는 것인 방법.
제78항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소솜이 중간엽 줄기 세포 (MSC), 섬유모세포, 또는 대식세포로부터 단리된 것인 방법.
제87항에 있어서, MSC, 섬유모세포, 또는 대식세포가 인간 MSC, 인간 섬유모세포, 또는 인간 대식세포인 방법.
제87항 또는 제88항에 있어서, MSC가 와튼 젤리, 제대혈, 태반, 말초 혈액, 골수, 또는 지방 조직으로부터 단리된 것인 방법.
제78항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 배양이 2-차원 (2D) 또는 3-차원 (3D) 배양인 방법.
제90항에 있어서, 3D 배양이 현적 배양, 매트릭스 상 배양, 미세담체 상 배양, 합성 세포외 스캐폴드 상 배양, 키토산 막 상 배양, 자기 부상 하 배양, 회전 생물반응기 중 현탁 배양, 또는 비-접촉 억제 조건 하 배양을 포함하는 것인 방법.
제78항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 배양이 TGFβ 슈퍼패밀리 (TGFβ1, 액티빈 (Activin), BMP, GDF, GDNF, 인히빈 (Inhibin), 노달 (Nodal), 레프티 (Lefty), MIS) EGF, PDGF, 및 FGF로부터 선택되는 1종 이상의 성장 인자의 사용을 포함하는 것인 방법.
제78항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하는 엑소솜에 비해 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하는 엑소솜의 생성을 향상시키는 것인 방법.
제93항에 있어서, 향상이 FLOT1, CD9, CD81, CAV1, EGFR, AKT1 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하는 엑소솜에 비해 ALIX, TSG101, TGFBR2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 및 CD105로부터 선택되는 1종 이상의 마커를 포함하는 엑소솜의 생성의 1.5배, 2.0배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배, 또는 5.0배, 6.0배, 7.0배, 8.0배, 9.0배, 또는 10.0배 이상 증가를 포함하는 것인 방법.