KR20150046320A - 경질 알켄올의 효소 탈수에 의한 휘발성 디엔의 생산방법 - Google Patents
경질 알켄올의 효소 탈수에 의한 휘발성 디엔의 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
생물학적 공정을 통해 공액 디엔을 생성하는 방법이 기재된다. 보다 구체적으로, 본 출원은 효소 탈수를 통해, 특히 알켄올 데히드라타제를 사용함으로써 경질 알켄올로부터 공액 디엔 (예를 들어, 부타디엔, 이소프렌 또는 디메틸부타디엔)을 생산하는 방법을 기재한다.
Description
본 발명은 생물학적 공정을 통해 공액 디엔, 특히 휘발성 디엔을 생성하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 효소 탈수를 통해, 특히 알켄올 데히드라타제, 예컨대 리나로올(linalool) 데히드라타제 (EC 4.2.1.127)를 사용함으로써 경질 알켄올로부터 부타디엔, 이소프렌 또는 디메틸부타디엔을 생산하는 방법에 관한 것이다.
공액 디엔, 예를 들어 1,3-디엔, 예컨대 부타디엔 또는 이소프렌은 산업상 중요한 분자이다. 이소프렌 (2-메틸-1,3-부타디엔)은 화학식 C5H8을 갖는 공액 디엔이다. 이소프렌은 타이어 산업에 핵심 화합물이며, 또한 접착제에 많은 응용성이 있다. 이소프렌은 몇몇 경로를 이용하여 화학적으로 생산된다:
- 오일로부터 추출 증류 (C5 컷)
- 이소아밀렌의 탈수소화
- 이소펜탄의 이중 탈수소화
- 이소부텐과 포름알데히드의 반응
- 아세톤과 아세틸렌의 반응
- 프로필렌 이량체화
WO 2009/076676에서는 이소프렌으로의 대사 경로를 보고하고 있다. 그 경로는 메발로네이트 경로에서의 하류 중간체, 즉 이소프레닐-피로포스페이트 또는 프레닐-피로포스페이트의 탈인산화-탈수에 기반한다. 당해 공정은 전 메발로네이트 경로를 밟을 것을 요구하는 단점이 있다: 메발로네이트의 이중 인산화, 뒤이어 이소프레닐-피로포스페이트로의 탈카르복실화-탈수, 프레닐-피로포스페이트로의 추가 이성질체화, 및 최종적으로 이소프렌으로의 이중 탈인산화/탈수.
부타디엔 (1,3-부타디엔)은 화학식 C4H6을 갖는 공액 디엔이다. 부타디엔은 합성 고무, 나일론, ABS (아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌), 플라스틱, 라텍스 생산에서 단량체로서 사용되는 중요한 공업용 화학물질이다. 부타디엔의 상이한 생산 가능성이 존재한다. 부타디엔은 예를 들어 에틸렌 및 다른 올레핀의 생산에 사용되는 수증기 분해 공정의 부산물로서 생산된다. 당해 공정에서, 부타디엔은 C4 스트림에서 발생하고 보통은 극성 비양성자성 용매, 예컨대 아세토니트릴중으로의 추출에 의하여 다른 부산물로부터 단리되고, 이어서 그로부터 스트리핑된다. 부타디엔은 또한 직쇄(normal) 부탄의 촉매 탈수소화에 의하여 생산될 수 있거나 또는 에탄올로부터 생산될 수 있다. 후자의 경우에, 두 상이한 공정이 사용중에 있다. 1-단계 공정의 경우, 금속 산화물 촉매상 400 내지 450℃에서 에탄올을 부타디엔, 수소와 물로 전환시킨다 (Kirshenbaum, I. (1978), Butadiene. In M. Grayson (Ed.), Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd ed., vol. 4, pp. 313-337. New York: John Wiley & Sons). 2-단계 공정의 경우, 에탄올을 아세트알데히드로 산화시키고 이는 탄탈-촉진 다공성 실리카 촉매상 325 내지 350℃에서 부가적인 에탄올과 반응하여 부타디엔을 산출한다 (Kirshenbaum, I. (1978), loc cit.). 부타디엔은 또한 직쇄 부텐의 촉매 탈수소화에 의하여 생산될 수 있다.
지난 20년 동안, 유전자 조작 기술은 미생물의 대사 변형과, 따라서 그렇게 변형하지 않으면 그들 미생물은 낮은 수율로 생산하게 되는 핵심 물질 생산에 그들의 사용을 가능케해 주었다. 자연발생 대사 경로를 증진시킴으로써, 이들 기술은 산업상 타당성이 있는 다수 화합물의 생물학적 생산을 위한 새로운 길을 열어준다. 몇몇 공업용 화합물, 예컨대 동물 사료용 아미노산, 생분해성 플라스틱 또는 직물 섬유는 현재 유전자 변형 생물을 이용하여 일상적으로 생산되고 있다.
전술한 화합물을 생산하기 위한 환경친화적이고, 비용 효과적이며 간단한 방법을 제공할 필요성이 여전히 존재한다.
본 출원은 특허청구범위에서 특정되는 바와 같은 실시양태의 제공에 의하여 이러한 필요성을 역점을 두어 다룬다.
본 발명은 경질 알켄올의 전환에 기초한, 특히 경질 알켄올의 효소 탈수에 의한 휘발성 디엔 화합물, 특히 공액 디엔, 예컨대 1,3-디엔의 합성을 위한 신규 생체촉매의 설계에 기반한다. 본 발명은 상기 전환이 탈수 반응을 촉매하는 효소를 사용하여 생물학적으로 수행될 수 있다는 증명에 기반한다. 본 발명은 시험관내에서, 무세포 시스템에서, 또는 생물, 특히 미생물을 사용하여 이행될 수 있다. 본 발명은 또한 탄소원, 및 특히 탄수화물 (특히 글루코스), 폴리올 (특히 글리세롤), 생분해성 폴리머 (특히 전분, 셀룰로스, 폴리-3-히드록시알케노에이트)로부터 공액 디엔, 예컨대 1,3-디엔의 생산에 관한 것이며, 탄소원은 미생물에 의하여 경질 알켄올로 전환되고 이는 이어서 공액 디엔, 예컨대 1,3-디엔으로 전환된다.
보다 구체적으로, 본 발명은 알켄올 데히드라타제를 사용하여 화학식 CnH2nO에 대응하는 화합물을 CnH2n -2 + H2O (여기서, 3 < n < 7)로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 공액 디엔을 생산하는 방법에 관한 것이다. 전환은 탈수이다.
화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물은 본 발명과 관련하여 경질 알켄올로서 호칭된다.
한 바람직한 실시양태에서, n은 4이다. 이 경우에, 본 발명에 따른 방법에 기질로서 사용될 경질 알켄올은 화학식 C4H8O에 대응한다. 당해 화학식에 대응하는 화합물은 부트-2-엔-1-올 (크로틸 알콜), 부트-3-엔-2-올 및 부트-3-엔-1-올 (이소크로틸 알콜)이다. 본 발명의 방법에 따른 이들 화합물의 전환으로부터 생기는 디엔은 부타디엔이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에 기질로서 사용되는 경질 알켄올은 부트-2-엔-1-올 (크로틸 알콜) 또는 부트-3-엔-2-올이고, 생산된 디엔은 부타디엔이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, n은 5이다. 이 경우에, 본 발명에 따른 방법에 기질로서 사용될 경질 알켄올은 화학식 C5H10O에 대응한다. 당해 화학식에 대응하는 화합물은 2-메틸부트-2-엔-1-올, 3-메틸부트-2-엔-1-올 (프레놀), 3-메틸부트-3-엔-2-올, 2-메틸부트-3-엔-2-올, 2-메틸부트-3-엔-1-올 및 3-메틸부트-3-엔-1-올 (이소프레놀)이다. 본 발명의 방법에 따른 이들 화합물의 전환으로부터 생기는 디엔은 이소프렌이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에 기질로서 사용되는 경질 알켄올은 2-메틸부트-2-엔-1-올, 3-메틸부트-2-엔-1-올 (프레놀), 3-메틸부트-3-엔-2-올, 2-메틸부트-3-엔-2-올 또는 3-메틸부트-3-엔-1-올 (이소프레놀)이고, 생산된 디엔은 이소프렌이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에 기질로서 사용되는 경질 알켄올은 3-메틸부트-2-엔-1-올 (프레놀), 3-메틸부트-3-엔-2-올, 2-메틸부트-3-엔-2-올 또는 3-메틸부트-3-엔-1-올 (이소프레놀)이고, 생산된 디엔은 이소프렌이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에 기질로서 사용되는 경질 알켄올은 3-메틸부트-2-엔-1-올 (프레놀) 또는 2-메틸부트-3-엔-2-올이고, 생산된 디엔은 이소프렌이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, n은 6이다. 이 경우에, 본 발명에 따른 방법에 기질로서 사용될 경질 알켄올은 화학식 C6H12O에 대응한다. 당해 화학식에 대응하는 화합물은 2,3-디메틸부트-2-엔-1-올, 2,3-디메틸부트-3-엔-2-올 및 2,3-디메틸부트-3-엔-1-올이다. 본 발명의 방법에 따른 이들 화합물의 전환으로부터 생기는 디엔은 디메틸부타디엔이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에 기질로서 사용되는 경질 알켄올은 2,3-디메틸부트-2-엔-1-올 또는 2,3-디메틸부트-3-엔-2-올이고, 생산된 디엔은 디메틸부타디엔이다.
화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물은 3개 군, 즉 하기로 세분될 수 있다:
(i) 화학식 I의 1급 알릴 알콜 (PRA):
<화학식 I>
(ii) 화학식 II의 2급 또는 3급 알릴 알콜 (STA):
<화학식 II>
및
(iii) 화학식 III의 1급 호모알릴 알콜 (PHA):
<화학식 III>
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 및 CH3으로부터 선택된다.
한 바람직한 실시양태에서, 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물은 화학식 I의 1급 알릴 알콜 (PRA)이다:
<화학식 I>
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 및 CH3으로부터 선택된다. 당해 화학식에 대응하는 화합물은 부트-2-엔-1-올 (크로틸 알콜), 2-메틸부트-2-엔-1-올, 3-메틸부트-2-엔-1-올 (프레놀) 및 2,3-디메틸부트-2-엔-1-올이다 (도 1 참조). 한 바람직한 실시양태에서, 1급 알릴 알콜은 부트-2-엔-1-올 (크로틸 알콜)이고, 생산된 디엔은 부타디엔이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 1급 알릴 알콜은 3-메틸부트-2-엔-1-올 (프레놀)이고, 생산된 디엔은 이소프렌이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물은 화학식 II의 2급 또는 3급 알릴 알콜 (STA)이다:
<화학식 II>
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 및 CH3으로부터 선택된다. 당해 화학식에 대응하는 화합물은 부트-3-엔-2-올, 3-메틸부트-3-엔-2-올, 2-메틸부트-3-엔-2-올 및 2,3-디메틸부트-3-엔-2-올이다 (도 2 참조).
한 바람직한 실시양태에서, STA는 부트-3-엔-2-올이고, 생산된 디엔은 부타디엔이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, STA는 2-메틸부트-3-엔-2-올이고, 생산된 디엔은 이소프렌이다.
추가 바람직한 실시양태에서, 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물은 화학식 III의 1급 호모알릴 알콜 (PHA)이다:
<화학식 III>
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 및 CH3으로부터 선택된다. 당해 화학식에 대응하는 화합물은 부트-3-엔-1-올 (이소크로틸 알콜), 2-메틸부트-3-엔-1-올, 3-메틸부트-3-엔-1-올 (이소프레놀) 및 2,3-디메틸부트-3-엔-1-올이다 (도 3 참조). 한 바람직한 실시양태에서, 호모알릴 알콜은 3-메틸부트-3-엔-1-올 (이소프레놀)이고, 생산된 디엔은 이소프렌이다.
도 4는 전술한 PRA, PHA 및 STA 화합물의 본 발명의 방법에 따른 공액 디엔으로의 전환에 대한 도식적인 개관을 제공한다.
본 발명과 관련하여 예를 들어 sp2 C=C 이중 결합에서의 Z/E 반전 때문에 또는 키랄 sp3 C 중심에서의 R/S 반전 때문에 입체이성질체가 존재하는 화합물이 언급되는 경우, 그러한 화합물에 대한 언급에는 모든 이들 입체이성질체가 포함된다. 예를 들어, 부트-2-엔-1-올 (크로틸 알콜)의 언급은 시스 (Z) 및 트랜스 (E) 입체이성질체를 말한다. 마찬가지로, 2-메틸부트-2-엔-1-올의 언급은 시스 (Z) 및 트랜스 (E) 입체이성질체를 말한다. 또한, 부트-3-엔-2-올의 언급, 3-메틸부트-3-엔-2-올의 언급, 2-메틸부트-3-엔-1-올의 언급 또는 2,3-디메틸부트-3-엔-1-올의 언급은 R 및 S 이성질체 양쪽 모두를 말한다.
한 바람직한 실시양태에서, 부트-2-엔-1-올 (크로틸 알콜)의 언급은 시스 (Z) 입체이성질체를 말한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 부트-2-엔-1-올 (크로틸 알콜)의 언급은 트랜스 (E) 입체이성질체를 말한다. 또 다른 실시양태에서, 부트-2-엔-1-올 (크로틸 알콜)의 언급은 양쪽 입체이성질체 모두를 포함하는 혼합물을 말한다. 이들 중 어느 것이 본 발명에 따른 방법에 기질로서 사용되는 경우, 생성물은 부타디엔이다.
한 바람직한 실시양태에서, 2-메틸부트-2-엔-1-올의 언급은 시스 (Z) 입체이성질체를 말한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 2-메틸부트-2-엔-1-올의 언급은 트랜스 (E) 입체이성질체를 말한다. 또 다른 실시양태에서, 부트-2-메틸부트-2-엔-1-올의 언급은 양쪽 입체이성질체 모두를 포함하는 혼합물을 말한다. 이들 중 어느 것이 본 발명에 따른 방법에 기질로서 사용되는 경우, 생성물은 이소프렌이다.
한 바람직한 실시양태에서, 부트-3-엔-2-올의 언급은 R 이성질체를 말한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 부트-3-엔-2-올의 언급은 S 이성질체를 말한다. 또 다른 실시양태에서, 부트-3-엔-2-올의 언급은 양쪽 이성질체 모두를 포함하는 혼합물을 말한다. 이들 중 어느 것이 본 발명에 따른 방법에 기질로서 사용되는 경우, 생성물은 부타디엔이다.
한 바람직한 실시양태에서, 3-메틸부트-3-엔-2-올의 언급은 R 이성질체를 말한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 3-메틸부트-3-엔-2-올의 언급은 S 이성질체를 말한다. 또 다른 실시양태에서, 3-메틸부트-3-엔-2-올의 언급은 양쪽 이성질체 모두를 포함하는 혼합물을 말한다. 이들 중 어느 것이 본 발명에 따른 방법에 기질로서 사용되는 경우, 생성물은 이소프렌이다.
한 바람직한 실시양태에서, 2-메틸부트-3-엔-1-올의 언급은 R 이성질체를 말한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 2-메틸부트-3-엔-1-올의 언급은 S 이성질체를 말한다. 또 다른 실시양태에서, 2-메틸부트-3-엔-1-올의 언급은 양쪽 이성질체 모두를 포함하는 혼합물을 말한다. 이들 중 어느 것이 본 발명에 따른 방법에 기질로서 사용되는 경우, 생성물은 이소프렌이다.
한 바람직한 실시양태에서, 2,3-디메틸부트-3-엔-1-올의 언급은 R 이성질체를 말한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 2,3-디메틸부트-3-엔-1-올의 언급은 S 이성질체를 말한다. 또 다른 실시양태에서, 2,3-디메틸부트-3-엔-1-올의 언급은 양쪽 이성질체 모두를 포함하는 혼합물을 말한다. 이들 중 어느 것이 본 발명에 따른 방법에 기질로서 사용되는 경우, 생성물은 디메틸부타디엔이다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 화학식 CnH2nO에 대응하는 화합물의 CnH2n -2 + H2O (여기서, 3 < n < 7)로의 전환이 알켄올 데히드라타제를 사용하여 달성됨을 특징으로 한다. 알켄올 데히드라타제는 알켄올을 탈수시킬 수 있는 효소이며, 바람직하게는 그는 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 적어도 1종 화합물을 탈수시킬 수 있는 효소이며, 여기에서 반응의 생성물은 CnH2n -2 + H2O이다. 당해 활성은 첨부된 실시예에 기재된 바와 같은 검정으로 측정될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 사용될 알켄올 데히드라타제의 일례는 "리나로올 데히드라타제-이소머라제" (EC 4.2.1.127)로 지칭되고 있으며 캐스텔라니엘라 데프라그란스(Castellaniella defragrans) (구 "알칼리진스 데프라그란스(Alcaligenes defragrans)) 균주 65Phen에서 동정된 알켄올 데히드라타제이다 (Brodkorb et al., J. Biol. Chem. 285 (2010), 30436-30442). 리나로올 데히드라타제-이소머라제는 모노테르펜의 혐기성 분해에 관여되는 이기능성 효소이다. 천연 효소는 160 kDa의 분자량을 가지는 것으로 밝혀졌으며 40 kDa 서브유닛의 호모사량체인 것으로 추측된다. 그 효소는 열역학적 구동력에 따라 시험관내 두 반응을 양쪽 방향 모두로 촉매한다. 한편, 그 효소는 1급 알릴 알콜 제라니올의 3급 알릴 알콜 모티프를 담지하고 있는 그의 입체이성질체 리나로올로의 이성질체화를 촉매한다. 다른 한편, 그 효소는 3급 알콜 리나로올로부터 공액 디엔 모티프를 담지하는 분자인 상응하는 비-시클릭 모노테르펜 베타-미르센으로의 수분 탈퇴 (탈수)를 촉매한다. 도 5는 혐기성 조건하에 시험관내에서 리나로올 데히드라타제-이소머라제에 의하여 촉매되는 반응의 개관을 도시한다. 캐스텔라니엘라 데프라그란스에서, 그 단백질은 막을 통한 수송 후에 절단되는 주변세포질 위치선정을 위한 신호 펩티드를 갖는 전구체 단백질로서 발현된다. 그 효소는 EC 4.2.1.127로서 분류된다. 리나로올 데히드라타제-이소머라제는 혐기성 조건하에서의 하기 반응 촉매능을 보유한다:
리나로올 < = > 미르센 + H2O
당해 활성은 예를 들어 문헌 [Brodkorb et al. (loc. cit.)]에 기재된 바와 같은 검정으로 측정될 수 있다. 그러한 검정에서는, 바이알을 35℃에서 예열하고, 무산소성 단백질 용액을 바이알중으로 옮긴 다음 DTT를 2 mM가 되도록 첨가한다. 반응 혼합물을 부틸 격막으로 밀봉하고 헤드스페이스(headspace)를 CO2/N2 (10/90 (v/v))로 플러싱한다. 반응은 특유한 농도의 리나로올을 첨가함으로써 개시한 다음 35℃에서 인큐베이션한다. 리나로올의 미르센으로의 전환은 예를 들어 기체 크로마토그래피에 의하여 미르센의 생산을 조사함으로써 평가된다.
바람직한 실시양태에서, 리나로올 데히드라타제-이소머라제는 또한 혐기성 조건하에서의 제라니올의 리나로올로의 이성질체화 촉매능을 보유한다:
제라니올 < = > 리나로올
당해 활성은 예를 들어 문헌 [Brodkorb et al. (loc. cit.)]에 기재된 바와 같은 검정으로 측정될 수 있다. 그러한 검정에서는, 바이알을 35℃에서 예열하고, 무산소성 단백질 용액을 바이알중으로 옮긴 다음, DTT를 2 mM가 되도록 첨가한다. 반응 혼합물을 부틸 격막으로 밀봉한 다음 헤드스페이스를 CO2/N2 (10/90 (v/v))로 플러싱한다. 반응은 특유한 농도의 제라니올을 첨가함으로써 개시한 다음 35℃에서 인큐베이션한다. 제라니올의 리나로올로의 전환은 미르센, 즉 효소에 의하여 촉매된 2차 반응의 생성물의 생산을 예를 들어 기체 크로마토그래피에 의하여 조사함으로써 평가된다.
제라니올, 리나로올 및 미르센은 식물에 의하여 생산되는 비-시클릭 C10-테르페노이드이며, 각각 알릴 알콜 및 탄화수소의 부류에 속한다. 문헌 [Lueddecke and Harder (Z. Naturforsch. 66c (2011), 409-412]에서는 리나로올 데히드라타제-이소머라제의 높은 기질 특이성에 관하여 보고하였다. 본 발명자들은 본 발명에 이르러 놀랍게도 리나로올 데히드라타제-이소머라제가 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)의 화합물에 작용할 수 있고, 그들을 공액 디엔으로 전환시킬 수 있음을 발견하였다. 첨부된 실시예에서, 이러한 발견은 부트-2-엔-1-올 (크로틸 알콜)의 부타디엔으로의 전환, 부트-3-엔-2-올의 부타디엔으로의 전환, 3-메틸부트-2-엔-1-올 (프레놀)의 이소프렌으로의 전환, 3-메틸부트-3-엔-1-올 (이소프레놀)의 이소프렌으로의 전환 및 2-메틸부트-3-엔-2-올의 이소프렌으로의 전환에 대하여 제시된다. 따라서, 본 발명자들은 리나로올 데히드라타제-이소머라제가 예기치 않게도 보고된 높은 기질 특이성에도 불구하고 그의 천연 기질보다 훨씬 더 짧은 알켄올을 또한 전환시킬 수 있음을 보여줄 수 있었다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 알켄올 데히드라타제는 리나로올 데히드라타제 (EC 4.2.1.127)이다.
본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 알켄올 데히드라타제의 서열의 일례가 서열 1에 주어져 있다 (도 6). 알켄올 데히드라타제에 대한 서열은 또한 UniProtKB/TrEMBL 데이터베이스에서 수탁번호 E1XUJ2하에 이용할 수 있다. 이들 서열은 리나로올 데히드라타제-이소머라제로서 분류되는 알켄올 데히드라타제를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 서열 1에 나타낸 아미노산 서열 또는 서열 1과 적어도 x% 동일한 서열을 포함하고 화학식 CnH2nO에 대응하는 화합물의 CnH2n -2 + H2O (여기서, 3 < n < 7)로의 전환을 촉매할 수 있으며, x는 30 내지 100의 정수, 바람직하게는 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99인 알켄올 데히드라타제를 사용한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "알켄올 데히드라타제"는 따라서 서열 1과 전술한 정도의 서열 동일성을 보이고 화학식 CnH2nO에 대응하는 화합물의 CnH2n -2 + H2O (여기서, 3 < n < 7)로의 전환을 촉매할 수 있는 효소를 말한다. 서열 1의 서열 또는 상응하는 코딩 뉴클레오티드 서열을 사용함으로써, 통상의 기술자는 전술한 전환을 촉매할 수 있는 추가 알켄올 데히드라타제를 동정하는 것이 가능하다.
알켄올 데히드라타제의, 예를 들어 리나로올 데히드라타제 (EC 4.2.1.127)의 그러한 변이체는 이하에서 좀더 상세히 기재되는 바와 같이 N- 또는 C-말단에, 바람직하게는 C-말단에 결실을 보이는 단축된 변형체를 또한 포괄한다. 첨부된 실시예는 그러한 절단 변형체가 전술한 전환 촉매능을 유지함을 보여준다.
바람직하게는, 동일성의 정도는 각 서열을 서열 1의 아미노산 서열과 비교함으로써 측정된다. 비교되는 서열이 동일한 길이를 갖지 않는 경우, 동일성의 정도는 바람직하게는 보다 긴 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 보다 짧은 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율을 말하거나 또는 보다 짧은 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 보다 긴 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율을 말한다. 서열 동일성의 정도는 바람직하게는 적합한 컴퓨터 알고리즘, 예컨대 클루스탈(CLUSTAL)을 사용하여 관련 기술분야 주지의 방법에 따라 측정될 수 있다.
클루스탈 분석 방법을 사용하여 특정 서열이 예를 들어 기준 서열과 80% 동일한지를 측정하는 경우, 디폴트 세팅이 사용될 수 있거나 또는 세팅은 바람직하게는 다음과 같다: 매트릭스: 블로섬(blosum) 30; 오픈 갭 페널티: 10.0; 신장 갭 페널티: 0.05; 지연 발산: 40; 갭 분리 거리: 아미노산 서열의 비교의 경우 8. 뉴클레오티드 서열 비교의 경우, 신장 갭 페널티는 바람직하게는 5.0으로 설정된다.
바람직하게는, 동일성의 정도는 서열의 완전한 길이에 대해서 계산된다.
또한, 용어 "상동성"이 본 발명과 관련하여 사용되는 경우, 당해 용어는 바람직하게는 "서열 동일성"을 의미한다.
전술한 바와 같이, 캐스텔라니엘라 데프라그란스 (구 "알칼리진스 데프라그란스")에서 동정된 "리나로올 데히드라타제-이소머라제"로서 호칭되는 알켄올 데히드라타제는 주변세포질 공간으로의 수송을 보장해주는 신호 펩티드를 보유한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 그러한 신호 서열을 보이지 않는 효소를 이용한다. 실시예에서는 his-태그의 삽입에 의한 신호 펩티드의 붕괴는 이. 콜라이에서 효소의 발현을 방해하지 않으며 활성 단백질의 세포내 생산으로 인도함을 보여준다.
본 발명에 따른 공정에 사용되는 리나로올 데히드라타제-이소머라제와 같은 알켄올 데히드라타제는 자연발생 알켄올 데히드라타제일 수 있거나 또는 예를 들어, 예를 들어 효소 활성, 안정성, 특히 열 안정성 등을 변경하거나 또는 개선하는 돌연변이 또는 다른 변경의 도입에 의하여 리나로올 데히드라타제-이소머라제와 같은 자연발생 알켄올 데히드라타제로부터 유래되는 알켄올 데히드라타제일 수 있다.
첨부된 실시예는 리나로올 데히드라타제 (EC 4.2.1.127)의 절단 변형체, 바람직하게는 C-말단에 결실을 보이는 절단 변형체가 전술한 전환을 효율적으로 촉매할 수 있음을 또한 보여준다. 따라서, 용어 "알켄올 데히드라타제"는 결실, 특히 C-말단에서의 결실에 의하여 알켄올 데히드라타제, 예컨대 리나로올 데히드라타제 (EC 4.2.1.127)로부터 유래되는 효소를 또한 포괄한다. 보다 바람직하게는, "알켄올 데히드라타제"는 C-말단으로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산 잔기의 결실에 의하여 서열 1에 서술된 바와 같은 아미노산 서열을 보이는 효소로부터 유래되는 효소이다.
본 출원과 관련하여 용어 "리나로올 데히드라타제-이소머라제" 또는 "리나로올 데히드라타제-이소머라제의 활성을 보유한 단백질/효소"는 리나로올 데히드라타제-이소머라제로부터 유래되고, 화학식 CnH2nO에 대응하는 화합물의 CnH2n -2 + H2O (여기서, 3 < n < 7)로의 전환을 촉매할 수 있지만, 그들의 천연 기질, 즉 제라니올, 리나로올 및/또는 미르센에 대한 낮은 친화도를 보유할 뿐이거나, 또는 더 이상 그들의 천연 기질을 받아들이지 않는 효소를 또한 포괄한다. 바람직한 기질의 그러한 변형은 화학식 CnH2nO에 대응하는 화합물의 CnH2n -2 + H2O (여기서, 3 < n < 7)로의 전환을 향상시키고, 어쩌면 발생할지도 모르는 불필요한 부산물의 생산을 감소시키도록 해준다. 단백질의 목적하는 효소 활성을 변형 및/또는 개선하는 방법은 통상의 기술자에게 주지이며, 예를 들어 무작위 돌연변이유발 또는 부위-특이적 돌연변이유발 및 소위 "지향 진화", DNA 셔플링 또는 생체내 진화의 목적하는 특성 또는 접근법을 보유한 효소의 후속 선택을 포함한다.
예를 들어, 원핵동물 세포에서의 유전자 조작을 위해서는, 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 코딩하는 핵산 분자를 DNA 서열의 재조합에 의하여 돌연변이유발 또는 서열 변형을 가능케 해주는 플라스미드중으로 도입시킬 수 있다. 표준 방법 (문헌 [Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA] 참조)은 염기 교환이 수행되도록 또는 천연 또는 합성 서열이 첨가되도록 해준다. DNA 단편은 어댑터와 링커를 단편에 적용함으로써 서로 연결시킬 수 있다. 또한, 적합한 제한 부위를 제공하거나 또는 잉여 DNA 또는 제한 부위를 제거하는 조작 수단이 사용될 수 있다. 삽입, 결실 또는 치환이 가능한 그런 경우에, 시험관내 돌연변이유발, "프라이머 수선", 제한 또는 라이게이션이 이용될 수 있다. 일반적으로, 서열 분석, 제한 분석 및 생화학과 분자 생물학의 그 밖의 방법이 분석 방법으로서 수행된다. 생성되는 리나로올 데히드라타제-이소머라제 변이체는 이어서 그들의 효소 활성에 대하여 및 특히 기질로서 예를 들어 제라니올, 리나로올 및/또는 미르센보다는 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물을 선호하는 그들의 능력에 대하여 시험된다.
공액 디엔 화합물의 생산에 관해서 향상된 효소 특성을 지닌 변이체를 동정하기 위한 그러한 방법은 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물이 천연 기질보다 짧다는 사실에 기인하여 효소의 촉매 부위에서 입체적 및/또는 전자적 상보를 가능케 해주는 보조인자의 존재하에서 또한 수행될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 알켄올 데히드라타제는 높은 열 안정성을 보인다. 그러한 효소는 예를 들어 알켄올 데히드라타제를 코딩하는 핵산 서열을 무작위로 돌연변이시킨 다음 수득된 돌연변이체를 보다 높은 열 안정성에 대하여 스크리닝하는 것을 수반하는 일상적인 방법에 의하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 알켄올 데히드라타제는 68℃ 이상의 온도에서 안정하고 효소 활성이 있다. 디메틸부타디엔의 비등점이 대기압에서 68℃이므로, 68℃ 이상의 온도에서 그러한 효소를 사용하고 본 발명에 따른 방법을 수행하는 것은 디메틸부타디엔이 반응으로부터 탈기되고 기체상으로부터 용이하게 회수될 수 있다는 이점이 있다.
알켄올 데히드라타제의 변형된 변형체, 예를 들어 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물을 기질로서 받아들이거나 또는 선호하지만, 그의 천연 기질에 대한 낮은 친화도를 보유하거나 또는 그의 천연 기질을 더 이상 받아들이지 않는 변이체 또는 보다 높은 열 안정성을 보유한 변이체는 자연발생 알켄올 데히드라타제, 예컨대 리나로올 데히드라타제-이소머라제로부터, 또는 이미 변형된, 최적화된 또는 합성 제조된 알켄올 데히드라타제로부터 유래될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 시험관내에서, 예를 들어 단리된 효소의 존재하에서 또는 효소 또는 부분 정제된 효소 제제를 포함하는 세포 용해물의 존재하에서 수행될 수 있다. 시험관내에서는 바람직하게는 무세포 시스템에서를 의미한다.
한 실시양태에서, 방법에 사용되는 효소는 정제된 형태로 사용되어 화학식 CnH2nO에 대응하는 화합물을 CnH2n -2 + H2O (여기서, 3 < n < 7)로 전환시킨다. 그러나, 그러한 방법은 효소와 기질 생산 및 정제 비용이 높으므로 비용이 많이 소요될 수 있다.
따라서, 또 다른 바람직한 실시양태에서, 방법에 사용되는 효소는 단백질 정제 비용을 절약하기 위하여 반응에 비-정제 추출물로서, 또는 그렇지 않으면 비-용해 박테리아의 형태로 존재한다. 그러나, 그러한 방법과 관련된 비용은 기질의 생산 및 정제 비용에 기인하여 여전히 상당히 높을 수 있다.
시험관내 반응에서는, 천연 또는 재조합의 정제되거나 또는 정제되지 않은 효소를 효소가 활성이도록 해주는 물리화학적 조건하에 기질의 존재하에서 인큐베이션하며, 인큐베이션은 디엔의 생산을 가능케 해주는 충분한 기간 동안 진행시킨다. 인큐베이션의 말기에, 통상의 기술자에게 알려져 있는 임의 검출 시스템, 예컨대 그러한 화합물의 형성을 측정하기 위한 기체 크로마토그래피 또는 비색분석 시험을 사용하여 디엔 화합물의 존재를 임의로 측정한다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 방법은 시험관내에서 수행되며 효소는 고정화된다. 상이한 지지체상에 효소를 고정화하는 수단 및 방법은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 배양으로, 그 효소를 생산하는 생물, 바람직하게는 미생물의 존재하에서 수행된다. 따라서, 본 발명의 그러한 실시양태에서, 알켄올 데히드라타제, 예컨대 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 생산하는 생물, 바람직하게는 미생물이 사용된다. 바람직한 실시양태에서, (미)생물은 숙주에 의하여 생산되는 효소가 생산 숙주에 관하여 이종이라는 점에서 재조합성이다. 방법은 따라서 효소를 분리하거나 또는 정제할 필요 없이 배양 배지에서 직접 수행될 수 있다. 특히 유리한 방식에서는, 용액에 존재하는 탄소원으로부터 직접 디엔 화합물을 생산하도록, 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물을 내생적으로 생산하고, 또한 천연 또는 변형된 알켄올 데히드라타제, 예컨대 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 발현 또는 과발현하는 천연 또는 인공 특성을 보유하는 (미)생물이 사용된다.
예를 들어, 본 발명에 따른 방법은 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물을 생산하는 미생물을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Perez et al. (Phytochemistry 19 (1980), 183-187)]에서는 알릴릭 포스페이트를 가수분해할 수 있는 시트루스 시넨시스(Citrus sinensis)로부터의 효소, 예를 들어 프레놀 디포스페이트를 프레놀과 디포스페이트로 전환시킬 수 있는 프레닐 디포스파타제 (EC 3.1.7.1)를 기재하고 있다. 그러한 효소를 코딩하는 핵산 서열은 프레놀을 생산할 수 있도록 상응하는 기질을 생산하는 미생물중으로 도입시킬 수 있다. 또한, 문헌 [Withers et al. (Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007), 6277-6283)]에서는 예를 들어 메발로네이트-기반 이소펜테닐 피로포스페이트 생합성 경로가 조작되고 또한 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 6,051의 nudF 유전자를 발현한 이. 콜라이 세포를 기재하였다. nudF 유전자에 의하여 코딩된 단백질은 프레닐 디포스페이트 전구체에 직접 작용하고 이소펜테놀 (이소프레놀)의 생산으로 인도한다.
따라서, 본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서, 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물을 생산할 수 있고, 알켄올 데히드라타제를 (과)발현하도록 유전자 조작된 미생물을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 알켄올 데히드라타제는 바람직하게는 숙주 미생물과는 상이한 생물에서 기원한다. 유전자 변형은 예를 들어 염색체중으로 알켄올 데히드라타제를 코딩하는 상응하는 유전자의 통합, 효소-코딩 서열의 상류에 프로모터를 함유하는 플라스미드로부터 효소의 발현, (프로모터 및 코딩 서열은 바람직하게는 상이한 생물에서 기원한다), 또는 통상의 기술자에게 알려져 있는 여타 방법에 있을 수 있다. 대안적으로, 다른 박테리아 또는 효모가 특이적인 이점이 있을 수 있고 선택될 수 있다. 예를 들어, 효모, 예컨대 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 호극한성 박테리아, 예컨대 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 또는 클로스트리디아에(Clostridiae) 과로부터의 혐기성 박테리아, 미세조류, 또는 광합성 박테리아가 사용될 수 있다.
화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물의 합성을 담당하는 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하고, 이들 유전자를 또 다른 생물, 특히 미생물, 예컨대 예를 들어 이. 콜라이, 사카로미세스 또는 피키아(Pichia), 호극한성 박테리아, 예컨대 서무스 서모필루스, 또는 클로스트리디아에 과로부터의 혐기성 박테리아, 미세조류, 또는 광합성 박테리아중으로 도입시키는 것 또한 생각할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 (미)생물은 알켄올 데히드라타제를 코딩하는 핵산 분자를 함유하도록 유전자 변형되는 (미)생물이다. 전술한 바와 같은 알켄올 데히드라타제를 코딩하는 그러한 핵산 분자는 단독으로 또는 벡터의 일부로서 사용될 수 있다. 핵산 분자는 핵산 분자에 포함된 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서 전역에 걸쳐 사용되는 용어 "작동적으로 연결된" 또는 "작동가능하게 연결된"은 발현이 발현 제어 서열과 양립하는 조건하에서 달성되도록 하는 방식으로 1종 이상 발현 제어 서열과 발현시킬 폴리뉴클레오티드내 코딩 영역간의 결합을 말한다.
발현은 이종 DNA 서열에서 바람직하게는 번역가능한 mRNA로의 전사를 포함한다. 박테리아에서뿐만 아니라 진균에서도 발현을 보장해주는 조절 요소는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 그들은 프로모터, 인핸서, 종결 신호, 표적화 신호 등을 포함한다. 벡터에 관한 설명과 관련하여 예를 이하에 추가로 제공한다.
핵산 분자와 관련하여 사용하기 위한 프로모터는 그의 기원에 관하여 및/또는 발현시킬 유전자에 관하여 동종 또는 이종일 수 있다. 적합한 프로모터는 예를 들어 구성적 발현에 적합한 프로모터이다. 그러나, 외부 영향에 의하여 결정되는 시점에서 오로지 활성화되는 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 인공 및/또는 화학적 유도성 프로모터가 이에 관련해서 사용될 수 있다.
벡터는 벡터에 함유된 상기 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이들 발현 제어 서열은 박테리아 또는 진균에서 번역가능한 RNA의 전사 및 합성을 보장해주기에 적당할 수 있다.
또한, 분자 생물학에서 통상적인 방법 (예를 들어, 문헌 [Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA] 참조)에 의하여 상이한 돌연변이를 폴리뉴클레오티드중으로 삽입시키는 것이 가능하며, 그에 따라 변형된 생물학적 특성을 아마도 보유하는 폴리펩티드의 합성으로 인도된다. 예를 들어 아미노산 서열의 변형이 폴리펩티드의 생물학적 활성 또는 조절에 영향을 미치는 위치에서 점 돌연변이의 도입을 생각할 수 있다.
또한, 변형된 기질 또는 생성물 특이성을 소유하는 돌연변이체가 제조될 수 있다. 바람직하게는, 그러한 돌연변이체는 증가한 활성을 나타낸다. 또한, 상기 정의한 바와 같은 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드중으로의 돌연변이 도입은 유전자 발현율 및/또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩된 효소의 활성을 예를 들어 열 안정성의 점에서 최적화되도록 해준다.
박테리아 또는 진균을 유전자 변형시키기 위해서는, 상기 정의한 바와 같은 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이들 분자의 일부를 DNA 서열의 재조합에 의한 돌연변이유발 또는 서열 변형을 허용하는 플라스미드중으로 도입시킬 수 있다. 표준 방법 (문헌 [Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA] 참조)은 염기 교환이 수행되도록 또는 천연 또는 합성 서열이 첨가되도록 해준다. DNA 단편은 어댑터와 링커를 단편에 적용함으로써 서로 연결시킬 수 있다. 또한, 적합한 제한 부위를 제공하거나 또는 잉여 DNA 또는 제한 부위를 제거하는 조작 수단이 사용될 수 있다. 삽입, 결실 또는 치환이 가능한 그런 경우에, 시험관내 돌연변이유발, "프라이머 수선", 제한 또는 라이게이션이 이용될 수 있다. 일반적으로, 서열 분석, 제한 분석 및 생화학과 분자 생물학의 그 밖의 방법이 분석 방법으로서 수행된다.
(미)생물중으로 도입된 폴리뉴클레오티드는 전술한 활성을 보유한 폴리펩티드의 생산으로 인도하도록 발현된다. 상이한 발현 시스템의 개관은 예를 들어 다음에 실려있다: 문헌 [Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544) 및 Sawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9), Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4), Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463), Griffiths et al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440)]. 효모 발현 시스템의 개관은 예를 들어 다음에 의하여 주어진다: 문헌 [Hensing et al. (Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261-279), Bussineau et al. (Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13-19), Gellissen et al. (Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79-93, Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486-496), Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742-745) 및 Buckholz (Bio/Technology 9 (1991), 1067-1072)].
발현벡터는 문헌에 널리 기재되어 있다. 대체로, 그들은 선택 마커 유전자 및 선택된 숙주에서의 복제를 보장해주는 복제 기원뿐만 아니라 박테리아 또는 바이러스 프로모터, 그리고 대부분의 경우에 전사에 대한 종결 신호를 함유한다. 프로모터와 종결 신호 사이에는 일반적으로 적어도 하나의 제한 부위 또는 코딩 DNA 서열의 삽입을 가능케 해주는 폴리링커가 존재한다. 상응하는 유전자의 전사를 태생적으로 제어하는 DNA 서열은 그것이 선택된 숙주 생물에서 활성을 띤다면 프로모터 서열로서 사용될 수 있다. 그러나, 당해 서열은 또한 다른 프로모터 서열로 교환될 수 있다. 유전자의 구성적 발현을 보장해주는 프로모터 및 유전자 발현의 의도적 제어를 가능케 해주는 유도성 프로모터를 사용하는 것이 가능하다. 이들 특성을 소유하는 박테리아 및 바이러스 프로모터 서열은 문헌에 상세히 기재되어 있다. 미생물 (예를 들어, 이. 콜라이, 에스. 세레비지아에)에서의 발현에 대한 조절 서열은 문헌에 충분히 기재되어 있다. 하류 서열의 특히 높은 발현을 가능케 해주는 프로모터는 예를 들어 T7 프로모터 (Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89), lacUV5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., in Rodriguez and Chamberlin (Eds), Promoters, Structure and Function; Praeger, New York, (1982), 462-481; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25), lp1, rac (Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100)이다. 유도성 프로모터는 바람직하게는 폴리펩티드의 합성에 사용된다. 이들 프로모터는 종종 구성적 프로모터로 달성되는 것에 비해 보다 높은 폴리펩티드 수율을 가져온다. 폴리펩티드의 최적량을 수득하기 위하여, 2단계 공정이 종종 사용된다. 첫 번째로, 숙주 세포를 최적 조건하에서 비교적 높은 세포 밀도까지 배양한다. 두 번째 단계에서, 사용되는 프로모터의 유형에 따라 전사를 유도한다. 이와 관련하여, 락토스 또는 IPTG (=이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)에 의하여 유도될 수 있는 tac 프로모터가 특히 적합하다 (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25). 전사에 대한 종결 신호 역시 문헌에 기재되어 있다.
알켄올 데히드라타제를 코딩하는 코딩 영역은 통상의 기술자에게 알려져 있는 방식으로 변형시킬 수 있다. 예를 들어 단백질의 정제를 간소화시켜 주는 태그, 예컨대 his-태그를 삽입시키는 것이 가능하다 (실시예 1 참조). 또한, 주변세포질내 국소화를 보장해주며 그에 따라 단백질로 하여금 세포내 생산되도록 해주는 효소의 신호 서열을 결실 또는 붕괴시키는 것이 또한 가능하다. 배양 배지중으로 단백질의 분비를 가능케 해주는 분비 신호를 코딩 영역에 부착시키는 것이 또한 가능하다.
알켄올 데히드라타제가 또 다른 폴리펩티드 모이어티, 예를 들어 또 다른 효소에 융합되는 융합 단백질로서 알켄올 데히드라타제를 발현시키는 것이 또한 가능하다.
숙주 세포를 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질전환시키는 것은 예를 들어 문헌 [Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990]에 기재된 바와 같은 표준 방법에 의하여 수행될 수 있다. 숙주 세포는, 특히 pH 값, 온도, 염 농도, 통기, 항생제, 비타민, 미량 원소 등에 관해서, 사용되는 특정 숙주 세포의 필수요건을 충족하는 영양 배지에서 배양시킨다.
본 발명에 사용되는 생물은 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있고, 바람직하게는 그들은 미생물이다. 본 발명과 관련하여 용어 "미생물"은 효모와 같은 진균뿐만 아니라 박테리아, 그리고 또한 조류 및 고세균을 말한다. 용어 "미생물"은 또한 식물 세포 또는 동물 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 미생물은 박테리아이다. 본 발명에 따른 공정에 사용될 바람직한 박테리아는 바실루스, 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 슈도모나스(Pseudomonas), 지모모나스(Zymomonas), 메틸로박터(Methylobacter) 또는 에스케리키아(Escherichia) 속의 박테리아이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 박테리아는 에스케리키아 속 및 한층 더 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 종에 속한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 박테리아는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 종 또는 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 종 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 종에 속한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 미생물은 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물을 내생적으로 생산하도록 변형되고 그를 상기 본원에 기재된 바와 같은 디엔 화합물로 전환시키는, 바람직하게는 에스케리키아 속의 재조합 박테리아이다.
본 발명과 관련하여 용어 "미생물"은 효모와 같은 진균뿐만 아니라 박테리아, 그리고 또한 조류와 고세균을 말한다. 한 바람직한 실시양태에서, 미생물은 박테리아이다. 원칙적으로 어떠한 박테리아도 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 공정에 사용될 바람직한 박테리아는 바실루스, 클로스트리디움, 코리네박테리움, 슈도모나스, 지모모나스 또는 에스케리키아 속의 박테리아이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 박테리아는 에스케리키아 속 및 한층 더 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 종에 속한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 박테리아는 슈도모나스 푸티다 종 또는 지모모나스 모빌리스 종 또는 코리네박테리아 글루타미쿰 종에 속한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 미생물은 진균, 보다 바람직하게는 사카로미세스, 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 아스페르길루스(Aspergillus), 트리코더마(Trichoderma), 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 또는 피키아 속의 진균 및 한층 더 바람직하게는 사카로미세스 세레비지아에, 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei), 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 종의 진균이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 미생물은 재조합 진균, 바람직하게는 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물을 생산하고, 그를 상기 본원에 기재된 바와 같은 디엔 화합물로 전환시키는 효모이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 알켄올 데히드라타제를 발현하는 광합성 미생물을 사용한다. 바람직하게는, 미생물은 광합성 박테리아, 또는 미세조류이다. 한층 더 바람직하게는, 그러한 미생물은 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물을 내생적으로 생산하는 천연 또는 인공 특성을 보유한다. 이 경우에, 미생물은 용액에 존재하는 CO2로부터 직접 디엔을 생산할 수 있을 것이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 알켄올 데히드라타제를 발현하는 다세포 생물을 사용한다. 그러한 생물에 대한 예는 식물 또는 동물이다.
한 실시양태에서, 방법은 미생물을 표준 배양 조건에서 (30-37℃, 1 atm, 박테리아의 호기성 성장을 가능케 해주는 발효조에서) 배양하는 것을 수반한다. 부타디엔 및 이소프렌은 각각 -4℃ 및 34℃의 비등점을 가지며, 배양에 34℃ 이상의 온도가 선택되면 이미 기체상태로 있게 될 것이다. 바람직한 실시양태에서, 방법은 미생물을 비-표준 조건하에서, 바람직하게는 호열성 생물의 배양 조건에 상응하도록 보다 높은 온도에서 배양하는 것을 수반한다. 당해 실시양태는 심지어는 보다 높은 비등점을 가지는 디엔, 특히 디메틸부타디엔 (68℃의 비등점)은 배양물로부터 탈기될 것이고 기체상으로부터 용이하게 수집될 수 있다는 이점이 있다. 따라서, 특히 디메틸부타디엔이 생산되는 본 발명에 따른 방법의 그런 실시양태에서, 미생물은 68℃ 이상의 온도에서 배양시킬 수 있는 호열성 미생물이다.
추가 바람직한 실시양태에서, 미생물을 사용하는 본 발명에 따른 방법은 그 미생물이 지지체상에 고정화되도록 수행된다.
추가 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 미세호기성 조건에서 수행된다. 이는 생산된 디엔 화합물을 함유하는 기체상 유출물내 잔류 산소 농도를 최소화하도록 주입된 공기의 양이 제한된다는 것을 의미한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 생산된 디엔이 반응으로부터 탈기되도록 하는 조건하에서 수행된다. 이는 반응의 열역학적 평형이 공액 디엔의 생산쪽으로 이동되는 이점이 있다. 방법은 기체상 디엔을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 방법은 반응중에 기체상 형태하의 생산된 디엔을 수집하는 시스템의 존재하에서 수행된다.
특정 실시양태에서, 방법은 기체상으로 존재하는 생산된 디엔 (부타디엔, 이소프렌 또는 디메틸부타디엔)을 검출하는 단계를 또한 포함한다. 공기 또는 또 다른 기체의 환경에서 생산될 디엔의 존재는 소량조차도 다양한 기술을 사용함으로써 및 특히 적외선 또는 화염 이온화 검출을 구비하는 기체 크로마토그래피 시스템을 사용함으로써, 또는 질량 분석법과 커플링함으로써 검출될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법과 관련하여 상기 본원에서 기재된 바와 같이 화학식 CnH2nO에 대응하는 화합물의 CnH2n -2 + H2O (여기서, 3 < n < 7)로의 전환을 위한, 알켄올 데히드라타제, 예컨대 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 생산하는 생물의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 그러한 생물은 알켄올 데히드라타제, 예컨대 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 코딩하는 적어도 1종 핵산 분자의 도입에 기인하여 유전자 변형된다는 점에서 재조합 생물이다. 바람직하게는, 그러한 핵산 분자는 생물에 관하여 이종이며, 이는 그 핵산 분자가 상기 생물에서 자연 발생하지 않는다는 것을 의미한다.
바람직한 실시양태에서, 그러한 생물은 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물을 생산하는 생물이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법과 관련하여 상기 본원에서 기재된 바와 같이 화학식 CnH2nO에 대응하는 화합물의 CnH2n -2 + H2O (여기서, 3 < n < 7)로의 전환을 위한, 알켄올 데히드라타제, 예컨대 리나로올 데히드라타제-이소머라제의 용도에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 또한 알켄올 데히드라타제 및 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물을 생산하는 생물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 알켄올 데히드라타제, 예컨대 리나로올 데히드라타제-이소머라제, 및 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
상술한 상이한 성분의 바람직한 실시양태에 관해서는, 본 발명에 따른 방법과 관련하여 상기 기재된 바와 동일하다.
<도면의 간단한 설명>
도 1은 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 1급 알릴 알콜 (PRA)을 개략적으로 도시한다. 특히 다음의 것들이 도시되어 있다:
기질 / 계통명 / 화학식 / 카테고리 / R1 / R2 / 생성물
도 2는 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 2급 및 3급 알릴 알콜 (STA)을 개략적으로 도시한다.
기질 / 계통명 / 화학식 / 카테고리 / R1 / R2 / 생성물
도 3은 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 1급 호모알릴 알콜 (PHA)을 개략적으로 도시한다.
기질 / 계통명 / 화학식 / 카테고리 / R1 / R2 / 생성물
도 4는 전술한 PRA, PHA 및 STA 화합물의 본 발명의 방법에 따른 공액 디엔으로의 전환에 대한 도식적 개관을 도시한다.
도 5는 리나로올 데히드라타제-이소머라제에 의하여 촉매된 반응의 개관을 도시한다.
도 6은 캐스텔라니엘라 데프라그란스 (구 "알칼리진스 데프라그란스")로부터의 리나로올 데히드라타제-이소머라제의 아미노산 서열을 도시한다.
도 7은 22시간 인큐베이션 후 80 mM 트랜스-크로틸 알콜로의 효소 (흑색) 및 효소-무함유 (적색) 검정에 대하여 수득된 GC/FID 크로마토그램을 도시한다.
도 8은 22시간 인큐베이션 후 80 mM 3-부텐-2-올로의 효소 (흑색) 및 효소-무함유 (적색) 검정에 대하여 수득된 GC/FID 크로마토그램을 도시한다.
도 9는 22시간 인큐베이션 후 80 mM 이소프레놀로의 효소 (흑색) 및 효소-무함유 (청색) 검정에 대하여 수득된 GC/FID 크로마토그램을 도시한다.
도 10 은 22시간 인큐베이션 후 80 mM 2-메틸-3-부텐-2-올로의 효소 (적색) 및 효소-무함유 (흑색) 검정에 대하여 수득된 GC/FID 크로마토그램을 도시한다.
도 11은 실시예 7에 기재된 바와 같은 트랜스-크로틸 알콜 농도의 범위에 대한 1,3-부타디엔 생산의 동역학을 도시한다.
도 12 는 실시예 8에 기재된 바와 같은 부트-3-엔-2-올 농도의 범위에 대한 1,3-부타디엔 생산의 동역학을 도시한다.
도 13 은 18시간 인큐베이션 후 50 mM 부트-3-엔-1-올로의 효소 (적색) 및 효소-무함유 (흑색) 검정으로부터 수득된 GC/FID 크로마토그램을 도시한다.
도 14 는 6시간 인큐베이션 후 160 mM 2-메틸부트-3-엔-2-올로의 효소 (적색) 및 효소-무함유 (흑색) 검정으로부터 수득된 전형적인 GC/FID 크로마토그램을 도시한다.
도 15는 1시간 인큐베이션 후 50 mM 3-메틸부트-3-엔-2-올로의 효소 (적색) 및 효소-무함유 (흑색) 검정으로부터 수득된 전형적인 GC/FID 크로마토그램을 도시한다.
도 16은 각각 크로틸 알콜의 1,3 부타디엔으로의 전환의 전체 반응 및 부트-3-엔-2-올의 1,3 부타디엔으로의 탈수 반응에 대한 리나로올 데히드라타제의 절단 변형체의 활성을 도시한다.
도 17은 재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제가 시스- 또는 트랜스-크로틸 알콜의 1,3-부타디엔으로의 전환을 촉매할 수 있음을 도시한다.
본 발명의 다른 측면 및 이점은 제한의 목적으로가 아니라 예증의 목적상 주어지는 하기 실시예에서 기재될 것이다.
실시예
실시예
1: 이.
콜라이에서
리나로올
데히드라타제
-이소머라제에 대한 유전자의 클로닝 및 발현
클로닝
및 박테리아 배양
이. 콜라이의 코돈 사용빈도에 맞추기 위한 올리고뉴클레오티드 연쇄에 의하여 캐스텔라니엘라 데프라그란스 (구 "알칼리진스 데프라그란스")의 게놈으로부터 추론된 리나로올 데히드라타제-이소머라제의 서열을 생성하였다. 6 히스티딘 코돈의 신장물을 메티오닌 개시 코돈 뒤에 삽입하여 정제를 위한 친화도 태그를 제공하였다. 그렇게 합성된 유전자를 pET25b(+) 발현벡터에 클로닝하였다 (벡터는 진아트 아게(GeneArt AG)에서 구축하였다). 컴피턴트 이. 콜라이 BL21(DE3) 세포 (노바젠, Novagen)를 열 쇼크 절차에 따라 당해 벡터로 형질전환시켰다. 음성 대조군으로서, 이. 콜라이 BL21(DE3) 균주를 공벡터로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 진탕하에 (160 rpm) ZYM-5052 자기-유도 배지 (Studier FW, Prot. Exp. Pur. 41 (2005), 207-234)상에서 6시간 동안 37℃에서 성장시키고, 단백질 발현을 18℃에서 밤새 지속시켰다 (대략 12시간). 세포를 4℃, 10,000 rpm에서 20분 동안 원심분리에 의하여 수집하고, 펠릿을 -80℃에서 동결시켰다.
세포
용해물의
제조
100 ml의 배양 세포로부터의 펠릿을 얼음 위에서 해동시킨 다음 4 ml의 50 mM 트리스(Tris)-HCl pH 7.5에 재현탁시켰다. 이어서 10 ㎕의 리소나제 (노바젠)를 첨가하였다. 세포를 10분 동안 실온에서 인큐베이션하고 이어서 20분 동안 얼음으로 복귀시켰다. 브래드포드법 (바이오라드, Biorad)을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다.
실시예
2: (2E)-2-
부텐
-1-올 (트랜스-
크로틸
알콜
)
로부터의
1,3-부타디엔 생산
효소 검정을 하기 조건하에서 수행하였다:
50 mM 트리스 HCl pH 7.5
2 mM D,L-디티오트레이톨
0-80 mM (2E)-2-부텐-1-올 (트랜스-크로틸 알콜)
pH를 7.5로 조정하였다.
재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 함유하는 0.25 ml의 세포 용해물을 0.5 ml의 반응 혼합물에 첨가하였다. 공벡터로 형질전환시킨 이. 콜라이 세포의 용해물을 함유하는 효소-무함유 대조군 반응을 병행하여 수행하였다. 검정물을 37℃에서 1 내지 22시간 동안 2 ml 밀봉 유리 바이알 (인터킴, Interchim)에서 진탕하에 인큐베이션하였다. 이어서 1 ml의 헤드스페이스 상을 수집하여 화염 이온화 검출기 (FID)가 구비된 기체 크로마토그래프 배리언(Varian) 450-GC에 주입하였다. 질소를 담체 기체로서 1.5 ml/분의 유량으로 사용하였다. 130℃에서 등온 모드를 사용하여 알티-알루미나 본드(Rt-Alumina Bond)/Na2SO4 칼럼 (레스텍, Restek)상에서 휘발성 화합물을 크로마토그래피 분리하였다. 효소 반응 생성물을 1,3-부타디엔 표준 (시그마, Sigma)과의 비교에 의하여 동정하였다. 이들 GC 조건하에서, 부타디엔에 대한 체류시간은 7.6분이었다. 리나로올 데히드라타제-이소머라제로의 효소 검정에서 1,3-부타디엔의 현저한 생산이 관찰되었다. 효소-무함유 대조군 검정에서는 부타디엔 신호가 관찰되지 않았다 (도 7). 당해 전환에 대한 대사회전수는 효소 활성 부위당 약 3x10-5 s-1 기질 분자에 달하였다.
실시예
3:
3-부텐-2-
올로부터의
1,3-부타디엔 생산
효소 검정을 하기 조건하에서 수행하였다:
50 mM 트리스 HCl pH 7.5
2 mM D,L-디티오트레이톨
0-80 mM 3-부텐-2-올
pH를 7.5로 조정하였다.
재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 함유하는 0.25 ml의 세포 용해물을 0.5 ml의 반응 혼합물에 첨가하였다. 공벡터로 형질전환시킨 이. 콜라이 세포의 용해물을 함유하는 효소-무함유 대조군 반응을 병행하여 수행하였다. 검정물을 37℃에서 1 내지 22시간 동안 2 ml 밀봉 유리 바이알 (인터킴)에서 진탕하에 인큐베이션하였다. 1,3-부타디엔 생산을 실시예 2에 기재된 바와 같은 GC/FID 절차에 의하여 분석하였다. 리나로올 데히드라타제-이소머라제로의 효소 검정에서 1,3-부타디엔의 현저한 생산이 관찰되었다. 효소-무함유 대조군 검정에서는 부타디엔 신호가 관찰되지 않았다 (도 8). 당해 전환에 대한 대사회전수는 효소 활성 부위당 약 10-4 s-1 기질 분자에 달하였다.
R 및 S 에난티오퓨어(enantiopure) 부트-3-엔-2-올을 사용하여 유사한 실험을 또한 수행하였으며, 유사한 결과가 관찰되었다.
실시예
4:
3-메틸-2-부텐-1-올 (프레놀)로부터의 2-메틸-1,3-부타디엔 (이소프렌) 생산
효소 검정을 하기 조건하에서 수행하였다:
50 mM 트리스 HCl pH 7.5
2 mM D,L-디티오트레이톨
0-80 mM 3-메틸-2-부텐-1-올 (프레놀)
pH를 7.5로 조정하였다.
재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 함유하는 0.25 ml의 세포 용해물을 0.5 ml의 반응 혼합물에 첨가하였다. 공벡터로 형질전환시킨 이. 콜라이 세포의 용해물을 함유하는 효소-무함유 대조군 반응을 병행하여 수행하였다. 검정물을 37℃에서 1 내지 22시간 동안 2.0 ml 밀봉 유리 바이알 (인터킴)에서 진탕하에 인큐베이션하였다. 100 ㎕의 헤드스페이스 상을 이어서 수집하여 화염 이온화 검출기 (FID)가 구비된 기체 크로마토그래프 배리언 450-GC에 주입하였다. 헤드스페이스 상으로부터의 휘발성 화합물을 질소를 담체 기체로서 1.5 ml/분의 유량으로 사용하여 Rtx-1 칼럼 (레스텍)상에서 분리하였다. 각 샘플에 대한 오븐 사이클은 4분 동안 100℃이었고, 온도를 20℃/분으로 130℃의 온도로 승온시키며, 130℃에서 1.5분 동안 유지시켰다. 총 실행시간은 7분이었다. 효소 반응 생성물을 이소프렌 표준 (시그마)과의 비교에 의하여 동정하였다. 이들 GC 조건하에서, 이소프렌에 대한 체류시간은 3.08분이었다. 리나로올 데히드라타제-이소머라제로의 효소 검정에서 이소프렌의 현저한 생산이 관찰되었다. 효소-무함유 대조군 검정에서는 프레놀의 자연분해에 상응하는 이소프렌의 무의미한 신호가 관찰되었다 (표 1). 당해 전환에 대한 대사회전수는 효소 활성 부위당 약 3x10-4 s-1 기질 분자에 달하였다.
<표 1> 80 mM 프레놀로의 검정에서 22시간 인큐베이션 후의 이소프렌 생산
실시예
5:
3-메틸-3-부텐-1-올 (이소프레놀)로부터의 2-메틸-1,3-부타디엔 (이소프렌) 생산
효소 검정을 하기 조건하에서 수행하였다:
50 mM 트리스 HCl pH 7.5
2 mM D,L-디티오트레이톨
0-80 mM 3-메틸-3-부텐-1-올 (이소프레놀)
pH를 7.5로 조정하였다.
재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 함유하는 0.25 ml의 세포 용해물을 0.5 ml의 반응 혼합물에 첨가하였다. 공벡터로 형질전환시킨 이. 콜라이 세포의 용해물을 함유하는 효소-무함유 대조군 반응을 병행하여 수행하였다. 검정물을 37℃에서 1 내지 22시간 동안 2 ml 밀봉 유리 바이알 (인터킴)에서 진탕하에 인큐베이션하였다. 이소프렌 생산은 실시예 4에 기재된 바와 같은 GC/FID 절차에 의하여 분석하였다. 리나로올 데히드라타제-이소머라제로의 효소 검정에서 이소프렌의 현저한 생산이 관찰되었다. 효소-무함유 대조군 검정에서는 이소프렌 신호가 관찰되지 않았다 (도 9). 당해 전환에 대한 대사회전수는 효소 활성 부위당 약 3x10-5 s-1 기질 분자에 달하였다.
실시예
6:
2-
메틸
-3-부텐-2-올로
부터의
2-메틸-1,3-부타디엔 (이소프렌) 생산
효소 검정을 하기 조건하에서 수행하였다:
50 mM 트리스 HCl pH 7.5
2 mM D,L-디티오트레이톨
0-80 mM 2-메틸-3-부텐-2-올
pH를 7.5로 조정하였다.
재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 함유하는 0.25 ml의 세포 용해물을 0.5 ml의 반응 혼합물에 첨가하였다. 공벡터로 형질전환시킨 이. 콜라이 세포의 용해물을 함유하는 효소-무함유 대조군 반응을 병행하여 수행하였다. 검정물을 37℃에서 1 내지 22시간 동안 2 ml 밀봉 유리 바이알 (인터킴)에서 진탕하에 인큐베이션하였다. 이소프렌 생산은 실시예 4에 기재된 바와 같은 GC/FID 절차에 의하여 분석하였다. 리나로올 데히드라타제-이소머라제로의 효소 검정에서 이소프렌의 현저한 생산이 관찰되었다. 효소-무함유 대조군 검정에서는 이소프렌 신호가 관찰되지 않았다 (도 10). 당해 전환에 대한 대사회전수는 효소 활성 부위당 약 10-3 s-1 기질 분자에 달하였다.
실시예 7: (E)-부트-2-
엔
-1-
올
(트랜스-
크로틸
알콜)로부터의 1,3-부타디엔 생산의 동역학
세포 용해 및
상청액의
제조
세포 용해물을 하기와 같이 변형을 가한 실시예 1에 기재된 절차에 따라 제조하였다. 200 ml의 배양 세포로부터 수득한 펠릿을 얼음 위에서 해동시킨 다음, 4 mM D,L-디티오트레이톨, 20 mM 글루타티온, 25 mM MgCl2 및 25 mM KCl로 보충한 3 ml의 50 mM 트리스-HCl pH 7.5에 재현탁시켰다. 이어서 10 ㎕의 리소나제 (머크, Merck)를 첨가하였다. 세포를 10분 동안 실온에서 인큐베이션하고 이어서 20분 동안 얼음으로 복귀시켰다. 세포 용해물을 13,000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의하여 정화하였다. 수집된 상청액을 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-4 10 kDa 필터 유닛 (밀리포어, Millipore)상에서 농축하였다. 리나로올 데히드라타제-이소머라제의 발현 수준은 상청액의 SDS-PAGE 분석에 의하여 평가하였다. 브래드포드법 (바이오라드)을 사용하여 총 단백질 농도를 측정하였다.
효소 검정
효소 검정을 하기 조건하에서 수행하였다:
50 mM 트리스-HCl pH 7.5
0-160 mM 트랜스-크로틸 알콜 (알파 에이서, Alfa Aesar)
재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 함유하는 0.2 내지 0.4 ml의 상청액을 0.5 ml의 반응 혼합물에 첨가하였다. 검정물중 리나로올 데히드라타제-이소머라제의 농도는 약 1.2 mg/ml이었다. 공벡터로 형질전환시킨 이. 콜라이 세포의 상청액을 함유하는 효소-무함유 대조군 반응을 병행하여 수행하였다. 반응을 37℃에서 2 ml 밀봉 유리 바이알 (인터킴)에서 진탕하에 인큐베이션하였다. 검정 튜브를 -80℃에서 동결시킴으로써 반응을 정지시켰다. 부타디엔의 생산은 5.5시간 인큐베이션 기간에 걸쳐서 샘플링한 분취량을 분석함으로써 측정하였다. 생산된 1,3-부타디엔의 양을 실시예 2에 기재된 절차에 따라 기체 크로마토그래피 (GC) 분석에 의하여 정량하였다. 도 11은 트랜스-크로틸 알콜 농도의 범위에 대한 1,3-부타디엔 생산의 동역학을 도시한다.
실시예 8: 부트-3-
엔
-2-
올로부터의
1,3-부타디엔 생산의 동역학
재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 함유하는 정화한 세포 용해물을 실시예 7에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
효소 검정
효소 검정을 하기 조건하에서 수행하였다:
50 mM 트리스-HCl pH 7.5
0-160 mM 부트-3-엔-2-올 (시그마-알드리치, Sigma-Aldrich)
재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 함유하는 0.2 내지 0.4 ml의 상청액을 0.5 ml의 반응 혼합물에 첨가하였다. 검정물중 리나로올 데히드라타제-이소머라제의 농도는 약 1.2 mg/ml이었다. 공벡터로 형질전환시킨 이. 콜라이 세포의 상청액을 함유하는 효소-무함유 대조군 반응을 병행하여 수행하였다. 검정물을 37℃에서 2 ml 밀봉 유리 바이알 (인터킴)에서 진탕하에 인큐베이션하였다. 검정 튜브를 -80℃에서 동결시킴으로써 반응을 정지시켰다. 부타디엔의 생산은 5.5시간 인큐베이션 기간에 걸쳐서 샘플링한 분취량을 분석함으로써 측정되었다. 생산된 1,3-부타디엔의 양은 실시예 2에 기재된 절차에 따라 기체 크로마토그래피 (GC) 분석에 의하여 정량하였다. 도 12는 부트-3-엔-2-올 농도의 범위에 대한 1,3-부타디엔 생산의 동역학을 도시한다.
실시예
9:
부트
-3-엔-1-올 (
이소크로틸
알콜
)
로부터의
1,3-부타디엔 생산
세포
용해물의
제조
세포 용해물을 하기와 같은 변형을 가한 실시예 1에 기재된 절차에 따라 제조하였다. 200 ml의 배양 세포로부터 수득된 펠릿을 얼음 위에서 해동시킨 다음, 4 mM D,L-디티오트레이톨, 20 mM 글루타티온, 25 mM MgCl2 및 25 mM KCl로 보충한 3 ml의 50 mM 트리스-HCl pH 7.5에 재현탁시켰다. 이어서 10 ㎕의 리소나제 (머크)를 첨가하였다. 세포를 10분 동안 실온에서 인큐베이션하고 이어서 20분 동안 얼음으로 복귀시켰다.
효소 검정
효소 검정을 하기 조건하에서 수행하였다:
50 mM 트리스-HCl pH 7.5
50 mM 부트-3-엔-1-올 (시그마)
재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 함유하는 0.4 ml의 세포 용해물을 0.5 ml의 반응 혼합물에 첨가하였다. 공벡터로 형질전환시킨 이. 콜라이 세포의 용해물을 함유하는 효소-무함유 대조군 반응을 병행하여 수행하였다. 검정물을 37℃에서 18시간 동안 2 ml 밀봉 유리 바이알 (인터킴)에서 진탕하에 인큐베이션하였다. 1 ml의 헤드스페이스 상을 이어서 수집하고, 화염 이온화 검출기 (FID)가 구비된 기체 크로마토그래프 배리언 450-GC에 주입하였다. 질소를 담체 기체로서 6 ml/분의 유량으로 사용하였다. 130℃에서 등온 모드를 사용하여 J&W GS-알루미나 (30 m x 0.53 mm ID) 칼럼 (레스텍)상에서 휘발성 화합물을 크로마토그래피 분리하였다. 효소 반응 생성물을 1,3-부타디엔 표준 (시그마-알드리치)과의 비교에 의하여 동정하였다. 이들 GC 조건하에서, 부타디엔에 대한 체류시간은 3.05분이었다. 리나로올 데히드라타제-이소머라제의 존재하 효소 검정에서는 1,3-부타디엔이 생산되었고, 효소-무함유 대조군 검정에서는 부타디엔 신호가 관찰되지 않았다 (도 13).
실시예
10: 2
-
메틸부트
-3-엔-2-올로부터의
2-
메틸
-1,3-부타디엔 (
이소프렌) 생산
실험의 또 다른 회차 동안, 실시예 6에서 시험한 반응을 재현하였으며 결과를 확인하였다. 정확한 검정 조건은 다음과 같았다:
재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 함유하는 정화한 세포 용해물을 실시예 7에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
효소 검정
효소 검정을 하기 조건하에서 수행하였다:
50 mM 트리스-HCl pH 7.5
160 mM 2-메틸부트-3-엔-2-올 (시그마)
재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 함유하는 0.2 내지 0.4 ml의 상청액을 0.5 ml의 반응 혼합물에 첨가하였다. 검정물중 리나로올 데히드라타제-이소머라제의 농도는 약 1.2 mg/ml이었다. 공벡터로 형질전환시킨 이. 콜라이 세포의 상청액을 함유하는 효소-무함유 대조군 반응을 병행하여 수행하였다. 검정물을 6시간 동안 37℃에서 2 ml 밀봉 바이알 (인터킴)에서 진탕하에 인큐베이션하였다. 이어서 검정 튜브를 -80℃에서 동결시킴으로써 반응을 정지시켰다.
1 ml의 헤드스페이스 상을 이어서 수집하고, 화염 이온화 검출기 (FID)가 구비된 기체 크로마토그래프 배리언 450-GC에 주입하였다. 질소를 담체 기체로서 1.5 ml/분의 유량으로 사용하였다. 155℃에서 등온 모드를 사용하여 Rt-알루미나 본드/Na2SO4 칼럼 (레스텍)상에서 휘발성 화합물을 크로마토그래피 분리하였다. 효소 반응 생성물을 이소프렌 표준 (시그마-알드리치)과의 비교에 의하여 동정하였다. 이들 GC 조건하에서, 이소프렌에 대한 체류시간은 7.5분이었다.
리나로올 데히드라타제-이소머라제의 존재하에서 셋업한 효소 검정에서는 이소프렌의 현저한 생산이 관찰되었다. 효소-무함유 대조군 검정에서는 이소프렌 신호가 관찰되지 않았다 (도 14).
실시예
11: 3
-
메틸부트
-3-엔-2-올로부터의
2-
메틸
-1,3-부타디엔 (
이소프렌) 생산
세포
용해물의
제조
세포 용해물을 하기와 같이 변형을 가한 실시예 1에 기재된 절차에 따라 제조하였다. 200 ml의 배양 세포로부터 수득된 펠릿을 얼음 위에서 해동시킨 다음, 4 mM D,L-디티오트레이톨, 20 mM 글루타티온, 25 mM MgCl2 및 25 mM KCl을 함유하는 3 ml의 50 mM 트리스-HCl pH 7.5에 재현탁시켰다. 이어서 10 ㎕의 리소나제 (머크)를 첨가하였다. 세포를 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였고 이어서 20분 동안 얼음으로 복귀시켰다.
효소 검정
효소 검정을 하기 조건하에서 수행하였다:
50 mM 트리스-HCl pH 7.5
50 mM 3-메틸부트-3-엔-2-올 (시그마-알드리치)
재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 함유하는 0.45 ml의 세포 용해물을 0.5 ml의 반응 혼합물에 첨가하였다. 공벡터로 형질전환시킨 이. 콜라이 세포의 용해물을 함유하는 효소-무함유 대조군 반응을 병행하여 수행하였다. 검정물을 37℃에서 1시간 동안 2 ml 밀봉 유리 바이알 (인터킴)에서 진탕하에 인큐베이션하였다. 1 ml의 헤드스페이스 상을 이어서 수집하여 화염 이온화 검출기 (FID)가 구비된 기체 크로마토그래프 배리언 450-GC에 주입하였다. 질소를 담체 기체로서 6 ml/분의 유량으로 사용하였다. 150℃에서 등온 모드를 사용하여 J&W GS-알루미나 (30 m x 0.53 mm ID) 칼럼 (레스텍)상에서 휘발성 화합물을 크로마토그래피 분리하였다. 효소 반응 생성물을 이소프렌 표준 (시그마-알드리치)과의 비교에 의하여 동정하였다. 이들 GC 조건하에서, 이소프렌에 대한 체류시간은 3.85분이었다. 리나로올 데히드라타제-이소머라제의 존재하 효소 검정에서는 상당량의 이소프렌이 생산되었고, 효소-무함유 대조군 검정에서는 3-메틸부트-3-엔-2-올의 자연분해에 상응하는 이소프렌의 무의미한 신호가 관찰되었다 (도 15, 표 2).
<표 2> 50 mM 3-메틸부트-3-엔-2-올로의 검정에서 1시간 인큐베이션 후의 이소프렌 생산
실시예 12:
리나로올
데히드라타제의
절단 변이체:
크로틸
알콜의 1,3 부타디엔으로의 전환의 전체 반응에 관한 및 부트-3-엔-2-올의 1,3 부타디엔으로의 탈수 반응에 대한 활성
리나로올 데히드라타제-이소머라제의 활성과 용해도에 있어서 향상을 기대하는 다양한 스크린은 C-말단 부분에서 절단되는 효소의 9종 변이체의 콜렉션의 동정을 이끌어내었다. 야생형 전장 효소는 서열 1로 나타낸 바와 같은 M1-K397에 상응한다. 관찰된 절단 변형체는 서열 1로 나타낸 바와 같은 M1-L385, M1-R386, M1-P388, M1-P389, M1-A391, M1-K393, M1-L394, M1-A395 및 M1-G396이다. 이들 C-말단 절단 변형체의 경우에, 단백질의 길이만이 변형되며, 단백질 서열의 나머지는 불변이다. 최단 변이체 (M1-L385)는 96.9%의 동일성을 갖는다.
활성은 하기 검정에 따라 시험하였다:
당해 검정은 다음과 같이 셋업하였다. 시판 pET25b+ 발현벡터에 클로닝한 리나로올 데히드라타제-이소머라제 C-말단 절단 변이체의 콜렉션을 BL21(DE3) 컴피턴트 세포중으로 형질전환시켰다. 단리된 클론을 사용하여 1 ml의 자기유도 배지 (Studier FW, Prot.Exp.Pur. 41, (2005), 207-234)를 접종하고 700rpm 및 85% 습도로 세팅한 진탕 인큐베이터에서 20 내지 22시간 동안 30℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 펠릿화하여 -80℃에서 밤새 저장하였다. 발현된 재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제 변이체를 함유하고 있는 이들 세포 펠릿을 50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 25 mM KCl, 25 mM MgCl2, 4 mM DTT, 10 mM 글루타티온 + 50 mM 트랜스-크로틸 알콜 (알파 에이서) 또는 50 mM 부트-3-엔-2-올 (시그마 알드리치)을 함유하는 반응 믹스에 재현탁시켰다. 공발현벡터 peT25b+ 또는 야생형 효소를 발현하는 발현벡터를 함유하는 박테리아 클론을 사용하여 대조군 반응을 셋업하였다. 당해 반응 믹스를 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 80℃에서의 5분 인큐베이션에 의하여 반응을 정지시켰다. 이어서 생산된 1,3-부타디엔의 양을 기체 크로마토그래피 (GC) 분석에 의하여 정량하였다. GC 헤드스페이스 분석을 위해, 300 ㎕의 헤드스페이스 기체를 레스텍 RT-알루미나 칼럼 (5 m x 0.32mm)과 화염 이온화 검출 시스템 (FID)이 구비된 브루커(Bruker) GC450 시스템에 주입하였다. 1,3 부타디엔의 검출에 사용된 GC 분석법은 140℃에서의 일정한 오븐 온도, 200℃에서의 주입구 온도 (1:4의 분할비) 및 250℃에서의 FID 검출기 온도를 특징으로 한다. 질소를 담체 기체로서 사용하였고 (1.25 ml/분의 일정 유량), 공기 (공기 유량: 300 ml/분), 질소 (유량: 28 ml/분)와 수소 (유량: 30 ml/분)의 혼합물을 사용하여 FID 검출 시스템을 공급하였다.
각각 크로틸 알콜의 1,3 부타디엔으로의 전환의 전체 반응 및 부트-3-엔-2-올의 1,3 부타디엔으로의 탈수 반응에 대한 리나로올 데히드라타제의 상기 절단 변형체의 활성을 도 16에 도시하였다.
실시예 13: 재조합
리나로올
데히드라타제-이소머라제는
크로틸
알콜 시스- 및 트랜스-
크로틸
알콜 입체이성질체의 1,3-부타디엔으로의 전환을 촉매한다
재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 코딩하는 유전자를 시판 노바젠 peT-25b+ 박테리아 발현벡터중으로 서브클로닝하고, BL21(DE3) 컴피턴트 세포중으로 형질전환시킨 다음, 적당한 항생제로 보충한 LB 아가 플레이트상에 플레이팅하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 후속 효소 검정에서 음성 대조군으로서 사용되도록 peT-25b+ 벡터로 또한 형질전환시켰다. 단일 형질전환체를 사용하여 500 ml의 자기유도 배지 (Studier F.W, 2005; loc. cit.)를 접종하였고 배양물을 진탕 인큐베이터중 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포 펠릿은 50 ㎕의 머크 노바젠 리소나제(Merck Novagen Lysonase)로 보충한 7.5 ml의 용해 완충제 (50mM 트리스-Cl pH 7.5, 4mM DTT, 25mM MgCl2 , 25mM KCl)에 재현탁시키기에 앞서 -80℃에서 밤새 저장하였다. 세포 현탁액을 10분 동안 실온에서, 뒤이어 20분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 세포 용해물을 이어서 원심분리에 의하여 정화하고, 여과 농축기 (아미콘 울트라 - 밀리포어 (Millipore)를 사용하여 상청액을 2배 농축하였다. 농축된 가용성 분획에 존재하는 재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제의 양을 겔 농도측정을 이용하여 소 혈청 알부민 교정 곡선에 대하여 SDS-PAGE 겔상에서 산정하였다. 225 ㎕의 세포 용해물 상청액, 0 내지 100mM 범위의 트랜스-크로틸 알콜 (알파 에이서) 또는 시스-크로틸 알콜 (켐샘프코, ChemSampCo), 4mM DTT, 25mM MgCl2, 25mM KCl, 4mM 글루타티온 및 50mM 트리스-Cl pH 7.5가 250 ㎕ 최종 반응 부피로 들어있는 2ml 유리 바이알 (인터킴)에서 효소 반응을 셋업하였다. 효소 반응은 재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제를 함유하는 세포 용해물 또는 공발현벡터로 형질전환시킨 세포로부터 수득한 세포 용해물을 사용하여 셋업하였다. 바이알을 밀봉하고 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 5분 동안 80℃에서 인큐베이션함으로써 효소 반응을 정지시키고, 반응 헤드스페이스에 존재하는 1,3-부타디엔을 기체 크로마토그래피 (GC)에 의하여 정량하였다. GC 헤드스페이스 분석을 위하여, 300 ㎕의 헤드스페이스 기체를 레스텍 RT-알루미나 칼럼 (5 m x 0.32 mm)과 화염 이온화 검출 시스템 (FID)이 구비된 브루커 GC450 시스템에 주입하였다. 1,3-부타디엔의 검출에 사용된 GC 분석법은 140℃에서의 일정한 오븐 온도 (등온 모드), 200℃에서의 주입구 온도 (1:4의 분할비) 및 250℃에서의 FID 검출기 온도를 특징으로 한다. 질소를 담체 기체로 사용하였고 (유량: 1.25 ml/분), 공기 (공기 유량: 300 ml/분), 질소 (유량: 28 ml/분)와 수소 (유량: 30 ml/분)의 혼합물을 사용하여 FID 검출 시스템을 공급하였다. 효소 반응 생성물을 1,3-부타디엔 표준 (시그마-알드리치)과의 비교에 의하여 동정하였다. 이들 GC 조건하에서, 부타디엔에 대한 체류시간은 1.05분이었다. 도 17은 재조합 리나로올 데히드라타제-이소머라제가 시스- 또는 트랜스-크로틸 알콜의 1,3-부타디엔으로의 전환을 촉매할 수 있음을 도시한다. 효소-무함유 대조군 반응에서는 어떠한 유의미한 1,3-부타디엔 신호도 관찰되지 않았다.
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<110> Scientist of Fortune S.A.
<120> Production of volatile dienes by enzymatic dehydration of light
alkenols
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<213> Castellaniella defragrans
<400> 1
Met Arg Phe Thr Leu Lys Thr Thr Ala Ile Val Ser Ala Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Ala Gly Phe Gly Pro Pro Pro Arg Ala Ala Glu Leu Pro Pro Gly
20 25 30
Arg Leu Ala Thr Thr Glu Asp Tyr Phe Ala Gln Gln Ala Lys Gln Ala
35 40 45
Val Thr Pro Asp Val Met Ala Gln Leu Ala Tyr Met Asn Tyr Ile Asp
50 55 60
Phe Ile Ser Pro Phe Tyr Ser Arg Gly Cys Ser Phe Glu Ala Trp Glu
65 70 75 80
Leu Lys His Thr Pro Gln Arg Val Ile Lys Tyr Ser Ile Ala Phe Tyr
85 90 95
Ala Tyr Gly Leu Ala Ser Val Ala Leu Ile Asp Pro Lys Leu Arg Ala
100 105 110
Leu Ala Gly His Asp Leu Asp Ile Ala Val Ser Lys Met Lys Cys Lys
115 120 125
Arg Val Trp Gly Asp Trp Glu Glu Asp Gly Phe Gly Thr Asp Pro Ile
130 135 140
Glu Lys Glu Asn Ile Met Tyr Lys Gly His Leu Asn Leu Met Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Tyr Gln Leu Val Thr Gly Ser Arg Arg Tyr Glu Ala Glu His Ala
165 170 175
His Leu Thr Arg Ile Ile His Asp Glu Ile Ala Ala Asn Pro Phe Ala
180 185 190
Gly Ile Val Cys Glu Pro Asp Asn Tyr Phe Val Gln Cys Asn Ser Val
195 200 205
Ala Tyr Leu Ser Leu Trp Val Tyr Asp Arg Leu His Gly Thr Asp Tyr
210 215 220
Arg Ala Ala Thr Arg Ala Trp Leu Asp Phe Ile Gln Lys Asp Leu Ile
225 230 235 240
Asp Pro Glu Arg Gly Ala Phe Tyr Leu Ser Tyr His Pro Glu Ser Gly
245 250 255
Ala Val Lys Pro Trp Ile Ser Ala Tyr Thr Thr Ala Trp Thr Leu Ala
260 265 270
Met Val His Gly Met Asp Pro Ala Phe Ser Glu Arg Tyr Tyr Pro Arg
275 280 285
Phe Lys Gln Thr Phe Val Glu Val Tyr Asp Glu Gly Arg Lys Ala Arg
290 295 300
Val Arg Glu Thr Ala Gly Thr Asp Asp Ala Asp Gly Gly Val Gly Leu
305 310 315 320
Ala Ser Ala Phe Thr Leu Leu Leu Ala Arg Glu Met Gly Asp Gln Gln
325 330 335
Leu Phe Asp Gln Leu Leu Asn His Leu Glu Pro Pro Ala Lys Pro Ser
340 345 350
Ile Val Ser Ala Ser Leu Arg Tyr Glu His Pro Gly Ser Leu Leu Phe
355 360 365
Asp Glu Leu Leu Phe Leu Ala Lys Val His Ala Gly Phe Gly Ala Leu
370 375 380
Leu Arg Met Pro Pro Pro Ala Ala Lys Leu Ala Gly Lys
385 390 395
Claims (15)
- 알켄올 데히드라타제를 사용하여 화학식 CnH2nO에 대응하는 화합물을 CnH2n -2 + H2O (여기서, 3 < n < 7)로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 공액 디엔을 생산하는 방법.
- 제1항에 있어서, 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물이 하기 화학식 I의 1급 알릴 알콜 (PRA)인 방법.
<화학식 I>
상기 식에서,
R1 및 R2는 독립적으로 H 및 CH3으로부터 선택된다. - 제1항에 있어서, 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물이 하기 화학식 II의 2급 또는 3급 알릴 알콜 (STA)인 방법.
<화학식 II>
상기 식에서,
R1 및 R2는 독립적으로 H 및 CH3으로부터 선택된다. - 제1항에 있어서, 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물이 하기 화학식 III의 1급 호모알릴 알콜 (PHA)인 방법.
<화학식 III>
상기 식에서,
R1 및 R2는 독립적으로 H 및 CH3으로부터 선택된다. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내에서 수행되는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 알켄올 데히드라타제를 생산하는 미생물을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 미생물이 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물을 생산할 수 있는 것인 방법.
- 화학식 CnH2nO에 대응하는 화합물을 CnH2n -2 + H2O (여기서, 3 < n < 7)로 전환시키기 위한, 알켄올 데히드라타제 또는 알켄올 데히드라타제를 생산하는 미생물의 용도.
- 알켄올 데히드라타제 및 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물을 생산하는 생물을 포함하는 조성물.
- 알켄올 데히드라타제 및 화학식 CnH2nO (여기서, 3 < n < 7)에 대응하는 화합물을 포함하는 조성물.
- 알켄올 데히드라타제가 리나로올 데히드라타제 (EC4.2.1.127)인 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법, 제8항의 용도 또는 제9항 또는 제10항의 조성물.
- 알켄올 데히드라타제가 서열 1로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 1로 나타낸 아미노산 서열과 적어도 30% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 화학식 CnH2nO에 대응하는 화합물을 CnH2n -2 + H2O (여기서, 3 < n < 7)로 전환시키는 효소 활성을 나타내는 단백질인 제1항 내지 제7항 및 제11항 중 어느 한 항의 방법, 제8항 또는 제11항의 용도 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조성물.
- n이 4이고 생산된 디엔 화합물이 부타디엔인 제1항 내지 제7항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 방법 또는 제8항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 용도, 또는 n이 4인 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물.
- n이 5이고 생산된 디엔 화합물이 이소프렌인 제1항 내지 제7항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 방법 또는 제8항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 용도, 또는 n이 5인 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물.
- n이 6이고 생산된 디엔 화합물이 디메틸부타디엔인 제1항 내지 제7항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 방법 또는 제8항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 용도, 또는 n이 6인 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물.
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