KR20140027307A - 알부민 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 모체 알부민과 비교하여 변화된 혈장 반감기를 갖는 모체 알부민의 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드 및 콘쥬게이트에 관한 것이다.

Description

알부민 변이체{ALBUMIN VARIANTS}

서열 목록에 대한 참조

본 출원은 컴퓨터로 판독 가능한 형태의 서열 목록을 함유하며, 이것은 본원에 참고로 포함된다.

기술 분야

본 발명은 알부민, 이들의 단편 또는 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드와 비교하여 FcRn에 대한 결합 친화도의 변화 및/또는 반감기의 변화를 갖는 알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 알부민의 결합 친화도 및/또는 반감기를 사용자 또는 출원의 필요 및 요구에 맞추는 것을 허용한다.

알부민은 그것이 가장 풍부한 단백질인 포유동물의 혈장에서 자연적으로 발견된 단백질이다. 그것은 혈액의 바람직한 삼투압을 유지하고 또한 혈류의 다양한 물질의 수송에 있어서 중요한 역할을 갖는다. 알부민은 사람, 돼지, 마우스, 래트, 토끼 및 염소를 포함하는 많은 종으로부터 특성화되었고 그것들은 높은 정도의 서열 및 구조적 상동 관계를 공유한다.

알부민은 생체 내에서 그것의 수용체, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) "Brambell"에 결합하고 이 상호작용은 알부민의 혈장 반감기에 중요한 것으로 알려져 있다. FcRn은 막 결합 단백질이며, 많은 세포 및 조직 타입에서 발현된다. FcRn은 세포 내 분해로부터 알부민을 구조하는 것으로 알려져 있다 (Roopenian D. C. and Akilesh, S. (2007), Nat. Rev. Immunol 7, 715-725). FcRn은 사람과 같은 포유동물의 혈청에서 높은 수준의 IgG 및 알부민을 유지하는데 기여하는 이기능성 분자이다.

FcRn-면역글로불린 (IgG) 상호작용이 선행 업계에서 특성화되는 한편, FcRn-알부민 상호작용은 덜 특성화된다. 주요 FcRn 결합 부위는 DIII 내에 위치한다 (381-585). Andersen et al (2010), Clinical Biochemistry 43,367-372. 데이터는 IgG 및 알부민이 FcRn상의 별개의 부위에 비협조적으로 결합한다는 것을 나타낸다 (Andersen et al. (2006), Eur. J. Immunol 36, 3044-3051; Chaudhury et al. (2006), Biochemistry 45, 4983-4990).

마우스 FcRn은 마우스 및 사람의 IgG에 결합하는 것으로 알려져 있는 반면에, 사람 FcRn은 더 차등적인 것으로 나타난다 (Ober et al. (2001) Int. Immunol 13, 1551-1559). Andersen et al. (2010) Journal of Biological Chemistry 285(7):4826-36은 각각 마우스 및 사람 알부민에 대한 사람 및 마우스 FcRn의 친화도를 설명한다 (가능한 조합 모두). 생리학적 pH에서 어떤 수용체에 어떤 종의 알부민의 결합도 관찰되지 않았다. 산성 pH에서, 결합 친화도의 100배 차이가 관찰되었다. 모든 경우에서, 어떤 종의 알부민 및 IgG의, 수용체 둘 다에 결합이 첨가되었다.

사람 혈청 알부민 (HSA)은 585개의 아미노산의 폴리펩티드로서 잘 특성화되었으며, 이것의 서열은 Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical, Applications pp10, Academic Press, Inc., Orlando (ISBN 0-12-552110-3)에서 발견될 수 있다. 그것이 pH 6.0에서 결합하지만 pH 7.4에서는 아닌 경우, 그것은 그것의 수용체 FcRn에 대한 특징적인 결합을 갖는다.

HSA의 혈장 반감기는 대략 19일인 것이 발견되었다. 낮은 혈장 반감기를 갖는 자연적 변이체는 치환 D494N을 갖는 것으로 확인되었다 (Peach, R. J. and Brennan, S. 0., (1991) Biochim Biophys Acta.1097:49-54). 이 치환은 이 변이체에서 N-글리코실화 부위를 발생시켰으며, 이것은 야생형 알부민에 존재하지 않는다. 글리코실화 또는 아미노산 변화가 혈장 반감기의 변화의 원인인지는 알려져 있지 않다.

알부민은 긴 혈장 반감기를 가지며 이 성질 때문에 그것은 약물 전달에 사용에 제안되었다. 알부민은 약학적으로 유익한 화합물에 콘쥬게이션되었고 (conjugated) (WO 2000/69902a), 콘쥬게이트 (conjugate)는 알부민의 긴 혈장 반감기를 유지한다는 것이 발견되었다. 콘쥬게이트의 결과의 혈장 반감기는 일반적으로 유익한 치료적 화합물만의 혈장 반감기보다 훨씬 더 길었다.

게다가, 알부민은 치료적으로 유익한 펩티드에 유전적으로 융합되었으며 (WO 2001/79271 A 및 WO 2003/59934 a), 융합이 치료적으로 유익한 펩티드의 활성 및 치료적으로 유익한 펩티드만의 혈장 반감기보다 훨씬 더 긴 혈장 반감기를 갖는다는 전형적인 결과를 갖는다.

Otagiri et al (2009), Biol. Pharm. Bull. 32(4), 527-534는 70개 이상의 알부민 변이체를 개시하고, 이들 중 25개는 도메인 III에서 돌연변이되는 것으로 발견된다. 카르복시 말단에서 최종 175개의 아미노산이 없는 자연적 변이체는 감소된 반감기를 갖는 것으로 나타났다 (Andersen et al (2010), Clinical Biochemistry 43, 367-372). Iwao et al (2007)은 마우스 모델을 사용하여 자연 발생한 사람 알부민 변이체의 반감기를 연구하였고, K541E 및 K560E는 감소된 반감기를 갖고, E501K 및 E570K는 증가된 반감기를 갖고 K573E는 반감기에 대하여 거의 아무 효과도 갖지 않았다 (Iwao, et. al. (2007) B.B.A. Proteins and Proteomics 1774, 1582-1590).

Galliano et al (1993) Biochim. Biophys. Acta 1225, 27-32는 자연적 변이체 E505K를 개시한다. Minchiotti et al (1990)은 자연적 변이체 K536E를 개시한다. Minchiotti et al (1987) Biochim. Biophys. Acta 916, 411-418은 자연적 변이체 K574N을 개시한다. Takahashi et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4413-4417은 자연적 변이체 D550G를 개시한다. Carlson et al (1992). Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 8225-8229는 자연적 변이체 D550A를 개시한다.

WO2011/051489 (PCT/EP2010/066572)는 FcRn에 알부민의 결합을 조절하는, 알부민의 많은 점 돌연변이를 개시하고, WO2010/092135는 알부민에서 콘쥬게이션 (conjugation)에 이용 가능한 티올의 수를 증가시키는, 알부민의 많은 점 돌연변이를 개시하고, 개시는 FcRn에 알부민의 결합에 대한 돌연변이의 영향에 대하여 침묵한다. WO2011/103076은 알부민 변이체를 개시하며, 각각 HSA 의 도메인 III의 치환을 함유한다.

알부민은 많은 리간드와 결합하는 능력을 갖고 이들은 알부민과 관련된다 (관련된다). 이 성질은 알부민에 비공유 결합하는 능력을 가진 약물의 혈장 반감기를 연장하기 위해 이용되었다. 이것은 또한 약학적으로 유익한 화합물과 결합함으로써 달성될 수 있으며, 이것은 알부민 결합 성질을 갖는 모이어티에 알부민이 결합하는 성질을 거의 또는 전혀 갖지 않는다. 그 안에 리뷰 기사 및 참고문헌, Kratz (2008) Journal of Controlled Release 132, 171-183 참조.

알부민은 약학적으로 유익한 화합물의 제조시 사용되며, 이러한 제조는 예를 들어, 알부민의 나노입자 또는 미크로입자일 수도 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 예에서, 약학적으로 유익한 화합물 또는 화합물의 혼합물의 전달은 유익한 화합물이 전달의 수단을 위해 알부민과 결합하는 것으로 나타나는 경우 알부민의, 그것의 수용체에 대한 친화도의 변화로부터 이익을 얻을 수도 있다.

무엇이 형성된 결합체, 콘쥬게이트 또는 융합 폴리펩티드의 혈장 반감기를 결정하는지는 분명하지 않지만 (예를 들어, Levemir®, Kurtzhals P et al. Biochem. J. 1995; 312:725-731, 하지만 이에 제한되지 않음), 그것은 알부민 및 선택된 약학적으로 유익한 화합물/폴리펩티드의 결합의 결과로서 나타난다. 치료되기 위한 표시의 상세한 내용에 따라 특정 약물을 설계할 수 있기 위해, 결합, 콘쥬게이션 또는 융합의 구성 요소에 의해 제공된 것들보다 더 길거나 더 짧은 혈장 반감기가 달성될 수 있도록 특정 알부민 콘쥬게이트, 결합체 또는 알부민 융합 폴리펩티드의 혈장 반감기를 조절할 수 있는 것이 바람직할 것이다.

알부민은 종양에 누적되고 이화작용되는 것으로 알려져 있고, 그것은 또한 류머티스성 관절염 (rheumatoid arthritis) 환자의 염증이 생긴 관절에 누적되는 것으로 나타났다. 그 안에 리뷰 기사 및 참고문헌, Kratz (2008) Journal of Controlled Release 132, 171-183 참조. FcRn에 대한 증가된 친화도를 갖는 HSA 변이체가 약학적으로 유익한 화합물의 전달에 유리할 것으로 예상된다.

Kenanova et al (2009) J. Nucl. Med.; 50 (Supplement 2):1582)에 설명된 바와 같이 더 짧은 반감기 또는 통제된 혈청 약물 동력학을 제공하기 위해 FcRn에 거의 또는 전혀 결합하지 않는 알부민의 변이체를 갖는 것이 바람직할 수도 있다.

Kenanova et al (2010, Protein Engineering, Design & Selection 23(10): 789-798; WO2010/118169)은 HSA 의 도메인 III의 구조 모델 (pH 7 내지 8에서 용해됨) 및 FcRn의 구조 모델 (pH 6.4에서 용해됨)을 포함하는 도킹 (docking) 모델을 개시한다. Kenanova et al은 도메인 III에서 위치 464, 505, 510, 531 및 535가 잠재적으로 FcRn과 상호작용한다는 것을 개시한다. 위치 464, 510 및 535에서 히스티딘은 Chaudhury et al., (2006)에 의해 특히 흥미로운 것으로 확인되었고 이들은 Kenanova (2010)에 의해 마우스에서 친화도의 큰 감소 및 더 짧은 반감기를 갖는 것으로 나타났다. 하지만, Kenanova et al의 연구는 HSA 의 도메인 III에 제한되고 그러므로 고유의 온전한 구성의 HSA 를 고려하지 않는다. 그러므로, 확인된 위치는 FcRn 수용체에 대한 친화도의 감소를 발생시킨다.

국제 특허 출원 WO2011/051489 (PCT/EP10/066572)는 알부민 서열에서 하나 이상의 점 돌연변이의 존재로 인해, FcRn에 대한, 조절된 (즉, 증가된 또는 감소된) 결합 친화도를 갖는 변이체 알부민의 첫 번째 등급을 개시한다. 국제 특허 출원 WO2011/124718 (PCT/EP2011/055577)은 FcRn에 대한, 조절된 결합 친화도를 갖는 변이체 알부민의 두 번째 등급을 개시하고, 알부민의 하나 이상의 다른 도메인과 함께 알부민의 도메인 III를 포함하고 선택적으로 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다.

본 발명은 추가의 변이체가 FcRn 수용체에 대하여 조절된 결합 친화도를 갖고, 분자의 범위의 제공을 통해, 결합 친화도 (및 그러므로) 반감기가 필요에 따라 맞춰지는 것을 허용한다. 이러한 맞춤은 FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 반감기의 큰 증가로부터 FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 반감기의 작은 증가, FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 반감기의 작은 감소로부터 FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 반감기의 큰 감소의 범위에 있을 수도 있다. 그러므로 알부민 모이어티 또는 모이어티들은 융합 폴리펩티드, 콘쥬게이트, 결합체, 나노입자 및 알부민 모이어티를 포함하는 조성물의 FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 반감기를 맞추기 위해 사용될 수도 있다.

본 발명은 모체 알부민과 비교하여 개선된 성질을 갖는 알부민의 변이체를 확인하고 및/또는 설계하는 방법을 제공한다. WO2011/051489 (PCT/EP2010/066572)는 FcRn에 알부민의 결합을 조절하는 알부민의 많은 점 돌연변이를 개시한다. 점 돌연변이는 HSA 및 FcRn을 포함하는 도킹 모델을 제조하기 위해 사용되었다. 도킹 모델은 알부민의 영역을 확인하기 위해 사용되며 이것은 결합 중에 FcRn과 상호작용하고 그러므로 이들의 돌연변이는 야생형 HSA 및 FcRn 사이의 결합 친화도와 비교하여, 알부민 및 FcRn 사이의 결합 친화도를 변화시킬 것이다.

본 발명은 알부민의 모체 또는 참조와 비교하여 개선된 성질을 갖는 알부민의 변이체를 제공한다. 특히 본 발명은 그것의 모체 또는 참조와 비교하여 FcRn에 대하여 변화된 결합 친화도를 갖는 알부민의 변이체 및/또는 변화된 혈장 반감기를 제공한다.

그러므로 본 발명은 모체 또는 참조 알부민의 분리된 알부민의 변이체 또는 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드와 관련되며, (a) 492 내지 538; (b) 505, 531, 524, 472, 108, 190, 197 및 425; (c) 186 내지 201; (d) 457 내지 472; (e) 414 내지 426; (f) 104 내지 120; (g) 75 내지 91; (h) 144 내지 150; (i) 30 내지 41, (j) 550 내지 585 및 (k) 497 내지 585의 위치에서 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y 및/또는 종결 코돈 중 하나 이상 (다수)을 갖는 276, 410 및 414로부터 선택된 SEQ ID NO: 2의 위치와 동등한 알부민의 위치에 해당하는, 하나 이상 (다수)의 위치에서 변화를 포함한다.

여기에서, 폴리펩티드가 (i) 위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹 및/또는 (ii) 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 (특히 원래의 잔기 (예를 들어 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환) 및/또는 (iii) 위치 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584로 구성된 그룹 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수))으로부터 선택된 하나 이상 (다수)의 변화를 포함할 때, 폴리펩티드는 또한 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 변화를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 잔기 497 내지 585, 즉, 위치 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585 중 어느 하나의 위치 (SEQ ID NO: 2에 관하여, 동등한 위치)에서 종결 코돈의 도입을 포함한다. 종결 코돈은 여기에 언급된 하나 이상 (다수)의 변화 대신 또는 이와 함께 도입될 수도 있다.

본 발명은 모체 또는 참조 알부민에 비해 FcRn에 대하여 변화된 결합 친화도를 갖는 알부민 변이체 또는 이들의 단편을 제공하며,

(a) SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치: 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 39, 41, 77, 78, 79, 81, 84, 85, 87, 88, 89, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 117, 118, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197 중 어느 하나; 및/또는

(b) SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치: 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 276 중 어느 하나; 및/또는

(c) SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치: 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 561, 566, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583에서 변화 (예를 들어, 치환, 삭제 또는 삽입)를 포함하며,

변이체 또는 이들의 단편의 변화된 결합 친화도는 참조, 예를 들어, 변화를 포함하지 않는 모체 알부민 또는 단편의 결합 친화도에 관한 것이다.

(a) (상기)에 설명된 위치는 제1 도메인은 알부민, 예를 들어, HSA 와 같은 폴리펩티드의 첫 번째 도메인 (예를 들어, 도메인 I)에 있을 수도 있다. (b) (상기)에 설명된 위치는 알부민, 예를 들어, HSA 와 같은 폴리펩티드의 두 번째 도메인 (예를 들어, 도메인 II)에 있을 수도 있다. (c) (상기)에 설명된 위치는 알부민, 예를 들어, HSA 와 같은 폴리펩티드의 세 번째 도메인 (예를 들어, 도메인 III)에 있을 수도 있다.

알부민 변이체 또는 이들의 단편은 SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치에서 변화 (예를 들어, 치환 또는 삽입)을 추가로 포함할 수도 있다:

(i) 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584 중 어느 하나,

(ii) 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 어느 하나 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585의 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567의 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 및/또는

(iii) 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584 중 어느 하나 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수)).

모체 알부민 및/또는 변이체 알부민이 다음을 포함하거나 이들로 구성되는 것이 바람직하다:

(a) SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드에 대하여 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;

(b) 낮은 엄중 조건 하에 (i) SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열, 또는 (ii) (i)의 전체 길이 보체와 잡종화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드;

(c) SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열에 대하여 적어도 60% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 및/또는

(d) SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드의 단편.

하나 이상의 위치에서 변화는 치환, 삽입 및 삭제 중에 독립적으로 선택될 수도 있으며, 치환이 바람직하다.

본 발명은 또한 변이체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드; 핵산 구조, 벡터, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포; 및 변이체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 이들의 단편 및 유익한 치료적 모이어티를 포함하는 콘쥬게이트 또는 결합체 또는 본 발명의 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 및 융합 파트너 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따르는, 변이체 알부민, 이들의 단편, 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 콘쥬게이트를 포함하는 조성물 또는 본 발명에 따르는, 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 결합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 바람직하게 약학적 조성물이다.

본 발명은 추가로 변이체 알부민, 이들의 단편, 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 콘쥬게이트, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 결합체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이며,

상기 변이체 알부민, 이들의 단편, 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 변이체 알부민 또는 단편을 포함하는 콘쥬게이트 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편의 결합체는 HSA 또는 이들의 단편 또는 HSA 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 HSA 또는 이들의 단편의 결합체의 해당 결합 친화도 및/또는 혈장 반감기와 비교하여 FcRn에 대하여 변화된 결합 친화도 및/또는 변화된 혈장 반감기를 가지며, HSA 또는 이들의 단편을 포함한다.

도 1: (i) 전체 길이 성숙한 HSA (Hu_1_2_3), (ii) HSA의 도메인 I 및 도메인 III을 포함하는 알부민 변이체 (Hu_1_3), (iii) HSA의 도메인 II 및 도메인 III을 포함하는 알부민 변이체 (Hu_2_3), (iv) 전체 길이 히말라야 원숭이 (Macaca mulatta) 알부민 (Mac_mul), (v) 전체 길이 집쥐 (래투스 노르베기쿠스 (rattus norvegicus)) 알부민 (Rat) 및 (vi) 전체 길이 생쥐 (무스 무스쿨루스 (Mus musculus)) 알부민 (마우스)의 아미노산 서열의 다중 정렬. 위치 500, 550 및 573 (전체 길이 HSA에 관하여)은 화살표로 나타난다. 도 4에서, 도메인 I, II 및 III은 1, 2 및 3으로 나타난다 (각각).
도 2: 사람, 양, 마우스, 토끼 및 염소의 성숙한 알부민 및 침팬지 "침프 (chimp)", 마카크 (macaque), 햄스터, 기니피그, 래트, 소, 말, 당나귀, 개, 닭, 및 돼지의 미성숙한 알부민의 아미노산 서열의 다중 정렬. 도메인 1, 2 및 3의 시작 및 끝 아미노산 (Dockal et al (The Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274(41): 29303-29310)에 의해 정의됨)은 성숙한 사람 알부민에 관하여 나타난다.
도 3: 그것들의 성질에 기초하는 아미노산의 보존 기.
도 4: HSA의 도메인 구조 및 HSA 히브리드 (hybrid) 분자의 shFcRn 결합 성질. (a) pH-의존적 플렉시블 (flexible) 루프 ('His 166' 표시 바로 아래에 오렌지색 리본) 및 IgG 결합 부위에 관한 His-166 (공-막대 모양의 빨간색 잔기 ('α2' 표시 아래에 및 'Glu115, Glu116' 및 'IgG' 표시의 왼쪽에 공-막대 모양의 잔기))의 위치를 나타내는 shFcRn의 전체적인 구조 (23). (b) 전체 길이 HSA의 결정 구조는 세 개의 α-헬릭스 (helix) 도메인으로 구성된다; DI (핑크색), DII (오렌지색) 및 DIII (청록색/파란색) (19). DIII는 하위 도메인 DIIIa (청록색) 및 DIIIb (파란색)으로 분열된다. (c) 구성된 히브리드 HSA 분자의 도메인 구성 (DI-DII, DI-DIII, DII-DIII, DIII; 도메인은 도 4a 및 4b와 같은 계획으로 셰이딩된다 (shaded)). (d) HSA 도메인 변이체의 SDS-PAGE 겔 이동. (E) pH 6.0에서 고정된 shFcRn을 통해 주사된 WT HSA 및 도메인 조합의 SPR 센서그램. (F) pH 7.4 및 pH 6.0에서 shFcRn에 WT HSA, HSA DIIIa 및 HSA Bartin의 pH 의존적 결합을 나타내는 ELISA.
도 5: shFcRn 결합에 대한 HSA Casebrook의 구조적 영향. (a) HSA에서 Asp-494 주위의 상호작용 네트워크의 클로즈업 (close-up) 뷰. Asp-494는 하위 도메인 DIIIa (청록색) 및 DIIIb (파란색)을 연결하는 루프에 위치한다. Asp-494는 Arg-472와 이온 상호작용 및 Gln417과 수소 결합 상호작용을 형성하며, 둘 다 하위 도메인 DIIIa에 위치한다. Asp-494는 또한 Thr-496과 수소 결합을 형성하고, 따라서 DIIIa 및 DIIIb를 연결하는 루프를 안정화한다. (b) 돌연변이 D494N, D494A, D494Q, E495Q, E495A, T496A 및 D494N/T496A의 SDS-PAGE 겔 이동. WT HSA 및 (c) 재조합에 의해 생성된 Casebrook (D494N), D494A 및 D494Q에 shFcRn의 결합을 나타내는 SPR 센서그램. pH 6.0에서 (d) E495Q 및 E495A 및 (E) T496A 및 D494N/T496A. (F) WT HSA 및 이형 접합체 환자로부터 분리된 Casebrook에 결합하는 shFcRn의 SPR 센서그램. (G) pH 6.0에서 shFcRn에 WT HSA 및 Casebrook의 경쟁적 결합. 수용체는 고정된 HSA를 통해 WT 또는 Casebrook HSA의 적정량의 존재시 주사되었다. (H) pH 6.0에서 WT HSA 및 Q417A에 shFcRn의 결합을 나타내는 SPR 센서그램.
도 6: 보존된 히스티딘은 shFcRn에 결합에 필수적이다. (a) HSA의 DIII에서 선택된 잔기의 위치. 돌연변이 발생 (Asp-494, Glu-495, Lys-500 및 Glu-501)에 대하여 선택된 하위 도메인 DIIIa 및 DIIIb를 연결하는 루프의 잔기, 뿐만 아니라 보존된 히스티딘 (His-464, His-510 및 His-536)과 같은 연결 루프에 근접한 추가적 잔기 및 Lys-536 및 Pro-537은 공-막대 모양으로 나타난다 (고동색). 비-보존된 His-440은 말단에 위치한다. 최종 C-말단 α-헬릭스는 노란색으로 강조된다 (C-말단 α-헬릭스로 표지됨). 산성 pH (6.0)에서 WT HSA 및 (b) P499A, K500A and E501A, 및 (c) H440Q, H464Q, H510Q 및 H535Q, 뿐만 아니라 (c) K536A, P537A 및 K538A에 결합하는 shFcRn의 SPR 센서그램.
도 7: His-166은 pH-의존적 방식으로 플렉시블 루프를 안정화한다. 다른 pH 조건에서 FcRn HC 루프 영역의 클로즈업 뷰. (a) 낮은 pH (4.2)에서, 양전하를 띤 His-166은 shFcRn의 표면 노출된 루프 내 Glu-54 및 Tyr-60과 전하가 안정화된 수소 결합 상호작용을 형성한다 (23). (b) 높은 pH (8.2)에서, 전하를 띠지 않은 His-166은 Glu-54 및 Tyr-60과의 상호작용이 느슨해지고, 잔기 Trp-51 및 Tyr-60 사이의 루프는 플렉시블하고 구조적으로 무질서해진다 (점선으로 나타남) (8). (c) pH 6.0에서 ELISA 웰에 코팅된 HSA의 적정량에 shFcRn WT 및 돌연변이 (E54Q, Q56A 및 H166a) 의 결합.
도 8: 제시된 shFcRn-HSA 도킹 모델.
(a) 'FcRnα1', 'FcRnα2' 및 'FcRnα3'으로 표지된 FcRn HC (녹색), β2m (회색) 및 세 개의 HSA α-헬릭스 도메인 DI (핑크색), DII (오렌지색) 및 DIII (청록색/파란색)을 나타내는, 두 방향으로 도킹된 분자의 개요. DIII 하위 도메인은 DIIIa (청록색) 및 DIIIb (파란색)로 분열된다.
(b) shFcRn (녹색 카툰 (cartoon)) 및 HSA (공간 채움 다이어그램 (그레이 스케일 (grey-scale)에서: 어두운 회색)에 의해 나타난 파란색 표면) 사이의 상호작용 계면의 클로즈업 뷰. HSA의 C-말단 끝 (감색 (그레이 스케일에서:어두운 회색)) 및 하위 도메인 DIIIa 및 DIIIb 사이의 잔기 490-510에 해당하는 루프는 shFcRn (잔기 51-59)의 pH-의존적 및 플렉시블 루프가 결합할 수도 있는HSA 표면에 틈을 형성한다. shFcRn의 His-166은 HSA 잔기 Glu-54 및 Glu-505와 강한, 전하 안정화된 상호작용을 형성할 수도 있다. HSA Glu-505는 shFcRn Arg-162와 추가로 상호작용할 수 있다. 가능한 염다리가 shFcRn의 Lys-150 및 Glu-151 사이에서 HSA의 Glu-501 and Lys-500로 형성된다. HSA 표면상의 클레프트 (cleft)는 DIIIa 및 DIIIb를 연결하는 루프 및 잔기 520-535를 포함하는 α-헬릭스 사이에서 형성된다. shFcRn의 His-161은 낮은 pH에서 HSA의 Glu-531과 상호작용할 수도 있고, 복합체는 shFcRn Glu-168 및 HSA Lys-524 사이의 염다리에 의해 추가로 보강될 수 있다.
(c) 도킹 모델에서 shFcRn (녹색 표면 (도면의 왼쪽 하단의 공간 채움 다이어그램) 및 HSA (핑크색, 파란색 및 청록색 카툰 (리본 다이어그램)) 사이의 상호작용 계면. shFcRn의 β-헤어핀 (hairpin) 루프는 HSA의 도메인 DI (핑크색, 표지 Lys190, Asp108 및 Arg197 등) 및 DIIIa (청록색, 표지 Glu425 및 His464 등) 사이에 끼워진다. shFcRn Asp110은 이 계면의 일부 구조적 재배열에 따라 HSA의 Lys190 또는 Arg197에 대한 파트너일 수 있다. 보존된 His464는 β-헤어핀 루프에 접촉하는 DIIIa α-헬릭스에 위치한다.
도 9: shFcRn-HSA 도킹 모델의 묘사. (a-b) 복합체의 두 방향이 나타난다. 알부민은 공간 채움 다이어그램에 의해 나타나고, FcRn은 리본 다이어그램으로 나타난다. HSA의 코어 결합 계면은 핑크색으로 강조되는 한편 (그레이 스케일에서 이것은 가장 어두운 (거의 검은색) 영역으로 나타난다; DI (CBI)), 계면의 말단에 위치한 지역은 DII (오렌지색) 및 DIII는 하위 도메인 DIIIa (청록색) 및 DIIIb (파란색)로 분열되는 것으로 나타난다.
도 10: pH 6.0 및 pH 7.4에서 HSA Casebrook 돌연변이 시리즈 (100-0.045 μg/ml)에 shFcRn-GST의 결합. ELISA 값은 2배수의 평균을 나타낸다.
도 11: pH 6.0에서 shFcRn-GST에 이형 접합체 개개로부터 분리된 Casebrook HSA 변이체 및 WT HSA (200-1.625 μg/ml)의 결합.
도 12: pH 6.0에서 WT HSA and Casebrook 변이체의 CD 스펙트럼. 각 변이체의 5 μM이 평가되었고 나타난 범위는 5번 실행의 평균을 나타낸다.
도 13: HSA의 히스티딘 변이체의 축소 SDS-PAGE 분석. 레인 1, SeeBlue®Plus2 (6 μl) 및 각각 (2) H440Q, (3) H464Q, (4) H510Q 및 (5) H535Q의 레인 당 1 μg.
도 14: 절단된 WT HSA 및 HSA 변이체 568종결 (최종 17개의 아미노산이 결핍된 절단된 변이체)의 결합. shFcRn에 C-말단 절단된 HSA 변이체의 결합. pH 6.0에서 각각의 10 μM은 고정된 shFcRn (2000 RU)를 통해 주사되었다.
도 15: pH 6.0 및 pH 7.4에서WT HSA 및 HSA E168A (200-0.045 μg/ml)에 shFcRn-GST의 결합. ELISA 값은 2배수의 평균을 나타낸다.
도 16: 두 방향으로, FcRn에 두 개의 리간드 (IgG 및 HSA)의 동시 결합을 나타내는, 제시된 shFcRn-HSA 도킹 모델.
도 17: 결합시 HSA의 하위 도메인 DIII 내에 실질적인 재배열이 나타나지 않지만, HSA DIII에 관하여 HSA DI의 방향으로 많은 이동이 나타나는, 결합된 지방산 및 유리 상태의 HSA의 비교. Myr: 미리스테이트; β2m: β2-미크로글로불린.
도 18: 실시예 1에 설명된 HSA 및 FcRn의 도킹 모델의 HSA (SEQ ID NO:2)의 PDB 파일의 알파 탄소의 추출물이다.
도 19: 실시예 1에 설명된 HSA 및 FcRn의 도킹 모델의 FcRn (FcRn의 SEQ ID NO)의 PDB 파일의 알파 탄소의 추출물이다.
도 20: shFcRn에 C-말단 절단된 HSA 변이체의 결합. pH 6.0에서 각 변이체의 10 μM은 고정된 shFcRn-GST (2000 RU)를 통해 주사되었다.
도 21: C-말단 절단된 HSA 변이체의 경쟁적 결합. 경쟁적 결합은 pH 6.0에서 고정된 HSA (~2200 RU)를 통해 shFcRn-GST (100 nM) 단독 또는 단계 희석된 HSA 변이체와 함께 주사함으로써 측정되었다.
도 22: HSA의 C-말단의 점 돌연변이는 shFcRn에 결합을 조절한다. pH 6.0에서 HSA WT 및 HSA (a) HSA Q580A, (b) HSA K574A 및 (c) HSA K573P/Q580A의 10 μM은 고정된 shFcRn-GST (~2000 RU)를 통해 주사되었다.
도 23: pH 5.5에서 WT HSA, HSA K573P 및 HSA N111Q/K573P의 shFcRn 결합으로서, 샘플은 pH 5.5에서 고정된 shFcRn-HIS (~1500-2500 RU)를 통해 주사되었다.
도 24: 제시된 shFcRn-HSA 도킹 모델은 위치 78-88 및 108-112를 포함하는 HSA의 루프를 포함하는 shFcRn (공간 채움 다이어그램) 및 HSA (리본 다이어그램) DI, DII 및 DIII 사이의 공간적 관계를 나타낸다.

본 발명은 모체 또는 참조 알부민의 분리된 알부민의 변이체 또는 이들의 단, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드에 관한 것이며, 알부민 및 FcRn 사이의 상호작용에 영향을 미치고 및/또는 이에 수반되는 하나 이상 (다수)의 위치에서 변화, 바람직하게 SEQ ID NO: 　2의 성숙한 폴리펩티드의 위치 30 내지 41, 75 내지 91, 104 내지 120, 144 내지 150, 186 내지 201, 414 내지 426, 457 내지 472, 492 내지 538, 550 내지 585, 276, 410, 및/또는 411에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치에서 변화를 포함하며, 이들의 변이체, 단편 또는 융합이 (i) 위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹 및/또는 (ii) 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환)으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 치환을 포함할 때, 이들의 변이체, 단편 또는 융합은 또한 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 변화를 포함한다.

바람직한 변화는 534, 505, 111, 527, 510 및/또는 108과 동등한 위치에서 만들어진 것들을 포함한다 (위치는 SEQ UD NO:2에 관한 것이다). 치환 K534V, E505Q, N111D, T527M, H510D 및 D108A 또는 그것과 동등한 위치에서 이러한 치환이 더 바람직하다. 치환 K534I, K534L, D108E 및 N111E, 또는 이것과 동등한 위치에서 이러한 치환은 또한 그것들이 K534V, D108A and N111D의 잘 보존된 치환이기 때문에 바람직하다. 위치 105 내지 120 (SEQ ID NO: 2에 관하여)을 포함하는 루프와 동등한 위치에서 변화가 바람직하고, 위치 106 내지 115와 동등한 위치가 더 바람직하고 108, 109, 110, 111 및 112와 동등한 위치가 더 바람직하다. 당업자는 여기에 설명된 바와 같이 SEQ ID NO: 2의 그것들과 동등한 위치를 확인할 수 있다.

본 발명은 모체 또는 참조 알부민과 비교하여 FcRn에 대하여 변화된 결합 친화도를 갖는 알부민 변이체 또는 이들의 단편을 제공하고,

(a) SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치: 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 39, 41, 77, 78, 79, 81, 84, 85, 87, 88, 89, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 117, 118, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197 중 어느 하나; 및/또는

(b) SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치: 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 276 중 어느 하나; 및/또는

(c) SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치: 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 561, 566, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583에서 변화 (예를 들어, 치환, 삭제 또는 삽입)를 포함하며,

변이체 또는 이들의 단편의 변화된 결합 친화도는 변화를 포함하지 않는 모체 알부민 또는 단편과 같은 참조의 결합 친화도에 관한 것이다.

(a) (상기)에 설명된 위치는 알부민, 예를 들어, HSA와 같은 폴리펩티드의 첫 번째 도메인 (예를 들어, 도메인 I)에 있을 수도 있다. (b) (상기)에 설명된 위치는 알부민, 예를 들어, HSA 와 같은 폴리펩티드의 두 번째 도메인 (예를 들어, 도메인 II)에 있을 수도 있다. (c) (상기)에 설명된 위치는 알부민, 예를 들어, HSA 와 같은 폴리펩티드의 세 번째 도메인 (예를 들어 도메인 IIII)에 있을 수도 있다.

알부민 변이체 또는 이들의 단편은 SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치에서 변화 (예를 들어, 치환 또는 삽입)를 추가로 포함할 수도 있다:

(i) 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584 중 어느 하나,

(ii) 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 어느 하나 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 및/또는

(iii) 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584 중 어느 하나 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수)).

모체 알부민 및/또는 변이체 알부민은

(a) SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드와 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;

(b) 낮은 엄중 조건 하에 (i) SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열, 또는 (ii) (i)의 전체 길이 성분과 잡종화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드;

(c) SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열과 적어도 60% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 및/또는

(d) SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드의 단편을 포함하거나 이들로 구성되는 것이 바람직하다.

하나 이상의 위치에서 변화는 치환, 삽입 및 삭제 중에 독립적으로 선택될 수도 있으며, 치환이 바람직하다.

본 발명은 또한 잔기 497 내지 585의 위치 (또는 SEQ ID NO: 2에 관하여, 동등한 위치)에 또는 잔기 497 (또는 SEQ ID NO: 2에 관하여, 동등한 위치) 내지 알부민의 성숙한 서열의 최종 잔기의 위치에 종결 코돈의 도입을 포함한다. 종결 코돈은 여기에 언급된 하나 이상 (다수)의 변화 대신 또는 이와 함께 도입될 수도 있다.

본 발명은 FcRn 수용체에 대한 알부민 모이어티의 결합 친화도 (및 그러므로 반감기)가 특정 사용자 또는 출원의 필요를 충족하기 위해 맞춰지는 것을 허용한다. 이러한 맞춤은 반감기의 큰 증가에서 반감기의 작은 증가, 반감기의 작은 감소에서 반감기의 큰 감소의 범위로 다양할 수도 있다. 그러므로 알부민 모이어티 또는 모이어티들은 알부민 모이어티를 포함하는 융합 폴리펩티드, 콘쥬게이트, 결합체, 나노입자 및 조성물의 반감기를 맞추기 위해 사용될 수도 있다. 본 발명은 특히 의약품에 적용 가능하다. 일부 의약품은 예를 들어, 투약 간격을 증가시키는 긴 반감기로부터 이익을 얻는다. 일부 의약품은 예를 들어, 환자의 신체로부터 제거를 가속화하는 짧은 혈장 반감기로부터 이익을 얻는다. 그러므로, 의약품에서 본 발명에 따르는 알부민 모이어티의 사용은 의약품의 반감기가 원하는 만큼 맞춰지는 것을 허용한다.

정의

변이체 : 용어 "변이체"는 하나 이상 (다수)의 변화(들), 즉, 하나 이상 (다수)의 위치에서 치환, 삽입, 및/또는 삭제에 의해 모체 알부민으로부터 유도된 폴리펩티드를 의미한다. 치환은 다른 아미노산으로 위치를 차지하는 아미노산 대체를 의미하고; 삭제는 위치를 차지하는 아미노산의 제거를 의미하고; 삽입은 위치를 차지하는 아미노산에 바로 인접한 하나 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10, 바람직하게 1-3개의 아미노산을 추가하는 것을 의미한다. 치환에 관하여, "바로 인접한"은 위치를 차지하는 아미노산 ('지정된 아미노산')의 N-측 ('업스트림') 또는 C-측 ('다운스트림')에 인접할 수도 있다. 그러므로, 지정된/번호가 매겨진 'X'에 대하여, 위치 'X+1' ('다운스트림') 또는 위치 'X-1' ('업스트림')에서 삽입될 수도 있다.

돌연변이: 용어 "돌연변이"는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

야생형 알부민: 용어 "야생형" (WT) 알부민은 동물에서 또는 사람에서 자연적으로 발견되는 것과 같은 아미노산 서열을 가진 알부민을 의미한다.

FcRn 및 shFcRn : 용어 "FcRn"은 사람 신생아 Fc 수용체 (FcRn)를 의미한다. shFcRn은 FcRn의 가용성 재조합 형태이다. hFcRn은 SEQ ID NO: 30 (주요 조직 적합성 복합체 등급 I-유사 Fc 수용체 (FCGRT)의 절단된 중쇄) 및 SEQ ID NO: 31 (베타-2-미크로글로불린)의 헤테로다이머이다. 더불어, SEQ ID NO: 30 및 31은 hFcRn을 형성한다.

smFcRn : 용어 "smFcRn"은 마우스 신생아 Fc 수용체의 가용성 재조합 형태이다.

분리된 변이체 : 용어 "분리된 변이체"는 사람의 손에 의해 변형되고 그것이 자연적으로 발생하는 적어도 하나의 성분으로부터 완벽히 또는 부분적으로 분리된 변이체를 의미한다. 변이체는 SDS-PAGE 또는 GP-HPLC에 의해 결정된 바와 같이, 적어도 1% 순수, 예를 들어, 적어도 5% 순수, 적어도 10% 순수, 적어도 20% 순수, 적어도 40% 순수, 적어도 60% 순수, 적어도 80% 순수, 및 적어도 90% 순수할 수도 있다.

실질적으로 순수한 변이체 : 용어 "실질적으로 순수한 변이체"는 천연적으로 또는 재조합에 의해 연결된 다른 폴리펩티드 물질의 최대 10 중량%, 최대 8 중량%, 최대 6 중량%, 최대 5 중량%, 최대 4 중량%, 최대 3 중량%, 최대 2 중량%, 최대 1 중량%, 및 최대 0.5 중량%를 함유하는 조제물을 의미한다. 바람직하게, 변이체는 적어도 92 중량% 순수, 예를 들어, 적어도 94 중량% 순수, 적어도 95 중량% 순수, 적어도 96 중량% 순수, 적어도 97 중량% 순수, 적어도 98 중량% 순수, 적어도 99 중량%, 적어도 99.5 중량% 순수, 및 100 중량% 순수한 조제물에 존재하는 총 폴리펩티드 물질이다. 본 발명의 변이체는 바람직하게 실질적으로 순수한 형태로 있다. 이것은 예를 들어, 잘 알려진 재조합 방법에 의해 및 정제 방법에 의해 변이체를 제조함으로써 달성될 수 있다.

성숙한 폴리펩티드: 용어 "성숙한 폴리펩티드"는 어떤 번역 후 변형, 예를 들어, N-말단 가공, C-말단 절단, 글리코실화, 인산화, 등 이후 그것의 최종 형태의 폴리펩티드를 의미한다. 성숙한 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 585일 수도 있으며, 어떤 번역 후 변형도 포함한다.

성숙한 폴리펩티드 암호화 서열: 용어 "성숙한 폴리펩티드 암호화 서열"은 성숙한 알부민 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 1 내지 1758일 수도 있다.

서열 동일성: 두 개의 아미노산 서열 사이 또는 두 개의 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성이 파라미터 "서열 동일성"에 의해 설명된다.

본 발명의 목적을 위해, 두 개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), 바람직하게 3.0.0 이후의 버젼에서 시행된 바와 같이 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 측정된다. 사용된 선택적 파라미터는 10의 갭 오픈 페널티 (gap open penalty), 0.5의 갭 연장 페널티 (gap extension penalty), 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버젼) 치환 매트릭스이다. Needle 표지된 "가장 긴 동일성"의 결과 (-노브리프 옵션을 사용하여 얻어짐)는 퍼센트 동일성으로 사용되고 다음과 같이 계산된다:

(동일한 잔기 x 100)/(정렬의 길이 - 정렬에서 갭의 총 수)

본 발명의 목적을 위해, 두 개의 데옥시리보뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 상기), 바람직하게 3.0.0 이후의 버젼에서 시행된 바와 같이 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, 상기)을 사용하여 결정된다. 사용된 선택적 파라미터는 10의 갭 오픈 페널티, 0.5의 갭 연장 페널티, 및 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버젼) 치환 매트릭스이다. Needle 표지된 "가장 긴 동일성"의 결과 (-노브리프 옵션을 사용하여 얻어짐)는 퍼센트 동일성으로 사용되고 다음과 같이 계산된다:

(동일한 데옥시리보뉴클레오티드 x 100)/(정렬의 길이 - 정렬에서 갭의 총 수)

단편: 용어 "단편"은 FcRn에 결합하는 능력을 유지하는, 알부민의 아미노 및/또는 카르복실 말단 및/또는 알부민의 내부 영역으로부터 삭제된 하나 이상 (다수)의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 HSA로부터 유도된 하나의 중단되지 않은 서열로 구성될 수도 있거나 그것은 HSA로부터 유도된 둘 이상의 (다수)의 서열을 포함할 수도 있다. 본 발명에 따르는 단편은 대략 20개 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게 30개 이상의 아미노산 잔기, 더 바람직하게 40개 이상의 아미노산 잔기, 더 바람직하게 50개 이상의 아미노산 잔기, 더 바람직하게 75개 이상의 아미노산 잔기, 더 바람직하게 100개 이상의 아미노산 잔기, 더 바람직하게 200개 이상의 아미노산 잔기, 더 바람직하게 400개 이상의 아미노산 잔기 및 가장 바람직하게 500개 이상의 아미노산 잔기의 크기를 갖는다. 단편은 알부민의 하나 이상의 도메인, 예를 들어, D+DII, D+DIII, DI+DIII, DII+DIII, D+DII+DIII, DII+DIII +DIII, 또는 이러한 도메인의 단편 또는 도메인의 조합을 포함하거나 이들로 구성될 수도 있다.

도메인 I, II 및 III은 HSA (SEQ ID NO: 2)에 관하여 정의될 수도 있다. 예를 들어, HSA 도메인 I은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 194 (± 1 내지 15개의 아미노산)로 구성되거나 이를 포함할 수도 있고, HSA 도메인 II는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 192 (1 내지 15개의 아미노산) 내지 387 (± 1 내지 15개의 아미노산)로 구성되거나 이를 포함할 수도 있고 도메인 III은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 381 (± 1 내지 15개의 아미노산) 내지 585 (± 1 내지 15개의 아미노산)로 구성되거나 이를 포함할 수도 있다. "± 1 내지 15개의 아미노산"은 잔기 수가 정해진 아미노산 위치의 C-말단 및/또는 N-말단으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 아미노산만큼 벗어날 수도 있다는 것을 의미한다. 도메인 I, II 및 III의 예는 Dockal et al (The Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274(41): 29303-29310) 및 Kjeldsen et al (Protein Expression and Purification, 1998, Vol 13: 163-169)에 의해 설명되고 하기 표로 나타난다.

당업자는 HSA에 대한 아미노산 서열 정렬에 의해, 예를 들어, EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), 바람직하게 3.0.0 이후의 버젼에서 시행된 바와 같이 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 비-사람 알부민의 도메인 I, II 및 III를 확인할 수 있다. 사용된 선택적 파라미터는 10의 갭 오픈 페널티, 0.5의 갭 연장 페널티, 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버젼) 치환 매트릭스이다. 다른 적합한 소프트웨어는 MUSCLE (로그-예측에 의한 다중 서열 비교 (Multiple sequence comparison by log-expectation), Robert C. Edgar, 버젼 3.6, http://www.drive5.com/muscle; Edgar (2004) 핵산s Research 32(5), 1792-97 및 Edgar (2004) BMC Bioinformatics, 5(1):113)를 포함하며, 이것은 유저 가이드 (user guide) (버젼 3.6, 2005년 9월)에 설명된 바와 같이 기본 설정으로 사용될 수도 있다. MUSCLE의 3.6 이후의 버젼이 또한 본 발명의 어떤 양태에 대해서도 사용될 수 있다. 적합한 정렬의 예는 도 1 및 2에 제공된다.

대립유전자 변이체 : 용어 "대립유전자 변이체"는 같은 염색체 자리를 차지하는 유전자의 둘 이상의 대체 형태 중 어느 하나를 의미한다. 대립유전자 변화는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하고, 집단 내에 다형 현상 (다형 현상)을 일으킬 수도 있다. 유전자 돌연변이는 침묵할 수 있거나 (암호화된 폴리펩티드에서 변화 없음) 변화된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 수도 있다. 폴리펩티드의 대립유전자 변이체는 유전자의 대립유전자 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드이다.

암호화 서열: 용어 "암호화 서열"은 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 이것은 그것의 번역된 폴리펩티드 생성물의 아미노산 서열을 직접 명시한다. 암호화 서열의 경계는 일반적으로 오픈 리딩 프레임에 의해 결정되며, 이것은 보통 ATG 시작 코돈 또는 GTG 및 TTG와 같은 대체 시작 코돈으로 시작하고 TTA, TAG, 및 TGA와 같은 종결 코돈으로 끝난다. 암호화 서열은 DNA, cDNA, 합성, 또는 재조합 폴리뉴클레오티드일 수도 있다.

cDNA : 용어 "cDNA"는 진핵세포로부터 얻은 성숙한, 스플라이싱된 (spliced), mRNA 분자로부터 역전사에 의해 제조될 수 있는 DNA 분자를 의미한다. cDNA는 해당 게놈 DNA에 존재할 수도 있는 인트론 서열이 결핍된다. 처음의, 주요 RNA 전사물은 성숙한 스플라이싱된 mRNA로 나타나기 전에, 스플라이싱을 포함하는 연속적인 단계를 통해 가공되는 mRNA에 대한 전구체이다.

핵산 구조: 용어 "핵산 구조"는 단일- 또는 이중-가닥의, 핵산 분자를 의미하며, 이것은 자연 발생한 유전자로부터 분리되거나 달리 자연에 존재하지 않거나 합성인 방식으로 핵산의 세그먼트를 함유하도록 변형된다. 용어 핵산 구조는 핵산 구조가 본 발명의 암호화 서열의 발현에 필요한 대조군 서열을 함유할 때 용어 "발현 카세트"와 동의어이다.

대조군 서열: 용어 "대조군 서열"은 본 발명의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필수적인 모든 성분을 의미한다. 각각의 대조군 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 원래의 또는 외부의 것 또는 서로 원래의 또는 외부의 것일 수도 있다. 이러한 대조군 서열은 선도, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열, 및 전사 종결자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 최소한으로, 대조군 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함한다. 대조군 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 암호화 영역 내에 대조군 서열의 결찰을 가능하게 하는 특정 제한 부위를 도입할 목적으로 결합자와 함께 제공될 수도 있다.

작동 가능하게 결합됨 : 용어 "작동 가능하게 결합됨"은 대조군 서열이 암호화 서열의 발현을 지시하도록 폴리뉴클레오티드의 암호화 서열에 관하여 적절한 위치에 대조군 서열이 배치되는 구조를 의미한다.

발현: 용어 "발현"은 전사, 전사 후 변형, 번역, 번역 후 변형, 및 분비를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 변이체의 생산에 수반된 어떤 단계도 포함한다.

발현 벡터: 용어 "발현 벡터"는 변이체를 암호화하는 폴리펩티드를 포함하고 그것의 발현을 위해 제공되는 추가적인 뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합하는 선형 또는 원형 DNA 분자를 의미한다.

숙주 세포: 용어 "숙주 세포"는 형질전환, 트랜스펙션, 형질도입, 등에 민감한 어떤 세포 타입도 의미하며, 핵산 구조 또는 발현 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "숙주 세포"는 복제 중에 발생하는 돌연변이로 인해 모체 세포와 동일하지 않은 모체 세포의 어떤 자손도 포함한다.

혈장 반감기: 혈장 반감기는 이상적으로 적합한 개체의 생체 내에서 결정된다. 하지만, 시간 및 비용이 많이 소모되고 동물 또는 사람에서 실험을 수행하는 것과 관련된 윤리적 문제가 불가피하기 때문에, 혈장 반감기가 연장되거나 감소하는지 결정하기 위해 시험관 내 검정을 사용하는 것이 바람직하다. 알부민의, 그것의 수용체 FcRn에 결합은 혈장 반감기에 중요하다는 것이 알려져 있고 수용체 결합 및 혈장 반감기 사이의 연관성은 알부민의 그것의 수용체에 대한 더 높은 친화도가 더 긴 혈장 반감기로 이어진다는 것이다. 따라서 본 발명에 대하여 알부민의 FcRn에 대한 더 높은 친화도는 증가한 혈장 반감기를 나타내고 알부민의 그것의 수용체에 대하여 더 낮은 친화도는 감소된 혈장 반감기를 나타내는 것으로 생각된다.

이 출원 및 청구범위에서, 알부민의 그것의 수용체 FcRn에 대한 결합은 용어 친화도 및 표현 "더 강한" 또는 "더 약한"을 사용하여 설명된다. 따라서, HSA보다 더 높은 FcRn에 대한 친화도를 갖는 분자는 HSA보다 더 강하게 FcRn에 결합하는 것으로 생각되고 HSA보다 더 낮은 FcRn에 대한 친화도를 갖는 분자는 HSA보다 더 약하게 FcRn에 결합하는 것으로 생각된다.

용어 "더 긴 혈장 반감기" 또는 "더 짧은 혈장 반감기" 및 유사한 표현은 해당 모체 또는 참조 또는 해당 알부민 분자에 관련되는 것으로 생각된다. 따라서, 더 긴 혈장 반감기

본 발명의 변이체 알부민에 관하여 더 긴 혈장 반감기는 변이체가, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드의 30 내지 41, 75 내지 91, 104 내지 120, 144 내지 150, 186 내지 201, 414 내지 426, 457 내지 472, 492 내지 538, 550 내지 585, 276, 410, 및/또는 411에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치에서, 여기에 설명된 변화(들)를 제외하고 같은 서열을 갖는 해당 알부민보다 더 긴 혈장 반감기를 갖는다는 것을 의미하며, 변이체, 단편 또는 융합 폴리펩티드가 (i) 위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹, (ii) 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 변화 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 또는 (iii) 위치 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584로 구성된 그룹 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수))으로부터 선택된 하나 이상 (다수)의 변화를 포함할 때, 폴리펩티드는 또한 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585, 또는 잔기 497 (또는 SEQ ID NO: 2에 관하여, 동등한 위치) 내지 알부민의 성숙한 서열의 최종 잔기로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 변화를 포함하는 것이 바람직하다. 종결 돌연변이는 여기에 언급된 하나 이상 (다수)의 변화 대신에 또는 이와 함께 도입될 수도 있다.

참조: 참조는 알부민 변이체, 융합체, 콘쥬게이트, 조성물, 결합체 또는 나노입자가 비교되는 알부민, 융합체, 콘쥬게이트, 조성물, 결합체 또는 나노입자이다. 참조는 이들의 단편의 전체 길이 알부민 (예를 들어, HSA 또는 이들의 천연 대립유전자)를 포함하거나 이들로 구성될 수도 있다. 참조는 또한 알부민 변이체, 융합체, 콘쥬게이트, 조성물, 결합체 또는 나노입자가 비교되는 '해당' 알부민, 융합체, 콘쥬게이트, 조성물, 결합체 또는 나노입자로 나타날 수도 있다. 참조는 HSA (SEQ ID NO: 2) 또는 a 이들의 단편, 융합체, 콘쥬게이트, 결합체, 나노입자 또는 미크로입자를 포함하거나 이들로 구성될 수도 있다. 바람직하게도, 참조는 알부민 모이어티를 제외하고 본 발명에 따르는 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 콘쥬게이트, 조성물, 결합체, 나노입자 또는 미크로입자와 동일하다 ("연구되고 있음"). 바람직하게 참조의 알부민 모이어티는 알부민 (예를 들어 HSA, SEQ ID NO: 2) 또는 이들의 단편을 포함하거나 이들로 구성된다. 참조의 알부민 모이어티의 아미노산 서열은 본 발명에 따르는 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 콘쥬게이트, 조성물, 결합체, 나노입자 또는 미크로입자의 알부민 모이어티의 아미노 서열보다 더 긴, 또는 더 짧은, 또는 바람직하게 같은 길이 (± 1 내지 15개의 아미노산)일 수도 있다 ("연구되고 있음").

동등한 아미노산 위치: 이 명세서를 통해, 아미노산의 위치는 전체 길이 성숙한 사람 혈청 알부민 (즉, 선도 서열 없이, SEQ ID NO: 2)에 관하여 정의된다. 하지만, 당업자는 본 발명이 또한 비-사람 알부민의 변이체 (예를 들어, 여기에 개시된 것들) 및/또는 사람 또는 비-사람 알부민의 단편과 관련된 것으로 생각한다. 동등한 위치는 짝으로 (예를 들어, ClustalW) 또는 다중 (예를 들어 MUSCLE) 정렬을 사용하여 아미노산 서열을 비교함으로써 사람 혈청 알부민의 단편에서, 동물 알부민에서 및 이들의 단편, 융합 및 다른 유도체 또는 변이체에서 확인될 수 있다. 예를 들어, 도 1은 전체 길이 사람 혈청 알부민의 500, 550 및 573과 동등한 위치는 사람 혈청 알부민의 단편 및 다른 종의 알부민에서 쉽게 확인된다. 위치 500, 550 및 573은 화살표로 나타난다. 더 상세한 설명은 하기 표 1에 제공된다.

표 1: HSA, 동물 알부민 및 알부민 단편에서 동등한 위치의 확인의 예

도 1은 ClustalW 1.81 포맷의 출력을 포함하는 기본 파라미터를 사용하여 MUSCLE에 의해 발생하였다. 미가공 출력 데이터는 출력 포맷: RTF_new; 글꼴 크기: 10; 공통 라인: 공통 라인 없음; 서열의 일부 (셰이딩에 동의해야 함): 0.5; 입력 서열 포맷: ALN을 사용하는 BoxShade 3.21 (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)를 사용하여 셰이딩되었다. 그러므로, 이 명세서를 통해 사람 혈청 알부민에서 정의된 아미노산 위치는 또한 사람 혈청 알부민, 다른 종의 동물의 단편, 유도체 또는 변이체 및 융합체 및 이들의 단편 및 융합체에서 동등한 위치에 적용된다. 이러한 동등한 위치는 그것의 원래의 단백질에서 다른 잔기 수 및/또는 (II) 그것의 원래의 단백질에서 다른 본래의 아미노산을 가질 수도 있다.

유사하게도, 도 2는 동등한 위치가 SEQ ID NO: 2 (HSA)에 관하여 알부민의 단편 (예를 들어, 도메인)에서 확인될 수 있다는 것을 나타낸다.

변이체의 설계에 대한 관습

본 발명의 목적을 위해, SEQ ID NO: 2에 개시된 성숙한 폴리펩티드는 또 다른 알부민에서 해당하는 아미노산 잔기를 결정하기 위해 사용된다. 또 다른 알부민의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 개시된 성숙한 폴리펩티드로 정렬되고, 정렬에 기초하여, SEQ ID NO: 2에 개시된 성숙한 폴리펩티드에서 어떤 아미노산 잔기에도 해당되는 아미노산 위치 번호는 EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), 바람직하게 3.0.0 이후의 버젼에서 시행된 바와 같이 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 결정된다.

또 다른 알부민에서 해당하는 아미노산 잔기의 확인은 "ClustalW"를 사용하여 다수의 폴리펩티드 서열의 정렬에 의해 확인될 수 있다 (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948).

또 다른 폴리펩티드 (또는 단백질)가 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드에서 나누어지고 전통적인 서열-기반 비교가 그것들의 관계를 검출하는 것에 실패할 때 (Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), 다른 짝 서열 비교 알고리즘이 사용될 수 있다. 서열-기반 검색에서 더 큰 민감도는 데이터베이스를 검색하기 위해 폴리펩티드 패밀리 (프로파일)의 확률론적 표현을 이용하는 검색 프로그램을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, PSI-BLAST 프로그램은 반복적인 데이터베이스 검색 과정을 통해 프로파일을 생성하고 먼 상동체를 검출할 수 있다 (Atschul et al., 1997, Nucleic acids Res. 25: 3389-3402). 폴리펩티드에 대한 패밀리 또는 슈퍼패밀리가 단백질 구조 데이터베이스에서 하나 이상의 견본을 가지면, 더 큰 민감도가 달성될 수 있다. GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881)와 같은 프로그램은 쿼리 (query) 서열에 대한 구조적 폴드 (fold)을 예측하는 신경망에 입력으로서 다양한 출처 (PSI-BLAST, secondary structure prediction, structural alignment profiles, 및 solvation potentials)의 정보를 이용한다. 유사하게, Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919의 방법은 SCOP 데이터베이스에 존재하는 슈퍼패밀리 모델 내 미확인 구조의 서열을 정렬하기 위해 사용될 수 있다. 이들 정렬은 폴리펩티드에 대한 상동성 모델을 발생시키기 위해 차례로 사용될 수 있고, 이러한 모델은 그 목적을 위해 개발된 다양한 도구를 사용하여 정확성이 평가될 수 있다.

알려진 구조의 단백질에 대하여, 여러 도구 및 공급원이 구조적 정렬을 회수하고 생성하는데 이용 가능하다. 예를 들어, 단백질의 SCOP 슈퍼패밀리는 구조적으로 정렬되었고, 그들 정렬은 접근 가능하고 다운로드 가능하다. 둘 이상의 단백질 구조는 거리 정렬 매트릭스 (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) 또는 결합 연장 (Shindyalov and Bourne, 1998, 단백질 Engineering 11: 739-747)과 같은 다양한 알고리즘을 사용하여 정렬될 수 있고, 이들 알고리즘의 실행은 가능한 구조적 상동체를 발견하기 위해 원하는 구조가 있는 쿼리 구조 데이터베이스에 추가적으로 이용될 수 있다 (예를 들어, Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

본 발명의 알부민 변이체를 설명하는데 있어서, 하기 설명된 명명법은 참고의 편의를 위해 적용된다. 승인된 IUPAC 단일 문자 또는 세 가지 문자 아미노산 약자가 이용된다. 용어 '점 돌연변이' 및/또는 '변화'는 삭제, 삽입 및 치환을 포함한다.

치환. 아미노산 치환을 위해, 다음 명명법이 사용된다: 본래의 아미노산, 위치, 치환된 아미노산. 따라서, 예를 들어, 위치 226에서 알라닌으로 트레오닌의 치환은 "Thr226Ala" 또는 "T226A"로 지정된다. 다수의 돌연변이 (또는 변화)는 추가 표시 ("+")에 의해 구별되는데, 예를 들어, "Gly205Ar+Ser411Phe" 또는 "G205+S411F"이며, 각각 위치 205 및 411에서 아르기닌 (R)로 글리신 (G) 및 페닐알라닌 (F)로 세린 (S)의 치환을 나타낸다. 도면은 또한 ("/")를 허용하는데, 예를 들어, "E492T/N503D"이며, 이것은 ("+")와 교체 가능한 것으로 보여져야 한다.

삭제. 아미노산 삭제를 위해, 다음 명명법이 사용된다: 본래의 아미노산, 위치*. 따라서, 위치 195에서 글리신의 삭제는 "Gly195*" 또는 "G195*"로 지정된다. 다수의 삭제는 표시 ("+")에 의해 구별되는데, 예를 들어, "Gly195+Ser411*" 또는 "G195+S411*"이다.

삽입. 상기 설명된 바와 같이, 삽입은 위치를 차지하는 아미노산 '명명된 (또는 원래의) 아미노산', 'X')의 N-측 ('업스트림', 'X-1') 또는 C-측 ('다운스트림', 'X+1')에 있을 수도 있다.

본래의 아미노산 ('X')의 C-측 ('다운스트림', 'X+1')에 아미노산 삽입을 위해, 다음 명명법이 사용된다: 본래의 아미노산, 위치, 본래의 아미노산, 삽입된 아미노산. 따라서 위치 195에서 글리신 다음에 리신의 삽입은 "Gly195GlyLys" 또는 "G195GK"로 지정된다. 다수의 아미노산의 삽입은 [본래의 아미노산, 위치, 본래의 아미노산, 삽입된 아미노산 #1, 삽입된 아미노산 #2; 등]으로 지정된다. 예를 들어, 위치 195에서 글리신 다음에 리신 및 알라닌의 삽입은 "Gly195GlyLysAla" 또는 "G195GKA"로 나타난다.

이러한 경우에, 삽입된 아미노산 잔기(들)는 삽입된 아미노산 잔기(들)에 선행하는 아미노산 잔기의 위치 번호에 소문자의 추가에 의해 번호가 매겨진다. 상기 예에서, 따라서 순서는 다음과 같을 것이다:

본래의 아미노산 (X)의 N-측 ('업스트림', 'X-1')에 아미노산 삽입을 위해, 다음 명명법이 사용된다: 본래의 아미노산, 위치, 삽입된 아미노산, 본래의 아미노산. 따라서, 위치 195에서 글리신 (G) 사전에 리신 (K)의 삽입은 "Gly195LysGly" 또는 "G195KG"로 지정된다. 다수의 아미노산의 삽입은 [본래의 아미노산, 위치, 삽입된 아미노산 #1, 삽입된 아미노산 #2; 등, 본래의 아미노산]으로 지정된다. 예를 들어, 위치 195에서 글리신 전에 리신 (K) 및 알라닌 (a) 의 삽입은 "Gly195LysAlaGly" 또는 "G195KAG"로 나타난다. 이러한 경우에, 삽입된 아미노산 잔기(들)은 삽입된 아미노산 잔기(들)에 이은 아미노산 잔기의 위치 번호에 프라임 (prime)이 있는 소문자의 추가에 의해 번호가 매겨진다. 상기 예에서, 따라서 서열은 다음과 같을 것이다:

다수의 변화. 다중 변화를 포함하는 변이체는 표시 ("+")의 추가에 의해 구별되는데, 예를 들어, "Arg170Ty+Gly195Glu" 또는 "R170+G195E"이며, 각각 위치 170 및 195에서 아르기닌 및 글리신에 대한 티로신 및 글루탐산의 치환을 나타낸다.

다른 치환. 다른 치환이 위치에 도입될 수 있는 경우, 다른 치환은 콤마 (comma) 에 의해 구별되는데, 예를 들어, "Arg170Tyr,Glu"이며, 위치 170에서 티로신 또는 글루탐산으로 아르기닌의 치환을 나타낸다. 따라서, "Tyr167Gly,Al+Arg170Gly,Ala"는 다음 변이체를 지정한다:

"Tyr167Gl+Arg170Gly", "Tyr167Gl+Arg170Ala", "Tyr167Al+Arg170Gly", 및 "Tyr167Al+Arg170Ala".

모체 알부민

알부민은 단백질이고 포유동물의 혈장에서 가장 풍부한 단백질을 구성하고 포유동물의 긴 숫자의 알부민은 생화학적 방법 및/또는 서열 정보에 의해 특성화되었다. 여러 알부민, 예를 들어, 사람 혈청 알부민 (HSA)은 또한 결정학적으로 특성화되었고 구조가 결정되었다 (HSA: He XM, Carter DC (July 1992). "Atomic structure and chemistry of human serum albumin". Nature 358 (6383): 209-15; horse albumin: Ho, J.X. et al. (2001). X-ray and 1차 구조 of horse serum albumin (Equus caballus) at 0.27-nm resolution. Eur J Biochem. 215(1):205-12).

용어 "모체" 또는 "모체 알부민"은 변화가 본 발명의 알부민 변이체를 생산하기 위해 사람의 손으로 만들어진 알부민을 의미한다. 모체는 자연 발생한 (야생형) 폴리펩티드 또는 이들의 대립유전자, 또는 이들의 변이체일 수도 있다.

용어 "알부민"은 HSA 또는 HSA 도메인과 같은 및/또는 매우 유사한 3차원 구조를 갖는 단백질을 의미하고 유사한 성질을 갖는다. 유사한 3차원 구조는 예를 들어, 모체 알부민 하에 언급된 종의 알부민의 구조이다. 알부민의 주요 성질 중 일부는 그것이 정상 혈장의 삼투 효과 중 85%, 약 19일 ± 5일의 긴 혈장 반감기, 리간드-결합, 예를 들어, 빌리루빈, 지방산, 헤민 및 티록신을 포함하는 산성, 친유성 화합물과 같은 내인성 분자의 결합 (또한 Kragh-Hansen et al, 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695의 표 1을 참고하면 되며, 본원에 참고로 포함된다), 산성 또는 음전기 특징을 갖는 작은 유기 화합물, 예를 들어, 와파린, 디아제팜, 이부프로펜 및 파클리탁셀과 같은 약물의 결합 (또한 Kragh-Hansen et al, 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695의 표 1을 참고하면 되며, 본원에 참고로 포함된다)에 기여하기 때문에, 혈장 부피를 조절하는 그것의 능력이다. 이들 성질 모두가 알부민으로서 단백질 또는 단편을 특성화하기 위해 충족될 필요는 없다.

HSA는 본 발명에 따르는 바람직한 알부민이고 585개의 아미노산잔기로 구성된 단백질이고 67 kDa의 분자량을 갖는다. 그것의 자연의 형태에서 그것은 글리코실화되지 않는다. HSA의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2에서 나타난다. 당업자는 HSA와 근본적으로 같은 성질을 갖지만 SEQ ID NO: 2와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변화를 갖는 자연의 대립유전자가 존재할 수도 있다는 것을 인정할 것이고, 발명자는 또한 본 발명에 따르는 모체 알부민으로서 이러한 자연의 대립유전자의 사용을 고려한다.

알부민은 대략 20일 이상의 일반적으로 긴 혈장 반감기를 갖는데, 예를 들어, HSA는 19일의 혈장 반감기를 갖는다. HSA의 긴 혈장 반감기가 그것의 수용체 FcRn과 상호작용을 통해 조절되는 것으로 알려져 있지만, HSA의 긴 반감기의 뒤에 정확한 메카니즘의 이해 또는 지식이 본 발명에 필수적인 것은 아니다.

본 발명에 따라, 용어 "알부민"은 HSA와 같은, 또는 매우 유사한 3차원 구조를 갖고 긴 혈장 반감기를 갖는 단백질을 의미한다. 본 발명에 따르는 알부민 단백질의 예로서 사람 혈청 알부민 (예를 들어 AAA98797 또는 P02768-1, SEQ ID NO: 2 (성숙), SEQ ID NO: 4 (미성숙)), 영장류 혈청 알부민, (예를 들어, 침팬지 혈청 알부민 (예를 들어, 예측된 서열 XP_517233.2 SEQ ID NO: 5), 고릴라 혈청 알부민 또는 마카크 혈청 알부민 (예를 들어 NP_001182578, SEQ ID NO: 6), 설치류 혈청 알부민 (예를 들어, 햄스터 혈청 알부민 (예를 들어 A6YF56, SEQ ID NO: 7), 기니피그 혈청 알부민 (예를 들어 Q6WDN9-1, SEQ ID NO: 8), 마우스 혈청 알부민 (예를 들어 AAH49971 또는 P07724-1 버젼 3, SEQ ID NO: 9) 및 래트 혈청 알부민 (예를 들어 AAH85359 또는 P02770-1 버젼 2, SEQ ID NO: 10)), 소 혈청 알부민 (예를 들어 소 혈청 알부민 P02769-1, SEQ ID NO: 11), 말 혈청 알부민, 예를 들어, 말 혈청 알부민 (예를 들어 P35747-1, SEQ ID NO: 12) 또는 당나귀 혈청 알부민 (예를 들어 Q5XLE4-1, SEQ ID NO: 13), 토끼 혈청 알부민 (예를 들어 P49065-1 버젼 2, SEQ ID NO: 14), 염소 혈청 알부민 (예를 들어 ACF10391, SEQ ID NO: 15), 양 혈청 알부민 (예를 들어 P14639-1, SEQ ID NO: 16), 개 혈청 알부민 (예를 들어 P49822-1, SEQ ID NO: 17), 닭 혈청 알부민 (예를 들어 P19121-1 버젼 2, SEQ ID NO: 18) 및 돼지 혈청 알부민 (예를 들어 P08835-1 버젼 2, SEQ ID NO: 19) 또는 이러한 알부민과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 적어도 99% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드가 언급될 수 있다. 모체 또는 참조 알부민은 인공적 변이체, 예를 들어, HSA K573P (SEQ ID NO: 3) 또는 키메라 알부민, 예를 들어, HSA의 N-말단 및 마카카 알부민 (SEQ ID NO: 20)의 C-말단, HSA의 N-말단 및 마우스 알부민 (SEQ ID NO: 21)의 C-말단, HSA의 N-말단 및 토끼 알부민 (SEQ ID NO: 22)의 C-말단, HSA의 N-말단 및 양 알부민 (SEQ ID NO: 23)의 C-말단일 수도 있다.

알부민의 다른 예는 오발부민 (예를 들어 P01012.pro: 닭 오발부민; O73860.pro: 칠면조 오발부민)을 포함하며, 이것은 또한 본 출원의 범위에 포함된다. SEQ ID NO: 2에 개시된 바와 같은 HSA 또는 이들의 어떤 자연 발생한 대립유전자도 본 발명에 따르는 바람직한 알부민이다.

본 발명에 따르는 모체 알부민, 이들의 단편, 또는 알부민 또는 이들의 단편의 알부민 부분을 포함하는 융합 폴리펩티드는 일반적으로 SEQ ID NO: 2에 나타난 HSA의 서열과 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 바람직하게 적어도 80%, 바람직하게 적어도 85%, 바람직하게 적어도 86%, 바람직하게 적어도 87%, 바람직하게 적어도 88%, 바람직하게 적어도 89%, 바람직하게 적어도 90%, 바람직하게 적어도 91%, 바람직하게 적어도 92%, 바람직하게 적어도 93%, 바람직하게 적어도 94%, 바람직하게 적어도 95%, 더 바람직하게 적어도 96%, 더 바람직하게 적어도 97%, 더 바람직하게 적어도 98% 및 가장 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 서열 동일성은 SEQ ID NO: 2의 전체 길이 또는 단편으로 구성되거나 이를 포함하는 분자, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 하나 이상의 도메인, 예를 들어, 도메인 III (예를 들어 SEQ ID NO: 27)로 구성되거나 이를 포함하는 분자, 도메인 II 및 도메인 III (예를 들어 SEQ ID NO: 25)로 구성되거나 이를 포함하는 분자, 도메인 I 및 도메인 III (예를 들어 SEQ ID NO: 24)으로 구성되거나 이를 포함하는 분자, 도메인 III (예를 들어 SEQ ID NO: 26)의 두 개의 카피로 구성되거나 이를 포함하는 분자, 메인 III (예를 들어 SEQ ID NO: 28)의 세 개의 카피로 구성되거나 이를 포함하는 분자 또는 도메인 I 및 도메인 III (예를 들어 SEQ ID NO: 29)의 두 개의 카피로 구성되거나 이를 포함하는 분자에 걸쳐 있을 수도 있다.

모체는 바람직하게 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다. 모체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드를 포함하거나 이들로 구성될 수도 있다.

또 다른 구체예에서, 모체는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드의 대립유전자 변이체이다.

모체 알부민은 매우 낮은 엄중 조건, 낮은 엄중 조건, 중간 엄중 조건, 중간-높은 엄중 조건, 높은 엄중 조건, 또는 매우 높은 엄중 조건 하에 (i) SEQ ID NO: 　1의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열, (ii) SEQ ID NO: 　1의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 전체 길이 대응 가닥과 잡종화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수도 있다 (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York).

SEQ ID NO: 1의 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 부분서열, 뿐만 아니라 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 이들의 단편은 업계에 잘 알려진 방법에 따라 다른 속 또는 종의 균주의 모체를 암호화하는 DNA를 확인하고 클로닝하도록 핵산 프로브를 설계하기 위해 사용될 수도 있다. 특히, 이러한 프로브는 표준 서던 블로팅 (southern blotting) 과정 후, 그 안에서 해당 유전자를 확인하고 분리하기 위해, 원하는 속 또는 종의 게놈 또는 cDNA와 잡종화에 사용될 수 있다. 이러한 프로브는 전체 서열보다 훨씬 더 짧을 수 있지만, 길이가 적어도 14, 예를 들어, 적어도 25, 적어도 35, 또는 적어도 70개의 뉴클레오티드여야 한다. 바람직하게, 핵산 프로브는 길이가 적어도 100개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 길이가 적어도 200개의 뉴클레오티드, 적어도 300개의 뉴클레오티드, 적어도 400개의 뉴클레오티드, 적어도 500개의 뉴클레오티드, 적어도 600개의 뉴클레오티드, 적어도 700개의 뉴클레오티드, 적어도 800개의 뉴클레오티드, 또는 적어도 900개의 뉴클레오티드이다. DNA 및 RNA 프로브 둘 다가 사용될 수 있다. 프로브는 전형적으로 해당 유전자를 검출하기 위해 표지된다 (예를 들어, ³²P, ³H, ³⁵S, 비오틴, 또는 아비딘). 이러한 프로브는 본 발명에 의해 포함된다.

이러한 다른 유기체로부터 제조된 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리는 상기 설명된 프로브와 잡종화되고 모체를 암호화하는 DNA에 대하여 스크리닝될 수도 있다. 이러한 다른 유기체의 게놈 또는 다른 DNA는 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 다른 분리 기술에 의해 분리될 수도 있다. 라이브러리의 DNA 또는 분리된 DNA는 니트로셀룰로스 또는 다른 적합한 운반 물질로 이동하고 이에 고정될 수도 있다. SEQ ID NO: 1 또는 이들의 부분 서열과 상동성인 클론 또는 DNA를 확인하기 위해, 운반 물질이 서던 블롯에 사용된다.

본 발명의 목적을 위해, 잡종화는 폴리뉴클레오티드가 낮은 내지 매우 높은 엄중 조건 하에 SEQ ID NO: 1, 그것의 대응 가닥, 또는 이들의 부분서열에 나타난 폴리뉴클레오티드에 해당하는 표지된 뉴클레오티드 프로브에 잡종화된다는 것을 나타낸다. 프로브가 잡종화되는 분자는 예를 들어, X-선 필름 또는 업계에 알려진 어떤 다른 검출 방법을 사용하여, 검출될 수 있다.

핵산 프로브는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열, 즉, SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 1 내지 1785를 포함하거나 이들로 구성될 수도 있다. 핵산 프로브는 SEQ ID NO: 2 또는 이들의 단편의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 구성될 수도 있다.

길이가 적어도 100개의 뉴클레오티드의 긴 프로브에 대하여, 매우 낮은 내지 매우 높은 엄중 조건은 선택적으로 12 내지 24시간 동안 표준 서던 블로팅 후, 42 ℃에서 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 미크로그램/ml 전단되고 변성된 연어 정자 DNA, 및 매우 낮은 및 낮은 엄중에 대하여 25% 포름아미드, 중간 및 중간-높은 엄중에 대하여 35% 포름아미드, 또는 높은 및 매우 높은 엄중에 대하여 50% 포름아미드에서 사전 잡종화 및 잡종화로서 정의된다. 운반 물질은 최종적으로 45 ℃ (매우 낮은 엄중), 50 ℃ (낮은 엄중), 55 ℃ (중간 엄중), 60 ℃ (중간-높은 엄중), 65 ℃ (높은 엄중), 또는 70 ℃ (매우 높은 엄중에서 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 각각 15분 동안 세 번 세척된다.

길이가 약 15개의 뉴클레오티드 내지 약 70개의 뉴클레오티드인 짧은 프로브에 대하여, 엄중 조건은 선택적으로 12 내지 24시간 동안 표준 서던 블로팅 후. Bolton 및 McCarthy (1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 1390)에 따르는 계산을 사용하여 계산된 T_m보다 낮은 약 5 ℃ 내지 약 10 ℃에서 0.9 M NaCl, 0.09 M Tris-HCl pH 7.6, 6 mM EDTA, 0.5% NP-40, 1X 덴하르트 용액 (Denhardt's solution), 1 mM 나트륨 피로포스페이트, 1 mM 일염기 나트롬 포스페이트, 0.1 mM ATP, 및 ml 당 0.2 mg의 효모 RNA로 사전 잡종화 및 잡종화로서 정의된다. 운반 물질은 최종적으로 계산된 Tm보다 낮은 5 ℃ 내지 10 ℃에서 6X SCC 플러스 0.1% SDS로 15분 동안 한 번 및 6X SSC를 사용하여 각각 15분 동안 두 번 세척된다.

모체는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수도 있으며, 이것은 알부민으로서 기능할 수 있는 폴리펩티드를 암호화한다. 구체예에서, 모체는 SEQ ID NO: 1을 포함하거나 이로 구성된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.

알부민 모이어티

본 발명에 따르는 알부민 변이체 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 콘쥬게이트, 결합체, 나노입자 또는 조성물의 알부민 부분은 "알부민 모이어티" 또는 "알부민 성분"으로 나타날 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 알부민 모이어티를 포함하거나 이로 구성될 수도 있다.

본 발명의 특정 양태가 하기 논의된다:

변이체의 제조

본 발명의 첫 번째 양태는 바람직하게 참조 알부민에 관하여 변화된, FcRn (바람직하게 shFcRn)에 대한 결합 친화도 또는 반감기 (예를 들어, 혈장에서)를 갖는, 변이체 알부민, 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드인 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이며, 방법은 다음의 단계를 포함한다:

a. 알부민 또는 이들의 단편 또는 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 알부민 부분에서, FcRn에 대한 알부민의 결합 또는 반감기 (예를 들어 혈장에서)에 중요한 하나 이상 (다수)의 아미노산 잔기 위치를 확인하는 단계;

b. 상기 알부민, 이들의 단편 또는 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 알부민 부분을 암호화하는 핵산을 제공하는 단계;

c. 하나 이상 (다수)의 아미노산 잔기가 a에서 확인된 위치에 위치하고, 삭제, 치환 또는 삽입과 같은 변화, 가장 바람직하게 치환이 있도록, b에 제공된 핵산을 변형하는 단계

d. 적합한 숙주 세포에서 변형된 핵산을 발현하는 단계; 및

e. 변이체 알부민, 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계.

알부민, 이들의 단편 또는 융합 폴리펩티드의 알부민 부분에서, FcRn에 대한 알부민의 결합 또는 반감기 (예를 들어 혈장에서)에 중요한 하나 이상 (다수)의 아미노산 잔기 위치의 확인은 무작위의 돌연변이 발생 후 이어지는 발생한 돌연변이의 분석 및 비-돌연변이된 모체 또는 참조 분자와 비교, 및 구조적 고려사항에 기초한 확인 후 선택적으로 이어지는 확인된 변화를 갖는 변이체의 발생 및 비-돌연변이된 모체 분자와 비교를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 방법으로 실행될 수 있다.

참조 알부민이 여기에 개시되고, 참조 알부민이 HSA (SEQ ID NO: 2)인 것이 특히 바람직하다.

자연의 HSA와 비교하여 변화된 FcRn에 대한 결합 또는 반감기 (예를 들어 혈장에서)를 갖는 변이체 HSA를 제조하기 위해 변화되는 하나 이상 (다수) 아미노산 잔기 위치를 확인하는 바람직한 방법은 다음 단계를 포함한다:

i) 알부민, 예를 들어, HSA의 3차원 구조 (모델)을 제공하는 단계;

ii) FcRn의 3차원 구조 (모델)을 제공하는 단계;

iii) (i)의 알부민 구조 및 (ii)의 FcRn 구조를 함께 결합될 때 알부민 및 FcRn에 의해 형성된 복합체의 구조를 모델링하기 위해 사용하고, 따라서 '도킹 모델'을 생성하는 단계;

iv) FcRn과 상호작용하거나 FcRn과 상호작용에 수반되는 알부민에서 아미노산 잔기를 확인하기 위해 도킹 모델을 사용하는 단계;

단계 iii) 및 iv)는 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 실행될 수 있다.

도킹 모델은 적합한 방법 또는 소프트웨어를 사용하여 제조될 수도 있다. 적합한 소프트웨어는 ZDOCK Fast Fourier Transform 기반 단백질 도킹 프로그램과 같은 고속 푸리에 (fourier) 기반 소프트웨어를 포함한다 (Chen R et al (2003). Proteins 52(1):80-87). FcRn 및 알부민에 대한 도킹 모델의 구조에 관하여, 알부민의 모델이 도메인 III 및 도메인 I 또는 도메인 II 중 적어도 하나, 바람직하게 모든 도메인을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 알부민은 HSA이다 (예를 들어 SEQ ID NO: 2). 바람직하게, 알부민의 모델은 pH 7 내지 8에서 해결된다. 알부민의 모델은 2.5 Å에서 HSA의 결정 구조이거나, 이에 기초할 수도 있다 (PDB 코드 1bm0 (Sugio S et al (1999) Protein Eng 12(6):439-446)). 바람직하게, FcRn은 사람 FcRn이고 가장 바람직하게 가용성 사람 FcRn이다. FcRn의 모델이 6.4보다 낮은 pH에서, 예를 들어, pH 6.3, 6.2, 6.1, 6, 5.9, 5.8, 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5.0, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 4.4, 4.3, 4.2, 4.1, 4.0, 3.9, 3.8, 3.7, 3.6, 3.5, 3.4, 3.3, 3.2, 3.1, 3.0 이하의 pH에서 용해되는 것이 바람직하다. 더 바람직하게 pH는 3.7 내지 4.7, 4.0 내지 4.4이고 가장 바람직하게 4.2이다. 낮은 pH의 이익은 그것이 알부민 및 FcRn이 결합하는 자연의 생리학적 환경을 더 대표한다는 것이다. FcRn의 모델은 pH 8.2에서 FcRn의 2.7 Å 해상도 구조이거나, 이에 기초할 수도 있다 (PDB 코드 1exu).

두 번째 FcRn 모델은 첫 번째 FcRn 모델에 추가로 사용될 수도 있고 두 번째 모델이 첫 번째 모델과 다른 pH, 예를 들어, 6.4, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8 또는 9.0 이상의 pH과 같은 더 높은 pH에서 용해되는 것이 바람직하다. 추가적인 FcRn 모델을 사용하는 것의 이익은 FcRn 및 알부민 모이어티 사이의 결합시 pH의 영향이 연구될 수 있다는 것이다. 따라서, 다른 pH에서 용해된 FcRn을 사용하여 생성된 도킹 모델은 하나의 pH에서 알부민-FcRn 결합에 수반되지만 다른 것, 즉, pH-의존적 결합에 수반되지 않는 아미노산 잔기를 확인하기 위해 비교될 수도 있다.

FcRn과 상호작용하거나 FcRn과 상호작용에 수반되는 알부민에서 아미노산 잔기의 확인은 수동으로 및/또는 시각적으로 실행될 수도 있다.

선택적으로, 제조하는 방법 및/또는 확인 방법은 (iv)에서 확인된 것들과 동등한 아미노산을 확인하기 위해 두 번째 알부민 (예를 들어, 비-사람 알부민)의 1차 구조 및/또는 3차 구조를 (i)의 1차 구조 및/또는 3차 구조와 비교하는 단계를 포함할 수도 있다. 1차 구조 비교는 두 번째 알부민 및 (i)의 알부민 사이의 서열 정렬에 의해 실행될 수도 있다. 2차 구조 비교는 PDBeFold (SSM으로도 알려짐), 3D에서 단백질 구조를 비교하는 상호작용 서비스와 같이 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 실행될 수도 있다 (예를 들어, 버젼 2.36 이후, http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/ssm/에서 이용 가능하고 Krissinel et al (2004) Acta Cryst. D60, 2256-2268 및 Krissinel (2007) Bioinformatics 23, 717-723과 같은 간행물에서 설명된다).

선택적으로, 제조하는 방법 및/또는 확인 방법은 (iv) 또는 (v)에서 확인된 위치에서 알부민의 변이체를 제조하는 단계 및 제조된 변이체가 (i)의 알부민과 같은 참조와 비교하여 FcRn에 대하여 변화된 결합을 갖는지 확인하는 단계 (예를 들어, 결합 친화도 분석에 의해)를 포함할 수도 있다. 결합 친화도 분석은 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance) (예를 들어 여기에 설명된 바와 같이) 및/또는 ELISA (예를 들어, WO2011/051489 (PCT/EP10/066572)에 개시된 바와 같이, 본원에 참고로 포함됨)에 의해 및/또는 제조된 변이체가 (i)의 알부민과 같은 참조와 비교하여, 예를 들어, 혈장에서, 변화된 반감기를 갖는다는 것을 확인함으로써 수행될 수도 있다. 하지만, 당업자는 FcRn에 대하여 HSA와 다른 결합 성질을 갖는 폴리펩티드를 확인하기 위해 다른 방법이 사용될 수도 있고, 방법은 어떻게 FcRn에 대하여 다른 결합 성질을 갖는 폴리펩티드가 확인되는지에 의존하지 않는다는 것을 인정할 것이다.

본 발명의 첫 번째 양태에 따라, 바람직하게 FcRn에 대한 알부민의 결합 또는 반감기 (예를 들어 혈장에서)에 영향을 미치는 알부민의 아미노산 잔기는 다음 영역 중 하나 이상 (다수)에 위치한다: (a) 505, 531, 524, 472, 108, 190, 197 및 425; (b) 492 내지 538; (c) 186 내지 201; (d) 457 내지 472; (e) 414 내지 426; (f) 104 내지 120; (g) 75 내지 91; (h) 144 내지 150; (i) 30 내지 41, (j) 550 내지 585 및 (k) 497 내지 585의 위치에서 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y 및/또는 종결 코돈 중 하나 이상 (다수)을 갖는 276, 410 및 414; 여기에서, 폴리펩티드가 (i) 위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹, 및/또는 (ii) 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 (특히 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 및/또는 (iii) 위치 82, 114, 119, 464, 201, 505, 510, 513, 533, 535, 536, 550, 560, 563, 565, 573, 574로 구성된 그룹 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수))으로부터 선택된 하나 이상 (다수)의 변화를 포함할 때, 폴리펩티드가 또한 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585에서 선택된 위치에서 삽입되거나 치환되는 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 변화를 포함하는 것이 바람직하다 (SEQ ID NO: 2에 관하여 위치가 제공되지만, 본 발명은 또한 SEQ ID NO: 2 이외의 서열의 동등한 위치를 포함한다).

게다가, 종결 코돈의 도입은 위치 497 내지 585 중 어느 하나, 즉, 위치 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, (또는 SEQ ID NO: 2에 관하여, 동등한 위치) 중 어느 하나에서 이루어질 수도 있다. 도입은 삽입 또는 치환에 의해 이루어질 수도 있다. 이러한 종결 코돈은 여기에 설명된 변화에 추가로 또는 대신에 도입될 수도 있다.

그러므로, 본 발명의 첫 번째 양태는 모체 또는 참조 알부민과 비교하여 FcRn에 대하여 변화된 결합 친화도를 갖는 알부민 변이체 또는 이들의 단편을 제공하며, 다음에서 변화 (예를 들어, 치환, 삭제 또는 삽입)를 포함한다:

(a) SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치: 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 39, 41, 77, 78, 79, 81, 84, 85, 87, 88, 89, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 117, 118, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197 중 어느 하나; 및/또는

(b) SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치: 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 중 어느 하나; 및/또는

(c) SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치: 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 561, 566, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583;

여기에서 변이체 또는 이들의 단편의 변화된 결합 친화도는 변화를 포함하지 않는 모체 알부민 또는 단편과 같은 참조의 결합 친화도에 관한 것이다.

(a) (상기)에 설명된 위치는 알부민, 예를 들어, HSA 와 같은 폴리펩티드의 첫 번째 도메인 (예를 들어 도메인 I)에 있을 수도 있다. (b) (상기)에 설명된 위치는 알부민, 예를 들어, HSA 와 같은 폴리펩티드의 두 번째 도메인 (예를 들어 도메인 II)에 있을 수도 있다. (c) (상기)에 설명된 위치는 알부민, 예를 들어, HSA 와 같은 폴리펩티드의 세 번째 도메인 (예를 들어 도메인 IIII)에 있을 수도 있다.

알부민 변이체 또는 이들의 단편은 SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치에서 변화 (예를 들어, 치환 또는 삽입)을 추가로 포함할 수도 있다:

(i) 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584 중 어느 하나,

(ii) 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 어느 하나 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 및/또는

(iii) 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584 중 어느 하나 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수)).

모체 알부민 및/또는 변이체 알부민은 다음을 포함하거나 이들로 구성되는 것이 바람직하다:

(a) SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드와 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;

(b) 낮은 엄중 조건 하에 (i) SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열, 또는 (ii) (i)의 전체 길이 보체와 잡종화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드;

(c) SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열에 적어도 60% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 및/또는

(d) SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드의 단편.

본 발명의 첫 번째 양태에 대한 추가의 참조는 하기 본 발명의 열세 번째 양태에 제공된다. 당업자는 본 발명의 어떤 양태도 본 발명의 또 다른 양태 또는 양태들 및/또는 본 발명의 양태에 대한 참조 중 하나 이상 (다수) 및/또는 여기에서 만들어진 다른 개시와 결합할 수도 있다는 것을 이해한다.

본 발명의 두 번째 양태는 다음을 포함하는 변이체 알부민 또는 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편의 결합체를 포함하는 변이체 알부민 또는 이들의 단편, 또는 융합 폴리펩티드를 얻는 방법에 관한 것이다:

(a) 모체 알부민 또는 이들의 단편, 또는 모체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드에 SEQ ID NO: 　2의 성숙한 폴리펩티드의 위치 30 내지 41, 75 내지 91, 104 내지 120, 144 내지 150, 186 내지 201, 414 내지 426, 457 내지 472, 492 내지 538, 550 내지 585, 276, 410, 및/또는 411에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치에서 변화를 도입하며, 여기에서, 폴리펩티드가 (i) 위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹, 및/또는 (ii) 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 및/또는 (iii) 위치 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584로 구성된 그룹 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수))으로부터 선택된 하나 이상 (다수)의 변화를 포함할 때, 폴리펩티드가 또한 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585에서 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 변화를 포함하는 것이 바람직한 단계; 및

(b) 변이체 알부민 또는 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계.

그러므로, 위치는 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585 중 하나 이상 (다수)으로부터 선택될 수도 있다.

게다가, 종결 코돈은 위치 497 내지 585, 즉, 중 어느 하나 위치 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585 (또는 SEQ ID NO: 2에 관하여, 동등한 위치)에서 도입될 수도 있다. 도입은 삽입 또는 치환에 의해 이루어질 수도 있다. 이러한 종결 코돈은 여기에 설명된 것에 추가로 또는 대신에 도입될 수도 있다.

그러므로, 본 발명의 두 번째 양태는 다음을 포함하는 변이체 알부민 또는 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편의 결합체를 얻는 방법에 관한 것이다:

(a) 모체 알부민 또는 이들의 단편, 또는 모체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드에 모체 또는 참조 알부민과 비교하여 FcRn에 대하여 변화된 결합 친화도를 갖는 위치 알부민 변이체 또는 이들의 단편에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치에서 변화를 도입하며,

(a) SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치: 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 39, 41, 77, 78, 79, 81, 84, 85, 87, 88, 89, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 117, 118, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197 중 어느 하나; 및/또는

(b) SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치: 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 중 어느 하나; 및/또는

(c) SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치: 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 561, 566, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583에서 변화 (예를 들어, 치환, 삭제 또는 삽입)을 포함하는 단계;

여기에서 변이체 또는 이들의 단편의 변화된 결합 친화도는 변화를 포함하지 않는 모체 알부민 또는 단편과 같은 참조의 결합 친화도에 관한 것이다.

(a) (상기)에 설명된 위치는 알부민, 예를 들어, HSA 와 같은 폴리펩티드의 첫 번째 도메인 (예를 들어 도메인 I)에 있을 수도 있다. (b) (상기)에 설명된 위치는 알부민, 예를 들어, HSA 와 같은 폴리펩티드의 두 번째 도메인 (예를 들어 도메인 II)에 있을 수도 있다. (c) (상기)에 설명된 위치는 알부민, 예를 들어, HSA 와 같은 폴리펩티드의 세 번째 도메인 (예를 들어 도메인 IIII)에 있을 수도 있다.

알부민 변이체 또는 이들의 단편은 SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치에서 변화 (예를 들어, 치환 또는 삽입)을 추가로 포함할 수도 있다:

(i) 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584 중 어느 하나,

(ii) 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 어느 하나 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 및/또는

(iii) 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584 중 어느 하나 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수)).

모체 알부민 및/또는 변이체 알부민은 다음을 포함하거나 이들로 구성되는 것이 바람직하다:

(a) SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드와 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;

(b) 낮은 엄중 조건 하에 (i) SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열, 또는 (ii) (i)의 전체 길이 보체와 잡종화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드;

(c) SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열에 적어도 60% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 및/또는

(d) SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드의 단편.

변이체는 업계에 알려진 어떤 돌연변이 발생 과정, 예를 들어, 부위-지향성 돌연변이 발생, 합성 유전자 구조, 반합성 유전자 구조, 무작위의 돌연변이 발생, 셔플링 (shuffling), 등을 사용하여 당업자에 의해 제조될 수 있다.

부위-지향성 돌연변이 발생은 하나 이상 (다수)의 돌연변이 (변화)가 모체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상 (다수)의 정의된 부위에서 생성되는 기술이다.

부위-지향성 돌연변이 발생은 원하는 돌연변이를 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용을 수반하는 PCR에 의해 시험관 내에서 달성될 수 있다. 부위-지향성 돌연변이 발생은 또한 모체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 돌연변이를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 이후의 결찰을 포함하는 플라스미드의 부위에서 제한 효소에 의한 분열을 수반하는 카세트 돌연변이 발생에 의해 시험관 내에서 수행될 수 있다. 특이하게, 플라스미드 및 올리고뉴클레오티드에서 분해하는 제한효소가 같고, 플라스미드의 결찰 및 서로에 대한 삽입을 허용한다. 예를 들어, Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; 및 Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966을 참고하면 된다.

부위-지향성 돌연변이 발생은 또한 업계에 알려진 방법에 의해 생체 내에서 달성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호: 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; 및 Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16을 참고하면 된다.

어떤 부위-지향성 돌연변이 발생 과정도 본 발명에 사용될 수 있다. 변이체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 이용 가능한 많은 상업적 키트가 있다.

합성 유전자 구조는 원하는 폴리펩티드를 암호화하도록 설계된 폴리뉴클레오티드 분자의 시험관 내 합성을 수반한다. 유전자 합성은 많은 기술, 예를 들어, Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054)에 의해 설명된 다중 미크로칩-기반 기술 및 유사한 기술을 이용하여 수행될 수 있으며 올리고뉴클레오티드는 광-프로그램 가능한 미소유체 칩에서 합성되고 조립된다.

단일 또는 다중 아미노산 치환, 삭제, 및/또는 삽입은 돌연변이 발생, 재조합, 및/또는 셔플링의 알려진 방법을 사용한 후 이어서, 적절한 스크리닝 과정, 예를 들어, Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO　95/17413; 또는 WO　95/22625에 의해 개시된 것들을 사용하여 만들어지고 테스트될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 오류 발생이 쉬운 PCR, 파지 디스플레이 (예를 들어, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; 미국 특허 번호: 5,223,409; WO　92/06204) 및 영역-지향성 돌연변이 발생 (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127)을 포함한다.

돌연변이 발생/셔플링 방법은 숙주 세포에 의해 발현된 클로닝되고, 돌연변이가 발생된 폴리펩티드의 활성을 검출하기 위해 고-처리, 자동화된 스크리닝 방법과 결합될 수 있다 (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). 활성 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이 발생된 DNA 분자는 숙주 세포로부터 회수될 수 있고 업계의 표준 방법을 사용하여 신속하게 시퀀싱될 수 있다. 이들 방법은 폴리펩티드에서 개개의 아미노산 잔기의 중요성의 신속한 결정을 허용한다.

반합성 유전자 구조는 합성 유전자 구조, 및/또는 부위-지향성 돌연변이 발생, 및/또는 무작위의 돌연변이 발생, 및/또는 셔플링의 양태를 결합함으로써 달성된다. 반합성 구조는 PCR 기술과 함께, 합성된 폴리뉴클레오티드 단편을 이용하는 공정에 의해 전형화된다. 따라서 유전자의 정의된 영역은 데 노보 합성화될 수도 있는 한편, 다른 영역은 부위-특이적 돌연변이 유발 프라이머를 사용하여 증폭되면서, 오류 발생이 쉬운 PCR 또는 오류 발생이 쉽지 않은 PCR 증폭을 받을 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 부분서열은 셔플링될 수도 있다.

본 발명의 두 번째 양태에 대한 추가의 참조는 하기 본 발명의 열세 번째 양태에 제공된다.

변이체

본 발명의 세 번째 양태는 모체 알부민의 변이체 알부민 또는 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공하고, SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드의 위치 30 내지 41, 75 내지 91, 104 내지 120, 144 내지 150, 186 내지 201, 414 내지 426, 457 내지 472, 492 내지 538, 550 내지 585, 276, 410 및/또는 411에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치에서 변화를 포함하며, (i) 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹 위치, 및/또는 (ii) 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 위치 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 및/또는 (iii) 위치 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584로 구성된 그룹 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수))로부터 선택된 하나 이상 (다수)의 변화를 포함할 때; 폴리펩티드는 또한 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 변화를 포함하는 것이 바람직하다.

게다가, 종결 코돈은 위치 497 내지 585 중 어느 하나에 도입될 수도 있다. 도입은 삽입 또는 치환에 의해 이루어질 수도 있다. 이러한 종결 코돈은 여기에 설명된 돌연변이에 추가로 또는 대신에 도입될 수도 있다.

그러므로, 본 발명의 세 번째 양태는 모체 알부민의 변이체 알부민 또는 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공하며, 다음에서 변화 (예를 들어, 치환, 삭제 또는 삽입)을 포함한다:

(a) SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치: 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 39, 41, 77, 78, 79, 81, 84, 85, 87, 88, 89, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 117, 118, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197 중 어느 하나; 및/또는

(b) SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치: 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 중 어느 하나; 및/또는

(c) SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치: 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 561, 566, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583.

(a) (상기)에 설명된 위치는 알부민, 예를 들어, HSA 와 같은 폴리펩티드의 첫 번째 도메인 (예를 들어 도메인 I)에 있을 수도 있다. (b) (상기)에 설명된 위치는 알부민, 예를 들어, HSA 와 같은 폴리펩티드의 두 번째 도메인 (예를 들어 도메인 II)에 있을 수도 있다. (c) (상기)에 설명된 위치는 알부민, 예를 들어, HSA 와 같은 폴리펩티드의 세 번째 도메인 (예를 들어 도메인 IIII)에 있을 수도 있다.

알부민 변이체 또는 이들의 단편은 SEQ ID NO: 2의 다음 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치에서 변화 (예를 들어, 치환 또는 삽입)을 추가로 포함할 수도 있다:

(i) 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584 중 어느 하나,

(ii) 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 어느 하나 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 및/또는

(iii) 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584 중 어느 하나 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수)).

모체 알부민 및/또는 변이체 알부민은 다음을 포함하거나 이들로 구성되는 것이 바람직하다:

(a) SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드와 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;

(b) 낮은 엄중 조건 하에 (i) SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열, 또는 (ii) (i)의 전체 길이 보체와 잡종화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드;

(c) SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열에 적어도 60% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 및/또는

(d) SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드의 단편.

본 발명에 따르는 변이체 알부민, 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 알부민 부분은 일반적으로 SEQ ID NO: 2에 나타난 HSA의 서열과 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 바람직하게 적어도 80%, 바람직하게 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90%, 더 바람직하게 적어도 95%, 더 바람직하게 적어도 96%, 더 바람직하게 적어도 97%, 더 바람직하게 적어도 98% 및 가장 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.

한 양태에서, 본 발명의 변이체에서 변화의 수는 1-20개, 예를 들어, 1-10 및 1-5, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변화이다.

변이체 알부민, 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 해당하는 모체 또는 참조 알부민, 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드와 비교하여 FcRn에 대하여 변화된 결합 친화도 및/또는 변화된 혈장 반감기를 갖는다.

특정 바람직한 구체예에서, 모체 또는 참조 알부민은 HSA이고 변이체 알부민, 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 HSA, 해당하는 단편 또는 HSA 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드와 비교하여 FcRn에 대하여 변화된 결합 친화도 및/또는 변화된 혈장 반감기 및/또는 FcRn에 대하여 변화된 결합 친화도를 갖는다.

알부민의, 그것의 수용체에 결합 및 혈장 반감기 사이의 연관성은 HSA D494N의 자연 발생한 대립 유전자에 기초하여 본 발명자에 의해 인식되었다. 발명자는 사전에 이 대립유전자를 분석하였고 FcRn에 대한 WT HSA의 친화도보다 더 낮은 그것의 수용체에 대한 친화도를 갖는 것을 발견하였다.

게다가, 사람 FcRn으로 대체된 자연의 마우스 FcRn을 갖는 형질전환된 마우스는 정상 마우스보다 더 높은 혈청 알부민 수준을 갖는다 (J Exp Med. (2003) 197(3):315-22). 발명자는 사전에 마우스 FcRn이 마우스 혈청 알부민에 대하여 갖는 것보다 사람 FcRn이 마우스 혈청 알부민에 대하여 더 높은 친화도를 갖는 것을 발견하였고, 그러므로, 형질전환된 마우스에서 혈청 알부민의 관찰된 증가는 혈청 알부민 및 그것의 수용체 사이의 더 높은 친화도와 일치하며, FcRn에 대한 알부민 결합 및 혈장 반감기 사이의 연관성을 확인한다. 게다가, 마우스 모델, Kenanova et al (2009) J. Nucl. Med.; 50에서 FcRn에 거의 또는 전혀 결합하지 않는 알부민의 변이체는 감소된 반감기를 갖는 것으로 나타났다 (보충 2):1582).

FcRn에 대한 변이체 알부민의 친화도가 모체 또는 참조 알부민보다 더 높은지 또는 더 낮은지 결정하는 한 방법은 하기 설명된 바와 같이 표면 플라스몬 공명 검정 (SPR)을 사용하는 것이다. 당업자는 FcRn에 대한 변이체 알부민의 친화도가 FcRn에 대한 모체 또는 참조 알부민의 친화도 보다 더 높거나 더 낮은지 결정하기 위해 다른 방법, 예를 들어, 결합 불변 KD의 결정 및 비교가 유용할 수도 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 자연의 HSA에 대한 KD 보다 더 낮은 KD를 갖는 변이체 알부민은 HSA보다 더 높은 혈장 반감기를 갖는 것으로 생각되고 자연의 HSA에 대한 KD보다 더 높은 KD를 갖는 변이체 알부민은 HSA보다 더 낮은 혈장 반감기를 갖는 것으로 생각된다.

알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드의 30 내지 41, 75 내지 91, 104 내지 120, 144 내지 150, 186 내지 201, 414 내지 426, 457 내지 472, 492 내지 538, 550 내지 585, 276, 410 및/또는 411로 구성된 그룹으로부터 선택된 HSA의 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치에서 하나 이상 (다수)의 변화, 예를 들어, 치환, 삭제 또는 삽입을 포함하고 종결 코돈의 도입은 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드의 위치 497 내지 585 중 어느 하나에서 이루어질 수도 있으며, 폴리펩티드가 (i) 위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹, (ii) 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 또는 (iii) 위치 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584로 구성된 그룹 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수))으로부터 선택된 하나 이상 (다수)의 변화를 포함할 때, 폴리펩티드는 또한 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 변화를 포함하는 것이 바람직하다. 도입은 삽입 또는 치환에 의해 이루어질 수도 있다. 도입은 삽입 또는 치환에 의해 이루어질 수도 있다. 이러한 종결 코돈은 여기에 설명된 것에 추가로 또는 대신에 도입될 수도 있다. 치환은 자연의 알부민 서열이 남은 19개의 자연 발생하는 아미노산 중에 선택된 다른 아미노산으로 치환되는 경우 어떤 치환도 될 수 있다.

한 양태에서, 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드의 위치 30 내지 41, 75 내지 91, 104 내지 120, 144 내지 150, 186 내지 201, 414 내지 426, 457 내지 472, 492 내지 538, 550 내지 585, 276, 410 및/또는 411에 해당하는하나 이상 (다수)의 위치에서 변화를 포함하며, 폴리펩티드가 (i) 위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹, (ii) 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 (특히 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 또는 (iii) 위치 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584로 구성된 그룹 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수))으로부터 선택된 하나 이상 (다수)의 변화를 포함할 때, 폴리펩티드는 또한 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 변화를 포함하는 것이 바람직하다.

또 다른 양태에서, 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드의 30 내지 41, 75 내지 91, 104 내지 120, 144 내지 150, 186 내지 201, 414 내지 426, 457 내지 472, 492 내지 538, 550 내지 585, 및/또는 276, 410, 411 중 어느 하나에 해당하는 둘 이상 (다수)의 위치에서 변화를 포함하며, 이들의 변이체, 단편 또는 융합체가 위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584에서 하나 이상 (다수)의 치환을 포함할 때, 이들의 변이체, 단편 또는 융합체는 또한 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 치환을 포함한다. 또한 폴리펩티드가 (i) 위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹, (ii) 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 또는 (iii) 위치 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584로 구성된 그룹 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수))으로부터 선택된 하나 이상 (다수)의 변화를 포함할 때, 폴리펩티드는 또한 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 변화를 포함한다.

또 다른 양태에서, 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드의 위치 30 내지 41, 75 내지 91, 104 내지 120, 144 내지 150, 186 내지 201, 414 내지 426, 457 내지 472, 492 내지 538, 550 내지 585, 276, 410, 및/또는 411 중 어느 하나에 해당하는 세 위치에서 변화를 포함하며, 폴리펩티드가 (i) 위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹, (ii) 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 또는 (iii) 위치 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584로 구성된 그룹 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수))로부터 선택된 하나 이상 (다수)의 변화를 포함할 때; 폴리펩티드는 또한 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 변화를 포함한다.

각각의 언급된 위치에 가능한 삽입 및 치환은 하기 표 2에서 제공된다.

표 2: 모체 알부민의 가능한 및 바람직한 변화, 위치는 SEQ ID NO: 2에 관한 것이지만, 하지만 본 발명은 또한 SEQ ID NO: 2 외에 다른 서열에서 동등한 위치를 포함한다.

상기, 표 2에서, 참조는 HSA (SEQ ID NO: 2)로 구성된다. 하지만, 본 발명은 또한 HSA에 대하여 진술된 것들과 동등한 위치에서 여기에 언급된 변화를 갖는 사람 또는 비-사람 알부민의 비-사람 알부민의 변이체 및/또는 단편를 포함한다. 당업자는 SEQ ID NO: 2로 서열 정렬에 의해 동등한 위치를 확인할 수 있다.

변이체는 그룹 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 (SEQ ID NO: 2에 관련된 번호)로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상 (다수)의 위치에서 변화, 더 특히, 이들 위치 중 하나 이상 (다수)에서 Cys의 치환 또는 삽입을 추가로 포함할 수도 있다. 예를 들어, 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환은 그것의 티올 기를 통한 콘쥬게이션에 이용 가능할 수도 있는 Cys를 도입하고 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567의 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환은 기존의 이황화 결합을 깨서 Cys를 발생시키며, 이것은 그것의 티올 기를 통한 콘쥬게이션에 이용 가능할 수도 있다. 이들 위치 중 하나 이상 (다수)는 단독으로, 또는 더 바람직하게 또 다른 위치 또는 여기에 개시된 위치와 결합하여 변화될 수도 있다.

변이체는 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584 (SEQ ID NO: 2에 관련된 번호)로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상 (다수)의 위치에서 변화를 추가로 포함할 수도 있다. 이들 위치 중 하나 이상 (다수)은 단독으로, 또는 더 바람직하게, 또 다른 위치 또는 여기에 개시된 위치와 결합하여 변화될 수도 있다. 변화가 더 특히 다음 치환 중 하나 이상 (다수)로부터 선택되면, 그것은 또 다른 위치 또는 여기에 개시된 위치에서 변화와 결합되는 것이 바람직하다.

의심을 방지하기 위해, 1 내지 88개의 아미노산의 C-말단 절단을 포함하는 알부민의 변이체를 본 발명의 모든 양태에 포함되고 또한 스스로 본 발명의 양태를 형성한다. 그러므로, 변이체는 SEQ ID NO: 2의 위치 1 내지 497에서 1 내지 584와 동등한 서열을 갖는 알부민을 포함하거나 이들로 구성될 수도 있다. 이러한 변이체는 위치 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585 중 어느 하나에서 종결 코돈을 도입함으로써 제조될 수도 있다. 따라서 알부민은 모체 알부민, 또는 이들의 단편에 관련된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88에 의해 절단될 수도 있고, 그것은 이것으로부터 유도된다. 절단이 88개 이내의 아미노산인 것이 바람직하고, 그러므로 알부민은 모체 알부민, 또는 이들의 단편에 관련된 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88개의 아미노산에 의해 절단되는 것이 바람직하며, 그것은 이것으로부터 유도된다. 변이체가 위치 406, 407, 408, 409, 410, 411 또는 585에서 종결 코돈을 포함하는 것은 덜 바람직하다. 변이체는 여기에 설명된 바와 같이 하나 이상 (다수)의 다른 변화를 포함할 수도 있고 아닐 수도 있다. 절단은 '단편'으로 나타날 수도 있다.

바람직한 절단은 500 내지 584, 예를 들어, 573 또는 574 내지 584의 위치에 있다. 따라서 이러한 변이체는 모체 알부민, 예를 들어 HSA (SEQ ID NO: 2)에 관하여 절단되지만, DI+DIII, DIII, 또는 D+DIII와 같은 알부민 단편에 동일하게 적용한다. 당업자는 HSA로 단편의 정렬에 의해 이러한 단편 내에서 절단의 위치를 결정할 수 있다. 따라서 변이체는

모체 알부민 또는 이들의 단편의 적어도 85 내지 99.5%의 N-말단, 예를 들어, 적어도 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.5%의 N-말단을 포함하거나 이들로 구성될 수도 있다. 바람직한 절단은 모체 알부민 또는 이들의 단편의 85, 86, 97 또는 98%의 N-말단을 포함한다. 따라서, 제조 방법, 단편, 융합체, 콘쥬게이트, 나노입자, 결합체 및 조성물은 이러한 절단된 변이체를 포함할 수도 있다. 절단된 변이체가 위치 573 (또는 이들의 동등물)을 유지하는 것이 바람직하다. 573에서 아미노산은 Pro, Trp 또는 Tyr인 것이 바람직하다.

한 구체예에서, 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는, SEQ ID NO: 2에서, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585로 구성된 그룹으로부터 선택된 HSA의 위치에 해당하는 위치에서 하나의 치환을 함유한다.

한 구체예에서, 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는, SEQ ID NO: 2에서, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 39, 41, 77, 78, 79, 81, 84, 85, 87, 88, 89, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 117, 118, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 472, 497, 502, 507, 508, 509, 511, 513, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 561, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583으로 구성된 그룹으로부터 선택된 HSSA의 위치에 해당하는 위치에서 하나의 치환을 함유한다.

본 발명에 따르는 변이체 알부민, 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 HSA의 다른 위치에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치에서 추가적인 치환, 삽입 또는 삭제를 포함할 수도 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드의 30 내지 41, 75 내지 91, 104 내지 120, 144 내지 150, 186 내지 201, 414 내지 426, 457 내지 472, 492 내지 538, 550 내지 585, 276, 410 및/또는 411로 구성된 그룹으로부터 선택된 HSA의 위치에 해당하는 위치에서 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 열여섯, 열일곱, 열여덟, 열아홉, 스물 이상의 치환을 함유하며, 폴리펩티드가 (i) 위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹, (ii) 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 또는 (iii) 위치 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584로 구성된 그룹 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수))으로부터 선택된 하나 이상 (다수)의 변화를 포함할 때, 폴리펩티드는 또한 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 변화를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 HSA의 다른 위치에 해당하는 위치에서 추가적인 치환, 삽입 또는 삭제를 포함할 수도 있다.

추가의 구체예에서, 본 발명에 따르는 알부민의 변이체 또는 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 모체 또는 참조 알부민 이들의 단편 또는 모체 또는 참조 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 혈장 반감기보다 더 긴 혈장 반감기 및/또는 FcRn에 대하여 더 강한 결합 친화도를 갖는다.

추가의 구체예에서, 본 발명에 따르는 알부민의 변이체 또는 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 모체 또는 참조 알부민 이들의 단편 또는 모체 또는 참조 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 혈장 반감기보다 더 짧은 혈장 반감기 및/또는 FcRn에 대하여 더 약한 결합 친화도를 갖는다.

SEQ ID NO: 2에서 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치에서 하나 이상 (다수) 치환 이외에, 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 분자의 다른 위치에서 추가적인 치환, 삭제 또는 삽입을 함유할 수도 있다. 이러한 추가적인 치환, 삭제 또는 삽입은 변화된 글리코실화; 티올 기와 같은 표면의 반응기의 도입, 카르바모일화 부위의 제거/생성, 등과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는 분자의 다른 성질을 변화시키기 위해 유용할 수도 있다.

표면상에 반응 잔기를 제공하기 위해 변화될 수도 있고 유리하게 본 발명에 적용될 수 있는 잔기는 WO2010/092135에 개시되었다 (본원에 참고로 포함됨). 특정 바람직한 잔기는 SEQ ID NO: 2의 위치에 해당하는 위치를 포함한다.

표면상에 반응 티올 기를 제공하기 위해 SEQ ID NO: 2에서 또는 다른 알부민의 해당하는 위치에서 만들어질 수 있는 변화의 예는 SEQ ID NO: 2에서 다음 변화에 해당하는 변화를 포함한다: L585C, D1C, A2C, D562C, A364C, A504C, E505C, T79C, E86C, D129C, D549C, A581C, D121C, E82C, S270C, A578C, L595LC, D1DC, A2AC, D562DC, A364AC, A504AC, E505EC, T79TC, E86EC, D129DC, D549DC, A581AC, A581AC, D121DC, E82EC, S270SC, A579AC, C360*, C316*, C75*, C168*, C558*, C361*, C91*, C124*, C169* 및 C567*. 대안으로, 시스테인 잔기는 알부민의 N 또는 C 말단에 추가될 수도 있다. 용어 '반응성 티올'은 시스테인에 이황화 결합되지 않고 및/또는 콘쥬게이션 파트너와 같은 파트너에 결합에 입체적으로 이용 가능한 Cys에 의해 제공된 티올 기를 의미하고 및/또는 이를 포함한다.

폴리뉴클레오티드

본 발명의 네 번째 양태는 본 발명의 변이체 중 어느 하나를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드는 분리된 폴리뉴클레오티드일 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 벡터 (예를 들어, 플라스미드)에 및/또는 숙주 세포에 포함될 수도 있다.

핵산 구조

본 발명은 또한 대조군 서열과 호환되는 조건 하에 적합한 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 지시하는 하나 이상 (다수)의 대조군 서열에 작동 가능하게 결합되는, 본 발명의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조에 관한 것이다.

폴리뉴클레오티드는 변이체의 발현을 제공하기 위해 다양한 방법으로 제조될 수도 있다. 벡터에 삽입 전에 폴리뉴클레오티드의 제조는 발현 벡터에 따라서는 바람직하거나 필수적일 수도 있다. 재조합 DNA를 이용하여 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 기술이 업계에 잘 알려져 있다.

대조군 서열은 프로모터 서열일 수도 있으며, 이것은 폴리뉴클레오티드를 발현하는 숙주 세포에 의해 인식된다. 프로모터 서열은 변이체의 발현을 매개하는 전사 대조군 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이, 절단된, 및 히브리드 프로모터를 포함하는 숙주 세포의 전사 활성을 나타내는 어떤 핵산 서열도 될 수 있고, 숙주 세포에 상동성 또는 이종 기원성인 세포 외 또는 세포 내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 얻어질 수도 있다.

효모 숙주에서, 유용한 프로모터는 사카로미세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 에놀라제 (ENO-1), 사카로미세스 세레비시애 프로테아제 A (PRA1), 사카로미세스 세레비시애 프로테아제 B (PRB1), 사카로미세스 세레비시애 번역 신장 인자 (TEF1), 사카로미세스 세레비시애 번역 신장 인자 (TEF2), 사카로미세스 세레비시애 갈락토키나제 (GAL1), 사카로미세스 세레비시애 알콜데히드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (ADH1, ADH2/GAP), 사카로미세스 세레비시애 트리오스 포스페이트 이소머라제 (TPI), 사카로미세스 세레비시애 메탈로티오네인 (CUP1), 및 사카로미세스 세레비시애 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 유전자로부터 얻어진다. 효모 숙주 세포에 유용한 다른 프로모터는 Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488에 의해 설명된다.

당업자는 쌀 및 포유동물 세포, 예를 들어, CHO 또는 HEK에 사용되는 유용한 프로모터를 알고 있다. 쌀 숙주에서, 유용한 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus) 35S RNA 유전자 (CaMV35S), 옥수수 알콜데히드로게나제 (Adh1) 및 알파 Amy3로부터 얻어진다.

포유동물 숙주 세포, 예를 들어, CHO 또는 HEK에서, 유용한 프로모터는 시토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus; CMV) 및 CAG 히브리드 프로모터 (CMV 초기 인핸서 요소 및 닭 베타-액틴 프로모터의 히브리드), 원숭이 액포 바이러스 40 (Simian vacuolating virus 40; SV40)으로부터 얻어진다.

대조군 서열은 또한 적합한 전사 종결자 서열일 수도 있으며, 이것은 전사를 종결하기 위해 숙주 세포에 의해 인식된다. 종결자 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 작동 가능하게 결합된다. 숙주 세포에서 기능적인 어떤 종결자도 사용될 수 있다.

효모 숙주 세포에 대한 바람직한 종결자는 사카로미세스 세레비시애 에놀라제, 사카로미세스 세레비시애 시토크롬 C (CYC1), 사카로미세스 세레비시애 알콜데히드로게나제 (ADH1) 및 사카로미세스 세레비시애 글리세르알데히드-3-포스페이 데히드로게나제에 대한 유전자로부터 얻어진다. 효모 숙주 세포에 유용한 다른 종결자는 Romanos et al., 1992, 상기에 의해 설명된다. 효모 숙주 세포에 유용한 다른 종결자는 Romanos et al., 1992, 상기에 의해 설명된다. 당업자는 쌀 및 포유동물 세포, 예를 들어, CHO 또는 HEK에 사용되는 유용한 종결자를 알고 있다. 예를 들어, 쌀 숙주에서, 바람직한 종결자는 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 노팔린 신타제 (Nos) 및 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S RNA 유전자 (CaMV35S)로부터 얻어진다.

대조군 서열은 또한 적합한 선도 서열, 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 번역되지 않은 영역일 수도 있다. 선도 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 작동 가능하게 결합된다. 숙주 세포에서 기능적인 어떤 선도 서열도 사용될 수 있다.

효모 숙주 세포에 적합한 선도는 사카로미세스 세레비시애 에놀라제 (ENO-1), 사카로미세스 세레비시애 3-포스포글리세레이트 키나제, 사카로미세스 세레비시애 알파-인자, 및 사카로미세스 세레비시애 알콜데히드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (ADH2/GAP)에 대한 유전자로부터 얻어진다.

대조군 서열은 또한 폴리아데닐화 서열, 변이체-암호화 서열의 3'-말단에 작동 가능하게 결합된 서열일 수도 있고, 전사될 때, 전사된 mRNA에 폴리아데노신 잔기를 추가하기 위한 신호로서 숙주 세포에 의해 인식된다. 숙주 세포에서 기능적인 어떤 폴리아데닐화 서열도 사용될 수 있다.

효모 숙주 세포에 유용한 폴리아데닐화 서열은 Guo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990에 의해 설명된다.

대조군 서열은 또한 변이체의 N-말단에 결합된 신호 펩티드를 암호화하고 변이체를 세포의 분비 경로로 향하게 하는 신호 펩티드 암호화 영역일 수도 있다. 폴리뉴클레오티드의 암호화 서열의 5'-끝은 선천적으로 변이체를 암호화하는 암호화 영역의 세그먼트를 갖는 번역 리딩 프레임에 자연적으로 결합된 신호 펩티드 암호화 영역을 함유할 수도 있다. 대안으로, 암호화 서열의 5'-끝은 암호화 서열에 이질적인 신호 펩티드 암호화 영역을 함유할 수도 있다. 외부 신호 펩티드 암호화 영역은 암호화 서열이 신호 펩티드 암호화 영역을 자연적으로 함유하지 않는 경우 필요할 수도 있다. 대안으로, 외부 신호 펩티드 암호화 영역은 변이체의 분비를 향상시키기 위해 자연적 신호 펩티드 암호화 영역을 간단하게 대체할 수도 있다. 하지만, 발현된 변이체를 숙주 세포의 분비 경로로 향하게 하는 어떤 신호 펩티드 암호화 영역도 사용될 수 있다.

효모 숙주 세포에 유용한 신호 펩티드는 사카로미세스 세레비시애 알파-인자 및 사카로미세스 세레비시애 인버타제에 대한 유전자로부터 얻어진다. 다른 유용한 신호 펩티드 암호화 서열은 Romanos et al., 1992, 상기에 의해 설명된다. 당업자는 쌀 및 포유동물 세포, 예를 들어, CHO 또는 HEK에 사용되는 유용한 신호 펩티드를 알고 있다.

신호 펩티드 및 프로펩티드 영역 둘 다가 변이체의 N-말단에 존재하는 경우, 프로펩티드 영역은 변이체의 N-말단 옆에 위치하고 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 N-말단 옆에 위치한다.

본 발명의 네 번째 양태에 대한 추가의 참조는 하기 본 발명의 열세 번째 양태에 제공된다.

생산 방법

본 발명의 네 번째 양태는 본 발명에 따르는 변이체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발병의 변이체는 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 한 편리한 방법은 모체 알부민 또는 이들의 단편 또는 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 클로닝, SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드의 위치 30 내지 41, 75 내지 91, 104 내지 120, 144 내지 150, 186 내지 201, 414 내지 426, 457 내지 472, 492 내지 538, 550 내지 585, 276, 410 및/또는 411에 해당하는 하나 이상 (다수)의 위치에서 원하는 치환(들)을 도입하기 위해 상기 핵산의 변형으로서, 폴리펩티드가 (i) 위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹, (ii) 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 또는 (iii) 위치 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584로 구성된 그룹 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수))으로부터 선택된 하나 이상(다수)의 변화를 포함할 때, 폴리펩티드는 또한 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 변화를 포함하는 것이 바람직한 변형, 적합한 유전자 조절 요소, 예를 들어, 프로모터, 종결자, 활성화 부위, 리보솜 결합 부위 등과 작동 가능하게 결합된 변형된 핵산이 배치된, 적합한 유전적 구조의 제조, 적합한 숙주 유기체에 유전적 구조의 도입, 변이체의 발현으로 이어지는 조건 하에 형질전환된 숙주 유기체의 배양 및 변이체의 회수에 의한 것이다. 이 모든 기술은 업계에 알려져 있고 본 발명에 따라 특정 변이체를 제조하는 적합한 방법을 설계하는 것은 일반 업자의 기술 내에 있다.

본 발명의 변이체 폴리펩티드는 또한 형질전환된 숙주 유기체의 배양 중에 성장 배지로 분비된 변이체 폴리펩티드를 제공하기 위해 신호 서열에 연결될 수도 있다. 일반적으로 회수 및 정제를 쉽게하기 위해 성장 배지로 분비된 변이체 폴리펩티드를 제공하는 것이 유리하다.

변이체 폴리펩티드를 제조하는 기술은 또한 WO 2009019314 (참고로 포함됨)에 개시되었고 이들 기술은 또한 본 발명에 적용될 수도 있다.

알부민은 균류 (아스페?루스 (Aspergillus) (WO06066595), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces) (Fleer 1991, Bio/technology 9, 968-975), 피치아 (Pichia) (Kobayashi 1998 therapeutic Apheresis 2, 257-262) 및 사카로미세스 (Sleep 1990, Bio/technology 8, 42-46)를 포함하지만 이에 제한되지 않음), 박테리아 (Pandjaitab 2000, J. Allergy Clin. Immunol. 105, 279-285)), 동물 (Barash 1993, Transgenic Research 2, 266-276) 및 식물 (감자 및 담배 (Sijmons 1990, Bio/technology 8, 217 및 Farran 2002, Transgenic Research 11, 337-346) 및 쌀, 예를 들어, 오리자 사티바 (Oryza sativa)) 및 포유동물 세포 예를 들어, CHO 및 HEK를 포함하는 다양한 숙주에서 재조합 단백질로서 성공적으로 발현되었다. 본 발명의 변이체 폴리펩티드는 적합한 숙주 세포에서 재조합에 의해 생산된다. 원칙적으로 적합한 양의 폴리펩티드를 생산할 수 있는 어떤 숙주 세포도 사용될 수 있고 본 발명에 따라 적합한 숙주 세포를 선택하는 것은 일반 업자의 기술 내에 있다. 바람직한 숙주 유기체는, 바람직하게 사카로미카캐 (Saccharomycacae), 더 바람직하게 사카로미세스 세레비시애 중에 선택된 효모이다.

본 발명의 변이체 폴리펩티드는 여과, 원심분리, 크로마토그래피, 및 친화도 분리 기술 등과 같은 알려진 분리 기술의 조합을 사용하여 성장 배지로부터 회수되고 정제될 수도 있다. 이러한 알려진 분리 단계의 특정 조합을 사용하여 본 발명의 변이체를 정제하는 것은 일반 업자의 기술 내에 있다. 본 발명의 변이체에 적용될 수 있는 정제 기술의 예로서, WO00/44772의 교시 내용이 언급될 수 있다.

본 발명의 변이체 폴리펩티드는 치료적으로 유익한 화합물 (백신과 같이 예방적으로 유익한 화합물)을 이것이 필요한 동물 또는 사람 개체에 전달하는데 사용될 수도 있다. 이러한 치료적으로 유익한 화합물은 진단에 사용되는 표지 및 쉽게 검출 가능한 화합물, 예를 들어, 다양한 이미징 기술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:약물과 같은 약학적 활성 화합물, 또는 항체와 같은 특이적 결합 모이어티. 본 발명의 변이체는 둘 이상 (다수)의 다른 치료적으로 유익한 화합물, 예를 들어, 항체 및 약물에 연결될 수도 있으며, 이것은 결합된 분자에 원하는 표적에 특이적으로 결합하는 능력을 제공하고 그로 인해 상기 특정 표적에서 고농도의 연결된 약물을 제공하는 능력을 제공한다.

본 발명의 다섯 번째 양태에 대한 추가의 참조는 하기 본 발명의 열세 번째 양태에서 제공된다.

융합 폴리펩티드

본 발명의 여섯 번째 양태는 융합 폴리펩티드에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명에 따르는 알부민의 변이체 또는 이들의 단편은 비-알부민 폴리펩티드 융합 파트너와 융합될 수도 있다. 융합 파트너는 원칙적으로 어떤 폴리펩티드도 될 수 있지만 일반적으로 융합 파트너는 치료적, 예방적 (백신 포함), 진단적, 이미징 또는 다른 유익한 성질을 갖는 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 이러한 성질은 '약학적으로 유익한 성질'로 나타날 수도 있다. 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 업계에 알려져 있다. 이러한 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 및 융합 파트너 폴리펩티드가 융합되지 않은 융합 파트너 폴리펩티드 단독과 비교하여 더 긴 혈장 반감기를 갖는다는 것이 발견되었다. 본 발명에 따라 선행 업계의 해당하는 융합 폴리펩티드와 비교하여 본 발명에 따르는 융합 폴리펩티드의 혈장 반감기를 변화시키는 것이 가능하다. '변화'는 혈장 반감기를 증가시키는 것 또는 혈장 반감기를 감소시키는 것 둘 다를 포함한다. 혈장 반감기를 증가시키는 것이 바람직하다. 본 발명은 원하는 용어에 대한 반감기의 맞춤을 허용한다.

치료적, 예방적 (백신 포함), 진단적, 이미징 또는 다른 유익한 것들 중 하나 이상 (다수)은 알부민의 N-말단, C-말단에 융합되고, 알부민 구조 또는 이들의 어떤 조합의 루프에 삽입될 수도 있다. 그것은 융합 폴리펩티드의 다양한 성분을 분리하는 결합자 서열을 포함할 수도 있거나 아닐 수도 있다.

알부민 또는 이들의 단편의 융합에 관한 교시 내용은 업계에 알려져 있고 당업자는 이러한 교시 내용이 또한 본 발명에 적용될 수 있다는 것을 인정할 것이다. WO 2001/79271A (특히 페이지 9 및/또는 표 1), WO 2003/59934A (특히 표 1), WO03/060071 (특히 표 1) 및 WO01/079480 (특히 표 1) (각각 본원에 전문이 참고로 포함됨)은 또한 알부민 또는 이들의 단편에 융합될 수도 있는 치료적, 예방적 (백신 포함), 진단적, 이미징 또는 다른 유익한 폴리펩티드의 예를 함유하고 이들 예는 또한 본 발명에 적용된다. 본 발명의 여섯 번째 양태에 대한 추가의 참조는 본 발명 하기 본 발명의 열세 번째 양태에서 제공된다.

콘쥬게이트

본 발명의 일곱 번째 양태는 콘쥬게이트 (콘쥬게이션)에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명의 알부민의 변이체 또는 이들의 단편은 업계에 알려진 기술을 사용하여 두 번째 분자 ('콘쥬게이션 파트너')에 콘쥬게이션 될 수도 있다. 콘쥬게이션 파트너는 치료적, 예방적 (백신 포함), 진단적, 이미징 또는 다른 유익한 모이어티일 수도 있다. 상기 콘쥬게이션 파트너는 폴리펩티드 또는 비-폴리펩티드 화학물질일 수도 있다. 콘쥬게이션 파트너는 폴리펩티드, 화학물질 (예를 들어 화학적으로 합성된 약물) 또는 핵산 (예를 들어 DNA, RNA, siRNa) 일 수도 있다.

상기 두 번째 분자는 진단적 또는 이미징 모이어티를 포함할 수도 있고, 이 구체예에서, 콘쥬게이트는 이미징과 같은 진단적 도구로서 유용할 수도 있거나; 두 번째 분자는 치료적 또는 예방적 (예를 들어, 백신) 화합물일 수도 있고 이 구체예에서, 콘쥬게이트가 치료적 또는 예방적 화합물의 치료적 또는 예방적 성질, 뿐만 아니라 콘쥬게이트의 알부민 부분에 의해 제공된 원하는 혈장 반감기를 가질 경우 콘쥬게이트는 치료적 또는 예방적 (예를 들어 백신 접종) 목적을 위해 사용될 수도 있다. 알부민 및 치료적 분자의 콘쥬게이트는 업계에 알려져 있고 이러한 콘쥬게이트가 비-콘쥬게이션된, 유리된 치료적 분자와 비교하여 긴 혈장 반감기를 갖는다는 것을 확인하였다. 본 발명에 따라, 선행 업계의 해당하는 콘쥬게이트와 비교하여 본 발명에 따르는 콘쥬게이트의 FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 혈장 반감기를 변화시키는 것이 가능하다. '변화'는 혈장 반감기를 증가시키는 것 및 혈장 반감기를 감소시키는 것 둘 다 및/또는 FcRn에 대한 결합 친화도를 증가시키는 것 및 FcRn에 대한 결합 친화도를 감소시키는 것 둘 다를 포함한다. 혈장 반감기 및/또는 FcRn에 대한 결합 친화도를 증가시키는 것이 바람직하다. 콘쥬게이트는 편의상 잘 알려진 화학법을 사용하여 HSA의 표면상에 존재하는 유리 티올기 (성숙한 HSA의 아미노산 잔기 34)를 통해 결합될 수도 있다.

한 특정 바람직한 양태에서, 변이체 알부민 또는 이들의 단편은 유익한 치료적 또는 예방적 (백신 포함) 화합물에 콘쥬게이션되고 콘쥬게이트는 이를 필요로 하는 환자의 질병의 치료에 사용되며, 이 질병은 특정 선택된 치료적 화합물에 반응한다. 변이체 알부민 또는 이들의 단편에 이러한 치료적으로 유용한 화합물을 콘쥬게이션하는 기술은 업계에 알려져 있다. WO 2009/019314 (전문이 본원에 참고로 포함됨)는 폴리펩티드에 치료적 화합물을 콘쥬게이션하는데 적합한 기술의 예를 개시하며, 이 기술은 본 발명에도 적용될 수 있다. 게다가 WO 2009/019314는 치환된 트랜스페린에 콘쥬게이션될 수도 있는 화합물 및 모이어티의 예를 개시하고 이들 예는 또한 본 발명에 적용될 수도 있다. WO 2009/019314의 교시 내용은 본원에 참고로 포함된다.

HSA은 그것의 자연적인 형태로 편의상 콘쥬게이션에 사용될 수도 있는 하나의 유리 티올기를 함유한다. (Cys34에서). 이 양태 내 특정 구체예로서, 변이체 알부민 또는 이들의 단편은 추가적인 유리 티올 기를 표면상에 생성하기 위해 제공된 추가의 변형을 포함할 수도 있다. 이것은 변이체 알부민 또는 이들의 단편의 페이로드 (payload)가 증가되어 치료적 (예를 들어, 예방적) 화합물 중 하나 이상의 분자가 변이체 알부민 또는 이들의 단편의 각각의 분자에 콘쥬게이션될 수 있거나, 둘 이상 (복수)의 다른 치료적 화합물, 예를 들어, 종양에 특이적인 항체와 같은 표적화 성질을 갖는 화합물; 및 변이체 알부민 또는 이들의 단편에 콘쥬게이션되고 그로 인해 종양에 대하여 매우 특이적인 약물을 생성하는 세포독성 약물이 변이체 알부민 또는 이들의 단편의 각각의 분자에 콘쥬게이션될 수도 있는 이익을 갖는다. 표면상에 추가의 유리 티올 기를 제공하도록 변형될 수도 있는 특정 잔기의 교시 내용은 동시 출원 중인 특허 출원 WO 2010/092135에서 발견될 수 있으며, 이것은 참고로 포함된다.

콘쥬게이션 파트너는 대안으로 융합 폴리펩티드에 콘쥬게이션될 수 있으며 (여기에 설명됨), 알부민에 융합된 융합 파트너, 뿐만 아니라 같은 알부민 또는 융합 파트너에 콘쥬게이션된 콘쥬게이션 파트너를 포함하는 분자를 발생시킨다.

본 발명의 일곱 번째 양태에 대한 추가의 참조는 하기 본 발명의 열세 번째 양태에서 제공된다.

결합체

본 발명의 여덟 번째 양태는 결합체에 관한 것이다. 그러므로, 알부민의 변이체 또는 이들의 단편은 "결합체"의 형태로 더 사용될 수도 있다. 이 연결에서, 용어 "결합체"는 알부민의 변이체 또는 이들의 단편 및 변이체 알부민 또는 이들의 단편에 비-공유 결합에 의해 결합되거나 연결된 또 다른 화합물을 포함하는 화합물을 의미하기 위한 것이다. 변이체 알부민 및 소수성 상호작용에 의해 알부민에 연결된 지질로 구성된 결합체는 이러한 결합체의 예로서 언급될 수 있다. 이러한 결합체는 업계에 알려져 있고 그것들은 잘 알려진 기술을 사용하여 제조될 수도 있다. 변이체 알부민 및 탁산, 탁솔 또는 탁솔 유도체 (예를 들어, 파클리탁셀)를 포함하는 결합체는 본 발명에 따르는 바람직한 결합체의 예로서 언급될 수 있다. 결합체의 추가의 예는 치료적, 예방적 (백신 포함), 진단적, 이미징 또는 다른 유익한 모이어티를 포함한다.

본 발명에 따르는 알부민의 반감기는 '다른 화합물' 단독의 반감기보다 더 길거나 더 짧을 수도 있다. 본 발명의 알부민 결합체의 반감기는 본래의 HSA (본 발명에 따르는 변이체 또는 유도체 대신)와 같은 참조 알부민 및 '다른 화합물'을 포함하거나 이로 구성된 유사한/동등한 알부민 결합체의 반감기보다 더 길거나 더 짧을 수도 있다. 비슷하게는, 본 발명에 따라 FcRn에 대한 결합체의 결합 친화도는 본래의 HSA (본 발명에 따르는 변이체 또는 유도체 대신)와 같은 참조 알부민 및 '다른 화합물'을 포함하거나 이로 구성된 유사한/동등한 알부민 결합체의, FcRn에 대한 결합 친화도 보다 더 강하거나 더 약할 수도 있다. 결합체의 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, 지질-화합물을 가진 HSA의 조제 (연결에 의해)는 Hussain, R. and Siligardi, G. (2006) International Journal of Peptide Research and Therapeuticals, Vol. 12, NO: 3, pp. 311-315에 설명된다. 본 발명의 여덟 번째 양태에 대한 추가의 참조는 하기 본 발명의 열세 번째 양태에서 제공된다.

다른 사용

본 발명의 아홉 번째 양태는 변이체 알부민, 이들의 단편, 융합체 또는 콘쥬게이트 또는 나노입자 또는 이들의 결합체의 사용에 관한 것이다. 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 FcRn에 대한 그것들의 결합 친화도 및/또는 혈장 반감기가 모체 또는 참조 알부민 또는 이들의 단편 또는 모체 또는 참조 알부민을 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 이들의 단편과 비교하여 변화된다는 이익을 갖는다. 이것은 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 콘쥬게이트, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 결합체의, FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 혈장 반감기가 특정 치료적 목적에 따라 선택될 수 있다는 이점을 갖는다.

예를 들어, 동물 또는 사람에서 이미징 목적을 위해 사용된 결합체 또는 융합 폴리펩티드에 대하여, 이미징 모이어티가 매우 짧은 반감기를 갖고 HSA를 포함하는 콘쥬게이트 또는 융합 폴리펩티드가 이미징 목적을 위해 필요한 것들보다 훨씬 더 긴 혈장 반감기를 갖는 경우, 이미징 목적을 위해 충분히 길지만 그것이 적용되는 특정 환자의 신체로부터 제거되기에 충분히 짧은 혈장 반감기를 갖는 융합 폴리펩티드의 콘쥬게이트를 제공하기 위해, 모체 또는 참조 알부민 또는 이들의 단편보다 더 짧은 혈장 반감기를 갖는 본 발명의 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 사용하는 것이 이로울 것이다.

이러한 치료가 필요한 환자의 특정 질병을 치료하거나 완화하기 위해 유효한 치료적 화합물을 포함하는 콘쥬게이트, 결합체 또는 융합 폴리펩티드에 대한 또 다른 예에서, 본 발명의 결합체 또는 콘쥬게이트 또는 융합 폴리펩티드의 투여가 더 적은 빈도로 필요하거나 투여량을 감소시켜서 모체 또는 참조 알부민 또는 이들의 결합체 또는 이들의 단편이 사용된 경우와 비교하여 더 적은 부작용을 갖는다는 이득을 갖는 더 긴 혈장 반감기를 갖는 결합체 또는 콘쥬게이트 또는 융합 폴리펩티드를 제공하기 위해, 모체 또는 참조 알부민 또는 이들의 단편보다 더 긴 혈장 반감기를 갖는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 사용하는 것이 이로울 것이다. 예를 들어, 본 발명은 결합체가 탁산, 탁솔 또는 탁솔 유도체 (예를 들어, 파클리탁셀)을 포함하는, 본 발명에 따르는 결합체의 유효량을 개인에게 투여하는 단계를 포함하는, 개인의 증식성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

추가의 양태에서 본 발명은 본 발명에 따르는 변이체 알부민, 이들의 결합체 또는 이들의 단편, 변이체 알부민 단편 또는 이들의 결합체 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 바람직하게 약학적 조성물이다. 조성물은 약학적 분야 내의 인식된 편람에 개시된 것들과 같은, 업계에 알려진 기술을 사용하여 제조될 수도 있다. 알부민, 이들의 변이체, 단편, 융합체, 콘쥬게이트 또는 결합체가 조절되는 (즉, 참조 분자의 그것보다 더 강하거나 더 약한 및/또는 더 길거나 더 짧음) FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 혈장 반감기를 갖기 때문에, 조성물은 또한 여기에 설명된 바와 같이 알부민, 변이체, 단편, 융합체, 콘쥬게이트 또는 이들의 결합체 대신에 참조 분자를 포함하는 동등한 조성물과 비교하여 FcRn에 대한 결합친화도 및/또는 조절된 혈장 반감기를 갖는다. 조성물은 백신일 수도 있다. 본 발명에 따르는 폴리펩티드는 활성 의약품 또는 첨가제일 수도 있다. 선택적으로, 조성물은 단위 투약 형태로 제공된다.

바람직하게 알부민, 이들의 변이체, 단편, 융합체, 콘쥬게이트 또는 결합체는 참조 분자, 예를 들어, 알부민 성분 (예를 들어, 알부민, 변이체, 단편, 융합체, 콘쥬게이트 또는 결합체)이 야생형 알부민 (예를 들어 HSA) 또는 변이체, 단편, 융합체, 콘쥬게이트 또는 결합체인 점을 제외하고 같은 조성물의 혈장 반감기보다 더 긴 혈장 반감기를 갖는다.

특정 구체예에서, 조성물은 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 이들의 단편 및 약학적으로 유익한 모이어티 및 알부민 결합 도메인 (ABD)를 포함하는 화합물을 포함한다. 본 발명에 따라, ABD는 생체 내에서 순환하는 알부민에 결합할 수 있고 그로 인해 ABD 및 상기 ABD에 결합된 어떤 화합물 또는 모이어티의 순환에서 수송을 제공하는 부위, 모이어티 또는 도메인을 의미한다. ABD는 업계에 알려져 있고 알부민에 매우 단단하게 결합하는 것으로 나타났고 알부민에 결합된 ABD를 포함하는 화합물이 어느 정도로는 단일 분자로서 작동할 것이다. 발명자는 약학적으로 유익한 모이어티를 포함하는 화합물과 함께 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 사용함으로써 인식하였고 ABD는 상기 화합물이 이들이 필요한 환자에 주사되었고 원래의 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 제형으로서 투여되는 경우와 비교하여 약학적으로 유익한 모이어티 및 ABD를 포함하는 화합물의 FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 혈장 반감기를 변화시키는 것이 가능하게 한다.

본 발명에 따라 변이체 알부민 또는 이들의 단편, 변이체 알부민 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 콘쥬게이트, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 결합체는 또한 업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 나노- 또는 미크로입자에 통합될 수도 있다. 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 이들의 단편에 적용될 수도 있는 나노- 또는 미크로입자를 제조하는 바람직한 방법은 WO 2004/071536 또는 WO2008/007146 또는 Oner & Groves (Pharmaceutical Research, Vol 10(9), 1993, 페이지 1387 내지 1388)에 개시되고 이것은 본원에 참고로 포함된다.

본 발명의 아홉 번째 양태에 대한 추가의 참조는 하기 본 발명의 열세 번째 양태에서 제공된다.

조성물

본 발명의 열 번째 양태는 조성물에 관한 것이다. 그러므로 본 발명은 또한 약학적 조성물의 제조에 알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 알부민의 변이체 또는 이들의 단편을 포함하는 콘쥬게이트, 또는 알부민의 변이체 또는 이들의 단편을 포함하는 결합체의 사용에 관련되며, 알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 알부민의 변이체 또는 이들의 단편을 포함하는 콘쥬게이트, 또는 알부민의 변이체 또는 이들의 단편을 포함하는 결합체는 HSA 또는 해당하는 이들의 단편 또는 HSA 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 HSA를 포함하는 콘쥬게이트와 비교하여 FcRn에 대하여 변화된 결합 친화도 및/또는 변화된 혈장 반감기를 갖는다.

이런 이유로, HSA의 해당 단편은 변이체 알부민의 단편과 함께 정렬하고 이와 같은 수의 아미노산을 갖는 HSA의 단편을 의미하기 위한 것이다. 유사하게는 HSA를 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 HSA를 포함하는 콘쥬게이트는 변이체 알부민을 포함하는 콘쥬게이트의 융합 폴리펩티드와 같은 크기 및 아미노산 서열을 갖는 분자를 의미하기 위한 것이며, 이것과 비교된다. 본 발명의 열 번째 양태에 대한 추가의 참조는 하기 본 발명의 열세 번째 양태에서 제공된다.

나노입자

본 발명의 열한 번째 양태는 여기에 개시된 변이체, 융합체, 콘쥬게이트, 결합체, 나노입자, 조성물 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 나노입자에 관한 것이다.

나노- 또는 미크로입자로 분자의 통합 기술은 업계에 알려져 있다. 본 발명에 따르는 알부민, 이들의 변이체, 단편, 융합체, 콘쥬게이트 또는 결합체에 적용될 수도 있는 나노- 또는 미크로입자를 제조하는 바람직한 방법은 WO 2004/071536 또는 WO2008/007146 또는 Oner & Groves (Pharmaceutical Research, Vol 10(9), 1993, 페이지 1387 내지 1388)에 개시되며, 이것은 본원에 참고로 포함된다. 바람직하게 나노입자의 평균 지름은 5 내지 1000 nm, 더 바람직하게 5, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 130, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 999 내지 5, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 130, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 nm이다. 200 nm 지름 미만, 및 더 특히 130 nm 미만의 미크로입자의 이점은 0.2 μm (미크론) 필터를 통한 여과에 의해 멸균할 수 있다는 점이다. 바람직하게, 미크로입자의 평균 지름은 1000 nm (1 μm (미크론)) 내지 100 μm (미크론), 더 바람직하게 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 내지 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μm (미크론)이다.

본 발명의 열한 번째 양태에 대한 추가의 참조는 하기 본 발명의 열세 번째 양태에서 제공된다.

본 발명의 열두 번째 양태는 치료 또는 예방 또는 진단의 방법에서 여기에 개시된 변이체, 융합체, 콘쥬게이트, 결합체, 나노입자, 조성물 또는 폴리뉴클레오티드의 사용에 관한 것이다. 일부 경우에서, 이것은 알부민, 이들의 변이체, 단편, 융합체, 콘쥬게이트 또는 결합체 또는 조성물의 투여는 참조 분자 또는 조성물이 사용된 경우와 비교하여 더 적은 빈도 또는 감소된 투여량 (및 결과적으로 더 적은 부작용을 갖는)이 필요하다는 이득을 가질 것이기 때문에 참조 분자 또는 조성물보다 더 긴 혈장 반감기를 갖는 알부민, 이들의 변이체, 단편, 융합체, 콘쥬게이트 또는 결합체 또는 조성물을 사용하는 것이 이로울 것이다. 변이체, 융합체, 콘쥬게이트, 결합체, 나노입자, 조성물 또는 폴리뉴클레오티드의 사용에 관하여, 알부민 모이어티는 여기에 개시된 하나 이상의 변화를 포함할 수도 있다.

본 발명의 열두 번째 양태에 대한 추가의 참조는 하기 본 발명의 열세 번째 양태에서 제공된다.

본 발명의 열세 번째 양태는 다음을 포함하는 분자의 반감기를 변화시키는 방법을 제공한다:

(a) 분자가 폴리펩티드인 경우, 분자를 여기에 개시된 폴리펩티드에 또는 여기에 개시된 콘쥬게이트에 융합하거나 콘쥬게이션하는 단계; 분자를 여기에 개시된 폴리펩티드 또는 여기에 개시된 콘쥬게이트에 연결하는 단계; 분자를 여기에 개시된 나노입자 또는 여기에 개시된 조성물에 통합하는 단계;

(b) 본자가 폴리펩티드가 아닌 경우, 분자를 여기에 개시된 폴리펩티드 또는 여기에 개시된 콘쥬게이트에 콘쥬게이션 하는 단계; 분자를 여기에 개시된 폴리펩티드 또는 여기에 개시된 콘쥬게이트에 연결하는 하는 단계; 분자를 여기에 개시된 나노입자 또는 여기에 개시된 조성물에 통합하는 단계.

'분자'의 예는 치료, 예방 (활성 약학적 성분으로서 또는 첨가제로서 백신에서 사용되는 것들을 포함), 이미징 및 진단, 예를 들어, 여기에 설명된 것들에 유용한 것들을 포함한다.

본 발명의 모든 양태에 대한 참조는 하기 제공된다. 당업자는 본 발명의 어떤 양태도 본 발명의 또 다른 양태 또는 양태들 및/또는 본 발명의 양태에 대한 참조 중 하나 이상 (다수) 및/또는 여기에서 만들어진 다른 개시와 결합할 수도 있다는 것을 이해한다.

알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 이들의 단편, 콘쥬게이트, 나노입자, 결합체 또는 조성물은 해당 알부민 또는 이들의 단편 또는 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 이들의 단편, 콘쥬게이트, 나노입자, 결합체 또는 조성물의 혈장 반감기보다 더 길거나 더 짧은, 바람직하게 더 긴 혈장 반감기 또는 더 강하거나 더 약한, 바람직하게 더 약한 FcRn에 대한 결합을 가질 수도 있다. 바람직하게 알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 이들의 단편, 콘쥬게이트, 나노입자, 결합체 또는 조성물은 HSA 또는 해당 알부민 또는 이들의 단편 또는 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 이들의 단편, 콘쥬게이트, 나노입자, 결합체 또는 조성물의 혈장 반감기 보다 더 긴 혈장 반감기를 갖는다.

대안으로, 이것은 FcRn 또는 해당하는 이들의 단편 또는 HSA 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드에 대한 HSA의 해당하는 KD보다 더 낮은 FcRn (예를 들어, shFcRn)에 대한 KD를 갖는 알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 이들의 단편, 콘쥬게이트, 나노입자, 결합체 또는 조성물로서 발현될 수도 있다. 바람직하게, 알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 이들의 단편, 콘쥬게이트, 나노입자, 결합체 또는 조성물에 대한 KD는 FcRn에 대한 HSA의 0.9 KD보다 더 작고, 더 바람직하게 FcRn에 대한 HSA의 0.5X KD보다 더 작고, 더 바람직하게 FcRn에 대한 HSA의 0.1X KD보다 더 작고, 더 바람직하게 FcRn에 대한 HSA의 0.05X KD보다 더 작고, 더 바람직하게 FcRn에 대한 HSA의 0.02X KD보다 더 작고, 가장 바람직하게 FcRn에 대한 HSA의 0.01X KD보다 더 작다 (X가 '곱해짐'를 의미하는 경우). 알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 이들의 단편, 콘쥬게이트, 나노입자, 결합체 또는 조성물의 KD는 FcRn에 대한 WT 알부민 (SEQ ID NO: 2)의 KD 및 FcRn에 대한 HSA K573P (SEQ ID NO: 3)의 KD 사이일 수도 있다. 이러한 KD는 HSA 및 FcRn 사이의 결합 친화도보다 더 높은 결합 친화도를 나타낸다. 더 높은 결합 친화도는 더 긴 반감기, 예를 들어, 혈장 반감기를 나타낸다.

대안으로, 알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 이들의 단편, 콘쥬게이트, 나노입자, 결합체 또는 조성물은 HSA 또는 해당하는 이들의 단편 또는 HSA 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 혈장 반감기보다 더 짧은 혈장 반감기를 갖는다.

이것은 FcRn에 대한 HSA 또는 해당하는 알부민 또는 이들의 단편 또는 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 이들의 단편, 콘쥬게이트, 나노입자, 결합체 또는 조성물의 해당하는 KD 보다 더 높은 FcRn에 대한 KD를 갖는 알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 이들의 단편, 콘쥬게이트, 나노입자, 결합체 또는 조성물로서 발현될 수도 있다. 바람직하게, 알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 이들의 단편, 또는 알부민의 변이체 또는 이들의 단편을 포함하는 콘쥬게이트에 대한 KD는 FcRn에 대한 HSA의 2X KD보다 크고, 더 바람직하게 FcRn에 대한 HSA의 5X KD보다 크고, 더 바람직하게 FcRn에 대한 HSA의 10X KD보다 크고, 더 바람직하게 FcRn에 대한 HSA의 25X KD보다 크고, 가장 바람직하게 FcRn에 대한 HSA의 50X KD보다 크다. 알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 이들의 단편, 콘쥬게이트, 나노입자, 결합체 또는 조성물은 FcRn에 대한 눌 (null) 결합체일 수도 있다.

본 발명에 따라 알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 이들의 단편, 또는 알부민의 변이체 또는 이들의 단편을 포함하는 콘쥬게이트 또는 나노입자 또는 결합체 또는 조성물은 바람직하게 알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 이들의 단편, 또는 알부민의 변이체 또는 이들의 단편을 포함하는 콘쥬게이트 또는 나노입자 또는 결합체 또는 조성물이다. 더 낮은 결합 친화도는 더 짧은 반감기, 예를 들어, 혈장 반감기를 나타낸다.

본 발명의 한 이점은 사용자의 요구를 만족하는 결합 친화도 또는 반감기를 달성하기 위해 그것이 알부민, 알부민의 변이체 또는 이들의 단편 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 이들의 단편, 콘쥬게이트, 나노입자, 결합체 또는 조성물의 반감기가 맞춰지는 것을 허용한다는 점이다.

KD를 결정하고 및/또는 비교할 때, 다음 파라미터 중 하나 이상 (및 바람직하게 모두)이 사용될 수도 있다:

기구: Biacore 3000 기구 (GE Healthcare)

유동 세포: CM5 센서 칩

FcRn: 선택적으로 GST와 같은 태그에 커플링된 사람 FcRn, 바람직하게 가용성 사람 FcRn

FcRn의 양: 1500-2500 RU

커플링 화학법: 아민 커플링 화학법 (예를 들어, 기구의 제조사에 의해 제공된 프로토콜에 설명됨).

커플링 방법: 커플링은 10 mM 나트륨 아세테이트 pH 5.0 (GE Healthcare) 중의 단백질의 10 μg/ml를 주사함으로써 수행될 수도 있다. 포스페이트 버퍼 (67 mM 포스페이트 버퍼, 0.15 M NaCl, 0.005% Tween 20, pH 6.0)는 러닝 버퍼 및 희석 버퍼로 사용될 수도 있다. 표면의 재생은 pH 7.4에서 HBS-EP 버퍼 (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20) (Biacore AB)의 주사를 사용하여 수행될 수도 있다.

테스트 분자 (예를 들어, HSA 또는 변이체)의 주사의 양: 1.0-0.5 mM

주사의 유속: 일정, 예를 들어 40 μl/ml

주사의 온도: 25 ℃

데이터 평가 소프트웨어: BIAevaluation 4.1 소프트웨어 (BIAcore AB).

본 발명은 알부민, 단편, 융합체, 콘쥬게이트, 결합체, 나노입자 또는 조성물의 결합 친화도 및/또는 반감기, 예를 들어, 혈장 반감기를 조절하기 위해 (증가 또는 감소시키기 위해) 변화될 수도 있는 SEQ ID NO: 2의 위치 (및 그러므로 사람 혈청의 알부민 및 단편 및 알부민 및 비-사람 혈청 알부민의 동등한 위치)를 개시한다. 변화는 치환, 삽입 또는 삭제일 수도 있다. 치환이 바람직하다.

치환 또는 삽입은 보존된, 즉, 원하는 위치의 아미노산에 관하여 보존된 아미노산의 도입을 포함할 수도 있거나 포함하지 않을 수도 있다. 보존된 아미노산의 예는 도 3의 그룹에 의해 나타난다: 지방족, 방향족, 소수성, 하전, 극성, 양성, 소형 및 소규모.

바람직한 위치는 결합 중에 FcRn과 상호작용하고 및/또는 FcRn과 알부민, 단편, 융합체, 콘쥬게이트, 결합체, 나노입자 또는 조성물의 상호작용에 영향을 미치는 것들이다.

바람직한 위치는 (a) 492 내지 538; (b) 505, 531, 524, 472, 108, 190, 197 및 425; (c) 186 내지 201; (d) 457 내지 472; (e) 414 내지 426; (f) 104 내지 120; (g) 75 내지 91; (h) 144 내지 150; (i) 30 내지 41, (j) 497 내지 585의 위치에서 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y 및/또는 종결 코돈 중 하나 이상 (다수)를 갖는 550 내지 585 및 (k) 276, 410 및 414로부터 선택된 SEQ ID NO:2의 위치에 해당하며,

폴리펩티드가 (i) 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹 위치, (ii) 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 및/또는 (iii) 위치 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584로 구성된 그룹 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수))로부터 선택된 하나 이상(다수)의 변화를 포함할 때; 폴리펩티드는 또한 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 변화를 포함하는 것이 바람직하다.

더 바람직하게, 폴리펩티드가 (ii), (ii) 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 (특히 원래의 잔기 (예를 들어, 비-Cys 잔기) 내지 Cys에서 위치 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)의 치환 및/또는 Cys 내지 비-Cys 잔기에서 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)의 삭제 또는 치환), 및/또는 (iii) 위치 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584로 구성된 그룹 (특히 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나 이상 (다수))으로부터 선택된 하나 이상(다수)의 변화를 포함할 때; 폴리펩티드는 또한 위치 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 39, 41, 77, 78, 79, 81, 84, 85, 87, 88, 89, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 117, 118, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 472, 497, 502, 507, 508, 509, 511, 513, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 561, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 변화를 포함한다.

본 발명에 따라, 알부민 변이체가 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E로부터 선택된 변화를 포함할 때, 변화는 여기에 설명된 하나 이상 (다수)의 변화와 결합하여 제공되는 것이 바람직하다. 위치 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584 중 하나 이상 (다수)에서 다른 변화는 여기에 설명된 하나 이상 (다수)의 변화와 결합하여 제공될 수도 있거나 아닐 수도 있다.

종결 코돈은 위치 497 내지 585 중 어느 하나, 즉, 위치 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 더 바람직하게 570 내지 585 중 어느 하나 (또는 SEQ ID NO: 2에 관하여, 동등한 위치)에서 도입될 수도 있다. 도입은 삽입 또는 치환에 의해 이루어질 수도 있다. 도입은 삽입 또는 치환에 의해 이루어질 수도 있다. 이러한 종결 코돈은 여기에 설명된 것에 추가로 또는 대신에 도입될 수도 있다.

위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 아미노산의 N-측 ("X-1")에 하나 이상 (다수)의 아미노산의 삽입을 위해, 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈로 구성된 그룹으로부터 선택된 추가적인 변화가 있을 수도 있거나 아닐 수도 있다.

반대로, 위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 아미노산의 C-측 ("X+1")에 하나 이상 (다수)의 아미노산의 삽입을 위해, 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 추가적인 변화가 있는 것이 바람직하다.

FcRn과 상호작용하는 HSA의 아미노산 잔기는 FcRn의 아미노산으로부터 10 Å 미만 (예를 들어, 5 Å 미만)에 위치한 HSA의 어떤 아미노산 잔기 또는 FcRn의 아미노산으로부터 10 Å 미만에 위치한 아미노산 잔기와 수소 결합, 염다리 또는 극성 또는 비극성 상호작용에 수반된 어떤 아미노산 잔기도 되는 것으로 생각된다. 바람직하게 HSA 잔기의 아미노산은 FcRn의 아미노산으로부터 10 Å 미만, 더 바람직하게 FcRn의 아미노산으로부터 6 Å 미만 및 가장 바람직하게 FcRn의 아미노산으로부터 3 Å 미만에 위치한다.

바람직하게 FcRn에 알부민의 결합에 영향을 미치는 알부민의 아미노산 잔기는 결합 표면, 예를 들어, 도 9에 정의된 결합 표면 (핑크색 (그레이 스케일에서 가장 어두운 (거의 검은색) 영역으로 보인다))에 위치한다. 아미노산은 알부민의 도메인 I에 의해 제공된 결합 표면의 일부에 또는 도메인 III에 의해 제공된 결합 표면의 일부에 있을 수도 있다.

그러므로 하나 이상 (다수)의 변화는 도메인 I에, 예를 들어, 30 내지 41, 75 내지 91, 104 내지 120, 144 내지 150, 186 내지 201로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에 있을 수도 있다. 하나 이상의 변화는 도메인 II, 예를 들어, 위치 276에 있을 수도 있다. 하나 이상의 변화는 도메인 III에, 예를 들어, 414 내지 426, 457 내지 472, 492-538, 550 내지 585로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에 있을 수도 있다.

유리하게는, 폴리펩티드는 HSA와 같은 참조 또는 모체 알부민과 실질적으로 같은 3차 구조 (또는, 단편에 대하여, 구조의 적절한 부위)를 유지한다. 당업자는 모든 단백질이 어느 정도의 구조적 가요성을 갖는 것처럼 3차 구조에서 어느 정도의 변화가 예측된다는 것을 명심하여 '실질적으로 같은 3차 구조'를 이해한다. 이것은 특히 모체 또는 참조 알부민 (예를 들어, HSa) 이 FcRn에 대하여 갖는 것보다 더 높은 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드에 적용된다.

His 잔기 중 하나 이상은 모체 알부민에 비해 유지될 수도 있고 아닐 수도 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 2에 관하여, 다음 His 잔기 중 하나 이상이 유지될 수도 있다: 3, 9, 39, 67, 105, 128, 146, 242, 247, 288, 338, 367, 440, 464, 510, 535. 도메인 I에서 His 잔기 중 하나 이상, 바람직하게 모두가 유지된다 (즉, 3, 9, 39, 67, 105, 128, 146). 도메인 II에서 His 잔기 중 하나 이상, 바람직하게 모두가 유지된다 (즉, 242, 247, 288, 338, 367). 도메인 III에서 His 잔기 중 하나 이상, 바람직하게 모두가 유지된다 (즉, 440, 464, 510, 535). His 464, 510, 535 중 하나 이상 또는 모두 세 개가 유지될 수도 있다.

알부민의 이황화 결합 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17이 폴리펩티드에서 유지된다는 것이 바람직하다. 전체 길이 알부민으로부터 유도된 폴리펩티드에 대하여, 상기 알부민에 보통 존재하는 모든 이황화 결합이 유지되는 것이 바람직하다. 알부민의 단편으로부터 유도된 폴리펩티드에 대하여, 상기 단편에 보통 존재하는 모든 이황화 결합이 유지되는 것이 바람직하다. Cys-34 (또는 비-사람 알부민에서 동등물)가 유지되는 것이 바람직하다.

변화가 75, 90, 91, 200, 461, 514, 558, 559 및 567 중 하나 이상 (다수)로부터 선택된 위치에 있을 때, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상 (다수)의 변화가 있는 것이 또한 바람직하다.

폴리펩티드, 특히 단일 변화를 포함하는 폴리펩티드에 대하여, 변화는 Cys로 치환, Cys의 삽입 및/또는 이황화 결합을 붕괴시키는 잔기의 삭제를 포함하지 않고 그러므로 폴리펩티드 내 추가적인 콘쥬게이션 가능한 Cys를 제공하는 것이 바람직하다. 위치 75, 90, 91, 200, 461, 514, 558, 559 및 567 중 하나 이상 (다수)에서 변화(들)은 Cys로부터 어떤 다른 아미노산 (A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y)으로의 치환이 아니고, Cys의 삭제가 아니고, 상기 Cys의 이황화 결합 파트너의 치환 또는 삭제가 아니며, 그러므로 위치 53, 62, 75, 90, 91, 101, 124, 168, 169, 177, 200, 245, 246, 253, 265, 278, 279, 289, 316, 360, 361, 369, 392, 437, 438, 448, 461, 476, 477, 487, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상에서 Cys가 삭제되고, 치환되고 및/또는 삽입을 받지 않는 것이 특히 바람직하다. 가장 바람직하게, 이황화 결합에 보통 수반된 Cys는 삭제되지 않고, 치환되지 않고 및/또는 삽입을 받지 않는다. 그러므로, 변화가 위치 34, 38, 40, 76, 79, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 490, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 542, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 중 하나 이상 (다수)에서 있으면, 변화는 Cys로 치환 및/또는 Cys의 삽입이 아닌 것이 바람직하다.

본 발명의 모든 양태에 대하여, 위치 573 (또는 이들의 동등물)은 Pro, Trp 또는 Tyr 잔기인 것이 바람직하다. 그러므로, 둘 이상 (다수)의 변화가 있을 때, 위치 573 (또는 이들의 동등물)은 Pro, Trp 또는 Tyr인 것이 바람직하다.

본 발명의 모든 양태에 대하여, 융합 파트너 폴리펩티드 및/또는 콘쥬게이트는 4-1BB 리간드, 5-헬릭스, 사람 C-C 케모킨, 사람 L105 케모킨, huL105_3.으로 지정된 사람 L105 케모킨, 감마-인터페론에 의해 유도된 모노킨 (MIG), 부분적 CXCR4B 단백질, 혈소판 염기성 단백질 (PBP), α1-항트립신, ACRP-30 Homologue; 보체 성분 C1q C, 아데노이드-발현된 케모킨 (ADEC), aFGF; FGF-1, AGF, AGF 단백질, 알부민, 에토포시드, 안지오스타틴, 탄저 백신 (Anthrax vaccine), 콜랍신에 특이적인 항체, 항스타신, 항-TGF 베타 패밀리 항체, 항트롬빈 III, APM-1; ACRP-30; 파목신, 아포-지질단백질 종, 아릴술파타제 B, b57 단백질, BCMA, 베타-트롬보글로불린 단백질 (베타-TG), bFGF; FGF2, 혈액 응고 인자, BMP 가공 효소 퓨린, BMP-10, BMP-12, BMP-15, BMP-17, BMP-18, BMP-2B, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-9, 뼈 형태 발생 단백질-2, 칼시토닌, 칼파인-10a, 칼파인-10b, 칼파인-10c, 암 백신, 카르복시펩티다제, C-C 케모킨, MCP2, CCR5 변이체, CCR7, CCR7, CD11a Mab, CD137; 4-1BB 수용체 단백질, CD20 Mab, CD27, CD27L, CD30, CD30 리간드, CD33 항체 독소, CD40, CD40L, CD52 Mab, 세레부스 단백질, 케모킨 에오탁신, 케모킨 hIL-8, 케모킨 hMCP1, 케모킨 hMCP1a, 케모킨 hMCP1b, 케모킨 hMCP2, 케모킨 hMCP3, 케모킨 hSDF1b, 케모킨 MCP-4, 케모킨 TECK 및 TECK 변이체, 케모킨-유사 단백질 IL-8M1 전체 길이 및 성숙한, 케모킨-유사 단백질 IL-8M10 전체 길이 및 성숙한, 케모킨-유사 단백질 IL-8M3, 케모킨-유사 단백질 IL-8M8 전체 길이 및 성숙한, 케모킨-유사 단백질 IL-8M9 전체 길이 및 성숙한, 케모킨-유사 단백질 PF4-414 전체 길이 및 성숙한, 케모킨-유사 단백질 PF4-426 전체 길이 및 성숙한, 케모킨-유사 단백질 PF4-M2 전체 길이 및 성숙한, 콜레라 백신, 콘드로모듈린-유사 단백질, c-키트 리간드; SCF; 비만 세포 성장 인자; MGF; 섬유육종-유도된 줄기 세포 인자, CNTF 및 이들의 단편 (예를 들어, CNTFAx15`(Axokine™), 전 및 활성 형태 둘 다의 응고 인자, 콜라겐, 보체 C5 Mab, 연결 조직 활성화 단백질-III, CTAA16.88 Mab, CTAP-III, CTLA4-Ig, CTLA-8, CXC3, CXC3, CXCR3; CXC 케모킨 수용체 3, 시아노비린-N, 다르베포에틴, 지정된 엑소더스 (exodus), 지정된 huL105_7., DIL-40, DN아제, EDAR, EGF 수용체 Mab, ENA-78, 엔도스타틴, 에오탁신, 상피 호중구 활성화 단백질-78, EPO 수용체; EPOR, 에리트로포이에틴 (EPO) 및 EPO 모방체, 유트로핀, 엑소더스 단백질, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X 및 인자 XIII, FAS 리간드 억제 단백질 (DcR3), FasL, FasL, FasL, FGF, FGF-12; 섬유아세포 성장 인자 상동 인자-1, FGF-15, FGF-16, FGF-18, FGF-3; INT-2, FGF-4; 젤로닌, HST-1; HBGF-4, FGF-5, FGF-6; 헤파린 결합 분비된 형질전환 인자-2, FGF-8, FGF-9; 신경교 활성화 인자, 피브리노겐, flt-1, flt-3 리간드, 모낭 자극 호르몬 알파 서브유닛, 모낭 자극 호르몬 베타 서브유닛, 폴리트로핀, 프락탈킨, 단편, 근원섬유 단백질 트로핀 I, FSH, 갈락토시다제, 갈렉틴-4, G-CSF, GDF-1, 유전자 치료, 신경교종-유도된 성장 인자, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드, 글루코세레브로시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코시다제, 글리코델린-A; 프로게스테론-결합 자궁 내막 단백질, GM-CSF, 고나도트로핀, 과립구 화학 주성 단백질-2 (GCP-2), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 성장 호르몬, 성장 관련 종양유전자-알파 (GRO-알파), 성장 관련 종양유전자-베타 (GRO-베타), 성장 관련 종양유전자-감마 (GRO-감마), hAPO-4; TROY, hCG, B형 간염 표면 항원, B형 간염 백신, HER2 수용체 Mab, 히루딘, HIV gp120, HIV gp41, HIV 억제자 펩티드, HIV 억제자 펩티드, HIV 억제자 펩티드, HIV 프로테아제 억제 펩티드, HIV-1 프로테아제 억제자, HPV 백신, 사람 6CKine 단백질, 사람 Act-2 단백질, 사람 지질 생성 억제 인자, 사람 B 세포 자극 인자-2 수용체, 사람 베타-케모킨 H1305 (MCP-2), 사람 C-C 케모킨 DGWCC, 사람 CC 케모킨 ELC 단백질, 사람 CC 타입 케모킨 인터류킨 C, 사람 CCC3 단백질, 사람 CCF18 케모킨, SLC (2차 림프성 케모킨)로 지정된 사람 CC-타입 케모킨 단백질, 사람 케모킨 베타-8 짧은 형태, 사람 케모킨 C10, 사람 케모킨 CC-2, 사람 케모킨 CC-3, 사람 케모킨 CCR-2, 사람 케모킨 Ck베타-7, 사람 케모킨 ENA-78, 사람 케모킨 에오탁신, 사람 케모킨 GRO 알파, 사람 케모킨 GRO알파, 사람 케모킨 GRO베타, 사람 케모킨 HCC-1, 사람 케모킨 HCC-1, 사람 케모킨 I-309, 사람 케모킨 IP-10, 사람 케모킨 L105_3, 사람 케모킨 L105_7, 사람 케모킨 MIG, 사람 케모킨 MIG-베타 단백질, 사람 케모킨 MIP-1알파, 사람 케모킨 MIP1베타, 사람 케모킨 MIP-3알파, 사람 케모킨 MIP-3베타, 사람 케모킨 PF4, 사람 케모킨 단백질 331D5, 사람 케모킨 단백질 61164, 사람 케모킨 수용체 CXCR3, 사람 케모킨 SDF1알파, 사람 케모킨 SDF1베타, 사람 케모킨 ZSIG-35, 사람 Chr19Kine 단백질, 사람 CK베타-9, 사람 CK베타-9, 사람 CX3C 111 아미노산 케모킨, 사람 DNAX 인터류킨-40, 사람 DVic-1 C-C 케모킨, 사람 EDIRF I 단백질 서열, 사람 EDIRF II 단백질 서열, 사람 호산구 CC 타입 케모킨 에오탁신, 사람 호산구-발현된 케모킨 (EEC), 사람 급속 경련 골격근 트로포닌 C, 사람 급속 경련 골격근 트로포닌 I, 사람 급속 경련 골격근 트로포닌 서브유닛 C, 사람 급속 경련 골격근 트로포닌 서브유닛 I 단백질, 사람 급속 경련 골격근 트로포닌 서브유닛 T, 사람 급속 경련 골격근 트로포닌 T, 사람 태아 비장 발현된 케모킨, FSEC, 사람 GM-CSF 수용체, 사람 gro-알파 케모킨, 사람 gro-베타 케모킨, 사람 gro-감마 케모킨, 사람 IL-16 단백질, 사람 IL-1RD10 단백질 서열, 사람 IL-1RD9, 사람 IL-5 수용체 알파 사슬, 사람 IL-6 수용체, 사람 IL-8 수용체 단백질 hIL8RA, 사람 IL-8 수용체 단백질 hIL8RB, 사람 IL-9 수용체 단백질, 사람 IL-9 수용체 단백질 변이체 #3, 사람 IL-9 수용체 단백질 변이체 단편, 사람 IL-9 수용체 단백질 변이체 단편#3, 사람 인터류킨 1 델타, 사람 인터류킨 10, 사람 인터류킨 10, 사람 인터류킨 18, 사람 인터류킨 18 유도체, 사람 인터류킨-1 베타 전구체, 사람 인터류킨-1 베타 전구체., 사람 인터류킨-1 수용체 악세서리 단백질, 사람 인터류킨-1 수용체 길항제 베타, 사람 인터류킨-1 타입-3 수용체, 사람 인터류킨-10 (전구체), 사람 인터류킨-10 (전구체), 사람 인터류킨-11 수용체, 사람 인터류킨-12 40 kD 서브유닛, 사람 인터류킨-12 베타-1 수용체, 사람 인터류킨-12 베타-2 수용체, 사람 인터류킨-12 p35 단백질, 사람 인터류킨-12 p40 단백질, 사람 인터류킨-12 수용체, 사람 인터류킨-13 알파 수용체, 사람 인터류킨-13 베타 수용체, 사람 인터류킨-15, 클론 P1의 사람 인터류킨-15 수용체, 사람 인터류킨-17 수용체, 사람 인터류킨-18 단백질 (IL-18), 사람 인터류킨-3, 사람 인터류킨-3 수용체, 사람 인터류킨-3 변이체, 사람 인터류킨-4 수용체, 사람 인터류킨-5, 사람 인터류킨-6, 사람 인터류킨-7, 사람 인터류킨-7., 사람 인터류킨-8 (IL-8), 사람 세포 내 IL-1 수용체 길항제, 사람 IP-10 및 HIV-1 gp120 초가변 영역 융합 단백질, 사람 IP-10 및 사람 Muc-1 코어 에피토프 (VNT) 융합 단백질, 사람 간 및 활성화 조절된 케모킨 (LARC), 사람 Lkn-1 전체 길이 및 성숙한 단백질, 사람 포유동물 관련 케모킨 (MACK) 단백질 전체 길이 및 성숙한, 사람 성숙한 케모킨 Ck베타-7, 사람 성숙한 gro-알파, 패혈증을 치료하기 위해 사용된 사람 성숙한 gro-감마 폴리펩티드, 사람 MCP-3 및 사람 Muc-1 코어 에피토프 (VNT) 융합 단백질, 사람 MI10 단백질, 사람 MI1A 단백질, 사람 단핵구 화학 주성 인자 hMCP-1, 사람 단핵구 화학 주성 인자 hMCP-3, 사람 단핵구 화학 주성의 프로단백질 (MCPP) 서열, 사람 뉴로탁틴 케모킨 유사 도메인, 사람 비-ELR CXC 케모킨 H174, 사람 비-ELR CXC 케모킨 IP10, 사람 비-ELR CXC 케모킨 Mig, 사람 PAI-1 돌연변이, IL-16 활성을 가진 사람 단백질, IL-16 활성을 가진 사람 단백질, 사람 2차 림프성 케모킨 (SLC), 사람 SISD 단백질, 사람 STCP-1, 사람 간질 세포-유도된 케모킨, SDF-1, 사람 T 세포 혼합된 림프구 반응 발현된 케모킨 (TMEC), 사람 흉선 및 활성화 조절된 시토킨 (TARC), 사람 흉선 발현된 사람 TNF-알파, 사람 TNF-알파, 사람 TNF-베타 (LT-알파), 사람 타입 CC 케모킨 에오탁신 3 단백질 서열, 사람 타입 II 인터류킨-1 수용체, 사람 야생형 인터류킨-4 (hIL-4) 단백질, 사람 ZCHEMO-8 단백질, 사람화된 항-VEGF 항체, 및 이들의 단편, 사람화된 항-VEGF 항체, 및 이들의 단편, 히알루로니다제, ICE 10 kD 서브유닛, ICE 20 kD 서브유닛, ICE 22 kD 서브유닛, 이두로네이트-2-술파타제, 이두로니다제, IL-1 알파, IL-1 베타, IL-1 억제자 (IL-1i)., IL-1 성숙한, IL-10 수용체, IL-11, IL-11, IL-12 p40 서브유닛, IL-13, IL-14, IL-15, IL-15 수용체, IL-17, IL-17 수용체, Il-17 수용체, Il-17 수용체, IL-19, IL-1i 단편, IL1-수용체 길항제, IL-21 (TIF), IL-3 함유 융합 단백질, IL-3 돌연변이 단백질, IL-3 변이체, IL-3 변이체, IL-4, IL-4 뮤테인, IL-4 뮤테인 Y124G, IL-4 뮤테인 Y124X, IL-4 뮤테인, Il-5 수용체, IL-6, Il-6 수용체, IL-7 수용체 클론, IL-8 수용체, IL-9 성숙한 단백질 변이체 (Met117 버젼), 면역글로불린 또는 면역글로불린-기반 분자 또는 플라스미노겐을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 둘 중 하나의 단편 (예를 들어 Small Modular ImmunoPharmaceutical™, ("SMIP") 또는 dAb, Fab' 단편, F(abb')2, scAb, scFv 또는 scFv 단편), 인플루엔자 백신, 인히빈 알파, 인히빈 베타, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, 인테그린 Mab, 인터-알파 트립신 억제제, 인터-알파 트립신 억제제, 인터페론 감마-유도 가능 단백질 (IP-10), 인터페론 (예를 들어, 인터페론 알파 종 및 아종, 인터페론 베타 종 및 아종, 인터페론 감마 종 및 아종), 인터페론 (예를 들어, 인터페론 알파 종 및 아종, 인터페론 베타 종 및 아종, 인터페론 감마 종 및 아종), 인터류킨 6, 인터류킨 8 (IL-8) 수용체, 인터류킨 8 수용체 B, 인터류킨-1알파, 인터류킨-2 수용체 결합된 단백질 p43, 인터류킨-3, 인터류킨-4 뮤테인, 인터류킨-8 (IL-8) 단백질, 인터류킨-9, 인터류킨-9 (IL-9) 성숙한 단백질 (Thr117 버젼), 인터류킨 (예를 들어, IL10, IL11 및 IL2), 인터류킨 (예를 들어, IL10, IL11 및 IL2), 일본 뇌염 (Japanese encephalitis) 백신, 칼리크레인 (Kalikrein) 억제제, 케라틴 합성 세포 성장 인자, 쿠니츠 (Kunitz) 도메인 단백질 (예를 들어, 아프로티닌, 아밀로이드 전구체 단백질 및 WO 03/066824에 설명된 것들, 알부민 융합체가 있거나 없음), 쿠니츠 도메인 (예를 들어, 아프로티닌, 아밀로이드 전구체 단백질 및 WO 03/066824에 설명된 것들, 알부민 융합체가 있거나 없음), LACI, 락토페린, 잠재적 TGF-베타 결합 단백질 II, 렙틴, 간 발현된 케모킨-1 (LVEC-1), 간 발현된 케모킨-2 (LVEC-2), LT-알파, LT-베타, 황체 형성 호르몬, 라임 백신, 림포탁틴, 대식 세포 유도된 케모킨 유사체 MDC (n+1), 대식세포 유도된 케모킨 유사체 MDC-eyfy, 대식세포 유도된 케모킨 유사체 MDC-yl, 대식세포 유도된 케모킨, MDC, 대식세포-유도된 케모킨 (MDC), 마스핀; 프로테아제 억제제 5, MCP-1 수용체, MCP-1a, MCP-1b, MCP-3, MCP-4 수용체, M-CSF, 멜라노마 억제 단백질, 막 결합 단백질, Met117 사람 인터류킨 9, MIP-3 알파, MIP-3 베타, MIP-감마, MIRAP, 변형된 RANTES, 단클론성 ㅎ항체, MP52, 돌연변이 인터류킨 6 S176R, 근원섬유 수축성 단백질 트로포닌 I, 나트륨 이뇨성 펩티드, 신경 성장 인자-베타, 신경 성장 인자-베타2, 뉴로필린-1, 뉴로필린-2, 뉴로탁틴, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 뉴로트로핀-4a, 뉴로트로핀-4b, 뉴로트로핀-4c, 뉴로트로핀-4d, 호중구 활성화 펩티드-2 (NAP-2), NOGO-66 수용체, NOGO-A, NOGO-B, NOGO-C, PTEC로 지정된 새로운 베타-케모킨, N-말단 변형된 케모킨 GroHEK/hSDF-1알파, N-말단 변형된 케모킨 GroHEK/hSDF-1베타., N-말단 변형된 케모킨 met-hSDF-1 알파, N-말단 변형된 케모킨 met-hSDF-1 베타, OPGL, 골형성 단백질-1; OP-1; BMP-7, 골형성 단백질-2, OX40; ACT-4, OX40L, 옥시토신 (뉴로피신 I), 부갑상선 호르몬, 패치드 (Patched), 패치드-2, PDGF-D, 백일해 (pertussis) 변성 독소, 뇌하수체 발현된 케모킨 (PGEC), 태반 성장 인자, 태반 성장 인자-2, 플라스미노겐 활성화제 억제제-1; PAI-1, 플라스미노겐 활성화제 억제제-2; PAI-2, 플라스미노겐 활성화제 억제제-2; PAI-2, 혈소판 유도된 성장 인자, 혈소판 유도된 성장 인자 Bv-sis, 혈소판 유도된 성장 인자 전구체 A, 혈소판 유도된 성장 인자 전구체 B, 혈소판 Mab, 혈소판-유도된 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF), 혈소판-유도된 성장 인자 A 사슬, 혈소판-유도된 성장 인자 B 사슬, 패혈증을 치료하기 위해 사용된 폴리펩티드, 프리프로아포지질단백질 (Preproapolipoprotein) "밀라노 (milano)" 변이체, 프리프로아포지질단백질 "파리스 (paris)" 변이체, 프리트롬빈 (pre-thrombin), 영장류 CC 케모킨 "ILINCK", 영장류 CXC 케모킨 "IBICK", 프로인슐린, 프로락틴, 프로락틴2, 프로삽티드, 프로테아제 억제제 펩티드, 단백질 C, 단백질 S, 프로트롬빈 (pro-thrombin), 프로우로키나제, RANTES, RANTES 8-68, RANTES 9-68, RANTES 펩티드, RANTES 수용체, 재조합 인터류킨-16, 레지스틴, 레스트릭토신, 레트로바이러스 프로테아제 억제제, 리신, 로타바이러스 백신, RSV Mab, 사포린, 사르신, 분비된 및 막 관통 폴리펩티드, 혈청 콜린에스테라제, 혈청 단백질 (예를 들어, 혈액 응고 인자), 가용성 BMP 수용체 키나제 단백질-3, 가용성 VEGF 수용체, 줄기 세포 억제 인자, 스타필로코쿠스 (Starphylococcus) 백신, 기질 유도 인자-1 알파, 기질 유도 인자-1 베타, 물질 P (타키키닌), T1249 펩티드, T20 펩티드, T4 엔도뉴클레아제, TACI, 타르 (Tarc), TGF-베타 1, TGF-베타 2, Thr117 사람 인터류킨 9, 트롬빈, 트롬보포이에틴, 트롬보포이에틴 유도체1, 트롬보포이에틴 유도체2, 트롬보포이에틴 유도체3, 트롬보포이에틴 유도체4, 트롬보포이에틴 유도체5, 트롬보포이에틴 유도체6, 트롬보포이에틴 유도체7, 흉선 발현된 케모킨 (TECK), 갑상선 자극 호르몬, 틱 (tick) 항응고 펩티드, Tim-1 단백질, TNF-알파 전구체, TNF-R, TNF-RII; TNF p75 수용체; 사멸 수용체, tPA, 트랜스페린, 형질전환 성장 인자 베타, 트로포닌 펩티드, 절단된 단핵구 화학주성 단백질 2 (6-76), 절단된 단핵구 화학주성 단백질 2 (6-76), 절단된 RANTES 단백질 (3-68), 종양 괴사 인자, 요산 옥시다제, 유로키나제, 바소프레신 (뉴로피신 II), VEGF R-3; flt-4, VEGF 수용체; KDR; flk-1, VEGF-110, VEGF-121, VEGF-138, VEGF-145, VEGF-162, VEGF-165, VEGF-182, VEGF-189, VEGF-206, VEGF-D, VEGF-E; VEGF-X, 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand's factor), 야생형 단핵구 화학주성 단백질 2, 야생형 단핵구 화학주성 단백질 2, ZTGF-베타 9, 대체 항체 스카폴드 (scaffold), 예를 들어, 항칼린(들), 아드넥틴(들), 피브리노겐 단편(들), 나노바디, 예를 들어, 카멜리드 나노바디 (camelid nanobody), 인페스틴, 및/또는 WO01/79271 (특히 페이지 9 및/또는 표 1), WO 2003/59934 (특히 표 1), WO03/060071 (특히 표 1) 또는 WO01/079480 (특히 표 1)에 언급된 어떤 하나의 분자 중 하나 이상 (다수)를 포함할 수도 있다 (각각은 전문이 본원에 참고로 포함됨).

게다가, 콘쥬게이트는 다음과 같은 화학치료 약물 중 하나 이상 (다수)를 포함할 수도 있다: 13-씨스-레티노산, 2-CdA, 2-클로로데옥시아데노신, 5-아자시티딘, 5-플루오로유라실, 5-FU, 6-페르캅토퓨린, 6-MP, 6-TG, 6-티오구아닌, A, 아브락산, Accutane®, 액티노마이신-D, Adriamycin®, Adrucil®, Agrylin®, Ala-Cort®, 알데스류킨, 알렘투쥬맙, ALIMTA, 알리트레티노인, Alkaban-AQ®, Alkeran®, 올트랜스레티놀산 (All-transretinoic Acid), 알파 인터페론, 알트레타민, 아메톱테린, 아미포스틴, 아미노글루테티미드, 아나그렐리드, Anandron®, 아나스트로졸, 아라비노실시토신, Ara-C, Aranesp®, Aredia®, Arimidex®, Aromasin®, Arranon®, 3산화 비소 (Arsenic Trioxide), 아스파라기나제, ATRA, Avastin®, 아자시티딘, BCG, BCNU, 베바시쥬맙, 벡사로텐, BEXXAR®, 비칼루타미드, BiCNU, Blenoxane®, 플레오마이신, 보르테조밉, 부술판, Busulfex®, C225, 칼슘 류코보린, Campath®, Camptosar®, 캄프토테신-11, 카페시타빈, Carac™, 카르보플라틴, 카르무스틴, 카르무스틴 웨이퍼, Casodex®, CC-5013, CCNU, CDDP, CeeNU, Cerubidine®, 세툭시맙, 클로람부실, 시스플라틴, 시트로보룸 인자, 클라드리빈, 코르티손, Cosmegen®, CPT-11, 시클로포스파미드, Cytadren®, 시타라빈, 시타라빈 리포솜, Cytosar-U®, Cytoxan®, 다카르바진, 다코겐, 댁티노마이신, 다르베포에틴 알파, 다사티닙, 다우노마이신, 다우노루비신, 다우노루비신 히드로클로라이드, 다우노루비신 리포솜, DaunoXome®, 데카드론, 데시타빈, Delta-Cortef®, Deltasone®, 데닐류킨 디프티톡스, DepoCyt™, 덱사메타손, 덱사메타손 아세테이트, 덱사메타손 나트륨 포스페이트, 덱사손, 덱스라족산, DHAD, DIC, 디오덱스, 오세탁셀, Doxil®, 독소루비신, 독소루비신 리포솜, Droxia™, DTIC, DTIC-Dome®, Duralone®, Efudex®, Eligard™, Ellence™, Eloxatin™, Elspar®, Emcyt®, 에피루비신, 에포에틴 알파, Erbitux™, 에를로티닙, 에르비니아 L-아스파라기나제, 에스트라무스틴, 에티올, Etopophos®, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, Eulexin®, Evista®, 엑세메스탄, Fareston®, Faslodex®, Femara®, 필그라스팀, 플록수리딘, Fludara®, 플루다라빈, Fluoroplex®, 플루오로유라실, 플루오로유라실 (크림), 플루옥시메스테론, 플루타미드, 폴린산, FUDR®, 풀베스트란트, G-CSF, 게피티닙, 젬시타빈, 젬투쥬맙 오조가미신, Gemzar®, Gleevec™, Gliadel® 웨이퍼, GM-CSF, 고세렐린, 과립구-콜로니 자극 인자, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, Halotestin®, Herceptin®, 헥사드롤, Hexalen®, 헥사메틸멜라민, HMM, Hycamtin®, Hydrea®, Hydrocort Acetate®, 히드로코르티손, 히드로코르티손 나트륨 포스페이트, 히드로코르티손 나트륨 숙시네이트, 히드로코르톤 포스페이트, 히드록시유레아, 이브리투모맙, 이브리투모맙 티욱세탄, Idamycin®, 이다루비신, Ifex®, IFN-알파, 이포스파미드, IL-11, IL-2, 이마티닙 메실레이트, 이미다졸 카르복사미드, 인터페론 알파, 인터페론 알파-2b (PEG 콘쥬게이트), 인터류킨-2, 인터류킨-11, 인트론 A (인터페론 알파-2b), Iressa®, 이리노테칸, 이소트레티노인, Kidrolase®, Lanacort®, 라파티닙, L-아스파라기나제, LCR, 레날리도미드, 레트로졸, 류코보린, 류케란, Leukine™, 류프롤리드, 류로크리스틴, Leustatin™, 리포솜 Ara-C, Liquid Pred®, 로무스틴, L-PAM, L-사르콜리신, Lupron®, Lupron Depot®, M, Matulane®, 막시덱스, 메클로레타민, 메클로레타민 히드로클로라이드, Medralone®, Medrol®, Megace®, 메게스트롤, 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란, 페르캅토퓨린, 메스나, Mesnex™, 메토트렉세이트, 메토트렉세이트 나트륨, 메틸프레드니솔론, Meticorten®, 미토마이신, 미토마이신-C, 미톡산트론, M-Prednisol®, MTC, MTX, Mustargen®, 뮤스틴, Mutamycin®, Myleran®, Mylocel™, Mylotarg®, Navelbine®, 넬라라빈, Neosar®, Neulasta™, Neumega®, Neupogen®, Nexavar®, Nilandron®, 닐루타미드, Nipent®, 니트로겐 머스타드, Novaldex®, Novantrone®, 옥트레오티드, 옥트레오티드 아세테이트, Oncospar®, Oncovin®, Ontak®, Onxal™, Oprevelkin, Orapred®, Orasone®, 옥살리플라틴, 탁솔 또는 탁솔 유도체 예를 들어 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 단백질-결합, 파미드로네이트, 파니투무맙, Panretin®, Paraplatin®, Pediapred®, PEG 인터페론, 페가스파르가스, 페그필그라스팀, PEG-INTRON™, PEG-L-아스파라기나제, PEMETREXED, 펜토스타틴, 페닐알라닌 머스타드, Platinol®, Platinol-AQ®, 프레드니솔론, 프레드니손, Prelone®, 프로카르바진, PROCRIT®, Proleukin®, 카르무스틴 임플란트와 함께 프로리페프로스판 20, Purinethol®, R, 랄록시펜, Revlimid®, Rheumatrex®, Rituxan®, 리툭시맙, 로페론-A (인터페론 알파-2a), Rubex®, 루비도마이신 히드로클로라이드, Sandostatin®, Sandostatin LAR®, 사르그라모스팀, Solu-Cortef®, Solu-Medrol®, 소라페닙, SPRYCEL™, STI-571, 스트렙토조신, SU11248, 수니티닙, Sutent®, 타목시펜, Tarceva®, Targretin®, Taxol®, Taxotere®, Temodar®, 테모졸로미드, 테니포시드, TESPA, 탈리도미드, Thalomid®, TheraCys®, 티오구아닌, Thioguanine Tabloid®, 티오포스포아미드, Thioplex®, 티오테파, TICE®, Toposar®, 토포테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 타르스투쥬맙, 트레티노인, Trexall™, Trisenox®, TSPA, TYKERB®, VCR, Vectibix™, Velban®, Velcade®, VePesid®, Vesanoid®, Viadur™, Vidaza®, 빈블라스틴, 빈블라스틴 술페이트, Vincasar Pfs®, 빈크리스틴, 비노렐빈, 비노렐빈 타르트레이트, VLB, VM-26, 보리노스타트, VP-16, Vumon®, Xeloda®, Zanosar®, Zevalin™, Zinecard®, Zoladex®, 졸레드론산, 졸린자, Zometa®; 탄소-11, 탄소-14, 크롬-51, 코발트-57, 코발트-58, 에르븀-169, 플루오린-18, 갈륨-67, 금-198, 인듐-111, 인듐-113m, 이오딘-123, 이오딘-125, 이오딘-131, 철-59, 크립톤-81m, 질소-13, 산소-15, 인-32, 레늄-186, 루비듐-82, 사마륨-153, 셀레늄-75, 스트론튬-89, 테크네튬-99m, 탈륨-201, 트리륨, 제논-127, 제논-133, 이트륨-90과 같은 방사성 의약품; 가돌리늄, 자철, 망간, 테크네튬, I125, I131, P32, TI201, 이오파미돌, PET-FDG와 같은 이미징제.

추가의 융합 파트너, 콘쥬게이션 파트너 및/또는 본 발명에 따르는 나노입자, 결합체 또는 조성물에 포함되는 분자는 말단 비대증 (acromegaly) 약물 예를 들어, 소마튤린, 란레오티드, 옥트레오티드, 산도스타틴; 항혈전증 (antithrombotic), 예를 들어, 비발리루딘, 안지오맥스, 달테파린, 프라그민, 에녹사파린, 로베녹스, 드로트레코긴 알파 (예를 들어, 활성화됨), 지그리스, 헤파린; 지원된 생식적 치료 화합물, 예를 들어, 융모성성선자극호르몬, 오비드렐, 폴리트로핀, 알파/베타; 효소, 예를 들어, 히알루로니다제, 힐레넥스; 당뇨병 약물, 예를 들어, 엑세나티드, 비에타, 글루카곤, 인슐린, 리라글루티드, 알비글루티드, GLP-1 작용제, 엑센딘 또는 엑센딘 유사체; 진단에 유용한 화합물, 예를 들어, 프로티렐린, 티렐 TRH 티피논, 세크리틴 (예를 들어, 합성 사람), 키르호스팀, 티로트로핀 (예를 들어, 알파), 티로겐' 적혈구 생성 (erythropoiesis) 약물, 예를 들어, 다르베포에틴 알파, 아라네스프, 에포에틴 알파, 에포겐, 에프렉스, 유전적 결함을 치료하는 약물, 예를 들어, 페가데마세, 성장 부전을 치료하는 약물, 예를 들어, 아다겐, 메카세르민, 린파베이트, 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis)을 치료하는 약물, 예를 들어, 도르나제 알파, 풀모자임, 대사 장애를 치료하는 약물, 예를 들어, 아갈시다제 베타, 파브라짐, 알글루코시다제 알파, 미오짐, 라로니다제, 알두라짐, 장애 내 생식기 혹 (genital wart intralesional)을 치료하는 약물, 예를 들어, 인터페론 알파-n3, 알페론 N, 육아종증 (granulomatous disease)을 치료하는 약물, 예를 들어, 인터페론 감마-1b, 액티이뮨; 성장 부전을 치료하는 약물, 예를 들어, 페그비소만트, 소마버트, 소마트로핀, 제노트로핀, 뉴트로핀, 휴마트로프, 세로스팀, 프로트로핀; 심부전을 치료하는 약물, 예를 들어, 네시리티드, 나트레코; 혈우병을 치료하는 약물, 예를 들어, 응고 인자, 예를 들어, 인자 VIII, 헬릭세이트 FS, 코게네이트 FS, 인자 IX, 베네FIX, 인자 VIIa, 노보세븐, 데스모프레신, 스티메이트, DDAVP; 조혈제, 예를 들어, 필그라스팀 (G-CSF), 뉴포겐, 오프렐베킨, 뉴메가, 페그필그라스팀, 뉼라스타, 사르그라모스팀, 류킨; C형 간염을 치료하는 약물, 예를 들어, 인터페론 알파-2a, 로페론 A, 인터페론 알파-2b, 인트론 A, 인터페론 알파콘-1, 인페르겐, 페그인터페론 알파-2a, 페가시스, 페그인터페론 알파-2b, PEG-인트론; HIV를 치료하는 약물, 예를 들어, 엔푸비르티드, 푸제온; Fabs, 예를 들어, Fab (항트롬빈), 압식시맙, ReoPro; 단클론성 항체, 예를 들어, 다클리쥬맙, 제나팍스; 항바이러스 단클론성 항체, 예를 들어, 발리비쥬맙, 시나지스; 천식을 치료하는 단클론성 항체, 예를 들어, 오말리쥬맙, 졸레어; 진단적 이미징에 사용되는 단클론성 항체, 예를 들어, 아르시투모맙, CEA-Scan, 카프로맙 펜데티드, ProstaScint, 사투모맙 펜데티드, OncoScint CR/OV, 진단적 이미징에 사용되는 Fabs, 예를 들어, 노페투모맙, 베를루마; 면역 억제 단클론성 항체, 예를 들어, 바실릭시맙, 시뮬렉트, 뮤로모납-CD3, 오르토클론 OKT3; 악성 종양을 치료하는 단클론성 항체, 예를 들어, 알렘투쥬맙, 캄파쓰, 이브리투모맙 티욱세탄, 제발린, 리툭시맙, 리툭산, 타르스투쥬맙, 헤르셉틴; 류머티스성 관절염 (Ra) 을 치료하는 단클론성 항체, 예를 들어, 아달리무맙, 휴미라, 인플릭시맙, 레미카데; 방사선-면역-치료에 사용되는 단클론성 항체, 예를 들어, 토시투모맙 및 이오딘 I¹³¹, 토시투모맙, 벡사르; 황반 변성 (macular degeneration)의 치료에 사용되는 약물, 예를 들어, 페가프타닙, 마큐겐; 악성 종양을 치료하는 약물, 예를 들어, 알데스류킨, 프로류킨, 인터류킨-2, 아스파라기나제, 엘스파르, 라스뷰리카제, 엘리테크, 데닐류킨 디프티톡스, 온탁, 페가스파르가스, 온카스파, 고세렐린, 류프롤리드; 다발성 경화증 (MS)을 치료하는 약물, 예를 들어, 글라티라머 아세테이트 (예를 들어, 코폴리머-1), 코팍손, 인터페론 베타-1a, 아보넥스, 인터페론 베타-1a, 레비프, 인터페론 베타-1b, 베타세론; 점막염 (mucositis)을 치료하는 약물, 예를 들어, 팔리페르민, 케피반스; 근육 긴장 이상 (dystonia) 를 치료하는 약물, 예를 들어, 뉴로톡신, 보툴리눔 독소 타입 A, BOTOX, BOTOX 코스메틱, 보툴리눔 독소 타입 B, MYOBLOC; 골다공증 (osteoporosis)을 치료하는 약물, 예를 들어, 테리파라티드, 포르테오; 건선 (psoriasis)을 치료하는 약물, 예를 들어, 알레파셉트, 아메비브; RA를 치료하는 약물, 예를 들어, 아바타셉트, 오렌시아, 아나킨라, 키네레트, 에타네르셉트, 엔브렐; 혈전 용해제, 예를 들어, 알테플라제, 액티바제, rtPA, 아니스트렙라제, 에미나제, 레테플라제, 레타바제, 스트렙토키나제, 스트렙타제, 테넥테플라제, TNK아제, 유로키나제, 아보키나제, 킨리틱; 골다공증을 치료하는 약물, 예를 들어, 칼시토닌 (예를 들어, 연어), 미아칼킨, 포르티칼, 피부궤양 (skin ulcer)을 치료하는 약물, 예를 들어, 베카플러민, 레그라넥스, 콜라게나제, 산틸을 포함한다.

이러한 폴리펩티드 및 화합물은 진단적 모이어티, 치료적 모이어티, 예방적 모이어티 또는 유익한 모이어티로서 나타날 수도 있다.

바람직하게 융합 파트너 및/또는 콘쥬게이션 파트너는 알부민, 변이체 또는 이들의 단편이 아니다.

하나 이상 (다수)의 치료적 또는 예방적 폴리펩티드는 알부민의 N-말단, C-말단에 융합되고, 알부민 구조 또는 이들의 어떤 조합의 루프에도 삽입될 수 있다. 그것은 융합 폴리펩티드의 다양한 성분을 구분하는 결합자 서열을 포함할 수도 있거나 아닐 수도 있다.

알부민 또는 이들의 단편의 융합에 관련된 교시 내용은 업계에 알려져 있고 당업자는 이러한 교시 내용이 또한 본 발명에 적용될 수 있다는 것을 인정할 것이다. WO 2001/79271A 및 WO 2003/59934A (본원에 참고로 포함됨)는 또한 알부민 또는 이들의 단편에 융합될 수도 있는 치료적 및 예방적 폴리펩티드의 예를 함유하고, 이들 예는 또한 본 발명에 적용된다.

본 발명은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 생각되어서는 안 되는 다음 실시예에 의해 추가로 설명된다.

실시예

재료 및 방법

알부민의 C-말단 절단의 발생을 포함하는, HSA 돌연변이 및 히브리드 분자의 생산

알부민의 변이체를 당업자에게 알려진 기술을 사용하여, 예를 들어, WO2011/051489 (PCT/EP10/066572)의 방법을 사용하여 또는 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 제조하였다.

shFcRn 의 생산. shFcRn의 재조합 변이체, 예를 들어, GST-태그된 shFcRn의 구조 및 생산은 이전에 설명되었다 (36). 대안으로, HIS-태그된 shFcRn 헤테로다이머를 WO2011/124718에 설명된 바와 같이 제조하였다.

ELISA . HSA 변이체로 코팅된 미세적정 플레이트, GST-태그된 shFcRn 및 홀스래디쉬 퍼옥시다제 콘쥬게이션된 염소 항-GST 항체를 사용하여 ELISA를 Andersen et al (2012; Nature Communications 3:610; DOI:10.1038/ncomms1607)에 따라 수행하였다.

표면 플라스몬 공명. Biacore 3000 기구 (GE Healthcare)를 제조사에 의해 설명된 바와 같이 아민 커플링 화학법을 사용하여 shFcRn-GST (~1000-2000 RU)와 커플링된 CM5 센서 칩과 함께 사용하였다. 커플링을 각 단백질의 10-12 μg/ml을 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.5 (GE Healthcare)에 주사함으로써 수행하였다. 모든 실험에 대하여, pH 6.0에서 또는 7.4 버퍼 (67 mM 포스페이트 버퍼, 0.15 m NaCl, 0.005% Tween 20), 또는 pH 7.4에서 HBS-P 버퍼 (0.01 m HEPES, 0.15 m NaCl, 0.005% 계면활성제 P20)를 러닝 버퍼 및 희석 버퍼로서 사용하였다. 동력학 측정을 HSA 변이체 (80-0.1 μm)의 단계 희석액을 25 ℃에서 50 μl/ml의 유속으로 주사함으로써 수행하였다. 모든 실험에서, 데이터를 0점 조정하였고, 참조 세포 값을 뺐다. 동력학적 비율 값을 BIAevaluation 4.1 소프트웨어를 사용함으로써 제공된, 미리 정의된 모델 (랭뮤어 (Langmuir) 1:1 리간드 모델 및 정상 상태 (steady-state) 친화도 모델)을 사용하여 계산하였다.

경쟁적 결합을 고정된 HSA를 통해 (~2000-2500 RU) shFcRn (100 nM) 단독 또는 HSA 변이체의 적정량 (1000-0.015 nM)과 함께 주사함으로써 측정하였다. 칩에 고정된 HSA에 shFcRn의 퍼센트 (%) 결합을 shFcRn 단독을 주사함으로써 제공된 총 SPR 반응을 HSA 변이체와 함께 사전 배양될 때 반응에 의한 것으로 나눔으로써 계산하였다.

원형 2색성 분광학 ( Circular dichroism spectroscopy )

원형 2색성 (CD) 스펙트럼을 암모늄 d-캄포-10-술포네이트 (Icatayama Chemicals, Tokyo Japan)로 보정된 Jasco J-810 분광편광계 (Jasco International Co., Ltd., Tokyo Japan)를 사용하여 기록하였다. 모든 측정을 0.1 cm의 경로 길이를 갖는 석영 큐벳 (Starna, Essex, UK)을 사용하여 23 ℃에서, 추가된 NaCl 없이, 10 mM PBS (pH 6.0) 중의 2 mg/ml^-1의 HSA 농도로 수행하였다. 각 샘플을 1초의 반응 시간에 20 nm/분^-1 (1 nm의 밴드 넓이)에서 7번 스캔하였고, 파장 범위를 190-270 nm로 설정하였다. 수거된 데이터를 평균화하였고 샘플이 없는 대조군의 스펙트럼을 뺐다. 2차 구조 성분의 함량을 시경망 프로그램 CDNN 버젼 2.1 및 33-멤버 기초에 기초한 공급된 신경망을 사용하여, 타원형 데이터로부터 부드럽게 한 후 (방법-이동, 나선형 넓이 5) 계산하였다 (Bohm etl al (1992) Protein Eng 5, 191-195).

도킹 과정. HSA 및 shFcRn의 도킹 모델을 ZDOCK Fast Fourier Transform 기반 단백질 도킹 프로그램을 사용하여 생성하였다 (37). HSA DIII (잔기 382-582)에 대한 좌표를 2.5 Å에서 HSA의 결정 구조로부터 회수하였다 (PDB 코드 1bm0) (19). shFcRn의 두 개의 다른 모델을 사용하였다: pH 8.2에서 2.7 Å 해상도 구조 (PDB 코드 1exu) 및 pH 4.2에서 2.6 Å 해상도 구조 (PDB 코드 3m17) 98, 23). shFcRn의 구조적 모델 둘 다에 존재하는 b2m 도메인을 도킹 중에 수용체 모델에 포함시켰다. ZDOCK 프로그램을 FcRn에서 두 개의 히스티딘 His-161 및 His-166 및 HSA에서 잔기 His-464, His-510 및 His-535와 도킹 포즈에 대한 참고로 실행하였다. 모든 결정 구조를 여기에 설명된 결정학적 데이터를 가지고 PyMOL (DeLano Scientific)을 사용하여 설계하였다.

실시예 1. 도킹 모델의 구조

HSA 및 shFcRn의 도킹 모델을 ZDOCK Fast Fourier Transform 기반 단백질 도킹 프로그램을 사용하여 생성하였다 (Chen R et al (2003) Proteins 52(1):80-87). HSA DIII (잔기 382-582)에 대한 좌표를 2.5 Å에서 HSA의 결정 구조로부터 회수하였다 (PDB 코드 1bm0) (Sugio S et al (1999) Protein Eng 12(6):439-446). shFcRn의 두 개의 다른 모델을 사용하였다: pH 8.2에서 2.7 Å 해상도 구조 (PDB 코드 1exu) 및 pH 4.2에서 2.6 Å 해상도 구조 (PDB 코드 3m17) 98, 23) (West et al (2000) Biochemistry 39(32):9698-9708, 및 Mezo AR et al (2010) J Biol Chem 285(36):27694-27701). shFcRn의 구조적 모델 둘 다에 존재하는 b2m 도메인을 도킹 중에 수용체 모델에 포함시켰다. 단백질-단백질 계면에서 ZDOCK 프로그램을 FcRn에서 두 개의 히스티딘 His-161 및 His-166 및 HSA에서 잔기 His-464, His-510 및 His-535와 도킹 포즈에 대한 참고로 실행하였다 (19). 모든 결정 구조를 여기에 설명된 결정학적 데이터를 가지고 PyMOL (DeLano Scientific)을 사용하여 설계하였다.

소프트웨어는 pH 4.2에서 정렬된 루프를 가진 shFcRn에 대한 하위 도메인 DIII의 도킹에 대한 하나의 모델 및 루프 잔기 52-59가 없이, pH 8.2에서 shFcRn에 대한 여덟 개의 모델을 반환하였다. 이들 여덟 개의 모델 중에, 다섯 개는 HSA 도메인 DI 및 DII의 위치에 의해 판단된 바와 같이 분명히 잘못된 (부적합) 포즈를 나타냈고, 거절되었다. 세 개의 잔여 모델은 같은 일반적인 구조적 포즈와 밀접하게 관련되고 이를 갖고 있었다. 이들에서 FcRn의 낮은 pH 형태의 중첩은 조직화된 루프가 도킹된 (docked) HSA와 심각하게 충돌하지 않았다는 것을 나타냈다. 최종 선택된 모델 (좌표는 도 18 및 19에 나타남)은 얻어진 결합 데이터와 매우 잘 맞는 상호작용 영역을 나타낸다 (도 8a). 특히, HSA의 하위 도메인 DIIIa 및 DIIIb (490-510) 사이의 긴 루프, 뿐만 아니라 C-말단 부분 (최종 C-말단 α-헬릭스)은 shFcRn (잔기 51-60)에서 pH-의존적 및 플렉시블 루프가 결합할 수도 있는 (도 8b) HSA의 표면상의 균열을 형성한다. shFcRn의 구조는 Glu-54와 분자 내 상호작용을 통해 His-166가 루프를 안정화한다는 것을 나타내지만 (도 7a), 도킹 모델은 His-166이 HSA의 Glu-505에 결합에 관여할 수도 있다는 것을 추가적으로 제안한다 (도 8b). Glu-505는 또한 수용체의 Arg-162와 상호작용할 수도 있다. His-510의 주요 역할은 그것이 pH-의존적 α1-도메인 루프 내 Glu-54와 상호작용하는 것으로 예측된다는 사실에 의해 지지된다 (도 8b). His-510 (H510Q)의 돌연변이가 결합을 14배 감소시켰다 (도 3c, 표 1). 따라서, hFcRn의 His-166 및 HSA의 His-510은 hFcRn-HSA 상호작용 계면의 코어의 이온 네트워크를 조절하는데 수반되는 것으로 보인다.

모델은 각각 HSA의 Glu-501 및 Lys-500과 함께 shFcRn의 Lys-150 및 Glu-151 사이의 가능한 염다리를 또한 예측한다 (도 8b). 이것은 이들 위치에서 돌연변이된 HSA 변이체의 감소된 결합 능력을 나타내는 결합 데이터에 따른다 (도 6b). 게다가, 모델은 HSA의 C-말단에서 알파 헬릭스의 주요 역할을 제안한다. 이것은 DIIIb의 최종 17개의 아미노산의 삭제가 shFcRn에 대한 결합을 거의 제거한다는 사실에 의해 지지된다 (도 14).

HSA의 표면상의 또 다른 클레프트가 DIIIa-DIIIb 연결 루프 및 DIIIb (잔기 520-535)의 다른 α-헬릭스 중 하나 사이에서 형성된다. 여기에서, shFcRn의 His-161은 산성 pH에서 Glu-531과 상호작용할 수도 있다 (도 8b). 이것은 His-161이 돌연변이될 때 10배 감소된 결합 친화도가 발견되었다는 이전의 발견과 일치한다 (Andersen JT et al (2006) The conserved histidine 166 residue of the human neonatal Fc receptor heavy chain is critical for the pH-dependent binding to albumin. Eur J Immunol 36(11):3044-3051). HSA-shFcRn 복합체는 shFcRn의 Glu-168 및 DIII의 Lys-524 사이에서 형성된 염다리에 의해 추가로 보강될 수 있고, 예측은 Glu-168의 돌연변이가 HSA에 대한 결합을 적당히 감소시킨다는 사실에 의해 지지된다 (도 15).

게다가, His-535는 Phe-157과 우선적으로 상호작용할 수도 있는 한편, His-464는 HSA에서 도메인 DI 및 하위 도메인 DIIIa 사이에 끼워진 잔기 99-102를 포함하는 FcRn 내의 β-헤어핀에 가까이 위치한다 (도 8c). 여기에서, shFcRn Asp-101은 Arg-197 및 Lys-190과 같은 DI에서 여러 가능한 파트너를 갖지만, 그것들은 Asp-101에 접근하기 위해 반드시 일부 구조적 변화를 경험해야 한다. 흥미롭게도, β-헤어핀은 pH에 의존하여, 두 개의 다른 구조를 갖는다 (West et al (2000). 이것은 Asp-101이 확실히 shFcRn의 플렉시블 요소에 위치한다는 것을 제안한다. Crystal structure and immunoglobulin G binding properties of the human major histocompatibility complex-related Fc receptor, Biochemistry 39(32):9698-9708, 및 Mezo AR et al (2010) X-ray crystal structures of monomeric and dimeric peptide inhibitors in complex with the human neonatal Fc receptor, FcRn. J Biol Chem 285(36):27694-27701은 그것이 shFcRn에서 플렉시블 요소를 형성한다는 것을 제안한다.

MHC 등급 I-관련된 FcRn은 이화작용으로부터 IgG 및 알부민을 보호하도록 발달하였다 (5, 8, 22). IgG에 대한 FcRn 결합이 수십 년 동안 더 상세히 연구된 한편, 그것의 최근 발견된 알부민과의 상호작용은 분자적 수준에서 제대로 이해되지 않았다. 여기에서 데이터는 어떻게 그것들이 pH-민감한 방식으로 상호작용하여, 세포 재생을 가능하게 하는지를 나타내는 분자 둘 다에서 여러 상호작용 표면의 중요성에 대한 기계론적 증거를 제공한다.

D+DII와 달리, pH에 의해 조절되는 DIII 단독은 수용체에 결합할 수 있다는 발견은 이전 보고와 일치하게, 결론적으로 DIII가 FcRn에 대한 주요한 코어 결합 부위를 보호한다는 것을 나타낸다 (9). 하지만, 데이터는 또한 결합에 있어서 DI의 역할을 나타내며, 예를 들어, 도킹 모델은 FcRn 및 HSA DI 사이의 상호작용을 제안한다. 더 특이적으로, DIII 단독에 대한 친화도는 전체 길이 HSA에 대한 것보다 훨씬 더 약하고, 직접적으로 또는 간접적으로, DI 또는 DII의 수용체에 결합에 적당한 기여가 있을 수도 있다는 것을 제안하는 발견이다. 데이터는 또한 DI-DIII 구조가 hFcRn에 단일 HSA DIII보다 약간 더 강하게 결합하였다는 것을 나타낸다. 이것은 DIII의 구조적 안정화 또는 DI가 DIII에 융합될 때 hFcRnr과 상호작용하는 것으로 인한 것일 수도 있지만, DI-DIII 융합에에서 DI는 전체 길이 HSA의 DI와 다른 위치를 갖는다. 흥미롭게도, 모델은 DI 및 shFcRn 사이에서 일부 상호작용이 있을 수도 있다는 것을 제안한다.

DIII에 위치한 (16) 여러 HSA 다형 현상은 수용체 결합 및 그 결과 혈액에서 그것들의 수준에 영향을 미칠 수도 있다. N-결합된 글리코실화 부위를 도입하는 단일 점 돌연변이를 갖는, 한 이러한 다형 현상, Casebrook은 이형 접합체 담체에서 WT 알부민 중 약 35%에 존재한다 (20). 토끼 알부민에서 돌연변이의 도입은 토끼에 주사될 때 반감기가 50% 감소된 변이체를 발생시켰다 (24). 이들 관찰에 기초하여, HSA 변이체 모방 Casebrook을 제조하였고 (WO2011/051489 (PCT/EP10/066572), 참고로 본원에 포함됨) 그것은 shFcRn에 대한 친화도의 2배 감소를 갖는다는 것을 발견하였다. 이것은 또한 이형 접합체의 개개로부터 분리된 Casebrook 변이체에 대한 경우였으며, WT 알부민의 존재시 shFcRn에 결합에 대하여 경쟁하는 능력의 50% 감소를 나타낸다. 산성 pH에서 용해된 shFcRn의 결정 구조를 조사할 때, 부분적으로 노출된 및 양성자화된 His-166이 각각 산성 (Glu-54) 및 극성 (Tyr-60) 아미노산에 결합을 통해, 염기성 pH에서 무질서화된 루프를 안정화하는데 관여하는 것이 발견되었다. 루프의 무질서는 염기성 pH에서 His-166의 양성자화의 손실에 의해 설명될 가능성이 크며, 이것은 아마 pH-의존적 방식으로 루프의 가요성 및 구조를 조절한다.

HSA DIII에서 총 네 개의 히스티딘 잔기가 글루타민 잔기로 돌연변이 되었다. 세 개의 매우 잘 보존된 히스티딘 잔기 (His-464, His-510 및 His-535)는 산성 pH에서 결합에 있어서 중요한 것으로 발견되었다. DIII에 존재하는 히스티딘 잔기의 중요성, 및 또한 HSA에 결합에 대하여 FcRn 내에 His-166의 중요성과 관련된 정보를 HSA-shFcRn 복합체의 도킹을 안내하기 위해 사용하였다. 분자적 데이터에 따라, DIII는 DI로부터 작은 기여로 주요 상호작용 계면을 형성한다. 게다가, IgG 및 알부민은 다른 단백질의 결합을 방해하지 않고 비-중첩 부위에 결합하는 것으로 나타났다 (9, 21). 이것은 두 개의 리간드의 동시 결합을 위해 방해가 존재하지 않는 도킹 모델과 잘 맞는다 (도 16). 알부민 결합이 수용체 상의 구조적 변화를 유발하는지 아닌지 또는 그 반대는 제외될 수 없다.

도킹 모델의 조사 후에, HSA Casebrook 변이체에 존재하는 올리고당 부착 부위 (Asn-494) 및 shFcRn 사이에 직접적인 결합이 발견되지 않았다. 하지만, Asp-494는 DIIIa 및 DIIIb를 연결하는 연장된 루프 (490-510)의 N-말단 영역의 일부이고, 루프의 N-말단 끝에서 조성물의 변화가 일반적으로 루프의 구조적 변화를 유발할 것이다. Asp-494 및 Glu-495 잔기의 구조적 중요성은 모든 종에 걸쳐 둘 다 매우 잘 보존된다는 사실에 의해 지지된다 (도 2). 중요하게는, 도킹 모델은 루프의 C-말단에서 여러 잔기가 수용체의 α1-α2-플랫폼과 직접적으로 접촉한다는 것을 제안하며, 예측된 주요 잔기는 HSA상의 His-510 및 Glu-505, 뿐만 아니라 shFcRn상의 Glu-54이다. His-510은 세 개의 보존된 히스티딘 잔기 중 하나이고, 이 잔기 (즉, H510Q)의 돌연변이는 shFcRn에 결합을 크게 감소시켰다. FcRn 결합에 수반된 HSA상에서, 두 개의 잔여 보존된 히스티딘 잔기 중에, His-535는 방향족 스태킹 (stacking) 또는 HSA의 하위 도메인 DIIIa 및 DIIIB 사이의 루프의 안정화에 의해 HSA-FcRn 복합체를 보강할 수도 있다. His-464는 직접적으로 또는 간접적으로, FcRn에서 플렉시블 β-헤어핀 요소와 상호작용할 수도 있다. 흥미롭게는, 이 β-헤어핀 루프는 낮은 및 높은 pH 결정 구조의 비교에 의해 판단된 바와 같이, His-166에 의해 안정화된 pH-의존적 루프를 제외하고는, FcRn에서 가장 플렉시블한 부분이다. 플렉시블 β-헤어핀 루프는 낮은 및 높은 pH 결정 구조의 비교에 의해 판단된 바와 같이, His-166에 의해 안정화된 pH-의존적 루프를 제외하고는, FcRn에서 가장 플렉시블한 부분이다. shFcRn에서 플렉시블 β-헤어핀은 His-464를 함유하는 HSA의 α-헬릭스, 뿐만 아니라 DI의 긴 루프 둘 다와 접촉하며, DI 및 DIIIa를 수반하는 shFcRn-HSA 계면의 간접적인 구조적 "조율"을 제안한다. 요약하면, 데이터는 FcRn 및 알부민 둘 다의 히스티딘 잔기가 최적의 pH-의존적 결합에 필수적이다는 것을 나타낸다. 데이터는 알라닌으로 보존된 히스티딘 잔기의 돌연변이가 마우스에 주사될 때 항체 단편과 융합된 HSA DIII 돌연변이의 증가된 제거를 발생시킨다는 것을 나타내는 연구를 지지하지만, FcRn 결합과의 연관성은 나타나지 않았다 (25). 게다가, 진화론적 관점으로부터, 다른 기능을 가진, 두 개의 완벽하게 관련되지 않은 가용성 분자가 둘 다의 경우에 변성 및 연장된 반감기로부터의 구조를 일으키는 유사한 pH- 및 히스티딘-의존적 방식으로 단일 세포 결합된 수용체에 결합하도록 진화되었다는 것이 흥미롭다.

알부민의 주요 기능은 세 개의 도메인 내 또는 사이의 소수성 포켓에 비대칭적으로 결합되는 지방산을 수송하는 것이다 (1, 26, 27). HSA DIII는 두 개의 높은 친화도 결합 부위를 보호하고, 지방산은 HSA DIIIa 및 DIIIb 사이의 루프에 가깝게 결합하며, 이것은 또한 FcRn 결합에 영향을 미치는 것으로 발견된 여러 잔기를 포함한다. 결합된 지방산 및 유리된 상태의 HSA의 비교 (19, 27)는 결합시 HSA의 하위 도메인 DIII 내에 실질적인 재배열이 아니라, HSA DIII에 비해 HSA DI의 방향으로 많은 이동을 나타낸다 (도 17). 사실상, 도킹 모델에서 해당하는 FcRn-결합 도메인에 HSA을 결합하는 지방산에서 DIII의 중첩은 DI가 지방산에 결합할 때 FcRn으로부터 멀리 이동한다는 것을 나타낸다.

FcRn의 반감기 조절 기능은 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 치료적 및 진단적 목적에 이용될 수도 있다 (28, 29). 분명하게, 결합 라이브러리 또는 분자 조작으로부터 얻은 생체 활성 펩티드 및 작은 단백질은 유망한 후보이지만, 그것들 (및 모든 약물)은 신장 청정 역치 이하인 그것들의 크기의 결과로서 매우 짧은 반감기, 뿐만 아니라 프로테아제에 의한 분해에 대한 민감도로 인해 생체 내에서 확실한 효과를 나타내는 것에 실패할 수도 있다 (30, 31). 이것은 이러한 분자의 선도 후보로부터 시판되는 약물(들)로 전이를 제안한다. 이들 장애의 해결은 FcRn에 의해 조절된 IgG 또는 알부민의 연장된 반감기의 이점을 취하는 것일 수도 있다. 여러 예는 IgG Fc 또는 HSA에 치료적 단백질의 유전적 융합이 생물 분류 및 약물 동력학을 개선한다는 것을 나타냈다 (29).

IgG의 혈청 반감기는 또한 자연에 의해 발달된 것 이상으로 광범위하게 개선될 수도 있다. 이것은 조작된 IgG 변이체를 발생시키는 조사의 극심한 영역이이고 그것들의 Fc 부분에서 점 돌연변이는 개선된 pH-의존적 FcRn 결합을 일으켰고, 그 결과 생체 내 반감기를 연장하였다 (4, 5, 32). 마우스 알부민이 HSA보다 shFcRn에 대하여 더 강하게 결합한다는 관찰을 제외하고는, 예는 지금까지 알부민을 위해 제공되지 않았다 (21). 이 연구에서 제공된 도킹 모델은 증가된 혈청 반감기를 가진 새로운 HSA 변이체의 개발을 안내할 수도 있으며, 이것은 화학적 및 생물학적 약물 둘 다의 전달에 매력적일 수 있다.

종양 및 염증성 조직은 모세혈관 누출 및 결함이 있는 림프 드레니지 (lymphatic drainage)의 결과로서 알부민의 증가된 누적을 나타낸다 (33). 그 결과, 알부민-기반 의약품 또는 진단은 종양 또는 염증의 부위에 축적된다. 게다가, 알부민 반감기의 미세 조정은 또한 융합된 분자의 조직 독성으로 인한 종양 표적화 및 이미징에 관하여 매력적인 접근법일 수도 있다. FcRn에 대한 친화도를 약화시킴으로써 IgG 반감기의 조절은 종양을 정상 조직 비율로 개선하고 그 결과 종양 이미징을 개선하는 것으로 나타났다 (34, 35). 이 출원에 설명된 HSA 변이체는 실질적으로 감소되거나 없거나 중간의 FcRn 결합 친화력으로, 매력적인 알부민 후보의 역할을 할 수도 있다.

WO2011/051489 (PCT/EP10/066572; 본원에 참고로 포함됨)는 알부민의 특정 위치 (예를 들어, HSA의 위치 573)가 FcRn에 대한 결합 친화도를 변화시키기 위해 어떤 다른 아미노산으로 치환될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 신호 위치의 변화는 모체 알부민 (WT HSA, SEQ ID NO: 2)의 결합 친화도와 다른 결합 친화도를 갖는 알부민 변이체의 그룹을 제공한다. 위치 573에 대하여, 모든 변이체는 WT HSA와 비교하여 shFcRn에 개선된 결합을 나타냈다. 특히, 변이체 K573F, K573H, K573P, K573W 및 K573Y는 shFcRn에 대하여 모체 HSA보다 10배 더 낮은 KD를 가졌다. 변이체 K573STOP는 위치 573에서 종결 코돈을 갖고 WT HSA에 비해 크게 감소된 결합을 갖는, 절단된 알부민이다.

실시예 2. FcRn 에 대한 최적의 결합에 필요하고 그러므로 그것의 변화가 FcRn 및 알부민 사이의 결합 친화도를 변화시키는 HSA 의 영역의 확인.

도킹 모델에 기초하여, 시각적으로 아미노산 잔기의 위치를 확인하였으며, 이것은 알부민 및 FcRn 사이의 상호작용 계면에 직접적으로 위치하고 계면에 가까운 곳에 위치한다. 이들 위치는 도 9에서 어두운 셰이딩에 의해 나타나고 알부민의 도메인 I의 위치: 30 내지 41, 75 내지 91, 104 내지 120, 144 내지 150 and 186 내지 201 및 알부민의 도메인 III의 위치: 414 내지 426, 457 내지 572, 492 내지 538 및 550 내지 585에 위치한다.

실시예 3. FcRn 에 HSA 의 결합에 수반된 아미노산 위치의 확인.

DIII 는 FcRn 에 대한 pH 의존적 결합에 수반된다

알부민은 여섯 개의 이황화 결합을 형성하는 열두 개의 시스테인 잔기의 복합 네트워크에 의해 안정화된 α-헬릭스를 포함하는 세 개의 상동성 도메인 (DI, DII 및 DIII)으로 구성된다 (19). 세 개의 도메인은 루프에 의해 결합되고 심장 모양의 구조를 형성한다 (도 4b). 두 개의 이전의 연구는 FcRn 결합에 중요한 것으로 알부민의 DIII를 나타냈다 (2, 17). 이것을 확인하고 어떻게 각각 개개의 도메인이 FcRn 결합 부위에 기여하는지 추가로 조사하기 위해, 여러 도메인 변이체 (DI-DIII, DII-DIII, DI-DII, DIII), 뿐만 아니라 전체 길이 HSA (도 4c)를 효모에서 생산하였다 (도 4d). 고정된 가용성 재조합 사람 FcRn (shFcRn-GST)에 각각의 결합을 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 측정하였으며, 도메인 변이체의 동량을 pH 6.0 및 pH 7.4에서 주사하였다. shFcRn에 결합된 DIII로만 구성된 변이체, 및 DIII가 없는 변이체는 결합하지 않았다 (도 4b). 게다가, DI-DIII 변이체는 shFcRn에 대하여 DIII 단독보다 약간 더 강하게 결합하였다 (표 2a). 다른 한편으로, DII는 결합에 기여하는 것으로 보이지 않았다.

세 개의 HSA 도메인 각각은 두 개의 하위 도메인, a 및 b를 갖고 있다. C-말단 하위 도메인 DIIIb의 중요성을 나타내기 위해, HSA 변이체는 이 도메인이 삭제된 경우 제조되었다 (HSA DIIIa). DIIIb의 부족은 shFcRn 결합을 완벽히 폐지하였다 (도 4f). 재조합 HSA Bartin 변이체는 비교를 위해 포함되었고 (17) DIIIb가 수용체 결합에 중요하다는 관찰을 지지한다. 이들 결과는 온전한 DIII가 수용체 결합에 중요하다는 것을 입증한다.

표 2a. shFcRn - GST 에 HSA 변이체의 결합에 대한 SPR -유도된 동력학 .

^a동력학적 비율 상수를 단순 1차 (1:1) 랭뮤어 이분자 상호작용 모델을 사용하여 얻었으며, 이것은 한 HSA 분자가 하나의 FcRn에 결합한다는 것을 가정한다. 동력학적 값은 3배수의 평균을 나타낸다.

^b평형 상태 친화도 상수를 BIAevaluation 4.1 소프트웨어에 의해 지원되는 평형 (Req) 결합 모델을 사용하여 얻었다. 동력학적 값은 3배수의 평균을 나타낸다.

^cND, 없거나 매우 약한 결합으로 인해 결정되지 않음.

^dNA, 빠른 결합 동력학 때문에 얻지 못함.

Casebrook-FcRn 결합을 변형시키는 HSA DIII 의 점 돌연변이

HSA는 정상적으로 비-글리코실화되지만, 희귀한 다형 현상으로 인한 소수의 예외가 존재한다 (16). 하나의 이러한 변이체 (Casebrook)은 아미노산 잔기 494에서 Asp에서 Asn으로 암호화를 변화시키는 단일 뉴클레오티드 치환을 갖고 (20), 하위 도메인 DIIIa 및 DIIIb을 연결하는 긴 루프를 형성하는 아미노산 (잔기 490-510)의 스트레치 (stretch)에 위치한다 (도 5a 및 6a). 이 자연적인 다형 현상은 글리코실화 모티프 (motif) (⁴⁹⁴Asn-Glu-Thr⁴⁹⁶) 및 N-결합된 올리고당의 부착을 도입한다. 연구는 우리가 ⁴⁹⁴Asn-Glu-Thr⁴⁹⁶에서 올리고당 및 개개의 아미노산의 역할을 분석하는 것을 허용하는 SDS-PAGE의 이동 및 많은 재조합 HSA 변이체의 FcRn 결합으로 만들어졌다. Casebrook의 재조합 버젼 (D494N)은 SDS-PAGE에서 야생형 (WT) HSA보다 더 천천히 이동하였으며, 이것은 올리고당 잔기의 부착을 반영한다 (도 5e). 게다가, 여섯 개의 변이체, D494A, D494Q, E495Q, E495A, T496A 및 D494N/T496A에서, 글리코실화 모티프를 분열시켰고, 그 결과, 이들 돌연변이 모두는 그것들의 WT 대응물과 유사하게 이동하였다 (도 5b).

모든 변이체를 SPR에 의해 고정된 shFcRn에 결합에 대하여 테스트하였고, 분명한 결합 차이를 산성 pH에서 다음과 같이 가장 강한 것에서 가장 약한 것의 단계로 검출하였다: WT > T496A > D494N/T496A > D494N > E495Q E495A > D494A > D494Q (도 5c-f, 표 2a). 결합이 ELISA에 의해 연구될 때 같은 경향을 얻었다 (도 10). 결합 동력학은 D494N (Casebrook)을 제외한 대부분의 돌연변이에 대한 해리도의 차이를 나타냈고, 이것은 2배 감소된 결합 친화도를 나타내며, 변화된 결합 및 해리 상수 둘 다로부터 발생하였다. Ala 또는 Gln으로 Asp-494 및 Glu-495의 돌연변이는 수용체 결합에 대한 큰 효과를 갖는 한편, Thr-496을 플랭크 (flank)하는 돌연변이는 결합에 대하여 작은 효과만을 갖는다. 이형 접합체 개개로부터 분리된 HSA Casebrook 변이체는 그것의 재조합 대응물과 유사한 shFcRn에 결합하였다 (도 5f, 도 11, 표 2a).

Casebrook 변이체는 이형 접합체 개개에서 정상 HSA보다 2-3배 더 낮은 수준으로 존재한다 (20). 생체 내 상황을 모방하기 위해, Casebrook 변이체가 FcRn 결합에 대하여 경쟁하는 대량의 WT HSA의 존재시 존재하는 경우, 경쟁적 SPR-기반 검정을 사용하였고 수용체 결합에 대하여 경쟁하는 Casebrook 변이체의 능력이 HSA WT와 비교하여 거의 50% 감소했다는 것을 발견하였으며 (도 5g), 발견은 결합 친화도의 2배 감소를 반영한다 (표 2a).

Casebrook 의 구조적 영향- DIIIa - DIIIb 연결 루프의 안정성

HSA 돌연변이의 온전성 및 폴딩 (folding)을 원형 2색성에 의해 조사하였다. 상기 WT HSA와 큰 차이는 pH 7.4 및 pH 6.0 둘 다에서 돌연변이 중 어느 하나에 대하여 관찰되지 않았다 (도 12, 표 3).

표 3: CD 에 의해 결정된 2차 구조적 요소

그 다음, HSA (19)의 결정 구조를 조사하였고, Asp-494가 DIII 하위 도메인, a 및 b 둘 다에서 아미노산을 수반하는 극성 상호작용의 분자 내 네트워크에 수반되는 것을 발견하였다 (도 5a). Asp-494의 카르복실 측쇄는 Arg-472과 전하를 띤-안정화된 염다리, 뿐만 아니라 Gln-417 및 Thr-496과 수소 결합을 형성한다. Asn-494의 N-결합된 글리코실화는 그것의 수소 결합 능력을 감소시키고 염다리의 음성 성분을 제거할 것이며, 이것은 루프를 안정화하는데 있어서 중요할 수도 있다. 이것은 Q417A 돌연변이가 shFcRn에 결합을 감소시켰다는 발견을 지지한다 (도 5h, 표 2a). 게다가, 글리코실화, 즉, 부피가 큰 모이어티의 도입은 잔기 490-495를 포함하는 루프의 N-말단 끝을 매우 잘 불안정하게 할 수도 있고, 따라서 그것의 구조에 영향을 미친다.

루프의 N-말단 끝에서 Asp-494, Glu-495 및 Thr-496 외에, 루프의 중간에 Pro-499, Lys-500 및 Glu-501 (도 6a) 를 돌연변이 발생에 의해 표적화하였고 shFcRn에 대한 효과를 조사하였다. 중간의 효과가 P499A 및 E501A에 대하여 발견되는 한편, K500A는 수용체에 결합을 크게 감소시켰다 (도 6b, 표 2a).

HSA DIII 에서 보존된 히스티딘 잔기에 대한 역할

히스티딘 잔기가 엄격히 pH-의존적 IgG-FcRn 상호작용에서 중요한 요소라는 사실에 의해 안내되면 (4, 5), HSA DIII 내에서 발견된 네 개의 히스티딘 잔기의 역할을 평가하였다. 이들 중에, 세 개는 모든 종에 걸쳐 매우 잘 보존되고 (His-464, His-510 및 His-535) 하나는 아니다 (His-440) (도 2). His-440 및 His-464가 하위 도메인 DIIIa 내에서 발견되는 한편, His-510은 하위 도메인 DIIIa 및 DIIIb를 연결하는 루프의 끝에 위치하고, His-535는 DIIIa의 α-헬릭스 중 하나에서 발견된다 (도 6a). 모두 네 개의 히스티딘 잔기가 개별적으로 글루타민으로 돌연변이되고 (도 13) pH 6.0에서 shFcRn에 결합하는 것에 대하여 테스트하였다. 세 개의 보존된 히스티딘 잔기의 각각의 돌연변이는 거의 완벽하게 결합을 폐지하는 반면에, 비-보존된 His-440의 돌연변이는 아니었다 (도 6c, 표 2a). 따라서, 데이터는 pH-의존적 FcRn 결합에 필수적인 것으로 DIII 내에서 세 개의 히스티딘 잔기를 정확히 찾아내며, 이것은 IgG의 Fc 엘보우 (elbow) 영역에서 보존된 히스티딘 잔기에 대한 필요와 유사하다. (His-310 및 His-435).

게다가, His-535의 부근의 아미노산 (Lys-536, Pro-537 및 Lys-538)은 또한 알라닌 개별적으로 알라닌 잔기로 돌연변이될 때, 결합을 감소시키는 것으로 나타났다 (Fig 6d, 표 2a). 종합해보면, 결합 데이터는 pH-의존적 FcRn 결합에 중요한 DIII상의 코어 구조적 영역을 정의한다.

FcRn 상의 결합 부위의 매핑 ( mapping )

우리는 이전에 마우스 및 사람 FcRn HC 둘 다의 α2-도메인에 위치한 매우 잘 보존된 히스티딘 잔기가 알부민 결합에 중요하다는 것을 확인하였다 (각각 His-168 및 His-166) (21, 22). 분자적 설명을 얻기 위해, 최근에 산성 조건 하에 용해된 shFcRn의 결정 구조 (pH 4.2) (도 4a) (23)를 조사하였다. His-166이 α1-도메인 (잔기 51-60) 내 표면 노출된 루프 상에서 발견된 Glu-54 및 Tyr-60과 전하 안정화된 수소 결합을 수반하는 분자 내 상호작용의 네트워크에 관여된다는 것을 발견하였다 (도 7a). 낮은 pH에서, His-166은 양전하를 가질 것이고 이것은 전하를 띠지 않는 His-166이 생리학적 pH에서 Glu-54 및 Tyr-60과 그것의 상호작용을 느슨하게 하거나 손실한다는 것을 제안하며, 이것은 더 플렉시블한 루프를 발생시킬 것이다. 이 설명은 이 루프-영역이 염기성 pH (pH 8.5)에서 용해된 shFcRn의 결정 구조에서 구조적으로 무질서화된다는 사실에 의해 지지된다 (도 7b). 게다가, 해당 루프는 또한 산성 pH에서 용해된 래트 IgG2a를 갖는 복합체에서 래트 FcRn의 동시-결정 구조에서 정의된 구조로 정렬된다 (6). 낮은 및 높은 pH에서 두 개의 사람 FcRn 구조의 비교는 Trp-51 및 Tyr-60 사이의 플렉시블 루프의 로킹 및 방출에서 중심 조절 역할을 제안한다 (도 7a 및 7b).

Glu-54는 또한 Gln-56과 상호작용에 수반된다 (도 7a). Glu-54 및 Gln-56의 중요성을 나타내기 위해, 두 개의 잔기는 개별적으로 각각 글루타민 또는 알라닌으로 돌연변이되고, 두 개의 결과의 수용체 변이체 (shFcRn E54Q 및 shFcRn Q56A)를 pH 6.0에서 ELISA에 의해 HSA에 결합에 대하여 테스트하였다 (WO2011/051489 (PCT/EP10/066572)에서 설명된 방법을 사용하였으며, 본원에 참고로 포함됨). E54Q 돌연변이의 영향은 HSA에 대하여 거의 아무런 수용체 결합이 검출되지 않은 반면에, Q56A 변이체는 부분적으로 HSA에 대한 결합을 상실했기 때문에, 눈에 띄었다 (도 7c). 따라서, 데이터는 Glu54에 결합을 통한 pH-의존적 방식의 shFcRn의 α1-도메인 루프를 안정화하는데 있어서 His-166에 대한 중요한 구조적 역할, 및 산성 pH에서 이 루프의 정렬된 구조가 효과적인 알부민 결합에 필수적이다는 것을 입증한다.

실시예 4. HSA 의 C-말단 끝의 절단은 shFcRn 에 대한 결합을 조절한다.

절단된 HSA 돌연변이에 대한 발현 구조 (표 6, 하기)를 PCR 및 간극회복 (gap-repair)에 의해 생성하였다. PCR 생성물을 주형으로서 pDB3927 (WO2010/092135에 설명됨 (본원에 참고로 포함됨)) 및 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 제조사의 지시에 따라, Phusion Polymerase (New England Biolabs)를 사용하여 생성하였다 (표 4 및 5). 이것은 특이적 코돈 (즉, 아미노산 568 및 572 내지 585, 위치 573을 제외함)이 번역 종결 코돈 아미노 TAA와 대체되는 DNA를 발생시켰다. 이들 PCr 생성물을 플라스미드에 클로닝하였고 간극회복에 의해 효모에서 발현 플라스미드를 형성하기 위해 사용하였다.

표 4. 절단된 HSA 분자

표 4에서, 'HSA 585종결'이 본래의 아미노산이 위치 585에서 종결 코돈으로 치환되는 HSA의 변이체인 알부민 변이체가 지정된다.

특이적으로, HSA 568종결 발현 구조에 대하여 올리고뉴클레오티드 xAP314 및 xAP307를 사용하여 pDB3927로부터 493 bp 단편을 증폭하였으며, 제조사의 지시에 따라, HSA DIII를 암호화하는 DNA 서열을 함유한다. 종결 코돈을 올리고뉴클레오티드 xAP307로 조작하여 HSA를 암호화하는 DNA 서열의 번역을 아미노산 567 이후에 종결하였다. PCR 단편을 Qiagen PCR-클린업 (clean up) 키트를 사용하여 정제된 (제조사의 지시에 따라) AvrII/Bsu36I로 분해하였고 AvrII/Bsu36I-분해된 pDB3927에 결찰하였다. 결찰물을 이. 콜리 (E. coli) DH5α로 형질전환하였고, 이후에 플라스미드를 형질전환체로부터 분리하였고 (Qiagen 미니프렙 (miniprep) 키트 (제조사의 지시에 따라)) 올바른 구조물을 제한 분석에 의해 확인하였다. 이것은 HSA 568종결 발현 구조 pDB4557을 생산하였다.

플라스미드 pDB4548 내지 pDB4556 (표 4)을 생산하기 위해 HSA 572종결 및 HSA 574종결 내지 HSA 581 종결 발현 구조를 올리고뉴클레오티드 (표 5)를 사용하여 HSA 568종결 구조와 같은 방식으로 만들었다.

HSA 582종결 내지 HSA 585종결 구조 (1.122 kb) 단편을 오리고뉴클레오티드 (표 5)를 사용하여 pDB3927로부터 PCR 증폭하였다. PCR-단편을 각각 분리된 BglII/HindIII으로 분해하였고 pDB2923에 결찰하여 각각 플라스미드 #10D, #11B, #12C 및 #13D를 생산하였다 (Finnis, C. J. et al. (2010). High-level production of animal-free recombinant transferrin from Saccharomyces cerevisiae. Microb Cell Fact 9, 87). 플라스미드 #10D 내지 #13D를 AvrII/SphI으로 분해하였고 666bp 단편 (containing the DNA encoding the C-말단 end of 알부민)을 각각으로부터 분리하였고 AvrII/SphI-분해된 pDB3927에 결찰하여 각각 간극회복 구조 pDB4544 - pDB4547을 생산하였다 (표 4).

플라스미드 pDB4544 - pDB4557을 NsiI/PvuI로 분해하였고, Acc65I/BamHI-분해된 pDB3936과 함께, 상기 설명된 바와 같이 에스. 세레비시애 BXP10cir⁰을 동시 형질전환하여 간극회복에 의해 효모에서 발현 플라스미드를 생성하기 위해 사용되기 전에, DNA를 정제하였다 (제조사의 지시에 따라 Qiagen PCR Purification 키트).

스톡 (stock)을 각각의 결과의 효모 균주에 대하여 제조하였다. 10 ml BMMD 브로스 (broth) (아미노산 및 암모늄 술페이트 (Difco)가 없는 0.17 부피% 효모 질소 염기, 37.8mM 암모늄 술페이트, 36 mM 시트르산, 126mM 이나트륨 히드로겐 오르토포스페이트 pH 6.5, 2 부피% 글루코스, NaOH로 pH 6.5로 조정됨)를 필요한 균주로 접종하였고 200 rpm으로 오비탈 셰이킹 (orbital shaking)하면서 30 ℃에서 48시간 동안 키웠다. 각각의 배양물의 5 mL을 같은 부피의 40 부피% 트레할로스와 혼합하였고 1 ml 앨리쿼트를 -80 ℃에서 저장을 위해 냉동 바이알 (cryovial)에 옮겼다.

HSA 573종결 변이체를 생산하는 효모 균주의 구조는 WO2011/0541489에 설명된다 (본원에 참고로 포함됨).

표 5. 절단된 HSA 돌연변이의 제조용 올리고뉴클레오티드 서열

다음 변이체 (단편)를 생성하였고 shFcRn-GST에 결합을 재료 및 방법에 설명된 바와 같이 결정하였다. 더 특이적으로, HSA의 C-말단 끝에서 아미노산을 암호화하는 코돈을 개별적으로 TAA (즉, 번역 종결 코돈)로 대체하여 표 6의 절단된 HSA 변이체를 생성하였다. shFcRn에 결합하는 HSA 변이체에 대한 결합 데이터는 표 6, 도 20 및 도 21에 제공된다.

표 6: shFcRn - GST 에 HSA 절단 변이체의 결합에 대한 SPR -유도된 동력학 .

a: HSA 변이체의 희석액을 고정된 shFcRn (~2000 RU)을 통해 주사하였다.

b: 동력학적 비율 상수를 단순 1차 (1:1) 이분자 상호작용 모델을 사용하여 얻었다. 동력학적 값은 2배수의 평균을 나타낸다.

c: 평형 상태 친화도 상수를 BIAevaluation 4.1 소프트웨어에 의해 공급된 평형 (Req) 결합 모델을 사용하여 얻었다.

d: 미결정 (ND).

표 6 및 도 20의 데이터는 shFcRn에 대한 pH 의존적인 결합에 있어서 HSA의 C-말단의 중요성을 나타낸다. 놀랍게도, 최종 아미노산 (Leu585)의 제거는 수용체의 결합을 WT HSA와 비교하여 50% 감소시켰고 추가의 절단은 효과를 증가시켰다 (도 20).

유사하게는, 절단 길이의 증가와 함께 감소된 친화도의 일반적인 경향은 경쟁적 결합 검정에서 관찰된다 (도 21). 즉, 경쟁은 더 많은 아미노산의 제거로 점진적으로 감소되었다.

KD의 결정은 C-말단 절단의 극적인 영향을 나타낸다 (표 4).

실시예 5. HSA 의 C-말단 끝에서 변화는 shFcRn 에 대한 결합을 조절한다.

HSA 돌연변이의 발현 구조 (표 7, 하기)를 PCR 및 간극회복에 의해 생성하였다. 이것을 주형으로서 pDB3927 및 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 제조사의 지시에 따라, Phusion Polymerase (New England Biolabs)를 사용하여 PCR 생성물을 생성함으로써 달성하였다 (표 7 및 8). 각 PCR-단편을 AvrII/Bsu36I로 분해하였고, 정제하였고 (Qiagen PCR-클린업 키트 (제조사의 지시에 따라)) AvrII/Bsu36I-분해된 pDB3927에 결찰하였다. 결찰물을 이. 콜리 DH5α로 형질전환하였고, 이후에 플라스미드를 형질전환체로부터 분리하였고 (Qiagen 미니프렙 키트 (제조사의 지시에 따라)) 올바른 구조물을 시퀀싱 (sequencing)에 의해 확인하였다.

표 7 HSA 의 C-말단 끝의 변화

표 8. HSA 의 C-말단 끝의 변화의 제조용 올리고뉴클레오티드 서열

원하는 치환을 함유하는 플라스미드, pDB4535 내지 pDB4537 (표 7)을 NsiI/PvuI로 분해하였고, Acc65I/BamHI-분해된 pDB3936과 함께, 상기 설명된 바와 같이 에스. 세레비시애 BXP10cir⁰을 동시 형질전환하여 간극회복에 의해 효모에서 발현 플라스미드를 생성하기 위해 사용되기 전에, DNA를 정제하였다 (제조사의 지시에 따라 Qiagen PCR Purification 키트). 스톡을 상기 설명된 바와 같이 각각의 결과의 효모 균주에 대하여 제조하였다.

다음 변이체를 생성하였고 shFcRn-GST에 대한 결합 친화도를 재료 및 방법에 설명된 바와 같이 결정하였다. 결과는 표 9 및 도 22에 제공된다.

표 9: shFcRn - GST 에 대한 HSA 변이체의 결합에 대한 SPR -유도된 동력학 .

a: HSA 변이체의 희석물을 고정된 shFcRn (~2000 RU)를 통해 주사하였다.

b: 동력학적 비율 상수를 단순 1차 (1:1) 이분자 상호작용 모델을 사용하여 얻었다. 동력학적 값은 2배수의 평균을 나타낸다.

c: 평형 상태 친화도 상수를 BIAevaluation 4.1 소프트웨어에 의해 공급된 평형 (Req) 결합 모델을 사용하여 얻었다.

d: 미결정 (ND).

데이터는 shFcRn에 대한 pH 의존적 결합에 있어서 HSA의 C-말단 끝의 중요성의 추가의 증거를 제공한다. Q580 및 K574의 알라닌 치환은 결합 친화도를 각각 대략 2 및 4배 감소시키는 것으로 나타났다 (도 22 및 표 5). 이중 돌연변이 (K573P를 Q580A와 결합시킴)는 shFcRn에 대하여 개선된 친화도를 발생시킨다. 종합해보면, 실시예 4 및 5의 데이터는 shFcRn에 알부민의 결합을 위한 DIIIb의 최종 α-헬릭스에서 아미노산의 중요성을 나타낸다.

실시예 6. shFcRn 에 알부민 변이체의 결합 친화도의 SPR 분석

알부민의 변이체를 하기 방법에 따라 생성하였다.

특이적 HSA 뮤테인 발현 플라스미드의 제조.

HSA 변이체는 Sambrook, J. and D.W. Russell, 2001 (Molecular Cloning: a laboratory manual, 3^rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y)에 의해 설명된 바와 같이, 여러 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 발현되었다. 하기 설명된 것은 WT HSA를 암호화하는 플라스미드, pDB3964의 적합한 제한 부위의 근접에 기초하여, HSA 서열 내에 돌연변이를 도입하기 위해 이용된 두 개의 방법이다 (WO2010/092135에 설명되었으며, 본원에 참고로 포함됨).

방법 1: 원하는 돌연변이에 가까운 제한 부위가 존재할 때, 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드를 설계하였으며, 원하는 변화 및 적절한 제한 부위를 포함한다 (표 10 및 11). 적절한 프라이머를 PCR 반응에 이용하였으며 (표 12 및 13에 설명됨), New England Biolabs Phusion 키트 및 주형으로서 pDB3964를 이용하였다. 결과의 생성물을 정제하였다 (QIAquick PCR Purification Kit, 제조사의 지시에 따라). 생성물을 적절한 제한 효소로 분해하였고 (표 10) 정제하였다 (QIAquick Gel Extraction Kit (제조사의 지시에 따라)). 결과의 단편을 적절히 분해된 pDB3964에 결찰하였으며, WT HSA 서열을 원하는 돌연변이를 함유하는 HSA 서열로 치환하였다. 결찰물을 이. 콜리 DH5α로 형질전환하였고 플라스미드를 분리하였다 (Qiagen 플라스미드 Plus Kit (제조사의 지시에 따라). 모든 플라스미드를 시퀀싱하여 HSA 서열이 원하는 위치(들)에서만 돌연변이되었는지 확인하였다.

표 10: 플라스미드 및 아미노산 치환 및 적절한 프라이머 (표 2를 또한 참조하면 된다)

표 11: 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드

표 12: PCR 반응 성분

표 13: PCR 반응 조건

방법 2. 적합한 제한 부위는 원하는 돌연변이의 부근에 존재하지 않았고, 합성 DNA 단편을 유전자 조립에 의해 생산하였고 (GeneArt, Life Technologies) HSA 유전자 내에 돌연변이(들) 및 야생형 HSA를 암호화하는 플라스미드, pDB3964에 삽입되는 적합한 제한 부위를 함유하도록 설계하였으며, 전하를 띠지 않은 아미노산을 암호화하는 합성 단편의 뉴클레오티드 서열은 pDB3964의 그것과 동일하였다 (표 14 및 15를 참조하면 된다). 합성 구조물을 표 14에 지정된 제한 효소로 분해하였고, 원하는 단편을 정제하였고 (QIAquick Gel Extraction Kit) 적절하게 분해된 pDG3964에 결찰하였으며, WT HSA 서열을 원하는 돌연변이를 함유하는 HSA 서열로 치환하였다. 결찰된 플라스미드를 이. 콜리 DH5α 세포에 형질전환하였고 플라스미드를 분리하였다 (Qiagen 플라스미드 Plus Kit (제조사의 지시에 따라). 모든 플라스미드를 시퀀싱하여 HSA 서열이 원하는 위치(들)에서만 돌연변이되었는지 확인하였다.

표 14: 플라스미드 및 아미노산 치환

표 15: 아미노산 치환을 HSA 에 도입하기 위해 사용된 코돈.

K573P 와 조합 돌연변이의 생산

조합 돌연변이 (표 16)을 생산하여 표 10 및 14에 설명된 돌연변이의 서브세트와 HSA K573P 변이체 (플라스미드 pDB4110)를 결합시켰다. K573P 변이체 DNA를 암호화하는 0.358kb 단편을 SacI/SphI 제한 효소로 분해에 의해 플라스미드 pDB4110으로부터 분리하였고, QIAquick Gel Extraction Kit를 사용하여 정제하였고 같은 효소로 분해된 pDB4704, pDB4716 및 pDB4753 (표 10을 참조하면 된다)에 결찰하여, 각각 HSA 변이체 E505Q/K573P, E425A/K573P 및 T527M/K573P를 생산하였다. 추가의 조합 돌연변이를 NaeI/NcoI 제한 효소로 pDB4110의 분해, 상기 설명된 바와 같이 분리 및 pDB4745, pDB4746 및 pDB4747의 동등한 단편의 결찰 (표 14에 설명됨)에 의해 제조하여 각각 조합 돌연변이 N111D/K573P, N111G/K573P 및 N111H/K573P를 생산하였다. K534V/K573P 돌연변이를 생산하기 위해, 원하는 돌연변이 둘 다를 함유하는 합성 DNA를 유전자 조립 (GeneArt, Life Technologies)에 의해 생산하였다. 단편을 SalI/Bsu36I 제한 부위를 통해 분해하였고, 상기 설명된 바와 같이 분리하였고 적절하게 분해된 pDB3964에 결찰하였다. 조합 돌연변이 N111R/K573P, N111Q/K573P 및 N111E/K573P을 생산하기 위해, N111 돌연변이를 함유하는 단편을 SacII/NheI 제한 부위를 통해 GeneArt 구조로부터 제거하였고 pDB4110의 SacI/SphI 단편을 함유하는 적절하게 분해된 pDB3964에 클로닝하였으며, 상기 설명된 바와 같이 K573P 돌연변이 (pDB4852로 지정됨)를 암호화한다. 결찰된 플라스미드를 이. 콜리 세포에 형질전환하였고 플라스미드를 분리하였다 (Qiagen 플라스미드 Plus Kit (제조사의 지시에 따라). 모든 플라스미드는 HSA 서열이 원하는 위치에서만 돌연변이되었는지 확인하기 위해 시퀀싱하였다.

표 16: 조합 돌연변이

발현 플라스미드 및 효모 스톡의 생산

발현 플라스미드의 제조 및 에스. 세레비시애의 형질전환을 상기 설명된 바와 같이 수행하였으며, 세포가 플레이트되고, 이후에 onto BMMD 플레이트가 0.69g/L CSM-Leu (MP Biomedicals)로 보충되는 것으로 변형하였다.

스톡을 상기 설명된 48시간 방법 (pDB4703-pDB4720, pDB4737-pDB4756, pDB4849-pDB4855) 또는 WO 2011/051489에 설명된 24시간 방법 (pDB4860-pDB4876)에 의해 제조하였으며, BMMS 브로스 (아미노산 및 암모늄 술페이트 (Difco)가 없는 0.17 부피% 효모 질소 염기, 37.8mM 암모늄 술페이트, 36 mM 시트르산, 126mM 이나트륨 히드로겐 오르토포스페이트 pH 6.5, 2 부피% 수크로스, NaOH로 pH 6.5로 조정됨)를 두 경우 모두에 사용하는 것으로 변형하였다.

SPR 분석

SPR 분석을 Biacore 3000 기구 (GE Healthcare)에서 수행하였다. 고정을 제조사의 지시에 따르는 GE Healthcare 아민 커플링 화학법을 사용하여 shFcRn (GeneArt 1025291)과 커플링된 CM5 칩에서 수행하였다. shFcRn-HIS의 고정된 수준은 1500-2500 RU였고 나트륨 아세테이트 pH 5.0 (GE Healthcare)에 5-10 μg/mL shFcRn을 주사함으로써 달성하였다. 칩 표면을 25 ℃에서 ~1-2 시간 동안 러닝 버퍼 - HBS-EP 버퍼 (pH 7.4에서 0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20) (GE Healthcare))의 일정한 유속 (5 μL/분)으로 안정화하도록 남겨두었다. 리간드 안정화 후, 칩 표면을 이-염기/일-염기 포스페이트 퍼버 pH 5.5로 프라이밍하였고 (x2) 30 μL/분으로 5-12 x 45 μL 이-염기/일-염기 포스페이트 버퍼를 주사한 후, 이어서 각각의 주사 사이에 HBS_EP 재생 단계 (12초)에 의해 조절하였다. 표면을 30 μL/분으로 3 x 45 μL 양성 대조군을 주사한 후, 이어서 12초 재생 펄스에 의해 활성에 대하여 체크하였다. 동력학 측정을 25 ℃에서 고정된 shFcRn을 통해 30 μL/분으로 HSA의 희석액 (100 μL-1 μL) 및 HSA 변이체를 주사함으로써 수행하였다. 참조 세포 값을 뺐고 Biaevaluation 소프트웨어 4.1를 사용하여 동력학 데이터를 얻었고 KD 값을 확인하였다.

변이체는 알부민 (SEQ ID NO: 2)이었고, 각각은 D108A, N111D, N111G, N111H, N111K, K190A, R197A, K276N, R410A, Y411A, P416A, E425A, E425K, K466A, D471A, R472A, N503D, N503K, E505K, E505Q, H510D, H510E, D512A, D512E, K524A, K525A, T527A, T527D, T527M, E531A, E531H, K534V, H535F, E565V, A569L, A569S, A569V, 및 V576F로부터 선택된 하나의 점 돌연변이를 갖는다.

처음에, 변이체를 shFcRn에 대한 그것들의 결합 반응 (RU)를 결정하기 위해 SPR에 의해 분석하였다. 야생형 알부민의 결합 반응보다 20% 더 높거나 더 낮은 결합 반응을 나타내는 유일한 변이체를 KD를 결정하기 위해 분석하였다 (표 18, 하기). 야생형 HSA 및 돌연변이 K573P를 갖는 HSA를 대조군으로서 사용하였다.

표 18: shFcRn - HIS 에 대한 알부민 변이체의 결합 친화도

*다섯 번 반복의 평균, 그러므로 Ka 및 Kd 데이터는 제공되지 않는다.

야생형 HSA보다 더 낮은 KD를 갖는 변이체는 shFcRn에 대하여 더 높은 결합 친화도를 갖는다. 반대로, 야생형 HSA보다 더 높은 KD를 갖는 변이체는 shFcRn에 대하여 더 낮은 결합 친화도를 갖는다.

위치 108 및 111에 대한 데이터는 FcRn과 상호작용에서 위치 105 내지 120을 포함하는 루프의 수반을 지지하고 그러므로 이 루프 내 어떤 위치에서도 변화는 FcRn에 대한 알부민의 결합 친화도를 조절한다는 것을 예측한다.

실시예7 . shFcRn - HIS 에 대한 알부민 변이체의 결합 친화도의 SPR 분석

변이체는 알부민 (SEQ ID NO: 2)이었고, N111D, N111G, N111H, N111D/K573P, N111G/K573P, N111H/K573P, E505Q, E425A, T527M, E505Q/K573P, E425A/K573P 및 T527M/K573P로부터 선택된 하나의 점 돌연변이를 갖는 각각을 상기 설명된 바와 같이 제조하였다.

표 19: shFcR - HIS 에 대한 알부민 변이체의 결합 친화도

*8개의 평균 및 표준 편차 **5개의 평균 및 표준 편차.

야생형 HSA보다 더 낮은 KD를 갖는 변이체는 shFcRn에 대하여 더 높은 결합 친화도를 갖는다. 반대로, 야생형 HSA보다 더 높은 KD를 갖는 변이체는 shFcRn에 대하여 더 낮은 결합 친화도를 갖는다.

K573P를 포함하는 데이터는 유일하게 K573P 치환과 일치하는 친화도의 증가를 일으킨다.

실시예 8. shFcRn - HIS 에 대한 알부민 변이체의 결합 친화도의 SPR 분석

변이체는 알부민 (SEQ ID NO: 2)이었고, N111R, N111Q, N111E, N111R/K573P, N111Q/K573P, N111E/K573P, N109D, N109E, N109Q, N109R, N109K, N109H, N109G, D108E, T83N, L575F 및 K534V/K573P로부터 선택된 하나의 점 돌연변이를 갖는 각각을 상기 설명된 바와 같이 제조하였다.

표 20: shFcRn - HIS 에 대한 알부민 변이체의 결합 친화도

*11개의 평균 및 표준 편차 **5개의 평균 및 표준 편차.

데이터는 FcRn에 대한 HSA의 결합에 있어서 108-111 루프의 역할을 입증하며, 감소된 결합 친화도는 D108A 및 N111K 변이체에서 관찰되었다 (표 18). 위치 111에서 추가의 돌연변이는 N111K 변이체에 대하여 관찰된 감소된 친화도에서 N111E 변이체로의 다양한 결합 친화도를 입증하였으며, 이것은 WT HSA와 비교하여 FcRn에 대하여 증가된 친화도를 나타냈다 (표 20). 변이체 N111Q/K573P (도 23)는 K573P 치환과 일치하는 증가된 반응 및 감소된 해리를 가지고 결합 곡선을 나타낸다. HSA 및 FcRn의 루프 영역 108-112의 상대적인 영역 (도 24)은 이 영역이 실시예 6에서 예측된 바와 같이 FcRn 결합에 기여할 가능성을 갖는다는 것을 제안한다.

도메인 1의 인접한 루프 영역의 상대적 위치는, 잔기 78-88을 포함하며 (도 24), 이 영역이 FcRn 결합에 기여할 가능성을 갖는다는 것을 제안한다. 이것은 관찰에 의해 지지된다. T83N 변이체가 WT HSA와 비교하여 FcRn에 대하여 증가된 친화도를 나타낸다는 관찰에 의해 지지된다 (표 20).

인접한 잔기, 특히 E82, P110 및 L112의 돌연변이 (도 24)는 FcRn에 대한 HSA의 결합 친화도를 변화시키는 것으로 예측될 것이다.

여기에 설명되고 청구된 본 발명은 이들 양태들이 본 발명의 여러 양태의 도시로서 의도되기 때문에, 여기에 개시된 특정 양태에 의해 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 어떤 동등한 양태도 본 발명의 범위 내에 있어야 한다. 실제로, 여기에 나타나고 설명된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형은 상기 언급된 설명으로부터 당업자에게 분명해질 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구항의 범위 내에 있기 위한 것이다. 충돌의 경우에, 정의를 포함하는 본 개시가 조절될 것이다.

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470 475 480 Leu Ser Ile Val Ile His Asp Thr Cys Arg Lys Gln Glu Thr Thr Pro 485 490 495 Ile Asn Asp Asn Val Ser Gln Cys Cys Ser Gln Leu Tyr Ala Asn Arg 500 505 510 Arg Pro Cys Phe Thr Ala Met Gly Val Asp Thr Lys Tyr Val Pro Pro 515 520 525 Pro Phe Asn Pro Asp Met Phe Ser Phe Asp Glu Lys Leu Cys Ser Ala 530 535 540 Pro Ala Glu Glu Arg Glu Val Gly Gln Met Lys Leu Leu Ile Asn Leu 545 550 555 560 Ile Lys Arg Lys Pro Gln Met Thr Glu Glu Gln Ile Lys Thr Ile Ala 565 570 575 Asp Gly Phe Thr Ala Met Val Asp Lys Cys Cys Lys Gln Ser Asp Ile 580 585 590 Asn Thr Cys Phe Gly Glu Glu Gly Ala Asn Leu Ile Val Gln Ser Arg 595 600 605 Ala Thr Leu Gly Ile Gly Ala 610 615 <210> 19 <211> 607 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 19 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Thr Tyr Lys Ser Glu Ile Ala 20 25 30 His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Gln Tyr Phe Lys Gly Leu Val Leu 35 40 45 Ile Ala Phe Ser Gln His Leu Gln Gln Cys Pro Tyr Glu Glu His Val 50 55 60 Lys Leu Val Arg Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 65 70 75 80 Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Ile His Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95 Lys Leu Cys Ala Ile Pro Ser Leu Arg Glu His Tyr Gly Asp Leu Ala 100 105 110 Asp Cys Cys Glu Lys Glu Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 115 120 125 His Lys Asn Asp Asn Pro Asp Ile Pro Lys Leu Lys Pro Asp Pro Val 130 135 140 Ala Leu Cys Ala Asp Phe Gln Glu Asp Glu Gln Lys Phe Trp Gly Lys 145 150 155 160 Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu 165 170 175 Leu Leu Tyr Tyr Ala Ile Ile Tyr Lys Asp Val Phe Ser Glu Cys Cys 180 185 190 Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Ile Glu His Leu 195 200 205 Arg Glu Lys Val Leu Thr Ser Ala Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala 210 215 220 Ser Ile Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Asp Phe Thr Glu Ile Ser Lys 245 250 255 Ile Val Thr Asp Leu Ala Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp 260 265 270 Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys 275 280 285 Glu Asn Gln Asp Thr Ile Ser Thr Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys 290 295 300 Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Ala Lys Arg Asp Glu 305 310 315 320 Leu Pro Ala Asp Leu Asn Pro Leu Glu His Asp Phe Val Glu Asp Lys 325 330 335 Glu Val Cys Lys Asn Tyr Lys Glu Ala Lys His Val Phe Leu Gly Thr 340 345 350 Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu 355 360 365 Leu Leu Arg Ile Ala Lys Ile Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Asp Cys Cys 370 375 380 Ala Lys Glu Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Ala Thr Val Phe Asp Lys Phe 385 390 395 400 Gln Pro Leu Val Asp Glu Pro Lys Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu 405 410 415 Leu Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Ile Val 420 425 430 Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu 435 440 445 Val Ala Arg Lys Leu Gly Leu Val Gly Ser Arg Cys Cys Lys Arg Pro 450 455 460 Glu Glu Glu Arg Leu Ser Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Leu Val Leu 465 470 475 480 Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val 485 490 495 Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser 500 505 510 Ala Leu Thr Pro Asp Glu Thr Tyr Lys Pro Lys Glu Phe Val Glu Gly 515 520 525 Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Leu Cys Thr Leu Pro Glu Asp Glu Lys 530 535 540 Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro 545 550 555 560 His Ala Thr Glu Glu Gln Leu Arg Thr Val Leu Gly Asn Phe Ala Ala 565 570 575 Phe Val Gln Lys Cys Cys Ala Ala Pro Asp His Glu Ala Cys Phe Ala 580 585 590 Val Glu Gly Pro Lys Phe Val Ile Glu Ile Arg Gly Ile Leu Ala 595 600 605 <210> 20 <211> 584 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> N terminal is residues 1 to 572 of HSA. C terminal is residues 573 to 584 of Macaque albumin. <400> 20 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Lys Phe Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Ala 580 <210> 21 <211> 584 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N terminal is residues 1 to 572 from HSA. C terminal is residues 573 to 584 from mouse albumin. <400> 21 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Asn Leu Val 565 570 575 Thr Arg Cys Lys Asp Ala Leu Ala 580 <210> 22 <211> 584 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N terminal is residues 1 to 572 of HSA. C terminal is residues 573 to 584 of rabbit albumin. <400> 22 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val 565 570 575 Glu Ser Ser Lys Ala Thr Leu Gly 580 <210> 23 <211> 584 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal is residues 1 to 572 of HSA. C-terminal is residues 573 to 583 of sheep albumin. <400> 23 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ser Thr Gln Ala Ala Leu Ala 580 <210> 24 <211> 399 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial albumin variant: human serum albumin domain 1 and human serum albumin domain 3 <400> 24 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu 195 200 205 Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg 210 215 220 Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val 225 230 235 240 Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu 245 250 255 Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn 260 265 270 Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr 275 280 285 Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala 290 295 300 Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr 305 310 315 320 Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln 325 330 335 Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys 340 345 350 Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe 355 360 365 Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu 370 375 380 Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 385 390 395 <210> 25 <211> 403 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial albumin variant: human serum albumin domain 2 and human serum albumin domain 3 <400> 25 Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu 1 5 10 15 Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp 20 25 30 Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu 35 40 45 Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys 50 55 60 His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys 85 90 95 Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu 100 105 110 Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val 115 120 125 Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe 130 135 140 Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser 145 150 155 160 Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu 165 170 175 Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe 180 185 190 Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln 195 200 205 Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala 210 215 220 Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr 225 230 235 240 Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys 245 250 255 Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser 260 265 270 Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser 275 280 285 Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro 290 295 300 Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe 305 310 315 320 Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu 325 330 335 Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys 340 345 350 His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp 355 360 365 Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr 370 375 380 Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala 385 390 395 400 Leu Gly Leu <210> 26 <211> 410 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial albumin variant: two consecutive copies of human serum albumin domain 3 <400> 26 Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu 1 5 10 15 Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 20 25 30 Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg 35 40 45 Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys 50 55 60 Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 65 70 75 80 Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys 85 90 95 Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu 100 105 110 Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 115 120 125 Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys 130 135 140 Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr 145 150 155 160 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu 165 170 175 Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly 180 185 190 Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Val Glu Glu 195 200 205 Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly 210 215 220 Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val 225 230 235 240 Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly 245 250 255 Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro 260 265 270 Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu 275 280 285 His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu 290 295 300 Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu 305 310 315 320 Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala 325 330 335 Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr 340 345 350 Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln 355 360 365 Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys 370 375 380 Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu 385 390 395 400 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 405 410 <210> 27 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial albumin variant: human serum albumin domain 3 <400> 27 Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu 1 5 10 15 Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 20 25 30 Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg 35 40 45 Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys 50 55 60 Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 65 70 75 80 Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys 85 90 95 Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu 100 105 110 Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 115 120 125 Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys 130 135 140 Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr 145 150 155 160 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu 165 170 175 Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly 180 185 190 Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 195 200 205 <210> 28 <211> 615 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSA Domain III + HSA Domain III + HSA Domain III <400> 28 Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu 1 5 10 15 Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 20 25 30 Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg 35 40 45 Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys 50 55 60 Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 65 70 75 80 Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys 85 90 95 Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu 100 105 110 Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 115 120 125 Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys 130 135 140 Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr 145 150 155 160 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu 165 170 175 Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly 180 185 190 Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Val Glu Glu 195 200 205 Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly 210 215 220 Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val 225 230 235 240 Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly 245 250 255 Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro 260 265 270 Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu 275 280 285 His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu 290 295 300 Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu 305 310 315 320 Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala 325 330 335 Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr 340 345 350 Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln 355 360 365 Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys 370 375 380 Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu 385 390 395 400 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn 405 410 415 Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys 420 425 430 Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val 435 440 445 Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly 450 455 460 Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu 465 470 475 480 Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys 485 490 495 Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val 500 505 510 Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val 515 520 525 Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys 530 535 540 Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val 545 550 555 560 Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala 565 570 575 Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp 580 585 590 Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala 595 600 605 Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 610 615 <210> 29 <211> 604 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSA Domain I + HSA Domain III + HSA Domain III <400> 29 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu 195 200 205 Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg 210 215 220 Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val 225 230 235 240 Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu 245 250 255 Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn 260 265 270 Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr 275 280 285 Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala 290 295 300 Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr 305 310 315 320 Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln 325 330 335 Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys 340 345 350 Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe 355 360 365 Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu 370 375 380 Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Val 385 390 395 400 Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln 405 410 415 Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys 420 425 430 Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn 435 440 445 Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg 450 455 460 Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys 465 470 475 480 Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys 485 490 495 Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val 500 505 510 Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe 515 520 525 His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys 530 535 540 Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys 545 550 555 560 Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys 565 570 575 Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys 580 585 590 Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 595 600 <210> 30 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(290) <223> Truncated heavy chain of the major histocompatibility complex class I-like Fc receptor (FCGRT) (together, SEQ ID No. 30 and SEQ ID No. 31 form FcRN) <400> 30 Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr 20 25 30 His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp 35 40 45 Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu 50 55 60 Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr 100 105 110 Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val 115 120 125 Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp 130 135 140 Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile 145 150 155 160 Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr 165 170 175 Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg 180 185 190 Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys 195 200 205 Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe 210 215 220 Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu 225 230 235 240 Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser 245 250 255 Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His 260 265 270 Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val 275 280 285 Glu Leu 290 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(119) <223> Beta-2-microglobulin (together, SEQ ID No. 30 and SEQ ID No. 31 form FcRN) <400> 31 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 20 25 30 His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 35 40 45 Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60 Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 85 90 95 Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile 100 105 110 Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 115 <210> 32 <211> 584 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HSA 585stop <400> 32 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn 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Claims (38)

1. FcRn에 대한 참조 알부민, 이들의 단편 또는 융합체의 결합 친화도와 비교하여 FcRn에 대하여 변화된 결합 친화도를 갖는 알부민의 변이체, 이들의 단편 또는 상기 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드인 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서,
   (a) SEQ ID NO: 2에 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 모체 알부민을 암호화하는 핵산을 제공하는 단계;
   (b) 폴리펩티드를 암호화하기 위해 단계 (a)의 서열을 변형시키는 단계로서, 이것은 (a) 75 내지 91 중 어느 하나 (바람직하게 83); (b) 492 내지 538 중 어느 하나; (c) 505, 531, 524, 472, 108, 190, 197 및 425 중 어느 하나; (d) 186 내지 201 중 어느 하나; (e) 457 내지 472 중 어느 하나; (f) 414 내지 426 중 어느 하나; (g) 104 내지 120 중 어느 하나; (h) 144 내지 150 중 어느 하나; (i) 30 내지 41 중 어느 하나, (j) 550 내지 585 중 어느 하나, (k) A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y 중 하나 이상을 갖는 276, 410 및 414 중 어느 하나로부터 선택된 SEQ ID NO: 2의 위치에 해당하는 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 변화를 갖는 변이체 알부민, 이들의 단편 또는 상기 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드이며,
   폴리펩티드가
   (i) 위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹;
   (ii) 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 중 하나 이상 (다수)에서 Cys의 삽입 또는 이것으로 치환;
   (iii) 이황화 결합을 파괴하기 위한 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)에서 변화, 및/또는
   (iv) D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E 중 하나로부터 선택된 하나 이상의 변화를 포함할 때, 폴리펩티드는 또한 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 변화를 포함하는 단계;
   (c) 적합한 숙주 세포에서 단계 (b)의 변형된 서열을 도입하는 단계;
   (d) 폴리펩티드의 발현으로 이어지는 조건 하에 적합한 성장 배지에서 세포를 성장시키는 단계; 및
   (e) 성장 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하며;
   폴리펩티드는 FcRn에 대하여 변화된 결합 친화도 및/또는 모체 알부민, 참조 알부민, 이들의 단편 또는 상기 모체 알부민, 참조 알부민 또는 이들의 단편 또는 융합체를 포함하는 융합 폴리펩티드의 반감기와 비교하여 변화된 혈장 반감기를 갖는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 폴리펩티드가 (ii) 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹, 또는 위치 82, 114, 119, 464, 201, 505, 510, 513, 533, 535, 536, 550, 560, 563, 565, 573, 574로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 변화를 포함할 때, 폴리펩티드는 또한 위치 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 39, 41, 77, 78, 79, 81, 84, 85, 87, 88, 89, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 117, 118, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 472, 497, 502, 507, 508, 509, 511, 513, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 561, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 변화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 참조는 HSA (SEQ ID NO: 2) 또는 이들의 단편, 또는 HSA 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 가장 바람직하게 SEQ ID NO: 2인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 변화는 치환인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 모체 알부민, 참조 알부민, 이들의 단편 또는 상기 모체 알부민, 참조 알부민 또는 이들의 단편 또는 융합체를 포함하는 융합 폴리펩티드의 FcRn에 대한 결합 친화도와 비교하여 FcRn에 대하여 변화된 결합 친화도를 갖는 알부민의 변이체, 이들의 단편 또는 상기 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드인 폴리펩티드로서, (a) 75 내지 91 (바람직하게 83); (b) 492 내지 538; (c) 505, 531, 524, 472, 108, 190, 197 및 425; (d) 186 내지 201; (e) 457 내지 472; (f) 414 내지 426; (g) 104 내지 120; (h) 144 내지 150; (i) 30 내지 41; (j) 550 내지 585, (k) A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y 중 하나 이상을 갖는 276, 410 및 414 중 어느 하나로부터 선택된 SEQ ID NO: 2의 위치에 해당하는 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 변화를 포함하며,
   폴리펩티드가
   (i) 위치 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 구성된 그룹;
   (ii) 위치 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585로 구성된 그룹 중 하나 이상 (다수)에서 Cys의 삽입 또는 이것으로 치환;
   (iii) 이황화 결합을 파괴하기 위한 위치 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 중 하나 이상 (다수)에서 변화; 및/또는
   (iv) 위치 D63N, E82K, E84K, D87N, L90P, K106E, R114G, E119K, V146E, H464A, H464N, C201F, D494N, E501K, E503K, E505K, H510A, I513N, D518N, K525E, E529K, V533M, H535A, K536E, I537N, D550G, D550A, V557M, K560E, D563N, E565K, E570K, K573E, K574N, K574E, K584E로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 변화를 포함할 때,
   폴리펩티드는 또한 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585 및/또는 497 내지 585로부터 선택된 위치에서 삽입되거나 치환된 종결 코돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 변화를 포함하는 폴리펩티드.
6. 제 5항에 있어서, 참조는 HSA (SEQ ID NO: 2) 또는 이들의 단편, 또는 HSA 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 가장 바람직하게 SEQ ID NO: 2인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
7. 제 6항에 있어서, 변화는 치환인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
8. 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 모체 알부민, 참조 알부민, 이들의 단편 또는 상기 모체 알부민, 참조 알부민 또는 이들의 단편 또는 융합체를 포함하는 융합 폴리펩티드보다 더 강한, FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 더 긴 혈장 반감기를 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
9. 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 모체 알부민, 참조 알부민, 이들의 단편 또는 상기 모체 알부민, 참조 알부민 또는 이들의 단편 또는 융합체를 포함하는 융합 폴리펩티드보다 더 약한, FcRn에 대한 결합 친화도 및/또는 더 짧은 혈장 반감기를 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
10. 제 5항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 상에 콘쥬게이션 가능한 티올 기를 제공하는 하나 이상의 추가의 변화를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
11. 제 5항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 2에 대한 폴리펩티드의 서열 동일성은 80%보다 크고, 바람직하게 90%보다 크고, 더 바람직하게 95%보다 크고, 더 바람직하게 96%보다 크고, 더 바람직하게 97%보다 크고, 더 바람직하게 98%보다 크고 및 가장 바람직하게 99%보다 큰 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
12. 제 5항 내지 제 11 중 어느 한 항에 있어서, 단편은 적어도 20개의 아미노산, 바람직하게 적어도 50개의 아미노산, 바람직하게 적어도 100개의 아미노산, 더 바람직하게 적어도 200개의 아미노산, 더 바람직하게 적어도 300개의 아미노산, 더 바람직하게 적어도 400개의 아미노산 및 가장 바람직하게 적어도 500 아미노산인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
13. 제 5항 내지 제 12 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드 및 치료적, 예방적, 진단적, 이미징 또는 다른 유익한 모이어티로부터 선택된 융합 파트너 폴리펩티드.
14. 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드를 포함하는 콘쥬게이트 및 콘쥬게이션 파트너.
15. 제 14항에 있어서, 콘쥬게이션 파트너는 치료적, 예방적, 진단적, 이미징 또는 다른 유익한 모이어티인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
16. 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드 및 치료적, 예방적, 진단적, 이미징 또는 다른 유익한 모이어티를 포함하는 결합체.
17. 제 5항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드, 제 13항에 따르는 융합 폴리펩티드, 제 14항 또는 제 15항에 따르는 콘쥬게이트 또는 제 16항에 따르는 결합체를 포함하는 나노입자 또는 미크로입자.
18. 제 5항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 콘쥬게이트, 결합체 또는 나노입자 또는 미크로입자를 포함하는 조성물로서, FcRn에 대한 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 콘쥬게이트, 결합체 또는 나노입자 또는 미크로입자의 결합 친화도는 FcRn에 대한 해당하는 모체 알부민, 참조 알부민, 이들의 단편 또는 상기 모체 알부민, 참조 알부민 또는 이들의 단편 또는 융합체를 포함하는 융합 폴리펩티드, 콘쥬게이트, 결합체 또는 나노입자 또는 미크로입자를 포함하는 조성물의 결합 친화도보다 더 강한 조성물.
19. 제 18항에 있어서, FcRn에 대한 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 콘쥬게이트, 결합체 또는 나노입자 또는 미크로입자의 결합 친화도는 FcRn에 대한 HSA의 결합 친화도보다 더 강한 것을 특징으로 하는 조성물.
20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서, FcRn에 대한 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 콘쥬게이트, 결합체 또는 나노입자 또는 미크로입자의 결합 계수는 FcRn에 대하여 HSA의 0.9X KD보다 작고, 더 바람직하게 FcRn에 대하여 HSA의 0.5X KD보다 작고, 더 바람직하게 FcRn에 대하여 HSA의 0.1X KD보다 작고, 더 바람직하게 FcRn에 대하여 HSA의 0.05X KD보다 작고, 더 바람직하게 FcRn에 대하여 HSA의 0.02X KD보다 작은 및 가장 바람직하게 FcRn에 대하여 HSA의 0.01X KD보다 작은 것을 특징으로 하는 조성물
21. 제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드, 제 14항 또는 제 15항에 따르는 콘쥬게이트, 제 16항에 따르는 결합체 또는 제 17항에 따르는 나노입자 또는 미크로입자를 포함하며, 항체 결합 도메인 (ABD) 및 치료적, 예방적, 진단적, 이미징 또는 다른 유익한 모이어티를 포함하는 화합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
22. 제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
23. 치료적, 예방적, 진단적, 이미징 또는 다른 유익한 모이어티의 FcRn에 대한 결합 친화도 또는, 바람직하게, 혈장의 반감기를 변화시키기 위해 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드, 제 14항 또는 제 15항에 따르는 콘쥬게이트, 제 16항에 따르는 결합체 또는 제 17항에 따르는 나노입자 또는 미크로입자 또는 제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따르는 조성물의 사용.
24. 제 23항에 있어서, 결합 친화도는 FcRn에 대한 것이며 HSA (SEQ ID NO: 2) 또는 이들의 단편, 융합체, 콘쥬게이트, 결합체, 나노입자 또는 미크로입자를 포함하거나 이들로 구성된 참조의 FcRn에 대한 결합 친화도와 비교하여 증가되는 것을 특징으로 하는 사용.
25. 제 23항에 있어서, 결합 친화도는 FcRn에 대한 것이며 HSA (SEQ ID NO: 2) 또는 이들의 단편, 융합체, 콘쥬게이트, 결합체, 나노입자 또는 미크로입자를 포함하거나 이들로 구성된 참조의 FcRn에 대한 결합 친화도와 비교하여 감소되는 것을 특징으로 하는 사용.
26. (a) 분자가 폴리펩티드인 경우, 제 5항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드 또는 제 14항 또는 제 15항에 따르는 콘쥬게이트에 분자를 융합하거나 콘쥬게이션하는 단계; 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드 또는 제 13항 또는 제 14항에 따르는 콘쥬게이트에 분자를 결합시키는 단계; 제 16항에 따르는 결합체, 제 17항에 따르는 나노입자 또는 미크로입자 또는 제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따르는 조성물에 분자를 통합하는 단계;
    (b) 분자가 폴리펩티드가 아닌 경우, 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드 또는 제 14항 또는 제 15항에 따르는 콘쥬게이트에 분자를 콘쥬게이션하는 단계; 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드 또는 제 14항 또는 제 15항에 따르는 콘쥬게이트에 분자를 결합시키는 단계; 제 16항에 따르는 결합체, 제 17항에 따르는 나노입자 또는 미크로입자 또는 제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따르는 조성물에 분자를 통합하는 단계를 포함하는 분자의 FcRn에 대한 결합 친화도 또는 바람직하게, 혈장의 반감기를 변화시키는 방법.
27. 제 26항에 있어서, 분자는 치료적, 예방적, 진단적, 이미징 또는 다른 유익한 모이어티인 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 5항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 콘쥬게이트, 결합체, 나노입자 또는 미크로입자 또는 이들의 조성물로서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 콘쥬게이트, 결합체, 나노입자 또는 미크로입자 또는 조성물은 상기 설명된 것들로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
29. 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
30. 제 29항에 따르는 핵산을 포함하는 벡터.
31. 제 29항에 따르는 핵산 또는 제 30항에 따르는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
32. 제 25항에 있어서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게, 효모 (예를 들어, 사카로미세스 세레비시애) 또는 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 또는 HEK) 또는 식물 세포 (예를 들어, 쌀)인 숙주 세포.
33. 제 5항 내지 제 22항 중 어느 한 항 또는 제 28항 또는 제 29항에 따르는 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 콘쥬게이트, 조성물, 결합체, 나노입자 또는 미크로입자 또는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는 예방, 치료 또는 진단 방법.
34. FcRn에 대한 참조 알부민, 이들의 단편 또는 융합체의 결합 친화도와 비교하여 FcRn에 대하여 변화된 결합 친화도를 갖는 변이체 알부민, 이들의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드인 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서,
    (a) (i) HSA (SEQ ID NO: 2)의 잔기 1 내지 585와 같은, 알부민의 3차원 구조 (모델)을 제조하고;
    (ii) FcRn의 3차원 구조 (모델), 6.3 이하의 pH에서 용해되는 구조를 제공하고;
    (iii) FcRn에 결합된 알부민에 의해 형성된 복합체의 구조를 모델링하기 위해 (i)의 알부민 구조 및 (ii)의 FcRn 구조를 사용하여 도킹 모델을 생성하고;
    (iv) 도킹 모델을 사용하여 FcRn과 상호작용하고 FcRn과 알부민의 상호작용에 영향을 미치는 알부민의 아미노산 잔기를 확인함으로써
    알부민 또는 이들의 단편 또는 알부민 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 알부민 부분에서 FcRn에 대한 알부민의 결합에 중요한 하나 이상의 아미노산 잔기 위치를 확인하는 단계;
    (b) 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공하는 단계;
    (c) (a)에서 확인된 위치에 위치하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서 변화가 있도록, (b)에 제공된 핵산을 변형시키는 단계;
    (d) 적합한 숙주 세포에서 변형된 핵산을 발현하는 단계; 및
    (e) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
35. 제 34항에 있어서, FcRn의 제공된 3차원 구조 (모델)은 pH 3.7 내지 4.7에서 용해되는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 34항 또는 제 35항에 있어서, 참조는 HSA (SEQ ID NO: 2) 또는 이들의 단편, 또는 HSA 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 가장 바람직하게 SEQ ID NO: 2인 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제 34항, 제 35항 또는 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 변화는 치환인 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제 34항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는
    (v) (iv)에서 확인된 것들과 동등한 아미노산을 확인하기 위해 두 번째 알부민 (예를 들어, 비-사람 알부민)의 1차 구조 및/또는 3차 구조를 (i)의 알부민의 1차 구조 및/또는 3차 구조와 비교하는 단계; 및/또는
    (vi) (iv) 또는 (v)에서 확인된 하나 이상의 변화를 포함하는 폴리펩티드를 제조하고 제조된 폴리펩티드가 FcRn에 대한 (i)의 알부민의 결합 친화도와 비교하여 FcRn에 대하여 변화된 결합 친화도를 갖는지 확인 (예를 들어, 결합 친화도 분석에 의해)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

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