ES2966835T3

ES2966835T3 - Modulación de la inmunogenicidad del FVIII por VWF truncado

Info

Publication number: ES2966835T3
Application number: ES18737505T
Authority: ES
Inventors: Anne Verhagen; Sabine Pestel; Thomas Weimer; Marco Hofmann; Huy Huynh; Eugene Maraskovsky
Original assignee: CSL Behring Lengnau AG
Current assignee: CSL Behring Lengnau AG
Priority date: 2017-06-22
Filing date: 2018-06-22
Publication date: 2024-04-24
Anticipated expiration: 2038-06-22
Also published as: CN110799208A; CA3068098A1; US11141466B2; DK3641800T5; DK3641800T3; US20200197495A1; JP2020530436A; BR112019026743A2; AU2018287215A1; EP3641800B1; PL3641800T3; WO2018234518A1; EP3641800A1; KR20200018690A

Abstract

La presente invención se refiere a un polipéptido recombinante que comprende un factor von Willebrand (VWF) truncado capaz de unirse al factor VIII de coagulación sanguínea (FVIII) para su uso en la reducción de la inmunogenicidad del factor VIII (FVIII), en donde dicho polipéptido recombinante y un factor VIII de coagulación sanguínea (FVIII) se coadministran a un sujeto que padece un trastorno de la coagulación sanguínea. La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas y kits para dicho uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Modulación de la inmunogenicidad del FVIII por VWF truncado

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a un polipéptido recombinante que comprende un Factor von Willebrand (VWF) truncado capaz de unirse al Factor VIII (Fv Ii I) de la coagulación sanguínea para su uso en la reducción de la inmunogenicidad del Factor VIII (FVIII) en el que dicho polipéptido recombinante y una proteína de Factor VIII (FVIII) se coadministran a un individuo que padece un trastorno de la coagulación sanguínea.

Antecedentes de la Invención

Existen diversos trastornos hemorrágicos causados por deficiencias de los factores de coagulación de la sangre. Los trastornos más comunes son la hemofilia A y B, que resultan de las deficiencias del Factor VIII (FVIII) y IX de la coagulación sanguínea, respectivamente. Otro trastorno de sangrado conocido es la enfermedad de von Willebrand (VWD).

La hemofilia A es un trastorno hemorrágico heredado. Es el resultado de una deficiencia ligada al cromosoma X de la coagulación de la sangre VIII, y afecta casi exclusivamente a los seres humanos con una incidencia de entre uno y dos individuos por cada 10.000. El defecto del cromosoma X es transmitido por vehículos femeninos que no son hemofílicos. La manifestación clínica de la hemofilia A es una mayor tendencia al sangrado. Antes de que se introdujera el tratamiento con concentrados de factor VIII, la esperanza media de vida de una persona con hemofilia grave era inferior a 20 años. El uso de concentrados de Factor VIII a partir de plasma ha mejorado considerablemente la situación de los pacientes con hemofilia A, aumentando ampliamente la esperanza media de vida y dando a la mayoría de ellos la posibilidad de llevar una vida más o menos normal. Sin embargo, ha habido ciertos problemas con los concentrados derivados del plasma y su uso, el más grave de los cuales ha sido la transmisión de virus. A la fecha, los virus causantes de la hepatitis B, la hepatitis no A no B y el sida han afectado gravemente a la población. Desde entonces, se han desarrollado recientemente diferentes procedimientos de inactivación de virus y nuevos concentrados de Factor VIII altamente purificados que han establecido un estándar de seguridad muy elevado también para el Factor VIII derivado del plasma.

La clonación del ADNc del Factor VIII (Wood et al. 1984. Nature 312:330-336; Vehar et al. 1984. Nature 312:337-342) hizo posible la expresión recombinante del Factor VIII, lo que condujo al desarrollo de varios productos de Factor VIII recombinante, que fueron aprobados por las autoridades reguladoras entre 1992 y 2003. El hecho de que el dominio B central de la cadena polipeptídica del Factor VIII, situado entre los aminoácidos Arg-740 y Glu-1649, no parezca necesario para una actividad biológica completa también ha conducido al desarrollo de productos de Factor VIII con supresión del dominio B.

La molécula madura del Factor VIII consta de 2332 aminoácidos que pueden agruparse en tres dominios A homólogos, dos dominios C homólogos y un dominio B que están dispuestos en el orden: A1-A2-B-A3-C1-C2. Durante su secreción en el plasma, el Factor VIII se procesa intracelularmente en una serie de heterodímeros unidos a iones metálicos a medida que el Factor VIII de cadena simple se escinde en el límite B-A3 y en diferentes sitios dentro del dominio B. Este procesamiento da lugar a moléculas heterogéneas de cadena pesada formadas por el A1, el A2 y varias partes del dominio B, que tienen un tamaño molecular que oscila entre 90 kDa y 200 kDa. Las cadenas pesadas están unidas mediante un ion metálico a las cadenas ligeras, que consisten en el dominio A3, el C1 y el C2 (Saenko et al. 2002. Vox Sang. 83: 89-96). En el plasma, este Factor VIII heterodimérico se une con gran afinidad al Factor von Willebrand (FvW), lo que lo protege de un catabolismo prematuro. La semivida del Factor VIII no activado ligado al vWF es de aproximadamente 12 a 14 horas en plasma.

El vWF es una glicoproteína adhesiva multimérica presente en el plasma de los mamíferos, que tiene múltiples funciones fisiológicas. Durante la hemostasia primaria, el vWF actúa como mediador entre los receptores específicos de la superficie plaquetaria y los componentes de la matriz extracelular, tales como el colágeno. Además, el VWF sirve como proteína portadora y estabilizadora del FVIII procoagulante. El VWF se sintetiza en las células endoteliales y los megacariocitos como una molécula precursora de 2813 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADNc del VWF de tipo salvaje se divulgan en Collins et al. 1987,Proc.Acad. Sci. USA 84:4393-4397. El polipéptido precursor, pre-pro-vWF, está constituido por un péptido señal de 22 residuos, un pro-péptido de 741 residuos y el polipéptido de 2050 residuos encontrado en el vWF plasmático maduro (Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). Una vez secretada al plasma, la proteasa ADAMTS13 escinde el vWF dentro del dominio A1 del vWF.

En el plasma, el FVIII se une con alta afinidad al vWF, lo que lo protege del catabolismo prematuro y, por lo tanto, juega además de su papel en la hemostasia primaria, un papel crucial para regular los niveles plasmáticos de FVIII y, como consecuencia, también es un factor central para controlar la hemostasia secundaria. La semivida del FVIII no activado ligado al vWF es de aproximadamente 12 a 14 horas en plasma. En la enfermedad de von Willebrand de tipo 3, en la que no hay o casi no hay VWF, la semivida del FVIII es de solo aproximadamente 6 horas, lo que conduce a síntomas de hemofilia A leve a moderada en dichos pacientes debido a la disminución de las concentraciones de FVIII. El efecto estabilizador del vWF sobre el FVIII también se ha usado para ayudar a la expresión recombinante del FVIII en las células CHO (Kaufman et al 1989, Mol Cell Biol 9: 1233-1242, 1989). El FVIII libre que no está unido al vWF tiene una semivida en circulación de aproximadamente 2 horas (Vlot et al. Thromb Haemost 2000;83:65-91).

En los pacientes con hemofilia A grave sometidos a tratamiento profiláctico, el Factor VIII debe administrarse por vía intravenosa (i.v.) aproximadamente 3 veces por semana debido a la corta semivida plasmática del Factor VIII, de aproximadamente 12. Cada administración i.v. es engorrosa, asociada con dolor y conlleva el riesgo de una infección, especialmente porque se hace principalmente en casa por los propios pacientes o por los padres de los niños diagnosticados con hemofilia A.

Por lo tanto, era muy deseable crear un Factor VIII con una semivida funcional aumentada que permitiera la fabricación de composiciones farmacéuticas que contuvieran Factor VIII, que debían administrarse con menos frecuencia.

Se ha descrito que los polipéptidos derivados del VWF, en particular los fragmentos del VWF, estabilizan el FVIIIin vitroein vivo.El documento WO 2013/106787 A1 está dirigido a proteínas quiméricas que comprenden ciertos fragmentos del vWF y una proteína FVIII. Esos heterodímeros quiméricos del FVIII y del fragmento del vWF tienen una relación molar fija del vWF a FVIII de 1:1.

El documento WO 2014/198699 A2 y WO 2013/083858 A2 describen fragmentos de VWF y su uso en el tratamiento de la hemofilia. Se encontró que la biodisponibilidad de los FVIII puede mejorar significativamente en la administración conjunta extravascular con cantidades molares similares de fragmentos del vWF. Yee et al. Yee y col., (2014) Blood 124(3):445-452 descubrió que un fragmento de VWF que contenía los dominios D'D3 es suficiente para estabilizar el Factor VIII en ratones con deficiencia de VWF.

Un enfoque para proporcionar una semividain vivoprolongada del Factor VIII mediante la coadministración de un vWF truncado se ha desvelado en el documento WO 2016/188907 A1.

Sin embargo, una complicación importante en hasta el 30% de los pacientes que padecen hemofilia A es la aparición de inhibidores, en particular aloanticuerpos, que inactivan la actividad del FVIII y pueden anular la terapia de sustitución. Se ha descrito que el riesgo de generación de inhibidores del FVIII en pacientes con hemofilia A no tratados previamente es mayor cuando se tratan con productos de FVIII recombinante, y se ha especulado que la unión del vWF a diferentes epitopos en el FVIII-LC (dominios A3 y C2) protege estos epitopos y, por lo tanto, podría tener un efecto beneficioso en la reducción de la inmunogenicidad (C. Escuriola Ettinghausen, W. Kreuz; Haemophilia (2006), 12, (Suppl. 6), 102-106). Los epitopos no blindados del FVIII parecen plantear el riesgo de desencadenar la generación de inhibidores. Además, se supone que la interacción del FVIII-HC y el FVIII-LC en el complejo de dos cadenas de FVIII también tiene un efecto de protección sobre epitopos que de otro modo serían de libre acceso en el FVIII-HC y el FVIII-LC.

El desarrollo de aloanticuerpos neutralizantes anti-factor VIII (inhibidores) en pacientes con hemofilia A grave puede depender del concentrado utilizado para la terapia de reemplazo. Los pacientes tratados con factor VIII derivado de plasma que contenía factor von Willebrand presentaron una menor incidencia de inhibidores que los tratados con factor VIII recombinante. La incidencia de inhibidores en niños pequeños (edad <6 años, hemofilia A grave y sin tratamiento previo con ningún concentrado de factor VIII) tratados con FVIII recombinante se midió 1,87 veces superior en comparación con los pacientes tratados con pdFVIII. La incidencia de inhibidores fue del 26,8 % en la cohorte tratada con FVIII recombinante en comparación con el 44,5 % en la cohorte de pdFVIII (Peyvandi F, N Engl J Med (2016), 74:2054-64).

Por lo tanto, además de un aumento de la semivida in vivo del FVIII, existe una necesidad continua de mejorar las terapias para evitar o reducir la aparición de dichos inhibidores del FVIII.

Se ha sugerido que el vWF podría disminuir las inmunorreacciones contra el Factor VIII cuando está en complejo con el Factor VIII al proteger al FVIII de sitios de anticuerpos inhibidores potenciales conocidos en la cadena pesada (dominio A2) y la cadena ligera (dominio A3/C2) (Ragni, J Thromb. Haemost. 10: 2324-2327, 2012).

La pureza de los concentrados de FVIII, y en particular la presencia del factor von Willebrand (vWF), fue objeto de controversia por influir en la inmunogenicidad del FVIII exógeno. Así, S. Delignat et al. (Haemophilia (2012), 18, 248 254) evaluaron in vivo e in vitro el efecto inmunoprotector del FvW frente al FVIII. El vWF redujo la inmunogenicidad del FVIII en ratones deficientes en FVIII e impidió in vitro la endocitosis del FVIII por las células presentadoras de antígenos profesionales (por ejemplo, las DC). Se propuso que el vWF, en virtud del aumento de la semivida del FVIII en la circulación, puede permitir un mayor tiempo de contacto con las células B tolerogénicas de la zona marginal en el bazo.

Con el documento WO13106787A1 se muestran proteínas quiméricas que comprenden un fragmento vWF y una proteína FVIII, en las que el fragmento vWF y la proteína FVIII están covalentemente asociados entre sí o covalentemente unidos entre sí. Se propone que las proteínas quiméricas tengan menos inmunogenicidad que una proteína FVIII sin el fragmento vWF unido covalentemente. No se muestran los datos relativos a la inmunogenicidad. La proporción molar de las construcciones se fija en 1:1.

De acuerdo con la divulgación de WO15185758A2 se propone una composición que comprende un complejo no covalente de Factor VIII y péptidos vWF para la reducción de la formación de inhibidores contra FVIII. Sin embargo, los péptidos vWF siguen presentando los aminoácidos 764 a 1035 y 1691 a 1905 y no se presentan datos relativos a la inmunogenicidad.

El documento WO 2013/083858 A2 describe que el vWF y sus fragmentos pueden proteger al FVIII contra la captación celular por las células presentadoras de antígenos humanas. Sin embargo, en comparación con el FVW plasmático completo (aminoácidos 764-2813), los fragmentos probados sólo mostraron una reducción moderada de la captación de FVIII. Los fragmentos de FVW ensayados no contenían ninguna fracción de prolongación de la semivida para aumentar la semivida de los fragmentos de FVW y/o del FVIII.

Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad clínica inigualable de proporcionar productos o composiciones de FVIII que tengan una semivida prolongada y una inmunogenicidad reducida.

Sumario de la invención

Los inventores han descubierto que la captación de Factor VIII por las células presentadoras de antígenos, en particular las células dendríticas derivadas de monocitos, puede reducirse sustancialmente coadministrando una proteína de Factor VIII junto con un polipéptido recombinante dimérico que comprende un vWF truncado, preferentemente un vWF truncado que comprende los aminoácidos 764 a 1242 de SEQ ID NÚM.:4. El vWF truncado es un polipéptido recombinante dimérico que comprende un vWF truncado. El polipéptido recombinante comprende una fracción de prolongación de la semivida (HLEM), en particular, puede estar fusionado a albúmina humana.

Así, un aspecto de la presente invención se refiere a un polipéptido recombinante que comprende un Factor von Willebrand (FvW) truncado capaz de unirse al Factor VIII (FVIII) de la coagulación sanguínea, en el que dicho polipéptido carece de un dominio vWF A1 funcional, y en el que dicho polipéptido comprende una fracción de prolongación de la semivida (HLEM), para su uso en la reducción de la inmunogenicidad del Factor VIII (FVIII), en el que dicho polipéptido recombinante y una proteína del Factor VIII (FVIII) se coadministran a un individuo que padece un trastorno de la coagulación sanguínea, en el que el sujeto es un individuo no tratado previamente con FVIII y/o en el que el sujeto tiene riesgo y/o se espera que desarrolle una reacción inmunitaria contra el FVIII; y en el que el polipéptido recombinante se administra como homodímero. Esto incluye que dicho polipéptido recombinante y la proteína Factor VIII (FVIII) pueden administrarse preferentemente de forma simultánea, secuencial o separada, quedando dichos modos de administración englobados por el término "coadministrados". La inmunogenicidad del Factor VIII (FVIII) se reduce preferentemente en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, salvo que dicho FVIII se administra sin coadministración del polipéptido recombinante.

Además, los inventores han descubierto que la captación de Factor VIII por las células presentadoras de antígenos, en particular las células dendríticas derivadas de monocitos, puede reducirse aún más coadministrando una proteína de Factor VIII junto con un exceso molar de polipéptido recombinante que comprende un vWF truncado. En otras palabras, al aumentar la proporción molar del polipéptido recombinante que comprende un FVW truncado sobre el FVIII coadministrado, se puede lograr una mayor reducción de la captación del Factor VIII por las células presentadoras de antígenos, en particular las células dendríticas derivadas de monocitos.

Así pues, en ciertas realizaciones, la proporción molar entre el polipéptido recombinante y el FVIII que se va a coadministrar es de al menos 2:1, al menos 3:1, al menos 4:1, al menos 5:1, al menos 8:1, al menos 10:1, al menos 15:1, al menos 20:1, al menos 25:1 o al menos 50:1, o incluso superior.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende (i) un polipéptido recombinante que comprende un Factor von Willebrand (vWF) truncado, en el que dicho polipéptido carece de un dominio vWF A1 funcional, en el que dicho polipéptido comprende una fracción de prolongación de la semivida (HLEM), y en el que dicho polipéptido es un homodímero, y (ii) una proteína Factor VIII (FVIII), para su uso en la reducción de la inmunogenicidad del Factor VIII (FVIII) en el que dicha composición se administra a un individuo que padece un trastorno de la coagulación sanguínea, en el que, dicho sujeto es un individuo no tratado previamente con FVIII y/o en el que el sujeto tiene un riesgo y/o se espera que desarrolle una reacción inmunitaria contra el FVIII, particularmente una reacción inmunitaria caracterizada por anticuerpos inhibidores contra el FVIII.

En un aspecto particular, el polipéptido recombinante comprende un vWF truncado que tiene un dominio vWF D' funcional y un dominio vWF D3 funcional.

En otro aspecto particular, el polipéptido recombinante comprende un vWF truncado que tiene un dominio funcional vWF D' y un dominio funcional vWF D3, preferentemente carente de cualquier otro dominio funcional vWF.

En otro aspecto particular, el polipéptido recombinante comprende un vWF truncado que tiene un dominio funcional vWF D' y un dominio funcional vWF D3, preferentemente carente de cualquier otro dominio funcional vWF, y que lleva una o múltiples mutaciones aminoacídicas que aumentan la afinidad al FVIII.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

LaFigura 1muestra el fenotipado de los marcadores de superficie de los MDDC con tinción negativa para CD14 y tinción positiva para CD40, HLA-DR y CD86 mediante citometría de flujo;

LaFigura 2muestra la inhibición por vWF de la captación del factor VIII en los MDDC: se evaluó la captación de proteínas comerciales de FVIII (Advate, Helixate y Refacto) y rec scFVIII (CSL 627) en presencia del producto pdvWF Biostate (a), la fusión truncada vWF-albúmina CSL 626 (b) y la fusión completa recvWF-albúmina CSL 650 (c). El porcentaje de captación de FVIII en MDDC de cuatro productos de FVIII diferentes, Advate, CSL 627, Helixate y Refacto, se traza por separado frente a una proporción molar creciente de vWF : FVIII. Las proporciones molares vWF: FVIII se refieren a la subunidad monomérica de los diferentes productos vWF. Los experimentos se realizaron por triplicado (a) o cuadruplicado (b) y (c), respectivamente;

LaFigura 3muestra la inhibición por el vWF de la captación del factor VIII en los MDDC: Se evaluó la inhibición de la captación del FVIII en los MDDC por diferentes proteínas vWF (el producto pdVWF Biostate, la fusión truncada vWF-albúmina CSL 626 y la fusión de longitud completa recvWF-albúmina CSL 650). El porcentaje de captación de FVIII en los MDDc de cuatro productos de FVIII diferentes, Advate (a), CSL 627 (b), Helixate (c) y Refacto (d), se representa gráficamente por separado frente a una proporción molar creciente de vWF : FVIII. Las proporciones molares vWF: FVIII se refieren a la subunidad monomérica de los diferentes productos vWF;

LaFigura 4muestra las curvas normalizadas de la inhibición por vWF de la captación del factor VIII en los MDDC: se evaluó la captación de proteínas comerciales de FVIII (Advate®, Helixate® y Refacto®) y rec scFVIII (CSL 627) en presencia del producto Biostate de pdVWF (a), la fusión truncada de vWF-albúmina CSL 626 (b) y la fusión completa de recvWF-albúmina CSL 650 (c). Las concentraciones de vWF se refieren a la subunidad monomérica para los diferentes productos de vWF. Los experimentos se realizaron por triplicado (a) o cuadruplicado (b) y (c), respectivamente. Los datos se normalizaron para cada experimento individual. La lectura en ausencia de vWF (0 nM) se definió como 100% y la lectura en presencia de la concentración más alta de vWF (2222 nM o 4444 nM) se definió con 0% para cada experimento individual. Las curvas se ajustaron con el programa GraphPad Prism (log(inhibidor) frente a respuesta - Pendiente variable, cuatro parámetros, ajuste ordinario por mínimos cuadrados). A partir de estas curvas ajustadas, se han calculado los valores IC50 para las respectivas proteínas vWF, que se resumen en la Tabla 2;

LaFigura 5muestra el flujo de trabajo de Prolmmune del ensayo de presentaciones de antígenos MHC de clase II ProPresent® : (A) Monocitos aislados de PBMC con HLA, (B) Cultivo de monocitos y generación de células dendríticas inmaduras, (C) Carga de antígeno (CSL627, pdVWF), procesamiento intracelular, maduración de células dendríticas y presentación de antígeno (D) Lisis de células dendríticas, (E) Aislamiento de complejos péptido / MHC clase II por inmunoafinidad y elución de péptidos, (F) Secuenciación de péptidos por LC-MS2 (adaptado de la página de inicio de Prolmmune ProPresent® );

LaFigura 6muestra una comparación de la presentación del antígeno ProPresent® de Prolmmune de CSL627 en presencia y ausencia de pdVWF: cada punto de datos representa un grupo de péptidos con restricción HLA-DR; el número de péptidos derivados de CSL627, únicos unidos a HLA-DR de grupos de péptidos con restricción HLA-DR se representó gráficamente en ausencia (eje X) y presencia (eje Y) de pdVWF. Gráfico X-Y, regresión lineal (<m>S Excel);

LaFigura 7muestra una comparación de la presentación del antígeno ProPresent® de Prolmmune de CSL627 en presencia y ausencia de CSL626: cada punto de datos representa un grupo de péptidos restringidos a HLA-DR; el número de péptidos derivados de CSL627, únicos unidos a HLA-DR de grupos de péptidos restringidos a HLA-DR se representó gráficamente en ausencia (eje X) y presencia (eje Y) de CSL626. Gráfico X-Y, regresión lineal (M<s>Excel);

LaFigura 8muestra una comparación de la presentación del antígeno ProPresent® de Prolmmune de CSL627 en presencia y ausencia de EYA-FP: cada punto de datos representa un grupo de péptidos restringidos a HLA-DR; el número de péptidos derivados de CSL627, únicos unidos a HLA-DR de grupos de péptidos restringidos a HLA-DR se representó gráficamente en ausencia (eje X) y presencia (eje Y) de EYA-FP. Gráfico X-Y, regresión lineal (MS Excel).

Descripción detallada de las realizaciones preferentes

Reducción de la inmunogenicidad del FVIII

Dentro de la presente divulgación, "el polipéptido recombinante" también se denomina alternativamente "el polipéptido de la invención".

La presente invención se basa en la observación de que la captación de FVIII en las células presentadoras de antígeno (APC) se reduce sustancialmente en presencia de un polipéptido recombinante que comprende un vWF truncado en comparación con la captación tras un tratamiento de referencia en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico al tratamiento de la invención, excepto que el FVIII se administra sin coadministración del polipéptido recombinante.

En términos de la presente invención, la inmunogenicidad reducida lograda del FVIII también puede entenderse como la inducción de menos inmunogenicidad contra el FVIII.

La inmunogenicidad reducida del FVIII incluye, pero no se limita a, una respuesta inmunitaria humoral reducida, es decir, un título y/o frecuencia más bajos de anticuerpos inhibidores anti-FVIII y/o una respuesta inmunitaria mediada por células reducida contra el FVIII. Además, la inmunogenicidad reducida puede incluir una reacción de hipersensibilidad reducida contra el FVIII, incluido un riesgo reducido de anafilaxia. Por ejemplo, la inmunogenicidad reducida del FVIII puede caracterizarse por un título inferior de anticuerpos inhibidores dirigidos contra el FVIII, preferentemente el título de anticuerpos inhibidores dirigidos contra el FVIII se reduce en al menos un 2%, en al menos un 5%, en al menos un 10%, en al menos un 15% o en al menos un 20%, en comparación con el título de anticuerpos inhibidores en un individuo que sigue un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, excepto que dicho FVIII se administra sin coadministración de dicho polipéptido recombinante. Los anticuerpos inhibidores se denominan aquí alternativamente "inhibidor".

Además, la inmunogenicidad reducida del FVIII puede caracterizarse por una menor frecuencia de anticuerpos inhibidores dirigidos contra el FVIII, preferentemente la frecuencia de anticuerpos inhibidores dirigidos contra el FVIII se reduce en al menos un 5%, en al menos un 10%, en al menos un 15%, en al menos un 20% o en al menos un 30%, en comparación con la frecuencia de anticuerpos inhibidores en una población de sujetos tras un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, excepto que dicho FVIII se administra sin coadministración de dicho polipéptido recombinante. El título y/o la frecuencia de anticuerpos inhibidores dirigidos contra el FVIII pueden determinarse de acuerdo con procedimientos estándar, por ejemplo, de acuerdo con un ensayo Bethesda.

La reducción de la inmunogenicidad del FVIII puede lograrse reduciendo la captación del FVIII en las células presentadoras de antígenos (APC) en presencia del polipéptido recombinante coadministrado, en el que las APC pueden seleccionarse del grupo formado por células dendríticas o macrófagos. Por ejemplo, la coadministración del polipéptido recombinante y el FVIII reduce la porción de APC del sujeto que ha internalizado el FVIII en al menos un factor de 1,1, en al menos un factor de 1,2, en al menos un factor de 1,3, en al menos un factor de 1,4, en al menos un factor de 1,5, en al menos un factor de 2, en al menos un factor de 3 o en al menos un factor de 4, en comparación con el tratamiento de referencia.5, en al menos un factor de 2, en al menos un factor de 3 o en al menos un factor de 4, en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, salvo que dicho FVIII se administra sin coadministración del polipéptido recombinante.

De acuerdo con una realización preferente, la reducción de la inmunogenicidad del FVIII tras la administración del polipéptido recombinante se consigue o se acompaña de una presentación de antígenos de tipo MHC de clase II de los péptidos del FVIII por parte de las células presentadoras de antígenos (APC) del sujeto en presencia del polipéptido recombinante, preferentemente en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, salvo que el FVIII se administra sin la administración del polipéptido recombinante. Dicha presentación de antígenos de tipo MHC clase II de los péptidos FVIII por las células presentadoras de antígenos (APC) del sujeto, preferentemente, se apaga (es decir, se reduce) en un factor de al menos 1,5, al menos 2,0, al menos 2,5, al menos 3,0, al menos 3,5 o al menos 4,0.

De acuerdo con otra realización preferente, la reducción de la inmunogenicidad del FVIII tras la administración del polipéptido recombinante se consigue o se acompaña de un número atenuado de péptidos FVIII de unión única de tipo MHC de clase II por las células presentadoras de antígenos (APC) del sujeto en presencia del polipéptido recombinante, preferentemente en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, excepto que dicho FVIII se administra sin la administración del polipéptido recombinante. Dicho número de péptidos FVIII de unión única de tipo MHC de clase II por las células presentadoras de antígenos (APC) del sujeto está siendo preferentemente apagado (es decir, reducido) por un factor de al menos 1.5, al menos 2,0, al menos 2,5, al menos 3,0, al menos 3,5, o al menos 4,0.

De acuerdo con otra realización preferente, la reducción de la inmunogenicidad del FVIII tras la administración del polipéptido recombinante se consigue o se acompaña de un número atenuado de péptidos FVIII de unión a MHC de clase II agrupados por las células presentadoras de antígenos (APC) del sujeto en presencia del polipéptido recombinante, preferentemente en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, excepto que dicho FVIII se administra sin la administración del polipéptido recombinante. Dicho número de péptidos FVIII de unión a MHC de tipo clase II agrupados por las células presentadoras de antígenos (APC) del sujeto se apaga (es decir, se reduce) preferentemente en un factor de al menos 1.5, al menos 2,0, al menos 2,5, al menos 3,0, al menos 3,5 o al menos 4,0.

En particular, el haplotipo MHC de clase II del sujeto puede seleccionarse del grupo formado por HLA-DR, HLA-DP y HLA-DQ.

De acuerdo con otra realización preferente, al menos una parte de dichos péptidos FVIII es capaz de desencadenar la proliferación de células T, que es una etapa necesaria para la activación de células B mediada por células T auxiliares y la secreción de anticuerpos.

El número de péptidos FVIII de unión única a MHC clase II es el número de secuencias peptídicas distintas que pueden asignarse de forma única al FVIII. Se trata de los péptidos exclusivos de la proteína FVIII, que no se encuentran en otras proteínas. El número de péptidos FVIII de unión única a MHC clase II se utiliza para cuantificar la presentación de antígenos por las células presentadoras de antígenos (APC) del individuo.

Los péptidos FVIII de unión a clase MHC únicos pueden solaparse y agruparse. Los grupos de péptidos FVIII de unión a MHC de clase II son alineaciones incrustadas de péptidos FVIII de unión a MHC de clase II únicos que se solapan. El número de grupos de péptidos FVIII que se unen al CMH de clase II presentados por las células presentadoras de antígenos (CPA) del individuo también se utiliza para cuantificar la presentación de antígenos

Proporciones

El polipéptido de la invención es un homodímero. Cualquier proporción molar de acuerdo con la invención se refiere a una proporción de la concentración molar de la subunidad monomérica del polipéptido de la invención. Los ratios se forman sobre la concentración molar del FVIII coadministrado. Cualquier proporción de polipéptido de la invención sobre FVIII en esta solicitud se refiere a la cantidad de monómeros comprendidos en el polipéptido de la invención, que preferentemente está presente como un dímero, que se va a administrar (en moles), dividido por la cantidad del FVIII que se va a administrar (en moles), a menos que se indique lo contrario. A modo de ejemplo, la administración conjunta de 100 pm de un polipéptido monomérico (no de acuerdo con la invención) con 1 pm del FVIII significa una proporción de 100. La misma proporción de 100 se obtiene si 50 pm de un polipéptido dimérico de la invención son administrado conjuntamentes con 1 pm del FVIII. Una proporción de, por ejemplo, 100 se denomina aquí alternativamente 100:1.

La proporción molar entre el polipéptido recombinante de la invención que se va a administrar y el FVIII que se va a administrar es preferentemente de al menos 2:1, al menos 3:1, al menos 4:1, al menos 5:1, al menos 6:1, al menos 8:1, al menos 10:1, al menos 15:1, al menos 20:1, al menos 25:1 o al menos 50:1 basada en la cantidad de polipéptido recombinante calculada como monómero y la cantidad de FVIII calculada como monómero.

La proporción molar del polipéptido de la invención a administrar al FVIII a administrar es de acuerdo con otro aspecto de la invención mayor que 50:1, más preferentemente la proporción es mayor que 60:1, al menos 75:1, al menos 100:1, mayor que 200:1, al menos 300:1, al menos 400:1, al menos 500:1, al menos 600:1, al menos 700:1, al menos 800:1, al menos 900:1, al menos 1.000:1, al menos 1.500:1, al menos 2.000:1, al menos 2.500:1, al menos 3.000:1 al menos 5.000:1, al menos 8.000:1 o hasta 10.000:1.

La proporción molar del polipéptido de la invención a administrar al FVIII a administrar puede, de acuerdo con ciertas realizaciones, no superar una proporción de 10.000, una proporción de 5.000, una proporción de 2.500 o una proporción de 500.

La proporción molar del polipéptido de la invención a administrar al FVIII a administrar puede oscilar entre 2 y 1000, o entre 4 y 750, o entre 10 y 500.

La proporción entre el polipéptido de la invención que se va a administrar y el FVIII que se va a administrar se proporciona en un intervalo para asegurar una semivida del FVIII suficientemente aumentada y simultáneamente para asegurar la inmunogenicidad reducida del FVIII aquí identificada mediante la coadministración del polipéptido de la invención. En particular, a la luz de las divulgaciones publicadas anteriormente, específicamente considerando el citado Delignet et al., 2012, se encontró sorprendentemente que ambos objetos podrían lograrse simultáneamente.

Más adelante se describen otros detalles del tratamiento de acuerdo con la invención.

El VWF truncado

La presente invención se refiere a un polipéptido recombinante que comprende un Factor von Willebrand (vWF) truncado. El término "factor von Willebrand" (vWF), tal como se usa en la presente memoria, incluye el vWF natural (nativo), pero también las variantes de los mismos que conservan al menos la actividad de unión a FVIII del vWF natural, por ejemplo, variantes de secuencia en las que se han insertado, suprimido o sustituido uno o más restos. La actividad de unión a FVIII se determina mediante un ensayo de unión a FVIII-VWF como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 2016/188907 A1.

Un VWF preferido de acuerdo con esta invención es el VWF humano representado por la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NÚM.:4. El ADNc que codifica la SEQ ID NÚM.:4 se muestra en la SEQ ID NÚM.:3.

El gen que codifica el VWF nativo humano se transcribe en un ARNm de 9 kb que se traduce en un prepropolipéptido de 2813 aminoácidos con un peso molecular estimado de 310.000 Da. El prepropolipéptido contiene un péptido señal de 22 aminoácidos N-terminal, seguido de un pro-polipéptido de 741 aminoácidos (aminoácidos 23-763 de la SEQ ID NÚM.:4) y la subunidad madura (aminoácidos 764-2813 de la SEQ ID NÚM.:4). La escisión del propolipéptido de 741 aminoácidos del N-terminal da lugar a un VWF maduro que consiste en 2050 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del prepropolíptido del VWF humano nativo se muestra en la SEQ ID NÚM.:4. A menos que se indique lo contrario, la numeración de aminoácidos de los residuos del VWF en esta solicitud se refiere a la SEQ ID NÚM.:4, incluso si la molécula de VWF, en particular un VWF truncado, no comprende todos los residuos de la SEQ ID NÚM.:4.

El propolipéptido del VWF nativo comprende múltiples dominios. En la literatura se pueden encontrar diferentes anotaciones de dominio (véase, por ejemplo Zhou et al. (2012) Blood 120(2): 449-458). En esta solicitud se aplica la siguiente anotación de dominio del prepropolíptido nativo del VWF: D1 -D2-D'-D3-A1 -A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK.

Con referencia a la SEQ ID NÚM.:4, el dominio D' consiste en los aminoácidos 764-865; y el dominio D3 consiste en los aminoácidos 866-1242.

La característica "truncado" en términos de la presente invención significa que el polipéptido no comprende la secuencia completa de aminoácidos del VWF maduro (aminoácidos 764-2813 de la SEQ ID NÚM.:4). Normalmente, el vWF truncado no comprende todos los aminoácidos 764-2813 de SEQ ID NÚM.:4 sino solamente un fragmento de los mismos. Un VWF truncado también puede denominarse fragmento de VWF o, en plural, fragmentos de VWF.

El VWF truncado es capaz de unirse a un Factor VIII. Preferentemente, el VWF truncado es capaz de unirse a la forma madura del Factor VIII nativo humano. En otra realización, el VWF truncado es capaz de unirse a un FVIII recombinante, preferentemente a un FVIII como el descrito en el presente documento, preferentemente a un Factor VIII de cadena única que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NÚM.:5. La unión del vWF truncado al Factor VIII se puede determinar mediante un ensayo de unión de FVIII-vWF como se describe en el Ejemplo 2 del documento 2016/188907 A1.

El vWF truncado de la presente invención comprende o consiste preferentemente en un dominio D' funcional y/o un dominio D3 funcional, en particular un dominio D' funcional y un dominio D3 funcional. El Factor von Willebrand (vWF) truncado de la invención es al menos capaz de unirse al Factor VIII (FVIII). Más preferente, el vWF truncado comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de por lo menos el 90 % con los aminoácidos 776 a 805 de SEQ ID NÚM.:4 y es capaz de unirse a FVIII. En las realizaciones preferentes, el vWF truncado comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, con los aminoácidos 766 a 805 de SEQ ID NÚM.:4 y es capaz de unirse a FVIII. De manera preferente el vWF truncado comprende o consiste en los aminoácidos 766 a 805 de SEQ ID NÚM.:4. Salvo indicación en contrario, las identidades de secuencia se determinan a lo largo de toda la longitud de la secuencia de referencia (por ejemplo, los aminoácidos 776 a 805 de SEQ ID NÚM.:4).

El vWF truncado de la presente invención comprende preferentemente o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de por lo menos el 90 % con los aminoácidos 766 a 864 de SEQ ID NÚM.:4 y es capaz de unirse a FVIII. En las realizaciones preferentes, el vWF truncado comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, con los aminoácidos 776 a 864 de SEQ ID NÚM.:4 y es capaz de unirse a FVIII. De manera preferente, el vWF truncado comprende o consiste en los aminoácidos 776 a 864 de SEQ ID NÚM.:4.

En otra realización preferente, el vWF truncado consiste en (a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NÚM.: 4 o (b) un fragmento del mismo, siempre que el vWF truncado todavía sea capaz de unirse al FVIII. Más preferentemente, el vWF truncado consiste en (a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, con los aminoácidos 764 a 1242 de SEQ ID NÚM.:4, o b) un fragmento de éste, siempre que el vWF truncado sea todavía capaz de unirse a FVIII. Mucho más preferentemente, el VWF truncado consiste en (a) los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NÚM.: 4 o (b) un fragmento del mismo, siempre que el VWF truncado todavía sea capaz de unirse al FVIII.

Como se describe con más detalle a continuación, el polipéptido de la invención puede prepararse mediante un procedimiento que utiliza células que comprenden un ácido nucleico que codifica el polipéptido que comprende el VWF truncado. El ácido nucleico se introduce en las células huésped adecuadas por medio de técnicas conocidasper se.

En una realización preferente, el ácido nucleico en la célula huésped codifica (a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 1 a 1242 de SEQ ID NÚM.:4, o b) un fragmento de éste, siempre que el VWF maduro truncado sea todavía capaz de unirse a FVIII.

Más preferentemente, el ácido nucleico codifica (a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, con los aminoácidos 1 a 1242 de SEQ ID NÚM.:4, o b) un fragmento de éste, siempre que el vWF truncado sea todavía capaz de unirse a FVIII. Lo más preferente es que el ácido nucleico codifique (a) los aminoácidos 1 a 1242 de SEQ ID NÚM.:4, o (b) un fragmento del mismo, siempre que el vWF truncado sea todavía capaz de unirse a FVIII. Especialmente si el polipéptido de acuerdo con esta invención es un dímero, el ácido nucleico comprenderá una secuencia que codifica los aminoácidos 1 a 763 de VWF (por ejemplo SEQ ID NÚM.:4), incluso si el VWF truncado en el polipéptido no comprende los aminoácidos 1 a 763 del VWF (por ejemplo SEQ ID NÚM.:4).

El vWF truncado del polipéptido recombinante de la invención de acuerdo con una realización preferente puede no comprender la secuencia de aminoácidos 1 a 763 del vWF de la SEQ ID NÚM.:4.

De acuerdo con otras realizaciones preferentes, el vWF truncado comprende o consiste en una de las siguientes secuencias de aminoácidos, cada una de las cuales se refiere a SEQ ID NÚM.:4: 776-1220; 766-1220; 764-1220; 776-1225; 766-1225; 764-1225; 776-1230; 766-1230; 764-1230; 776-1235; 766-1235; 764-1235; 776-1240; 766-1240; 764-1240; 776-1242; 766-1242; 764-1242;764-1250; 764-1041; 764-828; 764-865; 764-1045; 764-1035; 764-1128; 764-1198; 764-1268; 764-1261; y 764-1264.

En ciertas realizaciones, el VWF truncado tiene una deleción interna en relación con el VWF maduro de tipo salvaje. Por ejemplo, uno, más, o todos los dominios A1, A2, A3, D4, C1, C2, C3, C4, C5, C6, CK o combinaciones de los mismos pueden ser suprimidos, y se conservan el dominio D' y/o el dominio D3. De acuerdo con realizaciones adicionales, el vWF truncado carece de uno o más de los dominios A1, A2, A3, D4, C1, C2, C3, C4, C5, C6 o CK. De acuerdo con otras realizaciones, el VWF truncado carece de los aminoácidos 1243 a 2813 de la SEQ ID NÚM.:4, es decir, los dominios A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK.

En otras realizaciones, el VWF truncado no comprende los sitios de unión para la glicoproteína plaquetaria Iba (GPIba), el colágeno y/o la integrina aIIbpIII (secuencia RGDS dentro del dominio C1). En otras realizaciones, el VWF truncado no comprende el sitio de escisión (Tyr1605-Met1606) para ADAMTS13 que se encuentra en el dominio central A2 del VWF. En otra realización, el vWF truncado no comprende los sitios de unión para GPIba, y/o no comprende el sitio de unión para colágeno, y/o no comprende el sitio de unión para integrina aIIbpIII, y/o no comprende el sitio de escisión (Tyr1605-Met1606) para ADAMTS13, que se encuentra en el dominio central A2 de vWF.

En otras realizaciones, el vWF truncado comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 %, o al menos 91 %, o al menos 92 %, o al menos 93 %, o al menos 94 %, o al menos 95 %, o al menos el 96 %, o al menos el 97 %, o al menos el 98 %, o al menos el 99 %, a una de las secuencias de aminoácidos recitadas en el párrafo anterior, siempre que el vWF truncado sea capaz de unirse al FVIII.

Un polipéptido de la invención se denomina un "dímero" en la presente invención si dos monómeros de polipéptido de la invención están unidos por un enlace covalente. Preferentemente, el enlace covalente se localiza dentro de la porción truncada del VWF del polipéptido de la invención. Preferentemente, las dos subunidades monoméricas están unidas covalentemente a través de al menos un puente disulfuro, por ejemplo, mediante uno, dos, tres o cuatro puentes disulfuro. Los residuos de cisteína que forman el al menos un puente disulfuro se encuentran preferentemente dentro de la porción truncada del VWF del polipéptido de la invención. En una realización, estos residuos de cisteína son Cys-1099, Cys-1142, Cys-1222, Cys-1225, o Cys-1227 o combinaciones de ellos. Preferentemente, el polipéptido dimérico de la invención no comprende ningún otro enlace covalente que vincule los monómeros además de dicho enlace covalente situado dentro de la porción truncada del VWF del polipéptido, en particular no comprende ningún otro enlace covalente situado dentro de la porción HLEM o HLEP del polipéptido. Sin embargo, según otras realizaciones, el polipéptido dimérico de la invención puede comprender un enlace covalente situado en la porción HLEM o HLEP del polipéptido que une los monómeros.

El dímero es un homodímero, por lo que cada monómero comprende preferentemente una HLEM como se desvela en la presente memoria. El vWF truncado comprende, preferentemente, o consiste en dos polipéptidos, cada uno con una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con los aminoácidos 764 a 1099, los aminoácidos 764 a 1142, los aminoácidos 764 a 1222, los aminoácidos 764 a 1225 o los aminoácidos 764 a 1227 de la SEQ ID NÚM.: 4 y es capaz de unirse al FVIII. En las realizaciones preferentes, el vWF truncado comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, con los aminoácidos 764 a 1099, aminoácidos 764 a 1142, aminoácidos 764 a 1222, aminoácidos 764 a 1225 o los aminoácidos 764 a 1227 de SEQ ID NÚM.:4 y es capaz de unirse a FVIII. De manera preferente el VWF truncado comprende o consiste los aminoácidos 764 a 1099, los aminoácidos 764 a 1142, los aminoácidos 764 a 1222, los aminoácidos 764 a 1225, los aminoácidos 764 a 1227 o los aminoácidos 764 a 1242 de SEQ ID NÚM.:4.

El vWF truncado puede ser uno cualquiera de los fragmentos del vWF desvelados en los documentos WO 2013/106787 A1, WO 2014/198699 A2, WO 2011/060242 A2 o WO 2013/093760 A2 de referencia.

De acuerdo con otras realizaciones preferidas, el VWF truncado como se ha divulgado anteriormente puede comprender al menos una de las sustituciones de aminoácidos como se divulga en WO 2016/000039 A1. Estas versiones modificadas del VWF truncado comprenden al menos una sustitución de aminoácidos dentro de su dominio D', en comparación con la secuencia de aminoácidos del dominio D' del VWF de tipo salvaje según la SEQ ID NÚM.: 4. La secuencia de aminoácidos de las versiones modificadas del VWF truncado puede tener una o más sustituciones de aminoácidos en relación con la respectiva secuencia de tipo salvaje. Estas versiones modificadas del vWF truncado presentan preferentemente una mayor afinidad de unión al FVIII en comparación con la afinidad de unión de un polipéptido de referencia que tiene la misma secuencia de aminoácidos excepto por dichas modificaciones.

A menos que se indique lo contrario, la numeración de aminoácidos de los residuos de vWF truncados en la presente memoria se refiere a la SEQ ID NÚM.:4, incluso si la molécula de vWF no necesita comprender todos los residuos de la SEQ ID NÚM.:4.

La secuencia de aminoácidos del dominio D' del vWF truncado modificado tiene preferentemente una o 2 sustituciones de aminoácidos en proporción con el dominio D' del SEQ ID NÚM.:4. Se prefiere que S en la posición 764 del SEQ ID NÚM.:4, correspondiente a la posición 1 del SEQ ID NÚM.:2, sea sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, P, V, E, y, A y L. También se prefiere que S en la posición 766 del SEQ ID NÚM.:4, correspondiente a la posición 3 del SEQ ID Nú M.:2, sea sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en y, I, M, V, F, H, R y W. las combinaciones preferentes de sustituciones incluyen S764G/S766Y, S764P/S766I, S764P/S766M, S764V/S766Y, S764E/S766Y, S764Y/S766Y, S764L/S766Y, S764P/S766W, S766W/S806A, S766Y/P769K, S766Y/P769N, S766Y/P769R y S764P/S766L, con respecto a la secuencia de SEQ ID NÚM.:4. La afinidad de unión del polipéptido de la presente invención al FVIII puede incrementarse aún más mediante la introducción de dichas sustituciones en comparación con la afinidad de unión de un polipéptido de referencia que tenga la misma secuencia de aminoácidos excepto por dichas modificaciones. Como la interacción de vWF con el FVIII tiene típicamente una alta tasa de asociación, los cambios en la constante de disociación dependen en gran medida de los cambios en la tasa de disociación. En consecuencia, el principal objetivo para aumentar la asociación de vWF con FVIII implica esfuerzos para disminuir la tasa de disociación entre FVIII y vWF. Preferentemente, la tasa de disociación de las variantes de vWF truncado con dichas modificaciones y el FVIII en comparación con vWF y FVIII de tipo silvestre es al menos dos veces menor, más preferentemente al menos 5 veces menor, preferentemente al menos 10 veces menor y más preferentemente al menos 20 veces menor. Dichas sustituciones dentro del vWF truncado pueden contribuir a aumentar la semivida del FVIII coadministrado y/o pueden permitir la reducción de la dosis a administrar del polipéptido recombinante de la invención.

De acuerdo con otras realizaciones preferentes, el vWF truncado como se ha desvelado anteriormente en la presente memoria puede comprender al menos una de las sustituciones de aminoácidos como se desvela en el documento PCT 2016/050010 A1 en tramitación. Estas versiones modificadas del vWF truncado presentan preferentemente una mayor afinidad de unión al FVIII en comparación con la afinidad de unión de un polipéptido de referencia que tiene la misma secuencia de aminoácidos excepto por dichas modificaciones. Por lo tanto, el vWF truncado tal como se desvela en la presente memoria puede comprender una de las siguientes sustituciones de aminoácidos o combinación de sustituciones de aminoácidos: S764P/S766W/V1083A, S764G/S766Y/V1083A, S764E/S766Y/V1083A, N1011S/V1083A/K1181E, S766Y/V1083A, V1083A, S1042T, V805A/Q1158L, K912E/T1088S, o L781P. Dichas sustituciones dentro del vWF truncado pueden contribuir a aumentar la semivida del FVIII coadministrado y/o pueden permitir la reducción de la dosis a administrar del polipéptido recombinante de la invención.

Los polipéptidos de la invención que tienen dichas sustituciones pueden utilizarse preferentemente para asegurar una semivida aún mayor del FVIII coadministrado y proporcionar simultáneamente una inmunogenicidad reducida del FVIII, incluso en caso de que se aplique sólo un exceso molar moderado del polipéptido de la invención sobre el FVIII coadministrado.

El término "vWF endógeno" como se usa en la presente memoria se refiere a las subunidades monoméricas del vWF, independiente de su grado de di- u oligomerización.

Resto de extensión de la semivida (HLEM)

Además del vWF truncado, el polipéptido de la invención además comprende un resto que extiende la semivida. El resto que extiende la semivida puede ser una secuencia heteróloga de aminoácidos, en particular una proteína de mejora de la semivida (HLEP). Alternativamente, el resto que extiende la semivida puede ser un resto conjugado químicamente al polipéptido que comprende el vWF truncado por un enlace covalente diferente de un enlace peptídico.

En ciertas realizaciones de la invención, la semivida del polipéptido de la invención se prolonga mediante una modificación química, por ejemplo, la unión de una fracción que prolonga la semivida, como el polietilenglicol (PEGilación), el PEG glicosilado, el hidroxietilalmidón (HESilación), los ácidos polisiálicos, los polipéptidos similares a la elastina, los polímeros de heparosán o el ácido hialurónico. En otra realización, el polipéptido de la invención es conjugado a un HLEP tal como albúmina a través de un enlazador químico. El principio de esta tecnología de conjugación ha sido descrito de forma ejemplar por Conjuchem LLC (véase, por ejemplo La patente estadounidense n° 7.256.253).

El polipéptido recombinante comprende además, preferentemente, un enlace químico o una secuencia enlazadora situada entre el VWF truncado y el HLEM.

Dicha secuencia enlazadora puede ser un enlazador peptídico compuesto por uno o más aminoácidos, en particular de 1 a 50, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5 o 1 a 3 (por ejemplo, 1 , 2 o 3) aminoácidos y que pueden ser iguales o diferentes entre sí. Preferentemente, la secuencia enlazadora no está presente en la posición correspondiente en el VWF de tipo salvaje. Los aminoácidos preferidos presentes en dicha secuencia de enlace incluyen Gly y Ser. La secuencia de enlace debe ser no inmunogénica. Los enlazadores preferidos pueden estar compuestos por residuos alternos de glicina y serina. Los enlazadores adecuados se describen, por ejemplo, en WO2007/090584.

En otra realización de la invención, el enlazador peptídico entre la fracción truncada del VWF y la HLEM consiste en secuencias peptídicas que sirven como enlazadores interdominio naturales en las proteínas humanas. Preferentemente, estas secuencias peptídicas en su entorno natural se encuentran cerca de la superficie de la proteína y son accesibles al sistema inmunitario, de modo que se puede asumir una tolerancia natural contra esta secuencia. Se dan ejemplos en WO 2007/090584. Las secuencias de enlace escindibles se describen, por ejemplo, en WO 2013/120939 A1.

En una realización preferida del polipéptido recombinante, el enlazador entre el VWF truncado y la HLEM es un enlazador peptídico de glicina/serina que tiene o consiste en la secuencia de aminoácidos 480 - 510 de la SEQ ID NÚM.:2.

En una realización el polipéptido tiene la siguiente estructura: tVWF - L1 - H, (I)

en la que tVWF es el VWF truncado, L1 es un enlace químico o una secuencia de enlace, y H es un HLEM, en particular un HLEP.

L1 puede ser un enlace químico o una secuencia de enlace que consiste en uno o más aminoácidos, por ejemplo de 1 a 50, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5 o 1 a 3 (por ejemplo 1 , 2 o 3) aminoácidos y que pueden ser iguales o diferentes entre sí. Normalmente, las secuencias enlazadoras no están presentes en la posición correspondiente en el VWF de tipo salvaje. Ejemplos de aminoácidos adecuados presentes en L1 incluyen Gly y Ser. El enlazador debe ser no inmunogénico y puede ser un enlazador no escindible o escindible. Los enlazadores no escindibles pueden estar compuestos de restos alternos de glicina y serina como se ilustra en el documento WO2007/090584. En otra realización de la invención, el enlazador peptídico entre la parte truncada del VWF y la parte de la albúmina consiste en secuencias peptídicas que sirven como enlazadores naturales entre dominios en las proteínas humanas. Preferentemente, estas secuencias peptídicas en su entorno natural se encuentran cerca de la superficie de la proteína y son accesibles al sistema inmunitario, de modo que se puede asumir una tolerancia natural contra esta secuencia. Se dan ejemplos en WO2007/090584. Las secuencias de enlace escindibles se describen, por ejemplo, en WO 2013/120939 A1.

Las secuencias HLEP preferidas se describen infra. También se incluyen en la invención las fusiones al "aminoácido N-terminal" exacto o al "aminoácido C-terminal" exacto de la HLEP respectiva, o las fusiones a la "parte N-terminal" o a la "parte C-terminal" de la HLEP respectiva, que incluyen deleciones N-terminales de uno o más aminoácidos de la HLEP El polipéptido puede comprender más de una secuencia HLEP, por ejemplo, dos o tres secuencias HLEP. Estas múltiples secuencias HLEP pueden fusionarse con la parte C-terminal del VWF en tándem, por ejemplo, como repeticiones sucesivas.

Polipéptidos que extienden la semivida (HLEP)

Preferentemente, la fracción que extiende la semivida es un polipéptido que extiende la semivida (HLEP). Uno o más HLEP pueden ser fusionados a los extremos N- o C-terminal de VWF siempre que no interfieran con, o supriman la capacidad de unión del VWF truncado a FVIII. Más preferentemente, la HLEP se selecciona a partir de polipéptidos capaces de unirse al receptor Fc neonatal (FcRn), como la albúmina o fragmentos de la misma, o regiones constantes de inmunoglobulina y porciones de las mismas, por ejemplo el fragmento Fc, cadenas aleatorias solvatadas con gran volumen hidrodinámico (por ejemplo XTEN (Schellenberger et al. 2009; Nature Biotechnol. 27:1186-1190), repeticiones de homo-aminoácidos (HAP) o repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS), afamina, alfa-fetoproteína, proteína de unión de vitamina D, transferrina o variantes de la misma, péptido carboxilo-terminal (CTP) de la subunidad de gonadotropina-p coriónica humana, polipéptidos o lípidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a región de albúmina o inmunoglobulina constante. La región o porciones de la constante de inmunoglobulina es preferentemente un fragmento Fc de inmunoglobulina G1, un fragmento Fc de inmunoglobulina G2 o un fragmento Fc de inmunoglobulina A.

Un "polipéptido que extiende la semivida" tal como se usa en este documento se selecciona preferentemente del grupo compuesto por albúmina, un miembro de la familia de la albúmina, la región constante de la inmunoglobulina G y sus fragmentos, la región y los polipéptidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a la albúmina, a los miembros de la familia de la albúmina, así como a las porciones de una región constante de inmunoglobulina. Puede ser una proteína de longitud completa que mejora la semivida descrita en este documento (por ejemplo, albúmina, un miembro de la familia de la albúmina o la región constante de la inmunoglobulina G) o uno o más fragmentos de la misma que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica o la actividad biológica del factor de coagulación. Dichos fragmentos pueden tener una longitud de 10 o más aminoácidos o pueden incluir al menos unos 15, al menos unos 20, al menos unos 25, al menos unos 30, al menos unos 50, al menos unos 100, o más aminoácidos contiguos de la secuencia HLEP o pueden incluir parte o todos los dominios específicos del HLEP respectivo, siempre que el fragmento HLEP proporcione una extensión de la semivida funcional de al menos un 25% en comparación con el polipéptido respectivo sin la HLEP.

La porción HLEP del polipéptido de la invención puede ser una variante de una HLEP de tipo salvaje. El término "variantes" incluye inserciones, deleciones y sustituciones, conservadoras o no conservadoras, en las que tales cambios no alteran sustancialmente la actividad de fijación del FVIII del VWF truncado.

En particular, las construcciones propuestas de fusión del HLEP de VWF de la invención pueden incluir variantes polimórficas de HLEP que están presentes en la naturaleza y fragmentos de HLEP. El HLEP puede derivarse de cualquier vertebrado, especialmente de cualquier mamífero, por ejemplo ser humano, mono, vaca, ovejas, o cerdo. Las HLEP no mamíferas incluyen, entre otras, la gallina y el salmón.

De acuerdo con ciertas realizaciones de la presente divulgación, la porción HLEM, en particular una HLEP, del polipéptido recombinante de la invención puede especificarse con el término alternativo "FP". Preferentemente, el término "FP" representa una albúmina humana.

De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas, el polipéptido recombinante es una proteína de fusión. Una proteína de fusión en términos de la presente invención es una proteína creada por la unión dentro del marco de al menos dos secuencias de ADN que codifican el VWF truncado así como la HLEP El experto entiende que la traducción de la secuencia de ADN de la proteína de fusión dará lugar a una única secuencia de proteína. Como resultado de una inserción dentro del marco de una secuencia de ADN que codifica un enlazador peptídico según otra realización preferida, puede obtenerse una proteína de fusión que comprende el VWF truncado, un enlazador adecuado y el HELP

De acuerdo con algunas realizaciones, el FVIII coadministrado no comprende ninguna de las estructuras HLEM o HLEP aquí descritas. De acuerdo con algunas otras realizaciones, el FVIII coadministrado puede comprender al menos una de las estructuras HLEM o HLEP aquí descritas.

Albúmina como HELP

Preferentemente, el HLEP es una albúmina o un fragmento de la misma. El extremo N-terminal de la albúmina puede fusionarse con el extremo C-terminal del VWF truncado. Alternativamente, el C-terminal de la albúmina puede fusionarse con el N-terminal del VWF truncado.

Los términos "albúmina de suero humano" (HSA) y "albúmina humana" (HA) y "albúmina" (ALB) se utilizan indistintamente en esta solicitud. Los términos "albúmina" y "albúmina sérica" son más amplios y abarcan la albúmina sérica humana (y sus fragmentos y variantes), así como la albúmina de otras especies (y sus fragmentos y variantes).

Tal y como se utiliza aquí, "albúmina" se refiere colectivamente al polipéptido de albúmina o a la secuencia de aminoácidos, o a un fragmento o variante de albúmina, que tiene una o más actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas) de la albúmina. En particular, la "albúmina" se refiere a la albúmina humana o a sus fragmentos, especialmente la forma madura de la albúmina humana tal como se muestra en la SEQ ID NÚM.:6 o la albúmina de otros vertebrados o sus fragmentos, o análogos o variantes de estas moléculas o sus fragmentos.

De acuerdo con ciertas realizaciones de la presente divulgación, el término alternativo "FP" se utiliza para identificar la HLEP, en particular para definir la albúmina como HLEP

De acuerdo con una realización preferente adicional, el polipéptido recombinante de la invención que comprende el VWF truncado comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ I<d>NÚM.: 2.

En particular, los polipéptidos propuestos de la invención pueden incluir variantes polimórficas naturales de la albúmina humana y fragmentos de albúmina humana. En general, un fragmento o variante de albúmina tendrá una longitud de al menos 10, preferentemente de al menos 40, y más preferentemente de más de 70 aminoácidos.

Las realizaciones preferidas de la invención incluyen variantes de albúmina utilizadas como HLEP del polipéptido de la invención con una unión mejorada al receptor FcRn. Dichas variantes de albúmina pueden dar lugar a una semivida plasmática más larga de una proteína de fusión de la variante de albúmina del VWF truncada en comparación con una fusión del VWF truncado con una albúmina de tipo salvaje. Las variantes incluyen las descritas en los documentos WO 2014072481, WO 2012150319, WO 2013135896, WO 2011124718, WO 2011051489 y WO 2012059486. La porción de albúmina de los polipéptidos de la invención puede comprender por lo menos un subdominio o un dominio de HA o modificaciones conservadoras del mismo.

Inmunoglobulinas como HLEP

En otra realización preferente, la HLEP puede ser una región constante de inmunoglobulina (Fc). Las regiones constantes (Fc) de la inmunoglobulina G (IgG) son conocidas en la técnica para aumentar la semivida de las proteínas terapéuticas (Dumont J A et al. 2006. BioDrugs 20:151-160). La región constante de la cadena pesada de la IgG consiste en 3 dominios (CH1-CH3) y una región bisagra. La secuencia de inmunoglobulina puede proceder de cualquier mamífero o de las subclases IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, respectivamente. Las IgG y los fragmentos de IgG sin un dominio de unión al antígeno también pueden utilizarse como HLEP La porción de polipéptido terapéutico está conectada a la IgG o a los fragmentos de IgG preferentemente a través de la región bisagra del anticuerpo o de un enlazador peptídico, que incluso puede ser escindible. Diversas patentes y solicitudes de patentes describen la fusión de proteínas terapéuticas con regiones constantes de inmunoglobulina para aumentar la vida mediain vivode las proteínas terapéuticas. US 2004/0087778 y WO 2005/001025 describen proteínas de fusión de dominios Fc o al menos porciones de regiones constantes de inmunoglobulina con péptidos biológicamente activos que aumentan la semivida del péptido, que de otro modo se eliminaría rápidamente in vivo. Se describieron proteínas de fusión Fc-IFN-p que conseguían una mayor actividad biológica, una vida media circulante prolongada y una mayor solubilidad (el documento WO 2006/000448 A2). Se desvelaron proteínas Fc-EPO con una vida media sérica prolongada y una mayor potenciain vivo(WO 2005/063808 A1), así como fusiones de Fc con G-CSF (el documento WO 2003/076567 A2), péptido similar al glucagón-1 (el documento WO 2005/000892 A2), factores de coagulación (el documento WO 2004/l0 l740 A2) y la interleucina-10 (la Patente de los Estados Unidos N° 6.403.077), todos ellos con propiedades de mejora de la semivida.

Varios HLEP que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención se describen en detalle en WO 2013/120939 A1.

N-glicanos y sialilación del polipéptido de la invención

El polipéptido de la invención comprende preferentemente N-glicanos, y al menos el 75%, preferentemente al menos el 85%, más preferentemente al menos el 90% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos una fracción de ácido siálico. En realizaciones preferidas, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos una fracción de ácido siálico. Los inventores descubrieron que los polipéptidos que comprenden fragmentos de FVW altamente sialilados no sólo pueden tener una semivida más prolongada por sí mismos, sino que también pueden ser capaces de prolongar aún más la semivida del FVIII coadministrado. En otras palabras, la administración del polipéptido de la invención conduce a una semivida prolongada y/o a una eliminación reducida del FVIII coadministrado.

El polipéptido de la invención comprende preferentemente N-glicanos, y al menos el 50% de los grupos sialilo de los N-glicanos de las glicoproteínas son grupos sialilo ligados a a-2,6. En general, los grupos sialilo terminales pueden estar unidos a los grupos galactosa a través de un enlace a-2,3- o a través de un enlace a-2,6. Típicamente, los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden más grupos sialilo ligados a a-2,6 que a a-2,3. Preferentemente, al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 80%, o al menos el 90% de los grupos sialilo de los N-glicanos son grupos sialilo ligados a a-2,6. Estas realizaciones pueden obtenerse, por ejemplo, coexpresando la a-2,6-sialiltransferasa humana en células de mamífero.

Los procedimientos adecuados para producir dichas glicoproteínas se describen en el documento PCT/WO2016/188905 A1. En consecuencia, se describe un procedimiento de producción de una glicoproteína que comprende N-glicanos con mayor sialilación, que comprende (i) proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un factor von Willebrand (VWF) truncado, y (ii) cultivar dichas células a una temperatura inferior a 36,0 °C. Además, se describe un procedimiento para producir un dímero de una glicoproteína que comprende un factor von Willebrand (VWF) truncado, o para aumentar la dimerización de dicha glicoproteína, que consiste en (i) proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la glicoproteína, y ii) cultivar dichas células a una temperatura inferior a 36,0 °C. Además, se describe un procedimiento de producción de una glicoproteína que comprende N-glicanos con mayor sialilación, que comprende (i) proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un factor von Willebrand (VWF) truncado y un ácido nucleico recombinante que codifica una a-2,6-sialiltransferasa, y ii) cultivar las células en condiciones que permitan la expresión de la glucoproteína y de la a-2,6-sialiltransferasa.

En una realización, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, de los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden al menos un grupo de ácido siálico. En otra realización, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden al menos un grupo de ácido siálico.

En otra realización, menos del 15%, menos del 12%, menos del 10%, o menos del 8%, o menos del 6%, o menos del 5%, o menos del 4%, o menos del 3%, o menos del 2% o incluso menos del 1% de los N-glicanos del polipéptido de la invención son asialo-N-glicanos, es decir, son N-glicanos que carecen de un grupo ácido siálico. En otra realización, menos del 15%, menos del 12%, menos del 10%, o menos del 8%, o menos del 6%, o menos del 5%, o menos del 4%, o menos del 3%, o menos del 2% o incluso menos del 1% de los N-glicanos del polipéptido de la invención son asialo-N-glicanos, es decir, no tienen un grupo ácido siálico.

] Otras realizaciones de la invención comprenden un Factor de von Willebrand (VWF) truncado, en el que dicho VWF truncado es capaz de unirse a un Factor VIII (FVIII), y en el que dicha glicoproteína comprende N-glicanos, en el que menos del 35%, preferentemente menos del 34%, preferentemente menos del 33%, preferentemente menos del 32%, preferentemente menos del 31%, preferentemente menos del 30%, preferentemente menos del 29%, preferentemente menos del 28%, preferentemente menos del 27%, preferentemente menos del 26%, preferentemente menos del 25%, preferentemente menos del 24%, preferentemente menos del 23%, preferentemente menos del 22%, preferentemente menos del 21%, preferentemente menos del 20%, preferentemente menos del 19%, preferentemente menos del 18%, preferentemente menos del 17%, preferentemente menos del 16%, preferentemente menos del 15%, preferentemente menos del 14%, preferentemente menos del 13%, preferentemente menos del 12%, preferentemente menos del 11%, preferentemente menos del 10%, preferentemente menos del 9%, preferentemente menos del 8%, preferentemente menos del7%,preferentemente menos del 6% y preferentemente menos del 5% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

Todavía otras realizaciones de la invención comprenden un factor de von Willebrand (VWF) truncado, en el que dicho VWF truncado es capaz de unirse a un Factor VIII (FVIII) y en el que dicho VWF truncado comprende N-glucanos, en el que menos del 6 %, preferentemente, menos del 5 %, preferentemente, menos del 4 %, preferentemente, menos del 3 %, preferentemente menos del 2 % y, preferentemente, menos del 1 % de dichos N-glucanos comprenden, en promedio, tres o más restos de galactosa terminales y no sialilados.

Las realizaciones descritas anteriormente pueden combinarse entre sí. Todos los porcentajes de N-glicanos mencionados anteriormente, o cualquier indicación del grado de sialilación, deben entenderse como porcentajes o grados medios, es decir, se refieren a una población de moléculas, no a una única molécula. Está claro que la glicosilación o sialilación de las moléculas individuales de glicoproteínas dentro de una población de glicoproteínas mostrará cierta heterogeneidad.

Dímeros

Los polipéptidos de esta invención tiene una alta proporción de homodímeros. En una realización, al menos el 50% o al menos el 60 % o al menos el 70 % o al menos el 80 % o al menos el 90 % o al menos el 95 % o aproximadamente el 100 % de los polipéptidos están presentes como dímeros. En otra realización, la proporción dímero:monómero del polipéptido de la invención es por lo menos de 1,5, preferentemente por lo menos de 2, más preferentemente por lo menos de 2,5 o por lo menos de 3. Lo más preferentemente, todos los péptidos de la invención están presentes como homodímeros. Es preferente además que el polipéptido de la invención no comprenda formas multiméricas. El uso de dímeros es favorable, ya que el dímero tiene una afinidad mejorada con el factor VIII en comparación con el monómero. El contenido de dímero, y la proporción entre dímero y monómero del polipéptido de la invención, se pueden determinar como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 2016/188907.

En una realización, la afinidad del polipéptido de la invención al Factor VIII es mayor que la del VWF nativo humano a la misma molécula de Factor VIII. La afinidad del factor VIII puede referirse al factor VIII nativo humano, o a la molécula del factor VIII caracterizada por el SEQ ID NÚM.:5.

Se ha encontrado que las preparaciones del polipéptido de esta invención con una alta proporción de dímeros tienen una mayor afinidad al Factor VIII. Esta mayor afinidad al Factor VIII conduce a una mayor estabilización del Factor VIII por los polipéptidos de la presente invención. Alternativamente o en combinación con una proporción aumentada de dímeros también los polipéptidos de acuerdo con la invención con mutaciones dentro del dominio de unión al Factor VIII que aumentan la afinidad al Factor VIII son realizaciones preferidas de la invención. En la presente memoria se desvelan mutaciones adecuadas.

Preparación del polipéptido

El ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención puede prepararse según procedimientos conocidos en la técnica. Basándose en la secuencia de ADNc de la forma prepro de VWF nativo humano (SEQ ID NÚM.:3), puede diseñarse y generarse ADN recombinante que codifique los constructos o polipéptidos de VWF truncado antes mencionados de la invención.

Incluso si el polipéptido que es secretado por las células huésped no comprende los aminoácidos 1 a 763 de la preforma del VWF nativo humano, se prefiere que el ácido nucleico (por ejemplo el ADN) que codifica el precursor intracelular del polipéptido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, con los aminoácidos 23 a 763 o, preferentemente, con los aminoácidos 1 a 763 de la SEQ ID NÚM.:4. Más preferentemente, el ácido nucleico (por ejemplo, el ADN) que codifica el precursor intracelular del polipéptido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 23 a 763 de la SEQ ID N<ú>M.:4, o los aminoácidos 1 a 763 de la SEQ ID NÚM.:4.

Los constructos en los que el ADN contiene el marco de lectura abierto completo insertado en la orientación correcta en un plásmido de expresión pueden utilizarse para la expresión de proteínas. Los vectores de expresión típicos contienen promotores que dirigen la síntesis de grandes cantidades de ARNm correspondientes al ácido nucleico insertado en las células portadoras del plásmido. También pueden incluir una secuencia de origen de replicación que permite su replicación autónoma dentro del organismo anfitrión, y secuencias que aumentan la eficiencia con la que se traduce el ARNm sintetizado. Los vectores estables a largo plazo pueden mantenerse como entidades de libre replicación utilizando elementos reguladores de, por ejemplo, virus (por ejemplo, las secuencias OriP del genoma del virus de Epstein Barr). También se pueden producir líneas celulares que hayan integrado el vector en el ADN genómico, y de esta manera el producto génico se produce de forma continua.

Típicamente, las células a proporcionar se obtienen introduciendo el ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención en células huésped de mamífero.

Cualquier célula huésped susceptible de cultivo celular, y de expresión de glicoproteínas, puede ser utilizada de acuerdo con la presente invención. En ciertas realizaciones, una célula huésped es de mamífero. Los ejemplos no limitantes de células de mamífero que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen la línea de mieloma de ratón BALB/c (NSO/1, N.°<e>C<a>CC: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, Países Bajos)); línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL10); células de ovario de hámster chino /-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243251, 1980); células de riñón de mono (CV1 ATCC c Cl 70); células de riñón de mono verde africano (<v>E<r>O-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MOCK, ATCC CCL 34) células de hígado de rata de búfalo (BRL 3A, At CC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (HepG2, Hb 8065); tumor mamario de ratón (Mm T 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals NY Acad. Sci., 383:44-68, 1982); células MRC 5; células PS4; células de amniocitos humanos (CAP); y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Preferentemente, la línea celular es una línea celular de roedores, especialmente una línea celular de hámster como CHO o BHK.

Los procedimientos adecuados para introducir ácidos nucleicos suficientes para lograr la expresión de una glicoproteína de interés en células huésped de mamíferos son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Gething et al., Nature, 293:620-625, 1981 Mantei et al., Nature, 281:40-46, 1979 Levinson et al. Patentes EP 117,060; y EP 117.058. En el caso de las células de mamíferos, los procedimientos habituales para introducir material genético en ellas incluyen el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Erb (Virology, 52:456-457, 1978) o el procedimiento de lipofectamine™ (Gibco BRL) de Hawley-Nelson (Focus 15:73, 1993). Los aspectos generales de las transformaciones del sistema de células de mamíferos han sido descritos por Axel en US. Pat. N° 4.399.216. Para diversas técnicas para introducir material genético en células de mamífero, véase Keown y col., Methods in Enzymology, 1989, Keown y col., Methods in Enzymology, 185:527-537, 1990, y Mansour y col., Nature, 336:348-352, 1988.

Las células se cultivan en condiciones que permiten la expresión del polipéptido. El polipéptido puede recuperarse y purificarse utilizando procedimientos conocidos por el artesano experto.

Tratamiento del trastorno de coagulación

El polipéptido recombinante que comprende un VWF truncado como el descrito anteriormente se utiliza para reducir la inmunogenicidad del FVIII, en el que el polipéptido recombinante y una proteína FVIII se coadministran a un individuo que padece un trastorno de la coagulación sanguínea. En particular, el trastorno de coagulación sanguíneo incluye la hemofilia A. El término "hemofilia A" se refiere a una deficiencia en la coagulación funcional del FVIII, que suele ser hereditaria.

En otra realización, el trastorno de la coagulación sanguínea es la hemofilia A severa, preferentemente asociada con un nivel de actividad del FVIII endógeno que está por debajo del 1% del nivel de actividad del FVIII endógeno en NHP. En términos de la presente invención, el trastorno de la coagulación sanguínea es preferentemente la hemofilia A grave.

En una realización, el trastorno de la coagulación sanguínea es la hemofilia A moderada. La hemofilia A moderada se caracteriza preferentemente por un nivel de actividad del FVIII endógeno que es de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 5% del nivel de actividad del FVIII endógeno en NHP Normalmente, los individuos con hemofilia A moderada tienen un nivel de actividad del FVIII endógeno de 0,01 a 0,05 UI/ml en el plasma.

En otra realización, el trastorno de la coagulación sanguínea es la hemofilia A leve. La hemofilia A leve se caracteriza preferentemente por un nivel de actividad del FVIII endógeno que es de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 40% del nivel de actividad del FVIII endógeno en NHP Típicamente, los sujetos que tienen hemofilia A leve tienen un nivel de actividad del FVIII endógeno de 0,05 a 0,4 IU/ml en el plasma.

El tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea abarca el tratamiento de pacientes a los que ya se les ha diagnosticado cualquier forma de la enfermedad en cualquier fase o manifestación clínica; el retraso del inicio o la evolución o el agravamiento o el deterioro de los síntomas o signos de la enfermedad; y/o la prevención y/o la reducción de la gravedad de la enfermedad.

Un "sujeto" o "paciente" al que se administra un polipéptido de la invención es preferentemente un ser humano. En ciertos aspectos, el humano es un paciente pediátrico. En otros aspectos, el humano es un paciente adulto.

Se espera que el individuo desarrolle y/o tenga riesgo de desarrollar una reacción inmunitaria contra el FVIII; y/o el individuo sea un individuo no tratado previamente con FVIII.

En realizaciones particulares, el individuo tiene un riesgo de desarrollar una reacción inmune contra el FVIII, particularmente una reacción inmune caracterizada por anticuerpos inhibidores contra el FVIII. Se conocen varios tipos de estos factores de riesgo para el desarrollo de anticuerpos inhibidores anti-FVIll en pacientes, en particular en pacientes con hemofilia A, tras la administración de FVIII. Por ejemplo, el individuo puede presentar un genotipo caracterizado por inversiones, grandes deleciones y/o mutaciones sin sentido del gen FVIII que eliminan o eliminan sustancialmente la producción endógena de FVIII en dicho sujeto. Así, se han identificado ciertos tipos de mutación del gen F8 que se asocian a un factor de riesgo genético. Otros factores genéticos de riesgo son los polimorfismos de IL10, TNFA, FCGR2A o CTLA4.

En ciertas realizaciones, la coadministración del polipéptido recombinante con FVIII es profiláctica, por ejemplo, en una situación en la que el individuo que padece un trastorno de la coagulación de la sangre como se describesupraestá sometido a un tratamiento continuo que comprende la coadministración regular del polipéptido recombinante y FVIII.

En otras realizaciones, la coadministración puede ser terapéutica, por ejemplo, en circunstancias en las que el individuo que sufre un trastorno de la coagulación sanguínea experimenta un episodio de hemorragia aguda o tiene el riesgo de experimentar un episodio de hemorragia aguda.

En la presente memoria se describen composiciones y kits que comprenden un polipéptido de la invención, así como composiciones y kits que comprenden un polipéptido de la invención y FVIII. Las composiciones suelen suministrarse como parte de una composición estéril y farmacéutica que incluye un vehículo farmacológicamente aceptable. Esta composición puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del procedimiento deseado para administrarla a un paciente).

Los términos "Factor VIII" y "FVIII" o "proteína del Factor VIII" se utilizan indistintamente en el presente documento y abarcan tanto el FVIII derivado del plasma como el FVIII recombinante. El FVIII recombinante abarca, sin limitación, FVIII de longitud completa, así como variantes delecionadas o truncadas del dominio B de dos cadenas, así como variantes delecionadas o truncadas del dominio B de cadena sencilla, por ejemplo, las descritas en el documento WO 2004/067566 y otras variantes del FVIII con mutaciones fuera del dominio B pero que tienen la actividad biológica de FVIII. De acuerdo con una realización preferente, el FVIII es un factor VIII de una sola cadena consistente en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NÚM.:5.

El polipéptido de la invención puede ser administrado a un paciente por varias vías, tal como oral, transdérmica, subcutánea, intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, tópica o local. La vía más adecuada para la administración en un caso determinado dependerá del polipéptido particular, el individuo, la naturaleza y la gravedad de la enfermedad y la condición física del individuo. Preferentemente, un polipéptido de la invención se administrará por vía intravenosa o subcutánea. Preferentemente, el polipéptido y el FVIII se coadministran.

La determinación del número total de dosis y la duración del tratamiento con un polipéptido de la invención y FVIII está bien dentro de las capacidades de los expertos en la técnica. La dosificación del polipéptido de la invención así como del FVIII a administrar depende de las concentraciones del FVIII a administrar, de la concentración del VWF endógeno en el paciente a tratar, o de ambas. Una dosificación eficaz basada en las proporciones definidas por los inventores de esta solicitud puede ser determinada por el experto, teniendo en cuenta el peso molecular del polipéptido de la invención así como el peso molecular del FVIII que se va a administrar. El grado de gravedad del trastorno de la coagulación sanguínea también puede considerarse para determinar la dosificación adecuada del polipéptido de la invención, así como del FVIII que debe administrarse. Las dosificaciones típicas de FVIII pueden oscilar entre aproximadamente 20 UI/kg de peso corporal y aproximadamente 1.000 UI/kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 20 UI/kg de peso corporal y aproximadamente 500 UI/kg de peso corporal, y más preferentemente entre aproximadamente 20 UI/kg de peso corporal y aproximadamente 400 UI/kg de peso corporal.

De acuerdo con esta invención, el paciente que está siendo tratado con el polipéptido de la invención también es tratado o al menos ha sido tratado con el Factor VIII de coagulación sanguínea. El polipéptido de la invención y el FVIII pueden administrarse simultáneamente, es decir, juntos, o de forma secuencial. Alternativamente, puede realizarse una administración por separado. Todos estos modos de administración se engloban en los términos "terapia combinada" y "coadministración".

De acuerdo con una determinada realización, el polipéptido de la invención y el FVIII pueden administrarse como una mezcla, es decir, dentro de la misma composición o tras una etapa de mezcla de dos composiciones; o pueden administrarse secuencialmente o por separado, es decir, como composiciones separadas.

La coadministración del polipéptido recombinante y de la proteína FVIII es de acuerdo con una realización preferente lograda mediante la administración conjunta en una única composición que comprende el polipéptido recombinante y la proteína FVIII. De acuerdo con otras realizaciones preferidas, la coadministración del polipéptido recombinante y la proteína FVIII se consigue proporcionando un producto combinado que comprende el polipéptido recombinante y el FVIII mezclados en una única composición o proporcionando un conjunto o kit de al menos dos productos separados dispuestos para ser mezclados antes de la administración, en el que un primer producto comprende el polipéptido recombinante y un segundo producto comprende el FVIII. Dicho producto combinado es especialmente adecuado para la administración simultánea. Dicho conjunto o kit es particularmente adecuado para la administración simultánea o la administración secuencial.

De acuerdo con una determinada realización, el polipéptido de la invención y el FVIII pueden administrarse por separado, es decir, como composiciones separadas y, si procede, con diferentes esquemas de dosificación.

Preferentemente, el polipéptido de la invención y el FVIII pueden administrarse conjuntamente. El programa de administración del polipéptido de la invención puede ser idéntico al programa de administración del FVIII o puede ser diferente. Se puede reconocer que en particular de acuerdo con esta realización la co-presencia in vivo de ambos, el polipéptido de la invención y el FVIII, al menos transitoriamente es más importante que el modo de administración. Un régimen de dosificación idéntico no es crucial para que el polipéptido de la invención tenga su beneficio para reducir la inmunogenicidad del FVIII siempre que se administre conjuntamente. Así pues, la administración con respecto al régimen de dosificación y/o la vía de administración del polipéptido de la invención y el FVIII podría proporcionarse independientemente siempre que se consiga una copresencia in vivo. De acuerdo con esta realización, una composición que comprende el polipéptido de la invención, pero que no comprende ningún FVIII, puede ser particularmente adecuada, ya que el FVIII se proporciona y administra independientemente, sin embargo, preferentemente junto con el polipéptido de la invención.

En particular, en el caso de que el polipéptido recombinante y la proteína FVIII se proporcionen en composiciones o productos separados para ser mezclados antes de la coadministración, la mezcla puede ser tratada antes de la administración de tal manera que permita antes de la administración que al menos una proporción de dicho polipéptido recombinante se una a dicho FVIII. Por ejemplo, la mezcla podría incubarse durante un tiempo determinado. Dicha incubación puede llevarse a cabo en menos de 1 minuto, o en menos de 5 minutos, ya sea a temperatura ambiente o, si procede, a temperatura elevada, aunque preferentemente a una temperatura inferior a 40°C. Esta etapa de incubación rápida también puede ser apropiada durante la reconstitución de un producto combinado que comprenda el polipéptido recombinante y el FVIII mezclado en una única composición.

La concentración de Factor VIII en la composición utilizada está típicamente en el intervalo de 10-10,000 IU/ml. En diferentes realizaciones, la concentración de FVIII en las composiciones de la invención está en el intervalo de 10 8.000 IU/ml, o 10-5.000 IU/ml, o 20-3.000 IU/ml, o 50-1.500 IU/ml, o 3.000 IU/ml, o 2.500 IU/ml, o 2,000 IU/ml, o 1.500 IU/ml, o 1.200 IU/ml, o 1.000 IU/ml, o 800 IU/ml, o 750 IU/ml, o 600 IU/ml, o 500 IU/ml, o 400 IU/ml, o 300 IU/ml, o 250 IU/ml, o 200 IU/ml, o 150 IU/ml, o 125 IU/ml, o 100 IU/ml, o 625 IU/ml, o 50 IU/ml, siempre que se cumplan los requisitos relativos a la relación con respecto al polipéptido VWF de la invención tal como se define en el presente documento.

La "unidad internacional", o "IU", es una unidad de medida de la actividad de coagulación de la sangre (potencia) del FVIII, medida por un ensayo de actividad del FVIII, como un ensayo de coagulación de una etapa o un ensayo de actividad del FVIII con sustrato cromogénico, utilizando un estándar calibrado en "IU" con respecto a una preparación estándar internacional. Los ensayos de coagulación de una etapa son conocidos en la técnica, como el descrito en N Lee, Martin L, et al., An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511 519 (1983). Principio del ensayo de una etapa: La prueba se ejecuta como una versión modificada del ensayo del tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa): La incubación del plasma con fosfolípidos y un activador de superficie conduce a la activación de los factores del sistema intrínseco de coagulación. La adición de iones de calcio desencadena la cascada de coagulación. Se determina el tiempo hasta la formación de un coágulo de fibrina medible. El ensayo se realiza en presencia de plasma deficiente de Factor VIII. La capacidad de coagulación del plasma deficiente se restablece mediante el Factor de Coagulación VIII incluido en la muestra a analizar. El acortamiento del tiempo de coagulación es proporcional a la cantidad de Factor VIII presente en la muestra. La actividad del Factor VIII de la coagulación se cuantifica por comparación directa con una preparación estándar con una actividad conocida del Factor VIII en Unidades Internacionales.

Otro ensayo estándar es un ensayo de sustrato cromogénico. Los ensayos de sustrato cromogénico se pueden adquirir comercialmente, tales como el kit de ensayo Coamatic® FVIII (Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338 - 20128 Milano, Italia). Principio del ensayo cromogénico: En presencia de calcio y fosfolípidos, el Factor X es activado por el Factor IXa a Factor Xa. Esta reacción es estimulada por factor Villa como cofactor. La FVIIIa está formada por bajas cantidades de trombina en la mezcla de reacción del FVIII en la muestra que se va a medir. Cuando se usan las concentraciones óptimas de Ca2+, fosfolípido y factor IXa y una cantidad excesiva de factor X, la activación del factor X es proporcional a la potencia del factor VIII. El Factor X activado libera el cromóforo pNA del sustrato cromogénico S-2765. La liberación de pNA, medida a 405 nm, es por lo tanto proporcional a la cantidad de FXa formado y, por lo tanto, también a la actividad del Factor VIII de la muestra.

Composiciones farmacéuticas

Las formulaciones terapéuticas del polipéptido de la invención adecuadas en los procedimientos descritos en el presente documento pueden prepararse para su almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando el polipéptido que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables que se emplean típicamente en la técnica (todos los cuales se denominan aquí "portadores"), es decir, agentes tamponadores, agentes estabilizadores, conservantes, isotonificadores, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos diversos. Véase,Remington's Pharmaceutical Sciences,16ta edición (Osol, ed. 1980). Estos aditivos deben ser no tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas.

Los agentes tamponadores ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden presentarse en concentraciones que van desde unos 2 mM hasta unos 50 mM.

Los agentes de tampón adecuados incluyen tanto ácidos orgánicos como inorgánicos y sales de estos, tales como tampones de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato de monosódico, etc.), tampones de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de hidróxido sódico-ácido succínico, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato sódico, mezcla de ácido tartáricotartrato potásico, mezcla de ácido tartárico-hidróxido sódico, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disodico, mezcla de fumarato monosódicofumarato disódico, etc.) tampones de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gluconato sódico, mezcla de ácido glucónico-hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico-gluconato potásico etc.), tampón de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato sódico, mezcla de ácido oxálico-hidróxido sódico, mezcla de ácido oxálico-oxalato potásico, etc.), tampones de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato sódico, mezcla de ácido lácticohidróxido sódico, mezcla de ácido láctico-lactato potásico, etc.) y tampones de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido sódico, etc.). Adicionalmente, se pueden usar tampones fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina, tales como Tris.

Pueden añadirse conservantes para retardar el crecimiento microbiano, y pueden añadirse en cantidades que oscilan entre el 0,2% y el 1% (p/v). Entre los conservantes adecuados se encuentran el fenol, el alcohol bencílico, el metacresol, el metilparabeno, el propilparabeno, el cloruro de octadecildimetilbencilamonio, los haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), el cloruro de hexametonio y los alquilparabenos como el metilparabeno o el propilparabeno, el catecol, el resorcinol, el ciclohexanol y el 3-pentanol. Para garantizar la isotonicidad de las composiciones líquidas pueden añadirse isotonificadores, a veces conocidos como "estabilizadores", que incluyen alcoholes de azúcares polihídricos, preferentemente trihídricos o superiores, como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizadores se refieren a una amplia categoría de excipientes cuya función puede variar desde un agente de volumen hasta un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a evitar la desnaturalización o la adherencia a la pared del envase. Los estabilizadores típicos pueden ser alcoholes polihídricos de azúcar (enumerados anteriormente); aminoácidos como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc, azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, como la lactosa, la trehalosa, la estaquiosa, el manitol, el sorbitol, el xilitol, el ribitol, el mioinisitol, el galactitol, el glicerol y similares, incluidos los ciclitoles como el inositol; el polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, como la urea, el glutatión, el ácido tióctico, el tioglicolato de sodio, el tioglicerol, el a-monotioglicerol y el tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, péptidos de 10 residuos o menos); proteínas como la albúmina de suero humano, la albúmina de suero bovino, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como los monosacáridos de polivinilpirrolidona, como la xilosa, la manosa, la fructosa y la glucosa; disacáridos como la lactosa, la maltosa, la sacarosa y los trisacáridos como la rafinosa; y polisacáridos como el dextrano. Los estabilizadores pueden estar presentes en el intervalo de 0,1 a 10.000 pesos por parte de peso de proteína activa.

Pueden añadirse tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger la proteína terapéutica contra la agregación inducida por la agitación, lo que también permite exponer la formulación a la tensión superficial de cizallamiento sin causar la desnaturalización de la proteína. Entre los tensioactivos no iónicos adecuados se encuentran los polisorbatos (20, 80, etc.), los polioxámeros (184, 188, etc.), los polioles plurónicos, los monoéteres de sorbitán polioxilados (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, o en un intervalo de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.

Otros excipientes diversos incluyen agentes de carga (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E) y cosolventes.

La formulación del presente documento también puede contener un segundo agente terapéutico además de un polipéptido de la invención. A continuación se ofrecen ejemplos de segundos agentes terapéuticos adecuados.

El programa de dosificación puede variar desde una vez al mes hasta diariamente, dependiendo de una serie de factores clínicos, incluyendo el tipo de enfermedad, la gravedad de la misma y la sensibilidad del paciente al polipéptido de la invención. En realizaciones específicas, un polipéptido de la invención se administra, dos veces por semana, cada 5 días, una vez por semana, cada 10 días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas o una vez al mes, o en cualquier intervalo entre dos de los valores anteriores, por ejemplo desde cada cuatro semanas hasta cada mes, desde cada 10 días hasta cada dos semanas, o de dos a tres veces por semana, etc.

La dosificación de un polipéptido de la invención que se va a administrar variará según el polipéptido particular, el sujeto y la naturaleza y gravedad de la enfermedad, la condición física del sujeto, el régimen terapéutico (por ejemplo, si se utiliza un segundo agente terapéutico) y la vía de administración seleccionada; la dosificación adecuada puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica.

Un experto en la técnica reconocerá que la cantidad óptima y el espaciamiento de las dosificaciones individuales de un polipéptido de la invención se determinarán por la naturaleza y el alcance de la condición que se está tratando, la forma, la ruta y el sitio de administración, y la edad y la condición del sujeto particular que se está tratando, y que un médico determinará en última instancia las dosificaciones apropiadas que se utilizarán. Estas dosificaciones pueden repetirse tantas veces como sea necesario. Si se producen efectos secundarios, se puede modificar o reducir la cantidad y/o la frecuencia de la dosificación, de acuerdo con la práctica clínica habitual.

La composición farmacéutica se formula preferentemente para ser administrada extravascularmente, preferentemente para ser administrada subcutáneamente.

De acuerdo con cierta realización, la composición farmacéutica comprende como componente activo tanto el polipéptido de la invención como un FVIII, o alternativamente comprende sólo el polipéptido de la invención sin ningún FVIII dependiendo del modo de administración desvelado en la presente memoria.

Los expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en la presente memoria es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos mostradas en el listado de secuencias se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1:

Ciertas realizaciones de la invención se describirán ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que están destinados únicamente a la ilustración y no pretenden limitar el alcance de la generalidad descrita anteriormente.

Ejemplos

Ejemplo 1

Niveles de captación del factor VIII por células dendríticas derivadas de monocitos cuando se tratan con VWF derivado del plasma y VWF truncado recombinante

1.1 Definiciones/Abreviaturas

1.2 Materiales y procedimientos

BIOSTATE (VWF derivado de plasma humano (pd) de CSL Behring)

CSL626 (fusión truncada VWF (764-1242)-albúmina, dímero)

CSL650 (rec. Fusión VWF-albúmina de CSL Behring)

CSL627 (FVIII de cadena simple rec. de CSL Behring)

Advate® (rec. FVIII de Shire)

Helixate® (rec. FVIII de CSL Behring)

ReFacto® (rec. FVIII de Pfizer)

La generación de la proteína de fusión de albúmina D'D3 (D'D3-FP), también especificada en la presente memoria como fusión truncada de VWF-albúmina CSL 626, así como la caracterización de la unión del dímero D'D3-FP al FVIII se ha desvelado en el documento WO 2016/188907 A1. La secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación se muestra como SEQ ID NÚM.: 1, la secuencia de aminoácidos del D'D3-FP maduro se muestra como SEQ ID NÚM.: 2.

El FVIII recombinante de cadena simple suprimido del dominio B, es decir, rVIII-Cadena Simple, que tiene una secuencia de aminoácidos como se define en SEQ ID NÚM.:5.

CSL650 (rec. Fusión VWF-albúmina) tiene una secuencia de aminoácidos como la descrita en el documento WO 2009/156137 A1.

1.3 Captación de FVIII en células dendríticas derivadas de monocitos

Se decantó una capa leucocitaria entera en un tubo falcon de 50 ml y se diluyó 1:2 con PBS estéril (Sigma # D8537, 25 ml de sangre/25 ml de PBS). La sangre se mezcló y se colocó en capas sobre un gradiente de Ficoll, (GE, #17-1440-02) que contenía 15 ml de Ficoll. El gradiente se separó por centrifugación a 1000 * g (aceleración (5); freno (1)), durante 20 minutos. Se recogió la capa central que contenía PBMC y se transfirió a un nuevo tubo de recogida de 50 ml.

A continuación, las células se separaron por centrifugación (1400 rpm) y se lavaron dos veces con 50 ml de PBS estéril, decantando el sobrenadante cada vez. A continuación, el precipitado se resuspendió en cloruro de amonio (10 ml) y se incubó a temperatura ambiente (TA) durante 10 minutos para lisar los glóbulos rojos restantes. Tras la lisis, las células se rellenaron con 40 ml de PBS y se centrifugaron para separar las PBMC restantes. Las células se lavaron una vez más con 50 ml de PBS y se centrifugaron (1200 rpm) para recoger el sedimento celular final. El sedimento celular se resuspendió en 20 ml de PBS y las células se contaron con un hemocitómetro para preparar la purificación de monocitos.

Se tomaron 2*108 PBMC y se granularon por centrifugación (1200 rpm, 10 min, 4°C). El sedimento celular se resuspendió en 1600 pl de tampón de purificación, (PBS pH 7,2, 0,5% BSA (Miltenyi Biotec # 130-091-376), 2 mM EDTA). A continuación, se añadieron microperlas CD14 (Miltenyi Biotec # 130-050-201) a las células (400 pl) y se incubaron durante 15 min a 4°C. Tras la incubación, las células se lavaron con tampón de purificación helado (20 ml) y se volvieron a granular por centrifugación (1200 rpm, 10 min, 4°C). El sobrenadante se aspiró completamente y se resuspendió con tampón de purificación helado (500 pl).

Las células se pasaron por un colador celular de 70 pm para eliminar las células grumosas y luego se añadieron directamente a una columna MACS LS equilibrada (Miltenyi Biotec # 130-041-401). La columna se lavó 3 veces con 3 ml de tampón de purificación para eliminar las células no unidas. A continuación, se retiró la columna MACS del imán y se añadieron 5 ml de tampón de purificación a la columna. Las células se decantaron por presión a través de una jeringa y se granularon por centrifugación (1200 rpm, 5 min).

Las células se resuspendieron en medio de crecimiento completo, (RPMI 1640 (Sigma #R0883) suplementado con 10% FBS (GE #SV30176.03), 50 U/ml de Penicilina y 50 pg/ml de Estreptomicina (Pen-Strep, Gibco #15070-63), 2 mM de Glutamax (Gibco #35050) y se contaron. Las células se colocaron en una placa de Petri (1*107 células/placa) y se añadieron citocinas a las células para inducir la diferenciación (500 UI de IL-4/106 células, 1000 UI de GM-CSF/106 células, R&D Systems, 204-IL-010/CF/215-GM-050/CF). Las placas se dejaron incubar a 37°C, CO25%. El tercer día, las células se rellenaron con citocinas en 5 ml de medio completo fresco (500 UI de IL-4/106 células, 1000 UI de GM-CSF/106 células).

Después del día 5 las células cultivadas fueron removidas de cada placa y peletizadas por centrifugación, (1200 rpm, 10 min). A continuación, las células se lavaron una vez con medio XVIVO precalentado (LONZA n° 04-743Q), se resuspendieron en medio XVIVO (2 ml) y se contaron. Las células se caracterizaron por citometría de flujo para la expresión de CD14 (BD Biosciences CD14-V450, #560349), CD40 (BD Biosciences, CD40-PE, #555589), CD86 (BD Biosciences, CD86-PE, #555658) y HLA-DR (BD Biosciences, HLA-DR-PE, #347401). A continuación, las células se sembraron en una placa de fondo redondo de 96 pocillos (2,5*105 células/pocillo). Las células preparadas para el análisis a 37°C se colocaron en una incubadora (37°C, CO25%), y las placas que se utilizarían como control de referencia a 4°C se colocaron en hielo.

Las proteínas VWF se diluyeron en un volumen de 50 pl y se añadieron a los pocillos. Las diluciones se hicieron para alcanzar concentraciones finales de 2222 nM, 1111 nM, 555,5 nM y 0 nM para pdVWF y CSL650, basadas en la subunidad monomérica, y 4444 nM, 2222 nM y 1111 nM para CSL626 basadas en la subunidad monomérica. Tras una preincubación de 10 minutos de las proteínas VWF, se diluyeron también las proteínas FVIII (88,88 nM final) y se añadieron a cada pocillo correspondiente. Las placas se dejaron incubar durante 2 horas para permitir la absorción del factor VIII.

Tras la incubación, se centrifugaron las placas para separar las células (1200 rpm, 5 min) y se desechó el sobrenadante. Los pocillos se lavaron dos veces con tampón FACS, (PBS 2% FBS, GE #SV30176.03) y luego se resuspendieron en 100 pl de Intrapep Reagent 2 (Beckman Coulter, #IM2389) para fijar las células. Las células se dejaron fijar a temperatura ambiente durante 15 minutos, después se centrifugaron (1.200 rpm, 5 min) y se desechó el sobrenadante. Las células se lavaron con 200 pl de tampón FACS y se resuspendieron con 100 pl de reactivo Intrapep 2 (Beckman Coulter, #IM2389) para permeabilizarlas. Las células se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos y, a continuación, se trataron con 10 pg/ml de anticuerpo anti-factor VIII A2 (Thermo Fisher #MA1-27389) durante 15 minutos. A continuación, las células se precipitaron, se lavaron con un lavado FACS y se tiñeron con un anticuerpo secundario (Jackson #115-115-164, Anti-mouse IgG, 50 pl, dilución 1:100) durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Tras la incubación, las células se lavaron dos veces con tampón FACS y se analizaron mediante citometría de flujo.

1.4 Análisis de datos

Usando flowjo, las células fueron separadas en MDDC individuales por FSC y SSC, un cuadrante de base fue fijado en MDDC no tratados con Factor VIII o VWF. La migración positiva por encima del cuadrante de referencia se representó en porcentaje y los valores finales se determinaron restando la captación a 4 °C para tratamientos equivalentes. El porcentaje final de migración se representó gráficamente utilizando el prisma frente a la proporción correspondiente de captación de VWF.

1.5 Resultados

El fenotipado de los marcadores de superficie de las MDDC mostró una tinción negativa para CD14 y tinciones positivas para CD40, HLA-DR y CD86 (Figura 1).

Las Figuras 2 y 3 muestran el porcentaje de captación de factor VIII en MDDC. Se evaluó la captación de tres proteínas FVIII disponibles comercialmente (Advate®,Helixate® yRefacto®) y rec scFVIII (CSL 627) en presencia del producto pdVWF Biostate, la fusión truncada VWF-albúmina CSL 626 y la fusión recvWF-albúmina CSL 650 de longitud completa. Diferentes proporciones molares de VWF : FVIII. Las concentraciones de VWF se refieren a la subunidad monomérica para los diferentes productos de VWF. La captación del factor VIII se evaluó en ausencia de VWF (proporción molar de VWF : FVIII = 0) hasta un exceso molar de 25 veces del producto pdVWF Biostate y de la fusión recvWF-albúmina de longitud completa CSL 650 y hasta un exceso molar de 50 veces de la fusión VWF-albúmina truncada CSL 626.

La Figura 2 muestra los resultados en tres paneles individuales para el producto pdVWF Biostate (a), la fusión truncada VWF-albúmina CSL 626 (b) y la fusión de longitud completa recvWF-albúmina CSL 650 (c). Los resultados de tres proteínas comerciales de FVIII (Advate®,Helixate® y Refacto®) y rec scFVIII (CSL 627) se representan por separado en cada panel. La Figura 3 representa los datos de la figura 2 en una disposición diferente. Cuatro paneles individuales para Advate® (a), CSL 627 (b),Helixate® (c) y Refacto® (d) muestran los resultados de la captación de FVIII en MDDC en presencia de proporciones molares crecientes de VWF : FVIII. En cada panel se representan por separado el producto Biostate pdVWF, la fusión VWF-albúmina truncada CSL 626 y los resultados de la fusión recvWF-albúmina de longitud completa CSL 650.

La captación de FVIII en los MDDC se redujo para todas las proteínas del factor VIII cuando la proporción molar de VWF : El FVIII se incrementó utilizando el producto pdVWF Biostate, la fusión truncada VWF-albúmina CSL 626, así como la fusión recvWF-albúmina CSL 650 de longitud completa.

La Figura 4 muestra el porcentaje normalizado de captación de factor VIII en MDDC basado en los datos mostrados en la Figura 2. Tres paneles individuales para el producto pdVWF Biostate (a), la fusión truncada VWF-albúmina CSL 626 (b) y la fusión completa recvWF-albúmina CSL 650 (c) muestran los resultados de tres proteínas comerciales FVIII (Advate®,Helixate® y Refacto®) y rec scFVIII (CSL 627) por separado. Los datos se representaron gráficamente frente a la concentración molar de VWF. Las concentraciones de VWF se refieren a la subunidad monomérica para los diferentes productos de VWF. Los datos se normalizaron para cada experimento individual. Los experimentos se realizaron por triplicado (a) o cuadruplicado (b) y (c), respectivamente. La lectura en ausencia de VWF (0 nM) se definió como 100% y la lectura en presencia de la concentración más alta de VWF (2222 nM o 4444 nM) se definió con 0% para cada experimento individual. Tras la normalización, se excluyeron los valores negativos y los valores atípicos. Las curvas se ajustaron con el programa GraphPad Prism (log(inhibidor) frente a respuesta - Pendiente variable, cuatro parámetros, ajuste ordinario por mínimos cuadrados) y se calcularon los valores IC50. A partir de estas curvas ajustadas, se han calculado los valores IC50 para los respectivos productos VWF, que se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2: Valores IC50 calculados de las proteínas VWF para la inhibición de la captación del factor VIII en MDDC

La Tabla 2 muestra los valores IC<50>calculados para la inhibición de la captación del factor VIII en MDDC. Los valores IC50 para cada producto FVIII, Advate®, CSL 627, Helixate®y Refacto®, se calcularon por separado para las tres proteínas VWF diferentes pdVWF/Biostate, CSL 626 y CSL 650 (Figura 4). También se calculó la media y la desviación estándar de IC<50>para todo el FVIII por separado para tres proteínas VWF diferentes. El IC<50>para todos los productos FVIII probados en presencia de la fusión truncada VWF-albúmina CSL 626 sólo aumentó moderadamente en comparación con el producto pdVWF Biostate y la fusión de longitud completa recvWF-albúmina CSL 650.

Los resultados mostrados en la Figura 2, en la Figura 3 y en la Tabla 2 demuestran que el pdVWF, el rec VWF de longitud completa, pero sorprendentemente también el VWF truncado fusión albúmina CSL 626 fue capaz de inhibir la endocitosis de diferentes productos de FVIII en células dendríticas de monocitos a tasas similares. Las concentraciones crecientes de VWF mostraron un aumento en la reducción de la captación de FVIII tanto para los productos de FVIII de longitud completa como para los de BDD.

Notablemente, el valor IC50 para la fusión de albúmina VWF truncada CSL 626 probada se compara al menos de manera similar con los valores IC50 de los productos VWF de longitud completa probados.

Dado que la captación del FVIII por las células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas de monocitos, es la primera etapa de una reacción inmunitaria contra el FVIII administrado, los resultados demuestran una reducción de la inmunidad al FVIII mediante la administración de la fusión truncada de VWF-albúmina CSL 626 que está presente como dímero. La reducción cuantitativa de la captación celular mediada por CSL 626 en comparación con los productos de VWF de longitud completa es sorprendentemente fuerte.

Ejemplo 2

Presentación del antígeno del factor VIII por células dendríticas derivadas de monocitos cuando se tratan con VWF derivado del plasma y VWF truncado recombinante

2.1 Definiciones/Abreviaturas

2.2 Materiales y procedimientos

Factor von Willebrand derivado del plasma (pdVWF): La fuente de pdVWF es el plasma humano. El FVIII residual derivado del plasma unido al pdVWF se separó del concentrado intermedio mediante una etapa de cromatografía de exclusión por tamaño (HiPrep Sephacryl S500, GE Healthcare) utilizando un tampón HEPES que contenía 400 nM de calcio (Josica D. et al. Journal of Chromatography (1998); 796(2), p. 289-298).

CSL627 (rec. FVIII de cadena simple de CSL Behring): es un FVIII recombinante de cadena simple suprimido del dominio B, es decir, rVIII-Cadena Sencilla, que tiene una secuencia de aminoácidos como se define en SEQ ID NÚM.:5. CSL626 (fusión truncada de VWF (764-1242)-albúmina, dímero) se utilizó como se describe en el Ejemplo 1. Se utilizó una variante de CSL626 con una mayor afinidad de unión al FVIII con sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre del VWF, en referencia a la numeración de secuencia de SEQ ID NÚM.:4, siendo la sustitución S764E/S766Y/V1083A. Esta variante D'D3-FP también se denomina EYA-FP en el ejemplo 2.

2.3 Ensayo de presentación del antígeno ProPresent

El ensayo ProPresent fue realizado por Proimmune (Oxford, Reino Unido) para identificar péptidos CSL627 y pdVWF, CSL626 o EYA-FP únicos unidos a moléculas HLA en células dendríticas derivadas de monocitos (MODC) tras la captación y procesamiento del antígeno. Los antígenos de prueba (CSL627, pdVWF, CSL626 y EYA-FP) fueron preparados por nosotros.

Brevemente, PBMC de 12 a 24 donantes sanos no emparentados con tipificación HLA (tabla 3-5) fueron purificadas de sangre entera por centrifugación en gradiente de densidad. Las DC inmaduras derivadas de monocitos (MODC) se generaron in vitro y maduraron en presencia de 146,4 nM de CSL627 solamente o en presencia de 146,4 nM de CSL627 precomplejado con 1,9667 pM de pdVWF, CSL626 o EYA-FP (las concentraciones molares se calcularon en función del contenido de monómero). La maduración de las MODC se monitoriza mediante citometría de flujo a través de la regulación al alza de CD209, CD86 y HLA-DR. Las MODC se cosecharon y lavaron antes de la lisis en una solución tampón que contenía detergente. Las moléculas HLA se recuperaron en una etapa específica de inmunoafinidad. A continuación, se eluyeron los péptidos de los complejos HLA purificados y se procesaron para su posterior análisis. Las muestras de péptidos se analizaron posteriormente mediante espectrometría de masas de secuenciación de alta resolución (LC-MS/MS), véase la Figura 5. A continuación, los datos resultantes se compilaron y analizaron mediante un programa informático de análisis de secuencias que hacía referencia a la base de datos Uniprot Swiss-Prot Complete Human Proteome Database con las secuencias de antígenos de prueba incorporadas, así como péptidos derivados de seis proteínas de control endógenas, Proteína de membrana asociada al lisosoma 1 (LAMP-1), Proteína de membrana asociada al lisosoma 3 (LAMP-3), Receptor de transferrina (TFRC), Receptor de IgE de baja afinidad y receptores de unión Fc gamma (FcER2/FcGR2), Apolipoproteína B (ApoB) e Integrina a-M (ITGAM). El péptido de cadena invariante asociado al MHC de clase II (CLIP) está regulado a la baja y puede no detectarse en las MODC totalmente maduras. La identificación de las secuencias peptídicas por LC-MS/MS se basó en algoritmos de puntuación y en la determinación de la significación estadística. La probabilidad de que los péptidos sean identidades reales se describe mediante sus valores esperados. (Xue L, Clin Exp Immunol. (2016);183(1):102-13, Leone DA J Immunol (2017), 199 (2) 531-546, Lamberth et al., Sci. Transl. Med. 9, eaag1286 (2017)). La Figura 5 muestra el flujo de trabajo de Prolmmune del ensayo de presentaciones de antígenos MHC de clase II ProPresent® : (A) Monocitos aislados de PBMC con HLA, (B) Cultivo de monocitos y generación de células dendríticas inmaduras, (C) Carga de antígeno (CSL627, pdVWF), procesamiento intracelular, maduración de células dendríticas y presentación de antígeno (D) Lisis de células dendríticas, (E) Aislamiento de complejos péptido / MHC clase II por inmunoafinidad y elución de péptidos, (F) Secuenciación de péptidos por LC-MS2 (adaptado de la página de inicio de ProlmmuneProPresent®).

2.4 Análisis de datos

Todos los péptidos identificados se agrupan y alinean para cada donante. Un grupo de péptidos superpuestos incrustados en una alineación define un grupo de péptidos en una determinada posición de aminoácidos de las proteínas analizadas. Los péptidos centrales de los grupos de péptidos identificados se predicen utilizando NetMHClI 3.1. El péptido central con la mayor afinidad de unión prevista se utiliza para indicar la ubicación de ese grupo peptídico específico. El número de todos los grupos de péptidos en un conjunto de donantes se utiliza para cuantificar la eficacia de la presentación del antígeno y como puntuación de la inmunogenicidad potencial, respectivamente, para una proteína de prueba correspondiente. El recuento total de péptidos únicos en todos los grupos de péptidos de cada donante también se tiene en cuenta para cuantificar la fuerza de presentación del antígeno (véase el ejemplo a continuación).

Ejemplo de análisis de datos:

1 = Alineación de péptidos solapados (2 - 13, n = 12 péptidos únicos) con la secuencia de aminoácidos de CSL627, pdVWF, CSL626 o eYA-FP; los índices de aminoácidos indican posiciones ejemplificadas en la secuencia de aminoácidos ingenua.

2-7 = Ejemplo de grupo peptídico presentado por MODC del donante X: 6 péptidos únicos superpuestos se asignan a la misma región dentro de la secuencia de aminoácidos de CSL627, pdVWF, CSL626 o EYA-FP.

8-13 = Ejemplo de grupo peptídico presentado por MODC del donante Y: 5 péptidos únicos superpuestos se asignan a la misma región dentro de la secuencia de aminoácidos de CSL627, pdVWF, CSL626 o EYA-FP.

14 = Secuencia peptídica central (9-mer) basada en la secuencia 1 (Alineación de péptidos detectados) predicha por NetMHClI 3.1

El número de péptidos únicos unidos a HLA-DR de un respectivo grupo de péptidos restringidos a HLA-DR se analiza adicionalmente para comparar la presentación de antígeno de CSL627 en presencia y ausencia de pdVWF, CSL626 o EYA-FP. Los números de péptidos únicos unidos a HLA-DR por grupo de péptidos restringidos a HLA-DR se ilustran en un gráfico X-Y. En el eje X, todos los grupos de péptidos con restricción HLA-DR identificados con su número respectivo de péptidos únicos unidos a HLA-DR como resultado de la presentación del antígeno CSL627 en ausencia de pdVWF, CSL626 y EYA-FP se comparan con todos los grupos de péptidos con restricción HLA-DR identificados con su número respectivo de péptidos únicos unidos a HLA-DR como resultado de la presentación del antígeno CSL627 en presencia de pdVWF, CSL626 y EYA-FP en el eje Y. Se realizó una regresión lineal simple (Microsoft Excel) para comparar la eficiencia de presentación del antígeno CSL627 por HLA-DR de los MODC.

2.5 Selección de donantes

Se seleccionó un panel de muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes humanos sanos del banco de células de Prolmmune. Cada muestra de PBMC fue tipificada HLA (Human Leukocyte Antigen) y criopreservada en nitrógeno líquido (fase vapor) antes de su uso. El panel se seleccionó de tal forma que los alelos HLA de clase II conocidos por su alta expresión en la población mundial estuvieran bien representados. Los paneles de donantes establecidos y su información de tipificación HLA-DRB1 o HLA-DRB1/DQB1/DPB1 se enumeran en las tablas siguientes.

Tabla 3:Conjunto de donantes A Información de tipificación HLA-DRB1, -DQB1, -DPB1

Tabla 4:Información de tipificación HLA-DRB1 del conjunto de donantes B

Tabla 5:Conjunto de donantes C Información de tipificación HLA-DRB1

2.6.1 Resultados

MHC clase II Presentación del antígeno CSL627 por MODC en presencia y ausencia de pdVWF

La detección de proteínas endógenas por espectrometría de masas de secuenciación (LAMP-1, LAMP-2, TFRC, FcER2/FcGR2, ApoB, ITGAM, CLIP) y el seguimiento por citometría de flujo del marcador de superficie de DC (CD209, CD86, HLA-DR) se consideraron aceptables para generar datos de muestra robustos.

Tabla 6:Número de grupos de péptidos

La Tabla 6 resume los datos generados por los ensayos de presentación de antígeno ProPresent® de Prolmmune con tres paneles independientes A, B y C de en total 36 donantes sanos, no emparentados, con HLA-DRB1- y HLA-DRB1/DQB1/DPB1 como fuente de PBMC. Las DC inmaduras se cargaron con 146,4 nM de CSL627 solamente o con 146,4 nM de CSL627 precomplejado con 1,9667 pM de pdVWF de acuerdo con el contenido de monómeros. La presentación del antígeno CSL627 en ausencia de pdVWF y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 38,0 ± 7,1 grupos de péptidos HLA-DRB1 en dos paneles independientes de donantes. La presentación del antígeno CSL627 en presencia de pdVWF y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 14,5 ± 0,7 grupos de péptidos HLA-DRB1 en dos paneles independientes de donantes. pdVWF fue capaz de reducir la presentación del antígeno CSL627 restringida por HLA-DRB1 basándose en el número de grupos de péptidos identificados de 2,2 a 3,0 veces. CSL627 La presentación de antígenos en presencia de pdVWF se redujo 10 veces de acuerdo con los grupos de péptidos restringidos HLA-DQB1 identificados y 3,5 veces de acuerdo con los grupos de péptidos restringidos HLA-DQB1 identificados utilizando un panel de donantes con el tipo HLA-DRB1/DQB1/DPB1.

Aproximadamente el 50-70 % de los grupos de péptidos CSL627 estaban restringidos a HLA-DRB1 y aproximadamente el 30-50 % de los grupos de péptidos CSL627 estaban presentados por HLA-DQB1 y HLA-DPB1.

Mientras que el número de grupos de péptidos derivados de CSL627 y restringidos a HLA-DRB1-, HLA-DQB1- y HLA-DPB1 disminuyó o algunos incluso desaparecieron en presencia de pdVWF, no se detectó ningún grupo adicional o nuevo de péptidos derivados de CSL627 y restringidos a HLA-DRB1-, HLA-DQB1- y HLA-DPB1- y no se detectó ningún grupo peptídico derivado de CSL627 ni ningún grupo peptídico derivado de HLA-DRB1-, HLA-DQB1- y HLA-DPB1- en comparación con las secuencias de grupo peptídico derivadas de la presentación del antígeno CSL627 sin pdVWF.

La presentación de antígeno de pdVWF en presencia o ausencia de CSL627 se investigó en un panel de donantes con tipificación HLA-DRB1/DQB1/DPB1 y un segundo panel independiente de donantes con tipificación HLA-DRB1.

Se investigó la presentación antigénica de pdVWF en ausencia de CSL627 en un panel de donantes con tipificación HLA-DRB1. Se investigó la presentación de antígeno de pdVWF en presencia de CSL627 en ambos paneles, donantes tipificados HLA-DRB1/DQB1/DPB1 y donantes tipificados HLA-<d>R<b>1. La presentación de antígeno de pdVWF en presencia de CSL627 y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 13.0 ± 5,7 grupos de péptidos HLA-DRB1 en dos paneles independientes de donantes, mientras que la presentación del antígeno pdVWF en ausencia de CSL627 identificó 17 grupos de péptidos HLA-DRB1 en un panel de donantes.

La reducción múltiple de la presentación de antígeno de CSL627 basada en el número de grupos de péptidos en presencia de exceso molar de pdVWF puede estar sesgada por la carga abundante de proteína pdVWF. Sin embargo, la presentación del antígeno pdVWF no se vio influida por la presencia o ausencia de CSL627. Teniendo en cuenta el exceso de carga molar de pdVWF en comparación con la carga proteica de CSL627, la presentación del antígeno de pdVWF fue menos eficaz que la de CSL627. No puede excluirse una inhibición de la presentación del antígeno CSL627 a través de un exceso de péptidos competidores derivados del pdVWF, pero también se había producido un aumento de la presentación del antígeno del pdVWF cuando las DC se cargaron únicamente con pdVWF.

Tabla 7:Número de péptidos únicos

La Tabla 7 resume los datos generados por los ensayos de presentación de antígeno ProPresent® de Prolmmune con tres paneles independientes A, B y C de en total 36 donantes sanos, no emparentados, con HLA-DRB1- y HLA-DRB1/DQB1/DPB1 como fuente de PBMC. Las DC inmaduras se cargaron con 146,4 nM de CSL627 solamente o con 146,4 nM de CSL627 precomplejado con 1,9667 pM de pdVWF de acuerdo con el contenido de monómeros. La presentación del antígeno CSL627 en ausencia de pdVWF y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 1035 ± 99 péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 en dos paneles independientes de donantes. La presentación de antígeno CSL627 en presencia de pdVWF y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 192 ± 9,9 péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 en dos paneles independientes de donantes. pdVWF fue capaz de reducir la presentación de antígeno CSL627 restringida a HLA-DRB1 basada en el número de péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 de 4,8 a 6,0 veces. CSL627 La presentación de antígenos en presencia de pdVWF se redujo 21,7 veces en función de los péptidos únicos identificados unidos a HLA-DQB1 y 14,2 veces en función de los péptidos únicos identificados unidos a HLA-DPB1 utilizando un panel de donantes con el tipo HLA-DRB1/DQB1/DPB1. Aproximadamente el 80% de los péptidos únicos derivados de CSL627 estaban restringidos a HLA-DRB1 y aproximadamente el 20% de los péptidos únicos derivados de CSL627 estaban presentados por HLA-DQB1 y HLA-DPB1.

Se investigó la presentación antigénica de pdVWF en ausencia de CSL627 en un panel de donantes con tipificación HLA-DRB1. Se investigó la presentación de antígeno de pdVWF en presencia de CSL627 en ambos paneles, donantes tipificados HLA-DRB1/DQB1/DPB1 y donantes tipificados HLA-DRB1. La presentación de antígeno de pdVWF en presencia de CSL627 y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 39.0 ± 28,3 péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 en dos paneles independientes de donantes, mientras que la presentación del antígeno pdVWF en ausencia de CSL627 identificó 60 péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 en un panel de donantes.

La reducción múltiple de la presentación de antígeno de CSL627 basada en el número de péptidos únicos en presencia de exceso molar de pdVWF puede estar sesgada por la carga abundante de proteína pdVWF. Sin embargo, la presentación del antígeno pdVWF no se vio influida por la presencia o ausencia de CSL627. Teniendo en cuenta el exceso de carga molar de pdVWF en comparación con la carga proteica de CSL627, la presentación del antígeno de pdVWF fue menos eficaz que la de CSL627. Sólo aproximadamente el 25 % de los péptidos únicos identificados eran derivados de pdVWF cuando se cargaron con CSL627 a DCs. No puede excluirse una inhibición de la presentación del antígeno CSL627 a través de un exceso de péptidos competidores derivados del pdVWF, pero también se había producido un aumento de la presentación del antígeno del pdVWF cuando las DC se cargaron únicamente con pdVWF.

La Figura 6 muestra una comparación de la presentación del antígeno ProlmmuneProPresent® de CSL627 en presencia y ausencia de pdVWF. Cada punto de datos representa un grupo de péptidos restringido a HLA-DR. El número de péptidos únicos HLA-DR derivados de CSL627 de grupos de péptidos restringidos HLA-DR se representó gráficamente en ausencia (eje X) y presencia (eje Y) de pdVWF. Gráfico X-Y, regresión lineal (MS Excel).

La Figura 6 ilustra los ensayos de presentación de antígeno Prolmmune ProPresent® con tres paneles independientes A, B y C de en total 36 donantes sanos, no emparentados, con HLA-DRB1- y HLA-DRB1/DQB1/DPB1- como fuente de PBMCs. Las DC inmaduras se cargaron con 146,4 nM de CSL627 solamente o con 146,4 nM de CSL627 precomplejado con 1,9667 pM de pdVWF de acuerdo con el contenido de monómeros.

Vis-á-vis el número total de péptidos únicos unidos a HLA-DRB1, derivados de CSL627 de cada grupo de péptidos se redujo en presencia de VWF. Se identificaron varios grupos de péptidos cuando las DC se cargaron con CSL627 sin pdVWF, pero algunos grupos de péptidos derivados de CSL627 desaparecieron en presencia de pdVWF (Tablas 4 y 5). Ningún grupo de péptidos fue más eficiente presentado en base al número de péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 cuando se probó CSL627 en presencia de pdVWF en comparación con CSL627 sin pdVWF.

La regresión lineal correlaciona los datos con una pendiente de 0,22*X (R2 = 0,73). En presencia de pdVWF, la presentación del antígeno CSL627 es aproximadamente una quinta parte (aprox. 22%) de la eficacia de presentación del antígeno CSL627 en ausencia de pdVWF.

2.6.2 Resultados

MHC clase II Presentación de antígeno CSL627 por MODC en presencia y ausencia de CSL626

Tabla 8:Número de grupos de péptidos

La Tabla 8 resume los datos generados por los ensayos de presentación de antígenoProPresent® de Prolmmune con dos paneles independientes A y B de 24 donantes sanos, no emparentados, con tipificación HLA-DRB1 como fuente de PBMC. Las DC inmaduras se cargaron con 146,4 nM de CSL627 solamente o con 146,4 nM de CSL627 precomplejado con 1,9667 pM de CSL626 de acuerdo con el contenido de monómero. La presentación del antígeno CSL627 en ausencia de CSL626 y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 38,0 ± 7,1 grupos de péptidos HLA-DRB1 en dos paneles independientes de donantes. La presentación del antígeno CSL627 en presencia de CSL626 y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 20 agrupaciones de péptidos HLA-DRB1 en dos paneles independientes de donantes. CSL626 fue capaz de reducir CSL627 la presentación de antígeno restringido HLA-DRB1 basado en el número de grupos de péptidos identificados de 1,55 a 2,55 veces.

Aunque el número de agrupaciones de péptidos derivados de CSL627 y restringidos por HLA-DRB1 disminuyó o algunos incluso desaparecieron en presencia de CSL626, no se detectó ninguna agrupación de péptidos derivada de CSL627 y restringida por HLA-DRB1 adicional o nueva y ninguna agrupación de péptidos derivada de CSL627 y restringida por HLA-DRB1 aumentó en comparación con las secuencias de agrupaciones de péptidos derivadas de la presentación de antígeno CSL627 sin CSL626.

Se investigó la presentación de antígeno de CSL626 en presencia y ausencia de CSL627 en un panel de 12 donantes con tipificación HLA-DRB1. La presentación del antígeno CSL626 en presencia de CSL627 y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 3 grupos de péptidos HLA-DRB1 en 12 donantes sanos no emparentados, mientras que la presentación del antígeno CSL626 en ausencia de CSL627 identificó 2 grupos de péptidos HLA-DRB1 en el mismo conjunto de donantes.

La reducción de la presentación de antígeno de CSL627 basada en el número de grupos de péptidos en presencia de exceso molar de CSL626 puede estar sesgada por la carga abundante de proteína CSL626. Sin embargo, la presentación del antígeno CSL626 no se vio influida significativamente por la presencia o ausencia de CSL627. Teniendo en cuenta el exceso de carga molar de CSL626 en comparación con la carga proteica de CSL627, la presentación del antígeno de CSL626 fue menos eficaz que la de CSL627. No puede excluirse una inhibición de la presentación del antígeno CSL627 a través de un exceso de péptidos competidores derivados de CSL626, pero también se había producido un aumento de la presentación del antígeno CSL626 cuando las DC se cargaron únicamente con CSL626.

Tabla 9:Número de péptidos únicos

La Tabla 9 resume los datos generados por los ensayos de presentación de antígeno ProPresent® de Prolmmune con dos paneles independientes A y B de 24 donantes sanos, no emparentados, con tipificación HLA-DRB1 como fuente de PBMC. Las DC inmaduras se cargaron con 146,4 nM de CSL627 solamente o con 146,4 nM de CSL627 precomplejado con 1,9667 pM de CSL626 de acuerdo con el contenido de monómero. La presentación del antígeno CSL627 en ausencia de CSL626 y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 1035 ± 99 péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 en dos paneles independientes de donantes. La presentación del antígeno CSL627 en presencia de CSL626 y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 212 péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 en un conjunto de 12 donantes. CSL626 fue capaz de reducir CSL627 la presentación de antígenos restringida por HLA-DRB1 basándose en el número de péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 de 4,4 a 5,4 veces.

Se investigó la presentación antigénica de CSL626 en presencia y ausencia de CSL627 en un panel de donantes con tipificación HLA-DRB1. La presentación del antígeno CSL626 en presencia de CSL627 y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 24 péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 en 12 donantes sanos no emparentados, mientras que la presentación del antígeno CSL626 en ausencia de CSL627 identificó 28 péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 en el mismo conjunto de donantes.

La reducción múltiple de la presentación de antígeno de CSL627 basada en el número de péptidos únicos en presencia de un exceso molar de CSL626 puede estar sesgada por una carga abundante de proteína CSL626. Sin embargo, la presentación del antígeno CSL626 no se vio influida por la presencia o ausencia de CSL627. Teniendo en cuenta el exceso de carga molar de CSL626 en comparación con la carga proteica de CSL627, la presentación del antígeno de CSL626 fue menos eficaz que la de CSL627. Sólo aproximadamente el 10 % de los péptidos únicos identificados eran derivados de CSL626 cuando se cargaron con CSL627 a DCs. No puede excluirse una inhibición de la presentación del antígeno CSL627 a través de un exceso de péptidos competidores derivados de CSL626, pero también se había producido un aumento significativo de la presentación del antígeno CSL626 cuando las DC se cargaron únicamente con CSL626.

La Figura 7 muestra una comparación de la presentación del antígeno ProlmmuneProPresent® de CSL627 en presencia y ausencia de CSL626. Cada punto de datos representa un grupo de péptidos restringido a HLA-DR. El número de péptidos únicos unidos al HLA-DR derivados de CSL627 de grupos de péptidos restringidos al HLA-DR se representó gráficamente en ausencia (eje X) y presencia (eje Y) de CSL626. Gráfico X-Y, regresión lineal (MS Excel).

La Figura 7 ilustra los ensayos de presentación de antígeno Prolmmune ProPresent® con dos paneles independientes A y B de 24 donantes sanos, no emparentados, con tipificación HLA-DRB1 como fuente de PBMC. Las DC inmaduras se cargaron con 146,4 nM de CSL627 solamente o con 146,4 nM de CSL627 precomplejado con 1,9667 pM de CSL626 de acuerdo con el contenido de monómero.

Vis-á-vis el número total de péptidos únicos unidos a HLA-DRB1, derivados de CSL627 de cada grupo de péptidos se redujo en presencia de CSL626. Se identificaron varios grupos de péptidos cuando las DC se cargaron con CSL627 sin CSL626, pero algunos grupos de péptidos derivados de CSL627 desaparecieron en presencia de CSL626 (Tablas 6 y 7). Ningún grupo de péptidos fue más eficiente presentado en base al número de péptidos únicos unidos a HLA-d Rb 1 cuando se probó CSL627 en presencia de CSL626 en comparación con CSL627 sin CSL626.

La regresión lineal correlaciona los datos con una pendiente de 0,25*X (R2 = 0,66). En presencia de CSL626, la presentación del antígeno CSL627 es aproximadamente una cuarta parte (aprox. 25%) de la eficacia de presentación del antígeno CSL627 en ausencia de CSL626.

2.6.3 Resultados

MHC clase II Presentación del antígeno CSL627 por MODC en presencia y ausencia de EYA-FP

Tabla 10: Número de grupos de péptidos

La Tabla 10 resume los datos generados por los ensayos de presentación de antígenos ProPresent® de Prolmmune con dos paneles independientes A y B de 24 donantes sanos, no emparentados, con tipificación HLA-DRB1 como fuente de PBMC. Las DC inmaduras se cargaron con 146,4 nM de<c>S<l>627 solamente o con 146,4 nM de CSL627 precomplejado con 1,9667 pM de EYA-FP de acuerdo con el contenido de monómeros. La presentación del antígeno CSL627 en ausencia de<e>YA-FP y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 38,0 ± 7,1 grupos de péptidos HLA-DRB1 en dos paneles independientes de donantes. La presentación del antígeno CSL627 en presencia de EYA-FP y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 15 grupos de péptidos HLA-DRB1 en dos paneles independientes de donantes. EYA-FP fue capaz de reducir la presentación del antígeno CSL627 restringido HLA-DRB1 basado en el número de grupos de péptidos identificados de 2,1 a 3,0 veces.

Aunque el número de agrupaciones peptídicas derivadas de CSL627 y restringidas por HLA-DRB1 disminuyó o algunas incluso desaparecieron en presencia de EYA-FP, no se detectó ninguna agrupación peptídica adicional o nueva derivada de CSL627 y restringida por HLA-DRB1 y ninguna agrupación peptídica derivada de CSL627 y restringida por HLA-DRB1 aumentó en comparación con las secuencias de agrupaciones peptídicas derivadas de la presentación de antígeno CSL627 sin EYA-Fp.

Se investigó la presentación antigénica de EYA-FP en presencia y ausencia de CSL627 en un panel de 12 donantes con tipificación HLA-DRB1. La presentación del antígeno eYA-FP en presencia de CSL627 y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 2 grupos de péptidos HLA-DRB1 en 12 donantes sanos no emparentados, mientras que la presentación del antígeno EYA-FP en ausencia de CSL627 identificó los mismos 2 grupos de péptidos HLA-DRB1 en el mismo conjunto de donantes.

La reducción de la presentación de antígeno de CSL627 basada en el número de grupos de péptidos en presencia de exceso molar de EYA-FP puede estar sesgada por la carga abundante de proteína EYA-FP Sin embargo, la presentación del antígeno EYA-FP no se vio influida significativamente por la presencia o ausencia de CSL627. Teniendo en cuenta el exceso de carga molar de EYA-FP en comparación con la carga proteica de CSL627, la presentación del antígeno de EYA-FP fue menos eficaz que la de CSL627. No puede excluirse una inhibición de la presentación del antígeno CSL627 a través de un exceso de péptidos competidores derivados de EYA-FP, pero también se había producido un aumento de la presentación del antígeno de EYA-FP cuando las DC se cargaron únicamente con EYA-FP

Tabla 11:Número de péptidos únicos

La Tabla 11 resume los datos generados por los ensayos de presentación de antígenos ProPresent® de Prolmmune con dos paneles independientes A y B de 24 donantes sanos, no emparentados, con tipificación HLA-DRB1 como fuente de PBMC. Las DC inmaduras se cargaron con 146,4 nM de c Sl627 solamente o con 146,4 nM de CSL627 precomplejado con 1,9667 pM de EYA-FP de acuerdo con el contenido de monómeros. La presentación del antígeno CSL627 en ausencia de eYA-FP y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 1035 ± 99 péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 en dos paneles independientes de donantes. La presentación del antígeno CSL627 en presencia de EYA-FP y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 241 péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 en un conjunto de 12 donantes. EYA-FP fue capaz de reducir la presentación de antígenos CSL627 restringida por HLA-DRB1 basándose en el número de péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 de 3,9 a 4,7 veces.

Se investigó la presentación antigénica de EYA-FP en presencia y ausencia de CSL627 en un panel de donantes con tipificación HLA-DRB1. La presentación del antígeno EYA-FP en presencia de CSL627 y la posterior espectrometría de masas de secuenciación identificaron 21 péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 en 12 donantes sanos no emparentados, mientras que la presentación del antígeno EYA-FP en ausencia de CSL627 identificó 20 péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 en el mismo conjunto de donantes.

La reducción múltiple de la presentación de antígeno de CSL627 basada en el número de péptidos únicos en presencia de un exceso molar de EYA-FP puede estar sesgada por una carga abundante de proteína EYA-FP Sin embargo, la presentación del antígeno EYA-F<p>no se vio influida por la presencia o ausencia de CSL627. Teniendo en cuenta el exceso de carga molar de EYA-FP en comparación con la carga proteica de CSL627, la presentación del antígeno de EYA-FP fue menos eficaz que la de CSL627. Sólo aproximadamente el 8 % de los péptidos únicos identificados eran derivados de EYA-FP cuando se cargaron con CSL627 a DCs. No puede excluirse una inhibición de la presentación de antígenos CSL627 por exceso de péptidos competidores derivados de EYA-FP, pero también se había producido un aumento significativo de la presentación de antígenos de EYA-FP cuando las DC se cargaron únicamente con EYA-FP

La Figura 8 muestra una comparación de la presentación del antígeno ProlmmuneProPresent® de CSL627 en presencia y ausencia de EYA-FP Cada punto de datos representa un grupo de péptidos restringido a HLA-DR. El número de péptidos únicos HLA-DR derivados de CSL627 de grupos de péptidos restringidos HLA-DR se representó gráficamente en ausencia (eje X) y presencia (eje Y) de EYA-FP Gráfico X-Y, regresión lineal (MS Excel).

La Figura 8 ilustra los ensayos de presentación de antígeno Prolmmune ProPresent® con dos paneles independientes A y B de 24 donantes sanos, no emparentados, con tipificación HLA-DRB1 como fuente de PBMC. Las DC inmaduras se cargaron con 146,4 nM de CSL627 solamente o con 146,4 nM de CSL627 precomplejado con 1,9667 pM de EYA-FP de acuerdo con el contenido de monómeros.

En presencia de EYA-FP se redujo el número total de péptidos únicos derivados de CSL627 unidos a HLA-DRB1 de cada grupo peptídico. Se identificaron varios grupos de péptidos cuando las DC se cargaron con CSL627 sin EYA-FP, pero algunos grupos de péptidos derivados de CSL627 desaparecieron en presencia de EYA-FP (tablas 8 y 9). Ningún grupo de péptidos fue más eficiente presentado en base al número de péptidos únicos unidos a HLA-DRB1 cuando se probó CSL627 en presencia de EYA-FP en comparación con CSL627 sin EYA-FP

La regresión lineal correlaciona los datos con una pendiente de 0,27*X (R2 = 0,63). En presencia de EYA-FP, la presentación del antígeno CSL627 es aproximadamente una cuarta parte de la eficiencia de presentación del antígeno CSL627 en ausencia de EYA-FP

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido recombinante que comprende un Factor von Willebrand (VWF) truncado capaz de unirse al Factor VIII (FVIII) de la coagulación sanguínea, en el que dicho polipéptido carece de un dominio<v>W<f>A1 funcional, y en el que dicho polipéptido comprende una fracción de prolongación de la semivida (HLEM), para su uso en la reducción de la inmunogenicidad del Factor VIII (FVIII), en el que dicho polipéptido recombinante y una proteína del Factor VIII (FVIII) de la coagulación sanguínea se coadministran a un individuo que padece un trastorno de la coagulación sanguínea, en el que el individuo es un individuo no tratado previamente con FVIII y/o en el que el individuo tiene riesgo y/o se espera que desarrolle una reacción inmunitaria contra el FVIII; y en el que el polipéptido recombinante se administra como homodímero.

2. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la inmunogenicidad reducida del FVIII comprende una respuesta inmunitaria humoral reducida de un individuo contra el FVIII, en particular un título y/o frecuencia más bajos de anticuerpos inhibidores contra el FVIII, y/o una respuesta inmunitaria mediada por células reducida contra el FVIII.

3. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la reducción de la inmunogenicidad del FVIII tras la administración se consigue o va acompañada de una captación reducida del FVIII en las células presentadoras de antígenos (APC) del individuo en presencia del polipéptido recombinante coadministrado, preferentemente en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, salvo que dicho FVIII se administra sin la coadministración del polipéptido recombinante.

4. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que tras la coadministración del polipéptido recombinante y FVIII, la porción de las APC del individuo que tienen FVIII internalizado se reduce en al menos un factor de 1,1, en al menos un factor de 1,2, en al menos un factor de 1,3, en al menos un factor de 1,4, en al menos un factor de 15, en al menos un factor de 2, en al menos un factor de 3, en al menos un factor de 4, en al menos un factor de 5, o en al menos un factor de 10, en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, salvo que dicho FVIII se administra sin coadministración del polipéptido recombinante.

5. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en el que el valor IC<50>para el polipéptido recombinante coadministrado que representa el potencial de inhibición de la captación de FVIII en APC (cálculo con base en la concentración molar del monómero) está sólo moderadamente aumentado en comparación con un valor IC<50>respectivo para un VWF de longitud completa, preferentemente el valor IC<50>del polipéptido recombinante coadministrado excede el valor IC<50>de VWF de longitud completa en no más de un factor de 3, no más de un factor de 2,5, en no más de un factor de 2,4, en no más de un factor de 2,3, en no más de un factor de 2,2, en no más de un factor de 2,1, en no más de un factor de 2,0, en no más de un factor de 1,8, en no más de un factor de 1,5, en no más de un factor de 1,3, en no más de un factor de 1,2, o en no más de un factor de 1,1.

6. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, en el que el valor IC<50>para el polipéptido recombinante coadministrado que representa el potencial de inhibición de la captación del FVIII en las APC (cálculo basado en la concentración molar del monómero) es idéntico o incluso reducido en comparación con un valorIC<50>respectivo para un VWF de longitud completa, preferentemente el valor IC<50>del polipéptido recombinante coadministrado se reduce en comparación con el valor IC<50>del VWF de longitud completa en un factor de al menos 12, de al menos 1,5, de al menos 2, de al menos 2,5 o de al menos 3.

7. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la reducción de la inmunogenicidad del FVIII tras la administración del polipéptido recombinante se consigue o va acompañada de una presentación de antígenos de tipo MHC de clase II de los péptidos del FVIII por las células presentadoras de antígenos (APC) del individuo en presencia del polipéptido recombinante en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, salvo que dicho FVIII se administra sin administrar el polipéptido recombinante, en el que la presentación de antígenos de tipo MHC de clase II de los péptidos FVIII por las células presentadoras de antígenos (APC) del individuo preferentemente se apaga, es decir, se reduce en un factor de 1 a 1.es decir, se reduce, en un factor de al menos 1,5, al menos 2,0, al menos 2,5, al menos 3,0, al menos 3,5, o al menos 4,0.

8. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el individuo tiene riesgo y/o se espera que desarrolle una reacción inmunitariacaracterizado poranticuerpos inhibidores contra el FVIII.

9. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el polipéptido recombinante y el FVIII se coadministran para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un individuo que padece un trastorno de la coagulación sanguínea.

10. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la inmunogenicidad reducida del FVIII secaracteriza porun título inferior de anticuerpos inhibidores dirigidos contra el FVIII, preferentemente el título de anticuerpos inhibidores dirigidos contra el FVIII se reduce en al menos un 2%, en al menos un 5%, en al menos un 10%, en al menos un 15%, en al menos un 20%, en al menos un 30%, en al menos un 40%, en al menos un 50%, o en al menos un 80%, en comparación con el título de anticuerpos contra el FVIII en un individuo que sigue un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, con la excepción de que dicho FVIII se administre sin coadministración de dicho polipéptido recombinante.

11. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la inmunogenicidad reducida del FVIII secaracteriza poruna menor frecuencia de anticuerpos inhibidores dirigidos contra el FVIII en una población de individuos, preferentemente la frecuencia de anticuerpos inhibidores dirigidos contra el FVIII se reduce en al menos un 5%, en al menos un 10%, en al menos un 15%, en al menos un 20%, en al menos un 30%, en al menos un 40%, en al menos un 50%, o en al menos un 80%, en comparación con la frecuencia de anticuerpos contra el FVIII en una población de individuos tras un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, salvo que dicho FVIII se administra sin coadministración de dicho polipéptido recombinante.

12. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proporción molar del polipéptido recombinante al FVIII a coadministrar es de al menos 2:1, al menos 3:1, al menos 4:1, al menos 5:1, al menos 6:1, al menos 8:1, al menos 10:1, al menos 15:1, al menos 20:1, al menos 25:1, al menos 50:1, al menos 70:1, al menos 80:1, al menos 100:1, o al menos 150:1.

13. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el individuo es un individuo humano, en el que el trastorno de coagulación sanguínea preferentemente es hemofilia A.

14. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho polipéptido se administra por vía intravenosa, subcutánea, intradérmica, oral, transdérmica, intranasal, intraperitoneal, tópica o local, sublingual o intramuscular, preferentemente por vía intravenosa o subcutánea.

15. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polipéptido comprende un dominio VWF D' y/o un dominio<v>W<f>D3 funcional.

16. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el VWF truncado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% a aminoácidos 766 a 805 de la SEQ ID NÚM.:4, preferentemente comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NÚM.:4.

17. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el polipéptido recombinante tiene al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del VWF de tipo silvestre cuando se hace referencia a la numeración de secuencia de SEQ ID NÚM.:4, seleccionándose la sustitución del grupo que consiste en: S764G/S766Y, S764P/S7661, S764P/S766M, S764V/S766Y, S764E/S766Y, S764Y/S766Y, S764L/S766Y, S764P/S766W, S766W/S806A, S766Y/P769K, S766Y/P769N, S766Y/P769R y S764P/S766L, S764P/S766W/V1083A, S764G/S766Y/V1083A, S764E/S766Y/V1083A, N1011S/V1083A/K1181E, S766Y/V1083A, V1083A, S1042T, V805A/Q1158L, K912E/T1088S y L781P

18. El polipéptido recombinante para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el HLEM es una secuencia de aminoácidos heteróloga fusionada al VWF truncado, en el que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga comprende o consiste preferentemente en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en regiones constantes de inmunoglobulina y porciones de la misma, preferentemente la porción Fc de inmunoglobulina, albúmina y fragmentos de la misma, transferrina o fragmentos de la misma, el péptido C-terminal de la gonadotropina coriónica humana, una secuencia XTEN, repeticiones de homo-aminoácidos (HAP), repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS), afamina, alfa-fetoproteína, proteína de unión a la vitamina D, polipéptidos capaces de unirse bajo condiciones fisiológicas a la albúmina o a las regiones constantes de las inmunoglobulinas, polipéptidos capaces de unirse al receptor Fc neonatal (FcRn), en particular a las regiones constantes de las inmunoglobulinas y a porciones de las mismas, preferentemente la porción Fc de la inmunoglobulina, y combinaciones de los mismos.

19. Una composición farmacéutica que comprende

(i) un polipéptido recombinante que comprende un Factor von Willebrand (VWF) truncado capaz de unirse al Factor VIII (FVIII) de la coagulación sanguínea, en el que dicho polipéptido carece de un dominio VWF A1 funcional, en el que dicho polipéptido comprende una fracción de prolongación de la semivida (HLEM), y en el que dicho polipéptido es un homodímero, y

(ii) una proteína del Factor VIII (FVIII),

para uso en la reducción de la inmunogenicidad del Factor VIII (FVIII), en el que dicha composición se administra a un individuo que padece un trastorno de la coagulación sanguínea, en el que dicho sujeto es un individuo no tratado previamente con FVIII y/o en el que el individuo tiene riesgo y/o se espera que desarrolle una reacción inmunitaria contra el FVIII, particularmente una reacción inmunitariacaracterizada poranticuerpos inhibidores contra el FVIII.