KR20130121198A - 진단 및 치료용 종양 관련 항원의 동정 - Google Patents

Abstract

본 발명은 그 발현이 암 질환과 관련된 유전 산물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 유전 산물이 발현되거나 비정상적으로 발현되는 것인 질환, 특히 암 질환의 치료 및 진단에 관한 것이다.

Description

진단 및 치료용 종양 관련 항원의 동정{IDENTIFICATION OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS FOR DIAGNOSIS AND THERAPY}

본 발명은 종양의 진단 및 치료용 표적 구조물을 제공하는 것이다.

다방면에 걸친 접근 및 전통적인 치료 방법의 전반적인 사용에도 불구하고, 암은 여전히 주요 사망 원인 중 하나이다. 보다 최근의 치료 개념은 재조합 종양 백신 및 항체 요법 등의 다른 특이적 방법을 사용하여 환자의 면역계를 전체적인 치료 개념에 포함시키는 것을 목적으로 한다. 이와 같은 치료 계획의 성공을 위한 필요 조건은 면역계 효과기의 기능이 간섭적으로 증진된 환자의 면역계가 종양 특이적 또는 종양 관련 항원 또는 에피토프를 인지하는 것이다. 종양 세포는 이들이 유래하는 비악성 세포와 본질적으로 생물학적 차이점을 갖는다. 이러한 차이점은 종양으로 발전하는 동안 발생한 유전자 변형에 의한 것으로, 특히, 암세포의 질적 또는 양적으로 변형된 분자 구조물을 형성하는 원인이 된다. 종양 내재 숙주의 특이적 면역계에 의하여 인지되는 이러한 종류의 종양 관련 구조물을 종양 관련 항원이라 부른다. 종양 관련 항원의 특이적 인지는 두 개의 기능적 상호 연결 단위인 세포성 기전 및 체액성 기전을 수반한다: CD4⁺ T 림프구 및 CD8⁺ T 림프구는 각각 MHC (major histocompatibility complex, 주 조직 적합 복합체) 클래스 II 및 I 분자 상에 제시되는 가공된 항원을 인지하는 한편, B 림프구는 미가공된 항원에 직접 결합하는 혈중 항체 (circulating antibody) 분자를 생산한다. 종양 관련 항원의 잠재적인 임상-치료적 중요성은 면역계에 의한 종양 세포 상의 항원 인지가 세포 독성 효과기 기전이 개시되도록 하여, 헬퍼 T 세포의 존재하에 암세포를 제거할 수 있도록 한다는 사실에서 유래한다 (Pardoll, Nat . Med . 4: 525-31, 1998). 따라서, 종양 면역학의 주요 목적은 이러한 구조물을 분자적으로 밝히는 것이다. 이들 항원의 분자적 본질은 오랫동안 알려지지 않았었다. 적절한 클로닝 기술이 개발되고 나서야, 세포 독성 T 림프구 (CTL) (van der Bruggen 등, Science 254: 1643-7, 1991)의 표적 구조물을 분석하거나 또는 프로브로서 혈중 자가 항체 (Sahin 등, Curr. Opin . Immunol . 9: 709-16, 1997)를 사용하여, 종양 관련 항원에 대한 종양의 cDNA 발현 라이브러리를 체계적으로 스크리닝하는 것이 가능해졌다. 이를 위하여, 새로 발생한 종양 조직으로부터 cDNA 발현 라이브러리를 제조하고, 적합한 시스템에서 단백질로서 재조합적으로 발현시켰다. 환자로부터 분리한 면역 효과기, 즉, 종양 특이적 용해 패턴을 갖는 CTL 클론, 또는 혈중 자가 항체를 각각의 항원을 클로닝하는데 사용하였다.

최근 수년간, 이러한 접근에 의하여 다양한 종양에서 항원 다중성이 밝혀졌다.

그러나, 전통적인 방법으로 항원 동정에 사용되는 프로브들은 일반적으로 이미 암이 진행된 환자로부터 얻은 면역 효과기 (혈중 자가 항체 또는 CTL 클론)이다. 다수의 데이터로부터 종양이 예컨대 T 세포를 내성화 (tolerization)하고 무기력 (anergization)하게 할 수 있다는 것과, 특히, 질환의 진행 과정 중에, 면역 효과기 레퍼토리로부터 효과적으로 면역을 인지하게 할 수 있는 특이성이 상실된다는 것을 알 수 있다. 현재 환자에 대한 연구는 이미 발견되어 사용되고 있는 종양 관련 항원의 실제 기능에 대한 어떠한 확실한 증거도 아직 얻어내지 못하고 있다. 따라서, 자발적 면역 반응을 일으키는 단백질이 잘못된 표적 구조물이라는 것을 배제할 수 없다.

본 발명의 목적은 종양의 진단 및 치료용 표적 구조물을 제공하는 것이다.

이러한 목적은 청구 범위의 주요 내용에 의하여 달성될 수 있다.

본 발명에 따르면, 종양 세포 중에서 선택적으로 또는 비정상적으로 발현된 유전자들을 동정하여, 종양 관련 항원을 제공한다. 이들 유전자 및/또는 이들의 유전적 산물 및/또는 그 유도체 및/또는 그 단편들은 치료 및 진단적 접근을 위한 표적 구조물로서 유용하다.

본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원은 서열 목록 중 (a) 서열 번호: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62, 및 64~67로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 핵산, (b) 엄격한 조건 하에 (a)의 핵산과 혼성화한 핵산, (c) (a) 또는 (b)의 핵산에 관하여 변성된 (degenerate) 핵산 및 (d) (a), (b) 또는 (c)의 핵산과 상보적인 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 가진다. 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원은 서열 목록 중 서열 번호: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 및 64~67로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산에 의하여 코딩된 아미노산 서열을 가진다. 더 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원은 서열 목록 중 서열 번호: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50~60, 63, 68 및 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함한다.

본 발명은 일반적으로 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원, 그 일부 또는 그 유도체, 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산, 그 일부 또는 그 유도체, 또는 상기 코딩하는 핵산에 반대하여 지시되는 핵산, 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원, 그 일부 또는 그 유도체에 반대하여 지시되는 항체 또는 T 세포 및/또는 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부 또는 그 유도체를 발현시키는 숙주 세포의 종양 질환의 치료, 예방, 진단 및/또는 모니터링을 위한 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따라 동정된 것들 이외에 종양 관련 항원, 그 대신 코딩하는 핵산 또는 상기 코딩하는 핵산에 반대하여 지시되는 핵산, 상기 종양 관련 항원에 대하여 지시되는 항체 또는 T 세포 및/또는 상기 종양 관련 항원을 발현시키는 숙주 세포와 조합하여, 2종 이상의 이들 항원, 핵산, 항체, T 세포 및/또는 숙주 세포의 조합의 용도를 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원, 그 일부 또는 그 유도체에 대하여 지시되는 항체의 용도와 관련된 본 발명의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원, 그 일부 또는 그 유도체에 대하여 지시된 T 세포 수용체도 역시 필요에 따라 MHC 분자와의 복합체로 사용될 수 있다.

비(非)막통과 부분, 특히 종양 관련 항원의 세포 밖 부분에 대응하거나 그것으로 이루어진, 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원의 일부가 치료, 예방, 진단 및/또는 모니터링에 특히 적절하다. 그러므로, 본 발명에 따르면, 비막통과 부분, 특히 종양 관련 항원의 세포 밖 부분에 대응하거나 그것으로 이루어진 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원의 일부, 또는 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산의 대응 부분이 치료, 예방, 진단 및/또는 모니터링에 좋다. 유사하게, 막을 통하여 생기는 것이 아닌 부분, 특히 종양 관련 항원의 세포 밖 부분에 대응하거나 그것으로 이루어진 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원의 일부에 대하여 지시되는 항체를 이용하는 것이 좋다.

본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원 1종 이상이 선택적으로 발현되거나 이례적으로 발현된 것이 치료, 예방 및/또는 진단하기에 좋은 질환들이다.

또한, 본 발명은 핵산과 단백질 또는 펩티드에 관한 것인데, 이들은 공지유전자의 변형된 스플라이싱 (스플라이스 변이체) 또는 교대 오픈 리딩 프레임을 사용한 변형 번역으로부터 기인한다. 이러한 측면에서 본 발명은 서열 목록 중 서열 번호: 28 및 49로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다. 또한, 이러한 측면에서, 본 발명은 서열 목록 중 서열 번호: 29 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 펩티드에 관한 것이다.

유전자의 변형 스플라이싱은 변형된 전사 서열 (스플라이스 변이체)을 초래한다. 그 변형된 서열 부분에 있는 스플라이스 변이체의 번역은 본래의 단백질과 그 구조 및 기능에서 뚜렷한 차이가 있을 수 있는 변형 단백질을 초래한다. 종양 관련 스플라이스 변이체는 종양 관련 전사 및 종양 관련 단백질/항원을 생성할 수 있다. 이들은 종양 세포의 탐지 및 종양의 치료적 표적화 양자 모두를 위한 분자 표지로서 이용될 수 있다. 환자의 시료 중에 있는 종양 세포의 탐지는 본 발명에 따라, 예컨대 스플라이스 변이체 특이적 올리고뉴클레오타이드로 PCR 증폭기에 의하여 핵산을 추출한 후에 수행될 수 있다.

본 발명에 따르면, 모든 서열 의존성 탐지 시스템이 탐지에 적합하다. 이에는 PCR 이외에도 예를 들어, 유전자칩/마이크로어레이 시스템, 노던 블럿, RN아제 보호 분석 (RNAse protection assays; RDA) 등이 있다. 모든 탐지 시스템은 탐지가 적어도 하나의 스플라이스 변이체 특이적 핵산 서열로의 특이적 혼성화에 기초한다는 공통점을 가진다. 그러나, 종양 세포도 역시 본 발명에 따라, 스플라이스 변이체에 의하여 코딩된 특이적 에피토프를 인지하는 항체에 의하여 탐지될 수 있다. 상기 항체는 상기 스플라이스 변이체에 특이적인 면역 펩티드를 사용하여 제조될 수 있다. 좋기로는 건강한 세포에서 생성되고, 유전 산물의 변이체와 현저히 다른 아미노산 서열이 면역화에 특히 적합하다. 항체로 종양 세포를 탐지하는 것은 환자로부터 분리한 시료 상에서 또는 정맥 내로 투여된 항체의 조영으로서 수행할 수 있다.

진단에의 이용가능성 외에도, 새롭거나 변형된 에피토프가 있는 스플라이스 변이체는 본 명세서에서 설명된 바와 같이 이들 에피토프가 항체 또는 T 림프구를 표적하는 데에 사용될 수 있기 때문에 면역 치료법을 위한 강력한 표적이다. 수동 면역치료법 (passive immunotherapy)에 있어서, 스플라이스 변이체 특이적 에피토프를 인식하는 항체 또는 T 림프구는 채택적으로 여기로 전달된다. 다른 항원의 경우, 항체를 또한 이들 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 사용하는 표준 기술을 사용하여 생산할 수도 있다. 별법으로서, 상기 에피토프를 함유하는 펩티드를 코딩하는 면역화 핵산을 사용하는 것이 가능하다. 에피토프 특이적 T 림프구의 생체내 또는 생체외 생성을 위한 다양한 기술이 알려져 있고 상세하게 기술되어 있으며 (예컨대, Kessler JH, 등 2001, Sahin 등, 1997), 스플라이스 변이체 특이적 에피토프 또는 상기 펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 펩티드를 사용한다는 점에서 유사하다. 또한, 스플라이스 변이체 특이적 에피토프 또는 상기 펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 펩티드는 활성 면역 치료 (예컨대 백신화, 백신 치료)에 있어서 약학적 활성 물질로서 사용될 수 있다.

한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원 또는 상기 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산을 인식하고, 좋기로는 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현을 가지는 세포에 대한 선택성이 있는 작용제들을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 또 한 가지 측면에서, 본 발명은 (Ⅰ) 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원의 발현 또는 활성을 억제, 및/또는 (Ⅱ) 종양 억제 또는 종양 파괴 활성을 지니고 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원을 발현시키거나 비정상적으로 발현시키는 세포에 대하여 선택적인, 및/또는 (Ⅲ) 투여하는 경우 예컨대, 펩티드 에피토프 등의 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부와 MHC 분자의 복합체의 양을 선택적으로 증가시키는 작용제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 특별한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 작용제는 세포 사멸 유도, 세포 성장 감소, 세포막의 손상 또는 시토카인 분비를 일으킬 수 있고, 좋기로는 종양 억제 활성을 지닐수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 작용제는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 선택적으로 혼성화하는 안티센스 핵산이다. 또 한 가지의 실시 상태에 있어서, 상기 작용제는 좋기로는 센스 RNA 가닥과 안티센스 RNA 가닥을 포함하는 siRNA인데, 여기서 센스 및 안티센스 RNA 가닥들은 RNA 듀플렉스 (duplex)를 형성하고, 상기 센스 RNA 가닥은 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산, 좋기로는 종양 관련 항원을 코딩하는 mRNA에 있는 약 19개 내지 약 25개의 연속 뉴클레오타이드의 표적 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 한 가지의 실시 상태에 있어서, 상기 작용제는 종양 관련 항원, 특히 종양 관련 항원에 선택적으로 결합하는 보체 활성화 항체 또는 독소 결합 항체에 선택적으로 결합하는 항체이다. 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 종양 관련 항원에 선택적으로 결합하는 항체는 치료적으로 유용한 물질에 결합 및/또는 상기 종양 관련 항원을 발현시키거나 비정상적으로 발현시키는 상기 세포에 천연 또는 인공 효과기 기전을 보충한다. 또 한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 작용제는 세포 위의 MHC 분자에 의하여 결합되는 종양 관련 항원 또는 그 일부를 인식하여 이러한 방법으로 표지된 세포를 용해하는 세포 독성 T 림프구이다. 또 한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 작용제는 특히 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 인식하는 다른 세포의 효과기의 기능을 증진시키는 헬퍼 T 림프구이다.

또 한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 작용제는 각각 상이한 종양 관련 항원을 인식 및/또는 상이한 종양 관련 항원의 발현 또는 활성을 억제, 및/또는 종양 억제 또는 종양 파괴 활성이 있고 상이한 종양 관련 항원을 발현시키거나 비정상적으로 발현시키는 세포에 대한 선택성, 및/또는 투여시, 상기 상이한 종양 관련 항원 중 적어도 1종이 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원인 것인 상이한 종양 관련 항원 또는 그 일부와 MHC 분자 사이의 복합체의 양을 선택적으로 증가시키는 2종 이상의 작용제를 포함한다. 좋기로는, 종양에 선택적으로 제한된 종양 관련 항원은 이 특이적 위치에 효과기 기전을 보충하기 위한 표지로서 제공한다. 본 발명은 실시 상태를 포함하는데, 여기서 상기 작용제 그 자체는 종양 관련 항원의 활성을 억제하는 능력, 종양 억제 또는 종양 파괴 활성 능력이 있지는 않지만, 특정 위치 특히 종양 또는 종양 세포에 특히 세포 손상 잠재력이 있는 효과기 기전을 보충함으로써 이러한 효과를 매개한다.

본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원의 활성은 단백질 또는 펩티드의 임의의 활성일 수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서 이러한 활성은 효소 활성이다.

본 발명에 따르면, "발현 또는 활성의 억제"라는 어구는 발현이나 활성의 완전하거나 본질적으로 완전한 억제 및 발현이나 활성의 감소를 포함한다.

투여시, 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부와 MHC 분자 간의 복합체의 양을 선택적으로 증가시키는 작용제는 (i) 종양 관련 항원 또는 그 일부, (ii) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산, (iii) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현시키는 숙주 세포, 및 (iv) 상기 종양 관련 항원의 펩티드 에피토프와 MHC 분자 간의 분리된 복합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 가지 이상의 성분을 함유한다.

또한, 본 발명은 (i) 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부, (ii) 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산, (iii) 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 항체, (iv) 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 특이적으로 혼성화하는 안티센스 핵산, (v) 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산에 반대하여 지시하는 siRNA, (vi) 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현시키는 숙주 세포, 및 (ⅶ) 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원 또는 그 일부와 MHC 분자 간의 분리된 복합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 가지 이상의 성분을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산은 발현 벡터 내에서 약학 조성물에 존재하고, 프로모터에 기능적으로 연결되어 있다. 또 한가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산은 후술하는 바이러스 내에서 약학 조성물에 존재한다.

또 한가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 약학 조성물에 존재하는 숙주 세포는 종양 관련 항원 또는 그 일부를 분비하고, 이를 표면에서 발현시키고, 좋기로는 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 MHC 분자를 추가로 발현시킨다. 한가지 실시 상태에 있어서, 숙주 세포는 MHC 분자를 내부적으로 발현시킨다. 또 한가지 실시 상태에 있어서, 숙주 세포는 MHC 분자 및/또는 종양 관련 항원 또는 그 일부를 재조합 방법으로 발현시킨다. 숙주 세포는 비증식적인 것이 좋다. 양호한 실시 상태에 있어서, 숙주 세포는 항원 제시 세포, 특히, 수지상 세포, 단핵 세포 또는 대식 세포이다.

추가의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 약학 조성물에 존재하는 항체는 모노클로날 항체이다. 추가의 실시 상태에 있어서, 상기 항체는 키메라 (chimeric) 또는 인간화 항체, 천연 항체 또는 합성 항체의 단편이다. 상기 항체는 본 명세서에서 치료제 또는 진단제라 부르는 치료적 또는 진단적으로 유용한 작용제와 결합될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 존재하는 안티센스 핵산은, 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 인접한 뉴클레오타이드의 6 내지 50 서열, 특히 10 내지 30, 15 내지 30 및 20 내지 30 서열을 포함할 수 있다.

또 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 약학 조성물에 의하여 직접 또는 핵산의 발현을 통하여 제공되는 종양 관련 항원 또는 그 일부는 세포 표면의 MHC 분자에 결합하는데, 상기 결합이 세포 용해 반응을 유발하거나 및/또는 사이토카인 방출을 유도하는 것이 좋다.

SEQ ID NO: 1에 따른 핵산을 표적으로 하는 siRNA의 특정 실시 상태에 있어서, 센스 RNA 가닥의 서열이 SEQ ID NO: 70이고 안티센스 RNA 가닥의 서열이 SEQ ID NO: 71이거나, 센스 RNA 가닥의 서열이 SEQ ID NO: 72이고 안티센스 RNA 가닥의 서열이 SEQ ID NO: 73이다.

본 발명의 약학 조성물은 약학상 적합한 담체 및/또는 보조제를 함유할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 종양 관련 항원의 선택적인 발현 또는 비정상적인 발현으로 특징되는 질환의 치료 또는 예방을 위하여 사용되는 것이 좋다. 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 질환은 종양성 질환, 좋기로는 암이다.

양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 약학 조성물은 치료 또는 예방용으로 사용될 수 있는 백신 형태이다. 이러한 백신은 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원 또는 그 일부 및/또는 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산을 포함하는 것이 좋다. 특별한 가지 실시 상태에 있어서 상기 핵산은 바이러스 또는 숙주 세포 내에 존재한다.

또한, 본 발명은 1종 이상의 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현으로 특징되는 질환, 좋기로는 종양성 질환, 특히 암의 퇴행, 진행, 과정 및/또는 발병을 치료, 예방, 진단 또는 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 치료 또는 예방에는 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 것이 포함된다.

일반적으로, 상기 본 발명에 따른 진단 및/또는 모니터링 방법은 문제의 질환이 있거나 질환에 걸린 또는 질환에 걸릴 가능성이 있는 것으로 의심되는 환자, 좋기로는 문제의 질환에 걸린 환자로부터 채취한 생물학적 시료에서, (i) 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 또는 그 일부, (ii) 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원 또는 그 일부, (iii) 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원 또는 그 일부에 대한 항체 및 (iv) 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원 또는 그 일부에 특이적인 T 림프구, 좋기로는 세포 독성 또는 헬퍼 T 림프구 및/또는 종양 관련 항원 또는 그 일부와 MHC 분자 간의 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 파라미터들의 양을 검출 및/또는 측정하는 것에 관한 것이다. 상기 양을 검출 및/또는 측정하는 방법은 본 명세서에 기재되어 있으며, 당해 기술 분야의 숙련자에게 명백할 것이다.

좋기로는, 상기 핵산, 상기 종양 관련 항원 또는 상기 그 일부, 상기 항체 및/또는 상기 T 림프구의 존재, 및/또는 문제의 질환이 없는 환자에 비하여 증가된 상기 핵산, 상기 종양 관련 항원 또는 상기 그 일부, 상기 항체 및/또는 상기 T 림프구의 양은 상기 질환의 존재나 상기 질환의 발병 가능성을 나타내는 것이다.

본 발명의 진단 및/또는 모니터링의 방법은, 상기 핵산, 상기 종양 관련 항원 또는 상기 그 일부, 상기 항체 및/또는 상기 T 림프구의 양을 검출 및 측정함으로써, 상기 질환의 전이 행동을 평가 및/또는 예측하는 것이 가능하고, 좋기로는 상기 핵산, 상기 종양 관련 항원 또는 상기 그 일부, 상기 항체 및/또는 상기 T 림프구의 존재 및/또는 상기 질환에 걸리지 않은 환자 또는 상기 질환이 전이되지 않은 환자에 비하여 증가된 상기 핵산, 상기 종양 관련 항원 또는 상기 그 일부, 상기 항체 및/또는 상기 T 림프구의 양이 상기 질환의 전이 행동 또는 상기 질환의 전이 행동 가능성을 나타내는 것인 실시 상태도 역시 포함한다.

특별한 가지 실시 상태에 있어서, 양을 검출 또는 측정하는 것은 (i) 생물학적 시료의, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 또는 그 일부, 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부, 상기 항체 또는 그 일부 또는 상기 T 림프구에 특이적으로 결합하는 작용제와의 접촉, (ii) 상기 작용제와 핵산 또는 그 일부분, 종양 관련 항원 또는 그 일부, 항체 또는 그 일부, 또는 T 림프구와의 복합체의 형성 또는 그 양을 검출하는 것을 포함한다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 질환은 2종 이상의 상이한 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현으로 특징되며, 상기 양의 검출 또는 측정은 상기 2종 이상의 상이한 종양 관련 항원을 코딩하는 2종 이상의 핵산 또는 그 일부, 2종 이상의 상이한 종양 관련 항원 또는 그 일부, 상기 2종 이상의 상이한 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 2종 이상의 항체 및/또는 상기 2종 이상의 상이한 종양 관련 항원 또는 그 일부에 특이적인 2종 이상의 T 림프구, 또는 MHC 분자와 T 림프구의 복합체의 양을 검출 또는 측정하는 것을 포함한다. 또 다른 실시 상태에 있어서, 환자로부터 채취한 생물학적 시료를 비교 가능한 정상인의 생물학적 시료와 비교한다.

본 발명에 따른 모니터링 방법은 제1 시점에, 제1 시료에서 전술한 1개 이상의 파라미터의 양을 검출 및/또는 측정하고, 제2 시점에 또 다른 시료에서 검출 및/또는 측정하는 것을 포함하는 것이 좋은데, 여기서 상기 2개의 시료를 비교하여 상기 질환의 경과를 측정한다.

본 발명에 따르면, 핵산 또는 그 일부의 검출, 또는 핵산 또는 그 일부의 양을 측정하는 것은, 상기 핵산 또는 상기 그 일부에 특이적으로 혼성화하는 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 수행되거나, 상기 핵산 또는 상기 그 일부의 선택적인 증폭, 예컨대 PCR 증폭에 의하여 수행될 수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드 프로브는 상기 핵산의 인접 (contiguous) 뉴클레오타이드의 6 내지 50 서열, 특히, 10 내지 30 서열, 15 내지 30 서열 및 20 내지 30 서열을 포함한다.

특정 실시 상태에 있어서, 검출될 종양 관련 항원 또는 그 일부 또는 본 발명의 방법으로 측정될 양은 세포내, 세포 표면 또는 MHC 분자와의 복합체로 존재한다. 본 발명에 따르면, 종양 관련 항원 또는 그 일부의 검출 또는 종양 관련 항원 또는 그 일부의 양을 측정하는 것은, 상기 종양 관련 항원 또는 상기 그 일부에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명에 따르면, 항체의 검출 또는 항체 양의 측정은 상기 항체에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 펩티드를 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명에 따르면, 항원 또는 그 일부 및/또는 MHC 분자와의 복합체에 특이적인 T 림프구를 검출 또는 그 양을 측정하는 것은, 상기 종양 관련 항원 또는 상기 그 일부와 MHC 분자 간의 복합체를 나타내는 세포를 사용하여 수행될 수 있다.

T 림프구는 또한, 증식, 사이토카인 생성, 및 MHC 분자와 종양 관련 항원 또는 그 일부와의 복합체로의 특이적 자극에 의하여 유발되는 이들의 세포 독성 활성을 검출함으로써 검출될 수 있다. 또한, T 림프구는 재조합 MHC 분자 또는 1종 이상의 종양 관련 항원의 면역원성 단편이 로딩된 2종 이상의 MHC 분자들의 복합체를 이용하여 검출될 수도 있다.

올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드 프로브, 항체, 단백질 또는 펩티드, 또는 세포 등의 본 발명의 방법으로 그 양을 검출 또는 측정하는 데 사용되는 작용제는 검출가능한 수단, 특히 방사성 마커 또는 효소 마커 등의 검출가능한 마커로 표지되는 것이 좋다.

특별한 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현으로 특징되는 질환의 치료, 예방, 진단 또는 모니터링 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하고 치료제 또는 진단제에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 상기 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 다른 실시 상태에 있어서, 항체는 키메라 또는 인간화 항체 또는 천연 항체의 단편이다.

특정 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현으로 특징되는 질환을 진단 또는 모니터링하는 본 발명의 방법은 널리 퍼진 종양 세포 또는 전이 종양 세포를 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 시료를 가지고 수행한다. 이러한 생물학적 시료로서는 예컨대 혈액, 혈청, 골수, 타액, 기관지 흡인물 (bronchial aspirate) 및/또는 기관지 세정 (bronchial lavage)을 들 수 있다.

특별한 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현으로 특징되는 질환이 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 상기 환자 또는 특히 건강한 개체로서 동일한 종의 다른 개체 또는 상이한 종의 개체로부터 채취한 면역활성 세포를 함유하는 시료를 제공하고, (ii) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 대한 세포 독성 T 세포의 생산에 유리한 조건 하에서, 상기 시료를 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현시키는 숙주 세포와 접촉시키며, (iii) 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현시키는 세포를 용해시키기에 적절한 양의 세포 독성 T 세포를 환자에게 도입하는 것을 포함한다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 방법은 획득한 세포 용해성 T 세포의 T 세포 수용체의 클로닝 및 T 세포 수용체를 코딩하는 핵산을, 상기 환자 또는 특히 건강한 개체로서 동일한 종의 다른 개체 또는 상이한 종의 개체로부터 획득한 T 세포에 이식시켜서, T 세포가 목적하는 특이성을 부여받고, (iii) 하에서와 같이, 환자에게 도입될 수 있다는 것을 포함한다.

한 가지 실시 상태에 있어서, 숙주 세포는 MHC 분자를 내부적으로 발현시킨다. 또 다른 실시 상태에 있어서, 숙주 세포는 MHC 분자 및/또는 종양 관련 항원 또는 그 일부를 재조합적으로 발현시킨다. 숙주 세포는 그 표면에서 MHC 분자에의하여 종양 관련 항원 또는 그 일부를 나타내는 것이 좋다. 숙주 세포는 비증식성인 것이 좋다. 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 숙주 세포는 항원 제시 세포, 특히, 수지상 세포, 단핵 세포 또는 대식 세포이다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현으로 특징되는 질환을 치료하는 방법에 관한 것인데, 상기 방법은 (i) 환자로부터 비정상적인 양으로 종양 관련 항원을 발현시키는 세포를 동정하고, (ii) 상기 세포 시료를 분리하여, (iii) 상기 세포를 배양하고 (iv) 상기 세포를 상기 세포에 대한 면역 반응을 유발시키기에 적절한 양으로 환자에게 도입시키는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 (a) 서열 번호: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62, 및 64 내지 67로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 핵산, (b) 엄격한 조건하에 (a)의 핵산과 혼성화한 핵산, (c) (a) 또는 (b)의 핵산에 대하여 변성된 핵산 및 (d) (a), (b) 또는 (c)의 핵산과 상보적인 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 서열 번호: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50-60, 63, 68 및 69로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 핵산 분자, 특히, DNA 또는 RNA 분자에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 재조합 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다.

또한, 숙주 세포는 MHC 분자를 코딩하는 핵산을 포함할 수도 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 숙주 세포는 MHC 분자를 내생적으로 발현시킨다. 또 다른 실시 상태에 있어서, 숙주 세포는 MHC 분자 및/또는 본 발명의 핵산 또는 재조합 핵산 분자 또는 그 일부를 재조합적으로 발현시킨다. 숙주 세포는 비증식성인 것이 좋다. 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 숙주 세포는 항원 제시 세포, 특히, 수지상 세포, 단핵 세포 또는 대식 세포이다.

또 다른 실시 상태에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라 동정되는 핵산과 혼성화하고 유전 프로브 또는 "안티센스" 분자로서 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명에 따라 동정되는 핵산 또는 그 일부와 혼성화하는, 적격 (competent) 프로브 또는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 형태의 핵산 분자를, PCR 증폭, 서던 혼성화 및 노던 혼성화를 사용하여, 본 발명에 따라 동정되는 핵산과 상동인 핵산을 찾는 데에 사용할 수 있다. 덜 엄격한 조건 하에서, 더 좋기로는 중간 정도의 엄격한 조건 하에서, 가장 좋기로는 매우 엄격한 조건 하에서 혼성화를 수행할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 및 64 내지 67로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 핵산, (b) 엄격한 조건 하에서 (a)의 핵산과 혼성화하는 핵산, (c) (a) 또는 (b)의 핵산에 대하여 변성된 핵산 및 (d) (a), (b) 또는 (c)의 핵산과 상보적인 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산에 의하여 코딩되는 단백질 또는 펩티드에 관한 것이다. 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명은 서열 번호: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50-60, 63, 68 및 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 단백질 또는 펩티드에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원의 면역원성 단편에 관한 것이다. 상기 단편은 인간 MHC 분자 또는 항체에 결합하는 것이 좋고, 인간 HLA 수용체 또는 인간 항체에 결합하는 것이 좋다. 본 발명에 따르면, 단편은 6 이상의 아미노산 서열, 특히, 8 이상, 10 이상, 12 이상, 15 이상, 20 이상, 30 이상 또는 50 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것이 좋다.

이러한 측면에 있어서, 본 발명은, 특히, 서열 목록 중 서열 번호: 51 내지 60, 68 및 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 갖거나 포함하는 펩티드에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 작용제에 관한 것이다. 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 작용제는 단백질 또는 펩티드, 특히 항체, T 세포 수용체 또는 MHC 분자이다. 또 다른 실시 상태에 있어서, 상기 항체는 모노클로날, 키메라, 인간화 항체, 조합 기술에 의하여 생산된 항체 또는 항체의 단편이다. 한 가지 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명은 (i) 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원 또는 그 일부와 (ii) 본 발명에 따라 동정되는 상기 종양 관련 항원 또는 상기 그 일부가 결합하는 MHC 분자와의 복합체에 선택적으로 결합하는 항체에 관한 것이며, 상기 항체는 (i) 또는 (ii)에 단독으로 결합하지 않는다.

특히, 본 발명은, 서열 목록 중 서열 번호: 51 내지 60, 68 및 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 갖거나 포함하는 펩티드에 특이적으로 결합하는 작용제 특히, 항체에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, "결합"이라는 용어는 좋기로는 특이적 결합에 관한 것이다. "특이적 결합"은 항체 등의 작용제가 다른 표적에 결합하는 것에 비하여 특이적인 에피토프 등의 표적에 더 강하게 결합하는 것을 의미한다. 작용제가 제2 표적에 대한 해리 상수(K_D)보다 더 낮은 해리 상수(K_D)를 가진 제1 표적에 결합한다면, 제2 표적에 비하여 제1 표적에 더 강하게 결합한다. 작용제가 특이적으로 결합하는 표적에 대한 해리 상수(K_D)는 작용제가 특이적으로 결합하지 않는 표적에 대한 해리 상수(K_D)보다 10배 이상, 좋기로는 20배 이상, 더 좋기로는 50배 이상, 훨씬 더 좋기로는 100배, 200배, 500배 또는 1000배 이상 낮은 것이 좋다.

이러한 특이적인 항체는 예컨대 전술한 펩티드를 이용하여 면역시킴으로써 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 본 발명의 작용제 또는 본 발명의 항체와 치료제 또는 진단제와의 컨쥬게이트에 관한 것이다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 치료제 또는 진단제는 독소이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현을 검출하기 위한 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 (i) 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 또는 그 일부, (ii) 종양 관련 항원 또는 그 일부, (iii) 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 항체, 및/또는 (iv) 종양 관련 항원 또는 그 일부 또는 MHC 분자와의 복합체에 특이적인 T 세포를 검출 또는 그 양을 측정하기 위한 작용제를 포함한다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 핵산 또는 그 일부를 검출하기 위한 작용제는 상기 핵산을 선택적으로 증폭시키기 위한 핵산 분자이며, 특히, 상기 핵산의 인접 뉴클레오타이드의 6 내지 50 서열, 특히, 10 내지 30, 15 내지 30 및 20 내지 30 서열을 포함한다.

본 발명에 있어서, 대조 시료 또는 대조 생물 등의 "대조"는 실험 시료 또는 환자 등의 실험 생물로부터 본 발명의 방법에 따라 얻은 결과와 서로 관련 지우고 비교하는 데에 사용될 수 있다. 전형적으로 대조 생물은 건강한 생물, 특히 암으로 고생하지 않는 생물이다.

"대조치"는 충분히 다수의 대조군을 측정함으로써 대조군으로부터 경험적으로 결정될 수 있다. 대조치는 2 이상, 좋기로는 3 이상, 5 이상, 8 이상, 12 이상, 20 이상, 30 이상, 50 이상 또는 100 이상의 대조군을 측정하여 결정하는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 핵산의 "유도체 (derivative)"는 상기 핵산 내에 단일 또는 2 이상, 4 이상 또는 6 이상, 좋기로는 3 이하, 4 이하, 5 이하, 6 이하, 10 이하, 15 이하, 20 이하 등의 다수의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 및/또는 첨가가 존재하는 것을 의미한다. 또한, 상기 "유도체"라는 용어에는 뉴클레오타이드 염기, 당 또는 포스페이트 상에서의 핵산의 화학적 유도체화가 포함된다. "유도체"라는 용어에는 또한 자연 발생이 아닌 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 핵산이 포함된다.

본 발명에 있어서, 핵산은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)인 것이 좋다. 본 발명에 있어서, 핵산은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합 생산되고 화학 합성된 분자들을 포함한다. 본 발명에 있어서, 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 및 선형 또는 공유 결합성 폐순환 분자로서 존재할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "RNA"라는 용어는 1 이상의 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. "리보뉴클레오타이드"는 베타-D-리보-푸라노즈 부분의 2' 위치에 히드록실기가 있는 뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 용어는 1개 이상의 뉴클레오타이드를 첨가, 결실 치환 및/또는 변경에 의하여 자연 발생 RNA와 상이한 변형 RNA 및 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 부분 정제된 RNA 등의 분리된 RNA, 본질적으로 온전한 (pure) RNA, 합성 RNA 및 재조합 생산된 RNA를 포함한다. 이러한 변형은, 예컨대 RNA의 1개 이상의 뉴클레오타이드에 RNA의 말단 또는 내부 등에 비(非)뉴클레오타이드 물질을 첨가하는 것을 포함한다. RNA 분자에 있는 뉴클레오타이드는 자연 발생이 아닌 뉴클레오타이드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드 등의 비표준 뉴클레오타이드도 역시 포함할 수 있다. 이들 변형 RNA들은 유사체 또는 자연 발생 RNA의 유사체로 부를 수 있다.

본 발명에 기재된 상기 핵산은 분리되는 것이 좋다. 본 발명에 있어서, 상기 "분리된 핵산"이라는 용어는 (i) 예컨대, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의하여, 생체외(in vitro) 증폭되거나, (ii) 클로닝에 의하여 재조합적으로 생산되거나, (iii) 예컨대, 절단 및 겔-전기영동 분획에 의하여 정제되거나, (iv) 예컨대, 화학 합성에 의하여 합성된 것을 의미한다. 분리된 핵산은 재조합 DNA 기술에 의한 조작에 사용 가능한 핵산이다.

두 핵산 서열이 서로 혼성화 가능하고 서로 안정된 듀플렉스를 형성할 수 있는 경우, 하나의 핵산이 다른 하나의 핵산에 대하여 "상보적"이라고 하며, 이 때, 상기 혼성화는 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건 (엄격한 조건) 하에서 수행되는 것이 좋다. 엄격한 조건은, 예컨대, 문헌 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook 등, Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel 등, Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 기재되어 있으며, 예컨대, 65 ℃의 혼성화 완충액 (3.5 x SSC, 0.02 % Ficoll, 0.02 % 폴리비닐피롤리돈, 0.02 % 소 혈청 알부민, 2.5　mM NaH₂PO₄ (pH 7), 0.5 % SDS, 2　mM EDTA)에서의 혼성화를 기재하고 있다. SSC는 pH 7의 0.15　M 염화나트륨/0.15　M 시트르산나트륨이다. 혼성화 후, DNA가 전이된 막을, 예컨대, 실온에서 2 x SSC로 세척하고 나서, 68 ℃에 이르는 온도에서 0.1 내지 0.5 x SSC/0.1 x SDS로 세척한다.

본 발명에 있어서, 상보적 핵산은 적어도 40 %, 특히 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 % 및 좋기로는 적어도 95 %, 적어도 98 % 또는 적어도 99% 이상의 뉴클레오타이드 상동성을 갖는다.

"동일성 퍼센티지"라는 용어는 가장 잘 정렬된 이후 얻은, 비교될 2개의 서열 사이에 동일성이 있는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 퍼센티지를 나타내는 것으로, 이 퍼센티지는 순전히 통계적인 것이고 2개 서열 간의 차이는 그 길이 전체에 걸쳐 랜덤하게 분포되어 있다. 통상적으로, 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 간의 서열 비교는 이들을 최적으로 정렬시킨 후에, 이들 서열을 비교함으로써 이루어지는데, 상기 비교는 서열이 유사한 부분을 확인하고 비교하기 위하여 단편 또는 "비교의 창"에 의하여 행해진다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 손으로 하는 것 외에도, 스미스와 워터만의 부분적인 상동 알고리즘 (local homology algorithm of Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482), 네들만과 분쉬의 부분적인 상동 알고리즘 (local homology algorithm of Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443), 피어슨과 립만의 유사성 조사법 (similarity search method of Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444) 또는 이들 알고리즘을 이용한 컴퓨터 프로그램 (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)을 이용하여 수행할 수 있다.

동일성 퍼센티지는 비교될 2개 서열 간의 동일한 위치의 수를 측정하고, 이 수를 비교되는 위치의 수로 나눈 후, 이 서열 간의 동일성 퍼센티지를 얻기 위하여 이렇게 얻은 결과에 100을 곱함으로써 계산된다.

본 발명에 있어서, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산은 단독 또는 다른 핵산, 특히 이형(heterologous) 핵산과 조합으로 존재할 수 있다. 양호한 실시 상태에 있어서, 핵산은 상기 핵산에 대하여 상동 또는 이형일 수 있는 발현 제어 서열 또는 조절 서열과 기능적으로 결합되어 있다. 코딩 서열 및 조절 서열이 상기 코딩 서열의 발현 또는 전사가 상기 조절 서열의 제어 또는 영향하에 있도록 하는 방법으로 서로 공유 결합되어 있는 경우, 이들은 서로 "기능적으로(functionally)" 결합되어 있다고 한다. 이 후, 상기 코딩 서열에 기능적으로 결합된 조절 서열과 함께, 상기 코딩 서열이 기능 단백질로 번역되는 경우, 상기 조절 서열의 도입은, 코딩 서열 내에서의 프래임 쉬프트를 일으키거나 상기 코딩 서열이 원하는 단백질 또는 펩티드로 번역되지 못하게 하는 일 없이, 상기 코딩 서열을 전사시킨다.

본 발명에 있어서, "발현 제어 서열" 또는 "조절 서열"이라는 용어는 프로모터, 인핸서 및 기타 유전자의 발현을 조절하는 조절 인자를 포함한다. 본 발명의 특별한 실시 상태에 있어서, 상기 발현 제어 서열은 조절될 수 있다. 조절 서열의 정확한 구조는 종 또는 세포 유형의 기능에 따라서 다양할 것이나, 일반적으로, TATA 박스, 캡 형성(capping) 서열, CAAT 서열 등과 같이, 각각 전사 및 번역의 개시에 수반되는 5' 미전사(untranscribed) 서열 및 5' 미번역(untranslated) 서열을 포함한다. 보다 구체적으로, 5' 미전사 조절 서열은 기능적으로 결합된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 부위를 포함한다. 조절 서열은 또한 인핸서 서열 또는 상류 활성화 인자 서열을 포함한다.

본 발명에 있어서, 핵산은 또한 숙주 세포로부터의 상기 핵산에 의하여 코딩되는 단백질 또는 펩티드의 분비를 제어하는 펩티드를 코딩하는 다른 핵산과 함께 존재할 수 있다. 본 발명에 있어서, 핵산은 또한 코딩되는 단백질 또는 펩티드를 숙주 세포의 세포막 상에 고정시키거나 (anchored), 상기 세포의 특정 세포 기관 내로 구획화시키는 펩티드를 코딩하는 다른 핵산과 함께 존재할 수 있다. 유사하게 기록 유전자 또는 임의의 "태그 (tag)"를 나타내는 핵산과의 조합이 가능하다.

양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 있어서의 재조합 핵산 분자는 벡터이며, 적절한 경우, 예컨대, 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 등의 핵산의 발현을 조절하는 프로모터를 갖는다. "벡터"라 함은 본 명세서에서 그의 가장 일반적인 의미로 사용되며, 상기 핵산을, 예컨대, 원핵 세포 및/또는 진핵 세포 내로 도입시키거나, 적절한 경우, 게놈 내로 통합시킬 수 있는 핵산을 위한 모든 중간 운반체를 포함한다. 이러한 종류의 벡터는 세포 내에서 복제 및/또는 발현되는 것이 좋다. 중간 운반체를, 예컨대, 전기 천공법(穿孔法), 미세 발사물(microprojectiles)에 의한 충격, 리포좀 투여, 아그로박테리아에 의한 전달 또는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스를 통한 삽입에 사용하기 위하여 채택할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 박테리오파지 또는 바이러스 게놈을 포함한다.

본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산을 사용하여 숙주 세포를 형질 감염시킬 수 있다. 본 명세서에서 핵산은 재조합 DNA와 RNA를 모두 의미한다. 재조합 RNA는 DNA 주형의 생체 외 전사에 의하여 제조할 수 있다. 또한, 이를 적용 전에 서열 안정화, 캡형성 및 폴리아데닐화에 의하여 변형시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, "숙주 세포(host cell)"라는 용어는 외래 핵산으로 형질 감염되거나 형질 전환될 수 있는 모든 세포를 의미한다. 본 발명에 있어서, "숙주세포"라는 용어는 원핵 세포 (예컨대, E. coli) 또는 진핵 세포 (예컨대, 수지상 세포, B 세포, CHO 세포, COS 세포, K562 세포, 효모 세포 및 곤충 세포)를 포함한다. 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소, 영장류의 세포 등의 포유류 세포가 특히 좋다. 상기 세포는 다양한 조직 유형으로부터 유래하고 1차 세포 및 세포주 (cell line)를 포함할 수 있다. 특정 실시 상태에 있어서, 케라티노사이트, 말초혈 백혈구, 골수의 줄기 세포 및 배아 줄기 세포가 포함된다. 또 다른 실시 상태에 있어서, 상기 숙주 세포는 항원 제시 세포, 특히, 수지상 세포, 단핵 세포 또는 대식 세포이다. 핵산은 숙주 세포 내에서 단일 복제물 또는 2 이상의 복제물의 형태로 존재할 수 있으며, 일례로서, 숙주 세포 내에서 발현된다.

본 발명에 있어서, "발현"이라는 용어는 그의 가장 일반적인 의미로 사용되며, RNA 또는 RNA 및 단백질의 생산을 포함한다. 이는 또한 핵산의 부분 발현도 포함한다. 또한, 발현은 일시적 또는 안정적으로 수행될 수 있다. 포유류 세포에서의 양호한 발현 시스템으로는 pcDNA3.1 및 pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA) 등이 있으며, 이들은 사이토메갈로바이러스(CMV)의 인핸서-프로모터 서열 및 G418에 대하여 저항성을 부여하는 유전자 (이로 인하여 안정적으로 형질 감염된 세포주를 선별할 수 있음)와 같은 선별 표지를 함유한다.

MHC 분자가 종양 관련 항원 또는 그 일부를 나타내는 본 발명의 경우에 있어서, 발현 벡터는 또한 상기 MHC 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. MHC 분자를 코딩하는 핵산 서열이 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산과 동일한 발현 벡터 상에 존재하거나, 2개 핵산이 상이한 발현 벡터 상에 존재할 수 있다. 후자의 경우, 2개의 발현 벡터를 세포 내로 동시 형질 감염시킬 수 있다. 숙주 세포가 종양 관련 항원 또는 그 일부 및 MHC 분자 모두를 발현시키지 않는 경우, 이들을 코딩하는 2개 핵산을 모두 동일 발현 벡터 또는 상이한 발현 벡터 상에서 세포 내로 형질 감염시킬 수 있다. 세포가 이미 MHC 분자를 발현하는 경우, 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산 서열만이 세포 내로 형질 감염될 수 있다.

본 발명은 또한 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산을 증폭시키기 위한 키트를 포함한다. 이러한 키트는, 예컨대, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 혼성화하는 한 쌍의 증폭 프라이머를 포함한다. 상기 프라이머는 상기 핵산의 인접 뉴클레오타이드 6 내지 50, 특히, 10 내지 30, 15 내지 30 및 20 내지 30의 서열을 포함하고, 프라이머 다이머의 형성을 막기 위하여, 겹쳐지지 않는 것이 좋다. 프라이머 중 하나는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산의 한 가닥과 혼성화하고, 다른 프라이머는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산의 증폭을 가능하게 하는 배열로 상보적 가닥과 혼성화 할 것이다.

"안티센스 분자" 또는 "안티센스 핵산"을 사용하여 핵산 발현을 조절, 특히, 감소시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, "안티센스 분자" 또는 "안티센스 핵산"이라 는 용어는 생리적 조건 하에서 특정 유전자를 포함하는 DNA 또는 상기 유전자의 mRNA와 혼성화하여 상기 유전자의 전사 및/또는 상기 mRNA의 번역을 억제하는, 올리고리보뉴클레오타이드, 올리고데옥시리보뉴클레오타이드, 변형된 올리고리보뉴클레오타이드 또는 변형된 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 등의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 "안티센스 분자"는 또한 핵산 또는 그 일부를 그의 천연 프로모터에 대하여 역방향으로 함유하는 구조물을 포함한다. 핵산 또는 그 일부의 안티센스 전사는 효소를 특정하는 자연 발생 mRNA와 듀플렉스를 형성하여 mRNA의 축적 또는 mRNA의 활성 효소로의 번역을 방지할 수 있다. 핵산을 불활성화시키기 위하여 리보자임을 사용하는 것 또한 가능하다. 본 발명에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산의 인접 뉴클레오타이드 6 내지 50, 특히, 10 내지 30, 15 내지 30 및 20 내지 30의 서열을 가지며, 표적 핵산 또는 그 일부와 완전히 상보적인 것이 좋다.

양호한 실시 상태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 번역 개시 자리, 전사 개시 자리 또는 프로모터 자리와 같은 5' 상류 자리 및 N-말단과 혼성화한다. 또 다른 실시 상태에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 3' 미번역 부위 또는 mRNA 스플라이싱 자리와 혼성화한다.

한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 이들의 조합으로 이루어지며, 하나의 뉴클레오타이드의 5' 말단과 다른 하나의 뉴클레오타이드의 3' 말단은 포스포디에스테르 결합에 의하여 서로 연결되어 있다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 통상적인 방법으로 합성되거나 재조합적으로 생산될 수 있다.

양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 "변형된(modified)" 올리고뉴클레오타이드이다. 본 명세서에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는, 예컨대, 안정성 또는 치료 효율 등을 증진시키기 위하여, 그의 표적에 결합하는 능력을 손상시키지 않는 한, 매우 다양한 방법으로 변형시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, "변형된 올리고뉴클레오타이드"라 함은 (i) 이들의 뉴클레오타이드 중 2 개 이상이 합성 뉴클레오시드 상호 결합 (즉, 포스포디에스테르 결합이 아닌 뉴클레오시드 간 결합)에 의하여 서로 결합되고/결합되거나 (ii) 핵산에서는 일반적으로 발견되지 않는 화학기가 상기 올리고뉴클레오타이드에 공유적으로 결합되어 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 합성 뉴클레오시드 상호 결합은 포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 포스페이트에스테르, 알킬포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트 (phosphoramidates), 카바메이트, 카보네이트, 포스페이트트리에스테르, 아세타미데이트 (acetamidates), 카복시메틸에스테르 및 펩티드인 것이 좋다.

"변형된 올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 또한 공유적으로 변형된 염기 및/또는 당을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. "변형된 올리고뉴클레오타이드"는, 예컨대, 3' 위치의 히드록실기 및 5' 위치의 포스페이트기를 제외한 저분자량 유기 작용기와 공유적으로 결합하는 당 잔기를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 변형된 올리고뉴클레오타이드는, 예컨대, 2'-O-알킬화 리보오스 잔기 또는 리보오스 대신에 아라비노오스와 같은 다른 당을 포함할 수 있다.

*올리고뉴클레오타이드에 대한 전술한 모든 실시 상태가 폴리뉴클레오타이드에도 역시 적용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.

본 명세서에서 사용되는 "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA"는 표적 유전자 또는 mRNA가 품질이 저하된 것을 확인하는 데에 사용되는, 좋기로는 길이가 10 뉴클레오타이드 이상, 더 좋기로는 길이가 15 뉴클레오타이드 이상, 가장 좋기로는 길이가 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오타이드인 분리 RNA 분자를 의미한다. siRNA의 크기로는 19 내지 25 뉴클레오타이드의 범위가 가장 좋다.

본 발명에 따른 siRNA는 부분 정제된 RNA, 실질적으로 완전한 RNA, 합성 RNA 또는 재조합적으로 생산된 RNA와 1개 이상의 뉴클레오타이드의 첨가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의하여 자연 발생 RNA과 상이해진 변경 RNA를 포함할 수 있다. 이러한 변경은, 예컨대 siRNA의 1개 이상의 내부 뉴클레오타이드 또는 siRNA의 말단 등에 비(非)뉴클레오타이드 물질을 첨가; siRNA가 뉴클레아제 소화에 저항성 있도록 하는 변형 (예컨대, 당-인산 골격에 2'-치환 리보뉴클레오타이드 또는 변형을 이용); 또는 siRNA에 있는 1개 이상의 뉴클레오타이드를 데옥시리보뉴클레오타이드로 치환하는 것을 포함한다. 또한, siRNA는 특히, 1개 이상의 포스포로티오에이트 결합을 도입함으로써, 변형 올리고뉴클레오타이드에 대하여 전술한 바와 같이 그 안정성을 증가시키기 위하여 변형될 수 있다.

siRNA의 단일 또는 이중 가닥도 역시 3'-오버행 (overhang)을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "3'-오버행"은 RNA 가닥의 3' 말단으로부터 뻗은 1개 이상의 비결합 뉴클레오타이드를 의미한다. 따라서 한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 siRNA는 길이가 1 내지 약 6개 뉴클레오타이드 (리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드 포함), 좋기로는 1 내지 약 5개 뉴클레오타이드, 더 좋기로는 1 내지 4 뉴클레오타이드, 특히 좋기로는 약 2 내지 약 4 뉴클레오타이드인 1개 이상의 3'오버행을 포함한다. siRNA 분자의 이중 가닥이 3'-오버행을 포함하는 것인 실시 상태에 있어서, 상기 오버행의 길이는 2개 가닥이 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 가장 양호한 실시 상태에 있어서, 3'-오버행은 siRNA의 2개 가닥 모두에 존재하고, 그 길이는 2 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA의 2개 가닥 각각이 디데옥시티미딜산 ("TT") 또는 디우리딜산 ("uu")의 3'-오버행을 포함할 수 있다.

siRNA의 안정성을 증진시키기 위하여, 3'-오버행도 역시 품질 저하에 대하여 안정해질 수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 오버행은 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오타이드 등 퓨린 뉴클레오타이드를 포함함으로써 안정해진다. 별법으로써, 예컨대, 3'-오버행에 있는 우리딘 뉴클레오타이드의 2'-데옥시티미딘으로의 치환 등의 변형 유사체에 의한 피리미딘 뉴클레오타이드의 치환은 용인되며, RNAi의 품질 저하의 효율에 영향을 미치지 않는다. 특히, 2'-데옥시티미딘에 2'-히드록시의 부재는 조직 배양 배지 내에 있는 3'-오버행의 뉴클레아제 저항을 유의적으로 증가시킨다.

siRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 2개의 상보적인 단일 가닥 RNA 분자를 포함하거나, 2개의 상보적인 부위가 염기쌍을 이루고 있고 단일 가닥 "헤어핀" 부위에 의하여 공유적으로 결합된 단일 분자를 포함할 수 있다. 즉, 상기 센스 부위와 안티 센스 부위는 연결 분자에 의하여 공유적으로 결합될 수 있다. 상기 결합 분자는 폴리뉴클레오타이드 또는 비(非)뉴클레오타이드 연결기일 수 있다. 다른 이론에 의하여 뒷받침되기를 기대하지 않고, 후자 유형의 siRNA 분자 내의 헤어핀 부위는 "디서 (Dicer)" 단백질 (또는 그 상당물)에 의하여 세포 내적으로 분열되어 2개의 개별 염기쌍 RNA 분자를 형성하는 것으로 여겨진다.

본 명세서의 "표적 mRNA"는 억제 조절에 대한 표적인 RNA 분자를 의미한다.

pol III 프로모터로부터의 RNA 발현이 첫 번째 전사된 뉴클레오타이드가 퓨린인 경우에만 효율적인 것으로 여겨지듯이, siRNA는 표적 부위의 변화 없이 pol III 발현 벡터로부터 발현될 수 있다.

본 발명에 따른 siRNA는 표적 mRNA 서열 ("표적 서열") 중 임의의 서열에 있는 약 19 내지 25의 인접 뉴클레오타이드의 임의의 잔기를 표적할 수 있다. siRNA에 대한 표적 서열을 선별하는 기술은 예컨대, 그 전문이 본 명세서에 참고로서 포함된 투쉴 (Tuschl T.) 등의 문헌 ("siRNA 이용자 지침", Oct. 11, 2002에 개정)에 기재되어 있다. "siRNA 이용자 지침"은 미국 뉴욕에 있는 록펠러 대학의 RNA 분자 생물학의 연구실의 토마스 투쉴에 의하여 유지되는 세계적인 웹사이트에서 이용가능하고, 록펠러 대학의 웹사이트에 접근하여 찾을 수 있으며, 키워드 "siRNA"로 찾을 수 있다. 따라서 현존 siRNA의 센스 가닥은 표적 mRNA에 있는 약 19개 내지 약 25개의 뉴클레오타이드의 임의의 인접 잔기와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일반적으로, 표적 mRNA 상의 표적 서열은 좋기로는 개시 코돈으로부터 50 내지 100 nt 아래 방향 (즉, 3'-방향)에서 시작하는, 표적 mRNA에 대응하는 소정의 cDNA 서열로부터 선택될 수 있다. 그러나, 표적 서열은 5'- 또는 3'-미번역 부위, 또는 개시 코돈 근처 부위에 위치할 수 있다.

siRNA는 당해 기술분야의 숙련자에게 알려진 다수의 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, siRNA는 그 전문이 본 명세서에 참고로서 포함된 투쉴 등의 미국 공개 출원인 제2002/0086356호에 기재되어 있는 체외 시스템에 있는 드로소필라 등의 당해 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 재조합적으로 생산되거나 화학적으로 합성될 수 있다.

좋기로는, siRNA는 적절하게 보호된 리보뉴클레오시드 포스포르아미디트 및 통상의 DNA/RNA 합성기를 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. siRNA는 2개의 별개의 상보적 RNA 분자 또는 2 군데의 상보적인 부위가 있는 단일 RNA 분자로서 합성될 수 있다.

별법으로써, siRNA는 임의의 적절한 프로모터를 이용하여 재조합 원형 또는 선형 DNA 플라스미드로부터 발현될 수도 있다. siRNA의 투여 또는 siRNA의 약학 조성물에의 편입에 대한 참고가 본 명세서에서 만들어지는 경우, 본 발명에 따른 이러한 실시 상태가 포함된다. 플라스미드로부터 본 발명의 siRNA를 발현시키는 적절한 프로모터로서는 예컨대, U6 또는 H1 RNA pol III 프로모터 서열 및 사이토메갈로바이러스 프로모터를 들 수 있다.

기타 적절한 프로모터의 선별은 당해 기술 분야의 기술 내에 있다. 본 발명의 재조합 플라스미드도 역시 특정 조직 내에서 또는 특정 세포 내의 환경에서 siRNA 발현을 유도하거나 조절가능한 프로모터를 포함할 수 있다.

재조합 플라스미드로부터 발현된 siRNA는 표준 기술에 의하여 배양 세포 발현 시스템으로부터 분리되거나 세포 내부적으로 발현될 수 있다. 생체 외에서 siRNA를 세포로 전달하기 위하여 재조합 플라스미드를 이용하는 것은 더 자세히 후술한다. siRNA는 2개의 분리된 상보적인 RNA 분자들 또는 2 군데의 상보적인 부위가 있는 단일 RNA 분자로서 재조합 플라스미드로부터 발현될 수 있다.

siRNA 발현에 적절한 플라스미드의 선별, siRNA 발현을 위한 핵산 서열을 플라스키드에 삽입하는 방법 및 재조합 플라스미드를 관심 세포로 전달하는 방법이 당해 기술 분야의 기술 범위 내에 있다.

또한, siRNA는 생체 내에서 세포 내부적으로 재조합 바이러스 벡터로부터 발현될 수도 있다. 상기 재조합 바이러스 벡터는 siRNA를 코딩하는 서열 및 siRNA 서열을 발현시키는 임의의 적절한 프로모터를 포함한다. 상기 재조합 바이러스 벡터도 역시 특정 조직 내에서 또는 특정 세포 내의 환경에서 siRNA 발현을 유도하거나 조절가능한 프로모터를 포함할 수 있다. siRNA는 2개의 분리된 상보적인 RNA 분자들 또는 2 군데의 상보적인 부위가 있는 단일 RNA 분자로서 재조합 바이러스 벡터로부터 발현될 수 있다.

"펩티드"라는 용어는 올리고- 및 폴리펩티드를 포함하고, 펩티드 결합에 의하여 공유적으로 연결된 2개 이상, 좋기로는 3개 이상, 4개 이상, 6개 이상, 8개 이상, 10개 이상, 13개 이상, 16개 이상 또는 21개 이상이고, 좋기로는 8개 이하, 10개 이하, 20개 이하, 30개 이하, 40개 이하 또는 50개 이하, 특히 100개 이하의 아미노산을 포함하는 물질을 의미한다. "단백질"이라는 용어는 크기가 큰 펩티드, 좋기로는 100개 이상의 아미노산 잔기를 가진 펩티드를 의미하지만, 일반적으로 "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 유사어이므로, 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

본 발명에 따라 개시된 단백질 및 펩티드를 분리하는 것이 좋다. "분리된 (isolated) 단백질" 또는 "분리된 펩티드"라 함은 그의 본래 환경으로부터 분리된 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 분리된 단백질 또는 펩티드는 본질적으로 정제된 상태일 수 있다. "본질적으로 정제된 (essentially purified)"이라는 용어는 자연 상태 또는 생체 내에서 본질적으로 단백질 또는 펩티드와 결합된 다른 물질이 없는 것을 의미한다.

이러한 단백질 및 펩티드는, 예컨대, 항체의 생산 및 면역학적 또는 진단 분석법에 사용되거나 치료제로서 사용될 수 있다. 본 발명에 개시된 단백질 및 펩티드는 조직 또는 세포 호모제네이트 등의 생물학적 시료로부터 분리될 수 있으며, 또한, 다수의 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 재조합적으로 발현될 수 있다.

본 발명의 목적상, 단백질 또는 펩티드 또는 아미노산 서열의 "유도체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 결실 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다.

아미노산 삽입 변이체는 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 융합 및 특정 아미노산 서열에 있는 1개 또는 2개 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입이 있는 아미노산 서열 변이체의 경우에 있어서, 결과적으로 생성되는 생성물의 적절한 스크리닝이 가능한 무작위 삽입 또한 가능할지라도, 1개 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열의 특정 자리로 삽입된다. 아미노산 결실 변이체는 서열로부터 1개 이상의 아미노산의 제거되는 특징이 있다. 아미노산 치환 변이체는 서열 내의 1개 이상의 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입되는 특징이 있다. 상동 단백질 또는 펩티드 간의 비보존적인 아미노산 서열 내의 위치에 존재하는 변형 및/또는 아미노산을 소수성, 친수성, 전기 음성도, 측쇄의 부피 등과 같은 성질이 유사한 다른 아미노산으로 치환(보존적 치환)하는 것이 좋다. 보존적 치환은, 예컨대, 하나의 아미노산을 치환될 아미노산과 동일한 군에 있는 아래에 열거된 다른 아미노산으로 교체하는 것을 의미한다.

1. 크기가 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성인 잔기: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)

2. 음으로 하전된 잔기 및 그의 아미드: Asn, Asp, Glu, Gln

3. 양으로 하전된 잔기: His, Arg, Lys

4. 크기가 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val (Cys)

5. 크기가 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr, Trp.

세 개의 잔기는, 단백질 구조에 있어서의 이들의 특수한 역할 때문에, 괄호 안에 나타내었다. Gly는 측쇄가 없는 유일한 잔기이기 때문에 사슬에 유연성을 부여한다. Pro는 사슬을 매우 제한하는 특수한 기하학적 구조를 갖는다. Cys는 이황화 가교를 형성할 수 있다.

전술한 아미노산 변이체는, 예컨대, 고상 합성 (solid phase synthesis, Merrifield, 1964) 및 유사한 방법에 의하거나, 재조합 DNA 조작에 의하는 등의 공지의 펩티드 합성 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 치환, 삽입 또는 결실이 있는 단백질 또는 펩티드를 제조하기 위한 DNA 서열 조작은, 예컨대, 삼브룩 (Sambrook) 등 (1989)에 상세히 기술되어 있다.

본 발명에 있어서, 단백질 또는 펩티드의 "유도체"는 또한, 탄수화물, 지질 및/또는 단백질 또는 펩티드 등의 단백질 또는 펩티드와 관련된 임의의 분자의 단일 또는 다중 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함한다. 또한, "유도체"라는 용어는 상기 단백질 또는 펩티드의 모든 기능적 화학 등가물까지 확장한다.

본 발명에 있어서, 종양 관련 항원의 일부 또는 단편은 이들이 유도된 단백질 또는 펩티드의 기능적 특성을 가진다. 이러한 기능적 특성에는 항체와의 상호 작용, 다른 펩티드 또는 단백질과의 상호 작용, 핵산의 선택적 결합 및 효소 활성 등이 있다. 특수한 성질은 MHC 분자와의 복합체를 형성하는 능력, 적절한 경우, 좋기로는 세포 독성 또는 헬퍼 T 세포를 자극함으로써 면역 반응을 일으키는 능력이다. 본 발명의 종양 관련 항원의 일부 또는 단편은 종양 관련 항원의 6개 이상, 특히 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 30개 이상 또는 50개 이상의 연속 아미노산 서열을 포함하는 것이 좋다. 본 발명의 종양 관련 항원의 일부 또는 단편은 종양 관련 항원의 8개 이하, 특히 10개 이하, 12개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 30개 이하 또는 55개 이하에 이르는 연속 아미노산 서열을 포함하는 것이 좋다. 종양 관련 항원의 일부 또는 단편은, 막을 통하여 생기는 것이 아닌 부분, 특히 항원의 세포 밖 부분에 대응하거나 그것으로 이루어진 종양 관련 항원의 일부인 것이 좋다.

본 발명에 따른 종양 관련 항원의 양호한 부분 또는 단편은 특히 생체 내의 세포 독성 T 림프구의 자극에 적합하나, 생체 밖의 치료적 채택 전달을 위한 확장되고 자극된 T 림프구의 생산에도 역시 적합하다.

본 발명에 따르면, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산의 일부 또는 단편은, 적어도 종양 관련 항원 및/또는 상기 정의된 바와 같은 종양 관련 항원의 일부 또는 단편을 코딩하는 핵산의 일부와 관련된다. 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산의 일부 또는 단편은 오픈 리딩 프레임에 대응하는 핵산의 일부인 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 특정 실시 상태는 종양 관련 항원으로부터 유도된 "우성 음성 (dominant negative)" 단백질 또는 펩티드를 제공하는 것을 반드시 수반한다. 우성 음성 단백질 또는 펩티드는, 세포 기관과 상호 작용하는 방식으로, 활성 단백질 또는 펩티드가 세포 기관과 상호 작용하는 것을 방해하거나, 활성 단백질 또는 펩티드와 경쟁하여, 상기 활성 단백질의 효율을 감소시키는, 불활성 단백질 또는 펩티드 변형체이다.

표적 단백질에 특이적으로 결합하는 특이 항체를 함유하는 항혈청은 다양한 표준 방법으로 제조할 수 있다. 예컨대 문헌 ("Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" by Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual" by Ed Harlow, David Lane, ISBN: 0879693142 and "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447) 참조. 이에 대하여, 이들의 자연 형태에서 복합 막 단백질을 인식하는 친화성이 있고 특이적인 항체를 생성하는 것도 역시 가능하다 (Azorsa 등, J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson 등, J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000). 이것은 치료적으로 이용되는 항체의 제조와 특히 관련이 있으나, 다양한 진단적 적용과도 관련이 있다. 이러한 관점에서, 전체 단백질을, 세포 밖의 일부 서열 및 생리(학)적으로 접힌 형태의 표적 분자를 발현하는 세포로 면역시키는 것이 가능하다.

모노클로날 항체는 통상적으로 하이브리도마 기술을 사용하여 제조된다. (자세한 기술 사항은 다음을 참조: "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" by Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual" by Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447).

항체 분자의 소부분인 파라토프 만이 항체가 자신의 에피토프에 결합하는 데 수반된다는 것이 알려져 있다 (cf. Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford). 예컨대, pFc' 및 Fc 부위는 보체 캐스케이드(cascade)의 작용 인자이지만 항원 결합에는 관련되지 않는다. pFc' 부위가 효소적으로 제거되어 있거나 pFc' 부위 없이 생산된, F(ab')₂ 단편이라고 불리는 항체는 완전한 항체의 2개의 항원 결합 부위를 모두 운반한다. 유사하게, Fc 부위가 효소적으로 제거되어 있거나 상기 Fc 부위 없이 생산된, Fab 단편이라고 불리는 항체는 본래 항체 분자의 1개의 항원 결합 부위를 운반한다. 또한, Fab 단편은 공유적으로 결합된 항체 경쇄 및, Fd라고 불리는, 상기 항체의 중쇄 부분으로 구성된다. Fd 단편은 항체 특이성의 주요한 결정 인자이며 (단일 Fd 단편은, 항체의 특이성을 변화시키지 않고, 10개 이하의 서로 다른 경쇄와 결합할 수 있음), Fd 단편은, 분리시, 에피토프에 대한 결합 능력을 보유한다.

항원 에피토프와 직접적으로 상호 작용하는 상보적 결정 부위(complementary-determining regions, CDRs)와 파라토프의 3차 구조를 유지하는 프레임워크 부위 (framework regions, FRs)가 항체의 항원 결합 부위 내에 위치한다. IgG 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄의 Fd 단편은 모두 4 개의 프레임워크 부위 (FR1 내지 FR4)를 포함하며, 이들은 각각 3 개의 상보적 결정 부위 (CDR1 내지 CDR3)에 의하여 분리된다. CDRs, 구체적으로, CDR3 부위, 보다 구체적으로 중쇄의 CDR3 부위가 항체 특이성에 큰 비중으로 관여한다.

포유류 항체의 비(非) CDR 부위는, 본래 항체의 에피토프에 대한 특이성을 그대로 유지하면서, 특이성이 동일하거나 상이한 항체의 유사 부위로 대체될 수 있다는 것이 알려져 있다. 이것은 비인간 CDR이 인간 FR 및/또는 Fc/pFc' 부위에 공유적으로 결합하여 기능적인 항체를 생산하는 "인간화된" 항체의 개발을 가능하게 하였다.

또 한 가지 예로서, WO 92/04381호에는 쥐의 FR 부위의 적어도 일부가 인간 기원의 FR 부위로 대체되어 있는 인간화된 쥐의 RSV 항체의 생산 및 용도가 기재되어 있다. 항원 결합 능력이 있는 본래의 항체의 단편을 포함하는, 이러한 종류의 항체를 종종 "키메라" 항체라고 부른다.

본 발명에 따르면, "항체"라는 용어는 또한 항체의 F(ab')₂, Fab, Fv 및 Fd 단편, Fc 및/또는 FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 경쇄-CDR3 부위가 인간 또는 인간 이외의 상동 서열로 대체되어 있는 키메라 항체, FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 경쇄-CDR3 부위가 인간 또는 인간 이외의 상동 서열로 대체되어 있는 키메라 F(ab')₂-단편 항체, FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 경쇄-CDR3 부위가 인간 또는 인간 이외의 상동 서열로 대체되어 있는 키메라 Fab-단편 항체, 및 FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 부위가 인간 또는 인간 이외의 상동 서열로 대체되어 있는 키메라 Fd-단편 항체를 제공한다. "항체"라는 용어는 "단쇄" 항체도 포함한다.

본 발명은 또한 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 이러한 종류의 결합 물질은, 예컨대, 파지 디스플레이 라이브러리로서 또는 고정화된 형태로 용액 내에서 간단히 제조될 수 있는 변성(degenerate) 펩티드 라이브러리에 의하여 제공될 수 있다. 마찬가지로, 1개 이상의 아미노산이 있는 펩티드의 조합 라이브러리를 제작하는 것이 가능하다. 비펩티드 합성 잔기(nonpeptidic synthetic residues) 및 펩티드의 라이브러리도 역시 제조될 수 있다.

항체는 또한 종양 관련 항원을 발현하는 세포 및 조직을 나타내기 위하여 특이적 진단 물질에 결합될 수 있다. 이들은 또한 치료적으로 유용한 물질과 결합될 수도 있다.

진단 물질은 (ⅰ) 탐지가능한 시그널을 제공, (ⅱ) 예컨대 FRET (형광 공명 에너지 전이) 등의 제1 및 제2 라벨에 의하여 제공된 탐지가능한 시그널을 변형시키는 제2 라벨과 상호 작용, (ⅲ) 전하, 소수성, 모양 또는 기타 물리적 파라미터에 의한 예컨대 전기 영동 이동성 등의 이동성에 영향 또는 (ⅳ) 예컨대 친화도, 항체/항원 또는 이온성 복합체 등의 연결 부분의 제공 기능을 하는 임의의 라벨을 포함한다. 형광 라벨, 발광 라벨, 발색단 라벨, 방사성 동위 원소 라벨, 동위 원소 라벨, 좋기로는 안정한 동위 원소 라벨, 동중핵 (isobaric) 라벨, 효소 라벨, 입자 라벨, 특히 금속 입자 라벨, 자성 입자 라벨, 폴리머 입자 라벨 등의 구조물, 비오틴 등의 작은 유기 분자, 수용체, 또는 세포 부착 단백질 또는 렉틴과 같은 결합 분자의 리간드, 결합제를 사용하여 탐지할 수 있는 핵산 및/또는 아미노산 잔기를 포함하는 라벨 서열 등이 라벨로서 적합하다. 진단 물질로는 황산바륨, 이오세탐산 (iocetamic acid), 이오파노산 (iopanoic acid), 칼슘 이포데이트 (calcium ipodate), 소듐 디아트리조에이트 (sodium diatrizoate), 메글루민 디아트리조에이트 (meglumine diatrizoate), 메트리즈아미드 (metrizamide), 소듐 티로파노에이트 (sodium tyropanoate) 및 불소-18 및 탄소-11과 같은 양전자 방출체, 요오드-123, 테크네튬-99m, 요오드-131 및 인듐 111과 같은 감마 방출체, 불소 및 가돌리늄과 같은 핵 자기 공명용 핵종 (nuclides)을 포함하는 방사성 진단제 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, "치료적으로 유용한 물질"은 치료 효과를 나타낼 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 본 발명에 있어서, 치료적으로 유용한 물질로는 1종 이상의 종양 관련 항원을 발현하는 세포에 선택적으로 도입되는 것이 좋으며, 항암제, 방사성 요오드 표지 화합물, 독소, 세포 증식 억작용제 또는 세포 용해제 등을 포함한다. 항암제로는, 예컨대, 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 아자티오프린 (azathioprine), 황산벨로마이신 (bleomycin sulfate), 부설판 (busulfan), 카무스틴 (carmustine), 클로람부실 (chlorambucil), 시스플라틴 (cisplatin), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 시클로스포린 (cyclosporine), 시타라비딘 (cytarabidine), 다카바진 (dacarbazine), 닥티노마이신 (dactinomycin), 다우노루빈 (daunorubin), 독소루비신 (doxorubicin), 택솔 (taxol), 에토포시드 (etoposide), 플루오로우라실 (fluorouracil), 인터페론-α, 로무스틴 (lomustine), 머캅토퓨린 (mercaptopurine), 메토트렉세이트 (methotrexate), 미토탄 (mitotane), 프로카바진 HCl (procarbazine HCl), 티오구아닌 (thioguanine), 황산빈블라스틴 (vinblastine sulfate) 및 황산빈크리스틴 (vincristine sulfate) 등을 들 수 있다. 기타 항암제가, 예컨대, 구드만 (Goodman)과 길만 (Gilman)의 문헌 ["The Pharmacological Basis of Therapeutics" (8th Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc.), 특히 52장 [Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner]]에 개시되어 있다. 독소는 포크위드 (pokeweed) 항바이러스 단백질, 콜레라 독소, 백일해 독소 (pertussis toxin), 리신 (ricin), 겔로닌 (gelonin), 아브린 (abrin), 디프테리아 외독소 (diphtheria exotoxin) 또는 수도모나스 (Pseudomonas) 외독소 등의 단백질일 수 있다. 독소 잔기는 또한 코발트-60 등의 고에너지 방출 방사성 핵종(radionuclide)일 수도 있다.

"주요 조직 적합 유전자 복합체" 또는 "MHC"라는 용어는 모든 척추 동물에존재하는 유전자 복합체를 의미하는 것이다. MHC 단백질 또는 분자는, T 세포 수용체 (TCR)에 의하여 인식되도록 펩티드에 결합하고 이들을 제시함으로써, 정상의 면역 반응에 있어서 림프구와 항원 제시 세포 사이의 시그널링에 관여한다. MHC 분자는 세포 내부의 처리 구역 내의 펩티드에 결합하고, T 세포가 인식하도록 이들 펩티드를 항원 제시 세포의 표면에 제시한다. HLA로도 불리는 상기 인간 MHC 부위는 염색체 6 위에 위치하고 클래스 I 및 클래스 II 부위를 포함한다. 본 발명의 모든 측면의 한 가지 양호한 실시 상태에 있어서, MHC 분자는 HLA 분자이다.

본 명세서에서 사용되는 "감소" 또는 "억제"는 농도, 예컨대 대조 시료 (예컨대, siRNA로 처리하지 않은 시료)와 비교시 단백질 또는 mRNA 농도의 전부 감소, 좋기로는 20% 이상, 더 좋기로는 50% 이상, 가장 좋기로는 75% 이상 감소시키는 능력을 의미한다. RNA 또는 단백질 발현의 감소 또는 억제는 표적 mRNA 분열 또는 질저하에 의하여 일어날 수 있다. 단백질 발현 또는 핵산 발현을 위한 분석은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 예컨대 ELISA, 단백질 발현 분석인 웨스턴 블롯 분석 및 RNA 발현 분석인 노던 블롯팅 또는 RNase 보호 분석이 포함된다.

본 발명에 있어서, "환자"는 인간, 인간 이외의 영장류 또는 다른 동물, 특히 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 마우스와 래트 등의 설치류와 같은 포유류이다. 특히 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 환자는 인간이다.

본 발명에 있어서, "비정상적 발현"은 건강한 개체의 상태와 비교시 발현이 변화된 것, 좋기로는, 증가된 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, "증가" 또는 "증가량"은 10% 이상, 특히 20% 이상, 50% 이상 또는 100% 이상의 증가를 의미한다. 만일 시험 시료에서는 탐지가능하나 대조 시료에서는 탐지 불가하거나 존재하지 않는 경우라면, 물질은 양도 역시 대조 시료와 비교시 생물학적 시료 등의 시험 시료에서 증가한다.

본 발명에 있어서, "질환"은 종양 관련 항원이 발현되거나 비정상적으로 발현되는 임의의 병리학적 상태를 의미한다. 본 발명에 있어서, "비정상적 발현"은 건강한 개체의 상태와 비교시 발현이 변화된 것, 좋기로는, 증가된 것을 의미한다. 발현에 있어서의 증가는 10% 이상, 특히 20% 이상, 50% 이상 또는 100% 이상의 증가를 의미한다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 종양 관련 항원은 질환이 있는 개체의 조직에서만 발현하는 반면, 건강한 개체에서의 발현은 억제된다. 이러한 질환의 한 예로서 암을 들 수 있으며, 본 발명에 있어서, "암"은 백혈병, 정상피종 (seminomas), 흑색종, 기형종 (teratomas), 림프종, 신경아세포종, 신경아교종 (gliomas), 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌암, 자궁 경부암, 소장암, 간암, 결장암, 위암, 창자암 (intestinal cancer), 두경부암, 위장관암 , 림프절암, 식도암, 결장직장암, 췌장암, 이비인후 (ENT) 암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암 및 폐암 및 이들의 전이를 포함한다. 이들의 예로는 폐 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 결장 암종, 신장 세포 암종, 자궁 경부 암종 또는 전술한 종양 또는 암 유형의 전이가 있다. 본 발명에 있어서, 암이라는 용어는 암 전이도 역시 포함한다.

"종양"은 신속하고 비통제적인 세포 증식에 의하여 성장하고 새로운 성장 중단을 개시하는 자극 이후에도 계속적으로 성장하는 비정상적인 세포군 또는 조직군을 의미한다. 종양은 구조 조직 및 정상 세포와의 기능적 배위의 부분 또는 완전한 결핍을 나타내고, 전혀 다른 조직 덩어리를 형성하는데, 이것은 양성이거나 악성일 수 있다.

"전이"는 그 본래 부위에서 몸의 다른 부위로 암 세포가 퍼지는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정으로 제1차 종양으로부터 악성 세포의 분리, 세포 밖 매트릭스의 침입, 체강 및 혈관에 들어가기 위한 내피 기저막 투과 및 그리고 나서 혈액에 의하여 이송된 후에 표적 기관에의 침입에 좌우된다. 최종적으로 표적 자리에서의 새로운 종양 성장은 신생 혈관 형성에 의존한다. 종양 전이는 종종 제1차 종양을 제거한 후에도 발생하는데, 이는 종양 세포 또는 성분이 남아있어서 전이 가능성을 발전시킬 것이기 때문이다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 "전이"라는 용어는 부위 림프절계 및 제1차 종양에서 떨어져 있는 전이를 의미하는 "원격 전이 (distant metastasis)"를 말한다.

본 발명에 있어서, 생물학적 시료는 체액을 포함하는 조직 시료 및/또는 세포 시료일 수 있고, 본 명세서에 기재된 다양한 방법에 사용하기 위하여, 세절 채취 생검(punch biopsy)을 포함하는 조직 생검 및 혈액, 기관지 흡인물, 가래, 소변, 대변 또는 기타 체액을 채취하는 등의 통상적인 방법으로 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서 "생물학적 시료"라는 용어는 생물학적 시료의 단편도 역시 포함한다.

본 발명에 있어서, "면역 활성 세포"라 함은 적절한 자극에 의하여 면역 세포 (B 세포, 헬퍼 T 세포 또는 세포 용해 T 세포 등)로 성숙할 수 있는 세포를 의미한다. 면역 활성 세포는 CD34⁺ 조혈 모세포 (hematopoietic stem cells), 미숙 및 성숙 T 세포, 및 미숙 및 성숙 B 세포를 포함한다. 종양 관련 항원을 인식하는 세포 용해성 또는 T 헬퍼 세포의 생산이 소망되는 경우, 세포 용해성 T 세포 및 T 헬퍼 세포의 생산, 분화 및/또는 선별에 유리한 조건하에서 상기 면역 활성 세포를 종양 관련 항원을 발현하는 세포와 접촉시킨다. 항원에 노출시 T 세포 전구체의 세포 용해성 T 세포로의 분화는 면역계의 클론 선택 (clonal selection)과 유사하다.

"T 세포" 및 "T 림프구"라는 용어는 본 명세서에서 상호교환하여 이용되며, 세포 용해성 T 세포를 포함하는 세포 독성 T 세포와 헬퍼 T 세포를 포함한다.

일부 치료 방법, 1종 이상의 종양 관련 항원을 제시하는 암세포와 같은 항원 제시 세포의 세포 용해를 일으키는, 환자의 면역계 반응에 기초한다. 이와 관련하여, 예컨대, 종양 관련 항원과 MHC 분자의 복합체에 특이적인 자기 유래 (autologous) 세포 독성 T 림프구를 세포 이상을 갖는 환자에게 투여한다. 이러한 세포 독성 T 림프구의 생체 외(in vitro) 생산이 공지되어 있다. T 세포를 분화시키는 방법의 일례를 WO-A-9633265에서 찾을 수 있다. 일반적으로, 혈액 세포와 같은 세포를 함유하는 시료를 환자로부터 채취하고, 상기 세포를 복합체를 제시하고 세포 독성 T 림프구 (예컨대, 수지상 세포)의 증식을 유발시킬수 있는 세포와 접촉시킨다. 표적 세포는 COS 세포와 같이 형질 감염된 세포일 수 있다. 이러한 형질 감염된 세포는 자신의 표면에 원하는 복합체를 제시하고, 세포 독성 T 림프구와 접촉시, 후자의 증식을 촉진시킨다. 그리고 나서, 상기 클론 확장된 (clonally expanded) 자기 유래 세포 독성 T 림프구를 환자에 투여한다.

항원 특이적 세포 독성 T 림프구를 선별하는 또 다른 방법에 있어서, MHC 클래스 I 분자/펩티드 복합체의 형광 테트라머를 세포 독성 T 림프구의 특정 클론을 검출하는데 사용한다 (Altman 등, Science 274:94-96, 1996; Dunbar 등, Curr . Biol. 8:413-416, 1998).

본 발명은 입양 전이 (adoptive transfer)(Greenberg, J. Immunol . 136(5):1917, 1986; Riddel 등, Science 257:238, 1992; Lynch 등, Eur . J. Immunol. 21:1403-1410, 1991; Kast 등, Cell 59:603-614, 1989)라 부르는 치료 방법을 포함하는데, 여기서 소망하는 복합체(예컨대, 수지상 세포)를 제시하는 세포는 치료하고자 하는 환자의 세포 독성 T 림프구와 결합하여, 특정 세포 독성 T 림프구를 증식시킨다. 그리고 나서, 상기 증식된 세포 독성 T 림프구를 특정 복합체를 제시하는 특이한 비정상 세포로 특징되는 세포 이형(anomaly)을 갖는 환자에게 투여한다. 그리고 나면, 상기 세포 독성 T 림프구는 상기 비정상 세포를 용해시키어, 소망하는 치료 효과가 달성된다.

또한, 소망하는 복합체 (예컨대, 수지상 세포)를 제시하는 세포를 건강한 개체 또는 다른 종 (예컨대, 마우스)의 세포 독성 T 림프구와 결합시키는데, 이는 친화도가 높은 특이적 세포 독성 T 림프구를 증식시킨다. 이들 증식된 특이적 T 림프구의 높은 친화성의 T 세포 수용체를 클로닝하고, 필요에 따라 상이한 정도로 인간화하여, 이렇게 얻은 T 세포 수용체를 예컨대 레트로바이러스 벡터를 사용하여, 유전자 전이를 통하여 환자의 T 세포 내로 형질 도입시킬 수 있다. 그리고 나서, 이들 유전자 변형된 T 림프구를 사용하여 입양 전이를 수행한다 (Stanislawski 등, Nat Immunol. 2:962-70, 2001; Kessels 등, Nat Immunol. 2:957-61, 2001).

입양 전이는 본 발명에 따라 적용될 수 있는 치료의 형태인 것만은 아니다. 세포 독성 T 림프구는 또한 공지된 방법 자체로 생체 내(in vivo) 생성 가능하다. 한 가지 방법은 상기 복합체를 발현하는 비증식성 세포를 이용한다. 본 발명에서 사용되는 세포는 복합체의 제시에 필요한 하나 또는 양쪽 유전자로 형질 감염된 세포 또는 방사선 조사된 종양 세포와 같이, 일반적으로 복합체 (즉, 항원 펩티드 및 제시 MHC 분자)를 발현하는 세포일 수 있다. 또 다른 양호한 형태는, 예컨대, 리포좀 전달(liposomal transfer) 또는 전기 영동에 의하여 세포 내로 도입될 수 있는 재조합 RNA 형태로 종양 관련 항원을 도입하는 것이다. 결과적으로 얻은 세포는 원하는 복합체를 제시하고, 이후 증식되는 자기 유래 세포 독성 T 림프구에 의하여 인식된다.

항원 제시 세포 내로의 생체 내 통합을 가능하게 하기 위하여 종양 관련 항원 또는 그 단편을 보조제와 조합함으로써 유사한 효과를 얻을 수 있다. 상기 종양 관련 항원 또는 그 단편은 단백질, DNA (예컨대, 벡터 내에 포함되어), 또는 RNA로서 표현될 수 있다. 상기 종양 관련 항원은 MHC 분자에 대한 펩티드 파트너를 생산하도록 가공되는 한편, 그의 단편은 추가적인 가공이 필요없이 제시될 수 있다. 후자는 특히, 이들이 MHC 분자에 결합할 수 있는 경우이다. 완전한 항원이 수지상 세포에 의하여 생체 내에서 가공되는 투여 형태가 좋은데, 이는 효과적인 면역 응답에 요구되는 T 헬퍼 세포 반응을 생성할 수 있기 때문이다 (Ossendorp 등, Immunol Lett. 74:75-9, 2000; Ossendorp 등, J. Exp . Med . 187:693-702, 1998). 일반적으로, 종양 관련 항원의 유효량을, 예컨대, 내피 (intradermal) 주입을 통하여, 환자에게 투여하는 것이 가능하다. 그러나, 림프절 내로 주입하는 것도 가능하다 (Maloy 등, Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303, 2001).

또한, 본 발명에 따라 기재된 약학 조성물 및 치료 방법은 본 명세서에 기재된 질환을 치료학적으로 치료 또는 예방하기 위한 면역화 또는 백신 접종에 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, "면역화" 또는 "백신 접종"라 함은 항원에 대한 면역 반응을 증가시키거나 활성화시키는 것을 의미한다. 종양 관련 항원 또는 이를 코딩하는 핵산의 사용에 의한 암에 대한 면역 효과를 테스트하기 위하여 동물 모델을 사용하는 것이 가능하다. 예컨대, 인간 암세포를 마우스에 도입시켜, 암을 유발하고, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산을 하나 이상 투여할 수 있다. 암세포에 대한 효과 (예컨대, 종양 크기의 감소)를 핵산에 의한 면역화의 유효성을 측정함으로서 측정할 수 있다.

면역화 또는 백신 접종을 위한 조성물의 일부로서, 한 가지 이상의 종양 관련 항원 또는 그의 자극 단편을 면역 반응을 유도하거나 면역 응답을 증가시키기 위한 1종 이상의 보조제와 함께 투여한다. 보조제는 항원에 통합되거나 또는 후자와 함께 투여되어 면역 반응을 강화시키는 물질이다. 보조제는 항원 보유체 (reservoir) (세포 외적으로 또는 대식세포 내)를 제공하고, 대식세포를 활성화시키며, 특정 림프구를 자극함으로써 면역 반응을 강화시킨다. 보조제는 알려져 있고, 모노포스포릴 리피드 A (MPL, SmithKline Beecham), QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO　96/33739), QS7, QS17, QS18 및 QS-L1 (So 등, Mol. Cells 7:178-186, 1997)과 같은 사포닌, 불완전 프로인드 보조제 (incomplete Freund's adjuvant), 완전 프로인드 보조제 (complete Freund's adjuvant), 비타민 E, 몬타나이드 (montanide), 알룸 (alum), CpG 올리고뉴클레오타이드 (cf. Kreig 등, Nature 374:546-9, 1995) 및 스쿠알렌 및/또는 토코페롤과 같은 생분해성 오일로부터 제조되는 다양한 유중수 (water-in-oil) 에멀젼을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 펩티드를 DQS21/MPL과 혼합하여 투여하는 것이 좋다. MPL에 대한 DQS21의 비율은 통상적으로 약 1:10 내지 10:1이고, 약 1:5 내지 5:1이 좋고, 약 1:1이 특히 좋다. 인간에 투여하기 위하여, 백신 작용제는 통상적으로 DQS21 및 MPL를 약 1 ㎍ 내지 약 100 ㎍ 범위로 함유한다.

환자의 면역 반응을 자극하는 다른 물질도 역시 투여될 수 있다. 예컨대, 그의 림프구에 대한 조절 특성이 있기 때문에, 사이토카인을 백신 접종에 사용할 수 있다. 이러한 사이토카인에는, 예컨대, 백신의 보호 작용을 증가시키는 것으로 나타난 인터루킨-12 (IL-12) (cf. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF 및 IL-18 등이 있다.

면역 반응을 강화시키므로 백신 접종에 사용될 수 있는 다수의 화합물이 있다. 상기 화합물은 B7-1 및 B7-2 (각각, CD80 및 CD86) 등의 단백질 또는 핵산의 형태로 제공되는 공동 자극 분자를 포함한다.

본 발명은 또한 핵산, 단백질 또는 펩티드를 투여하는 것을 제공한다. 단백질과 펩티드는 공지된 방법 그대로 투여될 수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 생체 외적 (ex vivo) 방법, 즉, 세포를 환자로부터 추출하여, 종양 관련 항원을 통합시키기 위하여 상기 세포를 유전자 변형시키고, 상기 변형된 세포를 환자 내로 다시 도입함으로써, 핵산을 투여한다. 이는 일반적으로 유전자의 기능적 복제를 환자의 세포 내로 생체 외에서(in vitro) 도입하고, 상기 유전자 변형된 세포를 환자 내로 재도입하는 것을 포함한다. 상기 유전자의 기능적 복제는 상기 유전자가 유전자 변형된 세포에서 발현될 수 있도록 하는 조절 인자의 기능적 조절하에 있다. 형질 감염법 및 형질 도입법은 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 또한, 본 발명은 표적 제어 리포좀 및 바이러스와 같은 벡터를 사용하여 생체 내에서 핵산을 투여하는 것을 제공한다. 본 발명에 따라서, 핵산을 약학 조성물 내에 편입시키거나 투여하는 것에 대한 참고가 만들어지는 경우, 이것은 이러한 벡터 내에 핵산이 존재하는 것인 실시 상태를 포함한다.

양호한 실시 상태에 있어서, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산을 투여하기 위한 바이러스 또는 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 백시니아 바이러스 및 약독화 폭스 바이러스 등의 폭스 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스 (Semliki Forest virus), 레트로바이러스, 신드비스 바이러스 (Sindbis virus) 및 Ty 바이러스 유사 입자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아데노바이러스 및 레트로바이러스가 특히 좋다. 레트로바이러스는 통상적으로 복제 결함이 있다 (즉, 이들은 감염성 입자를 생성할 수 없다).

핵산을 생체 외 또는 생체 내적으로 세포 내로 도입시키기 위하여 다양한 방법으로는 핵산 CaPO₄ 침전물의 형질 감염, DEAE와 관련된 핵산의 형질 감염, 원하는 핵산을 운반하는 상기 바이러스로의 형질 감염 또는 감염, 리포좀 매개 형질 감염 등을 들 수 있다. 특별한 실시 상태에 있어서, 핵산을 특정 세포로 도입시키는 것이 좋다. 이러한 실시 상태에 있어서, 핵산을 세포에 투여하기 위하여 사용되는 담체 (예컨대, 레트로바이러스 또는 리포좀)는 결합된 표적 제어 분자를 가질 수 있다. 예컨대, 표적 세포 상의 표면 막 단백질에 특이적인 항체 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드와 같은 분자를 상기 핵산 담체 내로 통합시키거나 여기에 부착시킬 수 있다. 바람직한 항체는 종양 관련 항원에 선택적으로 결합하는 항체를 포함한다. 핵산이 리포좀을 통하여 투여되는 것이 소망되는 경우, 표적 제어 및/또는 흡수를 가능하게 하기 위하여, 엔도사이토시스와 관련된 표면 막 단백질에 결합하는 단백질을 리포좀 작용제에 포함시킬 수 있다. 이러한 단백질로는 특정 세포 유형에 특이적인 캡시드 단백질 또는 그 단편, 흡수되는(internalized) 단백질에 대한 항체, 세포 내 자리를 어드레싱(addressing)하는 단백질 등이 있다.

본 발명의 치료 조성물은 약학적으로 양립 가능한 작용제로 투여될 수 있다. 이러한 작용제는 일반적으로 약학적으로 양립 가능한 농도의 염, 완충 물질, 보존제, 담체, 예컨대, CpG 올리고뉴클레오타이드, 사이토카인, 케모카인, 사포닌 , GM-CSF 및/또는 RNA 등의 보조제와 같은 면역 강화제를 함유하며, 적절한 경우, 다른 치료 활성 화합물을 함유할 수 있다.

본 발명의 상기 치료 활성 화합물은 주사 또는 주입 (infusion)을 포함하는 통상적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 상기 투여는, 예컨대, 경구, 정맥내, 복막내, 근육내, 피하 또는 경피적 투여일 수 있다. 항체는 폐 에어로졸에 의하여 치료적으로 투여하는 것이 좋다. 안티센스 핵산은 느린 정맥내 투여로 투여하는 것이 좋다.

본 발명의 조성물은 유효량으로 투여된다. "유효량"이라 함은 단독 또는 추가 투여량과 함께 소망하는 반응 또는 소망하는 효과를 달성하는 양을 의미한다. 하나 이상의 종양 관련 항원 발현 특성을 갖는 특정 질환 또는 특정 증상의 치료의 경우, 상기 소망하는 반응은 상기 질병의 경과를 억제하는 것과 관계된 것이다. 이는 질환 진행 속도를 늦추고, 특히, 질환 진행을 중단 또는 역행시키는 것을 포함한다. 이러한 질환 또는 증상의 치료에 있어서의 소망하는 반응은 또한 상기 질환 또는 상기 증상의 발병을 예방하거나 발병을 지연시키는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 암의 진단 또는 치료는 이미 형성되거나 형성될 것인 암전이를 진단 또는 치료하는 것도 역시 포함한다. 본 발명에서 "치료"라는 용어는 치료적 치료와 예컨대 예방과 같은 예방적 치료를 포함한다.

본 발명의 조성물의 유효량은 치료하고자 하는 증상, 질병의 증세, 연령, 생리적 조건, 키 및 체중 등의 환자의 개인적 파라미터, 치료 기간, 동반되는 치료법이 있는 경우 그 유형, 투여의 특정 경로 및 유사 인자에 따라 달라질 것이다.

본 발명의 약학 조성물은 살균 처리되고 치료적 활성 물질을 유효량으로 함유하여 소망하는 반응 또는 소망하는 효과를 발생시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물의 투여량은 투여 유형, 환자의 상태, 소망하는 투여 기간 등과 같은 다양한 파라미터에 따라서 달라질 수 있다. 환자의 반응이 초기 투여량으로 불충분한 경우, 더 많은 투여량 (또는 보다 국소적인 상이한 투여 경로에 의하여 달성되는 효과적으로 증가된 분량)을 사용할 수 있다.

일반적으로, 1　ng 내지 1　mg, 바람직하게는 10　ng 내지 100　㎍ 분량의 종양 관련 항원을 작용제화하고, 치료 또는 면역 반응을 발생시키거나 증가시키기 위하여 투여한다. 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 (DNA 및 RNA)의 투여가 소망되는 경우, 1　ng 내지 0.1　mg 분량을 작용제화하고 투여한다.

본 발명의 약학 조성물을 일반적으로 약학상 양립 가능한 양 및 약학상 양립 가능한 조성으로 투여한다. "약학상 양립 가능한"이라 함은 약학 조성물의 활성 성분의 작용과 상호 작용하지 않는 비독성 물질을 의미한다. 이러한 종류의 작용제는 일반적으로 염, 완충 물질, 보존제, 담체 및, 적절한 경우, 다른 치료적 활성 화합물을 함유할 수 있다. 약제에 사용되는 경우, 상기 염은 약학상 양립 가능하여야 한다. 그러나, 약학상 양립 가능하지 않은 염은 약학상 양립 가능한 염을 제조하는데 사용할 수 있으며, 본 발명에 포함된다. 이러한 종류의 약리적으로 또는 약학상 양립 가능한 염으로는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 숙신산 등의 산으로부터 제조된 것을 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 약학상 양립 가능한 염은 또한 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염과 같은 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염으로서 제조될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 양립 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, "약학상 양립 가능한 담체"라 함은 인간에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 양립 가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 인캡슐레이팅 물질을 의미하는 것이다. "담체"라 함은 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분으로서, 적용을 용이하게 하기 위하여 활성 성분이 결합되어 있는 것을 의미한다. 본 발명의 약학 조성물의 성분은 일반적으로 소망하는 약학적 효과를 실질적으로 손상시키는 상호 작용이 일어나지 않는 것들이다.

본 발명의 약학 조성물은 아세트산염, 시트르산염, 붕산염 및 인산염과 같은 적절한 완충 물질을 함유할 수 있다.

상기 약학 조성물은 또한, 적절한 경우, 염화벤즈알코늄(benzalkonium chloride), 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살(thimerosal)과 같은 적절한 보존제를 함유할 수 있다.

상기 약학 조성물은 일반적으로 일정한 투여 제형으로 제공되며, 알려진 방법 자체로 제조될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 예컨대, 캡슐제, 정제, 로젠지제, 용제, 현탁제, 시럽제, 엘릭서제 또는 에멀젼제 형태일 수 있다.

비경구 투여에 적합한 조성물은 일반적으로, 활성 화합물의 수성 또는 비수성 살균 작용제를 포함하는데, 수용자의 혈액과 등장인 것이 좋다. 양립 가능한 담체 및 용매의 예로는 링거액 또는 염화나트륨 등장액이 있다. 또한, 일반적으로 살균된 고정유(fixed oil)를 용액 또는 현탁액 매질로서 사용할 수 있다.

이하, 본 발명은 후술하는 도면 및 실시예에 의하여 보다 상세히 설명할 것이나, 이들 도면 및 실시예는 단지 예시적인 목적으로 사용된 것이며 본 발명을 한정하는 것이 아니다. 발명의 상세한 설명 및 실시예에 의하여, 본 발명에 포함되는 추가의 실시 상태도 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자가 접근가능하다.

도 1. ISC -468 mRNA 발현
A. ISC-468 특이적 프라이머로 RT-PCR 조사 결과 태반 외의 시험된 어떤 정상 조직 내에서도 유의적인 발현이 나타나지 않았다.
B. 두경부, 간, 신장 및 결장 암종에서의 ISC-468 mRNA 발현.
C. 유방, 난소 및 위 암종에서의 ISC-468 mRNA 발현.
도 2. 정상 조절 조직 및 유방암에서의 ISC -468 mRNA 발현의 정량적인 PCR 분석
ISC-468 특이적 프라이머로 실시간 PCR 조사 결과 정상 고환, 태반, 위 및 PBMC와 모든 유방 암종 생검에서 선택적인 mRNA 발현이 나타났다.
도 3. 정상 고환 및 전립선 암종에서의 특이적 ISC -507 발현
유전자 특이적 ISC-507 프라이머로 RT-PCR 분석 결과 정상 고환 (A) 및 전립선 암종 생검 (B)에서 배타적인 cDNA 증폭이 나타났다.
도 4. ISC -507의 정량적인 발현
ISC-507 특이적 프라이머로 정량적인 RT-PCR 결과 고환, 림프절 및 전립선 시료 및 전립선암 시료에서 선택적인 발현이 나타났다.
도 5. 정상 고환 및 다양한 종양 시료에서의 ISC -466 발현
ISC-466 특이적 프라이머로 RT-PCR 분석 결과 태반을 제외한 정상 조직 내에서 어떠한 발현도 나타나지 않았으나 (A), 두경부 암종 생검 및 신장 암종 생검에서 발현이 나타났다 (B). 또한, 뚜렷한 발현은 유방 암종 및 폐 암종 세포주와 난소 암종 세포주에서 검출되었다 (C 및 D).
도 6 ISC -518 mRNA 발현
ISC-518 특이적 프라이머로 RT-PCR 분석 결과 고환을 제외한 정상 조직 내에서 어떠한 발현도 나타나지 않았다.
도 7. ISC -518의 정량적인 발현
정량적인 RT-PCR 결과 정상 고환 및 간 암종 풀에서 높고 선택적인 발현이 나타났다.
도 8. 정상 및 종양 조직에서의 ISC -477 발현
ISC-477 특이적인 프라이머로 RT-PCR 조사 결과 태반 및 난소 정상 조직에서 선택적인 발현 (A), 조사된 위 암종 (B), 유방, 결장 및 폐 암종 (C) 및 난소와 췌장 암종 시료 (D)에서 높은 발현이 나타났다.
*도 9. ISC -489 mRNA 발현
ISC-489 특이적 프라이머로 RT-PCR 조사 결과 태반 조절 조직에서 선택적인 발현이 나타나고, 추가로, 폐 암종 시료 (A, C), 위 암종 시료 (B, C), 두경부 종양 (C) 및 간암종 시료 (C)에서 다양한 수준의 발현이 나타났다.
도 10. 정상 고환 및 다양한 종양 시료에서의 ISC -461 발현
ISC-461 특이적 프라이머로 RT-PCR 조사 결과 태반 조절 조직에서 선택적인 발현이 나타나고, 추가로 유방 암종 및 흑색종 (B), 유방 암종, 폐 암종 및 흑색종 세포주 (C) 및 난소 암종 세포주 (D)에서 다양한 수준의 발현이 나타났다.
도 11. 태반 및 종양 유도 시료에서 ISC -465 mRNA 발현
ISC-465 특이적 프라이머로 RT-PCR 조사 결과, 태반 (A) 및 유방암, 흑색종, 폐암 또는 위암에서 유도된 일부 세포주 (B)에서 선택적인 발현이 나타났다.
도 12. Mem -030의 정량적인 발현
A. Mem-030 특이적 프라이머로 정량적인 RT-PCR 결과 조사된 두경부 암종 시료 모두에서 유의적인 과발현이 나타났다. 정상 방광, 뇌, 골수, 자궁 경부, 결장, 십이지장, 심장, 폐, 림프절, 유방, 근육, 난소, PBMC, PBMC 활성, 태반, 전립선, 망막, 비장, 위, 고환, 흉선 및 편도선 조직을 분석하였다.
B. 식도, 간, 자궁암 및 흑색종 유도 조직에서 Mem-030의 유포
도 13. Mem -055의 정량적인 발현
Mem 055 특이적 프라이머로 정량적인 RT-PCR 결과, 정상 조절 조직에서 높고 선택적인 발현이 나타나고, 위암 및 폐암 유래 조직에서 유의적인 과발현이 나타난다 (A). Mem-055는 간 암종, 난소 암종 및 유방암 시료에서 과발현된다 (B).
도 14. Mem -062 mRNA 발현
Mem-064 특이적 프라이머로 RT-PCR 분석 결과 고환에서 선택적인 발현이 나타나고, 폐암 유래 조직에서 약한 발현이 나타났다. Mem-064 전사의 강하고 유의적인 발현 농도를 다양한 난소 종양 (B)에서 탐지할 수 있었다.
도 15. 정상 고환 및 신장 세포 암종에서 특이적 Mem -068 발현
유전자 특이적 Mem-068 프라이머로 RT-PCR 분석 결과 정상 고환에서 cDNA 증폭이 나타나고, 태반 (A), 신장 세포 암종 및 위암 (B)에서 약하게 나타난다.
도 16. 정상 고환 및 다양한 종양 시료에서의 Mem -071 발현
Mem-071 특이적 프라이머로 RT-PCR 분석 결과 고환을 제외한 정상 조직 내에서 어떠한 발현도 나타나지 않았다 (A). 또한, 신장 세포 암종 시료 및 위암에서 뚜렷한 발현이 탐지되었다 (B).
도 17. Mem -072 mRNA 발현
Mem-072 특이적 프라이머로 RT-PCR 분석 결과 정상 조직 내에서 어떠한 발현도 나타나지 않았고 (A), 다양한 폐암 시료에서 유의적인 발현이 나타났다 (A+B).
도 18. 정상 및 종양 조직에서 Mem -106 발현
Mem-106 특이적 프라이머로 RT-PCR 조사 결과 고환을 제외한 정상 조직에서 어떠한 발현도 나타나지 않았고 (A), 난소 암종, 전립선 암종, 흑색종 및 결장암 세포주에서 높은 발현이 조사되었다 (B).
도 19. Mem -131 mRNA 발현
Mem-131 특이적 프라이머로 RT-PCR 조사 결과 활성 PBMC를 제외한 시험된 모든 조직에서 유의적인 발현이 나타나지 않았다. 유방 암종과 폐 암종에서 Mem-131 mRNA 발현. 폐 암종과 난소 암종에서 Mem-131 mRNA 발현.
도 20. ISC -468 mRNA 발현
(A) RT-PCR 및 (B) 실시간 PCR (ISC-468 특이적 프라이머로 조사) 결과 정상 고환, 태반 및, 유방 암종 생검의 80%에서 선택적인 mRNA 발현이 나타났다.
도 21. ISC -468 발현의 면역 형광 분석법
(A) ISC-468-eGFP 형질 감염된 세포의 염색으로 항 ISC-468 항체의 특이성을 확인하였다. (B) ISC-468 특이적 RNAi 듀플렉스 또는 비침묵 (non-silencing) 대조 듀플렉스로 형질 감염된 MeOH 고정 세포 염색. (C) ISC-468 특이적 RNAi 듀플렉스 또는 비침묵 대조 듀플렉스로 형질 감염된 비고정 세포의 염색.
도 22. ISC -468 발현의 면역 조직 화학적 분석
(A) 100X, (B) 200X 정상 유방 조직에서 어떠한 발현도 검출되지 않았다. 반대로, (C) 100X, (D) 200X 유방 암종 표본에서 강하고 균질한 막 염색이 관찰되었다.
도 23. ISC -468 mRNA 발현의 RNAi 유도 녹다운
ISC-468 특이적 siRNA 듀플렉스로의 세포 형질 감염은 대조 세포와 비교시 ISC-468 mRNA 발현의 뚜렷한 녹다운을 초래하였다.
도 24. 세포 증식 분석
ISC-468 특이적 siRNA 듀플렉스로의 세포 감염은 대조 세포와 비교시 세포 증식의 뚜렷한 손상을 초래하였다.
도 25. 세포 주기 분석
ISC-468 특이적 siRNA 듀플렉스로의 세포 감염은 대조 세포와 비교시 (A) MCF-7 및 (B) BT-549 유방 암종 세포에서 G1/S 구속을 초래하였다.
도 26. AKT 포스포릴리에룽 ( phosphorylierung )
ISC-468 특이적 siRNA 듀플렉스로의 세포 감염은 대조 세포와 비교시 AKT ㅍ포스포릴리에룽의 뚜렷한 손상을 초래하였다.
도 27. 항체 매개 증식 억제
ISC-468 특이적 항체로 MCF-7 유방 암종 세포의 배양은 관련이 없는 대조 항체로 배양된 세포와 비교시 증식이 감소되었다.
도 28. 세포 증식 분석
ISC-468 특이적 siRNA 듀플렉스로의 세포 감염은 대조 세포와 비교시 (A) 주화성, (B) 화학 운동성 및 (C) 침입에서 뚜렷한 손상을 초래하였다.
도 29. 에스트로겐 수용체 상관관계
유방 암종 시료에서 ISC-468 mRNA 발현 수준은 에스트로겐 수용체 상태와 관련있다. 에러바와 함께 중간값, 10^th 및 90^th 백분위수가 나타난다.
도 30. 17β- 에스트라디올 처리
100nM 17β-에스트라디올로 에스트로겐 수용체 양성 유방 암종 세포주 MCF-7을 처리하여 ISC-468 mRNA 발현을 유도하였다. 에스트로겐 수용체 음성 유방 종양 세포주 MDA-MB-231에서는 어떠한 유도도 보이지 않았다.
도 31. 서열
본 명세서에서 참조로 만들어진 서열을 제시한다.

재료 및 방법

본 명세서에서 언급된 기술 및 방법은 본래 알려진 방식으로 수행되면, 예컨대, "Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y."에 기재되어 있다. 키트 및 시약의 사용을 포함하는 모든 방법은 제조자의 설명서에 따라서 수행한다.

RNA 추출, 폴리 -d(T) 프라이밍된 ( primed ) cDNA 의 제작 및 통상적인 RT - PCR 분석

카오트로픽제(chaotropic agent)로서 구아니듐 이소티오시아네이트를 사용하여 천연 조직 물질로부터 전체 RNA를 추출하였다 (Chomczynski & Sacchi, Anal . Biochem. 162:156-9, 1987). 산성 페놀로 추출하고 이소프로판올로 침전시킨 후, 상기 RNA를 DEPC 처리된 물에 용해시켰다.

제조자의 사용 설명서에 따라, Superscript II (Invitrogen)을 사용하여, 20 ㎕의 반응 혼합물에서, 전체 RNA 4 ㎍으로부터 첫 번째 가닥 cDNA 합성을 수행하였다. 프라이머로서 dT(18) 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다. cDNA의 완전성 및 품질을 혼성화 온도 67℃, PCR 30 사이클 (SEQ ID NO:33,34)에서, p53의 증폭에 의하여 조사하였다.

첫 번째 가닥 cDNA의 집적소 (archive)를 다수의 정상 조직 및 종양 본체 (entities)로부터 제작하였다. 발현 연구를 위하여, 이들 cDNA 0.5　㎕를, GOI 특이적 프라이머 (아래 참조) 및 HotStarTaq DNA 중합효소 (Qiagen) 1 U를 사용하여, 30 ㎕의 반응 혼합물에서 증폭시켰다. 각각의 반응 혼합물은 dNTPs 150μM, 각각의 프라이머 0.3μM 및 10 x 반응 완충물 3　㎕를 함유하였다.

상기 프라이머는 2개의 상이한 엑손에 위치하도록 선택하였으며, 주형인 비가역 (nonreverse) 전사된 DNA를 테스트하여, 잘못된 양성 결과의 원인인 게놈 DNA의 오염에 의한 간섭의 배제를 확인하였다. 95℃에서 15 분 후, HotStarTaq DNA 중합효소를 활성화시키기 위하여, PCR 35 사이클을 수행하였다 (94℃에서 0.5 분, 특정 혼성 온도에서 0.5 분, 72 ℃에서 0.5 분 및 72 ℃에서 6 분간 최종 신장).

이러한 반응물 20　㎕를 분류하고 브롬화에티듐 염색 아가로오스 겔 상에서 분석하였다.

무작위 헥사머 프라이밍된 cDNA 의 제조 및 정량적 실시간 PCR

수개의 유전자의 발현을 실시간 PCR에 의하여 정량화하였다. 삽입 리포터 염료 (reporter dye)로서 SYBR Green를 사용하여 PCR 산물을 검출하였다. SYBR Green의 리포터 형광은 용액 내에서는 억제되고, 상기 염료는 이중 가닥 DNA 단편에 결합한 후에만 활성화된다. 각각의 PCR 사이클 후의 GOI 특이적 프라이머를 사용하는 특이적 증폭의 결과로서 SYBR Green 형광의 증가를 정량화에 사용하였다. 표적 유전자의 발현을 절대적으로 정량화하거나 조사될 조직에서 일정하게 발현되는 대조 유전자의 발현에 대하여 상대적으로 정량화한다. ΔΔ-C_t법 (PE Biosystems, USA)을 사용하여 소위 하우스키핑 유전자로서 18s RNA에 대하여 시료를 표준화한 후에, 발현을 측정하였다. 반응을 이중으로 수행하고, 삼중으로 측정하였다. QuantiTect SYBR Green PCR 키트 (Qiagen, Hilden)를 제조자의 설명서에 따라서 사용하였다. 전술한 프로토콜을 사용하여, 무작위 프라이머(Invitrogen)로 cDNA를 합성하였다. 희석된 cDNA의 각각의 5 μl 부분을 총 부피 30 μl로 하여 PCR에 사용하였다: 센스 프라이머 300　nM, 안티센스 프라이머 300 nM; 초기 변성은 95℃에서 15분; 95℃에서 30초; 30　초간 어닐링; 72℃에서 30　초; 40 사이클. 사용된 프라이머의 서열을 각각의 실시예에서 나타낸다.

클로닝 및 서열 분석

통상적인 방법에 의하여 전장 및 유전자 단편의 클로닝을 수행하였다. 서열을 확인하기 위하여, 교정(proofreading) 폴리머라아제 pfu (Stratagene)를 사용하여 대응 항원을 증폭시켰다. PCR의 완료 후, 사용자의 설명에 따라서 단편을 TOPO-TA 벡터 내로 클로닝하기 위하여, HotStarTaq DNA 폴리머라아제에 의하여 엠플리콘의 말단에 아데노신을 결합시켰다. 상업적 용역에 의하여 시퀀싱을 수행하였다. 통상적인 예측 프로그램 및 알고리즘을 사용하여 서열을 분석하였다.

세포 증식 분석

siRNA 듀플렉스 1x10⁴ 세포로 형질 감염시키고 24시간 후, 다양한 농도의 FCS로 보충된 매질에서 48시간 배양하였다. Wallac Victor2 멀티 라벨 카운터 (Perkin Elmer)에 있는 제조자의 설명서에 따라, DELFIA 세포 증식 키트(Perkin Elmer)를 사용하여, 새로 합성된 DNA 가닥 안으로의 BrdU 편입을 측정함으로써, 증식을 분석하였다.

세포 주기 분석 및 세포 자살

플로우시토메트리 (flowcytometric) DNA 함량 분석에 앞서, 다양한 농도의 FCS로 보충되고, 48시간 후에 거두어 들인 후, 프로피듐요오다이드로 염색한 배지에서 세포를 배양하였다. 자살 세포 및 세포 주기 중 S/G2/M에 있는 세포를CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 정량화하였다.

세포 이동

실험에 앞서, 무혈청 배지에서 12시간 배양된 세포가 있는 8.0 ㎛ 구멍이 있는 막의 트랜스웰 챔버 (transwell chamber)에서 세포 이동을 분석하였다. 전술한 바와 같이 siRNA 듀플렉스로 형질 감염시키고 24시간 후에, siRNA 실험을 위하여, 무혈청 조건으로 세포를 이동시켰다. 400 ㎕ 무혈청 배양 배지 중의 4x10⁴ 세포를 상부 챔버에 첨가하였다. 바닥 챔버는 화학 유인 물질 (chemoattractant)로서 FCS, PDGF-BB (Sigma-Aldrich) 또는 SDF-1α/CXCL12 (R&D Systems)로 보충된 800 ㎕ 배양 배지를 함유하였다. 24시간 후, 막의 바닥 편으로 이동한 세포를 냉각 (ice-cold) 메탄올에서 고정시키고, 막을 잘라내어 현미경의 슬라이드 위에 놓고, 형광현미경용 Hoechst (Dako)와 함께 설치하였다. 무작위로 5개의 가시적인 시야 (100x 배율)에 있는 세포를 각각의 막에 대하여 카운트하였다. 모든 실험을 삼중으로 하였다. (i) 상부 챔버 및 하부 챔버에 어떠한 화학 유인 물질도 첨가하지 않은 동일한 실험 설비, 및 (ii) 상부 챔버 및 하부 챔버 모두에 화학 유인 물질을 첨가한 동일한 실험 설비를 사용하여, 세포의 화학 운동 효과를 분석하였다.

생체 내의 침입 분석

실험에 앞서, 무혈청 배지에서 12시간 배양된 세포가 있는 8.0 ㎛ 구멍이 있는 막의 트랜스웰 챔버 (BD Biosciences)에서 생체 내 침입을 분석하였다. 상부 챔버를 무혈청 배지에서 1 ㎎/㎖로 희석한 매트리겔 (Matrigel) (BD Biosciences) 100 ㎕로 제조하였다. 겔화하기 위하여 챔버를 37℃에서 5시간 배양하였다. 전술한 바와 같이 siRNA 듀플렉스로 형질 감염시키고 24시간 후에, siRNA 실험을 위하여, 무혈청 조건으로 세포를 이동시켰다. 400 ㎕ 무혈청 배양 배지 중의 1x10⁵ 세포를 상부 챔버에 첨가하였다. 바닥 챔버는 화학 유인 물질로서 FCS가 보충된 800 ㎕ 배양 배지를 함유하였다. 24시간 후, 막의 바닥 편으로 침입한 세포를 냉각 (ice-cold) 메탄올에서 고정시키고, 막을 잘라내어 현미경의 슬라이드 위에 놓고, 형광현미경용 Hoechst (Dako)와 함께 설치하였다. 무작위로 5개의 가시적인 시야 (100x 배율)에 있는 세포를 각각의 막에 대하여 카운트하였다. 모든 실험을 삼중으로 하였다.

실시예 1: 종양 치료 및 진단 표적으로서 ISC -468의 동정

ISC-468 (SEQ　ID　NO:1)은 아미노산 (SEQ　ID　NO:2)이 212개이고 분자량이 23,6　kDa인 단백질을 코딩한다.

이것은 임신 중 발현된 태반 특이적 단백질로서 이미 기술되어 있다 (Fant 등, Mol Reprod Dev. 63:430-6, 2002).

상기 단백질은 생물 정보학 기술(TMpred, SOUSI)로 분석된 것처럼, 짧은 추정 세포막 통과 (transmembrane) 도메인(aa 25-47)에 앞서는 아미노산 1 내지 23으로부터 쪼갤 수 있는 신호 펩티드를 갖는 것으로 예측된다. 상기 잔존 단백질은 세포 밖에 있는 것으로 예상되므로, 본 발명에 따라 모노클로날 항체를 위한 표적 구조물로서 사용될 수 있다.

본 발명에 따라, ISC-468을 위한 유전자 특이적 프라이머쌍 (SEQ　ID　NO:3, 4)을 RT-PCR 분석에 사용하여 정상 조직 및 종양 조직의 포괄적인 패널로부터 유도된 cDNA를 증폭시켰다. 기대되는 바와 같이, 이 유전자를 발현시키는 건강한 조직으로서 태반을 확인하였다 (도 1). 그 외 어떠한 정상 기관 조직에서도 어떠한 유의적인 발현이 검출되지 않았다. 본 발명자들은 종양 표본 조사시, 결장, 췌장, 식도, 위, 폐, 유방, 난소, 두경부, 신장, 전립선 및 간암을 비롯한 다양한 종류의 상이한 종양에서 발현 수치가 높고 유의적이라는 놀라운 사실을 발견하였다 (도 1과 2 및 표 1). 60개의 유방암 시료에서의 ISC-468 발현에 대한 정량적인 실시간 RT-PCR 분석을 통하여, 전체 시료의 80%가 유의적인 수치의 ISC-468을 발현시킨다는 것을 나타내었다 (도 20A,B).

[표 1] 정상 및 종양 조직에서의 ISC-468 발현

종양에서 ISC-468 전사의 선택적이고 높은 발현은 이전에 알려지지 않았으며, 혈청과 골수에서 암세포의 퍼짐을 검출하고 기타 조직에서 전이를 검출하기 위하여, RT-PCR 등의 분자 진단 방법용으로 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이 분자는 치료적 접근에 특이적 표적으로 더 사용될 수 있다.

특히 다음의 펩티드가 본 발명에 따른 ISC-468 특이 항체를 생산하기 위하여 선택되었다. SEQ　ID　NO:58, 59, 60, 68, 69, 2. 항체의 선택성은 ISC-468-eGFP 형질 감염된 세포의 면역 형광 분석에 의하여 확인되었다 (도 21A).

내생적 발현 유방 암종 세포주 MCF-7 및 BT-549에서 ISC-468의 세포내 국재성은 면역 형광 분석에 의하여 분석되었다. MeOH 고정 세포 (도 21B) 또는 비고정 세포 (도 21C)의 염색은 ISC-468이 발현 세포의 원형질막에 위치한다는 것을 나타냈다. 염색의 특이성은 ISC-468 발현을 RNAi 유도로 녹다운시키면, 원형질막의 염색이 상실되는 것으로 확인하였다.

또한, ISC-468 특이 항체는 정상 유방 및 유방 암종의 임상 시료에서 ISC-468 발현의 면역 조직 화학적 분석에 사용되었다. ISC-468의 발현은 정상 유방 표본에서는 검출되지 않았다 (도 22A,B). 반대로, 유방 암종 표본은 강하고 동일한 ISC-468 발현을 나타내었다 (도 22C,D). 시그널은 ISC-468이 암세포에서 선택적으로 발현되는 막단백질이라는 것을 확인하면서, 발현 암세포의 원형질막에서 강조되었다.

ISC-468의 세포 밖 도메인은 면역 진단을 위한 표적 구조물 및 모노클로날 항체를 이용한 치료로서 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 또한, ISC-468은 본 발명에 따라 종양 특이적 면역 반응(T 및 B 세포 매개 면역 반응)을 유도하는 백신 (RNA, DNA, 단백질, 펩티드)으로 사용될 수 있다.

ISC-468 발현의 RNAi 유도된 녹다운은 ISC-468 mRNA(서열 번호: 70-73)를 특이적으로 표적화하는 siRNA 듀플렉스로 세포를 감염시킴으로써 달성되었다. 내생적 발현 유방 암종 세포주 MCF-7 및 BT-549의 감염은 ISC-468 mRNA 발현의 안정적이고 특이적인 감소를 초래하였다 (도 23).

ISC-468 발현의 생리적인 기능을 통찰하기 위하여, 수종의 RNAi 기재 생체 밖 세포 분석을 행하였다.BrdU 기재 증식 분석으로 분석할 때, siRNA 듀플렉스로의 유방암 세포주 MCF-7 및 BT-549의 형질 감염은 각 대조군에 비하여 세포 증식의 뚜렷한 감소를 초래하였다 (도 24). FACS 기재 세포 주기 분석은 세포 증식의 저지가 G1/S 정지로부터 초래된다는 것을 나타내었다 (도 25A,B). 또한, ISC-468의 RNAi 유도 녹다운이 AKT 인산화를 억제시킴으로써 내생적 발현 암세포에 있는 AKT 시그날링 경로에 깊은 영향을 미친다는 것을 나타낼 수 있다 (도 26). 또한, 세포가 관계없는 대조 항체와 비교시 ISC-468 특이적 펩티드(SEQ ID NO:68,69)에 반대로 생성되는 ISC-468 특이적 항체로 배양될 때, MCF-7 세포의 증식은 약화되었다 (도 27). 이러한 결과는 ISC-468이 아마도 AKT 시그날링 경로 및 기타의 것들의 성장 인자 유도 활성을 조정함으로써, 암세포 증식에 결정적인 요소라는 것을 나타낸다. ISC-468 자체는 성장 인자, 케모카인 또는 기타 물질의 수용체, 공수용체 또는 막결합 차페론을 나타낼 수 있다.

또한, 암세포의 이동 능력에 미치는 ISC-468 발현의 영향을 분석하였다. 유방 암종 세포주 MCF-7 및 BT-549에서 ISC-468 발현의 RNAi 유도된 녹다운은 트랜스웰 이동 분석으로 평가시 주화성, 화학 운동성 및 세포의 침입에 뚜렷한 손상을 초래하였다 (도 28A,B,C). 주화성, 화학 운동성 및 침입은 암세포의 다른 기관으로의 전이에 있어 중요한 요소이다. 그러므로, 암세포에 있어 ISC-468의 발현은 암세포 전이를 위한 양성 (positive) 인자일 수 있다.

유방 암종에서, ISC-468의 발현이 종양의 에스트로겐 수용체 상태와 관련된다는 것을 보일 수 있다. 60개의 유방 암종 시료에서의 ISC-468 발현의 정량적인 실시간 RT-PCR 분석은 에스트로겐 수용체 양성 유방 암종이 수용체 음성 (negative) 종양보다 ISC-468 발현 수치가 유의적으로 더 높다는 것을 나타내었다 (도 29). 따라서, ISC-468의 발현은 17β-에스트라디올로 처리함으로써 에스트로겐 수용체 양성 유방 암종 세포주 MCF-7에서 유도될 수 있다 (도 30).

실시예 2: 종양 치료 및 진단 표적으로서 ISC -507의 동정

ISC-507 (SEQ　ID　NO:5)은 분자량이 85.6　kDa이고, 754개 아미노산의 단백질 (SEQ　ID　NO:6)을 코딩한다.

ISC-507은 디스인테그린 (disintegrin) 및 금속 단백질 분해효소 활성을 지닌 아연 결합 단백질 과(科)의 하나로 부착 단백질 및/또는 엔도펩티다아제로서 기능할 수 있다. 이 군의 멤버는 수정, 신경 발생, 근육 발달 및 면역 반응을 비롯산 다수의 생물학 공정에 포함되는 것으로서 기술되어 왔다 (Seals 등, Genes Dev . 17(1):7-30, 2003).

ISC-507은 하나의 막통과 도메인 (아미노산 671 내지 687), 크기가 큰 N 말단 세포 밖 세포질 부위 및 짧은 C 말단 세포질 부위를 가질 수 있다.

ISC-507 발현은 정자의 성숙과 결정적으로 관련되는 것인 고환에 인접하는 작은 선인 포유류 부고환에 특이적으로 제한되는 것으로 기록되어 왔다. 문헌에 따르면, ISC-507은 부고환으로부터 정자 표면까지 이동되어 선체(先體) 반응 중 정자 머리에 재분배된다 ((Adachi 등, Mol Reprod Dev. 64:414-21, 2003).

ISC-507 특이적 프라이머(SEQ　ID　NO:7, 8)로 RT-PCR 분석 결과, 고환에서의 선택적인 발현과 전립선 및 림프절 유도 조직에서의 약한 발현을 제외하고 (표 2, 도 4)기타 정상 조직으로부터 ISC-507의 부재 (표 2, 도 3)를 확인하였다.

그러나 본 발명자들은 전립선암에서 ISC-507 발현 수치가 매유 유의적이라는 놀라운 사실을 관찰하였다 (도 3, 4). 이 단백질이 암과 관련되어 있다는 것은 종전에는 보고된 바가 없다.

[표 2] 정상 및 종양 조직에서의 ISC-507 발현

전립선암에 있어 독성 관련 정상 조직의 부재 및 ISC-507의 잦고 유의적인 발현은 본 발명에 따른 단백질을 진단 및 치료 마커로서 가치있게 한다. 본 발명에 있어서 이것은 RT-PCR을 이용한, 혈청, 골수, 소변에서의 분산된 종양 세포의 검출 및 다른 기관에의 전이 검출을 포함한다. 또한, 본 발명에 따라, ISC-507의 세포 밖 도메인은 모노클로날 항체를 이용하여 면역 진단 및 치료를 위한 표적 구조물로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따라, ISC-507은 종양 특이적 면역 반응(T 및 B 세포 매개 면역 반응)을 유도하는 백신 (RNA, DNA, 단백질, 펩티드)로서 사용될 수 있다. ISC-507을 검출하는 항체는 다음의 펩티드 및 단백질과 함께 생산될 수 있다. SEQ　ID　NO:51, 52, 53, 54, 55, 6, 56 및 57.

본 발명에 따라, ISC-507에 결합하는 항체는 치료 또는 진단 목적에 유용할 수 있다.

실시예 3: 종양 치료 및 진단 표적으로서 ISC -466의 동정

ISC-466(SEQ　ID　NO:9)은 분자량 48,2 kDA이고, 426개의 아미노산 단백질 (SEQ　ID　NO:10)을 코딩한다. 임신 특이적 당단백질 과(科)에 속한다. 인간 임신 특이적 당단백질 (PSGs)은 임신 기간 중 태반 합포세포영양막 (syncytiotrophoblasts)에 의하여 주로 제조된 분자군이고, 면역 글로불린 상과(上科)의 일부이다 (Beauchemin 등, Exp Cell Res . 252(2):243-9, 1999).

다른 PSGs와 마찬가지로, ISC-466도 역시 태반에 제한되는 것으로 기록되었다.

본 발명에 따라, ISC-466을 위한 유전자 특이적 프라이머쌍 (SEQ ID NO:11, 12)을 RT-PCR 분석에 사용하여 정상 조직 및 종양 조직의 포괄적인 패널로부터 유도된 cDNA를 증폭시켰다. 상기 RT-PCR 분석을 통해 정상 태반에서 ISC-466 트랜스크립트의 발현과, 흉선 및 난소에서의 약한 발현 (표 3, 도 5A)이 나타났다. 어떤 유의적인 발현도 다른 정상 기관 조직에서 검출되지 않았다. 암세포주 분석으로, 본 발명자들은 유방암 (도 5C), 폐암 (도 5C), 난소암 (도 5D) 및 두경부암 및 신장 암종 (도 5B)을 비롯한 다양한 종류의 종양에서 발현 수치가 높고 유의적이라는 매우 놀라운 사실을 발견하였다.

[표 3] 정상 및 종양 조직에서의 ISC-466 발현

ISC-466이 결장 암종과 관련된다는 관찰(Salahshor 등, BMC Cancer . 5:66, 2005)과 반대로, 본 발명자들의 분석 결과, 두경부, 유방, 난소, 전립선암 및 흑색종을 위한 진단 및 치료 마커로서 본 발명에 따른 ISC-466이 나타났다.

실시예 4: 종양 치료 및 진단 표적으로서 ISC -518의 동정

ISC-518 (SEQ　ID　NO:13)은 237개 아미노산 번역 산물(SEQ　ID　NO:14)을 코딩한다. 그러나, 조직 분포에 관한 데이터 및 암과의 관련성에 관한 어떠한 데이터도 지금까지 이용가능하지 않았다.

ISC-518은 가설의 생물 정보적으로 예견된 유전자/단백질이다. 서열 분석을 통하여 상기 단백질이 막통과 도메인(아미노산 102 내지 118)을 가지고 있다는 것이 알려졌다. 상기 세포 밖 C 말단은 세포 표면 당단백질에서 발생하는 기능 도메인의 특징이 있다.

본 발명에 따라, ISC-518을 위한 유전자 특이적 프라이머쌍 (SEQ　ID　NO:15, 16)을 RT-PCR 분석에 사용하여 정상 조직 및 종양 조직의 포괄적인 패널로부터 유도된 cDNA를 증폭시켰다. 이 유전자를 발현시키는 것으로 본 발명자들이 발견한 유일한 정상 조직은 고환이고, 이와 반대로 다른 정상 기관에서는 ISC-518의 어떠한 유의적인 발현도 탐지가능하지 않았다 (도 6). 종양 표본 조사시, 본 발명자들은 간암종 (hepatocarcinomas)에서 발현 수치가 높고 유의적이라는 매우 놀라운 사실을 발견하였다 (도 7).

[표 4] 정상 조직 및 종양 조직에서의 ISC-518의 발현

생물 정보학 분석 결과 ISC-518로 코딩되는 단백질은 세포 표면 분자를 의미한다는 것이 나타났다. 이 표면 분자의 미리 알려지지 않은 선택적인 발현으로 인하여 치료 목적을 위한 표적, 및 종양 세포의 검출을 위한 진단 방법과 종양 세포의 제거를 위한 치료 방법의 개발을 위한 표적이 된다.

실시예 5: 종양 치료 및 진단 표적으로서 ISC -477의 동정

ISC-477 (SEQ　ID　NO:17)은 130개의 아미노산 번역 산물(SEQ　ID　NO:18)을 코딩한다. ISC-477은 가설의 단백질이다. 조직 분포에 관한 데이터 및 암과의 관련성에 관한 어떠한 데이터도 공적으로 이용가능하지 않았다.

구조 분석은 소수성 부위를 드러내고 이것은 막통과 부위 또는 시그날 펩티드일 수 있다.

본 발명에 따라, ISC-477을 위한 유전자 특이적 프라이머 쌍 (SEQ　ID　NO: 19, 20)을 RT-PCR 분석에 사용하여, 정상 조직 및 종양 조직의 포괄적인 패널로부터 유도된 cDNA를 증폭시켰다. 이 유전자를 발현시키는 것으로 본 발명자들이 발견한 유일한 정상 조직은 태반과 난소이다. 반대로 다른 정상 기관에서는 ISC-477의 어떠한 유의적인 발현도 탐지가능하지 않았다 (도 8A). 종양 표본 조사시, 본 발명자들은 폐암, 난소암, 결장암 및 위암에서 발현 수치가 높고 유의적이라는 매우 놀라운 사실을 발견하였다 (도 8A-D). 발현 수치는 정상 난소에서의 발현보다 분명히 더 높다.

[표 5] 정상 조직 및 종양 조직에서의 ISC-477의 발현

실시예 6: 종양 치료 및 진단 표적으로서 ISC -489의 동정

ISC-489 (SEQ　ID　NO:21)는 363개 아미노산 번역 산물(SEQ　ID　NO:22)을 코딩한다. 상기 단백질은 G 단백질 결합 수용체 과(科) 중 새로 기술된 구성원이다. 그러나, 조직 분포에 관한 데이터 및 암과의 관련성에 관한 어떠한 데이터도 공적으로 이용가능하지 않았다.

본 발명에 따라, ISC-489를 위한 유전자 특이적 프라이머 쌍 (SEQ　ID　NO: 23, 24)을 RT-PCR 분석에 사용하여, 정상 조직 및 종양 조직의 포괄적인 패널로부터 유도된 cDNA를 증폭시켰다. 이 유전자를 발현시키는 것으로 본 발명자들이 발견한 유일한 정상 조직은 태반과 식도 (약한 발현)이다. 반대로 다른 정상 기관에서는 ISC-489의 어떠한 유의적인 발현도 탐지가능하지 않았다 (도 9A). 종양 표본 조사시, 본 발명자들은 두경부암 및 위암에서 발현 수치가 높고 유의적이라는 놀라운 사실을 발견하였다 (도 9B, 9C).

G 단백질 결합 수용체 과(科)의 구성원으로서, ISC-489는 세포 표면에서 표적화될 수 있는 수개의 세포 밖 루프와 7개의 막통과 도메인이 있는 완전한 막 단백질이다.

[표 6] 정상 조직과 종양 조직에서의 ISC-489의 발현

두경부 암종에서 ISC-489의 현저한 발현과 예기치 않은 높은 발생으로 인하여 본 발명에 따른 이 단백질이 진단 및 치료 마커로서 매우 흥미로워진다.

실시예 7: 종양 치료 및 진단 표적으로서 ISC -461의 동정

ISC-461 (SEQ　ID　NO:25)은 분자량이 47,1 kDA이고, 419개 아미노산 단백질(SEQ　ID　NO:26)을 코딩한다.

이것은 임신 특이적 당단백질 과(科)에 속한다. 상기 인간 임신 특이적 당단백질 (PSGs)은 임신 기간 중 태반 합포세포영양막에 의하여 주로 제조된 분자군이고, 면역 글로불린 상과(上科)의 일부이다 (Beauchemin 등, Exp Cell Res . 252(2):243-9, 1999).

다른 PSGs와 마찬가지로, ISC-461도 역시 태반에 제한되는 것으로 기록되었다.

본 발명에 따라, ISC-461을 위한 유전자 특이적 프라이머쌍 (SEQ　ID　NO:11, 27)을 RT-PCR 분석에 사용하여 정상 조직 및 종양 조직의 포괄적인 패널로부터 유도된 cDNA를 증폭시켰다. 기대한 바와 같이, 태반이 이 유전자를 발현시키는 것으로 확인되고, 고환 및 난소에서도 약한 발현이 확인되었다 (도10A 및 10B). 어떤 유의적인 발현도 다른 정상 기관 조직에서 검출되지 않았다. 암 유래 조직과 암세포주의 분석으로, 본 발명자들은 유방암(도 10C), 난소암 (도 10D) 및 흑색종 (도 10B, 10C)을 비롯한 다양한 종류의 종양에서 발현 수치가 높고 유의적이라는 매우 놀라운 사실을 발견하였다.

[표 7] 정상 조직 및 종양 조직에서의 ISC-461 발현

본 발명의 추가의 목적은 진단과 치료 모두에 사용될 수 있는 ISC-461을 위한 스플라이스 변이체를 동정하는 것이었다.

스플라이스 변이체의 분석으로, 본 발명자들은 스플라이스 형태 (SEQ　ID　NO:28) 및 그로써 코드되는 단백질(SEQ　ID　NO:29)을 확인할 수 있었다.

실시예 8: 종양 치료 및 진단 표적으로서 ISC -465의 동정

ISC-465 (SEQ　ID　NO:30)는 분자량이 47,0 kDA인 419개 아미노산 단백질 (SEQ　ID　NO:31)을 코딩한다.

이것은 임신 특이적 당단백질 과(科)에 속한다. 상기 인간 임신 특이적 당단백질 (PSGs)은 임신 기간 중 태반 합포세포영양막에 의하여 주로 제조된 분자군이고, 면역 글로불린 상과(上科)의 일부이다 (Beauchemin 등, Exp Cell Res . 252(2):243-9, 1999).

다른 PSGs와 마찬가지로, ISC-465도 역시 태반에 제한되는 것으로 기록되었다.

본 발명에 따라, ISC-465를 위한 유전자 특이적 프라이머쌍 (SEQ　ID　NO:11, 32)을 RT-PCR 분석에 사용하여 정상 조직 및 종양 조직의 포괄적인 패널로부터 유도된 cDNA를 증폭시켰다. 기대한 바와 같이, 태반이 이 유전자를 발현시키는 것으로 확인되고, 그 외에도 정상 난소에서 약한 발현이 확인되었다 (도11A). 어떤 유의적인 발현도 다른 정상 기관 조직에서 검출되지 않았다. 암 유래 조직과 암세포주의 분석으로, 본 발명자들은 다양한 종류의 종양 (도 11A, 11B), 특히 유방암 (도 11B)에서 발현 수치가 높고 유의적이라는 놀라운 사실을 발견하였다.

[표 8] 정상 조직 및 종양 조직에서의 ISC-465 발현

종양에서 ISC-465 전사의 선택적이고 높은 발현은 미리 알려져 있지 않았고, 혈청 및 골수에 있는 종양 세포의 분산을 검출하고, 기타 조직에의 전이를 검출하기 위하여, 본 발명에 따라, RT-PCR 등의 분자 진단 방법용으로 사용될 수 있다. 이 분자는 치료적 접근을 위한 특이 표적으로서 더 사용될 수 있다.

실시예 9: 종양 치료 및 진단 표적으로서 Mem -030의 동정

Mem-030 (SEQ　ID　NO:35)은 분자량 67,9 kDA인 592개 아미노산 단백질(SEQ　ID　NO:36)을 코딩한다.

Mem-030은 GTP, GDP 및 GMP에 결합하여 GMP 뿐만 아니라 GTP의 GDP로의 가수 분해를 촉매할 수 있는 크기가 큰 GTPases인 GBP-단백질에 속한다 (Cheng 등, J Biol. Chem . 260:15834-9, 1985). GTPases는 세포 증식, 분화, 시그날 변환 및 세포 내 단백질 수송에 중요한 역할을 하고, 유도할 수 있는 인터페론이다 (Boehm 등, J Immunol . 161(12):6715-23, 1998).

또한, Mem-030은 내피 세포 위에 있는 IFN-g, 인터루킨 1-b (IL-1b) 및 종양 사멸 인자-a (TNF-a) 1과 같은 염증성 시토카인의 증식 효과를 방해한다 (Guenzi 등, EMBO J. 20(20):5568-77, 2001).

본 발명에 따라, Mem-030을 위한 유전자 특이적 프라이머쌍 (SEQ　ID　NO: 37, 38)을 실시간 RT-PCR 분석에 사용하여 정상 조직 및 종양 조직의 포괄적인 패널로부터 유도된 cDNA를 증폭시켰다. Mem-030은 편재된 발현 패턴을 보인다 (도 12A, 표 9).

암 유래 조직과 암세포주의 분석으로, 본 발명자들은 다양한 종류의 종양 (도 12A, 12B), 특히 두경부 암종에서 발현 수치가 높고 유의적이라는 매우 놀라운 사실을 발견하였다.

[표 9] 정상 조직 및 종양 조직에서의 Mem-030 발현

생물 정보학 및 문헌 분석으로 인하여, Mem-030의 상동 유전자는 효율적인 치료 표적(SEQ　ID　NO:39)이 될 수 있고 분자량 66,6 kDA인 586개 아미노산 단백질 (SEQ　ID　NO:40)을 코딩할 수 있다.

생물 정보학 분석 결과, 2개 단백질 모두 세포 표면 분자를 의미한다는 것이 나타났다. 이 표면 분자의 미리 알려지지 않은 선택적인 과발현으로 인하여 치료 목적을 위한 표적, 및 종양 세포의 검출을 위한 진단 방법과 종양 세포의 제거를 위한 치료 방법의 개발을 위한 표적이 된다.

실시예 10: 종양 치료 및 진단 표적으로서의 Mem -055의 동정

Mem-055 (SEQ　ID　NO:41)은 분자량 27,9 kDA인 250개 아미노산 단백질(SEQ　ID　NO:42)을 코딩한다.

이 유전자에 의하여 코딩된 단백질은 낮은 pH에서 단백질 이황화 결합을 감소시킬 수 있는 리소좀 티올 환원 효소이다. 이 효소는 항원 제시 세포에서 구조적으로 발현되고 다른 세포 형태에 있는 감마 인터페론에 의하여 유도된다. 이 효소는 MHC 클래스 II 제한된 항원 가공에 중요한 역할을 한다 (Arunachalam 등, Proc Natl Acad Sci U S A. 97(2):745-50, 2000).

생물학 정보 기술(TMPRED, SOUSI)로 Mem-055의 국재화 및 단백질 위상을 추정 시그날 서열 및 막통과 도메인을 분석함으로써 예측되었다. Mem-055는 세포 밖 C 말단을 가질 수 있다.

본 발명에 따라, Mem-055을 위한 유전자 특이적 프라이머쌍 (SEQ　ID　NO:43, 44)을 실시간 RT-PCR 분석에 사용하여, 정상 조직 및 종양 조직의 포괄적인 패널로부터 유도된 cDNA를 증폭시켰다. Mem-055는 편재된 발현 패턴을 보인다 (도 13A, 표 10).

암 유래 조직 내의 Mem-055 발현 분석으로, 본 발명자들은 다양한 종류의 종양 (도 13A, 13B), 특히 위암에서 과발현 수치가 높고 유의적이라는 매우 놀라운 사실을 발견하였다.

[표 10] 정상 조직 및 종양 조직에서의 Mem-055 발현

Mem-055는 치료 및 진단용 표적 구조물인데, 이는 상이한 종류의 암종에 있는 추정 세포 밖 도메인과 예측되지 않은 과발현 때문이다.

실시예 11: 종양 치료 및 진단 표적으로서 Mem -062의 동정

Mem-062 (SEQ　ID　NO:45)는 분자량이 30,7 kDA인 271개 아미노산 단백질 (SEQ　ID　NO:46)을 코딩한다. 컴퓨터를 바탕으로 한 스크리닝법으로, Mem-062를 미리 동정할 수 있고, 특이 발현된 고환, 전립선 및 태반으로 Mem-062를 기술하였다 (Bera 등, Biochem Biophys Res Commun.312(4):1209-15, 2003).

본 발명에 따라, Mem-062을 위한 유전자 특이적 프라이머쌍 (SEQ　ID　NO:47, 48)을 RT-PCR 분석에 사용하였다. Mem-062는 놀랍게도 암-고환 특이적 발현 패턴을 보였다 (도 14A, 표 11). 다른 정상 기관 조직에서는 어떠한 발현도 검출되지 않았다. 종양 유래 조직 분석으로, 본 발명자들은 Mem-062 발현 수치(도 14B), 특히 난소 종양에서의 발현 수치가 유의적이라는 놀라운 사실을 발견하였다.

[표 11] 정상 조직 및 종양 조직에서의 Mem-062 발현

교대 스플라이싱으로 인하여 교대 전사 (SEQ　ID　NO:49)및 이에 대응하는 번역 산물(SEQ　ID　NO:50)이 생산된다.

실시예 12: 종양 치료 및 진단 표적으로서 Mem -068의 동정

Mem-068 (SEQ　ID　NO:61)은 새로 동정된 cDNA 클론이다.

생물 정보학적인 예상 접근(Genscan)에 의하여, Mem-068을 염색체 9(SEQ　ID　NO:62)에 있는 다수의 엑손 유전자로서 기술할 수 있었다. 추론된 단백질 서열 (SEQ　ID　NO:63)은 751개의 아미노산을 가지며, 분자량 82,4 kDA의 단백질을 형성한다.

본 발명에 따라, Mem-068을 위한 유전자 특이적 프라이머쌍을 RT-PCR 분석에 사용하였다. 놀랍게도 Mem-068은 암-고환 특이적 발현 패턴을 보인다 (도 15A, 표 12). 태반 (약한 발현)을 제외한 기타 다른 정상 기관 조직에서는 어떠한 발현도 검출되지 않았다. 암 유래 조직 분석으로, 본 발명자들은 발현된 Mem-068 수치 (도 15B), 특히 신장 세포 암종과 위암에서의 수치가 유의적이라는 놀라운 사실을 발견하였다.

[표 12] 정상 조직 및 종양 조직에서의 Mem-068 발현

막통과 예상 프로그램 TMpred에 따르면, Mem-068은 Mem-068이 치료 또는 진단용 관심 표적이 되게 하는 세포 표면에서 발현될 수 있다.

실시예 13: 종양 치료 및 진단 표적으로서 Mem -071의 동정

Mem-071 (SEQ　ID　NO:64)은 염색체 1에 있는 2 엑손으로 코딩되는, 새로운 cDNA 클론이다.

본 발명에 따라, Mem-071을 위한 유전자 특이적 프라이머쌍을 RT-PCR 분석에 사용하여, 정상 조직 및 종양 조직의 포괄적인 패널로부터 유도된 cDNA를 증폭시켰다 (도 16A). 이 유전자를 발현시키는 것으로 발견된 유일한 정상 조직은 고환이었다 (도 16A). 반대로 암 표본 분석으로, 본 발명자들은 신장 세포 암종 및 위암에서의 발현 수치가 높고 유의적이라는 사실을 발견하였다 (도 16B).

[표 13] 정상 조직 및 종양 조직에서의 Mem-071 발현

신장 세포암에서의 Mem-071의 예상 밖의 높은 발생으로 인하여 본 발명에 따른 이 단백질은 진단 및 치료 마커로서 매우 흥미로워 진다.

실시예 14: 종양 치료 및 진단 표적으로서 Mem -072의 동정

Mem-072 (SEQ　ID　NO:65)는 염색체 16 상의 3 엑손으로 코딩되는, 새로 동정된 유전자이다.

본 발명에 따라, Mem-072를 위한 유전자 특이적 프라이머쌍을 RT-PCR 분석에 사용하여, 정상 조직 및 종양 조직의 포괄적인 패널로부터 유도된 cDNA를 증폭시켰다. 시험된 모든 정상 조직 내에 어떠한 발현도 발견할 수 없었다 (도 17A, 표 14). 암 유래 조직 및 암 세포주 분석으로, 본 발명자들은 폐암 시료에서의 발현 수치가 높고 유의적이라는 사실을 알게 되었다 (도 17B).

[표 14] 정상 조직 및 종양 조직에서의 Mem-072 발현

폐 종양에서의 Mem-072의 선택적이고 높은 발현은 미리 알려지지 않은 것이며, 본 발명에 따라, 혈청 및 골수에서의 종양 세포 분산 검출, 및 기타 조직에서의 전이 검출을 위한 RT-PCR 등의 분자 진단 방법용으로 사용될 수 있다. 이 분자는 치료적 접근을 위한 특이 표적으로서 더 사용될 수 있다.

실시예 15: 종양 치료 및 진단 표적으로서의 Mem -106의 동정

Mem-106 (SEQ　ID　NO:66)은 염색체 2에서 코딩된 인트론이 없는, 새로 동정된 cDNA이다.

본 발명에 따라, Mem-106을 위한 유전자 특이적 프라이머쌍이 RT-PCR 분석에 사용되었다. 놀랍게도, Mem-106은 암-고환 특이적 발현 패턴을 보였다 (도 18A, 표 15). 기타 다른 정상 기관 조직에서는 어떠한 발현도 검출되지 않았다. 암 유래 조직 분석으로, 본 발명자들은 특히 난소암에서 Mem-106 발현 (도 18B) 수치가 유의적이라는 놀라운 사실을 발견하였다.

[표 15] 정상 조직 및 종양 조직에서의 Mem-106의 발현

Mem-106은 치료 및 진단용 표적 구조물인데, 이는 상이한 유형의 암종에서 예상 밖의 과발현 때문이다.

실시예 16: 종양 치료 및 진단 표적으로서의 Mem -131의 동정

Mem-131 (SEQ　ID　NO:67)은 새로 동정된 cDNA 클론이다. Mem-131은 염색체 15 상의 2 엑손 유전자이다.

본 발명에 따라, Mem-131을 위한 유전자 특이적 프라이머쌍을 RT-PCR 분석에 사용하여 정상 조직 및 종양 조직의 포괄적인 패널로부터 유도된 cDNA를 증폭시켰다. RT-PCR 분석 결과 정상의 활성 PBMCs에서만 Mem-131 전사 발현이 나타난다 (표 16, 도 19A). 기타 다른 정상 기관 조직에서는 어떠한 발현도 검출되지 않았다. 종양 시료 분석으로, 본 발명자들은 유방암 (도 19B)), 폐암 (도 19B+C) 및 난소암(도 19C)을 비롯한 다양한 종류의 종양의 발현 수치가 높고 유의적이라는 놀라운 사실을 발견하였다.

[표 16] 정상 및 종양 조직에서의 Mem-131 발현

분석 결과, 본 발명에 따른 Mem-131은 폐암, 유방암 및 난소암을 위한 진단 및 치료용 마커이다.

SEQUENCE LISTING <110> Ganymed Pharmaceuticals AG et al. <120> Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy <130> 342-28PCT <140> <141> 2006-09-06 <150> EP05019786.2 <151> 2005-09-12 <160> 73 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1126 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atatatcaga ccatcagaag gatttgtata aagagtgact ctcctatgaa ggtaaaggcc 60 acccctcttc agttccagtg actgagatac atttttccaa tcctgggggc aaatacagac 120 acagcaagtt ccttcttccc tttggaaatt tggcagctgc cttcaccagt gagcacaaag 180 ccacatttca aaggaaactg acaaattatc cccagctgcc agaagaagaa atcctcactg 240 gacggcttcc tgtttcctgt ggttcattat ctgattggct gcagggatga aagtttttaa 300 gttcatagga ctgatgatcc tcctcacctc tgcgttttca gccggttcag gacaaagtcc 360 aatgactgtg ctgtgctcca tagactggtt catggtcaca gtgcacccct tcatgctaaa 420 caacgatgtg tgtgtacact ttcatgaact acacttgggc ctgggttgcc ccccaaacca 480 tgttcagcca cacgcctacc agttcaccta ccgtgttact gaatgtggca tcagggccaa 540 agctgtctct caggacatgg ttatctacag cactgagata cactactctt ctaagggcac 600 gccatctaag tttgtgatcc cagtgtcatg tgctgccccc caaaagtccc catggctcac 660 caagccctgc tccatgagag tagccagcaa gagcagggcc acagcccaga aggatgagaa 720 atgctacgag gtgttcagct tgtcacagtc cagtcaaagg cccaactgcg attgtccacc 780 ttgtgtcttc agtgaagaag agcataccca ggtcccttgt caccaagcag gggctcagga 840 ggctcaacct ctgcagccat ctcactttct tgatatttct gaggattggt ctcttcacac 900 agatgatatg attgggtcca tgtgatcctc aggtttgggg tctcctgaag atgctatttc 960 tagaattagt atatagtgta caaatgtctg acaaataagt gctcttgtga ccctcatgtg 1020 agcacttttg agaaagagaa acctatagca acttcatgaa ttaagccttt ttctatattt 1080 ttatattcat gtgtaaacaa aaaataaaat aaaattctga tcgcat 1126 <210> 2 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Val Phe Lys Phe Ile Gly Leu Met Ile Leu Leu Thr Ser Ala 1 5 10 15 Phe Ser Ala Gly Ser Gly Gln Ser Pro Met Thr Val Leu Cys Ser Ile 20 25 30 Asp Trp Phe Met Val Thr Val His Pro Phe Met Leu Asn Asn Asp Val 35 40 45 Cys Val His Phe His Glu Leu His Leu Gly Leu Gly Cys Pro Pro Asn 50 55 60 His Val Gln Pro His Ala Tyr Gln 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gaaatatgga 840 cacatgaaga taaaatagaa ctatattcaa atatagaaac taccttattg cgtttttcat 900 tttggcaaga aaagatcctt aaaacacgga aggattttga tcatgttgta ttactcagtg 960 ggaagtggct ctactcacat gtgcaaggaa tttcttatcc agggggtatg tgcctgccct 1020 attattccac cagtatcatt aaggatcttt tacctgacac aaacataatt gcaaacagaa 1080 tggcacatca actggggcat aaccttggga tgcagcatga cgagttccca tgcacctgtc 1140 cttcaggaaa atgcgtgatg gacagtgatg gaagcattcc tgcactgaaa ttcagtaaat 1200 gcagccaaaa ccaataccac cagtacttga aggattataa gccaacatgc atgctcaaca 1260 ttccatttcc ttacaatttt catgatttcc aattttgtgg aaacaagaag ttggatgagg 1320 gtgaagagtg tgactgtggc cctgctcagg agtgtactaa tccttgctgt gatgcacaca 1380 catgtgtact gaagccagga tttacttgtg cagaaggaga atgctgtgaa tcttgtcaga 1440 taaaaaaagc agggtccata tgcagaccgg cgaaagatga atgtgatttt cctgagatgt 1500 gcactggcca ctcgcctgcc tgtcctaagg accagttcag ggtcaatgga tttccttgca 1560 agaactcaga aggctactgt ttcatgggga aatgtccaac tcgtgaggat cagtgctctg 1620 aactatttga tgatgatgca atagagagtc atgatatctg ctacaagatg aatacaaaag 1680 gaaataaatt tggatactgc aaaaacaagg aaaacagatt tcttccctgt gaggagaaag 1740 atgtcagatg tggaaagatc tactgcactg gaggggagct ttcctctctc cttggagaag 1800 acaagactta tcaccttaag gatccccaga agaatgctac tgtcaaatgc aaaactattt 1860 ttttatacca tgattctaca gacattggcc tggtggcgtc aggaacaaaa tgtggagagg 1920 gaatggtgtg caacaatggt gaatgtctaa acatggaaaa ggtctatatc tcaaccaatt 1980 gcccctctca gtgcaatgaa aatcctgtgg atggccacgg actccagtgc cactgtgagg 2040 aaggacaggc acctgtagcc tgtgaagaaa ccttacatgt taccaatatc accatcttgg 2100 ttgttgtgct tgtcctggtt attgtcggta tcggagttct tatactatta gttcgttacc 2160 gaaaatgtat caagttgaag caagttcaga gcccacctac agaaaccctg ggagtggaga 2220 acaaaggata ctttggtgat gagcagcaga taaggactga gccaatcctg ccagaaattc 2280 atttcctaaa taaacctgca agtaaagatt caagaggaat cgcagatccc aatcaaagtg 2340 ccaagtgagc ttgaagttgg atatccaaaa tggccgtgca agcttaggct ggggattctg 2400 gatgcaacgt ctttacaacc ttacctagat atctgctact cacatttttg gtagtgtttc 2460 aaacgttctt tatccagaca gacaatgttt aagagaaaca acttatttct gttaatattt 2520 accggtagaa ttcacaccct ctatcataaa catatgctgc agaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580 aa 2582 <210> 6 <211> 754 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Leu Pro Gly Cys Ile Phe Leu Met Ile Leu Leu Ile Pro Gln Val 1 5 10 15 Lys Glu Lys Phe Ile Leu Gly Val Glu Gly Gln Gln Leu Val Arg Pro 20 25 30 Lys Lys Leu Pro Leu Ile Gln Lys Arg Asp Thr Gly His Thr His Asp 35 40 45 Asp Asp Ile Leu Lys Thr Tyr Glu Glu Glu Leu Leu Tyr Glu Ile Lys 50 55 60 Leu Asn Arg Lys Thr Leu Val Leu His Leu Leu Arg Ser Arg Glu Phe 65 70 75 80 Leu Gly Ser Asn Tyr Ser Glu Thr Phe Tyr Ser Met Lys Gly Glu Ala 85 90 95 Phe Thr Arg His Pro Gln Ile Met Asp His Cys Phe Tyr Gln Gly Ser 100 105 110 Ile Val His Glu Tyr Asp Ser Ala Ala Ser Ile Ser Thr Cys Asn Gly 115 120 125 Leu Arg Gly Phe Phe Arg Ile Asn Asp Gln Arg Tyr Leu Ile Glu Pro 130 135 140 Val Lys Tyr Ser Asp Glu Gly Glu His Leu Val Phe Lys Tyr Asn Leu 145 150 155 160 Arg Val Pro Tyr Gly Ala Asn Tyr Ser Cys Thr Glu Leu Asn Phe Thr 165 170 175 Arg Lys Thr Val Pro Gly 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Asn Ile Pro Phe Pro Tyr Asn Phe His 385 390 395 400 Asp Phe Gln Phe Cys Gly Asn Lys Lys Leu Asp Glu Gly Glu Glu Cys 405 410 415 Asp Cys Gly Pro Ala Gln Glu Cys Thr Asn Pro Cys Cys Asp Ala His 420 425 430 Thr Cys Val Leu Lys Pro Gly Phe Thr Cys Ala Glu Gly Glu Cys Cys 435 440 445 Glu Ser Cys Gln Ile Lys Lys Ala Gly Ser Ile Cys Arg Pro Ala Lys 450 455 460 Asp Glu Cys Asp Phe Pro Glu Met Cys Thr Gly His Ser Pro Ala Cys 465 470 475 480 Pro Lys Asp Gln Phe Arg Val Asn Gly Phe Pro Cys Lys Asn Ser Glu 485 490 495 Gly Tyr Cys Phe Met Gly Lys Cys Pro Thr Arg Glu Asp Gln Cys Ser 500 505 510 Glu Leu Phe Asp Asp Asp Ala Ile Glu Ser His Asp Ile Cys Tyr Lys 515 520 525 Met Asn Thr Lys Gly Asn Lys Phe Gly Tyr Cys Lys Asn Lys Glu Asn 530 535 540 Arg Phe Leu Pro Cys Glu Glu Lys Asp Val Arg Cys Gly Lys Ile Tyr 545 550 555 560 Cys Thr Gly Gly Glu Leu Ser Ser Leu Leu Gly Glu Asp Lys Thr Tyr 565 570 575 His Leu Lys Asp Pro Gln Lys Asn Ala Thr Val Lys Cys Lys Thr Ile 580 585 590 Phe Leu Tyr His Asp Ser Thr Asp Ile Gly Leu Val Ala Ser Gly Thr 595 600 605 Lys Cys Gly Glu Gly Met Val Cys Asn Asn Gly Glu Cys Leu Asn Met 610 615 620 Glu Lys Val Tyr Ile Ser Thr Asn Cys Pro Ser Gln Cys Asn Glu Asn 625 630 635 640 Pro Val Asp Gly His Gly Leu Gln Cys His Cys Glu Glu Gly Gln Ala 645 650 655 Pro Val Ala Cys Glu Glu Thr Leu His Val Thr Asn Ile Thr Ile Leu 660 665 670 Val Val Val Leu Val Leu Val Ile Val Gly Ile Gly Val Leu Ile Leu 675 680 685 Leu Val Arg Tyr Arg Lys Cys Ile Lys Leu Lys Gln Val Gln Ser Pro 690 695 700 Pro Thr Glu Thr Leu Gly Val Glu Asn Lys Gly Tyr Phe Gly Asp Glu 705 710 715 720 Gln Gln Ile Arg Thr Glu Pro Ile Leu Pro Glu Ile His Phe Leu Asn 725 730 735 Lys Pro Ala Ser Lys Asp Ser Arg Gly Ile Ala Asp Pro Asn Gln Ser 740 745 750 Ala Lys <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 7 gtgcagaagg agaatgctgt g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: 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ccagtcgcag 780 tgacccagtc accctgaatc tcctcccgaa gctgcccatc ccctacatca ccatcaacaa 840 cttaaacccc agggagaata aggatgtctt agccttcacc tgtgaaccta agagtgagaa 900 ctacacctac atttggtggc taaacggtca gagcctcccc gtcagtcccg gggtaaagcg 960 acccattgaa aacaggatac tcattctacc cagtgtcacg agaaatgaaa caggacccta 1020 tcaatgtgaa atacaggacc gatatggtgg cctccgcagt aacccagtca tcctaaatgt 1080 cctctatggt ccagacctcc ccagaattta cccttcattc acctattacc gttcaggaga 1140 aaacctcgac ttgtcctgct tcacggaatc taacccaccg gcagagtatt tttggacaat 1200 taatgggaag tttcagcaat caggacaaaa gctctttatc ccccaaatta ctagaaatca 1260 tagcgggctc tatgcttgct ctgttcataa ctcagccact ggcaaggaaa tctccaaatc 1320 catgacagtc aaagtctctg gtccctgcca tggagacctg acagagtctc agtcatgact 1380 gcaacaactg agacactgag aaaaagaaca ggctgatacc ttcatgaaat tcaagacaaa 1440 gaagaaaaaa actcaatgtt attggactaa ataatcaaaa ggataatgtt ttcataattt 1500 tttattggaa aatgtgctga ttctttgaat gttttattct ccagatttat gaactttttt 1560 tcttcagcaa ttggtaaagt atacttttat aaacaaaaat tgaaatattt gcttttgctg 1620 tctatctgaa tgccccagaa ttgtgaaact attcatgagt attcataggt ttatggtaat 1680 aaagttattt gcacatgttc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1731 <210> 10 <211> 426 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Gly Pro Leu Pro Ala Pro Ser Cys Thr Gln Arg Ile Thr Trp Lys 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Asn Phe Trp Asn Pro Pro Thr 20 25 30 Thr Ala Glu Val Thr Ile Glu Ala Gln Pro Pro Lys Val Ser Glu Gly 35 40 45 Lys Asp Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Asn Leu Pro Gly 50 55 60 Tyr Phe Trp Tyr Lys Gly Glu Met Thr Asp Leu Tyr His Tyr Ile Ile 65 70 75 80 Ser Tyr Ile Val Asp Gly Lys Ile Ile Ile Tyr Gly Pro Ala Tyr Ser 85 90 95 Gly Arg Glu Thr Val Tyr Ser Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val 100 105 110 Thr Arg Lys Asp Ala Gly Thr Tyr Thr Leu His Ile Ile Lys Arg Gly 115 120 125 Asp Glu Thr Arg Glu Glu Ile Arg His Phe Thr Phe Thr Leu Tyr Leu 130 135 140 Glu Thr Pro Lys Pro Tyr Ile Ser Ser Ser Asn Leu Asn Pro Arg Glu 145 150 155 160 Ala Met Glu Ala Val Arg Leu Ile Cys Asp Pro Glu Thr Leu 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attccgcctc 360 ttaggtgtta tcttattcgg ccgcttaggt gacctgggaa cctgccagac aaaacctggt 420 cagtactgga aagaagaggt ccacattcaa gatgttggag gtttgatttg cagagcatgc 480 aatctttcac tgcccttcca tggatgtctt ttagacctgg gaacctgcca ggcagaacct 540 ggtcagtact gtaaagaaga ggtccacatt caaggtggca ttcaatggta ttcagtcaaa 600 ggctgcacaa agaacacatc agagtgcttc aagagtactc tcgtcaagag aattctgcaa 660 ctgcatgaac ttgtaactac tcactgctgc aatcattctt tgtgcaattt ctgagtcagt 720 ggcccatatc taaaatgctt ggcagatcaa tcagtctcga agcctgacct ggctatcaca 780 aaatgatggc tattgtcaat tagcccactt cagaaacctc agacccttgt aggtagaagg 840 aattttgatc tgaaattgac tttggttttc aatattccca atatctcccc caccacctcc 900 aactcatctg agaaatagcc ctttcaacac catttctctc ctctcctcct tctgcttaat 960 ttaccttcct accacaaggc tacaaagaag gaaaaatgtt agtgattctc caagtcaaac 1020 taggcatgtc acctctaact actttcattt ccctcaataa ttccatactc caaaatatgg 1080 ttacaaatgt ttcacaagac agcaagtgac ctgagaatat tcatttggtt tccaaagcaa 1140 actgccttgc tcctttgggg tgatttatgg tatagaagaa actgacttaa catatactat 1200 agggaaaaaa taagccatga atcagcaagc caggcctgcg ggaaaagtat gaacccaaac 1260 aggaaagggc tgaggcaggt ggtagggctg gcacttattt cttccatctg cctcagagtt 1320 tatccaaatt ttgaattttc cgtaccttaa ccatgcctaa atgctttggc ttgttcaatt 1380 ttggcagatt aagcagttca aggtaagcag agaagtaagt tcccaaccac aaggaattta 1440 aaaggagtag gaacgtactt tgaactacat ttcccatttt gcgatcatta cgtcttctat 1500 tacaatgccc tactttggca gcatgaagag tactgcatta atttaattta atttaaaatt 1560 taatttaaaa ctgtctttct ctgtattttc aggagtttga aaattcaaaa aataaataat 1620 aaatgtcaat aaaa 1634 <210> 14 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Thr Val Thr Pro Gln Tyr Leu Pro Glu Tyr Lys Gly Lys His Pro 1 5 10 15 Lys Cys Asp Ser Leu Val Val Phe Arg Asn Val Cys Val Cys Val Ser 20 25 30 Thr Ala Thr Gly Ile Ser Thr Leu Asp Gln Ser Val Ala Phe Ser Cys 35 40 45 Asn Gly Leu His His Ile Thr Asn Cys Thr Arg Ser His Pro Phe Lys 50 55 60 Lys Val Gln Thr Gln Glu Asn Phe His Ser Thr Leu Met Lys Lys Ile 65 70 75 80 Glu Ile Ser Gly Thr Cys Leu Ser Phe His Leu Leu Phe Gly 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23 <210> 17 <211> 744 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 atcaggttca acgcagtgac tgctcagtag aagccatggc tcgcagacac tgcttctcct 60 actggttact ggtatgctgg ttggtggtaa ctgtggcaga aggacaagaa gaggtattta 120 cgcttcctgg agattcacaa aataatgcgg acgctaccga ctgccagatc tttacactca 180 cccctccacc tgccccgagg agtccggtca caagggccca gcccatcaca aagacaccca 240 ggtgtccctt ccattttttt ccacgaaggc ccagaatcca ttttaggttt ccaaacagac 300 ctttcgtccc ttcaaggtgt aaccaccgtt ttccattcca gccattttat tggccacacc 360 gttaccttac ttataggtat ttccccagaa gaagactcca gagaggaagc tcatctgagg 420 aaagctgaga gggaagagaa acccaaacat actgaagcaa aaaaaagcct atccttcaga 480 aaaaagcaac aaaaagattt ctgttttatc tttcgaaact aaaactattg gatttgaaga 540 ttaagtatcc taaacatcac tgactagaaa ctgttctctt tgtcagcagt gaagatattg 600 gatcataggt tattgatggt tgcaaaattg gacaataacc acgttatttt tatcctcaac 660 ctcttatggt cacaggatat ttatgcaaat aaaatcttta aatgggaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 744 <210> 18 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Ala Arg 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Asp Ser Pro Leu Leu Thr Ala Pro 85 90 95 Leu Gly Ser Ala Pro Val Gly Thr Leu Cys Arg Arg Pro His Pro Thr 100 105 110 Phe Pro Phe His Thr Ala Leu Ala Glu Val Leu His Glu Gly Ala Ala 115 120 125 Pro Ala Ala Asn Phe Cys Leu Asp Ile Gln Glu Pro Pro Gln Trp Ser 130 135 140 Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Asn Ser Val Arg Ala Gln Ile Ser Val 145 150 155 160 Gly Trp Arg Arg Ser Gly Val Trp Lys Phe Arg Gly Thr Gly Ala Gln 165 170 175 Ala His Asp Cys Ser Gly Met Asp Gln Tyr Cys Ile Leu Gly Arg Ile 180 185 190 Gly Glu Gly Ala His Gly Ile Val Phe Lys Ala Lys His Val Glu Pro 195 200 205 Arg Val Gly Trp Gln Cys Leu Pro Ser Ile Leu Gln Thr Gly Glu Ile 210 215 220 Val Ala Leu Lys Lys Val Ala Leu Arg Arg Leu Glu Asp Gly Phe Pro 225 230 235 240 Asn Gln Ala Leu Arg Glu Ile Lys Ala Leu Gln Glu Met Glu Asp Asn 245 250 255 Gln Tyr Val Val Gln Leu Lys Ala Val Phe Pro His Gly Gly Gly Phe 260 265 270 Val Leu Ala Phe Glu Phe Met Leu Ser Asp Leu Ala Glu Val Val Arg 275 280 285 His Ala Gln Arg Pro Leu Ala Gln Ala Gln Val Lys Ser Tyr Leu Gln 290 295 300 Met Leu Leu Lys Gly Val Ala Phe Cys His Ala Asn Asn Ile Val His 305 310 315 320 Arg Asp Leu Lys Pro Ala Asn Leu Leu Ile Ser Ala Ser Gly Gln Leu 325 330 335 Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Phe Ser Pro Asp Gly Ser 340 345 350 Arg Leu Tyr Thr His Gln Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu 355 360 365 Leu Leu Tyr Gly Ala Arg Gln Tyr Asp Gln Gly Val Asp Leu Trp Ser 370 375 380 Val Gly Cys Ile Met Gly Glu Leu Leu Asn Gly Ser Pro Leu Phe Pro 385 390 395 400 Gly Lys Asn Asp Ile Glu Gln Leu Cys Tyr Val Leu Arg Ile Leu Gly 405 410 415 Thr Pro Asn Pro Gln Val Trp Pro Glu Leu Thr Glu Leu Pro Asp Tyr 420 425 430 Asn Lys Ile Ser Phe Lys Glu Gln Val Pro Met Pro Leu Glu Glu Val 435 440 445 Leu Pro Asp Val Ser Pro Gln Ala Leu Asp Leu Leu Gly Gln Phe Leu 450 455 460 Leu Tyr Pro Pro His Gln Arg Ile Ala Ala Ser Lys Leu Trp Glu Pro 465 470 475 480 Gln Glu Arg Gly Lys Ala Asp Phe Gly Val Lys Gln Ser Phe Leu Val 485 490 495 Glu Gly Arg Phe Lys His Glu Met Phe Glu Glu Val Phe Ala Glu Glu 500 505 510 Arg Asn Ala Pro Leu Pro Ala His Pro Ser Glu Leu Pro Ile Pro Gln 515 520 525 Arg Leu Gly Gly Pro Ala Pro Lys Ala His Pro Gly Pro Pro His Ile 530 535 540 His Asp Phe His Val Asp Arg Pro Leu Glu Glu Ser Leu Leu Asn Pro 545 550 555 560 Glu Leu Ile Arg Pro Phe Ile Leu Glu Gly Pro Cys Glu Gly Trp Ser 565 570 575 Arg Gly Arg Gly His Val Pro Ser Gln Glu Tyr Glu Asn Ile Gln Ser 580 585 590 Ser Arg Gly Asp Ser Trp Pro Val Leu Val Ser Leu Thr Cys Met Phe 595 600 605 Trp Lys Glu Pro Gly Gln Gln Pro Thr Pro Gln Ala Ala Gln Lys Pro 610 615 620 Arg Met Ala Pro Gln Pro Ala Glu Thr Thr Val His Trp Glu Asp Gly 625 630 635 640 Tyr Leu Glu Ala Ser Gly Gly Glu Gly Val Val His Glu Gly Pro Ser 645 650 655 Gln Val Gln Gly Ile Ser Cys Phe Glu Gly Ala Leu Ile Arg Tyr Glu 660 665 670 Ala His Ala Thr Cys Val His Thr Leu Val Glu Asp Val Gln Asp Arg 675 680 685 Thr His Leu Leu Ala Pro Pro Lys Ala Phe Ala Trp Leu Leu Leu Gln 690 695 700 Glu His Ala Gln Ser Thr Ala Ser Thr Ala Leu Pro Gly Asn Thr Leu 705 710 715 720 Ala Pro Pro Ala Gln Pro Met Leu Asn Ser Thr Gly Gln Ser Cys Arg 725 730 735 Pro Ser Pro Lys Pro Pro Gly Cys Glu Asn Ile Ala Gln Glu Tyr 740 745 750 <210> 64 <211> 455 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 tcagaccgac agtcaggcag aagcagggcc cccggtctgt ctaggcttca ggatgcctaa 60 gaagctctcg gtgggcagcc agtgctccag aaccaggggg ttgttgtggg caggtctctg 120 gggaggcctg aggggccaca cggtgtcctg ggtgtggggt ctgcatctac atacgactca 180 taggcacctg ccattggggc gatttgtgat ggtttaggga aacagggtct gcccttggat 240 gggctggcct acagtcaggg gccttccttg tctgtcttac tttccccgct ctgccagagt 300 gaacccaagg atgccgccag cctcacccca gtgggtggca gttacgccgg catggaactc 360 agactcaccg gcacgcatga cttccaaccg tccacacatc tttgcaccca cagtatctgc 420 ttcagagaat gtattctaaa taataaaaat cataa 455 <210> 65 <211> 746 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 cccactttgc tggatgaagc tctgtgaact cttcctggtt cttagtactg cctaattcat 60 gaatccttct ttgctcaaat gaactcaaag ttaatttaaa gtttttattc taacatgaga 120 ctctttctcc catgagactt tgcatgaggg agaacagtcg ctaattaaca gccagttctt 180 gaaatcacgc agtcctgaaa tccagctgat gctgctcagc agagaagcag atgtttggag 240 gttaaaacaa agtcacaagt ctgacccaca ctcaaaggga gaagattatg caagagcaaa 300 agcacgagat ggaaaccatg gggccatctt atagtctgtc tgccggagaa agatgaacac 360 aaatcctcgt gcagaaaagt gtgacactaa aagaaccaac ctgatactac tatccttaga 420 aaagcctgca tacaaggttg gctgtcatct gggaatgtag gtgatcaaga gttctctcca 480 ctgacataaa ctttgtttaa ataataagga tgactcattg tgactagact atgcaaataa 540 tgggatgtgt gttaaacatc tcctttcctt ctgggagtct ggaattttgg tgtatgctaa 600 acagtgggtg cctgcaagac cagcctcaaa taaaaaccct gggcactgag tctctaaaaa 660 gactcccagt aggcaatatt tcacacgtgt tctcacaaac ttactgctgg aggaattatg 720 cacgccttgc atgactctat tggaaa 746 <210> 66 <211> 782 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 gcacgagaga tgttataata attttcaaaa gaaggtaaaa tcatgactca tatggatata 60 aaaatgaaca ccttgttatg gattgaactg tgtgccccta aaagatatgt tgaagcctga 120 actcccagta cctgagaatg tgaccatgtt tggaaatagt gtctttgcag gtttaatcaa 180 gttaagatga ggtcattaga tgggacctaa tttaatatgg ctgatgccct tataagaaga 240 gggaattttg gacacagaca tacaaggagg acgccatgtg aagacacagt tggaaaagca 300 gggaagagat ggccttgtgt ataaggaggc agagactgga gttatgctgc cacaagccaa 360 ggaacaactg gggctacctg agctggaaga ggcgaggaag gattctcccc tagagggttc 420 tgagggagcg tggacctgcc aacaacttgg tttcagattt ctagtctcca gaactatgca 480 gtaataaatt tctgttgttt taagccaccc agtttgtggc actttgttac gtcagccctg 540 tgaaacaaac aaacaaacaa acaaaaaaca agttaaatat tttatttaac tcataatatg 600 gaaataggtg aggtgttaca accaattcaa aaaagaagtg aaaaataagc ccaaatgtat 660 atagagtaaa ggaatgttga aatgaatgtg caaatggaag caaaactaga ttctcctaca 720 atgggacaga aaagtcaatt gaacctctac tggacagaac ataatttgca tgtgtataga 780 aa 782 <210> 67 <211> 525 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 gcaccaggtt tctggtaagg ggcaattttg tgtttgcctg ttctttggga atatcacctg 60 gagatagatg gattcccaga cccaccaaat ctaggtttta gaccaaaaaa gaatgtttta 120 ttattagaat tgagtatatc tcaggtcctc tttcattact acaacacaaa ataaatctgg 180 gggccaggaa cggtggctca cacctgtaat cccagagtgc taggattaca agcaacaagc 240 atgagctacc acgctcggcc tatgcatctc agtcttaaat tttcttctag gtggatttag 300 gggtttgtgc tcgtggccct aaaaatgaac atgagaaagg cagggagtac ctgcttagtt 360 gcaataggcc ttgtttaggc taaaaataag ctcgatacct gtattttata tactgtaaag 420 agcattaacc ataacctgcc tgcaacagcc tctgtaggta gaaacaatta tggaggtgtc 480 aagtaagaat aaagagctga taacatcaaa aaaaaaaaaa aaaaa 525 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Ala Pro Gln Lys Ser Pro Trp Leu Thr Lys Pro 1 5 10 <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Pro Leu Gln Pro Ser His Phe Leu Asp Ile Ser Glu Asp 1 5 10 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA sense strand <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide bases <400> 70 ccaugagagu agccagcaat t 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA antisense strand <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide bases <400> 71 uugcuggcua cucucaugga g 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA sense strand <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide bases <400> 72 gguucaggac aaaguccaat t 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA antisense strand <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide bases <400> 73 uuggacuuug uccugaaccg g 21

Claims (48)

1. (Ⅰ) 종양 관련 항원의 발현 또는 활성을 억제하는/억제하거나
   (Ⅱ) 종양 억제 활성이 있고, 종양 관련 항원을 발현 또는 비정상적으로 발현시키는 세포에 선택적인/선택적이거나
   (Ⅲ) 투여시, MHC 분자와 종양 관련 항원 또는 그 일부 간의 복합체의 양을 선택적으로 증가시키는 작용제를 포함하고,
   상기 종양 관련 항원은
   (a) 서열 번호: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 및 64 내지 67로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 핵산,
   (b) 엄격한 조건 하에 상기 (a)의 핵산과 혼성화한 핵산,
   (c) (a) 또는 (b)의 핵산에 관하여 변성된 (degenerate) 핵산 및
   (d) (a), (b) 또는 (c)의 핵산과 상보적인 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 가지는 것인 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 (Ⅱ) 하의 작용제는 세포 사멸, 세포 성장 감소, 세포막 손상 또는 사이토카인 분비를 일으키는 것인 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 (Ⅰ) 또는 (Ⅱ) 하의 작용제는 상기 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 선택적으로 혼성화한 안티센스 핵산인 것인 약학 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 (Ⅰ) 또는 (Ⅱ) 하의 작용제는 선택적으로 종양 관련 항원에 결합하는 항체인 것인 약학 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 작용제는
   (ⅰ) 종양 관련 항원 또는 그 일부,
   (ⅱ) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산,
   (ⅲ) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 항체,
   (ⅳ) 상기 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 특이적으로 혼성화한 안티센스 핵산,
   (ⅴ) 상기 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산에 대하여 지시되는 siRNA,
   (ⅵ) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현시키는 숙주 세포 및
   (ⅶ) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부와 MHC 분자 간의 분리된 복합체
   로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 구성 성분을 포함하는 것인 약학 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 작용제는 각각의 경우에 상이한 종양 관련 항원의 발현 또는 활성을 선택적으로 억제하거나, 각각의 경우에 상이한 종양 관련 항원을 발현 또는 비정상적으로 발현시키는 세포에 선택성이 있거나, MHC 분자와 상이한 종양 관련 항원 또는 그 일부 간의 복합체의 양을 증가시키는 2종 이상의 작용제를 포함하고,
   상기 종양 관련 항원 중의 적어도 1개는
   (a) 서열 번호: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 및 64 내지 67로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 핵산,
   (b) 엄격한 조건 하에 상기 (a)의 핵산과 혼성화한 핵산,
   (c) (a) 또는 (b)의 핵산에 관하여 변성된 핵산 및
   (d) (a), (b) 또는 (c)의 핵산과 상보적인 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산으로 코딩되는 서열을 가지는 것인 약학 조성물.
7. (ⅰ) 종양 관련 항원 또는 그 일부,
   (ⅱ) 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산,
   (ⅲ) 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 항체,
   (ⅳ) 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 특이적으로 혼성화한 안티센스 핵산,
   (ⅴ) 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산에 대하여 지시되는 siRNA,
   (ⅵ) 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현시키는 숙주 세포 및
   (ⅶ) 종양 관련 항원 또는 그 일부와 MHC 분자 간의 분리된 복합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 구성 성분을 포함하고,
   상기 종양 관련 항원은
   (a) 서열 번호: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 및 64 내지 67로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 핵산,
   (b) 엄격한 조건 하에 상기 (a)의 핵산과 혼성화한 핵산,
   (c) (a) 또는 (b)의 핵산에 관하여 변성된 핵산 및
   (d) (a), (b) 또는 (c)의 핵산과 상보적인 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산으로 코딩되는 서열을 가지는 것인 약학 조성물.
8. 제5항 또는 제7항에 있어서, 상기 (ⅱ)의 핵산은 발현 벡터 내에 존재하는 것인 약학 조성물.
9. 제5항 또는 제7항에 있어서, 상기 숙주 세포는 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 분비하는 것인 약학 조성물.
10. 제5항 또는 제7항에 있어서, 상기 숙주 세포는 부가적으로 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 MHC 분자를 발현시키는 것인 약학 조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 숙주 세포는 재조합 방식으로 MHC 분자 및/또는 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현시키는 것인 약학 조성물.
12. 제10항에 있어서, 상기 숙주 세포는 MHC 분자를 내생적으로 발현시키는 것인 약학 조성물.
13. 제5, 7, 10 또는 12항에 있어서, 상기 숙주 세포는 항원 제시 세포인 것인 약학 조성물.
14. 제4, 5 또는 7항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날, 키메라 (chimeric) 또는 인간화 항체이거나, 항체의 단편인 것인 약학 조성물.
15. 제4, 5, 7 또는 14항에 있어서, 상기 항체는 치료제 또는 진단제와 결합되는 것인 약학 조성물.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암의 치료 또는 예방용으로 사용될 수 있는 약학 조성물.
17. 제16항에 있어서, 상기 암은 폐 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 흑색종, 결장 종양, 위암, 췌장 종양, ENT 종양, 신장 세포 암종 또는 자궁 경부 암종, 결장암종 또는 유방암종인 것인 약학 조성물.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 종양 관련 항원은 서열 번호: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50 내지 60, 63, 68 및 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 것인 약학 조성물.
19. 제1, 2, 5 내지 13 및 16 내지 18 중 어느 하나의 항에 있어서, 백신 형태인 것인 약학 조성물.
20. 제19항에 있어서, 치료 용도 및/또는 예방 용도인 것인 약학 조성물.
21. (ⅰ) 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 또는 그 일부,
    (ⅱ) 종양 관련 항원 또는 그 일부,
    (ⅲ) 종양 관련 항원 또는 그 일부에 대한 항체 및/또는
    (ⅳ) 환자로부터 분리된 생물학 시료에 있는 종양 관련 항원 또는 그 일부에 특이적인 T 림프구의 양을 검출 또는 측정하는 것을 포함하고,
    상기 종양 관련 항원은
    (a) 서열 번호: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 및 64 내지 67로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 핵산,
    (b) 엄격한 조건 하에 상기 (a)의 핵산과 혼성화한 핵산,
    (c) (a) 또는 (b)의 핵산에 관하여 변성된 핵산 및
    (d) (a), (b) 또는 (c)의 핵산과 상보적인 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산으로 코딩되는 서열을 가지는 것인,
    종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현으로 특징되는 질환을 진단 또는 모니터링하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 양의 검출 또는 특정은
    (ⅰ) 상기 생물학적 시료를, 상기 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 또는 그 일부, 종양 관련 항원 또는 그 일부, 상기 항체, 또는 상기 T 림프구에 특이적으로 결합하는 작용제와 접촉시키고,
    (ⅱ) 상기 작용제와 상기 핵산 또는 그 일부, 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부, 상기 항체, 또는 상기 T 림프구 간 복합체의 형성을 검출 또는 그 양을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 또는 그 일부에 특이적으로 결합하는 작용제는 상기 핵산 또는 상기 그 일부에 특이적으로 혼성화한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드인 것인 방법.
24. 제22항에 있어서, 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 특이적으로 결합하는 작용제는 상기 종양 관련 항원 또는 상기 그 일부에 특이적으로 결합하는 항체인 것인 방법.
25. 제22항에 있어서, 상기 항체에 특이적으로 결합하는 작용제는 상기 항체에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 펩티드인 것인 방법.
26. 제22항에 있어서, 상기 T 림프구에 특이적으로 결합하는 작용제는 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부와 MHC 분자 간의 복합체를 제시하는 세포인 것인 방법.
27. 제21항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 질환의 상기 모니터링은 상기 질환이 있거나 상기 질환에 걸린 것으로 의심이 되는 환자의 시료 중에 있는 상기 질환의 퇴행, 진행 또는 발병을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
28. 제27항에 있어서, 제1 시점에서 제1 시료에 있는 양을 검출 또는 측정하고, 제2 시점에서 또 다른 시료에 있는 양을 검출 또는 측정하여, 상기 2개의 시료를 비교하는 것을 포함하는 방법.
29. 제22항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 작용제는 검출가능한 방식으로 표지된 것인 방법.
30. 제21항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 시료는 체액 및/또는 체내 조직을 포함하는 것인 방법.
31. 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현으로 특징되는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서,
    상기 종양 관련 항원은
    (a) 서열 번호: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 및 64 내지 67로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 핵산,
    (b) 엄격한 조건 하에 상기 (a)의 핵산과 혼성화한 핵산,
    (c) (a) 또는 (b)의 핵산에 관하여 변성된 핵산 및
    (d) (a), (b) 또는 (c)의 핵산과 상보적인 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산으로 코딩되는 서열을 가지는 것인,
    제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 기재된 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현으로 특징되는 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
32. 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현으로 특징되는 질환을 치료, 예방, 진단 또는 모니터링하는 방법에 있어서,
    상기 종양 관련 항원은
    (a) 서열 번호: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 및 64 내지 67로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그 일부 또는 그 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에 상기 (a)의 핵산과 혼성화한 핵산,
    (c) (a) 또는 (b)의 핵산에 관하여 변성된 핵산 및
    (d) (a), (b) 또는 (c)의 핵산과 상보적인 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산으로 코딩되는 서열을 가지는 것인,
    상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하고, 치료제 또는 진단제와 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현으로 특징되는 질환을 치료, 예방, 진단 또는 모니터링하는 방법.
33. 제24항 또는 제32항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날, 키메라 또는 인간화한 항체이거나, 항체의 단편인 것인 방법.
34. (ⅰ) 면역 반응성 세포를 함유하는 시료를 제공하고,
    (ⅱ) 상기 종양 관련 항원 또는 상기 그 일부에 대한 세포 용해성 또는 사이토카인 방출 T 세포의 생산에 유리한 조건하에, 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현시키는 숙주 세포와 상기 시료를 접촉하고,
    (ⅲ) 상기 세포 용해성 또는 사이토카인 방출 T 세포를 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현시키는 세포를 용해시키는 데에 적절한 양으로 환자에게 도입하는 것을 포함하고,
    상기 종양 관련 항원은
    (a) 서열 번호: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 및 64 내지 67로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 핵산,
    (b) 엄격한 조건 하에 상기 (a)의 핵산과 혼성화한 핵산,
    (c) (a) 또는 (b)의 핵산에 관하여 변성된 핵산 및
    (d) (a), (b) 또는 (c)의 핵산과 상보적인 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산으로 코딩되는 서열을 가지는 것인,
    종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현으로 특징되는 질환이 있는 환자를 치료하는 방법.
35. 제34항에 있어서, 상기 숙주 세포는 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 MHC 분자를 재조합적으로 발현시키는 것인 방법.
36. 제34항에 있어서, 상기 숙주 세포는 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 MHC 분자를 내생적으로 발현시키는 것인 방법.
37. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 기재된 약학 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 환자에 있어서 암의 진행을 억제시키는 방법.
38. 제21항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 종양 관련 항원은 서열 번호: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50-60, 63, 68 및 69로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 것인 방법.
39. (a) 서열 번호: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 및 64 내지 67로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 핵산,
    (b) 엄격한 조건 하에 상기 (a)의 핵산과 혼성화한 핵산,
    (c) (a) 또는 (b)의 핵산에 관하여 변성된 핵산 및
    (d) (a), (b) 또는 (c)의 핵산과 상보적인 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산으로 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 그 일부에 특이적으로 결합하는 작용제.
40. 제39항에 있어서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50 내지 60, 63, 68 및 69로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 것인 작용제.
41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 작용제는 항체인 것인 작용제.
42. 제41항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날, 키메라 또는 인간화한 항체이거나, 항체의 단편인 것인 작용제.
43. (ⅰ) 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 그 일부와,
    (ⅱ) 상기 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 상기 그 일부가 결합하는 MHC 분자의 복합체에 선택적으로 결합하고,
    상기 항체는 (ⅰ) 또는 (ⅱ)에 단독으로 결합하지 않고,
    상기 단백질 또는 폴리펩티드는
    (a) 서열 번호: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 및 64 내지 67로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 핵산,
    (b) 엄격한 조건 하에 상기 (a)의 핵산과 혼성화한 핵산,
    (c) (a) 또는 (b)의 핵산에 관하여 변성된 핵산 및
    (d) (a), (b) 또는 (c)의 핵산과 상보적인 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산에 의하여 코딩되는 것인 항체.
44. 제43항에 있어서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 서열 번호: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50 내지 60, 63, 68 및 69로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 것인 항체.
45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날, 키메라 또는 인간화한 항체이거나, 항체의 단편인 것인 항체.
46. 제39항 내지 제42항 중 어느 하나의 항에 기재된 작용제 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체와, 치료제 또는 진단제 간의 컨쥬게이트.
47. 제46항에 있어서, 상기 치료제 또는 진단제는 독소인 것인 컨쥬게이트.
48. (ⅰ) 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 또는 그 일부,
    (ⅱ) 종양 관련 항원 또는 그 일부,
    (ⅲ) 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 항체 및/또는
    (ⅳ) 종양 관련 항원 또는 그 일부와 MHC 분자 간의 복합체에 특이적인 T 림프구의 양을 검출 또는 측정하는 작용제를 포함하고,
    상기 종양 관련 항원은
    (a) 서열 번호: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 및 64 내지 67로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 핵산,
    (b) 엄격한 조건 하에 상기 (a)의 핵산과 혼성화한 핵산,
    (c) (a) 또는 (b)의 핵산에 관하여 변성된 핵산 및
    (d) (a), (b) 또는 (c)의 핵산과 상보적인 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 가지는 것인,
    종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현을 검출하기 위한 키트.

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