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KR20130119945A - 3-히드록시프로피온산 생산을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

3-히드록시프로피온산 생산을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20130119945A
KR20130119945A KR1020137015983A KR20137015983A KR20130119945A KR 20130119945 A KR20130119945 A KR 20130119945A KR 1020137015983 A KR1020137015983 A KR 1020137015983A KR 20137015983 A KR20137015983 A KR 20137015983A KR 20130119945 A KR20130119945 A KR 20130119945A
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exogenous
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홀리 젠센
브라이언 러쉬
쟈넷 휴리타
베스 마스텔
앨런 베리
데비 야버
마이클 캐틀렛
미셸 바나트
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노보자임스 인코포레이티드
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Abstract

본 출원은 활성 3-HP 발효 경로를 포함하는 유전적으로 변형된 효모 세포, 및 3-HP를 생산하는 이들 세포의 사용을 개시한다.

Description

3-히드록시프로피온산 생산을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR 3-HYDROXYPROPIONIC ACID PRODUCTION}
서열 목록에 대한 참고
본 출원은 컴퓨터 판독 가능 형태로 서열 목록을 함유하며, 이것은 본원에 참고로 포함된다.
3-히드록시프로피온산 (3-HP)은 발효에 의해 만들어질 수 있는 상위 12개의 고잠재성 빌딩 블록 (building block) 화합물 중 하나로서 미국 에너지부 (U.S. Department of Energy)에 의해 확인된 세 개의 탄소 카르복실산이다. 젖산 (2-히드록시프로피온산)의 이소머 (isomer)인, 3-HP에 대한 다른 이름은 에틸렌 젖산 및 3-히드록시프로피오네이트를 포함한다. 3-HP는 글루코스로부터 이론상 100% 수득율, 다양한 화학 반응에 참여하는 것을 허용하는 다수의 작용기, 및 낮은 독성을 갖는, 매력적인 재생 가능한 플랫폼 화학물질이다. 3-HP는 1,3-프로판디올, 말론산, 아크릴아미드, 및 아크릴산과 같은, 여러 화학 상품을 형성하는 기질로서 사용될 수 있다. 아크릴산은 아크릴레이트 에스테르 및 초흡수성 폴리머를 만들기 위해 사용된 대량의 화학물질이고 (> 70억 lbs/년), 현재 프로필렌의 촉매 산화로부터 유도된다. 3-HP의 발효성 생산은 이들 상업적으로 중요한 화학물질에 대한 공급원료로서 석유화학물질에 대한 지속 가능한 대체물질을 제공할 것이고, 따라서 에너지 소비, 석유에 대한 미국 의존, 및 온실 가스의 생산을 감소시킨다.
박테리아는 당을 유기산으로 발효시키는데 사용될 수 있다. 하지만, 박테리아는 대규모 유기산 생산에 대해 특정 문제점을 제공한다. 유기산이 생산되면, 발효 배지는 점점 산성이 된다. 낮은 pH 조건이 실제로 바람직한데, 결과물이 부분적으로 또는 전체적으로 산성 형태이기 때문이다. 하지만, 유기산을 생산하는 대부분의 박테리아는 강한 산성 환경에서 잘 수행하지 못하고, 그러므로 배지가 더 산성이 되면서 죽거나 그것들이 경제적으로 살 수 없도록 천천히 생산하기 시작한다. 이것을 방지하기 위해, 더 높은 pH를 유지하기 위해 배지에 버퍼를 처리하는 것이 필요하다. 하지만, 이것은 유기산 생성물의 회수를 더 어렵고 비싸게 만든다.
최근 수년 동안 당을 유기산으로 발효시키는 효모의 사용에 관한 흥미가 증가하였다. 효모는 많은 발효 공업에서 생체 촉매로서 사용되고, 박테리아를 통해 여러 이점을 제공한다. 많은 박테리아가 성장 및 당의 효과적인 대사에 필요한 특정 아미노산 또는 단백질을 합성할 수 없는 한편, 대부분의 효모 종은 무기 질소 화합물로부터 그것들의 필수 아미노산 또는 단백질을 합성할 수 있다. 효모는 또한 박테리오파지 감염에 민감하지 않으며, 이것은 박테리아의 생산성 또는 전체 발효 실행의 손실로 이어질 수 있다.
효모가 유기산 생산에 대한 매력적인 후보물질이지만, 그것들은 여러 문제점을 제공한다. 첫 번째로, 효모에서 경로 조작은 전형적으로 박테리아에서 보다 더 어렵다. 효모에서 효소는 세포질, 미토콘드리아, 또는 퍼옥시좀에서 분류되는 반면, 박테리아에서 그것들은 세포질에 모인다. 이것은 모든 효소의 생합성 경로가 단일 세포 내의 같은 구획에 동시 존재한다는 것을 보장하도록 표적화 신호가 제거될 필요가 있다는 것을 의미한다. 경로의 수송의 조절은 구획 사이를 중재하고 또한 원하는 생성물에 대한 탄소 흐름을 최대화하는 것이 필요할 수도 있다. 두 번째로, 모든 효모 종이 대규모로 경제적 발효에 대하여 필요한 기준을 만족하는 것은 아니다. 사실은, 작은 퍼센트의 효모만이 충분히 높은 부피 및 낮은 pH 조건 하에 강하게 성장하는 능력을 가진 특이적 당 이용의 조합을 보유한다. 미국 에너지부는 3-HP를 포함하는, 여러 유기산의 경제적인 발효에 대하여 대략 2.5 g/L/시간의 생산율이 필요하다는 것을 추정하였다 (http://www1.eere.energy.gov/biomass/pdfs/35523.pdf).
많은 효모 종이 헥소스 당을 에탄올로 발효시키지만, 자연적으로 유기산의 큰 수득을 생산하는 것은 적다. 이것은 유기산을 생산하는 다양한 효모 종을 유전적으로 변형시키기 위한 노력으로 이어졌다. 젖산을 생산하는 유전적으로 변형된 효모 균주는 이전에 네이티브 (native) 피루베이트 데카르복실라제 (PDC) 유전자를 방해하고 삭제하고 락테이트 데히드로게나제 (LDH)를 삽입하여 에탄올 생산을 제거하는 단계에 의해 개발되었다 (예를 들어, W099/14335, WO00/71738, WO02/42471, WO03/049525, WO03/102152 및 WO03/102201). 이 대안은 당 대사 작용을 에탄올 생산에서 젖산 생산으로 전환한다. 효모에 대한 발효 생성물 및 경로는 박테리아의 것들과 다르고, 따라서 다른 조작 접근법이 수득율을 최대화하기 위해 필요하다. 유기산 생성물 수득율 또는 순도를 향상시키기 위해 제거 또는 감소가 필요할 수도 있는 다른 네이티브 생성물은 글리세롤, 아세테이트, 및 디올이다. 유전적으로 변화된 효모 균주에서 글리세롤의 감소는 예를 들어, WO07/106524에 설명된다.
젖산과 달리 3-HP는 자연에 알려진 어떤 경로의 주요 최종 생성물이 아니며, 일부 박테리아 및 균류에서 미량으로만 발견된다. 따라서, 유전공학의 큰 거래가 3-HP를 생산하는 효모를 생성하기 위해 필요하다. 사카로미세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주는 이전에 락테이트 중재를 통해 3-HP를 생산하도록 조작되었다 (WO02/042418 참조). 하지만, 야생형 에스. 세레비시애 (S. cerevisiae)의 오차 수준은 그것을 3-HP 생산을 위한 최적의 숙주로 만드는데 불충분하다. 그러므로, 산업상 규모에서 더 비용-효율적 방식으로 3-HP를 생성하는 향상된 효모 균주가 필요하다.
특정 구체예에서 여기에 제공된 것은 PEP, 피루베이트, 및/또는 글리세롤에서 3-HP로 활성 3-HP 발효 경로를 포함하는 유전적으로 변형된 효모 세포이다. 특정 구체예에서, 여기에 제공된 세포는 PPC, PYC, AAT, ADC, BAAT, gabT, 3-HPDH, HIBADH, 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제, ACC, AAM, 알라닌 데히드로게나제, 알데히드 데히드로게나제, BCKA, KGD, 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제, β-알라닐-CoA 암모니아 리아제, Co-A 아실화 말로네이트 세미알데히드 데히드로게나제, CoA 신테타제, CoA 트랜스퍼라제, 글리세롤 데히드라타제, IPDA, LDH, 락틸-CoA 데히드라타제, 말레이트 데카르복실라제, 말레이트 데히드로게나제, 말로닐-CoA 리덕타제, OAA 포르메이트리아제, OAA 데히드로게나제, 피루베이트/알라닌 아미노트랜스퍼라제, PDH, 2-케토산 데카르복실라제, 3-HP-CoA 데히드라타제, 3-HP-CoA 히드롤라제, 또는 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제 활성과 함께 효소를 암호화하는 하나 이상의 3-HP 경로 유전자를 함유한다.
특정 구체예에서 여기에 제공된 것은 PEP 또는 피루베이트에서 3-HP로 활성 3-HP 발효 경로를 포함하는 유전적으로 변형된 효모 세포이며, 세포는 PPC, PYC, AAT, ADC, BAAT, gabT, 3-HPDH, HIBADH, 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유한다. 특정 구체예에서, 3-HP 경로 유전자 중 하나 이상은 외인성이고, 이들 구체예에서 유전자는 효모, 균류, 박테리아, 식물, 곤충, 또는 포유동물 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 세포는 아이. 오리엔탈리스 (I. orientalis)로부터 유도된 효모 PYC 유전자 또는 알. 스패로이데스 (R. sphaeroides), 알. 에틀리 (R. etli), 피. 플루오레센스 (P. fluorescens), 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum), 또는 에스. 멜리로티 (S. meliloti)로부터 유도된 박테리아 PYC 유전자; 이. 콜리 (E. coli), 엠. 써모아우토트로피쿰 (M. thermoautotrophicum), 또는 씨. 페르프링겐스 (C. perfringens)로부터 유도된 박테리아 PPC 유전자, 아이. 오리엔탈리스 또는 에스. 세레비시애로부터 유도된 효모 AAT 유전자 또는 이. 콜리로부터 유도된 박테리아 AAT 유전자; 에스. 아베르미틸리스 (S. avermitilis), 씨. 아세토부틸리쿰 (C. acetobutylicum), 에이치. 필로리 (H. pylori), 비. 리체니포르미스 (B. licheni mis), 또는 씨. 글루타미쿰으로부터 유도된 박테리아 ADC 유전자; 아이. 오리엔탈리스 또는 에스. 클루이베리 (S. kluyveri)로부터 유도된 효모 BAAT 유전자 또는 에스. 아베르미틸리스로부터 유도된 박테리아 BAAT; 에스. 세레비시애로부터 유도된 효모 gabT 유전자 또는 에스. 아베르미틸리스로부터 유도된 박테리아 gabT 유전자; 아이. 오리엔탈리스 또는 에스. 세레비시애로부터 유도된 효모 3-HPDH 유전자 또는 이. 콜리 또는 엠. 세둘라 (M. sedula)로부터 유도된 박테리아 3-HPDH 유전자; 에이. 패칼리스 (A. faecalis), 피. 푸티다 (P. putida), 또는 피. 애루기노사 (P. aeruginosa)로부터 유도된 박테리아 HIBADH 유전자; 및/또는 씨. 클루이베리 (C. kluyveri)로부터 유도된 효모 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자 또는 알. 유트로파 (R. eutropha)로부터 유도된 박테리아 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자를 함유한다.
특정 구체예에서 여기에 제공된 것은 PEP 또는 피루베이트에서 3-HP로 활성 3-HP 발효 경로를 포함하는 유전적으로 변형된 효모 세포이며, 세포는 PPC, 말레이트 데히드로게나제, 및 말레이트 데카르복실라제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유한다. 특정 구체예에서, 3-HP 경로 유전자 중 하나 이상은 외인성이고, 이들 구체예에서, 유전자는 효모, 균류, 박테리아, 식물, 곤충, 또는 포유동물 근원으로부터 유도될 수도 있다.
특정 구체예에서 여기에 제공된 것은 PEP 또는 피루베이트에서 3-HP로 활성 3-HP 발효 경로를 포함하는 유전적으로 변형된 효모 세포이며, 세포는 PPC, 2-케토산 데카르복실라제, KGD, BCKA, 인돌피루베이트 데카르복실라제, 3-HPDH, HIBADH, 또는 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유한다. 특정 구체예에서, 3-HP 경로 유전자 중 하나 이상은 외인성이고, 이들 구체예에서, 유전자는 효모, 균류, 박테리아, 식물, 곤충, 또는 포유동물 근원으로부터 유도된다.
특정 구체예에서 여기에 제공된 것은 PEP 또는 피루베이트에서 3-HP로 활성 3-HP 발효 경로를 포함하는 유전적으로 변형된 효모 세포이며, 세포는 PPC, OAA 포르메이트리아제, 말로닐-CoA 리덕타제, Co-A 아실화 말로네이트 세미알데히드 데히드로게나제, 3-HPDH, HIBADH, 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자이다. 특정 구체예에서, 3-HP 경로 유전자 중 하나 이상은 외인성이고, 이들 구체예에서, 유전자는 효모, 균류, 박테리아, 식물, 곤충, 또는 포유동물 근원으로부터 유도된다.
특정 구체예에서 여기에 제공된 것은 피루베이트에서 3-HP로 활성 3-HP 발효 경로를 포함하는 유전적으로 변형된 효모 세포이며, 세포는 PDH, 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA 리덕타제, CoA 아실화 말로네이트 세미알데히드 데히드로게나제, 3-HPDH, HIBADH, 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자이다. 특정 구체예에서, 3-HP 경로 유전자 중 하나 이상은 외인성이고, 이들 구체예에서, 유전자는 효모, 균류, 박테리아, 식물, 곤충, 또는 포유동물 근원으로부터 유도된다.
특정 구체예에서 여기에 제공된 것은 피루베이트에서 3-HP로 활성 3-HP 발효 경로를 포함하는 유전적으로 변형된 효모 세포이며, 세포는 알라닌 데히드로게나제, 피루베이트/알라닌 아미노트랜스퍼라제, 알라닌 2,3 아미노뮤타제, CoA 트랜스퍼라제, CoA 신테타제, β-알라닐-CoA 암모니아 리아제, 3-HP-CoA 데히드라타제, 3-HP-CoA 히드롤라제, 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제, BAAT, 3-HPDH, HIBADH, 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유한다. 특정 구체예에서, 3-HP 경로 유전자 중 하나 이상은 외인성이고, 이들 구체예에서, 유전자는 효모, 균류, 박테리아, 식물, 곤충, 또는 포유동물 근원으로부터 유도된다.
특정 구체예에서 여기에 제공된 것은 피루베이트에서 3-HP로 활성 3-HP 발효 경로를 포함하는 유전적으로 변형된 효모 세포이며, 세포는 LDH, CoA 트랜스퍼라제, 락틸-CoA 데히드라타제, 3-HP-CoA 데히드라타제, 3-HP-CoA 히드롤라제, 및 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유한다. 특정 구체예에서, 3-HP 경로 유전자 중 하나 이상은 외인성이고, 이들 구체예에서, 유전자는 효모, 균류, 박테리아, 식물, 곤충, 또는 포유동물 근원으로부터 유도된다.
특정 구체예에서 여기에 제공된 것은 PEP 또는 피루베이트에서 3-HP로 활성 3-HP 발효 경로를 포함하는 유전적으로 변형된 효모 세포이며, 세포는 글리세롤 데히드라타제 및 알데히드 데히드로게나제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유한다. 특정 구체예에서, 3-HP 경로 유전자 중 하나 이상은 외인성이고, 이들 구체예에서, 유전자는 효모, 균류, 박테리아, 식물, 곤충, 또는 포유동물 근원으로부터 유도된다.
여기에 제공된 유전적으로 변형된 효모 세포는 어떤 효소 종도 될 수 있다. 특정 구체예에서, 세포는 크랩트리 (Crabtree)-음성이고, 이들 중 특정 구체예에서, 그것들은 속 (genus) 이사트첸키아 (Issatchenkia), 칸디다 (Candida), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces), 피치아 (Pichia), 쉬조사카로미세스 (Schizosaccharomyces), 토룰라스포라 (Torulaspora), 지고사카로미세스 (Zygosaccharomyces), 또는 사카로미세스 (Saccharomyces)에 속한다. 이들 중 특정 구체예에서, 세포는 아이. 오리엔탈리스/피. 페르멘탄스 (P. fermentans) 클레이드 (clade) 또는 사카로미세스 클레이드에 속할 수도 있고, 이들 구체예에서, 그것들은 아이. 오리엔탈리스, 씨. 람비카 (C. lambica), 또는 에스. 불데리 (S. bulderi)일 수도 있다. 특정 구체예에서, 효모 세포는 3-HP 저항성 효모 세포일 수도 있다. 3-HP 저항은 세포의 네이티브 특성일 수도 있고 그것은 활성 3-HP 발효 경로와 관련된 유전적 변형, 또는 이들의 조합의 도입 전에, 중에, 또는 후에 돌연변이 및/또는 선택을 겪은 세포로부터 발생한다. 특정 구체예에서, 효모 세포는 3-HP, 다른 발효 제품 또는 부산물, 및/또는 같은 종의 야생형 효모 세포에 의해 나타나는 것보다 더 큰 다양한 배지 성분 외에 유기산에 대한 내성의 정도를 나타낼 수도 있다. 특정 구체예에서, 효모 세포는 돌연변이 및/또는 선택된 세포는 같은 종의 야생형 세포보다 3-HP에 대하여 더 높은 정도의 저항을 소유하도록, 돌연변이 및/또는 선택을 겪었다. 이들 중 일부 구체예에서, 세포는 하나 이상의 외인성 3-HP 경로 유전자로 유전적으로 변형되기 전에 돌연변이 및/또는 선택을 겪었다. 일부 구체예에서, 세포는 젖산 또는 3-HP의 존재시 선택을 겪었다. 일부 구체예에서, 선택은 케모스태트 (chemostat) 선택이다.
활성 3-HP 발효 경로에 관련된 변형에 더하여, 여기에 제공된 세포는 하나 이상의 네이티브 유전자의 삭제 또는 붕괴를 함유할 수도 있다. 예를 들어, 세포는 하나 이상의 PDC, ADH, GAL6, CYB2A, CYB2B, GPD, GPP, ALD, 또는 PCK 유전자의 삭제 또는 붕괴를 함유할 수도 있다. 특정 구체예에서, 이들 삭제 또는 붕괴는 활성 3-HP 발효 경로와 관련된 하나 이상의 유전자의 도입에 결합될 수도 있다.
특정 구체예에서 여기에 제공된 것은 적어도 하나의 탄소 근원의 존재시 세포를 배양하고 배양 배지로부터 3-HP를 분리함으로써 여기에 제공된 유전적으로 변형된 효모 세포를 사용하여 3-HP를 생산하는 방법이다. 이들 중 특정 구체예에서, 탄소 근원은 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 수크로스, 프럭토스, 셀룰로스, 글루코스 올리고머, 및 글리세롤 중 하나 이상으로부터 선택될 수도 있다.
도 1: 선택 3-HP 발효 경로의 개요
도 2: 플라스미드 pMlBa107
도 3: 표적화된 통합 기술의 개략적 표현
도 4: 플라스미드 pGMEr125(a)
도 5: 플라스미드 pGMR 25(b)
도 6: 플라스미드 pGMEr121
도 7: 플라스미드 pMhCt074
도 8: 플라스미드 pMhCt083
도 9: 플라스미드 pMhCt087
도 10: 플라스미드 pMhCt075
도 1 1: 플라스미드 pMhCt077
도 12: 플라스미드 pMhCt095
도 13: 플라스미드 pMhCt096
도 14: 플라스미드 pMeJi310-2
도 15: 플라스미드 pMeJi312-2
도 16: 플라스미드 pGMEr126
도 17: 플라스미드 pGMEr130
도 18: 플라스미드 pGMEr137
도 19: 플라스미드 pACN5
도 20: 플라스미드 pACN23
도 21: 플라스미드 pHJJ27
도 22: 플라스미드 pACN43
도 23: 플라스미드 pHJJ75
도 24: 플라스미드 pHJJ76
도 25: 플라스미드 pJLJ49
도 26: 플라스미드 pJLJ62
도 27: 플라스미드 pMI458
도 28: 플라스미드 pCM208
도 29: 플라스미드 pJY39
도 30: 플라스미드 pMcTs64
도 31: 플라스미드 pMcTs65
도 32: 플라스미드 pJLJ8.
본 발명의 다음 설명은 단지 본 발명의 다양한 구체예를 설명하기 위한 것이다. 이와 같이, 논의된 특정 변형은 본 발명의 범위에 대한 제한으로 생각되는 것이 아니다. 당업자에게 다양한 등가물, 변화, 및 변형은 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 이루어질 수도 있다는 것이 명백하고, 이러한 동등한 구체예는 여기에 포함되는 것으로 생각된다.
여기에 인용된 모든 참고문헌은 전문이 참고로 포함된다.
약어
3-HP, 3-히드록시프로피온산; 3-HPA, 3-히드록시프로피온알데히드; 3-HPDH, 3-히드록시프로피온산데히드로게나제; AAM, 알라닌 2,3 아미노뮤타제; AAT, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제; ACC, 아세틸-CoA 카르복실라제; ADC, 아스파르테이트 1-데카르복실라제; AKG, 알파-케토글루타레이트; ALD, 알데히드 데히드로게나제; BAAT, β-알라닌 아미노트랜스퍼라제; BCKA, 분지형-사슬 알파-케토산 데카르복실라제; bp, 염기쌍; CYB2, L-(+)-락테이트-시토크롬 c 옥시도리덕타제; CYC, 이소-2-시토크롬 c; EMS, 에탄 메틸 술포나제; ENO, 에놀라제; gabT, 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제; GAPDH, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 3; GPD, 글리세롤 3-포스페이트 데히드로게나제; GPP, 글리세롤 3-포스페이트 포스파타제; HIBADH, 3-히드록시이소부티레이트 데히드로게나제; IPDA, 인돌피루베이트 데카르복실라제; KGD, 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제; LDH, 락테이트 데히드로게나제; MAE, 말산 효소; OAA, 옥살로아세테이트; PCK, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제; PDC, 피루베이트 데카르복실라제; PDH, 피루베이트 데히드로게나제; PEP, 포스포에놀피루베이트; PGK, 포스포글리세레이트 키나제; PPC, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제; PYC, 피루베이트 카르복실라제; RKI, 리보스 5-포스페이트 케톨-이소머라제; TAL, 트랜스알돌라제; TEF1, 번역 신장 인자-1; TEF2, 번역 신장 인자-2; TKL, 트랜스케톨라제, XDH, 자일리톨 데히드로게나제; XR, 자일로스 리덕타제, YP, 효모 추출물/펩톤.
설명
여기에 제공된 것은 3-HP의 생산을 위한 유전적으로 변형된 효모 세포, 이들 효모 세포를 만드는 방법, 및 3-HP를 생산하는 이들 세포를 사용하는 방법이다. 여기에 사용된 바와 같이 "3-HP"는 3-히드록시프로피온산의 염 및 산성 형태를 포함한다.
많은 3-HP 발효 경로가 업계에 알려져 있다 (예컨대, 미국 특허 번호 6,852,517; 미국 특허 번호 7,309,597; 미국 공개 번호 2001/0021978; 미국 공개 번호 2008/0199926; WO02/42418; 및 W010/031083이며, 모든 것은 본원에 참조로 포함됨). 3-HP 발효 경로는 포스포에놀피루베이트 (PEP), 피루베이트, 옥살로아세테이트 (OAA), 아스파르테이트, β-알라닌, 말로네이트 세미알데히드, 말레이트, 말로닐-CoA, 아세틸-CoA, 알라닌, 락테이트, 락틸-CoA, 아크릴일-CoA, 글리세롤, 3-히드록시프로피온알데히드 (3-HPA), β-알라닐-CoA, 3-HP-CoA, 및 글리세레이트를 포함할 수도 있는, 일련의 중간물을 통해 작동된다. 여러 알려진 3-HP 발효 경로의 개요는 도 1에 설명된다.
여기에 개시된 바와 같이, 한 세트의 다양한 종의 효모 세포는 3-HP 저항성에 대하여 테스트되었다. 3-HP 저항을 나타내는 세포는 다양한 농도의 3-HP를 함유하는 배지에서 그것들의 성장률 및 글루코스 소비 속도에 기초하여 추가로 평가되었다. 이 실험에 기초하여, 한 세트의 이상적인 3-HP 생산용 숙주 세포를 확인하였다. 이들 숙주 세포들은 활성 3-HP 발효 경로를 함유하도록 유전적으로 변형되었으며, 낮은 pH 조건 하에 3-HP를 생산하는 유전적으로 변형된 효모 세포를 발생시킨다.
특정 구체예에서 여기에 제공된 것은 적어도 하나의 활성 3-HP 발효 경로를 갖는, PEP, 피루베이트, 및/또는 글리세롤에서 3-HP로 유전적으로 변형된 효모 세포이다. "활성 3-HP 발효 경로"를 갖는 효모 세포는 여기에 사용된 바와 같이 3-HP 발효 경로에서 각각의 반응을 촉진하는데 필요한 활성 효소를 생산하고, 그러므로 적어도 하나의 발효 가능한 당의 존재시 발효 조건 하에 배양될 때 측정 가능한 수득율로 3-HP를 생산할 수 있다. 활성 3-HP 발효 경로를 갖는 효모 세포는 하나 이상의 3-HP 경로 유전자를 포함한다. "3-HP 경로 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 3-HP 발효 경로에 수반되는 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 나타낸다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 효모 세포는 PEP 또는 피루베이트, OAA, 아스파르테이트, β-알라닌, 및 말로네이트 세미알데히드 중간물 (예컨대, 미국 공개 번호 2010/0021978, 도 1)를 통해 진행되는 활성 3-HP 발효 경로를 갖는다. 이들 구체예에서, 효모 세포는 피루베이트 카르복실라제 (PYC), PEP 카르복실라제 (PPC), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AAT), 아스파르테이트 1-데카르복실라제 (ADC), β-알라닌 아미노트랜스퍼라제 (BAAT), 아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제 (gabT), 3-HP 데히드로게나제 (3-HPDH), 3-히드록시이소부티레이트 데히드로게나제 (HIBADH), 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자 중 하나 이상을 포함하는, 한 세트의 3-HP 발효 경로 유전자를 포함한다. 3-HP 발효 경로 유전자는 또한 바람직하게 PEP의 OAA로 전환을 촉진하는 폴리펩티드를 생산하도록 변형된 PEP 카르복시키나제 (PCK) 유전자를 포함할 수도 있다 (네이티브 PCK 유전자는 유전적으로 바람직하게 OAA의 PEP로 역반응을 촉진하는 폴리펩티드를 생산한다).
특정 구체예에서, 여기에 제공된 효모 세포는 PEP 또는 피루베이트, OAA, 및 말레이트 중간물을 통해 진행되는 활성 3-HP 발효 경로를 갖는다 (예컨대, 미국 공개 번호 2010/0021978, 도 4). 이들 구체예에서, 효모 세포는 PPC, PYC, 말레이트 데히드로게나제, 및 말레이트 데카르복실라제 유전자 중 하나 이상을 포함하는, 한 세트의 3-HP 발효 경로 유전자를 포함한다. 3-HP 발효 경로 유전자는 또한 바람직하게 PEP의 OAA로 전환을 촉진하는 폴리펩티드를 생산하도록 변형된 PCK 유전자를 포함할 수도 있다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 효모 세포는 PEP 또는 피루베이트, OAA, 및 말로네이트 세미알데히드 중간물을 통해 진행되는 활성 3-HP 발효 경로를 갖는다 (예컨대, 미국 공개 번호 2010/0021978, 도 1). 이들 구체예에서, 효모 세포는 PPC, PYC, 2-케토산 데카르복실라제, 알파-케토글루타레이트 (AKG) 데카르복실라제 (KGD), 분지형-사슬 알파-케토산 데카르복실라제 (BCKA), 인돌피루베이트 데카르복실라제 (IPDA), 3-HPDH, HIBADH, 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자 중 하나 이상을 포함하는, 한 세트의 3-HP 발효 경로를 포함한다. 3-HP 발효 경로 유전자는 또한 바람직하게 PEP의 OAA로 전환을 촉진하는 폴리펩티드를 생산하도록 변형된 PCK 유전자를 포함할 수도 있다. 게다가, 3-HP 발효 경로 유전자는 OAA의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하도록 변형된, PDC 유전자 및/또는 벤조일포르메이트 데카르복실라제 유전자를 포함할 수도 있다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 효모 세포는 PEP 또는 피루베이트, OAA, 말로닐-CoA, 및 말로네이트 세미알데히드 중간물을 통해 진행되는 활성 3-HP 발효 경로를 가지며, 말로네이트 세미알데히드 중간물은 선택적이다 (예컨대, 미국 공개 번호 2010/0021978, 도 2). 이들 구체예에서, 효모 세포는 PPC, PYC, OAA 포르메이트리아제, 말로닐-CoA 리덕타제, CoA 아실화 말로네이트 세미알데히드 데히드로게나제, 3-HPDH, HIBADH, 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자 중 하나 이상을 포함하는, 한 세트의 3-HP 발효 경로 유전자를 포함한다. 3-HP 발효 경로 유전자는 또한 바람직하게 PEP의 OAA로 전환을 촉진하는 폴리펩티드를 생산하도록 변형된 PCK 유전자를 포함할 수도 있다. 게다가, 3-HP 발효 경로 유전자는 OAA의 말로닐 Coa로 전환을 촉진하는 폴리펩티드를 생산하기 위해 2-케토산 데히드로게나제 유전자를 변형함으로써 유도된 OAA 데히드로게나제 유전자를 포함할 수도 있다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 효모 세포는 피루베이트, 아세틸-CoA, 말로닐-CoA, 및 말로네이트 세미알데히드 중간물을 통해서 진행되는 활성 3-HP 발효 경로를 가지며, 말로네이트 세미알데히드 중간물은 선택적이다 (예컨대, WO02/042418, 도 44). 이들 구체예에서, 효모 세포는 피루베이트 데히드로게나제 (PDH), 아세틸-CoA 카르복실라제 (ACC), 말로닐-CoA 리덕타제, CoA 아실화 말로네이트 세미알데히드 데히드로게나제, 3-HPDH, HIBADH, 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자 중 하나 이상을 포함하는, 한 세트의 3-HP 발효 경로 유전자를 포함한다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 효모 세포는 피루베이트, 알라닌, β-알라닌, β-알라닐-CoA, 아크릴일-CoA, 3-HP-CoA, 및 말로네이트 세미알데히드 중간물을 통해서 진행되는 활성 3-HP 발효 경로를 가지며, β-알라닐-CoA, 아크릴일-CoA, 3-HP-CoA, 및 말로네이트 세미알데히드 중간물은 선택적이다 (β-알라닌은 말로네이트 세미알데히드 중간물을 통해 또는 β-알라닐-CoA, 아크릴일-CoA, 및 3-HP-CoA 중간물을 통해 3-HP로 전환될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 7,309,597, 도 1)). 이들 구체예에서, 효모 세포는 알라닌 데히드로게나제, 피루베이트/알라닌 아미노트랜스퍼라제, 알라닌 2,3 아미노뮤타제, CoA 트랜스퍼라제, CoA 신테타제, β-알라닐-CoA 암모니아 리아제, 3-HP-CoA 데히드라타제, 3-HP-CoA 히드롤라제, 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제, BAAT, 3-HPDH, HIBADH, 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자 중 하나 이상을 포함하는, 한 세트의 3-HP 발효 경로를 포함한다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 효모 세포는 피루베이트, 락테이트, 락틸-CoA, 아크릴일-CoA, 및 3-HP-CoA 중간물을 통해서 진행되는 활성 3-HP 발효 경로를 갖는다 (예컨대, WO02/042418, 도 1). 이들 구체예에서, 효모 세포는 LDH, CoA 트랜스퍼라제, CoA 신테타제, 락틸-CoA 데히드라타제, 3-HP-CoA 데히드라타제, 3-HP-CoA 히드롤라제, 및 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제 유전자 중 하나 이상을 포함하는, 한 세트의 3-HP 발효 경로를 포함한다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 효모 세포는 글리세롤 및 3-HPA 중간물을 통해서 진행되는 활성 3-HP 발효 경로를 갖는다 (예컨대, 미국 특허 6,852,517). 이들 구체예에서, 효모 세포는 글리세롤 데히드라타제 및 알데히드 데히드로게나제 유전자 중 하나 이상을 포함하는, 한 세트의 3-HP 발효 경로를 포함한다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 효모 세포는 PEP 또는 피루베이트, OAA, 아스파르테이트, β-알라닌, β-알라닐-CoA, 아크릴일-CoA, 3-HP-CoA, 및 알라닌 중간물을 통해서 진행되는 활성 3-HP 발효 경로를 가지며, OAA, 아스파르테이트, 및 알라닌 중간물은 선택적이다 (PEP 또는 피루베이트는 OAA 및 아스파르테이트를 통해 또는 알라닌을 통해 β-알라닌으로 전환될 수 있다) (WO02/042418, 도 54; 미국 특허 7,309,597, 도 1 참조). 이들 구체예에서, 효모 세포는 PPC, PYC, AAT, ADC, CoA 트랜스퍼라제, CoA 신테타제, β-알라닐-CoA 암모니아 리아제, 3-HP-CoA 데히드라타제, 3-HP-CoA 히드롤라제, 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제, 알라닌 데히드로게나제, 피루베이트/알라닌 아미노트랜스퍼라제, 및 AAM 유전자 중 하나 이상을 포함하는, 한 세트의 3-HP 발효 경로를 포함한다. 3-HP 발효 경로 유전자는 또한 바람직하게 PEP의 OAA로 전환을 촉진하는 폴리펩티드를 생산하도록 변형된 PCK 유전자를 포함할 수도 있다.
여기에 제공된 효모 세포에서 3-HP 발효 경로 유전자는 내인성 또는 외인성일 수도 있다. "내인성"은 유전자, 프로모터, 및 종결 서열과 같은 유전적 구성요소에 관하여 여기에 사용된 바와 같이 유전적 구성요소가 특정 효모 세포의 네이티브 형태의 게놈의 특정 위치에 존재한다는 것을 의미한다. "외인성"은 유전적 구성요소에 관하여 여기에 사용된 바와 같이 유전적 구성요소가 특정 효모 세포의 네이티브 형태의 게놈의 특정 위치에 존재하지 않는다는 것을 의미한다. "네이티브"는 효모 세포에 관하여 여기에 사용된 바와 같이 특정 효모 종의 야생형 효모 세포를 나타낸다. "네이티브"는 대사 경로에 관하여 여기에 사용된 바와 같이 네이티브 효모 세포에 존재하고 활성인 대사 경로를 나타낸다.
외인성 유전적 구성요소는 네이티브 또는 비-네이티브 서열을 가질 수도 있다. 네이티브 서열을 갖는 외인성 유전적 구성요소는 네이티브 세포의 게놈에 존재하는 유전적 구성요소와 동일한 서열을 포함한다 (기능에 영향을 미치지 않는 개체 간 돌연변이를 제외) (즉, 외인성 유전적 구성요소는 내인성 유전적 구성요소와 동일하다). 하지만, 외인성 구성요소는 내인성 구성요소에 비해 숙주 세포 게놈의 다른 위치에 존재한다. 예를 들어, 내인성 PYC 유전자와 동일한 외인성 PYC 유전자는 효모 세포 내에 삽입될 수도 있으며, 비-네이티브 (증가된) 수의 PYC 유전자 카피를 갖는 변형된 세포를 발생시킨다. 비-네이티브 서열을 갖는 외인성 유전적 구성요소는 네이티브 세포의 게놈에서 발견되지 않는 서열을 포함한다. 예를 들어, 특정 종의 외인성 PYC 유전자는 또 다른 종의 효모 세포 내에 삽입될 수도 있다. 외인성 유전자는 바람직하게 작동 방식에서 숙주 세포 게놈로 통합되며, 숙주 세포에서 활성 단백질을 생산할 수 있다는 것을 의미한다. 하지만, 특정 구체예에서, 외인성 유전자는 숙주 세포질에 안정적으로 유지되는 벡터의 일부로서 세포 내로 도입될 수도 있다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 효모 세포는 하나 이상의 외인성 3-HP 발효 경로 유전자를 포함한다. 특정 구체예에서, 여기에 개시된 유전적으로 변형된 효모 세포는 단일 외인성 유전자를 포함한다. 다른 구체예에서, 효모 세포는 다수의 외인성 유전자를 포함한다. 이들 구체예에서, 효모 세포는 단일 외인성 유전자의 다수의 카피 및/또는 둘 이상의 다른 외인성 유전자의 카피를 포함할 수도 있다. 다수의 외인성 유전자를 포함하는 효모 세포는 어떤 수의 외인성 유전자도 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들 효모 세포는 1 내지 20개의 외인성 유전자를 포함할 수도 있고, 특정 바람직한 구체예에서, 그것들은 1 내지 7개의 외인성 유전자를 포함할 수도 있다. 외인성 유전자의 다수의 카피는 그것들이 서로 인접한 단일 위치에서 통합될 수도 있다. 대안으로, 그것들은 숙주 세포의 게놈 내의 여러 위치에서 통합될 수도 있다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 효모 세포는 하나 이상의 내인성 3-HP 발효 경로 유전자를 포함한다. 이들 중 특정 구체예에서, 세포는 이들 내인성 유전자 중 하나 이상을 과발현하도록 조작될 수도 있으며, 변형된 세포가 적어도 일부 조건 하에서 네이티브 세포보다 더 높은 수준으로 내인성 유전자를 발현한다는 것을 의미한다. 이들 중 특정 구체예에서, 발현되는 내인성 유전자는 하나 이상의 외인성 조절 인자에 작동가능하게 결합될 수도 있다. 예를 들어, 하나 이상의 네이티브 또는 비-네이티브 외인성 강한 프로모터는 그것들이 하나 이상의 내인성 3-HP 경로 유전자에 작동 가능하게 결합되는 세포 내로 도입될 수도 있다.
유전자 여기에 제공된 변형된 효모 세포에서 3-HP 발효 경로는 프로모터 또는 종결자와 같은 하나 이상의 조절 인자에 작동 가능하게 결합될 수도 있다. 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 유전자의 전사의 시작을 조절하는, 유전자의 번역 개시 코돈 (일반적으로 약 1 내지 1000개의 염기쌍 (bp) 이내, 바람직하게 약 1 내지 500 bp 이내)에 대하여 업스트림 (즉, 5')에 위치한 번역되지 않은 서열을 나타낸다. 용어 "종결자"는 여기에 사용된 바와 같이 유전자의 전사의 끝을 조절하는, 유전자의 번역 종결 코돈 (일반적으로 약 1 내지 1000 bp 이내, 바람직하게 약 1 내지 500 bp 이내, 및 특히 약 1 내지 100 bp 이내)에 대하여 다운스트림 (즉, 3')에 위치한 번역되지 않은 서열을 나타낸다. 프로모터 또는 종결자는 유전자의 그것에 관하여 게놈에서 그것의 위치가 프로모터 또는 종결자가, 경우에 따라, 그것의 전사 조절 기능을 수행하는 위치인 경우 유전자와 "작동 가능하게 결합" 된다. 적합한 프로모터 및 종결자는, 예를 들어, W099/14335, WO00/71738, WO02/42471, WO03/102201, WO03/102152 및 WO03/049525에 설명된다 (모두 전문이 본원에 참고로 포함됨).
여기에 제공된 세포의 3-HP 발효 경로 유전자에 결합된 조절 요소는 내인성 또는 외인성일 수도 있다. 예를 들어, 외인성 3-HP 발효 경로 유전자는 내인성 프로모터 및/또는 종결자에 의해 조절되는 효모 세포 내에 삽입될 수도 있다. 대안으로, 외인성 3-HP 발효 경로 유전자는 하나 이상의 외인성 조절 요소에 결합될 수도 있다. 예를 들어, 외인성 유전자는 하나 이상의 외인성 조절 요소를 포함하는 유전자 발현 구조물의 일부로서 세포 내로 도입될 수도 있다. 특정 구체예에서, 외인성 조절 요소, 또는 외인성 조절 요소의 기능적인 부분은 네이티브 서열을 포함할 수도 있다. 다른 구체예에서, 외인성 조절 요소는 비-네이티브 서열을 포함할 수도 있다. 이들 구체예에서, 외인성 조절 요소는 네이티브 조절 요소에 대한 상대적으로 높은 정도의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 외인성 유전자는 네이티브 프로모터 또는 종결자에 대한 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 외인성 프로모터 또는 종결자에 결합될 수도 있다. 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 대한 서열 동일성 퍼센트는 업계에 알려진 방법, 예를 들어, 기본 파라미터를 갖는 BLAST (미국 국립 생물 정보 센터 (National Center Biological In mation; NCBI) 기본 지역 정렬 검색 도구) 버젼 2.2.1 소프트웨어를 사용하여 계산될 수 있다. 예를 들어, 기본 파라미터를 갖는 BLAST 버젼 2.2.1 알고리즘을 사용하여, 적어도 90%의 동일성 점수를 갖는 서열은 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것으로 생각된다. BLAST 소프트웨어는 NCBI, Bethesda, Maryland에서 이용 가능하다.
특정 양태에서, 여기에 제공된 세포에서 3-HP 발효 경로 유전자에 결합된 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)는 경로 유전자에 이질적일 수도 있다. 경로 유전자에 이질적인 조절 요소는 그것의 자연적인 형태로 유전자에 결합되지 않는 조절 요소이다. 당업자는 경로 유전자에 이질적인 조절 요소가 내인성 또는 외인성일 수도 있다는 것을 인정할 수 있으며, 경로 유전자 및 효모 세포와 그것의 관계에 의존적이다. 일부 예에서, 내인성 3-HP 발효 경로 유전자는 경로 유전자에 이질적인 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 결합된다. 다른 예에서, 외인성 3-HP 발효 경로 유전자는 경로 유전자에 이질적인 외인성 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 결합된다.
다수의 외인성 유전자가 숙주 세포 내에 삽입되는 이들 구체예에서, 각각의 외인성 유전자는 다른 조절 요소에 의해 조절될 수도 있거나, 둘 이상의 외인성 유전자는 같은 조절 요소에 의해 조절될 수도 있다. 예를 들어, 첫 번째 외인성 유전자가 첫 번째 조절 요소에 결합되는 경우, 두 번째 외인성 유전자는 또한 첫 번째 조절 요소에 결합될 수도 있거나, 그것은 두 번째 조절 요소에 결합될 수도 있다. 첫 번째 및 두 번째 조절 요소는 동일하거나 높은 정도의 서열 동일성을 공유할 수도 있거나, 그것들은 전혀 관련이 없을 수도 있다.
여기에 제공된 효모 세포에서 하나 이상의 3-HP 발효 경로 유전자에 작동 가능하게 결합되는 프로모터의 예는 PDC1, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK), 자일로스 리덕타제 (XR), 자일리톨 데히드로게나제 (XDH), L-(+)-락테이트-시토크롬 c 옥시도리덕타제 (CYB2), 번역 신장 인자-1 (TEF1), 번역 신장 인자-2 (TEF2), 에놀라제 (ENO1), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH), 및 오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라제 (URA3) 유전자에 대한 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
이들 예에서, 3-HP 발효 경로 유전자는 PDC1, PGK, XR, XDH, CYB2, TEF1, TEF2, EN01, GAPDH, 또는 URA3 유전자에 대한 내인성 또는 외인성 프로모터에 결합될 수도 있다. 프로모터가 외인성인 경우, 그것들은 PDC1, PGK, XR, XDH, CYB2, TEF1, TEF2, EN01, GAPDH, 또는 URA3 유전자에 대한 네이티브 프로모터와 동일하거나 높은 정도의 서열 동일성 (즉, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%)을 공유할 수도 있다.
여기에 제공된 효모 세포에서 하나 이상의 3-HP 발효 경로 유전자에 결합될 수도 있는 종결자의 예는 PDC1, XR, XDH, 트랜스알돌라제 (TAL), 트랜스케톨라제 (TKL), 리보스 5-포스페이트 케톨-이소머라제 (RKI), CYB2, 또는 이소-2-시토크롬 c (CYC) 유전자 또는 유전자의 갈락토스 패밀리 (특히 GAL10 종결자)에 대한 종결자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 예에서, 3-HP 발효 경로 유전자는 PDC1, XR, XDH, TAL, TKL, RKI, CYB2, 또는 CYC 유전자 또는 갈락토스 패밀리 유전자에 대한 내인성 또는 외인성 종결자에 결합될 수도 있다. 종결자가 외인성인 경우, 그것들은 PDC1, XR, XDH, TAL, TKL, RKI, CYB2, 또는 CYC 유전자 또는 갈락토스 패밀리 유전자에 대한 네이티브 종결자와 동일하거나 높은 정도의 서열 동일성 (즉, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%)을 공유할 수도 있다. 특정 구체예에서, 3-HP 발효 경로 유전자는 숙주 세포에 네이티브인 네이티브 GAL10 유전자의 기능적 부분 또는 네이티브 GAL10 종결자와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 종결자에 결합된다.
외인성 유전자는 업계에 알려진 어떤 방법을 통해서도 효모 숙주 세포 내에 삽입될 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 유전자는 숙주 세포 게놈으로 통합된다. 외인성 유전자는 표적화된 또는 무작위의 방식으로 게놈으로 통합될 수도 있다. 이들 구체예에서, 유전자가 표적화된 방식으로 통합될 수도 있는 경우, 그것은 외인성 유전자의 통합이 네이티브 유전자의 삭제 또는 붕괴와 결합되는, 특정 유전자에 대한 위치로 통합될 수도 있다. 예를 들어, 외인성 3-HP 경로 유전자의 도입은 다른 발효 생산 경로에 수반된 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자의 삭제 또는 붕괴와 결합될 수도 있다. 대안으로, 외인성 유전자는 유전자에 해당하지 않는 게놈의 일부로 통합될 수도 있다.
표적화된 통합 및/또는 삭제는 통합 구조물을 이용할 수도 있다. 용어 "구조물"은 여기에 사용된 바와 같이 숙주 세포를 형질전환하기 위해 사용되는 DNA 서열을 나타낸다. 구조물은, 예를 들어, 원형 플라스미드 또는 벡터, 원형 플라스미드 또는 벡터의 일부 (예를 들어, 제한 효소 분해 생성물), 선형 플라스미드 또는 벡터, 또는 주형으로 플라스미드 또는 게놈 DNA를 사용하여 제조된 PCR 생성물일 수도 있다. 외인성 구조물을 갖는 효모 세포를 형질전환하는 방법은, 예를 들어, W099/14335, WO00/71738, WO02/42471, WO03/102201, WO03/102152, 및 WO03/049525에 설명된다. 통합 구조물은 삽입 부위 표적의 두 개의 클로닝된 표적 DNA 서열을 사용하여 조립될 수 있다. 두 개의 표적 DNA 서열은 네이티브 숙주 게놈에서 인접하거나 비-인접할 수도 있다. 이 맥락에서, "비-인접"은 DNA 서열이 네이티브 게놈에서 서로 바로 인접하지 않지만, 대신 삭제되는 영역에 의해 분리된다. "인접한" 서열은 여기에 사용된 바와 같이 네이티브 게놈에서 서로 직접적으로 인접하다. 표적화된 통합이 표적 유전자의 삭제 또는 붕괴에 결합되는 경우, 통합 구조물은 또한 삭제 구조물로서 나타날 수도 있다. 삭제 구조물에서, 표적 서열 중 하나는 표적 유전자의 프로모터, 프로모터 영역의 모두 또는 일부, 표적 유전자의 모두 또는 일부를 암호화하는 서열, 또는 이들의 일부 조합에 대한 영역 5'을 포함할 수도 있다. 다른 표적 서열은 표적 유전자의 종결자, 종결 영역의 모두 또는 일부, 및/또는 표적 유전자의 모두 또는 일부를 암호화하는 서열에 대한 영역 3'을 포함할 수도 있다. 표적화된 통합이 네이티브 유전자의 삭제 또는 붕괴에 결합되지 않을 경우, 간섭 서열 (intervening sequence)의 삽입이 네이티브 유전자의 발현을 붕괴시키지 않는 표적 서열이 선택된다. 두 개의 표적 서열이 원래 숙주 세포의 게놈에 나타나기 때문에 서로 같은 방향인 통합 또는 삭제 구조물이 제조된다. 통합 또는 삭제 구조물이 외인성 유전자를 숙주 세포 내로 도입하기 위해 사용되는 경우, 유전자 발현 카세트는 외인성 유전자의 발현을 허용하는 두 개의 표적 유전자 서열 사이의 구조물로 클로닝된다. 유전자 발현 카세트는 외인성 유전자를 함유하고, 외인성 유전자에 작동 가능하게 결합된 프로모터 또는 종결자와 같은, 하나 이상의 조절 서열을 추가로 포함할 수도 있다. 유전자 발현 카세트를 함유하지 않는 삭제 구조물이 또한 구성될 수 있다. 이러한 구조물은 외인성 유전자의 삽입 없이 유전자 서열을 삭제 또는 붕괴하도록 설계된다.
통합 또는 삭제 구조물은 두 개의 표적 유전자 서열 사이의 구조물로 클로닝된 하나 이상의 선택 마커 카세트를 포함할 수도 있다. 선택 마커 카세트는 형질전환체 (형질전환체)의 선택을 허용하는 적어도 하나의 선택 마커 유전자를 함유한다. "선택 마커 유전자"는 선택 배양 배지에서 형질 전환된 세포의 생존 및/또는 성장에 필요한 단백질을 암호화하는 유전자이고, 그러므로 세포에 대한 선택 압력을 적용하기 위해 사용될 수도 있다. 성공적인 형질전환체는 선택 마커 유전자를 함유할 것이며, 이것은 성공적에 형질전환된 세포에 선택을 위한 근거를 제공하는 적어도 하나의 특징을 전달한다. 전형적인 선택 마커 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소에 대한 저항성 (예를 들어, 블레오마이신 또는 제오마이신 (예를 들어, 스트렙토알로테이추스힌두스타누스 블레 (Streptoalloteichus hindustanus ble) 유전자), 아미노글리코시드, 예를 들어, G418 또는 카나마이신 (예를 들어, 트랜스포손 Tn903의 카나마이신 저항 유전자), 또는 히그로마이신 (예를 들어, 이. 콜리의 아미노글리코시드 항생제 저항 유전자)에 대한 저항성)을 부여하고, (b) 세포의 영양 요구성 (auxotroph) 결핍 (예를 들어, 루신 (예를 들어, 케이. 마르시아누스 (K. marxianus) LEU2 유전자), 우라실 (예를 들어, 케이. 마르시아누스, 에스. 세레비시애, 또는 아이. 오리엔탈리스 URA3 유전자), 또는 트립토판 (예를 들어, 케이. 마르시아누스, 에스. 세레비시애, 또는 아이. 오리엔탈리스 TRP 유전자)의 결핍)을 보충하고, 세포가 단순 배지에서 이용할 수 없는 임계 양분의 합성을 가능하게 하거나, (d) 세포의 특정 탄소 근원에서 성장하는 능력을 부여하는 (예를 들어, 에스. 세레비시애의 MEL5 유전자, 이것은 알파-갈락토시다제 (멜리비아제) 효소를 암호화하고 독특한 탄소 근원으로서 멜리비오제에서 성장하는 능력을 부여한다) 단백질을 암호화한다. 바람직한 선택 마커는 URA3 유전자, 제오신 저항 유전자, G418 저항 유전자, MEL5 유전자, 및 히그로마이신 저항 유전자를 포함한다. 또 다른 바람직한 선택 마커는 L-락테이트:페리시토크롬 c 옥시도리덕타제 (CYB2) 유전자 카세트이며, 숙주 세포는 원래 이러한 유전자가 부족하거나 그것의 네이티브 CYB2 유전자(들)이 먼저 삭제되거나 붕괴된다는 것을 제공한다. 선택 마커 유전자는 숙주 세포에서 작동 가능한 하나 이상의 프로모터 및/또는 종결 서열에 작동 가능하게 결합된다. 특정 구체예에서, 이들 프로모터 및/또는 종결 서열은 선택 마커 카세트에 포함되는 외인성 프로모터 및/또는 종결 서열이다. 적합한 프로모터 및 종결자는 여기에 설명된 바와 같다.
통합 또는 삭제 구조물은 숙주 세포를 형질전환하기 위해 사용된다. 형질전환은, 예를 들어, 전기천공법 (electroporation) 및/또는 화학적 형질전환 (예를 들어, 염화 칼슘, 아세트산 리튬-기반, 등) 방법을 사용하여 달성될 수도 있다. 선택 마커의 존재 또는 부재에 기초한 선택 또는 스크리닝은 성공적인 형질전환체를 확인하기 위해 수행될 수도 있다. 성공적인 형질전환체에서, 표적 부위의 위치에서 상동 재조합 이벤트는 표적 부위 서열의 붕괴 또는 삭제를 일으킨다. 구조물이 삭제 또는 붕괴되는 네이티브 유전자를 표적화하는 경우, 네이티브 표적 유전자의 모두 또는 일부, 그것의 프로모터, 및/또는 그것의 종결자는 그것의 재조합 이벤트 중에 삭제될 수도 있다. 통합 구조물의 표적 서열 사이의 발현 카세트, 선택 마커 카세트, 및 어떤 다른 유전물질이 표적 서열과 일치하는 위치에서 숙주 세포 내에 삽입된다. PCR 또는 서던 (Southern) 분석법에 의한 분석은 원하는 삽입/삭제가 일어났는지 확인하기 위해서 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 형질전환은 단일 구조물 또는 PCR 생성물 대신, 둘 이상의 구조물, PCR 생성물, 또는 이들의 조합의 DNA를 사용하여 수행될 수도 있다. 이들 구체예에서, 한 통합 단편의 3' 말단은 또 다른 통합 단편의 5' 말단과 중복되지 않는다. 한 예에서, 한 구조물은 표적 서열의 위치 및 마커 유전자 카세트의 비-기능적 부분으로부터 첫 번째 서열을 함유하는 한편, 다른 것은 표적 서열의 위치의 두 번째 서열 및 마커 유전자 카세트의 두 번째 비-기능적 부분을 함유할 것이다. 완벽한 카세트를 형성하도록 결합될 수 있는 마커 유전자 카세트의 일부가 선택된다. 세포는 이들 조각으로 동시에 형질전환되며, 완벽한, 기능적 마커 또는 구조물적 유전자 카세트의 형성을 일으킨다. 성공적인 형질전환체는 선택 마커에 의해 전달된 특징에 기초하여 선택될 수 있다. 또 다른 예에서, 한 단편 상에 있지만 표적 서열에 없는 선택 마커 잔기는 원하는 부위에서의 높은 통합 확률을 갖도록, 별도의 단편 상에 있다. 다른 구체예에서, 세 개의 선형 DNA로부터 형질전환은 외인성 유전물질을 통합하기 위해 사용될 수 있다. 이들 구체예에서, 한 단편은 두 번째 단편이 있는 5' 말단 상에서 및 세 번째 단편이 있는 3' 말단 상에서 중복된다.
선택 마커 유전자 및 그것의 조절 요소의 일부 또는 모두가 이후의 상동 재조합 이벤트의 결과로서 자발적으로 삭제될 수 있는 통합 또는 삭제 구조물이 설계될 수도 있다. 이것을 달성하는 편리한 방법은 선택 마커 유전자 및/또는 조절 요소가 반복 서열에 의해 플랭크 (flank) 되는 구조물을 설계하는 것이다. 반복 서열은 동일한 DNA 서열이고, 숙주 세포에 네이티브 또는 비-네이티브이고, 서로 같은 또는 다른 방향에 있는 구조물의 방향이다. 반복 서열은 유리하게 길이가 약 50 내지 1500 bp이고, 어떤 것에 대해서도 암호화할 필요가 없다. 반복 서열의 내용물은 상동 재조합 이벤트가 발생하는 것을 허용하고, 이것은 선택 마커 유전자 및 반복 서열 중 하나의 삭제를 일으킨다. 상동 재조합이 상대적으로 낮은 빈도로 발생하기 때문에, 자발적 상동 재조합이 세포 중 일부에서 나타나는 것을 허용하기 위해 비-선택 배지에서 여러 라운드 동안 형질전환체를 성장시키는 것이 필요할 수도 있다. 선택 마커 유전자가 자발적으로 삭제되는 세포는 선택 마커 유전자에 의해 전달된 그것들의 선택 특징의 손실에 기초하여 선택되거나 스크리닝 될 수 있다. 특정 경우에, 리콤비나제 효소의 발현은 반복 부위 사이의 재조합을 향상시킬 수도 있다.
여기에 제공된 변형된 효모 세포에서 외인성 3-HP 발효 경로 유전자는 어떤 적합한 근원의 근원 유전자로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 외인성 유전자는 효모, 균류, 박테리아, 식물, 곤충, 또는 포유동물 근원으로부터 유도될 수도 있다. 여기에 사용된 바와 같이, 외인성 유전자는 네이티브 근원 유전자로부터 "유도된 (derived from)" 외인성 유전자는 1) 네이티브 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드와 동일하고, 2) 네이티브 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유하고, 및/또는 3-HP 발효 경로에서 네이티브 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드로서 같은 기능을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 예를 들어, 아이. 오리엔탈리스 PYC 유전자로부터 유도된 PYC 유전자는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 및/또는 피루베이트의 OAA로 전환을 촉진하는 능력을 가진 폴리펩티드를 암호화할 수도 있다. 네이티브 유전자로부터 유도된 유전자는 네이티브 유전자의 암호화 영역에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 특정 구체예에서, 네이티브 유전자로부터 유도된 유전자는 근원 유전자의 암호화 영역과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 아이. 오리엔탈리스 PYC 유전자로부터 유도된 PYC 유전자는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
여기에 제공된 변형된 효모 세포의 특정 구체예에서, 외인성 3-HP 발효 경로 유전자가 유발되는 네이티브 근원 유전자는 3-HP 발효 경로에 수반되는 폴리펩티드를 생산한다. 하지만, 다른 구체예에서, 네이티브 근원 유전자는 3-HP 발효 경로에 수반되지 않거나 3-HP 발효 경로에서 역반응을 촉진하는 폴리펩티드를 암호화할 수도 있다. 이들 구체예에서, 외인성 3-HP 경로 유전자는 변형된 활성 및/또는 기질 선호도를 발생시키는, 하나 이상의 표적화된 또는 무작위의 돌연변이 대 네이티브 근원 유전자를 겪었을 것이다. 예를 들어, 네이티브 근원 유전자는 3-HP 발효 경로에서 원하는 반응 방향의 증가된 활성 및/또는 원하지 않는 방향의 감소된 활성으로 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 발생시키도록 돌연변이될 수도 있다. 예를 들어, 3-HP 발효 경로에서 네이티브 근원 유전자가 정반응 및 역반응을 촉진할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 경우, 결과의 외인성 유전자가 정방향에서 증가된 활성 및 역방향에서 감소된 활성을 갖는 유전자는 변형될 수도 있다. 유사하게, 네이티브 근원 유전자는 네이티브 폴리펩티드와 다른 기질 선호도를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 생산하도록 돌연변이될 수도 있다. 예를 들어, 3-HP 경로 유전자는 바람직하지 않거나 네이티브 폴리펩티드에 의해 전혀 작용하지 않는 기질에 대하여 작용하는 능력을 가진 폴리펩티드를 생산하도록 돌연변이 될 수도 있다. 이들 구체예에서, 외인성 3-HP 경로 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드는 네이티브 근원 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드가 완벽히 촉진할 수 없는 반응을 촉진할 수도 있다. 결과의 3-HP 경로 유전자가 하나 이상의 다운스트림 3-HP 경로 중간물 또는 부산물의 존재시 DNA, RNA, 또는 단백질 수준에서 감소된 피드백 (feedback) 억제를 나타내는 네이티브 근원 유전자가 또한 돌연변이될 수도 있다.
여기에 제공된 변형된 효모 세포의 특정 구체예에서, 외인성 3-HP 경로 유전자는 숙주 효모 종으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 아이. 오리엔탈리스인 경우, 외인성 유전자는 아이. 오리엔탈리스 유전자로부터 유도될 수도 있다. 이들 구체예에서, 외인성 유전자는 야생형 세포의 유전자의 발현을 구동하는 프로모터와 다른 프로모터에 의해 조절되는 경우 외인성 유전자의 숙주 세포로 통합이 네이티브 유전자 서열의 카피 수를 증가시키고 및/또는 유전자의 조절 또는 발현 수준을 변화시키는, 네이티브 유전자의 암호화 영역과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 다른 구체예에서, 외인성 3-HP 경로 유전자는 네이티브 3-HP 경로 유전자의 암호화 영역과 다른 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있지만, 그럼에도 불구하고, 네이티브 3-HP 경로 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 동일한 폴리펩티드를 암호화한다. 다른 구체예에서, 외인성 3-HP 경로 유전자는 하나 이상의 네이티브 3-HP 경로 유전자에 의해 암호화된폴리펩티드에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 이들 중 특정 구체예에서, 외인성 유전자는 하나 이상의 네이티브 유전자에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 외인성 3-HP 유전자는 네이티브 3-HP 경로 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드에 대하여 50%보다 작은 서열 동일성을 갖지만 그럼에도 불구하고, 3-HP 발효 경로의 네이티브 폴리펩티드와 같은 기능 (즉, 같은 반응을 촉진하는 능력)을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 수도 있다. 네이티브 근원 유전자는 보통의 진핵생물 개시 코돈 (ATG)으로 시작하는 암호화 서열을 제공하기 위해 필요한 경우, 또는 다른 목적으로 돌연변이 유발을 받을 수도 있다.
다른 구체예에서, 외인성 3-HP 경로 유전자는 숙주 효모 세포의 그것과 다른 종으로부터 유도될 수도 있다. 이들 중 특정 구체예에서, 외인성 3-HP 경로 유전자는 숙주 세포와 다른 효모 종으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 아이. 오리엔탈리스인 경우, 외인성 유전자는 에스. 세레비시애로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, 외인성 3-HP 경로 유전자는 균류, 박테리아, 식물, 곤충, 또는 포유동물 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 아이. 오리엔탈리스인 경우, 외인성 유전자는 박테리아 근원, 예를 들어, 이. 콜리로부터 유도될 수도 있다. 이들 구체예에서, 외인성 3-HP 경로 유전자가 비-효모 근원으로부터 유도되는 경우, 외인성 유전자 서열은 효모 숙주 세포의 발현에 코돈-최적화될 수도 있다.
이들 구체예에서, 외인성 3-HP 경로 유전자가 숙주 세포 종 이외의 종으로부터 유도되는 경우 외인성 유전자는 근원 유기체의 네이티브 3-HP 경로 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드와 동일한 폴리펩티드를 암호화할 수도 있다. 이들 중 특정 구체예에서, 외인성 3-HP 경로 유전자는 근원 유기체의 네이티브 3-HP 경로 유전자와 동일할 수도 있다. 다른 구체예에서, 외인성 유전자는 근원 유기체의 네이티브 3-HP 경로 유전자에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유할 수도 있다. 다른 구체예에서, 외인성 3-HP 경로 유전자는 근원 유기체의 네이티브 3-HP 경로 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유하는 폴리펩티드를 암호화할 수도 있다. 이들 중 특정 구체예에서, 외인성 유전자는 근원 유기체의 하나 이상의 네이티브 3-HP 경로 유전자에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 다른 구체에에서, 외인성 3-HP 유전자는 근원 유기체의 네이티브 3-HP 경로 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드에 대하여 50%보다 작은 서열 동일성을 갖지만, 그럼에도 불구하고 3-HP 발효 경로에서 근원 유기체의 네이티브 폴리펩티드와 같은 기능을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 수도 있다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 효모 세포는 ACC (아세틸-CoA의 말로닐-CoA로 전환을 촉진), 알라닌 2,3 아미노뮤타제 (AAM, 알라닌의 β-알라닌으로 전환을 촉진), 알라닌 데히드로게나제 (피루베이트의 알라닌으로 전환을 촉진), 알데히드 데히드로게나제 (3-HPA의 3-HP로 전환을 촉진), KGD (OAA의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진), AAT (OAA의 아스파르테이트로 전환을 촉진), ADC (아스파르테이트의 β-알라닌으로 전환을 촉진), BCKA (OAA의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진), BAAT (β-알라닌의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진), 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제 (gabT, β-알라닌의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진), β-알라닐-CoA 암모니아 리아제 (β-알라닐-CoA의 아크릴일-CoA로 전환을 촉진), Co-A 아실화 말로네이트 세미알데히드 데히드로게나제 (말로닐-CoA의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진), CoA 신테타제 (β-알라닌의 β-알라닐-CoA로 전환 또는 락테이트의 락틸-CoA로 전환을 촉진), CoA 트랜스퍼라제 (β-알라닌의 β-알라닐-CoA 및/또는 락테이트의 락틸-CoA로 전환을 촉진), 글리세롤 데히드라타제 (글리세롤의 3-HPA로 전환을 촉진), IPDA (OAA의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진), LDH (피루베이트의 락테이트로 전환을 촉진), 락틸-CoA 데히드라타제 (락틸-CoA의 아크릴일-CoA로 전환을 촉진), 말레이트 데카르복실라제 (말레이트의 3-HP로 전환을 촉진), 말레이트 데히드로게나제 (OAA의 말레이트로 전환을 촉진), 말로닐-CoA 리덕타제 (말로닐-CoA의 말로네이트 세미알데히드 또는 3-HP로 전환을 촉진), OAA 포르메이트리아제 (피루베이트-포르메이트 리아제 및 케토산 포르메이트-리아제로도 알려짐, OAA의 말로닐 Coa로 전환을 촉진), OAA 데히드로게나제 (OAA의 말로닐 CoA로 전환을 촉진); PPC (PEP의 OAA로 전환을 촉진), 피루베이트/알라닌 아미노트랜스퍼라제 (피루베이트의 알라닌으로 전환을 촉진), PYC (피루베이트의 OAA로 전환을 촉진), PDH (피루베이트의 아세틸-CoA로 전환을 촉진), 2-케토산 데카르복실라제 (OAA의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진), 3-HP-CoA 데히드라타제 (아크릴일-CoA 히드라타제로도 알려짐, 아크릴일-CoA의 3-HP-CoA로 전환을 촉진), 3-HPDH (말로네이트 세미알데히드의 3-HP로 전환을 촉진), 3-HP-CoA 히드롤라제 (3-HP-CoA의 3-HP로 전환을 촉진), HIBADH (말로네이트 세미알데히드의 3-HP로 전환을 촉진), 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제 (3-HP-CoA의 3-HP로 전환을 촉진), 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 (말로네이트 세미알데히드의 3-HP로 전환을 촉진)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 3-HP 경로 효소를 암호화하는 유전자를 발현한다. 이들 효소 활성 각각에 대하여, 괄호의 원하는 반응은 네이티브 또는 비-네이티브 활성의 결과일 수도 있다.
"피루베이트 카르복실라제 유전자" 또는 "PYC 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 피루베이트 카르복실라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 피루베이트, C02, 및 ATP의 OAA, ADP, 및 포스페이트로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 특정 구체예에서, PYC 유전자는 효모 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, PYC 유전자는 SEQ ID NO: 2에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 아이. 오리엔탈리스 PYC 유전자로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, 유전자는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 아이. 오리엔탈리스-유도 PYC 유전자는 SEQ ID NO: 1에 설명된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 SEQ ID NO: 1에 설명된 뉴클레오티드에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 다른 구체예에서, PYC 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, PYC 유전자는 보전 (anaplerosis)을 위해 PYC만 사용하고 PPC는 사용하지 않는 (하기 참조) 소수의 박테리아 종 중 하나, 예를 들어, 알. 스패로이데스, 또는 PYC 및 PPC 둘 다를 소유하는 박테리아 종, 예를 들어, 알 에틀리로부터 유도될 수도 있다. 알. 스패로이데스 및 알. 에틀리의 PYC 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3 및 4에 각각 설명된다. PYC 유전자는 SEQ ID NO: 3 또는 4의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자, 또는 SEQ ID NO: 3 또는 4의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자로부터 유도될 수도 있다. 대안으로, PYC 유전자는 활성화를 위해 아세틸-Coa에 대한 의존성을 갖지 않는 효소를 암호화하는 PYC 유전자, 예를 들어, SEQ ID NO: 5 (카르복시트랜스퍼라제 서브유닛) 또는 SEQ ID NO: 6 (비오틴 카르복실라제 서브유닛)에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 피. 플루오레센스 PYC 유전자, SEQ ID NO: 7에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 씨. 글루타미쿰 PYC 유전자, 또는 SEQ ID NO: 5, 6, 또는 7의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자로부터 유도될 수도 있다. PYC 유전자는 또한 아스파르테이트에 의해 억제되지 않는 효소를 암호화하는 PYC 유전자, 예를 들어, SEQ ID NO: 8 (Sauer FEMS Microbiol Rev 29:765 (2005))에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 멜리로티 PYC 유전자, 또는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산을 암호화하는 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"PEP 카르복실라제 유전자" 또는 "PPC 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 PEP 카르복실라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, PEP 및 CO2의 OAA 및 포스페이트로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 특정 구체예에서, PPC 유전자는 박테리아 PPC 유전자로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, PPC 유전자는 SEQ ID NO: 10에 설명된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 이. 콜리 PPC 유전자로부터 유도될 수도 있다. 특정 구체예에서, 이. 콜리-유도 PPC 유전자는 SEQ ID NO: 9에 설명된 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 9에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 다른 구체예에서, PPC 유전자는 "A" 타입 PPC로부터 유도될 수도 있으며, 많은 고세균류 (archaea) 및 제한된 수의 박테리아에서 발견되고, 이것은 아세틸 CoA에 의해 활성화되며 아스파르테이트에 의해 덜 억제된다. 예를 들어, PPC 유전자는 SEQ ID NO: 11에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 엠. 써모아우토트로피쿰 PPC A 유전자, 예를 들어, 서열 SEQ ID NO: 12에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 씨. 페르프링겐스 PPC A 유전자, 또는 SEQ ID NO: 1 1 또는 12의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산을 암호화하는 유전자로부터 유도될 수도 있다. 이들 중 특정 구체예에서, 유전자는 네이티브 유전자에 비해 개선된 특징을 갖는 효소를 발생시키기 위하여 하나 이상의 돌연변이를 겪을 수도 있다. 예를 들어, 유전자는 네이티브 폴리펩티드에 비해 아스파르테이트 피드백에 대한 증가된 저항성을 갖는 PPC 폴리펩티드를 암호화하도록 돌연변이 될 수도 있다. 다른 구체예에서, PPC 유전자는 식물 근원으로부터 유도될 수도 있다.
"아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 유전자" 또는 "AAT 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타매녀, OAA의 아스파르테이트로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 활성을 갖는 효소는 EC 2.6.1.1로서 분류된다. 특정 구체예에서, AT 유전자는 아이. 오리엔탈리스 또는 에스. 세레비시애와 같은 효모 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, AAT 유전자는 SEQ ID NO: 14에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 아이. 오리엔탈리스 AAT 유전자 또는 SEQ ID NO: 15에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 세레비시애 AAT2 유전자로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, 유전자는 SEQ ID NO: 14 또는 15의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 아이. 오리엔탈리스-유도 AAT 유전자는 SEQ ID NO: 13에 설명된 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 13에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 다른 구체예에서, AT 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, AAT 유전자는 SEQ ID NO: 16에 설명된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 이. 콜리 aspC 유전자로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, 유전자는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다.
"아스파르테이트 데카르복실라제 유전자" 또는 "ADC 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 아스파르테이트 데카르복실라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 아스파르테이트의 β-알라닌으로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 아스파르테이트 데카르복실라제 활성을 가진 효소는 EC 4.1.1.11로서 분류된다. 특정 구체예에서, DC 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 활성 아스파르테이트 데카르복실라제는 불활성화 프로효소의 단백질 가수분해 과정이 필요할 수도 있기 때문에, 이들 구체예에서, 효모 숙주 세포는 박테리아 ADC 유전자에 의해 암호화된 활성 효소의 형성을 지지하도록 선택되어야 한다.
일부 구체예에서, DC 유전자는 SEQ ID NO: 17에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 아베르미틸리스 panD 유전자로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, DC 유전자는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 에스. 아베르미틸리스-유도 ADC 유전자는 SEQ ID NO: 130, 145, 146, 또는 147 중 어느 하나에 설명된 뉴클레오티드 서열; 또는 SEQ ID NO: 130, 145, 146, 또는 147 중 어느 하나에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
다른 구체예에서, DC 유전자는 SEQ ID NO: 18에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 씨. 아세토부틸리쿰 panD 유전자로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, DC 유전자는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 씨. 아세토부틸리쿰-유도 ADC 유전자는 SEQ ID NO: 131에 설명된 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 131에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
다른 구체예에서, DC 유전자는 SEQ ID NO: 133에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에이치. 필로리 ADC 유전자로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, DC 유전자는 SEQ ID NO: 133의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 에이치. 필로리-유도 ADC 유전자는 SEQ ID NO: 133에 설명된 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 133에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
다른 구체예에서, DC 유전자는 SEQ ID NO: 135에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 바실루스 종 TS25 ADC 유전자로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, DC 유전자는 SEQ ID NO: 135의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 바실루스 종 TS25-유도 ADC 유전자는 SEQ ID NO: 134에 설명된 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 134에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
다른 구체예에서, DC 유전자는 SEQ ID NO: 137에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 씨. 글루타미쿰 ADC 유전자로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, DC 유전자는 SEQ ID NO: 137의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 씨. 글루타미쿰-유도 ADC 유전자는 SEQ ID NO: 136에 설명된 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 136에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
다른 구체예에서, DC 유전자는 SEQ ID NO: 139에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 비. 리체니포르미스 ADC 유전자로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, DC 유전자는 SEQ ID NO: 139의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 비. 리체니포르미스-유도 ADC 유전자는 SEQ ID NO: 138, 148, 149, 150, 또는 151 중 어느 하나에 설명된 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 138, 148, 149, 150, 또는 151 중 어느 하나에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
"β-알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자" 또는 "BAAT 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 β-알라닌 아미노트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어느 유전자도 나타내며, β-알라닌의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. β-알라닌 아미노트랜스퍼라제 활성을 가진 효소는 EC 2.6.1.19로서 분류된다. 특정 구체예에서, BAAT 유전자는 효모 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, BAAT 유전자는 SEQ ID NO: 20에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 pyd4 유전자에 대한 아이. 오리엔탈리스 상동체로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, BAAT 유전자는 SEQ ID NO: 20의 아마노산에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 아이. 오리엔탈리스-유도 BAAT 유전자는 SEQ ID NO: 19에 설명된 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 19에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 다른 구체예에서, BAAT 유전자는 SEQ ID NO: 21에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 클루이베리 pyd4 유전자로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, BAAT 유전자는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 에스. 클루이베리-유도 BAAT 유전자는 SEQ ID NO: 142에 설명된 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 142에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 다른 구체예에서, BAAT 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, BAAT 유전자는 SEQ ID NO: 22에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 아베르미틸리스 BAAT 유전자로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, BAAT 유전자는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 에스. 아베르미틸리스-유도 BAAT 유전자는 서열 SEQ ID NO: 140에 설명된 뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO: 140에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
BAAT 유전자는 또한 "4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제" 또는 "gabT 유전자"일 수도 있고, 그것이 4-아미노부티레이트 뿐만 아니라 β-알라닌에 대한 네이티브 활성을 갖는다는 것을 의미한다. 대안으로, BAAT 유전자는 박테리아 또는 효모 근원으로부터 무작위로 유도될 수도 있거나 BAAT 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하도록 박테리아 또는 효모 근원의 네이티브 gabT 유전자를 조작하도록 지시될 수도 있다. 예를 들어, BAAT 유전자는 SEQ ID NO: 23에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 아베르미틸리스 gabT로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, 에스. 아베르미틸리스-유도 BAAT 유전자는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 다른 구체예에서, BAAT 유전자는 SEQ ID NO: 24에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 세레비시애 gabT 유전자 UGA1로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, 에스. 세레비시애-유도 BAAT 유전자는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 에스. 세레비시애-유도 BAAT 유전자는 SEQ ID NO: 141에 설명된 뉴클레오티드 서열 또는 서열 SEQ ID NO: 141에 설명된 뉴클레오티드에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
"3-HP 데히드로게나제 유전자" 또는 "3-HPDH 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 3-HP 데히드로게나제 활성을 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 말로네이트 세미알데히드의 3-HP로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 3-HP 데히드로게나제 활성을 가진 효소는 그것들이 NAD(H) 공통인자를 이용하면 EC 1.1.1.59로서, 및 그것들이 NADP(H) 공통인자를 이용하면 EC 1.1.1.298로서 분류된다. EC 1.1.1.298로서 분류된 효소는 대안으로, 말로네이트 세미알데히드 리덕타제로 나타난다.
특정 구체예에서, 3-HPDH 유전자는 효모 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 3-HPDH 유전자는 SEQ ID NO: 26에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 YMR226C 유전자에 대한 아이. 오리엔탈리스 상동체로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, 3-HPDH 유전자는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 아이. 오리엔탈리스-유도 3-HPDH 유전자는 SEQ ID NO: 25에 설명된 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 25에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 다른 구체예에서, 3-HPDH 유전자는 SEQ ID NO: 129에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 세레비시애 YMR226C 유전자로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, 3-HPDH 유전자는 SEQ ID NO: 129의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 에스. 세레비시애-유도 3-HPDH 유전자는 SEQ ID NO: 144에 설명된 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 144에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
다른 구체예에서,3-HPDH 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 3-HPDH 유전자는 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 암호화하는 이. 콜리 ydfG 유전자로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, 유전자는 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 이. 콜리-유도 3-HPDH 유전자는 SEQ ID NO: 143에 설명된 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 143에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 다른 구체예에서, 3-HPDH 유전자는 SEQ ID NO: 29에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 엠. 세둘라 말로네이트 세미알데히드 리덕타제 유전자로부터 유도될 수도 있다. 일부 구체예에서, 3-HPDH 유전자는 SEQ ID NO: 29에 설명된 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다. 특정 구체예에서, 엠. 세둘라-유도 3-HPDH 유전자는 SEQ ID NO: 343에 설명된 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 343에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
"3-히드록시이소부티레이트 데히드로게나제 유전자" 또는 "HIBADH 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 3-히드록시이소부티레이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 3-히드록시이소부티레이트의 메틸말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 3-히드록시이소부티레이트 데히드로게나제 활성을 가진 효소는 EC 1.1.1.31로서 분류된다. 일부 3-히드록시이소부티레이트 데히드로게나제는 또한 3-HPDH 활성을 갖는다. 특정 구체예에서, HIBADH 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, HIBADH 유전자는 SEQ ID NO: 28에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에이. 패칼리스 M3A 유전자, SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 31에 설명된 아미노산 서열을 각각 암호화하는 피. 푸티다 KT2440 또는 E23440 mmsB 유전자, 또는 SEQ ID NO: 32에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 피. 애루기노사 PA01 mmsB 유전자로부터 유도될 수도 있다. 특정 구체예에서, HIBADH 유전자는 SEQ ID NO: 28, 30, 31, 또는 32에 설명된 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한다.
"4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 4-히드록시부타노에이트의 숙시네이트 세미알데히드로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 활성을 갖는 효소는 EC 1.1.1.61로서 분류된다. 일부 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제는 또한 3-HPDH 활성을 갖는다. 특정 구체예에서, 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자는 SEQ ID NO: 33에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 알. 유트로파 H16 4hbd 유전자 또는 SEQ ID NO: 34에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 씨. 클루이베리 DSM 555 hbd 유전자로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, 유전자는 SEQ ID NO: 33 또는 34에 설명된 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수도 있다.
"PEP 카르복시키나제 유전자" 또는 "PCK 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 PEP 카르복시키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, PEP, C02, 및 ADP 또는 GDP의 OAA 및 ATP 또는 GTP로, 또는 그 반대의 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. PEP 카르복시키나제 활성을 가진 효소는 EC 4.1.1.32로서 (GTP/GDP 이용) 및 EC 4.1.1.49 (ATP/ADP 이용)로서 분류된다. 특정 구체예에서, PCK 유전자는 효모 근원으로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, PCK 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있고, 이들 중 특정 구체예에서, 유전자는 데카르복실화가 우세한 경우 PCK 반응이 반응의 더 일반적인 형태 대신에 OAA의 생산을 선호하는 박테리아로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, PCK 유전자는 SEQ ID NO: 35에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 엠. 숙시니시프로듀센스 (M. succiniciproducens) PCK 유전자, SEQ ID NO: 36에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에이. 숙시니시프로듀센스 (A. succiniciproducens) PCK 유전자, SEQ ID NO: 37에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에이. 숙시노게네스 (A. succinogenes) PCK 유전자, 또는 SEQ ID NO: 38에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 알. 유트로파 PCK 유전자로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, PCK 유전자는 유도되는 네이티브 유전자에 비해, 결과의 유전자가 바람직하게 PEP의 OAA로 전환을 촉진하는 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 돌연변이를 겪었다. 예를 들어, PCK 유전자는 SEQ ID NO: 39에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 이. 콜리 K12 균주 PCK 유전자로부터 유도될 수도 있으며, 유전자는 바람직하게 PEP의 OAA로 전환을 촉진하도록 돌연변이되었다. 다른 구체예에서, PEP의 OAA로 전환은, 예를 들어, ATP/ADP 또는 GTP/GDP 대신에 무기 포스페이트 및 디포스페이트를 사용하는 프로피온산 박테리아 (예를 들어, 피. 셰르마니이 (P. shermanii), 에이. 우디이 (A. woodii))에서 발견되는 PEP 카르복시트랜스포스포릴라제에 의해 촉진된다.
"말레이트 데히드로게나제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 말레이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, OAA의 말레이트로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 특정 구체예에서, 말레이트 데히드로게나제 유전자는 박테리아 또는 효모 근원으로부터 유도될 수도 있다.
"말레이트 데카르복실라제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 말레이트 데카르복실라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 말레이트의 3-HP로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 말레이트 데카르복실라제 활성은 자연 발생하는 것으로 알려져 있지 않다. 그러므로, 말레이트 데카르복실라제 유전자는 하나 이상의 돌연 변이를 아세토락테이트 데카르복실라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 네이티브 근원 유전자로 통합함으로써 유도될 수도 있다. 아세토락테이트 데카르복실라제 활성을 갖는 폴리펩티드는 2-히드록시-2-메틸-3-옥소부타노에이트의 2-아세토인으로 전환을 촉진하고, EC 4.1.1.5로서 분류된다. 특정 구체예에서, 말레이트 데카르복실라제 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 말레이트 데카르복실라제 유전자는 SEQ ID NO: 40에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 엘. 락티스 (L. lactis) aldB 유전자, SEQ ID NO: 41에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 써모필루스 (S. thermophilus) aldB 유전자, SEQ ID NO: 42에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 비. 브레비스 (B. brevis) aldB 유전자, 또는 SEQ ID NO: 43에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 이. 애로게네스 (E. aerogenes) budA 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"알파-케토글루타레이트 (AKG) 데카르복실라제 유전자" 또는 "KGD 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 알파-케토글루타레이트 (2-옥소글루타레이트)의 숙시네이트 세미알데히드 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. AKG 데카르복실라제 활성을 가진 효소는 EC 4.1.1.71로서 분류된다. KGD 유전자는 OAA의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 유도하기 위해 사용될 수도 있다. 이 활성은 네이티브 KGD 유전자에서 발견될 수도 있거나, 그것은 하나 이상의 돌연변이를 네이티브 KGD 유전자로 통합함으로써 유도될 수도 있다. 특정 구체예에서, KGD 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, KGD 유전자는 SEQ ID NO: 44에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 엠. 튜버쿨로시스 (M. tuberculosis) KGD 유전자, SEQ ID NO: 45에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 비. 자포니쿰 (B. japonicum) KGD 유전자, 또는 SEQ ID NO: 46에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 엠. 로티 (M. loti; 아카 리조비움 로티 (aka Rhizobium loti)) KGD 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"분지형-사슬 알파-케토산 데카르복실라제 유전자" 또는 "BCKA 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 분지형-사슬 알파-케토산 데카르복실라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 이것은 데카르복실레이트에 길이가 3 내지 6개의 탄소의 다양한 알파-케토산을 제공할 수 있다. BCKA 활성을 가진 효소는는 EC 4.1.1.72로서 분류된다. BCKA 유전자는 OAA의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 유도하기 위해 사용될 수도 있다. 이 활성은 네이티브 BCKA 유전자에서 발견될 수도 있거나, 그것은 하나 이상의 돌연변이를 네이티브 BCKA 유전자로 통합함으로써 유도될 수도 있다. 특정 구체예에서, BCKA 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, BCKA 유전자는 SEQ ID NO: 47에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 엘. 락티스 kdcA 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"인돌피루베이트 데카르복실라제 유전자" 또는 "I PDA 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 인돌피루베이트 데카르복실라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 인돌피루베이트의 인돌아세트알데히드로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. IPDA 활성을 가진 효소는 EC 4.1.1.74로서 분류된다. IPDA 유전자는 OAA의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 유도하기 위해 사용될 수도 있다. 이 활성은 네이티브 IPDA 유전자에서 발견될 수도 있거나, 그것은 하나 이상의 돌연변이를 네이티브 IPDA 유전자로 통합함으로써 유도될 수도 있다. 특정 구체예에서, 인돌피루베이트 데카르복실라제 유전자는 효모, 박테리아, 또는 식물 근원으로부터 유도될 수도 있다.
"피루베이트 데카르복실라제 유전자" 또는 "PDC 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 피루베이트 데카르복실라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 피루베이트의 아세트알데히드로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. PDC 활성을 가진 효소는 EC 4.1.1.1로서 분류된다. 바람직한 구체예에서, 여기에 제공된 바와 같이 변형된 효모 세포로 통합되는 PDC 유전자는 네이티브 유전자에 비해 결과의 유전자가 OAA의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 것으로부터 유도된 하나 이상의 돌연변이를 겪었다. 특정 구체예에서, PDC 유전자는 효모 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, PDC 유전자는 SEQ ID NO: 49에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 이. 오리엔탈리스 PDC 유전자, SEQ ID NO: 50에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 스. 세레비시애 PDC1 유전자, 또는 SEQ ID NO: 51에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 케이. 락티스 (K. lactis) PDC로부터 유도될 수도 있다. 특정 구체예에서, PDC 유전자는 SEQ ID NO: 48에 설명된 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 48에 설명된 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴크레오티드 서열을 포함할 수도 있는 아이. 오리엔탈리스 PDC 유전자로부터 유도된다. 다른 구체예에서, PDC 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, PDC 유전자는 SEQ ID NO: 52에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) PDC 유전자 또는 SEQ ID NO: 53에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에이. 파스튜리아누스 (A. pasteurianus) PDC 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"벤조일포르메이트 데카르복실라제" 유전자 여기에 사용된 바와 같이 벤조일포르메이트 데카르복실라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 벤조일포르메이트의 벤즈알데히드로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 벤조일포르메이트 데카르복실라제 활성을 가진 효소는 EC 4.1.1.7로서 분류된다. 바람직한 구체예에서, 여기에 제공된 바와 같이 변형된 효모 세포로 통합되는 벤조일포르메이트 데카르복실라제 유전자는 네이티브 유전자에 비해 결과의 유전자가 OAA의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 것으로부터 유도된 하나 이상의 돌연변이를 겪었다. 특정 구체예에서, 벤조일포르메이트 데카르복실라제 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 벤조일포르메이트 데카르복실라제 유전자는 SEQ ID NO: 54에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 피. 푸티다 mdIC 유전자, SEQ ID NO: 55에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 피. 애루기노사 mdIC 유전자, SEQ ID NO: 56에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 피. 스투트제리 (P. stutzeri) dpgB 유전자, 또는 SEQ ID NO: 57에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 피. 플루오레센스 ilvB-1 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"OAA 포르메이트리아제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 OAA 포르메이트리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 아세틸레이트 케토산의 그것의 해당 CoA 유도체로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. OAA 포르메이트리아제 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드는 피루베이트 또는 또 다른 케토산에 대한 활성을 가질 수도 있다. 특정 구체예에서, OAA 포르메이트리아제 유전자는 OAA를 말로닐-CoA로 전환시키는 폴리펩티드를 암호화한다.
"말로닐-CoA 리덕타제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 말로닐-CoA 리덕타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 말로닐-CoA의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다 (Co-A 아실화 말로네이트 세미알데히드 데히드로게나제 활성으로도 나타남). 특정 구체예에서, 말로닐-CoA 리덕타제 유전자는 말로네이트 세미알데히드의 3-HP로 전환을 촉진하는 능력도 갖는 이기능성 말로닐-CoA 리덕타제 유전자로부터 유도될 수도 있다. 이들 중 특정 구체예에서, 말로닐-CoA 리덕타제 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 말로닐-CoA 리덕타제 유전자는 SEQ ID NO: 58에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 씨. 아우란티아쿠스 (C. aurantiacus) 말로닐-CoA 리덕타제 유전자, SEQ ID NO: 59에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 알. 카스텐홀지이 (R. castenholzii) 말로닐-CoA 리덕타제 유전자, 또는 SEQ ID NO: 60에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에리트로박터 종 NAP1 말로닐-CoA 리덕타제 유전자로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, 말로닐-CoA 리덕타제 유전자는 말로닐-CoA의 말로네이트 세미알데히드로 전환을 촉진하는 폴리펩티드를 암호화하는 말로닐-CoA 리덕타제 유전자로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 말로닐-CoA 리덕타제 유전자는 SEQ ID NO: 61에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 엠. 세둘라 Msed_0709 유전자 또는 SEQ ID NO: 62에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 토코다이이 (S. tokodaii) 말로닐-CoA 리덕타제로부터 유도될 수도 있다.
"피루베이트 데히드로게나제 유전자" 또는 "PDH 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 피루베이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 피루베이트의 아세틸-CoA로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 특정 구체예에서, PDH 유전자는 효모 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, PDH 유전자는 각각 SEQ I D NO: 63-66에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 세레비시애 LAT1, PDA1, PDB1, 또는 LPD 유전자로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, PDH 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, PDH 유전자는 각각 SEQ ID NO: 67-69에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 이. 콜리 균주 K12 substr. MG1655 aceE, aceF, 또는 Ipd 유전자, 또는 각각 SEQ ID NO: 70-73에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 비. 서브틸리스 (B. subtilis) pdhA, pdhB, pdhC, 또는 pdhD 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"아세틸-CoA 카르복실라제 유전자" 또는 "ACC 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 아세틸-CoA 카르복실라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 아세틸-CoA의 말로닐-CoA로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 아세틸-CoA 카르복실라제 활성을 가진 효소는 EC 6.4.1.2로서 분류된다. 특정 구체예에서, 아세틸-CoA 카르복실라제 유전자는 효모 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 아세틸-CoA 카르복실라제 유전자는 SEQ ID NO: 74에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 세레비시애 ACC1 유전자로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, 아세틸-CoA 카르복실라제 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 아세틸-CoA 카르복실라제 유전자는 각각 SEQ ID NO: 75-78에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 이. 콜리 accA, accB, accC, 또는 accD 유전자, 또는 각각 SEQ ID NO: 79-82에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 씨. 아우란티아쿠스 accA, accB, accC, 또는 accD 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"알라닌 데히드로게나제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 알라닌 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 피루베이트의 알라닌으로 NAD-의존적 환원성 아미노화를 촉진하는 능력을 의미한다. 알라닌 데히드로게나제 활성을 가진 효소는 EC 1.4.1.1로서 분류된다. 특정 구체예에서, 알라닌 데히드로게나제 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 알라닌 데히드로게나제 유전자는 SEQ ID NO: 83에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 비. 서브틸리스 알라닌 데히드로게나제 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"피루베이트/알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 피루베이트/알라닌 아미노트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 피루베이트 및 L-글루타메이트의 알라닌 및 2-옥소글루타레이트로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 특정 구체예에서, 피루베이트/알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자는 효모 근원으로부터 유도된다. 예를 들어, 피루베이트/알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자는 SEQ ID NO: 84에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 폼베 피루베이트/알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자 또는 SEQ ID NO: 85에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 세레비시애 ALT2 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"알라닌 2,3 아미노뮤타제 유전자" 또는 "AAM 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 알라닌 2,3 아미노뮤타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 ㄴ나타내며, 알라닌의 β-알라닌으로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 알라닌 2,3 아미노뮤타제 활성은 자연 발생하는 것으로 알려져 있지 않다. 그러므로, 알라닌 2,3 아미노뮤타제 유전자는 하나 이상의 돌연변이를 유사한 활성, 예를 들어, 리신 2,3 아미노뮤타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 네이티브 근원 유전자로 통합함으로써 유도될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 7,309,597). 특정 구체예에서, 네이티브 근원 유전자는 SEQ ID NO: 86에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 비. 서브틸리스 리신 2,3 아미노뮤타제 유전자, SEQ ID NO: 87에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 피. 깅기발리스 (P. gingivalis) 리신 2,3 아미노뮤타제 유전자, 또는 SEQ ID NO: 88에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에프. 뉴클레아툼 (F. nucleatum) (ATCC-10953) 리신 2,3 아미노뮤타제 유전자일 수도 있다.
"CoA 트랜스퍼라제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 CoA 트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 이것은 예를 들어, β-알라닌의 β-알라닐-CoA으로 전환 및/또는 락테이트의 락틸-CoA로 전환을 촉진하는 능력을 포함한다. 특정 구체예에서, CoA 트랜스퍼라제 유전자는 효모 근원으로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, CoA 트랜스퍼라제 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, CoA 트랜스퍼라제 유전자는 SEQ ID NO: 89에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 엠. 엘스데니이 (M. elsdenii) CoA 트랜스퍼라제 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"CoA 신테타제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 CoA 신테타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타낸다. 한 예에서, 이것은 β-알라닌의 β-알라닐-CoA로 전환을 촉진하는 능력을 포함한다. 또 다른 예에서, 이것은 락테이트의 락틸-CoA로 전환을 촉진하는 능력을 포함한다. 특정 구체예에서, CoA 신테타제 유전자는 효모 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, CoA 신테타제 유전자는 에스. 세레비시애 CoA 신테타제 유전자로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, CoA 신테타제 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, CoA 신테타제 유전자는 이. 콜리 CoA 신테타제, 알. 스패로이데스, 또는 에스. 엔테리카 (S. enterica) CoA 신테타제 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"β-알라닐-CoA 암모니아 리아제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 β-알라닐-CoA 암모니아 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, β-알라닐-CoA의 아크릴일-CoA로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 특정 구체예에서, β-알라닐-CoA 암모니아 리아제 유전자는 박테리아 근원, 예를 들어, SEQ ID NO: 90에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 씨. 프로피오니쿰 (C. propionicum) β-알라닐-CoA 암모니아 리아제 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"3-HP-CoA 데히드라타제 유전자" 또는 "아크릴일-CoA 히드라타제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 3-HP-CoA 데히드라타제 유전자 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 아크릴일-CoA의 3-HP-CoA로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 3-HP-CoA 데히드라타제 활성을 가진 효소는 EC 4.2.1.116로서 분류된다. 특정 구체예에서, 3-HP-CoA 데히드라타제 유전자는 효모 또는 균류 근원, 예를 들어, SEQ ID NO: 91에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 피. 소재 (P. sojae) 3-HP-CoA 데히드라타제 유전자로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, 3-HP-CoA 데히드라타제 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 3-HP-CoA 데히드라타제 유전자는 SEQ ID NO: 92에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 씨. 아우란티아쿠스 3-HP-CoA 데히드라타제 유전자, SEQ ID NO: 93에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 알. 루브룸 (R. rubrum) 3-HP-CoA 데히드라타제 유전자, 또는 SEQ ID NO: 94에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 알. 캡슐라테스 (R. capsulates) 3-HP-CoA 데히드라타제 유전자로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, 3-HP-CoA 데히드라타제 유전자는 포유동물 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 3-HP-CoA 데히드라타제 유전자는 SEQ ID NO: 95에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에이치. 사피엔스 (H. sapiens) 3-HP-CoA 데히드라타제 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"3-HP-CoA 히드롤라제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 3-HP-CoA 히드롤라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 3-HP-CoA의 3-HP로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 특정 구체예에서, 3-HP-CoA 유전자는 효모 또는 균류 근원으로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, 3-HP-CoA 유전자는 박테리아 또는 포유동물 근원으로부터 유도될 수도 있다.
"3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 이것은 예를 들어, 3-HP-CoA의 3-HP로 전환을 촉진하는 능력을 포함한다. 특정 구체예에서, 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제 유전자는 박테리아 근원, 예를 들어, SEQ ID NO: 96에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 피. 플루오레센스 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제 유전자 또는 SEQ ID NO: 97에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 비. 세레우스 (B. cereus) 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제 유전자로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제 유전자는 SEQ ID NO: 98에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 포유동물 근원, 예를 들어, 에이치. 사피엔스 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"락테이트 데히드로게나제 유전자" 또는 "LDH 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 락테이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 피루베이트의 락테이트로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 특정 구체예에서, LDH 유전자는 균류, 박테리아, 또는 포유동물 근원으로부터 유도될 수도 있다.
"락틸-CoA 데히드라타제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 락틸-CoA 데히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 락틸-CoA의 아크릴일-CoA로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 특정 구체예에서, 락틸-CoA 데히드라타제 유전자는 박테리아 근원으로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 락틸-CoA 데히드라타제 유전자는 SEQ ID NO: 99-101에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 엠. 엘스데니이 락틸-CoA 데히드라타제 E1, Ella, 또는 Ellb 서브유닛 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"알데히드 데히드로게나제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 알데히드 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 이것은 예를 들어, 3-HPA의 3-HP로 및 그 반대의 전환을 촉진하는 능력을 포함한다. 특정 구체예에서, 알데히드 데히드로게나제 유전자는 효모 근원, 예를 들어, SEQ ID NO: 102에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 세레비시애 알데히드 데히드로게나제 유전자 또는 SEQ ID NO: 122, 124, 또는 126에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 아이. 오리엔탈리스 알데히드 데히드로게나제 유전자로부터 유도될 수도 있다. 다른 구체예에서, 알데히드 데히드로게나제는 박테리아 근원, 예를 들어, SEQ ID NO: 103에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 이. 콜리 aldH 유전자 또는 SEQ ID NO: 104에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 케이. 뉴모니애 (K. pneumoniae) 알데히드 데히드로게나제 유전자로부터 유도될 수도 있다.
"글리세롤 데히드라타제 유전자"는 여기에 사용된 바와 같이 글리세롤 데히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 어떤 유전자도 나타내며, 글리세롤의 3-HPA로 전환을 촉진하는 능력을 의미한다. 특정 구체예에서, 글리세롤 데히드라타제 유전자는 박테리아 근원, 예를 들어, 케이. 뉴모니아 (K. pneumonia) 또는 씨. 프레운디이 (C. freundii) 글리세롤 데히드라타제 유전자로부터 유도될 수도 있다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 유전적으로 변형된 효모 세포는 하나 이상의 네이티브 유전자의 삭제 또는 붕괴를 더 포함한다. 네이티브 유전자에 관한 "삭제 또는 붕괴"는 유전자의 전체 암호화 영역이 제거 (삭제)되거나 유전자가 더 이상 활성 효소를 생산하지 않거나, 크게 감소된 양 (적어도 75% 감소, 바람직하게 저어도 90% 감소)의 활성 효소를 생산하거나, 크게 감소된 (적어도 75% 감소, 바람직하게 적어도 90% 감소) 활성을 갖는 효소를 생산하는 유전자의 암호화 영역, 그것의 프로모터, 및/또는 그것의 종결 영역이 변형된다는 것을 의미한다.
특정 구체예에서, 하나 이상의 네이티브 유전자의 삭제 또는 붕괴는 하나 이상의 네이티브 대사 경로의 삭제 또는 붕괴를 일으킨다. 대사 경로에 관한 "삭제 또는 붕괴"는 경로가 작동 불가능하거나 네이티브 경로에 비해 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 적어도 95% 감소된 활성을 나타낸다는 것을 의미한다. 특정 구체예에서, 네이티브 대사 경로의 삭제 또는 붕괴는 3-HP 생산을 감소시키는 하나 이상의 네이티브 유전자의 감소된 발현을 일으키는 하나 이상의 유전적 변형을 통합함으로써 달성된다.
특정 구체예에서, 네이티브 유전자의 삭제 또는 붕괴는 강제 진화 ( ced evolution), 돌연변이 유발, 또는 유전적 조작 방법에 이어서, 원하는 돌연변이를 확인하기 위해 적절한 선택 또는 스크리닝에 의해 달성될 수 있다. 특정 구체예에서, 네이티브 숙주 세포 유전자의 삭제 또는 붕괴는 하나 이상의 외인성 유전자의 숙주 세포로 통합과 결합될 수도 있다, 즉, 외인성 유전자는 또한 삭제 구조물인 유전자 발현 통합 구조물을 사용하여 통합될 수도 있다. 다른 구체예에서, 삭제 또는 붕괴는 외인성 유전자를 함유하지 않는 삭제 구조물을 사용하여 또는 업계에 알려진 다른 방법으로 달성될 수도 있다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 유전적으로 변형된 효모 세포는 예를 들어, 피루베이트 데카르복실라제 (PDC, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환) 및/또는 알콜 데히드로게나제 (ADH, 아세트알데히드를 에탄올로 전환) 유전자를 포함하는, 에탄올 발효에 수반되는 효소를 암호화하는 하나 이상의 네이티브 유전자의 삭제 또는 붕괴를 포함한다. 이들 변형은 효모 세포의 에탄올을 생산하는 능력을 감소시키고, 이로 인해 3-HP 생산을 최대화한다. 하지만, 특정 구체예에서, 여기에 제공된 유전적으로 변형된 효모 세포는 3-HP 및 에탄올을 동시 생산하도록 조작될 수도 있다. 이들 구체예에서, 에탄올 발효에 수반되는 효소를 암호화하는 네이티브 유전자는 바람직하게 삭제되거나 붕괴되고, 특정 구체예에서, 효모 세포는 에탄올 생산을 증가시키는 하나 이상의 외인성 유전자를 포함할 수도 있다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 유전적으로 변형된 효모 세포는 대체 발효 생성물, 예를 들어, 글리세롤 또는 다른 부산물, 예를 들어, 아세테이트 또는 디올의 생산에 수반되는 효소를 암호화하는 하나 이상의 네이티브 유전자의 삭제 또는 붕괴를 포함한다. 예를 들어, 여기에 제공된 세포는 글리세롤 3-포스페이트 데히드로게나제 (GPD, 디히드록시아세톤 포스페이트의 글리세롤 3-포스페이트로 반응을 촉진함), 글리세롤 3-포스파타제 (GPP, 글리세롤-3 포스페이트의 글리세롤로 전환을 촉진함), 글리세롤 키나제 (글리세롤 3-포스페이트의 글리세롤로 전환을 촉진함), 디히드록시아세톤 키나제 (디히드록시아세톤 포스페이트의 디히드록시아세톤로 전환을 촉진함), 글리세롤 데히드로게나제 (디히드록시아세톤의 글리세롤로 전환을 촉진함), 알데히드 데히드로게나제 (ALD, 예를 들어, 아세트알데히드를 아세테이트로 또는 3-HP를 3-HPA로 전환함), 또는 부탄디올 데히드로게나제 (부탄디올의 아세토인으로 및 그 반대의 전환을 촉진함) 유전자 중 하나 이상의 삭제 또는 붕괴를 포함할 수도 있다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 유전적으로 변형된 효모 세포는
3-HP 발효 경로에서 역반응을 촉진하는 효소, 예를 들어, PEP 카르복시키나제 (PCK), OAA 데카르복실라제 활성을 갖는 효소, 또는 CYB2A 또는 CYB2B (락테이트의 피루베이트로 전환을 촉진함)를 암호화하는 하나 이상의 네이티브 유전자의 삭제 또는 붕괴를 포함한다. PCK는 PEP의 OAA로 및 그 반대의 전환을 촉진하지만, PEP 반응에 대한 OAA에 대하여 선호도를 나타낸다. OAA의 PEP로 전환을 감소시키기 위해, 네이티브 PCK 유전자의 하나 이상의 카피가 삭제되거나 붕괴될 수도 있다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 네이티브 PCK 유전자가 삭제되거나 붕괴되는 효모 세포는 PEP의 OAA로 전환을 선호하는 폴리펩티드를 암호화하도록 돌연변이된 하나 이상의 외인성 PCK 유전자를 발현할 수도 있다. OAA 데카르복실라제는 OAA의 피루베이트로 전환을 촉진한다. OAA 데카르복실라제 활성을 갖는 효소, 예를 들어, 이. 콜리의 eda 유전자에 의해 암호화된 것들 및 효모 및 균류의 말산 효소 (MAE)가 확인되었다. OAA 데카르복실라제 활성을 감소시키기 위해, OAA 데카르복실라제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 네이티브 유전자의 하나 이상의 카피는 삭제되거나 붕괴될 수도 있다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 네이티브 OAA 데카르복실화 유전자가 삭제되거나 붕괴되는 효모 세포는 피루베이트의 OAA로 전환을 촉진하는 폴리펩티드를 암호화하도록 돌연변이 된 하나 이상의 외인성 OAA 데카르복실화 유전자를 발현할 수도 있다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 유전적으로 변형된 효모 세포는 3-HP 발효 경로 생성물 또는 중간물로 원하지 않는 반응에 수반되는 효소를 암호화하는 하나 이상의 네이티브 유전자의 삭제 또는 붕괴를 포함한다. 이러한 유전자의 예는 3HP를 3HP의 알데히드로 전환시키는 효소를 암호화하는 것들을 포함하며, 이것은 박테리아 세포에 해로운 것으로 알려져 있다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 유전적으로 변형된 효모 세포는, 예를 들어, GAL6 (갈락토스를 글루코스로 전환하는 GAL 시스템의 음성 조절기)를 포함하는, 3-HP 발효 경로에 대하여 중성 효과를 갖는 효소를 암호화하는 하나 이상의 네이티브 유전자의 삭제 또는 붕괴를 포함한다. 중성 유전자의 삭제 또는 붕괴는 네이티브 발효 경로에 영향을 미치지 않고 하나 이상의 외인성 유전자의 삽입을 허용한다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 효모 세포는 3-HP 저항성 효모 세포이다. "3-HP-저항성 효모 세포"는 여기에 사용된 바와 같이 4.0 미만의 pH에서 75 g/L 이상의 3-HP를 함유하는 배지에 적어도 2.5 g/L/hr의 평균 당분해 속도를 나타내는 효모 세포를 나타낸다. 이러한 속도 및 조건은 3-HP를 생산하는 경제적인 공정을 대표한다. 이들 중 특정 구체예에서, 효모 세포는 그것들의 네이티브 형태로 3-HP 저항성을 나타낼 수도 있다. 다른 구체예에서, 세포는 활성 3-HP 발효 경로와 관련된 유전적 변형의 도입 전에, 중에, 또는 후에 돌연변이 및/또는 선택된 세포는 같은 종의 야생형 세포보다 3-HP에 대하여 더 높은 정도의 저항성을 소유하는, 돌연변이 및/또는 선택 (예를 들어, 케모스태트 선택 또는 반복된 일련의 계대 배양)을 겪을 수도 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 세포는 하나 이상의 외인성 3-HP 경로 유전자를 가지고 유전적으로 변형되기 전에 3-HP 또는 젖산의 존재시 돌연변이 및/또는 선택을 겪었다. 특정 구체예에서, 돌연변이 및/또는 선택은 그것들의 네이티브 형태로 3-HP 저항성을 나타내는 세포에서 수행될 수도 있다. 돌연변이 및/또는 선택을 겪는 세포는 3-HP 생산을 위한 산업상 숙주로서 그것들의 가능성을 결정하기 위해 다양한 수준의 3-HP의 존재시 당 소비 및 다른 특징에 대하여 테스트될 수도 있다. 3-HP 저항성 이외에, 여기에 제공된 효모 세포는 하나 이상의 추가적 유기산 (예를 들어, 젖산) 또는 다른 발효 생성물, 부산물, 또는 배지 성분에 대한 저항성의 돌연변이 및/또는 선택을 겪을 수도 있다.
선택, 예를 들어, 3-HP에 대한 또는 다른 화합물에 대한 저항성의 선택은 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 달성될 수도 있다. 예를 들어, 상기 언급된 바와 같이, 선택은 케모스태트 선택일 수도 있다. 케모스태트 선택은 미생물 (예를 들어, 효모)의 연속 배양을 허용하는 케모스태트를 사용하며, 특이적 성장 속도 및 세포 수가 독립적으로 조절될 수 있다. 연속 배양은 본질적으로 배지가 연속적으로 추가되고 어떤 오버플로우 (overflow)의 연속적인 제거도 일어날 수 있는 일정한 부피의 플로우 시스템 (flow system)이다. 세포 수 및 영양 상태는 일정하게 유지되고, 시스템은 정상 상태이다. 케모스태트는 희석 속도 및 제한된 영양, 예를 들어, 탄소 또는 질소 근원의 농도의 변화를 통해 배양의 군집 밀도 및 특이적 성장 속도 둘 다의 조절을 허용한다. 배양이 성장함에 따라 조건을 변화시킴으로써 (다른 것들 중에, 예를 들어, 접종물 균주의 성장에 필요한 두 번째 탄소 근원의 농도를 감소시킴), 변화된 조건에서 더 빨리 성장할 수 있는 집단의 미생물은 선택될 것이고 새로운 조건 하에 작용하지 않는 미생물보다 커질 것이다. 전형적으로 이러한 선택은 케모스태트 배양의 성장의 과정을 통해 적어도 하나의 배양 성분의 점진적 증가 또는 감소가 필요할 것이다. 미생물의 유도 진화에서 케모스태트의 작동 및 그것들의 사용은 업계에 잘 알려져 있다 (예컨대, Novick Proc Natl Acad Sci USA 36:708-719 (1950), Harder J Appl Bacteriol 43:1-24 (1977). 선택되는 다른 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,629,162에 설명된 바와 같이 선택적 조건 하에 반복된 연속적 계대 배양이다. 이러한 방법은 상기 설명된 글루코스 제한 케모스태트 방법을 대신해서, 또는 이에 더하여 사용될 수 있다.
하기 실시예에 개시된 바와 같이 3-HP 배지에서 성장 및 글루코스 소비의 최고의 조합을 나타내는 효모 균주는 3-HP 발효 경로에 관한 다양한 유전적 변형에 대하여 바람직한 숙주 세포이다. 상대적으로 높은 정도의 3-HP 저항성에 대한 가능성을 소유하는 효모 속은 4 미만의 pH에서 75 g/L 이상의 3-HP의 존재시 성장에 의해 지시된 바와 같이, 예를 들어, 칸디다, 클루이베로미세스, 이사트첸키아, 사카로미세스, 피치아, 쉬조사카로미세스, 토룰라스포라, 및 지고사카로미세스를 포함한다. 3-HP 저항성을 나타내는 종은 아이. 오리엔탈리스 (씨. 크루세이 (C. krusei)로도 알려짐), 씨. 람비카 (피치아 페르멘탄스로도 알려짐), 및 에스. 불데리 (카자흐스타니아 불데리 (Kazachstania bulderi)로도 알려짐)를 포함한다. 아이. 오리엔탈리스 및 씨. 람비카는 아이. 오리엔탈리스/피. 페르멘탄스 클레이드의 것인 한편, 에스. 불데리는 사카로미세스 클레이드의 것이다. 3-HP 저항성을 나타내는 특이적 균주는 아이. 오리엔탈리스 균주 24210, PTA-6658, 60585, 및 CD1822, 에스. 불데리 균주 MYA-402 및 MYA-404, 및 씨. 람비카 균주 ATCC 38617를 포함하였다.
다른 야생형 효모 또는 균류는 여기에 설명된 바와 같이 높은 수준의 3-HP의 존재시 성장 및 글루코스 이용의 허용 가능한 수준을 갖는지 유사한 방식으로 테스트되고 확인될 수도 있다. 예를 들어, Gross 및 Robbins (Hydrobiologia 433(103):91-109)는 잠재적 생산 숙주로서 테스트하기에 적절한 낮은 pH (<4) 환경에서 81개의 균류 종의 목록을 편집하였다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 변형된 효모 세포는 하나 이상의 유전적 변형을 크랩트리-음성 숙주 효모 세포로 통합함으로써 발생된다. 이들 중 특정 구체예에서, 숙주 효모 세포는 속 이사트첸키아, 칸디다, 또는 사카로미세스에 속하고, 이들 중 특정 구체예에서, 숙주 세포는 아이. 오리엔탈리스/피. 페르멘탄스 또는 사카로미세스 클레이드에 속한다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 아이. 오리엔탈리스 또는 씨. 람비카, 또는 에스. 불데리이다.
아이. 오리엔탈리스/피. 페르멘탄스 클레이드는 적어도 종 아이. 오리엔탈리스, 피. 갈레이포르미스 (P. galei mis), 피. 종 YB-4149 (NRRL 지명), 씨. 에타놀리카 (C. 에탄올ica), 피. 데세르티콜라 (P. deserticola), 피. 멤브라니파시엔스 (P. membranifaciens), 및 피. 페르멘탄스를 함유하는 가장 말단의 클레이드이다. 아이. 오리엔탈리스/피. 페르멘탄스 클레이드의 멤버는 "Identification and Phylogeny of Ascomycetous Yeasts from Analysis of Nuclear Large Subunit (26S) Ribosomal DNA Partial Sequences," Antonie van Leeuwenhoek 73:331-371, 1998에서 Kurtzman 및 Robnett에 의해 설명된 방법을 사용하여, 효모 종의 26S 리보솜 DNA의 가변 D1/D2 도메인의 분석에 의해 확인되며, 본원에 참고로 포함된다 (특히 p. 349 참조). 수백개의 자낭균류 (ascomycetes)의 26S 리보솜 DNA의 가변 D1/D2 도메인의 분석은 아이. 오리엔탈리스/피. 페르멘탄스 클레이드가 아주 밀접하게 관련된 종을 함유한다는 것을 나타낸다. 아이. 오리엔탈리스/피. 페르멘탄스 클레이드의 멤버는 26S 리보솜 DNA의 가변 D1/D2 도메인에서 클레이드 외부의 효모 종보다 클레이드의 다른 멤버에 대하여 더 큰 유사성을 나타낸다. 그러므로, Kurtzman 및 Robnett의 방법을 사용하여, 아이. 오리엔탈리스/피. 페르멘탄스 클레이드의 다른 멤버는 그것들 각각의 리보솜 DNA의 D1/D2 도메인의 비교에 의해 및 클레이드의 다른 멤버의 그것과 클레이드 외부의 밀접하게 관련된 종을 비교함으로써 확인될 수 있다.
특정 구체예에서, 여기에 제공된 유전적으로 변형된 효모 세포는 속 이사트첸키아에 속하고, 이들 중 특정 구체예에서, 효모 세포는 아이. 오리엔탈리스이다. 첫 번째 특징으로 할 때, 종 아이. 오리엔탈리스는 명칭 피치아 쿠드리아브제비이 (Pichia kudriavzevii)로 지정되었다. 아이. 오리엔탈리스의 무성생식 (무성 형태)는 칸디다 크루세이로서 알려져 있다. 종 아이. 오리엔탈리스에 대한 많은 추가적 동의어가 별도로 나열되었다 (Kurtzman and Fell, The 효모s, a Taxonomic Study. 섹션 35. 이사트첸키아 쿠드리아브트세브 (Issatchenkia kudryavtsev), pp 222-223 (1998)).
3-HP 생산을 위한 이상적인 효모 세포는 이상적으로 낮은 pH 수준에서 성장할 수 있다. 낮은 pH에서 발효를 수행하는 능력은 다운스트림 회수 비용을 감소시키며, 더 경제적인 생산을 일으킨다. 그러므로, 특정 구체예에서, 효모 숙주 세포는 낮은 pH 수준 (예를 들어, 7, 6, 5, 4, 또는 3 미만의 pH 수준)에서 성장할 수 있다.
적합한 숙주 세포는 3-HP 저항성 및/또는 낮은 pH 성장 능력 외에 하나 이상의 바람직한 특징을 소유할 수도 있다. 예를 들어, 3-HP 저항성을 나타내는 잠재적 숙주 세포는 당분해 속도, 열 내성, 바이오매스 가수분해 생성물 억제제에 대한 내성, 전체적인 과정의 견고성, 등에 기초하여 추가로 선택될 수도 있다. 이들 기준은 3-HP 발효 경로와 관련된 어떤 유전적 변형 이전에 평가될 수도 있으며, 그것들은 하나 이상의 이러한 변형이 일어나고 난 후에 평가될 수도 있다.
대부분 효모가 에탄올의 네이티브 생산자이기 때문에, 피루베이트 (PDC)로부터 에탄올 생산의 첫 번째 단계를 촉진하는 효소의 제거 또는 극심한 감소는 대체 생성물의 충분한 수득율에 필요하다. 크랩트리-양성 효모, 예를 들어, 사카로미세스에서, 삭제된 또는 붕괴된 PDC 유전자는 숙주가 에탄올 또는 아세테이트와 같은 이-탄소 화합물에 대한 영양 요구성을 얻는 것을 유발하고, 글루코스를 함유한 배지에서 성장의 결핍을 유발한다. 이들 한계를 극복할 수 있는 돌연변이는 아세테이트 독립성 및 글루코스 내성에 대하여 점진적 선택을 사용하여 얻어질 수 있다 (예컨대, van Maris AppI Environ Microbiol 70:159 (2004)). 그러므로, 특정 구체예에서, 바람직한 효모 숙주 세포는 크랩트리-음성 효모 세포이며, PDC 삭제 균주는 글루코스에서 성장할 수 있고 C2 자가 영양성 (prototrophy)을 유지한다.
특정 세포에서 이용되는 유전자 발현의 수준 및/또는 외인성 유전자의 수는 선택된 효모 종에 따라 다를 것이다. 완전히 게놈-나열된 효모에 대하여, 전체-게놈 화학양론적 모델은 효소가 원하는 경로를 3-HP 발효 경로로 발달시키기 위해 발현되어야 하는지 결정하기 위해 사용될 수도 있다. 전체-게놈 화학양론적 모델은, 예를 들어, Hjersted et al, "게놈-scale analysis of Saccharomyces cerevisiae metabolism and ethanol production in fed-batch culture," Biotechnol. Bioeng. 2007; 및 Famili et al, "Saccharomyces cerevisiae phenotypes can be predicted by using con균주t-based analysis of a 게놈-scale reconstructed metabolic network," Proc. Natl. Acad. Sci. 2003, 100(23): 13134-9에 설명된다.
알려진 게놈 서열이 없는 효모에 대하여, 원하는 유전자에 대한 서열 (과발현 후보물질로서 또는 삽입 부위로서)은 전형적으로 실시예 2A에 하기 설명된 것들과 같은 기술을 사용하여 얻어질 수 있다. 일상적인 실험 설계는 3-HP 경로에서 작용하는 유전자 및 효소를 포함하는, 다양한 유전자의 발현 및 다양한 효소의 활성을 테스트하기 위해 이용될 수 있다. 각각의 효소가 효모에서 개별적으로 및 효소의 최대 차단시 발현되고 개선된 3-HP 생산위해 필요한지 (또는 요구되는지) 확립하기 위해, 바람직하게 모든 경로 효소를 포함하는, 실험이 수행될 수도 있다. 하나의 예시적 실험 설계는 각각의 개별적 효소 뿐만 아니라 효소의 각각의 독특한 쌍의 발현을 테스트하고, 모든 필요한 효소의 발현, 또는 효소의 각각의 독특한 조합을 추가로 테스트할 수 있다. 많은 접근법이 인정되는 것만큼, 취해질 수 있다.
특정 구체예에서, 방법은 여기에 제공된 바와 같이 유전적으로 변형된 효모 세포로부터 3-HP를 생산하기 위해 제공된다. 특정 구체예에서, 이들 방법은 적어도 하나의 탄소 근원의 존재시 여기에 제공된 바와 같이 유전적으로 변형된 효모 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 일정 기간 동안 세포가 3-HP를 생산하는 것을 허용하고, 배지로부터 세포에 의해 생산된 3-HP를 분리한다. 탄소 근원은 제공된 효모에 의해 발효될 수 있는 어떤 탄소 근원일 수도 있다. 탄소 근원은 12개의 탄소 당, 예를 들어, 수크로스, 헥소스 당, 예를 들어, 글루코스 또는 프럭토스, 글리칸 또는 글루코스의 다른 폴리머, 글루코스 올리고머, 예를 들어, 말토스, 말토트리오스 및 이소말토트리오스, 판노스, 및 프럭토스 올리고머일 수도 있다. 세포가 펜토스 당을 발효시키는 능력을 전달하기 위해 변형되면, 발효 배지는 펜토스 당, 예를 드어, 자일로스, 자일란 또는 자일로스의 다른 올리고머, 및/또는 아라비노스를 포함할 수도 있다. 이러한 펜토스 당은 적합하게 헤미셀룰로스-함유 바이오매스의 가수분해물이다. 올리고머 당의 경우에서, 세포에 의한 발효를 위하여 이들을 해당하는 모노머 당으로 분해하기 위해 효소를 발효 브로스에 추가하는 것이 필요할 수도 있다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 타입의 유전적으로 변형된 효모 세포가 배지에 존재할 수도 있다. 유사하게, 특정 구체예에서, 유전적으로 변형된 효모 세포보다 같은 또는 다른 종의 하나 이상의 네이티브 효모 세포가 배지에 존재할 수도 있다.
특정 구체예에서, 3-HP를 생산하기 위해 여기에 제공된 세포의 배양은 단계별로 나누어질 수도 있다. 예를 들어, 세포 배양 과정은 배양 단계, 생산 단계 및 회수 단계로 나누어질 수도 있다. 업계의 보통의 기술 중 하나는 이들 단계에 사용된 조건이 사용되는 효모의 종, 효모에 의해 이용된 특이적 3-HP 발효 경로, 원하는 수득율, 또는 다른 인자와 같은 인자에 기초하여 달라질 수도 있다.
배지는 전형적으로 특정 세포에 필요한 만큼, 질소의 근원 (예를 들어, 아미노산, 단백질, 암모니아 또는 암모늄 염, 등과 같은 무기 질소 근원), 및 다양한 비타민, 미네랄 등을 포함하는, 영양소를 함유할 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세포는 화학적 한정 배지에서 배양될 수 있다. 한 예에서, 배지는 약 약 5 g/L 암모늄 술페이트, 약 3 g/L 칼륨 디히드로겐 포스페이트, 약 0.5 g/L 마그네슘 술페이트, 미량의 원소, 비타민 및 약 150 g/L 글루코스를 함유한다. pH는 배양 중에 자유롭게 다양한 것이 허용될 수도 있거나 pH가 사전 결정된 수준 이하로 떨어지거나 그 이상으로 증가하는 것을 방지하는데 필요한 경우 완충될 수도 있다. 특정 구체예에서, 발효 배지는 약 1.0의 OD600을 생산하기 위해 평가의 대상이 되는 충분한 효모 세포로 접종된다. 달리 명백하게 지시되지 않으면, OD600은 여기에 사용된 바와 같이 모델 DU600 분광광도계 (Beckman Coulter)를 사용하여 1 cm 경로길이로 600 nm의 파장에서 측정된 최적의 밀도를 나타낸다. 배양 온도는 약 30-40 ℃로 다양할 수도 있고, 배양 시간은 최대 약 120 시간일 수도 있다.
한 예에서, 발효 배지에서 세포의 농도는 전형적으로 생산 단계 중에 약 0.1 내지 20, 바람직하게 0.1 내지 5, 더 바람직하게 1 내지 3 g 건조 세포/발효 배지의 리터의 범위에 있다. 발효는 경로 필요조건에 의존적으로 호기성으로, 미세호기성으로, 또는 혐기성으로 수행될 수도 있다. 원하면, 산소 흡수율 (OUR)은 과정 조절로서 발효를 통해 달라질 수 있다 (예컨대, WO03/102200). 일부 구체예에서, 여기에 제공된 변형된 효모 세포는 2 내지 45 mmol/L/hr, 예를 들어, 2 내지 25, 2 내지 20, 2 내지 15, 2 내지 10, 10 내지 45, 15 내지 40, 20 내지 35, 또는 25 내지 35 mmol/L/hr의 산소 흡수율을 특징으로 하는 미세호기성 조건 하에서 배양된다. 특정 구체예에서, 여기에 제공된 변형된 효모 세포는 2 내지 25 mmol/L/hr의 산소 흡수율을 특징으로 하는 미세호기성 조건 하에 배양될 때 특히 잘 수행될 수도 있다. 배지는 생산 단계 중에 pH가 약 3.0 내지 약 7.0, 또는 약 4.0 내지 약 6.0의 범위에서 유지되도록 완충될 수도 있다. 적합한 완충제는 형성되는 산을 중화하는 염기성 물질이고, 예를 들어, 칼슘 히드록시드, 칼슘 카르보네이트, 나트륨 히드록시드, 칼륨 히드록시드, 칼륨 카르보네이트, 나트륨 카르보네이트, 암모늄 카르보네이트, 암모니아, 암모늄 히드록시드 등을 포함한다. 일반적으로, 통상적인 발효 과정에 사용되는 이들 완충제가 또한 여기에 적합하다.
이들 구체예에서, 완충된 발효가 이용되는 경우, 산성 발효 생성물은 형성되는 해당하는 염에 대하여 중화될 수도 있다. 이들 구체예에서, 산의 회수는 자유 산의 재생을 수반한다. 이것은 세포를 제거함으로써 및 발효 브로스를 황산과 같은 강산으로 산성화함으로써 수행될 수도 있다. 이것은 염 부산물의 형성을 일으킨다. 예를 들어, 칼슘 염이 중화제로서 이용되고 황산이 산성화제로서 이용되는 경우, 석고가 염 부산물로서 생산된다. 이 부산물은 브로스로부터 분리되고, 산은 액체-액체 추출, 증류, 흡수, 등과 같은 기술을 사용하여 회수된다 (예컨대, T.B. Vickroy, Vol. 3, Chapter 38 of Comprehensive Biotechnology, (ed. M. Moo-Young), Pergamon, Ox d, 1985; R. Datta, et al, FEMS Microbiol Rev, 1995, 16:221-231; 미국 특허 번호 4,275,234, 4,771,001, 5,132,456, 5,420,304, 5,510,526, 5,641,406, 및 5,831,122, 및 WO93/00440).
다른 구체예에서, 발효 브로스의 pH는 배양 중에 3-HP의 pKa 이상, 전형적으로 4.5 이상인 시작 pH로부터 산성 발효 생성물의 pKa 이하, 예를 들어, 4.5 또는 4.0 미만, 예를 들어, 약 1.5 내지 약 4.5의 범위, 약 2.0 내지 약 4.0의 범위, 또는 약 2.0 내지 약 3.5의 범위로 떨어지는 것이 허용될 수도 있다.
다른 구체예에서, 발효는 발효 과정의 시작 전에 또는 시작할 때 발효 배지의 pH를 생성물 산의 pKa 이하로 조정함으로써 생성물 산을 생산하기 위해 수행될 수도 있다. 그 이후 pH는 배양을 통해 생성물 산의 pKa 이하로 유지될 수도 있다. 특정 구체예에서, pH는 4.5 또는 4.0 미만, 예를 들어, 약 1.5 내지 약 4.5의 범위, 약 2.0 내지 약 4.0의 범위, 또는 약 2.0 내지 약 3.5의 범위로 유지될 수도 있다.
여기에 제공된 방법의 특정 구체예에서, 유전적으로 변형된 효모 세포는 상대적으로 낮은 수준의 에탄올을 생산한다. 특정 구체예에서, 에탄올은 10% 이하의 수득율, 바람직하게 2% 이하의 수득율로 생산될 수도 있다. 이들 중 특정 구체예에서, 에탄올은 검출 가능하게 생산되지 않는다. 하지만, 다른 구체예에서, 3-HP 및 에탄올은 동시 생산될 수도 있다. 이들 구체예에서, 에탄올은 10% 이상, 25% 이상, 또는 50% 이상의 수득율로 생산될 수도 있다.
여기에 제공된 방법의 특정 구체예에서, 탄소 근원에서 3-HP의 최종 수득율은 이론상 수득율의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 50% 이상이다. 3-HP의 농도, 또는 역가는 탄소 근원의 수득율 뿐만 아니라 농도의 함수일 것이다. 특정 구체예에서, 역가는 발효 중의 일부 시점에서, 및 바람직하게 발효의 끝에 적어도 1-3, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 또는 50 g/L 이상에 도달할 수도 있다. 특정 구체예에서, 3-HP의 최종 수득율은, 특히 생산 단계 중에, 발효 배지의 온도를 변화시킴으로써 증가될 수도 있다.
생산되면, 업계에 알려진 어떤 방법도 발효 배지로부터 3-HP를 분리하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일반적인 분리 기술은 브로스로부터 바이오매스를 제거하기 위해 사용될 수 있고, 일반적인 분리 과정 (예를 들어, 추출, 증류, 및 이온-교환 과정)은 미생물이 없는 브로스로부터 3-HP를 얻기 위해 사용될 수 있다. 게다가, 3-HP는 그것이 생산되는 동안 분리될 수 있거나, 그것은 생성물 생산 단계가 종결된 후에 브로스로부터 분리될 수 있다.
여기에 개시된 방법을 사용하여 생산된 3-HP는 화학적으로 다른 유기 화합물로 전환될 수 있다. 예를 들어, 3-HP는 1,3 프로판디올, 가치있는 폴리에스테르 모노머를 형성하기 위해 수소화될 수 있다. 프로판디올은 또한 시험관 내 또는 생체 내에서 옥시도리덕타제 활성을 가진 폴리펩티드를 사용하여 3-HP로부터 생성될 수 있다. 3-HP와 같은 유기산을 수소화하는 것은 어떤 방법, 예를 들어, 숙신산 및/또는 젖산을 수소화하기 위해 사용된 것들을 사용해서도 수행될 수 있다. 예를 들어, 3-HP는 금속 촉매를 사용하여 수소화될 수 있다. 또 다른 예에서, 3-HP는 탈수 반응을 수행하기 위해 어떤 알려진 방법을 사용하여 아크릴산을 형성하도록 탈수화될 수 있다. 예를 들어, 3-HP는 아크릴산을 형성하기 위해 촉매 (예를 들어, 금속 또는 미네랄 산 촉매)의 존재시 가열될 수 있다.
다음 예는 본 발명을 더 잘 설명하기 위해 제공되고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되지 않는다. 특이적 물질이 언급된 규모에 대하여, 그것은 단지 설명의 목적을 위한 것이고 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 당업자는 창의적인 능력의 사용 없이 및 본 발명의 범위를 제한하지 않고 동등한 수단 또는 반응물을 개발할 수도 있다. 많은 변형이 여기에 설명된 과정으로 만들어질 수 있지만, 본 발명의 범위 내에 남아있다고 생각될 것이다. 이러한 변형이 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이 발명자의 의도이다.
실시예
배지 및 용액
TE는 10 mM 염기성 트리스 및 1 mM EDTA, pH 8.0로 구성되었다.
2X YT + amp 플레이트는 16 g/L 트립톤, 10 g/L 효모 추출물, 5 g/L NaCl, 100 mg/L 앰피실린, 및 15 g/L 박토 아가로 구성되었다.
ura 선택 플레이트는 암모늄 술페이트가 있는 6.7 g 효모 질소 염기, 5 g 카사미노산, 100 mL 0.5 M 숙신산 pH 5, 20 g 노블 아가 (Noble agar), 및 855 mL 탈염수로 구성되었다. 가압 증기 멸균 후, 40 mL 멸균 50% 글루코스 및 2 mL 10 mg/mL 클로라페니콜을 추가하였고 플레이트에 부었다.
ura 선택 배지는 암모늄 술페이트가 있는 6.7 g 효모 질소 염기, 5 g 카사미노산, 100 mL 0.5 M 숙신산 pH 5, 및 855 mL 탈염수로 구성되었다. 가압 증기 멸균 후, 40 mL 멸균 50% 글루코스 및 2 mL 10 mg/mL 클로라페니콜을 추가하였다.
YP + 10% 글루코스 배지는 500 mL YP 브로스 및 100 mL 멸균 50% 글루코스로 구성되었다.
YP 브로스는 10 g/L의 효모 추출물, 20 g/L의 펩톤으로 구성되었다.
YPD 플레이트는 10 g의 효모 추출물, 20 g의 펩톤, 20 g 박토 아가, 및 960 mL까지 탈염수로 구성되었다. 가압 증기 멸균 후, 40 mL 멸균 50% 글루코스를 추가하였고 플레이트에 부었다.
TAE는 4.84 g/L의 염기성 트리스, 1.14 mL/L의 빙초산, 및 2 mL/L의 0.5 M EDTA pH 8.0으로 구성되었다.
TBE는 10.8 g/L의 염기성 트리스, 5.5 g/L 붕산, 및 4 mL/L의 0.5 M EDTA pH 8.0으로 구성되었다.
LiOAc / TE 용액은 멸균수 8, 1 M LiOAc 1, 및 10X TE 1로 구성되었다.
10X TE (200 mL)는 2.42 g 염기성 트리스, 4 mL 0.5M EDTA, pH 8.0. 5 M HCl을 pH를 7.5로 조정하기 위해 사용하였고 용액을 가압 증기 멸균으로 멸균하였다.
PEG / LiOAc / TE 용액은 50% PEG3350 8, 1 M LiOAc 1, 및 10X TE 1로 구성되었다.
50% PEG3350를 150 mL 물에 100 g PEG3350을 추가하고 용해될 때까지 가열하고 교반함으로써 제조하였다. 부피는 물로 최대 200 mL까지 채워지고 가압 증기 멸균으로 멸균하였다.
ScD FOA 플레이트는 275 mL 2X-ScD 2X FOA 액체 배지 및 275 mL 2X-ScD 2X FOA 플레이트 배지로 구성되었고, 녹였고 65 ℃로 냉각하였다.
2X- ScD 2X FOA 액체 배지는 아미노산이 없는 6.66 g 효모 질소 염기, 1.54 g ura-DO 보충물 (Clontech, Mountain View, CA, USA), 20 g 덱스트로스, 50 mg 우라실, 2 mg 유리딘, 및 2 g 5-FOA (5-플루오로오로트산, 1수화물; Toronto Research Chemicals, North York,ON, Canada) 및 1 L까지 물로 구성되었다. 결과의 용액을 멸균하기 위해 여과하였다.
2X- ScD 2X FOA 플레이트 배지는 11 g 박토 아가 및 275 mL 물로 구성되었다. 결과의 용액을 멸균하기 위해 여과하였다.
DM2 배지는 암모늄 술페이트 (5.0 g/L), 마그네슘 술페이트 7수화물 (0.5 g/L), 1염기 칼륨 포스페이트 (3.0 g/L), 미량의 원소 용액 (1 mL/L) 및 비타민 용액 (1 mL/L)으로 구성되었다. 모든 배지 성분이 용해된 후, 배지의 pH를 적절한 염기 (예를 들어, KOH)를 사용하여 원하는 초기 pH로 조정하였다.
미량의 원소 용액은 EDTA (15.0 g/L), 아연 술페이트 7수화물 (4.5 g/L), 망간 클로라이드 탈수화물 (1.0 g/L), 코발트(II)클로라이드 6수화물 (0.3 g/L), 구리(II)술페이트 5수화물 (0.3 g/L), 이나트륨 몰리브덴 탈수화물 (0.4 g/L), 염화 칼슘 탈수화물 (4.5 g/L), 철 술페이트 7수화물 (3 g/L), 붕산 (1.0 g/L), 및 칼륨 이오다이드 (0.1 g/L)로 구성되었다.
비타민 용액은 비오틴 (D-; 0.05 g/L), 칼슘 판토테네이트 (D+; 1 g/L), 니코틴산 (5 g/L), 미오-이노시톨 (25 g/L), 피리독신 히드로클로라이드 (1 g/L), p-아미노벤조산 (0.2 g/L), 및 티아민 히드로클로라이드 (1 g/L)로 구성되었다.
DM1 X-a- gal 플레이트는 DM1 염, 20 g/L 글루코스, 미량의 원소 용액, 비타민 용액, 2 mL/L X-a-gal (16 mg/mL), 20 g/L 아가로 구성되었다.
DM1 염 용액은 2.28 g/L 유레아, 3 g/L 1염기 칼륨 포스페이트, 및 0.5 g/L 마그네슘 술페이트 7수화물로 구성되었다.
버터필드 포스페이트 버퍼는 1.25 mL/L의 스톡 용액 (26.22 g/L 칼륨 디히드로겐 포스페이트 및 7.78 g/L 나트륨 카르보네이트) 및 5 mL/L의 마그네슘 클로라이드 용액 (81.1 g/L MgCl2-6H20)로 구성되었다. 결과의 용액을 멸균하기 위해 가압 증기 멸균하였고, pH를 7.2로 조정하였다.
CNB1 셰이크 플라스크 배지는 유레아 (2.3 g/L), 마그네슘 술페이트 7수화물 (0.5 g/L), 1염기 칼륨 포스페이트 (3.0 g/L), 미량의 원소 용액 (1 mL/L) 및 비타민 용액 (1 mL/L), 글루코스 (120.0 g/L), 2-(N-모폴리노)에탄술폰산 (MES) (97.6 g/L)으로 구성되었다. 모든 배지 성분이 용해된 후, 배지의 pH를 적절한 염기 (예를 들어, KOH)를 사용하여 5.8의 초기 pH로 조정하였다.
표 0: 프라이머 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
잡다한 서열
프로모터: 실시예에 설명된 PDC, TDH3, EN01, PGK1 프로모터는 SEQ ID NO: 244, 245, 246, 및 247의 아이. 오리엔탈리스 서열로부터 각각 유도된다. 종결자: 실시예에 설명된 The TAL, TKL, RKI, 및 PDC 종결자는 SEQ ID NO: 248, 249, 250, 및 251의 아이. 오리엔탈리스 서열로부터 각각 유도된다. URA3 프로모터, ORF, 및 실시예에 설명된 종결자는 SEQ ID NO: 252의 아이. 오리엔탈리스 서열로부터 유도된다.
실시예 1A: 3- HP 에 기초한 숙주 효모 세포의 선택
한 세트의 야생형 효모 균주를 3-HP의 존재시 그것들의 성장하는 능력에 대해 테스트하였다.
1차 스크리닝 과정에 이용되는 3-HP 농도의 범위를 7개의 야생형 효모 균주의 다양한 수준의 3-HP를 함유하는 배지에서 성장하는 능력을 평가함으로써 결정하였다. 이 실험에 사용된 3-HP를 WO04/076398에 설명된 바와 같이 200 psi 및 175 ℃에서 수성 아크릴산 용액 (30%) 및 CO2 촉매로부터 화학적으로 합성하였다. 잔여 아크릴산을 상온에서 이소프로필로 역류 추출을 사용하여 제거하였다 (WO05/021470 참조).
세포를 YPD 플레이트에 스트리킹 (streak)하였고 하룻밤 동안 키웠다. 약 4의 OD600으로 세포 슬러리 (slurry)를 YPD 배지, pH 3.0에서 만들었고 이 슬러리를 0.05의 OD600으로 다양한 농도의 3-HP (pH 3.9)를 함유하는 미세역가 웰을 접종하기 위해 사용하였다. 플레이트를 가스 투과성 막으로 덮었고 30 ℃/300 RPM 셰이커에서 하룻밤 동안 배양하였다. 각각의 웰에 대한 최적의 밀도를 GENios 모델 플레이트 리더에서 600 nm의 파장으로 측정하였고, 플레이트를 성장에 대하여 시각적으로 관찰하였다. (125 g/L)로 자란 균주 중 하나 이상이 선택되는 가장 높은 3-HP 농도를 1차 스크리닝 과정에 대한 상한 범위로서 선택하였다.
1차 스크리닝
1차 스크리닝 과정을 위하여, 89개의 야생형 효모 균주를 찾는 범위에 대하여 사용된 같은 프로토콜을 사용하여 0 g/L, 75 g/L, 100 g/L, 또는 125 g/L 3-HP (pH 3.9)의 미세역가 플레이트에서 성장에 대하여 스크리닝하였다. 신선한 YPD 플레이트를 각각의 균주를 위해 사용하였고, 약 4의 OD600의 슬러리를 YPD 배지, pH 3.0에서 만들었다. 슬러리를
슬러리를 0.05의 OD600으로 각각의 웰을 접종하기 위해 사용하였다. 플레이트를 가스 투과성 막으로 덮었고 30 ℃/300 RPM 셰이커에서 하룻밤 동안 배양하였다.각각의 웰에 대한 최적의 밀도를 GENios 모델 플레이트 리더에서 600 nm의 파장으로 측정하였고, 플레이트를 성장에 대하여 시각적으로 관찰하였다. 유사한 프로토콜을 0 g/L, 30 g/L, 45 g/L, 및 60 g/L의 젖산 농도에서 성장을 평가하기 위해 실행하였다. 표 1은 성장이 관찰된 3-HP 또는 젖산의 가장 높은 농도를 요약한다.
100 g/L 3-HP에서 성장할 수 있고 75 g/L 3-HP에서 잘 자란 15개의 균주를 확인하였다 (표 1, 세트 B). 균주를 더 줄이기 위해, 두 번째 미세역가 플레이트 테스트를 수행하였다. 이 테스트는 첫 번째와 유사하지만, 100 g/L, 112.5 g/L, 및 125 g/L의 3-HP 농도 (pH 3.9)를 이용한다. 이 테스트로부터, 75 g/L 3-HP에서 잘 자라거나 75 및 112.5 g/L 둘 다에서 일부 성장을 보이는 3-HP 11개의 균주를 확인하였다 (표 1, 세트 C). 이들 11개의 균주를 2차 스크리닝으로 진행하였다. 75 g/L 3-HP에서 나쁜 성장을 갖고 112.5 g/L 3-HP에서 성장하지 않는 4개의 균주는 2차 스크리닝으로 진행하지 않았다. 2차 스크리닝으로 진행하지 않는 균주는 상업적 발효 공정에서 경제적으로 낮은 성능을 나타내는 것이 예상된다. 하지만, 하나 이상의 이러한 균주가 그럼에도 불구하고 상업적으로 실행 가능한 발효 공정에 대한 최소의 필요조건을 만족시키는 것은 가능하다.
표 1: 3-HP 또는 젖산에서 성장
Figure pct00005
Figure pct00006
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Figure pct00009
상기 테스트된 아이. 오리엔탈리스 균주 CD1822를 글루코스 제한 케모스태트에서 91일 동안 아이. 오리엔탈리스 ATCC PTA-6658를 발달시킴으로써 생성하였다. 시스템은 DM 배지에서 15 g/L 덱스트로스가 제공되고, 공급 배지에서 추가된 젖산을 가지고 pH=3에서 0.06 h-1의 희석 속도로 작동된다. 약 2 mmol L-1h-1의 낮은 산소 전달 속도, 및 공기 포화도 0%로 일정하게 남아있는 용존 산소 농도를 갖는 조건을 유지하였다. 최종 시점의 단일 콜로니 분리체는 두 개의 셰이크 플라스크 검정으로 특징화된다. 첫 번째 검정에서, 균주는 DM1 한정 배지에서 pH 조정 없이 25 g/L 총 젖산의 존재시 그것들의 글루코스를 에탄올로 발효시키는 능력을 특징으로 한다. 두 번째 검정에서, 분리체의 성장 속도를 DM1 한정 배지에서 pH 조정 없이 25, 32 및 45 g/L의 총 젖산의 존재시 측정하였다. 균주 CD1822는 측정된 발효 속도 및 성장 속도에 기초하여 선택된 단일 분리체였다. 아이. 오리엔탈리스를 발달시키는 다른 방법은 예를 들어, 미국 특허 번호 7,629,162에 설명된 바와 같이 선택적 조건 하에 반복된 연속적 계대 배양을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 방법은 상기 설명된 글루코스 제한 케모스태트 방법의 사용을 대신해서, 또는 이에 더하여 사용될 수 있다. 당업자에 의해 인정될 수 있는 바와 같이, 균주는 개선된 3-HP 내성을 발달시키기 위해 젖산 대신에 추가된 3-HP의 존재시 유사한 진화 과정을 사용하여 발생될 수 있다. 추가적으로, 균주는 여기에 설명된 바와 같이, 선택 전에 돌연변이될 수 있다 (예컨대, 실시예 1B).
2차 스크리닝
2차 스크리닝의 첫 번째 부분에 대하여, 성장 속도를 0 g/L, 35 g/L, 또는 75 g/L 3-HP를 함유하는 YPD 배지에서 pH 3.9에서 측정하였다. 셰이크 플라스크를 6 내지 10의 OD600으로 하룻밤 동안 성장된 시드 플라스크로부터 수확된 바이오매스로 접종하였다. 250 mL 배플 (baffled) 성장 속도 플라스크 (50 mL 작업 부피)를 0.1의 OD600으로 접종하였고 250 rpm 및 30 ℃에서 키웠다. 샘플을 시간 단위의 검정을 통해 채취하였고 OD600을 통해 바이오매스 성장에 대하여 분석하였다. 결과의 OD600 데이터를 플로팅하였고 성장 속도를 확립하였다.
표 2: 3-HP에서 성장 속도 (μ)
Figure pct00010
2차 스크리닝의 두 번째 부분에 대하여, 글루코스 소비를 100 g/L 및 0 g/L, 35 g/L, 또는 75 g/L 3-HP 글루코스를 함유하는 YPD 배지에서 pH 3.9에서 같은 10개의 균주에 대하여 측정하였다. 셰이크 플라스크를 6 내지 10의 OD600으로 하룻밤 동안 성장된 시드 플라스크로부터 수확된 바이오매스로 접종하였다. 250 mL 배플 당분해 검정 플라스크 (50 mL 작업 부피)를 0.1의 OD600으로 접종하였고 250 rpm 및 30 ℃에서 키웠다.
샘플을 시간 단위의 검정을 통해 채취하였고 Yellow Springs Instruments (YSI)의 2700 생화학 분석기를 사용하여 글루코스 소비에 대하여 분석하였다. 결과의 데이터를 플로팅하였고 글루코스 소비 속도를 확립하였다.
표 3: 글루코스 소비 속도 (g/L/hr) in 3-HP
Figure pct00011
4개의 균주 (피. 멤브라니파시엔스, 에스. 폼베 (S. pombe), 씨. 발리다 (C. valida), 및 제트. 렌투스 (Z. lentus))는 경제적 발효 공정에 필요한 75 g/L 3-HP (pH 3.9) 조건 하에 2.5 g/L/hr 글루코스 이용 속도를 달성하지 않았다.
3-HP에서 선도 균주를 확인하기 위해, 균주 성능을 3개의 범주로 분류하였다. 이들 범주 중 둘은 성장 속도의 다른 양태에 기초하였다: 1) 가장 높은 산 농도에서 성장 속도 및 2) 산 농도에 대하여 플로팅된 성장 속도의 기울기. 세 번째 범주는 가장 높은 산 농도에서 당분해 속도였다. 이 분류는 표준화된 경계로서 각각의 속도에 대하여 최고값 및 최저값을 사용하여 표준화된 규모로 이루어졌다. 따라서 각각의 균주는 각각의 범주에 대하여 0 내지 1의 등급을 받았으며, 1은 최고 가능 점수이다. 균주의 전체 속도는 3개의 범주에 대한 표준화 값의 합계였다. 성장 속도 및 당분해 속도가 똑같이 가중되는 가중점수가 되었다. 이 경우에, 가장 높은 산 농도에서 당분해 속도는 50% 가중되는 한편, 두 개의 성장 속도는 각각 25% 가중되었다. 범주 당 표준화 값 및 합계 및 가중 점수는 표 4에 요약된다.
표 4: 3-HP에서 균주 등급
Figure pct00012
테스트된 균주 중에, 종 아이. 오리엔탈리스, 씨. 람비카, 및 에스. 불데리의 균주는 낮은 pH에서 3-HP에 대한 생산 숙주로서 가장 큰 가능성을 나타냈다.
같은 과정을 pH 2.85 (~80% 자유 산)에서 0, 25, 및 50 g/L 젖산을 함유하는 배지로 1차 스크리닝의 원래의 91개의 야생형 효모 균주를 스크리닝하고, 평가하고, 점수를 매기기 위해 이용하였다. 표준화 값 및 가중 및 합계 점수는 2차 스크리닝으로 진행된 13개의 균주에 대하여 유도되었다.
표 5: 젖산에서 균주 등급
Figure pct00013
젖산에 대하여, 에스. 자벤시스 (S. javensis)만이 50 g/L 젖산이 있는 배지에서 pH 2.85에서 2.5 g/L/hr 글루코스 이용 속도를 달성하지 않았다. 아이. 오리엔탈리스, 씨. 람비카, 및 에스. 불데리는 3-HP 및 젖산에 대하여 산 내성을 나타내는 한편, 산 중 하나에 대해서만 내성인 많은 균주가 있었다. 이것은 또한 1차 스크리닝의 결과에서 보여질 수 있다 (표 1). 예를 들어, 씨.밀레리 (C. milleri), 씨. 루고사 (C. rugosa), 씨. 반데르왈티이 (C. vanderwaltii), 케이. 오메리 (K. ohmeri), 에스. 바야누스 (S. bayanus), 에스. 자벤시스, 와이. 리폴리티카 (Y. lipolytica), 제트. 비스포루스 (Z. bisporus), 및 제트. 콤부챈시스 (Z. kombuchaensis)는 모두 45-60 g/L 젖산에서 성장을 입증하였지만 테스트된 가장 낮은 농도의 3-HP (35 g/L)에서 성장은 입증하지 않았다. 따라서, 균주의 한 유기산에 대한 내성은 명확하게 다른 산에 대하여 그것의 내성의 예측기로서 사용될 수 없다. 이것은 상기 3-HP 저항성을 나타내는 균주와 WO03/049525에서 유기산 생성을 위해 바람직한 숙주로서 확인된 8개의 균주의 목록을 비교함으로써 추가로 강조된다. 이들 균주 중 둘 (씨. 디덴시애 (C. diddensiae) 및 씨. 엔토모필라 (C. entomophila))은 테스트를 위해 얻어질 수 있고, 다른 6개는 상기 설명된 1차 스크리닝에 포함되었다. 이들 6개 중에서, 씨. 크루세이 (아이. 오리엔탈리스로서 테스트됨) 만이 35 g/L 3-HP의 존재시 성장할 수 있다.
실시예 1B: 돌연변이 유발 및 3- HP 에 대한 저항성을 가진 돌연변이 균주의 선택
실시예 1A에 선택된 효모 세포를 돌연변이 유발을 받고 높은 3-HP 내성을 갖는 돌연변이를 확인하기 위해 선택 압력에 노출하였다.
예를 들어, 신선한 YP (효모 추출물/펩톤) + 20 g/L 글루코스 플레이트 또는 액체 배양 (OD600 1-4)의 효모 세포를 약 10의 OD600으로 멸균수에 재현탁한다. 이 세포 현탁액의 200 μL 앨리쿼트를 개개의 튜브로 피펫팅하였고 약 1시간 동안 3 μL 에탄 메틸 술포네이트 (EMS)에 노출하였으며, 이것은 세포 중 약 65%를 살해한다. 더 높은 EMS 농도가 또한 살해율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 노출 후, 세포는 5% 나트륨 티오술페이트로 중화되고, PBS 버퍼로 세척되고, 약 4시간 동안 풍부 배지에서 회수되고, 선택 배지에서 배양된다. 조건이 선택적이라는 것을 확인하기 위해 목 (mock) 샘플 (EMS 없음)을 또한 실행하였다. 대안으로, 세포는 UV 조사를 사용하여 돌연변이가 일어날 수 있다.
3-HP 저항 돌연변이 균주를 선택하기 위해, EMS 처리된 세포 현탁액의 앨리쿼트 (돌연변이된 세포 중 약 2X 108개)를 감자 덱스트로스 아가 (PDA) 또는 모제 균주가 성장하지 않거나 매우 느리게 성장하는 수준으로 3-HP를 함유하는 또 다른 배지에 도말하였다. 이들 플레이트를 콜로니가 나타날 때까지 수 일 동안 배양한다. 단일 콜로니를 정제하고, 선택의 어떤 적합한 효과를 제거하기 위해 비-선택 배지에 스트리킹하고, 증가된 저항성을 확인하기 위해 선택 배지에서 다시 테스트한다. 저항성 균주를 생성물 및 기질의 HPLC 분석에 대한 주기적인 샘플링을 갖는 셰이크 플라스크 포맷으로 테스트한다. 대안으로, 3-HP 내성에 대한 선택을 케모스태트 또는 연속적 셰이크 플라스크 진화에 의해 수행할 수도 있다. 추가적 라운드의 돌연변이 유발 및 선택을 수행할 수 있다. 돌연변이 유발을 상업적 3-HP 생산을 위해 필수적인 속성을 갖도록 원래 3-HP 생산 필요조건을 만족시키지 않는 숙주의 저항성을 증가시키기 위해 사용할 수도 있다.
실시예 2A: DNA 의 숙주 게놈에 형질전환 과정
다음 실시예에 설명된 변형된 효모 균주를 생성하기 위해 효모 숙주 게놈으로 DNA 형질전환을 하기 특이적 과정에 기초하여 수행하였다.
4 mL의 YP + 10% 글루코스 배지를 14 mL 팔콘 (Falcon) 튜브에 추가하였고 원하는 균주를 멸균 루프를 사용하여 이 배지로 접종하였다. 배양물을 37 ℃에서 하룻밤 동안 (~16 시간) 250 rpm으로 흔들면서 키웠다. 배양물의 작은 앨리쿼트를 약 시간 간격으로 회수하였고 OD600을 측정하였다. 배양물을 OD600이 0.6-1.0일 때까지 키웠다.
세포를 상온에서 2279X g로 원심분리에 의해 수확하였고, 펠렛을 25 mL 멸균수에 재현탁하였고, 상온에서 2279X g로 원심분리되었다. 펠렛을 1 mL 멸균수에 재현탁하였고, 재현탁된 세포를 1.5 mL 튜브로 옮겼고 16,100X g로 펠렛화하였다. 세포를 1 mL LiOAc/TE 용액에 재현탁하였고 16,100X g로 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 500 μL LiOAc/TE 용액에 재현탁하였다.
다음 성분을 1.5 mL 튜브에 추가하였다: 100 μL의 상기 세포, 10 μL 갓 끓인 후 냉각된 연어 정자 DNA (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), 및 10 μL의 원하는, 선형화 형질전환 DNA. DNA 대신에 물로 대조군 반응을 또한 제조하였다. 각각의 형질전환 반응에 대하여, 600 μL의 PEG/LiOAc/TE 용액을 추가하였고 반응물을 30 ℃에서 30분 동안 250 rpm 셰이커 플랫폼 상에서 그것의 측면에서 배양하였다. 40 μL DMSO를 각각의 반응에 추가하였고 42 ℃ 항온조에서 5분 동안 배양하였다. 세포를 5,400X g로 1분 동안 펠렛화하였다. 세포를 물에 재현탁하였고, 둘로 나누었고, 형질전환 반응물의 각 절반을 ura 선택 배지 플레이트에 도말하였다. 플레이트를 37 ℃에 배치하였다. 콜로니는 일반적으로 18 내지 24시간 성장 후 볼 수 있고, 균주 배경에 의존적이다.
멸균 루프를 소량의 효모를 페트리 디쉬에서 300 μL 효모 용해 용액 (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, Wl, USA)을 함유한 1.5 mL 튜브로 옮기기 위해 사용하였고 게놈 DNA를 MasterPure™ Yeast DNA Purification Kit (EPICENTRE® Biotechnologies)를 사용하여 제조사의 제시에 따라 추출하였다.
MasterPure™ Yeast DNA Purification Kit (EPICENTRE® Biotechnologies)를 사용하여 제조된 게놈 DNA를 분리된 형질전환체에서 올바른 통합 이벤트가 발생하는지 결정하기 위한 PCR 반응에 사용하였다. PCR 반응물 (25 μL)은 스크리닝 되는 균주에 대한 0.5 μL 게놈 DNA, 1X Crimson Taq™ 반응 버퍼 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), 각각 25 pmol의 센스 및 안티센스 프라이머, 각각 200 μM의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 0.625 유닛의 Crimson Taq™ DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 가장 큰 것으로 예상되는 생성물의 kbp 당 95 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서, 95 ℃에서 30초 동안, 50 ℃에서 30초 동안, 및 68 ℃에서 1분 동안 30 사이클; 68 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific, Westbury, New York, USA)로 수행하였다. 열 순환 (thermocycling) 후, PCR 반응 생성물을 TAE 또는 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였고 밴드의 크기를 시각화하였고 설명된 바와 같이 특이적 프라이머 세트에 대하여 설명하였다.
실시예 2B: 삽입 부위의 선택
외인성 유전자를 숙주 효모 세포로 통합하는데 적합한 삽입 부위는 효모 숙주 세포에서 삭제될 때 3-HP 생산에 대하여 이롭거나 중성화 효과를 갖는 유전자에 대한 위치일 수도 있다. 선택된 효모 균주에 대하여 적합한 삽입 부위의 비-제한 예는 여기에 작용하는 예에서 설명된다. 당업자는 쉽게 이것들 및 다른 삽입 부위, 예를 들어, 하나 이상의 PDC (예를 들어, SEQ ID NO: 49에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 및/또는 SEQ ID NO: 48에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는 아이. 오리엔탈리스 PDC 유전자), ADH (예를 들어, SEQ ID NO: 106, 108, 또는 110에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 및/또는 SEQ ID NO: 105, 107, 또는 109에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는 아이. 오리엔탈리스 ADH 유전자), GAL6 (예를 들어, SEQ ID NO: 112에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 및/또는 서열 SEQ ID NO: 111에 설명된 뉴클레오티드의 암호화 영역을 포함하는 아이. 오리엔탈리스 GAL6 유전자), CYB2A (예를 들어, 서열 SEQ ID NO: 114에 설명된 아미노산을 암호화하는 및/또는 SEQ ID NO: 113에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는 아이. 오리엔탈리스 CYB2A 유전자), CYB2B (예를 들어, 서열 SEQ ID NO: 116에 설명된 아미노산을 암호화하는 및/또는 SEQ ID NO: 115에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는 아이. 오리엔탈리스 CYB2B 유전자), GPD (예를 들어, 서열 SEQ ID NO: 118에 설명된 아미노산을 암호화하는 및/또는 SEQ ID NO: 117에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는 아이. 오리엔탈리스 GPD 유전자), ALD (예를 들어, 서열 SEQ ID NO: 120에 설명된 아미노산을 암호화하는 및/또는 SEQ ID NO: 119에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는 아이. 오리엔탈리스 ALD 상동체 5680 유전자, 서열 SEQ ID NO: 122에 설명된 아미노산을 암호화하는 및/또는 SEQ ID NO: 121에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는 아이. 오리엔탈리스 ALD 상동체 42026 유전자, 서열 SEQ ID NO: 124에 설명된 아미노산을 암호화하는 및/또는 SEQ ID NO: 123에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는 아이. 오리엔탈리스 ALD 상동체 42426 유전자, 또는 서열 SEQ ID NO: 126에 설명된 아미노산을 암호화하는 및/또는 SEQ ID NO: 125에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는 아이. 오리엔탈리스 ALD 상동체 42727 유전자), 또는 PCK (예를 들어, 서열 SEQ ID NO: 128에 설명된 아미노산을 암호화하는 및/또는 SEQ ID NO: 127에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는 아이. 오리엔탈리스 PCK 유전자) 유전자 또는 이들의 상동체에 대한 위치)의 사용에 대한 교시 내용을 적용할 수 있다. 이들 유전자에 대한 서열이 발표되지 않은 경우, 그것들은 표준 과정, 예를 들어, 예를 들어, 게놈 시퀀싱, 게놈 또는 cDNA 라이브러리의 프로브 잡종화, 또는 알려진 상동 서열에 기초하는 퇴화 프라이머를 사용하여 유전자 단편의 증폭 후 이어서, 전체 서열을 얻기 위한 게놈 워킹 (게놈 walking) 을 사용하여 얻어질 수 있다. 삽입 부위에 대한 다른 적합한 위치는 오픈 리딩 프레임을 함유하지 않는 유전자 간 영역을 포함한다.
실시예 2C: 삽입 벡터, 선택 마커 카세트, 유전자 발현 카세트, 및 통합 구조물을 위한 기술
삽입 부위 벡터를 하나 이상의 외인성 유전자를 숙주 효모 세포로 통합하기 위해 생성하였다. 숙주 효모 세포는 실시예 1에 설명된 바와 같이 선택 공정을 겪은 세포일 수도 있거나, 그것들은 돌연변이 유발 및/또는 선택을 겪지 않은 세포일 수도 있다.
삽입 부위 벡터를 생성하기 위해, 원하는 삽입 부위의 영역 업스트림 (5') 및 영역 다운 스트림 (3')을 주형으로서 숙주 게놈 DNA를 사용하여 둘 다 증폭시켰다. 업스트림 영역은 바람직하게 70 bp 이상이고 1.5 kbp 이하이다. 결과의 표적 서열은 단편이 인접하거나 거의 인접하도록 각각의 단편의 하나의 카피를 가진 벡터를 얻기 위해서 클로닝 벡터에 동시에 또는 순차적으로 결찰된다. 유전자 발현 카세트 및/또는 선택 마커 카세트의 삽입을 허용하기 위해 단편들 사이에 독특한 제한 부위가 포함될 수도 있다. 독특한 제한 효소 부위는 또한 클로닝 벡터로부터 이들 부위 사이에서 DNA의 이후의 제거를 허용하기 위해 업스트림 단편의 5' 말단에 또는 근처에 또는 다운스트림 단편의 3' 말단에 또는 근처로 통합될 수도 있다.
삽입 부위 벡터로 통합을 위한 선택 마커 카세트를 표준 클로닝 기술을 사용하여 생성하였다. 이들 선택 마커 카세트는 선택 가능 마커를 위한 유전자를 함유할 수도 있고, 또한 업스트림 프로모터 및/또는 다운스트림 종결 서열을 함유할 수도 있다. 적합한 선택 마커 유전자의 예는 URA3, TRP1, HIS, MEL5, CYB2A, LEU2, 및 G418 유전자를 포함한다. 플랭킹 (플랭킹) 서열은 재조합을 통해 마커의 미래의 손실을 허용하기 위해 프로모터/마커 유전자/종결 서열의 측면 상의 카세트로 통합될 수도 있다. 이들 플랭킹 서열은 직접적인 또는 역방향 반복 서열 (기능적 또는 비기능적 서열) 또는 하나 이상의 loxP 부위를 포함할 수도 있다.
유전자 발현 카세트를 표준 클로닝 기술을 사용하여 생성하였다. 이들 유전자 발현 카세트는 과발현되는 유전자를 함유하고, 또한 업스트림 프로모터 및/또는 다운스트림 종결 서열을 함유할 수도 있다. 특정 구체예에서, 이들 프로모터/유전자/종결자 조합의 둘 이상의 카피는 단일 유전자-발현 카세트로 통합될 수도 있다. 이종 기원 유전자는 숙주 효모 균주에서 개선된 발현에 코돈-최적화될 수도 잇다. 선택된 마커 카세트는 여기에 설명된 바와 같이 과발현되는 유전자 및 어떤 연관된 프로모터 및/또는 종결자와 인접하거나 거의 인접한 유전자 발현 카세트로 클로닝될 수 있다.
대안으로, 네이티브 프로모터의 외인성 프로모터와 대체를 위해, 발현 카세트는, 표적화 서열 사이에서, 통합되는 프로모터의 선택 카세트 업스트림을 가질 수도 있다.
유전자 발현 카세트는 유전자 발현 통합 구조물을 생성하기 위해 표준 클로닝 기술을 사용하여 여기에 설명된 삽입 부위 벡터에서 두 개의 표적 부위 서열 사이에 삽입될 수 있다. 하나 이상의 선택 마커 카세트는 유전자 발현 카세트의 일부로서 또는 별도로 또한 표적 서열 사이에 삽입될 수도 있다. 특정 변화에서, 유전자 발현 카세트의 조각은 통합 단편 사이에 일반적인 중복 단편이 있도록 다른 삽입 부위 벡터로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 하나의 벡터는 업스트림 삽입 단편, 프로모터, 유전자, 및 종결자를 함유할 수도 있고, 두 번째 벡터는 종결자, 선택 마커 카세트, 및 다운스트림 삽입 단편을 함유할 수도 있다. 또 다른 예에서, 두 개의 유전자의 동시 삽입을 허용하기 위해, 하나의 벡터는 업스트림 삽입 단편, 프로모터, 유전자, 종결자 및 선택 마커 카세트의 모두 또는 일부를 함유할 수도 있고, 두 번째 벡터는 선택 마커 카세트의 모두 또는 일부, 두 번째 프로모터, 유전자, 종결자, 및 다운스트림 삽입 단편을 함유할 수도 있다.
유전자 넉아웃 (knockout) 구조물을 생성하기 위해, 삽입 부위 벡터를 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 영역으로부터 유도된 삭제되거나 붕괴되는 유전자의 표적 DNA 서열을 사용하여 만들었다. 선택된 표적 서열은 표적 유전자의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 영역 및/또는 표적 유전자 암호화 서열의 모두 또는 일부 또는 그것의 조절 요소 (예를 들어, 프로모터 또는 종결자)를 포함할 수도 있다. 하나 이상의 선택 마커 카세트는 두 개의 표적 서열 사이의 삽입 부위 벡터로 통합될 수도 있다. 넉아웃이 외인성 유전자의 발현과 커플링되는 경우, 하나 이상의 유전자 발현 카세트는 또한 삽입 부위 벡터로 통합된다.
숙주 효모 게놈으로 통합되는 DNA 단편을 클로닝 벡터의 단편의 및 다수의 벡터의 중복 단편의 제한 효소 분해로 선형화할 수 있다. 대안으로, 선형 통합 단편을 PCR, 또는 PCR 및 제한 효소 분해의 조합을 사용하여 생성할 수 있다. 삽입 부위 플랭킹 영역은 벡터 주형에서 그것들의 존재에 의해 또는 증폭 프라이머로 통합에 의해 통합 단편으로 통합될 수 있다. 후자의 경우에, 플랭킹 영역의 뉴클레오티드 중 최소 70개는 바람직하게 프라이머로 통합된다.
선택된 효모 균주를 위해 적합한 삽입 벡터, 선택 마커 카세트, 유전자 발현 카세트, 및 통합 구조물의 비-제한 예는 다음 작용 예에서 설명된다. 당업자는 3-HP를 생산하는, 대체 변형된 효모 균주를 생성하기 위해 이들 실시예의 교시 내용 및 이전의 설명을 쉽게 적용할 수 있다
실시예 2D: adh1202 위치에서 외인성 유전자를 발현하는 삽입 벡터의 구조물
선택 가능 마커로서 URA3을 사용하여 플라스미드 pMlBa107를 PDC 프로모터 및 종결자에 의해 조절되는 아이. 오리엔탈리스 adh1202 위치에서 단일 유전자의 통합을 허용하기 위해 생성하였다. ura 선택 가능 마커와 함께 PDC 프로모터 및 종결자를 PCR 증폭하였고 하기 설명된 바와 같이 pCR4™4BLUNT TOPO® (Invitrogen, La Jolla, CA, USA)로 클로닝하였다. PDC 프로모터, 종결자 및 URA3 선택 가능 마커 PCR 단편를 SOE PCR로 구성하였다. PDC 프로모터를 PCR 생성물의 3' 말단 상의 PDC 종결자에 대하여 상동성을 함유하는 프라이머로 증폭하였고 PDC 종결자 및 URA3 선택 가능 마커를 생성물의 5' 말단 상의 PDC 프로모터에 대하여 상동성을 갖는 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 이들 두 개의 단편을 SOE PCR을 통해 함께 넣었다.
PDC 프로모터를 프라이머 0611184 및 0611195를 사용하여 pACN5로부터 증폭하였다 (도 19). 프라이머 0611184는 NotI 제한 부위를 PCR 생성물의 5' 말단으로 도입한다. 프라이머 0611195는 PDC 프로모터 이후에 XbaI 제한 부위를 도입하고 PCR 생성물의 3' 말단 상의 PDC 종결자에 대하여 상동성을 도입한다.
증폭 반응을 제조사의 지시에 따라 Platinum® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. 각각의 PCR 반응물은 50 μL의 최종 부피에 0.5 μL의 희석된 pACN5 (도 19), 25 pM 각각의 프라이머 0611184 및 0611195, 1X Pfx 증폭 버퍼 (Invitrogen), 2 mM MgS04, 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.25 유닛 Platinum® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen)를 함유하였다. 증폭 반응물을 95 ℃에서 2분 동안 1 사이클; 각각 95 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 72 ℃에서 2분 동안 30 사이클; 72 ℃에서 3분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)에서 배양하였다.
PCR 생성물을 89 mM 염기성 트리스-89 mM 붕산-2 mM 이나트륨 EDTA (TBE) 버퍼를 사용하는 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 700 bp의 단편을 겔에서 잘라냈고 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 아가로스로부터 추출하였다.
PDC 종결자 및 URA3 선택 가능 마커를 프라이머 0611189 및 0611185를 사용하여 pHJJ76으로부터 증폭하였다 (도 24). 프라이머 0611189는 PCR 생성물의 5' 말단 상의 PDC 프로모터에 대하여 상동성 및 PDC 종결자 바로 앞에 Pad 제한 부위를 도입한다. 프라이머 0611185는 PCR 생성물의 3' 말단에 NotI 제한 부위를 도입한다. 증폭 반응을 제조사의 지시에 따라 Platinum® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. 각각의 PCR 반응물은 50 μL의 최종 부피에 0.5 μL의 희석된 pHJJ76 (도 19), 25 pM 각각의 프라이머 0611189 및 0611185, 1X Pfx 증폭 버퍼 (Invitrogen), 2 mM MgS04, 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.25 유닛 Platinum® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen)를 함유하였다. 증폭 반응물을 95 ℃에서 2분 동안 1 사이클; 각각 95 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 72 ℃에서 2분 동안 30 사이클; 72 ℃에서 3분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)에서 배양하였다.
PCR 생성물을 89 mM 염기성 트리스-89 mM 붕산-2 mM 이나트륨 EDTA (TBE) 버퍼를 사용하는 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 2000 bp의 단편을 겔에서 잘라냈고 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 아가로스로부터 추출하였다.
2000 bp PDC 종결자 및 URA3 선택 가능 마커 PCR 생성물 및 700 bp PDC 프로모터 PCR 생성물을 SOE-PCR을 사용하여 융합하였다. 증폭 반응을 제조사의 지시에 따라 Platinum® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. 각각의 PCR 반응물은 100 μL의 최종 부피에 8 ng의 2000 bp PDC 종결자 및 URA3 선택 가능 마커 PCR 생성물, 24 ng의 700 bp PDC 프로모터 PCR 생성물, 50 pM 각각의 프라이머 0611184 및 0611185, 1X Pfx amplification buffer (Invitrogen), 2 mM MgS04, 0.2 mM dNTP 혼합물, 2.5 유닛 Platinum® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen)를 함유하였다. 증폭 반응물을 95 ℃에서 2분 동안 1 사이클; 각각 95 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 68 ℃에서 3분 동안 30 사이클; 68 ℃에서 3분 동안 1 사이클로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)에서 배양하였다.
2700 bp PCR 생성물을 89 mM 염기성 트리스-89 mM 붕산-2 mM 이나트륨 EDTA (TBE) 버퍼를 사용하는 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 2700 bp의 단편을 겔에서 잘라냈고 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 아가로스로부터 추출하였다.
2700 bp PCR 생성물을 제조사의 지시에 따라 시퀀싱용 Zero Blunt® TOPO® PCR Kit를 사용하여 pCR™4BLUNT TOPO® (Invitrogen) 벡터로 클로닝하였다. 6 μL의 총 반응량에서, 1 또는 4 μL의 2700 bp PCR 생성물, 1 μL 염 용액 (Invitrogen) 및 1 μL pCR™4BLUNT TOPO® (Invitrogen)을 상온에서 15분 동안 함께 배양하였다. 2 μL의 각 클로닝 반응물을 제조사의 지시에 따라 One Shot® TOP10 화학적 컴피턴트 (competent) 이. 콜리 (Invitrogen) 세포에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 여러 결과의 형질전환체를 NotI 분해에 의해 원하는 PCR 생성물의 적절한 삽입으로 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMlBa100으로 지정하였다.
플라스미드 pHJJ76 (도 24)는 adh1202 위치에서 유전자 통합을 허용하는 상동성을 함유한다. 플라스미드 pHJJ76를 adh1202 상동 서열의 내부에 존재하는 URA3 선택 가능 마커를 제거하기 위해 NotI로 분해하였다. 분해된 pHJJ76를 89 mM 염기성 트리스-89 mM 붕산-2 mM 이나트륨 EDTA (TBE) 버퍼를 사용하는 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 5.2 kbp 단편을 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 아가로스로부터 추출하였고, T4 DNA 리가제를 사용하여 함께 다시 결찰하였다. 결찰 생성물을 제조사의 지시에 따라 One Shot® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 (Invitrogen) 세포에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 여러 결과의 형질전환체를 ApaI 및 SacI 분해로 스크리닝하였다. 원하는 분해 생성물을 수득하는 클론을 pHJJ76-no ura로 분해하였다.
유전자가 adh1202에서 통합을 위해 PDC 프로모터 및 종결자에 의해 조절되는 배치될 수 있는 경우, pMlBa100 (상기)의 PDC 프로모터 및 종결자 및 URA3 선택 가능 마커를 플라스미드를 생성하기 위해 pHJJ76-no ura로 클로닝하였다. pHJJ76-no ura를 NotI으로 분해한 후 이어서 CIP를 처리하였다. 선형 5.2 kbp 단편을 QIAQUICK® PCR Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 분해하였다. pMlBa100을 NotI으로 분해하였고 89 mM 염기성 트리스-89 mM 붕산-2 mM 이나트륨 EDTA (TBE) 버퍼를 사용하는 1% 아가로스 겔에서 실행하였다. 2742 bp 단편을 겔에서 잘라냈고, QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 추출하였고, T4 DNA 리가제를 사용하여 pHJJ76-no ura의 5.2 kbp 단편으로 결찰하였다. 결찰 생성물을 제조사의 지시에 따라 One Shot® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 (Invitrogen) 세포에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 여러 결과의 형질전환체를 KpnI 및 XbaI 분해로 스크리닝하였다. 원하는 분해 생성물을 수득하는 클론을 pMlBa107로 지정하였다 (도 2).
실시예 2E: PDC 위치에서 다수의 외인성 유전자를 발현하는 삽입 벡터 단편의 구조물
다음 삽입 벡터 단편을 내인성 아이. 오리엔탈리스 PDC 유전자를 다수의 유전자, 예를 들어, PDC, ENO1, 및 TDH3 프로모터로부터 발현되는 것으로 여기에 설명된 세 개의 유전자를 발현하는 카세트로 대체하는 설계된 DNA 구조물을 생성하기 위해 사용할 수 있다.
TDH3 프로모터. 왼쪽 구조물 (pMhCt068 및 유도체) 및 오른쪽 구조물 (pMhCt069 및 유도체) 사이의 상동 재조합은 URA3 단백질의 발현을 일으키며, 균주의 우라실 영양 요구성에서 우라실 자가 영양성으로 전환을 일으키고, 원하는 성분의 선택을 허용한다. 각각의 왼쪽 구조물의 5' 말단은 PDC 위치의 DNA 업스트림에 대하여 상동성인 한편, 각각의 오른쪽 구조물의 3' 말단은 PDC 위치의 DNA 다운스트림에 대하여 상동성이다. 이들 상동 영역은 발현 카세트를 표적화하기 위해 PDC 위치에 제공한다. 이 표적화 접근법은 도 3에 개략적으로 나타나고, 어떤 적합한 위치, 예를 들어, 상기 설명된 어떤 위치, 예를 들어, ADH 위치 (하기 실시예 참조) 또는 ALD 위치를 표적화하기 위해 여기에 설명된 다수의 유전자의 어떤 조합도 사용하도록 변형될 수 있다.
왼쪽 단편의 구조물
빈 벡터 왼쪽 구조물, pMhCt068을 하기 설명된 바와 같이 다수의 단계로 클로닝하였다.
PDC 프로모터 영역 및 원하는 추가의 제한 부위를 함유하는 PCR 단편 및 플랭킹 DNA를 프라이머 0611166 및 0611167을 사용하여 게놈 아이. 오리엔탈리스 DNA로부터 증폭하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 100 ng의 게놈 아이. 오리엔탈리스 DNA (바람직하게, 예를 들어, EPICENTRE® Biotechnologies의 MasterPure™ Yeast DNA Purification Kit를 사용하여), 1X ThermoPol 반응 버퍼 (New England Biolabs), 100 pmol 각각의 프라이머 0611166 및 0611167, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 2 μL 100 mM MgS04, 및 2 유닛 VentR® (엑소-) DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 94 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 94 ℃에서 30초 동안, 54 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 1분 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 780개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
TAL 종결 영역 및 원하는 추가의 제한 부위를 함유하는 PCR 단편 및 플랭킹 DNA를 프라이머 0611168 및 0611169를 사용하여 pACN5로부터 증폭시켰다 (도 19). PCR 반응물 (50 μL)은 1 μL의 pACN5 미니-프렙 (Mini-prep) 플라스미드 DNA, 1X iProof™ HF 버퍼 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), 100 pmol 각각의 프라이머 0611168 및 0611169, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL DMSO 및 1 유닛 iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad Laboratories)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 59 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 45초 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 460개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
PCR을 상기 생성물 둘 다를 융합하는 단일 증폭 생성물을 생성하기 위해 사용하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 125 ng의 PDC 프로모터 함유 PCR 생성물, 76 ng의 TAL 종결자 함유 PCR 생성물, 1X ThermoPol 반응 버퍼 (New England Biolabs), 100 pmol 각각의 프라이머 0611166 및 0611169, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 2 μL 100 mM MgS04, 및 2 유닛 VentR® (엑소-) DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 94 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 94 ℃에서 30초 동안, 54 ℃에서 30초 동안, 72 ℃에서 1분 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1250개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
EN01 프로모터 영역 및 원하는 추가의 제한 부위를 함유하는 PCR 단편 및 플랭킹 DNA를 프라이머 0611170 및 0611171을 사용하여 pACN43으로부터 증폭하였다 (도 22). PCR 반응물 (50 μL)은 1 μL의 pACN43 미니-프렙 플라스미드 DNA, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 100 pmol 각각의 프라이머 0611170 및 0611171, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 1 유닛 Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 59 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 45초 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1050개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
원하는 추가의 제한 부위 및 플랭킹 DNA와 함께, RKI 종결 영역에 이어서 URA3 프로모터 영역 및 URA3 ORF의 5' 말단을 함유하는 PCR 단편을 프라이머 0611172 및 0611173을 사용하여 pACN43으로부터 증폭하였다 (도 22). PCR 반응물 (50 μL)은 1 μL의 pACN43 미니-프렙 플라스미드 DNA, 1X iProof™ HF 버퍼 (Bio-Rad Laboratories), 100 pmol 각각의 프라이머 0611172 및 0611173, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL DMSO 및 1 유닛 iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad Laboratories)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 59 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 45초 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1400개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
PCR을 상기 생성물 둘 다를 융합하는 단일 증폭 생성물을 생성하기 위해 사용하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 93 ng의 EN01 프로모터 함유 PCR 생성물 (상기); 125 ng의 RKI 종결자, URA3 프로모터 및 부분적 ORF 함유 PCR 생성물 (상기); 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs); 100 pmol 각각의 프라이머 0611170 및 0611173; 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP; 1.5 μL DMSO; 및 1 유닛 Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 56 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 2분 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 2460개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
PCR 생성물에 대한 수령자 벡터를 생성하기 위해, 플라스미드 pMhCt017 (관련없는 인서트 (insert)를 갖는 표준 클로닝 벡터 pUC19)을 HindIII 및 EcoRI로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE에서 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 2.6 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 결과의 HindIII 내지 EcoRI 정제된 단편은 pUC18에서 발견된 것과 동일하였다 (Yanisch-Perron, C, Vieira, J. and Messing, J. (1985) 유전자, 33, 103-119).
상기 정제된 1250 bp 및 2460 bp PCR 생성물을 125 ng pMhCt017 HindIII 내지 EcoRI 벡터 단편, 92 ng의 PDC 프로모터 및 TAL 종결자 PCR 생성물, 165 ng의 EN01 프로모터 및 URA3 프로모터 및 부분적 ORF 함유 PCR 생성물, 1X In-Fusion 반응 버퍼 (Clontech) 및 1 μL의 IN-FUSION™ 효소 (Clontech)로 구성된 10 μL의 총 반응량에서 IN-FUSION™ Advantage PCR Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 분해된 pMhCt017 단편에 삽입하였다. 반응물을 37 ℃에서 15분 동안, 50 ℃에서 15분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 반응물을 40 μL의 TE 버퍼로 희석하였고 2.5 μL을 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 제조사의 지시에 따라 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 여러 결과의 형질전환체를 ApaLI 분해에 의해 원하는 PCR 생성물의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론은 DNA 시퀀싱으로 올바른 것으로 확인하였고 pMhCt068로 지정하였다.
플라스미드 pMhCt068은 여기에 설명된 원하는 이소성 유전자의 추가를 위해 PDC 프로모터 영역에 이어서 NheI 및 AscI 제한 부위, TAL 종결자, 여기에 설명된 원하는 두 번째 이소성 유전자의 클로닝을 위해 EN01 프로모터 영역에 이어서 XbaI 및 PacI 제한 부위, RKI 종결자, 아이. 오리엔탈리스 URA3 프로모터 및 아이. 오리엔탈리스 URA3 ORF의 5' 말단을 함유한다. 플라스미드 pMhCt068는 PDC 프로모터 내로 약 200 bp에서 A에서 T로 뉴클레오티드 변화, PDC 프로모터로 방법의 2/3에서 G에서 T로 뉴클레오티드 변화, 및 NheI 제한 부위의 5' 측면 상에 존재하는 조숙한 시작 코돈 (ATG)을 갖는 것으로 발견되었다. 따라서, 올바른 버젼의 pMhCt068를 하기 설명된 바와 같이 구성하였다.
PDC 프로모터 영역을 pACN5로부터 프라이머 0611166 및 0611828로 PCR 증폭하였으며 (도 19), 상기 원하는 시작 코돈을 도입하지 않는다. PCR 반응물 (50 μL)은 1 내지 50배 희석된 pACN5의 미니-프렙 중 1 μL, 1X ThermoPol 반응 버퍼 (New England Biolabs), 100 pmol 각각의 프라이머 0611166 및 0611828, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 2 μL 100 mM MgS04, 및 2 유닛 VentR® (엑소-) DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 94 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 94 ℃에서 30초 동안, 54 ℃에서 30초 동안, 72 ℃에서 1분 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 780개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
PDC 프로모터 함유 PCR 생성물을 상기 설명된 바와 같이 TAL 종결자 함유 PCR 생성물에 융합하였다. TAL 종결자 PCR 단편을 0611168 프라이머로 만들었고, 결과의 PCR 융합 생성물은 조숙한 시작 코돈이 없고 원하지 않는 시작 코돈을 포함하는 생성물을 갖는, 혼합물일 것이다. 결과의 1250 bp PCR 생성물을 정제하였고 상기 설명된 바와 같이 IN-FUSION™ Advantage PCR Cloning Kit (Clontech)를 통해 RKI 종결자, URA3 프로모터 및 부분적 ORF 함유 융합 PCR 생성물 및 pUC18와 결합시켰다. 예상된 ApaLI 분해를 수득하는 클론은 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 나타나며, PDC 프로모터에서 돌연변이의 원하는 부재 및 NheI 제한 부위의 조숙한 ATG 5'의 결핍을 포함하고, pMhCt082로 지정하였다.
오른쪽 단편의 구조물
빈 벡터 오른쪽 구조물, pMhCt068을 하기 설명된 바와 같이 다수의 단계로 클로닝하였다.
pACN43으로부터 아이. 오리엔탈리스 URA3 ORF, URA3 종결자 (URA3 종결 코돈의 275 bp 다운스트림), URA3 프로모터 (효모 숙주로 통합 후 마커 밖으로 루프-아웃 (loop-out) 되는 반복 영역의 역할을 함)의 3' 말단 및 원하는 추가의 제한 부위를 함유하는 PCR 단편 및 플랭킹 DNA를 프라이머 0611174 및 0611175를 사용하여 증폭하였다 pACN43 (도 22). PCR 반응물 (50 μL)은 1 μL의 pACN43 미니-프렙 플라스미드 DNA, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 100 pmol 각각의 프라이머 0611174 및 0611175, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 1 유닛 Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 59 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 45초 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1210 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
TDH3 프로모터 영역 및 원하는 추가의 제한 부위를 함유하는 PCR 단편 및 플랭킹 DNA를 프라이머 0611176 및 0611177을 사용하여 pACN23으로부터 증폭하였다 (도 20). PCR 반응물 (50 μL)은 1 μL의 pACN23 미니-프렙 플라스미드 DNA, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 100 pmol 각각의 프라이머 0611176 및 0611177, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 1 유닛 Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)을 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 59 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 45초 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1028 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
아이. 오리엔탈리스 PDC 유전자 영역 (PDC 종결 영역)의 종결 코돈의 영역 3' 및 및 원하는 추가의 제한 부위를 함유하는 PCR 단편 및 플랭킹 DNA를 프라이머 0611178 및 0611179를 사용하여 아이. 오리엔탈리스 게놈 DNA로부터 증폭하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 100 ng의 아이. 오리엔탈리스 게놈 DNA, 1X iProof™ HF 버퍼 (Bio-Rad Laboratories), 100 pmol 각각의 프라이머 0611178 및 0611179, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL DMSO 및 1 유닛 iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad Laboratories)를 함유한다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 59 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 45초 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 938개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
PCR을 상기 설명된 최종 두 개의 PCR 생성물 둘 다를 융합하는 단일 증폭 생성물을 생성하기 위해 사용하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 125 ng의 the TDH3 프로모터 함유 PCR 생성물, 114 ng의 PDC 종결 영역 함유 PCR 생성물, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 100 pmol 각각의 프라이머 0611176 및 0611179, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 1 유닛 Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 56 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 2분 30초 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1966개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
상기 정제된 1,210 bp PCR 생성물 및 1,966 bp PCR 융합 생성물을 상기 설명된 바와 같이 125 ng pMhCt017 HindIII 내지 EcoRI 벡터 단편, 54 ng의 URA3 ORF의 3' 말단에 이어서 URA3 종결자를 함유하는 PCR 생성물, 200 ng의 TDH3 프로모터 및 PDC 종결자 융합 PCR 생성물, 1X In-Fusion 반응 버퍼 (Clontech) 및 1 μL의 IN-FUSION™ 효소 (Clontech)로 구성된 10 μL의 총 반응량에서 IN-FUSION™ Advantage PCR Cloning Kit (Clontech) HindIII 및 EcoRI 분해된 pMhCt017 단편에 삽입하였다. 반응물을 37 ℃에서 15분 동안, 50 ℃에서 15분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 반응물을 40 μL의 TE 버퍼로 희석하였고 2.5 μL을 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 여러 결과의 형질전환체를 ApaLI 분해에 의해 원하는 PCR 생성물의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMhCt069로 지정하였다.
플라스미드 pMhCt069는 아이. 오리엔탈리스 URA3 마커의 3' 말단, 해당 URA3 종결자, URA3 프로모터 (이후 URA3 마커 밖으로 루프-아웃), TDH3 프로모터, 이소성 발현을 위해 원하는 유전자의 서브클로닝을 위한 XbaI 및 PacI 제한 부위, 및 C 위치의 3' 플랭킹 영역을 함유한다.
실시예 2F: adh9091 위치에서 다수의 외인성 유전자를 발현하는 삽입 벡터 단편의 구조물
내인성 아이. 오리엔탈리스 adh9091 유전자를 여기에 설명된 원하는 다수의 유전자를 발현하는 카세트로 대체하기 위해 다음 삽입 벡터 단편을 실시예 2E에 설명된 것과 유사한 접근법을 사용하여 설계하였다.
왼쪽 단편의 구조물
빈 벡터 왼쪽 구조물, pGREr125를 하기 설명된 바와 같이 다수의 단계로 클로닝하였다.
아이. 오리엔탈리스 adh9091 위치에서 상동 재조합에 필요한 5' 플랭크를 포함하는 구조물 및 빈 발현 카세트 PDC 프로모터/TAL 종결자를 벡터 플라스미드 pCR2.1-TOPO (Invitrogen)으로 PCR 클로닝하였다. PDC 프로모터 단편을 프라이머 0611250 및 0611251을 사용하여 플라스미드 pACN5로부터 PCR 증폭하였다 (도 19). PCR 반응물 (50 μL)은 15 ng의 플라스미드 pACN5 DNA, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611250 및 0611251, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 72 ℃에서 1분 30초 동안 35 사이클; 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 900 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 단편의 5' 말단에 NotI 제한 부위 및 단편의 3' 말단에 PacI 및 XbaI 제한 부위가 있는 결과의 PCR 단편의 총 길이는 약 753 bp였다.
XbaI 및 PacI 제한 부위를 포함하는, 상기 PCR 생성물에 대한 5' 상동성을 함유하는 두 번째 PCR 단편을 프라이머 0611252 및 0611253을 사용하여 플라스미드 pACN5로부터 TAL 종결 영역을 증폭시키기 위해 생성하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 15 ng의 플라스미드 pACN5 DNA (상기), 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611252 및 0611253, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 72 ℃에서 1분 30초 동안 35 사이클; 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 900 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 단편의 5' 말단에 XbaI 및 PacI 제한 부위 및 3' 말단에 PmeI 제한 부위가 있는 결과의 PCR 단편의 총 길이는 약 435 bp였다.
753 bp 단편 및 435 bp 단편을 프라이머 0611250 및 0611253을 사용하여 PCR로 함께 융합하였으며, 결과의 PDC 프로모터가 TAL 종결자의 업스트림인 1,149 bp 단편으로 이어진다. PCR 반응물 (50 μL)은 125 ng의 753 bp 단편, 75 ng의 435 bp 단편, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611250 및 0611253, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 72 ℃에서 1분 동안 35 사이클; 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1149 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
NotI 제한 부위를 포함하는 상기 1149 bp PCR 생성물에 대한 3' 상동성을 함유하는 PCR 단편을 아이. 오리엔탈리스 adh9091 로커스에 대한 5' 플랭크를 증폭하기 위해 프라이머 0611254 및 0611255를 사용하여 생성하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 주형 DNA로 플라스미드 pHJJ27 (도 21) 15 ng, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611254 및 0611255, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 72 ℃에서 1분 30초 동안 35 사이클; 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 900 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 단편의 5' 말단에 HpaI 제한 부위 및 3' 말단에 NotI 제한 부위가 있는 결과의 PCR 단편의 총 길이는 약 891 bp였다.
891 bp 단편을 약 2005 bp 단편을 발생시키는 프라이머 0611254 및 0611253을 사용하여 PCR로 1149 bp PDC 프로모터/TAL 종결자 단편의 업스트림과 융합하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 125 ng의 1149 bp 단편, 95 ng의 891 bp 단편, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611254 및 0611253, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 2분 동안 35 사이클; 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 2005 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
adh9091 위치에서 통합을 위한 5' 플랭크, PDC 프로모터 및 TAL 종결자를 포함하는, 결과의 2005 bp 단편을 pCR2.1-TOPO 벡터로 클로닝하였고 제조사의 지시에 따라 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)를 사용하여 One-Shot TOP10 이. 콜리 세포에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 여러 결과의 형질전환체를 AvaI 분해에 의해 원하는 단편의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 확인하였고 pGMEr112로 지정하였다. 플라스미드 pGMEr112는 adh9091 위치에서 상동 재조합에 대한 5' 플랭크에 이어서 빈 발현 카세트 PDC 프로모터/TAL 종결자를 포함한다.
URA3 프로모터 단편에 의해 구동되는 절단된 5' URA3 마커 유전자를 프라이머 0611283 및 0611263을 사용하여 플라스미드 pHJJ27로부터 PCR 증폭하였다 (도 21). PCR 반응물 (50 μL)은 15 ng의 플라스미드 pHJJ27, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611263 및 0611283, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 1분 30초 동안 35 사이클; 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 2005 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 단편의 5' 말단에 HpaI 및 PmeI 제한 부위 및 그것의 3' 말단에 NheI 제한 부위가 있는 결과의 PCR 단편의 총 길이는 약 885 bp였다.
결과의 885 bp 단편을 pCR2.1-TOPO 벡터로 클로닝하였고 제조사의 지시에 따라 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)를 사용하여 One-Shot TOP10 이. 콜리 세포로 클로닝하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 여러 결과의 형질전환체를 BglI 분해에 의해 원하는 인서트의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 확인하였고 pGMEr108로 지정하였다. 플라스미드 pGMEr108은 URA3 프로모터에 이어서 URA3 유전자의 절단된 5' 세그먼트를 포함하며, 이러한 단편은 5' 말단에 HpaI 및 PmeI 제한 부위에 의해 및 3' 말단에 NotI 제한 부위에 의해 플랭크된다.
5' adh9091 플랭크에 이어서 구조물 PDC 프로모터/TAL 종결자를 포함하는, 플라스미드 pGMEr112 (상기)의 1998 bp HpaI 및 PmeI 제한 단편을 HpaI 및 PmeI에 의해 선형화 pGMEr108 (상기)의 4806 bp 벡터에 결찰하였다. 1998 bp 인서트 단편 및 4806 bp 벡터 단편을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, 이중 제한 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 결찰 반응을 1:3 벡터:인서트 비율을 사용하여 수행하였다; 특히 반응을 2 μL의 4806 bp 선형화 벡터, 6 μL의 1998 bp 인서트 단편, 9 μL의 2X QUICK 결찰 반응 버퍼 및 1 μL QUICK T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)로 설정하였고, 제조사의 지시에 따라 수행하였다.
5 μL의 결찰 생성물을 제조사의 지시에 따라 이. 콜리 XL10-Gold® Ultracompetent 세포 (Agilent Technologies)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 여러 결과의 형질전환체를 HindIII 분해에 의해 원하는 인서트의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 확인하였고 pGMEr117로 지정하였다.
플라스미드 pGMEr117은 5' adh9091 플랭크에 이어서, 빈 발현 카세트 PDC 프로모터/TAL 종결자 및 URA3 프로모터에 의해 구동되는 절단된 5' URA3 유전자를 포함한다. 추가적으로, 플라스미드 pGMEr117은 두 개의 다른 XbaI 제한 부위를 낳는다: 원하는 유전자를 삽입하기 위해 사용될 수 있는, PDC 프로모터 및 TAL 종결자 사이의 (및 제한 부위 PacI에 인접한) 첫 번째 제한 부위, 및 원래의 pCR2.1-TOPO 백본에서 유전되는 (inherited) 두 번째 XbaI 제한 부위. 이 두 번째 XbaI 제한 부위를 제한하기 위해, 플라스미드 pGMEr117을 제한 효소 ApaI로 분해하였고, 선형화 플라스미드를 제조사의 지시에 따라 효소 DNA Polymerase I, 큰 (클레노브 (Klenow)) 단편 (New England Biolabs)과 함께 처리하였다. 결과의 선형 벡터 (블런트 (blunt) 말단 함유)를 제한 효소 EcoRV로 분해하였으며, 이것은 XbaI 제한 부위를 포함하는 벡터로부터 43 bp 단편을 잘라낸다. 제한 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였고 6761 bp 벡터 단편을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 자가 결찰 반응을 3 μL의 선형화 벡터, 6 μL의 멸균 2차 증류수, 10 μL의 2X QUICK 결찰 반응 버퍼 및 1 μL QUICK T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)로 설정하였고 제조사의 지시에 따라 수행하였다.
5 μL의 결찰 생성물을 제조사의 지시에 따라 이. 콜리 XL10-Gold® Ultracompetent 세포 (Agilent Technologies)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 여러 결과의 형질전환체를 XbaI 분해에 의해 원하는 인서트의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 확인하였고 pGMEr122로 지정하였다.
EN01 프로모터 단편을 프라이머 0611295 및 0611296을 사용하여 플라스미드 pACN43 (도 22)으로부터 PCR 증폭하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 15 ng의 플라스미드 pACN43, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611295 및 0611296, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 1분 동안 35 사이클; 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1009 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 단편의 5' 말단에 PmeI 제한 부위 및 3' 말단에 ApaI 및 NruI 제한 부위가 있는 결과의 PCR 단편의 총 길이는 약 1009 bp였다.
NruI 및 ApaI 제한 부위를 포함하는, 상기 PCR 생성물에 대하여 5' 상동성을 함유하는 두 번째 PCR 단편을 플라스미드 pACN43 (도 22)로부터 RKI 종결 영역을 증폭하기 위해 프라이머 0611297 및 0611298을 사용하여 생성하였다. 반응물 (50 μL)은 15 ng의 플라스미드 pACN43 DNA, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611297 및 0611298, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 1분 동안 35 사이클; 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 438 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 단편의 5' 말단에 NruI 및 ApaI 제한 부위 및 단편의 3' 말단에 PmeI 제한 부위가 있는 결과의 PCR 단편의 총 길이는 약 438 bp였다.
1009 bp 프로모터 단편 및 438 bp 종결자 단편을 프라이머 0611295 및 0611298을 사용하여 PCR로 함께 융합하였으며, EN01 프로모터가 RKI 종결자의 업스트림인 약 1447 bp 단편으로 이어진다. PCR 반응물 (50 μL)은 125 ng의 1009 bp 단편, 65 ng의 438 bp 단편, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611295 및 0611298, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 2분 동안 35 사이클; 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1447개의 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
EN01 프로모터/RKI 종결자 구조물을 포함하는, 결과의 1447 bp 단편을 pCR2.1-TOPO 벡터로 클로닝하였고 제조사의 지시에 따라 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)를 사용하여 One-Shot TOP10 이. 콜리 세포를 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 여러 결과의 형질전환체를 BamHI 분해에 의해 원하는 단편의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 확인하였고 pGMEr114로 지정하였으며, 빈 발현 카세트 EN01 프로모터/RKI 종결자를 포함한다.
플라스미드 pGMEr122 및 pGMEr114를 제한 효소 PmeI로 37 ℃에서 3시간 동안 분해하였다. 각각의 분해 반응을 중단하기 약 1시간 전에, 1 μL의 소 위장 알칼린 포스파타제 (New England Biolabs)를 말단을 탈-인산화하고 자가 결찰을 방지하기 위해 각각의 분해 튜브에 추가하였다. 플라스미드 pGMEr122의 결과의 6761 bp 벡터 단편, 및 플라스미드 pGMEr114의 구조물 ENO1 프로모터/TAL 종결자 (1439 bp)를 포함하는, 결과의 인서트 단편을 1X TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였고, 겔에서 잘라냈고, 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
플라스미드 pGMEr122의 3 μL의 벡터 단편, 플라스미드 pGMEr114의 4 μL의 인서트 단편, 2 μL의 멸균 2차 증류수, 10 μL의 2X QUICK 리가제 버퍼 및 1 μL의 QUICK T4 리가제 (New England Biolabs)를 포함하는 다음 결찰 반응물을 제조하였고 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 상기 결찰 반응물의 5 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 XL10-Gold® Ultracompetent 이. 콜리 세포 (Agilent Technologies)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 여러 결과의 형질전환체를 XbaI 및 BstBI을 사용하는 분해에 의해 원하는 인서트의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 시퀀싱으로 확인하였고 pGMEr125로 지정하였다. EN01 프로모터/RKI 종결자 구조물을 반대 방향에 삽입하였으며, (a) 및 (b)로 지정된 두 개의 버젼의 플라스미드 pGMEr125 (도 4 및 5)를 생성하였다.
플라스미드 pGMEr125a 및 pGMEr125b는 PDC 프로모터 영역, TAL 종결자, EN01 프로모터 영역, RKI 종결자, 아이. 오리엔탈리스 URA3 프로모터, 해당 URA3 마커의 5' 말단 및 아이. 오리엔탈리스 adh9091 위치의 5' 플랭킹 영역을 함유한다.
오른쪽 단편의 구조물
빈 벡터 오른쪽 구조물, pGREr121을 하기 설명된 바와 같이 다수의 단계로 클로닝하였다.
TDH3 프로모터 단편을 프라이머 0611256 및 0611257을 사용하여 플라스미드 pACN23 (도 20)로부터 PCR 증폭하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 15 ng의 플라스미드 pACN23 DNA, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611256 및 0611257, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 1분 30초 동안 35 사이클; 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 994 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 단편의 5' 말단에 SfoI 제한 부위 및 단편의 3' 말단에 PacI 및 NruI 제한 부위가 있는 결과의 PCR 단편의 총 길이는 약 994 bp였다.
NruI 및 PacI 제한 부위를 포함하는, 상기 PCR 생성물에 대한 5' 상동성을 함유하는 두 번째 PCR 단편을 0611258 및 0611259 플라스미드를 사용하여 프라이머 pACN23 (도 20)의 TKL 종결 영역을 증폭하기 위해 생성하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 15 ng의 플라스미드 pACN23 DNA, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611258 및 0611259, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 1분 30초 동안 35 사이클; 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 469 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 단편의 5' 말단에 PacI 및 NruI 제한 부위 및 단편의 3' 말단에 NotI 제한 부위가 있는 결과의 PCR 단편의 총 길이는 약 469 bp였다.
상기 994 bp 및 469 bp 단편을 프라이머 0611256 및 0611259를 사용하여 PCR로 함께 융합하였으며, TDH3 프로모터가 TKL 종결자의 업스트림인 약 1433 bp 단편으로 이어진다. PCR 반응물 (50 μL)은 125 ng의 994 bp 단편, 60 ng의 469 bp 단편, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 061159 및 0611256, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 1분 동안 35 사이클; 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1433 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
NotI 제한 부위를 포함하는, 상기 1433 bp PCR 생성물의 3' 말단에 대한 5' 상동성을 함유하는 PCR 단편을 프라이머 0611260 및 0611261을 사용하여 adh9091 위치에 대한 3' 플랭크를 증폭시키기 위해 생성하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 주형 DNA로서 플라스미드 pHJJ27 DNA (도 21) 15 ng, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611260 및 0611261, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 1분 30초 동안 35 사이클; 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1019 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 단편의 5' 말단에 NotI 제한 부위 및 단편의 3' 말단에 ApaI 제한 부위가 있는 결과의 PCR 단편의 총 길이는 약 1019 bp였다.
1019 bp 단편을 약 2405 bp 단편을 생성하는 프라이머 0611256 및 0611261을 사용하여 PCR로 1433 bp TDH3 프로모터/TKL 종결자 단편의 다운스트림과 융합하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 125 ng의 1433 bp 단편, 90 ng의 1019 bp 단편, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611256 및 0611261, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 2분 동안 35 사이클; 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 2405 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
TDH3 프로모터/TAL 종결자 구조물의 adh9091 위치 다운스트림에서 3' 플랭크를 포함하는 결과의 2405 bp 단편을 pCR2.1-TOPO 벡터로 클로닝하였고 제조사의 지시에 따라 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)를 사용하여 One-Shot TOP10 이. 콜리 세포에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 여러 결과의 형질전환체를 AvaI 분해에 의해 원하는 단편의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 확인하였고 pGMEr113로 지정하였다. 플라스미드 pGMEr113는 빈 발현 카세트 TDH3 프로모터/TKL 종결자가 선행하는 아이. 오리엔탈리스 adh9091 위치에서 상동 재조합을 위한 3' 플랭크를 포함한다.
PCR을 프라이머 0611264 및 0611284를 사용하여 플라스미드 pHJJ27 (도 21)로부터 URA3 ORF의 절단된 3' 단편, URA3 종결자, 및 URA3 프로모터 (상기 설명된 바와 같이 효모 숙주로 통합 후 마커 밖으로 루프-아웃되는 반복 영역의 역할을 함)을 증폭하기 위해 사용하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 15 ng의 플라스미드 pHJJ27 DNA, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611264 및 0611284, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 1분 30초 동안 35 사이클; 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1324 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 단편의 5' 말단에 NheI 제한 부위 및 단편의 3' 말단에 ApaI 및 SfoI 제한 부위가 있는 결과의 PCR 단편의 총 길이는 약 994 bp였다.
상기 겔-정제된 1324 bp 단편을 pCR2.1-TOPO 벡터로 클로닝하였고 제조사의 지시에 따라 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)를 사용하여 One-Shot TOP10 이. 콜리 세포에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 여러 결과의 형질전환체를 HindIII 분해에 의해 원하는 인서트의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 확인하였고 pGMEr109로 지정하였다. 플라스미드 pGMEr109는 URA3 ORF의 3' 단편 및 URA3 종결자, 이어서 URA3 프로모터를 포함한다. 플라스미드 pGMEr109의 URA3 유전자의 3' 단편의 업스트림 부분은 플라스미드 pGMEr108로 클로닝된 절단된 5' URA3 단편의 극단을 갖는 460 bp 상동성을 낳는다. 상동성의 영역은 세그먼트 둘 다를 함유하는 구조물을 갖는 숙주 유기체의 동시-형질 전환에서 기능적 선택 마커를 생성하는 유전자의 두 개의 부분 사이의 재조합을 허용한다.
플라스미드 pGMEr109를 KpnI로 분해하였고, 제조사의 지시에 따라 DNA Polymerase I, 큰 (클레노브) 단편 (New England Biolabs)을 처리하였다. 선형화 pGMEr109 플라스미드 (블런트 말단을 함유)를 BamHI로 분해하였다 생성물을 TBE 버퍼 중의 8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였고 5247 bp 벡터 단편을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
플라스미드 pGMEr113를 BamHI 및 EcoRV로 분해하였으며, URA3 종결자에 이어서 URA3 프로모터를 갖는 URA3 ORF의 구조물 TDH3 프로모터/TKL 종결자에 이어서 절단된 3' 단편을 낳는 2466 bp 단편을 발생시킨다. 이중 제한 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였고 약 2466 bp 벡터 단편을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 2466 bp BamHI/EcoRV 분해된 단편을 플라스미드 pGMEr109의 5247 bp 벡터 단편에 결찰하였다. 결찰 반응을 3 μL의 5247 bp 선형화 벡터, 3 μL의 2466 bp 인서트 단편, 3 μL의 멸균 2차 증류수, 10 μL의 2X QUICK 결찰 반응 버퍼 및 1 μL QUICK T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)로 설정하였고, 제조사의 지시에 따라 수행하였다.
5 μL의 결찰 생성물을 제조사의 지시에 따라 이. 콜리 XL10-Gold® Ultracompetent 세포 (Agilent Technologies)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 여러 결과의 형질전환체를 XbaI 및 PacI로 분해에 의해 원하는 인서트의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 확인하였고 pGMEr121 (도 6)로 지정하였다.
플라스미드 pGMEr121은 아이. 오리엔탈리스 URA3 마커의 3' 말단에 이어서 해당하는 URA3 프로모터, TDH3 프로모터, TKL 종결자 및 adh9091 위치의 3' 플랭킹 영역을 함유한다.
실시예 2G: 아이. 오리엔탈리스 CNB1 의 구성
아이. 오리엔탈리스 CNB1는 하기 설명된 바와 같이 아이. 오리엔탈리스 CD1822로부터 구성된다 (아이. 오리엔탈리스 ATCC PTA-6658로부터 아이. 오리엔탈리스 CD1822의 생성에 대하여 실시예 1A 참조). 균주 CD1822에 함유된 URA3 유전자의 카피 둘 다를 유전적 설계를 위한 선택 마커로서 이 유전자의 사용을 허용하기 위해 삭제하였다. URA3은 유전자의 존재 (우라실 결핍 배지에서 성장에 의해) 및 부재 (5-플루오오로트산의 존재시 성장에 의해) 둘 다에 이용 가능한 마커이기 때문에 효모 유전학을 위한 다용도 마커이다. URA3 유전자 중 하나의 붕괴를 반복 DNA 서열에 의해 플랭크된 MEL5 선택 마커를 함유하는 선택 카세트와 대체함으로써 수행하였다. MEL5 선택 카세트를 양성 균주 테스트를 MEL 마커 유전자의 손실에 대하여 스크리닝하였다. 두 번째 URA3 유전자의 손실은 5-플루오오로트산의 존재시 성장에 의해 선택되었다.
CD1822를 2.8 μg의 벡터 pMI458 (도 27)의 SacI/PspOMI 분해된 DNA. 플라스미드에 형질전환하였다. pMI458은 아이. 오리엔탈리스 URA3 유전자의 서열 업스트림 (P-loURA3, SEQ ID NO: 253) 및 다운스트림 (T-loURA3, SEQ ID NO: 254)에 상동성인 DNA 단편에 의해 플랭크된, 아이. 오리엔탈리스 PGK 프로모터 (P-loPGK, SEQ ID NO: 247)에 의해 조절되는, 에스. 세레비시애 MEL5 유전자 (SEQ ID NO: 255)를 함유한다. P-loURA3 및 T-loURA3 단편은 아이. 오리엔탈리스 게놈과 상대적으로 같은 방향에 있다. 대략 500 Mel + 콜로니를 30 ℃에서 5일 후에 얻었다. 열 개의 콜로니는 10 mL BFP (버터필드 포스페이트 버퍼) 튜브를 접종하고 25 μL을 DM1 X-α-gal 플레이트 상에 도말함으로써 분리된 단일 콜로니였다. 각각의 초기 분리체의 단일 파란 콜로니를 추가의 분석을 위해 YPD 상에서 골랐다.
PCR을 원하는 유전적 이벤트를 위한 형질전환체를 스크리닝하기 위해 사용하였다. PCR 스크리닝시 주형으로서 사용되는 게놈 DNA를 얻기 위해, 1.5 mL 하룻밤 동안 배양된 세포를 스크류-캡 미세원심분리 튜브에서 스핀 다운시켰고 0.2 ml의 2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM 트리스-HCl pH 8.0, 1 mM Na2EDTA pH 8.0 용액에 재현탁하였다. 10 mM 트리스 pH 8.0/1 mM EDTA (Sigma) 및 0.3 g 유리 비드로 평형화된 0.2 mL의 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜 (25:24:1) 혼합물을 추가하였다. 튜브를 Mini-BeadBeater-8 (BioSpec)에서 2분 동안 최고 속도에서 흔들었다. 0.2 mL의 TE를 추가하였고 튜브를 간단히 보텍스하였다. 수층을 16,100 x g로 5분 동안 원심분리에 의해 분리하였다. 상층액을 새 튜브로 제거하였고 1 mL의 100% 에탄올을 추가하였다. 튜브를 20 ℃에서 30분 동안 배치하였고, 16,100 x g로 5분 동안 원심분리하였고, 액체를 부었다. DNA를 공기건조하였고 500 μL TE에 재현탁하였다.
원하는 5' 교차 혼합을 위한 PCR 스크리닝을 프라이머 oCA405 및 oCA406을 사용하여 수행하였으며, 이것은 1.5 kbp 생성물을 생산한다. 원하는 3' 교차 혼합을 위한 PCR 스크리닝을 프라이머 WG26 및 CM647을 사용하여 수행하였으며, 이것은 1.6 kbp 생성물을 생산한다. pMI458을 생성하기 위해 사용된 URA3 영역 외부의 프라이머 (더 먼 업스트림 또는 다운스트림)는 oCA405 및 CM647이며, 이것은 야생형에 대해 3.2 kbp 생성물, pMI458 붕괴 대립유전자에 대해 5.0 kbp 생성물, 및 선택 마커가 밖으로 루프-아웃될 때 2.2 kbp 생성물을 생산한다. 이들 PCR 반응을 55 ℃ 어닐링 (annealing) 온도를 사용하여 수행하였다. PCR을 또한 네 개의 프라이머 접근법을 사용하여 URA3 오픈 리딩 프레임의 손실에 대해 스크리닝하기 위해 사용하였다. 프라이머 pJLJ28 및 pJLJ29는 액틴 유전자의 800 bp 단편을 증폭시켰고 프라이머 pJLJ30 및 pJLJ31은 URA3 유전자의 600 bp 단편을 증폭시켰다. 한 반응에서 모든 프라이머의 사용은 양성 내부 조절 (액틴 단편)을 제공한다. Roche의 Taq DNA 폴리머라제를 제조사의 프로토콜에 따라, 61 ℃의 어닐링 온도로 사용하였다. 균주 1822ura het MEL-1 및 1822ura het MEL-2를 URA3 위치에서 MEL5 선택 카세트를 통합하는 것으로 확인하였다.
KtSEQ1a (SEQ ID NO: 256) 및 KtSEQ1b (SEQ ID NO: 257) 서열 사이의 재조합을 허용함으로써 MEL5 마커를 1822ura het MEL-1 및 1822ura het MEL-2의 게놈으로부터 제거하였다. MEL+ 균주를 YPD 배지에서 하룻밤 동안 대략 0.5 내지 2.0의 OD600으로 키웠다. 배양물을 YPD 배지에서 약 0.00001의 OD600으로 다시 희석하였다. 200 μL의 배양 희석액을 96웰 미세역가 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 접착 커버로 덮었고, 6-7 시간 동안 (균주의 성장 속도에 의존하여, 대략 6번의 세포 분화) 최대 교반으로, 30 ℃ 배양기에서 배양하였다. 각각의 웰에서 100 μL (플레이트 당 약 ~1000 cfu)를 DM1 + X-α-gal 배지에 도발하였다. 플레이트를 색 변화를 관찰하기 위해 30 ℃에서 하룻밤 동안 또는 상온에서 2일 동안 배양하였다. 흰색 콜로니 (추정상 mel-)를 유사한 배지로 스트리킹하였고, 상기 설명된 바와 같이 PCR에 의해 스크리닝하였다. 두 개의 독립적 루프-아웃, 1822ura het mel-1로서 구성된, 1822ura het MEL-1로부터 하나 및 1822ura het mel-2로서 구성된, 1822ura het mel-2로부터 다른 것을 발견하였다. 이상하게, 얻어진 흰색 콜로니의 엄청난 중요성은 2.2 kbp의 예상된 밴드를 제공하지 않았다.
ura- 유도체를 얻기 위해, YP5D 배지 (YP + 100 g/L 덱스트로스)에서 하룻밤 동안 성장시켰고 하룻밤 동안의 배양물의 앨리쿼트 ((0.5, 5 및 50 μL)를 ScD-2X FOA 플레이트에 도말하였다. FOA-저항성 콜로니를 단일 콜로니에 스트리킹하였고 ura- 표현형에 대해 확인하였다. 1822ura het mel-2로부터 2 개의 콜로니 및 1822ura het mel-1로부터 6개의 콜로니는를 추가의 분석을 위해 골랐다. 이들 콜로니를 YPD에서 하룻밤 동안 성장시켰고 게놈 DNA를 상기 페놀/클로로포름 방법을 사용하여 추출하였다.
URA3 오픈 리딩 프레임의 존재를 PCR로 스크리닝하였다; 8개의 균주 중 아무것도 URA3 유전자를 함유하지 않았다. 1822ura het mel-1의 두 개의 ura-디센던트 (descendent)를 yJLJ3 (CNB1) 및 yJLJ4로 이름지었다. 게놈 시퀀싱에 기초하여, yJLJ3 (CNB1) 및 yJLJ4를 URA3 유전자 및 인근의 퍼메아제 유전자 둘 다의 삭제를 함유하도록 결정하였다; 바람직하게 URA3 유전자만 삭제될 것이다. 이 퍼메아제 유전자의 붕괴 없이 이 CD1822의 ura3 영양 요구체를 생성하기 위해, CD1822를 1 μg의 SacI/ApaI 분해된 pCM208 (도 28)에 형질전환하였다. 플라스미드 pCM208는 아이. 오리엔탈리스 URA3 유전자의 업스트림 (5' URA 플랭크 (근처), SEQ ID NO: 258) 및 다운스트림 (3' URA3 플랭크 (근처), SEQ ID NO: 259) 플랭킹 영역에 상동성인 DNA 서열을 함유한다. 대략 200 Mel+ 콜로니를 30 ℃에서 5일 후 얻었다. 8개의 파란 콜로니를 ScD X-α-gal 플레이트에 스트리킹함으로써 분리하였다. PCR을 원하는 유전적 이벤트를 위해 형질전환체를 스크리닝하기 위해 사용하였다. 5' 교차 혼합 스크리닝을 프라이머 oJY11 및 oJY12를 사용하여 수행하였으며, 이것은 원하는 형질전환체의 0.9 kbp 생성물을 생산한다. 3' 교차 혼합 스크리닝을 프라이머 oJY13 및 oJY14를 사용하여 수행하였으며, 이것은 원하는 형질전환체의 1.0 kbp 생성물을 생산한다. 8개의 콜로니 중 3개는 원하는 PCR 생성물을 나타냈다. 이 콜로니에 대한 MEL 마커를 루프-아웃될 수 있고 두 번째 URA3 유전자를 상기 설명된 바와 같이 삭제하였다. 대안으로, yJLJ3 또는 yJLJ4로부터 유도된 균주에서 URA3 및 퍼메아제 유전자 삭제는 실시예 2H에 설명된 바와 같이, 원-스텝 형질전환에 고정될 수 있다.
실시예 2H: URA3 선택 마커를 함유하는 MBin500 조절 균주의 구성
상기 설명된 바와 같이, 여기에 사용된 아이. 오리엔탈리스 균주 지정 CNB1은 URA3 유전자의 동형 접합체의 삭제로 인한 유리딘 영양 요구체였다. URA3 위치의 이형 수리는 691 bp의 5' 플랭킹 DNA, 및 1500 bp의 3' 플랭킹 DNA를 갖는 URA3 유전자로 구성된 ura 고정 카세트를 함유하는 ura 고정 벡터, pJLJ62 (도 26)를 사용함으로써 이루어진다. ura 고정 카세트는 5' NotI 제한 부위 및 3' ApaI 제한 부위에 의해 플랭크된다. NotI 및 ApaI를 사용하는 제한 분해를 벡터 백본으로부터 2796 bp ura 고정 카세트를 제거하기 위해 수행하였다. 분해물을 제조사에 의해 명시된 바와 같이 QIAQUICK PCR Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. DNA를 유리 멸균된 물에서 용출하였고 1 μg을 아이. 오리엔탈리스 CNB1를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 ura 선택 플레이트에서 선택하였고, 유리딘 보충이 필요하지 않은 단일 콜로니를 MBin500로 지정하였다.
실시예 2I: URA3 선택 마커의 제거
통합 카세트에 존재하는 2개의 URA3 프로모터 영역의 재조합을 통해 URA3 선택 마커 유전자를 제거한 균주를 분리하기 위해, 원하는 ura+ 균주를 3 mL의 YP + 10% 글루코스 배지에 접종하였고 37 ℃에서 적어도 4시간 동안 및 최대 하룻밤 동안 250 rpm으로 흔들면서 키웠다. 50-100 μL의 배양물을 ScD FOA 플레이트에 도말하였고 콜로니가 나타날 때까지 37 ℃에서 48-60시간 동안 배양하였다.
FOA에서 성장은 FOA가 URA3 단백질에 의해 독성 화합물로 전환되기 때문에 URA3 마커의 제거를 위해 선택하였으며, ura+ 세포의 죽음을 일으킨다. 여러 FOA-저항성 콜로니를 37 ℃의 YPD 플레이트 상에서 키움으로써 두 번 정제하였다. 이들 정제된 분리체를 여기에 설명된 바와 같이 PCR을 통해 적절한 URA3 루프-아웃에 대하여 스크리닝하였다.
실시예 2J: 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 ( SDS -PAGE) 분석 및 효모 검정을 위해 변형된 효모 균주의 셰이크 플라스크 성장 과정
4 mL의 ura 선택 배지를 14 mL 팔콘 튜브에 추가하였고 원하는 균주를 멸균 루프를 사용하여 이 배지에 접종하였다. 배양물을 37 ℃에서 하룻밤 동안 (~16 시간) 250 rpm으로 흔들면서 키웠다. 아이. 오리엔탈리스 위치의 적어도 하나의 야생형 카피를 갖는 균주에 대하여, 하룻밤 동안의 배양물의 500 μL를 25 mL의 YP + 10% 글루코스 배지를 함유하는 125 mL 배플 플라스크에 추가하였다. pdcΔ/pdcΔ 균주에 대하여, 하룻밤 동안의 배양물 1 mL을 25 mL의 액체 YP + 100 g/L 덱스트로스 배지를 함유하는 125 mL 배플 플라스크에 추가하였다. 플라스크를 37 ℃에서 250 rpm으로 흔들면서 키웠다. 배양물의 작은 앨리쿼트를 약 한 시간 간격으로 회수하였고 OD600를 측정하였다. 배양물을 OD600가 4 내지 6일 때까지 키웠다.
SDS-PAGE 분석을 위해 세포의 작은 샘플을 제조하기 위해, 2.5 OD 유닛에 해당하는 배양물의 양을 배양물로부터 취하였고 1.5 mL 튜브로 옮겼다. 세포를 16,100 x g로 펠렛화하였고, 상층액을 제거하였고, 세포 펠렛을 사용 전까지 -20 ℃에 저장하였다.
성장 플라스크에 남은 세포를 상온에서 2279 x g로 원심분리하여 수확하였고, 펠렛을 12.5 mL 0.85 M NaCl에 재현탁하였고, 상온에서 2279 x g로 원심분리하였다. 펠렛을 1 mL 0.85 M NaCl에 재현탁하였고, 재현탁된 세포를 2.0 mL 튜브로 옮겼고, 16,100 x g로 펠렛화하였다. 상층액을 제거하였고 펠렛을 일주일 이내에 효소 검정에 사용되면 -20 ℃, 또는 더 장기간 저장을 위해 -80 ℃에 저장하였다.
2.5 OD 유닛에 해당하는 세포 펠렛의 SDS-PAGE 분석을 위해, 세포를 100 dH2O에 재현탁하였고, 100 μL 0.2 M NaOH를 추가하였다. 샘플을 상온에서 5분 동안 배양하였고, 세포를 16,100 x g로 펠렛화하였고 100 μL SDS 샘플로 버퍼 (Bio-Rad Laboratories)에 재현탁하였다. 샘플을 95 ℃에서 5분 동안 가열하였고 세포를 간결한 원심분리로 펠렛화하였다. 1 내지 5 μL의 상층액을 제조사의 지시에 따라 Criterion 8-16% Pre-Cast Gel (Bio-Rad Laboratories) 상에서 분석하였다. 밴드를 InstantBlue™ Coomassie-Based Staining Solution (Expedeon Protein Solutions, San Diego, CA, USA)을 사용하여 시각화하였다.
실시예 2K: 생성물 분석을 위한 변형된 효모 균주의 셰이크 플라스크 성장 과정
균주를 Ura 선택 플레이트 상에 단일 콜로니에 대하여 스트리킹하였고 30 ℃에서 1-2일 동안 배양하였다. 시드 배양물을 Ura 선택 플레이트로부터 1-2개의 콜로니로 접종된 50 mL CNB1 셰이크 플라스크 배지를 함유하는 250 ml 배플 플라스크에서 제조하였다. 시드 배양물을 30 ℃에서 약 18시간 동안 200 rpm으로 흔들면서 키웠다. 배양물의 작은 앨리쿼트를 4-6의 OD600에 도달할 때까지 OD600를 측정하기 위해 회수하였다. 존재하는 잔여 글루코스를 Uristix® Reagent Strip (Bayer, Elkhart, IN, USA)를 사용하여 측정하였다. OD600=0.2로 50 mL CNB1 셰이크 플라스크 배지를 함유하는 125 ml 배플 플라스크를 접종하기 위해 시드 플라스크 배양을 사용하였다. 배양물을 30 ℃에서 140 rpm으로 20시간 동안 흔들면서 배양하였다. 브로스의 샘플을 하기 설명된 바와 같이 분석하기 위해 제거하였다. 배양물의 최적의 밀도 (OD)를 측정하기 위해 샘플의 앨리쿼트를 사용하였고 존재하는 잔여 글루코스를 Uristix® Reagent Strip을 사용하여 측정하였다. 샘플의 나머지를 원심분리하였고 상층액을 생성물 분석에 사용하였다.
실시예 2L: 생성물 분석을 위해 변형된 효모 균주의 발효 방법
여기에 설명된 균주를 시드 증식 단계를 사용한 후 이어서 2 L 바이오리액터 (Applikon, Foster City, CA, USA)에서 단일 단계 발효를 사용하여 배양하였다.
시드 단계 제조를 위해 25 mL의 1X DM2 배지 (KOH로 원하는 pH로 조정됨)를 125 mL 배플 플라스크에 추가한 후, 이어서 멸균 루프를 사용하여 원하는 균주로 접종하였다. 배양물을 원하는 온도에서 하룻밤 동안, 예를 들어, 약 16시간 250rpm으로 흔들면서 키웠다. 배양물의 작은 앨리쿼트를 4-6의 OD600에 도달할 때까지 OD600를 측정하기 위해 약 한 시간 간격으로 회수하였다.
존재하는 잔여 글루코스를 Uristix® Reagent Strip (Bayer, Elkhart, IN, USA)을 사용하여 측정하였다. 12 mL의 배양물을 4 mL의 멸균 냉각된 75% 글리세롤에 추가하였고, 완전히 혼합하였고, 10분 동안 얼음 위에서 배양하였다. 배양물 및 글리세롤 혼합물을 재혼합하였고 1.0 mL을 10개의 멸균 1.8 mL 냉동 바이알 (Thermo Scientific, Rochester, NY, USA) 각각에 앨리쿼트하였고 -80 ℃에서 저장하였다.
1.5 L의 DM2 배지를 함유하는 2 L 바이오리액터를 접종하기 위해 25 mL의 시드 플라스크 배양을 사용하였다. 바이오리액터에서 발효를 약 30 ℃ - 40 ℃의 온도에서 수행하였으며, 약 2.0-7.0의 범위에서 및 2-45 mmol/L/hr의 범위의 산소 흡수율 (OUR)로 이어지는 교반 및 에어레이션 (aeration) 조건 하에 pH를 조절하였다. 여기에 제공된 실시예에서, 바이오리액터에서 배양을 위한 온도, pH 및 OUR은 각각 30 ℃, 4.0 및 25-30이었다.
발효 브로스의 샘플을 분석을 위해 정기적으로 제거하였다. 간단히 말하면, 샘플의 앨리쿼트를 배양물의 최적의 밀도 (OD), 글루코스 농도 및 pH를 측정하기 위해 사용하였다. 샘플의 나머지를 원심분리하였다. 펠렛을 효소 검정을 위해 -80 ℃에서 저장하였고, 상층액을 3-HP 및 다른 세포 외 화합물의 분석을 위해 사용하였다. 여기에 보고된 모든 3-HP 생성값은 달리 명시되지 않으면 발효의 48시간 시점의 것이다. 바이오리액터로부터 배출된 가스 중 이산화탄소 함량 및 산소 함량을 결정함으로써 발효 중 이산화탄소 생산 및 산소 소비를 측정하였다.
실시예 2M: 변형된 효모 균주에 의해 생산된 3- HP 및 β-알라닌의 분석 방법
배양물 샘플을 1% 포름산으로 10X 희석에 의해 산성화하였고 0.46 μm 96-웰 여과 플레이트를 통해 여과하였다. 샘플의 분해 물질 농도에 기초하여 물로 추가의 희석을 수행하였다. 추가의 10X 희석을 1 mM NH4Ac, 0.1% NH3 및 5 mg/L의 13C 일괄적으로 표지된 3-HP (3-HP에 대한 내부 표준으로서), 또는 1% 포름산 및 3 mg/L의 13C 일률적으로 표지된 β-알라닌 (β-알라닌에 대한 내부 표준으로서)의 샘플 버퍼로 수행하였다. 총 희석 인자는 약 100 내지 1000이었고, β-알라닌 또는 3-HP의 농도에 기초하여 사용하였다.
2 μL 샘플을 표 6에 나열된 장치 설정 및 컬럼을 사용하여 Agilent 6410 Triple Quad MS/MS 검출기를 갖는 MassHunter 프로그램에 의해 조절된 Agilent 1200 HPLC (Agilent)로 주사하였다. 이온 단편 피크 영역의 정량의 그것의 안정한 동위원소 대응물에 대한 비율을 이온 억제 효과를 제거하기 위한 정량 및 장치 드리프팅 (drifting)에 사용하였다. 표준 편차는 매일 검정에서 5% 이하였다.
표 6: β-알라닌 및 3-HP 분석을 위한 LC/MS/MS 설정
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실시예 3: 3- HP 발효 경로 유전자를 발현하는 변형된 효모 균주
효모 숙주 세포에서, 다양한 3-HP 발효 경로에 수반되는 효소를, 단독으로 또는 조합으로, 암호화하는 하나 이상의 유전자가 발현될 수 있다. 3-HP 경로 효소는 외인성 유전자, 내인성 유전자, 또는 이들의 일부 조합으로부터 발현될 수도 있다. 발현되는 외인성 유전자는 유전자 발현 구조물, 예를 들어, 실시예 2에 설명된 발현 구조물을 사용하여 효모 세포로 도입될 수도 있다. 외인성 유전자는 단일 부위에 또는 다수의 위치에서 숙주 효모 게놈으로 통합될 수도 있고, 외인성 유전자의 통합은 하기 설명된 바와 같이 삽입 부위의 표적 유전자의 삭제 또는 붕괴와 결합될 수도 있다.
실시예 3A: 아스파르테이트 / 말로네이트 세미알데히드 경로 유전자를 발현하는 변형된 효모 균주
PEP 및/또는 피루베이트, OAA, 아스파르테이트, β-알라닌, 및 말로네이트 세미알데히드 중간물을 이용하는 경로를 통해 3-HP를 생산하는 효모 세포는 경로에 수반된 하나 이상의 효소를 발현함으로써 설계될 수 있다. 발현된 유전자는 PPC, PYC, AAT, ADC, BAAT, gabT, 3-HPDH (말로네이트 세미알데히드 리덕타제 포함), HIBADH, 또는 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자 중 하나 이상을 포함할 수도 있다.
발현된 유전자는 숙주 세포에 네이티브한 유전자로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 효모 숙주 세포가 아이. 오리엔탈리스인 경우, 발현된 유전자는 아이. 오리엔탈리스 PYC (예를 들어, SEQ ID NO: 2에 아미노산 서열을 암호화하는 및/또는 SEQ ID NO: 1에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는 아이. 오리엔탈리스 PYC 유전자), AAT (예를 들어, SEQ ID NO: 14에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 및/또는 SEQ ID NO: 13에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는 아이. 오리엔탈리스 AAT 유전자), BAAT (예를 들어, SEQ ID NO: 20에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 및/또는 SEQ ID NO: 19에 설명된 뉴클레오티드의 암호화 영역을 포함하는 아이. 오리엔탈리스 pyd4 상동체 유전자), 또는 3-HPDH (예를 들어, SEQ ID NO: 26에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 및/또는 SEQ ID NO: 25에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는 YMR226C 유전자에 대한 아이. 오리엔탈리스 상동체) 유전자로부터 유도될 수도 있다. 효모 숙주 세포가 또 다른 3-HP 내성 효모 균주인 경우, 유전자 서열은 업계에 알려진 기술을 사용하여 얻어질 수 있고 경로 유전자에 대하여 네이티브 상동체는 외인성으로 또는 외인성 조절 요소와 결합하여 발현될 수 있다. 네이티브 경로 유전자는 하나 이상의 PPC, PYC, AAT, BAAT, 및/또는 3-HPDH 유전자를 포함할 수도 있다.
대안으로, 발현된 3-HP 유전자 중 하나 이상은 숙주 세포에 비-네이티브인 근원 유전자로부터 유도될 수도 있다. 예를 들어, 효모 숙주 세포가 아이. 오리엔탈리스인 경우, 세포는 하나 이상의 비-네이티브 PYC 유전자, 예를 들어, SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 암호화하는 알. 스패로이데스 PYC 유전자, SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 암호화하는 알. 에틀리 PYC 유전자, SEQ ID NO: 5 또는 6의 아미노산 서열을 암호화하는 피. 플루오레센스 PYC 유전자, SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 암호화하는 씨. 글루타미쿰 PYC 유전자, SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 암호화하는 씨. 글루타미쿰 PYC 유전자, 또는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 멜리로티 PYC 유전자; 하나 이상의 비-네이티브 PPC 유전자, 예를 들어, SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 암호화하는 이. 콜리 PPC 유전자, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 암호화하는 엠. 써모아우토트로피쿰 PPC 유전자, 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 암호화하는 씨. 페르프링겐스 PPC 유전자; 하나 이상의 비-네이티브 AAT 유전자, 예를 들어, SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 암호화하는 이. 콜리 aspC 유전자 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 세레비시애 AAT2 유전자; 하나 이상의 비-네이티브 ADC 유전자, 예를 들어, SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 암호화하는 (및/또는 SEQ ID NO: 130, 145, 146, 또는 147에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는) 에스. 아베르미틸리스 panD 유전자, SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 암호화하는 (및/또는 SEQ ID NO: 131에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는) 씨. 아세토부틸리쿰 panD 유전자, SEQ ID NO: 133의 아미노산 서열을 암호화하는 (및/또는 SEQ ID NO: 132에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는) 에이치. 필로리 ADC 유전자, SEQ ID NO: 135의 아미노산 서열을 암호화하는 (및/또는 SEQ ID NO: 134에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는) 바실루스 종 TS25 ADC 유전자, SEQ ID NO: 137의 아미노산 서열을 암호화하는 (및/또는 SEQ ID NO: 136에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는) 씨. 글루타미쿰 ADC 유전자, 또는 SEQ ID NO: 139의 아미노산 서열을 암호화하는 (및/또는 SEQ ID NO: 138, 148, 149, 150, 또는 151 중 어느 하나에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는) 비. 리체니포르미스 ADC 유전자; 하나 이상의 비-네이티브 BAAT 또는 gabT 유전자, 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 암호화하는 (및/또는 SEQ ID NO: 142에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는) 에스. 클루이베리 pyd4 유전자, SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 암호화하는 (및/또는 SEQ ID NO: 140에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는) 에스. 아베르미틸리스 BAAT 유전자, SEQ ID NO: 23에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에스. 아베르미틸리스 gabT 유전자, 또는 SEQ ID NO: 24에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 (및/또는 SEQ ID NO: 141에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는) 에스. 세레비시애 UGA1 유전자; 하나 이상의 비-네이티브 3-HPDH 유전자, 예를 들어, SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 암호화하는 (및/또는 SEQ ID NO: 143에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는) 이. 콜리 ydfG 유전자 또는 SEQ ID NO: 129의 아미노산 서열을 암호화하는 (및/또는 SEQ ID NO: 144에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는) 에스. 세레비시애 YMR226C 유전자; 하나 이상의 비-네이티브 말로네이트 세미알데히드 리덕타제 유전자, 예를 들어, SEQ ID NO: 29에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 (및/또는 SEQ ID NO: 343에 설명된 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역을 포함하는) 엠. 세둘라 말로네이트 세미알데히드 리덕타제 유전자; 하나 이상의 비-네이티브 HIBADH 유전자, 예를 들어, SEQ ID NO: 28에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 에이. 패칼리스 M3A 유전자, 각각 SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 31에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 피. 푸티다 KT2440 또는 E23440 mmsB 유전자, 또는 SEQ ID NO: 32에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 피. 애루기노사 PAO1 mmsB 유전자; 및/또는 하나 이상의 비-네이티브 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자, 예를 들어, SEQ ID NO: 33에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 알. 유트로파 H16 4hbd 유전자 또는 SEQ ID NO: 34에 설명된 아미노산 서열을 암호화하는 씨. 클루이베리 DSM 555 hbd 유전자를 발현하도록 설계될 수도 있다.
실시예 3A-0: 아스파르테이트 / 말로네이트 세미알데히드 경로 유전자를 발현하는 변형된 효모 균주에 대한 효모 활성 검정
효소 검정을 위한 크루드 ( crude ) 무세포 추출물의 제조:
여기에서 셰이크 플라스크 또는 바이오리액터 배양물의 지시된 세포를 상기 설명된 바와 같이, 원심분리, 제거된 상층액, 및 -80 ℃에 저장된 세포 펠렛에 의해 수거하였다. CFE의 제조를 위해, 세포 펠렛을 녹였고, 포스페이트-완충된 식염수 (PBS)로 세척하였고 다시 원심분리에 의해 수거하였다. 상층액을 제거하였고 세포 펠렛을 2.0 mL 미세원심분리 튜브에서 1% 프로테아제 억제제 칵테일 (Sigma의 P8215)을 함유하는, 대략 동등한 양의 용해 버퍼에 재현탁하였다. 약 300 μL의 0.5 mM 지르코니아 비드 (BioSpec)를 추가하였고, 세포 용해를 FastPrep®-24 붕괴기 (MP Biomedicals)에서 3라운드 동안 6/20 초 설정으로 수행하였다. 샘플 튜브를 각 라운드 사이에 5분 동안 얼음 위에서 냉각하였다. 용해 후, 샘플을 4 ℃에서 15분 동안 미세 원심분리기의 최대 속도로 원심분리하였다. 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮겼고 얼음 위에 보관하였다. 제조사에 의해 제공된 지시에 따라 Bio-Rad 단백질 검정 시약 (Brad d Assay) 및 표준으로서 소 혈청 알부민을 사용하여 용해물의 총 단백질 농도를 결정하였다.
피루베이트 카르복실라제 ( PYC ) 활성:
여기에서 지시된 세포의 CFE에서 피루베이트 카르복실라제 활성을 다음과 같이 결정하였다. 검정 반응 혼합물에서 CFE와 결합될 때, 다음 최종 농도의 성분을 제공하는 스톡 반응 혼합 용액을 제조하였다: 트리스 (pH 8.0), 100 mM; NaHCO3, 10 mM; MgCl2, 5 mM; NADH, 0.2 mM; ATP, 1 mM; 아세틸 CoA, 1 mM; 피루베이트, 1 mM; 비오틴 (검정되는 PYC 효소에 필요하면), 5 μM; 소 심장 말레이트 데히드로게나제, 0.02 유닛/mL. 이 용액의 270 μL를 96-웰 미세역가 플레이트의 웰에 추가하였고 30 μL의 적절히 희석된 CFE를 반응을 시작하기 위해 추가하였다. NADH의 소모를 SpectraMax 340 PC 플레이트 리더를 사용하여 340 nm에서 관찰하였다. 피루베이트 카르복실라제 활성은 나노몰 소모된 NADH/초/mg 단백질로서 표현된다.
포스포에놀피루베이트 카르복실라제 ( PPC ) 활성:
CFE에서 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 (PPC) 활성을 다음과 같이 결정할 수도 있다. 검정 반응 혼합물에서 CFE와 결합될 때, 다음 최종 농도의 성분을 제공하는 스톡 반응 혼합 용액을 제조하였다: 트리스 (pH 8.0), 100 mM; NaHCO3, 10 mM; MgCl2, 5 mM; NADH, 0.1 mM; 아세틸 CoA, 0.5 mM; 포스포에놀피루베이트, 3.3 mM; 소 심장 (또는 돼지 심장) 말레이트 데히드로게나제, 0.02 유닛/mL. 이 혼합물의 270 μL를 96-웰 미세역가 플레이트의 웰에 추가하였고 30 μL의 적절히 희석된 CFE를 반응을 시작하기 위해 추가하였다. NADH의 소모는 SpectraMax 340 PC 플레이트 리더를 사용하여 340 nm에서 관찰된다.
아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 ( AAT ) 활성:
여기에서 지시된 세포의 CFE에서 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 활성을 다음과 같이 결정하였다. 검정 반응 혼합물에서 CFE와 결합될 때, 다음 최종 농도의 성분을 제공하는 스톡 반응 혼합 용액을 제조하였다: 100 mM 트리스 (pH 8.0), 100 mM; NaHCO3, 10 mM; MgCl2, 5 mM; NADH, 0.1 mM; 아스파르테이트, 1mM; α-케토글루타레이트, 1 mM; 및 말레이트 데히드로게나제, 0.02 유닛/mL. 일부 검정에서, 스톡 반응 혼합물은 또한 피리독살 5'-포스페이트 (0.1 mM)를 함유하였다. 이 용액의 270 μL를 96-웰 미세역가 플레이트의 웰에 추가하였고 30 μL의 적절히 희석된 CFE를 반응을 시작하기 위해 추가하였다. NADH의 소모를 SpectraMax 340 PC 플레이트 리더를 사용하여 340 nm에서 관찰하였다. 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 활성은 nmol 소모된 NADH/초/mg 단백질로서 표현된다.
아스파르테이트 데카르복실라제 ( ADC ) 활성:
여기에서 지시된 세포의 CFE에서 아스파르테이트 데카르복실라제 활성을 다음과 같이 결정하였다. 165 μL의 100 mM NH4Ac 버퍼 (pH 6.8), 및 25 μL의 80 mM 아스파르테이트를 37 ℃로 온도 조절되는 96-웰 미세역가 플레이트의 각각의 웰에 추가하였다. 반응을 10 μL의의 CFE를 추가함으로써 개시하였다. 다른 시간 간격 (5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 60분)으로, 샘플의 20 μL를 반응 혼합물로부터 회수하였고 퀸칭 (quenching) 버퍼 (2% 포름산 플러스 내부 표준으로서 13C 표지된 β-알라닌 2mg/L)의 180 μL에 추가하였다. 여과 후, 샘플에서 β-알라닌을 LC/MS/MS로 분석하였다. 기울기를 β-알라닌 대 시간 플롯으로부터 얻었다. 기울기를 반응물의 총 세포 단백질 농도로 나눔으로써 활성을 계산하였다. ADC 활성은 μmol 형성된 β-알라닌/초/g 단백질로서 표현된다.
변형된 ADC 검정을 일부 실험에서 사용하였다. 이들 경우에, 여기에서 지시된 세포의 CFE에서 ADC 활성을 다음과 같이 결정하였다. 110 μL의 100 mM NH4Ac 버퍼 (pH 7.6), 및 80 μL의 25 mM 아스파르테이트 (NaOH로 중화한 후)를 40 ℃로 온도 조절된 96-웰 미세역가 플레이트의 각 웰에 추가하였다. 10 μL의 CFE를 추가함으로써 반응을 개시하였다. 다른 시간 간격 (2, 4, 6, 8, 10분)으로, 샘플의 20 μL를 반응 혼합물로부터 회수하였고 퀸칭 버퍼 (2% 포름산 플러스 내부 표준으로서 13C로 표지되거나 2% 포름산에서 퀸치되고 20% 메탄올/80% 물과 내부 표준으로서 2mg/L 13C 표지된 β-알라닌을 1:10으로 옮긴다)의 180 μL에 추가하였다. 여과 후, 샘플에서 β-알라닌을 LC/MS/MS로 분석하였다. 기울기를 β-알라닌 대 시간 플롯으로부터 얻었다. 기울기를 반응물의 총 세포 단백질 농도로 나눔으로써 활성을 계산하였다. ADC 활성은 μmol 형성된 β-알라닌/초/g 단백질로서 표현된다.
β-알라닌 아미노트랜스퍼라제 ( BAAT ) 활성:
CFE에서 β-알라닌 아미노트랜스퍼라제 (BAAT) 활성을 다음과 같이 결정하였다. 100 mM의 NH4HCO3 (pH 7.6), 8 mM α-케토글루타레이트, 0.5 mM 아세틸-CoA, 0.1 mM 피리독살-5'-포스페이트, 및 200 mM β-알라닌을 함유하는 190 μL의 반응 혼합물을 상온에서 96 웰 미세역가 플레이트에 추가하였다. 10 μL의 CFE를 추가함으로써 반응을 개시하였다. 샘플 20 μL 각각 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 및 20분에 채취하였고 퀸칭 버퍼 (2.5% 포름산) 75 μL에 추가하였다. 샘플을 중화하였고 5 μL 10 M NaOH 및 50 μL 100 mM NaCO3 (pH 10)를 추가함으로써 pH를 조절하였다. 여과된 샘플을 주사시, OPA (o-프탈디알데히드) 시약, 10 mg/mL (Agilent Technologies 5061-3335)과 혼합함으로써 유도하였다. OPA로 유도된 글루타메이트 를 형광 발광 검출에 의해 HPLC 분리 후 정량하였다 (340 nm에서 들뜸; 460 nm에서 방출). 15 μL의 샘플을 5 μL 패킹 (Phenomonex 150 x 4.6 mm)과 함께 분석적 역상 제미니 C18 컬럼 (Gemini C18 column)으로 주사하였다. 컬럼을 62.5% 20 mM 포스페이트 버퍼 (pH 7.8) (A) 및 37.5% 메탄올 (B)로 평형화하였다. 선형 구배는 다음과 같다: 40% B로 램프, 0-0.3분; 40% B, 0.3-1분; 85% B로 램프, 1-1.75분; 85% B, 1.75-2.25분; 37.5%로 램프, 2.25-3분; 37.5% B, 3-4분. 유속은 2 mL/분이었다. 반응 버퍼에서 글루타메이트의 표준 곡선을 샘플의 농도를 결정하기 위해 사용하였다. 기울기를 [글루타메이트] 대 시간 플롯으로부터 얻었다. 기울기를 반응물의 총 세포 단백질 농도로 나눔으로써 활성을 계산하였다.
3- HP 데히드로게나제 (3- HPDH ) 활성:
여기에서 지시된 세포의 CFE에서 3-HP 데히드로게나제 활성을 다음과 같이 결정하였다. 100 mM NH4HCO3 (pH 7.6) 및 NADPH에서 희석 (전형적으로 100X 희석)된 CFE의 190 μL를 37 ℃로 온도 조절된 6-웰 미세역가 플레이트의 각 웰에 추가하였다. 60mM 말로네이트 세미알데히드 (MSA, 10 mM H2SO4 중의 200 mM MSA 스톡 용액으로부터 10 mM H2SO4로 새롭게 제조됨) 10 μL를 추가함으로써 반응을 개시하였다. 20 μL의 샘플을 각각 1, 2, 4, 6, 8, 10, 및 12분에 채취하였고, 끓는 물 80 μL에서 퀸치하였다. 냉각 후, 퀸치된 혼합물 75 μL를 2 mM NH4Ac (pH 6.8) 및 3 mg/L의 13C 표지된 3-HP를 함유하는 버퍼 75 μL와 혼합하였다. 여과 후, 샘플의 3-HP를 LC/MS/MS로 정량하였다. 기울기를 3-HP 대 시간 플롯으로부터 얻었다. 기울기를 반응물의 총 세포 단백질 농도로 나눔으로써 활성을 계산하였다. 3-HP 데히드로게나제 활성은 nmol 형성된 NADPH/초/mg 단백질로서 표현된다.
변형된 3-HPDH 검정을 일부 실험에 사용하였다. 이들 경우에서, 여기에서 지시된 세포의 CFE에서 3-HPDH 활성을 다음과 같이 결정하였다. 340 nm에서 시간의 흐름에 따른 말로네이트 세미-알데히드 감소를 다음 NADPH의 소실로 측정하였다. 말로네이트 세미-알데히드를 Yamada 및 Jacoby에 의해 개발된 프로토콜에 따라 내부에서 합성하였다 (Yamada, E.W., Jacoby, W.B., 1960, Direct conversion of malonic semialdegyde to acetyl-coenzyme A, Journal of Biological Chemistry, Volume 235, Number 3, pp. 589-594). 검정을 96 웰 미크로플레이트에서 수행하였고, 최종부피는 200 μL였다. 반응을 CCE 30 μL를 검정 버퍼 (2 mM 말로네이트 세미-알데히드, 100 mM 트리스 pH 8.0 및 0.5 mM NADPH) 170 μL에 추가함으로써 시작하였다. 340 nm에서 흡수율은 상온 (~25 ℃)에서 10분 동안 미크로 플레이트 리더 (Spectra Max 340PC, Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA)에서 선행되었다. 한 유닛의 3-HPDH 활성은 말로네이트 세미-알데히드의 존재시 1분에 NADPH의 1 μmol을 산화하기 위해 필요한 효소의 양으로 정의된다.
실시예 3A-1: adh1202 위치에서 아스파르테이트 데카르복실라제 ( ADC )를 발현하는 삽입 벡터
여러 아스파르테이트 데카르복실라제 유전자를 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화하였고 GeneArt® (Burlingame, CA, USA)로 합성하였으며, 표 7에 나열된 플라스미드를 발생시킨다. 합성 유전자는 벡터 pMA-T에 도착하고 XbaI 및 PacI 제한 분해를 통해 벡터로부터 유도될 수 있다. 제한 단편을 PDC 프로모터 및 종결자에 의해 조절되는 유전자를 배치하고, 통합이 아이. 오리엔탈리스 adh1202 위치에서 발생하는 것을 허용하는 pMlBa107의 같은 부위에 클로닝할 수 있다.
표 7: 형질전환체 구성
Figure pct00015
플라스미드 1045172, 105387, 105388, 105389, 105390, 및 105391을 XbaI 및 PacI로 분해하였고 TBE 버퍼를 사용하여 1.3% 아가로스 겔 상에서 실행하였다. ADC (panD) 유전자에 해당하는 각각의 분해로부터 400-500 bp의 단편을 겔에서 잘라냈고 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 아가로스로부터 추출하였다.
플라스미드 pMlBa107를 XbaI 및 PacI로 분해하였고, 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고 TBE 버퍼 중의 아가로스 겔 전기영동 후 벡터 밴드를 정제하였다. XbaI 및 PacI 분해된 panD 단편을 제조사의 지시에 따라 T4 DNA 리가제 및 QUICK Ligation Kit (New England Biolabs)를 사용하여 이 정제된 pMlBa107 벡터에 결찰하였다. 결찰 생성물을 제조사의 지시에 따라 XL10-GOLD ULTRA 세포 (Agilent Technologies)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+ amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 각각의 반응으로부터 24개의 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에서 골랐다. 결과의 형질전환체 중 네 개 각각의 미니-프렙 DNA를 ApaI, NcoI 및 SacI 분해로 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 표 7에 나타난 바와 같이 지정하였다. 결과의 플라스미드는 adh1202 위치에서 각 ADC 유전자의 정방향으로 향하는 발현 카세트와 통합을 허용한다.
각 통합 구조물 중 약 10 μg씩을 ApaI 및 KpnI로 분해하였고 89 mM 염기성 트리스-89 mM 붕산-2 mM 이나트륨 EDTA (TBE) 버퍼를 사용하여 1% 아가로스 겔 상에서 실행하였다. 각 플라스미드에 대하여 약 4450 bp의 단편을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAquick gel extraction kit (Qiagen)을 사용하여 추출하였다. 정제된 생성물의 농도는 39-138 ng/μl인 것으로 발견되었다. 통합 구조물 (ApaI 및 Kpn I로 분해됨)의 단편의 0.39-1.4 μg을 상기 설명된 바와 같이 아이. 오리엔탈리스 CNB1에 형질전환하였다. 형질전환체를 ura 선택 배지에 도말하였고 37 ℃에서 배양하였고, ura 선택 배지에서 재-스트리킹하였고, 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 게놈 DNA를 URA3+ 콜로니로부터 제조하였고 통합을 확인하기 위해 PCR로 체크하였다. 프라이머 0611718 및 0611632를 통합을 확인하기 위해 2.5 kbp 단편을 증폭하는데 사용하였다. 각각의 PCR 반응물은 25 μL의 최종 부피 중에 2.5 μL의 게놈 DNA, 각각 12.5 pM의 프라이머 0611718 및 0611632, 1X Crimson Taq™ 반응 버퍼 (New England Biolabs), 0.2 mM dNTP 혼합물, 0.625 유닛 Crimson Taq™ DNA 폴리머라제 (New England Biolabs)를 함유하였다. 증폭 반응물을 95 ℃에서 30초 동안 1 사이클; 각각 95 ℃에서 30초 동안, 50 ℃에서 30초 동안, 및 68 ℃에서 3분 동안 30 사이클; 및 68 ℃에서 10분 동안 1 사이클로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)에서 배양하였다.
각각의 구조물에 대하여 2개의 URA3+ 확인된 형질전환체를 표 7에 나타난 바와 같이 지정하였다. 이들 균주는 adh1202에서 지시된 ADC 유전자에 대한 이형 접합체 (heterozygous)이며, 발현은 아이. 오리엔탈리스의 PDC 프로모터 및 종결자에 의해 구동된다.
표 7에 나열된 균주 (및 음성 대조군으로서 균주 MBin500, 상기)의 PanD 발현 및 효소 활성을 테스트하였다. 각 균주의 하룻밤 동안의 배양물을 YPD에서 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였고, 37 ℃에서 125 mL 배플 플라스크 중의 신선한 YPD 25 mL에 1:50으로 희석하였고, OD600 ~2-8로 성장시켰다. 세포 펠렛을 CFE를 제조하기 위해 사용하였으며, 이것을 상기 설명된 바와 같이 ADC 활성에 대하여 검정하였다. 대표적인 결과는 표 8에 나타난다.
표 8: 형질전환체 효소 활성 데이터
Figure pct00016
다음으로, yWTY5-17 및 yWTY7-25의 동형 접합체 버젼을 생성하였다. 먼저, ura-유도체 yWTY5-17 및 yWTY7-25를 상기 설명된 바와 같이 분리하였다. 게놈 DNA를 FOA-저항성 콜로니로부터 제조하였고 URA3 선택 가능한 마커의 손실을 확인하기 위해 상기 설명된 바와 같이 PCR로 체크하였다. 프라이머 0611718 및 0611632를 존재하는 ura 마커 및 ura 마커의 부재시 1100 bp 단편과 통합하는 2.4 kbp 단편을 증폭하기 위해 사용하였다. 프라이머 0611718 및 0611632를 갖는 1100 bp의 PCR 단편을 수득하는 yWTY5-17 및 yWTY7-25의 Ura-균주를 각각 MlBa331 및 MlBa332로 지정하였다.
pWTY10-0033-5 및 pWTY10-0033-7의 각각 10 μg을 ApaI, KpnI, 및 NcoI로 분해하였고 89 mM 염기성 트리스-89 mM 붕산-2 mM 이나트륨 EDTA (TBE) 버퍼를 사용하여 1% 아가로스 겔 상에서 수행하였다. 각 플라스미드에 대한 약 4450 bp의 단편을 겔에서 잘라냈고 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 추출하였다. pWTY10-0033-5 및 pWTY10-0033-7로부터 정제된 단편을 상기 설명된 바와 같이 각각 MlBa331 및 MlBa332에 형질전환하였다. 형질전환체를 ura 선택 배지에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였고, ura 선택 배지에 재-스트리킹하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 게놈 DNA를 제조하였고 Crimson Taq™ PCR을 상기 설명된 바와 같이 통합을 확인하기 위해 실행하였다. 프라이머 0611718 및 0611632는 존재하는 ura 마커와 통합하는 2.4 kbp 단편을 증폭하고, ura 마커의 부재시 1100 bp 단편을 증폭한다. 프라이머 0611718 및 0611632를 갖는 1100 bp 및 2.4 kbp의 단편을 수득하는 MlBa331 및 MlBa332의 형질전환체를 저장하였고 각각 MlBa338 및 MlBa337로 지정하였다. MlBa337은 adh1202 위치에서 에스. 아베르미틸리스의 ADC 유전자에 대한 동형 접합체이고 MlBa338은 adh1202 위치에서 비. 리체니포르미스의 ADC 유전자에 대한 동형 접합체이다. 균주 둘 다는 아이. 오리엔탈리스의 PDC 프로모터 및 종결자에 의한, 각각의 ADC 유전자의 조절을 갖는다.
panD 동형 접합체 균주 MlBa337 및 MlBa338의 ADC 발현 및 효소 활성을 이형 접합체 panD 균주 yWTY5-17 및 yWTY7-25와 비교하였다. 배양물을 YPD에서 37 ℃에서 하룻밤 동안 성장시켰고, 37 ℃에서 125 mL 배플 플라스크 중의 신선한 YPD 25 mL에 1:50으로 희석하였고, OD600 ~2-8로 성장시켰다. 세포 펠렛을 CFE를 제조하기 위해 사용하였으며, 이것을 상기 설명된 바와 같이 ADC 활성에 대하여 검정하였다. 대표적인 결과는 표 9A에 나타난다.
표 9A: 형질전환체 효소 활성 데이터
Figure pct00017
균주 MlBa337 및 MlBa338로부터 제조된 CFE에서 ADC 활성과 비교할 세 번째 독립적인 실험의 결과는 표 9B에 나타난다.
표 9B: 형질전환체 효소 활성 데이터
Figure pct00018
상기 샘플의 SDS-PAGE 분석은 MlBa338의 panD 발현이 이들 균주 중에 가장 높다는 것을 나타냈다.
여기에 설명된 방법을 사용하여, 균주 MBin500, MlBa337 및 MlBa338을 3-HP 생산에 대하여 바이오리액터로 평가하였다. 대조군 균주 MBin500은 검출 가능한 3-HP를 생산하지 않았다 (2개의 독립적 발효의 평균). 균주 MlBa337은 1.33 g/L 3-HP를 생산하였고 (하나의 발효가 수행됨) 균주 MlBa338은 3.15 g/L 3-HP를 생산하였다 (3개의 독립적 발효의 평균). 균주 MlBa337 및 MlBa338의 개개의 발효를 추가로 그것들의 3-HP 생산 능력 및 ADC 활성에 관하여 비교하였다 (표 10). 이들 발효에서 세포 질량의 차이를 설명하기 위해, 3-HP 생산 능력은 표 10에서 세포 질량의 유닛 당 3-HP 농도 ([g/L 3-HP]/[g/L 건조 세포 중량]으로 표현됨)로 보고된다. 결과는 바실루스 리체니포르미스 panD 유전자 (균주 MlBa338) 대 스트렙토미세스 아베르미틸리스 panD 유전자 (균주 MlBa337)를 사용할 때, 개선된 ADC 활성 및 3-HP 생산 능력을 나타낸다.
표 10: 균주 MlBa337 및 MlBa338에서 3-HP 생산 능력 및 ADC 활성으로 통합
Figure pct00019
실시예 3A-2: adh1202 위치에서 β-알라닌 아미노트랜스퍼라제 ( BAAT ) 또는 3-히 드록시프로피온 산 데히드로게나제 (3- HPDH )를 발현하는 삽입 벡터
에스. 아베르미틸리스의 BAAT, 에스. 세레비시애의 UGA1, 에스. 클루이베리의 PYD4, 에스. 세레비시애의 YMR226c, 및 이. 콜리의 ydfG의 아이. 오리엔탈리스 코돈 최적화된 버젼을 GeneArt로 합성하였으며, 하기 나열된 플라스미드를 생성한다. 합성 유전자는 벡터 pMA-T에 도달하였고 XbaI 및 PacI를 사용하는 분해를 통해 벡터로부터 유도될 수 있다. 분해된 단편은 pMlBa107의 같은 부위로 클로닝될 수 있으며, PDC 프로모터 및 종결자에 의해 조절되는 유전자를 두고 통합이 adh1202 위치에서 발생하는 것을 허용한다.
표 11: 형질전환체 구성
Figure pct00020
플라스미드 1054168, 1054169, 1054170, 1054171, 1054172, 및 1054173을 XbaI 및 PacI로 분해하였고 89 mM 염기성 트리스-89 mM 붕산-2 mM 이나트륨 EDTA (TBE) 버퍼를 사용하여 1% 아가로스 겔 상에서 실행하였다. 1045168의 761 (ydfG) bp, 1045169의 1430 (UGA1) bp, 1045170의 1370 (BAAT) bp, 1045171의 1442 (PYD4) bp, 또는 1045173의 814 (YMR226c) bp의 단편을 겔에서 잘라냈고 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 아가로스로부터 추출하였다. 플라스미드 pMlBa107을 XbaI 및 PacI로 분해한 후 이어서 CIP를 처리하였으며 7.9 kbp 선형 단편을 생성하였다. 분해물을 QIAQUICK® PCR Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. ydfG, UGA1, BAAT, PYD4, 또는 YMR226c의 분해된 단편을 여기에 설명된 바와 같이 T4 DNA 리가제를 사용하여 pMlBa107 (XbaI 및 PacI로 분해되고 CIP가 처리됨)로 결찰하였다. 결찰 생성물을 제조사의 지시에 따라 One Shot® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+ amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다수의 결과의 형질전환체를 XbaI 및 PacI로 분해에 의해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 ydfG, BAAT, UGA1, YMR226c, 또는 PYD4에 대하여 각각 pMlBa120, pMlBa121, pMlBa122, pMlBa123, 및 pMlBa124로 지정하였다. 결과의 플라스미드는 adh1202 위치에서 원하는 유전자의 정방향을 향하는 발현 카세트와 통합을 허용한다.
표 11의 통합 구조물을 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된 원하는 유전자를 PDC 프로모터 및 종결자에 의해 조절되는 adh1202 위치로 통합하기 위해 사용하였다. 발현 카세트는 또한 여기에 설명된 바와 같이 ura- 숙주 내에서 형질전환체의 선택을 허용하는, URA3 선택 가능한 마커를 함유한다. 발현 카세트 및 adh1202 상동 영역은 플라스미드의 단편의 방출을 허용하는, ApaI 및 KpnI 제한 부위에 의해 플랭크된다.
표 11의 통합 구조물의 각각 15 μg을 ApaI, KpnI, 및 NcoI로 분해하였고 89 mM 염기성 트리스-89 mM 붕산-2 mM 이나트륨 EDTA (TBE) 버퍼를 사용하여 1% 아가로스 겔 상에서 실행하였다. NcoI로 분해는 벡터 백본을 분해하고 아가로스 겔의 원하는 단편을 추출하는 것을 더 쉽게 만든다. pMlBa120, pMlBa121, pMlBa122, pMlBa123, 및 pMlBa124의 각각 4884 bp, 5493 bp, 5553 bp, 4937 bp, 및 5565 bp의 단편을 겔에서 잘라냈고 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 아가로스로부터 추출하였다. 정제된 생성물의 농도는 80-120 ng/μL인 것으로 발견되었다. pMlBa120-4의 제한 단편의 0.8-1.2 μg을 여기에 사용된 바와 같이 아이. 오리엔탈리스 CNB1 (ura-)에 형질전환하였다. 형질전환체를 ura 선택 배지에 도말하였고 상온에서 60시간 동안 키웠다. 형질전환체를 ura 선택 배지 상에 재-스트리킹하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
다수의 형질전환체 각각의 통합을 확인하기 위해 콜로니 PCR로 체크하였다. 올바른 통합을 통합의 5' 및 3' 말단을 체크하는 프라이머 쌍을 사용함으로써 확인하였고 하기 나열된다. 프라이머 0611717은 역방향으로 PDC 프로모터에서 어닐링하는 한편, 프라이머 0611225는 정방향으로 URA3 선택 가능한 마커에서 어닐링한다. 프라이머 0611631 및 0611632는 각각 정방향 및 역방향으로 통합의 부위의 외부에서 어닐링한다; 프라이머 0611717 및 0611631은 올바른 구성요소의 976 bp 단편을 증폭시킨다; 프라이머 0611225 및 0611632는 올바른 구성요소의 1.4 kbp 단편을 증폭시키고; 프라이머 0611631 및 0611632는 야생형 염색체를 나타내는 2.7 kbp 단편을 증폭시키고 통합을 위해 단편 ~5kbp를 증폭시킬 것이다. 게놈 DNA를 생성하기 위해, 각각의 형질전환체 중 하나의 콜로니를 37 ℃에서 30분 동안 TE 중의 0.05 U/μL 리티카제 (Sigma, St. Louis, MO, USA)의 50 μL에서 배양한 후 이어서 95 ℃에서 10분 동안 배양하였다. 통합을 확인하기 위해 여기에 설명된 바와 같이 PCR을 실행하였다. 0611717 및 0611631을 갖는 976 bp, 0611225 및 0611632를 갖는 1.4 kbp, 및 0611631 및 0611632를 갖는 2.7 kbp의 PCR 단편을 수득하는 각각의 이형 접합체 중 하나의 형질전환체를 저장하였고 표 11에 나타난 바와 같이 MlBa308, MlBa309, MlBa310, MlBa311, 및 MlBa312로 지정하였다.
형질전환체 MlBa308, MlBa309, MlBa310, MlBa311, 및 MlBa312의 배양물을 YPD에서 37 ℃에서 하룻밤 동안 키웠다. 배양물을 37 ℃에서 125 mL 배플 플라스크 중의 신선한 YPD 25 mL에 1:50으로 희석하였고, OD600 ~4-10으로 키웠다. 세포의 샘플을 여기에 설명된 방법을 사용하여 SDS-PAGE로 단백질 발현에 대하여 분석하였다. CFE를 또한 배양물의 세포 펠렛으로부터 제조하였고, 3P 데히드로게나제 활성을 CFE에서 여기에 설명된 방법을 사용하여 측정하였다. 균주 MlBa310 및 MlBa312로부터 각각 UGA1 및 PYD4의 발현을 유전자에 대하여 통합되지 않는 균주에 없는 ~53 KDa 밴드의 등장에 의해 SDS-PAGE로 검출하였다. MlBa309에서 BAAT의 발현은 이들 조건 하에 SDS-PAGE로 검출되지 않았다. 표 12A는 균주의 CFE에서 3-HP 데히드로게나제 (3-HPDH) 활성을 나타낸다.
표 12A: 형질전환체 효소 활성 데이터
Figure pct00021
개선된 검정 조건을 사용하는 독립적인 실험에서, 균주 MBin500 (대조군), MlBa310, MlBa309 및 MlBa312로부터 제조된 CFE에서 BAAT 활성을 비교하였다. 이 실험의 결과는 표 12B에 나타난다.
표 12B: 형질전환체 효소 활성 데이터
Figure pct00022
플라스미드 pMlBa120-4 (상기)는 다음과 같은 발현 카세트를 플랭크하는 NotI 제한 부위를 함유한다: PDC 프로모터, 원하는 유전자 (BAAT 또는 3-HPDH), PDC 종결자, 및 URA3 선택 마커. adh1202 위치에서 통합에 대한 상동성은 NotI 제한 부위의 밖에 있다. 이들 플라스미드 모두는 정방향으로 발현 카세트를 갖는다.
동형 접합체 통합 균주의 스크리닝의 용이함을 허용하기 위해 새로운 플라스미드를 역방향을 향하는 발현 카세트로 구성하였다. 플라스미드 pMlBa120-4를 NotI으로 분해하였고 89 mM 염기성 트리스-89 mM 붕산-2 mM 이나트륨 EDTA (TBE) 버퍼를 사용하여 1% 아가로스 겔 상에서 실행하였다. 3.5 kbp (pMlBa120), 4.2 kbp (pMlBa121), 4.2 kbp (pMlBa122), 3.5 kbp (pMlBa123), 및 4.2 kbp (pMlBa124)의 단편을 겔에서 잘라냈고 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 아가로스로부터 추출하였다. 이들 각각의 단편을 여기에 설명된 바와 같이 T4 DNA 리가제를 사용하여 5.2 kbp 선형 NotI/ura 없는 CIP 처리된 pHJJ76에 결찰하였다. 결찰 생성물을 제조사의 지시에 따라 One Shot® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+ amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 XbaI 및 KpnI 분해에 의해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 UGA1, YMR226c, PYD4, ydfG, 및 BAAT에 대하여 각각 pMlBa131, pMlBa132, pMlBa133, pMlBa134, 및 pMlBa135로 지정하였다. 결과의 플라스미드는 adh1202 위치에서 원하는 유전자의 통합을 허용하며, 발현 카세트는 역방향을 향한다.
MlBa308-12의 Ura-유도체를 여기에 설명된 바와 같이 분리하였다. MlBa308-12에 대한 다수의 FOA-저항성 콜로니는 YPD 플레이트에서 37 ℃에서 성장시킴으로써 두 번 정제된 콜로니였다. 게놈 DNA를 FOA-저항성 콜로니로부터 제조하였고 여기에 설명된 바와 같이 URA3 선택 가능한 마커의 손실을 확인하기 위해 PCR로 체크하였다. 프라이머 0611631 및 0611632는 각각 정방향 및 역방향을 향하는 통합의 부위의 외부에서 어닐링한다. 프라이머 0611718은 ura 선택 가능한 마커의 PDC 종결자 업스트림에서 어닐링한다; 프라이머 0611632 및 0611631은 야생형 염색체에 대한 2.7 kbp 단편을 증폭시키고; 프라이머 0611718 및 0611632는 존재하는 ura 마커 및 ura 마커의 부재시 1100 bp 단편 통합에 대한 2.4 kbp 단편을 증폭시킨다. 0611718 및 0611632를 갖는 1100 bp, 및 0611631 및 0611632를 갖는 2.7 kbp의 PCR 단편을 수득하는 MlBa308-12의 하나의 ura-균주를 저장하였고 MlBa314 (MlBa310의 ura-균주), MlBa315 (MlBa312의 ura-균주), MlBa316 (MlBa311의 ura-균주), MlBa326 (MlBa308의 ura-균주), 및 MlBA328 (MlBa309의 ura-균주)로 지정하였다.
pMlBa131, pMlBa132, pMlBa133, 및 pMlBa135의 각각 10-15 μg을 ApaI, KpnI, 및 NcoI으로 분해하였고 89 mM 염기성 트리스-89 mM 붕산-2 mM 이나트륨 EDTA (TBE) 버퍼를 사용하여 1% 아가로스 겔 상에서 실행하였다. NcoI으로 분해는 아가로스 겔로부터 원하는 단편의 추출을 가능하게 한다. pMlBa131-3, pMlBa135 각각 5553 bp, 4937 bp, 5565 bp, 5493 bp의 단편을 겔에서 잘라냈고 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 아가로스로부터 추출하였다. 정제된 생성물의 농도는 67-80 ng/μL인 것으로 발견되었다. pMlBa131-3, 및 pMlBa135의 제한된 단편 중 0.67-0.8 μg을 여기에 설명된 바와 같이 MlBa314, MlBa316, MlBa315, 또는 MlBa328에 형질전환하였다. 형질전환체를 ura 선택 배지에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였고, ura 선택 배지에 재-스트리킹하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 게놈 DNA를 URA3+ 콜로니로부터 제조하였고 여기에 설명된 바와 같이 두 번째 발현 카세트의 통합을 확인하기 위해 PCR로 체크하였으며, 원하는 유전자에 대한 균주 동형 접합체를 만든다. 프라이머 0611718 및 0611632는 상기 설명된 바와 같이 첫 번째 통합을 위한 1100 bp 단편을 증폭시키고, 프라이머 0611632 및 0611717은 역방향의 두 번째 통합을 위한 814 bp 단편을 증폭시킨다. 0611718 및 0611632를 갖는 1100 bp 단편 및 0611717 및 0611632를 갖는 814 bp 단편을 증폭시키는, 각각의 계통의 URA3+ 형질전환체를 MlBA317, MlBA318, MlBA319, 및 MlBa329로 지정하였다 (표 13 참조).
표 13: 형질전환체 유전자형
Figure pct00023
YMR226c, UGA1, PYD4, 및 BAAT에 대한 균주 동형 접합체 또는 이형 접합체의 발현 및 효소 활성을 결정하였다. MlBA309-12, MlBa317-9 및 MlBa329의 하룻밤 동안의 배양물을 YPD에서 37 ℃에서 키웠고, 37 ℃에서 125 mL 배플 플라스크 중의 신선한 YPD 25 mL에 1:50으로 희석하였고, OD600 ~4-10으로 키웠다. 세포의 샘플을 여기에 설명된 방법을 사용하여 SDS-PAGE로 단백질 발현에 대하여 분석하였다. CFE를 또한 배양물의 세포 펠렛으로부터 제조하였고, 3P 데히드로게나제 활성을 CFE에서 여기에 설명된 방법을 사용하여 측정하였다. SDS-PAGE 결과에 기초하여, 균주 MlBa310, MlBa318, MlBa312 및 MlBa319는 ~53 KDa의 질량을 갖는 단백질 (UGA1 또는 PYD4 유전자에 의해 암호화된 단백질의 예상된 크기)을 함유하였다. 이 단백질에 해당하는 밴드는 균주 MBin500의 SDS-PAGE 분석에서 관찰되지 않았다. 게다가, 동형 접합체 균주 MlBa318 및 MlBa319 각각 UGA1 및 PYD4의 발현은 해당하는 이형 접합체 균주 MlBa310 또는 MlBa312보다 더 컸다 (SDS-PAGE 분석에 의해 판단된 바와 같음). BAAT 발현은 이들 조건 하에 균주 MlBa309 또는 MlBa329에서 (SDS-PAGE에 의해) 검출되지 않았다. 표 14A는 균주 MBin500, MlBa311 및 MlBa317의 CFE에서 3-HP 데히드로게나제 ("3-HPDH") 활성을 나타낸다.
표 14A: 형질전환체 효소 활성 데이터
Figure pct00024
개선된 검정 조건을 사용하는 독립적인 실험에서, 균주 MBin500 (대조군), MlBa319 및 MlBa329로부터 제조된 CFE에서 BAAT 활성을 비교하였다. 이 실험의 결과는 표 14B에 나타난다.
표 14B: 형질전환체 효소 활성 데이터
Figure pct00025
균주 MlBa317, MlBa318, 및 MlBa319의 Ura-유도체를 여기에 설명된 바와 같이 분리하였다. MlBa317, MlBa18, 및 MlBa19에 대한 다수의 FOA-저항성 콜로니는 MlBa317, MlBa18, 및 MlBa19 YPD 플레이트에서 37 ℃에서 키움으로써 정제된 콜로니였다. 게놈 DNA를 FOA-저항성 콜로니로부터 제조하였고 URA3 선택 가능한 마커의 손실을 확인하기 위해 여기에 설명된 바와 같이 PCR로 체크하였다. 프라이머 0611718 및 0611632는 상기 설명된 바와 같이 첫 번째 통합을 나타내는 1100 bp 단편을 증폭시키고, 프라이머 0611632 및 0611717은 역방향으로 두 번째 통합의 존재를 나타내는 814 bp 단편을 증폭시킨다. 프라이머 0611718 및 0611631은 ura 마커 및 ura 마커 없이 1200 bp 단편을 갖는 두 번째 통합을 나타내는 2.6 kbp 단편을 증폭시켰다. 0611718 및 0611632를 갖는 1100 bp, 0611632 및 0611717을 갖는 814 bp, 또는 0611718 및 0611631을 갖는 1200 bp의 PCR 단편을 수득하는 MlBa317 및 MlBa318의 ura 균주를 저장하였고 각각 MlBa320 및 MlBa321로 지정하였다. ura 마커가 MlBa319로부터 제거될 때 가능한 유전자 전환 이벤트는 발현 카세트 둘 다가 정방향을 향하도록 PCR에 의해 지시된 바와 같이 (0611632 및 0611631 프라이머를 갖는 2.7 kbp 단편 또는 0611632 및 0611717을 갖는 814 bp 단편은 아니지만, 0611718 및 0611632를 갖는 1100bp 단편은 증폭됨) MlBa322의 결과로 발생하였다.
실시예 3A-3: pdc 위치에서 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC ), β-알라닌 아미노트랜스퍼라제 ( BAAT ), 및 3- 히드록시프로피온산 데히드로게나제 (3-HPDH)를 발현하는 삽입 벡터의 왼쪽 단편의 구조물
에스 . 아베르미틸리스 ADC ( SEQ ID NO : 130) 및 에스 . 아베르미틸리스 BAAT (SEQ ID NO : 140)를 함유하는 왼쪽 단편
ENO1 프로모터 및 PDC 종결 영역 사이에서 발현하는 유전자의 삽입을 허용하기 위해, pMhCt068 벡터를 XbaI 및 PacI로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 6.1 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
사카로미세스 클루이베리 BAAT (pyd4) 유전자 (SEQ ID NO: 142)를 이후의 서브클로닝을 위한 제한 부위를 함유하는 프라이머 0611196 및 0611186으로 증폭하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 에스. 클루이베리 pyd4 유전자, 1X Pfx 증폭 버퍼 (Invitrogen), 100 pmol 프라이머 0611196 및 0611186 각각, 200 μM dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP 각각, 1.5 μL DMSO 및 2.5 유닛의 Platinum® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen)를 함유하는 플라스미드의 미니-프렙의 1 내지 50배 희석액 중 1 μL를 함유한다. PCR을 95 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 95 ℃에서 30초 동안, 40.8 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 1분 30초 동안 34 사이클, 72 ℃에서 5분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)에서 수행하였다. 열 순환 후, 약 1428 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하는 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
상기 생성된 pyd4 PCR 반응물을 XbaI 및 PacI로 분해하였고 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 1.4 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 이 정제된 DNA를 1X QUICK 결찰 버퍼 (New England Biolabs), 100 ng XbaI/PacI pMhCt068 벡터, 70.5 ng Xba I/PacI pyd4 인서트, 및 1 μL QUICK T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)를 함유하는 결찰 반응물 (20 μL)에서 상기 설명된 XbaI 및 PacI 제한된 pMhCt068 벡터에 클로닝하였다. 결찰 반응물을 상온에서 5분 동안 배양하였고, 얼음 위에서 냉각하였다. 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 이 반응물 5 μL를 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 여기에 설명된 바와 같이 XbaI 및 PacI로 분해에 의한 원하는 PCR 생성물의 적절한 인서트에 대하여 스크리닝하였으며, 한 확인된 분리체는 "왼쪽+pyd4#1"로 지정되었다.
SEQ ID NO: 17의 에스. 아베르미틸리스 ADC를 암호화하고 이. 콜리에서 발현에 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드를 프라이머 0611376 및 0611377로 증폭시켰다 (프라이머 0611376이 In-Fusion을 통해 pMhCt068에 삽입 후 NheI 제한 부위의 5' 말단에서 "T" 염기의 제거를 일으키며, 이것은 초기 pMhCt068 클론에 존재하는 원하지 않는 ATG 시작 코돈을 제거한다는 것을 나타냄). PCR 반응물 (50 μL)은 1 내지 50배 희석된 pACN5의 미니-프렙 중 1 μL, 1X ThermoPol 반응 버퍼 (New England Biolabs), 100 pmol 각각의 프라이머 0611376 및 0611377, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 2 μL 100 mM MgS04, 및 2 유닛 VentR® (엑소-) DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 94 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 94 ℃에서 30초 동안, 54 ℃에서 30초 동안, 72 ℃에서 1분 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 420 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
"왼쪽+pyd4#1" 플라스미드를 NheI 및 AscI로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 7.5 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 이. 콜리에 최적화된 에스. 아베르미틸리스 ADC 유전자를 함유하는, 상기 정제된 PCR 단편을 NheI 및 AscI로 분해하였고 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 420 bp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 결과의 단편을 1X QUICK 결찰 버퍼 (New England Biolabs), 100 ng NheI/AscI "왼쪽+pyd4#1" 벡터, 31 ng의 NheI 및 AscI 분해된 panD 인서트, 및 1 μL QUICK T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)를 함유하는 결찰 반응물 (20 μL)에서 선형화 "왼쪽+pyd4#1" 벡터에 결찰하였다. 결찰 반응물을 상온에서 5분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 이 반응물 5 μL을 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 스크리닝하였다. 여기에 설명된 바와 같이 AscI 및 PvuII로 분해에 의해 이. 콜리에 최적화된 에스. 아베르미틸리스 ADC 유전자의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMhCt070으로 지정하였다.
플라스미드 pMhCt070은 효모 숙주에서 발현에 코돈-최적화된 ADC 및 BAAT 상동체의 삽입을 위한 염기성 벡터의 역할을 한다. pMhCt070을 XbaI 및 PacI로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 약 6.5 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
에스. 아베르미틸리스 BAAT (SEQ ID NO: 140)을 암호화하고 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 최적화된 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 상기 설명된 XbaI 및 PacI 분해된 단편을 다음과 같이 pMhCt070 컷 벡터에 결찰하였다: 1X QUICK 결찰 버퍼 (New England Biolabs), 42 ng의 XbaI 및 PacI 분해된 pMhCt070 벡터, 4 μL의 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 BAAT XbaI 및 PacI 분해된 인서트, 및 1 μL QUICK T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)를 함유하는 결찰 반응물 (20 μL). 결찰 반응물을 상온에서 5분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 이 반응물 중 5 μL를 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 여기에 설명된 바와 같이 XbaI, PacI, 및 EcoRV 분해에 의해 원하는 BAAT ORF에 대하여 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMhCt072로 지정하였다.
pMhCt072의 이. 콜리에서 발현에 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 ADC 유전자를 아이. 오리엔탈리스 (SEQ ID NO: 130)에서 발현에 코돈-최적화된 버젼으로 대체하였다. 아이. 오리엔탈리스 (SEQ ID NO: 130) 코돈-최적화된 ADC 유전자 및 원하는 추가의 제한 부위 및 플랭킹 DNA를 프라이머 0611378 및 0611379로 증폭하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 panD (GeneArt®)를 함유하는 플라스미드의 1 내지 50배 희석된 미니-프렙 중 1 μL, 1X ThermoPol 반응 버퍼 (New England Biolabs), 100 p mol 각각의 프라이머 0611378 및 0611379, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 2 μL 100 mM MgSO4, 및 2 유닛 VentR ® (엑소-) DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 94 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 94 ℃에서 30초 동안, 54 ℃에서 30초 동안, 72 ℃에서 45초 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 420개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
pMhCt072의 미니-프렙 중 5 μL를 XbaI 및 PacI로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 7.5 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 상기로부터 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 ADC 유전자를 함유하는 분리된 PCR 생성물을 다음 IN-FUSION™ Advantage PCR Cloning Kit (Clontech) 반응에서 벡터에 추가하였다: 10 μL 반응 부피는 6 μL의 pMhCt072 분해된 및 정제된 벡터, 1μL의 정제된 코돈-최적화된 panD PCR 생성물, 1X In-Fusion 반응 버퍼 (Clontech) 및 1 μL의 IN-FUSION™ 효소 (Clontech)로 구성되었다. 반응물을 37 ℃에서 15분 동안, 50 ℃에서 15분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 반응물을 40 μL의 TE 버퍼로 희석하였고 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 2.5 μL를 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 NheI, AscI, 및 ClaI 분해에 의해 원하는 PCR 생성물의 적절한 삽입에 대하여 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMhCt074 (도 7)로 지정하였다.
pMhCt074은 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 ADC의 발현을 구동하는 PDC 프로모터 (panD, SEQ ID NO: 130), TAL 종결자, 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 BAAT (SEQ ID NO: 140)의 발현을 구동하는 ENO1 프로모터, RKI 종결자, 아이. 오리엔탈리스 URA3 프로모터 및 아이. 오리엔탈리스 URA3 ORF의 5' 단편을 함유하는 왼쪽 PDC 표적 구조물이다.
에스 . 아베르미틸리스 ADC ( SEQ ID NO : 130) 및 에스 . 클루이베리 BAAT ( SEQ ID NO : 142)를 함유하는 왼쪽 단편
에스. 클루이베리 BAAT (pyd4)를 발현하는 왼쪽 DNA 구조물을 생성하기 위해, 아이. 오리엔탈리스 (SEQ ID NO: 142, 상기)에서 발현되는, 코돈-최적화된 에스. 클루이베리 BAAT 서열을 함유하는, XbaI 및 PacI 분해된 단편을 다음과 같이 상기 pMhCt070 분해된 벡터에 결찰하였다: 1X QUICK 결찰 버퍼 (New England Biolabs), 42 ng의 XbaI 및 PacI 분해된 pMhCt070 벡터, 4 μL의 XbaI 및 PacI로 분해된, 코돈-최적화된 에스. 클루이베리 pyd4 인서트, 및 1 μL QUICK T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)를 함유하는 결찰 반응물 (20 μL). 결찰 반응물을 상온에서 5분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 이 반응물 중 5 μL를 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 XbaI, PacI, 및 EcoRV 분해에 의해 원하는 pyd4 ORF의 적절한 삽입에 대하여 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMhCt073으로 지정하였다.
플라스미드 pMhCt073은 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된, 원하는 에스. 클루이베리 BAAT (pyd4) 서열을 함유하지만 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된 원하는 에스. 아베르미틸리스 ADC (panD) 서열을 함유하지 않는다. 이 ORF에서 이동하기 위해, pMhCt073의 미니-프렙 중 5 μL를 XbaI 및 PacI로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 7.5 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 panD (상기)를 함유하는 분리된 PCR 생성물을 다음 IN-FUSION™ Advantage PCR Cloning Kit (Clontech) 반응물에서 벡터에 추가하였다: 10 μL 반응 부피는 6 μL의 pMhCt073 분해된 및 정제된 벡터, 1 μL의 정제된 코돈-최적화된 panD PCR 생성물, 1X In-Fusion 반응 버퍼 (Clontech) 및 1 μL의 IN-FUSION™ 효소 (Clontech)로 구성되었다. 반응물을 37 ℃에서 15분 동안, 50 ℃에서 15분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 반응물을 40 μL의 TE 버퍼로 희석하였고 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 2.5 μL을 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 NheI, AscI, 및 ClaI 분해에 의해 원하는 PCR 생성물의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다.
플라스미드 pMhCt076은 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 ADC의 발현을 구동하는 PDC 프로모터 (panD, SEQ ID NO: 130), TAL 종결자, 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된 에스. 클루이베리 BAAT의 발현을 구동하는 ENO1 프로모터 (pyd4, SEQ ID NO: 142), RKI 종결자, 아이. 오리엔탈리스 URA3 프로모터 및 아이. 오리엔탈리스 URA3 ORF의 5' 단편을 함유하는 왼쪽 PDC 표적 구조물이다.
플라스미드 pMhCt076는 PDC 프로모터 내로 약 200 bp에서 A에서 T로 뉴클레오티드 변화, pMhCt068 모체 벡터 (상기)에 존재하는 PDC 프로모터를 통해 방법의 2/3에서 G에서 T로 뉴클레오티드 변화를 함유하는 것을 결정하였다. 유전자 발현의 잠재적 변화에 대한 어떤 우려도 해결하기 위해, pMhCt076에 유사하지만 올바른 PDC 프로모터를 함유하는 구조물을 하기 설명된 바와 같이 클로닝하였다.
pMhCt082의 미니-프렙 중 5 μL를 NheI 및 PacI로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 4.7 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. pMhCt076의 미니-프렙 중 4 μL를 pMhCt076 NheI 및 PacI로 분해하였고 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 3.3 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 정제된 4.7 kbp 벡터 및 3.3 kbp 인서트를 1X QUICK 결찰 버퍼 (New England Biolabs), 3 μL pMhCt082 벡터, 6 μL pMhCt076 인서트, 및 1 μL QUICK T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)를 함유하는 결찰 반응물 (20 μL)에서 함께 결찰하였다. 결찰 반응물을 상온에서 5분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다.
이 반응물 중 5 μL을 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 상온에서 3일 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 StuI 및 NotI로 분해에 의해 원하는 PCR 생성물에 대해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMhCt083 (도 8)으로 지정하였다.
플라스미드 pMhCt083와 pMhCt076는 전자가 올바른 PDC 프로모터 서열을 함유하는 한편, 후자는 상기 설명된 하나의 A에서 T로 뉴클레오티드 변화 및 하나의 G에서 T로 뉴클레오티드 변화를 갖는 것을 제외하면 동일하다. 테스트는 pMhCt083 및 pMhCt077와 비교하여 pMhCt076 및 pMhCt077의 통합으로부터 에스. 아베르미틸리스 panD를 발현하는 균주의 panD 효소 활성에서 차이를 나타내지 않았다.
에스 . 아베르미틸리스 ADC ( SEQ ID NO : 130) 및 사카로미세스 세레비시애 사카로미세스 세레비시애 gabT ( SEQ ID NO : 141)를 함유하는 왼쪽 단편
pMhCt083의 미니-프렙 중 4 μL을 XbaI 및 PacI로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 6.5 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된 사카로미세스 세레비시애 gabT를 함유하는, XbaI 및 PacI로 분해된 단편 (UGA1, SEQ ID NO: 141)을 다음과 같이 pMhCt083 컷 벡터에 결찰하였다: 1X QUICK 결찰 버퍼 (New England Biolabs), XbaI 및 PacI로 분해된, 정제된 pMhCt083 벡터 1 μL, 3 μL 코돈-최적화된 에스. 세레비시애 UGA1 XbaI 및 PacI 분해된 인서트, 및 1 μL QUICK T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)를 함유하는 결찰 반응물 (20 μL). 결찰 반응물을 상온에서 5분 동안 배양하였고, 튜브를 얼음 위에 두었다. 이 반응물 중 5 μL을 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 XbaI 및 BglII 분해에 의해 원하는 BAAT ORF의 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다.
플라스미드 pMhCt087는 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 ADC의 발현을 구동하는 PDC 프로모터 (panD, SEQ ID NO: 130), TAL 종결자, 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈 최적화된 에스. 세레비시애 gabT의 발현을 구동하는 ENO1 프로모터 (UGA1, SEQ ID NO: 141), RKI 종결자, 아이. 오리엔탈리스 URA3 프로모터 및 아이. 오리엔탈리스 URA3 ORF의 5' 단편을 함유하는 왼쪽 PDC 표적 구조물이다.
실시예 3A-4: pdc 위치에서 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC ), β-알라닌 아미노 트랜스퍼라제 ( BAAT ), 및 3- 히드록시프로피온산 데히드로게나제 (3- HPDH )를 발현하는 삽입 벡터의 오른쪽 단편의 구조물
이. 콜리 3- HPDH ( SEQ ID NO : 143)를 함유하는 오른쪽 단편
pMhCt069 (상기)의 미니-프렙 중 2 μL를 XbaI 및 PacI로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 2.2 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된 이. 콜리 3-HPDH 유전자를 함유하는, XbaI 및 PacI로 분해된 단편 (ydfG, SEQ ID NO: 143)을 다음과 같이 pMhCt069 컷 벡터에 결찰하였다: 1X QUICK 결찰 버퍼 (New England Biolabs), XbaI 및 PacI로 분해된, 정제된 pMhCt069 벡터 2 μL, XbaI 및 PacI로 분해된, 코돈-최적화된 이. 콜리 ydfG 인서트 4 μL, 및 1 μL QUICK T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)를 함유하는 결찰 반응물 (20 μL). 결찰 반응물을 상온에서 5분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 이 반응물의 5 μL를 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 상온에서 3일 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 XbaI, PacI, 및 EcoRV 분해에 의해 원하는 ydfG ORF의 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 여기에 설명된 바와 같이 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMhCt075 (도 10)로 지정하였다.
플라스미드 pMhCt075는 아이. 오리엔탈리스 URA3 ORF의 3' 단편, 아이. 오리엔탈리스의 URA3 종결자에 이어서 URA3 프로모터 (이후에 URA3 마커의 밖으로 루프-아웃), 아이. 오리엔탈리스 TDH3 프로모터에 의해 구동되는, 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된 이. 콜리 3-HPDH 유전자 (ydfG, SEQ ID NO: 143), 및 아이. 오리엔탈리스 PDC 종결 영역을 함유하였다.
사카로미세스 세레비시애 3- HPDH ( SEQ ID NO : 144)를 함유하는 오른쪽 단편
아이. 오리엔탈리스 (상기)에서 발현에 코돈-최적화된 에스. 세레비시애 YMR226C 유전자를 함유하는, XbaI 및 PacI로 분해된 단편을 다음과 같이 pMhCt069 컷 벡터에 결찰하였다: 1X QUICK 결찰 버퍼 (New England Biolabs), XbaI 및 PacI로 분해된, 정제된 pMhCt069 벡터 2 μL, XbaI 및 PacI로 분해된, 코돈-최적화된 에스. 세레비시애 3-HPDH (YMR226C, SEQ ID NO: 144) 인서트 4 μL 및, 1 μL QUICK T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)를 함유하는 결찰 반응물 (20 μL). 결찰 반응물을 상온에서 5분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 이 반응물의 5 μL를 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 상온에서 3일 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 XbaI, PacI, 및 EcoRV 분해에 의해 원하는 YMR226C ORF의 적절한 삽입에 대하여 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMhCt077 (도 11)로 지정하였다.
플라스미드 pMhCt077은 아이. 오리엔탈리스 URA3 ORF의 3' 단편, 아이. 오리엔탈리스의 URA3 종결자에 이어서 URA3 프로모터 (이후에 URA3 마커의 밖으로 루프-아웃), 아이. 오리엔탈리스 TDH3 프로모터 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된 에스. 세레비시애 3-HPDH 유전자 (YMR226C, SEQ ID NO: 144), 및 아이. 오리엔탈리스 PDC 종결 영역을 함유한다.
실시예 3A-5: PDC 위치에서 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC ), β-알라닌 아미노트랜스퍼라제 ( BAAT ), 및 3- 히드록시프로피온산 데히드로게나제 (3-HPDH)를 발현하는 이형 접합체 및 동형 접합체 효모 균주
상기 실시예 3A-3 및 3A-4를 아이. 오리엔탈리스 PDC 위치에서 동시에 3개의 이소성 유전자의 발현을 표적화하는, 다양한 왼쪽 또는 오른쪽 구조물의 구조물을 설명한다. 형질전환 전에, 각 구조물 (하나의 원하는 왼쪽 구조물 및 하나의 원하는 오른쪽 구조물)의 약 10 μL를 NotI로 pUC18 백본 벡터의 원하는 형질전환 DNA를 방출하기 위해 분해하였다. 대부분의 분해에 대해, 제한 효소 PvuI를 또한 NotI 분해와 함께 포함되었다. 제한 효소 PvuI는 pUC18 벡터 단편을 약 절반 정도 분해하며, 더 큰 조각으로 나누어지고, 원하는 DNA 단편은 겔 전기영동에 의해 더 쉬울 수 있다. 밴드를 함유하는 더 큰, 발현 카세트를 겔 전기영동에 의해 pUC18 백본 벡터의 원하는 형질전환 DNA의 단편을 pUC18 백본 벡터로부터 겔 전기영동으로 분리하였고, 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 30 μL 용출 버퍼를 용출 단계에 사용하였다. 총 10 μL인 하나의 왼쪽 및 하나의 오른쪽 구조물의 등몰의 비율을 아이. 오리엔탈리스 균주 CNB1 또는 적절한 유도체를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 ura 선택 플레이트에서 선택하였고 성장을 위해 37 ℃에 두었다. 다음날, 약 12개의 형질전환체를 골랐고 ura 선택 플레이트에 단일 콜로니에 대해 재스트리킹하였고 37 ℃에서 키웠다. 다음날, 단일 콜로니를 각각의 초기 형질전환체에 의해 생성된 스트리크의 각각 골랐고 단일 콜로니에 대해 ura 선택 플레이트에 재스트리킹하였다. 37 ℃에서 성장의 또 다른 밤 이후, 최종 단일 콜로니를 각각의 스트리크로부터 골랐고 ura 선택 플레이트에 재스트리킹하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 키웠다. 단일 콜로니 정제 및 생장의 두 라운드 후에, 상기 설명된 바와 같이 발생된 원하는 표적화 통합을 확인하기 위해 PCR에 사용되는 게놈 DNA를 제조하였다. 왼쪽 및 오른쪽 구조물을 사용하여 PDC를 표적화 하기 위해, 프라이머 0611814, 0611554, 및 0611555를 사용하여 원하는 통합 이벤트의 확인을 결정하였다. 프라이머 0611554는 오른쪽 PDC 표적화 구조물에 존재하는 PDC 종결 영역의 3'의 아이. 오리엔탈리스 게놈 DNA에서 결합하고 중단을 향해 증폭하고; 프라이머 0611814는 오른쪽 구조물에 존재하는 TDH3 프로모터의 3' 말단 근처에 결합한다. 프라이머 0611814 및 0611554를 함유하는, PCR의 1.9 kbp 밴드의 발생은 PDC 위치에서 원하는 통합 이벤트의 발생을 나타냈다. 프라이머 0611555 및 0611554를 함유하는, PCR의 1.4 kbp 밴드의 발생은 야생형 PDC 위치의 존재를 나타냈다. 이 통합 이벤트가 이배체 아이. 오리엔탈리스 CNB1의 첫 번째 표적화 이벤트이기 때문에 원하는 구성요소는 프라이머 0611814 및 0611554에 대한 1.9 kbp 밴드 및 프라이머 0611555 및 0611554의 1.4 kbp 밴드 둘 다를 나타낼 것이다. 각각의 플라스미드에 대하여 원하는 밴드 패턴을 제공하는 2개의 독립적인 형질전환체를 표 15에 나타난 바와 같이 지정하였다.
표 15: 형질전환체 유전자형
Figure pct00026
그 다음, yMhCt004 또는 yMhCt005의 ura-유도체를 상기 설명된 바와 같이 분리하였다. 각각의 모체 균주의 다수의 FOA 저항성 콜로니의 게놈 DNA를 프라이머 0611815 및 0611817로 원하는 루프-아웃 이벤트에 대하여 PCR로 스크리닝하였다. 프라이머 0611815는 왼쪽 구조물의 RKI 종결자에서 어닐링하고 URA3 프로모터로 증폭시킨다. 프라이머 0611817은 TDH3 프로모터에서 어닐링하고 URA3 카세트를 향해 증폭시킨다. 838 bp 밴드의 존재는 원하는 바와 같이 ura3 스카 (scar) 부위 (모체 균주에서 2개의 URA3 프로모터 사이에서 상동 재조합 후 단일 URA3 프로모터의 왼쪽 뒤)만의 존재를 나타내는 한편, 약 2.2 kbp의 밴드는 온전한 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 존재를 나타내며, 원하는 재조합 이벤트가 발생하지 않았다는 것을 나타낸다. 상기 설명된 바와 같이 Crimson Taq™ DNA Polymerase로 함께 PCR 반응을 수행하였다. 모체 균주 yMhCt004의 하나의 FOA 저항성 콜로니를 yMhCt012로 지정하였고, 모체 균주 yMhCt005의 하나의 FOA 저항성 콜로니를 yMhCt007로 지정하였고, 원하는 828 bp 밴드를 제공하였다.
균주 yMhCt012를 pMhCt083 및 pMhCt077의 선형 DNA에 형질전환하는 한편, yMhCt007을 pMhCt087 및 pMhCt077의 선형 DNA에 형질전환하였다. 두 번의 라운드의 단일 콜로니 정제 후, 다수의 형질전환체의 게놈 DNA를 pMhCt087 및 pMhCt077의 선형 DNA에 형질전환하였다. 두 번의 라운드의 단일 콜로니 정제에서, 각각의 모체 균주의 다수의 형질전환체의 게놈 DNA를 PCR로 스크리닝하였다.
828 bp 밴드 (원래 표적화된 PDC 위치의 ura3 스카 영역의 증폭의) 및 2.2 kbp 밴드 (다른 염색체상에서 두 번째 통합 이벤트의 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 통합의)를 둘 다 갖는 각각의 모체 균주의 두 번의 독립적으로 분리된 구성요소를 표 16에 나타난 바와 같이 지정하였다.
표 16: 형질전환체 유전자형
Figure pct00027
yMhCt008의 ura-유도체를 상기 설명된 바와 같이 분리하였다. yMHCt008 모체 균주의 다수의 FOA 저항성 콜로니의 게놈 DNA를 여기에 설명된 바와 같이 프라이머 0611815 및 0611817을 갖는 원하는 루프-아웃 이벤트에 대하여 PCR로 스크리닝하였다. 828 bp 밴드의 존재는 원하는 바와 같이 ura3 스카 부위 (모체 균주에서 2개의 URA 3 프로모터 사이에서 상동 재조합 후 단일 URA3 프로모터 왼쪽 뒤)만의 존재를 나타냈다. 828 bp 밴드만을 나타내는 분리체를 여기에 설명된 바와 같이 프라이머 0611555 및 0611554를 사용하여 추가로 스크리닝하였다. 프라이머 0611555 및 0611554를 함유하는 PCR에서 약 1.4 kbp 밴드의 발생은 야생형 PDC 위치의 존재를 나타냈다. 두 개의 염색체상의 PDC 위치가 손실되었다는 것을 나타내는, 이 밴드가 없는 분리체를 yMhCt010으로 지정하였다.
균주를 셰이크 플라스크에서 키웠고 CFE를 제조하였고 여기에 설명된 바와 같이 아스파르테이트 데카르복실라제 (ADC) 활성 및 3-HP 데히드로게나제 (3-HPDH) 활성에 대하여 검정하였다. 다수의 검정 세트 (시험 1-4로 나타남)에 대한 실험 결과는 표 17에 나타난다. 표 17의 시험 1의 균주를 여기에 설명된 바와 같이 SDS-PAGE로 분석하였다. 시험 1의 균주 74/75 #1 및 균주 yMhCt002는 시험 1의 대조군 균주 (MBin500)에 존재하지 않는 27 kD에서 SDS-PAGE 분석의 밴드를 제공한다. 이 단백질 밴드의 크기는 그것의 ydfG 유전자에 의해 암호화된 단백질과 그것의 정체성이 일치한다.
표 17: 형질전환체 효소 활성 데이터
Figure pct00028
또 다른 검정 세트에 대한 실험 결과는 표 17에 나타난다 (시험 2). 표 17의 시험 2의 균주를 또한 여기에 설명된 바와 같이 SDS-PAGE로 분석하였다. MBin500을 제외한 시험 2의 모든 균주는 SDS-PAGE 분석에서 29 kD에서 밴드를 제공하였다. 이 단백질 밴드의 크기는 YMR226c 유전자에 의해 암호화된 단백질과 정체성이 일치한다. 시험 2에 대하여 균주 yMhCt005 및 87/77 #2는 이 시험에 대한 세 개의 다른 샘플에 존재하지 않는 53 kD에서 제공하였다. 이 단백질 밴드의 크기는 UGA1 유전자에 의해 암호화된 단백질과 그것의 정체성이 일치한다.
또 다른 검정 세트에 대하 실험 결과는 표 17에 나타난다 (시험 3). 표 17의 시험 3의 균주를 또한 여기에 설명된 바와 같이 SDS-PAGE로 분석하였다. MBin500을 제외한 시험 3의 모든 균주는 SDS-PAGE 분석에서 53 kD 및 29 kD에서 밴드를 제공하였다. 이 단백질 밴드의 크기는 UGA1 및 YMR226c 유전자 각각에 의해 암호화된 단백질과 정체성이 일치한다. 시험 3의 균주 MBin500 및 yMhCt005는 이 시험을 위해 yMhCt008 및 yMhCt009에 존재하지 않는 SDS-PAGE에서 64 kD에서 밴드를 나타냈다. 이 단백질 밴드의 크기는 아이. 오리엔탈리스 CNB1의 네이티브 피루베이트 데카르복실라제 (PDC) 유전자에 의해 암호화된 단백질과 정체성이 일치한다.
또 다른 검정 세트에 대하 실험 결과는 표 17에 나타난다 (시험 4). 표 17의 시험 4의 균주를 또한 여기에 설명된 바와 같이 SDS-PAGE로 분석하였다. MBin500을 제외한 시험 4의 모든 균주는 29 kD에서 밴드를 제공하였다. 이 단백질 밴드의 크기는 YMR226c 유전자에 의해 암호화된 단백질과 정체성이 일치한다. 시험 4의 균주 yMhCt005, yMhCt008, 및 yMhCt009는 53 kD에서 밴드를 나타냈다. 이 밴드의 크기는 UGA1 유전자에 의해 암호화된 단백질과 일치한다. 시험 4의 균주 yMhCt013, 및 yMhCt014는 53 kD에서 희미한 밴드를 나타냈다. 이 밴드의 크기는 PYD4 유전자에 의해 암호화된 단백질과 일치한다. 시험 4의 균주 MBin500, yMhCt004, 및 yMhCt005는 균주 yMhCt008, yMhCt009, yMhCt013, 및 yMhCt014에 없는 64 kD에서 밴드를 나타냈다. 이 단백질 밴드의 크기는 아이. 오리엔탈리스 CNB1의 네이티브 피루베이트 데카르복실라제 (PDC) 유전자에 의해 암호화된 단백질과 정체성이 일치한다.
여기에 설명된 방법을 사용하여, 3-HP 생산에 대하여 바이오리액터에서 평가된 균주 MBin500 및 yMhCt008을 테스트하였다. 대조군 균주 MBin500은 검출 가능한 3-HP를 생산하지 않았다 (두 개의 독립적인 발효의 평균). 균주 yMhCt008은 2.45 g/L 3-HP를 생산하였다 (12개의 독립적인 발효의 평균).
실시예 3A-6: adh1202 위치에서 β-알라닌 아미노트랜스퍼라제 ( BAAT ) 또는 3-히 드록시프로피온 산 데히드로게나제 (3- HPDH )를 발현하고, pdc 위치에서 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC ), β-알라닌 아미노트랜스퍼라제 ( BAAT ), 및 3- 히 드록시프로피온산 데히드로게나제 (3- HPDH )를 발현하는 효모 균주
pMhCt077, pMhCt083, 및 pMhCt087 (상기) 20 μg을 NotI 및 PvuI로 분해하였고 89 mM 염기성 트리스-89 mM 붕산-2 mM 이나트륨 EDTA (TBE) 버퍼를 사용하여 1% 아가로스 겔 상에서 실행하였다. 각각 pMhCt077, pMhCt083, 및 pMhCt087로부터 3815 bp, 5332 bp, 또는 5320 bp의 NotI 분해된 단편을 겔에서 잘라냈고 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 아가로스로부터 추출하였다. NotI 분해된 pMhCt077 560 ng 및 NotI 분해된 pMhCt083 또는 pMhCt087 560 ng을 균주 MlBa320, MlBa321, 및 MlBa322에 형질전환하였다. MlBa320을 pMhCt077/83 및 pMhCt077/87 조합과 형질전환하였다. MlBa321을 pMhCt077/87과 형질전환하였고 MlBa322를 여기에 설명된 바와 같이 pMhCt077/83과 형질전환하였다. 형질전환체를 ura 선택 배지에 도말하였고 상온에서 약 60시간 동안 배양하였다. 형질전환체를 ura 선택 배지에 재-스트리킹하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 게놈 DNA를 URA3+ 콜로니로부터 제조하였고 발현 카세트의 통합을 확인하기 위해 여기에 설명된 바와 같이 PCR로 체크하였다. 프라이머 쌍 611814 및 611554는 통합을 나타내는 1.9 kbp 단편을 증폭시켰다. 프라이머 쌍 611555 및 611554는 야생형 위치를 나타내는 1.4 kbp 단편을 증폭시켰다. 611554 및 611814를 갖는 1.9 kbp 및 611555 및 611554를 갖는 1.4 kbp의 PCR 단편을 증폭시키는 각각의 계통의 하나의 URA3+ 형질전환체를 저장하였다; 이들은 MlBa323, MlBa324, MlBa325, 및 MlBa327로 지정된다 (유전자형에 대하여 표 18 참조). 프로모터 및 종결자를 아이. 오리엔탈리스 유전자로부터 유도하였다.
표 18: 형질전환체 유전자형
Figure pct00029
균주를 셰이크 플라스크에서 키웠고 CFE를 제조하였고 3-HP 데히드로게나제 (3-HPDH) 활성에 대하여 여기에 설명된 바와 같이 검정하였다. 결과는 표 19에 나타난다.
표 19: 형질전환체 효소 활성 데이터
Figure pct00030
MlBa323, MlBa324, MlBa325 및 MlBa327의 ura-유도체를 여기에 설명된 바와 같이 분리하였다. 게놈 DNA를 FOA-저항성 콜로니로부터 제조하였고 URA3 선택 가능한 마커의 손실을 확인하기 위해 여기에 설명된 바와 같이 PCR로 체크하였다. 프라이머 0611815는 왼쪽 구조물의 RKI 종결자에서 어닐링하고 URA3 프로모터를 향해 증폭시켰고 프라이머 0611817은 TDH3 프로모터에서 어닐링하고 URA3은 다시 URA3 카세트를 향해 증폭시켰다. 828 bp 밴드의 존재는 원하는 바와 같이 URA3 스카 부위 (모체 균주에서 2개의 URA3 프로모터 사이에서 상동 재조합 후 단일 URA3 프로모터 왼쪽 뒤)만의 존재를 나타내는 한편, 약 2.2 kbp의 밴드는 온전한 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 존재를 나타내고, 원하는 재조합 이벤트가 일어나지 않았다는 것을 나타낸다. 프라이머 0611815 및 0611817을 갖는 828 bp의 PCR 단편을 수득하는, MlBa323, MlBa324, MlBa325, 및 MlBa327의 ura-균주를 저장하였고 각각 MlBa335, MlBa333, MlBa334, 및 MlBa336으로 지정하였다.
균주 MlBa333 및 MlBa334를 pMhCt077 및 pMhCt087의 단편과 형질전환하였고, 균주 MlBa335 및 MlBa336을 MlBa320-2 형질전환체에 대한 섹션에서 상기 설명된 바와 같이 pMhCt077 및 pMhCt083의 단편과 형질전환하였다. 형질전환체를 여기에 설명된 바와 같이 ura 선택 배지 상에서 키움에 의해 선택하였다. 게놈 DNA를 URA3+ 콜로니로부터 제조하였고 발현 카세트의 통합을 확인하기 위해 여기에 설명된 바와 같이 PCR로 체크하였다. 프라이머 0611815를 왼쪽 구조물의 RKI 종결자에서 어닐링하였고 URA3을 향해 증폭시켰다. 프라이머 0611817은 TDH3 프로모터에서 어닐링하였고 URA3 카세트를 향해 다시 증폭시켰다. 828 bp 밴드의 존재는 첫 번째 통합을 위해 원하는 바와 같이 URA3 스카 부위 (모체 균주에서 2개의 URA3 프로모터 사이에서 상동 재조합 후 단일 URA3 프로모터 왼쪽 뒤)만의 존재를 나타내고, 약 2.2 kbp의 밴드는 두 번째 통합을 위해 온전한 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 존재를 나타낸다. 프라이머 쌍 0611815 및 0611816은 ura 마커가 존재할 때 625 bp 단편을 증폭시킨다. 프라이머 0611555 및 0611554는 PDC 위치가 존재할 때 1.4 kbp 단편을 증폭시킨다. 동형 접합체 통합체는 이들 프라이머를 갖는 단편을 증폭시키지 않아야 한다. 프라이머 0611815 및 0611817을 갖는 828 bp 및 2.2 kbp, 프라이머 0611815 및 0611816을 갖는 625 bp의 PCR 단편을 증폭시키고 프라이머 0611555 및 0611554를 갖는 단편을 증폭시키지 않는, 각각의 계통의 하나의 URA3+ 형질전환체를 저장하였다; 이들을 MlBa340, MlBa341, MlBa345, 및 MlBa348로 지정하였다 (표 20A 참조). 프로모터 및 종결자를 아이. 오리엔탈리스 유전자로부터 유도하였다.
표 20A: 형질전환체 유전자형
Figure pct00031
균주 MBin500 (대조군), MlBa345, MlBa348, MlBa340 및 MlBa341로부터 제조된 CFE에서 아스파르테이트 1-데카르복실라제 (ADC), 베타-알라닌 아미노트랜스퍼라제 (BAAT) 및 3-HP 데히드로게나제 (3-HPDH) 활성을 비교하였다. 이 실험의 결과는 표 20B에 나타난다.
표 20B: 형질전환체 효소 활성 데이터
Figure pct00032
실시예 3A-7: adh1202 위치에서 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC )를 발현하는 다수의 뉴클레오티드 서열을 갖는 삽입 벡터의 왼쪽 단편
구조물을 아이. 오리엔탈리스 adh1202 위치에서 ADC (SEQ ID NO: 17)을 암호화하는 뉴클레오티드의 4개의 카피를 포함하도록 설계하였다. PDC 위치에 대하여 여기에 설명된 것들과 유사한 접근법으로, 왼쪽 및 오른쪽 구조물을 상동 재조합을 허용하도록 설계하였다. 통합 벡터 일반적인 설계 및 원하는 재조합 이벤트는 도 3에 나타난다. 이 접근법을 또한 하기 실시예에 설명된 바와 같이 대체 ADC (SEQ ID NO: 139)의 발현에 사용하였다.
재조합을 같은 ADC 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 다수의 카피 사이에서 발생하는 것으로부터 방지하기 위해, 아이. 오리엔탈리스 (SEQ ID NO: 130, 145, 146, 및 147)에서 발현에 코돈-최적화된, 4개의 별개의 뉴클레오티드 서열을 SEQ ID NO: 17의 같은 ADC 서열을 암호화하도록 설계하였다. 추가적으로, 구조물의 초기 설정을 아이. 오리엔탈리스의 ald5680 위치를 표적화하도록 설계하였기 때문에, adh1202 표적화 서열은 클로닝의 후반 단계에서 이들 벡터로 통합된다. ald5680 구조물은 ald5680에서 panD의 4개의 추가적 카피를 갖는, adh120에서 panD의 이소성 4개의 카피에 대하여 이미 동형인 아이. 오리엔탈리스 CNB1 균주에서 두 번째 위치를 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
왼쪽 ald5680 표적화 벡터를 다음과 같이 제조하였다. 원하는 추가적 제한 부위 및 플랭킹 DNA와 함께, ald5680 ORF의 5'인 서열을 함유하는 PCR 생성물을 프라이머 0612271 및 0612272로 증폭시켰다. PCR 반응물 (50 μL)은 1 내지 50배 희석된 pHJJ75 미니-프렙 플라스미드 DNA (도 23) 1 μL, 1X iProof™ HF 버퍼 (Bio-Rad Laboratories), 100 pmol 각각의 프라이머 0612271 및 0612272, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 1 유닛의 iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad Laboratories)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 59 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 45초 동안 32 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 930개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
대량의 DNA의 정제를 허용하기 위해, 상기 설명된 PCR 반응을 주형 DNA로 정제된 930 bp PCR 생성물을 사용하여 반복하였다. 5개의 50 μL 반응물을 설정하였고 1 μL의 정제된 930 bp PCR 생성물이 주형 DNA로 pHJJ75 플라스미드 (상기)를 대체하는 것을 제외한 상기 설명된 조건으로 증폭시켰다. 열 순환 후, 증폭된 930 bp 생성물을 상기와 같이 정제하였다.
PDC promo-optPanD-ENO1-UGA1를 함유하는 단편 (이것은 SEQ ID NO: 130의 서열을 암호화하는, 아이. 오리엔탈리스 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 ADC를 함유한다)을 NotI 및 EcoRI 분해를 통해 pMhCt087 (상기)에서 잘라냈다. pMhCt087의 미디-프렙 (midi-prep)의 10 μg을 NotI 및 EcoRI으로 분해하였고 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 4.4 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
클로닝을 위해 원하는 추가적 제한 부위 및 플랭킹 DNA를 갖는 URA3 분열 마커의 5' 절반을 함유하는 PCR 생성물을 프라이머 0612273 및 0612274를 사용하여 증폭하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 1 내지 50배 희석된 pMhCt082 미니-프렙 플라스미드 DNA (상기), 1X iProof™ HF 버퍼 (Bio-Rad Laboratories), 100 pmol 각각의 프라이머 0612273 및 0612274, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 1 유닛의 iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad Laboratories)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 59 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 45초 동안 32 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 960개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
상기 DNA 단편에 대한 수령자 벡터를 생성하기 위해, 플라스미드 pUC19 (Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985) Gene, 33, 103-119)를 HindIII 및 EcoRI으로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 2.6 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
상기 정제된 930 bp, 4.4 kbp, 및 960 bp DNA 단편을 HindIII 및 EcoRI로 분해된 pUC19 벡터 150 ng, ald5680 플랭킹 DNA를 함유하는 930 bp DNA 56 ng, NotI 및 EcoRI으로 분해된 pMhCt087의 PDC promo-optPanD-ENO1-UGA1 단편 250 ng, URA3 분열 마커의 5' 절반을 함유하는 960 bp PCR 생성물 5' 55 ng, 1X In-Fusion 반응 버퍼 (Clontech) 및 IN-FUSION™ 효소 (Clontech) 1 μL로 구성된, 10 μL의 총 반응량에서 IN-FUSION™ Advantage PCR Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 분해된 pUC19 단편에 삽입하였다. 반응물을 37 ℃에서 15분 동안, 50 ℃에서 15분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 반응물을 40 μL의 TE 버퍼로 희석하였고 2.5 μL를 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 상온에서 3일 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 SalI 및 HpaI 분해에 의해 원하는 PCR 생성물의 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMhCt089로 지정하였다.
그 다음, pMhCt089에서 UGA1 ORF를 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 panD 유전자로 대체하였으며 이것은 SEQ ID NO: 17의 ADC를 암호화한다. 에스. 아베르미틸리스 panD 버젼 r1 (SEQ ID NO: 145)을 벡터 pMA-T에서 GeneArt®로 합성하였다. 플라스미드 pMA-T를 XbaI 및 PacI로 분해하였고, 결과의 단편을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였고, 약 434 bp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 플라스미드 pMhCt089를 XbaI 및 PacI로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, 결과의 단편을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였고, 약 4.5 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. pMhCt089 벡터 및 에스. 아베르미틸리스 panD 버젼 r1을 1X QUICK 결찰 버퍼 (New England Biolabs), 2 μLXbaI/PacI pMhCt089 벡터, 2 μL XbaI/PacI 에스. 아베르미틸리스 panD 버젼 r1 인서트, 및 1 μL QUICK T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)를 함유하는 결찰 반응물 (20 μL)과 합쳤다. 결찰 반응물을 상온에서 5분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 이 반응물 중 5 μL를 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 상온에서 3일 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 XbaI 및 PacI 분해에 의해 원하는 PCR 생성물의 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMhCt092로 지정하였다.
왼쪽 구조물에 대한 최종 클로닝 단계는 pMhCt092에 존재하는 ald5680 5' 상동 영역을 adh1202 5' 상동 영역으로 대체하는 것이었다. 클로닝을 위해 원하는 추가의 제한 부위 및 플랭킹 DNA와 함께 adh1202 ORF의 서열 5'을 함유하는 PCR 생성물을 프라이머 0612470 및 0612471로 증폭하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 1 μL의 1 내지 50배 희석된 pGMEr140 미니-프렙 플라스미드 DNA (PCR 증폭된 영역이 동일한 여기에 설명된 pMlBa107의 유도체), 1X iProof™ HF 버퍼 (Bio-Rad Laboratories), 100 pmol 각각의 프라이머 0612470 및 0612471, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 1 유닛의 iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad Laboratories)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 59 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 30초 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 790 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
상기 PCR 생성물에 대한 수령자 벡터를 생성하기 위해, 플라스미드 pMhCt092를 HpaI 및 NotI로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 7.0 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. PCR 생성물 및 선형 벡터를 HpaI 및 NotI로 분해된 pMhCt092 벡터 120 ng, PCR 생성물을 함유하는 adh1202 5' 상동체 30 ng, 1X In-Fusion 반응 버퍼 (Clontech) 및 IN-FUSION™ 효소 (Clontech) 1 μL로 구성된, 10 μL의 총 반응량에서 IN-FUSION™ Advantage PCR Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 합쳤다. 반응물을 37 ℃에서 15분 동안, 50 ℃에서 15분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 반응물을 40 μL의 TE 버퍼로 희석하였고 2.5 μL를 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 BamHI 및 PstI로 분해에 의해 원하는 PCR 생성물의 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMhCt095 (도 12)로 지정하였다.
플라스미드 pMhCt095는 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 ADC 유전자 (SEQ ID NO: 130)의 발현을 구동하는 PDC 프로모터, 아이. 오리엔탈리스 RKI 종결자, 아이. 오리엔탈리스 URA3 프로모터 및 아이. 오리엔탈리스 URA3 ORF의 5' 단편을 함유하는, 왼쪽 아이. 오리엔탈리스 adh1202 표적화 구조물이다.
실시예 3A-8: adh1202 위치에서 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC )를 발현하는 다수의 뉴클 레오티드 서열을 갖는 삽입 벡터의 오른쪽 단편
클로닝을 위해 원하는 추가의 제한 부위 및 플랭킹 DNA와 함께 아이. 오리엔탈리스 URA3 ORF의 3' 단편을 함유하는 PCR 생성물을 프라이머 0612275 및 0612276으로 증폭하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 1 내지 50배 희석된 pMhCt069 미니-프렙 플라스미드 DNA (상기) 1 μL, 1X iProof™ HF 버퍼 (Bio-Rad Laboratories), 100 pmol 각각의 프라이머 0612275 및 0612276, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 1 유닛의 iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad Laboratories)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 59 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 45초 동안 32 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1155 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
TDH3 프로모터, 이소성 유전자의 삽입을 위한 XbaI 및 PacI 제한 부위, 및 PDC 종결자를 함유하는 단편을 NotI 및 PmeI로 분해를 통해 pMhCt069에서 잘라냈다. pMhCt069의 미디-프렙의 10 μg을 NotI 및 PmeI로 분해하였고 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 1.85 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
클로닝을 위해 원하는 추가의 제한 부위 및 플랭킹 DNA와 함께, ald5680 ORF의 서열 3'을 함유하는 PCR 생성물을 프라이머 0612277 및 0612278로 증폭시켰다. PCR 반응물 (50 μL)은 1 내지 50배 희석된 pHJJ75 미니-프렙 플라스미드 DNA (도 23) 1 μL, 1X iProof™ HF 버퍼 (Bio-Rad Laboratories), 100 pmol 각각의 프라이머 0612277 및 0612278, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 1 유닛의 iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad Laboratories)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 59 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 45초 동안 32 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1155 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
상기 정제된 1155 bp, 1.85 kbp, 및 844 bp DNA 단편을 HindIII 및 EcoRI로 분해된 pUC19 벡터의 단편 150 ng, URA3 분열 마커의 3' 부분을 함유하는 1155 bp DNA 66 ng, PmeI 및 NotI으로 분해되고 TDH3 프로모터, 이소성 유전자의 삽입을 위한 XbaI 및 PacI 제한 부위, 및 pMhCt069의 PDC 종결자를 함유하는 1.85 kbp 단편 106 ng, 3' ald5680 플랭킹 DNA를 함유하는 844 bp PCR 생성물 48 ng, 1X In-Fusion 반응 버퍼 (Clontech) 및 IN-FUSION™ 효소 (Clontech) 1 μL로 구성된, 10 μL의 총 반응량에서 IN-FUSION™ Advantage PCR Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 EcoRI 및 HindIII로 분해된 pUC19에 삽입하였다. 반응물을 37 ℃에서 15분 동안, 50 ℃에서 15분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 반응물을 40 μL의 TE 버퍼로 희석하였고 2.5 μL를 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 상온에서 3일 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 SalI 및 HpaI로 분해에 의해 원하는 PCR 생성물의 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 ald5680 right #20으로 지정하였다.
TKL 종결자, PGK1 프로모터, XbaI 및 PacI 제한 부위, 및 더 짧은 버젼의 PDC 종결 영역을 다음과 같이 ald5680 right #20의 TDH3 프로모터 및 3' ald5680 플랭킹 DNA 사이에 추가하였다. 클로닝을 위해 원하는 추가의 제한 부위 및 플랭킹 DNA와 함께, TKL 종결자를 프라이머 0612356 및 0612357로 증폭시켰다. 원하는 PCR 생성물을 어닐링 온도를 위한 온도 구배 및 일부 반응에서 DMSO를 사용하여 증폭시켰다. 4개의 동일한 PCR 반응을 제조하였으며, 각각의 PCR 반응물 (50 μL)은 1 내지 50배의 pACN23 미니-프렙 플라스미드 DNA (도 20) 1 μL, 1X iProof™ HF 버퍼 (Bio-Rad Laboratories), 100 pmol 각각의 프라이머 0612356 및 0612357, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 1 유닛의 iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad Laboratories)를 함유하였다. 4개의 튜브의 두 번째 세트를 반응 각각이 DMSO의 1.5 μL의 추가를 포함했다는 것을 제외하고 상기와 같이 설정하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, X ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 45초 동안 32 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였으며, X = 47.6 ℃, 51.8 ℃, 57.1 ℃, 또는 62.1 ℃이다. DMSO가 있고 없는 PCR을 나타난 각각의 어닐링 온도에 대하여 실행하였다. 열 순환 후, TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 이 겔의 시각화는 가장 높은 어닐링 온도에서 DMSO가 있고 가장 낮은 어닐링 온도에서 DMSO가 없이 수행된 PCR 반응이 원하는 844 bp 생성물의 가장 높은 수득율을 제공한다는 것을 나타냈다. 이들 4개의 PCR을 결합하였고, 약 844개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제한 경우, TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
원하는 PGK1 프로모터 영역의 PCR 증폭을 두 단계 공정으로 수행하였다. 먼저, PGK1 프로모터 DNA를 함유하는 PCR 생성물을 다음 프라이머 0612150 및 0612151로 증폭 후 클로닝하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 3 μL의 pJLJ49 미니-프렙 DNA (도 25), 1X Pfx 증폭 버퍼 (Invitrogen), 2 mM MgSO4, 100 pmol 각각의 프라이머 0612150 및 0612151, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 1.25 유닛 Platinum® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen)를 함유하였다. PCR을 95 ℃에서 2 분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 95 ℃에서 1분 동안, 55 ℃에서 1분 동안, 및 72 ℃에서 3분 동안 25 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 630 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
약 630 bp PCR 생성물을 제조사의 지시에 따라 시퀀싱용 Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit (Invitrogen)를 사용하여 pCR4™BLUNT TOPO® (Invitrogen) 벡터에 클로닝하였다. 6 μL의 총 반응량에서 0.5 또는 4 μL 630 bp PCR 생성물, 1 μL 염용액 (Invitrogen) 및 1 μL pCR4™BLUNT TOPO® (Invitrogen)를 상온에서 15분 동안 함께 배양하였다. 각 클로닝 반응물 2 μL를 제조사의 지시에 따라 One Shot® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 LB+kan 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 EcoRI 분해에 의해 원하는 PCR 생성물의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 PGK1_in_TOPO로 지정하였다.
PGK1_in_TOPO의 PGK1 프로모터를 다음과 같이 PCR 주형으로 사용 전에 분리하였고 정제하였다. PGK1_in_TOPO의 미디-프렙 25 μL를 XbaI 및 PacI로 분해하였고 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 640 bp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
클로닝을 위해 원하는 추가의 제한 부위 및 플랭킹 DNA와 함께, PGK1 프로모터를 온도 구배를 사용하여 프라이머 0612358 및 0612359로 증폭하였다. 8개의 동일한 PCR 반응물을 설정하였고, 각각의 PCR 반응물 (50 μL)은 PGK1_in_TOPO의 XbaI 및 PacI 분해를 통해 정제된 PGK1 프로모터 DNA 20 ng, 1X Herculase 반응 버퍼 (Agilent Technologies), 100 pmol 각각의 프라이머 0612358 및 0612359, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 2.5 유닛의 Herculase HotStart DNA Polymerase (Agilent Technologies)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, X ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 45초 동안 32 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였으며, X = 53.7 ℃, 55.4 ℃, 57.6 ℃, 60.0 ℃, 62.4 ℃, 64.8 ℃, 66.9 ℃, 68.6 ℃이다. 열 순환 후, 각각의 PCR 반응물 10 μL를 TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 이 겔의 시각화는 가장 높은 어닐링 온도로 수행된 4개의 PCR 반응물이 원하는 약 700 bp 생성물의 가장 높은 수득율을 제공한다는 것을 나타냈다. 이들 4개의 PCR을 합쳤고, 약 700개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제한 경우, TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
플라스미드 ald5680_right #20은 PDC 종결 영역으로서 아이. 오리엔탈리스 PDC ORF의 약 870 bp의 영역 다운스트림을 함유한다. 하지만, 이 영역은 종결자로서 적절한 기능에 대하여 필요 이상으로 클 가능성이 있고 그것의 현재 크기로 유지되면 PDC 위치에 대하여 원하지 않는 상동 재조합을 위한 촉매의 역할을 할 수도 있다. 그러므로, 더 작은 버젼으로 ald5680_right #20에서 PDC 종결자를 대체하는 PCR 생성물을 프라이머 0612360 및 0612361로 증폭하였다. 원하는 PCR 생성물을 어닐링 온도에 대한 온도 구배 및 일부 반응에서 DMSO를 사용하여 증폭하였다. 4개의 동일한 PCR 반응물을 설정하였고, 각각의 PCR 반응물 (50 μL)은 1 내지 50배 희석된 pJLJ49 미니-프렙 플라스미드 DNA (도 25) 1 μL, 1X iProof™ HF 버퍼 (Bio-Rad Laboratories), 100 pmol 각각의 프라이머 0612360 및 0612361, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 1 유닛의 iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad Laboratories)를 함유하였다. 4개의 튜브의 두 번째 세트를 반응물 각각이 1.5 μL의 DMSO의 추가를 포함한다는 것을 제외하고 상기와 같이 설정하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, X ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 45초 동안 32 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였으며, X = 47.6 ℃, 51.8 ℃, 57.1 ℃, 또는 62.1 ℃이다. DMSO가 있고 없는 PCR을 나타난 각각의 어닐링 온도에 대하여 실행하였다. 열 순환 후, 각각의 PCR 반응물 10 μL를 TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 이 겔의 시각화는 DMSO를 가지고 수행된 4개의 PCR 반응물이, 어닐링 온도에 관계없이, 원하는 약 338 bp 생성물의 가장 높은 수득율을 제공한다는 것을 나타냈다. 이들 4개의 PCR을 합쳤고, 약 338개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제한 경우, TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
PCR을 약 700 bp PGK1 함유 PCR 생성물을 338 bp PDC 종결자 생성물에 융합하는 단일 증폭 생성물을 생성하기 위해 사용하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 107 ng의 PGK1 함유 PCR 생성물, 56 ng의 PDC 종결자 함유 PCR 생성물, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 100 pmol 각각의 프라이머 0612358 및 0612361, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 1 유닛의 Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 56 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 2분 45초 동안 32 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1020개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
플라스미드 ald5680_right #20을 XbaI 및 NotI로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 5.6 kbp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
상기 정제된 487 bp 및 1020 bp PCR 생성물을 150 ng의 XbaI 및 NotI로 분해된 ald5680_right #20 벡터, 13 ng의 TKL 종결자 PCR 생성물, 28 ng의 PGK1 프로모터-PDC 종결자 PCR 생성물, 1X In-Fusion 반응 버퍼 (Clontech) 및 1 μL의 IN-FUSION™ 효소 (Clontech)로 구성된, 10 μL의 총 반응량에서 IN-FUSION™ Advantage PCR Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 분해된 ald5680_right#20 단편에 삽입하였다. 반응물을 37 ℃에서 15분 동안, 50 ℃에서 15분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 반응물을 40 μL의 TE 버퍼로 희석하였고 2.5 μL를 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 AccI 분해에 의해 원하는 PCR 생성물의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMhCt091로 지정하였다.
플라스미드 pMhCt091은 아이. 오리엔탈리스 URA3 ORF의 3' 단편, 아이. 오리엔탈리스 TDH3 프로모터에 이어서 원하는 유전자의 추가를 위한 NheI 및 AscI 제한 부위, 아이. 오리엔탈리스 TKL 종결자, 아이. 오리엔탈리스 PGK1 프로모터에 이어서 두 번째 원하는 유전자의 추가를 위한 XbaI 및 PacI 제한 부위, 및 3' ald5680 위치에서 상동 재조합을 표적화하는 플랭킹 DNA를 함유하는 빈 오른쪽 아이. 오리엔탈리스 ald5680 표적화 구조물이다.
에스. 아베르미틸리스 panD 버젼 r5 (SEQ ID NO: 146)을 벡터 1075328_SaPanD_r5에서 GeneArt®로 합성하였다. XbaI 및 PacI 제한 부위를 PCR로 pMhCt091의 5' 클로닝 부위로 클로닝을 위해 원하는 NheI 및 AscI 부위로 변화시켰다. PCR 반응물 (50 μL)은 1 내지 50배 희석된 1075328_SaPanD_r5 미니-프렙 플라스미드 DNA (GeneArt®) 1 μL, 1X iProof™ HF 버퍼 (Bio-Rad Laboratories), 100 pmol 각각의 프라이머 0612378 및 0612379, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL DMSO 및 1 유닛의 iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad Laboratories)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 59 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 30초 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 471 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
플라스미드 pMhCt091 (상기)을 NheI 및 AscI로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 6.9 kbp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 panD r5 함유 PCR 생성물을 NheI 및 AscI로 분해된 pMhCt091 벡터 150 ng, panD r5 PCR 생성물 19 ng, 1X In-Fusion 반응 버퍼 (Clontech) 및 1 μL IN-FUSION™ 효소 (Clontech)로 구성된, 10 μL의 총 반응량에서 IN-FUSION™ Advantage PCR Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 분해된 pMhCt091 단편에 삽입하였다. 반응물을 37 ℃에서 15분 동안, 50 ℃에서 15분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 반응물을 40 μL의 TE 버퍼로 희석하였고 2.5 μL를 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 SmaI 분해에 의해 원하는 PCR 생성물의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMhCt093으로 지정하였다.
플라스미드 pMhCt093를 XbaI 및 PacI로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 7.4 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 에스. 아베르미틸리스 panD 버젼 r2 (SEQ ID NO: 147)을 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화하였고 벡터 pMA-T에서 GeneArt®로 합성하였다. 플라스미드를 XbaI 및 PacI로 분해하였고 결과의 단편을 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 약 434 bp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
상기 정제된 ~434 bp 단편을 1X QUICK 결찰 버퍼 (New England Biolabs), XbaI 및 PacI로 분해된 pMhCt093 벡터 2 μL, 상기 ~434 bp 단편 2 μL, 및 1 μL QUICK T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)를 함유하는 결찰 반응물 (20 μL)에서 XbaI 및 PacI로 분해된 pMhCt093 벡터에 클로닝하였다. 결찰 반응물을 상온에서 5분 동안 배양하였고, 튜브를 얼음 위에 두었다. 이 반응물의 5 μL를 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 상온에서 3일 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 XbaI 및 PacI로 분해에 의해 원하는 PCR 생성물의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 분리체 pMhCt094를 이후의 작업을 위해 선택하였다. 오른쪽 구조물에 대한 최종 클로닝 단계는 adh1202 3' 상동 영역을 갖는 pMhCt094에 존재하는 ald5680 3' 상동 영역을 대체하는 것이다. 클로닝을 위해 원하는 추가의 제한 부위 및 플랭킹 DNA와 함께, adh1202 ORF의 서열 3'을 함유하는 PCR 생성물을 프라이머 612472 및 612473으로 증폭하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 1 내지 50배 희석된 pGMEr140 (상기) 미니-프렙 플라스미드 DNA 1 μL, 1X iProof™ HF 버퍼 (Bio-Rad Laboratories), 100 pmol 각각의 프라이머 0612472 및 0612473, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 1 유닛의 iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad Laboratories)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 10초 동안, 59 ℃에서 20초 동안, 72 ℃에서 30초 동안 34 사이클, 72 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 620개의 염기쌍 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다.
상기 PCR 생성물에 대한 수령자 벡터를 생성하기 위해, 플라스미드 pMhCt094를 SacII 및 NotI로 분해하였고, 37 ℃에서 30분 동안 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 7.0 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. PCR 생성물 및 선형 벡터를 SacII 및 NotI로 분해된 pMhCt094 벡터 191 ng, adh1202 3' 상동체 함유 PCR 생성물 36 ng, 1X In-Fusion 반응 버퍼 (Clontech) 1 μL의 IN-FUSION™ 효모 (Clontech)로 구성된, 10 μL의 총 반응량에서 IN-FUSION™ Advantage PCR Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 합쳤다. 반응물을 37 ℃에서 15분 동안, 50 ℃에서 15분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 반응물을 40 μL의 TE 버퍼로 희석하였고 2.5 μL를 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 NsiI 및 PvuI로 분해에 의해 원하는 PCR 생성물의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. NsiI 및 PvuI. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMhCt096 (도 13)로 지정하였다.
플라스미드 pMhCt096은 아이. 오리엔탈리스 URA3 ORF의 3' 단편, 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된 세 번째 에스. 아베르미틸리스 ADC 유전자의 발현을 구동하는 아이. 오리엔탈리스 TDH3 프로모터 (SEQ ID NO: 146), 아이. 오리엔탈리스 TKL 종결자, 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된 네 번째 에스. 아베르미틸리스 ADC 유전자의 발현을 구동하는 아이. 오리엔탈리스 PGK1 프로모터 (SEQ ID NO: 147), 아이. 오리엔탈리스 PDC 종결자, 및 3' adh1202 위치에 대한 상동 재조합을 표적화하는 플랭킹 DNA를 함유하는 오른쪽 아이. 오리엔탈리스 adh1202 표적화 구조물이다.
실시예 3A-9: pdc 위치에서 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC ), β-알라닌 아미노트랜스퍼라제 ( BAAT ), 및 3- 히드록시프로피온산 데히드로게나제 (3-HPDH); 및 adh1202 위치에서 4개의 뉴클레오티드 서열로부터 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC )를 발현하는 효모 균주
상기 실시예 3A-7 및 3A-8은 adh1202 위치에서 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 ADC 유전자의 4개의 뉴클레오티드 변이의 발현을 표적화하는 왼쪽 및 오른쪽 구조물의 생성을 설명한다. 아이. 오리엔탈리스 CNB1에 형질전환 전에, 10 μg의 pMhCt095를 pUC19 백본 벡터로부터 원하는 형질전환 DNA를 방출하기 위해 HpaI 및 SacII로 분해하였다. ~5 kbp 발현 카세트를 함유하는 밴드를 겔 전기영동으로 pUC19 백본 DNA로부터 분리하였고, 겔에서 잘라냈고, 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 30 μL의 용출 버퍼를 용출 단계에 사용하였다. 총 10 μL인 pMhCt095 및 pMhCt096 선형 형질전환 DNA의 등몰의 비율을 균주 yMhCt010 (상기)을 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 ura 선택 플레이트에서 선택하였고 성장을 위해 37 ℃에 두었다. 약 12개의 형질전환체를 다음날 골랐고 단일 콜로니에 대하여 ura 선택 플레이트에 재스트리킹하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 키웠고, 단일 콜로니를 골랐다.
각각의 초기 형질전환체에 의해 발생된 스트리크를 각각 골랐고 ura 선택 플레이트에 재스트리킹하였다. 37 ℃에서 성장의 또 다른 밤 이후, 최종 단일 콜로니를 각각의 스트리크로부터 골랐고 ura 선택 플레이트에 재스트리크하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 키웠다. 단일 콜로니 정제 및 생장의 두 라운드 후에, 여기에 설명된 바와 같이 발생된 원하는 표적화 통합을 확인하기 위해 PCR에 사용되는 게놈 DNA를 제조하였다. 프라이머 0611718은 pMhCt096에 존재하는 PDC 종결 영역에서 결합하는 한편, 프라이머 0611632는 adh1202 위치에서 표적화된 영역의 DNA 3'을 결합하고 안티-센스 방향으로 증폭한다. 이들 프라이머를 가지고 PCR로부터 약 727 bp 밴드의 발생은 adh1202 위치에서 원하는 통합 이벤트의 발생을 나타냈다.
PCR 반응물 (25 μL)은 스크리닝되는 균주에 대한 0.5 μL 게놈 DNA, 1X Crimson Taq™ 반응 버퍼 (New England Biolabs), 25 pmol의 센스 프라이머, 25 pmol의 안티-센스 프라이머, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 및 0.625 유닛의 Crimson Taq™ DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 95 ℃에서 30초 동안 1 사이클 후 이어서 각각 95 ℃에서 30초 동안, 50 ℃에서 30초 동안, 및 68 ℃에서 2.5분 동안 32 사이클, 68 ℃에서 10분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였고 밴드의 크기를 시각화하였고 상기 설명된 바와 같이 설명하였다. 원하는 727 bp 밴드를 제공하는 2개의 독립적으로 분리된 형질전환체를 yMhCt019 또는 95/96 2로 지정하였다 (표 21의 유전자형 참조).
표 21: 형질전환체 유전자형
Figure pct00033
yMhCt019의 ura-유도체를 여기에 설명된 바와 같이 분리하였다. yMhCt019의 다수의 FOA 저항성 콜로니의 게놈 DNA를 프라이머 0611815 및 0612795로 원하는 루프-아웃 이벤트를 위해 PCR로 스크리닝하였다. 프라이머 0611815는 왼쪽 구조물의 RKI 종결자에서 어닐링하고 URA3 프로모터를 향해 증폭시키는 한편, 프라이머 0612795는 (pMhCt096 또는 내인성 adh1202 위치의) 3' adh1202 상동체 내에서 5' 영역을 향해 어닐링한다. 상기 yMhCt019의 분리에 대해 연장 단계의 길이가 3.5분으로 변화한다는 것을 제외하고 설명된 바와 같이 PCR 반응을 수행하였다. 이들 프라이머로 3.7 kbp 밴드의 발생은 원하는 루프-아웃 이벤트가 발생하였고 URA3 프로모터 스카가 변형된 adh1202 위치에 남아있다는 것을 나타내는 한편, 약 5.1 kbp 밴드는 온전한 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 존재를 나타낼 것이며, 원하는 재조합 이벤트가 발생하지 않았다는 것을 나타낸다. 원하는 3.7 kbp 밴드를 제공하는 균주를 유지하였고 yMhCt021로 지정하였다.
adh1202에서 다수의 panD 발현 카세트에 대한 yMhCt021 동형 접합체의 유도체를 분리하기 위해, yMhCt021을 상기 설명된 바와 같이 선형 pMhCt095 및 pMhCt096에 형질전환하였다. 단일 콜로니 정제 및 생장의 두 라운드 후에, 발생된 원하는 표적화 통합을 확인하기 위해 PCR에 사용되는 게놈 DNA를 제조하였다. 잔여 야생형 adh1202 위치에 대하여 pMhCt095 및 pMhCt096 단편의 올바른 표적화를 프라이머 0612891 및 0612893으로 확인하였다. 프라이머 0612891은 pMhCt095의 r1 중단 후에 SaPanD r1의 3' 영역 플러스 PacI 부위의 절반에서 어닐링한다. 프라이머 0612893은 SaPanD r5의 극단의 5' 영역에서 어닐링하고, NheI 부위 및 pMhCt096의 선도를 포함하며, 역 상보성 방향으로 증폭시킨다.
이들 프라이머로 3.2 kbp 밴드의 발생은 yMhCt021의 잔여 adh1202 야생형 위치에서 pMhCt095 및 pMhCt096를 통한 두 번째 통합 이벤트로부터 예상된 바와 같이 온전한 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 존재를 나타내는 한편, 약 1.7 kbp 밴드는 다른 adh1202 위치에서 URA3 스카 부위의 존재 (초기 통합 이벤트 및 이후의 URA3 마커 루프-아웃으로부터)를 나타낼 것이다. 상기 yMhCt019의 분리에 대하여 연장 단계의 길이가 3.5분으로 변화한다는 것을 제외하고 설명된 바와 같이 PCR 반응을 수행하였다. 이들 밴드 크기 둘 다를 제공하는 균주를 yMhCt022로 지정하였다 (표 22의 유전자형 참조).
표 22: 형질전환체 유전자형
Figure pct00034
균주를 여기에서와 같이 셰이크 플라스크에서 키웠고 CFE를 제조하였고 아스파르테이트 데카르복실라제 (ADC) 활성에 대하여 검정하였다. 실험 결과는 표 23A에 나타난다.
표 23A: 형질전환체 효소 활성 데이터
Figure pct00035
균주 MBin500 (대조군), yMhCt019, 95/96-2, yMhCt008 및 yMhCt022로부터 제조된 CFE에서 아스파르테이트 1-데카르복실라제 (ADC), 베타-알라닌 아미노트랜스퍼라제 (BAAT) 및 3HP 데히드로게나제 (3-HPDH) 활성을 비교하였다. 이 실험의 결과는 표 23B에 나타난다.
표 23B: 형질전환체 효소 활성 데이터
Figure pct00036
균주 yMhCt019 및 95/96 2를 또한 여기에 설명된 바와 같이 SDS-PAGE로 분석하였다. 균주 둘 다는 53 kD, 29 kD, ~14 kD, 및 ~3 kD에서 단백질 밴드를 나타냈다. 53 kD 및 29 kD 단백질 밴드의 크기는 UGA1 및 YMR226c 유전자에 의해 암호화된 단백질의 크기와 각각 일치한다. 14 및 3 kD 단백질 밴드의 결합된 크기는 panD 유전자에 의해 암호화된 번역 후 분할 단백질 (post-translationally cleaved protein)과 일치한다. 53 kD, 29 kD, 14 kD 및 3 kD 단백질은 대조군 균주 MBin500의 SDS-PAGE 분석에서 관찰되지 않았다.
여기에 설명된 방법을 사용하여, 균주 MBin500 및 yMhCt019를 3-HP 생산에 대해 바이오리액터에서 평가하였다. 대조군 균주 MBin500는 검출 가능한 3-HP를 생산하지 않았다 (2개의 독립적 발효의 평균). 균주 yMhCt019는 5.23 g/L 3-HP을 생산하였다 (3개의 독립적 발효의 평균).
실시예 3A-10: adh1202 위치에서 4개의 뉴클레오티드 서열로부터 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC )를 발현하는 효모 균주
추가의 구조물을 adh1202 위치에서 비. 리체니포르미스로부터 대안의 ADC를 암호화하는 뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 139)의 4개의 카피를 포함하도록 설계하였다. 상기 설명된 것들과 유사한 접근으로, 왼쪽 및 오른쪽 구조물을 아이. 오리엔탈리스 adh1202 위치에서 상동 재조합을 허용하도록 설계하였다.
왼쪽 단편의 구조물
플라스미드 pMhCt095 (상기)를 여기에 설명된 바와 같이 XbaI 및 PacI로 분해하였고 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 7.3 kbp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
바실루스 리체니포르미스 아스파르테이트 데카르복실라제 (ADC) panD 유전자는 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화되었고 (버젼 1; SEQ ID NO: 149) 합성으로 플라스미드 1110206으로 구성되었다 (GeneArt®). 플라스미드 1110206을 여기에 설명된 바와 같이 XbaI 및 PacI로 분해하였고 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 380 bp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
~380 bp 정제된 단편을 10mM ATP (New England Biolabs), 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)와 함께 분해된 pMhCt095 60.5 ng, 1110206의 380 bp 단편 6.3 ng, 1 μL 10X 결찰 버퍼로 구성된, 10 μL의 총 반응량에서 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 7.3 kbp pMhCt095 선형화 벡터에 결찰하였다. 반응물을 상온에서 1.5시간 동안 배양하였고 반응물의 앨리쿼트 3 μL를 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 XbaI 및 PacI를 사용하는 제한 분해에 의한 적절한 삽입에 대하여 스크리닝하였다. 올바른 분해된 밴드 크기를 수득하는 클론을 pMeJi309로 지정하였다.
플라스미드 pMeJi309를 NheI 및 AscI로 분해하였고 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 7.3 kbp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
바실루스 리체니포르미스 아스파르테이트 데카르복실라제 panD 유전자는 다시 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화되었고 (버젼 2; SEQ ID NO: 148) 합성으로 플라스미드 1110205로 구성되었다 (GeneArt®).
PCR을 50 μL의 최종 부피로 3 μL 1110205, 25 pM 각각의 프라이머 0612695 및 0612724, 1X pfx 증폭 버퍼 (Invitrogen), 2 mM MgSO4, 1.25 유닛 Platinum® pfx DNA Polymerase (Invitrogen)를 함유하는 혼합물에서 수행하였다. 증폭 반응물을 95 ℃에서 2분 동안 1 사이클, 각각 95 ℃에서 1분 동안, 55 ℃에서 1분 동안, 및 72 ℃에서 1분 동안 25 사이클로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)에서 수행하였다.
증폭 반응의 PCR 생성물을 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 400 bp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 93 ng pMeJi309 벡터 단편, 52 ng 상기 PCR 생성물, 2 μL 1X IN-FUSION™ 반응 버퍼 (Clontech), 및 1 μL의 IN-FUSION™ 효소 (Clontech)를 함유하는 반응물에서 IN-FUSION™ Advantage PCR Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 상기 분해된 pMeJi309 벡터에 삽입하였다. 반응물을 37 ℃에서 15분 동안, 50 ℃에서 15분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 반응물의 2.5 μL 샘플을 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 XbaI 및 PacI를 사용하는 제한 분해에 의해 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 올바른 분해된 밴드 크기 DNA를 수득하는 클론을 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMeJi310-2 (도 14)로 지정하였다.
오른쪽 단편의 구조물
플라스미드 pMhCt096 (상기)를 XbaI 및 PacI로 분해하였고 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 4.8 kbp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
바실루스 리체니포르미스 아스파르테이트 데카르복실라제 panD 유전자는 다시 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화되었고 (버젼 3; SEQ ID NO: 151) 합성으로 플라스미드 1110208로 구성되었다 (GeneArt®). 플라스미드 1110208을 XbaI 및 PacI로 분해하였고 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고 약 380 bp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
상기 380 bp 단편을 10mM ATP, 및 1 μL T4 리가제로 72.2 ng 분해된 pMhCt096, 6.9 ng 1110208의 380 bp 단편, 1 μL 10X 결찰 버퍼로 구성된, 10 μL의 총 반응량에서 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 7.3 kbp pMhCt096 선형화 벡터로 결찰하였다. 반응물을 상온에서 1.5시간 동안 배양하였고 반응물의 3 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 NheI 및 AscI를 사용하는 제한 분해에 의해 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 올바른 분해된 밴드 크기를 수득하는 클론을 pMeJi311로 지정하였다.
플라스미드 pMeJi311를 효소 NheI 및 AscI로 분해하였고 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 7.3 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
바실루스 리체니포르미스 아스파르테이트 데카르복실라제 panD 유전자는 다시 아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화되었고 (버젼 4; SEQ ID NO: 150) 합성으로 플라스미드 1110207로 구성되었다 (GeneArt®). PCR을 50 μL의 최종 부피로 3 μL 1110207, 25 pM 각각의 0612698 및 0612725, 1X pfx 증폭 버퍼 (Invitrogen), 2 mM MgSO4, 1.25 유닛 Platinum® pfx DNA Polymerase (Invitrogen)를 함유하는 혼합물에서 수행하였다. 증폭 반응물을 95 ℃에서 2분 동안 1 사이클, 각각 95 ℃에서 1분 동안, 55 ℃에서 1분 동안, 및 72 ℃에서 1분 동안 25 사이클, 및 72 ℃에서 3분 동안 1 사이클로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)에서 수행하였다.
증폭 반응의 PCR 생성물을 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 400 bp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 65.1 ng의 pMeJi311 NheI 내지 AscI 분해된 벡터 단편, 85 ng의 상기 PCR 생성물, 2 μL 1X IN-FUSION™ 반응 버퍼 (Clontech), 및 1 μL의 IN-FUSION™ 효소 (Clontech)를 함유하는 반응물에서 IN-FUSION™ Advantage PCR Cloning Kit (Clontech)를 사용하여 상기 분해된 pMeJi311 벡터에 삽입하였다. 반응물을 37 ℃에서 15분 동안, 50 ℃에서 15분 동안 배양하였고, 얼음 위에 두었다. 반응물의 2.5 μL 샘플을 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 상온에서 2일 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 NheI 및 AscI를 사용하는 제한 분해에 의해 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 올바른 분해된 밴드 크기 DNA를 수득하는 클론을 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였고 pMeJi312-2 (도 15)로 지정하였다.
왼쪽 및 오른쪽 단편의 통합
여기에 설명된 바와 같이 플라스미드 pMeJi310-2를 HpaI 및 SacII로 분해하였고 플라스미드 pMeJi312-2를 EcoRI 및 SacII로 분해하였다. 이것들을 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 2개의 약 5 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
아이. 오리엔탈리스 CNB1을 분해된 pMeJi310-2 및 pMeJi312-2 DNA와 형질전환하였고 올바른 위치 표적화 및 형질전환을 여기에 설명된 바와 같이 Crimson Taq (New England Biolabs) PCR로 확인하였다. 프라이머 0612794 및 0611245는 약 3.17kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 612479 및 0611632는 약 1.48 kbp 밴드를 수득하였다; 및 프라이머 611248 및 612795는 약 2.3 kbp 밴드를 수득하였다. 발현 카세트의 적절한 통합에 대하여 예상된 밴드를 제공하는 균주를 MeJi409-2로 지정하였다. 균주 MeJi409-2의 ura-유도체를 상기 설명된 바와 같이 얻었다.
여기에 설명된 방법을 사용하여, 균주 MBin500 및 MeJi409-2를 3-HP 생산에 대하여 발효 바이오리액터에서 평가하였다. 대조군 균주 MBin500는 검출 가능한 3-HP를 생산하지 않았다 (2개의 독립적 발효의 평균)). 균주 MeJi409-2 (하나의 발효)는 4.62 g/L를 생산하였다. 다른 (예를 들어, 이후의) 발효와 비교하여 이들 발효에서 세포 질량의 양의 차이를 설명하기 위하여, 세포 질량의 유닛 당 3-HP 농도 ([g/L 3-HP]/[g/L 건조 세포 중량]로 표현됨)를 MeJi409-2에 대하여 0.20인 것으로 계산하였다.
실시예 3A-11: adh9091 위치에서 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC ) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 ( AAT )를 발현하는 효모 균주
SEQ ID NO: 14의 아이. 오리엔탈리스 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AAT)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 13)을 프라이머 0611268 및 0611269를 사용하여 아이. 오리엔탈리스 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시켰다. PCR 반응물 (50 μL)은 50 ng의 균주 아이. 오리엔탈리스 게놈 DNA, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611268 및 0611269, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛의 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 1분 30초 동안 32 사이클, 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 1278 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 단편의 5' 말단에 NruI 제한 부위 및 그것의 3' 말단에 PacI 제한 부위를 갖는, 결과의 PCR 단편의 총 길이는 약 1278 bp이다.
AAT 유전자 CDS (SEQ ID NO: 13)를 포함하는 상기 결과의 1278 bp 단편을 pCR2.1-TOPO 벡터에 클로닝하였고 제조사의 지시에 따라 One-Shot TOP10 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 Bam HI 분해에 의해 원하는 단편의 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 시퀀싱으로 확인하였고 pGMEr111로 지정하였다.
플라스미드 pGMEr121 및 pGMEr111을 제한 효소 PacI 및 NruI로 이중-분해하였다. 플라스미드 pGMEr121로부터, 결과의 7695 bp 벡터 단편 및 플라스미드 pGMEr111로부터, AAT 암호화 서열을 포함하는 1272 bp 인서트 단편을 1X TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였고, 겔에서 잘라냈고, 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
결찰 반응을 3 μL의 벡터 단편, 4 μL의 인서트 단편, 2 μL의 멸균 2차 증류수, 10 μL의 2X QUICK 리가제 버퍼 및 1 μL의 QUICK T4 리가제 (QUICK Ligation Kit, New England Biolabs)로 설정하였고 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 상기 결찰 반응물의 5 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 XL10-Gold® Ultracompetent 이. 콜리 세포 (Agilent Technologies)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 SmaI/PpuMI 이중 분해에 의해 원하는 인서트의 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 시퀀싱으로 확인하였고 pGMEr126 (도 16)으로 지정하였다.
플라스미드 pGMEr126는 아이. 오리엔탈리스 AAT 발현 카세트를 포함하며, 여기에서 유전자 전사는 아이. 오리엔탈리스 TDH3 프로모터 및 TKL 종결자에 의해 조절되고, URA3 암호화 서열 및 URA3 프로모터의 절단된 3' 영역, 업스트림에 의해, 및 아이. 오리엔탈리스 adh9091 위치를 갖는 3' 상동 영역, 다운스트림에 의해 플랭크된다.
아이. 오리엔탈리스에서 발현에 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 panD 유전자 (SEQ ID NO: 130)를 프라이머 061166 및 0611662를 사용하여 GeneArt®에서 받은 pMA-T 벡터로부터 PCR 증폭하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 50 ng의 균주 플라스미드 DNA, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611661 및 0611662, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛의 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 59 ℃에서 30초 동안, 72 ℃에서 30초 동안 35 사이클, 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 453 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 단편의 5' 말단에 NruI 제한 부위 및 3' 말단에 ApaI 제한 부위를 갖는 결과의 PCR 단편의 총 길이는 약 453 bp였다.
에스. 아베르미틸리스 panD 유전자의 코돈-최적화된 버젼을 포함하는, 결과의 453 bp 단편을 pCR2.1-TOPO 벡터에 클로닝하였고 제조사의 지시에 따라 One-Shot TOP10 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 EcoRI 분해에 의해 원하는 단편의 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 플라스미드를 시퀀싱으로 확인하였고 pGMEr127로 지정하였다.
플라스미드 pGMEr127 및 pGMEr125(a)를 제한 효소 NruI 및 Apa I로 분해하였다. 분해 반응을 중단하기 전에, 끝을 탈-인산화하고 자가-결찰을 방지하기 위해 1 μL의 소 위장 알칼린 포스파타제 (New England Biolabs)를 pGMEr125(a) 분해물에 추가하였다. 결과의 플라스미드 pGMEr125(a) (상기)의 8818 bp 벡터 단편 및 플라스미드 pGMEr127 (상기)의 에스. 아베르미틸리스 panD 유전자 (SEQ ID NO: 130)의 코돈-최적화된 버젼을 포함하는, 440 bp 인서트 단편을 1X TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였고, 겔에서 잘라냈고, 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
결찰 반응을 4 μL의 벡터 단편, 4 μL의 인서트 단편, 9 μL의 2X QUICK 리가제 버퍼 및 1 μL의 QUICK T4 리가제 (New England Biolabs)로 설정하였고 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 상기 결찰 반응물의 5 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 XL10-Gold® Ultracompetent 이. 콜리 세포 (Stratagene)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 BamHI 분해에 의해 원하는 인서트의 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 확인하였고 pGMEr130 (도 17)으로 지정하였다.
플라스미드 pGMEr130은 다음 단편으로 구성된 구조물을 포함한다: 아이. 오리엔탈리스 adh9091 위치의 5' 플랭크, 아이. 오리엔탈리스 PDC 프로모터/TAL 종결자를 갖는 빈 발현 카세트, 아이. 오리엔탈리스 ENO1 프로모터 및 RKI 종결자에 의해 조절되는 panD 발현 카세트 (SEQ ID NO: 130 함유), 및 아이. 오리엔탈리스 URA3 프로모터에 의해 조절되는 URA3 마커 유전자의 절단된 5' 단편.
효모 균주 아이. 오리엔탈리스 CNB1가 에스. 아베르미틸리스 panD 유전자 (SEQ ID NO: 130) 및 아이. 오리엔탈리스 AAT 유전자 (SEQ ID NO: 13)의 아이. 오리엔탈리스 코돈-최적화된 버젼을 발현할 수 있는지 결정하기 위해, 발현 플라스미드 pGMEr130 및 pGMEr126을 구성하였다. 플라스미드 pGMEr130은 (5'-3'에서) 아이. 오리엔탈리스 adh9091 위치에서 구조물의 게놈 통합을 위한 5' 플랭킹 영역, ENO1 프로모터 및 RKI 종결자에 의해 조절되는 panD 발현 카세트, 및 URA3 프로모터에 의해 구동되는 URA3 선택 마커의 절단된 5' 부분을 포함한다. 플라스미드 pGMEr126은 (5'-3'에서) URA3 선택 마커의 3' 부분, TDH3 프로모터 및 TKL 종결자에 의해 조절되는 AAT 유전자 발현 카세트, 및 아이. 오리엔탈리스 adh9091 위치에서 구조물의 게놈 통합을 위한 3' 플랭크를 포함한다. 모든 프로모터 및 종결자를 아이. 오리엔탈리스로부터 유도하였다.
플라스미드 pGMEr126을 제한 효소 EcoRI로 분해하였으며, 이것은 원하는 4758 bp 단편을 자르는 한편, 플라스미드 pGMEr130를 형질전환에 필요한 5034 bp 단편을 생성하는 제한 효소 HindIII로 분해하였다. 4758 bp 및 5034 bp 단편을 1X TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였고 겔에서 잘라냈고, 및 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
아이. 오리엔탈리스 CNB1을 배양하였고 여기에 설명된 바와 같이 4758 bp 및 5034 bp 선형 단편 둘 다의 약 500 ng로 동시-형질전환하였다. 8개의 형질전환체 균주를 얻었고 셰이크 플라스크에서 배양하였다. 결과의 브로스를 SDS-PAGE를 수행하기 위해 사용하였고,
아이. 오리엔탈리스 (SEQ ID NO: 130)에서 발현에 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 panD 유전자 및 아이. 오리엔탈리스 AAT 유전자 (SEQ ID NO: 130)의 발현을 검출하기 위해 트리스-HCl (Bio-Rad Laboratories) 겔을 사용하였다. 양성 균주를 yGMEr008로 지정하였고 그것의 브로스를 또한 상기 설명된 바와 같이 ADC 및 AAT 활성 수준을 결정하기 위해 사용하였다.
실시예 3A-12: adh9091 위치에서 피루베이트 카르복실라제 ( PYC ), 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC ) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 ( AAT )를 발현하는 효모 균주
SEQ ID NO: 2의 아이. 오리엔탈리스 피루베이트 카르복실라제 (PYC)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 프라이머 0611266 및 0611267을 사용하여 아이. 오리엔탈리스 게놈 DNA로부터 PCR 증폭하였다. PCR 반응물 (50 μL)은 50 ng의 아이. 오리엔탈리스 게놈 DNA, 1X Phusion HF 버퍼 (New England Biolabs), 50 pmol 각각의 프라이머 0611266 및 0611267, 200 μM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 1.5 μL의 100% DMSO (New England Biolabs) 및 1 유닛의 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하였다. PCR을 98 ℃에서 2분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 98 ℃에서 30초 동안, 59 ℃에서 30초 동안, 72 ℃에서 1분 동안 35 사이클, 72 ℃에서 7분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 3557 bp PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 결과의 PCR 단편은 단편의 5' 말단에 XbaI 제한 부위 및 그것의 3' 말단에 PacI 제한 부위를 갖는다.
아이. 오리엔탈리스 PYC 유전자 CDS (SEQ ID NO: 1)를 포함하는, 결과의 3557 bp 단편을 pCR2.1-TOPO 벡터에 클로닝하였고 제조사의 지시에 따라 One-Shot TOP10 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 EcoRI 분해에 의해 원하는 단편의 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 6개의 클론을 확인하였고 pGMEr132.7, pGMEr132.14, pGMEr132.16, pGMEr132.25, pGMEr132.27 및 pGMEr132.30으로 지정하였다. 시퀀싱 분석은 플라스미드 pGMER132.14가 적절한 PYC CDS를 갖지만 CDS 5' 말단에서 XbaI 제한 부위가 없어진다는 것을 나타냈다. 이 제한 부위가 발현 플라스미드 pGMEr125 (변형된 XbaI 부위를 갖는 PYC CDS 상에서 5' 말단을 포함)의 PYC CDS를 삽입하기 위해 필요하기 때문에, 플라스미드 pGMEr132.14의 315 bp HindIII 단편을 플라스미드 pGMEr132.7의 315 bp HindIII 단편으로 대체하였으며, 이것은 올바른 XbaI 부위를 포함하는 PYC CDS의, 바뀌지 않은 5' 말단을 갖는다. 플라스미드 pGMEr132.14의, 결과의 7173 bp HindIII 벡터 단편, 및 플라스미드 pGMEr132.7의 315 bp HindIII 인서트 단편을 1X TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였고, 겔에서 잘라냈고, 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
결찰 반응을 4 μL의 벡터 단편, 5 μL의 인서트 단편, 10 μL의 2X QUICK 리가제 버퍼 및 1 μL의 QUICK T4 리가제 (New England Biolabs)로 설정하였고 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 상기 결찰 반응물의 5 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 One-Shot TOP10 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 BamHI 및 XbaI 이중 분해에 의해 원하는 인서트의 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 확인하였고 pGMEr133으로 지정하였다.
PDC 프로모터의 아이. 오리엔탈리스 PYC CDS 다운스트림을 삽입하기 위해, 플라스미드 pGMEr125(b), 플라스미드 pGMEr125(b) 및 pGMEr133 (상기)를 PacI 및 XbaI로 분해하였다. 플라스미드 pGMEr125(b)의 결과의 8188 bp 벡터 단편, 및 플라스미드 pGMEr133의 아이. 오리엔탈리스 PYC CDS (SEQ ID NO: 1)를 포함하는, 3553 bp 인서트 단편을 1X TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였고, 겔에서 잘라냈고, 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
결찰 반응을 3 μL의 벡터 단편, 6 μL의 인서트 단편, 10 μL의 2X QUICK 리가제 버퍼 및 1 μL의 QUICK T4 리가제 (New England Biolabs)로 설정하였고 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 상기 결찰 반응물의 5 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 One-Shot TOP10 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 BamHI 분해에 의해 원하는 단편의 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 확인하였고 pGMEr136으로 지정하였다.
플라스미드 pGMEr136은 아이. 오리엔탈리스 adh9091 위치의 5' 플랭크, 아이. 오리엔탈리스 PDC 프로모터 및 TAL 종결자에 의해 조절되는 아이. 오리엔탈리스 PYC 유전자 발현 카세트 (SEQ ID NO: 1), 아이. 오리엔탈리스 ENO1 프로모터/RKI 종결자를 갖는 빈 발현 카세트, 및 URA3 프로모터에 의해 조절되는 아이. 오리엔탈리스 URA3 마커 유전자의 절단된 5' 단편을 포함한다.
약 5 μg의 플라스미드 pGMEr136 (상기) 및 4 μg의 플라스미드 pGMEr127을 제한 효소 ApaI 및 NruI로 분해하였다. 플라스미드 pGMEr136의 결과의 11729 bp 벡터 단편, 및 pGMEr127의 아이. 오리엔탈리스 (SEQ ID NO: 130)에서 발현에 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 panD 유전자를 포함하는, 결과의 인서트 단편을 제조사의 지시에 따라 NucleoSpin® Extract II (Macherey-Nagel)를 사용하여 1X TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다.
5 μL의 벡터 단편, 4 μL의 인서트 단편, 9 μL의 2X QUICK 리가제 버퍼 및 1 μL의 QUICK T4 리가제 (New England Biolabs)를 포함하는 결찰 반응을 설정하였다. 반응물을 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 결찰 반응물의 5 μL을 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 BamHI 분해에 의해 원하는 인서트에 대해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 선택하였고 pGMEr137 (도 18)로 지정하였다.
플라스미드 pGMEr137은 아이. 오리엔탈리스 PDC 프로모터 및 TAL 종결자에 의해 전사 조절되는 아이. 오리엔탈리스 PYC 유전자 (SEQ ID NO: 1), 아이. 오리엔탈리스 ENO1 프로모터 및 RKI 종결자에 의해 전사 조절되는 아이. 오리엔탈리스 (SEQ ID NO: 130)에서 발현에 코돈-최적화된 에스. 아베르미틸리스 panD 유전자, URA3 프로모터에 이어서 URA3 마커의 5' 말단 및 아이. 오리엔탈리스 adh9091 위치의 5' 플랭킹 영역을 포함한다.
플라스미드 pGMEr126 (상기)를 제한 효소 EcoRI으로 분해하였으며, 이것은 원하는 4758 bp 단편을 잘랐다; 한편 플라스미드 pGMEr137 (상기)를 8400 bp 단편을 생성하는 제한 효소 HpaI 및 NheI로 분해하였다. 4758 bp 및 8400 bp 단편 둘 다를 1X TBE 버퍼 중의 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다; 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NucleoSpin® Extract II (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 아이. 오리엔탈리스 CNB1을 배양하였고 여기에 설명된 바와 같이 4758 bp 및 8400 bp 선형 단편 약 500 ng에 형질전환하였으며, 형질전환체 yGMEr009를 발생시킨다.
실시예 3A-13: pdc 위치에서 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC ), β-알라닌 아미노트랜스퍼라제 ( BAAT ), 및 3- 히드록시프로피온산 데히드로게나제 (3-HPDH)를 발현하고, adh9091 위치에서 피루베이트 카르복실라제 ( PYC ), 아스파르 테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC ), 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 ( AAT )를 발현하는 효모 균주
이미 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AAT), β-알라닌 아미노트랜스퍼라제 (BAAT), 및 3-HP 데히드로게나제 (3-HPDH)를 과발현하는 균주에서 피루베이트 카르복실라제 (PYC) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AAT) 활성을 증가시키기 위해, 균주 yMhCt010 (상기)을 상기 설명된 바와 같이 pGMEr137 (상기) 및 pGMEr126 (상기)의 선형 단편에 형질전환하였다. 단일 콜로니 정제 및 생장의 두 라운드 후에, 상기 설명된 바와 같이 발생한 원하는 표적화 통합을 확인하기 위해 PCR에 사용되는 게놈 DNA를 제조하였다. pGMEr137 및 pGMEr126 단편의 adh9091 위치로 올바른 표적화를 프라이머 0611814 및 0612055를 사용하여 확인하였다. 프라이머 0611814는 pGMEr126의 TDH3 프로모터의 3' 말단에서 어닐링하고 3' 방향으로 증폭시킨다. 프라이머 0612055는 pGMEr126에 존재하는 adh9091 3' 플랭킹 상동체의 3'을 어닐링하고, 통합 DNA가 상동 재조합을 통해 올바른 위치를 표적화한 경우, 이 프라이머 쌍으로 PCR 생성물의 증폭만이 발생할 것이다. 프라이머 0611814 및 0612055를 함유하는 PCR의 약 3066 bp 밴드의 존재는 adh9091 위치에서 발생한 pGMEr126 및 pGMEr137 단편의 원하는 통합을 나타낸다.
pGMEr137 및 pGMEr126의 선형 단편을 갖는 yMhCt010의 다수의 독립적 형질전환체의 단일 콜로니 정제 및 생장의 두 라운드 후에, 상기 설명된 바와 같이 발생된 원하는 표적화 통합을 확인하기 위해 PCR에 사용되는 게놈 DNA를 제조하였다. 프라이머 0611814 및 0612055를 함유하는 PCR의 약 3066 bp 밴드를 제공하는 3개의 독립적으로 분리된 균주를 yMhCt020, GMErin010#2, 및 GMErin010#3으로 지정하였다. 이들 균주는 pdc 위치 둘 다 및 adh9091 위치 중 하나에서 해당하는 ADC (SEQ ID NO: 17)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 130); pdc 위치 둘 다에서 해당하는 gabT (SEQ ID NO: 24)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 141); pdc 위치 둘 다에서 해당하는 3-HPDH (SEQ ID NO: 129)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 144); adh9091 위치 중 하나에서 해당하는 PYC (SEQ ID NO: 2)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 1); 및 adh9091 위치 중 하나에서 AAT (SEQ ID NO: 14)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다 (표 24 참조).
표 24: 형질전환체 유전자형
Figure pct00037
균주 yMhCt020, GMErin010#2, 및 GMErin010#3를 셰이크 플라스크에서 키웠고 CFE를 제조하였고 PYC, 여기에 사용된 바와 같이 AAT 및 3-HPDH 활성에 대해 검정하였다. 실험 결과는 표 25에 나타난다.
표 25: 형질전환체 효소 활성 데이터
Figure pct00038
표 25의 균주들을 또한 여기에 설명된 바와 같이 SDS-PAGE로 분석하였다. MBin500 및 GMEr009-2는 단백질 밴드가 4개의 다른 샘플에 없는 64 kD인 것을 나타냈다. 이들 단백질의 질량은 아이. 오리엔탈리스 CNB1의 네이티브 피루베이트 데카르복실라제로서 그것들의 정체성과 일치한다. 균주 yMhCt008, yMhCt020, GMErin010 #2, 및 GMErin010#3 53 kD 및 29 kD에서 밴드를 나타냈다. 이들 단백질의 질량은 UGA1 및 YMR226c 유전자에 의해 암호화된 단백질의 질량과 각각 일치한다. 균주 GMEr009-2, yMhCt020, GMErin010 #2, 및 GMErin010 #3 모두는 46.3 kD에서 밴드를 나타냈다. 이들 단백질의 질량은 ATT 유전자에 의해 암호화된 단백질의 질량과 일치한다.
실시예 3A-14: adh1202 위치 둘 다에서 4개의 뉴클레오티드 서열의 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC )를 발현하는 효모 균주
SEQ ID NO: 139 (상기)의 비. 리체니포르미스 ADC를 암호화하는 뉴클레오티드의 4개의 카피를 함유하는 MeJi409-2의 ura3-유도체를 상기 설명된 FOA 카운터-선택 루프-아웃 프로토콜을 사용하여 분리하였다. 모체 균주 MeJi409-2의 다수의 FOA 저항성 콜로니의 게놈 DNA를 프라이머 0611815 및 0611817을 갖는 원하는 루프-아웃 이벤트에 대해 스크리닝하였다. 프라이머 0611815는 왼쪽 구조물의 RKI 종결자에서 어닐링하였고 ura3 프로모터를 향해 증폭시켰다. 프라이머 0611817은 TDH3 프로모터에서 어닐링하였고 ura3 카세트를 향해 증폭시켰다. 828 bp 밴드의 존재는 ura3 스카 부위 (모체 균주에서 2개의 URA3 프로모터 사이에서 상동 재조합 후 단일 URA3 프로모터 왼쪽 뒤)만의 존재를 나타내는 한편, 2.2 kbp의 밴드는 온전한 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 존재를 나타내며, 원하는 재조합 이벤트가 발생하지 않았다는 것을 나타낸다. PCR 반응을 상기 설명된 바와 같이 Crimson Taq™ DNA Polymerase (New England Biolabs)로 수행하였다. 모체 균주 MeJi409-2의 하나의 FOA 저항성 콜로니를 MeJi411로 지정하였고, 원하는 828 bp 밴드를 제공하였다.
왼쪽 및 오른쪽 단편의 통합
여기에 설명된 바와 같이 플라스미드 pMeJi310-2를 HpaI 및 SacII로 분해하였고 및 플라스미드 pMeJi312-2를 EcoRI 및 SacII로 분해하였다. 이것들을 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 2개의 약 5 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
MeJi411를 분해된 pMeJi310-2 및 pMeJi312-2 DNA 및 올바른 위치 표적화에 형질전환하였고 형질전환체를 여기에 설명된 바와 같이 Crimson Taq (New England Biolabs)로 확인하였다. 프라이머 0611225 및 0611632는 약 5 kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 0611815 및 0611632는 ura 마커를 갖는 약 6 kbp 밴드, 및 ura 마커가 없는 4.5 kbp를 수득하였다. 프라이머 0611631 및 0612579는 야생형 adh1202 위치가 온전할 때 (이 밴드를 나타내지 않은 균주를 선택하였다) 약 936 bp 밴드를 수득하였다. 발현 카세트의 적절한 통합에 대하여 예측된 밴드를 제공한 균주를 MeJi412로 지정하였다.
실시예 3A-15: PDC 프로모터에 의해 조절되는 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC )를 암호화하는 뉴클레오티드의 2개의 카피 및 TDH3 프로모터에 의해 조절되는 2개의 카피와 함께, adh1202 위치에서 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 (ADC)를 암호화하는 뉴클레오티드의 4개의 카피를 발현하는 효모 균주
이 실시예는 아이. 오리엔탈리스 PDC 프로모터에 의해 조절되는 2개의 카피 및 아이. 오리엔탈리스 TDH3 프로모터에 의해 조절되는 2개의 카피와 함께, adh1202 위치에서 SEQ ID NO: 139의 비. 리체니포르미스를 암호화하는 뉴클레오티드의 4개의 카피를 포함하도록 설계된 구조물을 설명한다. 상기 설명된 것과 유사한 접근법으로, 왼쪽 및 오른쪽 구조물을 아이. 오리엔탈리스 CNB1 adh1202 위치에서 상동 재조합을 허용하도록 설계하였다.
왼쪽 단편의 구조물
플라스미드 pMeJi310-2 (상기; 도 14 참조)를 XbaI 및 StuI로 분해한 후 이어서 CIP를 처리하였고 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 6.7 kbp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. PDC 프로모터를 NotI로 분해에 의해 pMeJi310-2에서 자른 후 이어서 클레노브로 필-인 (fill-in) 반응시켰고 그 다음 NheI로 분해하였다. 약 708 bp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
정제된 단편의 708 bp를 pMeJi310-2의 6.7 kbp 단편 1 μL, pMeJi310-2의 708 bp 단편 1 또는 5 μL, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 1 μL 10X 결찰 버퍼, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 10 μL의 총 반응량에서 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 6.7 kbp pMeJi310-2 선형화 벡터에 결찰하였다.
반응물을 16 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였고 반응물의 4 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)를 사용하여 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 ApaLI를 사용하는 제한 분해에 의해 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 올바른 분해된 밴드 크기를 수득하는 클론을 pMlBa137로 지정하였다.
오른쪽 단편의 구조물
플라스미드 pMeJi312-2 (상기)를 XbaI 및 StuI로 분해한 후 이어서 CIP를 처리하였고 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 6.8 kbp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
TDH3 프로모터를 PmeI 및 NheI로 분해에 의해 pMeJi312-2에서 잘라냈다. 약 966 bp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
정제된 단편의 966 bp를 pMeJi312-2의 6.8 kbp 1 μL, pMeJi312-2의 966 bp 단편 1 또는 5 μL, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 1 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 10 μL의 총 반응량에서 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 6.8 kbp pMeJi312-2 선형화 벡터에 결찰하였다. 반응물을 16 ℃에서 약 6시간 동안 배양하였고 반응물의 4 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 SalI를 사용하는 제한 분해에 의해 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 올바른 분해된 밴드 크기를 수득하는 클론을 pMlBa136으로 지정하였다.
왼쪽 및 오른쪽 단편의 통합
플라스미드 pMlBa137를 HpaI 및 SacII로 분해하였고 여기에 설명된 바와 같이 플라스미드 pMlBa136을 EcoRI 및 SacII로 분해하였다. 이것들은 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 2개의 약 5 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
아이. 오리엔탈리스 CNB1을 분해된 pMlBa137 및 pMlBa136 DNA에 형질전환하였고 올바른 위치 표적화 및 형질전환을 여기에 설명된 바와 같이 Crimson Taq (New England Biolabs) PCR로 확인하였다. 프라이머 0611717 및 0611631은 약 2.5 kbp 및 955 bp의 밴드를 수득하였다; 프라이머 0611718 및 0611632는 약 733 bp 밴드를 수득하였다; 프라이머 0612794 및 0611245는 약 2.7 kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 0611225 및 0612795는 약 4.2 kbp 밴드를 수득하였다. 발현 카세트의 적절한 통합에 대해 예측된 밴드를 제공하는 균주를 MlBa351로 지정하였다.
MlBa351 로부터 ura 마커의 제거
MlBa351의 ura-유도체를 상기 설명된 바와 같이 분리하였다. MlBa351의 다수의 FOA 저항성 콜로니의 게놈 DNA를 프라이머 0611815 및 0611817로 원하는 루프-아웃에 대해 PCR로 스크리닝하였다. 프라이머 0611815는 왼쪽 구조물의 RKI 종결자에서 어닐링하고 ura3 프로모터를 향해 증폭시킨다. 프라이머 0611817은 TDH3 프로모터에서 어닐링하고 ura3 카세트를 향해 증폭시킨다. 828 bp 밴드의 존재는 원하는 바와 같이 ura3 스카 부위 (모체 균주의 2개의 URA3 프로모터 사이에서 상동 재조합 후 단일 URA3 프로모터 왼쪽 뒤)의 존재를 나타내는 한편, 약 2.2 kbp의 밴드는 온전한 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 존재를 나타내며, 원하는 재조합 이벤트가 발생하지 않았다는 것을 나타낸다.
상기 설명된 바와 같이 Crimson Taq™ DNA Polymerase (New England Biolabs)로 PCR을 수행하였다. 상기 프라이머로 828 bp 단편을 수득하는 FOA 저항성 콜로니를 SEQ ID NO: 139의 비. 리체니포르미스 ADC를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 138의 4개의 카피가 온전하게 남아있다는 것을 확인하기 위해, 2.7 kbp 생성물을 수득하는 프라이머 0612794 및 0611245 및 4 kbp 생성물을 수득하는 프라이머 0611815 및 0612795로 추가로 테스트하였다. 모체 균주 MlBa351의 하나의 FOA 저항성 콜로니를 MlBa353으로 지정하였고, 3개의 프라이머 세트 모두로 원하는 PCR 생성물을 제공하였다.
역 발현 카세트 오른쪽 단편의 구조물
플라스미드 pMlBa136은 정방향으로 가는 2개의 발현 카세트를 함유한다. 동형 접합체 균주의 스크리닝을 용이하게 하기 위해, pMlBa136의 panDbl 발현 카세트가 역방향에 위치하는 경우 새로운 플라스미드를 구성하였다. 플라스미드 pMlBa136 (상기)을 NotI 및 PmeI로 분해한 후 이어서 여기에 설명된 바와 같이 클레노브로 필-인 반응시켰고 및 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 3.4 및 4.4 kbp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. pMlBa136의 4.4 kbp 단편에 CIP를 처리하였고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® PCR Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
pMlBa136의 3.4 kbp 정제된 단편을 pMlBa136의 4.4 kbp 단편 1 μL, pMlBa136의 3.4 kbp 단편 1 또는 5 μL, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 1 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 10 μL의 총 반응량에서 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 4.4 kbp pMlBa136 벡터에 결찰하였다. 반응물을 16 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였고 배양물의 4 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 PacII 및 EcoRI를 사용하는 제한 분해에 의해 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 올바른 분해된 밴드 크기를 수득하는 클론을 pMlBa138로 지정하였다.
왼쪽 및 오른쪽 단편의 통합
플라스미드 pMlBa137을 HpaI 및 SacII로 분해하였고 여기에 설명된 바와 같이 플라스미드 pMlBa138을 EcoRI 및 SacII로 분해하였다. 이들은 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 2개의 약 5 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
MlBa353를 분해된 pMlBa137 및 pMlBa138 DNA에 형질전환하였고 올바른 위치 표적화 및 형질전환을 제조사의 지시에 따라 Phire® Plant Direct PCR Kit (Finnzymes)를 사용하여 PCR로 확인하였다. 프라이머 0611718 및 0611632는 약 733 bp 밴드를 수득하였다 (첫 번째 통합이 존재하는지 확인하기 위해); 프라이머 0612367 및 0611632는 약 960 bp 밴드를 수득하였다 (두 번째 카피가 통합되었는지 확인하기 위해); 프라이머 0611631 및 0612579는 야생형 adh1202 위치가 존재하는 경우 약 936 bp 밴드를 수득하였다 (이 밴드의 결핍은 wt adh1202 위치의 손실을 확인한다). 발현 카세트의 적절한 통합에 대하여 예측된 밴드를 제공하는 2개의 균주를 저장하였고 MlBa355 및 MlBa356으로 지정하였다.
MeJi409 -2, MeJi412 , MlBa351 및 MlBa355 에서 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 활성
균주 MeJi409-2, MeJi412, MlBa351 및 MlBa355를 셰이크 플라스크에서 키웠고 CFE를 제조하였고 여기에 설명된 바와 같이 아스파르테이트 1-데카르복실라제 (ADC) 활성에 대하여 검정하였다. 결과는 표 26에 나타난다. 각 균주에 대한 활성은 2개의 독립적 셰이크 플라스크 배양물의 평균이다. 여기에 설명된 방법을 사용하여, 균주 MeJi409-2, MeJi412, MlBa351 및 MlBa355를 또한 3-HP 생산에 대하여 바이오리액터에서 테스트하였다. 이들 바이오리액터 실험의 결과는 또한 표 26에 나타난다. 이들 발효에서 세포 질량의 차이에 대해 설명하기 위해, 표 26에 나타난 3-HP 생산 능력은 세포 질량의 유닛 당 3-HP 농도로서 표현된다 (g/L 3-HP/g/L 건조 세포 중량으로 표현됨). 결과는 세포에서 ADC 활성의 수준이 증가함에 따라 3-HP 생산 능력이 증가한다는 것을 나타낸다.
표 26: 형질전환체 ADC 활성 및 3-HP 생산 데이터
Figure pct00039
실시예 3A-16: PDC 위치에서 피루베이트 카르복실라제 ( PYC )를 발현하는 플라스미드 구조물
PDC 위치에서 통합에 대하여 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 플라스미드 pANN28 (SEQ ID NO: 2의 아이. 오리엔탈리스 PYC를 암호화함)를 하기 설명된 바와 같이 구성하였다.
아이. 오리엔탈리스 PDC의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 영역을 제조사의 지시에 따라 주형으로 게놈 DNA Pfu 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 프라이머 oANN7 및 oANN8은 업스트림 영역을 플랭킹하는 독특한 제한 부위의 통합을 허용하고 프라이머 oANN9 및 oANN10은 다운스트림 영역을 플랭킹하는 독특한 제한 부위의 통합을 허용하였다. PCR 생성물을 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 각각의 PCR 생성물에 대한 약 800 bp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 TOPO 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였고 제조사의 지시에 따라 일렉트로-컴피턴트 (electro-competent) 이. 콜리 DH10B 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 PCR 생성물을 생성하기 위해 사용된 같은 프라이머로 콜로니 PCR에 의해 적절한 삽입에 대하여 스크리닝하였다. 양성 클론을 추가로 시퀀싱에 의해 확인하였다. 올바른 PDC 다운스트림 플랭크를 수득하는 클론을 pANN04로 지정하였다. 올바른 PDC 업스트림 플랭크를 수득하는 클론을 pANN07로 지정하였다.
플라스미드 pANN04를 ApaI 및 SacI로 분해하였다 (벡터/백본으로 사용됨); 플라스미드 pANN04를 NotI 및 SacI으로 분해하였다; 플라스미드 pANN07을 NotI 및 ApaI로 분해하였다. 각각의 단편을 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 벡터에 대한 약 3.5 kbp의 밴드, 및 각각의 인서트에 대한 약 1 kbp를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 정제된 생성물을 49 ng의 벡터, 120 ng의 다운스트림 인서트, 41 ng의 업스트림 인서트, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 1 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 10 μL의 총 반응량에서 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 결찰하였다. 반응물을 상온에서 30분 동안 배양하였고 반응물의 2 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 일렉트로-컴피턴트 이. 콜리 OneShot TOP10 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 LB + 카나마이신 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 프라이머 oANN7 및 oANN10 (약 1.7 kbp의 밴드를 수득함)로 콜로니 PCR에 의해 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 올바른 삽입물을 수득하는 클론을 pANN12로 지정하였다.
pGMEr137 (상기)의 아이. 오리엔탈리스 PYC 암호화 서열 (SEQ ID NO: 1)을 암호화된 효소의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 3개의 EcoRI 제한 부위를 제거하도록 돌연변이 유발을 지시하는 부위를 변형시켰다. 플라스미드 pGMEr137를 제조사의 지시에 따라 Multi change kit (Stratagene)를 사용하여 상기 언급된 제한 부위의 제거에 사용된 프라이머 oANN13, oANN14 및 oANN15를 갖는 주형으로서 사용하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 EcoRI을 사용하는 제한 분해에 대해 스크리닝하였다. 양성 클론을 시퀀싱으로 추가로 확인하였다. 올바른 pyc 암호화 서열을 수득하는 클론을 pANN14로 지정하였다.
플라스미드 pJY39 (도 29)를 XhoI 및 PacI로 분해하였다; 플라스미드 pACN5 (상기; 도 19 참조)를 XhoI 및 XbaI로 분해하였다; 플라스미드 pANN14를 XbaI 및 PacI로 분해하였다. 각각의 단편을 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 벡터에 대한 약 8 kbp, 첫 번째 인서트에 대한 약 700 bp, 및 PYC를 암호화하는 두 번째 인서트에 대한 약 3.6 kbp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 정제된 생성물을 51 ng의 벡터, 49 ng의 첫 번째 인서트, 210 ng의 두 번째 인서트, 10 mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 1 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 10 μL의 총 반응량에서 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 결찰하였다. 반응물을 상온에서 30분 동안 배양하였고 반응물의 2 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 일렉트로-컴피턴트 이. 콜리 OneShot TOP10 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 LB + 카나마이신 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 프라이머 oJLJ57 및 oJLJ43 (약 1 kbp의 밴드를 수득함), 프라이머 oJLJ45 및 oANN16 (약 730 bp의 밴드를 수득함), 및 프라이머 oANN20 및 oJY45 (약 1.2 kbp의 밴드를 수득함)로 콜로니 PCR에 의해 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 올바른 삽입물을 수득하는 클론을 pANN15로 지정하였다.
플라스미드 pANN12 및 pANN15를 NotI로 분해하였다. 플라스미드 pANN15를 백본의 추가의 분류 및 원하는 단편의 개선된 분리를 위해 추가적으로 NcoI로 분해하였다. 분해된 pANN12를 제조사의 지시에 따라 Qiagen kit를 사용하여 정제하였다. NotI 단편을 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 5 kbp (pANN12) 및 약 6.3 kbp (pANN15)의 밴드를 제조사의 지시에 따라 Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
pANN15의 정제된 생성물을 50 ng의 벡터, 115 ng의 인서트, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 1 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 10 μL의 총 반응량에서 T4리가제를 사용하여 pANN12 선형화 벡터에 결찰하였다. 반응물을 상온에서 1.5시간 동안 배양하였고 반응물의 2 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 일렉트로-컴피턴트 이. 콜리 OneShot TOP10 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 LB + 카나마이신 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 프라이머 oANN20 및 oJY45 (약 1.2 kbp의 밴드를 수득함)로 콜로니 PCR에 의해 적절한 삽입을 위해 스크리닝하였다. 올바른 삽입물을 수득하는 클론을 인서트 방향을 분류하기 위해 SacI/EcoRI로 및 SacI/EcoRV로 제한 효소 분해로 추가로 스크리닝하였다. 업스트림 PDC 플랭크 근처의, ura3 마커를 수득하는 클론을 pANN27로 지정하였다. 다운스트림 PDC 플랭크 근처의, ura3 마커를 수득하는 클론을 pANN28로 지정하였다.
실시예 3A-17: adh1202 위치에서 4개의 뉴클레오티드 서열의 아스파르테이트 1-데 카르복실라 제 ( ADC ) 및 pdc 위치에서 피루베이트 카르복실라제 ( PYC )를 발현하는 효묘 균주
본 실시예는 adh1202 위치에서 SEQ ID NO: 139의 비. 리체니포르미스 ADC를 암호화하는 뉴클레오티드의 4개의 카피 및 pdc 위치에서 SEQ ID NO: 2의 아이. 오리엔탈리스 PYC를 암호화하는 뉴클레오티드를 발현하는 효모 균주의 구조물을 설명한다.
MeJi412 로부터 ura 마커의 제거
MeJi412의 ura-유도체를 상기 설명된 바와 같이 분리하였다. MeJi412의 다수의 FOA 저항성 콜로니를 프라이머 0611815 및 0611817로 원하는 루프-아웃 이벤트에 대해 콜로니 PCR로 스크리닝하였다. 프라이머 0611815는 왼쪽 구조물의 RKI 종결자에서 어닐링하고 ura3 프로모터를 향해 증폭시킨다.　 프라이머 0611817은 TDH3 프로모터에서 어닐링하고 ura3 카세트를 향해 증폭시킨다. 869 bp의 존재는 원하는 바와 같이 ura3 스카 부위 (모체 균주에서 2개의 URA3 프로모터 사이에서 상동 재조합 후 단일 URA3 프로모터 왼쪽 뒤)만의 존재를 나타내는 한편, 약 2.6 kbp의 밴드는 온전한 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 존재를 나타내며, 원하는 재조합 이벤트가 발생하지 않았다는 것을 나타낸다. 상기 설명된 바와 같이 Phire® Plant Direct PCR Kit (Finnzymes)로 PCR 반응을 수행하였다. 상기 프라이머로 869 bp 단편을 수득하는 FOA 저항성 콜로니를 SEQ ID NO: 139의 비. 리체니포르미스 ADC를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 138의 4개의 카피가 온전하게 남아있다는 것을 확인하기 위해, 3.8 kbp 생성물을 수득하는 프라이머 0612794 및 0611817, 및 3.7 kbp 생성물을 수득하는 프라이머 611815 및 612795로 추가로 테스트하였다. 모체 균주 MeJi412의 하나의 FOA 저항성 콜로니는 3개의 프라이머 세트 모두로 원하는 PCR 생성물을 제공하였다.
단편의 통합
플라스미드 pANN28 (상기)를 AscI 및 SacI로 분해하였고 TBE 버퍼 중의 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 7.1 kbp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 겔 Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
균주 MeJi413을 pANN28의 분리되고 정제된 단편에 형질전환하였고 올바른 위치 표적화 및 형질전환을 제조사의 지시에 따라 콜로니 PCR (Failsafe (Failsafe), 믹스 E, Epicenter)로 확인하였다. 프라이머 oANN12 및 oJLJ44는 약 1 kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 oANN11 및 oANN16은 약 1.3 kbp 밴드를 수득하였다. 발현 카세트의 적절한 통합에 대해 예측된 밴드를 제공하는 균주를 yANN35로 지정하였다.
yANN35의 ura-유도체를 상기 설명된 바와 같이 분리하였다. 다수의 FOA 저항성 콜로니를 프라이머 oANN12 및 oJY44로 원하는 루프-아웃 이벤트에 대하여 콜로니 PCR로 스크리닝하였다. 프라이머 oANN12는 다운스트림 플랭킹 영역의 외부에서 어닐링한다. 프라이머 oJY44는 TAL 종결자로 어닐링한다. 1.5 kbp 밴드의 존재는 ura3 스카 부위 (모체 균주에서 2개의 URA3 프로모터 사이에서 상동 재조합 후 단일 URA3 프로모터 왼쪽 뒤)만의 존재를 나타내는 한편, 약 2.8 kbp의 밴드는 온전한 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 존재를 나타내며, 원하는 재조합 이벤트가 발생하지 않았다는 것을 나타낸다. 상기 설명된 바와 같이 Failsafe DNA Polymerase (Epicenter)로 PCR 반응을 수행하였다. 이 이벤트에 양성인 분리체를 프라이머 oANN16 및 oANN11로 콜로니 PCR로 추가로 확인하였다. 하나의 FOA 저항성 콜로니를 yANN37로 지정하였다.
균주 yANN37를 pANN28의 원하는 및 정제된 단편에 형질전환하였고 올바른 위치 표적화 및 형질전환을 제조사의 지시에 따라 콜로니 PCR (Failsafe, 믹스 E, Epicenter)로 확인하였다. 예비 스크리닝을 PDC 유전자에 특이적인 프라이머 oHJJ116 및 oHJJ117로 수행하였다. 약 500 bp의 밴드는 유전자의 존재 및 따라서 원하는 통합에 대한 음성 결과를 나타낸다. PDC의 삭제에 대해 양성인 분리체를 추가의 PCR 반응물로 추가로 확인하였다. 프라이머 oANN11 및 oANN16는 약 1.3 kbp 밴드를 수득하였다. 프라이머 oANN12 및 oJLJ44는 약 1 kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 oANN12 및 oJY44는 약 1.5 kbp 밴드 및 약 2.9 kbp 밴드 (첫 번째 및 두 번째 통합 이벤트 각각에 해당함)를 수득하였다.
추가적으로, adh1202 위치에서 이전의 통합 이벤트를 상기 설명된 바와 같이 콜로니 PCR로 확인하였다. 프라이머 0611631 및 0611245는 약 3.8 kbp 밴드를 수득하였다. 프라이머 0611245 및 oNovo3은 약 3 kbp 밴드를 수득하였다. 프라이머 0611815 및 0612795는 약 3.6 kbp 밴드를 수득하였다. 발현 카세트의 적절한 통합에 대한 예측된 밴드를 제공하는 균주를 yANN41로 지정하였다.
실시예 3A-18: adh1202 위치에서 4개의 뉴클레오티드 서열의 아스파르테이트 1-데 카르복실라 제 ( ADC ) 및 pdc 위치에서 피루베이트 카르복실라제 ( PYC )를 발현하 는 효모 균주
본 실시예는 adh1202 위치에서 SEQ ID NO: 139의 비. 리체니포르미스 ADC를 암호화하는 뉴클레오티드의 4개의 카피 (PDC 프로모터에 의해 조절되는 2개의 카피 및 TDH3 프로모터에 의해 조절되는 2개의 카피와 함께) 및 pdc 위치에서 SEQ ID NO: 2의 아이. 오리엔탈리스 PYC를 암호화하는 뉴클레오티드를 발현하는 효모 균주의 구조물을 설명한다.
MlBa355 의 ura 마커의 제거
MlBa355의 ura-유도체를 상기 설명된 바와 같이 분리하였다. MlBa355의 다수의 FOA 저항성 콜로니의 게놈 DNA를 프라이머 0611815 및 0611718로 원하는 루프-아웃 이벤트에 대해 PCR로 스크리닝하였다. 약 500 bp 밴드의 존재는 원하는 바와 같이 ura3 스카 부위 (모체 균주에서 2개의 URA3 프로모터 사이에서 상동 재조합 후 단일 URA3 프로모터 왼쪽 뒤)만의 존재를 나타내는 한편, 약 1.9 kbp의 밴드는 온전한 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 존재를 나타내며, 원하는 재조합 이벤트가 발생하지 않았다는 것을 나타낸다. PCR을 제조사의 지시에 따라 Phire® Plant Direct PCR kit (Finnzymes)를 사용하여 수행하였다. 상기 프라이머로 약 500 bp 단편을 수득하는 FOA 저항성 콜로니를 SEQ ID NO: 139의 비. 리체니포르미스를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 138의 4개의 카피가 온전하게 남아있다는 것을 확인하기 위해, 3.5 kbp 생성물을 수득하는 프라이머 0611631 및 0611245, 및 4.5 kbp 생성물을 수득하는 프라이머 0611815 및 0611632로 추가로 테스트하였다. 그것들은 adh1202에서 첫 번째 변형이 존재한다는 것을 확인하기 위해 프라이머 0611815 및 0611817을 사용하는 PCR로 테스트하였다. 이들 PCR 프라이머는 828 bp 단편을 수득하였다. 모체 균주 MlBa355의. 하나의 FOA 저항성 콜로니를 MlBa357로 지정하였고, 4개의 프라이머 세트 모두로 원하는 PCR 생성물을 제공하였다
플라스미드 pANN28 (상기)을 AscI 및 SacI로 분해하였고 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 7.1 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
MlBa357을 분해된 pANN28 DNA에 형질전환하였고 올바른 위치 표적화 및 형질전환을 Phire Plant Direct PCR Kit (Finnzymes)를 사용하는 PCR로 확인하였다. 프라이머 0611622 및 0611552는 약 850 bp 밴드를 수득하였다; 프라이머 0611245 및 0612794는 약 2.8 kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 0611815 및 0612795는 약 3.9 kbp 밴드를 수득하였다. 발현 카세트의 적절한 통합에 대해 예측된 밴드를 제공하는 균주를 McTs241로 지정하였다.
McTs241의 ura-유도체를 이전에 설명된 바와 같이 분리하였다. McTs241의 다수의 FOA 저항성 콜로니를 프라이머 0614233 및 0611554로 원하는 루프-아웃 이벤트 및 ura 마이너스 선택 플레이트에서 성장에 대해 PCR로 스크리닝하였다. 4.6 kbp 밴드의 존재는 원하는 바와 같이 ura3 스카 부위 (모체 균주에서 2개의 URA3 프로모터 사이에서 상동 재조합 후 단일 URA3 프로모터 왼쪽 뒤)만의 존재를 나타내는 한편, 약 5.9 kbp의 밴드는 온전한 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 존재를 나타내며, 원하는 재조합 이벤트가 발생하지 않았다는 것을 나타낸다. PCR 반응을 상기 설명된 바와 같이 Phire Plant Direct PCR Kit (Finnzymes)를 사용하여 수행하였다. 원하는 루프-아웃 이벤트를 갖는 모체 균주 McTs241의 하나의 FOA 저항성 콜로니를 McTs247로 지정하였다.
동형 접합체 통합을 생성하기 위해, McTs247을 분해된 pANN28 DNA에 형질전환하였고 올바른 위치 표적화 및 형질전환을 Phire Plant Direct PCR Kit (Finnzymes)를 사용하여 PCR로 확인하였다. 첫 번째 스크리닝으로서 형질전환체를 pdc 위치가 온전하고 따라서 PDC 위치에서 PYC의 동형 접합체 통합이 발생하지 않는 경우에만 약 850 bp 밴드를 수득해야하는 프라이머 0611552 및 0611553을 가지고 PCR로 스크리닝하였다. 본 PCR의 밴드에 음성인 것들을 프라이머 0611555 및 0611554로 추가적인 PCR로 스크리닝하였다. 이들 프라이머로 생성물을 PDC가 온전하고 따라서 PDC 위치에서 PYC의 동형 접합체 통합이 아닌 경우 1.4 kbp 밴드를 증폭시켜야만 한다. 형질전환체의 추가의 스크리닝을 약 850 bp 밴드를 수득하는 프라이머 0611622 및 0611552를 사용하는 PCR로 수행하였다; 프라이머 0611245 및 0612794는 약 2.8 kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 0611815 및 0612795는 약 3.9 kbp 밴드를 수득하였다. 발현 카세트의 적절한 통합에 대해 예측된 밴드를 제공하는 균주를 McTs253으로 지정하였다.
실시예 3A-19: 균주 MeJi412, yANN35, yANN41, MlBa355, McTs241 및 McTs253 의 PYC 활성, ADC 활성 및 3- HP 생산 능력
균주 MeJi412, yANN35, yANN41, MlBa355, McTs241 및 McTs253을 셰이크 플라스크에서 키웠고 CFE를 제조하였고 여기에 설명된 바와 같이 피루베이트 카르복실라제 (PYC) 활성 및 아스파르테이트 1-데카르복실라제 (ADC) 활성에 대하여 검정하였다. 결과는 표 27에 나타난다. 균주 MeJi412, yANN35, yANN41, MlBa355, McTs241 및 McTs253을 또한 여기에 설명된 방법을 사용하여 3-HP 생산에 대해 바이오리액터에서 테스트하였다. 이들 바이오리액터 실험의 결과는 또한 표 27에 나타난다. 이들 발효에서 세포 질량의 차이에 대해 설명하기 위해, 나타난 3-HP 생산 능력은 세포 질량의 유닛 당 3-HP 농도로 표현된다 (g/L 3-HP/g/L 건조 세포 중량으로 표현됨). 결과는 세포의 PYC 활성의 수준이 증가함에 따라, 3-HP 생산 능력이 증가한다는 것을 나타낸다.
표 27: 형질전환체 PYC 및 ADC 활성 및 3-HP 생산 능력
Figure pct00040
실시예 3A-20: adh1202 위치에서 4개의 뉴클레오티드 서열의 아스파르테이트 1-데 카르복실라 제 ( ADC ) 및 베타-알라닌 아미노트랜스퍼라제 ( BAAT )의 삭제를 발현하는 효모 균주
본 실시예는 adh1202 위치에서 SEQ ID NO: 139의 비. 리체니포르미스 ADC를
암호화하는 뉴클레오티드의 4개의 카피 및 성능 및 SEQ ID NO: 20의 BAAT (PYD4)를 암호화하는 네이티브 아이. 오리엔탈리스 유전자의 삭제를 발현하는 효모 균주의 구조물을 설명한다.
아이. 오리엔탈리스 BAAT (PYD4) 삭제 플라스미드의 구조물
플라스미드 pMlBa123 (상기)를 NotI, KpnI, ApaI로 분해하였고 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 3.6 kbp 및 3.8 kbp의 2개의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 이들 2개의 조각은 플라스미드 백본 및 SEQ ID NO: 144의 에스. 세레비시애 3-HPDH 유전자 (YMR226c)를 갖는 ura 선택 카세트를 포함하였다.
업스트림 아이. 오리엔탈리스 PYD4 상동체에 대한 PCR 생성물을 이전에 프라이머 0613178 및 0613180를 사용하는 것으로 설명된 바와 같이 아이. 오리엔탈리스 MBin500 게놈 DNA를 사용하는 PCR 증폭으로 생성하였다. 각각의 프라이머 50 pmol을 50 μL의 최종 부피로 주형으로서 MBin500 게놈 DNA 0.5 μL, 0.2 mM 각각의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 1X Expand High-Fidelity Buffer (Roche), 3.5 U Expand High-Fidelity 효소 믹스 (Roche)를 함유하는 PCR 반응물에 사용하였다. 증폭 반응을 95 ℃에서 3분 동안 1 사이클 및 각각 95 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 1분 동안 30 사이클로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 (Eppendorf)에서 수행하였다. 사이클 후, 반응물을 72 ℃에서 5분 동안 배양하였고 추가로 가공될 때까지 10 ℃로 냉각하였다. 프라이머 0613178 및 0613180를 사용하는 PCR의 약 800 bp 밴드 및 프라이머 0613179 및 0613181을 사용하는 PCR의 약 900 bp 밴드는 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
PYD4 업스트림 PCR 생성물, PYD4 다운스트림 PCR 생성물, 및 pMlBa123 NotI/KpnI/ApaI 분해된 플라스미드를 제조사의 지시에 따라 IN-FUSION HD™ (Clontech Laboratories, Inc.)으로 반응물에 모았다. In-FUSION 반응물 2 μL를 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 회수 단계 후, 형질전환 반응물의 100 μL 앨리쿼트 2개를 mL 당 100 μg 앰피실린이 보충된 150 mM 2X YT 플레이트에 도말하였다. 플레이트를 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 추정의 재조합 클론을 선택 플레이트에서 선택하였고 플라스미드 DNA를 BIOROBOT® 9600 (Qiagen)을 사용하여 각각 제조하였다. 클론을 제한 분해 및 시퀀싱으로 분석하였다. 올바른 서열을 갖는 플라스미드를 시퀀싱으로 확인하였고 pMcTs61로 명명하였다.
플라스미드 pMcTs61은 PDC 프로모터, 에스. 세레비시애의 YMR226c 유전자, 및 PDC 종결자를 함유한다. 이들 원하지 않는 세그먼트를 제거하기 위해, pMcTs61을 EcoRI 및 XhoI로 분해한 후 이어서 블런트 말단을 생성하기 위해 클레노브 단편을 추가하였다. 7.1 kbp 단편을 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 분해된 블런트 플라스미드를 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 사용하여 함께 결찰하였다. 반응 혼합물은 20 μL의 총 부피에서 1X T4 DNA 리가제 버퍼, 1 μL T4 DNA 리가제, 5 μL pMcTs61 분해된 및 블런트화 정제된 DNA를 함유하였다. 반응물을 상온에서 2시간 동안 배양하였다. 결찰 반응물의 10 μL 샘플을 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 회수 단계 후, 형질전환 반응물의 100 μL 앨리쿼트 2개를 mL 당 100 μg 앰피실린이 보충된 150 mM 2X YT 플레이트에 도말하였다. 플레이트를 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 추정의 재조합 클론 선택 플레이트로부터 선택하였다. 클론을 콜로니 PCR로 분석하였다. 각각의 콜로니로부터 주형 DNA를 50 μL 멸균수에 1개의 콜로니를 용해시킴으로써 제조하였고, 95 ℃에서 10분 동안 가열하였고, 이후 사용할 때까지 얼음 위에서 냉각하였다. 프라이머 0612911 및 0612909를 형질전환체를 스크리닝하기 위해 사용하였다. 이들 프라이머로 PCR 반응은 플라스미드가 올바른 경우 1 kbp 밴드를 증폭시킬 것이다. 각각의 프라이머 10 pmol을 20 μL의 최종 부피에서 2 μL 콜로니 DNA 주형, 0.1mM 각각의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 1X Crimson Taq 반응 버퍼 (New England Biolabs), 1 U Crimson Taq DNA Polymerase (New England Biolabs)를 함유하는 PCR 반응물에 사용하였다. 증폭 반응을 95 ℃에서 3분 동안 1 사이클; 및 각각 95 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 3분 동안 30 사이클로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 (Eppendorf)에서 수행하였다. 사이클 후, 반응물을 72 ℃에서 5분 동안 배양하였고 추가로 가공될 때까지 10 ℃에서 냉각하였다. 5 μL의 PCR 반응물에서 1 kbp PCR 단편을 TAE 버퍼 중에 에티듐 브로마이드가 들어있는 1% TAE-아가로스 겔 상에서 시각화하였다. 올바른 크기의 PCR 생성물을 갖는 하나의 형질전환체를 선택하였고 pMcTs64 (도 30)로 명명하였다. pMcTs64의 플라스미드 DNA를 BIOROBOT® 9600 (Qiagen)을 사용하여 제조하였다.
pMcTs64 구조물을 사용하여 MeJi413 으로부터 네이티브 아이. 오리엔탈리스 BAAT ( PYD4 )의 삭제
플라스미드 pMcTs64 (상기; 도 30 참조)를 ApaI, NcoI, KpnI로 분해하였고 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 3.3 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
균주 MeJi413 (상기)을 분해된 pMcTs64 DNA에 형질전환하였고 올바른 위치 표적화 및 형질전환을 Phire Plant Direct PCR Kit (Finnzymes)를 사용하여 PCR로 확인하였다. 프라이머 0612908 및 0613242는 약 1.7 kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 0613241 및 0612909는 삭제 카세트의 통합을 확인하는 약 1.5 kbp 밴드를 수득하였다. 프라이머 0611815 및 0611632는 약 4.2 kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 0611817 및 0611631은 adh1202 위치에서 ADC 카세트가 온전하다는 것을 확인하기 위해 약 4.8 kbp 밴드를 수득한다. 삭제 카세트 및 ADC 카세트의 적절한 통합에 대해 예측된 밴드를 제공하는 균주를 McTs225로 지정하였다.
McTs225의 ura-유도체를 이전에 설명된 바와 같이 분리하였다. McTs225의 다수의 FOA 저항성 콜로니를 프라이머 0612911 및 0612910으로 원하는 루프-아웃 이벤트에 대하여 PCR로 스크리닝하였다. 1.1 kbp 밴드의 존재는 원하는 바와 같이 ura3 스카 부위 (모체 균주에서 2개의 URA3 프로모터 사이에서 상동 재조합 후 단일 URA3 프로모터 왼쪽 뒤)만의 존재를 나타내는 한편, 약 2.5 kbp의 밴드는 온전한 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 존재를 나타내며, 원하는 재조합 이벤트가 발생하지 않았다는 것을 나타낸다. 프라이머 0611815 및 0611632는 약 4.2 kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 0611817 및 0611631은 adh1202 위치에서 ADC 카세트가 온전하다는 것을 확인하기 위해 약 4.8 kbp 밴드를 수득한다. PCR 반응을 상기 설명된 바와 같이 Phire Plant Direct PCR Kit (Finnzymes)를 사용하여 수행하였다. 원하는 루프-아웃 이벤트를 갖는 모체 균주 McTs225의 하나의 FOA 저항성 콜로니를 McTs228로 지정하였다.
SEQ ID NO: 20의 아이. 오리엔탈리스 BAAT (PYD4)를 암호화하는 네이티브 유전자의 동형 접합체 삭제를 생성하기 위해, McTs228을 분해된 pMcTs64에 형질전환하였고 올바른 위치 표적화 및 형질전환을 Phire Plant Direct PCR Kit (Finnzymes)를 사용하여 PCR로 확인하였다. 2개의 프라이머 세트를 PYD4 위치 삭제하도록 PCR로 스크리닝하기 위해 사용하였다. 프라이머 0613550 및 0612910은 PYD4의 동형 접합체 삭제가 발생하지 않았다는 것을 나타내는, PYD4 위치가 온전한 경우 약 700 bp 밴드를 수득한다. 추가적으로 형질전환체를 PYD4가 삭제되지 않은 경우 약 600 bp를 수득하는 프라이머 0612911 및 0613551로 스크리닝하였다. 아이. 오리엔탈리스 PYD4 위치에 음성인 형질전환체를 약 3.5 kbp 및 2.1 kbp 밴드를 수득하는 프라이머 0613242 및 0613243으로 추가로 스크리닝하였다; 프라이머 0612908 및 0613243은 약 1.7 kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 0612909 및 0612911은 약 950 bp 밴드를 수득하였다. 약 4.8 kbp를 수득하는 프라이머 0611817 및 0611631 및 약 4.2 kbp 밴드를 수득하는 프라이머 611815 및 612712를 갖는, adh1202 위치의 ADC 카세트는 온전한 것으로 확인되었다. 발현 카세트의 적절한 통합에 대해 예측된 밴드를 제공하는 균주를 McTs236으로 지정하였다.
McTs236의 ura-유도체를 이전에 설명된 바와 같이 분리하였다. McTs236의 다수의 FOA 저항성 콜로니를 약 2.1 kbp 밴드를 수득하는 프라이머 0613242 및 0613243으로 원하는 루프-아웃 이벤트에 대해 PCR로 스크리닝하였다. 약 3 kbp를 수득하는 프라이머 0611245 및 0612794 및 약 3.6 kbp 밴드를 수득하는 프라이머 0611815 및 0612795를 갖는, ADH1202 위치의 ADC 카세트는 온전한 것으로 확인되었다. 발현 카세트의 적절한 통합에 대해 예측된 밴드를 제공하는 균주를 McTs245로 지정하였다.
여기에 설명된 방법을 사용하여, 균주 MlBa372 및 McTs245를 3-HP 생산에 대해 바이오리액터에서 테스트하였다. 이들 발효에서 세포 질량의 차이를 설명하기 위해, 3-HP 생산 능력은 세포 질량의 유닛 당 3-HP 농도로서 표현된다 (g/L 3-HP/g/L 건조 세포 중량으로 표현됨). 균주 MlBa372 및 McTs245에 대한 g/L 3-HP/g/L 건조 세포 중량은 각각 1.66 및 0.16이었다. 이들 결과는 이 유전자의 삭제가 3-HP 생산 능력의 10배 감소로 이어지기 때문에, 아이. 오리엔탈리스의 네이티브 PYD4 유전자가 베타-알라닌의 말로네이트 세미알데히드로 전환의 원인이 된다는 것을 제안한다.
실시예 3A-21: adh1202 위치에서 4개의 뉴클레오티드 서열의 아스파르테이트 1-데 카르복실라 제 ( ADC ) 및 3- HP 데히드로게나제 (3- HPDH )의 삭제를 발현하는 효모 균주
본 실시예는 adh1202 위치에서 SEQ ID NO: 139의 비. 리체니포르미스 ADC를 암호화하는 뉴클레오티드의 4개의 카피 및 SEQ ID NO: 26의 3-HPDH를 암호화하는 네이티브 아이. 오리엔탈리스 유전자의 삭제를 발현하는 효모 균주의 구조물 및 성능을 설명한다.
아이. 오리엔탈리스 3- HPDH 삭제 플라스미드의 구조물
플라스미드 pMlBa123 (상기)를 NotI, KpnI, ApaI로 분해하였고 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 3.6 kbp 및 3.8 kbp에서 2개의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 이들 2개의 조각은 플라스미드 백본 및 SEQ ID NO: 144의 에스. 세레비시애 3-HPDH 유전자를 갖는 ura 선택 카세트를 포함했다.
업스트림 아이. 오리엔탈리스 3-HPDH 상동체에 대한 PCR 생성물을 프라이머 0613183 및 0613184를 사용하여 이전에 설명된 바와 같이 제조된 아이. 오리엔탈리스 MBin500 게놈 DNA로부터 증폭하였다. 다운스트림 아이. 오리엔탈리스 3-HPDH 상동체 조각을 프라이머 0613185 및 0613186을 사용하여 아이. 오리엔탈리스 MBin500 게놈 DNA로부터 증폭하였다. 각각의 프라이머 50 pmol을 50 μL의 최종 부피에 주형으로서 MBin500 게놈 DNA 0.5, 0.2 mM 각각의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 2% DMSO, 1X Phusion HF 버퍼 (FinnzymeS), 2U Phusion® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes)를 함유하는 PCR 반응물에 사용하였다. 증폭 반응을 95 ℃에서 3분 동안 1 사이클; 및 각각 95 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 1분 동안 30 사이클로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA)에서 수행하였다. 사이클 후, 반응물을 72 ℃에서 5분 동안 배양하였고 추가로 가공될 때까지 10 ℃에서 냉각하였다. 프라이머 0613183 및 0613184의 PCR의 약 640 bp 밴드 및 프라이머 0613185 및 0613186의 PCR의 약 670 bp 밴드를 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
아이. 오리엔탈리스 3-HPDH 업스트림 PCR 생성물, 아이. 오리엔탈리스 3-HPDH 다운스트림 PCR 생성물, 및 pMlBa123 NotI/KpnI/ApaI 분해된 플라스미드를 제조사의 지시에 따라 IN-FUSION HD™ (Clontech Laboratories, Inc.)으로 반응물에 모았다. In-FUSION 반응물의 2 μL을 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 회수 기간 후에, 형질전환 반응물의 2개의 100 μL 앨리쿼트를 mL 당 100 μg 앰피실린이 보충된 150 mM 2X YT 플레이트에 도말하였다. 플레이트를 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 추정의 재조합 클론을 선택 플레이트로부터 선택하였고 플라스미드 DNA를 BIOROBOT® 9600 (Qiagen)를 사용하여 각각 제조하였다. 클론을 제한 분해 및 시퀀싱으로 분석하였다. 올바른 서열을 갖는 플라스미드를 시퀀싱으로 확인하였고 pMcTs60으로 명명하였다.
플라스미드 pMcTs60은 PDC 프로모터, 에스. 세레비시애의 YMR226c 유전자, 및 PDC 종결자를 함유한다. 이들 원하지 않는 세그먼트를 제거하기 위해, pMcTs60을 NotI 및 XbaI로 분해하였고 3-HPDH 상동 영역 및 플라스미드 백본을 함유하는 약 5 kbp 밴드를 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. ura3 선택 카세트를 프라이머 0613416 및 0613417을 갖는 하나 및 프라이머 0613418 및 0613419를 갖는 다른 것의, 2개의 PCR 반응으로 증폭시켰다. 각각의 프라이머 50 pmol을 50 μL의 최종 부피에 주형으로서 pMcTs60 플라스미드 DNA 0.5 μL, 0.2 mM 각각의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 1X Expand High-Fidelity Buffer (Roche), 3.5 U Expand High-Fidelity Enzyme Mix (Roche)를 함유하는 PCR 반응물에 사용하였다. 증폭 반응을 95 ℃에서 3분 동안 1 사이클; 및 각각 95 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 1분 동안 30 사이클로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® 5333 (Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA)에서 수행하였다. 사이클 후, 반응물을 72 ℃에서 5분 동안 배양하였고 추가로 가공될 때까지 10 ℃에서 냉각하였다. 프라이머 0613416 및 0613417의 PCR의 약 700 bp 밴드 및 프라이머 0613418 및 0613419의 PCR의 약 1 kbp 밴드를 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 아이. 오리엔탈리스 3-HPDH 상동 영역을 함유하는 플라스미드 백본 및 ura3 카세트 PCR 생성물을 제조사의 지시에 따라 IN-FUSION HD™ (Clontech Laboratories, Inc.)으로 반응물에 모았다. In-FUSION 반응의 2 μL를 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent Cell (Stratagene)에 형질전환하였다. 회수 기간 후, 형질전환 반응물의 2개의 100 μL 앨리쿼트를 mL 당 100 μg 앰피실린이 보충된 150 mM 2X YT 플레이트에 도말하였다. 플레이트를 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 추정의 재조합 클론을 선택 플레이트로부터 선택하였고 플라스미드 DNA를 BIOROBOT® 9600 (Qiagen)을 사용하여 각각 제조하였다. 클론을 제한 분해로 분석하였고 올바른 제한 분해 패턴을 갖는 플라스미드를 pMcTs65 (도 31)로 명명하였다.
pMcTs65 구조물을 사용하여 MeJi413 으로부터 네이티브 아이. 오리엔탈리스 3-HPDH의 삭제
플라스미드 pMcTs65 (상기; 도 31 참조)를 ApaI, Sph, KpnI로 분해하였고 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 2.9 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
균주 MeJi413 (상기)를 분해된 pMcTs65 DNA에 형질전환하였고 올바른 위치 표적화 및 형질전환을 Phire Plant Direct PCR Kit (Finnzymes)를 사용하여 PCR로 확인하였다. 프라이머 0613034 및 0613035는 삭제 카세트의 통합을 확인하기 위해 약 2.7 kbp 밴드를 수득하였다. 프라이머 0611815 및 0611632는 약 4.2 kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 0611817 및 0611631은 adh1202 위치에서 ADC 카세트가 온전하다는 것을 확인하기 위해 약 4.8 kbp 밴드를 수득하였다. 삭제 카세트 및 ADC 카세트의 적절한 통합에 대해 예측된 밴드를 제공하는 균주를 McTs229로 지정하였다.
McTs229의 ura-유도체를 이전에 설명된 바와 같이 분리하였다. McTs229의 다수의 FOA 저항성 콜로니를 프라이머 0613034 및 0613241로 원하는 루프-아웃 이벤트에 대해 PCR로 스크리닝하였다. 1.4 kbp 밴드의 존재는 원하는 바와 같이 ura3 스카 부위 (모체 균주에서 2개의 URA3 프로모터 사이에서 상동 재조합 후 단일 URA3 프로모터 왼쪽 뒤)만의 존재를 나타내는 한편, 약 2.8 kbp의 밴드는 온전한 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 존재를 나타내며, 원하는 재조합 이벤트가 발생하지 않았다는 것을 나타낸다. 1.9 kbp 밴드의 존재는 이것들이 삭제에 대해 이형 접합체이기 때문에 이들 형질전환체에 존재하는 야생형 위치를 나타낸다. 프라이머 0611815 및 0611632는 약 4.2 kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 0611631 및 0612366은 adh1202 위치에서 ADC 카세트가 온전하다는 것을 확인하기 위해 약 4.5 kbp 밴드를 수득하였다. PCR 반응을 상기 설명된 바와 같이 Phire Plant Direct PCR Kit (Finnzymes)를 사용하여 수행하였다. 원하는 루프-아웃 이벤트를 갖는 모체 균주 McTs225의 하나의 FOA 저항성 콜로니를 McTs238로 지정하였다.
SEQ ID NO: 26의 아이. 오리엔탈리스 3-HPDH를 암호화하는 네이티브 유전자의 동형 접합체 삭제를 생성하기 위해, McTs238을 분해된 pMcTs65에 형질전환하였고 올바른 위치 표적화 및 형질전환을 Phire Plant Direct PCR Kit (Finnzymes)를 사용하여 PCR로 확인하였다. 2개의 프라이머 세트를 YMR226c 위치 삭제에 대해 PCR로 스크리닝하기 위해 사용하였다. 프라이머 0613034 및 0613747은 3-HPDH의 동형 접합체 삭제가 발생하지 않는다는 것을 나타내는 3-HPDH 위치가 온전한 경우 약 500 bp 밴드를 수득할 것이다. 추가적으로 형질전환체를 3-HPDH가 삭제되지 않은 경우 약 660 bp 밴드를 수득하는 프라이머 0613746 및 0613241로 스크리닝하였다.
아이. 오리엔탈리스 3-HPDH 위치에 음성인 야생형인 형질전환체를 약 2.8 kbp 및 1.4 kbp 밴드를 수득하는 프라이머 0613034 및 0613241로 추가에 형질전환하였다; 프라이머 0612908 및 0613241은 약 1.5 kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 0613034 및 0612909는 약 1 kbp 밴드를 수득하였다. 약 3 kbp를 수득하는 프라이머 0611245 및 0612794 및 약 3.6 kbp 밴드를 수득하는 프라이머 0611815 및 0612795를 가지고 ADH1202 위치에서 ADC 카세트가 온전한 것으로 확인하였다. 발현 카세트의 적절한 통합에 대해 예측된 밴드를 갖는 균주를 McTs244로 지정하였다.
McTs244의 ura-유도체를 이전에 설명된 바와 같이 분리하였다. McTs244의 다수의 FOA 저항성 콜로니를 약 1.4 kbp 밴드를 수득하는 프라이머 0613034 및 0613241로 원하는 루프-아웃 이벤트에 대해 PCR로 스크리닝하였다. ADH1202 위치에서 ADC 카세트를 약 3 kbp 밴드를 수득하는 프라이머 0611245 및 0612794 및 약 3.6 kbp 밴드를 수득하는 프라이머 0611815 및 0612795를 가지고 ADH1202 위치에서 ADC 카세트가 온전한 것으로 확인하였다. 루프-아웃 이벤트를 갖는 모체 균주 McTs244의 하나의 FOA 저항성 콜로니를 McTs259로 지정하였다.
여기에 설명된 방법을 사용하여, 균주 MlBa372 및 McTs244를 3-HP 생산에 대해 바이오리액터에서 테스트하였다. 이들 발효에서 세포 질량의 차이를 설명하기 위해, 3-HP 생산 능력은 세포 질량의 유닛 당 3-HP 농도로 표현된다 (g/L 3-HP/g/L 건조 세포 중량으로 표현됨). 균주 MlBa372 및 McTs259에 대한 g/L 3-HP/g/L 건조 세포 중량은 각각 1.66 및 < 0.1이었다. 이들 결과는 이 유전자의 삭제가 3-HP 생산을 폐지하기 때문에, 아이. 오리엔탈리스의 네이티브 3-HPDH가 말로네이트 세미알데히드의 3-HP로 전환의 원인이 된다는 것을 나타낸다.
실시예 3A-22: pdc 위치에서 피루베이트 카르복실라제 ( PYC ), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 ( AAT ), β-알라닌 아미노트랜스퍼라제 ( BAAT ), 및 3- 히드록 시프로피온산 데히드로게나제 (3- HPDH ); 및 adh1202 위치에서 4개의 뉴클레오티드의 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC )를 발현하는 효모 균주
adh1202 위치에서 SEQ ID NO: 139의 비. 리체니포르미스 ADC를 암호화하는 뉴클레오티드의 4개의 카피를 또한 함유하는 균주에서 아이. 오리엔탈리스 pdc 위치에서 SEQ ID NO: 2의 아이. 오리엔탈리스 PYC를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 14의 아이. 오리엔탈리스 AAT를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21의 에스. 클루이베리 BAAT를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 142, 및 SEQ ID NO: 129의 에스. 세레비시애 3-HPDH를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 144를 포함하도록 추가적인 구조물을 설계하였다. 상기 설명된 것과 유사한 접근법으로, 왼쪽 및 오른쪽 구조물을 아이. 오리엔탈리스 CNB1 pdc 위치에서 상동 재조합을 허용하도록 설계하였다. 이들 구조물을 제조하였고 하기 설명된 바와 같이 MlBa357에 형질전환하였다.
왼쪽 단편의 구조물
SEQ ID NO: 14의 아이. 오리엔탈리스 AAT를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 13을 제조사의 지시에 따라 주형 (Pfu Polymerase, Stratagene)으로서 플라스미드 pGMEr126 (도 16)을 사용하여 PCR로 증폭하였다. 프라이머 oANN1 및 oANN2는 유전자 암호화 서열을 플랭킹하는 독특한 제한 부위의 통합을 허용하였다. PCR 생성물을 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 1.3 kbp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 ApaI 및 NruI로 분해하였고 여기에 설명된 바와 같이 겔 정제하였다.
플라스미드 pGMEr135 (ENO1 프로모터/RKI 종결자 인서트가 반대 방향인 것을 제외하고, 상기 pGMEr136과 동일함)를 ApaI 및 NruI로 분해하였고 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 11.7 kbp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
정제된 1.3 kbp PCR 생성물을 49.8 ng의 벡터, 354 ng의 1.3 kbp 인서트, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 1 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 10 μL의 총 반응량의 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 11.7 kbp pGMEr135 선형화 벡터에 결찰하였다. 반응물을 상온에서 30분 동안 배양하였고 반응물의 2 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 일렉트로-컴피턴트 이. 콜리 DH10B 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 LB + 카나마이신 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 프라이머 oHJ2 및 oANN1 (약 2.3 kbp의 밴드를 수득) 및 프라이머 oANN5 및 oANN6 (약 877 bp의 밴드를 수득)로 콜로니 PCR에 의해 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 올바른 삽입물을 수득하는 클론 및 서열을 여기에 설명된 바와 같이 ApaI 및 NruI로 분해하였다. 약 1.3 kbp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
SEQ ID NO: 2의 아이. 오리엔탈리스 PYC를 암호화하는 원하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 1을 함유하는 플라스미드 pGMEr137 (상기; 도 18 참조)를 ApaI 및 NruI로 분해하였고 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 11.7 kbp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
정제된 1.3 kbp PCR 생성물을 49.4 ng의 벡터, 54 ng의 1.3 kbp 인서트, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 1 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 10 μL의 총 반응량의 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 11.7 kbp pGMEr137 선형 벡터에 결찰하였다. 반응물을 상온에서 30분 동안 배양하였고 반응물의 2 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 일렉트로-컴피턴트 이. 콜리 DH10B 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 LB + 카나마이신 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 프라이머 oHJ2 및 oANN1 (약 2.3 kbp의 밴드를 수득함) 및 프라이머 oANN5 및 oANN6 (약 877 bp의 밴드를 수득함)로 콜로니 PCR에 의해 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 올바른 삽입물을 수득하는 클론 및 서열을 pANN02로 지정하였다.
반대 방향으로 서열을 암호화하는 ATT 를 갖는 왼쪽 단편의 구조물
플라스미드 pANN02를 PmeI로 분해하였고 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 10.3 kbp의 밴드 및 약 2.7 kbp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. pANN2의 10.3 kbp 벡터 단편을 CIP (New England Biolabs)로 탈인산화하였고 제조사의 지시에 따라 Purification Kit (Qiagen)로 정제하였다. pANN02의 2.7 kbp 단편을 36 ng의 벡터, 28 ng의 인서트, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 1 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 10 μL의 총 반응량의 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 pANN02의 탈인산화된 10.3 kbp 선형화 벡터에 결찰하였다. 반응물을 상온에서 30분 동안 배양하였고 반응물의 2 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 일렉트로-컴피턴트 이. 콜리 TOP10 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 LB + 카나마이신 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 프라이머 oJY44 및 oHJ1 (약 1.3 kbp의 밴드를 수득함)로 콜로니 PCR로 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 올바른 삽입물을 수득하는 클론을 pANN5로 지정하였다.
오른쪽 단편의 구조물
2개의 비. 리체니포르미스 ADC 암호화 영역 및 아이. 오리엔탈리스 PDC 위치 3' 표적화 플랭킹 DNA를 함유하는 오른쪽 구조물을 다음과 같이 구성하였다. pMhCt071 플라스미드 (에스. 세레비시애 3-HPDH ORF가 아이. 오리엔탈리스에 최적화된 코돈이 아닌 것을 제외하고 상기 pMhCt077과 동일한 플라스미드)를 PmeI 및 PacI로 분해하였고, 10 유닛 소 위장 포스파타제 (New England Biolabs)를 처리하였고, TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, 약 4.7 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit를 사용하여 정제하였다.
플라스미드 pMeJi312-2 (상기; 도 15 참조)를 2개의 비. 리체니포르미스 ADC 발현 카세트를 추출하기 위해 PmeI 및 PacI로 분해하였고 TAE 버퍼 중의 0.9% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 2.8 kbp 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit를 사용하여 정제하였다.
1X QUICK 결찰 버퍼 (New England Biolabs), 1 μL pMhCt071 벡터의 4.7 kbp 단편, 3 μL pMeJi312-2의 2.8 kbp 인서트, 및 1 μL QUICK T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)를 함유하는 결찰 반응물 (20 μL)에서 pMeJi312-2의 이중 비. 리체니포르미스 ADC 암호화 영역을 함유하는 단편을 선형화 pMhCt071 벡터 단편에 결찰하였다. 결찰 반응물을 상온에서 5분 동안 배양하였고, 튜브를 얼음 위에 두었다. 이 반응물 중 5 μL를 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent Technologies)를 형질전환하기 위해 사용하였다. 형질전환체를 2X YT+ amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 ApaLI 분해에 의해 원하는 단편의 적절한 결찰에 대해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 클론을 유지하였고 pMhCt110으로 지정하였다.
플라스미드 pMhCt110을 XbaI 및 PacI로 분해한 후 이어서 CIP를 처리하였고 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 7.1 kbp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
SEQ ID NO: 144의 코돈-최적화된 에스. 세레비시애 3-HPDH 암호화 서열을 XbaI 및 PacI로 분해에 의해 pMlBa123 (상기)로부터 잘라냈고 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 814 bp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 814 bp 정제된 단편을 1 μL의 분해된 pMhCt110, 1 또는 pMlBa123의 814 bp 단편 7 μL, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 1 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 10 μL의 총 반응량의 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 pMhCt110의 7.1 kbp 단편에 결찰하였다. 반응물을 상온에서 30분 동안 배양하였고 반응물의 4 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 상온에서 일주일 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 효소 XbaI 및 PacI 및 AscI 및 PacI의 2개의 조합을 사용하는 제한 분해에 의해 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 각 분해물에서 올바른 분해된 밴드 크기를 수득하는 클론을 pMlBa142로 지정하였다.
플라스미드 pMlBa142를 AscI로 분해한 후 이어서 클레노브로 필-인 반응시켰고 그 다음 NheI로 분해하고 CIP를 처리하였다. 분해물을 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 7.5 kbp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
SEQ ID NO: 21의 에스. 클루이베리 BAAT를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 142를 PacI로 분해에 의해 pMlBa124 (상기)로부터 잘라낸 후 이어서 클레노브로 필-인 반응시켰고 그 다음 XbaI로 분해하였다. 분해물을 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 1.4 kbp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
pMlBa124로부터 1.4 kbp 정제된 단편을 1 μL의 분해된 pMlBa142, pMlBa124의 1.4 단편 7 μL, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 1 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 10 μL의 총 반응량의 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 pMlBa142의 7.5 kbp 단편에 결찰하였다. 반응물을 16 ℃에서 2.5시간 동안 배양하였고 전체 결찰물을 제조사의 지시에 따라 Sure Cell (Agilent)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하엿다. 결과의 형질전환체 중 다수를 StuI 및 PmeI로 제한 분해에 의해 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 올바른 분해된 밴드 크기를 수득하는 클론을 pMlBa144로 지정하였다.
왼쪽 및 오른쪽 단편의 MlBa357 로 통합
여기에 설명된 바와 같이 플라스미드 pANN5를 NotI 및 NheI로 분해하였고 플라스미드 pMlBa144를 NotI로 분해하였다. 이것들을 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, pANN5의 8.2 kbp 단편 및 pMlBa144의 6 kbp 단편을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
MlBa357을 분해된 pANN5 및 pMlBa144 DNA에 형질전환하였고 올바른 위치 표적화 및 형질전환을 제조사의 지시에 따라 Phire® Plant Direct PCR Kit (Finnzymes)를 사용하여 PCR로 확인하였다. 프라이머 0611552 및 0613695는 약 4.1 kbp 밴드를 수득하였다 (pdc 위치에서 왼쪽 절반 통합을 확인하기 위해); 프라이머 0612358 및 0611554는 약 2.5 kbp 밴드를 수득하였다 (pdc 위치에서 오른쪽 절반 통합을 확인하기 위해); 0611245 및 0611631은 약 3.5 kbp 밴드를 수득하였다 (왼쪽 절반 4X ADC 통합이 adh1202 위치에 남아있다는 것을 확인하기 위해); 및 프라이머 0611815 및 0611632는 약 4.6 kbp 밴드를 수득하였다 (오른쪽 절반 4X ADC 통합이 adh1202 위치에 남아있다는 것을 확인하기 위해). pdc 위치에서 발현 카세트의 적절한 통합에 대해 예측된 밴드를 제공하고 adh1202 위치에서 발현 카세트를 유지하는 하나의 분리체를 저장하였고 MlBa360으로 지정하였다.
MlBa360 의 ura 마커의 제거
MlBa360의 ura-유도체를 상기 설명된 바와 같이 분리하였다. MlBa360의 다수의 FOA 저항성 콜로니의 게놈 DNA을 프라이머 0611815 및 0613689로 원하는 루프-아웃 이벤트에 대해 PCR로 스크리닝하였다. 약 1.9 kbp 밴드의 존재는 원하는 바와 같이 ura3 스카 부위 (모체 균주에서 2개의 URA3 프로모터 사이에서 상동 재조합 후 단일 URA3 프로모터 왼쪽 뒤)를 갖는 ura 마커의 제거를 나타내는 한편, 약 3.3 kbp의 밴드는 온전한 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 존재를 나타내며, 원하는 재조합 이벤트가 발생하지 않았다는 것을 나타낸다. PCR을 제조사의 지시에 따라 Phire® Plant Direct PCR kit (Finnzymes)를 사용하여 수행하였다. 상기 프라이머로 약 1.9 kbp 단편을 수득하는 2개의 FOA 저항성 콜로니를 저장하였고 MlBa363 및 MlBa364로 지정하였다.
역 발현 카세트 오른쪽 단편의 구조물
플라스미드 pMlBa144는 원하는 ADC 및 정방향으로 가는 3-HPDH 발현 카세트를 함유한다. 동형 접합체 균주의 스크리닝을 쉽게 하기 위해, pMlBa144의 ADC 발현 카세트가 역방향에 위치하는 경우 새로운 플라스미드를 구성하였다. 플라스미드 pMlBa144 (상기)를 StuI 및 PmeI로 분해하였고 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 여기에 설명된 바와 같이. 약 6.1 kbp 및 2.8 kbp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다. pMlBa144의 6.1 kbp 단편에 CIP를 처리하였고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® PCR Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
pMlBa144의 2.8 kbp 정제된 단편을 pMlBa144의 6.1 kbp 단편 1 μL, pMlBa144의 2.8 kbp 단편 7 μL, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 1 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 10 μL의 총 반응량의 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 6.1 kbp pMlBa144 선형화 벡터에 결찰하였다. 반응물을 16 ℃에서 4시간 동안 배양하였고 반응물의 4 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 SphI 및 XbaI를 사용하는 제한 분해에 의해 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 올바른 분해된 밴드 크기를 수득하는 클론을 pMlBa146으로 지정하였다.
왼쪽 및 오른쪽 단편의 MlBa363 으로 통합
여기에 설명된 바와 같이 플라스미드 pANN5를 NotI 및 NheI로 분해하였고 플라스미드 pMlBa146을 NotI로 분해하였다. 이것들을 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, pANN5의 8.2 kbp 단편 및 pMlBa146의 6.2 kbp 단편을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® PCR Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
MlBa363을 분해된 pANN5 및 pMlBa144 DNA에 형질전환하였고 올바른 위치 표적화 및 형질전환을 제조사의 지시에 따라 Phire® Plant Direct PCR kit (Finnzymes) 또는 Kapa Robust DNA Polymerase를 사용하여 PCR로 확인하였다. pdc 위치에서 통합을 확인하기 위해, 다음 프라이머 쌍을 사용하였다. 프라이머 0613689 및 0611815는 약 1.9 kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 0612366 및 0611554는 약 2.5 kbp 밴드를 수득하였다; 0613688 및 0611815는 약 3.2 kbp 밴드를 수득하였다; 0611622 및 0611552는 약 945 bp 밴드를 수득하였다. adh1202에서 통합을 체크하기 위해 다음 프라이머 쌍을 사용하였다. 프라이머 0611245 및 0612794는 약 2.8 kbp 밴드를 수득하였고 프라이머 0611815 및 0612795는 약 3.9 kbp 밴드를 수득하였다. pdc 위치에서 발현 카세트의 적절한 통합에 대해 예측된 밴드를 제공하고 adh1202 위치에서 발현 카세트를 유지하는 2개의 분리체를 저장하였고 MlBa372 및 MlBa373으로 지정하였다.
MlBa372 의 ura 마커의 제거
MlBa372의 ura-유도체를 상기 설명된 바와 같이 분리하였다. MlBa372의 다수의 FOA 저항성 콜로니의 게놈 DNA을 프라이머 0611815 및 0613688로 원하는 루프-아웃 이벤트에 대해 PCR로 스크리닝하였다. 약 2.1 kbp 밴드의 존재는 원하는 바와 같이 ura3 스카 부위 (모체 균주에서 2개의 URA3 프로모터 사이에서 상동 재조합 후 단일 URA3 프로모터 왼쪽 뒤)를 갖는 ura 마커의 제거를 나타내는 한편, 약 3.3 kbp의 밴드는 온전한 URA3 프로모터-URA3 ORF-URA3 종결자-URA3 프로모터 카세트의 존재를 나타내며, 원하는 재조합 이벤트가 발생하지 않았다는 것을 나타낸다. MlBA372의 FOA 저항성 콜로니를 또한 첫 번째 염색체의 변형을 확인하기 위해 프라이머 0611815 및 0613689 (1.9 kbp 단편을 증폭시킨다) 및 pdc 위치의 손실을 확인하기 위해 0611552 및 0611553 (pdc 위치가 존재하는 경우 850 bp 단편을 증폭시킨다)을 가지고 PCR로 스크리닝하였다. PCR을 제조사의 지시에 따라 Phire® Plant Direct PCR kit (Finnzymes)을 사용하여 수행하였다. 0611815 및 0613689로 약 1.9 kbp 단편을 수득하지만, 0613688 및 0611815 또는 0611552 및 0611553으로 단편을 증폭시키지 않는 FOA 저항성 콜로니를 저장하였고 MlBa375로 지정하였다. MlBa375의 유전자형은 표 28에 나타난다.
표 28: 형질전환체 유전자형
Figure pct00041
실시예 3A-23: 글리세롤 3- 포스페이트 데히드로게나제 ( GPD ) 유전자에 대하여 삭제된 효모 균주
균주 MlBa375 의 GPD 유전자의 삭제
추가적 구조물을 숙주 아이. 오리엔탈리스 게놈의 글리세롤 3-포스페이트 데히드로게나제 유전자 (SEQ ID NO: 117, 이것은 SEQ ID NO: 118의 GPD를 암호화한다)의 카피 둘 다를 삭제하도록 설계하였다. 이들 구조물은 GPD 유전자의 서열 업스트에 대하여 상동성인 약 1003 bp의 뉴클레오티드 서열 및 GPD 유전자의 서열 다운스트림에 대하여 상동성인 약 852 bp의 서열을, 사이에서 클로닝된 a TPDC-URA3 마커 카세트 (PDC 종결자-URA3 프로모터-URA3 유전자-URA3 종결자-URA3 프로모터)와 함께, 함유하였다.
GPD의 영역 업스트림 및 다운스트림을 제조사의 지시에 따라 Pfu DNA Polymerase를 사용하여 아이. 오리엔탈리스 CNB1 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 업스트림 영역은 ApaI 부위를 함유하였다; 이것을 ApaI 인식 서열에서 뉴클레오티드 중 하나에 대하여 미스매치로 설계된 중첩된 프라이머를 사용하는 PCR로 제거하였다. 프라이머 쌍 oACN48/oACN51 및 oACN49/oACN50을 사용하여 업스트림 영역에 대한 이들 2개의 중첩된 단편을 증폭시켰다. 이들 PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 분리하였고 이로부터 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였고, 프라이머 oACN48/oACN49 (정방향 ApaI/역방향 NotI 부위를 가짐)로 PCR의 두 번째 라운드에 대한 주형으로서 사용하였다. 다운스트림 영역을 제조사의 지시에 따라 Pfu DNA Polymerase를 사용하여 아이. 오리엔탈리스 게놈 DNA의 프라이머 oACN52/oACN53 (정방향 NotI/역방향 SacI 부위를 가짐)로 증폭시켰다. PCR 생성물 둘 다를 겔 정제하였고 벡터 pCR® BluntII-TOPO® (Invitrogen)에 별도로 클로닝하였다. 분리체를 플라스미드 DNA의 제한 분해에 의해 원하는 인서트를 갖는 것으로 확인하였고, 시퀀싱으로 확인하였다. 벡터 pACN58은 클로닝된 업스트림 단편을 함유하였고 pACN59는 다운스트림 단편을 함유하였다. 플라스미드 pACN58을 업스트림 플랭크를 방출하기 위해 ApaI/NotI로 분해하였고, 플라스미드 pACN59를 다운스트림 플랭크를 방출하기 위해 SacI/NotI로 분해하였고 pACN59를 백터 백본을 제공하기 위해 ApaI/SacI로 분해하였다. 3개의 원하는 단편을 1% 아가로스 겔 상에서 분리하였고, 잘라냈고 정제하였고, T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하는 3-조각 결찰 반응으로 결찰하였다. 결찰 반응물을 이. 콜리 TOP10 일렉트로컴피턴트 세포에 형질전환하였고 형질전환체를 플라스미드 DNA의 제한 분해로 확인하였다. 이 공정 중에, 다운스트림 영역의 추가적인 SacI 부위를 검출하였으며, 이것은 853 bp의 다운스트림 영역을 생성하였다 (1 kbp에서 반대). 원하는 인서트를 갖는 2개의 분리체를 pACN62 및 pACN63으로 명명하였다.
TPDC1-URA3 카세트를 NotI 분해 및 겔 정제를 사용하여 벡터 pJLJ8 (도 32)로부터 분리하였다. 이 단편을 NotI로 분해되고 탈인산화된 pACN62 (상기)에 결찰하였고, 결찰물을 이. 콜리 DH10B 일렉트로컴피턴트 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. URA3 인서트를 갖는 콜로니를 프라이머 oACN48/oJLJ44 및 oACN48/oJLJ46을 사용하여 PCR로 확인하였다. 프라이머 oJLJ44는 다운스트림 URA3 프로모터의 말단에서 어닐링하고 TPDC1-URA3 카세트로부터 바깥쪽으로 증폭시킨다. 프라이머 oJLJ46은 PDC 종결자의 5' 말단에서 어닐링하고 TPDC1-URA3 카세트로부터 바깥쪽으로 증폭시킨다. 벡터 pHJJ56은 다운스트림 GPD 영역에 직면한 URA3을 함유하고 pHJJ57은 업스트림 GPD 영역에 직면한 URA3을 함유한다.
플라스미드 pHJJ56 및 pHJJ57을 KpnI 및 ApaI로 분해에 의해 선형화하였고 삭제 카세트를 함유하는 단편을 겔 추출로 정제하였다. 선형화된 pHJJ56를 ura-균주 MlBa375에 형질전환하였다. 단일 콜로니를 정제를 위해 재스트리킹하였고 프라이머 oJLJ44, oJLJ46, oACN54 및 oACN55를 사용하여 원하는 GPD 삭제를 위해 PCR로 테스트하였다. 세포를 40 μL Y-용해 버퍼 및 2 μL 지몰리아제 (ZymoResearch)에서 37 ℃에서 30분 동안 용해시켰고 용해 반응물 중 1 μL를 25 μL PCR 반응물에서 사용하였다. PCR 반응물은 55 ℃의 어닐링 온도 및 다음 사이클링 프로파일을 가지고, 제조사의 지시에 따라 Failsafe DNA 폴리머라제 및 버퍼 E를 사용하였다: 94 ℃에서 2분 동안 1 사이클; 각각 94 ℃에서 30초 동안, 55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 1.5분 동안 29 사이클; 및 72 ℃에서 3분 동안 1 사이클. GPD 넉아웃의 하나의 카피를 갖는 균주는 약 0.9 및 1.2 kbp의 밴드를 생산하였고 yHJN1 및 yHJN2로 명명하였다.
균주 yHJN1 및 yHJN2를 YPD 배지에서 하룻밤 동안 키웠고 URA3 마커의 손실로 선택하기 위해 ScD-2X FOA 배지에 도말하였다. 단일 콜로니를 YPD 상에서 정제하였고 ura-표현형을 확인하기 위해 ScD-ura 및 YPD 배지에 패치하였다. Ura-콜로니를 첫 번째 통합을 확인하기 위해 사용된 같은 PCR 반응물을 사용하여 넉아웃을 유지하는지 확인하였다. yHJN1의 ura-유도체를 yHJN3으로 명명하였고 yHJN2의 ura-유도체를 yHJN4로 명명하였다.
선형화된 pHJJ57을 yHJN3 및 yHJN4에 형질전환하였고 단일 콜로니를 ScD-ura 배지 상에서 정제하였다. GPD 넉아웃의 2개의 카피의 존재를 한 반응에서 프라이머 oJLJ44, oACN54, 및 oACN55를 사용하여, 및 두 번째 반응에서 프라이머 oJLJ46, oACN54, 및 oACN55를 사용하여 PCR로 확인하였다. 프라이머 oACN54는 GPD에 대한 업스트림 플랭킹 서열의 약 37 bp 업스트림 영역으로 어닐링하는 한편, oACN55는 다운스트림 플랭크의 약 24 bp 다운스트림 영역으로 어닐링한다. 전 반응은 GPD의 카피 둘 다가 삭제되는 경우 약 900 및 1050 bp의 밴드를 생산하고, 후 반응은 약 1025 및 1200 bp의 밴드를 생산한다. GPD 넉아웃의 2개의 카피를 갖는 콜로니는 삭제의 단일 카피를 갖는 것들보다 ScD-ura 플레이트에서 더 천천히 자랐다. 삭제된 GPD 유전자의 2개의 카피를 갖는 균주를 yHJN7 (yHJN3으로부터 유도됨) 및 yHJN8 (yHJN4로부터 유도됨)로 명명하였다.
균주 MlBa372, yHJN7 및 yHJN8을 여기에 설명된 방법을 사용하여, 글리세롤 생산에 대해 바이오리액터에서 테스트하였다. 균주 MlBa372는 48시간에 29.5 g/L 글리세롤을 생산하였다. 검출 불가능한 글리세롤은 발효 중에 균주 yHJN7 또는 yHJN8에 의해 생산되었다. 최종 발효 브로스에서 글리세롤의 부재는 발효 브로스로부터 3-HP의 회수 및 정제시 이점을 제공할 수도 있다.
3A-24: adh1202 위치에서 4개의 뉴클레오티드 서열의 아스파르테이트 1- 데카르복실라제 ( ADC ), adh9091 위치에서 3- HP 데히드로게나제 (3- HPDH ) 및 네이티브 3-HP 데히드로게나제 (3- HPDH )의 삭제를 발현하는 효모 균주
adh9091 위치에서 아이. 오리엔탈리스 3- HPDH 의 통합을 위한 플라스미드 구조물
SEQ ID NO: 26의 아이. 오리엔탈리스 3-HPDH를 암호화하는 SEQ ID NO: 25 및 SEQ ID NO: 20의 아이. 오리엔탈리스 BAAT (PYD4)를 암호화하는 SEQ ID NO: 19의 뉴클레오티드 서열을 프라이머 0611954 및 0611957 (3-HPDH에 대해) 또는 0611997 및 0611998 (PYD4)을 사용하여 이전에 설명된 바와 같이 제조된 MBin500 아이. 오리엔탈리스 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 증폭 중에 프라이머 0611954는 PYD4의 5' 말단에 kozak 서열 (TAAA) 및 NheI 부위를 추가하였고, 프라이머 0611957은 3-HPDH의 3' 말단에 PacI 부위를 추가하였다. 증폭 중에 프라이머 0611997은 PYD4의 5' 말단에 kozak 서열 (TAAA) 및 PacI 부위를 추가하였고, 프라이머 0611998은 3-HPDH의 3' 말단에 PacI 부위를 추가하였다. 각각의 프라이머의 50 pmol을 50 μL의 최종 부피에 주형으로서 MBin500 게놈 DNA 50 ng, 0.2 mM 각각의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 1X Expand High-Fidelity Buffer (Roche), 및 2.6 유닛의 Expand High-Fidelity DNA Polymerase (Roche)를 함유하는 PCR 반응물에서 사용하였다. PCR을 95 ℃에서 3분 동안 1 사이클 후 이어서 각각 95 ℃에서 1분 동안, 55 ℃에서 1분 동안, 및 72 ℃에서 1분 (3-HPDH PCR) 또는 2분 (PYD4 PCR) 동안 30 사이클, 72 ℃에서 5분 동안 최종 연장으로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific)로 수행하였다. 열 순환 후, 약 831 bp 3-HPDH 또는 1.4 kbp PYD4 PCR 생성물을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, PCR 반응 생성물을 TAE 버퍼 중의 1.0% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 5 μL의 정제된 3-HPDH 또는 PYD4를 제조사의 지시에 따라 TOPO-TA Cloning Kit (Invitrogen)를 사용하여 pCR2.1 (Invitrogen)에 클로닝하였다.
형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 EcoRI으로 분해에 의해 스크리닝하였다. 원하는 인서트 크기를 수득하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 올바른 것으로 확인하였다. 3-HPDH를 함유하는 하나의 클론을 pMBin190으로 지정하였고, PYD4를 함유하는 또 다른 하나를 pMBin193으로 지정하였다.
1.4 kbp PYD4 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, 플라스미드 pMBin193을 XbaI 및 PacI로 분해하였고 TAE 버퍼 중의 1.0% 아가로스 겔에서 실행하였다. 분해된 PYD4 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 XbaI 및 PacI 제한된 선형 pMlBa107 플라스미드 (상기)에 결찰하였다. 결찰 생성물을 제조사의 지시에 따라 One Shot® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 SnaBI 또는 EcoRI로 분해에 의해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 하나의 클론을 pMBin203로 지정하였다. 플라스미드 pMBin203은 다음 발현 카세트를 플랭크하는 NotI 부위를 함유한다: PDC 프로모터 및 PYD4 CDS의 종결자 업 및 다운스트림, URA3 프로모터, URA3 ORF, 및 URA3 종결자에 이어서 URA3 프로모터.
약 4.1 kbp 단편을 (PDC 프로모터, PYD4 CDS, PDC 종결자, 및 URA3 선택 마커를 함유) 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 경우, 플라스미드 pMBin203를 NotI로 분해하였고 TAE 버퍼 중의 1.0% 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 약 5.7 kbp 선형 플라스미드를 상기 설명된 바와 같이 정제한 경우, 플라스미드 pHJJ27 (adh9091 위치에 대한 5' 및 3' 상동 영역 함유; 도 21 참조)를 NotI으로 분해하였고, CIP를 처리하였고 TAE 버퍼 중의 1.0% 아가로스 겔 상에서 분리하였다. pMBin203의 단편을 상기 설명된 바와 같이 T4 DNA 리가제를 사용하여 NotI 제한된 pHJJ27에 결찰하였다. 결찰 생성물을 제조사의 지시에 따라 One Shot® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT + amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 PstI로 분해에 의해 스크리닝하였다. 원하는 밴드 크기를 수득하는 하나의 클론을 pMBin204로 지정하였다. 플라스미드 pMBin204는 adh9091 위치에 대한 PYD4의 표적화를 허용한다.
SEQ ID NO: 26의 아이. 오리엔탈리스 3-HPDH를 암호화하는 SEQ ID NO: 25의 뉴클레오티드 서열을 NheI 및 PacI로 분해에 의해 플라스미드 pMBin190 (상기)으로부터 제거하였고 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 827 bp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 플라스미드 pMBin204 (상기)를 XbaI 및 PacI로 분해하였고 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 8.4 kbp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
상기 정제된 약 827 bp 아이. 오리엔탈리스 3-HPDH 유전자 생성물을 1 μL의 8.4 kbp 벡터, 10 μL의 827 bp 인서트, 10 mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 2 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 20 μL의 총 반응량의 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 8.4 kbp pMBin204 선형화 벡터에 결찰하였다. 반응물을 16 ℃에서 18시간 동안 배양하였고 반응물의 10 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 One Shot TOP10 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 회수 기간 후, 형질전환 반응물의 2개의 100 μL 앨리쿼트를 mL 당 100 μg 앰피실린이 보충된 150 mM 2X YT 플레이트에 도말하였다. 플레이트를 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 추정의 재조합 클론을 선택 플레이트로부터 선택하였고 플라스미드 DNA를 BIOROBOT® 9600 (Qiagen)를 사용하여 각각 제조하였다. 클론을 제한 분해로 분석하였고 올바른 제한 분해 패턴을 갖는 플라스미드를 pMcTs90으로 지정하였다.
adh9091 위치에서 에스 . 세레비시애 3- HPDH 의 통합을 위한 플라스미드 구조물
SEQ ID NO: 129의 에스. 세레비시애 3-HPDH를 암호화하는 826 bp 야생형 뉴클레오티드 서열을 JGI69 게놈 DNA로부터 PCR 증폭하였고 유전자의 5' 말단에서 XbaI 부위 및 유전자의 3' 말단에서 PacI 부위로 수정하였다. 증폭 반응을 제조사의 지시에 따라 Platinum® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. 마스터 PCR 반응물은 200 μL의 최종 부피에 1.125 μL의 에스. 세레비시애 게놈 DNA, 112.5 pM 각각의 프라이머 611191 및 611199, 1X Pfx 증폭 버퍼 (Invitrogen), 2 mM MgSO4, 0.2 mM dNTP 믹스, 5 유닛 Platinum® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen)를 함유하였다. 믹스를 8개의 튜브로 앨리쿼트하였고 구배 PCR을 수행하였다. 증폭 반응물을 95 ℃에서 2분 동안 1 사이클; 각각 95 ℃에서 30초 동안, 구배 40-55 ℃에서 30초 동안, 및 72 ℃에서 2분 동안 30 사이클; 및 72 ℃에서 3분 동안 1 사이클로 프로그램된 EPPENDORF® MASTERCYCLER® (Eppendorf Scientific Inc.)로 수행하였다.
826 bp 야생형 YMR226c PCR 유전자 생성물을 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 826 bp의 단편을 겔에서 잘라냈고 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 아가로스로부터 추출하였다. PCR 생성물을 37 ℃에서 하룻밤 동안 XbaI 및 PacI로 분해하였고 QIAQUICK® PCR Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
플라스미드 pMlBa100 (상기)를 XbaI 및 PacI로 분해한 후 이어서 CIP를 처리하였고 6.8 kbp 선형 단편을 생성하였다. 분해물을 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® PCR Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
826 bp YMR226c 정제된 및 분해된 pCR 단편을 pMlBa100의 6.7 kbp 단편 1 μL, 1 μL 또는 7 μL의 826 bp YMR226c PCR 생성물, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 1 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 10 μL의 총 반응량의 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 6.8 kbp pMlBa100 선형화 벡터에 결찰하였다. 반응물을 16 ℃에서 약 4시간 동안 배양하였고 전체 반응물을 제조사의 지시에 따라 Sure Chemically Competent Cell (Aglient)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 XbaI 및 PacI를 사용하는 제한 분해에 의해 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다. 분해에 의해 올바른 클론을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 올바른 분해된 밴드 크기 및 DNA 서열을 수득하는 클론을 pMlBa101로 지정하였다.
플라스미드 pHJJ76-no ura (상기)를 NotI으로 분해한 후 이어서 CIP를 처리하였다. 선형 5.2 kbp 단편을 QIAQUICK® PCR Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
YMR226c 발현 카세트를 NotI으로 분해에 의해 pMlBa101로부터 잘라냈다. 약 3546 bp에서 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 QIAQUICK® Gel Extraction Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
pMlBa101의 3546 bp 정제된 단편을 pHJJ76-no ura의 5.2 kbp 단편 1 μL, pMlBa101의 3546 bp 단편 1 μL 또는 5 μL, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 1 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 10 μL의 총 반응량의 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 5.2 kbp pHJJ76-no ura 선형화 벡터에 결찰하였다. 반응물을 16 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였고 반응물의 4 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 ONE SHOT® TOP10 화학적 컴피턴트 이. 콜리 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 형질전환체를 2X YT+amp 플레이트에 도말하였고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 결과의 형질전환체 중 다수를 XbaI 및 KpnI를 사용하는 제한 분해에 의해 적절한 삽입에 대해 스크리닝하였다 올바른 분해된 밴드 크기를 수득하는 클론을 pMlBa109로 지정하였다.
SEQ ID NO: 129의 에스. 세레비시애 3-HPDH를 암호화하는 야생형 뉴클레오티드 서열을 XbaI 및 PacI로 분해에 의해 플라스미드 pMlBa109로부터 제거하였고 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 818 bp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
정제된 약 818 bp 에스. 세레비시애 3-HPDH 유전자 생성물을 1 μL의 8.4 kbp 벡터, 10 μL의 818 bp 인서트, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 2 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 20 μL의 총 반응량의 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 상기 8.4 kbp pMBin204 선형화 벡터에 결찰하였다. 반응물을 16 ℃에서 18시간 동안 배양하였고 반응물의 10 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 One Shot TOP10 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다. 회수 기간 후, 형질전환 반응물의 2개의 100 μL 앨리쿼트를 mL 당 100 μg 앰피실린이 보충된 150 mM 2X YT 플레이트에 도말하였다. 플레이트를 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 추정의 재조합 클론을 선택 플레이트로부터 선택하였고 플라스미드 DNA를 BIOROBOT® 9600 (Qiagen)을 사용하여 각각 제조하였다. 클론을 제한 분해로 분석하였고 올바른 제한 분해 패턴을 갖는 플라스미드를 pMcTs91로 지정하였다.
adh9091 위치에서 엠. 세둘라 3- HPDH 의 통합을 위한 플라스미드 구조물
SEQ ID NO: 29의 엠. 세둘라 3-HPDH를 암호화하는 SEQ ID NO: 343의 아이. 오리엔탈리스 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열을 GeneArt®로 합성하였으며 플라스미드 11AAE2AP를 생성하였다. 합성 유전자를 XbaI 및 PacI로 플라스미드로부터 분해하였고 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 959 bp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
정제된 약 959 bp 엠. 세둘라 3-HPDH 유전자 생성물을 1 μL의 8.4 kbp 벡터, 16 μL의 959 bp 인서트, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 2 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 20 μL의 총 반응량의 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 상기 8.4 kbp pMBin204 선형화 벡터에 결찰하였다. 반응물을 상온에서 1시간 동안 배양하였고 반응물의 10 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent)에 형질전환하였다. 회수 기간 후, 형질전환 반응물의 2개의 100 μL 앨리쿼트를 mL 당 100 μg 앰피실린이 보충된 150 mM 2X YT 플레이트에 도말하였다. 플레이트를 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 추정의 재조합 클론을 선택 플레이트로부터 선택하였고 플라스미드 DNABIOROBOT® 9600 (Qiagen)을 사용하여 각각 제조하였다. 클론을 제한 분해로 분석하였고 올바른 제한 분해 패턴을 갖는 플라스미드를 pMcTs76으로 지정하였다.
adh9091 위치에서 이. 콜리의 통합을 위한 플라스미드 구조물
SEQ ID NO: 27의 이. 콜리 3-HPDH를 암호화하는 SEQ ID NO: 143의 아이. 오리엔탈리스 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열을 GeneArt®로 합성하였으며 플라스미드 1045168를 생성하였다. 합성 유전자를 XbaI 및 PacI로 플라스미드로부터 분해하였고 여기에 설명된 바와 같이 TBE 버퍼 중의 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. 약 761 bp의 밴드를 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
정제된 약 761 bp 이. 콜리 3-HPDH 유전자 생성물을 1 μL의 8.4 kbp 벡터, 16 μL의 761 bp 인서트, 10mM ATP (New England Biolabs)가 들어있는 10X 결찰 버퍼 2 μL, 및 1 μL T4 리가제 (New England Biolabs)로 구성된, 20 μL의 총 반응량의 T4 리가제 (New England Biolabs)를 사용하여 상기 8.4 kbp pMBin204 선형화 벡터에 결찰하였다. 반응물을 상온에서 1시간 동안 배양하였고 반응물의 10 μL 앨리쿼트를 제조사의 지시에 따라 SoloPack Gold SuperCompetent 세포 (Agilent)에 형질전환하였다. 회수 기간 후, 형질전환 반응물의 2개의 100 μL 앨리쿼트를 mL 당 100 μg 앰피실린이 보충된 150 mM 2X YT 플레이트에 도말하였다. 플레이트를 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 추정의 재조합 클론을 선택 플레이트로부터 선택하였고 플라스미드 DNABIOROBOT® 9600 (Qiagen)을 사용하여 각각 제조하였다. 클론을 제한 분해로 분석하였고 올바른 제한 분해 패턴을 갖는 플라스미드를 pMcTs77로 지정하였다.
McTs259 의 adh9091 에서 3- HPDH 단편의 통합
여기에 설명된 바와 같이 플라스미드 pMcTs76, pMcTs77, pMcTs91을 KpnI 및 ApaI로 분해하였고, 플라스미드 pMcTs90을 SacI 및 ApaI로 분해하였다. 결과의 분해 생성물을 TBE 버퍼 중의 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였고, pMcTs76의 5.5 kbp 단편, pMcTs77의 5.3 kbp 단편, pMcTs90의 5.4 kbp 단편, 및 pMcTs91의 5.4 kbp 단편을 겔에서 잘라냈고 제조사의 지시에 따라 NUCLEOSPIN® Extract II Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다.
adh1202 위치에서 SEQ ID NO: 139의 비. 리체니포르미스 ADC를 암호화하는 뉴클레오티드의 4개의 카피 및 SEQ ID NO: 26 (상기)의 3-HPDH를 암호화하는 네이티브 아이. 오리엔탈리스 유전자의 삭제를 발현하는 균주 McTs259를 분해된 pMcTs76, pMcTs77, pMcTs90, 또는 pMcTs91 DNA에 형질전환하였다. 올바른 위치 표적화 및 형질전환을 제조사의 지시에 따라 Phire® Plant Direct PCR kit (Finnzymes)를 사용하여 PCR로 확인하였다. adh9091 위치에서 통합을 확인하기 위해, 다음 프라이머 쌍을 사용하였다. 프라이머 0614627 및 0612909는 통합된 pMcTs76의 단편에 대한 약 3.47 kbp 밴드, 통합된 pMcTs77의 단편에 대한 약 3.27 kbp 밴드, 통합된 pMcTs90의 단편에 대한 약 3.34 kbp 밴드, 통합된 pMcTs91의 단편에 대한 약 3.33 kbp 밴드를 수득하였다; 프라이머 0612908 및 0614626은 약 1.97 kbp 밴드를 수득하였다. adh1202에서 통합을 체크하기 위해 다음 프라이머 쌍을 사용하였다. 프라이머 0611245 및 0612794는 약 3.0 kbp 밴드를 수득하였고 프라이머 0611815 및 0612795는 약 3.6 kbp 밴드를 수득하였다. 네이티브 아이. 오리엔탈리스 3-HPDH 유전자의 삭제를 체크하기 위해 다음 프라이머를 사용하였다. 프라이머 0613034 및 0613241은 약 1.4 kbp 밴드를 수득하였다. adh9091 위치에서 발현 카세트의 적절한 통합에 대해 예측된 밴드를 제공하고, adh1202에서 발현 카세트를 유지하고 아이. 오리엔탈리스 3-HPDH 위치에서 삭제를 유지하는 분리체를 저장하였고 표 29에 나타난 바와 같이 McTs261 (pMcTs76 단편), McTs263 (pMcTs77 단편), McTs267 (pMcTs90 단편), 및 McTs269 (pMcTs91 단편)로 지정하였다.
표 29: 형질전환체 구조물
Figure pct00042
형질전환체 균주를 상기 설명된 셰이크 플라스크 방법을 사용하여 3-HP 생산에 대해 테스트하였다. 이형 접합 형질전환체 McTs267, McTs269, 및 McTs263은 각각 g/L 건조 세포 중량 당 0.149 (+/- 0.024), 0.168 (+/- 0.052), 0.162 (+/- 0.018) g/L 3-HP을 생산하였다. 네이티브 균주 MeJi412는 g/L 건조 세포 중량 당 263 (+/- 0.026) g/L 3-HP를 생산하였고 3-HPDH 삭제 균주는 검출 가능한 3-HP를 생산하지 않았다. 이형 접합 형질전환체 McTs261은 이 실험으로 검출 가능한 3-HP를 생산하지 않았다. 이 결과들은 이형 접합 3-HPDH 형질전환체가 외인성 또는 내인성 3-HPDH 유전자 서열을 사용하여 3-HPDH 삭제 균주의 일부 3-HPDH 활성을 회복할 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 3B: 말레이트 경로 유전자를 발현하는 변형된 효모 균주
PEP, OAA, 및 말레이트 중간물을 이용하는 경로를 통해 3-HP를 생산하는 효모 세포는 경로에 수반되는 하나 이상의 효소를 발현함으로써 조작될 수 있다. 발현된 유전자는 하나 이상의 PPC, 말레이트 데히드로게나제, 및 말레이트 데카르복실라제 유전자를 포함할 수도 있다. 발현된 유전자는 숙주 세포에 비-네이티브인 근원 유전자로부터 유도될 수도 있다.
실시예 3C: 말로네이트 세미알데히드 경로 유전자를 발현하는 변형된 효모 균주
PEP, OAA, 및 말레이트 중간물을 이용하는 경로를 통해 3-HP를 생산하는 효모 세포는 경로에 수반되는 하나 이상의 효소를 발현함으로써 조작될 수 있다. 발현된 유전자는 PPC, 2-케토산 데카르복실라제, KGD, BCKA, 인돌피루베이트 데카르복실라제, 3-HPDH (말로네이트 세미알데히드 리덕타제 등), HIBADH, 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 발현된 유전자는 숙주 세포에 네이티브인 유전자로부터 유도될 수도 있거나, 그것들은 숙주 세포에 비-네이티브인 근원 유전자로부터 유도될 수도 있다.
실시예 3D: 말로닐 - CoA 경로 유전자를 발현하는 변형된 효모 균주
PEP, OAA, 말로닐-CoA, 및, 선택적으로, 말로네이트 세미알데히드 중간물을 이용하는 경로를 통해 3-HP를 생산하는 효모 세포는 경로에 수반되는 하나 이상의 효소를 발현함으로써 조작될 수 있다. 발현된 유전자는 PPC, OAA 포르마테리아제, 말로닐-CoA 리덕타제, CoA 아실화 말로네이트 세미알데히드 데히드로게나제, 3-HPDH (말로네이트 세미알데히드 리덕타제 등), HIBADH, 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 발현된 유전자는 숙주 세포에 네이티브인 유전자로부터 유도될 수도 있거나, 그것들은 숙주 세포에 비-네이티브인 근원 유전자로부터 유도될 수도 있다.
실시예 3E: 말로닐 - CoA 경로 유전자를 발현하는 변형된 효모 균주
피루베이트, 아세틸-CoA, 말로닐-CoA, 및, 선택적으로, 말로네이트 세미알데히드 중간물을 이용하는 경로를 통해 3-HP를 생산하는 효모 세포는 경로에 수반되는 하나 이상의 효소를 발현함으로써 조작될 수 있다. 발현된 유전자는 PDH, 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA 리덕타제, CoA 아실화 말로네이트 세미알데히드 데히드로게나제, 3-HPDH (말로네이트 세미알데히드 리덕타제 등), HIBADH, 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 발현된 유전자는 숙주 세포에 네이티브인 유전자로부터 유도될 수도 있거나, 그것들은 숙주 세포에 비-네이티브인 근원 유전자로부터 유도될 수도 있다.
실시예 3F: 알라닌 경로 유전자를 발현하는 변형된 효모 균주
피루베이트, 알라닌, β-알라닌, 및, 선택적으로, 말로네이트 세미알데히드, β-알라닐-CoA, 아크릴일-CoA, 및 3-HP-CoA 중간물을 이용하는 경로를 통해 3-HP를 생산하는 효모 세포는 경로에 수반되는 하나 이상의 효소를 발현함으로써 조작될 수 있다. 발현된 유전자는 알라닌 데히드로게나제, 피루베이트/알라닌 아미노트랜스퍼라제, 알라닌 2,3 아미노뮤타제, CoA 트랜스퍼라제, CoA 신테타제, β-알라닐-CoA 암모니아 리아제, 3-HP-CoA 데히드라타제, 3-HP-CoA 히드로라제, 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드로라제, BAAT, 3-HPDH (말로네이트 세미알데히드 리덕타제 등), HIBADH, 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 발현된 유전자는 숙주 세포에 네이티브인 유전자로부터 유도될 수도 있거나, 그것들은 숙주 세포에 비-네이티브인 근원 유전자로부터 유도될 수도 있다.
실시예 3G: 락테이트 경로 유전자를 발현하는 변형된 효모 균주
피루베이트, 락테이트, 락틸-CoA, 아크릴일-CoA, 및 3-HP-CoA 중간물을 이용하는 경로를 통해 3-HP를 생산하는 효모 세포는 이 경로에 수반되는 하나 이상의 효소를 발현함으로써 조작될 수 있다. 발현된 유전자는 LDH, CoA 트랜스퍼라제, CoA 신테타제, 락틸-CoA 데히드라타제, 3-HP-CoA 데히드라타제, 3-HP-CoA 히드로라제, 및 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드로라제 유전자 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 발현된 유전자는 숙주 세포에 네이티브인 유전자로부터 유도될 수도 있거나, 그것들은 숙주 세포에 비-네이티브인 근원 유전자로부터 유도될 수도 있다.
실시예 3H: 글리세롤 경로 유전자를 발현하는 변형된 효모 균주
글리세롤 및 3-HPA 중간물을 이용하는 경로를 통해 3-HP를 생산하는 효모 세포는 이 경로에 수반되는 하나 이상의 효소를 발현함으로써 조작될 수 있다. 발현된 유전자는 글리세롤 데히드라타제 및 알데히드 데히드로게나제 유전자 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 발현된 유전자는 숙주 세포에 네이티브인 유전자로부터 유도될 수도 있거나, 그것들은 숙주 세포에 비-네이티브인 근원 유전자로부터 유도될 수도 있다.
실시예 3I: β- 알라닐 CoA 경로 유전자를 발현하는 변형된 효모 균주
PEP 또는 피루베이트, β-알라닌, β-알라닐-CoA, 아크릴일-CoA, 3-HP-CoA, 및, 선택적으로 OAA, 아스파르테이트, 및 알라닌 중간물을 이용하는 경로를 통해 3-HP를 생산하는 효모 세포는 이 경로에 수반되는 하나 이상의 효소를 발현함으로써 조작될 수 있다. 발현된 유전자는 PPC, PYC, AAT, ADC, CoA 트랜스퍼라제, CoA 신테타제, β-알라닐-CoA 암모니아 리아제, 3-HP-CoA 데히드라타제, 3-HP-CoA 히드로라제, 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드로라제, 알라닌 데히드로게나제, 피루베이트/알라닌 아미노트랜스퍼라제, 및 AAM 유전자 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 발현된 유전자는 숙주 세포에 네이티브인 유전자로부터 유도될 수도 있거나, 그것들은 숙주 세포에 비-네이티브인 근원 유전자로부터 유도될 수도 있다.
일부 양태에서, 효모 세포 또는 이들의 사용 방법은 다음 번호가 매겨진 단락에 의해 설명될 수도 있다:
[B1] 활성 3-HP 발효 경로를 포함하는 유전적으로 변형된 효모 세포로서, 세포는 다음으로부터 선택된 하나 이상의 외인성 3-HP 경로 유전자를 포함한다:
외인성 PPC 유전자;
외인성 PYC 유전자;
외인성 AAT 유전자;
외인성 ADC 유전자;
외인성 BAAT 또는 gabT 유전자; 및
외인성 3-HPDH 유전자.
[B2] 외인성 AAT 유전자를 포함하는, 단락 B1의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B3] 외인성 PYC 유전자를 포함하는, 단락 B1 또는 B2의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B4] 외인성 ADC 유전자를 포함하는, 단락 B1 내지 단락 B3 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B5] 외인성 BAAT 또는 gabT 유전자를 포함하는, 단락 B1 내지 단락 B4 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B6] 외인성 3-HPDH 유전자를 포함하는, 단락 B1 내지 단락 B5 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B7] 다음을 포함하는, 단락 B1의 유전적으로 변형된 효모 세포:
외인성 PYC 유전자;
외인성 AAT 유전자;
외인성 ADC 유전자;
외인성 BAAT 또는 gabT 유전자; 및
외인성 3-HPDH 유전자.
[B8] 외인성 PPC 유전자를 포함하는, 단락 B1 내지 단락 B7 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B9] 외인성 PPC 유전자가 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B1 내지 단락 B7 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B10] SEQ ID NO: 2로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B9의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B11] SEQ ID NO: 3으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B9의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B12] SEQ ID NO: 4로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B9의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B13] SEQ ID NO: 5로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B9의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B14] SEQ ID NO: 6으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B9의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B15] SEQ ID NO: 7로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B9의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B16] SEQ ID NO: 8로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B9의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B17] 외인성 PYC 유전자가 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 B1 내지 단락 B16 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B18] AAT 유전자가 SEQ ID NO: 14, 15, 및 16의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B1 내지 단락 B17 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B19] AAT 유전자가 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B1 내지 단락 B17 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B20] AAT 유전자가 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B1 내지 단락 B17 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B21] AAT 유전자가 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B1 내지 단락 B17 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B22] AAT 유전자가 SEQ ID NO: 13의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 B1 내지 단락 B21 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포
[B23] ADC 유전자가 SEQ ID NO: 17, 18, 133, 135, 137, 및 139로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B1 내지 단락 B22 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포
[B24] ADC 유전자가 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B23의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B25] ADC 유전자가 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B23의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B26] ADC 유전자가 SEQ ID NO: 133의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B23의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B27] ADC 유전자가 SEQ ID NO: 135의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B23의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B28] ADC 유전자가 SEQ ID NO: 137의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B23의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B29] ADC 유전자가 SEQ ID NO: 139의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B23의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B30] ADC 유전자가 SEQ ID NO: 130, 131, 132, 134, 136, 및 138로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는, 단락 B1 내지 단락 B29 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B31] ADC 유전자가 SEQ ID NO: 130의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 B30의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B32] ADC 유전자가 SEQ ID NO: 131의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 B30의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B33] ADC 유전자가 SEQ ID NO: 132의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 B30의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B34] ADC 유전자가 SEQ ID NO: 134의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 B30의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B35] ADC 유전자가 SEQ ID NO: 136의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 B30의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B36] ADC 유전자가 SEQ ID NO: 138의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 B30의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B37] 외인성 BAAT 또는 gabT 유전자가 SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 및 24로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B1 내지 단락 B36 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B38] 외인성 BAAT 또는 gabT 유전자가 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B37의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B39] 외인성 BAAT 또는 gabT 유전자가 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B37의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B40] 외인성 BAAT 또는 gabT 유전자가 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B37의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B41] 외인성 BAAT 또는 gabT 유전자가 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B37의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B42] 외인성 BAAT 또는 gabT 유전자가 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B37의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B43] BAAT 유전자 또는 gabT 유전자가 SEQ ID NO: 19, 140, 141, 및 142로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 B1 내지 단락 B42 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B44] BAAT 유전자 또는 gabT 유전자가 SEQ ID NO: 19의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 43의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B45] BAAT 유전자 또는 gabT 유전자가 SEQ ID NO: 140의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 43의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B46] BAAT 유전자 또는 gabT 유전자가 SEQ ID NO: 141의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 43의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B47] BAAT 유전자 또는 gabT 유전자가 SEQ ID NO: 142의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 43의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B48] 상기 외인성 BAAT 유전자 또는 외인성 gabT는 BAAT 유전자이며, 이것은 또한 gabT 유전자인, 단락 B1 내지 단락 B47 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B49] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 및 129로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B1 내지 단락 B48 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B50] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B49의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B51] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B49의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B52] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B49의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B53] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B49의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B54] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B49의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B55] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B49의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B56] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B49의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B57] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B49의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B58] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B49의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B59] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 129의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B49의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B60] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 25, 143, 144, 및 343으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 B1 내지 단락 B59 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B61] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 25의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 B60의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B62] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 143의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 B60의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B63] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 144의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 B60의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B64] 3-HPDH 유전자가 SEQ ID NO: 343의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단락 B60의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B65] 3-HPDH 유전자는 또한 HIBADH 유전자인, 단락 B1 내지 단락 B64 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B66] 3-HPDH 유전자는 또한 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자인, 단락 B1 내지 단락 B65 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B67] PPC 유전자가 SEQ ID NO: 10, 11, 및 12로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B1 내지 단락 B66 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B68] PPC 유전자가 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B67의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B69] PPC 유전자가 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B67의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B70] PPC 유전자가 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는, 단락 B67의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B71] PPC 유전자가 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, B1 내지 단락 B70 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B72] 상기 효모 세포는 크랩트리-음성인, B1 내지 단락 B71 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B73] 효모 세포는 이사트첸키아, 칸디다, 클루이베로미세스, 피치아, 쉬조사카로미세스, 토룰라스포라, 지고사카로미세스, 및 사카로미세스로부터 선택된 속에 속하는, B1 내지 단락 B72 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B74] 효모 세포는 아이. 오리엔탈리스/피. 페르멘탄스 클레이드 및 사카로미세스 클레이드로부터 선택된 클레이드에 속하는, 단락 B73의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B75] 효모 세포는 아이. 오리엔탈리스, 씨. 람비카, 및 에스. 불데리로부터 선택되는, 단락 B73의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B76] 상기 세포는 PDC, ADH, GAL6, CYB2A, CYB2B, GPD, GPP, ALD, 및 PCK 유전자로부터 선택된 네이티브 유전자의 하나 이상의 삭제 또는 붕괴를 추가로 포함하는, 단락 B1 내지 단락 B75 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B77] 삭제 또는 붕괴 중 하나 이상이 외인성 3-HP 경로 유전자 중 하나 이상의 삽입으로부터 발생하는, 단락 B76의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B78] 외인성 3-HP 경로 유전자 중 하나 이상이 하나 이상의 외인성 조절 요소에 작동 가능하게 결합되는, 단락 B1 내지 단락 B77 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B79] 하나 이상의 조절 요소가 하나 이상의 3-HP 경로 유전자에 이질적인, 단락 B78의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B80] 외인성 PYC 유전자가 PYC 유전자에 이질적인 외인성 프로모터에 작동 가능하게 결합되는, 단락 B1 내지 단락 B79 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B81] 외인성 AAT 유전자가 AAT 유전자에 이질적인 외인성 프로모터에 작동 가능하게 결합되는, 단락 B1 내지 단락 B80 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B82] 외인성 ADC 유전자가 ADC 유전자에 이질적인 외인성 프로모터에 작동 가능하게 결합되는, 단락 B1 내지 단락 B81 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B83] 외인성 BAAT 또는 gabT 유전자가 BAAT 또는 gabT 유전자에 이질적인 외인성 프로모터에 작동 가능하게 결합되는, 단락 B1 내지 단락 B82 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B84] 외인성 3-HPDH 유전자가 3-HPDH 유전자에 이질적인 외인성 프로모터에 작동 가능하게 결합되는, 단락 B1 내지 단락 B83 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B85] 외인성 PPC 유전자가 PPC 유전자에 이질적인 외인성 프로모터에 작동 가능하게 결합되는, 단락 B1 내지 단락 B84 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B86] 세포는 75 g/L 이상의 3-HP를 함유하는 배지에서 4 미만의 pH에서 성장할 수 있는, 단락 B1 내지 단락 B85 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B87] 세포는 3-HP-저항성 효모 세포인, 단락 B1 내지 단락 B86 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B88] 세포는 돌연변이 및/또는 선택을 겪었으며, 이러한 돌연변이 및/또는 선택된 세포는 같은 종의 야생형 세포보다 3-HP에 대하여 더 높은 정도의 저항성을 소유하는, 단락 B1 내지 단락 B87 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B89] 세포는 하나 이상의 외인성 3-HP 경로 유전자를 가지고 유전적으로 변형되기 전에 돌연변이 및/또는 선택을 겪는, 단락 B88의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B90] 세포는 젖산 또는 3-HP의 존재시 선택을 겪는, 단락 B88 또는 B89의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B91] 선택은 케모스태트 선택인, 단락 B91의 유전적으로 변형된 효모 세포.
[B92] (i) 적어도 하나의 탄소 근원을 포함하는 배지의 존재시 단락 B1 내지 단락 B91 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 효모 세포를 배양하는 단계; 및
(ii) 배양물로부터 3-HP를 분리하는 단계
를 포함하는 3-HP를 생산하는 방법.
[B93] 상기 탄소 근원은 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 수크로스, 프럭토스, 셀룰로스, 글루코스 올리고머, 및 글리세롤로부터 선택되는, 단락 B92의 방법.
[B94] 배지는 5 미만, 예를 들어, 약 1.5 내지 약 4.5, 약 2.0 내지 약 4.0, 또는 약 2.0 내지 약 3.5의 범위의 pH인, 단락 B92 또는 B93의 방법.
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gatacccctt cgttattcga aatggtttct 1440 tcaaagaata gagcccaaaa attattggca tatattggtg acttgtgtgt caatggttct 1500 tcaattaaag gtcaaattgg tttccctaaa ttgaacaagg aagcagaaat cccagatttg 1560 ttggatccaa atgatgaggt tattgatgtt tctaaacctt ctaccaatgg tctaagaccg 1620 tatctattaa agtatggacc agatgcgttt tccaaaaaag ttcgtgaatt cgatggttgt 1680 atgattatgg ataccacctg gagagatgca catcaatcat tattggctac aagagttaga 1740 actattgatt tactgagaat tgctccaacg actagtcatg ccttacaaaa tgcatttgca 1800 ttagaatgtt ggggtggcgc aacatttgat gttgcgatga ggttcctcta tgaagatcct 1860 tgggagagat taagacaact tagaaaggca gttccaaata ttcctttcca aatgttattg 1920 agaggtgcta atggtgttgc ttattcgtca ttacctgata atgcaattga tcattttgtt 1980 aagcaagcaa aggataatgg tgttgatatt ttcagagtct ttgatgcttt gaacgatttg 2040 gaacaattga aggttggtgt tgatgctgtc aagaaagccg gaggtgttgt tgaagctaca 2100 gtttgttact caggtgatat gttaattcca ggtaaaaagt ataacttgga ttattattta 2160 gagactgttg gaaagattgt ggaaatgggt acccatattt taggtattaa ggatatggct 2220 ggcacgttaa agccaaaggc tgctaagttg 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atgtcttacg aaatcccaca aacacaaaag gcctgtgtct tttacgaaaa cggcggccca 60 atcacataca aggacattcc agttccaaag ccaaaaccta ctgagatttt agtcaaggtt 120 ctgtactctg gtgtctgcca caccgacttg cacgcatgga agggtgactg gcctctagct 180 accaagttgc cattggttgg tggtcacgaa ggtgccggtg ttgttgttgc caagggtgaa 240 aacgtcacct cttttgagat tggtgattac gcaggtatca agtggttgaa tggttcatgt 300 atgggttgtg aattctgtga acaaggtgct gaaccaaact gtcctaaggc cgacttgagt 360 ggttacaccc acgacggttc cttccaacag tatgctactg ctgacgctat tcaagctgca 420 cacatctcca aggaaaccga cttggctggt gttgctccaa tcttgtgtgc aggtgtcact 480 gtctacaagg ctttaaagac tgcagacctt agagcaggtg aatgggtttg tatttccggt 540 gcagctggtg gtttaggttc tcttgctatt caatatgcaa aggctatggg tctgagagtt 600 gttggtattg acggtggtga cgaaaagaag gaattgtgta aatcccttgg tgctgaagca 660 tttattgatt tcacaaagac caaggatatc gtcaaggctg tccaagaggc aaccaatggt 720 ggtccacatg gtgtcatcaa tgtctctgtc tctgaagctg caatttctca atcttgtgaa 780 tacgttagac ctctaggtaa ggttgttctt gttggtttac cagcaggcgc acaagtcaaa 840 actggtgtct ttgaagccgt 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Issatchenkia orientalis <400> 107 atgtttgcat caaccttcag aagtcaagct gtaagagctg caagatttac tagattccaa 60 tccacttttg ccattcctga gaagcaaatg ggtgttatct ttgaaactca tggtggtcct 120 ttacaataca aggaaattcc agttccaaaa ccaaaaccaa ctgaaatttt aatcaatgtt 180 aaatactctg gtgtctgcca taccgattta cacgcatgga aaggtgactg gccattacca 240 gcaaagttac ccctagttgg tggtcacgaa ggtgcgggca ttgttgttgc gaaaggttct 300 gcagttacca actttgagat tggcgattat gctggtatta agtggttaaa cggttcatgt 360 atgtcatgtg aattctgtga acaaggtgat gaatctaact gtgaacatgc cgatttgagt 420 ggttatactc atgatggttc tttccaacaa tatgccactg ctgacgctat tcaagctgca 480 aagatcccaa agggtaccga cttatctgaa gttgcgccaa ttttatgtgc tggtgttact 540 gtctataaag ctttgaaaac tgctgattta agagcaggtc aatgggttgc gatttctggt 600 gccgctggtg gtctaggttc tcttgctgtc caatatgcaa aggcaatggg tctaagagtt 660 ttaggtatcg atggtggtga aggtaaaaag gaactttttg aacaatgtgg tggtgatgtg 720 tttatcgatt tcaccagata cccaagagat gcacctgaaa agatggttgc tgatattaag 780 gctgcaacta acggtttggg tccacacggt gttatcaatg tctctgtctc 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caacgctcac 300 aagccatcca tcgtcttggt cgacgaaaag aacgaaatct tggaaaaggg ttaa 354 <210> 133 <211> 117 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 133 Met Thr Phe Glu Met Leu Tyr Ser Lys Ile His Arg Ala Thr Ile Thr 1 5 10 15 Asp Ala Asn Leu Asn Tyr Ile Gly Ser Ile Thr Ile Asp Glu Asp Leu 20 25 30 Ala Lys Leu Ala Lys Leu Arg Glu Gly Met Lys Val Glu Ile Val Asp 35 40 45 Val Asn Asn Gly Glu Arg Phe Ser Thr Tyr Val Ile Leu Gly Lys Lys 50 55 60 Arg Gly Glu Ile Cys Val Asn Gly Ala Ala Ala Arg Lys Val Ala Ile 65 70 75 80 Gly Asp Val Val Ile Ile Leu Ala Tyr Ala Ser Met Asn Glu Asp Glu 85 90 95 Ile Asn Ala His Lys Pro Ser Ile Val Leu Val Asp Glu Lys Asn Glu 100 105 110 Ile Leu Glu Lys Gly 115 <210> 134 <211> 387 <212> DNA <213> Bacillus sp. TS25 <400> 134 atgtacagaa ccatgatgaa gtccaagttg cacagagcga ccgtcaccga agcaaacttg 60 aactacgtcg gttccatcac catcgaccaa gacttgatgg aagctgcaga catcttggaa 120 aacgagaagg tccaaatcgt caacaacaac aacggtgcta gattcgaaac ctacgtcatc 180 gctggtccaa gaggctccgg caccatctgt ttgaacggtg cagcagcaag attggtccaa 240 ccaggtgaca ccgttatcat catctcctac gcaatgttgg aagaagccga ggctagaaag 300 caccaacctg tcgtcgtttt gttgaaccca gacaacacca tccaagaatt gatcagagaa 360 acccacggtg ctaccgctac cgtctaa 387 <210> 135 <211> 128 <212> PRT <213> Bacillus sp. TS25 <400> 135 Met Tyr Arg Thr Met Met Lys Ser Lys Leu His Arg Ala Thr Val Thr 1 5 10 15 Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr Ile Asp Gln Asp Leu 20 25 30 Met Glu Ala Ala Asp Ile Leu Glu Asn Glu Lys Val Gln Ile Val Asn 35 40 45 Asn Asn Asn Gly Ala Arg Phe Glu Thr Tyr Val Ile Ala Gly Pro Arg 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ile Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala Arg Leu Val Gln 65 70 75 80 Pro Gly Asp Thr Val Ile Ile Ile Ser Tyr Ala Met Leu Glu Glu Ala 85 90 95 Glu Ala Arg Lys His Gln Pro Val Val Val Leu Leu Asn Pro Asp Asn 100 105 110 Thr Ile Gln Glu Leu Ile Arg Glu Thr His Gly Ala Thr Ala Thr Val 115 120 125 <210> 136 <211> 411 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 136 atgttgagaa ccatcttggg ttccaaaatc cacagagcta ccgttaccca agcagacttg 60 gactacgttg gttcagtcac catcgatgca gacttggttc atgccgcagg tttgatcgaa 120 ggtgaaaagg ttgccatcgt cgacatcacc aatggcgcta gattggaaac ctacgttatc 180 gttggtgatg ctggcaccgg taacatctgt atcaacggtg cagcagcaca cttgatcaac 240 ccaggtgatt tggttatcat catgtcctac ttgcaagcta ccgatgcaga ggccaaggct 300 tacgaaccaa agatcgttca cgtcgacgca gacaacagaa tcgttgcttt gggtaacgac 360 ttggcagaag ctttgcctgg ttccggtttg ttgacctcaa gatctatcta a 411 <210> 137 <211> 136 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 137 Met Leu Arg Thr Ile Leu Gly Ser Lys Ile His Arg Ala Thr Val Thr 1 5 10 15 Gln Ala Asp Leu Asp Tyr Val Gly Ser Val Thr Ile Asp Ala Asp Leu 20 25 30 Val His Ala Ala Gly Leu Ile Glu Gly Glu Lys Val Ala Ile Val Asp 35 40 45 Ile Thr Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Val Ile Val Gly Asp Ala 50 55 60 Gly Thr Gly Asn Ile Cys Ile Asn Gly Ala Ala Ala His Leu Ile Asn 65 70 75 80 Pro Gly Asp Leu Val Ile Ile Met Ser Tyr Leu Gln Ala Thr Asp Ala 85 90 95 Glu Ala Lys Ala Tyr Glu Pro Lys Ile Val His Val Asp Ala Asp Asn 100 105 110 Arg Ile Val Ala Leu Gly Asn Asp Leu Ala Glu Ala Leu Pro Gly Ser 115 120 125 Gly Leu Leu Thr Ser Arg Ser Ile 130 135 <210> 138 <211> 384 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 138 atgtacagaa ccttgatgtc cgctaagttg cacagagcta gagtcaccga agcaaacttg 60 aactacgttg gttccgtcac catcgacgag gacttgttgg acgcagtcgg tatgatggca 120 aacgaaaagg tccaaatcgt caacaacaac aacggtgcta gattggaaac ctacatcatc 180 cctggtgaga gaggttccgg tgtcgtctgt ttgaacggtg ctgcagctag attggtccaa 240 gttggtgacg tcgttatcat cgtttcctac gccatgatgt ccgaagaaga agcaaagacc 300 cacaagccaa aggtcgctgt tttgaacgaa agaaacgaaa tcgaagagat gttgggtcaa 360 gaaccagcta gaaccatctt gtaa 384 <210> 139 <211> 127 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 139 Met Tyr Arg Thr Leu Met Ser Ala Lys Leu His Arg Ala Arg Val Thr 1 5 10 15 Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Ser Val Thr Ile Asp Glu Asp Leu 20 25 30 Leu Asp Ala Val Gly Met Met Ala Asn Glu Lys Val Gln Ile Val Asn 35 40 45 Asn Asn Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Ile Ile Pro Gly Glu Arg 50 55 60 Gly Ser Gly Val Val Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala Arg Leu Val Gln 65 70 75 80 Val Gly Asp Val Val Ile Ile Val Ser Tyr Ala Met Met Ser Glu Glu 85 90 95 Glu Ala Lys Thr His Lys Pro Lys Val Ala Val Leu Asn Glu Arg Asn 100 105 110 Glu Ile Glu Glu Met Leu Gly Gln Glu Pro Ala Arg Thr Ile Leu 115 120 125 <210> 140 <211> 1356 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 140 atgacaccac agccaaaccc acaagtcggt gcagcagtca aagctgcaga tagagcacac 60 gtcttccact cttggtctgc acaagaattg atcgatccat tggctgttgc tggtgcagag 120 ggttcctact tctgggatta cgatggtaga cgttaccttg acttcacctc cggcttagtc 180 ttcaccaaca tcggttacca acacccaaag gttgtcgcag ctatccaaga acaagccgca 240 tctttgacta catttgcccc agctttcgca gttgaagcaa gatccgaagc tgcaagattg 300 atcgctgagc gtactccagg tgatttagac aaaatcttct tcaccaacgg tggcgcagat 360 gctatcgagc acgctgttcg tatggcaaga atccacgctg gtagaccaaa ggtcttatcc 420 gcatacagat cataccacgg tggtacacaa caggcagtca acatcactgg tgatccaagg 480 agatgggcat ccgattccgc ttctgctggc gttgtccact tctgggctcc atacttatac 540 agatccagat tctacgccga aactgagcaa caagaatgtg agcgtgctct tgagcacttg 600 gaaactacta tcgccttcga aggtccaggt actattgccg ctatcgtttt ggaaactgtc 660 ccaggtactg ctggtatcat ggttcctcca ccaggttact tagcaggtgt tagagaattg 720 tgtgacaaat acggtatcgt cttcgtcttg gatgaagtca tggctggttt cggcagaact 780 ggcgaatggt tcgctgcaga cttattcgat gttaccccag acttgatgac cttcgctaag 840 ggtgtcaact caggttacgt tccattgggt ggtgttgcta tctccggcaa aatcgcagag 900 actttcggta agagagctta cccaggtggt ttgacgtact ccggtcaccc tcttgcttgc 960 gcagccgctg ttgctactat caacgttatg gcagaagaag gtgtcgttga aaacgctgca 1020 aacttgggtg ctagagttat cgaaccaggt ttgagagaac ttgcagagag acacccatca 1080 gttggtgaag ttagaggtgt tggtatgttc tgggctttgg aattggttaa ggatagagaa 1140 accagagaac ctttggtccc atacaatgcc gctggtgaag cgaacgcacc aatggctgct 1200 ttcggtgcag ctgcaaaggc aaacggtttg tggccattca tcaacatgaa cagaacccac 1260 gttgttcctc cttgtaacgt taccgaagcc gaagctaaag aaggcttggc agcattggat 1320 gcagctttat ctgttgcaga tgagtacact gtctaa 1356 <210> 141 <211> 1416 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 141 atgtccatct gtgagcaata ctacccagaa gaaccaacca agccaaccgt caagaccgaa 60 tccatccctg gtccagaatc ccaaaagcaa ttgaaggaat tgggtgaagt tttcgacacc 120 agaccagctt acttcttggc agactacgaa aagtccttgg gtaactacat caccgacgtc 180 gacggtaaca cctacttgga cttgtacgct caaatctcct ccatcgcctt gggttacaac 240 aacccagcat tgatcaaagc cgctcaatcc ccagaaatga tcagagcatt ggttgacaga 300 ccagccttgg gtaacttccc ttccaaggac ttggacaaga tcttgaagca aatcttgaag 360 tccgctccaa agggtcagga ccacgtctgg tccggtttgt ccggtgcaga cgcaaacgaa 420 ttggctttca aggctgcatt catctactac agagctaagc aaagaggtta cgacgcagac 480 ttctccgaaa aggaaaactt gtccgttatg gacaacgacg caccaggtgc tccacacttg 540 gcagttttgt ccttcaagag agctttccac ggtagattgt tcgcatccgg ttccactacc 600 tgttccaagc caatccacaa gttggacttc cctgctttcc actggccaca cgccgaatac 660 ccatcctacc agtacccttt ggacgaaaac tccgacgcaa acagaaagga ggacgaccac 720 tgcttggcaa tcgttgaaga attgatcaag acctggtcca tccctgttgc tgcgttgatc 780 atcgaaccaa tccaatccga gggtggtgac aaccacgcct ccaagtactt cttgcaaaag 840 ttgagagaca tcaccttgaa gtacaacgtc gtctacatca tcgacgaagt ccaaactggc 900 gttggcgcaa ccggtaagtt gtggtgtcac gaatacgcag acatccagcc tccagtcgac 960 ttggtcacct tctccaagaa gttccaatcc gctggctact tcttccacga ccctaagttc 1020 atcccaaaca agccatacag acaattcaac acctggtgtg gtgaaccagc aagaatgatc 1080 atcgcaggtg caatcggtca agagatctcc gacaagaagt tgaccgaaca atgctccaga 1140 gtcggtgact acttgttcaa gaagttggaa ggtttgcaaa agaagtaccc agagaacttc 1200 caaaacttga gaggtaaggg tagaggcacc ttcatcgctt gggacttgcc aactggcgag 1260 aagagagact tgttgttgaa gaagttgaag ttgaacggct gtaacgttgg tggctgtgct 1320 gttcacgcag tcagattgag accttccttg accttcgaag agaagcacgc agacatcttc 1380 atcgaagctt tggctaagtc cgtcaacgaa ttgtaa 1416 <210> 142 <211> 1428 <212> DNA <213> Saccharomyces kluyveri <400> 142 atgccatcct actccgttgc agaattgtac tacccagacg aacctaccga acctaagatc 60 tccacctcct cctacccagg tccaaaggca aagcaagaat tggaaaagtt gtccaacgtc 120 ttcgacacca gagcagctta cttgttggca gactactaca agtcccgtgg taactacatc 180 gttgaccagg acggtaacgt cttgttggac gtttacgctc aaatctcctc catcgccttg 240 ggttacaaca acccagaaat cttgaaggtt gcaaagtccg acgcaatgtc cgttgcattg 300 gccaaccgtc cagcattggc ttgtttccca tccaacgact acggtcaatt gttggaagac 360 ggtttgttga aggcagcacc acaaggtcaa gacaagatct ggaccgcttt gtccggttcc 420 gacgcaaacg aaaccgcctt caaagcctgc ttcatgtacc aagctgcgaa gaagagaaac 480 ggtagatcct tctccaccga agaattggaa tccgttatgg acaaccaatt gccaggcacc 540 tccgaaatgg ttatctgttc cttcgaaaag ggtttccacg gtcgtttgtt cggttccttg 600 tccactacca gatccaagcc tatccacaag ttggacatcc cagctttcaa ctggcctaaa 660 gccccattcc cagacttgaa gtacccattg gaagaaaaca aggaagccaa caaggctgaa 720 gaatcctcct gtatcgaaaa gttctcccaa atcgttcaag agtggcaagg taagatcgct 780 gcagttatca tcgaaccaat ccagtccgag ggtggcgaca accacgcttc ctccgacttc 840 ttccaaaagt tgagagaaat caccatcgaa aacggtatct tgatgatcgt cgacgaagtt 900 caaaccggtg tcggtgctac cggcaagatg tgggcacacg aacactggaa cttgtccaac 960 cctccagact tggttacctt ctccaagaag ttccaagcag caggtttcta ctaccacgac 1020 ccaaagttgc aaccagacca gccattcaga cagttcaaca cctggtgtgg tgacccatcc 1080 aaggctttga tcgccaaggt tatctacgaa gaaatcgtta agcacgactt ggtcaccaga 1140 actgccgaag tcggtaacta cttgttcaac agattggaaa agttgttcga aggtaagaac 1200 tacatccaga acttgagagg taagggtcaa ggcacctaca tcgctttcga cttcggcacc 1260 tcctccgaga gagactcctt cttgtccaga ttgagatgta acggtgcaaa cgtcgctggt 1320 tgcggtgact ccgctgtcag attgagacca tccttgacct tcgaagagaa gcacgcagac 1380 gtcttggttt ccatcttcga caagaccttg agacaattgt acggctaa 1428 <210> 143 <211> 747 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 143 atgatcgttt tggtcaccgg tgcaaccgca ggtttcggcg aatgtatcac cagaagattc 60 atccagcagg gtcacaaggt tatcgctacc ggtagaagac aagagagatt gcaagaattg 120 aaggacgagt tgggtgacaa cttgtacatc gctcaattgg acgttagaaa cagagcagct 180 atcgaagaaa tgttggcatc cttgccagct gaatggtgca acatcgacat cttggtcaac 240 aacgctggtt tggcattggg tatggaacca gctcacaagg ctagtgttga ggactgggag 300 accatgatcg acaccaacaa caagggtttg gtctacatga ccagagcagt tttgcctggt 360 atggttgaaa gaaaccacgg tcacatcatc aacatcggtt ccaccgctgg ttcctggcca 420 tacgctggcg gtaacgtcta cggtgctacc aaggctttcg ttagacagtt ctccttgaac 480 ttgagaaccg acttgcacgg caccgctgtt agagttaccg acatcgaacc aggtttggtt 540 ggtggcaccg aattctccaa cgtcagattc aagggcgacg acggtaaggc tgaaaagacc 600 taccaaaaca ccgtcgcttt gaccccagaa gacgtttcag aggctgtttg gtgggtcagt 660 accttgccag cacacgtcaa catcaacacc ttggaaatga tgccagtcac ccaatcctac 720 gcaggtttga acgttcacag acaataa 747 <210> 144 <211> 804 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 144 atgtcccaag gtagaaaggc agcagaaaga ttggcaaaga agaccgtctt gatcaccggt 60 gcgtccgctg gtatcggtaa ggctaccgcg ttggagtact tggaagcatc caacggtgac 120 atgaagttga tcttggcagc aagaagattg gagaagttgg aagaattgaa gaagaccatc 180 gaccaagaat tcccaaacgc taaggtccac gttgcacaat tggacatcac ccaagcagag 240 aagatcaagc cattcatcga aaacttgcca caagaattca aggacatcga catcttggtc 300 aacaacgctg gtaaggcgtt gggttccgac agagttggtc aaatcgcaac cgaagacatc 360 caagacgtct tcgacaccaa cgtcaccgct ttgatcaaca tcacccaagc tgttttgcca 420 atcttccaag cgaagaactc cggtgacatc gtcaacttgg gttccatcgc tggtagagac 480 gcatacccaa ccggctccat ctactgcgcc tccaagttcg ctgtcggtgc tttcaccgac 540 tccttgagaa aggaattgat caacaccaag atcagagtca tcttgattgc ccctggtttg 600 gtcgaaaccg aattctcctt ggttagatac agaggtaacg aagaacaagc aaagaacgtt 660 tacaaggaca ctaccccatt gatggccgac gacgttgcag acttgatcgt ttacgctacc 720 tccagaaagc aaaacaccgt tatcgcagac accttgatct tcccaaccaa ccaagcatcc 780 ccacaccaca tcttcagagg ttaa 804 <210> 145 <211> 420 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 145 atgcttagaa ccatgttcaa atccaagatc cacagagcaa ccgtcactca agcagatttg 60 cattacgttg gttctgttac tattgacgca gacttacttg atgcagccga tttacttcct 120 ggtgagcttg ttcatattgt tgatatcacc aatggtgcgc gtcttgaaac ctatgtcatt 180 gagggtgaac gtggttccgg tgtcgtcggt atcaatggcg cagctgcaca cctcgtccat 240 ccaggtgacc tggtcatcat catttcttat gcacaggtct ccgatgctga agcccgtgcc 300 ttaagaccaa gagtcgttca cgtcgacaga gataacagag ttgtcgcttt aggtgcagac 360 ccagcagagc cagttccagg ttccgatcaa gctagatcac cacaggctgt taccgcctaa 420 <210> 146 <211> 420 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 146 atgttaagaa ctatgtttaa gtccaagatt cacagagcta ccgtcaccca agcagatttg 60 cattacgtcg gttccgttac cattgatgca gatttactcg atgcggcaga cttgttacct 120 ggtgaactag ttcacattgt tgacattacc aatggtgcta gattggaaac ttacgtcatt 180 gaaggtgaaa gaggtagtgg tgtcgttggt atcaatggtg cagctgctca cttagttcac 240 ccaggtgact tagtcatcat catttcatat gcacaagttt ccgatgcgga agctagagca 300 ttaagaccaa gagttgttca tgttgataga gacaacagag tcgttgcact tggtgcagat 360 cctgctgaac cagttccagg ttcagatcaa gctaggtctc cacaagcagt tactgcataa 420 <210> 147 <211> 420 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 147 atgttaagaa ctatgttcaa gagtaagatt catagggcta ccgttaccca ggcagatcta 60 cattatgttg gttctgttac cattgacgca gatttgttgg atgcagcaga cttgttacca 120 ggtgaactcg ttcacattgt cgatatcacc aacggtgcca gactggaaac ttatgtcatt 180 gaaggtgaga gaggcagtgg tgttgtcggc attaacggtg ccgcagcaca cttggttcat 240 ccaggtgact tggtcatcat catttcttac gcacaagtct ccgatgccga agctagagca 300 ttgagaccta gagtcgttca cgttgacaga gacaatagag ttgttgctct tggtgcagat 360 ccagctgagc cagttccagg ttccgatcaa gcgagatctc ctcaagctgt tactgcataa 420 <210> 148 <211> 384 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 148 atgtatagaa ccttgatgag tgcaaagctt cacagagcaa gagtcactga agcaaacttg 60 aactacgttg gttctgttac tattgacgaa gacttacttg atgcagtcgg tatgatggca 120 aacgagaaag ttcaaattgt caacaataac aatggtgcgc gtcttgaaac ctatatcatt 180 cctggtgaac gtggttccgg tgtcgtctgc ttgaatggcg cagctgcaag gctcgtccaa 240 gttggtgacg tcgtcatcat tgtttcttat gcaatgatgt ccgaagaaga agccaaaaca 300 cataagccaa aggtcgctgt cctcaatgaa agaaacgaaa ttgaggaaat gttaggtcag 360 gaaccagcga gaaccatctt ataa 384 <210> 149 <211> 384 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 149 atgtatagaa ccttgatgag tgcaaagctt cacagagcaa gagtcactga agcaaacttg 60 aactacgttg gttctgttac tattgacgaa gacttacttg atgcagtcgg tatgatggca 120 aacgagaaag ttcaaattgt caacaataac aatggtgcgc gtcttgaaac ctatatcatt 180 cctggtgaac gtggttccgg tgtcgtctgc ttgaatggcg cagctgcaag gctcgtccaa 240 gttggtgacg tcgtcatcat tgtttcttat gcaatgatgt ccgaagaaga agccaaaaca 300 cataagccaa aggtcgctgt cctcaatgaa agaaacgaaa ttgaggaaat gttaggtcag 360 gaaccagcga gaaccatctt ataa 384 <210> 150 <211> 384 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 150 atgtacagaa cgttaatgtc 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orientalis <400> 152 taaaacgacg gccagtgaat tccgcggcgg ccgcgagtcc atcggttcct gtca 54 <210> 153 <211> 59 <212> DNA <213> Issatchenkia orientalis <400> 153 cataagaaaa tcaaagacag aaggcgcgcc tttgctagca tttttgtgtt ttgctgtgt 59 <210> 154 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer <400> 154 acacagcaaa acacaaaaat gctagcaaag gcgcgccttc tgtctttgat tttcttatg 59 <210> 155 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 155 gggggaaaga actaccaata ggcctccttt aattcggaga aaatc 45 <210> 156 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 156 gattttctcc gaattaaagg aggcctattg gtagttcttt ccccc 45 <210> 157 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 157 aaaataaact agtaaaataa attaattaat tatctagaga gggggttata t 51 <210> 158 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 158 atataacccc ctctctagat aattaattaa tttattttac tagtttattt t 51 <210> 159 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 159 gaccatgatt acgccaagct ccgcggcggc cgcccagtca aaaccttctt ctc 53 <210> 160 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 160 taaaacgacg gccagtgaat tccgcggcgg ccgcctttga aggagcttgc ca 52 <210> 161 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 161 ctattccttc ctcaaattgc tgtttaaacg cgttgaagat ctattctcc 49 <210> 162 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 162 ggagaataga tcttcaacgc gtttaaacag caatttgagg aaggaatag 49 <210> 163 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 163 aatgttcatt ttacattcag atgttaatta aggtctagat gtgtttgttt gtgtg 55 <210> 164 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 164 cacacaaaca aacacatcta gaccttaatt aacatctgaa tgtaaaatga acatt 55 <210> 165 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 165 gaccatgatt acgccaagct ccgcggcggc cgcaatgcca agagttatgg ggc 53 <210> 166 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 166 ggctacccta tatatggtga gcg 23 <210> 167 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 167 gggtccaagt tatccaagca g 21 <210> 168 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 168 ccttaattaa ccgtaaagtt gtctcaatg 29 <210> 169 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 169 cagcaaaaca caaaaattct agaaaattta attaacatct gaatgtaaaa tgaac 55 <210> 170 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 170 gttcatttta cattcagatg ttaattaaat tttctagaat ttttgtgttt tgctg 55 <210> 171 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 171 gctctagata aaatgccctc ttattctgtc gc 32 <210> 172 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 172 gactggatca ttatgactcc 20 <210> 173 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 173 acgccttgcc aaatgcggcc gcgagtccat cggttcctgt caga 44 <210> 174 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 174 tcaaagacag aattaattaa gctctagaat ttttgtgttt tgctgtgtt 49 <210> 175 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 175 aacacaaaaa ttctagagct taattaattc tgtctttgat tttcttatg 49 <210> 176 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 176 gtttaaacct ttaattcgga gaaaatctga tc 32 <210> 177 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 177 gttaacggta ccgagctcta agtagtggtg 30 <210> 178 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 178 aaccgatgga ctcgcggccg catttggcaa ggcgtatcta t 41 <210> 179 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 179 ggcgccagca atttgaggaa ggaataggag 30 <210> 180 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 180 aaactattag attaattaag ctcgcgatgt gtttgtttgt gtgttttgtg tg 52 <210> 181 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 181 caaacaaaca catcgcgagc ttaattaatc taatagttta atcacagctt at 52 <210> 182 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 182 tacattatgg tagcggccgc gtgtgacatt ttgatccact cg 42 <210> 183 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 183 tggatcaaaa tgtcacacgc ggccgctacc ataatgtatg cgttgag 47 <210> 184 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 184 gggccctaaa agtgttggtg tattaga 27 <210> 185 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 185 gctagctcaa caaactcttt atcagattta gca 33 <210> 186 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 186 gctagcgagg aaaagaagtc taacctttgt 30 <210> 187 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 187 tcgcgataaa atgtcaactg tggaagatca ctcct 35 <210> 188 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 188 ttaattaagc tgctggcgct tcatctt 27 <210> 189 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 189 tcgcgataaa atgtccagag gcttctttac tg 32 <210> 190 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 190 ttaattaact aaaggtctct cacgacagag 30 <210> 191 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 191 gttaacccgg tttaaacata gcctcatgaa atcagccatt 40 <210> 192 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 192 gggcccatat ggcgcccggg gcgttgaaga tctattctcc agca 44 <210> 193 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 193 gtttaaacga ttggtagttc tttccccctc 30 <210> 194 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 194 aataaattaa gggcccttta tcgcgagagg gggttatatg tgtaaa 46 <210> 195 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 195 tataaccccc tctcgcgata aagggccctt aatttatttt actagtttat 50 <210> 196 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 196 gtttaaactt ttgtagcacc tcctggt 27 <210> 197 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 197 cagcaaaaca caaaaagcta gctaaaatgt tacgtaccat gttcaaaa 48 <210> 198 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 198 gaaaatcaaa gacagaaggc gcgccttatg ctgtaacagc ctgcgg 46 <210> 199 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 199 cagcaaaaca caaaaagcta gctaaaatgt taagaaccat gttcaaatc 49 <210> 200 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 200 gaaaatcaaa gacagaaggc gcgccttatg cagtaacagc ttgtggg 47 <210> 201 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 201 gcatggtggt gcaagcgacg 20 <210> 202 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 202 ggtgctgcat ttgctgctg 19 <210> 203 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 203 tgtatacagg atcgaagaat agaag 25 <210> 204 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 204 gaacgtctac aacgaggtga ac 22 <210> 205 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 205 ggcgcgcctc gcgataaaat g 21 <210> 206 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 206 agggccctta attaattatg cagtaacagc tt 32 <210> 207 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 207 cgctacgata cgctacgata 20 <210> 208 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 208 ctcccttccc tgatagaagg 20 <210> 209 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 209 ggggagcaat ttgccaccag g 21 <210> 210 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 210 ctccttcatt taactatacc agacg 25 <210> 211 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 211 gacagatgta aggaccaata gtgtcc 26 <210> 212 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 212 ccatatcgaa atctagcccg tcc 23 <210> 213 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 213 cataagaaaa tcaaagacag aaggcgcgcc tttgctagct ttttgtgttt tgctgtgt 58 <210> 214 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 214 attggacaca acattatat 19 <210> 215 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 215 gtaaaacgac ggccagtgaa ttgttaacat aggctccaac atctcg 46 <210> 216 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 216 ggaaccgatg gactcgcggc cgcgtgggat attggaag 38 <210> 217 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 217 ggaggtgcta caaaaggaat tc 22 <210> 218 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 218 gaccatgatt acgccaagct ccgcggagtc aaaaccttct tctctacc 48 <210> 219 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 219 gtaaaacgac ggccagtgaa ttctttgaag gagcttgcca agaaac 46 <210> 220 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 220 cctattcctt cctcaaattg ctg 23 <210> 221 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 221 ataactcttg gcattgcggc cgccaagtta gttagagc 38 <210> 222 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 222 atgaccatga ttacgccaag ctccgcggca aagacggtgt attagtgctt g 51 <210> 223 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 223 cacaaaacac acaaacaaac acagctagca aaggcgcgcc atctaatagt ttaatcacag 60 ctta 64 <210> 224 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 224 gccgttgcag caaatgtcga ggcctgtgtg acattttgat ccactcg 47 <210> 225 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 225 cgagtggatc aaaatgtcac acaggcctcg acatttgctg caacggc 47 <210> 226 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 226 cattttacat tcagatgtta attaattatc tagatgttgt tgttgttgtc g 51 <210> 227 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 227 cgacaacaac aacaacatct agataattaa ttaacatctg aatgtaaaat g 51 <210> 228 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 228 gctctaacta acttggcggc cgcttttatt ataaaattat atattattct t 51 <210> 229 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 229 aacacacaaa caaacacagc tagctaaaat gttaagaact atgttta 47 <210> 230 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 230 gattaaacta ttagatggcg cgccttatgc agtaactgct tgtgga 46 <210> 231 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 231 cgacggccag tgaattcgtt aacccgtttc gatgggattc cc 42 <210> 232 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 232 caggaaccga tggactcgcg gccgctccct tctctaaatg gactgc 46 <210> 233 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 233 tatataattt tataataaaa gcggccgcac caggggttta gtgaagtc 48 <210> 234 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 234 catgattacg ccaagctccg cggccataac tgacatttat ggtaagg 47 <210> 235 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 235 ccaacaatct taattggtga c 21 <210> 236 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 236 ggctgttacc gcctaattaa 20 <210> 237 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 237 gttcttaaca ttttagctag ctg 23 <210> 238 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 238 acgcgtcgac tcgacatttg ctgcaacggc 30 <210> 239 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 239 ctagtctaga tgttgttgtt gttgtcgtt 29 <210> 240 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 240 caaaacacag caaaacacaa aaagctagca tgtatagaac cttgatgag 49 <210> 241 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 241 caaagacaga aggcgcgcct tataagatgg ttctcgctgg 40 <210> 242 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 242 caaaacacac aaacaaacac agctagcatg tacagaacgt taatgtctgc 50 <210> 243 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL PRIMER <400> 243 gtgattaaac tattagatgg cgcgccttac aggatggttc tggcagg 47 <210> 244 <211> 703 <212> DNA <213> Issatchenkia orientalis <400> 244 gagtccatcg gttcctgtca gatgggatac tcttgacgtg gaaaattcaa acagaaaaaa 60 aaccccaata atgaaaaata acactacgtt atatccgtgg tatcctctat cgtatcgtat 120 cgtagcgtat cgtagcgtac cgtatcacag tatagtctaa tattccgtat cttattgtat 180 cctatcctat tcgatcctat tgtatttcag tgcaccattt taatttctat tgctataatg 240 tccttattag ttgccactgt gaggtgacca atggacgagg gcgagccgtt cagaagccgc 300 gaagggtgtt cttcccatga atttcttaag gagggcggct cagctccgag agtgaggcga 360 gacgtctcgg tcagcgtatc ccccttcctc ggcttttaca aatgatgcgc tcttaatagt 420 gtgtcgttat ccttttggca ttgacggggg agggaaattg attgagcgca tccatatttt 480 tgcggactgc tgaggacaat ggtggttttt ccgggtggcg tgggctacaa atgatacgat 540 ggtttttttc ttttcggaga aggcgtataa aaaggacacg gagaacccat ttattctaaa 600 aacagttgag cttctttaat tattttttga tataatattc tattattata tattttcttc 660 ccaataaaac aaaataaaac aaaacacagc aaaacacaaa aat 703 <210> 245 <211> 961 <212> DNA <213> Issatchenkia orientalis <400> 245 agcaatttga ggaaggaata ggagaaggag aagcaatttc taggaaagag caaggtgtgc 60 aacagcatgc tctgaatgat attttcagca atagttcagt tgaagaacct gttggcgtat 120 ctacatcact tcctacaaac aacaccacga attgcgtccg tggtgacgca actacgaatg 180 gcattgtcaa tgccaatgcc agtgcacata cacgtgcaag tcccaccggt tccctgcccg 240 gctatggtag agacaagaag gacgataccg gcatcgacat caacagtttc aacagcaatg 300 cgtttggcgt cgacgcgtcg atggggctgc cgtatttgga tttggacggg ctagatttcg 360 atatggatat ggatatggat atggatatgg agatgaattt gaatttagat ttgggtcttg 420 atttggggtt ggaattaaaa ggggataaca atgagggttt tcctgttgat ttaaacaatg 480 gacgtgggag gtgattgatt taacctgatc caaaaggggt atgtctattt tttagagtgt 540 gtctttgtgt caaattatgg tagaatgtgt aaagtagtat aaactttcct ctcaaatgac 600 gaggtttaaa acaccccccg ggtgagccga gccgagaatg gggcaattgt tcaatgtgaa 660 atagaagtat cgagtgagaa acttgggtgt tggccagcca agggggaagg aaaatggcgc 720 gaatgctcag gtgagattgt tttggaattg ggtgaagcga ggaaatgagc gacccggagg 780 ttgtgacttt agtggcggag gaggacggag gaaaagccaa gagggaagtg tatataaggg 840 gagcaatttg ccaccaggat agaattggat gagttataat tctactgtat ttattgtata 900 atttatttct ccttttatat caaacacatt acaaaacaca caaaacacac aaacaaacac 960 a 961 <210> 246 <211> 992 <212> DNA <213> Issatchenkia orientalis <400> 246 tattggtagt tctttccccc tctcaagctg gcgtgaaatg caaccttacg gcgtctacgt 60 tactacaagg tccagaaagt gtaggtattg ctactatttt tattttttat tggttctgga 120 gaaatgcaga cagtcaatga acacaactgt ctcaatatgc atctatgcac atgcacacac 180 acacacatca caggtacccc tacaaagaga ggtctcttga taatgtttca ttaccacgtg 240 gcatcccccc cccccccccc aataaacaag tggccgagtt cccctgttgc agaggaggac 300 aaaaaaaccg ctggtgttgg taccattatg cagcaactag cacaacaaac aaccgaccca 360 gacatacaaa tcaacaacac ttcgccaaag acaccctttc cagggaggat ccactcccaa 420 cgtctctcca taatgtctct gttggcccat gtctctgtcg ttgacaccgt aaccacacca 480 accaacccgt ccattgtact gggatggtcg tccatagaca cctctccaac ggggaacacc 540 tcattcgtaa accgccaagg ttaccgttcc tcctgactcg ccccgttgtt gatgctgcgc 600 acctgtggtt gcccaacatg gttgtatatc gtgtaaccac accaacacat gtgcagcaca 660 tgtgtttaaa agagtgtcat ggaggtggat catgatggaa gtggacttta ccacttggga 720 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PRIMER <400> 271 aacacttatg gcgtctcctc 20 <210> 272 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 272 cgaaccaatt caagaaaacc aac 23 <210> 273 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 273 tctgtccctt ggcgacgc 18 <210> 274 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 274 cttttcaaac agataagtac c 21 <210> 275 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 275 atgggctgac ctgaaaattc 20 <210> 276 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 276 gctgaaaata tcattcagag cat 23 <210> 277 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 277 actgttgatg tcgatgcc 18 <210> 278 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 278 tctgaatgca gtacgagttg 20 <210> 279 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 279 gaagggggtc caagttatcc 20 <210> 280 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 280 gatatgggcg gtagagaaga 20 <210> 281 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 281 gctccttcaa aggcaacaca 20 <210> 282 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 282 tgaactatca catgaacgta 20 <210> 283 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 283 tcaaggtagg gtcacttaac 20 <210> 284 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 284 tgattccttc aatcacaggt 20 <210> 285 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 285 aaccgaccta tcgaatgcct 20 <210> 286 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 286 accatgatta cgccaagctt ggtaccttgg ggtttacgct tacagcgtac t 51 <210> 287 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 287 tcaacgcccc gggggatctg gatccgcggc cgcaagaaat tcctttcttt tcccctttat 60 a 61 <210> 288 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 288 aaccgatgga ctcctcgagg gatccgcggc cgcgcataac aaaattgtgc ctaaccca 58 <210> 289 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 289 acgactcact atagggcgaa ttgggccccg ggaaaaggag agagaaaagg aga 53 <210> 290 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 290 tatgaccatg attacgccaa gcttggtacc tcctacagaa gtagcaccag cacca 55 <210> 291 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 291 ggaaccgatg gactcctcga gggatccgcg gccgcagact accgtgtaaa taagagtacc 60 <210> 292 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 292 tcttcaacgc cccgggggat ctggatccgc ggccgcattt gatataaacg cttctataat 60 a 61 <210> 293 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 293 gtaatacgac tcactatagg gcgaattggg cccaacatct gctgctgtaa tatattca 58 <210> 294 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 294 gcatgtctgt taactctcaa accat 25 <210> 295 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 295 tccataatcc aatagatcat ccc 23 <210> 296 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 296 aacacaatgg aaccaaccta gt 22 <210> 297 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 297 atttacacgg tagtctgcgg ccgccatagc ctcatgaaat cagcc 45 <210> 298 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 298 ctctaggttc actggttgtt tcttgggctg cctccttcaa 40 <210> 299 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 299 ttgaaggagg cagcccaaga aacaaccagt gaacctagag 40 <210> 300 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 300 tattatagaa gcgtttatat caaatgcggc cgcggatcca gatcccccgg ggcgtt 56 <210> 301 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 301 aatgatcaac ttgagaggta 20 <210> 302 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 302 caggtctgtt acataaagca 20 <210> 303 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 303 gtttacgctc aaatctcctc c 21 <210> 304 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 304 ggtacatgaa gcaggctttg aagg 24 <210> 305 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 305 gattgtgtcc gtcagccttt gctc 24 <210> 306 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 306 taccatattt tcagaggatc a 21 <210> 307 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 307 aggatgttct tgcctgcaag t 21 <210> 308 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 308 gatgatatag ttgatgcttt ccaaag 26 <210> 309 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 309 gggccccttc atttacgaaa taaagtgccg cgg 33 <210> 310 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 310 gcggccgcaa ataaatttaa aataaacgat atcaaaattc 40 <210> 311 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 311 cgacgccaaa gaagggctca gccgaaaaag 30 <210> 312 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 312 ccatttcttt ttcggctgag cccttctttg gc 32 <210> 313 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 313 gcggccgcaa taacctcagg gagaactttg gc 32 <210> 314 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 314 gagctcccaa acaaggtctc agtaggatcg 30 <210> 315 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 315 cgccataagg agaggctgta gatttgtc 28 <210> 316 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 316 ccaggacatc ttgcttgcaa tgtcg 25 <210> 317 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 317 gttccatcgg gcccctaaag gtctctcacg acag 34 <210> 318 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 318 caaacacatc gcgataaaat gtccagaggc ttc 33 <210> 319 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 319 gcaagacctt ggatctgaag gg 22 <210> 320 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 320 cgaaccaatt caagaaaacc aacag 25 <210> 321 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 321 gggcccgtcc cttggcgacg ccctgatc 28 <210> 322 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 322 gcggccgcta tttttgtgtt ttgctgtgtt ttg 33 <210> 323 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 323 gcggccgcca tctgaatgta aaatgaacat taaaatg 37 <210> 324 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 324 gagctccccc agttgttgtt gcaattaac 29 <210> 325 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 325 gaagagacgt acaagatccg cc 22 <210> 326 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 326 taggaatggt gcatcatcca ac 22 <210> 327 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 327 ttcttatctg aaaactccga gttcgcaaag aaggttgaag 40 <210> 328 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 328 ttattgaaat taatccaagg attcaagttg aacatacaat tactg 45 <210> 329 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 329 tttccaaaaa agttcgtgag ttcgatggtt gtatgattat gg 42 <210> 330 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 330 cctctaccac caccaccaaa tg 22 <210> 331 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 331 gggaagaaac taagaagaag tatg 24 <210> 332 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 332 caatccttct agagaggggg ttatatgtgt aaatatagag tttg 44 <210> 333 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 333 ttctaccctc gagattggtt ctttccccct ctcaag 36 <210> 334 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 334 gtggtcaatc tagaaaatat gactgacaaa atctccctag gtac 44 <210> 335 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 335 caattttgga gctgattcca aatcgtaaac 30 <210> 336 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 336 caagagtatc ccatctgaca ggaaccgatg g 31 <210> 337 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 337 gctggagaat agatcttcaa cgccccg 27 <210> 338 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 338 cggagaaggc gtataaaaag gacacggag 29 <210> 339 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 339 ggataaaagt attacatacg tacaggattg tgtattagtg tatttcg 47 <210> 340 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 340 cctccagtgt ttttctctct gtctctttgt tttttttttc 40 <210> 341 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 341 ggttaattaa tttatttgta cataaaaacc acataaatgt aaaagc 46 <210> 342 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 342 gaattccttt aattcggaga aaatctgatc aagag 35 <210> 343 <211> 945 <212> DNA <213> Metallosphaera sedula <400> 343 atgaccgaaa aggtctccgt cgtcggtgca ggcgtcatcg gtgtcggttg ggctaccttg 60 ttcgcttcca agggttactc cgtctccttg tacaccgaaa agaaggaaac cttggacaag 120 ggtatcgaaa agttgcgtaa ctacgtccaa gtcatgaaga acaactccca aatcaccgaa 180 gacgtcaaca ccgtcatctc cagagtttcc cctactacca acttggacga agccgttaga 240 ggtgcaaact tcgtcatcga ggctgtcatc gaagactacg acgctaagaa gaagatcttc 300 ggttacttgg actccgtctt ggacaaggaa gttatcttgg catcctccac ctccggtttg 360 ttgatcaccg aagtccaaaa ggctatgtcc aagcacccag aaagagctgt catcgcccac 420 ccatggaacc caccacactt gttgcctttg gtcgaaatcg ttccaggtga gaagacctcc 480 atggaagtcg ttgagagaac caagtccttg atggaaaagt tggacagaat cgtcgtcgtt 540 ttgaagaagg aaatcccagg tttcatcggt aacagattgg cattcgcttt gttcagagaa 600 gctgtctact tggttgacga gggtgtcgca accgtcgagg acatcgacaa ggttatgact 660 gccgctatcg gcttgagatg ggccttcatg ggtccattct tgacctacca cttgggtggt 720 ggtgagggtg gtttggaata cttcttcaac agaggtttcg gttacggtgc caacgaatgg 780 atgcacacct tggctaagta cgacaagttc ccatacaccg gtgtcaccaa ggccatccag 840 caaatgaagg aatactcctt catcaagggt aagaccttcc aagagatctc caagtggaga 900 gacgaaaagt tgttgaaggt ctacaagttg gtctgggaaa agtaa 945 <210> 344 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 344 agggtacctt agtacgaagg 20 <210> 345 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 345 ctattcttac gatgaaggcg 20 <210> 346 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 346 ccttaattaa ttatccacgg aagatatgat g 31 <210> 347 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 347 gctctagata aaatgtccca aggtagaaaa gc 32 <210> 348 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 348 gctagctaaa atgtttggta atatttccca 30 <210> 349 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 349 ttaattaact atttatctaa tgatcctc 28 <210> 350 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 350 tctagataaa atgtctatta gtgaaaaata ttttcctcaa g 41 <210> 351 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARTIFICIAL DNA PRIMER <400> 351 ttaattaact tttaaatttt ggaaaaagct tgatcaataa tgg 43

Claims (38)

  1. 외인성 PPC 유전자;
    외인성 PYC 유전자;
    외인성 AAT 유전자;
    외인성 ADC 유전자;
    외인성 BAAT 또는 gabT 유전자; 및
    외인성 3-HPDH 유전자
    로부터 선택된 하나 이상의 외인성 3-HP 경로 유전자를 포함하는, 활성 3-HP 발효 경로를 포함하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  2. 제 1항에 있어서, 외인성 PYC 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  3. 제 2항에 있어서, PYC 유전자는 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, PYC 유전자가 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 AAT 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  6. 제 5항에 있어서, AAT 유전자는 SEQ ID NO: 14, 15, 및 16으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, AAT 유전자는 SEQ ID NO: 13의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 ADC 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  9. 제 8항에 있어서, ADC 유전자는 SEQ ID NO: 17, 18, 133, 135, 137, 및 139로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, ADC 유전자는 SEQ ID NO: 130, 131, 132, 134, 136, 및 138로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 BAAT 유전자 또는 외인성 gabT 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  12. 제 11항에 있어서, BAAT 유전자 또는 gabT 유전자는 SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 및 24로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, BAAT 유전자 또는 gabT 유전자는 SEQ ID NO: 19, 140, 141, 및 142로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  14. 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BAAT 유전자 또는 gabT는 BAAT 유전자이며, 이것은 또한 gabT 유전자인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 3-HPDH 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  16. 제 15항에 있어서, 3-HPDH 유전자는 SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 및 129로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  17. 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 3-HPDH는 SEQ ID NO: 25, 143, 144, 및 343으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  18. 제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 3-HPDH 유전자는 또한 HIBADH 유전자인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  19. 제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 3-HPDH 유전자는 또한 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 유전자인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 PPC 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  21. 제 20항에 있어서, PPC 유전자는 SEQ ID NO: 10, 11, 및 12로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  22. 제 20항 또는 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, PPC 유전자는 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  23. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 세포는 크랩트리-음성인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  24. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 효모 세포는 이사트첸키아, 칸디다, 클루이베로미세스, 피치아, 쉬조사카로미세스, 토룰라스포라, 지고사카로미세스, 및 사카로미세스로부터 선택된 속에 속하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  25. 제 24항에 있어서, 효모 세포는 아이. 오리엔탈리스/피. 페르멘탄스 클레이드 및 사카로미세스 클레이드로부터 선택된 클레이드에 속하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  26. 제 24항에 있어서, 효모 세포는 아이. 오리엔탈리스, 씨. 람비카, 및 에스. 불데리로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  27. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 PDC, ADH, GAL6, CYB2A, CYB2B, GPD, GPP, ALD, 및 PCK 유전자로부터 선택된 네이티브 유전자의 하나 이상의 삭제 또는 붕괴를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  28. 제 27항에 있어서, 삭제 또는 붕괴 중 하나 이상은 외인성 3-HP 경로 유전자로부터 발생하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  29. 제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 3-HP 경로 유전자 중 하나 이상은 하나 이상의 외인성 조절 요소와 작동 가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 75 g/L 이상의 3-HP를 함유하는 배지에서 4 미만의 pH에서 성장할 수 있는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  31. 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 3-HP-저항성 효모 세포인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 돌연변이 및/또는 선택을 겪었으며, 이러한 돌연변이 및/또는 선택된 세포는 같은 종의 야생형 세포보다 3-HP에 대하여 더 높은 정도의 저항성을 소유하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  33. 제 32항에 있어서, 세포는 하나 이상의 외인성 3-HP 경로 유전자를 가지고 유전적으로 변형되기 전에 돌연변이 및/또는 선택을 겪는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  34. 제 32항 또는 제 33항에 있어서, 세포는 젖산 또는 3-HP의 존재시 선택을 겪는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  35. 제 34항에 있어서, 선택은 케모스태트 선택인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 효모 세포.
  36. (i) 적어도 하나의 탄소 공급원을 포함하는 배지의 존재시 제 1항 내지 제 35항 중 어느 한 항의 유전적으로 변형된 효모 세포를 배양하는 단계
    (ii) 배양물로부터 3-HP를 분리하는 단계
    를 포함하는, 3-HP를 생산하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 탄소 공급원은 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 수크로스, 프럭토스, 셀룰로스, 글루코스 올리고머, 및 글리세롤로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 36항 또는 제 37항에 있어서, 배지는 5 미만, 예를 들어, 약 1.5 내지 약 4.5, 약 2.0 내지 약 4.0, 또는 약 2.0 내지 약 3.5의 범위의 pH인 것을 특징으로 하는 방법.
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