CN110914434A - 苏氨酸生产酵母 - Google Patents

Abstract

本发明涉及苏氨酸的生物生产领域。发明人已经构思了遗传修饰的酵母，与亲本酵母相比，其具有提高的生产苏氨酸的能力。

Description

苏氨酸生产酵母

技术领域

本发明涉及苏氨酸的生物生产领域。

背景技术

苏氨酸或L-苏氨酸是一种必需氨基酸，被广泛用作动物饲料和食品的添加剂，以及用作医学和制药用途的液体和合成材料。

苏氨酸，连同丝氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，是不带电荷的极性氨基酸之一，并且在许多活生物体(包括非人类和人类哺乳动物)的代谢中必不可少。

大多数植物、真菌和细菌可以从碳水化合物来源合成苏氨酸。但是，动物(包括人类)都依赖于外部提供的苏氨酸来源。

心脏、骨骼肌和中枢神经系统中存在高浓度的苏氨酸，并且苏氨酸在许多蛋白质、胶原蛋白、弹性蛋白和牙釉质的形成中很重要。苏氨酸有助于维持体内适当的蛋白质平衡，也有助于预防肝脏中脂肪的堆积。苏氨酸非常令人感兴趣的点还在于它可以通过保护消化道来支持消化功能，因为需要它来产生顺转(veer)消化道的粘液。因此，苏氨酸有助于预防消化不良和溃疡。

还已经证明，苏氨酸支持免疫系统，因为需要它来在胸腺中产生抗体。

此外，由于苏氨酸被身体用于产生其他氨基酸，即丝氨酸和甘氨酸，因此苏氨酸的充分吸收对于产生这两种必需氨基酸也是非常重要的。特别地，丝氨酸和甘氨酸对于生物体中胶原蛋白的产生很重要。众所周知，胶原蛋白在所有非人类和人类哺乳动物生物中都非常重要。

化学生产的苏氨酸可用于大多数应用。然而，在化石资源减少和更强的环境约束(例如有害中间体和废物)的背景下，基于自然资源的替代性和更具可持续性的工艺越来越引起人们的关注。此外，人们普遍寻找用于多种工业应用的节省成本的苏氨酸来源。

苏氨酸可以通过非合成工艺、通过酶促转化或发酵、由前体化合物(例如糖(如葡萄糖)、天冬氨酸(aspartate)或高丝氨酸)开始进行生产。然而，因为前体通常是化学合成的，或者必须首先通过发酵生产，所以与化学合成的工艺相比，没有真正的工业或经济优势。通过发酵方法生产和纯化苏氨酸的工艺的示例性实施方案例如公开于美国专利号US3,375,173和US 4,996,147中。

通过发酵从天然来源生产苏氨酸可以解决许多上述问题。有许多细菌和酵母能够在适当条件下过量生产氨基酸。但是，由于L-苏氨酸合成的调控非常复杂，因此只有少数菌株能够生产经济上有价值的量的苏氨酸。因此，通过发酵工艺生产苏氨酸的主要缺点是苏氨酸的生物合成非常复杂，且具有多重反馈抑制(Chassagnol等人(2001)；Biochem.J.(356)433-444)。

在所有情况下，候选苏氨酸生产生物都必须经过许多轮的突变和选择，然后才能作为有价值的生产者被保留。在美国专利申请号US 20090093030以及美国专利号8,852,898中公开了在自发突变或化学诱导的突变后选择的候选苏氨酸生产微生物的说明性实施方案。

通过细菌和酵母的生物合成途径生产必需氨基酸(例如苏氨酸)需要NADPH形式的大量还原力。然而，在这些微生物中，特别是在酵母中，葡萄糖代谢的主要途径是糖酵解，然后进行发酵，其仅产生NADH。因此，在微生物中保持适当的NADPH/NADH平衡(尽管很复杂)对于优化苏氨酸的生物生产，同时获得有活力的重组微生物是至关重要的。

已知的主要细菌性氨基酸生产者是谷氨酸棒状杆菌(C.glutanicum)，它是一种革兰氏阳性、兼性厌氧、非致病性土壤细菌。谷氨酸棒状杆菌被用于大规模工业生产增味剂L-谷氨酸(L-glutamate)以及食品添加剂L-赖氨酸。已经进行了各种尝试以通过谷氨酸棒状杆菌的发酵来生产苏氨酸，如Palmieri等人Arch Microbiol(1996)165:48中所示。

根据其他改进策略，已经通过对候选微生物(主要是细菌生物大肠杆菌)进行遗传工程改造研究了通过发酵增加苏氨酸生产。Kwang Ho Lee等人(Mol Syst Biol.2007；3:149)中公开了示例性实施方案。

在本领域中仍然需要其他苏氨酸生产方法。

发明内容

因此，本发明涉及一种生产苏氨酸的重组酵母，在其基因组中：

(A)至少一种编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸和/或至少一种编码可使用NAD和NADP两者作为辅酶的天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；

(B)至少一种编码高丝氨酸激酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；

(C)至少一种编码苏氨酸合酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；并且

(D)(i)至少一种编码天门冬氨酸激酶(aspartokinase)的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；和/或

(ii)至少一种编码天冬氨酸激酶(aspartate kinase)的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。

如所附实施例所示，与非重组或天然菌株相比，本发明的重组酵母具有增加的苏氨酸生产。

还可通过使酵母与下文所述的另外的修饰重组，来进一步提高所述有利性质。

因此，生产苏氨酸的重组酵母可以有利地用于下文所述的生产苏氨酸的方法中或用于生产苏氨酸。

本发明还涉及一种生产苏氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在培养基中培养本发明的重组酵母；和

(b)从所述培养基中回收苏氨酸。

在一个优选的实施方案中，培养基至少包含碳源，优选选自由葡萄糖和蔗糖组成的组的碳源。

本发明还涉及本发明的重组酵母用于生产苏氨酸的用途。

具体实施方式

发明人已经构思了遗传修饰的微生物，尤其是遗传修饰的酵母，与亲本微生物相比，尤其是与亲本酵母相比，其具有提高的生产苏氨酸的能力。

在整个本说明书中描述了这些遗传修饰的微生物，包括这些遗传修饰的酵母。

定义

如本文所用，术语“微生物”是指未经人工修饰的酵母。如果微生物提供了将要整合到微生物“受体”的遗传元件(所述“受体”将表达该外源遗传元件)，或者如果微生物用作基因构建或蛋白质表达的工具，则该微生物可能是“供体”。本发明的微生物选自表达用于苏氨酸的生物合成的基因的酵母。

如本文所用，术语“重组微生物”或“遗传修饰的微生物”或“重组酵母”或“遗传修饰的酵母”是指经遗传修饰或遗传工程改造的酵母。根据这些术语的通常含义，这意味着本发明的微生物不是在自然界中存在的，而是通过引入或通过删除或通过修饰来自自然界中存在的等同微生物的遗传元件而被修饰的。也可以通过在特定选择压力下结合定向诱变和进化来迫使新的代谢途径的发展和进化来对其进行修饰(参见例如WO 2004/076659)。

如果将外源基因与所有允许其在宿主微生物中表达的元件一起引入到微生物中，则可以对微生物进行修饰以表达这些外源基因。可以对微生物进行修饰以调节内源基因的表达水平。用外源DNA修饰或“转化”微生物，如酵母，是本领域技术人员的常规工作。特别地，根据本发明的微生物的遗传修饰，特别是本文定义的遗传修饰，可以通过使用CRISPR-Cas系统进行，如DiCarlo等人(Nucl.Acids Res.,vol.41,No.7,2013:4336-4343)中所述。

术语“内源基因”是指该基因在任何遗传修饰之前存在于野生型株的微生物中。可以通过引入异源序列以补充或替代内源性调节元件，或通过向染色体或质粒中引入基因的一个或多个额外拷贝，来使内源基因过表达。也可以对内源基因进行修饰以调节其表达和/或活性。例如，可以向编码序列中引入突变以修饰基因产物，或者可以引入异源序列以补充或替代内源调节元件。内源基因的调节可导致基因产物的活性的上调和/或增强，或者，导致内源基因产物的活性的下调和/或减弱。增强内源基因表达的另一种方法是向染色体或质粒中引入基因的一个或多个额外拷贝。

术语“外源基因”是指该基因通过本领域技术人员熟知的方法被引入到微生物中，而该基因不是天然存在于野生型微生物中的。如果将外源基因与所有允许其在宿主微生物中表达的元件一起引入到微生物中，则微生物可以表达这些外源基因。用外源DNA转化微生物是本领域技术人员的常规工作。外源基因可以被整合到宿主染色体中，或由质粒或载体在染色体外表达。本领域已知多种质粒，它们的复制起点和它们在细胞中的拷贝数是不同的。可以修改外源基因的序列以在宿主微生物中表达。实际上，本领域技术人员知晓密码子使用偏好的概念以及如何针对特定的密码子使用偏好修改核酸序列而不更改推断蛋白质。

术语“异源基因”是指该基因衍生自不同于表达它的受体微生物的微生物物种。它是指不天然存在于该微生物中的基因。

在本申请中，所有基因均以其通用名称并参考其核苷酸序列，以及有的情况也参考其氨基酸序列进行指代。使用已知基因的登录号(accession number)给出的索引，本领域技术人员能够确定其他生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等同基因。该常规工作有利地使用共有序列进行，所述共有序列可以通过以下方法确定：与衍生自其他微生物的基因进行序列比对并设计简并探针(degenerated probe)以克隆另一生物体中的相应基因。

本领域技术人员知晓调节(特别是上调或下调)内源基因表达的不同方法。例如，增强内源基因表达的一种方法是向染色体或质粒中引入基因的一个或多个额外拷贝。

另一种方法是用更强的启动子代替基因的内源启动子。这些启动子可以是同源的或异源的。在本说明书的其他地方更详细地描述了在本发明中特别令人感兴趣的启动子。

核酸表达构建体还可以包含5'和/或3'识别序列和/或选择标记。

术语“过表达”是指与未修饰的微生物相比，基因或酶的表达增加。通过增加编码所述酶的基因的表达来增加酶的表达。可以通过本领域技术人员已知的所有技术来增加基因的表达。在这方面，可以特别提及的是在打算过表达的核酸上游实施强启动子，或在启动子(特别是强启动子)和终止子之间引入所述核酸的多个拷贝。

术语“低表达”是指与未修饰的微生物相比，基因或酶的表达降低。通过降低编码所述酶的基因的表达来降低酶的表达。可以通过本领域技术人员已知的所有技术来降低基因的表达。在这方面，可以特别提及的是在打算低表达的核酸上游实施弱启动子。还可以提及的是实施编码比亲本酶的活性更低的所述酶的变体，或在细胞中比亲本酶更快速地降解的所述酶的变体的核酸。比亲本酶更快速地降解的所述亲本酶的变体涵盖降解决定子(degron)标记的酶。还可以提及的是降低目的基因的转录激活子的表达。

术语“诱导型启动子”用于限定在以下情况下，其活性被诱导(即增加)的启动子：

-在一种或多种特定代谢物的存在下。培养基中该代谢物浓度越高，启动子活性越强；或者

-在低浓度的一种或多种代谢物的存在下，或在不存在一种或多种代谢物的情况下。这些代谢物不同于其存在增加会诱导启动子活性的那些代谢物。培养基中该代谢物浓度越低，启动子活性越强。

术语“抑制型启动子”用于限定在以下情况下，其活性被抑制(即降低)的启动子：

-在一种或多种特定代谢物的存在下。培养基中该代谢物浓度越高，启动子活性越弱；或者

-在低浓度的一种或多种代谢物的存在下，或在不存在一种或多种代谢物的情况下。这些代谢物不同于其存在增加会抑制启动子活性的那些代谢物。培养基中该代谢物浓度越低，启动子活性越弱。

如本文所用，“降解决定子标记的”酶是指包含添加的蛋白质降解信号氨基酸序列的酶，该氨基酸序列充当破坏信号，所述破坏信号将使所述酶成为降解的对象，所述降解可以是)非泛素依赖性降解或(ii)泛素依赖性降解。所述添加的蛋白质降解信号，在本领域中也称为“降解决定子”，其涵盖用作破坏信号的氨基酸序列，所述氨基酸序列由引起靶蛋白降解的可转移降解信号组成。降解决定子涵盖“N-降解决定子”，它们是可转移的N-末端氨基酸，可遵循众所周知的N-末端规则引起靶蛋白降解(Bachmair等人,1986,Science,Vol.234(4773):179-186)。N-降解决定子的不稳定性质归因于其首要氨基酸，这些氨基酸容易发生乙酰化或精氨酰化修饰，并最终导致泛素化和降解。通常，降解决定子需要至少两种组分以确保靶蛋白降解：(i)靶降解识别标签，例如聚泛素标签，和(ii)与该降解识别标签紧邻的非结构化氨基酸序列。为了对蛋白质进行降解决定子标记，特别是在本文中对酶进行降解决定子标记，本领域技术人员可以参考Yu等人(2015,Current Opinion inBiotechnology,Vol.36:199-204)、Cho等人(2010,Genes&Development,Vol.24:438-442)，或参考Fortmann等人(2015,J Mol Biol,Vol.427(17):2748-2756)、Ravid等人(2008,NatRev Mol Cell Biol,Vol.9(9):679-690)和Hochstrasser(1996,Annu Rev Genet,Vol.30:405-439)。

酶的“活性”与术语“功能”可互换使用，在本发明的上下文中表示酶催化所需反应的能力。

术语酶的“活性降低”或“活性减弱”是指通过氨基酸序列突变实现蛋白质的比催化活性降低，和/或通过核苷酸序列突变，或通过删除相应的同源基因，或还通过对蛋白质进行降解决定子标记实现细胞中蛋白质的浓度降低。

术语酶的“活性增强”表示例如通过编码酶的基因的过表达实现酶的比催化活性提高和/或细胞中酶的数量/利用率提高。

术语“编码”是指多核苷酸通过转录和翻译的机制生产氨基酸序列的过程。

编码本发明中考虑的酶的基因可以是外源的或内源的。

基因的“衰减”是指基因以比在未修饰的微生物中更慢地速度表达。衰减可以通过本领域技术人员已知的手段和方法来实现，并且包含通过同源重组实现的基因缺失、通过将外部元件插入到基因中的基因衰减或在弱启动子下的基因表达。本领域技术人员知晓表现出不同强度的多种启动子以及哪个启动子用于弱遗传表达。

在本发明中实施的方法优选地需要使用一种或多种染色体整合构建体，用于将异源核苷酸序列稳定地引入到染色体上的特定位置，或者用于在功能上破坏遗传修饰的微生物细胞中的一种或多种靶基因。在一些实施方案中，靶基因的破坏阻止了相关功能蛋白的表达。在一些实施方案中，靶基因的破坏导致被破坏的基因表达非功能蛋白。

在本发明的实践中可以改变的染色体整合构建体的参数包括但不限于同源序列的长度；同源序列的核苷酸序列；整合序列的长度；整合序列的核苷酸序列；和靶基因座的核苷酸序列。在一些实施方案中，每个同源序列的长度的有效范围是20至5,000个碱基对，优选50至100个碱基对。在特定的实施方案中，每个同源序列的长度为约50个碱基对。有关基因靶向所需的同源性长度的更多信息，请参见D.Burke等人,Methods in yeastGenetics–A cold spring harbor laboratory course Manual(2000)。

在一些实施方案中，打算插入上述DNA构建体的被破坏的基因可以有利地包含一种或多种用于选择转化的微生物细胞的选择标记。优选地，所述选择标记包含在根据本发明的DNA构建体中。

在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性标记。抗生素抗性标记的说明性实例包括但不限于NAT1、AURl-C、HPH、DSDA、KAN<R>和SH BLE基因产物。来自诺尔斯式链霉菌(S.noursei)的NAT 1基因产物赋予了对诺尔丝菌素(nourseothricin)的抗性；来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的AURl-C基因产物赋予了对Auerobasidin A(AbA)的抗性；肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)的HPH基因产物赋予了对潮霉素B的抗性；大肠杆菌的DSDA基因产物允许细胞在以D-丝氨酸作为唯一氮源的平板上生长；Tn903转座子的KAN<R>基因赋予了对G418的抗性；印度斯坦链异壁链霉菌(Streptoalloteichushindustanus)的SH BLE基因产物赋予了对Zeocin(博来霉素)的抗性。

在一些实施方案中，在分离出本发明的遗传修饰的微生物细胞之后，删除抗生素抗性标记。本领域技术人员能够在特定的遗传背景下选择合适的标记。

在一些实施方案中，选择标记拯救了遗传修饰的微生物细胞中的营养缺陷型(例如营养性营养缺陷型)。在这样的实施方案中，亲本微生物细胞在一种或多种在氨基酸或核苷酸生物合成途径中起作用的基因产物(例如酵母中的HIS3、LEU2、LYS1、LYS2、MET 15、TRP1、ADE2和URA3基因产物)中包含功能性破坏，这使得亲本微生物细胞无法在不添加一种或多种营养物质(营养缺陷表型)的培养基中生长。然后可以通过用编码被破坏的基因产物的功能性拷贝(NB：基因的功能性拷贝可以源自近缘种，例如克鲁维酵母(Kluveromyces)、念珠菌(Candida)等)的染色体整合体转化亲本微生物细胞来拯救营养缺陷表型，并可以根据亲本微生物细胞的营养缺陷表型的损失来选择所产生的遗传修饰微生物细胞。

对于包含启动子序列、编码序列(例如酶编码序列)或终止子序列的每个核酸序列，本文描述了参考序列。本说明书还涵盖与参考核酸序列具有特定百分比的核酸同一性的核酸序列。

对于每一个或多个目的氨基酸序列，本文描述了参考序列。本说明书还涵盖与参考氨基酸序列具有特定百分比的氨基酸同一性的氨基酸序列(例如酶氨基酸序列)。

由于明显的原因，在整个本说明书中，分别符合所考虑的核苷酸或氨基酸同一性的特定核酸序列或特定氨基酸序列应进一步导致获得显示出所需生物活性的蛋白质(或酶)。如本文所用，两个核酸序列之间或两个氨基酸序列之间的“同一性百分比”是通过比较窗口来比较两条最佳比对的序列来确定的。

因此，与参考序列(不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的核苷酸或氨基酸序列部分可以包括添加或缺失(例如“空位”)，以获得两个序列之间的最佳比对。

通过如下方法计算同一性百分比：确定可以注释两条比较序列为相同核酸碱基或相同氨基酸残基的位置数，然后将在两个核酸碱基之间或在两个氨基酸残基之间均可观察到同一性的位置数除以比较窗口中的总位置数，然后将结果乘以100，得到两条序列之间的核苷酸同一性百分比或两条序列之间的氨基酸同一性百分比。

序列最佳比对的比较可以使用已知算法由计算机来执行。

最优选地，使用CLUSTAL W软件(版本1.82)确定序列同一性百分比，参数设置如下：(1)CPU MODE＝ClustalW mp；(2)ALIGNMENT＝"全长"；(3)OUTPUT FORMAT＝"aln w/数目"；(4)OUTPUT ORDER＝"对齐的"；(5)COLORALIGNMENT＝"否"；(6)KTUP(字长)＝"默认"；(7)WINDOW LENGTH＝"默认"；(8)SCORE TYPE＝"百分比"；(9)TOPDIAG＝"默认"；(10)PAIRGAP＝"默认"；(11)PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE＝"无"；(12)MATRIX＝"默认"；(13)GAP OPEN＝"默认"；(14)END GAPS＝"默认"；(15)GAP EXTENSION＝"默认"；(16)GAPDISTANCES＝"默认"；(17)TREE TYPE＝"分支图"和(18)TREE GRAP DISTANCES＝"隐藏"。

“发酵”或“培养”通常在发酵罐中进行，发酵罐含有适合于所培养微生物的合适的培养基，该培养基含有至少一种简单碳源，和共底物(必要的话)。

本文公开的微生物可以在发酵培养基中生长以从草酰乙酸(oxaloacetate)生产产物。为了最大程度地生产苏氨酸，用作生产宿主的微生物株优选具有高的碳水化合物利用率。这些特征可以通过诱变和选择、基因工程改造来赋予，或者可以是天然的。用于本细胞的发酵培养基或“培养基”可包含至少约10g/L的葡萄糖。另外的碳底物可以包括但不限于单糖，例如果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖；寡糖，例如乳糖麦芽糖、半乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉或纤维素或其混合物，以及来自可再生原料的未纯化混合物，例如干酪乳清渗透玉米浆、甜菜糖蜜和大麦麦芽。其他碳底物可包括甘油。

因此，预期本发明中使用的碳源可以涵盖各种各样的含碳底物，并且仅受生物选择的限制。

尽管预期所有上述碳底物及其混合物均适用于本发明，但是对于被改造为使用C5糖(更特别是葡萄糖)的微生物，优选的碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖，或它们与C5糖如木糖和/或阿拉伯糖的混合物。

优选的碳底物是葡萄糖。

除了合适的碳源外，发酵培养基还可以包含合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液和本领域技术人员已知的适合于培养物的生长和促进生产所需产物所必需的酶促途径的其他组分。

此外，可以考虑适合于根据本发明的重组微生物的生长的其他遗传修饰。

术语“需氧条件”是指培养基中的氧浓度足以使需氧或兼性厌氧微生物使用双氧(di-oxygene)作为末端电子受体。

“微需氧条件”是指其中氧浓度低于空气中的氧浓度(即氧浓度多达6％O₂)的培养基。

“合适的培养基”是指包含对细胞的维持和/或生长必不可少或有益的营养物质的培养基(例如无菌液体培养基)，所述营养物质例如碳源或碳底物、氮源，例如胨、酵母提取物、肉类提取物、麦芽提取物、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵；磷源，例如磷酸一钾或磷酸氢二钾；微量元素(例如金属盐)，例如镁盐、钴盐和/或锰盐；以及生长因子，例如氨基酸、维生素、生长促进剂等。根据本发明的术语“碳源”或“碳底物”或“碳的来源”是指可以被本领域技术人员使用用来支持微生物正常生长的任何碳源，包括己糖(例如葡萄糖、半乳糖或乳糖)、戊糖、单糖、寡糖、二糖(例如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)、糖蜜、淀粉或其衍生物、纤维素、半纤维素及其组合。

根据本发明引入的遗传修饰的一般特征

-基因因两种非互斥的修饰而过表达：

·将它们置于强启动子控制之下；和/或

·插入所考虑的基因的多个拷贝。

-所有基因组修饰均根据已知的遗传工程技术插入到酵母中；

-根据本发明的酵母基因组中引入的基因构建体中所包括的连续基因具有以下结构：

Prom₁-ORF₁-term₁-ORF₂-gene₂-term₂-…/…-Prom_n-ORF_n-term_n，其中：

-Prom1是调节编码序列(ORF1)的表达的序列，

-ORF1是编码所需蛋白质PROT1(尤其是所需酶PROT1)的核酸序列，

-Term1是转录终止子序列，其通过在新合成的mRNA中提供信号来介导转录终止，这些信号触发了从转录复合物中释放mRNA的过程，并且-“1”、“2”、.../...“n”可以描述或可以不描述相同的ORF(开放阅读框)、启动子或终止子。基因的顺序无关紧要，“n”是通常在5到20之间的整数。这些构建体被插入在酵母染色体之一中的受控位置。在一些实施方案中，插入位点对于被插入的构建体的功能或对于所得的遗传修饰的酵母的生存力不是必需的。

-当酵母是例如酿酒酵母时，通常将引入到酵母基因组中的、源自酿酒酵母以外的其他生物体的基因进行“转码”(通常将其进行密码子优化)，这意味着这些基因是以表达酿酒酵母的最佳密码子用法合成的。来自酿酒酵母的一些基因的核苷酸序列(而不是蛋白质序列)也已被修饰(“转码”)以使与所述基因的内源性拷贝的重组最小化。

-可以通过酵母遗传工程化中使用的标准方法删除基因。在一些实施方案中，可以通过插入上述基因构建体之一而中断靶向删除的基因，或者，用一小段核苷酸取代靶向删除的基因。

-可以通过如下方法下调基因表达：破坏基因的内源性拷贝并用处于弱启动子的控制之下的ORF的拷贝替代它。弱启动子的列表和序列在本说明书的其他地方描述。

-可以通过如下方法使基因“可诱导或可抑制”：删除基因的内源性拷贝(如果需要的话)并将新的ORF的拷贝置于诱导型或抑制型启动子的控制之下。诱导型或抑制型启动子是在环境条件改变或外部刺激时其活性被调节和控制(即增加或降低)的启动子。诱导或抑制可以是人为控制的，其涵盖通过非生物因素，例如目标生物体中非天然存在的化合物、光、氧水平、热或冷，进行诱导或抑制。诱导型或抑制型启动子的列表和序列在本说明书的其他地方描述。

-如已在本文其他地方规定的，可以通过使用Yu等人2015(Current Opinion inBiotechnology,Vol.36:199-204)中描述的“降解决定子”技术，通过去稳定化，使蛋白质低表达。简而言之，该技术在于在蛋白质序列中引入将蛋白质靶向降解的修饰。它可以仅包含两个首要氨基酸，遵循被称为N-末端规则的原则，或包含一个更大的序列，其将整个蛋白质靶向泛素-蛋白酶体(ubiquitin-preoteasome)降解途径。

根据本发明的重组酵母

发明人已经构思了重组微生物，尤其是重组酵母，其生产苏氨酸的能力提高。

本发明涉及苏氨酸的生产提高的重组酵母，其中苏氨酸的生产提高是通过由基因工程方法引入到其基因组中的多种改变而获得的。

本发明涉及生产苏氨酸的重组酵母，在其基因组中：

(A)至少一种编码天冬氨酸半醛脱氢酶HOM2的核酸和/或至少一种编码可使用NAD和NADP两者作为辅酶的天冬氨酸半醛脱氢酶HOM2的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；

(B)至少一种编码高丝氨酸激酶THR1的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；

(C)至少一种编码苏氨酸合酶THR4的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；并且

(D)(i)至少一种编码天门冬氨酸激酶HOM3的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；和/或

(ii)至少一种编码天冬氨酸激酶AK的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。

发明人已经发现，酵母细胞提高苏氨酸的生产可以通过在这些酵母细胞的基因组中引入多种遗传改变来达到。如本文中充分描述的，所述多个遗传改变涵盖某些基因的过表达、某些其他基因的受控表达以及另外的其他基因的抑制或缺失。

发明人已经通过以下方法实现了酵母细胞的提高苏氨酸的生产：优化草酰乙酸的代谢，从而使随后的人工修饰的代谢途径主要导向苏氨酸的生产，而同时维持所得遗传修饰的酵母细胞的最佳生存力。

在漫长的研究时间之后，本发明人已经确定，通过如下方法获得酵母细胞的苏氨酸的高生产：增加草酰乙酸向连续中间代谢物天冬氨酸、磷酸-天冬氨酰、天冬氨酰-半醛、高丝氨酸和磷酸-高丝氨酸的转化，并另外提高磷酸-高丝氨酸向苏氨酸的转化，同时尤其重要的是，保持氧化还原状态，从而使所得重组酵母细胞具有良好的生存力。最后一点很重要，在整个研究工作中对发明人构成了重大挑战。

根据本发明提出的解决方案出乎意料地使得能够通过消耗较少的还原力，消耗NADH形式而不是NADPH形式的还原力，和/或生产NADH而不是NADPH，在酵母细胞中在整个苏氨酸生产途径中维持可行的NADH/NADPH平衡。

如本说明书中详细公开的，所得重组酵母细胞被遗传修饰，以(I)实现天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因(HOM2)、高丝氨酸激酶(THR1)和苏氨酸合酶(THR4)的过表达和/或受控表达，以及(II)实现天门冬氨酸激酶编码基因(HOM3)的受控表达和/或天冬氨酸激酶(AK)的过表达和/或受控表达。

此外，在根据本发明的重组酵母的一些实施方案中，所述酵母包含另外的遗传修饰，以最佳地使用中间代谢物天冬氨酰-半醛，用于苏氨酸生产，所述另外的遗传修饰包括(i)天冬氨酸转氨酶(AAT2)的过表达和/或受控表达、(ii)将氧代-戊二酸转化为谷氨酸的谷氨酸脱氢酶(GDH)的过表达和/或受控表达、(iii)高丝氨酸脱氢酶(HOM6)的过表达和(iv)可能的转运蛋白(probabletransporter)(AQR1)的过表达。

在根据本发明的重组酵母的一些实施方案中，所述酵母包含用于苏氨酸生产的替代性的另外的遗传修饰，所述另外的遗传修饰包括：

A.a)删除至少一种、优选所有编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶(MET2)的内源性核酸，或者

b)抑制至少一种、优选所有编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶(MET2)的核酸和/或以下事实：至少一种、优选所有编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶(MET2)的核酸处于不稳定的形式；

和/或

B.a)删除至少一种、优选所有编码甲硫氨酸合酶(MET17)的内源性核酸，或者

b)抑制至少一种、优选所有编码甲硫氨酸合酶(MET17)的核酸和/或以下事实：至少一种、优选所有编码甲硫氨酸合酶(MET17)的核酸处于不稳定的形式。

与不包含上述遗传修饰的亲本酵母相比，根据本发明的重组酵母生产苏氨酸的产率更高。

本发明的重组酵母已经进行了遗传工程改造，以便促进利用NADH而非NADPH的酶的表达，例如合适的谷氨酸脱氢酶或合适的天冬氨酸半醛脱氢酶。

在根据本发明的重组酵母的一些实施方案中，过表达的天冬氨酸-半醛脱氢酶由被置于强启动子和/或诱导型或抑制型启动子的控制之下的酿酒酵母内源基因组成。

在一些实施方案中，天冬氨酸-半醛脱氢酶优选由酿酒酵母HOM2基因编码。

在一些实施方案中，天冬氨酸-半醛脱氢酶最优选地由酿酒酵母HOM2基因的变体编码，该基因编码使用NAD和NADP的突变的HOM2蛋白，如本文的实施例所示。这种基因变体例如在实施例中说明，并称为HOM2-2。它对应于如下文所述突变的酿酒酵母HOM2基因。

以放宽HOM2对于NADP作为辅酶的高选择性并增强该酶对NAD的亲和力为目的的、针对天冬氨酸-半醛脱氢酶变体中的几个氨基酸残基的突变的性质，是本领域技术人员已知的并且可以例如见于Faehnle,C.R.等人,Journal of Molecular Biology 1055–1068(2005)。特别地，可以提及突变S39至E39，其对应于核苷酸序列的第115至117位的核苷酸TCT替换为核苷酸GAG。

根据本领域技术人员熟知的氨基酸命名法，S代表丝氨酸，E代表谷氨酸。

在一些实施方案中，天门冬氨酸激酶最优选地由酿酒酵母HOM3基因编码，如本文的实施例所示。

此外，通过将编码天门冬氨酸激酶的核酸置于诱导型或抑制型启动子的控制之下，可以实现天门冬氨酸激酶表达的受控表达。可用于获得本发明的生产苏氨酸的重组酵母的示例性诱导型或抑制型启动子在本说明书的其他地方描述。

说明性地，在其中所述诱导型或抑制型启动子是源自酿酒酵母的pCUP1-1启动子的实施方案中，可以通过向培养基中添加铜来诱导天门冬氨酸激酶的表达。本领域技术人员可以特别参考Koller等人(2000,Yeast,Vol.16:651-656)。

天冬氨酸-半醛脱氢酶编码基因过表达和/或受控表达

在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，天冬氨酸-半醛脱氢酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含天冬氨酸-半醛脱氢酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的天冬氨酸-半醛脱氢酶和天冬氨酸-半醛脱氢酶编码基因在本说明书的其他地方详述。

在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含天冬氨酸-半醛脱氢酶(HOM2)编码序列的表达盒包含允许天冬氨酸-半醛脱氢酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。

作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种天冬氨酸-半醛脱氢酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。

不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信天冬氨酸-半醛脱氢酶的过表达可以促进中间代谢物天冬氨酰磷酸(Aspartyl-P)向天冬氨酰-半醛的转化。当至少一种天冬氨酸-半醛脱氢酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。

在一些实施方案中，天冬氨酸-半醛脱氢酶可以是使用NADH或NADPH来催化天冬氨酰磷酸(Aspartyl-P)转化为天冬氨酰-半醛的酶变体。

在一些优选的实施方案中，所述天冬氨酸-半醛脱氢酶编码基因是来自酿酒酵母的基因，或者，是利用NADH和NADPH两者的变体，如本文的实施例中所示和先前讨论的。

在优选的实施方案中，将所述天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因置于强启动子pADH1、强启动子pTEF1、诱导型或抑制型启动子pCUP1-1、诱导型或抑制型启动子pACU8或诱导型或抑制型启动子pACU5(特别是诱导型或抑制型启动子pACU5)的控制之下。

说明性地，可以将天冬氨酸-半醛脱氢酶基因插入在HOM3基因内和/或PYK2基因内和/或MUP3基因内和/或SAM1基因内和/或SAM2基因内和/或HIS3基因内，优选插入在HIS3基因内，如本文实施例所示。

高丝氨酸激酶编码基因过表达和/或受控表达

在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，高丝氨酸激酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含高丝氨酸激酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的高丝氨酸激酶(THR1)和高丝氨酸激酶编码基因在本说明书的其他地方详述。

在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含高丝氨酸激酶编码序列的表达盒包含允许高丝氨酸激酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。

作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种高丝氨酸激酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。

不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，高丝氨酸激酶的过表达会增加中间代谢物向磷酸-高丝氨酸的转化。当至少一种高丝氨酸激酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。

在优选的实施方案中，所述高丝氨酸激酶编码基因是来自酿酒酵母的基因，如本文实施例中所示。

在优选的实施方案中，将所述高丝氨酸激酶编码基因置于强启动子pTDH3或诱导型或抑制型启动子pACU6的控制之下，优选置于强启动子pTDH3的控制之下。

说明性地，可以将高丝氨酸激酶基因插入在SAM3基因内，如本文实施例所示。

苏氨酸合酶编码基因过表达和/或受控表达

在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，苏氨酸合酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含苏氨酸合酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的苏氨酸合酶(THR4)和苏氨酸合酶编码基因在本说明书的其他地方详述。

在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含苏氨酸合酶编码序列的表达盒包含允许苏氨酸合酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。

作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种苏氨酸合酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。

不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，苏氨酸合酶的过表达会增加中间代谢物向苏氨酸的转化。当至少一种苏氨酸合酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。

在优选的实施方案中，所述苏氨酸合酶编码基因是来自酿酒酵母的基因，如本文实施例中所示。

在优选的实施方案中，将所述苏氨酸合酶编码基因置于强启动子pTDH3、诱导型或抑制型启动子pACU6或强启动子pCCW12的控制之下，优选置于强启动子pCCW12的控制之下。

说明性地，可以将苏氨酸合酶基因插入在SAM3基因内，如本文实施例所示。

天门冬氨酸激酶编码基因的受控表达

本发明所涵盖的天门冬氨酸激酶和天门冬氨酸激酶编码基因在本说明书的其他地方详述。

不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，通过控制天门冬氨酸激酶编码基因的表达，可以控制天冬氨酸向天冬氨酰磷酸(Aspartyl-P)的转化水平，这将有助于本发明的重组酵母的高生存力水平。

在根据本发明的重组酵母的一些实施方案中，天门冬氨酸激酶编码基因的受控表达是通过如下方法获得的：在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含天门冬氨酸激酶(HOM3)编码序列的表达盒，所述天门冬氨酸激酶(HOM3)编码序列被置于诱导型调控元件(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下。

在一些实施方案中，天门冬氨酸激酶编码基因的受控表达是通过如下方法获得的：在天然酵母天门冬氨酸激酶开放阅读框的位置插入诱导型调控序列，例如诱导型或抑制型启动子，其取代最初存在于酵母基因组中该基因组位置上的内源启动子。

在一些优选的实施方案中，所述天门冬氨酸激酶编码基因是来自酿酒酵母的基因，如本文实施例中所示。

在优选的实施方案中，将所述天门冬氨酸激酶编码基因置于诱导型或抑制型启动子pCUP-1-1、诱导型或抑制型启动子pSAM4或诱导型或抑制型启动子pACU3p的控制之下。

说明性地，可以将天门冬氨酸激酶基因插入在TRP1基因内和/或HOM3基因内和/或MUP3基因内和/或SAM3基因内。

天冬氨酸激酶编码基因过表达和/或受控表达

在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，天冬氨酸激酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含天冬氨酸激酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的天冬氨酸激酶(AK)和天冬氨酸激酶编码基因在本说明书的其他地方详述。

在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含天冬氨酸激酶编码序列的表达盒包含允许天冬氨酸激酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。

作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种天冬氨酸激酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。

不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，通过控制天冬氨酸激酶编码基因的表达，可以控制天冬氨酸向天冬氨酰磷酸(Aspartyl-P)的转化水平，这将有助于本发明的重组酵母的高生存力水平。

在优选的实施方案中，所述天冬氨酸激酶编码基因是来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因，如本文实施例中所示。

在优选的实施方案中，将所述天冬氨酸激酶编码基因置于诱导型或抑制型启动子pACU7的控制之下。

说明性地，可以将天冬氨酸激酶基因插入在TRP1基因内，如本文实施例所示。

如先前所示，根据本发明的生产苏氨酸的重组酵母的基因组是这样的：

(i)至少一种编码天门冬氨酸激酶HOM3的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；和/或

(ii)至少一种编码天冬氨酸激酶AK的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的生产苏氨酸的重组酵母的基因组是这样的：至少一种编码天门冬氨酸激酶HOM3的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明的生产苏氨酸的重组酵母的基因组是这样的：至少一种编码天冬氨酸激酶AK的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。

编码(i)天冬氨酸半醛脱氢酶、(ii)高丝氨酸激酶、(iii)苏氨酸合酶、(iv)天门冬氨酸激酶和(v)天冬氨酸激酶的基因的描述见下文。

天冬氨酸-半醛脱氢酶(HOM2)

天冬氨酸-半醛脱氢酶是本领域已知能够催化通过L-天冬氨酰-4-磷酸的还原去磷酸化、NADPH依赖性地形成L-天冬氨酸-半醛的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的天冬氨酸-半醛脱氢酶可以称为HOM2。

用于测量天冬氨酸-半醛脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

本说明书中优选的天冬氨酸半醛-脱氢酶是EC号为1.2.1.11的酶。

根据一个优选的实施方案，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些优选的实施方案中，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。

根据另一个优选的实施方案，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸可以是来自酿酒酵母的天冬氨酸-半醛脱氢酶的变体或突变体，其中所述变体酶或所述突变体酶使用NADH或NADPH来催化反应。这样的变体或突变体酶是本领域已知的，并且在本文之前已有讨论。

根据又一个优选的实施方案，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的参考核酸序列组成的组的核酸具有至少27％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核酸编码源自酿酒酵母的天冬氨酸-半醛脱氢酶。

就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化通过L-天冬氨酰-4-磷酸的还原去磷酸化而NADPH依赖性地形成L-天冬氨酸-半醛。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少27％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

对于来自酿酒酵母的天冬氨酸-半醛脱氢酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP010442，或本文描述的SEQ ID NO.3。

根据另一个特定的实施方案，编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少27％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自Lactobacillus wasatchensis的天冬氨酸-半醛脱氢酶与SEQ ID NO.3的天冬氨酸-半醛脱氢酶具有27％的氨基酸同一性。

就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化通过L-天冬氨酰-4-磷酸的还原去磷酸化而NADPH依赖性地形成L-天冬氨酸-半醛的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少27％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如上所述，本发明中天冬氨酸-半醛脱氢酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述天冬氨酸-半醛脱氢酶的核酸序列的5'和3'位置。

如本说明书中其他地方所规定的，天冬氨酸-半醛脱氢酶在根据本发明的重组酵母中过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。

在一些实施方案中，天冬氨酸-半醛脱氢酶的过表达可归因于所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制。

在一些其他实施方案中，天冬氨酸-半醛脱氢酶的过表达可归因于所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的天冬氨酸-半醛脱氢酶编码序列。

在其他实施方案中，天冬氨酸-半醛脱氢酶的过表达可能是由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制，以及(ii)所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的天冬氨酸-半醛脱氢酶编码序列。

高丝氨酸激酶(THR1)

高丝氨酸激酶是在本领域中被描述为用于催化L-高丝氨酸的ATP依赖性磷酸化成为磷酸L-高丝氨酸(L-homoserine phosphate)的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的高丝氨酸激酶可以称为THR1。

用于测量高丝氨酸激酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Mannhaupt和Feldmann(1990,Eur JBiochem,Vol.191:115-122)描述的方法。

本说明书中优选的高丝氨酸激酶是EC号为n°EC 2.7.1.39的酶。

根据一个优选的实施方案，编码高丝氨酸激酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码高丝氨酸激酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些其他优选的实施方案中，编码高丝氨酸激酶的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。

根据又一个优选的实施方案，编码高丝氨酸激酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：4的核酸具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO：4的核酸编码源自酿酒酵母的高丝氨酸激酶。

就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化L-高丝氨酸的ATP依赖性磷酸化，成为磷酸L-高丝氨酸。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

对于来自酿酒酵母的高丝氨酸激酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP011890，或本文描述的SEQ ID NO.5。

根据另一个特定的实施方案，编码高丝氨酸激酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自Aquamarina atlantica的高丝氨酸激酶与SEQ ID NO.5的高丝氨酸激酶具有25％的氨基酸同一性。

就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化L-高丝氨酸的ATP依赖性磷酸化，成为磷酸L-高丝氨酸的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如上所述，本发明中高丝氨酸激酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述高丝氨酸激酶的核酸序列的5'和3'位置。

如本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，高丝氨酸激酶在根据本发明的重组酵母中过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。

在一些实施方案中，高丝氨酸激酶的过表达可归因于所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制。

在一些其他实施方案中，高丝氨酸激酶的过表达可归因于所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的高丝氨酸激酶编码序列。

在其他实施方案中，高丝氨酸激酶的过表达可能是由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制，以及(ii)所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的高丝氨酸激酶编码序列。

苏氨酸合酶(THR4)

苏氨酸合酶是在本领域中被描述为用于催化O-磷酸-L-高丝氨酸H₂O依赖性地脱磷酸成为L-苏氨酸的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的苏氨酸合酶可以称为THR4。

用于测量苏氨酸合酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Schildkraut和Greer Journal ofBacteriology,(1973),Vol.115,p.777-785描述的方法。

本说明书中优选的苏氨酸合酶是EC号为n°EC 4.2.3.1的酶。

根据一个优选的实施方案，编码苏氨酸合酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码苏氨酸合酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些其他优选的实施方案中，编码苏氨酸合酶的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。

根据又一个优选的实施方案，编码苏氨酸合酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：6的核酸具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO：6的核酸编码源自酿酒酵母的苏氨酸合酶。

就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化O-磷酸-L-高丝氨酸H₂O依赖性地去磷酸化成为L-苏氨酸。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

对于来自酿酒酵母的苏氨酸合酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP_009982.1，或本文描述的SEQ ID NO.7。

根据另一个特定的实施方案，编码苏氨酸合酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自Aquamarina atlantica的苏氨酸合酶与SEQ ID NO.7的苏氨酸合酶具有25％的氨基酸同一性。

就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化O-磷酸-L-高丝氨酸H₂O依赖性地去磷酸化成为L-苏氨酸的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如上所述，本发明中苏氨酸合酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述苏氨酸合酶的核酸序列的5'和3'位置。

如本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，苏氨酸激酶在根据本发明的重组酵母中过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。

在一些实施方案中，苏氨酸合酶的过表达可归因于所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制。

在一些其他实施方案中，苏氨酸合酶的过表达可归因于所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的苏氨酸合酶编码序列。

在其他实施方案中，苏氨酸合酶的过表达可能是由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制，以及(ii)所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的苏氨酸合酶编码序列。

天门冬氨酸激酶(HOM3)

天门冬氨酸激酶是在本领域中被描述为用于在ATP的存在下催化L-天冬氨酸向4-磷酸-L-天冬氨酸的转化的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的天门冬氨酸激酶可以称为HOM3。

用于测量天门冬氨酸激酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Stadtman等人(1961,J Biol Chem,Vol.236(7):2033-2038)描述的方法。

本说明书中优选的天门冬氨酸激酶是EC号为n°EC 2.7.2.4的酶。

根据一个优选的实施方案，编码天门冬氨酸激酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码天门冬氨酸激酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些实施方案中，编码天门冬氨酸激酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自枯草芽孢杆菌和酵母。在一些其他优选的实施方案中，编码天门冬氨酸激酶的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。

根据又一个优选的实施方案，编码天门冬氨酸激酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：8的核酸具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO：8的核酸编码源自酿酒酵母的天门冬氨酸激酶。

就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶在ATP的存在下催化L-天冬氨酸转化为4-磷酸-L-天冬氨酸。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

对于来自酿酒酵母的天门冬氨酸激酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP010972，或本文描述的SEQ ID NO.9。

根据另一个特定的实施方案，编码天门冬氨酸激酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自Aquamarina atlantica的天门冬氨酸激酶与SEQ ID NO.9的天门冬氨酸激酶具有25％的氨基酸同一性。

就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，在ATP的存在下催化L-天冬氨酸转化为4-磷酸-L-天冬氨酸的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如上所述，本发明中天门冬氨酸激酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述天门冬氨酸激酶的核酸序列的5'和3'位置。

如本说明书中其他地方所规定的，在根据本发明的重组酵母中应控制天门冬氨酸激酶的强表达。

在优选的实施方案中，控制天门冬氨酸激酶的强表达是通过以下方法进行的：将编码天门冬氨酸激酶的核酸序列置于合适的诱导型或抑制型启动子，优选强诱导型或抑制型启动子的控制之下。

天冬氨酸激酶(AK)

天冬氨酸激酶是在本领域中被描述为用于在ATP的存在下、催化L-天冬氨酸转化为4-磷酸-L-天冬氨酸的蛋白质。由枯草芽孢杆菌基因组编码的天冬氨酸激酶可以称为AK。

用于测量天冬氨酸激酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识，并且与先前针对天门冬氨酸激酶所指定的方法相同。

根据一个优选的实施方案，编码天冬氨酸激酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码天冬氨酸激酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些实施方案中，编码天冬氨酸激酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自枯草芽孢杆菌和酵母。在一些其他优选的实施方案中，编码天冬氨酸激酶的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。

对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中以登录号NC_000964.3公开的核酸序列。

根据又一个优选的实施方案，编码天冬氨酸激酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：10的核酸具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO：10的核酸编码源自枯草芽孢杆菌的天冬氨酸激酶。

就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶在ATP的存在下、催化L-天冬氨酸转化为4-磷酸-L-天冬氨酸。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

对于来自枯草芽孢杆菌的天冬氨酸激酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP_389558.2，或本文描述的SEQ ID NO.11。

根据另一个特定的实施方案，编码天冬氨酸激酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少25％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自Aquamarina atlantica的天冬氨酸激酶与SEQ ID NO.11的天门冬氨酸激酶具有25％的氨基酸同一性。

就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，在ATP的存在下、催化L-天冬氨酸向4-磷酸-L-天冬氨酸转化的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少25％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考核酸序列具有至少26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与所述参考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如上所述，本发明中天冬氨酸激酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述天冬氨酸激酶的核酸序列的5'和3'位置。

如本说明书中其他地方所规定的，在根据本发明的重组酵母中应控制天冬氨酸激酶的强表达。

在优选的实施方案中，控制天冬氨酸激酶的强表达是通过以下方法进行的：将编码天冬氨酸激酶的核酸序列置于合适的诱导型或抑制型启动子，优选强诱导型或抑制型启动子的控制之下。

生产苏氨酸的重组酵母的特定实施方案

天冬氨酸转氨酶过表达和/或受控表达

在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，至少一种编码天冬氨酸转氨酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。

天冬氨酸转氨酶(也称为天冬氨酸氨基转移酶)是在本领域中被描述为用于催化L-天冬氨酸和2-氧代戊二酸(2-oxoglutarate)的反应以生产草酰乙酸和L-谷氨酸的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的天冬氨酸转氨酶可以称为AAT2。

根据这些实施方案，天冬氨酸转氨酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含天冬氨酸转氨酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的天冬氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶编码基因在本说明书的其他地方详述。

在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含天冬氨酸转氨酶编码序列的表达盒包含允许天冬氨酸转氨酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。

作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种天冬氨酸转氨酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。

不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，天冬氨酸转氨酶的过表达可能会导致草酰乙酸向天冬氨酸的高水平转化。当至少一种天冬氨酸转氨酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。

用于测量天冬氨酸转氨酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Yagi等人(1982,Biochem,Vol.92:35-43)中描述的方法。

在一些实施方案中，所述天冬氨酸转氨酶编码基因是来自酿酒酵母的AAT2基因，如本文实施例中所示。

在优选的实施方案中，天冬氨酸氨基转移酶由拟南芥AAT2-基因编码。

在优选的实施方案中，将所述天冬氨酸转氨酶编码基因置于诱导型或抑制型启动子pSAM4或诱导型或抑制型启动子pACU1或强启动子pADH1或强启动子pPGK1或强启动子pTEF3的控制之下。

说明性地，可以将AAT2基因插入在TRP1基因内和/或PYK1基因内和/或GNP1基因内和/或MUP3基因内，如本文实施例所示。

本说明书中优选的天冬氨酸转氨酶通过EC号2.6.1.1已知。

编码天冬氨酸转氨酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码天冬氨酸转氨酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些优选的实施方案中，编码天冬氨酸转氨酶的核酸可以是源自酵母生物的核酸，最优选地是酿酒酵母。

根据又一个优选的实施方案，编码天冬氨酸转氨酶或AAT2的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：12的核酸序列具有至少39％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。

就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化L-天冬氨酸和2-氧代戊二酸的反应以生产草酰乙酸和L-谷氨酸。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少39％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:12的核酸序列具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:14的核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:14的核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

对于来自酿酒酵母的天冬氨酸转氨酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP013127，或本文描述的SEQ ID NO.13。说明性地，源自大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶与SEQ ID NO.13的天冬氨酸转氨酶AAT2具有39％的氨基酸同一性。

根据另一个特定的实施方案，编码天冬氨酸转氨酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少39％，有利地至少65％，优选至少80％同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。

就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化L-天冬氨酸和2-氧代戊二酸的反应以生产草酰乙酸和L-谷氨酸的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少39％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如上所述，本发明中天冬氨酸转氨酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述天冬氨酸转氨酶的核酸序列的5'和3'位置。

如在本说明书的其他地方说明的，在根据本发明的重组酵母中，天冬氨酸转氨酶过表达。

在一些实施方案中，天冬氨酸转氨酶的过表达可归因于所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制。

在一些其他实施方案中，天冬氨酸转氨酶的过表达可归因于所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的天冬氨酸转氨酶编码序列。

在其他实施方案中，天冬氨酸转氨酶的过表达可能是由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制，以及(ii)所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的天冬氨酸转氨酶编码序列。

谷氨酸脱氢酶过表达和/或受控表达

在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，至少一种编码将氧代-戊二酸转化为谷氨酸的谷氨酸脱氢酶编码基因的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。

根据一个特定的实施方案，本发明的重组菌株的基因组是这样的，即，至少一种编码将氧代-戊二酸转化为谷氨酸的谷氨酸脱氢酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。

谷氨酸脱氢酶(也称为NAD特异性谷氨酸脱氢酶)是在本领域中被描述为用于催化2-氧代戊二酸的转化以产生L-谷氨酸的蛋白质。因此，谷氨酸脱氢酶是特异性地参与涉及在NADH存在下将2-氧代戊二酸转化为L-谷氨酸的化学反应的酶。

根据这些实施方案，谷氨酸脱氢酶编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含谷氨酸脱氢酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的谷氨酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶编码基因在本说明书的其他地方详述。

在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含谷氨酸脱氢酶编码序列的表达盒包含允许谷氨酸脱氢酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。

作为根据本发明的重组酵母的这些实施方案的补充或替代方案，至少一种谷氨酸脱氢酶编码基因可以处于在酵母细胞中起作用的诱导型或抑制型启动子的控制之下。

不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，谷氨酸脱氢酶的过表达同时产生NAD(通过将氧代戊二酸转化为谷氨酸)。当至少一种谷氨酸脱氢酶编码序列处于诱导型或抑制型启动子的控制之下时，这同样适用。

用于测量谷氨酸脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Noor和Punekar(2005,Microbiology,Vol.151:1409-1419)中描述的方法。

在优选的实施方案中，所述谷氨酸脱氢酶编码基因编码利用NADH而非NADPH的谷氨酸脱氢酶，并且更特别地是来自尖尾内旋纤毛虫(Entodinium caudatum)的GDH基因(GDH.eCa)，如本文实施例中所示。

本说明书中优选的谷氨酸脱氢酶可以特别是EC号为n°EC 1.4.1.2的酶。

在优选的实施方案中，将所述谷氨酸脱氢酶编码基因置于强启动子pTDH3的控制之下。

说明性地，可以将谷氨酸脱氢酶基因插入在TRP1基因内，如本文实施例中所示，和/或HIS3基因内和/或SAM3基因内。

根据一个优选的实施方案，编码谷氨酸脱氢酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码谷氨酸脱氢酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些实施方案中，编码谷氨酸脱氢酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自尖尾内旋纤毛虫、枯草芽孢杆菌和共生梭菌(Clostridiumsymbiosium)。

根据又一个优选的实施方案，编码谷氨酸脱氢酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：14的核酸序列具有至少49％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO.14的核酸编码源自尖尾内旋纤毛虫的谷氨酸脱氢酶，对所述核酸序列进行了密码子优化，以在酵母，特别是在酿酒酵母中表达。

就该序列而言，相同性质的生物活性是编码这样一种酶的能力，该酶催化2-氧代戊二酸转化以生产L-谷氨酸。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少49％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:14的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:14的核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:14的核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

对于来自尖尾内旋纤毛虫的谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号AAF15393，或参考本文描述的SEQ ID NO.15。说明性地，源自肠贾第鞭毛虫(Giardia intestinalis)的谷氨酸脱氢酶与SEQ ID NO.15的谷氨酸脱氢酶具有49％的氨基酸同一性。

根据另一个特定的实施方案，编码谷氨酸脱氢酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：15的氨基酸序列具有至少49％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。

就该序列而言，相同性质的生物活性如先前所述，即，催化2-氧代戊二酸转化以生产L-谷氨酸的能力。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少49％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如上所述，本发明中谷氨酸脱氢酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义，其分别存在于编码所述谷氨酸脱氢酶的核酸序列的5'和3'位置。

如本说明书中其他地方所规定的，谷氨酸脱氢酶在根据本发明的重组酵母中过表达。

在一些实施方案中，谷氨酸脱氢酶的过表达可归因于所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制。

在一些其他实施方案中，谷氨酸脱氢酶的过表达可归因于所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的谷氨酸脱氢酶编码序列。

在其他实施方案中，谷氨酸脱氢酶的过表达可能是由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制，以及(ii)所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的谷氨酸脱氢酶编码序列。

高丝氨酸脱氢酶的过表达

在根据本发明的生产苏氨酸的重组酵母的一些实施方案中，所述重组酵母的基因组是这样的：至少一种编码高丝氨酸脱氢酶的核酸过表达。

在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，高丝氨酸脱氢酶(HOM6)编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个拷贝的、包含高丝氨酸脱氢酶编码序列的表达盒而获得的。本发明所涵盖的高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸脱氢酶编码基因在本说明书的其他地方详述。

在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含高丝氨酸脱氢酶编码序列的表达盒包含允许高丝氨酸脱氢酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。

在其他实施方案中，所述一个或多个拷贝的、包含高丝氨酸脱氢酶编码序列的表达盒包含允许高丝氨酸脱氢酶强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。

不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，高丝氨酸脱氢酶的过表达会增加中间代谢物天冬氨酰-半醛向高丝氨酸的转化。

在一些实施方案中，使用源自酵母的高丝氨酸脱氢酶，例如来自酿酒酵母的基因，HOM6。在一些实施方案中，在酵母基因组中引入了高丝氨酸脱氢酶编码基因的多个拷贝。在一些实施方案中，尤其是在其中存在高丝氨酸脱氢酶编码基因的唯一一个拷贝的实施方案中，所述HOM6编码基因被置于强启动子的控制之下。

在优选的实施方案中，所述高丝氨酸脱氢酶编码基因是来自酿酒酵母的基因，如本文实施例中所示。

在优选的实施方案中，将所述高丝氨酸脱氢酶编码基因置于强启动子pRPLA1或强启动子pADH1的控制之下。

说明性地，可以将高丝氨酸脱氢酶基因插入在HOM3基因内和/或MUP3基因内，如本文实施例所示。

高丝氨酸-O-乙酰基转移酶编码基因的删除或低表达

在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，所述重组酵母被进一步优选地定义为在其基因组中：

a)至少一种、优选所有编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶的内源性核酸已被删除，和/或

b)至少一种、优选所有编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。

不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，高丝氨酸-O-乙酰基转移酶基因的低表达将通过减少由于所生产的高丝氨酸转化为乙酰基高丝氨酸而导致的其消耗来增加重组酵母的磷酸-高丝氨酸生产。

在具体的实施方案中，本发明的重组酵母被进一步定义为在其基因组中(a)至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶的内源性核酸已被删除，并且(b)至少一种编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。

在一些实施方案中，例如可以通过使高丝氨酸-O-乙酰基转移酶基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使高丝氨酸-O-乙酰基转移酶(MET2)的低表达表现为条件性的。

抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。

高丝氨酸-O-乙酰基转移酶低表达还包括插入编码不稳定的高丝氨酸-O-乙酰基转移酶的核酸。不稳定的高丝氨酸-O-乙酰基转移酶是高丝氨酸-O-乙酰基转移酶的变体，与亲本高丝氨酸-O-乙酰基转移酶相比，其在酵母细胞中更快被降解。

在优选的实施方案中，不稳定的高丝氨酸-O-乙酰基转移酶由降解决定子标记的高丝氨酸-O-乙酰基转移酶蛋白组成。

例如，高丝氨酸-O-乙酰基转移酶基因可以被loxP中断，或者例如被URA3.Kl-loxP中断，并因此被删除。

甲硫氨酸合酶编码基因的删除或低表达

在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，所述重组酵母被进一步优选地定义为在其基因组中：

a)至少一种、优选所有编码甲硫氨酸合酶的内源性核酸已被删除，和/或

b)至少一种、优选所有编码甲硫氨酸合酶的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。

甲硫氨酸合酶是在本领域中被描述为用于在甲硫醇的存在下、催化O-乙酰基-L-高丝氨酸(OAH)转化为甲硫氨酸和乙酸(acetate)的蛋白质。甲硫氨酸合酶在本领域中还被描述为用于催化OAH转化为高半胱氨酸或催化O-乙酰丝氨酸(OAS)转化为半胱氨酸。由酿酒酵母基因组编码的甲硫氨酸合酶可以称为MET17。由酿酒酵母基因组编码的甲硫氨酸合酶在本领域中也可以称为MET25或MET15。

不希望受到任何特定理论的束缚，发明人相信，甲硫氨酸合酶基因的低表达将通过减少由于所生产的高丝氨酸转化为高半胱氨酸而导致的其消耗来增加重组酵母的磷酸-高丝氨酸生产。

在一些实施方案中，例如可以通过使甲硫氨酸合酶基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使甲硫氨酸合酶的低表达表现为条件性的。

抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。

甲硫氨酸合酶低表达还包括插入编码不稳定的甲硫氨酸合酶的核酸。不稳定的甲硫氨酸合酶(MET17)是甲硫氨酸合酶的变体，与亲本甲硫氨酸合酶相比，其在酵母细胞中更快被降解。

在优选的实施方案中，不稳定的甲硫氨酸合酶由降解决定子标记的甲硫氨酸合酶蛋白组成。

例如，甲硫氨酸合酶基因可以被loxP中断，或者例如被URA3.Kl-loxP中断，并因此被删除。

高丝氨酸脱氢酶(HOM6)

高丝氨酸脱氢酶是在本领域中被描述为用于在NAD或NADP的存在下、催化L-高丝氨酸向L-天冬氨酸4-半醛转化的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的高丝氨酸脱氢酶可以称为HOM6。

用于测量高丝氨酸脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Calnyanto等人(2006,Microbiology,Vol.152:105-112)描述的方法。

本说明书中优选的高丝氨酸脱氢酶是EC号为n°1.1.1.3的酶。

根据一个优选的实施方案，编码高丝氨酸脱氢酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些优选的实施方案中，编码高丝氨酸脱氢酶的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。

根据又一个优选的实施方案，编码高丝氨酸脱氢酶的核酸可以是选自由以下组成的组的核酸：与SEQ ID NO：16的核酸具有至少31％，有利地至少65％，优选至少80％核酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。SEQ ID NO：16的核酸编码源自酵母菌属(Saccharomyces)的高丝氨酸脱氢酶，其也可以称为HOM6。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少31％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:16的核酸序列具有至少32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:16的核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列涵盖与SEQID NO:16的核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的核酸序列。

对于来自酿酒酵母的高丝氨酸脱氢酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号AJR75529或NP012673，或本文描述的SEQ IDNO.17。

根据另一个特定的实施方案，编码高丝氨酸脱氢酶的核酸可以是编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有至少31％，有利地至少65％，优选至少80％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的序列。说明性地，源自嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的高丝氨酸脱氢酶与SEQ ID NO.17的高丝氨酸脱氢酶具有31％的氨基酸同一性。

如本文所述，与参考核酸序列具有至少31％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如本文所述，与参考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列涵盖与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％氨基酸同一性，并且具有相同性质的生物活性的氨基酸序列。

如上所述，本发明中高丝氨酸脱氢酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述高丝氨酸脱氢酶的核酸序列的5'和3'位置。

在一个特定的实施方案中，本发明的重组酵母的基因组是这样的：至少一种编码高丝氨酸脱氢酶的核酸过表达。

在一些实施方案中，高丝氨酸脱氢酶的过表达可归因于所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制。

在一些其他实施方案中，高丝氨酸脱氢酶的过表达可归因于所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的高丝氨酸脱氢酶编码序列。

在其他实施方案中，高丝氨酸脱氢酶的过表达可能是由于(i)所述重组酵母内强启动子对相应基因的控制，以及(ii)所述重组酵母的基因组内存在多个拷贝的高丝氨酸脱氢酶编码序列。

高丝氨酸O-乙酰基转移酶(MET2)

高丝氨酸O-乙酰基转移酶是在本领域中被描述为用于催化乙酰辅酶A和L-高丝氨酸之间的反应，以生成CoA和O-乙酰基-L-高丝氨酸的蛋白质。由酿酒酵母基因组编码的高丝氨酸O-乙酰基转移酶可以称为MET2。

用于测量高丝氨酸O-乙酰基转移酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Shuzo Yamagata(1987,TheJournalof Bacteriology,Vol.169(8):3458-3463)描述的方法。

本说明书中优选的高丝氨酸O-乙酰基转移酶是EC号为n°EC 2.3.1.31的酶。

根据一个优选的实施方案，编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些实施方案中，编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)和酵母。在一些其他优选的实施方案中，编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸可以是源自酵母的核酸，特别是源自酿酒酵母的核酸。

根据一个特定的实施方案，编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸可以是SEQ IDNO：18的核酸。SEQ ID NO：18的核酸编码源自酿酒酵母的高丝氨酸O-乙酰基转移酶，其也可以称为MET2。

对于来自酿酒酵母的高丝氨酸O-乙酰基转移酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP014122，或本文描述的SEQ ID NO.19。

如上所述，在本发明的一些实施方案中，本发明中高丝氨酸O-乙酰基转移酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述高丝氨酸O-乙酰基转移酶的核酸序列的5'和3'位置。

如在本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，在根据本发明的重组酵母中，高丝氨酸O-乙酰基转移酶(a)被完全或部分删除或(b)处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。

甲硫氨酸合酶(MET17)

甲硫氨酸合酶是在本领域中被描述为用于催化O-乙酰基-L-高丝氨酸(OAH)转化为高半胱氨酸的蛋白质。甲硫氨酸合酶在本领域中还被描述为用于催化O-乙酰丝氨酸(OAS)转化为半胱氨酸。由酿酒酵母基因组编码的甲硫氨酸合酶可以称为MET17。由酿酒酵母基因组编码的甲硫氨酸合酶在本领域中也可以称为MET25或MET15。

用于测量甲硫氨酸合酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Ravanel(1995,Archives ofBiochemistry and Biophysics,Vol.316:572-584)描述的方法。

本说明书中优选的甲硫氨酸合酶是EC号为n°2.5.1.49的酶。

根据一个优选的实施方案，编码甲硫氨酸合酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自包括原核生物和真核生物的组。在一些实施方案中，编码甲硫氨酸合酶的核酸可以是源自古细菌的核酸。在一些实施方案中，编码甲硫氨酸合酶的核酸可以是源自生物的核酸，所述生物优选选自酵母，特别是选自酿酒酵母。

根据一个特定的实施方案，编码甲硫氨酸合酶的核酸可以是SEQ ID NO：20的核酸。SEQ ID NO：20的核酸编码源自酿酒酵母的甲硫氨酸合酶，其也可以称为MET17。

对于来自酿酒酵母的甲硫氨酸合酶的氨基酸序列，本领域技术人员可以参考UniProt数据库中的登录号NP013406，或本文描述的SEQ ID NO.21。

如上所述，在本发明的一些实施方案中，本发明中甲硫氨酸合酶的表达水平由至少一个启动子和至少一个终止子调节，例如在下文中更详细地定义的，其分别存在于编码所述甲硫氨酸合酶的核酸序列的5'和3'位置。

如在本说明书中其他地方所规定的，在本发明的一些实施方案中，在根据本发明的重组酵母中，甲硫氨酸合酶(a)被完全或部分删除或(b)处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。

目标化合物的输出

如下所述，在本发明的重组酵母中可能过表达的输出蛋白编码基因是可能的转运蛋白AQR1。

因此，在一个特定的实施方案中，本发明的重组酵母的基因组是这样的：至少一种编码可能的转运蛋白的核酸过表达。

AQR1是来自酿酒酵母的转运蛋白。对于AQR1的氨基酸序列可以参考UniProt数据库中的登录号NP_014334。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001182903。

在根据本发明的重组酵母的优选实施方案中，可能的转运蛋白编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个额外拷贝的、包含所述可能的转运蛋白编码序列的表达盒而获得的。

不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，可能的转运蛋白编码基因的过表达将增加所生产的苏氨酸向酵母细胞外的分泌，例如在培养基中。

在一些实施方案中，可能的转运蛋白编码基因的过表达是通过在酵母基因组的选定位置插入一个或多个额外拷贝的、包含可能的转运蛋白基因编码序列的表达盒而获得的。在这些实施方案的一些中，所述一个或多个拷贝的、包含可能的转运蛋白编码序列的表达盒包含允许所述可能的转运蛋白强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。

在一些其他实施方案中，在酵母基因组的选定位置插入一个拷贝的可能的转运蛋白编码基因。在这些其他实施方案中，所述一个或多个拷贝的、包含可能的转运蛋白编码序列的表达盒包含允许所述可能的转运蛋白强表达的调控序列，例如在酵母细胞中起作用的强启动子。

在优选的实施方案中，将所述可能的氨基酸转运蛋白AQR1置于强启动子pTEF3的控制之下。

说明性地，可以将AQR1基因插入在hom3基因内，如本文实施例所示。

在根据本发明的重组酵母的其他实施方案中，可以通过(i)编码酵母通透酶的基因的低表达，通过(ii)编码氨基酸输出蛋白的基因的低表达，或通过(iii)编码酵母通透酶的基因的低表达以及编码氨基酸输出蛋白的基因的低表达两者，来提高所生产的苏氨酸向酵母细胞外的输出。

如下所述，在根据本发明的重组酵母中可能低表达的通透酶编码基因涵盖AGP1、AGP3、BAP3、BAP2、GAP1和GNP1。

AGP1是来自酿酒酵母的通用氨基酸通透酶(general amino acid permease)1。对于AGP1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号(access number)NP_009905。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001178671。

AGP3是来自酿酒酵母的通用氨基酸通透酶3。对于AGP3的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_116600。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001179912。

BAP3是来自酿酒酵母的缬氨酸氨基酸通透酶。对于BAP3的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_010331。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001180354。

BAP2是来自酿酒酵母的Leu/Val/Ile氨基酸通透酶。对于BAP2的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_009624。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001178416。

GAP1是来自酿酒酵母的通用氨基酸通透酶。对于GAP1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_012965.3。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001179829。

GNP1是来自酿酒酵母的高亲和力谷氨酰胺通透酶。对于GNP1的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_010796。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001180816。

在根据本发明的重组酵母的一些实施方案中，所述重组酵母被进一步定义为其一个或多个编码通透酶的基因低表达，所述通透酶涵盖AGP1、AGP3、BAP3、BAP2、GAP1和GNP1通透酶。

不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，任何通透酶基因的低表达将增加所生产的苏氨酸向酵母细胞外的分泌，例如在培养基中。

在优选的实施方案中，在本发明的重组酵母的基因组中进行了以下修饰中的至少一种：

(A)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码通用氨基酸通透酶GAP1的内源性核酸，并且任选地：

(i)至少一种编码通用氨基酸通透酶GAP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或

(ii)至少一种编码不稳定的通用氨基酸通透酶GAP1的核酸已经被插入；

(B)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的内源性核酸，并且任选地：

(i)至少一种编码高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或

(ii)至少一种编码不稳定的高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的核酸已经被插入；

(C)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码通用氨基酸通透酶AGP1的内源性核酸，并且任选地：

(i)至少一种编码通用氨基酸通透酶AGP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或

(ii)至少一种编码不稳定的通用氨基酸通透酶AGP1的核酸已经被插入。

在具体的实施方案中，在本发明的重组酵母的基因组中已经进行了这些修饰中的至少两种、优选所有修饰。

在更具体的实施方案中，在本发明的重组酵母的基因组中已经进行了所有以下修饰：

(A)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码通用氨基酸通透酶GAP1的内源性核酸，并且任选地：

(i)至少一种编码通用氨基酸通透酶GAP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或

(ii)至少一种编码不稳定的通用氨基酸通透酶GAP1的核酸已经被插入；

(B)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的内源性核酸，并且任选地：

(i)至少一种编码高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或

(ii)至少一种编码不稳定的高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的核酸已经被插入；并且

(C)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码通用氨基酸通透酶AGP1的内源性核酸，并且任选地：

(i)至少一种编码通用氨基酸通透酶AGP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或

(ii)至少一种编码不稳定的通用氨基酸通透酶AGP1的核酸已经被插入。

关于通透酶，这些基因中的一种或多种的低表达涵盖它们的表达的完全抑制，例如通过中断或删除所述一种或多种通透酶基因。

在一些实施方案中，例如可以通过使通透酶编码基因的表达处于抑制型调控序列(例如诱导型或抑制型启动子)的控制之下，使通透酶编码基因的低表达表现为条件性的。

抑制基因表达、中断靶基因或删除靶基因的方法是本领域技术人员众所周知的。

关于通透酶基因，低表达还涵盖插入编码不稳定的通透酶蛋白的核酸或插入编码不稳定的通透酶蛋白的核酸，或两者。

不稳定的通透酶是通透酶的变体，与亲本通透酶相比，其在酵母细胞中更快被降解。

在优选的实施方案中，不稳定的通透酶由降解决定子标记的通透酶蛋白组成。

例如，低表达的基因可以被loxP中断，从而被删除。

在一个特定的实施方案中，本发明的编码天门冬氨酸激酶、通用氨基酸通透酶、高亲和力谷氨酰胺通透酶、通用氨基酸通透酶、高丝氨酸-O-乙酰基转移酶和甲硫氨酸合酶的核酸独立地是来自酵母的核酸，优选来自酿酒酵母的核酸。

生产苏氨酸的重组酵母的其他实施方案

考虑到进一步增加苏氨酸的生产，本发明的重组酵母可以包含另外的遗传改变，使得它们生产大量的中间产物草酰乙酸。这些可选的遗传改变如下所述。

根据本发明的重组酵母的一些实施方案，可以通过如下方法进一步提高苏氨酸的生产：将所述重组酵母置于导致中间代谢物草酰乙酸的生产增加的条件下。

可以通过在酵母基因组中引入另外的遗传修饰来将所述重组酵母置于导致草酰乙酸的生产增加的条件下。

本发明人发现，通过向生产苏氨酸的重组酵母中引入另外的遗传改变(下文描述的那些)，可以最佳地提高苏氨酸衍生物的生产。

生产苏氨酸的重组酵母的最先的其他实施方案

根据本发明的生产苏氨酸的重组酵母的这些最先的其他实施方案，为了提高中间产物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的生产，进行了重组酵母的进一步遗传工程化。

不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，在生产苏氨酸的重组酵母中引入的另外的遗传改变会(i)导致过量生产NADPH，(ii)导致磷酸烯醇丙酮酸分别向草酰乙酸和丙酮酸受控且平衡的转化，以及(iii)导致降低丙酮酸向乙醇的转化，以及重新转向磷酸烯醇丙酮酸向草酰乙酸的转化。

通过遗传工程化在本发明的生产苏氨酸的重组酵母中引入的这些另外的遗传改变在下面更详细地说明。

根据这些实施方案，引入遗传改变以过表达葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶(也称为MET19或ZWF1)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,脱羧1(6-phosphogluconate dehydrogenase,decarboxylating 1)(也称为GND1)。不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，MET19和GND1的过表达会引起NADPH生产的增加。

根据这些实施方案，引入遗传改变以使磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(也称为PEPC或PPC)和/或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶[ATP](也称为PCK1或PEPCK)过表达。

根据这些实施方案，引入遗传改变以使丙酮酸激酶1(也称为PYK1或CDC19)和丙酮酸激酶2(也称为(PYK2))低表达。在这些实施方案的一些中，可以删除PYK2基因而非使其低表达。

在这些实施方案的一些中，优选地通过删除，使一个或多个编码丙酮酸脱羧酶的基因失活。丙酮酸脱羧酶编码基因包括分别称为PDC1、PDC5和PDC6的基因。根据这些实施方案中的一些，优选通过中断或删除使PDC1和/或PDC6基因失活，而其他丙酮酸脱羧酶编码基因PDC5保持不变，或者通过用弱启动子控制它使其表达降低。

在这些实施方案的一些中，通过改变一种或多种醇脱氢酶编码基因的表达来降低重组酵母的醇脱氢酶活性。在这些实施方案的一些中，通过将基因置于弱启动子的控制之下或通过产生不稳定的ADH1酶来降低ADH1的表达。在这些实施方案的一些中，优选通过中断或删除使ADH3、ADH4和ADH5中的一种或多种失活。

在这些实施方案的一些中，可以将外源乙酰脱氢酶编码基因(也称为MHPF)引入酵母基因组中并使其过表达。

在这些实施方案的一些中，可以将外源乙酸激酶编码基因(也称为ACKA)引入酵母基因组中并使其过表达。

在这些实施方案的一些中，可以将外源磷酸乙酰基转移酶编码基因(也称为PTA)引入酵母基因组中并使其过表达。

葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶

葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶是在本领域中被描述为用于催化D-葡萄糖6-磷酸成为6-磷酸-D-葡萄糖酸-1,5-内酯(6-phospho-D-glucono-1,5-lactone)，同时将NADP还原为NADPH的蛋白质。

用于测量葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Kuby,S.等人(1966)Dehydrogenasesand Oxidases Methods in Enzymology 9,116-117描述的方法。

本说明书中优选的葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶是EC号为n°1.1.1.49的酶。

对于葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(也称为MET19)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_014158.1。对于核酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NM_001183079.1。

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,脱羧1

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,脱羧1是在本领域中被描述为用于催化6-磷酸葡萄糖酸(6-phosphogluconate)氧化脱羧为核酮糖5-磷酸和CO2，同时将NADP还原为NADPH的蛋白质。

用于测量6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,脱羧1的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考He W.等人(2007)BMC StructuralBiology,7:38描述的方法。

本说明书中优选的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,脱羧1是EC号为n°1.1.1.44的酶。

对于6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,脱羧1(也称为GND1)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_012053。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001179314。

丙酮酸激酶1

丙酮酸激酶1是在本领域中被描述为用于催化磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸同时生成ATP的蛋白质。

用于测量丙酮酸激酶1的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Susan-resiga和Nowak(biochemistry,2004,43,15230-15245)描述的方法。

本说明书中优选的丙酮酸激酶1是EC号为n°2.7.1.40的酶。

对于丙酮酸激酶1(也称为PYK1)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_009362。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001178183。

丙酮酸激酶2

丙酮酸激酶2酶是在本领域中被描述为用于催化磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸同时生成ATP的蛋白质。丙酮酸激酶2可以在糖酵解通量水平非常低的条件下被酵母细胞使用。

用于测量丙酮酸激酶2的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Susan-resiga和Nowak(biochemistry,2004,43,15230-15245)描述的方法。

本说明书中优选的丙酮酸激酶2是EC号为n°2.7.1.40的酶。

对于丙酮酸激酶2(也称为PYK2)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_014992。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001183767。

丙酮酸脱羧酶同工酶1

丙酮酸脱羧酶同工酶1是在本领域中被描述为参与醇发酵期间丙酮酸向乙醛和二氧化碳的非氧化转化的蛋白质。

用于测量丙酮酸脱羧酶同工酶1的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Wang等人(Biochemistry,2001,40:1755-1763)描述的方法。

本说明书中优选的丙酮酸脱羧酶同工酶1是EC号为n°4.1.1.1的酶。

对于丙酮酸脱羧酶同工酶1(也称为PDC1)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_013145。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001181931。

丙酮酸脱羧酶同工酶5

丙酮酸脱羧酶同工酶5是在本领域中被描述为参与醇发酵期间丙酮酸向乙醛和二氧化碳的非氧化转化的蛋白质。

用于测量丙酮酸脱羧酶同工酶5的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Wang等人(Biochemistry,2001,40:1755-1763)描述的方法。

本说明书中优选的丙酮酸脱羧酶同工酶5是EC号为n°4.1.1.1的酶。

对于丙酮酸脱羧酶同工酶5(也称为PDC5)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_013235。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001182021。

丙酮酸脱羧酶同工酶6

丙酮酸脱羧酶同工酶6是在本领域中被描述为参与醇发酵期间丙酮酸向乙醛和二氧化碳的非氧化转化的蛋白质。

用于测量丙酮酸脱羧酶同工酶6的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Wang等人(Biochemistry,2001,40:1755-1763)描述的方法。

本说明书中优选的丙酮酸脱羧酶同工酶6是EC号为n°4.1.1.1的酶。

对于丙酮酸脱羧酶同工酶6(也称为PDC6)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_013235。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001182021。

乙醛脱氢酶

乙醛脱氢酶是在本领域中被描述为用于催化乙醛转化为乙酰辅酶A(使用NAD和辅酶A)的蛋白质。

用于测量乙醛脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Fisher等人(2013)Chemi.Biol.Interact.202 70-77描述的方法。

本说明书中优选的乙醛脱氢酶是EC号为n°1.2.1.10的酶。

对于乙醛脱氢酶(也称为MHPF)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_414885。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中以登录号NC_000913.3公开的核酸序列。

乙酸激酶

乙酸激酶是在本领域中被描述为用于由乙酸和ATP形成乙酰磷酸的蛋白质。

用于测量乙酸激酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Sagers等人J.Bacteriology(1961)82233-238描述的方法。

对于乙酸激酶(也称为ACKA)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_416799。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中以登录号NC_000913.3公开的核酸序列。

磷酸乙酰基转移酶

磷酸乙酰基转移酶是在本领域中被描述为用于催化乙酰辅酶A和乙酰磷酸的可逆相互转化的蛋白质。

用于测量磷酸乙酰基转移酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Castano-Cerezo和Canovas,Microbial Cell Factories 2009,8:54描述的方法。

本说明书中优选的磷酸乙酰基转移酶是EC号为n°2.3.1.8的酶。

对于磷酸乙酰基转移酶(也称为PTA)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_416800。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中以登录号NC_000913公开的核酸序列。

醇脱氢酶1

醇脱氢酶1是在本领域中被描述为用于催化无支链伯醇转化为其相应的醛的蛋白质。

用于测量醇脱氢酶1的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Ganzhorn等人(1987)TheJournal ofBiological Chemistry,262,3754-61描述的方法。

本说明书中优选的醇脱氢酶1是EC号为n°1.1.1.1的酶。

对于醇脱氢酶1(也称为ADH1)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_014555。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001183340。

醇脱氢酶3

醇脱氢酶3是在本领域中被描述为用于催化无支链伯醇转化为其相应的醛的蛋白质。

用于测量醇脱氢酶3的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Ganzhorn等人(1987)TheJournal ofBiological Chemistry,262,3754-61描述的方法。

本说明书中优选的醇脱氢酶3是EC号为n°1.1.1.1的酶。

对于醇脱氢酶3(也称为ADH3)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_013800。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001182582。

醇脱氢酶4

醇脱氢酶4是在本领域中被描述为用于催化无支链伯醇转化为其相应的醛的蛋白质。

用于测量醇脱氢酶4的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Ganzhorn等人(1987)The Journal ofBiological Chemistry,262,3754-61描述的方法。

本说明书中优选的醇脱氢酶4是EC号为n°1.1.1.1的酶。

对于醇脱氢酶4(也称为ADH4)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_011258。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001181122。

醇脱氢酶5

醇脱氢酶5是在本领域中被描述为用于催化无支链伯醇转化为其相应的醛的蛋白质。

用于测量醇脱氢酶5的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Ganzhorn等人(1987)The Journal ofBiological Chemistry,262,3754-61描述的方法。

本说明书中优选的醇脱氢酶5是EC号为n°1.1.1.1的酶。

对于醇脱氢酶5(也称为ADH5)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_009703。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_001178493。

生产苏氨酸的重组酵母的其次的其他实施方案

根据本发明的生产苏氨酸的重组酵母的另外的其他实施方案，为了提高中间产物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的生产，进行了重组酵母的进一步遗传工程化。

不希望受任何特定理论的束缚，发明人相信，在生产苏氨酸的重组酵母中引入的另外的遗传改变会(i)导致过量生产NADPH，(ii)导致磷酸烯醇丙酮酸分别向草酰乙酸和丙酮酸受控且平衡的转化，以及(iii)导致降低丙酮酸向乙醇的转化，以及重新转向磷酸烯醇丙酮酸向草酰乙酸的转化。

为此目的，发明人构想了一种全新的代谢途径，其始于磷酸烯醇丙酮酸，最后产生草酰乙酸。

通过遗传工程化在本发明的生产苏氨酸的重组酵母中引入的这些另外的遗传改变在下面更详细地说明。

根据这些实施方案，引入遗传改变以使丙酮酸激酶1(也称为PYK1)低表达，任选地也使丙酮酸激酶2(也称为PYK2)低表达。在这些实施方案中的一些中，可以通过将基因置于弱启动子或诱导型或抑制型启动子的控制之下而使PYK1低表达。在这些实施方案的一些中，可以例如通过中断或删除使PYK2失活。在这些实施方案中的一些中，可以删除PYK1基因而非使其低表达。在这些实施方案中的一些中，可以删除PYK1基因和PYK2基因而非使它们低表达。

根据这些实施方案，引入遗传改变以(i)通过组成型过表达或(ii)通过诱导型过表达使磷酸烯醇丙酮酸羧激酶[ATP](也称为PCK或PCKA或PEPCK)过表达。

根据这些实施方案，引入遗传改变以(i)通过组成型过表达或(ii)通过诱导型过表达使苹果酸脱氢酶，例如过氧化物酶体苹果酸脱氢酶(也称为MDH3)在细胞质中过表达。

根据这些实施方案，引入遗传改变以(i)通过组成型过表达或(ii)通过诱导型过表达使NADP依赖性苹果酸酶3(也称为ME3或NADP-ME3)过表达。

根据这些实施方案，引入遗传改变以降低一种或多种醇脱氢酶的表达，优选降低选自包括以下的组的一种或多种醇脱氢酶的表达：醇脱氢酶1(也称为ADH1)、醇脱氢酶3(也称为ADH3)、醇脱氢酶4(也称为ADH4)和醇脱氢酶5(也称为ADH5)，例如(i)通过将相应的编码序列置于弱启动子或诱导型或抑制型启动子的控制之下，或(ii)通过产生所述醇脱氢酶的不稳定形式。

仍然根据这些实施方案，引入遗传改变以(i)通过组成型过表达或(ii)通过诱导型过表达使外源乙醛脱氢酶(也称为MHPF)过表达。

丙酮酸激酶1和丙酮酸激酶2如先前所定义。

磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PPCK)

磷酸烯醇羧激酶[ATP]酶是在本领域中被描述为用于催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇丙酮酸(通过三磷酸核苷和草酰乙酸之间的直接磷酰基转移)的蛋白质。

用于测量磷酸烯醇羧激酶[ATP]的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Bazaes S.等人(2007)The ProteinJournal,26,265-269和

J.Van der Werf等人(1997)Arch Microbiol 167:332–342描述的方法。

本说明书中优选的磷酸烯醇羧激酶[ATP]是EC号为n°4.1.1.49的酶。

对于磷酸烯醇羧激酶[ATP](也称为PCKA)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_417862。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中以登录号NC_000913公开的核酸序列。

根据本发明的优选的磷酸烯醇羧激酶可以选自磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PPCK，例如EC号为n°4.1.1.32的PEPCK。

苹果酸脱氢酶

苹果酸脱氢酶是在本领域中被描述为用于在NADH的存在下催化苹果酸转化为草酰乙酸的蛋白质。

用于测量苹果酸脱氢酶的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。例如可以提及由Sigma出售的名为“苹果酸脱氢酶测定试剂盒”的商业试剂盒，编号为MAK196-1KT。

对于苹果酸脱氢酶(也称为MDH3)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_010205。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_00118037。

NADP依赖性苹果酸酶3

NADP依赖性苹果酸酶3酶是在本领域中被描述为用于在NADP的存在下催化苹果酸转化为丙酮酸的蛋白质。

用于测量NADP依赖性苹果酸酶3的活性水平的方法属于本领域技术人员的常识。

在这方面，本领域技术人员可以有利地参考Gerrard-Wheeler等人FEBSJournal276(2009)5665-5677描述的方法。

本说明书中优选的NADP依赖性苹果酸酶是EC号为n°1.1.1.40的酶。

对于NADP依赖性苹果酸酶3(也称为NADP-ME3或ME3)的氨基酸序列，可以参考UniProt数据库中的登录号NP_197960。对于核酸序列，可以参考NCBI数据库中的登录号NM_122489。

醇脱氢酶1、醇脱氢酶3、醇脱氢酶4、乙醛脱氢酶和醇脱氢酶5如前所定义。

启动子

如本文所公开的，为了获得根据本发明的重组酵母而被遗传工程改造的目的基因的表达包含在酵母细胞中(包括在酿酒酵母中)起作用的合适的调控序列。

如本说明书中所公开的，多种启动子可用于目的编码序列的期望表达，包括(i)组成型强启动子(在本文中也称为强启动子)，(ii)组成型弱启动子(在本文中也称为弱启动子)和(iii)诱导型或抑制型启动子。酵母启动子及其在不同培养基中的相对活性的列表可见于Keren等人(2013)Molecular Systems Biology 9:701。

允许给定基因的组成型过表达的启动子可见于文献(Velculescu等人(1997)Cell88,243-251)。

在本发明中更特别感兴趣的强启动子可以选自由以下组成的组：

·pTDH3(SEQ ID N°22)，

·pENO2(SEQ ID N°23)，

·pTEF KI(SEQ ID N°24)，

·pTEF3(SEQ ID N°25)，

·pTEF1(SEQ ID N°26)，

·pADH1(SEQ ID N°27)，

·pGMP1(SEQ ID N°28)，

·pFBA1(SEQ ID N°29)，

·pPDC1(SEQ ID N°30)，

·pCCW12(SEQ ID N°31)，和

·pGK1(SEQ ID N°32)。

根据一个特定的实施方案，根据本发明的强启动子独立地选自由以下组成的组：pTDH3、pENO2、pTEF-KI、pTEF3、pTEF1、pADH1、pGMP1、pFBA1、pPDC1、pCCW12和pGK1。

在本发明中更特别感兴趣的弱启动子可以选自由以下组成的组：

·pURA3(SEQ ID N°34)，

·pRPLA1(SEQ ID N°35)，

·pNUP57(SEQ ID N°114)，和

·pGAP1(SEQ ID N°115)。

根据一个具体的实施方案，根据本发明的弱启动子独立地选自由以下组成的组：pURA3、pRPLA1、pNUP57和pGAP1。

如前所述，诱导型或抑制型启动子是其活性受是否存在生物或非生物因子以及所述因子的量所控制的启动子。因此，对于某些启动子，当给定因子的量增加或被增加时，它们的活性将特别地被诱导并因此增加，因此，当所述因子的量降低或被降低时，这些相同启动子的活性可以被抑制并因此降低。包含诱导型或抑制型启动子的本发明的重组酵母的培养基中所述因子的量可以由本领域技术人员确定并控制。

例如，增加包含pSAM4启动子的本发明重组酵母的培养基中甲硫氨酸的量将诱导并因此增加处于该启动子的控制之下的基因的转录。相反，降低所述培养基中甲硫氨酸的量将会抑制并因此降低处于该启动子的控制之下的基因的转录。

在另一个实例中，增加包含pCTR1启动子的本发明重组酵母的培养基中铜的量将抑制并因此降低处于该启动子的控制之下的基因的转录。相反，降低所述培养基中铜的量将会诱导并因此增加处于该启动子的控制之下的基因的转录。

因此，以下启动子在本文中称为“诱导型或抑制型启动子”。

根据第一个实施方案，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以选自包括以下的组：可用铜诱导或抑制的启动子、可用甲硫氨酸诱导或抑制的启动子和可用苏氨酸诱导或抑制的启动子，特别是选自由以下组成的组：

·pSAM4-甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°36)，

·pCUP1-1–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°37)，

·pCUP1.cgla–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°38)，

·pCUP1.sba–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°39)，

·pACU1–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°40)，

·pACU2–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°41)，

·pACU3p–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°42)，

·pACU4p–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°43)，

·pACU5–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°44)，

·pACU6–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°45)，

·pACU7–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°46)，

·pACU8–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°47)，

·pACU9–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°48)，

·pACU10p–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°49)，

·pACU11–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°50)，

·pACU12–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°51)，

·pACU13–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°52)，

·pACU14–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°53)，

·pACU15–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°54)，

·pGAL/CUP1p–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°55)，

·pCRS5–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°56)，和

·pCHA1–苏氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°57)。

因此，在该实施方案中，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以特别地独立地选自由以下组成的组：pSAM4、pCUP1-1、pCUP1.Cgla、pCUP1.Sba、pACU1、pACU2、pACU3p、pACU4p、pACU5、pACU6、pACU7、pACU8、pACU9、pACU10p、pACU11、pACU12、pACU13、pACU14、pACU15、pGAL/CUP1p、pCRS5和pCHA1。

因此，如上所述，通过增加甲硫氨酸、铜或苏氨酸的存在来诱导这些启动子的活性，并且当甲硫氨酸、铜或苏氨酸的量减少时，它们的活性降低，即，被抑制。

根据第二个实施方案，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以选自包括以下的组：可用铜诱导或抑制的启动子、可用葡萄糖诱导或抑制的启动子、可用赖氨酸诱导或抑制的启动子和可用甲硫氨酸诱导或抑制的启动子，特别是选自由以下组成的组：

·pCTR1–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°58)，

·pCTR3–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°59)，

·pCUR1–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°60)，

·pCUR2–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°61)，

·pCUR3–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°62)，

·pCUR4–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°63)，

·pCUR5p–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°64)，

·pCUR6–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°65)，

·pCUR7–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°66)，

·pCUR8–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°67)，

·pCUR9–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°68)，

·pCUR10–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°69)，

·pCUR11–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°70)，

·pCUR12–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°71)，

·pCUR13–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°72)，

·pCUR14–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°73)，

·pCUR15–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°74)，

·pCUR16–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°75)，

·pCUR17–铜诱导型或抑制型(SEQ ID N°76)，

·pLYS1–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°77)，

·pLYS4–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°78)，

·pLYS9–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°79)，

·pLYR1p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°80)，

·pLYR2p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°81)，

·pLYR3p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°82)，

·pLYR4p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°83)，

·pLYR5p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°84)，

·pLYR6p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°85)，

·pLYR7p–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°86)，

·pLYR8–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°87)，

·pLYR9–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°88)，

·pLYR10–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°89)，

·pLYR11–赖氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°90)，

·pMET17–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°91)，

·pMET6–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°92)，

·pMET14–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°93)，

·pMET3–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°94)，

·pSAM1–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°95)，

·pSAM2–甲硫氨酸诱导型或抑制型(SEQ ID N°96)，

·pMDH2–葡萄糖诱导型或抑制型(SEQ ID N°33)，

·pJEN1–葡萄糖诱导型或抑制型(SEQ ID N°116)，

·pICL1–葡萄糖诱导型或抑制型(SEQ ID N°117)，

·pADH2–葡萄糖诱导型或抑制型(SEQ ID N°118)，和

·pMLS1–葡萄糖诱导型或抑制型(SEQ ID N°119)。

根据该实施方案，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以独立地选自由以下组成的组：pCTR1、pCTR3、pCUR1、pCUR2、pCUR3、pCUR4、pCUR5p、pCUR6、pCUR7、pCUR8、pCUR9、pCUR10、pCUR11、pCUR12、pCUR13、pCUR14、pCUR15、pCUR16、pCUR17、pLYS1、pLYS4、pLYS9、pLYR1p、pLYR2p、pLYR3p、pLYR4p、pLYR5p、pLYR6p、pLYR7p、pLYR8、pLYR9、pLYR10、pLYR11、pMET17、pMET6、pMET14、pMET3、pSAM1、pSAM2、pMDH2、pJEN1、pICL1、pADH2和pMLS1。

因此，如上所述，通过增加甲硫氨酸、铜、赖氨酸或葡萄糖的存在量，来抑制这些启动子的活性，并且当甲硫氨酸、铜、赖氨酸或葡萄糖的量减少时它们的活性增加，即被诱导。

在一个特定的实施方案中，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以选自包括以下的组：可用铜诱导或抑制的启动子、可用葡萄糖诱导或抑制的启动子、可用赖氨酸诱导或抑制的启动子、可用甲硫氨酸诱导或抑制的启动子和可用苏氨酸诱导或抑制的启动子。

在一个更具体的实施方案中，根据本发明的诱导型或抑制型启动子可以独立地选自由以下组成的组：pSAM4、pCUP1-1、pCUP1.Cgla、pCUP1.Sba、pACU1、pACU2、pACU3p、pACU4p、pACU5、pACU6、pACU7、pACU8、pACU9、pACU10p、pACU11、pACU12、pACU13、pACU14、pACU15、pGAL/CUP1p、pCRS5、pCHA1、pCTR1、pCTR3、pCUR1、pCUR2、pCUR3、pCUR4、pCUR5p、pCUR6、pCUR7、pCUR8、pCUR9、pCUR10、pCUR11、pCUR12、pCUR13、pCUR14、pCUR15、pCUR16、pCUR17、pLYS1、pLYS4、pLYS9、pLYR1p、pLYR2p、pLYR3p、pLYR4p、pLYR5p、pLYR6p、pLYR7p、pLYR8、pLYR9、pLYR10、pLYR11、pMET17、pMET6、pMET14、pMET3、pSAM1、pSAM2、pMDH2、pJEN1、pICL1、pADH2和pMLS1。

更具体地，所述启动子(相同或不同)可以优选地以选自由以下组成的组的核酸的序列为特征：与序列SEQ ID NO：22至96和114至119具有至少80％同一性的序列。

也可以使用如Blazeck&Alper(2013)Biotechnol.J.8 46-58中描述的合成型启动子。

本发明的强、弱和诱导型或抑制型启动子可以源自来自酵母纲的任何生物，并且特别地可以独立地源自选自由以下组成的组的生物：酿酒酵母、布拉迪酵母(Saccharomyces boulardii)、Saccharomyces castelii、贝酵母(Saccharomycesbayanus)、Saccharomyces arboricola、库德里阿兹威酵母(Saccharomyceskudriavzevii)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyceslactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、卡氏德巴利酵母(Debaryomyces castelii)、解脂假丝酵母(Yarrowia lipolitica)和产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)。

本发明的强、弱和诱导型或抑制型启动子可以优选源自选自由以下组成的组的生物：酿酒酵母、Saccharomyces castelii、贝酵母、Saccharomyces arboricola、库德里阿兹威酵母和乳酸克鲁维酵母。

终止子

如本文所公开的，为了获得根据本发明的重组酵母而被遗传工程改造的目的基因的表达包含在酵母细胞中(包括在酿酒酵母中)起作用的合适的转录终止子序列。

所述转录终止子(相同或不同)可见于文献Yamanishi等人(2013)ACSsyntheticbiology 2,337-347。

在本发明中更特别感兴趣的终止子可以选自由以下组成的组：

·tTDH2，来自编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶同工酶2的基因(TDH2基因＝序列SEQ IDN°97)，

·tCYC1(＝序列SEQ ID N°98)，

·tTDH3(＝序列SEQ ID N°99)，和

·tADH1，来自编码醇脱氢酶的基因(ADH1基因＝序列SEQ ID N°100)，

·tADH2，来自编码醇脱氢酶的基因(ADH2基因＝序列SEQ ID N°101)，

·tTPI1来自编码磷酸甘油醛异构酶(Triose Phosphate Isomerase)的基因(TPI1基因＝序列SEQ ID N°102)，

·tMET17，来自编码O-乙酰基高丝氨酸-O-乙酰基丝氨酸硫化氢解酶(O-acetylhomoserine-O-acetyl serine sulfhydrylase)的基因(Met17基因＝序列SEQ ID N°103)，

·tENO2，来自编码烯醇酶II的基因(ENO2基因＝序列SEQ ID N°104)，

·tMET3(＝序列SEQ ID N°105)，和

·tPGK1，来自编码3-磷酸甘油酸激酶的基因(PGK1基因＝序列SEQ ID N°106)，

·tDIT1(＝序列SEQ ID N°107)，

·tRPL3(＝序列SEQ ID N°108)，

·tRPL41B(＝序列SEQ ID N°109)，

·tRPL15A(＝序列SEQ ID N°110)，

·tIDP1(＝序列SEQ ID N°111)。

更具体地，所述终止子(相同或不同)可以优选地以选自由以下组成的组的核酸的序列为特征：与序列SEQ ID NO：97至111具有至少80％同一性的序列。

重组酵母

通常，与细菌相比，酵母可以快速生长并且可以以更高的密度培养，并且在工业环境中不需要无菌环境。此外，与细菌细胞相比，酵母细胞可以更容易地从培养基中分离出来，从而大大简化了产物提取和纯化的过程。

优选地，本发明的酵母可以选自酵母菌属、念珠菌属、阿舒囊霉属(Ashbya)、德克拉酵母属(Dekkera)、毕赤酵母属(Pichia)(汉逊酵母属(Hansenula))、德巴利酵母属(Debaryomyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、路德酵母属(Lodderomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、Zigosaccharomyces、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、有孢酵母属(Torulaspora)、克鲁维酵母属、酒香酵母属(Brettanomycces)、隐球菌属(Cryptococcus)或马拉色菌属(Malassezia)。

更优选地，酵母可以是酵母菌属、德克拉酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、有孢酵母属、Zigosaccharomyces属或酒香酵母属的Crabtree阳性酵母。

更优选地，酵母可以选自酿酒酵母、布拉迪酵母、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、贝酵母或Zigosaccharomyces bailii、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、布鲁塞尔德克酵母(Dekkera brucelensis)、中间型德克酵母(Dekkeraintermedia)、卡斯酒香酵母(Brettanomycces custersii)、中间型酒香酵母(Brettanomycces intermedius)、嗜热克鲁维酵母(Kluyveromyces themotolerens)、球有孢圆酵母(Torulaspora globosa)、光滑有孢圆酵母(Torulaspora glabrata)。

更优选地，重组酵母可以属于酵母菌属，并且优选地是酿酒酵母物种。

被实施以在基因内插入特定DNA构建体的方法属于本领域技术人员的常识。在下文的实施例中更详细地描述了相关方法。

培养条件

本发明还涉及重组酵母(例如如上定义的)在生产苏氨酸中的用途。

本发明还涉及用于生产苏氨酸的方法，其包括以下步骤：

(a)在培养基中培养先前定义的重组酵母；和

(b)从所述培养基中回收苏氨酸。

通常，本发明的微生物(或酵母)在合适的培养基中在约20℃至约37℃范围内的温度下，优选在范围为27至34℃的温度下生长。

当根据本发明的重组酵母属于酿酒酵母物种时，在合适的培养基中温度可以有利地在27至34℃的范围内。

适合酵母的生长培养基是常见的商业制备培养基，例如肉汤，其包括酵母氮碱、硫酸铵和右旋糖作为碳/能源，或YPD培养基——蛋白胨、酵母提取物和右旋糖的对于最快生长而言最佳比例的混合物。也可以使用其他限定的或合成的生长培养基，并且微生物或发酵科学领域的技术人员将知道用于特定微生物生长的合适的培养基。

术语“合适的培养基”是以上定义的。

用于根据本发明的重组酵母的已知培养基的实例是本领域技术人员已知的，并且在以下出版物中给出：D.Burke等人,Methods in yeast Genetics-A cold spring harborlaboratory course Manual(2000)。

用于发酵的合适的pH范围可以在pH 3.0至pH 7.5之间，其中优选pH 4.5至pH 6.5作为初始条件。

发酵可以在需氧条件或微需氧条件下进行。

发酵培养基中产物的量可以使用本领域已知的多种方法来确定，例如高效液相色谱法(HPLC)或气相色谱法(GC)。

本方法可以采用分批发酵方法。经典的分批发酵是封闭的体系，其中培养基的组成在发酵开始时就设定好了，并且在发酵过程中不会发生人为改变。因此，在发酵开始时，用所需的一种或多种生物接种培养基，并且在不向该体系中添加任何物质的情况下能够发生发酵。然而，通常，“分批”发酵是就添加碳源而言的分批，并且经常尝试控制诸如温度、pH和氧浓度之类的因素。在分批体系中，该体系的代谢物和生物质组成一直在变化直至发酵停止。在分批培养中，细胞通过静态停滞期进入高生长对数期，最后进入稳定期，在稳定期生长速率降低或停止。如果不进行处理，稳定期的细胞将最终死亡。对数期的细胞通常负责最终产物或中间体的大量生产。

本发明中也可以使用补料分批体系(Fed-Batch system)。补料分批体系与典型的分批体系类似，不同之处在于，随着发酵的进行，以增量方式添加碳源底物。当分解代谢物阻抑(例如葡萄糖阻抑)易于抑制细胞的代谢并且希望培养基中底物的量有限时，补料分批体系是有用的。补料分批体系中实际底物浓度的测量很困难，因此是根据可测量因素(例如pH值、溶氧量和废弃(如C0₂)的分压)的变化进行估算的。

发酵是本领域常见且公知的，并且实例可见于Sunderland等人，(1992)，其通过引用并入本文。尽管本发明以分批模式进行，但是可以预期该方法将适用于连续发酵。

连续发酵是一种开放体系，其中向生物反应器中连续添加确定的发酵培养基，并同时去除等量的条件培养基以进行流程。连续发酵通常使培养物保持恒定的高密度，其中细胞主要处于对数生长期。

连续发酵允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或任何数量的因素。例如，一种方法将使限制性营养物质例如碳源或氮水平保持在恒定速率，并允许所有其他参数发生变化。在其他体系中，可以连续改变影响生长的许多因素，而使细胞浓度(通过培养基浊度测量)保持恒定。连续体系力争维持稳态生长条件，因此由于培养基被抽出而导致的细胞损失必须与发酵中的细胞生长速率相平衡。为连续发酵过程调节营养物质和生长因子的方法以及使产物形成速率最大化的技术是工业微生物学领域众所周知的。

预期可以使用分批、补料分批或连续方法实施本发明，并且任何已知的发酵方式将是合适的。另外，预期可以将细胞固定在作为全细胞催化剂的基质上，并使其经受发酵条件以进行生产。

为了仍然改善苏氨酸的生产，一个特定的实施方案可以由以下构成：在合适的培养基(例如如上提到的)中培养重组酵母细胞，其中所述培养基包含最适量的碳源，特别是葡萄糖。

优选地，仅在整个培养期间的一部分期间在这种最佳培养基中培养细胞。在一些实施方案中，在培养开始后10小时或更长时间，涵盖在培养开始后11、12、13、14、15或16小时或更长时间，将酵母细胞在所述最佳培养基中孵育。

优选地，在培养开始后5小时至15小时的时间段内，包括6小时至10小时，例如8小时，将细胞在这样的最佳培养基中培养。

在优选的实施方案中，所述最佳培养基中包含的碳源由葡萄糖组成。在优选的实施方案中，所述最佳培养基包含12％w/w或更多的葡萄糖，包括15％w/w或更多的葡萄糖。在优选的实施方案中，所述最佳培养基包含至多40％w/w的葡萄糖，其包含至多35％w/w的葡萄糖。

因此，在上述优选实施方案中，根据本发明的用于生产苏氨酸的方法还可以在步骤(a)和(c)之间包括中间步骤(b)，该中间步骤(b)由以下构成：在所述最佳培养基中培养所述酵母细胞。

苏氨酸的纯化

根据本发明的一个特定方面，苏氨酸的发酵生产包括从培养基中分离苏氨酸的步骤。从培养基中回收苏氨酸是本领域技术人员的常规工作。可以通过本领域众所周知的多种技术来实现，包括但不限于蒸馏、气体汽提(gas-stripping)、渗透蒸发(pervaporation)、选择性沉淀或液体萃取。本领域的专家知晓如何根据待分离材料的特性来调整各种技术的参数。

作为本发明的微生物模型的酵母被保留，因为合成的苏氨酸被完全输出到细胞外，从而简化了纯化过程。

合成的苏氨酸可以通过蒸馏收集。蒸馏可以涉及不同于培养基的任选组分，以便通过形成共沸物(特别是与水)来促进苏氨酸的分离。该任选组分是有机溶剂，例如环己烷、戊烷、丁醇、苯、甲苯、三氯乙烯、辛烷、二乙醚或其混合物。

用选自氦气、氩气、二氧化碳、氢气、氮气或其混合物的汽提气体进行气体汽提。

用有机溶剂作为疏水相(例如戊烷、己烷、庚烷或十二烷)进行液体萃取。

实施例

实施例1：制备根据本发明的重组酿酒酵母菌株的方案

下文实施的所有重组酿酒酵母菌株均是使用标准酵母分子遗传学方法(D.Burke、D.Dawson、T.Stearns CSHL Press的Methods in yeast Genetics-A cold spring harborlaboratory course Manual(2000))从标准菌株构建的。

利用酵母有效重组具有序列同源性的游离DNA末端的能力，将下述基因簇同时整合到重组酵母中。

另外，为了更好地理解以下基因型；

-ade2、his3、leu2、trp1和ura3是营养缺陷型标记基因。

-小写字母表示所考虑的基因是无活性的，大写字母表示活性基因。

-基因名称后的“::”：是指该基因被随后的内容中断(如果插入了多个基因，则将它们标注在方括号[]中)。基因的中断伴随编码序列的整体缺失，但保留了启动子。因此，后面有“::”的基因是无活性的，并以小写字母表示。如果未指定，则插入的基因的转录受被破坏的基因的启动子控制。

-“基因.Kl”是指该基因源自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。

更特别地，待克隆的编码序列是人工合成的。对于异源序列(非酵母的)，对核酸序列进行修饰以获得使用酵母密码子用法的同义编码序列。使用限制酶和经典克隆技术，将每个合成序列克隆在转录启动子和转录终止子之间。每个启动子序列的前面是与上游基因的终止子序列同源的50至200个核苷酸序列。类似地，每个基因(包含启动子-编码序列-终止子的基因)的终止子的后面是与紧随其后的基因同源的序列。因此，每个待整合的单元与单元上游和单元下游都有50-200个核苷酸重叠。对于第一个单元，启动子的前面是与其将要整合进去的酵母染色体基因座核苷酸同源的50-200个核苷酸。类似地，对于最后一个单元，终止子的后面是与其将要整合进去的酵母染色体基因座核苷酸同源的50-200个核苷酸。

然后从质粒构建体PCR扩增每个单元，得到具有重叠序列的线性DNA的X单元。为了选择重组事件，该基因中的至少一个是营养缺陷型标记。将所有线性片段同时转化到酵母中，并针对与所用标记相关的营养缺陷型选择重组酵母。然后通过PCR和测序验证序列的完整性。

实施例2：生产苏氨酸的比较例

获得了两种重组菌株：YA2979-46B和YA2980-1B。这两种菌株已经被重组，以便仅包含根据本发明的一部分修饰。

相应地，这两种菌株如下：

YA2979-46B：MAT-α,ade2,can1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-PPC-5.Ec-tTPI1-can1]x4,his3::[pACU5-HOM2-2-tRPL3-pTDH3-GDH.Eca-tIDP1-HIS3]x7,leu2,pyk1::[LEU2.Kl-pTEF3-AQR1-tRPL41B,pCUR3-PYK1-tPYK1],sam3::[pCCW12-THR4-tRPL3-pTDH3-THR1-tIDP1-sam3]x2,trp1::[pPDC1-PPC-5.Ec-tRPL3-pACU7-AK.Bs-tIDP1-TRP1]x4

YA2980-1B：MAT-α,ade2,can1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-PPC-5.Ec-tTPI1-can1]x4,his3::[pACU5-HOM2-2-tRPL3-pTDH3-GDH.Eca-tIDP1-HIS3]x7,leu2,pyk1::[LEU2.Kl-pCUR3-PYK1-tPYK1],sam3::[pCCW12-THR4-tRPL3-pTDH3-THR1-tIDP1-sam3]x2,trp1::[pPDC1-PPC-5.Ec-tRPL3-pACU7-AK.Bs-tIDP1-TRP1]x4

PPC-5是PPC的更稳定形式，其中已在N+1(氨基酸序列的第2位)中添加了丙氨酸。

使所有这些菌株在YE(酵母提取物)2％、葡萄糖8％、(NH₄)₂SO₄ 50mM和CH₃SNa 1g/L中生长24小时。8小时后添加500μM的CuSO₄。在26小时后，按照制造商的建议，使用Waters的AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒，使用用于氨基酸测定的AccQ-Tag柱前衍生法测定培养基中苏氨酸的含量。

用这两种菌株获得的苏氨酸量为2g/L^-1。相比之下，未修饰的菌株不能产生可检测量的苏氨酸。

由这些实验得出的结果是，与天然菌株相比，当在相同条件下培养时，包含本发明的修饰的重组菌株生产更多量的苏氨酸。

序列表

<110> 安迪苏法国联合股份有限公司

<120> 苏氨酸生产酵母

<130> PR74670

<150> EP17305909

<151> 2017-07-11

<160> 119

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 1098

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 天冬氨酸-半醛脱氢酶 (HOM2)

<220>

<223> 天冬氨酸-半醛脱氢酶 (HOM2)

<400> 1

atggctggaa agaaaattgc tggtgttttg ggtgctactg gttccgttgg tcaacgtttc 60

attctgttgt tggcaaatca ccctcatttc gaactgaaag ttcttggtgc ctcttctaga 120

tcagctggca agaaatacgt tgacgctgtg aactggaagc aaaccgattt gctaccggaa 180

tctgctaccg atattattgt ttccgaatgt aaatctgaat tctttaaaga gtgtgacatc 240

gtcttttccg gattggatgc tgactatgct ggcgctatcg aaaaggaatt catggaagct 300

ggtatcgcca ttgtttccaa tgccaagaat tatagaagag aacaagatgt gccattgatt 360

gttcctgttg tcaatcctga gcatttggat attgtagctc aaaagcttga caccgccaag 420

gctcaaggta agccaagacc agggttcatt atctgtattt ccaattgttc cactgcaggt 480

ttggttgcac cattgaagcc tttgattgaa aaattcggtc ctattgatgc tttgaccact 540

actactttgc aagcaatctc aggtgctggt ttctccccag gtgtaccagg tattgatatt 600

ctagacaata ttattccata cattggtggt gaagaagaca agatggaatg ggagaccaag 660

aaaatcttgg ctccattagc agaagacaag acacacgtca aactattgac tccagaagaa 720

atcaaagtct ctgctcaatg taacagagtc gctgtttccg atgggcacac cgaatgtatc 780

tctttgaggt tcaagaacag acctgctcca tccgtcgagc aagtcaagac atgcctaaaa 840

gaatacgtct gcgatgccta caaattaggc tgtcattctg ctccaaagca aactattcat 900

gttttggaac aaccagacag acctcaacca aggttggaca ggaacagaga cagcggttac 960

ggtgtttccg ttggtagaat cagagaagac ccattgttag atttcaaaat ggttgtcctt 1020

tcccacaaca ccattattgg tgccgctggt tctggtgtct tgattgccga aatcttacta 1080

gcaagaaact tgatttaa 1098

<210> 2

<211> 1098

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 天冬氨酸-半醛脱氢酶 (HOM2)

<220>

<223> 天冬氨酸-半醛脱氢酶 (HOM2)

<400> 2

atggctggaa agaaaattgc tggtgttttg ggtgctactg gttccgttgg tcaacgtttc 60

attctgttgt tggcaaatca ccctcatttc gaactgaaag ttcttggtgc ctctgagaga 120

tcagctggca agaaatacgt tgacgctgtg aactggaagc aaaccgattt gctaccggaa 180

tctgctaccg atattattgt ttccgaatgt aaatctgaat tctttaaaga gtgtgacatc 240

gtcttttccg gattggatgc tgactatgct ggcgctatcg aaaaggaatt catggaagct 300

ggtatcgcca ttgtttccaa tgccaagaat tatagaagag aacaagatgt gccattgatt 360

gttcctgttg tcaatcctga gcatttggat attgtagctc aaaagcttga caccgccaag 420

gctcaaggta agccaagacc agggttcatt atctgtattt ccaattgttc cactgcaggt 480

ttggttgcac cattgaagcc tttgattgaa aaattcggtc ctattgatgc tttgaccact 540

actactttgc aagcaatctc aggtgctggt ttctccccag gtgtaccagg tattgatatc 600

ctagacaata ttattccata cattggtggt gaagaagaca agatggaatg ggagaccaag 660

aaaatcttgg ctccattagc agaagacaag acacacgtca aactattgac tccagaagaa 720

atcaaagtct ctgctcaatg taacagagtc gctgtttccg atgggcacac cgaatgtatc 780

tctttgaggt tcaagaacag acctgctcca tccgtcgagc aagtcaagac atgcctaaaa 840

gaatacgtct gcgatgccta caaattaggc tgtcattctg ctccaaagca aactattcat 900

gttttggaac aaccagacag acctcaacca aggttggaca ggaacagaga cagcggttac 960

ggtgtttccg ttggtagaat cagagaagac ccattgttag atttcaaaat ggttgtcctt 1020

tcccacaaca ccattattgg tgccgctggt tctggtgtct tgattgccga aatcttacta 1080

gcaagaaact tgatttaa 1098

<210> 3

<211> 365

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 天冬氨酸-半醛脱氢酶 (HOM2)

<220>

<223> 天冬氨酸-半醛脱氢酶 (HOM2)

<400> 3

Met Ala Gly Lys Lys Ile Ala Gly Val Leu Gly Ala Thr Gly Ser Val

1 5 10 15

Gly Gln Arg Phe Ile Leu Leu Leu Ala Asn His Pro His Phe Glu Leu

20 25 30

Lys Val Leu Gly Ala Ser Ser Arg Ser Ala Gly Lys Lys Tyr Val Asp

35 40 45

Ala Val Asn Trp Lys Gln Thr Asp Leu Leu Pro Glu Ser Ala Thr Asp

50 55 60

Ile Ile Val Ser Glu Cys Lys Ser Glu Phe Phe Lys Glu Cys Asp Ile

65 70 75 80

Val Phe Ser Gly Leu Asp Ala Asp Tyr Ala Gly Ala Ile Glu Lys Glu

85 90 95

Phe Met Glu Ala Gly Ile Ala Ile Val Ser Asn Ala Lys Asn Tyr Arg

100 105 110

Arg Glu Gln Asp Val Pro Leu Ile Val Pro Val Val Asn Pro Glu His

115 120 125

Leu Asp Ile Val Ala Gln Lys Leu Asp Thr Ala Lys Ala Gln Gly Lys

130 135 140

Pro Arg Pro Gly Phe Ile Ile Cys Ile Ser Asn Cys Ser Thr Ala Gly

145 150 155 160

Leu Val Ala Pro Leu Lys Pro Leu Ile Glu Lys Phe Gly Pro Ile Asp

165 170 175

Ala Leu Thr Thr Thr Thr Leu Gln Ala Ile Ser Gly Ala Gly Phe Ser

180 185 190

Pro Gly Val Pro Gly Ile Asp Ile Leu Asp Asn Ile Ile Pro Tyr Ile

195 200 205

Gly Gly Glu Glu Asp Lys Met Glu Trp Glu Thr Lys Lys Ile Leu Ala

210 215 220

Pro Leu Ala Glu Asp Lys Thr His Val Lys Leu Leu Thr Pro Glu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Val Ser Ala Gln Cys Asn Arg Val Ala Val Ser Asp Gly His

245 250 255

Thr Glu Cys Ile Ser Leu Arg Phe Lys Asn Arg Pro Ala Pro Ser Val

260 265 270

Glu Gln Val Lys Thr Cys Leu Lys Glu Tyr Val Cys Asp Ala Tyr Lys

275 280 285

Leu Gly Cys His Ser Ala Pro Lys Gln Thr Ile His Val Leu Glu Gln

290 295 300

Pro Asp Arg Pro Gln Pro Arg Leu Asp Arg Asn Arg Asp Ser Gly Tyr

305 310 315 320

Gly Val Ser Val Gly Arg Ile Arg Glu Asp Pro Leu Leu Asp Phe Lys

325 330 335

Met Val Val Leu Ser His Asn Thr Ile Ile Gly Ala Ala Gly Ser Gly

340 345 350

Val Leu Ile Ala Glu Ile Leu Leu Ala Arg Asn Leu Ile

355 360 365

<210> 4

<211> 1074

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 高丝氨酸激酶 (THR1)

<220>

<223> 高丝氨酸激酶 (THR1)

<400> 4

atggttcgtg ccttcaaaat taaagttcca gcttcttccg ccaatatcgg ccctggttat 60

gatgttcttg gtgtcggtct ttctctattc ttggagttag atgtcaccat cgactccagc 120

caagctcagg aaacaaacga cgatcccaac aactgcaagc tgtcttacac taaagaaagt 180

gaaggctatt ctacggtccc attgcgttct gatgctaacc tgattaccag gactgcgtta 240

tatgtgttgc gttgcaacaa tattagaaac ttcccctccg gaaccaaagt tcacgtctcc 300

aacccaatcc cacttggccg tggattgggt tcctctggtg cagcagttgt ggcaggtgtt 360

attttaggta acgaagtggc ccaattgggt ttctctaagc aacgtatgtt ggactactgt 420

ttgatgattg aacgtcatcc agacaacata accgctgcta tgatgggagg cttttgcggt 480

tcattcctaa gggacttgac cccacaagag gtggaaagac gtgagattcc attggctgag 540

gtgcttccag aaccttctgg tggtgaagat accggtctgg ttcccccatt acctcccacc 600

gatatcggta gacatgtcaa ataccaatgg aaccccgcca ttaaatgtat tgcgatcatc 660

ccacagttcg agttgtccac cgccgactcc agaggcgttc ttccaaaagc ctacccaacc 720

caggacttgg ttttcaatct acaaagattg gccgtcttga ccacagcttt gaccatggac 780

ccacctaatg ccgacttaat ctaccctgct atgcaagatc gtgtccacca accttataga 840

aagacattga tcccaggtct cacggaaatc ttatcatgtg tcaccccatc cacataccct 900

ggcctattgg gtatctgctt gtcaggtgca ggcccaacta tcttggcttt ggccactgag 960

aatttcgaag aaatctctca agaaattatc aacaggttcg ccaaaaacgg catcaagtgc 1020

tcctggaaac tactggagcc tgcctacgat ggtgctagcg tcgaacagca atga 1074

<210> 5

<211> 357

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 高丝氨酸激酶 (THR1)

<220>

<223> 高丝氨酸激酶 (THR1)

<400> 5

Met Val Arg Ala Phe Lys Ile Lys Val Pro Ala Ser Ser Ala Asn Ile

1 5 10 15

Gly Pro Gly Tyr Asp Val Leu Gly Val Gly Leu Ser Leu Phe Leu Glu

20 25 30

Leu Asp Val Thr Ile Asp Ser Ser Gln Ala Gln Glu Thr Asn Asp Asp

35 40 45

Pro Asn Asn Cys Lys Leu Ser Tyr Thr Lys Glu Ser Glu Gly Tyr Ser

50 55 60

Thr Val Pro Leu Arg Ser Asp Ala Asn Leu Ile Thr Arg Thr Ala Leu

65 70 75 80

Tyr Val Leu Arg Cys Asn Asn Ile Arg Asn Phe Pro Ser Gly Thr Lys

85 90 95

Val His Val Ser Asn Pro Ile Pro Leu Gly Arg Gly Leu Gly Ser Ser

100 105 110

Gly Ala Ala Val Val Ala Gly Val Ile Leu Gly Asn Glu Val Ala Gln

115 120 125

Leu Gly Phe Ser Lys Gln Arg Met Leu Asp Tyr Cys Leu Met Ile Glu

130 135 140

Arg His Pro Asp Asn Ile Thr Ala Ala Met Met Gly Gly Phe Cys Gly

145 150 155 160

Ser Phe Leu Arg Asp Leu Thr Pro Gln Glu Val Glu Arg Arg Glu Ile

165 170 175

Pro Leu Ala Glu Val Leu Pro Glu Pro Ser Gly Gly Glu Asp Thr Gly

180 185 190

Leu Val Pro Pro Leu Pro Pro Thr Asp Ile Gly Arg His Val Lys Tyr

195 200 205

Gln Trp Asn Pro Ala Ile Lys Cys Ile Ala Ile Ile Pro Gln Phe Glu

210 215 220

Leu Ser Thr Ala Asp Ser Arg Gly Val Leu Pro Lys Ala Tyr Pro Thr

225 230 235 240

Gln Asp Leu Val Phe Asn Leu Gln Arg Leu Ala Val Leu Thr Thr Ala

245 250 255

Leu Thr Met Asp Pro Pro Asn Ala Asp Leu Ile Tyr Pro Ala Met Gln

260 265 270

Asp Arg Val His Gln Pro Tyr Arg Lys Thr Leu Ile Pro Gly Leu Thr

275 280 285

Glu Ile Leu Ser Cys Val Thr Pro Ser Thr Tyr Pro Gly Leu Leu Gly

290 295 300

Ile Cys Leu Ser Gly Ala Gly Pro Thr Ile Leu Ala Leu Ala Thr Glu

305 310 315 320

Asn Phe Glu Glu Ile Ser Gln Glu Ile Ile Asn Arg Phe Ala Lys Asn

325 330 335

Gly Ile Lys Cys Ser Trp Lys Leu Leu Glu Pro Ala Tyr Asp Gly Ala

340 345 350

Ser Val Glu Gln Gln

355

<210> 6

<211> 1545

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 高丝氨酸激酶 (THR4)

<220>

<223> 高丝氨酸激酶 (THR4)

<400> 6

atgcctaacg cttcccaagt ttacagatct accagatcca gctctccaaa gacaatctct 60

tttgaagagg ctatcattca aggtctggcc actgacggtg gtcttttcat tccaccaact 120

attccacaag tggaccaagc cactcttttc aatgattggt caaagctctc cttccaagac 180

ttagcctttg ctatcatgag actatacatt gcccaagaag agattccaga tgctgatcta 240

aaggacttga tcaagagatc ttattctact ttccgttctg atgaagtcac ccccttggtg 300

caaaacgtca ctggtgacaa ggagaatttg cacattttag aattattcca cggtcctacc 360

tacgctttca aagacgttgc tttacaattt gtcggtaatc tttttgaata cttcttacaa 420

agaaccaacg ccaatttacc tgaaggcgag aaaaagcaaa tcactgtggt cggtgctact 480

tccggtgaca ctggttctgc agccatctac ggtttaagag gcaaaaagga cgtttccgtt 540

ttcatcttat atccaaccgg tagaatttcc ccaattcaag aagaacaaat gaccaccgtt 600

ccagatgaaa acgtccagac tttgtctgtt accggtactt tcgacaactg tcaagatatc 660

gtcaaagcta ttttcggtga caaagaattc aactctaaac acaacgtcgg tgctgttaac 720

tccatcaact gggcaagaat cttggcccaa atgacctatt acttttattc attcttccaa 780

gccaccaacg gtaaggactc caagaaggtc aagttcgttg tgccaagtgg gaacttcggt 840

gatatattgg ccggttattt tgccaagaaa atgggtttgc ctattgaaaa actggccatc 900

gctaccaatg aaaacgacat tttggacaga tttttgaaat ctggtctata cgaaagatca 960

gacaaggttg ctgctacttt atccccagca atggatatct taatctcttc taactttgaa 1020

agactactat ggtacctagc tcgtgaatac ctagctaatg gtgatgattt gaaagccggt 1080

gaaatcgtca acaattggtt ccaggaattg aagaccaacg gtaagttcca agttgacaaa 1140

tccatcattg aaggcgcatc aaaggacttt acatcagaaa gagtttccaa tgaagaaaca 1200

tctgaaacaa tcaagaagat ctacgaatca tctgtaaatc caaaacatta catcttagat 1260

cctcacacag ctgtcggtgt ttgcgccaca gaaagattga ttgcaaaaga taatgacaag 1320

tccatccaat acatttctct atctaccgct cacccagcta aatttgccga tgctgtaaac 1380

aatgcattgt ctggattttc caattattca tttgaaaagg atgttttgcc tgaggaattg 1440

aagaaactat ccacattaaa gaagaaatta aaattcatcg aaagagctga cgttgaattg 1500

gtcaaaaacg ctattgaaga agaacttgct aaaatgaaat tataa 1545

<210> 7

<211> 514

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 高丝氨酸激酶 (THR4)

<220>

<223> 高丝氨酸激酶 (THR4)

<400> 7

Met Pro Asn Ala Ser Gln Val Tyr Arg Ser Thr Arg Ser Ser Ser Pro

1 5 10 15

Lys Thr Ile Ser Phe Glu Glu Ala Ile Ile Gln Gly Leu Ala Thr Asp

20 25 30

Gly Gly Leu Phe Ile Pro Pro Thr Ile Pro Gln Val Asp Gln Ala Thr

35 40 45

Leu Phe Asn Asp Trp Ser Lys Leu Ser Phe Gln Asp Leu Ala Phe Ala

50 55 60

Ile Met Arg Leu Tyr Ile Ala Gln Glu Glu Ile Pro Asp Ala Asp Leu

65 70 75 80

Lys Asp Leu Ile Lys Arg Ser Tyr Ser Thr Phe Arg Ser Asp Glu Val

85 90 95

Thr Pro Leu Val Gln Asn Val Thr Gly Asp Lys Glu Asn Leu His Ile

100 105 110

Leu Glu Leu Phe His Gly Pro Thr Tyr Ala Phe Lys Asp Val Ala Leu

115 120 125

Gln Phe Val Gly Asn Leu Phe Glu Tyr Phe Leu Gln Arg Thr Asn Ala

130 135 140

Asn Leu Pro Glu Gly Glu Lys Lys Gln Ile Thr Val Val Gly Ala Thr

145 150 155 160

Ser Gly Asp Thr Gly Ser Ala Ala Ile Tyr Gly Leu Arg Gly Lys Lys

165 170 175

Asp Val Ser Val Phe Ile Leu Tyr Pro Thr Gly Arg Ile Ser Pro Ile

180 185 190

Gln Glu Glu Gln Met Thr Thr Val Pro Asp Glu Asn Val Gln Thr Leu

195 200 205

Ser Val Thr Gly Thr Phe Asp Asn Cys Gln Asp Ile Val Lys Ala Ile

210 215 220

Phe Gly Asp Lys Glu Phe Asn Ser Lys His Asn Val Gly Ala Val Asn

225 230 235 240

Ser Ile Asn Trp Ala Arg Ile Leu Ala Gln Met Thr Tyr Tyr Phe Tyr

245 250 255

Ser Phe Phe Gln Ala Thr Asn Gly Lys Asp Ser Lys Lys Val Lys Phe

260 265 270

Val Val Pro Ser Gly Asn Phe Gly Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Phe Ala

275 280 285

Lys Lys Met Gly Leu Pro Ile Glu Lys Leu Ala Ile Ala Thr Asn Glu

290 295 300

Asn Asp Ile Leu Asp Arg Phe Leu Lys Ser Gly Leu Tyr Glu Arg Ser

305 310 315 320

Asp Lys Val Ala Ala Thr Leu Ser Pro Ala Met Asp Ile Leu Ile Ser

325 330 335

Ser Asn Phe Glu Arg Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Arg Glu Tyr Leu Ala

340 345 350

Asn Gly Asp Asp Leu Lys Ala Gly Glu Ile Val Asn Asn Trp Phe Gln

355 360 365

Glu Leu Lys Thr Asn Gly Lys Phe Gln Val Asp Lys Ser Ile Ile Glu

370 375 380

Gly Ala Ser Lys Asp Phe Thr Ser Glu Arg Val Ser Asn Glu Glu Thr

385 390 395 400

Ser Glu Thr Ile Lys Lys Ile Tyr Glu Ser Ser Val Asn Pro Lys His

405 410 415

Tyr Ile Leu Asp Pro His Thr Ala Val Gly Val Cys Ala Thr Glu Arg

420 425 430

Leu Ile Ala Lys Asp Asn Asp Lys Ser Ile Gln Tyr Ile Ser Leu Ser

435 440 445

Thr Ala His Pro Ala Lys Phe Ala Asp Ala Val Asn Asn Ala Leu Ser

450 455 460

Gly Phe Ser Asn Tyr Ser Phe Glu Lys Asp Val Leu Pro Glu Glu Leu

465 470 475 480

Lys Lys Leu Ser Thr Leu Lys Lys Lys Leu Lys Phe Ile Glu Arg Ala

485 490 495

Asp Val Glu Leu Val Lys Asn Ala Ile Glu Glu Glu Leu Ala Lys Met

500 505 510

Lys Leu

<210> 8

<211> 1583

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (HOM3)

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (HOM3)

<400> 8

atgccaatgg atttccaacc tacatcaagt cattcgaact gggtcgtgca aaagttcggt 60

ggtacatctg tcggtaaatt tcccgtccaa atagtggatg acattgtgaa gcactattct 120

aaacctgacg gcccaaacaa taatgtcgct gtcgtttgtt ccgcccgttc ttcatacacc 180

aaggctgaag gtaccacttc tcgtcttttg aaatgttgtg atttggcttc gcaagaatct 240

gaatttcaag acattatcga agttatcaga caagaccata tcgataatgc cgaccgcttc 300

attctcaatc ctgccttgca agccaagtta gtggatgata ccaataaaga acttgaactg 360

gtcaagaaat atttaaatgc ttcaaaagtt ttgggtgaag tgagttcacg tacagtagat 420

ctggtgatgt catgtggtga gaagttgagt tgtttgttca tgactgcttt atgtaatgac 480

cgtggctgta aggccaaata tgtggatttg agccacattg ttccctctga tttcagtgcc 540

agcgctttgg ataacagttt ctacactttc ctggttcaag cattgaaaga aaaattggcc 600

ccctttgtaa gtgctaaaga gcgtatcgtt ccagtcttta cagggttttt tggtttagtt 660

ccaactggtc ttctgaatgg tgttggtcgt ggctataccg atttatgtgc cgctttgata 720

gcagttgctg taaatgctga tgaactacaa gtttggaagg aagttgatgg tatatttact 780

gctgatcctc gtaaggttcc tgaagcacgt ttgctagaca gtgttactcc agaagaagct 840

tctgaattaa catattatgg ttccgaagtt atacatcctt ttacgatgga acaagttatt 900

agggctaaga ttcctattag aatcaagaat gttcaaaatc cattaggtaa cggtaccatt 960

atctacccag ataatgtagc aaagaagggt gaatctactc caccacatcc tcctgagaac 1020

ttatcctcat ctttctatga aaagagaaag agaggtgcca ctgctatcac caccaaaaat 1080

gacattttcg tcatcaacat tcattccaat aagaaaaccc tatcccatgg tttcctagct 1140

caaatattta ccatcctgga taagtacaag ttagtcgtag atttaatatc tacttctgaa 1200

gttcatgttt cgatggcttt gcccattcca gatgcagact cattaaaatc tctgagacaa 1260

gctgaggaaa aattgagaat tttaggttct gttgatatca caaagaagtt gtctattgtt 1320

tcattagttg gtaaacatat gaaacaatac atcggcattg ctggtaccat gtttactact 1380

cttgctgaag aaggcatcaa cattgaaatg atttctcaag gggcaaatga aataaacata 1440

tcctgcgtta tcaatgaatc tgactccata aaagcgctac aatgtattca tgccaagtta 1500

ctaagtgagc ggacaaatac ttcaaaccaa tttgaacatg ccattgatga acgtttagaa 1560

caattgaaaa gacttggaat taa 1583

<210> 9

<211> 526

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (HOM3)

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (HOM3)

<400> 9

Pro Met Asp Phe Gln Pro Thr Ser Ser His Ser Asn Trp Val Val Gln

1 5 10 15

Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Gly Lys Phe Pro Val Gln Ile Val Asp

20 25 30

Asp Ile Val Lys His Tyr Ser Lys Pro Asp Gly Pro Asn Asn Asn Val

35 40 45

Ala Val Val Cys Ser Ala Arg Ser Ser Tyr Thr Lys Ala Glu Gly Thr

50 55 60

Thr Ser Arg Leu Leu Lys Cys Cys Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ser Glu

65 70 75 80

Phe Gln Asp Ile Ile Glu Val Ile Arg Gln Asp His Ile Asp Asn Ala

85 90 95

Asp Arg Phe Ile Leu Asn Pro Ala Leu Gln Ala Lys Leu Val Asp Asp

100 105 110

Thr Asn Lys Glu Leu Glu Leu Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ala Ser Lys

115 120 125

Val Leu Gly Glu Val Ser Ser Arg Thr Val Asp Leu Val Met Ser Cys

130 135 140

Gly Glu Lys Leu Ser Cys Leu Phe Met Thr Ala Leu Cys Asn Asp Arg

145 150 155 160

Gly Cys Lys Ala Lys Tyr Val Asp Leu Ser His Ile Val Pro Ser Asp

165 170 175

Phe Ser Ala Ser Ala Leu Asp Asn Ser Phe Tyr Thr Phe Leu Val Gln

180 185 190

Ala Leu Lys Glu Lys Leu Ala Pro Phe Val Ser Ala Lys Glu Arg Ile

195 200 205

Val Pro Val Phe Thr Gly Phe Phe Gly Leu Val Pro Thr Gly Leu Leu

210 215 220

Asn Gly Val Gly Arg Gly Tyr Thr Asp Leu Cys Ala Ala Leu Ile Ala

225 230 235 240

Val Ala Val Asn Ala Asp Glu Leu Gln Val Trp Lys Glu Val Asp Gly

245 250 255

Ile Phe Thr Ala Asp Pro Arg Lys Val Pro Glu Ala Arg Leu Leu Asp

260 265 270

Ser Val Thr Pro Glu Glu Ala Ser Glu Leu Thr Tyr Tyr Gly Ser Glu

275 280 285

Val Ile His Pro Phe Thr Met Glu Gln Val Ile Arg Ala Lys Ile Pro

290 295 300

Ile Arg Ile Lys Asn Val Gln Asn Pro Leu Gly Asn Gly Thr Ile Ile

305 310 315 320

Tyr Pro Asp Asn Val Ala Lys Lys Gly Glu Ser Thr Pro Pro His Pro

325 330 335

Pro Glu Asn Leu Ser Ser Ser Phe Tyr Glu Lys Arg Lys Arg Gly Ala

340 345 350

Thr Ala Ile Thr Thr Lys Asn Asp Ile Phe Val Ile Asn Ile His Ser

355 360 365

Asn Lys Lys Thr Leu Ser His Gly Phe Leu Ala Gln Ile Phe Thr Ile

370 375 380

Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Val Val Asp Leu Ile Ser Thr Ser Glu Val

385 390 395 400

His Val Ser Met Ala Leu Pro Ile Pro Asp Ala Asp Ser Leu Lys Ser

405 410 415

Leu Arg Gln Ala Glu Glu Lys Leu Arg Ile Leu Gly Ser Val Asp Ile

420 425 430

Thr Lys Lys Leu Ser Ile Val Ser Leu Val Gly Lys His Met Lys Gln

435 440 445

Tyr Ile Gly Ile Ala Gly Thr Met Phe Thr Thr Leu Ala Glu Glu Gly

450 455 460

Ile Asn Ile Glu Met Ile Ser Gln Gly Ala Asn Glu Ile Asn Ile Ser

465 470 475 480

Cys Val Ile Asn Glu Ser Asp Ser Ile Lys Ala Leu Gln Cys Ile His

485 490 495

Ala Lys Leu Leu Ser Glu Arg Thr Asn Thr Ser Asn Gln Phe Glu His

500 505 510

Ala Ile Asp Glu Arg Leu Glu Gln Leu Lys Arg Leu Gly Ile

515 520 525

<210> 10

<211> 1215

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (AK)

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (AK)

<400> 10

atggctatta tcgtccaaaa attcggagga actagcgtta aggatgacaa agggagaaag 60

ttggccttag ggcacattaa ggaggcaatt tcagagggtt ataaggtggt tgtagttgta 120

tcggctatgg gtagaaaagg ggacccctac gcgacggact cactattggg tttactttac 180

ggggatcaat cagcaatcag cccaagagag caggatctgc tgctatcatg tggagaaacc 240

atatcctcgg ttgtgttcac cagcatgtta ttagataatg gagtaaaagc agcagccctg 300

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acttataccg aaatctgcaa cttggcttac caaggtgcta aggtaatatc tccaagagct 660

gtggaaattg ctatgcaagc aaaggttcct atccgtgtta ggagtactta ttcaaacgat 720

aaaggtacgt tagtaactag tcatcatagt tccaaagttg gctctgacgt ctttgaaagg 780

ttaatcactg gtatcgcaca tgttaaagac gtcactcaat tcaaggtccc ggcgaaaata 840

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aaggtgtctg ccgtgggtgc tggcattatg ggtgtcccag gtgtgacatc gaaaattgtt 1080

tctgccttat ctgaaaaaga aattccgatt ttgcaatctg ctgattccca tacaacaatt 1140

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gaattgtcca aataa 1215

<210> 11

<211> 404

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (AK)

<220>

<223> 天冬氨酸激酶 (AK)

<400> 11

Met Ala Ile Ile Val Gln Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Lys Asp Asp

1 5 10 15

Lys Gly Arg Lys Leu Ala Leu Gly His Ile Lys Glu Ala Ile Ser Glu

20 25 30

Gly Tyr Lys Val Val Val Val Val Ser Ala Met Gly Arg Lys Gly Asp

35 40 45

Pro Tyr Ala Thr Asp Ser Leu Leu Gly Leu Leu Tyr Gly Asp Gln Ser

50 55 60

Ala Ile Ser Pro Arg Glu Gln Asp Leu Leu Leu Ser Cys Gly Glu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Val Phe Thr Ser Met Leu Leu Asp Asn Gly Val Lys

85 90 95

Ala Ala Ala Leu Thr Gly Ala Gln Ala Gly Phe Leu Thr Asn Asp Gln

100 105 110

His Thr Asn Ala Lys Ile Ile Glu Met Lys Pro Glu Arg Leu Phe Ser

115 120 125

Val Leu Ala Asn His Asp Ala Val Val Val Ala Gly Phe Gln Gly Ala

130 135 140

Thr Glu Lys Gly Asp Thr Thr Thr Ile Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr

145 150 155 160

Ser Ala Ala Ala Leu Gly Ala Ala Val Asp Ala Glu Tyr Ile Asp Ile

165 170 175

Phe Thr Asp Val Glu Gly Val Met Thr Ala Asp Pro Arg Val Val Glu

180 185 190

Asn Ala Lys Pro Leu Pro Val Val Thr Tyr Thr Glu Ile Cys Asn Leu

195 200 205

Ala Tyr Gln Gly Ala Lys Val Ile Ser Pro Arg Ala Val Glu Ile Ala

210 215 220

Met Gln Ala Lys Val Pro Ile Arg Val Arg Ser Thr Tyr Ser Asn Asp

225 230 235 240

Lys Gly Thr Leu Val Thr Ser His His Ser Ser Lys Val Gly Ser Asp

245 250 255

Val Phe Glu Arg Leu Ile Thr Gly Ile Ala His Val Lys Asp Val Thr

260 265 270

Gln Phe Lys Val Pro Ala Lys Ile Gly Gln Tyr Asn Val Gln Thr Glu

275 280 285

Val Phe Lys Ala Met Ala Asn Ala Gly Ile Ser Val Asp Phe Phe Asn

290 295 300

Ile Thr Pro Ser Glu Ile Val Tyr Thr Val Ala Gly Asn Lys Thr Glu

305 310 315 320

Thr Ala Gln Arg Ile Leu Met Asp Met Gly Tyr Asp Pro Met Val Thr

325 330 335

Arg Asn Cys Ala Lys Val Ser Ala Val Gly Ala Gly Ile Met Gly Val

340 345 350

Pro Gly Val Thr Ser Lys Ile Val Ser Ala Leu Ser Glu Lys Glu Ile

355 360 365

Pro Ile Leu Gln Ser Ala Asp Ser His Thr Thr Ile Trp Val Leu Val

370 375 380

His Glu Ala Asp Met Val Pro Ala Val Asn Ala Leu His Glu Val Phe

385 390 395 400

Glu Leu Ser Lys

<210> 12

<211> 1257

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 天冬氨酸转氨酶 (AAT2)

<220>

<223> 天冬氨酸转氨酶 (AAT2)

<400> 12

atgtctgcca ctctgttcaa taacatcgaa ttgctgcccc ctgatgccct ttttggtatt 60

aagcaaaggt acgggcaaga tcaacgtgct accaaggtcg acttgggtat cggggcctac 120

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cataacgaca gctcctacaa ccatgaatac ctcggtatta ccggtctgcc aagtttgaca 240

tctaacgccg ccaagatcat cttcggtacg caatccgatg cctttcagga agacagagta 300

atctcagtac aatcactgtc tggtacgggt gctcttcata tatctgcgaa gtttttttca 360

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atttttgaga atcaaggctt gaaaacggcg acttaccctt actgggccaa cgaaactaag 480

tctttggacc taaacggctt tctaaatgct attcaaaaag ctccagaggg ctccattttc 540

gttctgcact cttgcgccca taacccaact ggtctggacc ctactagtga acaatgggtt 600

caaatcgttg atgctatcgc ctcaaagaac cacatcgcct tatttgacac cgcctaccaa 660

gggtttgcca ctggagattt ggacaaggat gcctatgctg tgcgtctagg tgtggagaag 720

ctttcaacgg tctctcccgt ctttgtctgt cagtcctttg ccaagaacgc cggtatgtac 780

ggtgagcgtg taggttgttt ccatctagca cttacaaaac aagctcaaaa caaaactata 840

aagcctgctg ttacatctca attggccaaa atcattcgta gtgaagtgtc caacccaccc 900

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cacaaggata tggttaccat gtcctccaga attacgaaaa tgaggcacgc attaagagac 1020

catttagtca agttgggcac tcctggcaac tgggatcata tagtaaatca atgcgggatg 1080

ttctccttta cagggttgac tcctcaaatg gttaaacgac ttgaagaaac ccacgcagtt 1140

tacttggttg cctcaggtag agcttctatt gctggattga atcaaggaaa cgtggaatac 1200

gtggctaaag ccattgatga agtggtgcgc ttctatacta ttgaagctaa attgtaa 1257

<210> 13

<211> 418

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 天冬氨酸转氨酶 (AAT2)

<220>

<223> 天冬氨酸转氨酶 (AAT2)

<400> 13

Met Ser Ala Thr Leu Phe Asn Asn Ile Glu Leu Leu Pro Pro Asp Ala

1 5 10 15

Leu Phe Gly Ile Lys Gln Arg Tyr Gly Gln Asp Gln Arg Ala Thr Lys

20 25 30

Val Asp Leu Gly Ile Gly Ala Tyr Arg Asp Asp Asn Gly Lys Pro Trp

35 40 45

Val Leu Pro Ser Val Lys Ala Ala Glu Lys Leu Ile His Asn Asp Ser

50 55 60

Ser Tyr Asn His Glu Tyr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Pro Ser Leu Thr

65 70 75 80

Ser Asn Ala Ala Lys Ile Ile Phe Gly Thr Gln Ser Asp Ala Phe Gln

85 90 95

Glu Asp Arg Val Ile Ser Val Gln Ser Leu Ser Gly Thr Gly Ala Leu

100 105 110

His Ile Ser Ala Lys Phe Phe Ser Lys Phe Phe Pro Asp Lys Leu Val

115 120 125

Tyr Leu Ser Lys Pro Thr Trp Ala Asn His Met Ala Ile Phe Glu Asn

130 135 140

Gln Gly Leu Lys Thr Ala Thr Tyr Pro Tyr Trp Ala Asn Glu Thr Lys

145 150 155 160

Ser Leu Asp Leu Asn Gly Phe Leu Asn Ala Ile Gln Lys Ala Pro Glu

165 170 175

Gly Ser Ile Phe Val Leu His Ser Cys Ala His Asn Pro Thr Gly Leu

180 185 190

Asp Pro Thr Ser Glu Gln Trp Val Gln Ile Val Asp Ala Ile Ala Ser

195 200 205

Lys Asn His Ile Ala Leu Phe Asp Thr Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Thr

210 215 220

Gly Asp Leu Asp Lys Asp Ala Tyr Ala Val Arg Leu Gly Val Glu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Thr Val Ser Pro Val Phe Val Cys Gln Ser Phe Ala Lys Asn

245 250 255

Ala Gly Met Tyr Gly Glu Arg Val Gly Cys Phe His Leu Ala Leu Thr

260 265 270

Lys Gln Ala Gln Asn Lys Thr Ile Lys Pro Ala Val Thr Ser Gln Leu

275 280 285

Ala Lys Ile Ile Arg Ser Glu Val Ser Asn Pro Pro Ala Tyr Gly Ala

290 295 300

Lys Ile Val Ala Lys Leu Leu Glu Thr Pro Glu Leu Thr Glu Gln Trp

305 310 315 320

His Lys Asp Met Val Thr Met Ser Ser Arg Ile Thr Lys Met Arg His

325 330 335

Ala Leu Arg Asp His Leu Val Lys Leu Gly Thr Pro Gly Asn Trp Asp

340 345 350

His Ile Val Asn Gln Cys Gly Met Phe Ser Phe Thr Gly Leu Thr Pro

355 360 365

Gln Met Val Lys Arg Leu Glu Glu Thr His Ala Val Tyr Leu Val Ala

370 375 380

Ser Gly Arg Ala Ser Ile Ala Gly Leu Asn Gln Gly Asn Val Glu Tyr

385 390 395 400

Val Ala Lys Ala Ile Asp Glu Val Val Arg Phe Tyr Thr Ile Glu Ala

405 410 415

Lys Leu

<210> 14

<211> 1317

<212> DNA

<213> 尖尾内旋纤毛虫（Entodinium caudatum）

<220>

<223> 谷氨酸脱氢酶 (GDH)

<220>

<223> 谷氨酸脱氢酶 (GDH)

<400> 14

atgatagatt tagaagcgag aaaccctgct caacccgaat tcattcaagc cagtagagaa 60

gtaatcgaat cgatcattga tgttgttaat agcaatccga aatacctgga aaacaaaatt 120

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tataagggag gcctaaggtt tcacagagca gtcactctag gtactctgaa attccttggt 300

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tcagattttg atcctagagg taaatcagat gccgagattt taagattctg taggtctttt 420

atgacttcgt tgttcaaata tattgggcca gagatagatg ttcctgctgg agatataggt 480

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gaaggagttc taactggtaa gggtcttaac tggggtggct ctcttgttag acctgaagcc 600

acaggttttg gaacgatgta ttttgctaac gaagtcttac atgcacatgg tgacgacatc 660

aaggggaaaa ccattgccat atccggattt ggtaatgttg cctttggtgc tgtcttaaaa 720

gcgaaacaat taggcgctaa ggtagtcact atatctggcc cagatggtta catttatgac 780

gagaatggga taaacaccga cgagaaaatc aactacatgt tggaattaag agcctcaaat 840

aatgatgtgg ttgcgccatt tgcagagaag tttggtgcaa aattcatacc agggaagaag 900

ccatgggaag ttccagtgga tatggctttt ccctgtgcca ttcagaacga attgaatgcc 960

gaagatgctg ccactttaca taagaatgga gtgaaatatg tgatcgagac atccaatatg 1020

ggctgtacag cagatgctgt gcaatacttc attaagaacc gtattgtttt cgctccgggt 1080

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gcaaatatag caggcttcaa gaaagtagct gatgcaatgg tagatcttgg ctattaa 1317

<210> 15

<211> 438

<212> PRT

<213> 尖尾内旋纤毛虫（Entodinium caudatum）

<220>

<223> 谷氨酸脱氢酶 (GDH)

<220>

<223> 谷氨酸脱氢酶 (GDH)

<400> 15

Met Ile Asp Leu Glu Ala Arg Asn Pro Ala Gln Pro Glu Phe Ile Gln

1 5 10 15

Ala Ser Arg Glu Val Ile Glu Ser Ile Ile Asp Val Val Asn Ser Asn

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Pro Lys Tyr Leu Glu Asn Lys Ile Leu Glu Arg Ile Thr Glu Pro Asn

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Leu Ile His Glu Phe Lys Val Glu Trp Glu Asn Asp Lys His Glu Ile

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Met Val Asn Lys Gly Tyr Arg Ile Gln Phe Asn Asn Ala Ile Gly Pro

65 70 75 80

Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Arg Ala Val Thr Leu Gly Thr Leu

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Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Gly Leu

100 105 110

Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Arg Gly Lys

115 120 125

Ser Asp Ala Glu Ile Leu Arg Phe Cys Arg Ser Phe Met Thr Ser Leu

130 135 140

Phe Lys Tyr Ile Gly Pro Glu Ile Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly

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Val Gly Gly Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu

165 170 175

Thr Gln Gln His Glu Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly Leu Asn Trp Gly

180 185 190

Gly Ser Leu Val Arg Pro Glu Ala Thr Gly Phe Gly Thr Met Tyr Phe

195 200 205

Ala Asn Glu Val Leu His Ala His Gly Asp Asp Ile Lys Gly Lys Thr

210 215 220

Ile Ala Ile Ser Gly Phe Gly Asn Val Ala Phe Gly Ala Val Leu Lys

225 230 235 240

Ala Lys Gln Leu Gly Ala Lys Val Val Thr Ile Ser Gly Pro Asp Gly

245 250 255

Tyr Ile Tyr Asp Glu Asn Gly Ile Asn Thr Asp Glu Lys Ile Asn Tyr

260 265 270

Met Leu Glu Leu Arg Ala Ser Asn Asn Asp Val Val Ala Pro Phe Ala

275 280 285

Glu Lys Phe Gly Ala Lys Phe Ile Pro Gly Lys Lys Pro Trp Glu Val

290 295 300

Pro Val Asp Met Ala Phe Pro Cys Ala Ile Gln Asn Glu Leu Asn Ala

305 310 315 320

Glu Asp Ala Ala Thr Leu His Lys Asn Gly Val Lys Tyr Val Ile Glu

325 330 335

Thr Ser Asn Met Gly Cys Thr Ala Asp Ala Val Gln Tyr Phe Ile Lys

340 345 350

Asn Arg Ile Val Phe Ala Pro Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val

355 360 365

Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln Asn Ser Met Lys Leu Asn Trp

370 375 380

Thr Ala Glu Glu Val Asp Ala Lys Leu Lys Asn Ile Met Thr Asn Ile

385 390 395 400

His Ala Ser Cys Val Lys Glu Gly Lys Glu Ser Asp Gly Tyr Ile Asn

405 410 415

Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Lys Lys Val Ala Asp Ala

420 425 430

Met Val Asp Leu Gly Tyr

435

<210> 16

<211> 1080

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 高丝氨酸脱氢酶 (HOM6)

<220>

<223> 高丝氨酸脱氢酶 (HOM6)

<400> 16

atgagcacta aagttgttaa tgttgccgtt atcggtgccg gtgttgttgg ttcagctttc 60

ttggatcaat tgttagccat gaagtctacc attacttaca atctagttct tttggctgaa 120

gctgagcgtt ctttaatctc caaggacttt tctccattaa atgttggttc tgattggaag 180

gctgctttag cagcctccac tactaaaacg ttgcctttgg atgatttaat tgctcatttg 240

aagacttcac ctaagccagt cattttggtt gataacactt ccagcgctta cattgctggt 300

ttttacacta agtttgtcga aaatggtatt tccattgcta ctccaaacaa gaaggccttt 360

tcctctgatt tggctacctg gaaggctctt ttctcaaata agccaactaa cggttttgtc 420

tatcatgaag ctaccgtcgg tgctggtttg cctatcatca gtttcttaag agaaattatt 480

caaaccggtg acgaagttga aaaaattgaa ggtatcttct ctggtactct atcttatatt 540

ttcaacgagt tctccactag tcaagctaac gacgtcaaat tctctgatgt tgtcaaagtt 600

gctaaaaaat tgggttatac tgaaccagat ccaagagatg atttgaatgg gttggatgtt 660

gctagaaagg ttaccattgt tggtaggata tctggtgtgg aagttgaatc tccaacttcc 720

ttccctgtcc agtctttgat tccaaaacca ttggaatctg tcaagtctgc tgatgaattc 780

ttggaaaaat tatctgatta cgataaagat ttgactcaat tgaagaagga agctgccact 840

gaaaataagg tattgagatt cattggtaaa gtcgatgttg ccaccaaatc tgtgtctgta 900

ggaattgaaa agtacgatta ctcacaccca ttcgcatcat tgaagggatc agataacgtt 960

atttccatca agactaagcg ttacaccaat cctgttgtca ttcaaggtgc cggtgccggt 1020

gctgccgtta ctgccgctgg tgttttgggt gatgttatca agattgctca aagactttaa 1080

<210> 17

<211> 308

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 高丝氨酸脱氢酶 (HOM6)

<220>

<223> 高丝氨酸脱氢酶 (HOM6)

<400> 17

Met Ser Thr Lys Val Val Asn Val Ala Val Ile Gly Ala Gly Val Val

1 5 10 15

Gly Ser Ala Phe Leu Asp Gln Leu Leu Ala Met Lys Ser Thr Ile Thr

20 25 30

Tyr Asn Leu Val Leu Leu Ala Glu Ala Glu Arg Ser Leu Ile Ser Lys

35 40 45

Asp Phe Ser Pro Leu Asn Val Gly Ser Asp Trp Lys Ala Ala Leu Ala

50 55 60

Ala Ser Thr Thr Lys Thr Leu Pro Leu Asp Asp Leu Ile Ala His Leu

65 70 75 80

Lys Thr Ser Pro Lys Pro Val Ile Leu Val Asp Asn Thr Ser Ser Ala

85 90 95

Tyr Ile Ala Gly Phe Tyr Thr Lys Phe Val Glu Asn Gly Ile Ser Ile

100 105 110

Ala Thr Pro Asn Lys Lys Ala Phe Ser Ser Asp Leu Ala Thr Trp Lys

115 120 125

Ala Leu Phe Ser Asn Lys Pro Thr Asn Gly Phe Val Tyr His Glu Ala

130 135 140

Thr Val Gly Ala Gly Leu Pro Ile Ile Ser Phe Leu Arg Glu Ile Ile

145 150 155 160

Gln Thr Gly Asp Glu Val Glu Lys Ile Glu Gly Ile Phe Ser Gly Thr

165 170 175

Leu Ser Tyr Ile Phe Asn Glu Phe Ser Thr Ser Gln Ala Asn Asp Val

180 185 190

Lys Phe Ser Asp Val Val Lys Val Ala Lys Lys Leu Gly Tyr Thr Glu

195 200 205

Pro Asp Pro Arg Asp Asp Leu Asn Gly Leu Asp Val Ala Arg Lys Val

210 215 220

Thr Ile Val Gly Arg Ile Ser Gly Val Glu Val Glu Ser Pro Thr Ser

225 230 235 240

Phe Pro Val Gln Ser Leu Ile Pro Lys Pro Leu Glu Ser Val Lys Ser

245 250 255

Ala Asp Glu Phe Leu Glu Lys Leu Ser Asp Tyr Asp Lys Asp Leu Thr

260 265 270

Gln Leu Lys Lys Glu Ala Ala Thr Glu Asn Lys Val Leu Arg Phe Ile

275 280 285

Gly Lys Val Asp Val Ala Thr Lys Ser Val Ser Val Gly Ile Glu Lys

290 295 300

Tyr Asp Tyr Ser

305

<210> 18

<211> 1461

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 高丝氨酸-O-乙酰基转移酶 (MET2)

<220>

<223> 高丝氨酸-O-乙酰基转移酶 (MET2)

<400> 18

atgtcgcata ctttaaaatc gaaaacgctc caagagctgg acattgagga gattaaggaa 60

actaacccat tgctcaaact agttcaaggg cagaggattg ttcaagttcc ggaactagtg 120

cttgagtctg gcgtggtcat aaataatttc cctattgctt ataagacgtg gggtacactg 180

aatgaagctg gtgataatgt tctggtaatt tgtcatgcct tgactgggtc cgcagatgtt 240

gctgactggt ggggccctct tctgggtaac gacttagcat tcgacccatc aaggtttttt 300

atcatatgtt taaactctat gggctctcca tatgggtctt tttcgccatt aacgataaat 360

gaggagacgg gcgttagata tggacccgaa ttcccattat gtactgtgcg cgatgacgtt 420

agagctcaca gaattgttct ggattctctg ggagtaaagt caatagcctg tgttattggt 480

ggctctatgg gggggatgct gagtttggaa tgggctgcca tgtatggtaa ggaatatgtg 540

aagaatatgg ttgctctggc gacatcagca agacattctg cctggtgcat atcgtggtct 600

gaggctcaaa gacaatcgat ttactcagat cccaactact tggacgggta ctatccggta 660

gaggagcaac ctgtggccgg actatcggct gcacgtatgt ctgcattgtt gacgtacagg 720

acaagaaaca gtttcgagaa caaattctcc agaagatctc cttcaatagc acaacaacaa 780

aaagctcaaa gggaggagac acgcaaacca tctactgtca gcgaacactc cctacaaatc 840

cacaatgatg ggtataaaac aaaagccagc actgccatcg ctggcatttc tgggcaaaaa 900

ggtcaaagcg tggtgtccac cgcatcttct tcggattcat tgaattcttc aacatcgatg 960

acttcggtaa gttctgtaac gggtgaagtg aaggacataa agcctgcgca gacgtatttt 1020

tctgcacaaa gttacttgag gtaccagggc acaaagttca tcaataggtt cgacgccaat 1080

tgttacattg ccatcacacg taaactggat acgcacgatt tggcaagaga cagagtagat 1140

gacatcactg aggtcctttc taccatccaa caaccatccc tgatcatcgg tatccaatct 1200

gatggactgt tcacatattc agaacaagaa tttttggctg agcacatacc gaagtcgcaa 1260

ttagaaaaaa ttgaatctcc cgaaggccac gatgccttcc tattggagtt taagctgata 1320

aacaaactga tagtacaatt tttaaaaacc aactgcaagg ccattaccga tgccgctcca 1380

agagcttggg gaggtgacgt tggtaacgat gaaacgaaga cgtctgtctt tggtgaggcc 1440

gaagaagtta ccaactggta g 1461

<210> 19

<211> 486

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 高丝氨酸-O-乙酰基转移酶 (MET2)

<220>

<223> 高丝氨酸-O-乙酰基转移酶 (MET2)

<400> 19

Met Ser His Thr Leu Lys Ser Lys Thr Leu Gln Glu Leu Asp Ile Glu

1 5 10 15

Glu Ile Lys Glu Thr Asn Pro Leu Leu Lys Leu Val Gln Gly Gln Arg

20 25 30

Ile Val Gln Val Pro Glu Leu Val Leu Glu Ser Gly Val Val Ile Asn

35 40 45

Asn Phe Pro Ile Ala Tyr Lys Thr Trp Gly Thr Leu Asn Glu Ala Gly

50 55 60

Asp Asn Val Leu Val Ile Cys His Ala Leu Thr Gly Ser Ala Asp Val

65 70 75 80

Ala Asp Trp Trp Gly Pro Leu Leu Gly Asn Asp Leu Ala Phe Asp Pro

85 90 95

Ser Arg Phe Phe Ile Ile Cys Leu Asn Ser Met Gly Ser Pro Tyr Gly

100 105 110

Ser Phe Ser Pro Leu Thr Ile Asn Glu Glu Thr Gly Val Arg Tyr Gly

115 120 125

Pro Glu Phe Pro Leu Cys Thr Val Arg Asp Asp Val Arg Ala His Arg

130 135 140

Ile Val Leu Asp Ser Leu Gly Val Lys Ser Ile Ala Cys Val Ile Gly

145 150 155 160

Gly Ser Met Gly Gly Met Leu Ser Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Gly

165 170 175

Lys Glu Tyr Val Lys Asn Met Val Ala Leu Ala Thr Ser Ala Arg His

180 185 190

Ser Ala Trp Cys Ile Ser Trp Ser Glu Ala Gln Arg Gln Ser Ile Tyr

195 200 205

Ser Asp Pro Asn Tyr Leu Asp Gly Tyr Tyr Pro Val Glu Glu Gln Pro

210 215 220

Val Ala Gly Leu Ser Ala Ala Arg Met Ser Ala Leu Leu Thr Tyr Arg

225 230 235 240

Thr Arg Asn Ser Phe Glu Asn Lys Phe Ser Arg Arg Ser Pro Ser Ile

245 250 255

Ala Gln Gln Gln Lys Ala Gln Arg Glu Glu Thr Arg Lys Pro Ser Thr

260 265 270

Val Ser Glu His Ser Leu Gln Ile His Asn Asp Gly Tyr Lys Thr Lys

275 280 285

Ala Ser Thr Ala Ile Ala Gly Ile Ser Gly Gln Lys Gly Gln Ser Val

290 295 300

Val Ser Thr Ala Ser Ser Ser Asp Ser Leu Asn Ser Ser Thr Ser Met

305 310 315 320

Thr Ser Val Ser Ser Val Thr Gly Glu Val Lys Asp Ile Lys Pro Ala

325 330 335

Gln Thr Tyr Phe Ser Ala Gln Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Gly Thr Lys

340 345 350

Phe Ile Asn Arg Phe Asp Ala Asn Cys Tyr Ile Ala Ile Thr Arg Lys

355 360 365

Leu Asp Thr His Asp Leu Ala Arg Asp Arg Val Asp Asp Ile Thr Glu

370 375 380

Val Leu Ser Thr Ile Gln Gln Pro Ser Leu Ile Ile Gly Ile Gln Ser

385 390 395 400

Asp Gly Leu Phe Thr Tyr Ser Glu Gln Glu Phe Leu Ala Glu His Ile

405 410 415

Pro Lys Ser Gln Leu Glu Lys Ile Glu Ser Pro Glu Gly His Asp Ala

420 425 430

Phe Leu Leu Glu Phe Lys Leu Ile Asn Lys Leu Ile Val Gln Phe Leu

435 440 445

Lys Thr Asn Cys Lys Ala Ile Thr Asp Ala Ala Pro Arg Ala Trp Gly

450 455 460

Gly Asp Val Gly Asn Asp Glu Thr Lys Thr Ser Val Phe Gly Glu Ala

465 470 475 480

Glu Glu Val Thr Asn Trp

485

<210> 20

<211> 1335

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 高半胱氨酸/半胱氨酸合酶 (MET17)

<220>

<223> 高半胱氨酸/半胱氨酸合酶 (MET17)

<400> 20

atgccatctc atttcgatac tgttcaacta cacgccggcc aagagaaccc tggtgacaat 60

gctcacagat ccagagctgt accaatttac gccaccactt cttatgtttt cgaaaactct 120

aagcatggtt cgcaattgtt tggtctagaa gttccaggtt acgtctattc ccgtttccaa 180

aacccaacca gtaatgtttt ggaagaaaga attgctgctt tagaaggtgg tgctgctgct 240

ttggctgttt cctccggtca agccgctcaa acccttgcca tccaaggttt ggcacacact 300

ggtgacaaca tcgtttccac ttcttactta tacggtggta cttataacca gttcaaaatc 360

tcgttcaaaa gatttggtat cgaggctaga tttgttgaag gtgacaatcc agaagaattc 420

gaaaaggtct ttgatgaaag aaccaaggct gtttatttgg aaaccattgg taatccaaag 480

tacaatgttc cggattttga aaaaattgtt gcaattgctc acaaacacgg tattccagtt 540

gtcgttgaca acacatttgg tgccggtggt tacttctgtc agccaattaa atacggtgct 600

gatattgtaa cacattctgc taccaaatgg attggtggtc atggtactac tatcggtggt 660

attattgttg actctggtaa gttcccatgg aaggactacc cagaaaagtt ccctcaattc 720

tctcaacctg ccgaaggata tcacggtact atctacaatg aagcctacgg taacttggca 780

tacatcgttc atgttagaac tgaactatta agagatttgg gtccattgat gaacccattt 840

gcctctttct tgctactaca aggtgttgaa acattatctt tgagagctga aagacacggt 900

gaaaatgcat tgaagttagc caaatggtta gaacaatccc catacgtatc ttgggtttca 960

taccctggtt tagcatctca ttctcatcat gaaaatgcta agaagtatct atctaacggt 1020

ttcggtggtg tcttatcttt cggtgtaaaa gacttaccaa atgccgacaa ggaaactgac 1080

ccattcaaac tttctggtgc tcaagttgtt gacaatttaa agcttgcctc taacttggcc 1140

aatgttggtg atgccaagac cttagtcatt gctccatact tcactaccca caaacaatta 1200

aatgacaaag aaaagttggc atctggtgtt accaaggact taattcgtgt ctctgttggt 1260

atcgaattta ttgatgacat tattgcagac ttccagcaat cttttgaaac tgttttcgct 1320

ggccaaaaac catga 1335

<210> 21

<211> 444

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> 高半胱氨酸/半胱氨酸合酶 (MET17)

<220>

<223> 高半胱氨酸/半胱氨酸合酶 (MET17)

<400> 21

Met Pro Ser His Phe Asp Thr Val Gln Leu His Ala Gly Gln Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Asp Asn Ala His Arg Ser Arg Ala Val Pro Ile Tyr Ala Thr

20 25 30

Thr Ser Tyr Val Phe Glu Asn Ser Lys His Gly Ser Gln Leu Phe Gly

35 40 45

Leu Glu Val Pro Gly Tyr Val Tyr Ser Arg Phe Gln Asn Pro Thr Ser

50 55 60

Asn Val Leu Glu Glu Arg Ile Ala Ala Leu Glu Gly Gly Ala Ala Ala

65 70 75 80

Leu Ala Val Ser Ser Gly Gln Ala Ala Gln Thr Leu Ala Ile Gln Gly

85 90 95

Leu Ala His Thr Gly Asp Asn Ile Val Ser Thr Ser Tyr Leu Tyr Gly

100 105 110

Gly Thr Tyr Asn Gln Phe Lys Ile Ser Phe Lys Arg Phe Gly Ile Glu

115 120 125

Ala Arg Phe Val Glu Gly Asp Asn Pro Glu Glu Phe Glu Lys Val Phe

130 135 140

Asp Glu Arg Thr Lys Ala Val Tyr Leu Glu Thr Ile Gly Asn Pro Lys

145 150 155 160

Tyr Asn Val Pro Asp Phe Glu Lys Ile Val Ala Ile Ala His Lys His

165 170 175

Gly Ile Pro Val Val Val Asp Asn Thr Phe Gly Ala Gly Gly Tyr Phe

180 185 190

Cys Gln Pro Ile Lys Tyr Gly Ala Asp Ile Val Thr His Ser Ala Thr

195 200 205

Lys Trp Ile Gly Gly His Gly Thr Thr Ile Gly Gly Ile Ile Val Asp

210 215 220

Ser Gly Lys Phe Pro Trp Lys Asp Tyr Pro Glu Lys Phe Pro Gln Phe

225 230 235 240

Ser Gln Pro Ala Glu Gly Tyr His Gly Thr Ile Tyr Asn Glu Ala Tyr

245 250 255

Gly Asn Leu Ala Tyr Ile Val His Val Arg Thr Glu Leu Leu Arg Asp

260 265 270

Leu Gly Pro Leu Met Asn Pro Phe Ala Ser Phe Leu Leu Leu Gln Gly

275 280 285

Val Glu Thr Leu Ser Leu Arg Ala Glu Arg His Gly Glu Asn Ala Leu

290 295 300

Lys Leu Ala Lys Trp Leu Glu Gln Ser Pro Tyr Val Ser Trp Val Ser

305 310 315 320

Tyr Pro Gly Leu Ala Ser His Ser His His Glu Asn Ala Lys Lys Tyr

325 330 335

Leu Ser Asn Gly Phe Gly Gly Val Leu Ser Phe Gly Val Lys Asp Leu

340 345 350

Pro Asn Ala Asp Lys Glu Thr Asp Pro Phe Lys Leu Ser Gly Ala Gln

355 360 365

Val Val Asp Asn Leu Lys Leu Ala Ser Asn Leu Ala Asn Val Gly Asp

370 375 380

Ala Lys Thr Leu Val Ile Ala Pro Tyr Phe Thr Thr His Lys Gln Leu

385 390 395 400

Asn Asp Lys Glu Lys Leu Ala Ser Gly Val Thr Lys Asp Leu Ile Arg

405 410 415

Val Ser Val Gly Ile Glu Phe Ile Asp Asp Ile Ile Ala Asp Phe Gln

420 425 430

Gln Ser Phe Glu Thr Val Phe Ala Gly Gln Lys Pro

435 440

<210> 22

<211> 554

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pTDH3

<220>

<223> pTDH3

<400> 22

ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt 60

tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa 120

aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc 180

tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat 240

ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat 300

ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga 360

aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa 420

agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact 480

tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccaagaa cttagtttcg aataaacaca 540

cataaacaaa caaa 554

<210> 23

<211> 550

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pENO2

<220>

<223> pENO2

<400> 23

cgctcagcat ctgcttcttc ccaaagatga acgcggcgtt atgtcactaa cgacgtgcac 60

caacttgcgg aaagtggaat cccgttccaa aactggcatc cactaattga tacatctaca 120

caccgcacgc cttttttctg aagcccactt tcgtggactt tgccatatgc aaaattcatg 180

aagtgtgata ccaagtcagc atacacctca ctagggtagt ttctttggtt gtattgatca 240

tttggttcat cgtggttcat taattttttt tctccattgc tttctggctt tgatcttact 300

atcatttgga tttttgtcga aggttgtaga attgtatgtg acaagtggca ccaagcatat 360

ataaaaaaaa aaagcattat cttcctacca gagttgattg ttaaaaacgt atttatagca 420

aacgcaattg taattaattc ttattttgta tcttttcttc ccttgtctca atcttttatt 480

tttattttat ttttcttttc ttagtttctt tcataacacc aagcaactaa tactataaca 540

tacaataata 550

<210> 24

<211> 419

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pTEF Kl

<220>

<223> pTEF Kl

<400> 24

ctctctcgca ataacaatga acactgggtc aatcatagcc tacacaggtg aacagagtag 60

cgtttataca gggtttatac ggtgattcct acggcaaaaa tttttcattt ctaaaaaaaa 120

aaagaaaaat ttttctttcc aacgctagaa ggaaaagaaa aatctaatta aattgatttg 180

gtgattttct gagagttccc tttttcatat atcgaatttt gaatataaaa ggagatcgaa 240

aaaatttttc tattcaatct gttttctggt tttatttgat agtttttttg tgtattatta 300

ttatggatta gtactggttt atatgggttt ttctgtataa cttcttttta ttttagtttg 360

tttaatctta ttttgagtta cattatagtt ccctaactgc aagagaagta acattaaaa 419

<210> 25

<211> 598

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pTEF3

<220>

<223> pTEF3

<400> 25

ggctgataat agcgtataaa caatgcatac tttgtacgtt caaaatacaa tgcagtagat 60

atatttatgc atattacata taatacatat cacataggaa gcaacaggcg cgttggactt 120

ttaattttcg aggaccgcga atccttacat cacacccaat cccccacaag tgatccccca 180

cacaccatag cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc ttccagattt tctcggactc 240

cgcgcatcgc cgtaccactt caaaacaccc aagcacagca tactaaattt cccctctttc 300

ttcctctagg gtgtcgttaa ttacccgtac taaaggtttg gaaaagaaaa aagagaccgc 360

ctcgtttctt tttcttcgtc gaaaaaggca ataaaaattt ttatcacgtt tctttttctt 420

gaaaattttt ttttttgatt tttttctctt tcgatgacct cccattgata tttaagttaa 480

taaacggtct tcaatttctc aagtttcagt ttcatttttc ttgttctatt acaacttttt 540

ttacttcttg ctcattagaa agaaagcata gcaatctaat ctaagtttta attacaaa 598

<210> 26

<211> 383

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pTEF1

<220>

<223> pTEF1

<400> 26

gtttagcttg cctcgtcccc gccgggtcac ccggccagcg acatggaggc ccagaatacc 60

ctccttgaca gtcttgacgt gcgcagctca ggggcatgat gtgactgtcg cccgtacatt 120

tagcccatac atccccatgt ataatcattt gcatccatac attttgatgg ccgcacggcg 180

cgaagcaaaa attacggctc ctcgctgcag acctgcgagc agggaaacgc tcccctcaca 240

gacgcgttga attgtcccca cgccgcgccc ctgtagagaa atataaaagg ttaggatttg 300

ccactgaggt tcttctttca tatacttcct tttaaaatct tgctacgata cagttctcac 360

atcacatccg aacataaaca acc 383

<210> 27

<211> 700

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pADH1

<220>

<223> pADH1

<400> 27

gggtgtacaa tatggacttc ctcttttctg gcaaccaaac ccatacatcg ggattcctat 60

aataccttcg ttggtctccc taacatgtag gtggcggagg ggagatatac aatagaacag 120

ataccagaca agacataatg ggctaaacaa gactacacca attacactgc ctcattgatg 180

gtggtacata acgaactaat actgtagccc tagacttgat agccatcatc atatcgaagt 240

ttcactaccc tttttccatt tgccatctat tgaagtaata ataggcgcat gcaacttctt 300

ttcttttttt ttcttttctc tctcccccgt tgttgtctca ccatatccgc aatgacaaaa 360

aaatgatgga agacactaaa ggaaaaaatt aacgacaaag acagcaccaa cagatgtcgt 420

tgttccagag ctgatgaggg gtatctcgaa gcacacgaaa ctttttcctt ccttcattca 480

cgcacactac tctctaatga gcaacggtat acggccttcc ttccagttac ttgaatttga 540

aataaaaaaa agtttgctgt cttgctatca agtataaata gacctgcaat tattaatctt 600

ttgtttcctc gtcattgttc tcgttccctt tcttccttgt ttctttttct gcacaatatt 660

tcaagctata ccaagcatac aatcaactat ctcatataca 700

<210> 28

<211> 549

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pGPM 1

<220>

<223> pGPM 1

<400> 28

gccaaacttt tcggttaaca catgcagtga tgcacgcgcg atggtgctaa gttacatata 60

tatatatata tatatatata tatatatata gccatagtga tgtctaagta acctttatgg 120

tatatttctt aatgtggaaa gatactagcg cgcgcaccca cacacaagct tcgtcttttc 180

ttgaagaaaa gaggaagctc gctaaatggg attccacttt ccgttccctg ccagctgatg 240

gaaaaaggtt agtggaacga tgaagaataa aaagagagat ccactgaggt gaaatttcag 300

ctgacagcga gtttcatgat cgtgatgaac aatggtaacg agttgtggct gttgccaggg 360

agggtggttc tcaactttta atgtatggcc aaatcgctac ttgggtttgt tatataacaa 420

agaagaaata atgaactgat tctcttcctc cttcttgtcc tttcttaatt ctgttgtaat 480

taccttcctt tgtaattttt tttgtaatta ttcttcttaa taatccaaac aaacacacat 540

attacaata 549

<210> 29

<211> 650

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pFBA1

<220>

<223> pFBA1

<400> 29

acgcaagccc taagaaatga ataacaatac tgacagtact aaataattgc ctacttggct 60

tcacatacgt tgcatacgtc gatatagata ataatgataa tgacagcagg attatcgtaa 120

tacgtaatag ttgaaaatct caaaaatgtg tgggtcatta cgtaaataat gataggaatg 180

ggattcttct atttttcctt tttccattct agcagccgtc gggaaaacgt ggcatcctct 240

ctttcgggct caattggagt cacgctgccg tgagcatcct ctctttccat atctaacaac 300

tgagcacgta accaatggaa aagcatgagc ttagcgttgc tccaaaaaag tattggatgg 360

ttaataccat ttgtctgttc tcttctgact ttgactcctc aaaaaaaaaa aatctacaat 420

caacagatcg cttcaattac gccctcacaa aaactttttt ccttcttctt cgcccacgtt 480

aaattttatc cctcatgttg tctaacggat ttctgcactt gatttattat aaaaagacaa 540

agacataata cttctctatc aatttcagtt attgttcttc cttgcgttat tcttctgttc 600

ttctttttct tttgtcatat ataaccataa ccaagtaata catattcaaa 650

<210> 30

<211> 700

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pPDC1

<220>

<223> pPDC1

<400> 30

ttatttacct atctctaaac ttcaacacct tatatcataa ctaatatttc ttgagataag 60

cacactgcac ccataccttc cttaaaaacg tagcttccag tttttggtgg ttccggcttc 120

cttcccgatt ccgcccgcta aacgcatatt tttgttgcct ggtggcattt gcaaaatgca 180

taacctatgc atttaaaaga ttatgtatgc tcttctgact tttcgtgtga tgaggctcgt 240

ggaaaaaatg aataatttat gaatttgaga acaattttgt gttgttacgg tattttacta 300

tggaataatc aatcaattga ggattttatg caaatatcgt ttgaatattt ttccgaccct 360

ttgagtactt ttcttcataa ttgcataata ttgtccgctg cccctttttc tgttagacgg 420

tgtcttgatc tacttgctat cgttcaacac caccttattt tctaactatt ttttttttag 480

ctcatttgaa tcagcttatg gtgatggcac atttttgcat aaacctagct gtcctcgttg 540

aacataggaa aaaaaaatat ataaacaagg ctctttcact ctccttgcaa tcagatttgg 600

gtttgttccc tttattttca tatttcttgt catattcctt tctcaattat tattttctac 660

tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa 700

<210> 31

<211> 998

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pCCW12

<220>

<223> pCCW12

<400> 31

aaccagggca aagcaaaata aaagaaactt aatacgttat gccgtaatga agggctacca 60

aaaacgataa tctcaactgt aaacaggtac aatgcggacc cttttgccac aaaacataca 120

tcattcattg ccggaaaaag aaagaagtga agacagcagt gcagccagcc atgttgcgcc 180

aatctaatta tagatgctgg tgccctgagg atgtatctgg agccagccat ggcatcatgc 240

gctaccgccg gatgtaaaat ccgacacgca aaagaaaacc ttcgaggttg cgcacttcgc 300

ccacccatga accacacggt tagtccaaaa ggggcagttc agattccaga tgcgggaatt 360

agcttgctgc caccctcacc tcactaacgc tgcggtgtgc ggatacttca tgctatttat 420

agacgcgcgt gtcggaatca gcacgcgcaa gaaccaaatg ggaaaatcgg aatgggtcca 480

gaactgcttt gagtgctggc tattggcgtc tgatttccgt tttgggaatc ctttgccgcg 540

cgcccctctc aaaactccgc acaagtccca gaaagcggga aagaaataaa acgccaccaa 600

aaaaaaaaat aaaagccaat cctcgaagcg tgggtggtag gccctggatt atcccgtaca 660

agtatttctc aggagtaaaa aaaccgtttg ttttggaatt ccccatttcg cggccaccta 720

cgccgctatc tttgcaacaa ctatctgcga taactcagca aattttgcat attcgtgttg 780

cagtattgcg ataatgggag tcttacttcc aacataacgg cagaaagaaa tgtgagaaaa 840

ttttgcatcc tttgcctccg ttcaagtata taaagtcggc atgcttgata atctttcttt 900

ccatcctaca ttgttctaat tattcttatt ctcctttatt ctttcctaac ataccaagaa 960

attaatcttc tgtcattcgc ttaaacacta tatcaata 998

<210> 32

<211> 700

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pGK1

<220>

<223> pGK1

<400> 32

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 240

tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 300

cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt 360

agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg 420

ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca 480

cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac 540

atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt 600

tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc 660

aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaaca 700

<210> 33

<211> 913

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pMDH2

<220>

<223> pMDH2

<400> 33

ccttcgctaa ataataaacc tgaactgtac ttagcgaagc cttcatagca cctacgtaca 60

cgtatatata gacattttac gtaatggaga aactgaggtt tttgttttca ctttttttct 120

ttctttttca ctattgctcg aaccgcctgc gatgagctaa gaaaaaaaag tgaaagaaat 180

catagaaagc aaaaatgaga ttatatagcc cagagccctc ttctggcgcc tgtcccaagg 240

cggaccaaca acaacacttg cccaaaccta agaaaatccc ctcatacttt tccgtttgta 300

tctcctactt tcttacttcc tttttttctt ctttatttgc ttggtttacc attgaagtcc 360

atttttacta cagacaatag ctagtcattc gctatcttcc gtttgtcact ttttttcaaa 420

tttctcatct atatagcgaa gtacggaaaa gatgtcactt gccggcatct cggccttccc 480

cggccaaatg gactcatcat ctacgatacg gcccctttaa tccgcaatta ctttgcccat 540

tcggccgtag ccgttctaaa gccgccgtgc cttgccccca atactcccct aatgatccgg 600

gaagttccgg tttttttcct ttgtttagtg gcattttgtg ttgcccaagg ttgggaaggt 660

ccgatttgac tttaaggaac tacggaaggt atctaaggtt tctaaaaaca atatacacgc 720

gcgtgcgtag atatataaag ataaagattt atcgatatga gataaagatt gctgcatgat 780

tctccttctg attctttttc cctgtatata ttttctcccc ttctgtataa atcgtacagt 840

cagaagtagt ccagaatata gtgctgcaga ctattacaaa agttcaatac aatatcataa 900

aagttatagt aac 913

<210> 34

<211> 406

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pURA3

<220>

<223> pURA3

<400> 34

ggtacccaaa ccgaagttat ctgatgtaga aaaggattaa agatgctaag agatagtgat 60

gatatttcat aaataatgta attctatata tgttaattac cttttttgcg aggcatattt 120

atggtgaagg ataagttttg accatcaaag aaggttaatg tggctgtggt ttcagggtcc 180

ataaagcttt tcaattcatc tttttttttt ttgttctttt ttttgattcc ggtttctttg 240

aaattttttt gattcggtaa tctccgagca gaaggaagaa cgaaggaagg agcacagact 300

tagattggta tatatacgca tatgtggtgt tgaagaaaca tgaaattgcc cagtattctt 360

aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga taaatc 406

<210> 35

<211> 535

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pRPLA1

<220>

<223> pRPLA1

<400> 35

tcaagttgga tactgatctg atctctccgc cctactacca gggaccctca tgattaccgc 60

tcgaatgcga cgtttcctgc ctcataaaac tggcttgaaa atatttattc gctgaacagt 120

agcctagctt ataaaaattt catttaatta atgtaatatg aaaactcaca tgccttctgt 180

ttctaaaatt gtcacagcaa gaaataacat taccatacgt gatcttatta aactctagta 240

tcttgtctaa tacttcattt aaaagaagcc ttaaccctgt agcctcatct atgtctgcta 300

catatcgtga ggtacgaata tcgtaagatg ataccacgca actttgtaat gatttttttt 360

ttttcatttt ttaaagaatg cctttacatg gtatttgaaa aaaatatctt tataaagttt 420

gcgatctctt ctgttctgaa taatttttag taaaagaaat caaaagaata aagaaatagt 480

ccgctttgtc caatacaaca gcttaaaccg attatctcta aaataacaag aagaa 535

<210> 36

<211> 400

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pSAM4

<220>

<223> pSAM4

<400> 36

agattttggt gttagatggt actcttgcat atgtaacctt taataaattt tgcaaatcga 60

attcctttgt aacgtgcaaa gcattttata gcctggcgct cgcattgtta agcaacaggc 120

ggtgcggcaa cgttgaaatg tttcacgcag ggttttttac gtactgcacg gcattctgga 180

gtgaaaaaaa atgaaaagta cagctcgaag ttttttgtcc atcggttgta ctttgcagag 240

tattagtcat ttttgatatc agagtactac tatcgaagca tttttacgct tgaataactt 300

gaatattatt gaaagcttag ttcaaccaag ctgaaaagaa ccattattca acataattgg 360

aaatcatttc gttactaaat cgtccgaaaa ttgcagaaaa 400

<210> 37

<211> 505

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pCUP1-1

<220>

<223> pCUP1-1

<400> 37

cggcaaactt caacgatttc tatgatgcat tttataatta gtaagccgat cccattaccg 60

acatttgggc gctatacgtg catatgttca tgtatgtatc tgtatttaaa acacttttgt 120

attatttttc ctcatatatg tgtataggtt tatacggatg atttaattat tacttcacca 180

ccctttattt caggctgata tcttagcctt gttactagtt agaaaaagac atttttgctg 240

tcagtcactg tcaagagatt cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc 300

gtcttttccg ctgaaccgtt ccagcaaaaa agactaccaa cgcaatatgg attgtcagaa 360

tcatataaaa gagaagcaaa taactccttg tcttgtatca attgcattat aatatcttct 420

tgttagtgca atatcatata gaagtcatcg aaatagatat taagaaaaac aaactgtaca 480

atcaatcaat caatcatcac ataaa 505

<210> 38

<211> 500

<212> DNA

<213> 光滑念珠菌（Candida glabrata）

<220>

<223> pCUP1.Cgla

<220>

<223> pCUP1.Cgla

<400> 38

cacaccacac aaccgtcagc accccggctg tacgtctgtg aaggctgcgg tatagacacg 60

gactgcgata cagaactcat gacttatatc tgtagactcc tctgcttcaa tgcgaactcc 120

aggatcaccg aatagcatgc gatgagctgt tgattcttat atataattat ctattgcatt 180

ttttttttaa tgctgcatgg gggggcctag taaatcaccc gtacaagtca cgcgtgagag 240

aaagagaagg gccctttcgt cgtggaagcg tggatcgtga gcgacctgtt tctaaatata 300

gcttttgggt aggatattat attaagtgaa attttattag agggtaaatg tatgtgaaag 360

ttatgtataa tatgttgcta aattagcgat cgtgaatgca tagaatctaa tcgttataga 420

aaaccgcaac ttgtgctgtt ttgttgtgtt ttcttgtcgt ttttttatat tatttatcta 480

gtattttgct ttagttgtta 500

<210> 39

<211> 425

<212> DNA

<213> 贝酵母（Saccharomyces bayanus）

<220>

<223> pCUP1.Sba

<220>

<223> pCUP1.Sba

<400> 39

agaaggaggg gtcctattac caatacttgg acgctatacg tgcatatgta catgtacgta 60

tctgtattta aacacttttg tattattttc tttatatatg tgtataggtt tacatggttg 120

acttttatca ttgtttgtgc acatttgcaa tggccatttt tttgtttttg agaaaggtat 180

tattgctgtc actattcgag atgcttttgc tgacattcct cctagaagcc aaaaggccga 240

tgcgtttttt ccgctgagag gataccagca aaaaaagcta ccagtacaag atgggacggc 300

aaaagcgtat aaaagaagaa gcaaaatgac cagatatgct ttcaatttca tcaatgtttc 360

tttctccctg ttatgatcca gaagaataat caaaagcaaa acatctattc aatcaatctc 420

ataaa 425

<210> 40

<211> 741

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU1

<220>

<223> pACU1

<400> 40

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc 420

cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca 480

acgaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac 540

cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat 600

atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct 660

tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca tagatacaat 720

tctattaccc ccatccatac a 741

<210> 41

<211> 757

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU2

<220>

<223> pACU2

<400> 41

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccgaatt cgaaaaagac atttttgctg tcagtcactg 360

tcaagagatt cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc gtcttttccg 420

ctgaaccgtt ccagcaaaaa agactaccaa cgaattccac gtgaagctgt cgatattggg 480

gaactgtggt ggttggcaaa tgactaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac 540

tgtgtaacat aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg 600

atgaaaaaaa taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc 660

ctttttcttg ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca 720

gatacataga tacaattcta ttacccccat ccataca 757

<210> 42

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU3p

<220>

<223> pACU3p

<400> 42

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag 180

attcttttgc tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc 240

gttccagcaa aaaagactac caacgaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt 300

atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat 360

ggaaaagctg cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct 420

tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt 480

caaggagaaa aaactata 498

<210> 43

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU4p

<220>

<223> pACU4p

<400> 43

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa 180

aagacgcatc gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg 240

actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt 300

atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat 360

ggaaaagctg cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct 420

tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt 480

caaggagaaa aaactata 498

<210> 44

<211> 530

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU5

<220>

<223> pACU5

<400> 44

ggaggacgaa acaaaaaagt gaaaaaaaat gaaaattttt ttggaaaacc aagaaatgaa 60

ttatatttcc gtgtgagacg acatcgtcga atatgattca gggtaacagt attgatgtaa 120

tcaatttcct acctgaatct aaaattcccg gaattcgaaa aagacatttt tgctgtcagt 180

cactgtcaag agattctttt gctggcattt cttccagaag caaaaagagc gatgcgtctt 240

ttccgctgaa ccgttccagc aaaaaagact accaacgaat tccgagcaga tccgccaggc 300

gtgtatatat agcgtggatg gccaggcaac tttagtgctg acacatacag gcatatatat 360

atgtgtgcga cgacacatga tcatatggca tgcatgtgct ctgtatgtat ataaaactct 420

tgttttcttc ttttctctaa atattctttc cttatacatt aggacctttg cagcataaat 480

tactatactt ctatagacac acaaacacaa atacacacac taaattaata 530

<210> 45

<211> 867

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU6

<220>

<223> pACU6

<400> 45

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc 420

cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca 480

acgaattcga aaaagacatt tttgctgtca gtcactgtca agagattctt ttgctggcat 540

ttcttccaga agcaaaaaga gcgatgcgtc ttttccgctg aaccgttcca gcaaaaaaga 600

ctaccaacga attctaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat 660

aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa 720

taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg 780

ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga 840

tacaattcta ttacccccat ccataca 867

<210> 46

<211> 867

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU7

<220>

<223> pACU7

<400> 46

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tcgttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct 420

tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt 480

tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt 540

tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg 600

tctttttcga attctaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat 660

aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa 720

taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg 780

ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga 840

tacaattcta ttacccccat ccataca 867

<210> 47

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU8

<220>

<223> pACU8

<400> 47

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc 420

cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca 480

acgaattcga aaaagacatt tttgctgtca gtcactgtca agagattctt ttgctggcat 540

ttcttccaga agcaaaaaga gcgatgcgtc ttttccgctg aaccgttcca gcaaaaaaga 600

ctaccaacga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag attcttttgc 660

tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc gttccagcaa 720

aaaagactac caacgaattc gaaaaagaca tttttgctgt cagtcactgt caagagattc 780

ttttgctggc atttcttcca gaagcaaaaa gagcgatgcg tcttttccgc tgaaccgttc 840

cagcaaaaaa gactaccaac gaattctaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa 900

actgtgtaac ataataaccg aagtgtcgaa aaggtggcac cttgtccaat tgaacacgct 960

cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt 1020

tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt 1080

cagatacata gatacaattc tattaccccc atccataca 1119

<210> 48

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU9

<220>

<223> pACU9

<400> 48

tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60

ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 120

tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 180

attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccga attcgaaaaa 240

gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag attcttttgc tggcatttct tccagaagca 300

aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc gttccagcaa aaaagactac caacgaattc 360

gaaaaagaca tttttgctgt cagtcactgt caagagattc ttttgctggc atttcttcca 420

gaagcaaaaa gagcgatgcg tcttttccgc tgaaccgttc cagcaaaaaa gactaccaac 480

gaattcgggc tctttacatt tccacaacat ataagtaaga ttagatatgg atatgtatat 540

ggtggtaatg ccatgtaata tgattattaa acttctttgc gtccatccaa aaaaaaagta 600

agaatttttg aaaattcaat ataa 624

<210> 49

<211> 876

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU10p

<220>

<223> pACU10p

<400> 49

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attggttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa 180

aagacgcatc gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg 240

actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc gttggtagtc ttttttgctg gaacggttca 300

gcggaaaaga cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg 360

acagtgactg acagcaaaaa tgtctttttc gaattcgttg gtagtctttt ttgctggaac 420

ggttcagcgg aaaagacgca tcgctctttt tgcttctgga agaaatgcca gcaaaagaat 480

ctcttgacag tgactgacag caaaaatgtc tttttcgaat tcgttggtag tcttttttgc 540

tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct tctggaagaa atgccagcaa 600

aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt tccaattcgg atgataatgc 660

gattagtttt ttagccttat ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct 720

attaacagat atataaatgg aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt 780

tcagtttgta ttacttctta ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat 840

acctctatac tttaacgtca aggagaaaaa actata 876

<210> 50

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU11

<220>

<223> pACU11

<400> 50

gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60

aacttgcggg aattcgaaaa agacattttt gctgtcagtc actgtcaaga gattcttttg 120

ctggcatttc ttccagaagc aaaaagagcg atgcgtcttt tccgctgaac cgttccagca 180

aaaaagacta ccaacgaatt ccaccgcacg ccttttttct gaagcccact ttcgtggact 240

ttgccatata tgcaaaattc atgaagtgtg ataccaagtc agcatacacc tcactagggt 300

agtttctttg gttgtattga tcatttggtt catcgtggtt cattaatttt ttttctccat 360

tgctttctgg ctttgatctt actatcattt ggatttttgt cgaaggttgt agaattgtat 420

gtgacaagtg gcaccaagca tatataaaaa aaaaaagcat tatcttccta ccagagttga 480

ttgttaaaaa cgtatttata gcaaacgcaa ttgtaattaa ttcttatttt gtatcttttc 540

ttcccttgtc tcaatctttt atttttattt tatttttctt ttcttagttt ctttcataac 600

accaagcaac taatactata acatacaata ata 633

<210> 51

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU12

<220>

<223> pACU12

<400> 51

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tggttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct 420

tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt 480

tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt 540

tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg 600

tctttttcga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc 660

gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca 720

aaaatgtctt tttcgaattc gttggtagtc ttttttgctg gaacggttca gcggaaaaga 780

cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg acagtgactg 840

acagcaaaaa tgtctttttc caattctaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa 900

actgtgtaac ataataaccg aagtgtcgaa aaggtggcac cttgtccaat tgaacacgct 960

cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt 1020

tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt 1080

cagatacata gatacaattc tattaccccc atccataca 1119

<210> 52

<211> 1497

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU13

<220>

<223> pACU13

<400> 52

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tggttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct 420

tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt 480

tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt 540

tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg 600

tctttttcga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc 660

gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca 720

aaaatgtctt tttcgaattc gttggtagtc ttttttgctg gaacggttca gcggaaaaga 780

cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg acagtgactg 840

acagcaaaaa tgtctttttc gaattcgttg gtagtctttt ttgctggaac ggttcagcgg 900

aaaagacgca tcgctctttt tgcttctgga agaaatgcca gcaaaagaat ctcttgacag 960

tgactgacag caaaaatgtc tttttcgaat tcgttggtag tcttttttgc tggaacggtt 1020

cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct 1080

tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga 1140

acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga 1200

atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg tctttttcca attctaatta agttagtcaa 1260

ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct 1320

tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc 1380

tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt 1440

cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga tacaattcta ttacccccat ccataca 1497

<210> 53

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU14

<220>

<223> pACU14

<400> 53

gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60

aacttgcggg aattggaaaa agacattttt gctgtcagtc actgtcaaga gattcttttg 120

ctggcatttc ttccagaagc aaaaagagcg atgcgtcttt tccgctgaac cgttccagca 180

aaaaagacta ccaacgaatt cgaaaaagac atttttgctg tcagtcactg tcaagagatt 240

cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc gtcttttccg ctgaaccgtt 300

ccagcaaaaa agactaccaa cgaattcgaa aaagacattt ttgctgtcag tcactgtcaa 360

gagattcttt tgctggcatt tcttccagaa gcaaaaagag cgatgcgtct tttccgctga 420

accgttccag caaaaaagac taccaacgaa ttcgaaaaag acatttttgc tgtcagtcac 480

tgtcaagaga ttcttttgct ggcatttctt ccagaagcaa aaagagcgat gcgtcttttc 540

cgctgaaccg ttccagcaaa aaagactacc aaccaattcc accgcacgcc ttttttctga 600

agcccacttt cgtggacttt gccatatatg caaaattcat gaagtgtgat accaagtcag 660

catacacctc actagggtag tttctttggt tgtattgatc atttggttca tcgtggttca 720

ttaatttttt ttctccattg ctttctggct ttgatcttac tatcatttgg atttttgtcg 780

aaggttgtag aattgtatgt gacaagtggc accaagcata tataaaaaaa aaaagcatta 840

tcttcctacc agagttgatt gttaaaaacg tatttatagc aaacgcaatt gtaattaatt 900

cttattttgt atcttttctt cccttgtctc aatcttttat ttttatttta tttttctttt 960

cttagtttct ttcataacac caagcaacta atactataac atacaataat a 1011

<210> 54

<211> 398

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACU15

<220>

<223> pACU15

<400> 54

tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac 60

ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag 120

tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg 180

attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccga attcgttggt 240

agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc gctctttttg cttctggaag 300

aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc 360

gggctcttta catttccaca acatataagt aagattag 398

<210> 55

<211> 428

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pGAL/CUP1p

<220>

<223> pGAL/CUP1p

<400> 55

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag 180

attcttttgc tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc 240

gttccagcaa aaaagactac caacgcaata tggattgtca gaatcatata aaagagaagc 300

aaataactcc ttgtcttgta tcaattgcat tataatatct tcttgttagt gcaatatcat 360

atagaagtca tcgaaataga tattaagaaa aacaaactgt acaatcaatc aatcaatcat 420

cacataaa 428

<210> 56

<211> 518

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pCRS5

<220>

<223> pCRS5

<400> 56

gtggacgaaa agacataact gcagaagtac agctgccttt atttcttgtg gtcatttatt 60

gcttttattt tcaagtcaga tatacaagaa aatcaaatcc catcgtcaac gtcacgtata 120

aacgattaat ttacagtaat accatactct accaacatta ttttagtccg acgttcagtc 180

ctgtaggtgt tccaaatcct tctggcattg acttctgtgc agaaaccctt caaaatgagt 240

tccactttac gtcagatcgc ataacaaccg gtcatatatt tttttctttt gctaaacccc 300

ctactgcaag cacttttaag aaaaagaaca ataaatgcgt ctttattgct gtgtggaagt 360

gatttttgtc tttcggacaa aaaaaggata gggatgcgag agggctgtga agtagtgatc 420

aagcggggcc tatataagaa gggcgcacat cgtcccccct aagaatagcg aagcgatatt 480

acactgaaca ctacaatgtc aaatagtact caataaat 518

<210> 57

<211> 510

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pCHA1

<220>

<223> pCHA1

<400> 57

gatctctgct gacgttgtat ccacagatct aattgcaaga tagcctcttg cgaccttatt 60

aaaagcctct ccgtgatatc ctctagggct tgggttgcca ttaatcgatg tgtccttgtt 120

tccttatgcg agctgtttct tatctatctt atggtcccat tctttactgc actgtttaca 180

ttttgatcaa ttgcgaaatg ttcctactat ttttcttttt ctcttttcgc gagtactaat 240

caccgcgaac ggaaactaat gagtcctctg cgcggagaca tgattccgca tgggcggctc 300

ctgttaagcc ccagcggaaa tgtaattcca ctgagtgtca ttaaatagtg ccaaagcttt 360

atcaaattgt ttgcgatgag ataagataaa agggacaata tgaggaggaa cacaggtata 420

taaatatcgc caaataaaag gaaaatgttt atacagtttt ctctttttta agtgctggat 480

agacaagaga caggaaaatt aaccagcgag 510

<210> 58

<211> 601

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pCTR1

<220>

<223> pCTR1

<400> 58

caagtccgat tgttcctctt caggagcttc ctgaaccaaa ctttttccgc aaggccgcat 60

tttgaaccgt attttgctcg ttccagcctt tccacgtttt tgttatctaa gcaacttggc 120

acatttccct actatactac aaaccgatac gtaaatactt ccctaaatag catatgaatt 180

attcagtaat ttttaaggat cgaaactgca cctcaactat tcgttactgt ggttatgttc 240

tcatgtattg atgcaaatca tgggatattt gctcaagacg acggtaaaat gagcaaaaat 300

ggcacgatcc tgaaaagagc acttttcaag attcgggcta caaaatgcaa cataaaaaat 360

gttgtattgt catctcgaca gggtcttgta tgttttattc ctcttatgat tagttcacat 420

tagtaaaaca gatacgcagt gtgctcttaa taaacaacta ctccatagct ttatttgcat 480

aacaaaactt ttaagcacaa acttaaacag gtggagtaat agttcggcgg cgactcaaat 540

tacatttgtt ggaagaatcg aatagaaaat aaaaaaaagt gtattatatt tgacattcaa 600

a 601

<210> 59

<211> 522

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pCTR3

<220>

<223> pCTR3

<400> 59

gatgtgatga caaaacctct tccgataaaa acatttaaac tattaacaaa caaatggatt 60

cattagatct attacattat gggtggtatg ttggaataaa aatcaactat catctactaa 120

ctagtattta cgttactagt atattatcat atacggtgtt agaagatgac gcaaatgatg 180

agaaatagtc atctaaatta gtggaagctg aaacgcaagg attgataatg taataggatc 240

aatgaatatt aacatataaa acgatgataa taatatttat agaattgtgt agaattgcag 300

attccctttt atggattcct aaatcctcca ggagaacttc tagtatatct acatacctaa 360

tattattgcc ttattaaaaa tggaatccca acaattacat caaaatccac attctcttca 420

cttctccgat agacttgtaa tttatcttat ttcatttcct aacactttga tcgaagaaga 480

gggataacaa cagacgaaaa cacatttaag ggctatacaa ag 522

<210> 60

<211> 675

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR1

<220>

<223> pCUR1

<400> 60

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat 420

tctaattaag ttagtcaagg cgccatcctc atgaaaactg tgtaacataa taaccgaagt 480

gtcgaaaagg tggcaccttg tccaattgaa cacgctcgat gaaaaaaata agatatatat 540

aaggttaagt aaagcgtctg ttagaaagga agtttttcct ttttcttgct ctcttgtctt 600

ttcatctact atttccttcg tgtaatacag ggtcgtcaga tacatagata caattctatt 660

acccccatcc ataca 675

<210> 61

<211> 674

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR2

<220>

<223> pCUR2

<400> 61

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgatt 360

gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 420

ctaattaagt tagtcaaggc gccatcctca tgaaaactgt gtaacataat aaccgaagtg 480

tcgaaaaggt ggcaccttgt ccaattgaac acgctcgatg aaaaaaataa gatatatata 540

aggttaagta aagcgtctgt tagaaaggaa gtttttcctt tttcttgctc tcttgtcttt 600

tcatctacta tttccttcgt gtaatacagg gtcgtcagat acatagatac aattctatta 660

cccccatcca taca 674

<210> 62

<211> 794

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR3

<220>

<223> pCUR3

<400> 62

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

taggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 420

gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 480

gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt 540

ctaattaagt tagtcaaggc gccatcctca tgaaaactgt gtaacataat aaccgaagtg 600

tcgaaaaggt ggcaccttgt ccaattgaac acgctcgatg aaaaaaataa gatatatata 660

aggttaagta aagcgtctgt tagaaaggaa gtttttcctt tttcttgctc tcttgtcttt 720

tcatctacta tttccttcgt gtaatacagg gtcgtcagat acatagatac aattctatta 780

cccccatcca taca 794

<210> 63

<211> 850

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR4

<220>

<223> pCUR4

<400> 63

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat 420

tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat 480

gtcatgggat atttgctcaa gacgacggta aaatgagcaa atatggcacg atcctcaatt 540

gtcatgggat atttgctcaa gacgacggta aaatgagcaa atatcccatg acaattctaa 600

ttaagttagt caaggcgcca tcctcatgaa aactgtgtaa cataataacc gaagtgtcga 660

aaaggtggca ccttgtccaa ttgaacacgc tcgatgaaaa aaataagata tatataaggt 720

taagtaaagc gtctgttaga aaggaagttt ttcctttttc ttgctctctt gtcttttcat 780

ctactatttc cttcgtgtaa tacagggtcg tcagatacat agatacaatt ctattacccc 840

catccataca 850

<210> 64

<211> 491

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR5p

<220>

<223> pCUR5p

<400> 64

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag 180

caaatatggc acgatcctca attgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag 240

caaatatggc acgatcccaa ttcggatgat aatgcgatta gttttttagc cttatttctg 300

gggtaattaa tcagcgaagc gatgattttt gatctattaa cagatatata aatggaaaag 360

ctgcataacc actttaacta atactttcaa cattttcagt ttgtattact tcttattcaa 420

atgtcataaa agtatcaaca aaaaattgtt aatatacctc tatactttaa cgtcaaggag 480

aaaaaactat a 491

<210> 65

<211> 833

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR6

<220>

<223> pCUR6

<400> 65

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccgaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc 360

gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc 420

gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc 480

gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt catgatcgca aaatggcaaa tggcacgtga 540

agctgtcgat attggggaac tgtggtggtt ggcaaatgac taattaagtt agtcaaggcg 600

ccatcctcat gaaaactgtg taacataata accgaagtgt cgaaaaggtg gcaccttgtc 660

caattgaaca cgctcgatga aaaaaataag atatatataa ggttaagtaa agcgtctgtt 720

agaaaggaag tttttccttt ttcttgctct cttgtctttt catctactat ttccttcgtg 780

taatacaggg tcgtcagata catagataca attctattac ccccatccat aca 833

<210> 66

<211> 803

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR7

<220>

<223> pCUR7

<400> 66

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 360

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 420

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 480

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 540

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 600

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 660

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 720

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 780

ctttttacaa caaatataaa aca 803

<210> 67

<211> 863

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR8

<220>

<223> pCUR8

<400> 67

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 360

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 420

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 480

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 540

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 600

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 660

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 720

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 780

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 840

ctttttacaa caaatataaa aca 863

<210> 68

<211> 863

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR9

<220>

<223> pCUR9

<400> 68

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 420

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 480

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 540

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 600

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 660

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 720

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 780

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 840

ctttttacaa caaatataaa aca 863

<210> 69

<211> 923

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR10

<220>

<223> pCUR10

<400> 69

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 420

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 480

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 540

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 600

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 660

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 720

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 780

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 840

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 900

ctttttacaa caaatataaa aca 923

<210> 70

<211> 983

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR11

<220>

<223> pCUR11

<400> 70

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 420

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 480

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 540

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 600

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 660

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 720

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 780

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 840

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 900

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 960

ctttttacaa caaatataaa aca 983

<210> 71

<211> 1043

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR12

<220>

<223> pCUR12

<400> 71

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 360

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca 420

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 480

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 540

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 600

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 660

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 720

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 780

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 840

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 900

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 960

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1020

ctttttacaa caaatataaa aca 1043

<210> 72

<211> 1043

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR13

<220>

<223> pCUR13

<400> 72

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctc atgggatatt 420

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 480

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 540

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 600

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 660

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 720

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 780

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 840

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 900

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 960

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1020

ctttttacaa caaatataaa aca 1043

<210> 73

<211> 1223

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR14

<220>

<223> pCUR14

<400> 73

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt 240

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 300

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 360

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctc atgggatatt 420

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 480

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 540

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctc atgggatatt 600

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 660

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt 720

tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc 780

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 840

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 900

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 960

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 1020

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 1080

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 1140

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1200

ctttttacaa caaatataaa aca 1223

<210> 74

<211> 1283

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR15

<220>

<223> pCUR15

<400> 74

gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 60

gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 120

ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 180

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca 240

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 300

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 360

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 420

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca 480

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 540

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 600

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca 660

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 720

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca 780

tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc 840

tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt 900

tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga 960

tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca 1020

aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta 1080

accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa 1140

cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt 1200

caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta 1260

ctttttacaa caaatataaa aca 1283

<210> 75

<211> 686

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR16

<220>

<223> pCUR16

<400> 75

gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60

aacttgcggg aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 120

cacgatcctc aattgtcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 180

cacgatcctc aatgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag caaatatggc 240

acgatcctga attccaccgc acgccttttt tctgaagccc actttcgtgg actttgccat 300

atatgcaaaa ttcatgaagt gtgataccaa gtcagcatac acctcactag ggtagtttct 360

ttggttgtat tgatcatttg gttcatcgtg gttcattaat tttttttctc cattgctttc 420

tggctttgat cttactatca tttggatttt tgtcgaaggt tgtagaattg tatgtgacaa 480

gtggcaccaa gcatatataa aaaaaaaaag cattatcttc ctaccagagt tgattgttaa 540

aaacgtattt atagcaaacg caattgtaat taattcttat tttgtatctt ttcttccctt 600

gtctcaatct tttattttta ttttattttt cttttcttag tttctttcat aacaccaagc 660

aactaatact ataacataca ataata 686

<210> 76

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCUR17

<220>

<223> pCUR17

<400> 76

gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc 60

aacttgcggg aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 120

cacgatcctc aattgtcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 180

cacgatcctc aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 240

cacgatcctc aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg 300

cacgatcctg aattccaccg cacgcctttt ttctgaagcc cactttcgtg gactttgcca 360

tatatgcaaa attcatgaag tgtgatacca agtcagcata cacctcacta gggtagtttc 420

tttggttgta ttgatcattt ggttcatcgt ggttcattaa ttttttttct ccattgcttt 480

ctggctttga tcttactatc atttggattt ttgtcgaagg ttgtagaatt gtatgtgaca 540

agtggcacca agcatatata aaaaaaaaaa gcattatctt cctaccagag ttgattgtta 600

aaaacgtatt tatagcaaac gcaattgtaa ttaattctta ttttgtatct tttcttccct 660

tgtctcaatc ttttattttt attttatttt tcttttctta gtttctttca taacaccaag 720

caactaatac tataacatac aataata 747

<210> 77

<211> 500

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pLYS1

<220>

<223> pLYS1

<400> 77

gcaagttaac attagggaga acgtggggcc ttcctccatg agtgcagagc aattgaagat 60

gtttagaggt ttaaaggaga ataaccagtt gctggatagc tctgtgccag ctacagttta 120

tgccaaattg gcccttcatg gtattcctga cggtgttaat ggacagtact tgagctataa 180

tgaccctgcc ttggcggact ttatgccttg aggatagcag gtacatataa attgttacat 240

actaagtcga tgagtcaaaa aagactctta tacatttata cattttgcat tattattttt 300

tttttccagc ggaatttgga attccgctct caaccgccaa aattcccctg cgatttcagc 360

gacaaagagt cataaagtca tcctcgagaa accacgatga aatatataaa aagcccatct 420

tccctgacgg aaactggtat tttaggaggc ataccataag ataacaacga aaacgcttta 480

tttttcacac aaccgcaaaa 500

<210> 78

<211> 650

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pLYS4

<220>

<223> pLYS4

<400> 78

ttgaaaaatg cgaagttgaa gtgccataga agagaaacag cccacacagg ggagaagccc 60

actggaaagg gggcactgac caactttaaa taggaaacag aagataccac aagccagcga 120

tacaacagca ccaaacaccg aaaagaatag ccaaagctgt cctctggtgt tggaaaaact 180

ggaaaaaacg caactgcgtt ggctgctacg gtgaaaaatt ttcctatgac ttttttcact 240

gcttgttcgt gcgaaattac cgcaaacccg gtaaaatgta cacgtatcaa gtgataaaca 300

atttcgtgtc aagtgagcag aatggagcga tttggaaaaa aaaaattttt attgtttttt 360

cccccgggat tttgctcgag atgactgaaa ttttgtaatc gatgagtcta taccagaggc 420

agcaaatatc accaacatac acaggtatac acaatctcat gtccacacac acgtacagac 480

acgcacatat atatatatat atatatatcc ccataggtat ttatatatac aaaagaatcc 540

tcgtgtgttt gtgtgtgcaa tagctagttt tgcgctgcct cttatagtag acaatatcac 600

tttttcaata aaatagaact tgcaaggaaa caaaattgta tcgcttcaag 650

<210> 79

<211> 500

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pLYS9

<220>

<223> pLYS9

<400> 79

acatatgcaa gagtcttatg tatcgtatct aagtgccacg taggggattc ccatcatttg 60

atgatttcca aatataatac ctgtagagag cggtggagca aaagtcaaat tttaatcgca 120

actgcagaca agtcaagctg aggaaattgt ggatgatctc ttgtttcttt tgatattcac 180

cacaacagaa gtgaagagtg tgattgcggt tactactgac cacgaagcaa tgcgtttagt 240

agtgaaaaga attactcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag 300

tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag 360

atgatagaaa gtagcacaga atttggctta atggtatata aaccgtaggg tcctggtaaa 420

attacatggg aaggatcctt aggcagtagg gaaaacttat caggacaatt gagttatatt 480

aacgtattat atattttaat 500

<210> 80

<211> 494

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR1p

<220>

<223> pLYR1p

<400> 80

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt 180

cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta 240

tcagcaatag atgatagaaa gaattcggat gataatgcga ttagtttttt agccttattt 300

ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat ataaatggaa 360

aagctgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc agtttgtatt acttcttatt 420

caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt taacgtcaag 480

gagaaaaaac tata 494

<210> 81

<211> 494

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR2p

<220>

<223> pLYR2p

<400> 81

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180

tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240

tttcgattcc agagtatgag gaattcggat gataatgcga ttagtttttt agccttattt 300

ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat ataaatggaa 360

aagctgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc agtttgtatt acttcttatt 420

caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt taacgtcaag 480

gagaaaaaac tata 494

<210> 82

<211> 616

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR3p

<220>

<223> pLYR3p

<400> 82

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt 180

cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta 240

tcagcaatag atgatagaaa gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa 300

ttcgctttgt agtgaaaaat aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat 360

tatcagcaat agatgataga aagaattcgg atgataatgc gattagtttt ttagccttat 420

ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct attaacagat atataaatgg 480

aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt tcagtttgta ttacttctta 540

ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat acctctatac tttaacgtca 600

aggagaaaaa actata 616

<210> 83

<211> 616

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR4p

<220>

<223> pLYR4p

<400> 83

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180

tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240

tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa 300

attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg 360

aatttcgatt ccagagtatg aggaattcgg atgataatgc gattagtttt ttagccttat 420

ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct attaacagat atataaatgg 480

aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt tcagtttgta ttacttctta 540

ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat acctctatac tttaacgtca 600

aggagaaaaa actata 616

<210> 84

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR5p

<220>

<223> pLYR5p

<400> 84

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180

tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240

tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa 300

attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg 360

aatttcgatt ccagagtatg aggaattctt tctatcatct attgctgata attccattgg 420

aaattctcaa taccctttat tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa tttttccaac 480

ggaatttcga ttccagagta tgaggaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt 540

atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat 600

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tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt 720

caaggagaaa aaactata 738

<210> 85

<211> 1104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR6p

<220>

<223> pLYR6p

<400> 85

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attgctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt 180

cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta 240

tcagcaatag atgatagaaa gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa 300

ttcgctttgt agtgaaaaat aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat 360

tatcagcaat agatgataga aagaattcct catactctgg aatcgaaatt ccgttggaaa 420

aattcgcttt gtagtgaaaa ataaagatgt caataaaggg tattgagaat ttccaatgga 480

attatcagca atagatgata gaaacaattg ctcatactct ggaatcgaaa ttccgttgga 540

aaaattcgct ttgtagtgaa aaataaagat gtcaataaag ggtattgaga atttccaatg 600

gaattatcag caatagatga tagaaagaat tcctcatact ctggaatcga aattccgttg 660

gaaaaattcg ctttgtagtg aaaaataaag atgtcaataa agggtattga gaatttccaa 720

tggaattatc agcaatagat gatagaaaga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt 780

tggaaaaatt cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc 840

aatggaatta tcagcaatag atgatagaaa caattcggat gataatgcga ttagtttttt 900

agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat 960

ataaatggaa aagctgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc agtttgtatt 1020

acttcttatt caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt 1080

taacgtcaag gagaaaaaac tata 1104

<210> 86

<211> 1836

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR7p

<220>

<223> pLYR7p

<400> 86

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccga attgtttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat 180

tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa 240

tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa 300

attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg 360

aatttcgatt ccagagtatg aggaattctt tctatcatct attgctgata attccattgg 420

aaattctcaa taccctttat tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa tttttccaac 480

ggaatttcga ttccagagta tgagcaattg tttctatcat ctattgctga taattccatt 540

ggaaattctc aatacccttt attgacatct ttatttttca ctacaaagcg aatttttcca 600

acggaatttc gattccagag tatgaggaat tctttctatc atctattgct gataattcca 660

ttggaaattc tcaataccct ttattgacat ctttattttt cactacaaag cgaatttttc 720

caacggaatt tcgattccag agtatgagga attctttcta tcatctattg ctgataattc 780

cattggaaat tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt 840

tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag caattgtttc tatcatctat tgctgataat 900

tccattggaa attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt 960

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attccattgg aaattctcaa taccctttat tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa 1080

tttttccaac ggaatttcga ttccagagta tgaggaattc tttctatcat ctattgctga 1140

taattccatt ggaaattctc aatacccttt attgacatct ttatttttca ctacaaagcg 1200

aatttttcca acggaatttc gattccagag tatgagcaat tgtttctatc atctattgct 1260

gataattcca ttggaaattc tcaataccct ttattgacat ctttattttt cactacaaag 1320

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ctgataattc cattggaaat tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa 1440

agcgaatttt tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat 1500

tgctgataat tccattggaa attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac 1560

aaagcgaatt tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg agcaattcgg atgataatgc 1620

gattagtttt ttagccttat ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct 1680

attaacagat atataaatgg aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt 1740

tcagtttgta ttacttctta ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat 1800

acctctatac tttaacgtca aggagaaaaa actata 1836

<210> 87

<211> 981

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR8

<220>

<223> pLYR8

<400> 87

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgctcatact ctggaatcga aattccgttg gaaaaattcg ctttgtagtg aaaaataaag 420

atgtcaataa agggtattga gaatttccaa tggaattatc agcaatagat gatagaaaga 480

attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag tgaaaaataa 540

agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag atgatagaaa 600

gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa ttcgctttgt agtgaaaaat 660

aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat tatcagcaat agatgataga 720

aacaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac 780

cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat 840

atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct 900

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tctattaccc ccatccatac a 981

<210> 88

<211> 981

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR9

<220>

<223> pLYR9

<400> 88

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgtttctatc atctattgct gataattcca ttggaaattc tcaataccct ttattgacat 420

ctttattttt cactacaaag cgaatttttc caacggaatt tcgattccag agtatgagga 480

attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat tctcaatacc ctttattgac 540

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gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa attctcaata ccctttattg 660

acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg 720

agcaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac 780

cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat 840

atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct 900

tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca tagatacaat 960

tctattaccc ccatccatac a 981

<210> 89

<211> 1225

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR10

<220>

<223> pLYR10

<400> 89

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

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cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgtttctatc atctattgct gataattcca ttggaaattc tcaataccct ttattgacat 420

ctttattttt cactacaaag cgaatttttc caacggaatt tcgattccag agtatgagga 480

attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat tctcaatacc ctttattgac 540

atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag 600

gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa attctcaata ccctttattg 660

acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg 720

aggaattctt tctatcatct attgctgata attccattgg aaattctcaa taccctttat 780

tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa tttttccaac ggaatttcga ttccagagta 840

tgaggaattc tttctatcat ctattgctga taattccatt ggaaattctc aatacccttt 900

attgacatct ttatttttca ctacaaagcg aatttttcca acggaatttc gattccagag 960

tatgagcaat tctaattaag ttagtcaagg cgccatcctc atgaaaactg tgtaacataa 1020

taaccgaagt gtcgaaaagg tggcaccttg tccaattgaa cacgctcgat gaaaaaaata 1080

agatatatat aaggttaagt aaagcgtctg ttagaaagga agtttttcct ttttcttgct 1140

ctcttgtctt ttcatctact atttccttcg tgtaatacag ggtcgtcaga tacatagata 1200

caattctatt acccccatcc ataca 1225

<210> 90

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLYR11

<220>

<223> pLYR11

<400> 90

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat 360

tgctcatact ctggaatcga aattccgttg gaaaaattcg ctttgtagtg aaaaataaag 420

atgtcaataa agggtattga gaatttccaa tggaattatc agcaatagat gatagaaaga 480

attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag tgaaaaataa 540

agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag atgatagaaa 600

gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa ttcgctttgt agtgaaaaat 660

aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat tatcagcaat agatgataga 720

aagaattcct catactctgg aatcgaaatt ccgttggaaa aattcgcttt gtagtgaaaa 780

ataaagatgt caataaaggg tattgagaat ttccaatgga attatcagca atagatgata 840

gaaagaattc ctcatactct ggaatcgaaa ttccgttgga aaaattcgct ttgtagtgaa 900

aaataaagat gtcaataaag ggtattgaga atttccaatg gaattatcag caatagatga 960

tagaaagaat tcctcatact ctggaatcga aattccgttg gaaaaattcg ctttgtagtg 1020

aaaaataaag atgtcaataa agggtattga gaatttccaa tggaattatc agcaatagat 1080

gatagaaaca attctaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat 1140

aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa 1200

taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg 1260

ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga 1320

tacaattcta ttacccccat ccataca 1347

<210> 91

<211> 686

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pMET17

<220>

<223> pMET17

<400> 91

ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60

tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120

atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180

aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240

ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat 300

cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgagg 360

tcacatgatc gcaaaatggc aaatggcacg tgaagctgtc gatattgggg aactgtggtg 420

gttggcaaat gactaattaa gttagtcaag gcgccatcct catgaaaact gtgtaacata 480

ataaccgaag tgtcgaaaag gtggcacctt gtccaattga acacgctcga tgaaaaaaat 540

aagatatata taaggttaag taaagcgtct gttagaaagg aagtttttcc tttttcttgc 600

tctcttgtct tttcatctac tatttccttc gtgtaataca gggtcgtcag atacatagat 660

acaattctat tacccccatc cataca 686

<210> 92

<211> 510

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pMET6

<220>

<223> pMET6

<400> 92

ccacaggaaa tatttcacgt gacttacaaa cagagtcgta cgtcaggacc ggagtcaggt 60

gaaaaaatgt gggccggtaa agggaaaaaa ccagaaacgg gactactatc gaactcgttt 120

agtcgcgaac gtgcaaaagg ccaatatttt tcgctagagt catcgcagtc atggcagctc 180

tttcgctcta tctcccggtc gcaaaactgt ggtagtcata gctcgttctg ctcaattgag 240

aactgtgaat gtgaatatgg aacaaatgcg atagatgcac taatttaagg gaagctagct 300

agttttccca actgcgaaag aaaaaaagga aagaaaaaaa aattctatat aagtgataga 360

tatttccatc tttactagca ttagtttctc ttttacgtat tcaatatttt tgttaaactc 420

ttcctttatc ataaaaaagc aagcatctaa gagcattgac aacactctaa gaaacaaaat 480

accaatataa tttcaaagta catatcaaaa 510

<210> 93

<211> 508

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pMET14

<220>

<223> pMET14

<400> 93

cctatgcatg tttagagcaa gcgcctttgt gagccctccc ggttacgacg ccttggcaat 60

gtagcagata actctgcact tctagaatca ttccactacg acatttggct catcaccagc 120

tcgcgagaaa tgtaaataag ccaacaacca agaatgcgta acattaaaga atacagttgc 180

tttcatttcg gcgtgatggt acggcaccca cggttcctta cattattctc gaaaaatagc 240

tgcacgcttt tccaggaata aaagaccgtg ccactaattt cacgtgatca atatatttac 300

aagccacctc aaaaaatgtg gcaatggaga agaggatgaa cgactcaata tgacttcaac 360

ttcatgaatt tgtcaaaata tctatataag atgcaaaatt tctatacaac atcagttgcg 420

tatccgttaa tgtcgttcat tttctctctt tgttcgaact tgacatcaag aaaagttgga 480

attatttctc caagcacact gtacacca 508

<210> 94

<211> 552

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pMET3

<220>

<223> pMET3

<400> 94

aacgatatgt acgtagtggt ataaggtgag ggggtccaca gatataacat cgtttaattt 60

agtactaaca gagacttttg tcacaactac atataagtgt acaaatatag tacagatatg 120

acacacttgt agcgccaacg cgcatcctac ggattgctga cagaaaaaaa ggtcacgtga 180

ccagaaaagt cacgtgtaat tttgtaactc accgcattct agcggtccct gtcgtgcaca 240

ctgcactcaa caccataaac cttagcaacc tccaaaggaa atcaccgtat aacaaagcca 300

cagttttaca acttagtctc ttatgaagtt acttaccaat gagaaataga ggctctttct 360

cgacaaatat gaatatggat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatgt 420

aaacttggtt cttttttagc ttgtgatctc tagcttgggt ctctctctgt cgtaacagtt 480

gtgatatcgt ttcttaacaa ttgaaaagga actaagaaag tataataata acaagaataa 540

agtataatta ac 552

<210> 95

<211> 363

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pSAM1

<220>

<223> pSAM1

<400> 95

gaaacggacg taagacggaa atagaatttg aagataaagt tatatatcac tacacacgaa 60

tactttcttt tttttttttc acaggaaaac tgtggtggcg cccttgccta ctagtgcatt 120

tcttttttcg ggttcttgtc tcgacgaaat tttagcctca tcgtagtttt tcactctggt 180

atcgatgaaa aagggaagag taaaaagttt tccgtttagt acttaatggg attggtttgg 240

gacgtatata tcgactggtg ttgtctgtta ttcatcgttg tttttcggtt agcttcgaaa 300

aaaaaataga gtaaaaacca ggaatttacc ctaaaaacaa gaaaaaataa gataaacgaa 360

aat 363

<210> 96

<211> 500

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pSAM2

<220>

<223> pSAM2

<400> 96

gagctttgct ctattatata agataaaata tgcactaaaa gtttgcattt ctttacataa 60

ctaaaactaa gacattatgc atagcttacc tgatcaaaaa gtatgtaaac ttgttaacat 120

cttcacatgt gattcatctg gtcgtacttt cttgcggtgc agtgtaatat ttctacccac 180

gtgactataa ttgagcttga aaactgtggc gtttttccac cgatgggtcc acgccagata 240

ttaaccgaag ccaaaatacc gatgaaattt ctgagatagc tcttgtaaac gacgtcaaat 300

cttcatatgc aaggagatct tgatttcttt ttggtagtca tctgtcgtct tgaggcgtat 360

aagaaggagg ttatatctgt cctttctaca aagtattttc gagaatcttg cttctgcccc 420

ttttttcttt ttttaaaagg tttaaaaaac ataactgtct tcaatatatc cagtatttac 480

gacaatatac aaacataatc 500

<210> 97

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> tTDH2

<220>

<223> tTDH2

<400> 97

atttaactcc ttaagttact ttaatgattt agtttttatt attaataatt catgctcatg 60

acatctcata tacacgttta taaaacttaa atagattgaa aatgtattaa agattcctca 120

gggattcgat ttttttggaa gtttttgttt ttttttcctt gagatgctgt agtatttggg 180

aacaattata caatcgaaag atatatgctt acattcgacc gttttagccg tgatcattat 240

cctatagtaa cataacctga agcataactg acactactat catcaatact tgtcacatga 300

<210> 98

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> tCYC1

<220>

<223> tCYC1

<400> 98

acaggcccct tttcctttgt cgatatcatg taattagtta tgtcacgctt acattcacgc 60

cctcctccca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc 120

cctatttatt ttttttaata gttatgttag tattaagaac gttatttata tttcaaattt 180

ttcttttttt tctgtacaaa cgcgtgtacg catgtaacat tatactgaaa accttgcttg 240

agaaggtttt gggacgctcg aaggctttaa tttgcaagct tcgcagttta cactctcatc 300

<210> 99

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> tTDH3

<220>

<223> tTDH3

<400> 99

gtgaatttac tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatgacttag 60

tttcaattta tatactattt taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag ctttgtgttt 120

tttcttgatg cgctattgca ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata tctgtagtag 180

atacctgata cattgtggat gctgagtgaa attttagtta ataatggagg cgctcttaat 240

aattttgggg atattggctt ttttttttaa agtttacaaa tgaatttttt ccgccaggat 300

<210> 100

<211> 354

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> tADH1

<220>

<223> tADH1

<400> 100

actagttcta gagcggccgc caccgcggtg ggcgaatttc ttatgattta tgatttttat 60

tattaaataa gttataaaaa aaataagtgt atacaaattt taaagtgact cttaggtttt 120

aaaacgaaaa ttcttattct tgagtaactc tttcctgtag gtcaggttgc tttctcaggt 180

atagcatgag gtcgctctta ttgaccacac ctctaccggc atgccgagca aatgcctgca 240

aatcgctccc catttcaccc aattgtagat atgctaactc cagcaatgag ttgatgaatc 300

tcggtgtgta ttttatgtcc tcagaggaca acacctgttg taatcgttct tcca 354

<210> 101

<211> 301

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> tADH2

<220>

<223> tADH2

<400> 101

gcggatctct tatgtcttta cgatttatag ttttcattat caagtatgcc tatattagta 60

tatagcatct ttagatgaca gtgttcgaag tttcacgaat aaaagataat attctacttt 120

ttgctcccac cgcgtttgct agcacgagtg aacaccatcc ctcgcctgtg agttgtaccc 180

attcctctaa actgtagaca tggtagcttc agcagtgttc gttatgtacg gcatcctcca 240

acaaacagtc ggttatagtt tgtcctgctc ctctgaatcg tctccctcga tatttctcat 300

t 301

<210> 102

<211> 299

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> tTPI1

<220>

<223> tTPI1

<400> 102

gattaatata attatataaa aatattatct tcttttcttt atatctagtg ttatgtaaaa 60

taaattgatg actacggaaa gcttttttat attgtttctt tttcattctg agccacttaa 120

atttcgtgaa tgttcttgta agggacggta gatttacaag tgatacaaca aaaagcaagg 180

cgctttttct aataaaaaga agaaaagcat ttaacaattg aacacctcta tatcaacgaa 240

gaatattact ttgtctctaa atccttgtaa aatgtgtacg atctctatat gggttactc 299

<210> 103

<211> 299

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> tMET17

<220>

<223> tMET17

<400> 103

gtgtgcgtaa tgagttgtaa aattatgtat aaacctactt tctctcacaa gtactatact 60

tttataaaac gaactttatt gaaatgaata tccttttttt cccttgttac atgtcgtgac 120

tcgtactttg aacctaaatt gttctaacat caaagaacag tgttaattcg cagtcgagaa 180

gaaaaatatg gtgaacaaga ctcatctact tcatgagact actttacgcc tcctataaag 240

ctgtcacact ggataaattt attgtaggac caagttacaa aagaggatga tggaggttt 299

<210> 104

<211> 305

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> tENO2

<220>

<223> tENO2

<400> 104

ggatcctaaa gtgcttttaa ctaagaatta ttagtctttt ctgcttattt tttcatcata 60

gtttagaaca ctttatatta acgaatagtt tatgaatcta tttaggttta aaaattgata 120

cagttttata agttactttt tcaaagactc gtgctgtcta ttgcataatg cactggaagg 180

ggaaaaaaaa ggtgcacacg cgtggctttt tcttgaattt gcagtttgaa aaataactac 240

atggatgata agaaaacatg gagtacagtc actttgagaa ccttcaatca gctggtaacg 300

tcttc 305

<210> 105

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> tMET3

<220>

<223> tMET3

<400> 105

tcgtcataaa atgctcccat ctcaaaagta gggcaaaatt catgatcgac cgcgcaaaat 60

aaatagattt gcaaataagt tttgtatgta catttattaa tatatataat atatcaaaag 120

aaaaaaatca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ttgcactctt attcagtcat caattacaaa 180

acctagagat agcgatggtg catattcaat aaaaaactcc ttatactgtc gagaaagctt 240

attattggta cttctcgaag atactaaaaa aggttaattt ttggagacgg aggcaatagc 300

<210> 106

<211> 301

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> tPGK1

<220>

<223> tPGK1

<400> 106

attgaattga attgaaatcg atagatcaat ttttttcttt tctctttccc catcctttac 60

gctaaaataa tagtttattt tattttttga atatttttta tttatatacg tatatataga 120

ctattattta tcttttaatg attattaaga tttttattaa aaaaaaattc gctcctcttt 180

taatgccttt atgcagtttt tttttcccat tcgatatttc tatgttcggg ttcagcgtat 240

tttaagttta ataactcgaa aattctgcgt tcgttaaagc tttcgagaag gatattattt 300

a 301

<210> 107

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> tDIT1

<220>

<223> tDIT1

<400> 107

taaagtaaga gcgctacatt ggtctacctt tttgttcttt tacttaaaca ttagttagtt 60

cgttttcttt ttctcatttt tttatgtttc ccccccaaag ttctgatttt ataatatttt 120

atttcacaca attccattta acagaggggg aatagattct ttagcttaga aaattagtga 180

tcaatatata tttgcctttc ttttcatctt ttcagtgata ttaatggttt cgagacactg 240

caatggccct agttgtctaa gaggatagat gttactgtca aagatgatat tttgaatttc 300

<210> 108

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> tRPL3

<220>

<223> tRPL3

<400> 108

gaagttttgt tagaaaataa atcatttttt aattgagcat tcttattcct attttattta 60

aatagtttta tgtattgtta gctacataca acagtttaaa tcaaattttc tttttcccaa 120

gtccaaaatg gaggtttatt ttgatgaccc gcatgcgatt atgttttgaa agtataagac 180

tacatacatg tacatatatt taaacatgta aacccgtcca ttatattgct tactttcttc 240

ttttttgccg ttttgacttg gacctctggt ttgctatttc cttacaatct ttgctacaat 300

<210> 109

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> tRPL41B

<220>

<223> tRPL41B

<400> 109

gcggattgag agcaaatcgt taagttcagg tcaagtaaaa attgatttcg aaaactaatt 60

tctcttatac aatcctttga ttggaccgtc atcctttcga atataagatt ttgttaagaa 120

tattttagac agagatctac tttatattta atatctagat attacataat ttcctctcta 180

ataaaatatc attaataaaa taaaaatgaa gcgatttgat tttgtgttgt caacttagtt 240

tgccgctatg cctcttgggt aatgctatta ttgaatcgaa gggctttatt atattaccct 300

<210> 110

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> tRPL15A

<220>

<223> tRPL15A

<400> 110

gctggttgat ggaaaatata attttattgg gcaaactttt gtttatctga tgtgttttat 60

actattatct ttttaattaa tgattctata tacaaacctg tatatttttt ctttaaccaa 120

tttttttttt tatagaccta gagctgtact tttattctgc tatcaagcaa acccctaccc 180

cctcttctca atcctcccct caggcagaac ttatctacct gtatcaagga gcggacgagg 240

gagtcctaat tgttctacgt ataccaatgc tagcagctta cataggtggt ggcactacca 300

<210> 111

<211> 300

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> tIDP1

<220>

<223> tIDP1

<400> 111

tcgaatttac gtagcccaat ctaccacttt tttttttcat tttttaaagt gttatactta 60

gttatgctct aggataatga actacttttt tttttttttt tttactgtta tcataaatat 120

atatacctta ttgttgtttg caaccgtcgg ttaattcctt atcaaggttc cccaagttcg 180

gatcattacc atcaatttcc aacattttca tgagttcttc ttcttcatta ccgtgtttta 240

gggggctgtt cgcacttcta atagggctat caccaagctg ttctaattcg tccaaaagtt 300

<210> 112

<211> 1089

<212> DNA

<213> 克鲁维酵母（Kluveromyces lactis）

<220>

<223> Leu2

<220>

<223> Leu2

<400> 112

atgtctaaga atatcgttgt cctaccgggt gatcacgtcg gtaaagaagt tactgacgaa 60

gctattaagg tcttgaatgc cattgctgaa gtccgtccag aaattaagtt caatttccaa 120

catcacttga tcgggggtgc tgccatcgat gccactggca ctcctttacc agatgaagct 180

ctagaagcct ctaagaaagc cgatgctgtc ttactaggtg ctgttggtgg tccaaaatgg 240

ggtacgggcg cagttagacc agaacaaggt ctattgaaga tcagaaagga attgggtcta 300

tacgccaact tgagaccatg taactttgct tctgattctt tactagatct ttctcctttg 360

aagcctgaat atgcaaaggg taccgatttc gtcgtcgtta gagaattggt tggtggtatc 420

tactttggtg aaagaaaaga agatgaaggt gacggagttg cttgggactc tgagaaatac 480

agtgttcctg aagttcaaag aattacaaga atggctgctt tcttggcatt gcaacaaaac 540

ccaccattac caatctggtc tcttgacaag gctaacgtgc ttgcctcttc cagattgtgg 600

agaaagactg ttgaagaaac catcaagact gagttcccac aattaactgt tcagcaccaa 660

ttgatcgact ctgctgctat gattttggtt aaatcaccaa ctaagctaaa cggtgttgtt 720

attaccaaca acatgtttgg tgatattatc tccgatgaag cctctgttat tccaggttct 780

ttgggtttat taccttctgc atctctagct tccctacctg acactaacaa ggcattcggt 840

ttgtacgaac catgtcatgg ttctgcccca gatttaccag caaacaaggt taacccaatt 900

gctaccatct tatctgcagc tatgatgttg aagttatcct tggatttggt tgaagaaggt 960

agggctcttg aagaagctgt tagaaatgtc ttggatgcag gtgtcagaac cggtgacctt 1020

ggtggttcta actctaccac tgaggttggc gatgctatcg ccaaggctgt caaggaaatc 1080

ttggcttaa 1089

<210> 113

<211> 362

<212> PRT

<213> 克鲁维酵母（Kluveromyces lactis）

<220>

<223> Leu2

<220>

<223> Leu2

<400> 113

Met Ser Lys Asn Ile Val Val Leu Pro Gly Asp His Val Gly Lys Glu

1 5 10 15

Val Thr Asp Glu Ala Ile Lys Val Leu Asn Ala Ile Ala Glu Val Arg

20 25 30

Pro Glu Ile Lys Phe Asn Phe Gln His His Leu Ile Gly Gly Ala Ala

35 40 45

Ile Asp Ala Thr Gly Thr Pro Leu Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ala Ser

50 55 60

Lys Lys Ala Asp Ala Val Leu Leu Gly Ala Val Gly Gly Pro Lys Trp

65 70 75 80

Gly Thr Gly Ala Val Arg Pro Glu Gln Gly Leu Leu Lys Ile Arg Lys

85 90 95

Glu Leu Gly Leu Tyr Ala Asn Leu Arg Pro Cys Asn Phe Ala Ser Asp

100 105 110

Ser Leu Leu Asp Leu Ser Pro Leu Lys Pro Glu Tyr Ala Lys Gly Thr

115 120 125

Asp Phe Val Val Val Arg Glu Leu Val Gly Gly Ile Tyr Phe Gly Glu

130 135 140

Arg Lys Glu Asp Glu Gly Asp Gly Val Ala Trp Asp Ser Glu Lys Tyr

145 150 155 160

Ser Val Pro Glu Val Gln Arg Ile Thr Arg Met Ala Ala Phe Leu Ala

165 170 175

Leu Gln Gln Asn Pro Pro Leu Pro Ile Trp Ser Leu Asp Lys Ala Asn

180 185 190

Val Leu Ala Ser Ser Arg Leu Trp Arg Lys Thr Val Glu Glu Thr Ile

195 200 205

Lys Thr Glu Phe Pro Gln Leu Thr Val Gln His Gln Leu Ile Asp Ser

210 215 220

Ala Ala Met Ile Leu Val Lys Ser Pro Thr Lys Leu Asn Gly Val Val

225 230 235 240

Ile Thr Asn Asn Met Phe Gly Asp Ile Ile Ser Asp Glu Ala Ser Val

245 250 255

Ile Pro Gly Ser Leu Gly Leu Leu Pro Ser Ala Ser Leu Ala Ser Leu

260 265 270

Pro Asp Thr Asn Lys Ala Phe Gly Leu Tyr Glu Pro Cys His Gly Ser

275 280 285

Ala Pro Asp Leu Pro Ala Asn Lys Val Asn Pro Ile Ala Thr Ile Leu

290 295 300

Ser Ala Ala Met Met Leu Lys Leu Ser Leu Asp Leu Val Glu Glu Gly

305 310 315 320

Arg Ala Leu Glu Glu Ala Val Arg Asn Val Leu Asp Ala Gly Val Arg

325 330 335

Thr Gly Asp Leu Gly Gly Ser Asn Ser Thr Thr Glu Val Gly Asp Ala

340 345 350

Ile Ala Lys Ala Val Lys Glu Ile Leu Ala

355 360

<210> 114

<211> 499

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pNUP57

<220>

<223> pNUP57

<400> 114

tcatctgcgc aatgactatc aagaccttct gcaagaattt caaatctcac tgaaaatctt 60

gaccgaaaag tgtcttgaaa acccatcaag cctgcaaaac ctatctttga cattagtctc 120

cattataaaa acggcatagt tgggagaaaa cttttcatac ttcaattgtg gactgatata 180

agtattttgg ttttgcccgc atgatcatcc cacatggcta cagcagttct ctcataggaa 240

atagtacaat agctacgtga tataatctaa ataattgttg ccaatgtgta attatatcat 300

tttgaacgtt cgcgaaatgg attattttca aaaattttgt ttcttgaaat gagtaaaagc 360

aaaagtccaa ctctccaagt cgatgtaaac aactttttgc caaagggact gaaagactaa 420

atcgaggatt atcccgttca aactattcca gaaacgctcg ttagtaacaa aagacatacc 480

ttgttgacca attgatcac 499

<210> 115

<211> 451

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pGAP1

<220>

<223> pGAP1

<400> 115

cactttcacc agatcccaaa tgtcccgccc ctattcccgt gttccatcac gtaccataac 60

ttaccatttc atcacgttct ctatggcaca ctggtactgc ttcgactgct ttgcttcatc 120

ttctctatgg gccaatgagc taatgagcac aatgtgctgc gaaataaagg gatatctaat 180

ttatattatt acattataat atgtactagt gtggttattg gtaattgtac ttaattttga 240

tatataaagg gtggatcttt ttcattttga atcagaattg gaattgcaac ttgtctcttg 300

tcactattac ttaatagtaa ttatatttct tattaacctt ttttttaagt caaaacacca 360

aggacaagaa ctactcttca aaggtatttc aagttatcat acgtctcaca cacgcttcac 420

agtttcaagt aaaaaaaaag aatattacac a 451

<210> 116

<211> 998

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pJEN1

<220>

<223> pJEN1

<400> 116

aatgtgttta taaattattt tttttgctgg tagcaaaatc aactcattgt cttccattca 60

gagtctaatc gaacgttatc gcaatgcttg cacactttta aacaatacga tttagtttaa 120

gtggatggac ccccacgctt agtgttccac aggtttgtcc ccactgtttt tacattccac 180

tgtacatttt tgcaatagaa ggtcattgta tgctaccttg ggcggctaag aatacctgta 240

aaaatttgga gaaattagat tcgtaaagaa tgactcgcaa cgactccaat gatttcttct 300

tttcaccctt tgaacggccg atatccgcgc gggatcctga ccccgcaatt tactccacta 360

gaccggcgtg tttctctttt tccttttcct ggggttagag cccaagagct aatagccgac 420

aaacggactc caaaaaaaaa aggaggcaca ggacaaacgc agcacctgcg tcattcacgc 480

tgaagcggca gcaagcattt tcgatcagct ccaattaaat gaagactatt cgccgtaccg 540

ttcccagatg ggtgcgaaag tcagtgatcg aggaagttat tgagcgcgcg gcttgaaact 600

atttctccat ctcagagccg ccaagcctac cattattctc caccaggaag ttagtttgta 660

agcttctgca caccatccgg acgtccataa ttcttcactt aacggtcttt tgccccccct 720

tctactataa tgcattagaa cgttacctgg tcatttggat ggagatctaa gtaacactta 780

ctatctccta tggtactatc ctttaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatcag 840

caaagtgaag taccctcttg atgtataaat acattgcaca tcattgttga gaaatagttt 900

tggaagttgt ctagtccttc tcccttagat ctaaaaggaa gaagagtaac agtttcaaaa 960

gtttttcctc aaagagatta aatactgcta ctgaaaat 998

<210> 117

<211> 450

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pICL1

<220>

<223> pICL1

<400> 117

ttttgctact cgtcatccga tgagaaaaac tgttcccttt tgccccaggt ttccattcat 60

ccgagcgatc acttatctga cttcgtcact ttttcatttc atccgaaaca atcaaaactg 120

aagccaatca ccacaaaatt aacactcaac gtcatctttc actacccttt acagaagaaa 180

atatccatag tccggactag catcccagta tgtgactcaa tattggtgca aaagagaaaa 240

gcataagtca gtccaaagtc cgcccttaac caggcacatc ggaattcaca aaacgtttct 300

ttattatata aaggagctgc ttcactggca aaattcttat tatttgtctt ggcttgctaa 360

tttcatctta tccttttttt cttttcacac ccaaatacct aacaattgag agaaaactct 420

tagcataaca taacaaaaag tcaacgaaaa 450

<210> 118

<211> 598

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pADH2

<220>

<223> pADH2

<400> 118

tatcttaact gatagtttga tcaaaggggc aaaacgtagg ggcaaacaaa cggaaaaatc 60

gtttctcaaa ttttctgatg ccaagaactc taaccagtct tatctaaaaa ttgccttatg 120

atccgtctct ccggttacag cctgtgtaac tgattaatcc tgcctttcta atcaccattc 180

taatgtttta attaagggat tttgtcttca ttaacggctt tcgctcataa aaatgttatg 240

acgttttgcc cgcaggcggg aaaccatcca cttcacgaga ctgatctcct ctgccggaac 300

accgggcatc tccaacttat aagttggaga aataagagaa tttcagattg agagaatgaa 360

aaaaaaaaaa aaaaaaggca gaggagagca tagaaatggg gttcactttt tggtaaagct 420

atagcatgcc tatcacatat aaatagagtg ccagtagcga cttttttcac actcgaaata 480

ctcttactac tgctctcttg ttgtttttat cacttcttgt ttcttcttgg taaatagaat 540

atcaagctac aaaaagcata caatcaacta tcaactatta actatatcgt aatacaca 598

<210> 119

<211> 793

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<220>

<223> pMLS1

<220>

<223> pMLS1

<400> 119

tgtctaatgc gaaggtactt ttattttttt cagattcaaa gcaatattat ttagacaatt 60

gatactaagt gagcttaagg aggattaaac aactgtggaa tccttcacaa ggattcaata 120

tttgtttttc ctggttattt tgccatcatt caactttcct cagacgtaaa attcgtgctt 180

agtgatgtct caatattccc gcagggtaat aaaattcaat aactatcact atatacgcaa 240

cagtattacc ctacattgct atcggctcaa tggaaatccc catatcatag cttccattgg 300

gccgatgaag ttagtcgacg gatagaagcg gttgtcccct ttcccggcga gccggcagtc 360

gggccgaggt tcggataaat tttgtattgt gttttgattc tgtcatgagt attacttatg 420

ttctctttag gtaaccccag gttaatcaat cacagtttca taccggctag tattcaaatt 480

atgacttttc ttctgcagtg tcagccttac gacgattatc tatgagcttt gaatatagtt 540

tgccgtgatt cgtatcttta attggataat aaaatgcgaa ggatcgatga cccttattat 600

tatttttcta cactggctac cgatttaact catcttcttg aaagtatata agtaacagta 660

aaatataccg tacttctgct aatgttattt gtcccttatt tttcttttct tgtcttatgc 720

tatagtacct aagaataacg actattgttt tgaactaaac aaagtagtaa aagcacataa 780

aagaattaag aaa 793

Claims (15)

1.一种生产苏氨酸的重组酵母，在其基因组中：

(A)至少一种编码天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸和/或至少一种编码可使用NAD和NADP两者作为辅酶的天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；

(B)至少一种编码高丝氨酸激酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；

(C)至少一种编码苏氨酸合酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下；并且

(D)(i)至少一种编码天门冬氨酸激酶的核酸处于诱导型启动子的控制之下；和/或

(ii)至少一种编码天冬氨酸激酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。

2.根据权利要求1所述的重组酵母，在其基因组中至少一种编码天冬氨酸转氨酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。

3.根据权利要求1或2所述的重组酵母，在其基因组中至少一种编码将氧代-戊二酸转化为谷氨酸的谷氨酸脱氢酶的核酸过表达和/或处于诱导型或抑制型启动子的控制之下。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组酵母，在其基因组中至少一种编码高丝氨酸脱氢酶的核酸过表达。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组酵母，在其基因组中：

a)至少一种、优选所有编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶的内源性核酸已被删除，和/或

b)至少一种、优选所有编码高丝氨酸-O-乙酰基转移酶的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的重组酵母，在其基因组中：

a)至少一种、优选所有编码甲硫氨酸合酶的内源性核酸已被删除，和/或

b)至少一种、优选所有编码甲硫氨酸合酶的核酸处于诱导型或抑制型启动子的控制之下和/或处于不稳定的形式。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的重组酵母，在其基因组中至少一种编码可能的转运蛋白的核酸过表达。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组酵母，在其基因组中进行了以下修饰中的至少一种：

(A)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码通用氨基酸通透酶GAP1的内源性核酸，并且任选地：

(i)至少一种编码通用氨基酸通透酶GAP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或

(ii)至少一种编码不稳定的通用氨基酸通透酶GAP1的核酸已经被插入；

(B)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的内源性核酸，并且任选地：

(i)至少一种编码高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或

(ii)至少一种编码不稳定的高亲和力谷氨酰胺通透酶GNP1的核酸已经被插入；

(C)已经从酵母基因组中删除了至少一种、优选所有编码通用氨基酸通透酶AGP1的内源性核酸，并且任选地：

(i)至少一种编码通用氨基酸通透酶AGP1的核酸已经被插入，并处于诱导型或抑制型启动子的控制之下，和/或

(ii)至少一种编码不稳定的通用氨基酸通透酶AGP1的核酸已经被插入。

9.根据权利要求8所述的重组酵母，在其基因组中已经进行了权利要求8中给出的至少两种、优选所有修饰。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组酵母，其中，编码天门冬氨酸激酶、通用氨基酸通透酶、高亲和力谷氨酰胺通透酶、通用氨基酸通透酶、高丝氨酸-O-乙酰基转移酶和甲硫氨酸合酶的核酸独立地是来自酵母的核酸，优选来自酿酒酵母的核酸。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的重组酵母，其中，所述诱导型或抑制型启动子独立地选自由以下组成的组：可用铜诱导或抑制的启动子、可用甲硫氨酸诱导或抑制的启动子和可用苏氨酸诱导或抑制的启动子，特别是选自由以下组成的组：pSAM4、pCUP1-1、pCUP1.Cgla、pCUP1.Sba、pACU1、pACU2、pACU3p、pACU4p、pACU5、pACU6、pACU7、pACU8、pACU9、pACU10p、pACU11、pACU12、pACU13、pACU14、pACU15、pGAL/CUP1p、pCRS5和pCHA1。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的重组酵母，其中，所述诱导型或抑制型启动子独立地选自由以下组成的组：可用铜诱导或抑制的启动子、可用赖氨酸诱导或抑制的启动子和可用甲硫氨酸诱导或抑制的启动子，特别是选自由以下组成的组：pCTR1、pCTR3、pCUR1、pCUR2、pCUR3、pCUR4、pCUR5p、pCUR6、pCUR7、pCUR8、pCUR9、pCUR10、pCUR11、pCUR12、pCUR13、pCUR14、pCUR15、pCUR16、pCUR17、pLYS1、pLYS4、pLYS9、pLYR1p、pLYR2p、pLYR3p、pLYR4p、pLYR5p、pLYR6p、pLYR7p、pLYR8、pLYR9、pLYR10、pLYR11、pMET17、pMET6、pMET14、pMET3、pSAM1、pSAM2、pMDH2、pJEN1、pICL1、pADH2和pMLS1。

13.生产苏氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在培养基中培养如权利要求1至12中任一项定义的重组酵母；和

(b)从所述培养基中回收苏氨酸。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述培养基至少包含碳源，优选选自由葡萄糖和蔗糖组成的组的碳源。

15.如权利要求1至12中任一项定义的重组酵母用于生产苏氨酸的用途。