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KR20130119506A - 임신성 합병증의 진단 및 치료 방법 - Google Patents

임신성 합병증의 진단 및 치료 방법 Download PDF

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KR20130119506A
KR20130119506A KR1020137025428A KR20137025428A KR20130119506A KR 20130119506 A KR20130119506 A KR 20130119506A KR 1020137025428 A KR1020137025428 A KR 1020137025428A KR 20137025428 A KR20137025428 A KR 20137025428A KR 20130119506 A KR20130119506 A KR 20130119506A
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KR
South Korea
Prior art keywords
pregnancy
soluble endoglin
eclampsia
patient
concentration
Prior art date
Application number
KR1020137025428A
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English (en)
Inventor
에스. 아난트 카루만치
비카스 수카트메
Original Assignee
베스 이스라엘 데코니스 메디칼 센터
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

본 발명은 가용성 엔도글린의 농도 또는 생물학적 활성을 측정함으로써 임신관련 고혈압 질환 또는 임신관련 고혈압 질환 발병 가능성에 대한 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 가용성 엔도글린 농도 또는 생물학적 활성을 변경시키는 화합물들을 사용하여, 전자간증 및 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

임신성 합병증의 진단 및 치료 방법{METHODS OF DIAGNOSING AND TREATING COMPLICATIONS OF PREGNANCY}
연방 후원 연구에 관한 진술(Statement as to Federally Sponsored Research)
본 발명은 부분적으로 미국국립보건원 인가 번호 DK 064255 및 HL 079594를 통해 미국 정부의 지지하에 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.
기술분야(Field of the Invention)
일반적으로, 본 발명은 임신관련 고혈압 질환(pregnancy related hypertensive disorders)을 가진 환자의 검출 및 치료에 관한 것이다.
전자간증(Pre-eclampsia)은 고혈압, 부종(edema) 및 단백뇨(proteinuria)의 증상을 보이며 임신 5 내지 10%에 영향을 미치는데, 상당한 모체 및 태아의 질병률(morbidity) 및 사망률(mortality)을 야기할 수 있다. 전자간증은 전세계적으로 해마다 200,000명 이상의 모체의 사망을 일으킨다. 전자간증의 증상들은 전형적으로 임신 20주 후에 나타나며, 보통 여성의 혈압 및 소변의 정기적인 측정에 의해 검출된다. 그러나, 이러한 모니터링 방법들은 증상의 초기 단계에서의 진단에는 비효과적이나, 효과적인 치료를 이용할 수 있다면 환자의 위험을 감소시키거나 태아 분만시의 위험을 감소시킬 수 있다.
현재 전자간증에 대한 알려진 치료법은 없다. 전자간증은 경증에서 생명을 위협할 정도의 증상까지 그 질병의 경중도가 다양할 수 있다. 전자간증의 경증상은 침상 안정(bed rest) 및 잦은 모니터링으로 치료될 수 있다. 심각한 증상들을 완화시키기 위해서, 입원이 권유되고 발작 예방을 위해 혈압 약물처치(blood pressure medication) 또는 항경련제 투여(anticonvulsant medications)가 처방된다. 모체 또는 태아의 생명을 위협할 정도의 증상인 경우에는 임신 상태가 종결되고 태아는 조산된다.
태아 및 태반(placenta)의 적절한 발생은 몇 가지 성장 인자들(growth factors) 또는 혈관형성인자들(angiogenic factors)에 의해 매개된다. 이러한 혈관형성인자들 중 하나는 CD 105로도 알려진, 엔도글린(endoglin)이다. 엔도글린은 동종이량체의 세포막 당단백질(homodimeric cell membrane glycoprotein)인데 융합세포영양막(syncytiotrophoblasts), 제대혈관내피세포(human unbilical vein endothelial cells:HUVEC)와 같은 내피 세포 및 혈관 내피 세포에서 주로 발현된다. 엔도글린은 베타글리칸(betaglycan), 전환성장인자(TGF)-β 수용체 타입 III와 서열 상동성(sequence identity)을 공유한다. 엔도글린은 TGF-β 수용체 복합체의 조절 성분으로 입증되었고, TGF-β 수용체는 혈관 형성(angiogenesis), 증식(proliferation), 분화(differentiation) 및 세포자멸사(apoptosis)를 조절한다. 또한 엔도글린은 액티빈-A(activin-A), 골형태형성단백질(bone morphogenic protein:BMP)-2 및 BMP-7을 포함하여 TGF-β 수퍼패밀리의 다른 몇몇 멤버들에 결합한다. 특히, 엔도글린은 TGF-β1 및 TGF-β3에 고친화도로 결합하고, TGF-β 시그널링 수용체 타입 I 및 II와 이종삼량체의 결합(heterotrimeric associations)을 형성한다. 엔도글린 유전자의 코딩 영역에서의 돌연변이들은 출혈성 모세혈관확장증 타입 1(haemorrhagic telangiectasia type 1:HHT1), 다발적 혈관 형성이상(multisystemic vascular dysplasia) 및 재발성 출혈(recurrent 출혈)로 특징지워지는 우성 유전 혈관 질환(dominantly inherited vascular disorder)의 원인이 된다. 또한 가용성 형태의 엔도글린은 전이성 유방암(metastatic breast cancer) 및 전이성 대장암(metastatic colorectal cancer)을 앓는 환자에게 높은 농도로 존재함을 동정하고 확인할 수 있다. 그러나, 암의 발병기전(pathogenesis)에 있어서 가용성 엔도글린의 정확한 기능적 역할은 명확하지 않다. 가용성 엔도글린의 생산이 전자간증 또는 정상임신에 관련된다고 보고되고 있지는 않다.
몇 가지 인자들은 태아 및 태반의 발생, 더욱 상세하게는, 전자간증에 관련된다는 보고가 있어 왔다. 이들은 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor:VEGF), 가용성 Flt-1 수용체(sFlt- 1) 및 태반 성장 인자(placental 성장 인자:PlGF)를 포함한다. VEGF는 내피 세포-특이성 분열촉진 물질(endothelial cell-specific mitogen)이고, 혈관형성 유발인자(angiogenic inducer)이면서, 혈관 투과성 매개인자(mediator of vascular permeability)이다. 또한 VEGF는 사구체 모세혈관 복원(glomerular capillary repair)에 중요하다고 여겨지고 있다. VEGF는 많은 다른 조직들로부터 얻은 내피 세포에서 다르게 발현되는 두 개의 동종의 막-스패닝(spanning) 티로신 키나아제 수용체들, 즉, fms-유사 티로신 키나아제(Flt-1) 및 키나아제 도메인 수용체 (KDR) 중 하나에 동종이량체로서 결합한다. KDR은 아니지만, Flt-1은 태반의 형성에 기여하는 영양막 세포들(trophoblast cells)에 의해 고발현된다. PlGF는 VEGF 패밀리 멤버로 또한 태반의 발생에 관여한다. PlGF는 세포영양막 및 융합세포영양막에 의해 발현되고, 내피 세포의 증식, 이동(migration) 및 활성화를 유발할 수 있다. PlGF는 Flt-1 수용체에 동종이량체로서 결합하나, KDR 수용체에는 그러하지 아니하다. PlGF 및 VEGF 둘다는 태반 발생에 결정적으로 작용하는 유사분열촉진활성(mitogenic activity) 및 혈관 형성에 기여한다.
수용체의 막통과 및 세포질 도메인들이 없는 sFlt-1은, 최근 인간의 제대 정맥 내피 세포의 배양 배지로 확인되었고 이어서 생체 내(in vivo) 발현이 태반의 조직에서 증명되었다. sFlt-1은 고친화도로 VEGF에 결합하나 내피 세포의 유사분열유도(mitogenesis)를 자극하지는 않는다.
혈관형성 및 유사분열촉진 시그널링 경로들의 주요한 조절은 발생 단계의 태반의 영양막 세포들에 의한 절절한 증식, 이동 및 혈관 형성을 유지하는 데 결정적으로 작용한다.
전자간증 또는 자간증(eclampsia)을 앓고 있거나 발병 위험이 있는 환자에 대한 정확한 진단방법에 대한 요구가 있으며, 특히 가장 심각한 증상이 발병하기 전에 더욱 그러하다. 또한 치료방법도 요구된다.
<발명의 요약>
본 발명은 전자간증 및 자간증을 포함하여 임신관련 고혈압 질환들의 진단 및 치료방법에 관한 것이다.
유전자 발현 분석법(gene expression analysis)을 사용하여, 전자간증을 포함하여 고혈압과 관련된 임신 합병증으로 고통받고 있는 임신한 여성으로부터 채취한 태반 조직 샘플에서 가용성 엔도글린(sE)의 농도가 현저하게 상승하는 것을 발견하였다. 엔도글린은 혈관 형성 조절에 작용하는 TGF-β 수용체 복합체의 일부분이다. 엔도글린은 TGF-β 수용체들의 리간드가 되는 TGF-β 패밀리 멤버들에 고친화도로 결합할 수 있다. 병에 걸린 개체들에서, 과잉의 가용성 엔도글린은 태반의 필요한 양의 필수 혈관형성 및 유사분열촉진 인자들을 고갈시킬 수 있다. 본 발명에서, 가용성 엔도글린에 결합하거나 이를 중화시키는 화합물들은 고농도의 가용성 엔도글린을 감소시키는 데 사용된다. 또한, 생물학적 활성의 가용성 엔도글린의 농도를 낮추도록 지시받는 RNA 간섭(interference) 및 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머들뿐 아니라 가용성 엔도글린에 대한 항체들이 또한 제공된다. 끝으로, 본 발명은 전자간증 및 자간증을 포함하여, 임신관련 고혈압 질환들 또는 그에 대한 소인(predisposition)의 조기 진단 및 관리를 위한 검출 수단(detection tool)으로서 가용성 엔도글린 농도를 측정하는 방법을 제공한다.
따라서, 하나의 양상에서, 본 발명은 환자에게 가용성 엔도글린에 결합 가능한 화합물을 투여함으로써, 환자에 있어서 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하는데, 상기 투여 단계는 환자의 하나 이상의 임신관련 고혈압 질환의 증상을 치료 또는 예방하기에 충분한 시간 및 양으로 투여되는 것을 특징으로 한다. 임신관련 고혈압 질환의 비제한적인 예들은 전자간증, 자간증, 임신성 고혈압(gestational hypertention), 만성 고혈압, HELLP 증후군 및 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)를 갖는 임신을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 화합물은 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 정제된 가용성 엔도글린 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 화합물은 TGF-β 패밀리 멤버(예컨대, TGF-βl, TGF-β3, 액티빈-A, BMP-2 및 BMP-7)와 같은 성장 인자 또는 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합 가능한 그의 단편이다.
다른 바람직한 구현예에서, 또한 상기 방법은 정제된 sFlt-1 항체, sFlt-1 항원-결합 단편, 니코틴, 쎄오필린(theophylline), 아데노신, 니페디핀, 미녹시딜, 황산 마그네슘, VEGF189, VEGF121, VEGF165와 같은 모든 이소폼들(isoforms) 또는 그의 단편들을 포함하는 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 또는 모든 이소폼들 또는 그의 단편들을 포함하는 태반 성장 인자(PlGF)와 같은 화합물을 투여하는 단계를 포함하는데, 상기 투여 단계는 환자의 임신관련 고혈압 질환의 증상을 치료 또는 예방하기에 충분한 시간 및 양으로 투여하는 것을 특징으로 한다.
다른 양상에서, 본 발명은 환자에게 가용성 엔도글린에 결합 가능한 성장 인자의 농도를 증가시키는 화합물(예컨대, 화학적 화합물, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 또는 그의 단편)을 투여함으로써 환자에 있어서 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법을 특징으로 한다. 상기 화합물은 임신관련 고혈압 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 시간 및 양으로 투여된다. 바람직한 구현예에서, 상기 화합물은 TGF-β 패밀리 멤버(예컨대, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP-2 및 BMP-7) 및 그의 단편들의 농도를 증가시킨다. 이러한 화합물들의 비제한적인 예들은 사이클로스포린(cyclosporine), 알파 토코페롤(alpha tocopherol), 메티세르자이드(methysergide), 브로모크립틴(bromocriptine) 및 알도메트(aldomet)를 포함한다.
다른 관련된 양상에서, 본 발명은 성장 인자가 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 결합하는 것을 저해하는 화합물(예컨대, 화학적 화합물, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 또는 그의 단편)을 환자에게 투여함으로써 환자에 있어서 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법을 특징으로 한다. 상기 화합물은 임신관련 고혈압 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 시간 및 양으로 투여된다. 바람직한 구현예에서, 상기 화합물은 가용성 엔도글린에 결합하여 성장 인자의 결합을 방해한다. 이러한 화합물들의 비제한적인 예들은 스크리닝(screening)을 통해 얻은 저분자의 화합물들 및 항체들을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 환자에게 가용성 엔도글린의 발현 또는 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 화합물을 투여함으로써 환자에 있어서 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하는데, 상기 투여 단계는 임신관련 고혈압 질환을 치료 또는 예방하기에 충분하게 투여되는 것을 특징으로 한다. 바람직한 구현예에서, 상기 화합물은 정제된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP), 카뎁신(cathepsin), 또는 엘라스타제(elastase)로 구성되는 군에서 선택되는 단백질 분해효소(proteolytic enzyme)의 효소 활성을 저해하는 화합물이다. 메탈로프로테아제들(MMPs)은 임의의 하나의 MMP 1-26를, 바람직하게 MMP9 또는 막-타입(membrane-type) MMP1을 포함한다.
바람직하게, 가용성 엔도글린의 생물학적 활성을 저해 가능한 상기 화합물은 혈관 형성 분석법에 의해 측정된 바와 같이 엔도글린의 혈관형성 활성을 저해하는 능력에 의해 동정된다. 이러한 분석법의 하나의 예로, 전자간증 환자의 혈청은 항-혈관형성 상태를 유발하도록 매트리겔 튜브 형성 분석법(matrigel tube formation assay)에서 사용된다. 이어서 상기 화합물이 첨가되고 항-혈관형성 상태의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소는 치료상 유효한 화합물임을 나타낸다.
가용성 엔도글린의 생물학적 활성을 저해할 수 있는 상기 화합물은 적어도 가용성 엔도글린의 서열의 적어도 일부분에 대해 80% 이상의, 바람직하게 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 상보성인 하나 이상의 가닥을 갖는 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머일 수 있다. 하나의 구현예에서, 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머는 8, 10 이상의, 바람직하게 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 그 이상의 가용성 엔도글린의 연속적인 뉴클레오티드들에 상보적이고, 이는 가용성 엔도글린의 발현 또는 생물학적 활성을 감소시키거나 저해할 수 있다. 바람직하게, 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머는 길이가 8 내지 30인 뉴클레오티드들이다.
또한 가용성 엔도글린의 생물학적 활성을 저해 가능한 상기 화합물은 가용성 엔도글린 핵산 분자의 서열의 적어도 일부분에 대해 80% 이상의, 바람직하게 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 상보성인 하나 이상의 가닥을 갖는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자일 수 있다. 하나의 구현예에서, 이중 가닥 RNA는 길이가 19 내지 25인 뉴클레오티드들인 작은 간섭 RNA(small interfering RNA:siRNA)인데, 이는 가용성 엔도글린의 발현 또는 생물학적 활성을 감소시키거나 저해할 수 있다. 추가의 바람직한 구현예에서, dsRNA는 가용성 엔도글린 분자의 핵산 서열의 18 이상의, 바람직하게 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 35, 45, 50 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오티드들에 100% 핵산 상동성을 가진다. 바람직하게, dsRNA는 siRNA이다.
상기 임의의 양상에 따른 다양한 구현예에 있어서, 상기 방법은 환자에게 항-고혈압 화합물(예컨대, 아데노신, 니페디핀, 미녹시딜 및 황산 마그네슘)을 투여하는 단계를 더 포함한다. 상기 양상에 따른 다른 구현예에 있어서, 상기 환자는 임신한 사람, 분만 후의 사람(post-partum human), 임신하지 않은 사람, 또는 비-인간(예컨대, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 개, 또는 고양이)이다. 본 발명에 따른 치료방법들은 전자간증, 자간증, 임신성 고혈압, 만성 고혈압, HELLP 증후군 및 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)를 갖는 임신을 포함하는 임신관련 고혈압 질환을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 바람직한 질환들은 전자간증 및 자간증이다. 상기 양상에 따른 다양한 구현예에 있어서, 상기 방법은 후술할 치료 중 환자를 모니터하거나 또는 유효 치료 용량(effective therapeutic dosages)을 결정하기 위한 본 발명의 진단 방법들과 조합될 수 있다.
또한 본 발명의 임의의 치료 양상은 정제된 sFlt-1 항체, sFlt-1 항원-결합 단편, 니코틴, 쎄오필린, 아데노신, 니페디핀, 미녹시딜, 황산 마그네슘, VEGF189, VEGF121 또는 VEGF165, 또는 그의 단편들과 같은 모든 이소폼들을 포함하는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 모든 이소폼들 및 그의 단편들을 포함하는 태반 성장 인자 (PlGF)와 같은, 하나 이상의 추가적인 화합물들을 투여하는 단계를 포함할 수 있는데, 상기 투여 단계는 환자의 전자간증 또는 자간증을 치료 또는 예방하는 데 충분한 시간 및 양으로 투여하는 단계임을 특징으로 한다. 이러한 화합물들의 바람직한 예들은 미국 특허출원공개 제20040126828호 및 제20050025762호 및 PCT 공개 제WO 2004/008946호에 개시되어 있다. 바람직하게, 상기 화합물은 sFlt-1에 결합하거나 또는 sFlt-1 발현을 감소시킬 수 있는 화합물일 수 있다.
본 발명의 임의의 치료 양상은 단독으로 사용되거나 본 발명의 하나 이상의 추가적인 방법들과 조합하여 사용될 수 있다. 하나의 예에서, MMP 저해제 및 항체는 존재하는 가용성 엔도글린을 중화시키고 막 결합 형태(membrane bound form)의 분해에 의해 가용성 엔도글린을 더 생산하는 것을 차단하도록 조합하여 사용될 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 정제된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 항체는 가용성 엔도글린에 대한 성장 인자(예컨대, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP-2 및BMP-7)의 결합을 방해한다. 다른 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 다른 바람직한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간의 또는 인간화 항체(humanized antibody)이다. 다른 구현예에서, 항체는 Fc부가 결여된다. 좀더 다른 구현예에서, 항체는 F(ab')2, Fab 또는 Fv 구조이다. 다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 제약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)로 존재한다.
다른 양상에서, 본 발명은 환자의 얻은 샘플에서 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 발병 또는 발병 소인이 있는 환자의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서 가용성 엔도글린의 농도는 유리되거나, 결합되거나, 또는 전체 가용성 엔도글린의 농도이다. 어떤 구현예에서, 가용성 엔도글린의 농도는 분해(degradation) 또는 효소적 절단(enzymatic cleavage)으로부터 기인한 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 농도이다. 임신관련 고혈압 질환 또는 임신관련 고혈압 질환의 발병 가능성의 진단은 정상 기준 샘플(normal reference sample)과 비교하여 가용성 엔도글린의 상대적인 농도의 변경(예컨대, 증가)에 기인하거나 또는 상기 정상 기준값(reference value)에 대한 가용성 엔도글린의 절대적인 농도의 검출에 기인할 수 있다. 예를 들어, 통상적으로, 가용성 엔도글린의 순환 혈청(circulating serum) 또는 혈장(plasma) 농도는 임신하지 않은 상태 중에는 2-7 ng/ml 및 정상 임신 중에는 10-20 ng/ml의 범위를 가진다. 구현예들이 가용성 엔도글린의 절대적인 농도의 측정을 포함하기 때문에, 15 ng/ml, 20 ng/ml 이상의, 또는 바람직하게 25 ng/ml 이상의 농도는, 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 진단 인디케이터로 고려될 수 있다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 미국 특허출원공개 제20040126828호, 제20050025762호 및 제2005017044호 및 PCT 공개 제WO 2004/008946호 및 제WO 2005/077007호에 개시된 바와 같이 환자로부터 얻은 샘플에서 하나 이상의 sFlt-1, VEGF 또는 PlGF 폴리펩티드를 측정하는 단계를 더 포함한다. 또한 상기 방법은 환자로부터 얻은 샘플에서 sFlt-1, VEGF 또는 PlGF 폴리펩티드의 둘 이상의 농도를 측정하고, 메트릭(metric)을 사용하여 sFlt-1, VEGF 또는 PlGF의 농도 사이의 관계를 계산하는 단계를 포함할 수 있는데, 상기 기준 샘플에 대한 환자 샘플의 변경은 임신관련 고혈압 질환 또는 임신관련 고혈압 질환의 발병 가능성이 있는 것으로 진단된다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 또한 체질량지수(BMI), 태아의 재태기간(gestational age:GA), 또는 둘다를 결정하는 단계 및 메트릭에 BMI 또는 GA 또는 둘다를 대입하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 메트릭은 전자간증 항-혈관형성 지수(pre-eclampsia anti- angiogenic index:PAAI):[sFlt-1/VEGF + PlGF]인데, 상기 PAAI는 항-혈관형성 활성의 인디케이터로 사용된다. 하나의 구현예에서, 10 이상의, 더욱 바람직하게 20 이상의 PAAI는, 전자간증 또는 자간증을 나타내는 것이다. 다른 구현예에서 메트릭은 다음의 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수: (sFlt-1 + 0.25(가용성 엔도글린 폴리펩티드))/PlGF이다. 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 값의 증가는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 진단 인디케이터이다. 예를 들어 임신 21-32주 기간에 75 이상의 값 또는 임신 32주 이후의 기간에 100 이상의 값은 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환이 있음을 진단한다. 본 발명의 진단을 위한 정보 제공 방법에 있어 다른 유용한 메트릭은: (가용성 엔도글린 + sFlt-l)/PlGF이다. 또한 상기 방법들 중 임의의 방법은 체질량지수(BMI), 태아의 재태기간(GA) 또는 둘다를 결정하는 단계 및 메트릭에 BMI 또는 GA 또는 둘다를 대입하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 양상에 따른 다양한 구현예에 있어서, 샘플은 소변, 양수, 혈액, 혈청, 혈장 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)과 같은 체액(bodily fluid)이다. 바람직하게, 가용성 엔도글린, sFlt-1, VEGF 또는 PlGF 폴리펩티드의 농도는 ELISA와 같은 면역학적 분석법에 의해 측정된다. 다른 예에서, 가용성 엔도글린의 농도가 20 이상, 바람직하게 25 ng/ml 이상인 경우 자체 또는 증가된 sFlt-1 및 감소된 유리 PlGF 또는 VEGF가 함께 나타나는 것은 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 진단에 사용된다.
하나의 구현예에서, 가용성 엔도글린의 농도의 증가는 전자간증 또는 자간증의 발병 또는 발병 가능성을 나타낸다. 상기 양상의 바람직한 구현예에서, 측정된 sFlt-1 폴리펩티드의 농도는 유리되거나, 결합되거나, 또는 전체 sFlt-1 폴리펩티드의 농도이다. 추가적인 구현예에서, 또한 sFlt-1 폴리펩티드는 sFlt-1 단편들, 분해 산물들(degradation products) 또는 효소적 절단 산물들(enzymatic cleavage products)을 포함할 수 있다. 상기 양상의 다른 바람직한 구현예에서, VEGF 또는 PlGF의 농도는 유리된 VEGF 또는 PlGF의 농도이다. 다른 양상에서, 본 발명은 환자로부터 얻은 샘플에서 엔도글린 핵산 분자(예컨대, mRNA), 바람직하게 가용성 엔도글린 핵산의 농도를 측정하는 단계 및 그것과 기준 샘플을 비교하는 단계를 포함하는, 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 발병 또는 발병 소인에 대한 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는데, 상기 기준 샘플(예컨대, 정상 기준)에 비해 농도의 변경(예컨대, 증가)은 환자의, 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 진단하거나, 또는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 발병 가능성을 진단한다. 추가적인 구현예에서, 상기 방법은 환자로부터 얻은 샘플에서 sFlt-1, VEGF 또는 PlGF 핵산 분자(예컨대, mRNA)의 농도를 측정하는 단계 및 그것과 기준 샘플을 비교하는 단계를 더 포함할 수 있는데, 상기 정상 기준 샘플에 비해 농도의 변경(예컨대, VEGF 또는 PlGF 농도의 감소 또는 sFlt-1 농도의 증가)은 환자의, 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 진단하거나, 또는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 발병 가능성을 진단한다.
상기 진단 양상들의 바람직한 구현예에서, 상기 농도는 둘 이상의 경우들(occasions)에 대해 측정되고 측정값들 사이의 농도의 변화는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 진단 인디케이터가 된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 제 1 측정에서 제 2 측정 사이의 가용성 엔도글린의 농도의 증가(예컨대, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 진단에 사용된다. 상기 진단 양상들의 다른 구현예에서, 가용성 엔도글린의 농도는 정상 기준 샘플과 비교되는데, 정상 기준 샘플과 비교되는 가용성 엔도글린의 농도의 증가(예컨대, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)는 전자간증 또는 자간증을 나타낸다.
다른 양상에서, 본 발명은 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 발병 또는 발병 소인의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는데, 이는 환자의 엔도글린 유전자의 핵산 서열을 결정하는 단계 및 그것과 기준 서열을 비교하는 단계를 포함하며, 상기 환자의 유전자 산물의 농도 또는 생물학적 활성을 변화시키는 환자의 핵산 서열의 변경은 환자의 임신관련 고혈압 질환의 발병 또는 발병 가능성을 진단한다. 하나의 구현예에서, 변경은 핵산 서열의 다형성(polymorphism)이다. 다른 구현예에서, 또한 sFlt-1 , VEGF 또는 PlGF, 또는 이들의 임의의 조합의 핵산 서열, 유전자는 결정되고 기준 서열과 비교된다. 환자의 유전자 산물의 농도 또는 생물학적 활성을 변화시키는 이러한 임의의 하나 이상의 서열들의 변경은 환자의 임신관련 고혈압 질환의 발병을 진단한다.
상기 양상에 따른 다양한 구현예에 있어서, 샘플은 가용성 엔도글린 및 sFlt-1, VEGF 또는 PlGF를 정상적으로 검출할 수 있는 환자의 체액(예컨대, 소변, 양수, 혈액, 혈청, 혈장, 또는 뇌척수액)이다. 추가적인 구현예에서, 샘플은 조직 또는 세포(예컨대, 태반 조직 또는 태반 세포들, 내피 세포, 백혈구 및 단핵구)이다. 상기 양상에 따른 다른 구현예에 있어서, 환자는 임신하지 않은 사람, 임신한 사람 또는 분만 후의 사람이다. 상기 양상에 따른 다른 구현예에 있어서, 환자는 비-인간(예컨대, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 개, 또는 고양이)이다. 하나의 구현예에서, 환자는 임신하지 않은 또는 임신한 사람이고, 상기 방법은 전자간증 또는 자간증의 발병 가능성을 진단하는데 사용된다. 추가적인 구현예에서, 또한 BMI 또는 GA 또는 둘다가 측정된다. 상기 양상에 따른 다양한 구현예에 있어서, 기준에 비해 가용성 엔도글린 핵산 또는 폴리펩티드 농도의 증가는 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터이다.
다른 양상에서, 본 발명은 환자로부터 얻은 샘플에서 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP-2 및 BMP-7과 같은, 가용성 엔도글린 리간드의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 발병 또는 발병 가능성이 있는 환자의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 임의의 진단 양상들의 다양한 구현예에서, 임신관련 고혈압 질환은 전자간증, 자간증, 임신성 고혈압, 만성 고혈압, HELLP 증후군, 또는 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)를 갖는 임신이다. 임의의 진단 양상들에서, 농도의 측정 단계는 둘 이상의 경우들에 대해 수행되며, 측정값들 사이에서 농도의 증가는 임신관련 고혈압 질환의 진단 인디케이터가 된다. 진단을 위한 정보 제공 방법들은 증상이 발병하기 전(예컨대, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주 전)에 임신관련 고혈압 질환으로 진단하는 데 사용하는 것이 바람직하다.
다른 양상에서, 본 발명은 엔도글린 핵산 또는 그의 단편, 또는 그에 대해 상보적인 서열을 검출하는 데 유용한 핵산 서열을 포함하는 환자의, 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 진단용 키트를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 핵산 서열은, 바람직하게 고엄격성(high stringency) 조건에서, 가용성 엔도글린 또는 그의 단편을 인코딩하는 핵산에 혼성화(hybridize)된다. 바람직한 구현예에서, 상기 키트는 sFlt-1, VEGF 또는 PlGF의 검출용 핵산 서열을 더 포함한다.
관련 양상에서, 본 발명은 가용성 엔도글린 결합 분자(예컨대, 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편)를 포함하는 환자의, 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 진단용 키트를 제공한다. 하나의 구현예에서, 상기 구성요소는 면역학적 분석법, 효소 분석법, 또는 비색 분석법(colorimetric assay)이다. 상기 양상에 따른 다른 구현예에 있어서, 상기 키트는 임신 또는 임신하지 않은 환자의 전자간증 또는 자간증의 발병 가능성을 진단한다. 상기 양상의 바람직한 구현예에서, 또한 상기 키트는 sFlt-1, VEGF 또는 PlGF 폴리펩티드의 검출용 구성요소를 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 키트는 가용성 엔도글린을 검출하고, VEGF, sFlt-1 및 PlGF를 더 검출하며 샘플(예컨대, PAAI 또는 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수)용 진단비(diagnostic ratio)를 결정하는 데 사용된다.
바람직한 구현예에서, 상기 진단 키트들은 상기 키트 구성 요소들의 의도된 사용을 위한 라벨(label) 또는 설명서들(instructions)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 진단 키트는 라벨화되거나 또는 환자의 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 발병, 또는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 발병 가능성의 진단에 사용하기 위한 설명서들을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 진단 키트는 환자 샘플의 가용성 엔도글린의 농도를 결정하고 기준값에 대해 가용성 엔도글린 농도를 비교하도록 상기 키트를 사용하기 위한 라벨 또는 설명서들들을 포함한다. 기준값들이 상기 키트의 의도된 사용에 의존할 것이라는 것을 이해해야 할 것이다. 예를 들어, 샘플은 정상 가용성 엔도글린 기준값과 비교될 수 있는데, 상기 가용성 엔도글린 농도의 증가는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 나타낸다. 또한 샘플은 전자간증을 앓는 것으로 알려진 환자로부터 얻은 값 또는 샘플인 기준에 비교될 수 있는데, 상기 가용성 엔도글린 농도의 감소는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 나타낸다.
관련 양상에서, 본 발명은 기준 샘플에 대한 가용성 엔도글린 폴리펩티드 또는 핵산 농도의 측정 및/또는 비교를 위한 구성 요소들을 제공함으로써 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 발병 또는 발병 소인이 있는 환자의 진단용 장치를 제공함을 특징으로 하는데, 상기 정상 기준값과 비교되는 가용성 엔도글린의 농도의 변경은 환자의 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 진단한다. 바람직한 구현예에서, 상기 장치는 소변 샘플에서 폴리펩티드 농도를 측정 및 비교하는데 사용되는 측면 흐름(lateral flow) 또는 딥스틱 포맷(dipstick format)의 막을 포함한다.
또한 상기 장치는 기준 샘플에 비해 환자로부터 얻은 샘플에서 가용성 엔도글린 및 sFlt-1, VEGF 및 PlGF 핵산 분자들 또는 폴리펩티드들 중 하나 이상의 농도를 비교하기 위한 구성 요소들을 포함할 수 있는데, 상기 가용성 엔도글린 및 하나 이상의 sFlt-1, VEGF 및PlGF 핵산 분자들 또는 폴리펩티드들 중 하나 이상의 농도의 변경은 환자의 전자간증 또는 자간증의 발병 또는 전자간증 또는 자간증의 발병 가능성을 진단한다. 바람직한 구현예에서 상기 장치는 가용성 엔도글린 및 sFlt-1, VEGF 및 PlGF 폴리펩티드들 중 하나 이상의 농도를 비교하는 메트릭용 구성 요소들을 포함한다.
또한 본 명세서에 개시된 임의의 진단을 위한 정보 제공 방법들 및 키트들은 치료 중 환자를 모니터하거나 또는 유효 치료 용량을 결정하기 위해 전자간증 또는 자간증의 발병 또는 발병 위험이 있다고 진단받은 환자를 모니터하는 데 사용될 수 있다. 하나의 예에서, 치료 모니터링에 사용되는 키트는 전자간증 또는 자간증을 나타내는 기준 가용성 엔도글린 값을 가질 수 있는데, 상기 기준 샘플에 비해 환자 샘플의 가용성 엔도글린 값의 감소는 치료 효능 또는 치료 화합물들의 유효 용량을 나타내는데 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 키트는 라벨화되거나 또는 치료 모니터링 또는 치료 용량 결정에 사용하기 위한 설명서들을 포함하며, 치료 화합물이 상기 키트에 포함될 수 있다. 가용성 엔도글린 단백질 또는 핵산의 농도는 단독으로 측정되거나 sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF 단백질 또는 핵산들, 또는 이들의 임의의 조합의 농도와 함께 측정된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 가용성 엔도글린의 농도는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 나타내는 기준 샘플과 비교되고, 기준 샘플에 비해 가용성 엔도글린 농도의 변경(예컨대, 감소)은 치료 효능 또는 치료 화합물의 유효 용량을 나타낸다. 하나의 예에서, 투여 치료 전의 값에 비해 투여 치료 중 또는 그 후에 측정된 가용성 엔도글린 폴리펩티드 또는 핵산의 농도의 감소(예컨대, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상)는 임신관련 고혈압 질환의 개선을 나타낸다. 다른 예에서, 혈청 또는 혈장에서의 가용성 엔도글린의 절대적인 농도가 측정되고 상기 화합물의 치료 효능을 모니터링하는 데 사용된다. 예를 들어, 바람직하게 치료 화합물은 가용성 엔도글린의 농도가 25 ng/ml 미만, 바람직하게 20 ng/ml 미만의 용량으로 투여된다.
sFlt-1의 측정을 포함하는 상기 치료 모니터링 양상들의 구현예에서, sFlt-1 폴리펩티드 또는 핵산의 농도의 감소는 전자간증 또는 자간증의 개선을 나타낸다. 다른 구현예에서, 치료 화합물은 sFlt-1 폴리펩티드의 농도가 2 ng/ml 미만이 되는 용량으로 투여된다. VEGF 또는 PlGF의 측정을 포함하는 구현예에서, 치료 전의 값에 비해 투여 치료 중 또는 그 후에 측정된 VEGF 또는 PlGF 폴리펩티드 또는 핵산의 농도의 증가는 전자간증 또는 자간증의 개선을 나타낸다. 가용성 엔도글린의 측정 이외에 sFlt-1, VEGF 또는 PlGF의 측정을 포함하는 구현예에서, 상기 방법은 메트릭을 사용하여 sFlt-1, VEGF 또는 PlGF의 농도 사이의 관계를 계산하는 단계를 포함할 수 있는데, 상기 기준 샘플에 비해 환자 샘플에서 상기 농도 사이의 관계의 변경은, 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터이다. 이러한 메트릭의 한 예는 PAAI이다. 이러한 예에서, 환자의 PAAI 값의 감소(예컨대, 20 미만, 바람직하게 10 미만)는 전자간증 또는 자간증의 개선을 나타낸다. 또한 PAAI의 감소(예컨대, 20 미만, 바람직하게 10 미만)는 치료 화합물의 유효 용량을 나타낼 수 있다. 다른 예는 다음의 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수인데, 상기 그러한 값의 증가는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 진단 인디케이터이다.
치료 처리의 진단 또는 모니터링에 관련된 양상들의 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드들은 ELISA 또는 웨스턴 블롯(western blot)과 같은 면역학적 분석법을 사용하여 측정된다. 가용성 엔도글린의 농도는 분해 또는 효소적 절단에 기인한 가용성 엔도글린의 농도뿐 아니라 유리되거나, 결합되거나(예컨대, 리간드에 결합) 또는 전체(즉, 유리된 것 + 결합된 것) 가용성 엔도글린의 농도일 수 있다. 임의의 모니터링 방법들에 있어서, 농도의 측정 단계는 둘 이상의 경우에 대해 수행될 수 있으며 측정값들 사이의 농도의 변화는 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터가 된다.
다른 양상에서, 본 발명은 엔도글린 핵산 분자를 발현하는 세포와 후보 화합물(candidate compound)을 접촉시키는 단계 및 후보 화합물에 의해 접촉된 세포에서의 핵산 분자의 발현 농도와 후보 화합물에 의해 접촉되지 않은 대조군 세포에서의 발현 농도를 비교하는 단계를 포함하는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 상기 엔도글린 핵산 분자의 발현의 변경은 후보 화합물이 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 데 유용한 화합물임을 확인한다.
다른 양상에서, 본 발명은 가용성 엔도글린 폴리펩티드를 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계 및 후보 화합물에 의해 접촉된 세포에서의 폴리펩티드의 발현 농도와 후보 화합물에 의해 접촉되지 않은 대조군 세포에서의 폴리펩티드 발현 농도를 비교하는 단계를 포함하는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 상기 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 발현의 변경은 후보 화합물이 임신관련 고혈압 질환을 개선하는데 유용한 화합물임을 확인한다. 하나의 구현예에서, 발현의 변경은 면역학적 분석법(immunological assay), 효소 분석법(enzymatic assay), 또는 면역 분석법(immunoassay)을 사용하여 분석된다. 하나의 구현예에서, 발현의 변경은 가용성 엔도글린의 농도의 감소이다. 발현의 변경은 전사(transcription)의 변경 또는 번역(translation)의 변경에 기인할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 가용성 엔도글린 폴리펩티드를 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계 및 후보 화합물에 의해 접촉된 세포에서의 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 생물학적 활성과 후보 화합물에 의해 접촉되지 않은 대조군 세포에서의 생물학적 활성 농도를 비교하는 단계를 포함하는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 상기 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 생물학적 활성의 변경은 후보 화합물이 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 화합물임을 확인한다. 하나의 구현예에서, 변경은 혈관 형성 분석법(angiogenesis assay), 성장 인자 결합 분석법(growth factor binding assay), 또는 본 명세서에 개시된 임의의 분석법들을 사용하여 분석된 바와 같이 가용성 엔도글린의 생물학적 활성의 감소이다.
다른 양상에서, 본 발명은 가용성 엔도글린 폴리펩티드와 후보 화합물의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 상기 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 결합하는 화합물은 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 데 유용할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 후보 화합물의 존재하에서 가용성 엔도글린 폴리펩티드와 성장 인자 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 상기 후보 화합물의 부존재시 가용성 엔도글린 폴리펩티드와 성장 인자 사이의 결합에 비해, 가용성 엔도글린 폴리펩티드와 성장 인자의 결합의 감소는 후보 화합물이 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 데 유용한 화합물임을 확인한다. 하나의 구현예에서, 상기 성장 인자는 TGF-β 패밀리 멤버이다.
다른 양상에서, 본 발명은 가용성 엔도글린 폴리펩티드와 성장 인자 사이의 결합을 방해하는 폴리펩티드를 동정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 후보 폴리펩티드의 존재시 가용성 엔도글린 폴리펩티드와 성장 인자 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함하는데, 상기 후보 폴리펩티드의 부존재시 가용성 엔도글린 폴리펩티드와 성장 인자 사이의 결합에 비해, 결합의 감소는 후보 폴리펩티드가 가용성 엔도글린 폴리펩티드와 성장 인자 사이의 결합을 방해하는 폴리펩티드임을 확인한다. 하나의 구현예에서, 상기 성장 인자는 TGF-β 패밀리 멤버이다.
관련 양상에서, 본 발명은 상기 양상에 따라 동정된 화합물을 제공하는데, 상기 화합물은 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 특이적으로 결합하여 가용성 엔도글린 폴리펩티드가 TGF-β 패밀리 멤버와 결합하는 것을 방해하는 폴리펩티드이다. 하나의 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 가용성 엔도글린에 결합하는 항체이며, 바람직하게 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 명세서에 개시된 상기 방법들은 특히 전자간증 및 자간증에 관해 언급하고 있으나, 본 발명의 진단 및 모니터링 방법은 또한 임신성 고혈압, HELLP 증후군 및 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)를 갖는 임신을 포함하여 고혈압과 관련된 일반적인 임신 합병증에 제한 없이 적용됨을 이해해야 할 것이다.
본 발명의 목적에 따라, 다음의 약어 및 용어가 다음과 같이 정의된다.
"변경(alteration)"은 후술하는 바와 같이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 방법에 의해 검출되는 유전자 또는 폴리펩티드의 발현 농도의 변화(증가 또는 감소)를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 변경은 발현 농도의 10%의 변화, 바람직하게 25%의 변화, 더욱 바람직하게 발현 농도의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 변화를 포함한다. 또한 "변경(alteration)"은 본 발명의 임의의 폴리펩티드들(예컨대, 가용성 엔도글린, sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF)의 생물학적 활성의 변화(증가 또는 감소)를 나타낼 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 변경은 생물학적 활성의 10%의 변화, 바람직하게 25%의 변화, 더욱 바람직하게 생물학적 활성의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 변화를 포함한다. 가용성 엔도글린의 생물학적 활성의 예들은 액티빈-A, BMP-2, BMP-7, TGF-β1 및 TGF-β3과 같은 잘 알려진 리간드들을 사용하여 혈관 형성 및 결합 분석법(angiogenesis and binding assays)으로 분석된다. 가용성 엔도글린의 생물학적 활성은 본 발명이 속하는 기술 분야 또는 본 명세서에 개시된 리간드 결합 분석법(ligand binding assays), 면역 분석법(immunoassays) 및 혈관 형성 분석법(angiogenesis assays)에 의해 측정될 수 있다. 이러한 분석법의 예는 엔도글린 시그널링의 길항 작용(antagonism)이 모세관 형성시 질량 손실을 초래하는 생체 외 매트리겔 내피 튜브 형성 분석법(in vitro matrigel endothelial tube formation assay)이 있다(Li et al., Faseb Journal 14:55-64 (2000)). PlGF 또는 VEGF의 생물학적 활성의 다른 예들은 면역 분석법, 리간드 결합 분석법 또는 Scatchard plot 분석법에 의해 측정되는 바와 같은 수용체들에 대한 결합 및 BrdU 라벨(BrdU labeling), 세포 계수 실험법(cell counting experiments), 또는 3H-티미딘 편입 분석법(3H-thymidine incorporation)과 같은 DNA 합성에 대한 정량 분석법(quantitative assays)에 의해 측정되는 바와 같은 세포 증식 또는 이동의 유발을 포함한다. sFlt-1의 생물학적 활성의 예들은 면역 분석법, 리간드 결합 분석법, 또는 Scatchard plot 분석법에 의해 측정되는 바와 같은 PlGF 및 VEGF에 대한 결합을 포함한다. 각각의 폴리펩티드들의 생물학적 활성 분석법의 추가적인 예들은 본 명세서에 개시되어 있다.
"안티센스 뉴클레오베이스 올리고머(antisense nucleobase oligomer)"는 길이에 무관하게, 엔도글린 유전자의 mRNA 또는 코드화 가닥(coding strand)에 상보적인 뉴클레오베이스 올리고머를 의미한다. "뉴클레오베이스 올리고머(nucleobase oligomer)"는 연결기들(linkage groups)에 의해 서로 연결된, 8 이상의 뉴클레오베이스들, 바람직하게 12 이상 및 가장 바람직하게 16 이상의 염기들의 사슬을 포함하는 화합물을 의미한다. 이러한 정의는 단백질 핵산(Protein Nucleic Acids), 록 핵산(locked nucleic acids) 및 아라비노핵산(arabinonucleic acids)과 같은 올리고뉴클레오티드 유사체들(oligonucleotide mimetics)뿐 아니라, 변형된 및 변형되지 않은 것 모두, 자연의 및 비-자연의 올리고뉴클레오티드들을 모두 포함하는 것으로 고려될 수 있다. 다수의 뉴클레오베이스들 및 연결기들은 참조로서 본 명세서에 편입된, 미국 특허공개 제20030114412호(예를 들어 공개문 단락 27-45 참조) 및 제20030114407호(예를 들어 공개문 단락 35-52 참조)에 개시된 것들을 포함하여, 본 발명의 뉴클레오베이스 올리고머들로 이용될 수 있다. 또한 뉴클레오베이스 올리고머는 번역의 개시 및 종결 사이트로 표적화 될 수 있다. 바람직하게 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머는 약 8 내지 30 뉴클레오티드들을 포함한다. 또한 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머는 엔도글린 mRNA 또는 DNA에 상보적인 40, 60, 85, 120, 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오티드들을 포함할 수 있고, 전장(full-length) mRNA 또는 유전자일 수 있다.
"체질량지수(body mass index)"는 키 및 체중을 이용하여 구해지는, 체중이 건강 범위 내에 포함되는지 아닌지를 일반적으로 나타내주는 수를 의미한다. 체질량지수를 결정하는데 일반적으로 사용되는 공식은 인간의 체중(kg)을 키(m)의 제곱으로 나눈 값, 즉 체중(kg)/(키(m))2 이다.
"화합물(compound)"은 임의의 저분자 화학적 화합물(small molecule chemical compound), 항체, 핵산 분자, 또는 폴리펩티드, 또는 그의 단편들을 의미한다. 본 발명의 치료방법들에 특히 유용한 화합물들은 가용성 엔도글린의 농도 또는 생물학적 활성이 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 변경되거나, 바람직하게 감소될 수 있다.
"키메라 항체(chimeric antibody)"는 하나 이상의 다른 단백질의 부분(전형적으로 면역글로불린 불변 도메인(immunoglobulin constant domain))에 연결된 항체 분자의 하나 이상의 항원-결합부(antigen-binding portion)를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.
"이중-가닥 RNA(double-stranded RNA:dsRNA)"은 센스 및 안티센스 가닥을 둘다 포함하는 리보핵산 분자(ribonucleic acid molecule)를 의미한다. dsRNAs는 전형적으로 RNA 간섭(RNA interference)을 매개하는 데 사용된다.
또한 CD 105로도 알려진, "엔도글린(endoglin)"은 엔도글린의 생물학적 활성을 갖는 포유동물의 성장 인자(Fonsatti et al., Oncogene 22:6557-6563, 2003; Fonsatti et al., Curr. Cancer Drug Targets 3:427-432, 2003)를 의미하고, 임의의 다음의 GenBank accession numbers 중 임의의 것으로 한정되는 단백질에 대해 상동성이 있다: AAH29080 및 NP_031958(마우스); AAS67893(랫트); NP_000109, P17813, VSP_004233 및 CAA80673(인간); 및 A49722 (돼지), 또는 미국 특허 제6,562,957호에 개시된 것. 엔도글린은 태반으로부터의 융합세포영양막 및 증식하는 혈관 세포들에서 고농도로 발현되는 동종이합체의 세포막 당단백질이다. 47개의 아미노산들에 의해 그들의 세포질 테일들(tails)에 차이가 있는 L 및 S, 두 가지의 별개의 엔도글린의 이소폼들이 있다. 이소폼들 둘다는 본 명세서에서 사용된 바와 같이 엔도글린에 포함된다. 엔도글린은 TGF-β의 존재시, TGF-β 패밀리 멤버들에 결합하고, 엔도글린은 TGF-β 시그널링 수용체들 RI 및 RII에 관련될 수 있고, 성장 인자들에 대한 반응을 강화할 수 있다. 엔도글린의 생물학적 활성은 액티빈-A, BMP-2, BMP-7, TGF-βl 및 TGF-β3과 같은 TGF-β 패밀리 멤버들에 대한 결합; 혈관 형성의 유발, 세포 증식, 부착(attachment), 이동, 침입(invasion)의 조절; 및 내피 세포의 활성화를 포함한다. 엔도글린의 생물학적 활성의 분석법들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있고, 리간드 결합 분석법들 또는 Scatchard plot 분석법; BrdU 라벨, 세포 계수 실험법, 세포 증식의 측정시 사용되는 3H-티미딘 편입 분석법과 같은 DNA 합성 분석을 위한 정량 분석법들; 및 본 명세서 또는 McCarty et al., Intl. J. Oncol. 21:5-10, 2002; Akhtar et al. Clin. Chem. 49:32-40, 2003; 및 Yamashita et al, J. Biol. Chem. 269:1995-2001, 1994에 개시된 바와 같은 혈관 형성 분석법들을 포함한다. "가용성 엔도글린(soluble endoglin)"은 단백질의 세포외부(extracellular portion)의 하나 이상의 부분을 포함하는 엔도글린의 임의의 순환하는(circulating), 막에 결합하지 않은 형태(non-membrane bound form)를 의미한다(도 1 참조). 가용성 엔도글린은 단백질 분해효소(proteolytic enzyme)에 의한 엔도글린의 막 결합 형태의 절단(cleavage)으로부터 기인할 수 있다. 하나의 잠재적인 절단 사이트(potential cleavage site)는 1-437 아미노산의 엔도글린 폴리펩티드를 포함하는 가용성 엔도글린 폴리펩티드를 생성하는 437 아미노산에 있다(도 2 A 및 2B 참조). 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 가용성 엔도글린에 의해 보유된 세포외 리간드 결합 도메인(extracellular ligand binding domain)은 TGF-βl 및 TGF-β3과 같은 리간드들에의 결합을 허용하고, 그에 의해 TGF-β의 결손(deficiency)을 가져올 것이다. 더욱이, 엔도글린은 내피-특이성 분자(endothelial-specific molecule)이기 때문에, TGF-β의 결손은 내피 세포에서 최대가 될 것이다. 또한 가용성 엔도글린은 엔도글린의 효소적 절단에 기인하고 엔도글린의 생물학적 활성을 유지하는 순환성 분해 산물들(circulating degradation products) 또는 단편들을 포함할 수 있다. 가용성 엔도글린의 생물학적 기능은 현시점에서 잘 알려지지 않았으나, TGF-β 및 다른 잘 알려진 리간드들의 결손을 일으킬 것을 예상할 수 있다. 가용성 엔도글린의 생물학적 활성은 유리된 액티빈 A 또는 유리된 TGF-β3의 농도를 측정함으로써 또는 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려졌거나 또는 본 명세서에 개시된 혈관 형성 분석법을 사용하여 분석될 수 있다.
"엔도글린 핵산(endoglin nucleic acid)"은 상술한 임의의 엔도글린 단백질들을 인코딩하는 핵산을 의미한다. 예를 들어, 인간의 엔도글린 유전자는 14 엑손들(exons)로 구성되는데, 상기 엑손 1은 시그널 펩티드 서열(signal peptide sequence)을 인코딩하고, 엑손들 2-12는 세포외 도메인(extracellular domain)을 인코딩하고, 엑손 13은 세포막 도메인(transmembrane domain)을 인코딩하고, 엑손 14는 C-터미널 세포질 도메인(C-terminal cytoplasmic domain)을 인코딩한다(도 1, 2A 및 2B 참조). 바람직하게, 엔도글린 핵산은 가용성 엔도글린을 인코딩한다(도 2A 참조).
"발현(expression)"은 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 방법에 의한 유전자 또는 폴리펩티드의 검출(detection)을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드 발현은 종종 웨스턴 블롯팅(western blotting)에 의해 검출되고, DNA 발현은 종종 서던 블롯팅(Southern blotting) 또는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction:PCR)에 의해 검출되고, RNA 발현은 종종 노던 블롯팅(northern blotting), PCR, 또는 RNAse 프로텍션 분석법들(RNAse protection assays)에 의해 검출된다.
"단편(fragment)"은 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 부분(portion)을 의미한다. 이러한 부분은 바람직하게, 기준 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상을 포함한다. 단편들은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 뉴클레오티드들 또는 아미노산들을 포함할 수 있다. 바람직하게, 가용성 엔도글린의 단편들은 4 내지 437 아미노산들 및 10 내지 1311 뉴클레오티드들을 포함한다.
"재태기간(gestational age)"은 보통 주로써 언급되는 모체의 최종 월경기간의 첫날로부터 기산하는, 태아의 나이를 의미한다.
"임신성 고혈압(gestational hypertension)"은 임신 20주 이후에 단백뇨(proteinuria) 없이 고혈압(high blood pressure)이 발병하는 것을 의미한다.
"전자간증 또는 자간증의 병력(history of pre-eclampsia or eclampsia)"은 환자 자신 또는 관련된 가족 구성원들이 이전에 전자간증 또는 자간증 또는 임신성 고혈압으로 진단받은 것을 의미한다.
"상동성(homologous)"이라 함은 비교 서열(comparison sequence)의 길이 전체에 걸쳐 알려진 유전자 또는 단백질 서열에 대해 30% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 및 가장 바람직하게 90% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 임의의 유전자 또는 단백질 서열을 의미한다. 또한 "상동성(homologous)" 단백질은 비교 단백질(comparison protein)의 하나 이상의 생물학적 활성을 가질 수 있다. 일반적으로, 단백질에 대해서는, 비교 서열들의 길이는 10 아미노산 이상, 바람직하게 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 적어도 437 아미노산 또는 그 이상일 것이다. 핵산에 대해서는, 비교 서열들의 길이는 일반적으로 적어도 25, 50, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 또는 적어도 1311 뉴클레오티드 또는 그 이상일 것이다. 또한 "상동성(homology)"은 항체들을 발생시키는데 사용되는 에피토프(epitope) 및 항체들이 지시받도록 하는 단백질 또는 그의 단편 사이에서의 실질적인 유사성을 나타낼 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 상동성은 문제가 되는 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 항체들의 생산을 유도하기에 충분한 유사성을 나타낸다.
"인간화 항체(humanized antibody)"는 소정의 항원(predetermined antigen)에 결합 가능한 면역글로불린 아미노산 서열 변이체(immunoglobulin amino acid sequence variant) 또는 그의 단편을 의미한다. 보통, 항체는 적어도 중쇄(heavy chain)의 가변 도메인(variable domain)뿐 아니라 경쇄(light chain)도 모두 포함할 것이다. 또한 항체는 중쇄의 CH1, 힌지(hinge), CH2, CH3, 또는 CH4 영역들을 포함할 수 있다. 인간화 항체는 실질적으로 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 프래임워크 영역(framework region:FR) 및 실질적으로 비-인간 면역글로불린의 아미노산 서열("임포트(import)" 서열들)을 갖는 상보성 결정 영역(complementarity determining region:CDR)을 포함한다.
일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 근원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기들을 갖는다. 일반적으로, 인간화 항체는 CDR 영역들 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간 면역글로불린의 그것에 대응하고, FR 영역들 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 공통 서열(human immunoglobulin consensus sequence)의 그것들인, 가변 도메인들(Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv) 중 하나 이상, 및 전형적으로 두 개의 가변 도메인들을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 인간화 항체는 최적으로 적어도 면역글로불린 불변 영역(Fc) 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 그것을 포함할 것이다. "상보성 결정 영역(complementarity determining region:CDR)"은 각각의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄들 내에 가변 영역들에서 세 개의 과가변 서열들(hypervariable sequences)을 의미한다. "프래임워크 영역(framework region:FR)"은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄들의 세 개의 과가변 서열들(CDR)의 양 측면에 위치한 아미노산들의 서열들을 의미한다.
인간화 항체의 FR 및 CDR 영역들은 정확하게 모 서열들(parental sequences)에 대응할 필요는 없으며 예컨대, 임포트 CDR 또는 공통 FR은 그 사이트에서 CDR 또는 FR 잔기가 공통 또는 임포트 항체 중 하나에 대응하지 않도록 하나 이상의 잔기의 치환(substitution), 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)에 의해 돌연변이가 유발될 수 있다. 이러한 돌연변이들은, 그러나, 광범위하지는 않을 것이다. 보통, 인간화 항체 잔기들의 75% 이상, 바람직하게 90% 및 가장 바람직하게 95% 이상이 모 FR 및 CDR 서열들의 그것들에 대응할 것이다.
"혼성화하다(hybridize)"라 함은 다양한 엄격성(stringency)의 조건 아래에서, 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열들, 또는 그의 부분들 사이 쌍을 이루어 이중-가닥 분자(double-stranded molecule)를 형성하는 것을 의미한다(예컨대, Wahl and Berger Methods Enzymol. 152:399, 1987; Kimmel, Methods Enzymol. 152:507, 1987참조). 예를 들어, 엄격한 염(stringent salt)의 농도는 보통 약 750 mM 이하의 NaCl 및 약 75 mM 이하의 트리소듐 시트레이트(trisodium citrate), 바람직하게 약 500 mM 이하의 NaCl 및 약 50 mM 이하의 트리소듐 시트레이트, 및 가장 바람직하게 약 250 mM 이하의 NaCl 및 약 25 mM 이하의 트리소듐 시트레이트일 것이다. 저엄격성 혼성화(Low stringency hybridization)는 예컨대, 포름아미드(formamide)와 같은 유기 용매의 부존재시 얻을 수 있는 반면에, 고엄격성 혼성화(high stringency hybridization)는 약 35% 이상의 포름아미드 및 가장 바람직하게 약 50% 이상의 포름아미드의 존재시에 얻을 수 있다. 엄격한 온도 조건들(Stringent temperature conditions)은 보통 약 30℃ 이상, 더욱 바람직하게 약 37 ℃이상 및 가장 바람직하게 약 42℃ 이상의 온도를 포함할 것이다. 혼성화 시간(hybridization time), 예컨대, 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate:SDS)와 같은 세정제(detergent)의 농도 및 캐리어 DNA(carrier DNA)의 포함(inclusion) 또는 배제(exclusion)와 같은, 추가 파라미터들을 변화시키는 것은, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 엄격성의 다양한 수준은 이러한 가변 조건들을 필요에 따라서 조합함으로써 얻어진다. 바람직한 구현예에서, 혼성화는 30℃, 750 mM의 NaCl, 75 mM의 트리소듐 시트레이트 및 1% SDS에서 이루어질 것이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 혼성화는 37℃, 500 mM의 NaCl, 50 mM의 트리소듐 시트레이트, 1% SDS, 35% 포름아미드 및 100μg/ml 변성된(denatured) 연어 정자 DNA(salmon sperm DNA:ssDNA)에서 이루어질 것이다. 가장 바람직한 구현예에서, 혼성화는 42℃, 250 mM의 NaCl, 25 mM의 트리소듐 시트레이트, 1% SDS, 50% 포름아미드 및 200μg/ml ssDNA에서 이루어질 것이다. 이러한 조건들의 유용한 변형은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이다.
대부분의 응용의 경우, 혼성화 뒤에 이어지는 세정 단계들(washing steps)도 엄격성 면에서 달라질 것이다. 세정 엄격성 조건들(Wash stringency conditions)은 염 농도 및 온도에 의해 제한될 수 있다. 상술한 대로, 세정 엄격성은 염 농도를 감소시키거나 또는 온도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 세정 단계들에서 엄격한 염 농도는 바람직하게 약 30 mM 이하의 NaCl 및 약 3 mM 이하의 트리소듐 시트레이트 및 가장 바람직하게 약 15 mM 이하의 NaCl 및 약 1.5 mM 이하의 트리소듐 시트레이트일 것이다. 세정 단계들에서 엄격한 온도 조건들은 보통 약 25℃ 이상, 더욱 바람직하게 약 42℃ 이상 및 가장 바람직하게 약 68℃ 이상의 온도를 포함할 것이다. 바람직한 구현예에서, 세정 단계들은 25℃, 30 mM NaCl, 3 mM 트리소듐 시트레이트 및 0.1% SDS에서 이루어질 것이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 세정 단계들은 42℃, 15 mM NaCl, 1.5 mM 트리소듐 시트레이트 및 0.1% SDS에서 이루어질 것이다. 가장 바람직한 구현예에서, 세정 단계들은 68℃, 15 mM NaCl, 1.5 mM 트리소듐 시트레이트 및 0.1% SDS에서 이루어질 것이다. 이러한 조건들의 추가적인 변형은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 혼성화 기술들(hybridization techniques)은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 질 알려져 있으며, 예를 들어, Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness(Proc. Natl. Acad. Sd., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); 및 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York에 개시되어 있다.
"자궁내 태아 발육지연(intrauterine growth retardation:IUGR)"은 태아의 재태기간에 대해 예상된 체중의 10 퍼센트 미만의 출생 체중을 초래하는 증후군을 의미한다. 저출생 체중(low birth weight )에 대한 현재의 세계보건기구 표준은 2,500 g (5 lbs. 8 oz.) 미만의 체중이거나 또는 미국의 인종, 출산 경력(parity) 및 태아 성(sex)에 따른 재태기간에 대한 출생시 체중의 표에 따라 10th 퍼센타일(10th percentile) 미만인 경우이다(Zhang and Bowes, Obstet. Gynecol. 86:200-208, 1995). 또한 이러한 저출생 체중 아기들은 "재태기간에 비해 작은 태아(SGA)"로 불린다. 전자간증은 IUGR 또는 SGA와 관련된다고 알려진 이상이다.
"메트릭(metric)"은 측정을 의미한다. 메트릭은, 예를 들어, 중요한 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 농도를 비교하는데 사용될 수 있다. 전형적인 메트릭들은 비(ratios)와 같은, 수학적 공식 또는 알고리즘들을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 사용되는 메트릭은 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환 발병 환자 및 정상 대조군(normal control subject)의 가용성 엔도글린, sFlt-1, VEGF, PlGF, 또는 이들의 임의의 조합의 농도들 사이를 가장 잘 구별하는 것이다. 이용되는 메트릭에 따라서 임신관련 고혈압 질환의 진단 인디케이터는 기준값(예컨대, 임신관련 고혈압 질환이 발병하지 않은 대조군(control subject)으로부터)보다 훨씬 높거나 낮을 수 있다. 가용성 엔도글린 농도는 유리되거나, 결합되거나(예컨대, 성장 인자에 결합), 또는 전체(유리된 것 + 결합된 것) 가용성 엔도글린의 양을 측정함으로써 결정된다. sFlt-1 농도는 유리되거나, 결합되거나(예컨대, 성장 인자에 결합), 또는 전체 sFlt-1(유리된 것 + 결합된 것)의 양을 측정함으로써 측정된다. VEGF 또는 PlGF 농도는 유리된 PlGF 또는 유리된 VEGF(예컨대, sFlt-1에 결합되지 않은)의 양을 측정함으로써 결정된다. 하나의 전형적인 메트릭은 전자간증 항-혈관형성 지수(pre-eclampsia anti-angiogenic index:PAAI)로도 표현되는, [sFlt-1/(VEGF + PlGF)]이다. 다른 예는 다음의 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수(soluble endoglin anti-angiogenic index)이다: (sFlt-1 + 0.25(가용성 엔도글린 폴리펩티드))/PlGF. 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수값의 증가는 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터가 된다. 다른 전형적인 메트릭은 다음과 같다: (가용성 엔도글린 + sFlt-1)/PlGF. 본 발명의 임의의 메트릭들은 모체의 BMI 또는 태아의 GA를 더 포함할 수 있다.
"전자간증 항-혈관 형성 지수(pre-eclampsia anti-angiogenesis index :PAAI)"는 항-혈관형성의 활성의 인디케이터로서 사용되는 sFlt-1/VEGF + PlGF의 비를 의미한다. 10 이상의, 더욱 바람직하게 20 이상의 PAAI는, 전자간증 또는 전자간증의 위험과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 나타낸다.
"가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수(soluble endoglin anti-angiogenic index)"는 (sFlt-1 + 0.25 가용성 엔도글린)/PlGF의 비를 의미한다. 예를 들어, 75 또는 그보다 높은, 바람직하게 100 또는 그보다 높은, 또는 더욱 바람직하게 200 또는 그보다 높은 값은 전자간증 또는 자간증과 같은, 고혈압과 관련된 임신 합병증을 나타낸다.
"작동가능하게 연결된(operably linked)"이라 함은 적합한 분자들(예컨대, 전사 활성인자 단백질들)이 조절 서열(regulatory sequence(s))에 결합되는 경우 유전자 발현을 허용하기 위한 방식으로 유전자 또는 조절서열이 연결되는 것을 의미한다.
"제약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 치료받는 포유동물에게 제약학적으로 허용가능하면서도, 그것과 함께 투여되는 화합물의 치료 특성을 보유하는 담체를 의미한다. 하나의 전형적인 제약학적으로 허용가능한 담체 물질은 생리 식염수이다. 다른 제약학적으로 허용가능한 담체들 및 그들의 제형화는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences,(20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA에 개시되어 있다.
"태반 성장 인자(placental growth factor:PlGF)"는 GenBank accession number P49763로 한정되는 단백질에 상동성이 있으며 PlGF 생물학적 활성을 갖는 포유동물의 성장 인자를 의미한다. PlGF는 VEGF 패밀리에 속하는 글리코실화 동종이량체(glycosylated homodimer)이고, 선택적 스플라이싱 메카니즘들(alternative splicing mechanisms)을 통해 두 개의 별개의 이소폼들로 발견될 수 있다. PlGF는 태반에서 세포영양막 및 융합세포영양막에서 발현되고, PlGF 생물학적 활성들은 내피 세포, 특히 영양막 세포들의 증식, 이동 및 활성화 유발을 포함한다.
"다형성(polymorphism)"은 전자간증 또는 자간증의 발병 소인을 나타내는 가용성 엔도글린, sFlt-1, PlGF, 또는 VEGF 핵산 분자의 유전적 다양성(genetic variation), 돌연변이, 결실 또는 부가를 의미한다. 이러한 다형성들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어, Raab et al. (Biochem. J. 339:579-588, 1999) 및 Parry et al. (Eur. J Immunogenet. 26:321-323, 1999)에 개시되어 있다. 다형성은 프로모터 서열(promoter sequence), 오픈 리딩 프레임(open reading frame), 인트론 서열(intronic sequence), 또는 유전자의 비번역 3' 영역(untranslated 3' region of a gene)에 존재할 수 있다. 엔도글린 유전자에서 이러한 다형성들로 알려진 예들은 엑손 7의 3' 말단을 지나 26 염기들에서 인트론 7로 6 염기의 GGGGGA의 삽입을 포함한다(Ann. Neurol. 41:683-6, 1997).
"임신관련 고혈압 질환(pregnancy related hypertensive disorder)"은 혈압의 증가와 관련되거나 또는 그것을 특징으로 하는 임신과 관련된 임의의 이상 또는 질병을 의미한다. 이러한 이상들에는 전자간증(미성숙 전자간증(premature pre-eclampsia), 중증 전자간증(severe pre-eclampsia)을 포함하여), 자간증, 임신성 고혈압, HELLP 증후군(용혈(hemolysis), 간 효소의 상승, 혈소판수의 감소), 태반조기박리(abruption placenta), 만성 고혈압, 자궁내 태아 발육지연을 갖는 임신(pregnancy with intra uterine growth restriction) 및 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)를 갖는 임신을 포함한다. SGA 태아를 갖는 임신이 종종 고혈압과 관련되지 않는 경우에도, 이러한 정의에 포함됨을 주의해야 할 것이다.
"전자간증(pre-eclampsia)"은 단백뇨 또는 부종, 또는 둘다를 수반하는 고혈압, 사구체 기능 장애(glomerular dysfunction), 뇌부종(brain edema), 간부종(liver edema), 또는 임신 또는 최근 임신의 영향에 따른 응고 이상(coagulation abnormalities)을 특징으로 하는 전신 질환(multi-system disorder)을 의미한다. 미성숙(premature), 경증(mild), 중등도(moderate) 및 중증(severe) 전자간증과 같은 전자간증의 모든 형태들이 이러한 정의에 포함된다. 전자간증은 일반적으로 임신 20주 이후에 발생한다. 전자간증은 일반적으로 다음의 증상들의 몇 가지 조합으로 정의된다: (1) 임신 20주 이후에 수축기 혈압(systolic blood pressure:BP) > 140 mmHg 및 확장기 혈압(diastolic blood pressure:BP) > 90 mmHg (일반적으로 4-168 시간 떨어져, 두 가지 경우를 측정), (2) 새로운 단백뇨의 발병 (소변 검사시 딥스틱에 의할 경우 1+, 24 시간 회수물에서 300mg을 초과하는 단백질, 또는 단백질/크레아티닌비가 0.3을 초과하는 임의의 단일 소변 샘플) 및 (3) 분만후 12주에 고혈압 및 단백뇨의 소실. 중증 전자간증은 일반적으로 (1) 확장기 혈압 BP > 110 mmHg (일반적으로 4-168 시간 떨어져, 두 가지 경우를 측정) 또는 (2) 24 시간 소변 회수물에서 3.5g 이상의 단백질 측정값 또는 딥스틱에 의할 경우 최소한 3+ 단백질을 나타내는 두 개의 랜덤 요 샘플을 특징으로 하는 단백뇨로서 정의된다. 전자간증에서, 고혈압 및 단백뇨는 일반적으로 서로 7일 이내에 발생한다. 중증 전자간증에서, 중증 고혈압, 중증 단백뇨 및 HELLP 증후군(용혈, 간 효소의 상승, 혈소판수의 감소) 또는 자간증은 동시에 또는 한 번에 하나씩 발생할 수 있다. HELLP 증후군은 저혈소판증(<100000 세포들/μl), 증가된 LDH(>600 IU/L) 및 증가된 AST(>70 IU/L)의 출현으로 특징지워진다. 때때로, 중증 전자간증은 발작(seizures)이 발생할 수 있다. 이러한 증후군의 중증 형태는 "자간증(eclampsia)"으로서 언급된다. 또한 자간증은 간(예컨대, 간세포 손상(hepatocellular damage), 문맥주위괴사(periportal necrosis)) 및 중추신경계(예컨대, 뇌 부종 및 뇌 출혈(hemorrhage))와 같은 몇 가지 기관 또는 조직의 장애 또는 손상을 포함할 수 있다. 발작의 병인(etiology)은 뇌부종 및 신장내 작은 혈관의 국소 연축(focal spasm)의 발생의 이차적인 것으로 생각되고 있다.
"미성숙 전자간증(premature pre-eclampsia)"은 37주 미만또는 34주 미만에 증상이 발병하는 경우의 전자간증을 의미한다.
"단백질(protein)" 또는 "폴리펩티드(polypeptide)" 또는 "폴리펩티드 단편(polypeptide fragment)"은 번역후변형(post-translational modification)(예컨대, 당화(glycosylation) 또는 인산화)과 상관없이, 자연 발생의 폴리펩티드 또는 펩티드 전부 또는 일부를 구성하거나, 또는 비-자연 발생의 폴리펩티드 또는 펩티드를 구성하는 임의의 둘 이상의 아미노산들의 사슬을 의미한다.
"기준 샘플(reference sample)"은 비교 목적으로 사용되는 임의의 샘플, 표준, 또는 농도를 의미한다. "정상 기준 샘플(normal reference sample)"은 동일한 환자로부터 이전에 채취한 샘플, 전자간증 또는 자간증과 같은, 임의의 임신관련 고혈압 질환을 앓지 않는 임신한 환자로부터의 샘플, 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 앓지 않는 임신한 환자로부터의 샘플, 임신한 환자이지만 샘플이 임신 초기(예컨대, 제 1 또는 제 2의 3개월 또는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 검출 이전의)에 채취된 샘플, 임신한 환자이지만 샘플이 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 병력이 없는 환자로부터 채취된 샘플, 임신하지 않은 환자이지만 알려진 정상 농도의 정제된 기준 폴리펩티드인 샘플(예컨대, 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환은 나타나지 않음)일 수 있다. "기준 표준 또는 농도(reference standard or level)"는 기준 샘플로부터 유래된 값 또는 수를 의미한다. 정상 기준 표준 또는 농도는 다음 척도(criteria)들 중 하나 이상에 의해 샘플 환자에 매치되는 정상 환자로부터 유래된 값 또는 수일 수 있다: 태아의 재태기간, 모체의 연령, 임신 전 모체의 혈압, 임신 중 모체의 혈압, 모체의 BMI, 태아의 체중, 전자간증 또는 자간증의 사전 검사(prior diagnosis) 및 전자간증 또는 자간증의 가족력. "양성 기준(positive reference)" 샘플, 표준 또는 값은 다음 척도(criteria)들 중 하나 이상에 의해 샘플 환자에 매치되는, 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환이 발병한 것으로 알려진 환자로부터 유래된 샘플 또는 값 또는 수이다: 태아의 재태기간, 모체의 연령, 임신 전 모체의 혈압, 임신 중 모체의 혈압, 모체의 BMI, 태아의 체중, 임신관련 고혈압 질환의 사전 검사 및 임신관련 고혈압 질환의 가족력.
"감소하다 또는 저해하다(reduce or inhibit)"라 함은 치료받지 않은 샘플들과 비교할 때, 상술한 분석법들("발현(expression)" 참조)에 의해 검출된, 단백질 또는 핵산의 농도 변화가 바람직하게 20% 또는 그 이상, 더욱 바람직하게 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 전체적인 감소를 일으키는 능력을 의미한다.
"샘플(sample)"은 환자로부터 얻은 조직 생검(tissue biopsy), 세포, 체액 (예컨대, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 침, 양수, 또는 뇌척수액) 또는 다른 표본을 의미한다. 바람직하게, 생물학적 샘플은 가용성 엔도글린 핵산 분자들 또는 폴리펩티드들 또는 둘다를 포함한다.
"작은 간섭 RNAs(small interfering RNAs:siRNAs)"은 분해되는 표적 유전자 또는 mRNA를 동정하는데 사용되는, 바람직하게 길이가 10 뉴클레오티드(nt) 이상, 더욱 바람직하게 길이가 15 뉴클레오티드들 이상 및 가장 바람직하게 길이가 19 뉴클레오티드 이상인 분리된 dsRNA 분자를 의미한다. 19-25 뉴클레오티드의 범위는 siRNAs에 대한 가장 바람직한 크기이다. 또한 siRNAs는 단일의 RNA 분자 내에 포함된 siRNA 듀플렉스(duplex)의 양 가닥들 안에 짧은 헤어핀(hairpin) RNAs를 포함할 수 있다. siRNA는 하나 이상의 뉴클레오티드들의 부가, 결실, 치환, 및/또는 변경에 의해 자연 발생한 RNA와는 차이가 있는 변경된 RNA 뿐 아니라 dsRNA의 임의의 형태(대형 dsRNA, 부분적으로 정제된 RNA, 완전히 정제된 RNA, 합성 RNA, 재조합 생산된 RNA의 단백질 가수 분해 산물들)를 포함한다. 이러한 변경들은 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 nt RNA의 말단(들)에 대해 또는 (RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드들에서) 내부에서와 같은, 비-뉴클레오티드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, RNA 분자들은 3' 하이드록실기를 포함한다. 또한 본 발명의 RNA 분자들의 뉴클레오티드들은 인공 뉴클레오티드들(non-naturally occurring nucleotides) 또는 디옥시리보뉴클레오티드들(deoxyribonucleotides)을 포함하여, 비-표준 뉴클레오티드들(non-standard nucleotides)을 포함할 수 있다. 총체적으로, 이러한 모든 변경 RNA들은 RNA의 유사체를 의미한다. 본 발명의 siRNA들은 RNA 간섭(RNAi)을 매개할 수 있는 능력을 갖는 자연 RNA에 충분히 유사할 것을 필요로 한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, RNAi는 세포 또는 기관 내로 작은 간섭 RNAs 또는 dsRNAs의 도입을 통해 특이적 mRNA 분자의 ATP-의존적 표적화 절단(ATP-dependent targeted cleavage) 및 분해를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "매개 RNAi(mediate RNAi)"는 분해되는 RNA들을 구별하거나 동정하는 능력을 의미한다.
"가용성 엔도글린 결합 분자(soluble endoglin binding molecule)"는 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 저분자 화합물을 의미한다. 가용성 엔도글린 결합 분자는 예를 들어, 항체, 항체-관련 펩티드, 가용성 엔도글린 결합 항체의 하나 이상의 CDR 영역들, 또는 가용성 엔도글린 상호작용 단백질(soluble endoglin interacting protein)일 수 있다.
"가용성 Flt-1(soluble FIt-1:sFlt-1)"(또한 sVEGF-R1로도 알려진)은 GenBank accession number UOl134로 한정되는 단백질에 상동성이 있고, sFlt-1 생물학적 활성을 갖는, Flt-1 수용체의 가용성 형태를 의미한다. sFlt-1 폴리펩티드의 생물학적 활성은 임의의 표준 방법, 예를 들어, VEGF에 대한 sFlt-1 결합을 분석하는 방법을 사용함으로써 분석될 수 있다. sFlt-1은 세포막 도메인(transmembrane domain) 및 Flt-1 수용체의 세포질 티로신 키나아제 도메인(cytoplasmic tyrosine kinase domain)이 결여된다. sFlt-1은 VEGF 및 PlGF에 고친화도로 결합할 수 있으나, 증식 또는 혈관 형성을 유발할 수는 없고, 따라서 Flt-1 및 KDR 수용체들과는 기능적으로 차이가 있다. sFlt-1은 초기에 인간의 제대 내피 세포(human umbilical endothelial cells)로부터 정제되고, 이후에 생체 내의 영양막 세포들에 의해 생성된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, sFlt-1은 임의의 sFlt-1 패밀리 멤버 또는 이소폼을 포함한다. 또한 sFlt-1은 Flt-1 수용체의 효소적 절단에 의해 생성되고 sFlt-1 생물학적 활성을 유지하는 분해 산물들 또는 단편들도 의미할 수 있다. 하나의 예에서, 태반으로부터 분비된 특이성 메탈로프로테이나제들(metalloproteinases)은 Flt-1 수용체의 세포외 도메인을 절단하여 순환계(circulation) 내로 Flt-1의 N-터미널부를 방출시킬 수 있다.
"특이적으로 결합한다(specifically binds)"라 함은 화합물 또는 항체가 본 발명의 폴리펩티드는 인식하여 결합하지만, 본래부터 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는, 생물학적 샘플과 같은, 샘플의 다른 분자들은 인식하여 결합하지 않는 것을 의미한다. 하나의 예에서, 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 항체는 막 결합 엔도글린에는 결합하지 않는다. 다른 예에서, 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 항체는 가용성 엔도글린에는 특이하나 전장(full-length) 엔도글린에는 그러하지 않은 엔도글린의 아미노산들 1 내지 437 내의 영역을 인식한다.
"환자(subject)"는 인간 또는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 개, 또는 고양이와 같은 비-인간 포유동물을 포함하는 포유동물을 의미하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 제한에는 임신의, 분만후의(post-partum) 및 임신하지 않은 포유동물들도 포함된다.
"실질적으로 동일한(substantially identical)"이라 함은 예를 들어 후술하는 방법들을 사용하여, 최적으로 정렬시, 예컨대, 엔도글린 또는 가용성 엔도글린 서열 같은 제 2 핵산 또는 아미노산 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 핵산 또는 아미노산 서열을 의미한다. "실질적인 상동성(substantial identity)"은 전장 서열(full-length sequence), 에피토프들(epitopes) 또는 면역원성 펩티드들(immunogenic peptides), 기능성 도메인들(functional domains), 코딩(coding) 및/또는 조절 서열들(regulatory sequences), 엑손들(exons), 인트론들(introns), 프로모터들(promoters) 및 유전자 서열들(genomic sequences)과 같은, 서열의 다양한 타입들 및 길이들을 표현하기 위해 사용된다. 두 개의 폴리펩티드들 또는 핵산 서열들 사이의 퍼센트 상동성은 예를 들어, GeneMatcher Plus™로서 편입된 Smith Waterman Alignment (Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) J MoI Biol 147:195-7); "BestFit" (Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)), Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed pp 353-358; BLAST program (Basic Local Alignment Search Tool; (Altschul, S. F., W. Gish, et al. (1990) J MoI Biol 215: 403-10), BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL, 또는 Megalign (DNASTAR) software와 같은 공공연히 시판되는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 본 발명이 속하는 기술분야 내의 다양한 방식으로 결정된다. 또한, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 비교되는 서열들의 길이를 넘어 최대 정렬(alignment)을 이루는 데 필요한 임의의 알고리즘들을 포함하여, 정렬 측정을 위한 적합한 파라미터들을 결정할 수 있다. 일반적으로, 단백질에 있어서, 비교 서열들의 길이는 10 아미노산 이상, 바람직하게 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 13O, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 적어도 437 아미노산들 또는 그 이상일 것이다. 핵산에 있어서, 비교 서열들의 길이는 일반적으로 적어도 25, 50, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 또는 적어도 1311 뉴클레오티드들 또는 그 이상일 것이다. 서열 상동성의 측정 목적을 위해 DNA 서열과 RNA 서열을 비교하는 경우, 티민 뉴클레오티드는 우라실 뉴클레오티드와 균등한 것으로 이해해야 할 것이다. 보존적 치환들(conservative substitutions)은 전형적으로 다음의 군내의 치환을 포함한다: 글라이신(glycine), 알라닌(alanine); 발린(valine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine); 아스파라긴산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid), 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine); 세린(serine), 트레오닌(threonine); 라이신(lysine), 아르기닌(arginine); 및 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine).
"전자간증의 증상(symptoms of pre-eclampsia)"은 다음 중 임의의 것을 의미한다: (1) 임신 20주 이후의 수축기 혈압 (BP) >140 mmHg 및 확장기 혈압 (BP) >90 mmHg, (2) 새로운 단백뇨의 발병 (소변 검사시 딥스틱에 의할 경우 1+, 24 시간 회수물에서 300mg을 초과하는 단백질, 또는 단백질/크레아티닌비가 0.3을 초과하는 임의의 단일 소변 샘플) 및 (3) 분만후 12주에 고혈압 및 단백뇨의 소실. 또한 전자간증의 증상들은 신기능 장애(renal dysfunction) 및 사구체 내피증식(glomerular endotheliosis) 또는 비대(hypertrophy)를 포함할 수 있다. "자간증의 증상(symptoms of eclampsia)"은 임신 또는 최근 임신의 영향에 따라 다음의 증상들 중 어느 하나가 발생함을 의미한다: 발작(seizures), 혼수(coma), 저혈소판증(thrombocytopenia), 간부종(liver edema), 폐부종(pulmonary edema) 및 뇌부종(cerebral edema).
"전환성장인자 β(transforming growth factor β:TGF-β)"는 TGF-β 생물학적 활성을 가지고 모든 척추 동물들에서 발견되는 측분비(paracrine) 폴리펩티드들과 구조적으로 관련된 패밀리 멤버이고 후생동물의 성장(metazoan growth), 분화 및 형태형성 인자들(morphogenesis factors)의 대형 패밀리의 원형인 포유동물의 성장 인자를 의미한다(Massaque et al. Ann Rev Cell Biol 6:597-641 (1990); Massaque et al. Trends Cell Biol 4:172-178 (1994); Kingsley Gene Dev. 8:133-146 (1994); 및 Sporn et al. J Cell Biol 119:1017- 1021 (1992)을 재참조). Kingsley의 상술한 문헌에 개시된 바와 같이, TGF-β 수퍼패밀리는 25 이상의 멤버들을 가지고 고도로 관련된 서열들을 갖는 상이한 서브-패밀리들(sub-families)로 그룹지워질 수 있다. 가장 명확한 서브-패밀리들은 다음을 포함한다: TGF-β 수퍼패밀리의 다른 멤버들보다 TGF-β1에 더 유사한 네 개 이상의 유전자들을 포함하는 TGF-β 서브-패밀리; 동종- 또는 이종-이량체들 또는 두 개의 서브-단위, 인히빈(inhibin)β-A 및 인히빈β-B를 포함하는 액티빈 서브-패밀리. 포유동물 인자들 BMP2 및 BMP4를 포함하는 디카펜타플레직(decapentaplegic) 서브-패밀리는, 피하에 또는 근육 내로 이식시 이소성 뼈(ectopic bone) 및 연골(cartilage)의 형성을 유도할 수 있다. 6OA 서브-패밀리는, BMP5-8를 포함하여, 골유도 활성(osteoinductive activity)을 가지는 많은 포유동물의 동종체(homologs)를 포함한다. TGF-β 수퍼패밀리의 다른 멤버들은 성장 분화 인자 1(gross differentiation factor 1:GDF-1), GDF-3/VGR-2, 도살린(dorsalin), 노달(nodal), 뮬러관 억제 물질(mullerian-inhibiting substance:MIS) 및 신경교세포계-유래 신경영양인자(glial-derived neurotrophic growth factor:GDNF)를 포함한다. DPP 및 6OA 서브-패밀리들은 TGF-β 수퍼패밀리의 다른 멤버들보다 서로 더 가깝게 관련되어 있고, 종종 DVR(dpp 및 vgl 관련)이라 불리는 더 큰 분자들의 컬렉션의 일부로서 함께 분류됨을 주의해야 할 것이다. 그것이 사용된 문맥상 다른 의미가 명백하지 않는 한, TGF-β 용어는 본 발명의 명세서 전반에서 사용될 때 일반적으로 TGF-β 수퍼패밀리의 멤버들을 의미하는 것으로 이해해야 할 것이다. (Massague et al, Annu. Rev. Biochem. 67:753-91, 1998; Josso et al, Curr. Op. Gen. Dev., 7:371-377, 1997). TGF-β는 많은 세포 타입들에서 성장, 분화, 운동성(motility), 조직 리모델링, 신경발생(neurogenesis), 상처 회복, 세포자멸사 및 혈관 형성을 조절하도록 기능한다. 또한 TGF-β는 많은 세포 타입들에서 세포 증식을 저해하고, 기질 단백질(matrix proteins)들의 합성을 유발할 수 있다.
"치료량(therapeutic amount)"은 본 명세서에 개시된 바와 같이 전자간증 또는 자간증으로 고통받는 환자들에게 투여하는 경우에 전자간증 또는 자간증 증상의 질적 또는 양적인 감소를 유발하기에 충분한 양을 의미한다. 또한 "치료량(therapeutic amount)"은 전자간증 또는 자간증으로 고통받는 환자들에게 투여시 엔도글린 또는 sFlt-1의 발현 농도의 감소 또는 본 명세서에 개시된 분석법들에 의해 측정된 바와 같이VEGF 또는 PlGF의 발현 농도의 증가를 유발하기에 충분한 양을 의미할 수 있다.
"치료(treating)"는 화합물 또는 약리학적 조성물을 치료 목적으로 투여하는 것을 의미한다. "질병을 치료한다(treat disease)" 또는 "치료적처치(therapeutic treatment)"를 위해 사용하는 것은 환자의 이상을 개선시키기 위해 이미 병으로 고통받는 환자에게 투여 치료를 행하는 것을 의미한다. 바람직하게, 환자는 후술하는 임의의 특징적인 증상들의 확인 또는 본 명세서에 개시된 진단을 위한 정보 제공 방법들의 사용에 기초하여, 전자간증 또는 자간증과 같은, 고혈압과 관련된 임신성 합병증을 앓는 것으로서 진단된다. "질병을 예방한다(prevent disease)"라 함은 특정 질환으로 발병할 가능성이나 그밖의 위험이 있으나, 아직 발병하지 않은 환자의 예방적 처리(prophylactic treatment)를 의미한다. 바람직하게 환자에게 본 명세서에 개시된 진단을 위한 정보 제공 방법들을 사용하여 전자간증 또는 자간증의 발병 위험이 있음을 확인하는 것이다. 따라서, 청구항 및 구현예들에서, 처리 단계는 치료 또는 예방 목적 중 하나로 포유동물에게 투여하는 단계를 의미한다.
"영양막(trophoblast)"은 자궁 점막층(uterine mucosa)을 통해 배아가 모체로부터 영양분을 받고; 세포들이 태반의 형성에 기여하게 되는데, 이러한 자궁 점막층을 침식시키는 포배(blastocyst)를 덮고 있는 신경능선조직의 세포 층(mesectodermal cell layer)을 의미한다.
"혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor:VEGF)"는 미국 특허 제5,332,671호; 제5,240,848호; 제5,194,596호; 및 Charnock- Jones et al. (Biol Reproduction, 48: 1120-1128, 1993)에 개시된 성장 인자에 대해 상동성이 있고, VEGF 생물학적 활성을 갖는 포유동물의 성장 인자를 의미한다. VEGF는 글리코실화 동종이량체로서 존재하고, 네 개 이상의 다른 스프라이싱 이소폼들(spliced isoforms)을 포함한다. 고유한 VEGF(native VEGF)의 생물학적 활성은 혈관 내피 세포 또는 제대정맥 내피 세포의 선택적 성장의 증진(promotion) 및 혈관 형성의 유발을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, VEGF는 임의의 VEGF 패밀리 멤버 또는 이소폼(예컨대, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF189, VEGF165, 또는 VEGF 121)을 포함한다. 바람직하게, VEGF는 VEGF121 또는 VEGF165 이소폼(Tischer et al., J. Biol. Chem. 266, 11947-11954, 1991 ; Neufed et al. Cancer Metastasis 15:153- 158, 1996)인데, 이는 미국 특허 제6,447,768호; 제5,219,739호; 및 제5,194,596호에 개시되어 있으며, 참조로서 본 명세서에 편입된다. 또한 Gille et al. (J. Biol. Chem. 276:3222-3230, 2001)에 개시된 KDR-선택적 VEGF 및 Flt-선택적 VEGF와 같은 VEGF의 돌연변이 형태들(mutant forms)이 포함된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 또한 VEGF는 LeCouter et al. (Science 299:890-893, 2003)에 개시된 바와 같은 VEGF의 임의의 변형된 형태들(modified forms)을 포함한다. 인간 VEGF가 바람직하나, 본 발명이 인간 형태로 제한되는 것은 아니며 VEGF의 다른 동물(예컨대 마우스, 랫트, 개, 또는 닭) 형태들을 포함할 수 있다.
"벡터(vector)"는 보통 플라스미드(plasmid) 또는 박테리오파지(bacteriophage)로부터 유래되는데, 그 안으로 DNA의 단편들이 삽입되거나 또는 클론(cloned)되는 DNA 분자를 의미한다. 재조합 벡터(recombinant vector)는 하나 이상의 독특한 제한 사이트들을 포함하고, 클론된 서열이 복제(reproducible)되도록 제한된 숙주 또는 비히클 생명체(vehicle organism) 내에서 자가 복제(autonomous replication)할 수 있다. 벡터는 숙주 세포(recipient cell) 내로 형질감염(transfection)이 되자마자, RNA가 발현되도록 유전자 또는 코딩 영역에 작동적으로 연결되는 프로모터를 포함한다.
본 발명의 다른 특성 및 이점들은 다음의 바람직한 구현예들에 대한 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백할 것이다.
본 발명의 특허 또는 특허출원 서류는 하나 이상의 컬러로 작성된 도면을 포함한다. 본 발명의 특허 또는 특허출원 공개문의 컬러도면은 신청 후 필요한 비용을 지불하는 경우 본국 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 엔도글린 단백질의 개략도이다. SP: 시그널 펩티드(signal peptide), ZP: 조나 펠루시다 도메인(zona pellucida domain), CL: 가용성 엔도글린의 방출을 위한 잠재적인 절단 사이트(437 아미노산), TM: 세포막 도메인(transmembrane domain), Cyto: 세포질 도메인(cytoplasmic domain).
도 2a는 가용성 엔도글린의 예측 cDNA 서열(SEQ ID NO: 1)을 도시한다. 도 2b는 가용성 엔도글린의 예측 아미노산 서열(SEQ ID NO: 2)을 도시한다.
도 3은 정상 임신의 태반(N), 경증 전자간증 임신의 태반(p) 및 중증 전자간증 임신의 태반(P)의 엔도글린 mRNA 농도를 보여주는 노던 블롯 결과이다.
도 4는 태반에서의 엔도글린 단백질 농도를 보여주는 웨스턴 블롯의 결과이다. 샘플들은 두 명의 전자간증 환자들, p32 및 p36로부터 얻는데, 이는 2003년에 Beth Israel Deaconess Medical Center에 제출된, 임신한 여성의 모체 혈청으로부터 얻는다. 웨스턴 블롯은 Santa Cruz Biotechnology, Inc., (Santa Cruz, CA)로부터 얻은 N-터미널 항체를 사용하여 프로브되는데, 태반에서 11OkD 밴드 및 태반 및 혈청 샘플들에서 존재하는 작은 63 kD 밴드 둘 다를 보여준다.
도 5는 정상임신, 경증 전자간증, 중증 전자간증 및 조산(pre-term delivery)에 의한 합병증 있는 비-전자간증 임신 여성에서의 가용성 엔도글린의 순환성 농도(circulating concentration)를 도시하는 그래프이다. 모든 혈액 표본들은 분만 전 24 시간 이내에 얻었다. 가용성 엔도글린은 R & D Systems, MN (cat # DNDGOO)의 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. 이러한 데이타는 전자간증 환자들이 임상 질환(clinical disease)의 시기에 있을 때 가용성 엔도글린 농도가 현저하게 상승됨을 보여 준다.
도 6은 5개의 서로 다른 임신 여성의 연구 그룹의 다양한 재태기간 그룹 윈도우(various gestational age group windows) 중의 임신 기간에 걸친 평균 가용성 엔도글린 농도(mean soluble endoglin concentration)를 도시하는 그래프이다.
도 7은 5개의 서로 다른 임신 여성의 연구 그룹의 다양한 재태기간 그룹 윈도우 중의 임신 기간에 걸친 평균 sFltl 농도(mean sFlt1 concentrations)를 도시하는 그래프이다.
도 8은 5개의 서로 다른 임신 여성의 연구 그룹의 다양한 재태기간 그룹 윈도우 중의 임신 기간에 걸친 평균 PlGF 농도(mean PlGF concentrations)를 도시하는 그래프이다.
도 9는 임상 증상이 나타나기 전에 채취한 샘플들의 전자간증 항-혈관 형성에 대한 가용성 엔도글린 항-혈관형성의 지수(soluble endoglin anti-angiogenic index)의 값들을 도시하는 그래프이다.
도 10은 임상의 미성숙 전자간증 발병 이전(PE < 37주)의 주수에 따른 가용성 엔도글린의 평균 농도를 도시하는 그래프이다.
도 11은 임상의 미성숙 전자간증 발병 이전(PE < 37주)의 주수에 따른 가용성 엔도글린 항-혈관형성의 지수의 값을 도시하는 그래프이다.
도 12는 증상이 나타나기 전에 또는 이후에 전자간증의 기간(PE > 37주) 동안의 가용성 엔도글린 농도의 변화를 도시하는 그래프이다.
도 13은 증상이 나타나기 전에 또는 이후에 전자간증의 기간(PE>37주) 동안의 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 농도의 변경을 도시하는 그래프이다.
도 14는 임신성 고혈압 중 및 임신성 고혈압 (1-5주 선행하는 임신성 고혈압 (임신 33-36주 동안)) 이전의 여성 및 정상혈압의(normotensive) 대조군들에서 검출된 가용성 엔도글린 농도를 도시하는 그래프이다.
도 15는 임신성 고혈압 중 및 임신성 고혈압 (1- 5주 선행하는 임신성 고혈압 (임신 33-36주 동안)) 이전의 여성 및 정상혈압의(normotensive) 대조군들에서의 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 농도를 도시하는 그래프이다.
도 16은 중증 SGA, 경증 SGA의 여성들 및 정상혈압의 대조군들에서의 33-36주 임신 기간대에 검출된 가용성 엔도글린 농도를 도시하는 그래프이다.
도 17은 중증 SGA, 경증 SGA의 여성들 및 정상혈압의 대조군들에서의 33-36주 임신 기간대에 검출된 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 농도를 도시하는 그래프이다.
도 18은 서로에 대해 플롯팅된 동일한 임신 환자에 있어서의 sFltl 및 가용성 엔도글린의 농도를 도시하는 그래프이다.
도 19는 25.2주에 얻은 전자간증 태반의 엔도글린(빨강) 및 평활근 액틴(초록)의 이중 면역형광염색(double immunofluorescence staining) 사진이다. 엔도글린을 검출하기 위해 사용되는 항체는 전장 엔도글린 및 가용성 엔도글린 둘다를 염색한다. 적절한 임신 기간대의 태반 대조군들은 조기 산통을 갖는 환자로부터 유래된다.
도 20은 41.3주에 얻은 전자간증 태반의 엔도글린(빨강) 및 평활근 액틴(초록)의 이중 면역형광염색(double immunofluorescence staining) 사진이다. 엔도글린을 검출하기 위해 사용되는 항체는 전장 엔도글린 및 가용성 엔도글린 둘다를 염색한다. 적절한 임신 기간대의 태반 대조군들은 조기 산통을 갖는 환자로부터 유래된다.
도 21a는 전자간증의 태반 및 혈청 둘다를 이용한 엔도글린에 대한 면역 침전법(immunoprecipitation) 및 웨스턴 블롯 실험의 방사능(autoradiogram) 사진이다. 도 21b는 전자간증의 태반을 이용한 엔도글린에 대한 면역 침전법 및 웨스턴 블롯 실험의 방사능 사진이다. 세 가지의 다른 N 및 P 샘플들은 개개의 환자들을 나타낸다. 양자의 도면에서, 면역침전법에는 시판되는 단일클론 항체를 사용하고, 웨스턴 블롯의 경우에는 다중클론 항체들을 사용하였다. 이러한 항체들 둘다는 엔도글린 단백질의 N-터미널 영역에 대하여 형성되고 전장 및 절단(truncated)된 가용성 엔도글린 단백질을 검출한다.
도 22는 성장 인자 감소 매트리겔에서의 HUVECs를 이용한 혈관 형성 분석 결과를 도시하는 그래프이다. 혈관 형성 분석법들은 가용성 엔도글린 또는 sFltl 또는 양자의 존재하에 수행하였고 내피관 길이(endothelial tube lengths)를 측정하였다. C- 는 대조군(control)을 나타내고, E- 는 1 μg/ml의 가용성 엔도글린을 나타내며, S는 1 μg/ml의 sFltl를 나타낸다. E + S는 1 μg/ml의 E + 1 μg/ml 의 sFltl의 조합을 나타낸다. 데이타는 세 개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
도 23은 재료 및 방법란에 설명된 바와 같이 마우스에서 에반스 블루 리키지(Evans blue leakage)를 사용하여 평가된 몇 가지 기관 베드(organ bed)의 미세혈관 투과성(microvascular permeability)을 도시하는 그래프이다. C - 대조군(GFP), E - 가용성 엔도글린, S - sFltl, S + E -sFltl + 가용성 엔도글린. 데이타는 네 개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
도 24는 200 pg/ml - 200 ng/ml 범위의 용량의 TGF-β1(B1) 및 TGF-β3 (B3)의 존재하에서 미세혈관 반응성 실험된 랫트의 신장 미세혈관 직경(rat renal microvessel diameter)의 퍼센트 변화를 도시하는 그래프이다. 1μg/ml의 가용성 엔도글린(E)의 존재하에 동일한 실험을 반복하였다. 이러한 주어진 데이타는 4개의 독립적인 실험의 평균이다.
도 25는 1 ng/ml의 VEGF(V), TGF-β1(B1) 및 그의 조합(V+B1)의 존재시 신장 미세혈관 직경의 퍼센트 변화를 도시하는 그래프이다. 또한 각각 1 μg/ml의 sFlt1(S) 및 가용성 엔도글린(E)의 조합(V+Bl+S+E)의 효과를 도시한다. 데이타는 4개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
도 26a는 sFltl 및 대조군 아데노바이러스(CMV)를 함께 주입한 임신한 랫트의 치사시에 채취한 혈액 샘플들의 주변 스미어(smear)의 사진이다. 도 26b는 sFlt 및 아데노바이러스 발현 가용성 엔도글린을 함께 주입한 임신한 랫트의 치사시에 채취한 혈액 샘플들의 주변 스미어의 사진인데, 분열적혈구(schistocytes) 및 증가한 망상적혈구(reticulocyte) 수에 의해 증명되는 활성 용혈(active hemolysis)을 설명한다. 화살촉 모양(Arrowhead)은 분열적혈구를 나타낸다.
도 27a-d는 표 8에서 설명된 다양한 동물군들의 신장 조직구조(renal histology; H &E stain)를 도시하는 일련의 사진이다. 도 27a는 사구체 내피증식이 나타나지 않은 대조군의 신장 조직구조를 도시한다. 도 27b는 사구체 내피증식이 나타나지 않은 가용성 엔도글린이 주입된 군의 신장 조직구조를 도시한다. 도 27c는 적당한내피 증식을 보여주며 sFlt1이 주입된 랫트의 신장 조직구조를 도시한다(화살촉에 의한 도시). 도 27d는 족세포(podocytes)에서의 단백질 흡수 소적(resorption droplets)에 의해 중증 사구체 내피증식 및 심하게 부푼 사구체염(swollen glomeruli)을 보이는 가용성 엔도글린 및 sFlt1이 주입된 랫트의 신장 조직구조를 도시한다. 모든 광학 현미경은 6OX의 배율을 가진다(original magnification).
본 발명자들은 가용성 엔도글린 농도가 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환이 발병한 여성으로부터 채취한 혈액 혈청 샘플들에서 상승함을 발견하였다. 가용성 엔도글린은 단백질 분해효소들에 의한 막 결합 형태의 세포외 부분의 절단에 의해 형성될 수 있다. 과잉의 가용성 엔도글린은 태반에서 필요한 양의 혈관형성 및 유사분열촉진 인자들을 고갈시킬 수 있다. 따라서, 가용성 엔도글린은 전자간증 및 자간증을 포함하여, 임신관련 고혈압 질환의 우수한 진단 마커이다. 더욱이, 성장 인자들에 대한 가용성 엔도글린의 결합을 방해하는 치료 약제들, 가용성 엔도글린 발현 또는 생물학적 활성을 감소시키는 약제들, 또는 성장 인자들의 농도를 증가시키는 약제들이, 환자의 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있음을 발견하였다. 이러한 약제들은 가용성 엔도글린에 대한 항체들, 가용성 엔도글린의 농도를 감소시키는 안티센스 또는 RNAi의 올리고뉴클레오티드들, 성장 인자들의 농도를 증가시키는 화합물들, 가용성 엔도글린의 방출을 방해함으로써 그에 의해 엔도글린의 막 결합 형태가 단백질 가수 분해로 절단되는 것을 방해하는 화합물들 및 가용성 엔도글린에 결합하여 성장 인자 결합 사이트를 차단하는 저분자들을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 또한 전자간증 및 자간증을 포함하여, 임신관련 고혈압 질환의 조기 진단 및 관리를 위한 검출 수단으로서 가용성 엔도글린의 농도를 측정하는 방법을 특징으로 한다.
본 발명의 상세한 설명은 특히 가용성 엔도글린, sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF에 대해 상세하게 설명할 것이나, 또한 상세한 설명이 가용성 엔도글린, sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF의 패밀리 멤버들, 이소폼들, 및/또는 변이체들에도 적용될 수 있음을 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다.
진단(Diagnostics)
본 발명은 전자간증, 자간증과 같은 임신관련 고혈압 질환, 또는 이러한 이상들의 발병 소인에 대해 가용성 엔도글린의 검출(detection)에 기초한 분석법들을 특징으로 한다. 본 명세서에 개시된 상기 방법들은 특히 전자간증 및 자간증을 구체적으로 언급하고 있으나, 본 발명의 진단 및 모니터링 방법들은 임신성 고혈압, 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)를 갖는 임신, HELLP, 만성 고혈압, 전자간증(경증, 중등도 및 중증) 및 자간증을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 임의의 임신관련 고혈압 질환에 적용될 수 있음을 이해해야 할 것이다.
유리되거나, 결합되거나, 또는 전체 농도 중 어느 하나의 엔도글린의 농도는, 환자 샘플에서 측정되고 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인의 인디케이터로서 사용된다.
전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 갖는 환자는 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 발현의 증가를 보일 것이다. 가용성 엔도글린 폴리펩티드는 전장 가용성 엔도글린, 분해 산물들, 가용성 엔도글린의 다른 스플라이싱 이소폼들, 가용성 엔도글린의 효소적 절단 산물들 등을 포함할 수 있다. 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 전자간증 또는 자간증의 진단을 위해 또는 이러한 병의 발병 위험이 있는 환자를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 방법들에 사용되는 항체의 하나의 예에는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (cat # sc-20072)에 의해 시판되는 엔도글린의 N-터미널 영역에 대한 단일클론 항체가 있다. 이러한 폴리펩티드들의 발현의 변경을 측정하기 위한 다양한 프로토콜들이, 면역학적 방법들(ELISAs 및 RIAs와 같은)을 포함하여 알려져 있으며 이는 전자간증 또는 자간증 또는 이러한 이상들의 발병 위험의 진단을 위한 기초를 제공한다. 다시 말해서, 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 농도의 증가는 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 갖는 환자를 진단한다.
가용성 엔도글린의 높은 농도는 전자간증 또는 자간증의 양성 인디케이터(positive indicator)가 된다. 예를 들어, 가용성 엔도글린의 농도가 기준에 비해 증가된 경우(예컨대, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상), 전자간증 또는 자간증의 양성 인디케이터로 고려될 수 있다. 또한, 정상 농도에 비해 검출된 임의의 가용성 엔도글린, sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF의 농도의 변경은 자간증, 전자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 나타낸다. 정상적으로, 가용성 엔도글린의 순환 혈청 농도는 비임신의 상태 중에는 2-7 ng/ml 및 정상임신 중에는 10-20 ng/ml 범위를 가진다. 15 ng/ml 이상, 바람직하게 20 ng/ml 이상 및 가장 바람직하게 25 ng/ml 또는 그 이상의, 가용성 엔도글린의 높은 혈청 농도는 전자간증의 양성 인디케이터로 고려된다.
하나의 구현예에서, 가용성 엔도글린의 농도는 sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF 폴리펩티드 또는 핵산, 또는 이들의 임의의 조합의 농도를 조합하여 측정된다. sFlt-1, VEGF 및 PlGF의 측정 방법들은 PCT 공개 제WO 2004/008946호 및 미국 특허공개 제20040126828호에 개시되어 있으며, 본 명세서에 참조로서 완전히 편입된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 또한 체질량지수(BMI) 및 태아의 재태기간이 측정되고 진단 메트릭이 포함된다.
하나의 구현예에서, 가용성 엔도글린, sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF, 또는 이들 사이의 임의의 조합을 포함하는 메트릭은, 둘 이상의 단백질들의 농도 사이의 관계가 전자간증 또는 자간증을 나타내는지에 관해 결정하는 데 사용된다. 하나의 예에서, 메트릭은 PAAI(sFlt-1/ VEGF + PlGF)인데, 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 진단하는 항-혈관형성 지수로서, 가용성 엔도글린 측정을 조합하여 사용된다. 가용성 엔도글린의 농도가 기준 샘플에 비해 증가하는 경우(예컨대, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 또는 심지어 10-배 또는 그 이상), PAAI는 10 이상, 더욱 바람직하게 20 이상이 되며, 이후에 환자는 전자간증, 자간증, 또는 동일한 질병으로 발병할 급박한 위험을 갖는 것으로 고려된다. PAAI(sFlt- 1/ VEGF + PlGF)비는 단지 진단 인디케이터로서 사용될 수 있는 유용한 메트릭의 하나의 예이다. 본 발명이 이들로 제한되는 것을 의도하지는 않는다. 사실상 정상 대조군에 비해 환자에 있어서, 가용성 엔도글린, sFlt-1, PlGF, 또는 VEGF, 또는 이들의 임의의 조합의 농도의 변경을 검출하는 모든 메트릭은, 진단 인디케이터로서 사용될 수 있다. 다른 예는 다음의 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수이다: (sFlt-1 + 0.25(가용성 엔도글린 폴리펩티드))/PlGF. 가용성 엔도글린 메트릭의 값의 증가는 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터가 된다. 가용성 엔도글린 지수가 100 이상, 바람직하게 200 이상인 경우 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터가 된다. 다른 예는 다음의 지수이다: (가용성 엔도글린 + sFlt-l)/PlGF. 지수들은 모체의 BMI 또는 태아의 GA를 더 포함할 수 있다.
표준 방법들은 소변, 혈청, 혈장, 침, 양수, 또는 뇌척수액을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아닌, 임의의 체액에서 가용성 엔도글린, VEGF, PlGF, 또는 sFlt-1 폴리펩티드의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 가용성 엔도글린, VEGF, PlGF 또는 sFlt-1에 직접 작용하는 항체들을 사용하는 면역 분석법, ELISA, 웨스턴 블롯팅 및 Ong et al. (Obstet. Gynecol. 98:608-611, 2001) 및 Su et al. (Obstet. Gynecol, 97:898-904, 2001)에 개시된 바와 같은 정량 효소 면역 분석 기술들(quantitative enzyme immunoassay techniques)을 포함한다. ELISA 분석법들은 가용성 엔도글린, VEGF, PlGF, 또는 sFlt-1의 농도를 측정하는 바람직한 방법이다. 바람직하게, 가용성 엔도글린이 측정된다.
엔도글린, sFlt-1, PlGF, 또는 VEGF 핵산 서열로부터 유래된 올리고뉴클레오티드들 또는 그보다 긴 단편들(longer fragments)은 발현을 모니터할 뿐 아니라, 전자간증 또는 자간증의 발병 가능성을 나타내는 엔도글린, sFlt-1, PlGF, 또는 VEGF 핵산 분자에서의 유전적 다양성(genetic variation), 돌연변이(mutation), 또는 다형성(polymorphism)을 갖는 환자를 동정하는 데 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 다형성들은 핵산 또는 폴리펩티드 발현 농도 또는 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 다형성들은 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있고 예를 들어, Raab 등의 상술한 문헌 및 Parry et al. (Eur. J Immunogenet. 26:321-3, 1999)에 개시되어 있다. 예를 들어, 엔도글린 유전자의 다형성들이 개시되어 있으며, 많은 것들이 유전성출혈성모세혈관확장 타입 I(hereditary haemorrhagic telangiectasia type I:HHTl)으로 불리는 우성 혈관 질환(dominant vascular disorder)에 관련되어 있다. 이러한 많은 돌연변이들은 불안정한 엔도글린의 가용성 형태의 생산을 일으켜, HHT 환자들의 내피 세포 및 단핵구에서 찾아낸 엔도글린의 발현을 감소시킨다(Raab 등의 상술한 문헌). 다른 예에서, GenBank database(www.ncbi.nlm.nih.gov)의 조사표는 Flt-1/sFlt-1의 유전자 및 프로모터 영역의 330 이상의 다형성들을 보여준다. 정상, 기준 샘플에 비해 유전적 다양성, 돌연변이, 또는 다형성은 전자간증, 자간증, 또는 전자간증 또는 자간증의 발병 소인의 진단 인디케이터로서 사용될 수 있다.
이러한 유전적 변경들은 프로모터 서열, 오픈 리딩 프레임(open reading frame), 인트론 서열, 또는 유전자의 번역되지 않는 3' 영역에 존재할 수 있다. 유전적 변경들에 대한 관련 정보는 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 갖는 환자를 진단하는데 사용될 수 있다. 주지된 바와 같이, 가용성 엔도글린, sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF, 또는 이들의 임의의 조합의 농도 또는 생물학적 활성의 특이적 변경은, 전자간증 또는 자간증, 또는 이들의 발병 소인의 가능성과 상호관련된다. 결과로서, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는, 주어진 돌연변이를 검출하는데, 전자간증 또는 자간증을 야기하거나 또는 증가시키는지를 측정하기 위해 단백질의 하나 이상의 생물학적 활성들을 분석할 수 있다.
하나의 구현예에서, 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 갖는 환자는 엔도글린, 바람직하게 가용성 엔도글린을 인코딩하는 핵산, 또는 sFlt-1의 발현 농도의 증가, 또는 PlGF 또는 VEGF 농도의 변경을 보여줄 것이다. 이러한 변경을 검출하는 방법들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 표준이고, Ausubel 등의 상술한 문헌에 개시되어 있다. 하나의 예에서 노던 블롯팅 또는 실시간 PCR(real-time PCR)은 엔도글린, 바람직하게 가용성 엔도글린, sFlt-1, PlGF, 또는 VEGF mRNA 농도를 검출하는 데 사용된다.
지놈 서열들, 또는 밀접하게 관련된 분자들을 포함하여, 엔도글린 또는 가용성 엔도글린 핵산 분자를 검출할 수 있는 PCR 프로브에 의한 혼성화는, 전자간증 또는 자간증 또는 이러한 이상들의 발병 위험을 갖는 환자로부터 유래한 핵산 서열을 혼성화하는 데 사용될 수 있다. 프로브의 특이성은, 그것이 예컨대, 5' 조절영역(regulatory region)의 고특이적 영역(highly specific region)으로부터 비롯되는지, 또는 예컨대, 보존 모티프(conserved motif)의 저특이적 영역(less specific region)으로부터 비롯되는지를 결정하고, 혼성화 또는 증폭(amplification)의 엄격성(최대, 고, 중, 또는 저)은, 프로브가 자연 발생 서열(naturally occurring sequence), 대립유전자 변이체들(allelic variants), 또는 다른 관련된 서열들에 혼성화되는지를 결정한다. 혼성화 기술들은 가용성 엔도글린 핵산 분자로 전자간증 또는 자간증을 나타내는 돌연변이들을 동정하는 데 사용될 수 있거나, 또는 가용성 엔도글린 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 발현 농도를 모니터하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, Ausubel 등의 상술한 문헌의 노던 분석에 의해).
이미 다른 구현예에서, 환자들은 엔도글린 또는 가용성 엔도글린 핵산 분자 서열의 직접적인 분석법에 의해 전자간증 또는 자간증의 발병 소인을 진단받을 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 핵산들 또는 폴리펩티드들의 측정은 두 가지 이상의 다른 경우들에 대해 진행될 수 있고, 시간에 걸친 정상 기준 농도에 비한 농도의 변경은 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인의 인디케이터로서 사용된다.
전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 갖는 환자의 체액에 존재하는 임의의 가용성 엔도글린 폴리펩티드 또는 핵산의 농도는 정상 대조군의 농도에 비해 또는 동일한 환자의 동일한 체액으로부터 이전에 얻은 샘플에 비해 ㅈ적게는 10%, 20%, 30%, 또는 40%, 또는 많게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 증가될 수 있다. 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 갖는 환자의 체액의 가용성 엔도글린 폴리펩티드 또는 핵산의 농도는 1회 측정 후 다음 측정시까지의 시간에 걸쳐 10%, 20%, 30%, 또는 40%로 적게, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%로 많게 변경될 수 있다.
전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 갖는 환자의 체액의 가용성 엔도글린의 농도와 함께 측정된 sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF의 농도는 정상 대조군의 sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF의 농도에 비해 적게는 10%, 20%, 30%, 또는 40%, 또는 많게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 변경될 수 있다. 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 갖는 환자의 체액의 가용성 엔도글린의 농도와 함께 측정된 sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF의 농도는 1회 측정 후 다음 측정시까지의 시간에 걸쳐 적게는 10%, 20%, 30%, 또는 40%, 또는 많게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 변경될 수 있다.
하나의 구현예에서, 체액(예컨대, 소변, 혈장, 혈청, 양수, 또는 뇌척수액)의 환자 샘플은 전자간증 증상들의 발병 전에 임신 초기에 수집된다. 다른 예에서, 샘플은 전자간증 증상들의 발병 전에 임신 초기에 수집된 조직 또는 세포일 수 있다. 조직들 및 세포들의 제한되지 않는 예들에는 태반의 조직, 태반 세포들, 내피 세포 및 단핵구와 같은 백혈구를 포함한다. 인간에 있어서, 예를 들어, 모체의 혈액 혈청 샘플들은 임신의 제 1, 제 2, 또는 제 3의 3개월 동안의 임신한 여성의 전주정맥(antecubital vein)으로부터 수집된다. 바람직하게, 분석은 제 1의 3개월 동안에는, 예를 들어, 4, 6, 8, 10, 또는 12주, 또는 그 가운데의 임의의 간격으로 수행되고, 또는 제 2의 3개월 동안에는, 예를 들어 14, 16, 18, 20, 22, 또는 24주, 또는 그 가운데의 임의의 간격으로 수행된다. 또한 이러한 분석법들은 제 2의 3개월의 말기 또는 제 3의 3개월, 예를 들어 26, 28, 30, 32, 34, 36, 또는 38주, 또는 임의의 그 가운데의 임의의 간격으로 수행될 수 있다. 가용성 엔도글린의 농도는 이러한 기간 동안 두 번 측정하는 것이 바람직하다. 분만 후의 전자간증 또는 자간증의 진단에 있어서, 가용성 엔도글린용 분석법들은 분만 후에 수행될 수 있다. 전자간증 또는 자간증의 발병 소인의 진단에 있어서, 분석은 임신의 시작 전에 수행된다. 하나의 예에서, 치료요법의 모니터링 및 관리를 위해, 분석법은 전자간증의 진단 후 임신중에 수행된다.
하나의 특별한 예에서, 일련의 혈액 샘플들은 임신 중에 수집될 수 있고 ELISA에 의해 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 농도가 측정될 수 있다. 다른 예에서, 샘플은 제 2의 3개월 동안 및 제 3의 3개월의 초기에 수집되고 제 1 샘플링으로부터 다음까지의 가용성 엔도글린의 농도의 증가는 전자간증 또는 자간증, 또는 각각의 발병 소인을 나타낸다.
또한 본 발명은 환자로부터 얻은 체액, 바람직하게 소변 내의 가용성 엔도글린의 임의의 리간드들(예컨대, TGF-βl, TGF-β3, 액티빈-A, BMP-2 및 BMP-7)의 측정을 포함하고, 가용성 엔도글린 리간드의 농도의 변경(예컨대, 증가 또는 감소)은 전자간증 또는 자간증을 나타낸다.
수의학적 적용에서, 분석은 임신 중 임의의 시간에 수행될 수 있으나, 바람직하게, 전자간증 증상들의 발병 전에, 임신 초기에 수행된다. 임신 기간은 종들 사이에서 광범위하게 다양하기 때문에, 분석의 타이밍은 수의사에 의해 결정될 것이나,일반적으로 인간의 임신 중 분석의 타이밍에 대응될 것이다.
본 명세서에 개시된 진단을 위한 정보 제공 방법들은 전자간증 또는 자간증 발병의 존재, 심각성, 예상 발병 시기의 더 정확한 진단을 위해 개별적으로 또는 본 명세서에 개시된 임의의 다른 진단을 위한 정보 제공 방법과 함께 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 진단을 위한 정보 제공 방법들은 전자간증 또는 자간증 발병의 존재, 심각성, 예상 발병 시기의 정확한 진단에 유용한 것으로 확인된 임의의 다른 진단들과 함께 사용될 수 있다.
또한 본 명세서에 개시된 진단을 위한 정보 제공 방법들은 환자에 있어서 전자간증 또는 자간증을 모니터하고 관리하는 데 사용될 수 있다. 하나의 예에서, 치료법은 혈액, 혈장, 또는 혈청 가용성 엔도글린 농도가 25 ng/ml 미만이 될 때까지 투여된다. 다른 예에서, 환자가 정상 대조군에 비해 증가된 가용성 엔도글린의 농도를 갖는 것으로 측정되는 경우, 이후의 치료요법은 혈청 PlGF 농도가 약 400 pg/mL로 증가할 때까지 투여될 수 있다. 이러한 구현예에서, 가용성 엔도글린, sFlt-1, PlGF 및 VEGF, 또는 이들 중 임의의 것 및 모든 것의 농도는, 질병을 진단할 뿐 아니라 전자간증 및 자간증의 치료 및 관리를 모니터링하는 방법으로서 반복적으로 측정된다.
진단 키트(Diagnostic Kits)
또한 본 발명은 진단 테스트 키트를 제공한다. 예를 들어, 진단 테스트 키트는 가용성 엔도글린에 대한 항체들 및 항체들과 가용성 엔도글린 폴리펩티드 사이의 결합을 검출하고, 더욱 바람직하게 평가하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 검출을 위해, 가용성 엔도글린 폴리펩티드-항체 상호작용이 항체 및 가용성 엔도글린 폴리펩티드 사이의 결합 후 기질에 부착되는 라벨의 양을 측정함으로써 확인될 수 있도록 항체 또는 가용성 엔도글린 폴리펩티드 중 하나는 라벨링되고, 항체 또는 가용성 엔도글린 폴리펩티드 중 하나는 기질-결합된다. 종래의 ELISA는 항체-기질 상호작용을 검출하기 위한 공지의, 잘 알려진 방법인데, 본 발명의 키트에 제공될 수 있다. 가용성 엔도글린 폴리펩티드들은 소변, 혈청, 혈장, 침, 양수, 또는 뇌척수액을 포함하나 이들로 제한되는 것은 아닌, 사실상 모든 체액에서 검출될 수 있다. 또한 본 발명은 가용성 엔도글린 핵산의 농도를 검출하고 측정하는 데 사용될 수 있는 가용성 엔도글린 핵산을 포함하는 진단 테스트 키트를 제공한다. 정상 대조군에 존재하는 농도와 같은, 기준에 비한 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 농도의 변경을 측정하는 키트는, 본 발명의 방법들의 진단 키트로서 유용하다.
본 발명의 진단 키트들은 미국 특허출원공개 제20040126828호, 제20050025762호 및 제2005017044호 및 PCT 공개 제WO2004/008946호 및 제WO 2005/077007호에 개시된 바와 같이 sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF 폴리펩티드들 또는 핵산들의 검출을 위한 항체들 또는 핵산들을 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 키트는 상술한 임의의 진단 방법들을 수행하는 데 필요한 임의의 구성 요소들을 포함한다. 예를 들어, 상기 키트는 바람직하게 막(membrane)을 포함하는데, 상기 가용성 엔도글린 결합 약제 또는 가용성 엔도글린 결합 약제에 결합하는 약제가 막에 고정된다. 딥스틱(dipstick) 구조를 샘플 내에 위치시킴으로써 샘플이 막 상에 놓이는 딥스틱 구조 상에 지지되거나, 상기 막은 카세트(cassette)의 개방부를 통해 샘플이 막 위에 놓이는 측면 흐름 카세트(lateral flow cassette) 내에 지지될 수 있다.
또한 상기 진단 키트들은 일반적으로 표준 커브(standard curve)를 확인하는데 사용되도록 상기 키트 구성 요소들 및 기준 샘플 또는 정제된 단백질들의 의도된 사용에 대한 라벨 또는 설명서들을 포함한다. 하나의 예에서, 상기 키트는 전자간증, 자간증, 또는 전자간증 또는 자간증의 발병 소인의 진단용 키트를 사용하기 위한 설명서들을 포함한다. 이미 다른 예에서, 상기 키트는 전자간증 또는 자간증의 치료에 적합한 치료요법(therapeutic treatment) 또는 용량 계획(dosage regimens)을 모니터하기 위한 키트의 사용에 대한 설명서들을 포함한다. 또한 상기 진단 키트는 환자 샘플의 PAAI 또는 가용성 엔도글린 항-혈관 형성 지수를 측정하고 기준 샘플 값에 대한 PAAI 또는 가용성 엔도글린 항-혈관 형성 지수를 비교하기 위한 키트의 사용에 대한 라벨 또는 설명서들을 포함할 수 있다. 기준 샘플 값들이 상기 키트의 의도된 사용에 의존함을 이해해야 할 것이다. 예를 들어, 샘플은 정상 기준값에 비교될 수 있는데, 상기 PAAI 또는 가용성 엔도글린 항-혈관 형성 지수의 증가 또는 가용성 엔도글린 값의 증가는 전자간증 또는 자간증, 또는 전자간증 또는 자간증의 발병 소인을 나타낸다. 다른 예에서, 치료 모니터링에 사용되는 키트는 전자간증 또는 자간증을 나타내는 기준 PAAI 또는 가용성 엔도글린 항-혈관 형성 지수 값 또는 가용성 엔도글린 값을 가질 수 있는데, 상기 PAAI 또는 가용성 엔도글린 항-혈관 형성 지수 값의 감소 또는 기준 샘플에 비해 환자 샘플의 가용성 엔도글린 값의 감소는 치료 화합물들의 치료 효능 또는 유효 용량을 나타내는데 사용될 수 있다.
스크리닝 분석법(Screening Assays)
상술한 바와 같이, 가용성 엔도글린 핵산 또는 폴리펩티드의 농도는 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 갖는 환자에 있어 증가된다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명의 조성물들은 전자간증 또는 자간증을 갖는 환자에 있어서 그의 발현이 변경되는 가용성 엔도글린 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 발현을 조절하는 화합물들을 동정하기 위한 후보 화합물들의 고쓰루풋(high-throuhput) 저비용의 스크리닝에 유용하다.
가용성 엔도글린 핵산 분자의 발현을 변경하는 새로운 후보 화합물들을 동정하기 위한 스크리닝 분석법들을 수행하기 위해 임의의 수의 방법들이 이용될 수 있다. 하나의 실시예로서, 후보 화합물들은 가용성 엔도글린 핵산 서열을 발현하도록 배양된 세포들에서의 배양 배지에 다양한 농도로 첨가된다. 전형적인 세포 배양은 영양막(예컨대, BEWO, JAR 및 JEG 세포들) 및 HUVECs를 포함한다. 고농도의 엔도글린의 막 결합 형태를 발현하는 세포들에는 가용성 엔도글린을 형성하기 위해 엔도글린의 세포외 도메인을 절단하는 프로테이나제(예컨대, 기질메탈로프로테이나제)가 처리될 수 있다. 이어서 이러한 세포들은 새로운 후보 화합물들을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 이어서 유전자 발현이 측정되는데, 예를 들어, 마이크로어레이 분석법(microarray analysis), 노던 블롯 분석법(Ausubel 등의 상술한 문헌), 또는 RT-PCR이, 혼성화 프로브로서 핵산 분자로부터 준비된 임의의 적합한 단편을 사용하여 행해진다. 후보 화합물의 존재하에서의 유전자 발현의 농도를 후보 화합물이 결여된 대조군 배양 배지에서 측정된 농도와 비교한다. 가용성 엔도글린 유전자, 핵산 분자, 또는 폴리펩티드, 또는 그의 기능적 등가물의 발현의 감소를 촉진하는 화합물은, 본 발명에 유용한 것으로 고려되는데; 이러한 분자는, 예를 들어, 환자에 있어 전자간증 또는 자간증을 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 후보 화합물들의 효과는 동일한 일반적인 접근 방법 및 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 특이적인 항체로 웨스턴 블롯팅 또는 면역침전법과 같은, 표준 면역학적 기술들을 사용하여 폴리펩티드 생산 레벨에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 면역 분석법들은 생물에 있어서 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드들의 발현을 검출하고 모니터하는 데 사용될 수 있다. 이러한 폴리펩티드에 대해 결합 가능한 다중클론 또는 단일클론 항체들(상술한 대로 생산된)은 폴리펩티드의 농도를 측정하기 위해 임의의 표준 면역 분석법 포맷(예컨대, ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 RIA 분석법)에 사용될 수 있다. 몇 가지 구현예에서, 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 발현 또는 생물학적 활성의 감소를 촉진하는 화합물은 특히 유용한 것으로 고려된다. 다시 말해서, 이러한 분자는, 예를 들어, 환자에 있어서, 전자간증 또는 자간증, 또는 전자간증 또는 자간증의 증상들을 지연시키고, 개선하거나 또는 치료하기 위한 치료요법으로서 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 후보 화합물들은 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것들에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 후보 화합물의 효능은 이러한 폴리펩티드 또는 그의 기능적 등가물과 상호 작용하는 능력에 의존적이다. 이러한 상호작용은 많은 표준 결합 기술들 및 기능성 분석법들(예컨대, Ausubel 등의 상술한 문헌에 개시된 방법들)을 사용하여 쉽게 분석될 수 있다. 하나의 구현예에서, 후보 화합물은 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 생체 외에서 테스트될 수 있다. 다른 구현예에서, 후보 화합물은 가용성 엔도글린 폴리펩티드 및 TGF-β, TGF-β3, 액티빈-A, BMP-2 및 BMP-7과 같은 성장 인자의 결합을 감소시킴으로써 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 생물학적 활성을 감소시키는 능력에 대해 테스트된다.
다른 실시예에서, 가용성 엔도글린 핵산은 검출가능한 리포터(detectable reporter)와의 전사 또는 번역 융합체(fusion)로 발현되고, 유도성 프로모터와 같은 이종 프로모터(hererologous promotor)의 제어 아래 분리된 세포(isolated cell:예컨대, 포유동물의 또는 곤충의 세포) 내에서 발현된다. 이어서 융합 단백질을 발현하는 세포는 후보 화합물과 접촉하고, 그 세포에서의 검출가능한 리포터의 발현은 치료받지 않은 대조군 세포에서의 검출가능한 리포터의 발현과 비교된다. 가용성 엔도글린 검출가능한 리포터의 발현을 감소시키는 후보 화합물은 전자간증 또는 자간증의 치료에 유용한 화합물이다. 바람직한 구현예에서, 후보 화합물은 핵산에 융합되는 리포터 유전자 또는 핵산의 발현을 변경한다.
하나의 특정한 실시예에서, 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 결합하는 후보 화합물은 크로마토그래피-기초 기술(chromatography-based technique)을 사용하여 동정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 폴리펩티드는 그러한 폴리펩티드(예컨대, 상기 언급한 것들)를 발현하도록 유전자조작된 세포들로부터 표준 기술들에 의해 정제될 수 있고 칼럼(column)에 고정될 수 있다. 이어서 후보 화합물들의 용액은 칼럼을 통과하고, 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 특이적인 화합물은 폴리펩티드에 결합하고 칼럼에 고정되는 능력에 기초하여 동정된다. 상기 화합물을 분리하기 위해, 칼럼은 세정되어 비-특이적으로 결합한 분자들이 제거되고, 이어서 주요한 상기 화합물은 칼럼으로부터 방출되고 회수된다. 유사한 방법들이 폴리펩티드 마이크로어레이에 결합된 화합물을 분리하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법(또는 임의의 다른 적합한 방법)에 의해 분리된 화합물들은, 필요하다면, 더욱 정제될 수 있다(예컨대, 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)에 의해). 또한, 이러한 후보 화합물들은 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 능력에 대해 테스트받을 수 있다. 또한 이러한 접근에 의해 분리된 화합물들은 예를 들어, 인간 환자에 있어서 전자간증 또는 자간증을 치료하기 위한 치료요법으로서 사용될 수 있다. 10 mM 이하의 친화도를 가지고 본 발명의 폴리펩티드에 대한 결합하는 것으로 확인된 화합물들은 특히 본 발명에서 유용한 것으로 고려된다. 다른 방법으로서, 임의의 생체 내 단백질 상호작용 검출 시스템(in vivo protein interaction detection system), 예를 들어, 임의의 이중-하이브리드 분석법(two-hybrid assay)은 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 화합물들 또는 단백질들을 동정하는 데 이용될 수 있다.
잠재적인 길항제들(potential antagonists)은 유기 분자들, 펩티드들, 펩티드 유사체들(peptide mimetics), 폴리펩티드들, 핵산들 및 가용성 엔도글린 핵산 서열 또는 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 결합하는 항체들을 포함한다.
또한 가용성 엔도글린 DNA 서열들은 전자간증 또는 자간증의 치료를 위한 치료 화합물의 발견 및 개발에 이용될 수 있다. 인코딩된 단백질은, 발현시, 약물들의 스크리닝을 위한 표적으로서 사용될 수 있다. 또한, 인코딩된 단백질 또는 Shine-Delgarno 또는 다른 번역 촉진 서열들(translation facilitating sequences)의 아미노 터미널 영역들을 인코딩하는 DNA 서열들은 표준 기술들(standard techniques)에 의해 분리될 수 있다(Ausubel 등의 상술한 문헌).
선택적으로, 상술한 임의의 분석법들에 의해서 동정되는 화합물들은 가용성 엔도글린의 생물학적 활성을 감소시키는 화합물들에 대한 분석법에서 유용한 것으로 확인될 수 있다.
본 발명의 저분자들은 바람직하게 2,000 달톤(daltons) 이하, 더욱 바람직하게 300 및 1,000 달톤 사이, 가장 바람직하게 400 및 700 달톤 사이의 분자량을 가진다. 이러한 저분자들은 유기 분자들임이 바람직하다.
테스트 화합물 및 추출물(Test compounds and extracts)
일반적으로, 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 활성을 감소시킬 수 있는 화합물들은 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 방법들에 따라, 천연물(natural product) 또는 합성의(또는 반-합성의) 추출물 둘다의 거대 라이브러리(large libraries) 또는 화학적 라이브러리(chemical libraries) 또는 폴리펩티드 또는 핵산 라이브러리로부터 동정된다. 약물 발견 및 개발 영역에서의 당업자는 본 발명의 스크리닝 방법(들)에 결정적이지 않은 테스트 추출물 또는 화합물들의 정확한 근원을 이해할 것이다. 스크리닝에 사용되는 화합물들은 공지의 화합물들(예를 들어, 다른 질병들 또는 질환들에 사용되는 치료요법으로 알려진 것)을 포함할 수 있다. 다른 방법으로서, 사실상 많은 알려지지 않은 화학적 추출물 또는 화합물들이 본 명세서에 개시된 방법들을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 이러한 추출물 또는 화합물들의 예에는 식물성-, 진균성-, 원핵생물성- 또는 동물성-기초한 추출물, 발효 액체 배지(fermentation broths) 및 합성의 화합물들뿐 아니라, 현존하는 화합물들의 변형을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한 다수의 방법들은 당류-, 지질-, 펩티드- 및 핵산-기초 화합물들을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아닌, 많은 화학적 화합물들의 일반적 무작위적 또는 직접적(directed) 합성(예컨대, 반-합성 또는 전체 합성)에 적용된다. 합성 화합물 라이브러리는 Brandon Associates (Merrimack, NH) 및 Aldrich Chemical (Milwaukee, WI)로부터 시판되는 것이다. 다른 방법으로서, 박테리아성, 진균성, 식물성 및 동물성 추출물의 형태로 천연 화합물들의 라이브러리는 Biotics (Sussex, UK), Xenova (Slough, UK), Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, FL) 및 PharmaMar, U.S.A. (Cambridge, MA)를 포함하여, 여러 출처에서 시판된다. 또한, 천연 및 합성으로 생산된 라이브러리는, 필요하다면, 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 방법, 예컨대, 추출 및 분할(fractionation) 방법들에 따라 생산된다. 더욱이, 필요하다면, 임의의 라이브러리 또는 화합물은 표준 화학적, 물리학적, 또는 생화학적 방법들을 사용하여 쉽게 변형된다.
또한, 본 발명이 속하는 약물 발견 및 개발 분야의 당업자는 쉽게 디레플리케이션(dereplication) 방법들(예컨대, 분류학적(taxonomic) 디레플리케이션, 생물학적 디레플리케이션 및 화학적 디레플리케이션, 또는 이들의 임의의 조합) 또는 그들의 몰트-디스럽팅(molt-disrupting) 활성이 이미 알려진 물질들의 사본 및 반복단위의 제거가 가능하다면 언제든지 사용할 수 있음을 이해할 것이다.
조제(crude) 추출물이 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 활성을 감소시키거나, 또는 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 결합하는 것으로 발현되는 경우에, 양성 초래 추출물(positive lead extract)의 추가적인 분할이 관찰된 효과(observed effect) 를 발휘하는 화학적 성분을 분리하는데 더욱 필요하다. 따라서, 추출, 분할 및 정제(purification) 과정의 목적은 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 조제 추출물 내의 화학적 엔티티(entity)의 주요 특성 규명 및 동정에 있다. 이러한 이질성 추출물들의 분할 및 정제 방법들은 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려져 있다. 필요하다면, 인간의 전자간증 또는 자간증의 치료를 위한 치료요법으로서 사용되는 화합물들은 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 방법들에 따라 화학적으로 변형된다.
치료(Therapeutics)
본 발명은 환자에 있어서 전자간증 또는 자간증을 치료 또는 예방하기 위한 방법들 및 조성물들을 특징으로 한다. 가용성 엔도글린의 농도는 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 갖는 환자들에 있어 증가되고, 가용성 엔도글린 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 발현 농도 및/또는 생물학적 활성을 감소시키는 임의의 약제는 본 발명의 방법들에 유용하다. 이러한 약제들은 리간드들에 대한 가용성 엔도글린 결합을 파괴할 수 있는 TGF-β1 , TGF-β3 , 액티빈-A, BMP2, 또는 BMP7과 같은 화합물들; 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 정제된 항체 또는 항원-결합 단편; 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머들; 및 RNA 간섭을 조절하는데 사용되는 dsRNAs를 포함한다. 부가적인 유용한 화합물들은 가용성 엔도글린의 생물학적 활성을 변경시킬 수 있는 예를 들어, 혈관 형성 분석법에 의해 측정되는,임의의 화합물들을 포함한다, 전형적인 치료 방법들은 다음에 상세히 설명한다. 또한 이러한 방법들은 PCT 공개 제WO 2004/008946호 및 미국 특허 공개 제20040126828호에 개시된 바와 같이 Flt-1 농도를 감소시키거나 또는 VEGF 또는 PlGF 농도를 증가 또는 sFlt-1 농도를 감소시키는 방법들과 연합될 수 있다.
TGF-β 시그널링 경로를 표적화하는 치료(Therapeutics targeting the TGF-β signaling pathway)
TGF-β는 많은 세포 타입들에서 성장, 분화, 운동성, 조직 리모델링, 신경발생, 상처 회복, 세포자멸사 및 혈관 형성을 조절하는 25 이상의 성장 인자들의 패밀리의 원형이다. 또한 TGF-β는 많은 세포 타입들에서 세포 증식을 저해하고 기질 단백질들의 합성을 유발할 수 있다. 그것이 사용된 문맥으로부터 달리 확인되지 않는 한, 본 명세서 전반에서 사용된 TGF-β는 일반적으로 적합한 TGF-β 수퍼패밀리의 임의의 및 모든 멤버들을 가리키는 것으로 이해해야 할 것이다. 가용성 엔도글린은 TGF-β1 , TGF-β3 , 액티빈, BMP-2 및 BMP-7를 포함하여 TGF-β 패밀리의 몇 가지 특이적 멤버들에 결합하고, 태아 또는 태반의 이러한 필요한 유사분열촉진 및 혈관형성 인자의 발생을 감소시킬 수 있다. 본 발명은 가용성 엔도글린에 결합하여 가용성 엔도글린의 효과를 중화시키는 이러한 리간드들의 농도를 증가시키는 방법들을 특징으로 한다.
정제된 단백질들(Purified proteins)
본 발명의 바람직한 구현예에서, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈- A, BMP2 및 BMP7을 포함하나 이들로 제한되는 것은 아닌, TGF-β 패밀리 단백질들과 같은 임의의 가용성 엔도글린 리간드의 정제된 형태들은 전자간증 또는 자간증의 치료 또는 예방을 위해 질환을 갖는 환자에게 투여된다.
정제된 TGF-β 패밀리 단백질들은 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 임의의 단백질, 더욱 바람직하게, 실질적으로 혈관 형성을 유도할 수 있는, TGF-β1 또는 TGF-β3, 또는 임의의 알려진 TGF-β 패밀리 멤버의 아미노산 서열과 동일한 임의의 단백질을 포함한다. 예들은 제한되지 않으며 R & D Systems, MN에서 시판되는 인간 TGF-βl (cat #240-B-002) 및 인간 TGF-β3 (cat #243-B3-002)을 포함한다.
엔도글린의 단백질분해적 절단을 저해하는 치료 화합물(Therapeutic compounds that inhibit proteolytic cleavage of endgolin)
본 발명자들은 단백질 분해효소가 엔도글린의 막 결합 형태를 절단하여, 세포외 도메인을 가용성 형태로서 방출시키는, 엔도글린의 세포외 도메인의 잠재적인 절단 사이트(potential cleavage site)를 확인하였다. 절단 사이트의 서열 정렬은 기질메탈로프로테이나제(MMP)가 가용성 엔도글린의 절단 및 방출을 담당할 수 있음을 보여준다. 다른 방법으로서, 또한 카뎁신(cathepsin) 또는 엘라스타제(elastase)가 절단 이벤트에 포함될 수 있다. 또한 MMPs는 콜라게나제(collagenases), 젤라티나제(gelatinases) 및 스트로멜리신(stromelysins)으로서 알려져 있고, 현재 26 패밀리 멤버들이 알려져 있다(Whittaker and Ayscough, Cell Transmissions 17:1 (2001)를 재참조). 바람직한 MMP는 MMP9인데, 이는 전자간증 환자들의 태반에서 상향 조절(up-regulated)된다고 알려져 있다(Lim et al., Am. J. Pathol. 151:1809-1818, 1997). MMPs의 활성은 프로-효소의 활성화 및 메탈로프로테이나제들(TIMPS)의 조직 저해제들과 같은 내인성 저해제들(endogenous inhibitors)에 의한 저해를 통해 제어된다. MMPs의 저해제들은 아연 결합 단백질들(zinc binding proteins)이다. 4개의 알려진 내인성 저해제들(TIMP 1-4)이 있는데, Whittaker 등의 상술한 문헌에 개시되어 있다. 하나의 바람직한 MMP 저해제는 엔도글린과 유사성을 공유하는 분자인 베타글리칸을 절단하는 것으로 확인된 막 타입-MMPl의 저해제이다(Velasco-Loyden et al., J. Biol. Chem. 279:7721-7733 (2004)). 또한, 다양한 천연-발생 및 합성의 MMP 저해제들이 동정되었고, 또한 Whittaker 등의 상술한 문헌에 개시되어 있다. 예들은 MMPs에 직접 작용하는 항체들 및 마리마스태트(marimastat), 바티마스태트(batimastat), CT1746, BAY 12-9566, 프리노마스태트(Prinomastat), CGS-27023A, D9120, BMS275291 (Bristol Myers Squibb) 및 트로케이드(trocade)를 포함하는 다양한 화합물들을 포함하며, 이들 중 일부는 현재 임상의 시도가 있다. 가용성 엔도글린의 방출 및 농도의 상향 조절(up-regulation)에 있어서 MMPs, 카뎁신, 또는 엘라스타제들의 잠재적인 역할을 감안할 때, 본 발명은 환자에 있어서 전자간증 또는 자간증의 치료 또는 예방을 위해, 가용성 엔도글린의 절단 및 방출과 관련된 임의의 MMP, 카뎁신, 또는 엘라스타제의 활성을 저해하는 것으로 알려진, 상술한 바와 같은 임의의 화합물의 사용을 위해서도 제공한다.
가용성 엔도글린 결합 단백질들을 증가시키는 치료화합물(Therapeutic compounds that increase soluble endoglin binding proteins)
본 발명은 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2 및 BMP7를 포함하나 이들로 제한되는 것은 아닌, 가용성 엔도글린 결합 단백질들의 혈청 농도를 자극하거나 증가시키는 것으로 알려진 임의의 화합물을 환자에 있어서 전자간증의 치료 또는 예방을 위해 사용하는 것에도 관계한다. 이러한 화합물들은 단독 또는 상술한 정제된 단백질들과 조합하여 사용될 수 있거나 또는 임의의 다른 방법들이 본 명세서에 개시된 TGF-β 패밀리 단백질들 농도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 하나의 예에서, 사이클로스포린(cyclosporine)은 하루에 두 번 100-200 mg의 용량으로 TGF-βl 생산을 자극하는데 사용된다.
가용성 엔도글린 결합 단백질들의 혈청 농도를 증가시킬 수 있는 화합물들의 사용에 추가하여, 본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 치료방법들과 조합하여 임의의 만성 고혈압 투약(chronic hypertension medications)에서의 사용을 위해서 제공한다. 임신 중 고혈압의 치료를 위해 사용된 투약은 메틸도파(methyldopa), 하이드랄아진(hydralazine) 하이드로클로라이드(hydrochloride), 또는 라베탈올(labetalol)을 포함한다. 이러한 투약 각각에 대해, 투여 및 용량 방식은 내과 의사 및 제조자의 설명서에 의해 결정된다.
가용성 엔도글린의 항-혈관형성의 활성을 변경시키는 치료 화합물(Therapeutic compounds that alter the anti-angiogenic activity of soluble endoglin)
추가적인 치료 화합물들은 혈관 형성 분석법을 사용하여 동정될 수 있다. 예를 들어, 고농도의 가용성 엔도글린을 갖는 전자간증 혈청이 매트리겔 튜브 형성 분석법에 가해지면 항-혈관형성 상태가 유발될 것이다. 그 후에 테스트 화합물들이 분석법에 첨가될 수 있고 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상에 의한 항-혈관형성 상태의 복귀(reversion)는 상기 화합물이 가용성 엔도글린의 생물학적 활성을 감소시키고 치료 화합물로서 유용함을 나타낸다.
치료 핵산(Therapeutic nucleic acids)
최근 연구는 혈관 손상 사이트에 대한 VEGF와 같은 내피 세포 미토겐(mitogen)을 발현 가능한 핵산(DNA 또는 RNA)의 전달이 증식 및 손상된 혈관의 내피세포재증식(reendothelialization)을 유발할 것임을 보여준다. 본 발명은 혈관 손상에 관련되지는 않으나, 내피 세포에 대한 핵산의 전달을 위한 이러한 일반적인 기술들은 본 발명에서 TGF-βl, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2 및 BMP7과 같은 가용성 엔도글린 결합 단백질들을 인코딩하는 핵산들의 전달을 위해서 사용될 수 있다. 또한 상기 기술들은 환자에 있어서 전자간증 또는 자간증의 치료 또는 예방을 위해서, 가용성 엔도글린의 절단 및 방출과 관련된 임의의 MMP, 카뎁신, 또는 엘라스타제의 활성을 저해하는 것으로 알려진, 상술한 바와 같은, 단백질들을 인코딩하는 핵산들의 전달을 위해 사용될 수 있다. 이러한 일반적인 기술들은 미국 특허 제5,830,879호 및 제6,258,787호에 개시되어 있으며 참조로서 본 명세서에 편입된다.
본 발명에서 핵산은 TGF-βl, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2 및 BMP7과 같은 가용성 엔도글린 결합 단백질들을 인코딩하는, 게노믹 DNA, cDNA 및 mRNA를 포함하는 임의의 핵산(DNA 또는 RNA)일 수 있다. 필요한 단백질을 인코딩하는 핵산들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 일반적인 방법, 예컨대 재조합 DNA, PCR 증폭을 사용하여 얻을 수 있다.
핵산의 전달 방법(Modes for delivering nucleic acids)
본 명세서에 개시된 임의의 핵산 적용을 위해서, 핵산들을 투여하기 위한 표준 방법들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 가용성 엔도글린 결합 단백질을 인코딩하는 핵산의 조작 및 취급을 단순화하기 위해, 핵산은 바람직하게 프로모터에 작동가능하게 연결된 카세트 내로 삽입된다. 프로모터는 목적으로 하는 표적 숙주 세포 내에서 가용성 엔도글린 결합 단백질의 발현을 구동할 수 있어야만 한다. 적합한 프로모터들의 선택은 쉽게 수행될 수 있다. 바람직하게, 고발현 프로모터를 사용할 것이다. 적합한 프로모터의 예는 763 염기쌍의 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus:CMV) 프로모터이다. 또한 라우스육종바이러스(Rous sarcoma virus:RSV) (Davis, et al., Hum. Gene Titer. 4:151-159, 1993) 및 마우스유방암바이러스(mouse mammary tumor virus:MMTV) 프로모터들을 사용할 수 있다. 특정 단백질들은 그들의 고유의 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 또한 발현을 상승시키는 다른 요소들이 포함될 수 있다(예컨대, tat 유전자 및 tar 요소와 같은 고농도의 발현에 기여하는 인핸서들 또는 시스템). 재조합 벡터는 pUCl18, pBR322와 같은 플라스미드 벡터 또는 예를 들어, E. coli 복제 기원(E. coli origin of replication)을 포함하는 다른 알려진 플라스미드 벡터들일 수 있다(Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989 참조). 또한 플라스미드 벡터는 마커 폴리펩티드가 치료 대상 생물의 대사작용에 악영향을 미치지 않는다면, 암피실린 저항성(ampicillin resistance)이 있는 β 락타마제 유전자(β lactamase gene)와 같은 선택적 마커를 포함할 수 있다. 또한 카세트는 PCT 공개 제WO95/22618호에 개시된 시스템과 같은, 합성 전달 시스템에서 핵산 결합 모이어티에 결합될 수 있다.
핵산은 이용된 벡터에 따른 임의의 적합한 수단에 의해 세포들 내로 도입될 수 있다. 이러한 많은 방법들이 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있다(Sambrook 등의 상술한 문헌 및 Watson et al., "Recombinant DNA", Chapter 12, 2d edition, Scientific American Books, 1992). 재조합 벡터들은 칼슘 포스페이트 침전법(calcium phosphate precipitation), 일렉트로포레이션(electroporation), 리포좀-매개 형질감염(liposome-mediated transfection), 유전자 총(gene gun), 마이크로인젝션(microinjection), 바이러스 캡시드-매개 전이법(viral capsid-mediated transfer), 폴리브렌-매개 전이법(polybrene-mediated transfer), 또는 프로토플라스트 융합법(protoplast fusion)과 같은 방법들에 의해 전이될 수 있다. 리포좀 준비, 표적화 및 내용물의 전달을 위한 방법을 검토하려면, Mannino and Gould-Fogerite, (Bio Techniques, 6:682- 690, 1988), Feigner and Holm, (Bethesda Res. Lab. Focus, 11:21, 1989) 및 Maurer (Bethesda Res. Lab. Focus, 11 :25, 1989)를 참조한다.
재조합 벡터(플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터 중 하나)의 전이는 양수 안으로의 직접적인 주입 또는 정맥 내 전달(intravenous delivery)을 통해 수행될 수 있다.
또한 아데노바이러스 벡터들 또는 아데노-관련 벡터들(AAV)을 사용하는 유전자 전달(Gene delivery)이 사용될 수 있다. 아데노바이러스는 많은 동물종에 존재하며, 심한 병원성이 아니고, 분할기 및 정지 세포들(quiescent cells)들로 균일하게 복제할 수 있다. 일반적인 규칙에 따라, 유전자 전달에 사용된 아데노바이러스는 바이러스성 복제(viral replication)에 요구되는 하나 이상의 유전자들이 결여된다. 가용성 엔도글린 결합 단백질의 전달에 사용된 복제-결손(Replication-defective) 재조합 아데노바이러스 벡터들은, 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 기술들에 따라 생산될 수 있다(Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 89:2581-2584, 1992; Stratford- Perricadet et al., J. Clin. Invest., 90:626-630, 1992; 및 Rosenfeld et al., Cell, 68:143-155, 1992 참조). 자궁(utero)에서 유전자 치료요법의 사용 예는 미국 특허 제6,399,585호를 참조한다.
전이가 일어나는 경우, 핵산은 가용성 엔도글린 결합 단백질의 혈청 농도를 증가시키는 데 충분한 시간 동안 손상된 사이트에서 세포들에 의해 발현된다. 핵산을 포함하는 벡터들이 세포들의 지놈 안으로 정상적으로 편입되지 않기 때문에, 관심 단백질의 발현은 단지 제한된 시간 동안에만 일어난다. 전형적으로, 단백질이 약 이틀에서 몇 주 동안, 바람직하게 약 1 내지 2주 동안 치료 농도에서 발현된다. DNA의 재적용은 치료 단백질의 발현의 추가적인 기간을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
가용성 엔도글린 발현을 저해하는 치료 핵산(Therapeutic nucleic acids that inhibit soluble endoglin expression )
또한 본 발명은 가용성 엔도글린 mRNA의 발현을 직접적으로 하향조절하기 위해 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머들의 사용을 특징으로 한다. 상보적인 핵산 서열(센스 또는 코드화 가닥)에 대한 결합으로 인해, 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머들은 추측컨대 RNAse H에 의한 RNA 가닥의 효소적 절단을 통해 단백질 발현을 저해할 수 있다. 바람직하게 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머는 고농도의 가용성 엔도글린을 발현하는 세포에 있어서 가용성 엔도글린 단백질 발현을 감소시킬 수 있다. 바람직하게 가용성 엔도글린 단백질 발현의 감소는 대조군 올리고뉴클레오티드를 갖는 치료받은 세포들에 비해 10% 이상, 바람직하게 20% 또는 그 이상, 더욱 바람직하게 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상을 나타낸다. 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머의 선택 및 제조 방법들은 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있다. VEGF 발현을 하향 조절하기 위한 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머들의 예는 미국 특허 제6,410,322호에 개시되어 있으며, 참조로서 본 명세서에 편입된다. 또한 단백질 발현의 분석 방법들은 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있으며 웨스턴 블롯팅, 면역침전법 및 ELISA를 포함한다.
또한 본 발명은 가용성 엔도글린의 발현을 저해하기 위한 RNA 간섭(RNAi)의 사용을 특징으로 한다. RNA 간섭(RNAi)은 대상 유전자들 또는 mRNA에 상응하는 이중-가닥 RNA(dsRNA)가 생물 내에 도입되어 해당하는 RNA를 파괴하는 최근에 발견된 유전자에 대응하는 전사 후 유전자 사일런싱(post-transcriptional gene silencing :PTGS) 메카니즘이다. RNAi 반응에 있어서, dsRNA 분자의 센스 및 안티센스 가닥 둘다는 21 내지 23 뉴클레오티드(nt)의 길이의 범위를 갖고 2- 뉴클레오티드 3' 테일들을 갖는 작은 RNA 단편들 또는 분절들 내로 프로세싱된다. 다른 방법으로서, 합성의 dsRNAs는, 21 내지 23 nt의 길이 및 2-뉴클레오티드 3 ' 테일들을 갖는데, 합성되고, 정제되고, 반응에 사용될 수 있다. 이러한 21 내지 23 뉴쿨레오티드(nt) dsRNAs는 "가이드 RNAs(guide RNAs)" 또는 "작은 간섭 RNAs(short interfering RNAs)" (siRNAs)로 알려져 있다.
이어서 siRNA 듀플렉스들은 복합체 내의 siRNA에 대한 상동성을 갖는 내인성 mRNAs를 표적으로 하여 파괴하는 단백질들로 구성된 뉴클레아제 복합체(nuclease complex)에 결합한다. 복합체 내의 단백질들의 상동성이 명확하지는 않지만, 복합체의 기능은 siRNA 가닥들의 하나 및 내인성 mRNA 사이의 염기쌍 상호작용을 통해 상동성 mRNA 분자를 표적화한다. 이어서 mRNA는 siRNA의 3' 터미널로부터 약 12 nt가 절단되고 분해된다. 이러한 방식으로, 특이적 유전자들은 표적화되고 분해될 수 있고, 그에 의해 표적 유전자로부터 단백질 발현의 손실을 야기할 수 있다. 또한 siRNAs는 화학적으로 합성되거나 또는 화학적으로 siRNAs를 합성하는 회사(예컨대, Dharmacon Research Inc., Pharmacia, 또는 ABI)로부터 얻을 수 있다.
dsRNA의 특이적 요구들 및 변형들은 PCT 공개 제WOO1/75164호(참조로서 본 명세서에 편입된)에 개시되어 있다. dsRNA 분자들은 길이면에서 다양할 수 있으나, 특징적인 2- 내지 3- 뉴클레오티드 3' 돌출부 말단(overhanging ends)에 전형적으로 (2'-디옥시)티미딘 또는 우라실 중 하나를 갖는 21- 내지 23- 뉴클레오티드 dsRNAs인 siRNA 분자들을 사용하는 것이 가장 바람직하다. siRNAs는 전형적으로 3' 하이드록실기를 포함한다. 또한 dsRNA의 블런트(blunt) 말단 형태뿐 아니라 단일 가닥 siRNA는 사용될 수 있다. RNA의 안정성을 더욱 높이기 위해, 3' 돌출부(overhangs)는 분해에 대항해 안정화될 수 있다. 이러한 하나의 구현예에서, RNA는 아데노신 또는 구아노신과 같은 퓨린 뉴클레오티드들을 포함함으로써 안정화된다. 다른 방법으로서, 변형된 유사체들에 의한 피리미딘 뉴클레오티드들의 치환, 예컨대, (2'-디옥시)티미딘에 의한 우리딘 2- 뉴클레오티드 돌출부의 치환은 내성이 있고 RNAi의 효율에 영향을 미치지 않는다. 2' 하이드록실기의 부재는 조직 배양 배지에서의 돌출부의 뉴클레아제 저항성을 현저하게 상승시킨다.
다른 방법으로서, siRNA는 PCT 공개 제WO01/75164호(참조로서 본 명세서에 편입된)에 개시된 임의의 방법들을 사용하거나 또는 Elbashir et al. (Genes & Dev., 15:188- 200, 2001)에 개시된 생체 외(in vitro) RNA 전사 및 dsRNA의 어닐링(annealing) 방법의 표준 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. 또한 siRNAs는 Elbashir 등의 상술한 문헌에 개시된 방법, dsRNA가 약 21 내지 약 23 뉴클레오티드들의 siRNAs를 발생시키도록 프로세싱되는 조건들 하에 융합체성 배반엽 초파리 배아들(syncytial blastoderm Drosophila embryos)로부터 무세포 초파리 라이세이트(cell-free Drosophila lysate)에서 표적 유전자의 서열에 대응하는 dsRNA의 인큐베이션에 의해 얻어지고, 이어서 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려진 기술들을 사용하여 분리된다. 예를 들어, 겔 전기영동법(gel electrophoresis)이 21-23 nt RNAs를 분리하는 데 사용될 수 있고, 이어서 RNAs는 겔 슬라이스들(slices)로부터 용출될 수 있다. 또한, 크로마토그래피(예컨대, 크기 배제 크로마토그래피), 글리세롤 구배 원심분리법(glycerol gradient centrifugation) 및 항체를 갖는 친화성 정제는 21 내지 23 nt RNAs를 분리하는데 사용될 수 있다.
다양한 방법들이 dsRNA 또는 올리고뉴클레오티드들의 포유동물 세포 내로의 형질감염 또는 도입에 적용되고 있다. 예를 들어, TransIT-TKO™ (Mirus, cat. # MIR 2150), Transmessenger™ (Qiagen, cat. # 301525) 및 Oligofectamine™ (Invitrogen, cat. # MIR 12252-011)을 포함하나 이들로 제한되지는 않는, 몇 가지 형질감염 시약들이 상업적으로 시판되고 있다. 각각의 형질감염 시약의 프로토콜은 제조자로부터 시판된다.
본 발명에서, dsRNA, 또는 siRNA는, 가용성 엔도글린 mRNA의 mRNA 서열에 상보적이고, 가용성 엔도글린의 발현을 감소시키거나 저해시킬 수 있다. 바람직하게, 가용성 엔도글린 단백질 발현의 감소는 대조군 dsRNA 또는 siRNA의 치료받은 세포들에 비해 10% 이상, 더욱 바람직하게 25% 및 가장 바람직하게 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상이다. 단백질 발현 농도의 분석 방법들은 또한 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있고, 웨스턴 블롯팅, 면역침전법 및 ELISA를 포함한다.
본 발명에서, 사용된 핵산들은 임의의 방식으로 핵산의 안정성 또는 기능을 상승시키는 임의의 변형을 포함한다. 예들은 포스페이트 백본(phosphate backbone), 뉴클레오티드 간의 결합(internucleotide linkage), 또는 슈가 모이어티(sugar moiety)에 대한 변형들을 포함한다.
임신 초기에 유용한 가용성 엔도글린 기초 치료 화합물(Soluble endoglin based therapeutic compounds useful in early pregnancy)
전장 엔도글린 시그널링(full-length endoglin signaling)의 저해는 융모성 체외이식조직 배양(villous explant cultures)에서 영양막 침습(invasivness)을 증가시키는 것으로 확인되었다(Caniggia I et al, Endocrinology, 1997, 138:4977-88). 그러므로 가용성 엔도글린은 임신 초기에 영양막 침습을 상승시킬 것이다. 따라서, 임신관련 고혈압 질환의 발병 또는 임신관련 고혈압 질환의 발병 가능성을 갖지 않는 여성에 있어 임신 초기에 가용성 엔도글린 농도를 증가시키는 조성물들은 태반형성을 상승시키는 데 유용할 수 있다. 가용성 엔도글린 농도를 증가시키는 조성물들의 예들에는 정제된 가용성 엔도글린 폴리펩티드들, 가용성 엔도글린을 인코딩하는 핵산 분자들 및 가용성 엔도글린의 농도 또는 생물학적 활성을 증가시키는 화합물들 또는 성장 인자들을 포함한다.
유전자 및 단백질 발현 분석(Assays for gene and protein expression)
다음의 방법들은 단백질 또는 유전자 발현을 평가하고 가용성 엔도글린 결합 단백질 농도를 증가시키거나, 또는 가용성 엔도글린 단백질 농도를 감소시키는 상기 언급한 임의의 방법들의 효과를 측정하기 위해 사용될 수 있다.
환자의 혈액 혈청은 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 또는 특이적 항체들을 사용하는 면역 분석법들과 같은 방법들을 사용하여, 가용성 엔도글린의 농도가 측정된다. 또한 환자의 혈액 혈청은 TGF-β1 , TGF-β3 , 액티빈-A, BMP2, BMP7, 또는 가용성 엔도글린에 결합하는 것으로 알려진 임의의 단백질 리간드의 농도로 측정된다. 단백질의 혈청 농도를 측정하는 데 사용되는 방법들은 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 또는 특이적 항체들을 사용하는 면역 분석법들을 포함한다. 또한, 생체 외 혈관 형성 분석법들(in vitro angiogenesis assay)은 환자의 혈액이 항-혈관형성 상태(anti-angiogenic state)에서 혈관형성-촉진 상태(pro-angiogenic state)로 전환하는지에 대해 측정하기 위해 수행될 수 있다. 이러한 분석법들은 실시예 4에서 상세히 설명되었다. 긍정적인 결과는 가용성 엔도글린, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2, BMP7, 또는 가용성 엔도글린에 결합하는 것으로 알려진 임의의 단백질 리간드의 농도에 있어서 적어도 10%, 20%, 바람직하게 30%, 더욱 바람직하게 적어도 40% 또는 50% 및 가장 바람직하게 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 증가가 고려된다. 또한 긍정적인 결과가 생체 외 혈관 형성 분석법을 사용하여 적어도 10%, 바람직하게 20%, 30%, 40%, 50% 및 가장 바람직하게 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 항-혈관형성 상태에서 혈관형성-촉진 상태로의 전환이 고려될 수 있다.
또한 환자의 혈액 혈청 또는 소변 샘플들은 TGF-βl, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2, BMP7, 또는 가용성 엔도글린을 인코딩하는 핵산들 또는 폴리펩티드들의 농도로 측정될 수 있다. 유전자 발현에 대한 분석을 위한 몇 가지 잘 알려진 방법들이 있다. 몇 가지 예들은 환자의 혈액 샘플들로부터의 RNA 제조 및 노던 블롯팅, PCR 기초 증폭, 또는 RNAse 프로텍션 분석법들에 대한 RNA의 사용을 포함한다. 긍정적인 결과는 가용성 엔도글린, TGF-βl, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2, BMP7 핵산들의 농도에 있어서 적어도 10%, 20%, 바람직하게 30%, 더욱 바람직하게 적어도 40% 또는 50% 및 가장 바람직하게 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 증가가 고려된다.
치료요법을 위한 항체들의 사용(Use of antibodies for therapeutic treatment)
전자간증을 앓고 있는 임신한 여성으로부터 채취한 혈청 샘플들에서 발견된 고농도의 가용성 엔도글린은 가용성 엔도글린이 태아 또는 태반의 적절한 발생 및 혈관 형성을 위해 요구되는 영양막 세포들 및 모체의 내피 세포의 기능성 성장 인자들에 결합하여 이를 감소시키기 위한 "생리학적 싱크(physiologic sink)"로서 작용함을 보여준다. 가용성 엔도글린에 결합(예컨대, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2, BMP7에 대한 결합)하여 가용성 엔도글린의 활성을 중화시키는, 항체들과 같은, 화합물들의 사용은, 유리된 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2 및 BMP7의 증가를 일으킴으로써 전자간증 또는 자간증의 예방 또는 치료에 도움을 줄 수 있다. 이러한 증가는 태반 발생 및 태아의 영양분을 위해서 및 전신 모체의 내피 세포 건강을 위해서 요구되는 영양막 증식, 이동 및 혈관 형성의 증가를 허용할 것이다.
본 발명은 가용성 엔도글린의 리간드-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항체들을 제공한다. 항체들은 가용성 엔도글린의 활성을 중화시키는 데 사용되고 가장 효과적인 메카니즘은 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2, 또는 BMP7에 대한 결합 사이트의 직접적인 차단을 통해 이루어지나, 그러나, 다른 메카니즘도 배제되지는 않는다. 치료 목적을 위한 항체들의 제조 및 사용 방법들은 미국 특허 제6,054,297호; 제5,821,337호; 제6,365,157호; 및 제6,165,464호를 포함한 몇 가지 특허들에 개시되어 있으며 참조로서 본 명세서에 편입된다. 항체들은 다중클론 또는 단일클론일 수 있으며; 단일클론 항체들이 바람직하다.
단일클론 항체들, 특히 마우스들을 포함하는 설치류(rodents)로부터 유래한 것들은, 다양한 질병들의 치료에 사용되어 왔다. 그러나, 치료 효능의 신속 제거(clearance) 및 감소를 일으키는 인간 항-마우스 면역글로불린 반응의 유발을 포함하여 이들의 사용은 제한된다. 예를 들어, 설치류 단일클론 항체들의 임상의 사용에 있어서 주요한 제한은 치료 중의 항-글로불린 반응(anti-globulin response)이다(Miller et al., Blood, 62:988-995 1983; Schroff et al., Cancer Res., 45:879-885, 1985).
본 발명이 속하는 기술분야는 동물성 항원-결합 가변 도메인(animal antigen-binding variable domain)이 인간 불변 도메인(human constant domain)에 결합하는 "키메라(chimeric)" 항체들을 구성함으로써 이러한 문제를 극복하고자 하였다(미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 81:6851-6855, 1984; Boulianne et al, Nature, 312:643-646, 1984; Neuberger et al., Nature, 314:268-270, 1985). 이러한 키메라 항체들의 생산 및 사용은 후슬한다.
가용성 엔도글린에 결합하는 리간드의 경쟁적 저해는 전자간증 또는 자간증의 예방 또는 치료를 위해 유용하다. 이러한 증가는 내피성 장애(endothelial dysfunction)의 구조(rescue) 및 혈관 형성을 향한 혈관형성-촉진/항-혈관형성인자들의 균형의 시프트(shift)를 야기할 수 있다.
본 발명의 단일클론 항체들의 칵테일(cocktail)은 전자간증 또는 자간증의 치료에 유용하다. 칵테일은 적게는 2, 3, 4의 다른 항체들 또는 많게는 6, 8, 또는 10의 다른 항체들을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체들은 항-고혈압 약물(예컨대, 메틸도파, 하이드랄아진 하이드로클로라이드, 또는 라베탈올)과 결합되거나 또는 전자간증, 자간증, 또는 전자간증 또는 자간증과 관련된 증상들의 치료를 위해 사용되는 임의의 다른 약물들과 함께 조합될 수 있다.
항체들의 제조(Preparation of antibodies)
sFlt-1 수용체에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체들은 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 방법들에 의해 생산될 수 있다. 이러한 방법들은 Huse et al. (Science, 246, 1275-1281, 1989)에 개시된 재조합 DNA 방법뿐 아니라, Kohler and Milstein (Nature, 256: 495- 497, 1975) 및 Campbell에 의해 개시된 면역학적 방법을 포함한다("Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" in Burdon et al., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985).
단일클론 항체들은 배양된 하이브리도마(hybridoma) 세포들의 상등액(supernatants) 또는 마우스들 안으로 하이브리도마 세포들의 복막 내 접종(intra-peritoneal inoculation)으로 인해 유발되는 복수(ascites)로부터 제조될 수 있다. 원래 Kohler and Milstein (Eur. J. Immunol, 6, 511-519, 1976)에 개시된 하이브리도마 기술은 많은 특이적 항원들에 대항하여 단일클론 항체들을 고농도로 분비하는 하이브리드 세포주(cell lines)를 생산하도록 광범위하게 적용된다.
숙주 동물 또는 그로부터 배양된 항체-생성 세포들의 면역화(immunization)의 루트 및 스케쥴은 일반적으로 항체 자극 및 생산에 대한 확립된 종래의 기술들에 일치한다. 전형적으로, 테스트 모델로서 사용되는 마우스들, 그러나, 인간 환자들을 포함하는 임의의 포유동물 또는 그로부터의 항체 생성세포들은 사람을 포함하는 포유동물, 하이브리드 세포주의 생산을 위한 기초로서 기능하도록 본 발명의 방법들에 따라 조작될 수 있다.
면역화 후에, 면역성 림프계 세포들(lymphoid cells)은 배양되고 무한정 이차배양되어 대량의 단일클론 항체들을 생산할 수 있는 하이브리드 세포주를 만들기 위해 골수종세포(myeloma cell)와 융합된다. 본 발명의 목적을 위해, 융합을 위해 선택된 면역성 림프계 세포들은 림프구(lymphocytes) 및 그들의 정상적으로 분화된 자손(progeny)인데, 이는 면역화된 동물들의 림프절(lymph node) 조직 또는 비장(spleen) 조직 중 하나에서 얻어진다. 비장 세포들의 사용이 바람직한데, 이는 마우스 시스템에 관해 항체 생성 세포들이 좀더 집중되고 편리한 근원을 제공하기 때문이다. 골수종 세포들은 융합된 하이브리드의 지속적인 증식(propagation)의 기초를 제공한다. 골수종 세포들은 혈장 세포들로부터 유래한 종양(tumor) 세포들이다. 마우스의 골수종 세포주는, 예를 들어, American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)으로부터 얻을 수 있다. 또한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 개시되어 있다(Kozbor et al., J. Immunol, 133:3001-3005, 1984; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63, 1987).
하이브리드 세포주는 세포 배양 배지 내에서 생체 외(in vitro)로 유지할 수 있다. 일단 하이브리도마 세포주가 확립되면, 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 배지와 같은 다양한 영양적으로 적당한 배지에 유지될 수 있다. 더욱이, 하이브리드 세포주는 액체 질소 하에서의 냉동 및 저장을 포함하여, 많은 종래의 방식들로 저장 및 보존될 수 있다. 냉동 세포주는 다시 시작된 합성 및 단일클론 항체의 분비로 무한정 재생 및 배양될 수 있다. 분비된 항체는 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 종래의 방법들에 의해 조직 배양 상등액으로부터 회복될 수 있다.
항체는 마우스, 랫트, 토끼, 염소 및 인간을 포함하여, 임의의 포유동물에서 준비될 수 있다. 항체는 다음의 면역글로불린 클래스들의 하나의 멤버일 수 있다: IgG, IgM, IgA3 IgD, 또는 IgE 및 그의 서브클래스들, 그리고 바람직하게 IgG 항체이다.
단일클론 항체들을 생산하기 위한 바람직한 동물은 마우스이나, 본 발명이 그것으로 제한되는 것은 아니고; 사실상, 인간 항체들이 사용될 수 있고 바람직할 수 있다. 이러한 항체들은 인간 하이브리도마를 사용함으로써 얻을 수 있다(Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss Inc., p. 77-96, 1985). 본 발명에서, 인간 항체 분자의 유전자들과 함께 적합한 항원 특이성이 있는 마우스 항체 분자의 유전자들을 스플라이싱함으로써 키메라 항체들의 생산을 위해 개발된 기술들이 사용될 수 있고(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sd. 81, 6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature 'ill, 604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314, 452-454, 1985); 이러한 항체들은 본 발명의 보호범위 내에 포관되며 후술한다.
세포 융합 기술에 대한 다른 대체적인 것으로서, Epstein-Barr 바이러스(EBV) 무한증식의 B 세포들이 본 발명의 단일클론 항체들을 생산하는 데 사용된다(Crawford et al., J. Gen. Virol, 64:697-700, 1983; Kozbor and Roder, J. Immunol., 4:1275-1280, 1981; Kozbor et al., Methods Enzymol, 121:120-140, 1986). 일반적으로, 방법은 적합한 근원, 일반적으로 감염된 세포주로부터 Epstein-Barr 바이러스를 분리시키는 단계, 및 바이러스를 포함하는 상등액에 대해 표적 항체 분비 세포들을 노출시키는 단계를 포함한다. 세포들은 세정되고, 적합한 세포 배양 배지에서 배양된다. 이어서, 세포 배양에 존재하는 바이러스성 형질전환 세포들은 Epstein-Barr 바이러스성 핵 항원의 존재하에 동정될 수 있고, 형질전환 항체 분비 세포들은 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 표준 방법들을 사용하여 동정될 수 있다. 재조합 DNA와 같은 단일클론 항체들을 생산하기 위한 다른 방법들은, 또한 본 발명의 영역 내에 포함된다.
가용성 엔도글린 면역원의 제조(Preparation of soluble endoglin immunogens)
가용성 엔도글린은 면역원(immunogen)으로서 단독으로 사용되거나, 또는 세파로스 비드(sepharose beads)와 같은 담체 단백질 또는 다른 물질(objects)에 부착될 수 있다. 가용성 엔도글린은 인간 제대정맥 내피 세포(영양막 또는 HUVEC; Burrows et al., Clin. Cancer Res. 1:1623-1634, 1995; Fonsatti et al., Clin. Cancer Res. 6:2037-2043, 2000)와 같은 내인성 단백질을 발현하기 위해 알려진 세포들로부터 정제될 수 있다. 막 결합 엔도글린을 발현하는 세포들은, 세포외 도메인을 절단하는 단백질 분해효소(예컨대, 기질메탈로프로테이나제)로 처리되어, 가용성 형태의 엔도글린을 생산할 수 있다. 또한, 가용성 엔도글린, 또는 그의 일부분들을 인코딩하는 핵산 분자들은, 표준 재조합 DNA 기술들을 사용하여 숙주 세포들에서의 발현을 위해 알려진 벡터들 내로 삽입될 수 있다. 가용성 엔도글린 발현을 위한 적합한 숙주 세포들은 바쿨로바이러스 세포들(예컨대, SfP 세포들), 박테리아성 세포들(예컨대, E. coli) 및 포유동물의 세포들(예컨대, NIH3T3 세포들)을 포함한다.
또한, 펩티드들은 면역원들로서 합성되고 사용될 수 있다. 펩티드들에 대한 항체의 제조 방법들은 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있고 일반적으로 혈청 알부민과 같은 적합한 담체 분자와 펩티드의 결합을 요구한다. 펩티드들은 GenBank accession numbers AAH29080 및 NP_031958 (마우스); AAS67893 (랫트); NP_000109, P17813, VSP_004233 및CAA80673 (인간); 및 A49722 (돼지)에 대응하는 가용성 엔도글린 아미노산 서열의 임의의 부분과 실질적으로 동일한 임의의 아미노산 서열을 포함한다. 펩티드들은 임의의 길이일 수 있고, 바람직하게 10 아미노산들 또는 그 이상, 더욱 바람직하게 25 아미노산들 또는 그 이상 및 가장 바람직하게 40, 50, 60, 70, 80, 100, 200, 300, 400, 437 아미노산들 또는 그 이상일 수 있다. 바람직하게, 아미노산 서열들은 인간 엔도글린 서열들의 임의의 서열에 적어도 60%, 더욱 바람직하게 85%, 및, 가장 바람직하게 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 펩티드들은 상업적으로 얻거나 또는 예를 들어, Merrifield solid-phase 방법(Science, 232:341-347, 1985)과 같은, 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 기술들을 사용하여 만들 수 있다. 방법은 Biosearth 9500 자동화 펩티드 기기와 같은 상업적으로 시판되는 합성기(synthesizers)를 사용할 수 있는데, 차단된 아미노산들을 절단하여 하이드로겐 플로라이드(hydrogen fluoride)를 얻을 수 있고, 펩티드들이 15-20 μm Vydac C4 PrepPAK 칼럼에서 Waters Delta Prep 3000 instrument를 사용하여 preparative HPLC에 의해 정제될 수 있다.
항체들의 기능성 등가물들(Functional equivalents of antibodies)
또한 본 발명은 본 명세서에 개시되어 있는 항체들의 기능성 등가물들을 포함한다. 기능성 등가물들은 본 발명의 항체들의 가변 또는 과가변 영역들의 아미노산 서열에 실질적으로 동일한 아미노산 서열들을 갖는 폴리펩티드들을 포함한다. 기능성 등가물들은 그의 단편들뿐 아니라 키메라화(chimerized), 인간화 및 단일쇄 항체들을 포함하여 항체들과 비교할 수 있는 결합 특성을 가진다. 이러한 기능성 등가물들의 제조 방법들은, 예를 들어, PCT 공개 제WO93/21319호; 유럽특허출원번호 제239,400호; PCT 공개 제WO89/09622호; 유럽특허출원번호 제338,745호; 유럽특허출원번호 제332424호; 및 미국 특허 제4,816,567호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 참조로서 본 명세서에 편입된다.
키메라화 항체들은 바람직하게 인간 항체 불변 영역들로부터 실질적으로 또는 독점적으로 유래된 불변 영역들 및 인간 이외의 포유동물의 가변 영역의 서열로부터 실질적으로 또는 독점적으로 유래된 가변 영역들을 가진다. 이러한 인간화 항체들은 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린들, 면역글로불린쇄들 또는 그의 단편들(Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체들의 다른 항원-결합 서브서열들과 같은)이다. 비-인간 항체들의 인간화 방법들은 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있다(Vaswani and Hamilton, Ann. allergy Asthma Immunol, 81 :105- 119, 1998 및 Carter, Nature Reviews Cancer, 1:118-129, 2001를 재참조). 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 근원으로부터 그것 안으로 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기들을 갖는다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기들은 수입(import)된 잔기들을 의미하고, 이는 전형적으로 수입된 가변 도메인으로부터 얻을 수 있다. 인간화는 본질적으로 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 다음의 방법들로 수행될 수 있는데(Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323-329, 1988; 및 Verhoeyen et al., Science, 239:1534- 1536 1988), 이는 설치류 CDRs 또는 다른 CDR 서열들을 인간 항체의 대응하는 서열들로 치환하는 방법에 의한다. 따라서, 이러한 인간화 항체들은 키메라 항체들인데 상기 완전한(intact) 인간 가변 도메인의 훨씬 적은 부분이 비-인간 종의 대응하는 서열로 치환된다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조). 실제로, 인간화 항체들은 전형적으로 인간 항체들인데 상기 몇 가지 CDR 잔기들 및 가능한 몇 가지 FR 잔기들은 설치류 항체들의 유사한 부위로부터의 잔기들로 치환된다(Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596, 1992).
인간화 항체들의 추가적인 제조 방법들은 미국 특허 제5,821,337호 및 제6,054,297호 및 Carter(상술한 문헌)에서 찾을 수 있으며, 이들 모두는 참조로서 본 명세서에 편입된다. 인간화 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 이소타입을 포함하여, 면역글로불린들의 임의의 클래스에서 선택된다. 세포독성 활성(cytotoxic activity)이 요구되지는 않으나, 본 발명에서와 같이, 불변 도메인은 바람직하게 IgG2 클래스에 속한다. 인간화 항체는 하나 이상의 클래스 또는 이소타입의 서열들을 포함할 수 있고 특히 바라던 효과기(effector) 기능을 최적화하기 위해 불변 도메인들을 선택하는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들의 통상적인 업무 범위 내에 있다.
또한 인간 항체들은 파아지 디스플레이 라이브러리(phage display libraries)를 포함하여, 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 다양한 기술들을 사용하여 제조될 수 있다(Marks et al., J. MoI. Biol, 222:581-597, 1991 및 Winter et al. Annu. Rev. Immunol, 12:433-455, 1994). 또한 Cole et al. 및 Boerner et al.의 기술들은 인간 단일클론 항체들의 제조에 유용하다(Cole 등의 상술한 문헌; Boerner et al., J. Immunol, 147: 86-95, 1991).
인간 이외의 적합한 포유동물들은 단일클론 항체들이 만들어질 수 있는 임의의 포유동물을 포함한다. 인간 이외의 포유동물들의 예들은, 예를 들어 토끼, 랫트, 마우스, 말, 염소, 또는 영장류(primate)를 포함하는데, 마우스가 바람직하다.
또한 항체들의 기능성 등가물들은 단일쇄 항체들(single-chain antibodies:scFvs)로서 알려진 단일쇄 항체 단편들(single-chain antibody fragments)을 포함한다. 단일쇄 항체 단편들은 전형적으로 항원들 또는 수용체들에 결합하는 재조합 폴리펩티드들인데, 이러한 단편들은 하나 이상의 상호연결 링커들을 가지거나 또는 가지지 않는 항체 가변 경쇄 서열(antibody variable light-chain sequence:VL)의 하나 이상의 단편에 연결된 항체 가변 중쇄 아미노산 서열(antibody variable heavy-chain amino acid sequence:VH)의 하나 이상의 단편을 포함한다. 이러한 링커는 그로부터 단일쇄 항체 단편이 유래된 전체 항체의 표적 분자 결합-특이성을 유지하도록 연결되면, VL 및 VH 도메인들의 적절한 삼차원 폴딩이 일어나도록 보증하도록 선택된 짧고, 가요성인 펩티드일 수 있다. 일반적으로, VL 또는 VH 서열의 카르복실 터미널은 이러한 펩티드 링커에 의해 상보적인 VL 및 VH 서열의 아미노산 터미널에 공유 결합한다. 단일쇄 항체 단편들은 분자 클로닝(molecular cloning), 항체 파아지 디스플레이 라이브러리 또는 유사한 기술들에 의해 생산될 수 있다. 이러한 단백질들은 박테리아를 포함하여, 진핵세포들 또는 원핵생물성 세포들 각각에서 생산될 수 있다.
단일쇄 항체 단편들은 본 명세서에서 개시한 전체 항체들의 하나 이상의 가변 영역들 또는 CDRs을 갖는 아미노산 서열들을 포함하나, 그러한 항체들의 불변 도메인들의 몇 가지 또는 전부가 결여된다. 이러한 불변 도메인들은 항원 결합에 필요하지는 않으나, 전체 항체들의 구조의 주요 부분을 구성한다. 그러므로 단일쇄 항체 단편들은 불변 도메인의 부분 또는 전부를 포함하는 항체들의 사용에 관련된 몇 가지 문제들을 극복할 수 있다. 예를 들어, 단일쇄 항체 단편들은 생물학적 분자들 및 중쇄 불변 영역 사이의 원하지 않는 상호작용들, 또는 다른 원하지 않는 생물학적 활성을 갖지 않는 경향이 있다. 또한, 단일쇄 항체 단편들은 전체 항체들보다 훨씬 작고, 따라서 전체 항체들보다 더 큰 모세관 투과성(capillary permeability)을 가질 수 있는데, 이는 단일쇄 항체 단편들이 표적 항원-결합 사이트에 대해 더욱 효과적으로 위치하여 결합하도록 허용한다. 또한, 항체 단편들은 원핵생물성 세포들에서 상대적으로 큰 스케일로 생산될 수 있는데, 따라서 그들의 생산을 용이하게 한다. 더욱이, 단일쇄 항체 단편들의 상대적으로 작은 크기는 그들이 전체 항체들보다 숙주에서 면역성 반응을 유발하는 것이 더 적을 수 있게 한다.
더욱이 기능성 등가물들은 전체 항체의 결합 특성과 동일하거나 또는 대등한 결합 특성을 갖는 항체들의 단편들을 포함한다. 이러한 단편들은 하나 또는 둘다의 Fab 단편들 또는 F(ab')2 단편을 포함할 수 있다. 전체 항체의 6 CDRs보다 적게, 예컨대 3, 4 또는 5 CDRs을 포함하는 단편들도 기능적이긴 하지만, 바람직하게 항체 단편들은 전체 항체의 6 CDRs 모두를 포함한다.
더욱이, 기능성 등가물들은 다음의 면역글로불린 클래스 중 임의의 하나의 멤버들이거나 또는 이에 결합할 수 있다: IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE 및 그의 서브클래스.
항체들의 기능성 등가물의 제조(Preparation of functional equivalents of antibodies)
항체들의 등가물들은 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 방법들에 의해 제조된다. 예를 들어, 항체들의 단편들은 효소에 의해 전체 항체들로부터 제조될 수 있다. 바람직하게, 항체들의 등가물들은 이러한 등가물들을 인코딩하는 DNA로부터 제조된다. 항체의 단편들을 인코딩하는 DNA는 전장 항체를 인코딩하는 DNA의 목적 부분 이외의 모든 부분을 삭제함으로써 제조될 수 있다.
키메라화된 항체들을 인코딩하는 DNA는 실질적으로 또는 전적으로 인간 불변 영역들을 인코딩하는 DNA 및 실질적으로 또는 전적으로 인간 이외의 포유동물의 가변 영역의 서열로부터 유래된 서열을 인코딩하는 DNA를 재조합함으로써 제조될 수 있다. 인간화 항체들을 인코딩하는 DNA는 실질적으로 또는 전적으로 대응하는 인간 항체 영역들로부터 유래된 CDRs 이외의 불변 영역들 및 가변 영역들을 인코딩하는 DNA 및 인간 이외의 포유동물로부터 유래된 CDRs을 인코딩하는 DNA를 재조합함으로써 제조될 수 있다.
항체들의 단편들을 인코딩하는 DNA 분자들의 적합한 근원들은 전장 항체를 발현하는, 하이브리도마와 같은 세포들을 포함한다. 단편들은 그 자체가 항체 등가물들로서 사용되거나, 또는 상술한 바와 같이 등가물들 내로 재조합될 수 있다.
본 명세서에서 개시한 DNA 결실 및 재조합은 상기 언급한 공개된 특허출원에 개시된 바와 같은, 알려진 방법들에 의해 수행될 수 있다.
항체 스크리닝 및 선택(Antibody screening and selection)
단일클론 항체들은 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 방법들을 사용하여 분리 및 정제된다. 예를 들어, 항체들은 가용성 엔도글린 펩티드 항원에 대항한 ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석법과 같은 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 방법들을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 이러한 기술들의 비제한적인 예는 미국 특허 제6,365,157호의 실시예 II 및 III에 개시되어 있으며, 참조로서 본 명세서에 편입된다.
항체의 치료적 사용(Therapeutic uses of antibodies)
전자간증 또는 자간증의 치료 또는 예방을 위해 생체 내(in vivo)에서 사용되는 경우, 본 발명의 항체들은 환자에게 치료상 유효량으로 투여된다. 바람직하게, 항체들은 비경구적으로 또는 정맥 내에 지속적인 주입(infusion)에 의해 투여된다. 투여량(dose) 및 용량(dosage) 요법은 질병의 심각성 및 환자의 총체적인 건강에 의존한다. 투여된 항체의 양은 전형적으로 환자 체중의 약 0.001 내지 약 10 mg/kg, 바람직하게 환자 체중의 약 0.01 내지 약 5 mg/kg의 범위에 있다.
경구 투여용으로, 항체들은 제약학적으로 허용가능한 경구 비히클(pharmaceutically acceptable parenteral vehicle)과 함께 주사 가능한 단위 용량 형태(용액, 서스펜젼, 이멀젼)로 제형화된다. 이러한 비히클들은 원래 비독성이고, 비-치료성을 띤다. 이러한 비히클들의 예들에는 물, 식염수(saline), 링거 용액(Ringer's solution), 덱스트로즈 용액 및 5% 인간 혈청 알부민이 있다. 또한 불휘발성유(fixed oils) 및 에틸 올레이트와 같은 비수성(Nonaqueous) 비히클들이 사용될 수 있다. 리포좀들은 담체로서 사용될 수 있다. 비히클은 등장성 삼투압(isotonicity) 및 화학적 안정성을 상승시키는 물질, 예컨대, 버퍼 및 보존제들과 같은, 미량의 첨가제를 포함할 수 있다. 항체들은 전형적으로 이러한 비히클 내에 약 1 mg/ml 내지 10 mg/ml의 농도로 제형화된다.
조합 치료요법(Combination therapies)
선택적으로, 전자간증 또는 자간증의 치료는 임의의 다른 표준 전자간증 또는 자간증 치료요법과 함께 시술될 수 있는데, 이러한 방법들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있으며, 미국 특허출원공개 제20040126828호, 제20050025762호 및 제2005017044호 및 PCT 공개 제WO 2004/008946호 및 제WO 2005/077007호에 개시된 방법들을 포함한다.
투여 용량 및 방법(Dosages and Modes of Administration)
바람직하게, 치료는 전자간증 또는 자간증의 치료 또는 예방을 위해 임신 중에 투여되거나 또는 분만 후의 전자간증 또는 자간증을 치료하기 위해 임신 후에 투여된다. 투여 기술들 및 용량은 화합물의 타입(예컨대, 화학적 화합물, 정제된 단백질, 항체, 안티센스, RNAi, 또는 핵산 벡터)에 따라 다양하며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있거나 또는 쉽게 결정된다.
본 발명의 치료 화합물들은 단위 용량 형태로, 제약학적으로 허용가능한 희석제(diluent), 담체, 또는 부형제(excipient)와 함께 투여될 수 있다. 투여는 양수 내로 직접주입에 의한 경구, 정맥 내, 피하, 구강 또는 국소 투여일 수 있다. 지속적인 주입에 의한 정맥 내 전달은 본 발명의 치료 화합물들을 투여하기 위한 바람직한 방법이다.
조성물은 구강 투여용 환(pill), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 액체, 또는 지효성 정제(sustained release tablet); 또는 정맥 내, 피하 또는 경구 투여용 액체; 또는 국소 투여용 폴리머 또는 다른 지효성 비히클의 형태일 수 있다.
제형화(formulations)를 위해 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 방법들은, 예를 들어, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A.R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)에서 찾을 수 있다. 경구 투여용 제형화는, 예를 들어, 부형제, 멸균수(sterile water), 식염수, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물성 오일, 또는 수소화 나프탈렌(hydrogenated napthalenes)을 포함할 수 있다. 생체 적합성, 생물분해성 락티드 폴리머, 락티드/글리콜리드 코폴리머, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머들이 상기 화합물들의 방출을 제어할 수 있도록 사용될 수 있다. 나노입자성 제형화(예컨대, 생물분해성 나노입자들, 고형 지질 나노입자들, 리포좀)는 상기 화합물들의 생물학적 분포(biodistribution)를 제어하기 위해 사용될 수 있다. 다른 잠재적으로 유용한 경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 코폴리머 입자들, 삼투성 펌프(osmotic pumps), 이식성주입 시스템(implantable infusion systems) 및 리포좀(liposomes)을 포함한다. 제형화에 있어서 상기 화합물의 농도는 투여되는 약물의 용량 및 투여 루트를 포함하여, 여러 인자들에 따라 다양하다.
상기 화합물은 선택적으로 제약 산업에서 통상적으로 사용되는 비독성 산 첨가 염(non-toxic acid addition salts) 또는 금속 착화합물(metal complexes)과 같은 제약학적으로 허용가능한 염으로서 투여될 수 있다. 산 첨가 염의 예들에는 아세트(acetic), 젖(lactic), 파모인(pamoic), 말레인(maleic), 시트르(citric), 말(malic), 아스코르빈(ascorbic), 숙신(succinic), 벤조(benzoic), 팔미트(palmitic), 수베르(suberic), 살리실(salicylic), 타르타르(tartaric), 메탄설폰(methanesulfonic), 톨루엔설폰(toluenesulfonic), 또는 트리플루오르아세트 산 등과 같은 유기산; 탄닌산, 카르복시메틸 셀룰로오스 등과 같은 폴리머산; 및 하이드로클로로산, 하이드로브로모산, 황산 인산 등과 같은 무기산을 포함한다. 금속 착화합물은 아연, 철 등을 포함한다.
구강 사용을 위한 제형화는 비독성 제약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합하여 활성 성분(active ingredients)을 함유하는 정제를 포함한다. 이러한 부형제는, 예를 들어, 불활성 희석제 또는 필러(fillers)(예컨대, 슈크로즈 및 소르비톨), 윤활 약제들(lubricating agent), 글리던트(glidants) 및 항-유착제(예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 수소화 식물성 오일, 또는 활석(talc))일 수 있다.
또한 구강 사용을 위한 제형화는 씹을 수 있는 정제로서, 또는 활성 성분이 불활성 고형 희석제와 혼합되는 경성(hard) 겔라틴 캡슐로서, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 배지와 혼합되는 연성(soft) 겔라틴 캡슐로서 제공될 수 있다.
상기 화합물의 투여 용량 및 시간은 환자의 총체적인 건강 및 전자간증의 증상의 심각성을 포함하는 다양한 임상의 인자들에 따른다. 일반적으로, 전자간증 또는 전자간증의 발병 가능성이 검출되는 경우, 정제된 단백질의 지속적인 주입은 이상의 더한 진행을 치료 또는 예방하는 데 사용된다. 치료는 1 내지 100일, 더욱 바람직하게 1 내지 60일 및 가장 바람직하게 1 내지 20일 범위의 기간 동안, 또는 임신이 완료될 때까지 지속될 수 있다. 용량은 각각의 화합물 및 이상의 심각성에 따라 다양하고 10 내지 20 ng/ml 가용성 엔도글린; 및/또는 1 내지 500 pg/mL 유리된 VEGF 또는 유리된 PlGF, 또는 둘다, 바람직하게 1 내지 100 pg/mL, 더욱 바람직하게 5 내지 50 pg/mL 및 가장 바람직하게 5 내지 10 pg/mL VEGF 또는 PlGF, 또는 l-5 ng의 sFlt-1 범위의 항정-상태 혈액 혈청 농도(steady-state blood serum concentration)를 얻도록 적정된다.
본 명세서에 개시된 진단을 위한 정보 제공 방법들은 치료 중 전자간증 또는 자간증을 모니터하거나 또는 치료 화합물들의 용량을 결정하는 데 사용될 수 있다. 하나의 예에서, 치료 화합물이 투여되고 치료요법의 진행중 PAAI가 측정된다. PAAI가 20 이하, 바람직하게 10 이하인 경우, 그러한 치료 용량은 유효 용량으로 인정된다. 다른 예에서, 치료 화합물이 투여되고 치료요법의 진행중 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수가 측정된다. 가용성 엔도글린 항-혈관형성의 지수가 200 이하, 바람직하게 100 이하인 경우, 그러한 치료 용량은 유효 용량으로 간주된다.
환자 모니터링(Subject monitoring)
전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상의 발병 가능성을 갖는 환자의 질병 상태 또는 치료는 본 발명의 방법들 및 조성물들을 사용하여 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 소변, 혈장, 양수, 또는 CSF와 같은, 체액에 존재하는 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 발현이, 모니터링된다. 가용성 엔도글린 모니터링은 sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF 폴리펩티드의 발현을 모니터링하기 위한 방법들과 함께 행해질 수 있다. 이러한 모니터링은, 예를 들어, 환자에 있어서 특정 약물의 효능을 평가하거나 또는 질병의 진행 정도를 평가하는 데 유용할 수 있다. 가용성 엔도글린 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 발현을 감소시키는 치료는 본 발명에서 특히 유용할 수 있다.
실시예
다음의 실시예들은 본 발명을 설명하기 위해서 고려될 수 있다. 이들은 임의의 방식으로 본 발명을 제한하는 것을 의도하지는 않는다.
실시예 1. 전자간증 발병한 임신 여성에 있어서 엔도글린 mRNA 및 단백질의 상승 농도(Increased levels of endoglin mRNA and protein in pregnant women with pre-eclampsia).
전자간증에 있어서 병리학적 역할을 수행하는 신규한 분비 인자들을 동정하기 위해서, Affymetrix U95A 마이크로어레이 칩(chips)을 사용하여 17명의 전자간증을 갖는 임신한 여성 및 13명의 정상 임신한 여성으로부터의 태반의 조직의 유전자 발현 프로파일링(profiling)을 수행하였다. 엔도글린의 유전자가 전자간증의 발병 여성에 있어서 상향조절됨을 발견하였다.
전자간증에 있어서 엔도글린의 상향조절을 확인하기 위해, 정상혈압의 임신한 여성과 비교하여 전자간증의 임신한 여성에 있어서, 노던 블롯을 하여 태반의 엔도글린 mRNA 농도를 분석하였고(도 3), 웨스턴 블롯 분석법을 하여 엔도글린의 혈청 단백질 농도를 측정하였다(도 4). 전자간증은 (1) 임신 20주 후에 수축기 혈압 (BP) >140 mmHg 및 확장기 혈압 BP >90 mmHg, (2) 새로운 단백뇨의 발병 (소변 검사시 딥스틱에 의할 경우 1+, 24 시간 회수물에서 300mg을 초과하는 단백질, 또는 단백질/크레아티닌비가 0.3을 초과하는 임의의 단일 소변 샘플) 및 (3) 분만 후 12주에 고혈압 및 단백뇨의 소실로서 정의된다. 원래(underlying) 고혈압, 단백뇨, 또는 신장 질환이 있는 환자들을 배제하였다. 환자들을 신장염 범위의 단백뇨(nephritic range protanurea)(24시간 소변 수집으로 3g을 초과하는 단백질 또는 단백질/크레아티닌비가 3.0 이상인 소변)의 존재 또는 부존재에 기초하여 경증 및 중증 전자간증으로 분류하였다. 평균 소변 단백질/크레아티닌비는 경증 전자간증 군에서는 0.94 +/- 0.2이고 중증 전자간증 군에서는 7.8 +/- 2.1이었다. 다양한 군들의 평균 재태기간은 다음과 같다: 정상 38.8 +/-0.2주, 경증 전자간증 34 +/- 1.2주, 중증 전자간증 31.3 +/-0.6주 및 조산 29.5 +/- 2.0주. 분만 후 즉시 태반 샘플들을 얻었다. 각각의 태반으로부터 4개의 임의의 샘플들을 채취해, RNAlater 안정화 용액 (Ambion, Austin, TX) 안에 넣고 -70℃에서 보존하였다. Qiagen RNAeasy Maxi 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 RNA 분리를 하였다.
정상화 대조군이 태반 엔도글린 mRNA의 증가를 보임으로써 노던 블롯에 의해 엔도글린(Unigene Hs.76753)의 코딩 영역에서의 400 염기쌍 프로브 및 GAPDH 프로브를 가지고 프로브를 하였다. 웨스턴 블롯에서는 정상혈압의 임신한 여성과 비교하여 전자간증의 임신한 여성에 있어서 엔도글린 단백질의 태반 및 모체의 혈청 농도 둘다의 증가를 보이는 엔도글린의 아미노 터미널에 대한 항체를 가지고 프로브를 하였다.
실시예 2. 전자간증 환자들의 태반 및 혈청에서의 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 증명(Demonstration of a soluble endoglin polypeptide in the placentas and serum of pre-eclamptic patients).
전자간증 여성의 태반 및 혈청에서의 엔도글린 단백질의 농도를 측정하기 위해 사용한 웨스턴 블롯 분석법은 더 작은 단백질(63 kDa)의 존재, 즉 이것이 전자간증의 임신한 여성의 태반 및 혈청에 존재함을 제시하였다. 이러한 더 작은 단편이 엔도글린의 세포외 도메인임을 증명하였다. 이러한 트렁케이티드 버젼(truncated version)은 전자간증 발병 환자들에 있어서 태반의 융합세포영양막 및 내피 세포로부터 흘러나와서 과잉의 양으로 순환하는 것 같다. 이러한 엔도글린의 가용성 형태는 정상 혈관 건강에 필요한 혈중 리간드들(circulating ligands)에 결합함으로써 항-혈관형성의 약제로서 작용할 수 있다.
실시예 3. 정상 및 전자간증의 임신 여성에 있어서 가용성 엔도글린의 순환성 농도의 비교.
정상, 경증 전자간증, 또는 중증 전자간증의 여성의 혈청의 순환성, 가용성 엔도글린의 농도를 비교하기 위해서, 이러한 여성으로부터 채취한 혈액 샘플들에 대해 ELISA 분석을 하였다. 환자들을 신장염 범위(24시간 소변 수집으로 3g을 초과하는 단백질 또는 단백질/크레아티닌비가 3.0 이상인 소변)의 단백뇨의 존재 또는 부존재에 기초해 경증 및 중증 전자간증으로 분류하였다. 평균 소변 단백질/크레아티닌비는 경증 전자간증 군에서는 0.94 +/- 0.2이고 중증 전자간증 군에서는 7.8 +/- 2.1이었다(도 5). ELISA는 상술한 바와 같이 상업적으로 시판되는 R & D Systems, MN (cat # DNDGOO)사의 ELISA 키트를 사용하여 수행하였다(Maynard et al, J. Clin. Invest. 111:649-658, 2003).
실시예 4. 혈관 형성 모델 분석법(Model assay for angiogenesis)
내피관 분석법이 혈관 형성의 생체 외 모델에 사용될 수 있다. 성장 인자 감소된 매트리겔(7 mg/mL, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA)을 사전 동결된(pre-chilled) 48-웰 세포 배양 플레이트의 웰(100 μl/웰)에 넣고 37℃에서 25-30 분 동안 인큐베이션하여 중합시켰다. 3-5계대의 인간 제대정맥 내피 세포(무혈청의 내피의 기저 배지 300 μl에 30,000 +, Clonetics, Walkersville, MD)를 10% 환자 혈청으로 처리하고, 매트리겔 코팅된 웰 상에 플레이팅하고, 37℃에서 12-16 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 튜브 형성은 4X로 역 위상차 현미경(inverted phase contrast microscope)(Nikon Corporation, Tokyo, Japan)을 통해 평가하고 Simple PCI 영상화 분석법 소프트웨어를 사용하여 분석하였다(튜브 면적 및 총 길이).
실시예 5. 전자간증 및 자간증 여성의 진단 인디케이터로서 가용성 엔도글린 단백질 농도(Soluble endoglin protein levels as a diagnostic indicator of pre-eclampsia and eclampsia in women; Romero Study).
이러한 연구는 가용성 엔도글린이 임상의 전자간증 중에 변경되는지와 여성의 전자간증 및 자간증을 예상하는 데 사용할 수 있는지를 평가하기 위해 고안되었다.
이러한 연구는 Wayne State University/NICHD Perinatology Branch, Detroit, MI의 Dr. Roberto Romero와 공동으로 진행하였다. 후향의 장기적인 환자군-대조군 연구(case-control study)를 이전에 Chaiworapongsa et al.(The Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine, January 2005, 17 (1):3- 18)에 개시된 바와 같이 저장된 생물학적 샘플 데이타베이스를 사용하여 수행하였다. 모든 여성을 Sotero del Rio Hospital, Santiago, Chile의 출산 전 클리닉(prenatal clinic)에 등록하고, 분만할 때까지 관찰하였다. 출산 전 방문(Prenatal visits)을 제 1 및 제 2의 3개월에는 4주 간격으로, 제 3의 3개월에는 2주 간격으로 분만할 때까지 계획하였다. 혈장 샘플들을 다음의 6개의 간격 각각에서 단지 한번 각각의 환자로부터 선택하였다: 임신 기간의 (1) 7-16주, (2) 16-24주, (3) 24-28주, (4) 28-32주, (5) 32-37주 및(6) >37주. 각각의 전자간증의 경우에 있어서, 하나의 대조군을 전자간증 임상 진단의 시기에 재태기간(+/- 2주)을 매칭함으로써 선택하였다. 전자간증 진단의 임상의 척도(criteria)는 이전에 Chaiworapongsa 등 상술한 문헌에 개시된 것과 동일하다.
혈장 엔도글린 농도의 측정(Measurement of Plasma Endoglin Levels)
-70℃에서 저장한 혈장 샘플들을 녹이고 혈장 가용성 엔도글린 농도를 상업적으로 시판되는 R&D systems, Minneapolis, MN.(catalog # DNDGOO)사의 ELISA 키트를 사용하여 하나의 배치(batch)로 측정하였다.
통계 분석(Stastistical Analysis)
혈액 샘플링의 재태기간 및 샘플 저장의 간격을 조절한 후에 공분산(covariance) 분석법을 사용하여 전자간증 발병 예정된 환자들 및 정상임신 사이의 가용성 엔도글린의 혈장 농도의 차이를 평가하였다. 비율(proportions) 비교를 위해 Chi-square 또는 Fisher's exact tset를 이용하였다. 사용된 통계 패키지(statistics package)는 SPSS V.12(SPSS Inc., Chicago, IL)이었다. 통계학적 유의성(Significance)은 p 값이 0.05 이하로 하였다.
결과(Results)
연구 모집단(population)의 임상 특성을 표 1에 나타내었다. 전자간증을 갖는 군은 더 많은 미분만부(nulliparous) 여성을 포함하고 대조군보다 조기에 분만하였다. 중요하게, 태아의 출생시 체중이 전자간증의 군에서 더 작았고 재태 기간에 비해 작은 태아(SGA)를 갖는 여성의 비율이 더 높았다.
Figure pat00001
평균±표준편차 또는 수(퍼센트)로서 표현된 값
GA: 재태기간(gestational age)
전자간증 발병 환자들의 임상의 특성을 표 2에 나타내었다. 환자들의 3분의 2(72%)가 중증 전자간증을 보였으나, 10명의 환자들은 발병 <34주의 중증의 조기 발병 전자간증을 보였다.
Figure pat00002
평균±표준편차 또는 수(퍼센트)로서 표현된 값
α(n=26); β(n=42)
6 개의 재태기간대에서 측정된 대조군 및 전자간증의 여성의 혈청 가용성 엔도글린 농도를 표 3에 도시하였다. 전자간증의, 그들의 표본들 사이에서 2개의 군들 - 임상의 전자간증(전자간증의 증상이 나타나는 시기에 채취한 샘플들) 및 임상전의 전자간증(임상의 증상들이 나타나기 이전에 채취한 샘플들)으로 분류하였다. 데이타는 중기-임신(임신 기간의 24-28주)에서, 혈청 가용성 엔도글린 농도가 전자간증 발병 예정된 여성에 있어서 상승하기 시작하고 임신 기간 28-32주의 대조군에 비해 3 배 이상 높아지는 것을 보여준다. 임상의 전자간증 발병 여성으로부터 채취한 혈액 샘플들은 대조군에 매칭되는 재태기간에 비교하는 경우 매우 극적인 상승(대략 10-15 배)을 보여준다.
Figure pat00003
pβ:임상 소견에서 전자간증 및 정상 임신의 샘플 사이에서의 비교
평균±표준편차로서 표현된 값
δ:2명의 전자간증 환자들은 임상 소견에서 적용 가능한 혈액 샘플이 없음
혈장 가용성 엔도글린 농도 및 전자간증의 임상 진단 간격 사이의 관계를 시험하기 위해, 다른 재태기간에 있는 전자간증 환자들의 혈장 샘플들을 혈액 샘플링으로부터 임상 진단의 간격을 따라 5개의 군으로 나누었다: (1) 임상 진단시, (2) 임상 소견 전의 2-5.9주, (3) 임상 소견 전의 6-10.9주, (4) 임상 소견 전의 11-15.9주 및 (5) 임상 소견 전의 16-25주. 표 4에 나타난 데이타는 혈장 가용성 엔도글린 농도가 전자간증의 증상들 발병 이전의 6-10.9주에서 상승하기 시작하고 전자간증 발병 예정된 여성의 증상들 이전의 2-5.9주에서 3배 이상 높아짐을 증명한다.
Figure pat00004
평균±표준편차로서 표현된 값
δ:2명의 전자간증 환자들은 임상 소견에서 적용 가능한 혈액 샘플이 없음
혈장 가용성 엔도글린 농도의 진단의 가능성을 시험하여 전자간증 발병을 일으키는 농도를 확인하기 위하여, 환자들을 전자간증(PE<34주)의 조기 발병 및 전자간증(PE>34주)의 만기 발병으로 나누었다. 조기-발병 전자간증을 갖는 환자들의 경우, 평균 혈장 가용성 엔도글린 농도가 정상임신에서보다 전자간증(임상의 진단 이전의)에서 현저하게 높았고 임신 기간 약 16-24주에서 시작하여(표 5) 24-28주 및 28-32주 임신 기간대에 매우 극적인 차이들을 보여주었다. 대조적으로, 만기 발병 전자간증을 갖는 환자들의 경우에, 임상 전의 전자간증에 있어서 혈장 가용성 엔도글린 농도가 임신 기간 32-36주에서의 매우 극적인 차이를 가지며 단지 28-32주에서 정상임신에서보다 현저하게 높아짐을 보여주었다(표 6).
Figure pat00005
Figure pat00006
요약(Summary)
이러한 실험의 결과는 임상적인 전자간증 발병 여성이 재태기간이 일치되는 대조군에 비하여 매우 높은 농도의 순환성 가용성 엔도글린을 가짐을 증명하고 있다. 또한 결과는 전자간증 발병 예정된 여성(임상전의 전자간증)이 정상임신으로 예상되는 여성들보다 더 높은 농도의 혈장 가용성 엔도글린을 가짐을 증명하고 있다. 가용성 엔도글린 농도의 증가는 임상의 증상들의 발병 이전 적어도 6-10주에 검출가능하다. 결국, 이러한 결과는 조기 발병 및 만기 발병 전자간증 둘다에서 순환성 가용성 엔도글린 농도가 상승하나, 조기 발병 전자간증에서 변경들이 좀더 극적임을 증명하고 있다.
실시예 6. 여성의 전자간증 및 자간증의 진단 인디케이터로서 가용성 엔도글린 단백질 농도(Soluble endoglin protein levels as a diagnostic indicator of pre-eclampsia and eclampsia in women; CPEP Study).
상술한 바와 같이, 혈관형성-촉진의 단백질인 TGF-β에 대한 세포 표면 수용체이면서 내피 및 융합세포영양막에서 발현되는, 가용성 엔도글린이, 전자간증의 태반에서 상향조절됨을 발견하였다. 상술한 실험에서, 전자간증에 있어서 과잉의 가용성 엔도글린이 세포외 도메인의 떨어져나감(shedding)을 통해 태반으로부터 순환계로 방출됨을 보여주었고; 이어서 가용성 엔도글린은 태반 성장 인자 (PlGF) 및 VEGF에 결합하는 항-혈관형성 인자인, sFltl와 공동 작용하여, 내피성 장애를 유발할 수 있다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 전자간증 발병 여성의 임신 및 임신성 고혈압 (GH)과 같은 다른 임신 합병증을 갖는 여성 및 정상혈압의 대조군 임신 여성에 비해 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)의 합병증을 갖는 임신을 통해 가용성 엔도글린, sFltl 및 유리된 PlGF의 혈청 농도를 비교하였다. 이러한 연구는 NIH의 Dr. Richard Levine과 공동으로 수행하였다.
이러한 연구에는 두 가지 주요한 목적이 있다. 제 1 목적은, 정상혈압의 대조군과 비교하여, 가용성 엔도글린, sFltl의 증가된 혈청 농도 및 PlGF의 감소된 농도를 전자간증 및 임신성 고혈압 또는 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)의 합병증을 갖는 임신과 같은 다른 임신성 질환들의 발병 이전에 검출할 수 있는지를 측정하기 위함이었다. 제 2 목적은 임상의 증상들의 발병 이전 및 이후에 및 정상혈압의 대조군에서 얻은 표본들의 별도의 시험을 통해 전자간증, 임신성 고혈압, 또는 SGA를 갖는 여성에 있어서 재태기간에 모체의 가용성 엔도글린, sFlt-1 및 유리된 PlGF의 혈청 농도의 추이를 설명하기 위함이었다.
방법(Methods)
임상정보(Clinical information)
이러한 연구는 Calcium for Pre-eclampsia Prevention trial(CPEP)에 참가하는 4,589명의 건강한 미분만부 여성의 코호트(cohort) 내에 네스팅된 임신 합병증(미성숙 전자간증, 만기 전자간증(term pre-eclampsia), 임신성 고혈압, SGA 태아를 갖는 임신, 정상혈압의 대조군 임신)의 환자 대조군 연구(case-control study)이다. 120개의 랜덤 케이스를 각각의 연구 군들에서 선택하였다. 연구 방법들은 전자간증에 대해 최근에 수행된 네스티드 환자 대조군 연구(nested case control study)(Levine et al, N. Eng. J. Med. 2004, 350:672-83)와 동일하게 하였다. 각각의 여성으로부터 연구 등록 이전에(13-21주), 26-29주에, 36주에 및 고혈압 또는 단백뇨의 의심이 있는 경우에 혈액 표본들을 얻었다. 산통의 시작 및 분만 이전의 임신 중 임의의 시간에 수집된 모든 혈청 표본들이 연구에 적합하다. 만기 전자간증, 임신성 고혈압, 또는 SGA가 발병하고, 알려진 중요한 구조적 또는 염색체 이상 없이 생산아(liveborn) 또는 사산아(stillborn)를 분만한 120 명의 여성을 포함하는 환자군 및 그들로부터 기저 혈청 표본을 얻었다. 미성숙 전자간증의 경우, CPEP 코호트로부터의 모든 72 환자들(PE<37주)로서 구성하여 연구하였다. 전자간증의 진단을 위한 임상의 척도는 Levine(2004) 등, 상술한 문헌에 개시되어 있다. 임신성 고혈압의 모든 환자군은 임신성 고혈압의 발병 이전 1일로부터 그 다음 7일간의 간격 내에 정상 소변 단백질 값을 가질 것이 요구되었다. SGA는 재태기간, 인종의 특이성, 미분만부 및 태아 성에 따른 출생시 체중에 대한 Zhang & Bowes' 표를 사용하여, <10th 및 <5th (중증 SGA) 퍼센타일로 구성하였다. 대조군은 잘 알려진 중요한 구조적 기형 또는 염색체 이상 없이 생산아 또는 사산아를 분만하고, 전자간증 또는 임신성 고혈압 또는 SGA를 갖지 않는 여성들로부터 무작위로 선택하여 임상 센터에 의해서, 제 1 혈청 표본 (± 1주)의 회수시의 재태기간, 냉동보관기간(± 1년) 및 냉동-해동 횟수별로 하나의 환자에 하나의 대조군을 매치시켰다. 총 1674 개의 혈청 표본들을 연구하였다. 재태기간에 의한 매칭은 sFlt-1, VEGF 및 PlGF의 농도에서 재태기간-관련 차이에 따라 대조군에 수행하였다. 냉동-보관기간을 위한 매칭은 냉동 저장 중 분해로 인한 차이를 최소화하여 수행하였다. 임상 센터에 의한 매칭은 전자간증비(pre-eclampsia rates)가 센터별로 현저하게 차이가 나는 사실로부터 대조군에 대해 수행하였는데, 아마도 이 차이는 질병의 병태생리학에 기인할 것이다. 또한, 센터들은 표본들의 수집, 제조 및 저장을 위한 약간 다른 방법들을 사용할 수 있다. 또한 해동 횟수에 의한 매칭은 환자군 및 대조군이 균일하게 냉동 해동 분해되도록 보장하기 위해 수행하였다.
ELISA 측정(ELISA measurements)
다양한 혈관형성의 마커들에 대한 ELISA는 임상 결과를 모르는 단독 연구원(single research Assistant)에 의해 Karumanchi laboratory에서 수행되었다.
가용성 엔도글린(DNDGOO), sFltl(DVRlOO), PlGF(DPGOO)을 위해 상업적으로 시판되는 ELISA 키트들을 R&D systems, (Minneapolis, MN)으로부터 얻었다.
통계 분석(Statistical analysis)
T-테스트를 대수적 형질전환(logarithmatic transformation) 이후에 통계학적 유의성을 결정하기 위해 다양한 측정의 비교를 위해 사용하였다. P<0.05를 통계학적 유의성으로서 고려하였다.
결과(Results)
상기 방법들에 설명된 바와 같이 5개의 서로 다른 임신 여성의 연구 그룹의 다양한 재태기간 그룹 윈도우(various gestational age group windows) 중의 임신 기간에 걸친 평균 가용성 엔도글린(도 6), sFltl(도 7) 및 PlGF(도 8) 농도를 도 6-8에 도시하였다. 전자간증 군들 및 임신성 고혈압 군들의 경우에 있어서, 임상의 증상들의 발병 이후에 채취한 표본들은 본 명세서에 도시하지 않았다. 재태기간-매칭되는 대조군 표본들과 비교하여, 가용성 엔도글린 및 sFltl의 증가 및 유리된 PlGF의 감소가 조기 전자간증(preterm pre-eclampsia) 이전 9-11주에 시작하고, 전자간증발병 이후에, 각각의 농도가 5-배(46.4 vs 9.8 ng/ml, P<.0001) 및 3-배 높은 농도에(6356 vs 2316 pg/ml, P<.0001) 및 4-배 낮은 농도에(144 vs 546 pg/ml, P<.0001) 도달하였다. 만기 전자간증의 경우에 있어서, 가용성 엔도글린 증가가 12-14주에 시작되고, 유리된 PlGF 감소가 9-11주에 시작되며, sFltl 증가가 전자간증 발병 이전의 <5주에 시작되었다. sFltl 및 유리된 PlGF의 혈청 농도는 임신 기간 10-42주로부터 GA 또는 재태기간에 비해 평균적인 태아/재태기간에 비해 큰 태아(AGA/LGA)를 갖는 임신들 사이에 현저하게 차이가 나지는 않았다. 혈청 가용성 엔도글린은 SGA 임신에 있어서 17-20주에 소폭으로 증가하기 시작하였고(7.2 vs 5.8 ng/ml, P=.03), 경증 및 중증 SGA, 각각의 경우에 있어서, 37-42주에는 15.7 및 43.7 ng/ml의 농도에 도달하였으며, AGA/LGA 임신에 있어서 2.9 ng/ml에 필적하였다(중증 SGA vs AGA/LGA, P=.OO2). 임신 기간 고혈압 연구에 있어서, GA-매칭 대조군 표본들과 비교하여, 가용성 엔도글린의 소폭 증가가 임신성 고혈압 이전의 <l-5주에 분명히 있었고, 임신성 고혈압의 발병 이후에 가용성 엔도글린의 농도가 2-배 높은 농도(29.7 vs 12.5 ng/ml, P=.OO2)에 도달하였다. 최고 사분위수(quartile)의 대조군 가용성 엔도글린 농도(>7.2 ng/ml)에 있는 21-32주에 얻은 표본들에 대한 이후의 조기 PE의 조절 교차비(odds ratio)는 다른 모든 사분위수와 비교할 때, 이는 9.8(95% CI 4.5-21.5)이었다.
전자간증의 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수를 (sFltl + 0.25 가용성 엔도글린)/PlGF로서 정의하였다. 상기 지수를 5개의 다른 연구군들에 대해서 다양한 재태기간 군 전체에 대해서 측정하였다. 임상 증상들이 나타나기 이전에 채취된 샘플들의 전자간증 항-혈관 형성을 위한 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수를 도 9에 도시하였다. 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수의 상승 값이 임신 17-20주의 조기에 기록되었고 중증 미성숙 전자간증에 있어서 임신 기간이 진행함에 따라 극적으로 증가함이 확인되었다. 전자간증, SGA 및 GH에 있어서, 대조군 여성과 비교하는 경우 임신 말기(33-36주) 중 소폭의 상승이 있었다.
도 10 및 11은 임상의 미성숙 전자간증 발병 이전(PE <37주)의 주수에 따른 가용성 엔도글린(도 10) 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수(도 11)의 평균 농도를 도시한다. 미성숙 전자간증의 발병 이전의 조기 9-11주인 경우, 1-5주에 선행하는 임상의 증상들이 극적으로 상승(>5 배)하여 전자간증 발병 예정 여성에 있어서 가용성 엔도글린 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수의 2-3배의 상승이 있었다.
도 12 및 13은 증상들이 나타나기 이전 및 이후에 만기 전자간증의 임신(PE>37주) 동안의 가용성 엔도글린(도 12) 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수(도 13)를 도시한다. 가용성 엔도글린 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수의 상승은 임신 33-36주에 시작하여 임상의 전자간증 기간에 평균 2-배 높은 값에 도달하였다.
도 14 및 15는 정상혈압의 대조군과 비교하는 경우 임신성 고혈압 및 1-5주 선행하는 임신성 고혈압(임신 33-36주 동안) 동안의 여성에서 검출된 가용성 엔도글린(도 14) 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수(도 15)의 소폭의 상승을 도시한다.
도 16 및 17은 대조군 임신과 비교하는 경우 중증 SGA를 갖는 여성 및 SGA를 갖지 않는 모든 여성에 있어서 33-36주 임신 기간대에 검출된 가용성 엔도글린(도 16) 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수(도 17)의 소폭의 상승을 도시한다. .
요약(Summary)
이러한 연구 결과는 가용성 엔도글린 농도 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 농도가, 임신 33주 이전에 측정되는 경우에 있어서, 정상 대조군 임신과 비교하는 경우 미성숙 전자간증 발병 예정 여성 및 임상의 미성숙 전자간증 (PE <37주)을 갖는 여성에서 극적으로 상승함이 확인되었다. 그러므로, 가용성 엔도글린 농도 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 농도(33주 이전)는 미성숙 전자간증의 진단 뿐 아니라, 전자간증의 예측에 사용될 수 있다. 가용성 엔도글린 농도 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 농도의 상승은 전자간증의 증상이 나타나기 이전의 10-12주만큼 조기에 시작되는 것이 명백하다.
또한 가용성 엔도글린 농도 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 농도는 만기 전자간증 (PE >37주)에서 현저하게 상승하고 임신의 말기(33-36주 임신 기간대)에 측정하는 경우 임신성 고혈압 및 중증 SGA에서 소폭으로 상승하였다. 그러므로, 가용성 엔도글린 농도 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 농도는 임신 33주 이후에 측정하는 경우 SGA 및 임신 기간 고혈압과 같은 다른 임신 합병증을 확인하는 데 사용할 수 있다.
Example 7. 전자간증의 발병기전에 있어서의 가용성 엔도글린의 연관성(Involvement of soluble endoglin in the pathogenesis of pre-eclampsia).
혈관형성-촉진의 단백질인 TGF-β에 대한 세포 표면 수용체이면서 내피 및 융합세포영양막을 발현하는, 엔도글린이, 전자간증의 태반에서 상향조절됨이 확인되었다. 또한 전자간증에 있어서 과잉의 가용성 엔도글린이 세포외 도메인의 떨어져나감(shedding)을 통해 태반으로부터 순환계로 분비됨이 확인되었다. 가용성 엔도글린은 태반 성장 인자 (PlGF) 및 VEGF에 결합하는 항-혈관형성 인자인, sFltl와 공동 작용하여, 내피성 장애를 유발할 수 있다는 가설을 시험하기 위해 실험을 고안하였다.
재료 및 방법(Materials and Methods)
시약(Reagents)
재조합 인간 엔도글린, 인간 sFltl, 마우스 엔도글린, 마우스 sFltl , 인간 TGF-β1 , 인간 TGF-β3 , 마우스 VEGF를 R&D systems(Minneapolis, MN)에서 얻었다. 인간 엔도글린의 N-터미널 영역에 대한 마우스 단일클론 항체(catalog # sc 20072) 및 다중클론 항체(sc 20632)를 Santa Cruz Biotechnology, Inc에서 얻었다. 인간 sFltl, 마우스 sFltl 및 인간 가용성 엔도글린용 ELISA 키트를 R&D systems, MN에서 얻었다.
아데노바이러스의 생성(Generation of adenoviruses)
sFltl에 대한 아데노바이러스 및 대조군 아데노바이러스(CMV)는 앞에서 설명하였고(Maynard et al, J. Clin. Invest. 111: 649:658 (2003)), Harvard Medical Core facility에서 Dr. Richard Mulligan의 도움으로 생성하였다. 가용성 엔도글린 아데노바이러스를 만들기 위해서, Adeasy Kit(Stratagene)를 사용하였다. 간단히 말해서, 인간 가용성 엔도글린(Thr 27 - Leu 586)을 템플레이트로서 인간 cDNA 전장 엔도글린 클론(Invitrogen, CA)을 사용하고, 프라이머로서 다음의 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 PCR 증폭하였다: 전방으로 5'- ACG AAG CTT GAA ACA GTC CAT TGT GAC CTT-3 ' (SEQ ID NO: 3) 및 역으로 5'TTA GAT ATC TGG CCT TTG CTT GTG CAA CC-3' (SEQ ID NO: 4). 증폭된 PCR 단편들을 먼저 pSecTag2-B (Invitrogen, CA)로 이차클로닝한 후 DNA 서열을 확인하였다. His-tagged 인간 가용성 엔도글린을 인코딩하는 포유동물의 발현 구조체(construct)는 템플레이트로서 pSecTag2 B-가용성 엔도글린을 사용하여 PCR 증폭하고, 아데노바이러스 생성을 위해, pShuttle-CMV 벡터(Stratagene; Kpn1 및 Sea1 사이트), 아데노바이러스 전이 벡터(adenovirus transfer vector)로 이차클로닝되었다. 이어서 제조자 설명서를 따라 가용성 엔도글린(sE)을 발현하는 아데노바이러스를 표준 프로토콜을 사용하여 만들고 웨스턴 블롯팅에 의해 발현을 확인하였다. 이어서 확인된 클론을 293개의 세포들로 증폭하고 상술한 바와 같이 CsCl2 밀도 구배로 정제하였다(Kuo et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4605-4610 (2001)). 최종 산물들을 광학 흡광도 방법에 의해 적정하였다(Sweeney et al, Virology, 2002, 295:284-288). 적정값(titer)을 상기 바이러스 제조에서 유래된 공식에 기초한 플라크 형성 단위 (pfu)/mL로서 표현하고 표준 플라크 희석 기초 적정 분석법 키트(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, cat. No. Kl 653-1) 및 광학 흡광도 방법을 사용하여 적정하였다.
환자(Patients)
이러한 연구를 위해 모든 환자들을 적합한 IRB-승인된 동의서(IRB-approved consents)를 얻은 이후에 Beth Israel Deaconess Medical Center에 가입시켰다. 전자간증을 다음과 같이 정의할 수 있다: (1) 이전의 정상혈압의 환자의 임신 20주 이후에 수축기 혈압 BP > 140 및 확장기 혈압 BP >90, (2) 새로운 단백뇨의 발병(소변 검사시 딥스틱에 의할 경우 1+, 24 시간 회수물에서 300mg을 초과하는 단백질, 또는 단백질/크레아티닌비가 0.3을 초과하는 임의의 단일 소변 샘플) 및 (3) 분만 후 12주에 고혈압 및 단백뇨의 소실. 기저 고혈압(baseline hypertension), 단백뇨, 또는 신장 질환을 갖는 환자들을 제외하였다. 이러한 연구 목적을 위하여, 환자들을 신장염-범위 단백뇨의 부재 또는 존재에 기초하여 경증 및 중증 전자간증으로 분류하였다(24시간 소변 수집시 단백질 > 3 g 또는 소변의 크레아티닌에 대한 단백질비가 3.0 이상). HELLP 증후군을 환자들이 저혈소판증(<100000 세포들/μl), 증가된 LDH (>600 IU/L) 및 증가된 AST (>70 IU/L)의 소인을 갖는 경우로 정의하였다. 건강한 임신한 여성을 대조군으로서 포함하였다. 다른 의학적 이유로 조기-분만을 한 8명의 환자들을 부가적인 대조군으로서 포함하였다. 분만 후에 즉시 태반 샘플들을 얻었다. 사전 동의(informed consent)를 얻은 이후에 분만기(태반의 분만 이전에 0-12 시간)에 임신한 환자들에서 혈청을 수집하였다. 이러한 실험은 Beth Israel Deaconess Medical Center의 Institutional Review Board에 의해 승인되었다.
ELISA 및 웨스턴 블롯(ELISA and Western blots)
다양한 단백질들(sFltl, 가용성 엔도글린)의 ELISA를 R&D systems, MN의 상업적인 키트를 사용하여 제조자의 설명서에 따라 수행하였다. 웨스턴 블롯 및 ELISA를 그 밖에 개시된 바와 같이 랫트 혈장에서 아데노바이러스성-감염 전이유전자(adenoviral-infected transgenes)의 발현을 검사하는데 사용하였다(Maynard 등 상술한 문헌).
면역침전법(IP) 실험(Immunoprecipitation experiments)
웨스턴 블롯에 이어 전자간증 발병 환자들의 태반의 조직 및 혈청 표본들에서 가용성 엔도글린을 동정하고 특성화하는데 IP를 사용하였다. 인간 태반의 조직을 차가운 PBS로 세정한 후 균질화 버퍼[10 mM Tris-HCl, pH 7.4; 15 mM NaCl; 60 mM KCl; 1 niM EDTA; 0.1 mM EGTA; 0.5% NonidetP-40; 5% 슈크로즈; Roche (Indianapolis, IN)의 프로테아제 혼합물]에서 10 분 동안 라이싱하였다. 이어서 태반 라이세이트를 항-인간 단일클론 마우스 엔도글린 항체로 면역침전하였다(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). 제조자의 설명서에 따라 immunopure IgG 배향 키트(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA)를 사용하여 3-5 mg의 정제된 항체를 2ml 단백질 A-세파로스(protein A-Sepharose)에 직접 결합하게 하여 면역친화성 칼럼(Immunoaffinity columns)을 제조하였다. 이어서 칼럼을 프로테아제 혼합물을 함유하는 RIPA 버퍼로 광범위하게 세정한 후, 결합된 단백질들을 pH 2.8, 0.1 mol/L 글라이신-HCl 버퍼로 녹여서 분리하였다. 용리액(eluent)을 1 mol/L Tris-HCl 버퍼를 함유하는 0.5-ml 분획물로 수집하였다. 단백질-함유 분획물(Protein-containing fractions)을 풀링(pool)하고 CENTRICON Centrifugal Concentrator(Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA)로 9- 내지 10-배로 농축하였다. 면역침전된 샘플들을 4-12% 구배 겔(Invitrogen)로 분리하고 단백질들을 폴리비닐리덴 디플로라이드(PVDF) 막에 전이시켰다. 엔도글린 단백질을 다중클론 항-인간 토끼 엔도글린 프라이머리 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다.
내피 튜브 분석(Endothelial tube assay)
성장 인자가 감소된 매트리겔(7mg/mL, Col산통ative Biomedical Products, Bedford, MA)을 사전 동결된 48-웰 세포 배양 플레이트의 웰(1001/웰)에 넣고 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하여 중합이 일어나게 하였다. HUVEC 세포들 (무혈청의 300 μl의 내피의 기저 배지에 30,000 + , Clonetics, Walkersville, MD)을 다양한 조합의 재조합 단백질(가용성 엔도글린, sFltl, 또는 둘다)로 처리한 후 매트리겔코팅된 웰에 플레이팅하여, 37℃에서 12-16 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 튜브 형성을 4X의 역 위상차 현미경(Nikon Corporation, Tokyo, Japan)으로 평가하고 Simple PCI 영상화 분석법 소프트웨어를 사용하여 정량 분석(튜브 면적 및 총 길이) 하였다.
미세혈관 투과성 실험(Microvascular permeability experiments)
BaIb-C 마우스들에게 눈뒤정맥얼기(retro-orbital venous plexus)를 통해 GFP 또는 가용성 엔도글린 또는 sFltl 또는 그의 조합을 발현하는 Ix 108 pfu의 아데노바이러스를 주입한 후 48 시간 후에 미세혈관 투과성 분석법을 수행하였다. 마우스들에게 0.5 ml Avertin을 복강 주사(IP injection)하여 마취시켰다. 100 ml의 1% Evans blue dye(in PBS)를 꼬리 정맥(tail vein) 내로 주입하였다. 40분 후, 마우스들을 PBS 함유 2 mM EDTA로 20분 동안 심장 천자(heart puncture)를 통해 관류시켰다. 기관(뇌, 폐, 간, 신장)을 수집하고 포름아미드로 3일 동안 인큐베이션하여 Evans blue dye를 용리시켰다. 포름아미드 용액의 OD를 620 nm 파장을 사용하여 측정하였다.
신장 미세혈관 반응성 실험(Renal microvascular reactivity experiments)
앞에서 설명한 바와 같이(Maynard 등의 상술한 문헌) 랫트의 신장 미세혈관(70-170 μm 내부 직경)을 사용하여 미세혈관 반응성 실험을 수행하였다. 모든 실험군들에서, 미세혈관의 전구 수축(pre-contraction) 후에 신장 미세혈관의 이완 반응을 40 mmHg의 팽창압(distending pressure)에서 40-60%의 그들의 기저 직경에 대해 U46619(트롬복세인 길항제)로 시험하였다. 정상-상태 톤(steady-state tone)에 도달한 후, TGF-βl 또는 TGF-β3 또는 VEGF와 같은 다양한 시약들에 대한 반응을 표준 순서로 시험하였다. 모든 약물들을 장관외로 적용하였다.
동물성 모델(Animal models)
임신한 및 임신하지 않은 Sprague-Dawley 랫트 양자에게 꼬리 정맥 주사로 2 x 109 pfu의 아데노바이러스(Ad CMV 또는 Ad sFltl 또는 Ad sE 또는 Ad sFltl +Ad sE)를 주입하였다. 임신한 랫트에게 임신 8-9일에 주입한 후(제 2의 3개월의 초기) 임신 16-17일에 혈압을 측정하였다(제 3의 3개월의 초기). 랫트를 펜토바르비탈 소듐(60 mg/kg, i.p.)으로 마취한 후 혈압을 측정하였다. 경동맥(carotid artery)을 분리하고 압력변환기(pressure transducer, Millar Instruments, Houston, TX)에 연결된 3-Fr 고성능 마이크로팁 카테터(high-fidelity microtip catheter)로 캐뉼러를 하였다. 혈압을 기록하고, 10분 동안의 평균을 내었다. 이어서 안락사(euthanasia) 이전에 혈액, 조직 및 소변 샘플들을 얻었다. 혈장 농도를 혈압측정일(아데노바이러스의 주사 후 8일)에 측정하였고, 이러한 단백질들의 발현의 최고치에 대응하여 아데노바이러스의 주사 후 7-10일에 인식하였다. 먼저 웨스턴 블롯팅에 의해 순환성 sFlt- 1 및 가용성 엔도글린 농도를 확인하고 이어서 시판되는 마우스의 ELISA 키트들(R & D systems, Minneapolis, MN)을 사용하여 정량하였다. 뇨 알부민을 표준 딥스틱에 의해 측정하고 시판되는 랫트 알부민 ELISA 키트(Nephrat kit, Exocell Inc, Philadelphia, PA)를 사용하여 경쟁적 효소 면역 분석법(competitive enzyme-linked immunoassay)에 의해 정량하였다. 뇨 크레아티닌을 피크린산 비색 방법 키트(Metra creatinine assay kit, Quidel Corp, San Diego, CA)에 의해 측정하였다. AST 및 LDH를 시판되는 키트들(Thermo Electron, Louisville, CO)을 사용하여 측정하였다. 랫트 혈액의 혈소판수를 자동 혈구계측기(automated hemocytometer, Hemavet 850, Drew Scientific Inc, Oxford, CT)를 사용하여 측정하였다. 순환 혈액의 분열적혈구들의 검출을 위해 혈액의 말초혈액바른표본(peripheral smear)을 Wright's stain으로 염색하였다. 혈압 측정 및 표본들의 수집 후에, 랫트를 치사시켜 조직학적 분석을 위해 기관을 회수하였다. 리터(litter)를 계산하고 개개의 태반 및 태아의 무게를 재었다. 회수된 신장을 Bouin's 용액에 넣고, 파라핀에 임베딩하여, 단편을 만든 후 H&E, PAS 또는 Masson's trichrome stain으로 염색하였다.
통계 비교(Statistical comparisons)
결과를 평균 ± 표준오차(standard error of mean, SEM)로 나타내고 다수의 군들 사이의 비교를 ANOVA를 사용하여 분산분석(analysis of variance)에 의해 수행하였다. p < 0.05인 경우의 현저한 차이를 기록하였다.
결과(Results)
전자간증 환자들에서의 상승된 가용성 엔도글린(Elevated soluble endoglin in patients with pre-eclampsia)
환자들의 혈청 표본들의 사용을 표 7에 나타내었고, 전자간증 환자들 및 대조군 임신의 환자들의 다양한 군들의 가용성 엔도글린의 순환성 농도를 측정하였다.
Figure pat00007
가용성 엔도글린의 평균 혈청 농도는 경증 전자간증에서는 2배 이상 높고 중증 전자간증의 환자들에서는 3-4배 높다. HELLP 증후군의 합병증을 갖는 전자간증 환자들에 있어서, 가용성 엔도글린의 농도는 재태기간이 매치되는 대조군 표본들에 비해 5-10배 이상 높다. 또한, 임신한 환자들에서 가용성 엔도글린의 농도는 sFltl의 농도에 상호관련된다(도 18). 상관 R2 값은 0.6이었다. (본 명세서에 기록된 sFlt-1의 순환성 농도는 이전에 공개된 것(Maynard 등의 상술한 문헌)보다 4-5 배 이상 높게 나타남을 참고. 이는 R&D system의 새로운 ELISA 키트의 15 감도(sensitivity)의 차이에 기인하는데 희석분석에서 요소가 결여되고 따라서 이전에 공개된 것보다 일관되게 높은 값을 나타낸다.) 다시 말해서, 가용성 엔도글린의 가장 높은 농도를 갖는 환자들은 또한 sFltl의 가장 높은 순환성 농도를 갖는다. 가용성 엔도글린의 기원은 태반의 면역조직화학(immunohistochemistry)에 보여지는 강화된 염색의 증거로서 태반의 융합세포영양막인 것 같다(도 19 및 20). 이러한 특징은 엔도글린 단백질이 융합세포영양막에 의해 발현되고 전자간증에 있어서 크게 상향조절됨을 보여준다. 더욱이 웨스턴 블롯 데이타(도 21 A 및 21B) 및 노던 블롯에 의해 가용성 엔도글린이 엔도글린 단백질의 세포외 도메인의 쉐드 형태(shed form)이고 크기가 약 65 kDA이며 전자간증의 태반에서 과량으로 발현되고 전자간증 태반에서 과량으로 순환됨을 확인하였다. 단백질의 예상 길이는 약 437 아미노산들이다.
가용성 엔도글린은 항-혈관형성의 분자이며 혈관 장애를 유발한다(Soluble endoglin is an anti-angiogenic molecule and induces vascular dysfunction )
가용성 엔도글린의 기능을 이해하기 위해 혈관 형성의 생체 외 모델을 사용하였다. 가용성 엔도글린은 소폭으로 내피 튜브 형성을 저해하는데, 이는 sFlt1의 존재에 의해 더욱 강화된다(도 22). 전자간증에 있어서, 내피성 장애에 추가하여, 또한 부종에 의해 증명되듯이 미세혈관 투과성이 강화되고 세포 외로 Evan's blue 바운드 알부민의 유출이 강화됨이 기록되어 왔다. 가용성 엔도글린이 미세혈관 유출을 유발하는지를 보기 위해서, 마우스들을 48 시간 동안 가용성 엔도글린 및 sFlt로 처리하였다. 가용성 엔도글린과 sFltl의 조합은 Evan's blue 분석법(도 23)을 사용하여 증명되는 바와 같이 폐, 간 및 신장에서는 알부민 유출의 극적인 증가를 및 뇌에서는 소폭의 유출을 유발하였다. 가용성 엔도글린 단독으로는 간에서 소폭의 유출을 유발하였다. 이러한 데이타는 가용성 엔도글린 및 sFltl의 조합이 유효한 항-혈관형성의 분자들이며 현저한 혈관 유출을 유발할 수 있음을 보여준다.
가용성 엔도글린의 혈역학적 효과(hemodynamic effects)를 평가하기 위해, 랫트의 신장 미세혈관에서 일련의 미세혈관 반응성 실험을 수행하였다. 우리들은 먼저 엔도글린의 TGF-βl 및 TGF-β3의 2개의 알려진 리간드들의 효과를 연구하였다. TGF-βl 및 TGF-β3 둘다는 혈관 직경에서 투여량-의존적 증가(dose-dependent increase)를 유발하였다. 중요하게 과잉의 가용성 엔도글린의 존재하에서, 양 TGF들의 효과는 현저하게 약화되었다(도 24). 결국, VEGF 및 TGF-βl의 조합은 과잉의 가용성 엔도글린 및 sFltl에 의해 차단되는 혈관확장(vasodilation)을 유발하였다(도 25). 이는 sFltl 및 가용성 엔도글린이 VEGF 및 TGF-βl와 같은 혈관형성의 성장 인자들에 의해 유발된 생리적 혈관확장에 대항하고 고혈압을 유발시킬 수 있음을 보여준다.
가용성 엔도글린 및 sFltl의 생체 내 효과(In vivo effects of soluble endoglin and sFltl)
가용성 엔도글린 및 sFltl의 혈관 효과를 평가하기 위해, 임신한 랫트에서 아데노바이러스성 발현 시스템에 따라 재분류하였다. Sprague Dawley 랫트에 대조군 유전자(CMV) 또는 가용성 엔도글린 또는 sFltl 또는 sFltl + 가용성 엔도글린을 인코딩하는 아데노바이러스를 임신 8일째에 꼬리 정맥으로 주입하였다. 17일째, 동물들을 전자간증 표현형(pre-eclampsia phenotype)으로 시험하였다. 표 8은 혈역학적 및 생화학적 데이타(hemodynamic and biochemical data)를 포함한다.
Figure pat00008
MAP-평균동맥압(확장기 혈압 + 1/3 맥박압); Alb/Creat-알부민/크레아티닌비; LDH- 젖산탈수소효소(Lactate dehyrogenase); AST-아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(Aspartate aminotransferase).
*P<0.05 대조군과 비교시.
태아의 무게(Fetal weight)는 각 군마다 임의로 선택된 4명의 태아의 총합이다.
sFltl의 평균 순환성 농도는 sFltl군에서는 410 ng/ml이고, sFltl + sE군에서는 430 ng/ml이다. sE의 평균 순환성 농도는 sE 군에서는 318 ng/ml이고, sFltl + sE 군에서는 319 ng/ml이다.
가용성 엔도글린 단독으로는 경증 고혈압을 유발하였다. 이전에 기록된 바와 같이, sFltl는 고혈압 및 단백뇨 둘다를 유발하였다. 중요하게, sFltl 및 가용성 엔도글린의 조합은 중증 고혈압, 신장염 범위 단백뇨, 태아의 성장 제한 및 HELLP 증후군 발생의 생화학적 증거(상승된 LDH, 상승된 AST 및 감소된 혈소판수)를 유발하였다(표 8). 가용성 엔도글린 + sFltl 군에서 용혈의 증거는 분열적혈구 및 망상적혈구증식증(reticulocytosis)을 드러내는 말초혈액바른표본(peripheral smear)에 의해 확인되었다(도 26 A-B). 결국, 신장 조직구조(renal histology )는 또한 가용성 엔도글린+sFltl 군에서 중증 사구체 내피증식(severe glomerular endotheliosis)을 확인하였다(도 27A-27D).
요약(Summary)
이러한 결과는 가용성 엔도글린이 전자간증 태반에서 상향조절되고 전자간증 발병 환자들에서 극히 높은 농도로 존재함을 보여준다. 가용성 엔도글린의 가장 높은 농도는 전자간증의 가장 중증 형태의 하나인, HELLP 증후군 발병 환자들에게 나타난다. 또한 이러한 결과는 가용성 엔도글린 농도가 임신한 환자들의 상승된 sFltl와 상호관련되고 더 높은 순환성 sFltl 농도를 갖는 환자들에서 더 높아짐을 보여준다. 또한, 이 결과는 가용성 엔도글린이 혈관 형성 분석법들, 미세혈관 투과성 분석법들 및 미세혈관 반응성 실험과 같은 다수의 내피 분석법들에서 항-혈관형성 분자이고 내피의 기능을 파괴함을 보여준다. 중요하게, 가용성 엔도글린은 이러한 생체 외 내피의 분석법들로 sFltl의 독성 예후를 증폭시킬 수 있다. 더욱이, 생체 내 분석법들에 있어서, 가용성 엔도글린의 아데노바이러스성 발현은 임의의 현저한 단백뇨 없이 경증 고혈압을 유발시킨다. 그러나, sFltl의 존재하에서, 가용성 엔도글린은 중증 고혈압, 단백뇨, 사구체 내피증식, HELLP 증후군의 발생 및 태아의 성장 제한의 존재에 의해 증명되는 바와 같이 현저한 혈관 손상을 유발시킨다. 이러한 데이타는 가용성 엔도글린이 전자간증 모체의 증후군의 인과율(causality)에서 중요한 역할을 하며 전자간증의 치료를 위해 가용성 엔도글린을 중화시키는 약제들의 필요성이 강조됨을 보여준다.
가용성 엔도글린 방출 메카니즘은 엔도글린 분자의 세포외 영역의 단백질분해적 절단과 같다. 전자간증의 조직에서 상향조절된 특이적 프로테아제들은 후보 분자들로서 기능할 수 있다. 하나의 예로는 엔도글린에 대해 유사성을 공유하는 분자인, 베타글리칸을 절단하는 것으로 보이는 막 타입 기질메탈로프로테이나제-1(MTl-MMP)일 수 있다(Velasco-Loyden G et al, J. Biol. Chem. 279:7721-33 (2004)). 그러므로 이러한 프로테아제들의 저해제들은 전자간증의 치료를 위해 다양한 표적으로서 기능할 수 있다.
다른 구현예들(Other Embodiments)
본 발명의 구체적인 구현예들에 대한 설명은 예시를 위한 것이다. 이는 본 명세서에 개시된 구체적 형태로 본 발명의 범위를 축소시키거나 제한되는 것을 의도하지는 않는다. 본 발명이 참조로서 몇 가지 구현예들을 설명하였으나, 청구범위에 설명된 바와 같이 다양한 변형들이 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않음이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 본 명세서에서 언급한 모든 특허, 특허출원 및 공개문헌은 참조에 의해 본 명세서의 내용으로 편입된다.
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Claims (46)

  1. 환자의 임신관련 고혈압 질환(pregnancy related hypertensive disorder)의 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 가용성 엔도글린(soluble endoglin)에 특이적으로 결합 가능한 화합물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 투
    여 단계는 상기 환자에게 상기 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방에 충분한 시간 및 양으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 임신관련 고혈압 질환은 전자간증(pre-eclampsia), 자간증(eclampsia), 임신성 고혈압(gestational hypertension), 만성 고혈압(chronic hypertension), HELLP 증후군(HELLP syndrome) 및 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)를 갖는 임신(pregnancy with a small for gestational age (SGA) infant)으로 구성되는 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 임신관련 고혈압 질환은 전자간증 또는 자간증인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 정제된 가용성 엔도글린 항체 또는 가용성 엔도글린 항원-결합 단편(soluble endoglinantigen-binding fragment)인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 성장 인자(growth factor)인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 성장 인자는 전환성장인자(transforming growth factor:TGF)-β1 또는 TGF-β3, 액티빈 A(activin A), 골형태형성단백질(Bone Morphogenic Protein: BMP)-2 또는 BMP-7으로 구성되는 군에서 선택되는 것임
    을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 방법은 정제된 sFlt-1 항체(purified sFlt-1 antibody), sFlt 항원-결합 단편(sFlt antigenbinding fragment), 니코틴(nicotine), 쎄오필린(theophylline), 아데노신(adenosine), 니페디핀(nifedipine), 미녹시딜(minoxidil), 황산 마그네슘(magnesium sulfate), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor:VEGF) 및 태반 성장 인자(placental growth factor:PlGF)로 구성되는 군에서 선택되는 화합물을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 VEGF는 VEGF121 또는 VEGF 165인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 방법은 환자에게 항-고혈압 화합물(anti-hypertensive compound)을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 환자는 임신한 사람인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 환자는 분만 후의 사람인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 환자는 비-인간인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 환자는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 개 및 고양이로 구성된 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  14. 환자의 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에 있어서 가용성 엔도글린에 결합 가능한 성장 인자의 농도를 증가시키는 화합물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 투여 단계는 상기 환자에게 상기 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방에 충분한 양 및 시간으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 성장 인자는 TGF-βl, TGF-3β, 액티빈 A, BMP-2 및 BMP-7로 구성되는 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 화합물은 사이클로스포린(cyclosporine), 알파 토코페롤(alpha tocopherol), 메티세르자이드(methysergide), 브로모크립틴(bromocriptine) 및 알도메트(aldomet)로 구성되는 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  17. 환자의 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에 있어서 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 대한 성장 인자 결합을 저해하는 화합물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 투여는 상기 환자에게 상기 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방에 충분한 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 화합물이 가용성 엔도글린에 결합하여 성장 인자의 결합을 차단하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  19. 환자의 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 가용성 엔도글린 발현 또는 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 화합물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 투여는 상기 환자에게 상기 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방에 충분한 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 화합물은 기질 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase:MMP), 카뎁신(cathepsin) 및 엘라스타제(elastase)로 구성되는 군에서 선택되는 단백질 분해효소(proteolytic enzyme)를 저해하는 화합물임을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 MMP는 MMP9인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 MMP는 막 타입 기질 메탈로프로테이나제-1(membrane type matrix metalloproteinase-1)인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 화합물은 엔도글린 핵산 서열의 적어도 일부분에 대해 95% 이상 상보적인 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머(antisense nucleobase oligomer)를 포함하고, 상기 투여는 상기 환자에게 상기 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방에 충분한 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머는 길이가 8 내지 30 뉴클레오티드들인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  25. 제19항에 있어서, 상기 화합물은 엔도글린 핵산 서열의 적어도 일부분에 대해 95% 이상 상보적인 하나의 가닥(strand)을 갖는 이중 가닥 RNA(double stranded RNA)를 포함하고, 상기 투여는 상기 환자에게 상기 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방에 충분한 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNA는 길이가 19 내지 25 뉴클레오티드인 작은 간섭 RNA(small interfering RNA:siRNAs)인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  27. 제19항에 있어서, 상기 화합물은 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 정제된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  28. 제14항, 제17항 또는 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 임신관련 고혈압 질환은 전자간증, 자간증, 임신성 고혈압, 만성 고혈압, HELLP 증후군 및 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)를 갖는 임신으로 구성되는 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 임신관련 고혈압 질환은 전자간증 또는 자간증인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  30. 제1항 또는 제19항에 있어서, 상기 방법은 상기 환자의 상기 임신관련 고혈압 질환을 모니터링하는 단계를 더 포함하고, 상기 모니터링 단계는 상기 환자의 샘플에서 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 샘플이 혈청 또는 혈장이고 25 ng/ml보다 작은 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 농도가 상기 임신관련 고혈압 질환의 개선을 나타내는 것임을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 농도를 측정하는 단계는 둘 이상의 경우에 대해서 수행되고, 측정값들 사이의 상기 농도의 감소는 상기 임신관련 고혈압 질환의 개선의 인디케이터인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  33. 제30항에 있어서, 상기 농도를 측정하는 단계는 양성 기준 샘플(positive reference sample)과 비교되고, 상기 양성 기준 샘플에 비해 가용성 엔도글린의 농도의 감소는 상기 환자의 상기 임신관련 고혈압 질환의 개선을 나타내는 것임을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  34. 제30항에 있어서, 상기 모니터링 단계는 상기 화합물의 치료 용량(therapeutic dosage)을 결정하는 데 사용됨을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  35. 제30항에 있어서, 상기 농도를 측정하는 단계는 면역학적 분석법(immunological assay)을 사용하여 수행하는 것임을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  36. 제30항에 있어서, 상기 가용성 엔도글린 농도는 유리되거나, 결합되거나, 또는 전체 가용성 엔도글린의 농도인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  37. 제30항에 있어서, 상기 가용성 엔도글린의 농도는 분해(degradation) 또는 효소적 절단(enzymatic cleavage)에 기인하는 엔도글린 폴리펩티드의 농도임을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  38. 제30항에 있어서, 상기 모니터링 단계는 상기 환자의 샘플에서 하나 이상의 sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF 폴리펩티드의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 방법은 메트릭(metric)을 사용하여 상기 가용성 엔도글린, sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF의 농도 사이의 관계를 계산하는 단계를 더 포함하고, 상기 기준 샘플에 비해 환자 샘플에서의 상기 농도 사이의 관계에 있어서의 변경은, 상기 환자의 임신관련 고혈압 질환의 진단 인디케이터(diagnostic indicator)인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 메트릭은 전자간증 항-혈관형성 지수(pre-eclampsia anti-angiogenic index: PAAI): [sFlt-1/VEGF + PlGF]인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 20보다 작은 PAAI 값은 상기 전자간증 또는 자간증의 개선을 나타내는 것임을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  42. 제39항에 있어서, 상기 메트릭은 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수(soluble endoglin anti-angiogenic index): [(sFlt-1 + 0.25 가용성 엔도글린)/PlGF] 또는 [(가용성 엔도글린 + sFlt-1)/PlGF]인 것임을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  43. 제39항에 있어서, 상기 메트릭은 치료 화합물의 용량(dosage)을 결정하는 데 사용되는 것임을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 치료 화합물은 PAAI가 20보다 낮아지도록 하는 투여량(dose)으로 투여되는 것임을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  45. 제1항 또는 제19항에 있어서, 상기 방법은 상기 환자의 임신관련 고혈압 질환을 모니터링하는 단계를 더 포함하고, 상기 모니터링 단계는 상기 환자의 샘플에서 엔도글린 핵산 분자의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 엔도글린 핵산의 농도가 기준 샘플과 비교되고, 상기 기준에 비교되는 환자 샘플에서의 상기 농도의 변경이 상기 환자의 임신관련 고혈압 질환의 진단 인디케이터인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
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