KR20130035540A

KR20130035540A - 탁셀 화합물 당화 유도체

Info

Publication number: KR20130035540A
Application number: KR1020110099897A
Authority: KR
Inventors: 우진석; 이기호; 박병철; 조정원; 강선엽; 김대희; 서원민; 양지영; 백승원; 이상미; 유상은
Original assignee: 주식회사 진켐
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2013-04-09

Abstract

본 발명은 탁셀 화합물 구조에 당을 부착하여 신규 구조의 탁셀 화합물 유도체들을 만드는 기술 및 그 기술에 의해 합성되는 당화 유도체에 관한 것으로서, 최대 25배 이상 수용성이 향상되었으며, 생체 내에서 링커 또는 당쇄가 분해되어 탁셀 화합물의 항암 기능이 발휘될 수 있다.

Description

탁셀 화합물 당화 유도체 {Glycosylated Taxel compounds derivatives}

본 발명은 탁셀 화합물 구조에 당을 부착하여 신규 구조의 탁셀 화합물 유도체들을 만드는 기술 및 그 기술에 의해 합성되는 당화 유도체에 관한 것으로서, 최대 25배 이상 수용성이 향상되었으며, 생체 내에서 링커 또는 당쇄가 분해되어 탁셀 화합물의 항암 능력을 유지하거나 향상되었다.

현재 약물로 개발되는 선도물질의 약 70% 정도는 천연산물에서 유래되는 것으로 추정되며, 이들 중에 대다수는 당이 수식되어 있는 것으로 나타났다 (Poiter, P. Actual. Chim. 11:9, 1999).

당류의 부착은 약물의 흡수(absorption), 분포(distribution), 대사(metabolism) 또는 배설(excretion)의 조절에 매우 큰 영향을 미친다. 당류의 종류와 수에 따라 표적에 대한 친화도 또한 크게 변화될 수 있다.

도세탁셀(Docetaxel, 본 명세서에서 "DTX"와 혼용함)은 유방암, 난소암, 비소형세포 폐암 등에 작용하는 항암제로서 주목에서 추출한 택솔(taxol) 골격에 곁가지를 화학적으로 결합시켜 반합성한 것이다. 도세탁셀은 Sanofi-Aventis 사에서 Taxtere라는 상품명으로 생산하여 전세계 시장에 팔리고 있으며, 세계시장 규모는 20억$ 정도이며, 파클리탁셀(paclitaxel)의 시장 규모는 약 13억$ 정도이다.

도세탁셀은 파클리탁셀과 두가지 측면에서 화학적 성질이 다르다. 파클리탁셀은 10번 탄소 위치에 초산 에스테르기(acetate ester)를 갖고 있는데 반해 도세탁셀은 수산기(hydroxyl group)를 가지고 있고, 페닐프로피오네이트(phenylpropionate) 곁가지에 4차 부틸(tert-butyl)기가 치환되어 있다. 이와 같은 탄소 10번 위치의 수산기로 인하여 도세탁셀의 수용성은 파클리탁셀에 비해 다소 높다. 따라서, 수용성을 더욱 증가시킨 전구약물(prodrug)을 개발한다면 시장성이 매우 높을 것으로 판단된다. 도세탁셀의 국내 시장은 2007년 매출이 350억 원이었고, 시장 규모도 빠르게 성장하고 있다.

항암제인 도세탁셀은 구조적 특성으로 인하여 수용성이 낮다. 따라서, 체내에서 충분한 약효를 발휘하기 위해서는 과량의 약물을 투여하여야 하므로 부작용이 뒤따른다. 또는 도세탁셀의 수용성을 개선시킬 목적으로 특별한 전달 시스템을 도입하기도 한다.

또한, 도세탁셀은 체내에 투입된 약물이 혈류를 통하여 전신을 순환하기 때문에 암발생 부위 혹은 장기 이식 부위에 도달하여 약효를 발휘할 수 있는 유효 농도가 매우 낮다는 문제점이 있다.

이러한 문제점을 개선하기 위한 목적으로 난용성 약물에 수용성을 부여할 수 있는 구조물을 결합하여 수용성을 개선하거나, 또는 질병발생 부위로 약물을 유도할 수 있는 표적지향성(targeting) 물질을 결합시키는 연구들이 시도되고 있다.

본 발명은 난용성 물질인 항암제 탁셀의 수용성을 개선하고자 하는 목적으로 수용성을 증가시킬 수 있는 포도당, 시알산 등의 당구조물을 결합시키고자 하며, 결합 방식은 체내에 투입되는 경우 링커와 당 부위가 탁셀로부터 분리되어 원래 약물인 탁셀의 약리적 특성을 최대한 활용할 수 있는 전구약물의 형태로 제작하려는 것이다.

따라서, 본 발명은 탁셀 화합물의 용해도를 높이는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 용해도가 높고 생체 내에서 탁셀 화합물과 생체 이용율이 비슷하거나 더 높은 탁셀 화합물 유도체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 탁셀 화합물의 용해도를 높이고 탁셀 화합물과 생체 이용율이 유사하거나 높은 유도체에 관하여 연구하던 중 당을 수식하여 신규 구조의 탁셀 화합물 당화 유도체를 물질을 합성하기에 이르렀다.

본 발명은 용해도가 높고 다양한 생리활성을 나타내는 탁셀 화합물의 당화 유도체들, 좀더 자세히는 수용성이 크게 개선되어, 체내동태, 안전 면에서 우수한 탁셀 화합물 당화 유도체를 제공한다. 또한, 본 발명은 당을 탁셀 화합물에 부착시키는데 방해가 되는 입체적 장해(steric hindrance)를 극복하기 위해 링커(linker)를 탁셀 화합물과 당 사이에 개입시키는 방법을 이용하였다.

본 발명에서 사용된 시료는 탁셀 화합물들로, 구체적으로는 도세탁셀, 파클리탁셀 등이며, 더욱 바람직하게는 도세탁셀이다. 탁셀 화합물에 당이 수식될 관능기로는 수산화기, 메틸기가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 수산화기이다. 당의 수식 부위로는 도세탁셀을 예로 들면, 2 위치, 7 위치, 혹은 10 위치의 수산화기가 될 수 있으며, 세 곳에 모두 될 수도 있으며, 세 부위 중 한 부위가 될 수도 있다. 바람직하게는 2 위치의 수산화기이다. 본 발명에서는 당의 연결을 위해 링커를 사용할 수 있으며, 링커에는 에스테르 (ester) 또는 아마이드 (amide) 결합을 활용하여 연결할 수 있으며, 관능기로 포밀 (formyl)기, 아세틸 (acetyl)기, 프로피오닐 (propionyl)기, 부틸 (butyl)기, 아크릴 (acryl)기, 에틸석시닐 (ethylsuccinyl)기, 석시닐 (succinyl)기, 아미노헥실 (aminohexyl)기 등이 부착될 수 있으며, 바람직하게는 석시닐기가 단독으로 사용될 수 있다. 부착되는 당은 단당류, 이당류, 삼당류 및 다당류가 가능하며, 부착되는 당의 수가 1-5개인 것이 바람직하다. 각 당은 C3-C7인 알도즈 (aldose) 또는 케토즈 (ketose)로 통상의 당이 포함될 수 있다. 당의 종류에 특별한 제한은 없으며, 바람직하게는 단당이 글루코오스, 갈락토오스, 프럭토오스, 푸코오스, 만노오스, 람노오스, 갈락토사민, 글루코사민, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 반코사민, 에피-반코사민, 글루쿠론산, 시알산, 데옥시글루코오스, 데옥시갈락토오스로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 단당으로는 글루코오스, 이당으로는 락토오스, 삼당으로는 시알릴락토오스를 선택할 수 있다.

당의 부착 방법으로는 링커에 당을 부착하고 그 이후 도세탁셀과 같은 탁셀화합물을 부착하거나, 탁셀 화합물에 링커를 부착하고 링커에 당을 부착할 수 있다. 링커-당 복합체는 링커에 단당을 붙인 후에 이당, 삼당으로 확장할 수도 있으며, 링커에 이당을 부착 후에 삼당으로 확장할 수도 있다. 이때 이당, 삼당으로의 확장은 화학반응 또는 효소 반응으로 수행할 수 있다. 효소 반응의 예를 들면, 글루코오스에서 락토오스로 변형에는 갈락토실트랜스퍼레이즈 (galactosyltransferase)를 사용할 수 있으며, 락토오스에서 시알릴락토오스 (sialyllactose)로의 전환에는 시알릴트랜스퍼레이즈 (sialyltransferase)가 적절하다.

이하 본 발명의 탁셀 당화 유도체의 구체적인 예 몇 가지를 설명한다.

본 발명은 탁셀 화합물을 원료로 하여 만들어지는 화학식 I로 표시되는 탁셀 당화 유도체 화합물, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물을 제공한다.

(식중, R1은 아세틸기 또는 H이고, R2는 페닐기 또는 t-부틸옥시기이며, R은 C1-C12의 산이 에스테르 결합된 것이거나, C1-C12의 산이 에스테르 결합된 링커에 연결된 C3~C7의 알도즈 또는 케토즈 당쇄가 1~5개 포함된 당류임)

또한, 본 발명은 상기 화학식 I의 구조를 가지는 탁셀 화합물 골격의 R에 부가되어 링커가 붙어 있는 화합물, 또는 링커에 당 잔기가 부착된 화합물인 (1) 내지 (4)의 화합물을 제공한다.

구체적인 본 발명의 화합물을 예시하면, R1은 아세틸기 또는 H이고, R2는 페닐기 또는 t-부틸옥시기이며, R은 아래와 같다.

R=

(화합물 1);

R=

(화합물 2);

(화합물 3);

R=

(화합물 4).

또한, 본 발명은 상기 탁셀 유도체, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물을 포함하는 항암 전구약물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 (1)내지 (4)에 예시된 화합물의 제조 방법으로 이하 (5) 내지 (9)에 나타내는 공정도 제공한다.

(5) 이하의 공정:

글루코오스를 원료로 하여 1 -OH 위치에 석시닐기를 도입하고 기타 -OH기에 보호기를 도입하는 공정.

(이때 R3과 R4는 동일할 수도 있고 다를 수도 있으며, 쉽게 산 혹은 염기의 처리로 해리되어 H로 변형될 수 있는 통상의 화학합성에서 OH기의 보호기이며, 바람직하게는 MMTr (Monomethoxytrityl)기 또는 TMS (Tetramethylsilane)기이며, 더욱 바람직하게는 R3와 R4가 벤질 (Benzyl)기임).

(6) 이하의 공정:

탁셀 화합물에 공정(5)에 의해 만들어진 화합물 5를 부가한 후 -OH 보호기인 R3, R4를 제거하여 화합물 2를 만드는 공정.

(이때 R1이 H일 경우 쉽게 산 또는 염기의 처리로 해리되어 H로 변형될 수 있는 통상의 화학합성의 OH기 의 보호기가 될 수 있으며, 바람직하게는 Troc (2,2,2-Trichloroethyl chlorofomate)이며, R3과 R4는 동일할 수도 있고 다를 수도 있으며, 쉽게 산 또는 염기의 처리로 해리되어 H로 변형될 수 있는 통상의 화학합성의 OH기의 보호기가 될 수 있으며, 바람직하게는 벤질기임)

→

(R1은 아세틸기 또는 H이고, R2는 페닐기 (파클리탁셀의 경우) 또는 t-부틸옥시기 (도세탁셀의 경우)임)

(7) 이하의 공정:

상기 (6)의 공정으로 제조된 화합물 (2)를 갈락토실트랜스퍼레이즈 (galactosyltransferase)를 사용하는 효소학적인 방법으로 화합물 3을 합성하는 공정.

화합물 2

(R1은 아세틸기 또는 H이고, R2는 페닐기 (파클리탁셀의 경우) 또는 t-부틸옥시 (도세탁셀의 경우) 임)

(8) 이하의 공정:

상기 (7)의 공정으로 제조되는 화합물 3을 시알릴트랜스퍼레 이즈(sialyltransferase)를 사용하는 효소학적 방법으로 시알산 (sialic acid)을 전이시켜 화합물 4를 합성하는 공정.

화합물 3

(R1는 아세틸기 또는 H이고 R2는 페닐기 (파클리탁셀의 경우) 또는 t-부틸옥시 (도세탁셀의 경우) 임)

(9) 이하의 공정:

탁셀 화합물에 OH 기에 다이카복실레이트 (dicarboxylate)를 에스테르 결합시켜 부가하는 공정.

탁셀 화합물에 수산화기에 에스테르 결합을 할 수 있는 링커로 제공하기 위해 X를 부가할 수 있다. 이때 X는 이초산 (dicarboxylic acid) 또는 그의 무수물이며, 이의 염 혹은 용매화물이며 바람직하게는 옥살산 (oxalic acid), 말론산 (malonic acid), 숙신산 (succinic acid), 글루타르산 (glutaric acid), 애디프산 (adipic acid), 피멜릭산 (pimelic acid), 수베르산 (suberic acid), 아젤라익산 (azelaic acid), 세바스산 (sebacic acid), 운데칸다이오익산 (undecanedioic acid), 도데칸다이오익산 (dodecanedioic acid), 프탈산 (phthalic acid), 이소프탈산 (isophthalic acid), 테레프탈산 (terephthalic acid), 말레인산 (maleic acid), 퓨마르산 (fumaric acid), 글루타콘산 (glutaconic acid), 크로마틱산 (traumatic acid), 뮤코익산 (muconic acid) 중에서 선택되는 일종이며 더욱 바람직하게는 말론산 (malonic acid), 숙신산 (succinic acid), 말레인산 (maleic acid), 프탈산 (phthalic acid), 글루타르산 (glutaric acid), 애디프산 (adipic acid), 피멜릭산 (pimelic acid), 퓨마르산 (fumaric acid) 또는 그의 무수화물로서 이루어진 그룹 중에서 선택되는 일종이다.

(이때 R1는 아세틸기 또는 H이고 R2는 페닐기 (파클리탁셀의 경우) 또는 t-부틸옥시기 (도세탁셀의 경우)이며, R1이 H일 경우 쉽게 산 또는 염기의 처리로 해리되어 H로 변형될 수 있는 통상의 화학합성의 OH기의 보호기가 될 수 있으며, 바람직하게는 Troc이고,X는 C2- C12의 이초산기이며 바람직하게는 숙신산 무수화물 이다)

본 발명에 따른 탁셀 당화 유도체는 최대 25배 이상 수용성이 향상되었으며, 생체 내에서 링커 또는 당쇄가 분해되어 탁셀 화합물의 항암 능력을 유지하거나 향상되었다.

도 1은 도세탁셀과 도세탁셀 당화 유도체 화합물들의 수용성 시험 결과이다.
도 2a는 도세탁셀 당화 유도체 DTX-M2'-LS-Glc의 랫트 생체내 전환율 및 약동력학평가 시험 결과이다.
도 2b는 도세탁셀 당화 유도체 DTX-M2'-LS-Lac의 랫트 생체내 전환율 및 약동력학평가 시험 결과이다.
도 2c는 도세탁셀 당화 유도체 DTX-M2'-LS-SL의 랫트 생체내 전환율 및 약동력학평가 시험 결과이다.
도 2d는 도세탁셀 당화 유도체 DTX-M2'-LS의 랫트 생체내 전환율 및 약동력학평가 시험 결과이다.

이하, 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명의 구성을 더욱 자세히 설명한다.

그러나 본 발명이 이러한 실시예 및 시험예의 기재범위 내로 한정되지 않음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 기재된 실시예 에는 특별히 탁셀 화합물 중 도세탁셀 (DTX)의 당화 유도체 제조를 중심으로 기재하였으나, 여타 탁셀 화합물도 동일한 방법으로 당화 유도체 제조가 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

실시예 중, 이하의 약어를 사용한다.

DTX: Docetaxel

MMTr-Cl; Monomethoxytrityl chloride

MC; Methylene Chloride

TEA; Triethylamine

DMAP; 4-Dimethylaminopyridine

TMS; Tetramethylsilane

CMP; Cytidine 5' monophosphate

DCC; N,N-dicyclohexylcarbodiimide

Et3N; Triethylamine

Hex; Hexane

EA; Ethylacetate

Troc; 2,2,2-Trichloroethyl chlorofomate

MeOH: Methanol

EtOH: Ethanol

본 발명의 화합물 1 내지 화합물 4의 구조, 명칭, 분자량은 표 1과 같다.

실시예	구조	명칭	질량 (M.W.)	실측값
1		DTX-M2'-LS (1)	C₄₇H₅₇NO₁₇ _907.97	929 [M+Na]⁺
2		DTX-M2'-LS-Glc (2)	C₅₃H₆₇NO₂₂ 1070. 11	1092.2 [M+Na]⁺
3		DTX-M2'-LS-Lac (3)	C₅₉H₇₇NO₂₇ 1232. 25	1254.5 [M+Na]⁺
4		DTX-M2'-LS-SL (4)	C₇₀H₉₄N₂O₃₅ 1523. 51	1521.3 [M-2H]^2-

이들 화합물의 한 가지 제조 방법으로 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4에 화합물의 제조 방법을 예시한다. 상기 화합물 1 내지 4는 실시예 1~4의 방법 외에도 다른 방법으로도 제조 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

<실시예 1>

실시예 1은 화합물 1의 제조에 관한 설명이다.

제 1공정: 중간체 화합물 27,10- ditroc - DTX 의 합성

7,10-ditroc-DTX 1 g을 무수 메틸렌클로라이드 10 ㎖에 녹인 후 트리에틸렌아민 0.24 ㎖를 넣고 교반하였다. DMAP 21mg과 숙신산 무수물 95mg을 넣고 1시간 교반하였다. MC:MeOH(95:5)로 박막크로마토그래피 확인 후 반응이 끝나면 0.5 M 시트르산 수용액으로 반응액을 세척하였다. 실리카 컬럼 (Silica column)에 MC로 충진 후 MC:MeOH (98:2)(95:5)혼합용액을 차례로 전개하여 화합물 1의 중간체 1.16 g을 얻었다(107%).

제 2공정: 화합물 (1) DTX - M2' - LS (2 DTX )의 합성

제 1공정의 2숙시닐 7,10-ditroc-DTX 1.16g을 MeOH : 초산 (9:1) 12ml에 넣고 입구를 고무마개로 막은 후 상온에서 약 15분간 교반하여 충분히 녹여주었다. 분말 아연 580mg을 넣고 상온에서 1시간 교반하였다. 박막크로마토그래피 분석을 통하여 반응이 완료되면 유리 필터에 셀라이트(Celite)를 깔고 아연(zinc)을 여과하여 제거한 후 여액은 회전증발농축기를 사용하여 농축하였다. 에틸아세테이트 200ml로 녹인 후 증류수 200ml를 넣어 분획하여 에틸아세테이트 층을 농축하였다. 실리카 컬럼 (Silica column)을 메틸렌클로라이드(MC)로 충진한 후 MC : MeOH (95 : 5)로 전개하여 0.68g의 화합물 (1) DTX-M2'-LS를 얻었다(80%).

<실시예 2>

실시예 2는 화합물 2의 제조에 관한 설명이다. 이하 공정은 나누어 설명한다.

제 1공정: 중간체 화합물 2,3,4,6- 테트라 벤질-1-o- 메틸 글루코오스의 합성

메틸 글루코오스(50g), 분말 KOH(250g), 그리고 다이옥산(dioxane)(184ml)을 넣은 후 교반하였다. 오일배쓰에서 40분 동안 온도를 상온에서 120 ℃까지 올리면서 벤질 클로라이드(84ml)를 천천히 넣어 주었다. 1시간 30분 동안 환류하면서 벤질 클로라이드(166ml)를 천천히 넣어 주었다. 여과후 증발농축기를 사용하여 30~70℃의 온도에서 여액을 농축하였다. 실리카 컬럼 (12x42cm)으로 노말 헥산(n-Hexane): EtOAc을 15:1, 4:1, 2:1로 순차적으로 전개하여 오일상태의 중간체 화합물 146g을 얻었다(101.4%).

제 2공정: 중간체 화합물 2,3,4,6- 테트라 벤질 글루코오스 합성

제 1공정에서 얻어진 오일상태의 중간체 화합물 146g을 초산 1029ml와 2M H₂SO₄ 485ml에 녹였다. 오일배쓰에서 110~120℃로 3시간 동안 교반했다. 반응용기를 오일배쓰에서 꺼내 상온에서 3시간 교반하였다. 온도가 내려가면서 화합물이 석출되었다. 여기에 물 764ml를 넣고 반응액을 여과한 후 여과된 침전물(filter cake)을 메틸렌 클로라이드에 녹여 물로 씻어 주었다. 유기층을 농축하여 121g 중간체 화합물을 얻었다(85.2%).

제 3공정: 중간체 화합물 2,3,4,6- 테트라 벤질 1-O- 석시닐 글루코오스 합성

제 2공정 121g을 메틸렌 클로라이드 무수물 1200ml에 녹였다. 건조한 트리에틸렌아민 45.3g과 DMAP 5.47g, 숙신산 무수물 24.6g을 넣고 상온에서 1시간 30분 교반하였다. 0.5M 시트르산으로 반응액을 씻어준 후 유기층을 농축하였다. 실리카 컬럼 (12x42cm)으로 메틸렌 클로라이드:MeOH 50:1, 30:1로 순차적으로 전개하여 75.5g의 화합물 5를 얻었다(52.8%).

제 4공정: 중간체 화합물 2'-글루코오스(2,3,4,6- 테트라 벤질)-7,10- ditroc -DTX의 합성

둥근 플라스크에 7,10-Ditrox-DTX 5.48g을 넣고 입구를 고무마개로 막은 후 무수 메틸렌 클로라이드 60ml를 넣어 주었다. 4-다이메틸아미노피리딘(Dimethylaminopyridine) 0.7g, N,N-다이사이클로헥실카보다이이미드(Dicyclohexylcarbodiimide) 1.2g을 넣어준 후 상온에서 약 15분간 교반하여 충분히 녹여 주었다. 2,3,4,6-테트라 벤질 1-O-석시닐 글루코오스 4.5g을 넣어준 후 상온에서 1~2시간 교반하였다. 박막 크로마토그래피 분석으로 반응 종결을 확인한 후, 침전을 여과하여 제거하였다. 반응액에 메틸렌 클로라이드 190ml를 넣어준 후 10% 시트르산 수용액 250ml로 분획하였다. 메틸렌 클로라이드 층(하층액)을 분리하여 농축하였다. 실리카 컬럼 (5x23cm)을 충진한 후, n-Hex:EA (4:1~2:1)의 용매로 전개하여 6.95g의 중간체 화합물을 얻었다(82.5%).

제 5 공정: 화합물 2 DTX - M2' - LS - Glc 의 합성

1) 둥근 플라스크에 제 4공정의 2'-글루코오스(2,3,4,6-테트라 벤질)-7,10-ditroc-DTX) 6.95g, MeOH : 초산 (9:1) 70ml을 넣고 입구를 고무마개로 막은 후 상온에서 약 15분간 교반하여 충분히 녹여 주었다. 분말 아연 3.5g을 넣고 상온에서 1~2시간 교반하였다. 박막크로마토그래피 분석을 통하여 반응이 완료되면 유리필터에 셀라이트를 깔고 아연을 여과하여 제거한 후 여액은 회전증발농축기를 사용하여 농축하였다. 메틸렌 클로라이드 500ml로 녹인 후 증류수 500ml를 넣어 분획하여 메틸렌 클로라이드 층(하층액)을 농축하였다. 실리카 컬럼 (5 x 20 cm)을 메틸렌 클로라이드로 충진한 후 메틸렌 클로라이드 : MeOH (98 : 2)로 전개하여 4.3g의 중간체 화합물을 얻었다(77%).

2) 둥근 플라스크에 2'-글루코오스(Bn)-DTX) 6.6g, MeOH 100ml를 넣고 충분히 녹을 때까지 교반하였다. 50% 초산 70ml를 교반하며 천천히 넣어 주었다. 10중량%의 활성탄소 상의 팔라듐(Palladium on activate carbon) 6.6g을 넣어 주었다. 수소 가스를 천천히 가해주면서 밤새 상온에서 교반하였다. 박막 크로마토그래피 (전개용매 메틸렌 클로라이드 : MeOH 5:1)로 분석하여 반응종결을 확인한 후, 유리필터에 셀라이트를 깔고 반응용액을 여과하여 회전증발농축기로 농축하였다. 실리카 컬럼 (8x24 cm)을 메틸렌 클로라이드로 충진 후 메틸렌 클로라이드 : MeOH (10 : 1) 및 (5:1)로 전개하여 2.2g의 화합물 2를 얻었다(53%). 순도를 높이기 위해서는 Prep LC 정제를 수행하였다.

<실시예 3>

실시예 3은 화합물 3의 제조에 관한 설명이다.

화합물(2), DTX-M2'-LS-Glc의 글루코오스의 4번 위치에 갈락토오스를 전이 시켜주는 베타1,4-갈락토오실트랜스퍼레이즈 (1,4 galactosyltransferase, LgtB)를 사용하여 DTX-M2'-LS-Lac을 합성하였다.

반응기에 MgCl₂6H₂O 4.4 g, UDP-D-갈락토오스 13 g 그리고 Tris HCl 완충액 (pH 7.5)을 25~50 mM이 되도록 넣어 주었다. 반응 출발물질인 DTX-M2'-LS-Glc 4.8 g을 DMSO 0.2 ℓ로 잘 녹인 후 반응기에 천천히 넣어 잘 섞어 주었다. 부피가 1.1 ℓ가 되도록 증류수로 조절한 후 베타 1,4-갈락토오실트랜스퍼레이즈를 넣어 반응을 시작하였다. 반응 조건인 pH 6.5와 37℃를 유지하며, 전환되는 정도를 HPLC 분석을 통하여 확인하여 90% 정도의 전환률에서 반응을 종료하였다.

반응액 (4.8 g, 부피 약 1.1 ℓ)를 에틸렌아민 동량으로 2회 분획하여 반응액에 존재하는 DTX-M2'-LS-Lac을 회수하고 농축하였다. 실리카 컬럼 (7x23cm)을 메틸렌 클로라이드로 충진하고 메틸렌 클로라이드 : MeOH(10 : 1), (8 : 1), (5 : 1)로 전개하여 흰색 형태의 DTX-M2'-LS-Lac, 화합물 3을 2.17g 얻었다(40%).

<실시예 4>

실시예 4는 화합물 4의 제조에 관한 설명이다.

실시예 3에서 만들어진 화합물 3 즉, DTX-M2'-LS-Lac의 갈락토오스에 시알산(sialic acid)을 전이시켜주는 알파 2,3-시알릴트랜스퍼레이즈 (2,3-sialyltransferase, SialT)를 이용하여 DTX-M2'-LS-Lac와 CMP-시알산 전구체로부터 시알산이 부가된 화합물 4인 DTX-M2'-LS-SL을 합성하였다.

반응기의 MgCl₂6H₂O 9.84 g, CMP-시알산 45.7 g 그리고 Tris HCl 완충액 (pH 7.5)을 25~50 mM이 되도록 넣어 주었다. 반응 출발물질인 DTX-M2'-LS-Lac 대략 21 g을 DMSO 0.6 L로 잘 녹여 반응기에 넣고 증류수로 2.46 L 가 되도록 부피를 조절하였다. 불투명한 반응액에 알파 2,3-시알릴트랜스퍼레이즈을 넣어 반응을 시작하고 반응은 상온에서 진행하였다. 반응 조건인 pH 8.2를 유지시켜주며, 전환되는 정도를 HPLC 분석을 통하여 확인을 하였다. 90% 정도의 전환률을 보일 때 MeOH 동량을 넣어 반응을 종료하였다. 반응액을 원심분리 및 여과하여 침전물을 제거한 후 상층을 농축하였다. 농축 과정 중에 MeOH 동량을 넣어 침전물이 생기는 것을 다시 제거하고 회전증발농축기로 농축하였다. 실리카 컬럼 (8x40cm)을 메틸렌 클로라이드로 충진하고 MC : MeOH (8 : 1), (5 : 1), (3 : 1), (1 : 1)로 전개하여 흰색의 DTX-M2'-LS-SL, 화합물 3을 10.2g 얻었다(40%).

순도를 높이기 위하여 Prep-HPLC를 이용하여 추가적으로 정제를 진행하였다. 추가로 고순도 정제를 위해 역상 컬럼(Reverse phase column, 50 x 500 mm)에 완충액(A), 정제수;(B), 아세토나이트릴로 시간별 변화를 주면서 정제를 수행하였다. 감압건조 및 동결건조기로 건조하여 최종 회수하였다.

<분석예 1> 도세탁셀 유도체의 용해도 분석

도세탁셀 유도체의 수용액 상에서 용해도 측정 및 비교를 위하여 도세탁셀 표준품의 무게 대비 HPLC(UV)의 영역(A)에 대한 보정 곡선(Calibration curve)을 작성하고 상대적인 수용성을 확인하였다. 일정량의 증류수에 각각의 시료를 과포화상태로 녹인 후 37℃ 항온수조에서 30분간 방치하고 상등액을 HPLC 분석법에 의해서 분석을 하여 UV 파장 260㎚에서 나타나는 피크의 면적 (A)을 얻어 수용액 상에 녹아 있는 화합물의 양을 구하였다. 그 결과, 도세탁셀 용해도를 1로 하여 비교할 때 화합물 1(DTX-M2'-LS)은 1.03, 화합물 2(DTX-M2'-LS-Glc)는 3.06, 화합물 3(DTX-M2'-LS-Lac)은 5.39, 화합물 4(DTX-M2'-LS-SL)는 25.49와 같은 용해도를 보였다.

<분석예 2> 도세탁셀에 대한 생체내 전환 및 약동력학 평가

가. 랫트에서 화합물 2( DTX - M2' - LS - Glc )의 약동력학

DTX-M2'-LS-Glc를 수컷 SD 랫트에 정맥주사 또는 경구로 단회투여(6.22 mg/kg, n=3)한 후 24시간 동안 DTX-M2'-LS-Glc 및 도세탁셀의 시간에 따른 혈장농도의 변화를 측정하고, 실험 결과에 대한 비구획 분석(non-compartmental analysis)을 수행하여 약동력학 매개변수(pharmacokinetic parameter)를 구했다.

DTX-M2'-LS-Glc를 투여량 6.22 mg/kg으로 정맥투여한 경우 체내에서 매우 신속히 소실되어 투여 후 30분 이후에는 혈장에서 정량한계 이상으로 검출되지 않았다. 반면, 도세탁셀은 투여 5분부터 전체 시간인 24시간에 걸쳐서 지속적으로 검출되었으며, 최초의 시료 채취시점(sampling time point)에서 혈장농도가 최고에 달했다가 이후 다중지수 소멸(multi-exponential decay)의 패턴을 보이며 감소하므로 전구약물(prodrug)의 도세탁셀로의 전환이 체내에서 매우 신속히 완료되는 것으로 판단된다. 또한, DTX-M2'-LS-Glc를 투여한 후 생성되는 도세탁셀의 시간에 따른 혈장농도 변화는 제거 속도-한계적 대사물질 동력학(elimination rate-limited metabolite kinetics)을 따르는 것으로 추정된다.

DTX-M2'-LS-Glc에 대한 혈장농도 데이터가 충분하지 않아 전구약물 자체의 약동력학 매개변수는 구하지 못하였다. 생성된 도세탁셀의 겉보기 종말 반감기(apparent terminal half-life)는 11.9시간으로 도세탁셀 자체를 투여하였을 경우와 대체로 유사하였다.

DTX-M2'-LS-Glc를 정맥투여한 후 생성된 도세탁셀의 혈장농도변화를 도세탁셀 자체를 정맥투여한 후 얻어진 결과와 비교할 때 전체 시간에서 대체로 유사한 경향을 보였으며, 종말 반감기(terminal half-life)도 대체로 유사하였다. 그 결과로서 생물학적 이용률(BA)은 124%로 나타나, 투여된 전구약물이 체내에서 거의 정량적으로 도세탁셀로 변환되는 것으로 나타났다.

나. 랫트에서 화합물 3( DTX - M2' - LS - Lac )의 약동력학

DTX-M2'-LS-Lac을 수컷 SD 랫트에 정맥주사로 단회 투여(7.63 mg/kg, n=3)한 후 24시간 동안 DTX-M2'-LS-Lac 및 도세탁셀의 시간에 따른 혈장농도의 변화를 측정하고 실험결과에 대한 비구획 분석을 수행하여 약동력학 매개변수를 구했다.

DTX-M2'-LS-Lac를 7.63 mg/kg의 투여량으로 정맥투여 시 투여 후 2시간까지 혈장 내에서 정량한계 이상의 농도로 검출되었으며, 시간에 따른 혈장농도의 변화는 다층성(multi-compartmental disposition)의 특성을 나타내었다. 도세탁셀은 최초 시료 채취시점인 5분부터 혈장 내에서 지속적으로 검출되었으며, DTX-M2'-LS-Lac과 거의 평행한 다중지수 소멸(multi-exponential decay)의 특성을 보였다. 따라서, DTX-M2'-LS-Lac은 정맥 투여시 도세탁셀로 신속히 변환되는 것으로 보이며, 생성된 도세탁셀의 플라스마 동력학(plasma kinetics)은 DTX-M2'-LS-Lac의 농도변화에 의존하는 형성 속도-한계적 대사물질 동력학(formation rate-limited metabolite kinetics)의 특성을 보이는 것으로 판단된다.

DTX-M2'-LS-Lac은 도세탁셀보다 현저히 낮은 1.4 l/hr/kg의 체계적 제거율(systemic clearance)를 보였다. 정상 상태 분포 용적(Steady-state volume of distribution)은 0.3 l/kg으로 총 체액(total body water)에 비해 현저히 낮아서 혈관 외로 잘 분포하지 못하는 것으로 판단되며, 이는 전구약물로의 구조변환에 의한 수용성의 증가에 기인하는 것으로 보인다. 겉보기 종말 반감기(Apparent terminal half-life)는 전구약물 DTX-M2'-LS-Lac의 경우 0.2시간이며 생성된 도세탁셀은 2.4시간으로 비교적 짧았다.

DTX-M2'-LS-Lac를 정맥투여한 후 생성된 도세탁셀의 혈장농도 변화를 도세탁셀 자체를 정맥투여한 후 얻어진 결과와 비교해 보니 투여 30분 이후부터 현저히 감소하는 경향을 보였다. 그 결과, 생물학적 이용률(BA)이 48%로 낮아서 투여된 전구약물 DTX-M2'-LS-Lac이 체내에서 정량적으로 도세탁셀로 변환되지 못하는 것으로 나타났다.

다. 랫트에서 화합물 4( DTX - M2' - LS - SL )의 약동력학

DTX-M2'-LS-SL을 수컷 SD 랫트에 정맥주사로 단회 투여(9.43 mg/kg, n=3)한 후 24시간 동안 DTX-M2'-LS-SL 및 도세탁셀의 시간에 따른 혈장농도 변화를 측정하고, 실험결과에 대한 비구획 분석을 수행하여 약동력학적 매개변수를 구하였다.

DTX-M2'-LS-SL을 정맥투여한 후 생성된 도세탁셀의 혈장농도 변화를 도세탁셀 자체를 정맥투여한 후 얻어진 결과와 비교시 투여 2시간 이후부터 전체 시간에서 현저히 감소하는 경향을 보였다. 그 결과로서 생물학적 이용률(BA)은 53%로 낮은 것으로 나타났다.

라. 랫트에서 화합물 1( DTX - M2' - LS )의 약동력학

DTX-M2'-LS를 수컷 SD 랫트에 정맥주사로 단회 투여(5.62 mg/kg, n=3)한 후 24시간 동안 DTX-M2'-LS 및 도세탁셀의 시간에 따른 혈장농도 변화를 측정하고, 실험결과에 대한 비구획 분석을 수행하여 약동력학적 매개변수를 구하였다.

DTX-M2'-LS를 5.62 mg/kg 투여량으로 정맥투여시 투여 후 1시간까지 혈장 내에서 정량한계 이상의 농도로 검출되었다. 도세탁셀은 최초 시료 채취시점인 5분부터 8시간까지 혈장 내에서 지속적으로 정량한계 이상의 농도로 검출되었다.

DTX-M2'-LS는 3.2 l/hr/kg의 체계적 제거율을 보였으며, 이는 도세탁셀보다는 낮으나 당 부위(sugar moiety)를 가진 전구약물보다는 높았다. 정상 상태 분포 용적(steady-state volume of distribution)은 0.5 l/kg으로 총 체액과 유사했다. 겉보기 종말 반감기는 전구약물 DTX-M2'-LS의 경우 0.1시간으로 짧으나 생성된 도세탁셀은 6.6시간으로 상대적으로 더 긴 것으로 나타났다.

DTX-M2'-LS를 정맥투여한 후 생성된 도세탁셀의 혈장농도 변화를 도세탁셀 자체를 정맥투여한 후 얻어진 결과와 비교시 투여 후 1시간까지는 현저히 높으나 이후부터는 전체 시간에서 대체로 유사한 경향을 보였다. 생물학적 이용률(BA)은 240%로 이론적으로 가능한 수치를 2배 이상 초과하여 나타났다.

Claims

탁셀로부터 제조되며 아래 화학식 1로 표시되는 탁셀 유도체, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물.
<화학식 1>

(식중, R1은 아세틸기 또는 H이고, R2는 페닐기 또는 t-부틸옥시기이며, R은 C1-C12의 산이 에스테르 결합된 것이거나, C1-C12의 산이 에스테르 결합된 링커에 연결된 C3~C7의 알도즈 또는 케토즈 당쇄가 1~5개 포함된 당류임)
제1항에 있어서,
상기 탁셀은 도세탁셀 또는 파클리탁셀임을 특징으로 하는 탁셀 유도체, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물.
제1항에 있어서,
상기 링커는 포밀 (formyl)기, 아세틸 (acetyl)기, 프로피오닐 (propionyl)기, 부틸 (butyl)기, 아크릴 (acryl)기, 에틸석시닐 (ethylsuccinyl)기, 석시닐 (succinyl)기 또는 아미노헥실 (aminohexyl)기를 포함하는 것임을 특징으로 하는 탁셀 유도체, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물.
제1항에 있어서,
상기 당류는 글루코오스, 갈락토오스, 프럭토오스, 푸코오스, 만노오스, 람노오스, 갈락토사민, 글루코사민, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 반코사민, 에피-반코사민, 글루쿠론산, 시알산, 데옥시글루코오스 및 데옥시갈락토오스를 포함하는 단당류 그룹으로부터 선택된 1종 이상으로 단당류, 이당류 또는 다당류임을 특징으로 하는 탁셀 유도체, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물.
제1항에 있어서,
상기 탁셀 유도체에서 R₁은 아세틸기 또는 H이고, R₂는 페닐기 또는 t-부틸옥시기이며, R은
(1) R=
,
(2) R=
,
(3) R=
및
(4)R=

중 선택된 1종임을 특징으로 하는 탁셀 유도체, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물.
제1항 내지 제5항 중 선택된 한 항의 탁셀 유도체, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물을 포함하는 항암 전구약물.
(a) 글루코오스를 원료로 하여 1 -OH 위치에 석시닐기를 도입하고 기타 -OH기에 보호기를 도입하는 공정;

(이때 R3과 R4는 동일할 수도 있고 다를 수도 있으며, 쉽게 산 혹은 염기의 처리로 해리되어 H로 변형될 수 있는 통상의 화학합성에서 OH기의 보호기이며, 바람직하게는 MMTr (Monomethoxytrityl)기 또는 TMS (Tetramethylsilane)기이며, 더욱 바람직하게는 R3와 R4가 벤질 (Benzyl)기임)
(b) 탁셀 화합물에 상기 화합물 5를 부가한 후 -OH 보호기인 R3, R4를 제거하여 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 2를 만드는 공정;을 포함하는 탁셀 유도체, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 용매화물을 제조하는 방법.
<화학식 2>

(상기 화학식 2에서 R₁은 아세틸기 또는 H이고, R₂는 페닐기 또는 t-부틸옥시기임)
제7항의 화학식 2로 표시되는 화합물 2에 UDP-D-갈락토오스와 갈락토실 트랜스퍼레이즈를 이용하여 아래의 화학식 3으로 표시되는 탁셀 유도체, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 용매화물을 제조하는 방법.
<화학식 3>

(상기 화학식 3에서 R₁은 아세틸기 또는 H이고, R₂는 페닐기 또는 t-부틸옥시기임)
제8항의 화학식 3으로 표시되는 화합물 3에 시알산과 시알릴 트랜스퍼레이즈를 이용하여 아래의 화학식 4로 표시되는 탁셀 유도체, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 용매화물을 제조하는 방법.
<화학식 4>

(상기 화학식 4에서 R₁은 아세틸기 또는 H이고, R₂는 페닐기 또는 t-부틸옥시기임)
탁셀 화합물의 2 위치 수산화기에 다이카복실레이트를 에스테르 결합시키는 공정으로 아래 화학식 5로 표시되는 탁셀 유도체, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 용매화물을 제조하는 방법.
<화학식 5>

(상기 화학식 5에서 R₁은 아세틸기 또는 H이고, R₂는 페닐기 또는 t-부틸옥시기임)