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KR20110034617A - 심장 조직을 처치하는 세포를 이용하는 조성물 및 방법 - Google Patents

심장 조직을 처치하는 세포를 이용하는 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20110034617A
KR20110034617A KR1020107029313A KR20107029313A KR20110034617A KR 20110034617 A KR20110034617 A KR 20110034617A KR 1020107029313 A KR1020107029313 A KR 1020107029313A KR 20107029313 A KR20107029313 A KR 20107029313A KR 20110034617 A KR20110034617 A KR 20110034617A
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cells
polypeptide
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cardiac
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안드레 테르직
아타 버파
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메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치
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Abstract

본 문헌은 심장 인자를 함유하는 조성물, 상기 인자의 존재시 초기 세포를 배양함으로써 세포를 얻는 방법, 및 심장 조직에 대하여 획득한 세포를 투여하는 방법에 관한 것이다.

Description

심장 조직을 처치하는 세포를 이용하는 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR USING CELLS TO TREAT HEART TISSUE}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2008년 5월 27일자로 출원한 국제 출원 제PCT/US2008/064895호의 우선권의 이익을 주장한다.
기술분야
본 문헌은 심장 세포를 획득하고 심장 세포를 이용하는 것을 포함하는 방법 및 물질에 관한 것이다. 예를 들어, 본 문헌은 포유류 심장 조직에 기능적인 심근세포(cardiomyocyte)로서 심장 조직내로 편입되는 세포(예를 들어, 분화된 심장전구세포(cardioprogenitor cell) 또는 심장형성세포(cardiopoietic cell))를 제공하는 방법 및 물질에 관한 것이다.
순환기 질환(cardiovascular disease)은 환자 관리에서의 진전에도 불구하고 전세계적인 이환율 및 사망율의 주된 원인이다. 높은 회복 능력을 가진 조직과 대조적으로, 심장 조직은 회복할 수 없는 손상에 대하여 약하다. 따라서, 임상 세팅에서 세포 기반의 심혈관 재생의학(regenerative cardiovascular medicine)이 추구되고 있다.
최근 줄기세포 생물학의 출현은 전통적인 완화에서 처치 회복으로의 현재 실시 모델의 범위를 확장시킨다. 전형적으로, 임상 경험은 자가 출처(autologous source)에서 구성되고 변경되지 않은 상태에서 전달되는 성인 줄기세포에 기초를 두었다. 제1 세대 생물제제는 나이브 인간 줄기세포이고, 용이하게 접근가능한 세포형(cytotype)으로서 확인된다. 특정 개체는 나이브 인간 줄기세포의 전달보다 나은 결과를 내는 것을 나타내었다.
정의
본 문헌의 틀 내에서 그 반대로 지시되지 않는다면, 따옴표 사이에 표기된 용어는 다음의 정의를 가진다.
용어 'hMSC'는 인간 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 의미한다.
세포의 '심장 발생 잠재력(cardio-generative potential)'은 경색된 심장으로 주입될 때, 예를 들어 심근과 같은 심장 세포를 성공적으로 발생시키는 세포의 능력을 지시한다.
'심장형성세포(cardiopoietic cell)'(CP)는 미분화된 세포에서 분화의 과정에 참여하게 되는 세포이다. '심장형성세포'는 초기 심장 전사 인자 Nkx2.5 및 후기 심장 전위 인자 MEF2C의 핵 전위로 규정되는 심장 분화를 나타낸다(Behfar et al. Derivation of a cardiopoietic population from human mesenchymal stem yields progeny, Nature Clinical Practice, Cardiovascular Medicine, March 2006 vol. 3 supplement 1, S78 ~ S82 페이지). 심장 전사 인자 GATA4의 핵 전위를 관찰할 수 있다. 심장형성세포는 근절(sarcomere)이 결핍되어 있을 수 있고 근절 단백질(sarcomeric protein)의 발현이 결핍되어 있을 수 있다. 심장형성세포는 그 자체가 분할하는 능력을 유지한다. 또한 심장형성세포는 심근으로 분화될 수 있으므로 '심근세포 전구체' 또는 '심근 전구세포'로 불린다. 본 문헌의 문맥에서, 심장형성세포는 인간 성인 중배엽 줄기세포(human adult mesenchymal stem cell, hMSC)에서 유래할 수 있다. 'CP-hMSC'는 인간 성인 중배엽 줄기세포에서 유래한 심장형성세포를 지시한다.
'칵테일(cocktail)' 또는 '심장성 칵테일(cardiogenic cocktail)'은 적어도 두 개의 심장성 물질을 함유하는 조성물을 지시한다.
'심장성 물질'은 세포의 심장 발생 잠재력을 개선시키는 물질이다.
'칵테일 유도 세포(cocktail-guided cell)' 또는 '심장형성으로 유도되는 세포'는 칵테일과 접촉하고 추가로 분화하는 세포이다.
'분화'는 덜 특수화된 세포가 더 특수화된 세포로 되는 과정이다.
'박출 계수'는 심장 박동 동안 박출되는 혈액의 부분을 의미한다. 수식어 없이, 용어 박출 계수는 구체적으로 좌심실의 박출 계수(좌심실 박출 계수(left ventricular ejection fraction) 또는 LVEF)를 나타낸다.
'박출 계수 변화'는 경색된 심장으로 주입된 세포로 처치된 동물의 심장의, 주어진 시간 후에 측정된 박출 계수와 주입 전에 측정된 박출 계수 간의 차이를 의미한다.
다르게 규정되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 당업자가 흔히 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에서 설명된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있을지라도, 적합한 방법 및 물질이 하기에서 설명된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고 문헌들은 전체로서 참조로 포함된다. 충돌하는 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 조절할 것이다. 추가적으로, 물질, 방법, 및 실시예들은 단지 설명을 위한 것이고 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
요약
본 발명은 TGFβ-1, BMP4, α-트롬빈, 카디오트로핀(Cardiotrophin) 및 IL-6으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물, 및 카디오게놀 C(Cardiogenol C) 및 레티노산으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 TGFβ-1, BMP4, α-트롬빈, 카디오트로핀 및 카디오게놀 C를 포함한다. 본 발명의 조성물은 FGF-2, IGF-1, Activin-A, TNF-α, FGF-4, LIF, VEGF-A 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 FGF-2, IGF-1 및 액티빈-A(Activin-A)를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 조성물은 액티빈-A, FGF-2, IL-6, IGF-1 및 레티노산을 포함한다. 대안적인 구체예에 따르면, 본 발명의 조성물은 TNF-α, FGF-4, LIF, 및 VEGF-A로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 화합물이 없을 수 있다.
하기 화합물의 하나가 본 발명의 조성물에 존재할 때, ml 당 상기 TGFβ-1가 1 내지 5ng, ml 당 상기 BMP4가 1 내지 10ng, ml 당 상기 카디오트로핀이 0.5 내지 5ng, ml 당 상기 α-트롬빈이 0.5 내지 5유닛, 및 상기 카디오게놀 C가 50 내지 500nM, ml 당 상기 FGF-2가 1 내지 10ng, ml 당 상기 IGF-1이 10 내지 100ng, ml 당 상기 액티빈-A가 1 내지 50ng, ml 당 상기 TNF-α가 1 내지 50ng, ml 당 상기 FGF-4가 1 내지 20ng, ml 당 상기 IL-6이 10 내지 100ng, ml 당 상기 LIF가 1 내지 10유닛, ml 당 상기 VEGF-A가 1 내지 50ng, ml 당 상기 레티노산이 0.1 내지 1.0μM의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 조성물은 조합 방식으로 사용되는, 재조합 TGFβ-1(2.5ng/ml), BMP4(5ng/ml), 카디오트로핀(1ng/ml), 카디오게놀 C(100μM)을 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 조성물은 상기 화합물을 포함하고 추가로 α-트롬빈(1U/ml), FGF-2(10ng/ml), IGF-1(50ng/ml) 및 액티빈-A(5ng/ml)를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 조성물은 조합 방식으로 사용되는, 재조합 TGFβ-1(2.5ng/ml), BMP4(5ng/ml), 액티빈-A(5ng/ml), FGF-2(10ng/ml), IL-6(100ng/ml), 인자-Ila(Factor-Ila)(hα-트롬빈, 1U/ml), IGF-1(50ng/ml), 및 레티노산(1μM)을 포함한다.
바람직하게, 본 발명의 조성물은 소태아 혈청(fetal calf serum), 인간 혈청, 혈소판 용해물, 및 이의 혼합물을 함유하는 배지로 이루어진 군에서 선택된 배지에 포함된다.
또한 본 발명은 MEF2c mRNA, MESP-1 mRNA, Tbx-5 mRNA, GATA4 mRNA, Flk-1 mRNA, GATA6 mRNA, Fog-1 mRNA, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 mRNA의 상승된 수준을 발현하는 세포를 초기 분화되는 세포로부터 획득하는 방법에 관한 것이고/것이거나 Nkx2.5 폴리펩티드, MEF2C 폴리펩티드, Tbx-5 폴리펩티드, FOG-2 폴리펩티드, GATA-4 폴리펩티드 MESP-1 폴리펩티드, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 가지며, 여기에서 상기 적어도 하나의 폴리펩티드는 상기 분화된 세포의 핵과 관련되고, 상기 방법은 본 발명에 따른 조성물의 존재시 초기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 방법에서, 분화된 세포는 바람직하게 상승된 수준의 MEF2c mRNA 및 MESP-1 mRNA를 발현한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 초기 세포는 중배엽 줄기세포이다. 상기 세포는 골수 유래 줄기세포일 수 있다. 초기 세포들은 세포 표면에서 CD90, CD105, CD133, CD166, CD29, 및 CD44를 발현할 수 있고, 세포 표면에서 CD14, CD34, 및CD45를 발현하지 않는다.
가장 바람직하게, 분화된 세포는 심장형성세포이다.
본 발명의 다른 양태는 분화된 세포를 포유동물로 전달하는 방법이고, 여기에서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 분화된 세포 집단에서 세포 샘플이 MEF2c mRNA, MESP-1 mRNA, Tbx-5 mRNA, GATA4 mRNA, Flk-1 mRNA, GATA6 mRNA, Fog-1 mRNA, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 mRNA를 상승된 수준으로 발현하는 세포를 포함하고/포함하거나 Nkx2.5 폴리펩티드, MEF2C 폴리펩티드, Tbx-5 폴리펩티드, MESP-1 폴리펩티드, GAT A-4 폴리펩티드, FOG-2 폴리펩티드, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 가지며, 여기에서 상기 폴리펩티드는 상기 분화된 세포의 핵과 관련된 것임을 결정하는 단계; 및 (b) 상기 분화된 세포 집단의 세포를 상기 포유동물로 투여하는 단계. 상기 분화된 세포의 집단은 본 발명에 따른 임의의 상기 조성물이 존재시 배양된 상기 원래의 세포로부터 획득될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 단계 (a)는 역전사 중합효소 사슬 반응을 이용하는 것 또는 면역세포화학을 이용하는 것을 포함할 수 있다. 상기 투여하는 단계는 전신, 심장내, 및 관상동맥내(intracoronary) 투여로 이루어진 군에서 선택되는 투여를 통하여 상기 세포를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 심장 조직에 심근세포를 제공하는 방법이며, 여기에서 상기 방법은 상기 심장 조직, 본 발명에 따른 조성물과의 접촉으로 획득할 수 있는 청구항의 상기 분화된 세포에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 구체예의 상세한 내용은 하기 첨부된 도면 및 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점은 설명 및 청구항으로부터 분명해질 것이다.
도 1은 관상동맥 질환을 가진 11명의 환자의 골수에서 유래한 나이브(naive) 인간 중배엽 줄기세포(hMSC)로 처치 전 및 후에 고려된, 박출 계수(ΔEF)의 변화(%)를 나타낸다.
도 2는 DAPI로 면역염색(immunostain)한 후 공초점 현미경에서 획득하였고, 이는 양성의 박출 계수 변화를 보이지 않는 환자 2(왼쪽) 및 처치 후에 양성의 박출 계수 변화를 보이는 환자 9(오른쪽)에 대한 심장 전사 인자(cardiac transcription factor) 함량의 단백질 발현을 나타낸다.
도 3은 11명의 환자의 hMSC에서 2가지 유의한 심장 전사 인자 mRNA의 mRNA 발현을 보여준다.
도 4는 처치되지 않은 나이브 hMSC(왼쪽)의, 및 심장성 칵테일로 처치된 CP-hMSC(오른쪽)에서의, 각각 Nkx2.5 mRNA, GATA-6 mRNA 및 Fog-1 mRNA에 대한 심장 전사 인자의 mRNA 발현을 A.U.(arbitrary unit)로 나타낸다.
도 5는 심장성 칵테일로 처치된 CP-hMSC(오른쪽)에서 Nkx2.5, MEF2C, FOG-2 및 GATA4 폴리펩티드의 핵전위를 나이브 hMSC(왼쪽)과 비교하여 나타낸 공초점 현미경에서 획득한 이미지를 나타낸다.
도 6은 나이브 hMSC에서 '칵테일 유도(cocktail-guided)' CP-hMSC 및 결국 심근세포(CM)로의 (DO, D5, D15, 및 D20(일)에서의) 점진적인 변환을 설명한다.
도 7은 나이브 hMSC 및 칵테일 유도 심근세포의 전이 전자 현미경 초미세 구조(transition electron microscopy ultrastructure)를 나타낸다.
도 8은 광학 현미경에서의 칵테일 유도 심근세포를 나타낸다.
도 9는 히스토그램의 왼쪽 첫번째 그래프에 도 1의 각 환자로부터의 나이브 hMSC 및 CP-hMSC에 대한 Tbx-5 mRNA 발현(단위는 AU)을 나타내고, 히스토그램의 오른쪽에 존재하는 나이브 세포에 대한 결과를 나타내며, 히스토그램의 왼쪽에 존재하는 CP 세포에 대한 결과를 나타낸다. 중간의 두번째 그래프는 MEF2C mRNA 발현을 나타내고, 오른쪽의 세번째 그래프는 MESP-1 mRNA 발현을 나타낸다. 모든 환자로부터의 나이브 세포에 대한 평균 값 및 모든 환자에 대한 CP 세포에 대한 평균 값은 히스토그램의 배경으로 주어져 있다.
도 10은 나이브 hMSC의 다른 양으로 심장의 처치를 한 후의 박출 계수 변화(Δ 박출 계수)(12명의 환자의 각각에 대한 히스토그램의 오른쪽 부분) 대 CP-hMSC, 즉 칵테일 유도 hMSC(CP-hMSC)로 심장의 처치를 한 후의 박출 계수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 처치되지 않은 경색된 심장(왼쪽) 및 심장형성세포로 처치된 경색된 심장(오른쪽)의 심초음파검사를 나타내고, 이는 CP-hMSC로 처치할 시 훨씬 더 양호한 전벽(anterior wall) 소생을 나타낸다.
도 12는 경색된 심근(infracted myocardium)으로 나이브의 주입 후(왼쪽) 및 심장형성세포의 주입 후(오른쪽)의 박출계수 변화(ΔEF)를 나타내는 도 5와 유사한 그래프이다.
도 13은 처치 시작 6달 후 나이브 hMSC 및 CP-hMSC로 처치된 쥐의 경색된 심장을 나타낸다. 나이브 hMSC로 처치된 심장에 교정되지 않은 채로(uncorrected) 남아있는 동맥류(aneurysms) 및 흉터(scar)는 재근육화(re-muscularization)를 유도한 CP-hMSC 처치로 해결되었다.
도 14는 심장형성 hMSC로 처치된 쥐 심근에서 공초점 해상도는 인간 특이적인 라민(lamin) 면역염색으로 입증된 인간 종에 대하여 특이적인 h-ALU-DNA 서열에 대한 양성의 염색과 함께 인간 유래의 세포의 광범위한 존재를 보임을 나타내며, 이러한 모든 것은 경색된 대조군에서는 없었다.
도 15는 인간 기원의 심근세포를 심장형성 hMSC로 처치된 심장에서 인간 심장 트로핀-1 및 α-액티닌의 공존(co-localization)으로 추적한 것을 나타낸다. 인간 기원의 심근세포는 나이브 hMSC로 처치된 심장에는 없었다. 경색된 전벽 내의 정량화는 나이브 대 CP-hMSC로 처치된 심장에서의 심근 핵의 3±2% 및 25±5%를 나태내었으며, 이는 심장형성 hMSC 처치로 향상된 착상(engraftment)을 의미한다.
도 16은 인간 트로포닌, 심실 미오신 경쇄 mlC2V, 및 DAPI에 대하여 염색된 나이브 및 CP hMSC의 사진을 포함한다. 심실 세포의 표현형은 도 15에 나타낸 바와 같은 회복된 전벽에서 면역염색한 또는 도 17에 나타낸 바와 같은 흉터를 해결한 심실 미오신 경쇄 mlC2V로 인간 트로포닌 양성 세포의 대조염색법(counter staining)으로 확증하였다.
도 17은 인간 트로포닌, 심실 미오신 경쇄 mlC2V, 및 DAPI에 대하여 염색된 잔여 흉터의 사진이다.
도 18은 폐색된 관상 혈관 원위부의 혈관신생(angiogenesis)을 입증하는 CP-hMSC로 처치된 재생한 심근의 사진을 포함한다.
도 19는 심근 맥관 구조 내에서 인간 PECAM-1(CD-31)의 발현을 통하여 신혈관 형성에 기여하는 CP-hMSC를 입증한다.
도 20은 세포 전달 후 가짜(sham)에 비례하는 Δ박출 계수(%) 대 시간(달)을 나타낸 그래프이다. CP-hMSC 처치의 장기간의 영향은 1년 이상, 또는 인간 수명의 25년으로 해석되는 쥐 수명의 1/3 이상 동안 추적되었다. 가짜에 비례하여, 나이브 hMSC를 이용한 처치는 6개월 및 12개월에 각각 5% 및 2.5%의 박출 계수를 보였다. 반대로, 심장형성 hMSC로 처치된 경색된 마우스는 가짜에 비례하여 6개월 및 12개월에 25%의 유의한 박출 계수 개선을 입증하였다.
도 21은 세포 이식 후 Δ박출 계수(%) 대 시간(달)을 나타낸 그래프이다. 경색된 코호트(cohort)는 계층화하여 간섭 시간에 기록된 명시적인 심부전(박출 계수 <45%)을 가지는 서브그룹에서 효능을 평가하였다. 35%의 동등한 처치전 박출 계수에도 불구하고, 나이브 hMSC로 처치된 코호트에서 박출 계수에서 5% 감소한 것에 대조적으로, 오직 심장형성 hMSC 처치만이 6개월 및 12개월에서 10%로 절대적인 박출 계수를 개선시켰다.
도 22는 마우스의 지시된 서브그룹에 대한 생존(%)을 나타낸 막대 그래프이다. 400일 후속의 명백한 심부전 서브그룹에서, 가짜에서 어떤 생존자도 존재하지 않았고, >50%의 사망율이 나이브 hMSC 처치에서 기록되었다. 반대로, >80%의 생존은 심장형성 hMSC 처치로 이루어졌다.
도 23은 병리학적 검사 및 심전도로 측정된, CP-hMSC를 이용한 처치의 안전성을 설명한다.
본 문헌은 심장 세포(예를 들어, 분화된 심장전구세포)와 관련된 방법 및 물질을 제공한다. 예를 들어, 본 문헌은 기능적인 심근세포로서 심장 조직내로 편입되는 능력을 가지는 세포, 이러한 세포를 제조하는 방법, 이러한 세포를 제조하기위한 조성물, 및 세포(예를 들어, 분화된 심장전구세포) 집단이 기능적인 심근세포로서 심장 조직내로 편입되는 능력을 가지는 세포를 포함하는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 본 문헌은 또한 기능적인 심근 세포를 이용하여 심장 조직(예를 들어, 인간 심장 조직)을 제공하는 방법 및 물질을 제공한다.
본원에서 제공된 분화된 심장전구세포는 인간, 원숭이, 말, 개, 고양이, 래트, 또는 마우스를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 종의 것일 수 있다. 예를 들어, 분화된 심장전구세포는 포유류(예를 들어, 인간)의 분화된 심장전구세포일 수 있다.
일부 경우에서, 본원에서 제공된 분화된 심장전구세포는 기능적인 심근세포로서 심장 조직내로 편입되는 능력을 가진다.
임의의 적절한 방법이 분화된 심장전구세포를 획득하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 분화된 심장전구세포는 포유류(예컨대, 인간) 줄기세포와 같은 줄기세포로부터 유래될 수 있다.
일부 경우에서, 분화된 심장전구세포는 배아줄기세포로부터 유도될 수 있다. 일부 경우에서, 분화된 심장전구세포는 중배엽줄기세포로부터 유도할 수 있다. 중배엽줄기세포는 임의의 출처로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 중배엽줄기세포는 골수 또는 해면골(trabecular bone)과 같은 포유류(예컨대, 인간) 조직으로부터 획득될 수 있다. 중배엽줄기세포는 시험관내에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 중배엽줄기세포는 시험관내에서 수를 확장시킬 수 있다. 중배엽줄기세포는 세포 표면 상에서 폴리펩티드 마커를 발현할 수 있거나 또는 발현하지 않을 수 있다. 예를 들어, 중배엽줄기세포는 세포 표면 상에서 CD133, CD90, CD105, CD166, CD29, 및 CD44를 발현할 수 있고, 세포 표면 상에서 CD14, CD34, 및 CD45를 발현하지 않을 수 있다.
임의의 적절한 방법은 줄기세포(예컨대, 중배엽줄기세포)로부터 분화된 심장전구세포를 유도하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 분화된 심장전구세포는 중배엽줄기세포를 조성물(예컨대, 배양 배지)를 이용하여 배양함으로써 중배엽줄기세포로부터 유도할 수 있다. 조성물은 하나 이상의 인자를 함유하는 임의의 적절한 조성물일 수 있다. 인자는 폴리펩티드, 스테로이드, 호르몬 및 소분자와 같은 임의의 형태의 인자일 수 있다. 상기 인자의 예는 이에 한정되지 않지만, TGFβ, BMP, FGF-2, IGF-1, 액티빈-A, 카디오트로핀, α-트롬빈 및 카디오게놀 C를 포함한다.
하나의 구체예에서, TGFβ, BMP, 카디오트로핀, α-트롬빈, 및 카디오게놀 C를 함유하는 배지는 줄기세포(예컨대, 중배엽줄기세포)로부터 분화된 심장전구세포를 획득하는데 사용될 수 있다. 이러한 경우에서, FGF-2, IGF-1, 액티빈-A, 또는 이의 조합은 TGFβ, BMP, 카디오트로핀, α-트롬빈, 및 카디오게놀 C를 이용한 초기 배양 기간(예컨대, 1일 또는 2일) 이후에 배지에 첨가될 수 있다.
TGFβ는 인간 TGFβ와 같은 TGFβ 활성을 가지는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, TGFβ는 재조합 TGFβ 또는 합성 TGFβ일 수 있다. 하나의 구체예에서, TGFβ는 TGFβ-1일 수 있다. TGFβ의 임의의 적절한 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, ml 당 1 내지 10ng의 TGF-β(예컨대, ml 당 약 2.5ng의 TGFβ)가 사용될 수 있다.
BMP는 인간 BMP와 같은 BMP 활성을 가지는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, BMP는 재조합 BMP 또는 합성 BMP일 수 있다. 하나의 구체예에서, BMP는 BMP4일 수 있다. BMP의 임의의 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, ml 당 1 내지 20ng의 BMP(예컨대, ml 당 약 5ng의 BMP4)가 사용될 수 있다.
FGF-2는 인간 FGF-2와 같은 FGF-2 활성을 가지는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, FGF-2는 재조합 FGF-2 또는 합성 FGF-2일 수 있다. FGF-2의 임의의 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, ml 당 1 내지 20ng의 FGF-2(예컨대, ml 당 약 5ng의 FGF-2)가 사용될 수 있다.
IGF-1은 인간 IGF-1과 같은 IGF-1 활성을 가지는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, IGF-1은 재조합 IGF-1 또는 합성 IGF-1일 수 있다. IGF-1의 임의의 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, ml 당 10 내지 100ng의 IGF-1(예컨대, ml 당 약 50ng의 IGF-1)이 사용될 수 있다.
액티빈-A는 인간 액티빈-A와 같은 액티빈-A 활성을 가지는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 액티빈-A는 재조합 액티빈-A 또는 합성 액티빈-A일 수 있다. 액티빈-A의 임의의 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, ml 당 1 내지 50ng의 액티빈-A(예컨대, ml 당 약 10ng의 액티빈-A)가 사용될 수 있다.
α-트롬빈은 인간 α-트롬빈과 같은 α-트롬빈 활성을 가지는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, α-트롬빈은 재조합 α-트롬빈 또는 합성 α-트롬빈일 수 있다. α-트롬빈의 임의의 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, ml 당 0.5 내지 10유닛의 α-트롬빈(예컨대, ml 당 약 1유닛의 α-트롬빈)이 사용될 수 있다.
카디오트로핀은 인간 카디오트로핀-1과 같은 카디오트로핀 활성을 가지는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 카디오트로핀은 재조합 카디오트로핀 또는 합성 카디오트로핀일 수 있다. 카디오트로핀의 임의의 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, ml 당 0.5 내지 10ng의 카디오트로핀(예컨대, ml 당 약 1ng의 카디오트로핀-1)이 사용될 수 있다.
IL-6은 인간 IL-6과 같은 IL-6 활성을 가지는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, IL-6은 재조합 IL-6 또는 합성 IL-6일 수 있다. IL-6의 임의의 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, ml 당 100 내지 200ng의 IL-6이 사용될 수 있다.
카디오게놀 C 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염(예컨대, 카디오게놀 C 염산염)의 임의의 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, 10 내지 1000nM의 카디오게놀 C(예컨대, 약 100nM의 카디오게놀 C)가 사용될 수 있다.
레티노산은 합성 레티노산, 천연 레티노산, 비타민 A 대사물질, 비타민 A의 천연 유도체, 또는 비타민 A의 합성 유도체와 같은 레티노산 활성을 가지는 임의의 분자일 수 있다. 레티노산이 임의의 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, 1 x 10-6 내지 2 x 10-6μM의 레티노산이 사용될 수 있다.
일부 경우에서, TGFβ-1(예컨대, 2.5ng/ml), BMP4(예컨대, 5ng/ml), FGF-2(예컨대, 5ng/ml), IGF-1(예컨대, 50ng/ml), 액티빈-A(예컨대, 10ng/ml), 카디오트로핀(예컨대, 1ng/ml), α-트롬빈(예컨대, 1유닛/ml), 및 카디오게놀 C(예컨대, 100nM)로 보충된 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지가 줄기세포(예컨대, 중배엽줄기세포)로부터 분화된 심장전구세포를 획득하기 위하여 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 배지(예컨대, 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지)는 혈소판 용해물(예컨대, 인간 혈소판 용해물)을 함유할 수 있다.
일부 경우에서, 중배엽줄기세포로부터 분회된 심장전구세포를 획득하기 위하여 사용된 조성물은 TNF-α, LIF, 및 VEGF-A와 같은 추가적인 선택적 인자를 함유할 수 있다.
TNF-α는 인간 TNF-α와 같은 TNF-α 활성을 가지는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, TNF-α는 재조합 TNF-α 또는 합성 TNF-α일 수 있다. TNF-α의 임의의 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, ml 당 5 내지 50ng의 TNF-α가 사용될 수 있다.
LIF는 인간 LIF와 같은 LIF 활성을 가지는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, LIF는 재조합 LIF 또는 합성 LIF일 수 있다. LIF의 임의의 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, ml 당 2.5 내지 100ng의 LIF가 사용될 수 있다.
VEGF-A는 인간 VEGF-A와 같은 VEGF-A 활성을 가지는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, VEGF-A는 재조합 VEGF-A 또는 합성 VEGF-A일 수 있다. VEGF-A의 임의의 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, ml 당 5 내지 200ng의 VEGF-A가 사용될 수 있다.
본원에서 제공되는 조성물은 임의의 조합의 인자를 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 조성물은 TGFβ-1, BMP4, 액티빈-A, 카디오트로핀, α-트롬빈, 및 카디오게놀 C를 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 본원에서 제공되는 조성물은 TGFβ-1, BMP4, FGF-2, IGF-1, 카디오트로핀, α-트롬빈, 및 카디오게놀 C를 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 본원에서 제공되는 조성물은 TGFβ-1, BMP4, FGF-2, IGF-1, 카디오트로핀, α-트롬빈, 및 카디오게놀 C를 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 본원에서 제공되는 조성물은 TNF-α, IL-6, LIF, VEGF-A, 레티노산, 또는 이의 임의의 조합(예컨대, IL-6, LIF, VEGF-A, 및 레티노산; LIF, VEGF-A, 및 레티노산; 또는 TNF-α, IL-6, LIF, 및 VEGF-A)이 결핍될 수 있다.
본원에서 제공되는 조성물은 임의의 적절한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 조성물은 상업적으로 이용가능한 인자를 사용하여 제조될 수 있다. 일부 경우에서, 본원에서 제공되는 조성물은 세포 용해물(예컨대, 혈소판 용해물) 또는 심근세포 또는 TNF-α 자극 내배엽 세포(TNF-α-stimulated endodermal cell)와 같은 세포로부터 조건배지(conditioned media)를 함유하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 조성물은 상업적으로 이용가능한 인자로 보충된 혈소판 용해물을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 경우에서, 본원에서 제공되는 조성물은 조건배지로부터 분리된 인자를 사용하여 제조될 수 있다. 일부 경우에서, 인자는 혈청을 함유하거나 또는 함유하지 않는 세포 배양 배지와 같은 배지에 용해될 수 있다.
기능적인 심근세포로서 심장 조직 내로 편입되는 능력을 가지는 분화된 심장전구세포를 획득하기 위하여 임의의 적절한 방법이 본원에서 제공되는 조성물을 이용하여 줄기세포(예컨대, 중배엽줄기세포)를 배양하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 중배엽줄기세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50일 동안 본원에서 제공되는 조성물을 이용하여 배양될 수 있다. 일부 경우에서, 본원에서 제공되고 중배엽줄기세포를 배양하는데 사용되는 조성물은 매일 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50일마다 교체될 수 있다.
일부 경우에서, 중배엽줄기세포는 혈청의 존재시 또는 부재시에 본원에서 제공되는 조성물을 이용하여 배양될 수 있다. 본원에서 제공되는 조성물을 이용하여 줄기세포를 배양할 때 임의의 적절한 세포 밀도가 사용될 수 있다. 예를 들어, 분화된 심장전구세포를 획득하기 위하여 cm2 당 약 1000 내지 2000 중배엽줄기세포(예컨대, 약 1500~2000 세포/cm2)가 본원에서 제공되는 조성물을 사용하여 배양될 수 있다.
일단 줄기세포(예컨대, 중배엽줄기세포)가 본원에서 제공되는 조성물을 이용하여 배양되거나 또는 그렇지 않으면 분화 인자로 처치되면, 분화의 상태를 모니터링하여 줄기세포가 기능적인 심근세포로서 심장 조직 내로 편입되는 능력을 가지는 분화된 심장전구세포로 분화되는지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯팅,형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting FACS), 면역염색, 레이저 공초점 현미경, 및 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 기술(예컨대, 정량적 RT-PCR)과 같은 기술을 사용하여 세포의 샘플을 수집하고 평가할 수 있다. 일부 경우에서, MEF2c, MESP-1, Tbx-5, Nkx2.5, GATA6, Flk-1, Fog 1 및 Fog 2 폴리펩티드 또는 mRNA이 상승된 수준으로 발현하는 것으로 발견된 세포가 심장 조직을 처치하기 위하여 포유류 내로 투여하는데 선택될 수 있다.
본원에서 기술된 바와 같이, TGFβ-1, BMP4, FGF-2, IGF-1, 액티빈-A, 카디오트로핀, α-트롬빈, 및 카디오게놀 C를 함유하는 혈소판 용해물을 이용하여 배양된 중배엽줄기세포로부터 유도된 분화된 심장전구세포는 전처리된 중배엽줄기세포를 이용하여 관찰된 수준과 비교할 때, MEF2c mRNA, MESP-1 mRNA, Tbx-5 mRNA, GATA6 mRNA, Flk-1 또는 Fog 1 mRNA 수준에서 2 내지 5배의 증가를 보였다. 이러한 분화된 심장전구세포는 또한 허혈성 및 비허혈성 세팅 둘 다에서 구조적 회복과 직접적으로 연관된 심장 펌프 기능 개선으로 심근내로, 피하로, 또는 혈관내로 주입될 때 기능적인 심근세포로서 심장 조직 내로 편입되는 능력을 보였다. 기능적인 이점은 인간 특이적인 단백질의 염색을 통하여 생체내에서 초음파심장검사기로 및 검시시 조직학적으로 기록되었다. 또한 본원에서 기술된 바와 같이, TGFβ-1, BMP4, FGF-2, IGF-1, 액티빈-A, 카디오트로핀, α-트롬빈, 및 카디오게놀 C를 함유하는 혈청을 이용하여 배양된 중배엽줄기세포로부터 유도된 분화된 심장전구세포는 전처리된 중배엽줄기세포를 이용하여 관찰된 수준과 비교할 때, MEF2c mRNA, MESP-1 mRNA, 및 Tbx-5 mRNA 수준에서 5 내지 10배의 증가를 보였다.
또한 이러한 분화된 심장전구세포는 허혈성 및 비허혈성 세팅 둘 다에서 구조적 회복과 직접적으로 연관된 심장 펌프 기능 개선으로 심근내로(예컨대, 심장내 또는 심외막 경로를 통해), 심장동맥 내로 주입되거나, 심장에 융합되거나, 또는 전신으로 투여(예컨대, 피하로)될 때 기능적인 심근세포로서 심장 조직내로 편입되는 능력을 보였다. 기능적인 이점은 생체내에서 심장 초음파로, 인간 특이적인 단백질의 염색을 통해 검시시 현미경 분석으로 기록되었다. 이렇게 하여, MEF2c, MESP-1, Tbx-5, GATA6, Flk-1, Fog 1, FOG 2,또는 이의 조합의 상승된 폴리펩티드 또는 mRNA 수준과 같은 방출 기준은 포유류 내로 투여하기 전에 세포를 평가하는데 사용될 수 있다.
세포 집단 내에서 MEF2c, MESP-1, Tbx-5, GATA6, Flk-1, 또는 Fog(예를 들어 mRNA에 대한 FOG 1, 폴리펩티드에 대한 FOG 2)의 폴리펩티드 또는 mRNA 수준과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "상승된 수준"은 폴리펩티드 또는 mRNA에 대한 참조 수준보다 더 높은 임의의 수준을 지칭한다.
MEF2c, MESP-1, Tbx-5, GATA6, Flk-1, 또는 Fog(예를 들어 mRNA에 대한 FOG 1, 폴리펩티드에 대한 FOG 2)의 폴리펩티드 또는 mRNA 수준과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "참조 수준"은 전처치된 세포(예컨대, 전처치된 중배엽줄기세포)에서 전형적으로 발견되는 수준을 지칭한다. 예를 들어, MEF2c mRNA 참조 수준, MESP-1 mRNA 참조 수준, Tbx-5 mRNA 참조 수준, GATA6 mRNA 참조 수준, 및 FOG 1 mRNA 참조 수준은 각각 MEF2c, MESP-1, Tbx-5, GAT A6, Flk-1 및 FOG 1 mRNA의 평균 수준일 수 있고, 이는 본원에서 제공되거나 또는 그렇지 않으면 분화 인자로 처치된 조성물로 처치되지 않은 중배엽줄기세포의 무작위 샘플링(random sampling)에 존재한다. 특정 수준이 상승된 수준인지 여부를 결정할 때 비슷한 샘플로부터의 수준이 사용되는 것임을 인식할 것이다.
MEF2c, MESP-1, Tbx-5, GATA 4, GATA6, Flk-1, Fog 2 또는 FOG 1의 상승된 폴리펩티드 및/또는 mRNA 수준은 그 수준이 해당하는 참조 수준 보다 더 높도록제공되는 임의의 수준일 수 있다.
예를 들어, Tbx-5 mRNA의 상승된 수준은 비처치된 중배엽줄기세포에서 관찰되는 참조 수준 Tbx-5 mRNA보다 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 그 이상일 수 있다. 참조 수준은 임의의 양일 수 있음이 언급된다. 예를 들어, Tbx-5 mRNA에 대한 참조 수준은 0일 수 있다. 이 경우에서, 0보다 큰 Tbx-5 mRNA의 임의의 수준은 상승된 수준일 것이다.
일부 경우에서, 식별 기준은 포유류 내로 투여하기 전에 세포의 현미경 분석을 포함할 수 있다. 이러한 현미경 분석은 핵과 관련된 전사 인자 폴리펩티드에 대한 세포를 평가하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 포유류로의 방출에 대한 적절한 세포는 포유류로의 방출되기 전에 핵과 관련된 Nkx2.5, MEF2c, GATA4, MESP-1, FOG 2, Tbx-5, 또는 이의 임의의 조합의 존재에 대하여 평가될 수 있다.
임의의 적절한 방법은 심장 조직에 기능적인 심근세포로서 심장 조직내로 편입되는 능력을 가지는 분화된 심장전구세포를 제공하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 분화된 심장전구세포는 심근내로(예컨대, 심장내 또는 심외막 경로를 통해), 심장동맥 내로 주입되거나, 심장에 융합되거나, 또는 전신으로 투여(예컨대, 피하로)될 수 있다.
임의의 심장 조직은 분화된 심장전구세포로 제공될 수 있다. 예를 들어, 포유류(예컨대, 인간) 심장 조직은 분화된 심장전구세포로 제공될 수 있다. 일부 경우에서, 허혈성 심근증, 심근경색증, 또는 심부전을 겪은 심장 조직은 분화된 심장전구세포로 제공될 수 있다.
분화된 심장전구세포의 임의의 형태는 심장 조직으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 자가의 또는 이종의 분화된 심장전구세포는 심장 조직으로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 본원에서 제공되는 조성물을 이용하여 배양된 줄기세포(예컨대, 중배엽줄기세포)는 심장 조직으로 투여될 수 있다.
줄기세포는 본원에서 제공되는 조성물을 이용하여 심장 조직으로 투여되기 전에 임의의 시간 동안 배양될 수 있다. 예를 들어, 줄기세포는 본원에서 제공되는 조성물을 이용하여 심장 조직으로 투여되기 전에 6 내지 24시간(예컨대, 8시간, 10시간, 12시간, 18시간, 또는 22시간) 동안 또는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 30일, 35일, 40일, 45일, 또는 50일 동안 배양될 수 있다. 일부 경우에서, 본원에서 제공되는 조성물을 이용하여 배양된 줄기세포는 본원에서 제공되는 조성물과 함께 심장 조직으로 투여될 수 있다.
줄기세포는 본원에서 제공되는 조성물을 이용하여 본원에서 제공되는 조성물과 함께 심장 조직으로 투여되기 전에 임의의 시간 동안 배양될 수 있다. 예를 들어, 줄기세포는 본원에서 제공되는 조성물을 이용하여 본원에서 제공되는 조성물과 함께 심장 조직으로 투여되기 전에 6 내지 24시간(예컨대, 8시간, 10시간, 12시간, 18시간, 또는 22시간) 동안 또는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 30일, 35일, 40일, 45일, 또는 50일 동안 배양될 수 있다.
일부 경우에서, 분화된 심장전구세포는 포유류로 투여되기 전에 분화된 심장전구세포가 특정 방출 기준에 충족되는지 여부를 결정하기 위하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 분화된 심장전구세포가 포유류내로 투여되기 전에 MEF2c, MESP-1, Tbx-5, GATA6, Flk-1, Fog(mRNA에 대한 FOG 1, 폴리펩티드에 대한 FOG 2) 또는 이의 조합의 상승된 폴리펩티드 또는 mRNA를 상승된 수준으로 발현하는 확인하기 위하여 RT-PCR을 사용하여 분화된 심장전구세포는 평가될 수 있다.
본 발명은 추가로 하기 실시예에 기술될 것이며, 이는 청구항에 기술된 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
실시예
허혈성 심장 질환에 대하여 관상동맥우회술(coronary artery bypass)을 받은 환자들을 골수채취를 위하여 무작위로 선택하였다. 이들은 사전동의서(informed consent)를 제공하였고, 연구 프로토콜은 적절한 기관윤리위원회(Institutional Ethics Committee) 및 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다. 마우스를 제외하고 환자에게 어떠한 주입을 하는 것도 가치가 없었다.
실시예 1
중배엽줄기세포는 18 내지 45세의 건강한 개체의 반골의 후장골능(posterior iliac crest)에서 채취한 인간 골수로부터 유도되었다(Cambrex, East Rutherford, New Jersey). 유세포분석에 기초하여, 중배엽줄기세포는 CD90, CD133, CD105, CD166, CD29, 및 CD44를 발현하였지만, CD14, CD34, 및 CD45를 발현하지 않았다.
인간 골수 유도 중배엽 줄기세포는 TGFβ-1(2.5ng/ml), BMP4(5ng/ml), FGF-2(5ng/ml), IGF-1(50ng/ml), 액티빈-A(10ng/ml), 카디오트로핀(1ng/ml), α-트롬빈(1유닛/ml), 및 카디오게놀 C(100nM)로 보출된 혈소판 용해물 또는 혈청에서 배양되었다. cm2 당 약 1000~2000 세포의 밀도로 혈소판 용해물 함유 배양에서 4~10일 후, 세포는 비처치된 중배엽줄기세포보다 MEF2c mRNA, MESP-1 mRNA, Tbx-5 mRNA, GATA6 mRNA, Flk-1 또는 FOG 1 mRNA를 2~5배 더 발현하는 것으로 발견되었다.
cm2 당 약 1000~2000 세포의 밀도로 혈청 함유 배양에서 5~15일 후, 세포는 비처치된 중배엽줄기세포보다 MEF2c mRNA, MESP-1 mRNA, Tbx-5 mRNA, GATA 4 mRNA, GATA6 mRNA, Flk-1 또는 FOG 1 mRNA를 5~10배 더 발현하는 것으로 발견되었다.
RT-PCR 분석에서 사용된 프라이머 쌍은 Applied Biosystems로부터 상업적으로 입수한 표준 프라이머이었다.
분화된 심장전구세포가 기능적인 심근세포로서 심장 조직내로 편입되는 능력을 가지는 것을 결정한 결과는 박동하는 심장 내에서 생체내, 및 검시 후 시험관내에서 모두 획득하였다. 생체내에서, 이소플루란 마취 하에서, 질환이 있는 심장 내로 심장전구세포의 직접적인 심근전달은 2차원 M모드 프로빙을 이용한 단축으로, 장축, 도플러 맥파 분석(Doppler pulse wave analysis), 및 12개 유도 심전도로 심초음파검사에 의하여 모니터링된 바와 같이 심장 성능(cardiac performance)을 개선시켰다.
채취된 심장 조직은 3% 파라포름알데하이드에서 고정시키고, 절단하였으며, 인간 세포 추적(tracking)에 대한 면역프로빙(immuno-probing)을 하였다. 기능적 개선 및 흉터 해결이 된 새로운 인간 유도 심근세포 및 맥관구조는, 방출 기준을 통과하지 않은 세포를 이용한 이점의 부재와 반대로, 방출 기준(예컨대, MEF2c mRNA, MESP-1 mRNA, Tbx-5 mRNA, GATA 4 mRNA, GATA6 mRNA, Flk-1 또는 FOG 1 mRNA의 발현의 상승된 수준)을 수행하는 심장전구세포로 처치된 마우스에서의 분석에서 기록되었다.
환자에서 자가 주입에 대한 심장형성세포의 생산 규모를 확대시키기 위하여, 대안적인 방법은 면역형광법이 시간소모적, 질적 및 잠재적으로 오퍼레이터 의존적(potentially operator-dependent)일 수 있는 것으로 고려되었다. 선택의 한 가지 방법은 실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, RT- qPCR)이다. 이 방법은 참조 표준에 비하여 오퍼레이터 독립적 및 정량적인 더 빠른 결과(1일 이내)를 제공한다. 추가적으로, 면역염색된 샘플은 하나하나씩 형광 현미경 분석을 필요로 하지만, 48개의 다른 샘플(또는 조건)까지 96웰 플레이트를 사용하여 RT-qPCR로 이중으로 테스트될 수 있다.
RT-QPCR에 대한 적합한 마커를 식별하기 위하여, 심장 환자(n=7)로부터 획득된 골수 샘플로부터 유도되었다. 세포는 MEF2C 및 Nkx2.5에 대하여 면역형광 염색법(immunofluorescence staining)으로 평가되었다. RNA는 이들 세포로부터 추출되었고 Nkx2.5 및 MEF2C의 발현은 실시간 정량적 PCR로 측정하였다.
참조 표준은 심장성 칵테일의 존재시에 배양되지 않은 동일한 배치(batch)로부터의 세포로 이루어진다.
결과는 처치된 세포로부터 획득된 데이터에서 비처치된 세포로부터 획득된 데이터까지 표준화하는 이중 델타-Ct 방법(double delta-Ct method)을 이용하여 계산되었다.
MEF2C는 나이브 세포와 비교할 때 qPCR 및 면역형광법(핵 전위)으로 심장형성세포의 적합한 마커로서 식별되었다. 그에 반해서, 면역형광법(핵 전위)에 의하여 단백질 수준에서 보인 Nkx2.5에서 질적인 변화는 초기에 비처치된 세포에 비하여 RNA 수준에서 정량적인 변화로 해석되지 않았다. Nkx2.5의 다운스트림 유전자 발현의 유도는 Nxk2.5의 핵 전위에 달려있을 것이므로, 그 후 Nkx2.5의 다운스트림 유전자가 조사되었다. 이는 QPCR에 의한 식별을 위한 추가적인 적합한 유전자로서 MESP-1, Flk-1 및 Tbx5의 식별을 초래하였다.
인간 골수 흡입(15-2O mI)이 흉골절개 후 관상동맥 우회 수술 동안 획득되었다. 골수는 DMSO 기초 무혈청 동결액에서 냉동보관(cryostore)되었다. 중배엽줄기세포는 12시간 세척하면서 플라스틱 접시 상에서 원래 골수의 구획분할(platting)하고 CD347CD457CD133+ 마커 패널을 사용히여 형광 활성 세포 분류(Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS) 분석으로 확인된 식별을 가진 부착 세포를 선택함으로써 구성되었다. 세포는 5% 인간 혈소판 용해물(Mayo Clinic Blood Bank, Rochester, MN)로 보충된 DMEM 내 37℃에서 배양되었다.
심근경색은 면역손상된 누드 마우스(Harlan, Indianapolis, IN)에서 실행하였다. 맹검실험(blinded design), 한달의 후경색(post-infarction) 후에, 12.5μl의 증식배지(propagation medium)에 현탁된 총 600,000 나이브 또는 심장형성 유도 hMSC(cardiopoiesis guided hMSC)은 현미경 시각화 하에서 좌심실의 전벽 상의 5개의 심외막 부위에 주입하였다. 가짜는 세포 주입없이 동일한 수술 절차를 겪었다. 이 만성 경색 모델 내로 골수 hMSC의 심근 주입은 심초음파검사 상에서 박출 계수를 개선시키는 11마리의 연구된 개체 중에서 단지 2마리로부터의 세포의 이식과의 결과에서 이질성을 입증하였다.
환자 3 및 9는 높은 심장 발생 잠재력을 가진 개체로서 식별되었다. 도 1에서 우선 관찰되는 것은 환자 3 및 9 각각으로부터의 hMSC로 처치된 마우스(n=3)에서의 박출 계수의 변화는 유의하게 양성이지만, 반면 다른 환자 각각에 대한 변화는 그렇지 않다는 것이다.
심장 전자 요인의 단백질 발현은 도 2에 나타낸 바와 같이 공초점 현미경 상에서 hMSC에서 관찰되었다. 막대는 모든 패널에 대하여 대표적인 20μm에 해당한다.
면역염색은 3% 파라포름알데히드에서 고정 및 1% 트리톤(Triton) X-100에서 투과화(permeabilization)한 후에 MEF2C(1:400, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA), Nkx2.5(1:150, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), GATA4(Santa Cruz Biotechnology Inc.), 인산-AKTSer473(1:100, Cell Signaling Technologies), Tbx5(1:5000, Abeam, Cambridge, MA), Mesp-1(1:250, Novus Bio, Littleton, CO), Fog-2(1:100, Santa Cruz Biotechnology), 근절 단백질(sarcomeric protein) α-액티닌(1 :500, Sigma-Aldrich) 및 인간 특이적인 트로포닌-I(1:100, Abeam), mlC2v (1:500, Synaptic Systems, Gottigen, Germany), Sca-1(1:100, R&D Systems, Minneapolis, MN), CD-31/PECAM-1(1:500, Beckman Coulter, Fullerton, CA), α-평활근 액틴(Abeam), 인간 특이적인 트로포닌-I(1:100, Abeam), 인간 라민 A/C(1 :50, Novacastra, New Castle, UK), 및 Ki67(1:500, Abeam)에 특이적인 항체를 가지고 LSM 510 공초점 레이저 주사 현미경(Carl Zeiss Inc., Jena, Germany)으로 실행한 공초점 현미경 상에서 핵을 시각화하기 위하여 DAPI 염색과 함께 실행하였다.
초기 심장 전사 인자 Nkx 2.5, Tbx-5 및 MESP1과 후기 심장 전사 인자 MEF2C는 DAPI를 이용한 염색 하에서 관찰되었다. 환자 2에 대한 결과는 왼쪽이고, 환자 9에 대한 결과는 오른쪽이다. 획득된 이미지는 심장 전사 인자의 발현이 환자 2로부터의 hMSC에 대해서는 약하고 환자 9의 hMSC에 대해서는 높다는 것을 보여준다. 이는 환자 9로부터의 hMSC는 유효한 처치적 이점을 제공하지만, 반면 환자 2로부터의 hMSC는 그렇지 않다는 사실을 제공한다. DAPI에 의해 제공된 색깔은 파랑색이다.
도 2에서 Nkx 2.5에 대한 이미지의 첫번째 시리즈는 환자 2의 hMSC에 대하여(왼쪽) 단지 파랑색으로 DAPI 착색된 세포의 핵(왼쪽)을 보여준다. 또한 세포질에서 Nkx 2.5의 존재에 해당하는 옅은 녹색도 나타난다. 환자 9(오른쪽)에 대하여 해당하는 이미지는 세포질에서 및 또한 세포의 핵에서 Nkx 2.5(녹색)의 더 높은 발현을 보여준다.
이미지의 두번째 시리즈는 환자 2에 대하여 심장 전사 인자 Tbx-5(녹색) 및 MESP-1(빨강색), DAPI로 파랑색으로 착색되는 세포의 핵을 나타내고 TbX-5 및 MESP-1의 발현에 해당하는 녹색 또는 빨강색은 보이지 않는다. 환자 2에 대하여, 세포의 세포질은 빨강색으로 핵은 녹색으로 착색되며, 이는 두가지 심장 전사 인자 모두의 강한 발현 및 세포의 핵으로 Tbx-5의 전위에 해당하는 것이다.
이미지의 세번째 시리즈는 Nkx 2.5에 대한 결과와 유사하게 MEF2C에 대한 결과를 제공한다.
도 3은 연구의 11마리의 환자의 hMSC에 대하여 심장 전사 인자 발현(MEF2C 및 Tbx-5)를 드러내는 qPCR에서 연구된 mRNA 발현을 나타낸다.
정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)은 Applied Biosystems 7,900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems, Foster City, CA)이 있는 TaqMan PCR 키트를 사용하여 실행하였다. TaqMan 유전자 발현 반응은 96웰 플레이트에서 배양되었고 삼중으로 실행되었다. 임계 사이클(threshold cycle, Cτ)은 형광이 고정된 임계값을 통과한 때의 부분 사이클 수로서 정의된다. TaqMan C1-값은 2"ΔΔ C T 방법을 사용하여 결정된 상대적인 배수 변화로 전환되고, GAPDH (P/N 435,2662-0506003) 발현으로 표준화된다.
심장 전사 활성을 대표하는 표 1에서 열거된 유전자를 평가하였다.
세포는 인간 재조합 TGFβ-1(2.5ng/ml), BMP4(5ng/ml), 카디오트로핀(1ng/ml), α-트롬빈(1U/ml), 및 카디오게놀 C(100μM)를 포함하는 심장성 칵테일을 가지고 5일 자극하기 전 및 자그간 후 mRNA 및 단백질 수준에서 평가되었다. MEF2C mRNA 및 Tbx-5 mRNA 발현(단위는 AU(arbitrary unit)임) 둘 다 다른 환자 중 하나에 대한 것보다 환자 2 및 9의 hMSC에 대하여 훨씬 더 높았다.
Figure pct00001
좌심실 기능 및 구조는 경흉강 심초음파검사(Sequoia 512; Siemens, Malvern, PA and VisualSonics Inc, Toronto, Canada)로 연속적으로 이루어졌다. 박출 계수(%)는 [(LVVd - LWs)/LVVd] × 100으로 계산되었고, 여기에서 LVVd는 좌심실 이완말기의 부피(μl)이고, LWs는 좌심실 수축말기의 부피(μl)이다.
도 4는 각각 Nkx2.5 mRNA, GATA-6 mRNA 및 Fog-1 mRNA에 대한 심장 전사 인자, 처치되지 않은 나이브 hMSC(왼쪽) 및 심장성 칵테일로 처치된 CP-hMSC(오른쪽)의 mRNA 발현을 A.U.(arbitrary unit)의 단위로 나타낸다. 각각의 경우에서, 심장성 칵테일로 처치된 세포를 사용할 때 결과가 훨씬 더 좋다는 것이 분명하다.
도 5는 심장성 칵테일로 처치된 나이브 CP-hMSC에서 핵 전위 Nkx2.5, MEF2c, GATA4 및 FOG-2 폴리펩티드를 보여주는 공초점 현미경에서 획득된 이미지를 나타낸다. Nkx2.5, MEF2c, GATA4 및 FOG-2는 녹색으로 DAPI는 파랑새으로 나타난다. 나이브 hMSC의 이미지에서, 어떠한 전사 인자도 나타나지 않았다. 폴리펩티드는 짙은 녹색으로 나타내어지는 바와 같이 CP-hMSC의 핵 상(오른쪽)으로 전위된다.
도 6은 나이브 hMSC에서 '칵테일 유도' CP-hMSC 및 결국 심근세포(CM)로의 (DO, D5, D15, 및 D20(일)에서의) 점진적인 변환을 설명한다. D0에서, 핵은 DAPI에 의하여 파랑생으로 착색된다. D5에서, MEF2C 폴리펩티드는 핵으로 전위된다(녹색). D15에서, 근절 α-액티닌이 존재하고(빨강색), 이는 근절이 존재하고 따라서 세포가 명확하게 심근세포 분화에 관여하고 더이상 심장형성에는 관여하지 않음을 보여준다. 트로포닌-1의 대량이 D20에 심근세포에 존재한다(마지막 분화).
도 7은 나이브 hMSC(왼쪽) 및 칵테일 유도 심근세포(오른쪽)의 전이 전자 현미경 초미세 구조를 나타낸다. 이를 위하여, 세포는 15일 동안 1% 혈소판 용해물에서 배양되었다. 심근세포는 미토콘드리아 성숙, 근관세포(myotube)의 근절생성(sarcomerogenesis) 및 형성을 제시한다.
도 8은 광학 현미경에서의 칵테일 유도 심근세포를 나타낸다. 흥분-수축 시스템의 성숙은 칼슘의 일과성(calcium transient)의 유도를 통하여 평가되었다. 이를 위하여, 세포는 5일의 칵테일 자극 후 15일 동안 배양되었고 온도가 제어되는 Zeiss LSM 510 현미경(Zeiss)을 이용한 생생한 영상 및 1Hz 자극 동안 획득하는 라인스캔 이미지(line-scan image)를 위하여 칼슘 선택적인 프로브인 5μM의 플루오-4-아세톡시메티 에스테르(fluo-4-acetoxymethyl ester)(Molecular Probes, Carlsbad, CA)를 이용하여 37℃에서 30분 동안 로딩하였다.
도 9는 처치된 hMSC 대 처치되지 않은 hMSC에서 Tbx-5, MEF2C 및 MESP-1에서의 3배, 8배, 및 8배 증가를 나타낸다.
도 10에 나타낸 바와 같이, CARPI 기준에 만족하는 CP-hMSC는 경색 1달 후 생체내에서 전달되었고, 나이브 환자 매치된(naive patient-matched) hMSC 이상으로 박출 계수를 유의하게 개선시켰다.
도 11은 처치되지 않은 경색된 심장(왼쪽) 및 심장형성세포로 처치된 경색된 심장(오른쪽)의 심초음파검사를 나타내며, 이는 CP-hMSC로 처치시에 훨씬 양호한 전벽 소생을 보여준다. 심전도는 가벼운 마취(1.5% 이소플루란) 하에서 4개 다리의 유도(four-limb-lead) 심전도(MP150; Biopac, Goleta, CA)를 사용하여 기록되었다.
심초음파검사시, 수축성은 나이브 hMSC(n=17) 또는 가짜(n=10; 도 9)에서 기록된 미미한 변화와 반대로, CP-hMSC(n=14)로 처치한 후 1달 및 2달에 각각 15% 및 20%로 개선되었다. 상부: 관상동맥 결찰 4주 후 및 세포성 이식(cellular transplant) 1일 전(Ml 4주 후 - 전사없음)에 경색된 심장의 심초음파검사는 M-모드상에서 두가지 연구 그룹 모두에서 무동원체(akinetic) 전벽을 드러내었다. 중간: 세포성 이식 4주 후(세포 전사 4주 후), 나이브 hMSC로 처치된 심장은 CP-hMSC로 처치된 그룹에서의 소생과 달리 전벽에서 부동성(akinesis)이 유지됨을 입증하였다. 하부: 세포성 이식 8주 후(세포 전사 8주 후), 나이브 hMSC로 처치된 심장은CP hMSC로 처치된 경색된 심장에서의 강한 수축 활성에 대하여 심근 회복에 대한 제한된 증거를 계속 보여주었다. 왼쪽 패널은 2-D M-모드 캡쳐의 수준을 나타내는 점선과 함께 흉골주위(para-sternal, PS)를 장축의 관점으로 나타낸 것이다. 오른쪽 패널의 화살촉은 전벽 소생을 나타낸다.
도 12는 평균적으로 유도된 심장형성 hMSC가 경색된 심근(infracted myocardium)으로 주입 후 1달 및 2달 후속 조치에서 뚜렷한 개선을 획득하였음을 나타낸다. 반대로, 나이브 hMSC 또는 가짜 대조군은 박출 계수에 제한된 영향을 미쳤다. 별 및 이중별은 두개의 시점에 대하여 나이브 hMSC 이상으로 p < 0.01임을 나타낸다.
hMSC에서 유도된 심장형성세포로 처치된 심장에서, 기능적 개선은 심근 재생으로 3달 및 18달의 조직병리학적 평가와 관련성이 있음을 보여주었다. 나이브 hMSC로 처치된 심장에 교정되지 않은 채로 남아있는 동맥류 및 흉터는 재근육화를 유도한 심장형성 hMSC 처치로 해결되었다(도 13).
전체 병리학적 평가는 단면도 상에서, 시작 6개월 후에 나이브(왼쪽) hMSC로 처치된 경색된 심장과 달리 강한 재근육화 및 심장형성(CP, 오른쪽)에서 약화된 리모델링과 함께 좌전하행동맥(left anterior descending(LAD) artery) 결찰(심장에서 노랑색 원)의 흉터 다운스트림의 해결을 입증하였다. 이들 결과는 특히 양호하다.
ALU-DNA에 대한 프로빙은 5~10분 동안 85℃에서 혼성화 및 37℃에서 밤새 배양한 다음 항플루오레세인(anti-Fluorescein) GFP 표지된 2차 검출에 의하여 인간 ALU-프로브(Biogenex, San Ramon, CA)를 이용하여 실행되었다.
공초점 해상도는 CP-hMSC 처치된 쥐 심근에서, 인간 특이적인 라민 면역염색으로 입증된 인간 종에 대하여 특이적인 ALU DNA 서열에 대한 양성의 염색과 함께 인간 유래의 세포의 광범위한 존재를 보였고, 이러한 모든 것은 경색된 대조군에서는 없었다(도 14).
가까(왼쪽)와 달리, 공초점 현미경 평가에서 심장형성 hMSC 처치된 심장은 쥐의 경색된 심근 내에 내포된 인간 h-ALU DNA 프로브(중간)로 염색된 바와 같은 인간 핵의 극적인 존재를 드러내었고, 추가적으로 인간 특이적인 라민 항체(오른쪽, 도 14에서 나타낸 삽입도)에 대하여 추가적인 염색으로 확인되었다. 동결 심근 부분은 PBS 관류 고정된 심장에서 초과 산소공급된(super-oxygenated) 3% 파라포름알데히드에서 제조되었다. 막대는 50μm를 지시한다.
도 15는 심장형성 hMSC 로 처치된 심장의 전벽(중간 및 오른쪽 패널)에서의 유의한 염색에 대하여 인간 특이적인 트로포닌-1 항체는 나이브(왼쪽)에서 염색되지 않았음을 나타낸다.
또한, 도 16에 나타낸 바와 같이, 심장형성(하부) hMSC 처치된 심장에 대하여 나이브(상부)의 인간 트로포닌-1 염색은 mlC2v로 대비염색되었고, 착상된 인간 세포로부터 심실 심근의 생성을 입증하였다. 막대는 20μm(상부) 및 50μm(하부)를 지시한다.
hMSC로 처치된 심장으로부터 유도된 심장형성의 잔여 흉터내에서 도 17에 설명된 바와 같이, 심근에서 유도된 인간 줄기세포는 mlC2V과 함께 인간 트로포닌 공존(colocalization)하는 타고난 쥐 심근과 구별될 수 있다. 막대는 50μm를 지시한다.
도 18에서, 표면 현미경은 우관상동맥(right coronary artery(RCA); 왼쪽 하부) 및 회선(circumflex)(오른쪽 하부)에서 기인하는 CP-hMSC 처치된 심장에서 결찰된 LAD(검정 원) 원위부의 혈관신생을 검출하였다.
도 19는 심장형성 hMSC 처치된 심장으로부터 결맥관(collateral vessel)의 공초점 평가가 인간 특이적인 CD-31(PECAM-1) 염색을 입증한 것을 나타낸다. 막대는 20μm를 나타낸다.
도 20은 나이브 및 칵테일 유도(CP) hMSC로 처치한 것에 대하여 12개월 동안 가짜에 관하여 박출 계수의 변화의 진전을 %로 나타낸다. 가짜에 관하여, 나이브 hMSC를 이용한 처치는 6개월 및 12개월에 각각 5% 및 2.5%의 박출 계수 효과를 나타내었다.
반대로, CP-hMSC 처치된 경색된 마우스는 가짜에 관하여 6개월 및 12개월에 25%의 유의한 박출 계수 개선을 입증하였다(도 20). 게다가, 경색된 코호트는 계층화하여 간섭 시간에 기록된 명시적인 심부전(박출 계수 <45%)을 가지는 서브그룹에서 효능을 평가하였다. 35%의 동등한 처치전 박출 계수에도 불구하고, 나이브 hMSC로 처치된 코호트에서 박출 계수가 5% 감소한 것에 대조적으로, 오직 심장형성 hMSC 치처만이 6개월 및 12개월에서 10%로 절대적인 박출 계수를 개선시켰다(도 23). 도 22에 나타낸 바와 같이, 나이브 처치된 코호트 및 가짜와 달리 심장형성 hMSC 처치된 그룹에서 우수한 생존 이익은 겸열하면서 Kaplan-Meier 함수의 적용으로 결정되었다.
심장형성(CP) hMSC의 효능은 1년의 후속 단계에서 심초음파검사로 결정하였다(도 25 참조). 나이브 줄기세포로 처치된 심장의 장축 영상화는 정점의(apical) M-모드 평가에서 가장 명백한 섬유소(fibrotic) 및 운동기능감퇴(hypokinetic) 전벽을 드러내었다(환자 11, 왼쪽 패널). 반대로, CP-hMSC 처치된 심장은 유도된 줄기세포 처치로부터 지속되는 이점을 반영하는 전벽을 통하여 강한 수축성 프로파일을 드러내었다(환자 11, 오른쪽 패널).
실시예 2
유사한 결과과 조합 방식으로 사용되는 재조합 TGFβ-1(2.5ng/ml), BMP4(5ng/ml), 카디오트로핀(1ng/ml), 카디오겐 c(100μM) 및 α-트롬빈(1U/ml), FGF-2(10 ng/ml), IGF-1(50ng/ml) 및 액티빈-A(5ng/ml)를 함유하는 칵테일로 줄기세포를 처치함으로써 관찰되었다.
실시예 3
유사한 결과가 조합 방식으로 사용되는 재조합 TGF-β1(2.5ng/ml), BMP-4(5ng/ml), 액티빈-A(5ng/ml), FGF-2(10ng/ml), IL-6(100ng/ml), 인자 Na(hα-ㅌ트트롬빈, 1U/ml), IGF-1(50ng/ml), 및 레티노산(1μM)을 함유하는 칵테일로 줄기세포를 처치함으로써 관찰되었다.
기타 구체예
본 발명은 이의 상세한 설명과 함께 기술되어 있지만, 상기 기술은 본 발명의 범위를 설명하는 것으로 의도되고 한정하는 것으로 의도되지 않으며, 이는 첨부된 청구항의 범위로 한정된다는 것을 이해해야 한다. 다른 양태, 이점 및 변형이 하기 청구항의 범위 내에 포함된다.

Claims (25)

  1. TGFβ-1 , BMP4, α-트롬빈, 카디오트로핀 및 IL-6으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물, 및 카디오게놀 C 및 레티노산으로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, TGFβ-1 , BMP4, α-트롬빈, 카디오트로핀 및 카디오게놀 C를 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, FGF-2, IGF-1, 액티빈-A, TNF-α, FGF-4, LIF, VEGF-A 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, FGF-2, IGF-1 및 액티빈-A를 포함하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 액티빈-A, FGF- 2, IL-6, IGF-1 및 레티노산을 포함하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, TNF-α, FGF-4, LIF, 및 VEGF-A로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물이 결핍된 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 화합물이 상기 조성물에 존재할 때, ml 당 상기 TGFβ-1이 1 내지 5ng, ml 당 상기 BMP4가 1 내지 10ng, ml 당 상기 카디오트로핀이 0.5 내지 5ng, ml 당 상기 α-트롬빈이 0.5 내지 5유닛, 및 상기 카디오게놀 C가 50 내지 500nM, ml 당 상기 FGF-2가 1 내지 10ng, ml 당 상기 IGF-1이 10 내지 100ng, ml 당 상기 액티빈-A가 1 내지 50ng, ml 당 상기 TNF-α가 1 내지 50ng, ml 당 상기 FGF-4가 1 내지 20ng, ml 당 상기 IL-6이 10 내지 100ng, ml 당 상기 LIF가 1 내지 10유닛, ml 당 상기 VEGF-A가 1 내지 50ng, ml 당 상기 레티노산이 0.1 내지 1.0μM의 양으로 존재하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 조합 방식으로 사용되는 재조합 TGFβ-1(2.5ng/ml), BMP4(5ng/ml), 카디오트로핀(1ng/ml), 카디오게놀 C(100μM)를 포함하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, α-트롬빈(1U/ml), FGF-2(10ng/ml), IGF-1(50ng/ml) 및 액티빈-A(5ng/ml)를 더 포함하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 조합 방식으로 사용되는 재조합 TGFβ-1(2.5ng/ml), BMP4(5ng/ml), 액티빈-A(5ng/ml), FGF-2(10ng/ml), IL-6(100ng/ml), 인자 Ila(hα- 트롬빈, 1U/ml), IGF-1(50ng/ml), 및 레티노산(1μM)을 포함하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 소태아 혈청, 인간 혈청, 혈소판 용해물, 및 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된 배지로 이루어진 조성물.
  12. MEF2c mRNA, MESP-1 mRNA, Tbx-5 mRNA, GATA4 mRNA , Flk-1 mRNA, GATA6 mRNA, Fog-1 mRNA, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA를 상승된 수준으로 발현하는 초기 세포, 분화된 세포로부터 획득하는 방법에 관한 것으로서, Nkx2.5 폴리펩티드, MEF2C 폴리펩티드, Tbx-5 폴리펩티드, FOG-2 폴리펩티드, GATA-4 폴리펩티드, MESP-1 폴리펩티드, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리펩티드를 가지며, 여기에서 상기 하나 이상의 폴리펩티드는 상기 분화된 세포의 핵과 관련되고, 상기 방법은 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 존재시 초기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 분화된 세포는 MEF2c mRNA 및 MESP-1 mRNA를 상승된 수준으로 발현하는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 초기 세포는 중배엽줄기세포인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 중배엽줄기세포는 골수 유래의 줄기세포인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 중배엽줄기세포는 세포 표면 상에서 CD90, CD105, CD133, CD166, CD29, 및 CD44를 발현하고 세포 표면 상에서 CD 14, CD34, 및 CD45를 발현하지 않는 방법.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 분화된 세포는 심장형성세포인 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 의한 방법으로 획득되는 세포.
  19. 제18항에 있어서, 이 세포는 심장형성세포인 세포.
  20. 분화된 세포를 포유류로 전달하는 방법으로서,
    (a) 분화된 세포 집단에서 세포 샘플이 MEF2c mRNA, MESP-1 mRNA, Tbx-5 mRNA, GATA4 mRNA, Flk-1 mRNA, GATA6 mRNA, Fog-1 mRNA, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 mRNA를 상승된 수준으로 발현하는 세포를 포함하고/포함하거나 Nkx2.5 폴리펩티드, MEF2C 폴리펩티드, Tbx-5 폴리펩티드, MESP-1 폴리펩티드, GATA-4 폴리펩티드, FOG-2 폴리펩티드, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드를 가지며, 여기에서 상기 폴리펩티드는 상기 분화된 세포의 핵과 관련된 것임을 결정하는 단계; 및
    (b) 상기 분화된 세포 집단의 세포를 상기 포유류로 투여하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 잇어서, 상기 분화된 세포의 집단은 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조성물의 존재시 배양된 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항의 원래의 세포로부터 획득되는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 단계 (a)는 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하는 것을 포함하는 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계는 전신, 심장내 및 관상동맥내 투여로 이루어진 군에서 선택되는 투여를 통하여 상기 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 면역세포화학을 이용하는 것을 포함하는 방법.
  25. 심장 조직에 심근세포를 제공하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 심장 조직에, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 다른 조성물과의 접촉으로 획득할 수 있는 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 분화된 세포를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
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