CN113667635A - 无异源培养基及使用其扩增间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种无异源培养基及使用其扩增间充质干细胞的方法。具体而言，本发明提供一种无异源培养基，其包含基础培养基和至少50ng/mL的成纤维细胞生长因子。本发明还提供一种培养基补充制剂，其包含成纤维细胞生长因子，其中所述成纤维细胞生长因子的含量使得在添加至基础培养基后以至少50ng/mL的浓度存在，例如80‑150ng/mL，如约100ng/mL。本发明还提供一种使用本发明的无异源培养基或培养基补充制剂扩增间充质干细胞的方法。

Description

无异源培养基及使用其扩增间充质干细胞的方法

技术领域

本公开一般地涉及无异源培养基，更具体地涉及用于扩增充质干细胞的培养基和方法。

背景技术

干细胞是一组未分化的细胞，能够通过细胞分裂和分化再生体细胞。在干细胞谱系中，人间充质干细胞(hMSC)是可以从诸如骨髓、脂肪组织和羊水等人体组织中分离出来的成体干细胞。

由于具有高可及性、增殖潜力、固有的免疫调节和修复特性以及多分化能力[1-4]，hMSC已被广泛用作干细胞治疗、组织工程[5,6]、药物发现[3,4,7]和疾病建模[8,9]的可靠细胞来源。易于从骨髓、脂肪组织、羊水(AF)、脐带和胎盘中方便和直接地获得hMSC，用于细胞扩增的种子培养[1,10]。尽管许多研究人员已经证实了hMSC的治疗潜力，但是为了充分满足不断增长的临床需求，挑战仍然在于稳定和可放大的细胞扩增。干细胞分化能力和潜能的低一致性维持以及昂贵的干细胞培养阻碍了hMSC在当前医学领域的研究和应用。因此，找到成分更确定的、低成本的培养基用于hMSC的扩增而又不降低其可分化性和潜能是急需的。

生长培养基的选择是扩增效力的关键步骤。动物血清被广泛用作生长培养基中生长因子的来源[11,12]。然而，动物血清的组成是容易变化和不稳定的，并且有必要在使用前对其适合性进行测试，这将极大地增加运营成本[11,12]。此外，不确定的血清成分还具有传播传染剂或者细菌、真菌或病毒污染的风险。鉴于含血清生长培养基的上述缺点[11,12]，需要在无血清条件下建立新型细胞培养基，以提高一致性，降低运营成本并避免感染。

在本领域中，对于能够成本有效地扩增hMSC而又不降低其可分化性和潜能的无外源培养基和方法仍存在需求。

发明内容

在一个方面中，本公开提供了一种无异源培养基，其包含基础培养基和至少50ng/mL的成纤维细胞生长因子，例如80-150ng/mL，例如约100ng/mL。

在一个实施方案中，成纤维细胞生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)，尤其是人FGF2。

在一个实施方案中，本公开的无异源培养基可进一步包含人血小板裂解物和/或人血清。在一个实施方案中，所述人血小板裂解物和/或人血清的含量为0.5-5％v/v，例如0.5-1％v/v。

在一个实施方案中，所述基础培养基可选自MEM培养基、α-MEM培养基、DMEM培养基、IMDM培养基、HAM F12培养基、DMEM/F12混合培养基、PRMI1640培养基、StemSpan^TM培养基及其任何组合。

在一个实施方案中，本公开的无异源培养基可进一步包含细胞生长所需的营养物，例如氨基酸、维生素、碳水化合物和/或无机离子。

在一个实施方案中，本公开的无异源培养基不含有额外的细胞生长因子或激素。

在另一个方面中，本公开提供了一种培养基补充制剂，其包含成纤维细胞生长因子，其中所述成纤维细胞生长因子的含量使得在添加至基础培养基后以至少50ng/mL的浓度存在，例如80-150ng/mL，如约100ng/mL。

在一个实施方案中，所述成纤维细胞生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)，尤其是人FGF2。

在一个实施方案中，本公开的培养基补充制剂可进一步包含人血小板裂解物和/或人血清。在一个实施方案中，所述人血小板裂解物和/或人血清的含量使得在添加至基础培养基后以0.5-5％v/v，例如0.5-1％v/v的浓度存在。

在一个实施方案中，本公开的培养基补充制剂可进一步包含细胞生长所需的营养物，例如氨基酸、维生素、碳水化合物和/或无机离子。

在一个实施方案中，本公开的培养基补充制剂不含有额外的细胞生长因子或激素。

在又一个方面中，本公开提供了一种扩增间充质干细胞的方法，其包括在不添加动物血清的情况下，在适合所述间充质干细胞生长的条件下(1)在根据本公开所描述的无异源培养基中培养所述间充质干细胞，或者(2)在添加了本公开所描述的培养基补充制剂的基础培养基中培养所述间充质干细胞，以扩增所述间充质干细胞。

在一个实施方案中，本公开的方法可以在96小时内获得约0.8x 10⁵个细胞/mL的间充质干细胞并且所述间充质干细胞维持约99％的细胞活性和间充质干细胞身份。

在一个实施方案中，在传代至少50代后，所述间充质干细胞基本未分化并且增殖效率保持基本不变。

在一个实施方案中，所述间充质干细胞为人间充质干细胞。

附图说明

附图仅为了更清楚地说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的公开范围和保护范围。

图1示出了hMSC在不同培养基中的增殖。(A)在含有8ng/mL FGF2的商业人间充质XF扩增培养基或含有DMEM的条件培养基中培养hMSC，其中DMEM添加2％(v/v)人血小板裂解物，1％的Glutamax、1％青霉素/链霉素和0、8、20、50、100、150、200和500ng/mL的FGF2，传代20代。通过MTT测定法测量增殖速率。(B)在第10次传代时，将5,000个细胞/cm² hMSC铺在6孔板上，并在含有8ng/mL FGF2的商业人间充质XF扩增培养基或含有DMEM的条件培养基中培养，其中DMEM含2％(v/v)人血小板裂解物、1％的Glutamax、1％的青霉素/链霉素和0、8、20、50和100ng/mL的FGF2。在指定的时间点，收获细胞并计数活细胞。

图2示出了通过显微镜的hMSC验证。示出了在(A)含有8ng/mL FGF2的商业人间充质XF扩增培养基、(B)具有0ng/mL FGF2的条件培养基和(C)具有100ng/mL FGF2的条件培养基中生长的hMSC的宽场图像。(D)点图给出了在不同培养基中生长的hMSC的形态分析。

图3A-3B示出了通过显微镜的hMSC验证。示出了在含有8ng/mL FGF2的商业人间充质XF扩增培养基、具有0和100ng/mL FGF2的条件培养基中培养的hMSC的荧光图像。细胞用(A)MSC标记CD44和(B)上皮标记CD146染色并用DAPI复染。

图4示出了用FACS验证hMSC。示出了在含有8ng/mL FGF2的商业人间充质XF扩增培养基、具有0和100ng/mL FGF2的条件培养基中培养并用MSC标记(A)THY-1和(B)STRO-1以及(C)上皮标记CD146染色的hMSC的直方图。

图5示出了用qPCR和Western印迹验证hMSC。从在含有8ng/mL FGF2的商业人间充质XF扩增培养基、具有0和100ng/mL FGF2的条件培养基中培养的hMSC提取mRNA，并通过qPCR测定。示出了(A)MSC标记CD44、THY-1和STRO-1以及(B)上皮标记CD146和造血干细胞标记CD14和CD19的表达水平。(C)用抗CD44、THY-1和CD146的抗体探测的在不同培养基上生长的hMSC的Western印迹。泳道1：商业培养基；泳道2：具有0ng/mL FGF2的条件培养基；泳道3：具有100ng/mL FGF2的条件培养基。

具体实施方式

为了促进对本发明原理的理解的目的，现参考在附图中举例说明的实施方案，并且将具体描述所述实施方案。然而，将理解的是，这些描述并不旨在对本发明的范围进行任何限制。

以下提供对可用于培养间充质干细胞的无异源培养基和方法的描述。这些培养基和方法满足了本领域中存在的至少一项需求。

本文中所用章节标题仅用于组织目的，不应理解为以任何方式限制所述主题。

除非另有明确定义，否则本文中所用术语应根据其在本领域中的通常含义来理解。除非文中另有规定或指示，否则没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。

除非另有说明，否则本文中所用的术语“约”是指指定值的+/-10％，更优选+/-5％，例如+/-4％、+/-3％、+/-2％或+/-1％。

如本文所使用，术语“间充质干细胞”指从人或哺乳动物组织分离的未分化的多能细胞，其具有自我更新能力，且同时保持多能性和分化成间充质起源(例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞和肌腱)或非中胚层起源(例如肝细胞、神经细胞和上皮细胞)的多种细胞类型的能力，并且可源自各种组织。例如，间充质干细胞可以分化成间充质细胞如骨、软骨、肌肉和脂肪细胞以及纤维结缔组织。在一些实施方案中，间充质干细胞可为脐带来源的间充质干细胞、脐带血来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、肌肉来源的间充质干细胞、神经来源的间充质干细胞、皮肤来源的间充质干细胞、羊膜来源的间充质干细胞和胎盘来源的间充质干细胞。用于从各组织分离干细胞的技术在相关领域中是已知的。由于具有高的分化为不同细胞类型的多个谱系的分化能力，人间充质干细胞在再生医学中具有很高的价值。因此，在一个实施方案中，间充质干细胞是人间充质干细胞(hMSC)。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方案及实施例中的特征可以相互组合。

本公开证明了用于hMSC培养的包含人碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)的明确定义的无异源条件培养基。本公开的结果表明，在添加了特定量的FGF2的条件培养基中培养的hMSC，其增殖活性增强并成功维持了其细长和梭状形态。更重要的是，hMSC的未分化性也通过FACS、显微镜、qPCR和Western印迹得到了验证。本公开的精细调整的生长培养基可用于大规模生产hMSC。在本公开中，发明人成功地将包含特定量的FGF2的精细调整的生长培养基用于hMSC扩增。结果显示，在96小时内可达到0.8x 10⁵/mL hMSC细胞，并证实可维持99％的细胞活力和hMSC身份。

在一个方面，本公开提供了一种无异源培养基，其包含基础培养基和至少约50ng/mL的成纤维细胞生长因子，例如约80-150ng/mL诸如约100ng/mL。在一些实施方案中，本公开的无异源培养基可用于扩增间充质干细胞。

培养基

如本文所使用，术语“培养基”指设计成支持细胞生长的介质如固体、液体或凝胶。培养基构成和/或提供适合于允许细胞生长的条件。培养基可以是固体、液体或各种相和材料的混合物。培养基可以包括固体或液体生长培养基。培养基还包括凝胶状培养基如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原基质。术语“培养基”还指旨在用于细胞培养的材料，即其尚未与细胞接触。

如本文所使用，术语“无异源(xeno-free)培养基”是指不含有来自异源物种的成分的培养基。例如，当用于培养人MSC时，“无异源培养基”不含动物来源的成分，例如动物血清如胎牛血清。在一些实施方案中，无异源培养基可含有人源添加剂，例如人血清或人血小板裂解物。在一些实施方案中，无异源培养基仅含有人源添加剂。

本公开的培养基可以通过使用基础培养基来制备。如本文所使用，术语“基础培养基”是指适合暴露于细胞(例如MSC)的无补充培养基。基础培养基包括例如伊格尔氏最低必需(MEM)培养基、α改良MEM(α-MEM)培养基、达尔伯克改良伊戈尔培养基(Dulbeco’sModified Eagle’s Medium，DMEM)、伊思考夫改良达尔伯克培养基(Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium，IMDM)、HAM F12培养基、DMEM/F12混合培养基、PRMI1640培养基、StemSpan^TM培养基及其任何组合，并且没有特别限制，只要其可用于培养干细胞。其它适合于MSC培养的基础培养基是本领域中已知的。

在一些实施方案中，本公开的细胞培养基可以含有进一步包含细胞生长所需的营养物，例如氨基酸、维生素、碳水化合物和/或无机离子以及防止细菌污染的抗生素等成分。

在一些实施方案中，本公开的细胞培养基包含一种或多种或全部必需氨基酸，并且还可以含有一种或多种非必需氨基酸。氨基酸包括必需氨基酸如Thr、Met、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Lys和His；以及非必需氨基酸如Gly、Ala、Ser、Cys、Gln、Asn、Asp、Tyr、Arg和Pro。在一个实施方案中，用于本公开的细胞培养基可添加Glutamax。

在一些实施方案中，本公开的细胞培养基可包含维生素，例如脂溶性维生素如A、D、E、K；和/或水溶性维生素如B1、B2、B6、B12、泛酸、叶酸、生物素、C、烟酰胺等。

在一些实施方案中，本公开的细胞培养基可包含碳水化合物。碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中一些是合成蛋白质和核酸的成分，例如葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。

在一些实施方案中，本公开的细胞培养基可包含无机离子，例如钠、钾、镁、钙、磷等。

在一些实施方案中，本公开的细胞培养基可包含抗生素，例如青霉素、链霉素、卡那霉素(例如浓度为50ug/ml)和/或制霉菌素(例如浓度为25U/ml)。在一个实施方案中，每毫升培养液可含100U青霉素和100ug链霉素。

本领域技术人员将理解，为了获得最佳结果，基础培养基需要适合目标细胞系，其中关键营养物质具有足够的水平以维持细胞增殖。例如，如果发现葡萄糖这种能量来源被耗尽且因此限制了细胞增殖，则可能需要增加基础培养基中的葡萄糖(或其它能量来源)的水平或在培养过程中添加葡萄糖(或其它能量来源)。

成纤维细胞生长因子

成纤维细胞生长因子是一类由约150-200氨基酸组成的多肽，以两种密切相关的形式存在，即碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，又称为FGF2)是一种众所周知的生长因子，其能够从不同来源复制各种类型的干细胞[13–19]。在无饲养层培养的情况下，在细胞培养基中添加FGF2可有效促进人胚胎干细胞的增殖、自我更新和多能性[20,21]。发明人在最近开发的能够以高产量和高生物活性产生的FGF的2293T表达系统[15]的基础上，进一步尝试利用FGF2来配制用于hMSC培养的经济高效的生长培养基。

在一个实施方案中，本公开的无异源培养基包含至少约50ng/mL的成纤维细胞生长因子，例如约80-150ng/mL诸如约100ng/mL。在一个实施方案中，成纤维细胞生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)，尤其是人FGF2。在一个实施方案中，FGF2可以是天然的或者重组的。

在一些实施方案中，FGF2的水平为至少约80ng/ml，至少约90ng/ml、至少约95ng/ml或至少约100ng/ml。在一些实施方案中，FGF2的水平不超过约500ng/ml，例如不超过约400ng/ml、不超过约300ng/ml、不超过约200ng/ml、不超过约150ng/ml、不超过约140ng/ml、不超过约130ng/ml、不超过约120ng/ml或不超过约110ng/ml。在其它实施方案中，FGF2的水平为约80-150ng/mL，例如约90-140ng/mL、约95-130ng/mL、约100-120ng/mL、约100-110ng/mL、约100-105ng/mL或约100ng/mL。

在一个实施方案中，本公开的无异源培养基不含有额外的细胞生长因子或激素。在一个实施方案中，本公开的无异源培养基不含有除FGF2之外的细胞生长因子或激素。如此处所使用，术语“不含有额外的细胞生长因子或激素”是指不含有除了添加至本公开的培养基中的成纤维细胞生长因子如FGF2之外的其它细胞生长因子或激素。

人源添加剂

在一个实施方案中，本公开的培养基含有人源添加剂。例如，可以将人血小板裂解物和/或人血清添加到本公开的培养基中。

令人惊讶地，当添加本公开的量的FGF2时，本公开的培养基中可不含有额外的细胞生长因子或激素，或者如果添加人血小板裂解物和/或人血清的情况下，人血小板裂解物和/或人血清的量可低至0.5％(v/v)。在一个实施方案中，当添加本公开的量的FGF2时，本公开的培养基中添加的人血小板裂解物或人血清的量可低至0.5％(v/v)，并且不需要或不含有额外的细胞生长因子或激素。如此处所使用，术语“不需要或不含有额外的细胞生长因子或激素”是指不需要或不含有除了添加至本公开的培养基中的成纤维细胞生长因子如FGF2以及人血小板裂解物和人血清中的细胞生长因子之外的其它细胞生长因子或激素。

在一些实施方案中，人血小板裂解物或人血清以约0.5％-5％v/v(例如按体积比约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2％、约2.5％、约3％、约4％、或约5％)的浓度使用，优选以约0.5％-1.0％v/v的浓度使用，或更优选以约0.5％-0.8％v/v(例如约0.5％v/v)的浓度使用。

在一些实施方案中，考虑使用人血小板裂解物和人血清的混合物。在这种情况下，人血小板裂解物和人血清的混合物的浓度可以低至0.5％(v/v)，例如以约0.5％-5％v/v(例如按体积计约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2％、约2.5％、约3％、约4％、或约5％)的浓度使用，优选以约0.5％-1.0％v/v的浓度使用，或更优选以约0.5％-0.8％v/v(例如约0.5％v/v)的浓度使用。

血小板裂解物可从任何适合的来源获得。适合的商业来源是来自Mill CreekLife Sciences(Rochester,Minnesota,USA)的PLT Max或来自Millipore的血小板裂解物。血小板裂解物来源于与被培养的MSC相同的物种。如本文所使用，术语“来源于……”的血小板裂解物被用来描述已从血样制备的血小板裂解物，例如通过从血样分离血小板，之后裂解分离的血小板。血小板裂解物所来源的血样可来自或不来自与MSC相同的个体，或者当由脂肪组织制备MSC时，所来源的血样可来自用于制备MSC的脂肪组织。通常，血样来自与从中获得MSC或脂肪组织的个体不同的个体。

可使用本领域技术人员已知的方法或试剂盒从新鲜全血或从储存的全血制备血小板裂解物。血小板裂解物可来自单个供体，或者可来自汇集的血液或细胞。血小板裂解物可由可输注全血或血小板制备，例如收集后约5到7天。血小板裂解物可使用市售试剂盒(例如来自MacoPharma(France)的血小板裂解物试剂盒)从血液制备。在一个实施方案中，从在抗凝剂(例如肝素钠或柠檬酸盐)存在下收集的血液制备血小板裂解物。将血液在适当条件下离心，例如以200g离心约20分钟，之后收集血小板(顶层)，然后对血小板进行冷冻-解冻以溶解细胞。通常，进行多轮冷冻-解冻，例如两轮、三轮、四轮或更多轮。将溶解的血小板离心以允许将沉淀的细胞片段丢弃，例如以4000g离心约10分钟。血小板裂解物可例如通过借助适合的基质(例如0.22微米过滤器)过滤来灭菌，并且储存在适当的条件下(例如-80℃)直到使用。

人血清可从任何适合的来源获得，例如商业来源。在一个实施方案中，人血清是人AB血清，例如来自Sigma或Gibco公司的人AB血清；或者来自Gemini公司的人AB血清系列，包括GemCell^TM人AB血清、GemCell Plus^TM人AB血清等。

培养基补充制剂

本公开的培养基可以作为完全培养基提供，其中在细胞培养之前已将基础培养基和其它成分混合在一起。可选地，细胞培养基组分可以分开提供并在细胞培养之前或细胞培养期间与合适的基础培养基混合。

在一个方面，本公开提供一种培养基补充制剂，其包含成纤维细胞生长因子，其中所述成纤维细胞生长因子的含量足以在添加至基础培养基后以至少50ng/mL的浓度存在，例如80-150ng/mL，如约100ng/mL。在一些实施方案中，所述培养基补充制剂进一步包含人血小板裂解物和/或人血清。在一些实施方案中，人血小板裂解物和/或人血清的含量使得在添加至基础培养基后以约0.5-5％v/v，例如约0.5-1％v/v的浓度存在。在一些实施方案中，所述培养基补充制剂进一步包含细胞生长所需的营养物，例如氨基酸、维生素、碳水化合物和/或无机离子。在一些实施方案中，所述培养基补充制剂不含有额外的细胞生长因子或激素。

在一个实施方案中，本公开的培养基或培养基补充制剂可以包装在合适的溶剂中或与合适的溶剂一起包装或以冻干形式包装。本文所公开的细胞培养基和/或培养基补充制剂可以任选地与用于所需目的的使用说明书一起包装在合适的容器中。

扩增间充质干细胞的方法

在一个方面，本公开提供了一种扩增间充质干细胞的方法，其包括在不添加动物血清的情况下，在适合所述间充质干细胞生长的条件下(1)在本公开描述的无异源培养基中培养所述间充质干细胞，或者(2)在添加了本公开描述的培养基补充制剂的基础培养基中培养所述间充质干细胞，以扩增间充质干细胞。

在一个实施方案中，本公开描述的方法在96小时内获得约0.8x10⁵个细胞/mL的间充质干细胞并且所扩增的间充质干细胞维持约99％的细胞活性和间充质干细胞身份。在一个实施方案中，在传代至少50代后，间充质干细胞基本未分化并且增殖效率保持基本不变。如本文所使用，术语“增殖效率保持基本不变”是指增殖效率为原始分离的间充质干细胞的增殖效率的至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或者更高。

根据本公开的这个方面的培养可实施有限量的时间，使得不发生扩增，例如仅在细胞接种阶段期间，或进行较长的时间段从而允许间充质干细胞扩增，由此获得增加的细胞数量。对于每一轮的增殖，可使用胰蛋白酶/EDTA或通过细胞刮片收获粘附细胞，并且通过吸液管解离细胞，并且例如在约100至约10,000个细胞/cm²的密度下重新铺板。

在一个实施方案中，实施培养至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天、至少一个星期、至少两个星期、至少三个星期、至少四个星期或至少五个星期。在一个实施方案中，使细胞扩充至少两个群体倍增数、至少四个群体倍增数、至少六个群体倍增数、至少八个群体倍增数、至少十个群体倍增数、至少15个群体倍增数、至少20个群体倍增数、至少25个群体倍增数、至少30个群体倍增数、至少35个群体倍增数、至少40个群体倍增数、至少45个群体倍增数。

在一个实施方案中，可基于间充质干细胞表面标记的表达来选择和确认间充质干细胞。选择或分选可包括通过一个或多个这样的表面标记从混合的细胞群选择间充质干细胞(MSC)。在一个实施方案中，间充质干细胞表面标记可选自CD44、THY-1、STRO-1和其任何组合。

本公开至少部分基于令人惊讶的发现：当添加本公开的量的FGF2时，本公开的培养基中可不含有额外的细胞生长因子或激素，或者如果添加人血小板裂解物和/或人血清的情况下，人血小板裂解物和/或人血清的量可低至0.5％(v/v)。从本公开的培养基中具有50ng/mL FGF2开始，培养的细胞显示出与商业培养基相当的增殖速率。当向条件培养基提供100ng/mL FGF2时，显示出最大的hMSC增殖速率。结果显示，在商业培养基和含有50ng/mLFGF2的条件培养基中生长的hMSC大约需要96小时可达到每平方厘米0.7x10⁵个活细胞。而当本公开的培养基中添加的FGF2浓度为100ng/mL时，仅需96小时即可达到每平方厘米0.8x10⁵个活hMSC，而且细胞存活率大于99％，从而进一步提高了增殖率并证实可维持99％的细胞活力和hMSC身份。令人兴奋的是，采用本公开的培养基培养的hMSC在传代至少50次时仍基本未分化并且增殖效率保持基本不变。可见，本公开的无外源培养基可替代甚至优于商业XF扩增培养基。

实施例

本文中通过以下实施例对本发明进行描述，其仅旨在举例说明，对本发明的范围并无限制。

实施例1

材料和方法

细胞培养和转染

从骨髓中提取的人间充质干细胞购自Merck Millipore。将细胞在人间充质XF扩增培养基中或在补充0.5％v/v人血小板裂解物(Millipore)、1％w/v的Glutamax(LifeTechnologies，美国加利福尼亚州)、1％w/v青霉素-链霉素(美国加利福尼亚州生命技术公司)和不同浓度的FGF2的DMEM培养基(Life Technologies，CA，USA)中在维持37℃和5％CO₂的加湿培养箱中培养。当达到80％汇合时，将细胞以5,000个细胞/cm²的密度铺板。在铺板之前，所有培养板在室温下用0.1％明胶溶液包被30分钟。细胞培养基每天更换。

hMSC增殖率

将hMSC铺在96孔板上，并在人间充质XF扩增培养基或无外源条件培养基中培养。通过添加MTT到终浓度为1mg/mL来确定细胞的活力[22]，并在37℃下孵育6小时。然后将培养基替换为DMSO，并在酶标仪中于540nm处测量吸光度。

为了测量hMSC的增殖，在用胰蛋白酶处理之前，将细胞在不同的培养基中培养2、3和4天。然后将胰蛋白酶消化的细胞用台盼蓝染色，并使用Thermo Fisher Countess II自动细胞计数器对活细胞进行计数。

免疫细胞化学

将细胞铺在明胶包被的盖玻片上以进行成像。用冰冷的PBS洗涤细胞两次，然后在室温下在4％w/v多聚甲醛中固定30分钟。随后在4％w/v封闭用驴血清中将细胞封闭，并与小鼠单克隆CD44抗体(1：500，CBL154)、THY-1抗体(1：500，CBL415)、STRO-1抗体(1：500，MAB4315)、CD146抗体(1：500，MAB16985)、CD14抗体(1：500，MAB1219)或CD19抗体(1：500，MAB1794)在4℃下孵育过夜。用PBS洗涤三次后，将细胞用Alexa Fluor 647缀合的山羊抗小鼠抗体(1：1000，Invitrogen)染色，并在室温下用DAPI复染1小时。然后将细胞用PBS洗涤三次，再用ProLong Antifade Mountant(Thermo Fisher)固定在载玻片上进行观察。

形态分析

用尼康Eclipse Ti倒置显微镜拍摄相差图像。如以前所描述，使用ImageJ软件分析拍摄的图像[23]。简而言之，使用插件“度量和标签(Measure and Lavel)”测量了细胞的面积和Feret直径。将hMSC铺板并使其生长3天，然后进行测量。测量来自每种培养基的100个细胞，并独立进行三次重复实验。然后将数据绘制在面积对最大细胞直径的点图上。

荧光激活细胞分选(FACS)

用胰蛋白酶消化100mm培养皿中的细胞，并用冰冷的PBS洗涤三次。然后将细胞用冰冷的乙醇在4℃下固定30分钟。固定后，将细胞在PBS中的1％w/v BSA中孵育，然后在4％w/v的封闭用驴血清中封闭30分钟。然后在免疫细胞化学部分用相同的一抗将细胞染色。洗涤后，将细胞用Alexa Fluor 488偶联的山羊抗小鼠抗体(Invitrogen)在室温下染色30分钟。接着将细胞洗涤并重悬于PBS中，并在BD FACSAria III(BD Bioscience)上进行分析。

mRNA定量

根据制造商的说明，使用RNAzol试剂(Molecular Research Center)从hMSC单层提取总RNA。RNA的产量用Nanodrop(Thermo Fisher)定量。根据制造商的说明，使用寡核苷酸(dT)₁₅引物，用GoScript逆转录酶(Promega)对100ug RNA进行反转录。根据制造商的说明，使用LightCycler480SYBR Green I预混液，使用LightCycler 480qPCR仪(Roche)定量靶基因的mRNA水平。基因表达针对18S rRNA进行标准化，并用2'^ct计算。所有样品均一式三份运行。平均基因表达在3个独立实验中计算。

结果

无外源培养基中FGF2浓度的优化

以前的报道表明，成纤维细胞生长因子2(FGF2)的添加抑制了人间充质干细胞(hMSC)的分化，从而保持了完整的可分化性[24]。根据制造商的说明，hMSC在含有人血清的商业人间充质XF扩增培养基中最佳生长，并添加8ng/mL FGF2以维持最高的增殖率。本公开旨在通过调节基础培养基例如DMEM中FGF2的浓度来代替专有培养基的使用，从而降低培养hMSC的成本。因此，发明人用DMEM配制了条件培养基的无异源配方，该培养基中含有0.5％人血小板裂解物、1％的Glutamax、1％的青霉素/链霉素和0、8、20、50、100、150、200和500ng/mL的FGF2，用于50次传代。通过MTT测定法测量细胞活力。与商业XF扩增培养基相比，当FGF2浓度低时，本公开的条件培养基降低了hMSC的增殖速率(图1A)。然而，从条件培养基中具有50ng/mL FGF2开始，培养的细胞显示出与商业培养基相当的增殖速率。当向条件培养基提供100ng/mL FGF2时，显示出最大的hMSC增殖速率，而含有150ng/mL或更多FGF2的条件培养基显示对细胞增殖没有明显影响(图1A)。通过在第10代传代培养的不同天数计数活细胞来重复细胞增殖测定，相似的结果显示100ng/mL的FGF2浓度提供了足够的生长刺激(图1B)。在具有较低FGF2浓度0、8、20ng/mL的条件培养基中培养的活hMSC分别只能达到每平方厘米6,000、6,200和9,500个细胞(图1B)。在商业培养基和含有50ng/mL FGF2的条件培养基中生长的hMSC大约需要96小时可达到每平方厘米0.7x 10⁵个活细胞。结果显示，当最终浓度为100ng/mL FGF2时，仅需96小时即可达到每平方厘米0.8x 10⁵个活hMSC，而且细胞存活率大于99％，从而进一步提高了增殖率。可见，本公开的无外源培养基甚至优于商业XF扩增培养基。

用显微镜验证hMSC

在验证了含有高浓度FGF2的条件培养基支持hMSC的生长的基础上，进一步验证干细胞标记。在商业XF扩增培养基和含有0或100ng/mL FGF2补充剂的条件培养基中维持hMSC直到第10代传代并培养4天。在相差显微镜下观察细胞。在商业XF扩增培养基和含有100ng/mL FGF2的条件培养基中培养的细胞均显示出梭形和尖形形态(图2A和2C)。在没有添加FGF2的条件培养基中培养的细胞显示出更扁平的上皮型形态(图2B)。为了进一步表征不同培养基中hMSC的形态，从每种培养基中随机挑选100个细胞，并测量其细胞面积和最大细胞直径。结果显示在点状图上(图2D)。在含100ng/mL FGF2的条件培养基中培养的细胞中，超过90％的细胞显示<8000μm²的面积和<250μm的最大直径(图2B)，这小于用含有0ng/mLFGF2的条件培养基培养的细胞。随后将在不同培养基中培养的hMSC用间充质干细胞表面标记CD44和上皮标记CD146染色。在商业XF扩增培养基和含100ng/mL FGF2的条件培养基中培养的细胞用间充质干细胞标记CD44染色均为阳性(图3A)，而上皮标记CD146染色均为阴性(图3B)。同时，未添加FGF2培养的细胞的间充质干细胞标记物染色为阴性(图3A)，非MSC标记物染色为阳性(图3B)。

用FACS验证hMSC

为了进一步验证不同培养基中的多能干细胞群，荧光辅助细胞分选(FACS)被用于测量在商业XF扩增培养基和条件培养基中培养的hMSC的干细胞标记。与免疫细胞化学数据一致，在商业XF扩增培养基和含有100和500ng/mL FGF2的条件培养基中培养的细胞中的至少90％被计数为干细胞标记THY-1(图4A)和STRO-1(图4B)阳性。还对细胞进行上皮标记CD146染色，并发现细胞呈上皮标记CD146阴性(图4C)。相比之下，发现在没有FGF2补充剂的条件培养基中生长的细胞对间充质干细胞标记物呈阴性，而对非MSC标记物呈阳性(图4)。

用qPCR和Western印迹验证hMSC

为了消除由于抗体染色引起的可能的伪影，使用定量聚合酶链反应(qPCR)进一步验证了不同培养基中的多能干细胞群。采用对阳性干细胞标记CD44、THY-1和STRO-1具有高度特异性的靶标特异性探针(图5A)。定量指定标志物的mRNA表达水平，这进一步证实了在商业XF扩增培养基和具有100ng/mL FGF2的条件培养基中培养的hMSC对于这些干细胞标志物显示出相似的表达水平。这些细胞未显示出上皮标记CD146(图5B)和造血干细胞标记CD14和CD19(图5B)的mRNA表达。然而，在不添加FGF2的培养基中培养的细胞在使用间充质干细胞标记物后未显示可检测到的mRNA水平(图5A)；相比之下，却显示出上皮标记物CD146阳性mRNA水平(图5B)。没有细胞表达造血干细胞标记CD14和CD19(图5B)。

为了证实qPCR的结果，采用Western印迹检查干细胞标志CD44和THY-1的表达水平。使用了对干细胞标记具有特异性的抗体。与先前的结果一致，在商业XF扩增培养基和含100ng/mL FGF2的条件培养基中培养的hMSC对干细胞标记CD44和THY-1呈阳性，而对上皮标记CD146呈阴性。此外，在不添加FGF2的培养基中培养的细胞对间充质干细胞标记物呈阴性，而对非MSC标记物呈阳性(图5C)。

讨论

尽管干细胞在细胞疗法中具有优势[3,4,8,10]，到目前为止，干细胞的应用受限于由于需要昂贵的商业生长培养基例如XF培养基、基本培养基等所造成的高生产成本[25,26]。尽管使用血清可以降低成本，但进入临床试验时，未知变量(例如病毒、过敏原的存在)可能会成为问题[11,12]。为了促进干细胞从基础研究向临床应用的过渡，开发具有成本效益的无异源培养基用于人干细胞的强扩增至关重要。

从细胞增殖分析中获得的数据(图1)证实了FGF2在支持hMSC生长中的重要作用。没有添加FGF2的生长培养基不足以维持未分化hMSC的生长。在本公开的hMSC方法中，添加100ng/mL FGF2导致在培养板上在96小时内达到每平方厘米0.8x 10⁵个hMSC的惊人产量。

值得注意的是，与在无FGF2的培养基中生长的细胞相比，在浓度为100ng/mL或更高的FGF2的条件培养基中生长的细胞的形态更加细长且呈梭状(图2)。与不含FGF2补充剂的培养基相比，在含100ng/mL FGF2的培养基中培养的细胞显示出更小的最大细胞直径和更小的细胞面积。这种形态是hMSC能够以高得多的密度生长并表现出多能性的内在标准[27]。

CD44、THY-1和STRO-1是最常用的hMSC标记[10,27–29]。在膜表面表达的多结构糖蛋白CD44和THY-1可以触发各种细胞功能，包括分化、增殖、细胞粘附和凋亡。富含STRO-1的hMSC促进细胞分化为多种间充质谱系，例如骨髓基质细胞、脂肪细胞、成骨细胞、成纤维细胞和成肌细胞[28]。在荧光显微镜下，补充FGF2培养的hMSC呈hMSC表面标记CD44阳性，并且呈血液学标记CD19阴性。Western印迹和qPCR分析的结果进一步验证了在添加FGF2的培养物中衍生的hMSC的未分化特性。更令人兴奋的是，当在添加了FGF2的培养基中生长的hMSC传代50代时，没有发现明显的分化，并且增殖效率仍然保持不变。

细胞活力、流式细胞仪、形态学和免疫细胞化学特征的组合表明，FGF2的添加对于未分化hMSC的生长至关重要。此外，使用本公开的添加了至少50ng/mL、优选至少100ng/mL的FGF2的精细调整培养基，不仅可以有效地促进hMSC的扩增，还可以保持其分化为多种谱系的多能性。这一发展可有助于实现hMSC培养物的低成本和可放大生产，用于商业和治疗应用。

虽然在本文已经非常详细地描述了用于扩增hMSC的无外源培养基和方法的各种实施方案，但这些实施方案仅仅作为本文描述的公开内容的非限制性实例而提供。因此，本领域技术人员将理解，可以对本公开描述的方案进行各种变化和改变，而不偏离本发明的精神。实际上，本公开内容不旨在是穷尽性的或旨在限制本发明的范围。

进一步，在代表性实施方案的描述中，本公开内容已经以特定步骤顺序给出本发明的方法和/或过程。然而，该方法或过程不应限于所描述的特定步骤顺序。其它步骤顺序是可能的。因此，本文公开的特定步骤顺序不应解释为对本发明的限制。此外，针对方法和/或过程的公开内容不应限于以所描述的顺序进行它们的步骤。这样的顺序可以变化并且仍在本发明的范围内。

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Claims (14)

1.一种无异源培养基，其包含基础培养基和至少50ng/mL的成纤维细胞生长因子。

2.根据权利要求1所述的无异源培养基，其中所述成纤维细胞生长因子的浓度为80-150ng/mL，例如约100ng/mL。

3.根据权利要求1或2所述的无异源培养基，其中所述成纤维细胞生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)，尤其是人FGF2。

4.根据权利要求1-3任一项所述的无异源培养基，其进一步包含人血小板裂解物和/或人血清。

5.根据权利要求4所述的无异源培养基，其中所述人血小板裂解物和/或人血清的含量为0.5-5％v/v，例如0.5-1％v/v。

6.根据权利要求1-5任一项所述的无异源培养基，其中所述基础培养基选自MEM培养基、α-MEM培养基、DMEM培养基、IMDM培养基、HAM F12培养基、DMEM/F12混合培养基、PRMI1640培养基、StemSpan^TM培养基及其任何组合。

7.根据权利要求1-6任一项所述的无异源培养基，其进一步包含细胞生长所需的营养物，例如氨基酸、维生素、碳水化合物和/或无机离子。

8.根据权利要求1-7任一项所述的无异源培养基，其中所述无异源培养基不含有额外的细胞生长因子或激素。

9.一种培养基补充制剂，其包含成纤维细胞生长因子，其中所述成纤维细胞生长因子的含量使得在添加至基础培养基后以至少50ng/mL的浓度存在，例如80-150ng/mL，如约100ng/mL；优选地，所述成纤维细胞生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)，尤其是人FGF2；优选地，所述培养基补充制剂进一步包含人血小板裂解物和/或人血清，优选所述人血小板裂解物和/或人血清的含量使得在添加至基础培养基后以0.5-5％v/v，例如0.5-1％v/v的浓度存在。

10.根据权利要求9所述的培养基补充制剂，其进一步包含细胞生长所需的营养物，例如氨基酸、维生素、碳水化合物和/或无机离子。

11.根据权利要求9或10所述的培养基补充制剂，其不含有额外的细胞生长因子或激素。

12.一种扩增人间充质干细胞的方法，其包括在不添加动物血清的情况下，在适合所述间充质干细胞生长的条件下(1)在根据权利要求1-8任一项所述的无异源培养基中培养所述间充质干细胞，或者(2)在添加了权利要求9-11任一项所述的培养基补充制剂的基础培养基中培养所述间充质干细胞，以扩增所述间充质干细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其中在96小时内获得约0.8x 10⁵个细胞/mL的间充质干细胞并且所述间充质干细胞维持约99％的细胞活性和间充质干细胞身份。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中在传代至少50代后，所述间充质干细胞基本未分化并且增殖效率保持基本不变。

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