KR20100029081A - 발효 공정에서의 생산 수준이 향상된 알파-아밀라아제의 변이체 - Google Patents
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Abstract
보다 효율적으로, 그에 따라 보다 경제적으로 제조되는 바실러스 종 번호 707 알파 아밀라아제의 변이체들이 제공된다. 발효액 (fermentation broth) 에서의 상기 변이체의 용해도를 촉진시키는 아미노산 변이들의 도입을 통해 더욱 높은 발효 수율을 달성한다. 용해도 증가는 숙주 세포 내에서의 발현 후 용액 중에 더 많은 효소가 남아있게 한다. 이는 교대로 상기 발효액으로부터의 상기 발현된 변이체 효소의 회수가능 효율을 증가시킨다.
알파-아밀라아제 변이체, 바실러스, 발효액, 용해도
Description
서열목록
서열번호: 1-26 을 포함하는 서열목록이 또한 첨부되어 있는데, 이는 전체가 참조로 본원에 포함된다.
기술분야
전분은 아밀로오스 (15-30% w/w) 및 아밀로펙틴 (70-85% w/w) 의 혼합물로 이루어져 있다. 아밀로오스는 분자량 (MW) 이 약 60,000 내지 약 800,000 인 -1,4-결합 글루코오스 단위들의 선형 사슬들로 이루어져 있다. 아밀로펙틴은 상기와 같은 -1,4-결합 글루코오스 단위뿐 아니라, -1,6 분지점 (branch point) 을 24-30 개 글루코오스 단위마다 포함한 분지형 중합체로서; 이의 MW 는 100,000,000 정도로 높을 수 있다.
농축 덱스트로스 시럽의 형태인 전분 유래의 당은 현재 하기를 수반한 효소 촉매 공정에 의해 제조된다: (1) -아밀라아제를 가진 고형 전분의, 평균 중합도가 약 7-10 인 덱스트린으로의 액화 (또는 담화 (thining)), 및 (2) 생성된 액화 전분, 즉, 전분 가수분해물의, 아밀로글루코시다제 (또한 글루코아밀라아제로도 불림) 를 이용한 당화. 생성된 시럽은 글루코오스 함량이 높다. 상업적으로 제조된 글루코오스 시럽의 많은 부분은 후속적으로 효소에 의한 이성질화에 의해 이소시럽 (isosyrup) 으로 공지되어 있는 덱스트로스/과당 혼합물로 된다.
-아밀라아제 (EC 3.2.1.1) 는 전분, 글리코겐, 및 관련 다당류의 내부 -1,4-글루코시드 결합을 무작위로 절단하여 가수분해한다. 이들 효소들은, 전분 액화, 직물 발호, 종이 및 펄프 산업에서의 전분 변형, 곡물 가공, 제빵 및 양조를 포함하는, 다수의 중요한 상업적 용도를 갖고 있다. -아밀라아제는 또한 식기세척기용 세제 및 세탁 세제 제형물 (표백제를 함유한 것 포함) 에서 세척 단계 동안 전분질 오염을 제거하도록 사용될 수 있다. 바실러스 종 번호 707 로부터의 -아밀라아제는 이러한 용도에 사용시 특히 유리한 성능을 나타낸다. 불행히도, 이 -아밀라아제는 고수준으로 발현되지 않아, 경제적인 제조 및 상업적 이용이 곤란하다.
-아밀라아제는 광범위한 세균, 진균, 식물 및 동물 공급원으로부터 단리된다. 산업적으로 중요한 다수의 -아밀라아제는 부분적으로는 아밀라아제를 성 장 배지로 분비하는 바실러스의 역량이 일반적으로 높은 것에 기인하여, 바실러스 종으로부터 단리된다. 예를 들어, 바실러스 종 A 7-7 (DSM 12368) 은 -아밀라아제를 유리하게 높은 수준으로 분비한다. 상기 바실러스 종 A 7-7 -아밀라아제가 경제적으로 제조될 수 있지만, 상기 효소는 바실러스 종 번호 707 로부터의 -아밀라아제만큼 성능이 좋지는 않다. 따라서, 당업계에서는 성능이 보다 우수한 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제의 변이체를, 예를 들어, 바실러스 종 A 7-7 -아밀라아제에 필적하는 생산 수준으로 발현하는 것에 대한 필요성이 존재한다. 이러한 변이체는 보다 유효하고 경제적인 세제 제형물 또는 기타 제형물에서 유용할 것이다.
요약
보다 효율적으로 및 그에 따라 보다 경제적으로 제조되는 -아밀라아제의 변이체가 제공된다. 발효액 (fermentation broth) 에서의 상기 변이체의 용해도를 촉진시키는 아미노산 변이들을 도입하면 더욱 높은 발효 수율이 달성된다. 즉, 용해도를 증가시키면 숙주 세포 내에서의 발현 후 용액 중에 더 많은 효소가 남아있게 된다. 이는 교대로 상기 발효액으로부터의 상기 발현된 변이체 효소의 회수가능 효율을 증가시킨다.
일 구현예에서는, 상기 변이체의 1차 구조를, 발효액 중에 고농도로 가용적인 -아밀라아제를 닮도록 변형시킨다. 상기 변이체는 세정 제형물 등에서의 사용에 있어서 유리하게 보다 경제적으로 발현가능한 고-성능 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제일 수 있다. 적합한 변이체에는, 효소 표면 상에 소수성 아미노산 잔기가 보다 적은 것들이 포함되는데, 상기 소수성 아미노산 잔기들은 수용액에서 상기 효소의 응집 및 침전을 촉진시킨다.
이 때 상기 제 2 의 -아밀라아제는 상기 야생형 제 1 -아밀라아제보다 용해도가 더 크고, 상기 변이체 -아밀라아제의 아미노산 서열은 상기 제 2 의 -아밀라아제와 적어도 하나의 아미노산이 상이함. 일 구현예에서, 상기 -아밀라아제 변이체는, 상기 야생형 제 1 -아밀라아제의 발현 수준과 비교할 때 숙주 세포에서 더 높은 수준으로의 발현이 가능하다.
상기 -아밀라아제 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 개의 아미노산 변형, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 상기 제 1 의 야생형 -아밀라아제 및 상기 제 2 의 -아밀라아제의 아미노산 서열들의 서열 동일성은 적어도 60%, 80%, 또는 90% 일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 야생형 제 1 -아밀라아제 및 상기 제 2 의 -아밀라아제는 세균 -아밀라아제, 예컨대, 바실러스 -아밀라아제이다. 비제한적인 예로서, 상기 야생형 제 1 -아밀라아제는 서열번호: 1 에 개시된 아미노산 서열을 포함한 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제 [Tsukamoto.A., Kimura,K., Ishii,Y., Takano,T. 및 Yamane,K.(1988) Nucleotide sequence of the maltohexaose-producing amylase gene from an alkalophilic Bacillus sp. #707 and structural similarity to liquefying type alpha-amylases Biochem. Biophys. Res. Commun. 151 (1), 25-31] 일 수 있고/있거나 상기 제 2 의 -아밀라아제는 서열번호:2 또는 서열번호:3 또는 서열번호:7 또는 서열번호:8 에 개시된 아미노산 서열들을 포함한 바실러스 종 A 7-7 (DSM 12368) -아밀라아제일 수 있다[Bessler, C, Wieland,S. 및 Maurer,K.H. alpha amylase variants having an elevated solvent stability, method for the production thereof and detergents and cleansers containing these alpha amylase variants. 특허: WO 2006037484-A 13-APR-2006; HENKEL KOMMANDITGESELLSCHAFT AUF AKTIEN (DE)]. 상기 -아밀라아제 변이체의 변형된 아미노산은 N28R, S36D, S83N, M116W, R142K, R172Q, H183D, A186G, N251T, S255N, A256T, F441Y, S452R 및 K485N 으로 이루어진 군에서 선택될 수 있는데, 예컨대, N28R, S36D, M116W, R172Q, H183D, S255N 및 A256T 일 수 있다.
한 가지 목적은 또한 상기 인코딩 핵산을 포함하는 단리된 숙주 세포, 상기 단리된 핵산에 작동가능하게 연결된 벡터, 및 상기 벡터를 포함한 단리된 숙주 세포를 제공하는 것이다. 상기 단리된 숙주 세포는 미생물, 예컨대, 세균 또는 진균일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), B. 리체니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필루스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리쿠에파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 키르쿨란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus), B. 투링기엔시스 (B. thuringiensis), 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans) 또는 S. 무리너스 (S. murinus) 로 이루어진 군에서 선택될 수 있고; 또는 그람 음성 세균일 수 있는데, 이 때 상기 그람 음성 세균은 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli) 또는 슈도모나스 (Pseudomonas) 종이다.
또 다른 목적은 상기 -아밀라아제 변이체를 포함한 세제 첨가제를 제공하는 것이다. 상기 세제 첨가제는 무(無)-분진 과립, 미세과립 (microgranulate), 안정화된 액체, 또는 보호된 효소의 형태일 수 있다. 상기 세제 첨가제는 셀룰라아제, 프로테아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 카르보히드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 키티나아제, 큐티나아제, 시클로덱스트린 글루카노트랜스페라아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라아제, -갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, -글루코시다아제, β-글루코시다아제, 할로퍼옥시다아제, 인버타아제, 락카아제, 리파아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 펙틴 가수분해 효소, 펩티도글루타미나아제, 퍼옥시다아제, 파이타아제, 폴리페놀옥시다아제, 단백질 가수분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 풀루라나아제, 이소아밀라아제, 카라기나아제 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 효소를 추가로 포함할 수도 있다. 특히, 상기 아밀라아제는 또 다른 -아밀라아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 또는 글루코아밀라아제일 수 있다.
상기 세제 첨가제를 포함한 세제 조성물이 제공된다. 상기 세제 조성물은 셀룰라아제, 프로테아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 카르보히드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 키티나아제, 큐티나아제, 시클로덱스트린 글루카노트랜스페라아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라아제, -갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, -글루코시다아제, β-글루코시다아제, 할로퍼옥시다아제, 인버타아제, 락카아제, 리파아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 펙틴 가수분해 효소, 펩티도글루타미나아제, 퍼옥시다아제, 파이타아제, 폴리페놀옥시다아제, 단백질 가수분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 풀루라나아제, 이소아밀라아제, 카라기나아제, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터의 효소를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 목적은 상기 -아밀라아제 변이체를 포함한 손설겆이 또는 식기세척기용 조성물을 제공하는 것이다. 상기 조성물은 계면활성제, 세척 강화제 (detergent builder), 착화제 (complexing agent), 중합체, 표백 시스템, 안정화제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제 (suds suppressor), 항부식제, 오염 현탁화제, 재오염방지제, 염료, 살균제, 하이드로토프 (hydrotope), 변색 억제제 및 향료 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 셀룰라아제, 프로테아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 카르보히드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 키티나아제, 큐티나아제, 시클로덱스트린 글루카노트랜스페라아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라아제, -갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, -글루코시다아제, β-글루코시다아제, 할로퍼옥시다아제, 인버타아제, 락카아제, 리파아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 펙틴 가수분해 효소, 펩티도글루타미나아제, 퍼옥시다아제, 파이타아제, 폴리페놀옥시다아제, 단백질 가수분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 풀루라나아제, 이소아밀라아제, 카라기나아제 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 효소를 추가로 포함할 수 있다. 식기 세정 방법은 상기 손설겆이 또는 식기세척기용 조성물을 적용하는 것을 포함한다.
또 다른 목적은 상기 -아밀라아제 변이체를 포함한 세탁 세제 첨가제를 제공하는 것이다. 세탁 세제 조성물은 세탁 첨가제를 포함할 수 있고, 계면활성제, 세척 강화제, 착화제, 중합체, 표백 시스템, 안정화제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제, 항부식제, 오염 현탁화제, 재오염방지제, 염료, 살균제, 하이드로토프, 형광 증백제, 섬유 유연제, 및 향료 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 세탁 방법은 상기 세탁 세제 첨가제를 적용하는 것을 포함한다.
또 다른 목적은 상기 -아밀라아제 변이체를 포함한 균막(biofilm)-가수분해 조성물을 제공하는 것이다. 상기 균막 가수분해 조성물은 용액, 분말, 페이스트, 겔, 액체, 연고, 정제 또는 겔의 형태일 수 있다. 상기 조성물은 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 프로테아제, 펙티나아제, 항균제, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 균막 가수분해 방법은 상기 조성물을 상기 균막을 가수분해하기에 충분한 시간 동안 적용하는 것을 포함한다.
또 다른 목적은 상기 -아밀라아제 변이체를 수용액 중에 포함한 전분 가공 조성물을 제공하는 것이다. 상기 전분 가공 조성물은 글루코아밀라아제, 이소아밀라아제, 풀루라나아제, 파이타아제 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 전분 가공 방법은 상기 조성물을 전분을 가공하기에 충분한 시간 동안 적용하는 것을 포함한다.
또 다른 목적은 상기 -아밀라아제 변이체를 용액 중에 포함한 전분 당화용 조성물을 제공하는 것이다. 전분 당화 방법은 상기 조성물을 전분을 당화하기에 충분한 기간 동안 적용하는 것을 포함한다. 추가적인 목적은 상기 -아밀라아제 변이체를 용액 중에 포함하는 전분 액화 조성물을 제공하는 것이다. 전분 액화 방법은 상기 조성물을 전분을 액화하기에 충분한 기간 동안 적용하는 것을 포함한다.
또 다른 목적은 상기 -아밀라아제 변이체를 용액 중에 포함하는 직물 발호 조성물을 제공하는 것이다. 상기 직물 발호 조성물은 또 다른 효소를 추가로 포함할 수 있다. 직물 발호 방법은 상기 직물 발호 조성물을 직물을 발호하기에 충분한 시간 동안 적용하는 것을 포함한다.
도면의 간단한 설명
첨부된 도면은 본 명세서의 일부에 포함되고, 이를 구성하며, 각종 구현예를 설명한다. 도면에서:
도 1 은 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilus) 종 번호 707 -아밀라아제 (서열번호:1) (Swissprot 등록번호 P19571) 및 바실러스 종 A 7-7 -아밀라아제 (서열번호:2) 의 성숙형들 간의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 강조된 잔기들은 상기 두 아미노산 서열에서 상이한 잔기들이다.
도 2 는 바실러스 서브틸러스 종 번호 707 -아밀라아제 (서열번호:1) (Swissprot 등록번호 P19571) 및 바실러스 종 A 7-7 (DSM 12368) -아밀라아제 (서열번호:7) (GenBank 등록번호 CAL48155) 의 성숙형들 간의 SIM 아미노산 서열 정렬을 나타낸다(Xiaoquin Huang 및 Webb Miller. (1991) A Time-Efficient, Linear-Space Local Similarity Algorithm. Advances in Applied Mathematics, vol. 12, pp. 337-357). 동일한 아미노산 위치들은 서열 정렬 아래에 별표로 표시되어 있다.
도 3 은 바실러스 종 번호 707 아밀라아제 변이체들의 발현에 사용되는 플라스미드 pICatH-Amy707 의 도식을 나타낸다. pICatH 는 하기 특징들을 포함한다: 온도 민감성 복제 원점 (ori pE194, 바실러스에서의 복제용), pBR322 로부터의 복제 원점 (E. 콜리에서의 증폭용), 선별을 위한 네오마이신 저항성 유전자, 및 클로람페니콜 항생제 선별, 염색체 통합 및 카세트 증폭을 위한 본래적 B. 리케니포르미스 클로람페니콜 저항성 유전자 (CAT).
도 4 는 모 효소와 비교한 일련의 아밀라아제 707 변이체들 (R172Q, H183D, 및 S255N) 의 아밀라아제 활성을 비교한 것을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
용해도에 중요한 아미노산 잔기를 변형시켜 보다 효율적으로 및 그에 따라 보다 경제적으로 제조되는 -아밀라아제의 변이체들이 제공된다. 예를 들어, 발현 숙주 세포의 발효액 내에서 야생형 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제보다 더 가용적인 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제의 변이체들이 제공된다. 상기 변이체들은 부가적으로 발현 숙주 세포 내에서, 예컨대, 숙주 세포 세포질에서 용해도가 더 높을 수 있다. 상기 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제 변이체들은 용해도가 더 크기 때문에, 예를 들어, 발효액으로부터 더욱 효율적으로 단리 및 정제가능하고, 따라서 상기 변이체들을 함유한 제형물을 더 경제적으로 제조가능하다.
본 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제 변이체들을 포함한 제형물에는, 세정 제형물 (예컨대, 식기세척기용 세제 및 세탁 세제 제형물), 균막 처리 제형물, 전분 가공 제형물, 직물 발호 제형물, 제빵 제형물 등이 포함된다. 하기에서는 이를 실시할 수 있는 방식을 상술하고, 이에 의해 제조된 -아밀라아제 변이체들의 조성물 및 용도를 제공한다.
1. 정의 및 약어
본 상세한 설명에 따르면, 하기 약어 및 정의가 적용된다. 본원에 사용된 바, 단수 형태에는 문맥상 명백히 다르게 제시되지 않는 경우 복수의 대응물이 포함된다는 것을 유념해야 한다. 따라서, 예를 들어, "효소"에 대한 언급에는 복수의 이러한 효소가 포함되며, "제형물"에 대한 언급에는 당업자에게 공지된 하나 이상의 제형물 및 이의 등가물 등에 대한 언급이 포함된다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에게 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 이하, 하기 용어들을 제시한다.
1.1 정의
"아밀라아제"는, 무엇보다도, 전분 분해를 촉매할 수 있는 효소를 의미한다. "아밀라아제"에는, B. 리체니포르미스 및 B. 서브틸리스와 같은 바실러스종의 글루코아밀라아제, -아밀라아제, β-아밀라아제, 및 야생형 -아밀라아제 등의 임의의 아밀라아제가 포함된다. 아밀라아제는 전분 내의 -D-(1→4) O-글리코시드 결합을 절단하는 히드롤라아제이다. 일반적으로, -아밀라아제 (EC 3.2.1.1; -D-(1→4)-글루칸 글루카노히드롤라아제) 는 전분 분자 내의 -D-(1→4) O-글리코시드 결합을 무작위적 방식으로 절단하는 내부-작용 효소로 정의된다. 이와 대조적으로, 외부-작용 전분가수분해 효소, 예컨대 β-아밀라아제 (EC 3.2.1.2; -D-(1→4)-글루칸 말토히드롤라아제) 및 말토오스 생성 (maltogenic) -아밀라아제 (EC 3.2.1.133) 와 같은 일부 생성물-특이적 아밀라아제는 기질의 비-환원성 말단으로부터 전분 분자를 절단한다. β-아밀라아제, -글루코시다아제 (EC 3.2.1.20; -D-글루코시드 글루코히드롤라아제), 글루코아밀라아제 (EC 3.2.1.3; -D-(1→4)-글루칸 글루코히드롤라아제), 및 생성물-특이적 아밀라아제는 전분으로부터 특정 길이의 말토-올리고당을 생성할 수 있다.
"-아밀라아제 변이체," "-아밀라아제 변이체 폴리펩티드," 및 "변이체 효소"는 야생형 -아밀라아제의 아미노산 서열로부터 변형된 아미노산 서열을 가진 -아밀라아제 단백질을 의미한다. 본원에서 사용된 바, "모 효소," "모 서열," "모 폴리펩티드," "야생형 -아밀라아제 단백질," 및 "모 폴리펩티드"는 -아밀라아제 변이체 폴리펩티드가 기반으로 하는 효소 및 폴리펩티드, 예컨대, 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제를 의미한다. 야생형 -아밀라아제는 자연적으로 발생한다. "-아밀라아제 변이체"는 성숙 단백질, 즉, 신호 서열이 없는 단백질 서열의 아미노산 잔기에 있어서 야생형 -아밀라아제와 상이하다. 상기 -아밀라아제 변이체는, 예를 들어, 또 다른 -아밀라아제로부터의 것인 신호 펩티드에 연결된 성숙 또는 변이체 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. "변이체"라는 용어는 "돌연변이체"라는 용어와 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
"변이체"는 폴리펩티드 및 핵산을 지칭한다. 변이체는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 중의 하나 이상의 위치에서, 삽입, 치환, 전환, 절단 및/또는 역위를 각각 포함한다. 변이체 핵산에는 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 서열과 상보적인 서열이 포함될 수 있다. 예를 들어, 변이체 서열은 엄격한 조건, 예컨대, 50℃ 및 0.2X SSC (1X SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3 시트르산염, pH 7.0) 하에서 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 서열과 상보적이다. 더욱 특히는, 변이체라는 용어에는 고도로 엄격함 조건, 예컨대, 65℃ 및 0.1X SSC 하에서 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 혼성화할 수 있는 서열과 상보적인 서열이 포함된다.
"단리된"은 해당 서열이 자연에서는 천연적으로 결합되어 발견되는 적어도 하나 이상의 다른 성분이 상기 서열에 적어도 실질적으로 존재하지 않는 것을 의미한다.
"정제된"은 물질이 비교적 순수한 상태, 예컨대, 적어도 약 90% 순수, 적어도 약 95% 순수, 또는 적어도 약 98% 순수한 상태인 것을 의미한다.
"열안정성"은 효소가 참조 효소보다 더욱 열안정성인 것을 의미한다. 본 출원에서, -아밀라아제 변이체는, 예컨대, 동일한 온도, 기질 농도 등의 동일한 실험 조건 하에서 특정 시간 간격 후 비교적 더 높은 효소 활성을 가질 경우, 야생형 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제보다 더욱 열안정성이다. 다르게는, 더욱 열안정성인 효소는 시차 주사 열량계에 의해 측정되는 열용량이 참조 효소에 비해 더 높다.
"pH 범위"는 효소가 활성을 나타내는 pH 값들을 의미한다.
본원에서 사용된 바, "pH 안정한"은 효소가 특정 pH 에서 참조 효소보다 더 안정한 것을 의미한다. 본 출원에서, -아밀라아제 변이체는, 동일한 실험 조건, 예컨대 동일 pH 등 하에서 특정 시간 간격 후 비교적 더 높은 활성을 가질 경우, 야생형 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제보다 더욱 pH 안정성이다.
본원에서 사용된 바, "식품"에는 제조된 식품뿐 아니라, 식품용 성분, 예컨대 밀가루가 모두 포함된다.
본원에서 사용된 바, "식품 성분"에는 기능성 식품 또는 식료품이거나 또는 이에 첨가될 수 있는 제형물이 포함되며, 예를 들어, 산성화 또는 유화를 필요로 하는 광범위한 제품들에서 낮은 수준으로 사용되는 제형물도 포함된다. 식품 성분은 용도 및/또는 적용 방식 및/또는 투여 방식에 따라 용액 또는 고체의 형태일 수 있다.
본원에서 사용된 바, "기능성 식품"은 영양적 효과 및/또는 미각 만족을 제공할 수 있을 뿐 아니라, 또한 소비자에게 추가의 이로운 효과를 제공할 수 있는 식품을 의미한다.
본원에서 사용된 바, "아미노산 서열"은 용어 "폴리펩티드" 및/또는 용어 "단백질"과 동의어이다. 일부 경우, 용어 "아미노산 서열"은 용어 "펩티드"와 동의어이고; 일부 경우, 용어 "아미노산 서열"은 용어 "효소"와 동의어이다.
본원에서 사용된 바, "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 올리고뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이들의 변이체, 동족체, 절편 및 유도체를 지칭한다. 뉴클레오티드 서열은 게놈성, 합성 또는 재조합 기원일 수 있고, 센스 가닥인지 또는 안티-센스 가닥인지를 불문하고, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 본원에서 사용된 바, "뉴클레오티드 서열"이라는 용어에는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA, 및 RNA 가 포함된다. 뉴클레오티드 서열에 대한 합성은, 자동 합성기의 사용 (예컨대, Needham-VanDevanter 등, Nucl. Acids Res., 12:6159-6168 [1984] 참조) 을 포함하여, 당업계에 익히 공지되어 있다(예컨대, Beaucage 및 Caruthers, Tetrahedron Lett., 22: 1859-1862 [1981] 참조). DNA 서열은 또한 주문 제작된 것일 수도 있고, 다양한 시중의 공급업체로부터 주문한 것일 수도 있다.
"동족체"는 대상 아미노산 서열 및 대상 뉴클레오티드 서열과 특정 정도의 동일성 또는 " 상동성 (homology)"을 갖는 실재 (entity) 를 의미한다. "상동 서열"에는 대상 서열에 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일한, 특히 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열이 포함된다. 전형적으로, 동족체는 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 잔기를 포함할 것이다.
본원에서 사용된 바, "혼성화"에는 핵산 가닥이 염기쌍 형성 (base pairing) 을 통해 상보성 가닥과 연결되는 방법뿐 아니라, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술로 수행되는 증폭 방법이 포함된다. -아밀라아제 변이체 핵산은 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, RNA/DNA 이종이량체 (heteroduplex) 또는 RNA/DNA 공중합체로 존재할 수 있다. 본원에서 사용된 바, "공중합체"는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드를 모두 포함하는 단일 핵산 가닥을 지칭한다. -아밀라아제 변이체 핵산을 코돈-최적화하여 발현을 추가로 증가시킬 수도 있다.
본원에서 사용된 바, "합성" 화합물은 시험관내 화학적 또는 효소적 합성에 의해 제조된다. 이에는 하기에 제한되는 것은 아니나 메탄올자화 (methylotrophic) 효모들인 피치아 (Pichia), 한세눌라 (Hansenula), 스트렙토마이세스 및 트리코더마 (Trichoderma), 예컨대 T. 리이세이 (T. reesei), 또는 기타 선택되는 발현 숙주와 같은 숙주 유기체에 대한 최적 코돈을 사용하여 제조된 -아밀라아제 변이체 핵산이 포함된다.
본원에서 사용된 바, "형질전환된 세포"에는 재조합 DNA 기술을 사용하여 형질전환된 세포가 포함된다. 형질전환은 전형적으로 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 삽입하여 일어난다. 삽입된 뉴클레오티드 서열은 이종 뉴클레오티드 서열일 수 있는데, 즉, 형질전환 대상 세포에 자연적이지 않은 서열, 예컨대 융합 단백질일 수 있다.
본원에서 사용된 바, "작동가능하게 연결된"은 기재된 성분이 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 상기 코딩 서열의 발현이 상기 제어 서열과 상용성인 조건하에서 달성되는 방식으로 결찰된 것이다.
본원에서 사용된 바, "생물학적으로 활성인"이란, 자연 발생적 서열과 유사한 구조적, 조절적 또는 생화학적 기능 (그러나 반드시 동일한 정도는 아님) 을 갖는 서열을 지칭한다.
"용해도"는 특정 용매에 용해가능한 특정 물질의 양에 관계된 것이다. 또 다른 단백질보다 더 가용적인 단백질은 용액 밖으로 석출되지 않고 용매 중에 더 높은 농도에 이를 수 있다. 이러한 목적을 위한 용매에는, 수성 완충액 또는 염 용액, 발효액, 또는 발현 숙주의 세포질과 같은, 단백질이 존재할 수 있는 임의의 환경이 포함된다.
1.2 약어
다르게 지시되지 않는 한 하기 약어들이 적용된다:
3D 3차원
AE 알콜 에톡실레이트
AEO 알콜 에톡실레이트
AEOS 알콜 에톡시술페이트
AES 알콜 에톡시술페이트
AGU 글루코아밀라아제 활성 단위
AS 알콜 술페이트
cDNA 상보성 DNA
CMC 카르복시메틸셀룰로오스
DE 덱스트로스 당량
DNA 데옥시리보핵산
DP3 3 개의 소단위를 이용한 중합도
DPn n 개의 소단위를 이용한 중합도
DS 건조 고체
DTMPA 디에틸트리아미노펜타아세트산
EC 효소의 분류를 위한 효소 위원회
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
EDTMPA 에틸렌디아민테트라메틸렌 포스폰산
EO 에틸렌 옥시드
EP 발현된 단백질
F&HC 의류 및 가정 관리
HFCS 고 과당 옥수수 시럽
HFSS 고 과당 전분계 시럽
IPTG 이소프로필 β-D-티오갈락토시드
LAS 선형 알킬벤젠술포네이트
LU 리파아제 유닛
MW 분자량
nm 나노미터
NOBS 노나노일옥시벤젠술포네이트
NTA 니트릴로트리아세트산
PCR 중합효소 연쇄 반응
PEG 폴리에틸렌글리콜
pI 등전점
ppm 백만분율
PVA 폴리(비닐 알콜)
PVP 폴리(비닐피롤리돈)
RAU 참조 아밀라아제 유닛
RMS 제곱근평균
RNA 리보핵산
SAS 2급 알칸 술포네이트
1X SSC 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3 시트르산염, pH 7.0
SSF 동시 당화 및 발효
TAED 테트라아세틸에틸렌디아민
TNBS 트리니트로벤젠술폰산
w/v 중량/부피
w/w 중량/중량
wt 야생형
μL 마이크로리터
본원의 -아밀라아제 변이체는 야생형 -아밀라아제, 예컨대, 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제로부터 생성된다. 본 변이체는 상기 변이체를 발현하는 숙주 세포의 발효액에서 상기 변이체의 용해도를 증가시키는 등의 의해 야생형 -아밀라아제와 비교하여 생산 수준에 영향을 미치는 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형을 갖는다. 이러한 방식으로, 변이체는 바실러스 종 번호 707 로부터의 -아밀라아제의 고 성능 특징과, 예를 들어, 다른 종 또는 균주의 -아밀라아제의 고 생산 수준을 겸비할 수 있다. 일 구현예에서, 고 생산 수준은 -아밀라아제 변이체의 수용해도 (aqueous solubility) 를 향상시키는 아미노산 변이들에 의해 부여된다.
본 개시의 목적상, 아미노산 치환은, 예를 들어, R172Q 로 표기될 수 있는데, 이는 위치 172 의 아르기닌 (R) 잔기가 글루타민 (Q) 잔기로 대체된 것을 의미하며, 이 때 아미노산들은 당업계에 통상 공지된 1 문자로 표기된다. 잔기 위치 번호는 도 1 의 상부 서열 (서열번호:1) 로 나타낸 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제에서 사용된 것과 동일하다.
이론에 구애되지 않고, -아밀라아제 발현 수준은 부분적으로는 -아밀라아제의 1차 서열에 기인한 것으로 여겨진다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기는 발현된 효소의 응집 및 침전을 촉진시켜, 발효액으로부터 회수가능한 효소의 양을 저하시킬 수 있다. 유전자 조작을 통해 상기 효소의 1차 서열을 체계적으로 변이시키면 상기 -아밀라아제의 발현 수준에 기여하는 특정 아미노산 잔기들을 규명할 수 있다. 고수준으로 발현되는 -아밀라아제의 1차 서열은 적절한 아미노산 서열 변형에 대한 선택의 길잡이가 될 수 있다. 예를 들어, 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제의 1차 서열은 고도로 발현되는 바실러스 종 A 7-7 (DSM 12368) 로부터의 -아밀라아제의 1차 서열과 비교하여 33 개 아미노산이 상이하다. 본 개시의 목적상, "바실러스 종 A 7-7 (DSM 12368)"은 "바실러스 종 A 7-7"과 동의어이다. 이들 33 개 아미노산 중 하나 이상은 상기 발현된 -아밀라아제의 응집 및 침전에 영항을 줌으로써 발현 수준에 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 따라서, 상기 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제 서열 내의 이들 33 개 아미노산 중 하나 이상을, 상기 변이체가 상기 고도로 발현되는 바실러스 종 A 7-7 -아밀라아제의 서열에 상응하는 하나 이상의 아미노산을 포함하도록 치환시킬 수 있다. 이와 같은 변이체는 더 높은 수준으로 발현될 것으로 예상된다.
다르게는, 바실러스 종 A 7-7 -아밀라아제 서열 내의 하나 이상의 아미노산을 더 좋지 않게 발현되는 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제의 서열에 상응하도록 치환시켜 발현 수준에 기여하는 아미노산을 규명할 수도 있다. 이러한 경우에, 해당 치환이 발현에 영향을 미칠 경우 상기 변이체는 더 낮은 수준으로 발현될 것으로 예상된다.
다시 이론에 구애되지 않고, 일반적으로 효소의 응집 및 침전에 기여하는 아미노산 잔기들은 효소 표면 상에 노출되어 있을 것으로 예상된다. 특히, 단백질 표면 상의 소수성 구역이 응집 과정을 유도하는 것으로 예상된다. 3D (3차원) 구조 모델링을 통해 그러한 치환, 예컨대, 발현에 영향을 미칠 가능성이 가장 높은 단백질 표면 상의 아미노산들에 대한 치환을 규명할 수 있다. 아미노산 치환은 개별적으로 또는 둘 이상의 군으로 평가할 수 있다. 당업계에 공지된 방법들로 제조된 조합 라이브러리들을 이용하면, 다수의 아미노산 치환을 가진 변이체를 생성할 수 있다.
본원 변이체는 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가, 또는 결실에 의해 야생형 -아밀라아제 서열과 상이하다. 예를 들어, 변이체 -아밀라아제는 -아밀라아제 활성을 보유하면서도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 개의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제의 변이체는 상기 언급한 33 개 아미노산 위치 중 임의의 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 가져, 그의 서열이 바실러스 종 A 7-7 -아밀라아제 서열과 더욱 밀접히 유사해지도록 할 수 있다. 일 구현예에서, "변이체"에는 구체적으로 성숙 단백질의 첫번째 아미노산 잔기에서만 야생형 서열과 상이한 서열은 제외된다.
고도로 발현되는 임의의 -아밀라아제의 1차 서열은 고도-발현 변이체를 산출하는 아미노산 서열 변형의 선택에 대한 길잡이가 될 수 있다. 이를 위해, 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제에 대한 서열 동일성이 높은 -아밀라아제가 특히 적합한데, 그 이유는 어떤 잔기(들)가 발현에 영향을 미치는지를 결정하기 위해 최소 수의 잔기를 시험할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 바실러스 종 A 7-7 -아밀라아제는 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제에 대한 서열 동일성이 약 93% 이다. 적당한 바실러스 종 A 7-7 -아밀라아제가 도 1 에 개시되어 있다(서열번호:2; GenBank 등록번호 CAL48155). 또 다른 적당한 바실러스 종 A 7-7 -아밀라아제 (서열번호:3; GenBank 등록번호 CAD26710) 는 2 개의 잔기, D236G 및 Y353C 가 서열번호:2 에 나타난 바실러스 종 A 7-7 -아밀라아제 서열과 상이하다. 기타 적당한 -아밀라아제로는, 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제보다 더욱 고 수준으로 발현되는 임의의 -아밀라아제, 특히 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제와의 서열 동일성이 비교적 높은 -아밀라아제들을 들 수 있다. 상기 변이체는 그의 아미노산 서열이 상기 고도로 발현되는 -아밀라아제와 동일하지 않고, 적어도 하나의 아미노산이 이 서열과 상이할 것이다. 아미노산 치환으로서는, 이들에 한정되는 것은 아니나, N28R, S36D, S83N, S91A, N94S, M116W. N125S, T132S, E134D, R142K, S154N, R172Q, N174Q, H183D, A186G, I250L, N251T, S255N, A256T, L272I, Q280S, K302R, N311Q, S323T, E360D, R383K, I410M, A434P, S437N, F441Y, S452R, T459S, 및 K485N 을 들 수 있다. 이들 치환들이 모두 동등하게 유용한 특성을 부여하는 것은 아니다. 예를 들어, A186G 및 A434P 치환은 소수성을 감소시키는 유리한 점이 있지만, 또한 상기 변이체를 불안정하게 할 것으로 예상된다. 유사하게, I250L 치환은 용매에 노출되지 않는 아미노산에 가해지며; 따라서, 이러한 치환은 용해도에 거의 또는 전혀 영향이 없으면서 안정성에 영향을 줄 것으로 예상된다. 부가적인 치환이 상기 동일 잔기에 가해질 수 있다. 예를 들어, S452K, S452N, 또는 S452D 는 S452R 보다 더 나은 결과를 산출할 수 있다. 각종 아미노산 치환은 하기 표 1 에 개시되어 있다.
효소 변이체는 이의 핵산 및 1차 폴리펩티드 서열, 3D 구조 모델링, 및/또는 이의 특이적 활성에 의해 특징지어질 수 있다. -아밀라아제 변이체의 부가적인 특징에는 안정성, 칼슘 이온 (Ca2+) 의존성, pH 범위, 산화 안정성 및 열안정성이 포함된다. 일 측면에서, 상기 -아밀라아제 변이체들은 야생형 -아밀라아제의 성능 특징을 보유하면서도 야생형 -아밀라아제보다 더 높은 수준으로 발현된다. 발현 및 효소 활성 수준은 당분야의 당업자에 공지된 표준 검정을 이용하여 평가할 수 있다. 또 다른 측면에서, 변이체들은, 고온 (즉, 70-120℃), 및/또는 양극단의 pH (즉, pH 4.0 내지 6.0 또는 pH 8.0 내지 11.0), 및/또는 60 ppm 미만의 칼슘 농도에서의 안정성 향상 등의, 야생형 효소에 비해 향상된 성능 특징을 나타낸다.
발현 특징은 특정 숙주 세포에서 상기 변이체 생성시 상기 변이체의 발현 수준의 변경을 의미한다. 발현은 일반적으로 주어진 양의 시간에 걸쳐 당업계에 공지된 표준 기술들을 이용하여 발효액으로부터 회수가능한 활성 변이체의 양에 관한 것이다. 발현은 또한 숙주 세포 내에서 생성되는 또는 숙주 세포에 의해 분비되는 상기 변이체의 양 또는 비율에 관한 것일 수 있다. 발현은 또한 상기 변이체 효소를 인코딩하는 mRNA 의 번역률에 관한 것일 수도 있다.
변경된 Ca2+ 안정성은 Ca2+ 고갈 (depletion) 하에서 효소의 안정성이 변경된 것, 즉, 증가되거나 감소된 것을 의미한다. 중요한 돌연변이에는 특히 높은 pH, 즉, pH 8.0 내지 10.5 에서의 Ca2+ 안정성이 변경된 것, 특히 Ca2+ 안정성이 향상된 것이 포함된다.
추가의 측면에서, 중요한 돌연변이는 세정 조성물에서의 사용을 위해, 특별히 10-60℃, 특히 20-50℃, 더욱 특히 30-40℃ 의 온도에서, 변경된 특이적 활성을 나타낸다. 제빵 제품에 있어서, 중요한 돌연변이는 좀더 높은 온도 범위에서 변경된 특이적 활성을 나타낼 수 있다.
-아밀라아제 변이체는 또한 모 -아밀라아제에 비해 변경된 산화 안정성, 특히 더 높은 산화 안정성을 가질 수 있다. 예를 들어, 증가된 산화 안정성은 세제 조성물에서 유리하고, 감소된 산화 안정성은 전분 액화용 조성물에서 유리할 수 있다.
변이체 -아밀라아제는 야생형 α-아밀라아제보다 더 열안정성일 수 있다. 이러한 -아밀라아제 변이체는 제빵 또는 승온을 필요로 하는 기타 방법에 사용하기에 유리하다. 예를 들어, 열안정성 -아밀라아제 변이체는 약 55℃ 내지 약 80℃ 이상의 온도에서 전분을 분해할 수 있다. 열안정성 -아밀라아제 변이체는 약 95 ℃ 까지의 온도에 노출 후에도 활성을 유지할 수 있다.
본원에 기재된 -아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 또한, 특히 약 55℃ 내지 약 95℃ 이상, 특히 약 80℃ 의 증가된 온도에서 반감기가 모 효소에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 또는 그 이상 연장된 돌연변이를 가질 수 있다. 일 구현예에서, -아밀라아제 변이체는 80℃ 이상에서 약 1-10 분간 가열이 가능하다.
-아밀라아제 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 외-특이성 지표에 의해 측정된 외-특이성을 가질 수 있다. -아밀라아제 변이체로서는, 임의로는 동일 조건 하에서 측정시, 이들이 유래한 모 효소 또는 폴리펩티드와 비교하여, 더 높은 또는 증가된 외-특이성을 갖는 것들이 포함된다. 따라서, 예를 들어, -아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 모 폴리펩티드에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 500%, 1000%, 5000%, 10,000% 또는 그 이상인 외-특이성 지표를 가질 수 있다.
일 측면에서, 상기 핵산에 의해 인코딩되는 -아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 모 서열과 동일한 pH 안정성을 갖는다. 또 다른 측면에서, 상기 변이체는 상기 효소의 최종 상업적 목적을 위해 pH 범위를 원하는 영역으로 이동시키거나 더 큰 pH 안정성 범위를 부여하는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 상기 변이체는 약 pH 5.0 내지 약 pH 10.5 에서 전분을 분해할 수 있다. 상기 -아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 동일한 조건 하에서 모 폴리펩티드와 비교하여 (검정법에 따라) 더 긴 반감기 또는 더 높은 활성을 가질 수 있고, 또는 상기 -아밀라아제 변이체는 모 폴리펩티드와 동일한 활성을 가질 수도 있다. 상기 -아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 또한 동일한 pH 조건 하에서 모 폴리펩티드와 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 또는 그 이상의 반감기를 가질 수도 있다. 다르게는, 또는 부가적으로는, 상기 효소 변이체는 동일 pH 조건 하에서 모 폴리펩티드와 비교하여 더 높은 특이적 활성을 가질 수도 있다.
또 다른 측면에서는, 본원에 개시된 -아밀라아제 변이체 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산에 상보적인 핵산이 제공된다. 부가적으로는, 상기 상보물에 혼성화할 수 있는 핵산이 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용되는 서열은 합성 서열이다. 이에는, 메탄올자화 효모인 피치아 및 한세눌라 등의 숙주 유기체에서의 발현을 위한 최적 코돈을 이용하여 제조된 서열이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 기재된 방법, 또는 당업계에 공지된 임의의 대안적인 방법에 의해 제조된 효소 변이체를 인코딩하는 DNA 서열에 대해서, 적당한 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 신호, 및 임의로는 억제자 유전자 또는 다양한 활성자 유전자를 인코딩하는 제어 서열들을 전형적으로 포함하는 발현 벡터를 사용하여, 효소 형태로 발현시킬 수 있다.
3.1 벡터
-아밀라아제 변이체를 인코딩하는 DNA 서열을 지닌 재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 절차에 편리하게 적용될 수 있는 임의의 벡터일 수 있으며, 벡터의 선택은 종종 도입할 숙주 세포에 좌우될 것이다. 따라서, 벡터는 자가 복제 벡터, 즉, 염색체외 실재로서 존재하는 벡터, 염색체 복제와 독립적인 복제, 예컨대, 플라스미드, 박테리오파지 또는 염색체외 요소, 미니-염색체 또는 인공 염색체일 수 있다. 다르게는, 벡터는 숙주 세포에 도입시, 숙주 세포 게놈에 통합되고, 통합하여 들어간 염색체(들)와 함께 복제되는 벡터일 수 있다. 통합된 유전자를 또한 필수 조절 유전자 등의 항생제 선별 또는 기타 선별압에 의해 또는 필수 대사 경로 유전자의 상보성에 의해 강제된 증폭가능 구축물의 사용에 의해 증폭시켜, 염색체 내 상기 유전자의 다중 복제물을 생성할 수도 있다.
전형적으로 발현 벡터에는 클로닝 벡터의 성분들, 예컨대, 선별 목적을 위한, 선별된 숙주 유기체 내에서 상기 벡터의 자율 복제를 허용하는 요소 및 하나 이상의 표현형적으로 검출가능한 마커가 포함된다. 발현 벡터는 보통은 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 신호 및 임의로, 억제자 유전자 또는 하나 이상의 활성자 유전자를 인코딩하는 제어 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 측면에서, 사용된 모든 신호 서열은 효소 수집 및 임의로는 정제를 용이하게 하도록 해당 물질을 세포 배양 배지로 향하게 한다. -아밀라아제 변이체, 프로모터, 종결자 및 기타 요소 각각을 인코딩하는 DNA 구축물을 결찰하고, 이들을 복제에 필요한 정보를 담고 있는 적당한 벡터 내로 삽입하는데 사용되는 절차는 당업자들에 익히 공지되어 있다(예컨대, Sambrook 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 제 2 판, Cold Spring Harbor, 1989 및 제 3 판, 2001 참조).
상기 벡터에서, DNA 서열은 적당한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되어야 한다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 DNA 서열일 수 있는데, 숙주 세포에 상동 또는 이종인 단백질을 인코딩하는 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 특별히 세균 숙주에서, -아밀라아제 변이체를 인코딩하는 DNA 서열의 전사를 지휘하는 적당한 프로모터의 예는, E. 콜리의 lac 오페론의 프로모터, 스트렙토마이세스 코엘리컬러 (Streptomyces coelicolor) 아가라아제 유전자 dagA 또는 celA 프로모터, 각종 바실러스-유래 프로모터, 예컨대 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 종 번호 707, 또는 바실러스 종 A 7-7 -아밀라아제 유전자 (amyL) 의 프로모터, 바실러스 스테아로테르모필루스 말토오스 생성 아밀라아제 유전자 (amyM) 의 프로모터, 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 -아밀라아제 (amyQ) 의 프로모터, 및 바실러스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자의 프로모터 등이다. 진균 숙주에서의 전사에 있어서, 유용한 프로모터의 예는 아스페르길루스 오리재 (Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라아제, 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 아스파르트산 프로테이나아제, 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) 중성 -아밀라아제, A. 니게르 산 안정성 -아밀라아제, A. 니게르 글루코아밀라아제, 리조무코르 미에헤이 리파아제, A. 오리재 알칼리성 프로테아제, A. 오리재 트리오스 포스페이트 이소머라아제, 또는 A. 니둘란스 (A. nidulans) 아세트아미다아제를 인코딩하는 유전자로부터 유래된 것들이다. -아밀라아제 변이체 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 E. 콜리와 같은 세균 종에서 발현시키는 경우, 적합한 프로모터는, 예를 들어 T7 프로모터 및 파지 람다 프로모터를 비롯한 박테리오파지 프로모터로부터 선택될 수 있다. 효모 종에서의 발현에 적합한 프로모터의 예로서는, 이들에 한정되는 것은 아니나, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 의 Gal 1 및 Gal 10 프로모터 및 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) AOX1 또는 AOX2 프로모터가 포함된다. 트리코더마 리이세이에서의 발현을 위해서는, CBHII 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
상기 발현 벡터는 또한 -아밀라아제 변이체를 인코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 적당한 전사 종결자 및, 진핵생물에서는 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 종결 및 폴리아데닐화 서열은 적당하게는 프로모터와 동일한 원천으로부터 유래된 것일 수 있다. 벡터는 대상 숙주 세포에서 벡터의 복제를 가능하게 하는 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, pICatH, 및 pIJ702 의 복제 원점들이다.
상기 벡터는 또한 선별가능 마커, 예를 들어, 숙주 세포에서 결함을 보완하는 산물을 생성하는 유전자, 예컨대 B. 서브틸리스 또는 B. 리체니포르미스로부터의 dal 유전자, 또는 항생제 내성 예컨대, 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다. 나아가, 상기 벡터는 하이그로마이신 내성을 부여하는 amdS, argB, niaD 및 xxsC 와 같은 아스페르길루스 선별 마커를 포함할 수 있고, 또는 선별을 당업계에 공지된 바와 같은 공동-형질전환에 의해 달성할 수도 있다. 예컨대, WO 91/17243 을 참조하라.
3.2 변이체 발현 및 숙주 유기체
세포내 발현 또는 고체 상태 발효는, 예컨대, 숙주 세포로서 특정 세균 또는 진균을 사용하는 경우 등에서, 일부 면에서 유리할 수 있으나, 일반적으로는, 변이체의 발현이 세포외적이고, 배양 배지 내로 이루어지는 것이 유리하다. 일반적으로, 본원에 언급된 바실러스 -아밀라아제는 발현된 프로테아제가 배양 배지 내로 분비될 수 있게 하는 신호 서열을 포함한다. 원하는 경우, 상기 신호 서열을 상이한 신호 서열로 대체할 수 있는데, 이는 각 신호 서열을 인코딩하는 DNA 서열의 치환에 의해 편리하게 달성된다. 신호 서열은 전형적으로는 N-말단 도메인, H-도메인, 및 C-말단 도메인의 3 개의 도메인을 갖는 것을 특징으로 하고, 길이는 18 내지 35 개의 잔기 범위이다.
성숙 단백질은 처음에는 또다른 바실러스 종으로부터 또는 모 서열과 동일한 종으로부터 유래한 전-단백질에 대한, 융합 단백질의 형태일 수 있다. 예를 들어, B. 리체니포르미스 숙주 세포에서 단백질을 분비시키기 위해서는, B. 리체니포르미스 -아밀라아제의 신호 펩티드가 종종 사용되지만; 기타의 바실러스 -아밀라아제들로부터의 신호 단백질이 또한 치환될 수 있다. 유용한 신호 펩티드로서는, 예를 들어, 바실러스 종 번호 707 또는 바실러스 종 A 7-7 로부터의 것들이 있다.
DNA 구축물 또는 발현 벡터 중 하나를 포함하는 단리된 세포는, 유리하게는 -아밀라아제 변이체의 재조합 생성에 숙주 세포로서 사용된다. 상기 세포를 상기 변이체를 인코딩하는 DNA 구축물로 형질전환할 수 있는데, 편리하게는 상기 DNA 구축물 (하나 이상의 복제물) 을 숙주 염색체 내에 통합함으로써이다. 상기 통합의 경우 일반적으로 DNA 서열이 세포내에 안정적으로 유지될 가능성이 더 높아 유리한 것으로 고려된다. 숙주 염색체 내로의 DNA 구축물의 통합은 통상적인 방법에 따라, 예를 들어 상동 또는 이종 재조합에 의해 수행될 수 있다. 다르게는, 세포를 상이한 유형의 숙주 세포와 관련해 상기 기재한 바와 같은 발현 벡터로 형질전환시킬 수 있다.
적당한 세균 숙주 유기체의 예는, B. 서브틸리스, B. 리체니포르미스, B. 렌투스, B. 브레비스, B. 스테아로테르모필루스, B. 알칼로필루스, B. 아밀로리쿠에파시엔스, B. 코아굴란스, B. 라우투스, B. 메가테리움 (B. megaterium) 및 B. 투링기엔시스를 포함하는 바실라세아에 (Bacillaceae); S. 무리너스와 같은 스트렙토마이세스 종; L. 락티스 (L. lactis) 와 같은 락토코커스 (Lactococcus) 종; L. 루테리 (L. reuteri) 를 포함하는 락토바실러스 (Lactobacillus) 종; 류코노스톡 (Leuconostoc) 종; 페디오코커스 (Pediococcus) 종; 및 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종을 포함하는 락트산 세균 종과 같은 그람 양성 세균 종이다. 또 다른 유용한 숙주로는 예를 들어 바실러스 종 A 7-7 을 들 수 있다. 다르게는, E. 콜리를 포함하는 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae), 또는 슈도모나다세아에 (Pseudomonadaceae) 에 속하는 그람 음성 세균 종의 균주가 숙주 유기체로서 선택될 수 있다.
적합한 효모 숙주 유기체는 생물공학적으로 관련된 효모 종으로부터 선택될 수 있는데, 예컨대, 이들에 한정되는 것은 아니나 하기가 있다: 피치아 종, 한세눌라 종, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종, 야로이야 (Yarrowinia) 종, S. 세레비지애를 포함하는 사카로마이세스 종, 또는 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 에 속하는 종, 예컨대 S. 폼베 (S. pombe). 메탄올자화 효모 종 피치아 파스토리스 균주가 숙주 유기체로 사용가능하다. 다르게는, 숙주 유기체는 한세눌라 종일 수 있다. 사상 진균 중에서 적합한 숙주 유기체로서는, 아스페르길루스의 종, 예컨대, A. 니게르, A. 오리재, A. 투비겐시스 (A. tubigensis), A. 아와모리 (A. awamori), 또는 A. 니둘란스를 들 수 있다. 다르게는, 푸사리움 (Fusarium) 종, 예컨대 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 또는 리조무코르 종, 예컨대 R. 미에헤이의 균주를 숙주 유기체로 사용할 수 있다. 기타 적당한 효모로는 테르모마이세스 (Thermomyces) 및 무코르 (Mucor) 종이 포함된다. 진균 세포에 대해서는, 당업계에 공지된 방식으로 원형질체 형성 및 원형질체 형질전환 후 세포벽의 재생성을 포함하는 방법에 의해 형질전환시킬 수 있다. 아스페르길루스 숙주 세포의 형질전환에 적합한 절차는 예를 들어 EP 238023 에 기재되어 있다.
또 다른 측면에서는, -아밀라아제 변이체를 제조하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 변이체의 제조에 도움이 되는 조건하에서 상기 기재한 바와 같은 숙주 세포를 배양하고, 세포 및/또는 배양 배지로부터 변이체를 회수하는 것을 포함한다. 세포를 배양하는데 사용되는 배지는 해당 숙주 세포를 성장시키고 α-아밀라아제 변이체의 발현을 수득하는데 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적당한 배지 및 배지 성분은 시판 공급업자로부터 입수가능하거나, 또는 공개된 방법에 따라, 예컨대, ATCC (American Type Culture Collection) 의 카탈로그에 기재된 바와 같이 하여, 제조할 수 있다. 대표적인 배양 배지로는, 이들에 한정되는 것은 아니나, 삼천 리터 (3,000 L) 교반 탱크 발효기에서 실시되는 유가식 (fed-batch) 발효용 배지를 들 수 있다. 사용된 배지는 이용되는 숙주 세포에 가장 적합한 것, 예를 들어 바실러스 종 번호 707 을 배양하기 위한 하기 논의되는 배지일 것이다. 이러한 경우 성장 배지는 유기 화합물의 공급원으로서 옥수수 침지 고체 및 대두분과 함께 나트륨, 칼륨, 인산염, 마그네슘 및 황산염의 공급원으로서 무기 염 및 미량 원소로 이루어질 수 있다. 전형적으로는, 글루코오스와 같은 탄수화물 공급원 또한 초기 배지의 일부이다. 배양물 자체가 확립되고 성장하기 시작하면, 배양을 지속시키기 위해 탱크 내로 탄수화물을 당업계에 공지된 바와 같이 계량하여 공급한다. 효소 역가를 측정하기 위해 (예를 들어 비색계 검정법 사용) 일정한 간격으로 발효기로부터 시료를 취한다. 측정에 따라 효소 생산 속도가 증가하는 것이 멈출 때 발효 공정을 중단한다.
숙주 세포로부터 분비된 -아밀라아제 변이체는, 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 분리하고, 암모늄 술페이트와 같은 염에 의해 배지의 단백질 성분을 침전시킨 후, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피 절차를 사용하는 것을 포함하는, 익히 공지된 절차에 의해 배양 배지로부터 편리하게 회수될 수 있다.
숙주 세포는 -아밀라아제 변이체 단백질의 발현을 가능하게 하는 적당한 조건 하에서 배양될 수 있다. 단백질의 발현은, 구성적이어서 단백질이 지속적으로 생성되도록 할 수도 있고, 유도성이어서 발현 개시를 위한 자극이 필요할 수도 있다. 유도성 발현의 경우, 단백질 생성은 필요할 때 예를 들어, 배양 배지에 덱사메타손, IPTG 또는 세파로오스 (Sepharose) 등의 유도자 물질을 첨가하여 개시할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 TnT™ (Promega) 토끼 망상적혈구 시스템과 같은, 시험관내 무세포 시스템에서 재조합적으로 생성될 수 있다.
-아밀라아제 변이체를 발현하는 숙주를 또한, 숙주에 적합한 배지에서 호기성 조건 하에서 배양할 수 있다. 교반 또는 진탕과 폭기 (aeration) 의 조합이 제공될 수 있으며, 상기 숙주의 필요 및 원하는 -아밀라아제 변이체의 제조에 좌우되어, 숙주에 적절한 온도, 예컨대 약 30℃ 내지 약 75℃ 에서 제조가 일어난다. 배양은 약 12 내지 약 100 시간 또는 그 이상 (및 그 사이의 임의의 시간 값) 또는 더욱 특히 24 내지 72 시간 일어날 수 있다. 전형적으로는, 배양 브로스의 pH 는, 또한 -아밀라아제 변이체의 제조에 관해 숙주 세포가 필요로 하는 배양 조건에 따라, 약 5.5 내지 약 8.0 이다.
발효, 분리 및 농축 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 통상적인 방법을 이용하여 농축된 -아밀라아제 변이체 함유 용액을 제조할 수 있다. 발효 후, 발효액을 수득하고, 잔류 생 발효 물질을 비롯한 미생물 세포 및 각종 현탁 고체를 통상적인 분리 기술에 의해 제거하여, 아밀라아제 용액을 수득한다. 여과, 원심분리, 정밀여과, 회전 진공 드럼 여과, 이어서 한외여과, 추출 또는 크로마토그래피 등이 일반적으로 사용된다.
미농축 용액을 사용할 경우 정제된 -아밀라아제 변이체를 함유한 침전물을 수집하기 위해 인큐베이션 시간을 증가시켜야 하므로, 회수를 최적화하기 위해 -아밀라아제 변이체를 함유한 용액을 농축하는 것이 바람직하다. 용액을 원하는 효소 수준이 달성될 때까지 통상적인 기술을 사용하여 농축할 수 있다. 효소 변이체를 함유한 용액의 농축은 상기 논의된 기술 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다. 일 구현예에서는, 회전 진공 증발 및/또는 한외여과를 이용한다. 다르게는 한외여과를 사용할 수 있다.
정제를 목적으로 하는 "침전제"는 농축된 효소 변이체 용액으로부터 -아밀라아제 변이체를 침전시키는데 유효한 고체 형태의 화합물을 의미하며, 그의 본질은 결정질, 비결정질 또는 둘의 혼화물 (blend) 중 어떠한 것일 수도 있다. 침전은 예를 들어, 금속 할라이드 침전제를 사용하여 수행될 수 있다. 금속 할라이드 침전제에는 하기가 포함된다: 알칼리금속 클로라이드, 알칼리금속 브로마이드 및 상기 금속 할라이드 중 둘 이상의 혼화물. 상기 금속 할라이드는 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화나트륨, 브롬화칼륨 및 상기 금속 할라이드 중 둘 이상의 혼화물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 적당한 금속 할라이드로는 염화나트륨 및 염화칼륨을 들 수 있고, 특히 염화나트륨을 들 수 있는데, 이는 나아가 보존제로서 사용될 수 있다.
금속 할라이드 침전제는 -아밀라아제 변이체를 침전시키는데 유효한 양으로 사용된다. 효소 변이체의 침전을 초래하는데 유효한 금속 할라이드의 최소한의 유효량 및 최적 양, 뿐만 아니라, 인큐베이션 시간, pH, 온도 및 -아밀라아제 변이체의 농도를 비롯한 최대 회수를 위한 침전 조건의 선택은, 일상적인 시험 후 당업자에게 자명할 것이다.
일반적으로, 적어도 약 5% w/v (중량/부피) 내지 약 25% w/v 의 금속 할라이드를 농축 효소 변이체 용액에 첨가하는데, 통상은 적어도 8% w/v 이상을 첨가한다. 일반적으로, 약 25% w/v 이하의 금속 할라이드를 농축 효소 변이체 용액에 첨가하며, 통상은 약 20% w/v 이하를 첨가한다. 금속 할라이드 침전제의 최적 농도는 그 중에서도, 특이적 -아밀라아제 변이체의 본질 및 농축 -아밀라아제 변이체 용액 중의 그의 농도에 좌우될 것이다.
효소를 침전시키는 또 다른 대안은 농축 효소 변이체 용액에 첨가될 수 있는 유기 화합물을 사용하는 것이다. 유기 화합물 침전제로서는 하기를 들 수 있다: 4-히드록시벤조산, 4-히드록시벤조산의 알칼리금속염, 4-히드록시벤조산의 알킬 에스테르, 및 이들 유기 화합물 중 둘 이상의 혼화물. 상기 유기 화합물 침전제는 금속 할라이드 침전제의 첨가 전, 그와 동시에 또는 그 후에 첨가될 수 있고, 두 침전제인 유기 화합물 및 금속 할라이드는 순차적으로 또는 동시에 첨가될 수 있다. 추가의 설명을 위해서는 예컨대, Genencor International, Inc 의 미국 특허 제 5,281,526 호를 참조하다.
일반적으로, 유기 화합물 침전제는 4-히드록시벤조산의 알칼리금속염, 예컨대 나트륨 또는 칼륨염, 및 4-히드록시벤조산의 선형 또는 분지형 알킬 에스테르 (이 때, 알킬기는 탄소수가 1 내지 12 임), 및 이들 유기 화합물 중 둘 이상의 혼화물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 유기 화합물 침전제는 예를 들어 4-히드록시벤조산의 선형 또는 분지형 알킬 에스테르 (이 때, 알킬기는 탄소수가 1 내지 10 임), 및 이들 유기 화합물 중 둘 이상의 혼화물일 수 있다. 적당한 유기 화합물로서는 4-히드록시벤조산의 선형 알킬 에스테르 (이 때, 알킬기는 탄소수가 1 내지 6 임), 및 이들 유기 화합물 중 둘 이상의 혼화물을 들 수 있다. 4-히드록시벤조산의 메틸 에스테르, 4-히드록시벤조산의 프로필 에스테르, 4-히드록시벤조산의 부틸 에스테르, 4-히드록시벤조산의 에틸 에스테르 및 이들 유기 화합물 중 둘 이상의 혼화물이 또한 사용될 수 있다. 부가적인 유기 화합물로서는 또한, 이들에 한정되는 것은 아니나, 4-히드록시벤조산 메틸 에스테르 (메틸 파라벤) 및 4-히드록시벤조산 프로필 에스테르 (프로필 파라벤) 를 들 수 있는데, 이들은 또한 아밀라아제 보존제이다.
상기 유기 화합물 침전제는 금속 할라이드 침전제를 이용한 효소 변이체의 침전을 향상시키는데 유효한 양으로 사용된다. 유기 화합물 침전제의 최소한의 유효량 및 최적 양, 뿐만 아니라, 인큐베이션 시간, pH, 온도 및 효소 변이체의 농도를 비롯한 최대 회수를 위한 침전 조건의 선택은, 일상적인 시험 후에 본 명세서의 견지에서, 당업자에게 자명할 것이다.
일반적으로, 적어도 0.01% w/v 의 유기 화합물 침전제를 농축 효소 변이체 용액에 첨가하며, 통상은 적어도 0.02% w/v 를 첨가한다. 일반적으로, 0.3% w/v 이하의 유기 화합물 침전제를 농축 효소 변이체 용액에 첨가하며, 통상은 0.2% w/v 이하를 첨가한다.
금속 할라이드 침전제, 및 일 측면에서는, 유기 화합물 침전제를 함유하는 농축 효소 변이체 용액은, 필연적으로 정제되는 효소 변이체에 따라 pH 가 조정된다. 일반적으로, pH 는 아밀라아제의 등전점 (pI) 근처의 수준으로 조정된다. 예를 들어, pH 는 등전점보다 약 2.5 pH 단위 아래 내지 등전점보다 약 2.5 pH 단위 초과의 범위 내로 조정될 수 있다. 변이체의 pI 가 야생형의 pI 와 상이한 경우 pH 를 그에 따라 조정할 수 있다.
정제된 효소 변이체 침전물을 수득하기 위해 필요한 인큐베이션 시간은 특정 효소 변이체의 본질, 효소의 농도, 및 특정 침전제(들) 및 그(들)의 농도에 좌우된다. 일반적으로, 효소 변이체를 침전시키는데 유효한 시간은 약 1 내지 약 30 시간이고; 통상은 약 25 시간을 초과하지 않는다. 유기 화합물 침전제의 존재하에서, 인큐베이션 시간은 약 10 시간 미만으로, 대부분의 경우는 심지어 약 6 시간으로 더욱 감소될 수 있다.
일반적으로, 인큐베이션 동안의 온도는 약 4℃ 내지 약 50℃ 이다. 통상, 상기 방법은 약 10℃ 내지 약 45℃, 특히 약 20℃ 내지 약 40℃ 의 온도에서 수행된다. 침전 유도를 위한 최적 온도는 사용되는 용액 조건 및 효소 변이체 또는 침전제(들)에 따라 다르다.
정제된 효소 변이체 침전물의 전체적인 회수율 및, 상기 공정이 수행되는 효율은 효소 변이체, 첨가된 금속 할라이드 및 첨가된 유기 화합물을 포함한 용액을 진탕하면 향상된다. 진탕 단계는 금속 할라이드와 유기 화합물의 첨가 동안, 및 연이은 인큐베이션 기간 동안에 실시된다. 적합한 진탕 방법에는 기계적 교반 또는 쉐이킹, 강한 폭기 또는 임의의 유사한 기술이 포함된다.
인큐베이션 기간 후, 정제된 효소 변이체를 그 후 해리된 안료 및 기타 불순물로부터 분리하고, 통상의 분리 기술, 예컨대 여과, 원심분리, 정밀여과, 회전 진공 여과, 한외여과, 압축 여과, 십자 막 정밀여과, 십자 흐름 막 정밀여과, 등에 의해 수집한다. 사용되는 한 가지 방법은 십자 막 정밀여과일 수 있다. 침전물을 물로 세정하여 정제된 효소 변이체 침전물을 추가 정제할 수 있다. 예를 들어, 정제된 효소 변이체 침전물을 금속 할라이드 침전제를 함유하는 물, 예를 들어 금속 할라이드와 유기 화합물 침전제를 함유하는 물로 세정한다.
배양 동안, 열안정성 아밀라아제가 배양 브로스에 세포외적으로 축적된다. 원하는 -아밀라아제 변이체의 단리 및 정제를 위해, 배양 브로스를 원심분리 또는 여과하여 세포를 제거하고, 생성된 무세포 액체를 효소 정제에 사용한다. 일 구현예에서, 상기 무세포 브로스를 약 70% 포화도의 암모늄 술페이트를 사용한 염석 (salting out) 에 적용하고; 다음으로 상기 70% 포화-침전 분획을 완충액에 용해시키고, Sephadex G-100 컬럼 등의 컬럼에 적용하고, 용출하여 효소 변이체 활성 분획을 회수한다. 추가 정제를 위해, 이온 교환 크로마토그래피 등의 통상의 절차를 사용할 수 있다.
정제된 효소 변이체는 효소 변이체가 일반적으로 이용되는 모든 용도에 유용하다. 예를 들어, 이들은 세탁 세제 및 얼룩 제거제, 식품 산업, 전분 가공 및 제빵, 및 소화제로서의 약학 조성물에 사용될 수 있다. 이들은 액체 (용액, 슬러리) 또는 고체 (과립, 분말) 인 최종 생성물로 제조될 수 있다.
다르게는, 효소 생성물을 회수할 수 있고, 효소에 대한 추가 정제 없이 여과 또는 원심분리에 의해 세포 및 세포 잔해물을 제거하기 위해 플록킹제 (floccing agent) 를 배지에 첨가한다.
상기한 방법에 의해 제조 및 정제된 -아밀라아제 변이체는 각종 유용한 산업적 용도에 사용될 수 있다. 상기 변이체는 의류 & 가정관리 (F&HC) 와 관련된 적용을 용이하게 하는 가치있는 속성을 지닌다. 예를 들어, 변이체는 세척, 식기 세정 및 경질-표면 세정 세제 조성물 중의 성분으로서 사용될 수 있다. 변이체는 또한 전분으로부터 감미제 및 에탄올의 제조에, 및/또는 직물 발호에 유용하다. 변이체 -아밀라아제는 예를 들어, WO 2005/111203 및 미국 공개 출원 번호 2006/0014265 (Genencor International, Inc.) 에 기재된 바와 같은 전분 액화 및/또는 당화 공정을 비롯한 전분-전환 공정에서 특히 유용하다. -아밀라아제 변이체의 이러한 다양한 용도는 하기에 더욱 상세히 기재된다.
5. 세척 및 식기세정 조성물 및 용도
본원에서 논의되는 -아밀라아제 변이체는 예를 들어 식기 세정에 사용하기 위한 세제 조성물 또는 기타 세정 조성물로 제형화될 수 있다. 이들은 겔, 분말 또는 액체일 수 있다. 상기 조성물은 -아밀라아제 변이체 단독, 기타 전분 분해 효소, 기타 세정 효소, 및 세정 조성물에 통상인 기타 성분을 포함할 수 있다.
즉, 식기세척 세제 조성물은 계면활성제를 포함할 수 있다. 계면활성제는 음이온성, 비이온성, 양이온성, 양쪽이온성이거나 이러한 유형들의 혼합물일 수 있다. 상기 세제는 저-발포 내지 비-발포의 에톡시화 프로폭시화 직쇄 알콜 등의 비이온성 계면활성제를 0 내지 약 90 중량% 함유할 수 있다.
상기 세제 용도에서, -아밀라아제 변이체는 보통 프로필렌 글리콜을 함유한 액체 조성물에 사용된다. -아밀라아제 변이체는 프로필렌 글리콜에서 용해가능한데, 예를 들어 10% 염화칼슘을 함유한 25% 부피/부피 프로필렌 글리콜 용액에 순환시키면, 가능하다.
식기세척 세제 조성물은 무기 및/또는 유기 유형의 세척 강화제 염을 함유할 수 있다. 세척 강화제는 인-함유 및 비(非)-인-함유 유형으로 다시 나뉠 수 있다. 세제 조성물은 보통 약 1% 내지 약 90%의 세척 강화제를 함유한다. 인-함유 무기 알칼리성 세척 강화제가 존재하는 경우 이의 예로서는, 수용성 염, 특별히 알칼리금속 피로포스페이트, 오르토포스페이트, 및 폴리포스페이트를 들 수 있다. 인-함유 유기 알칼리성 세척 강화제가 존재하는 경우 이의 예로서는, 포스포네이트의 수용성 염을 들 수 있다. 비(非)-인-함유 무기 강화제가 존재하는 경우 이의 예로서는, 수용성 알칼리금속 카르보네이트, 보레이트 및 실리케이트, 뿐만 아니라 각종 유형의 수불용성 결정성 또는 비결정성 알루미노 실리케이트를 들 수 있으며, 이 중 제올라이트가 가장 잘 알려진 대표 물질이다.
적당한 유기 강화제의 예로서는 알칼리금속; 암모늄 및 치환된 암모늄; 시트레이트; 숙시네이트; 말로네이트; 지방산 술포네이트; 카르복시메톡시 숙시네이트; 암모늄 폴리아세테이트; 카르복실레이트; 폴리카르복실레이트; 아미노폴리카르복실레이트; 폴리아세틸 카르복실레이트; 및 폴리히드록시술포네이트를 들 수 있다.
기타 적당한 유기 강화제로서는 강화제 특성을 갖는 것으로 알려진 더욱 고분자량의 중합체 및 공중합체, 예를 들어 적절한 폴리아크릴산, 폴리말레산 및 폴리아크릴산/폴리말레산 공중합체, 및 이들의 염을 들 수 있다.
세정 조성물은 염소/브롬계 또는 산소계 표백제를 함유할 수 있다. 무기 염소/브롬계 표백제의 예로서는 리튬, 나트륨 또는 칼슘 하이포클로라이트, 및 하이포브로마이트, 뿐만 아니라 염소화 트리소듐 포스페이트가 있다. 유기 염소/브롬계 표백제의 예에는 헤테로시클릭 N-브로모- 및 N-클로로-이미드, 예컨대 트리클로로이소시아누르산, 트리브로모이소시아누르산, 디브로모이소시아누르산, 및 디클로로이소시아누르산, 및 이들의 칼륨 및 나트륨과 같은 수-가용화 양이온과의 염이 있다. 히단토인 화합물도 또한 적합하다.
상기 세정 조성물은 산소 표백제를 함유할 수 있는데, 예를 들어, 임의로는 표백 전구체를 가진, 무기 과산 (peracid) 의 형태로, 또는 퍼옥시 산 화합물로서이다. 적당한 퍼옥시 표백제 화합물의 전형적인 예는 알칼리금속 퍼보레이트 (4수화물 및 1수화물 모두), 알칼리금속 퍼카르보네이트, 퍼실리케이트 및 퍼포스페이트이다. 적당인 활성화제 물질로는 테트라아세틸에틸렌디아민 (TAED) 및 글리세롤 트리아세테이트를 들 수 있다. 효소 표백 활성화 시스템이 또한 존재할 수 있는데, 예를 들어, WO 2005/056783 에 개시된 바와 같은, 퍼보레이트 또는 퍼카르보네이트, 글리세롤 트리아세테이트 및 퍼히드롤라아제가 있다.
상기 세정 조성물을, 예컨대, 프로필렌 글리콜, 당 또는 당 알콜, 락트산, 붕산 또는 붕산 유도체 (예컨대, 방향족 보레이트 에스테르) 와 같은 폴리올과 같은 효소(들)에 대한 통상의 안정화제를 사용하여 안정화할 수 있다. 상기 세정 조성물은 또한 기타 통상의 세제 성분, 예를 들어 해교제 (deflocculant) 물질, 충전제 물질, 발포 억제제, 항부식제, 오염 현탁화제, 격리제, 오염 재침작 방지제, 탈수제, 염료, 살균제, 형광제, 증점제 및 향료를 함유할 수 있다.
마지막으로, -아밀라아제 변이체는 통상의 식기세척 세제에, 예컨대, 본원에 개시된 -아밀라아제 변이체를 하기 열거한 특허 및 공개 출원에 개시된 임의의 -아밀라아제 대신 또는 이에 더하여 사용하는 것을 고려하여, 하기 특허 공개물들에 기재된 세제 중 임의의 것에 사용될 수 있다: CA 2006687, GB 2200132, GB 2234980, GB 2228945, DE 3741617, DE 3727911, DE 4212166, DE 4137470, DE 3833047, DE 4205071, WO 93/25651, WO 93/18129, WO 93/04153, WO 92/06157, WO 92/08777, WO 93/21299, WO 93/17089, WO 93/03129, EP 481547, EP 530870, EP 533239, EP 554943, EP 429124, EP 346137, EP 561452, EP 318204, EP 318279, EP 271155, EP 271156, EP 346136, EP 518719, EP 518720, EP 518721, EP 516553, EP 561446, EP 516554, EP 516555, EP 530635, EP 414197, 및 U.S. 특허 제 5,112,518 호; 5,141,664 호; 및 5,240,632 호.
6. 세탁 세제 조성물 및 용도
구현예에 따르면, 하나 이상의 -아밀라아제 변이체는 전형적으로 세제 조성물의 성분일 수 있다. 그러한 것으로서, 이는 무-분진 과립, 안정화된 액체, 또는 보호된 효소의 형태로 세제 조성물에 포함될 수 있다. 무-분진 과립은 미국 특허 제 4,106,991 호 및 제 4,661,452 호에 개시된 바와 같이 제조될 수 있고, 임의로는 당업계에 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 왁스성 코팅 물질의 예로서는 폴리(에틸렌 옥시드) 제품; 평균 몰 중량이 1,000 내지 20,000 인 (폴리에틸렌글리콜, PEG); 16 내지 50 개의 에틸렌 옥시드 단위를 갖는 에톡시화 노닐페놀; 에톡시화 지방 알콜 (이 때, 알콜의 탄소수는 12 내지 20 이고, 15 내지 80 개의 에틸렌 옥시드 단위가 존재함); 지방 알콜; 지방산; 및 지방산의 모노- 및 디- 및 트리글리세리드가 있다. 유동층 기술에 의한 응용에 적합한 막-형성 코팅 물질의 예는 예를 들어, GB 특허 제 1483591 호에 제시되어 있다. 액체 효소 제제는 예를 들어, 확립된 방법에 따라 프로필렌 글리콜과 같은 폴리올, 당 또는 당 알콜, 락트산 또는 붕산을 첨가하여 안정화할 수 있다. 기타 효소 안정화제는 당업계에 익히 공지되어 있다. 보호된 효소는 예를 들어 US 5,879,920 (Genencor International, Inc.) 또는 EP 238216 에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있다. 폴리올은 단백질의 안정화제로서 뿐 아니라, 단백질 용해도 개선용으로서 인지되어 왔다. 예컨대, 문헌 [Kaushik 등, "Why is trehalose an exceptional protein stabilizer? An analysis of the thermal stability of proteins in the presence of the compatible osmolyte trehalose" J. Biol. Chem. 278: 26458-65 (2003)] 및 여기에 언급된 참조문헌들; 및 문헌 [M. Conti 등, "Capillary isoelectric focusing: the problem of protein solubility," J. Chromatography 757: 237-245 (1997)] 를 참조하라.
세제 조성물은 임의의 편리한 형태, 예컨대, 겔, 분말, 과립, 페이스트 또는 액체일 수 있다. 액체 세제는, 전형적으로 약 70% 이하의 물 및 0% 내지 약 30% 의 유기 용매를 함유하는 수성일 수 있고, 또한 물을 약 30% 만 함유하는 고밀도 겔 (compact gel) 유형의 형태일 수 있다.
상기 세제 조성물은 하나 이상의 계면활성제를 포함하고, 이들은 각각 음이온성, 비이온성, 양이온성 또는 쯔비터이온성일 수 있다. 상기 세제는 통상 0% 내지 약 50% 의 하기와 같은 음이온성 계면활성제를 함유할 것이다: 선형 알킬벤젠술포네이트 (LAS); -올레핀술포네이트 (AOS); 알킬 술페이트 (지방 알콜 술페이트) (AS); 알콜 에톡시술페이트 (AEOS 또는 AES); 2차 알칸술포네이트 (SAS); -술포 지방산 메틸 에스테르; 알킬- 또는 알케닐숙신산; 또는 비누. 상기 조성물은 또한 0% 내지 약 40% 의 하기와 같은 비이온성 계면활성제를 함유할 수 있다: 알콜 에톡실레이트 (AEO 또는 AE), 카르복실화 알콜 에톡실레이트, 노닐페놀 에톡실레이트, 알킬폴리글리코시드, 알킬디메틸아민옥시드, 에톡시화 지방산 모노에탄올아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 또는 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드 (예를 들어 WO 92/06154 에 기재된 바와 같음).
상기 세제 조성물은 부가적으로는 하나 이상의 기타 효소, 예컨대 리파아제, 큐티나아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 및/또는 락카아제를 임의의 조합으로 포함할 수 있다.
상기 세제는 약 1% 내지 약 65% 의 세척 강화제 또는 복합제, 예컨대 제올라이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포네이트, 시트레이트, 니트릴로트리아세트산 (NTA), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTMPA), 알킬- 또는 알케닐숙신산, 가용성 실리케이트 또는 층상 실리케이트 (예컨대, SKS-6, Hoechst 사 제조) 를 함유할 수 있다. 상기 세제는 또한 미강화 (unbuilt), 즉 본질적으로 세척 강화제가 없는 것일 수 있다. 효소는 그의 안정성을 해치지 않는 임의의 조성물로 사용될 수 있다. 효소는 일반적으로 공지된 캡슐화 형태, 예를 들어, 히드로겔 내에서의 과립화 또는 격리에 의해 유해한 성분으로부터 보호될 수 있다. 효소, 및 구체적으로 -아밀라아제는 전분 결합 도메인의 유무와 관계없이, 세탁 및 식기세척 용도에 한정되지 않으며, 표면 세정제 및 전분 또는 바이오매스로부터의 에탄올 생성에 사용될 수 있다.
세제는 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 예로서는 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리(비닐 알콜) (PVA), 폴리카르복실레이트, 예컨대 폴리아크릴레이트, 말레산/아크릴산 공중합체 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체를 들 수 있다.
세제는, TAED 또는 노나노일옥시벤젠술포네이트 (NOBS) 등의 과산-형성 표백 활성화제와 임의로 조합되는, 퍼보레이트 또는 퍼카르보네이트와 같은 H2O2 공급원을 포함할 수 있는 표백 시스템을 함유할 수 있다. 다르게는, 표백 시스템은 예를 들어, 아미드, 이미드, 또는 술폰 유형의 퍼옥시 산을 포함할 수 있다. 표백 시스템은 또한, 예컨대 WO 2005/056783 에 기재된 것과 같은, 퍼히드롤라아제가 퍼옥시드를 활성화하는 효소 표백 시스템일 수 있다.
상기 세제 조성물의 효소는 통상의 안정화제, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤 등의 폴리올; 당 또는 당 알콜; 락트산; 방향족 보레이트 에스테르 등의 붕산 또는 붕산 유도체를 사용하여 안정화할 수 있고; 상기 조성물은 예를 들어, WO 92/19709 호 및 WO 92/19708 호에 기재된 바와 같이 제형화될 수 있다.
상기 세제는 또한 기타 통상의 세제 성분, 예컨대 점토를 포함하는 섬유 유연제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제, 항부식제, 오염 현탁화제, 오염 재침착방지제, 염료, 살균제, 형광 증백제, 또는 향료를 함유할 수 있다. pH (사용 농도의 수용액에서 측정) 는 통상 중성 또는 알칼리성, 예를 들어 pH 약 7.0 내지 약 11.0 이다.
-아밀라아제 변이체는 세제에 통상 사용되는 농도로 혼입될 수 있다. 현재, 세제 조성물에, -아밀라아제 변이체는 세척액 1 리터당 0.00001-1.0 mg (순소 효소 단백질로서 계산됨) 의 -아밀라아제 변이체에 해당하는 양으로 첨가될 수 있는 것으로 고려된다. 상기 -아밀라아제 변이체를 포함하는 세제 조성물의 특정 형태는 하기를 포함하도록 제형화될 수 있다:
(1) 하기를 포함하는 적어도 600 g/L 의 용적 밀도 (bulk density) 를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로서 계산됨) 약 7% 내지 약 12%; 알콜 에톡시술페이트 (예컨대, C12-18 알콜, 1-2 에틸렌 옥시드 (EO)) 또는 알킬 술페이트 (예컨대, C16-18) 약 1% 내지 약 4%; 알콜 에톡실레이트 (예컨대, C14-15 알콜, 7 EO) 약 5% 내지 약 9%; 탄산나트륨 (예컨대, Na2CO3) 약 14% 내지 약 20%; 가용성 실리케이트 약 2 내지 약 6%; 제올라이트 (예컨대, NaAlSiO4) 약 15% 내지 약 22%; 황산나트륨 (예컨대, Na2SO4) 0% 내지 약 6%; 시트르산나트륨/시트르산 (예컨대, C6H5Na3O7/C6H8O7) 약 0% 내지 약 15%; 과붕산나트륨 (예컨대, NaBO3·H2O) 약 11% 내지 약 18%; TAED 약 2% 내지 약 6%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예컨대, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 0-3%; 효소 (순수 효소로서 계산됨) 0.0001-0.1% 단백질; 및 미량 성분 (예컨대, 비누거품 억제제, 향료, 형광 증백제, 광표백제) 0-5%.
(2) 하기를 포함하는 적어도 600 g/L 의 용적 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 6% 내지 약 11%; 알콜 에톡시술페이트 (예컨대, C12-18 알콜, 1-2 EO) 또는 알킬 술페이트 (예컨대, C16-18) 약 1% 내지 약 3%; 알콜 에톡실레이트 (예컨대, C14-15 알콜, 7 EO) 약 5% 내지 약 9%; 탄산나트륨 (예컨대, Na2CO3) 약 15% 내지 약 21%; 가용성 실리케이트 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 (예컨대, NaAlSiO4) 약 24% 내지 약 34%; 황산나트륨 (예컨대, Na2SO4) 약 4% 내지 약 10%; 시트르산나트륨/시트르산 (예컨대, C6H5Na3O7/C6H8O7) 0% 내지 약 15%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예컨대, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 1-6%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 미량 성분 (예컨대, 비누거품 억제제, 향료) 0-5%.
(3) 하기를 포함하는 적어도 600 g/L 의 용적 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 5% 내지 약 9%; 알콜 에톡실레이트 (예컨대, C12-15 알콜, 7 EO) 약 7% 내지 약 14%; 지방산으로서의 비누 (예컨대, C16-22 지방산) 약 1 내지 약 3%; 탄산나트륨 (Na2CO3 으로서) 약 10% 내지 약 17%; 가용성 실리케이트 약 3% 내지 약 9%; 제올라이트 (NaAlSiO4 로서) 약 23% 내지 약 33%; 황산나트륨 (예컨대, Na2SO4) 0% 내지 약 4%; 과붕산나트륨 (예컨대, NaBO3H2O) 약 8% 내지 약 16%; TAED 약 2% 내지 약 8%; 포스포네이트 (예컨대, EDTMPA) 0% 내지 약 1%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예컨대, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 0-3%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 미량 성분 (예컨대, 비누거품 억제제, 향료, 형광 증백제) 0-5%.
(4) 하기를 포함하는 적어도 600 g/L 의 용적 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 8% 내지 약 12%; 알콜 에톡실레이트 (예컨대, C12-15 알콜, 7 EO) 약 10% 내지 약 25%; 탄산나트륨 (Na2CO3 으로서) 약 14% 내지 약 22%; 가용성 실리케이트 약 1% 내지 약 5%; 제올라이트 (예컨대, NaAlSiO4) 약 25% 내지 약 35%; 황산나트륨 (예컨대, Na2SO4) 0% 내지 약 10%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예컨대, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 1-3%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예컨대, 비누거품 억제제, 향료) 0-5%.
(5) 하기를 포함하는 수성 액체 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 15% 내지 약 21%; 알콜 에톡실레이트 (예컨대, C12-15 알콜, 7 EO 또는 C12-15 알콜, 5 EO) 약 12% 내지 약 18%; 지방산으로서의 비누 (예컨대, 올레산) 약 3% 내지 약 13%; 알케닐숙신산 (C12-14) 0% 내지 약 13%; 아미노에탄올 약 8% 내지 약 18%; 시트르산 약 2% 내지 약 8%; 포스포네이트 0% 내지 약 3%; 중합체 (예컨대, PVP, PEG) 0% 내지 약 3%; 붕산염 (예컨대, B4O7) 0% 내지 약 2%; 에탄올 0% 내지 약 3%; 프로필렌 글리콜 약 8% 내지 약 14%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예컨대, 분산제, 비누거품 억제제, 향료, 형광 증백제) 0-5%.
(6) 하기를 포함하는 수성 구조화 액체 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 15% 내지 약 21%; 알콜 에톡실레이트 (예컨대, C12-15 알콜, 7 EO, 또는 C12-15 알콜, 5 EO) 3-9%; 지방산으로서의 비누 (예컨대, 올레산) 약 3% 내지 약 10%; 제올라이트 (NaAlSiO4 로서) 약 14% 내지 약 22%; 시트르산칼륨 약 9% 내지 약 18%; 붕산염 (예컨대, B4O7) 0% 내지 약 2%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예컨대, PEG, PVP) 0% 내지 약 3%; 부착 중합체 (예를 들어, 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체); 몰비 25:1, MW 3800) 0% 내지 약 3%; 글리세롤 0% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예컨대, 분산제, 비누거품 억제제, 향료, 형광 증백제) 0-5%.
(7) 하기를 포함하는 적어도 600 g/L 의 용적 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 지방 알콜 술페이트 약 5% 내지 약 10%; 에톡시화 지방산 모노에탄올아미드 약 3% 내지 약 9%; 지방산으로서의 비누 0-3%; 탄산나트륨 (예컨대, Na2CO3) 약 5% 내지 약 10%; 가용성 실리케이트 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 (예컨대, NaAlSiO4) 약 20% 내지 약 40%; 황산나트륨 (예컨대, Na2SO4) 약 2% 내지 약 8%; 과붕산나트륨 (예컨대, NaBO3·H2O) 약 12% 내지 약 18%; TAED 약 2% 내지 약 7%; 중합체 (예컨대, 말레산/아크릴산 공중합체, PEG) 약 1% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예컨대, 형광 증백제, 비누거품 억제제, 향료) 0-5%.
(8) 하기를 포함하는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 8% 내지 약 14%; 에톡시화 지방산 모노에탄올아미드 약 5% 내지 약 11%; 지방산으로서의 비누 0% 내지 약 3%; 탄산나트륨 (예컨대, Na2CO3) 약 4% 내지 약 10%; 가용성 실리케이트 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 (예컨대, NaAlSiO4) 약 30% 내지 약 50%; 황산나트륨 (예컨대, Na2SO4) 약 3% 내지 약 11%; 시트르산나트륨 (예컨대, C6H5Na3O7) 약 5% 내지 약 12%; 중합체 (예컨대, PVP, 말레산/아크릴산 공중합체, PEG) 약 1% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예컨대, 비누거품 억제제, 향료) 0-5%.
(9) 하기를 포함하는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 6% 내지 약 12%; 비이온성 계면활성제 약 1% 내지 약 4%; 지방산으로서의 비누 약 2% 내지 약 6%; 탄산나트륨 (예컨대, Na2CO3) 약 14% 내지 약 22%; 제올라이트 (예컨대, NaAlSiO4) 약 18% 내지 약 32%; 황산나트륨 (예컨대, Na2SO4) 약 5% 내지 약 20%; 시트르산나트륨 (예컨대, C6H5Na3O7) 약 3% 내지 약 8%; 과붕산나트륨 (예컨대, NaBO3·H2O) 약 4% 내지 약 9%; 표백 활성화제 (예컨대, NOBS 또는 TAED) 약 1% 내지 약 5%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예컨대, 폴리카르복실레이트 또는 PEG) 약 1% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예컨대, 형광 증백제, 향료) 0-5%.
(10) 하기를 포함하는 수성 액체 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 15% 내지 약 23%; 알콜 에톡시술페이트 (예컨대, C12-15 알콜, 2-3 EO) 약 8% 내지 약 15%; 알콜 에톡실레이트 (예컨대, C12-15 알콜, 7 EO, 또는 C12-15 알콜, 5 EO) 약 3% 내지 약 9%; 지방산으로서의 비누 (예컨대, 라우르산) 0% 내지 약 3%; 아미노에탄올 약 1% 내지 약 5%; 시트르산나트륨 약 5% 내지 약 10%; 하이드로트로프 (예컨대, 소듐 톨루엔술포네이트) 약 2% 내지 약 6%; 붕산염 (예컨대, B4O7) 0% 내지 약 2%; 카르복시메틸셀룰로오스 0% 내지 약 1%; 에탄올 약 1% 내지 약 3%; 프로필렌 글리콜 약 2% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예컨대, 중합체, 분산제, 향료, 형광 증백제) 0-5%.
(11) 하기를 포함하는 수성 액체 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 20% 내지 약 32%; 알콜 에톡실레이트 (예컨대, C12-15 알콜, 7 EO, 또는 C12-15 알콜, 5 EO) 6-12%; 아미노에탄올 약 2% 내지 약 6%; 시트르산 약 8% 내지 약 14%; 붕산염 (예컨대, B4O7) 약 1% 내지 약 3%; 중합체 (예컨대, 말레산/아크릴산 공중합체, 부착 중합체, 예컨대, 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체) 0% 내지 약 3%; 글리세롤 약 3% 내지 약 8%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예컨대, 하이드로트로프, 분산제, 향료, 형광 증백제) 0-5%.
(12) 하기를 포함하는 적어도 600 g/L 의 용적 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 음이온성 계면활성제 (선형 알킬벤젠술포네이트, 알킬 술페이트, -올레핀술포네이트, -술포 지방산 메틸 에스테르, 알칸술포네이트, 비누) 약 25% 내지 약 40%; 비이온성 계면활성제 (예컨대, 알콜 에톡실레이트) 약 1% 내지 약 10%; 탄산나트륨 (예컨대, Na2CO3) 약 8% 내지 약 25%; 가용성 실리케이트 약 5% 내지 약 15%; 황산나트륨 (예컨대, Na2SO4) 0% 내지 약 5%; 제올라이트 (NaAlSiO4) 약 15% 내지 약 28%; 과붕산나트륨 (예컨대, NaBO3·H2O) 0% 내지 약 20%; 표백 활성화제 (TAED 또는 NOBS) 약 0% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 미량 성분 (예컨대, 향료, 형광 증백제) 0-3%.
(13) 상기 조성물 1)- 12) 에 기재된 바와 같은 세제 조성물로서, 이 때 선형 알킬벤젠술포네이트의 전부 또는 일부가 (C12-C18) 알킬 술페이트로 대체된 조성물.
(14) 하기를 포함하는 적어도 600 g/L 의 용적 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: (C12-C18) 알킬 술페이트 약 9% 내지 약 15%; 알콜 에톡실레이트 약 3% 내지 약 6%; 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드 약 1% 내지 약 5%; 제올라이트 (예컨대, NaAlSiO4) 약 10% 내지 약 20%; 층상 디실리케이트 (예컨대, Hoechst 사의 SK56) 약 10% 내지 약 20%; 탄산나트륨 (예컨대, Na2CO3) 약 3% 내지 약 12%; 가용성 실리케이트 0% 내지 약 6%; 시트르산나트륨 약 4% 내지 약 8%; 과탄산나트륨 약 13% 내지 약 22%; TAED 약 3% 내지 약 8%; 중합체 (예컨대, 폴리카르복실레이트 및 PVP) 0% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예컨대, 형광 증백제, 광표백제, 향료, 비누거품 억제제) 0-5%.
(15) 하기를 포함하는 적어도 600 g/L 의 용적 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: (C12-C18) 알킬 술페이트 약 4% 내지 약 8%; 알콜 에톡실레이트 약 11% 내지 약 15%; 비누 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 MAP 또는 제올라이트 A 약 35% 내지 약 45%; 탄산나트륨 (Na2CO3 으로서) 약 2% 내지 약 8%; 가용성 실리케이트 0% 내지 약 4%; 과탄산나트륨 약 13% 내지 약 22%; TAED 1-8%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 3%; 중합체 (예컨대, 폴리카르복실레이트 및 PVP) 0% 내지 약 3%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예컨대, 형광 증백제, 포스포네이트, 향료) 0-3%.
(16) 상기 1) - 15) 에 기재된 바와 같은 세제 제형물로서, 안정화되거나 캡슐화된 과산을 부가적인 성분 또는 이미 상술한 표백 시스템에 대한 대체물로서 함유하는 제형물.
(17) 상기 1), 3), 7), 9), 및 12) 에 기재된 바와 같은 세제 조성물로서, 과붕산염이 과탄산염으로 대체된 조성물.
(18) 상기 1), 3), 7), 9), 12), 14), 및 15) 에 기재된 바와 같은 세제 조성물로서, 망간 촉매를 부가적으로 함유하는 조성물.
(19) 선형 알콕시화 1차 알콜과 같은 액체 비이온성 계면활성제, 강화제 시스템 (예컨대, 포스페이트), 효소(들), 및 알칼리를 포함하는 비-수성 세제 액체로서 제형화된 세제 조성물. 상기 세제는 또한 음이온성 계면활성제 및/또는 표백 시스템을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서는, 세제 조성물에 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제를 도입하여, 가정용 및/또는 산업용 직물/세탁물에 존재하는 균막의 제거/세정에 사용할 수 있다.
상기 세제 조성물은 예를 들어 오염된 섬유의 예비 처리에 적합한 세탁 첨가제 조성물 및 린스가 첨가된 섬유 유연제 조성물을 비롯한 손세탁 또는 세탁기 세탁 세제 조성물로서 제형화될 수 있고, 또는 일반 가정용 경질 표면 세정 작업에 사용하기 위한 세제 조성물로서 제형화될 수 있고, 또는 손설겆이 또는 식기세척기 작업을 위해 제형화될 수 있다.
특정 측면에서, 상기 세제 조성물은 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제, 하나 이상의 -아밀라아제 변이체 및 하나 이상의 기타 세정 효소, 예컨대 프로테아제, 리파아제, 큐티나아제, 카르보히드라아제, 셀룰라아제, 펙티나아제, 만난아제 (mannanase), 아라비나아제, 갈락타나아제, 자일라나아제, 옥시다아제, 락카아제, 및/또는 퍼옥시다아제, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일반적으로 선택된 효소(들)의 특성은 선택되는 세제와 상용성이어야 하고(예컨대, 최적 pH, 기타 효소 및 비-효소 성분과의 상용성, 등), 효소(들)는 유효한 양으로 존재해야 한다.
프로테아제: 적당한 프로테아제에는, 동물, 식물 또는 미생물 기원의 것들이 포함된다. 화학적으로 개질되거나 단백질 조작된 돌연변이체도 또한 적당하다. 프로테아제는 세린 프로테아제 또는 메탈로프로테아제, 예컨대, 알칼리성 미생물 프로테아제, 또는 트립신-유사 프로테아제일 수 있다. 알칼리성 프로테아제의 예는 서브틸리신, 특별히 바실러스 종으로부터 유래된 것들, 예컨대, 서브틸리신 Novo, 서브틸리신 Carlsberg, 서브틸리신 309 (예컨대 미국 특허 제 6,287,841 호 참조), 서브틸리신 147, 및 서브틸리신 168 (예컨대, WO 89/06279 참조) 이다. 트립신-유사 프로테아제의 예는 트립신 (예컨대, 돼지 또는 소 기원), 및 푸사리움 프로테아제 (예를 들어, WO 89/06270 및 WO 94/25583 참조) 이다. 유용한 프로테아제의 예에는 또한 이들에 한정되는 것은 아니나 WO 92/19729 및 WO 98/20115 에 기재된 변이체가 포함된다. 적당한 시중의 프로테아제 효소에는, Alcalase®, Savinase®, Esperase®, 및 KannaseTM (Novozymes, 이전 명칭 Novo Nordisk A/S); Maxatase®, MaxacalTM, MaxapemTM, ProperaseTM, Purafect®, Purafect OxPTM, FN2TM, 및 FN3TM (Genencor International, Inc.) 이 있다.
리파아제: 적당한 리파아제에는 세균 또는 진균 기원의 것이 포함된다. 화학적으로 개질되거나 단백질 조작된 돌연변이체도 또한 포함된다. 유용한 리파아제의 예로서는 이들에 한정되는 것은 아니나, 휴미콜라 (Humicola) (동의어 테르모마이세스), 예컨대, H. 라누기노사 (H. lanuginosa) (T. 라누기노수스 (T. lanuginosus)) (예컨대, EP 258068 및 EP 305216 참조), 및 H. 인솔렌스 (H. insolens) (예컨대, WO 96/13580 참조) 로부터의 리파아제; 슈도모나스 리파아제 (예컨대, P. 알칼리게네스 (P. alcaligenes) 또는 P. 슈도알칼리게네스 (P. pseudoalcaligenes); 예컨대, EP 218 272 참조), P. 세파시아 (P. cepacia) (예컨대, EP 331 376 참조), P. 스투트제리 (P. stutzeri) (예컨대, GB 1,372,034 참조), P. 플루오레센스 (P. fluorescens), 슈도모나스 종 균주 SD 705 (예컨대, WO 95/06720 및 WO 96/27002 참조), P. 위스콘시넨시스 (P. wisconsinensis) (예컨대, WO 96/12012 참조); 바실러스 리파아제 (예컨대, B. 서브틸리스; 예컨대, Dartois 등 Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360 (1993) 참조), B. 스테아로테르모필루스 (예를 들어, JP 64/744992 참조), 또는 B. 푸밀러스 (B. pumilus) (예를 들어, WO 91/16422 참조) 가 포함된다. 상기 제형물에의 사용이 고려되는 부가적인 리파아제 변이체에는 예를 들어 하기에 기재된 것들이 포함된다: WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225, 및 EP 260105. 시중의 리파아제 효소 중 일부로는 Lipolase® 및 Lipolase® Ultra (Novozymes, 이전 명칭 Novo Nordisk A/S) 가 포함된다.
폴리에스테라아제: 적당한 폴리에스테라아제에는 이들에 한정되는 것은 아니나, WO 01/34899 (Genencor International, Inc.) 및 WO 01/14629 (Genencor Interntional, Inc.) 에 기재된 것들이 포함되는데, 이들은 본원에 논의된 기타 효소들과 임의의 조합으로 포함될 수 있다.
아밀라아제: 상기 조성물은 다른 -아밀라아제, 예컨대 비-변이체 -아밀라아제와 조합될 수 있다. 이들로는 시판 아밀라아제, 예컨대 이들에 제한되는 것은 아니나, Duramyl®, TermamylTM, Fungamyl® 및 BAN™ (Novozymes, 이전 명칭 Novo Nordisk A/S); Rapidase® 및 Purastar® (Genencor International, Inc.) 를 들 수 있다.
셀룰라아제: 상기 조성물에는 셀룰라아제가 첨가될 수 있다. 적당한 셀룰라아제로서는, 세균 또는 진균 기원의 것들을 들 수 있다. 화학적으로 개질되거나 단백질 조작된 돌연변이체도 포함된다. 적당한 셀룰라아제로서는 바실러스, 슈도모나스, 휴미콜라, 푸사리움, 티엘라비아 (Thielavia), 아크레모니움 (Acremonium) 속으로부터의 셀룰라아제, 예컨대, 미국 특허 제 4,435,307 호; 제 5,648,263 호; 제 5,691,178 호; 제 5,776,757 호; 및 WO 89/09259 에 기재된 휴미콜라 인솔렌스, 마이셀리오프토라 테르모필라 (Myceliophthora thermophila) 및 푸사리움 옥시스포룸으로부터 생성된 진균 셀룰라아제가 포함된다. 사용이 고려되는 예시적인 셀룰라아제는 직물에 대한 색상 관리 이점을 갖는 것들이다. 이러한 셀룰라아제의 예로서는 예를 들어 EP 0495257; EP 531 372; WO 99/25846 (Genencor International, Inc.), WO 96/34108 (Genencor International, Inc.); WO 96/11262, WO 96/29397, 및 WO 98/08940 에 기재된 셀룰라아제들이 있다. 기타 예로서는 셀룰라아제 변이체, 예컨대 WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531 315; 미국 특허 제 5,457,046 호; 제 5,686,593 호; 및 제 5,763,254 호에 기재된 것들이 있다. 시판되는 셀룰라아제로서는 Celluzyme® 및 Carezyme® (Novozymes, 이전 명칭 Novo Nordisk A/S); Clazinase™ 및 Puradax® HA (Genencor International, Inc.); 및 KAC-500(B)™ (Kao Corporation) 을 들 수 있다.
퍼옥시다아제/옥시다아제: 본 조성물에서의 사용이 고려되는 적당한 퍼옥시다아제/옥시다아제로는 식물, 세균 또는 진균 기원의 것들을 들 수 있다. 화학적으로 개질되거나 단백질 조작된 돌연변이체도 포함된다. 유용한 퍼옥시다아제의 예로서는, 예컨대 WO 93/24618, WO 95/10602, 및 WO 98/15257 에 기재된 것 등의 코프리누스 (Coprinus), 예를 들어, C. 시네레우스 (C. cinereus) 로부터의 퍼옥시다아제, 및 이들의 변이체를 들 수 있다.
상기 세제 효소(들)에 대해서는, 하나 이상의 효소를 함유하는 별도의 첨가제를 첨가하거나, 이들 효소 모두를 포함하는 조합 첨가제를 첨가하여 세제 조성물에 포함시킬 수 있다. 세제 첨가제, 즉, 별도의 첨가제 또는 조합 첨가제는 과립, 액체, 슬러리 등으로 제형화될 수 있다. 적당한 과립 세제 첨가제 제형물로는 무-분진 과립을 들 수 있다.
무-분진 과립에 대해서는 예컨대, 미국 특허 제 4,106,991 호 및 제 4,661,452 호에 개시된 바와 같이 제조할 수 있고, 임의로는 당업계에 공지된 방법으로 코팅할 수도 있다. 왁스성 코팅 물질의 예로서는 평균 몰 중량이 1,000 내지 20,000 인 폴리(에틸렌 옥시드) 제품 (예컨대, 폴리에틸렌글리콜, PEG); 16 내지 50 개의 에틸렌 옥시드 단위를 갖는 에톡시화 노닐페놀; 에톡시화 지방 알콜 (이 때, 알콜의 탄소수는 12 내지 20 이고, 15 내지 80 개의 에틸렌 옥시드 단위가 존재함); 지방 알콜; 지방산; 및 지방산의 모노- 및 디- 및 트리글리세리드가 있다. 유동층 기술에 의한 응용에 적당한 막-형성 코팅 물질의 예는 예를 들어, GB 1483591 에 제시되어 있다. 액체 효소 제제에 대해서는 예를 들어, 확립된 방법에 따라 프로필렌 글리콜 등의 폴리올, 당 또는 당 알콜, 락트산 또는 붕산을 첨가하여 안정화할 수 있다. 보호된 효소는 EP 238 216 에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있다.
상기 세제 조성물은 임의의 편리한 형태, 예를 들어, 바 (bar), 정제, 겔, 분말, 과립, 페이스트 또는 액체일 수 있다. 액체 세제는 전형적으로 약 70% 이하의 물 및 0% 내지 약 30% 의 유기 용매를 함유하는 수성일 수 있다. 또한 30% 이하의 물을 함유하는 고밀도 세제 겔 또한 고려된다. 세제 조성물은, 반-극성 (semi-polar) 을 포함하는 비-이온성, 음이온성, 양이온성 또는 쯔비터이온성, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있는 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 계면활성제는 전형적으로 0.1 중량% 내지 60 중량% 의 수준으로 존재한다.
음이온성 계면활성제가 포함되어 있는 경우, 상기 세제는 선형 알킬벤젠술포네이트, -올레핀술포네이트, 알킬 술페이트 (지방 알콜 술페이트), 알콜 에톡시술페이트, 2차 알칸술포네이트, -술포 지방산 메틸 에스테르, 알킬- 또는 알케닐숙신산, 또는 비누 등의 음이온성 계면활성제를 전형적으로 약 1% 내지 약 40% 함유할 것이다.
비-이온성 계면활성제가 포함되어 있는 경우, 상기 세제는 알콜 에톡실레이트, 노닐페놀 에톡실레이트, 알킬폴리글리코시드, 알킬디메틸아민옥시드, 에톡시화 지방산 모노에탄올아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드, 또는 글루코사민의 N-아실-N-알킬 유도체 ("글루카미드") 등의 비-이온성 계면활성제를 보통 약 0.2% 내지 약 40% 함유할 것이다.
상기 세제는 0% 내지 약 65% 의 세척 강화제 또는 착화제, 예컨대 제올라이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포네이트, 카르보네이트, 시트레이트, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTMPA), 알킬- 또는 알케닐숙신산, 가용성 실리케이트 또는 층상 실리케이트 (예를 들어, Hoechst 사의 SKS-6) 를 함유할 수 있다.
상기 세제는 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 예로서는 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(비닐 알콜) (PVA), 폴리(비닐피리딘-N-옥시드), 폴리(비닐이미다졸), 폴리카르복실레이트, 예컨대, 폴리아크릴레이트, 말레산/아크릴산 공중합체), 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체가 있다.
상기 세제는, 과산-형성 표백 활성화제 (예를 들어, 테트라아세틸에틸렌디아민 또는 노나노일옥시벤젠술포네이트) 와 조합될 수 있는, 과붕산염 또는 과탄산염과 같은 H2O2 공급원을 포함할 수 있는 표백 시스템을 함유할 수 있다. 다르게는, 상기 표백 시스템은 퍼옥시산 (예컨대, 아미드, 이미드, 또는 술폰 유형의 퍼옥시산) 을 포함할 수 있다. 표백 시스템은 또한 효소 표백 시스템일 수도 있다.
상기 세제 조성물의 효소(들)에 대해서는, 통상적인 안정화제, 예컨대, 폴리올 (예컨대, 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤), 당 또는 당 알콜, 락트산, 붕산, 또는 붕산 유도체 (예컨대, 방향족 보레이트 에스테르), 또는 페닐 보론산 유도체 (예컨대, 4-포르밀페닐 보론산) 를 사용하여 안정화할 수 있다. 상기 조성물은 WO 92/19709 및 WO 92/19708 에 기재된 바와 같이 제형화될 수 있다.
상기 세제는 또한 예컨대 점토를 비롯한 섬유 유연제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제, 항부식제, 오염 현탁화제, 오염 재침착방지제, 염료, 살균제, 형광 증백제, 히드로트롭, 변색 억제제, 또는 향료 등의 기타 통상의 세제 성분을 함유할 수 있다.
상기 세제 조성물에, 효소 변이체를 세척액 1 리터당 약 0.01 내지 약 100 mg 의 효소 단백질, 특히 세척액 1 리터당 약 0.05 내지 약 5.0 mg 의 효소 단백질, 또는 더욱 특히는 세척액 1 리터당 0.1 내지 약 1.0 mg 의 효소 단백질에 해당하는 양으로 첨가할 수 있는 것이 고려된다.
6.1. 세제 조성물 평가 방법
다수의 -아밀라아제 세정 검정법이 존재한다. 세정 시험에 대한 대표적인 설명에는 하기가 포함된다. "견본(swatch)"은 오염물이 도포된 섬유 등의 물질의 조각이다. 상기 물질은 예를 들어, 면, 폴리에스테르 또는 천연 및 합성 섬유의 혼합물로 만들어진 섬유일 수 있다. 다르게는, 상기 물질은 여과지 또는 니트로셀룰로오스와 같은 종이, 또는 세라믹, 금속 또는 유리 등의 경질 물질 조각일 수 있다. -아밀라아제에 있어, 오염물은 전분 기재이지만, 혈액, 우유, 잉크, 풀, 차, 와인, 시금치, 육즙, 초콜렛, 달걀, 치즈, 점토, 안료, 오일, 또는 이들 화합물의 혼합물도 포함될 수 있다. 일 구현예에서, -아밀라아제 변이체는 BMI (blood/milk/ink; 혈액/우유/잉크) 검정법으로 시험된다.
"소형 견본"은 예를 들어 단일 구멍 펀치 장치, 또는 주문 제작된 96 개 구멍 펀치 장치 (이의 패턴은 표준 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 매칭됨) 로 절단되거나, 그렇지 않으면 상기 견본으로부터 제거된 견본의 한 구획이다. 상기 견본은 직물, 종이, 금속, 또는 기타 적당한 물질일 수 있다. 오염물은 상기 소형 견본을 24-, 48- 또는 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 두기 전 또는 둔 후에 상기 견본에 고정시킬 수 있다. 또한 작은 조각의 물질에 오염물을 도포하여 소형 견본을 제조할 수도 있다. 예를 들어, 소형 견본은 직경이 5/8" 또는 0.25" 인 오염물이 있는 섬유 조각일 수 있다. 주문 제작된 펀치는 96 개의 견본을 96-웰 플레이트의 모든 웰에 동시에 전달하는 방법으로 고안된 것이다. 상기 장치는 단순히 동일한 96-웰 플레이트를 여러 번 적재하여 웰 당 1 개 초과의 견본을 전달할 수 있다. 다-구멍 펀치 장치는 견본을, 이들에 한정되는 것은 아니나 24-웰, 48-웰, 및 96-웰 플레이트를 포함하는 임의 포맷의 플레이트에 동시에 전달하도록 고려될 수 있다. 또다른 고려되는 방법에서, 오염된 시험 플랫폼은 오염 물질로 코팅되는 금속, 플라스틱, 유리, 세라믹 또는 기타 적당한 물질로 제조된 비드일 수 있다. 그런 다음 하나 이상의 코팅된 비드를 적당한 완충액 및 효소가 담긴 96-, 48- 또는 24-웰 플레이트 또는 더 큰 포맷의 웰에 넣는다. 이러한 경우에, 상청액을 직접적인 흡광도 측정에 의해 또는 파생적인 발색 반응 후 방출된 오염물이 있는지 시험할 수 있다. 방출된 오염물에 대한 분석은 또한 질량 스펙트럼 분석에 의해 수행될 수 있을 것이다.
일 구현예에서는, 오염물의 고정도를 조절할 수 있게 하는 처리 프로토콜이 제공된다. 그 결과, 예를 들어, 시험 대상 효소의 부재하에 세척되는 경우 오염물의 양을 달리 방출하는 견본을 제조하는 것이 가능하다. 고정된 견본의 사용은 세척 검정법에서 신호-대-잡음 (signal-to-noise) 비의 현저한 개선을 가져온다. 나아가, 고정도를 다르게 함으로써, 다양한 세정 조건하에서 최적의 결과를 산출하는 오염물을 발생시킬 수 있다.
다양한 유형의 물질에 대해 공지된 "강도"의 오염을 갖는 견본이 시판중이고/이거나 (EMPA, St. Gallen, 스위스; wfk--Testgewebe GmbH, Krefeld Germany; 또는 Center for Test Materials, Vlaardingen, 네덜란드), 당업자에 의해 제조될 수 있다(Morris 및 Prato, Textile Research Journal 52(4): 280 286 (1982)). 견본은 예를 들어, 혈액/우유/잉크 (BMI), 시금치, 풀, 또는 초콜렛/우유/그을음으로 된 오염을 가진 면-함유 섬유를 포함할 수 있다. BMI 오염은 예를 들어, 0.0003% 내지 0.3% 과산화수소를 이용하여 면에 고정시킬 수 있다. 기타 조합에는 0.001% 내지 1% 글루타르알데히드로 고정된 풀 또는 시금치, 0.001% 내지 1% 글루타르알데히드로 고정된 젤라틴 및 쿠마시 (Coomassie) 오염, 또는 0.001% 내지 1% 글루타르알데히드로 고정된 초콜렛, 우유 및 그을음이 포함된다.
견본은 또한 효소 및/또는 세제 제형물로의 인큐베이션 동안 진탕될 수 있다. 세척 성능 데이터는 웰, 특히 96-웰 플레이트 내 견본의 배향 (수평 대 수직) 에 따라 다르다. 이것은 인큐베이션 기간 동안 혼합이 불충분하였다는 것을 나타내는 것일 것이다. 인큐베이션 동안 충분한 진탕을 확보하기 위한 다수의 방법이 있지만, 마이크로타이터 플레이트가 2 개의 알루미늄 플레이트 사이에 끼어 있는 플레이트 홀더를 구축할 수 있다. 이는 예를 들어, 접착 플레이트 봉합제를 웰에 둔 다음, 2 개의 알루미늄 플레이트를 임의의 유형의 적절한, 시중의 집게로 96-웰 플레이트에 집는 정도로 간단할 수 있다. 그런 다음 이를 시판 인큐베이터 쉐이커에서 고정시킬 수 있다. 쉐이커를 약 400 rpm 로 설정하면 매우 효과적으로 혼합되면서도, 누출 또는 교차-오염이 홀더에 의해 효과적으로 방지된다.
세척액 중의 아미노기의 농도를 정량화하기 위해 트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 을 사용할 수 있다. 이는 견본으로부터 제거된 단백질 양의 척도로서 기능할 수 있다(예컨대, Cayot 및 Tainturier, Anal. Biochem. 249: 184-200 (1997) 참조). 그러나, 세제 또는 효소 시료가 (예를 들어, 시료 중의 펩티다아제의 존재에 의해) 통상적이지 않게 소형인 펩티드 분절을 형성하는 경우, 더 큰 TNBS 신호, 즉, 더 큰 "잡음"이 수득될 것이다.
혈액/우유/잉크에 대한 세척 성능 측정을 위한 또다른 수단은 세척액의 흡광도를 측정하여 정량화될 수 있는 잉크 방출에 기반한다. 흡광도는 350 내지 800 nm 사이의 임의의 파장에서 측정될 수 있다. 일 구현예에서, 파장은 410 nm 또는 620 nm 에서 측정된다. 또한 풀, 시금치, 젤라틴 또는 쿠마시 오염물을 함유하는 오염물에 대한 세척 성능을 측정하기 위해 세척액을 시험할 수 있다. 이러한 오염물에 대한 적당한 파장으로는, 시금치 또는 풀에 대해서는 670 nm 및 젤라틴 또는 쿠마시에 대해서는 620 nm 를 들 수 있다. 예를 들어, 세척액의 분취물 (예를 들어, 전형적으로 96-웰 마이크로플레이트로부터 100-150 μL) 을 제거하고, 큐벳 또는 멀티웰 마이크로플레이트에 넣는다. 그런 다음 이를 분광광도계에 위치시키고, 적절한 파장에서 흡광도를 판독한다. 상기 시스템은 또한 식기 세척을 위한 적당한 효소 및/또는 세제 조성물을, 예를 들어, 천, 플라스틱 또는 세라믹 등의 적당한 물질 상의 혈액/우유/잉크 오염물을 사용하여, 측정하는데 사용될 수도 있다.
일 측면에서, BMI/면 견본에 25℃에서 30 분간 0.3% 과산화수소를 도포하거나 BMI/면 견본에 60℃에서 30 분간 0.03% 과산화수소를 도포하여, BMI 오염물을 면에 고정한다. BMI/면 견본으로부터 대략 0.25" 의 소형 견본을 절단하고, 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 둔다. 각 웰 내로, 세제 조성물과 변이체 단백질 등의 효소의 공지된 혼합물을 넣는다. 접착 플레이트 봉합제를 마이크로타이터 플레이트의 상부에 둔 후, 마이크로타이터 플레이트를 알루미늄 플레이트에 고정시키고 대략 250 rpm 에서 약 10 내지 60 분 동안 오비탈 쉐이커에서 진탕한다. 마지막에, 상청액을 새로운 마이크로타이터 플레이트 중의 웰로 옮기고, 620 nm 에서의 잉크의 흡광도를 측정한다. 0.01% 글루타르알데히드를 시금치/면 견본 또는 풀/면 견본에 25℃에서 30 분간 적용함으로써, 면에 고정된 시금치 오염물 또는 풀 오염물을 이용하여 이를 유사하게 시험할 수 있다. 초콜렛, 우유, 및/또는 그을음 오염물로도 동일한 시험을 수행할 수 있다.
7. 균막 제거 조성물 및 용도
상기 조성물은 주요 효소 성분으로서 하나의 -아밀라아제 변이체, 예컨대, 균막 제거에 사용하기 위한 1 성분 조성물을 포함할 수 있다. 다르게는, 상기 조성물은 균막 제거를 위해 다중 효소 활성, 예컨대 다중 아밀라아제, 또는 아미노펩티다아제, 아밀라아제 (β- 또는 - 또는 글루코-아밀라아제), 카르보히드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 큐티나아제, 시클로덱스트린 글루카노트랜스페라아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라아제, -갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, -글루코시다아제, β-글루코시다아제, 할로퍼옥시다아제, 인버타아제, 락카아제, 리파아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 펙틴 가수분해 효소, 펩티도글루타미나아제, 퍼옥시다아제, 파이타아제, 폴리페놀옥시다아제, 단백질 가수분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나아제, 및/또는 자일라나아제를 포함하는 효소들의 칵테일, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 부가적인 효소(들)는 아스페르길루스 속, 예컨대, A. 아쿨레아투스 (A. aculeatus), A. 아와모리, A. 니게르 또는 A. 오리재; 또는 트리코더마; 휴미콜라, 예컨대 H. 인솔렌스; 또는 푸사리움, 예컨대, F. 박트리디오이데스 (F. bactridioides), F. 세레알리스 (F. cerealis), F. 크룩웰렌스 (F. crookwellense), F. 쿨모룸 (F. culmorum), F. 그라미네아룸 (F. graminearum), F. 그라미눔 (F. graminum), F. 헤테로스포룸 (F. heterosporum), F. 네군디 (F. negundi), F. 옥시스포룸, F. 레티쿨라툼 (F. reticulatum), F. 로세움 (F. roseum), F. 삼부시눔 (F. sambucinum), F. 사르코크로움 (F. sarcochroum), F. 술푸레움 (F. sulphureum), F. 토룰로세움 (F. toruloseum), F. 트리코테시오이데스 (F. trichothecioides), 또는 F. 베네나툼 (F. venenatum) 에 속하는 미생물에 의해 생성될 수 있다.
-아밀라아제 변이체 포함 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 제조가능하고, 액체 또는 건조 조성물의 형태일 수 있다. 예를 들어, -아밀라아제 변이체 함유 조성물은 과립 또는 미세과립의 형태일 수 있다. 조성물에 포함되는 폴리펩티드에 대해서는 당업계에 공지된 방법에 따라 안정화할 수 있다.
폴리펩티드 조성물의 용도에 대한 예가 하기에 제시된다. -아밀라아제 변이체 함유 조성물의 투여량 및 조성물이 사용되는 기타 조건은 당업계에 공지된 방법에 근거해 결정가능다. -아밀라아제 변이체는 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제 또는 이의 변이체와 함께 조성물에 사용하는 것이 추가로 고려된다.
한 가지 측면은 균막의 분해 및/또는 제거이다. 본원에 사용된 용어 "분해"는 균막 내의 개별 미생물 세포들을 함께 연결 및 결합시키는 균막 매트릭스 내의 다당류의 가수분해로서 이해되어야 하며, 이렇게 하여 미생물 세포는 균막으로부터 방출 및 제거될 수 있다. 균막은 표면에 존재할 수 있고, 균막의 분해는 예컨대, 표면을 -아밀라아제 변이체 및 임의로는 균막의 분해를 담당하는 하나 이상의 기타 효소 (예컨대, 이에 한정되는 것은 아니나 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제) 를 포함하는 수성 매질에 침지, 이로 덮음 또는 이를 뿌림에 의해, 수성 매질에 접촉시켜 달성할 수 있다. 상기 조성물은 점액질, 예를 들어 펄프 및 제지 산업에서의 백수 (white water) 에서의 점액질을 가수분해하는데 사용될 수 있다.
-아밀라아제 변이체는 0.0001 내지 10,000 mg/L, 0.001-1000 mg/L, 0.01-100 mg/L, 또는 심지어 0.1-10 mg/L 의 양으로 존재할 수 있다. 부가적인 효소 및 효소 변이체는 이와 유사하거나 더 적은 양으로 존재할 수 있다. 공정은 대략 주위 온도 내지 약 70℃ 의 온도에서 수행될 수 있다. 적당한 온도 범위는 약 30℃ 내지 약 60℃, 예컨대, 약 40℃ 내지 약 50℃ 이다.
균막의 가수분해에 적당한 pH 는 약 3.5 내지 약 8.5 이다. 특히 적당한 pH 범위는 약 5.5 내지 약 8, 예컨대, 약 6.5 내지 약 7.5 이다. 효소 변이체가 균막을 효과적으로 제거하기 위한 접촉 시간 또는 반응 시간은 균막 특성 및 효소 변이체 단독 또는 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제와 같은 다른 효소와 조합으로 표면을 처리하는 빈도에 따라, 상당히 다를 수 있으나, 적당한 반응 시간은 약 0.25 내지 약 25 시간이다. 특히 적당한 반응 시간은 약 1 내지 약 10 시간, 예컨대 약 2 시간이다.
상기 -아밀라아제 변이체 및 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 자일라나아제, 다른 -아밀라아제를 포함하는 기타 아밀라아제, 리파아제, 프로테아제, 및/또는 펙티나아제를 비롯한 부가적인 효소가 조합될 수 있다. 상기 효소는 추가로 효소성 또는 비 효소성-살생물제 등의 항균제와 조합될 수 있다. 효소성 살생물제는, 산화환원효소, 예컨대, 락카아제 또는 퍼옥시다아제, 특별히 할로퍼옥시다아제, 및 임의로 예를 들어 특허 출원 WO 97/42825 및 DK 97/1273 에 기재된 바와 같은, 알킬 시린게이트 등의 증강제를 포함한 조성물일 수 있다.
균막이 제거되고/되거나 세정 제거되는 표면은 경질 표면일 수 있는데, 이는 정의상 미생물에 본질적으로 비-투과성인 임의의 표면에 관련된 것이다. 이의 예로서는, 임의로는 페인트, 에나멜, 중합체 등으로 코팅될 수 있는, 금속, 예컨대, 스테인레스 스틸 합금, 플라스틱/합성 중합체, 고무, 판자, 유리, 목재, 종이, 직물, 콘크리트, 바위, 대리석, 석고 및 세라믹 물질로부터 제조된 표면이 있다. 따라서, 표면은 급수 시스템, 식품 가공 시스템, 냉각 시스템, 화학약품 가공 시스템, 약제 가공 시스템, 또는 펄프 및/또는 제지 산업에서 발견되는 것 등의 목재 가공 시스템과 같은, 수용액을 보유, 이송, 가공 또는 접촉하는 시스템의 구성원일 수 있다. 따라서, 상기 효소 변이체 및 상기 효소 변이체를 함유한 조성물은 통상의 제자리-세정 (cleaning-in-place: C-I-P) 시스템에 유용하다. 상기 표면은 파이프, 탱크, 펌프, 막, 필터, 열 교환기, 원심분리기, 증발기, 믹서, 분무탑 (spray tower), 밸브 및 반응기와 같은 시스템 장치의 구성원일 수 있다. 상기 표면은 또한 오염된 내시경, 보철 장치 또는 의료용 이식물과 같은 의료 과학 및 산업에서 사용되는 기구 또는 그의 일부일 수 있다.
균막 제거용 조성물로는 또한 수송관 등의 금속 표면에 미생물 균막이 침범했을 때 발생하는 소위 생물-부식을 방지하기 위한 것이 고려된다. 상기 조성물은 균막을 분해하여 균막의 미생물 세포가 그것이 부착된 금속 표면을 부식하는 균막 환경을 만드는 것을 방지한다.
7.1 구강 관리 조성물
항-균막 조성물의 또다른 용도에는 구강 관리가 포함된다. 따라서 표면에는 치태가 있는 치아가 포함된다. 따라서, 상기 변이체 효소는 인간 또는 동물 치아에 존재하는 플라크 분해용으로 효소 변이체를 포함하는 의약의 제조를 위한 조성물 (예컨대 치약) 및 방법에 사용될 수 있다. 추가의 용도는 점막으로부터 균막, 예컨대 낭성 섬유증 환자의 폐에 있는 균막을 분해하는 것이다. 상기 표면은 또한 생물학적 기원의 기타 피부, 예컨대, 피부, 치아, 모발, 손발톱일 수 있고, 또는 오염된 콘택트 렌즈일 수도 있다.
구강 관리 조성물에 유용한 기타 효소로는, 이들에 한정되는 것은 아니나, 하기를 들 수 있다: 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제; 덱스트라나아제; 뮤타나아제; 옥시다아제, 예컨대 글루코오스 옥시다아제, L-아미노산 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 예컨대 WO 95/10602 에 기재된 코프리누스 종 퍼옥시다아제 또는 락토퍼옥시다아제; 할로퍼옥시다아제, 특별히 쿠르불라리아 (Curvularia) 종, 특히 C. 베루쿨로사 (C. verruculosa) 및 C. 이나에쿠알리스 (C. inaequalis) 로부터의 할로퍼옥시다아제; 락카아제; 프로테아제, 예컨대 파파인; 산성 프로테아제 (예를 들어, WO 95/02044 에 기재된 산성 프로테아제); 엔도글루코시다아제; 리파아제; AMGTM (Novozymes, 이전 명칭 Novo Nordisk A/S) 등의 아밀로글루코시다제를 비롯한 아밀라아제; 항-미생물 효소; 및 이들의 혼합물.
상기 구강 관리 조성물은 임의의 적당한 물리적 형태, 즉, 분말, 페이스트, 겔, 액체, 연고, 정제 등일 수 있다. "구강 관리 조성물"에는 충치를 방지하고, 치태 및 치석의 형성을 방지하고, 치태 및 치석을 제거하고, 치과 질환을 예방 및/또는 치료하는 등에 의해, 인간 및 동물의 입 안의 구강 위생을 유지하거나 개선하기 위해 사용될 수 있는 조성물이 포함된다. 구강 관리 조성물은 또한 의치, 인공치 등을 세정하기 위한 제품도 포함한다. 구강 관리 조성물의 예로서는 치약, 치과용 크림, 겔 또는 가루치약, 치아 구강세정제, 양치 전- 또는 후 린스 제형, 츄잉검, 로젠지 (lozenges) 및 캔디가 있다. 치약 및 치아용 겔에는 전형적으로 연마 광택 물질, 발포제, 향신제, 보습제 (humectant), 결합제, 증점제, 감미제, 미백/표백/염색제거제, 물, 및 임의로 효소가 포함된다. 플라크-제거액을 비롯한 구강세정제는 전형적으로 물/알콜 용액, 향신제, 보습제, 감미제, 발포제, 착색제 및 임의로 효소를 포함한다.
연마 광택 물질이 또한 구강 관리 조성물 내에 혼입될 수 있다. 그에 따라, 연마 광택 물질에는 알루미나 및 그의 수화물, 예컨대 -알루미나 3수화물; 마그네슘 트리실리케이트; 탄산마그네슘; 카올린; 알루미노실리케이트, 예컨대 하소 (calcined) 알루미늄 실리케이트 및 알루미늄 실리케이트; 탄산칼슘; 지르코늄 실리케이트; 및 또한 분말 플라스틱, 예컨대 폴리비닐 클로라이드; 폴리아미드; 폴리메틸 메타크릴레이트; 폴리스티렌; 페놀-포름알데히드 수지; 멜라민-포름알데히드 수지; 우레아-포름알데히드 수지; 에폭시 수지; 분말 폴리에틸렌; 실리카 제로겔; 히드로겔 및 에어로겔 등이 포함될 수 있다. 또한 연마제로서 적당한 것은 피로인산칼슘; 수-불용성 알칼리 메타포스페이트; 인산이칼슘 및/또는 이의 2수화물, 오르토인산이칼슘; 인산삼칼슘; 미립자 히드록시아파타이트 등이다. 또한 이러한 물질들의 혼합물을 사용하는 것도 가능하다. 구강 관리 조성물에 따라, 연마 제품은 약 0 중량% 내지 약 70 중량%, 예를 들어, 약 1 중량% 내지 약 70 중량%로 존재할 수 있다. 치약에 있어서, 연마재 함량은 전형적으로 최종 치약의 10 중량% 내지 70 중량% 범위내이다.
보습제는 예를 들어 치약으로부터 수분 손실을 방지하기 위해 사용된다. 구강 관리 조성물에 사용하기에 적당한 보습제에는 글리세롤; 폴리올; 소르비톨; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 프로필렌 글리콜; 1,3-프로판디올; 1,4-부탄디올; 수소화된 부분 가수분해 다당류 등 및 이들의 혼합물이 이다. 보습제는 일반적으로 치약 내에 0 중량% 내지 약 80 중량%, 또는 약 5 중량% 내지 약 70 중량%로 존재한다.
실리카, 전분, 트래거캔스 검, 잔탄 검, 아이리쉬 모스 (Irish moss) 추출물, 알기네이트, 펙틴, 셀룰로오스 유도체, 예컨대 히드록시에틸 셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스 및 히드록시프로필 셀룰로오스, 폴리아크릴산 및 이의 염, 폴리비닐피롤리돈은, 치약 제품의 안정화를 돕는 적당한 증점제 및 결합제의 예이다. 증점제는 치약 크림 및 겔에 최종 생성물의 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%의 양으로, 결합제는 약 0.01 내지 약 10 중량%로 존재할 수 있다.
발포제가 사용될 수 있는데, 이에는 비누, 음이온성, 양이온성, 비이온성, 양쪽이온성 및/또는 쯔비터이온성 계면활성제가 포함된다. 이들은 최종 생성물의 0 내지 약 15 중량%, 약 0.1 내지 약 13 중량%, 또는 심지어 약 0.25 내지 약 10 중량%의 수준으로 존재할 수 있다. 계면활성제는 본 효소들을 불활성화하지 않는 정도로만 오직 적합하다. 계면활성제로서는 지방 알콜 술페이트, 술폰화 모노-글리세리드 또는 탄소수 10 내지 20 의 지방산의 염, 지방산-알부멘 축합 생성물, 지방산 아미드 및 타우린의 염 및/또는 이세티온산의 지방산 에스테르의 염을 들 수 있다.
제형물에 사용하기에 적당한 감미제로는 사카린을 들 수 있다. 스피아민트와 같은 향신제 또한 보통 적은 양으로, 예컨대 약 0.01 내지 약 5 중량%, 특별히 약 0.1 내지 약 5 중량%로 존재한다. 미백/표백제로는 H2O2 를 들 수 있으며, 최종 생성물의 중량으로 계산하여, 약 5% 미만, 또는 약 0.25% 내지 약 4% 의 양으로 첨가될 수 있다. 미백/표백제는 산화환원효소 등의 효소일 수 있다. 적당한 치아 표백 효소의 예는 WO 97/06775 에 기재되어 있다. 물은 보통 치약 등의 상기 조성물을 유동가능한 형태가 되게 하는 양으로 첨가된다. 수용성 항-세균제, 예컨대 클로르헥시딘 디글루코네이트, 헥세티딘, 알렉시딘, Triclosan®, 4 차 암모늄 항-세균 화합물 및 아연, 구리, 은 및 주석과 같은 특정 금속 이온의 수용성 공급원 (예컨대, 염화아연, 구리 및 주석 및 질산은) 이 또한 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 부가적인 화합물로는 불소 공급원, 염료/착색제, 보존제, 비타민, pH-조정제, 항-충치제, 민감성 감소제 (desensitizing agent) 등이 있다.
효소는 또한 상기 기술한 구강 관리 조성물에 유용하다. 효소는 구강 세정에 사용할 경우 여러 가지 이점을 제공한다. 프로테아제는 치아 표면에 흡착하여 결과적인 플라크의 첫번째 층인 피막을 형성하는 타액 단백질을 분해한다. 프로테아제는 리파아제와 함께 세균 세포벽 및 세포막의 구조 성분을 형성하는 단백질 및 지질을 용해함으로써 세균를 파괴한다. 덱스트라나아제 및 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제와 같은 기타 카르보히드라아제는 세균이 부착될 수 있는 매트릭스를 형성하는 세균에 의해 생성된 유기 골격 구조를 분해한다. 프로테아제 및 아밀라아제는 플라크 형성을 방지할 뿐 아니라, 또한 칼슘을 결합시키는 탄수화물-단백질 복합체를 파괴하여 석회화 (mineralization) 발달을 방지한다.
치약은 전형적으로 하기 성분들을 포함할 수 있다(단위: 최종 치약 조성물에 대한 중량%): 연마재 약 70% 까지; 보습제: 0% 내지 약 80%; 증점제: 약 0.1% 내지 약 20%; 결합제: 약 0.01% 내지 약 10%; 감미제: 약 0.1% 내지 약 5%; 발포제: 0% 내지 약 15%; 미백제: 0% 내지 약 5%; 및 효소: 약 0.0001% 내지 약 20%. 일 구현예에서, 치약은 pH 가 약 6.0 내지 약 8.0 범위이고: 약 10% 내지 약 70% 연마재; 0% 내지 약 80% 보습제; 0.1% 내지 약 20% 증점제; 0.01% 내지 약 10% 결합제; 약 0.1% 내지 약 5% 감미제; 0% 내지 약 15% 발포제; 0% 내지 약 5% 미백제; 및 약 0.0001% 내지 약 20% 효소를 포함한다. 상기 효소에는, 단독 또는 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제 등의 기타 효소와의 조합된 -아밀라아제 변이체, 및 임의로는 상기 언급된 기타 유형의 효소가 포함된다.
구강세정제는 전형적으로 하기 성분들을 포함할 수 있다(단위: 최종 구강세정 조성물에 대한 중량%): 0% 내지 약 20% 보습제; 0% 내지 약 2% 계면활성제; 0% 내지 약 5% 효소; 0% 내지 약 20% 에탄올; 0% 내지 약 2% 기타 성분 (예컨대, 향신제, 감미제 활성 성분, 예컨대 불화물) 을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 약 0% 내지 약 70% 물을 함유할 수도 있다. 구강세정제 조성물은 시트르산 또는 인산 나트륨 등의 적당한 완충액으로 약 6.0 내지 약 7.5 의 pH 범위로 완충될 수 있다. 구강세정제는 비-희석 형태일 수 있는데, 즉, 사용전에 희석해야 할 수 있다. 구강 관리 조성물은 구강 관리 업계에 공지된 임의의 통상적인 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
8. 전분 가공 조성물 및 용도
또 다른 측면에서, 개시된 -아밀라아제 변이체를 가진 조성물은 전분 액화 및/또는 당화에 이용될 수 있다. 전분 가공은 감미제의 제조, 연료 또는 음료용 알콜 (즉, 음용 알콜) 제조, 음료 제조, 감자당 가공, 원하는 유기 화합물 예컨대, 시트르산, 이타콘산, 락트산, 글루콘산, 케톤, 아미노산, 항생제, 효소, 비타민 및 호르몬의 제조에 유용하다. 전분을 과당 시럽으로 전환하는 것은 통상적으로 하기 3 가지 연속 효소 공정으로 이루어진다: 액화 공정, 당화 공정, 및 이성체화 공정. 액화 공정 동안, 변이체 -아밀라아제는 약 5.5 내지 약 6.2 의 pH 및 약 95℃ 내지 약 160℃ 의 온도에서 대략 2 시간 동안 전분을 덱스트린으로 분해한다. 이러한 조건하에서 최적의 효소 안정성을 확보하기 위해, 약 1 mM 의 칼슘을 첨가한다(40 ppm 유리 칼슘 이온). 기타 -아밀라아제 변이체는 상이한 조건을 필요로 할 수 있다.
액화 공정 후, 글루코아밀라아제 (예컨대, AMG™) 및 임의로 탈분지화 효소, 예컨대 이소아밀라아제 또는 풀루라나아제 (예를 들어, Promozyme®) 를 첨가하면 덱스트린을 덱스트로오스로 전환할 수 있다. 본 단계 전, 고온 (95℃ 초과) 을 유지하면서 pH 를 약 4.5 미만의 값으로 감소시켜, 액화 -아밀라아제 변이체 활성을 변성시킨다. 온도를 60℃ 로 저하시키고, 글루코아밀라아제 및 탈분지 효소를 첨가할 수 있다. 당화 공정은 전형적으로 약 24 내지 약 72 시간 동안 진행된다.
당화 공정 후, pH 를 약 6.0 내지 약 8.0 (예컨대, pH 7.5) 의 범위의 값으로 증가시키고, 칼슘을 이온 교환으로 제거한다. 그런 다음 덱스트로오스 시럽을 예를 들어, 고정화 글루코오스 이소머라아제 (예컨대 Sweetzyme®) 을 사용하여 고 과당 시럽으로 전환시킨다.
상기 -아밀라아제 변이체는 상기 액화 공정을 수행하기 위한 적어도 하나의 개선된 효소 특성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 변이체 -아밀라아제는 더 높은 활성을 가질 수도 있고, 또는 칼슘 필요성을 감소시킬 수도 있다. 유리 칼슘의 첨가는 -아밀라아제 변이체의 고 안정성을 적절하게 확보하는데 필요하지만, 유리 칼슘은 글루코오스 이소머라아제의 활성을 강하게 억제한다. 따라서, 이성체화 단계 전에 값비싼 단위 조작에 의해, 유리 칼슘 수준을 3 ~ 5 ppm 미만으로 감소시키는 정도로 칼슘을 제거해야 한다. 이러한 작업을 피할 수 있다면 비용 절감을 수득할 수 있고, 액화 공정은 유리 칼슘 이온의 첨가 없이 수행될 수 있을 것이다. 따라서, 칼슘 이온을 필요로 하지 않거나 칼슘에 대한 요구성이 감소된 -아밀라아제 변이체가 특히 유리하다. 예를 들어, 저 농도의 유리 칼슘 (<40 ppm) 에서 안정하고 고도로 활성인 칼슘-의존성이 더 적은 -아밀라아제 변이체를 상기 조성물 및 절차에 이용할 수 있다. 이러한 -아밀라아제 변이체는 최적 pH 가 약 4.5 내지 약 6.5 의 범위이어야 하는데, 예컨대, 약 pH 4.5 내지 약 pH 5.5 이다. 상기 -아밀라아제 변이체는 특이적 가수분해를 제공하도록 단독으로 사용될 수 있고, 또는 넓은 범위의 활성을 가진 "칵테일" 을 제공하도록 다른 아밀라아제들과 조합될 수도 있다.
가공되는 전분은, 예를 들어 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99.5% 순수한 고도로 정제된 양질의 전분일 수 있다. 다르게는, 전분은 배아 (germ) 잔류물 및 섬유질 등의 비-전분 분획을 비롯한 도정(milling)된 전곡 (whole grain) 을 포함하는 물질을 함유하는 좀더 미정제된 전분일 수 있다. 전곡 등의 원료를, 구조를 개방하여 추가 가공을 가능하게 하기 위해 도정한다. 하기 2 가지 도정 공정이 적합하다: 습식 및 건식 도정. 또한, 콘그릿츠 (corn grits) 및 도정된 콘그릿츠를 적용할 수 있다. 건식 도정된 곡물은 전분 외에도 유의한 양의 비-전분 탄수화물 화합물을 포함할 것이다. 이러한 이질적 물질을 제트 쿠킹 (jet cooking) 으로 가공하는 경우, 종종 전분이 부분적으로만 호화 (gelatinization) 된다. 따라서, 미호화 전분에 대해 높은 활성을 갖는 -아밀라아제 변이체를 액화 및/또는 당화 제트 쿠킹된 건식 도정 전분을 포함하는 공정에 적용하는 것이 유리하다.
액화 공정 동안 우수한 가수분해 활성을 갖는 변이체 -아밀라아제는 유리하게는 당화 단계의 효율 (WO 98/22613 참조) 및, 당화 단계 동안 글루코아밀라아제에 대한 필요성을 증가시킨다. 글루코아밀라아제는 유리하게는 0.5 글루코아밀라아제 활성 유닛 (AGU)/g DS (즉, 건조 고체 1 g 당 글루코아밀라아제 활성 유닛) 이하, 또는 심지어 미만의 양으로 존재한다. 글루코아밀라아제는 아스페르길루스 종, 탈라로마이세스 종 (Talaromyces sp.), 파키키토스포라 종 (Pachykytospora sp.), 또는 트라메테스 종 (Trametes sp.) 내의 균주로부터 유래된 것일 수 있고, 예시적인 예는 아스페르길루스 니게르, 탈라로마이세스 에메르소니이 (Talaromyces emersonii), 트라메테스 신굴라타 (Trametes cingulata), 또는 파키키토스포라 파피라세아 (Pachykytospora papyracea) 이다. 일 구현예에서, 상기 공정은 또한 WO 98/22613 에 기재된 유형의 탄수화물-결합 도메인의 사용을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 공정은 호화 또는 입상 전분의 슬러리의 가수분해, 특히 상기 입상 전분의 초기 호화 온도 미만의 온도에서 입상 전분의 가용성 전분 가수분해물로의 가수분해를 포함할 수 있다. -아밀라아제 변이체와 접촉시키는 것 외에도, 상기 전분을 진균 -아밀라아제 (EC 3.2.1.1) 및, β-아밀라아제 (EC 3.2.1.2), 및 글루코아밀라아제 (EC 3.2.1.3) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소와 접촉시킬 수 있다. 일 구현예에서, 추가의 또 다른 전분가수분해 효소 또는 탈분지 효소, 예컨대 이소아밀라아제 (EC 3.2.1.68), 또는 풀루라나아제 (EC 3.2.1.41) 가 -아밀라아제 변이체에 첨가될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 공정은 상기 초기 호화 온도 미만의 온도에서 수행된다. 이러한 공정은 종종 적어도 30℃, 적어도 31℃, 적어도 32℃, 적어도 33℃, 적어도 34℃, 적어도 35℃, 적어도 36℃, 적어도 37℃, 적어도 38℃, 적어도 39℃, 적어도 40℃, 적어도 41℃, 적어도 42℃, 적어도 43℃, 적어도 44℃, 적어도 45℃, 적어도 46℃, 적어도 47℃, 적어도 48℃, 적어도 49℃, 적어도 50℃, 적어도 51℃, 적어도 52℃, 적어도 53℃, 적어도 54℃, 적어도 55℃, 적어도 56℃, 적어도 57℃, 적어도 58℃, 적어도 59℃, 또는 적어도 60℃ 에서 수행된다. 상기 공정이 수행되는 pH 는 약 3.0 내지 약 7.0, 약 3.5 내지 약 6.0, 또는 약 4.0 내지 약 5.0 범위내일 수 있다. 일 측면에서는, 예를 들어 32℃ 근처의 온도, 예컨대 30℃ 내지 35℃ 에서 에탄올을 생성하는 효모를 이용한 발효를 포함하는 공정이 고려된다. 또 다른 측면에서, 상기 공정은 예를 들어 30℃ 내지 35℃ 의 온도에서, 예컨대, 32℃ 근처에서 에탄올을 생성하는 효모, 또는 원하는 유기 화합물을 생성하는 또 다른 적당한 발효 유기체를 이용한 동시 당화 및 발효를 포함한다. 상기 발효 공정에서, 에탄올 함량은 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 또는 적어도 약 16% 에탄올에 달한다.
상기 중 임의의 측면에서 사용되는 전분 슬러리는 약 20% 내지 약 55% 건조 고체 입상 전분, 약 25% 내지 약 40% 건조 고체 입상 전분, 또는 약 30% 내지 약 35% 건조 고체 입상 전분을 가질 수 있다. 상기 효소 변이체는 가용성 전분을 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91 %, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 양으로 입상 전분의 가용성 전분 가수분해물로 전환시킨다.
또 다른 구현예에서, 상기 -아밀라아제 변이체는, 이에 제한되지 않으나 제트 쿠킹에 의한 호화를 포함하는, 호화 전분의 액화 또는 당화 공정에 사용된다. 상기 공정은 에탄올 등의 발효 생성물을 생성하기 위한 발효를 포함할 수 있다. 전분-함유 물질로부터 발효에 의해 에탄올을 생성하는 이러한 공정은 하기를 포함한다: (i) 상기 전분-함유 물질을 -아밀라아제 변이체로 액화시키는 단계; (ii) 수득된 액화 매시 (mash) 를 당화시키는 단계; 및 (iii) 단계 (ii) 에서 수득된 물질을 발효 유기체의 존재하에서 발효시키는 단계. 임의로 상기 공정은 에탄올의 회수를 추가로 포함한다. 상기 당화 및 발효 공정은 동시 당화 및 발효 공정 (SSF) 으로서 수행될 수도 있다. 발효 동안, 에탄올 함량은 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 예컨대 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 15%, 또는 적어도 16% 에탄올에 달한다.
상기 측면들에서 가공되는 전분은 덩이줄기, 뿌리, 줄기, 콩과 식물, 곡류 또는 전곡으로부터 수득된 것일 수 있다. 더 구체적으로는, 입상 전분은 옥수수, 옥수수속 (cobs), 밀, 보리, 귀리, 마일로 (milo), 사고 (sago), 카사바, 타피오카, 사탕수수, 쌀, 완두, 콩, 바나나, 또는 감자로부터 수득된 것일 수 있다. 특히 고려되는 것은 왁스성과 비-왁스성 유형의 옥수수 및 보리 모두이다.
본원에서 사용된 바, 용어 "액화" 또는 "액화하다" 는 전분이 좀더 짧은 사슬의 덜 점성인 덱스트린으로 전환되는 공정을 의미한다. 일반적으로, 상기 공정은 전분의 호화와 동시에 또는 그 후 -아밀라아제 변이체의 첨가를 수반한다. 부가적인 액화 유도 효소가 임의로 첨가될 수 있다. 본원에서 사용된 바, 용어 "일차 액화"는 슬러리의 온도가 호화 온도까지 또는 그 근처로 상승될 때의 액화 단계를 말한다. 온도 상승에 이어서, 슬러리를 열 교환기 또는 제트를 통해 약 90-150℃, 예컨대, 100-110℃ 의 온도로 한다. 열 교환 또는 제트 온도에 대한 적용에 이어, 슬러리를 상기 온도에서 3~10 분 동안 유지시킨다. 상기 90~150℃ 에서의 슬러리의 유지 단계를 일차 액화라 한다.
본원에서 사용된 바, 용어 "이차 액화"는 슬러리가 실온으로 냉각되는 경우, 일차 액화 (90~150℃ 까지 가열) 에 이은 액화 단계를 말한다. 상기 냉각 단계는 30 분 내지 180 분, 예를 들어, 90 분 내지 120 분일 수 있다. 본원에 사용된 바, 용어 "이차 액화의 분"은 이차 액화의 시작으로부터 덱스트로오스 당량 (Dextrose Equivalent: DE) 측정 시간까지의 경과된 시간을 말한다.
또 다른 측면에서는 -아밀라아제 변이체를 포함하는 조성물에서의 β-아밀라아제의 부가적인 사용이 고려되는데, β-아밀라아제 (EC 3.2.1.2) 는 외부-작용 말토오스 생성 아밀라아제로서, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 및 관련 글루코오스 중합체 중의 1,4--글루코시드 결합을 가수분해시켜, 말토오스를 방출시킨다. β-아밀라아제는 다양한 식물 및 미생물로부터 단리되었다(Fogarty 등, PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Vol. 15, pp. 112-115, 1979). 이러한 β-아밀라아제는 40℃ 내지 65℃ 범위의 최적 온도, 및 약 4.5 내지 약 7.0 범위의 최적 pH 를 갖는 것을 특징으로 한다. 고려되는 β-아밀라아제로서는, 이들에 한정되는 것은 아니나, 보리 Spezyme® BBA 1500, Spezyme® DBA, Optimalt™ ME, Optimalt™ BBA (Genencor International, Inc.); 및 Novozym™ WBA (Novozymes A/S) 로부터의 β-아밀라아제를 들 수 있다.
상기 조성물에서의 사용이 고려되는 또 다른 효소는 글루코아밀라아제 (EC 3.2.1.3) 이다. 글루코아밀라아제는 미생물 또는 식물로부터 유래된다. 예를 들어, 글루코아밀라아제는 진균 또는 세균 기원일 수 있다. 대표적인 세균 글루코아밀라아제는 아스페르길루스 글루코아밀라아제, 특히 A. 니게르 G1 또는 G2 글루코아밀라아제 (Boel 등 (1984), EMBO J. 3(5): 1097-1 102), 또는 이들의 변이체 (예컨대, WO 92/00381 및 WO 00/04136 에 개시된 것); A. 아와모리 글루코아밀라아제 (WO 84/02921); A. 오리재 글루코아밀라아제 (Agric. Biol. Chem. (1991), 55(4): 941-949), 또는 이들의 변이체 또는 절편이다.
기타 고려되는 아스페르길루스 글루코아밀라아제 변이체로서는, 열 안정성을향상시키는 하기 변이체들을 들 수 있다: G137A 및 G139A (Chen 등 (1996), Prot. Eng. 9: 499-505); D257E 및 D293E/Q (Chen 등 (1995), Prot. Eng. 8: 575-582); N182 (Chen 등 (1994), Biochem. J. 301: 275-281); 디술피드 결합, A246C (Fierobe 등 (1996), Biochemistry, 35: 8698-8704); 및 A435 및 S436 위치에 Pro 잔기 도입 (Li 등 (1997) Protein Eng. 10: 1199-1204). 기타 고려되는 글루코아밀라아제로는, 탈라로마이세스 글루코아밀라아제, 특히 T. 에메르소니이 (WO 99/28448), T. 레이세타누스 (T. leycettanus) (U.S. 특허 제 RE 32,153 호), T. 듀폰티 (T. duponti), 또는 T. 테르모필루스 (T. thermophilus) (U.S. 특허 제 4,587,215 호) 로부터 유래된 것을 들 수 있다. 고려되는 세균 글루코아밀라아제로서는, 클로스트리디움 (Clostridium) 속, 특히 C. 테르모아밀로라이티쿰 (C. thermoamylolyticum) (EP 135138) 및 C. 테르모히드로술푸리쿰 (C. thermohydrosulfuricum) (WO 86/01831) 으로부터의 글루코아밀라아제를 들 수 있다. 적당한 글루코아밀라아제로서는, 아스페르길루스 오리재로부터의 글루코아밀라아제, 예컨대 WO 00/04136 에서 서열번호:2 로 나타난 아미노산 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 심지어 90% 상동성을 가진 글루코아밀라아제를 들 수 있다. 또한 적당한 것은 시판 글루코아밀라아제, 예컨대 AMG 200L; AMG 300L; SAN™ SUPER 및 AMG™ E (Novozymes); OPTIDEX® 300 (Genencor International, Inc.); AMIGASE™ 및 AMIGASE™ PLUS (DSM); G-ZYME® G900 (Enzyme Bio-Systems); 및 G-ZYME® G990 ZR (A. 니게르 글루코아밀라아제 및 저 프로테아제 함량) 이다. 글루코아밀라아제는 0.02-2.0 AGU/g DS, 또는 0.1-1.0 AGU/g DS, 예컨대, 0.2 AGU/g DS 의 양으로 첨가될 수 있다.
부가적인 효소 변이체를 상기 조성물에 포함시킬 수 있다. 2 가지 이상의 α-아밀라아제 변이체를 단독으로 또는 본원에 논의된 다른 효소들과 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 세번째 효소는 효모 -아밀라아제 등의 또 다른 -아밀라아제 또는 또 다른 -아밀라아제 변이체일 수 있다. 이들은 바실러스 -아밀라아제 또는 비-바실러스 (non-Bacillus) -아밀라아제일 수 있다.
임의로 첨가될 수 있는 또 다른 효소는 탈분지화 효소, 예컨대 이소아밀라아제 (EC 3.2.1.68) 또는 풀루라나아제 (EC 3.2.1.41) 이다. 이소아밀라아제는 아밀로펙틴 중의 -1,6-D-글루코시드 분지 결합 및 β-제한 덱스트린을 가수분해하고, 이소아밀라아제가 풀루란을 공격하지 못함에 의해, 그리고 -제한 덱스트린에 대한 이소아밀라아제의 제한된 작용에 의해 풀루라나아제와 구별될 수 있다. 탈분지화 효소는 당업자에게 잘 알려진 유효량으로 첨가될 수 있다.
상기 공정의 생성물의 정확한 조성은 적용되는 효소의 조합 뿐 아니라 가공되는 입상 전분의 유형에 따라 다르다. 가용성 가수분해물은 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95.0%, 적어도 약 95.5%, 적어도 약 96.0%, 적어도 약 96.5%, 적어도 약 97.0%, 적어도 약 97.5%, 적어도 약 98.0%, 적어도 약 98.5%, 적어도 약 99.0% 또는 적어도 약 99.5% 의 순도를 가진 말토오스일 수 있다. 다르게는, 가용성 전분 가수분해물은 글루코오스이고, 또는 전분 가수분해물의 DE (총 가용화된 건조 고체의 글루코오스 %) 는 적어도 94.5%, 적어도 95.0%, 적어도 95.5%, 적어도 96.0%, 적어도 96.5%, 적어도 97.0%, 적어도 97.5%, 적어도 98.0%, 적어도 98.5%, 적어도 99.0% 또는 적어도 99.5% 이다. 일 구현예에서, 아이스 크림, 케이크, 캔디, 과일 통조림의 제조 공정은 글루코오스, 말토오스, DP3 및 DPn 의 혼합물을 함유하는 특수 시럽을 사용한다.
하기 2 가지 도정 공정이 적합하다: 습식 도정 및 건식 도정. 건식 도정에서, 전립 (whole kernel) 을 도정하여 사용한다. 습식 도정은 배아 및 거친가루 (전분 과립 및 단백질) 를 양호하게 분리하는데, 보통 전분 가수분해물을 시럽 제조에 사용하는 경우에 사용된다. 건식 및 습식 도정 모두 전분 가공 업계에 잘 알려져 있으며, 개시된 조성물 및 방법으로의 사용에 또한 고려된다. 상기 공정은 잔존물 (retentate) 이 효소, 생 (raw) 전분 및 물의 존재하의 재순환 하에서 유지되고, 투과물 (permeate) 이 가용성 전분 가수분해물인 한외여과 시스템에서 수행될 수 있다. 또 다른 방법은 잔존물이 효소, 생 전분 및 물의 존재하의 재순환 하에서 유지되고, 투과물이 가용성 전분 가수분해물인 한외여과 막을 가진 연속 막 반응기에서 수행되는 공정이다. 또한 고려되는 것은 잔존물이 효소, 생 전분 및 물의 존재하의 재순환 하에서 유지되고, 투과물이 가용성 전분 가수분해물인 미세여과 막을 가진 연속 막 반응기에서 수행되는 공정이다.
한 가지 점에서, 상기 공정의 가용성 전분 가수분해물은 고 과당 전분계 시럽 (HFSS), 예컨대 고 과당 옥수수 시럽 (HFCS) 으로의 전환에 적용된다. 상기 전환은 글루코오스 이소머라아제, 특히 고체 지지체에 고정된 글루코오스 이소머라아제를 사용하여 달성할 수 있다. 고려되는 이소머라아제로서는 시판 제품 Sweetzyme®, IT (Novozymes A/S); G-zyme® IMGI, 및 G-zyme® G993, Ketomax®, G-zyme® G993, G-zyme® G993 액체, 및 GenSweet® IGI 를 들 수 있다.
또 다른 측면에서, 생성된 가용성 전분 가수분해물은 연료 또는 음용 에탄올의 생성을 가져온다. 세번째 측면의 공정에서, 발효는 입상 전분 슬러리의 가수분해와 동시에 또는 별도로/후속적으로 수행될 수 있다. 발효가 상기 가수분해와 동시에 수행되는 경우, 온도는 30℃ 내지 35℃, 특히 31℃ 내지 34℃ 일 수 있다. 공정은, 잔존물이 효소, 생 전분, 효모, 효모 영양분 및 물의 존재하의 재순환 하에서 유지되고 투과물은 에탄올 함유 액체인 한외여과 시스템에서 수행될 수 있다. 또한 고려되는 것은, 잔존물이 효소, 생 전분, 효모, 효모 영양분 및 물의 존재하의 재순환 하에서 유지되고 투과물은 에탄올 함유 액체인 한외여과 막을 가진 연속 막 반응기에서 수행되는 공정이다.
상기 공정의 가용성 전분 가수분해물은 또한 처리된 전분을, 시트르산, 모노나트륨 글루타메이트, 글루콘산, 글루콘산나트륨, 글루콘산칼슘, 글루콘산칼륨, 글루코노 델타-락톤, 또는 에리토르브산나트륨 등의 발효 생성물로 발효시키는 것을 포함하는 발효 생성물의 제조에 사용될 수 있다.
-아밀라아제 변이체의 전분 가수분해 활성은 기질로서 감자 전분을 사용하여 측정할 수 있다. 상기 방법은 상기 효소에 의한 개질된 감자 전분의 분해에 기반하며, 상기 반응에 이어 전분/효소 용액의 시료를 요오드 용액을 혼합한다. 초기에는, 검정빛이 도는 청색 색조가 형성되나, 전분이 분해되는 동안 청색 색조가 옅어지고 점차 붉은빛이 도는 갈색으로 변하는데, 이것을 착색된 유리 표준과 비교한다.
9. 직물 발호 조성물 및 용도
또한 고려되는 것은 -아밀라아제 변이체 중 하나 이상을 사용하는 섬유를 (예컨대, 직물을 발호하기 위해) 처리하는 조성물 및 방법이다. -아밀라아제 변이체는 당업계에 잘 알려진 임의의 섬유-처리 방법에 사용될 수 있다(예를 들어 미국 특허 제 6,077,316 호 참조). 예를 들어, 일 측면에서 섬유의 촉감 및 외양은 용액에서 섬유를 용액 중에서 효소 변이체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 개선된다. 일 측면에서는, 섬유를 압력하에서 용액으로 처리한다.
일 측면에서는, 효소들을 직물의 방적 동안 또는 그 후, 또는 발호 단계, 또는 하나 이상의 부가적인 섬유 가공 단계 동안 적용한다. 직물의 방적 동안, 실은 상당한 기계적 스트레인 (mechanical strain) 에 노출된다. 기계 직기 (loom) 에서 방적하기 전, 직물의 인장 강도를 증가시키고 파손을 방지하기 위해 경사 (warp yarn) 를 종종 사이징 (sizing) 전분 또는 전분 유도체로 코팅한다. -아밀라아제 변이체는 이러한 사이징 전분 또는 전분 유도체를 제거하기 위해 적용될 수 있다. 직물 방적 후, 섬유는 발호 단계를 거칠 수 있다. 이어서 하나 이상의 부가적인 직물 가공 단계가 뒤따를 수 있다. 발호는 직물로부터 사이즈 (size) 를 제거하는 작용이다. 방적 후, 균질하고 내세탁성 (wash-proof) 인 결과를 확보하기 위해서는 섬유의 추가 가공 전에 사이즈 코팅을 제거하여야 한다. 또한 것은 효소 변이체의 작용에 의한 사이즈의 효소적 가수분해를 포함하는 발호 방법이 제공된다. -아밀라아제 변이체는, 예컨대, 수성 조성물 등에서, 세제 첨가제로서 면-함유 섬유를 비롯한 섬유 발호를 위해 단독으로 또는 기타 발호 화학 시약 및/또는 발호 효소와 함께 사용될 수 있다. -아밀라아제 변이체는 또한 인디고-염색 데님 섬유 및 의류에 스톤워시 룩 (stonewashed look) 을 생성하기 위한 조성물 및 방법에도 사용될 수 있다. 의복의 제조를 위해, 섬유를 절단 및 재봉하여 의복 또는 의류가 되도록 할 수 있는데, 이들은 차후에 마감된다. 특히, 데님 청바지의 제조를 위해, 상이한 효소 마감 방법이 개발되었다. 데님 의류 마감은 통상적으로 효소 발호 단계로 시작하는데, 이 단계 동안 섬유에 유연성을 부여하고 연이은 효소 마감 단계에 면이 좀 더 영향받을 수 있도록 하게 하기 위해 의류를 전분가수분해 효소의 작용에 적용시킨다. -아밀라아제 변이체는 데님 의류 마감 (예를 들어, "바이오-스토닝 (bio-stoning) 공정"), 효소 발호 및 섬유에 유연성을 부여하는 방법, 및/또는 마감 공정에 사용될 수 있다.
10. 제빵 및 식품 제조용 조성물 및 방법
제빵 및 식품 제조를 위한 가루의 상업적 및 가정용 사용을 위해, 가루 중에 -아밀라아제 활성의 적절한 수준을 유지하는 것이 중요하다. 활성 수준이 너무 높으면, 끈적이고/이거나 설익고 상품가치가 없는 생성물이 야기될 수 있으나; -아밀라아제 활성이 불충분한 가루는 적절한 효모 작용에 충분한 당을 함유하지 않아, 건조하고 푸석푸석한 빵을 산출할 수 있다. 따라서, 가루 중의 내생적인 -아밀라아제 활성 수준을 증대시키기 위해 -아밀라아제 변이체 폴리펩티드를 그 자체로 또는 또 다른 -아밀라아제(들)와 조합하여, 가루에 첨가할 수 있다. 상기 -아밀라아제는 전분의 존재하에서 전형적으로 예를 들어 30-90℃, 50-80℃, 55-75℃, 또는 60-70℃ 범위의 최적 온도를 갖는다. 최적 온도는 pH 5.5 의 가용성 전분 1% 용액에서 측정될 수 있다.
곡물 및 기타 식물 제품을 제빵에서 사용하는 것 외에도, 보리, 귀리, 밀과 같은 곡물 뿐 아니라, 옥수수, 홉 및 쌀과 같은 식물 성분은 산업용 및 가정용 양조 모두에서의 양조에 사용된다. 양조에 사용되는 성분들은 맥아로 만들지 않을 수도 있고, 또는 맥아로 만들어, 즉, 부분적 발아시켜, -아밀라아제를 비롯한 효소들의 수준을 증가시킬 수도 있다. 성공적인 양조를 위해서는, 발효를 위한 적절한 수준의 당을 보장하기 위해 적절한 수준의 -아밀라아제 효소 활성이 필요하다. 따라서 -아밀라아제 변이체 폴리펩티드를 그 자체로 또는 또 다른 -아밀라아제(들)와 조합하여, 양조에 사용되는 성분들에 첨가할 수 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 "가루" 는 도정하거나 또는 분쇄한 곡물 낟알을 의미한다. 용어 "가루" 는 또한 분쇄하거나 또는 짓이긴 사고 (Sago) 또는 덩이줄기 제품을 의미할 수 있다. 일부 구현예에서, 가루는 또한 도정하거나 또는 짓이긴 곡물 또는 식물성 물질 외에 성분들을 함유할 수 있다. 한정하려는 의도는 아니지만, 추가 성분의 예는 팽창제이다. 곡물 낟알에는 밀, 귀리, 호밀 및 보리를 들 수 있다. 덩이줄기 제품으로는 타피오카 가루, 카사바 가루 및 커스터드 가루를 들 수 있다. 용어 "가루"에는 또한 분쇄 옥수수 가루, 흰옥수수 가루 (maize-meal), 쌀가루, 통밀가루, 셀프 라이징 가루 (self-rising flour), 타피오카 가루, 카사바 가루, 분쇄한 쌀, 강화 밀가루 및 커스터드 가루를 들 수 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 "스톡(stock)" 은 압착되거나 또는 부서진 곡물 및 식물 성분을 의미한다. 예를 들어, 맥주 제조에 사용되는 보리는 발효를 위한 매시 (mash) 제조에 적절한 점조도 (consistency) 를 제공하기 위해 거칠게 분쇄되거나 압착된 곡물이다. 본원에 사용된 바, 용어 "스톡" 에는 압착되거나 거칠게 분쇄된 형태의 임의의 상기 언급한 유형의 식물 및 곡물이 포함된다. 본원에 기재된 방법은 가루 및 스톡 모두에서의 -아밀라아제 활성 수준 측정에 사용될 수 있다.
또한, -아밀라아제 변이체 폴리펩티드를, 제빵 제품의 노화 (staling), 즉 속이 굳는 것을 방지 또는 지연시키기 위해, 단독으로 또는 다른 아밀라아제와 조합하여 첨가할 수 있다. 노화 방지 (anti-staling) 아밀라아제의 양은 전형적으로 가루 1 kg 당 효소 단백질 0.01 내지 10 mg 범위, 예를 들어, 1 내지 10 mg/kg 일 것이다. -아밀라아제 변이체 폴리펩티드와 조합하여 사용할 수 있는 부가적인 노화 방지 아밀라아제로서는 엔도-아밀라아제, 예를 들어, 바실러스 유래의 세균 엔도-아밀라아제를 들 수 있다. 부가적인 아밀라아제는 말토오스 생성 -아밀라아제 (EC 3.2.1.133), 예컨대, 바실러스 유래의 것일 수 있다. Novamyl® 는 B. 스테아로테르모필루스 균주 NCIB 11837 유래의 말토오스 생성 -아밀라아제이며, 이는 [Christophersen 등, Starch, 50(1): 39-45 (1997)] 에 기재되어 있다. 노화 방지 엔도-아밀라아제의 다른 예로서는 B. 리체니포르미스 또는 B. 아밀로리쿠에파시엔스와 같은 바실러스에서 유래한 세균 -아밀라아제를 들 수 있다. 상기 노화 방지 아밀라아제는 대두 등의 식물 공급원 또는 바실러스 등의 미생물 공급원 유래의, β-아밀라아제 등의 엑소-아밀라아제일 수 있다.
-아밀라아제 변이체 폴리펩티드를 포함하는 제빵 조성물은 추가로 포스포리파아제를 함유할 수 있다. 포스포리파아제는 인지질로부터 지방산을 제거하여 리소-인지질을 형성하는 A1 또는 A2 활성을 가질 수 있다. 이는 리파아제 활성, 즉 트리글리세리드에 대한 활성을 갖거나 또는 갖지 않을 수 있다. 포스포리파아제는 전형적으로 30-90℃, 예컨대, 30-70℃ 범위의 최적 온도를 가질 수 있다. 첨가되는 포스포리파아제는 동물 기원, 예를 들어, 소 또는 돼지 췌장 등의 췌장, 뱀독 또는 벌독 유래의 것일 수 있다. 다르게는, 포스포리파아제는 미생물 기원, 예컨대, 하기의 속 또는 종 등의 사상 진균, 효모 또는 세균 유래의 것일 수 있다: 아스페르길루스, A. 니게르; 딕티오스텔리움 (Dictyostelium), D. 디스코이데움 (D. discoideum); 무코르, M. 자바니쿠스 (M. javanicus), M. 무세도 (M. mucedo), M. 서브틸리시무스 (M. subtilissimus); 네우로스포라 (Neurospora), N. 크라사 (N. crassa); 리조무코르, R. 푸실러스 (R. pusillus); 리조푸스 (Rhizopus), R. 아리주스 (R. arrhizus), R. 자포니쿠스 (R. japonicus), R. 스톨로니퍼 (R. stolonifer); 스클러로티니아 (Sclerotinia), S. 리베르티아나 (S. libertiana); 트리코피톤 (Trichophyton), T. 루브룸 (T. rubrum); 웨트겔리니아 (Whetzelinia), W. 스클레로티오룸 (W. sclerotiorum); 바실러스, B. 메가테리움, B. 서브틸리스; 시트로박터 (Citrobacter), C. 프룬디이 (C. freundii); 엔테로박터 (Enterobacter), E. 아에로게네스 (E. aerogenes), E. 클로아카에 (E. cloacae); 에드워드시엘라 (Edwardsiella), E. 타르다 (E. tarda); 에르위니아 (Erwinia), E. 헤르비콜라 (E. herbicola); 에스케리키아, E. 콜리; 클레브시엘라 (Klebsiella), K. 뉴모니아에 (K. pneumoniae); 프로테우스 (Proteus), P. 불가리스 (P. vulgaris); 프로비덴시아 (Providencia), P. 스투아르티이 (P. stuartii); 살모넬라 (Salmonella), S. 티피무리움 (S. typhimurium); 세라티아 (Serratia), S. 리쿠에파시엔스 (S. liquefasciens), S. 마르세센스 (S. marcescens); 시겔라 (Shigella), S. 플렉스네리 (S. flexneri); 스트렙토마이세스, S. 비올레세오루베르 (S. violeceoruber); 예르시니아 (Yersinia), Y. 엔테로콜리티카 (Y. enterocolitica); 푸사리움, F. 옥시스포룸 (예를 들어, 균주 DSM 2672).
포스포리파아제는 제빵 후 초기의 기간, 특히 처음 24 시간 동안 빵의 부드러움을 개선하는 양으로 첨가된다. 포스포리파아제의 양은 전형적으로 가루 1 kg 당 효소 단백질 0.01-10 mg, 예컨대, 0.1-5 mg/kg 의 범위일 것이다. 즉, 포스포리파아제 활성은 일반적으로 가루 1 kg 당 20-1000 리파아제 유닛 (Lipase Unit; LU) 범위일 것인데, 이 때, 리파아제 유닛은 30℃, pH 7.0 에서, 유화제로서 아라비아 검 및 기질로서 트리부티린을 이용하여 분당 1 μmol 의 부티르산을 방출하는데 필요한 효소의 양으로 정의된다.
반죽 조성물은 일반적으로 굵은 밀가루 또는 밀가루 및/또는 기타 유형의 굵은 가루, 가루 또는 전분, 예컨대 옥수수 가루, 옥수수 전분, 굵은 호밀 가루, 호밀 가루, 귀리 가루, 오트밀, 대두 가루, 굵은 사탕수수 가루, 사탕수수 가루, 굵은 감자 가루, 감자 가루 또는 감자 전분을 함유한다. 반죽은 새로 만든 것이거나, 냉동된 것이거나 또는 반만 구운 (par-baked) 것일 수 있다. 반죽은 발효된 반죽 또는 발효시킬 반죽일 수 있다. 반죽은 중탄산나트륨 등의 화학 팽창제의 첨가 또는 발효소, 즉, 발효 반죽의 첨가와 같은 다양한 방식으로으로 발효시킬 수 있다. 또한 반죽은 적당한 효모 배양물, 예컨대 사카로마이세스 세레비지애 (제빵 효모) 의 배양물, 예컨대, 시판 S. 세레비지애 균주를 첨가하여 발효시킬 수 있다.
반죽은 또한 기타 통상적인 반죽 성분, 예컨대, 단백질, 예컨대 분유, 글루텐 및 대두; 달걀 (예컨대, 달걀 전체, 노른자 또는 흰자); 산화제, 예컨대 아스코르브산, 브롬산칼륨, 요오드산칼륨, 아조디카르본아미드 (ADA) 또는 암모늄 퍼술페이트; 아미노산, 예컨대 L-시스테인; 당; 또는 염, 예컨대 염화나트륨, 아세트산칼슘, 황산나트륨 또는 황산칼슘을 포함할 수 있다. 반죽은 지방, 예컨대, 트리글리세리드, 예컨대 과립화된 지방 또는 쇼트닝을 추가로 포함할 수 있다. 반죽은 추가로 유화제, 예컨대 모노- 또는 디글리세리드, 모노- 또는 디글리세리드의 디아세틸 타르타르산 에스테르, 지방산의 당 에스테르, 지방산의 폴리글리세롤 에스테르, 모노글리세리드의 락트산 에스테르, 모노글리세리드의 아세트산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 리소레시틴을 포함할 수 있다. 특히, 반죽은 유화제의 첨가 없이 제조될 수 있다.
임의로, 부가적인 효소는 노화 방지 아밀라아제 및 포스포리파아제와 함께 사용될 수 있다. 부가적인 효소는 제 2 의 아밀라아제, 예컨대 아밀로글루코시다아제, β-아밀라아제, 시클로덱스트린 글루카노트랜스페라아제일 수 있고, 또는 부가적인 효소는 펩티다아제, 특히 엑소펩티다아제, 트랜스글루타미나아제, 리파아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 특히 펜토사나아제, 예컨대 자일라나아제, 프로테아제, 예를 들어, WO 95/00636 에 개시된 단백질 디술피드 이소머라아제 등의 단백질 디술피드 이소머라아제, 글루카노트랜스퍼라아제, 분지화 효소 (1,4--글루칸 분지화 효소), 4--글루카노트랜스퍼라아제 (덱스트린 글리코실트랜스퍼라아제) 또는 옥시도리덕타아제, 예컨대, 퍼옥시다아제, 락카아제, 글루코오스 옥시다아제, 피라노오스 옥시다아제, 리폭시게나아제, L-아미노산 옥시다아제 또는 탄수화물 옥시다아제일 수 있다. 부가적인 효소는 포유류 및 식물, 및 특히 미생물 (세균, 효모 또는 진균) 기원을 비롯한 임의의 기원의 것일 수 있으며, 이는 당업계에 통상적으로 사용되는 기술로 수득할 수 있다.
자일라나아제는 전형적으로 미생물 기원, 예컨대, 세균 또는 진균, 예컨대 아스페르길루스 균주, 특히 A. 아쿨레아투스 (A. aculeatus), A. 니게르 (WO 91/19782 참조), A. 아와모리 (예컨대, WO 91/18977) 또는 A. 투비겐시스 (예컨대, WO 92/01793); 트리코더마의 균주, 예컨대 T. 리이세이 또는 휴미콜라의 균주, 예컨대, H. 인솔렌스 (예컨대, WO 92/17573) 로부터 유래된 것일 수 있다. Pentopan® 및 Novozym 384® 는 트리코더마 리이세이로부터 생성된, 시판 자일라나아제 제제이다. 아밀로글루코시다아제는 A. 니게르 아밀로글루코시다아제 (예컨대 AMG®) 일 수 있다. 기타 유용한 아밀라아제 생성물로는, Grindamyl® A 1000 또는 A 5000 (Grindsted Products 로부터 입수가능, 덴마크) 을 들 수 있다. 글루코오스 옥시다아제는 진균 글루코오스 옥시다아제, 특히 아스페르길루스 니게르 글루코오스 옥시다아제 (예컨대, Gluzyme®) 일 수 있다. 대표적인 프로테아제는 Neutrase® 이다. 대표적인 리파아제는 하기로부터 유래된 것일 수 있다: 테르모마이세스 (휴미콜라), 리조무코르, 칸디다 (Candida), 아스페르길루스, 리조푸스, 또는 슈도모나스의 균주, 특히 테르모마이세스 라누기노수스 (휴미콜라 라누기노사 (Humicola lanuginosa)), 리조무코르 미에헤이, 칸디다 안타르크티카 (Candida antarctica), 아스페르길루스 니게르, 리조푸스 델레마르 (Rhizopus delemar) 또는 리조푸스 아리주스 또는 슈도모나스 세파시아. 특정 구현예에서, 리파아제는, 예를 들어, WO 88/02775 에 기재된 바와 같은 칸디다 안타르크티카로부터 유래한 리파아제 A 또는 리파아제 B 일 수 있고, 또는 리파아제는, 예를 들어, EP 238,023 에 기재된 바와 같은 리조무코르 미에헤이, 또는, 예를 들어, EP 305,216 에 기재된 휴미콜라 라누기노사, 또는, 예를 들어, EP 214,761 및 WO 89/01032 에 기재된 바와 같은 슈도모나스 세파시아로부터 유래한 것일 수도 있다.
상기 공정은 부드럽거나 또는 바삭바삭한 특징의, 또는 백색, 밝은색 또는 어두운색 유형의 반죽으로 제조된 임의 종류의 제빵 제품에 이용할 수 있다. 예로서는, 빵, 특히, 정백된 (white), 통곡물 또는 호밀 빵 (전형적으로 덩어리 또는 롤 형태임), 프렌치 바게트형 빵, 피타빵, 토티야, 케이크, 팬케이크, 비스킷, 쿠키, 파이 크러스트, 크리스피빵 (crisp bread), 찐빵, 피자 등이 있다.
또 다른 구현예에서, -아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 노화 방지 아밀라아제, 포스포리파아제 및 인지질과 함께 가루를 포함하는 프리믹스에서 사용될 수 있다. 프리믹스는 기타 반죽 개선 및/또는 빵 개선 첨가제, 예컨대 상기에 언급한 효모를 비롯한 임의의 첨가제를 함유할 수 있다. 일 측면에서, -아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 제빵 첨가제로서 사용하기 위한, 노화 방지 아밀라아제 및 포스포리파아제를 포함하는 효소 제제 성분이다.
효소 제제는 임의로 과립 또는 응집된 분말의 형태이다. 상기 제제는 입자의 95% (중량비) 이상이 25 내지 500 μm 의 범위인 좁은 입자 크기 분포를 가질 수 있다. 과립 또는 응집된 분말은, 유동층 과립제조기에서의 담체 상에 -아밀라아제 변이체 폴리펩티드를 분사하는 등의 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 담체는 적당한 입자 크기를 가진 미립자 코어로 이루어질 수 있다. 담체는 가용성이거나 또는 불용성일 수 있는데, 예컨대 염 (예컨대, NaCl 또는 황산나트륨), 당 (예컨대, 수크로오스 또는 락토오스), 당 알콜 (예컨대, 소르비톨), 전분, 쌀, 콘그릿츠 또는 대두일 수 있다.
또 다른 측면에서는, -아밀라아제 변이체 폴리펩티드를 포함하는 입자, 즉, -아밀라아제 입자의 외피형성이 고려된다. 외피형성된 -아밀라아제 입자를 제조하기 위해, 효소를 -아밀라아제 입자 전부가 현탁될 수 있도록 하는 충분한 양의 식품 등급의 지질과 접촉시킨다. 본원에 사용된 바와 같이, 식품 등급의 지질은 물에는 불용성이나, 탄화수소 또는 디에틸 에테르와 같은 비극성 유기 용매에는 가용성인 임의의 자연 유기 화합물일 수 있다. 적당한 식품 등급의 지질로서는, 이들에 한정되는 것은 아니나, 포화 또는 불포화의 지방 또는 오일 형태의 트리글리세리드를 들 수 있다. 포화 트리글리세리드를 구성하는 지방산 및 이들의 조합의 예로서는, 이들에 한정되는 것은 아니나, 부티르산 (유지방으로부터 유도됨), 팔미트산 (동물 및 식물 지방으로부터 유도됨) 및/또는 스테아르산 (동물 및 식물 지방으로부터 유도됨) 을 들 수 있다. 불포화 트리글리세리드를 구성하는 지방산 및 이들의 조합의 예로서는, 이들에 한정되는 것은 아니나, 팔미트올레산 (동물 및 식물 지방으로부터 유도됨), 올레산 (동물 및 식물 지방으로부터 유도됨), 리놀레산 (식물 오일로부터 유도됨), 및/또는 리놀렌산 (아마인유로부터 유도됨) 을 들 수 있다. 기타 적당한 식품 등급의 지질로는, 이들에 한정되는 것은 아니나, 상기 논의된 트리글리세리드로부터 유도된 모노글리세리드 및 디글리세리드, 인지질 및 당지질을 들 수 있다.
특히 액체 형태인 식품 등급의 지질은, 지질 물질이 적어도 대부분, 예컨대 100% 의 -아밀라아제 입자의 표면 중 적어도 일부를 덮도록 하는 방식으로 -아밀라아제 입자의 분말 형태와 접촉한다. 따라서, 각각의 -아밀라아제 입자는 개별적으로 지질 내에 둘러싸인다. 예컨대, -아밀라아제 입자의 전부 또는 실질적으로 전부에, 얇고, 연속적인 지질 외피막이 제공된다. 이는, 먼저 용기에 일정량의 지질을 붓고, 이후 지질이 각각의 -아밀라아제 입자의 표면을 완전히 적시도록 -아밀라아제 입자를 슬러리화함으로써 달성될 수 있다. 단기간의 교반 후에, 표면에 상당량의 지질을 보유한, 외피형성된 -아밀라아제 입자를 회수한다. 원할 경우, 사용되는 지질의 유형에 대한 선택 및 더 두꺼운 막을 구축하기 위한 조작 반복에 의해, -아밀라아제 입자에 적용된 코팅의 두께를 조절할 수 있다.
적재된 전달 비히클의 저장, 취급 및 혼입은 패키지화 믹스를 이용하여 달성할 수 있다. 패키지화 믹스는 상기 외피형성된 -아밀라아제를 포함할 수 있다. 그러나, 패키지화 믹스는 제조업자 또는 제빵사의 필요에 따라 부가적인 성분들을 추가로 함유할 수 있다. 상기 외피형성된 -아밀라아제를 반죽에 혼입시킨 후, 제빵사는 제품에 대한 일반적인 제조 공정을 계속해 나간다.
-아밀라아제 입자의 외피형성의 장점은 두 가지가 있다. 첫째로, 식품 등급의 지질은 이열성 (heat labile) 인 이들 효소를 위해 제빵 공정 동안 열변성으로부터 상기 효소를 보호해 준다. 결과적으로, -아밀라아제는 상기 발효 및 제빵 단계 동안 안정화되고 보호되는 한편, 최종 제빵 제품에서 보호막으로부터 유리되는데, 여기서 이는 폴리글루칸에서의 글루코시드 결합을 가수분해한다. 적재된 전달 비히클은 또한 활성 효소를 제빵 제품 내로 서서히 방출시킨다. 즉, 제빵 공정 후, 활성 -아밀라아제는 노화를 방해하는 속도로 보호성 코팅으로부터 연속적으로 방출되어 노화 기작의 속도를 감소시킨다.
일반적으로, -아밀라아제 입자에 적용되는 지질의 양은, 지질의 특성, -아밀라아제 입자에 적용되는 방식, 처리할 반죽 혼합물의 조성 및 수반되는 반죽 혼합 조작의 세기에 좌우되어, -아밀라아제의 총 중량의 수 퍼센트로부터 상기 중량의 몇 배에 이르기까지 가변적일 수 있다.
적재된 전달 비히클, 즉 지질-외피형성 효소를 제빵 제품 제조에 사용되는 성분에 제빵 제품의 저장수명 연장에 유효한 양으로 첨가한다. 제빵사는 원하는 노화 방지 효과 달성에 필요한, 상기 논의된 바와 같이 제조되는 외피형성 -아밀라아제의 양을 계산한다. 상기 외피형성 알파-아밀라아제의 필요량은 외피형성 효소의 농도 및 특정화된 가루의 -아밀라아제 비율을 기초로 계산된다. 이미 논의한 바와 같이 관찰가능한 노화 방지 개선은 -아밀라아제 농도와 비례하여 대응하지는 않으며, 특정 최소 수준 이상에서, -아밀라아제 농도에 있어서의 큰 증가는 추가적인 개선을 거의 제공하지 않지만, 넓은 범위의 농도가 유효하다는 것을 발견했다. 특정 제빵 제조에 실제로 사용되는 -아밀라아제 농도는, 제빵사의 의도치 않은 측정하기 어려운 오차에 대한 일정한 보증을 제빵사에게 제공하기 위해 필요한 최소값보다 훨씬 더 큰 것일 수 있다. 효소 농도의 하한은 제빵사가 달성하고자 하는 최소의 노화 방지 효과에 의해 결정된다.
제빵 제품의 제조 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: (a) 지질-코팅된 -아밀라아제 입자를 제조하는 단계로서, 이 때 실질적으로 100 % 의 -아밀라아제 입자가 코팅되는 단계; (b) 가루를 함유하는 반죽을 혼합하는 단계; (c) 혼합 완료 전에 상기 지질-코팅된 -아밀라아제를 반죽에 첨가하고, 혼합을 종료한 후 -아밀라아제에서 지질 코팅을 제거하는 단계; (d) 반죽을 발효 (proofing) 시키는 단계; 및 (e) 반죽을 베이킹하여 제빵 제품을 제공하는 단계로서, 이 때 -아밀라아제는 혼합, 발효 및 베이킹 단계 동안 불활성화되며, 제빵 제품에서는 활성인 단계.
외피형성된 -아밀라아제를 혼합 싸이클 동안, 예컨대 혼합 사이클의 종료 즈음에 반죽에 첨가할 수 있다. 외피형성된 -아밀라아제는 반죽 전체에 외피형성된 -아밀라아제가 충분히 분포할 수 있게 하는 혼합 단계 중 한 시점에서 첨가하지만, 상기 혼합 단계에 대해서는, 상기 보호성 코팅이 -아밀라아제 입자(들)로부터 벗겨지기 전에 종료한다. 반죽의 유형 및 부피 및 믹서 작용 및 속도에 따라서, 1 분 내지 6 분 또는 그 이상의 어느 시점이 반죽에 외피형성된 -아밀라아제를 혼합시키기 위해 필요할 수 있으나, 2 내지 4 분일 때가 평균이다. 따라서, 몇가지 변수가 정확한 과정을 결정할 수 있다. 먼저, 외피형성된 -아밀라아제의 양은 총량이 외피형성된 -아밀라아제가 반죽 믹스를 통틀어 퍼질 수 있을 만큼 충분한 것이어야 한다. 외피형성된 -아밀라아제 제제가 고도로 농축된 경우, 외피형성된 -아밀라아제를 반죽에 첨가하기 전에 부가적인 오일을 프리믹스에 첨가해야 할 수도 있다. 요리법 및 제조 공정에는 특정한 개질이 필요할 수도 있으나; 일반적으로 빵 반죽 제형물에 특정화된 오일 25% 가 반죽에 계속 남아 있어서, 혼합 싸이클의 종료 즈음에 첨가될 경우 농축된 외피형성된 -아밀라아제에 대한 담체로 사용되는 경우에, 좋은 결과가 달성될 수 있다. 빵 또는 기타 제빵 제품에서, 지방 함량이 극히 낮은 요리법 (예컨대, 프랑스 스타일 빵) 의 경우, 건조 가루 중량의 대략 1% 의 외피형성된 -아밀라아제 혼합물이면 외피형성된 -아밀라아제와 반죽을 적절히 혼합하기에 충분하다는 것을 발견하였으나, 작업이 가능한 백분율 범위는 매우 넓어서, 제형물, 최종 제품 및 제빵사 개인의 제조 방법 요구에 좌우된다. 두번째로, 외피형성된 -아밀라아제 현탁액은 반죽으로의 완전한 혼합을 위해 혼합 싸이클에서 충분한 시간 동안 머무르면서 믹스에 첨가되어야 하나, 과도한 기계적인 작용이 외피형성된 -아밀라아제 입자의 많은 부분에서 보호용 지질 외피를 벗겨낼 정도로 일찍 첨가하지는 않도록 한다.
또 다른 구현예에서, 세균 -아밀라아제 (BAA) 가 -아밀라아제 변이체 폴리펩티드를 포함하는 지질로 코팅된 입자에 첨가된다. BAA 는 완전히 구워진 빵조각에서 그의 과도한 열안정성 및 남아있는 활성 때문에, 빵을 점착성이 있는 덩어리로 감소시키나, BAA 를 지질 코팅된 입자에 혼입시킬 경우, 심지어는 매우 낮은 BAA 투여 수준에서도 실질적인 부가적인 노화 방지 보호가 수득된다. 예컨대, 가루 100 파운드 당 150 RAU (Reference Amylase Units; 기준 아밀라아제 단위) 의 BAA 투여량이 유효한 것으로 나타났다. 일 구현예에서, 약 50 내지 2000 RAU 의 BAA 가 지질 코팅된 효소 생성물에 첨가된다. 이러한 낮은 BAA 투여 수준은, 효소가 완전히 구워진 빵조각에서 전분과 자유로이 접촉하는 것을 방지하는 보호성 코팅의 능력과 더불어서 (수증기가 그 코팅으로부터 효소를 무작위로 방출하는 경우는 제외) BAA 의 부정적인 부작용없이 매우 높은 수준의 노화 방지 활성을 달성하는 것을 돕는다.
의도된 용도의 취지 또는 범위로부터 벗어나지 않고 동일물을 사용하는 조성물 및 방법에 다양한 개질 및 변형이 이뤄질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 상기 개질 및 변형은 첨부된 청구항 및 이들의 등가물의 범위 내에 있는 것을 조건으로 한다.
상기 인용된 모든 참조문헌들은 그들의 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
실시예 1
-아밀라아제 변이체 개발의 초기 단계로서, 상기 기술한 다양한 제형물에서 유리한 성능 특징을 나타낸 -아밀라아제를 선택하였다. 대표적인 -아밀라아제는 바실러스 종 번호 707 로부터의 것이다(서열번호: 1, Swissprot 등록번호 P19571 의 34-518 잔기).
그 다음, 숙주 세포에서 우수한 발현을 나타내고 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제에 대해 비교적 밀접한 서열 동일성을 가진 -아밀라아제를 동정하였 다. 이와 같은 -아밀라아제는 바실러스 종 A 7-7 (DSM 12368) -아밀라아제이다(서열번호:2; 또한 GenBank 등록번호 CAL48155, 서열번호:7 참조).
이들 -아밀라아제들의 성숙 아미노산 서열들을 비교한 것이 하기 도 1 에 나타나 있는데, 여기서 위쪽 서열은 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제 (서열번호: 1) 로부터의 것이고, 아래쪽 서열은 바실러스 종 A 7-7 (DSM 12368) -아밀라아제 (서열번호: 2) 로부터의 것이다. 485 개 아미노산 서열에서 단 33 개의 아미노산 위치들만이 상이하여, 상기 성숙 단백질들 간에 약 93% 의 서열 동일성을 제공한다. 상기 두 서열에서 차이가 나는 아미노산 위치들은 아래에서 강조되어 있다.
실시예 2
그 후 상기 두 서열에서 차이가 나는 아미노산들에 대해, 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제에서 발견되는 아미노산을 바실러스 종 A 7-7 (DSM 12368) -아밀라아제에서 발견되는 아미노산으로 치환이 발현에 미치는 잠재적인 영향에 대해 평가한다. 이러한 경우에, 각 제안된 변이체에 대해 3D 구조 모델을 생성하였는데, 이 때 상기 3D 구조 모델은 공지의 -아밀라아제 결정 구조를 기초로 하였다. 바실러스 종 번호 707 -아밀라아제에 대한 3D 구조 모델은 1WPC 의 Protein Database Brookhaven PDB/RSCB 단백질 데이터 뱅크 등록 번호를 갖는다. 상기 구조 모델은 특정 아미노산의 용매에의 노출 및 주어진 치환이 단백질 구조를 불안정하게 하는 정도를 평가하는데 이용되었다. 마지막으로, 상기 구조 모 델은 변이체에 있어서 특정 치환이 효소 표면의 소수성에 미치는 여향을 예측하는데 사용되었다. 용매에 노출되어 단백질의 소수성을 감소시키는 아미노산의 치환은 상기 변이체의 발현을 향상시킬 것으로 예상된다. 하기 표 1 에는 각종 가능한 아미노산 변경이 열거되어 있으며, 상기 기준들에 비추어 각각이 평가되어 있다.
실시예 3
상기 개시한 구조 모델링에 기초할 때, 하기 치환들이 특히 유리할 것으로 예상된다: N28R, S36D, M116W, R172Q, H183D, S255N 및 A256T. 또한 하기 치환이 유리할 것으로 예상된다: S83N, R142K, A186G, N251T, F441Y, S452R 및 K485N. 치환은, 예를 들어, 문헌 [Sambrook 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 제 2 판, Cold Spring Harbor, 1989 및 제 3 판, 2001] 에 기술된 바와 같이, 당업계에 익히 공지된 단백질 공학 기술로 이루어질 수 있다. 변이체들은 예를 들어 상기 기재된 기술들에 의해 발현 및 정제된다. 변이체들은 추가로 특이적 활성 및 발효액으로부터 회수된 변이체 단백질의 수준에 대해, 야생형 단백질과 비교하여, 평가된다.
변이체는 단일 아미노산 치환 또는, 상기 개시한 14 개 잔기 모두 또는 이들의 소집합의 치환을 비롯한 치환들의 조합을 포함할 수 있다. 돌연변이체들의 조합 라이브러리를 이용하여 소집합의 돌연변이를 제조하여 시험할 수 있다. 예를 들어, 모든 14 개 돌연변이를 가진 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드를 제한효소를 이용하여 분해하여 절편으로 할 수 있는데, 이 때 각 제한효소 절편은 하나 이상의 돌연변이를 인코딩한다. 라이브러리는, 각종 돌연변이 및 야생형 유전자 절편들을 무작위로 혼합하고, 이들을 당업계에 익히 공지된 결찰 절차를 이용하여 함께 결찰함으로써 구축할 수 있다. 생성된 핵산 중에서 다양한 돌연변이 소집합을 가진 전장 단백질을 인코딩하는 것을 선택한다.
실시예 4
발현이 향상된 707 아밀라아제 돌연변이체의 구축
발현 향상을 위해 6 개의 Amy707 아밀라아제 돌연변이체 (N28R, S36D, R172Q, H183D, S255N 및 A256T) 및 1 개의 이중 돌연변이 (S36D/S255N) 를 구축하였다.
코돈 최적화된, 합성 바실러스 종 번호 707 아밀라아제 유전자를 GeneArt Inc. (Toronto, 캐나다) 에서 주문하여, XhoI 절편 (EBS2XhoI_RV 및 PlatXho5_FW 프라이머들을 이용한 PCR) 으로서 벡터 pICatH (특허 WO/2005/052146 의 도 20) 내로 클로닝하였다. PCR 로 CAT 유전자에 대한 Amy707 유전자의 방향을 측정하여, 두 유전자가 동일한 방향 (oril) 을 가진 하나의 클론을 선별하여, pICatH-Amy707(oril) 로 명명하였다(도 3).
적격 (competent) B. 서브틸리스 균주 (BG3594comK) 를 pICatH-Amy707(oril) 로 형질전환하였다. 상기 B. 서브틸리스 균주에 대해서는 자일로오스 유도성 프로모터의 제어 하에 comK 유전자를 유도하여 적격하게 하였다(Hahn 등, Mol. Microbiol., 21:763-775 [1996]).
Qiagen 미니프렙 키트를 사용하여 B. 서브틸리스 세포로부터 pICatH-Amy707(ori) 플라스미드 DNA 를 단리하였다. 5O uL 미니프렙 DNA (~ 10-20 ng/uL), 10 uL dam 메틸라아제 1Ox 완충액 (NEB), S-아데노실 메티오닌 0.2 uL, dam 메틸라아제 4 uL, 멸균수 36 uL 를 이용하여 37℃에서 4 시간 동안 플라스미드 pICatH-Amy707 아밀라아제의 dam 메틸화를 실시하였다. 상기 반응 생성물을 QiaQuik (Qiagen 컬럼) 을 이용하여 단리하고, 상기 플라스미드 DNA 를 3O uL 완충액 EB (Qiagen) 로 용출하였다.
메틸화된 pICatH-707 아밀라아제 플라스미드를 Stratagene (La Jolla, CA) 사의 QuikChange® XL Multi Site-Directed Mutagenesis 키트를 이용한 Quick-Change Multi-Site 돌연변이생성 (QCMS) 에 적용하였다. 제조업자의 권장사항에 따라 반응 혼합물을 제조하였는데, 이는 하기로 이루어졌다: 총 25 uL 에 대해, 멸균수 15 μL, 반응 완충액 2.5μL, dNTP 믹스 1 μL, Quik 용액 0.5 μL, 순방향 (forward) 프라이머 (25uM) 0.5 μL, 역방향 프라이머 (25uM) 0.5 μL, pICatH-707 아밀라아제로 메틸화 및 정제된 플라스미드 (총 ~20-30ng) 4 μL, PfuTurbo® DNA 중합효소 1 μL. 순환 조건: 95℃ 1분 1X; 95℃ 1분 1X, 55℃ 1분 1X, 65℃ 18분 30X (X 는 순환 횟수를 나타냄).
사용된 프라이머들은 하기와 같았다:
QCMS PCR 후에, 1 uL 의 제한 효소 DpnI 를 상기 QCMS 반응물에 첨가하고, 37℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 추가로 0.5 uL 의 DpnI 를 첨가하고, 반응물을 37℃에서 추가로 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 시료 완충액 5 uL 중의 1 uL DpnI-분해 QCMS 반응물을 95℃에서 3 분간 인큐베이션하고, 4℃ 로 냉각시키고, 회전환 증폭 (rolling circle amplification; RCA) TempliPhi 키트 (Amersham Cat # 256400) 를 이용하여 증폭시켰다. 반응 완충액 5 uL 및 Phi29 중합효소 0.2 uL 를 상기 DpnI-분해 QCMS 반응물에 첨가하고, 30℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 완료 후, 효소를 Amersham 사의 프로토콜에 따라 불활성화하였다.
회전환 증폭 반응물을 탈이온수 중에서 10 배 희석하고, 2 ul 의 DNA 를 이용하여 100 uL 의 바실러스 서브틸리스 (유전자형: ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, degU Hy 32, oppA, ΔspoIIE3501, amyE::xylRPxylAcomK-ermC) 적격 세포를 형질전환시키고, 자일로오스로 유도하였다. 형질전환 반응물을 LB 한천 + 10ppm 네오마이신 + 1% 불용성 전분 플레이트 상에 플레이팅하고, 37 ℃ 에서 하룻밤 성장시켰다.
각 돌연변이생성 반응에 대해 4 개씩의 콜로니를 선별하고, 마이크로타이터 플레이트에서 멸균수 2OuL 중에 개별적으로 현탁시키고, 이들을 puReTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare) 를 이용한 콜로니 PCR 에 사용하였다. 상기 반응물은 세포 현탁액 2 uL , 물 22 uL, 및 각 707 PCR F1 & R1 프라이머 (각각 25 uM 스톡으로서임, 서열은 하기 나열됨) 0.5 uL 및 PureTaq 비드로 이루어졌다.
순환 조건은 하기와 같았다: 95℃ 4 분 1x; 95℃ 1 분, 53℃ 1 분, 72℃ 1 분, 25x: 72℃ 5 분 1x. 아가로오스 겔을 영동시켜, 상기 콜로니 PCR 반응이 성공적인 것을 확인하였다. ExoSAP-IT (GE Healthcare) 를 이용하여 프라이머들 및 dNTP 들을 제거하였다. PCR 산물 5 uL 를 2 uL 의 ExoSAP-IT 시약에 첨가하고, 반응물을 37℃에서 15 분간, 이어서 80℃ 에서 15 분간 인큐베이션하였다.
하기 프라이머들을 이용한 서열 분석을 위해 클론들을 Sequetech Corporation (Mountain View, CA) 사로 보내었다:
클론들 (N28R-1, S36D-4, R172Q-4, H183D-1, S255N-7, 또는 A256T-2) 을 5 ug/mL 클로람페니콜 및 1% 불용성 전분이 보충된 LB 플레이트 상에 스트리킹 (streaking) 하고, 37 ℃ 에서 하룻밤 성장시켰다. 표준 기술들을 이용하여 플라스미드들을 단리하였다.
숙주인 B. 리체니포르미스 (Δmpr, Δapr, Δcat) 를 원형질체 방법을 이용하여 자체 공지된 방식으로 앞서 서열분석한 클론들 중 하나로부터의 플라스미드 벡터로 형질전환하였다. Amy707 아밀라아제, N28R, S36D, R172Q, H183D, 및 S255N 에 대한 형질전환체들을 수득하였다. 모든 형질전환체 균주들에서 관심 유전자 (Amy707 또는 변이체 중 하나) 가 숙주 게놈 내로 편입되어 있었으며, 플라스미드 DNA 는 루프 아웃 (loop out) 되어 있었다.
실시예 5
진탕 플라스크에서의 단백질 발현
상기 형질전환된 B. 리체니포르미스 세포를 진탕 플라스크를 이용하여 순차적인 방식으로 5 ug/mL CMP 에서 75 ug/mL CMP 로 75 ug/mL 클로람페니콜 (CMP) 까지 증폭시킨 후, 단일한 전분 제거 콜로니가 수득될 때까지 플레이팅하였다. B. 리체니포르미스 세포에서 R172Q, H183D 및 S36D/S255N 에 대해 수득된 형질전환체들을 통합시키고, 루프 아웃하고, 증폭시켜, 50 ug/mL CMP 에서 성장시켰다. B. 리체니포르미스에서 N28R, S36D, 및 S255N 에 대해 수득된 형질전환체들을 통합시키고, 루프 아웃하고, 5 ug/mL CMP 에서 성장시켰다.
진탕 플라스크에서의 성장을 위해, 단일 변이체 콜로니들을 골라내어, 5 mL LB + 클로람페니콜이 적절한 농도로 담긴 긴 유리관에 접종하고, 5 - 6 시간 동안 성장시켜, 예비배양물을 수득하였다. 250 mL 차폐 (baffled) 진탕 플라스크에 50 mL 진탕 플라스크 배양 배지 (인산칼륨계, 4% 락토오스, 2% Nutrisoy) 를 충전하고, 거기에 1 mL 예비배양물을 접종하고, 37℃에서 250 rpm 으로 90 시간 동안 인큐베이션하였다. 분취물들을 원심분리하여, 배양 상청액을 수집하고, 이에 대해 아밀라아제 활성을 분석하거나, 또는 추가 사용시까지 -20℃에서 동결시켰다.
실시예 6
본 실시예에서는, 진탕 플라스크에서 성장시킨 B. 리체니포르미스에서 발현된 바실러스 종 번호 707 아밀라아제 및 707 아밀라아제 단일 위치 변이체들 (R172Q, H183D, 및 S255N) 및 2-위치 변이체 (S36D/S255N) 의 아밀라아제 활성을 하기 기술한 Megazyme Ceralpha 검정을 이용하여 시험하였다.
아밀라아제 활성에 대한 Megazyme Ceralpha 검정
본 검정은 Megazyme 엔도 알파-아밀라아제 키트 K-CERA 08/05 (AOAC Method 2002.01, Megazyme International Ireland) 에 대한 공개된 프로토콜을 변형한 것이다. 시약 바이알에는 비-환원성 말단-봉쇄(locked)된 p-니트로페닐 말토헵타오시드 (maltoheptaoside) (BPNPG7, 54.5 mg) 인 기질 및 열안정성 알파 글루코시다제 (pH 6.0 에서 125 U) 가 담겨있다. 상기 검정을 수행하기 위해, 1 개 바이알의 전체 내용물을 10.0 mL 의 증류수에 용해시킨다. 2 mL 분취물을 15 ml 스크류 캡 (screw cap) 튜브에서 동결 상태로 저장하였다. 사용 전에 각 튜브에 6 mL 검정 완충액 (5OmM Na 말산염, 2.6mM CaCl2, 5OmM NaCl, 0.002% Triton X-100, pH 6.7) 을 첨가하였다. 완충액 중의 기질 용액 0.79 mL 을 (바람직하게는 차폐된) 큐벳에 첨가하였다. 상기 큐벳을 홀더 (holder) 에 위치시키고, 바탕 판독값 (blank reading) 을 수득하였다. 그런 다음 10 μL 효소 시료 (검정 완충액에 희석된 것) 를 상기 큐벳에 첨가하고, 검정을 시작하였다. 400nm 또는 410nm 에서 분당 흡광도를 측정하고, 그 값들을 희석 및 단백질 농도에 대해 보정하였다. 각 변이체에 있어서의 아밀라아제 활성을 임의 단위로 기록하여, 도 4 에 나타내었다.
상기 인용된 모든 참조문헌들은 그들의 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
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GenBank CAL48155
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신호 서열을 포함하는 전장 CAL48155
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합성 뉴클레오티드 EBS2XhoI_RV
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합성 뉴클레오티드 Plat5XhoI_FW:
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합성 뉴클레오티드 707N28R-F
서열번호: 12
합성 뉴클레오티드 707N28R-R
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합성 뉴클레오티드 707S36D-F
서열번호:14
합성 뉴클레오티드 707S36D-R
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합성 뉴클레오티드 707R172Q-F
서열번호:16
합성 뉴클레오티드 707R172Q-R
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합성 뉴클레오티드 707H183D-F
서열번호:18
합성 뉴클레오티드 707H183D-R
서열번호:19
합성 뉴클레오티드 707S255N-F
서열번호:20
합성 뉴클레오티드 707S255N-R
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합성 뉴클레오티드 707A256T-F
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합성 뉴클레오티드 707A256T-R
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합성 뉴클레오티드 707 PCR F1
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합성 뉴클레오티드 707 PCR R1
서열번호:25
합성 뉴클레오티드 707 seq F1
서열번호:26
합성 뉴클레오티드 707 seq R1
서열목록제출서에 첨부하여 제출
Claims (63)
-
- 제 1 항의 핵산을 포함한 단리된 숙주 세포.
- 제 1 항의 단리된 핵산에 작동가능하게 연결된 벡터.
- 제 15 항의 벡터를 포함한 단리된 숙주 세포.
- 제 14 항 또는 제 16 항에 있어서, 미생물인 단리된 숙주 세포.
- 제 17 항에 있어서, 상기 미생물이 세균 또는 진균인 단리된 숙주 세포.
- 제 18 항에 있어서, 세균이 바실러스 서브틸리스, B. 리체니포르미스, B. 렌투스, B. 브레비스, B. 스테아로테르모필루스, B. 알칼로필루스, B. 아밀로리쿠에파시엔스, B. 코아굴란스, B. 키르쿨란스, B. 라우투스, B. 투링기엔시스, 스트렙토마이세스 리비단스 또는 S. 무리너스로 이루어진 군에서 선택되는 그람 양성 세균; 또는 에스케리키아 콜리 또는 슈도모나스 종인 그람 음성 세균인, 단리된 숙주 세포.
-
- 제 33 항에 있어서, 무-분진 과립, 미세과립, 안정화된 액체, 또는 보호된 효소의 형태인 세제 첨가제.
- 제 33 항에 있어서, 셀룰라아제, 프로테아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 카르보히드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 키티나아제, 큐티나아제, 시클로덱스트린 글루카노트랜스페라아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라아제, -갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, -글루코시다아제, β-글루코시다아제, 할로퍼옥시다아제, 인버타아제, 락카아제, 리파아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 펙틴 가수분해 효소, 펩티도글루타미나아제, 퍼옥시다아제, 파이타아제, 폴리페놀옥시다아제, 단백질 가수분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 풀루라나아제, 이소아밀라아제, 카라기나아제 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 효소를 추가로 포함하는 세제 첨가제.
- 제 33 항의 세제 첨가제를 포함한 세제 조성물.
- 제 37 항에 있어서, 셀룰라아제, 프로테아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 카르보히드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 키티나아제, 큐티나아제, 시클로덱스트린 글루카노트랜스페라아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라아제, -갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, -글루코시다아제, β-글루코시다아제, 할로퍼옥시다아제, 인버타아제, 락카아제, 리파아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 펙틴 가수분해 효소, 펩티도글루타미나아제, 퍼옥시다아제, 파이타아제, 폴리페놀옥시다아제, 단백질 가수분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 풀루라나아제, 이소아밀라아제, 카라기나아제, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터의 효소를 추가로 포함하는 세제 조성물.
- 제 39 항에 있어서, 계면활성제, 세척 강화제, 착화제, 중합체, 표백 시스템, 안정화제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제, 항부식제, 오염 현탁화제, 재오염방지제, 염료, 살균제, 하이드로토프, 변색 억제제 및 향료 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 손설겆이 또는 식기세척기용 조성물.
- 제 39 항에 있어서, 셀룰라아제, 프로테아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 카르보히드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 키티나아제, 큐티나아제, 시클로덱스트린 글루카노트랜스페라아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라아제, -갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, -글루코시다아제, β-글루코시다아제, 할로퍼옥시다아제, 인버타아제, 락카아제, 리파아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 펙틴 가수분해 효소, 펩티도글루타미나아제, 퍼옥시다아제, 파이타아제, 폴리페놀옥시다아제, 단백질 가수분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 풀루라나아제, 이소아밀라아제, 카라기나아제 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 효소를 추가로 포함하는, 손설겆이 또는 식기세척기용 조성물.
- 제 39 항의 손설겆이 또는 식기세척기용 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 식기 세정 방법.
- 제 43 항의 세탁 세제 첨가제를 포함하고, 계면활성제, 세척 강화제, 착화제, 중합체, 표백 시스템, 안정화제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제, 항부식제, 오염 현탁화제, 재오염방지제, 염료, 살균제, 하이드로토프, 형광 증백제, 섬유 유연제, 및 향료 중 하나 이상을 추가로 포함하는 세탁 세제 조성물.
- 제 43 항의 세탁 세제 첨가제를 적용하는 것을 포함하는, 세탁 방법.
- 제 46 항에 있어서, 용액, 분말, 페이스트, 겔, 액체, 연고, 정제 또는 겔의 형태인 균막 가수분해 조성물.
- 제 46 항에 있어서, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 프로테아제, 펙티나아제, 항균제, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 균막 가수분해 조성물.
- 제 46 항의 조성물을 균막을 가수분해하기에 충분한 시간 동안 적용하는 것을 포함하는, 균막 가수분해 방법.
- 제 50 항에 있어서, 글루코아밀라아제, 이소아밀라아제, 풀루라나아제, 파이타아제 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 전분 가공 조성물.
- 제 49 항의 조성물을 전분을 가공하기에 충분한 시간 동안 적용하는 것을 포함하는, 전분 가공 방법.
- 제 53 항의 조성물을 전분을 당화하기에 충분한 기간 동안 적용하는 것을 포함하는 전분 당화 방법.
- 제 55 항의 조성물을 전분을 액화하기에 충분한 기간 동안 적용하는 것을 포함하는 전분 액화 방법.
- 제 57 항에 있어서, 또 다른 효소를 추가로 포함하는 직물 발호 조성물.
- 제 57 항의 직물 발호 조성물을 직물을 발호하기에 충분한 시간 동안 적용하는 것을 포함하는 직물 발호 방법.
- 제 60 항의 제빵 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 제빵 방법.
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