KR20100025328A

KR20100025328A - 이중가닥 영역과 말단 단일가닥 영역을 포함하는 이중가닥 핵산 프로브가 고정된 마이크로어레이를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20100025328A
Application number: KR1020080084041A
Authority: KR
Inventors: 이주원
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2008-08-27
Filing date: 2008-08-27
Publication date: 2010-03-09
Also published as: ATE548470T1; US20100056397A1; CN101660211A; EP2159290A1; EP2159290B1

Abstract

본 발명은 광 지시에 의한 핵산의 합성과 혼성화에 의하여 핵산의 고정화 방법을 이용한 이중가닥 영역과 말단 단일가닥 영역을 포함하는 이중가닥 핵산 프로브가 고정된 마이크로어레이를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의하여, 스팟 밀도가 높으면서도 긴 프로브가 고정화된 마이크로어레이를 제조할 수 있다.

마이크로어레이, 마스크, 프로브

Description

이중가닥 영역과 말단 단일가닥 영역을 포함하는 이중가닥 핵산 프로브가 고정된 마이크로어레이를 제조하는 방법{Method of producing microarray having immoblized double strand nucleic acids comprising double strand region and terminal single strand region}

본 발명은 이중가닥 영역과 말단 단일가닥 영역을 포함하는 이중가닥 핵산 프로브가 고정된 마이크로어레이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

"광 지시된 (light directed)" 핵산 어레이의 제조방법은 알려져 있다 (예를 들면, 미국특허 제5,143,854호, 제5,744,305호, 및 제5,908,926호). 미국특허 제5,143,854호에 개시된 방법은 기판의 정의된 영역 (predefined region)을 활성화시킨 다음, 상기 기판을 미리선택된 모노머 용액과 접촉시키는 것과 관련된다. 상기 정의된 영역은 광원에 의하여, 일반적으로 마스크를 통하여 보여지는 광원에 의하여 활성화될 수 있다. 기판의 나머지 영역은 상기 마스크에 의하여 광원으로부터 차단되어 있고 화학적으로 보호되어 있기 때문에 불활성이다. 따라서, 광 패턴이 기판의 어느 영역이 주어진 모노머와 반응할지를 결정한다. 정의된 영역의 다른 세트의 활성화와 상기 기판과 다른 모노머 용액과의 접촉을 반복함으로써, 핵산의 다 양한 어레이가 기판 상에 생성된다. 물론, 기판으로부터 반응하지 않은 모노머 용액을 세척하는 것과 같은 다른 단계가 필요에 따라 사용될 수 있다.

광 지시된 핵산 어레이의 제조방법의 일 예를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. NVOC 및 MeNPOC와 같은 광분해성 보호기를 갖는 스페이서로 선택적으로 변형된, 고체 지지체의 표면은, 포토리소그래피 마스크를 통하여 조사되어, 조사된 영역 내에 반응성 기 (일반적으로 히드록실 기)를 생성한다. 다음으로, 5' 히드록실 기가 광 보호기로 보호된 3'-O-포스포아미다이트 활성화된 데옥시뉴클레오시드가 상기 표면에 제공되고 화학적 커플링이 광에 노출된 부위에서 일어난다. 캡핑(capping), 및 산화 반응 후, 상기 기판은 세척되고 제2 마스크로 상기 표면을 조사하여, 커플링을 위하여 추가의 히드록실 기를 노출시킨다. 제2의 5' 보호되고, 3'-O-포스포아미다이트 활성화된 데옥시뉴클레오시드가 상기 표면에 제공된다. 상기 선택된 광탈보호 및 커플링 사이클은 핵산의 원하는 세트가 생성될 때까지 반복된다. 핵산 어레이의 공간적으로 접근가능한 병행적 화학 합성을 위하여 광 분해성 보호기 및 포토리소그래피가 사용되는 광 지시된 방법에서는 (예, 미국특허 제5,527,681호), 어레이 형성을 돕기 위하여 컴퓨터 도구가 사용될 수 있다.

이러한 광 지시된 핵산 어레이의 합성법은, 공간적으로 접근가능한 정의된 영역에서 복수 개의 핵산 프로브를 병행적으로 합성할 수 있다. 따라서, 상기 정의된 영역은 광에 의하여 지정되는 것이므로, 정의된 영역과 정의된 영역 사이의 간격을 좁게하여, 즉 정의된 영역의 밀도를 높게하여 핵산 어레이를 합성할 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 기판 사이클 마다 새로운 마스크를 제작하여야 하기 때문 에, 합성될 수 있는 핵산의 길이에는 합성 효율 면에서 한계가 있다. 상업적으로는 25nt 길이 이하의 핵산이 합성되는 것으로 알려져 있다.

또한, 스팟팅 (spotting) 법에 의한 핵산 어레이의 생산방법도 알려져 있다. 스팟팅 법에서, 이미 합성된 핵산 또는 핵산 모노머와 같은 반응물은 기판상의 선택된 영역에 상대적으로 소량을 직접적으로 침적함으로써 전달된다. 침적은 디스펜서(dispenser)에 의하여 영역과 영역 사이를 이동하면서 이루어질 수 있다. 일반적 디스펜서에는 모노머 용액을 기판에 전달하기 위한 마이크로피펫 및 기판에 대하여 마이크로피펫의 위치를 제어하기 위한 로봇 시스템, 또는 인크젯 프린터가 포함될 수 있다. 또한, 디스펜서에는 다양 시약이 동시에 반응 영역에 전달될 수 있도록 일련의 튜브, 매니폴더, 피펫의 어레이 등이 포함될 수 있다. 이러한 스팟팅 법은 외래 합성된 핵산을 기판 상에 고정화하는 것이므로, 상대적으로 긴 핵산을 기판 상에 고정화할 수 있다. 그러나, 직접적으로 침적에 의하여 고정화하는 것이므로, 스팟의 밀도는 낮다는 단점이 있다.

따라서, 종래 기술에 의하면, 스팟의 밀도가 높으면서도 긴 핵산 프로브의 어레이를 효율적으로 생산하는 방법이 여전히 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 스팟 밀도가 높으면서도 길이가 긴 프로브가 고정화된 마이크로어레이를 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은, (a) 광 지시에 의하여 복수 개의 스팟 영역에서 핵산을 합성하여 복수 개의 제1 단일가닥 핵산을 고체 기판의 표면의 스팟 영역에 고정화하는 단계; 및 (b) 상기 제1 단일가닥 핵산에 상보적인 제1 영역과 상보적이지 않은 제2 영역으로 구성되는 제2 단일가닥 핵산을 상기 제1 단일가닥 핵산과 혼성화시켜 상기 제1 단일가닥 핵산을 이중가닥 영역과 말단 단일가닥 영역을 포함하는 이중가닥 핵산 프로브로 전환하는 단계로서, 상기 제1 단일가닥 핵산의 5' 말단이 상기 기판 표면에 부착되어 있는 경우 상기 제2 영역은 상기 제1 영역의 상류에 위치하고, 상기 제1 단일가닥 핵산의 3' 말단이 상기 기판 표면에 부착되어 있는 경우 상기 제2 영역은 상기 제1 영역의 하류에 위치하는 것인 단계;를 포함하는, 이중가닥 영역과 말단 단일가닥 영역을 포함하는 이중가닥 핵산 프로브가 고정된 마이크로어레이를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 이중가닥 영역과 말단 단일가닥 영역을 포함하는 이중가닥 핵산 프로브가 고정된 마이크로어레이를 제조하는 방법은, (a) 광 지시에 의하여 복수 개의 스팟 영역에서 핵산을 합성하여 복수 개의 제1 단일가닥 핵산을 고체 기판의 표면의 스팟 영역에 고정화하는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, "광 지시에 의하여 기판 상에서 핵산을 합성하는 방법"이란 기판 상의 특정한 영역에만 광을 조사하여 기판 상의 특정한 영역에만 활성 반응기를 도입하거나 생성시키고, 여기에 활성화된 핵산 모노머를 반응시켜, 기판 상에서 핵산의 뉴클레오티드를 연장하는 것을 의미한다. 광 지시에 의하여 기판 상에서 핵산을 합성하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 미국특허 제5,143,854호, 제5,744,305호, 및 제5,908,926호 등에 개시되어 있으며, 이들 내용은 원용에 의하여 그 전체로서 본 명세서에 포함되어 진다. 본 발명에 있어서, 상기 이중가닥 핵산 프로브의 "이중가닥 영역"은 기판 쪽에 위치하고, 말단 단일가닥 영역은 기판으로부터 먼쪽 말단에 위치한다.

이러한 "광 지시에 의하여 기판 상에서 핵산을 합성하는 방법"은 기판 상의 복수 개의 정의된 영역 (이하 "스팟"이라고도 함)에서 복수 개의 다른 핵산 서열을 동시에 병렬적으로 합성할 수 있다.

본 발명에 있어서, "스팟 (spot)"이란 중합의 형성을 위하여 활성화되어지거나, 활성화되었거나, 활성화되어질 것을 의도한 표면 상의 국재된 영역, 즉 "정의된 영역 (predefined region)"을 의미한다. 상기 스팟은 임의의 편리한 모양, 예를 들면, 원형, 사각형, 타원, 웨지 모양 등을 가질 수 있다.

본 발명에 있어서, "기판 (substrate)"이란 견고하거나 반고체 표면을 갖는 물질을 말한다. 기판의 적어도 일부 표면은 실질적으로 평평하지만, 예를 들면, 웰, 높혀진 영역, 에치된 트렌치 등에 의하여 다른 중합체에 대한 합성 영역을 물리적으로 분리되어 있을 수 있다.

본 발명에 있어서, "광 (light)"이란 감마파, X선 파, UV, 가시광선 및 적외선이 포함되며, 사용되는 광제거 가능한 보호기의 종류에 따라 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계는, 패턴화되어 있는 마스크를 통하여 광을 기판 표면에 선택적으로 조사하고, 상기 기판 표면의 특정한 영역을 선택적으로 활성화시키고, 상기 활성화된 영역에 핵산 모노머를 반응시켜 연결시킴으로써, 기판 표면 상에 뉴클레오티드를 연장하는 것을 포함한다. 상기 기판 표면의 특정한 영역을 선택적으로 활성화시키는 것은, 상기 기판 표면이 광제거 가능한 보호기로 활성기가 차단되어 있는 경우에는, 광의 조사를 통하여 활성화될 수 있다. 또한, 상기 활성화는 보호기를 제거하기 위한 화학물질에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 방법의 일 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계는 광 제거가능한 보호기가 표면에 부착되어 있는 기판 상에 마스크를 통하여 광을 조사하여 명과 암의 패턴을 형성하고, 형성된 패턴에 광 제거가능한 보호기를 가진 활성화된 핵산 모노머를 반응시켜 기판 상의 패턴화된 영역에 핵산 모노머를 연장하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 광이 조사되는 영역인 명 영역의 표면은, 광 제거가능한 보호기가 이탈되어 활성 반응기가 노출되어 광 제거가능한 보호기를 가진 활성화된 핵산 모노머와 반응할 수 있다. 상기 핵산 모노머에는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드가 포함된다.

상기 기판 상에 부착되어 있는 광 제거가능한 보호기는 링커를 통하여 기판 에 부착되어 있고, 상기 링커는 기판 측으로부터 먼쪽 말단의 활성기가 광 제거가능한 보호기에 의하여 차단되어 있는 것일 수 있다. 상기 링커는 광 제거가능한 보호기에 의하여 차단된 반응성 기를 제공할 수 있는 것이면 어느 것이나 될 수 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜, 또는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드와 같은 핵산 모노머가 될 수 있다.

본 발명에 있어서, "보호기 (protecting group)"란 모노머 단위에 화학적으로 결합하고 전자기파와 같은 활성자 (activator)에 선택적 노출에 의하여 제거될 수 있는 물질을 의미한다. "광제거 가능한 보호기 (photoremovable protecting group)"란 광에 의하여 제거될 수 있는 보호기를 의미한다. 상기 광 제거가능한 보호기의 예는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 6-니크로베라트릴옥시카르복닐 (NVOC), 6-니트로피페로닐 (NP), 6-니트로피페노닐 옥시카르보닐(NPOC), 6-니트로베라트릴(NV), 메틸-6-니트로베라트릴(MeNV), 메틸-6-니트로베라트릴옥시카르보닐(MeNVOC), 메틸-6-니트로피페노닐 (MeNP), 메틸-6-니트로피페노닐옥시카르보닐 (MeNPOC)이 될 수 있으나 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

광 제거가능한 보호기는 식 1과 같은, 활성화된 뉴클레오티드의 5'-히드록실기 상에 부착되어 있는 것일 수 있다:

(식 1)

식에서, B는 당 고리에 결합된 염기이고, R은 당이 데옥시리보즈인 경우 수 소 원자이고, 또는 R은 당이 리보즈인 경우 히드록실기이고, P는 활성화된 인산 기를 나타내고, X는 광제거 가능한 보호기이다. 상기 광제거 가능한 보호기 X는 상기한 바와 같은, NV, NP, MeNV, MeNP, 등이 될 수 있다. 상기 활성화된 인산 기, P는 바람직하게는, 포스페이트트리에스테르, 포스포아미다이트 등과 같은, 높은 커플링 효율을 가진 반응성 유도체이다. 반응 조건 및 다른 상기 활성화된 인산 기는 잘 알려져 있다 (예, 미국특허 제5,143,854호, 제5,744,305호, 및 제5,908,926호). 또한, 상기 염기 중의 반응성 기는 보호기로 차단되어 있으며, 이러한 염기의 차단 및 차단해제는 당업계에 알려져 있다. 상기 염기에는 우라실, 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 또는 이노신이 포함된다.

또한, 광 제거가능한 보호기는 식 2와 같은, 활성화된 뉴클레오티드의 3'-히드록실기 상에 부착되어 있는 것일 수 있다. 3'-히드록실 기가 광 제거가능한 보호기로 차단되어 있는 활성화된 뉴클레오티드의 예는 다음의 화합물일 수 있다.

(식 2)

식에서, B는 당 고리에 결합된 활성기가 차단된 염기이고, R은 당이 데옥시리보즈인 경우 수소 원자이고, 또는 R은 당이 리보즈인 경우 히드록실기이고, Y는 벤조이닐 카르보네이트(benzoinyl carbonate)로서, 디알콕시벤조이닐 카르보네이트, 디(C1-C4)알콕시벤조이닐 카르보네이트, 3',5' 또는 2', 3' 디메톡시벤조이닐 카르보네이트가 포함되며, Z는 포스포아미다이트이다. 상기 염기에는 우라실, 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 또는 이노신이 포함된다.

상기 링커는 3'말단이 기판에 부착되어 있고, 5'말단이 상기 광제거 가능한 보호기에 부착되어 있거나, 5'말단이 기판에 부착되어 있고 3'말단이 상기 광제거 가능한 보호기에 부착되어 있는, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 뉴클레오티드에는 전단계에서 합성되거나, 외부로부터 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

상기 패턴 형성 및 연장은 반복하여 이루어질 수 있다. 이 경우, 패턴의 형성과 연장 반응의 사이, 연장 반응과 패턴 형성 사이는 통상적인 세척 과정이 포함될 수 있다. 또한, 상기 패턴 형성 과정은 각 스팟에 도입하고자 하는 뉴클레오티드의 종류 등에 따라, 서로 동일하거나 동일하지 않은 패턴을 가질 수 있다. 패턴형성 과정에서, 하나의 뉴클레오티드에 대하여 하나의 마스크가 사용될 수 있으므로, 25mer의 핵산을 합성하는 경우, 100개의 마스크가 필요하다. 따라서, 100회의 마스크 제작, 광 조사, 탈보호, 보호기로 포함하는 활성화된 모노머 첨가 및 커플링 반응의 단계가 필요하다.

상기 제1 단일가닥 핵산은 DNA, RNA, PNA 및 이들 조합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 제1 단일가닥 핵산이 PNA인 경우, 혼성화 산물의 해리 상수가 낮아, 이중가닥 영역이 안정한 장점이 있다.

상기 제1 단일가닥 핵산의 길이는 제2 단일가닥의 제1 영역과 혼성화되어 제2 단일가닥 핵산을 고정화할 수 있는 결합력을 제공할 수 있는 길이일 수 있다. 예 를 들면, 상기 길이는 4nt 내지 25nt, 5nt 내지 10nt, 또는 10nt 내지 25nt인 것일 수 있다.

상기 제1 단일가닥 핵산이 그 표면 상에 연장되는 스팟의 밀도는 150,000 스팟/cm² 이상인 것일 수 있다. 광 지시에 의하여 핵산을 합성하는 방법은, 마스크 기법을 사용하기 때문에, 스팟을 고밀도로 배치할 수 있다. 그러나, 다량의 마스크를 사용하고, 많은 단계를 필요로 하기 때문에 합성할 수 있는 길이에는 한계가 있다.

본 발명의 방법의 일 구체예는, 상기 제1 단일가닥 핵산의 서열과 그 서열이 고정되는 스팟의 기판 상에서의 위치를 저장하는 단계를 더 포함하는 것이다. 상기 제1 단일가닥 핵산의 서열은 서열이 알려져 있고, 기판 상의 위치를 알고 있으므로, 제2 단일가닥 핵산이 혼성화되는 위치를 알 수 있다. 이는 이중가닥 핵산 프로브의 위치를 알 수 것이며, 이는 마이크로에레이 분석 결과 얻어지는 혼성화 결과를 스팟 별로 분석할 수 있다.

본 발명의 방법의 다른 일 예에서, 상기 (a) 단계는, (a-1) 상기 기판의 표면의 스팟 영역의 제1 영역에 선택적으로 광을 조사하고, 상기 표면의 스팟 영역의 제2 영역은 광을 조사하지 않아, 명과 암 영역의 패턴을 생성하는 단계로서, 상기 표면은 그 표면에 광제거 가능한 보호기를 갖는 것인 단계; (a-2) 상기 표면의 제1 영역과 제2 영역에 제1 뉴클레오티드를 접촉시켜 상기 제1 영역의 폴리뉴클레오티드에 상기 제1 뉴클레오티드를 연결시키고, 상기 제2 영역에는 연결시키지 않고, 상기 제1 뉴클레오티드는 광제거 가능한 보호기를 갖는 것인 단계; (a-3) 상기 표 면의 상기 제1 영역의 적어도 일부분 및 상기 표면의 상기 제2 영역의 적어도 일부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부분에 전자기파를 선택적으로 조사하여 상기 부분으로부터 상기 보호기를 제거하는 단계; (a-4) 상기 표면의 제1 영역과 제2 영역을 제2 뉴클레오티드를 접촉시켜 상기 보호기가 제거된 부분의 폴리뉴클레오티드에 상기 제2 뉴클레오티드를 연결시키는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 방법의 다른 일 예에서, 상기 (a) 단계는, (a-1) 광제거 가능한 3' 히드록실 보호기를 포함하는 뉴클레오시드를 지지체에 부착하는 단계로서, 상기 부착은 상기 뉴클레오시드의 5' 히드록실기를 통하여 이루어진 것인 단계; (a-2) 얻어진 상기 고체 지지체에 결합된 뉴클레오시드를 조사하여 상기 광 보호기를 제거하여 상기 3' 히드록실 기를 유리시키는 단계; 및 (a-3) 얻어진 고체 지지체에 결합된 뉴클레오시드를 5' 포스포아미다이트를 가진 뉴클레오시드와 접촉시켜 5' 포스포아미다이트를 유리 3' 히드록실 기와 반응시켜 디뉴클레오티드를 형성하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 방법은 또한, (b) 상기 제1 단일가닥 핵산에 상보적인 제1 영역과 상보적이지 않은 제2 영역으로 구성되는 제2 단일가닥 핵산을 상기 제1 단일가닥 핵산과 혼성화시켜 상기 제1 단일가닥 핵산을 이중가닥 영역과 말단 단일가닥 영역을 포함하는 이중가닥 핵산 프로브로 전환하는 단계로서, 상기 제1 단일가닥 핵산의 5' 말단이 상기 기판 표면에 부착되어 있는 경우 상기 제2 영역은 상기 제1 영역의 상류에 위치하고, 상기 제1 단일가닥 핵산의 3' 말단이 상기 기판 표면에 부 착되어 있는 경우 상기 제2 영역은 상기 제1 영역의 하류에 위치하는 것인 단계;를 포함한다.

상기 (b) 단계에서, 상기 혼성화는 당업계에 알려진 혼성화 조건에서 이루어질 수 있다. 예를 들면, 버퍼 중에서 4℃에서 14시간 동안 방치하는 것이 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제2 단일가닥 핵산의 제1 영역은 제1 단일가닥 핵산과 상보적이어서, 혼성화 결합에 의하여 상기 제2 단일가닥 핵산을 제1 단일가닥 핵산에 고정화시킨다. 여기서, "상보적 (complementary)"이란 서열의 85%이상, 바람직하게는 90%이상, 더욱 바람직하게는 95%이상, 가장 바람직하게는 100% 상보적인 것을 의미한다. 또한, 상기 제2 단일가닥 핵산의 제2 영역은 제1 단일가닥 핵산과 상보적이지 않은 서열을 포함한다. 여기서, "상보적이지 않은(noncomplementary)"이란, 제1 단일가닥 핵산과 실질적으로 상보적이지 않아, 상기 제1 영역과 제1 단일가닥 핵산의 혼성화 반응을 방해하지 않는 것을 의미한다. 상기 제2 영역은 제1 단일가닥 핵산과 5이하, 바람직하게는 4이하, 더욱 바람직하게는 3이하, 더 더욱 바람직하게는 2이하, 가장 바람직하게는 1이하의 상보적인 연속 서열 (contiguous sequence)를 갖는 것이다.

상기 제2 단일가닥 핵산은 상기 제1 단일가닥 핵산이 합성되는 고체 기판과는 다른 매질에 합성되거나 천연 핵산으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 다른 매질에서 합성은 당업계에 잘 알려져 있다.

예를 들면, 핵산의 합성은 일반적으로 뉴클레오티드의 3' 히드록실 기 상의 활성화된 인산 유도체를 고체 기판 상에 결합된 올리고머의 5' 히드록실 기와 커플링시키는 것과 관련된다. 이 커플링을 일으키기 위하여 2가지 주요한 화학적 방법이 존재한다: 포스페이트-트리에스테르 및 포스포아미다이트 법 (phosphoramidite method)(Gait, "Oligonucleotide Synthesis": A practical Approach", 1984, IRL, Press, London).

상기 제2 단일가닥 핵산은 마스크를 통한 광 조사에 의한 패턴화 과정이 없이 고체 매질에 합성된 것일 수 있다. 또한, 상기 제2 단일가닥 핵산은 cDNA인 것일 수 있다. 따라서, 상기 제2 단일가닥 핵산은 마스크를 통하여 복수 개의 위치에서 병렬적으로 합성되는 것이 아니기 때문에, 높은 효율로 상대적으로 긴 핵산을 합성할 수 있다. 상기 제2 단일가닥 핵산은 50nt 이상의 길이를 갖는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 제2 단일가닥 핵산은 50nt 내지 3000nt, 더욱 바람직하게는, 50nt 내지 1000nt의 길이를 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 제2 단일가닥 핵산은 세포에 의하여 합성되는 것이거나, 천연 핵산을 제한 효소로 절단하여 얻어지는 것일 수 있다.

상기 (b) 단계에 있어서, 상기 이중가닥 핵산 프로브의 기판 상에서의 위치는 상기 제2 단일가닥 핵산의 제1 영역에 상보적인 상기 제1 단일가닥 핵산의 위치에 대응되는 것으로 설정하고, 상기 이중가닥 핵산 프로브의 위치를 저장하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 저장은 컴퓨터 판독가능한 매체에 저장되는 것일 수 있다. 따라서, 상기 프로브의 위치, 및/또는 표적 핵산이 상기 프로브와 혼성화된 결과를 컴퓨터를 통하여 확인 분석할 수 있다. 즉, 상기 제1 단일가닥, 또는 제2 단일가닥의 제1 영역의 서열은, 프로브의 위치 또는 혼성화 분석 결과를 확인할 수 있는 접근가능한 정보로서 사용될 수 있다.

상기 제1 단일가닥 핵산 및 상기 제2 단일가닥 핵산의 제1 영역 중 하나는 PNA고, 다른 하나는 DNA 또는 RNA인 것일 수 있다. PNA와 DNA 또는 RNA와의 혼성화 강도는, DNA와 RNA 중의 어느 하나 이상 사이의 혼성화 강도에 비하여 상대적으로강하기 때문에, 제2 단일가닥이 안정적으로 고정되어 있을 수 있다.

본 발명의 방법은, (c) 핵산의 이중가닥 영역에 특이적으로 결합하는 물질을 상기 이중가닥 핵산 프로브와 반응시켜, 상기 이중가닥 핵산 프로브의 이중가닥 영역에 상기 물질을 결합시켜, 제2 단일가닥 핵산과 제1 단일가닥 핵산의 혼성화 결합을 강화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 핵산의 이중가닥 영역에 특이적으로 결합하는 물질의 예에는, 이중가닥 특이적 인터칼레이터인 것일 수 있다. 상기 이중가닥 특이적 인터칼레이터의 예에는 SYBR Green I 등이 포함된다. 이러한 이중가닥 특이적 결합 인터칼레이터는 이중결합을 더욱 더 안정화시키기 때문에, 이중가닥 핵산 프로브가 분석과정에서 단일가닥으로 해리되는 가능성이 낮아진다. 또한, 상기 제2 단일가닥 핵산의 기판 측 말단을 제1 단일가닥 또는 기판에 공유 또는 비공유 결합에 의하여 고정화하는 것도 가능하다.

본 발명의 이중가닥 영역과 말단 단일가닥 영역을 포함하는 이중가닥 핵산 프로브가 고정된 마이크로어레이를 제조하는 방법에 의하면, 스팟의 밀도가 높고, 고정화되는 프로브의 길이도 긴 이중가닥 핵산 프로브가 고정된 마이크로어레이를 효율적으로 제조할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

도 1a 및 1b는 본 발명의 이중가닥 핵산 프로브가 고정된 마이크로어레이를 제조하는 방법 중 단일가닥 마이크로어레이를 제조하는 방법의 일 예에 나타내는 도면이다. 도 1에서 M은 마스크를 나타내며, 10은 기판의 표면에 고정화되어 있는 광 제거 가능한 보호기를 나타내고, 20은 기판을 나타낸다. 상기 마스크에서 밝은 부분은 광이 투과되는 영역으로 명 영역이며, 빗금으로 표시한 부분은 광이 투과되지 않는 암 영역이다. 상기 보호기는 링커 또는 핵산 모노머 또는 올리고머에 연결된 것일 수 있다. 또한, x는 광 제거 가능한 보호기를 나타낸다. 먼저, M1를 통하여 광을 기판에 조사하면, 기판에 고정화되어 있는 광 제거 가능한 보호기가 광이 조사된 선택적 영역 (명 영역)에서 제거되어 활성기가 노출된다. 다음으로, 상기 활성기가 노출된 기판의 표면에 광 제거 가능한 보호기를 갖는 활성화된 제1 핵산 모노머를 반응시키며, 상기 모노머를 기판의 표면에 부착시킨다. 반응되지 않은 핵산 모노머를 세척하여 제거하고, 다시 새로운 마스크 M2를 통하여 광을 기판 표면의 선택적 영역이 조사하고, 광 제거 가능한 보호기를 갖는 활성화된 제2 핵산 모노머를 반응시켜, 제2 핵산 모노머를 제1 핵산 모노머에 연결한다. 이와 같은, 과 정을 M3 내지 M7에 대하여 반복하여 수행하면, 4개의 스팟 영역에 각각 4개의 다른 단일가닥 핵산 프로브가 고정된 단일가닥 마이크로어레이가 제조된다. 상기 광 제거 가능한 보호기를 갖는 활성화된 핵산 모노머는, 광 제거가능한 보호기는 식 1 또는 2와 같은, 활성화된 뉴클레오티드의 5'-히드록실기 또는 3'-히드록실기 상에 부착되어 있는 것일 수 있다. 도 1a와 1b에서, 광 제거가능한 보호기는 활성화된 뉴클레오티드의 5'-히드록실기 상에 부착되어 있는 것을 예시적으로 나타내었다. 도 1a와 1b에 나타낸 바와 같이, 광 지시에 의하여 복수의 정의된 영역에서 단일가닥 핵산을 합성하는 것은 마스크를 통하여 기판을 활성화시키기 때문에, 정의된 영역과 정의된 영역 사이의 간격을 좁게, 즉 정의된 영역 (스팟)의 밀도를 높게 할 수 있다. 반면, 많은 마스크 제작의 제작이 필요한 것과 같이, 제조과정이 복잡하다는 단점이 있다.

도 2는 도 1에서 제조된 단일가닥 마이크로어레이를 이중가닥 마이크로어레이로 전환하는 방법의 일 예에 나타내는 도면이다. 도2에서, S1 내지 S4는 각각 다른 서열의 단일가닥 핵산이 고정되어 있는 스팟 영역을 나타낸다. 또한, R1과 R2는 이중가닥 핵산 프로브의 이중가닥 영역과 말단 단일가닥 영역을 나타낸다. 도 2에 나타낸 이중가닥 핵산 프로브는, 단일가닥 핵산이 가판 상에서 3' -> 5' 방향으로 합성되었으므로, 그에 상보적인 제2 단일가닥은 기판 측으로부터 먼 쪽으로, 5'->3' 방향으로 배열되어 있는 예를 나타내는 것이나, 단일가닥 핵산이 가판 상에서 5' -> 3' 방향으로 합성되고, 그에 상보적인 제2 단일가닥은 기판으로부터 먼쪽으로 기판 측으로, 5'->3' 방향으로 배열되어 있는 것도 가능하다. 제2 단일가닥은 마스크를 사용하지 않고, 알려진 고상 핵산 합성방법 또는 천연 핵산을 제한 효소를 사용하여 얻어질 수 있는 것이므로, 상대적으로 긴 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 R2 영역은, 30nt 내지 1000nt의 것일 수 있다. 또한, 도 2에는 도시하지 않았으나, 상기 이중가닥 영역 R1에는, 혼성화 결합을 강화시키기 위하여 이중가닥 영역에 특이적으로 결합하는 물질이 처리될 수 있다. 예를 들면, 이중가닥 특이적인 인터컬레이터 화합물, 예를 들면, SYBR Green I이 사용될 수 있다. 또한, 상기 제2 단일가닥 핵산의 기판 측 말단을 제1 단일가닥 또는 기판에 공유 또는 비공유 결합에 의하여 고정화하는 것도 가능하다.

도 1a 및 1b는 본 발명의 이중가닥 핵산 프로브가 고정된 마이크로어레이를 제조하는 방법 중 단일가닥 마이크로어레이를 제조하는 방법의 일 예에 나타내는 도면이다.

도 2는 도 1에서 제조된 단일가닥 마이크로어레이를 이중가닥 마이크로어레이로 전환하는 방법의 일 예에 나타내는 도면이다.

Claims

(a) 광 지시에 의하여 복수 개의 스팟 영역에서 핵산을 합성하여 복수 개의 제1 단일가닥 핵산을 고체 기판의 표면의 스팟 영역에 고정화하는 단계; 및

(b) 상기 제1 단일가닥 핵산에 상보적인 제1 영역과 상보적이지 않은 제2 영역으로 구성되는 제2 단일가닥 핵산을 상기 제1 단일가닥 핵산과 혼성화시켜 상기 제1 단일가닥 핵산을 이중가닥 영역과 말단 단일가닥 영역을 포함하는 이중가닥 핵산 프로브로 전환하는 단계로서, 상기 제1 단일가닥 핵산의 5' 말단이 상기 기판 표면에 부착되어 있는 경우 상기 제2 영역은 상기 제1 영역의 상류에 위치하고, 상기 제1 단일가닥 핵산의 3' 말단이 상기 기판 표면에 부착되어 있는 경우 상기 제2 영역은 상기 제1 영역의 하류에 위치하는 것인 단계;를 포함하는, 이중가닥 영역과 말단 단일가닥 영역을 포함하는 이중가닥 핵산 프로브가 고정된 마이크로어레이를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는, 광 제거가능한 보호기가 표면에 부착되어 있는 기판 상에 마스크를 통하여 광을 조사하여 명과 암의 패턴을 형성하고, 형성된 패턴에 광 제거가능한 보호기를 가진 활성화된 모노머를 반응시켜 기판 상의 패턴화된 영역에 뉴클레오티드를 연장하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 기판 상에 부착되어 있는 광 제거가능한 보호기는 링 커를 통하여 기판에 부착되어 있고, 상기 링커는 기판 측으로부터 먼쪽 말단의 활성기가 광 제거가능한 보호기에 의하여 차단되어 있는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 링커는 3'말단이 기판에 부착되어 있고, 5'말단이 상기 광제거 가능한 보호기에 부착되어 있거나, 5'말단이 기판에 부착되어 있고 3'말단이 상기 광제거 가능한 보호기에 부착되어 있는, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 패턴 형성 및 연장을 반복하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 모노머는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 단일가닥 핵산은 DNA, RNA, PNA 및 이들 조합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 단일가닥 핵산의 길이는 4nt 내지 25nt인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 단일가닥 핵산이 그 표면 상에 연장되는 스팟의 밀도는 150,000 스팟/cm²이상인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 단일가닥 핵산의 서열과 그 서열이 고정되는 스팟의 기판 상에서의 위치를 저장하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서, 상기 제2 단일가닥 핵산은 상기 제1 단일가닥 핵산이 합성되는 고체 기판과는 다른 매질에 합성되거나 천연 핵산으로부터 유래된 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 제2 단일가닥 핵산은 마스크를 통한 광 조사에 의한 패턴화 과정이 없이 고체 매질에 합성된 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 제2 단일가닥 핵산은 cDNA인 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 제2 단일가닥 핵산은 50nt 이상의 길이를 갖는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 제2 단일가닥 핵산은 50nt 내지 1000nt의 길이를 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에 있어서, 상기 이중가닥 핵산 프로브의 위치는 상기 제2 단일가닥 핵산의 제1 영역에 상보적인 상기 제1 단일가닥 핵산의 위치에 대응되는 것으로 설정하고, 상기 이중가닥 핵산 프로브의 위치를 저장하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 단일가닥 핵산 및 상기 제2 단일가닥 핵산의 제1 영역 중 하나는 PNA고, 다른 하나는 DNA 또는 RNA인 것인 방법.
제1항에 있어서, (c) 핵산의 이중가닥 영역에 특이적으로 결합하는 물질을 상기 이중가닥 핵산 프로브와 반응시켜, 상기 이중가닥 핵산 프로브의 이중가닥 영역에 상기 물질을 결합시켜, 제2 단일가닥 핵산과 제1 단일가닥 핵산의 혼성화 결합을 강화시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제18항에 있어서, 상기 핵산의 이중가닥 영역에 특이적으로 결합하는 물질은 이중가닥 특이적 인터칼레이터인 것인 방법.
제19항에 있어서, 상기 인터칼레이터는 SYBR Green I인 것인 방법.