KR20090098710A - 세포투과성과 핵산 결합력이 좋은 펩타이드 핵산 유도체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 화학식1로 대표되는 새로운 종류의 펩타이드 핵산 올리고머와 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
<화학식 1>
화학식1의 펩타이드 핵산(PNA) 올리고머는 '변형되지 않은' PNA 올리고머와 비교하여 향상된 핵산 결합력과 세포투과성을 나타낸다. 본 발명의 PNA 올리고머는 핵산이나 리보핵산단백질과 같이 핵산 부분을 보유한 생리활성 분자들에 의하여 매개되는 세포 기능이나 생리학적 기능을 염기배열에 특이적으로 저해하거나 조절하는데 유용하다. 아울러 본 발명의 PNA 올리고머는 염기배열에 특이적으로 핵산과 결합하는 능력을 보유하고 있으므로 진단 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.
펩타이드 핵산, 세포투과성, 핵산 결합력, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스.
Description
본 발명은 세포투과성이 좋고 핵산에 결합력이 좋도록 화학적으로 변형된 펩타이드 핵산 유도체들에 관한 것이다.
올리고뉴클레오타이드(Oligonucleotide)는 안티센스(Antisnese) 유전자 발현 억제, 중합효소 연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction), 유전자 칩에 의한 진단 분석, 등 다양한 생물학적 목적으로 사용되어 왔다. 올리고뉴클레오타이드는 염기 배열에 특이적으로 DNA나 RNA와 같은 핵산에 작용하므로, 올리고뉴클레오타이드는 세포 내에서 DNA나 RNA가 관여하는 생물학적 과정을 예측 가능하게 조절하는데 매우 유용하다. 그러나 저분자(Small Molecule) 의약과 달리, 올리고뉴클레오타이드는 동물 세포막을 잘 통과하지 못하기 때문에, 세포막을 잘 통과하도록 적절히 변형시키거나 제형화시키지 않을 경우, 세포 내의 생물학적 과정에 거의 영향을 미치기 어렵다.
의약 타겟으로서 단백질 : 단백질은 다양한 세포 작용을 매개하는데, 현재 시판되고 있는 많은 의약들이 단백질의 작용을 조절함으로서 약효를 나타낸다. 예를 들어, 비스테로이드성 소염진통제(Non-steroidal Anti-inflammatory Drug)인 아스피린은 사이클로옥시게나제(Cyclooxygenase)란 효소를 저해하여 항염 효능을 나타낸다. 로사르탄(Losartan)은 안지오텐신 II 수용체(Angiotensin II Receptor)에 결합하여 이 수용체의 활성을 억제하여 혈압 강하 작용을 나타낸다. 로지글리타존(Rosiglitazone)은 세포 안에 있는 PPARgamma(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma) 수용체를 활성화시켜 당뇨 치료 효능을 나타낸다. 에타너셉트(Etanercept)는 퓨젼(Fusion) 단백질로서 종양괴사인자-а(TNF-a, Tumor Necrosis Factor-a)에 결합하여 TNF-a의 생물학적 기능을 무력화시켜 류마티스 관절염 치료 효능을 나타낸다. 허셉틴(Herceptin)은 일부 유방암 세포에 과잉 발현되어 있는 erbB2 단백질에 선택적으로 결합하여 유방암을 치료하는 항체단백질이다.
올리고뉴클레오타이드에 의한 단백질 합성 저해 : 단백질에 대한 유전 정보는 DNA(2-Deoxyribose Nucleic Acid)에 저장되어 있으며, 일련의 생물학적 과정을 통하여 단백질이 발현된다. 세포에 자극이 가해지면, 세포 핵의 DNA로부터 pre-mRNA(pre-messenger Ribonucleic Acid)가 전사된다. 이 pre-mRNA의 인트론(Intron) 부분이 효소에 의해 잘려나가면서 mRNA (messenger Ribonucleic Acid)가 만들어지고, mRNA는 핵에서 세포질로 이동하게 된다. 리보좀(Ribosome)이라 불리우는 효소 결합체가 세포질 내에서 mRNA에 결합하여 mRNA 가닥을 이동하면서 단백질을 합성한다(Biochemistry vol 41, 4503-4510, 2002 Cancer Res. vol 48, 2659-2668, 1988).
안티센스 올리고뉴클레오타이드(AO, Antisense Oligonucleotide)는 염기서열에 특이적으로 mRNA나 pre-mRNA에 결합하는 올리고뉴클레오타이드이다. AO는 mRNA에 강하게 결합하여 세포질 내에서 리보좀의 단백질 합성을 저해할 수 있다. 단, AO가 단백질 합성을 저해하기 위해서는 세포질 안에 존재해야 한다. AO가 세포 핵 안에서 pre-mRNA에 강하게 결합하여 pre-mRNA의 스플라이싱(Splicing)을 저해할 경우, 변형된 염기배열을 갖는 mRNA가 형성되고 결과적으로 변형된 단백질이 합성된다.
인공 올리고뉴클레오타이드 : DNA나 RNA와 같은 올리고뉴클레오타이드는 생체내에 존재하는 뉴클리에이즈(Nuclease)에 의해 쉽게 분해되므로, 임상 목적으로 사용하는데 한계가 있다. 이제까지 많은 종류의 인공 올리고뉴클레오타이드가 개발되고 깊이 연구되어 왔는데, 몇몇의 인공 올리고뉴클레오타이드는 DNA나 RNA와 비교하여 긴 대사 안전성을 나타낸다(Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540, 2006). 일부 대표적인 올리고뉴클레오 타이드의 화학적 구조는 아래에 제공되어 있으며, 이들 인공 올리고뉴클레오타이드는 DNA나 RNA와 마찬가지로 핵산과 상보적으로 결합한다.
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드(PTO, Phosphorothioate oligonucleotide)는 골격의 포스페이트 산소 중 하나가 황으로 치환된 DNA 유사체로서, 생체 내에 존재하는 뉴클리에이즈에 비교적 잘 견딘다(Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402, 1985).
PTO와 DNA가 구조적으로 매우 유사함을 반영하듯이, 이들은 대부분의 동물세포에 대한 투과성이 매우 나쁘다. 그러나 DNA를 잘 투과시키는 트랜스포터(Transporter)가 많이 발현된 간 세포들의 경우, DNA와 PTO 모두 세포투과성이 좋은 편이다. 전신성으로(Systemically) 투약된 PTO는 간이나 신장에 많이 분포되는 것으로 알려져 있다(Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296, 1997).
PTO의 세포투과력을 높이기 위하여, 리포펙션(Lipofection) 방법이 세포 실험 수준에서 널리 사용되고 있다. 그러나 리포펙션 방법은 세포막을 변형시기고 독성을 유발하므로 장기간 임상 사용에는 이상적이지 못하다.
지난 20여년 넘게, 안티센스 PTO와 PTO 변형체들이 각종 암, 면역질환, 대사 성 질환, 등의 질환을 치료하기 위하여 임상적으로 평가되어 왔다(Biochemistry vol 41, 4503-4510, 2002; Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540, 2006). 상당수의 이러한 안티센스 의약개발 프로그램들은 PTO의 부분적으로는 세포투과성 부족으로 성공적이지 못하였다. PTO의 세포투과력 부족을 극복하기 위해서는, 고용량의 PTO를 투약해야 한다. 그러나 PTO를 고용량 투약하면, 혈액 응고 시간이 길어지고, 컴플리먼트(Complement) 활성화, 신장 독성(Tubular Nephropathy), 쿠퍼(Kupffer) 세포 활성화, 비장 비대, 림프절 비대, 단핵식균세포(Mononuclear Cell) 침윤, 등 다양한 독성이 수반된다(Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540, 2006).
여러 안티센스 PTO들의 경우, 간이나 신장이 기여도가 큰 질환에서 임상적 약효를 나타내는 것으로 밝혀졌다. ISIS-301012(Mipomersen, 미포메르센)은 PTO 유사체로서 LDL 콜레스테롤 운반에 관여하는 apoB-100 단백질의 합성을 저해한다. 미포메르센은 일부 동맥경화 환자군에서 약효를 나타냈는데, 이는 미포메르센이 간에 주로 분포함에 기인하는 것으로 보인다(www.medscape.com/viewarticle/556073: 2009년 2월 19일 접속). ISIS-113715는 PTP1B(Protein Tyrosine Phosphatase 1B)의 합성을 저해하는 안티센스 PTO 유도체로서 제2형 당뇨 환자들에서 약효를 나타낸다고 보고되었다(Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336, 2004).
포스포로아미다이트 모폴리노 올리고뉴클레오타이드(PMO, Phosphoroamidite Morpholino Oligonucleotide)는 DNA 골격의 2-디옥시리보스(2-Deoxyribose)와 포스페이트(Phosphate)가 각각 포스포로아미다이트(Phosphoamidite)와 모폴 린(Morpholine)으로 치환된 올리고뉴클레오타이드이다(Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575-586, 2006). DNA 골격이 음전하를 갖는 반면, PMO 골격은 전하가 없다. 따라서 PMO와 RNA의 결합은 정전기적 반발이 없어, PMO와 RNA의 결합은 DNA와 RNA의 결합 보다 강하다. 아울러 PMO는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터(Hepatic Transporter)에 의해 인식되지 않는다. 따라서 PMO는 PTO와 매우 다른 조직 분포 특성을 가질 수 있으나, PMO 역시 세포막을 잘 통과하지 못한다.
펩타이드 핵산(PNA, Peptide Nucleic Acid)은 N-(2-아미노에틸)글리신[Aeg, N-(2-aminoethyl)glycine]을 단위 골격으로 갖는 폴리펩타이드로서 Nielsen 등에 의해 발명되었다(Science vol 254, 1497-1500, 1991). DNA나 RNA와 마찬가지로, PNA 역시 상보적인 핵산과 결합한다 [Nature (London) vol 365, 566-568, 1992]. PMO처럼 PNA 골격은 전하를 갖고 있지 않기 때문에, PNA와 RNA의 결합은 DNA와 RNA의 결합 보다 강하다. 아울러 PNA는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터(Hepatic Transporter)에 의해 인식되지 않는다. 따라서 PNA는 PTO와 매우 다른 조직 분포 특성을 가질 수 있으나, PNA 역시 세포막을 잘 통과하지 못한다(Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003).
록드핵산(LNA, Locked Nucleic Acid)은 RNA의 라이보스(Ribose) 골격이 구조적으로 제한된 핵산으로서, 핵산 결합력이 매우 강하다. 따라서, LNA는 강한 핵산 결합력을 지닌 DNA 혹은 RNA 유도체로 간주될 수 있다(Biochemistry vol 45, 7347-7355, 2006).
안티센스 작용 기전 : 안티센스 작용 기전은 AO의 종류에 따라 다르다. RNAse H는 mRNA와 DNA, RNA, 혹은 PTO의 듀플렉스(Duplex)를 인식하여 mRNA의 Duplex 부분을 분해한다. PTO의 안티센스 활성은 RNAse H에 의하여 상당히 증폭된다. 반면에 RNAse H는 mRNA와 PMO, PNA, 혹은 LNA의 듀플렉스를 인식하지 못하기 때문에, PMO, PNA, 그리고 LNA의 안티센스 활성은 전적으로 mRNA와 이들 올리고뉴클레오타이드간 결합에 따른 입체장애(Steric Block)에 의존한다(Biochemistry vol 41, 4501-4510, 2002).
mRNA와 동일한 결합력을 지닌 올리고뉴클레오타이드 중에서는, PTO가 PMO, PNA, 그리고 LNA 보다는 강한 안티센스 활성을 보일 것으로 예측된다. 입체 장애에 의존하는 PMO, PNA, 그리고 LNA의 경우, 안티센스 활성을 나타내기 위해서는 강한 mRNA 결합력이 요구된다.
PNA의 안티센스 활성 : PNA의 mRNA 결합력은 어느 정도까지는 PNA 길이에 비례하여 증가하지만, PNA의 안티센스 활성이 항상 PNA 길이에 비례하여 증가하는 것으로 같지 않다. 일부 보고에서는, PNA의 안티센스 활성이 12 혹은 13-mer에서 최대치에 도달하고 PNA의 길이가 더 길어지면 감소하였다(Nucleic acids Res. vol 32, 4893-4902, 2004). 반면에 특정 mRNA에 대해서는 안티센스 활성이 15 내지 18-mer에서 최대치에 도달하였다고 보고된 경우가 있는데, 이는 PNA의 mRNA 결합 부위의 구조적 접근성(Structural Accessibility)과 관련이 있는 것으로 보인 다(Biochemistry vol 40, 53-64, 2001).
많은 경우 PNA는 세포를 잘 통과하는 조건에서 1mM 농도에서 리보좀에 의한 단백질 합성을 저해하는 것으로 보고되었다(Science vol 258, 1481-85, 1992; Biochemistry vol 40, 7853-7859, 2001; Nucleic acids Res. vol 32, 4893-4902, 2004). 그러나 mRNA의 결합 부위의 접근성이 좋고 세포 투과가 잘되는 조건에서는, PNA의 안티센스 활성은 1mM(Neuropeptides vol 38, 316-324, 2004; Biochemistry vol 40, 53-64, 2001) 혹은 1nM 이하의 농도에서도 관측된 바 있다(Nucleic Acids Res. vol 36, 4424-4432, 2008).
PNA의 접근성이 매우 좋은 mRNA 결합 부위뿐만 아니라, PNA의 강한 유전자 결합력도 강한 안티센스 활성 확보에 매우 중요하다. DNA, PTO, LNA와 달리, PNA의 골격은 전하를 갖고 있지 않아서 크기가 커짐에 따라 서로 엉기고 결과적으로 mRNA에 결합에 부적절해지는 경향이 있다. 따라서 PNA의 길이를 늘리지 않고 PNA의 mRNA 결합력을 향상시킬 필요가 있다. 아울러 PNA 단량체에 전하를 도입하면 PNA가 서로 엉기는 것을 방지하는데 도움이 될 것으로 보인다.
PNA에 대한 세포투과 방법 : PNA는 세포막을 잘 통과하지 못하기 때문에, 세포안으로 적절히 넣어주지 않으면 안티센스 활성이 잘 나오지 않는다. PNA의 발명 초기에는, 마이크로인젝션(Microinjection)이나(Science vol 258, 1481-85, 1992), 혹은 세포에 전기천공법(Electroporation)으로(Biochemistry vol 40, 7853-7859, 2001) PNA를 세포내로 주입하여 PNA의 안티센스 활성을 확인하였다. 그러나 마이 크로인젝션이나 전기천공법은 세포를 손상시키므로 치료 목적으로 사용하기 어렵다. PNA의 세포투과성을 개선하기 위하여 다양한 방법들이 개발되었다(Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003; Curr. Top. Med. Chem. vol 7, 727-737, 2007).
PNA에 세포투과력이 좋은 펩타이드(CPP, Cell Penetrating Peptide)를 공유 결합시키거나 (Neuropeptides vol 38, 316-324, 2004), 상보적인 DNA와 듀플렉스를 만든 후 리포펙션(Lipofection) 시키거나 (Biochemistry vol 40, 53-64, 2001), 9-아미노아크리딘(9-Aminoacridine)이 결합된 PNA를 리포펙션시키거나 (Nucleic Acids Res. vol 32, 2695-2706, 2004), 포스포네이트 음이온(Phosphonate Anion)이 결합된 PNA를 리포펙션시키는 (Nucleic Acids Res.vol 36, 4424-4432, 2008) 방법 등으로, PNA가 세포에 효과적으로 주입된 바 있다. 아울러 PNA에 아다만탄(Adamantane)과 같은 친지질성 그룹을 도입하거나 (Bioconjugate Chem. vol 10, 965-972, 1999), 테트라페닐 포스포늄(Tetraphenyl Phosphonium)과 같은 친지질/친이온성(Amphiphilic) 그룹을 도입하여 (Nucleic Acids Res. vol 29, 1852-1863, 2001), PNA의 세포투과력을 높인 경우도 있다.
그러나 이러한 방법들은 PNA의 세포투과력을 높여주기는 하였지만, mRNA에 대한 PNA의 결합력을 향상시키지는 못한다.
CPP가 공유결합된 PNA : CPP는 세포를 잘 통과하는 폴리펩타이드(Polypeptide)로서 아르지닌(Arginine)과 라이신(Lysine) 잔기에서 유래하는 여 러개의 양성 전하(Positive Charge)를 보유하고 있다. 이제까지 트랜스포르탄(Transportan), 페니트라틴(Penetratin), NLS(Nuclear Localization Signal), Tat 등과 같이 다양한 CPP들이 발견되었는데, CPP는 공유 결합된 다양한 화물(Cargo)을 세포내로 전달한다. CPP가 공유 결합된 PNA 역시 세포안으로 잘 들어가는 것으로 알려져 있다.
비록 CPP가 결합된 일부 PNA에 대하여 100nM 수준의 안티센스 IC50 가 관측되었지만 (Neuropeptides vol 38, 316-324, 2004), 많은 경우 1mM 수준의 안티센스 IC50이 관측되었다.
CPP가 공유결합된 PNA는 혐수성(Hydrophobic) PNA 부분과 양이온성 CPP 부분으로 이루어지기 때문에, 상호 엉기고 세포내에서는 엔도좀(Endosome)에 갇혀 안티센스 활성에 기여하지 못하는 경향이 있다(Curr. Top. Med. Chem. Vol 7, 727-737, 2007; Nucleic Acids Res. vol 33, 6837-6849, 2005). 아울러 CPP를 PNA에 공유 결합시켜도 PNA의 mRNA 결합력을 증가시키지는 못한다.
이성질성 골격의 PNA : PNA의 Aeg 골격에 이성질성(Chiral) 치환체를 도입하려는 시도들이 있었다. 가령 PNA의 Aeg 골격을 2-N-(2-아미노에틸)라이신[N-(2-aminoethyl)lysine]으로 바꿀 경우, PNA의 물에 대한 용해도가 현저하게 증가하였다(Angew. Chemie. Int. Ed. Engl. vol 35, 1939-1941, 1996).
PNA의 Aeg 골격이 N-{L-(2-아미노-2-메틸)에틸}글라이신[N-{L-(2- amino-2- methyl)ethyl}glycine]으로 바뀐 경우, PNA의 DNA나 RNA에 대한 결합력이 현저하게 향상된 것으로 보고되었다. 10-mer PNA의 경우 상보적인 DNA나 RNA에 대하여 각각 19℃와 10℃의 Tm(Melting Temperature)의 증가가 보고되었다. 그러나 이러한 Tm의 증가는 Aeg를 N-{L-(2-아미노-2-메틸)에틸}글라이신으로 치환한 숫자에 비례하지 않았다(J. Am. Chem. Soc. vol 128, 10258-10267, 2006).
GPNA : PNA의 Aeg 골격을 2-N-(2-아미노에틸)아르지닌[N-(2-aminoethyl)- arginine]으로 치환할 경우, PNA의 세포투과성이 크게 향상된다고 보고되었고, 이러한 PNA는 골격에 구아니디늄(Guanidinium) 그룹이 있어 'GPNA'라 명명되었다(J. Am. Chem. Soc. vol 125, 6878-6879, 2003).
2-N-(2-아미노에틸)-D-아르지닌[N-(2-aminoethyl)-D-arginine]에서 유래된 GPNA는 2-N-(2-아미노에틸)-L-아르지닌[N-(2-aminoethyl)-L-arginine]에서 유래된 GPNA 보다 DNA와 RNA에 대한 결합력이 더 강한 것으로 보고되었다(Chem. Commun. 244-246, 2005). 5개의 D-형의 GPNA 모노머를 갖는 10-mer GPNA는 변형되지 않은 PNA와 비교하여 상보적인 DNA에 대하여 7℃ 높은 Tm이 관측되었다(Bioorg. Med. Chem. Lett. vol 16, 4931-4935, 2006). 사람의 EGFR-TK에 대한 16-mer 안티센스 GPNA를 마우스(Athymic Nude Mice)에 복강 투약할 경우, 항암 효과가 있다고 보고되었다. 그러나 이러한 안티센스 GPNA에 대한 세포에서의 안티센스 효능은 보고되지 않았다(WO 2008/061091).
변형된 핵산염기를 갖는 PNA : DNA 경우와 같이, 핵산염기(Nucleobase)의 변형을 통하여 PNA의 핵산 결합력을 높이고자 하는 시도들이 있었다.
아데닌(Adenine)이 2,6-디아미노퓨린(2,6-diaminopurine)으로 치환된 PNA에 대하여 상보적인 DNA나 RNA에 대한 결합력을 평가한 결과, 2,6-디아미노퓨린 치환 1 개당 2.5~6℃의 Tm 상승이 관측되었다(Nucleic Acids Res. vol 25, 4639-4643, 1997).
싸이토신(Cytosine)이 9-(2-아미노에톡시)페녹사진[9-(2-aminoethoxy)- phenoxazine]으로 치환된 PNA에 대하여 상보적인 DNA나 RNA에 대한 결합력을 평가한 결과, 9-(2-아미노에톡시)페녹사진 치환 1 개당 10.7~23.7℃의 Tm 상승이 관측되었다. 그러나 Tm 상승은 염기배열에 매우 민감하였다. 핵신염기 9-(3-아미노프로폭시)페녹사진[9-(3-aminopropoxy)phenoxazine] 또한 현저한 Tm 상승을 수반하였다. 이러한 이유로 9-(2-아미노에톡시)페녹사진이나 9-(3-아미노프로폭시)페녹사진을 핵산염기로 갖는 PNA 모노머를 'G-Clamp'라 불리우고 있다(Org. Lett. vol 4, 4395-4398, 2002). 그러나 'G-Clamp'를 포함하는 PNA의 세포투과력 데이타는 보고되지 않았다.
싸이토신이 6-{2-(2-아미노에톡시)페닐}피롤로싸이토신[6-{2-(2-amino- ethoxy)phenyl}-pyrrolocytosine]이나 6-{2,6-디(2-아미노에톡시)페닐}피롤로싸이토신[6-{2,6-di(2-aminoethoxy)phenyl}pyrrolocytosine]으로 치환된 PNA에 대하여 상보적인 DNA나 RNA에 대한 결합력을 평가한 결과, 치환 1 개당 3~11.5℃의 Tm 상승이 관측되었다(J. Am. Chem. Soc. vol 130, 12574-12575, 2008). 그러나 이러한 PNA에 대한 세포투과력 결과는 보고되지 않았다.
PNA의 다른 용도 : 특정 마이크로(micro)RNA에 강하게 결합할 경우, PNA는 해당 마이크로RNA의 생물학적 조절 작용을 저해할 수 있으며, 결과적으로 해당 마이크로RNA에 의해 직접 조절되는 단백질의 발현량을 증가시킨다(RNA vol 14, 336-346, 2008). 텔로머레이즈(Telomerase)와 같은 특정 리보핵산단백질(Ribonucleoprotein)에 강하게 결합할 경우, PNA는 해당 리보핵산단백질의 세포내 활성을 조절할 수 있다(Bioorg. Med. Chem. Lett. vol 9, 1273-78, 1999). 세포 핵 내에서 특정 유전자(Gene)의 특정 부위에 강하게 결합할 경우, PNA는 해당 유전자의 전사(Transcription) 수준을 조절할 수 있다(Biochemistry vol 46, 7581-89, 2007).
PNA는 DNA와 RNA에 강하게 결합하고 단일 핵산염기 부정합(Mismatch)을 민감하게 구분하기 때문에, PNA는 단일염기다형(SNP, Single Nucleotide Polymorphism)를 높은 정확도로 검출하는데 적합하다. PNA는 염기서열에 높은 선택성을 가지며 DNA와 RNA에 강하게 결합하기 때문에, PNA는 DNA나 RNA가 관련되지만 앞서 언급되지 않은 다양한 치료 혹은 진단 목적으로 사용될 수 있다(FASEB vol 14, 1041-1060, 2000).
본 발명은 세포투과성이 좋고 핵산에 결합력이 좋도록 화학적으로 변형된 펩타이드 핵산 유도체들을 제공하는데 그 목적이 있다
본 발명은 화학식1로 대표되는 새로운 종류의 PNA 올리고머(Oligomer)와 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
화학식1 중에서,
n은 5 혹은 5보다 큰 정수이며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소(Hydrido) 라디칼, 중수소(Deuterido) 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬(Alkyl) 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴(Aryl) 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소 라디칼, 중수소 라디칼, 하이드록시 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시(Alkyloxy) 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시(Aryloxy) 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아미노(Amino) 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아실(Acyl) 라디칼, 치환체가 있거나 없는 설포닐(Sulfonyl) 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소 라디칼, 중수소 라디칼, 하이드록시(Hydroxy) 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 그리고 치환체가 있 거나 없는 아릴 라디칼 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌(Adenine), 싸이민(Thymine), 구아닌(Guanine), 싸이토신(Cytosine), 그리고 우라실(Uracil)을 포함하는 천연 핵산염기나 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 하나는 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼이 핵산염기 짝짓기(Base Paring) 성질을 갖는 부위에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산염기다.
본 발명의 PNA 올리고머는 '변형되지 않은(Unmodified)' PNA 올리고머와 비교하여 향상된 핵산결합력과 세포투과성을 나타낸다. 본 발명에서 '변형되지 않은(Unmodified)' PNA 올리고머는, 화학식1의 PNA 올리고머 중, S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn이 수소 라디칼이고, B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn이 아데닌, 싸이민, 구아닌, 그리고 싸이토신을 포함하는 천연 핵산염기 중에서 독립적으로 선택되는 PNA 올리고머를 의미한다.
본 발명의 PNA 올리고머는 동물 세포막을 잘 통과하므로, 세포 안에 있는 핵산이나 핵산단백질의 핵산 부분에 염기서열에 특이적으로 결합하여 세포의 기능을 변화시키거나 기능에 영향을 미칠 수 있다.
화학식1의 PNA 올리고머는 mRNA에 강하게 결합하여 리보좀에 의한 단백질 합성을 강하게 저해할 수 있다. 본 발명의 PNA 올리고머는 mRNA 전구체(pre-mRNA)에 강하게 결합하여 pre-mRNA의 스플라이싱(Splicing)에 영향을 미칠 수 있다. 더구나 본 발명의 PNA 올리고머는 특정 마이크로RNA에 강하게 결합하여 해당 마이크로RNA에 의해 유발되는 특정 mRNA의 분해를 저해할 수 있다.
화학식1의 PNA 올리고머는 텔로머레이즈(Telomerase) 등과 같은 리보핵산단백질의 핵산 부위에 예측 가능하게 결합하여 이러한 리보핵산단백질의 생리학적 기능을 조절할 수 있다. 본 발명의 PNA 올리고머는 특정 유전자(Gene)에 결합하여 해당 유전자의 전사(Transcription) 정도를 조절할 수 있다. 화학식1의 PNA 올리고머는 바이러스 유전자나 복제유전자(Transcript)에 결합하여 해당 바이러스의 증식을 억제할 수 있다.
본 발명의 PNA 올리고머는 동물 세포 안에 있는 핵산이나 핵산단백질에 염기배열에 특이적으로 결합하여 앞에서 제시되지 않은 다른 세포 기능들에 영향을 미칠 수 있다. 또한 본 발명의 PNA 올리고머는 박테리아의 mRNA, 핵산, 혹은 유전자에 강하게 결합하여 박테리아의 증식을 억제하거나 박테리아의 생합성(Biosynthesis) 프로필(Profile)을 변화시킬 수 있다.
본 발명의 PNA 올리고머는 상보적인(Complementary) DNA와 결합시 염기 부정합(Mismatch)에 매우 민감하기 때문에, 단염기다형(SNP, Single Nucelotide Polymorphism)을 높은 정확도로 검출하는데 적합하다. 본 발명의 PNA 올리고머는 상보적인 DNA와 염기배열에 매우 특이적으로 결합하므로 유전자 프로파일링(Profiling)에 유용하다.
화학식1의 PNA 올리고머에 형광체(Fluorophore) 등과 같이 적절한 발색 체(Chromophore)를 결합시키면, 텔로미어(Telomere)와 같이 핵산 부위를 갖는 분자들의 세포내 위치를 찾거나 검색하는데 유용하다. 본 발명의 PNA 올리고머는 앞에서 제시되지 않은 다양한 진단이나 분석 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 PNA 올리고머는 '변형되지 않은(Unmodified)' PNA 올리고머와 비교하여 수용성이 좋기 때문에 물, 식염수, 혹은 완충 용액에 녹여 사용될 수 있다. 화학식1의 PNA 올리고머는 리포펙타민(Lipofect- amine)과 같은 양이온성 지질(Cationic Lipid)과 함께 제형화할 수 있다.
본 발명의 PNA 올리고머는 상보적인 DNA와 듀플렉스(Duplex)를 만든 후 양이온성 지질과 함께 제형화할 수 있다. 본 발명의 PNA 올리고머는 주사제, 흡입형 스프레이(Nasal Spray), 알약, 그래뉼(Granules), 경질캡슐, 연질캡슐, 리포좀(Liposome) 제형, 경구용 현탁액, 경피 흡수 (Transdermal) 제형, 등의 다양한 투약 형태로 제형화할 수 있다.
본 발명의 PNA 올리고머는 피검자(Subject)에게 치료 효과가 있는 용량으로 투여될 수 있는데, 투여 용량은 적응증, 투약 경로, 투약 스케쥴, 피검자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 PNA 올리고머는 정맥(Intravenous) 주사, 피하(Sub- cutaneous) 주사, 복강(Intraperitoneal) 주사, 흡입(Nasal Inhalation), 경구(Oral), 경피 흡수, 등 다양한 경로로 투약될 수 있다.
화학식1의 PNA 올리고머는 약제학적으로 허용 가능한 보조제 (Adjuvant)와 함께 투약될 수 있는데, 이러한 보조제는 구연산, 염산, 주석산(Tartaric Acid), 스테아린산, 폴리에틸렌글리콜(Polyethyleneglycol), 에탄올, 중탄산 나트륨, 증류수, 히알산(Hyaluronic Acid), 리포펙타민과 같은 양이온성 지질, 전분, 젤라틴, 탈크, 아스코르브산(비타민C), 올리브유, 야자유, 메틸셀룰로즈(Methylcellulose), 감미료, 방부제, 등을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 PNA 올리고머는 산이나 염기의 존재 여부에 따라 당량의 약제학적으로 허용 가능한 당량(Equivalent)의 산이나 염기로 중화시켜 사용될 수 있는데, 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기는 수산화 나트륨(Sodium Hydroxide), 수산화 칼륨(Potassium Hydroxide), 염산, 메탄설폰산(Methanesulfonic Acid), 구연산, 등을 포함하나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다.
선호되는 PNA 올리고머는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식1의 PNA 올리고머와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포괄하는데:
화학식1 중에서,
n은 5 혹은 5 보다 크지만 30 혹은 30 보다 작은 정수이며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소 라디칼이며;
X와 Y는 수소 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아실 라디칼, 치환체가 있거나 없는 설포닐 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 수소 라디칼, 하이드록시 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 혹은 치환체가 있거나 없는 아릴 라디칼 중에서 선택되며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 싸이민, 구아닌, 싸이토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기들이나 비천연 핵산염기 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 하나는 화학식2, 화학식3), 혹은 화학식4로 표시되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다.
화학식2, 화학식3, 화학식4 중에서,
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 수소 라디칼, 하이드록시 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
L1, L2 그리고 L3는 화학식5로 대표되는 공유결합성 링커(Linker)로서 염기성 아미노 라디칼과 핵산염기 짝짓기 성질을 갖는 부위를 연결시켜 주는데:
화학식5 중에서,
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌(Methylene) 라디칼이고, Qm은 아미노 라디칼에 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 라디칼, 산소(-O-) 라디칼, 황(-S-) 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아미노 [-N(H)-] 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 2 혹은 2 보다 크지만 15 혹은 15 보다 작은 정수이다.
특별히 관심이 있는 PNA 올리고머는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식1의 PNA 올리고머와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포괄하는데:
화학식1 중에서,
n은 8 혹은 8 보다 크지만 25 혹은 25 보다 작은 정수이며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소 라디칼이며;
X와 Y는 수소 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 아실 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Z는 하이드록시 라디칼, 혹은 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼을 대표하며;
B1, B2, ……, Bn-1, 그리고 Bn은 각각 독립적으로 아데닌, 싸이민, 구아닌, 싸이토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기들이나 비천연 핵산염기 중에서 선택되며;
B1, B2, ……, Bn-1, 그리고 Bn 중 최소한 둘은 화학식2, 화학식3, 혹은 화학식4로 표시되는 비천연 핵산염기 중에서 각자 독립적으로 선택되는데;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼이나 수소 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되고;
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 라디칼이고, Qm은 아미노 라디칼에 연결되며;
Q2, Q3, …, and Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 라디칼, 산소 라디칼, 그리고 아미노 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m은 2 혹은 2 보다 크지만 12 혹은 12 보다 작은 정수이다.
높은 관심이 있는 PNA 올리고머는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식1의 PNA 올리고머와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포괄하는데:
화학식1 중에서,
n 은 10 혹은 10 보다 크지만 25 혹은 25 보다 작은 정수이며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소 라디칼이며;
X와 Y는 수소 라디칼이나 치환체가 있거나 없는 아실 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되고;
Z는 하이드록시 라디칼, 혹은 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼을 대표하며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 싸이민, 구아닌, 싸이토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기들이나 비천연 핵산염기 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
B1, B2, ……, Bn-1, 그리고 Bn 중 최소한 셋은 화학식2, 화학식3, 혹은 화학 식4로 표시되는 비천연 핵산염기 중에서 각자 독립적으로 선택되고;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼 혹은 수소 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 메틸렌 라디칼이고, Qm은 아미노 라디칼에 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 라디칼, 산소 라디칼, 혹은 아미노 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m은 2 혹은 2 보다 크지만 10 혹은 10 보다 작은 정수이다.
더욱 높은 관심이 있는 PNA 올리고머는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식1의 PNA 올리고머와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포괄하는데:
식 중에서,
n 은 10 혹은 10 보다 크지만 20 혹은 20 보다 작은 정수이며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소 라디칼이며;
X와 Y는 수소 라디칼이나 치환체가 있거나 없는 아실 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되는데;
Z는 하이드록시 라디칼이나 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼 중에서 선택되며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 싸이민, 구아닌, 싸이토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기들이나 비천연 핵산염기 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 셋은 화학식2, 화학식3, 혹은 화학식4로 표시되는 비천연 핵산염기 중에서 각자 독립적으로 선택되고;
R1, R3, 그리고 R5는 수소 라디칼이며, R2, R4, 그리고 R6는 수소 라디칼이나 치환제가 있거나 없는 아미디닐(Amidinyl) 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되는데;
Q1과 Qm은 메틸렌 라디칼이고, Qm은 아미노 라디칼에 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 라디칼, 산소 라디칼, 아미노 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m은 2 혹은 2 보다 크지만 10 혹은 10 보다 작은 정수이다.
가장 높은 관심이 있는 PNA 올리고머는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식1의 PNA 올리고머와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포괄하는데:
화학식1 중에서,
n 은 10 혹은 10 보다 크지만 20 혹은 20 보다 작은 정수이며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소 라디칼이며;
X와 Y는 수소 라디칼과 치환체가 있거나 없는 아실 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되고;
Z는 하이드록시 라디칼 혹은 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 싸이민, 구아닌, 싸이토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기들이나 비천연 핵산염기들 중에서 각자 독립적으로 선택되며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 셋은 화학식2, 3 혹은 화학식4로 표시되는 비천연 핵산염기 중에서 각자 독립적으로 선택되고;
R1, R3 그리고 R5는 수소 라디칼이며, R2, R4 그리고 R6는 각각 수소 라디칼이거나 아미디닐(Amidinyl) 라디칼이며;
Q1과 Qm은 메틸렌 라디칼이고, Qm은 아미노 라디칼에 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 라디칼이나 산소 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m은 2 혹은 2 보다 크지만 8 혹은 8 보다 작은 정수이다.
강한 관심이 있는 구체적인 PNA 올리고머는 아래의 조건을 만족하는 화학식1의 PNA 올리고머와 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포괄하는데:
화학식1 중에서,
n 은 8 혹은 8 보다 크지만 20 혹은 20 보다 작은 정수이며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소 라디칼이며;
X는 수소 라디칼이고;
Y는 수소 라디칼 혹은 치환체가 있거나 없는 아실 라디칼이며;
Z는 하이드록시 라디칼 혹은 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼이며;
B1, B2, ……, Bn-1, 그리고 Bn은 아데닌, 싸이민, 구아닌, 그리고 싸이토신을 포함하는 천연 핵산염기들이나 비천연 핵산염기들 중에서 각자 독립적으로 선택되는데;
B1, B2, ……, Bn-1, 그리고 Bn 중 최소한 셋은 화학식2, 화학식3, 혹은 화학식4로 표시되는 비천연 핵산염기에서 각자 독립적으로 선택되고;
R1, R3 그리고 R5는 수소 라디칼이며, R2, R4 그리고 R6는 각각 수소 라디칼이거나 아미디닐 라디칼이며;
L1은 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, 혹은 -CH2-O-(CH2)3- 이며; 그리고,
L2와 L3는 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, 그리고 -(CH2)8- 중에서 각자 독립적으로 선택된다.
본 발명에 의한 PNA 올리고머는 핵산이나 리보핵산단백질과 같이 핵산 부분을 보유한 생리활성 분자들에 의하여 매개되는 세포 기능이나 생리학적 기능을 염기배열에 특이적으로 저해하거나 조절하는데 유용하다. 아울러 본 발명의 PNA 올리 고머는 염기배열에 특이적으로 핵산과 결합하는 능력을 보유하고 있으므로 진단 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 PNA 올리고머에 대하여 앞에서 사용된 용어나 약어는 아래의 표1에 설명 혹은 정의되어 있다.
| 용어/약어 | 설명 혹은 정의 |
| 올리고머 | 올리고뉴클레오타이드(Oligonucleotide) |
| 수소 라디칼 | 치환체에 결합된 수소 원자 (-H) |
| 중수소 라디칼 | 치환체에 결합된 중수소 원자 (-D) |
| 알킬 라디칼 | 선형(Linear)이나 가지형(Branched) 알킬기 |
| 아릴 라디칼 | 페닐, 피리딜, 퓨릴(Furyl), 나프틸(Naphthyl) 등의 방향기 |
| 메틸렌 라디칼 | -(CH2)- |
| 아실 라디칼 | 수소, 알킬, 혹은 아릴 라디칼을 치환체로 가진 '-C(O)-' |
| 설포닐 라디칼 | 알킬, 혹은 아릴 라디칼을 치환체로 가진 '-S(O)2-' |
| 알킬옥시 라디칼 | 'R-O-'로 표시되는 라디칼이며 R은 알킬 라디칼 |
| 산소 라디칼 | 치환체에 결합된 산소 원자 [-O-] |
| 황 라디칼 | 치환체에 결합된 황 원자 [-S-] |
| 아미디닐 라디칼 |
|
| 천연 핵산염기 |
|
일반적 합성 방법
본 발명의 분자들에 대한 NMR 스펙트럼은 Varian Mercury 300MHz, Bruker Avance 400, 혹은 Varian Inova 500MHz NMR Spectrometer를 이용하여 기록하였다. 본 발명의 화합물들에 대한 질량 분석은 Bruker Daltonics Ultraflex MALDI-TOF 혹은 Agilent LC/MS Ion Trap System을 이용하였다. 본 발명의 PNA 올리고머는 Hewlett Packard 1050 HPLC 혹은 Shimazu LC-6AD HPLC와 C18-Reverse Phase 컬럼을 이용하여 분석 및 정제하였다. 특별히 언급이 없을 경우, 저분자 화합물들의 크로마토그래피 분리에는 실리카겔이 사용되었다. 본 발명의 저분자 화합물들의 융점은 보정이 안된 상태로 보고되었다.
본 발명의 PNA 모노머 합성에 사용된 비천연 핵산염기 유도체들은, 각 합성 실시예에서 특별한 언급이 없을 경우, 아래에 제시된 합성법들(합성법 A, B, C) 중 하나에 따르거나 이를 약간 변형하여 합성되었다.
합성법 A: 6-알킬-피롤로싸이토신(6-Alkyl-pyrollocytosine) 유도체들은 반응식1에 따르거나 이를 약간 변형하여 적절한 프로텍팅 그룹(Protecting Group)이 붙은 상태로 합성되었다. 이러한 6-알킬-피롤로싸이토신 유도체들은 화학식2로 대표되는 싸이토신 대체 염기를 보유한 PNA 모노머들을 합성하는데 사용되었다.
우선 화합물 a를 NaH로 탈산(Deprotonation)시키고 에틸브로모아세테이트(Ethylbromoacetate)로 알킬화하여 화합물 b를 얻었다. 화합물 b를 문헌에 보고된 바와 같이 팔라듐(Palladium) 촉매하에 아세틸렌 유도체와 결합(Coupling)시키고 반응 중에 고리화시켜(Annulated) 화합물 c를 얻었다(Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids vol 22, 1029-1033, 2003).
합성법 B: 2,6-디아미노퓨린(2,6-Diaminopurine) 유도체들은 반응식 2에 따르거나 이를 약간 변형하여 적절한 프로텍팅 그룹(Protecting Group)이 붙은 상태 로 합성되었다. 이러한 2,6-디아미노퓨린 유도체들은 화학식3으로 대표되는 아데닌 대체 염기를 보유한 PNA 모노머들을 합성하는데 사용되었다.
먼저, 2-할로아데닌(2-Haloadenine)을 고온에서 디아민(Diamine)과 반응시켜 화합물 d를 얻은 후, d를 Boc2O와 반응시켜 화합물 e를 얻었다. 화합물 e를 NaH로 탈산시킨 후 에틸브로모아세테이트로 알킬화하여 화합물 f를 얻었다. 화합물 f의 아미노 그룹을 Cbz나 Boc 그룹으로 프로텍션(Protection)하여 화합물 g를 얻었다.
합성법 C: N-알킬화된(N-alkylated) 구아닌 유도체들은 반응식 3에 따르거나 이를 약간 변형하여 적절한 프로텍팅 그룹(Protecting Group)이 붙은 상태로 합성되었다. 이러한 N-알킬화된 구아닌 유도체들은 화학식4로 대표되는 구아닌 대체 염기를 보유한 PNA 모노머들을 합성하는데 사용되었다.
먼저, 2-할로하이포잔틴(2-Halohypoxanthine)을 디아민(Diamine)과 고온에서 반응시켜 화합물 h를 얻은 후, 화합물 h를 Boc2O와 반응시켜 화합물 i를 얻었다. 화합물 i를 NaH로 탈산시킨 후 에틸브로모아세테이트로 알킬화하여 화합물 j를 얻었다.
화학식1의 PNA 올리고머를 만들기 위하여, 합성법 D 혹은 합성법 E에 따라 두 종류의 PNA 모노머를 합성하였다. 반응식 4의 PNA 모노머 o가 사용된 경우, PNA 올리고머는 (주)씨티아이바이오의 요청에 따라 대전에 소재한 (주)파나진(www.panagene.com)에 위탁하여 합성되었다. 반응식 5의 PNA 모노머 q가 사용된 경우, PNA 올리고머를 특허에 보고된 방법이나 이를 약간 변형하여 자체 합성하였다(미국 특허 6,133,444).
합성법 D: 변형된 핵산염기를 갖는 PNA 모노머는 반응식 4에 따르거나 이를 약간 변형하여 문헌에 보고된 PNA 올리고머 합성법에 부합하는 프로텍팅 그룹이 붙은 상태로 합성되었다(Org. Lett. vol 9, 3291-3293, 2006). 반응식 4에서, 에스터(Ester) k는 반응식 1의 화합물 c, 반응식 2의 화합물 g, 혹은 반응식 3의 화합물 j에 해당되나, 꼭 이들 에스터 화합물 중 하나에 한정되는 것은 아니다.
우선 에스터 k를 염기 조건하에서 가수분해하여 카르복실산 l을 얻고, l을 에틸 N-[2-{N-(2-벤조티아졸리닐)설포닐아미노}에틸]글라이시네이트(Ethyl N-[2-{N-(2-benzothiazolinyl)sulfonylamino}ethyl]glycinate)와 펩타이드 축합시켜 화합물 m을 얻었다. 화합물 m을 LiOH로 조심스럽게 가수분해하여 카르복실산 n을 얻은 후, n을 EDCI 축합 반응을 이용하여 고리화된(Cyclized) PNA 모노머 o를 얻었다. 본 발명에서는 PNA 모노머의 화학적 구조를 반응식 4의 화합물 o와 같이 가정하였는데, 문헌 보고에 따르면 이러한 구조를 가졌다고 해석된 PNA 모노머들이 PNA 올리고머 합성에 성공적으로 사용된 바 있다(Org. Lett. vol 9, 3291-3293, 2006).
합성법 E: 아울러서, 변형된 핵산염기를 갖는 PNA 모노머는 반응식 5에 따르거나 이를 약간 변형하여 특허에 보고된 PNA 올리고머 합성법에 적절한 프로텍팅 그룹이 붙은 상태로 합성되었다(미국 특허 6,133,444). 반응식 5에서, 에스터 k는 반응식 1의 화합물 c, 반응식 2의 화합물 g, 혹은 반응식 3의 화합물 j에 해당되나, 꼭 이들 에스터 화합물 중 하나에 한정되는 것은 아니다.
우선 카르복실산 l을 EDCI 축합 반응을 이용하여 에틸 N-[2-{N-(9H-플로렌-9-일)아미노}에틸]글리시네이트(Ethyl N-[2-{N-(9H-fluoren-9-yl)amino}- ethyl]glycinate)와 축합하여 화합물 p를 얻었다. 그리고 p를 LiOH를 이용하여 가수분해하여 변형된 핵산염기를 보유한 PNA 모노머 q를 얻었다.
합성 실시예
다음의 합성 실시예들은 본 발명의 화합물들에 대한 합성법에 대한 세부적인 기술을 포함한다. 이러한 실시예들의 세부 내용은 본 발명에 대한 설명을 위하여 제공 되었으나 본 발명의 범위를 제한하기 위함은 아니다. 이러한 세부 내용들 대부분은 본 발명의 범위에 속하며 본 발명의 일부를 이루는 일반적 합성방법을 설명한다. 다음의 실시예들에 사용된 약어들에 대한 설명은 아래의 표2에 제공되어 있다.
| 구분 | 설명 |
| 1H NMR | 프로톤 핵자기 공명. NMR 데이터 제공시, 널리 사용되는 약어들이 다음과 같이 사용되었다: s = singlet, d = doublet, t = triplet, q = quartet, m = multiplet, br = broad, J = coupling constant, CDCl3 = 듀터리오 클로로포름, DMSOd6 = 헥사 듀터리오 DMSO, 등등. |
| MS | 질량 분광학. MS 데이터 제공시, 보편적으로 사용되는 약어들이 다음과 같이 사용되었다: MALDI-TOF = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight, ESI = Electrospray Ionization, MW = 분자량, (m+1) = MH+ 이온에 해당되는 MS 시그널, (m+23) = MNa+ 이온에 해당되는 시그널, 등등. |
| 용매류 | 용매류에 대하여 널리 사용되는 약어들이 다음과 같이 사용되었다: THF = 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran), MC = 메틸렌클로라이드(Methylene Chloride), DMF = 디메틸포름아마이드(N,N-Dimethylformamide), MeOH = 메탄올, DMSO = 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide), EA = 에틸아세테이트, 등등. |
| 시약류 | 시약류에 대하여 널리 사용되는 약어들이 다음과 같이 사용되었다: NaH = sodium hydride, HCl = 염산, EDCI = 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드[1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimide] 염산, HOBT = 1-하이드록시벤조트리아졸(1-hydroxy- benzotriazole), Boc = t-부톡시카르보닐(t-butyloxycarbonyl), Boc2O = Boc 안하이드라이드 혹은 디-t-부틸디카보네이트(di-t-butyl-di- carbonate), Cbz = 벤질옥시카르보닐(Benzyloxy carbonyl), Fmoc = (9H-플로렌-9-일)메톡시카르보닐[(9H-fluoren-9-yl)methoxycarbonyl], Bts = 벤조[d]티아졸-2-설포닐[(Benzo[d]thiazole-2-sulfonyl)], Bts-Cl = (벤조[d]티아졸-2-설포닐)클로라이드[(Benzo[d]thiazole-2- sulfonyl)]chloride, TFA = 트리플로로아세트산(Trifluoroacetic Acid), TEA = 트리에틸아민(Triethylamine), DIEA = 디이소프로필에틸아민(Di-isopropyl-ethylamine), LiOH = 리튬 하이드록사이드(Lithium Hydroxide), Aeg = N-(2-아미노에틸)글리신[N-(2-aminoethyl)- glycine], Fmoc-Aeg-OH = N-[2-{(9H-플로렌-9-일)메톡시카르보닐}아미노-에틸]글리신[N-[2-{(9H-fluoren-9-yl)methoxycarbonyl}amino- ethyl]glycine], Fmoc-Aeg-OMe = 메틸 N-[2-{(9H-플로렌-9-일)메톡시카르보닐}아미노-에틸]글리시네이트, Fmoc-Aeg-OtBu = t-부틸 N-[2-{(9H-플로렌-9-일)메톡시카르보닐}아미노-에틸]글리시네이트, Fmoc-Aeg-OSu = N-숙시닐 N-[2-{(9H-플로렌-9-일)메톡시카르보닐}아미노-에틸]글리시네이트, HBTU = O-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우라니움 헥사플로로포스페이트[O-(benzo- triazol-1-yl)- 1,1,3,3-tetra-methyluranium hexafluorophosphate], DCC = 1,3-디시클로헥실카보디이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide), 등등. |
- 실시예 1 -
3-{(t-부톡시카르보닐)아미노}-1-프로파놀(1)의 제조
150ml THF와 150ml 물에 녹인 14g의 3-아미노-1-프로파놀에 100ml THF에 녹인 40.7g의 Boc2O를 30분에 걸쳐 방울방울 가하였다. 반응 혼합물을 24시간 교반한 후, THF를 감압 제거하고 남은 수용액 층을 200ml EA로 추출하였다. 유기층을 0.5M 구연산 수용액과 증류수로 각각 세척한 후, 무수 마그네슘 설페이트(Magnesium Sulfate)로 탈수하였다. 마그네슘 설페이트를 여과하여 제거한 후 남는 용액을 감압 농축하여 25g의 화합물 1을 무색의 액체로 얻었다. 1H NMR (400MHz; CDCl3): δ4.84 (br s, 1H), 3.66 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.28 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 3.05 (br s, 1H), 1.66 (m, 2H), 1.45 (s, 9H).
- 실시예 2 -
에틸 {(N-벤조일)-5-요오도싸이도신-1-일}아세테이트(2)의 제조
60ml DMF에 녹인 8.3g의 N-벤조일-5-요오도싸이토신을 0℃에서 교반하면서 미네랄 오일에 혼합된 55% NaH 1.06g을 부가한 후, 반응 용액을 실온에서 2시간 교반하였다. 이 반응 용액에 2.7ml 에틸 브로모아세테이트를 가하고 24시간 실온에서 교반하고 용매를 감압 제거하였다. 얻어진 잔류물을 100ml MC와 60ml 증류수에 녹인 후 녹지 않은 물질을 여과하여 제거하고 여과액을 암모늄 클로라이드 포화 수용액으로 2회 세척하고, 유기층을 무수 마그네슘 설페이트로 탈수 후, 감압 농축하였다. 이렇게 얻어진 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(1:1 헥산/EA)로 정제하여 6.5g의 화합물 2(반응식 1의 화합물 b)를 노란색 고체로 얻었다. 융점: 154-5℃. 1H NMR (400MHz; CDCl3) δ 13.31 (br s, 1H), 8.37 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.69 (s, 1H), 7.55 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.46 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 4.49 (s, 2H), 4.27 (q, J= 7.2 Hz, 2H), 1.32 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
- 실시예 3 -
3-{3-(t-부톡시카르보닐아미노)프로필옥시}-1-프로핀(3)의 제조
55% NaH/미네랄오일 6.5g을 0℃에서 150ml THF에 분산시킨 후, 25g의 화합물 1을 15분에 걸쳐 방울방울 부가하고 반응 용액을 1시간 교반하였다. 이 반응 용액에 17.5ml의 프로파질(Prorargyl) 브로마이드 80% 톨루엔 용액을 30분에 걸쳐 방울방울 가하고, 상온에서 20시간 교반하였다. 이 용액에 250ml 물을 천천히 부가하여 반응을 종료시키고 THF를 감압 제거하였다. 그리고 남은 용액을 250ml EA로 추출하고 유기층을 250ml 물로 3회 세척하였다. 유기층을 무수 마그네슘 설페이트로 탈수하여 얻어진 여과액을 감압 농축하고 컬럼 크로마토그래피(5:1 헥산/EA)로 정제하여 22.7g의 화합물 3을 노란색 액체로 얻었다. 1H NMR (400 MHz; DMSOd6) δ 6.78 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.09 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 3.43-3.39 (m, 3H), 2.95 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.37 (s, 9H).
- 실시예 4 -
4-{2-(t-부톡시카르보닐아미노)에톡시}-1-부틴(4)의 제조
17ml THF에 녹인 3.8g의 4-(2-아지도에톡시)-2-부틴에 7.2g의 트리페닐포스핀과 0.7ml의 물을 부가하고 8시간 교반한 후, 용매를 감압 제거하였다. 얻어진 잔류물을 20ml EA에 녹인 후 10ml 1M 염산으로 2회 추출하여 얻어진 수용액 층에 소듐 카보네이트 수용액을 가하여 pH를 9-10에 맞추었다. 이 용액에 15ml THF에 녹인 5.96g의 Boc2O를 가한 후 반응 용액을 12시간 교반하였다. THF를 감압 제거한 후 얻어진 용액을 EA로 추출하고 유기층을 0.5M 구연산 수용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 마그네슘 설페이트를 이용하여 탈수하고 농축한 후 칼럼 크로마토그래피(9:1 헥산/EA)로 정제하여 3.4g의 화합물 4를 노란 액체로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; CDCl3) δ 4.95 (s, 1H), 3.58 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.53 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.32 (m, 2H), 2.46 (m, 2H), 2.00 (t, J = 2.8 Hz, 1H), 1.45 (s, 9H).
- 실시예 5 -
3-{2-(t-부톡시카르보닐아미노)에톡시}-1-프로핀 (5)의 제조
20g의 2{(t-부톡시카르보닐)아미노}-1-에탄올의 실시예 3의 경우와 유사하게 반응시키고 정제하여 23.7g의 화합물 5를 연노란색 오일로 얻었다. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 6.81 (t, 1H), 4.11 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 3.41 (m, 3H), 3.07 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 1.38 (s, 9H).
- 실시예 6 -
3-[N-{3-(t-부톡시카르보닐아미노)프로필}-N-(t-부톡시카르보닐) 아미노)]-2-프로핀(6)의 제조
83ml THF와 95ml 물에 녹인 N-[3-(t-부톡시카르보닐아미노)프로필] -N-(2-프로피닐)아민을 교반하면서 80ml THF에 녹인 42g의 Boc2O를 상온에서 방울방울 가하였다. 반응 용액을 1.5시간 교반한 후 감압 농축시켜 얻어진 수용액을 EA로 추출하였다. EA 층을 0.5M 구연산 수용액과 소금물로 각각 세척하고 무수 마그네슘설페이트로 탈수하였다. 마그네슘 설페이트를 여과하여 제거한 후, 여액을 감압 농축하고 컬럼 크로마토그래피(1:1 헥산/EA)로 정제하여 19g의 화합물 6을 액체로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; CDCl3) δ 5.26 (br s, 0.6H), 4.74 (br s, 0.4H), 4.07 (br s, 1H), 3.98 (br s, 1H), 3.40 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.13 (m, 2H), 2.21 (t, 1H), 1.73 (m, 2H), 1.49 (s, 9H), 1.45 (s, 9H).
- 실시예 7 -
3-[2-{2,3-비스(벤질옥시카르보닐)구아니디노}에톡시]-1-프로핀 (7)의 제조
110ml MC에 녹인 10.9g의 화합물 5에 110ml TFA를 0℃에서 교반하면서 2시간에 걸쳐 방울방울 가한 후, 3시간 더 교반하였다. 반응 용액을 감압 농축한 후 얻어진 잔류물을 40ml MC에 녹이고 교반하면서 12.3ml TEA를 0℃에서 부가하고 8.8g의 1,3-비스(벤질옥시카르보닐)-2- (메틸티오)슈도유레아를 상온에서 2시간에 걸쳐 방울방울 부가하였다. 반응 용액을 4시간 교반한 후 물로 2회 세척하였다. 이렇게 얻어진 유기층을 무수 마그네슘 설페이트로 탈수하고 감압 농축하고 컬럼 크로마토그래피(5:1 헥산/EA)로 정제하여 9.8g의 화합물 7을 흰색의 고체로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 11.72 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 7.40-7.35 (m, 10H), 5.18 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.18 (d, 2H), 3.67-3.66 (m, 4H), 2.43 (t, 1H).
- 실시예 8 -
2-{(t-부톡시카르보닐)아미노}-1-(2-프로피닐-1-옥시)}-(R)-프로판(8)의 제조
10.8g의 t-부틸 (R)-(1-하이드록시프로판-2-일)카바메이트를 실시예 3과 유사하게 반응시키고 정제하여 10.1g의 화합물 8을 노란 액체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ6.63 (d, 1H), 4.11 (d, 2H), 3.60 (m, 1H), 3.37-3.33 (m, 2H), 3.26-3.23 (m, 1H), 1.38 (s, 9H), 1.05 (d, 3H).
- 실시예 9 -
N-[2-{2-(t-부톡시카르보닐)아미노에톡시}에틸]-N-[2-{(3-부티닐)- 1-옥시}에틸]-N-(t-부톡시카르보닐)아민(9)의 제조.
5g의 2-{(3-부티닐)-1-옥시}에틸 메탄설포네이트와 5.32g의 2-[2-{2- (t-부톡시카르보닐)아미노}에틸-1-옥시]에틸아민을 60ml 아세토니트릴에 녹인 후 교반하면서 물에 녹인 3.6g의 포타슘 카보네이트를 0℃에서 부가한 후 온도를 상온으로 서서히 오르도록 방치하였다. 반응 용액을 24시간 교반하고 감압 농축한 후 MC에 녹이고 물로 세척하였다. 유기층을 농축한 후 남는 잔류물을 80ml THF와 80ml 물에 녹인 후 50ml THF에 녹인 8.4g의 Boc2O를 부가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 16시간 교반한 후 THF를 감압 제거하고 EA로 추출하였다. 유기층을 0.5M 구연산 수용액, 물, 소금물로 차례로 세척한 후, 무수 소듐 설페이트로 탈수하고 여과하였다. 여과액을 감압 농축한 후 컬럼 크로마토그래피(헥산 → 4:1 헥산/EA)로 정제하여 2.45g의 화합물 9를 연노랑 액체로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; CDCl3) δ 5.08 (br s, 0.5H), 4.93 (br s, 0.5H), 3.61-3.46 (m, 12H), 3.31 (m, 2H), 2.48 (m, 2H), 1.99 (t, 1H), 1.48 (s, 9H), 1.46 (s, 9H).
- 실시예 10 -
에틸 2-[6-{3-(t-부톡시카르보닐아미노)프로필-1-옥시}메틸-2- 옥소-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-3(7H)-일]아세테이트 (10)의 제조
120ml DMF에 녹인 6.5g의 화합물 2를 교반하면서 580mg의 CuI, 4.2ml TEA, 9.74g의 화합물 3 및 1.76g의 Pd(PPh3)4을 차례로 부가하였다. 빛을 차단한 조건에서 반응 혼합물을 50℃에서 24시간 교반한 후 감압 농축하였다. 얻어진 잔류물을 250ml 에탄올에 녹이고 18시간 환류 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후 컬럼 크로마토그래피(95:5 EA/에탄올)로 정제하여 2.3g의 화합물 10을 검붉은 거품/고체로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 11.30 (br s, 1H), 8.37 (s, 1H), 6.78 (m, 1H), 6.19 (s, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.37 (s, 2H), 4.14 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.42 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.98 (m, 2H), 1.63 (m, 2H), 1.36 (s, 9H), 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
- 실시예 11 -
2-[6-{3-(t-부톡시카르보닐아미노)프로필-1-옥시}메틸-2-옥소-2H-피롤로-[2,3-d]피리미딘-3(7H)-일]아세트 산(11)의 제조
3.3g의 화합물 10에 15ml THF, 30ml 물, 그리고 760mg의 LiOH를 차례로 가한 후 실온에서 20분 교반하였다. THF를 감압 제거한 후 얻어진 수용액을 에테르로 세척하였다. 수용액 층을 1M 염산으로 pH 3에 맞춘 후 EA로 추출하였다. 유기층을 무수 소듐 설페이트로 탈수하고 얻어진 여과액을 농축하여 2.46g의 화합물 11을 흰색 고체로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 11.05 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 6.79 (t, 1H), 6.12 (s, 1H), 4.35 (s, 2H), 4.23 (s, 2H), 3.41 (t, 2H), 2.97 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 1.64 (m, 2H), 1.36 (s, 9H).
- 실시예 12 -
에틸 N-[2-{(벤조[d]티아졸-2-설포닐)아미노}에틸]-N-[2-[6-{3- (t-부톡시카르보닐아미노)프로필-1-옥시}메틸-2-옥소-2H-피롤로-[2,3-d]피리미딘-3(7H)-일]아세틸]글리신네이트(12)의 제조
4.0g의 화합물 11과 3.6g의 of 에틸 N-[2-{(벤조[d]티아졸-2-설포닐)- 아미노}에틸]글리시네이트를 30ml DMF에 녹이고 2.42g의 EDCI와 1.70g의 HOBt를 부가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 8시간 교반 후 용매를 감압 제거하여 얻어진 잔류물을 MC에 녹이고 1M 염산과 물로 차례로 세척하였다. MC 용액을 농축하고 컬럼 크로마토그래피(95:5 MC/MeOH)로 정제하여 4.6g의 화합물 12를 노란색 거품/고체로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 11.09 (br s, 1H), 8.74 (s, 0.6H), 8.58 (s, 0.4H), 8.27 (m, 1H), 8.20-8.14 (m, 2H), 7.66 (m, 2H), 6.56 (br s, 1H), 6.16 (m, 1H), 4.91 (s, 1.2H), 4.73 (s, 0.8H), 4.38 (s, 2.6H), 4.17 (m, 0.9H), 4.07 (m, 2.5H), 3.67 (m, 1.1H), 3.49-3.44 (m, 4H), 3.26 (m, 0.9H), 3.01 (m, 2H), 1.66 (m, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.24 (t, J = 7.0 Hz, 1.2H), 1.17 (t, J = 7.0 Hz, 1.8H).
- 실시예 13 -
N-[2-{(벤조[d]티아졸-2-설포닐)아미노}에틸]-N-[2-[6-{3-(t- 부톡시카르보닐아미노)프로필-1-옥시}메틸-2-옥소-2H-피롤로-[2,3-d]-피리미딘-3(7H)-일]아세틸]글리신(13)의 제조.
4.5g의 화합물 12와 670mg의 LiOH를 20ml THF와 20ml 물에 분산시킨 후 상온에서 20분간 교반하였다. THF를 감압 제거한 후 얻어지는 수용액을 에테르로 세척하고 1M 염산으로 pH 3에 맞춘 후 EA로 추출하였다. 유기층을 무수 소듐 설페이트로 탈수하고 얻어진 여과액을 감압 농축하여 4.4g의 화합물 13을 어두운 노란색 고체로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 11.32 (br s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.28 (m, 1.6H), 8.22 (s, 0.4H), 7.73 (m, 2H), 6.78 (m, 1H), 6.20 (s, 1H), 4.94 (s, 1.2H), 4.84 (s, 0.8H), 4.52 (s, 0.8H), 4.37 (s, 2H), 4.30 (s, 1.2H), 4.26 (m, 1.2H), 4.07 (m, 2H), 3.87 (m, 0.8H), 3.43 (m, 2H), 2.99 (m, 2H), 1.63 (m, 2H), 1.37 (s, 9H).
- 실시예 14 -
1-(벤조[d]티아졸-2-설포닐)-2-옥소-4-[6-{3-(t-부톡시카르보닐- 아미노)프로필-1-옥시}메틸-2-옥소-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-3(7H)-일]아세틸]피페라진(14)의 제조.
4.4g의 화합물 13과 1.49g의 EDCI를 50ml DMF에 섞은 후 상온에서 16시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하여 얻어진 잔류물을 50ml MC에 녹이고 1M 염산과 물로 차례로 세척하였다. MC 층을 감압 농축하고 컬럼 크로마토그래피(아세톤)로 정제하여 1.5g의 화합물 14를 갈색 거품/고체로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 11.25 (br s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.29 (m, 1H), 8.25 (s, 0.6H), 8.19 (0.4H), 7.72 (m, 2H), 6.78 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 6.18 (s, 1H), 4.92 (s, 1.2H), 4.82 (s, 0.8H), 4.51 (s, 0.8H), 4.37 (s, 2H), 4.29 (s, 1.2H), 4.23 (m, 1.2H), 4.06 (m, 2H), 3.87 (m, 0.8H), 3.41 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.98 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.36 (s, 9H). MS/ESI (m+23/MNa+) = 682.2 (측정치), MW = 659.8 (C28H33N7O8S2).
아세틸렌 유도체 4 ~ 9를 출발 물질로 하여 실시예 10의 방법과 유사하게 반응시켜 피롤로싸이토신 유도체 15 ~ 20를 합성하였다. 화합물 15 ~ 20에 대한 분석 데이타는 아래의 표에 요약되어 있다.
표3은 실시예 15 내지 20의 피롤로싸이토신 유도체 15 ~ 20에 대한 분석 데이타이다.
| 화합물 | 출발물질 | X | 분석 데이타 |
| 15 | 4 |
|
1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 11.12 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 6.79 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 6.00 (s, 1H), 4.68 (s, 2H), 4.14 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.65 (t, J = 6.6, 2H), 3.39 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.08 (m, 2H), 2.78 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.37 (s, 9H), 1.20 (t, J = 7.2 Hz, 3H). 연한 녹색 거품/고체. |
| 16 | 5 |
|
1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 11.35 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 6.87 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 6.21 (s, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.41 (s, 2H), 4.15 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.43 (m, 2H), 3.12 (m, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H). 연한 노란색 거품/고체. |
| 17 | 6 |
|
H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 11.20 (br s, 0.6H), 8.86 (br s, 0.4H), 8.57 (s, 0.2H), 8.35 (s, 0.8H), 6.83-6.76 (m, 1H), 6.00 (s, 0.8H), 5.76 (s, 0.2H), 4.75 (s, 0.3H), 4.70 (s, 1.7H), 4.55 (s, 0.3H), 4.30 (s, 1.7H), 4.14 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.18 (m, 2H), 2.90-2.88 (m, 2H), 1.58 (m, 2H), 1.40-1.36 (m, 18H), 1.20 (t, 3H). 갈색 거품/고체. |
| 18 | 7 |
|
1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 11.57 (s, 1H), 11.33 (s, 1H), 8.50 (m, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.44-7.31 (m, 10H), 6.22 (s, 1H), 5.22 (s, 2H), 5.03 (s, 2H), 4.70 (s, 2H), 4.44 (s, 2H), 4.14 (q, 2H), 3.57-3.53 (m, 4H), 1.21 (t, 3H). 연갈색 고체. |
| 19 | 8 |
|
1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 11.32 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 6.71 (d, 1H), 6.20 (s, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.41 (m, 2H), 4.14 (q, 2H), 3.65 (m, 1H), 3.37-3.34 (m, 1H), 3.26-3.22 (m, 1H), 1.37 (s, 9H), 1.20 (t, 3H), 1.02 (d, 3H). 연갈색 고체. |
| 20 | 9 |
|
1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ11.13 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 6.73 (s, 1H), 5.99 (s, 1H), 4.68 (s, 2H), 4.12 (q, 2H), 3.67 (t, 2H), 3.48-3.27 (m, 10H), 3.04 (q, 2H), 2.78 (t, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.36 (s, 1H), 1.19 (t, 3H). 갈색 고체. |
피롤로싸이토신 유도체 15, 16, 17, 그리고 20을 출발 물질로 하여 실시예 11 내지 14와 유사한 방법으로 변형된 싸이토신 PNA 모노머 21 ~ 24를 제조하였다. 화합물 21 ~ 24에 대한 분석 데이타는 아래의 표에 요약되어 있다.
표4는 실시예 21 내지 24의 싸이토신 PNA 모노머 21 ~ 24에 대한 분석 데이타이다.
| 화합물 | 출발물질 | X | 분석 데이타 |
| 21 | 15 |
|
1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ11.06 (s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.28 (m, 1H), 8.14 (s, 0.6H), 8.08 (2, 0.4H), 7.72 (m, 2H), 6.78 (t, 1H), 5.98 (s, 1H), 4.91 (s, 1.2H), 4.80 (s, 0.8H), 4.51 (s, 0.8H), 4.29 (s, 1.2H), 4.24 (m, 1.2H), 4.06 (m, 2H), 3.86 (m, 0.8H), 3.64 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.38 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.07 (m, 2H), 2.78 (m, 2H), 1.37 (s, 9H). MS/ESI (m+1) = 660.2 (측정치), MW = 659.8 (C28H33N7O8S2). 갈색 거품/고체. |
| 22 | 16 |
|
1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 11.31 (s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.30-8.27 (m, 1.6H), 8.22 (s, 0.4H), 7.73 (m, 2H), 6.87 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 6.20 (m, 1H), 4.94 (s, 1.2H), 4.83 (s, 0.8H), 4.52 (s, 0.7H), 4.41 (s, 2.1H), 4.30 (s, 1.1 H), 4.25 (m, 1.2H), 4.06 (m, 2H), 3.87 (m, 0.8H), 3.42 (t, 2H), 3.12 (m, 2H), 1.38 (s, 9H). MS/ESI (m+1) = 646.2 (측정치), MW = 645.7 (C27H31N7O8S2). 붉은 거품/고체. |
| 23 | 17 |
|
1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 11.16 (br s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.28 (m, 1H), 8.21 (s, 0.6H), 8.15 (s, 0.4H), 7.73 (m, 2H), 6.77 (br s, 1H), 6.00 (br s, 1H), 4.92 (s, 1.2H), 4.82 (s, 0.8H), 4.52 (s, 0.9H), 4.30 (s, 3.1H), 4.25 (m, 1.2H), 4.07 (m, 2H), 3.87 (m, 0.8H), 3.19 (m, 2H), 2.89 (m, 2H), 1.59 (m, 2H), 1.41-1.36 (m, 18H); MS/ESI (m+23/MNa+) = 781.3 (측정치), MW = 758.9 (C33H42N8O9S2). 붉은 거품/고체. |
| 24 | 20 |
|
1H NMR (500 MHz; DMSOd6) δ11.10 (m,1H), 8.35 (m, 1H), 8.28 (m, 1H), 8.14 (s, 0.6H), 8.08 (s, 0.4H), 7.72 (m, 2H), 6.76 (m, 1H), 5.97-5.96 (s, 1H), 4.90 (s, 1.2H), 4.80 (s, 0.8H), 4.51 (s, 0.8H), 4.29 (s, 1.2H), 4.25 (t, 1.2H), 4.08-4.04 (m, 2H), 3.86 (t, 0.8H), 3.66 (m, 2H), 3.47 (m, 2H), 3.41 (m, 2H), 3.32-3.30 (m, 4H), 3.27 (m, 2H), 3.04 (m, 2H), 2.77 (m, 2H), 1.37 (s, 9H), 1.35 (s, 9H). MS/ESI (m+23/MNa+) = 869.3 (측정치), MW = 847.0 (C37H50N8O11S2). 노란색 고체. |
- 실시예 25 -
2-{3-(t-부톡시카르보닐아미노)프로필}아미노아데닌 (25)의 제조
6.8g의 2-클로로아데닌을 68ml 1,3-디아미노프로판과 68ml 모노메톡시에탄올에 녹이고 24시간 환류 교반한 후 감압 농축하였다. 얻어진 잔류물을 100ml THF와 100ml 물에 녹인 후, 70ml THF에 녹인 60g의 Boc2O를 서서히 부가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 6시간 교반 후 유기용매를 감압 제거하였다. 얻어진 수용액을 100ml EA로 2회 추출하고 유기층을 0.5M 구연산 수용액과 소금물로 차례로 세척한 후 무수 마그네슘 설페이트로 탈수하고 감압 농축한 후 컬럼 크로마토그래피(1:10 MeOH/MC)로 정제하여 Boc 그룹이 두 개 붙은 중간체 4.07g을 고체로 얻었다. 이 중간체를 100ml MeOH에 녹이고 45ml의 소듐 카보네이트 수용액을 서서히 부가하였다. 이 반응 용액을 50℃에서 1시간 교반한 후 감압 농축하여 얻어진 잔류물을 50ml MeOH에 녹이고 녹지 않는 물질을 여과하여 제거하였다. 여과액을 농축하여 3.16g의 화합물 25를 흰색 고체로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 12.11 (br s, 1H), 7.63 (s, 1H), 6.78 (t, 1H), 6.55 (s, 2H), 6.07 (t, 1H), 3.20 (q, 2H), 2.96 (q, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.37 (s, 9H).
2-클로로아데닌과 적절한 디아민을 실시예 25와 유사하게 반응시켜 2,6-디아미노퓨린 유도체 26 ~ 30을 합성하였다. 화합물 26 내지 30에 대한 분석 데이타는 아래의 표5에 요약되어 있다.
표5는 실시예 26 내지 30의 2,6-디아미노퓨린 유도체 26 내지 30에 대한 분석 데이타이다.
| 화합물 | 출발물질 | L 2 | 분석 데이타 |
| 26 |
|
-(CH2)2- | 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 12.20 (br s, 1H), 7.66 (s, 1H), 6.84 (t, 1H), 6.62 (s, 2H), 6.10 (t, 1H), 3.25 (q, 2H), 3.08 (q, 2H), 1.36 (s, 9H). 연황색 고체. |
| 27 |
|
-(CH2)4- | 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 12.07 (br s, 1H), 7.63 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.50 (s, 2H), 6.02 (s, 1H), 3.18 (q, 2H), 2.91 (q, 2H), 1.48-1.36 (m, 13H). 연두색 고체. |
| 28 |
|
-(CH2)5- | 1H NMR (400 MHz; DMSOd6) δ 12.14 (br s, 1H), 7.65 (s, 1H), 6.77 (t, 1H), 6.55 (s, 2H), 6.01 (s, 1H), 3.17 (m, 2H), 2.89 (q, 2H), 1.48 (m, 2H), 1.41-1.36 (m, 11H), 1.26 (m, 2H). 연황색 고체. |
| 29 |
|
-(CH2)7- | H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 12.11 (br s, 1H), 7.64 (s, 1H), 6.78 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.56 (s, 2H), 6.04 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.17 (td, J = 6.3, 6.3 Hz, 2H), 2.88 (td, J = 6.7, 6.7 Hz, 2H), 1.49-1.47 (m, 2H), 1.36-1.31 (m, 11H), 1.29-1.22 (m, 6H). 연두색 고체. |
| 30 |
|
|
H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 12.15 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 6.84 (t, 1H), 6.56 (s, 2H), 6.05 (t, 1H), 3.48 (t, 2H), 3.39-3.34 (m, 4H), 3.07 (q, 2H), 1.37 (s, 9H). 노란색 거품. |
- 실시예 31 -
2-[2-{2-(t-부톡시카르보닐아미노)-2-메틸}에틸]아미노-1H-퓨린- 6(9H)-온 (31)의 제조
2-클로로하이포잔틴 11g과 1,2-디아미노프로판(라세믹) 4.96ml를 33ml 모노메톡시에탄올에 분산시킨 후 130℃에서 24시간 교반하였다. 용매를 감압 제거하여 얻어진 잔류물을 97ml THF와 97ml 물에 녹인 후, 64ml THF에 녹인 22.8g의 Boc2O를 서서히 부가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 교반하고 EA를 부가하여 얻어지는 침전물을 여과하여 화합물 31을 회색 고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 12.42 (s, 1H), 10.44 (br s, 1H), 7.61 (s, 1H), 6.76 (d, 1H), 6.27 (m, 1H), 3.67 (m, 1H), 3.32 (m, 1H), 3.14 (m, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.02 (d, 3H).
- 실시예 32 -
에틸 2-[6-아미노-2-{3-(t-부톡시카르보닐아미노)프로필}아미노- 9H-퓨린-9-일]아세테이트(32)의 제조
3.16g의 화합물 25를 100ml DMF에 녹인 용액에 480mg의 55% NaH/미네랄오일을 부가하고 2시간 교반한 후 1.98ml 에틸 브로모아세테이트를 서서히 부가하였다. 2시간 후 반응 혼합물을 감압 농축하고 컬럼 크로마토그래피(1:10 EtOH/EA)로 정제하여 2.92g의 디아미노퓨린 유도체 32를 연황색 고체로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 7.67 (s, 1H), 6.80 (t, 1H), 6.71 (s, 2H), 6.28 (t, 1H), 4.85 (s, 2H), 4.15 (q, 2H), 3.20 (q, 2H), 2.94 (q, 2H), 1.57 (m, 2H), 1.37 (s, 9H), 1.21 (t, 3H).
- 실시예 33 -
에틸 2-[6-(벤질옥시카르보닐)아미노-2-{3-(t-부톡시카르보닐- 아미노)프로필}-아미노-9H-퓨린-9-일]아세테이트 (33)의 제조
4.68g의 화합물 32를 100ml DMF에 녹이고 교반하면서 상온에서 13.2g의 N-(벤질옥시카르보닐)-N'-메틸-이미다졸륨 트리플레이트를 가하였다. 12시간 후 반응 혼합물을 감압 농축하고 컬럼 크로마토그래피(5% MeOH/MC)로 정제하여 5.4g의 화합물 33을 흰색 고체로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 10.19 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.45-7.33 (m, 5H), 6.88 (t, 1H), 6.77 (t, 1H), 5.18 (s, 2H), 4.94 (s, 2H), 4.16 (q, 2H), 3.25 (q, 2H), 2.95 (q, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.36 (s, 9H), 1.21 (t, 3H).
- 실시예 34 -
에틸 N-[2-{2-(벤조[d]티아졸)설포닐}아미노에틸]-N-[2-[6- (벤질옥시카르보닐)아미노-2-{3-(t-부톡시카르보닐아미노)프로필}아미노-9H-퓨린-9-일]아세틸]글리시네이트(34)의 제조
5.4g의 화합물 33과 950mg의 LiOH를 40ml THF와 40ml 물에 녹이고 상온에서 1시간 교반하였다. THF를 감압 제거하고 남은 수용액을 1M 염산으로 pH 3에 맞춘 후 EA로 추출하고 유기층을 무수 소듐 설페이트로 탈수 후 여과하여 얻어진 여과액을 감압 농축하였다. 이렇게 얻어진 잔류물과 2.92g의 에틸 2-N-[2-{(벤조[d]티아졸-2-설포닐)아미노}에틸]- 글리시네이트를 240ml DMF에 녹이고 상온에서 1.95g의 EDCI와 1.38g의 HOBt를 부가하였다. 반응 혼합물을 20시간 교반하고 감압 농축하고 MC에 녹인 후 1M 염산으로 세척하였다. MC 용액을 감압 농축하고 컬럼 크로마토그래피(5% MeOH/MC)로 정제하여 2.7g의 화합물 34를 연황색 거품으로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 10.18 (m, 1H), 8.97 (br s, 0.6H), 8.80 (br s, 0.4H), 8.28 (d, 1H), 8.18 (m, 1H), 7.80 (s, 0.6H), 7.76 (s, 0.4H), 7.66 (m, 2H), 7.46-7.32 (m, 5H), 6.77 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 5.10 (s, 1.2H), 4.89 (s, 0.8H), 4.45 (s, 0.8H), 4.17 (q, 0.8H), 4.07-4.00 (m, 2.4H), 3.68 (m, 1.2H), 3.47 (m, 1.2H), 3.41 (m, 0.9H), 3.22 (m, 2.7H), 2.94 (m, 2H), 1.59 (m, 2H), 1.36 (s, 9H), 1.31-1.12 (m, 3H).
- 실시예 35 -
1-(벤조[d]티아졸-2-설포닐)-2-옥소-4-[[6-(벤질옥시카르보닐)-아미노-2-{3-(t-부톡시카르보닐아미노)프로필아미노}-9H-퓨린-9-일]아세틸]피페라진(35)의 제조
2.7g의 화합물 34와 340mg의 LiOH를 15ml THF와 20ml 물에 분산시키고 상온에서 30분 교반하였다. THF를 감압 제거하고 남은 수용액을 1M 염산으로 pH 3에 맞추고 EA로 추출하였다. 유기층을 무수 소듐 설페이트로 탈수하고 감압 농축하여 2.48g의 중간체를 얻었다. 이 중간체와 716mg의 EDCI를 DMF에 녹이고 상온에서 20시간 교반한 후 용매를 감압 제거하였다. 얻어진 잔류물을 MC에 녹이고 1M 염산과 물로 각각 세척한 후 감압 농축하여 얻어진 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (아세톤)로 정제하여 1.4g의 화합물 35를 흰색 거품으로 얻었다. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 10.16 (s, 1H), 8.35 (m, 1H), 8.26 (m, 1H), 7.81 (s, 0.6H), 7.77 (s, 0.4H), 7.72 (m, 2H), 7.45-7.31 (m, 5H), 6.78 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 5.12 (s, 1.2H), 5.01 (s, 0.8H), 4.55 (s, 0.8H), 4.29-4.27 (m, 2.4H), 4.09 (m, 2H), 3.88 (m, 0.8H), 3.26 (m, 2H), 2.95 (m, 2H), 1.61 (m, 2H), 1.36 (s, 9H); MS/ESI (m+1) = 779.2 (측정치), MW = 778.9 (C34H38N10O8S2).
실시예 32 내지 35의 방법과 유사하게 2,6-디아미노퓨린 유도체 26 내지 30을 출발 물질로 하여 아데닌 PNA 모노머 36 내지 40을 제조하였다. PNA 모노머 36 내지 40에 대한 분석 데이타는 아래 표6에 요약되어 있다.
표6은 실시예 36 내지~ 40의 아데닌 PNA 모노머 36 ~ 40의 분석 데이타이다.
| 화합물 | 출발물질 | L 2 | 분석 데이타 |
| 36 | 26 | -(CH2)2- | 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 10.17 (s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.26 (m, 1H), 7.82 (s, 0.6H), 7.78 (s, 0.4H), 7.72 (m, 2H), 7.45-7.31 (m, 5H), 6.79 (2H), 5.18 (s, 2H), 5.12 (s, 1.2H), 5.01 (s, 0.8H), 4.55 (s, 0.8H), 4.29-4.25 (m, 2.4H), 4.09 (m, 2H), 3.87 (m, 0.8H), 3.29 (m, 2H), 3.11 (m, 2H), 1.33 (d, 9H). MS/ESI (m+1) = 765.2 (실험치), MW = 764.8 (C33H36N10O8S2). 흰색 거품. |
| 37 | 27 | -(CH2)4- | H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 10.10 (s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.26 (m, 1H), 7.80 (s, 0.6H), 7.76-7.71 (m, 2.4H), 7.46-7.31 (m, 5H), 6.81-6.73 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 5.12 (s, 1.2H), 5.01 (s, 0.8H), 4.55 (s, 0.8H), 4.30-4.25 (m, 2.4H), 4.09 (m, 2H), 3.88 (m, 0.8H), 3.26 (m, 2H), 2.90 (m, 2H), 1.50-1.36 (m, 13H); MS/ESI (m+1) = 793.3 (실험치), MW = 792.9 (C35H40N10O8S2). 주황색 거품/고체. |
| 38 | 28 | -(CH2)5- | 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 10.09 (s, 1H), 8.35 (m, 1H), 8.26 (m, 1H), 7.80 (s, 0.6H), 7.76 (s, 0.4H), 7.74-7.72 (m, 2.0H), 7.46-7.31 (m, 5H), 6.79-6.72 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 5.12 (s, 1.2H), 5.01 (s, 0.8H), 4.56 (s, 0.8H), 4.30-4.27 (m, 2.4H), 4.09 (m, 2H), 3.88 (m, 0.8H), 3.25 (m, 2H), 2.89 (m, 2H), 1.49 (m, 2H), 1.36 (m, 11H), 1.25 (m, 2H); MS/ESI (m+1) = 807.3 (실험치), MW = 806.9 (C36H42N10O8S2). 노란 거품/고체. |
| 39 | 29 | -(CH2)7- | 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 10.11 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 8.37-8.34 (m, 1H), 8.28-8.24 (m, 1H), 7.80 (s, 0.6H), 7.76 (s, 0.4 Hz), 7.75-7.70 (m, 2H), 7.75-7.31 (m, 5H), 6.82-6.74 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 5.12 (s, 1.2H), 5.01 (s, 0.8H), 4.58 (s, 0.8H), 4.29 (m, 1.2H), 4.27 (q, J = 4.9 Hz, 1H), 4.06-4.03 (m, 2H), 3.88 (t, J =5.2 Hz, 1H), 3.26-3.20 (m, 2H), 2.88-2.85 (m, 2H), 1.51-1.45 (m, 2H), 1.39-1.32 (m, 11H), 1.28-1.15 (m, 6H). MS/ESI (m+1) = 834.8 (측정치), MW = 835.0 (C38H46N10O8S2). 주황색 거품/고체. |
| 40 | 30 |
|
1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 10.14 (s, 1H), 8.35 (m, 1H), 8.26 (m, 1H), 7.82 (s, 0.6H), 7.78 (s, 0.4H), 7.73 (m, 2H), 7.46-7.31 (m, 5H), 6.81-6.74 (m, 2H), 5.18 (s, 2H), 5.13 (s, 1.2H), 5.02 (s, 0.8H), 4.55 (s, 0.8H), 4.30-4.26 (m, 2.4H), 4.09 (m, 2H), 3.88 (m, 0.8H), 3.50 (m, 2H), 3.43-3.38 (m, 4H), 3.07 (m, 2H), 1.36 (s, 9H); MS/ESI (m+1) = 809.3 (측정치), MW = 808.9 (C35H40N10O9S2). 연황색 거품. |
- 실시예 41 -
에틸 2-[2-[2-{2-(t-부톡시카르보닐아미노)-2-메틸}에틸]아미노- 6-옥소-6,9-디하이드로-1H-퓨린-2-일]아세테이트 (41)의 제조.
4.69g의 화합물 31을 47ml DMF에 녹이고 교반하면서 790mg의 55% NaH/미네랄오일을 부가하였다. 반응 용액을 2시간 교반한 후 1.85ml 에틸 브로모아세테이트를 서서히 부가하고 2시간 추가로 교반하였다. 반응 용액을 감압 농축한 후 컬럼 크로마토그래피(5:95 MeOH/MC)로 정제하여 5.04g의 화합물 41을 연노란 고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 10.55 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 6.74 (d, 1H), 6.40 (m, 1H), 4.87 (s, 2H), 4.17 (q, 2H), 3.65 (m, 1H), 3.28 (m, 1H), 3.16 (m, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.21 (t, 3H), 1.01 (d, 3H).
- 실시예 42 -
2-{2-(t-부톡시카르보닐아미노)에톡시}에틸아민 (42)의 제조.
146g의 2-{2-(t-부톡시카르보닐아미노)에톡시}에틸 메탄설포네이트와 134g의 소듐 아자이드를 500ml DMF에 녹이고 70℃에서 20시간 교반한 후 감압 농축하였다. 얻어진 잔류물을 1,200ml 물에 녹이고 EA로 추출하고 유기층을 무수 소듐 설페이트로 탈수하고, 감압 농축한 후 2,000ml THF 녹이고 162g의 트리페닐포스핀을 부가하였다. 이 용액을 2시간 상온에서 교반한 후 200ml 물을 부가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 18시간 교반 후 500ml로 감압 농축하여 생긴 침전물을 여과하여 제거하였다. 여과액을 감압하여 THF를 제거한 후 MC로 세척하였다. 수용액 층을 농축하여 86.2g의 화합물 42를 액체로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; CDCl3) δ 4.96 (br s, 1H), 3.54-3.48 (m, 4H), 3.34 (q, 2H), 2.88 (t, 2H), 1.48-1.46 (m, 11H).
- 실시예 43 -
2-[2-{2-(t-부톡시카르보닐아미노)에톡시}에틸]아미노-1H-퓨린-6(9H)-온 (43)의 제조.
6.3g의 화합물 42와 2.0g의 2-브로모하이포잔틴을 55ml 모노메톡시에탄올과 17.5ml 물에 섞고 16시간 동안 환류 교반한 후 용매를 감압 제거하였다. 이렇게 얻어진 농축물을 20ml MC와 10ml 물에서 30분 교반하여 얻어진 침전물을 여과하여 2.1g의 화합물 43을 연황색 고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 12.43 (br s, 1H), 10.45 (br s, 1H), 7.89 (s, 0.2H), 7.61 (s, 0.8H), 6.77 (m, 1H), 6.34 (s, 0.8H), 6.12 (s, 0.2H), 3.52 (t, 2H), 3.41 (m, 4H), 3.09 (q, 2H), 1.36 (s, 9H).
- 실시예 44 -
2-[2-[3-(t-부톡시카르보닐아미노)프로필옥시}에틸]]아미노-1H- 퓨린-6(9H)-온 (44)의 제조
2-{3-(t-부톡시카르보닐아미노)프로필옥시}에틸아민과 2-브로모하이포잔틴을 실시예 43의 방법과 유사하게 반응시켜 화합물 44를 흰색 고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 12.43 (br s, 1H), 10.45 (br s 1H), 7.61 (m, 1H), 6.80 (t, 1H), 6.30 (s, 0.7H), 6.08 (s, 0.3H), 3.49 (t, 2H), 3.41 (t, 4H), 2.99 (q, 2H), 1.61 (m, 2H), 1.37 (s, 9H).
- 실시예 45 -
2-{3-(t-부톡시카르보닐아미노)프로필}아미노-1H-퓨린-6(9H)-온 (45)의 제조.
10g의 2-클로로하이포잔틴과 19.6ml 1,3-디아미노프로판을 40ml 모노메톡시에탄올에 섞고 130℃에서 10시간 교반하고 용매를 감압 제거하였다. 잔류물을 150ml THF와 150ml 물에 녹인 후 100ml THF에 녹인 19.2g의 Boc2O를 서서히 부가하였다. 혼합물을 실온에서 6시간 교반하고 EA를 부가하여 발생한 침전물을 여과하여 6.3g의 화합물 45를 암녹색 고체로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 11.13 (br s, 1H), 7.64 (s, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.31 (s, 1H), 3.23 (q, 2H), 2.98 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.38 (s, 9H).
적절한 디아민을 출발 물질로 하여 실시예 45의 방법과 유사하게 구아닌 유도체 46 및 47을 제조하였다. 화합물 46 및 47에 대한 분석 데이타는 아래 표7에 요약되어 있다.
표7은 실시예 46 및 47의 구아닌 유도체 46 및 47에 대한 분석 데이타이다.
| 화합물 | 출발물질 | n | 분석데이타 |
| 46 | 에틸렌 디아민 | 2 | 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 12.43 (br s, 1H), 10.61 (br, 1H), 7.62 (s, 1H), 6.93 (t, 1H), 6.32 (s, 1H), 3.29 (q, 2H),3.10 (q, 2H), 1.37 (s, 9H). 회색 고체. |
| 47 | 펜틸렌 디아민 | 5 | 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 12.44 (s, 1H), 10.35 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 6.80 (m, 1H), 6.29 (m, 1H), 3.21 (m, 2H), 2.90 (m, 2H), 1.49 (m, 2H), 1.39-1.35 (m, 11H), 1.27-1.23 (m, 2H). 연갈색 고체. |
실시예 32와 유사한 방법으로 화합물 43 내지 46을 화합물 48 내지 51로 변환하였다. 화합물 48 내지 51에 대한 분석 데이타는 아래의 표8에 요약되어 있다.
표8은 실시예 48 내지 51의 구아닌 유도체 48~ 51에 대한 분석 데이타이다.
| 화합물 | 출발물질 | L 3 | 분석 데이타 |
| 48 | 43 |
|
1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 10.67 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 6.78 (m, 1H), 6.15 (t, 1H), 4.87 (s, 2H), 4.15 (q, 2H), 3.51 (m, 2H), 3.41 (m, 4H), 3.10 (m, 2H), 1.37 (s, 9H), 1.20 (t, 3H). 흰색 거품/고체. |
| 49 | 44 |
|
1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 10.57 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 6.79 (m, 1H), 6.44 (m, 1H), 4.87 (s, 2H), 4.16 (q, 2H), 3.48 (t, 2H), 3.40 (m, 4H), 2.99 (q, 2H), 1.61 (m, 2H), 1.37 (s, 9H), 1.21 (t, 3H). 노란 거품/고체. |
| 50 | 45 |
|
1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 10.64 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 6.91 (t, 1H), 6.47 (s, 1H), 4.88 (s, 2H), 4.16 (q, 2H), 3.28 (q, 2H), 3.08 (q, 2H), 1.36 (s, 9H), 1.21 (t, 3H). 적갈색 고체. |
| 51 | 46 |
|
1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 10.44 (br s, 1H), 7.66 (s, 1H), 6.77 (m, 1H), 6.41 (m, 1H), 4.86 (s, 2H), 4.16 (q, 2H), 3.21 (q, 2H), 2.89 (q, 2H), 1.48 (m, 2H), 1.41-1.36 (m, 11H), 1.28-1.19 (m, 5H). 짙은 회색 고체. |
구아닌 유도체 48, 49 그리고 51을 출발 물질로 하여 실시예 34 및 35의 방법과 유사하게 반응시켜 변형된 구아닌 PNA 모노머 52 내지 54를 합성하였다. PNA 모노머 52 내지 54에 대한 분석 데이타는 아래의 표9에 요약되어 있다.
표9는 실시예 52 내지 54의 구아닌 PNA 모노머 52 내지 54에 대한 분석 데이타이다.
| 화합물 | 출발물질 | L 3 | 분석 데이타 |
| 52 | 48 |
|
1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 10.61 (m, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.25 (m, 1H), 7.76-7.65 (m, 3H), 6.78 (t, 1H), 6.54 (m, 1H), 5.07 (s, 1.2H), 4.96 (s, 0.8H), 4.54 (s, 0.8H), 4.30 (s, 1.2H), 4.25 (m, 1.2H), 4.07 (m, 2H), 3.88 (m, 0.8H), 3.49 (m, 2.4H), 3.40 (m, 3.6H), 3.09 (m, 2H), 1.36 (s, 9H); MS/ESI (m+23/MNa+) = 696.2 (observed), MW = 673.8 (C28H35N9O7S2). 암갈색 거품/고체. |
| 53 | 49 |
|
1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 10.69 (s, 1H), 8.36 (m, 1H), 8.25 (m, 1H), 7.73 (m, 2H), 7.64-7.60 (m, 1H), 6.80 (t, 1H), 6.65 (br s, 1H), 5.05 (s, 1.2H), 4.94 (s, 0.8H), 4.54 (s, 0.8H), 4.29 (s, 1.2H), 4.24 (m, 1.2H), 4.07 (m, 2H), 3.87 (m, 0.8H), 3.46~3.39 (m, 6H), 2.97 (m, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.36 (s, 9H); MS/ESI (m+1) = 689.8 (측정치), MW = 689.8 (C28H35N9O8S2). 노란 거품/고체. |
| 54 | 51 |
|
1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 10.42-10.40 (m, 1H), 8.37-8.32 (m, 1H), 8.28-8.25 (m, 1H), 7.73-7.70 (m, 2H), 7.58-7.54 (m, 1H), 6.76 (t, 1H), 6.39-6.38 (m, 1H), 5.03 (s, 1.2H), 4.92 (s, 0.8H), 4.54 (s, 0.8H), 4.29 (s, 1.2H), 4.25 (m, 1.2H), 4.08-4.07 (m, 2H), 3.87 (m, 0.8H), 3.18 (m, 2H), 2.89 (m, 2H), 1.47 (m, 2H), 1.40-1.30 (m, 11H), 1.24 (m, 2H). MS/ESI (m+23/MNa+) = 696.2 (측정치), MW = 673.8 (C28H35N9O7S2). 붉은 거품/고체. |
- 실시예 55 -
에틸 2-[6-아미노-2-{2-(t-부톡시카르보닐아미노)에틸}아미노-9H-퓨린-9-일]아세테이트 (55)의 제조.
화합물 26을 출발 물질로 하여 실시예 32의 방법과 유사하게 반응시켜 화합물 55를 연황색 고체로 합성하였다. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 7.70 (s, 1H), 6.84 (t, 1H), 6.79 (s, 2H), 6.30 (t, 1H), 4.87 (s, 2H), 4.16 (q, 2H), 3.25 (q, 2H), 3.08 (q, 2H), 1.37 (s, 9H), 1.22 (t, 3H).
- 실시예 56 -
에틸 2-[6-아미노-2-[2-{2,3-비스(벤질옥시카르보닐)구아니디노}- 에틸]아미노-9H-퓨린-9-일]아세테이트 (56)의 제조.
22ml MC에 녹인 4.42g의 화합물 55에 22ml TFA를 0℃에서 서서히 가한 후 2.5시간 교반하였다. 반응 용액을 감압 농축하고 100ml 에테르를 가하여 생긴 침전물을 여과하여 5.79g의 연갈색 고체 중간체를 수득하였다. 이중 3.9g을 39ml MC에 녹이고 6.9ml TEA를 0℃에서 서서히 부가하고 15분간 실온에서 교반하였다. 그리고 이 용액에 2.48g의 of 1,3-비스- (벤질옥시카르보닐)-2-(메틸티오)슈도유레아를 부가하고 24시간 교반하고 0.5M 염산으로 세척하였다. 유기층을 무수 마그네슘 설페이트로 탈수하고 감압 농축하여 4.58g의 화합물 56을 연황색 고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 11.59 (s, 1H), 8.56 (t, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.39-7.29 (m, 10H), 6.75 (s, 2H), 6.53 (s, 1H), 5.15 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 4.86 (s, 2H), 4.13 (q, 2H), 3.50 (q, 2H), 3.37 (m, 2H), 1.19 (t, 3H).
- 실시예 57 -
에틸 2-[6-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-[2-{2,3-비스(벤질옥시- 카르보닐아미노)구아니디노}에틸]아미노-9H-퓨린-9-일]아세테이트 (57)의 제조.
4.54g의 화합물 56과 8.22g의 N-(벤질옥시카르보닐아미노)-N'-메틸- 이미다졸륨 트리플레이트를 90ml DMF에 녹인 후 상온에서 29시간 교반하였다. 용매를 감압 제거하여 얻어진 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (1:3 헥산/EA)로 정제하여 3.06g의 화합물 57을 하얀 거품/고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 11.60 (s, 1H), 10.25 (s, 1H), 8.57 (t, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.45-7.29 (m, 15H), 7.14 (t, 1H), 5.18 (s, 2H), 5.14 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 4.95 (s, 2H), 4.15 (q, 2H), 3.54 (q, 2H), 3.42 (q, 2H), 1.19 (t, 3H).
- 실시예 58 -
에틸 2-[6-아미노-2-{4-(t-부톡시카르보닐아미노)부틸}아미노-9H-퓨린-9-일]아세테이트 (58)의 제조.
<실시예 32>의 방법과 유사하게 화합물 27을 출발 물질로 하여 화합물 58을 노란 거품/고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 7.67 (s, 1H), 6.79 (t, 1H), 6.69 (s, 2H), 6.30 (m, 1H), 4.85 (s, 2H), 4.15 (q, 2H), 3.22-3.17 (m, 2H), 2.93-2.89 (m, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.40-1.36 (m, 11H), 1.21 (t, 3H).
- 실시예 59 -
에틸 2-[6-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-[4-{2,3-비스(벤질옥시- 카르보닐아미노)구아니디노}부틸]아미노-9H-퓨린-9-일]아세테이트 (59)의 제조.
화합물 58을 실시예 56 및 57의 방법과 유사하게 반응시켜 화합물 59를 연황색 거품/고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 11.49 (s, 1H), 10.12 (s, 1H), 8.28 (t, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.45-7.31 (m, 5H), 6.95 (t, 1H), 5.17 (s, 2H), 4.93 (s, 2H), 4.16 (q, 2H), 3.28 (m, 4H), 1.51 (m, 4H), 1.46 (s, 9H), 1.38 (s, 9H), 1.21 (t, 3H).
- 실시예 60 -
에틸 2-[6-아미노-2-{5-(t-부톡시카르보닐아미노)펜틸}아미노-9H-퓨린-9-일]아세테이트 (60)의 제조.
화합물 28을 <실시예 32>의 방법과 유사하게 반응시켜 화합물 60을 주황색 거품/고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 7.67 (s, 1H), 6.78 (t, 1H), 6.69 (s, 2H), 6.28 (m, 1H), 4.85 (s, 2H), 4.15 (q, 2H), 3.18 (q, 2H), 2.89 (q, 2H), 1.47 (m, 2H), 1.40-1.34 (m, 11H), 1.25 (m, 2H), 1.21 (t, 3H).
- 실시예 61 -
에틸 2-[6-{디-(t-부톡시카르보닐)}아미노-2-[5-{(t-부톡시- 카르보닐)아미노}펜틸]아미노-9H-퓨린-9-일]아세테이트 (61)의 제조.
6.98g의 화합물 60을 100ml THF에 녹이고 7.95g의 Boc2O와 186mg 의 4-(N,N-디메틸아미노)피리딘을 가한 후 10분간 교반하였다. 그리고 반응 용액에 4.62ml TEA를 가하고 30분간 교반하면서 온도를 서서히 50℃로 올린 후 24시간 교반하였다. 반응 용액을 감압 농축하여 얻어진 잔류물을 170ml EA에 녹이고 0.5M 염산과 물로 각각 세척하였다. 유기층을 무수 소듐 설페이트로 탈수한 후 농축하고 크로마토그래피(1:1 헥산/MC → MC)로 정제하여 화합물 61을 노랑 거품/고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 8.05 (s, 1H), 7.23 (t, 1H), 6.77 (t, 1H), 5.00 (s, 2H), 4.19 (q, 2H), 3.25 (q, 2H), 2.91 (q, 2H), 1.53 (m, 2H), 1.40-1.39 (m, 29H), 1.28 (m, 2H), 1.22 (t, 3H).
- 실시예 62 -
에틸 2-[2-[2-{2,3-비스(벤질옥시카르보닐)구아니디노}에틸]- 아미노-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-퓨린-2-일]아세테이트 (62)의 제조.
실시예 57의 방법과 유사하게 반응시켜 화합물 50을 화합물 62로 변환하였다. 흰색 고체. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 11.59 (s, 1H), 10.68 (s, 1H), 8.50 (t, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.42-7.29 (m, 10H), 6.58 (m, 1H), 5.13 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 4.86 (s, 2H), 4.12 (q, 2H), 3.50 (m, 2H), 3.46 (m, 2H), 1.18 (t, 3H).
- 실시예 63 -
2-[6-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-[2-{2,3-비스(벤질옥시- 카르보닐아미노)구아니디노}에틸]아미노-9H-퓨린-9-일]아세트산 (63)의 제조.
2.57g의 화합물 57을 7.1ml THF와 7.1ml 물에 녹이고 340mg의 LiOH를 0℃에서 부가한 후 상온에서 40분 교반하였다. 반응 용액을 1N 염산으로 pH 5~6에 맞춘 후 얻어지는 고체를 여과하여 2.33g의 화합물 63을 흰색 고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 11.59 (s, 1H), 10.21 (s, 1H), 8.57 (t, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.45-7.28 (m, 15H), 7.12 (t, 1H), 5.17 (s, 2H), 5.13 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 4.83 (s, 2H), 3.53 (q, 2H), 3.42 (q, 2H).
- 실시예 64 -
t-부틸 N-[2-{(9H-플로렌-9-일)메톡시카르보닐아미노}에틸)]-N- [2-{6-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-[2-{2,3-비스(벤질옥시카르보닐아미노)구아니디노}에틸]아미노-9H-퓨린-9-일}아세틸]글리시네이트 (64)의 제조.
1.6g의 화합물 63을 30ml DMF에 녹이고 0℃에서 660mg의 EDCI와 910mg의 Fmoc-Aeg-OtBu를 부가하고, 상온에서 2시간 교반한 후 감압 농축하였다. 이렇게 얻어진 잔류물을 50ml MC에 녹이고 0.5M 염산으로 세척하였다. 유기층을 무수 소듐 설페이트로 탈수하고 감압 농축한 후 크로마토그래피(65:1 MC/MeOH)로 분리하여 500mg의 화합물 64를 흰색 고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 11.59 (s, 0.4H), 11.58 (s, 0.6H), 10.21 (s, 1H), 8.55 (m, 1H), 7.47-7.28 (m, 20H), 7.06 (br, 1H), 5.17-4.89 (m, 8H), 4.34??4.28 (m, 2.8H), 4.20 (m, 1H), 3.95 (s, 1.2H), 3.52 (m, 3.4H), 3.43 (m, 2.2H), 3.34 (m, 1.7H), 3.12 (m, 0.7H), 1.43 (s, 3H), 1.34 (s, 6H).
- 실시예 65 -
N-[2-{(9H-플로렌-9-일)메톡시카르보닐아미노}에틸)]-N-[2-{6-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-[2-{2,3-비스(벤질옥시카르보닐아미노)구아니디노}에틸]아미노-9H-퓨린-9-일}아세틸]글리신 (65)의 제조.
460mg의 화합물 64를 3.6ml MC에 녹이고 3.6ml TFA를 0℃에서 서서히 부가하고 상온에서 3.5시간 교반한 후 50ml 에테르를 부가하였다. 얻어지는 침전물을 여과하여 430mg의 화합물 65를 흰색 고체로 수득하였다. 1H NMR (400MHz; DMSOd6) δ 11.57 (s, 1H), 10.77 (br s, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 7.87 (m, 2H), 7.63 (m, 2H), 7.50-7.28 (m, 21H), 5.26-4.96 (m, 8H), 4.34-4.18 (m, 4H), 4.03 (s, 1H), 3.52-3.36 (m, 7H), 3.13 (m, 1H). MS/ESI (m+1) = 1019.4 (측정치), MW = 1018.0 (C53H51N11O11).
- 실시예 66 -
N-[2-{(9H-플로렌-9-일)메톡시카르보닐아미노}에틸)]-N-[2-{6-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-[4-{2,3-비스(벤질옥시카르보닐아미노)구아니디노}부틸]아미노-9H-퓨린-9-일}아세틸]글리신 (66)의 제조.
화합물 59를 실시예 63 내지 65의 방법과 유사하게 반응시켜 화합물 66을 흰색의 거품/고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 12.84 (br s, 1H), 11.50 (s, 1H), 10.14-10.13 (m, 1H), 8.28 (m, 1H), 7.88 (m, 2H), 7.80-7.77 (m, 1H), 7.68-7.66 (m, 2H), 7.49 (t, 1H), 7.45-7.29 (m, 9H), 6.90 (m, 1H), 5.17 (s, 2H), 5.07 (s, 1.2H), 4.89 (s, 0.8H), 4.35-4.18 (m, 3H), 4.00 (s, 1H), 3.52 (m, 1H), 3.35-3.25 (m, 6H), 3.12 (m, 1H), 1.49 (m, 4H), 1.44 (d, 9H), 1.37 (d, 9H). MS/ESI (m+1) = 978.4 (측정치), MW = 978.1 (C49H59N11O11)
- 실시예 67 -
N-[2-{(9H-플로렌-9-일)메톡시카르보닐아미노}에틸)]-N-[6-[2- {2,3-비스(벤질옥시카르보닐아미노)구아니디노}에톡시]]메틸-2-옥소-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-3(7H)-일]아세틸]글리신 (67)의 제조.
화합물 18을 <실시예 63 ~ 65>의 방법과 유사하게 반응시켜 화합물 67을 연황색 고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 11.99 (br s, 1H), 11.57 (br, 1H), 8.56 (m, 1H), 8.48-8.45 (m, 1H), 7.89-7.87 (m, 2H), 7.70-7.65 (m, 2H), 7.49-7.26 (m, 15H), 6.36-6.33 (m, 1H), 5.20 (s, 2H), 5.03-5.01 (m, 3.3H), 4.83 (s, 0.7H), 4.49-4.17 (m, 5.7H), 4.01 (m, 1.3H), 3.57-3.11 (m, 8H); MS/ESI (m+1) = 899.7 (측정치), MW = 898.9 (C47H46N8O11).
- 실시예 68 -
N-[2-{(9H-플로렌-9-일)메톡시카르보닐아미노}에틸)]-N-[2-[2-{2,3-비스(벤질옥시카르보닐아미노)구아니디노}에틸]아미노-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-퓨린-2-일}아세틸]글리신 (68)의 제조.
화합물 62를 실시예 63 내지 65의 방법과 유사하게 반응시켜 화합물 68을 흰색의 거품/고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 11.58 (s, 1H), 10.88 (s, 1H), 8.51 (m, 1H), 7.93 (m, 1H), 7.87 (m, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.47 (t, 1H), 7.41-7.26 (m, 14H), 6.66 (br, 1H), 5.16-4.89 (m, 8H), 4.34-4.18 (m, 3.8H), 4.00 (m, 1.2H), 3.50-3.35 (m, 7H), 3.13 (m, 1H); MS/ESI (m+1) = 885.3 (측정치), MW = 884.9 (C45H44N10O10).
- 실시예 69 -
2-[6-{2-(t-부톡시카르보닐아미노)에톡시}메틸-2-옥소-2H- 피롤로-[2,3-d]피리미딘-3(7H)-일]아세트산 (69)의 제조.
화합물 16을 실시예 11의 방법과 유사하게 반응시켜 화합물 69를 연갈색 고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 13.03 (br s, 1H), 11.31 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 6.85 (t, 1H), 6.19 (s, 1H), 4.63 (s, 2H), 4.40 (s, 2H), 3.42 (t, 2H), 3.11 (q, 2H), 1.37 (s, 9H).
- 실시예 70 -
메틸 N-[2-{(9H-플로렌-9-일)메톡시카르보닐아미노}에틸)]-N-[2-[6-[{2-(t-부톡시카르보닐아미노)에톡시}메틸]-2-옥소-2H-피롤로-[2,3-d]-피리미딘-3(7H)-일]아세틸]글리시네이트 (70)의 제조.
3.6g의 화합물 69, 3.6g의 Fmoc-Aeg-OMe, 2.5g의 EDCI, 1.73g의 of HOBt, 그리고 2.24ml DIEA를 70ml DMF에 녹이고, 상온에서 1,5시간 교반하였다. 반응 용매를 감압 제거하고 얻어진 잔류물을 100ml MC에 녹이고 1M 염산, 증류수, 그리고 소금물로 차례로 세척하였다. 유기층을 무수 소듐 설페이트로 탈수하고 감압 농축한 후 컬럼 크로마토그래피(100:2 MC/MeOH)로 정제하여 2.5g의 화합물 70을 노란 거품/고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 11.30 (s, 1H), 8.24 (s, 0.65H), 8.21 (s, 0.35H), 7.89-7.87 (m, 2H), 7.71-7.67 (m, 2H), 7.48-7.25 (m, 5H), 6.87 (t, 1H), 6.17 (s, 0.7H), 6.15 (s, 0.3H), 4.93 (s, 1.3H), 4.74 (s, 0.7H), 4.40-4.39 (m, 2.7H), 4.35-4.21 (m, 3H), 4.08 (s, 1.3H), 3.73 (s, 0.8H), 3.62 (s, 2.2H), 3.51 (t, 1.4H), 3.43-3.30 (m, 3.6H), 3.13-3.10 (m, 3H), 1.37 (s, 9H).
- 실시예 71 -
N-[2-{(9H-플로렌-9-일)메톡시카르보닐아미노}에틸)]-N-[2-[6- [{2-(t-부톡시카르보닐아미노)에톡시}메틸]-2-옥소-2H-피롤로-[2,3-d]-피리미딘-3(7H)-일]아세틸]글리신 (71)의 제조.
5.0g의 화합물 70을 75ml 1:1:1 아세토니트릴/아세톤/물 혼합 용매에 녹이고 0℃에서 28.5ml 2.5N LiOH 수용액을 서서히 부가하였다. 반응 용액을 10분 교반한 후 20% 구연산 수용액으로 중화시켰다. 포화 중탄산 나트륨 수용액으로 pH를 8에 맞추고 516mg의 Fmoc-OSu를 부가한 후 반응 용액을 상온에서 2시간 교반하였다. 20% 구연산 수용액을 이용하여 반응 용액을 pH 3에 맞추고 0℃에서 90분 교반한 후 얻어지는 고체를 여과하여 4.0g의 화합물 71을 연두색 고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 12.02 (br, 1H), 8.51-8.49 (m, 1H), 7.89-7.88 (d, 2H), 7.70-7.50 (m, 2H), 7.49 (t, 1H), 7.42-7.28 (m, 4H), 6.87 (t, 1H), 6.36 (s, 0.7H), 6.33 (s, 0.3H), 5.02 (s, 1.2H), 4.84 (0.8H), 4.43-4.42 (m, 2.4H), 4.34-4.19 (m, 3.2H), 4.01 (s, 1.4H), 3.48 (t, 1.2H), 3.44-3.41 (m, 2.1H), 3.37-3.29 (m, 2H), 3.12-3.10 (m, 2.7H), 1.37 (s, 9H); MS/ESI (m+1) = 689.3 (측정치), MW = 688.7 (C35H40N6O9).
- 실시예 72 -
N-[2-{(9H-플로렌-9-일)메톡시카르보닐아미노}에틸)]-N-[2-[2- {5-(t-부톡시카르보닐아미노)펜틸}아미노-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-퓨린-2-일]아세틸]글리신(72)의 제조.
화합물 51을 실시예 69 내지 71의 방법과 유사하게 반응시켜 화합물 72를 흰색 거품/고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ 13.01 (br, 1H), 10.52-10.46 (m, 1H), 7.88 (d, 2H), 7.65 (d, 2H), 7.54 (s, 0.5H), 7.50 (s, 0.5H), 7.48 (m, 1H), 7.40 (t, 2H), 7.31 (m, 2H), 6.81 (t, 0.5H), 6.72 (t, 0.5H), 6.52-6.48 (m, 1H), 4.98 (s, 1H), 4.77 (s, 1H), 4.33 (d, 1H), 4.23-4.21 (m, 2H), 4.05 (m, 1H), 3.96 (s, 1H), 3.50 (m, 1H), 3.35 (m, 2H), 3.21 (m, 2H), 3.14 (q, 1H), 2.88 (m, 2H), 1.46 (q, 2H), 1.39-1.35 (m, 11H), 1.23 (m, 2H); MS/ESI (m+1) = 717.4 (측정치), MW = 716.8 (C36H44N8O8).
- 실시예 73 -
N-[2-{(9H-플로렌-9-일)메톡시카르보닐아미노}에틸)]-N-[2-[6-{비스(t-부톡시카르보닐)아미노}-2-{5-(t-부톡시카르보닐아미노)펜틸}아미노-9H-퓨린-9-일]아세틸]글리신 (73)의 제조.
화합물 61을 실시예 69 내지 71의 방법과 유사하게 반응시켜 화합물 73을 흰색 거품/고체로 수득하였다. 1H NMR (500MHz; DMSOd6) δ12.71 (br s, 1H), 7.90-7.87 (m, 3H), 7.67 (m, 2H), 7.44-7.39 (m, 3H), 7.31 (m, 2H), 7.07 (m, 1H), 6.69 (m, 1H), 5.11 (s, 1.2H), 4.93 (s, 0.8H), 4.37-4.21 (m, 3.8H), 4.01 (s, 1.2H), 3.52 (m, 1H), 3.36 (m, 2H), 3.23 (m, 2H), 3.13 (m, 1H), 2.88 (m, 2H), 1.49 (m, 2H), 1.38-1.35 (m, 27H), 1.27-1.25 (m, 4H); MS/ESI (M+1) = 916.5 (측정치), MW = 916.0 (C46H61N9O11).
PNA 올리고머의 합성 : 화학식1의 PNA 올리고머는 반응식 4에 따라 자체 합성한 PNA 모노머 o를 대전에 소재한 (주)파나진(www.panagene.com)에 제공하여 문헌에 보고된 방법이나 이를 약간 변형하여 (주)파나진(www.panagene.com)이 합성하였다(Org. Lett. vol 9, 3291-3293, 2006). 이러한 PNA 올리고머는 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 동정되고 순도는 C18-Reverse Phase HPLC로 분석된 상태로 (주)파나진(www.panagene.com)에서 수령되었으며 별도의 정제 없이 본 발명에 사용되었다.
아울러 반응식 5의 PNA 모노머 q가 이용된 경우, 특허(US 6,133,444)에 공개된 방법이나 이를 약간 변형하여 화학식1의 PNA 올리고머를 합성하였다. 이렇게 합성된 PNA 올리고머는 MALDI-TOF MS로 동정되었고 C18-Reverse Phase HPLC를 이용하여 분리/분석되었다(증류수/아세토니트릴, 0.1% TFA). 도 1은 올리고 17을 HPLC 정제하기 전과 후의 HPLC 크로마토그램이고 도 2는 HPLC로 정제한 올리고 17에 대한 MALDI-TOF MS 스펙트럼으로서, 본 발명의 PNA 올리고머들의 합성에 대한 설명을 목적으로 제공되었으나 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
표 10은 본 발명의 PNA 올리고머들과 질량 분석 데이타a이다.
| 올리고머 | 염기배열(N→C) | 질량분석데이타 | |
| 이론치 | 측정치b | ||
| 올리고 1 | Fam-L(1)L(1)-TGC(1O3)-TAC(1O3)-TAC(1O3)- TG-Lys-NH2 | 4079.0 | 4078.3 |
| 올리고 2 | Fam-L(1)L(1)-TGC-TAC-TAC-TG-Lys-NH2 | 3745.6 | 3745.5 |
| 올리고 3 | TGC(1O3)-TAC-TAC(1O3)-TG-Lys-NH2 | 3319.4 | 3318.5 |
| 올리고 4 | TGC-TAC(1O3)-TAC-TG-Lys-NH2 | 3208.3 | 3208.3 |
| 올리고 5 | TGC-TAC-TAC-TG-Lys-NH2 | 3097.2 | 3097.8 |
| 올리고 6 | Fam-L(1)L(1)-TC(1O3)T-CC(1O3)C-AGC(1O3)- GTG-C(1O3)GC-C(1O3)AT-Lys-NH2 | 6140.1 | 6141.8 |
| 올리고 7 | Fam-L(1)L(1)-TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT- Lys-NH2 | 5584.4 | 5583.1 |
| 올리고 8 | TGC(2O2)-TAC-TAC(2O2)-TG-Lys-NH2 | 3553.7 | 3552.7 |
| 올리고 9 | GC(2O2)A-C(2O2)AT-TTG-C(2O2)CT-NH2 | 3319.4 | 3318.9 |
| 올리고 10 | GC(1O2)A-C(1O2)AT-TTG-C(1O2)CT-NH2 | 3511.6 | 3511.1 |
| 올리고 11 | GCA-CAT-TTG-CCT-Lys-NH2 | 3348.3 | 3345.8 |
| 올리고 12 | CA(3)T-A(3)GT-A(3)TA-A(3)GT-NH2 | 3580.8 | 3580.9 |
| 올리고 13 | CA(4)T-A(4)GT-A(4)TA-A(4)GT-NH2 | 3636.9 | 3634.9 |
| 올리고 14 | CA(5)T-A(5)GT-A(5)TA-A(5)GT-NH2 | 3693.0 | 3691.5 |
| 올리고 15 | CA(7)T-A(7)GT-A(7)TA-A(7)GT-NH2 | 3805.0 | 3803.4 |
| 올리고 16 | CAT-AGT-ATA-AGT-Lys-NH2 | 3420.3 | 3418.3 |
| 올리고 17 | CA(5)T-A(5)GT-A(5)TA-A(5)GT-Lys-NH2 | 3820.9 | 3819.8 |
| 올리고 18 | CA(2O2)T-A(2O2)GT-A(2O2)TA-A(2O2)GT-NH2 | 3700.7 | 3701.4 |
| 올리고 19 | L(1)-TAG(2O3)-CTG(2O3)-CTG-ATT-Lys-NH2 | 3746.9 | 3748.9 |
| 올리고 20 | TG(5)G-C(1O2)AA-C(1O2)TG-A(5)T-Lys-NH2 | 3525.6 | 3523.8 |
| 올리고 21 | Fam-L(2)-TG(5)G-C(1O2)AA-C(1O2)TG- A(5)T-Lys-NH2 | 3997.0 | 3996.1 |
| 올리고 22 | Fam-L(2)-TT-C(1O2)AT-A(5)GT-A(5)TA- AG(5)T-Lys-NH2 | 4806.9 | 4806.7 |
| 올리고 23 | Fam-L(2)L(2)-TC(1O2)A-GA(5)A-C(1O2)TT- A(5)T-Lys-NH2 | 4084.2 | 4083.8 |
| 올리고 24 | Fam-L(2)CA(5)T-A(4g)GT-A(4g)TA(5)-AGT- Lys-NH2 | 4348.5 | 4347.4 |
| 올리고 25 | TT-C(1O2g)-A(5)GT-A(5)TA-AG(5)T-Lys-NH2 | 4377.4 | 4375.6 |
| 올리고 26 | GC(1N3)A-C(1N3)AT-TTG-C(1N3)CT-NH2 | 3550.8 | 3550.9 |
| 올리고 27 | CAT-AGT-ATA-AGT-NH2 | 3292.3 | 3295.5 |
| 올리고 28 | Fam-L(2)-TGG-CAA-CTG-AT-Lys-NH2 | 3617.5 | 3616.3 |
a. PNA 올리고머 표기에 사용된 약어는 아래의 그림에 정의된 바와 같음.
b. 특별한 언급이 없는 한 측정치는 (m+1)에 해당, 즉 MH+ 에 해당.
본 발명에서 합성된 PNA 올리고머들 중 일부가 MALDI-TOF MS 데이터와 함께 표 10에 제공되어 있다. 표 10에 사용된 약어 중 A, T, G와 C는 천연 핵산염기를 갖는 PNA 모노머로서 각각 아데닌(Adenine), 싸이민(Thymine), 구아닌(Guanine), 그리고 싸이토신 (Cytosine)을 의미한다. C(mXn), C(mXng), A(mXn), A(m), A(mg), G(m), 그리고 G(mg)은 변형된 핵산염기를 보유한 PNA 모노머로서 Lys, Fam, L(1), 그리고 L(2)와 함께 표 10 아래에 정의되어 있다. 이러한 PNA 올리고머들은 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 제공되었으나 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
DNA 결합력 측정 : 본 발명의 올리고머와 DNA와의 결합력에 대한 지표로서 Tm을 다음과 같이 측정하였다.
4μM PNA 올리고머와 4μM DNA를 완충 용액(pH 7.16, 10mM 소듐 포스페이트, 100mM NaCl)에 섞은 후, 90℃에서 수분간 인규베이션하고 상온으로 서서히 냉각시켰다. 이 용액을 4ml Quartz Cuvette에 옮기고 잘 봉인한 후 Agilent 8453 UV/Visible Spectrophotometer에 장착하였다. Cuvette의 온도를 분당 0.5 혹은 1.0℃ 속도로 올리면서 260nm에서 흡광도 변화를 측정하고 흡광도 변화율이 가장 큰 온도, 즉, 변곡점을 PNA 올리고머와 DNA 사이의 Tm 값으로 정하였다.
Tm 측정에 사용된 DNA는 대전의 (주)바이오니아(www.bioneer.com) 혹은 서울의 (주)아람바이오시스템즈(www.ahrambio.com)로부터 구매하여 별도의 정제 없이 사용되었다.
도 3은 올리고 17과 상보적인 혹은 부정합(Mismatch)이 있는 DNA 사이에 관측된 온도에 따른 흡광도 변화 그래프들인데(표 11 참조 요망), 변곡점 (Transition)을 PNA와 DNA 사이의 Tm 값으로 읽어낸 예이다. 본 발명에서 측정된 Tm 값들 중 일부가 표 11에 요약되었는데, 이러한 Tm 측정 예는 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 제공되었을 뿐 본 발명의 범위를 한정하기 위함은 아니다.
표 11은 PNA 올리고머와 상보적이거나 Mismatch DNA 사이의 Tm 값a이다.
| 올리고머 | DNA 염기 배열 (5' → 3') | T m , o C | 비고 b |
| 올리고 5 | CAG-TAG-TAG-CA | 55 | 미변형 PNA 올리고머 |
| 올리고 3 | 65 | C(1O3) 2개 | |
| 올리고 4 | 61 | C(1O3) 1개 | |
| 올리고 8 | 68 | C(1O2) 2개 | |
| 올리고 10 | AGG-CAA-ATG-TGC | > 85 | C(1O2) 3개 |
| 올리고 11 | 59 | 미변형 PNA 올리고머 | |
| 올리고 12 | ACT-TAT-ACT-ATG | 60 | A(3) 모노머 4개 |
| 올리고 13 | 64 | A(4) 모노머 4개 | |
| 올리고 14 | 69 | A(5) 4개 | |
| 올리고 15 | 71 | A(7) 4개 | |
| 올리고 18 | 66 | A(2O2) 4개 | |
| 올리고 27 | 55 | 미변형 PNA 올리고머 | |
| 올리고 16 | ACT-TAT-ACT-ATG | 56 | 미변형 PNA 올리고머 |
| 올리고 17 | ACT-TAT-ACT-ATG | 72 | complementary |
| ACT-TA C -ACT-ATG | 61 | mismatch (T→C) | |
| ACT-TA A -ACT-ATG | 59 | mismatch (T→A) | |
| ACT-TA G -ACT-ATG | 58 | mismatch (T→G) | |
| 올리고 24 | ACT-TAT-ACT-ATG | 70 | A(5) 2개 + A(4g) 2개 |
| 올리고 20 | ATC-AGT-TGC-CA | 84 | complementary |
| ATC-A T T-TGC-CA | 62 | mismatch (G→T) | |
| ATC-A A T-TGC-CA | 65 | mismatch (G→A) |
싸이토신(Cytosine) 대신 본 발명의 변형된(Modified) 핵산염기인 피롤로싸이토신(Pyrrolocytosine) 유도체가 치환된 PNA 올리고머는 상보적인 DNA에 대한 결합력이 매우 강한 것으로 관측되었다. 예를 들어, 변형된 싸이토신 모노머 'C(1O2)'를 3개 포함하는 올리고 10은 85℃가 넘는 Tm 값이 관측된 반면에, 변형되지 않은(Unmodified) 올리고 11은 Tm 값이 59℃로 측정되었다. 아울러 올리고 3과 올리고 8의 예에서 보듯이, 변형된 싸이토신 모노머 'C(1O3)'이나 'C(2O2)'를 포함하는 PNA 올리고머들 또한 증가된 Tm 값을 나타냈다.
본 발명의 변형된 핵산염기 아데닌(Adenine) 유도체를 PNA 올리고머에 도입한 경우에도, DNA에 대한 결합력이 현저하게 증가하였다. 4개의 변형된 아네닌 모노모 A(7)을 4개 갖는 올리고 15의 경우 Tm 값이 71oC로서 변형이 안된 올리고 27의 Tm 값 55℃ 보다 현저히 높다.
본 발명의 변형된 PNA 모노머는 핵산염기 부정합(Mismatch)에 매우 민감하다. 예를 들어 A(5) 모노머의 경우 단일 핵산염기 부정합에 의해 11 ~ 14℃의 Tm 값 감소가 관측되었다. 'C(1O2)' 모노머의 경우 핵산염기 부정합에 의해 19 ~ 22℃의 Tm 값 감소가 관측되었다.
세포투과력 측정 : 본 발명의 PNA 올리고머의 세포투과 정도를 측정하기 위하여, 올리고머 말단에 공유결합된 플로레신(Fluorescein)을 갖는 PNA 올리고머를 인간에서 유래된 암 세포주에 처리하여 다음과 같이 세포 투과력을 평가하였다.
24-well Plate의 각 웰(Well)에 멸균된 커버글라스(Cover Glass)를 깔고, 세포의 성장 속도에 따라 웰당 20,000 ~ 100,000개의 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2 조건에서 16 ~ 24시간 배양하였다. 각 웰의 배지를 신선한 500μl Opti-MEM 배지(1% FBS 함유 혹은 미함유)로 교체한 후, 증류수에 녹인 플로레신이 붙은 PNA 올리고머 스톡(Stock) 용액을 정해진 양을 가하였다. 이렇게 처리된 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 정해진 시간 동안 배양한 후 세포를 PBS 혹은 0.1% Tween-20을 포함하는 PBS 완충 용액으로 세척하여 배양액 중에 남아 있던 PNA 올리고머를 제거하였다. 세포를 3.7% 혹은 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정한 후 PBS 혹은 0.1% Tween-20을 포함하는 PBS 완충 용액으로 여러 차례 세척하였다. 그리고 커버글라스를 마운팅(Mounting) 용액을 이용하여 슬라이드 글라스에 올려 놓고, 커버글라스의 가장자리를 매니큐어로 봉인하고 Zeiss LSM 510 Confocal Microscope(63X Objective)나 Nikon C1Si Confocal Microscope(40X Objective)를 이용하여 세포 이미지를 촬영하였다.
도 4 내지 도 8은 이렇게 촬영된 세포 투과 형광 사진으로서, 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 제공되었으나 본 발명의 범위를 한정하기 위함은 아니다.
도 4의 (a)와 도 4의 (b)는 'FBS 미함유' 배지에서 각각 올리고 1과 올리고 2를 5μM 농도로 HeLa 세포주에 처리하고 1, 2, 3, 혹은 24시간 후 세포의 형광 이미지(63X Objective)를 찍은 것이다. 올리고 1의 경우(도 4의 (a)), 24시간에 걸쳐 세포내의 형광이 점차 강해지고 명확한 반면에, 올리고 2의 경우(도 4의 (b))는 세포 내에 약간의 형광 흔적은 있지만 뚜렷하지 않다. 따라서 올리고 1이 올리고 2에 비하여 HeLa 세포주에 현저히 빠르게 투과하는 것으로 보인다.
도 5의 (a)와 도 5의 (b)는 'FBS 미함유' 배지에서 각각 올리고 6과 올리고 7을 2.5μM 농도로 MCF-7 세포주에 처리하고 0.5 혹은 1시간 후 세포의 형광 이미지(63X Objective)이다. 올리고 6의 경우(도 5의 (a)), 1시간에 걸쳐 세포내의 형광이 점차 강해지고 명확한 반면에, 올리고 7의 경우(도 5의 (b))는 세포 내에 약간의 형광 흔적은 있지만 뚜렷하지 않다. 따라서 올리고 6이 올리고 7에 비하여 MCF-7 세포주에 현저히 빠르게 투과하는 것으로 보인다.
도 6의 (a)와 도 6의 (b)는 '1% FBS 함유' 배지에서 각각 올리고 1과 올리고 6을 1μM 농도로 HeLa 세포주에 처리하고 6 혹은 24시간 후 세포의 형광 이미지(40X Objective)이다. 올리고 1의 경우(도 6의 (a)), 24시간이 지난 후에도 세포 내 형광색이 미약하나, 올리고 6의 경우(도 6의 (b))는 24시간에 걸쳐 세포 내 형광이 점차 강해지고 6시간 처리 후에도 세포 내의 형광이 뚜렷하다. 이러한 결과로 미루어, 올리고 6이 올리고 1에 비하여 HeLa 세포주에 현저히 빠르게 투과하는 것으로 보인다.
도 7의 (a)와 도 7의 (b)는 'FBS 미함유' 배지에서 각각 올리고 21과 올리고 28을 2μM 농도로 JAR 세포주에 처리하고 24시간 후 세포의 형광 이미지(40X Objective)이다. 도 7의 (a)의 세포 내 형광이 명확하나 도 7의 (b)의 경우 세포 내 형광이 거의 없는 것으로 보아 올리고 21이 올리고 28에 비하여 JAR 세포주에 빠르게 투과하는 것으로 보인다.
도 7의 (c)와 도 7의 (d)는 'FBS 미함유' 배지에서 각각 올리고 21과 올리고 28을 2μM 농도로 A549 세포주에 처리하고 24시간 후 세포의 형광 이미지(40X Objective)이다. 도 7의 (c)는 세포 내 형광이 명확하나 도 7의 (d)는 세포 내 형광이 거의 없는 것으로 보아 올리고 21이 올리고 28에 비하여 A549 세포주에 빠르게 투과하는 것으로 보인다.
도 7의 (e)와 도 7의 (f)는 'FBS 미함유' 배지에서 각각 올리고 21과 올리고 28을 2μM 농도로 HeLa 세포주에 처리하고 12시간 후 세포의 형광 이미지(40X Objective)이다. 도 7의 (e)는 세포 내 형광이 명확하나 도 7의 (f)는 세포 내 형광이 거의 없는 것으로 보아 올리고 21이 올리고 28에 비하여 A549 세포주에 빠르게 투과하는 것으로 보인다.
도 7의 (g)는 'FBS 미함유' 배지에서 올리고 21을 2μM 농도로 HeLa 세포주에 처리하고 24시간 후 세포의 형광 이미지(40X Objective)이다. 도 7의 (g)의 세포 내 형광이 도 7의 (e)의 세포 내 형광 보다 현저히 강한 것으로 보아, Oligo 21이 HeLa 세포주에 24시간에 걸쳐 지속적으로 흡수되는 것으로 보인다.
도 8의 (a), 도 8의 (b)와 도 8의 (c)는 'FBS 미함유' 배지에서 올리고 22를 2μM 농도로 각각 HeLa 세포주, A549 세포주, 그리고 JAR 세포주에 처리하고 24시간 후 세포의 형광 이미지(40X Objective)이다. 세포주마다 정도의 차이는 있지만 세포내 형광이 뚜fut한 것으로 보아, 올리고 22가 실험에 사용된 세포주들에 잘 흡수되는 것으로 보인다.
안티센스 효능 평가 : 본 발명의 올리고 9와 올리고 12는 mdm2 단백질 합성을 저해한다고 문헌에 보고된 안티센스 PNA 올리고머 T1-12와 T5-12에 해당하는 염기배열을 각각 갖는다(Nucleic Acids Res. vol 32, 4893-4902, 2004). 올리고 9과 올리고 12에 대하여 다음과 같이 JAR 세포주에서 mdm2 단백질 합성 저해 효능을 평가하였다. 이러한 안티센스 효능 평가 예는 본 발명의 내용을 설명하기 위하여 제공되었으나 본 발명의 범위를 한정하기 위함은 아니다.
JAR 세포주(HTB-144, ATCC)를 10% FBS와 1% 페니실린과 스트렙토마이신이 부가된 RPMI-1640 배지에서 배양하고, 신선한 RPMI-1640 배지(10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신 포함) 1ml가 충진된 12-well Plate의 각 웰에 세포들을 균일하게 분주한 후 3차 증류수에 녹인 PNA 올리고머 스톡 용액을 정해진 농도가 되로록 처리하고 세포를 37℃ 5% CO2 조건하에서 15시간 배양하였다.
각 웰을 차가운 PBS 용액으로 세척한 후 흡입 제거하였다. 각 웰에 1% 프로테아제 저해제 칵테일을 포함하는 RIPA Buffer 80μl를 가하고 플레이트(Plate)를 4℃에서 15분간 교반하였다. 각 웰의 내용물을 긁어모아 마이크로 튜브에 옮기고 10분간 얼음 위에 냉각시켰다. 10,000g에서 원심 분리하여 상등액을 취하여 마이크로 튜브에 옮긴 후 일부를 취해 Bradford 방법으로 단백질 농도를 정량하고 나머지는 샘플 버퍼와 섞은 후 3분간 끓인 후 다음과 같이 웨스턴 블로팅 방법으로 mdm2를 검출하였다.
미니젤 전기영동 장치의 각 레인에 세포 라이세이트(Lysate) 단백질을 20μg씩 로딩한 후 단백질을 SDS-PAGE 겔에 전개한 후, 전개된 단백질을 PVDF 멤브레인(0.45μm, Millipore)에 트랜스퍼(Transfer)시켰다. mdm2 검출에 사용된 항체는 SC-965(Santa Cruz Biotechnology)이었다.
도 9는 이렇게 얻어진 웨스턴 블로팅 결과의 일부로서, 도 9에서 나타난 바와 같이 올리고 9와 올리고 12가 5μM 농도 혹은 그 이상에서 mdm2의 합성을 저해하는 것으로 관측되었다.
도 1은 올리고 17을 정제하기 전(위)과 후(아래)의 C18-Reverse Phase HPLC 크로마토그램.
도 2는 HPLC 정제된 올리고 17에 대한 MALDI-TOF MS 스펙트럼.
도 3은 올리고 17에 상보적이거나 혹은 단일 염기 부정합(Single Base Mismatch)이 있는 DNA 사이의 Tm 값 측정을 위한 흡광도 변화.
도 4의 (a)와 도 4의 (b)는 'FBS 미함유' 배지에서 각각 올리고 1과 올리고 2를 5mM 농도로 HeLa 세포주에 처리하고 1, 2, 3, 24시간 후 세포의 형광 이미지(63X Objective).
도 5의 (a)와 도 5의 (b)는 'FBS 미함유' 배지에서 각각 올리고 6과 올리고 7을 2.5mM 농도로 MCF-7 세포주에 처리하고 0.5, 1시간 후 세포의 형광 이미지(63X Objective).
도 6의 (a)와 도 6의 (b)는 '1% FBS 함유' 배지에서 각각 올리고 1과 올리고 6을 1mM 농도로 HeLa 세포주에 처리하고 6 혹은 24시간 후 세포의 형광 이미지(40X Objective).
도 7의 (a)와 도 7의 (b)는 'FBS 미함유' 배지에서 각각 올리고 21과 올리고 28을 2mM 농도로 JAR 세포주에 처리하고 24시간 후 세포의 형광 이미지(40X Objective).
도 7의 (c)와 도 7의 (d)는 'FBS 미함유' 배지에서 각각 올리고 21과 올리고 28을 2mM 농도로 A549 세포주에 처리하고 24시간 후 세포의 형광 이미지(40X Objective).
도 7의 (e)와 도 7의 (f)는 'FBS 미함유' 배지에서 각각 올리고 21과 올리고 28을 2mM 농도로 HeLa 세포주에 처리하고 12시간 후 세포의 형광 이미지(40X Objective).
도 7의 (g)는 'FBS 미함유' 배지에서 각각 올리고 21을 2mM 농도로 HeLa 세포주에 처리하고 24시간 후 세포의 형광 이미지(40X Objective).
도 8의 (a), 도 8의 (b)와 도 8의 (c)는 'FBS 미함유' 배지에서 올리고 22를 2mM 농도로 각각 HeLa 세포주, A549 세포주, 그리고 JAR 세포주에 처리하고 24시간 후 세포의 형광 이미지(40X Objective).
도 9는 올리고 9와 올리고 12의 mdm2 안티센스 웨스턴 블로팅 결과.
도 10은 본 발명의 대표 도면.
Claims (13)
- 화학식1로 표시되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.<화학식 1>화학식1 중에서,n은 5 혹은 5보다 큰 정수이며;S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소 라디칼, 중수소 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;X와 Y는 수소 라디칼, 중수소 라디칼, 하이드록시 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아실 라디칼, 치환체가 있거나 없는 설포닐 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;Z는 수소 라디칼, 중수소 라디칼, 하이드록시 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 라디칼 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 싸이민, 구아닌, 싸이토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기나 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 하나는 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼이 핵산염기 짝짓기(Base Paring) 성질을 갖는 부위에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산염기다.
- 청구항 1의 펩타이드 핵산 유도체 중 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.화학식1 중에서,n은 5 혹은 5 보다 크지만 30 혹은 30 보다 작은 정수이며;S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소 라디칼이며;X와 Y는 수소 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아실 라디칼, 치환체가 있거나 없는 설포닐 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며;Z는 수소 라디칼, 하이드록시 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 혹은 치환체가 있거나 없는 아릴 라디칼 중에서 선택되며;B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 싸이민, 구아닌, 싸이토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기들이나 비천연 핵산염기 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 하나는 화학식2, 화학식3, 혹은 화학식4로 표시되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다:<화학식 2><화학식 3><화학식 4>화학식2, 화학식3, 화학식4 중에서,R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 수소 라디칼, 하이드록시 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,L1, L2 그리고 L3는 화학식5로 대표되는 공유결합성 링커로서 염기성 아미노 라디칼과 핵산염기 짝짓기 성질을 갖는 부위를 연결시켜 주는데:<화학식 5>화학식5 중에서,Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 라디칼이고, Qm은 아미노 라디칼에 연결되며;Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 라디칼, 산소 라디칼, 황 라디칼, 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,m 은 2 혹은 2 보다 크지만 15 혹은 15 보다 작은 정수이다.
- 청구항 2의 펩타이드 핵산 유도체 중 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.화학식1 중에서,n은 8 혹은 8 보다 크지만 25 혹은 25 보다 작은 정수이며;S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소 라디칼이며;X와 Y는 수소 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 아실 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며;Z는 하이드록시 라디칼, 혹은 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼을 대표하며;B1, B2, ……, Bn-1, 그리고 Bn은 각각 독립적으로 아데닌, 싸이민, 구아닌, 싸이토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기들이나 비천연 핵산염기 중에서 선택되며;B1, B2, ……, Bn-1, 그리고 Bn 중 최소한 둘은 화학식2, 화학식3, 혹은 화학식4로 표시되는 비천연 핵산염기 중에서 각자 독립적으로 선택되는데;R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼이나 수소 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되고;Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 라디칼이고, Qm은 아미노 라디칼에 연결되며;Q2, Q3, …, and Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 라디칼, 산소 라디칼, 그리고 아미노 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,m은 2 혹은 2 보다 크지만 12 혹은 12 보다 작은 정수이다.
- 청구항 2의 펩타이드 핵산 유도체 중 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.화학식1 중에서,n 은 10 혹은 10 보다 크지만 25 혹은 25 보다 작은 정수이며;S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소 라디칼이며;X와 Y는 수소 라디칼이나 치환체가 있거나 없는 아실 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되고;Z는 하이드록시 라디칼, 혹은 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼을 대표하며;B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 싸이민, 구아닌, 싸이토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기들이나 비천연 핵산염기 중에서 각자 독립적으로 선택되며;B1, B2, ……, Bn-1, 그리고 Bn 중 최소한 셋은 화학식2, 화학식3, 혹은 화학식4로 표시되는 비천연 핵산염기 중에서 각자 독립적으로 선택되고;R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼 혹은 수소 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며;Q1과 Qm은 메틸렌 라디칼이고, Qm은 아미노 라디칼에 연결되며;Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 라디칼, 산소 라디칼, 혹은 아미노 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,m은 2 혹은 2 보다 크지만 10 혹은 10 보다 작은 정수이다.
- 청구항 2의 펩타이드 핵산 유도체 중 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.화학식1 중에서,n 은 10 혹은 10 보다 크지만 20 혹은 20 보다 작은 정수이며;S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소 라디칼이며;X와 Y는 수소 라디칼이나 치환체가 있거나 없는 아실 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되는데;Z 는 하이드록시 라디칼이나 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼 중에서 선택되며;B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 싸이민, 구아닌, 싸이토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기들이나 비천연 핵산염기 중에서 각자 독립적으로 선택되며;B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 셋은 화학식2, 화학식3, 혹은 화학식4로 표시되는 비천연 핵산염기 중에서 각자 독립적으로 선택되고;R1, R3, 그리고 R5는 수소 라디칼이며, R2, R4, 그리고 R6는 수소 라디칼이나 치환제가 있거나 없는 아미디닐 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되는데;Q1과 Qm은 메틸렌 라디칼이고, Qm은 아미노 라디칼에 연결되며;Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 라디칼, 산소 라디칼, 아미노 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,m은 2 혹은 2 보다 크지만 10 혹은 10 보다 작은 정수이다.
- 청구항 2의 펩타이드 핵산 유도체 중 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.화학식1 중에서,n 은 10 혹은 10 보다 크지만 20 혹은 20 보다 작은 정수이며;S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소 라디칼이며;X와 Y는 수소 라디칼과 치환체가 있거나 없는 아실 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되고;Z는 하이드록시 라디칼 혹은 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼이며;B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 싸이민, 구아닌, 싸이토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산염기들이나 비천연 핵산염기들 중에서 각자 독립적으로 선택되며;B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 셋은 화학식2, 화학식3, 혹은 화학식4로 표시되는 비천연 핵산염기 중에서 각자 독립적으로 선택되고;R1, R3 그리고 R5는 수소 라디칼이며, R2, R4 그리고 R6는 각각 수소 라디칼이 거나 아미디닐 라디칼이며;Q1과 Qm은 메틸렌 라디칼이고, Qm은 아미노 라디칼에 연결되며;Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 라디칼이나 산소 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,m은 2 혹은 2 보다 크지만 8 혹은 8 보다 작은 정수이다.
- 청구항 2의 펩타이드 핵산 유도체 중 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.화학식1 중에서,n 은 8 혹은 8 보다 크지만 20 혹은 20 보다 작은 정수이며;S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소 라디칼이며;X는 수소 라디칼이고;Y는 수소 라디칼 혹은 치환체가 있거나 없는 아실 라디칼이며;Z는 하이드록시 라디칼 혹은 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼이며;B1, B2, ……, Bn-1, 그리고 Bn은 아데닌, 싸이민, 구아닌, 그리고 싸이토신을 포함하는 천연 핵산염기들이나 비천연 핵산염기들 중에서 각자 독립적으로 선택되는데;B1, B2, ……, Bn-1, 그리고 Bn 중 최소한 셋은 화학식2, 화학식3, 혹은 화학 식4로 표시되는 비천연 핵산염기에서 각자 독립적으로 선택되고;R1, R3 그리고 R5는 수소 라디칼이며, R2, R4 그리고 R6는 각각 수소 라디칼이거나 아미디닐 라디칼이며;L1은 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, 혹은 -CH2-O-(CH2)3- 이며; 그리고,L2와 L3는 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, -(CH2)2-O-(CH2)3-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, 그리고 -(CH2)8- 중에서 각자 독립적으로 선택된다.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 하나의 청구항에 속한 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 특정 치료 목적에 치료 효과가 있는 양을 포함하는 약제학적 조성물.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 하나의 청구항에 속하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 염을 특정 진단 목적으로 사용하는 방법.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 하나의 청구항에 속하는 펩타이드 핵산 유도체 혹 은 이의 염을 세포의 단백질 발현 조절 목적으로 사용하는 방법.
- 화학식4로 표시되는 화합물.<화학식 4>화학식4 중에서,R은 수소 라디칼, N-숙시닐 라디칼, 혹은 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼이며;P1은 수소 라디칼, t-부톡시카르보닐 라디칼, (9H-플로레닐-9-일)메톡시카르보닐 라디칼, 치환체가 있거나 없는 벤질옥시카르보닐 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 라디칼 중에서 선택되며;P2는 수소 라디칼, t-부톡시카르보닐 라디칼, (9H-플로레닐-9-일)메톡시카르보닐 라디칼, 치환체가 있거나 없는 벤질옥시카르보닐 라디칼, 치환체가 있는 알킬옥시카르보닐 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 아미디닐 라디칼, 1,3- 비스(t-부톡시카르보닐)아미디닐 라디칼, 그리고 1,3-비스(벤질옥시카르보닐)아미디닐 라디칼 중에서 선택되며; 그리고,L1은 화학식5로 대표되는 공유결합성 링커로서<화학식 5>화학식5 중에서,Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 라디칼이고, Qm은 아미노 라디칼에 연결되며;Q2, Q3, …, 은 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 라디칼, 산소 라디칼, 황 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,m은 2 혹은 2 보다 크지만 15 혹은 15 보다 작은 정수이다.
- 화학식6으로 표시되는 화합물.<화학식 6>화학식6 중에서,R은 수소 라디칼, N-숙시닐 라디칼, 혹은 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼이며;P1은 수소 라디칼, t-부톡시카르보닐 라디칼, (9H-플로레닐-9-일)메톡시카르보닐 라디칼, 치환체가 있거나 없는 벤질옥시카르보닐 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 라디칼 중에서 선택되며;P2는 수소 라디칼, t-부톡시카르보닐 라디칼, (9H-플로레닐-9-일)메톡시카르보닐 라디칼, 치환체가 있거나 없는 벤질옥시카르보닐 라디칼, 치환체가 있는 알킬옥시카르보닐 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 아미디닐 라디칼, 1,3-비스(t-부톡시카르보닐)아미디닐 라디칼, 그리고 1,3-비스(벤질옥시카르보닐)아미디닐 라디칼 중에서 선택되며;P3는 수소 라디칼, t-부톡시카르보닐 라디칼, (9H-플로레닐-9-일)메톡시카르보닐 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 벤질옥시카르보닐 라디칼 중에서 선택 되며;P4 는 수소 라디칼 혹은 t-부톡시카르보닐 라디칼이며; 그리고,L2는 화학식5로 대표되는 공유결합성 링커로서<화학식 5>화학식5 중에서,Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 라디칼이고, Qm은 아미노 라디칼에 연결되며;Q2, Q3, …, 은 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 라디칼, 산소 라디칼, 황 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,m은 2 혹은 2 보다 크지만 15 혹은 15 보다 작은 정수이다.
- 화학식7로 표시되는 화합물.<화학식 7>화학식7 중에서,R은 수소 라디칼, N-숙시닐 라디칼, 혹은 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼이며;P1은 수소 라디칼, t-부톡시카르보닐 라디칼, (9H-플로레닐-9-일)메톡시카르보닐 라디칼, 치환체가 있거나 없는 벤질옥시카르보닐 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 라디칼 중에서 선택되며;P2는 수소 라디칼, t-부톡시카르보닐 라디칼, (9H-플로레닐-9-일)메톡시카르보닐 라디칼, 치환체가 있거나 없는 벤질옥시카르보닐 라디칼, 치환체가 있는 알킬옥시카르보닐 라디칼, 치환체가 있거나 없는 알킬 라디칼, 아미디닐 라디칼, 1,3-비스(t-부톡시카르보닐)아미디닐 라디칼, 그리고 1,3-비스(벤질옥시카르보닐)아미디닐 라디칼 중에서 선택되며; 그리고,L3은 화학식5로 대표되는 공유결합성 링커로서<화학식 5>화학식5 중에서,Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 라디칼이고, Qm은 아미노 라디칼에 연결되며;Q2, Q3, …, 은 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 라디칼, 산소 라디칼, 황 라디칼, 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 라디칼 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,m은 2 혹은 2 보다 크지만 15 혹은 15 보다 작은 정수이다.
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