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KR20070085665A - 도코사헥사엔산을 생성하는 야로위아 리폴리티카 균주 - Google Patents

도코사헥사엔산을 생성하는 야로위아 리폴리티카 균주 Download PDF

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KR20070085665A
KR20070085665A KR1020077012473A KR20077012473A KR20070085665A KR 20070085665 A KR20070085665 A KR 20070085665A KR 1020077012473 A KR1020077012473 A KR 1020077012473A KR 20077012473 A KR20077012473 A KR 20077012473A KR 20070085665 A KR20070085665 A KR 20070085665A
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KR
South Korea
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desaturase
genes encoding
seq
gene
acid
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KR1020077012473A
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English (en)
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하워드 지. 다뮤드
피터 존 길리즈
다니엘 조셉 마쿨
스티븐 케이. 피카타지오
제임스 존 라지안티
지시옹 쉐
나렌드라 에스. 야다브
홍시앙 장
퀸 쿤 주
존 이. 세이프
Original Assignee
이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니
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Filing date
Publication date
Application filed by 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니 filed Critical 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니
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Abstract

본 발명에는 전체 오일 분획 중 5.6％ 초과의 도코사헥사엔산 (DHA, ω-3 다불포화 지방산)을 생성할 수 있는 유질 효모 야로위아 리폴리티카의 유전자 조작된 균주가 기재되어 있다. 이 균주는 이종 데새투라제, 엘론가제 및 아실트랜스퍼라제를 발현하는 다양한 키메라 유전자를 포함하고, 임의로는 DHA의 합성 및 고축적이 가능한 다양한 천연 데새투라제 및 아실트랜스퍼라제 녹아웃을 포함한다. 상기 숙주 세포 내에서 DHA를 생성하는 방법으로서, 생성 숙주 세포가 청구된다.
도코사헥사엔산, 야로위아 리폴리티카 균주, 데새투라제, 엘론가제

Description

도코사헥사엔산을 생성하는 야로위아 리폴리티카 균주 {DOCOSAHEXAENOIC ACID PRODUCING STRAINS OF YARROWIA LIPOLYTICA}
본 출원은 2004년 11월 4일자로 출원된 미국 가출원 제60/624812호를 우선권으로 주장하며, 그 전문은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 생명공학 분야에 속한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 고농도의 도코사헥사엔산 (ω-3 다불포화 지방산)을 생성할 수 있는 유질 효모 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)의 유전자 조작된 균주에 관한 것이다.
도코사헥사엔산 (DHA; 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산; C22:6 ω-3)은 뇌 기능의 성장, 기능 발달 및 건강 유지에 필수적이며, 요람기로부터 노화까지 인생 전반에 요구된다 [Horrocks, L.A. and Y.K. Yeo. Pharmacol. Res. 40(3):211-225 (1999)]. DHA 결핍은 태아기 알콜 증후군, 주의력 결핍 과잉활동 장애, 낭포성 섬유증, 페닐케톤뇨증, 단극적 우울증, 공격성 적대성 및 부신백질이영양증과 연관된다. 반대로, 증가된 DHA 섭취는 유익함을 나타내거나, 염증성 장애 (예를 들어, 류마티스 관절염), II형 당뇨병, 고혈압, 아테롬성 동맥경화증, 우울증, 심근경색증, 혈전증, 일부 암에서 유리한 효과를 갖고, 알쯔하이머병(Alzheimer's disease)과 같은 퇴행성 장애의 발병을 예방하는 데 유리한 효과를 갖는다.
어류 (예를 들어, 연어, 송어, 고등어)는 이들이 DHA와 같은 장쇄 지방산을 천연적으로 고농도로 함유하기 때문에 DHA의 중요한 공급원이다. 많은 연구 [미국 정부가 발행한 2005년 식사 가이드라인 자문 위원회 보고서(2005 Dietary Guidelines Advisory Committee Report for Americans, part D, section 4 (coordinated by the U.S. Dept. of Health & Human Services and the U.S. Dept. of Agriculture))에 보고됨]에 근거하여, 미국 심장 협회(the American Heart Association), 국제 콜레스테롤 교육 프로그램(the National Cholesterol Education Program), 세계 건강 기구(the World Health Association), 유럽 심장 학회(the European Society for Cardiology), 미국 당뇨 협회(the American Diabetes Association) 및 영양분에 대한 영국 과학 자문 위원회(the United Kingdom Scientific Advisory Committee on Nutrition)는 모두 이렇게 시사된 심장보호 효과를 위해 1주에 2회 식사의 생선 (각 식사 시 하루에 DHA 및 에이코사펜타엔산 (EPA, C20:5 ω-3) 약 450 mg 정도의 동량을 제공함)을 권장한다. 이와 같이, DHA는 기능성 식품, 유아용 영양분, 벌크 영양소 및 동물 건강과 관련된 다양한 제품에 혼입된다.
도코사펜타엔산 (DPA, C22:5 ω-3)의 생리학적 기능은 아직 공지되어 있지 않지만, 이 지방산는 DHA의 대사 전구체이고 EPA를 연장시킨 바로 하류 생성물이다. DPA는 또한 그 함량이 매우 낮기는 하지만 어유에도 함유된 것으로 공지되어 있다. DPA에 대해 단지 공지된 기능은 제약 제제를 뇌로 운반하기 위해 담체로서 유용성을 갖는다는 것이다 (일본 특허 공개 (공개) 제61-204136호 (1986)). 그러나, DHA 결핍을 보충할 때 DPA가 증가하는 것으로 공지되어 있으므로, DPA는 동물체 내 생리학적 역할을 수행할 수 있는 것으로 예상된다 [Homayoun et al., J. Neurochem., 51 :45 (1988); Hamm et al., Biochem. J., 245:907 (1987); 및 Rebhung et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58:314 (1994)]. 따라서, DPA 및 DHA 모두는 중요한 ω-3 지방산으로서 여겨져야만 한다. 당업자는 DHA에 대한 본원에서의 교시가 또한 광범위하게 적용가능하고 DPA 제조에 관한 본원의 교시가 미래의 목적하는 생성물이 될 것임을 인지할 것이다.
DHA는 여러 유형의 어유 및 해양 플랑크톤에서 천연적으로 발견되지만, 이러한 ω-3 지방산의 공급은 늘어나는 수요를 충족시키기에는 불충분할 것이라고 예측된다. 어유는 매우 불균질한 조성 (이 때문에, EPA를 풍부하게 하기 위해서는 과도한 정제가 요구됨), 불쾌한 맛 및 냄새 (이는 경제적으로 제거하기가 어렵고, 어유가 식품 성분으로서 허용되지 않게 함)를 가지며, 중금속 오염물의 환경적인 생체 축적 및 (기후, 질환 또는 남획으로 인한) 입수성의 변동이 쉽게 일어난다.
어유에 대한 대체물로서, DHA는 또한 미생물에서 생성될 수 있다. 일반적으로, 미생물성 오일 생성은 오일 합성 (이는 통상적인 세포 대사의 과정에서 일어남)을 가능하게 하는 적합한 배양 배지에서 EPA를 천연 합성할 수 있는 적절한 미생물을 배양한 후, 발효 배지로부터 미생물을 분리하고, 세포내 오일의 회수를 위한 처리하는 것을 포함한다. 특이적인 미생물 유기체 [예를 들어, 시조키트륨(Schizochytrium) 종 (미국 특허 제5,340,742호; 미국 특허 제6,582,941호); 울케 니아(Ulkenia) (미국 특허 제6,509,178호); 수도모나스(Pseudomonas) 종 YS-180 (U.S. 6,207,441); 트라우스토키트륨(Thraustochytrium) 속 균주 LFF1 (미국 특허 제2004/0161831 A1호); 크립테코디늄 코니(Crypthecodinium cohnii) (미국 특허 제2004/0072330 A1호; 문헌 [de Swaaf, M. E. et al. Biotechnol Bioeng. 81 (6):666-72 (2003)] 및 [Appl Microbiol Biotechnol. 61 (1):40-3 (2003)]); 에밀리아니아(Emiliania) 종 (일본 특허 출원 (공개) 제5-308978호 (1993)); 및 자포노키트륨(Japonochytrium) 종 (ATCC #28207; 일본 특허 출원 (공개) 제199588/1989호)]를 기초로 하는 여러 수많은 방법이 존재한다. 추가로, 하기 미생물: 비브리오 마리누스(Vibrio marinus) (심해로부터 단리된 박테리아; ATCC #15381); 미세조류 시클로텔라 크립티카(Cyclotella cryptica) 및 이소크리시스 갈바나(Isochrysis galbana); 및 편모충 곰팡이, 예를 들어 트라우스토키트륨 아우레움(Thraustochytrium aureum) (ATCC #34304; 문헌 [Kendrick, Lipids, 27:15 (1992)]), 및 ATCC #28211, ATCC #20890 및 ATCC #20891로 지칭되는 트라우스토키트륨 종은 DHA를 생산하는 능력이 있는 것으로 공지되어 있다. 그리고, 이들 몇몇 방법이 다양한 제한의 결과로서 산업적 사용성에 대하여 허용되지 않더라도, DHA의 상업적 제조를 위한 적어도 3가지의 상이한 발효 과정: DHASCO™ (매릴랜드주 콜롬비아 소재의 마르텍 바이오사이언시스 코포레이션(Martek Biosciences Corporation)) 제조용 크립테코디늄 코니의 발효; DHAGold (마르텍 바이오사이언시스 코포레이션)로서 종래 공지된 오일 제조용 시조키트륨 종의 발효; 및 DHActive™ (독일 프랑크푸르트 소재의 뉴트리노바(Nutrinova)) 제조용 울케니아 종의 발효 가 존재한다. 이러한 성공에도 불구하고, 이들 각각의 방법은 발효가 미생물 자체의 천연 능력에 의존적이기 때문에 생성된 오일 조성물의 특징을 조절하거나 또는 오일의 수율을 실질적으로 개선시키는 능력이 없어서 적용하기 어렵다.
따라서, 재조합 수단을 이용하는 DHA의 미생물 생성은 천연 미생물 공급원으로부터의 생성에 비해 여러 이점이 있을 것으로 예상된다. 예를 들어, 숙주의 천연 발생 미생물 지방산 프로파일은 숙주에서 새로운 생합성 경로의 도입 및/또는 원치않는 경로의 저해에 의해 변경되어, 원하는 PUFA (또는 그의 접합된 형태)의 생성 수준을 증가시키고, 원치않는 PUFA의 생성을 감소시킬 수 있기 때문에, 오일 생성을 위한 바람직한 특징을 갖는 재조합 미생물을 사용할 수 있다. 둘째로, 재조합 미생물은 특정 용도를 가질 수 있는 특정한 형태의 PUFA를 제공할 수 있다. 그리고, 마지막으로, 미생물성 오일 생성은 배양 조건의 조절에 의해, 현저하게는 미생물에서 발현되는 효소를 위한 특정한 기질 공급원을 제공함으로써, 또는 화합물 첨가/유전자 조작에 의해 원치않는 생화학적 경로를 저해함으로써 조작될 수 있다. 따라서, 예를 들어 그렇게 생성된 ω-3 지방산과 ω-6 지방산의 비율을 변형시킬 수 있거나, 다른 PUFA 하류 또는 상류 생성물의 유의한 축적이 없이 특이적 PUFA (예컨대, DHA)의 생성을 유전자 조작할 수 있다.
DHA의 미생물성 생성은 먼저 중간체 지방산인 EPA의 합성이 요구된다. 그리고, 미생물에서 생성되는 대부분의 DHA는 Δ6 데새투라제(desaturase)/Δ6 엘론가제(elongase) 경로 (조류, 이끼류, 진균, 선충류 및 인간에서 우세하게 발견됨)를 통해 합성되며, 여기서, 1) Δ12 데새투라제의 작용에 의해 올레산이 LA로 전환되 고, 2) 임의로, Δ15 데새투라제의 작용에 의해 LA는 ALA로 전환되고, 3) Δ6 데새투라제의 작용에 의해 LA는 GLA로 전환되고/되거나 ALA는 STA로 전환되고, 3) C18 /20 엘론가제의 작용에 의해 GLA가 DGLA로 전환되고/되거나 STA가 ETA로 전환되고, 3) Δ5 데새투라제의 작용에 의해 DGLA가 ARA로 전환되고/되거나 ETA가 EPA로 전환되고, 4) 임의로, Δ17 데새투라제의 작용에 의해 ARA가 EPA로 전환된다 (도 1). 그러나, EPA의 생합성을 위한 별법의 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로는 일부 유기체, 예컨대 유글레나 종에서 작동하며, 이는 C20 PUFA의 형성을 위한 주요 경로이다 (문헌 [Wallis, J.G., and Browse, J. Arch. Biochem. Biophys. 365:307-316 (1999)]; 제WO 00/34439호 및 [Qi, B. et al. FEBS Letters. 510:159-165 (2002)]). 이 경로에서는, 1) Δ9 엘론가제에 의해 LA 및 ALA가 각각 EDA 및 ETrA로 전환되고, 2) Δ8 데새투라제에 의해 EDA 및 ETrA가 각각 DGLA 및 ETA로 전환되고, 3) 상기 기재된 바와 같이 DGLA 및 ETA가 궁극적으로 EPA로 전환된다. EPA의 합성에 따라, C20 /22 엘론가제는 기질을 DPA로 전환시킨 다음, Δ4 데새투라제에 의해 탈포화시켜 DHA를 수득하는 데 작용한다.
상기 문헌은 ω-3/ω-6 PUFA 생합성 경로의 다양한 부분을 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) (비-유질 효모)에 도입한 수많은 최근의 예시적인 방법을 보고한다. 구체적으로, 문헌 [Dyer, J. M. et al., Appl. Eniv. Microbiol., 59:224-230 (2002)]은 리놀렌산의 합성을 보고하였고, 넛존(Knutzon) 등의 미국 특허 제6,136,574호는 리놀렌산 (LA), γ-리놀렌산 (GLA), ALA 및 스테 아리돈산 (STA)의 생성을 유도하였고, 문헌 [Domergue, F. et al., Eur. J. Biochem. 269:4104-4113 (2002)]는 EPA의 생성을 기재하였고, 문헌 [Pereira, S. L. et al., Biochem. J. 384:357-366 (2004)]는 최초로 DHA를 생성하였다 (EPA가 기질로서 공급되는 경우 전체 지방산의 3.8％). 그러나, 이러한 성공에도 불구하고, DHA의 시판량 (즉, 전체 지방산에 대하여 5 내지 30％ 초과)을 경제적으로 생성할 수 있는 복잡한 대사성 유전자 조작은 보고된 바가 없었다. 추가로, 이러한 조작을 위해 가장 적절한 숙주 유기체의 선택과 관련하여 상당한 편차가 존재한다.
최근에, 피카타지오(Picataggio) 등의 제WO 2004/101757호 및 동시-계류중인 미국 특허 출원 제60/624812호에서는 PUFA, 예컨대 ARA, EPA 및 DHA의 생성을 위한 바람직한 미생물 부류로서 유질 효모, 구체적으로 야로위아 리폴리티카 (이전에는 칸디다 리폴리티카(Candida lipolytica)로서 분류됨)의 유용성에 대해 연구하였다. 유질 효모는 천연적인 오일 합성 및 축적이 가능한 효모로서 정의되며, 여기서, 오일 축적은 세포 건조 중량의 약 80％까지일 수 있다. 이들 유기체는 ω-6 및 ω-3 지방산 생성이 천연적으로 결핍되어 있음에도 불구하고 (천연적으로 생성되는 PUFA는 18:2 지방산 (및 덜 통상적으로는, 18:3 지방산)으로 제한되기 때문), 피카타지오 등의 상기 문헌에서는 비교적 간단한 유전자 조작 접근법을 이용하여 야로위아 리폴리티카에서 (전체 지방산의) 1.3％ ARA 및 1.9％ EPA의 생성을 입증하였고, 더 복잡한 대사성 유전자 조작을 이용하여 28％ 이하의 EPA 생성을 입증하였다. 그러나, 상기 특정한 숙주 유기체에서 더욱 복잡한 대사성 유전자 조작에 의해 DHA를 경제적이고 상업적으로 생성한 적은 없다.
본 출원인은 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로를 이용하여 전체 오일 분획 중 5％ 초과의 DHA를 생성할 수 있는 다양한 야로위아 리폴리티카 균주의 유전자 조작에 의해 상기 문제점을 해결하였다. 이들 유질 효모에서 DHA 생성률을 더욱 증가시키기 위해 추가의 대사성 유전자 조작 및 발효 방법뿐만 아니라, Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 통해 DHA를 생성할 수 있는 방법 (이에 따라 GLA가 결여된 DHA-함유 오일을 생성함)을 제공한다.
<발명의 요약>
본 발명은 도코사헥사엔산 (DHA)을 생성하기 위해 유전자 조작된 재조합 생성 숙주, 이를 제조하는 방법 및 본 발명의 제조합 숙주에 의해 생성된 미생물성 오일을 함유한 식품 공급 제품에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는, ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로의 유전자인
a) Δ6 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
b) C18 /20 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
c) Δ5 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
d) Δ17 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
e) C20 /22 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및
f) Δ4 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자
를 포함하는 유전자 풀을 포함하는 백그라운드 야로위아 종을 포함하는, 도코사헥 사엔산의 생성을 위한 재조합 생성 숙주 세포를 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로의 유전자인
a) Δ15 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
b) Δ6 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
c) C18 /20 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
d) Δ5 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
e) C20 /22 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및
f) Δ4 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자
를 포함하는 유전자 풀을 포함하는 백그라운드 야로위아 종을 포함하는, 도코사헥사엔산 생성을 위한 재조합 생성 숙주 세포를 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로의 유전자인
a) Δ9 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
b) Δ8 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
c) Δ5 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
d) Δ17 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
e) C20 /22 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및
f) Δ4 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자
를 포함하는 유전자 풀을 포함하는 백그라운드 야로위아 종을 포함하는, 도코사헥사엔산 생성을 위한 재조합 생성 숙주 세포를 제공한다.
별법의 실시양태에서, 본 발명은 ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로의 유전자인
a) Δ15 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
b) Δ9 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
c) Δ8 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
d) Δ5 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
e) C20 /22 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및
f) Δ4 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자
를 포함하는 유전자 풀을 포함하는 백그라운드 야로위아 종을 포함하는, 도코사헥사엔산 생성을 위한 재조합 생성 숙주 세포를 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 생성 숙주는 임의로는 Δ12 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 전체 지방산에 대한 백분율로서 약 5％ 이상의 도코사헥사엔산을 갖는 미생물성 오일을 생성하는 제조합 생성 숙주를 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은
a) 도코사헥사엔산을 포함하는 미생물성 오일을 생성하는 본 발명의 생성 숙주를 배양하는 단계; 및
b) 임의로 단계 a)의 미생물성 오일을 회수하는 단계
를 포함하는, 도코사헥사엔산을 포함하는 미생물성 오일을 생성하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 미생물성 오일 및 본 발명의 생성 숙주를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 미생물성 오일은 DHA를 함유하지만 임의의 γ-리놀레산은 함유하지 않는다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 생성된 유효량의 미생물성 오일을 포함하는 식품을 제공한다. 다르게는, 본 발명은 본 발명의 방법으로 생성된 유효량의 미생물성 오일을 포함하는, 의료용 식품, 식이 보조제; 유아용 조제식 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택된 제품을 제공한다.
다르게는, 본 발명은 본 발명의 방법으로 생성된 유효량의 미생물성 오일을 포함하는 동물 사료를 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 도코사헥사엔산을 함유하는 본 발명의 방법에 의해 생성된 미생물성 오일을 인간 또는 동물이 소모가능하거나 사용가능한 형태로 제공하는 것을 포함하는, 에이코사펜타엔산이 풍부한 인간, 동물 또는 양식 유기체 식이 보충제를 제공하는 방법을 제공한다.
다르게는, 본 발명은 도코사헥사엔산을 함유하는 본 발명의 방법에 의해 생성된 미생물성 오일을 인간 또는 동물이 소모가능하거나 사용가능한 형태로 제공하는 것을 포함하는, 동물 또는 인간에서 도코사헥사엔산의 결핍을 치료하는 방법을 제공한다.
<미생물 기탁>
하기 미생물은 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었으며, 기탁 번호 및 기탁일은 하기와 같다.
미생물 기탁 번호 기탁일
플라스미드 pY89-5 ATCC PTA-6048 2004년 6월 4일
야로위아 리폴리티카 Y2047 ATCC PTA-7186 2005년 10월 26일
야로위아 리폴리티카 Y2201 ATCC PTA-7185 2005년 10월 26일
야로위아 리폴리티카 Y2096 ATCC PTA-7184 2005년 10월 26일
야로위아 리폴리티카 Y3000 ATCC PTA-7187 2005년 10월 26일
<도면의 간단한 설명 및 서열의 기재>
도 1은 ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로를 도시한다.
도 2는 유질 효모에서의 지질 축적에 대한 생화학적 메카니즘의 개략도이다.
도 3A는 메갈린(Megalign) DNASTAR 소프트웨어를 이용하여 생성한, 상이한 섬사상 진균으로부터의 Δ12 데새투라제 및 Δ15 데새투라제 단백질의 계통수를 도시한다. 도 3B는 pY57.YI.AHAS.w497l에 대한 플라스미드 지도를 제공한다.
도 4는 유질 효모에서의 지질 축적에서 다양한 아실트랜스퍼라제의 역할을 기재하는 개략도이다.
도 5는 전체 지질 분획 중 다양한 지방산 (DHA 포함)을 생산하는 본 발명의 일부 야로위아 리폴리티카 균주의 발달에 대한 약도이다.
도 6A는 pY5-30에 대한 플라스미드 지도를 제공한다. 도 6B는 야로위아 리폴리티카 ATCC #76982 균주에서 조직화학적 염색에 의해 측정된 TEF, GPD, GPM, FBA 및 FBAIN의 상대적인 프로모터 활성을 나타낸다. 도 6C는 다양한 배지에서 성장한 야로위아 리폴리티카에서 조직화학적 염색에 의해 측정된 YAT1, TEF, GPAT 및 FBAIN의 상대적인 프로모터 활성을 나타낸다.
도 7A는 야로위아 리폴리티카 ATCC #76982 균주에서 형광측정에 의해 측정된 GPD, GPM, FBA 및 FBAIN의 프로모터 활성을 비교하는 그래프이다. 도 7B는 실시간 PCR 상대적인 정량화의 결과를 그래프로 요약한 것이며, 여기서 야로위아 리폴리티카 ATCC #76982 균주의 GUS mRNA (즉, GPD::GUS, GPDIN::GUS, FBA::GUS 또는 FBAIN::GUS 키메라 유전자를 발현)는 pY5-30을 발현하는 야로위아 리폴리티카 균주의 mRNA (즉, 키메라 TEF::GUS 유전자) 수준에 대해 정량화되었다.
도 8는 (A) pKUNF12T6E, (B) pDMW271, (C) pZP3L37, (D) pZKUT16 및 (E) pKO2UM25E에 대한 플라스미드 지도를 제공한다.
도 9는 (A) pDMW303, (B) pZUF17, (C) pZUF4, (D) pFOE2S 및 (E) pZP2F0EN4에 대한 플라스미드 지도를 제공한다.
도 10은 (A) pKUNT2; (B) pDMW237; (C) pDMW240; (D) 효모 발현 벡터 pY89-5; 및 (E) pKUNFmKF2에 대한 플라스미드 지도를 제공한다.
도 11는 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) 세포 추출물의 지질 프로파일의 크로마토그램을 도시한다.
도 12은 다양한 유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제 폴리펩티드 서열의 정렬을 도시한다. 이용된 정렬 방법은 "클러스탈(Clustal) V 정렬 방법"에 상응한다.
도 13은 (A) pDMW277, (B) pZF5T-PPC, (C) pDMW287F 및 (D) pDMW297에 대한 플라스미드 지도를 제공한다.
도 14는 (A) pZP2C16M899, (B) pDMW314, (C) pDM325 및 (D) pZKL5598에 대한 플라스미드 지도를 제공한다.
도 15는 (A) pY72 [또는 "pY72.2loxp.Hyg.Fba.F15"], (B) pY80 [또는 "pY80.loxp.2F15"], (C) pY79 [또는 "pY79.Cre.AHASw497L"] 및 (D) pY86 [또는 "pY86.loxp.Ura3.Hyg.F12"]에 대한 플라스미드 지도를 제공한다.
도 16은 (A) pY94 [또는"pY94.loxp.D9ED8.Ura3"], (B) pY91M [또는"pY91.Dr.D6M (천연)"], (C) pDMW232 및 (D) pY37/F15에 대한 플라스미드 지도를 제공한다.
도 17은 (A) pKO2UF2PE, (B) pZKUGPI5S, (C) pDMW302T16 및 (D) pKO2UM26E에 대한 플라스미드 지도를 제공한다.
도 18은 (A) pZUF-Mod-1, (B) pMDAGAT1-17 및 (C) pMGPAT-17에 대한 플라스미드 지도를 제공한다.
도 19는 각각 모르티에렐라 알피나의 글리세롤-3-포스페이트 o-아실트랜스퍼라제 (GPAT)와 관련된 서열 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147 및 148 사이의 관계를 그래프로 나타낸다.
도 20은 각각 모르티에렐라 알피나의 C16 /18 지방산 엘론가제 효소 (ELO3)와 관련된 서열 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 및 93 사이의 관계를 그래프로 나타낸다.
도 21은 (A) pZUF6S, (B) pZUF6S-E3WT, (C) pZKUGPYE1-N 및 (D) pZKUGPYE2에 대한 플라스미드 지도를 제공한다.
도 22는 (A) pZKUGPYE1, (B) pZUF6FYE1, (C) pZP217 + Ura, (D) pY20 및 (E) pLV13에 대한 플라스미드 지도를 제공한다.
본 발명은 본 출원의 일부분인 하기 발명의 상세한 설명 및 첨부된 서열 기재로부터 더욱 잘 이해될 것이다.
하기 서열은 37 C.F.R.§1.821-1.825 ("뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 특허 출원에 대한 기재 요건 - 서열 규칙")에 부합하며, WIPO 표준 ST.25 (1998) 및 EPO 및 PCT의 서열 목록 요건 (규칙 5.2 및 49.5(a-bis), 및 행정 지침서 섹션 208 및 첨부 C)에 일치한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이타에 사용된 기호 및 포맷은 37 C.F.R.§1.822의 규칙에 부합한다.
서열 1-153 및 210-221는 표 1에 나타낸 바와 같이 프로모터, 유전자 또는 단백질 (또는 그의 단편)을 코딩하는 ORF이다.
유전자 및 단백질 서열에 대한 요약
기재 핵산 서열 단백질 서열
모르티에렐라 알피나 Δ6 데새투라제 1 (1374 bp) 2 (457 AA)
야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 모르티에렐라 알피나로부터 유래된 합성 Δ6 데새투라제 3 (1374 bp) 2 (457 AA)
모르티에렐라 알피나 Δ6 데새투라제 "B" 4 (1521 bp) 5 (458 AA)
모르티에렐라 알피나 Δ5 데새투라제 6 (1341 bp) 7 (446 AA)
이소크리시스 갈바나 Δ5 데새투라제 8 (1329 bp) 9 (442 AA)
야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 이소크리시스 갈바나로부터 유래된 합성 Δ5 데새투라제 10 (1329 bp) 9 (442 AA)
호모 사피엔스(Homo sapiens) Δ5 데새투라제 11 (1335 bp) 12 (444 AA)
야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 호모 사피엔스로부터 유래된 합성 Δ5 데새투라제 13 (1335 bp) 12 (444 AA)
다니오 레리오(Danio rerio) Δ5/Δ6 데새투라제 Drd6/d5(V) (진뱅크 관리 번호 AF309556) 14 (1590 bp) 15 (444 AA)
다니오 레리오 Δ5/Δ6 데새투라제 (진뱅크 관리 번호 BC068224) 16 (1946 bp) ---
다니오 레리오 Δ5/Δ6 데새투라제 돌연변이체 Drd6/d5(M) 17 (1335 bp) 18 (444 AA)
사프롤레그니아 디클리나(Saprolegnia diclina) Δ17 데새투라제 19 (1077 bp) 20 (358 AA)
야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 사프롤레그니아 디클리나로부터 유래된 합성 Δ17 데새투라제 유전자 21 (1077 bp) 20 (358 AA)
모르티에렐라 알피나 C18 /20 엘론가제 22 (957 bp) 23 (318 AA)
야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 모르티에렐라 알피나로부터 유래된 합성 C18 /20 엘론가제 유전자 24 (957 bp) 23 (318 AA)
트라우스토키트륨 아우레움 C18 /20 엘론가제 25 (819 bp) 26 (272 AA)
야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 트라우스토키트륨 아우레움으로부터 유래된 합성 C18/20 엘론가제 유전자 27 (819 bp) 26 (272 AA)
야로위아 리폴리티카 Δ12 데새투라제 28 (1936 bp) 29 (419 AA)
모르티에렐라 이자벨리나(Mortierella isabellina) Δ12 데새투라제 30 (1203 bp) 31 (400 AA)
푸사륨 모닐리포르메(Fusarium moniliforme) Δ12 데새투라제 32 (1434 bp) 33 (477 AA)
아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) Δ12 데새투라제 34 (1416 bp) 35 (471 AA)
아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus) Δ12 데새투라제 -- 36 (466 AA)
아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) Δ12 데새투라제 -- 37 (424 AA)
마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea) Δ12 데새투라제 38 (1656 bp) 39 (551 AA)
뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa) Δ12 데새투라제 40 (1446 bp) 41 (481 AA)
푸사륨 그라미네아륨(Fusarium graminearium) Δ12 데새투라제 42 (1371 bp) 43 (456 AA)
모르티에렐라 알피나 Δ12 데새투라제 44 (1403 bp) 45 (400 AA)
사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri) Δ12 데새투라제 -- 46 (416 AA)
클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) Δ12 데새투라제 47 (1948 bp) 48 (415 AA)
칸디다 알비칸스(Candida albicans) Δ12 데새투라제 -- 49 (436 AA)
데바리오마이세스 한세니이(Debaryomyces hansenii) CBS767 Δ12 데새투라제 -- 50 (416 AA)
푸사륨 모닐리포르메 Δ15 데새투라제 51 (1209 bp) 52 (402 AA)
아스페르길루스 니둘란스 Δ15 데새투라제 53 (1206 bp) 54 (401 AA)
마그나포르테 그리세아 Δ15 데새투라제 55 (1185 bp) 56 (394 AA)
뉴로스포라 크라싸 Δ15 데새투라제 57 (1290 bp) 58 (429 AA)
푸사륨 그라미네아륨 Δ15 데새투라제 59 (1212 bp) 60 (403 AA)
모르티에렐라 알피나 Δ15 데새투라제 61 (1353 bp) 62 (403 AA)
클루이베로마이세스 락티스 Δ15 데새투라제 63 (1248 bp) 64 (415 AA)
칸디다 알비칸스 Δ15 데새투라제 -- 65 (433 AA)
사카로마이세스 클루이베리 Δ15 데새투라제 -- 66 (419 AA)
데바리오마이세스 한세니이 CBS767 Δ15 데새투라제 -- 67 (435 AA)
아스페르길루스 푸미가투스 Δ15 데새투라제 -- 68 (396 AA)
이소크리시스 갈바나 Δ9 엘론가제 69 (792 bp) 70 (263 AA)
야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 Δ9 엘론가제 유전자 71 (792 bp) 70 (263 AA)
유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제 유전자 (비-관능성; 진뱅크 관리 번호 AAD45877) 72 (1275 bp) 73 (419 AA)
유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제 유전자 (비-관능성; 문헌 [Wallis et al., Archives of Biochem. Biophys., 365:307-306 (1999)]; 제WO 00/34439호) -- 74 (422 A)
야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 Δ8 데새투라제 유전자 (D8S-1) 75 (1270 bp) --
야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 Δ8 데새투라제 유전자 (D8S-3) 76 (1269 bp) --
유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제 유전자 (Eg5) 77 (1271 bp) 78 (421 AA)
유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제 유전자 (Eg12) 79 (1271 bp) 80 (421 AA)
야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 Δ8 데새투라제 유전자 (D8SF) 81 (1272 bp) 82 (422 AA)
라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) C16 /18 엘론가제 83 (2628 bp) 84 (267 AA)
야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 라투스 노르베기쿠스로부터 유래된 합성 C16 /18 엘론가제 유전자 85 (804 bp) 84 (276 AA)
모르티에렐라 알피나 C16 /18 엘론가제 (ELO3) 86 (828 bp) 87 (275 AA)
모르티에렐라 알피나 ELO3 - 부분 cDNA 서열 88 (607 bp) --
모르티에렐라 알피나 ELO3 - 게놈 워킹(genome walking)에 의해 수득한 3' 서열 89 (1,042 bp) --
모르티에렐라 알피나 ELO3 - 게놈 워킹에 의해 수득한 5' 서열 90 (2,223 bp) --
모르티에렐라 알피나 ELO3 - cDNA 콘티그 91 (3,557 bp) --
모르티에렐라 알피나 ELO3 - 인트론 92 (542 bp) --
모르티에렐라 알피나 ELO3 - 게놈 콘티그 93 (4,099 bp) --
야로위아 리폴리티카 C16 /18 엘론가제 유전자 94 (915 bp) 95 (304 AA)
칸디다 알비칸스 가능한 지방산 엘론가제 (진뱅크 관리 번호 EAL04510) -- 96 (353 AA)
야로위아 리폴리티카 C14 /16 엘론가제 유전자 97 (978 bp) 98 (325 AA)
뉴로스포라 크라싸 FEN1 유전자 (진뱅크 관리 번호 CAD70918) -- 99 (337 AA)
오스트레오코쿠스 타우리(Ostreococcus tauri) C20 /22 엘론가제 100 (903 bp) 101 (300 AA)
야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 오스트레오코쿠스 타우리로부터 유래된 합성 C20 /22 엘론가제 유전자 102 (903 bp) 103 (300 AA)
트라우스토키트륨 아우레움(Traustochytrium aureum) Δ4 데새투라세 104 (1548 bp) 105 (515 AA)
야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 트라우스토키트륨 아우레움으로부터 유래된 합성 Δ4 데새투라세 106 (1545 bp) 107 (514 AA)
모르티에렐라 알피나 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 (LPAAT1) 108 (945 bp) 109 (314 AA)
모르티에렐라 알피나 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 (LPAAT2) 110 (927 bp) 111 (308 AA)
야로위아 리폴리티카 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 (LPAAT1) 112 (1549 bp) 113 (282 AA)
야로위아 리폴리티카 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 (LPAAT2) - 유전자를 포함하는 게놈 단편 114 (1495 bp) --
야로위아 리폴리티카 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 (LPAAT2) 115 (672 bp) 116 (223 AA)
야로위아 리폴리티카 포스포리피드:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (PDAT) 117 (2326 bp) 118 (648 AA)
야로위아 리폴리티카 아실-CoA:스테롤-아실트랜스퍼라제 (ARE2) 119 (1632 bp) 120 (543 AA)
캐노르합디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans) 아실-CoA:1-아실 리소포스파티딜콜린 아실트랜스퍼라제 (LPCAT) -- 121 (282 AA)
야로위아 리폴리티카 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT1) 122 (1578 bp) 123 (526 AA)
모르티에렐라 알피나 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT1) 124 (1578 bp) 125 (525 AA)
뉴로스포라 크라싸 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT1) -- 126 (533 AA)
지베렐라 제애(Gibberella zeae) PH-1 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT1) -- 127 (499 AA)
마그나포르테 그리세아 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT1) -- 128 (503 AA)
아스페르길루스 니둘란스 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT1) -- 129 (458 AA)
야로위아 리폴리티카 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT2) 130 (2119 bp) 132 (1380 bp) 134 (1068 bp) 131 (514 AA) 133 (459 AA) 135 (355 AA)
모르티에렐라 알피나 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT2) 136 (996 bp) 137 (331 AA)
모르티에렐라 알피나 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 (GPAT) 138 (2151 bp) 139 (716 AA)
모르티에렐라 알피나 GPAT - 부분 cDNA 서열 140 (1212 bp) --
모르티에렐라 알피나 GPAT - -1050 bp 내지 +2886 bp 영역을 포함하는 게놈 단편 141 (3935 bp) --
모르티에렐라 알피나 GPAT - 게놈 워킹에 의해 수득한 3' cDNA 서열 142 (965 bp) --
모르티에렐라 알피나 GPAT - 게놈 워킹에 의해 수득한 5' cDNA 서열 143 (1908 bp) --
모르티에렐라 알피나 GPAT - 게놈 워킹에 의해 수득한 내부 서열 144 (966 bp) --
모르티에렐라 알피나 GPAT - 인트론 #1 145 (275 bp) --
모르티에렐라 알피나 GPAT - 인트론 #2 146 (255 bp) --
모르티에렐라 알피나 GPAT - 인트론 #3 147 (83 bp) --
모르티에렐라 알피나 GPAT - 인트론 #4 148 (99 bp) --
야로위아 리폴리티카 디아실글리세롤 콜린포스포트랜스퍼라제 (CPT1) - 유전자를 포함하는 게놈 단편 149 (2133 bp) --
야로위아 리폴리티카 디아실글리세롤 콜린포스포트랜스퍼라제 (CPT1) 150 (1185 bp) 151 (394 AA)
사카로마이세스 세레비지애 이노시톨 스핑고인지질-특이적 포스포리파제 C (ISC1) 152 (1434 bp) 153 (477 AA)
야로위아 리폴리티카 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 프로모터 (GPD) 210 (971 bp) --
야로위아 리폴리티카 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 + 인트론 프로모터 (GPDIN) 211 (1174 bp) --
야로위아 리폴리티카 포스포글리세레이트 뮤타제 프로모터 (GPM) 212 (878 bp) --
야로위아 리폴리티카 프럭토스-비스포스페이트 알돌라제 프로모터 (FBA) 1213 (1001 bp) --
야로위아 리폴리티카 프럭토스-비스포스페이트 알돌라제 + 인트론 프로모터 (FBAIN) 214 (973 bp) --
야로위아 리폴리티카 프럭토스-비스포스페이트 알돌라제 + 개질된 인트론 프로모터 (FBAINm) 215 (924 bp) --
야로위아 리폴리티카 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 (GPAT) 216 (1130 bp) --
야로위아 리폴리티카 암모늄 수송자 프로모터 (YAT1) 217 (778 bp) --
야로위아 리폴리티카 번역 연장 인자 ET1-α 프로모터 (TEF) 218 (436 bp) --
야로위아 리폴리티카 키메라 GPM::FBA 인트론 프로모터 (GPM::FBAIN) 219 (1020 bp) --
야로위아 리폴리티카 키메라 GPM::GPD 인트론 프로모터 (GPM::GPDIN) 220 (1052 bp) --
야로위아 리폴리티카 방출 단백질 프로모터 (EXP1) 221 (1000 bp) --
서열 154 및 156-209는 표 2에 나타낸 플라스미드이다.
Figure 112007040393459-PCT00001
Figure 112007040393459-PCT00002
서열 155은 야로위아 종에서 최적으로 발현되는 유전자를 위한 코돈-최적화된 번역 개시 부위에 상응한다.
서열 222는 진균 Δ15 및 Δ12 데새투라제에서 발견되는 His 박스 1 모티프에 상응한다.
서열 223은 Δ15 데새투라제 활성을 갖는 진균 단백질임을 표시하는 모티프에 상응하고, 서열 224는 Δ12 데새투라제 활성을 갖는 진균 단백질임을 표시하는 모티프에 상응한다.
서열 225-238은 각각 야로위아 리폴리티카 프로모터 영역을 증폭시키는데 사용되는 프라이머 YL211, YL212, YL376, YL377, YL203, YL204, GPAT-5-1, GPAT-5-2, ODMW314, YL341, ODMW320, ODMW341, 27203-F 및 27203-R에 상응한다.
서열 239-242는 각각 실시간 분석에 사용되는 올리고뉴클레오티드 YL-URA-16F, YL-URA-78R, GUS-767F 및 GUS-891R이다.
서열 243은 W497L 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 AHAS 유전자이다.
서열 244-249는 각각 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 야로위아 리폴리티카 AHAS 유전자의 합성에 사용되는, 프라이머 410, 411, 412, 413, 414 및 415에 상응한다.
서열 250-281은 전체 코돈-최적화된 코딩 영역을 함께 포함하는 16쌍의 올리고뉴클레오티드 (즉, D4-1A, D4-1B, D4-2A, D4-2B, D4-3A, D4-3B, D4-4A, D4-4B, D4-5A, D4-5B, D4-6A, D4-6B, D4-7A, D4-7B, D4-8A, D4-8B, D4-9A, D4-9B, D4-10A, D4-10B, D4-11A, D4-11B, D4-12A, D4-12B, D4-13A, D4-13B, D4-14A, D4-14B, D4-15A, D4-15B, D4-16A 및 D4-16B)에 상응한다.
서열 282-289는 각각 코돈-최적화된 Δ4 데새투라제 유전자의 합성 동안에 PCR 증폭을 위해 사용되는 프라이머 D4-1F, D4-4R, D4-5F, D4-8R, D4-9F, D4-12R, D4-13 및 D4-16R에 상응한다.
서열 290 및 291은 각각 코돈-최적화된 Δ4 데새투라제 유전자의 합성 동안 사용되는 프라이머 YL251 및 YL252에 상응한다.
서열 292-307은 이소크리시스 갈바나 Δ9 엘론가제의 전체 코돈-최적화된 코딩 영역을 함께 포함하는 8쌍의 올리고뉴클레오티드 (즉, 각각 IL3-1A, IL3-1B, IL3-2A, IL3-2B, IL3-3A, IL3-3B, IL3-4A, IL3-4B, IL3-5A, IL3-5B, IL3-6A, IL3-6B, IL3-7A, IL3-7B, IL3-8A 및 IL3-8B)에 상응한다.
서열 308-311은 각각 코돈-최적화된 Δ9 엘론가제 유전자의 합성 동안에 PCR 증폭을 위해 사용되는 프라이머 IL3-1F, IL3-4R, IL3-5F 및 IL3-8R에 상응한다.
서열 312는 pT9(1-4)에 기재된 417 bp NcoI / PstI 단편이고, 서열 313은 pT9(5-8)에 기재된 377 bp PstI / NotI 단편이다.
서열 314-339는 유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제의 전체 코돈-최적화된 코딩 영역을 함께 포함하는 13쌍의 올리고뉴클레오티드 (즉, 각각 D8-1A, D8-1B, D8-2A, D8-2B, D8-3A, D8-3B, D8-4A, D8-4B, D8-5A, D8-5B, D8-6A, D8-6B, D8-7A, D8-7B, D8-8A, D8-8B, D8-9A, D8-9B, D8-10A, D8-10B, D8-11A, D8-11B, D8-12A, D8-12B, D8-13A 및 D8-13B)에 상응한다.
서열 340-347은 각각 코돈-최적화된 Δ8 데새투라제 유전자의 합성 동안에 PCR 증폭을 위해 사용되는 프라이머 D8-1F, D8-3R, D8-4F, D8-6R, D8-7F, D8-9R, D8-10F 및 D8-13R에 상응한다.
서열 348은 pT8(1-3)에 기재된 309 bp Nco / BglII 단편이고, 서열 349는 pT8(4-6)에 기재된 321 bp BglII / XhoI 단편이고, 서열 350은 pT8(7-9)에 기재된 264 bp XhoI/SacI 단편이고, 서열 351은 pT8(10-13)에 기재된 369 bp SacI / NotI 단편이다.
서열 352 및 353은 각각 pDMW255에서 D8S-2의 합성 동안에 사용되는 프라이머 ODMW390 및 ODMW391에 상응한다.
서열 354 및 355는 실시예 9에 기재된 키메라 D8S-1::XPR 및 D8S-2::XPR 유전자이다.
서열 356 및 357은 D8S-3의 합성 동안에 사용되는 프라이머 ODMW392 및 ODMW393에 상응한다.
서열 358 및 359는 각각 유글레나 그라실리스로부터의 Δ8 데새투라제의 증폭을 위해 사용되는 프라이머 Eg5-1 및 Eg3-3에 상응한다.
서열 360-363은 각각 Δ8 데새투라제 클론의 서열분석을 위해 사용되는 프라이머 T7, M13-28Rev, Eg3-2 및 Eg5-2에 상응한다.
서열 364는 D8S-3의 증폭을 위해 사용되는 프라이머 ODMW404이다.
서열 365는 D8S-3을 포함하는 1272 bp 키메라 유전자이다.
서열 366 및 367은 각각 클로닝된 D8S-3 유전자에서 새로운 제한 효소 부위를 생성하기 위해 사용되는 프라이머 YL521 및 YL522에 상응한다.
서열 368-381은 각각 D8SF를 제공하는 부위 지정 돌연변이유발 반응에 사용되는 프라이머 YL525, YL526, YL527, YL528, YL529, YL530, YL531, YL532, YL533, YL534, YL535, YL536, YL537 및 YL538에 상응한다.
서열 382는 Cre 레콤비나제 효소에 의해 인식되는 LoxP 재조합 부위에 상응한다.
서열 383 및 384는 각각 플라스미드 pY80의 합성 동안에 GPD::Fm1::XPR2를 증폭시키기 위해 사용되는 프라이머 436 및 437에 상응한다.
서열 385-388은 각각 이작용성 Δ5/Δ6 데새투라제의 클로닝을 위해 사용되는 프라이머 475, 477, 478 및 476에 상응한다.
서열 389 및 390은 각각 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 플라스미드 pY91M으로부터 플라스미드 pY91V를 생성하기 위해 사용되는 프라이머 505 및 506에 상응한다.
서열 391-393는 각각 BD-클론테크 크리에이터 스마트(BD-Clontech Creator Smart®) cDNA 라이브러리 키트 프라이머 SMART IV 올리고뉴클레오티드, CDSIII/3' PCR 프라이머 및 5'-PCR 프라이머에 상응한다.
서열 394는 모르티에렐라 알피나 cDNA 라이브러리 서열분석에 사용되는 M13 전진 프라이머에 상응한다.
서열 395-398 및 400-401은 각각 모르티에렐라 알피나 LPAAT2 ORF의 클로닝에 사용되는 프라이머 MLPAT-F, MLPAT-R, LPAT-Re-5-1, LPAT-Re-5-2, LPAT-Re-3-1 및 LPAT-Re-3-2에 상응한다.
서열 399 및 402는 각각 야로위아 리폴리티카 LPAAT1 ORF의 5' (1129 bp) 및 3' (938 bp) 영역에 상응한다.
서열 403 및 404는 각각 "대조군" 플라스미드 pZUF-MOD-1의 생성을 위해 사용되는 프라이머 pzuf-mod1 및 pzuf-mod2에 상응한다.
서열 405 및 406은 각각 모르티에렐라 알피나 DGAT1 ORF의 클로닝을 위해 사용되는 프라이머 MACAT-F1 및 MACAT-R에 상응한다.
서열 407 및 408은 각각 모르티에렐라 알피나 DGAT2 ORF의 클로닝을 위해 사용되는 프라이머 MDGAT-F 및 MDGAT-R1에 상응한다.
서열 409 및 410은 각각 모르티에렐라 알피나 GPAT의 증폭을 위한 추정(degenerate) PCR에 사용되는 프라이머 MGPAT-N1 및 MGPAT-NR5에 상응한다.
서열 411-413은 각각 모르티에렐라 알피나 GPAT의 3'-말단의 증폭을 위해 사용되는 프라이머 MGPAT-5N1, MGPAT-5N2 및 MGPAT-5N3에 상응한다.
서열 414 및 415는 게놈-워킹에 사용되는 클론테크 유니버셜 게놈워커(Universal GenomeWalkerTM) 키트로부터의 게놈 워커 어댑터에 상응한다.
서열 416-419는 각각 게놈-워킹에 사용되는 PCR 프라이머 MGPAT-5-1A, 어댑터-1 (AP1), MGPAT-3N1 및 네스티드(Nested) 어댑터 프라이머 2 (AP2)에 상응한다.
서열 420 및 421은 각각 모르티에렐라 알피나 GPAT의 증폭을 위해 사용되는 프라이머 mgpat-cdna-5 및 mgpat-cdna-R에 상응한다.
서열 422 및 423은 각각 모르티에렐라 알피나 ELO3의 3'-말단 영역의 단리를 위한 게놈-워킹에 사용되는 프라이머 MA Elong 3'1 및 MA Elong 3'2에 상응한다.
서열 424 및 425는 각각 모르티에렐라 알피나 ELO3의 5'-말단 영역의 단리를 위한 게놈-워킹에 사용되는 프라이머 MA Elong 5'1 및 MA Elong 5'2에 상응한다.
서열 426 및 427은 각각 모르티에렐라 알피나 cDNA로부터의 완전한 ELO3을 증폭시키기 위해 사용되는 프라이머 MA ELONG 5' NcoI 3 및 MA ELONG 3' NotI 1에 상응한다.
서열 428 및 429는 야로위아 리폴리티카 YE2의 코딩 영역을 증폭시키기 위해 사용되는 프라이머 YL597 및 YL598에 상응한다.
서열 430 및 431은 각각 Aco 3' 종결자를 함유하는 NotI/PacI 단편의 증폭을 위해 사용되는 프라이머 YL325 및 YL326에 상응한다.
서열 432-435는 야로위아 리폴리티카 YE1의 코딩 영역을 증폭시키기 위해 사용되는 프라이머 YL567, YL568, YL569 및 YL570에 상응한다.
서열 436 및 437은 각각 야로위아 리폴리티카 YE1의 클로닝 동안에 부위-지정 돌연변이유발을 위해 사용되는 프라이머 YL571 및 YL572에 상응한다.
서열 438 및 439는 각각 야로위아 리폴리티카 CPT1 ORF의 클로닝을 위해 사용되는 프라이머 CPT1-5'-NcoI 및 CPT1-3'-NotI에 상응한다.
서열 440 및 441은 각각 사카로마이세스 세레비지애 ISC1 ORF의 클로닝을 위해 사용되는 프라이머 Isc1F 및 Isc1R에 상응한다.
서열 442 및 443은 각각 사카로마이세스 세레비지애 PCL1 ORF의 클로닝을 위해 사용되는 프라이머 Pcl1F 및 Pcl1R에 상응한다.
서열 444-447은 각각 야로위아 리폴리티카 DGAT2 유전자의 표적화된 파괴를 위해 사용되는 프라이머 P95, P96, P97 및 P98에 상응한다.
서열 448-450은 각각 야로위아 리폴리티카 DGAT2 유전자의 표적화된 통합을 스크리닝하기 위해 사용되는 프라이머 P115, P116 및 P112에 상응한다.
서열 451-454는 각각 야로위아 리폴리티카 PDAT 유전자의 표적화된 파괴를 위해 사용되는 프라이머 P39, P41, P40 및 P42에 상응한다.
서열 455-458은 각각 파괴된 야로위아 리폴리티카 PDAT 유전자의 표적화된 통합을 스크리닝하기 위해 사용되는 프라이머 P51, P52, P37 및 P38에 상응한다.
서열 459 및 460은 각각 야로위아 리폴리티카 DGAT1의 단리를 위해 사용되는 추정 프라이머 P201 및 P203에 상응한다.
서열 461-465는 각각 야로위아 리폴리티카에서 추정적 DGAT1 유전자의 표적화된 파괴를 위한 표적화 카세트의 생성에 사용되는 프라이머 P214, P215, P216, P217 및 P219에 상응한다.
서열 466 및 467은 각각 파괴된 야로위아 리폴리티카 DGAT1 유전자의 표적화된 통합을 스크리닝하기 위해 사용되는 프라이머 P226 및 P227에 상응한다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 구체적으로, 하기하는 출원인의 양수인의 동시 계류중인 출원을 포함한다:
미국 특허 출원 제10/840478호 (2004년 5월 6일 출원),
미국 특허 출원 제10/840579호 (2004년 5월 6일 출원),
미국 특허 출원 제10/840325호 (2004년 5월 6일 출원),
미국 특허 출원 제10/869630호 (2004년 6월 16일 출원),
미국 특허 출원 제10/882760호 (2004년 7월 1일 출원),
미국 특허 출원 제10/985109호 (2004년 11월 10일 출원),
미국 특허 출원 제10/987548호 (2004년 11월 12일 출원),
미국 특허 출원 제60/624812호 (2004년 11월 4일 출원),
미국 특허 출원 제11/024545호 및 제11/024544호 (2004년 12월 29일 출원),
미국 특허 출원 제60/689031호 (2005년 6월 9일 출원),
미국 특허 출원 제11/183664호 (2005년 7월 18일 출원),
미국 특허 출원 제11/185301호 (2005년 7월 20일 출원),
미국 특허 출원 제11/190750호 (2005년 7월 27일 출원),
미국 특허 출원 제11/225354호 (2005년 9월 13일 출원),
미국 특허 출원 제10/253,882호 (2005년 10월 19일 출원),
미국 특허 출원 제11/254,173호 (2005년 10월 19일 출원),
미국 특허 출원 제10/253,882호 (2005년 10월 19일 출원),
미국 특허 출원 제11/254,173호 (2005년 10월 19일 출원).
본 발명에 따라, 본 출원인은 5％ 초과의 도코사헥사엔산 (DHA, 22:6, ω-3)을 생성할 수 있는 야로위아 리폴리티카의 생성 숙주 균주를 제공한다. 이러한 특정 다불포화 지방산 (PUFA)의 축적은 고수준의 재조합 발현을 위한 유질 효모 숙주내에서 Δ6 데새투라제, C18 /20 엘론가제, Δ5 데새투라제, Δ17 데새투라제, C20 /22 엘론가제 또는 Δ4 데새투라제 활성을 갖는 단백질을 포함하는, 기능적 ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로의 도입에 의해 달성된다. 따라서, 본 발명은 야로위아 리폴리티카를 유전자 조작하여 DHA 및 그의 유도체를 상업적으로 생성할 수 있다는 것을 증명한다. 생성 방법 또한 청구한다.
본 발명은 여러 용도를 갖는다. 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 PUFA 또는 그의 유도체는 정맥내 영양 공급을 행하고 있는 환자를 위한 또는 영양 불량의 예방 또는 치료를 위한 식이 대체물 또는 보충제, 특히 유아용 조제식으로서 사용될 수 있다. 별법으로, 정제된 PUFA (또는 그의 유도체)를 일반적인 사용시에 수용자가 식이 보조를 위해 원하는 양으로 섭취하도록 제제화된 요리용 오일, 지방 또는 마가린에 혼입할 수 있다. PUFA는 또한 유아용 조제식, 영양 보충제 또는 다른 식품에 혼입될 수 있으며, 소염제 또는 콜레스테롤 강하제로서 사용될 수 있다. 임의로, 상기 조성물은 (인간 또는 가축의) 약제 용도로 사용될 수 있다. 이 경우, PUFA는 일반적으로 경구 투여되지만, 성공적으로 흡수될 수 있는 임의의 경로, 예를 들어 비경구 (예컨대, 피하, 근육내 또는 정맥내), 직장, 질 또는 국소 (예컨대, 피부 연고 또는 로션으로서)로 투여될 수 있다.
재조합 수단에 의해 생성된 PUFA로 인간 또는 동물을 보충함으로써, 첨가된 PUFA의 수준뿐 아니라 이들의 대사 결과물이 증가될 수 있다. 예를 들어, DHA로 처리하면, DHA뿐 아니라 DHA의 하류 생성물, 예컨대 에이코사노이드 (즉, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 트롬복산)의 수준도 증가될 수 있다. 복잡한 조절 메카니즘을 이용하여 다양한 PUFA를 조합하거나 PUFA의 상이한 접합체를 부가할 수 있으며, 이로써 개체에서 특이적인 PUFA의 원하는 수준을 달성하기 위해 상기 메카니즘을 방해, 조절 또는 극복할 수 있다.
별법의 실시양태에서, 양식용 사료 (즉, 건식 사료, 반-습식 및 습식 사료)는 일반적으로 영양제 조성물의 1％ 내지 2％ 이상이 ω-3 및/또는 ω-6 PUFA인 것을 요구하기 때문에, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 PUFA 또는 그의 유도체를 상기 제제의 합성에 이용할 수 있다.
정의
본원에서는 수많은 용어 및 약어들이 사용된다. 하기 정의를 제공한다.
"오픈 리딩 프레임(Open reading frame)"은 ORF로 약칭된다.
"폴리머라제 연쇄 반응"은 PCR로 약칭된다.
"아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션"은 ATCC로 약칭된다.
"다불포화 지방산"은 PUFA로 약칭된다.
"디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제"는 DAG AT 또는 DGAT로 약칭된다.
"인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제"는 PDAT로 약칭된다.
"글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제"는 GPAT로 약칭된다.
"리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제"는 LPAAT로 약칭된다.
"아실-CoA:1-아실 리소포스파티딜콜린 아실트랜스퍼라제"는 "LPCAT"로 약칭된다.
"아실-CoA:스테롤-아실트랜스퍼라제"는 ARE2로 약칭된다.
"디아실글리세롤"은 DAG로 약칭된다.
"트리아실글리세롤"은 TAG로 약칭된다.
"조효소 A"는 CoA로 약칭된다.
"포스파티딜-콜린"은 PC로 약칭된다.
용어 "푸사륨 모닐리포르메"는 "푸사륨 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides)"와 동의어이다.
용어 "식품"은 인간 소비에 일반적으로 적합한 임의의 음식을 나타낸다. 전형적인 식품으로는 육류 제품, 곡류 제품, 베이킹 식품, 스낵 식품, 유제품 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
용어 "기능성 식품"은 함유된 전형적인 영양제를 넘어서는 건강상의 이점을 제공할 수 있는 임의의 변형된 식품 또는 성분을 비롯하여 건강에 좋은 생성물을 잠재적으로 포함하는 식품을 나타낸다. 기능성 식품은 비타민, 허브 및 건강 기능 물질이 강화된 시리얼, 빵 및 음료와 같은 식품을 포함할 수 있다. 기능성 식품은 그의 영양적 가치를 넘어서는 건강상의 이점을 제공하는 물질을 함유하며, 상기 물질은 식품에 천연적으로 존재하거나 의도적으로 첨가된 것이다.
본원에 사용된 용어 "의료용 식품"은 의사의 지시하에 장에서 소비되거나 장으로 투여되도록 제제화되고, 인정된 과학 원리에 기초하여 구별되는 영양 요건이 의료적 평가에 의해 확립된 질환 또는 증상에서 특정한 식이 관리를 위해 의도된 식품을 나타낸다 (문헌 [section 5(b) of the Orphan Drug Act (21 U.S.C. 360ee(b)(3)] 참조). 하기의 경우에만 "의료용 식품"에 해당된다: (i) 경구 섭취 또는 관에 의한 장내 공급에 의해 부분적으로 또는 전적으로 환자에게 공급하기 위한 특이적으로 제제화되고 가공된 제품이다 (천연 상태로 사용되는 천연 발생 음식물과는 반대됨); (ii) 치료적 또는 만성 의료적 요구 때문에 통상적인 음식물 또는 특정한 영양제를 섭취, 소화, 흡수 또는 대사하는 능력이 제한되거나 손상된 환자, 또는 정상적인 식사의 변형만으로는 달성될 수 없는 의학적으로 결정된 다른 특정한 영양 요건을 가진 환자의 식이 관리를 위해 의도된다; (iii) 의학적 평가에 의해 결정되는 바와 같이, 특정한 질환 또는 증상으로 인한 특유한 영양분 요구의 관리를 위해 특이적으로 변형된 영양분 지원을 제공한다; (iv) 의학적 관리하에 사용되도록 의도된다; (v) 지속적인 현행의 의학적 관리를 받는 환자에게만 의도되며, 상기 환자가 다른 것 중에서도 의료용 식품의 사용 지침에 대한 주기적 기준에 대해 의학적 주의를 요한다. 따라서, 식이 보조제 또는 통상적인 식품과는 달리, 구별되는 영양 요건이 확립되어 있는 질환 또는 증상의 특별한 식이 관리를 위해 의도된 의료용 식품은 특정한 질환 또는 증상을 위해 구별되는 영양분 지원을 제공하는 것과 관련하여 과학적으로 타당하게 요구될 수 있다. 의료용 식품은 특정한 식이적 용도를 위한 보다 광범위한 부류의 식품 (예컨대, 저자극성 식품), 및 의료용 식품이 의학적 관리하에 사용된다는 요건에 따라 건강을 요구하는 식품 (예컨대, 식이 보조제)과는 구별된다.
용어 "의료용 영양제"는 본원에서 정의된 바와 같은 의료용 식품으로서, 전형적으로 특정한 식이적 요구를 위해 구체적으로 고안된 강화 음료를 나타낸다. 의료용 영양제는 일반적으로 특정한 의료적 또는 식이적 증상에 대해 집중된 식이 조성물을 포함한다. 시판되는 의료용 영양제의 예로는 엔슈어(Ensure®) 및 부스트(Boost®)가 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "약제"는 미국에서 판매되는 경우 연방 식품, 약품 및 화장품법의 섹션 505 또는 505에 의해 규제되는 화합물 또는 물질을 의미한다.
용어 "유아용 조제식"은 사람의 젖과 유사하여 오로지 유아에 의해 소비되는 것으로 고안된 식품을 의미한다. 유아용 조제식의 전형적인 예로는 시밀락(Similac®) 및 이소밀(Isomil®)이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
용어 "식이 보조제"는 (i) 음식을 보충하기 위해 의도되어, 통상적인 식품이나 식사 또는 음식용 단품으로서는 사용되지 않고, (ii) 한가지 이상의 식이 성분 (예를 들어, 비타민, 미네랄, 허브 또는 다른 식물성 약품, 아미노산, 효소 및 분비선 추출물) 또는 이들의 구성성분을 함유하고, (iii) 환약, 캡슐, 정제 또는 액체로서 입으로 복용하도록 의도되고, (iv) 식이 보조제인 것으로 표시된 제품을 나타낸다.
"식품 유사물"은 육류, 치즈, 우유 등과 같은 대응 식품과 비슷하게 제조되고, 상기 대응 식품의 외관, 맛 및 조직감을 갖도록 의도된 식품-유사 제품이다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "식품"은 또한 식품 유사물을 포함한다.
용어 "양식용 사료" 및 "양식사료"는 양식 산업에서 천연 사료를 보충하거나 대체하기 위한 제작 음식 또는 인공 음식 (제제화된 사료)을 나타낸다. 따라서, 양식사료는 양식 물고기 및 갑각류 (즉, 하급 주식용 어류 종 [예를 들어, 민물고기, 예컨대 잉어, 틸라피아 및 메기] 및 명품 또는 한정 시장을 위한 고급 환금 작물 종 [예를 들어, 주로 해양 종 및 양측 회유성 종, 예컨대 새우, 연어, 송어, 방어, 농어, 강성돔 및 참바리])에 유용한 인공적으로 배합된 사료를 나타낸다. 이들 제제화 사료는 양식 종을 위한 영양적으로 완전한 음식을 형성하기 위해 서로를 보충하는 다양한 비율의 여러 성분들로 이루어진다.
용어 "동물 사료"는 동물, 예를 들어 가축 (애완 동물, 농장 동물 등) 또는 어장에서 식품 생산을 위해 길러지는 동물에 의해서만 소비되도록 의도된 사료를 나타낸다.
용어 "사료 영양분"은 본 발명의 제조합 생성 숙주를 포함하는 효모 생물체로부터 유도될 수 있는 단백질, 지질, 탄수화물, 비타민, 미네랄 및 핵산과 같은 영양분을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "생물체(biomass)"는 구체적으로 상업적으로 유의한 양으로 재조합 생성 숙주에서 생성된 EPA의 발효에 소모되거나 사용되는 효모 세포 물질을 나타낸다.
용어 "지방산"은 약 C12 내지 C22의 다양한 쇄 길이의 장쇄 지방족산 (알칸산)을 나타낸다 (장쇄 및 단쇄 길이의 산은 모두 공지되어 있다). 우세한 쇄 길이는 C16 내지 C22이다. 지방산의 구조는 "X:Y"의 간단한 표기법으로 표현되며, 여기서, X는 특정 지방산에서 탄소 (C) 원자의 총 개수를 나타내고, Y는 이중 결합의 개수를 나타낸다. "포화 지방산"과 "불포화 지방산", "일불포화 지방산"과 "다불포화 지방산" (또는 "PUFA"), "오메가-6 지방산" (ω-6 또는 n-6)과 "오메가-3 지방산" (ω-3 또는 n-3)의 차이에 대한 더욱 상세한 설명은 제WO 2004/101757호에 제공되어 있다.
본원에서 PUFA를 기재하기 위해 사용된 명명법을 하기 표 3에 나타낸다. "속기 표시"란에서, 탄소의 개수, 이중 결합의 개수, 및 오메가 탄소 (이를 1번으로 함)에서부터 세었을 때 오메가 탄소에 가장 근접한 이중 결합의 위치를 나타내기 위해 오메가-참조 시스템을 사용한다. 하기 표에는 또한 ω-3 및 ω-6 지방산 및 그의 전구체의 일반명, 명세서에 사용될 약어, 및 각 화합물의 화학명이 기재된다.
불포화 지방산 및 전구체의 명명법
일반명 약어 화학명 속기 표시
미리스트산 -- 테트라데칸산 14:0
팔미트산 팔미테이트 헥사데칸산 16:0
팔미트올레산 -- 9-헥사데센산 16:1
스테아르산 -- 옥타데칸산 18:0
올레산 -- 시스-9-옥타데센산 18:1
리놀레산 LA 시스-9,12-옥타데카디엔산 18:2 ω-6
γ-리놀레산 GLA 시스-6,9,12-옥타데카트리엔산 18:3 ω-6
에이코사디엔산 EDA 시스-11,14-에이코사디엔산 20:2 ω-6
디호모-γ-리놀레산 DGLA 시스-8,11,14-에이코사트리엔산 20:3 ω-6
아라키돈산 ARA 시스-5,8,11,14-에이코사테트라엔산 20:4 ω-6
α-리놀렌산 ALA 시스-9,12,15-옥타데카트리엔산 18:3 ω-3
스테아리돈산 STA 시스-6,9,12,15-옥타데카테트라엔산 18:4 ω-3
에이코사트리엔산 ETrA 시스-11,14,17-에이코사트리엔산 20:3 ω-3
에이코사테트라엔산 ETA 시스-8,11,14,17-에이코사테트라엔산 20:4 ω-3
에이코사펜타엔산 EPA 시스-5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산 20:5 ω-3
도코사펜타엔산 DPA 시스-7,10,13,16,19-에이코사펜타엔산 22:5 ω-3
도코사헥사엔산 DHA 시스-4,7,10,13,16,19-에이코사헥사엔산 22:6 ω-3
용어 "고수준 DHA 생성"은 미생물 숙주의 전체 지질 중 약 5％ 이상의 DHA, 바람직하게는 전체 지질 중 약 10％ 이상의 DHA, 더욱 바람직하게는 전체 지질 중 약 15％ 이상의 EDHA, 더욱 바람직하게는 전체 지질 중 약 20％ 이상의 DHA, 더욱 바람직하게는 전체 지질 중 약 25-30％ 이상의 DHA를 생성하는 것을 나타낸다. 따라서, DHA의 구조적 형태에는 제한이 없지만, 예를 들어 DHA는 유리 지방산 또는 에스테르화된 형태, 예컨대 아실글리세롤, 인지질, 술포지질 또는 당지질로서 전체 지질 중에 존재할 수 있다.
용어 "임의의 GLA가 결여된"은 약 0.1％ 아래까지 검출가능한 수준을 갖는 장비를 이용하여 GC 분석에 의해 측정하였을 때, 미생물 숙주의 전체 지질 중에 임의의 검출가능한 GLA가 결여된 것을 나타낸다.
용어 "필수 지방산"은 특정한 필수 지방산을 새로 합성할 수 없는 유기체가 생존을 위해 섭취해야만 하는 특정한 PUFA를 나타낸다. 예를 들어, 포유동물은 필수 지방산 LA (18:2, ω-6) 및 ALA (18:3, ω-3)를 합성할 수 없다. 다른 필수 지방산으로는 GLA (ω-6), DGLA (ω-6), ARA (ω-6), EPA (ω-3) 및 DHA (ω-3)가 있다.
"미생물성 오일" 또는 "단세포 오일"은 미생물 (예컨대, 조류, 유질 효모 및 섬사상 진균)에 의해 그의 일생동안 천연적으로 생산되는 오일이다. 용어 "오일"은 25℃에서 액체이고 보통 다불포화된 지질을 나타낸다. 반대로, 용어 "지방"은 25℃에서 고체이고 보통 포화된 지질을 나타낸다.
"지질체"는 보통 특정한 단백질 및 단층의 인지질에 의해 둘러싸인 지질 액적을 나타낸다. 이들 기관은 대부분의 유기체가 중성 지질을 전달/저장하는 부위이다. 지질체는 TAG-생합성 효소를 함유하는 소포체의 마이크로도메인으로부터 발생하는 것으로 생각되며, 이들의 합성 및 크기는 특정한 단백질 성분에 의해 조절되는 것으로 여겨진다.
"중성 지질"은 세포에서 저장 지방 및 오일로서 지질체 중에서 흔히 발견되는 지질을 나타내며, 상기 지질은 대개 세포의 pH에서 하전된 기를 전혀 갖지 않기 때문에 그렇게 불린다. 일반적으로, 이들은 수 친화성이 전혀 없이 비-극성이다. 중성 지질은 일반적으로 글리세롤과 지방산의 모노-, 디- 및/또는 트리에스테르이며, 이들은 각각 모노아실글리세롤, 디아실글리세롤 또는 TAG (또는 집합적으로 아실글리세롤)로도 지칭된다. 아실글리세롤로부터 유리 지방산을 방출시키기 위해 가수분해 반응이 일어나야 한다.
용어 "트리아실글리세롤", "오일" 및 "TAG"는 3개의 지방 아실 잔기가 글리세롤 분자에 에스테르화된 중성 지질을 나타낸다 (상기 용어들은 본 명세서 내에서 서로 교환가능하게 사용될 것이다). 이러한 오일은 장쇄 PUFA 뿐 아니라, 단쇄 포화 및 불포화 지방산 및 장쇄 포화 지방산을 포함할 수 있다. 따라서, "오일 생합성"은 일반적으로 세포에서 TAG를 합성하는 것을 나타낸다.
용어 "아실트랜스퍼라제"는 아미노-아실기 이외의 기의 전달을 담당하는 효소 (EC 2.3.1.-)를 나타낸다.
용어 "DAG AT"는 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (아실-CoA-디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 또는 디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라제로도 공지됨) (EC 2.3.1.20)를 나타낸다. 이 효소는 아실-CoA 및 1,2-디아실글리세롤을 TAG 및 CoA로 전환시키는 것을 담당한다 (이는 TAG 생합성의 최종 단계와 관련이 있음). 두가지 부류의 DAG AT 효소인 DGAT1 및 DGAT2가 존재한다. DGAT1 부류는 아실-CoA:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 (ACAT) 유전자 부류와 상동성을 공유하는 반면, DGAT2는 관련이 없다 (문헌 [Lardizabal et al., J. Biol Chem. 276(42):38862-38869 (2001)]).
용어 "PDAT"는 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 효소 (EC 2.3.1.158)를 나타낸다. 이 효소는 인지질의 sn-2 위치로부터 1,2-디아실글리세롤의 sn-3 위치로 아실기를 전달하여 리소인지질 및 TAG을 생성하는 것을 담당한다 (이는 TAG 생합성의 최종 단계와 관련이 있음). 이 효소는 아실-CoA-독립성 메카니즘을 통해 TAG를 합성한다는 점에서 DGAT (EC 2.3.1.20)와는 상이하다.
용어 "ARE2"는 아실-CoA + 스테롤 = CoA + 스테롤 에스테르의 반응을 촉매하는 아실-CoA:스테롤-아실트랜스퍼라제 효소 (EC 2.3.1.26; 스테롤-에스테르 신타제 2 효소로도 공지됨)를 나타낸다.
용어 "GPAT"는 gpat 유전자에 의해 코딩되며, 아실-CoA 및 sn-글리세롤 3-포스페이트를 CoA 및 1-아실-sn-글리세롤 3-포스페이트로 전환시키는 (인지질 생합성의 제1 단계) 글리세롤-3-포스페이트 O-아실트랜스퍼라제 효소 (E.C. 2.3.1.15)를 나타낸다.
용어 "LPAAT"는 리소포스파티드산-아실트랜스퍼라제 효소 (EC 2.3.1.51)를 나타낸다. 이 효소는 아실-CoA 기를 1-아실-sn-글리세롤 3-포스페이트 (즉, 리소포스파티드산) 상에 전달하여 CoA 및 1,2-디아실-sn-글리세롤 3-포스페이트 (포스파티드산)를 생성하는 것을 담당한다. 상기 용어는 또한 아실-CoA:1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 2-O-아실트랜스퍼라제, 1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 및/또는 1-아실글리세롤포스페이트 아실트랜스퍼라제 (AGAT로 약칭됨)로서의 LPAAT를 나타낸다.
용어 "LPCAT"는 아실-CoA:1-아실 리소포스파티딜-콜린 아실트랜스퍼라제를 나타낸다. 이 효소는 CoA와 포스파티딜 콜린 (PC) 사이의 아실기 교환을 담당한다. 여기서, 상기 용어는 또한 CoA와 다른 인지질, 예컨대 리소포스파티드산 (LPA) 사이의 아실 교환과 관련된 효소를 나타낸다.
"전체 지질 및 오일 분획 중 PUFA 백분율(％)"은 이들 분획 중 전체 지방산에 대한 PUFA의 백분율을 나타낸다. 용어 "전체 지질 분획" 또는 "지질 분획"은 모두 유질 유기체 내의 모든 지질 (즉, 중성 및 극성), 예컨대 포스파티딜콜린 (PC) 분획, 포스파티딜에탄올아민 (PE) 분획 및 트리아실글리세롤 (TAG 또는 오일) 분획에 위치하는 지질의 합계를 나타낸다. 그러나, 용어 "지질" 및 "오일"은 본 명세서 내에서 서로 교환가능하게 사용될 것이다.
용어 "포스파티딜콜린" 또는 "PC"는 세포막의 주요 구성성분인 인지질을 나타낸다. PC의 화학 구조는 일반적으로 콜린 분자, 포스페이트기 및 글리세롤을 포함하는 것으로 기재될 수 있으며, 여기서, 지방 아실 쇄는 R 기로서 글리세롤 분자의 sn-1 및 sn-2 위치에 부착된다.
용어 "PUFA 생합성 경로 효소"는 PUFA의 생합성과 관련된 임의의 하기 효소 (및 하기 효소를 코딩하는 유전자)를 나타낸다: Δ4 데새투라제, Δ5 데새투라제, Δ6 데새투라제, Δ12 데새투라제, Δ15 데새투라제, Δ17 데새투라제, Δ9 데새투라제, Δ8 데새투라제, Δ9 엘론가제, C14 /16 엘론가제, C16 /18 엘론가제, C18 /20 엘론가제 및/또는 C20 /22 엘론가제.
용어 "ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로"는 적절한 조건하에 발현될 때, ω-3 및 ω-6 지방산 중 하나 또는 둘다의 생성을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자의 집합을 나타낸다. 전형적으로 ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로와 관련된 유전자는 하기 효소 중 일부 또는 모두를 코딩한다: Δ12 데새투라제, Δ6 데새투라제, C18 /20 엘론가제, C20 /22 엘론가제, Δ9 엘론가제, Δ5 데새투라제, Δ17 데새투라제, Δ15 데새투라제, Δ9 데새투라제, Δ8 데새투라제 및 Δ4 데새투라제. 대표적인 경로를 도 1에 도시하는데, 도 1은 다양한 중간체를 통해 올레산을 DHA로 전환시키는 것을 제공하며, 이는 ω-3 및 ω-6 지방산 둘다가 공통된 공급원으로부터 생성될 수 있는 방법을 입증한다. 상기 경로는 천연적으로 두가지 부분으로 나뉘어지며, 한 부분은 ω-3 지방산만을 생성할 것이고, 다른 부분은 ω-6 지방산만을 생성할 것이다. ω-3 지방산만을 생성하는 부분은 본원에서 ω-3 지방산 생합성 경로로 지칭되는 반면, ω-6 지방산만을 생성하는 부분은 본원에서 ω-6 지방산 생합성 경로로 지칭될 것이다.
본원에서 ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로의 문맥에서 사용된 용어 "기능적"은 상기 경로의 일부 (또는 모든) 유전자가 활성 효소를 발현하여, 생체내 가수분해 또는 기질 전환을 일으키는 것을 의미한다. 수많은 지방산 생성물은 상기 경로의 유전자의 하위 집합의 발현만을 필요로 할 것이기 때문에, "ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로" 또는 "기능적 ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로"가 상기 문단에 열거된 모든 유전자를 필요로 한다는 것을 암시하는 것은 아님을 이해해야 한다.
용어 "ω-6 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로"는 최소한 Δ6 데새투라제, C18/20 엘론가제, Δ5 데새투라제, Δ17 데새투라제, C20 /22 엘론가제 및 Δ4 데새투라제의 유전자를 포함하는 DHA 지방산 생합성 경로를 나타낼 것이다. 용어 "ω-3 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로"는 최소한 Δ15 데새투라제, Δ6 데새투라제, C18/20 엘론가제, Δ5 데새투라제, C20 /22 엘론가제 및 Δ4 데새투라제의 유전자를 포함하는 DHA 지방산 생합성 경로를 나타낼 것이다. 용어 "Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로의 조합"은 최소한 Δ15 데새투라제, Δ6 데새투라제, C18 /20 엘론가제, Δ5 데새투라제, Δ17 데새투라제, C20 /22 엘론가제 및 Δ4 데새투라제의 유전자를 포함하는 DHA 지방산 생합성 경로를 나타낼 것이다. 마지막으로, 용어 "Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로"는 포괄적으로 상기 기재된 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 중 임의의 하나 (또는 그 이상)을 나타낼 것이다.
관련된 방식으로, 용어 "ω-6 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로"는 최소한 Δ9 엘론가제, Δ8 데새투라제, Δ5 데새투라제, Δ17 데새투라제, C20 /22 엘론가제 및 Δ4 데새투라제의 유전자를 포함하는 DHA 지방산 생합성 경로를 나타낼 것이다. 용어 "ω-3 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로"는 최소한 Δ15 데새투라제, Δ9 엘론가제, Δ8 데새투라제, Δ5 데새투라제, C20 /22 엘론가제 및 Δ4 데새투라제의 유전자를 포함하는 DHA 지방산 생합성 경로를 나타낼 것이다. 용어 "Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로의 조합"은 최소한 Δ15 데새투라제, Δ9 엘론가제, Δ8 데새투라제, Δ5 데새투라제, Δ17 데새투라제, C20 /22 엘론가제 및 Δ4 데새투라제의 유전자를 포함하는 DHA 지방산 생합성 경로를 나타낼 것이다. 그리고, 용어 "Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로"는 포괄적으로 상기 기재된 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로 중 임의의 하나 (또는 그 이상)을 나타낼 것이다.
용어 "데새투라제"는 1개 이상의 지방산을 탈포화시켜, 즉 이중 결합을 도입시켜, 관심을 가진 지방산 또는 전구체를 생성시킬 수 있는 폴리펩티드를 나타낸다. 구체적인 지방산을 나타내기 위해 본 명세서에서 오메가-참조 시스템을 사용하였지만, 델타-시스템을 이용하여 기질의 카르복실 말단에서부터 세어 데새투라제의 활성을 표시하는 것이 더욱 편리하다. 본원에서 특히 관심을 갖는 것은 1) 분자의 카르복실-말단에서부터 세었을 때 8번째와 9번째 탄소 원자 사이에서 지방산을 탈포화시키고, 예를 들어 EDA에서 DGLA 및/또는 ETrA에서 ETA로의 전환을 촉매하는 Δ8 데새투라제; 2) LA에서 GLA로 및/또는 ALA에서 STA로의 전환을 촉매하는 Δ6 데새투라제; 3) DGLA에서 ARA로 및/또는 ETA에서 EPA로의 전환을 촉매하는 Δ5 데새투라제; 4) DPA에서 DHA로의 전환을 촉매하는 Δ4 데새투라제; 5) 올레산에서 LA로의 전환을 촉매하는 Δ12 데새투라제; 6) LA에서 ALA로 및/또는 GLA에서 STA로의 전환을 촉매하는 Δ15 데새투라제; 7) ARA에서 EPA 및/또는 DGLA에서 ETA로의 전환을 촉매하는 Δ17 데새투라제; 및 8) 팔미테이트에서 팔미트올레산 (16:1)으로 및/또는 스테아레이트에서 올레산 (18:1)으로의 전환을 촉매하는 Δ9 데새투라제이다.
본 발명의 Δ15 데새투라제와 관련하여, 용어 "이작용성"은 효소성 기질로서 올레산 및 LA 둘다를 사용하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 유사하게, 본 발명의 Δ5 데새투라제와 관련하여, 용어 "이작용성"은 (1) DGLA 및 ETA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소성 기질; 및 (2) LA 및 ALA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소성 기질을 사용하는 능력을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. "효소성 기질"은 폴리펩티드가 활성 부위에서 기질과 결합하여, 그에 대해 각각의 방식으로 작용하는 것을 의미한다.
용어 "엘론가제 시스템"은 상기 엘론가제 시스템이 작용하는 지방산 기질보다 2개의 탄소가 더 긴 지방산을 생성하도록 지방산 탄소 쇄의 신장을 담당하는 4가지 효소의 집합을 나타낸다. 보다 구체적으로, 신장 과정은 CoA가 아실 담체인 지방산 신타제와 연관되어 일어난다 (문헌 [Lassner et al., The Plant Cell 8:281-292 (1996)]). 기질-특이적이며 속도-제한적인 제1 단계에서는, 말로닐-CoA가 장쇄 아실-CoA와 축합되어 CO2 및 β-케토아실-CoA (이의 아실 부분은 2개의 탄소 원자만큼 신장되었음)를 생성한다. 후속 반응에서는, β-히드록시아실-CoA로 환원되고, 에노일-CoA로 탈수되고, 제2 환원에 의해 신장된 아실-CoA가 생성된다. 엘론가제 시스템에 의해 촉매되는 반응의 예로는 GLA에서 DGLA로의 전환, STA에서 ETA로의 전환, 및 EPA에서 DPA로의 전환이 있다.
목적을 위해, 제1 축합 반응 (즉, 말로닐-CoA에서 β-케토아실-CoA로의 전환)을 촉매하는 효소는 포괄적으로 "엘론가제"로 지칭될 것이다. 일반적으로, 엘론가제의 기질 선택성은 다소 광범위하지만, 쇄 길이와 불포화 정도 및 유형 모두에 의해 구별된다. 따라서, 엘론가제는 상이한 특이성을 가질 수 있다. 예를 들어, C14 /16 엘론가제는 C14 기질 (예컨대, 미리스트산)을 이용할 것이고, C16 /18 엘론가제는 C16 기질 (예컨대, 팔미테이트)을 이용할 것이고, C18 /20 엘론가제는 C18 기질 (예컨대, GLA, STA)을 이용할 것이고, C20 /22 엘론가제는 C20 기질 (예컨대, EPA)을 이용할 것이다. 마찬가지 방식으로, Δ9 엘론가제는 LA에서 EDA로의 전환 및 ALA에서 ETrA로의 전환을 촉매할 수 있다. 일부 엘론가제가 광범위한 특이성을 가지며, 따라서, 단일 효소가 여러 엘론가제 반응을 촉매할 수 있다 (예컨대, C16 /18 엘론가제 및 C18 /20 엘론가제 둘다로서 작용할 수 있다)는 점을 주의하는 것이 중요하다. 바람직한 실시양태에서, 적합한 숙주를 지방산 엘론가제를 위한 유전자로 형질전환시킴으로써 지방산 엘론가제의 특이성을 실험적으로 측정하고, 숙주의 지방산 프로파일에 대한 그의 효과를 측정하는 것이 가장 바람직하다.
용어 "고친화도 엘론가제" 또는 "EL1S" 또는 "ELO1"는 바람직하게는 GLA (엘론가제 반응 [즉, Δ6 엘론가제]의 생성물로서 DGLA와 함께)에 대한 기질 특이성을 갖는 C18 /20 엘론가제를 나타낸다. 이러한 한 엘론가제는 제WO 00/12720호에 기재되어 있고, 본원에서 서열 22 및 23로서 제공된다. 그러나, 본 발명자들은 상기 효소가 18:2 (LA) 및 18:3 (ALA)에 대해서도 일부 활성을 갖는다는 것을 밝혀냈고, 따라서, 서열 23은 Δ9 엘론가제 활성 (그의 Δ6 엘론가제 활성 이외에도)을 나타낸다. 따라서, 본원에서 서열 23로서 제공된 C18 /20 엘론가제는 예를 들어 이소크리시스 갈바나 Δ9 엘론가제 (서열 70) 대신에, 본원에 기재된 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 내에서 및 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로 내에서 모두 기능할 수 있는 것으로 결론지어 진다.
용어 "EL2S" 또는 "ELO2"는 바람직하게는 GLA (엘론가제 반응의 생성물로서 DGLA와 함께) 및/또는 STA (엘론가제 반응의 생성물로서 STA와 함께)에 대한 기질 특이성을 갖는 C18 /20 엘론가제를 나타낸다. 이러한 한 엘론가제는 미국 특허 제6,677,145호에 기재되어 있으며, 본원에서 서열 25 및 26으로서 제공된다.
용어 "ELO3"는 elo3 유전자 (서열 86)에 의해 코딩되는 모르티에렐라 알피나 C16/18 지방산 엘론가제 효소 (본원에서 서열 87로서 제공됨)를 나타낸다. 용어 "YE2"는 본원에서 서열 94로서 제공된 유전자에 의해 코딩되는 야로위아 리폴리티카 C16 /18 지방산 엘론가제 효소 (본원에서 서열 95로서 제공됨)를 나타낸다. 본원에서 보고된 데이타에 기초하면, ELO3 및 YE2 둘다 팔미테이트 (16:0)에서 스테아르산 (18:0)으로의 전환을 우세하게 촉매한다.
용어 "YE1"은 본원에서 서열 97로 제공된 유전자에 의해 코딩되는 야로위아 리폴리티카 C14 /16 지방산 엘론가제 효소 (본원에서 서열 98로 제공됨)를 나타낸다. 본원에서 보고된 데이타에 기초하면, YE2는 미리스트산 (14:0)에서 팔미테이트 (16:0)로의 전환을 우세하게 촉매한다.
용어 "전환 효율" 및 "기질 전환율(％)"은 특정 효소 (예컨대, 데새투라제 또는 엘론가제)가 기질을 생성물로 전환시킬 수 있는 효율을 나타낸다. 전환 효율은 하기 식에 따라 측정된다.
([생성물]/[기질+생성물])×100
여기서, '생성물'은 즉시 생성물 및 그로부터 유래된 경로에서의 모든 생성물을 나타낸다.
용어 "유질"은 에너지 공급원을 지질 형태로 저장하는 경향이 있는 유기체를 나타낸다 (문헌 [Weete, In: Fungal Lipid Biochemistry, 2nd Ed., Plenum, 1980]). 일반적으로, 이들 미생물의 세포성 오일 함량은 S형 곡선을 따르는데, 지질의 농도는 성장의 대수기 말기 또는 정지기 초기에서 최고에 도달할 때까지 증가한 다음, 정지기 말기 및 사멸기 동안에 점진적으로 감소한다 (문헌 [Yongmanitchai and Ward, Appl. Environ. Microbiol. 57:419-25 (1991)]).
용어 "유질 효모"는 오일을 생성할 수 있는 효모로서 분류되는 미생물을 나타낸다. 일반적으로, 유질 미생물의 세포성 오일 또는 트리아실글리세롤 함량은 S형 곡선을 따르는데, 지질의 농도는 성장의 대수기 말기 또는 정지기 초기에서 최고에 도달할 때까지 증가한 다음, 정지기 후기 및 사멸기 동안에 점진적으로 감소한다 (문헌 [Yongmanitchai and Ward, Appl. Environ. Microbiol. 57:419-25 (1991)]). 오일을 건조 세포 중량의 약 25％ 넘게 축적하는 유질 미생물은 드물지 않다. 유질 효모의 예로는 야로위아, 칸디다, 로도토룰라(Rhodotorula), 로도스포리듐(Rhodosporidium), 크립토코커스(Cryptococcus), 트리코스포론(Trichosporon) 및 리포마이세스(Lipomyces) 속이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
용어 "발효가능한 탄소 공급원"은 에너지를 유도하기 위해 미생물이 대사하는 탄소 공급원을 의미한다. 전형적인 본 발명의 탄소 공급원으로는 단당류, 올리고당류, 다당류, 알칸, 지방산, 지방산 에스테르, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 이산화탄소, 메탄올, 포름알데히드, 포르메이트 및 탄소-함유 아민이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "단리된 핵산 단편"은 임의로 합성, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 함유하는 단일- 또는 이중-가닥 RNA 또는 DNA의 중합체이다. DNA 중합체 형태의 단리된 핵산 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 절편으로 이루어질 수 있다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 "실질적인 부분"은 당업자에 의한 서열의 수동적 평가에 의해, 또는 컴퓨터-자동화 서열 비교 및 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; 문헌 [Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1993)])와 같은 알고리즘을 이용한 확인에 의해, 폴리펩티드 또는 유전자를 추정적으로 확인하기 위해, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열을 충분히 포함하는 부분이다. 일반적으로, 공지된 단백질 또는 유전자에 대한 상동성으로서 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 추정적으로 확인하기 위해서는, 10개 이상의 연속 아미노산 또는 30개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이 필요하다. 더욱이, 뉴클레오티드 서열과 관련하여, 유전자 확인 (예컨대, 써던 혼성화) 및 단리 (예컨대, 박테리아 콜로니 또는 박테리오파지 플라크의 동일계내 혼성화)의 서열-의존성 방법에서는 20 내지 30개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브가 사용될 수 있다. 또한, 12 내지 15개의 염기로 이루어진 짧은 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 증폭 프라이머로서 사용되어, 상기 프라이머를 포함하는 특정 핵산 단편을 수득할 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 "실질적인 부분"은 서열을 포함하는 핵산 단편을 구체적으로 확인하고/하거나 단리하기 위해 상기 서열을 충분히 포함한다.
용어 "상보적인"은 서로 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 염기들 사이의 관계를 기재하기 위해 사용된다. 예를 들어, DNA와 관련하여, 아데노신은 티민에 대해 상보적이고, 시토신은 구아닌에 대해 상보적이다.
"코돈 다의성(degeneracy)"은 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 영향을 주지 않으면서, 뉴클레오티드 서열의 다양성을 허용하는 유전자 코드의 성질을 나타낸다. 당업자는 주어진 아미노산을 특정하기 위해 뉴클레오티드 코돈을 사용하는데 있어서 특정한 숙주 세포에 의해 나타나는 "코돈-편향성(codon-bias)"을 잘 알 고 있다. 따라서, 숙주 세포에서의 개선된 발현을 위해 유전자를 합성할 때, 코돈 사용 빈도가 숙주 세포에서 바람직한 코돈 사용 빈도에 접근하도록 유전자를 고안하는 것이 바람직하다.
DNA 서열과 관련하여 "화학적으로 합성된"은 구성 뉴클레오티드들을 시험관내에서 조립한 것을 의미한다. DNA의 수동적인 화학적 합성은 널리 확립된 절차를 이용하여 달성할 수 있거나, 또는 자동화된 화학적 합성은 시판되는 수많은 기계를 이용하여 수행할 수 있다. "합성 유전자"는 당업자에게 공지된 절차를 이용하여 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 빌딩 블록으로부터 조립될 수 있다. 이들 빌딩 블록을 라이게이션하고 어닐링하여 유전자 절편을 형성한 다음, 이들을 효소적으로 조립하여 전체 유전자를 구축한다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 최적화에 기초하여 최적의 유전자 발현을 위해 유전자들을 맞추어서, 숙주 세포의 코돈 편향성을 반영할 수 있다. 당업자는 숙주가 우호적인 이들 코돈에 대해 코돈 사용이 편향되는 경우 유전자 발현이 성공적일 수 있음을 이해한다. 바람직한 코돈의 결정은 서열 정보를 입수할 수 있는 숙주 세포로부터 유래된 유전자의 개관에 기초할 수 있다.
"유전자"는 특정한 단백질을 발현하는 핵산 단편을 나타내며, 이는 코딩 영역 단독을 나타내거나, 코딩 서열의 이전 (5' 비-코딩 서열) 및 이후 (3' 비-코딩 서열)의 조절 서열을 포함할 수 있다. "천연 유전자"는 그의 조절 서열과 함께 천연적으로 발견되는 유전자를 나타낸다. "키메라 유전자"는 천연적으로 함께 발견되지 않는 조절 및 코딩 서열을 포함하는, 천연 유전자가 아닌 임의의 유전자를 나타낸다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 공급원으로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있으나, 천연적으로 발견되는 것과는 상이한 방식으로 정렬된다. "내인성 유전자"는 유기체 게놈 내의 천연적인 위치에 있는 천연 유전자를 나타낸다. "외래" 유전자는 유전자 전달에 의해 숙주 유기체로 도입된 유전자를 나타낸다. 외래 유전자는 비-천연 유기체에 삽입된 천연 유전자, 천연 숙주 내의 새로운 위치로 도입된 천연 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "트랜스진"은 형질전환 절차에 의해 게놈에 도입된 유전자이다. "코돈-최적화된 유전자"는 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용 빈도를 모방하도록 고안된 코돈 사용 빈도를 갖는 유전자이다.
"코딩 서열"은 특정한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 나타낸다. "적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류 (5' 비-코딩 서열), 내부, 또는 하류 (3' 비-코딩 서열)에 위치하며, 관련된 코딩 서열의 전사, RNA 가공 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 가공 부위, 이펙터(effector) 결합 부위, 및 스템-루프(stem-loop) 구조체를 포함할 수 있다.
"프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 나타낸다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3'에 위치한다. 프로모터는 전체가 천연 유전자로부터 유래될 수 있거나, 천연적으로 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소들로 이루어질 수 있거나, 심지어 합성 DNA 절편을 포함할 수 있다. 당업자라면, 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 상이한 발달 단계에서, 또는 상이한 환경적인 또는 생리학적 조건에 반응하여, 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 유전자가 대부분의 세포 유형에서 대부분 발현될 수 있게 하는 프로모터는 보통 "구성적(constitutive) 프로모터"로서 지칭된다. 추가로, 많은 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것이 인식될 것이다.
용어 "GPAT 프로모터" 또는 "GPAT 프로모터 영역"은 발현에 필요하며 gpat 유전자에 의해 코딩되는 글리세롤-3-포스페이트 O-아실트랜스퍼라제 효소 (예컨대 2.3.1.15)의 'ATG' 번역 개시 코돈 이전의 5' 상류 비번역 영역을 나타낸다. 적합한 야로위아 리폴리티카 GPAT 프로모터 영역의 예는 미국 특허 출원 제11/225354호에 기재되어 있다.
용어 "GPD 프로모터" 또는 "GPD 프로모터 영역"은 발현에 필요하며 gpd 유전자에 의해 코딩되는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 효소 (E.C. 1.2.1.12)의 'ATG' 번역 개시 코돈 이전의 5' 상류 비번역 영역을 나타낸다. 적합한 야로위아 리폴리티카 GPD 프로모터 영역의 예는 제WO 2005/003310호에 기재되어 있다.
용어 "GPM 프로모터" 또는 "GPM 프로모터 영역"은 발현에 필요하며 gpm 유전자에 의해 코딩되는 포스포글리세레이트 뮤타제 효소 (EC 5.4.2.1)의 'ATG' 번역 개시 코돈 이전의 5' 상류 비번역 영역을 나타낸다. 적합한 야로위아 리폴리티카 GPM 프로모터 영역의 예는 제WO 2005/003310호에 기재되어 있다.
용어 "FBA 프로모터" 또는 "FBA 프로모터 영역"은 발현에 필요하며 fba1 유전자에 의해 코딩되는 프럭토스-비스포스페이트 알돌라제 효소 (E.C. 4.1.2.13)의 'ATG' 번역 개시 코돈 이전의 5' 상류 비번역 영역을 나타낸다. 적합한 야로위아 리폴리티카 FBA 프로모터 영역의 예는 제WO 2005/049805호에 기재되어 있다.
용어 "FBAIN 프로모터" 또는 "FBAIN 프로모터 영역"은 발현에 필요한 fba1 유전자의 'ATG' 번역 개시 코돈 이전의 5' 상류 비번역 영역과 함께 fba1 유전자의 인트론을 갖는 5' 코딩 영역의 부분을 나타낸다. 적합한 야로위아 리폴리티카 FBAIN 프로모터 영역의 예는 제WO 2005/049805호에 기재되어 있다.
용어 "GPDIN 프로모터" 또는 "GPDIN 프로모터 영역"은 발현에 필요한 gpd 유전자의 'ATG' 번역 개시 코돈 이전의 5' 상류 비번역 영역과 함께 gpd 유전자의 인트론을 갖는 5' 코딩 영역의 부분을 나타낸다. 적합한 야로위아 리폴리티카 GPDIN 프로모터 영역의 예는 미국 특허 출원 제11/183664호에 기재되어 있다.
용어 "YAT1 프로모터" 또는 "YAT1 프로모터 영역"은 yat1 유전자에 의해 코딩되며 발현에 필요한 암모늄 수송자 효소 (TC 2.A.49; 진뱅크(GenBank) 관리 번호 XM_504457)의 'ATG' 번역 개시 코돈 이전의 5' 상류 비번역 영역을 나타낸다. 적합한 야로위아 리폴리티카 YAT1 프로모터 영역의 예는 미국 특허 출원 제11/185301호에 기재되어 있다.
용어 "EXP1 프로모터" 또는 "EXP1 프로모터 영역"은 발현에 필요하며 야로위아 리폴리티카 "YALI0C12034g" 유전자 (진뱅크 관리 번호 XM_501745)에 의해 코딩되는 단백질의 'ATG' 번역 개시 코돈 이전의 5' 상류 비번역 영역을 나타낸다. sp│Q12207 사카로마이세스 세레비지애 비고전적 방출 단백질 2 (그의 기능은 절단가능한 신호 서열이 결여된 단백질의 신규한 방출 경로와 관련이 있음)에 대한 "YALI0C12034g"의 유의한 상동성에 기초하여, 본원에서는 상기 유전자를 exp1 유전자라고 지칭하고, 그가 코딩하는 단백질을 EXP1라고 지칭한다. 적합한 야로위아 리폴리티카 EXP1 프로모터 영역의 예는 서열 221로서 기재되어 있지만, 이는 제한하려는 의도는 아니다. 당업자라면, EXP1 프로모터 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에, 증가되거나 감소된 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
용어 "프로모터 활성"은 프로모터의 전사 효율의 평가를 나타낼 것이다. 이는 예를 들어 직접적으로는 프로모터로부터 mRNA 전사체의 양을 측정함으로써 (예컨대, 노던 블럿 또는 프라이머 신장 방법), 또는 간접적으로는 프로모터로부터 발현된 유전자 생성물의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다.
"인트론"은 대부분의 진핵세포의 유전자 서열 (코딩 영역, 5' 비-코딩 영역, 또는 3' 비-코딩 영역)에서 발견되는 비-코딩 DNA의 서열을 나타낸다. 그들의 완전한 기능은 알려지지 않았지만, 일부 인핸서가 인트론에 위치한다 (문헌 [Giacopelli F. et al., Gene Expr. 11: 95-104 (2003)]). 이들 인트론 서열은 전사는 되지만, mRNA가 단백질로 번역되기 전에 예비-mRNA 전사체 내로부터 제거된다. 이러한 인트론 제거 과정은 인트론의 어느 한 측에 있는 서열 (엑손)의 자체-스플라이싱에 의해 일어난다.
용어 "인핸서"는 인접한 진핵세포 프로모터로부터의 전사 수준을 상승시켜 유전자 전사를 증가시킬 수 있는 시스-조절 서열을 나타낸다. 인핸서는 DNA의 여러 10 킬로베이스에 걸쳐 프로모터에 대해 작용할 수 있고, 그들이 조절하는 프로모터에 대해 5' 또는 3'일 수 있다. 인핸서는 또한 인트론 내부에 존재할 수 있다.
용어 "3' 비-코딩 서열" 및 "전사 종결자"는 코딩 서열의 하류에 위치하는 DNA 서열을 나타낸다. 이는 폴리아데닐화 인식 서열, 및 mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호를 코딩하는 다른 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 보통 폴리아데닐산 구역을 mRNA 전구체의 3' 말단에 부가하는 것에 영향을 미치는 것을 특징으로 한다. 3' 영역은 관련된 코딩 서열의 전사, RNA 가공 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미칠 수 있다.
"RNA 전사체"는 DNA 서열의 RNA 폴리머라제-촉매된 전사의 결과 생성된 생성물을 나타낸다. RNA 전사체가 DNA 서열의 완벽한 상보적인 카피인 경우에는 1차 전사체로 지칭되거나, 또는 상기 1차 전사체의 전사후 가공으로부터 유래된 RNA 서열일 수 있는 경우에는 성숙 RNA로서 지칭된다. "전령 RNA" 또는 "mRNA"는 인트론이 없으며 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 나타낸다. "cDNA"는 mRNA에 상보적이며 그로부터 유래된 이중-가닥 DNA를 나타낸다. "센스" RNA는 mRNA를 포함하며 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA 전사체를 나타낸다. "안티센스 RNA"는 표적 1차 전사체 또는 mRNA의 전체 또는 일부에 대해 상보적이고, 표적 유전자의 발현을 차단하는 RNA 전사체를 나타낸다 (미국 특허 제5,107,065호, 제WO 99/28508호). 안티센스 RNA는 특정한 유전자 전사체의 임의의 부분, 즉 5' 비-코딩 서열, 3' 비-코딩 서열, 또는 코딩 서열에 대해 성보적일 수 있다. "기능적 RNA"는 번역되지는 않지만 세포 과정에 대해 효과를 갖는 안티센스 RNA, 리보자임 RNA, 또는 다른 RNA를 나타낸다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편과 핵산 서열이 회합되는 것을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다 (즉, 상기 코딩 서열은 프로모터의 전사 조절하에 있다). 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결된다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 본 발명의 핵산 단편으로부터 유래된 센스 (mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 나타낸다. 발현은 또한 mRNA에서 폴리펩티드로의 번역을 나타낸다.
"성숙" 단백질은 번역후 가공된 폴리펩티드, 즉 1차 번역 생성물에 존재하는 임의의 프리- 또는 프로펩티드가 제거된 것을 나타낸다. "전구체" 단백질은 mRNA 번역의 1차 생성물, 즉 프리- 및 프로펩티드가 여전히 존재하는 것을 나타낸다. 프리- 및 프로펩티드는 세포내 국부화 신호일 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
용어 "레콤비나제"는 DNA 구조를 변경하기 위해 부위-특이적 재조합을 수행하는 효소를 나타내며, 이는 트랜스포사제, 람다 통합/제거 효소뿐 아니라, 부위-특이적 레콤비나제를 포함한다.
"레콤비나제 부위" 또는 "부위-특이적 레콤비나제 서열"은 레콤비나제가 인식하여 결합하는 DNA 서열을 나타낸다. 이는 기능이 유지되는 한 야생형 또는 돌연변이체 레콤비나제 부위일 수 있으며, 레콤비나제 효소는 여전히 상기 부위를 인식하여 DNA 서열에 결합하고, 인접한 두개의 레콤비나제 부위 사이의 재조합을 촉매할 수 있다.
"형질전환"은 핵산 분자를 숙주 유기체에 전달하여 유전적으로 안정한 내력을 나타내는 것이다. 예를 들어, 핵산 분자는 자율적으로 복제하는 플라스미드일 수 있거나, 또는 숙주 유기체의 게놈에 통합될 수 있다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 유기체로서 지칭된다.
용어 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"는 세포의 중심적인 대사의 일부분이 아닌 유전자를 보유하며, 보통 환형의 이중-가닥 DNA 단편의 형태를 갖는 별개의 염색체 요소를 나타낸다. 이러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래된 선형 또는 환형의 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA의 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 여기서, 수많은 뉴클레오티드 서열이 특유한 구축물 내로 접합 또는 재조합되고, 상기 구축물은 적절한 3' 비번역 서열과 함께 선택된 유전자 생성물을 위한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 세포 내로 도입할 수 있다. "발현 카세트"는 외래 유전자를 함유하고, 상기 외래 유전자 이외에도 외래 숙주에서 상기 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 요소를 갖는 특정한 벡터를 나타낸다.
용어 "상동성 재조합"은 (교차되는 동안) 2개의 DNA 분자 사이의 DNA 단편의 교환을 나타낸다. 교환된 단편은 상기 2개의 DNA 분자 사이에서 동일한 뉴클레오티드 서열 부위 (즉, "상동성 영역")에 의해 플랭킹된다. 용어 "상동성 영역"은 상동성 재조합에 참여하는 서로 상동성인 핵산 단편 상의 뉴클레오티드 서열의 신장부를 나타낸다. 효과적인 상동성 재조합은 일반적으로 이들 상동성 영역의 길이가 약 10 bp 이상이고, 바람직하게는 약 50 bp 이상인 경우에 일어난다. 전형적으로, 재조합을 위해 의도된 단편은 표적화된 유전자 파괴 또는 대체가 필요한 2개 이상의 상동성 영역을 함유한다.
용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 임의의 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 나타낸다. "서열 분석 소프트웨어"는 시판되는 것이거나, 독자적으로 개발된 것일 수 있다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어로는 1) GCG 집합의 프로그램 (위스콘신 팩키지 버전 9.0(Wisconsin Package Version 9.0), 제네틱 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group; GCG), 미국 위스콘신주 매디슨 소재); 2) BLASTP, BLASTN, BLASTX (문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]); 3) DNASTAR (디엔에이스타, 인크(DNASTAR, Inc.), 미국 위스콘신주 매디슨 소재); 4) 시퀀쳐(Sequencher) (진 코드스 코포레이션(Gene Codes Corporation), 미국 미시건주 앤 아버 소재); 및 5) 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘이 도입된 FASTA 프로그램 (문헌 [W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY])이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본원의 문맥상, 서열 분석 소프트웨어를 분석을 위해 이용하는 경우, 달리 명시하지 않는 한 분석 결과는 참조한 프로그램의 "디폴트 값"을 기초로 할 것이라는 것을 이해할 것이다. 본원에 사용된 "디폴트 값"은 처음 초기화시에 소프트웨어에 원래 내장되어 있는 임의의 집합의 값 또는 파라미터를 의미할 것이다.
용어 "보존된 도메인" 또는 "모티프"는 진화론적으로 관련이 있는 단백질의 정렬된 서열을 따라 특정한 위치에서 보존된 아미노산의 집합을 의미한다. 다른 위치의 아미노산은 상동성 단백질들 사이에서 다를 수 있는 반면, 특정한 위치에서 고도로 보존된 아미노산은 단백질의 구조, 안정성 또는 활성에 필수적인 아미노산을 나타낸다. 이들은 단백질 상동체 족의 정렬된 서열에서 고도의 보존성에 의해 확인되기 때문에, 새로 결정된 서열을 갖는 단백질이 이전에 확인된 단백질 족에 속하는지를 결정하는 식별자 또는 "사인"으로서 사용될 수 있다. Δ15 데새투라제 활성을 갖는 진균 단백질임을 표시하는 모티프는 서열 223로 제공되고, Δ12 데새투라제 활성을 갖는 진균 단백질임을 표시하는 모티프는 서열 224으로 제공된다.
본원에서 이용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989)] (이후 "마니아티스"); [Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984)] 및 [Ausubel, F, M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc, and Wiley-lnterscience (1987)]에 기재되어 있다.
DHA 생성을 위한 바람직한 미생물 숙주: 야로위아 리폴리티카
본 발명자들에 의한 작업 이전에는 (피카타지오(Picataggio) 등의 제WO 2004/101757호 참조), PUFA를 위한 생성 플랫폼으로서 사용하기에 적합한 미생물 부류로서 유질 효모를 조사한 적이 없었다. 전형적으로 유질 효모로서 확인된 족으로는 야로위아, 칸디다, 로도토룰라, 로도스포리듐, 크립토코커스, 트리코스포론 및 리포마이세스가 있으나, 이로 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 오일-합성 효모의 예로는 로도스포리듐 토룰리데스(Rhodosporidium toruloides), 리포마이세스 스타르케이이(Lipomyces starkeyii), 리포마이세스 리포페루스(L. lipoferus), 칸디다 레브카우피(Candida revkaufi), 칸디다 풀케리마(C. pulcherrima), 칸디다 트로피칼리스(C. tropicalis), 칸디다 유틸리스(C. utilis), 트리코스포론 풀란스(Trichosporon pullans), 트리코스포론 쿠타네움(T. cutaneum), 로도토룰라 글루티누스(Rhodotorula glutinus), 로도토룰라 그라미니스(R. graminis) 및 야로위아 리폴리티카 (이전에는 칸디다 리폴리티카로 분류됨)가 있으나, 이로 제한되지 않는다.
유질 효모는 DHA의 경제적이고 상업적인 생성을 위한 숙주 유기체로서 용이하게 사용될 수 있는 여러 성질을 갖는 것으로 고려되었다. 첫째, 상기 유기체는 천연적으로 오일을 합성 및 축적할 수 있는 것들로 한정되며, 여기서, 상기 오일은 세포 건조 중량의 약 25％ 초과, 더욱 바람직하게는 세포 건조 중량의 약 30％ 초과, 가장 바람직하게는 세포 건조 중량의 약 40％를 차지할 수 있다. 둘째, 오일 함량이 높은 유질 효모를 성장시키는 기술은 널리 개발되어 있다 (예를 들어, 제EP 0 005 277B1호; 문헌 [Ratledge, C, Prog. Ind. Microbiol. 16:119-206 (1982)] 참조). 그리고, 이들 유기체는 과거에 다양한 목적을 위해 상업적으로 사용되었다. 예를 들어, 야로위아 리폴리티카의 다양한 균주는 역사적으로 이소시트레이트 리아제 (제DD 259637호); 리파제 (제SU 1454852호, 제WO 2001083773호, 제DD 279267호); 폴리히드록시알카노에이트 (제WO 2001088144호); 시트르산 (제RU 2096461호, 제RU2090611호, 제DD 285372호, 제DD 285370호, 제DD 275480호, 제DD 227448호, 제PL 160027호); 에리트리톨 (제EP 770683호); 2-옥소글루타르산 (제DD 267999호); γ-데카락톤 (미국 특허 제6,451,565호, 제FR 2734843호); γ-도데카락톤 (제EP 578388호); 및 피루브산 (제JP 09252790호)의 제조 및 생산에 사용되었다.
유질 효모로서 분류된 유기체들 중에서, 본원의 목적상 야로위아 리폴리티카가 바람직한 미생물 숙주로서 선택되었다. 이러한 선별은, ω-3 지방산을 TAG 분획에 혼입시킬 수 있는 유질 균주를 입수할 수 있었고, 상기 유기체를 유전자 조작할 수 있었으며, 식품 등급의 시트르산의 일반적으로 안전한 것으로 인식된 (Generally Recognized As Safe ("GRAS"), 미국 식약청에 따라) 공급원으로서 이전에 상기 종을 사용하였다는 지식에 기초하였다. 추가의 실시양태에서, 지질 함량이 높고 (건조 중량％로서 측정) 부피 생산율이 높은 (g/Lh-1로서 측정) 야생형 균주의 확인을 위해 표적화된 예비 연구 때문에, ATCC #20362, ATCC #8862, ATCC #18944, ATCC #76982 및/또는 LGAM S(7)1로 지칭되는 야로위아 리폴리티카 균주가 가장 바람직하다 (문헌 [Papanikolaou S., and Aggelis G., Bioresour. Technol. 82(1):43-9 (2002)]).
제WO 2004/101757호에 기재된 바와 같이, 이전에 야로위아 리폴리티카는 ω-3/ω-6 생합성 경로를 코딩하는 유전자의 도입 및 발현에 의해 각각 1.3％ ARA 및 1.9％ EPA를 생성하도록 유전자 조작되었다. 보다 구체적으로, 두가지 상이한 DNA 발현 구축물 (ARA 합성을 위해 Δ6 데새투라제, Δ5 데새투라제 및 고-친화도 PUFA C18/20 엘론가제, 또는 EPA 합성을 위해 Δ6 데새투라제, Δ5 데새투라제, 고-친화도 PUFA C18 /20 엘론가제 및 코돈-최적화된 Δ17 데새투라제를 포함함)를 따로 형질전환시키고, 효소 오로티딘-5'-포스페이트 데카르복실라제 (EC 4.1.1.23)를 코딩하는 야로위아 리폴리티카 염색체 URA3 유전자에 통합시켰다. 적절한 기질을 공급한 숙주 세포의 GC 분석에 의해 ARA 및 EPA의 생성을 검출하였다. 이 작업은 유질 숙주가 ω-6 및 ω-3 지방산을 생성하도록 유전자 조작되는 능력에 대한 개념을 증명하는데는 적합하였지만, DHA 생성을 입증하거나, 또는 전체 오일 분획 중 5％ 초과의 DHA, 더욱 바람직하게는 전체 오일 분획 중 10％ 초과의 DHA, 훨씬 더욱 바람직하게는 전체 오일 분획 중 15 내지 20％의 DHA, 가장 바람직하게는 전체 오일 분획 중 25 내지 30％의 DHA를 합성할 수 있도록 복잡한 대사성 유전자를 조작하거나 제안하는데는 실패하였다.
동시 계류 중인 미국 특허 출원 제60/624812호에서는, 야로위아 리폴리티카를 사용한 복잡한 대사성 유전자 조작이 (1) EPA의 합성 및 고축적을 허용하는, 바람직한 데새투라제 및 엘론가제를 확인하기 위해; (2) 오메가 지방산을 저장 지질 풀로 전달하는 아실트랜스퍼라제의 활성을 조작하기 위해; (3) 강력한 프로모터, 다중 카피에서의 발현 및/또는 코돈-최적화를 사용하여 데새투라제, 엘론가제 및 아실트랜스퍼라제를 과발현시키기 위해; (4) EPA의 전반적인 축적을 감소시키는 PUFA 생합성 경로 내에서 특정 유전자의 발현을 하향-조절하기 위해; 그리고 (5) EPA 제조에 영향을 미치는 경로 및 광범위한 조절자를 조작하기 위해 수행한다. 이것은 야로위아 리폴리티카의 하나의 특정 재조합 균주에서 28％ 이하의 EPA를 생성하였다.
본 출원에서, 유사한 복잡한 대사성 유전자 조작은 야로위아 리폴리티카 재조합 균주에서 전체 오일 분획 중 5％ 초과의 DHA을 생성하기 위해 수행되었다. 보다 구체적으로, 균주는 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로를 사용하여 유전학적으로 유전자 조작되었고; 별법 실시양태에서, 형질전환 균주를 유전학적으로 유전자 조작하여 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로에 사용함으로써, GLA가 결여된 고-DHA 오일을 생성할 수 있다. 사용된 대사성 유전자 조작의 측면은 상기 유질 효모에서 DHA 생성을 유의하게 증가시키기 위해 수행될 수 있는 추가 유전자 조작 및 발효 방법과 함께 하기에 논의될 것이다.
개관: 지방산 및 트리아실글리세롤의 미생물성 생합성
일반적으로, 유질 미생물에서의 지질 축적은 성장 배지에 존재하는 전반적인 탄소:질소 비율에 반응하여 유발된다. 유질 미생물에서 유리 팔미테이트 (16:0)의 새로운 합성을 유도하는 상기 과정은 제WO 2004/101757호에 상세하게 기재되어 있다. 팔미테이트는 더욱 장쇄의 포화 및 불포화 지방산 유도체의 전구체이고, 이는 엘론가제 및 데새투라제의 작용에 의해 형성된다. 예를 들어, Δ9 데새투라제의 작용에 의해 팔미테이트가 그의 불포화 유도체 [팔미트올레산 (16:1)]로 전환되고, 유사하게, 팔미테이트가 C16 /18 지방산 엘론가제에 의해 신장되어 스테아르산 (18:0)을 형성하고, 이는 Δ9 데새투라제에 의해 그의 불포화 유도체로 전환되어 올레산 (18:1)을 수득할 수 있다.
TAG (지방산에 대한 1차 저장 단위)는 1) 아실트랜스퍼라제를 통해 아실-CoA의 한 분자가 글리세롤-3-포스페이트로 에스테르화되어 리소포스파티드산을 생성하고; 2) 아실트랜스퍼라제를 통해 아실-CoA의 제2 분자가 에스테르화되어 1,2-디아실글리세롤 포스페이트 (흔히 포스파티드산으로 확인됨)를 수득하고; 3) 포스파티드산 포스파타제에 의해 포스페이트를 제거하여 1,2-디아실글리세롤 (DAG)을 수득하고; 4) 아실트랜스퍼라제의 작용에 의해 제3 지방산을 부가하여 TAG를 형성하는 것을 포함하는 일련의 반응 (도 2)에 의해 형성된다.
포화 및 불포화 지방산 및 단쇄 및 장쇄 지방산을 비롯한 광범위한 지방산을 TAG에 도입시킬 수 있다. 아실트랜스퍼라제에 의해 TAG에 도입될 수 있는 지방산의 일부 제한적인 예로는 카프르산 (10:0), 라우르산 (12:0), 미리스트산 (14:0), 팔미트산 (16:0), 팔미트올레산 (16:1), 스테아르산 (18:0), 올레산 (18:1), 바센산 (18:1), LA, 엘레오스테아르산 (18:3), ALA, GLA, 아라키드산 (20:0), EDA, ETrA, DGLA, ETA, ARA, EPA, 베헨산 (22:0), DPA, DHA, 리그노세르산 (24:0), 네르본산 (24:1), 세로트산 (26:0) 및 몬탄산 (28:0) 지방산이 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, DHA를 TAG에 도입하는 것이 가장 바람직하다.
DHA , ω-3 지방산의 생합성
올레산이 DHA로 전환되는 대사 과정은 탄소 원자의 첨가에 의한 탄소 쇄의 신장, 및 이중 결합의 첨가에 의한 분자의 탈포화를 포함한다. 이는 소포체 막에 존재하는 일련의 특정한 탈포화 및 신장 효소를 필요로 한다. 그러나, 도 1 및 하기에 기재된 바와 같이, DHA 생성에 대한 여러 별법의 경로가 존재한다 (모든 경우에서, DHA 생성이 EPA 합성을 요구함).
구체적으로, 모든 경로는 Δ12 데새투라제의 작용에 의해 올레산에서 LA (18:2) (첫번째 ω-6 지방산)로의 초기 전환을 포함한다. 이어서, EPA 생합성을 위한 "ω-6 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로"를 이용하여 (이로써 EPA 생합성은 주로 ω-6 지방산의 형성을 통해 일어남), PUFA를 다음에 따라 형성한다: (1) Δ6 데새투라제의 작용에 의해 LA가 GLA로 전환되고; (2) C18 /20 엘론가제의 작용에 의해 GLA가 DGLA로 전환되고; (3) Δ5 데새투라제의 작용에 의해 DGLA가 ARA로 전환되고; (4) Δ17 데새투라제의 작용에 의해 ARA가 EPA로 전환된다. 별법으로, EPA 생합성이 주로 "ω-3 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로"를 통해 일어나는 경우에는, (1) Δ15 데새투라제의 작용에 의해 LA가 ALA (첫번째 ω-3 지방산)로 전환되고; (2) Δ6 데새투라제의 작용에 의해 ALA가 STA로 전환되고; (3) C18 /20 엘론가제의 작용에 의해 STA가 ETA로 전환되고; (4) Δ5 데새투라제의 작용에 의해 ETA가 EPA로 전환된다. 임의로, ω-6 및 ω-3 지방산의 조합물은 EPA가 생성되기 전에, Δ17 데새투라제의 작용에 의해 DGLA로부터 ETA를 제조할 때, 또는 Δ15 데새투라제 및 Δ17 데새투라제 둘다를 Δ6 데새투라제, C18 /20 엘론가제 및 Δ5 데새투라제와 함께 동시 발현시킬 때 합성될 수 있다.
EPA의 생합성에 대한 별법의 경로는 Δ9 엘론가제 및 Δ8 데새투라제를 이용한다. 보다 구체적으로, "ω-6 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로"를 통해, Δ9 엘론가제의 작용에 의해 LA가 EDA로 전환된 다음, Δ8 데새투라제가 EDA를 DGLA로 전환시킨다. 상기 기재된 바와 같이, Δ5 데새투라제의 작용에 의한 DGLA의 후속적인 탈포화에 의해 ARA를 수득하고, ARA는 Δ17 데새투라제의 작용에 의해 EPA로 직접 전환된다. 반대로, "ω-3 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로"를 이용하여, 먼저 Δ15 데새투라제의 작용에 의해 LA가 ALA로 전환된다. 그 다음, Δ9 엘론가제의 작용에 의해 ALA가 ETrA로 전환됨 후, Δ8 데새투라제가 ETrA를 ETA로 전환시킨다. Δ5 데새투라제의 작용에 의해 ETA가 후속적으로 탈포화되어 EPA를 수득한다.
EPA 합성 시에, C20 /22 엘론가제는 기질을 DPA로 전환시킨다. 이어서, DPA는 Δ4 데새투라제의 작용에 의해 DHA로 전환된다.
명확히 하기 위해, 이들 각 경로 및 구별되는 특징들을 하기 표에 요약하였다.
EPA 생합성을 위한 대안적인 생합성 경로
명칭 EPA 를 위한 최소 필요 유전자 * 경로
ω-6 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 Δ6D, C18 /20 ELO, Δ5D, Δ17D, C20/22 ELO, Δ4D PUFA 생성물의 ω-3/ω-6 비를 개선시킴
ω-3 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 Δ15D, Δ6D, C18 /20 ELO, Δ5D, C20/22 ELO, Δ4D 후속적인 PUFA 생합성을 위한 기질의 ω-3/ω-6 비를 개선시키고, GLA가 결여된 오일을 생성함
Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로의 조합 Δ15D, Δ6D, C18 /20 ELO, Δ5D, Δ17D, C20 /22 ELO, Δ4D ---
ω-6 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로 Δ9 ELO, Δ8D, Δ5D, Δ17D, C20/22 ELO, Δ4D PUFA 생성물의 ω-3/ω-6 비를 개선시킴
ω-3 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로 Δ15D, Δ9 ELO, Δ8D, Δ5D, C20/22 ELO, Δ4D 후속적인 PUFA 생합성을 위한 기질의 ω-3/ω-6 비를 개선시키고, GLA가 결여된 오일을 생성함
Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로의 조합 Δ15D, Δ9 ELO, Δ8D, Δ5D, Δ17D, C20 /22 ELO, Δ4D ---
* 약어: "D" = 데새투라제; "ELO" = 엘론가제
DHA 합성을 위한 미생물 유전자의 선별
DHA의 생성을 위해 야로위아 리폴리티카에 도입될 필요가 있는 특별한 기능들은 숙주 세포 (및 그의 천연 PUFA 프로파일 및/또는 데새투라제/엘론가제 프로파일), 기질의 유용성, 및 원하는 최종 생성물에 의해 좌우된다. 천연 숙주 세포와 관련하여, 야로위아 리폴리티카가 천연적으로 18:2 지방산을 생성할 수 있어서, 천연 Δ12 데새투라제 (서열 28 및 29; 제WO 2004/104167호 참조)를 보유한다는 것이 공지되어 있다. 원하는 최종 생성물과 관련하여, 생성되는 오일의 최종 지방산 프로파일 (즉, 고 DHA 오일의 최종 조성물 중 ％ GLA)의 면에서 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로 발현과는 반대되는 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 발현의 결과를 상기 기재하였다.
따라서, 일부 실시양태에서는, Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로를 통해 DHA를 생성하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 최소한 하기 유전자가 숙주 유기체에 도입되어 DHA 생합성을 위해 발현되어야 한다: Δ6 데새투라제, C18 /20 엘론가제, Δ5 데새투라제, 및 Δ17 데새투라제 또는 Δ15 데새투라제 중 하나 (또는 둘다), C20 /22 엘론가제 및 Δ4 데새투라제. 더욱 바람직한 실시양태에서, 숙주 균주는 추가로 Δ9 데새투라제, Δ12 데새투라제, C14 /16 엘론가제 및 C16 /18 엘론가제 중 하나 이상을 포함한다.
별법의 실시양태에서, DHA를 GLA의 동시 합성 없이 생성하는 것이 바람직하다 (따라서, Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로의 발현이 필요하다). 이 전략은 최소한 하기 유전자가 숙주 유기체에 도입되어 DHA 생합성을 위해 발현되는 것을 필요로 한다: Δ9 엘론가제, Δ8 데새투라제, Δ5 데새투라제, 및 Δ17 데새투라제 또는 Δ15 데새투라제 중 하나 (또는 둘다), C20 /22 엘론가제 및 Δ4 데새투라제. 더욱 바람직한 실시양태에서, 숙주 균주는 추가로 Δ9 데새투라제, Δ12 데새투라제, C14 /16 엘론가제 및 C16 /18 엘론가제 중 하나 이상을 포함한다.
당업자라면 DHA 생합성에 필요한 각각의 효소를 코딩하는 다양한 후보 유전자를 확인할 수 있을 것이다. 유용한 데새투라제 및 엘론가제 서열은 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있는데, 예를 들어, 천연 공급원 (박테리아, 조류, 진균, 식물, 동물 등)으로부터 단리되거나, 반-합성 경로를 통해 제조되거나, 새로이 합성될 수 있다. 숙주에 도입되는 데새투라제 및 엘론가제 유전자의 특정한 공급원은 본 발명에서 중요하지는 않지만, 데새투라제 또는 엘론가제 활성을 갖는 특정한 폴리펩티드를 선택하는데 있어서 고려할 점으로는 1) 폴리펩티드의 기질 특이성; 2) 폴리펩티드 또는 그의 성분이 속도-제한적 효소인지의 여부; 3) 데새투라제 또는 엘론가제가 원하는 PUFA의 합성에 필수적인지의 여부; 및/또는 4) 폴리펩티드에 필요한 보조인자가 있다. 발현된 폴리펩티드는 바람직하게는 숙주 세포에서 그가 위치하는 생화학적 환경과 상용성인 파라미터를 갖는다. 예를 들어, 폴리펩티드는 숙주 세포에서 기질에 대해 다른 효소와 경쟁할 수 있어야 한다. 따라서, 폴리펩티드의 KM 및 특정한 활성의 분석은 주어진 숙주 세포에서 PUFA 생성을 변형시키기 위해 주어진 폴리펩티드의 적합성을 측정하는 것으로 고려된다. 특정 숙주 세포에서 사용된 폴리펩티드는 의도된 숙주 세포에 존재하는 생화학적 조건하에 기능할 수 있지만, 원하는 PUFA를 변형시킬 수 있는 데새투라제 또는 엘론가제 활성을 갖는 임의의 폴리펩티드일 수 있는 것이다.
추가의 실시양태에서, 각각의 특정한 데새투라제 및/또는 엘론가제의 전환 효율을 고려하는 것이 유용할 것이다. 보다 구체적으로, 대부분의 효소는 기질에서 생성물로의 100％ 전환 효율로 기능하지 않기 때문에, 숙주 세포에서 생성된 비정제된 오일의 최종 지질 프로파일은 전형적으로 원하는 DHA 뿐만 아니라 다양한 상류 중간체 PUFA로 구성되는 다양한 PUFA의 혼합물 (예컨대, 100％ DHA 오일과 대조적임)일 것이다. 따라서, 각 효소의 전환 효율의 고려는 DHA의 생합성을 최적화할 때 중요한 변수이며, 이는 생성물의 최종 원하는 지질 프로파일의 측면에서 고려되어야 한다.
상기 각각을 고려하여, 적절한 데새투라제 및 엘론가제 활성을 갖는 후보 유전자는 공개적으로 입수가능한 문헌 (예컨대, 진뱅크), 특허 문헌, 및 PUFA를 생성하는 능력을 갖는 미생물의 실험적 분석에 따라 확인될 수 있다. 예를 들어, 하기 진뱅크 관리 번호는 DHA 생합성에 유용한 공개적으로 입수가능한 유전자의 예를 나타낸다: AY131238, Y055118, AY055117, AF296076, AF007561, L11421, NM_031344, AF465283, AF465281, AF110510, AF465282, AF419296, AB052086, AJ250735, AF126799, AF126798 (Δ6 데새투라제); AF390174 (Δ9 엘론가제); AF139720 (Δ8 데새투라제); AF199596, AF226273, AF320509, AB072976, AF489588, AJ510244, AF419297, AF07879, AF067654, AB022097 (Δ5 데새투라제); AAG36933, AF110509, AB020033, AAL13300, AF417244, AF161219, AY332747, AAG36933, AF110509, AB020033, AAL13300, AF417244, AF161219, X86736, AF240777, AB007640, AB075526, AP002063 (Δ12 데새투라제); NP_441622, BAA18302, BAA02924, AAL36934 (Δ15 데새투라제); AF338466, AF438199, E11368, E11367, D83185, U90417, AF085500, AY504633, NM_069854, AF230693 (Δ9 데새투라제); AY630574, AY332747, AY278558, AF489589 (Δ4 데새투라제); 및 NP_012339, NP_009963, NP_013476, NP_599209, BAB69888, AF244356, AAF70417, AAF71789, AF390174, AF428243, NP_955826, AF206662, AF268031, AY591335, AY591336, AY591337, AY591338, AY605098, AY605100, AY630573 (C14 /16, C16 /18, C18 /20 및 C20 /22 엘론가제). 유사하게, 특허 문헌은 PUFA 생성과 관련된 유전자의 추가의 여러 DNA 서열 (및/또는 상기 여러 유전자와 관련된 상세한 내용 및 그의 단리 방법)을 제공한다 [예를 들어, 제WO 02/077213호 (Δ9 엘론가제); 제WO 00/34439호 및 제WO 04/057001호 (Δ8 데새투라제); 미국 특허 제5,968,809호 (Δ6 데새투라제); 미국 특허 제5,972,664호 및 미국 특허 제6,075,183호 (Δ5 데새투라제); 제WO 94/11516호, 미국 특허 제5,443,974호, 제WO 03/099216호 및 제WO 05/047485호 (Δ12 데새투라제); 제WO 93/11245호 (Δ15 데새투라제); 제WO 91/13972호 및 미국 특허 제5,057,419호 (Δ9 데새투라제); 미국 출원 제2003/0196217호 (Δ17 데새투라제); 및 제WO 02/090493호 (Δ4 데새투라제); 및, 제WO 00/12720호, 미국 특허 제6,403,349호, 미국 특허 제6,677,145호, 미국 특허 제2002/0139974 A1호, 미국 특허 2004/0111763호 (C14 /16, C16/18, C18 /20 및 C20 /22 엘론가제)]. 이들 각 특허 및 출원은 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
상기 예는 제한하려고 의도된 것이 아니며, 상이한 공급원으로부터 유래된 (1) Δ6 데새투라제, C18 /20 엘론가제, Δ5 데새투라제, 및 Δ17 데새투라제 또는 Δ15 데새투라제 중 하나 (또는 둘다), C20 /22 엘론가제 및 Δ4 데새투라제를 코딩하는 수많은 다른 유전자 (및 임의로 Δ9 데새투라제, Δ12 데새투라제, C14 /16 엘론가제 및/또는 C16 /18 엘론가제를 코딩하는 다른 유전자); 또는 (2) Δ9 엘론가제, Δ8 데새투라제, Δ5 데새투라제, 및 Δ17 데새투라제 또는 Δ15 데새투라제 중 하나 (또는 둘다), C20 /22 엘론가제 및 Δ4 데새투라제를 코딩하는 수많은 다른 유전자 (및 임의로 Δ9 데새투라제, Δ12 데새투라제, C14 /16 엘론가제 및/또는 C16 /18 엘론가제를 코딩하는 다른 유전자)를 코딩하는 수많은 다른 유전자들이 야로위아 리폴리티카에 도입시키기에 적합할 것이다.
DHA 합성에 바람직한 유전자
야로위아 리폴리티카에서의 발현에 적합할 수 있는 데새투라제 및 엘론가제를 광범위하게 선택할 수 있지만, 본 발명의 바람직한 실시양태에서는 데새투라제 및 엘론가제가 하기 (또는 그의 유도체)로부터 선택된다:
야로위아 리폴리티카에서 EPA 생성합을 위한 바람직한 데새투라제 및 엘론가제
ORF 유기체 참조문헌 서열번호
Δ6 데새투라제 모르티에렐라 알피나 진뱅크 관리 번호 AF465281; 미국 특허 제5,968,809호 서열 1, 서열 2
Δ6 데새투라제 모르티에렐라 알피나 진뱅크 관리 번호 AB070555 서열 4, 서열 5
C18 /20 엘론가제 ("ELO1") 모르티에렐라 알피나 진뱅크 관리 번호 AX464731; 제WO 00/12720호 서열 22, 서열 23
C18 /20 엘론가제 ("ELO2") 트라우스토키트륨 아우레움 미국 특허 제6,677,145호 서열 25, 서열 26
Δ9 엘론가제 이소크리시스 갈바나 진뱅크 관리 번호 AF390174 서열 69, 서열 70
Δ8 데새투라제 유글레나 그라실리스 동시 계류 중인 미국 특허 출원 제11/166993호 서열 77, 서열 78
Δ5 데새투라제 모르티에렐라 알피나 진뱅크 관리 번호 AF067654; 미국 특허 제6,075,183호 서열 6, 서열 7
Δ5 데새투라제 이소크리시스 갈바나 제WO 02/081668 A2호 서열 8, 서열 9
Δ5 데새투라제 호모 사피엔스 진뱅크 관리 번호 NP_037534 서열 11, 서열 12
Δ5/Δ6 데새투라제 다니오 레리오 진뱅크 관리 번호 AF309556 서열 14, 서열 15
Δ5/Δ6 데새투라제 다니오 레리오 진뱅크 관리 번호 BC068224 서열 16
Δ5/Δ6 데새투라제 다니오 레리오 -- 서열 17, 서열 18
Δ17 데새투라제 사프롤레그니아 디클리나 미국 특허 출원 제US 2003/0196217 A1호 서열 19, 서열 20
Δ4 데새투라제 트라우스토키트륨 아우레움 진뱅크 관리 번호 AAN75707 서열 104, 서열 105
C20 /22 엘론가제 오스트레오코쿠스 타우리 진뱅크 관리 번호 AY591336 서열 100, 서열 101
C16 /18 엘론가제 ("YE2") 야로위아 리폴리티카 -- 서열 94, 서열 95
C16 /18 엘론가제 ("ELO3") 모르티에렐라 알피나 -- 서열 86, 서열 87
C16 /18 엘론가제 (rELO2) 라투스 노르베기쿠스 진뱅크 관리 번호 AB071986 서열 83, 서열 84
C14 /16 엘론가제 ("YE1") 야로위아 리폴리티카 -- 서열 97, 서열 98
Δ12 데새투라제 야로위아 리폴리티카 제WO 2004/104167호 서열 28, 서열 29
Δ12 데새투라제 모르티에렐라 이자벨리나 진뱅크 관리 번호 AF417245 서열 30, 서열 31
Δ12 데새투라제 (Fm d12) 푸사륨 모닐리포르메 제WO 2005/047485호 서열 32, 서열 33
Δ12 데새투라제 (An d12) 아스페르길루스 니둘란스 아스페르길루스 니둘란스 게놈 프로젝트에서 콘티그 1.15 (스캐폴드 1); AAG36933; 제WO 2005/047485호 서열 34, 서열 35
Δ12 데새투라제 아스페르길루스 플라부스 진뱅크 관리 번호 AY280867 (버전 AY280867.1; gi:30721844); 제WO 2005/047485호 서열 36
Δ12 데새투라제 (Afd12p) 아스페르길루스 푸미가투스 아스페르길루스 푸미가투스 게놈 프로젝트에서 AFA.133c 344248:345586 리버스 (AfA5C5.001c); 제WO 2005/047485호 서열 37
Δ12 데새투라제 (Mg d12) 마그나포르테 그리세아 마그나포르테 그리세아 게놈 프로젝트에서 콘티그 2.375 중 로커스 MG01985.1; 제WO 2005/047485호 서열 38, 서열 39
Δ12 데새투라제 (Nc d12) 뉴로스포라 크라싸 진뱅크 관리 번호 AABX01000374; 제WO 2005/047485호 서열 40, 서열 41
Δ12 데새투라제 (Fg d12) 푸사륨 그라미네아륨 푸사륨 그라미네아륨 게놈 프로젝트에서 콘티그 1.233; 제WO 2005/047485호 서열 42, 서열 43
Δ12 데새투라제 (Mad12) 모르티에렐라 알피나 진뱅크 관리 번호 AB020033 서열 44, 서열 45
Δ12 데새투라제 (Skd12) 사카로마이세스 클루이베리 진뱅크 관리 번호 BAD08375 서열 46
Δ12 데새투라제 (Kld12p) 클루이베로마이세스 락티스 "효모 프로젝트 게놀레부레스(Genolevures)"의 클루이베로마이세스 락티스 데이타베이스의 Klla0B:35614..36861 안티센스 (m)으로부터의 gnl│GLV│KLLV0B00473g ORF (프랑스 탈렌스 세덱스 LaBRI 바이오포르마틱스 센터) 서열 47, 서열 48
Δ12 데새투라제 (Cad12p) 칸디다 알비칸스 진뱅크 관리 번호 EAK94955 서열 49
Δ12 데새투라제 (Dhd12p) 데바리오마이세스 한세니이 CBS767D 진뱅크 관리 번호 CAG90237 서열 50
Δ15 데새투라제 (Fm d15) 푸사륨 모닐리포르메 제WO 2005/047479호 서열 51, 서열 52
Δ15 데새투라제 (An d15) 아스페르길루스 니둘란스 아스페르길루스 니둘란스 게놈 프로젝트에서 콘티그 1.122 (스캐폴드 9); 제WO 2005/047479호 서열 53, 서열 54
Δ15 데새투라제 (Mg d15) 마그나포르테 그리세아 마그나포르테 그리세아 게놈 프로젝트에서 콘티그 2.1597 중 로커스 MG08474.1; 제WO 2005/047479호 서열 55, 서열 56
Δ15 데새투라제 (Nc d15) 뉴로스포라 크라싸 진뱅크 관리 번호 AABX01000577; 제WO 2005/047479호 서열 57, 서열 58
Δ15 데새투라제 (Fg d15) 푸사륨 그라미네아륨 푸사륨 그라미네아륨 게놈 프로젝트에서 콘티그 1.320; 제WO 2005/047479호 서열 59, 서열 60
Δ15 데새투라제 (Mad15) 모르티에렐라 알피나 진뱅크 관리 번호 AB182163 서열 61, 서열 62
Δ15 데새투라제 (Kld15p) 클루이베로마이세스 락티스 진뱅크 관리 번호 XM_451551 서열 63, 서열 64
Δ15 데새투라제 (Cad15p) 칸디다 알비칸스 진뱅크 관리 번호 EAL03493 서열 65
Δ15 데새투라제 (Skd15) 사카로마이세스 클루이베리 진뱅크 관리 번호 BAD11952 서열 66
Δ15 데새투라제 (Dhd15p) 데바리오마이세스 한세니이 CBS767 진뱅크 관리 번호 CAG88182 서열 67
Δ15 데새투라제 (Afd15p) 아스페르길루스 푸미가투스 진뱅크 관리 번호 EAL85733 서열 68
* 주의: 아스페르길루스 푸미가투스 게놈 프로젝트는 유니버시티 오브 맨체스터의 공동 연구기관인 생어 인스티튜트(Sanger Institute) 및 더 인스티튜트 오브 게놈 리써치(The Institute of Genome Research (TIGR))에서 후원되고, 아스페르길루스 니둘란스 게놈 프로젝트는 매리랜드주 캠브리지 소재의 센터 포 게놈 리써치(Center for Genome Research (CGR))에서 후원되고, 마그나포르테 그리세아 게놈 프로젝트는 CGR 및 인터내셔널 라이스 블라스트 게놈 협회(International Rice Blast Genome Consortium)에서 후원하고, 푸사륨 그라미네아륨 게놈 프로젝트는 CGR 및 인터내셔녈 지베렐라 제애 게노믹스 협회(International Gibberella zeae Genomics Consortium (IGGR)에 의해 후원되었다.
본 발명자들은 야로위아 리폴리티카에서 발현될 때 각 효소의 기질 특이성 및/또는 기질 선택성을 측정하거나 확인하기 위해 다양한 엘론가제에 대해 상당한 분석을 수행하였다. 예를 들어, 두 가지 야로위아 리폴리티카 엘론가제의 코딩 서열을 공개적으로 입수하고, 각각의 단백질이 추정적 장쇄 지방-아실 엘론가제로서 해석되거나, 다른 지방산 엘론가제에 대해 유의한 상동성을 공유하였지만, 이들 효소의 기질 특이성은 측정된 적이 없었다. 본원에서 수행한 분석에 기초하여, YE1은 C16 지방산을 생성하는 기질로서 C14 지방산을 우세하게 사용하는 지방산 엘론가제 (즉, C14 /16 엘론가제)인 것으로 긍정적으로 결정되었고, YE2는 C18 지방산을 생성하는 기질로서 C16 지방산을 우세하게 사용하는 지방산 엘론가제 (즉, C16 /18 엘론가제)임이 결정되었다. 이와 관련하여, 신규한 모르티에렐라 알피나 ELO3 유전자를 확인할 때, 다른 지방산 엘론가제에 대한 상동성으로서 서열을 특성화하였다. 그러나, C16 /18 엘론가제로서 ELO3의 특이성을 확인하기 위해서는 지질 프로파일 분석이 필요하였다.
Δ12 데새투라제와 관련하여, 본 발명자들은 놀랍게도 야로위아 리폴리티카에서 18:2를 생성하는데 있어서 푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제 (서열 32에 의해 코딩됨)가 천연 야로위아 리폴리티카 Δ12 데새투라제에 비해 더 높은 효율로 기능한다는 것을 발견하였다 (제WO 2005/047485호 참조). 구체적으로, 야로위아 리폴리티카에서 TEF 프로모터의 조절하에 푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제의 발현은, 이전에 TEF 프로모터의 조절하에 야로위아 리폴리티카 Δ12 데새투라제를 코딩하는 키메라 유전자에 의해 수득되는 것 (LA의 생성물 축적률 59％)보다 18:2를 더 높은 수준 (LA의 생성물 축적률 68％)으로 생성하는 것으로 측정되었다. 이는 ([18:2+18:3]/[18:1+18:2+18:3])×100으로 계산되는 기질 전환율(％)의 차이가 각각 85％ 및 74％인 것에 상응한다. 이러한 결과에 기초하여, 본 발명의 진균 푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제의 발현은 야로위아 리폴리티카의 고농도 DHA-생산 균주의 유전자 조작 수단으로서 다른 공지된 Δ12 데새투라제에 비해 바람직하다 (그러나, 당업자는 푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제의 활성이 예를 들어 코돈-최적화에 따라 야로위아 리폴리티카에서 개선될 수 있다고 예측할 것이다).
별법으로, 야로위아 리폴리티카에서 개선된 효율로 기능할 수 있는 새로운 5가지 Δ12 데새투라제가 최근에 확인되었다. 구체적으로, 사카로마이세스 클루이베리 Δ12 데새투라제 (진뱅크 관리 번호 BAD08375)가 문헌 [Watanabe et al., Biosci. Biotech. Biocheml. 68(3):721-727 (2004)]에 기재되었고, 모르티에렐라 알피나로부터의 Δ12 데새투라제 (진뱅크 관리 번호 AB182163)는 문헌 [Sakuradani et al., Eur. J. Biochem. 261 (3):812-820 (1999)]에 기재되었다. 이들 서열 및 상기 기재된 방법을 이용하여, 추가의 3가지 Δ12 데새투라제가 본 발명자들에 의해 확인되었다: 클루이베로마이세스 락티스 gnl│GLV│KLLA0B00473g ORF (서열 48), 칸디다 알비칸스 진뱅크 관리 번호 EAK94955 (서열 49) 및 데바리오마이세스 한세니이 CBS767 진뱅크 관리 번호 CAG90237 (서열 50). 야로위아 리폴리티카에서 이들 추가의 Δ12 데새투라제의 과발현은 LA의 생성을 증가시키는 수단으로서 유용할 수 있으며, 이로써 다른 하류 PUFA (예컨대, DHA)의 생성을 증가시킬 수 있다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 푸사륨 모닐리포르메 (서열 51 및 52)는 ALA의 생성을 증가시키는데 바람직한 Δ15 데새투라제인데, 그 이유는 이 특정한 Δ15 데새투라제가 이전에 공지된 Δ15 데새투라제에 비하여 여러가지 독특한 특징을 갖고 있기 때문이다. 첫째, 푸사륨 모닐리포르메 Δ15 데새투라제는 그의 상당한 Δ12 데새투라제 활성 (따라서 이작용성 효소로서 특징지워짐)에 의해 구별된다. 이전의 연구에서, 서열 52을 코딩하는 키메라 유전자로 형질전환된 야로위아 리폴리티카의 Δ12 데새투라제-파괴된 균주가 LA를 ALA로 96％ ([18:3]/[18:2+18:3]×100로서 계산된 기질 전환율(％)) 전환시킬 뿐 아니라, 올레산을 LA로 24％ (([18:2+18:3]/[18:1+18:2+18:3])×100으로 계산된 기질 전환율(％)) 전환시킬 수 있다는 것이 측정되었다. 둘째로, 푸사륨 모닐리포르메 Δ15 데새투라제는, 다른 이종 발현된 Δ15 데새투라제에 대해 기재된 것에 비해 [예컨대, 비-유질 효모 사카로마이세스 세레비지애에서 캐노르합디티스 엘레강스 Δ15 데새투라제를 발현할 때 ALA의 생성물 축적률(％)이 단지 4.1％인 반면에 (문헌 [Meesapyodsuk et al., Biochem. 39:11948-11954 (2000)]), 사카로마이세스 세레비지애에서 브라시카 나푸스 Δ15 데새투라제를 발현할 때 ALA의 생성물 축적률(％)은 단지 1.3％이었음 (문헌 [Reed., D.W. et al., Plant Physiol. 122:715-720 (2000)])], 야로위아 리폴리티카에서 발현될 때 ALA를 매우 고농도로 합성가능하게 한다 [즉, 서열 52을 코딩하는 키메라 유전자로 형질전환된 야로위아 리폴리티카가 형질전환된 숙주 세포에서의 전체 지방산에 비해 ALA의 생성물 축적률(％)이 31％인 것으로 입증되었으며, 이는 ALA로의 전환 효율 ([18:3]/[18:2+18:3]×100로서 계산)이 83％와 동등함]. 마지막으로, 푸사륨 모닐리포르메 Δ15 효소는 18:2의 하류 ω-6 유도체에 대해 비교적 광범위한 기질 특이성을 갖는다. 구체적으로, Δ15 데새투라제는 GLA에서 STA로의 전환, DGLA에서 ETA로의 전환, 및 ARA에서 EPA로의 전환을 촉매할 수 있다.
바람직한 Δ15 데새투라제로서 푸사륨 모닐리포르메 Δ15 효소가 확인되었으나, 6가지 새로운 Δ15 데새투라제가 야로위아 리폴리티카에서 개선된 효율로 기능할 수 있다는 것이 최근 확인되었다. 구체적으로, 사카로마이세스 클루이베리 Δ15 데새투라제 (진뱅크 관리 번호 BAD11952; Skd15)는 문헌 [Oura et al., Microbiol. 150:1983-1990 (2004)]에 기재되어 있고, 모르티에렐라 알피나 Δ15 데새투라제 (진뱅크 관리 번호 AB182163; Mad15)는 문헌 [Sakuradani et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 66:648-654 (2005)]에 기재되어 있다. 각각 이전에 확인된 사카로마이세스 클루이베리 및 모르티에렐라 알피나 Δ12 데새투라제에 대한 그들의 근접한 상동성에 이은 기능적 활성의 측정에 기초하여 상기 두 서열의 일부가 확인되었기 때문에, 이들 두 쌍의 단백질은 푸사륨 모닐리포르메, 아스페르길루스 니둘란스, 마그나포르테 그리세아, 뉴로스포라 크라싸 및 푸사륨 그라미네아륨과 유사한 밀접한 관련이 있는 진균 Δ12 및 Δ15 데새투라제의 추가의 예로 제공된다 (상기 표 참조). 상기 발견은 진균 Δ12 데새투라제-유사 서열의 "쌍"이 Δ15 데새투라제 활성을 갖는 하나의 단백질 및 Δ12 데새투라제 활성을 갖는 하나의 단백질을 포함한다는 본 발명자들의 이전의 가설을 더욱더 뒷받침한다 (제WO 2005/047480호 및 제WO 2005/047485호 참조). 따라서, Δ12 데새투라제-유사 단백질의 유사한 "쌍"이 클루이베로마이세스 락티스, 칸디다 알비칸스, 데바리오마이세스 한세니이 CBS767 및 아스페르길루스 푸미가투스에서 확인되었고, 예상된 바와 같이, 각 쌍의 한 구성원은 이전에 확인된 사카로마이세스 클루이베리 Δ12 데새투라제 (Skd12)에 대해 더욱 근접하게 정렬하고, 나머지는 Skd15에 더욱 근접하게 정렬하였다 (도 3A). 따라서, 이 분석에 기초하여, 본 발명자들은 야로위아 리폴리티카에서의 과발현이 ω-3 지방산의 생성을 증가시키는데 유용할 수 있는 추정적 진균 Δ15 데새투라제로서 클루이베로마이세스 락티스 진뱅크 관리 번호 XM_451551, 데바리오마이세스 한세니이 CBS767 진뱅크 관리 번호 CAG88182, 칸디다 알비칸스 진뱅크 관리 번호 EAL03493 및 아스페르길루스 푸미가투스 진뱅크 관리 번호 EAL85733을 확인하였다.
추가의 실시양태에서에서, 본 발명자들은 Δ12 데새투라제 활성과 대조적으로 Δ15 데새투라제 활성을 갖는 진균 서열을 쉽게 구별하는 수단을 확인하였다. 구체적으로, Mad12, Skd12, Nc d12, Fm d12, Mg d12, An d12, Fg d12, Dhd12p, Kld12p, Cad12p, Afd12p, Mad15, Skd15, Nc d15, Fm d15, Mg d15, An d15, Fg d15, Dhd15p, Kld15p, Cad15p 및 Afd15p로 이루어진 아미노산 서열 정렬을 분석할 때 (상기 표 참조), 모든 진균 Δ15 또는 Δ12 데새투라제가 Fm d15의 위치 102 (서열 52)에 상응하며 고도로 보존된 His 박스 1 ("HECGH"; 서열 222)로부터 떨어져 있는 단지 3개의 아미노산 잔기인 위치에서 각각 Ile 또는 Val 아미노산 잔기를 함유한다는 것이 명백해졌다 (표 6).
Figure 112007040393459-PCT00003
본 발명자들은 상기 위치에 있는 Ile 및 Val이 각각 진균 데새투라제에서 Δ15 및 Δ12 데새투라제 특이성의 결정자인 것으로 결론지었다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은 상응하는 잔기(들) (즉, 또는 모티프 IXXHECGH [서열 223])에서 Ile를 갖는 임의의 진균 Δ12 데새투라제-유사 단백질이 Δ15 데새투라제일 것이고, 상응하는 잔기(들) (즉, 또는 모티프 VXXHECGH [서열 224])에서 Val을 갖는 임의의 진균 Δ12 데새투라제-유사 단백질이 Δ12 데새투라제일 것이라고 제안한다. 따라서, 상기 단일 루이신/발린 아미노산은 미래의 진균 데새투라제가 확인되고 해석되는 것으로 고려될 중요한 잔기일 것이다. 또한, 상기 위치에서 Ile에서 Val으로의 변화로 인한 돌연변이가 진균 Δ12 데새투라제-유사 단백질을 코딩하는 유전자 (예컨대, 본원에서 서열 52로 기재된 푸사륨 모닐리포르메 데새투라제)에서, 예를 들어 Δ12 탈포화에 대한 효소 특이성을 변경시키고, 반대로, 상기 위치에서 Val에서 Ile로의 변화로 인한 돌연변이가 예를 들어 Δ15 탈포화에 대한 효소 특이성을 변경시킬 것으로 고려된다.
바람직한 실시양태에서, 다양한 Δ5 데새투라제가 이용될 특정한 경로에 따라 DHA 생성을 위한 숙주 세포에서 발현하는데 가장 이로운 것으로 선택될 수 있다. 구체적으로, ω-6 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 또는 ω-6 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 발현할 때, 모르티에렐라 알피나, 이소크리시스 갈바나 및 호모 사피엔스 Δ5 데새투라제가 바람직하다. 반대로, ω-3 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 또는 ω-3 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 이용하는 것이 바람직한 경우에는 (이로써 ω-3 PUFA의 합성이 우세함), 예를 들어 피토프테라 메가스페르마(Phytopthera megasperma) 또는 다니오 레리오로부터의 ω-3-우호성 Δ5 데새투라제를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 하스팅스(Hastings) 등은 원래 사카로마이세스 세레비지애에서 다니오 레리오 cDNA (진뱅크 관리 번호 AF309556)의 발현이 이작용성 Δ6 및 Δ5 데새투라제 활성 (ω-6 기질에 비해 ω-3 기질에 대해 명확한 우호성을 가지며, Δ5 데새투라제에 비해 Δ6 데새투라제 활성이 약간 더 높음)을 나타낸다고 보고하였다. 그 후, 본 발명자들은 ORF의 위치 984에서 1 bp (T) 결실 (결과적으로 돌연변이 없음) 및 위치 1171에서 1 bp 치환 (G에서 A로) (결과적으로 V에서 M으로 아미노산 변화)에서 차이가 나는, 진뱅크 관리 번호 AF309556의 동족체로서 진뱅크 관리 번호 BC068224를 확인하였다. 그 후, 진뱅크 관리 번호 BC068224의 V1171 M 돌연변이를 제외하고는 진뱅크 관리 번호 AF309556과 동일한 돌연변이체 단백질 (본원에서 "Drd6/d5(M)"로서 확인됨)을 생성하였다. 본 발명자들의 초기 연구에서 사카로마이세스 세레비지애에서 Drd6/d5(M)의 발현이 진뱅크 관리 번호 AF309556에 비해 약 50％ 더 낮은 활성을 나타내는 것으로 결정되었지만, ETA를 제조하는 야로위아 균주의 발현은 이작용성 Δ5/Δ6 데새투라제가 훨씬 더 ω-3-특이적이었음을 확인하였다. 따라서, 상기 효소 (본원에서 서열 18으로 확인됨), 또는 유사한 기질 특이성을 갖는 효소가 ω-3 PUFA의 증가된 합성을 위한 ω-3 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 또는 ω-3 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로의 발현시에 바람직하다.
물론, 본 발명의 별법의 실시양태에서, 서열 2, 5, 7, 9, 12, 15, 18, 20, 23, 26, 29, 31, 33, 35-37, 39, 41, 43, 45, 46, 48-50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64-68, 70, 78, 84, 87, 95, 98, 101 및 105에 의해 코딩되는 데새투라제 및 엘론가제와 실질적으로 동일한 다른 DNA 또한 야로위아 리폴리티카에서 DHA의 생성을 위해 사용될 수 있다. "실질적으로 동일한"은 선택된 폴리펩티드, 또는 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열에 대해 80％, 90％ 또는 95％ 이상의 상동성으로 증가한 우호성을 나타내는 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 위해 의도된다. 폴리펩티드의 경우, 비교 서열의 길이는 일반적으로 16개 이상의 아미노산, 바람직하게는 20개 이상의 아미노산, 가장 바람직하게는 35개 이상의 아미노산이다. 핵산의 경우, 비교 서열의 길이는 일반적으로 50개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 60개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 75개 이상의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 110개 이상의 뉴클레오티드이다.
전형적으로, 상동성은 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정되고, 여기서 용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 사용되는 임의의 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 나타낸다. "서열 분석 소프트웨어"는 시판되는 것이거나 독자적으로 개발될 수 있다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어로는 1) GCG 집합의 프로그램 (위스콘신 팩키지 버전 9.0, 제네틱 컴퓨터 그룹, 미국 위스콘신주 매디슨 소재); 2) BLASTP, BLASTN, BLASTX (문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]); 3) DNASTAR (디엔에이스타, 인크, 미국 위스콘신주 매디슨 소재); 및 4) 스미스-워터맨 알고리즘이 도입된 FASTA 프로그램 (문헌 [W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY])이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본원의 문맥상, 서열 분석 소프트웨어를 분석을 위해 이용하는 경우, 달리 명시하지 않는 한 분석 결과는 참조한 프로그램의 "디폴트 값"을 기초로 할 것이라는 것을 이해할 것이다. 본원에 사용된 "디폴트 값"은 처음 초기화시에 소프트웨어에 원래 내장되어 있는 임의의 집합의 값 또는 파라미터를 의미할 것이다. 일반적으로, 이러한 컴퓨터 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 대한 상동성 정도를 분배함으로써 유사한 서열을 매칭시킨다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 서열 2, 9, 12, 20, 23, 26, 70, 78, 84, 101 및 105에 기재된 것과 실질적으로 동일한 데새투라제 및 엘론가제를 코딩하는 코돈-최적화된 유전자를 사용한다. 구체적으로, 당업자에게 공지된 바와 같이, 천연 유전자의 코돈을 선택된 숙주 미생물에서 최적의 유전자 발현을 위한 코돈으로 대체시켜서 코딩된 mRNA의 번역 효율을 증가시킴으로써 이종 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서, 외래 숙주에서 발현되는 특정 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 일부분을 변형시켜서, 변형된 폴리펩티드가 다른 숙주에 의해 바람직한 코돈을 사용하도록 하는 것이 종종 유용하며, 숙주 우호성 코돈의 사용은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 외래 유전자의 발현을 실질적으로 개선시킬 수 있다.
일반적으로, 숙주 우호성 코돈은 관심을 가진 특정 숙주 종 내에서 단백질에서의 코돈 사용을 측정하고 (바람직하게는 최다량으로 발현된 것), 가장 높은 빈도로 사용된 것을 측정함으로써 결정될 수 있다. 이어서, 관심을 가진 폴리펩티드 (예컨대, 데새투라제, 엘론가제, 아실트랜스퍼라제)의 코딩 서열은 상기 숙주 종에서 바람직한 코돈을 전부 또는 일부 사용하여 합성될 수 있다. 모든 (또는 일부) DNA 또한 전사된 mRNA에서 존재하는 2차 구조체의 임의의 불안정화 서열 또는 영역을 제거함으로써 합성될 수 있다. 그리고, 모든 (또는 일부) DNA 또한 원하는 숙주 세포에서 염기 조성을 더욱 바람직한 것으로 변경시킴으로써 합성될 수 있다.
추가로, 번역 개시 코돈 'ATG' 주변의 뉴클레오티드 서열은 효모 세포의 발현에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 원하는 폴리펩티드가 효모에서 불량하게 발현되는 경우에는, 외생 유전자의 뉴클레오티드 서열이 효율적인 효모 번역 개시 서열을 포함하여 최적의 유전자 발현을 달성하도록 변형될 수 있다. 효모에서의 발현의 경우, 이는 비효율적으로 발현되는 유전자를 프래임 내에서 내인성 효모 유전자, 바람직하게는 고도로 발현되는 유전자에 융합시킴으로써 부위-지정 돌연변이유발에 의해 수행될 수 있다. 별법으로, 야로위아 리폴리티카에 대해 본원에서 입증된 바와 같이, 숙주에서 컨센서스(consensus) 번역 개시 서열을 측정하여, 상기 서열을 관심을 가진 숙주에서의 최적의 발현을 위해 이종 유전자로 유전자 조작할 수 있다.
본 발명에서, 표 5의 여러 데새투라제 및 엘론가제 유전자를 상기 기재된 숙주 우호성을 기준으로 하여 야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화하였다. 이는 먼저 야로위아 리폴리티카 코돈 사용 프로파일을 측정하고 (제WO 04/101757호 참조), 바람직한 코돈을 확인함으로써 가능해진다. 이어서, 야로위아 리폴리티카에서의 유전자 발현을 더욱 최적화시키기 위해, 'ATG' 개시 코돈 주변의 컨센서스 서열 (즉, 'MAMMATGNHS' (서열 155), 사용된 핵산 다의성 코드는 M=A/C; S=C/G; H=A/C/T; 및 N=A/C/G/T임)을 측정하였다. 하기 표 7은 야로위아 리폴리티카에서 발현될 때 천연 및 코돈-최적화된 유전자의 활성을 비교하여, 각각의 코돈-최적화된 유전자에 대해 상세하게 제공한다. ％Sub. Conv.는 "기질 전환율(％)"의 약어이고 및 코돈-Opt.는 "코돈-최적화된"의 약어이다.
야로위아 리폴리티카에서 DHA 생합성을 위한 가장 바람직한 코돈-최적화된 데새투라제 및 엘론 가제
천연 유전자 천연 유전자 ％ Sub . Conv . 코돈- Opt . 유전자에서 변형된 전체 염기 코돈- Opt . 유전자 ％ Sub . Conv . 참조문헌 코돈- Opt . 서열 번호
모르티에렐라 알피나 Δ6 데새투라제 (진뱅크 관리 번호 AF465281) 30％ 1374 bp의 152 (144 코돈에 상응) 42％ 제WO 04/101753호 서열 3
모르티에렐라 알피나 고친화성 C18 /20 엘론가제 (진뱅크 관리 번호 AX464731) 30％ 957 bp의 94 (85 코돈에 상응) 47％ 제WO 04/101753호 서열 24
트라우스토키트륨 아우레움 C18 /20 엘론가제 ("ELO2") 33％ 817 bp의 114 (108 코돈에 상응) 46％ -- 서열 27
사프롤레그니아 디클리나 Δ17 데새투라제 (미국 특허 출원 제2003/0196217 A1호) 23％ 1077 bp의 127 (117 코돈에 상응) 45％ 동시 계류 중인 미국 특허 출원 제10/840478호 서열 19
이소크리시스 갈바나 Δ9 엘론가제 -- 789 bp의 126 (123 코돈에 상응) 30％ -- 서열 71
유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제 -- 1263 bp의 207 (192 코돈에 상응) 75％ 동시 계류 중인 미국 특허 출원 제11/166993호 서열 81
이소크리시스 갈바나 Δ5 데새투라제 7％ 1323 bp의 203 (193 코돈에 상응) 32％ -- 서열 10
호모 사피엔스 Δ5 데새투라제 (진뱅크 관리 번호 NP_037534) -- 1335 bp의 227 (207 코돈에 상응) 30％ -- 서열 13
트라우스토키트륨 아우레움 Δ4 데새투라제 --- 1546 bp의 170 (166 코돈에 상응) 20％ -- 서열 106
오스트레오코쿠스 타우리 C20 /22 엘론가제 --- 903 bp의 160 (147 코돈에 상응) 67％ -- 서열 102
라투스 노르베기쿠스 C16 /18 엘론가제 (진뱅크 관리 번호 AB071986) -- 792 bp의 127 (125 코돈에 상응) 43％ -- 서열 85
본 발명의 추가의 별법의 실시양태에서, 서열 3, 10, 13, 19, 24, 27, 71, 81, 85, 102 및 106에 제시된 바람직한 데새투라제 및 엘론가제와 실질적으로 동일하지 않은 다른 DNA 또한 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 야로위아 리폴리티카에 도입되기에 유용한 Δ6 데새투라제 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 GLA 또는 STA를 생성하는 능력을 가진 미생물로부터 수득될 수 있다. 이러한 미생물로는 예를 들어 모르티에렐라, 코니디오볼루스(Conidiobolus), 피티움, 피토파토라(Phytophathora), 페니실륨(Penicillium), 포르피리듐, 코이도스포륨(Coidosporium), 무코르(Mucor), 푸사륨, 아스페르길루스, 로도토룰라 및 엔토모프토라(Entomophthora) 속에 속하는 것들이 있다. 포르피리듐 속 중에서, 특히 포르피리듐 크루엔툼(P. cruentum)이 관심의 대상이다. 모르티에렐라 속 중에서, 특히 모르티에렐라 엑스텐시아(M. extensia), 모르티에렐라 엑시구아, 모르티에렐라 히그로필라, 모르티에렐라 라만니아나 바르. 안굴리스포라(M. ramanniana var. angulispora) 및 모르티에렐라 알피나가 관심의 대상이다. 무코르 속 중에서, 무코르 시르시넬로이데스(M. circinelloides) 및 무코르 자바니쿠스(M. javanicus)가 관심의 대상이다.
별법으로, 모르티에렐라 알피나 Δ6 데새투라제와 살질적으로 동일하지만, 예를 들어 분자의 카르복실 말단으로부터 6번째 탄소에서 지방산 분자가 탈포화될 수 있는 관련 데새투라제 또한 본 발명에서 Δ6 데새투라제로서 유용할 수 있으며, 상기 데새투라제는 여전히 효과적으로 LA를 GLA로 및/또는 ALA를 STA로 전환시킬 것으로 추정된다. 따라서, 관련 데새투라제 및 엘론가제는 본원에 개시된 데새투라제 및 엘론가제와 실질적으로 동일하게 기능할 수 있는 그들의 능력에 의해 확인될 (또는 생성될) 수 있다.
상기 제안된 바와 같이, 또다른 실시양태에서 당업자는 본원의 목적에 적합한, 예를 들어 Δ12 데새투라제 및 Δ6 데새투라제 활성 둘다를 갖는 융합 단백질을 생성할 수 있다. 이는 연결 링커를 이용하여 Δ12 데새투라제와 Δ6 데새투라제를 융합시킴으로써 가능해질 것이다. Δ12 데새투라제 또는 Δ6 데새투라제는 융합 단백질의 N-말단 부분에 있을 수 있다. 적절한 링커 분자를 고안하고 합성하는 수단은 당업자에게 용이하게 공지되어 있으며, 예를 들어 상기 링커는 알라닌 또는 리신 아미노산의 신장체일 수 있고, 융합 효소의 활성에는 영향을 미치지 않을 것이다.
마지막으로, 서열을 합성하고 서열을 함께 가져오는 방법이 문헌에 확립되어 있음은 당업계에 널리 공지되어 있다. 따라서, 천연 발생 데새투라제 및/또는 엘론가제 유전자의 돌연변이를 달성하기 위해, 시험관내 돌연변이유발 및 선별, 부위-지정 돌연변이유발, 화학적 돌연변이유발, "유전자 뒤섞기(shuffling)" 방법 또는 다른 수단을 이용할 수 있다. 이는 숙주 세포에서 기능하기에 더욱 바람직한 물리적 및 동력학적 파라미터 (예컨대, 긴 반감기 또는 원하는 PUFA의 높은 생성률)를 가지며 생체내에서 데새투라제 또는 엘론가제 활성을 갖는 폴리펩티드의 생성을 허용할 것이다.
요약하면, 야로위아 리폴리티카에서 DHA 생성에 적합한 PUFA 생합성 경로 효소를 코딩하는 바람직한 데새투라제 및 엘론가제 유전자의 서열이 제시되지만, 이들 유전자는 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다. 본 발명의 목적에 적합한 PUFA 생합성 경로 효소를 코딩하는 수많은 다른 유전자를 다양한 공급원 (예컨대, 적절한 데새투라제 또는 엘론가제 활성을 갖는, 야생형의 코돈-최적화된 합성 및/또는 돌연변이체 효소)으로부터 단리할 수 있다. 이들 별법의 데새투라제는 하기의 능력을 특징으로 한다: 1) 분자의 카르복실-말단에서부터 세었을 때 17번째 및 18번째 탄소 원자 사이의 지방산의 탈포화, 및 ARA에서 EPA로 및/또는 DGLA에서 ETA로의 전환을 촉매 (Δ17 데새투라제); 2) LA에서 GLA로 및/또는 ALA에서 STA로의 전환을 촉매 (Δ6 데새투라제); 3) DGLA에서 ARA로 및/또는 ETA에서 EPA로의 전환을 촉매 (Δ5 데새투라제); 4) 올레산에서 LA로의 전환을 촉매 (Δ12 데새투라제); 5) LA에서 ALA로의 전환을 촉매 (Δ15 데새투라제); 6) EDA에서 DGLA로 및/또는 ETrA에서 ETA로의 전환을 촉매 (Δ8 데새투라제); 7) DPA에서 DHA로의 전환을 촉매 (Δ4 데새투라제); 및/또는 8) 팔미테이트에서 팔미트올레산로 및/또는 스테아레이트에서 올레산으로의 전환을 촉매 (Δ9 데새투라제). 유사한 방식으로, 본원의 목적에 적합한 엘론가제는 특정한 공급원으로부터의 것으로 제한되지 않고, 대신에, 본원의 목적에 사용되는 효소는 엘론가제가 작용하는 기질에 비해 2개의 탄소만큼 지방산 탄소 쇄를 신장시켜서, 모노- 또는 다불포화 지방산을 생성하는 능력을 특징으로 한다. 보다 구체적으로, 이들 엘론가제는 하기 능력을 특징으로 한다: 1) LA에서 EDA로 및/또는 ALA에서 ETrA로의 신장 (Δ9 엘론가제); 2) C18 기질을 신장시켜 C20 생성물을 생성 (C18 /20 엘론가제); 3) C14 기질을 신장시켜 C16 생성물을 생성 (C14/16 엘론가제); 4) C16 기질을 신장시켜 C18 생성물을 생성 (C16 /18 엘론가제); 및/또는 5) C20 기질을 신장시켜 C22 생성물을 생성 (C20 /22 엘론가제). 또한, 일부 엘론가제는 광범위한 기질 특이성의 결과 여러 엘론가제 반응을 촉매할 수 있다는 것을 주목하는 것이 중요하다.
아실트랜스퍼라제 및 TAG 생합성의 최종 단계에서 이들의 역할
아실트랜스퍼라제는 TAG의 생합성과 밀접한 관계가 있다. 문헌 [D. Sorger and G. Daum, Appl. Microbiol. Biotechnol. 61:289-299 (2003)] 및 [H. Muellner and G. Daum, Acta Biochimica Polonica, 51 (2):323-347 (2004)]에서는 TAG 합성과 관련된 유전자 및 그를 유도하는 대사 중간체에 대한 상세한 설명을 비롯하여, 효모에서의 TAG 생합성에 대해 포괄적으로 간단히 고찰되었다. 상기 문헌의 저자들은 상이한 부류의 진핵세포 아실트랜스퍼라제 유전자 족에 대해 요약하였지만, 이들은 또한 지질 입자에서 TAG 생합성 및 천연 지질 형성의 조절적 측면이 명확하지 않음을 확인하였다.
중성 지질 합성을 유도하는 아실-CoA-의존성 또는 독립성 에스테르화 반응과 관련된 네 가지 진핵세포 아실트랜스퍼라제 유전자 족이 확인되었다:
(1) 아실-CoA:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 (ACAT) 족, EC 2.3.1.26 (일반적으로 스테롤 아실트랜스퍼라제로 공지됨). 이 족의 유전자는 아실-CoA 및 스테롤을 CoA 및 스테롤 에스테르로 전환시키는 것을 담당하는 효소를 포함한다. 이 족은 또한 TAG 생합성의 최종 단계와 관련된 DGAT1을 포함한다.
(2) 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 (LCAT) 족, EC 2.3.1.43. 이 족의 유전자는 포스파티딜콜린 및 스테롤을 스테롤 에스테르 및 1-아실글리세로포스포콜린으로 전환시키는 것을 담당한다. 이 족은 또한 인지질의 sn-2 위치의 아실기를 1,2-디아실글리세롤의 sn-3 위치로 전달하여 TAG를 생합성하는 것과 관련된 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (PDAT) 효소를 포함한다.
(3) 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DAG AT) 족, EC 2.3.1.20. 이 족의 유전자 (DGAT2 포함)는 TAG 생합성의 최종 단계와 관련이 있다.
(4) 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 및 아실-CoA 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 (GPAT/LPAAT) 족. GPAT (E.C. 2.3.1.15) 단백질은 TAG 생합성의 첫번째 단계를 담당하는 반면, LPAAT (E.C. 2.3.1.51) 효소는 TAG 생합성의 두번째 단계와 관련이 있다. 이 족은 또한 인지질과 CoA 사이에서의 아실 교환을 촉매하는 리소포스파티딜콜린 아실트랜스퍼라제 (LPCAT)를 포함한다.
또한, 이들 네 가지 아실트랜스퍼라제 유전자 족은 중성 지질 형성을 위한 중복 생합성 시스템을 나타내고, 상이한 조절, 대안적인 국부화, 및 상이한 기질 특이성의 결과인 것으로 여겨진다 (상기 문헌 [H. Muellner and G. Daum]). 이들 네 가지 각 유전자 족은 야로위아 리폴리티카에서 5％ 초과의 DHA를 합성하도록 하는 대사성 유전자 조작과 관련하여 중요하게 본원에서 논의될 것이다.
각종 아실트랜스퍼라제의 기능성
야로위아 리폴리티카에 존재하는 이러한 많은 아실트랜스퍼라제들 사이의 상호작용은 도 4에 개략적으로 도시하였다. TAG 생합성의 직접적인 메카니즘에 우선 초점을 맞추면, 이 과정의 제1 단계는 아실-CoA 1개 분자를 GPAT를 통해 sn-글리세롤-3-포스페이트로 에스테르화하여 리소포스파티드산 (LPA) (및 부산물로서의 CoA)를 생성하는 것이다. 이어서, 리소포스파티드산은 아실-CoA의 또다른 분자의 에스테르화에 의해 포스파티드산 (PA) (및 부산물로서의 CoA)으로 전환되며, 이 반응은 LPAAT에 의해 촉매된다. 이어서, 포스파티드산 포스파타제가 포스파티드산에서 포스페이트기를 제거하여 1,2-디아실글리세롤 (DAG)을 생성한다. 그 후, DAG AT (예컨대, DGAT1, DGAT2 또는 PDAT)에 의해서 DAG의 sn-3 위치에 세번째 지방산이 부가되어 TAG가 형성된다.
과거, DGAT1은 TAG 합성에 특이적으로 관여하여 아실-CoA기를 DAG로 전달하여 TAG를 형성함으로써 아실-CoA와 DAG를 TAG와 CoA로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소에 불과하다고 여겨졌다. DGAT1은 ACAT에 상동성인 것으로 알려져 있었으나, 최근의 연구를 통해, ACAT 유전자 족과는 관련이 없는 새로운 족의 DAG AT 효소가 밝혀졌다. 따라서, 이제는 명칭을 달리하여 ACAT 유전자 족과 관련이 있는 DAG AT 효소 (DGAT1 족) 및 관련이 없는 DAG AT 효소 (DGAT2 족)을 구별한다 [Lardizabal et al., J. Biol. Chem. 276(42):38862-38869 (2001)]. DGAT2 족의 구성원은 진핵생물의 모든 주요 종 (진균, 식물, 동물 및 원시(basal) 진핵생물)에서 확인된 바 있다.
훨씬 더 최근에, 문헌 [Dahlqvist et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 97:6487-6492 (2000)] 및 문헌 [Oelkers et al. (J. Biol. Chem. 275:15609-15612 (2000)]은 TAG 합성이 아실-CoA가 없어도 아실-CoA와 무관한 메카니즘을 통해 일어날 수 있음을 발견하였다. 구체적으로, PDAT가 포스파티딜콜린 기질의 sn-2 위치에서 아실기를 제거하여 DAG로 전달함으로써 TAG가 생성된다. 이 효소는 LCAT 족과 구조적으로 관련이 있고, PDAT의 기능이 DGAT2만큼 잘 특징규명되지는 않았지만 PDAT는 일부 오일종자 식물에서 인지질로부터 "독특한(unusual)" 지방산을 제거하는데 중요한 역할을 할 것이라고 추측되어 왔다 [Banas, A. et al., Biochem. Soc. Trans. 28(6):703-705 (2000)].
사카로마이세스 세레비지애에서의 TAG 합성과 관련하여, 3가지 경로가 기재된 바 있다 [Sandager, L. et al., J. Biol. Chem. 277(8):6478-6482 (2002)). 첫째, TAG는 DAG 및 아실-CoA로부터 DGAT2 (DGA1 유전자에 의해 코딩됨)의 활성에 의해 주로 합성된다. 그러나 보다 최근에는, PDAT (LRO1 유전자에 의해 코딩됨) 또한 확인된 바 있다. 최종적으로, 2종의 아실-CoA:스테롤-아실트랜스퍼라제 (ARE1 유전자 및 ARE2 유전자에 의해 코딩됨)는 아실-CoA 및 스테롤을 이용하여 스테롤 에스테르 (및 소량의 TAG, 문헌 [Sandager et al., Biochem. Soc. Trans. 28(6):700-702 (2000)] 참조)를 생성한다고 알려져 있다. PDAT와 DGAT2는 함께 사카로마이세스 세레비지애 중 오일 생합성의 대략 95％를 담당한다.
DGAT1, DGAT2, PDAT 및 ARE2를 코딩하는 여러가지 공개적으로 입수가능한 서열 (하기 참조)을 기초로, 본 발명자들은 야로위아 리폴리티카에서 DGAT1 (서열 122), DGAT2 (서열 130, 132 및 134 [여기서, 서열 130는 서열 132 및 서열 134에서 제공되는 것과 같은 2종 이상의 추가의 네스티드 ORF를 함유함. 서열 134에 의해 코딩되는 ORF는 다른 공지된 DGAT 효소와 높은 정도의 유사성을 보유하며 서열 134에서의 파괴는 천연 유전자의 DGAT 기능을 소실시키기 때문에, 서열 135의 폴리펩티드가 DGAT 기능성을 보유함이 확인됨]), PDAT (서열 117) 및 ARE2 (서열 119)를 코딩하는 유전자들을 단리하고 특징규명하였다. 그러나, 사카로마이세스 세레비지애에서 개발된 모델 (여기서는 PDAT와 DGAT2가 오일 생합성의 대략 95％를 담당함)과는 달리, 야로위아 리폴리티카의 PDAT, DGAT2 및 DGAT1은 오일 생합성을 최대 약 95％ 이하로 담당 (ARE2가 오일 생합성에 추가로 약간 기여할 수도 있음)하는 것으로 발견되었다.
야로위아 리폴리티카의 TAG 분획에서 DHA를 축적하는데 중요한 기능을 할 수 있는 최종 아실트랜스퍼라제 효소는 LPCAT이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 이 효소 (EC 2.3.1.23)는 sn-포스파티딜콜린의 sn-2 위치에서의 2원 아실 교환을 담당하여 ω-6 및 ω-3 PUFA 생합성을 증진시킨다는 가설이 있다. 이 가설은 하기 사람들의 연구를 기초로 한다: (1) 스팀느 에스.(Stymne S.) 및 에이.케이.스토바르트(A.K. Stobart) [Biochem J. 223(2):305-14(1984)]: 이들은 LPCAT가 아실-CoA 풀과 포스파티딜콜린 (PC) 풀 사이의 교환에 영향을 미칠 것이라는 가설을 세웠음; (2) 도메르구, 에프.(Domergue, F.) 등 [J. Bio. Chem 278:35115 (2003)]: 이들은 효모에서 PC의 sn-2 위치에 GLA가 축적되고 ARA가 효율적으로 합성될 수 없는 것은 아실-CoA 풀에서 일어나는 PUFA 생합성에 신장 단계가 포함되어 있으나 Δ5 및 Δ6 탈포화 단계는 PC의 sn-2 위치에서 우세하게 일어나기 때문이라고 제안하였음; (3) 아바디, 에이.(Abbadi, A.) 등 [The Plant Cell, 16:2734-2748 (2004)]: 이들은 트랜스제닉 오일종자 식물에서의 PUFA 축적 제약에 관한 분석을 기초로 하여, LPCAT가 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로의 성공적인 재구성에 중대한 역할을 한다고 제안하였음; (4) 제WO 2004/076617 A2호 (렌쯔, 에이.(Renz, A.) 등): 이들은 사카로마이세스 세레비지애에서 유전자 도입된 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로의 신장 효율을 실질적으로 개선시키는, 캐노르합디티스 엘레강스로부터의 LPCAT를 코딩하는 유전자 (T06E8.1)를 제공하였음. 데새투라제는 지질-커플링된 지방산 (sn-2 아실 PC)에서 이중 결합의 도입을 촉매하지만 엘론가제는 오로지 CoA 에스테르화된 지방산 (아실-CoA)의 신장만을 촉매하기 때문에, 본 발명자들은 LPCAT가 인지질과 아실-CoA 풀 사이에서 새로 합성된 지방산이 효율적이고 지속적으로 교환될 수 있게 한다고 결론을 내렸다.
DHA 합성을 위한 이종 아실트랜스퍼라제 유전자의 선별
야로위아 리폴리티카에서 천연적으로 생산된 PUFA는 18:2 지방산 (및 덜 통상적으로는, 18:3 지방산)으로 한정되기 때문에, GPAT, LPAAT (즉, LPAAT1 또는 LPAAT2), DGAT1, DGAT2, PDAT 및 LPCAT를 코딩하는 숙주 유기체의 천연 유전자는 18:3 이상의 길이를 갖는 지방산을 포함하는 TAG (예컨대, DHA)를 효율적으로 합성하는데 어려움이 있을 수 있다. 따라서, 일부 경우에서는 이종 (또는 "외래") 아실트랜스퍼라제가 천연 효소보다 바람직할 수 있다.
수많은 아실트랜스퍼라제 유전자가 여러 유기체에서 확인되었고, 간행물 및 특허 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 하기하는 진뱅크 관리 번호는 지질 생합성에 유용한 공개적으로 입수가능한 아실트랜스퍼라제 유전자의 예이다: CQ891256, AY441057, AY360170, AY318749, AY093169, AJ422054, AJ311354, AF251795, Y00771, M77003 (GPAT); Q93841, Q22267, Q99943, 015120, Q9NRZ7, Q9NRZ5, Q9NUQ2, O35083, Q9D1E8, Q924S1, Q59188, Q42670, P26647, P44848, Q9ZJN8, O25903 Q42868, Q42870, P26974, P33333, Q9XFW4, CQ891252, CQ891250, CQ891260, CQ891258, CQ891248, CQ891245, CQ891241, CQ891238, CQ891254, CQ891235 (LPAAT); AY445635, BC003717, NM_010046, NM_053437, NM_174693, AY116586, AY327327, AY327326, AF298815 및 AF164434 (DGAT1); 및 NC_001147 [유전자좌 NP_014888], NM_012079, NMJ 27503, AF051849, AJ238008, NM_026384, NM_010046, AB057816, AY093657, AB062762, AF221132, AF391089, AF391090, AF129003, AF251794 및 AF164434 (DGAT2); P40345, O94680, NP_596330, NP_190069 및 AB006704 [gi:2351069] (PDAT). 유사하게, 특허 문헌은 TAG 생성에 관여하는 유전자의 많은 추가 DNA 서열 (및/또는 상기 여러 유전자 및 이들의 단리 방법에 관한 상세 사항)을 제공한다 [예를 들어, 미국 특허 제5,210,189호, 제WO 2003/025165호 (GPAT), 유럽 특허 제1144649 A2호, 유럽 특허 제1131438호, 미국 특허 제5,968,791호, 미국 특허 제6,093,568호, 제WO 2000/049156호 및 제WO 2004/087902호 (LPAAT), 미국 특허 제6,100,077호, 미국 특허 제6,552,250호, 미국 특허 제6,344,548호, 미국 특허 출원 제2004/0088759 A1호 및 미국 특허 출원 제20040078836 A1호 (DGAT1), 미국 특허 출원 제2003/124126호, 제WO 2001/034814호, 미국 특허 출원 제2003/115632호, 미국 특허 출원 제2003/0028923호 및 미국 특허 출원 제2004/0107459호 (DGAT2), 제WO 2000/060095호 (PDAT) 및 제WO 2004/076617 A2호 (LPCAT)].
상기 예는 제한하고자 하는 것이 아니며, 다른 공급원으로부터 유래된 DGAT1, DGAT2, PDAT, GPAT, LPCAT 및 LPAAT를 코딩하는 수많은 다른 유전자가 야로위아 리폴리티카로의 도입에 적합하다. 예를 들어, 본 발명자들은 모르티에렐라 알피나 (서열 124 및 125), 뉴로스포라 크라싸 (서열 126), 지베렐라 제애 PH-1 (서열 127), 마그나포르테 그리세아 (서열 128) 및 아스페르길루스 니둘란스 (서열 129)로부터 신규 DGAT1을 확인하였고, 모르티에렐라 알피나로부터 신규 DGAT2 (서열 136 및 137), GPAT (서열 138 및 139), LPAAT1 (서열 108 및 109) 및 LPAAT2 (서열 110 및 111)를 확인하였다.
DHA 합성에 바람직한 아실트랜스퍼라제 유전자
야로위아 리폴리티카에서의 발현에 적합할 수 있는 아실트랜스퍼라제는 광범위하게 선택될 수 있지만, 본 발명의 바람직한 실시양태에서는 유의한 양의 더욱 장쇄의 ω-6 (예컨대, ARA) 및/또는 ω-3 (예컨대, EPA, DHA) PUFA를 생산하는 유기체로부터의 DGAT1, DGAT2, PDAT, GPAT, LPAAT 및 LPCAT가 선택된다. 따라서, 하기 효소 (또는 그의 유도체)가 특히 바람직하다:
DHA 를 고도로 생성하는 야로위아 리폴리티카 균주에서의 발현에 바람직한 이종 아실트랜스퍼라제
ORF 유기체 참조문헌 서열번호
DGAT1 모르티에렐라 알피나 동시 계류 중인 미국 특허 출원 제11/024544호 서열 124, 서열 125
DGAT2 모르티에렐라 알피나 동시 계류 중인 미국 특허 출원 제11/024545호 서열 136, 서열 137
GPAT 모르티에렐라 알피나 - 서열 138, 서열 139
LPAAT1 모르티에렐라 알피나 - 서열 108, 서열 109
LPAAT2 모르티에렐라 알피나 동시 계류 중인 미국 특허 출원 제60/689031호 서열 110, 서열 111
LPCAT 캐노르합디티스 엘레강스 클론 T06E8.1, 제WO 2004/076617 A2호 서열 121
본원에 개시한 본 발명을 한정하려는 것은 아니었지만, 모르티에렐라 알피나는 이종 아실트랜스퍼라제의 바람직한 공급원으로서 선택되었는데, 이는 상기 천연 유기체가 ARA를 전체 지방산 (TFA)의 50％ 초과의 농도로 생산할 수 있기 때문이다. 유사한 방식으로, 캐노르합디티스 엘레강스는 TFA의 최대 20 내지 30％를 EPA로 생산할 수 있다.
물론, 본 발명의 별법의 실시양태에서, 서열 108 내지 111, 121, 124, 125 및 136 내지 139에 의해 코딩되는 아실트랜스퍼라제와 실질적으로 동일한 다른 DNA 역시 야로위아 리폴리티카에서의 이종 발현에 사용되어 TAG 분획 중 EPA의 생성 및 축적을 용이하게 할 수 있다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 서열 108 내지 111, 121, 124, 125 및 136 내지 139에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 아실트랜스퍼라제를 코딩하는 코돈-최적화된 유전자가 사용된다.
외래 유전자의 발현을 위한 일반적인 발현 시스템, 카세트, 벡터 및 형질전환
외래 단백질의 고수준 발현을 지시하는 조절 서열, 예컨대 DHA의 고수준 생성을 유도하는 조절 서열을 함유하는 발현 벡터 및 미생물 발현 시스템은 당업자에게 공지되어 있다. 이들 중 임의의 것을 사용하여 바람직한 데새투라제, 엘론가제 및 아실트랜스퍼라제를 코딩하는 키메라 유전자를 구축할 수 있다. 이어서, 코딩된 효소의 고수준 발현을 제공하는 표준 형질전환 방법을 이용하여 이들 키메라 유전자를 야로위아 리폴리티카에 도입할 수 있다.
숙주 세포의 형질전환에 유용한 벡터 또는 DNA 카세트는 당업계에 공지되어 있다. 상기 구축물에 존재하는 서열들을 구체적으로 선택하는 것은, 원하는 발현 생성물, 숙주 세포의 특성, 및 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포를 분리하기 위해 제안된 수단에 따라 달라진다. 그러나 전형적으로, 상기 벡터 또는 카세트는 관련 유전자(들)의 전사 및 번역을 지시하는 서열, 선별가능한 마커 및 자율 복제 또는 염색체 통합을 허용하는 서열을 함유한다. 적합한 벡터는 전사 개시를 조절하는 유전자 (예컨대, 프로모터)인 영역 5' 및 전사 종결을 조절하는 DNA 단편 (즉, 종결자)인 영역 3'를 포함한다. 두가지 조절 영역 모두가 형질전환된 숙주 세포로부터의 유전자로부터 유래된 경우가 가장 바람직하지만, 이러한 조절 영역이 생성 숙주로서 선택된 특정 종에 천연인 유전자로부터 유래되어야 하는 것은 아님을 이해해야 한다.
2종 이상의 유전자가 별도의 복제 벡터로부터 발현되는 경우, 각 벡터는 상이한 선별 수단을 갖는 것이 바람직하며, 안정적인 발현을 유지하고 구축물 중 요소들의 재배열을 방지하기 위해서 다른 구축물과의 상동성이 없어야 한다. 조절 영역의 현명한 선택, 선별 수단 및 도입된 구축물의 증식 방법을 실험적으로 결정하여, 도입된 모든 유전자가 원하는 생성물의 합성을 위해 제공되기에 필요한 수준으로 발현되도록 할 수 있다.
관심 유전자(들)을 포함하는 구축물은 임의의 표준 기술을 이용하여 숙주 세포에 도입할 수 있다. 이들 기술로는 형질전환법 (예컨대, 리튬 아세테이트 형질전환 [Methods in Enzymology, 194:186-187 (1991)]), 원형질체 융합법, 볼리스트 충격(bolistic impact), 전기천공법, 미세주입법, 또는 관심 유전자(들)을 숙주 세포에 도입하는 임의의 다른 방법 등이 있다. 야로위아 리폴리티카에 적용할 수 있는 더욱 구체적인 교시 문헌으로는, 미국 특허 제4,880,741호 및 동 제5,071,764호 및 문헌 [Chen, D. C. et al. (Appl Microbiol Biotechnol. 48(2):232-235 (1997))] 등이 있다.
편의상, 본원에서는 임의의 방법으로 조작되어 DNA 서열 (예컨대, 발현 카세트)이 도입된 숙주 세포를 "형질전환" 또는 "재조합"된 것이라고 지칭할 것이다. 형질전환된 숙주는 발현 구축물의 카피를 1개 이상 보유할 것이며, 유전자가 게놈에 통합되었는지, 증폭되었는지 또는 다중 카피수를 갖는 염색체외 요소에 존재하는지 여부에 따라 2개 또는 그 이상일 수 있다. 형질전환된 숙주 세포는 제WO 2004/101757호 및 제WO 2005/003310호에 기재된 것과 같은 다양한 선별 기술로 확인할 수 있다.
본원에서 사용하기에 바람직한 선별 방법은 카나마이신, 하이그로마이신 및 아미노 글리코시드 G418에 대한 내성, 및 또한 우라실, 루이신 또는 히스티딘이 없는 배지에서의 성장 능력이다. 별법의 실시양태에서, 5-플루오로오로트산 (5-플루오로우라실-6-카르복실산 1수화물, "5-FOA")이 효모 Ura- 돌연변이체의 선별에 사용된다. 상기 화합물은 오로티딘 5'-모노포스페이트 데카르복실라제 (OMP 데카르복실라제)를 코딩하는 기능적 URA3 유전자를 보유하는 효모 세포에 독성이고, 따라서, 이러한 독성을 기초로, 5-FOA는 Ura- 돌연변이체 효모 균주의 선별 및 확인에 특히 유용하다 [Bartel, P. L. and Fields, S., Yeast 2-Hybrid System, Oxford University: New York, v. 7, pp 109-147, 1997].
본원에서 이용되는 별법의 바람직한 선별 방법은 술포닐우레아 내성을 기초로 하는, 야로위아 리폴리티카에 대한 우성의 비-항생제 마커에 의존한다. 상기 기술은 또한 일반적으로 반수체, 이배체, 이수체(異數體) 또는 이형접합체일 수 있는 다른 산업상의 효모 균주에도 적용될 수 있다. 산업상의 효모 균주를 위한 유전적 형질전환 시스템의 개발에 있어서 (1) 천연적으로 영양요구성인 균주가 거의 없고, 자발적이거나 유도된 영양요구성 돌연변이체의 단리가 균주의 배수성으로 인해 곤란하며, (2) 항생제 내성 유전자를 보유하는 유전자 변형된 유기체의 방출에 대한 제약으로 인해서 항생제 내성 마커의 사용이 균주의 상업적 이용을 제한할 수 있다는 2가지 주요 한계를 극복할 것이라 예측된다. 푸이그(Puig) 등 [J. Agric. Food Chem. 46:1689-1693 (1998)]은 표적 균주를 유전자 조작하여 유리딘에 대한 영양요구성으로 만들고 이후에는 URA3 마커를 사용하여 관심 형질을 도입하는 것을 기초로 하여 이러한 한계를 극복하는 방법을 개발하였지만, 상기 전략은 불필요한 작업이 요구되어 지나치게 소모적이다.
본원에 개시된, 야로위아 리폴리티카를 형질전환시키기 위한 신규한 술포닐우레아 내성 선별 마커는 외래 유전자가 아닌 돌연변이체 천연 유전자에 의존한다. 따라서, 따라서, 영양요구성일 필요도 없으며 영양요구성을 초래하지도 않고 야생형 균주의 형질전환을 초래하지도 않는다. 보다 구체적으로, 마커 유전자 (서열 243)는 술포닐 우레아 제초제 내성을 부여하는 단일 아미노산 변화 (W497L)를 갖는 천연 아세토히드록시산 신타제 (AHAS 또는 아세토락테이트 신타제, E.C. 4.1.3.18)이다. AHAS는 분지쇄 아미노산의 생합성 경로에서 공통적인 첫번째 효소이며, 술포닐우레아 및 이미다졸리논 제초제의 표적이다. W497L 돌연변이는 사카로마이세스 세레비지애에서의 작업에 근거하여 공지되어 있다 ([Falco, S. C, et al., Dev. Ind. Microbiol. 30:187-194 (1989)], [Duggleby, R.G., et. al. Eur. J. Biochem. 270:2895 (2003)]). 다음과 같은 결과를 나타낸 초기 시험을 통해, 야로위아 세포가 제초제에 천연적으로 내성이 있지는 않음이 결정되었다: 1) 제초제 흡수가 불량하거나 흡수하지 않음, 2) AHAS의 천연적인 제초제-내성 형태가 존재함, 및/또는 3) 제초제-불활성화 메카니즘을 이용함. 이로써, 형질전환체의 선별 수단으로서 돌연변이체 AHAS 유전자 (서열 243)의 합성 및 사용이 가능해졌다.
선별 마커를 재사용하는 추가의 방법은 부위-특이적 레콤비나제 시스템에 의존한다. 간략하게 설명하면, 상기 부위-특이적 재조합 시스템은 (1) 특징적인 DNA 서열 [예컨대 LoxP]을 갖는 재조합 부위, 및 (2) 2개 이상의 재조합 부위가 동일 DNA 분자상에서 소정의 간격을 두고 동일 방향으로 배향되어 있는 경우에 DNA 서열에 특이적으로 결합하여 DNA 서열들 사이의 재조합 (즉, 제거)을 촉매하는 레콤비나제 효소 [예컨대 Cre]의 2가지 요소로 구성된다. 바람직한 선별 마커 쌍이 여러 회의 순차적인 형질전환에 사용되도록 이것을 "재순환"시키는 것이 가능하기 때문에, 이 방법은 선별 수단으로서 유용성이 있다.
구체적으로, 숙주 게놈에 삽입되는 것이 바람직한 표적 유전자 (예컨대, 데새투라제, 엘론가제, 아실트랜스퍼라제), 및 또한 재조합 부위들로 측접(flnaking)되어 있는 제1 선별 마커 (예컨대, Ura3, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 [HPT])를 포함하는 통합 구축물을 제조한다. 형질전환 및 형질전환체의 선별 후, 제2 선별 마커 (예컨대, 술포닐우레아 내성 [AHAS]) 및 게놈에 도입된 부위-특이적 재조합 부위를 인식하는데 적합한 레콤비나제를 보유하는 복제 플라스미드를 도입함으로써 제1 선별 마커를 염색체로부터 제거해 낸다. 제2 마커를 보유하는 형질전환체의 선별 및 숙주 게놈으로부터의 제1 선별 마커 제거를 확인한 후, 상기 복제 플라스미드는 숙주에 의해 구별없이 관리(cure)된다. 이로써 제1 선별 마커와 제2 선별 마커 어느 것도 보유하지 않는 형질전환체가 생성되며, 따라서 상기 관리된 균주는 또다른 회의 형질전환에 이용될 수 있다. 당업자는 상기 방법이 본 발명에서 사용되는 특정 선별 마커 또는 특정 부위-특이적 재조합 시스템에 한정되는 것이 아님을 인지할 것이다.
야로위아 리폴리티카 중 외래 유전자의 과발현
당업자에게 공지된 바와 같이, 유전자 (예컨대, 데새투라제)를 클로닝 벡터에 삽입하는 것만으로는 이것이 필요한 수준으로 성공적으로 발현될 것을 보장하지 못한다. 전사, 번역, 단백질 안정성, 산소 제한 및 숙주 세포로부터의 분비 측면을 조절하는 수많은 상이한 유전자 요소들을 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 보다 구체적으로, 유전자 발현은 다음을 변경함으로써 조절될 수 있다: 관련 전사 프로모터 및 종결자 서열의 성질, 클로닝된 유전자의 카피 수, 상기 유전자가 플라스미드에 보유되는지 또는 숙주 세포의 게놈에 통합되는지의 여부, 합성된 외래 단백질의 최종적인 세포내 위치, 숙주 유기체 중에서의 번역 효율, 숙주 세포 중 클로닝된 유전자 단백질의 내재적 안정성, 및 클로닝된 유전자 내에서 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용 빈도에 도달할만큼의 코돈 사용. 이러한 과발현 방법 중 여러가지가 이하에서 논의될 것이고, 본 발명에서 예를 들어 야로위아 리폴리티카 중 데새투라제, 엘론가제 및 아실트랜스퍼라제의 과발현을 위한 수단으로서 유용하다.
원하는 유전자(들)의 발현은 mRNA 또는 코딩된 단백질로부터 불안정화 서열을 제거/결실시키거나, 또는 상기 mRNA에 안정화 서열을 부가함으로써 더 강력한 프로모터 (조절형 또는 구성적 프로모터)의 사용을 통해 전사 수준에서 증가되어 발현이 증가될 수 있다 (미국 특허 제4,910,141호).
원하는 숙주 세포에서 데새투라제, 엘론가제 및 아실트랜스퍼라제 유전자의 발현을 구동시키는데 유용한 개시 조절 영역 또는 프로모터는 매우 다양하며 당업자에게 알려져 있다. 사실상, 야로위아 리폴리티카에서 이들 유전자의 발현을 지시할 수 있는 임의의 프로모터가 본 발명에 적합하다. 숙주 세포에서의 발현은 일시적이거나 안정적인 방식으로 수행될 수 있다. 일시적 발현은 관심 유전자에 작동가능하게 연결된 조절가능한 프로모터의 활성을 유도하여 달성될 수 있고, 별법으로, 안정적인 발현은 관심 유전자에 작동가능하게 연결된 구성적 프로모터를 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 효모인 경우에는 특히 상기 숙주 종으로부터 유래된, 효모 세포에서 기능적인 전사 영역 및 번역 영역이 제공된다. 전사 개시 조절 영역은 예를 들어 1) 해당 경로 중의 유전자, 예컨대 알콜 데히드로게나제, 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제, 포스포글리세레이트 뮤타제, 프럭토스-비스포스페이트 알돌라제, 포스포글루코스-이소머라제, 포스포글리세레이트 키나제, 글리세롤-3-포스페이트 O-아실트랜스퍼라제 등, 또는 2) 조절가능한 유전자, 예컨대 산 포스파타제, 락타제, 메탈로티오네인, 글루코아밀라제, 번역 신장 인자 EF1-α (TEF) 단백질 (미국 특허 제6,265,185), 리보솜 단백질 S7 (미국 특허 제6,265,185), 암모늄 수송자 단백질, 방출 단백질 등으로부터 얻을 수 있다. 구성적 전사를 원하는지 또는 유도된 전사를 원하는지의 여부, 관심 ORF의 발현에 있어서의 프로모터 효율, 구축의 용이성 등에 따라, 수많은 조절 서열 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 상기한 예는 본원에 개시한 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
당업자가 알고 있는 바와 같이, 다양한 프로모터의 활성 비교에는 여러가지 방법이 이용가능하다. 이러한 유형의 비교는, 각 프로모터를 이들 프로모터에 ω-6 및 ω-3 지방산의 생성에 유용한 키메라 유전자의 구축이 필요한 추가의 용도에 사용하기 위한 프로모터 강도 결정을 용이하게 하는데 유용하다. 따라서, 리포터 유전자 (즉, β-글루쿠로니다제 (GUS)를 코딩하는 이. 콜라이(E. coli) 유전자)의 발현을 기초로 하여 프로모터 활성을 간접적으로 정량하는 것이 유용할 수 있다. 별법의 실시양태에서, 때로는 더욱 정량적인 수단을 이용하여 프로모터 활성을 정량화하는 것이 유용할 수 있다. 적합한 방법 중 하나는 실시간 PCR (실시간 PCR 이용에 대하여 일반적으로 고찰하기 위해서는, 문헌 [Ginzinger, D. J., Experimental Hematology, 30:503-512 (2002)] 참조)을 이용하는 것이다. 실시간 PCR은 형광성 리포터의 검출 및 정량화를 기초로 한다. 이 신호는 반응물 중 PCR 생성물의 양에 직접 비례하여 증가한다. 각 주기에서 형광 방출의 양을 기록함으로써, PCR 생성물의 양에 있어서의 최초의 유의한 증가가 표적 주형의 초기 양과 상관관계가 있는 지수 성장기 동안의 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 앰플리콘을 정량적으로 검출하기 위한 2가지 일반적 방법이 있다: (1) 형광성 프로브의 사용, 또는 (2) DNA-결합제 (예컨대, SYBR-그린 I, 에티듐 브로마이드)의 사용. 상대적인 유전자 발현 비교를 위해, 내인성 조절을 내부 기준물 (예컨대, 염색체에 의해 코딩되는 16S rRNA 유전자)로서 사용하여, 각각의 실시간 PCR 반응에 첨가되는 DNA의 총량에 있어서의 차이에 대해 표준화할 수 있도록 할 필요가 있다. 실시간 PCR에 대한 구체적인 방법은 당업계에 문서화되어 있다. 예를 들어 문헌 [Real Time PCR Special Issue (Methods, 25(4):383-481 (2001)]을 참조한다).
실시간 PCR 반응 후에, 기록된 형광 강도를 이용하여 하기 방법을 통해 주형의 양을 정량한다: 1) 절대적 표준 방법 (알려진 양의 기준물, 예컨대 시험관내 번역된 RNA (cRNA)를 사용함), 2) 상대적 표준 방법 (알려진 양의 표적 핵산을, 디자인된 검정법의 각 운행에 포함시킴), 또는 3) 유전자 발현의 상대적 정량화를 위한 비교 CT 방법 (ΔΔCT) (표적 서열의 상대적 양을, 선택된 임의의 기준물 값과 비교하고, 그 결과를 기준 값에 대한 상대치로서 나타냄). 비교 CT 방법은, 우선 표적의 CT 값과 표준물의 CT 값 사이의 차이 (ΔCT)를 결정하는 것이 필요하다: ΔCT = CT (표적) - CT (표준물). 정량할 각 샘플에 대해 이 값을 계산하고, 한 샘플을 각각의 비교가 수행될 기준물로서 선택해야 한다. 비교 ΔΔCT 계산은 각 샘플의 ΔCT와 기준선의 ΔCT 사이의 차이를 알아낸 후에, 이들 값을 식 2-ΔΔ CT에 따른 절대값으로 변환시키는 것을 포함한다.
야로위아 리폴리티카에서의 발현에 적합할 수 있는 프로모터의 선택폭은 매우 다양하지만, 본 발명의 바람직한 실시양태에서는 프로모터가 하기 표 9에 기재한 프로모터 (또는 그의 유도체)로부터 선택된다:
야로위아 리폴리티카에서의 과발현에 바람직한 천연 프로모터
프로모터 명칭 위치 * 천연 유전자 활성 "등급" 참조문헌 서열번호
TEF --- 번역 신장 인자 EF1-α 1 미국 특허 제6,265,185호 (뮬러 (Muller) 등), 진뱅크 관리 번호 AF054508 서열 218
GPD -968 bp 내지 +3 bp 글리세르알데히드- 3-포스페이트- 데히드로게나제 2 제WO 2005/ 003310호 서열 210
GPM -875 bp 내지 +3 bp 포스포-글리세레이트 뮤타제 1 제WO 2005/ 003310호 서열 212
FBA -1001 bp 내지 -1 bp 프럭토스-비스포스페이트 알돌라제 4 제WO 2005/ 049805호 서열 213
FBAIN -804 bp 내지 +169 bp (102 bp 인트론 [+64 내지 +165] 포함) 프럭토스-비스포스페이트 알돌라제 7 제WO 2005/ 049805호 서열 214
FBAINm -804 bp 내지 +169 bp, 변형됨*** 프럭토스-비스포스페이트 알돌라제 5 제WO 2005/ 049805호 서열 215
GPDIN -973 bp 내지 +201 bp (146 bp 인트론 [+49 내지 +194] 포함) 글리세르알데히드- 3-포스페이트- 데히드로게나제 3 동시 계류 중인 미국 특허 출원 제11/183664호 서열 211
GPAT -1130 bp 내지 +3 bp 글리세롤-3-포스페이트-O- 아실트랜스퍼라제 5 동시 계류 중인 미국 특허 출원 제11/225354호 서열 216
YAT1 -778 bp 내지 -1 bp 암모늄 수송자 효소 6 동시 계류 중인 미국 특허 출원 제11/185301호 서열 217
EXP1 -1000 bp 내지 -1 bp 방출 단백질 6 ---- 서열 221
* 천연 유전자에 대한 위치임. 여기서, 'ATG' 번역 개시 코돈의 'A' 위치를 +1로 함. *** FBAINm 프로모터는 FBAIN 프로모터의 변형된 형태로, FBAINm이 FBAIN 프로모터의 ATG 번역 개시 코돈과 인트론 사이에 52 bp 결실부를 가지며 (따라서, N-말단의 22개 아미노산만을 포함함) 인트론 뒤에 새로운 번역 컨센서스 모티프를 가짐. 추가로, 발현될 유전자의 코딩 영역과 융합될 경우에 FBAIN 프로모터는 융합 단백질을 생성하지만, FBAINm 프로모터는 그러한 융합 단백질을 생성하지 않음.
GPM의 활성은 TEF과 거의 동일하지만, GPD, FBA, FBAIN, FBAINm, GPDIN, GPAT, YAT1 및 EXP1의 활성은 모두가 TEF보다 높다 (활성은, "활성 등급"이라는 제목의 컬럼에서 상대적 방식으로 정량화함. 여기서, '1'은 가장 낮은 활성을 갖는 프로모터에 상응하고 '7'은 가장 높은 활성을 갖는 프로모터에 상응함). 이러한 정량화는 각 프로모터가 리포터로서 β-글루쿠로니다제 (GUS)를 코딩하는 이. 콜라이 유전자 [Jefferson, R.A. Nature. 14;342:837-838 (1989)] 및 야로위아 Xpr 유전자의 3' 영역의 약 100 bp를 보유하는 키메라 유전자의 생성에 사용된 비교 연구를 기초로 한다. 각각의 발현된 구축물에서의 GUS 활성은, 조직화학적 및/또는 형광측정 검정 [Jefferson, R. A. Plant Mol. Biol. Reporter 5:387-405 (1987)] 및/또는 실시간 PCR의 이용으로 측정한 것이다.
YAT1 프로모터는, 본 발명자들에 의해 야로위아 내에서 유질 조건 (즉, 질소 제한)하에 유도가능한 것으로 확인된 최초의 프로모터로서 특징규명되었다는 점에서 독특하다. 구체적으로, YAT1 프로모터는 질소 (예컨대, 최대 약 0.5％의 암모늄 술페이트)를 함유하는 배지 중에서 활성이지만, 상기 프로모터의 활성은 숙주 세포를 질소-제한 조건 (예컨대, 암모늄을 매우 낮은 수준으로 함유하거나 암모늄이 없는 배지 중)하에서 성장시킬 경우에 증가한다. 따라서, 바람직한 배지는 암모늄 술페이트 또는 다른 적합한 암모늄 염을 약 0.1％ 미만으로 함유하는 것이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, YAT1 프로모터는, 숙주 세포를 탄소:질소의 비율 (즉, C:N)이 높은 배지, 예컨대 약 8 내지 12％ 글루코스 및 약 0.1％ 이하의 암모늄 술페이트를 함유하는 고농도 글루코스 배지 (HGM)에서 성장시킬 경우에 유도된다. 이들 조건은 또한 유질인 효모 (예컨대, 야로위아 리폴리티카) 중에서 유질성을 유도하기에도 충분하다. 세포 추출물의 GUS 활성을 기초로, 세포를 최소 배지에서 HGM으로 변경시켜 24시간 동안 성장시킬 때 YAT1 프로모터의 활성은 약 37배 증가하였고, HGM 중에서 120시간이 지난 후에는 이 활성이 다소 저하되었으나 질소를 포함하는 최소 배지 중에서의 활성에 비해 여전히 25배 더 높았다 (실시예 1).
물론, 본 발명의 별법의 실시양태에서, 상기 표 9에 기재한 임의의 프로모터 영역으로부터 유래된 다른 프로모터도 야로위아 리폴리티카에서 TAG 분획물 중 DHA의 생성과 축적을 용이하게 하기 위한 이종 발현에 사용될 수 있다. 특히, 상기한 임의의 프로모터의 길이 변형은 동일한 활성을 갖는 돌연변이체 프로모터를 초래할 수 있는데, 이는 이들 조절 서열의 정확한 경계가 아직 완전하게 규명되지 못했기 때문이다. 별법의 실시양태에서, FBAIN 및 GPDIN 프로모터의 인트론 내에 위치한 인핸서를 사용하여 천연 야로위아 프로모터에 비해 활성이 증가된 키메라 프로모터를 생성할 수 있다 (예컨대, 키메라 GPM::FBAIN 및 GPM::GPDIN 프로모터 (서열 219 및 서열 220)는 야로위아 Xpr 유전자 3' 영역의 약 100 bp와 함께 GUS 리포터 유전자의 발현을 구동시킬 경우, GPM 프로모터 단독인 경우에 비해 활성이 증가되었음).
종결 영역은 개시 영역이 얻어진 유전자 또는 상이한 유전자의 3' 영역으로부터 유래될 수 있다. 다수의 종결 영역이 공지되어 있으며 다양한 숙주에서 (이들이 유래된 속과 종이 동일한 경우와 상이한 경우 둘다에 이용될 때) 만족스런 기능을 발휘한다. 종결 영역은 일반적으로 임의의 특정 성질이 아니라 편의성을 위주로 선택된다. 종결 영역은 효모 유전자, 특히 사카로마이세스, 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 칸디다, 야로위아 또는 클루이베로마이세스로부터 유래되는 것이 바람직하다. γ-인터페론 및 α-2 인터페론을 코딩하는 포유동물 유전자의 3'-영역도 효모에서 기능하는 것으로 공지되어 있다. 또한, 종결 조절 영역도 바람직한 숙주에 천연인 각종 유전자로부터 유래될 수도 있다. 임의로, 종결 부위는 필요치 않을 수 있지만, 이것이 포함되는 것이 가장 바람직하다. 제한하려는 것은 아니지만, 본원의 개시 내용에 유용한 종결 영역으로는 야로위아 리폴리티카 세포외 프로테아제 (XPR (진뱅크 관리 번호 M17741)) 3' 영역의 약 100 bp, 아실-coA 옥시다제 (Aco3 (진뱅크 관리 번호 AJ001301 및 CAA04661), Pox3 (진뱅크 관리 번호 XP_503244)) 종결자, Pex20 (진뱅크 관리 번호 AF054613) 종결자, Pex16 (진뱅크 관리 번호 U75433) 종결자, Lip1 (진뱅크 관리 번호 Z50020) 종결자, Lip2 (진뱅크 관리 번호 AJ012632) 종결자, 및 3-옥소아실-coA 티올라제 (OCT, 진뱅크 관리 번호 X69988) 종결자 등이 있다.
상기한 데새투라제, 엘론가제 및/또는 아실트랜스퍼라제 유전자의 추가의 카피 (즉, 1개 초과의 카피)가 야로위아 리폴리티카에 도입되어 DHA 생산 및 축적을 증가시킬 수 있다. 구체적으로, 추가의 카피의 유전자가 단일 발현 구축물 내에 클로닝될 수 있고/있거나; 플라스미드 카피수를 증가시키거나 클로닝된 유전자를 게놈에 다중 통합시킴으로써 추가의 카피의 클로닝된 유전자(들)이 숙주 세포에 도입될 수 있다 (하기 참조). 예를 들어 한 실시양태에서, 야로위아 리폴리티카의 균주 (즉, 균주 Y3000)는 3개 카피의 Δ12 데새투라제, 2개 카피의 Δ6 데새투라제, 4개 카피의 C18 /20 엘론가제, 5개 카피의 Δ5 데새투라제, 3개 카피의 Δ17 데새투라제, 3개 카피의 C16 /18 엘론가제, 1개 카피의 C20 /22 엘론가제 및 1개 카피의 Δ4 데새투라제를 포함하는 키메라 유전자를 야로위아 게놈에 도입 및 통합시켜서 DHA를 5％ 초과로 생산하도록 유전자 조작되었다.
일반적으로, 일단 유질 효모 중에서의 발현에 적합한 DNA (예컨대, 프로모터, ORF 및 종결자를 포함하는 키메라 유전자)가 수득되면, 이것을 숙주 세포 중에서 자가 복제가 가능한 플라스미드 벡터에 위치시키거나, 또는 숙주 세포의 게놈에 직접 통합시킨다. 발현 카세트의 통합은 숙주 게놈 내에서 무작위로 일어날 수도 있고, 또는 숙주 유전자좌와의 재조합을 표적화하기에 충분할 만큼 숙주 게놈에 상동성인 영역을 함유하는 구축물을 사용하여 표적화될 수도 있다. 본 발명에서 제한되지는 않지만, 전사 조절 영역 및 번역 조절 영역의 전부 또는 일부는 구축물이 표적화되는 내인성 유전자좌에 의해 제공될 수 있다.
본 발명에서, 야로위아 리폴리티카에서 유전자를 발현시키는 바람직한 방법은 선형 DNA를 숙주의 게놈으로 통합시키는 것이고, 게놈 내 여러 위치에 통합시키는 것이 유전자의 고수준 발현을 원하는 경우에 특히 유용할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 게놈 내에 다중 카피로 존재하는 서열을 동정하는 것이 바람직하다.
슈미드-베르거(Schmid-Berger) 등 [J. Bact. 176(9):2477-2482 (1994)]은 야로위아 리폴리티카에서 최초의 레트로트란스포손-유사 요소 Ylt1을 발견하였다. 이 레트로트란스포손은 제타 영역이라고 불리는 긴 말단 반복부 (LTR; 각각 대략 700 bp 길이)의 존재를 특징으로 한다. Ylt1 및 솔로 제타 요소들은 게놈 내에서 각각 35개 이상의 카피/게놈 및 50 내지 60개 카피/게놈으로 분산되어 존재하였다. 이들 두 요소 모두가 상동성 재조합 부위로서 기능하는 것으로 결정되었다. 추가로, 쥬렛젝(Juretzek) 등의 연구 [Yeast 18:97-113 (2001)]는 플라스미드를 효모 게놈의 반복적 영역에 표적화함으로써 (양 말단에 LTR 제타 영역을 갖는 선형 DNA를 사용함), 적은 카피 수의 플라스미드 형질전환체를 사용하여 달성되는 발현에 비해 유전자 발현이 크게 증가할 수 있음을 입증하였다. 따라서, 제타-지시된 통합은 플라스미드 DNA를 야로위아 리폴리티카에 다중 통합시켜서 유전자 발현이 고수준이 되게 하는 수단으로서 이상적일 수 있다. 그러나 불행히도, 야로위아 리폴리티카의 모든 균주가 제타 영역을 보유하는 것은 아니다 (예컨대, ATCC #20362로 동정된 균주). 균주에 이러한 영역이 없는 경우, 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 DNA를 별법의 유전자좌에 통합시켜서 발현 카세트를 원하는 카피수로 만드는 것도 가능하다. 예를 들어, 바람직한 별법의 유전자좌로는 Ura3 유전자좌 (진뱅크 관리 번호 AJ306421), Leu2 유전자의 유전자좌 (진뱅크 관리 번호 AF260230), Lys5 유전자 (진뱅크 관리 번호 M34929), Aco2 유전자의 유전자좌 (진뱅크 관리 번호 AJ001300), Pox3 유전자의 유전자좌 (Pox3 (진뱅크 관리 번호 XP_503244) 또는 Aco3 (진뱅크 관리 번호 AJ001301)), Δ12 데새투라제 유전자의 유전자좌 (서열 28), Lip1 유전자의 유전자좌 (진뱅크 관리 번호 Z50020) 및/또는 Lip2 유전자의 유전자좌 (진뱅크 관리 번호 AJ012632) 등이 있다.
유리하게도, Ura3 유전자는 5-FOA 선별 (상기 문헌)을 병행하여 반복적으로 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 천연 Ura3 유전자를 우선 넉아웃(knockout)시켜서 Ura- 표현형을 갖는 균주를 생성할 수 있고, 이때의 선별은 5-FOA 내성을 기초로 한다. 이어서, 다중 키메라 유전자 및 신규한 Ura3 유전자의 클러스터(cluster)를 야로위아 게놈의 상이한 유전자좌에 통합시킴으로써 Ura+ 표현형을 갖는 신규 균주를 생성할 수 있다. 도입된 Ura3 유전자가 넉아웃된 경우에는 이후의 통합에 의해 새로운 Ura3- 균주 (다시 5-FOA 선별을 이용하여 동정함)를 생성할 수 있다. 따라서, Ura3 유전자 (5-FOA 선별을 병행함)를 여러 회의 형질전환에서 선별 마커로서 이용할 수 있고, 이에 따라 유전자 변형물이 야로위아 게놈에 간편한 방식으로 쉽게 통합되도록 할 수 있다.
몇몇 예에서는, 본 발명의 단백질을 상이한 세포내 구획 (예컨대, 아실-CoA 풀 vs . 포스파티딜콜린 풀)으로 지시하는 것이 유용할 것이다. 본원에 기재한 목적상, DHA는 유리 지방산으로서 존재하거나 또는 에스테르화된 형태, 예컨대 아실글리세롤, 인지질, 술포지질 또는 당지질로서 존재할 수 있다. DHA 생합성을 허용하는 폴리펩티드를 코딩하는 상기 키메라 유전자가 적절한 세포내 표적화 서열을 포함하도록 추가로 유전자 조작될 수 있음이 이해된다.
쥬렛젝 등 [Yeast, 18:97-113 (2001)]은 야로위아 리폴리티카 내에서 통합된 플라스미드 카피수의 안정성이 개개의 형질전환체, 수용성 균주 및 사용된 표적화 플랫폼에 따라 달라진다는 것에 주목하였다. 따라서, 당업자는 원하는 발현 수준 및 패턴을 보이는 균주를 수득하기 위해서 다중 형질전환체가 스크리닝되어야 함을 인지할 것이다. 이러한 스크리닝은 DNA 블럿의 써던 분석 [Southern, J. Mol. Biol. 98:503 (1975)], mRNA 발현의 노던 분석 [Kroczek, J. Chromatogr. Biomed. Appl., 618(1-2):133-145 (1993)], 단백질 발현의 웨스턴 분석, PUFA 생성물의 표현형 분석 또는 GC 분석으로 수행될 수 있다.
요약하면, 상기 수단 각각은 야로위아 리폴리티카에서 특정 유전자 생성물 (예컨대, 데새투라제, 엘론가제, 아실트랜스퍼라제)의 발현을 증가시키는데 유용하며, 생명공학 분야의 당업자는 DHA를 많이 생산할 수 있는 가장 적절한 조합의 방법들을 쉽게 선택할 수 있을 것이다.
DHA 생산 증가를 위한 경로의 조작
상기 방법은 개개의 이종 유전자 발현을 상향 조절하는데 유용하지만, 야로위아 리폴리티카에서 DHA 생산을 증가시키는 것은 훨씬 더 복잡한 일이고 다양한 대사 경로를 조화롭게 조작하는 것이 요구될 수 있다. PUFA 생합성 경로의 조작이 우선 이루어진 후에 TAG 생합성 경로 및 TAG 분해 경로에서의 바람직한 조작이 뒷따를 것이다.
앞서 기재한 바와 같이, DHA를 전체 오일 분획의 5％ 초과로, 또는 더욱 바람직하게는 DHA를 전체 오일 분획의 10％ 초과로, 또는 훨씬 더욱 바람직하게는 DHA를 전체 오일 분획의 15 내지 20％ 초과로, 또는 가장 바람직하게는 DHA를 전체 오일 분획의 25 내지 30％ 초과로 생산하는 야로위아 리폴리티카 균주의 구축에는 (1) 적어도 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로를 발현하기 위한 Δ6 데새투라제, C18/20 엘론가제, Δ5 데새투라제 및 Δ17 데새투라제 또는 Δ15 데새투라제 (또는 둘다), C20 /22 엘론가제 및 Δ4 데새투라제; 또는 (2) 적어도 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 발현하기 위한 Δ9 엘론가제, Δ8 데새투라제, Δ5 데새투라제 및 Δ17 데새투라제 또는 Δ15 데새투라제 (또는 둘다), C20 /22 엘론가제 및 Δ4 데새투라제가 필요하다. 그러나, 이들 중 어느 실시양태에서도 숙주 균주에 Δ9 데새투라제, Δ12 데새투라제, C14 /16 엘론가제 및/또는 C16 /18 엘론가제를 추가로 포함시키는 것이 바람직할 수 있다.
일부 경우에서는, 천연 야로위아 리폴리티카 Δ12 데새투라제를 푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제로 대체하는 것이 유리한 것으로 입증될 수 있으며, 이는 푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제가 증가된 기질 전환율(％)을 나타내기 때문이다 (제WO 2005/047485호). 보다 구체적으로, 이들 2종의 Δ12 데새투라제 모두가 올레산이 LA로 전환되는 것을 촉매하지만, 상기 2종의 효소는 전반적인 특이성 (이에 따라 각 효소의 기질 전환율(％)이 영향을 받음)이 상이하다. 본 발명자들은 푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제가 LA를 포스포티딜콜린 기질의 sn-2 위치 (이로써 Δ6 데새투라제에 의한 이후의 반응을 용이하게 함)에 이동시키는 능력(loading capacity)이 야로위아 리폴리티카 Δ12 데새투라제보다 더 높다고 결정하였다. 이것을 기초로, 푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제의 과발현과 야로위아 리폴리티카 Δ12 데새투라제의 넉아웃은 DHA로의 추후 전환을 위한 생성물을 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 유기체의 천연 DAG AT의 활성을 조절함으로써 야로위아 리폴리티카 숙주의 지질 및 오일 내 PUFA의 백분율을 조작하는 것이 유용할 수 있다. 구체적으로, 오일 생합성이 유질화 동안 다중불포화와 경쟁한다고 예측되기 때문에, 유기체의 1종 이상의 아실트랜스퍼라제 (예컨대, PDAT 및/또는 DGAT1 및/또는 DGAT2) 활성을 저하시키거나 불활성화시켜서, 오일 생합성의 전반적인 비율은 저하시키면서 그와 동시에 지질 및 오일 분획으로 혼입되는 PUFA의 백분율 (전체 지방산에 대한 백분율)은 증가시킬 수 있다. 이러한 결과는 다중불포화가 보다 효율적으로 일어날 수 있기 때문이며, 또는 다른 말로 하면 특이적 DAG AT 활성을 하향 조절함으로써 오일 생합성과 다중불포화 사이의 기질 경쟁이 유질화 동안 다중포화가 유리하도록 저하될 수 있기 때문이다.
당업자는 최적 수준의 하향 조절을 이루는데 필요한 기술 및 이러한 억제 달성에 필요한 수단을 보유하고 있을 것이다. 예를 들어, 일부 바람직한 실시양태에서, 단일 DAG AT의 활성을 조작하는 것이 바람직할 수 있다 (예컨대, DGAT1 넉아웃을 생성하면서 PDAT와 DGAT2의 활성은 변경시키지 않음). 별법의 실시양태에서, 유질 유기체는 총 "n"종의 천연 DAG AT를 포함하고, 총 "n-1"종의 아실트랜스퍼라제 활성이 변형되어 오일 생합성의 속도를 저하시키는 반면에 나머지 아실트랜스퍼라제는 그의 야생형 활성을 유지한다. 그리고, 일부 상황에서는, 다중불포화 비율에 대한 오일 생합성의 최적 비율의 달성을 위해서 일부 바람직한 유질 유기체 중 모든 천연 DAG AT의 활성을 조작하는 것이 바람직할 수 있다.
유사한 방식으로, 본 발명자들은 이종 아실트랜스퍼라제의 발현 및 상응하는 천연 야로위아 리폴리티카 아실트랜스퍼라제의 넉아웃이 숙주 세포에서 생산되는 전반적 DHA를 유의하게 증가시킬 수 있다는 가설을 세웠다. 구체적으로, 이전에 제안되었던 바와 같이, C20 이상인 지방산에 특이성을 갖는 이종 GPAT, LPAAT, DGAT1, DGAT2, PDAT 및 LPCAT 아실트랜스퍼라제가 천연 효소보다 더 바람직할 수 있는데, 이는 야로위아 리폴리티카에서 천연적으로 생산된 PUFA가 18:2 지방산으로 제한되고 천연 효소가 더욱 장쇄의 지방산을 이용한 반응을 효율적으로 촉매할 수 없기 때문이다. 이러한 결론을 기초로 하여, 본 발명자들은 모르티에렐라 알피나에서 GPAT, LPAAT, DGAT1 및 DGAT2를 코딩하는 유전자를 동정하고 이들 유전자를 유전자 조작된 EPA-생산 야로위아 숙주에서 발현시켜서 PUFA 생합성을 증가시켰다 (본원 실시예 17 내지 실시예 20). 이후, 천연 및 이종 아실트랜스퍼라제 사이의 기질 경쟁을 저하시키는 수단으로서, 야로위아 리폴리티카 중의 여러가지 천연 아실트랜스퍼라제 (예컨대, DGAT1 및 DGAT2)의 활성을 감소시키거나 넉아웃시켰다. DHA를 생산하는 유전자 조작된 야로위아 숙주에서 유사한 결과가 예상된다.
당업자는 또한 DHA 생산에 영향을 주는 경로 및 포괄적인 조절자의 조작을 고려해야 한다. 예를 들어, 더욱 장쇄의 포화 및 불포화 지방산, 예컨대 팔미테이트 (16:0) 및 스테아르산 (18:0)의 전구체의 이용가능성을 증가시켜서 PUFA 생합성 경로로의 탄소 유동을 증가시키는 것이 유용하다. 상기한 장쇄의 포화 지방산의 합성은 C14 /16 엘론가제의 활성에 의존적인 반면, 상기한 장쇄의 불포화 지방산의 합성은 C16 /18 엘론가제의 활성에 의존적이다. 따라서, 천연 야로위아 리폴리티카 C14/16 엘론가제 (서열 97 및 98)의 과발현은 16:0 및 16:1 지방산의 생산을 실질적으로 증가시켰고 (대조군 균주에 비해 22％ 증가), 유사하게 천연 야로위아 리폴리티카 C16 /18 엘론가제 (서열 94 및 95)의 과발현은 18:0, 18:1, 18:2 및 18:3 지방산의 생산을 실질적으로 증가시켰으며 (대조군 균주에 비해 18％ 증가), C16 지방산의 축적을 저하시켰다 (대조군 균주에 비해 22％ 감소). 물론, 본원에서 입증되고 이나가끼, 케이.(Inagaki, K.) 등의 연구 [Biosci. Biotech. Biochem. 66(3):613-621 (2002)]에서 제안된 바와 같이, 본 발명의 일부 실시양태에서는 이종 C16 /18 엘론가제 (예컨대, 라투스 노르베기쿠스 [진뱅크 관리 번호 AB071986, 본원의 서열 83 및 84] 및/또는 모르티에렐라 알피나 [서열 86 및 87]로부터 유래된 것)의 동시 발현이 유용할 수 있다. 따라서, 야로위아 리폴리티카 숙주 균주는 DHA 생합성을 위해서 최소한 (1) Δ6 데새투라제, C18 /20 엘론가제, Δ5 데새투라제 및 Δ17 데새투라제 또는 Δ15 데새투라제 (또는 둘다), C20 /22 엘론가제, Δ4 데새투라제; 또는 (2) Δ9 엘론가제, Δ8 데새투라제, Δ5 데새투라제 및 Δ17 데새투라제 또는 Δ15 데새투라제 (또는 둘다), C20 /22 엘론가제, 및 Δ4 데새투라제를 발현하도록 조작되어야 하지만, 추가의 바람직한 실시양태에서는 숙주 균주가 Δ9 데새투라제, Δ12 데새투라제, C14 /16 엘론가제 및/또는 C16 /18 엘론가제 중 1종 이상을 추가로 포함한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 야로위아 리폴리티카에서 지방산 분해 및 TAG 분해에 영향을 주는 경로를 변형시켜서, 세포 내에서 아실-CoA 풀 또는 TAG 분획에 축적된 DHA의 분해를 최소화하였다. 이들 경로는 아실-CoA 옥시다제 및 리파제 유전자 각각에 의해 대표된다. 보다 구체적으로, 아실-CoA 옥시다제 (EC 1.3.3.6)는 각각의 분해 주기로 아세틸-CoA 분자 및 지방산 기질보다 2개의 탄소 원자가 더 짧은 지방산이 수득되는 퍼옥시좀 β-산화 반응을 촉매한다. 야로위아 리폴리티카에는 5종의 아실-CoA 옥시다제 동종효소가 존재하며, 진뱅크 관리 번호 AJ001299 내지 AJ001303 각각에 상응하는 POX1, POX2, POX3, POX4 및 POX5 유전자 (또한, Aco1, Aco2, Aco3, Aco4 및 Aco5 유전자라고도 공지되어 있음)에 의해 코딩된다 (또한, 상응하는 진뱅크 관리 번호 XP_504703, XP_505264, XP_503244, XP_504475 및 XP_502199 참조). 상기 동종효소 각각은 기질 특이성이 상이하다. 예를 들어, POX3 유전자는 단쇄 지방산에 대하여 활성인 아실-CoA 옥시다제를 코딩하는 반면, POX2 유전자는 더욱 장쇄의 지방산에 대하여 활성인 아실-CoA 옥시다제를 코딩한다 [Wang H.J., et al. J. Bacteriol., 181:5140-5148 (1999)]. 본 발명의 숙주 세포에서 퍼옥시좀 β-산화를 본원에서의 목적에 유리할 수 있는 방식으로 변형시키면, 상기 유전자 중 임의의 것의 활성이 저하되거나 제거될 수 있다고 여겨진다. 최종적으로, 혼동되는 것을 피하기 위해서, 본 발명자들은 상기한 아실-CoA 옥시다제를 POX 유전자라고 지칭할 것이지만, 이러한 용어는 공개적으로 입수가능한 몇몇 문헌에 따라 Aco 유전자 명명법과 혼용될 수 있다.
유사하게, 야로위아 리폴리티카에서 세포내 효소, 막-결합 효소 및 세포외 효소를 비롯한 여러 리파제 (EC 3.1.1.3)가 검출되었다 ([Choupina, A., et al. Curr. Genet. 35:297 (1999)], [Pignede, G., et al. J. Bacteriol. 182:2802-2810 (2000)]). 예를 들어, Lip1 (진뱅크 관리 번호 Z50020) 및 Lip3 (진뱅크 관리 번호 AJ249751)은 세포내 효소 또는 막-결합 효소인 반면, Lip2 (진뱅크 관리 번호 AJ012632)는 세포외 리파제를 코딩한다. 이들 리파제 각각은 이들 효소가 TAG 및 물이 DAG 및 지방산 음이온으로 직접 분해되는 반응을 촉매하기 때문에 파괴할 표적이었다.
추가의 별법의 실시양태에서, 야로위아 리폴리티카의 바람직한 숙주 균주에서 여러가지 포스포리파제의 활성이 조작될 수 있다. 포스포리파제는 막 지질의 생합성 및 분해에 중대한 역할을 한다. 보다 구체적으로, 용어 "포스포리파제"는 글리세로인지질 중의 1개 이상의 에스테르 연결부를 가수분해하는 능력을 공유하는 이질성 군의 효소를 지칭한다. 모든 포스포리파제가 인지질을 기질로서 표적화하지만, 각 효소는 특이적 에스테르 결합을 절단하는 능력을 보유한다. 따라서, 포스포리파제에 대한 명명법은 개개의 포스포리파제를 차별화하고, 인지질 분자 내에 표적화된 특이적 결합을 지시한다. 예를 들어, 포스포리파제 A1 (PLA1)은 글리세롤 부분의 sn-1 위치에서 지방 아실 에스테르 결합을 가수분해하지만, 포스포리파제 A2 (PLA2)는 이 분자의 sn-2 위치에서 지방산을 제거한다. PLA1 (EC 3.1.1.32) 및 PLA2 (EC 3.1.1.4)의 작용은 유리 지방산 및 2-아실 리소인지질 또는 1-아실 리소인지질 각각의 축적을 초래한다. 포스포리파제 C (PLC) (EC 3.1.4.3)는 인지질 주쇄 중의 포스포디에스테르 결합을 가수분해하여 1,2-DAG를 생성하고, 또한 포함된 구체적인 인지질 종에 따라 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 등을 생성한다 (예컨대, PLC1은 1-포스파티딜-1D-마이오-이노시톨 4,5-비스포스페이트 + H2O = 1D-마이오-이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 + DAG의 반응을 담당함. ISC1은 이노시톨 스핑고인지질-특이적 포스포리파제 C를 코딩함 [Sawai, H., et al. J. Biol. Chem. 275, 39793-39798 (2000)]). 제2의 포스포디에스테르 결합은 포스포리파제 D (PLD) (EC 3.1.4.4)에 의해 절단되어 포스파티드산이 생성되고, 또한 마찬가지로 포함된 인지질 클래스에 따라 콜린 또는 에탄올아민이 생성된다. 포스포리파제 B (PLB)는 sn-1 및 sn-2 지방산 둘다를 제거할 수 있으며, 히드롤라제 (상기 효소는 2가지 지방산 인지질 [PLB 활성]과 리소인지질 [리소포스포리파제 활성] 둘다를 절단하여 지방산을 방출함) 및 리소포스포리파제-트랜스아실라제 활성 (상기 효소는 유리 지방산을 리소인지질에 전달하여 인지질을 생성할 수 있음)을 둘다 보유한다는 점에서 독특하다. 형질전환체 야로위아 숙주 세포의 전체 오일 분획에 축적되는 DHA의 농도를 증가시키기 위해서는 이들 포스포리파제 중 1종 이상을 과발현하는 것이 유용할 수 있다. 이러한 영향은 포스포리파제가 신장 또는 트리글리세리드로의 혼입을 위해 PC로부터의 아실기를 CoA 풀에 방출하기 때문에 관찰된 것이라는 가설을 세웠다.
또다른 별법의 실시양태에서, 야로위아 리폴리티카의 바람직한 숙주 균주에서, 포스파티딜콜린 (PC) 생합성을 담당하는 CDP-콜린 경로의 효소가 DHA 생합성을 전반적으로 증가시키기 위한 수단으로서 조작될 수도 있다. 상기 기술의 유용성은 본 명세서에서 디아실글리세롤 콜린포스포트랜스퍼라제 (EC 2.7.8.2)를 코딩하는 야로위아 리폴리티카 CPT1 유전자의 과발현에 의해 야로위아 리폴리티카의 유전자 조작된 균주에서 EPA 생합성이 증가되는 것으로 입증된다. 당업자는 PC 생합성 경로를 잘 알고 있을 것이고, 다른 적절한 후보 효소를 인지하고 있을 것이다.
상기한 바와 같은 생화학적 경로를 조작하는 방법은 당업자에게 공지되어 있지만, 천연 유전자의 활성을 저하시키거나 없애기 위한 몇가지 기술의 개요를 이하에서 간략하게 제시할 것이다. 이들 기술은 상기 논의한 바와 같은 천연 야로위아 리폴리티카 Δ12 데새투라제, GPAT, LPAAT, DGAT1, DGAT2, PDAT, LPCAT, 아실-CoA 옥시다제 2 (Aco2 또는 Pox2), 아실-CoA 옥시다제 3 (Aco3 또는 Pox3) 및/또는 리파제 유전자의 활성을 하향 조절하는데 유용하다.
당업자는 천연 유전자의 활성을 저하시키거나 없애기 위해 사용될 가장 적절한 기술을 확인하겠지만, 일반적으로는 특정 유전자의 내인성 활성은 예를 들어 1) 표적 유전자 전체 또는 일부의 삽입, 치환 및/또는 결실에 의한 유전자 파괴, 2) 안티센스 서열을 유전자의 전사 생성물로 전사하기 위한 카세트의 제공, 3) 특이적 유전자 활성이 천연적으로 거의 없거나 전혀 없는 [또는 그러하도록 돌연변이된] 숙주 세포의 사용, 4) 돌연변이화된 헤테로서브유닛 (즉, 2종 초과의 헤테로서브유닛을 포함하는 효소의 것)을 과발현시켜서, "우성 음성 효과"에 의해 효소의 활성을 저하시킴, 및 5) iRNA 기술의 이용에 의해 저하 또는 제거될 수 있다. 일부 경우에서, 원치않는 유전자 경로의 억제는 특이적 억제제 (예컨대, 미국 특허 제4,778,630호에 기재된 것과 같은 데새투라제 억제제)의 사용을 통해 수행될 수도 있다.
유전자 파괴를 위해, 외래 DNA 단편 (전형적으로는 선별가능한 마커 유전자, 그러나 임의로는 발현시에 바람직한 표현형을 나타내는 키메라 유전자 또는 키메라 유전자 클러스터)을 파괴될 구조적 유전자에 삽입시켜서 그의 코딩 서열을 중단시키고 이에 의해 그 유전자를 기능적으로 불활성화시킨다. 파괴 카세트로 숙주 세포를 형질전환시키면, 기능적 천연 유전자가 기능적으로 파괴되지 않은 유전자와의 상동성 재조합에 의해 대체된다 (예컨대 문헌 [Hamilton et al. J. Bacteriol. 171:4617-4622 (1989)], [Balbas et al. Gene 136:211-213 (1993)], [Gueldener et al. Nucleic Acids Res. 24:2519-2524 (1996)] 및 [Smith et al. Methods Mol. Cell. Biol. 5:270-277(1996)] 참조).
안티센스 기술은 표적 유전자의 서열이 알려져 있는 경우에 유전자를 하향 조절하는 또다른 방법이다. 이를 수행하기 위해서, 원하는 유전자로부터의 핵산 절편을 클로닝하여 프로모터에 작동가능하게 연결시켜서 RNA의 안티센스 가닥이 전사되도록 한다. 이어서, 상기 구축물을 숙주 세포에 도입하고, RNA의 안티센스 가닥을 발현시킨다. 안티센스 RNA는 관심 단백질을 코딩하는 mRNA의 축적을 방해하여 유전자 발현을 억제한다. 당업자라면, 특정 유전자의 발현 저하를 위해서는 안티센스 기술의 이용에 대하여 특별히 고려해야 함을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 안티센스 유전자의 발현 수준을 적당하게 하기 위해서는 당업자에게 공지된 상이한 조절 요소를 이용하는 여러 키메라 유전자의 사용이 필요할 수 있다.
표적화된 유전자 파괴 및 안티센스 기술은 공지 서열의 유전자를 하향 조절하는 효과적인 수단을 제공하지만, 서열-기재가 아닌 다른 덜 특이적 방법이 개발되어 왔다 (예컨대, UV 조사/화학 작용제 또는 위치전이성(transposable) 요소/트란스포손의 사용을 통한 돌연변이유발. 제WO 04/101757호 참조).
별법의 실시양태에서, 특정 유전자의 내인성 활성은 단백질의 발현을 조절하는 조절 서열의 조작에 의해 저하될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 코딩 서열과 관련이 있는 조절 서열은 코딩 서열의 상류 (5' 비-코딩 서열), 내부, 또는 하류 (3' 비-코딩 서열)에 위치한 전사 및 번역 "조절" 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 전사, RNA 가공 또는 안정성, 또는 관련된 코딩 서열의 번역에 영향을 미친다. 따라서, 특정 유전자의 조절 서열의 조작은 유전자의 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 인핸서, 개시 조절 영역, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 가공 부위, 이펙터 결합 부위 및 스템-루프 구조의 조작을 지칭하는 것일 수 있다. 따라서, 예를 들어, DAG AT의 발현을 하향 조절하여 지질 및 오일 생합성의 비율 저하를 달성하기 위해서 DAG AT의 프로모터를 결실시키거나 파괴시킬 수 있다. 별법으로, DAG AT의 발현을 구동하는 천연 프로모터를, 프로모터 활성이 천연 프로모터에 비해 감소된 이종 프로모터로 치환될 수 있다. 조절 서열 조작에 유용한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
요약하면, 본원에서 교시된 내용을 이용하여, 형질전환체 유질 미생물 숙주는 DHA를 미생물 숙주 전체 지질의 약 5％ 이상, 바람직하게는 DHA를 전체 지질의 약 10％ 이상, 더욱 바람직하게는 DHA를 전체 지질의 약 15％ 이상, 더욱 바람직하게는 DHA를 전체 지질의 약 20％ 이상, 가장 바람직하게는 DHA를 전체 지질의 약 25 내지 30％ 이상으로 생산할 것이다.
DHA 생산을 위한 발효 공정
형질전환된 미생물 숙주 세포는, 키메라 유전자 (예컨대, 데새투라제, 엘론가제, 아실트랜스퍼라제 등을 코딩함)의 발현을 최적화하고 DHA를 가장 많이 가장 경제적으로 수득하는 조건하에 성장시킨다. 일반적으로, 최적화될 수 있는 배지 조건으로는, 탄소 공급원의 유형과 양, 질소 공급원의 유형과 양, 탄소:질소 비율, 산소 수준, 성장 온도, pH, 생물체 생성기의 길이, 오일 축적기의 길이 및 세포 수확 시간 등이 있다. 야로위아 리폴리티카는 일반적으로 복합 배지 (예컨대, 효모 추출물-펩톤-덱스트로즈 브로쓰(broth) (YPD)) 또는 성장에 필요한 성분이 없어서 원하는 발현 카세트가 선별될 수 있도록 하는 규정된 최소 배지 (예컨대, 효모 질소 염기 (디프코 래버러토리즈(DIFCO Laboratories), 미국 미시간주 디트로이트 소재)) 중에서 성장한다.
본 발명에서의 발효 배지는 적합한 탄소 공급원을 함유해야 한다. 적합한 탄소 공급원으로는 단당류 (예컨대, 글루코스, 프럭토스), 이당류 (예컨대, 락토스, 수크로스), 올리고당류, 다당류 (예컨대, 전분, 셀룰로스 또는 이들의 혼합물), 당 알콜 (예컨대, 글리세롤) 또는 보완가능한 공급원료 (예컨대, 치즈 유장 투과물, 옥수수 침유(cornsteep liquor), 사탕무 당밀, 보리 맥아)로부터의 혼합물 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 추가로, 탄소 공급원은 알칸, 지방산, 지방산의 에스테르, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 인지질 및 식물성 오일 (예컨대, 대두유) 및 동물 지방을 비롯한 지방산의 다양한 시판 공급원을 포함할 수 있다. 추가로, 탄소 공급원은 핵심적인 생화학적 중간체로의 대사 전환이 입증된 바 있는 1-탄소 공급원 (예컨대, 이산화탄소, 메탄올, 포름알데히드, 포르메이트 및 탄소-함유 아민)을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에 이용되는 탄소 공급원은 광범위하게 다양한 탄소-함유 공급원을 포괄하는 것으로 고려된다. 상기 언급한 모든 탄소 공급원 및 이들의 혼합물이 본 발명에 적합하다고 예상되지만, 바람직한 탄소 공급원은 당 및/또는 지방산이다. 가장 바람직한 것은 글루코스 및/또는 10 내지 22개 탄소를 함유하는 지방산이다.
질소는 무기 (예컨대, (NH4)2SO4) 또는 유기 (예컨대, 우레아 또는 글루타메이트) 공급원으로부터 공급될 수 있다. 발효 배지는 적절한 탄소 및 질소 공급원 뿐만이 아니라 적합한 미네랄, 염, 보조인자, 완충제, 비타민, 및 유질 효모의 성장 및 DHA 생산에 필요한 효소 경로의 촉진에 적합하다고 당업계에 공지된 기타 성분도 함유해야 한다. 특히, 지질 및 PUFA의 합성을 촉진시키는 여러 금속 이온 (예컨대, Mn+2, Co+2, Zn+2, Mg+2)에 주목한다 [Nakahara, T. et al., Ind. Appl. Single Cell Oils, D. J. Kyle and R. Colin, eds. pp 61-97 (1992)].
본 발명에서 바람직한 성장 배지는 시판용으로 제조된 통상의 배지, 예컨대 효모 질소 염기 (디프코 래버러토리즈, 미국 미시간주 디트로이트 소재)이다. 다른 규정된 성장 배지 또는 합성 성장 배지가 사용될 수도 있고, 야로위아 리폴리티카의 성장에 적절한 배지는 미생물학 또는 발효 과학 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 발효에 적합한 pH 범위는 전형적으로 약 pH 4.0 내지 pH 8.0이며, pH 5.5 내지 pH 7.0이 초기 성장 조건의 범위로서 바람직하다. 발효는 호기성 또는 혐기성 조건하에서 수행될 수 있고, 미호기성 조건이 바람직하다.
전형적으로, 유질 효모 세포 중 고수준의 PUFA의 축적은 2-단계 공정을 필요로하는데, 대사 상태가 성장 및 지방의 합성/저장 사이에서 "균형"을 이루어야 하기 때문이다. 따라서, 가장 바람직하게는, 야로위아 리폴리티카에서의 DHA 생산에 2-단계 발효 공정이 필요하다. 이러한 접근법은 제WO 2004/101757호에 다양한 적합한 발효 공정 디자인 (즉, 배치식, 공급형-배치식 및 연속식) 및 성장 동안의 고려사항으로서 기재되어 있다.
DHA 의 정제 및 가공
DHA를 비롯한 PUFA는 숙주 미생물 중에서 유리 지방산 또는 아실글리세롤, 인지질, 술포지질 또는 당지질 등과 같은 에스테르화 형태로 존재할 수 있으며, 당업계에 공지된 각종 수단을 통해 상기 숙주 세포로부터 추출될 수 있다. 효모 지질의 추출 기술, 품질 분석 및 허용 기준에 대한 검토 중 하나는 문헌 [Z. Jacobs (Critical Reviews in Biotechnology, 12(5/6):463-491 (1992))]이다. 하류 가공에 대한 간략한 검토는 또한 문헌 [A. Singh and O. Ward (Adv. Appl. Microbiol., 45:271-312 (1997))]에서도 찾을 수 있다.
일반적으로, DHA 및 다른 PUFA의 정제 수단으로는 유기 용매를 이용한 추출, 초음파처리, 초임계 유체 추출 (예컨대, 이산화탄소 사용), 비누화 및 압착과 같은 물리적 수단, 또는 이들의 조합 등을 들 수 있다. 추가의 세부사항에 대하여는 제WO 2004/101757호의 교시 내용을 참조한다.
정련되고/되거나 정제된 DHA를 함유하는 오일은 수소화되어 다양한 용융 성질 및 조직을 갖는 지방이 생성될 수 있다. 스프레드, 제과 지방, 고체 버터, 마가린, 베이킹 쇼트닝 등을 비롯한 많은 가공 지방에는 실온에서의 고화도 정도가 다양할 것이 요구되며, 공급원 오일의 물리적 성질을 변경하여야 생산될 수 있다. 이것은 가장 통상적으로 촉매적 수소화에 의해 달성된다.
수소화는 니켈과 같은 촉매의 보조하에 수소가 불포화 지방산 이중 결합에 첨가되는 화학 반응이다. 수소화는 2가지 주요 효과를 갖는다. 우선, 불포화 지방산 함량의 감소로 인해 오일의 산화적 안정성이 증가한다. 다음으로, 지방산 변형이 융점을 증가시켜서 실온에서 반액체 또는 고체인 지방을 초래하기 때문에, 오일의 물리적 성질이 변화된다.
수소화 반응에 영향을 미치고 따라서 최종 생성물의 조성을 변경시키는 변수는 많이 있다. 압력, 온도, 촉매 유형 및 농도, 교반 및 반응기 디자인 등을 비롯한 작업 조건은 조절될 수 있는 더 중요한 파라미터이다. 선택적인 수소화 조건이 이용되어 더 높은 수준으로 불포화된 지방산, 우선적으로는 덜 불포화된 지방산을 수소화할 수 있다. 매우 적은 정도 또는 약간의 수소화는 액체 오일의 안정성을 증가시키는데 흔히 이용된다. 추가의 수소화는 액체 오일을 물리적으로 고체인 지방으로 전환시킨다. 수소화 정도는 특정 최종 생성물에 대해 디자인된 원하는 성능 및 용융 특징에 따라 달라진다. 베이킹 제품의 제조에 사용되는 액체 쇼트닝, 상업적으로 튀기고 굽는 작업에 사용되는 고체 지방 및 쇼트닝, 및 마가린 제조를 위한 베이스 스톡(base stock)이 수소화를 통해 달성될 수 있는 무수한 오일 및 지방 생성물 중에 속한다. 수소화 및 수소화 생성물에 대한 보다 상세한 설명은 문헌 [Patterson, H. B. W., Hydrogenation of Fats and Oils: Theory and Practice. The American Oil Chemists' Society, 1994]에서 찾을 수 있다.
식료품에 사용하기 위한, 야로위아 리폴리티카의 DHA -생산 균주
시장은 현재 ω-3 및/또는 ω-6 지방산 (특히 ARA, EPA 및 DHA)이 혼입된 매우 다양한 식품 및 사료 제품을 선호하고 있다. DHA를 포함하는 본 발명의 효모 미생물성 오일은 식품 및 사료 제품에서 이들 제제의 건강상의 이점을 부여하는 기능을 하는 것으로 고려된다.
본원에 기재한 효모 숙주에 의해 생산된 ω-3 및/또는 ω-6 지방산-함유 미생물성 오일은 식품 유사물, 육류 제품, 곡류 제품, 베이킹 식품, 스낵 식품, 및 유제품을 포함하지만 이에 제한되지 않는 각종 식품 및 사료 제품에서 사용하기에 적합할 것이다. 추가로, 본 발명의 미생물성 오일은 의료용 영양제, 식이 보조제, 유아용 조제식 및 또한 약제 생성물 등을 비롯한 의료용 식품에서 건강상의 이점을 부여하기 위한 제제에 사용될 수 있다. 식품 가공 및 식품 제제화 분야의 당업자는 소정량과 소정의 조성을 갖는 미생물성 오일이 식품 또는 사료 제품에 첨가될 수 있는 방법을 이해할 것이다. 이러한 양은 본원에서 "유효량"이라 지칭되며, 상기 생성물이 보충할 음식물인 식품 또는 사료 제품, 또는 의료용 식품 또는 의료용 영양제가 교정되거나 처치될 의학적 상태에 따라 달라질 것이다.
식품 유사물은 당업자에게 공지된 공정을 이용하여 제조될 수 있다. 육류 유사물, 치즈 유사물, 우유 유사물 등을 언급할 수 있다. 대두로부터 제조된 육류 유사물은 콩 단백질 또는 두부 및 다양한 종류의 육류를 모방하도록 함께 혼합된 다른 성분을 함유한다. 이들 육류 대안물은 냉동 식품, 통조림 식품 또는 건조 식품으로 판매된다. 통상적으로, 이들은 이것들이 대체할 식품과 동일한 방식으로 사용될 수 있다. 육류 유사물의 예로는 햄 유사물, 소시지 유사물, 베이컨 유사물 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
식품 유사물은 이들의 기능적 특성과 조성적 특성에 따라 대용물 또는 대체물로 분류될 수 있다. 예를 들어, 대용 치즈는 대체하도록 디자인된 치즈와 유사하기만 할 것이 요구된다. 그러나, 생성물이 치즈와 영양적으로 동등하고 치즈에 대한 최소 조성 요건을 대신하여 충족시키기만 한다면, 그 생성물은 통상적으로 대체용 치즈라고 불릴 수 있다. 따라서, 대체용 치즈는 종종 대용 치즈보다 단백질 수준이 더 높고 비타민과 미네랄이 강화되어 있다.
우유 유사물 또는 비-유제품 식품으로는 대용 우유 및 비-유제품 냉동 후식 (예컨대, 대두 및/또는 콩 단백질 생성물로부터 제조된 것) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
육류 제품은 매우 다양한 생성물을 포함한다. 미국에서는 "육류"가 소, 돼지 및 양에서 얻은 "붉은 고기"를 포함한다. 붉은 고기뿐 아니라, 닭, 칠면조, 거위, 뿔닭, 오리 등을 비롯한 가금류 품목 및 어류와 조개류도 있다. 조리되고 가공된 육류 제품은 광범위하게 분류된다: 날 것, 보존처리되고 튀긴 것, 및 보존처리되고 요리된 것. 소시지 및 핫도그는 가공된 육류 제품의 예이다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "육류 제품"은 가공된 육류 제품 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
시리얼 식품은 시리얼 곡물을 가공하여 유래된 식품이다. 시리얼 곡물은 식용 곡물 (종자)을 생성하는 목초류로부터의 임의의 식물을 포함한다. 가장 대중적인 곡물은 보리, 옥수수, 기장, 귀리, 퀴노아, 쌀, 호밀, 사탕수수, 라이밀, 밀 및 야생 벼이다. 시리얼 식품의 예로는 전립 곡물, 분쇄 곡물, 그릿(grits), 밀가루, 겨, 싹(germ), 아침식사용 시리얼, 압출식 식품, 파스타 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
베이킹 제품은 상기 언급한 임의의 시리얼 식품을 포함하며, 베이킹된 것이거나 베이킹과 유사한 방식으로 가공된 것, 즉 열을 가하여 건조 또는 경화시킨 것이다. 베이킹 제품의 예로는 빵, 케이크, 도넛, 바아(bars), 파스타, 빵가루, 베이킹 스낵, 미니-비스킷, 미니-크래커, 미니-쿠키, 및 미니-프레첼 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 오일이 성분으로 사용될 수 있다.
스낵 식품은 임의의 상기 또는 하기 식품을 포함한다.
튀긴 식품은 임의의 상기 또는 하기 튀긴 식품을 포함한다.
음료는 액체 또는 건조 분말 형태일 수 있다.
예를 들어, 과일 주스, (신선한 것, 냉동된 것, 캔에 들어 있거나 농축된 것), 향미료가 첨가되거나 첨가되지 않은 우유 드링크 등과 같은 비-탄산 음료가 언급될 수 있다. 성인 및 유아용 영양제는 당업계에 공지되어 있으며 시판되고 있다 (예컨대, 로스 프로덕츠 디비젼(Ross Products Division), 애보트 래버러토리즈(Abbott Laboratories)의 시밀락®, 엔슈어®, 제비티(Jevity®) 및 알리멘툼(Alimentum®)). 유아용 조제식은 유아와 영아에게 공급되는 액체 또는 재구성된 분말이다. 유아용 조제식은 모유를 대신한다. 유아용 조제식은 흔히 유아를 위한 유일한 영양 공급원이기 때문에, 유아용 조제식은 유아의 음식에서 특별한 역할을 한다. 유아에게는 수유가 여전히 가장 우수한 영양공급이지만, 유아용 조제식은 아기가 생존만 하게 하는 것이 아니라 성장하도록 하는데도 충분하다. 유아용 조제식은 모유에 점점 더 근접하고 있다.
유제품은 우유로부터 유래된 생성물이다. 우유 유사물 또는 비-유제품은 우유 이외의 공급원, 예를 들어 앞서 논의한 두유로부터 유래한다. 상기 생성물로는 전유(全乳), 탈지유, 발효유 제품, 예컨대 요구르트 또는 산미유(酸味乳), 크림, 버터, 연유, 탈수유(dehydrated milk), 커피 화이트너, 커피 크리머, 아이스크림, 치즈 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 DHA-함유 오일이 포함될 수 있는 추가의 식품으로는, 예를 들어 츄잉검, 제과류 및 프로스팅류(frostings), 젤라틴류 및 푸딩류, 경질 및 연질의 캔디, 잼 및 젤리, 과립화된 백설탕, 당 대체물, 달콤한 소스, 토핑류 및 시럽류, 및 건조 배합된 분말 혼합물 등이 있다.
건강 식품 및 약제
건강 식품은 건강상의 이점을 부여하는 임의의 식품이며, 기능성 식품, 의료용 식품, 의료용 영양제 및 식이 보조제 등이 있다. 추가로, 본 발명의 미생물성 오일은 표준 제약 조성물에 사용될 수 있다. 본 발명의 유전자 조작된 야로위아 리폴리티카 균주 또는 그로부터 생산된 DHA-포함 미생물성 오일은 상기 언급한 임의의 식품에 쉽게 혼입되어 예를 들어 기능적 식품 또는 의료용 식품을 생성할 수 있다. 예를 들어, DHA를 포함하는 보다 농축된 제제로는 인간 또는 인간 이외의 동물에서 식이 보조제로 사용될 수 있는 캡슐, 분말, 정제, 소프트겔, 겔캡, 액상 농축물 및 에멀젼 등이 있다.
식이 보조제에서의 용도
DHA를 포함하는 보다 농축된 제제로는 인간 또는 인간 이외의 동물에서 식이 보조제로 사용될 수 있는 캡슐, 분말, 정제, 소프트겔, 겔캡, 액상 농축물 및 에멀젼 등이 있다. 특히, 본 발명의 DHA-오일은 유아용 조제식 또는 아기 음식물과 같은 식이 보조제로 혼입시키는 데 특히 적합하다.
유아용 조제식은 유아와 영아에게 공급되는 액체 또는 재구성된 분말이다. 본원에서, "유아용 조제식"은 젖먹이 유아에서 모유를 대신할 수 있는 장용 영양 생성물로 정의되며, 전형적으로 수용액 중에서 원하는 백분율(％)의 탄수화물 및 단백질과 혼합된 원하는 백분율(％)의 지방으로 구성된다 (예컨대, 미국 특허 제4,670,285호 참조). 전 세계적인 조성 연구 및 전문가 그룹에 의해 규명된 수준을 기초로 할 때, 평균적인 모유는 전형적으로 총 지방산을 약 0.20％ 내지 0.40％로 함유하며 (지방 칼로리의 약 50％로 추측됨), 일반적으로 DHA:ARA의 비율은 약 1:1 내지 1:2의 범위이다 (예컨대, 엔파밀 리필™(Enfamil LIPIL™) [미드 존슨 앤드 컴파니(Mead Johnson ＆ Company)] 및 시밀락 어드밴스™(Similac Advance™) [로스 프로덕츠 디비젼, 애보트 래버러토리즈]의 제제 참조). 유아용 조제식은 흔히 유아를 위한 유일한 영양 공급원이기 때문에, 유아용 조제식은 유아의 음식에서 특별한 역할을 하며, 유아에게는 수유가 여전히 가장 우수한 영양공급이지만 유아용 조제식은 아기가 생존만 하게 하는 것이 아니라 성장하도록 하는데도 충분하다.
동물 사료에서의 용도
본원에서, 동물 사료는 인간 이외의 동물을 위한 사료로 사용되거나 사료에 혼합하기 위한 생성물을 총칭하여 정의된다. 그리고, 상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 DHA-포함 오일은 다양한 동물 사료 중의 성분으로서 사용될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 오일은 애완동물 사료, 반추 동물 및 가금류 사료, 및 양식용 사료 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 제품에 사용될 수 있다고 예측된다. 애완동물 사료는 애완동물 (예컨대, 개, 고양이, 새, 파충류, 설치류)에게 공급될 제품이고, 이들로는 상기한 시리얼 및 건강 식품 뿐만이 아니라 육류 및 육류 부산물, 콩 단백질 생성물, 목초 및 건초 제품 (예컨대, 자주개자리, 큰조아재비, 귀리 또는 브롬 그래스, 야채) 등이 있다. 반추 동물 및 가금류 사료는 예를 들어 칠면조, 닭, 소 및 돼지에게 공급될 제품이다. 상기한 애완동물 사료와 마찬가지로, 이들 제품은 앞서 언급한 시리얼 및 건강 식품, 콩 단백질 생성물, 육류 및 육류 부산물, 및 목초 및 건초 제품을 포함할 수 있다. 그리고, 양식 사료 (또는 "양식사료")는 신선한 물 또는 해양 물 중에서 수상 유기체 및/또는 동물을 증식, 배양 또는 사육하는 양식에 사용되는 제품이다.
대부분의 동물 사료 제제에는 ARA, EPA 및/또는 DHA를 고농도로 생산하는 본 발명의 유전자 조작된 야로위아 리폴리티카 균주를 포함시키는 것이 특히 유용할 것이라고 여겨진다. 필요한 ω-3 및/또는 ω-6 PUFA를 제공하는 것 이외에도, 상기 효모 그 자체가 동물의 전반적 건강 및 영양에 기여하고 제제의 맛을 증가시킬 수 있는 단백질 및 다른 영양분 (예컨대, 비타민, 미네랄, 핵산, 복합 탄수화물 등)의 유용한 공급원이다. 보다 구체적으로, 야로위아 리폴리티카 (ATCC #20362)에서 건조 세포 중량에 대한 백분율(％)로서의 대략적인 화학적 조성은 다음과 같다: 35％ 단백질, 40％ 지질, 10％ 탄수화물, 5％ 핵산, 5％ 회분(ash) 및 5％ 수분. 추가로, 탄수화물 분획 내에 β-글루칸은 대략 45.6 mg/g, 만나스는 대략 11.4 mg/g, 키틴은 대략 52.6 mg/g로 포함한다 (반면, 트레할로스는 소량 성분임 [대략 0.7 mg/g]).
상당한 문헌들에서 β-글루칸, 만나스 및 키틴의 면역 조정 효과가 조사된 바 있다. 키틴과 만나스는 둘다 유용한 면역자극제로서 유사하게 인식되지만, 박테리아 및 진균 세포벽의 주요 구성성분인 β-글루칸이 비-특이적 면역을 자극 (즉, "면역자극 효과")함으로써 양식 종, 애완 동물 및 농장 동물 및 인간의 건강을 개선시키는 수단이 가장 잘 연구되어 있다. 아주 간단하게 설명하면, 면역 반응의 전반적 향상은 β-글루칸의 사용으로 달성될 수 있는데, 이는 이들 β-1,3-D-폴리글루코스 분자가 백혈구 (예컨대, 대식세포, 호중구 및 단핵구)의 생성을 비-특이적 방식으로 자극함으로써 각종 병원성 항원 또는 환경적인 스트레서에 대한 민감도와 방어력을 증가시킬 수 있기 때문이다. 보다 구체적으로, 수많은 연구들은, β-글루칸이 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충 감염에 대한 보호력을 향상시키고, 항생제 및 백신과 병용될 때 보강 효과를 발휘하며, 창상 치유를 향상시키고, 유리 라디칼로 인한 손상을 호전시키고, 종양 퇴행을 향상시키고, 박테리아 내독소의 독성을 조정하며, 점막 면역을 강화시킨다는 것을 입증해 왔다 (문헌 [Raa, J. et al., Norwegian Beta Glucan Research, Clinical Applications of Natural Medicine. Immune: Depressions Dysfunction ＆ Deficiency (1990)]에서 검토됨). 전통적인 동물 사육업 및 양식업 분야에 있어서 효모 β-글루칸, 만나스 및 키틴의 유용성을 문서화하고 있는 당업계 문헌의 예로는 [L.A. White et al. (J. Anim. Sci, 80:2619-2628 (2002)] (새끼 돼지를 위한 보충물), [K.S. Swanson et al. (J. Nutr. 132:980-989 (2002)] (개를 위한 보충물), [J. Ortuno et al. (Vet. Immunol. Immonopath. 85:41-50 (2002)] (도미(gilthead seabream)에게 투여된 온전한 사카로마이세스 세레비지애), [A. Rodriguez et al. (Fish Shell. Immuno. 16:241-249 (2004)] (도미에게 투여된 전장 무코르 써시넬로이데스), [M. Bagni et al. (Fish Shell. Immuno. 18:311-325 (2005) [(β-글루칸을 함유하는 효모 추출물을 함유하는, 농어(sea bass)를 위한 보충물), [J. Raa (In: Cruz - Suarez, L. E., Ricque-Marie, D., Tapia-Salazar, M., Olvera-Novoa, M.A. y Civera-Cerecedo, R., (Eds.). Avances en Nutricion Acuicola V. Memorias del V Simposium lnternacional de Nutricion Acuicola. 19-22 Noviembre, 2000. Merida, Yucatan, Mexico] (어류 및 조개류 사료에 면역-자극제를 사용하는 것에 대한 검토) 등이 있다.
야로위아 리폴리티카의 독특한 단백질:지질:탄수화물 조성 및 독특한 복합 탄수화물 프로파일 (대략 1:4:4.6 비율의 만난:β-글루칸:키틴을 포함함)을 기초로 하여, 본 발명의 유전적으로 유전자 조작된 효모 세포 (또는 그의 일부)는 동물 사료 제제에 유용한 첨가제라고 여겨진다 (예컨대, 온전한 [동결건조된] 효모 세포, 정제된 세포벽, 정제된 효모 탄수화물로서 사용되거나, 또는 다양한 다른 분획화 형태 중의 것으로 사용됨).
양식 산업과 관련하여, 다양한 어류 종에 대한 영양 요건의 이해가 높아지고 사료 제조에 있어서 기술적 진보가 이루어져서 양식 산업에서의 천연 사료를 보충하거나 대체하기 위해서 제조된 먹이 또는 인공 먹이 (제제화된 사료)를 개발하고 사용할 수 있게 되었다. 그러나, 일반적으로는 어류 양식용 사료에 포함된 다양한 영양분의 통상적인 비율은 (건조 먹이에 대한 백분율(％)로서 표현할 때) 32 내지 45％의 단백질, 4 내지 28％의 지방 (이 중 1 내지 2％ 이상이 ω-3 및/또는 ω-6 PUFA임), 10 내지 30％의 탄수화물, 1.0 내지 2.5％의 미네랄 및 1.0 내지 2.5％의 비타민을 포함한다. 상기 제제에는 각종 다른 성분들이 임의로 첨가될 수 있다. 이들로는 (1) 살과 비늘의 색 각각을 향상시키기 위한 카로테노이드, 특히 연어류 및 관상용 "수족관" 어류를 위한 카로테노이드, (2) 펠렛에 안정성을 제공하고 영양분이 물로 침출되는 것을 저하시키기 위한 결합제 (예컨대, 소 심장, 전분, 셀룰로스, 펙틴, 젤라틴, 아라비아 고무, 로커스트 빈, 한천, 카르기닌 및 다른 알기네이트), (3) 어류 먹이의 저장 수명을 연장시키고 지방의 악취를 저하시키기 위한 보존제, 예컨대 항미생물제 및 항산화제 (예컨대, 비타민 E, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 에톡시퀸, 및 프로피온산, 벤조산 또는 소르브산의 나트륨염 및 칼륨염), (4) 사료의 맛과 그의 섭취를 향상시키기 위한 화학주성인자 및 향미료, 및 (5) 기타 먹이. 이들 다른 먹이는 먹이의 영양적 가치를 향상시키고 어류에 의한 섭취를 증가시키기 위해서 섬유 및 회분 (각각, 충전재 및 칼슘과 인의 공급원으로 사용하기 위함)과 같은 물질 및 식물성 물질 및/또는 어류 가루 또는 오징어 가루 (예컨대, 살아있거나, 냉동된 것이거나 또는 건조된 조류, 브라인 슈림프, 담륜충 또는 기타 동물성 플랑크톤) 등의 물질을 포함할 수 있다. 문헌 [Nutrient Requirements of Fish (National Research Council, National Academy: Washington D. C, 1993)]은 어류를 위한 필수 영양분 및 다양한 성분들의 영양분 함량에 대한 상세한 설명을 제공한다.
양식사료 제제의 제조에는 각종 인자를 고려할 것이 요구되는데, 완전한 먹이는 영양적으로 균형을 이루어야 하고, 맛이 좋아야 하며, 물에 안정적이어야 하고, 적당한 크기와 조직을 가져야 하기 때문이다. 양식사료의 영양분 조성과 관련하여서는 문헌 ([Handbook on Ingredients for Aquaculture Feeds (Hertrampf, J. W. and F. Piedad-Pascual. Kluwer Academic: Dordrecht, The Netherlands, 2000)] 및 [Standard Methods for the Nutrition and Feeding of Farmed Fish and Shrimp (Tacon, A. G. J. Argent Laboratories: Redmond, 1990)])을 참조한다. 일반적으로, 사료는 건조 (즉, 최종 수분 함량이 6 내지 10％), 반-습식 (즉, 35％ 내지 40％ 물 함량) 또는 습식 (즉, 50 내지 70％ 물 함량) 상태가 되도록 제제화된다. 건조 사료는 건조 성분들이 단순히 섞여 있는 혼합물 (즉, "매쉬(mash)" 또는 "가루"), 압착형 펠렛, 부스러기 또는 과립, 및 플레이크를 포함한다. 어류의 먹이 공급 요건에 따라, 펠렛은 가라앉도록 제조될 수도 있고 또는 떠오르도록 제조될 수도 있다. 반-습식 사료 및 습식 사료는 단일 성분 또는 혼합 성분들 (예컨대, 잡어(trash fish) 또는 요리된 콩류)로 제조되고, 케이크나 볼로 성형될 수 있다.
여기서, 대부분의 양식용 사료에는 고농도의 DHA를 생산하는 본 발명의 유전자 조작된 야로위아 리폴리티카 균주를 포함시키는 것이 특히 유용할 것임은 명백하다. 필요한 ω-6 PUFA를 제공하는 것 이외에도, 상기 효모 그 자체는 제제의 맛을 증가시킬 수 있는 유용한 단백질 공급원이다. 별법의 실시양태에서, 본 발명의 야로위아 리폴리티카 균주에 의해 생산되는 오일은 상기 세포 덩어리로부터 추출 및 정제된 후에 양식용 사료 제제에 직접 도입될 수 있다.
바람직한 실시양태의 기재
본 발명은 유질 효모인 야로위아 리폴리티카가 전체 지질 분획 중 최대 5.6％로 DHA를 합성함을 입증한다. 도 5에 나타난 바와 같이, 다양한 유전자를 야생형 ATCC #20362 야로위아 리폴리티카에 통합하여 수많은 야로위아 리폴리티카 균주를 생성하였고, 각각의 형질전환체 균주는 PUFA (DHA 포함)를 상이한 양으로 생산할 수 있었다. 몇몇 대표적인 형질전환체 생물의 완전한 지질 프로파일을 하기 표 10에 나타내었다. 엘론가제는 다음과 같은 약어 명명법을 이용하여 표시한다: C18EL1은 고 친화성 C18 /20 엘론가제 (ELO1)를 지칭하고, C18EL2는 C18 /20 엘론가제 (ELO2)를 지칭하고, C16EL은 C16 /18 엘론가제를 지칭하며, C20EL은 C20 /22 엘론가제를 지칭한다. 지방산은 16:0, 16:1, 18:0, 18:1 (올레산), 18:2 (LA), GLA, DGLA, ARA, ETA, EPA, DPA 및 DHA로 표시하였고, 각각의 조성은 전체 지방산의 백분율(％)로 제시하였다. "지질 ％ dcw"는 건조 세포 중량으로 측정한, 세포 중의 지질의 백분율(％)을 나타낸다.
Figure 112007040393459-PCT00004
상기 표에서 보인 바와 같이, DHA 생산 균주는 하기 기재된 유전자 변형을 포함하였다 (이들에 대한 더 상세한 사항은 실시예에 제공되어 있음):
(1) FBA::F.Δ12::LIP2 및 TEF::F.Δ12::PEX16 키메라 유전자 내 푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제의 2개 카피의 발현,
(2) FBAIN::M.D12::PEX20 키메라 유전자 내 모르티에렐라 이사벨리나 Δ12 데새투라제의 1개 카피의 발현,
(3) TEF::Δ6S::LIP1 및 FBAIN::Δ6S::LIP1 키메라 유전자 내 모르티에렐라 알피나 Δ6 데새투라제로부터 유래된 합성 Δ6 데새투라제 유전자 (야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화됨)의 2개 카피의 발현,
(4) FBAIN::MAΔ5S::PEX20 및 TEF::MAΔ5S::LIP1 키메라 유전자 내 모르티에렐라 알피나 Δ5 데새투라제의 2개 카피의 발현,
(5) TEF::H.D5S::PEX16 및 GPAT::H.D5S::PEX20 키메라 유전자 내 호모 사피엔스 Δ5 데새투라제로부터 유래된 합성 Δ5 데새투라제 유전자 (야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화됨)의 2개 카피의 발현,
(6) TEF::I.D5S::PEX20 키메라 유전자 내 이소크리시스 갈바나 Δ5 데새투라제로부터 유래된 합성 Δ5 데새투라제 유전자 (야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화됨)의 1개 카피의 발현,
(7) FBAIN::Δ17S::LIP2, TEF::Δ17S::PEX20 및 FBAINm::Δ17S::PEX16 키메라 유전자 내 사프롤레그니아 디클리나 Δ17 데새투라제로부터 유래된 합성 Δ17 데새투라제 유전자 (야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화됨)의 3개 카피의 발현,
(8) FBAIN::EL1S::PEX20, GPAT::EL1S::XPR 및 GPDIN::EL1S::LIP2 키메라 유전자 내 모르티에렐라 알피나 고친화도 엘론가제로부터 유래된 합성 고친화도 C18 /20 엘론가제 유전자 (야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화됨)의 3개 카피의 발현,
(9) TEF::EL2S::XPR 키메라 유전자 내 트라우스토키트륨 아우레움 엘론가제로부터 유래된 합성 C18 /20 엘론가제 유전자 (야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화됨)의 1개 카피의 발현,
(10) TEF::rELO2S::PEX20 키메라 유전자 내 라투스 노르베기쿠스 rELO 유전자로부터 유래된 합성 C16 /18 엘론가제 유전자 (야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화됨)의 3개 카피의 발현,
(11) YAT1::Δ4S::Pex16 키메라 유전자 내 트라우스토키트륨 아우레움 Δ4 데새투라제 유전자로부터 유래된 합성 Δ4 데새투라제 유전자 (야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화됨)의 1개 카피의 발현,
(12) FBAIN::OtE2S::Oct 키메라 유전자 내 오스트레오코쿠스 타우리 C20 /22 엘론가제 유전자로부터 유래된 합성 C20 /22 엘론가제 유전자 (야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화됨)의 1개 카피의 발현,
(13) 오로티딘-5'-포스페이트 데카르복실라제를 코딩하는 천연 야로위아 리폴리티카 Ura3 유전자의 파괴,
(14) 이소프로필 말레이트 데히드로게나제를 코딩하는 천연 야로위아 리폴리티카 Leu2 유전자의 파괴,
(15) 아실-coA 옥시다제를 코딩하는 천연 야로위아 리폴리티카 Pox3 유전자의 파괴,
(16) Δ12 데새투라제를 코딩하는 천연 야로위아 리폴리티카 유전자의 파괴,
(17) 리파제 1을 코딩하는 천연 야로위아 리폴리티카 Lip1 유전자의 파괴, 및
(18) 아실-CoA 옥시다제를 코딩하는 천연 야로위아 리폴리티카 Pox2 유전자의 파괴.
본 발명자들은 야로위아 리폴리티카의 상기 특정 재조합 균주에서 5.6% DHA (여기서, 총 지방산에 대한 C22 지방산의 총 누적량(％)은 약 24％임)의 생산을 입증하였지만, 숙주 세포에서 DHA의 농도는 본 발명에 있어서 추가의 유전자 변형에 의해 극적으로 증가될 수 있는 것으로 고려된다. 추가로, 본원에서 기재한 교시 내용 및 결과를 기초로 하여, 유질 효모를 각종 ω-3 및/또는 ω-6 PUFA의 합성을 위한 생성 플랫폼으로서 사용하고, ω-6 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 및/또는 ω-3 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 및/또는 ω-6 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로 및/또는 ω-3 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 이용하여 생성되는 실행가능성 및 상업적 유용성을 인지할 것이라 예측된다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명된다. 이들 실시예가 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내는 것이긴 하지만 이는 오직 예시하기 위한 것임을 이해해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적 특성을 본 발명의 사상과 범위에서 벗어나지 않고 파악할 수 있을 것이고 본 발명에 각종 변화와 변형을 가하여 여러 용도 및 조건에 적합하게 할 수 있다.
통상의 방법
실시예에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 공지되어 있으며 하기 문헌에 기재되어 있다:
Figure 112007040393459-PCT00005
미생물 배양물의 유지 및 성장에 적합한 재료 및 방법은 당업계에 공지되어 있다. 하기 예에서 사용하기에 적합한 기술은 문헌 [Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, Eds), American Society for Microbiology: Washington, D. C. (1994)] 또는 문헌 [Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2nd ed., Sinauer Associates: Sunderland, MA (1989)] 등에서 찾을 수 있다. 달리 명시하지 않는 한, 미생물 세포의 성장 및 유지에 사용되는 모든 시약, 제한 효소 및 재료는 알드리치 케미칼스(Aldrich Chemicals) (미국 위스콘신주 밀워키 소재), 디프코 래버러토리즈 (미국 미시간주 디트로이트 소재), GIBCO/BRL (미국 메릴랜드주 가이터스버그 소재) 또는 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Company) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 얻었다.
이. 콜라이 (XL1-Blue) 감응성(competent) 세포는 스트라타진 컴퍼니(Stratagene Company) (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 구입하였다. 이. 콜라이 균주는 전형적으로 37℃의 루리아 베르타니(Luria Bertani, LB) 플레이트에서 성장시켰다.
통상의 분자 클로닝은 표준 방법 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 따라 수행하였다. 올리고뉴클레오티드는 시그마-제노시스(Sigma-Genosys) (미국 텍사스주 스프링 소재)가 합성한 것이었다. 개개의 PCR 증폭 반응은 총 부피를 50 ㎕로 하여 수행하였고, 달리 명시하지 않는 한은 PCR 완충제 (10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 20 mM Tris-HCl (pH 8.75), 2 mM MgSO4, 0.1％ 트리톤 X(Triton X)-100 함유), 100 ㎍/mL BSA (최종 농도), 200 μM씩의 각 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 각각의 프라이머 10 pmol 및 Pfu DNA 폴리머라제 (스트라타진, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재) 1 ㎕를 포함하였다. 부위-지정 돌연변이유발은 스트라타진의 퀵체인지(QuickChange)™ 부위-지정 돌연변이유발 키트를 제조사의 지시에 따라 사용 하여 수행하였다. PCR 또는 부위-지정 돌연변이유발이 서브클로닝에 이용된 경우에는 상기 구축물에 대하여 서열결정을 수행하여 서열에 오류가 없음을 확인하였다. PCR 생성물을 프로메가(Promega) (미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 pGEM-T-이지(pGEM-T-easy) 벡터에 클로닝하였다.
DNA 서열은 벡터 및 삽입물-특이적 프라이머의 조합물을 이용한 염료 종결자 기술 (미국 특허 제5,366,86호, 유럽 특허 제272,007호)을 이용하는 ABI 오토매틱 시퀀서(ABI Automatic sequencer)에서 생성하였다. 서열 교정(editing)은 시퀀서 (진 코드스 코포레이션, 미국 미시건주 앤 아버 소재)에서 수행하였다. 모든 서열은 양 방향으로 2배 이상의 범위를 포함한다. 유전자 서열의 비교는 DNASTAR 소프트웨어 (DNA 스타, 인크.(DNA Star, Inc.))를 이용하여 수행하였다. 별법으로, 유전자 서열의 조작은 제네틱스 컴퓨터 그룹 인크.(Genetics Computer Group Inc.) (위스콘신 패키지 버전 9.0, 제네틱스 컴퓨터 그룹 (GCG), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)에서 구한 프로그램 스위트를 이용하여 수행하였다. GCG 프로그램 "Pileup"은 갭 생성 디폴트 값을 12로 하고 갭 신장 디폴트 값을 4로 하여 사용하였다. GCG "Gap" 또는 "Bestfit" 프로그램은 디폴트 갭 생성 패널티를 50으로 하고 디폴트 갭 신장 패널티를 3으로 하여 사용하였다. 달리 언급하지 않는다면, 모든 다른 경우에서도 상기한 GCG 프로그램 디폴트 파라미터를 사용하였다.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, 문헌 ([Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1993)] 및 [Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)])) 검색을 수행하여, BLAST "nr" 데이타베이스 내의 서열 (3-차원 구조 브 룩하벤 프로테인 데이타 뱅크(Brookhaven Protein Data Bank), SWISS-PROT 단백질 서열 데이타베이스, EMBL 및 DDBJ 데이타베이스로부터 유래된 서열인 모든 비-풍부 진뱅크 CDS 번역부를 포함함)과 유사성을 갖는 단리된 서열을 동정하였다. 서열은 모든 리딩 프레임에서 번역되었고, NCBI에서 제공된 BLASTX 알고리즘 [Gish, W. and States, D. J. Nature Genetics 3:266-272 (1993)]을 이용하여 상기 "nr" 데이타베이스 내의 모든 공개적으로 입수가능한 단백질 서열과의 유사성에 대해 비교하였다.
의문(query) 서열과 최대의 유사성을 갖는 서열을 정리한 BLAST 비교 결과는 동일성(％), 유사성(％) 및 기대값으로 보고된다. "동일성(％)"은 2종 단백질 사이에서 동일한 아미노산의 백분율(％)로 정의된다. "유사성(％)"은 2종 단백질 사이에서 동일하거나 보존된 아미노산의 백분율(％)로 정의된다. "기대값"은 매치수를 주어진 스코어로 표시하여 상기 매치의 통계적 유의성을 추정하는데, 해당 크기의 데이타베이스 검색시에 아주 우연하게 기대되는 값이다.
약어의 의미는 다음과 같다: "sec"은 초를 의미하고, "min"은 분을 의미하며, "h"는 시간을 의미하고, "d"는 일(日)수를 의미하고, "㎕"는 마이크로리터를 의미하고, "mL"은 밀리리터를 의미하고, "L"은 리터를 의미하고, "μM"은 마이크로몰농도를 의미하고, "mM"은 밀리몰농도를 의미하고, "M"은 몰농도를 의미하고, "mmol"은 밀리몰수를 의미하고, "μmol"은 마이크로몰수를 의미하고, "g"은 그램을 의미하고, "㎍"은 마이크로그램을 의미하고, "ng"은 나노그램을 의미하고, "U"는 유닛을 의미하고, "bp"는 염기쌍을 의미하며, "kB"는 킬로베이스를 의미한다.
야로위아 리폴리티카의 형질전환 및 배양
야로위아 리폴리티카 균주 ATCC #20362, #76982 및 #90812은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 메릴랜드주 록크빌 소재)로부터 구입하였다. 야로위아 리폴리티카 균주를 일반적으로 28℃의 YPD 아가 (1％ 효모 추출물, 2％ 박토펩톤, 2％ 글루코스, 2％ 한천)에서 성장시켰다. 별법으로, "SD" 배지는 아미노산 없이 암모늄 술페이트가 들어 있는 0.67％ 효모 질소 염기 및 2％ 글루코스를 포함한다.
야로위아 리폴리티카의 형질전환은 달리 언급하지 않는 한은 문헌 [Chen, D. C. et al. (Appl. Microbiol Biotechnol. 48(2):232-235 (1997)]의 방법에 따라 수행하였다. 간략하게 설명하면, 야로위아를 YPD 플레이트에 스트리킹(streaking)하여 30℃에서 대략 18시간 동안 성장시켰다. 세포를 백금이로 여러번 크게 떠서 플레이트로부터 긁어 내고, 50％ PEG (평균 MW 3350) 2.25 mL, 2 M Li 아세테이트 (pH 6.0) 0.125 mL, 2 M DTT 0.125 mL 및 전단된 연어 정자 DNA 50 ㎍를 함유하는 형질전환 완충제 1 mL 중에 재현탁시켰다. 이어서, 선형화된 플라스미드 DNA 대략 500 ng을 재현탁된 세포 100 ㎕ 중에서 인큐베이션하고, 15분 간격으로 볼텍싱 혼합하면서 39℃에서 1시간 동안 유지시켰다. 세포를 선별 배지 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2일 내지 3일 동안 유지시켰다.
형질전환체 선별을 위해, 일반적으로 SD 배지 또는 최소 배지 ("MM")를 사용하였다. MM의 조성은 다음과 같다: 암모늄 술페이트 또는 아미노산이 없는 0.17％ 효모 질소 염기 (디프코 래버러토리즈, 미국 미시간주 디트로이트 소재), 2％ 글루코스, 0.1％ 프롤린, pH 6.1). 적절하다면, 아데닌, 루이신, 리신 및/또는 우라실 의 보충제를 최종 농도 0.01％로 첨가하였다 (이로써 "MMA", "MMLe", "MMLy" 및 "MMU" 선별 배지가 생성됨. 각각 20 g/L 한천으로 제조됨).
별법으로, 형질전환체를 암모늄 술페이트 또는 아미노산이 없는 0.17％ 효모 질소 염기 (디프코 래버러토리즈), 2％ 글루코스, 0.1％ 프롤린, 75 mg/L 우라실, 75 mg/L 유리딘, 900 mg/L FOA (자이모 리써치 코포레이션(Zymo Research Corp.), 미국 캘리포니아주 오렌지 소재) 및 20 g/L 한천을 포함하는 5-플루오로오로트산 ("FOA"; 또한, 5-플루오로우라실-6-카르복실산 1수화물) 선별 배지에서 선별하였다.
최종적으로, 유질성 조건을 촉진하기 위해 디자인된 "2-단계 성장 조건"을 위해서, 고농도 글루코스 배지 ("HGM")를 다음과 같이 제조하였다: 14 g/L KH2PO4, 4 g/L K2HPO4, 2 g/L MgSO4·7H2O, 80 g/L 글루코스 (pH 6.5). 균주는, 하기 프로토콜에 따라 "2-단계 성장 조건"하에서 배양하였다: 먼저, 세포를 30℃에서 액체 MM 중에서 250 rpm/분으로 48시간 동안 3벌로 진탕 성장시켰다. 세포를 원심분리로 수집하고, 액체 상등액을 추출하였다. 펠렛화된 세포를 HGM 중에 재현탁하고 72시간 또는 96시간 동안 30℃에서 250 rpm/분으로 진탕 성장시켰다. 세포를 다시 원심분리로 수집하고, 액체 상등액을 추출하였다.
"2-단계 성장 조건"을 위해 사용된 변형 배지는 "SD + AA" 배지였으며, 이것은 아미노산은 없지만 암모늄 술페이트가 함유된 6.7 g 효모 질소 염기, 20 g 글루코스, 및 1× 아미노산 혼합물 (20 mg/mL 아데닌 술페이트, 20 mg/mL 우라실, 20 mg/mL L-트립토판, 20 mg/mL L-히스티딘-HCL, 20 mg/mL L-아르기닌-HCL, 20 mg/mL L-메티오닌, 30 mg/mL L-티로신, 30 mg/mL L-루이신, 30 mg/mL L-이소루이신, 30 mg/mL L-리신-HCl, 50 mg/mL L-페닐알라닌, 100 mg/mL L-글루탐산, 100 mg/mL L-아스파르트산, 150 mg/mL L-발린, 200 mg/mL L-트레오닌 및 400 mg/mL L-세린)로 구성된 것이었다.
야로위아 리폴리티카의 지방산 분석
지방산 분석을 위해, 원심분리로 세포를 수집하고, 문헌 [Bligh, E. G. ＆ Dyer, W. J. (Can. J. Biochem. Physiol. 37:911-917 (1959)]에 기재된 바와 같이 하여 지질을 추출하였다. 지질 추출물을 나트륨 메톡시드와 에스테르교환반응시켜서 지방산 메틸 에스테르를 제조하고 [Roughan, G., and Nishida I. Arch Biochem Biophys. 276(1):38-46 (1990)], 그 후에는 30-m × 0.25 mm (i.d.) HP-INNOWAX (휴렛-팩커드(Hewlett-Packard)) 컬럼이 장착된 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다. 오븐 온도는 170℃ (25분 동안 고정)에서부터 3.5℃/분씩 185℃로 하였다.
직접적인 염기 에스테르교환반응을 위해서, 야로위아 배양물 (3 mL)을 수확하여 증류수 중에서 1회 세척하고 스피드-백(Speed-Vac)에서 진공하에 5 내지 10분 동안 건조시켰다. 상기 샘플에 나트륨 메톡시드 (1％, 100 ㎕)를 첨가한 후에 상기 샘플을 볼텍싱하고 20분 동안 흔들어 주었다. 1 M NaCl 3 방울 및 헥산 400 ㎕를 첨가한 후, 샘플을 볼텍싱하고 회전시켰다. 상층을 취하여 상기한 바와 같이 GC로 분석하였다.
실시예 1
야로위아 리폴리티카에서의 고농도 발현을 위한 프로모터의 동정
TEF, GPD, GPDIN, GPM, GPAT, FBA, FBAIN 및 YAT1 프로모터의 프로모터 활성을 조사하는 비교 연구를, 각 프로모터 및 리포터 유전자로서 β-글루쿠로니다제 (GUS)를 코딩하는 이. 콜라이 유전자를 포함하는 구축물을 합성하여 수행하였다 [Jefferson, R.A. Nature. 14(342):837-838 (1989)]. 이어서, 조직화학적 및 형광측정 검정 [Jefferson, R. A. Plant Mol. Biol. Reporter 5:387-405 (1987)] 및/또는 mRNA 정량화를 위한 실시간 PCR로 GUS 활성을 측정하였다.
키메라 프로모터:: GUS :: XPR 유전자를 포함하는 플라스미드의 구축
플라스미드 pY5-30 (도 6A, 서열 154)은 야로위아 자가 복제 서열 (ARS18), ColE1 플라스미드 복제 기점, 이. 콜라이에서의 선별을 위한 앰피실린-내성 유전자 (AmpR), 야로위아에서의 선별을 위한 야로위아 LEU2 유전자, 및 키메라 TEF::GUS::XPR 유전자를 함유하였다. 상기 플라스미드를 기초로 하여, TEF 프로모터가 각종 다른 천연 야로위아 리폴리티카 프로모터로 대체된 일련의 플라스미드를 제작하였다.
하기 표 11에 나타낸 프라이머를 사용하고 주형으로서는 게놈 야로위아 리폴리티카 DNA 또는 pGEM-T-이지 벡터 (프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)에 클로닝된 적절한 영역의 DNA를 함유하는 게놈 DNA의 단편을 사용하여 추정적 프로모터 영역을 PCR로 증폭시켰다:
키메라 프로모터:: GUS :: XPR 유전자를 포함하는 플라스미드의 구축
프로모터 프라이머 유전자에 대한 위치 RE 부위 플라스미드 명칭
GPD YL211, YL212 (서열 225 및 226) gdp 유전자의 -968 bp 내지 'ATG' 번역 개시 부위 (서열 210) SalI 및 NcoI pYZGDG
GPDIN YL376, YL377 (서열 227 및 228) gdp 유전자 부근의 -973 bp 내지 +201 bp (이로써 위치 +49 bp 내지 +194 bp에 위치한 146 bp 인트론을 포함함) (서열 211) PstI/NcoI (프로모터용), 및 PstI/SalI (벡터용) pDMW222
GPM YL203, YL204 (서열 229 및 230) gmp 유전자의 -875 bp 내지 'ATG' 번역 개시 부위 (서열 212) NcoI 및 SalI pYZGMG
GPAT GPAT-5-1, GPAT-5-2 (서열 231 및 232) gpat 유전자의 -1130 bp 내지 'ATG' 번역 개시 부위 (서열 216) SalI 및 NcoI pYGPAT-GUS
FBA ODMW314, YL341 (서열 233 및 234) fba 유전자 부근의 -1001 bp 내지 -1 bp (서열 213) NcoI 및 SalI pDMW212
FBAIN ODMW320, ODMW341 (서열 235 및 236) fba 유전자 부근의 -804 bp 내지 +169 bp (이로써 +62 bp 내지 +165 bp에 위치한 102 bp 인트론을 포함함) (서열 214) NcoI 및 SalI pDMW214
YAT1 27203-F, 27203-R (서열 237 및 238) yat1 유전자 부근의 -778 bp 내지 -1 bp (서열 217) HindIII 및 SalI, 또한 NcoI 및 HindIII pYAT-GUS
주: 'ATG' 번역 개시 코돈의 'A' 뉴클레오티드를 +1로 함.
GPD, GPDIN, GPM, FBA 및 FBAIN에 대한 개개의 PCR 증폭 반응은 총 부피를 50 ㎕로 하여 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이 수행하였다. 열순환기 조건은 95℃에서 1분, 56℃에서 30초 및 72℃에서 1분의 35 주기 후에 72℃에서 10분의 최종 신장으로 설정하였다.
GPAT 프로모터에 대한 PCR 증폭은 예비혼합된 2× PCR 용액 (다까라 바이오 인크.(TaKaRa Bio Inc.), 일본 520-2193 시가 오쯔 소재)의 1:1 희석물을 이용하여 총 부피를 50 ㎕로 하여 수행하였다. 최종 조성물은 25 mM TAPS (pH 9.3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM 2-머캅토에탄올, 200 μM씩의 각 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 10 pmol씩의 각 프라이머, 50 ng 주형 및 1.25 U 다까라 Ex Taq™ DNA 폴리머라제 (다까라 미루스 바이오(Takara Mirus Bio), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 함유하였다. 열순환기 조건은 94℃에서 2.5분, 55℃에서 30초 및 72℃에서 2.5분의 30 주기 후에 72℃에서 6분의 최종 신장으로 설정하였다.
YAT1 프로모터에 대한 PCR 증폭은 GPAT에 대하여 상기한 것과 유사한 조성물 중에서 수행하였다. 반응 혼합물을 우선 94℃로 150초 동안 가열하였다. 증폭은 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분의 30 주기 후에 72℃에서 7분의 최종 신장으로 하여 수행하였다.
각 PCR 생성물을 퀴아젠(Qiagen) PCR 정제 키트로 정제한 후에 제한 효소를 사용하여 소화시키고 (표준 조건을 이용하여 상기한 표에 따라 수행함), 소화 생성물을 1％ (w/v) 아가로스 중에서의 겔 전기영동으로 정제하였다. 이어서, 소화 PCR 생성물 (YAT1로부터의 생성물은 제외)을 유사하게 소화시킨 pY5-30 벡터로 라이게이션하였다. 이어서, 각 반응물의 라이게이션된 DNA를 사용하여 이. 콜라이 Top10, 이. 콜라이 DH10B 또는 이. 콜라이 DH5α을 개별적으로 형질전환시켰다. 앰피실린 (100 ㎍/mL)을 함유하는 LB 아가에서 형질전환체를 선별하였다.
YAT1은 pY5-30으로의 클로닝 이전에 추가의 조작이 필요하였다. 구체적으로, YAT1 PCR 생성물을 HindIII 및 SalI으로 소화시키면 약 600 bp 단편이 생성되었고, NcoI 및 HindIII으로 소화시키면 약 200 bp 단편이 생성되었다. 두가지 생성물 모두를 단리하여 정제하였다. 이어서, 플라스미드 pYGPAT-GUS를 SalI 및 NcoI으로 소화시키고, 약 9.5 kB 단편을 단리 및 정제하였다. 상기 3가지 DNA 단편을 함께 라이게이션하여 pYAT-GUS를 생성하였다.
각 형질전환 반응물의 플라스미드 DNA를 분석하여 예측된 플라스미드의 존재를 확인하였다. 이들 플라스미드를 다음과 같이 칭하였다: pYZGDG (GPD::GUS::XPR 키메라 유전자를 포함함), pDMW222 (GPDIN::GUS::XPR 키메라 유전자를 포함함), pYZGMG (GPM::GUS::XPR 키메라 유전자를 포함함), pYGPAT-GUS (GPAT::GUS::XPR 키메라 유전자를 포함함), pDMW212 (FBA::GUS::XPR 키메라 유전자를 포함함), pDMW214 (FBAIN::GUS::XPR 키메라 유전자를 포함함) 및 pYAT-GUS (YAT1::GUS::XPR 키메라 유전자를 포함함).
상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이, 상기 각 플라스미드 및 추가의 플라스미드 pY5-30 (TEF::GUS::XPR 키메라 유전자를 포함함)를 개별적으로 야로위아 리폴리티카에 형질전환시켰다. 야로위아 리폴리티카 숙주는 야로위아 리폴리티카 ATCC #76982 또는 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362, 균주 Y2034 (하기함 [실시예 13], Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로를 통해 ARA를 10％로 생산할 수 있음)였다. 형질전환된 모든 세포를 루이신이 없는 최소 배지 플레이트에 플레이팅하여 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다.
GUS 발현의 조직화학적 분석에 의한 야로위아 프로모터들의 비교 분석
플라스미드 pY5-30, pYZGDG, pYZGMG, pDMW212 및 pDMW214를 함유하는 야로위아 리폴리티카 ATCC #76982 균주들을 MM 3 mL 중의 단일 콜로니로부터 30℃에서 OD600 약 1.0으로 성장시켰다. 이어서, 세포 100 ㎕를 원심분리로 수집하여, 조직화학적 염색 완충제 100 ㎕ 중에 재현탁하고 30℃에서 인큐베이션하였다. 염색 완충제는 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 글루쿠로나이드 (X-Gluc) 5 mg을 디메틸 포름아미드 50 ㎕ 중에 용해한 후에 50 mM NaPO4 (pH 7.0) 5 mL를 가하여 제조하였다. 조직화학 염색 결과 (도 6B)는 구축물 pY5-30 중의 TEF 프로모터, 구축물 pYZGDG 중의 GPD 프로모터, 구축물 pYZGMG 중의 GPM 프로모터, 구축물 pDMW212 중의 FBA 프로모터, 및 구축물 pDMW214 중의 FBAIN 프로모터 모두가 활성임을 보여준다. FBA 프로모터와 FBAIN 프로모터 둘다가 모든 다른 프로모터보다 훨씬 강력하며, FBAIN 프로모터가 가장 강력한 프로모터 활성을 보유하는 것으로 여겨졌다.
별도의 실험에서, 플라스미드 pY5-30, pYGPAT-GUS, pYAT-GUS 및 pDMW214를 함유하는 야로위아 리폴리티카 Y2034 균주들을 SD 배지 5 mL 중의 단일 콜로니로부터 30℃에서 24시간 동안 OD600 약 8.0으로 성장시켰다. 이어서, 세포 1 mL를 원심분리로 수집하였다. 나머지 배양물을 원심분리하여 HGM으로 2회 세척하고, 각각 5 mL씩의 HGM 중에 재현탁하고, 30℃에서 추가로 성장시켰다. 24시간 및 120시간 후에, 각 배양물 약 0.25 mL씩을 원심분리하여 세포를 수집하였다. 세포 샘플을 조직화학적 염색 완충제 (상기) 100 ㎕ 중에 개별적으로 재현탁하였다. 각각에 자이몰라제(Zymolase) 2OT (1 mg/mL 5 ㎕; ICN 바이오메디칼스(ICN Biomedicals), 미국 캘리포니아주 코스타 메사 소재)를 가하고, 혼합물을 30℃에서 인큐베이션하였다.
조직화학적 염색 결과는, SD 배지 중에서 24시간 동안 성장시킨 경우, 구축물 pYAT-GUS 중의 YAT1 프로모터가 활성인 것처럼 구축물 pYGPAT-GUS 중의 GPAT 프로모터가 활성임을 보여준다 (도 6C, "SD 배지 중 24시간"). 비교하면, GPAT 프로모터가 TEF 프로모터보다는 훨씬 더 강력하고 FBAIN 프로모터에 비하여는 활성이 낮다고 여겨졌다. 마찬가지로, 세포를 SD 배지 중에서 24시간 동안 성장시킨 경우, YAT1 프로모터는 TEF 프로모터보다는 더 강력하였으나 FBAIN 프로모터 및 GPAT 프로모터보다는 유의하게 더 약한 것으로 여겨졌다. 그러나 더 흥미롭게도, HGM 중에서 24시간 동안 성장시킨 세포 중에서 YAT1 프로모터는 GPAT 프로모터보다 더 강력하고 FBAIN 프로모터에 필적하는 것으로 여겨졌다 (도 6C, "HG 배지 중 24시간"). 이것은 HGM 중에서 120시간이 지난 후에도 마찬가지였다 (도 6C, "HG 배지 중 120시간"). 따라서, YAT1 프로모터는 질소 제한으로 인해 유질 성장 조건을 촉진시키는 배지인 HGM 중에서 유도되는 것으로 여겨졌다.
GUS 발현의 형광측정 검정에 의한 야로위아 프로모터의 비교 분석
또한, GUS 활성을, 상응하는 기질 β-글루쿠로나이드로부터의 4-메틸룸벨리페론 (4-MU) 생성을 형광 측정함으로써 검정하였다 [Jefferson, R. A. Plant Mol. Biol. Reporter 5:387-405 (1987)].
플라스미드 pY5-30, pYZGDG, pYZGMG, pDMW212 및 pDMW214를 함유하는 야로위아 리폴리티카 ATCC #76982의 균주들을 3 mL MM (상기한 바와 같음) 중의 단일 콜로니로부터 30℃에서 OD600 약 1.0으로 성장시켰다. 이어서, 3 mL 배양물 각각을 50 mL MM을 함유하는 500 mL 플라스크에 첨가하고 30℃의 진탕 인큐베이터 중에서 약 24시간 동안 성장시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 프로메가 세포 용해 완충제 중에 재현탁하고 Bio101 바이오풀버라이저(BioPulverizer) 시스템 (비스타(Vista), 미국 캘리포니아주 소재)을 사용하여 용해시켰다. 원심분리 후, 상등액을 취하여 얼음상에 보관하였다.
유사하게, 플라스미드 pY5-30, pYAT-GUS, pYGPAT-GUS 및 pDMW214 구축물 각각을 함유하는 야로위아 리폴리티카 균주 Y2034를 10 mL SD 배지 중의 단일 콜로니로부터 30℃에서 OD600 약 5.0으로 48시간 동안 성장시켰다. 각 배양물 2 mL를 하기하는 GUS 활성 검정을 위해 수집하였고, 각 배양물 5 mL는 HGM으로 변경했다.
구체적으로, 5 mL 분취액으로부터의 세포를 원심분리로 수집하고, HGM 5 mL로 1회 세척하여 HGM 중에 재현탁하였다. 이어서, HGM 중의 배양물을 30℃의 인큐베이터에서 24시간 동안 진탕 성장시켰다. GUS 활성 검정을 위해 각 HGM 배양물 2 mL씩을 수집하였고, 나머지 배양물은 추가의 96시간 동안 더 성장시킨 후에 검정을 위해서 각 배양물을 2 mL씩 더 수집하였다.
SD 배지 중 2 mL씩의 배양물 샘플을 0.5× 세포 배양물 용해 시약 (프로메가) 1 mL 중에 재현탁하였다. 재현탁된 세포를 고무 O-링이 장착된 2.0 mL 스크류 캡 튜브 중에서 유리 비드 (0.5 mm 직경) 0.6 mL와 혼합하였다. 이어서, 상기 세포를 바이오스펙 미니 비드비터(Biospec mini beadbeater) (미국 오클라호마주 바르틀레스빌 소재)에서 90초 동안 가장 높은 셋팅으로 균질화했다. 균질화 혼합물을 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리기에서 2분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하여 세포 파편 및 비드를 제거하였다. 상등액을 이용하여 GUS 검정 및 단백질 결정을 수행하였다.
각각의 형광측정 검정을 위해, 추출물 100 ㎕를 GUS 검정 완충제 (추출 완충제 중 2 mM 4-메틸룸벨리페릴-β-D-글루쿠로나이드 ("MUG")) 700 ㎕에 첨가하거나, 또는 추출물 200 ㎕를 GUS 검정 완충제 800 ㎕에 첨가하였다. 상기 혼합물을 37℃로 유지시켰다. 0분, 30분 및 60분 시점에서 분취액을 100 ㎕씩 취하여 중지 완충제 (1 M Na2CO3) 900 ㎕에 첨가하였다. 각 시점에 여기 파장은 360 nm로 하고 방출 파장은 455 nm로 하여 설정된 사이토플루어 시리즈 4000 플루오레슨스 멀티-웰 플레이트 리더(CytoFluor Series 4000 Fluorescence Multi-Well Plate Reader) (퍼셉티브 바이오시스템즈(PerSeptive Biosystems), 미국 매사추세츠주 프레이밍햄 소재)를 이용하여 판독하였다. 각 샘플의 총 단백질 농도를, 추출물 10 ㎕와 바이오라드 브래드포드(BioRad Bradford) 시약 200 ㎕를 사용하거나 또는 추출물 20 ㎕와 바이오라드 브래드포드 시약 980 ㎕를 사용하여 결정하였다 [Bradford, M. M. Anal. Biochem. 72:248-254 (1976)]. GUS 활성은 단백질 1 mg 당 1분 당의 4-MU 나노몰(nmol)로 표시하였다.
야로위아 리폴리티카 ATCC #76982 균주에서 TEF, GPD, GPM, FBA 및 FBAIN 프로모터를 비교하도록 디자인된 이들 형광측정 검정의 결과를 도 7A에 나타내었다. 구체적으로, FBA 프로모터는 야로위아 리폴리티카에서 GPD 프로모터보다 2.2배 더 강력하였다. 추가로, FBAIN 프로모터의 GUS 활성은 GPD 프로모터보다 약 6.6배 더 강력하였다.
야로위아 리폴리티카 균주 Y2034에서 TEF, GPAT, YAT1 및 FBAIN 프로모터를 비교하도록 디자인된 이들 형광측정 검정의 결과를 하기 표에 나타내었다:
다양한 성장 조건하에서 TEF , FBAIN . YAT1 및 GPAT 프로모터의 활성 비교
배양 조건 프로모터
TEF FBAIN YAT1 GPAT
48시간, SD 0.401 43.333 0.536 5.252
24 시간, HGM 0.942 30.694 19.154 2.969
120시간, HGM 0.466 17.200 13.400 3.050
세포 추출물의 GUS 활성을 기준으로 YAT1 프로모터의 활성을 정량한 상기 데이타에 기초할 때, YAT1 프로모터의 활성은 세포를 SD 배지에서 HGM으로 변경하여 24시간 동안 성장시킬 경우에 약 37배 증가하였다. HGM 중에서 120시간이 지난 후, 상기 활성은 다소 감소하였으나 SD 배지 중에서의 활성에 비해 여전히 25배 더 높았다. 반대로, FBAIN 프로모터 및 GPAT 프로모터의 활성은 SD 배지에서 HGM으로 변경하여 24시간 동안 성장시킬 경우에 각각 30％ 및 40％ 감소하였다. TEF 프로모터의 활성은 HGM 중에서 24시간이 지난 후에 2.3배 증가하였다. 따라서, YAT1 프로모터는 유질 조건하에서 유도가능하다.
GUS 발현의 정량적 PCR 분석에 의한 야로위아 프로모터의 비교 분석
TEF, GPD, GPDIN, FBA 및 FBAIN 프로모터의 전사 활성을 pY5-30, pYZGDG, pDMW222, pDMW212 및 pDMW214 구축물을 함유하는 야로위아 리폴리티카 중에서 정량적 PCR 분석으로 측정하였다. 이를 위해서는 RNA의 단리 및 실시간 RT-PCR이 필요했다.
보다 구체적으로, pY5-30, pYZGDG, pDMW222, pDMW212 및 pDMW214를 함유하는 야로위아 리폴리티카 ATCC #76982 균주를 25 mL 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 중의 MM 6 mL에서 16시간 동안 30℃에서 단일 콜로니로부터 성장시켰다. 이어서, 6 mL 출발 배양물 각각을 HGM 140 mL를 함유하는 개개의 500 mL 플라스크에 첨가하고 30℃에서 4일 동안 인큐베이션시켰다. 각각 24시간씩의 간격을 두고, 각 플라스크로부터 배양물을 1 mL씩 취하여 광학 밀도를 측정하였고, 27 mL를 취하여 형광측정 GUS 검정 (상기한 바와 같음)에 사용하였으며, RNA 단리를 위해 1.5 mL씩의 2개 분취액을 취하였다. RNA 단리를 위한 배양물은 원심분리하여 세포 펠렛을 생성하였다.
변형된 퀴아젠 RNeasy 미니 프로토콜(RNeasy mini protocol) (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에 따라, 야로위아 균주로부터 RNA를 단리하였다. 간략하게 설명하면, 각 샘플마다 각 시점에서 퀴아젠 완충제 RLT 340 ㎕를 사용하여 2개의 세포 펠렛 각각을 재현탁했다. 2개 튜브 각각으로부터의 완충제 RLT/세포 현탁액 혼합물을 비드 비팅(beating) 튜브 (Bio101, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에서 합하였다. 0.5 mL 유리 비드 약 500 ㎕를 상기 튜브에 넣고, 설정치 5에서 2분 동안의 비드 비팅으로 세포를 파괴하였다 (바이오풀버라이저, Bio101 컴파니, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재). 이어서, 파괴된 세포를14,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 펠렛화하고, 상등액 350 ㎕를 새로운 마이크로원심분리 튜브에 옮겼다. 각각의 균질화된 용해물에 에탄올 (70％, 350 ㎕)을 첨가하였다. 완만한 혼합 후, 전체 샘플을 2 mL 수집 튜브 중의 RNeasy 미니 컬럼에 첨가하였다. 상기 샘플을 15초 동안 10,000 rpm에서 원심분리하였다. 완충제 RW1 (350 ㎕)을 RNeasy 미니 컬럼에 첨가하고, 상기 컬럼을 15초 동안 10,000 rpm에서 원심분리하여 세포를 세척하였다. 용출액은 버렸다. 퀴아젠의 DNase1 스톡(stock) 용액 (10 ㎕)을 완충제 RDD 70 ㎕에 첨가하고 완만하게 혼합하였다. 상기 전체 DNase 용액을 RNeasy 미니 컬럼에 첨가하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 단계 후에는 완충제 RW1 350 ㎕를 상기 미니 컬럼에 첨가하고, 컬럼을 15초 동안 10,000 rpm에서 원심분리하였다. 상기 컬럼을 완충제 RW1 700 ㎕로 2회 세척하였다. RNase-무함유 물 (50 ㎕)을 컬럼에 첨가하였다. 컬럼을 1분 동안 10,000 rpm에서 원심분리하여 RNA를 용출시켰다.
2-단계 RT-PCR 프로토콜을 이용하였고, 이때 전체 야로위아 RNA를 우선 cDNA로 전환시킨 후에 cDNA를 실시간 PCR로 분석하였다. cDNA로의 전환은 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)의 하이 캐퍼서티 cDNA 아르키브(High Capacity cDNA Archive) 키트 (PN#4322171; 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재) 및 미디아테크, 인크.(MediaTech, Inc.)의 분자생물학 등급 물 (PN# 46-000-Con; 미국 플로리다주 홀리 힐 소재)을 이용하여 수행하였다. 야로위아로부터 얻은 전체 RNA (100 ng)를 RT 완충제 10 ㎕, 25× dNTP 4 ㎕, 10× 랜덤 헥사머(Random Hexamer) 프라이머 10 ㎕, 멀티스크라이브 리버스 트랜스크립타제(Multiscribe Reverse Transcriptase) 5 ㎕ 및 RNase 인히비터(Inhibitor) 0.005 ㎕와 혼합하고 물을 사용하여 총 반응 부피를 100 ㎕로 맞추어 cDNA로 전환시켰다. 상기 반응물을 열순환기 중에서 10분 동안 25℃에서 인큐베이션한 후에 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션했다. 실시간 분석 이전에는 cDNA를 -20℃에서 보관하였다.
실시간 분석은 어플라이드 바이오시스템즈의 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(SYBR Green PCR Master Mix) (PN# 4309155)로 수행하였다. 역전사 반응물 (2 ㎕)을 2× SYBR PCR 믹스 10 ㎕, URA (즉, 프라이머 YL-URA-16F 및 YL-URA-78R [서열 239 및 서열 240]) 또는 GUS (즉, 프라이머 GUS-767F 및 GUS-891R [서열 241 및 서열 242])를 위한 100 μM의 전방향 및 역방향 프라이머 0.2 ㎕ 및 물 7.2 ㎕에 첨가하였다. 상기 반응물을 ABI 7900 시퀀스 디텍션 시스템(Sequence Ditection System) 기기에서 10분 동안 95℃로 열주기(thermocycle) 적용시킨 후, 95℃에서 5초 및 60℃에서 1분으로 하여 40회 주기를 실시하였다. 각각의 주기 중 60℃ 신장 동안의 실시간 형광 데이타를 수집하였다.
상대적 정량화는 유저 블러틴(User Bulletin) #2 ("유전자 발현의 상대적 정량화", 어플라이드 바이오시스템즈, 2001년 10월 업데이트)에 따라 ΔΔCT 방법으로 수행했다. 상기 URA 유전자를 이용하여 GUS 발현을 표준화하였다. 표준물 유전자로서의 URA 용도를 확인하기 위해서 GUS 및 URA의 PCR 효율을 비교하였고, 이들은 각각 1.04 및 0.99인 것으로 밝혀졌다 (여기서, 1.00은 100％ 효율에 해당함). PCR 효율이 둘다 100％에 가까웠기 때문에, 발현 정량화를 위한 ΔΔCT 방법의 이용과 같이 GUS 발현을 위한 표준물로서 URA의 용도가 확인되었다. 표준화된 양은 ΔCT로 표시한다.
각각의 상이한 균주 (즉, pYZGDG, pDMW222, pDMW212 및 pDMW214 구축물을 함유하는 야로위아 리폴리티카 ATCC #76982 균주) 중의 GUS mRNA를 pY5-30 (TEF::GUS)를 갖는 균주의 mRNA 수준에 대하여 정량화하였다. 따라서, 발현의 상대적 정량화는 TEF::GUS를 함유하는 균주의 mRNA 수준을 참조용 샘플로서 사용하여 계산하였다. GPD::GUS, GPDIN::GUS, FBA::GUS 및 FBAIN::GUS에 대한 표준화 값을 TEF::GUS 기준물의 표준화 값과 비교하였다. 이 양을 ΔΔCT라고 지칭한다. 이어서, ΔΔCT 값을 식 2-ΔΔ CT를 이용하여 절대값으로 전환시켰다. 이 값은, 키메라 GPD::GUS, GPDIN::GUS, FBA::GUS 및 FBAIN::GUS 유전자를 포함하는 균주 중에서의 GUS mRNA 수준을 키메라 TEF::GUS 유전자를 포함하는 경우에서의 값과 비교한 증가분 (배)으로 표시한다. 이 방법을 이용하면, TEF 프로모터의 활성을 GPD, GPDIN, FBA 및 FBAIN 프로모터와 비교하는 것이 가능하였다.
각각의 GUS 키메라 유전자에 대한 mRNA의 상대적 정량화 결과는 도 7B에 나타내었다. 보다 구체적으로, 상기 검정법은 HGM에서 24시간이 지난 후에는 FBA 및 FBAIN 프로모터의 전사 활성이 TEF 프로모터보다 각각 약 3.3배 및 6배 더 강력함을 보여주었다. 유사하게, GPD 및 GPDIN 프로모터의 전사 활성은 TEF 프로모터보다 각각 약 2배 및 4.4배 더 강력하였다. FBA::GUS, FBAIN::GUS, GPD::GUS 및 GPDIN::GUS 유전자 융합체의 전사 활성은 4일의 실험 기간에 걸쳐 감소했지만, FBAIN 및 GPDIN 프로모터의 전사 활성은 실험 마지막 날에 TEF 프로모터보다 여전히 약 3배 및 2.6배 더 강력했다.
실시예 2
야로위아 리폴리티카에서의 유전자 전사를 증가시키는데 유용한
인핸서의 동정
본 실시예의 연구는, FBAIN 및 GPDIN의 강력한 프로모터 활성 (상기 활성은 각각 FBA 및 GPD 프로모터의 활성보다 높음) 및 각 프로모터 영역 내 인트론 동정 결과를 기초로 하여, 각각의 인트론 내에 인핸서가 존재하는지 여부를 결정하기 위한 것이었다.
구체적으로, GPM::FBAIN 프로모터 융합체 및 GPM::GPDIN 프로모터 융합체로 구성된 2종의 키메라 프로모터를 생성하여, GUS 리포터 유전자의 발현을 구동하였다. 키메라 프로모터 ("성분 1" 및 "성분 2"로 구성됨)를 하기 표 13에 기재한다:
키메라 프로모터:: GUS :: XPR 유전자 내에 키메라 프로모터를 포함하는 플라스미드의 구축
키메라 프로모터 성분 1 성분 2 플라스미드 명칭
GPM::FBAIN (서열 219) GPM의 -1 bp 내지 -843 bp 영역 FBAIN의 +1 bp 내지 +171 bp. 여기서의 인트론은 위치 +62 bp 내지 +165 bp에 위치함. pDMW224
GPM::GPDIN (서열 220) GPM의 -1 bp 내지 -843 bp 영역 GPDIN의 +1 bp 내지 +198 bp. 여기서의 인트론은 위치 +49 bp 내지 +194 bp에 위치함. pDMW225
상기 키메라 프로모터들은 이들 각각이 플라스미드 pDMW224 및 pDMW225 내에서 GUS 리포터 유전자의 발현을 구동하도록 위치시켰다.
pDMW224 및 pDMW225를 포함하는 야로위아 리폴리티카 균주 중에서의 GUS 활성을 조직화학적 검정 결과 (실시예 1에 기재한 바와 같음)에 기초하여 pY5-30, pYZGDG, pYZGMG 및 pDMW214 구축물을 포함하는 야로위아 리폴리티카 균주 중에서의 GUS 활성과 비교함으로써, GPM::FBAIN 프로모터 및 GPM::GPDIN 프로모터의 활성을 TEF, FBAIN, GPDIN 및 GPM 프로모터의 활성과 비교하였다. 앞서 측정된 바와 같이, FBAIN 프로모터가 가장 강력한 프로모터였다. 그러나, 키메라 GPM::FBAIN 프로모터 및 키메라 GPM::GPDIN 프로모터는 둘다 GPM 프로모터보다 훨씬 더 강력하였고, GPDIN 프로모터와 활성면에서 동등한 것으로 여겨졌다. 따라서, 이것은 GPDIN 프로모터와 FBAIN 프로모터 둘다에 인핸서가 존재함을 확인시켜 주었다.
당업자는 GPDIN 인트론 또는 FBAIN 인트론을 사용한 유사한 키메라 프로모터를 쉽게 구축할 수 있을 것이다.
실시예 3
술포닐우레아 선별
야로위아의 유전적 개선은 적합한 비-항생제 선별가능한 형질전환 마커의 결여로 인해 방해를 받았다. 본 실시예는 술포닐우레아 내성을 기초로 하는, 야로위아 리폴리티카에 대한 우성의 비-항생제 마커의 개발을 기재하며, 이것은 반수체, 이배체, 이수체 또는 이형접합체일 수 있는 다른 산업상의 효모 균주에도 적용될 수 있다.
이론 및 초기 감수성 스크리닝
아세토히드록시산 신타제 (AHAS)는 분지쇄 아미노산의 생합성 경로에 공통적인 첫번째 효소이다. 이것은 술포닐우레아 및 이미다졸리논 제초제의 표적이다. 이와 같이, 미생물과 식물 모두에서 술포닐 우레아 제초제 내성이 보고된 바 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애에서는 AHAS에서의 단일 W586L 돌연변이가 술포닐우레아 제초제에 내성을 부여한다 ([Falco, S. C, et al., Dev. Ind. Microbiol. 30:187-194 (1989)], [Duggleby, R.G., et. al. Eur. J. Biochem. 270:2895 (2003)]).
야생형 AHAS 야로위아 리폴리티카 효소 (진뱅크 관리 번호 XP_501277) 및 사카로마이세스 세레비지애 효소 (진뱅크 관리 번호 P07342)의 아미노산 서열을 정렬했을 때, 사카로마이세스 세레비지애 효소의 위치 586에서의 Trp 아미노산 잔기는 야로위아 리폴리티카 효소의 위치 497에서의 Trp 아미노산 잔기와 동등하였다. 따라서, 야생형 세포 자체가 술포닐우레아에 감수성이 있다면 야로위아 리폴리티카 효소 중의 W497L 돌연변이가 술포닐우레아 제초제 내성을 부여할 것이라는 가설을 세웠다. 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, 최소 배지 중 100 ㎍/mL 농도의 술포닐우레아 (클로리무론 에틸)가 야생형 야로위아 리폴리티카 균주 ATCC #20362 및 ATCC #90812의 성장을 억제하는데 충분한 것으로 결정되었다.
돌연변이체 W497L AHAS 유전자의 합성
W497L 돌연변이를 함유하는 야로위아 리폴리티카 AHAS 유전자 (서열 243)를 게놈 DNA로부터 2-단계 반응으로 생성하였다. 우선, Pfu 울트라(Pfu Ultra)™ 하이-피델러티(High-Fidelity) DNA 폴리머라제 (스트라타진, 카탈로그 #600380) 및 프라이머 410 및 411 [서열 244 및 245]를 사용하여 AHAS 유전자의 5' 부분을 게놈 DNA로부터 증폭시켰고, 상기 유전자의 3' 부분은 프라이머 412 및 413 [서열 246 및 247]를 사용하여 유사하게 증폭시켰다. 2쌍의 프라이머를, W497L 돌연변이 (여기서의 돌연변이는 'CT'의 'TG'로의 변화임)를 함유하는 영역이 중복되도록 중복시켰다.
정확한 크기의 5' 및 3' PCR 생성물을 겔 정제하여, 2차 PCR의 주형으로 사용하였고, 이때 프라이머 414 및 415 (서열 248 및 249) 및 2가지 1차 PCR 반응에서 얻은 생성물들의 혼합물을 사용하여, 전체 돌연변이체 유전자가 증폭되었다. 이 돌연변이체 유전자는 고유의 천연 프로모터 및 종결자 서열을 보유하였다. 정확한 크기의 2차 PCR 생성물을 겔 정제하여 인-퓨전(in-fusion) 기술로 플라스미드 pY35 [키메라 TEF::푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제 (Fm2) 유전자, 이. 콜라이 복제 기점, 박테리아 앰피실린 내성 유전자, 야로위아 Leu 2 유전자 및 야로위아 자가 복제 서열 (ARS)을 함유함. 더욱 상세한 사항에 대하여는 제WO 2005/047485호 참조]의 벡터 주쇄에 클로닝한 후, 효소 SalI/BsiWI으로 소화시켰다. 인-퓨전 반응 혼합물로 TOP10 감응성 세포 (인비트로젠(Invitrogen), 카탈로그 #C4040-10)를 형질전환시켰다. 1일 후에 LB/Amp 플레이트상에서 선별하고, 여덟개 (8개)의 콜로니를 DNA 미니프렙(miniprep)으로 분석하였다. 제한 소화를 통해 7개의 클론이 제대로 된 것임을 확인하였다. 이들 중 술포닐우레아 내성 유전자 및 또한 LEU 유전자를 함유하는 하나를 "pY57" (또는 "pY57.YI.AHAS.w4971", 도 3B)라고 명명하였다.
표준 리튬 아세테이트 방법에 의해, 야생형 야로위아 리폴리티카 균주 ATCC #90812 및 ATCC #20362를 pY57 및 '빈(empty)' LEU로 형질전환시켰다. DNA를 포함하지 않는 ('No-DNA') 형질전환 대조군도 사용하였다. 형질전환체를 MM 또는 MM + 술포닐우레아 (SU; 100 ㎍/mL) 아가 플레이트에 플레이팅하고, 4일 동안 성장시킨 후에 콜로니의 존재 또는 부재를 평가하였다.
야로위아 리폴리티카에서의 AHAS 선별
플라스미드 ATCC #90812 ATCC #20362
MM MM + SU (100 ㎍/ mL ) MM MM + SU (100 ㎍/ mL )
pY57 콜로니 생성 콜로니 생성 콜로니 생성 콜로니 생성
Leu 벡터 대조군 콜로니 생성 콜로니 생성 없음 콜로니 생성 콜로니 생성 없음
No DNA 대조군 콜로니 생성 없음 콜로니 생성 없음 콜로니 생성 없음 콜로니 생성 없음
상기 나타낸 결과를 기초로 할 때, AHAS W497L은 야로위아 리폴리티카 ATCC #90812와 ATCC #20362 모두에서 양효한 비-항생제 선별 마커였다. 이어서, 본 발명자들은 술포닐우레아를 150 ㎍/mL의 농도로 사용하였다. 상기 신규 마커는 외래 유전자에는 의존적이 아니지만 돌연변이체 천연 유전자에는 의존적이며, 영양요구성도 필요 없고 영양요구성을 야기하지도 않기 때문에, 야로위아 리폴리티카의 형질전환에 유리하다. 제초제는 인간과 동물에게 비독성이다.
이러한 선별 방법은, 돌연변이체 AHAS 효소가 본원에 기재한 것과 유사한 방식으로 제작된 경우에는 반수체, 이배체, 이수체 또는 이형접합체일 수 있는 다른 산업상의 효모 균주에 일반적으로 적용될 수 있다고 예측된다.
실시예 4
야로위아 리폴리티카 중의 코돈-최적화 Δ4 데새투라제 유전자의 합성 및
기능적 발현
트라우스토키트륨 아우레움의 Δ4 데새투라제 유전자 (진뱅크 관리 번호 AAN75707)의 코돈 사용방식을 WO 2004/101753에 기재된 바와 유사한 방식으로 야로위아 리폴리티카에서의 발현에 최적화시켰다. 구체적으로, 야로위아 코돈 사용방식 패턴, ATG 번역 개시 코돈 주변의 컨센서스 서열, 및 RNA 안정성의 일반 규칙 [Guhaniyogi, G. and J. Brewer, Gene 265(1-2):11-23 (2001)]에 따라, 코돈-최적화 Δ4 데새투라제 유전자는 트라우스토키트륨 아우레움 유전자 (서열 104)의 DNA 서열을 기초로 하여 디자인하였다 (서열 106 및 107). 번역 개시 부위의 변형 외에, 1545 bp 코딩 영역 중 170 bp가 변형되었고 (11％), 166개 코돈이 최적화되었다. 번역 개시 부위를 변형시키기 위해, 서열 105 (야생형)의 제2 아미노산 (T)는 코돈-최적화 Δ4 데새투라제 유전자 (서열 107)에 포함시키지 않았다.
코돈-최적화 Δ4 데세투라제 유전자의 시험관내 합성
코돈-최적화 Δ4 데새투라제 유전자를 하기와 같이 합성하였다. 먼저, 16쌍의 올리고뉴클레오티드를 디자인하여 트라우스토키트륨 아우레움 Δ4 데새투라제 유전자의 코돈-최적화 코딩 영역의 전장을 신장시켰다 (예컨대, 서열 250 내지 281에 상응하는 D4-1A, D4-1B, D4- 2A1 D4-2B, D4-3A, D4-3B, D4-4A, D4-4B, D4-5A, D4-5B, D4-6A, D4-6B, D4-7A, D4-7B, D4-8A, D4-8B, D4-9A, D4-9B, D4-10A, D4-10B, D4-11A, D4-11B, D4-12A, D4-12B, D4-13A, D4-13B, D4-14A, D4-14B, D4-15A, D4-15B, D4-16A 및 D4-16B). 센스 (A) 및 안티센스 (B) 올리고뉴클레오티드의 각 쌍은 각 5'-말단에서의 4 bp 오버행 외에는 상보적이었다. 추가로, 프라이머 D4-1F (서열 282)은 NcoI 부위를 도입하였고, 프라이머 D4-4R (서열 283) 및 D4-5F (서열 284)은 BamHI 부위를 도입하였고, 프라이머 D4-8R (서열 285) 및 D4-9F (서열 286)는 274번 아미노산을 Phe에서 Leu로 변화시킨 HindIII 부위를 도입하였고, 프라이머 D4-12R (서열 287) 및 D4-13 (서열 288)은 ApaLI 부위를 도입하였고, 프라이머 D4-16R (서열 289)은 차후의 서브클로닝을 위해 NotI 부위를 도입하였다. 이후, 프라이머 D4-8R 및 D4-9F에 의해 도입된 274번 위치의 아미노산 변화는 이하의 전체 유전자 어셈블리를 이용해서 교정하였다.
각각의 올리고뉴클레오티드 (100 ng)는 37℃에서 1시간 동안 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.5 mM 스페르미딘, 0.5 mM ATP 및 10U T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 함유한 부피 20 ㎕에서 인산화하였다. 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각 쌍을 혼합하고, 하기 파라미터를 이용하는 열순환기에서 어닐링시켰다: 95℃ (2분), 85℃ (2분), 65℃ (15분), 37℃ (15분), 24℃ (15분) 및 4℃ (15분). 따라서, D4-1A (서열 250)를 D4-1B (서열 251)에 어닐링시켜 이중-가닥 생성물 "D4-1AB"를 생산하였다. 유사하게, D4-2A (서열 252)를 D4-2B (서열 253)에 어닐링시켜 이중-가닥 생성물 "D4-2AB" 등을 생산하였다.
어닐링된 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 4개의 개별적 풀을 하기에 나타내는 바와 같이 이어서 함께 라이게이션하였다: 풀 1 (D4-1AB, D4-2AB, D4-3AB 및 D4-4AB 포함); 풀 2 (D4-5AB, D4-6AB, D4-7AB 및 D4-8AB 포함); 풀 3 (D4-9AB, D4-10AB, D4-11AB 및 D4-12AB 포함); 및 풀 4 (D4-13AB, D4-14AB, D4-15AB 및 D4- 16AB 포함). 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 각 풀을 10U T4 DNA 리가제를 갖는 부피 20 ㎕에서 혼합하고, 라이게이션 반응물을 밤새 16℃에서 인큐베이션하였다.
각 라이게이션 반응의 생성물을 이어서 주형으로서 사용하여 디자인된 DNA 단편을 PCR로 증폭시켰다. 구체적으로, 라이게이션된 "풀 1" 혼합물 (즉, D4-1AB, D4-2AB, D4-3AB 및 D4-4AB)을 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 D4-1F 및 D4-4R (서열 282 및 283)을 프라이머로 사용하여, 코돈-최적화 Δ4 데새투라제 유전자의 제1 부분을 PCR로 증폭시켰다. PCR 증폭은 총 부피를 50 ㎕로 하여 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이 수행하였다. 증폭을 하기와 같이 수행하였다: 95℃에서 3분 동안 초기 변성, 이어서 95℃에서 1분 동안, 56℃에서 30초, 72℃에서 40초 동안의 35 주기. 72℃에서 10분 동안의 최종 신장 주기를 수행하고, 이어서 4℃에서의 반응 종결을 수행하였다. 433 bp PCR 단편을 pGEM-T 이지 벡터 (프로메가) 내로 서브클로닝하여 pT4(1-4)을 생성시켰다.
라이게이션된 "풀 2" 혼합물 (즉, D4-5AB, D4-6AB, D4-7AB 및 D4-8AB)을 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 D4-5F 및 D4-8R (서열 284 및 285)을 프라이머로서 사용하여, 코돈-최적화 Δ4 데새투라제 유전자의 제2 부분을 PCR로 유사하게 증폭시키고, pGEM-T-이지 벡터 내로 클로닝시켜 pT4(5-8)를 생성시켰다.
라이게이션된 "풀 3" 혼합물 (즉, D4-9AB, D4-10AB, D4-11AB 및 D4-12AB)을 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 D4-9F 및 D4-12R (서열 286 및 287)을 프라이머로서 사용하여, 코돈-최적화 Δ4 데새투라제 유전자의 제3 부분을 PCR로 유사하게 증폭시키고, pGEM-T-이지 벡터 내로 클로닝시켜 pT4(9-12)를 생성시켰다.
라이게이션된 "풀 4" 혼합물 (즉, D4-13AB, D4-14AB, D4-15AB 및 D4-16AB)을 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 D4-13F 및 D4-16R (서열 288 및 289)을 프라이머로서 사용하여, 코돈-최적화 Δ4 데새투라제 유전자의 제4 부분을 PCR로 유사하게 증폭시키고, pGEM-T-이지 벡터 내로 클로닝시켜 pT4(13-16)를 생성시켰다.
이. 콜라이를 따로 pT4(1-4), pT4(5-8), pT4(9-12) 및 pT4(13-16)로 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 앰피실린-내성 형질전환체로부터 단리시켰다. 플라스미드 DNA를 정제하고, 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 pT4(1-4)의 433 bp NcoI/BamHI 단편, p4(5-8)의 383 bp BamHI/HindIII 단편, p4(9-12)의 436 bp HindIII/ApaLI 단편, 및 p4(13-16)의 381 bp ApaLI/NotI 단편을 유리시켰다. 이어서 이들 4개 단편을 합하고, Nco1/Not1 소화 pZUF17 (서열 162; 도 9B)와 함께 정해진 방향으로 라이게이션시켜 pZUF4 (서열 163)을 생성시켰다.
클로닝 편의를 이유로, pZUF4에서 합성 Δ4 데새투라제 유전자 ("D4S")의 274번 아미노산을 처음부터 Phe에서 Leu로 변화시켰다. 주형으로서 pZUF4를 사용하고 올리고뉴클레오티드 YL251 및 YL252를 프라이머 (서열 290 및 291)로서 사용해서 부위-지정 돌연변이유발법에 의해 274번 아미노산인 Leu를 Phe로 교정하였다. 따라서, 생성된 플라스미드는 Δ4 데새투라제 유전자 (서열 106)의 정확한 합성 아미노산 서열을 함유했으며, pZUF4S (서열 164; 도 9C)로 표시했다.
야로위아 리폴리티카 중의 코돈-최적화 Δ4 데새투라제 유전자의 발현
키메라 FBAIN::D4S::Pex20 유전자를 포함한 구축물 pZUF4S인 자가-복제 플라스미드를 야로위아 리폴리티카 Y20362U (FOA 내성에 대해 선별함으로써 생성된, ATCC 번호 20362의 자발적 Ura- 돌연변이체) 내로 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이 형질전환시켰다. 형질전환체 세포를 MM 선별 배지 플레이트에 플레이팅하고, 30 ℃에서 2 내지 3일 동안 유지하였다. MM 플레이트에서 성장한 형질전환체 (3)을 골라내서 신선한 MM 플레이트에 재스트리킹하였다. 일단 성장했으면, 이들 균주를 30 ℃에서 10 ㎍ DPA가 공급된 3 mL 액체 MM에 개별적으로 접종시키고, 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 결과는 이들 3개의 형질전환체에서 DHA가 약 2％로 생산됨을 보여주었다. 코돈-최적화 유전자의 "기질 전환율(％)"은 약 20％인 것으로 측정되었다.
실시예 5
야로위아 리폴리티카 중의 코돈-최적화 C 20 /22 엘론가제 유전자의 합성 및
기능적 발현
오스트레오코쿠스 타우리의 C20 /22 엘론가제 유전자 (진뱅크 관리 번호 AY591336; "OtElo2")의 코돈 사용방식을 WO 2004/101753 및 실시예 4 (상기 문헌)에 기재된 바와 유사한 방식으로 야로위아 리폴리티카에서의 발현에 최적화시켰다. 구체적으로, 야로위아 코돈 사용방식 패턴 (WO 2004/101753), 'ATG' 번역 개시 코돈 주변의 컨센서스 서열, 및 RNA 안정성의 일반 규칙 [Guhaniyogi, G. and J. Brewer, Gene 265(1-2):11-23 (2001)]에 따라, 코돈-최적화 OtElo2 엘론가제 유전자 ("OtE2S"로 표시됨, 서열 102)는 오스트레오코쿠스 타우리의 공개된 서열 (진뱅크 관리 번호 AY591336, 서열 100)을 기초로 하여 디자인하였다. 번역 개시 부위의 변형 외에, 903 bp 코딩 영역 중 160 bp가 변형되었고 (17.7％), 147개 코돈이 최적화되었다 (49％). 코돈-최적화 ORF (서열 102 및 103) 내의 번역 개시 코돈 주변에 NcoI 부위를 부가하기 위해 제2 아미노산을 'S'에서 'A'로 변화시킨 것을 제외하면, 코돈-최적화 유전자에서의 어떤 변형도 코딩된 단백질의 아미노산 서열 (서열 101)을 변화시키지 않았다. 디자인된 OtE2S 유전자는 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 젠스크립트 코포레이션 (GenScript Corporation)사에 의해 합성되었으며, 이를 pUC57 (진뱅크 관리 번호 Y14837)에 클로닝하여 pOtE2S를 생성시켰다.
야로위아 리폴리티카 중의 코돈-최적화 OtE2S 유전자의 발현
pOtE2S의 NcoI/NotI 단편을 단리하고, Nco1/Not1 소화 pZUF17 (서열 162; 도 9B)와 함께 라이게이션하여 pFOE2S (도 9D)를 생성시켰다. 키메라 FBAIN::OtE2S::Pex20 유전자를 포함한 구축물 pFOE2S인 자가-복제 플라스미드를 야로위아 리폴리티카 균주 Y20362U (FOA 스크리닝 하에 선별된, ATCC 번호 20362의 자발적 Ura- 돌연변이체) 내로 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이 형질전환시켰다. 형질전환체 세포를 MM 선별 배지 플레이트에 플레이팅하고, 30 ℃에서 2 내지 3일 동안 유지하였다. MM 플레이트에서 성장한 pFOE2S 보유 Y20362U의 형질전환체 (3)을 골라내서 신선한 MM 플레이트에 재스트리킹하였다. 일단 성장했으면, 이들 균주를 30 ℃에서 10 ㎍ EPA가 공급된 3 mL 액체 MM에 개별적으로 접종시키고, 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 결과는 이들 3개의 형질전환체에서 DPA가 전체 지질의 약 1％ 내지 1.3％로 존재하며 EPA가 약 0.5％로 존재함을 보여주었다. 이들 형질전환체에서 코돈-최적화 OtE2S 유전자의 EPA에서 DPA로의 "기질 전환율(％)"은 67％인 것으로 측정되었다.
실시예 6
ω-6 Δ6 데새투라제 /Δ6 엘론가제 경로: DHA 를 전체 지질의
5％ 초과로 생산하는 균주 Y3000 의 생성
본 실시예는 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362로부터 유래되어 DHA를 전체 지질에 대하여 5.6％로 생산할 수 있는 균주 Y3000의 구축을 기재한다 (도 5). 이 균주는 ω-6 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로를 발현하도록 유전자 조작되었다.
균주 Y3000의 개발에는 균주 M4 (DGLA를 8％로 생성함), 균주 Y2047 (ARA를 11％로 생산함), 균주 Y2048 (EPA를 11％로 생산함), 균주 Y2060 (EPA를 13％로 생산함), 균주 Y2072 (EPA를 15％로 생산함), 균주 Y2072U3 (EPA를 16％로 생산함), 균주 Y2098 (EPA를 22％로 생산함), 및 균주 Y2098U (EPA를 21％로 생산함)의 구축이 요구되었다.
DGLA 를 전체 지질의 약 8％로 생산하는 M4 균주의 생성
4개의 키메라 유전자 (Δ12 데새투라제, Δ6 데새투라제 및 2개의 C18 /20 엘론가제 포함)를 야생형 야로위아 균주 ATCC #20362의 Ura3 유전자좌에 통합함으로써 DGLA가 생성될 수 있도록 하는 구축물 pKUNF12T6E (도 8A, 서열 156)를 제조하였다. pKUNF12T6E 플라스미드는 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pKUNF12T6E (서열 156)의 기재
서열 156 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
AscI/BsiWI (9420-8629) 야로위아 Ura3 유전자의 784 bp 5' 부분 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
SphI/PacI (12128-1) 야로위아 Ura3 유전자의 516 bp 3' 부분 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
SwaI/BsiWI (6380-8629) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·EL1S: 코돈-최적화 엘론가제 1 유전자 (서열 24) (모르티에렐라 알피나 (진뱅크 관리 번호 AX464731)로부터 유래됨) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)로부터의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::EL1S::Pex20
BglII/SwaI (4221-6380) ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·Δ6S: 코돈-최적화 Δ6 데새투라제 유전자 (서열 3) (모르티에렐라 알피나 (진뱅크 관리 번호 AF465281)로부터 유래됨) . Lip1: 야로위아 Lip1 유전자 (진뱅크 관리 번호 Z50020)로부터의 Lip1 종결자 서열 을 포함하는 TEF::Δ6S::Lip1
PmeI/ClaI (4207-1459) ·FBA:FBA 프로모터 (서열 213) ·F.Δ12:푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제 유전자 (서열 32) ·Lip2: 야로위아 Lip2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ012632)로부터의 Lip2 종결자 서열 을 포함하는 FBA::F.Δ12::Lip2
ClaI/PacI (1459-1) ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·EL2S: 코돈-최적화 엘론가제 유전자 (서열 27) (트라우스토키트륨 아우레움 (미국 특허 제6,677,145호)으로부터 유래됨) ·XPR: 야로위아 Xpr 유전자 (진뱅크 관리 번호 M17741)의 3' 영역의 약 100 bp 를 포함하는 TEF::EL2S::XPR
pKUNF12T6E 플라스미드를 AscI/SphI으로 소화시킨 후에, 이것을 상기 '통상의 방법'에 따라 사용하여 야생형 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362를 형질전환시켰다. 형질전환 세포를 FOA 선별 배지 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다. FOA 내성 콜로니를 골라내서 MM 및 MMU 선별 플레이트에 스트리킹했다. MMU 플레이트에서는 성장할 수 있으나 MM 플레이트에서는 성장할 수 없는 콜로니를 Ura- 균주로서 선별하였다. 이어서, Ura- 균주의 단일 콜로니를 30℃에서 액체 MMU에 접종하고 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 DGLA가 pKUNF12T6E의 4개 키메라 유전자를 함유하는 형질전환체 중에는 존재하지만 야생형 야로위아 대조군 균주 중에는 존재하지 않음을 보여주었다. 선별된 32개의 Ura- 균주 대개는 DGLA를 전체 지질의 약 6％로 생산하였다. DGLA를 전체 지질의 약 8％로 생산하는 균주는 2종이었다 (즉, 균주 M4 및 13-8).
ARA 를 전체 지질의 약 10％로 생산하는 Y2047 균주의 생성
3개의 Δ5 키메라 유전자를 야로위아 균주 M4의 Leu2 유전자에 통합하여 구축물 pDMW271 (도 8B, 서열 157)를 제조하였다. 플라스미드 pDMW271은 표 16에 나타낸 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pDMW271 (서열 157)의 기재
서열 157 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
AscI/BsiWI (5520-6315) 야로위아 Leu2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF260230)의 788 bp 5' 부분
SphI/PacI (2820-2109) 야로위아 Leu2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF260230)의 703 bp 3' 부분
SwaI/BsiWI (8960-6315) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·MAΔ5: 모르티에렐라 알피나 Δ5 데새투라제 유전자 (서열 6) (진뱅크 관리 번호 AF067654) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::MAΔ5::Pex20
SwaI/ClaI (8960-11055) ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·MAΔ5: 서열 6 (상기 참조) ·Lip1: 야로위아 Lip1 유전자 (진뱅크 관리 번호 Z50020)의 Lip1 종결자 서열 을 포함하는 TEF::MAΔ5::Lip1
PmeI/ClaI (12690-11055) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
ClaI/PacI (1-2109) ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·HΔ5S: 코돈-최적화 Δ5 데새투라제 유전자 (서열 13) (호모 사피엔스 (진뱅크 관리 번호 NP_037534)로부터 유래됨) ·Pex16: 야로위아 Pex16 유전자의 (진뱅크 관리 번호 U75433)의 Pex16 종결자 서열 을 포함하는 TEF::HΔ5S::Pex16
플라스미드 pDMW271을 AscI/SphI로 소화시킨 후에, 이것을 상기 '통상의 방법'에 따라 사용하여 균주 M4를 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MMLe 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다. MMLe 플레이트에서 성장된 개개의 콜로니를 골라내서 MM 및 MMLe 플레이트에 스트리킹했다. MMLe 플레이트에서는 성장할 수 있으나 MM 플레이트에서는 성장할 수 없는 콜로니를 Leu2- 균주로서 선별하였다. 이어서, Leu2- 균주의 단일 콜로니를 30℃에서 액체 MMLe 배지에 접종하고 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 ARA가 pDMW232 형질전환체 중에는 존재하지만 모(母) M4 균주 중에는 존재하지 않음을 보여주었다. 구체적으로, pDMW271을 함유하는 것으로 선별된 48개의 Leu2- 형질전환체 중에서 유전자 조작된 야로위아에서 ARA를 전체 지질의 5％ 미만으로 생산하는 균주는 35개였고, ARA를 6 내지 8％로 생산하는 균주는 12개였으며, ARA를 약 11％로 생산하는 균주는 1개였다. ARA를 11％로 생산하는 균주를 "Y2047"로 명명하였다.
EPA 를 전체 지질의 약 11％로 생산하는 Y2048 균주의 생성
3개의 합성 Δ17 데새투라제 키메라 유전자를 Y2047 균주의 아실-CoA 옥시다제 3 유전자에 통합하여 구축물 pZP3L37 (도 8C, 서열 158)을 제조하였다. 플라스미드 pZP3L37은 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pZP3L37 (서열 158)의 기재
서열 158 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
AscI/BsiWI (6813-6043) 야로위아 Pox3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ001301)의 763 bp 5' 부분
SphI/PacI (9521-10345) 야로위아 Pox3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ001301)의 818 bp 3' 부분
ClaI/BsiWI (4233-6043) ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·Δ17S: 코돈-최적화 Δ17 데새투라제 유전자 (서열 21) (사프롤레그니아 디클리나로부터 유래됨) (미국 특허 출원 제2003/0196217 A1호) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 TEF::Δ17S::Pex20
ClaI/PmeI (4233-1811) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·Δ17S:서열 21 (상기 참조) ·Lip2: 야로위아 Lip2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ012632)의 Lip2 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::Δ17S::Lip2
PmeI/SwaI (1811-1) 야로위아 Leu2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF260230)
PacI/SwaI (10345-1) ·FBAINm: FBAINm 프로모터 (서열 215) ·Δ17S:서열 21 (상기 참조) ·Pex16: 야로위아 Pex16 유전자 (진뱅크 관리 번호 U75433)의 Pex16 종결자 서열 을 포함하는 FBAINm::Δ17S::Pex16
플라스미드 pZP3L37을 AscI/SphI으로 소화시킨 후에, 이것을 상기 '통상의 방법'에 따라 사용하여 균주 Y2047을 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MM 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다. MM 플레이트에서 성장한 총 96개의 형질전환체를 골라내서 신선한 MM 플레이트에 재스트리킹했다. 일단 성장했으면, 이들 균주를 개별적으로 30℃에서 액체 MM에 접종하고 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 EPA가 pZP3L37을 함유하는 대부분의 형질전환체 중에는 존재하지만 모 Y2047 균주 중에는 존재하지 않음을 보여주었다. pZP3L37을 함유하는 것으로 선별된 96개의 형질전환체 중에서, 유전자 조작된 야로위아에서 EPA를 전체 지질의 2％ 미만으로 생산하는 균주는 20개였고, EPA를 2 내지 3％로 생산하는 균주는 23개였고, EPA를 3 내지 4％로 생산하는 균주는 5개였으며, EPA를 약 6％로 생산하는 균주는 2개 (즉, 균주 번호 71 및 균주 번호 94)였다. (EPA를 6％로 생산하는) 균주 번호 71은 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이 "2-단계 성장 조건" (즉, 48시간 MM, 72시간 HGM)을 이용하여 추가로 분석하였다. GC 분석은 상기 균주 번호 71이 EPA를 전체 지질의 약 11％로 생산함을 보여주었다. 이 균주를 "Y2048"로 칭하였다.
EPA 를 전체 지질의 약 13％로 생산하는, Ura - 표현형을 갖는 Y2060 균주의 생성
균주 Y2048에서 Ura3 유전자를 파괴하기 위해, TEF::rELO2S::Pex20 키메라 유전자를 균주 Y2048의 Ura3 유전자에 통합시켜 구축물 pZKUT16 (도 8D; 서열 159)를 생성시켰다. rELO2S는 16:0을 18:0로 연장시키는 래트 간 효소 (즉, C16 /18 엘론가제)를 코딩하는 코돈-최적화 rELO 유전자이다. 플라스미드 pZKUT16은 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pZKUT16 (서열 159)의 기재
서열 159 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
BsiWI/PacI (1-721) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)의 721 bp 5' 부분
SalI/ClaI (3565-4289) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)의 724 bp 3' 부분
ClaI/BsiWI (4289-1) ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·rELO2S: 코돈-최적화 rELO2 엘론가제 유전자 (서열 85) (래트 (진뱅크 관리 번호 AB071986)로부터 유래함) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 TEF::rELO2S::Pex20
구체적으로, 플라스미드 pZKUT16을 SalI/PacI으로 소화시킨 후에, 이것을 상기 '통상의 방법'에 따라 사용하여 균주 Y2048을 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MM + 5-FOA 선별 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다.
MM + 5-FOA 플레이트에서 성장한 총 40개의 형질전환체를 골라내서 MM 플레이트 및 MM + 5-FOA 플레이트에 따로 재스트리킹했다. MM + 5-FOA 플레이트에서 성장할 수 있지만 MM 플레이트에서는 성장할 수 없는 균주를 Ura- 균주로서 선별했다. 이들 40개의 Ura- 균주를 개별적으로 액체 MMU에 접종하고, 30℃에서 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕 성장시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 MMU 배지에서 2일간 성장시킨 후 EPA를 전체 지질의 5％ 미만으로 생산하는 균주는 14개였고, EPA를 5 내지 5.9％로 생산하는 균주는 9개였으며, EPA를 6 내지 6.9％로 생산하는 균주는 15개였고, EPA를 7 내지 8％로 생산하는 균주는 7개였음을 보여주었다. EPA를 7 내지 8％로 생산하는 균주는 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같은 2-단계 성장 조건 (즉, 48시간 MM, 96시간 HGM)을 이용하여 추가로 분석하였다. GC 분석은 상기 균주 모두가 EPA를 10％ 초과로 생산하며 이들 중 하나는 EPA를 전체 지질의 약 13％로 생산함을 보여주었다. 이 균주를 균주 "Y2060"이라고 칭하였다.
EPA 를 전체 지질의 약 15％로 생산하는 Y2072 균주의 생성
3개의 키메라 유전자 (C18 /20 엘론가제, Δ12 데새투라제 및 Δ5 데새투라제를 포함) 및 Ura3 유전자의 클러스터를 균주 Y2060의 천연 야로위아 Δ12 데새투라제 유전자 부위에 통합시킴으로써 구축물 pKO2UM25E (도 8E; 서열 160)를 생성시켰다. 플라스미드 pKO2UM25E는 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pKO2UM25E (서열 160)의 기재
서열 160 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
HindIII/AscI (1-728) 야로위아 Δ12 데새투라제 유전자 (서열 28)의 728 bp 5' 부분
SphI/EcoRI (3436-3992) 야로위아 Δ12 데새투라제 유전자 (서열 28)의 556 bp 3' 부분
BsiWI/HindIII (10437-1) ·GPAT: GPAT 프로모터 (서열 216) ·EL1S: 코돈-최적화 엘론가제 1 유전자 (서열 24) (모르티에렐라 알피나 (진뱅크 관리 번호 AX464731)로부터 유래됨) ·XPR: 야로위아 Xpr 유전자 (진뱅크 관리 번호 M17741)의 3' 영역의 약 100 bp 를 포함하는 GPAT::EL1S::XPR
BglII/BsiWI (7920-10437) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·M.Δ12: 모르티에렐라 이사벨리나 Δ12 데새투라제 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF417245; 서열 30) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::M.Δ12::Pex20
SalI/PacI (6046-7544) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
EcoRI/SalI (3992-6046) ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·I.Δ5S: 코돈-최적화 Δ5 데새투라제 유전자 (서열 10) (이소크리시스 갈바나 (WO 2002/081668)로부터 유래됨) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 TEF::I.Δ5S::Pex20
구체적으로, 플라스미드 pKO2UM25E를 SphI/AscI로 소화시킨 후에, 이것을 상기 '통상의 방법'에 따라 사용하여 Y2060을 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MM 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다.
MM 플레이트에서 성장한 총 63개의 형질전환체를 골라내서 신선한 MM 플레이트에 재스트리킹했다. 일단 성장했으면, 이들 균주를 개별적으로 30℃에서 액체 MM에 접종하고 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕 배양했다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은, MMU 배지 중에서 1일 동안 성장시킨 후에는 pKO2UM25E를 함유하는 거의 모든 형질전환체에 EPA가 존재함을 보여주었다. 선별된 63개의 형질전환체 중에서, EPA를 6 내지 8.9％로 생산하는 균주는 26개였으며, EPA를 9％ 초과로 생산하는 균주는 46개였다. EPA를 9％ 초과로 생산하는 균주는 상기 '통상의 방법'에 기재된 바와 같은 2-단계 성장 조건 (즉, 48시간 MM, 96시간 HGM)을 이용하여 추가의 분석을 위해 선별하였다. GC 분석은 선별된 46개의 균주 중 45개가 EPA를 11 내지 14.5％로 생산하지만 배양물 번호 2는 2-단계 성장 후 EPA를 전체 지질의 15.1％로 생산함을 보여주었다. 이 균주 (즉, 2번 균주)를 균주 "Y2072"라고 칭하였다.
EPA 를 전체 지질의 약 15 내지 16％로 생산하는, Ura - 표현형을 갖는 Y2072U3 및 Y2072U4 균주의 생성
구축물 pZKUT16 (도 8D, 서열 159; 상기 참조)을 사용해서 TEF::rELO2S::Pex20 키메라 유전자를 균주 Y2072의 Ura3 유전자에 통합시켰다. 구체적으로, 상기 '통상의 방법'에 따라 SalI/PacI-소화 플라스미드 pZKUT16을 사용해서 균주 Y2072를 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MM + 5-FOA 선별 플레이트에 플레이팅하고, 30 ℃에서 3 내지 4일 동안 유지하였다.
MM + 5-FOA 플레이트에서 성장한 총 24개의 형질전환체를 골라내서 MM 플레이트 및 MM + 5-FOA 플레이트에 따로 재스트리킹했다. MM + 5-FOA 플레이트에서 성장할 수 있지만 MM 플레이트에서는 성장할 수 없는 균주를 Ura- 균주로서 선별했다. 이들 24개의 Ura- 균주를 개별적으로 30℃에서 액체 MMU에 접종하고, 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕 배양시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 MMU 배지에서 2일간 성장시킨 후 EPA를 전체 지질의 8.9％ 미만으로 생산하는 균주는 14개였고, EPA를 9 내지 9.9％로 생산하는 균주는 8개였으며, EPA를 10.1％로 생산하는 균주는 1개 (즉, 12번 균주)였음을 보여주었다. 균주 번호 12 (10.1％ EPA) 및 균주 번호 11 (9.6％ EPA)은 2-단계 성장 절차 (즉, 48시간 MM, 96시간 HGM)을 이용하여 추가로 분석하였다. GC 분석은 균주 번호 12가 EPA를 약 15％로 생산했음을 보여주었으며, 이 균주를 "Y2072U3"으로 칭하였다. 이와는 달리, 균주 번호 11은 EPA를 약 16％로 생산하였으며, 이 균주를 균주 "Y2072U4"로 칭하였다.
EPA 를 전체 지질의 23 내지 28％로 생산하는 Y2096 , Y2097 , Y2098 , Y2105 및 Y2106 균주의 생성
4개의 키메라 유전자 (C18 /20 엘론가제, Δ6 데새투라제, Δ5 데새투라제 및 Δ12 데새투라제를 포함) 및 Ura3 유전자의 클러스터를 균주 Y2072U3의 야로위아 리파제 1 유전자 부위에 통합시킴으로써 구축물 pDMW303 (도 9A; 서열 161)를 생성시켰다. 플라스미드 pDMW303은 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pDMW303 (서열 161)의 기재
서열 161 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
BsiWI/AscI (1-819) 야로위아 리파제 1 유전자 (진뱅크 관리 번호 Z50020)의 819 bp 5' 부분
SphI/PacI (35278-4297) 야로위아 리파제 1 유전자 (진뱅크 관리 번호 Z50020)의 769 bp 3' 부분
SwaI/BsiWI (13300-1) ·GPAT: GPAT 프로모터 (서열 216) ·HΔ5S: 코돈-최적화 Δ5 데새투라제 유전자 (서열 13) (호모 사피엔스 (진뱅크 관리 번호 NP_037534)로부터 유래됨) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 GPAT::HΔ5S::Pex20
BglII/SwaI (10602-13300) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·Δ6S: 코돈-최적화 Δ6 데새투라제 유전자 (서열 3) (모르티에렐라 알피나 (진뱅크 관리 번호 AF465281)로부터 유래됨) . Lip1: 야로위아 Lip1 유전자 (진뱅크 관리 번호 Z50020)로부터의 Lip1 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::Δ6S::Lip1
ClaI/PmeI (8081-10558) ·GPDIN: GPDIN 프로모터 (서열 211) ·EL1S: 코돈-최적화 엘론가제 1 유전자 (서열 24) (모르티에렐라 알피나 (진뱅크 관리 번호 AX464731)로부터 유래됨) ·Lip2: 야로위아 리파제 2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ012632)의 Lip2 종결자 를 포함하는 GPDIN::EL1S::Lip2
EcoRI/ClaI (6453-8081) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
PacI/EcoRI (4297-6453) ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·F.Δ12: 푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제 유전자 (서열 32) ·Pex16: 야로위아 Pex16 유전자 (진뱅크 관리 번호 U75433)의 Pex16 종결자 를 포함하는 TEF::F.Δ12::Pex16
구체적으로, SphI/AscI-소화 플라스미드를 상기 '통상의 방법'에 따라 사용하여 균주 Y2072U3을 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MM 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 3 내지 4일 동안 유지시켰다.
MM 플레이트에서 성장한 총 48개의 형질전환체를 골라내서 신선한 MM 플레이트에 재스트리킹했다. 일단 성장했으면, 이들 균주를 개별적으로 30℃에서 액체 MM에 접종하고 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕 성장시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은, MM 배지 중에서 2일 동안 성장시킨 후에는 pDMW303을 함유하는 Y2072U3의 거의 모든 형질전환체에서 EPA가 생산됨을 보여주었다. 선별된 48개의 형질전환체 중에서, EPA를 전체 지질의 13.9％ 미만으로 생산하는 균주는 35개였고, EPA를 14 내지 16.9％로 생산하는 균주는 8개였으며, EPA를 17 내지 18.3％로 생산하는 균주는 4개였다.
(MM에서 2일 후) EPA를 전체 지질의 14％ 초과로 생산하는 균주는 2-단계 성장 절차 (즉, 48시간 MM, 96시간 HGM)를 이용해서 추가의 분석을 위해 선별하였다. GC 분석은 상기 12개의 균주 모두가 EPA를 전체 지질의 18％ 초과로 생산함을 보여주었다. 이들 중에서, 균주 번호 6 (균주 "Y2096"으로 표시함)은 EPA를 전체 지질의 약 24％로 생산했고, 균주 번호 43 (균주 "Y2097"로 표시함)은 EPA를 약 22.3％로 생산했고, 균주 번호 45 (균주 "Y2098"로 표시함)는 EPA를 약 22.4％로 생산했고, 균주 번호 47 (균주 "Y2099"로 표시함)은 EPA를 약 22.6％로 생산했고, 균주 번호 5 (균주 "Y2015"로 표시함)는 EPA를 약 23.3％로 생산했으며, 균주 번호 48 (균주 "Y2106"으로 표시함)은 EPA를 약 23％로 생산했다.
균주 Y2096 중의 EPA 함량 및 오일 양을 이하의 변형된 2-단계 성장 절차를 이용해서 추가로 분석하였다. 균주 Y2096은 단일 콜로니로부터 SD+AA 배지 3 mL에서 30℃ 및 250 rpm/분으로 진탕 배양시켰다. 성장 24시간 후에, SD + AA 배지 32 mL를 함유한 에를렌마이어 플라스크에 시발 배양액 3 mL를 첨가하였다. 30℃ 및 250 rpm/분의 진탕에서 48시간 추가 성장시킨 후에, 세포를 펠렛화하고, 상등액을 제거하였다. 펠렛을 250 mL 플라스크 중의 HGM 35 mL에 재현탁하였다. 배양액 35 mL를 30℃에서 인큐베이션하고, 250 rpm/분으로 추가 4일 동안 진탕 성장시켰다. 배양액의 분취액 (1 mL)을 GC 분석에 사용하고, 배양액 30 mL를 세포 건중량의 측정에 사용하였다. (내부 대조군으로서 사용하기 위한) C15:0 40 ㎍을 에스테르교환반응을 위한 나트륨 메톡시드에 첨가한 것을 제외하면 GC 분석을 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이 수행하였다. 세포 건중량은 배양액 30 mL로부터의 H2O-세척 세포 펠렛을 동결건조시킴으로써 측정하였다.
GC 분석은 Y2096이 전체 지질의 약 28.1％ EPA와 약 20.8％ 오일/세포 건중량을 생산하였음을 보여주었다. 균주 Y2096은 야생형 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362에 대해 하기 유전자형을 보유하였다:
Figure 112007040393459-PCT00006
EPA 를 전체 지질의 약 21％로 생산하는, Ura - 표현형을 갖는 Y2098U 균주의 생성
상기 '통상의 방법'에 따라 SalI/PacI-소화 구축물 pZKUT16 (서열 159)를 사용해서 TEF::rELO2S::Pex20 키메라 유전자를 균주 Y2098의 Ura3 유전자에 통합시켰다. 형질전환 후, 세포를 MM + 5-FOA 선별 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지하였다.
MM + 5-FOA 플레이트에서 성장한 총 48개의 형질전환체를 골라내서 MM 플레이트 및 MM + 5-FOA 플레이트에 따로 재스트리킹했다. MM + 5-FOA 플레이트에서 성장할 수 있지만 MM 플레이트에서는 성장할 수 없는 균주를 Ura- 균주로서 선별했다. 이들 48개의 균주 모두를 상기 '통상의 방법'에 기재된 바와 같은 2-단계 성장 조건 (즉, 48시간 MMU, 96시간 HGM)을 이용해서 분석하였다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 2-단계 성장 후 pZKUT16을 갖는 모든 형질전환체에서 EPA가 12 내지 20％로 존재했음을 보여주었다. 한가지 균주 (즉, 번호 33 균주)는 EPA를 약 21％로 생산했으며, 균주 "Y2098U"로 표시했다.
DHA 를 전체 지질의 5.6％ 초과로 생산하는 Y3000 균주의 생성
구축물 pZP2FOEN4 (도 9E; 서열 165)를 사용해서 2개의 키메라 유전자 (합성 C20/22 "OtE2S" 엘론가제 및 합성 Δ4 데새투라제 "D4S"를 포함)의 클러스터를 균주 Y2098U의 Pox2 유전자 부위에 통합시켰다. 플라스미드 pZP2FOEN4는 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pZP2FOEN4 (서열 165)의 기재
서열 165 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
BsiWI/AscI (6152-6962) 야로위아 Aco2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ001300)의 810 bp 5' 부분
SphI/EcoRI (9670-10325) 야로위아 Aco2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ001300)의 655 bp 3' 부분
EcoRI/PacI (10640-2648) ·YAT 프로모터: YAT1 프로모터 (서열 217) ·Δ4S: 코돈-최적화 Δ4 데새투라제 유전자 (서열 106) (트라우스토키트륨 아우레움 (진뱅크 관리 번호 AAN75707) 으로부터 유래됨) ·Pex16: 야로위아 Pex16 유전자 (진뱅크 관리 번호 U75433)의 Pex16 종결자 서열 을 포함하는 YAT::Δ4S::Pex16
EcoRV를 갖는 EcoRI/SwaI (10618-8345) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·OtE2S: 코돈-최적화 OtE2S 유전자 (서열 102) (오스트레오코쿠스 타우리 (진뱅크 관리 번호 AY591336) 로부터 유래됨) ·OCT: 야로위아 OCT 유전자 (진뱅크 관리 번호 X69988)의 OCT 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::OtE2S::Oct
SpeI를 갖는 SpeI/XbaI (12582-11095) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
플라스미드 pZP2FOEN4를 SphI/AscI으로 소화시킨 후에, 이것을 상기 '통상의 방법'에 따라 사용하여 Y2098U 균주를 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MM 선별 배지 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다. MM 플레이트에서 성장한 총 24개의 형질전환체를 골라내서 신선한 MM 플레이트에 재스트리킹했다. 일단 성장했으면, 이들 균주를 개별적으로 30℃에서 액체 배지 3 mL에 접종하고 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은, 24개의 형질전환체들 중 12개에서 DPA가 전체 지질의 약 3.6 내지 5.3％로 존재하며 DHA가 0.4 내지 1％로 존재함을 보여주었다. DPA 및 DHA를 생산하는 12개의 균주는 상기 2-단계 성장 조건 (즉, 48시간 MM, 96시간 HGM)을 이용하여 추가의 분석을 위해 선별하였다. 이어서 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 이들 12개의 형질전환체들에서 DPA가 15.6 내지 20％로 생산되며 DHA가 2.9 내지 5.6％로 생산됨을 보여주었다. DHA를 5.6％로 생산하는 균주를 균주 "Y3000"으로 칭했다.
실시예 7
Ura - 유전자형을 가지며 LA 를 전체 지질의
45％로 생산하는 중간체 균주 Y2031 의 생성
플라스미드 pKUNT2 (도 10A)의 TEF::Y.Δ12:Pex20 키메라 유전자를 야생형 야로위아 균주 ATCC #20362의 Ura3 유전자의 유전자좌에 통합시켜 Ura-유전자형을 구성함으로써 균주 Y2031을 생성시켰다.
구체적으로, 플라스미드 pKUNT2는 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pKUNT2 (서열 116)의 기재
서열 166 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
AscI/BsiWI (3225-3015) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)의 784 bp 5' 부분
SphI/PacI (5933-13) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)의 516 bp 3' 부분
EcoRI/BsiWI (6380-8629) ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·Y.Δ12: 야로위아 Δ12 데새투라제 유전자 (서열 28) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 TEF::Y.Δ12::Pex20
pKUNT2 플라스미드를 AscI/SphI으로 소화시킨 후, 이것을 상기 '통상의 방법'에 따라 사용하여 야생형 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362를 형질전환시켰다. 형질전환체 세포를 FOA 선별 배지 플레이트에 플레이팅하고 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다. FOA 내성 콜로니를 골라내서 MM 및 MMU 선별 플레이트에 스트리킹했다. MMU 플레이트에서는 성장할 수 있으나 MM 플레이트에서는 성장할 수 없는 콜로니를 Ura- 균주로서 선별하였다. 이어서 Ura- 균주의 단일 콜로니 (5)를 30℃에서 액체 MMU 에 접종시키고 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 야생형 ATCC #20362에서 LA가 약 20％로 존재한 것에 비해 2개의 Ura- 균주 (즉, 균주 번호 2 및 3)에서 LA가 약 45％로 존재했음을 보여주었다. 형질전환체 균주 번호 2를 균주 "Y2031"로 칭했다.
실시예 8
야로위아 리폴리티카 중의 코돈-최적화 Δ9 엘론가제 유전자의 합성 및
기능적 발현
이소크리시스 갈바나의 Δ9 엘론가제 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF390174)의 코돈 사용방식을 WO 2004/101753 및 실시예 4에 기재된 바와 유사한 방식으로 야로위아 리폴리티카에서의 발현에 최적화시켰다. 구체적으로, 야로위아 코돈 사용방식 패턴, ATG 번역 개시 코돈 주변의 컨센서스 서열, 및 RNA 안정성의 일반 규칙 [Guhaniyogi, G. and J. Brewer, Gene 265(1-2):11-23 (2001)]에 따라, 코돈-최적화 Δ9 엘론가제 유전자는 이소크리시스 갈바나 유전자 (서열 69)의 DNA 서열을 기초로 하여 디자인하였다 (서열 71). 번역 개시 부위의 변형 외에, 792 bp 코딩 영역 중 126 bp가 변형되었고, 123개 코돈이 최적화되었다. 코돈-최적화 유전자의 변형의 어느 것도 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지는 않았다 (진뱅크 관리 번호 AF390174, 서열 70).
야로위아에 대한 코돈-최적화 Δ9 엘론가제 유전자의 시험관내 합성
코돈-최적화 Δ9 엘론가제 유전자를 하기와 같이 합성하였다. 먼저, 8쌍의 올리고뉴클레오티드를 디자인하여 이소크리시스 갈바나 Δ9 엘론가제 유전자의 코돈-최적화 코딩 영역의 전장을 신장시켰다 (예컨대, 서열 292 내지 307에 상응하는 IL3-1A, IL3-1B, IL3-2A, IL3-2B, IL3-3A, IL3-3B, IL3-4A, IL3-4B, IL3-5A, IL3-5B, IL3-6A, IL3-6B, IL3-7A, IL3-7B, IL3-8A 및 IL3-8B). 센스 (A) 및 안티센스 (B) 올리고뉴클레오티드의 각 쌍은 각 5'-말단에서의 4 bp 오버행 외에는 상보적이었다. 추가로, 프라이머 IL3-1F, IL3-4R, IL3-5F 및 IL3-8R (서열 308-311)은 또한 차후의 서브클로닝을 위해 NcoI, PstI, PstI 및 Not1 제한 부위를 각각 도입하였다.
각각의 올리고뉴클레오티드 (100 ng)는 실시예 4에 기재된 바와 같이 인산화하였으며, 이어서 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각 쌍을 혼합하고, 함께 어닐링시켰다 [예를 들면, IL3-1A (서열 292)를 IL3-1B (서열 293)에 어닐링시켜 이중-가닥 생성물 "IL3-1AB"를 생산하였으며, IL3-2A (서열 294)를 IL3-2B (서열 295)에 어닐링시켜 이중-가닥 생성물 "IL3-2AB"을 생산함, 등.]
이어서 어닐링된 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 2개의 개별적 풀을 하기에 나타내는 바와 같이 함께 라이게이션하였다: 풀 1 (IL3-1AB, IL3-2AB, IL3-3AB 및 IL3-4AB 포함); 및 풀 2 (IL3-5AB, IL3-6AB, IL3-7AB 및 IL3-8AB 포함). 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 각 풀을 10U T4 DNA 리가제를 갖는 부피 20 ㎕에서 혼합하고, 라이게이션 반응물을 밤새 16℃에서 인큐베이션하였다.
이어서 각 라이게이션 반응의 생성물을 주형으로 사용하여, 디자인된 DNA 단편을 PCR로 증폭시켰다. 구체적으로, 라이게이션된 "풀 1" 혼합물 (즉, IL3-1AB, IL3-2AB, IL3-3AB 및 IL3-4AB)을 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 IL3-1F 및 IL3-4R (서열 308 및 309)을 프라이머로 사용하여, 코돈-최적화 Δ9 엘론가제 유전자의 제1 부분을 PCR로 증폭시켰다. PCR 증폭은 총 부피를 50 ㎕로 하여 실시예 4에 기재한 바와 같이 수행하였다. 417 bp PCR 단편을 pGEM-T 이지 벡터 (프로메가) 내로 서브클로닝하여 pT9(1-4)을 생성시켰다.
라이게이션된 "풀 2" 혼합물 (즉, IL3-5AB, IL3-6AB, IL3-7AB 및 IL3-8AB)을 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 IL3-5F 및 IL3-8R (서열 310 및 311)을 프라이머로서 사용하여, 코돈-최적화 Δ9 엘론가제 유전자의 제2 부분을 PCR로 유사하게 증폭시키고, pGEM-T-이지 벡터 내로 클로닝시켜 pT9(5-8)을 생성시켰다.
이. 콜라이를 따로 pT9(1-4) 및 pT9(5-8)로 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 앰피실린-내성 형질전환체로부터 단리시켰다. 플라스미드 DNA를 정제하고, 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 pT9(1-4)의 417 bp NcoI/PstI 단편 (서열 312) 및 pT9(5-8)의 377 bp PstI/Not1 단편 (서열 313)을 유리시켰다. 이어서 이들 2개 단편을 합하고, Nco1/Not1 소화 pZUF17 (서열 162; 도 9B)와 함께 정해진 방향으로 라이게이션시켜 pDMW237 (도 10B, 서열 167)을 생성시켰다. pDMW237 중의 생성된 합성 Δ9 엘론가제 유전자 ("IgD9e")의 DNA 서열은 야로위아에 대해 원래 디자인된 코돈-최적화 유전자 (즉, 서열 71)와 정확하게 동일하였다.
야로위아 리폴리티카 중의 코돈-최적화 Δ9 엘론가제 유전자의 발현
키메라 FBAIN::IgD9e::Pex20 유전자를 함유한 구축물 pDMW237 (도 10B)인 자가-복제 플라스미드를 야로위아 리폴리티카 Y2031 균주 (실시예 7) 내로 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이 형질전환시켰다. pDMW237을 갖는 Y2031의 3개 형질전환체를 개별적으로 MM 배지에서 2일 동안 성장시키고, 세포를 원심분리로 수집하고 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 결과는 pDMW237을 갖는 이들 형질전환체에서 약 7.1％, 7.3％ 및 7.4％ EDA가 각각 생산되었음을 보여주었다. 이들 데이타는 합성 코돈-최적화 IgD9e가 C18:2를 EDA로 전환시킬 수 있음을 입증하였다. 코돈-최적화 유전자의 "기질 전환율(％)"은 약 13％인 것으로 측정되었다.
실시예 9
야로위아 리폴리티카에서의 코돈-최적화 Δ8 데새투라제 유전자의 합성
유글레나 그라실리스의 Δ8 데새투라제 유전자 (진뱅크 관리 번호 AAD45877)의 코돈 사용방식을 WO 2004/101753 및 실시예 4 및 8 (상기 문헌)에 기재된 바와 유사한 방식으로 야로위아 리폴리티카에서의 발현에 최적화시켰다. 3개 상이한 코돈-최적화 유전자 (즉, "D8S-1", "D8S-2" 및 "D8S-3")의 합성에도 불구하고, 이들 유전자의 어느 것도 EDA를 DGLA로 탈포화시킬 수 없었다. 따라서, 이전에 공개된 Δ8 데새투라제 서열은 정확하지 않으며, Δ8 데새투라제를 유글레나 그라실리스로부터 직접 단리한 후에 mRNA 단리, cDNA 합성 및 PCR을 행하는 것이 필요하다고 가정하였다. 이로 인해 2개의 유사한 서열을 본원에서 Eg5 (서열 77 및 78) 및 Eg12 (서열 79 및 80)로 동정하였다.
각 유전자 서열의 기능적 분석은 유전자를 사카로마이세스 세레비지애 효모 발현 벡터 내에 클로닝하고, 기질 공급 시험을 행하여 수행하였다. Eg5 및 Eg12 모두는 데새투라제 EDA 및 ETrA가 DGLA 및 ETA를 각각 생산할 수 있게 하였지만, Eg5는 Eg12보다 유의하게 큰 활성을 가졌다.
Eg5의 확인된 Δ8 데새투라제 활성에 기초하여, 상기 서열은 야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위해 코돈-최적화되었고, 그에 의해 "D8SF" (서열 81 및 82)로 지칭되는 합성 기능적 코돈-최적화 Δ8 데새투라제를 합성하였다.
코돈-최적화 Δ8 데새투라제 유전자의 예비적 시험관내 합성
코돈-최적화 Δ8 데새투라제 유전자 ("D8S-1"이라고 칭함, 서열 75)는 유글레나 그라실리스의 공개된 서열 (서열 72 및 73)을 기초로 하여 야로위아 코돈 사용방식 패턴 (WO 2004/101753), 'ATG' 번역 개시 코돈 주변의 컨센서스 서열, 및 RNA 안정성의 일반 규칙 [Guhaniyogi, G. and J. Brewer, Gene 265(1-2): 11-23 (2001)]에 따라 디자인하였다. 번역 개시 부위의 변형 외에, 1260 bp 코딩 영역 중 200 bp가 변형되었다 (15.9％). 코돈-최적화 유전자의 변형은 번역 개시 코돈 주변에 NcoI 부위를 첨가하는 'K'에서 'E'로의 제2 아미노산 변화를 제외하면 코딩된 단백질의 아미노산 서열 (서열 73)을 변화시키지 않았다.
구체적으로, 코돈-최적화 Δ8 데새투라제 유전자를 하기와 같이 합성하였다. 먼저, 13쌍의 올리고뉴클레오티드를 디자인하여 유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제 유전자의 코돈-최적화 코딩 영역의 전장을 신장시켰다 (예컨대, 서열 314 내지 339에 상응하는 D8-1A, D8-1B, D8-2A, D8-2B, D8-3A, D8-3B, D8-4A, D8-4B, D8-5A, D8-5B, D8-6A, D8-6B, D8-7A, D8-7B, D8-8A, D8-8B, D8-9A, D8-9B, D8-10A, D8-10B, D8-11A, D8-11B, D8-12A, D8-12B, D8-13A 및 D8-13B). 센스 (A) 및 안티센스 (B) 올리고뉴클레오티드의 각 쌍은 각 5'-말단에서의 4 bp 오버행 외에는 상보적이었다. 추가로, 프라이머 D8-1A, D8-3B, D8-7A, D8-9B 및 D8-13B (서열 314, 319, 326, 331 및 339)는 또한 차후의 서브클로닝을 위해 NcoI, BglII, XhoI, SacI 및 Not1 제한 부위를 각각 도입하였다.
각각의 올리고뉴클레오티드 (100 ng)를 실시예 4에 기재된 바와 같이 인산화하고, 이이서 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각 쌍을 혼합하고, 함께 어닐링시켰다 [예를 들어, D8-1A (서열 314)를 D8-1B (서열 315)에 어닐링시켜 이중-가닥 생성물 "D8-1AB"를 생산함, D8-2A (서열 316)를 D8-2B (서열 317)에 어닐링시켜 이중-가닥 생성물 "D8-2AB"를 생산함, 등].
어닐링된 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 4개의 개별적 풀을 하기에 나타내는 바와 같이 이어서 함께 라이게이션하였다: 풀 1 (D8-1AB, D8-2AB 및 D8-3AB 포함); 풀 2 (D8-4AB, D8-5AB 및 D8-6AB 포함); 풀 3 (D8-7AB, D8-8AB, 및 D8-9AB 포함); 및 풀 4 (D8-10AB, D8-11AB, D8-12AB 및 D8-13AB 포함). 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 각 풀을 10U T4 DNA 리가제를 갖는 부피 20 ㎕에서 혼합하고, 라이게이션 반응물을 16℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
각 라이게이션 반응의 생성물을 이어서 주형으로서 사용하여 디자인된 DNA 단편을 PCR로 증폭시켰다. 구체적으로, 라이게이션된 "풀 1" 혼합물 (즉, D8-1AB, D8-2AB 및 D8-3AB)을 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 D8-1F 및 D8-3R (서열 340 및 341)을 프라이머로 사용하여, 코돈-최적화 Δ8 데새투라제 유전자의 제1 부분을 PCR로 증폭시켰다. PCR 증폭은 총 부피를 50 ㎕로 하여 실시예 4에 기재한 바와 같이 수행하였다. 309 bp PCR 단편을 pGEM-T 이지 벡터 (프로메가) 내로 서브클로닝하여 pT8(1-3)을 생성시켰다.
라이게이션된 "풀 2" 혼합물 (즉, D8-4AB, D8-5AB 및 D8-6AB)을 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 D8-4F 및 D8-6R (서열 342 및 343)을 프라이머로서 사용하여, 코돈-최적화 Δ8 데새투라제 유전자의 제2 부분을 PCR로 유사하게 증폭시키고, pGEM-T-이지 벡터 내로 클로닝시켜 pT8(4-6)을 생성시켰다. 라이게이션된 "풀 3" 혼합물 (즉, D8-7AB, D8-8AB 및 D8-9AB)을 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 D8-7F 및 D8-9R (서열 344 및 345)을 프라이머로서 사용하여, 코돈-최적화 Δ8 데새투라제 유전자의 제3 부분을 PCR로 유사하게 증폭시키고, pGEM-T-이지 벡터 내로 클로닝시켜 pT8(7-9)을 생성시켰다. 최종적으로, 라이게이션된 "풀 4" 혼합물 (즉, D8-10AB, D8-11AB, D8-12AB 및 D8-13AB)을 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 D8-10F 및 D8-13R (서열 346 및 347)을 프라이머로서 사용하여, 코돈-최적화 Δ8 데새투라제 유전자의 제4 부분을 PCR로 유사하게 증폭시키고, pGEM-T-이지 벡터 내로 클로닝시켜 pT8(10-13)을 생성시켰다.
이. 콜라이를 따로 pT8(1-3), pT8(4-6), pT8(7-9) 및 pT8(10-13)으로 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 앰피실린-내성 형질전환체로부터 단리시켰다. 플라스미드 DNA를 정제하고, 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 pT8(1-3)의 309 bp NcoI/BglII 단편 (서열 348), pT8(4-6)의 321 bp BglII/XhoI 단편 (서열 349), pT8(7-9)의 264 bp XhoI/SacI 단편 (서열 350) 및 pT8(10-13)의 369 bp Sac1/Not1 단편 (서열 351)을 유리시켰다. 이어서 이들 단편을 합하고, Nco1/Not1 소화 pY54PC (서열 168; WO2004/101757)와 함께 정해진 방향으로 라이게이션시켜 pDMW240 (도 10C)을 생성시켰다. 이는 pDMW240 중의 합성 Δ8 데새투라제 유전자 ("D8S-1", 서열 75)를 생성시켰다.
유글레나 그라실리스의 공개된 Δ8 데새투라제 아미노산 서열 (서열 73)에 비해, 번역 개시 코돈 주변에 NcoI 부위를 첨가하기 위해 D8S-1의 제2 아미노산을 'K'에서 'E'로 변화시켰다. 공개된 유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제 서열 (서열 73)과 정확하게 동일한 아미노산 서열을 갖는 또다른 형태의 합성된 유전자는 pDMW240을 주형으로서 사용하고 올리고뉴클레오티드 ODMW390 및 ODMW391 (서열 352 및 353)을 프라이머로서 사용하여 시험관내 돌연변이유발 (스트라타진, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에 의해 구축하였다. 생성된 플라스미드를 pDMW255라고 칭하였다. pDMW255 중의 합성 Δ8 데새투라제 유전자를 "D8S-2"라고 칭하였으며, 아미노산 서열은 서열 73에 도시한 서열과 정확하게 동일하였다.
비기능적 코돈-최적화 Δ8 데새투라제 유전자
야로위아 리폴리티카 균주 ATCC #76982(Leu-)를 pDMW240 (도 10C) 및 pDMW255로 각각 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이 형질전환시켰다. 재조합 구축물 함유 효모를 EDA [20:2(11,14)]를 보충한 MM에서 성장시켰다. 구체적으로, pDMW240 (D8S-1 함유) 또는 pDMW255 (D8S-2 함유)를 함유한 형질전환체 야로위아 리폴리티카의 단일 콜로니를 MM 3 mL 중에서 30℃에서 OD600 약 1.0까지 성장시켰다. 이어서 기질 공급을 위해 세포 100 ㎕를, EDA 기질 10 ㎍을 함유하는 MM 3 mL 중에서 30℃에서 약 24시간 동안 계대배양하였다. 세포를 원심분리로 수집하고 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
상기 형질전환체 중 어느 것도 EDA로부터 DGLA를 생산하지 않았으며, 따라서 D8S-1 및 D8S-2가 기능하지 않았고, EDA를 탈포화시킬 수 없었다. 키메라 D8S-1::XPR 및 D8S-2::XPR 유전자를 서열 354 및 355에 각각 나타낸다.
진뱅크 (관리 번호 AAD45877 [서열 73])에 기탁되고 WO 00/34439 또는 문헌 [Wallis et al., Archives of Biochem. Biophys, 365:307-316 (1999)]에 기재한 Δ8 데새투라제의 단백질 서열 (본원에서 서열 74)들 사이에서 3개의 아미노산 차이가 발견되었다. 구체적으로, 3개 아미노산은 진뱅크 관리 번호 AAD45877에서 누락된 것으로 나타났다. pDMW255를 주형으로 사용하고 ODMW392 및 ODMW393 (서열 356 및 357)을 프라이머로서 사용하여, 시험관내 돌연변이유발 (스트라타진, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에 의해 9 bp를 합성 D8S-2 유전자 내에 부가함으로써 WO 00/34439 및 문헌 [Wallis et al. (상기 문헌)]에 기재한 서열 (서열 74)과 동일한 단백질을 생산하였다. 생성된 플라스미드를 pDMW261이라고 칭하였다. pDMW261 중의 합성 Δ8 데새투라제 유전자를 "D8S-3" (서열 76)이라고 칭하였다. pDMW261 구축물을 야로위아 내로 형질전환시킨 후에, EDA를 사용하는 유사한 공급 실험을 상기 기재한 바와 같이 수행하였다. D8S-3의 경우 EDA에서 DGLA로의 탈포화가 관찰되지 않았다.
유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제 유전자의 단리
유글레나 그라실리스를 미시간 주립대학교(미국 미시건주 이스트 랜싱 소재)에 재직하는 리차드 트리에머(Richard Triemer) 박사의 실험실에서 얻었다. 활성적 성장 배양물 10 mL로부터, 분취액 1 mL를 500 mL 유리병 중의 유글레나 그라실리스 (Eg) 배지 250 mL에 옮겼다. Eg 배지는 물 970 mL 중에 나트륨 아세테이트 1 g, 소 추출물 (카탈로그 #U126-01, 디프코 래버러토리즈, 미국 미시간주 디트로이트 소재) 1 g, 박토(Bacto)® 트립톤 (카탈로그 #0123-17-3, 디프코 래버러토리즈) 2 g 및 박토® 효모 추출물 (카탈로그 #0127-17-9, 디프코 래버러토리즈) 2 g을 합하여 제조하였다. 여과 멸균 후에, 토양수 상등액 (카탈로그 #15-3790, 캐롤라이나 바이올로지컬 서플라이 컴파니(Carolina Biological Supply Company), 미국 노쓰캐롤라이나 벌링톤 소재) 30 mL를 무균적으로 첨가하여 최종 Eg 배지를 제조하였다. 유글레나 그라실리스 배양물을 23℃에서 교반 없이 2주 동안 광 주기 16시간, 암 주기 8시간으로 성장시켰다.
2주 후에, 배양물 10 mL을 지질 분석을 위해 들어내고, 1,800 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 물로 1회 세척하고, 재-원심분리하였다. 생성된 펠렛을 5분 동안 진공하에 건조시키고, 트리메틸술포늄 히드록시드 (TMSH) 100 ㎕에 재현탁하고, 실온에서 15분 동안 진탕 인큐베이션하였다. 이 후에, 헥산 0.5 mL를 첨가하고, 바이알을 15분 동안 실온에서 진탕 인큐베이션하였다. 지방산 메틸 에스테르 (헥산층으로부터 5 ㎕ 주사됨)를 분리하고, 오메가왁스 320 융합 실리카 모세관 컬럼 (카탈로그 #24152, 수펠코 인크.(Supelco Inc.))을 장착한 휴렛-팩커드 6890 가스 크로마토그래프로 정량하였다. 오븐 온도를 220℃에서 2.7분 동안 유지하고, 20℃/분으로 240℃까지 증가시키고, 이어서 추가 2.3분 동안 유지하는 프로그램대로 진행시켰다. 운반 기체를 왓트만(Whatman) 발생기로 제공하였다. 체류 시간을 상업적으로 입수가능한 표준의 메틸 에스테르 (카탈로그 #U-99-A, 누-체크 프렙, 인크.(Nu-Chek Prep, Inc.))와 비교하고, 생성된 크로마토그램을 도 11에 나타낸다.
잔존 2주 배양물 (240 mL)을 1,800 x g에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화하고, 물로 1회 세척하고, 재-원심분리하였다. 총 RNA를 생성된 펠렛으로부터 RNA STAT-60™ 시약 (델-테스트, 인크.(TEL-TEST, Inc.), 미국 택사스주 프랜즈우드 소재)으로 제공된 제조자의 프로토콜에 따라 (물 0.5 mL에 RNA를 용해한 시약 5 mL 사용) 추출하였다. 이러한 방법으로, 총 RNA (2 mg/mL) 1 mg을 펠렛으로부터 수득하였다. mRNA를 제공된 제조자의 프로토콜에 따라 mRNA 정제 키트 (아머샴 바이오사이언스즈(Amersham Biosciences), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)로 총 RNA 1 mg으로부터 단리하였다. 이런 방식으로, mRNA 85 ㎍을 수득하였다.
제조자의 프로토콜에 따라 제공된 올리고(dT) 프라이머와 함께 cDNA 합성용 수퍼스크립트™ 초이스 (Superscript™ Choice) 시스템 (인비트로젠™ 라이프 테크놀로지즈(Invitrogen™ Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 사용하여 cDNA를 mRNA 765 ng으로부터 합성하였다. 합성된 cDNA를 물 20 ㎕에 용해하였다.
하기 조건을 이용하여 올리고뉴클레오티드 프라이머 Eg5-1 및 Eg3-3 (서열 358 및 359)로 유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제를 cDNA로부터 증폭시켰다. 구체적으로, cDNA (1 ㎕)를 50 pmol Eg5-1, 50 pmol Eg5-1, PCR 뉴클레오티드 믹스 (10 mM, 프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 1 ㎕, 10X PCR 완충제 (인비트로젠) 5 ㎕, MgCl2 (50 mM, 인비트로젠) 1.5 ㎕, Taq 폴리머라제 (인비트로젠) 0.5 ㎕ 및 최종 50 ㎕가 되는 양의 물과 합하였다. 반응 조건은 3분 동안 94℃, 이어서 45초 동안 94℃, 45초 동안 55℃ 및 1분 동안 72℃의 35 주기였다. PCR을 72℃에서 7분 동안, 이어서 4℃에서 유지하여 마쳤다. PCR 반응물을 5 ㎕에 대해 아가로스 겔 전기영동으로 분석하고, 약 1.3 kB의 분자 중량을 갖는 DNA 밴드를 관찰하였다. 잔존 45 ㎕의 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, DNA 밴드는 제조자의 프로토콜에 따라 자이모클린™ 겔 DNA 리커버리 키트(Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit)(자이모 리써치, 미국 캘리포니아주 오렌지 소재)를 사용하여 정제하였다. 생성된 DNA를 제조자의 프로토콜에 따라 pGEM®-T 이지 벡터 (프로메가) 내로 클로닝하였다. 다중 클론을 T7, M13-28Rev, Eg3-2 및 Eg5-2 (각각 서열 360 내지 363)로 서열결정하였다.
따라서, 단지 몇개 bp가 상이한 Eg5 (서열 77) 및 Eg12 (서열 79)인 2개 클래스의 DNA 서열을 얻었다. Eg5 및 Eg12의 번역은 단지 1개 아미노산이 상이한 단백질 서열인 서열 78 및 80을 각각 생성하였다. 따라서, Eg5에 대한 DNA 및 단백질 서열을 서열 77 및 서열 78로 각각 나타내고; Eg12에 대한 DNA 및 단백질 서열을 서열 79 및 서열 80으로 각각 나타낸다.
단리된 유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제 서열 대 공개된 유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제 서열의 비교
진뱅크 관리 번호 AAD45877 (gi: 5639724, 본원에서 서열 73)로부터의 단백질 서열 및 문헌 [Wallis et al., Archives of Biochem. Biophys., 365:307-316 (1999); WO 00/34439][본원에서 서열 74]의 공개된 단백질 서열과 서열 78 (Eg5) 및 서열 80 (Eg12)으로 나타내는 단백질 서열의 정렬을 도 12에 나타낸다. 모든 4개 서열 중에 보존된 아미노산을 별표 (*)로 나타낸다. 서열의 정렬을 최대화하기 위해 대시(-)를 프로그램에 의해 사용하였다. 추정적 시토크롬 b5 도메인에 밑줄을 쳤다. 추정적 His 박스를 볼드체로 나타낸다. 동일성(％) 계산은 Eg5 Δ8 데새투라제 단백질 서열이 서열 73에 대해 95.5％ 및 서열 74에 대해 96.2％ 동일함을 나타내며, 여기서 "동일성(％)"을 2개 단백질 간의 동일한 아미노산의 비율(％)로서 정의한다. 서열 정렬 및 동일성(％) 계산은 LASERGENE 바이오인포매틱스 컴퓨팅 스위트(bioinformatics computing suite) (드나스타 인크., 미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 메갈린 프로그램으로 수행하였다. 서열의 다중 정렬은 디폴트 파라미터 (GAP PENALTY=1O, GAP LENGTH PENALTY=1O)를 갖는 클러스탈 정렬 방법 [Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989)]으로 수행하였다. 클러스탈 방법을 사용하는 쌍쌍 정렬에 대한 디폴트 파라미터는 KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5이었다. 다양한 유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제 서열들 간의 차이에 대한 더 완전한 분석을 위해서는 동시 계류 중인 미국 특허 출원 제11/166993호를 참조한다.
사카로마이세스 세레비지애 중의 유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제 서열의 기능적 분석
효모 에피솜 플라스미드 (YEp)-유형 벡터 pRS425 [Christianson et al., Gene, 110:119-22 (1992)]는 사카로마이세스 세레비지애 2μ 내인성 플라스미드로부터의 서열, LEU2 선별가능한 마커 및 다기능적 파지미드 pBluescript II SK +의 주쇄에 기초한 서열을 함유한다. 사카로마이세스 세레비지애의 강력한 구성적 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GPD) 프로모터를 pRS425의 SacII와 SpeI 부위 사이에 문헌 [Jia et al., Physiological Genomics, 3:83-92 (2000)]에 기재된 것과 동일한 방식으로 클로닝하여 pGPD-425를 생산하였다. NotI 부위를 pGPD-425의 BamHI 부위 내에 도입하여 (따라서, BamHI 부위에 의해 플랭킹된 NotI 부위를 생산함) 플라스미드 pY-75를 생산하였다. Eg5 (서열 77) 및 Eg12 (서열 79)을 NotI 소화에 의해 상기 기재한 pGEM®-T 이지 벡터로부터 유리시키고, pY-75의 NotI 부위 내로 클로닝하여 pY89-5 (ATCC #PTA-6048로 기탁됨) 및 pY89-12를 각각 생산하였다. 이런 방식으로, Δ8 데새투라제 (즉, Eg5 [서열 77] 및 Eg12 [서열 79])를 사카로마이세스 세레비지애에서의 발현을 위해 강력한 구성적 프로모터 뒤에 클로닝하였다. pY89-5의 지도를 도 10D에 나타낸다.
플라스미드 pY89-5, pY89-12 및 pY-75를 사카로마이세스 세레비지애 BY4741 (ATCC #201388) 내로 표준 리튬 아세테이트 형질전환 절차로 형질전환시켰다. 형질전환체는 CSM-leu (큐바이오젠(Qbiogene), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 보충한 DOBA 배지에서 선별하였다. 각 플레이트로부터의 형질전환체를 CSM-leu (큐바이오젠)으로 보충한 DOB 배지 2 mL에 접종하고, 1일 동안 30℃에서 성장시킨 후에, 0.5 mL를 1 mM로 EDA 또는 EtrA를 보충한 동일한 배지로 옮겼다. 이들을 30℃에서 250 rpm으로 밤새 인큐베이션하고, 펠렛을 원심분리로 수득하고, 진공하에 건조시켰다. 펠렛을 TMSH 50 ㎕로 에스테르교환하고, 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이 GC로 분석하였다. pY-75 (즉, 클론 75-1 및 75-2) 및 pY89-5 (즉, 클론 5-6-1 및 5-6-2)에 대한 2개 클론을 각각 분석하면서, 두 가지 독립적 형질전환으로부터의 pY89-12에 대한 2개 세트의 클론 (즉, 클론 12-8-1, 12-8-2, 12-9-1 및 12-9-2)을 분석하였다.
EDA 공급 클론의 GC 분석에 의해 얻은 지질 프로파일을 표 23에 나타내고; EtrA 공급 클론의 GC 분석에 의해 얻은 지질 프로파일을 표 24에 나타냈다. 지방산을 16:0 (팔미테이트), 16:1 (팔미트올레산), 18:0, 18:1 (올레산), 20:2 [EDA], 20:3 (8,11,14) [DGLA], 20:3 (11,14,17) [ETrA] 및 20:4 (8,11,14,17) [ETA]로서 확인하고; 각각의 조성을 전체 지방산의 백분율(％)로 나타낸다.
Figure 112007040393459-PCT00007
Figure 112007040393459-PCT00008
표 23 및 24의 데이타는 클로닝된 유글레나 Δ8 데새투라제가 EDA 및 EtrA를 탈포화시킬 수 있었음을 보여주었다. 서열 80에 나타낸 서열은 서열 78에 나타낸 서열에 비해 1개 아미노산 변화를 가지고, 저하된 Δ8 데새투라제 활성을 가졌다.
표 24 중의 클론 75-2에 의해 생성되는 소량의 20:4(8,11,14,17)는 20:4(8,11,14,17)에 대한 표준과 약간 다른 체류 시간을 가졌다. 이 피크는 그 실험에서 야생형 효모에 의해 생성되는 소량의 상이한 지방산일 가능성이 더 크다.
야로위아 리폴리티카에 대해 최적화된 Δ8 데새투라제 유전자 코돈의 추가 개질
pDMW261 중의 합성 D8S-3 유전자의 아미노산 서열을 기능적 유글레나 Δ8 데새투라제의 아미노산 서열 (서열 77 및 78)에 따라 교정하였다. pDMW261을 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 ODMW404 (서열 364) 및 D8-13R (서열 347)을 사용하여, 합성 D8S-3 데새투라제 유전자를 코딩하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 생성된 PCR 단편을 Bio101 진클린(Geneclean) 키트로 정제하고, 이어서 Kpn1 및 Not1로 소화시켰다 (프라이머 ODMW404가 KpnI 부위를 도입하고, 프라이머 D8-13R은 NotI 부위를 도입함). Kpn1/Not1 단편 (서열 365)을 Kpn1/Not1 소화 pKUNFmKF2 (도 10E, 서열 169) 내로 클로닝하여 pDMW277 (도 13A)을 생산하였다.
증폭시키고, D8S-3 유전자의 5' 말단을 교정하기 위해 디자인한 올리고뉴클레오티드 YL521 및 YL522 (서열 366 및 367)를 pDMW277이 주형으로서 사용되는 또다른 PCR 반응에서 프라이머로서 사용하였다. 프라이머는 PCR 단편의 5' 및 3' 말단에 Nco1 부위 및 BglII 부위를 각각 도입하였다. 318 bp PCR 생성물을 Bio101 진클린 키트로 정제하고, 이어서 Nco1 및 BglII로 소화시켰다. 소화 단편을 pDMW277로부터의 954 bp BglII/NotI 단편과 함께 사용하여 pZF5T-PPC (도 13B, 서열 170)를 교환하여 pDMW287을 형성시켰다. 합성 D8S-3 유전자의 5' 말단을 교정하는 것 외에, 이 클로닝 반응은 또한 합성 Δ8 데새투라제 유전자를 야로위아 리폴리티카 FBAIN 프로모터 (서열 214)의 조절 하에 두었다.
부위-지정 돌연변이유발 반응의 최종 시리즈 중의 제1 반응은 이어서 pDMW287 상에서 수행하였다. 프라이머의 제1 세트인 YL525 및 YL526 (서열 368 및 369)은 pDMW287 중의 합성 D8S-3 유전자의 아미노산 F에서 S (위치 #50)로의 교정을 위해 디자인하였다. 이 돌연변이유발 반응으로부터 생성된 플라스미드는 이어서 프라이머 YL527 및 YL528 (서열 370 및 371)을 사용하는 다음 부위-지정 돌연변이유발 반응에 주형이 되었다. 이들 프라이머는 아미노산 D8S-3 유전자의 아미노산 F에서 S (위치 #67)로의 교정을 위해 디자인하고, 플라스미드 pDMW287/YL527을 생성하였다.
유전자의 제2 쿼터 내에 서열 교정을 완료하기 위해, 하기 반응을 유전자의 제1 쿼터 상의 돌연변이와 동시에 수행하였다. pDMW287을 주형으로서 사용하고, 올리고뉴클레오티드 YL529 및 YL530 (서열 372 및 373)을 프라이머로서 사용하여, 시험관내 돌연변이유발 반응을 수행하여 합성 D8S-3 유전자의 아미노산 C에서 W (위치 #177)로의 교정을 수행하였다. 이 돌연변이유발 반응의 생성물 (즉, pDMW287/Y529)을 프라이머 YL531 및 YL532 (서열 374 및 375)를 사용하는 하기 반응에 주형으로서 사용하여 아미노산 P에서 L (위치 #213)로 교정하였다. 이 반응의 생성물을 pDMW287/YL529-31이라고 칭하였다.
유전자의 제1 및 제2 쿼터 상의 돌연변이와 동시에, 상기 반응을 유전자의 3' 말단 상에서 유사하게 수행하였다. 각각의 차후 돌연변이유발 반응은 이전 반응으로부터의 플라스미드 생성물을 사용하였다. 프라이머 YL533 및 YL534 (서열 376 및 377)를 pDMW287 상에 사용하여 아미노산 C에서 S (위치 #244)로 교정함으로써 pDMW287/YL533을 생성하였다. 프라이머 YL535 및 YL536 (서열 378 및 379)을 사용하여 pDMW287/YL533의 합성 D8S-3 유전자 중의 아미노산 A를 T (위치 #280)로 교정하여 pDMW287/YL533-5를 형성시켰다. 마지막으로, pDMW287/YL533-5를 주형으로서 사용하고 YL537 및 YL538 (서열 380 및 381)을 프라이머로 사용하여 합성 D8S-3 유전자 중의 위치 #333에서의 아미노산 P를 S로 교정하였다. 생성된 플라스미드를 pDMW287/YL533-5-7이라고 명명하였다.
pDMW287/YL529-31의 BglII/XhoI 단편 및 pDMW287/YL533-5-7의 XhoI/NotI 단편을 사용하여 pDMW287/YL257의 BglII/NotI 단편을 변화시켜 완전히 교정된 합성 Δ8 데새투라제 유전자 (D8SF라고 칭하고, 서열 81에 나타냄)를 함유한 pDMW287F (도 13C)을 생산하였다. 서열 82는 개시 메티오닌 이후의 추가의 발린을 제외하면 서열 78에 나타낸 서열과 본질적으로 동일한 서열 81의 뉴클레오티드 2 내지 1270을 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸다.
실시예 10
야로위아 리폴리티카 중의 코돈-최적화 Δ9 엘론가제 유전자 및
코돈-최적화 Δ8 데새투라제의 기능적 발현
본 실시예는 실시예 8 및 9로부터의 코돈-최적화 Δ9 엘론가제 및 코돈-최적화된 Δ8 데새투라제를 동시 발현하기 위해 형질전환된 야로위아 리폴리티카 중의 DGLA 생합성 및 축적을 기재한다. 이에 의해 본 실험은 유전자 활성 및 야로위아 리폴리티카의 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로 발현 능력을 모두 확인하였다.
구체적으로, 구축물 pDMW287F (실시예 9)의 키메라 FBAIN::D8SF::Pex16 유전자를 포함하는 ClaI/PacI 단편을 pDMW237 (실시예 8)의 ClaI/PacI 부위 내에 삽입시켜 구축물 pDMW297 (도 13D; 서열 123)을 생성하였다.
플라스미드 pDMW297은 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pDMW297 (서열 171)의 기재
서열 171 중의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
EcoRI/ClaI (9053-10448) ARS18 서열 (진뱅크 관리 번호 A17608)
ClaI/PacI (1-2590) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·D8SF: 코돈-최적화 Δ8 데새투라제 유전자 (서열 181) (유글레나 그라실리스 (진뱅크 관리 번호 AF139720)로부터 유래됨) ·Pex16: 야로위아 Pex16 유전자 (진뱅크 관리 번호 U75433)의 Pex16 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::D8SF::Pex16
PacI/SalI (2590-4082) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
SalI/BsiWI (4082-6257) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·IgD9e: 코돈-최적화 Δ9 엘론가제 유전자 (서열 71) (이소크리시스 갈바나 (진뱅크 관리 번호 390174) 로부터 유래됨) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::IgD9e::Pex20
이어서 구축물 pDMW297을 균주 Y2031 (실시예 13)의 형질전환에 대해 통상의 방법에 따라 사용하였다. 형질전환체 세포를 MM 선별 배지 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다. MM 플레이트에서 성장한 총 8개 형질전환체를 골라내서 신선한 MM 플레이트에 재스트리킹했다. 일단 성장했으면, 이들 균주를 개별적으로 30℃에서 액체 MM에 접종하고 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수집하고 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 DGLA가 분석된 모든 형질전환체에서 생산됨을 보여주었다. 1개 균주는 DGLA를 약 3.2％ 생산하고, 4개 균주는 DGLA를 4.3 내지 4.5％ 생산하고, 2개 균주는 DGLA를 5.5 내지 5.8％ 생산하고, 1개 균주는 DGLA를 6.4％ (본원에서 균주 "Y0489"라고 칭함) 생산하였다. 균주 Y0489 중의 코돈-최적화 D8SF 유전자의 "기질 전환율(％)"은 75％인 것으로 측정되었다.
실시예 11
ω-6 Δ9 엘론가제 /Δ8 데새투라제 경로:
야로위아 리폴리티카에서 DHA 를 생산하는 균주의 생성 (예언적)
본 실시예는 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362로부터 유래되어 ω-6 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로의 발현을 통해 DHA를 생산하도록 유전자 조작된 균주의 구축을 기재하고 있으며, 따라서 이들 DHA-생산 균주의 완전한 지질 프로파일의 분석은 최종 DHA-함유 오일에서 GLA 동시-합성이 없음을 나타내었다.
이들 DHA-생산 균주의 개발에는 첫째로 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362로부터 유래되어 EPA를 전체 지질에 대하여 9％로 생산할 수 있는 균주 Y2201 및 Y2203의 생성이 요구되었다 (도 5). 균주 Y2201 및 Y2203에는 균주 Y2152 및 Y2153 (DGLA를 ~3.5％로 생산함), 균주 Y2173 (DGLA를 14％로 생산함) 및 균주 Y2189 (EPA를 5％로 생산함)의 구축이 요구되었다.
후속적으로, Y2201 및 Y2203은 Lys-균주이기 때문에, 당업자에게 익히 공지된 방법을 사용하여 pZP2FOEN4 (서열 165)의 뉴클레오티드 위치 12582-11095를 스패닝하는 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)를 야로위아 Lys5 유전자 (진뱅크 관리 번호 M34929)로 교환하여 플라스미드 pZP2FOEN4-Lys를 생성하는 것이 필요하였다. 이러한 조작 후에, 균주 Y2201 및 Y2203은 상기 실시예 6에 기재된 바와 같이 플라스미드 pZP2FOEN4-Lys로 형질전환되어, ω-6 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 사용하여 DHA를 생산하는 형질전환체 균주가 생성되었다.
DGLA 를 전체 지질의 약 ~3.5％로 생산하는 균주 Y2152 및 Y2153 의 생성
구축물 pZP2C16M899 (도 14A, 서열 172)를 사용하여 4개의 키메라 유전자 (2개의 Δ9 엘론가제, 합성 C16 /18 지방산 엘론가제 및 Δ8 데새투라제 포함), 뿐만 아니라 단일 아미노산 돌연변이를 함유한 야로위아 AHAS 유전자 (아세토히드록시-산 신타제)의 클러스터를 통합시켰다. 야로위아 중의 돌연변이된 AHAS 효소는 양성 스크리닝 마커로서 사용되는 술포닐우레아 내성을 부여하였다. 플라스미드 pZP2C16M899는 야로위아 균주 ATCC #20362의 Pox2 유전자 부위 내로 통합되도록 디자인하고, 따라서 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pZP2C16M899 (서열 172)의 기재
서열 172 중의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
BsiWI/AscI (6152-6962) 야로위아 Aco2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ001300)의 810 bp 5' 부분
SphI/EcoRI (9670-10325) 야로위아 Aco2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ001300)의 655 bp 3' 부분
BsiWI/PmeI와 함께 EcoRV (929-3195) ·GPM/FBAIN: GPM::FBAIN 키메라 프로모터 (서열 219) ·rEL02S: 코돈-최적화된 rEL02 엘론가제 유전자 (서열 85) (래트 (진뱅크 관리 번호 AB071986)에서 유래됨) ·OCT: 야로위아 OCT 유전자 (진뱅크 관리 번호 X69988)의 OCT 종결자 서열 을 포함하는 GPM/FBA인트론::rEL02S::0ct
BsiWI/EcoRI (929-14447, 역방향) ·GPAT: GPAT 프로모터 (서열 216) ·IgD9e: 코돈-최적화된 Δ9 엘론가제 유전자 (서열 71) (이소크리시스 갈바나에서 유래됨) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 GPAT::IgD9e::Pex20
EcoRI/SwaI (14447 -12912) ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·IgD9e: 서열 71 (상기 문헌) ·Lip1: 야로위아 Lip1 유전자 (진뱅크 관리 번호 Z50020)의 Lip1 종결자 서열 을 포함하는 TEF::IgD9e::Lip1
SwaI/PacI (12912-10325) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·D8SF: 코돈-최적화된 Δ8 데새투라제 유전자 (서열 81) (유글레나 그라실리스 (진뱅크 관리 번호 AF139720)에서 유래됨) ·Pex16: 야로위아 Pex16 유전자 (진뱅크 관리 번호 U75433)의 Pex16 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::D8SF::Pex16
PmeI와 함께 EcoRV/BsiWI (3195-6152) W497L 돌연변이를 포함하는 야로위아 리폴리티카 AHAS 유전자 (서열 243)
플라스미드 pZP2C16M899를 SphI/AscI로 소화시킨 후에, 이것을 사용하여 ATCC #20362를 통상의 방법에 따라 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 술포닐우레아 150 mg을 함유한 MM 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다. 술포닐우레아 내성 콜로니를 골라내고 술포닐우레아 함유 MM 선별 플레이트 상에 스트리킹하였다. 총 96개 형질전환체를 이어서 술포닐우레아를 함유한 액체 MM에 30℃에서 접종시키고, 250 rpm/분에서 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수집하고 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 pZP2C16M899의 4개 키메라 유전자를 함유한 형질전환체에서 DGLA의 존재를 보였지만, 야생형 야로위아 대조군 균주에서는 보이지 않았다. 선별된 96개 균주 중 대부분은 전체 지질의 2％ 미만으로 DGLA를 생산하였다. DGLA를 전체 지질의 2 내지 2.9％로 생산하는 균주가 28개였다. DGLA를 전체 지질의 3.5％로 생산하는 균주가 2개였다. 균주 #65 및 #73을 본원에서 균주 "Y2152" 및 "Y2153"이라고 각각 칭하였다.
DGLA 를 전체 지질의 약 14 내지 16％로 생산하는 균주 Y2173 및 Y2175 의 생성
구축물 pDMW314 (도 14B, 서열 173)을 사용하여 4개의 키메라 유전자 (2개의 Δ9 엘론가제, Δ8 데새투라제 및 Δ12 데새투라제 포함)의 클러스터를 야로위아 균주 Y2152 및 Y2153의 Ura3 유전자 부위 내로 통합하여 DGLA의 생성을 증대시켰다. 플라스미드 pDMW314는 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pDMW314 (서열 173)의 기재
서열 173 중의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
AscI/BsiWI (10066-9275) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)의 784 bp 5' 부분
SphI/PacI (12774-1) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)의 516 bp 3' 부분
SwaI/BsiWI (6582-9275) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·F.Δ12: 푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제 유전자 (서열 32) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)로부터의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::F.D12S::Pex20
ClaI/EcoRI (6199-4123) GPAT::IgD9e::Pex20: pZP2C16M899 (상기 참조)에 기재된 바와 같음
EcoRI/SwaI (4123-2588) TEF::IgD9E::Lip1: pZP2C16M899 (상기 참조)에 기재된 바와 같음
SwaI/PacI (2588-1) FBAIN::D8SF::Pex16: pZP2C16M899 (상기 참조)에 기재된 바와 같음
플라스미드 pDMW314를 AscI/SphI로 소화시킨 후에, 이를 야로위아 리폴리티카 균주 Y2152 및 Y2153의 형질전환을 위해 통상의 방법에 따라 사용하였다. 형질전환체 세포를 FOA 선별 배지 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다. FOA 내성 콜로니를 골라내고 MM 및 MMU 선별 플레이트 상에 스트리킹하였다. MMU 플레이트에는 성장할 수 있지만, MM 플레이트에서는 성장할 수 없는 콜로니를 Ura- 균주로서 선별하였다. Ura- 균주의 단일 콜로니를 이어서 액체 MMU 내에 30℃에서 접종하고, 250 rpm/분에서 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수집하고 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 pDMW314의 4개 키메라 유전자를 함유한 거의 모든 형질전환체에서 DGLA의 증가된 생성을 보여주었다. pDMW314를 갖는 Y2152의 선별된 Ura- 균주 48개 중 대부분은 DGLA를 전체 지질의 약 6 내지 8％로 생산하였다. DGLA를 전체 지질의 약 13.9％로 생산하는 균주는 1개였다 (즉, #47은 본원에서 "Y2173"이라고 칭함).
유사하게, pDMW314를 갖는 Y2153의 선별된 24개 Ura- 균주 중 대부분은 DGLA를 전체 지질의 약 6 내지 8％로 생산하였다. DGLA를 전체 지질의 약 16.3％ 및 17.2％로 생산하는 균주는 2개였다 (즉, #6 및 #11은 본원에서 균주 "Y2175" 및 "Y2176"이라고 칭함).
EPA 를 전체 지질의 약 4.8％로 생산하는 균주 Y2189 의 생성
구축물 pDMW325 (도 14C, 서열 174)를 사용하여 4개의 키메라 유전자 (2개의 Δ5 데새투라제 및 2개의 Δ17 데새투라제 포함)의 클러스터를 야로위아 Y2173 균주의 Leu2 유전자 부위 내로 통합하여 EPA를 생성할 수 있었다. 플라스미드 pDMW325는 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pDMW325 (서열 174)의 기재
서열 174 중의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
AscI/BsiWI (4837-5632) 야로위아 Leu2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF260230)의 788 bp 5' 부분
SphI/PacI (2137-1426) 야로위아 Leu2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF260230)의 703 bp 3' 부분
SwaI와 함께 Pme/BsiWI (8277-5632) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·MAΔ5: 모르티에렐라 알피나 Δ5 데새투라제 유전자 (서열 6) (진뱅크 관리 번호 AF067654) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::MAΔ5::Pex20
EcoRI/SwaI와 함께 PmeI (10876-8278) ·GPM/FBAIN: GPM::FBAIN 키메라 프로모터 (서열 219) ·I.Δ5S: 코돈-최적화된 Δ5 데새투라제 유전자 (서열 10) (이소크리시스 갈바나 (WO 2002/081668)에서 유래됨) ·OCT: 야로위아 OCT 유전자 (진뱅크 관리 번호 X69988)의 OCT 종결자 서열 을 포함하는 GPM/FBAIN::I.Δ5S::0ct
EcoRI/PmeI (10876-12497) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
PmeI/ClaI (12497-14651) ·YAT: YAT1 프로모터 (서열 217) ·Δ17S: 코돈-최적화된 Δ17 데새투라제 유전자 (서열 21) (사프롤레그니아 디클리나에서 유래됨) ·Lip2: 야로위아 리파제2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ012632)의 Lip2 종결자 을 포함하는 YAT::D17S::Lip2
ClaI/PacI (14651-1426) ·GPD: GPD 프로모터 (서열 210) ·Δ17S: 서열 21 (상기 참조) ·Pex16: 야로위아 Pex16 유전자 (진뱅크 관리 번호 U75433)의 Pex16 종결자 서열 을 포함하는 GPD::D17S::Pex16
플라스미드 pDMW325를 AscI/SphI로 소화시킨 후에, 이를 사용하여 균주 Y2173을 통상의 방법에 따라 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MMLe 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다. 각각의 형질전환으로부터 MMLe 플레이트 상에 성장한 개개의 콜로니를 골라내고 MM 및 MMLe 플레이트 상에 스트리킹하였다. MMLe 플레이트 상에 성장할 수 있지만 MM 플레이트 상에 성장할 수 없는 이들 콜로니를 Leu2- 균주로서 선별하였다. Leu2- 균주의 단일 콜로니를 이어서 액체 MMLe 배지에 30℃에서 접종하고, 250 rpm/분에서 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수집하고 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 pDMW325 형질전환체에 EPA가 존재하지만, 모 Y2173 균주에는 존재하지 않음을 보여주었다. 구체적으로, pDMW325를 갖는 Y2173의 48개 선별된 Leu2- 형질전환체 중에, 대부분의 균주가 EPA를 전체 지질의 3％ 미만으로 생산하였다. EPA를 각각 전체 지질의 약 4.8％ 및 3.4％로 생산하는 균주가 2개 (즉, #21 및 #46, 본원에서 "Y2189" 및 "Y2190"이라고 칭함) 있었다.
EPA 를 전체 지질의 약 9％로 생산하는 균주 Y2201 및 Y2203 의 생성
구축물 pZKSL5598 (도 14D, 서열 175)을 사용하여 4개의 키메라 유전자 (Δ9 엘론가제, Δ8 데새투라제 및 2개의 Δ5 데새투라제 포함)의 클러스터를 야로위아 Y2189 균주의 Lys5 유전자 (진뱅크 관리 번호 M34929) 부위 내에 통합하여 EPA의 생성을 증대시켰다. 플라스미드 pZKSL5598은 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pZKSL5598 (서열 175)의 기재
서열 175 중의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
AscI/BsiWI (10409-9573) 야로위아 Lys5 유전자 (진뱅크 관리 번호 M34929)의 794 bp 5' 부분
SphI/PacI (13804-13117) 야로위아 Lys5 유전자 (진뱅크 관리 번호 M34929)의 687 bp 3' 부분
BsiWI/SwaI (7150-9573) ·NT: YAT1 프로모터 (서열 217) ·I.Δ5S: 코돈-최적화된 Δ5 데새투라제 유전자 (서열 10) (이소크리시스 갈바나 (WO 2002/081668)에서 유래됨) ·Lip1: 야로위아 Lip1 유전자 (진뱅크 관리 번호 Z50020)의 Lip1 종결자 서열 을 포함하는 NT::I.D5S::Lip1
SalI/BsiWI (4537-7150) ·GPAT: GPAT 프로모터 (서열 216) ·MAΔ5: 모르티에렐라 알피나 Δ5 데새투라제 유전자 (서열 6) (진뱅크 관리 번호 AF067654) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)로부터의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 GPAT::MAΔ5::Pex20
SwaI/PmeI (2381-348) ·FBAINm: FBAINm 프로모터 (서열 215) ·IgD9e: 코돈-최적화된 Δ9 엘론가제 유전자 (서열 71) (이소크리시스 갈바나에서 유래됨) ·OCT: 야로위아 OCT 유전자 (진뱅크 관리 번호 X69988)의 OCT 종결자 서열 을 포함하는 FBAINm::IgD9e::OCT
ClaI/PacI (1-13804) ·GPD: GPD 프로모터 (서열 210) ·D8SF: 코돈-최적화된 Δ8 데새투라제 유전자 (서열 81) (유글레나 그라실리스 (진뱅크 관리 번호 AF139720)에서 유래됨) ·Pex16: 야로위아 Pex16 유전자 (진뱅크 관리 번호 U75433)의 Pex16 종결자 서열 을 포함하는 GPD::D8SF::Pex16
SalII/PmeI (4537 -2417) 야로위아 Leu2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF260230)
플라스미드 pZKSL5598을 AscI/SphI로 소화시킨 후에, 이를 사용하여 균주 Y2189을 통상의 방법에 따라 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MMLys 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다. 각각의 형질전환으로부터 MMLys 플레이트 상에 성장한 개개의 콜로니를 골라내고 MM 및 MMLys 플레이트 상에 스트리킹하였다. 플레이트 상에 성장할 수 있지만 MM 플레이트 상에서는 성장할 수 없는 이들 콜로니를 Lys- 균주로서 선별하였다. Lys- 균주의 단일 콜로니를 이어서 액체 MMLys 배지에 30℃에서 접종하고, 250 rpm/분에서 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수집하고 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 pZKSL5598 형질전환체에서 EPA의 증가된 생성을 나타냈다. pZKSL5598을 갖는 Y2189의 96개 선별된 Lys- 형질전환체 중에서, 대부분의 균주는 EPA를 전체 지질의 4 내지 8％로 생산하였다. EPA를 각각 전체 지질의 약 9％ 및 8.7％로 생산하는 균주가 2개 있었다 (즉, #34 및 #77, 본원에서 "Y2201" 및 "Y2203"이라고 칭함).
실시예 12
ω-3 Δ9 엘론가제 /Δ8 데새투라제 경로:
야로위아 리폴리티카에서 DHA 를 생산하는 균주의 생성 (예언적)
본 실시예는 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362로부터 유래되어 ω-3 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로의 발현을 통해 DHA를 생산하도록 유전자 조작된 균주의 구축을 기재하고 있으며, 따라서 이들 DHA-생산 균주의 완전한 지질 프로파일의 분석은 최종 DHA-함유 오일에서 GLA 동시-합성이 없음을 나타내었다.
이들 DHA-생산 균주의 발달에는 첫째로 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362로부터 유래되어 EPA를 전체 지질에 대하여 1.3％로 생산할 수 있는 균주 L116의 생성이 요구되었다 (도 5). 균주 L116에는 균주 L98 (ALA를 생산함), 균주 L103 (증가된 ALA를 생산함) 및 균주 L115 (ETA를 약 4％로 생산함)의 구축이 요구되었다. 추가로, 균주 L116은 오직 (또는 강력한) ω-3 특이성을 갖는 것으로 본원에서 특성화된, 다니오 레리오 (진뱅크 관리 번호 BC068224)로부터 유래된 신규 이작용성 Δ5/Δ6 데새투라제의 합성 및 발현이 요구되었다.
후속적으로, L116 Ura- 균주는 pKUT16을 갖는 L116에서 Ura3 유전자의 파괴에 의해 생성된 다음 상기 실시예 6에 기재된 바와 같이 플라스미드 pZP2FOEN4로 형질전환되어, ω-3 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 사용하여 DHA를 생산하는 형질전환체 균주가 생성되었다.
재순환가능 선별을 위한 LoxP :: Ura3 / HPT :: LoxP 통합 구축물 및 Cre - SU 복제 플라스미드의 생성
Δ15 데새투라제의 다중 카피를 야로위아 리폴리티카 내로 도입하기 위해 재순환가능 선별 마커 및 부위-특이적 재조합 시스템 (즉, Cre/Lox)에 기반한 전략을 사용하였다. 간략하게 설명하면, 표적 유전자 (즉, 푸사륨 모닐리포르메 Δ15 데새투라제 [서열 51])를 통합 구축물에서 LoxP 부위에 의해 플랭킹되는 선별 마커 (예컨대, Ura3 및 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 [HPT])에 인접하게 클로닝하였다. 형질전환 및 형질전환체의 선별 후에, 선별 마커는 술포닐우레아 내성 (SU) 유전자 및 Cre 레콤비나제 유전자를 갖는 복제 플라스미드의 도입에 의해 염색체로부터 제거하였다. 선별 마커의 손실 후에, Cre 플라스미드를 치유하였다. 따라서, 치유된 균주는 또다른 형질전환에 사용가능하였다.
보다 구체적으로, 플라스미드 pY72 (도 15A, 서열 176)는 1개 카피의 푸사륨 모닐리포르메 Δ15 데새투라제 및 Ura3/HPT 선별 마커 (LoxP 부위에 의해 플랭킹됨)를 포함하는 통합 구축물이었다. 구축물 pY72는 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pY72 (서열 176)의 기재
서열 176 중의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
6763-7643 야로위아 Lip1 유전자 (진뱅크 관리 번호 Z50020)의 881 bp 5' 부분
9422-10184 야로위아 Lip1 유전자 (진뱅크 관리 번호 Z50020)의 763 bp 3' 부분
SwaI/Sbfl (16-2522) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·FmD15: 푸사륨 모닐리포르메 Δ15 데새투라제 유전자 (서열 51) . Lip2: 야로위아 Lip2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ012632)로부터의 Lip2 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::FmD15:Lip2
2531-2564 LoxP 서열 (서열 382)
2566-4184 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
4198-5861 ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·HPT: 히그로마이신 내성을 부여하는 에스케리키아 콜라이 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 코딩 영역 [Kaster, K.R., et al., Nucleic Acids Res. 11 :6895-6911 (1983)] ·XPR: 야로위아 Xpr 유전자 (진뱅크 관리 번호 M17741)의 3' 영역의 ~100 bp 를 포함하는 TEF::HPT::XPR
5862-5895 LoxP 서열 (서열 382)
유사하게, 플라스미드 pY80 (도 15B, 서열 177)을 사용하여 2개 카피의 푸사륨 모닐리포르메 Δ15 데새투라제 및 Ura3/HPT 선별 마커 (LoxP 부위에 의해 플랭킹됨)를 포함하는 통합 구축물을 생성하였다. 프라이머 436 및 437 (서열 383 및 384)을 사용하며, PCR을 사용하여 8878 bp 플라스미드 pY34 (WO 2005/047480)로부터의 GPD::Fm1::XPR2를 포함하는 PacI/FseI 단편을 증폭하였다. 이 PacI/FseI 단편을 PacI/FseI-소화 벡터 pY72 내로 인-퓨전 클로닝 (클론테크 래버러토리즈, 인크., 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)에 의해 클로닝하고, XL-2 울트라 감응성 세포 (BRL, 미국 메릴랜드주 베쎄스다 소재) 내로 형질전환시켰다. 10개 양성 형질전환체를 PacI/FseI 소화 후에 미니프렙 분석에 의해 동정하고, 단지 클론 #3 및 #4가 올바른 것이었다. 올바른 클론 중 하나를 "pY80"이라 칭하였다. 따라서, 구축물 pY80은 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pY80 (서열 177)의 기재
서열 177 중의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
PacI/FseI (4-2375) ·GPD: GPD 프로모터 (서열 210) ·FmD15: 푸사륨 모닐리포르메 Δ15 데새투라제 유전자 (서열 51) ·XPR: 야로위아 Xpr 유전자 (진뱅크 관리 번호 M17741)의 3' 영역의 ~100 bp 을 포함하는 GPD::FmD15:XPR
FseI/SbfI 2385-4891 FBAIN::FmD15:Lip2: pY72 (상기 참조)에 기재된 바와 같음
4900-4933 LoxP 서열 (서열 382)
4935-6533 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
6567-8230 TEF::HPT::XPR: pY72 (상기 참조)에 기재된 바와 같음
8231-8264 LoxP 서열 (서열 382)
8271-9079 야로위아 Lip1 유전자 (진뱅크 관리 번호 250020)의 809 bp 5' 부분
11791-12553 야로위아 Lip1 유전자 (진뱅크 관리 번호 250020)의 763 bp 3' 부분
구축물 pY79 (도 15C, 서열 178)는 술포닐우레아 내성 (SU) 유전자 (즉, AHAS) 및 TEF::Cre 레콤비나제 유전자를 갖는 복제 플라스미드이었다. 구체적으로, 구축물 pY79는 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pY79 (서열 178)의 기재
RE 부위 및 뉴클레오티드 서열 178 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
4329-7315 W497L 돌연변이체 (서열 243)를 포함한 야로위아 리폴리티카 AHAS 유전자
7362-1 ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·Cre: 리컴비나제 단백질에 대한 장내세균 파지 P1 Cre 유전자 (진뱅크 관리 번호 X03453) ·XPR: 야로위아 Xpr 유전자의 3' 영역의 ~100 bp (진뱅크 관리 번호 M17741) 을 포함하는 TEF::Cre::XPR
ALA 를 생산하는 균주 L98 의 생성
플라스미드 pY72 (서열 176)를 AscI/SphI로 소화시킨 후에, 이것으로 표준 리튬 아세테이트 방법을 사용하여 야생형 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362를 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 YPD+하이그로마이신 (250 ㎍/mL) 플레이트 상에 플레이팅하였다. 2일 후에, 20개 형질전환체를 골라내고 신선한 YPD+하이그로마이신 (250 ㎍/mL) 플레이트 상에 스트리킹하고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리로 수집하고 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 pY72 형질전환체에서 ALA가 존재하지만, 야생형 야로위아 대조군 균주에서는 존재하지 않았음을 보여주었다. 최고 클론은 ALA를 전체 지질의 약 27％로 생산하고, 80％의 기질 전환율을 나타냈다.
ATCC #20362/pY72 형질전환체를 pY79 (서열 178, 술포닐우레아 (SU) 내성 마커를 가짐)로 형질전환시키고, 형질전환체를 3일 동안 MM + SU (150 ㎍/mL) 플레이트 상에서 선별함으로써 pY72 중에서 LoxP 부위에 의해 플랭킹된 Ura3/HPT 마커를 게놈으로부터 제거하였다. SU-내성 (SUR) 형질전환체를 신선한 MM + SU (150 ㎍/mL) 플레이트 상에 1일 동안 재스트리킹하고, 이어서 YPD+하이그로마이신 (250 ㎍/mL) 플레이트 상에 레플리카-플레이팅하였다. 모든 클론 (클론 #1 제외)은 하이그로마이신 (Hygs)에 감수성이어서 이는 HPT 내성 유전자가 Cre 레콤비나제에 의해 성공적으로 제거되었음을 나타낸다.
플라스미드 pY79는 세포를 YPD에서 선별 없이 30℃에서 밤새 성장시킴으로써 Hygs 클론 #6 및 #14로부터 치유되었다. 배양물 (0.1 mL)을 YPD 1 mL에 희석하고, 이를 사용하여 가장 높은 희석이 20,000배가 되도록 계단 희석하였다. 각각의 희석을 이어서 새로운 YPD 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 MM + SU (150 ㎍/mL) 플레이트 상에 레플리카-플레이팅하였다. 모든 클론은 SU-감수성 (SUS)이어서, 이는 이들이 pY79를 성공적으로 치유하였음을 나타낸다. 클론 #6-1을 추가의 형질전환에 대해 사용하였다.
구체적으로, 상기 방법을 사용하여 플라스미드 pY80 (서열 177)을 AscI/SphI로 소화시킨 후에, 이를 사용하여 균주 #6-1을 형질전환시켰다. YPD+하이그로마이신 (250 ㎍/mL) 플레이트 상의 선별, 전체 지질의 GC 분석, 플라스미드 pY79 (서열 178)로의 형질전환, SUR 및 Hygs 클론의 동정, 및 플라스미드 pY79의 치유 후에, 균주 #1을 동정하였다. 이에 의해 이 균주는 3개 카피의 FmΔ15를 가지고, LA에서 ALA로의 96.1％의 기질 전환율을 가졌다.
균주 #1을 pY80 및 이어서 pY79로 상기 기재한 바와 같이 형질전환시켰다. 이는 불충분한 기질 (즉, LA)의 결과로서 5개 카피의 FmΔ15를 갖는 균주 L98을 생성하였지만, 이 균주 중의 Δ15 탈포화는 균주 #1 (3개 카피의 FmΔ15를 가짐)에 상대적으로 유의하게 개선되지 않았다.
증가된 ALA 를 생산하는 균주 L103 의 생성
플라스미드 pY86 (도 15D, 서열 179)을 1개 카피의 푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제 및 Ura3/HPT 선별 마커 (LoxP 부위에 의해 플랭킹됨)를 포함하는 통합 구축물이었다. 구체적으로, pY86은 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pY86 (서열 179)의 기재
서열 179 중의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
3399-4207 야로위아 Lip1 유전자의 809 bp 5' 부분 (진뱅크 관리 번호 Z50020)
6919-7681 야로위아 Lip1 유전자의 763 bp 3' 부분 (진뱅크 관리 번호 Z50020)
28-61 LoxP 서열 (서열 382)
63-1681 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
1695-3358 ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·HPT: 히그로마이신 내성을 부여하는 에스케리키아 콜라이 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 코딩 영역 [Kaster, K.R., et al., Nucleic Acids Res. 11 :6895-6911 (1983)] ·XPR: 야로위아 Xpr 유전자 (진뱅크 관리 번호 M17741)의 3' 영역의 ~100 bp 를 포함하는 TEF::HPT::XPR
3359-3392 LoxP 서열 (서열 382)
PacI/FseI (7690-7) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·FmD12: 모르티에렐라 이자벨리나 Δ12 데새투라제 유전자 (서열 32) ·Lip2: 야로위아 Lip2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ012632)의 Lip2 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::FmD12::Lip2
상기 방법으로, 플라스미드 pY86을 AscI/SphI로 소화시킨 후에, 이것으로 균주 L98을 형질전환시켰다. YPD+하이그로마이신 (250 ㎍/mL) 플레이트 상의 선별, 전체 지질의 GC 분석, 플라스미드 pY79 (서열 178)를 사용하는 형질전환 및 SUR 및 Hygs 클론의 동정 후에, 균주 L103을 동정하였다. 이에 의해 이 균주는 5개 카피의 FmΔ15, 1개 카피의 FmΔ12를 가졌고, Ura3-이었다. 균주 L98에 상대적으로, 균주 L103 중의 18:1의 양 (전체 지방산의 백분율로서)은 42％에서 약 10％로 저하되었고, 균주 L103 중의 18:2의 양 (전체 지방산의 백분율로서)은 2％에서 약 10％로 증가하고, 균주 L103 중의 ALA의 양 (전체 지방산의 백분율로서)은 22％에서 47％로 증가하였다.
ETA 를 전체 지질의 약 4％로 생산하는 균주 L115 의 생성
플라스미드 pY94 (도 16A, 서열 180)는 1개 카피의 Δ8 데새투라제, 1개 카피의 Δ9 엘론가제, 및 Ura3 선별 마커 (LoxP 부위에 의해 플랭킹됨)를 포함하는 통합 구축물이었다. 이 플라스미드는 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pY94 (서열 180)의 기재
서열 180 중의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
PacI/SwaI (1-2587) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·D8: 코돈-최적화된 Δ8 데새투라제 유전자 (서열 81) (유글레나 그라실리스 (진뱅크 관리 번호 AF139720)에서 유래됨) ·Pex16: 야로위아 Pex16 유전자 (진뱅크 관리 번호 U75433)의 Pex16 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::D8:Pex16
2592-4684 ·GPAT: GPAT 프로모터 (서열 216) ·D9E: 코돈-최적화된 Δ9 엘론가제 유전자 (서열 71) (이소크리시스 갈바나에서 유래됨) ·Lip1: 야로위아 Lip1 유전자 (진뱅크 관리 번호 Z50020)의 Lip1 종결자 서열 을 포함하는 GPAT::D9E::Lip1
4714-4747 LoxP 서열 (서열 382)
4761-6378 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
6380-6413 LoxP 서열 (서열 382)
6470-7253 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)의 784 bp 5' 부분
9965-10480 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)의 516 bp 3' 부분
표준 리튬 아세테이트 방법을 이용하여 플라스미드 pY94로 균주 L103을 형질전환시켰다. 형질전환 후, 상기 세포를 MM 플레이트에 플레이팅하고 3일 동안 유지시켰다. 이어서, 22개의 콜로니를 골라내고 신선한 MM 플레이트에 스트리킹하여 30℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 원심분리로 수집하고 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다. 클론 #8 (본원에서는 균주 L104라고 칭함)은 가장 높은 Δ9 엘론가제 및 Δ8 데새투라제 기질 전환율(％)을 가졌다.
균주 L104의 대수증식기 세포를 pY79 (서열 178) 1 ㎕ (약 0.5 ㎍/㎕)로 형질전환시키고, 형질전환체를 4일 동안 MMU + SU (100 ㎍/mL) 플레이트에서 선별함으로써 게놈으로부터 pY94에서 LoxP 부위에 의해 플랭킹된 Ura3 마커를 잘라냈다. 12개 SUR 형질전환체를 신선한 MM 및 MMU 플레이트에서 2일 동안 재스트리킹하였다. 모든 클론 (1개는 제외)은 URA 영양요구성 (즉, Uras)이므로, 이는 Ura3 내성 유전자를 Cre 레콤비나제에 의해 성공적으로 잘라냈음을 나타낸다.
세포의 1/3 백금이로부터 MMU 중에 1:10,000 내지 1:50,000 희석함으로써 플라스미드 pY79를 1개 URA 영양요구균으로부터 치유하였다. 희석물 (100 ㎕/플레이트)을 YPD 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 8개 콜로니를 YPD 플레이트로부터 골라내고, MMU 플레이트 및 MMU + SU 플레이트 상에 스트리킹하고, 30℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 클론은 SU-감수성 (SUs)이어서, 이는 이들이 pY79를 성공적으로 치유하였음을 나타낸다. 이들 중 하나를 L111이라 칭하고, 이에 의해 5개 카피의 FmΔ15, 1개 카피의 FmΔ12, 1개 카피의 Δ8 데새투라제, 1개 카피의 Δ9 엘론가제를 가지고, Ura3-이었다.
균주 L115 (5개 카피의 FmΔ15, 1개 카피의 FmΔ12, 2개 카피의 Δ8 데새투라제, 2개 카피의 Δ9 엘론가제를 보유하고 Ura3-을 특징으로 함)는 균주 L111을 pY94 (서열 180)로 상기 방법을 이용하여 형질전환시킴으로써 생성하였다. GC 분석은 균주 L115가 ETA를 전체 지질 (완전한 지질 프로파일, 하기 참조)의 약 4％로 생산하였음을 보여주었다.
EPA 를 전체 지질의 약 1.3％로 생산하는 균주 L116 의 생성
진뱅크 관리 번호 AF309556 [Hastings et al., PNAS 98(25): 14304-14309 (2001)]로서 동정된 다니오 레리오 데새투라제는 사카로마이세스 세레비지애에서 하기 이작용성 Δ6 및 Δ5 데새투라제 활성을 나타내는 것으로 보고되었다: (1) ω-6 기질에 비해 ω-3 기질의 별개의 성호성; 및 (2) Δ5 데새투라제 활성에 상대적으로 유의하게 더 높은 Δ6 데새투라제 활성.
본 발명자들은 진뱅크 관리 번호 BC068224를 진뱅크 관리 번호 AF309556의 상동체 (이들은 단지 ORF의 위치 984에서의 1 bp (T) 결실 (무효화 돌연변이를 생성함) 및 위치 1171에서의 1 bp 변화 ('G'에서 'A'로) ('V에서 'M'으로 아미노산을 변화시킴)가 상이함)로서 동정하였다.
V1171M 돌연변이 외에 진뱅크 관리 번호 AF309556 (본원에서 "Drd6/d5(V)"로서 동정됨, 서열 15)에 동일하게 돌연변이체 단백질을 이어서 생성하였다 (본원에서 "Drd6/d5(M)"로서 동정함, 서열 18). 구체적으로, 2개 중복 단편을 먼저 진뱅크 관리 번호 BC068224 cDNA 파지미드로부터 프라이머 쌍들 475 및 477 (서열 385 및 386) 및 478 및 476 (서열 387 및 388) [여기서, 프라이머 477 및 478은 "누락 T"를 가짐]으로 증폭하였다. 이어서, 전체 Drd6/d5(M) ORF는 프라이머 475 및 476 및 주형으로서의 2개 중복 단편을 사용하여 증폭시켰다. ORF는 하기 성분을 함유한 복제 플라스미드 중에 두고, 본원에서 플라스미드 "pY91M" (도 16B)로서 동정하였다:
플라스미드 pY91M (서열 181)의 기재
서열 181 중의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
2866-4170 ARS18 서열 (진뱅크 관리 번호 A17608)
4216-5703 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
SalI/BsiwI (5705-8423) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·DrD6: Drd6/d5(M) 유전자 (서열 17) (다니오 레리오 Δ5/Δ6 데새투라제 (진뱅크 관리 번호 BC068224) 에서 유래됨) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::DrD6:Pex20
플라스미드 pY91V는 플라스미드 pY91M으로부터 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 QuikChange® II 부위-지정 돌연변이유발 키트, (스트라타진, 카탈로그 #200523) 및 프라이머 505 및 506 (서열 389 및 390)을 사용하여 생성하였다. pY91V는 상기 기재한 M에서 V로 아미노산 돌연변이시키는 단일 bp 변화 외에 pY91M과 동일하였다.
플라스미드 pY91M 및 pY91V, 뿐만 아니라 대조군로서 제공된 빈 벡터를 균주 L115의 대수증식기 세포 내로 각각 표준 리튬 아세테이트 방법으로 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MM 플레이트에 플레이팅하고, 3일 동안 유지하였다. 콜로니를 이어서 골라내고, 신선한 MM 플레이트 상에 성장시키고, 30℃에서 밤새 성장시켰다. 각 클론의 세포의 1/3 백금이를 MM 3 mL에 접종하고, 30℃의 진탕기에서 24시간 동안 성장시켰다. 별법으로, 세포를 24 시간 동안 MM에서 성장시키고, 이어서 3일 동안 HGM에서 배양하였다. 모든 세포를 수확하고, 그의 지방산 조성을 이전에 기재한 바와 같이 GC에 의해 분석하였다.
빈 벡터 (대조군), pY91M 및 pY91V로 형질전환시킨 균주 L115 (FmΔ15, FmΔ12, Δ8 데새투라제 및 Δ9 엘론가제 키메라 유전자의 결과로서 ω-3 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 발현함)의 완전한 지질 프로파일을 하기 표 36에 나타낸다. 지방산을 16:0, 16:1, 17:1, 18:0, 18:1 (올레산), 18:2 (LA), GLA, 20:2 (EDA), DGLA, ARA, ALA, STA, 20:3 (ETrA), ETA 및 EPA로서 확인하고; 각각의 조성을 전체 지방산(％)으로서 나타낸다. 3개의 별도 실험을 수행하였으며, 이를 컬럼 "실험 번호"에 실험 번호 1, 2 및 3으로 나타냈다. 추가로, 각각의 균주에 대한 Δ6 및 Δ5 기질 전환율(％)은 ω-6 및 ω-3 기질을 모두 사용하는 활성에 대해 보고한다 (표 37).
Figure 112007040393459-PCT00009
* 클론 #11로서 동정된 L115/pY91M 형질전환체를 야로위아 리폴리티카 균주 "L116"이라고 칭하였다.
Figure 112007040393459-PCT00010
상기 결과에서 입증되는 바와 같이, 야로위아 리폴리티카 (즉, 균주 L115 + pY91M)에서의 Drd6/d5(M)의 발현은 Δ6 데새투라제 활성 (즉, ALA에서 STA로)보다 Δ5 데새투라제 활성 (즉, ETA에서 EPA로)에 대한 더 높은 기질 전환율(％) 및 Δ6 및 Δ5 데새투라제 활성 모두에 대해 매우 높은 ω-3 기질 선호성을 갖는, Δ6 및 Δ5 데새투라제 활성을 모두 갖는 이작용성 효소를 생산하였다. 예상외로, Drd6/d5(V) (즉, 균주 L115 + pY91V)는 ω-6 기질에 대해 Δ6 또는 Δ5 활성을 나타내지 않은 반면, Drd6/d5(M)은 ω-6 기질에 대해 Δ5 활성을 결실하였다. 따라서, Drd6/d5(M)은 Drd6/d5(V)와 상이한 특징을 가졌다. Drd6/d5(V)와 공개된 구축물과의 활성에서의 차이는 단백질이 발현되는 상이한 숙주 유기체 및/또는 기질의 기원 (즉, 기질 공급 [Hastings et al., 상기 문헌] 또는 기질 생합성 [본원에서 입증됨])과 관련이 있는 것으로 여겨진다.
Drd6/d5(M) 및 Drd6/d5(V)의 기질 특이성의 더 나은 이해를 위해, FBAIN::Drd6/d5(M)::Pex20 및 FBAIN::Drd6/d5(V)::Pex20 키메라 유전자를 야로위아 복제 플라스미드 내로 LEU 선별로 전달하고, 이에 의해 플라스미드 pY102(M) 및 pY102(V)를 각각 생성하였다. 이들 플라스미드를 이어서 균주 Q-d12D인, Δ12 데새투라제 넉아웃 (WO 2004/104167)을 포함하는 야로위아 리폴리티카 균주 내로 형질전환시켰다. 형질전환체를 1일 동안 MM에서 0.5 mM LA, ALA, ETrA [20:3 (11,14,17)], EDA, DGLA 또는 ETA의 존재하에 성장시키고, 기질 전환율(％)을 시험하였다. 결과를 하기 표 38에 나타낸다:
Figure 112007040393459-PCT00011
상기 결과는 신규 Drd6/d5(M) 데새투라제가 (공개된 Drd6/d5(V) 데새투라제에 비해) (1) 시험된 모든 기질에 대해 더 높은 기질 전환율(％); (2) ω-6 지방산에 비해 ω-3 지방산에 대해 더 높은 선택성 [ω-3 또는 ω-6 기질를 갖는 Drd6/d5(V)에는 Δ5 활성이 없었지만]; 및 (3) 예측되지 않은 Δ8 데새투라제 활성을 가졌음을 보여주었다.
Q-d12D 형질전환체 대 L115 형질전환체 간의 기질 전환율(％)에서의 차이는 기질 공급의 결과로 여겨졌다. Drd6/d5가 아실-CoA 기질 상에 작용하는 것으로 보고되었기 때문에, 데새투라제 활성은 지방산 공급 또는 야로위아 숙주에 의한 새로운 합성의 결과로서 상이할 수 있다. 또다른 예측되지 않은 관찰은 Drd6/d5(M)가 ETrA [20:3 (11, 14, 17)]를 ETA로 전환시키지만, EDA [20:2 (11, 14)]를 DGLA로 전환시키지 않았는데, 즉 단백질이 ω-3 기질에 대해서만 Δ8 데새투라제 활성을 가졌다는 것이었다.
이 신규 Drd6/d5(M) 데새투라제는 야로위아 리폴리티카에서 발현되는 경우에 경로 유전자 조작에 대한 특이한 이점을 제공할 수 있다는 특징을 가지는 것으로 고려된다.
실시예 13
EPA 를 전체 지질의 14％로 생산하는, 중간체 균주 Y2067U 의 생성
본 실시예는 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362로부터 유래되어 EPA를 전체 지질에 대하여 14％로 생산할 수 있는 균주 Y2067U의 구축을 기재한다 (도 5). 이 균주는 ω-6 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로를 발현하도록 유전자 조작되었다. 이 EPA 생산 균주에서 모르티에렐라 알피나 LPAAT2, DGAT1 및 DGAT2 및 야로위아 리폴리티카 CPT1 유전자 과발현이 미치는 효과를 실시예 17, 18, 19 및 24 각각 (하기 참조)에 기재한 바와 같은 TAG 함량 및/또는 조성의 분석을 기초로 조사하였다.
균주 Y2067U의 개발에는 균주 M4 (DGLA를 8％로 생성하고, 실시예 6에 기재됨), 균주 Y2034 (ARA를 10％로 생산함), 균주 E (EPA를 10％로 생산함), 균주 EU (EPA를 10％로 생산함) 및 균주 Y2067 (EPA를 15％로 생산함)의 구축이 요구되었다.
ARA 를 전체 지질의 약 10％로 생산하는 Y2034 균주의 생성
2개의 Δ5 키메라 유전자를 야로위아 균주 M4의 Leu2 유전자에 통합하여 구축물 pDMW232 (도 16C, 서열 182)를 제조하였다. 플라스미드 pDMW232는 표 39에 나타낸 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pDMW232 (서열 182)의 기재
서열 182 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
AscI/BsiWI (5550-4755) 야로위아 Leu2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF260230)의 788 bp 5' 부분
Sphl/PacI (8258-8967) 야로위아 Leu2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF260230)의 703 bp 3' 부분
SwaI/BsiWI (2114-4755) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·MAΔ5: 모르티에렐라 알피나 Δ5 데새투라제 유전자 (서열 6) (진뱅크 관리 번호 AF067654) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::MAΔ5::Pex20
SwaI/ClaI (2114-17) ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·MAΔ5: 서열 6 (상기함) ·Lip1: 야로위아 Lip1 유전자 (진뱅크 관리 번호 Z50020)의 Lip1 종결자 서열 을 포함하는 TEF::MAΔ5::Lip1
PmeI/ClaI (5550-4755) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
플라스미드 pDMW232를 AscI/SphI으로 소화시킨 후에, 이것을 상기 '통상의 방법'에 따라 사용하여 균주 M4를 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MMLe 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다. 각각의 형질전환으로부터 MMLe 플레이트에서 성장한 개개의 콜로니를 골라내고 MM 및 MMLe 플레이트에 스트리킹했다. MMLe 플레이트에서는 성장할 수 있으나 MM 플레이트에서는 성장할 수 없는 콜로니를 Leu2- 균주로서 선별하였다. 이어서, Leu2- 균주의 단일 콜로니를 30℃의 액체 MMLe 배지에 접종하고 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 ARA가 pDMW232 형질전환체 중에는 존재하지만 모(母) M4 균주 중에는 존재하지 않음을 보여주었다. 구체적으로, pDMW232를 함유하는 것으로 선별된 48개의 Leu2- 형질전환체 중에서 유전자 조작된 야로위아에서 ARA를 전체 지질의 5％ 미만으로 생산하는 균주는 34개였고, ARA를 6 내지 8％로 생산하는 균주는 11개였으며, ARA를 약 10％로 생산하는 균주는 3개였다. ARA를 10％로 생산하는 균주 중 하나를 "Y2034"로 명명하였다.
EPA 를 전체 지질의 약 10％로 생산하는 E 균주의 생성
플라스미드 pZP3L37 (실시예 6)을 AscI/SphI으로 소화시킨 후에, 이것을 상기 '통상의 방법'에 따라 사용하여 균주 Y2034를 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MM 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다. MM 플레이트에서 성장한 총 48개의 형질전환체를 골라내고 신선한 MM 플레이트에 재스트리킹했다. 일단 성장했으면, 이들 균주를 개별적으로 30℃의 액체 MM에 접종하고 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 EPA가 pZP3L37을 함유하는 대개의 형질전환체 중에는 존재하지만 모 균주 (즉, Y2034) 중에는 존재하지 않음을 보여주었다. pZP3L37을 함유하는 것으로 선별된 48개의 형질전환체 중에서, 유전자 조작된 야로위아에서 EPA를 전체 지질의 2％ 미만으로 생산하는 균주는 18개였고, EPA를 2 내지 3％로 생산하는 균주는 14개였으며, EPA를 약 7％로 생산하는 균주는 1개였다.
EPA를 7％로 생산하는 균주는 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이 "2-단계 성장 조건" (즉, 48시간 MM, 72시간 HGM)을 이용하여 배양한 후에 추가로 분석하였다. GC 분석은 상기 유전자 조작된 균주가 상기 2-단계 성장 후에 EPA를 전체 지질의 약 10％로 생산함을 보여주었다. 상기 균주를 "E" 균주라고 칭하였다.
EPA 를 전체 지질의 약 10％로 생산하는, Ura - 표현형을 갖는 EU 균주의 생성
5-FOA 내성인 균주 E의 돌연변이체 세포를 동정하여 균주 EU (Ura-)를 제조하였다. 구체적으로, 일군의 야로위아 E 균주 세포를 YPD 배지 3 mL에 접종하고, 30℃에서 250 rpm/분으로 24시간 동안 진탕 성장시켰다. 배양물을 YPD으로 OD600 0.4까지 희석한 후에 추가의 4시간 동안 인큐베이션했다. 상기 배양물을 MM + FOA 플레이트에 플레이팅 (플레이트 1개 당 100 ㎕)하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다. 총 16개의 FOA 내성 콜로니를 골라내고 MM 및 MM + FOA 선별 플레이트에 스트리킹했다. 이들 중 10개의 콜로니가 FOA 선별 플레이트에서는 성장하였으나 MM 플레이트에서는 성장하지 못했고, 이들을 잠재적인 Ura- 균주로서 선별하였다.
이들 균주 중 1개를, 키메라 GPD::푸사륨 모닐리포르메 Δ15::XPR2 유전자 및 선별 마커로서의 Ura3 유전자를 포함하는 pY37/F15를 사용한 형질전환의 숙주로 사용하였다 (도 16D, 서열 183). MM 플레이트에서 3일 동안의 선별 후, 상기 플레이트에서는 수백개의 콜로니가 성장하였고, 플라스미드를 보유하지 않는 형질전환 대조군에서는 콜로니 성장이 없었다. 이 실험으로 5-FOA 내성 숙주 균주가 Ura-인 것으로 확인되었으며, 이 균주를 균주 "EU"라고 칭하였다.
이어서, EU 균주의 단일 콜로니를 0.1 g/L 유리딘을 추가로 함유하는 액체 MMU에 접종하고, 30℃에서 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕 배양하였다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다. GC 분석은 EU 균주가 EPA를 전체 지질의 약 10％로 생산함을 보여주었다.
EPA 를 전체 지질의 약 15％로 생산하는 Y2067 균주의 생성
2개의 키메라 유전자 (이종 Δ12 데새투라제 및 C18 /20 엘론가제를 포함함) 및 Ura3 유전자를 함유하는 클러스터를 균주 EU의 천연 야로위아 Δ12 데새투라제 유전자에 통합하여 플라스미드 pKO2UF2PE (도 17A, 서열 184)를 제조하였다. 플라스미드 pKO2UF2PE는 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pKO2UF2PE (서열 184)의 기재
서열 184 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
AscI/BsiWI (3382-2645) 야로위아 Δ12 데새투라제 유전자 (서열 28)의 730 bp 5' 부분
SphI/EcoRI (6090-6646) 야로위아 Δ12 데새투라제 유전자 (서열 28)의 556 bp 3' 부분
SwaI/BsiWI (1-2645) ·FBAINm: FBAINm 프로모터 (서열 215) ·F.Δ12: 푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제 유전자 (서열 32) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 FBAINm::F.Δ12DS::Pex20
SwaI/PmeI (1-8525) ·GPAT: GPAT 프로모터 (서열 216) ·EL1S: 코돈-최적화된 엘론가제 1 유전자 (서열 24) (모르티에렐라 알피나 (진뱅크 관리 번호 AX464731)로부터 유래됨) ·OCT: 야로위아 OCT 유전자 (진뱅크 관리 번호 X69988)의 OCT 종결자 서열 을 포함하는 GPAT::EL1S::0CT
EcoRI/PacI (6646-8163) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
플라스미드 pKO2UF2PE를 AscI/SphI으로 소화시킨 후에, 이것을 상기 '통상의 방법'에 따라 사용하여 균주 EU를 형질전환시켰다 (균주 EU는 형질전환 완충제 중에 현탁시키기 전에 YPD 플레이트에 스트리킹하여 대략 36시간 [vs . 18시간] 동안 성장시켰음). 형질전환 후, 세포를 MM 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다. MM 플레이트에서 성장한 총 72개의 형질전환체를 골라내고 신선한 MM 플레이트에 따로 재스트리킹했다. 일단 성장했으면, 이들 균주를 개별적으로 30℃의 액체 MM에 접종하고 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 pKO2UF2PE를 함유하는 거의 모든 형질전환체 중에는 EPA가 존재함을 보여주었다. 보다 구체적으로, 72개의 선별된 형질전환체 중에서 유전자 조작된 야로위아에서 EPA를 전체 지질의 8 내지 9.9％로 생산하는 균주는 17개였고, EPA를 10 내지 10.9％로 생산하는 균주는 27개였으며, EPA를 11 내지 11.9％로 생산하는 균주는 16개였고, EPA를 12 내지 12.7％로 생산하는 균주는 7개였다. EPA를 12.7％로 생산하는 균주는 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같은 2-단계 성장 조건 (즉, 48시간 MM, 72시간 HGM)을 이용하여 추가로 분석하였다. GC 분석은 상기 유전자 조작된 균주가 상기 2-단계 성장 후에 EPA를 전체 지질의 약 15％로 생산함을 보여주었다. 상기 균주를 균주 "Y2067"이라고 칭하였다.
EPA 를 전체 지질의 약 14％로 생산하는, Ura - 표현형을 갖는 Y2067U 균주의 생성
플라스미드 pZKUT16 (실시예 6)을 SalI/PacI로 소화시킨 후에, 이것을 상기 '통상의 방법'에 따라 사용하여 Y2067 균주를 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MM + 5-FOA 선별 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다.
MM + 5-FOA 플레이트에서 성장한 총 24개의 형질전환체를 골라내고 MM 플레이트 및 MM + 5-FOA 플레이트에 따로 재스트리킹했다. MM + 5-FOA 플레이트에서는 성장할 수 있으나 MM 플레이트에서는 성장할 수 없는 균주를 Ura- 균주로서 선별하였다. 총 10개의 Ura- 균주를 개별적으로 30℃의 액체 MMU 배지에 접종하고 250 rpm/분으로 1일 동안 진탕 성장시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은, MMU 배지 중에서 1일 동안 성장시킨 후에는 pZKUT16을 함유하는 모든 형질전환체에 EPA가 5 내지 7％로 존재함을 보여주었다. EPA를 6.2％로 생산하는 균주는 2-단계 성장 조건 (즉, 48시간 MM, 96시간 HGM)을 이용하여 추가로 분석하였다. GC 분석은 상기 유전자 조작된 균주가 EPA를 전체 지질의 약 14％로 생산함을 보여주었다. 상기 균주를 균주 "Y2067U"라고 칭하였다.
야생형 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362에 대한 이 균주의 최종 유전자형은 다음과 같았다:
Figure 112007040393459-PCT00012
실시예 14
EPA 를 전체 지질의 16％로 생산하는, 중간체 균주 Y2107U1 의 생성
본 실시예는 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362로부터 유래되어 EPA를 전체 지질에 대하여 상당한 농도로 생산할 수 있는 균주 Y2107U1의 구축을 기재한다 (도 5). 모르티에렐라 알피나 GPAT 유전자 과발현의 영향을 실시예 20에 기재된 바와 같이 TAG 함량 및/또는 조성의 분석에 기초하여 이 EPA 생산 균주에서 조사하였다 (하기 참조).
본원에서 균주 Y2107U1 (EPA를 16％로 생산하고, Ura- 표현형을 보유함)의 발달에는 균주 M4 (DGLA를 8％로 생산함, 실시예 6에 기재됨), 균주 Y2047 (ARA를 11％로 생산함, 실시예 6에 기재됨), 균주 Y2048 (EPA를 11％로 생산함, 실시예 6에 기재됨), 균주 Y2060 (EPA를 13％로 생산함, 실시예 6에 기재됨), 균주 Y2072 (EPA를 15％로 생산함, 실시예 6에 기재됨), 균주 Y2072U1 (EPA를 14％로 생산함) 및 Y2089 (EPA를 18％로 생산함)의 구축이 요구되었다.
EPA 를 전체 지질의 약 14％로 생산하는, Ura - 표현형을 갖는 Y2072U1 균주의 생성
GPAT::I.Δ5S::Pex20 키메라 유전자를 Y2072 균주 (실시예 6)의 Ura3 유전자에 통합하여 구축물 pZKUGPI5S (도 17B, 서열 187)를 제조하였다. 보다 구체적으로, 플라스미드 pZKUGPI5S는 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pZKUGPI5S (서열 187)의 기재
서열 187 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
BsiWI/PacI (318-1038) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)의 721 bp 5' 부분
SalI/ClaI (3882-4606) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)의 724 bp 3' 부분
ClaI/BsiWI (4606-318) ·GPAT: GPAT 프로모터 (서열 216) ·I.Δ5S: 코돈-최적화된 Δ5 데새투라제 유전자 (서열 10) (이소크리시스 갈바나로부터 유래됨) (제WO 2002/081668호) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 GPAT::I.Δ5S::Pex20
플라스미드 pZKUGPI5S를 SalI/PacI으로 소화시킨 후, 이것을 상기 '통상의 방법'에 따라 사용하여 균주 Y2072를 형질전환시켰다. 형질전환 후에는 세포를 MM + 5-FOA 선별 플레이트에 플레이팅하고 30℃에서 3 내지 4일 동안 유지시켰다.
MM + 5-FOA 플레이트에서 성장한 총 24개의 형질전환체를 골라내고 MM 플레이트 및 MM + 5-FOA 플레이트에 따로 재스트리킹했다. MM + 5-FOA 플레이트에서는 성장할 수 있으나 MM 플레이트에서는 성장할 수 없는 균주를 Ura- 균주로서 선별하였다. 이들 24개의 Ura- 균주 각각을 개별적으로 액체 MMU에 접종하고 30℃에서 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕 성장시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은, MMU 중에서 2일 동안 성장시킨 후에는 EPA를 전체 지질의 7.3 내지 8.9％로 생산하는 균주가 8개이고, EPA를 9 내지 9.9％로 생산하는 균주가 14개이고, EPA를 10.5％로 생산하는 균주가 1개 (즉, #1)이며, EPA를 10.7％로 생산하는 균주가 1개 (즉, #23)임을 보여주었다. 균주 #1 및 균주 #23을 2-단계 성장 조건 (즉, 48시간 MM, 96시간 HGM)을 이용하여 추가로 분석하였다. GC 분석은 이들 2개의 균주가 상기 2-단계 성장 후에 EPA를 전체 지질의 약 14％로 생산함을 보여주었다. 균주 #1은 균주 "Y2072U1"이라고 칭하였다.
EPA 를 전체 지질의 약 18％로 생산하는 Y2089 균주의 생성
4개의 키메라 유전자 (C16 /18 엘론가제, C18 /20 엘론가제, Δ6 데새투라제 및 Δ12 데새투라제를 포함함) 및 Ura3 유전자의 클러스터를 Y2072U1 균주의 야로위아 리파제 1 유전자 부위에 통합하여 구축물 pDMW302T16 (도 17C, 서열 186)을 제조하였다. 플라스미드 pDMW302T16은 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pDMW302T16 (서열 186)의 기재
서열 186 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
BsiWI/AscI (1-817) 야로위아 리파제 1 유전자 (진뱅크 관리 번호 Z50020)의 817 bp 5' 부분
SphI/PacI (3525-4294) 야로위아 리파제 1 유전자 (진뱅크 관리 번호 Z50020)의 769 bp 3' 부분
EcoRI/BsiWI (13328-1) ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·rELO2S: 코돈-최적화된 rEL02 엘론가제 유전자 (서열 85) (래트 (진뱅크 관리 번호 AB071986)로부터 유래됨) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 TEF::rELO2S::Pex20
BgIII/EcoRI (10599-13306) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·Δ6S: 코돈-최적화된 Δ6 데새투라제 유전자 (서열 3) (모르티에렐라 알피나 (진뱅크 관리 번호 AF465281)로부터 유래됨) ·Lip1: 야로위아 Lip1 유전자 (진뱅크 관리 번호 Z50020)의 Lip1 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::D6S::Lip1
ClaI/PmeI (8078-10555) ·GPDIN: GPDIN 프로모터 (서열 211) ·EL1S: 코돈-최적화된 엘론가제 1 유전자 (서열 24) (모르티에렐라 알피나 (진뱅크 관리 번호 AX464731)로부터 유래됨) ·Lip2: 야로위아 리파제 2 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ012632)의 Lip2 종결자 를 포함하는 GPDIN::EL1S::Lip2
EcoRI/ClaI (6450-8078) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
PacI/EcoRI (4294-6450) ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·F.Δ12: 푸사륨 모닐리포르메 Δ12 데새투라제 유전자 (서열 32) ·Pex16: 야로위아 Pex16 유전자 (진뱅크 관리 번호 U75433)의 Pex16 종결자 를 포함하는 TEF::F.Δ12::Pex16
플라스미드 pDMW302T16을 SphI/AscI으로 소화시킨 후에, 이것을 상기 '통상의 방법'에 따라 사용하여 균주 Y2072U1을 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MM 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 3 내지 4일 동안 유지시켰다.
MM 플레이트에서 성장한 총 48개의 형질전환체를 골라내고 신선한 MM 플레이트에 재스트리킹했다. 일단 성장했으면, 이들 균주를 개별적으로 30℃의 액체 MM에 접종하고 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕 성장시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은, MM 배지 중에서 2일 동안 성장시킨 후에는 pDMW302T16을 함유하는 Y2072U1의 거의 모든 형질전환체에서 EPA가 생산됨을 보여주었다. 선별된 48개의 형질전환체 중에서, EPA를 10％ 미만으로 생산하는 균주는 27개였고, EPA를 10 내지 12.9％로 생산하는 균주는 14개였으며, EPA를 13 내지 13.9％로 생산하는 균주는 5개였다. 균주 #34 (EPA를 13.9％로 생산함)를 선별하여 2-단계 성장 절차 (즉, 48시간 MM, 96시간 HGM)를 이용한 추가의 분석을 수행하였다. GC 분석은 균주 #34가 EPA를 전체 지질의 약 18％로 생산함을 보여주었다. 균주 #34를 균주 "Y2089"라고 칭하였다.
야생형 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362에 대한 균주 Y2089의 유전자형은 다음과 같았다:
Figure 112007040393459-PCT00013
EPA 를 전체 지질의 약 16％로 생산하는, Ura - 표현형을 갖는 Y2107U1 균주의 생성
GPAT::EL1S::Pex20 키메라 유전자를 균주 Y2089의 Ura3 유전자 내로 통합하여 구축물 pZKUGPE1S (서열 187)를 제조하였다. 보다 구체적으로, 플라스미드 pZKUGPE1S는 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pZKUGPE1S (서열 187)의 기재
서열 187 중의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
BsiWI/PacI (318-1038) 야로위아 Ura3 유전자의 721 bp 5' 부분 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
SalI/ClaI (3882-4606) 야로위아 Ura3 유전자의 724 bp 3' 부분 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
ClaI/BsiWI (4606-318) ·GPAT:GPAT 프로모터 (서열 216) ·EL1S: 코돈-최적화된 엘론가제 1 유전자 (서열 24) (모르티에렐라 알피나 (진뱅크 관리 번호 AX464731)에서 유래됨) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)로부터의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 GPAT::EL1S::Pex20
플라스미드 pZKUGPE1S를 PstI/PacI로 소화시키고, 이어서 이를 사용하여 통상의 방법에 따라 균주 Y2089를 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MM + 5-FOA 선별 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 3 내지 4일 동안 유지시켰다.
MM + 5-FOA 플레이트 상에 성장한 총 8개 형질전환체를 골라내고 MM 플레이트 및 MM + 5-FOA 플레이트 상에 따로 재스트리킹하였다. MM + 5-FOA 플레이트에서는 성장할 수 있으나 MM 플레이트에서는 성장할 수 없는 이들 균주를 Ura- 균주로서 선별하였다. 각각의 이들 8 Ura- 균주를 액체 MMU에 개별적으로 접종시키고, 30℃에서 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕하여 성장시켰다. 세포를 원심분리로 수집하고 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 2일 동안 MMU에서 성장시킨 후에는 EPA를 전체 지질의 6.6 내지 8.7％로 생산하는 균주가 6개였고, EPA (즉, #4 및 #5)를 9.4 내지 10％로 생산하는 균주가 2개였음을 보여주었다. 균주 #4 및 #5는 2-단계 성장 조건 (즉, 48시간 MM, 72시간 HGM)을 이용하여 추가로 분석하였다. GC 분석은 이들 2개의 균주가 EPA를 전체 지질의 약 16％로 상기 2-단계 성장 후에 생산하였음을 보여주었다. 균주 #4를 균주 "Y2107U1"이라고 칭하고, 균주 #5를 균주 "Y2107U2"라고 칭하였다.
실시예 15
EPA 를 전체 지질의 9 내지 12％로 생산하는, 중간체 균주 MU 의 생성
본 실시예는 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362로부터 유래되어 EPA를 전체 지질에 대하여 상당한 농도로 생산할 수 있는 균주 MU의 구축을 기재한다 (도 5). 다양한 천연 야로위아 리폴리티카 아실트랜스퍼라제 넉아웃의 영향을 실시예 27에 기재된 바와 같이 TAG 함량 및/또는 조성의 분석에 기초하여 이 EPA 생산 균주에서 조사하였다 (하기 참조).
균주 MU (본원에서 EPA를 9 내지 12％로 생산함)의 발달에는 균주 M4 (DGLA를 8％로 생산함, 실시예 6에 기재됨), 균주 Y2034 (ARA를 10％로 생산함, 실시예 13에 기재됨), 균주 E (EPA를 10％로 생산함, 실시예 13에 기재됨), 균주 EU (EPA를 10％로 생산함, 실시예 13에 기재됨) 및 균주 M26 (EPA를 14％로 생산함)의 구축이 요구되었다.
EPA 를 전체 지질의 약 14％로 생산하는 M26 균주의 생성
구축물 pKO2UM26E (서열 188, 도 17D)를 사용하여 3개의 키메라 유전자 (C18/20 엘론가제, Δ6 데새투라제 및 Δ12 데새투라제 포함) 및 Ura3 유전자의 클러스터를 EU 균주의 야로위아 Δ12 데새투라제 유전자 부위 내로 통합하였다 (실시예 13). 플라스미드 pKO2UM26E는 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pK02UM26E (서열 188)의 기재
서열 188 중의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
HindIII/AscI (1-728) 야로위아 Δ12 데새투라제 유전자 (서열 28)의 728 bp 5' 부분
SphI/EcoRI (3436-3992) 야로위아 Δ12 데새투라제 유전자 (서열 28)의 556 bp 3' 부분
BsiWI/Hindlll (11095-1) ·GPAT: GPAT 프로모터 (서열 216) ·EL1S: 코돈-최적화된 엘론가제 1 유전자 (서열 24) (모르티에렐라 알피나 (진뱅크 관리 번호 AX464731)에서 유래됨) ·XPR: 야로위아 Xpr 유전자 (진뱅크 관리 번호 M17741)의 3' 영역의 ~100 bp 를 포함하는 GPAT::EL1S::XPR
BglII/BsiWI (8578-11095) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·M.Δ12: 모르티에렐라 이자벨리나 Δ12 데새투라제 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF417245; 서열 30) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::M.Δ12::Pex20
SalI/PacI (6704 내지 8202) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
EcoRI/SalI (3992-6704) ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·M.Δ6B: 모르티에렐라 알피나 Δ6 데새투라제 유전자 "B" (진뱅크 관리 번호 AB070555; 서열 4) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::M.Δ6B::Pex20
플라스미드 pKO2UM26E를 SphI/AscI로 소화시킨 후에, 이것을 사용하여 EU 균주 (실시예 13)를 통상의 방법에 따라 형질전환시켰다. 형질전환 후, 세포를 MM 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다.
MM 플레이트에서 성장한 총 48개의 형질전환체를 골라내고 신선한 MM 플레이트에 재스트리킹했다. 일단 성장했으면, 이들 균주를 개별적으로 30℃의 액체 MM에 접종하고 250 rpm/분에서 1일 동안 진탕하여 성장시켰다. 세포를 원심분리로 수집하고 지질을 추출하고 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 EPA가 1일 동안 MM 배지에서 성장시킨 후에는 pKO2UM26E를 갖는 거의 모든 형질전환체에서 생산되었음을 보였다. 선별된 48개의 형질전환체 중에서, 유전자 조작된 야로위아에서 EPA를 전체 지질의 4％ 미만으로 생산하는 균주가 5개였고, EPA를 4 내지 5.9％로 생산하는 균주가 23개였고, EPA를 6 내지 6.9％로 생산하는 균주가 9개였고, EPA를 7 내지 8.2％로 생산하는 균주가 11개였다. EPA를 8.2％로 생산하는 균주를 2-단계 성장 절차 (즉, 48시간 MM, 96시간 HGM)를 이용한 추가의 분석을 위해 선별하였다. GC 분석은 상기 유전자 조작된 균주가 EPA를 전체 지질의 약 14％로 생산하였음을 보였다. 상기 균주를 균주 "M26"이라고 칭하였다.
야생형 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362에 대한 M26 균주의 유전자형은 다음과 같았다:
Figure 112007040393459-PCT00014
EPA 를 전체 지질의 약 14％로 생산하는 MU 균주의 생성
균주 MU는 균주 M26의 Ura 영양요구균이었다. 이 균주는 균주 M26을 PacI 및 HincII로 소화시킨 플라스미드 pZKUM (서열 189) 5 ㎍으로 형질전환시킴으로써 제조하였다. 형질전환을 동결-EZ 효모 형질전환 키트 (Frozen-EZ Yeast Transformation kit; 자이모 리서치 코포레이션, 미국 캘리포니아 오렌지 소재)로 수행하고, 형질전환체는 하기 배지를 갖는 아가 플레이트 상에 형질전환된 세포 믹스 100 ㎕를 플레이팅함으로써 선별하였다: 6.7 g/L 효모 질소 염기 (디프코 래버러토리즈, 미국 미시간주 디트로이트 소재), 20 g/L 덱스트로즈, 50 mg/L 우라실 및 800 mg/L FOA. 7일 후에, MM 및 MMU 아가 플레이트 상에 플레이팅된 작은 콜로니들이 도출되었다. 모두가 URA 영양요구이었다. 균주 중 하나를 "MU"라고 칭하였다.
실시예 16
모르티에렐라 알피나 게놈 DNA 및 cDNA 의 구축
본 실시예는 모르티에렐라 알피나 (ATCC #16266)로부터 게놈 DNA 및 cDNA의 제조를 기재한다. 이는 실시예 17, 18, 19, 20 및 21에 각각 기재하는 바와 같이 모르티에렐라 알피나 LPAAT2, DGAT1, DGAT2, GPAT 및 ELO3을 단리할 수 있다.
모르티에렐라 알피나로부터의 게놈 DNA 의 제조
게놈 DNA를 모르티에렐라 알피나 (ATCC #16266)로부터 QiaPrep 스핀 미니프렙 키트(Spin Miniprep Kit) (퀴아젠, 카탈로그 #627106)로 단리하였다. YPD 아가 플레이트 (2％ 박토-효모 추출물, 3％ 박토-펩톤, 2％ 글루코스, 2.5％ 박토-아가) 상에 성장한 세포를 긁어 내어 키트 완충제 P1 1.2 mL에 재현탁하였다. 재현탁한 세포를 2개 2.0 mL 스크루 캡 튜브에 두었으며, 이들 각각은 0.6 mL 유리 비드 (0.5 mm 직경)를 함유하였다. 세포를 HOMOGENIZE 셋팅에서의 바이오스펙(Biospec) (미국 오클라호마주 바르틀레스빌 소재) 미니 비드 비터(beater) 상에서 2분 동안 균질화하였다. 튜브를 이어서 14,000 rpm에서의 에펜도르프 미세원침에서 2분 동안 원심분리하였다. 상등액 (0.75 mL)을 3개의 1.5 mL 미세원침관 내로 전달하였다. 키트 완충제 P2의 동일 부피를 각각의 튜브에 첨가하였다. 3회 뒤집어서 튜브를 혼합한 후에, 완충제 N3 0.35 mL를 각각의 튜브에 첨가하였다. 각각의 튜브의 함유물을 총 5회 뒤집어서 다시 혼합하였다. 혼합물을 14,000 rpm에서의 에펜도르프 미세원침에서 5분 동안 원심분리하였다. 각 튜브로부터의 상등액을 개별적으로 3개의 개별 키트 스핀 컬럼 내로 옮겼다. 컬럼에 이어서 하기 단계를 수행하였다: 원심분리 (14,000 rpm에서 1분), 완충제 PE로 1회 세척, 원심분리 (14,000 rpm에서 1분), 및 이어서 최종 원심분리 (14,000 rpm에서 1분). 완충제 EB (50 ㎕)를 각 컬럼에 첨가하고, 1분 동안 정치하였다. 게놈 DNA를 이어서 14,000 rpm에서 1분 동안 원심분리함으로써 용출시켰다.
모르티에렐라 알피나로부터의 cDNA 의 제조
모르티에렐라 알피나의 cDNA를 제조자의 프로토콜에 따라 BD-클론테크 크리에이터 스마트® cDNA 라이브러리 키트 (캐나다 온타리오주 미시소거 소재)로 제조하였다.
구체적으로, 모르티에렐라 알피나 균주 ATCC #16266을 YPD 배지 (2％ 박토-효모 추출물, 3％ 박토르(Bactor)-펩톤, 2％ 글루코스) 60 mL에 3일 동안 23℃에서 성장시켰다. 세포를 3750 rpm에서의 벡크만(Beckman) GH3.8 로터에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화하고, 트리졸(Trizole) 시약 (인비트로젠) 6 X 0.6 mL에 재현탁하였다. 재현탁한 세포를 6개의 2 mL 스크루 캡 튜브에 옮겼으며, 이들 각각은 0.5 mm 유리 비드 0.6 mL를 함유하였다. 세포를 HOMOGENIZE 셋팅에서의 바이오스펙 미니 비드 비터 상에서 2분 동안 균질화하였다. 튜브를 잠시 원심분리하여 비드를 가라앉혔다. 상기 액체를 4개의 신선한 1.5 mL 미세원침관에 옮기고, 클로로포름/이소아밀 알콜 (24:1) 0.2 mL를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 손으로 1분 동안 진탕하고, 3분 동안 정치하였다. 튜브를 이어서 14,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상부 층을 4개 새로운 튜브에 옮겼다. 이소프로필 알콜 (0.5 mL)을 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후에, 14,000 rpm 및 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 RNase-무함유 물로 제조한 각 75％ 에탄올 1 mL로 세척하고, 공기 건조시켰다. 총 RNA 샘플을 이어서 물 500 ㎕에 재용해하고, 1:50 희석 RNA 샘플을 사용하여 A260 nm로 RNA 양을 측정하였다. 총 3.14 mg의 RNA가 수득되었다.
이 총 RNA 샘플을 제조자의 프로토콜에 따라 퀴아젠 RNeasy 총 RNA 미디(Midi) 키트로 추가 정제하였다. 따라서, 총 RNA 샘플을 2 mL로 희석하고, β-머캅토에탄올 80 ㎕ 및 100％ 에탄올 5.6 mL를 갖는 완충제 RLT 8 mL와 혼합하였다. 샘플을 4개 부분으로 나누고, 4개 RNeasy 미디드(midid) 컬럼 상에 적하하였다. 컬럼을 이어서 5분 동안 4500Xg에서 원심분리하였다. 컬럼을 세척하기 위해, 완충제 RPE 2 mL를 적하하고, 컬럼을 2분 동안 4500Xg에서 원심분리하였다. 원심분리 시간을 5분으로 연장한 것 외에는 세척 단계를 1회 반복하였다. 총 RNA는 RNase 무함유 물 250 ㎕를 각 컬럼에 가하고, 1분 동안 대기하고, 4500Xg 3분 동안 원심분리하여 용출시켰다.
이어서, 폴리A(+)RNA를 아머샴 바이오사이언스즈 mRNA 정제 키트의 프로토콜에 따라 상기 총 RNA 샘플로부터 단리하였다. 간략하게 설명하면, 2개 올리고-dT-셀룰로스 컬럼을 사용하였다. 컬럼을 각 고염 완충제 1 mL로 2회 세척하였다. 이전의 단계로부터의 총 RNA 샘플을 총 부피 2 mL로 희석하고, 10 mM Tris/HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA로 조정하였다. 샘플을 65℃에서 5분 동안 가열하고, 이어서 얼음상에 두었다. 샘플 완충제 (0.4 mL)를 첨가하고, 샘플을 이어서 2개 올리고-dT-셀룰로스 컬럼 상에 중력 공급 하에 적하하였다. 컬럼을 350Xg에서 2분 동안 원심분리하고, 각 고염 완충제 0.25 mL로 2회 세척하였으며, 각 횟수 후에 350Xg에서 2분 동안 원심분리하였다. 컬럼을 저염 완충제로 추가로 3회 세척한 후에, 동일한 일상적 원심분리를 수행하였다. 폴리(A)+RNA는 컬럼을 65℃로 예열한 각 용출 완충제 0.25 mL로 4회 세척한 후에, 동일한 원심분리 절차를 수행함으로써 용출하였다. 전체 정제 과정을 1회 반복하였다. 정제된 폴리(A)+RNA를 30.4 ng/㎕의 농도로 얻었다.
cDNA를 BD-클론테크 및 폴리A(+) RNA 샘플 0.1 ㎍로 특정지어진 LD-PCR 방법으로 생성하였다. 구체적으로, 제1 가닥 cDNA 합성을 위해, 폴리(A)+RNA 샘플 3 ㎕를 SMART IV 올리고 뉴클레오티드 (서열 391) 1 ㎕ 및 CDSIII/3' PCR 프라이머 (서열 392) 1 ㎕와 혼합하였다. 혼합물을 72℃에서 2분 동안 가열하고, 얼음상에서 2분 동안 냉각하였다. 상기 튜브에 제1 가닥 완충제 2 ㎕, 20 mM DTT 1 ㎕, 10 mM dNTP 믹스 1 ㎕ 및 파워스크립트(Powerscript) 역전사효소 1 ㎕를 첨가하였다. 혼합물을 42℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 얼음상에서 냉각하였다.
제1 가닥 cDNA 합성 혼합물을 PCR 반응에 대해 주형으로서 사용하였다. 구체적으로, 반응 혼합물은 제1 가닥 cDNA 혼합물 2 ㎕, 5'-PCR 프라이머 (서열 393) 2 ㎕, CDSIII/3'-PCR 프라이머 (서열 392) 2 ㎕, 물 80 ㎕, 10X 어드밴티지(Advantage) 2 PCR 완충제 10 ㎕, 5OX dNTP 믹스 2 ㎕ 및 5OX 어드밴티지 2개 폴리머라제 믹스 2 ㎕를 함유하였다. 열순환기 조건은 GenAmp 9600 기기상에서 95℃에서 20초 후에 95℃에서 5초 및 68℃에서 6분의 14 내지 20 주기로 설정하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색으로 정량하였다.
상기 PCR 생성물 (cDNA) 75 ㎕를 키트로 공급한 20 ㎍/㎕ 프로테이나제 K 3 ㎕와 혼합하였다. 혼합물을 45℃에서 20분 동안 인큐베이션하고, 이어서 물 75 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜 혼합물 (25:24:1) 150 ㎕로 추출하였다. 수성 상을 클로로포름:이소아밀 알콜 (25:1) 150 ㎕로 추가 추출하였다. 수성 상을 이어서 3M 나트륨 아세테이트 15 ㎕, 20 ㎍/㎕ 글리코겐 2 ㎕ 및 100％ 에탄올 400 ㎕와 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 14000 rpm에서의 미세원침에서 즉시 원심분리하였다. 펠렛을 80％ 에탄올 150 ㎕로 1회 세척하고, 공기 건조시키고, 물 79 ㎕에 용해하였다.
용해된 cDNA를 이어서 SfiI (cDNA 79 ㎕를 1OX SfiI 완충제 10 ㎕, SfiI 효소 10 ㎕ 및 100X BSA 1 ㎕와 혼합하고, 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 인큐베이션함)로 소화하였다. 크실렌 시아놀 염료 (1％, 2 ㎕)를 첨가하였다. 혼합물을 제조자 절차에 정확하게 따라 키트로 제공한 크로마 스핀(Chroma Spin)-400 컬럼 상에서 이어서 분획하였다. 컬럼으로부터 수집한 분획을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다. cDNA를 함유한 제1의 3개 분획을 모으고, cDNA를 에탄올로 침전시켰다. 침전된 cDNA를 물 7 ㎕로 재용해하고, 키트-공급 pDNR-LIB 내로 라이게이션하였다.
라이브러리 서열분석
라이게이션 생성물을 사용하여 이. 콜라이 XL-1 블루(Blue) 전기천공법 감응성 세포 (스트라타진)를 형질전환시켰다. 추측된 총 2 x 106 콜로니를 수득하였다. cDNA 라이브러리의 서열분석을 M13 전진 프라이머 (서열 394)로 아젠코트 바이오사이언스 코포레이션(Agencourt Bioscience Corporation)(미국 매사추세츠주 비벌리 소재)에 의해 수행하였다.
실시예 17
모르티에렐라 알피나 LPAAT2 발현은 PUFA (％)를 증가시킨다.
본 실시예는 모르티에렐라 알피나 LPAAT2 (서열 110 및 111)를 동시 발현하도록 형질전환된 야로위아 리폴리티카 균주 Y2067U (실시예 13)에서의 증가된 EPA 생합성 및 축적을 기재한다. Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 또는 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 통해 DHA를 생산하도록 유전자 조작된 야로위아 리폴리티카 숙주 균주는 모르티에렐라 알피나 LPAAT2가 그에서 유사하게 동시 발현되는 경우에 (예컨대, 균주 Y3000에서) 증가된 DHA 생합성 및 축적을 입증할 수 있었음을 고려한다.
모르티에렐라 알피나 LPAAT2 ORF를 하기와 같이 클로닝하였다. 프라이머 MLPAT-F 및 MLPAT-R (서열 395 및 396)을 사용하여 모르티에렐라 알피나 (실시예 16)의 cDNA로부터 LPAAT2 ORF를 PCR에 의해 증폭시켰다. 반응 혼합물은 cDNA 1 ㎕, 각 프라이머 1 ㎕, 물 22 ㎕ 및 ExTaq 프리믹스 2X Taq PCR 용액 (다까라 바이오 인크., 일본 520-2193 시가현 오쯔 소재) 25 ㎕를 함유하였다. 증폭을 하기와 같이 수행하였다: 94℃에서 150초 동안 초기 변성, 이어서 94℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 90초 동안 신장의 30주기. 72℃에서 10분 최종 신장 주기를 수행한 후에, 반응을 4℃에서 종결하였다. ~950 bp DNA 단편을 PCR 반응물로부터 수득하였다. 이를 퀴아젠 (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재) PCR 정제 키트로 제조자의 프로토콜에 따라 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 NcoI 및 NotI로 소화시키고, NcoI-NotI 절단 pZUF17 벡터 (서열 162; 도 9B) 내로 클로닝하여 유전자가 야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위한 자가-복제 벡터 중에서 야로위아 리폴리티카 FBAIN 프로모터 및 PEX20-3' 종결자 영역의 조절 하에 놓이게 하였다. 정확한 형질전환체를 미니프렙 DNA의 제한 분석에 의해 확인하고, 생성된 플라스미드를 "pMLPAT-17" (서열 190)이라고 칭하였다.
모르티에렐라 알피나 LPAAT2를 야로위아 리폴리티카의 게놈 내로 통합하기 위해, 플라스미드 pM LPAT-Int를 생성하였다. 프라이머 LPAT-Re-5-1 및 LPAT-Re-5-2 (서열 397 및 398)를 사용하여 야로위아 리폴리티카 LPAAT1 (서열 112)의 AUG 바로 상류에 1103 bp 단편의 야로위아 리폴리티카 게놈을 함유한 1129 bp DNA 단편인 YLPAT-5' (서열 399)를 증폭하였다. 반응 혼합물은 야로위아 리폴리티카 게놈 DNA 1 ㎕, 각 프라이머 1 ㎕, 물 22 ㎕ 및 ExTaq 프리믹스 2X Taq PCR 용액 (다까라) 25 ㎕를 함유하였다. 증폭을 상기 기재한 바와 같이 수행하였다. ~1130 bp DNA 단편을 PCR 반응물로부터 수득하였다. 이를 퀴아젠 PCR 정제 키트로 제조자의 프로토콜에 따라 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 SalI 및 ClaI으로 소화시키고, SalI-ClaI 절단 pBluescript SK (-) 벡터 내로 클로닝하여 플라스미드 "pYLPAT-5"를 생성하였다.
프라이머 LPAT-Re-3-1 및 LPAT-Re-3-2 (서열 400 및 401)를 이어서 사용하여 야로위아 리폴리티카 LPAAT1의 정지 코돈 직후에 903 bp 단편의 야로위아 리폴리티카 게놈을 함유한 938 bp 단편 YLPAT-3' (서열 402)을 상기와 동일한 조건으로 증폭하였다. 정제된 PCR 생성물을 ClaI 및 XhoI으로 소화시키고, ClaI-XhoI 소화 pYLPAT-5'내로 클로닝하였다. 정확한 형질전환체를 미니프렙 분석으로 확인하고, 생성된 플라스미드를 "pYLPAT-5'-3"'라고 칭하였다.
pMLPAT-17 (서열 190)을 이어서 ClaI 및 NotI로 소화시키고, 야로위아 리폴리티카 URA3 유전자, 야로위아 리폴리티카 FBAIN 프로모터 및 모르티에렐라 알피나 LPAAT2 유전자를 함유한 ~3.5 kb 단편을 퀴아젠 QiaexII 겔 정제 키트로 제조자의 프로토콜에 따라 단리하였다. 이 단편을 ClaI-NotI 소화 pYLPAT-5'-3' 내로 클로닝하였다. 정확한 형질전환체를 미니프렙 및 제한 분석에 의해 확인하였다. 생성된 플라스미드를 "pMLPAT-Int" (서열 191)라고 명명하였다.
"대조군" 벡터 pZUF-MOD-1 (서열 192, 도 18A)을 하기와 같이 제조하였다. 첫째, 프라이머 pzuf-mod1 및 pzuf-mod2 (서열 403 및 404)를 사용하며, pDNR-LIB (클론테크, 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 주형로서 사용하여 252 bp "스터퍼(stuffer)" DNA 단편을 증폭시켰다. 증폭시킨 단편을 퀴아젠 QiaQuick PCR 정제 키트로 정제하고, 표준 조건을 사용하여 NcoI 및 NotI로 소화시키고, 이어서 QiaQuick PCR 정제 키트로 다시 정제하였다. 이 단편을 유사하게 소화시킨 NcoI-/NotI-절단 pZUF17 벡터 (서열 162; 도 9B) 내로 라이게이션하고, 생성된 라이게이션 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 Top10 세포 (인비트로젠)를 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 4개의 생성된 콜로니로부터 퀴아젠 QiaPrep 스핀 미니프렙 키트로 정제하였다. 정제된 플라스미드를 NcoI 및 NotI로 소화시켜 -250 bp 단편의 존재를 확인하였다. 생성된 플라스미드를 "pZUF-MOD-1" (서열 192)이라고 명명하였다.
야로위아 리폴리티카 균주 Y2067U (실시예 13으로부터, EPA를 전체 지질의 14％로 생산함)를 플라스미드 pMLPAT-17, 플라스미드 pZUF-MOD-1 (대조군) 및 SpeI/XbaI 소화 플라스미드 pMLPAT-Int로 개별적으로 통상의 방법에 따라 형질전환시켰다. 형질전환체를 2일 동안 아미노산 보충 합성 MM에서, 이어서 4일 동안 HGM에서 성장시켰다. pZUF-MOD-1를 함유한 2개의 형질전환체, pMLPAT-17을 함유한 2개의 형질전환체, 및 pMLPAT-Int를 갖는 2개의 형질전환체 (게놈 내에 통함됨)의 지방산 프로파일을 (상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이) GC 분석에 기초하여 하기 표에 나타낸다. 지방산을 18:0, 18:1 (올레산), 18:2 (LA), GLA, DGLA, ARA, ETA 및 EPA로서 확인하고; 각각의 조성을 전체 지방산(％)으로서 나타낸다.
Figure 112007040393459-PCT00015
상기 입증한 바와 같이, pMLPAT-17로부터의 모르티에렐라 알피나 LPAAT2의 발현은 EPA(％)를 "대조군" 균주에서의 ~14％에서 15.5 내지 16％로 증가시켰다. 16.6 내지 17.3％로의 EPA의 추가 증가는 모르티에렐라 알피나 LPAAT2가 pMLPAT-Int를 사용하여 게놈 내로 통합되는 경우에 달성되었다. 추가 증가는 천연 야로위아 리폴리티카 LPAAT1 (서열 112 및 113) 및/또는 LPAAT2 (서열 115 및 116)가 예를 들어 균주 Y2067U + pMLPAT-Int에서 넉아웃 되는 경우에 예측될 것이다.
실시예 18
모르티에렐라 알피나 DGAT1 발현은 PUFA (％)를 증가시킨다.
본 실시예는 모르티에렐라 알피나 DGAT1 cDNA (서열 124)를 동시 발현하도록 형질전환된 야로위아 리폴리티카 균주 Y2067U (실시예 13)에서의 증가된 EPA 생합성 및 축적을 기재한다. Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 또는 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 통해 DHA를 생산하도록 유전자 조작된 야로위아 리폴리티카 숙주 균주는 모르티에렐라 알피나 DGAT1이 그에서 유사하게 동시 발현되는 경우에 (예컨대, 균주 Y3000에서) 증가된 DHA 생합성 및 축적을 입증할 수 있었음을 고려한다.
모르티에렐라 알피나 DGAT1 ORF를 하기와 같이 클로닝하였다. 첫째, cDNA의 클로닝을 돕기 위해, DGAT1의 제2 코돈의 서열을 'ACA'에서 'GCA'로 바꾸어 트레오닌에서 알라닌으로 아미노산을 변화시켰다. 모르티에렐라 알피나 DGAT1 ORF의 완전한 코딩 영역을 프라이머 MACAT-F1 및 MACAT-R (서열 405 및 406)로 증폭시켜 이를 달성하였다. 구체적으로, PCR 반응 혼합물은 프라이머 MACAT-F1 및 MACAT-R 각 20 μM 용액 1 ㎕, 모르티에렐라 알피나 cDNA (상기 참조, 실시예 16) 1 ㎕, 물 22 ㎕ 및 ExTaq 프리믹스 2X Taq PCR 용액 (다까라 바이오 인크, 일본 520-2193 시가현 오쯔 소재) 25 ㎕를 함유하였다. 증폭을 하기와 같이 수행하였다: 94℃에서 150초 동안 초기 변성, 이어서 94℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 90초 동안 신장의 30주기. 72℃에서 10분 동안의 최종 신장 주기를 수행한 후에, 반응을 4℃에서 종결하였다. ~1600 bp DNA 단편을 PCR 반응으로부터 수득하였다. 이를 퀴아젠 PCR 정제 키트로 제조자의 프로토콜에 따라 정제하였다.
모르티에렐라 알피나 DGAT1 ORF를 NcoI-NotI 소화 플라스미드 pZUF17 (서열 162; 도 9B) 내로 삽입하여 ORF를 FBAIN 프로모터 및 PEX20-3' 종결자 영역의 조절 하에 클로닝하였다. 그러나, DGAT1 ORF가 내부 NcoI 부위를 함유하였기 때문에, 클로닝을 위해 2개의 개별 제한 효소 소화를 수행하는 것이 요구되었다. 첫째, 정제된 PCR 생성물 ~2 ㎍을 BamHI 및 NcoI로 소화시켰다. 반응 혼합물은 총 부피 60 ㎕ 중에 20 U의 각 효소 (프로메가) 및 제한 완충제 D 6 ㎕를 함유하였다. 혼합물을 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. ~320 bp 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, 퀴아젠 QiaexII 겔 정제 키트로 정제하였다. 달리, NcoI를 NotI로 대체한 것 외에 상기와 동일한 반응 조건을 이용하여 정제된 PCR 생성물 ~2 ㎍을 BamHI 및 NotI로 소화시켰다. ~1280 bp 단편을 상기와 같이 단리하고, 정제하였다. 최종적으로, pZUF17 ~3 ㎍을 NcoI 및 NotI로 소화시키고, 상기와 같이 정제하하여, ~7 kB 단편을 생성하였다.
~7 kB NcoI/NotI pZUF17 단편, ~320 bp NcoI/BamHI DGAT1 단편 및 ~1280 bp BamHI/NotI DGAT1 단편을 함께 실온에서 밤새 인큐베이션하는 3-방식 라이게이션으로 라이게이션하였다. 라이게이션 혼합물은 총 부피 20 ㎕ 중에 7 kB 단편 100 ng, 및 320 bp 및 1280 bp 단편 각각 200 ng, 리가제 완충제 2 ㎕, 및 2 U T4 DNA 리가제 (프로메가)를 함유하였다. 라이게이션 생성물을 사용하여 이. 콜라이 Top10 화학 감응성 세포 (인비트로젠)를 제조자의 프로토콜에 따라 형질전환시켰다.
형질전환으로부터의 개개 콜로니 (총 12개)를 사용하여 미니프렙 분석을 위해 배양물에 접종하였다. 제한 지도분석 및 서열분석은 12개 중 5개 콜로니가 원하는 플라스미드를 가졌음을 보여주었으며, 이를 "pMDGAT1-17" (도 18B, 서열 193)이라고 명명하였다.
야로위아 리폴리티카 균주 Y2067U (실시예 13으부터)를 pMDGAT1-17 및 pZUF-MOD-1 (상기 참조, 실시예 17)로 통상의 방법에 따라 각각 형질전환시켰다. 형질전환체를 2일 동안 아미노산 보충 합성 MM에서, 이어서 4일 동안 HGM에서 성장시켰다. pMDGAT1-17을 함유한 2개의 형질전환체 및 pZUF-MOD-1을 함유한 2개의 형질전환체의 지방산 프로파일을 (상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이) GC 분석에 기초하여 하기 표 46에 나타낸다. 지방산을 18:0, 18:1 (올레산), 18:2 (LA), GLA, DGLA, ARA, ETA 및 EPA로서 확인하고; 각각의 조성을 총 지방산(％)으로서 나타낸다.
Figure 112007040393459-PCT00016
상기 입증한 바와 같이, 플라스미드 pMDGAT1-17로부터의 모르티에렐라 알피나 DGAT1의 발현은 EPA(％)를 "대조군" 균주에서의 ~13.3％에서 ~14.1％ ("Y2067U + pMDGAT1-17 #1") 및 ~15.1％ ("Y2067U + pMDGAT1-17 #2")로 각각 증가시켰다. EPA에서의 추가 증가는 천연 야로위아 리폴리티카 DGAT1 (서열 122 및 123)이 예를 들어 균주 Y2067U + pMDGAT1-17에서 넉아웃 되는 경우에 예측될 것이다.
실시예 19
모르티에렐라 알피나 DGAT2 발현은 PUFA (％)를 증가시킨다.
본 실시예는 모르티에렐라 알피나 DGAT2 cDNA (서열 136)를 동시 발현하도록 형질전환된 야로위아 리폴리티카 균주 Y2067U (실시예 13)에서의 증가된 EPA 생합성 및 축적을 기재한다. Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 또는 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 통해 DHA를 생산하도록 유전자 조작된 야로위아 리폴리티카 숙주 균주는 모르티에렐라 알피나 DGAT2가 그에서 유사하게 동시 발현되는 경우에 (예컨대, 균주 Y3000에서) 증가된 DHA 생합성 및 축적을 입증할 수 있었음을 고려한다.
모르티에렐라 알피나 DGAT2 ORF를 하기와 같이 플라스미드 pZUF17 내로 클로닝하였다. 첫째, ORF를 모르티에렐라 알피나 cDNA으로부터의 프라이머 MDGAT-F 및 MDGAT-R1 (서열 407 및 408) (상기 참조, 실시예 16)로 PCR-증폭시켰다. 예측된 1015 bp 단편을 단리하고, 정제하고, NcoI 및 NotI로 소화시키고, NcoI-NotI 절단 pZUF17 벡터 (서열 162; 도 9B) 내로 클로닝하여 유전자가 야로위아 리폴리티카 FBAIN 프로모터 및 PEX20-3' 종결자 영역의 조절 하에 놓이게 하였다. 정확한 형질전환체를 미니프렙 DNA의 제한 분석에 의해 확인하고, 생성된 플라스미드를 "pMDGAT2-17" (서열 194)이라고 칭하였다.
야로위아 리폴리티카 균주 Y2067U (실시예 13으부터)를 pMDGAT2-17 및 pZUF-MOD-1 (상기 참조, 실시예 17)로 통상의 방법에 따라 각각 형질전환시켰다. 형질전환체를 2일 동안 아미노산 보충 합성 MM에서, 이어서 4일 동안 HGM에서 성장시켰다. pMDGAT2-17을 함유한 2개의 형질전환체 및 pZUF-MOD-1을 함유한 2개의 형질전환체의 지방산 프로파일을 (상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이) GC 분석에 기초하여 하기에 나타낸다. 지방산을 18:0, 18:1 (올레산), 18:2 (LA), GLA, DGLA, ARA, ETA 및 EPA로서 확인하고; 각각의 조성을 총 지방산(％)으로서 나타낸다.
Figure 112007040393459-PCT00017
플라스미드 pMDGAT2-17로부터의 모르티에렐라 알피나 DGAT2의 발현은 EPA(％)를 "대조군" 균주에서의 ~13.3％에서 ~15.25％ ("Y2067U + pMDGAT2-17")로 증가시켰다. EPA에서의 추가 증가는 천연 야로위아 리폴리티카 DGAT2 (서열 130 내지 135)가 예를 들어 균주 Y2067U + pMDGAT2-17에서 넉아웃 되는 경우에 예측될 것이다.
실시예 20
모르티에렐라 알피나 GPAT 는 PUFA (％)를 증가시킨다.
본 실시예는 모르티에렐라 알피나 GPAT ORF (서열 138)를 동시 발현하도록 형질전환된 야로위아 리폴리티카 균주 Y2107U1 (실시예 14)에서의 증가된 DGLA 생합성 및 축적 (및 저하된 18:1의 양)을 기재한다. Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 또는 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 통해 DHA를 생산하도록 유전자 조작된 야로위아 리폴리티카 숙주 균주는 모르티에렐라 알피나 GPAT가 그에서 유사하게 동시 발현되는 경우에 (예컨대, 균주 Y3000에서) 증가된 DHA 생합성 및 축적을 입증할 수 있었음을 고려한다.
추정 PCR 프라이머를 사용하는 모르티에렐라 알피나 GPAT 의 동정
아스페르길루스 니둘란스 (진뱅크 관리 번호 EAA62242) 및 뉴로스포라 크라싸 (진뱅크 관리 번호 XP_325840)로부터의 GPAT의 서열을 기초로 하여, 하기 프라이머를 추정 PCR을 위해 디자인하였다:
MGPAT-N1 (서열 409) CCNCAYGCNAAYCARTTYGT
MGPAT-NR5 (서열 410) TTCCANGTNGCCATNTCRTC
[주의: 서열 409 및 410에 사용된 핵산 다의성 코드는 하기와 같음: R= A/G; Y=C/T; 및 N=A/C/T/G.]
PCR 증폭은 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) GeneAmp 9600 PCR 머신에서 다까라 ExTaq 프리믹스 Taq 폴리머라제 (다까라 바이오 인크., 일본 시가현 오쯔 소재)를 사용하여 수행하였다. 증폭을 하기와 같이 수행하였다: 94℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 90초 동안 신장의 30주기, 이어서 72℃에서 7분 동안의 최종 신장 주기.
~1.2 kB 단편을 수득하였다 (서열 140). 이 단편을 퀴아젠 QiaQuick PCR 정제 키트로 정제하고, TOPO® 클로닝 벡터 pCR2.1-TOPO (인비트로젠) 내로 클로닝하고, 서열결정하였다. 생성된 서열은 번역되는 경우에 BLAST 프로그램 분석에 기초하여 공지된 GPAT에 상동성을 가졌다.
1212 bp cDNA 단편의 서열에 기초하여, 모르티에렐라 알피나 GPAT의 5' 및 3' 말단 영역을 PCR 증폭 및 게놈 워킹 기술로 클로닝하였다. 이는 모르티에렐라 알피나 GPAT (서열 141)의 -1050 bp 내지 + 2885 bp 영역에 상응하는 콘티그를 어셈블리할 수 있다. 이 콘티그는 GPAT의 전체 코딩 영역 및 4개의 인트론 (서열 145, 146, 147 및 148)을 포함한다.
구체적으로, 실시예 16에 기재된 모르티에렐라 알피나 cDNA 샘플 (1 ㎕)을 GPAT의 3'-말단의 증폭을 위해 주형으로 사용하였다. MGPAT-5N1 (서열 411) 및 CDSIII/3' (서열 392)를 프라이머로서 사용하였다. PCR 증폭은 퍼킨 엘머 GeneAmp 9600 PCR 머신에서 다까라 ExTaq 프리믹스 Taq 폴리머라제 (다까라 바이오 인크., 일본 시가현 오쯔 소재)를 사용하여 수행하였다. 증폭을 하기와 같이 수행하였다: 94℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 120초 동안 신장의 30주기, 이어서 72℃에서 7분 동안의 최종 신장 주기.
PCR 생성물을 1:10으로 희석하고, 희석된 PCR 생성물 1 ㎕는 MGPAT-5N2 (서열 412) 및 CDSIII/3'를 프라이머로서 사용하는 제2회 증폭에 주형으로서 사용하였다. 조건은 상기와 정확하게 동일하였다. 제2회 PCR 생성물을 다시 1:10으로 희석하고, 희석된 PCR 생성물 1 ㎕는 MGPAT-5N3 (서열 413) 및 CDSIII/3'를 프라이머로서 사용하는 제3회 PCR의 주형으로서 사용하였다. PCR 조건은 다시 동일하였다.
~1 kB 단편을 제3회 PCR에서 생성하였다. 이 단편을 퀴아젠 PCR 정제 키트로 정제하고, 서열 분석을 위해 pCR2.1-TOPO 벡터 내로 클로닝하였다. 서열 분석으로부터의 결과는 이 965 bp 단편 (서열 142)이 GPAT 유전자의 3'-말단에 상응함을 보여주었다.
클론테크 유니버셜 게놈워커™ 키트를 사용하여 모르티에렐라 알피나 GPAT의 5'-말단 영역에 상응하는 게놈 DNA의 한 조각을 수득하였다. 간략하게 설명하면, 각 모르티에렐라 알피나 게놈 DNA 2.5 ㎍을 DraI, EcoRV, PvuII 또는 StuI로 개별적으로 소화시키고, 소화된 DNA 샘플을 퀴아젠 Qiaquick PCR 정제 키트로 정제하고, 각 키트 완충제 EB 30 ㎕로 용출시키고, 정제된 샘플을 이어서 하기 나타내는 게놈 워커 어댑터 (서열 414 [상부 가닥] 및 415 [하부 가닥])로 라이게이션하였다:
Figure 112007040393459-PCT00018
각각의 라이게이션 반응 혼합물은 25 μM 게놈 워커 어댑터 1.9 ㎕, 10X 라이게이션 완충제 1.6 ㎕, T4 DNA 리가제 0.5 ㎕ 및 정제된 소화 게놈 DNA 샘플 4 ㎕를 함유하였다. 반응 혼합물을 16℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 반응을 70℃에서 5분 동안 인큐베이션에 의해 종결하였다. 이어서, 10 mM TrisHCl 72 ㎕, 1 mM EDTA, pH 7.4 완충제를 각 라이게이션 반응 믹스에 첨가하였다.
4개 개별 PCR 반응을 수행하고, 이들 각각은 4개의 라이게이션 혼합물 중 하나를 주형으로서 사용하였다. PCR 반응 혼합물은 라이게이션 혼합물 1 ㎕, 20 μM MGPAT-5-1A (서열 416) 0.5 ㎕, 10 μM 키트 프라이머 AP1 (서열 417) 1 ㎕, 물 22.5 ㎕, 및 ExTaq 프리믹스 Taq 2X PCR 용액 (다까라) 25 ㎕를 함유하였다. PCR 반응은 하기 조건을 사용하는 32주기 동안 수행하였다: 94℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 180초 동안 신장. 72℃에서 7분 동안의 최종 신장 주기를 수행한 후에, 반응을 4℃에서 종결하였다.
각각의 PCR 반응의 생성물을 1:50으로 개별적으로 희석하고, 제2회 PCR의 주형으로서 사용하였다. 각각의 반응 혼합물은 주형으로서의 희석된 PCR 생성물 중 하나 1 ㎕, 20 μM MGPAT-3N1 (서열 418) 0.5 ㎕, 10 μM 키트 프라이머 AP2 (서열 419) 21 ㎕, 물 22.5 ㎕ 및 ExTaq 프리믹스 Taq 2X PCR 용액 (다까라) 25 ㎕를 함유하였다. PCR 반응을 상기한 바와 동일한 열순환기 조건으로 32주기 동안 수행하였다.
DNA 단편을 제2회 PCR로부터 수득하였다. 이 단편을 정제하고, pCR2.1-TOPO 내로 클로닝하고, 서열결정하였다. 서열 분석은 1908 bp 단편 (서열 143)이 모르티에렐라 알피나 GPAT 유전자의 5'-말단이었음을 보여주었다.
유사하게, 966 bp 단편 (서열 144)은 프라이머 MGPAT-5N1을 제1회 PCR에 대한 유전자 특이적 프라이머로서 사용하고, 프라이머 MGPAT-5N2를 제2회 PCR에 대한 유전자 특이적 프라이머로서 사용하는 것을 제외하고는 상기한 2개 회수의 게놈 워킹에 의해 수득하였다. 이 단편을 또한 정제하고, pCR2.1-TOPO 내로 클로닝하고, 서열결정하였다. 서열 분석은 이들이 GPAT 유전자의 부분을 함유함을 보여주었으나, 단편은 유전자의 말단까지 연장하기에 충분히 길지 않았다. 3' cDNA 서열 (서열 142)과의 비교는 ORF의 최종 171 bp가 함유되지 않았음을 보여주었다.
모르티에렐라 알피나로부터의 전장 GPAT 서열의 어셈블리
완전한 GPAT 유전자 (GPAT 번역 개시 'ATG' 코돈의 상류로 1050개 염기를 연장하고, GPAT 종결 코돈 너머로 22개 염기를 연장하는 영역을 포함함)를 함유한 3935 bp 서열 (서열 141)을 원래 부분적 cDNA 단편 (서열 140), 3' cDNA 단편 (서열 142), 내부 게놈 단편 (서열 144), 및 5' 게놈 단편 (서열 143)(상기함)(도 19에 도시함)의 서열로부터 어셈블리하였다. 이 영역에는 2151 bp GPAT ORF가 포함된다. 'ATG'에서 정지 코돈 TAG'로의 모르티에렐라 알피나 GPAT ORF의 완전한 뉴클레오티드 서열은 서열 138 (서열 141의 염기 1050 내지 2863에 상응함, 4개 인트론 (즉, 인트론 1 [서열 145], 서열 141의 염기 1195 내지 1469에 상응함; 인트론 2 [서열 146], 서열 141의 염기 1585 내지 1839에 상응함; 인트론 3 [서열 147], 서열 141의 염기 2795 내지 2877에 상응함 및 인트론 4 [서열 148], 서열 141의 염기 2940 내지 3038에 상응함)을 제외함)을 제공한다. 번역된 아미노산 서열 (서열 139)은 수많은 진균, 식물 및 동물 GPAT와 상동성을 보였다.
보다 구체적으로, 서열의 동일성을 BLAST (베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool); [Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1993)]) 검색을 수행하여 측정하였다. 본원에서 서열 139라고 기재한 아미노산 단편은 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis)의 추정적 GPAT의 단백질 서열 (진뱅크 관리 번호 EAK84237)과 47％ 동일성 및 65％ 유사성을 가지며, 기대값이 1e-152이고; 추가로, 서열 139는 아스페르길루스 푸미가투스의 GPAT (진뱅크 관리 번호 EAL20089)와 47％ 동일성 및 62％ 유사성을 가지며, 기대값이 1e-142이었다.
FBAIN :: MGPAT :: PEX20 -3' 키메라 유전자를 포함하는 플라스미드 pMGPAT -17의 구축
모르티에렐라 알피나 GPAT ORF를 하기와 같이 클로닝하였다. 프라이머 MGPAT-cDNA-5 및 MGPAT-cDNA-R (서열 420 및 421)을 사용하여 GPAT ORF를 모르티에렐라 알피나의 cDNA로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 반응 혼합물은 cDNA 1 ㎕, 각 프라이머 1 ㎕, 물 22 ㎕ 및 ExTaq 프리믹스 2X Taq PCR 용액 (다까라 바이오 인크., 일본 520-2193 시가현 오쯔 소재) 25 ㎕를 함유하였다. 증폭을 하기와 같이 수행하였다: 94℃에서 150초 동안 초기 변성, 이어서 94℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 120초 동안 신장의 30주기. 72℃에서 10분 동안의 최종 신장 주기를 수행한 후에, 반응을 4℃에서 종결하였다. ~2.2 kB DNA 단편을 PCR 반응으로부터 수득하였다. 이를 퀴아젠 PCR 정제 키트로 제조자의 프로토콜에 따라 정제하였다.
정제된 PCR 생성물을 BamHI 및 EcoRI로 소화시키고, ~470 bp 단편을 겔 아가로스 전기영동에 의해 단리하고, 퀴아젠 겔 정제 키트로 정제하였다. 별법으로, PCR 생성물을 또한 EcoRI 및 NotI로 절단하고, 1.69 kB 단편을 상기와 같이 단리하고, 정제하였다. 2개의 단편을 BamHI 및 NotI 절단 pZUF-MOD-1 벡터 (서열 192; 도 18A) 내로 라이게이션하여 유전자가 야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위한 자가-복제 벡터 중에서 야로위아 리폴리티카 FBAIN 프로모터 및 PEX20-3' 종결자 영역의 조절 하에 놓이게 하였다. 정확한 형질전환체를 미니프렙 DNA의 제한 분석에 의해 확인하고, 생성된 플라스미드를 "pMGPAT-17" (서열 195; 도 18C)이라고 칭하였다.
모르티에렐라 알피나 GPAT 를 과발현하는 형질전환체 야로위아 리폴리티카 중의 지질 조성의 분석
야로위아 리폴리티카 균주 Y2107U1 (실시예 14로부터)을 플라스미드 pMGPAT-17 및 플라스미드 pZUF-MOD-1 (상기 참조, 실시예 17)로 통상의 방법에 따라 각각 형질전환시켰다. 형질전환체를 2일 동안 아미노산 보충 합성 MM에서, 이어서 4일 동안 HGM에서 성장시켰다. pZUF-MOD-1을 함유한 2개의 형질전환체 및 pMGPAT-17을 함유한 4개의 형질전환체의 지방산 프로파일을 (상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이) GC 분석에 기초하여 하기 표에 나타낸다. 지방산을 18:0, 18:1 (올레산), 18:2 (LA), GLA, DGLA, ARA, ETA 및 EPA로서 확인하고; 각각의 조성을 총 지방산(％)으로서 나타낸다.
Figure 112007040393459-PCT00019
상기 입증한 바와 같이, pMGPAT-17로부터의 모르티에렐라 알피나 GPAT의 발현은 DGLA(％)를 "대조군" 균주에서의 ~2.5％에서 6.5％로 증가시켰다. 18:1의 수준은 ~23％에서 ~16％로 저하되었다. DGLA (또는 임의의 다른 하류 PUFA)에서의 추가 증가는 천연 야로위아 리폴리티카 GPAT가 pMGPAT-17을 발현하는 형질전환체 균주에서 넉아웃 되는 경우에 예측될 것이다.
실시예 21
모르티에렐라 알피나 지방산 엘론가제 " ELO3 "은 PUFA (％)를 증가시킨다.
본 실시예는 모르티에렐라 알피나 C16 /18 지방산 엘론가제 ("ELO3", 서열 86)를 동시 발현하도록 형질전환된 야로위아 리폴리티카 균주 Y2031 (실시예 7)에서 대조군 균주에 상대적으로 35％ 증가의 C18 지방산 (18:0, 18:1, 18:2 및 GLA) 및 31％ 저하의 C16 지방산을 기재한다. ELO3 (증가된 발현을 위해 임의로 코돈-최적화될 수 있음)이 원하는 PUFA, 즉 DHA의 생성을 증가시키기 위한 수단으로서 유전자 조작된 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 또는 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로 내로 탄소 플럭스를 가할 수 있음을 고려한다. 예를 들어, 이 C16 /18 지방산 엘론가제를 포함하는 키메라 유전자는 예를 들어, 균주 Y3000 내로 쉽게 도입될 수 있었다.
모르티에렐라 알피나 C 16 /18 지방산 엘론가제의 서열 확인
모르티에렐라 알피나 지방산 엘론가제의 부분을 코딩하는 cDNA 단편 (서열 88)을 9,984개 모르티에렐라 알피나 cDNA 서열 (실시예 16) 중에서 동정하였다. 이 단편은 수많은 지방산 엘론가제에 유의한 상동성을 가지고, 따라서 엘론가제로서 임시적으로 동정되었다.
서열 88이 가장 유사성을 갖는 서열을 요약한 BLAST 비교의 결과를 동일성(％), 유사성(％), 및 기대값에 따라 보고한다. 구체적으로, 서열 88의 번역된 아미노산 서열은 칸디다 알비칸스 SC5314 (진뱅크 관리 번호 EAL04510.1, 이는 사카로마이세스 세레비지애 EUR4, FEN1 및 ELO1과 유사한 3개의 잠재적인 지방산 엘론가제 유전자 중 하나로 본원에 주석을 달음)로부터의 잠재적인 지방산 엘론가제의 단백질 서열과 32％ 동일성 및 46％ 유사성을 가지며, 기대값이 4e-13이었다. 추가로, 서열 88은 사카로마이세스 세레비지애 (진뱅크 관리 번호 NC_001142, 염색체 X의 염기 67849 내지 68781)로부터의 ELO1과 35％ 동일성 및 53％ 유사성을 가졌다. 불포화 C12-C16 지방 아실-CoA에서 C16-C18 지방산으로의 카르복시-말단 신장을 촉매하는 배지-쇄 아실 엘론가제로서 사카로마이세스 세레비지애 ELO1을 기재한다.
상기 보고한 상동성을 기초하여, 서열 88의 야로위아 리폴리티카 유전자 생성물을 본원에서 "엘론가제 3" 또는 "ELO3"으로서 칭하였다.
부분적 지방산 엘론가제 cDNA 서열 (서열 88)의 분석은 5' 및 3'-말단이 모두 불완전하였음을 나타냈다. 모르티에렐라 알피나 ELO3의 누락된 3' 영역을 얻기 위해, 클론테크 유니버셜 게놈워커™ 키트를 사용하였다 (실시예 20에 기재함). 구체적으로, MA Elong 3'1 (서열 422) 및 AP1을 프라이머 (즉, 프라이머 MGPAT-5-1A 및 AP1 대신에)로서 사용한 것 외에는 4개의 라이게이션 혼합물의 동일한 세트를 제1회의 PCR에 이전에 기재한 동일한 성분 및 조건으로 사용하였다. 제2회의 PCR은 MA Elong 3'2 (서열 423) 및 AP2를 프라이머로서 사용하였다. 1042 bp DNA 단편을 제2회의 PCR로부터 수득하였다 (서열 89). 이 단편을 정제하고, pCR2.1-TOPO 내로 클로닝하고, 서열결정하였다. 서열 분석은 단편이 유전자의 'TAA' 정지 코돈의 ~640 bp 하류를 포함하는 ELO3의 3'-말단을 함유하였음을 보여주었다.
클론테크 3'-말단 RACE (상기 참조)에 사용된 4개의 라이게이션 혼합물의 동일한 세트를 또한 사용하여 모르티에렐라 알피나 ELO3의 5'-말단 영역을 수득하였다. 구체적으로, MA Elong 5'1 (서열 424, 5' 말단에 존재) 및 AP1을 프라이머 (즉, 프라이머 MA Elong 3'1 및 AP1 대신에)로서 사용한 것 외에는 제1회의 PCR을 상기한 동일한 성분 및 조건으로 수행하였다. 제2회의 PCR은 MA Elong 5'2 (서열 425, 5' 말단에 존재) 및 AP2를 프라이머로서 사용하였다. 2223 bp DNA 단편 (서열 90)을 수득하였다. 이를 정제하고, pCR2.1-TOPO 내로 클로닝하고, 서열결정하였다. 서열 분석은 단편이 ELO3 유전자의 5'-영역을 함유하였음을 보여주었다.
따라서, 모르티에렐라 알피나 ELO3 (서열 91)의 전체 cDNA 서열은 원래 부분적 cDNA 서열 (서열 88)을 게놈 워킹 (서열 90 및 89, 각각 도 20에 도시함)에 의해 수득한 중복 5' 및 3' 서열과 합하여 수득하였다. 이로써 ELO3의 추정적 'ATG' 번역 개시 코돈의 상류 2091 bp; ELO3 ORF 828 bp (즉, 서열 86, 서열 91의 염기 2092 내지 2919에 상응함); 및 ELO3 정지 코돈의 하류 638 bp (서열 91의 염기 2920 내지 3557에 상응함)를 포함하는, 본원에서 서열 91로서 동정된 3557 bp 서열을 수득하였다.
모르티에렐라 알피나 ELO3의 상응하는 게놈 서열은 서열 91로서 제공된 cDNA 단편보다 길다. 구체적으로, 542 bp 인트론 (서열 92)을 ORF의 318 bp에서 ELO3 유전자를 함유한 게놈 DNA에서 발견하였으며; 따라서, 본원에서 서열 93으로서 제공된 게놈 DNA 단편은 4,099 bp이다 (도 20).
번역된 ELO3 단백질 서열 (서열 87)은 BLAST 프로그램 분석에 기초하여 하기 상동성을 가졌다: 칸디다 알비칸스 SC5314로부터의 잠재적인 지방산 엘론가제 (진뱅크 관리 번호 EAL04510.1)와의 37％ 동일성 및 51％ 유사성, 기대값 4e-43. 추가로, 번역된 ELO3은 뉴로스포라 크라싸로부터의 XP_331368 ("가상 단백질"로서 본원에 주석을 달음)의 단백질 서열과 33％ 동일성 및 44％ 유사성을 공유하며, 기대값이 3e-44이었다.
FBAIN :: ELO3 :: PEX16 -3' 키메라 유전자를 포함하는 플라스미드 pZUF6S - E3WT 의 구축
모르티에렐라 알피나 지방산 ELO3 ORF를 하기와 같이 클로닝하였다. 프라이머 MA Elong 5' NcoI 3 및 MA Elong 3' NotI (서열 426 및 427)을 사용하여 ELO3 ORF를 모르티에렐라 알피나의 cDNA (실시예 16)로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 반응 혼합물은 cDNA 1 ㎕, 각 프라이머 1 ㎕, 물 22 ㎕ 및 ExTaq 프리믹스 2X Taq PCR 용액 (다까라) 25 ㎕를 함유하였다. 증폭을 하기와 같이 수행하였다: 94℃에서 30초 동안 초기 변성, 이어서 94℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 120초 동안 신장의 32 주기. 72℃에서 7분 동안의 최종 신장 주기를 수행하고, 이어서 4℃에서 반응을 종결하였다. ~830 bp DNA 단편을 PCR 반응으로부터 수득하였다. 이를 퀴아젠 (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재) PCR 정제 키트로 제조자의 프로토콜에 따라 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 2개 분취액으로 나누었으며, 여기서 하나는 NcoI 및 NspI로 소화시키는 반면에, 다른 하나는 NspI 및 NotI로 소화시켰다. ~270 bp NcoI-NspI 및 ~560 bp NspI-NotI 단편을 NcoI-NotI 절단 pZF5T-PPC 벡터 (도 13B, 서열 170) 내로 3-조각 라이게이션에 의해 클로닝하여 유전자가 야로위아 리폴리티카에서의 발현을 위한 자가-복제 벡터 중에서 야로위아 리폴리티카 FBAIN 프로모터 및 PEX16-3' 종결자 영역 (진뱅크 관리 번호 U75433)의 조절 하에 놓이게 하였다. 정확한 형질전환체를 미니프렙 분석에 의해 확인하고, 생성된 플라스미드를 "pZF5T-PPC-E3" (서열 196)이라고 칭하였다.
플라스미드 pZF5T-PPC-E3을 ClaI 및 PacI로 소화시키고, ~2.2 kB 밴드 (즉, FBAIN::ELO3::PEX16-3' 단편)를 아가로스 겔로부터 퀴아젠 겔 추출 키트로 정제하였다. 상기 단편을 Pex20-3' 종결자와 FBAIN 프로모터의 조절 하의 모르티에렐라 알피나 Δ6 데새투라제 ORF ("D6S"; 진뱅크 관리 번호 AF465281) (즉, FBAIN::D6S::Pex20 키메라 유전자) 및 Ura3 유전자를 함유한 자가-복제 플라스미드인 ClaI-PacI 절단 pZUF6S (도 21A, 서열 197) 내로 클로닝하였다. 정확한 형질전환체를 미니프렙 분석에 의해 확인하고, 생성된 플라스미드를 "pZUF6S-E3WT" (도 21B, 서열 198)라고 칭하였다.
모르티에렐라 알피나 ELO3 을 과발현하는 형질전환체 야로위아 리폴리티카 중의 지질 조성의 분석
야로위아 리폴리티카 균주 Y2031 (실시예 7)을 플라스미드 pZUF6S (대조군, FBAIN::D6S::Pex20 키메라 유전자 포함) 및 플라스미드 pZUF6S-E3WT (FBAIN::D6S::Pex20 키메라 유전자 및 FBAIN::ELO3::PEX16 키메라 유전자 포함)로 통상의 방법에 따라 형질전환시켰다. 형질전환체를 2일 동안 아미노산 보충 합성 MM에서, 이어서 4일 동안 HGM에서 성장시켰다. pZUF6S를 함유한 6개의 클론 (클론 #1-6, 단일 형질전환으로부터) 및 pZUF6S-E3WT를 함유한 22개의 클론 (4개의 상이한 형질전환 [즉, #3, 5, 6, 및 7]으로부터)의 지방산 프로파일을 (상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이) GC 분석에 기초하여 하기 표 49에 나타낸다. 지방산을 16:0 (팔미테이트), 16:1 (팔미트올레산), 18:0, 18:1 (올레산), 18:2 (LA) 및 GLA로서 확인하고; 각각의 조성을 총 지방산(％)으로서 나타낸다.
Figure 112007040393459-PCT00020
일부 샘플 (볼드체 및 이탤릭체로 표기함)은 예측 판독에서 벗어났다. 구체적으로, Y2031+pZUF6S-E3WT #3-3 또는 Y2031+pZUF6S-E3WT #5-6은 GLA를 생산하지 않았다. 유사하게, Y2031+pZUF6S-E3WT #7-1, #7-3 및 #7-4는 GC 에러를 가졌으며, 여기서 16:0 및 16:1 피크는 GC에 의해 단일 피크로서 판독되었다. 이들 상이한 결과로서, 표 50은 대조군 및 ELO3을 발현하는 형질전환체 균주에서의 평균 지질을 보고한다. 구체적으로, 표 50은 표 49에 부정확 것인 볼드체 및 이탤릭체로 나타낸 줄을 이들 평균 계산 시 포함하지 않은채 표 49에서의 지방산 프로파일로부터의 평균을 나타낸다. "총 C16"은 16:0 및 16:1의 평균 면적의 합을 나타내고, "총 C18"은 18:0, 18:1, 18:2 및 GLA의 평균 면적의 합을 반영한다.
Figure 112007040393459-PCT00021
상기 보고한 데이타를 기초하여, 모르티에렐라 알피나 ELO3의 과발현은 모르티에렐라 알피나 Δ6 데새투라제만을 과발현하는 Y2031의 대조군 균주에 상대적으로 야로위아 리폴리티카 균주 Y2031에서 모르티에렐라 알피나 Δ6 데새투라제와 동시 발현하는 경우에 C18(％)을 증가시키고, C16(％)을 저하시켰다. 이는 모르티에렐라 알피나 ELO3이 실제로 C16 /18 지방산 엘론가제이었음을 나타냈다.
실시예 22
야로위아 C 16 /18 지방산 엘론가제 " YE2 "는 PUFA (％)를 증가시킨다
본 실시예는 야로위아 리폴리티카 C16 /18 지방산 엘론가제 ("YE2", 서열 94)를 동시 발현하도록 형질전환된 야로위아 리폴리티카 균주 Y2031 (실시예 7)에서 증가된 GLA 생합성 및 축적을 기재한다. YE2 엘론가제가 원하는 PUFA, 즉 DHA의 생성을 증가시키기 위한 수단으로서 유전자 조작된 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 또는 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로 내로 탄소 플럭스를 가할 수 있음을 고려한다. 예를 들어, 이 C16 /18 지방산 엘론가제를 포함하는 키메라 유전자는 예를 들어, 균주 Y3000 내로 쉽게 도입될 수 있었다.
야로위아 리폴리티카 C 16 /18 지방산 엘론가제의 서열 확인
야로위아 리폴리티카로부터의 신규 지방산 엘론가제 후보는 래트 Elo2 C16/18 지방산 엘론가제 단백질 서열 (진뱅크 관리 번호 AB071986, 서열 84)을 조회 서열로서 사용하는 서열 비교에 의해 동정하였다. 구체적으로, 이 rElo2 조회 서열을 사용하여 진뱅크 및 "효모 프로젝트 게놀레부레스"의 공개 야로위아 리폴리티카 단백질 데이타베이스 (프랑스 탈렌스 세덱스 LaBRI 바이오인포르마틱스 센터) (또한, 문헌 [Dujon, B. et al., Nature 430 (6995):35-44 (2004)] 참조)를 조사하였다. 이로써 "무명의 단백질 생성물"로서 주석을 달은 상동성 서열인 진뱅크 관리 번호 CAG77901 (서열 94 및 95)을 동정하였다. 이 유전자를 YE2라고 칭하였다.
BLAST 알고리즘 (문헌 [Altschul, S. F., et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)] 참조)을 사용해 야로위아 YE2 아미노산 서열을 공개 데이타베이스와 비교하여 가장 유사한 공지 아미노산 서열이 칸디다 알비칸스 SC5314 (서열 96, 진뱅크 관리 번호 EAL04510)의 것 (가능한 지방산 엘론가제로서 주석을 달음)임을 밝혀냈다. 상기 단백질들은 약 40％ 동일성을 공유하고, 스코어가 236이며, E 값은 7e-61이었다.
야로위아 YE2 유전자의 단리
YE2 유전자의 코딩 영역은 야로위아 게놈 DNA를 주형으로서 사용하고, 올리고뉴클레오티드 YL597 및 YL598 (서열 428 및 429)을 프라이머로서 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 반응을 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이 총 부피 50 ㎕로 수행하였다. 열순환기 조건은 95℃에서 1분 동안, 56℃에서 30초 동안, 72℃에서 1분 동안의 35주기, 이어서 72℃에서 10분 동안의 최종 신장으로 설정하였다. YE2 코딩 영역의 PCR 생성물을 정제하고, NcoI/NotI로 소화시키고, 이어서 NcoI/NotI 소화 pZKUGPYE1-N (하기 참조, 실시예 23; 또한 도 21C, 서열 199 참조)와 라이게이션하여 pZKUGPYE2 (도 21D, 서열 200)를 생성하였다. 'ATG' 번역 개시 코돈 주변의 NcoI 부위의 첨가는 YE2의 제2 아미노산을 L에서 V로 변화시켰다.
pZKUGPYE2의 ClaI/NotI 단편 (GPAT 프로모터 및 YE2 코딩 영역 함유) 및 Aco 종결자를 함유하는 NotI/PacI 단편 (ACO 3' 종결자를 프라이머 YL325 및 YL326 [서열 430 및 431]으로 PCR 증폭시키고, 이어서 NotI/PacI로 소화시켜 제조함)을 ClaI/PacI 소화 벡터 pZUF6S와 정해진 방향으로 라이게이션하여 pZUF6YE2를 생산하였다. pZKUT16의 ClaI/NcoI 단편 (TEF 프로모터 함유) 및 pZUF6YE2의 NcoI/PacI 단편 (YE2의 코딩 영역 및 Aco 종결자 함유)을 이후 ClaI/PacI 소화 벡터 pZUF6S와 정해진 방향으로 라이게이션하여 pZUF6TYE2 (서열 201)를 생산하였다.
YE2 를 과발현하는 형질전환체 야로위아 리폴리티카 중의 지질 조성의 분석
플라스미드 pZUF6S (도 21A, 서열 197) 및 pZUF6TYE2 (서열 201)를 사용하여 야로위아 균주 Y2031을 따로 형질전환시켰다. 이들 2개 플라스미드의 성분을 표 51 및 52에 기재한다.
플라스미드 pZUF6S (서열 197)의 기재
서열 197 중의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
EcoRI/ClaI (3114-4510) 야로위아 자율 복제 서열 18 (ARS18; 진뱅크 관리 번호 M91600)
SalI/PacI (6022-4530) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
EcoRI/BsiWI (6063-318) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·Δ6S: 코돈-최적화된 Δ6 데새투라제 유전자 (서열 3) (모르티에렐라 알피나 (진뱅크 관리 번호 AF465281)에서 유래됨) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자 (진뱅크 관리 번호 AF054613)로부터의 Pex20 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::Δ6S::Pex20
플라스미드 pZUF6TYE2 (서열 201)의 기재
서열 201 중의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
EcoRI/ClaI (7461-8857) 야로위아 자율 복제 서열 18 (ARS18; 진뱅크 관리 번호M91600)
SalI/PacI (1907-415) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
EcoRl/BsiWI (1948-4665) FBAIN::Δ6S::Pex20: pZUF6에 기재된 바와 같음 (상기 참조)
ClaI/PacI (8857 -415) ·TEF: TEF 프로모터 (진뱅크 관리 번호 AF054508) ·YE2: 야로위아 YE2 유전자 (서열 94; 진뱅크 관리 번호 CAG77901)의 코딩 영역 ·Aco: 야로위아 Aco3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJOO1301)의 Aco3 종결자 서열 을 포함하는 TEF::YE2::Aco
야로위아 리폴리티카 균주 Y2031 (실시예 7)을 플라스미드 pZUF6S (대조군) 및 플라스미드 pZUF6TYE2로 통상의 방법에 따라 형질전환시켰다. 형질전환체를 2일 동안 액체 MM에서 성장시켰다. pZUF6S 또는 pZUF6YE2를 각각 함유한 8개 콜로니의 지방산 프로파일을 (상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이) GC 분석에 기초하여 하기 표 53에 나타낸다. 지방산을 16:0 (팔미테이트), 16:1 (팔미트올레산), 18:0, 18:1 (올레산), 18:2 (LA) 및 GLA로서 확인하고; 각각의 조성을 총 지방산(％)으로서 나타낸다.
Figure 112007040393459-PCT00022
GC 분석은 pZUF6S를 갖는 Y2031 형질전환체에서 생산된 것이 총 지질의 약 27.1％ C16 (C16:0 및 C16:1) 및 62.2％ C18 (C18:0, C18:1, C18:2 및 GLA)임을 보여주었으며; pZUF6TYE2를 갖는 Y2031 형질전환체에서는 약 21.3％ C16 및 73.6％ C18이 생산되었다. 따라서, pZUF6TYE2 형질전환체에서 (pZUF6S를 갖는 형질전환체에 비해) C16의 총량은 약 21.4％ 저하되었고, C18의 총량은 약 18％ 증가되었다. 이들 데이타는 YE2가 C16 /18 지방산 엘론가제로서 기능하여 야로위아에서 C18 지방산을 생산한다는 것을 입증하였다. 추가로, pZUF6S 형질전환체에서 생산되는 GLA에 상대적으로 pZUF6TYE2 형질전환체에서 약 12.8％ GLA를 더 생산하였다. 이들 데이타는 YE2 엘론가제가 탄소 플럭스를 유전자 조작된 PUFA 경로 내로 가하여 최종 생성물 (즉, GLA)을 더 생산할 수 있었음을 제안하였다.
실시예 23
야로위아 C 14 /16 지방산 엘론가제 " YE1 "이 PUFA (％)를 증가시킨다.
본 실시예는 야로위아 리폴리티카 C14 /16 지방산 엘론가제 ("YE1", 서열 97)를 동시 발현하도록 형질전환된 야로위아 리폴리티카 균주 Y2031 (실시예 7)에서의 증가된 GLA 생합성 및 축적을 기재한다. YE1 엘론가제가 원하는 PUFA, 즉 DHA의 생성을 증가시키기 위한 수단으로서 유전자 조작된 Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 또는 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로 내로 탄소 플럭스를 가할 수 있음을 고려한다. 구체적으로, 이 C14 /16 지방산 엘론가제를 포함하는 키메라 유전자는 예를 들어, 균주 Y3000 내로 쉽게 도입될 수 있었다.
야로위아 리폴리티카 C 14 /16 지방산 엘론가제의 서열 확인
야로위아 리폴리티카로부터의 신규 지방산 엘론가제 후보는 실시예 22에서 사용한 것과 유사한 방식으로 래트 Elo2 C16/18 지방산 엘론가제 단백질 서열 (진뱅크 관리 번호 AB071986, 서열 84)을 조회 서열로서 사용하는 서열 비교에 의해 동정하였다. 이로써 "무명의 단백질 생성물"로서 주석을 달은 상동성 서열인 진뱅크 관리 번호 CAG83378 (서열 97 및 98)을 동정하였다. 이 유전자를 "YE1"이라고 칭하였다.
BLAST 알고리즘 (문헌 [Altschul, S. F., et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)] 참조)을 사용해 야로위아 YE1 아미노산 서열을 공개 데이타베이스와 비교하여 가장 유사한 공지 서열이 뉴로스포라 크라싸로부터의 FEN1 (진뱅크 관리 번호 CAD70918, 서열 99)(YE1과 약 60％ 동일성을 갖는 가능한 지방산 엘론가제)임을 밝혀냈다.
야로위아 YE1 유전자의 단리
YE1 유전자 (서열 97)의 DNA 서열은 내부 NcoI 부위를 보유한다. 야로위아 번역 모티프를 YE1 유전자의 'ATG' 번역 개시 코돈 주변에 혼입하기 위해 2-단계 전략을 사용하여 야로위아로부터의 전체 YE1 유전자를 PCR하였다. 구체적으로, 야로위아 게놈 DNA를 주형으로서 사용하여, YE1의 제1 절반은 올리고뉴클레오티드 YL567 및 YL568 (서열 432 및 433)을 프라이머로서 사용하는 PCR에 의해 증폭시키는 반면에, YE1 유전자의 제2 절반은 올리고뉴클레오티드 YL569 및 YL570 (서열 434 및 435)을 프라이머로서 유사하게 사용하여 증폭시켰다. PCR 반응을 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이 총 부피 50 ㎕로 수행하였다. 열순환기 조건은 95℃에서 1분 동안, 56℃에서 30초 동안, 72℃에서 1분 동안의 35주기, 이어서 72℃에서 10분 동안의 최종 신장으로 설정하였다. YE1의 5' 부분에 상응하는 PCR 생성물을 정제하고, 이어서 NcoI 및 SacI로 소화시켜 YE1-1 단편을 수득한 반면에, YE1의 3' 부분의 PCR 생성물을 정제하고, SacI 및 NotI로 소화시켜 YE1-2 단편을 수득하였다. YE1-1 및 YE1-2 단편을 NcoI/NotI 소화 pZKUGPE1S (상기 참조, 실시예 14)와 직접 라이게이션하여 pZKUGPYE1 (도 22A, 서열 202)를 생성하였다. YE1의 내부 NcoI 부위는 이어서 pZKUGPYE1을 주형으로서 사용하고 올리고뉴클레오티드 YL571 및 YL572 (서열 436 및 437)를 프라이머로서 사용하는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 돌연변이시킴으로써 pZKUGPYE1-N (서열 199)을 생성하였다. 서열 분석은 돌연변이가 YE1의 아미노산 서열을 변화시키지 않았음을 보여주었다. ATG 번역 개시 코돈 주변의 NcoI 부위의 첨가는 YE1의 제2 아미노산을 S에서 A로 변화시켰다.
pZF5T-PPC의 ClaI/NcoI 단편 (FBAIN 프로모터 함유) 및 pZKUGPYE1-N의 NcoI/PacI 단편 (YE1의 코딩 영역 및 Aco 종결자 함유)을 ClaI/PacI 소화 벡터 pZUF6S와 정해진 방향으로 라이게이션하여 pZUF6FYE1 (서열 203)을 생산하였다.
YE1 을 과발현하는 형질전환체 야로위아 리폴리티카 중의 지질 조성의 분석
플라스미드 pZUF6S 및 pZUF6FYE1 (서열 203)을 사용하여 야로위아 균주 Y2031 (실시예 7로부터)을 통상의 방법에 따라 따로 형질전환시켰다. 대조군 플라스미드 pZUF6S (도 21A, 서열 197; FBAIN::D6S::Pex20 키메라 유전자 포함)의 성분을 실시예 22에 기재한다. pZUF6FYE1 (도 22B, 서열 203, FBAIN::D6S::Pex20 키메라 유전자 및 FBAIN::YE1::Aco 키메라 유전자 포함)의 성분을 하기 표 54에 기재한다.
플라스미드 pZUF6FYE1 (서열 203)의 기재
서열 203 중의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
EcoRI/ClaI (7047-8445) 야로위아 자율 복제 서열 18 (ARS18; 진뱅크 관리 번호 M91600)
SalI/PacI (1493-1) 야로위아 Ura3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ306421)
EcoRI/BsiWI (1534-4251 ) FBAIN::Δ6S::Pex20: pZUF6에 기재된 바와 같음 (상기 참조, 실시예 22)
ClaI/PacI (8443-1) ·FBAIN: FBAIN 프로모터 (서열 214) ·YE1: 야로위아 YE1 유전자 (서열 97; 진뱅크 관리 번호 CAG83378)의 코딩 영역 ·Aco: 야로위아 Aco3 유전자 (진뱅크 관리 번호 AJ001301)로부터의 Aco3 종결자 서열 을 포함하는 FBAIN::YE1::Aco
형질전환 후, 형질전환체를 2일 동안 아미노산 보충 합성 MM에서, 이어서 4일 동안 HGM에서 성장시켰다. pZUF6S를 함유한 6개 클론 및 pZUF6FYE1을 함유한 5개 클론의 지방산 프로파일을 (상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이) GC 분석에 기초하여 하기 표 55에 나타낸다. 지방산을 16:0 (팔미테이트), 16:1 (팔미트올레산), 18:0, 18:1 (올레산), 18:2 (LA) 및 GLA로서 확인하고; 각각의 조성을 총 지방산(％)으로서 나타낸다.
Figure 112007040393459-PCT00023
GC 분석은 pZUF6S를 갖는 Y2031 형질전환체에서 생산된 것이 총 지질의 약 31.1％ C16 (C16:0 + C16:1)임을 측정한 반면에, pZUF6FYE1을 갖는 Y2031 형질전환체에서는 약 39.6％ C16이 생산되었다. pZUF6S를 갖는 형질전환체에 비해 pZUF6FYE1 형질전환체에서 C16의 총량은 약 26.7％ 증가되었다. 따라서, 이들 데이타는 YE1이 C14 /16 지방산 엘론가제로서 기능하여 야로위아에서 C16 지방산을 생산한다는 것을 입증하였다. 추가로, pZUF6S 형질전환체에서보다 pZUF6FYE1 형질전환체에서 57％의 GLA를 더 생산하였으며, 이는 YE1 엘론가제가 탄소 플럭스를 유전자 조작된 경로 내로 가하여 최종 생성물 (즉, GLA)을 더 생산할 수 있었음을 제안하였다.
실시예 24
야로위아 리폴리티카 CPT1 과발현은 PUFA (％)를 증가시킨다.
본 실시예는 야로위아 리폴리티카 CPT1 cDNA (서열 150)를 과발현하도록 형질전환된 야로위아 리폴리티카 균주 Y2067U (실시예 13)에서 증가된 EPA 생합성 및 축적을 기재한다. EPA의 합성을 유도하는 PUFA가 또한 증가하였다. Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 또는 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 통해 DHA를 생산하도록 유전자 조작된 야로위아 리폴리티카 숙주 균주가, 야로위아 리폴리티카 CPT1이 유사하게 동시 발현되는 경우에 (예컨대, 균주 Y3000에서) 증가된 DHA 생합성 및 축적을 입증할 수 있었음을 고려한다.
야로위아 리폴리티카 균주 ATCC #20326 cDNA를 하기 절차로 제조하였다. 세포를 YPD 배지 (2％ 박토-효모 추출물, 3％ 박토르-펩톤, 2％ 글루코스) 200 mL에 1일 동안 30℃에서 성장시키고, 이어서 3750 rpm에서의 벡크만 GH3.8 로터에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화하고, HGM으로 2회 세척하였다. 세척된 세포를 HGM 200 mL에 재현탁하고, 추가 4시간 동안 30℃에서 성장시켰다. 이어서, 세포를 3750 rpm에서 10분 동안 4 x 50 mL 튜브 중에서 원심분리하여 수확하였다.
총 RNA를 퀴아젠 RNeasy 총 RNA 미디 키트로 단리하였다. 세포를 파괴하기 위해, 수확된 세포를 키트 완충제 RLT (제조자에 의해 지정된 바와 같이 β-머캅토에탄올을 보충함) 4 X 600 ㎕에 재현탁하고, 4개의 2 mL 스크루캡 튜브 중에서 동일한 부피의 0.5 mm 유리 비드와 혼합하였다. 바이오스펙 미니 비드 비터를 사용하여 2분 동안 균질화 셋팅에서 세포를 파괴하였다. 추가의 완충제 RLT 4 x 600 ㎕를 첨가하였다. 유리 비드 및 세포 파편을 원심분리로 제거하고, 상등액을 사용하여 총 RNA를 제조자의 프로토콜에 따라 단리하였다.
폴리A(+)RNA를 상기 총 RNA 샘플로부터 퀴아젠 올리고텍스 mRNA 정제 키트로 제조자의 프로토콜에 따라 단리하였다. 단리된 폴리A(+)RNA는 동일한 키트를 사용하여 추가로 1회 정제하여 mRNA 샘플의 순도를 보장하였다. 최종 정제된 폴리(A)+RNA의 농도는 30.4 ng/㎕이었다.
제1 가닥 cDNA 합성을 위해 사용되는 PCR 열순환기 조건을 20초 동안 95℃, 이어서 5초 동안 95℃ 및 6분 동안 68℃의 20주기로 설정하는 것 외에 실시예 16에 기재한 바와 같이 BD-클론테크 및 폴리A(+) RNA 샘플 0.1 ㎍로 정해진 LD-PCR 방법으로 cDNA를 생성하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색으로 정량하였다.
야로위아 리폴리티카 CPT1 cDNA를 하기와 같이 클로닝하였다. 프라이머 CPT1-5'-NcoI 및 CPT1-3'-NotI (서열 438 및 439)를 사용하여 야로위아 리폴리티카의 cDNA로부터 야로위아 리폴리티카 ORF를 PCR에 의해 증폭시켰다. 반응 혼합물은 cDNA 0.5 ㎕, 각 프라이머 0.5 ㎕, 물 11 ㎕ 및 ExTaq 프리믹스 2X Taq PCR 용액 (다까라 바이오 인크., 일본 520-2193 시가현 오쯔 소재) 12.5 ㎕를 함유하였다. 증폭을 하기와 같이 수행하였다: 94℃에서 300초 동안 초기 변성, 이어서 94℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 60초 동안 신장의 30주기. 72℃에서 10분 동안의 최종 신장 주기를 수행한 후에, 반응을 4℃에서 종결하였다. ~1190 bp DNA 단편을 PCR 반응으로부터 수득하였다. 이를 퀴아젠 PCR 정제 키트로 제조자의 프로토콜에 따라 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 NcoI 및 NotI로 소화시키고, NcoI-NotI 절단 pZUF17 벡터 (서열 162; 도 9B) 내로 클로닝하여 유전자가 야로위아 리폴리티카 FBAIN 프로모터 및 PEX20-3' 종결자 영역의 조절 하에 놓이게 하였다. 정확한 형질전환체를 미니프렙 분석에 의해 확인하고, 생성된 플라스미드를 "pYCPT1-17" (서열 204)이라고 칭하였다.
키메라 FBAIN::CPT1::PEX20 유전자를 야로위아 리폴리티카의 게놈 내로 통합하기 위해, pYCPT1-17을 NcoI 및 NotI로 소화시키고, CPT1 ORF를 함유한 ~1190 bp 단편을 단리함으로써 플라스미드 pYCPT1-ZP217을 생성하였다. 이 단편을 이어서 NcoI 및 NotI로 소화시킨 pZP217 + Ura (서열 205) 내로 클로닝하였다. 도 22C에 나타난 바와 같이, 플라스미드 pZP217 + Ura는 키메라 TEF::합성 Δ17 데새투라제 (야로위아 리폴리티카에 코돈-최적화됨)::Pex20-3' 유전자 및 Ura3 유전자 (선별가능한 마커로서 사용하기 위함)를 포함하는 야로위아 리폴리티카 통합 플라스미드이다. 정확한 형질전환체를 미니프렙 분석에 의해 확인하고, 생성된 플라스미드를 "pYCPT1-ZP217" (서열 206)이라고 칭하였다.
야로위아 리폴리티카 균주 Y2067U (실시예 13으로부터)를 BssHII/Bbul 소화 pYCPT1-ZP217 및 pZUF-MOD-1 (상기 참조, 실시예 7)로 통상의 방법에 따라 각각 형질전환시켰다. 형질전환체를 2일 동안 아미노산 보충 합성 MM에서, 이어서 4일 동안 HGM에서 성장시켰다. pZUF-MOD-1을 함유한 2개의 형질전환체 및 pYCPT1-ZP217을 함유한 4개의 형질전환체 (게놈 내에 통합됨)의 지방산 프로파일을 (상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이) GC 분석에 기초하여 하기 표에 나타낸다. 지방산을 18:0, 18:1 (올레산), 18:2 (LA), GLA, DGLA, ARA, ETA 및 EPA로서 확인하고; 각각의 조성을 총 지방산(％)으로서 나타낸다.
Figure 112007040393459-PCT00024
상기 나타낸 바와 같이, 게놈 통합에 의한 강력한 FBAIN 프로모터 조절 하의 야로위아 리폴리티카 CPT1의 발현은 EPA(％)를 대조군" 균주에서의 13.4％에서 15.7 내지 16％로 증가시켰다. 추가로, GLA, DGLA 및 ARA 수준을 또한 증가시켰다.
실시예 25
사카로마이세스 세레비지애 ISC1 은 PUFA (％)를 증가시킨다.
본 실시예는 사카로마이세스 세레비지애 ISC1 유전자 (서열 152)를 동시 발현하도록 형질전환된 야로위아 리폴리티카 균주 M4 (실시예 6)에서의 증가된 EPA 생합성 및 축적을 기재한다. Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 또는 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 통해 DHA를 생산하도록 유전자 조작된 야로위아 리폴리티카 숙주 균주는 사카로마이세스 세레비지애 ISC1이 유사하게 동시 발현되는 경우에 (예컨대, 균주 Y3000에서) 증가된 DHA 생합성 및 축적을 입증할 수 있었음을 고려한다.
사카로마이세스 세레비지애 ISC1 ORF를 하기와 같이 플라스미드 pZP217 + Ura 내로 클로닝하였다. 첫째, ORF는 사카로마이세스 세레비지애 균주 S288C (프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터의 게놈 DNA 및 프라이머 쌍 Isc1F 및 Isc1R (서열 440 및 441)을 사용하여 PCR-증폭하였다. 프라이머 Isc1F는 증폭된 ORF에서 ISC1의 야생형 5' 서열을 'ATGTACAA'에서 'ATGGACAA'로 변형시켰는데, 이는 NcoI 부위를 혼입하여 프레임에 ISC1을 유지하는데 필요하기 때문이다. 증폭을 하기와 같이 수행하였다: 94℃에서 120초 동안 초기 변성, 이어서 94℃에서 30초 동안 변성, 50℃에서 30초 동안 어닐링 및 68℃에서 120초 동안 신장의 35주기. 68℃에서 10분 동안의 최종 신장 주기를 수행하고, 이어서 4℃에서 반응을 종결하였다. 1455 bp DNA 단편을 ISC1에 대한 PCR 반응으로부터 수득하고, PCR 생성물 크기는 1％ 아가로스 겔 (30분 동안 120 V) 및 인비트로젠 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)로부터의 1 kB DNA 표준 래더(ladder)를 사용하는 전기영동에 의해 확인하였다.
DNA는 제조자 지시서에 따라 자이모 리써치 코포레이션 (미국 캘리포니아주 오렌지 소재)로부터의 DNA 클린 & 컨센트레이터-5 (DNA Clean & Concentrator-5) 키트로 정제하고, 이어서 NcoI/NotI로 소화시켰다. 이어서, ISC1 단편을 NcoI 및 NotI로 소화시킨 pZP217 + Ura (서열 205; 도 22C) 내로 개별적으로 클로닝하였다. 정확한 형질전환체를 겔 전기영동으로 확인하고, 생성된 플라스미드를 "pTEF::ISC1" (서열 207)이라고 칭하였다. 따라서, 이 플라스미드는 하기를 포함하는 DNA 카세트를 함유하였다: 3'-POX2, URA3, TEF::ISC1::Pex20 및 POX2 프로모터 영역.
"대조군" 벡터를 하기와 같이 제조하였다. 첫째, 사카로마이세스 세레비지애 pcl1 ORF (유사분열 세포 주기 내로의 진입 및 형태발생의 조절과 관련된 단백질을 코딩함)를 사카로마이세스 세레비지애 균주 S288C로부터의 게놈 DNA 및 프라이머 쌍 Pcl1F 및 Pcl1R (서열 442 및 443)로 PCR 증폭시켰다. 증폭을 상기와 같이 수행하였다. 861 bp DNA 단편을 pcl1에 대한 PCR 반응으로부터 수득하였다 (전기영동에 의해 확인함, 상기 참조). DNA를 DNA 클린 & 컨센트레이터-5 키트로 정제하고, 이어서 NcoI/NotI로 소화시켰다. 이어서, 단편을 유사하게 소화시킨 pZP217 + Ura 내로 클로닝하였다. 정확한 형질전환체를 겔 전기영동에 의해 확인하고, 생성된 플라스미드를 "pTEF::pcl1"이라고 칭하였다. 이어서, 플라스미드 pTEF::pcl1을 HincII로 소화시켜 pcl1 ORF를 제거하였다. 잔존 플라스미드를 재라이게이션하여 3'-POX2, URA3, TEF::Pex20 및 POX2 프로모터 영역을 포함하는 선형 DNA 카세트를 AscI/SphI의 소화 시에 생성하였다.
감응성 야로위아 리폴리티카 균주 M4 세포 (실시예 6으로부터)를 AscI/SphI-소화 pTEF::ISC1 및 "대조군"으로 각각 형질전환시켰다 (여기서, 각 플라스미드 5 ㎍을 소화시킴). 형질전환을 동결 EZ 효모 형질전환 II 키트 (자이모 리써치)로 달성하고, 형질전환체를 아미노산 없는 YNB (6.7 g/L; 벡톤, 딕킨손 앤드 코포레이션(Becton, Dickinson and Co.), 미국 메릴랜드주 스파크스 소재 [카탈로그 #291940]), 글루코스 (20 g/L) 및 아가 (20 g/L)를 함유하는 플레이트 상에서 선별하였다. 수백개 형질전환체 콜로니를 수득하였다. 각 DNA 카세트를 야로위아 리폴리티카 P0X2 유전자좌 내로 통합한 것을 ISC1에 대한 5개 독립성 형질전환체로부터의 게놈 DNA를 사용하는 PCR에 의해 확인하였다.
형질전환체를 2％ 글루코스를 함유한 아미노산 없는 YNB에서 2일 동안 성장시켰다. 세포를 원심분리로 수확하고, 100 g/L 덱스트로즈, 2 g/L MgSO4 및 50 mM 포스페이트 완충제 (pH 6.5)를 함유한 배지에 추가 5일 성장 동안 재현탁하였다. 각 배양물 0.75 mL로부터의 세포를 원심분리로 수확하고, 그의 지방산 조성을 분석하였다. "대조군" 벡터를 포함한 3개 형질전환체의 지방산 프로파일 및 pTEF::ISC1을 포함한 5개 형질전환체를 (상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이) GC 분석에 기초하여 하기에 나타낸다. 지방산을 16:0, 16:1, 18:0, 18:1 (올레산), 18:2 (LA), GLA, DGLA, ARA, ETA 및 EPA로서 확인하고; 각각의 조성을 총 지방산(％)으로서 나타낸다.
Figure 112007040393459-PCT00025
사카로마이세스 세레비지애 ISC1 유전자의 발현은 EPA(％)를 "대조군" 균주에서의 9.3％에서 10.7％ ("M4 + pTEF::ISC1")로 개선시켰으며, 14.5％ 증가를 나타냈다.
실시예 26
야로위아 리폴리티카 아실트랜스퍼라제 넉아웃의 생성
본 실시예는 PDAT, DGAT2, DGAT1, PDAT 및 DGAT2, PDAT 및 DGAT1, DGAT1 및 DGAT2, 또는 PDAT, DGAT1 및 DGAT2 유전자를 파괴한 야로위아 리폴리티카의 단일, 이중 및 삼중 넉아웃 균주의 생성을 기재한다. 각 넉아웃 균주 중의 유전자(들)의 파괴를 확인하고, 지방산 함량 및 조성에 대한 각 파괴의 분석을 실시예 27에서의 총 지질의 GC 분석에 의해 측정하였다.
야로위아 리폴리티카 DGAT2 유전자의 표적화된 파괴
야로위아 리폴리티카 ATCC #90812 중의 DGAT2 유전자의 표적화된 파괴는 플라스미드 pY21DGAT2라고 칭한 표적화 카세트를 사용하는 내인성 DGAT2 유전자의 상동성 재조합-매개 대체에 의해 달성되었다. pY21DGAT2는 플라스미드 pY20 (도 22D, 서열 208)으로부터 유래되었다. 구체적으로, pY21DGAT2는 570 bp HindIII/EcoRI 단편을 유사하게 선형화된 pY20 내로 삽입하여 생성하였다. 570 bp DNA 단편은 (5'에서 3'로의 배향에서) (서열 130 중의 코딩 서열 (ORF)의) 위치 +1090 내지 +1464로부터의 3' 상동성 서열, BglII 제한 부위 및 (서열 130 중의 코딩 서열 (ORF)의) 위치 +906 내지 +1089로부터의 5' 상동성 서열을 함유하였다. 상기 단편은 2쌍의 PCR 프라이머 P95 및 P96 (서열 444 및 445), 및 P97 및 P98 (서열 446 및 447)을 각각 사용하는 PCR 증폭에 의해 제조하였다.
pY21DGAT2를 BglII 제한 소화에 의해 선형화하고, 통상의 방법에 따라 중간-로그 단계 야로위아 리폴리티카 ATCC #90812 세포로 형질전환시켰다. 세포를 YPD 하이그로마이신 선별 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다.
14개 야로위아 리폴리티카 ATCC #90812 하이그로마이신-내성 콜로니를 단리하고, 표적화된 파괴에 대해 PCR로 스크리닝하였다. 1세트의 PCR 프라이머 (P115 및 P116 [서열 448 및 449])를 디자인하여 특이적 연결 단편을 증폭시킨 후 상동성 재조합하였다. 또다른 쌍의 PCR 프라이머 (P115 및 P112 [서열 450])를 디자인하여 천연 유전자를 검출하였다.
ATCC #90812 균주의 14개 하이그로마이신-내성 콜로니 중 2개는 연결 단편에 대해 양성이었고, 천연 단편에 대해 음성이었다. 따라서, 표적화된 통합을 이들 2개 균주에서 확인하였으며, 이들 중 하나를 "S-D2"라고 칭하였다.
야로위아 리폴리티카 PDAT 유전자의 표적화된 파괴
야로위아 리폴리티카 ATCC #90812 중의 PDAT 유전자의 표적화된 파괴는 pLV13 (도 22E, 서열 209)이라고 칭한 표적화 카세트를 사용하는 내인성 PDAT 유전자의 상동성 재조합-매개 대체에 의해 달성되었다. pLV13은 플라스미드 pY20 (도 22D, 서열 208)으로부터 유래되었다. 구체적으로, pY20의 하이그로마이신 내성 유전자를 야로위아 Ura3 유전자로 대체하여 플라스미드 pLV5를 생성하였다. 이어서, pLV13은 992 bp BamHI/EcoRI 단편을 유사하게 선형화된 pLV5 내에 삽입함으로써 생성하였다. 992 bp DNA 단편은 (5'에서 3'로의 배향에서) (서열 117 중의 코딩 서열 (ORF)의) 위치 +877 내지 +1371로부터의 3' 상동성 서열, BglII 제한 부위 및 (서열 117 중의 코딩 서열 (ORF)의) 위치 +390 내지 +876으로부터의 5' 상동성 서열을 함유하였다. 상기 단편은 PCR 프라이머 P39 및 P41 (서열 451 및 452), 및 P40 및 P42 (서열 453 및 454)를 각각 사용하는 PCR 증폭에 의해 제조하였다.
pLV13을 BglII 제한 소화에 의해 선형화하고, 통상의 방법에 따라 중간-로그 단계 야로위아 리폴리티카 ATCC #90812 세포로 형질전환시켰다. 세포를 Bio101 DOB/CSM-Ura 선별 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다.
10개 야로위아 리폴리티카 ATCC #90812 콜로니를 단리하고, 표적화된 파괴에 대해 PCR로 스크리닝하였다. 1세트의 PCR 프라이머 (P51 및 P52 [서열 455 및 456])를 디자인하여 표적화 카세트를 증폭시켰다. 또다른 세트의 PCR 프라이머 (P37 및 P38 [서열 457 및 458])를 디자인하여 천연 유전자를 검출하였다. 10개 균주 중 10개는 연결 단편에 대해 양성이었고, 10개 균주 중 3개는 천연 단편에 대해 음성이어서 이들 3개 균주에서 성공적인 표적화 통합을 확인하였다. 이들 중 하나를 "S-D2"라고 칭하였다.
야로위아 리폴리티카 DGAT1 유전자의 표적화된 파괴
전장 Y1 DGAT1 ORF는 추정 PCR 프라이머 P201 및 P203 (각각 서열 459 및 460) 및 주형으로서의 야로위아 리폴리티카 ATCC #76982 게놈 DNA를 사용하는 PCR에 의해 클로닝하였다. Y1 DGAT1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있지 않기 때문에 추정 프라이머가 요구되었다.
PCR은 증폭이 하기와 같이 수행되는 RoboCycler Gradient 40 PCR 머신에서 수행하였다: 95℃에서 1분 동안 초기 변성, 이어서 95℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 1분 동안 신장의 30주기. 72℃에서 10분 동안의 최종 신장 주기를 수행하고, 이어서 4℃에서 반응을 종결하였다. 예측된 PCR 생성물 (약 1.6 kB)을 아가로스 겔 전기영동에 의해 검출하고, 단리하고, 정제하고, TOPO® 클로닝 벡터 (인비트로젠) 내로 클로닝하고, 부분적으로 서열결정하여 그의 정체를 확인하였다.
야로위아 리폴리티카 ATCC #90812 중의 추정적 DGAT1 유전자의 표적화된 파괴는 표적화 카세트를 사용하는 내인성 DGAT1 유전자의 상동성 재조합-매개 대체에 의해 수행하였다 (DGAT2에 대한 상기 방법을 이용함). 구체적으로, 1.6 kB 단리된 Y1 DGAT1 ORF (서열 122)를 PCR 주형 분자로서 사용하여 5' 상동성 Y1 DGAT1 서열 (프라이머 P214 및 P215 (서열 461 및 462)로 증폭시킴), 야로위아 루이신2 (Leu2; 진뱅크 관리 번호 AAA35244) 유전자, 및 3' 상동성 Y1 DGAT1 서열 (프라이머 P216 및 P217 (서열 463 및 464)로 증폭시킴)로 이루어진 Y1 DGAT1 표적화 카세트를 구축하였다. 표적화 카세트의 각 개개의 부분을 Pfu 울트라 폴리머라제 (스트라타진, 카탈로그 #600630) 및 상기한 열순환기 조건으로 증폭시킨 후에, 각 단편을 정제하였다. 3개의 정확한 크기의 정제된 단편은 PCR 프라이머 P214 및 P219 (서열 465)를 사용하는 제2 PCR 반응을 위해 주형 분자로서 함께 혼합하여 Y1 DGAT1 파괴 카세트를 수득하였다.
표적화 카세트를 겔 정제하고, 이를 사용하여 중간-로그 단계 야생형 야로위아 리폴리티카 (ATCC #90812)를 형질전환시켰다. 형질전환을 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이 수행하였다. 형질전환체를 Bio101 DOB/CSM-Leu 선별 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 2 내지 3일 동안 유지시켰다. 몇몇 루이신 원시영양체를 PCR에 의해 스크리닝하여 표적화된 DGAT1 파괴를 확인하였다. 구체적으로, 1세트의 PCR 프라이머 (P226 및 P227 [서열 466 및 467])를 디자인하여 파괴 카세트와 천연 표적 유전자 간의 연결부를 증폭시켰다. 또다른 세트의 PCR 프라이머 (P214 및 P217 [서열 461 및 464])를 디지인하여 천연 유전자를 검출하였다.
모든 루이신 원시영양체 콜로니는 연결 단편에 대해 양성이고, 천연 단편에 대해 음성이었다. 따라서, 표적화된 통합을 이들 균주에서 확인하였으며, 이들 중 하나를 "S-D1"이라고 칭하였다.
PDAT 및/또는 DGAT2 및/또는 DGAT1 유전자 중에 파괴를 함유하는 야로위아 리폴리티카 이중 및 삼중 넉아웃 균주의 생성
야로위아 리폴리티카 ATCC #90812 하이그로마이신-내성 "S-D2" 돌연변이체 (DGAT2 파괴 함유)를 플라스미드 pLV13 (PDAT 파괴 함유)로 형질전환시키고, 형질전환체를 단일 PDAT 파괴에 대해 기재한 바와 같이 PCR에 의해 스크리닝하였다. 12개 형질전환체 중 2개는 DGAT2 및 PDAT 유전자 모두에서 파괴되었음을 확인하였다. 이들 균주 중 하나를 "S-D2-P"라고 칭하였다.
유사하게, DGAT1 및 PDAT ("S-D1-P"), DGAT2 및 DGAT1 ("S-D2-D1") 중의 이중 넉아웃, 및 DGAT2, DGAT1 및 PDAT ("S-D2-D1-P") 중의 삼중 넉아웃을 갖는 균주를 생성시켰다.
실시예 27
야로위아 리폴리티카 아실트랜스퍼라제 넉아웃은 지질 함량을 저하시키고 , PUFA (％)를 증가시킨다.
본 실시예는 지방산 함량 및 조성의 변화에 의해 측정하는 바와 같이, 야생형 야로위아 리폴리티카 및 EPA를 생산하도록 미리 유전자 조작된 야로위아 리폴리티카 균주에서의 단일 및/또는 이중 및/또는 삼중 아실트랜스퍼라제 넉아웃의 영향을 분석한다. Δ6 데새투라제/Δ6 엘론가제 경로 또는 Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 통해 DHA를 생산하도록 유전자 조작된 야로위아 리폴리티카 숙주 균주가 숙주의 천연 아실트랜스퍼라제에 대한 유사한 조작물이 생성되는 경우에 (예컨대, 균주 Y3000 내에서) 증가된 DHA 생합성 및 축적을 입증할 수 있었음을 고려한다.
TAG 함량은 아실트랜스퍼라제 파괴를 갖는 야로위아 리폴리티카 ATCC #90812에서 저하된다.
첫째, TAG 함량은 (1) PDAT, DGAT2 및 DGAT1 중의 단일 파괴; (2) PDAT 및 DGAT2, DGAT1 및 PDAT, 및 DGAT1 및 DGAT2 중의 이중 파괴; 및 (3) PDAT, DGAT2 및 DGAT1 중의 삼중 파괴를 함유한 야생형 및 돌연변이체 야로위아 리폴리티카 ATCC #90812에서 비교하였다.
구체적으로, 야생형 및 돌연변이체 야로위아 리폴리티카 ATCC #90812 (즉, 균주 S-D1, S-D2, S-P, S-D1-D2, S-D1-P, S-D2-P, 및 S-D1-D2-P)를 함유한 플레이트로부터 1백금이의 세포를 YPD 배지 3 mL에 각각 개별적으로 접종시키고, 밤새 진탕기 (300 rpm) 상에서 30℃에서 성장시켰다. 세포를 수확하고, 0.9％ NaCl로 1회 세척하고, HGM 50 mL에 재현탁하였다. 이어서, 세포를 48시간 동안 진탕기 상에 성장시켰다. 세포를 물로 세척하고, 세포 펠렛을 동결건조시켰다. 세포 건중량 20 mg을 GC에 의한 총 지방산 분석에 사용하고, 오일 분획을 TLC (하기 참조) 및 GC 분석하였다.
TLC에 사용된 방법을 다음 5단계로 하기에 기재한다: (1) 15:0 지방산 (10 ㎕의 10 mg/mL) 내부 표준을 건조 세포 덩어리 2 내지 3 mg에 첨가한 후에, 총 지질을 메탄올/클로로포름 방법으로 추출하였다. (2) 5 x 20 cm 실리카 겔 60 플레이트의 하부로부터 대략 1 인치 그은 연한 연필 줄을 따라 추출된 지질 (50 ㎕)을 25 내지 50 ㎕ 마이크로피펫으로 블럿팅하였다. (3) 이어서 TLC 플레이트를 N2 하에 건조시키고, 약 ~100 mL의 헥산:에틸 에테르:아세트산 (80:20:1) 용매를 함유한 탱크 내에 삽입하였다. (4) 밴드 분리 후에, 요오드 증기를 플레이트의 한 면 상에 취입하여 밴드를 확인하였다. 이는 추가 분석을 위해 면도날을 사용하여 플레이트의 다른 면 상의 샘플을 긁어 낼 수 있게 한다. (5) 긁어 낸 샘플의 염기성 에스테르교환반응 및 GC 분석을 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이 수행하였다.
GC 결과를 하기 표 58에 나타낸다. 배양물을 "S" 균주 (야생형), "S-P" (PDAT 넉아웃), "S-D1" (DGAT1 넉아웃), "S-D2" (DGAT2 넉아웃), "S-D1-D2" (DGAT1 및 DGAT2 넉아웃), "S-P-D1" (PDAT 및 DGAT1 넉아웃), "S-P-D2" (PDAT 및 DGAT2 넉아웃) 및 "S-P-D1-D2" (PDAT, DGAT1 및 DGAT2 넉아웃)로서 기재한다. 약어는 하기와 같이 사용한다: "WT" = 야생형; "FA" = 지방산; "dcw" = 세포 건중량; 및 "FA％ dcw, ％ WT" = 야생형 (％)에 상대적인 FA％ dcw (여기서 "S" 균주는 야생형임).
Figure 112007040393459-PCT00026
표 58의 결과는 오일 생합성에 대한 3개의 DAG AT의 상대적 기여도를 나타낸다. DGAT2가 최고로 기여하지만, PDAT 및 DGAT1은 DGAT2와 동일하거나 그 미만으로 기여한다. 삼중 넉아웃 균주 중의 잔류 오일 함량 약 3％는 야로위아 리폴리티카 아실-CoA:스테롤-아실트랜스퍼라제 효소 (ARE2에 의해 코딩됨) (서열 119 및 120)의 기여도일 수 있다.
파괴된 DGAT2 유전자를 갖는 야로위아 리폴리티카 균주 EU 에서 TAG 함량은 저하되고, EPA (％)는 증가된다 .
야생형 야로위아 리폴리티카 ATCC #90812 (상기 문헌)에서의 다양한 아실트랜스퍼라제 넉아웃의 영향을 시험한 후에, 이어서 TAG 함량 및 지방산 조성을 EU 균주의 DGAT2 넉아웃 균주 (즉, 10％ EPA를 생산하도록 유전자 조작됨, 실시예 13 참조)에서 연구하였다.
구체적으로, 균주 EU 중의 DGAT2 유전자를 실시예 26에서 S 균주 (ATCC #90812)에 대해 기재한 바와 같이 파괴하였다. DGAT2-파괴 균주를 EU-D2라고 칭하였다. EU 및 EU-D2 균주를 2개의 상이한 조건에 따른 성장 후에 수확하고, 분석하였다. 하기 표에 "3 mL"로서 나타낸 조건에서는, 세포를 1일 동안 MM 배지 3 mL에서 성장시키고, 세척하고, 이어서 3일 동안 HGM 3 mL에서 성장시켰다. 별법으로, 하기 표에 "51 mL"로서 나타낸 조건에서는, 세포를 1일 동안 MM 배지 51 mL에서 성장시키고, 세척하고, 이어서 3일 동안 HGM 51 mL에서 성장시켰다. 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 및 트리아실글리세롤 (TAG 또는 오일)의 지방산 조성을 배양물 51 mL의 추출물에서 TLC 분리 ("분획") 후에 측정하였다.
GC 결과를 하기 표 59에 나타낸다. 배양물을 "EU" 균주 (야생형) 및 "EU-D2" 균주 (DGAT2 넉아웃)라고 기재한다. 지방산을 16:0, 16:1, 18:0, 18:1 (올레산), 18:2 (LA), GLA, DGLA, ARA, ETA 및 EPA로서 확인하고; 각각의 조성을 총 지방산(％)으로서 나타낸다.
Figure 112007040393459-PCT00027
결과는 DGAT2 넉아웃이 (총 지방산의) EPA(％)를 배가시키고, 지질 함량 (dcw(％))을 반감시켰음을 나타낸다. 추가로, 지질 함량에서 관찰된 거의 모든 변화는 TAG 분획에서의 변화 때문이다. 균주 EU의 배양물 51 mL에서의 예측보다 낮은 EPA(％)는 불안정성 때문인 것으로 여겨진다.
파괴된 아실트랜스퍼라제 유전자를 갖는 야로위아 리폴리티카 균주 MU 에서 TAG 함량은 저하되고, EPA (％)는 증가된다 .
최종적으로, 균주 EU-D2에서 단일 DGAT2 넉아웃으로부터 얻어진 증가된 EPA(％) 및 저하된 지질 함량을 기초로 하여, TAG 함량 및 지방산 조성을 이어서 균주 MU의 다양한 아실트랜스퍼라제 넉아웃 균주 (즉, 14％ EPA를 생산하도록 유전자 조작됨, 실시예 15 참조)에서 연구하였다. 구체적으로, PDAT, DGAT2 및 DGAT1 중의 단일 파괴 및 PDAT 및 DGAT2 중의 이중 파괴를 균주 MU에서 생성하였다. 지질 함량 및 조성은 4개의 상이한 성장 조건에서의 성장 후에 각각의 이들 균주에서 비교하였다.
보다 구체적으로, PDAT, DGAT2, DGAT1 중의 단일 파괴를 실시예 26에 기재한 방법 (URA3 유전자에 기반한 DGAT1 파괴에 대한 선별은 제외함)으로 균주 MU에서 생성하였다. 이는 "MU-D1" (DGAT1에서 파괴됨), "MU-D2" (DGAT2에서 파괴됨), 및 "MU-P" (PDAT에서 파괴됨)라고 동정된 단일 넉아웃 균주를 생성하였다. 개개의 넉아웃 균주를 PCR로 확인하였다. 추가로, MU-D2 균주를 동일한 방법에 의해 PDAT 유전자에 대해 파괴하고, 이 파괴를 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 이중 넉아웃 균주를 "MU-D2-P"라고 칭하였다.
MU-D1, MU-D2, MU-P, 및 M-D2-P 넉아웃 균주를 분석하여 하기에 기재하는 바와 같이 지질 함량 및 조성에 대한 각각의 넉아웃 효과를 측정하였다. 추가로, 유질성을 촉진하는 성장 조건을 총 지질 함량에 대한 그의 효과를 측정하기 위해 또한 조사하였다. 따라서, "실험 A", "실험 B", "실험 C" 및 "실험 E"로 나타내는 총 4개의 상이한 실험을 수행하였다. 구체적으로, 상기 각 균주를 함유한 플레이트로부터 3백금이의 세포를 MMU 배지 [실험 B 및 C의 경우 3 mL; 및 실험 A 및 E의 경우 50 mL]에 접종하고, 진탕기 중 30℃에서 24시간 (실험 A, B 및 C의 경우) 또는 48시간 (실험 E의 경우) 동안 성장시켰다. 세포를 수확하고, HGM으로 1회 세척하고, HGM 배지 (실험 A 및 E의 경우 50 mL; 및 실험 B의 경우 3 mL) 또는 HGM 배지 (우라실 ("HGMU") 함유) (실험 C의 경우 3 mL) 중에 재현탁하고, 4일 동안 상기와 같이 배양하였다. 하나의 분취액 (1 mL)을 상기 '통상의 방법' 항목에 기재한 바와 같이 GC에 의한 지질 분석에 사용한 반면에, 제2 분취액을 600 nm에서의 배양물 OD를 측정하는데 사용하였다. 실험 A 및 E의 잔존 배양물을 수확하고, 물로 1회 세척하고, 세포 건중량 (dew) 측정을 위해 동결건조시켰다. 반대로, 실험 B 및 C의 dcw를 그의 관계를 나타내는 방정식으로 그의 OD600으로부터 측정하였다. 또한, 실험 A, B, C 및 E 중의 각각의 상이한 균주의 지방산 조성을 측정하였다.
결과를 하기 표 60에 나타낸다. 배양물을 "MU" 균주 (모 EPA 생산 균주), "MU-P" (PDAT 넉아웃), "MU-D1" (DGAT1 넉아웃), "MU-D2" (DGAT2 넉아웃) 및 "MU-D2-P" (DGAT2 및 PDAT 넉아웃)으로 기재한다. 약어는 하기와 같이 사용한다: "WT" = 야생형 (즉, MU); "OD" = 광학 밀도; "dcw" = 세포 건중량; "TFA" = 총 지방산; 및 "TFA％ dcw, ％ WT" = 야생형 ("MU") 균주에 상대적인 TFA％ dcw. 지방산을 16:0, 16:1, 18:0, 18:1 (올레산), 18:2 (LA), GLA, DGLA, ARA, ETA 및 EPA로서 확인하고; 각각의 조성을 총 지방산(％)으로서 나타낸다.
Figure 112007040393459-PCT00028
상기 데이타는 형질전환된 세포 내의 지질 함량이 성장 조건에 따라 변하였음을 보여주었다. 추가로, 지질 함량에 대한 각각의 아실트랜스퍼라제의 기여도도 변하였다. 구체적으로, 실험 B, C 및 E에서 DGAT2는 PDAT 또는 DGAT1보다 오일 생합성에 더 기여하였다. 반대로, 실험 A에서 입증된 바와 같이, DGAT2, DGAT1 및 PDAT에서의 단일 넉아웃은 지질 함량에서 대략 동등한 손실을 발생하였다 (즉, 각각 48％, 49％ 및 42％ 손실 ["TFA％ dcw, ％ WT" 참조]).
지방산 조성과 관련하여, 상기 데이타는 각각의 개개 DAG AT 유전자의 넉아웃이 오일 함량을 낮추고, EPA(％)를 증가시켰음을 보여준다. 예를 들어, DGAT2 넉아웃은 지질 함량을 대략 반감시키고, 총 지방산에서 EPA(％)를 대략 배가시켰다 (균주 EU-D2에서 관찰된 결과와 유사함, 상기 참조). DAGAT2 및 PDAT 모두의 넉아웃은 최소 오일 및 최고 EPA(％)를 생산하였다.
본원에 보고한 결과를 기초로 하여, 천연 DGAT2 및/또는 DGAT1 및/또는 PDAT의 파괴가 DHA를 비롯한 고농도의 PUFA를 생산하도록 유전자 조작된 야로위아 리폴리티카의 균주 (예컨대, 균주 Y3000 내에서)에서 실질적으로 PUFA(％)를 증가시키는 유용한 수단임을 고려한다. 사실, 야로위아 리폴리티카 균주 Y2214 중의 천연 DGAT2 유전자의 파괴 (Δ9 엘론가제/Δ8 데새투라제 경로를 통해 14％ ARA를 생산함; 야생형 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362에 대한 이 균주의 최종 유전자형은 다음과 같음: Aco2-, Lys5-, 2X GPAT::IgD9e::PEX20, 2X TEF::IgD9e::LIP1, FBAINm::IgD9e::0CT, 2X FBAIN::D8SF::PEX16, GPD::D8SF::PEX16, GPAT::MAΔ5::PEX20, FBAIN::MAΔ5::PEX20, YAT1::I.D5S::LIP1, GPM/FBAIN::I.D5S::OCT, FBAIN::F.D12S::PEX20 및 GPM/FBAIN::rELO2S::OCT)는 ARA(％)를 1.7배 증가시켰다 (데이타는 나타내지 않음).
SEQUENCE LISTING <110> E.I. du Pont de Nemours and Company <120> DOCOSAHEXAENOIC ACID PRODUCING STRAINS OF YARROWIA LIPOLYTICA <130> CL3160 PCT <140> US 60/624,812 <141> 2004-11-04 <160> 467 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1374 <212> DNA <213> Mortierella alpina AF465281 <220> <221> misc_feature <223> delta-6 desaturase <400> 1 atggctgctg ctcccagtgt gaggacgttt actcgggccg aggttttgaa tgccgaggct 60 ctgaatgagg gcaagaagga tgccgaggca cccttcttga tgatcatcga caacaaggtg 120 tacgatgtcc gcgagttcgt ccctgatcat cccggtggaa gtgtgattct cacgcacgtt 180 ggcaaggacg gcactgacgt ctttgacact tttcaccccg aggctgcttg ggagactctt 240 gccaactttt acgttggtga tattgacgag agcgaccgcg atatcaagaa tgatgacttt 300 gcggccgagg tccgcaagct gcgtaccttg ttccagtctc ttggttacta cgattcttcc 360 aaggcatact acgccttcaa ggtctcgttc aacctctgca tctggggttt gtcgacggtc 420 attgtggcca agtggggcca gacctcgacc ctcgccaacg tgctctcggc tgcgcttttg 480 ggtctgttct ggcagcagtg cggatggttg gctcacgact ttttgcatca ccaggtcttc 540 caggaccgtt tctggggtga tcttttcggc 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Asn Thr His His Ala Ala Pro Asn Val His Gly Glu Asp Pro Asp 210 215 220 Ile Asp Thr His Pro Leu Leu Thr Trp Ser Glu His Ala Leu Glu Met 225 230 235 240 Phe Ser Asp Val Pro Asp Glu Glu Leu Thr Arg Met Trp Ser Arg Phe 245 250 255 Met Val Leu Asn Gln Thr Trp Phe Tyr Phe Pro Ile Leu Ser Phe Ala 260 265 270 Arg Leu Ser Trp Cys Leu Gln Ser Ile Leu Phe Val Leu Pro Asn Gly 275 280 285 Gln Ala His Lys Pro Ser Gly Ala Arg Val Pro Ile Ser Leu Val Glu 290 295 300 Gln Leu Ser Leu Ala Met His Trp Thr Trp Tyr Leu Ala Thr Met Phe 305 310 315 320 Leu Phe Ile Lys Asp Pro Val Asn Met Leu Val Tyr Phe Leu Val Ser 325 330 335 Gln Ala Val Cys Gly Asn Leu Leu Ala Ile Val Phe Ser Leu Asn His 340 345 350 Asn Gly Met Pro Val Ile Ser Lys Glu Glu Ala Val Asp Met Asp Phe 355 360 365 Phe Thr Lys Gln Ile Ile Thr Gly Arg Asp Val His Pro Gly Leu Phe 370 375 380 Ala Asn Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu 385 390 395 400 Phe Pro Ser Met Pro Arg His Asn Phe Ser Lys Ile Gln Pro Ala Val 405 410 415 Glu Thr Leu Cys Lys Lys Tyr Asn Val Arg Tyr His Thr Thr Gly Met 420 425 430 Ile Glu Gly Thr Ala Glu Val Phe Ser Arg Leu Asn Glu Val Ser Lys 435 440 445 Ala Thr Ser Lys Met Gly Lys Ala Gln 450 455 <210> 3 <211> 1374 <212> DNA <213> Mortierella alpina <220> <221> misc_feature <223> synthetic delta-6 desaturase (codon-optimized) <400> 3 atggctgccg ctccctctgt gcgaaccttt acccgagccg aggttctgaa cgctgaggct 60 ctgaacgagg gcaagaagga cgctgaggct cccttcctga tgatcatcga caacaaggtg 120 tacgacgtcc gagagttcgt ccctgaccat cctggaggct ccgtgattct cacccacgtt 180 ggcaaggacg gcaccgacgt ctttgacacc tttcatcccg aggctgcttg ggagactctc 240 gccaacttct acgttggaga cattgacgag tccgaccgag acatcaagaa cgatgacttt 300 gccgctgagg tccgaaagct gcgaaccctg ttccagtctc tcggctacta cgactcctct 360 aaggcctact acgccttcaa ggtctccttc aacctctgca tctggggact gtccaccgtc 420 attgtggcca agtggggtca gacctccacc ctcgccaacg tgctctctgc tgccctgctc 480 ggcctgttct ggcagcagtg cggatggctg gctcacgact ttctgcacca ccaggtcttc 540 caggaccgat tctggggtga tctcttcgga gccttcctgg gaggtgtctg ccagggcttc 600 tcctcttcct ggtggaagga caagcacaac actcaccatg ccgctcccaa cgtgcatggc 660 gaggatcctg acattgacac ccaccctctc ctgacctggt ccgagcacgc tctggagatg 720 ttctccgacg tccccgatga ggagctgacc cgaatgtggt ctcgattcat ggtcctgaac 780 cagacctggt tctacttccc cattctctcc ttcgctcgac tgtcttggtg cctccagtcc 840 attctctttg tgctgcccaa cggtcaggct cacaagccct ccggagctcg agtgcccatc 900 tccctggtcg agcagctgtc cctcgccatg cactggacct ggtacctcgc taccatgttc 960 ctgttcatca aggatcctgt caacatgctc gtgtacttcc tggtgtctca ggctgtgtgc 1020 ggaaacctgc tcgccatcgt gttctccctc aaccacaacg gtatgcctgt gatctccaag 1080 gaggaggctg tcgacatgga tttctttacc aagcagatca tcactggtcg agatgtccat 1140 cctggactgt tcgccaactg gttcaccggt ggcctgaact accagatcga gcatcacctg 1200 ttcccttcca tgcctcgaca caacttctcc aagatccagc ctgccgtcga gaccctgtgc 1260 aagaagtaca acgtccgata ccacaccact ggtatgatcg agggaactgc cgaggtcttc 1320 tcccgactga acgaggtctc caaggccacc tccaagatgg gcaaggctca gtaa 1374 <210> 4 <211> 1521 <212> DNA <213> Mortierella 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Pro Asn Val His Gly Glu Asp Pro 210 215 220 Asp Ile Asp Thr His Pro Leu Leu Thr Trp Ser Glu His Ala Leu Glu 225 230 235 240 Met Phe Ser Asp Val Pro Asp Glu Glu Leu Thr Gln Met Trp Ser Arg 245 250 255 Phe Met Val Leu Asn Gln Ala Trp Phe Tyr Phe Pro Ile Leu Ser Phe 260 265 270 Ala Arg Leu Ser Trp Cys Ile Gln Ser Ile Leu Phe Val Leu Pro Asn 275 280 285 Gly Gln Ala His Lys Pro Ala Gly Ala Arg Val Pro Ile Ser Leu Val 290 295 300 Glu Gln Leu Ser Leu Ala Met His Trp Thr Trp Tyr Leu Ala Thr Met 305 310 315 320 Phe Leu Phe Ile Lys Asp Pro Val Asn Met Met Val Tyr Phe Leu Val 325 330 335 Ser Gln Ala Val Cys Gly Asn Leu Leu Ala Ile Val Phe Ser Leu Asn 340 345 350 His Asn Gly Met Pro Val Ile Ser Gln Glu Glu Ala Val Glu Met Asp 355 360 365 Phe Phe Thr Lys Gln Ile Ile Thr Gly Arg Asp Val Tyr Pro Gly Trp 370 375 380 Phe Ala Asp Trp Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His 385 390 395 400 Leu Phe Pro Ser Met Pro Arg His His Phe Ser Lys Ile Gln Pro Ala 405 410 415 Val Glu Ser Leu Cys Lys Lys Tyr 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aaa tac gga gtc aaa tac caa gag 1248 Pro Arg Val Arg Ala Leu Cys Glu Lys Tyr Gly Val Lys Tyr Gln Glu 405 410 415 aag acc ttg tac gga gca ttt gcg gat atc att agg tct ttg gag aaa 1296 Lys Thr Leu Tyr Gly Ala Phe Ala Asp Ile Ile Arg Ser Leu Glu Lys 420 425 430 tct ggc gag ctc tgg ctg gat gcg tat ctc aac aaa taa agcatgactt 1345 Ser Gly Glu Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu Asn Lys 435 440 ctccctaaat agaaaaaaag cggagccgaa tcctccaatc agagcgagcc ttcacagact 1405 agacatcagg aagaatcgcg actaaacccc cagtcaatca gttcagtaaa atgacgcgta 1465 gcactttgtt ttttgatatc tgcaagataa ttgtggcact ttgaatgcgt tttaaagaga 1525 cggctcaaag atgtgtgtct cgctcctaat aaaggaagaa tctgaaagga aaaaaaaaaa 1585 aaaaa 1590 <210> 15 <211> 444 <212> PRT <213> Danio rerio (GenBank Accession No. AF309556) <400> 15 Met Gly Gly Gly Gly Gln Gln Thr Asp Arg Ile Thr Asp Thr Asn Gly 1 5 10 15 Arg Phe Ser Ser Tyr Thr Trp Glu Glu Val Gln Lys His Thr Lys His 20 25 30 Gly Asp Gln Trp Val Val Val Glu Arg Lys Val Tyr Asn Val Ser Gln 35 40 45 Trp Val Lys 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ataaatataa tatataaaga attttatgat catgatatat 420 gatcattact ttacctaagt ggaagattaa gtggtagttg tacatcatat acacccgcag 480 aacgtagcta gacagaccca atgagcaaaa gcaccggcgt cgagcatcat atcagtggtg 540 ttgctactac agaaacggca acagagacag ttactgttcc tcctgccaag acagctattg 600 acacacatgg taacatcttc aaggttccag actatactat caaagacatc ctaggtgcca 660 tcccaaagga gtgttacaag agagacactc tttggtcatt gcattatgtg gtaagagata 720 ttattgccat ctgtattatt gggtatgttg gtaccaacta cattccagtt tggtttccaa 780 atagtggtct cctaagattt gttgcctata tggtgcaatc atacttaatt gggttatttg 840 gttttgggtt gtggattttg gctcacgaat gcggtcatgg tgccttctct gattcaagat 900 taatcaacga taccgttggg tgggttttgc actcatggtg gatggtccca tacttttctt 960 ggaaattctc tcactctaag catcataaag ctaccggtca tttgactaga gatatggttt 1020 ttgttccata cacgaaaaaa gaatacttgg aaatgaaggg taaatcaaaa ctaagggaga 1080 tcaccgaaga agcaccaatt gtaactttat taactttgat tggccaacaa attggtggtt 1140 tgcagttgta tttagcaaca aatgccactg gccaatctta tcctggtgtt cctaaattct 1200 tcaaatccca ttactggcct acttctccgg tgttcgatac caaggacttc tggtacatca 1260 ttctgagtga cattggtatt atttccacac ttacaatcaa ttatttgtgg gcaaagacct 1320 atggctccca tgtcatgttg atcaactggt ttgttccatg gttatgggtt aaccactggt 1380 tagtatttgt cacatttttg caacacactg acccaaccat gcctcattac gaagccagtg 1440 aatggacctt cgctaaaggt gctgctgcca ccattgatag aaactttggc tttgttggtc 1500 aacatatttt ccacgatatt attgaaacgc atgttttgca tcattactgt tcaagaattc 1560 ctttctacaa cgctcgtgta gccactgaag ctattaagaa agttatgggt gaacattatc 1620 gttatgaagg cgaaaatatg tggcaatcat tatggaaggt ggcaagatcc tgtcagtttg 1680 tagatggtga caacggtgtt ttgatgttca gaaacacaaa cggagtcgga gcaccatgtc 1740 aagaatgagt gcacatagag tatcaatttt tcattcatca agttcattcc cttatcatta 1800 tcattcttat tattatttat cttaactgta cattaaaatt ttacccgatg caaaatatca 1860 accgaatgtg cttatgccac gtcggttaat tggaaaatat taatcttacc agtcaaattg 1920 ctttactctc aaaatttttg ataggagt 1948 <210> 48 <211> 415 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis (gnl|GLV|KLLA0B00473g) <220> <221> MISC_FEATURE <223> delta-12 desaturase <400> 48 Met 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<213> Candida albicans SC5314 (GenBank Accession No. EAK94955) <220> <221> MISC_FEATURE <223> delta-12 desaturase <400> 49 Met Ala Ala Ala Thr Thr Ser Phe Ser Ser Gly Phe Asn Asn Asn Asn 1 5 10 15 Asn Ala Asp Gln Ser Thr Asp Ser Ser Ala Thr Ile Ser Lys Ser Gly 20 25 30 Asn Val Ala Ser Phe Lys Thr Thr Ser Thr Thr Ser Thr Tyr Gln Thr 35 40 45 Asn Leu Thr Ala Ile Asp Thr Tyr Gly Asn Glu Phe Lys Val Pro Asp 50 55 60 Tyr Thr Ile Lys Asp Ile Leu Ser Ala Ile Pro Thr His Cys Tyr Glu 65 70 75 80 Arg Arg Leu Leu Gln Ser Leu Ser Tyr Val Phe Arg Asp Ile Phe Cys 85 90 95 Met Val Val Leu Gly Phe Ile Ala Asn Asn Tyr Ile His Leu Ile Pro 100 105 110 Asn Gln Phe Ile Arg Phe Ala Ala Trp Thr Gly Tyr Val Trp Cys Gln 115 120 125 Gly Leu Phe Gly Thr Gly Ile Trp Val Leu Ala His Glu Cys Gly His 130 135 140 Gln Ala Phe Ser Asp Tyr Gly Ser Val Asn Asp Phe Val Gly Trp Val 145 150 155 160 Leu His Ser Tyr Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Phe Ser His 165 170 175 Gly Lys His His Lys Ala Thr Gly His Leu Thr Arg Asp 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acgccgtctc tgctgctgct ccctcctcct cctcctcctc ttccagccaa 120 aagtcggccg agcccatcga ataccccgac atcaagacca tccgcgacgc catccccgac 180 cactgcttcc gcccgcgcgt ctggatctcc atggcctact tcatccgcga cttcgccatg 240 gcctttggcc tcggctacct cgcctggcag tacatccccc tgatcgcctc caccccgctc 300 cgctacggcg cctgggctct gtacggctac ctccagggtc tcgtctgcac gggcatctgg 360 attctggcgc acgagtgcgg ccacggcgcc ttctcgaggc acacgtggtt caacaacgtc 420 atggggtgga ttggccactc cttcctcttg gtcccttact tcagctggaa gttcagccac 480 catcgccacc atcgcttcac cggccacatg gagaaggaca tggcgtttgt gcctgccacc 540 gaggctgatc gcaaccagag gaagctggcc aacttgtaca tggacaagga gacggccgag 600 atgtttgagg atgtgcccat tgtccagctc gtcaagctca tcgcccacca gctggccggc 660 tggcagatgt acctcctctt caacgtctcc gccggtaagg gcagcaagca gtgggagact 720 ggcaagggcg gcatgggctg gttgagggtt agccactttg agccttcctc tgctgtgttc 780 cgcaactccg aggccatcta cattgccctg tccgatcttg gtctcatgat catgggctat 840 atcctctacc aggccgcgca ggttgttggc tggcagatgg taggtctgct gtacttccag 900 cagtacttct gggttcacca ttggttggtc gccatcactt acctccacca cacccacgag 960 gaagtccacc actttgacgc cgactcgtgg accttcgtca agggcgctct cgccaccgtc 1020 gaccgcgatt ttggcttcat tggcaagcac ctcttccaca acattatcga ccaccacgtc 1080 gtccaccact tgttccctcg catccccttc tactacgccg aagaagccac caactcgatc 1140 cgccccatgc tcggccccct ctaccaccgc gacgaccgct ccttcatggg ccagctgtgg 1200 tacaacttca cccactgcaa gtgggtcgtt ccggaccccc aggtccccgg cgcgcttatt 1260 tgggcgcaca ccgttcagag cacccagtaa 1290 <210> 58 <211> 429 <212> PRT <213> Neurospora crassa <400> 58 Met Thr Val Thr Thr Arg Ser His Lys Ala Ala Ala Ala Thr Glu Pro 1 5 10 15 Glu Val Val Ser Thr Gly Val Asp Ala Val Ser Ala Ala Ala Pro Ser 20 25 30 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gln Lys Ser Ala Glu Pro Ile Glu Tyr 35 40 45 Pro Asp Ile Lys Thr Ile Arg Asp Ala Ile Pro Asp His Cys Phe Arg 50 55 60 Pro Arg Val Trp Ile Ser Met Ala Tyr Phe Ile Arg Asp Phe Ala Met 65 70 75 80 Ala Phe Gly Leu Gly Tyr Leu Ala Trp Gln Tyr Ile Pro Leu Ile Ala 85 90 95 Ser Thr Pro Leu Arg Tyr Gly Ala Trp Ala Leu Tyr Gly Tyr Leu Gln 100 105 110 Gly Leu Val Cys Thr Gly Ile Trp Ile Leu Ala His Glu Cys Gly His 115 120 125 Gly Ala Phe Ser Arg His Thr Trp Phe Asn Asn Val Met Gly Trp Ile 130 135 140 Gly His Ser Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Phe Ser His 145 150 155 160 His Arg His His Arg Phe Thr Gly His Met Glu Lys Asp Met Ala Phe 165 170 175 Val Pro Ala Thr Glu Ala Asp Arg Asn Gln Arg Lys Leu Ala Asn Leu 180 185 190 Tyr Met Asp Lys Glu Thr Ala Glu Met Phe Glu Asp Val Pro Ile Val 195 200 205 Gln Leu Val Lys Leu Ile Ala His Gln Leu Ala Gly Trp Gln Met Tyr 210 215 220 Leu Leu Phe Asn Val Ser Ala Gly Lys Gly Ser Lys Gln Trp Glu Thr 225 230 235 240 Gly Lys Gly Gly Met Gly Trp Leu Arg Val Ser His Phe Glu Pro Ser 245 250 255 Ser Ala Val Phe Arg Asn Ser Glu Ala Ile Tyr Ile Ala Leu Ser Asp 260 265 270 Leu Gly Leu Met Ile Met Gly Tyr Ile Leu Tyr Gln Ala Ala Gln Val 275 280 285 Val Gly Trp Gln Met Val Gly Leu Leu Tyr Phe Gln Gln Tyr Phe Trp 290 295 300 Val His His Trp Leu Val Ala Ile Thr Tyr Leu His His Thr His 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ctgcaccgga 300 atctggattc tcggtcatga gtgcggccac ggtgccttct ctacccacag caagctcaac 360 aatgtgaccg gctggttcct ccactcgttc ctcatggtcc cctatttcag ctggaagtac 420 tctcaccacc gtcaccaccg cttcaccggc cacatggatc tcgacatggc ctttgtcccc 480 cgcacttcgc ccaagccttc tttgtctttc cgcattgctg gtatggacgt cgctgagctg 540 attgaggaca cccccattgc ccaggccgtc aagctcatct tccaccagct cttcggatgg 600 caggtgtaca ccttcttcaa cgccagctct ggcaagggta gcaagcagtg ggagcccaag 660 agcggcttgg ccagctggtt ccgcgtcagc cacttcgagc ccaccagcgc tgtcttccgc 720 cccgccgagg ctcctttcat cctcatctcc gacattggtc tcgccctcac tggaactgct 780 ctgtactttg cttccaagga ggtcggcgtt tccaccgttc tctacctcta cctcgtcccc 840 tacctctggg tccaccactg gctcgtcgcc atcacctacc tccaccacca ccacaccgag 900 cttccccact acaccgccga gggctggacc tacgtcaagg gtgctctcgc tactgttgac 960 cgcgagtttg gcttcattgg caagcacctt ttccacggca tcattgagaa gcacgtcatt 1020 caccacctgt tccctaagat ccccttctac aaggctgacg aggccaccga ggccatcaag 1080 cccatcatcg gcgaccacta ctgccacgac gaccgcagct tccttggcca gctctggacc 1140 atctttggca gcctcaagta cgtcgagcac gaccccgccg tccctggtgc catgcgctgg 1200 gccaaggagt ag 1212 <210> 60 <211> 403 <212> PRT <213> Fusarium graminearium <400> 60 Met Ala Thr Arg Gln Arg Thr Ala Thr Thr Val Val Val Glu Lys Asp 1 5 10 15 Leu Pro Lys Val Thr Leu Glu Ala Thr Ser Gln Pro Gln Phe Pro Asp 20 25 30 Ile Lys Thr Ile Lys Asp Ala Ile Pro Ala His Cys Phe Gln Pro Ser 35 40 45 Leu Ile Thr Ser Tyr Tyr Tyr Val Val Arg Asp Phe Ala Met Val Gly 50 55 60 Ser Leu Val Trp Ala Ala Leu Thr Tyr Ile Pro Gly Ile Glu Asp Gln 65 70 75 80 Tyr Leu Arg Val Ala Ala Trp Met Ala Tyr Gly Phe Leu Gln Gly Leu 85 90 95 Phe Cys Thr Gly Ile Trp Ile Leu Gly His Glu Cys Gly His Gly Ala 100 105 110 Phe Ser Thr His Ser Lys Leu Asn Asn Val Thr Gly Trp Phe Leu His 115 120 125 Ser Phe Leu Met Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His His Arg 130 135 140 His His Arg Phe Thr Gly His Met Asp Leu Asp Met Ala Phe Val Pro 145 150 155 160 Arg Thr Ser Pro Lys Pro Ser Leu Ser Phe Arg Ile Ala Gly Met Asp 165 170 175 Val Ala Glu Leu 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agcctgccgt cgaagaggag gtttcggagc aggaacacca ccaccacgag 720 gagtccatct ttgccgaaac tcccatctac acgctcggag cgcttttgtt cgtcttgacc 780 ttcggatggc ccttgtactt gatcgtcaac ttttcaggac acgaggcccc tcactgggtc 840 aaccatttcc agactgtcgc tcctctctat gagcctcacc agcgcaagaa catcttctac 900 tccaactgcg gcattgtcgc catgggttcg atcttgactt acctttcgat ggtcttctcg 960 cccttgactg tcttcatgta ctatggcatc ccttacctcg gagtcaacgc ctggatcgtc 1020 tgcattacct atctccagca caccgatccc aaggtgcctc acttccgtga taacgagtgg 1080 aacttccagc gcggtgctgc ctgcactatc gaccgatcct tcggtaccat cgtgaaccac 1140 ctgcaccacc acattggcga ctctcaccag tgccaccata tgttctcgca gatgcccttc 1200 tacaatgctg tggaggctac aaagtacttg aaggccaaac ttggcaagta ctacatattt 1260 gacgacacgc ccattgccaa agccctctac cgcaattgga gagagtgcaa attcgtggag 1320 gacgagggag atgtagtgtt ttacaagcat taa 1353 <210> 62 <211> 403 <212> PRT <213> Mortierella alpina (GenBank Accession No. AB182163) <220> <221> MISC_FEATURE <223> delta-15 desaturase <400> 62 Met Ala Pro Pro His Val Val Asp Glu Gln Val 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210 215 220 Ser Gly His Glu Ala Pro His Trp Val Asn His Phe Gln Thr Val Ala 225 230 235 240 Pro Leu Tyr Glu Pro His Gln Arg Lys Asn Ile Phe Tyr Ser Asn Cys 245 250 255 Gly Ile Val Ala Met Gly Ser Ile Leu Thr Tyr Leu Ser Met Val Phe 260 265 270 Ser Pro Leu Thr Val Phe Met Tyr Tyr Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Val 275 280 285 Asn Ala Trp Ile Val Cys Ile Thr Tyr Leu Gln His Thr Asp Pro Lys 290 295 300 Val Pro His Phe Arg Asp Asn Glu Trp Asn Phe Gln Arg Gly Ala Ala 305 310 315 320 Cys Thr Ile Asp Arg Ser Phe Gly Thr Ile Val Asn His Leu His His 325 330 335 His Ile Gly Asp Ser His Gln Cys His His Met Phe Ser Gln Met Pro 340 345 350 Phe Tyr Asn Ala Val Glu Ala Thr Lys Tyr Leu Lys Ala Lys Leu Gly 355 360 365 Lys Tyr Tyr Ile Phe Asp Asp Thr Pro Ile Ala Lys Ala Leu Tyr Arg 370 375 380 Asn Trp Arg Glu Cys Lys Phe Val Glu Asp Glu Gly Asp Val Val Phe 385 390 395 400 Tyr Lys His <210> 63 <211> 1248 <212> DNA <213> Kluyveromyces lactis (GenBank Accession No. XM_451551) <220> <221> misc_feature <223> delta-15 desaturase <400> 63 atgagcaaaa gcaccggcgt cgagcatcat atcagtggtg ttgctactac agaaacggca 60 acagagacag ttactgttcc tcctgccaag acagctattg acacacatgg taacatcttc 120 aaggttccag actatactat caaagacatc ctaggtgcca tcccaaagga gtgttacaag 180 agagacactc tttggtcatt gcattatgtg gtaagagata ttattgccat ctgtattatt 240 gggtatgttg gtaccaacta cattccagtt tggtttccaa atagtggtct cctaagattt 300 gttgcctata tggtgcaatc atacttaatt gggttatttg gttttgggtt gtggattttg 360 gctcacgaat gcggtcatgg tgccttctct gattcaagat taatcaacga taccgttggg 420 tgggttttgc actcatggtg gatggtccca tacttttctt ggaaattctc tcactctaag 480 catcataaag ctaccggtca tttgactaga gatatggttt ttgttccata cacgaaaaaa 540 gaatacttgg aaatgaaggg taaatcaaaa ctaagggaga tcaccgaaga agcaccaatt 600 gtaactttat taactttgat tggccaacaa attggtggtt tgcagttgta tttagcaaca 660 aatgccactg gccaatctta tcctggtgtt cctaaattct tcaaatccca ttactggcct 720 acttctccgg tgttcgatac caaggacttc tggtacatca ttctgagtga cattggtatt 780 atttccacac ttacaatcaa ttatttgtgg gcaaagacct atggctccca tgtcatgttg 840 atcaactggt ttgttccatg gttatgggtt aaccactggt tagtatttgt cacatttttg 900 caacacactg acccaaccat gcctcattac gaagccagtg aatggacctt cgctaaaggt 960 gctgctgcca ccattgatag aaactttggc tttgttggtc aacatatttt ccacgatatt 1020 attgaaacgc atgttttgca tcattactgt tcaagaattc ctttctacaa cgctcgtgta 1080 gccactgaag ctattaagaa agttatgggt gaacattatc gttatgaagg cgaaaatatg 1140 tggcaatcat tatggaaggt ggcaagatcc tgtcagtttg tagatggtga caacggtgtt 1200 ttgatgttca gaaacacaaa cggagtcgga gcaccatgtc aagaatga 1248 <210> 64 <211> 415 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis (GenBank Accession No. XM_451551) <220> <221> MISC_FEATURE <223> delta-15 desaturase <400> 64 Met Ser Lys Ser Thr Gly Val Glu His His Ile Ser Gly Val Ala Thr 1 5 10 15 Thr Glu Thr Ala Thr Glu Thr Val Thr Val Pro Pro Ala Lys Thr Ala 20 25 30 Ile Asp Thr His Gly Asn Ile Phe Lys Val Pro Asp Tyr Thr Ile Lys 35 40 45 Asp Ile Leu Gly Ala Ile Pro Lys Glu Cys Tyr Lys Arg Asp Thr Leu 50 55 60 Trp Ser Leu His Tyr Val Val Arg Asp Ile Ile Ala Ile Cys Ile 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PRT <213> Debaryomyces hansenii CBS767 (GenBank Accession No. CAG88182) <220> <221> MISC_FEATURE <223> delta-15 desaturase <400> 67 Met Ser Val Val Asp Leu Thr Ser Thr Thr Ser Gly Ser Ala Ile Asn 1 5 10 15 Ser Ser Asn Ile Ser Gln Arg Gly Asn Gly Ser Thr Ile Val Glu Thr 20 25 30 Lys Lys Gly Pro Ser Ser Asn Leu Lys Ala Ile Asp Thr Phe Gly Asn 35 40 45 Glu Phe Lys Val Pro Asp Tyr Thr Ile Lys Gln Ile Leu Ser Ala Ile 50 55 60 Pro Lys His Cys Tyr Glu Arg Ser Leu Val Arg Ser Leu Gly Tyr Val 65 70 75 80 Ala Arg Asp Ile Thr Met Met Cys Leu Ile Gly Tyr Val Gly Gln Lys 85 90 95 Thr Ile Pro Met Val Gln Ile Ala Asp Gln Glu Gly Leu Ser Thr Ala 100 105 110 Ile Arg Gly Gly Leu Trp Cys Val Tyr Ser Tyr Leu Leu Gly Leu Phe 115 120 125 Gly Phe Gly Leu Trp Ile Leu Ala His Glu Cys Gly His Gly Ala Phe 130 135 140 Ser Asp Tyr Gln Asn Val Asn Asp Val Val Gly Trp Ile Leu His Ser 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Phe Ser His Ser Lys His 165 170 175 His Lys Ala Thr Gly His Leu Thr Lys Asp 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gttcaaggcc aagccgctca tcaccgcgat gcagatctgc 600 cagttcgtgg gcggcttcct gttggtctgg gactacatca acgtcccctg cttcaactcg 660 gacaaaggga agttgttcag ctgggctttc aactatgcat acgtcggctc ggtcttcttg 720 ctcttctgcc actttttcta ccaggacaac ttggcaacga agaaatcggc caaggcgggc 780 aagcagctct ag 792 <210> 70 <211> 263 <212> PRT <213> Isochrysis galbana <400> 70 Met Ala Leu Ala Asn Asp Ala Gly Glu Arg Ile Trp Ala Ala Val Thr 1 5 10 15 Asp Pro Glu Ile Leu Ile Gly Thr Phe Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Pro 20 25 30 Leu Leu Arg Asn Ser Gly Leu Val Asp Glu Lys Lys Gly Ala Tyr Arg 35 40 45 Thr Ser Met Ile Trp Tyr Asn Val Leu Leu Ala Leu Phe Ser Ala Leu 50 55 60 Ser Phe Tyr Val Thr Ala Thr Ala Leu Gly Trp Asp Tyr Gly Thr Gly 65 70 75 80 Ala Trp Leu Arg Arg Gln Thr Gly Asp Thr Pro Gln Pro Leu Phe Gln 85 90 95 Cys Pro Ser Pro Val Trp Asp Ser Lys Leu Phe Thr Trp Thr Ala Lys 100 105 110 Ala Phe Tyr Tyr Ser Lys Tyr Val Glu Tyr Leu Asp Thr Ala Trp Leu 115 120 125 Val Leu Lys Gly Lys Arg Val Ser Phe Leu Gln Ala Phe His His Phe 130 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cggtactgga 240 gcctggctgc gaagacagac cggtgatact ccccagcctc tctttcagtg tccctctcct 300 gtctgggact ccaagctgtt cacctggact gccaaggcct tctactattc taagtacgtg 360 gagtacctcg acaccgcttg gctggtcctc aagggcaagc gagtgtcctt tctgcaggcc 420 ttccatcact ttggagctcc ctgggacgtc tacctcggca ttcgactgca caacgagggt 480 gtgtggatct tcatgttctt taactcgttc attcacacca tcatgtacac ctactatgga 540 ctgactgccg ctggctacaa gttcaaggcc aagcctctga tcactgccat gcagatttgc 600 cagttcgtcg gtggctttct cctggtctgg gactacatca acgttccctg cttcaactct 660 gacaagggca agctgttctc ctgggctttc aactacgcct acgtcggatc tgtctttctc 720 ctgttctgtc acttctttta ccaggacaac ctggccacca agaaatccgc taaggctggt 780 aagcagcttt ag 792 <210> 72 <211> 1275 <212> DNA <213> Euglena gracilis (GenBank Accession Nos. AF139720 and AAD45877) <220> <221> misc_feature <222> (14)..(1273) <223> non-functional delta-8 desaturase <400> 72 attttttttc gaaatgaagt caaagcgcca agcgctatcc cccttacaat tgatggaaca 60 aacatatgat gtggtcaatt tccaccctgg tggtgcggaa attatagaga attaccaagg 120 aagggatgcc actgatgcct tcatggttat gcactttcaa gaagccttcg acaagctcaa 180 gcgcatgccc aaaatcaatc ccagttttga gttgccaccc caggctgcag tgaatgaagc 240 tcaagaggat ttccggaagc tccgagaaga gttgatcgca actggcatgt ttgatgcctc 300 ccccctctgg tactcataca aaatcagcac cacactgggc cttggagtgc tgggttattt 360 cctgatggtt cagtatcaga tgtatttcat tggggcagtg ttgcttggga tgcactatca 420 acagatgggc tggctttctc atgacatttg ccaccaccag actttcaaga accggaactg 480 gaacaacctc gtgggactgg tatttggcaa tggtctgcaa ggtttttccg tgacatgttg 540 gaaggacaga cacaatgcac atcattcggc aaccaatgtt caagggcacg accctgatat 600 tgacaacctc ccccccttag cctggtctga ggatgacgtc acacgggcgt caccgatttc 660 ccgcaagctc attcagttcc agcagtacta tttcttggtc atctgtatct tgttgcggtt 720 catttggtgt ttccagtgcg tgttgaccgt gcgcagtttg 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aattgccatc gtggtcttca tgaaccacta ccctctggag aagatcggtg 960 atcccgtctg ggacggacat ggcttctctg tgggtcagat ccatgagacc atgaacattc 1020 gacgaggcat cattactgac tggttctttg gaggcctgaa ctaccagatc gagcaccatc 1080 tctggcccac cctgcctcga cacaacctca ctgccgtttc ctaccaggtg gaacagctgt 1140 gccagaagca caacctcccc taccgaaacc ctctgcccca tgaaggtctc gtcatcctgc 1200 tccgatacct ggccgtgttc gctcgaatgg ccgagaagca gcccgctggc aaggctctct 1260 aagcggccgc 1270 <210> 76 <211> 1269 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D8S-3: synthetic delta 8-desaturase gene codon-optimized for Yarrowia lipolytica in pDMW261 <400> 76 atgaagtcca agcgacaggc tctgtctccc ctccagctga tggaacagac ctacgacgtc 60 tccgcttggg tgaacttcca ccctggtgga gctgaaatca ttgagaacta ccagggacga 120 gatgctactg acgccttcat ggttatgcac tttcaggaag ccttcgacaa gctcaagcga 180 atgcccaaga tcaacccctc ctttgagctg cctccccagg ctgccgtcaa cgaagctcag 240 gaggatttcc gaaagctccg agaagagctg atcgccactg gcatgtttga cgcctctccc 300 ctctggtact cgtacaagat ctccaccacc ctgggtcttg 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gtt aaa gac gac tcc ccg tcc 536 Phe Val Ile Ala Tyr Val Val Tyr Ala Val Lys Asp Asp Ser Pro Ser 70 75 80 aac gga gga gtg gtc aag cga tac tcg cct att tca aga aac ttc ttc 584 Asn Gly Gly Val Val Lys Arg Tyr Ser Pro Ile Ser Arg Asn Phe Phe 85 90 95 atc tgg aag ctc ttt ggc cgc tac ttc ccc ata act ctg cac aag acg 632 Ile Trp Lys Leu Phe Gly Arg Tyr Phe Pro Ile Thr Leu His Lys Thr 100 105 110 gtg gat ctg gag ccc acg cac aca tac tac cct ctg gac gtc cag gag 680 Val Asp Leu Glu Pro Thr His Thr Tyr Tyr Pro Leu Asp Val Gln Glu 115 120 125 130 tat cac ctg att gct gag aga tac tgg ccg cag aac aag tac ctc cga 728 Tyr His Leu Ile Ala Glu Arg Tyr Trp Pro Gln Asn Lys Tyr Leu Arg 135 140 145 gca atc atc tcc acc atc gag tac ttt ctg ccc gcc ttc atg aaa cgg 776 Ala Ile Ile Ser Thr Ile Glu Tyr Phe Leu Pro Ala Phe Met Lys Arg 150 155 160 tct ctt tct atc aac gag cag gag cag cct gcc gag cga gat cct ctc 824 Ser Leu Ser Ile Asn Glu Gln Glu Gln Pro Ala Glu Arg Asp Pro Leu 165 170 175 ctg tct ccc gtt tct ccc agc tct ccg ggt tct caa cct gac aag tgg 872 Leu Ser Pro Val Ser Pro Ser Ser Pro Gly Ser Gln Pro Asp Lys Trp 180 185 190 att aac cac gac agc aga tat agc cgt gga gaa tca tct ggc tcc aac 920 Ile Asn His Asp Ser Arg Tyr Ser Arg Gly Glu Ser Ser Gly Ser Asn 195 200 205 210 ggc cac gcc tcg ggc tcc gaa ctt aac ggc aac ggc aac aat ggc acc 968 Gly His Ala Ser Gly Ser Glu Leu Asn Gly Asn Gly Asn Asn Gly Thr 215 220 225 act aac cga cga cct ttg tcg tcc gcc tct gct ggc tcc act gca tct 1016 Thr Asn Arg Arg Pro Leu Ser Ser Ala Ser Ala Gly Ser Thr Ala Ser 230 235 240 gat tcc acg ctt ctt aac ggg tcc ctc aac tcc tac gcc aac cag atc 1064 Asp Ser Thr Leu Leu Asn Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Ala Asn Gln Ile 245 250 255 att ggc gaa aac gac cca cag ctg tcg ccc aca aaa ctc aag ccc act 1112 Ile Gly Glu Asn Asp Pro Gln Leu Ser Pro Thr Lys Leu Lys Pro Thr 260 265 270 ggc aga aaa tac atc ttc ggc tac cac ccc cac ggc att atc ggc atg 1160 Gly Arg Lys Tyr Ile Phe Gly Tyr His Pro His Gly Ile Ile Gly Met 275 280 285 290 gga gcc 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2133 <210> 150 <211> 1185 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 150 atgggcgtat tcattaaaca ggagcagctt ccggctctca agaagtacaa gtactccgcc 60 gaggatcact cgttcatctc caacaacatt ctgcgcccct tctggcgaca gtttgtcaaa 120 atcttccctc tgtggatggc ccccaacatg gtgactctgt tgggcttctt ctttgtcatt 180 gtgaacttca tcaccatgct cattgttgat cccacccacg accgcgagcc tcccagatgg 240 gtctacctca cctacgctct gggtctgttc ctttaccaga catttgatgc ctgtgacgga 300 tcccatgccc gacgaactgg ccagagtgga ccccttggag agctgtttga ccactgtgtc 360 gacgccatga atacctctct gattctcacg gtggtggtgt ccaccaccca tatgggatat 420 aacatgaagc tgctgattgt gcagattgcc gctctcggaa acttctacct gtcgacctgg 480 gagacctacc ataccggaac tctgtacctt tctggcttct ctggtcctgt tgaaggtatc 540 ttgattctgg tggctctttt cgtcctcacc ttcttcactg gtcccaacgt gtacgctctg 600 accgtctacg aggctcttcc cgaatccatc acttcgctgc tgcctgccag cttcctggac 660 gtcaccatca cccagatcta cattggattc ggagtgctgg gcatggtgtt caacatctac 720 ggcgcctgcg gaaacgtgat caagtactac aacaacaagg gcaagagcgc tctccccgcc 780 attctcggaa tcgccccctt tggcatcttc tacgtcggcg tctttgcctg ggcccatgtt 840 gctcctctgc ttctctccaa gtacgccatc gtctatctgt ttgccattgg ggctgccttt 900 gccatgcaag tcggccagat gattcttgcc catctcgtgc ttgctccctt cccccactgg 960 aacgtgctgc tcttcttccc ctttgtggga ctggcagtgc actacattgc acccgtgttt 1020 ggctgggacg ccgatatcgt gtcggttaac actctcttca cctgttttgg cgccaccctc 1080 tccatttacg ccttctttgt gcttgagatc atcgacgaga tcaccaacta cctcgatatc 1140 tggtgtctgc gaatcaagta ccctcaggag aagaagactg agtaa 1185 <210> 151 <211> 394 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <400> 151 Met Gly Val Phe Ile Lys Gln Glu Gln Leu Pro Ala Leu Lys Lys Tyr 1 5 10 15 Lys Tyr Ser Ala Glu Asp His Ser Phe Ile Ser Asn Asn Ile Leu Arg 20 25 30 Pro Phe Trp Arg Gln Phe Val Lys Ile Phe Pro Leu Trp Met Ala Pro 35 40 45 Asn Met Val Thr Leu Leu Gly Phe Phe Phe Val Ile Val Asn Phe Ile 50 55 60 Thr Met Leu Ile Val Asp Pro Thr His Asp Arg Glu Pro Pro Arg Trp 65 70 75 80 Val Tyr Leu Thr Tyr Ala Leu Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Thr Phe Asp 85 90 95 Ala Cys Asp Gly Ser His Ala Arg Arg Thr Gly Gln Ser Gly Pro Leu 100 105 110 Gly Glu Leu Phe Asp His Cys Val Asp Ala Met Asn Thr Ser Leu Ile 115 120 125 Leu Thr Val Val Val Ser Thr Thr His Met Gly Tyr Asn Met Lys Leu 130 135 140 Leu Ile Val Gln Ile Ala Ala Leu Gly Asn Phe Tyr Leu Ser Thr Trp 145 150 155 160 Glu Thr Tyr His Thr Gly Thr Leu Tyr Leu Ser Gly Phe Ser Gly Pro 165 170 175 Val Glu Gly Ile Leu Ile Leu Val Ala Leu Phe Val Leu Thr Phe Phe 180 185 190 Thr Gly Pro Asn Val Tyr Ala Leu Thr Val Tyr Glu Ala Leu Pro Glu 195 200 205 Ser Ile Thr Ser Leu Leu Pro Ala Ser Phe Leu Asp Val Thr Ile Thr 210 215 220 Gln Ile Tyr Ile Gly Phe Gly Val Leu Gly Met Val Phe Asn Ile Tyr 225 230 235 240 Gly Ala Cys Gly Asn Val Ile Lys Tyr Tyr Asn Asn Lys Gly Lys Ser 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Ile Leu Gly Ile Ala Pro Phe Gly Ile Phe Tyr Val 260 265 270 Gly Val Phe Ala Trp Ala His Val Ala Pro Leu Leu Leu Ser Lys Tyr 275 280 285 Ala Ile Val Tyr Leu Phe Ala Ile Gly Ala Ala Phe Ala Met Gln Val 290 295 300 Gly Gln Met Ile Leu Ala His Leu Val Leu Ala Pro Phe Pro His Trp 305 310 315 320 Asn Val Leu Leu Phe Phe Pro Phe Val Gly Leu Ala Val His Tyr Ile 325 330 335 Ala Pro Val Phe Gly Trp Asp Ala Asp Ile Val Ser Val Asn Thr Leu 340 345 350 Phe Thr Cys Phe Gly Ala Thr Leu Ser Ile Tyr Ala Phe Phe Val Leu 355 360 365 Glu Ile Ile Asp Glu Ile Thr Asn Tyr Leu Asp Ile Trp Cys Leu Arg 370 375 380 Ile Lys Tyr Pro Gln Glu Lys Lys Thr Glu 385 390 <210> 152 <211> 1434 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 152 atgtacaaca gaaaagacag agatgttcac gagaggaagg aagatggtca atctgagttt 60 gaagcactga acgggaccaa cgcaattatg tccgataata gtaaagcgta ttccataaag 120 tttctgacct tcaatacatg ggggttaaaa tacgtctcca aacaccgtaa agaaagactc 180 agagcaattg ctgataaatt ggcgggccac tcaatgctta cgccaatatc tgacgagttg 240 ttgcccaatg gtggagatag taatgaaaac gaagattacg acgtgattgc cttacaagaa 300 atctggtgtg tggaagactg gaagtatcta gcttctgcgt gtgcctccaa gtatccgtat 360 cagcgtttgt tccattctgg tattctgacg gggcctgggt tggccatact gtccaaggtc 420 ccgatagagt cgacctttct ttaccggttc ccgataaacg gtagaccgag tgcggtgttc 480 cgtggcgact ggtacgtagg gaaatctata gcaatcaccg tattgaacac aggaacccgc 540 cccattgcaa taatgaacag tcacatgcac gccccatacg ccaagcaggg tgatgccgcc 600 tacttgtgcc acagatcttg tcaggcctgg gatttcagca ggctcattaa gctttacagg 660 caggccggtt atgcggtgat tgtggtgggt gacttaaact ccagaccggg ctcactgccc 720 cacaaatttc tcacgcagga ggccggcctg gtcgactcct gggagcaatt gcatgggaag 780 caagacttgg cggtgatcgc tcgtctgtct ccattgcaac aattgcttaa gggctgtacc 840 acgtgcgatt cgctgctcaa cacatggagg gcccaaagac aacccgatga ggcatgcagg 900 ttggattatg ctcttatcga ccctgatttc ttgcaaacag tagacgcagg tgtcaggttc 960 actgaacgga tccctcacct ggactgcagt gtctctgacc attttgcata ctcatgcacc 1020 cttaacatcg tcccacaggg cacagagtcc cgtccatcca cctccgttaa gcgtgcgaag 1080 actcatgata gagagctgat cttgcagaga tactccaact acgaaaccat gatagaatgc 1140 atccacacgt acttgaagac agcccaaaga cagaaatttt tccgtggcct acatttctgg 1200 gcctcaatac ttctcctaat agcgtcgttg gtcgtgacaa cgtttactgc aaacaaggca 1260 ggctggtcct ccatcttctg ggtccttttc gctattgctg tctccatctc gggcaccatc 1320 gacggtgcca tctccttctt gtttggcagg tctgaaatca gagccctcat cgaagtcgaa 1380 caagaggttc tggacgcgga gcaccacctg caaactttct tgagcgagaa atga 1434 <210> 153 <211> 477 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae (GenBank Accession No. NP_010935) <400> 153 Met Tyr Asn Arg Lys Asp Arg Asp Val His Glu Arg Lys Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gln Ser Glu Phe Glu Ala Leu Asn Gly Thr Asn Ala Ile Met Ser Asp 20 25 30 Asn Ser Lys Ala Tyr Ser Ile Lys Phe Leu Thr Phe Asn Thr Trp Gly 35 40 45 Leu Lys Tyr Val Ser Lys His Arg Lys Glu Arg Leu Arg Ala Ile Ala 50 55 60 Asp Lys Leu Ala Gly His Ser Met Leu Thr Pro Ile Ser Asp Glu Leu 65 70 75 80 Leu Pro Asn Gly Gly Asp Ser Asn Glu Asn Glu Asp Tyr Asp Val Ile 85 90 95 Ala Leu Gln Glu Ile Trp Cys Val Glu Asp Trp Lys Tyr Leu Ala Ser 100 105 110 Ala Cys Ala Ser Lys Tyr Pro Tyr Gln Arg Leu Phe His Ser Gly Ile 115 120 125 Leu Thr Gly Pro Gly Leu Ala Ile Leu Ser Lys Val Pro Ile Glu Ser 130 135 140 Thr Phe Leu Tyr Arg Phe Pro Ile Asn Gly Arg Pro Ser Ala Val Phe 145 150 155 160 Arg Gly Asp Trp Tyr Val Gly Lys Ser Ile Ala Ile Thr Val Leu Asn 165 170 175 Thr Gly Thr Arg Pro Ile Ala Ile Met Asn Ser His Met His Ala Pro 180 185 190 Tyr Ala Lys Gln Gly Asp Ala Ala Tyr Leu Cys His Arg Ser Cys Gln 195 200 205 Ala Trp Asp Phe Ser Arg Leu Ile Lys Leu Tyr Arg Gln Ala Gly Tyr 210 215 220 Ala Val Ile Val Val Gly Asp Leu Asn Ser Arg Pro Gly Ser Leu Pro 225 230 235 240 His Lys Phe Leu Thr Gln Glu Ala Gly Leu Val Asp Ser Trp Glu Gln 245 250 255 Leu His Gly Lys Gln Asp Leu Ala Val Ile Ala Arg Leu Ser Pro Leu 260 265 270 Gln Gln Leu Leu Lys Gly Cys Thr Thr Cys Asp Ser Leu Leu Asn Thr 275 280 285 Trp Arg Ala Gln Arg Gln Pro Asp Glu Ala Cys Arg Leu Asp Tyr Ala 290 295 300 Leu Ile Asp Pro Asp Phe Leu Gln Thr Val Asp Ala Gly Val Arg Phe 305 310 315 320 Thr Glu Arg Ile Pro His Leu Asp Cys Ser Val Ser Asp His Phe Ala 325 330 335 Tyr Ser Cys Thr Leu Asn Ile Val Pro Gln Gly Thr Glu Ser Arg Pro 340 345 350 Ser Thr Ser Val Lys Arg Ala Lys Thr His Asp Arg Glu Leu Ile Leu 355 360 365 Gln Arg Tyr Ser Asn Tyr Glu Thr Met Ile Glu Cys Ile His Thr Tyr 370 375 380 Leu Lys Thr Ala Gln Arg Gln Lys Phe Phe Arg Gly Leu His Phe Trp 385 390 395 400 Ala Ser Ile Leu Leu Leu Ile Ala Ser Leu Val Val Thr Thr Phe Thr 405 410 415 Ala Asn Lys Ala Gly Trp Ser Ser Ile Phe Trp Val Leu Phe Ala Ile 420 425 430 Ala Val Ser Ile Ser Gly Thr Ile Asp Gly Ala Ile Ser Phe Leu Phe 435 440 445 Gly Arg Ser Glu Ile Arg Ala Leu Ile Glu Val Glu Gln Glu Val Leu 450 455 460 Asp Ala Glu His His Leu Gln Thr Phe Leu Ser Glu Lys 465 470 475 <210> 154 <211> 8953 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid pY5-30 <400> 154 ggtggagctc cagcttttgt tccctttagt gagggttaat ttcgagcttg gcgtaatcat 60 ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag 120 ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg 180 cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa 240 tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 300 ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 360 taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 420 agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 480 cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 540 tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 600 tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 660 gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 720 acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 780 acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 840 cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 900 gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 960 gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 1020 agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 1080 ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 1140 ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 1200 atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 1260 tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 1320 gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg 1380 ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg 1440 caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt 1500 cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct 1560 cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 1620 cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta 1680 agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca 1740 tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat 1800 agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac 1860 atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa 1920 ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt 1980 cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg 2040 caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat 2100 attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt 2160 agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgcgc 2220 cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac 2280 ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg 2340 ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt 2400 tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc 2460 cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 2520 tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga 2580 ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga 2640 attttaacaa aatattaacg cttacaattt ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg 2700 ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc 2760 tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac 2820 ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggtaccgggc cccccctcga 2880 ggtcgatggt gtcgataagc ttgatatcga attcatgtca cacaaaccga tcttcgcctc 2940 aaggaaacct aattctacat ccgagagact gccgagatcc agtctacact gattaatttt 3000 cgggccaata atttaaaaaa atcgtgttat ataatattat atgtattata tatatacatc 3060 atgatgatac tgacagtcat gtcccattgc taaatagaca gactccatct gccgcctcca 3120 actgatgttc tcaatattta aggggtcatc tcgcattgtt taataataaa cagactccat 3180 ctaccgcctc caaatgatgt tctcaaaata tattgtatga acttattttt attacttagt 3240 attattagac aacttacttg ctttatgaaa aacacttcct atttaggaaa caatttataa 3300 tggcagttcg ttcatttaac aatttatgta gaataaatgt tataaatgcg tatgggaaat 3360 cttaaatatg gatagcataa atgatatctg cattgcctaa ttcgaaatca acagcaacga 3420 aaaaaatccc ttgtacaaca taaatagtca tcgagaaata tcaactatca aagaacagct 3480 attcacacgt tactattgag attattattg gacgagaatc acacactcaa ctgtctttct 3540 ctcttctaga aatacaggta caagtatgta ctattctcat tgttcatact tctagtcatt 3600 tcatcccaca tattccttgg atttctctcc aatgaatgac attctatctt gcaaattcaa 3660 caattataat aagatatacc aaagtagcgg tatagtggca atcaaaaagc ttctctggtg 3720 tgcttctcgt atttattttt attctaatga tccattaaag gtatatattt atttcttgtt 3780 atataatcct tttgtttatt acatgggctg gatacataaa ggtattttga tttaattttt 3840 tgcttaaatt caatcccccc tcgttcagtg tcaactgtaa tggtaggaaa ttaccatact 3900 tttgaagaag caaaaaaaat gaaagaaaaa aaaaatcgta tttccaggtt agacgttccg 3960 cagaatctag aatgcggtat gcggtacatt gttcttcgaa cgtaaaagtt gcgctccctg 4020 agatattgta catttttgct tttacaagta caagtacatc gtacaactat gtactactgt 4080 tgatgcatcc acaacagttt gttttgtttt tttttgtttt ttttttttct aatgattcat 4140 taccgctatg tatacctact tgtacttgta gtaagccggg ttattggcgt tcaattaatc 4200 atagacttat gaatctgcac ggtgtgcgct gcgagttact tttagcttat gcatgctact 4260 tgggtgtaat attgggatct gttcggaaat caacggatgc tcaaccgatt tcgacagtaa 4320 taatttgaat cgaatcggag cctaaaatga acccgagtat atctcataaa attctcggtg 4380 agaggtctgt gactgtcagt acaaggtgcc ttcattatgc cctcaacctt accatacctc 4440 actgaatgta gtgtacctct aaaaatgaaa tacagtgcca aaagccaagg cactgagctc 4500 gtctaacgga cttgatatac aaccaattaa aacaaatgaa aagaaataca gttctttgta 4560 tcatttgtaa caattaccct gtacaaacta aggtattgaa atcccacaat attcccaaag 4620 tccacccctt tccaaattgt catgcctaca actcatatac caagcactaa cctaccaaac 4680 accactaaaa ccccacaaaa tatatcttac cgaatataca gtaacaagct accaccacac 4740 tcgttgggtg cagtcgccag cttaaagata tctatccaca tcagccacaa ctcccttcct 4800 ttaataaacc gactacaccc ttggctattg aggttatgag tgaatatact gtagacaaga 4860 cactttcaag aagactgttt ccaaaacgta ccactgtcct ccactacaaa cacacccaat 4920 ctgcttcttc tagtcaaggt tgctacaccg gtaaattata aatcatcatt tcattagcag 4980 ggcagggccc tttttataga gtcttataca ctagcggacc ctgccggtag accaacccgc 5040 aggcgcgtca gtttgctcct tccatcaatg cgtcgtagaa acgacttact ccttcttgag 5100 cagctccttg accttgttgg caacaagtct ccgacctcgg aggtggagga agagcctccg 5160 atatcggcgg tagtgatacc agcctcgacg gactccttga cggcagcctc aacagcgtca 5220 ccggcgggct tcatgttaag agagaacttg agcatcatgg cggcagacag aatggtggca 5280 atggggttga ccttctgctt gccgagatcg ggggcagatc cgtgacaggg ctcgtacaga 5340 ccgaacgcct cgttggtgtc gggcagagaa gccagagagg cggagggcag cagacccaga 5400 gaaccgggga tgacggaggc ctcgtcggag atgatatcgc caaacatgtt ggtggtgatg 5460 atgataccat tcatcttgga gggctgcttg atgaggatca tggcggccga gtcgatcagc 5520 tggtggttga gctcgagctg ggggaattcg tccttgagga ctcgagtgac agtctttcgc 5580 caaagtcgag aggaggccag cacgttggcc ttgtcaagag accacacggg aagagggggg 5640 ttgtgctgaa gggccaggaa ggcggccatt cgggcaattc gctcaacctc aggaacggag 5700 taggtctcgg tgtcggaagc gacgccagat ccgtcatcct cctttcgctc tccaaagtag 5760 atacctccga cgagctctcg gacaatgatg aagtcggtgc cctcaacgtt tcggatgggg 5820 gagagatcgg cgagcttggg cgacagcagc tggcagggtc gcaggttggc gtacaggttc 5880 aggtcctttc gcagcttgag gagaccctgc tcgggtcgca cgtcggttcg tccgtcggga 5940 gtggtccata cggtgttggc agcgcctccg acagcaccga gcataataga gtcagccttt 6000 cggcagatgt cgagagtagc gtcggtgatg ggctcgccct ccttctcaat ggcagctcct 6060 ccaatgagtc ggtcctcaaa cacaaactcg gtgccggagg cctcagcaac agacttgagc 6120 accttgacgg cctcggcaat cacctcgggg ccacagaagt cgccgccgag aagaacaatc 6180 ttcttggagt cagtcttggt cttcttagtt tcgggttcca ttgtggatgt gtgtggttgt 6240 atgtgtgatg tggtgtgtgg agtgaaaatc tgtggctggc aaacgctctt gtatatatac 6300 gcacttttgc ccgtgctatg tggaagacta aacctccgaa gattgtgact caggtagtgc 6360 ggtatcggct agggacccaa accttgtcga tgccgatagc gctatcgaac gtaccccagc 6420 cggccgggag tatgtcggag gggacatacg agatcgtcaa gggtttgtgg ccaactggta 6480 aataaatgat gtcgactcag gcgacgacgg aattcctgca gcccatctgc agaattcagg 6540 agagaccggg ttggcggcgt atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 6600 cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttcacc ccacatatca 6660 aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 6720 cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 6780 gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 6840 aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 6900 cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaccatgg atggtacgtc 6960 ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca ttcagtctgg 7020 atcgcgaaaa ctgtggaatt 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atggtgcacg accacgcatt aatggactgg attggggcca 7920 actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg gcagatgaac 7980 atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct ttaggcattg 8040 gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc aacggggaaa 8100 ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa aaccacccaa 8160 gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaagtg cacgggaata 8220 tttcgccact ggcggaagca acgcgtaaac tcgacccgac gcgtccgatc acctgcgtca 8280 atgtaatgtt ctgcgacgct cacaccgata ccatcagcga tctctttgat gtgctgtgcc 8340 tgaaccgtta ttacggatgg tatgtccaaa gcggcgattt ggaaacggca gagaaggtac 8400 tggaaaaaga acttctggcc tggcaggaga aactgcatca gccgattatc atcaccgaat 8460 acggcgtgga tacgttagcc gggctgcact caatgtacac cgacatgtgg agtgaagagt 8520 atcagtgtgc atggctggat atgtatcacc gcgtctttga tcgcgtcagc gccgtcgtcg 8580 gtgaacaggt atggaatttc gccgattttg cgacctcgca aggcatattg cgcgttggcg 8640 gtaacaagaa agggatcttc actcgcgacc gcaaaccgaa gtcggcggct tttctgctgc 8700 aaaaacgctg gactggcatg 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Yarrowia lipolytica <400> 216 caacttttct tgtcgacctg agataccgag gttgcgcagg ggatcaactt ttgtgtctca 60 gagggaccca agtgcgtacg gagagtacag tacatactgt agctaacggt agcaggcgaa 120 ctactggtac atacctcccc cggaatatgt acaggcataa tgcgtatctg tgggacatgt 180 ggtcgttgcg ccattatgta agcagcgtgt actcctctga ctgtccatat ggtttgctcc 240 atctcaccct catcgttttc attgttcaca ggcggccaca aaaaaactgt cttctctcct 300 tctctcttcg ccttagtcta ctcggaccag ttttagttta gcttggcgcc actggataaa 360 tgagacctca ggccttgtga tgaggaggtc acttatgaag catgttagga ggtgcttgta 420 tggatagaga agcacccaaa ataataagaa taataataaa acagggggcg ttgtcatttc 480 atatcgtgtt ttcaccatca atacacctcc aaacaatgcc cttcatgtgg ccagccccaa 540 tattgtcctg tagttcaact ctatgcagct cgtatcttat tgagcaagta aaactctgtc 600 agccgatatt gcccgacccg cgacaagggt caacaaggtg gtgtaaggcc ttcgcagaag 660 tcaaaactgt gccaaacaaa catctagagt ctctttggtg tttctcgcat atatttaatc 720 ggctgtctta cgtatttggc ctcggtaccg gactaatttc ggatcatccc caatacgctt 780 tttcttcgca gctgtcaaca gtgtccatga tctatccacc taaatgggtc 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tttacggatc agcaataagg ttccttctcc 780 tagtttccac gtccatatat atctatgctg cgtcgtcctt ttcgtgacat caccaaaaca 840 catacaacca tggctgttac tgacgtcctt aagcgaaagt ccggtgtcat cgtcggcgac 900 gatgtccgag ccgtgagtat ccacgacaag atcagtgtcg agacgacgcg ttttgtgtaa 960 tgacacaatc cgaaagtcgc tagcaacaca cactctctac acaaactaac ccagctctcc 1020 <210> 220 <211> 1052 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPM::GPDIN chimeric Yarrowia lipolytica promoter <400> 220 gtcgaccatt aattctcacg tgacacagat tattaacgtc tcgtaccaac cacagattac 60 gacccattcg cagtcacagt tcactagggt ttgggttgca tccgttgaga gcggtttgtt 120 tttaaccttc tccatgtgct cactcaggtt ttgggttcag atcaaatcaa ggcgtgaacc 180 actttgtttg aggacaaatg tgacacaacc aaccagtgtc aggggcaagt ccgtgacaaa 240 ggggaagata caatgcaatt actgacagtt acagactgcc tcgatgccct aaccttgccc 300 caaaataaga caactgtcct cgtttaagcg caaccctatt cagcgtcacg tcataatagc 360 gtttggatag cactagtcta tgaggagcgt tttatgttgc ggtgagggcg attggtgctc 420 atatgggttc aattgaggtg gcggaacgag cttagtcttc aattgaggtg cgagcgacac 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ctgctgtgtg ctgtgtgtgt gtgttgtttg gcgctcattg ttgcgttatg cagcgtacac 240 cacaatattg gaagcttatt agcctttcta ttttttcgtt tgcaaggctt aacaacattg 300 ctgtggagag ggatggggat atggaggccg ctggagggag tcggagaggc gttttggagc 360 ggcttggcct ggcgcccagc tcgcgaaacg cacctaggac cctttggcac gccgaaatgt 420 gccacttttc agtctagtaa cgccttacct acgtcattcc atgcatgcat gtttgcgcct 480 tttttccctt gcccttgatc gccacacagt acagtgcact gtacagtgga ggttttgggg 540 gggtcttaga tgggagctaa aagcggccta gcggtacact agtgggattg tatggagtgg 600 catggagcct aggtggagcc tgacaggacg cacgaccggc tagcccgtga cagacgatgg 660 gtggctcctg ttgtccaccg cgtacaaatg tttgggccaa agtcttgtca gccttgcttg 720 cgaacctaat tcccaatttt gtcacttcgc acccccattg atcgagccct aacccctgcc 780 catcaggcaa tccaattaag ctcgcattgt ctgccttgtt tagtttggct cctgcccgtt 840 tcggcgtcca cttgcacaaa cacaaacaag cattatatat aaggctcgtc tctccctccc 900 aaccacactc acttttttgc ccgtcttccc ttgctaacac aaaagtcaag aacacaaaca 960 accaccccaa cccccttaca cacaagacat atctacagca 1000 <210> 222 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His Box 1 <400> 222 His Glu Cys Gly His 1 5 <210> 223 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta-15 desaturase motif <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 223 Ile Xaa Xaa His Glu Cys Gly His 1 5 <210> 224 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta-12 desaturase motif <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 224 Val Xaa Xaa His Glu Cys Gly His 1 5 <210> 225 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL211 <400> 225 tttgtcgacg cagtaggatg tcctgcacgg 30 <210> 226 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL212 <400> 226 tttccatggt tgatgtgtgt ttaattcaag aatg 34 <210> 227 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL376 <400> 227 aatctgcagt ggtgcaaacg gggcgga 27 <210> 228 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL377 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Artificial Sequence <220> <223> Primer ODMW341 <400> 236 tttgtcgacg tttaaacagt gtacgcagta ctatagagg 39 <210> 237 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 27203-F <400> 237 gatcgtcgac ataagtttgc aaaaagatcg ta 32 <210> 238 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 27203-R <400> 238 gatcccatgg ttgtgaatta gggtggtgag aatg 34 <210> 239 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL-URA-16F <400> 239 gctcgagcta acgtccacaa g 21 <210> 240 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL-URA-78R <400> 240 cttggctgcc acgagctt 18 <210> 241 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GUS-767F <400> 241 ccaaaagcca gacagagtgt ga 22 <210> 242 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GUS-891R <400> 242 ttcatgacga ccaaagccag ta 22 <210> 243 <211> 2987 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> misc_feature <223> mutant acetohydroxyacid synthase (AHAS) with W497L mutation 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atcttccacg agatgatgct gcgacacaac gtcgacactg tcttcggtta 900 ccccggtgga gccattctcc ccgtctttga cgccattcac aactctgagt acttcaactt 960 tgtgctccct cgacacgagc agggtgccgg ccacatggcc gagggctacg ctcgagcctc 1020 tggtaagccc ggtgtcgttc tcgtcacctc tggccccggt gccaccaacg tcatcacccc 1080 catgcaggac gctctttccg atggtacccc catggttgtc ttcaccggtc aggtcctgac 1140 ctccgttatc ggcactgacg ccttccagga ggccgatgtt gtcggcatct cccgatcttg 1200 caccaagtgg aacgtcatgg tcaagaacgt tgctgagctc ccccgacgaa tcaacgaggc 1260 ctttgagatt gctacttccg gccgacccgg tcccgttctc gtcgatctgc ccaaggatgt 1320 tactgctgcc atcctgcgag agcccatccc caccaagtcc accattccct cgcattctct 1380 gaccaacctc acctctgccg ccgccaccga gttccagaag caggctatcc agcgagccgc 1440 caacctcatc aaccagtcca agaagcccgt cctttacgtc ggacagggta tccttggctc 1500 cgaggagggt cctaagctgc ttaaggagct ggctgagaag gccgagattc ccgtcaccac 1560 tactctgcag ggtcttggtg cctttgacga gcgagacccc aagtctctgc acatgctcgg 1620 tatgcacggt tccggctacg ccaacatggc catgcagaac gctgactgta tcattgctct 1680 cggcgcccga tttgatgacc gagttaccgg ctccatcccc aagtttgccc ccgaggctcg 1740 agccgctgcc cttgagggtc gaggtggtat tgttcacttt gagatccagg ccaagaacat 1800 caacaaggtt gttcaggcca ccgaagccgt tgagggagac gttaccgagt ctgtccgaca 1860 gctcatcccc ctcatcaaca aggtctctgc cgctgagcga gctccctgga ctgagactat 1920 ccagtcctgg aagcagcagt tccccttcct cttcgaggct gaaggtgagg atggtgttat 1980 caagccccag tccgtcattg ctctgctctc tgacctgaca gagaacaaca aggacaagac 2040 catcatcacc accggtgttg gtcagcatca gatgtggact gcccagcatt tccgatggcg 2100 acaccctcga accatgatca cttctggtgg tcttggaact atgggttacg gcctgcccgc 2160 cgctatcggc gccaaggttg cccgacctga ctgcgacgtc attgacatcg atggtgacgc 2220 ttctttcaac atgactctga ccgagctgtc caccgccgtt cagttcaaca ttggcgtcaa 2280 ggctattgtc ctcaacaacg aggaacaggg tatggtcacc cagctgcagt ctctcttcta 2340 cgagaaccga tactgccaca ctcatcagaa gaaccccgac ttcatgaagc tggccgagtc 2400 catgggcatg aagggtatcc gaatcactca cattgaccag ctggaggccg gtctcaagga 2460 gatgctcgca tacaagggcc ctgtgctcgt tgaggttgtt gtcgacaaga agatccccgt 2520 tcttcccatg 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ggattcatga ccaca 25 <210> 248 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 414 <400> 248 ctggtaaata aatgatgttc cctagtccca gtgtacaccc gccg 44 <210> 249 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 415 <400> 249 tatgcttccg gctcgtacga ggtgtgctgg attcatgacc ac 42 <210> 250 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-1A <400> 250 ggtcggcttc gacgagaccg tcactatgga caccgtccga aaccacaaca tgcccgacga 60 tgcctggtgc gctatccacg gcaccgtgta cgacatcacc aagtt 105 <210> 251 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-1B <400> 251 ggagaacttg gtgatgtcgt acacggtgcc gtggatagcg caccaggcat cgtcgggcat 60 gttgtggttt cggacggtgt ccatagtgac ggtctcgtcg aagccga 107 <210> 252 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-2A <400> 252 ctccaaggtg catcctggtg gagacattat catgctggcc gctggcaagg aggccaccat 60 cctgttcgag acctaccaca tcaagggtgt tcccgacgct gtcctgc 107 <210> 253 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-2B <400> 253 tttcgcagga cagcgtcggg aacacccttg atgtggtagg tctcgaacag gatggtggcc 60 tccttgccag cggccagcat gataatgtct ccaccaggat gcacctt 107 <210> 254 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-3A <400> 254 gaaagtacaa ggtcggcaag ctccctcagg gcaagaaggg tgagacctcc cacatgccca 60 ccggactcga ctctgcctcc tactactcct gggactctga gttcta 106 <210> 255 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-3B <400> 255 tcggtagaac tcagagtccc aggagtagta ggaggcagag tcgagtccgg tgggcatgtg 60 ggaggtctca cccttcttgc cctgagggag cttgccgacc ttgtac 106 <210> 256 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-4A <400> 256 ccgagtcctc cgagagcgag tcgccaagaa gctggccgag cccggtctca tgcagcgagc 60 tcgaatggag ctctgggcca aggctatctt tctcctggct ggtttc 106 <210> 257 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-4B <400> 257 cagaaaccag ccaggagaaa gatagccttg gcccagagct ccattcgagc tcgctgcatg 60 agaccgggct cggccagctt cttggcgact 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agcgtacagg t 91 <210> 268 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-10A <400> 268 ttcagatcga cgccaactgc cgatatggct ctccctggaa cgtggctcga ttctggatca 60 tgaagctcct gaccactctc tacatggtg 89 <210> 269 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-10B <400> 269 gagccaccat gtagagagtg gtcaggagct tcatgatcca gaatcgagcc acgttccagg 60 gagagccata tcggcagttg gcgtcgatc 89 <210> 270 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-11A <400> 270 gctctgccca tgtacatgca gggacccgct cagggtctga agctgttctt tatggctcac 60 ttcacctgcg gagaggtcct cgcc 84 <210> 271 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-11B <400> 271 tggtggcgag gacctctccg caggtgaagt gagccataaa gaacagcttc agaccctgag 60 cgggtccctg catgtacatg ggca 84 <210> 272 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-12A <400> 272 accatgttca ttgttaacca cattatcgag ggtgtctcct acgcctccaa ggacgctgtc 60 aagggcgtca tggctcctcc ccgaa 85 <210> 273 <211> 83 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<220> <223> Primer D4-15A <400> 278 accaccagat tgagcaccat tgctttcctc agaaccccca caccgtcaac gtctacatct 60 ccggcatcgt caaggagacc tgcgaggagt acggcgtgc 99 <210> 279 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-15B <400> 279 tagggcacgc cgtactcctc gcaggtctcc ttgacgatgc cggagatgta gacgttgacg 60 gtgtgggggt tctgaggaaa gcaatggtgc tcaatctgg 99 <210> 280 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-16A <400> 280 cctaccaggc tgagatctcc ctcttctctg cctatttcaa gatgctgtcc cacctccgaa 60 ccctcggcaa cgaggacctc accgcctggt ccacc 95 <210> 281 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-16B <400> 281 ttaggtggac caggcggtga ggtcctcgtt gccgagggtt cggaggtggg acagcatctt 60 gaaataggca gagaagaggg agatctcagc ctgg 94 <210> 282 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-1F <400> 282 ttccatggtc ggcttcgacg agaccgtc 28 <210> 283 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D4-4R <400> 283 ttggatcccc agaaaccagc 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Primer IL3-5B <400> 301 aatgaacgag ttaaagaaca tgaagatcca cacaccctcg ttgtgcagtc gaatgccgag 60 gtagacgtcc cagggagctc caaagtgat 89 <210> 302 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IL3-6A <400> 302 cattcacacc atcatgtaca cctactatgg actgactgcc gctggctaca agttcaaggc 60 caagcctctg atcactgcca tgcagatttg c 91 <210> 303 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IL3-6B <400> 303 actggcaaat ctgcatggca gtgatcagag gcttggcctt gaacttgtag ccagcggcag 60 tcagtccata gtaggtgtac atgatggtgt g 91 <210> 304 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IL3-7A <400> 304 cagttcgtcg gtggctttct cctggtctgg gactacatca acgttccctg cttcaactct 60 gacaagggca agctgttctc ctgggctttc aact 94 <210> 305 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IL3-7B <400> 305 gcgtagttga aagcccagga gaacagcttg cccttgtcag agttgaagca gggaacgttg 60 atgtagtccc agaccaggag aaagccaccg acga 94 <210> 306 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IL3-8A <400> 306 acgcctacgt cggatctgtc tttctcctgt tctgtcactt cttttaccag gacaacctgg 60 ccaccaagaa atccgctaag gctggtaagc a 91 <210> 307 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IL3-8B <400> 307 aagctgctta ccagccttag cggatttctt ggtggccagg ttgtcctggt aaaagaagtg 60 acagaacagg agaaagacag atccgacgta g 91 <210> 308 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IL3-1F <400> 308 tttccatggc tctggccaac gacgctggcg agcgaatctg g 41 <210> 309 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IL3-4R <400> 309 tttctgcaga aaggacactc gcttgccctt gaggac 36 <210> 310 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IL3-5F <400> 310 tttctgcagg ccttccatca ctttggagct ccctgggacg t 41 <210> 311 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IL3-8R <400> 311 tttgcggccg ctaaagctgc ttaccagcct tagcggattt ct 42 <210> 312 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 417 bp NcoI/PstI fragment pT9(1-4) <400> 312 catggctctg 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Sequence <220> <223> Primer D8-13A <400> 338 ctgccccatg aaggtctcgt catcctgctc cgatacctgg ccgtgttcgc tcgaatggcc 60 gagaagcagc ccgctggcaa ggctctctaa 90 <210> 339 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D8-13B <400> 339 ccgcttagag agccttgcca gcgggctgct tctcggccat tcgagcgaac acggccaggt 60 atcggagcag gatgacgaga ccttcatggg 90 <210> 340 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D8-1F <400> 340 tttccatgga gtccaagcga caggctctgt ctcccctc 38 <210> 341 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D8-3R <400> 341 tttagatctt gtacgagtac cagaggggag aggcgtc 37 <210> 342 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D8-4F <400> 342 acaagatctc caccaccctg ggtcttggcg tgcttggata c 41 <210> 343 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D8-6R <400> 343 tttctcgagt gacatcgtcc tcggaccagg cgaggggagg cag 43 <210> 344 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D8-7F <400> 344 tcactcgagc ttctcccatc tcccgaaagc tc 32 <210> 345 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D8-9R <400> 345 cgacgagctc ggaaacaaag aacaccagg 29 <210> 346 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D8-10F <400> 346 tttgagctcg tcggtggctt cggaattgcc atcgtggtc 39 <210> 347 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer D8-13R <400> 347 tttgcggccg cttagagagc cttgccagcg ggctgc 36 <210> 348 <211> 309 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 309 bp NcoI/BglII fragment of pT8(1-3) <400> 348 catggagtcc aagcgacagg ctctgtctcc cctccagctg atggaacaga cctacgacgt 60 cgtgaacttc caccctggtg gagctgaaat cattgagaac taccagggac gagatgctac 120 tgacgccttc atggttatgc actttcagga agccttcgac aagctcaagc gaatgcccaa 180 gatcaacccc tcctttgagc tgcctcccca ggctgccgtc aacgaagctc aggaggattt 240 ccgaaagctc cgagaagagc tgatcgccac tggcatgttt gacgcctctc ccctctggta 300 ctcgtacaa 309 <210> 349 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 321 bp BglII/XhoI fragment of pT8(4-6) <400> 349 gatctccacc accctgggtc ttggcgtgct tggatacttc ctgatggtcc agtaccagat 60 gtacttcatt ggtgctgtgc tgctcggtat gcactaccag caaatgggat ggctgtctca 120 tgacatctgc caccaccaga ccttcaagaa ccgaaactgg aataacctcg tgggtctggt 180 ctttggcaac ggactccagg gcttctccgt gacctgttgg aaggacagac acaacgccca 240 tcattctgct accaacgttc agggtcacga tcccgacatt gataacctgc ctcccctcgc 300 ctggtccgag gacgatgtca c 321 <210> 350 <211> 264 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 264 bp XhoI/SacI fragment of pT8(7-9) <400> 350 tcgagcttct cccatctccc gaaagctcat tcagttccaa cagtactatt tcctggtcat 60 ctgtattctc ctgcgattca tctggtgttt ccagtgcgtg ctgaccgttc gatccctcaa 120 ggaccgagac aaccagttct accgatctca gtacaagaaa gaggccattg gactcgctct 180 gcactggact ctcaaggctc tgttccacct cttctttatg ccctccatcc tgacctcgct 240 cctggtgttc tttgtttccg agct 264 <210> 351 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 369 bp Sac1/Not1 fragment of pT8(10-13) <400> 351 cgtcggtggc ttcggaattg ccatcgtggt cttcatgaac cactaccctc tggagaagat 60 cggtgatccc gtctgggacg gacatggctt ctctgtgggt cagatccatg agaccatgaa 120 cattcgacga ggcatcatta ctgactggtt ctttggaggc ctgaactacc agatcgagca 180 ccatctctgg cccaccctgc ctcgacacaa cctcactgcc gtttcctacc aggtggaaca 240 gctgtgccag aagcacaacc tcccctaccg aaaccctctg ccccatgaag gtctcgtcat 300 cctgctccga tacctggccg tgttcgctcg aatggccgag aagcagcccg ctggcaaggc 360 tctctaagc 369 <210> 352 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer ODMW390 <400> 352 aagaatcatt caccatgaag tccaagcgac aggc 34 <210> 353 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer ODMW391 <400> 353 gcctgtcgct tggacttcat ggtgaatgat tctt 34 <210> 354 <211> 1852 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric D8S-1::XPR gene <400> 354 cgatcaggag agaccgggtt ggcggcgtat ttgtgtccca aaaaacagcc ccaattgccc 60 caattgaccc caaattgacc cagtagcggg cccaaccccg gcgagagccc ccttcacccc 120 acatatcaaa cctcccccgg ttcccacact tgccgttaag ggcgtagggt actgcagtct 180 ggaatctacg cttgttcaga ctttgtacta gtttctttgt ctggccatcc gggtaaccca 240 tgccggacgc aaaatagact actgaaaatt tttttgcttt gtggttggga ctttagccaa 300 gggtataaaa gaccaccgtc cccgaattac ctttcctctt cttttctctc tctccttgtc 360 aactcacacc cgaaatcgtt aagcatttcc ttctgagtat aagaatcatt caccatggag 420 tccaagcgac aggctctgtc tcccctccag ctgatggaac agacctacga cgtcgtgaac 480 ttccaccctg gtggagctga aatcattgag aactaccagg gacgagatgc tactgacgcc 540 ttcatggtta tgcactttca ggaagccttc gacaagctca agcgaatgcc caagatcaac 600 ccctcctttg agctgcctcc ccaggctgcc gtcaacgaag ctcaggagga tttccgaaag 660 ctccgagaag agctgatcgc cactggcatg tttgacgcct ctcccctctg gtactcgtac 720 aagatctcca ccaccctggg tcttggcgtg cttggatact tcctgatggt ccagtaccag 780 atgtacttca ttggtgctgt gctgctcggt atgcactacc agcaaatggg atggctgtct 840 catgacatct gccaccacca gaccttcaag aaccgaaact ggaataacct cgtgggtctg 900 gtctttggca acggactcca gggcttctcc gtgacctgtt ggaaggacag acacaacgcc 960 catcattctg ctaccaacgt tcagggtcac gatcccgaca ttgataacct gcctcccctc 1020 gcctggtccg aggacgatgt cactcgagct tctcccatct cccgaaagct 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chimeric D8S-2::XPR gene <400> 355 cgatcaggag agaccgggtt ggcggcgtat ttgtgtccca aaaaacagcc ccaattgccc 60 caattgaccc caaattgacc cagtagcggg cccaaccccg gcgagagccc ccttcacccc 120 acatatcaaa cctcccccgg ttcccacact tgccgttaag ggcgtagggt actgcagtct 180 ggaatctacg cttgttcaga ctttgtacta gtttctttgt ctggccatcc gggtaaccca 240 tgccggacgc aaaatagact actgaaaatt tttttgcttt gtggttggga ctttagccaa 300 gggtataaaa gaccaccgtc cccgaattac ctttcctctt cttttctctc tctccttgtc 360 aactcacacc cgaaatcgtt aagcatttcc ttctgagtat aagaatcatt caccatgaag 420 tccaagcgac aggctctgtc tcccctccag ctgatggaac agacctacga cgtcgtgaac 480 ttccaccctg gtggagctga aatcattgag aactaccagg gacgagatgc tactgacgcc 540 ttcatggtta tgcactttca ggaagccttc gacaagctca agcgaatgcc caagatcaac 600 ccctcctttg agctgcctcc ccaggctgcc gtcaacgaag ctcaggagga tttccgaaag 660 ctccgagaag agctgatcgc cactggcatg tttgacgcct ctcccctctg gtactcgtac 720 aagatctcca ccaccctggg tcttggcgtg cttggatact tcctgatggt ccagtaccag 780 atgtacttca ttggtgctgt gctgctcggt atgcactacc agcaaatggg atggctgtct 840 catgacatct gccaccacca gaccttcaag aaccgaaact ggaataacct cgtgggtctg 900 gtctttggca acggactcca gggcttctcc gtgacctgtt ggaaggacag acacaacgcc 960 catcattctg ctaccaacgt tcagggtcac gatcccgaca ttgataacct gcctcccctc 1020 gcctggtccg aggacgatgt cactcgagct tctcccatct cccgaaagct cattcagttc 1080 caacagtact atttcctggt catctgtatt ctcctgcgat tcatctggtg tttccagtgc 1140 gtgctgaccg ttcgatccct caaggaccga gacaaccagt tctaccgatc tcagtacaag 1200 aaagaggcca ttggactcgc tctgcactgg actctcaagg ctctgttcca cctcttcttt 1260 atgccctcca tcctgacctc gctcctggtg ttctttgttt ccgagctcgt cggtggcttc 1320 ggaattgcca tcgtggtctt catgaaccac taccctctgg agaagatcgg tgatcccgtc 1380 tgggacggac atggcttctc tgtgggtcag atccatgaga ccatgaacat tcgacgaggc 1440 atcattactg actggttctt tggaggcctg aactaccaga tcgagcacca tctctggccc 1500 accctgcctc gacacaacct cactgccgtt tcctaccagg tggaacagct gtgccagaag 1560 cacaacctcc cctaccgaaa ccctctgccc catgaaggtc tcgtcatcct gctccgatac 1620 ctggccgtgt tcgctcgaat ggccgagaag cagcccgctg gcaaggctct 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tcggtgattc cgtctgggac ggacatg 37 <210> 381 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL538 <400> 381 catgtccgtc ccagacggaa tcaccgatct tctccag 37 <210> 382 <211> 34 <212> DNA <213> cow cat <400> 382 ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34 <210> 383 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 436 <400> 383 tatctgctgt cgtggttaat taacgcggac acaatatctg gtcaa 45 <210> 384 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 437 <400> 384 ctgcaggtaa aggccggcct cgacgcagta ggatgtcctg 40 <210> 385 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 475 <400> 385 ccatccacac ttgcggccgc ttatttgttg agatacgc 38 <210> 386 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 477 <400> 386 acaagcttgc ggccgcttat ttgttgagat acgcatcc 38 <210> 387 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 478 <400> 387 agtggctctc cataaacctg acgaaattaa agagg 35 <210> 388 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 476 <400> 388 ctagtggatc cgaattccat gggtggcgga ggacagcaga 40 <210> 389 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 505 <400> 389 catcatctct ttcccacagt gcctcggcac aactac 36 <210> 390 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 506 <400> 390 gtagttgtgc cgaggcactg tgggaaagag atgatg 36 <210> 391 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMART IV oligonucleotide <400> 391 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccggg 39 <210> 392 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDSIII/3'PCR primer <220> <221> misc_feature <222> (28)..(57) <223> thymidine (dT); see BD Biosciences Clontech's SMART cDNA technology <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n is a, c, g, or t <400> 392 attctagagg ccgaggcggc cgacatgttt tttttttttt tttttttttt tttttttvn 59 <210> 393 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-PCR primer <400> 393 aagcagtggt atcaacgcag agt 23 <210> 394 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer M13 <400> 394 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 395 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MLPAT-F <400> 395 gatcccatgg tcgggtccgt cacccgaccc aca 33 <210> 396 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MLPAT-R <400> 396 gatcgcggcc gctcacatcc agttctctga ccac 34 <210> 397 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer LPAT-Re-5-1 <400> 397 gatcgagctc gacattgagc attgatctat tt 32 <210> 398 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer LPAT-Re-5-2 <400> 398 gactatcgat accatggtcg ggcaatgaga acggcagcaa g 41 <210> 399 <211> 1129 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 399 gatcgagctc gacattgagc attgatctat ttgtttagtt tagtacgtac gtagagtagt 60 tggttattgt atactggata ctggtcggat agtcgtgtac aagtacagta tatacttgta 120 gtttggaaca ctagtcacaa gtatagttaa taacagtata gtatatactt ctactgtaca 180 tatagttaca aaacagtaca gtatatactt ctactgtaca tactgtagtt tcatggttga 240 tataggtgaa aatgacatgg tatcccgctt cccaatgact gatacgagca acaaacaatt 300 ctctctaata gatgttcatt ataaccacac tgtacggtaa ttatatcgta gacagtgtac 360 agtattagaa cgtgtttttg atcccaagtt ggtggaaatg ttgagttgag atgagatgat 420 aatgttatca gcatgagggg tggatgtata cagtaggaga aggagtatgg gcagttgtgc 480 ggtagcagcg tctctgaatc acacaaagcc gggcttacag cagaggcaag aatggcgcca 540 tgtgcctgcg caatcaaggg cgtgaaccac ggcttgattc cacggcttga tgccacagct 600 taatgccaca tgccacagca taataccacg gcatgacccc gctgactcca accttcattt 660 cggcacgtgt aggtgcacaa gggacttcaa gaggggccaa tttcatgcgg acacatggcg 720 caaaaaacgc ccgactttga ttacacagac acgtaataac gacgaagccg agatgagcac 780 acgtggccaa gtctgccaat ggccccctgg acccccctga caaagtttcc caacaagccc 840 agccgtgcat ggtgtgtttt tgtgcggaga cacacgccaa ttaggctcat ttgagggtat 900 gcagcgaaaa aaaattagtg tgggtagttt gtttgcagga atcaagtggg tggttgaaaa 960 acaagaaaga gcgacgacaa gagagagaga aaaagagaga gagactccat aaagcgtgca 1020 tcaaaattaa ggtgtgtgac tatccgaaaa ccaaacatga acagttggat atatgtcgct 1080 gtgattgcag ttgctgccgt tctcattgcc cgaccatgga tcgatgatc 1129 <210> 400 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer LPAT-Re-3-1 <400> 400 gactatcgat gcggccgcag actgcagcac aagaagtgct 40 <210> 401 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer LPAT-Re-3-2 <400> 401 gatcctcgag tctagagcag ggtgttggag gggatggaga 40 <210> 402 <211> 938 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 402 gactatcgat gcggccgcag actgcagcac aagaagtgct tgtagctact ttaggagaga 60 gataggtaat atgaaacatt tttcagatcg acacccacgg cgaaccattg gctgtggagc 120 tatgggtgaa tggattaata tagcaacgaa atctacctcg attaccaacg caaaacgagc 180 ccactttctc tgtactgtgc tatatcgtgt ataccccagt tctcttagat cagtcgtacc 240 cgcccgtact gtcatggact attcaaactg ttggttttta gtctactcct acttgtacca 300 tgcttatgct cgatgtacca gctacttcgt ccgcggacgt gtctctataa taaccctgaa 360 agctgctcat tcctctaaaa gtcgtgacac cacctagtct tactcatcga gattgtatta 420 ctcatcgaga ttgtattact catcgagatt gtattactca tcttgatttt ctctcgtacg 480 atgttgttag taatcatggc cttccagccg aactctaccg accgaggtaa cttcacaagg 540 tttagacaga gtccaattat tcgaggagcc cataagtcta cctttaccta ctctactgta 600 gtgtgaagat gatcatgaga ggcatagatt ggattggaca gttggacggg tgacgaggga 660 gcagacaagt gcgagattgg cgttgttata tggactccag ggaccgtgaa ttgctcttaa 720 actggccgat attagcggct ggaaagatcc ttgtcccact ctcttctttg tctatcctgg 780 tgatccattt ttttgacagc taaaattaac tcgccgaaac acgtcggcat accgagatta 840 aattacaaaa gaagattaaa acgcgaccag caaaccgcaa cttccgcttt actcaacctc 900 tccatcccct ccaacaccct gctctagact cgaggatc 938 <210> 403 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PZUF-mod1 <400> 403 gatcccatgg atccaggcct gttaacgg 28 <210> 404 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PZUF-mod2 <400> 404 gatcgcggcc gcagacatga taagatacat tg 32 <210> 405 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MACAT-F1 <400> 405 gatcccatgg cagagtcgac aacaacgaca tg 32 <210> 406 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MACAT-R <400> 406 gatcgcggcc gctcaaacat ccatatggcg cttg 34 <210> 407 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MDGAT-F <400> 407 gatcccatgg cgctctttgc gcctttac 28 <210> 408 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MDGAT-R1 <400> 408 gatcgcggcc gcctattcga tgatgcacag ttcct 35 <210> 409 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MGPAT-N1 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <400> 409 ccncaygcna aycarttygt 20 <210> 410 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MGPAT-NR5 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 410 ttccangtng ccatntcrtc 20 <210> 411 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MGPAT-5N1 <400> 411 catctctcgg ctgatccaga tg 22 <210> 412 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MGPAT-5N2 <400> 412 ttgtctggcg ctacctggaa c 21 <210> 413 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MGPAT-5N3 <400> 413 cattgtcgct cgtgtcatca gc 22 <210> 414 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genome Walker adaptor-1 <400> 414 gtaatacgac tatagggcac gcgtggtcga cggcccgggc tggt 44 <210> 415 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genome Walker adaptor-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' end is associated with a -PO4 group <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> 3' end is associated with a -H2N group <400> 415 accagccc 8 <210> 416 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MGPAT-5-1A <400> 416 cagctccttt gtgaatttag tg 22 <210> 417 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AP1 <400> 417 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 418 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MGPAT-3N1 <400> 418 cataacgatc cagaagtttg atg 23 <210> 419 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AP2 <400> 419 actatagggc acgcgtggt 19 <210> 420 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer mgpat-cdna-5 <400> 420 gatcggatcc tcagatctac gactttgtgt cg 32 <210> 421 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MGPAT-cDNA-R <400> 421 gatcgcggcc gcctaaatgt cttttgactt ggc 33 <210> 422 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MA Elong 3'1 <400> 422 gatacggatc agagcctgtg gaaca 25 <210> 423 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MA elong 3'2 <400> 423 cttctacctt tcaaagtttt acgag 25 <210> 424 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MA Elong 5'1 <400> 424 gcataggtcc agactccatt atgcg 25 <210> 425 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MA Elong 5'2 <400> 425 cagaggaata taggtcggca ccaaa 25 <210> 426 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MA ELONG 5' NcoI 3 <400> 426 gatcccatgg agtctggacc tatg 24 <210> 427 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MA ELONG 3' NotI 1 <400> 427 gatcgcggcc gcttactggg ccttcttctg 30 <210> 428 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL597 <400> 428 tttccatggt ctcgtcaatc tcgccgac 28 <210> 429 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL598 <400> 429 tttgcggccg cttagatgga cttggccttc aag 33 <210> 430 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL325 <400> 430 tttgcggccg catggagcgt gtgttctgag tc 32 <210> 431 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL326 <400> 431 cccttaatta actcacctgc aggattgaga ctatgaatgg attccc 46 <210> 432 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL567 <400> 432 tttccatggc tgccgtccct attgaattca acgtcc 36 <210> 433 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL568 <400> 433 gatcagctca aagtacttgg tcag 24 <210> 434 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL569 <400> 434 ctgaccaagt actttgagct gatc 24 <210> 435 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL570 <400> 435 tttgcggccg cttatgctcg tcgagatcgg gtagtg 36 <210> 436 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL571 <400> 436 tcctccacac ctaccatcac ggtgccactg ctcttc 36 <210> 437 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL572 <400> 437 gaagagcagt ggcaccgtga tggtaggtgt ggagga 36 <210> 438 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPT1-5'-NcoI <400> 438 acgtccatgg gcgtattcat taaacagg 28 <210> 439 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPT1-3'-NotI <400> 439 acgtgcggcc gcttattcgg tcttcttctc ctg 33 <210> 440 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Isc1F <400> 440 ataccatgga caacagaaaa gacagagatg 30 <210> 441 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Isc1R <400> 441 tgcggccgct catttctcgc tcaagaaagt t 31 <210> 442 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Pcl1F <400> 442 ataccatggg tgaatacagc aaaggctctt 30 <210> 443 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Pcl1R <400> 443 tgcggccgct taaaacccat gttgactcat gat 33 <210> 444 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P95 <400> 444 ggcaagctta ttgtcgttgg tggagcaca 29 <210> 445 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P96 <400> 445 aattccacca gatctgtcgt ggtattcgga cactt 35 <210> 446 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P97 <400> 446 ataccacgac agatctggtg gaattgccac cgagggagc 39 <210> 447 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P98 <400> 447 gcggaattcg cagatagact ggtttcgctt 30 <210> 448 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P115 <400> 448 aactacatct tcggctatca cc 22 <210> 449 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P116 <400> 449 tgaacaagcg tagattccag ac 22 <210> 450 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P112 <400> 450 cacccttgct cggcgatgta tc 22 <210> 451 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P39 <400> 451 ggcggtaccg gatcctcaat cgaagagact aagc 34 <210> 452 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P41 <400> 452 cttctgtatt ctagatctca agatcgagaa gcaccagaaa a 41 <210> 453 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P40 <400> 453 gcttctcgat cttgagatct agaatacaga agtcaacggt tcatccat 48 <210> 454 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P42 <400> 454 ccggaattca gctttgagct tggagaagta 30 <210> 455 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P51 <400> 455 tagatagact ggactatacg gc 22 <210> 456 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P52 <400> 456 gactgtccta ccctgatttg 20 <210> 457 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P37 <400> 457 ccaggtacca agatcgagaa gcaccagaaa agc 33 <210> 458 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P38 <400> 458 ctcgaattca gaatacagaa gtcaacggtt catcca 36 <210> 459 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P201 <400> 459 ctcgcggccg ccatggaggt ccgacgacga aarathgayg t 41 <210> 460 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P203 <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n is a, c, g, or t <400> 460 gaggcggccg ctactggttc tgcttgtagt tgtaggcnar rtarta 46 <210> 461 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P214 <400> 461 atctcgacaa tcgtcgcagc cctcctcaag agcatcgtcc agaa 44 <210> 462 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P215 <400> 462 cgaacagatc ccaatattac atgaggcgag tttgagagac ag 42 <210> 463 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P216 <400> 463 aactggtatt taaatgatgt ccccaagacg gagcgtattc gacc 44 <210> 464 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P217 <400> 464 gtagttgtag gctaggtagt aaaggaatgc acaagtgggt 40 <210> 465 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P219 <400> 465 cgaatacgct ccgtcttggg gacatcattt aaataccagt 40 <210> 466 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P226 <400> 466 cgacgaaaaa ttgacgtgct 20 <210> 467 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P227 <400> 467 gatttccgaa cagatcccaa 20

Claims (46)

  1. ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로의 유전자인
    a) Δ6 데새투라제(desaturase)를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    b) C18 /20 엘론가제(elongase)를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    c) Δ5 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    d) Δ17 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    e) C20 /22 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및
    f) Δ4 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자
    를 포함하는 유전자 풀(gene pool)을 포함하는 백그라운드 야로위아 종(Yarrowia sp.)을 포함하는, 도코사헥사엔산의 생성을 위한 재조합 생성 숙주 세포.
  2. ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로의 유전자인
    a) Δ15 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    b) Δ6 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    c) C18 /20 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    d) Δ5 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    e) C20 /22 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및
    f) Δ4 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자
    를 포함하는 유전자 풀을 포함하는 백그라운드 야로위아 종을 포함하는, 도코사헥사엔산의 생성을 위한 재조합 생성 숙주 세포.
  3. ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로의 유전자인
    a) Δ9 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    b) Δ8 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    c) Δ5 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    d) Δ17 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    e) C20 /22 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및
    f) Δ4 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자
    를 포함하는 유전자 풀을 포함하는 백그라운드 야로위아 종을 포함하는, 도코사헥사엔산의 생성을 위한 재조합 생성 숙주 세포.
  4. ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로의 유전자인
    a) Δ15 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    b) Δ9 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    c) Δ8 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    d) Δ5 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    e) C20 /22 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및
    f) Δ4 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자
    를 포함하는 유전자 풀을 포함하는 백그라운드 야로위아 종을 포함하는, 도코사헥사엔산의 생성을 위한 재조합 생성 숙주 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 풀이 Δ12 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 임의로 포함하는 것인 재조합 생성 숙주.
  6. 제5항에 있어서, 상기 백그라운드 야로위아 종이 Δ12 데새투라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 천연 유전자가 결여된 것인 재조합 생성 숙주.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로 유전자 중 하나 이상이 서열 210 내지 221로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 갖는 프로모터 서열의 조절하에 있는 것인 재조합 생성 숙주.
  8. 제5항에 있어서, 상기 Δ12 데새투라제가 서열 29, 31, 33, 35, 36, 37, 39, 41, 43, 45, 46, 48 내지 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 생성 숙주.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Δ6 데새투라제가 서열 2 및 5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; 상기 C18 /20 엘론가제가 서열 23 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 생성 숙주 세포.
  10. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 Δ9 엘론가제가 서열 70 및 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; 상기 Δ8 데새투라제가 서열 78, 80 및 82로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 갖는 것인 재조합 생성 숙주 세포.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Δ5 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자가 효소성 기질로서
    a) 리놀렌산 및 디호모-γ-리놀렌산;
    b) α-리놀렌산 및 에이코사테트라엔산; 및
    c) 리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, α-리놀렌산 및 에이코사테트라엔산
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 지방산에 결합하는 이작용성 Δ5/Δ6 데새투라제 폴리펩티드를 코딩하는 것인 재조합 생성 숙주.
  12. 제11항에 있어서, 상기 이작용성 Δ5/Δ6 데새투라제 폴리펩티드가 서열 15 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 생성 숙 주.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Δ5 데새투라제가 서열 7, 9, 12, 15 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; 상기 C20 /22 엘론가제가 서열 101 및 103으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; 상기 Δ4 데새투라제가 서열 105 및 107로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 생성 숙주 세포.
  14. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 Δ17 데새투라제가 서열 20에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 생성 숙주 세포.
  15. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 유전자 풀이 Δ15 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 임의로 포함하는 것인 재조합 생성 숙주 세포.
  16. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 Δ15 데새투라제를 코딩하는 상기 하나 이상의 유전자가 효소성 기질로서의 올레산 및 리놀레산 둘다에 결합하는 이작용성 Δ15/Δ12 데새투라제 폴리펩티드를 코딩하는 것인 재조합 생성 숙주.
  17. 제16항에 있어서, 상기 이작용성 Δ15/Δ12 데새투라제 폴리펩티드가 서열 52에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 생성 숙주.
  18. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 Δ15 데새투라제가 서열 52, 54, 56, 58, 60, 62 및 64 내지 68로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 생성 숙주.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 풀이 임의로
    a) Δ9 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    b) C16 /18 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및
    c) C14 /16 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자
    로 이루어진 군으로부터 선택된 ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로 유전자를 포함하는 것인 재조합 생성 숙주.
  20. 제19항에 있어서, 상기 C16 /18 엘론가제가 서열 84, 87 및 95로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; 상기 C14 /16 엘론가제가 서열 98에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 생성 숙주.
  21. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 풀이 임의로
    a) 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT1);
    b) 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT2);
    c) 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (PDAT);
    d) 아실-CoA:1-아실 리소포스파티딜콜린 아실트랜스퍼라제 (LPCAT);
    e) 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 (GPAT); 및
    f) 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 (LPAAT)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아실트랜스퍼라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 것인 재조합 생성 숙주.
  22. 제21항에 있어서, 상기 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT1)가 서열 123 및 125 내지 129로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; 상기 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGAT2)가 서열 131, 133, 135 및 137로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; 상기 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (PDAT)가 서열 118에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 상기 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 (GPAT)가 서열 139에 기재된 아미노산 서열을 갖고; 상기 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 (LPAAT)가 서열 109, 111, 113 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; 상기 아실-CoA:1-아실 리소포스파티딜콜린 아실트랜스퍼라제 (LPCAT)가 서열 121에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인 재조합 생성 숙주.
  23. ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로의 유전자인
    a) Δ6 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    b) C18 /20 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    c) Δ5 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    d) Δ17 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    e) C20 /22 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    f) Δ4 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    g) C16 /18 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및
    h) Δ12 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자
    를 포함하는 유전자 풀을 포함하는 백그라운드 야로위아 종을 포함하고;
    상기 백그라운드 야로위아 종이 오로티딘-5'-포스페이트 데카르복실라제 (Ura3), 이소프로필 말레이트 데히드로게나제 (Leu2), 아실-CoA 옥시다제 (Pox3), 아실-CoA 옥시다제 (Pox2), Δ12 데새투라제 및 리파제 1 (Lip1)로 이루어진 군으로부터 선택된 효소를 코딩하는 임의의 천연 유전자가 결여된 것인,
    도코사헥사엔산 생성을 위한 재조합 생성 숙주 세포.
  24. ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로의 유전자인
    a) i. Δ6 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; C18 /20 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; Δ5 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; Δ 17 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; C20 /22 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및 Δ4 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    ii. Δ9 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; Δ8 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; Δ5 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; Δ17 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; C20 /22 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및 Δ4 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자;
    iii. Δ15 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; Δ6 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; C18 /20 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; Δ5 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; C20 /22 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및 Δ4 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및
    iv. Δ15 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; Δ9 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; Δ8 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; Δ5 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; C20 /22 엘론가제를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및 Δ4 데새투라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자
    로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 세트;
    b) i. Δ12 데새투라제;
    ii. Δ9 데새투라제;
    iii. C14 /16 엘론가제; 및
    iv. C16 /18 엘론가제
    로 이루어진 군으로부터 선택된 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자; 및
    c) (i) DGAT1, DGAT2 및 PDAT로 이루어진 군으로부터 선택된 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제;
    (ii) 아실-CoA:1-아실 리소포스파티딜콜린 아실트랜스퍼라제 (LPCAT);
    (iii) 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 (GPAT);
    (iv) 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 (LPAAT);
    (v) 포스포리파제 C; 및
    (vi) 포스포리파제 A2
    로 이루어진 군으로부터 선택된 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자
    를 포함하는 유전자 풀을 포함하는 백그라운드 야로위아 종을 포함하며,
    여기서,
    (1) 상기 백그라운드 야로위아 종이 Δ12 데새투라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 천연 유전자가 결여되고;
    (2) 상기 백그라운드 야로위아 종이 리파제 1 (Lip1-), 퍼옥시좀 아실 CoA 옥시다제 ACO3 (Pox3-), 아실-CoA 옥시다제 2 (Pox2-), 오로티딘-5'-포스페이트 데카르복실라제 (Ura3-), 사카로핀 데히드로게나제 (Lys5-), 리파제 2 (Lip2-) 및 이소프로필 말레이트 데히드로게나제 (Leu2-)로 이루어진 군으로부터 선택된 효소를 코딩하는 임의의 천연 유전자가 결여된 것인,
    도코사헥사엔산 생성을 위한 재조합 생성 숙주 세포.
  25. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 전체 지방산의 백분율로서 약 5％ 이상의 도코사헥사엔산을 포함하는 미생물성 오일을 생성하는 재조합 생성 숙주.
  26. 제25항에 있어서, 도코사헥사엔산을 포함하는 미생물성 오일을 생성하고, 상기 미생물성 오일이 임의의 γ-리놀레산이 결여된 것인 재조합 생성 숙주.
  27. a) 도코사헥사엔산을 포함한 미생물성 오일을 생성하는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 생성 숙주를 배양하는 단계; 및
    b) 임의로 단계 a)의 미생물성 오일을 회수하는 단계
    를 포함하는, 도코헥사엔산을 포함한 미생물성 오일을 생성하는 방법.
  28. 제27항의 방법에 의해 생성된 미생물성 오일.
  29. 제28항에 있어서, 약 5％ 이상의 도코사헥사엔산을 함유하는 미생물성 오일.
  30. 제28항에 있어서, 임의의 γ-리놀레산이 결여된 미생물성 오일.
  31. 제28항에 있어서, 리놀레산, γ-리놀렌산, 에이코사디엔산, 디호모-γ-리놀레산, 아라키돈산, α-리놀렌산, 스테아리돈산, 에이코사트리엔산, 에이코사테트라엔산, 도코사펜타엔산 및 도코사헥사엔산으로 이루어진 군으로부터 선택된 지방산을 포함하는 블렌딩 오일.
  32. 제27항의 방법에 의해 생성된 유효량의 미생물성 오일을 포함하는 식품.
  33. 제32항에 있어서, 식품 유사물, 육류 제품, 곡물 제품, 베이킹 식품, 스낵 식품 및 유제품으로 이루어진 군으로부터 선택된 식품.
  34. 제27항의 방법에 의해 생성된 유효량의된 미생물성 오일을 포함하는, 의료용 식품, 식이 보조제, 유아용 조제식 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택된 제품.
  35. 제27항의 방법에 의해 생성된 유효량의 미생물성 오일을 포함하는 동물 사료.
  36. 제35항에 있어서, 애완 동물 사료, 반추 동물 사료, 가금류 사료 및 양식용 사료로 이루어진 군으로부터 선택된 동물 사료.
  37. 유효량의 미생물성 오일을 포함하고, 임의로 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 숙주를 포함하는 효모 생물체를 포함하는 동물 사료.
  38. 제37항에 있어서, 상기 효모 생물체가 단백질, 지질, 탄수화물, 비타민, 미네랄 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 사료 영양분을 포함하는 것인 동물 사료.
  39. 제27항의 방법에 의해 생성된 미생물성 오일과 식품을 배합하는 것을 포함하는, 도코사헥사엔산이 보충된 식품의 제조 방법.
  40. 제27항의 방법에 의해 생성된 미생물성 오일과, 의료용 식품, 식이 보조제, 유아용 조제식 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택된 제품을 배합하는 것을 포함하는, 도코사헥사엔산이 보충된 상기 제품의 제조 방법.
  41. 제27항의 방법에 의해 생성된 미생물성 오일과 동물 사료를 배합하는 것을 포함하는, 도코사헥사엔산이 보충된 동물 사료의 제조 방법.
  42. 제37항의 동물 사료와, 사료 영양분을 포함하는 효모 생물체를 배합하는 것을 포함하는, 도코헥사엔산을 포함하는 동물 사료에 사료 영양분을 보충하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 사료 영양분이 단백질, 지질, 탄수화물, 비타민, 미 네랄 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  44. 제27항의 방법에 의해 생성된 도코사헥사엔산 함유 미생물성 오일을 인간 또는 동물이 소모가능하거나 사용가능한 형태로 제공하는 것을 포함하는, 에이코사펜타엔산이 풍부한 식이 보충제를 인간, 동물 또는 양식 유기체에게 제공하는 방법.
  45. 제27항의 방법에 의해 생성된 도코사헥사엔산 함유 미생물성 오일을 인간 또는 동물이 소모가능하거나 사용가능한 형태로 제공하여 도코사헥사엔산의 결핍을 치료하는 것을 포함하는, 동물 또는 인간에서 도코사헥사엔산의 결핍을 치료하는 방법.
  46. ATCC 기탁번호 ATCC PTA-7187의 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) Y3000인, 도코사헥사엔산의 생성에 유용한 재조합 생성 숙주.
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Families Citing this family (169)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8313911B2 (en) * 2003-05-07 2012-11-20 E I Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US11952581B2 (en) 2003-08-01 2024-04-09 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
PT2172536T (pt) 2003-08-01 2016-08-17 Basf Plant Science Gmbh Processo para a produção de ácidos gordos poli-insaturados em organismos transgénicos
EP2623584B1 (de) 2004-02-27 2019-04-10 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Pflanzen
EP2363492A3 (en) 2004-04-22 2012-03-14 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells.
US7807849B2 (en) 2004-04-22 2010-10-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
NZ552254A (en) * 2004-06-04 2008-12-24 Fluxone Sciences As Metabolically engineered cells for the production of polyunsaturated fatty acids
US7879591B2 (en) 2004-11-04 2011-02-01 E.I. Du Pont De Nemours And Company High eicosapentaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US7588931B2 (en) 2004-11-04 2009-09-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US20060094102A1 (en) * 2004-11-04 2006-05-04 Zhixiong Xue Ammonium transporter promoter for gene expression in oleaginous yeast
GB0503657D0 (en) 2005-02-22 2005-03-30 Fluxome Sciences As Metabolically engineered cells for the production of resveratrol or an oligomeric or glycosidically-bound derivative thereof
US7470532B2 (en) * 2005-10-19 2008-12-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina C16/18 fatty acid elongase
BRPI0620552A2 (pt) 2005-11-23 2011-11-22 Du Pont polinucleotìdeo isolado, polipeptìdeo delta-9 elongase, construção recombinante, célula vegetal, método para transformar uma célula, método para produção de uma planta transgênica, sementes transgênicas, método para fabricar ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, óleos, método para produzir pelo menos um ácido graxo poliinsaturado, plantas de semente oleaginosa, sementes, alimentos, fragmento de ácido nucléico isolado e progênies de plantas
AR059376A1 (es) * 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
US7465793B2 (en) 2006-04-20 2008-12-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Synthetic Δ17 desaturase derived from Phytophthora ramourum and its use in making polyunsaturated fatty acids
AU2007243282A1 (en) * 2006-04-28 2007-11-08 Resolvyx Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of cardiovascular disease
US7943823B2 (en) 2006-04-28 2011-05-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
US7695950B2 (en) 2006-05-17 2010-04-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ5 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
US7678560B2 (en) 2006-05-17 2010-03-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ 5 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
GB0614442D0 (en) 2006-07-20 2006-08-30 Fluxome Sciences As Metabolically engineered cells for the production of pinosylvin
EP2500420B1 (en) * 2006-08-24 2016-06-22 BASF Plant Science GmbH Pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains
CN101578363A (zh) 2006-08-29 2009-11-11 联邦科学技术研究组织 脂肪酸的合成
US20080095711A1 (en) * 2006-08-31 2008-04-24 Falck John R Modulators of Pulmonary Hypertension
BRPI0716306A2 (pt) 2006-10-23 2015-06-16 Du Pont "polinucleotídeo isolado, constructo de dna recombinante célula, yarrowia sp transformada, método para transformar uma célula, método para produzir uma planta transformada, método para produzir leveduras, sementes trangênicas, método para produzir ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa em ima célula, óleo ou subprodutos, método para produzir pelo menos um ácido graxo poli-insaturada em uma célula vegetal oleaginosa, plantas oleaginosas, sementes trangênicas, alimentos ou alimentações e plantas da progênie"
US7709239B2 (en) * 2006-12-07 2010-05-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company Mutant Δ8 desaturase genes engineered by targeted mutagenesis and their use in making polyunsaturated fatty acids
US8846374B2 (en) 2006-12-12 2014-09-30 E I Du Pont De Nemours And Company Carotenoid production in a recombinant oleaginous yeast
US7923223B2 (en) 2006-12-20 2011-04-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ-9 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
BRPI0806354A2 (pt) 2007-02-12 2011-09-06 Du Pont plantas oleaginosas transgências, sementes, óleos, produtos alimentìcios ou análogos a alimento, produtos alimentìcios medicinais ou análogos alimentìcios medicinais, produtos farmacêuticos, bebidas fórmulas para bebês, suplementos nutricionais, rações para animais domésticos, alimentos para aquacultura, rações animais, produtos de sementes inteiras, produtos de óleos misturados, produtos, subprodutos e subprodutos parcialmente processados
US7790156B2 (en) * 2007-04-10 2010-09-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ-8 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
US7794701B2 (en) 2007-04-16 2010-09-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids
US8957280B2 (en) 2007-05-03 2015-02-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-5 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
JP5371749B2 (ja) * 2007-05-25 2013-12-18 サントリーホールディングス株式会社 新規なリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子
US8476059B2 (en) 2007-06-01 2013-07-02 Solazyme, Inc. Sucrose feedstock utilization for oil-based fuel manufacturing
BRPI0809911A2 (pt) * 2007-06-18 2014-10-07 Suntory Holdings Ltd Homólogos de glicerol-3-fosfato aciltransferase (gpat) e uso dos mesmos
CA2694661C (en) * 2007-07-31 2017-10-03 Basf Plant Science Gmbh Desaturases and process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
JP5711968B2 (ja) * 2007-10-03 2015-05-07 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーＥ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 高エイコサペンタエン酸を生成するためのヤロウィア・リポリティカ（ＹａｒｒｏｗｉａＬｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の最適化株
EP2198005B1 (en) * 2007-10-03 2014-05-07 E. I. du Pont de Nemours and Company Peroxisome biogenesis factor protein (pex) disruptions for altering the content of polyunsaturated fatty acids and the total lipid content in oleaginous eukaryotic organisms
US8343753B2 (en) * 2007-11-01 2013-01-01 Wake Forest University School Of Medicine Compositions, methods, and kits for polyunsaturated fatty acids from microalgae
US8206772B2 (en) 2007-11-08 2012-06-26 Kraft Foods Global Brands Llc Structured lipid compositions and methods of formulation thereof
US8486478B2 (en) 2007-11-08 2013-07-16 International Great Brands LLC Structured lipid compositions
US7879384B2 (en) 2007-11-08 2011-02-01 Kraft Foods Global Brands Llc Structured glycerol esters useful as edible moisture barriers
WO2009126548A2 (en) * 2008-04-07 2009-10-15 Rich Products Corporation Method for preparing edible aquatic animals for storage
US20090291479A1 (en) * 2008-05-23 2009-11-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Manipulation of acyl-coa binding protein expression for altered lipid production in microbial hosts
US8168858B2 (en) 2008-06-20 2012-05-01 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 fatty acid elongase genes and their use in making polyunsaturated fatty acids
JP4955813B2 (ja) * 2008-07-10 2012-06-20 株式会社Ｊ−オイルミルズ 飲食品の呈味向上剤
DE112009002048T5 (de) * 2008-08-26 2012-01-26 Basf Plant Science Gmbh Nukleinsäure, die Desaturasen kodieren, und modifiziertes Planzenöl
AU2009285590B2 (en) 2008-08-29 2015-02-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Manipulation of SNF1 protein kinase activity for altered oil content in oleaginous organisms
US20100297296A1 (en) * 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Healthier Baked Goods Containing Microalgae
US20100303989A1 (en) 2008-10-14 2010-12-02 Solazyme, Inc. Microalgal Flour
CA2743880C (en) 2008-11-18 2020-08-18 James Robertson Petrie Recombinant cells comprising exogenous a5 elongase and methods for producing docosapentaenoic acid
CA3037322A1 (en) 2008-11-28 2010-06-03 Corbion Biotech, Inc. Production of tailored oils in heterotrophic microorganisms
BRPI0917722A2 (pt) 2008-12-18 2017-05-30 Du Pont organismo transgênico e método para manipular o teor de malonatos em um organismo transgênico
EP2410051B1 (en) 2009-03-18 2014-12-31 Suntory Holdings Limited NOVEL ACETYL-CoA CARBOXYLASE
US8207363B2 (en) * 2009-03-19 2012-06-26 Martek Biosciences Corporation Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
SG174413A1 (en) * 2009-03-19 2011-10-28 Los Angeles Biomed Res Inst Vaccine compositions and methods for treatment of mucormycosis and other fungal diseases
WO2010110375A1 (ja) * 2009-03-26 2010-09-30 サントリーホールディングス株式会社 新規なリゾリン脂質アシル基転移酵素
BRPI1009731A2 (pt) * 2009-06-16 2015-08-25 Du Pont Óleo extraído, óleo mesclado, alimento ou ração, produto, biomassa microbiana e ração para animais
US8524485B2 (en) 2009-06-16 2013-09-03 E I Du Pont De Nemours And Company Long chain omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acid biosynthesis by expression of acyl-CoA lysophospholipid acyltransferases
EP2443248B1 (en) * 2009-06-16 2017-12-27 E. I. du Pont de Nemours and Company IMPROVEMENT OF LONG CHAIN OMEGA-3 AND OMEGA-6 POLYUNSATURATED FATTY ACID BIOSYNTHESIS BY EXPRESSION OF ACYL-CoA LYSOPHOSPHOLIPID ACYLTRANSFERASES
CA2761589C (en) * 2009-06-16 2017-12-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Improved optimized strains of yarrowia lipolytica for high eicosapentaenoic acid production
AU2010296296B2 (en) * 2009-09-18 2014-04-17 Suntory Holdings Limited Glycerol-3-phosphate acyl transferase
WO2011079005A1 (en) 2009-12-24 2011-06-30 E.I. Dupont De Nemours And Company Plant membrane bound o-acyl transferase (mboat) family protein sequences and their uses for altering fatty acid compositions
WO2011087981A2 (en) 2010-01-15 2011-07-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Clinical benefits of eicosapentaenoic acid in humans
EA031136B1 (ru) * 2010-01-19 2018-11-30 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Микроорганизмы, продуцирующие эйкозапентаеновую кислоту, композиции жирных кислот и способы их получения и применения
JP5890687B2 (ja) * 2010-02-03 2016-03-22 サントリーホールディングス株式会社 グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素ホモログとその利用
CA2795460A1 (en) 2010-04-22 2011-10-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for obtaining polyunsaturated fatty acid-containing compositions from microbial biomass
GB201008826D0 (en) 2010-05-26 2010-07-14 Fluxome Sciences As Production of metabolites
SG10201504197SA (en) 2010-05-28 2015-06-29 Solazyme Inc Food Compositions Comprising Tailored Oils
US8769868B2 (en) 2010-06-09 2014-07-08 Photonz Corporation Limited Compositions comprising eicosapentaenoic acid suitable for high purification
AU2011289384A1 (en) 2010-08-11 2013-01-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company A sustainable aquaculture feeding strategy
WO2012021686A1 (en) 2010-08-11 2012-02-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Improved aquaculture meat products
US20120040076A1 (en) 2010-08-11 2012-02-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Aquaculture feed compositions
US8980589B2 (en) 2010-08-26 2015-03-17 E I Du Pont De Nemours And Company Mutant delta-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids
CN103080317B (zh) 2010-08-26 2017-07-11 纳幕尔杜邦公司 突变型hpgg基序和hdash基序δ‑5去饱和酶以及它们在制备多不饱和脂肪酸中的用途
KR20130138760A (ko) 2010-08-26 2013-12-19 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니 고농도의 에이코사펜타엔산 생성을 위한 재조합 미생물 숙주 세포
CN101979622B (zh) * 2010-09-13 2012-10-10 北京凯泰新世纪生物技术有限公司 一种脂肪酶催化合成鱼油乙酯的方法
KR101964886B1 (ko) 2010-11-03 2019-04-03 테라비아 홀딩스 인코포레이티드 유동점이 낮은 미생물 오일, 이 오일로 제조된 유전성 유체 및 관련 방법
AU2011353002A1 (en) 2010-12-30 2013-05-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Use of Saccharomyces cerevisiae SUC2 gene in Yarrowia lipolytica for sucrose utilization
EP2658985A1 (en) 2010-12-30 2013-11-06 E.I. Du Pont De Nemours And Company Increased oil content by increasing yap1 transcription factor activity in oleaginous yeasts
AU2012212079B2 (en) 2011-02-02 2016-07-28 Corbion Biotech, Inc. Tailored oils produced from recombinant oleaginous microorganisms
US20130040340A1 (en) 2011-02-07 2013-02-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of alcohol esters in situ using alcohols and fatty acids produced by microorganisms
EP2673063A1 (en) * 2011-02-11 2013-12-18 E.I. Du Pont De Nemours And Company Purification of triglyceride oil from microbial sources using short path distillation
US8999663B2 (en) 2011-02-11 2015-04-07 E L Du Pont De Nemours And Company Method for obtaining a lipid-containing composition from microbial biomass
US8969049B2 (en) 2011-03-31 2015-03-03 E I Du Pont De Nemours And Company Yarrowia diacylglycerol acyltransferase promoter regions for gene expression in yeast
US20120247066A1 (en) 2011-04-01 2012-10-04 Ice House America, Llc Ice bagging apparatus and methods
US8906650B2 (en) 2011-04-01 2014-12-09 E I Du Pont De Nemours And Company Yarrowia esterase/lipase promoter regions for gene expression in yeast
US8735094B2 (en) 2011-04-05 2014-05-27 E I Du Pont De Nemours And Company Yarrowia n-alkane-hydroxylating cytochrome P450 promoter regions for gene expression in yeast
EP2702148A1 (en) 2011-04-07 2014-03-05 E.I. Du Pont De Nemours And Company Yarrowia peroxisomal 2,4-dienoyl-coa reductase promoter regions for gene expression in yeast
US8846352B2 (en) 2011-05-06 2014-09-30 Solazyme, Inc. Genetically engineered microorganisms that metabolize xylose
EP2714724A1 (en) * 2011-05-26 2014-04-09 E. I. Du Pont de Nemours and Company Expression of caleosin in recombinant oleaginous microorganisms to increase oil content therein
CN102559710B (zh) * 2011-06-27 2013-10-30 中国农业科学院油料作物研究所 等鞭金藻δ4-脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法
CN102373229B (zh) * 2011-06-27 2013-09-11 中国农业科学院油料作物研究所 油脂酵母δ12和δ15双功能脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法
MX342216B (es) 2011-07-21 2016-09-20 Dsm Ip Assets Bv Composiciones de acidos grasos.
ES2857173T3 (es) * 2011-07-21 2021-09-28 Dsm Ip Assets Bv Aceites microbianos enriquecidos en ácidos grasos poliinsaturados
EP3388516A1 (en) 2011-10-19 2018-10-17 Massachusetts Institute Of Technology Engineered microbes and methods for microbial oil production
JP5685783B2 (ja) * 2012-01-19 2015-03-18 国立大学法人名古屋大学 新規ヤロウィア属微生物、並びにそれを用いた油分解剤及び油分解除去方法
CN110358686A (zh) 2012-04-18 2019-10-22 柯碧恩生物技术公司 定制油
US9719114B2 (en) 2012-04-18 2017-08-01 Terravia Holdings, Inc. Tailored oils
BR122019026149A8 (pt) 2012-06-15 2022-06-28 Commw Scient Ind Res Org Célula hospedeira, processo de produzir um lipídio de planta extraído, método de produzir semente, farinha de semente, método para produzir um produto alimentício, uso e processo para produzir ésteres de etila
DK2861727T3 (en) 2012-06-19 2018-06-14 Du Pont MUTERED ACYL-COA: LYSOPHOSPHATIDYLCHOLINE ACYL TRANSFERASES
CN109182238A (zh) 2012-08-10 2019-01-11 嘉吉有限公司 用于生产脂肪酸和脂肪酸衍生产物的微生物及方法
CN105121646B (zh) * 2012-10-30 2020-07-21 农业研究有限公司 新的酰基转移酶多核苷酸、多肽、及其使用方法
JP6064573B2 (ja) * 2012-12-12 2017-01-25 栗田工業株式会社 飼料用添加物及び混合飼料
CA2892516A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Down-regulation of a polynucleotide encoding a sou2 sorbitol utilization protein to modify lipid production in microbial cells
EP2935601B1 (en) 2012-12-21 2018-03-21 E. I. du Pont de Nemours and Company Recombinant microbial cells that produce at least 28% eicosapentaenoic acid as dry cell weight
SG10201709538QA (en) 2012-12-24 2017-12-28 Qualitas Health Ltd Eicosapentaenoic acid (epa) formulations
US10098371B2 (en) 2013-01-28 2018-10-16 Solazyme Roquette Nutritionals, LLC Microalgal flour
US9816079B2 (en) 2013-01-29 2017-11-14 Terravia Holdings, Inc. Variant thioesterases and methods of use
US9567615B2 (en) 2013-01-29 2017-02-14 Terravia Holdings, Inc. Variant thioesterases and methods of use
US10047383B2 (en) 2013-03-15 2018-08-14 Cargill, Incorporated Bioproduction of chemicals
US9290749B2 (en) 2013-03-15 2016-03-22 Solazyme, Inc. Thioesterases and cells for production of tailored oils
US9783836B2 (en) 2013-03-15 2017-10-10 Terravia Holdings, Inc. Thioesterases and cells for production of tailored oils
BR112015026948A8 (pt) 2013-04-26 2017-10-03 Solazyme Inc "composições, lubrificante, tensoativo, solvente, formulação de limpeza, composição de borracha reticulável ou reticulada, tira de pneu, espuma de poliuretano e seu método de preparação
WO2015010103A2 (en) 2013-07-19 2015-01-22 Opx Biotechnologies, Inc. Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
US11408013B2 (en) 2013-07-19 2022-08-09 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
FR3009619B1 (fr) 2013-08-07 2017-12-29 Roquette Freres Compositions de biomasse de microalgues riches en proteines de qualite sensorielle optimisee
WO2015021352A2 (en) 2013-08-08 2015-02-12 Knipbio Methylotrophs for aquaculture and animal feed
JP6619229B2 (ja) * 2013-08-22 2019-12-11 協和発酵バイオ株式会社 アラキドン酸生産ポリケチドシンターゼ及びその利用
JP6517196B2 (ja) 2013-10-04 2019-05-22 テラヴィア ホールディングス， インコーポレイテッド 調整油
ES2875965T3 (es) 2013-12-04 2021-11-11 Nippon Suisan Kaisha Ltd Aceite microbiano que contiene ácido dihomo-gamma-linolénico y biomasa microbiana que contiene ácido dihomo-gamma-linolénico
CA3241340A1 (en) * 2013-12-18 2015-06-25 Grains Research And Development Corporation Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
BR112016017468A2 (pt) 2014-01-31 2017-10-10 Dsm Ip Assets Bv promotores adequados para a expressão de genes heterólogos em leveduras
ES2656390T3 (es) 2014-02-12 2018-02-27 Omnigen Research, Llc Composición y método para promover la reducción de estrés por calor en animales
WO2015127421A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Novogy, Inc. Diacylglycerol acyl transferase (dga1) polynucleotides, and methods of increasing yeast cell lipid production by overexpression of heterologous dga1
WO2015149026A1 (en) 2014-03-28 2015-10-01 Solazyme, Inc. Lauric ester compositions
DK3137616T3 (da) * 2014-05-01 2023-08-21 Ginkgo Bioworks Inc Forøgelse af cellulær lipid produktion ved forøgelse af aktiviteten af diacylglycerolacyltransferase og formindskelse af aktiviteten af triacylglycerollipase
EP3149153B1 (en) 2014-05-29 2022-07-13 Ginkgo Bioworks, Inc. Increasing lipid production in oleaginous yeast
KR102527795B1 (ko) * 2014-06-27 2023-05-02 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 도코사펜타에노산을 포함하는 지질
SG10201909391QA (en) * 2014-06-27 2019-11-28 Commw Scient Ind Res Org Lipid comprising docosapentaenoic acid
US9969990B2 (en) 2014-07-10 2018-05-15 Corbion Biotech, Inc. Ketoacyl ACP synthase genes and uses thereof
CN104099254B (zh) * 2014-07-11 2017-02-15 无锡超科食品有限公司 一株产多不饱和脂肪酸的菌株及其筛选方法
WO2016014968A1 (en) 2014-07-24 2016-01-28 Solazyme, Inc. Variant thioesterases and methods of use
EP2993228B1 (en) 2014-09-02 2019-10-09 Cargill, Incorporated Production of fatty acid esters
CN107208103A (zh) 2014-09-18 2017-09-26 泰拉瑞亚控股公司 酰基‑acp硫酯酶及其突变体
FR3028527A1 (fr) 2014-11-13 2016-05-20 Pivert Identification de facteurs de transcription de yarrowia lipolytica
WO2016075314A1 (fr) 2014-11-13 2016-05-19 Institut National De La Recherche Agronomique Identification de facteurs de transcription de yarrowia lipolytica affectant la production de proteines
BR112017011542A2 (pt) * 2014-12-10 2018-03-13 Novogy Inc produção de ácido oleico em levedura
CA2969304C (en) 2014-12-12 2023-08-22 Dsm Ip Assets B.V. Feed supplement material for use in aquaculture feed
CA2987508A1 (en) 2015-05-28 2016-12-01 Evolva Sa Biosynthesis of phenylpropanoids and phenylpropanoid derivatives
CN105176848B (zh) * 2015-08-19 2017-05-17 江南大学 一株过表达3‑磷酸甘油脱氢酶基因的高山被孢霉、其构建方法及应用
MX2018002964A (es) 2015-09-09 2018-05-17 Omnigen Res Llc Una composicion y/o combinacion para acuacultivo.
EP3370542A1 (en) 2015-10-01 2018-09-12 DSM IP Assets B.V. Supplement material for use in pet food
JP7011590B2 (ja) 2015-10-12 2022-02-10 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 細胞内での遺伝子組換えおよび相同組換えの増加のための保護ｄｎａ鋳型および使用方法
US20180362961A1 (en) 2015-12-11 2018-12-20 Danisco Us Inc. Methods and compositions for enhanced nuclease-mediated genome modification and reduced off-target site effects
DK3390631T3 (da) 2015-12-18 2020-07-13 Danisco Us Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til t-rna-baseret guide-rna-ekspression
CN106434416B (zh) * 2016-07-28 2019-08-30 中国农业科学院油料作物研究所 一种产二十碳五烯酸的菌株及其应用
WO2018144701A2 (en) 2017-02-02 2018-08-09 Cargill Incorporated Genetically modified cells that produce c6-c10 fatty acid derivatives
CN107345211A (zh) * 2017-04-27 2017-11-14 广州弘宝元生物科技有限公司 引入外源多肽的活细胞脂质体及其应用
EP3630943A4 (en) 2017-06-01 2021-06-09 Knipbio, Inc. HETEROLOGICAL CAROTINOID PRODUCTION IN MICROORGANISMS
CN109234216B (zh) * 2017-07-10 2022-05-20 上海医药工业研究院 一种生产鲨烯的基因工程菌及其方法
CN108467841B (zh) * 2018-03-23 2021-08-24 辽宁大学 蛭石固定化耐低温降解多环芳烃混合菌颗粒及其制备方法和应用
CN110358692B (zh) 2018-04-09 2021-07-27 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 生产神经酸的重组酵母菌株及其应用
EP3784791A1 (en) 2018-04-23 2021-03-03 DuPont Nutrition Biosciences ApS Increasing export of 2' fucosyllactose from microbial cells through the expression of a heterologous nucleic acid
CN110373437B (zh) * 2018-12-11 2022-09-27 山东理工大学 一种产十八碳四烯酸卷枝毛霉细胞工厂的构建及其发酵技术
CN109929870B (zh) * 2019-02-20 2021-03-16 天津大学 糖代谢与脂质代谢协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用
CN111685223B (zh) * 2019-03-13 2024-02-02 吉态来博(北京)生物科技发展有限公司 含有解脂亚罗酵母的饲料、其制备方法及其应用
CN109837256B (zh) * 2019-03-21 2020-12-01 江南大学 一种二酰甘油酰基转移酶1及其在生产甘油三酯中的应用
CN110229832A (zh) * 2019-06-16 2019-09-13 山东理工大学 一种提高耶式解脂酵母生物量和细胞壁产量的菌株和方法
CN110499259B (zh) * 2019-07-22 2021-07-27 浙江工业大学 一种解酯耶氏酵母yw100-1及其应用
CN110923261B (zh) * 2019-12-20 2021-12-17 江南大学 一种提高酿酒酵母细胞膜脂肪酸c20:0和/或c22:0含量的方法
WO2021130078A1 (en) 2019-12-23 2021-07-01 Dsm Ip Assets B.V. Aquaculture feed
CN112538438B (zh) * 2020-12-11 2023-04-04 南京工业大学 一株高产油酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用
EP4262427A1 (en) 2020-12-17 2023-10-25 DSM IP Assets B.V. Aquaculture feed
EP4294932A1 (en) * 2021-02-18 2023-12-27 Zero Acre Farms Inc. Systems and methods of making oil from microorganisms
AU2022231106A1 (en) * 2021-03-03 2023-10-12 Nourish Ingredients Pty Ltd Production of phospholipids in microbes and uses thereof
CN113388533B (zh) * 2021-06-11 2022-09-20 东北农业大学 一株发酵性能良好且具有产香功能的汉逊德巴利酵母菌及其筛选方法
KR20240145461A (ko) * 2021-12-10 2024-10-07 파이코일 바이오테크놀로지 인터내셔널, 아이엔씨. 옥세노클로렐라 프로토테코이데스에서 필수 장쇄 다중불포화 지질 (lcpufa)의 종속영양 생산
CN118632928A (zh) 2022-02-02 2024-09-10 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 耶氏酵母属生产方法
CN115029257B (zh) * 2022-05-05 2023-09-26 南京工业大学 产β-胡萝卜素的重组解脂耶氏酵母及其构建方法和应用

Family Cites Families (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2454404A (en) 1942-10-03 1948-11-23 American Cyanamid Co Preparation of piperazine
US2454504A (en) 1946-01-29 1948-11-23 Franz F Ehrenhaft Nonintermittent cinematographic projector
NZ190194A (en) 1978-05-08 1982-02-23 Cpc International Inc Production of oil by fermenting yeast in fatty acids
US4670285A (en) 1982-08-06 1987-06-02 The University Of Toronto Innovations Foundation Infant formula
US5071764A (en) 1983-10-06 1991-12-10 Pfizer Inc. Process for integrative transformation of yarrowia lipolytica
US4880741A (en) 1983-10-06 1989-11-14 Pfizer Inc. Process for transformation of Yarrowia lipolytica
GB8407195D0 (en) 1984-03-20 1984-04-26 Cadbury Schweppes Plc Microbial desaturase enzyme inhibitors
US4792523A (en) 1984-08-31 1988-12-20 Cetus Corporation 3'Expression enhancing fragments and method
DD227448A1 (de) 1984-10-18 1985-09-18 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur herstellung von zitronensaeure auf mikrobiellem wege
JPH075484B2 (ja) 1985-03-06 1995-01-25 帝人株式会社 血液脳関門通過性医薬品組成物
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
CA1317901C (en) 1986-07-08 1993-05-18 Yoshifumi Shinmen Process for production of bishomo-_-linolenic acid and eicosapentaenoic acid
JP2527340B2 (ja) 1986-12-15 1996-08-21 アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド ロ―ダミン染料の５−及び６−スクシニミジルカルボキシレ―ト異性体
US5246841A (en) 1986-12-26 1993-09-21 Sagami Chemical Research Center Microbial process for production of eicosapentaenoic acid
DD259637A1 (de) 1987-04-09 1988-08-31 Adw Ddr Verfahren zur herstellung von isozitratlyase in rekombinanten mikroorganismen
SU1454852A1 (ru) 1987-05-19 1989-01-30 Институт Микробиологии Им.Августа Кирхенштейна Штамм дрожжей JaRRoWIa LIроLYтIса-продуцент липазы и питательна среда дл его культивировани
JP2582622B2 (ja) 1987-10-27 1997-02-19 日東化学工業株式会社 糸状菌による高度不飽和脂肪酸の製造法
DD267999B5 (de) 1988-01-06 2000-08-10 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur herstellung von 2-oxoglutarsaeure durch hefen
US5340742A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
DD275480A1 (de) 1988-09-15 1990-01-24 Ve Forschungszentrum Biotechno Verfahren zur herstellung von zitronensaeure durch aerobe submerse kultivierung von hefen
US5057419A (en) 1988-09-22 1991-10-15 Rutgers University Genetically engineered plasmid and organisms for the production of specialized oils
DD279267A1 (de) 1989-01-05 1990-05-30 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur herstellung mikrobieller lipase
PL160027B1 (pl) 1989-03-23 1993-01-29 Akad Rolnicza Sposób jednoczesnego otrzymywania kwasu cytrynowego i kwasu izocytrynowego PL
DD285370A5 (de) 1989-06-29 1990-12-12 Ingenieurtechnik Im Stammbetrieb Veb Kombinat Suesswaren,Dd Verfahren zur immobilisierung von mikroorganismen bzw. coimmobilisierung von mikroorganismen und enzymen
DD285372A5 (de) 1989-06-29 1990-12-12 Ingenieurtechnik,Dd Verfahren zur immobilisierung von mikroorganismen bzw. coimmobilisierung von mikroorganismen und enzymen
US5366860A (en) 1989-09-29 1994-11-22 Applied Biosystems, Inc. Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination
JP3007119B2 (ja) 1990-01-12 2000-02-07 紀夫 村田 グリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼをコードするｄｎａ鎖
DE69133261D1 (de) 1990-03-16 2003-06-26 Calgene Llc Davis Dnas, die für pflanzliche desaturasen kodieren und deren anwendungen
US5244921A (en) 1990-03-21 1993-09-14 Martek Corporation Eicosapentaenoic acids and methods for their production
AU659087B2 (en) 1990-05-25 1995-05-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleotide sequence of soybean stearoyl-ACP desaturase gene
US5658767A (en) 1991-01-24 1997-08-19 Martek Corporation Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
US5246842A (en) 1991-10-30 1993-09-21 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Production of eicosapentaenoic acid from filamentous fungi utilizing lactose as a primary carbon source
AU675923B2 (en) 1991-12-04 1997-02-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Fatty acid desaturase genes from plants
US5246642A (en) * 1992-02-04 1993-09-21 Slaughter Jr Gibbs M Method for resurfacing fiberglass boat hulls
JPH05308978A (ja) 1992-05-11 1993-11-22 Onoda Cement Co Ltd 藻類によるドコサヘキサエン酸の製造方法
DE69321885T2 (de) 1992-06-25 1999-05-12 International Flavors & Fragrances Inc., New York, N.Y. Verfahren zur fermentativen Herstellung von 10-Hydroxy-C18-Carbonsäure und Gamma-Dodekalaktonderivaten
IT1256043B (it) 1992-08-12 1995-11-21 Ceppo mutante di yarrowia lipolytica e procedimento per la produzione di acido citrico
DE69333025T2 (de) 1992-11-17 2004-04-29 E.I. Du Pont De Nemours And Co., Wilmington Für mikrosom delta 12 fettsäuredesaturase kodierende gene und verwandte enzyme von pflanzen
US6093568A (en) 1994-04-06 2000-07-25 Calgene, Inc. Plant lysophosphatidic acid acyltransferases
US5910630A (en) 1994-04-06 1999-06-08 Davies; Huw Maelor Plant lysophosphatidic acid acyltransferases
WO1996033263A1 (fr) 1995-04-17 1996-10-24 JAPAN, represented by DIRECTOR-GENERAL OF AGENCY OF INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Nouveaux micro-organismes capables de produire des acides gras hautement insatures et procede de production d'acides gras hautement insatures utilisant ces micro-organismes
FR2734843A1 (fr) 1995-06-02 1996-12-06 Centre Nat Rech Scient Nouveau procede de bioconversion microbienne.
EP0770683A1 (en) 1995-10-04 1997-05-02 Mitsubishi Chemical Corporation Method for producing erythritol
JPH09252790A (ja) 1996-03-21 1997-09-30 Japan Energy Corp 発酵法によるピルビン酸の製造方法
EP0894142B2 (en) * 1996-03-28 2013-11-20 DSM IP Assets B.V. Microbial oil containing a polyunsaturated fatty acid and method of producing oil from pasteurised and granulated biomass
AU2887897A (en) 1996-05-21 1997-12-09 Novo Nordisk A/S Novel yeast promoters suitable for expression cloning in yeast and heterologous expression of proteins in yeast
AU723553C (en) 1996-07-23 2005-04-14 Nagase & Co., Ltd. Process for preparing docosahexaenoic acid and docosapentaenoic acid
JP3792309B2 (ja) * 1996-08-30 2006-07-05 サントリー株式会社 不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法
RU2090611C1 (ru) 1996-09-27 1997-09-20 Финогенова Татьяна Васильевна Штамм дрожжей yarrowia lipolytica - продуцент лимонной кислоты, способ получения лимонной кислоты и способ выделения цитрата натрия
PL190181B1 (pl) 1996-10-11 2005-11-30 Scarista Ltd Zastosowanie oleju zawierającego kwas eikozapentaenowy (KEP) i/lub kwas stearydonowy (KS) oraz preparat farmaceutyczny zawierający olej
US6432684B1 (en) * 1997-04-11 2002-08-13 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US5968809A (en) 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US5972664A (en) * 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6075183A (en) 1997-04-11 2000-06-13 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
EP1034308A4 (en) 1997-12-04 2002-04-03 Smithkline Beecham Corp PROCESS USING ANTISENSE EXPRESSION SEQUENCES TO PRODUCE CONDITIONALLY EXPRESSED MUTANT CELLS
US20030167483A1 (en) 1998-06-24 2003-09-04 Farese Robert V. Diacylglycerol O-acyltransferase
US6344548B1 (en) 1998-06-24 2002-02-05 The Regents Of The University Of California Diacylglycerol o-acyltransferase
BR9911800A (pt) 1998-07-02 2001-02-28 Calgene Llc Proteìnas de diacil glicerol acil transferase
US7135617B2 (en) 1998-07-02 2006-11-14 Calgene Llc Diacylglycerol acyl transferase proteins
US6677145B2 (en) * 1998-09-02 2004-01-13 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US6403349B1 (en) 1998-09-02 2002-06-11 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
US6100077A (en) 1998-10-01 2000-08-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Isolation of a gene encoding diacylglycerol acyltransferase
EP0997533A1 (de) 1998-10-24 2000-05-03 Haarmann & Reimer Gmbh Verfahren zur Gewinnung von Gamma-Decalacton
FR2785911B1 (fr) 1998-11-18 2001-01-26 Agronomique Inst Nat Rech Gene codant pour une acyltransferase de colza, et ses utilisations
AU1837600A (en) 1998-12-02 2000-06-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant diacylglycerol acyltransferases
NZ512656A (en) 1998-12-07 2003-09-26 Univ Washington Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids
DE69933391T2 (de) * 1998-12-17 2007-11-15 National Research Council Of Canada, Ottawa Diacylglyzerin-acyltransferase gen aus pflanzen
CA2362650A1 (en) 1999-02-22 2000-08-24 E.I. Du Pont De Nemours And Company Lysophosphatidic acid acetyltransferases
CA2366187C (en) 1999-04-01 2010-05-25 Basf Plant Science Gmbh A new class of enzymes in the biosynthetic pathway for the production of triacylglycerol and recombinant dna molecules encoding these enzymes
KR19990046733A (ko) 1999-04-20 1999-07-05 류성구 미생물슈도모나스에의한도코사핵사노인산(ｄｈａ)의제조방법
EP1230373B1 (en) 1999-11-12 2007-02-07 BASF Plant Science GmbH Use of a class of enzymes and their encoding genes to increase the oil content in transgenic organisms
IL150414A0 (en) * 2000-02-09 2002-12-01 Basf Ag Novel elongase gene and method for producing multiple-unsaturated fatty acid
DE60036647T2 (de) 2000-04-28 2008-07-17 Laboratoires Mayoly Spindler Klonierung und expression einer extrazellulären säurebeständigen lipase aus yarrowia lipolytica
CN1380903A (zh) 2000-05-19 2002-11-20 钟渊化学工业株式会社 转化体和用其生成聚酯的方法
US6552250B1 (en) 2000-06-14 2003-04-22 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Diacylglycerol O-acyltransferase
DE10102337A1 (de) * 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte
US6635451B2 (en) * 2001-01-25 2003-10-21 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
GB2377455A (en) 2001-02-09 2003-01-15 Univ Hull Method of culturing crypthecodinium cohnii
US7045326B2 (en) 2001-02-23 2006-05-16 The Regents Of The University Of California Mono- and diacylglycerol acyltransferases and methods of use thereof
GB0107510D0 (en) * 2001-03-26 2001-05-16 Univ Bristol New elongase gene and a process for the production of -9-polyunsaturated fatty acids
JP2002296554A (ja) 2001-03-30 2002-10-09 Minebea Co Ltd ファラデー回転子
US7045683B2 (en) * 2001-05-04 2006-05-16 Abbott Laboratories Δ4-desaturase genes and uses thereof
WO2003025165A1 (en) 2001-09-21 2003-03-27 National Research Council Of Canada Higher plant cytosolic er-based glycerol-3-phosphate acyltransferase genes
US7211656B2 (en) * 2002-01-30 2007-05-01 Abbott Laboratories Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof
DE10219203A1 (de) * 2002-04-29 2003-11-13 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen
BR122014000528B1 (pt) 2002-05-22 2016-02-16 Monsanto Technology Llc polinucleotídeo e vetor com atividade dessasturase no carbono 12 de molécula de ácido graxo, bem como método para produção de planta com óleo de semente contendo níveis alterados de ácidos graxos de ômega-3
CN112280807A (zh) * 2002-06-19 2021-01-29 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 包含多不饱和脂肪酸的微生物油的制备
BR0313536A (pt) 2002-07-31 2005-06-14 Monsanto Technology Llc Sequencias de ácido nucléico de diacilglicerol acetiltransferase e produtos associados
EP1576166B1 (en) 2002-12-19 2014-10-15 University Of Bristol Novel method for the production of polyunsaturated fatty acids
JP4280158B2 (ja) 2002-12-27 2009-06-17 富士フイルム株式会社 ドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物及びその利用
US20040172682A1 (en) * 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
CA2517253C (en) 2003-02-27 2018-07-03 Basf Plant Science Gmbh Method for the production of polyunsaturated fatty acids
CA2520795C (en) 2003-03-31 2015-06-23 University Of Bristol Novel plant acyltransferases specific for long-chained, multiply unsaturated fatty acids
US7214491B2 (en) * 2003-05-07 2007-05-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ-12 desaturase gene suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US7125672B2 (en) * 2003-05-07 2006-10-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Codon-optimized genes for the production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US7238482B2 (en) 2003-05-07 2007-07-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
KR100952263B1 (ko) 2003-06-04 2010-04-09 세키스이가가쿠 고교가부시키가이샤 경화성 수지 조성물
ATE440509T1 (de) 2003-06-04 2009-09-15 Nestec Sa Getränk zur gewichtskontrolle
AU2003903058A0 (en) 2003-06-18 2003-07-03 Phytopharm Australia Ltd A process and apparatus for the modification of plant extracts
US7259255B2 (en) * 2003-06-25 2007-08-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase promoters for gene expression in oleaginous yeast
US7459546B2 (en) * 2003-06-25 2008-12-02 E.I. Du Pont De Nemours And Company Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase regulatory sequences for gene expression in oleaginous yeast
US7267976B2 (en) 2003-07-02 2007-09-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous yeasts
PT2172536T (pt) * 2003-08-01 2016-08-17 Basf Plant Science Gmbh Processo para a produção de ácidos gordos poli-insaturados em organismos transgénicos
CA2542574C (en) 2003-11-12 2014-03-18 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous plants and yeast
US7504259B2 (en) * 2003-11-12 2009-03-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ12 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeast
US7202356B2 (en) * 2003-11-14 2007-04-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fructose-bisphosphate aldolase regulatory sequences for gene expression in oleaginous yeast
US7264408B2 (en) 2004-04-28 2007-09-04 Finisar Corporation Modular optical device package
US7256033B2 (en) * 2004-06-25 2007-08-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
US7264949B2 (en) * 2004-09-15 2007-09-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company Glycerol-3-phosphate o-acyltransferase promoter for gene expression in oleaginous yeast
US7273746B2 (en) 2004-11-04 2007-09-25 E.I. Dupont De Nemours And Company Diacylglycerol acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7192762B2 (en) 2004-11-04 2007-03-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina glycerol-3-phosphate o-acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7198937B2 (en) 2004-11-04 2007-04-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina diacylglycerol acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7189559B2 (en) 2004-11-04 2007-03-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina lysophosphatidic acid acyltransferase homolog for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US8685679B2 (en) 2004-11-04 2014-04-01 E I Du Pont De Nemours And Company Acyltransferase regulation to increase the percent of polyunsaturated fatty acids in total lipids and oils of oleaginous organisms
US20060094102A1 (en) 2004-11-04 2006-05-04 Zhixiong Xue Ammonium transporter promoter for gene expression in oleaginous yeast
US7588931B2 (en) 2004-11-04 2009-09-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
WO2006064317A1 (en) 2004-12-14 2006-06-22 Avestha Gengraine Technologies Pvt. Ltd. Recombinant production docosahexaenoic acid (dha) in yeast
US7470532B2 (en) 2005-10-19 2008-12-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina C16/18 fatty acid elongase

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