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KR20070034471A - Ｓｔｅａｐ-１ 단백질과 결합하는 항체 및 그로부터 유래된분자 - Google Patents

Ｓｔｅａｐ-１ 단백질과 결합하는 항체 및 그로부터 유래된분자 Download PDF

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KR20070034471A
KR20070034471A KR1020067024433A KR20067024433A KR20070034471A KR 20070034471 A KR20070034471 A KR 20070034471A KR 1020067024433 A KR1020067024433 A KR 1020067024433A KR 20067024433 A KR20067024433 A KR 20067024433A KR 20070034471 A KR20070034471 A KR 20070034471A
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소우다베 에테사미
피아 엠. 샬리타-에이드
후안 제이. 페레즈-필라르
캐런 제이. 모리슨
시아오-치 지아
메리 패리스
진 구다스
어써 비. 레이타노
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Abstract

본원에는 신규한 STEAP-1 단백질 및 그의 변이체과 결합하는 항체 및 그로부터 유래된 분자가 기재되어 있는데, STEAP-1은 정상 성체 조직에서 조직 특이적 발현을 나타내고, 표 I에 열거된 암에서 이상하게 발현된다. 결과적으로, STEAP-1은 암에 대한 진단적, 예후적, 예방적 및(또는) 치료적 표적을 제공한다. STEAP-1 유전자 또는 그의 단편, 또는 그의 코딩된 단백질, 그의 변이체, 또는 그의 단편을 사용하여 체액성 또는 세포성 면역 반응을 유도시킬 수 있고; STEAP-1과 반응성인 항체 또는 T 세포를 능동 또는 수동 면역에 사용할 수 있다.
STEAP-1, STEAP-1와 특이적으로 결합하는 항체, 암 치료

Description

ＳＴＥＡＰ-１ 단백질과 결합하는 항체 및 그로부터 유래된 분자 {Antibodies and Molecules Derived Therefrom That Bind To STEAP-1 Proteins}
연방 정부의 후원을 받는 연구 하에 이루어진 발명에 대한 권리 진술
적용되지 않는다.
본 발명은 STEAP-1로 지칭된 단백질과 결합하는 항체 뿐만 아니라 그의 결합성 단편 및 그로부터 공학적으로 처리시킨 분자에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, STEAP-1을 발현하는 암을 치료하는데 있어 유용한 진단, 예후, 예방 및 치료적 방법 및 조성물에 관한 것이다.
암은 관상 질환에 이어 두 번째로 높은 인간 사망 원인이다. 전세계적으로, 수 백만명이 매년 암으로 인해 사망한다. 미국 암 협회에 보고된 바에 따르면, 미국에서만도 매년 50만명을 훨씬 웃도는 숫자가 암으로 인해 사망하고, 매년 백이십만명 이상이 새로운 암 환자로 진단된다. 심장 질환으로 인한 사망률은 상당히 떨어졌지만, 암으로 인한 사망률은 대체로 증가하는 추세다. 다음 세기 초반에는, 암이 제1 사망 원인이 될 것으로 예상된다.
전 세계적으로, 몇 가지 암이 두드러지게 치명적이다. 특히, 폐, 전립선, 유방, 결장, 췌장, 난소 및 방광 암종이 암 사망에 있어 주요 원인이다. 이들 암종 및 거의 모든 기타 암종은 공통적으로 치사적이다. 거의 예외없이, 특정 암종으로부터의 전이성 질병 역시 치사적이다. 더우기, 초기에 자신의 원발성 암으로부터 살아남은 암 환자인 경우에도, 자신의 삶인 현저하게 변경되었다는 것을 흔히 경험하는 것으로 밝혀졌다. 많은 암 환자는 암 재발이나 치료 실패 가능성에 대한 자각으로 인해 심각한 우울증을 겪게 된다. 많은 암 환자는 치료 후 신체적으로 쇠약해진다. 더우기, 많은 암 환자는 재발된다.
전 세계적으로, 전립선 암은 남성에게서 네 번째로 자주 발병하는 암이다. 북미와 북유럽에서는, 전립선 암이 남성에게서 압도적으로 가장 흔히 발병하는 암이고, 남성 암 사망 원인 중에 두 번째로 높다. 미국에서만도, 매년 30,000명을 훨씬 웃도는 남성이 이 질병으로 사망하고, 이는 폐암에 이어 두 번째로 높다. 이러한 규모에도 불구하고, 아직까지도 전이성 전립선 암에 대한 효과적인 치료법이 없다. 외과적 전립선절제술, 방사선 요법, 호르몬 제거 요법, 외과적 거세 및 화학요법이 여전히 주요 치료 양식이다. 불행하게도, 이들 치료법은 많은 이들에게 있어 유효하지 못하고, 종종 바람직하지 못한 결과를 초래하기도 한다.
진단 측면에서 보면, 국부의 초기 종양을 정확하기 탐지할 수 있는 전립선 종양 마커가 없다는 사실이 상기 질병을 진단 및 관리하는데 있어 상당한 제약이 되고 있다. 혈청 전립선 특이적 항원 (PSA) 검정이 매우 유용한 도구이긴 하지만, 그의 특이성과 일반적인 활용성은 몇 가지 중요한 사항이 결여된 것으로 널리 간주되고 있다.
전립선 암에 대한 부가의 특이적 마커를 확인하는데 있어서의 기술적 진보는, 마우스에서 상이한 병기를 재현할 수 있는 전립선 암 이종이식편을 생성시킴으로써 향상되었다. LAPC (로스앤젤레스 전립선 암) 이종이식편은 중증 복합 면역결핍증 (SCID) 마우스에서 생존한, 안드로겐 의존성에서 안드로겐 비의존성으로의 이행을 모방할 수 있는 능력을 나타낸 전립선 암 이종이식편이다 [참고: Klein etal., 1997, Nat. Med. 3: 402]. 보다 최근에 확인된 전립선 암 마커에는 PCTA-1 [참고: Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7252], 전립선-특이적 막 (PSM) 항원 [참고: Pinto et al., Clin Cancer Res 1996 Sep 2 (9): 1445-51], STEAP [참고: Hubert, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Dec 7; 96(25): 14523-8] 및 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA) [참고: Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735]이 포함된다.
기존에 확인된 마커, 예를 들어 PSA, PSM, PCTA 및 PSCA가 전립선 암을 진단 및 치료하기 위한 노력들을 촉진시켜 주었지만, 진단 및 치료법을 추가로 개선시키기 위해서는 전립선 암 및 관련 암에 대한 부가의 마커 및 치료적 표적을 확인할 필요가 있다. 신 세포 암종 (RCC)은 성인 악성 종양의 대략 3%를 차지한다. 선종 직경이 2 내지 3 cm에 도달하면, 악성으로 진행될 수 있다. 성인에게서 발병되는 두 가지 주요 악성 신 종양은 신 골반 또는 수뇨관의 이행 세포 암종 및 신 세포 선암종이다. 신 세포 선암종의 발생수는 미국에서 29,000건 이상 증례인 것으로 추정되며, 1998년에는 이 질병으로 인해 11,600명 이상의 환자가 사망하였다. 이행 세포 암종은 이 보다는 덜 발생하는데, 미국에서 매년 대략 500건 증례가 발생 한다.
수 십년 동안 수술이 신 세포 선암종에 대한 주요 요법이었다. 최근까지도, 전이성 질병은 어떠한 전신 요법으로도 치료하기가 어려웠다 (난치성). 최근에 개발된 전신 요법, 특히 면역요법을 이용하여, 지속적 반응 가능성을 나타내는 적당한 환자에게서 전이성 신 세포 암종에 공격적으로 접근할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 환자에 대한 유효한 요법이 여전히 요망된다.
미국에서 발생하는 모든 신규 암 증례 중에서, 방광암이 남성에게서 대략 5%를 차지하고 (5번째로 가장 흔한 종양) 여성에게서는 대략 3%를 차지한다 (8번째로 가장 흔한 종양). 노인 집단 증가와 동시에 그 발생수도 서서히 증가하고 있다. 1998년에는 54,500건의 증례가 발생한 것으로 추정되었는데, 그중 남성이 39,500명이고 여성이 15,000명이다. 미국에서 연령 조정 발생수는 남성의 경우 100,000명당 32명이고 여성의 경우에는 100,000명당 8명이다. 3:1의 역사적 남성/여성 비율은 여성의 흡연 패턴과 관련하여 감소할 수 있다. 1998년에 방광암으로 사망한 수는 11,000명인 것으로 추정되었다 (남성 7,800명, 여성 3,900명). 방광암 발생수와 사망률은 연령이 증가함에 따라 증가하고, 집단이 노령화됨에 따라 이에 따른 문제점도 증가할 것이다.
대부분의 방광암은 방광에서 재발한다. 방광암은 방광의 경요도적 전기 절제 방법 (TUR)과 방광내 화학요법 또는 면역요법을 병용하여 관리한다. 방광암의 다병소성과 재발성은 TUR의 한계를 드러낸다. 대부분의 근육-침습성 암은 TUR 단독에 의해서는 치유되지 않는다. 근치 방광절제술 및 요로 전환술이 상기 암을 제 거하는데 있어 가장 유효한 수단이지만, 이는 뇨 기능과 성적 기능에 부인하기 어려운 명백한 충격을 가한다. 방광암 환자에게 이득이 되는 치료 양식에 대한 요망 (필요성)이 여전히 상당히 존재한다.
2000년 미국에서는 130,200건 증례의 결장암이 발생한 것으로 추정되었는데, 결장암은 93,800건이고, 직장암은 36,400건이다. 결장직장암은 남성과 여성에게서 세 번째로 흔히 발병하는 암이다. 1992년과 1996년 사이에는 발병률이 상당히 저하되었다 (매년 2.1%씩 저하됨). 조사 결과는 이러한 저하가 스크리닝 증가와 폴립 제거 증가로 인해, 폴립이 침습성 암으로 진행되는 것을 예방한 것에 따른 결과로 제안되었다. 2000년에는 결장직장암으로 인한 사망자 수가 56,300명인 것으로 추정되었는데 (결장암으로 인한 사망자 수는 47,700명이고, 직장암으로 인한 사망자 수는 8,600명이다), 이는 미국 암 사망률의 약 11%를 차지한다.
현재에는, 수술이 결장직장암에 대한 가장 흔한 형태의 치료법이며, 암이 확산되지 않은 경우에는, 이러한 수술이 종종 치유적이다. 암이 장 벽을 깊이 천공하였거나 림프절로 확산된 대부분의 환자에게 수술을 하기 전 또는 수술 후에 화학요법 또는 화학요법 + 방사선 요법을 투여한다. 영구적 결장조루술 (이로써, 신체 폐기물 제거를 위한 복부 개구가 생긴다)이 때때로 결장암에 요망되지만, 직장암에 경우에는 드물게 요구된다. 결장직장암에 대한 유효한 진단 및 치료 양식이 지속적으로 요망된다.
2000년에 대략 164,100건 증례가 새로이 폐암 및 기관지 암으로 진단되었는데, 이는 미국 암 진단의 14%를 차지한다. 폐암 및 기관지 암의 발생률은 남성의 경우 1984년 100,000명당 86.5명 정도로 높은 수준에서 1996년도에는 70.0명으로 상당히 저하되었다. 1990년도에는, 여성의 발병 증가율이 느려지기 시작하였다. 1996년에는 여성의 발병률이 100,000명당 42.3명이었다.
폐암 및 기관지암으로 인한 사망자 수는 2000년에 대략 156,900명이었고, 이는 모든 암 사망자 수의 28%를 차지한다. 1992년과 1996년 사이에는, 폐암으로 인한 사망률이 남성에게서 급격히 저하된 반면 (매년 1.7%씩 저하됨), 여성의 경우에는 여전히 현저하게 증가하였다 (매년 0.9%씩 증가함). 지난 40년간은 유방암이 여성 암 사망의 주요 원인이었지만, 1987년 이래로는 매년 유방암으로 인한 사망자 수 보다 폐암으로 인한 사망자 수가 더 많았다. 폐암 발생률과 사망률 감소는 대부분이 지난 30년에 비해 흡연율이 감소하였기 때문인 것으로 예상되지만, 여성들 간의 흡연 패턴 저하는 남성에 비해 뒤떨어진다. 우려되는 것은, 성인 흡연율은 서서히 감소하였지만, 청소년의 흡연율은 다시 증가하고 있다는 것이다.
폐암 및 기관지 암에 대한 치료법 선택은 암의 유형과 병기에 의해 결정되는데, 이에는 수술, 방사선 요법 및 화학요법이 포함된다. 많은 국부성 암의 경우에는 통상적으로 수술 요법이 선택된다. 질병이 통상적으로 이것이 발견되는 시점에 확산되기 때문에, 수술과 병용해서 방사선 요법 및 화학요법을 수행하는 것이 종종 필요하다. 소세포 폐암의 경우에 선택되는 치료법은 화학요법 만을 수행하거나 화학요법을 방사선 요법과 병용하는 것이며; 이러한 섭생시, 대다수의 환자들은 차도를 경험하며, 몇몇 경우에는 이러한 차도가 장 시간 지속된다. 그러나, 폐암 및 기관지 암에 대한 유효한 치료 및 진단 접근법에 대한 여전히 요망된다.
2000년 미국에서는 대략 182,800건의 새로운 침습성 유방암 증례가 여성에게 발생한 것으로 예상되었다. 부가적으로, 새로운 유방암 증례의 대략 1,400건이 2000년에 남성에게서 진단된 것으로 예상되었다. 1980년대에 매년 약 4%씩 증가한 후, 여성에게서의 유방암 발생률은 1990년대에 100,000건당 약 110.6건으로 감소하였다.
미국에서만도, 2000년에 유방암으로 인한 사망자 수가 41,200명인 것으로 추정되었다 (여성 40,800명, 남성 400명). 유방암은 여성 암 사망 원인 중에 두 번째로 높다. 가장 최근의 데이터에 따르면, 사망률은 1992과 1996년 사이에 현저하게 저하되었는데, 가장 큰 감소는 백인이든 흑인이든 젊은 여성에게서 나타났다. 이러한 감소는 조기 검진과 개선된 치료 결과인 것으로 추정되었다.
의학적 환경과 환자의 선호도를 고려하면, 유방암 치료법은 덩어리절제술 (종양의 국소 제거) 및 팔 아래 림프절의 제거; 유방절제술 (유방의 외과적 제거) 및 팔 아래 림프절의 제거; 방사선 요법; 화학요법; 또는 호르몬 요법을 포함할 수 있다. 종종 2가지 이상 방법을 병용해서 사용한다. 수 많은 연구 결과, 병기 초기에는 덩어리절제술 + 방사선 요법 후의 장기간 생존율이 변형 근치 유방절제술 후의 생존율과 유사한 것으로 밝혀졌다. 재건 기술에 있어서의 상당한 진보로 인해, 유방절제술 후 유방 재건술에 대한 몇 가지 선택권이 제공되었다. 최근에는, 이러한 제건술이 유방절제술과 동시에 수행되었다.
적당량의 주변 정상 유방 조직을 수반한 계내 관상 암종 (DCIS)의 국소 절제는 DCIS의 국소적 재발을 예방할 수 있다. 유방에 대한 방사선 요법 및(또는) 타 목시펜은 나머지 유방 조직에서 DCIS가 발생할 기회를 감소시킬 수 있다. 이는 DCIS가 치료되지 않은 채로 있는 경우에 침습성 유방암으로 진행될 수 있기 때문에 중요하다. 그럼에도 불구하고, 이들 치료법에 대한 심각한 부작용 또는 후유증이 있다. 따라서, 효능있는 유방암 치료법에 대한 요망이 있다.
2000년 미국에서는 대략 23,100건 증례의 난소암이 새로이 진단되었다. 이는 여성에게서 발병하는 모든 암의 4%를 차지하고, 부인과 암 중에서 두 번째로 높다. 1992년과 1996년 사이에는 난소암 발생률이 상당히 저하되었다. 난소암으로 인해, 2000년에 대략 14,000명이 사망하였다. 난소암은 기타 여성 생식계 암 보다 더 많은 사망자 수를 유발시켰다.
수술, 방사선 요법 및 화학요법이 난소암에 대한 치료법 선택 범위이다. 수술에는 통상적으로, 양쪽 난소 또는 난소 중의 1개의 제거, 난관 (나팔관)의 제거 (난관 난소 절제술), 및 자궁의 제거 (자궁적출술)이 포함된다. 극히 초기인 일부 종양에서는, 특히 임신하고자 하는 젊은 여성에게서는 발병된 난소만을 제거할 것이다. 병이 진행된 경우에는, 화학요법의 효과를 증강시키기 위해 복부내 모든 질병을 제거하고자 시도하였다. 난소암에 유효한 탁월한 치료 선택권이 여전히 요망된다.
2000년 미국에서는 대략 28,300건 증례의 췌장암이 새로이 진단되었다. 과거 20년 동안, 췌장암 발생률이 남성의 경우 저하되었다. 여성의 경우에는 췌장암 발생률이 대략 일정한 채로 유지되었는데, 이는 감소 시작일 수 있다. 2000년 미국에서는 췌장암으로 인해 28,200명이 사망한 것으로 추정되었다. 지난 20년간, 남성의 사망률은 약간이긴 하지만 상당히 감소된 반면 (매년 약 0.9%씩 감소함), 여성에게서는 약간 증가하였다.
수술, 방사선 요법 및 화학요법이 췌장암에 대한 치료법 선택 범위이다. 이들 치료법은 많은 환자에게 있어 생존 기간을 연장시키고/시키거나 증상을 경감시킬 수 있지만, 대부분의 경우에 완치를 가져다 주지는 않는 것으로 예상된다. 암에 대한 부가의 치료적 및 진단적 선택권이 상당히 요망된다. 이에는 치료 양식으로서 항체, 백신 및 소분자를 사용하는 것이 포함된다. 부가적으로, 진단, 탐지, 모니터링 및 모든 암 치료 및 연구 분야에서의 추가의 기술 수준에 대한 조사 도구로서 이들 양식을 사용할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 STEAP-1 단백질 및 STEAP-1 단백질의 폴리펩티드 단편과 결합하는 항체 뿐만 아니라 그의 결합성 단편 및 그로부터 공학적으로 처리시킨 분자를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 STEAP-1은 8P1D4와 동의어이다. 본 발명은 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 뮤린 및 기타 포유류 항체, 키메라 항체, 인간화 및 완전한 인간 항체, 및 탐지 가능한 마커 또는 치료제로 표지시킨 항체를 포함한다. 특정 양태에서는, 도 2의 전체 핵산 서열이 코딩되지 않고/않거나 도 2의 전체 아미노산 서열이 제조되지 않는다는 단서 조항이 있다. 특정 양태에서는, 도 2의 전체 핵산 서열이 코딩되고/되거나 도 2의 전체 아미노산 서열이 제조되는데, 이들 중의 어느 하나는 각각의 인간 단위 투여형으로 존재한다.
본 발명은 추가로, 각종 생물학적 샘플 중에서 STEAP-1 폴리뉴클레오티드 및 단백질의 존재 및 상태를 탐지하는 방법 뿐만 아니라 STEAP-1을 발현하는 세포를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 양태는 몇몇 형태의 성장 조절이상 (예: 암)을 나타내거나 나타낸 것으로 의심되는 조직 또는 혈액학 샘플 중에서 STEAP-1 유전자 생성물을 모니터링하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, STEAP-1을 발현하는 암, 예를 들어 표 I에 열거된 조직의 암을 치료하기 위한 각종 면역원성 또는 치료 조성물 및 전략을 제공하는데, 이에는 STEAP-1의 전사, 해독, 프로세싱 또는 기능을 억제하는 것을 목적으로 하는 요법 및 암 백신이 포함된다. 한 국면에서, 본 발명은 인간 대상체에게서 STEAP-1을 발현하는 암을 치료하기 위한 조성물, 및 이를 포함하는 방법을 제공하는데, 상기 조성물은 인간에게 사용하기 적합한 담체, 및 STEAP-1의 생성 또는 기능을 억제시키는 한 가지 이상 작용제의 인간 단위 용량을 포함한다. 바람직하게는, 담체가 독특한 인간 담체이다. 본 발명의 또 다른 국면에서는, 상기 작용제가 STEAP-1 단백질과 면역반응성인 부분이다. 이러한 부분의 비제한적 예에는 항체 (예: 단일쇄, 모노클로날, 폴리클로날, 인간화, 키메라 또는 인간 항체), 이의 기능적 등가물 (천연 발생적이든 아니면 합성이든지 간에), 및 그의 조합물이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 항체는 진단적 또는 치료적 부분에 접합시킬 수 있다. 또 다른 국면에서는, 상기 작용제가 본원에 기재된 바와 같은 소분자이다.
또 다른 국면에서는, 상기 작용제가 STEAP-1에 대한 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 유발시키기 위해 인간에게서 HLA 부류 I 분자와 결합하는 CTL 에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드 및(또는) 조력 T 림프구 (HTL) 반응을 유발시키 기 위해 인간에게서 HLA 부류 II 분자와 결합하는 HTL 에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 본 발명의 펩티드는 동일하거나 하나 이상의 별개의 폴리펩티드 분자 상에 존재할 수 있다. 본 발명의 추가 국면에서는, 상기 작용제가 상기 언급된 바와 같은 CTL 또는 HTL 반응 자극성 펩티드들 중의 하나 이상을 발현하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 본 발명의 또 다른 국면에서는, 하나 이상의 핵산 분자가 상기 언급된 바와 같이 STEAP-1과 면역학적으로 반응성인 부분을 발현할 수 있다. 이러한 하나 이상의 핵산 분자는 또한, STEAP-1의 생성을 억제하는 분자일 수 있거나, 또는 이러한 분자를 코딩할 수 있다. 상기 핵산의 비제한적 예에는 STEAP-1의 생성에 필수적인 뉴클레오티드 서열에 상보적인 것 (예를 들어, STEAP-1 생성에 필수적인 뉴클레오티드 이중 나선과 삼중 나선을 형성하는 안티센스 서열 또는 분자) 또는 STEAP-1 mRNA를 용해시키는데 유효한 리보자임이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태는 다음 특징들 중의 1가지, 2가지, 3가지, 4가지 또는 5가지를 갖는, 특정 펩티드 영역을 포함하는 항체 에피토프, 또는 이러한 펩티드 영역을 코딩하는 올리고뉴클레오티드이다:
i) 도 5의 친수성 프로파일에서 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 이상의 값을 나타내거나 1.0 등가 값을 나타내는 아미노산 위치를 포함하고, 도 3에 제시된 단백질의 완전한 길이까지 정수 단위로 증가하는, 도 3의 특정한 펩티드의 5개 이상 아미노산의 펩티드 영역;
ii) 도 6의 수친화도 프로파일에서 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 이하의 값을 나 타내거나 0.0 등가 값을 나타내는 아미노산 위치를 포함하고, 도 3에 제시된 단백질의 완전한 길이까지 정수 단위로 증가하는, 도 3의 특정한 펩티드의 5개 이상 아미노산의 펩티드 영역;
iii) 도 7의 이용 가능한 잔기 비율 (%) 프로파일에서 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 이상의 값을 나타내거나 1.0 등가 값을 나타내는 아미노산 위치를 포함하고, 도 3에 제시된 단백질의 완전한 길이까지 정수 단위로 증가하는, 도 3의 특정한 펩티드의 5개 이상 아미노산의 펩티드 영역;
iv) 도 8의 평균 가요성 프로파일에서 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 이상의 값을 나타내거나 1.0 등가 값을 나타내는 아미노산 위치를 포함하고, 도 3에 제시된 단백질의 완전한 길이까지 정수 단위로 증가하는, 도 3의 특정한 펩티드의 5개 이상 아미노산의 펩티드 영역; 또는
v) 도 9의 베타-회전 프로파일 프로파일에서 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 이상의 값을 나타내거나 1.0 등가 값을 나타내는 아미노산 위치를 포함하고, 도 3에 제시된 단백질의 완전한 길이까지 정수 단위로 증가하는, 도 3의 특정한 펩티드의 5개 이상 아미노산의 펩티드 영역.
본 발명은 또한, 표 I에 열거된 암(들)에서 과발현되는 것으로 밝혀진, STEAP-1로 명명된 유전자에 관한 것이다. 정상 조직에서의 STEAP-1 유전자 발현을 노던 블롯 발현 분석한 결과, 성체 조직에서 제한된 발현 패턴을 나타낸다. STEAP-1의 뉴클레오티드 서열 (도 2) 및 아미노산 서열 (도 2 및 도 3)이 제공된다. 정상 성체 조직에서의 STEAP-1의 조직 관련 프로파일을, 표 I에 열거된 조직 에서 관찰된 과발현과 연계해 고찰해 보면, STEAP-1이 적어도 몇몇 암에서 이상하게 과발현되므로, 표 I에 열거된 바와 같은 조직(들)의 암에 대한 유용한 진단적, 예방적, 예후적 및(또는) 치료적 표적으로서 제공된다는 사실이 밝혀졌다.
본 발명은 바람직하게는 분리된 형태의, STEAP-1 유전자, mRNAs, 및(또는) 코딩 서열의 전부 또는 일부에 상응하거나 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 STEAP-1-관련 펩티드 및 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 25개 초과의 연속된 아미노산의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; STEAP-1-관련 단백질의 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100개, 또는 100개 초과의 연속된 아미노산 뿐만 아니라 상기 펩티드/단백질 자체; DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드 및 관련 분자, STEAP-1 유전자 또는 mRNA 서열 또는 그의 일부와 상보적이거나 90% 이상 상동률을 나타내는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 및 STEAP-1 유전자, mRNAs, 또는 STEAP-1-코딩 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또한, cDNAs, 및 STEAP-1을 코딩하는 유전자를 분리하기 위한 수단을 제공한다. STEAP-1 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 DNA 분자, 이러한 분자로 형질전환 또는 형질도입시킨 세포, 및 STEAP-1 유전자 생성물을 발현하기 위한 숙주-벡터 시스템을 또한 제공한다.
도 1. 436개 뉴클레오티드의 STEAP-1 SSH 서열.
도 2. STEAP-1 변이체 1 ("STEAP-1 v.1" 또는 "STEAP-1 변이체 1"로 지칭되 기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2A에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 66-1085로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 2 ("STEAP-1 v.2"로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2B에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-872로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 3 ("STEAP-1 v.3"으로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2C에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-944로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 4 ("STEAP-1 v.4"로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2D에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-872로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 5 ("STEAP-1 v.5"로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2E에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-872로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 6 ("STEAP-1 v.6"로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2F에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-872로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 7 ("STEAP-1 v.7"로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2G에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-872로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 8 ("STEAP-1 v.8"로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2H에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-872로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 9 ("STEAP-1 v.9"로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2I에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-872로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 10 ("STEAP-1 v.10"로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2J에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-872로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 11 ("STEAP-1 v.11"로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2K에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-872로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 12 ("STEAP-1 v.12"로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2L에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-872로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 13 ("STEAP-1 v.13"로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2M에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-872로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 14 ("STEAP-1 v.14"로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2N에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-872로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 15 ("STEAP-1 v.15"로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2O에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-872로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 16 ("STEAP-1 v.16"로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2P에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-872로부터 연장된다.
STEAP-1 변이체 17 ("STEAP-1 v.17"로 지칭되기도 함)의 cDNA 및 아미노산 서열이 도 2Q에 도시되어 있다. 출발 메티오닌에 대한 코돈이 밑줄쳐져 있다. 오픈 리딩 프레임은 정지 코돈을 포함하여 핵산 96-872로부터 연장된다. 본원에 사용된 바와 같이, STEAP-1에 대한 언급에는 달리 지시되지 않는 한, 도 10, 11 및(또는) 12에 도시된 것을 포함한, 그의 모든 변이체가 포함된다.
도 3. STEAP-1 v.1의 아미노산 서열이 도 3A에 도시되어 있고; 이는 339개 아미노산을 갖는다.
STEAP-1 v.2의 아미노산 서열이 도 3B에 도시되어 있고; 이는 258개 아미노산을 갖는다.
STEAP-1 v.3의 아미노산 서열이 도 3C에 도시되어 있고; 이는 282개 아미노산을 갖는다.
STEAP-1 v.4의 아미노산 서열이 도 3D에 도시되어 있고; 이는 258개 아미노 산을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, STEAP-1에 대한 언급에는 달리 지시되지 않는 한, 도 10, 11 및(또는) 12에 도시된 것을 포함한, 그의 모든 변이체가 포함된다.
도 4. 도 4A. STEAP-1 v.1과 마우스 TNF-α-유도된 지방-관련 단백질 (gi/16905133)과의 아미노산 정렬. 도 4B. STEAP-1 v.1과 랫트 pHyde 단백질 (gi/21717655/)과의 아미노산 정렬. 도 4C. 마우스 전립선의 6개 막관통 상피 항원 (gi/20820492/)에 대한 STEAP-1의 상동성을 도시함.
도 5. STEAP-1 변이체 1의 친수성 아미노산 프로파일 [도 5(a)]. STEAP-1 변이체 3의 친수성 아미노산 프로파일 [도 5(b)]. 이는 ExPasy 분자 생물학 서버를 통하여 www.URL ch/cgi-bin/protscale.pl 상에 위치한 ProtScale 웹사이트 상에서 입수한, 문헌 [참고: Hopp T. P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 78: 3824-3828]의 방법을 사용하여 컴퓨터 알고리즘 서열 분석함으로써 결정하였다.
도 6. [도 6(a)]. STEAP-1 변이체 1의 수친화도 아미노산 프로파일. [도 6(b)]. STEAP-1 변이체 3의 수친화도 아미노산 프로파일. 이는 ExPasy 분자 생물학 서버를 통하여 www.URL expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl 상에 위치한 ProtScale 웹사이트 상에서 입수한, 문헌 [참고: Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132]의 방법을 사용하여 컴퓨터 알고리즘 서열 분석함으로써 결정하였다.
도 7. [도 7(a)]. STEAP-1 변이체 1의 이용 가능한 잔기 아미노산 비율 (%) 프로파일. [도 7(b)]. STEAP-1 변이체 3의 이용 가능한 잔기 아미노산 비율 (%) 프로파일. 이는 ExPasy 분자 생물학 서버를 통하여 www.URL expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl 상에 위치한 ProtScale 웹사이트 상에서 입수한, 문헌 [참고: Janin J., 1979 Nature 277: 491-492]의 방법을 사용하여 컴퓨터 알고리즘 서열 분석함으로써 결정하였다.
도 8. [도 8(a)]. STEAP-1 변이체 1의 평균 가요성 아미노산 프로파일. [도 8(b)]. STEAP-1 변이체 3의 평균 가요성 아미노산 프로파일. 이는 ExPasy 분자 생물학 서버를 통하여 www.URL expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl 상에 위치한 ProtScale 웹사이트 상에서 입수한, 문헌 [참고: Bhaskaran R., and Ponnuswamy P.K., 1988. lnt. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255]의 방법을 사용하여 컴퓨터 알고리즘 서열 분석함으로써 결정하였다.
도 9. [도 9(a)]. STEAP-1 변이체 1의 베타-회전 아미노산 프로파일. [도 9(b)]. STEAP-1 변이체 3의 베타-회전 아미노산 프로파일. 이는 ExPasy 분자 생물학 서버를 통하여 www.URL expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl 상에 위치한 ProtScale 웹사이트 상에서 입수한, 문헌 [참고: Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1: 289-294]의 방법을 사용하여 컴퓨터 알고리즘 서열 분석함으로써 결정하였다.
도 10. STEAP-1의 SNP 변이체의 도식적 정렬. 변이체 STEAP-1 v.4 내지 v.17은 STEAP-1 v.2와 비교해서 단일 뉴클레오티드 차이를 나타내는 변이체이다. 이들 SNP 변이체가 별도로 도시되었지만, 이들은 기본 쌍, 예를 들어 STEAP-1 v.1 과 v.3을 함유하는 어떠한 전사 변이체 및 어떠한 조합으로든 존재할 수 있다. 수치는 STEAP-1 v.2에 상응한다. 블랙 박스는 STEAP-1 v.2와 동일한 서열을 나타낸다. SNPs는 박스 위에 지시된다.
도 11. STEAP-1의 전사 변이체의 엑손 조성. 본 도면은 폴리 A 테일을 수반하지 않는 전사 변이체의 구조를 도시한 것이다. 변이체 STEAP-1 v.1, v.2 및 v.3은 동일한 엑손 2 및 3을 공유하는 전사 변이체이다. STEAP-1 v.1의 제1 엑손은 다른 2가지 전사 변이체의 제1 엑손 보다 5' 말단에서 30개 염기가 더 짧다. STEAP-1 v.2의 제4 엑손은 STEAP-1 v.1의 조합 엑손 4, 인트론 4 및 엑손 5와 동일하다. STEAP-1 v.1과 비교해서 변이체 STEAP-1 v.3은 STEAP-1 v.1의 인트론 4로부터 스플라이싱된 부가의 엑손을 갖는다. 인트론의 길이와 엑손의 길이는 비례하지 않는다.
도 12. STEAP-1의 단백질 변이체의 도식적 정렬. 단백질 변이체는 뉴클레오티드 변이체에 상응한다. 도 10에서 뉴클레오티드 변이체 STEAP-1 v.5 내지 v.17은 STEAP-1 v.2와 동일한 단백질을 코딩한다. 도 11에 도시된 바와 같은 전사 변이체 STEAP-1 v.1 및 v.3으로부터 해독된 단백질은 위치 169에 아미노산 F (Phe) 또는 L (Leu)을 함유할 수 있다. 단일 아미노산 차이가 박스 위에 지시된다. 블랙 박스는 STEAP-1 v.1과 동일한 서열을 나타낸다. 상이한 충진 패턴을 보이는 박스는 상이한 서열을 나타낸다. 박스 아래의 수치는 STEAP-1 v.1에 상응한다.
도 13. 도 13(a)-(c). STEAP-1 단백질 변이체에 대해 예측된 이차 구조 및 막관통 도메인. STEAP-1 단백질 변이체 1 (서열 46), 2 (서열 47), 및 3 (서열 48)의 이차 구조 (각각 도 13a 내지 13c)는, www.expasy.ch/tools/ 상에 위치한 ExPasy 분자 생물학 서버로부터 입수한, 다음 방법 [HNN - Hierarchical Neural Network method; 참고: Guermeur, 1997, http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html]을 사용하여 예측하였다. 이 방법은 일차 단백질 서열로부터의 알파 나선의 존재 및 위치, 연장된 가닥 (strand), 및 무작위 코일을 예측한다. 소정의 이차 구조의 단백질 비율(%)이 또한 열거된다. 도 13(d), 13(f), 및 13(h): TMBASE를 활용하는 호르만 (Hofmann) 및 스토펠 (Stoffel)의 TMpred 알고리즘 [참고: K. Hofmann, W. Stoffel. TMBASE - A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374: 166, 1993]을 기초로 한, STEAP-1 변이체 1 내지 3의 막관통 영역의 존재 가능성 및 그의 배향을 각각 도 13(d), 13(f), 및 13(h)에 도식적으로 나타내었다. 도 13(e), 13(g), 13(i): TMHMM 알고리즘 [참고: Erik L. L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne, and Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998]을 기초로 한, STEAP-1 변이체 1 내지 3의 막관통 영역의 존재 가능성, 및 그의 세포외 및 세포내 배향을 각각 도 13(e), 13(g), 및 13(i)에 도식적으로 나타내었다. TMpred 및 TMHMM 알고리즘은 www.expasy.ch/tools/ 상에 위치한 ExPasy 분자 생물학 서버로부터 입수한다.
도 14. 도 14a. 위암 환자 표본에서의 STEAP-1 발현. 정상 위 (N) 및 10개의 상이한 위암 환자 표본 (T)으로부터 RNA를 추출하였다. 레인당 10 ㎍의 총 RNA를 수반한 노던 블롯 (Northern blot)을 STEAP-1 서열로 프로빙하였다. 그 결과, 위 종양 조직에서 대략 1.6 kb STEAP-1가 강력히 발현되었다. 하부 패널은 RNA 샘플의 질을 보여주는 블롯의 에티듐 브로마이드 염색을 나타낸다. 도 14b. 직장암 환자 조직에서의 STEAP-1의 발현. 정상 직장 (N), 직장암 환자 종양 (T), 및 직장암 전이 (M)로부터 RNA를 추출하였다. 10 ㎍의 총 RNA를 수반한 노던 블롯을 STEAP-1 서열로 프로빙하였다. 그 결과, 직장암 환자 조직에서 STEAP-1가 강력히 발현되었다. 하부 패널은 RNA 샘플의 질을 보여주는 블롯의 에티듐 브로마이드 염색을 나타낸다. 도 14c. 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)에서의 STEAP-1의 발현. 제1 가닥 cDNA를 HUVEC 세포, LAPC-4AD 및 LAPC-9AD 전립선 암 이종이식편 뿐만 아니라 인간 뇌 조직으로부터 제조하였다. 악틴 (actin) 및 GAPDH에 대한 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 표준화를 수행하였다. STEAP-1에 대한 프라이머를 사용하는 반정량적 PCR을 증폭 27 주기 및 30 주기에 수행하였다 (A). 대조군으로서, 악틴에 대한 프라이머를 사용하는 PCR이 (B)에 제시된다. 그 결과, 전립선 암 이종이식편 조직에서 탐지된 발현과 유사하게 HUVEC 세포에서도 STEAP-1이 강력히 발현되었다. HUVEC 세포에서의 STEAP-1의 발현은 표적화 STEAP-1이 상기 종양의 신생혈관계의 표적 내피 세포일 수도 있다는 것을 지시한다. 도 14(d) 및 도 14(e). 정상 조직 및 암 조직에서의 STEAP-1 발현. 제1 가닥의 cDNA를 정상 조직 (방광, 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 전립선, 비장, 골격근, 고환, 췌장, 결장 및 위), 및 환자 암 표본 풀 (전립선암 풀, 방광암 풀, 신장암 풀, 결장암 풀, 폐암 풀, 난소암 풀, 유방암 풀, 암 전이 풀, 췌장암 풀, 전립선암 이종이식편 풀, 및 림프절로의 전립선 전이 풀)로부터 제조하였다. 악틴에 대한 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 표준화를 수행하였다. STEAP-1에 대한 프라이머를 사용하는 반정량적 PCR을 증폭 26 주기 및 30 주기에 수행하였다. 도 14d에는, RT-PCR 아가로스 겔 사진이 도시되어 있다. 도 14e에서는, 알팔마거 (Alphalmager) 소프트웨어를 사용하여 PCR 생성물을 정량화하였다. 그 결과, 시험된 모든 정상 조직 중에서 정상 전립선에서 STEAP-1이 강력히 발현되었다. STEAP-1 발현의 상향 조절이 전립선암 풀, 방광암 풀, 신장암 풀, 결장암 풀, 폐암 풀, 난소암 풀, 유방암 풀 및 췌장암 풀에서 탐지되었다. STEAP-1의 강력한 발현이 암 전이 풀, 전립선암 이종이식편 풀, 및 림프절로의 전립선 전이 풀에서 탐지되었다. 도 14(f): 림프종 환자 표본에서의 STEAP-1 발현. 제1 가닥의 cDNA를 림프종 환자 표본 패널로부터 제조하였다. 악틴에 대한 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 표준화를 수행하였다. STEAP-1에 대한 프라이머를 사용하는 반정량적 PCR을 증폭 26 주기 및 30 주기에 수행하였다. 샘플을 아가로스 겔 상에서 수행하고, 알팔마거 소프트웨어를 사용하여 PCR 생성물을 정량화하였다. 신호가 증폭 26 주기 또는 30 주기로서 각각 탐지된 경우에는, 발현이 강하거나 중간 수준인 것으로 기록되고, 신호가 증폭 30 주기에서도 전혀 탐지되지 않는 다면, 발현되지 않은 것으로 기록되었다. 결과는 시험된 11개 종양 표본 중의 8개 (72.7%)에서 STEAP-1이 발현된 것으로 나타났다.
도 15. MAb M2/92.30에 의한 STEAP-1의 특이적 세포 표면 염색. 좌측 패널: 항-STEAP MAb M2/92.30 (10 ㎍/ml)으로 염색시킨 STEAP1 (암선) 또는 대조군 네오마이신 내성 유전자 (명선)를 안정적으로 발현하는 재조합 3T3 및 Rat1 세포의 FACS 분석. 염소 항-마우스 IgG-PE 접합체 이차 시약을 사용하여, 세포 표면 결합된 MAb를 탐지하였다. 이어서, 염색된 세포를 대상으로 하여 FACS 분석을 수행하였다. 각각의 대조군 세포와 비교한 Rat1-STEAP1 및 3T3-STEAP1 세포의 형광 이동에 의해 지시된 바와 같이, MAb M2/92.30은 세포 표면 STEAP1과 특이적으로 결합하였다. 우측 패널: 밝은 세포 표면 형광을 나타내는 MAb M2/92.30으로 염색시킨 3T3-STEAP1 세포의 형광 현미경 검사.
도 16. STEAP1 M2/92.30 MAb는 인간 전립선 암 이종이식편 상의 세포 표면 STEAP-1을 인식한다. LAPC9 전립선 암 세포를 10 ㎍/ml의 MAb M2/92.30 또는 대조군 항-KLH MAb로 염색시켰다. 염소-항-마우스 IgG-PE 접합된 이차 Ab를 사용하여 표면 결합된 MAb를 탐지하였다. 이어서, 염색된 세포를 대상으로 하여 FACS 분석을 수행하였다. 이들 결과는 항-STEAP1 MAb M2/120.545가 전립선 암 이종이식편 세포에서 발현된 내인성 세포 표면 STEAP1과 특이적으로 결합한다는 것을 입증하였다.
도 17. STEAP1 M2/92.30 MAb는 마우스 STEAP-1을 인식한다. 293T 세포를, 뮤린 STEAP1 cDNA를 코딩하는 pCDNA3.1 또는 빈 (empty) 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 2일 후, 상기 세포를 수거하고, 항-STEAP1 MAb M2/92.30 (10 ㎍/ml)으로 염색시키며, 염소 항-마우스 IgG-PE 접합체 이차 시약을 사용하여 세포 표면 결합된 MAb를 탐지하였다. 이이서, 세포를 대상으로 하여 FACS 분석을 수행하였다. 빈 벡터로 형질감염시킨 세포와 비교한, 뮤린 STEAP1로 형질감염시킨 293T 세포의 형광 이동으로써 지시된 바와 같이, MAb M2/92.30은 뮤린 STEAP1 단백질과 특이적으로 결합한다.
도 18. STEAP1/120.545 MAb는 세포 표면 STEAP-1을 인식한다. 패널 A 및 패널 B. 3T3-neo (A, 검은색 히스토그램) 및 3T3-STEAP1 세포 (A, 흰색 히스토그램) 및 Rat1-neo (B, 검은색 히스토그램) 및 Rat1-STEAP 세포 (B, 흰색 히스토그램)를 MAb M2/120.545 (10 ㎍/ml)으로 염색시키고, 염소 항-마우스 IgG-PE 접합된 이차 Ab를 사용하여 표면 결합된 MAb를 탐지하였다. 이어서, 세포를 대상으로 하여 FACS 분석을 수행하였다. 그들 각각의 neo 대조군과 비교한 3T3-STEAP1 및 Rat1-STEAP1 세포의 형광 이동으로써 지시된 바와 같이, MAb M2/120.545는 세포 표면 STEAP1과 특이적으로 결합한다. 패널 C. LNCaP 세포를 MAb M2/120.545 또는 대조군 항-KLH MAb로 염색시키고, 이를 대상으로 하여 상기 언급된 바와 같이 FACS 분석을 수행하였다. 패널 D. 밝은 세포 표면 형광을 보여주는 M2/120.545 염색된 LNCaP 세포의 형광 현미경 검사. 이들 결과는 M2/120.545 MAb가 LNCaP 세포 중의 내인성 세포 표면 STEAP1과 특이적으로 결합한다는 것을 입증하였다.
도 19. 도 19(a) M2/X92.30 VH 클론 #2의 cDNA (서열 49) 및 아미노산 서열 (서열 50). 도 19(b) M2/X92.30 VL 클론 #2의 cDNA (서열 51) 및 아미노산 서열 (서열 52). 도 19(c) M2/X92.30 VL 클론 #6의 cDNA (서열 53) 및 아미노산 서열 (서열 54). 도 19(d) M2/X120.545 VL 클론 #8의 cDNA (서열 55) 및 아미노산 서열 (서열 56).
도 20. 도 20a. M2/X92.30 VH 클론 #2의 아미노산 서열 (서열 57).
도 20b. M2/X92.30 VL 클론 #2의 아미노산 서열 (서열 58).
도 20c. M2/X92.30 VL 클론 #6의 cDNA (서열 59) 및 아미노산 서열 (서열 60).
도 20d. M2/X92.30 VL 클론 #2 (서열 61)와 M2/M92.30 VL 클론 #6 (서열 62)의 아미노산 정렬.
도 20e. M2/X120.545 VL 클론 #8의 아미노산 서열 (서열 63).
신호 펩티드의 서열이 밑줄쳐져 있다.
도 21. STEAP1 M2/92.30 MAb는 인간 전립선 및 방광암 이종이식편 상의 세포-표면 STEAP-1을 인식한다. UGB1 방광암 세포 (좌측 패널) 및 LAPC9 전립선암 세포 (우측 패널)를 10 ㎍/ml의 MAb M2/92.30 또는 대조군 항-KLH MAb로 염색시켰다. 염소 항-마우스 IgG-PE 접합된 이차 Ab를 사용하여 표면 결합된 MAb를 탐지하였다. 이어서, 염색된 세포를 대상으로 하여 FACS 분석을 수행하였다. 이들 결과는 항-STEAP1 MAb M2/92.30가 방광 및 전립선암 이종이식편 세포에서 발현된 내인성 세포 표면 STEAP1과 특이적으로 결합한다는 것을 입증하였다.
도 22. STEAP1/92.30 MAb에 의한 STEAP-1 내재화. 3T3-STEAP1 세포를 4℃에서 M2/92.30 MAb (10 ㎍/ml)으로 염색시키고, 세척한 다음, 4℃에서 염소 항-마우스 IgG-PE 접합체 이차 Ab와 함께 항온 배양하였다. 이 세포의 절반을 30분 동안 37℃로 이동시키고, 나머지 절반은 4℃ 하에 유지시켰다. 이어서, 각 처리로부터의 세포를 형광 현미경으로 검사하였다. 4℃ 하에 유지시킨 세포는 밝은 "고리 모 양" 세포 표면 형광을 나타내었다. 37℃로 이동시킨 세포는 "고리 모양" 세포 표면 형광을 상실하였고, 캡핑과 내재화의 지표인 작은 반점의 응집된 형광 외관을 나타내었다.
도 23. STEAP1 M2/120.545 MAb에 의한 STEAP-1 내재화. PC3-STEAP1 세포를 4℃에서 M2/120.545 MAb (10 ㎍/ml)로 염색시키고, 세척한 다음, 염소 항-마우스 IgG-PE 접합체 이차 Ab와 함께 항온 배양하였다. 이 세포의 절반을 30분 동안 37℃로 이동시키고, 나머지 절반은 4℃ 하에 유지시켰다. 이어서, 각 처리로부터의 세포를 형광 현미경으로 검사하였다. 4℃ 하에 유지시킨 세포는 밝은 "고리 모양" 세포 표면 형광을 나타내었다. 37℃로 이동시킨 세포는 "고리 모양" 세포 표면 형광을 상실하였고, 캡핑과 내재화의 지표인 작은 반점의 응집된 형광 외관을 나타내었다.
도 24. STEAP-1 내재화. 항-마우스 IgG - 사포린 접합체 [공급처: Advanced Targeting Systems, San Diego, CA]를 사용하여, 뮤린 Steap-1 M2/120.545가 LNCaP 세포 표면 상에서의 Steap-1의 발현을 통하여 표적 세포 내로 유입된다는 사실을 입증하였다. 다음 프로토콜을 사용하였다. LNCaP 세포를 96-웰 판에서 5000개 세포/90 ㎕/웰로 도말하고 밤새 항온 배양하였다. 이차 면역독소 접합체 (항-마우스 IgG-사포린 및 항-염소 IgG-사포린) 또는 항-마우스 IgG를 세포 배양 배지에서 만들어 100 ng/ml의 최종 농도를 산출하였다. 일차 항체를 1 내지 1000 ng/ml 범위의 농도로 부가하였다. 상기 판을 72시간 동안 항온 배양하고, 생육성을 MTT 검정에 의해 결정하였다. 그 결과, LNCaP 세포가 M2/120.545 및 항-마우스 IgG-사포린 의 존재 하에 사멸된 것으로 나타났다. 이차 항체 단독 (항-마우스 IgG)을 이용하거나 비특이적 이차 항체 접합체 (항-염소 IgG 사포린)을 이용한 경우에는 어떠한 효과도 탐지되지 않았다. 1 ㎍/ml 이하로 시험된 일차 항체 (M2/120.545) 단독을 이용한 경우에는 독성이 전혀 관찰되지 않았다.
도 25. 항- STEAP -1 MAb M2 /92.30 및 M2 /120.545에 의한 STEAP1 의 면역침전. 3T3-STEAP1 및 3T3-neo 세포를 RIPA 완충액 (25 mM Tris-Cl pH 7.4; 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1% 트리톤 X-100, 0.5% 데옥시콜산, 0.1% SDS, 및 프로테아제 억제제 칵테일)에서 용해시켰다. 세포 용해물을 단백질 G 세파로스 비드로 예비청정시킨 다음, 5 ㎍의 MAb M2/92.30 또는 M2/120.545와 함께 실온에서 2시간 동안 항온 배양하였다. 단백질 G 비드를 가하고, 혼합물을 1시간 동안 추가로 항온 배양하였다. 면역 복합체를 세척하고, SDS-PAGE 샘플 완충액에서 가용화시켰다. 이어서, 이로써 가용화된 샘플을 대상으로 하여, 토끼 항-STEAP pAb를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석을 수행하였다. STEAP1로 형질감염시킨 293T 세포의 완전 세포 용해물을 또한 양성 대조군으로서 수행하였다. 대략 37 kD의 면역반응성 밴드가 3T3-STEAP1 세포로부터 유래된 샘플에서만 관찰되었는데, 이는 M2/92.30와 M2/120.545 MAbs 둘 다에 의해 STEAP1이 특이적으로 면역침전되었다는 지표이다.
도 26. 마우스에서 LAPC9 인간 전립선 암 이종이식편의 성장에 대한 STEAP -1 MAb의 효과. STEAP-1 M2/92.30 및 M2/120.545를 2가지 상이한 용량 100 ㎍ 및 500 ㎍에서 시험하였다. PBS 및 항-KLH MAb를 대조군으로서 사용하였다. 연구 코호트 (cohort)는 6개 군으로 이루어지는데, 각 군은 10마리 마우스로 구성되었다. MAbs는 종양 세포 주사와 동일한 날부터 시작하여, 매주 2회씩 총 12회분을 복강내 (IP) 투약하였다. 매주 2회씩 캘리퍼 측정을 통하여 종양 크기를 모니터링하였다. 가장 긴 치수 (L) 및 이에 직각인 치수 (W)를 취하여, 다음 식을 이용하여 종양 용적을 계산하였다: W2 x L/2. 각 동물에 대해 처리한지 40일 째에 혈청 PSA 농도를 시판용 ELISA 키트로 측정하였다. 크루스칼-왈리스 (Kruskal-Wallis) 시험 및 만-위트니 (Mann-Whitney) U 시험을 사용하여, 군들 간의 PSA 수준과 종양 성장의 차이를 평가하였다. 모든 시험은 양측 시험이었다 (a=0.05). 데이터는 STEAP-1 M2/92.30 및 M2/120.545가 인간 전립선 이종이식편의 성장을 용량-의존적 방식으로 상당히 지연시켰다는 것을 보여준다.
도 27. 마우스에서 LAPC9 인간 전립선 암 이종이식편의 성장에 대한 STEAP -1 MAb의 효과. STEAP-1 M2/92.30 및 M2/120.545를 2가지 상이한 용량 100 ㎍ 및 500 ㎍에서 시험하였다. PBS 및 항-KLH MAb를 대조군으로서 사용하였다. 연구 코호트는 6개 군으로 이루어지는데, 각 군은 10마리 마우스로 구성되었다. MAbs는 종양 세포 주사와 동일한 날부터 시작하여, 매주 2회씩 총 12회분을 복강내 (IP) 투약하였다. 매주 2회씩 캘리퍼 측정을 통하여 종양 크기를 모니터링하였다. 가장 긴 치수 (L) 및 이에 직각인 치수 (W)를 취하여, 다음 식을 이용하여 종양 용적을 계산하였다: W2 x L/2. 각 동물에 대해 처리한지 40일 째에 혈청 PSA 농도를 시판용 ELISA 키트로 측정하였다. 크루스칼-왈리스 시험 및 만-위트니 U 시험을 사용하 여, 군들 간의 PSA 수준과 종양 성장의 차이를 평가하였다. 모든 시험은 양측 시험이었다 (a=0.05). 데이터는 STEAP-1 M2/92.30 및 M2/120.545가 인간 전립선 이종이식편의 성장을 용량-의존적 방식으로 상당히 지연시켰다는 것을 보여준다.
도 28. STEAP-1은 ERK-1 및 ERK-2 인산화를 유도시켰다. 좌측 패널: PC3 세포를 네오마이신 내성 유전자 단독으로, 또는 pSRα 벡터 중의 STEAP-1와 함께 형질감염시켰다. 세포를 0.5% FBS에서 밤새 성장시킨 다음, 10 ㎍/ml MEK 억제제 PD98058의 존재 또는 부재 하에 5분 동안 10% FBS로 자극하였다. 세포 용해물을 12.5% SDS-PAGE에 의해 분해시키고, 항-포스포-ERK (Cell Signaling) 및 항-ERK (Zymed)로 웨스턴 블롯팅하였다. 우측 패널: NIH-3T3 세포를 네오마이신 내성 유전자 단독으로, 또는 pSRα 벡터 중의 STEAP-1와 함께 형질감염시켰다. 세포를 상기 언급된 바와 같이 처리하였는데, 단 MEK 억제제의 부재 하에 수행하였다. 또한, NIH-3T3-Neo 세포를 10 mg/ml Na 살리실레이트로 처리하였다. STEAP-1의 발현은 혈청에서 ERK-1 및 ERK-2의 인산화를 유도시키고, 상단 MEK 키나제 억제제 PD98058에 의해 억제되었다.
도 29. STEAP-1은 세포-세포 소통을 매개한다. PC3 세포를 네오마이신 내성 유전자 단독으로, 또는 pSRα 벡터 중의 STEAP-1 또는 대조군 유전자와 함께 형질감염시켰다. 수용자 세포를 1 mg/ml 덱스트란-텍사스 적색으로 표지시키고, 공여자 세포를 2.5 ㎍/ml 칼세인 (calcein) AM으로 표지시켰다. 공여자 (녹색) 및 수용자 (적색) 세포를 37℃ 하에 18 내지 24 시간 동안 공동 배양하고, 형광성 염료의 공동-국재를 알아보기 위해 현미경으로 분석하였다. 좌측 패널: PC3-Neo 세포 를 공여자와 수용자 둘 다로서 사용하였다. 중앙 패널: PC3-STEAP-1 세포를 공여자와 수용자 둘 다로서 사용하였다. 우측 패널: PC3-대조군 세포를 공여자와 수용자 둘 다로서 사용하였다. STEAP-1은 칼세인이 덱스트란-덱사스 적색을 함유하는 세포로 전이되는 것을 유도시켰는데, 이는 STEAP-1이 세포-세포 소통을 촉진시킨다는 것을 지시한다.
도 30. 세포 소통은 공여자 및 수용자 세포 상에서의 STEAP-1 발현을 요구한다. PC3 세포를 네오마이신 내성 유전자 단독으로, 또는 pSRα 벡터 중의 STEAP-1과 함께 형질감염시켰다. 수용자 세포를 1 mg/ml 덱스트란-텍사스 적색으로 표지시키고, 공여자 세포를 2.5 ㎍/ml 칼세인 AM으로 표지시켰다. 공여자 (녹색) 및 수용자 (적색) 세포를 37℃ 하에 18 내지 24 시간 동안 공동 배양하고, 형광성 염료의 공동-국재를 알아보기 위해 현미경으로 분석하였다. 상부 패널: 광 현미경; 하부 패널: UV 형광. 좌측 패널: PC3-Neo 세포를 공여자와 수용자 둘 다로서 사용하였다. 중앙 패널: PC3-Neo가 공여자 세포이고 PC3-STEAP-1가 수용자 세포이다. 우측 패널: PC3-STEAP-1 세포를 공여자와 수용자 둘 다로서 사용하였다. STEAP-1이 공여자와 수용자 둘 다 상에서 발현된 경우에만 세포-세포 소통이 탐지되었다.
도 31. 갭 결합에 대한 STEAP-1/120.545 MAb 효과. PC3 세포를 네오마이신 내성 유전자 단독으로, 또는 pSRα 벡터 중의 STEAP-1과 함께 형질감염시켰다. 수용자 세포를 1 mg/ml 덱스트란-텍사스 적색으로 표지시키고, 공여자 세포를 2.5 ㎍/ml 칼세인 AM으로 표지시켰다. 공여자 (녹색) 및 수용자 (적색) 세포를 37℃ 하에 18 내지 24 시간 동안 공동 배양하고, 형광성 염료의 공동-국재를 알아보기 위 해 현미경으로 분석하였다. 모든 실험에서는, 동일한 세포를 공여자 및 수용자로서 사용하였다. 세포를 도말하기에 앞서, 10분 동안 지시된 양의 STEAP-1/120.545 MAb와 함께 항온 배양하고, 분석하기에 앞서 MAb를 배지 내에 24시간 동안 유지시켰다. STEAP1/120.545는 STEAP-1 매개된 갭 결합을 용량-의존적 방식으로 저하시킨다.
도 32. STEAP-1 MAb 및 RNAi에 의한 ERK-1 및 ERK-2 인산화의 억제. PC3 세포를 네오마이신 내성 유전자 단독으로, 또는 pSRα 벡터 중의 STEAP-1 및 MAb와 함께 형질감염시켰다. RNAi 녹다운 (knockdown)의 경우에는, PC3-STEAP-1 세포를, STEAP-1에 대한 siRNA를 함유하는 pPUR-U6-27-STEAP-1 벡터로 안정적으로 형질감염시켰다. 세포를 0.1% FBS에서 37℃ 하에 18시간 동안 고갈시키고, 10 ㎍/ml M2/92.30 MAb의 존재 또는 부재 하에 10분 동안 얼음 위에 놓아둔 다음, 3분 동안 실온 하에 놓아둔 후, 10% FBS로 5분 동안 자극하였다. 세포를 RIPA 완충액에 용해시키고, 완전 세포 용해물을 12.5% SDS-PAGE에 의해 분해시킨 다음, 단백질을 웨스턴 블롯팅하여 탐지하였다. 토끼 항혈청 (Cell Signaling)을 사용하여 포스포-ERK를 탐지하고, 토끼 항-ERK (Zymed)를 사용하여 ERK를 탐지하였다. 양 (sheep) 항-STEAP-1을 사용하여 STEAP-1을 탐지하고, 항-악틴 MAb (Santa Cruz)를 사용하여 악틴을 탐지하였다. ERK-1 및 ERK-2 인산화는 둘 다 10% 혈청에 의해 유도되었고, STEAP-1에 대한 siRNA 및 M2/92.30 MAb에 의해 억제되었다.
도 33. 세포-세포 소통에 대한 STEAP-1 RNAi의 효과. PC3 세포를 네오마이신 내성 유전자 단독으로, 또는 pSRα 벡터 중의 STEAP-1과 함께 형질감염시켰다. RNAi 녹다운의 경우에는, PC3-STEAP-1 세포를, STEAP-1에 대한 siRNA를 함유하는 pPUR-U6-27-STEAP-1 벡터 또는 빈 벡터로 안정적으로 형질감염시켰다. 수용자 세포를 1 mg/ml 덱스트란-텍사스 적색으로 표지시키고, 공여자 세포를 2.5 ㎍/ml 칼세인 AM으로 표지시켰다. 공여자 (녹색) 및 수용자 (적색) 세포를 37℃ 하에 18 내지 24 시간 동안 공동 배양하고, 형광성 염료의 공동-국재를 알아보기 위해 현미경으로 분석하였다. 모든 실험에서는, 동일한 세포를 공여자 및 수용자로서 사용하였다. PC3-STEAP-1 세포에서 안정적으로 발현된 특이적 STEAP-1 RNAi가 STEAP-1 유도된 세포-세포 소통을 저하시킨다.
섹션 개요
I.) 정의
II.) STEAP-1 폴리뉴클레오티드
II.A.) STEAP-1 폴리뉴클레오티드의 용도
II.A.1.) 유전적 이상의 모니터링
II.A.2.) 안티센스 양태
II.A.3.) 프라이머 및 프라이머 쌍
II.A.4.) STEAP-1-코딩 핵산 분자의 분리
II.A.5.) 재조합 핵산 분자 및 숙주-벡터 시스템
III.) STEAP-1-관련 단백질
III.A.) 모티프-보유 단백질 양태
III.B.) STEAP-1-관련 단백질의 발현
III.C.) STEAP-1-관련 단백질의 변형
III.D.) STEAP-1-관련 단백질의 용도
IV.) STEAP-1 항체
V.) STEAP-1 세포성 면역 반응
VI.) STEAP-1 트랜스제닉 동물
VII.) STEAP-1의 탐지 방법
VIII.) STEAP-1-관련 유전자 및 그의 생성물의 상태를 모니터링하는 방법
IX.) STEAP-1과 상호 작용하는 분자의 확인
X.) 치료적 방법 및 조성물
X.A.) 항암 백신
X.B.) 항체에 의거한 요법에 대한 표적으로서의 STEAP-1
X.C.) 세포성 면역 반응에 대한 표적으로서의 STEAP-1
X.C.1. 미니유전자 (minigene) 백신
X.C.2. CTL 펩티드와 조력 펩티드의 조합물
X.C.3. CTL 펩티드와 T 세포 프라이밍 작용제의 조합물
X.C.4. CTL 및(또는) HTL 펩티드로 펄싱된 DC를 포함하는 백신 조성물
X.D.) 양자 면역요법
X.E.) 치료 또는 예방 목적을 위한 백신 투여
XI.) STEAP-1의 진단 및 예후 양태
XII.) STEAP-1 단백질 기능의 억제
XII.A.) 세포내 항체를 이용한 STEAP-1의 억제
XII.B.) 재조합 단백질을 이용한 STEAP-1의 억제
XII.C.) STEAP-1 전사 또는 해독의 억제
XII.D.) 치료 전략을 위한 일반적 고려 사항
XIII.) STEAP-1의 조정제의 확인, 성상 확인 및 용도
XIV.) RNAi, 및 저분자 간섭 RNA (siRNA)의 치료적 용도
XV.) 키트/제조품
1.) 정의:
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기 및 기타 과학적 용어들은 당업자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 지닌 것으로 간주된다. 몇몇 경우에는, 통상적으로 이해되고 있는 의미를 지닌 용어가 명료하게 하기 위해 및(또는) 즉시 참조할 수 있도록 하기 위해 본원에서 정의되고, 이러한 정의가 본원에 포함되는 것이 당해 분야에서 일반적으로 이해되고 있는 것에 비해 상당한 차이를 나타내는 것으로 간주되서는 안된다. 본원에 기재되거나 참고된 많은 기술 및 과정들은 널리 인식되고 있고, 당업자가 통상적인 방법론, 예를 들어 문헌 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 기재된 광범위하게 활용되고 있는 분자 클로닝 방법론을 이용하여 흔히 이용하고 있다. 경우에 따라, 시판용 키트와 시약의 사용을 포함하는 과정들은 일반적으로 달리 언급되지 않는 한, 제조업자가 규정한 프로토콜 및(또는) 파라미터에 따라서 수행한다.
용어 "진행된 전립선 암", "국소적으로 진행된 전립선 암", "진행된 질병" 및 "국소적으로 진행된 질병"은 전립선 피막을 통하여 확장되는 전립선 암을 의미하고, 미국 비뇨기 협회 (AUA) 시스템 하의 병기 C 질병, 휘트모어-제웨트 (Whitmore-Jewett) 시스템 하의 병기 C1 - C2 질병, 및 TNM (종양, 절, 전이) 시스템 하의 병기 T3 - T4 및 N+ 질병을 포함한다. 일반적으로, 국소적으로 진행된 질병에 걸린 환자에게는 수술이 권장되지 않고, 이러한 환자는 임상적으로 국재된 (기관-한정된) 전립선 암 환자와 비교해서 실질적으로 더 나쁜 결과를 초래한다. 국소적으로 진행된 질병은 전립선 외측연 (lateral border)을 벗어난 경화가 손으로 만져질 수 있거나 (촉진 가능하거나), 또는 전립선 바닥 위의 경화 또는 비대칭이 손으로 만져질 수 있는지에 따라 임상적으로 확인한다. 국소적으로 진행된 전립선 암은 현재 근치 전립선절제술 후, 종양이 전립선 피막을 침입하거나 침투하여 절제 (수술) 가장자리로 확장되거나 정낭 (seminal vesicle)을 침입하는 경우에 병리적으로 진단된다.
"본래의 당화 패턴을 변경"시키는 것은 본원 목적상, 본래 서열 STEAP-1에 발견된 하나 이상의 탄수화물 부분을 제거하고/하거나 (하층 당화 부위를 제거하거나 또는 화학적 및(또는) 효소적 수단에 의해 당화물을 제거함으로써 수행됨) 본래 서열 STEAP-1에 존재하지 않는 하나 이상의 당화 부위를 부가하는 것을 의미한다. 또한, 상기 표현에는 존재하는 각종 탄수화물 부분의 성질과 비율 상의 변화를 포함한, 본래 단백질의 당화물 상의 정성적 변화가 포함된다.
용어 "유사체"는 또 다른 분자 (예: STEAP-1-관련 단백질)와 구조적으로 유사하거나 또는 이러한 분자와 유사하거나 이에 상응하는 속성을 공유하고 있는 분자를 지칭한다. 예를 들어, STEAP-1 단백질의 유사체는 STEAP-1과 특이적으로 결합하는 항체 또는 T 세포에 의해 특이적으로 결합될 수 있다.
용어 "항체"는 달리 명백히 지시되지 않는 한 가장 광범위한 의미로 사용된다. 따라서, "항체"는 천연 발생적이거나 합성일 수 있는데, 예를 들면 통상적인 하이브리도마 기술에 의해 생성된 모노클로날 항체일 수 있다. 항-STEAP-1 항체는 모노클로날 및 폴리클로날 항체 뿐만 아니라 항원-결합성 도메인을 포함하는 이들 항체의 단편 및(또는) 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 STEAP-1과 특이적으로 결합하고/하거나 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 모든 형태의 항체 또는 그의 단편을 지칭하고, 구체적으로는 STEAP-1과 특이적으로 결합하고/하거나 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 모노클로날 항체 (완전한 길이 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중-특이적 항체 (예: 이중-특이적 항체), 및 항체 단편을 포괄한다. 어떠한 특이적 항체도 본원에 제공된 방법 및 조성물에 사용할 수 있다. 따라서, 한 양태에서는 용어 "항체"가 경쇄 면역글로불린 분자로부터의 하나 이상의 가변 영역과 중쇄 분자로부터의 하나 이상의 가변 영역 (이들은 결합하여, 표적 항원에 대한 특이적 결합 부위를 형성한다)을 포함하는 분자를 포괄한다. 한 양태에서는, 항체가 IgG 항체이다. 예를 들면, 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 항체는 세포 배양물, 파아지 또는 각종 동물 (이에는 소, 토끼, 염소, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그, 양, 개, 고양이, 원숭이, 침팬지, 유인원이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다)에서 생성시킬 수 있다. 따라서, 한 양태에서는, 본 발명의 항체가 포유류 항체이다. 파아지 기술을 사용하여 초기 항체를 분리할 수 있거나 또는 변경된 특이성 또는 결합 활성도 특징을 지닌 변이체를 생성시킬 수 있다. 이러한 기술은 당해 분야에 통상적이고 널리 공지되어 있다. 한 양태에서는, 항체를 당해 분야에 공지된 재조합 수단에 의해 생성시킨다. 예를 들어, 재조합 항체는 숙주 세포를, 이러한 항체를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터로 형질감염시킴으로써 생성시킬 수 있다. 1개 이상의 벡터를 사용하여 숙주 세포에서 1개 이상의 VL 및 1개의 VH 영역을 발현하는 DNA 서열을 형질감염시킬 수 있다. 항체를 생성시키기 위한 재조합 수단에 관해 기재한 문헌의 예에는 다음이 포함된다 [참고: Delves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997); Shephard, et al., MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic Press, 1993); CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, most recent edition)]. 본 발명의 항체를 재조합 수단에 의해 변형시켜, 목적하는 기능을 매개하는데 있어서의 항체의 보다 큰 효능을 증가시킬 수 있다. 따라서, 항체를 재조합 수단에 의해 치환시킴으로써 변형시킬 수 있는 것이 본 발명의 범위 내에 속한다. 전형적으로는, 이러한 치환이 보존적 치환일 것이다. 예를 들어, 항체의 불변 영역 내의 1개 이상의 아미노산을 상이한 잔기로 대체할 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호, 미국 특허 제6,194,551호, WO 9958572; and Angal, et al., Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993)]. 아미노산에 있어서의 변형에는 아미노산의 결실, 부가, 치환이 포함된다. 몇몇 경우에는, 이러한 변화가 바람직하지 못한 활성, 예를 들어 보체-의존성 세포독성을 저하시키기 위해 이루어진다. 종종, 탐지 가능한 신호를 제공해 주는 물질을 공유적 또는 비공유적으로 결합시킴으로써 항체를 표지시킨다. 광범위한 표지 및 접합 기술이 공지되어 있고, 이는 과학지와 특허 문헌에 광범위하게 보고되었다. 이들 항체를 대상으로 하여, 정상 또는 결함있는 STEAP-1와의 결합을 알아보기 위해 스크리닝할 수 있다 [참고:예를 들어, ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press, 1996)]. 목적하는 생물학적 활성을 지닌 적합한 항체는 시험관내 검정, 예를 들어 증식, 이동, 부착, 연질 한천 성장, 혈관형성, 세포-세포 소통, 세포소멸, 수송, 신호 전달, 및 생체내 검정, 예를 들어 종양 성장의 억제를 수행한 후에 확인 (동정)할 수 있다. 본원에 제공된 항체는 진단 적용에도 유용할 수 있다. 포획 또는 비-중화 항체로서, 항원의 수용체-결합성 또는 생물학적 활성은 억제시키지 않으면서 특이적 항원과 결합할 수 있는 능력이 있는지를 알아보기 위해 이들 항체를 스크리닝할 수 있다. 중화 항체로서, 항체는 경쟁적 결합 검정에 유용할 수 있다. 이들 항체를 사용하여 STEAP-1 또는 그의 수용체를 정량화할 수도 있다.
"항체 단편"은 표적과 결합하는 면역글로불린 분자의 가변 영역의 적어도 일부, 즉 항원-결합성 영역으로서 규정된다. 한 양태에서는, 구체적으로 단일 항-STEAP-1 항체 및 그의 클론 (작동제, 길항제 및 중화 항체 포함), 및 다중-에피토프 특이성을 지닌 항-STEAP-1 항체 조성물이 포괄된다. 본 발명의 방법 및 조성물의 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 항체는 항원 결합성 항체 단편의 형태, 예를 들어 Fab 단편, F(ab')2 단편, 단일쇄 가변 영역 등일 수 있다. 본래 분자의 단편은 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 생성시킬 수 있고, 이에는 효소적 분해 및 재조합 수단이 포함된다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 모든 형태의 "항원"을 사용하여 STEAP-1에 대해 특이적인 항체를 생성시킬 수 있다. 따라서, 유발성 항원은 단일 에피토프, 다중 에피토프 또는 전체 단백질 단독일 수 있거나, 또는 당해 분야에 공지된 한 가지 이상의 면역원성 증강제와 조합한 것일 수 있다. 유발성 항원은 분리된 완전한 길이 단백질, 세포 표면 단백질 (예를 들어, 항원의 적어도 일부로 형질감염시킨 세포로 면역시킴), 또는 가용성 단백질 (예를 들어, 단백질의 세포외 도메인 부분으로만 면역시킴)일 수 있다. 항원은 유전적으로 변형된 세포에서 생성시킬 수 있다. 이러한 항원을 코딩하는 DNA는 게놈성 또는 비-게놈성 (예: cDNA)일 수 있고, 세포외 도메인의 적어도 일부를 코딩한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "일부"는 필요에 따라, 관심있는 항원의 면역원성 에피토프를 구성하기 위한 최소 수의 아미노산 또는 핵산을 지칭한다. 관심있는 세포를 형질전환시키는데 적합한 어떠한 유전 벡터도 이용할 수 있는데, 이에는 아데노바이러스성 벡터, 플라스미드, 및 비-바이러스성 벡터, 예를 들어 양이온성 지질이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 한 양태에서는, 본원의 방법 및 조성물의 항체는 관심있는 STEAP-1의 세포외 도메인의 적어도 일부와 특이적으로 결합한다.
본원에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 "생체 활성제"와 접합시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "생체 활성제"는 해당 항원과 결합하고/하거나 세포-사멸성 독소를 증강시키기 위해 목적하는 생물학적 효과를 증강 또는 매개하는 합성 또는 천연 발생적 화합물을 지칭한다.
한 양태에서, 본 발명에 유용한 결합성 단편은 생물학적 활성 단편이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "생물학적 활성"이란 목적하는 항원성 에피토프와 결합할 수 있고 생물학적 효과를 직접 또는 간접적으로 발휘할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 직접 효과에는 성장 신호의 조정, 자극 및(또는) 억제; 항-세포소멸성 신호의 조정, 자극 및(또는) 억제; 세포소멸성 또는 괴사성 신호의 조정, 자극 및(또는) 억제; ADCC 케스케이드의 조정, 자극 및(또는) 억제; 및 CDC 케스케이드의 조정, 자극 및(또는) 억제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
"이중-특이적" 항체가 또한 본 발명의 방법 및 조성물에 유용하다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "이중-특이적 항체"는 2가지 이상의 상이한 항원성 에피토프에 대한 결합 특이성을 지닌 항체, 전형적으로 모노클로날 항체를 지칭한다. 한 양태에서는, 에피토프가 동일한 항원으로부터의 것이다. 또 다른 양태에서는, 에피토프가 2가지 상이한 항원으로부터의 것이다. 이중-특이적 항체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 이중-특이적 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동-발현을 이용하여 재조합적으로 생성시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Milstein et al., Nature 305: 537-39 (1983)]. 또 다른 한편, 이중-특이적 항체는 화학적 연쇄를 이용하여 제조할 수 있다 [참고: 예를 들어, Brennan, et al., Science 229: 81 (1985)]. 이중-특이적 항체에는 이중-특이적 항체 단편이 포함된다 [참고: 예를 들어, Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 90: 6444-48 (1993), Gruber, et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994)].
본원에서의 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및(또는) 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 뿐만 아니라 표적 항원과 특이적으로 결합하고/하거나 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 상기 항체의 단편이 포함된다 [참고: 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)].
용어 "코돈 최적화 서열"은 활용 빈도가 약 20% 미만인 모든 코돈을 대체시킴으로써 특정한 숙주 종에 대해 최적화시킨 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 가짜 폴리아데닐화 서열을 제거하고/하거나, 엑손/인트론 스플라이싱 신호를 제거하고/하거나, 트랜스포손 (transposon)-유사 반복 서열을 제거하고/하거나 코돈 최적화에 덧붙여 GC 함량을 최적화함으로써 소정의 숙주 종에서의 발현에 대해 최적화시킨 뉴클레오티드 서열이 본원에서 "발현 증강된 서열"로서 지칭된다.
"조합 라이브러리"는 수 많은 화학적 "빌딩 블록 (기본적 구성 단위)", 예를 들어 시약을 합함으로써 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 생성시킨 다양한 화학적 화합물의 집합체이다. 예를 들어, 선형 조합 화학적 라이브러리, 예를 들어 폴리펩티드 (예: 돌연변이 단백질) 라이브러리는 소정의 화합물 길이 (즉, 폴리펩티드 화합물 내의 아미노산의 수)에 대해 가능한 모든 방식으로, 아미노산으로 불리우는 화학적 빌딩 블록 세트를 합함으로써 형성시킨다. 이와 같이 화학적 빌딩 블록을 조합 혼합함으로써 수 많은 화학적 화합물을 합성한다 [참고: Gallop et al., J. Med. Chem. 37(9):1233-1251 (1994)].
조합 라이브러리의 제조 및 스크리닝은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 조합 화학적 라이브러리에는 펩티드 라이브러리 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,010,175호; Furka, Pept. Prot. Res. 37: 487-493 (1991), Houghton et al., Nature, 354: 84-88 (1991)], 펩티드 [참고: PCT 공개공보 WO 91/19735], 코딩된 펩티드 [참고: PCT 공개공보 WO 93/20242], 무작위 바이오-올리고머 [참고: PCT 공개공보 WO 92/00091], 벤조디아제핀 [참고: 미국 특허 5,288,514호], 다양체, 예를 들어 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드 [참고: Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993)], 비닐성 (vinylogous) 폴리펩티드 [참고: Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)], 베타-D-글루코스 스캐폴딩을 수반한 비-펩티드성 펩티드-모방체 [참고: Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)], 소화합물 라이브러리의 유사한 유기 합성물 [참고: Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)], 올리고카바네이트 [참고: Cho, et al., Science 261: 1303 (1993)] 및(또는) 펩티딜 포스포네이트 [참고: Campbell et al., J. Org. Chem. 59: 658 (1994); Gordon et al., J. Med. Chem. 37: 1385 (1994)], 핵산 라이브러리 [참고: 예를 들어 Stratagene, Corp.], 펩티드 핵산 라이브러리 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,539,083호], 항체 라이브러리 [참고: 예를 들어, Vaughn et al., Nature Biotechnology 14 (3): (1996), and PCT/US96/10287], 탄수화물 라이브러리 [참고: 예를 들어, Liang et al., Science 274: 1520-1522 (1996), 및 미국 특허 제5,593,853호], 및 유기 소분자 라이브러리 [참고: 예를 들어, 벤조디아제핀: Baum, C&EN, Jan 18, page 33 (1993); 이소프레노이드: 미국 특허 제5,569,588호; 티아졸리디논 및 메타티아자논: 미국 특허 제5,549,974호; 피롤리돈: 미국 특허 제5,525,735호 및 제5,519,134호; 모르폴리노 화합물: 미국 특허 제5,506,337호; 벤조디아제핀: 미국 특허 제5,288,514호 등]이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
조합 라이브러리를 제조하기 위한 장치는 시판되고 있다 [참고: 예를 들어, 357 NIPS, 390 NIPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY; Symphony, Rainin, Woburn, MA; 433A, Applied Biosystems, Foster City, CA; 9050, Plus, Millipore, Bedford, NIA]. 용액 상 화학을 위한, 널리 공지된 수 많은 로봇 시스템이 또한 개발되었다. 이들 시스템에는 자동화 워크스테이션, 예를 들어 다음 제조업체 [Takeda Chemical Industries, LTD. (Osaka, Japan)]에 의해 개발된 자동화 합성 장치, 및 화학자에 의해 수행된 수동 합성 작동을 모방하는, 로봇 팔을 활용한 많은 로봇 시스템 (Zymate H, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.)이 포함된다. 상기 장치 모두가 본 발명에 사용하기 적합하다. 이들이 본원에 논의된 바와 같이 작동될 수 있도록 이들 장치에 대한 변형 (존재하는 경우)의 성질과 이행이 관련 분야의 전문가에게 명백할 것이다. 또한, 수 많은 조합 라이브러리 그 자체가 시판되고 있다 [참고: 예를 들어, ComGenex, Princeton, NJ; Asinex, Moscow, RU; Tripos, Inc., St. Louis, MO; ChemStar, Ltd, Moscow, RU; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MD 등].
본원에 사용된 바와 같은 용어 "보존적 치환"은 당업자에게 공지되어 있고 일반적으로, 생성되는 분자의 생물학적 활성은 변경시키지 않으면서 이루어지는 아미노산의 치환을 지칭한다. 당업자는 일반적으로, 폴리펩티드의 비-필수 영역에서의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인지하고 있다 [참고; 예를 들어, Watson, et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition 1987)]. 이러한 예시 치환은 바람직하게, 표 III(a-b)에 제시된 바에 따라서 만들어진다. 예를 들어, 이러한 변화에는 기타 소수성 아미노산을 이소루이신 (I), 발린 (V), 및 루이신 (L)으로 치환시키고; 글루탐산 (E)을 아스파르트산 (D)으로 치환시키거나 그 반대로 치환시키며; 아스파라긴 (N)을 글루타민 (Q)으로 치환시키거나 그 반대로 치환시키고; 트레오닌 (T)을 세린 (S)으로 치환시키거나 그 반대로 치환시키는 것이 포함된다. 특정한 아미노산의 환경, 및 단백질의 3차원적 구조에서의 그의 역할에 따라서, 기타 치환도 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 글리신 (G)과 알라닌 (A)은 알라닌 (A)와 발린 (V)과 같이, 종종 상호 교환될 수 있다. 비교적 소수성인 메티오닌 (M)은 종종 루이신 및 이소루이신과 상호 교환될 수 있고, 종종 발린과 상호 교환될 수 있다. 리신 (K) 및 아르기닌 (R)은 종종, 아미노산 잔기의 중요한 특징이 그의 전하이고 이들 두 아미노산 잔기의 pK가 상이하다는 것은 중요하지 않는 위치에서 상호 교환 가능하다. 기타 변화들도 특별한 환경 하에서 "보존적"인 것으로 간주될 수 있다 [참고: 예를 들어, 본원의 표 III(a); pages 13-15 "Biochemistry" 2nd ED. Lubert Stryer ed (Stanford University); Henikoff et al., PNAS 1992 Vol 89 10915-10919; Leiet al., J Biol Chem 1995 May 19; 270 (20): 11882-6]. 기타 치환 또한 허용 가능하고, 이는 실험적으로 결정하거나 또는 공지된 보존적 치환에 따라서 결정할 수 있다.
용어 "세포독성제"는 세포의 발현 활성, 세포의 기능을 억제 또는 방지시키고/시키거나 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 이 용어에는 방사성 동위원소, 화학요법제, 및 독소, 예를 들어 소분자 독소 또는 세균성, 진균성, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 (그의 단편 및(또는) 변이체 포함)가 포함된다. 세포독성제의 예에는 아우리스타틴, 아우리스타틴 e, 아우로마이신, 마이탄시노이드, 이트륨, 비스무트, 리신, 리신 A-쇄, 콤브레스타틴, 두오카르마이신, 돌로스타틴, 독소루비신, 다우노루비신, 탁솔, 시스플라틴, cc1065, 에티듐 브로마이드, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 디히드록시 안트라신 디온, 악티노마이신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소 (PE) A, PE40, 아브린, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 겔로닌, 미토겔린, 레트스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 쿠리신, 크로틴, 칼리케아미신, 사파오나리아 오피시날리스 (Sapaonaria officinalis) 억제제, 및 글루코코르티코이드 및 기타 화학요법제 뿐만 아니라 방사성 동위원소, 예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 또는 213, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소 (Lu177 포함)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 항체를, 프로-드럭 (pro-drug)을 그의 활성 형태로 전환시킬 수 있는 항암 프로-드럭 활성화 효소와 접합시킬 수도 있다.
용어 "디아보디 (diabody)"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 가변 경쇄 도메인 (VL)과 연결된 가변 중쇄 도메인 (VH)을 포함한다 (VH - VL). 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 이들 도메인을 또 다른 쇄의 상보적 도메인와 짝짓기시킴으로써, 2개의 항원-결합 부위를 창출시킨다. 디아보디는, 예를 들어 다음 문헌에 보다 상세히 기재되었다 [참고: EP 404,097; WO 1993/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)].
"유전자 생성물"은 본원에서 펩티드/단백질 또는 mRNA을 지시하기 위해 사용된다. 예를 들어, "본 발명의 유전자 생성물"은 종종, 본원에서 "암 아미노산 서열", "암 단백질", "표 I에 열거된 암의 단백질, "암 mRNA", "표 I에 열거된 암의 mRNA" 등으로서 지칭된다. 한 양태에서는, 암 단백질이 도 2의 핵산에 의해 코딩된다. 암 단백질은 단편일 수 있거나, 또는 도 2의 핵산에 의해 코딩된 완전한 길이 단백질일 수 있다. 한 양태에서는, 암 아미노산 서열을 사용하여 서열 동일률 또는 유사율을 결정한다. 또 다른 양태에서는, 이 서열이 도 2의 핵산에 의해 코딩된 단백질의 천연 발생적 대립 유전자성 변이체이다. 또 다른 양태에서는, 상기 서열이 본원에 추가로 기재되는 바와 같은 서열 변이체이다.
"이종-접합체" 항체가 본 발명의 방법 및 조성물에 유용하다. 본원에 사용된 바와 같은 이종-접합체 항체는 2개의 공유적으로 결합된 항체를 지칭한다. 이러한 항체는 합성 단백질 화학 분야에 공지된 방법, 예를 들어 가교결합제를 사용하여 제조할 수 있다 [참고: 미국 특허 제4,676,980호].
특정한 핵산 또는 단백질 생성물의 존재, 부재, 정량화 또는 기타 특성을 알아보기 위한 "고 처리능력 스크리닝" 검정은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 유사하게, 결합 검정 및 리포터 (reporter) 유전자 검정도 유사하게 널리 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어 미국 특허 제5,559,410호에는 단백질에 대한 고 처리능력 스크리닝 방법이 기재되어 있고; 미국 특허 제5,585,639호에는 핵산 결합에 대한 (즉, 어레이에서) 고 처리능력 스크리닝 방법이 기재되어 있는 반면, 미국 특허 제5,576,220호 및 제5,541,061호에는 리간드/항체 결합에 대한 고 처리능력 스크리닝 방법이 기재되어 있다.
또한, 고 처리능력 스크리닝 시스템은 시판되고 있다 [참고: 예를 들어, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ; Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA 등]. 이들 시스템은 전형적으로, 샘플 및 시약 피펫팅, 액체 투약, 지속 항온 배양, 및 해당 검정에 적당한 탐지기에서 미세판의 최종 판독을 포함한 전 과정을 자동화한다. 이들 설정 가능한 시스템은 고 처리능력과 신속한 출발을 제공해줄 뿐만 아니라 고도의 융통성과 주문 설계를 제공해준다. 이 시스템의 제작업자는 각종 고 처리능력 시스템에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 따라서, 제작업자 [Zymark Corp.]는 유전자 전사, 리간드 결합 등의 조정을 탐지하기 위한 스크리닝 시스템에 관해 기재한 기술 고시물을 제공한다.
용어 "동족체 (상동체)"는, 예를 들어 상응하는 위치에 동일하거나 유사한 화학적 잔기 서열을 가짐으로써, 또 다른 분자와의 상동성을 나타내는 분자를 지칭한다.
한 양태에서는, 본원에 제공된 항체가 "인간 항체"이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는 본질적으로, 상보성 결정 영역 (CDRs)을 포함한 경쇄 전체 서열과 중쇄 서열이 인간 유전자로부터의 것인 항체를 지칭한다. 한 양태에서는, 인간 모노클로날 항체가 트리오마 (trioma) 기술, 인간 B-세포 기술 [참고: 예를 들어 Kozbor, et al., Immunol. Today 4: 72 (1983)], EBV 형질전환 기술 [참고: Cole et al. MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY 77-96 (1985)], 또는 파아지 디스플레이를 사용하는 기술 [참고: 예를 들어, Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581(1991)]에 의해 제조한다. 구체적 양태에서는, 인간 항체를 트랜스제닉 마우스에서 생성시킨다. 이러한 부분적 내지 완전한 인간 항체를 제조하기 위한 기술은 당해 분야에 공지되어 있고, 어떠한 기술도 사용할 수 있다. 특히 바람직한 한 가지 양태에 따르면, 인간 중쇄 및 경쇄 항체 유전자를 발현하도록 공학적으로 처리시킨 트랜스제닉 마우스에서 완전한 인간 항체 서열을 만든다. 인간 항체를 생산하는 트랜스제닉 마우스 및 그의 자손을 생성시키는 방법에 관한 예시 설명이 WO 02/43478 및 미국 특허 제6,657,103호 (Abgenix)에 보고되었다. 이때, 목적하는 항체를 생산하는 트랜스제닉 마우스로부터의 B 세포를 융합하여, 이러한 항체를 지속적으로 생산하기 위한 하이브리도마 세포주를 만들 수 있다 [참고: 미국 특허 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호; 및 제5,545,806호; 및 Jakobovits, Adv. Drug Del. Rev. 31: 33-42 (1998); Green, et al., J. Exp. Med. 188: 483-95 (1998)].
"인간 백혈구 항원" 또는 "HLA"는 인간 부류 I 또는 부류 II 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 단백질이다 [참고: 예를 들어, Stites, et al., IMMUNOLOGY, 8TH ED., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994)].
본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간화 항체"는 비-인간 (예: 뮤린) 항체 뿐만 아니라 인간 항체로부터의 서열을 함유하는 항체 형태를 지칭한다. 이러한 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FRs는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로, 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 [참고: Cabilly U. S. Patent No. 4,816,567; Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033; and ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press 1996)].
폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용된 용어 "혼성화"는 통상적인 혼성화 조건, 바람직하게는 예를 들어, 50% 포름아미드/6X SSC/0.1% SDS/100 ㎍/ml ssDNA에서의 혼성화를 지칭하는데, 여기서 혼성화를 위한 온도는 37℃ 이상이고 0.1X SSC/0.1% SDS에서 세척하기 위한 온도는 55℃ 이상이다.
용어 "분리된" 또는 "생물학적으로 순수한"이란, 천연 상태에서 발견되는 바와 같은 물질에 통상적으로 수반되는 성분들이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭한다. 따라서, 본 발명에 따르는 분리된 펩티드는 바람직하게, 그의 계내 환경 하에서 펩티드와 통상적으로 연합된 물질을 함유하지 않는다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 이것이 STEAP-1 유전자 이외의 유전자에 상응하거나 이와 상보적인 오염성 폴리뉴클레오티드, 또는 STEAP-1 유전자 생성물 이외의 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 오염성 폴리뉴클레오티드로부터 실질적으로 격리된 경우에 "분리된" 것으로 여겨진다. 당업자는 분리된 STEAP-1 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위한 핵산 분리 과정을 용이하게 이용할 수 있다. 단백질은, 예를 들어 물리적, 기계적 또는 화학적 방법을 이용하여, 이러한 단백질과 통상적으로 연합되는 세포성 구성분들로부터 STEAP-1 단백질을 제거시킨 경우에 "분리된" 것으로 여겨진다. 당업자는 분리된 STEAP-1 단백질을 수득하기 위한 표준 정제 방법을 용이하게 이용할 수 있다. 또 다른 한편으론, 분리된 단백질을 화학적 수단에 의해 제조할 수 있다.
적합한 "표지"에는 방사성 핵종, 효소, 기질, 조인자, 억제제, 형광성 부분, 화학발광성 부분, 자기 입자 등이 포함된다. 이러한 표지의 용도를 교시하는 특허에는 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호가 포함된다. 또한, 본원에 제공된 항체는 형광체의 항원-결합성 성분으로서 유용할 수 있다 [참고: 예를 들어, Zeytun et al., Nat. Biotechnol. 21: 1473-79 (2003)].
용어 "포유류"는 포유류로서 분류된 모든 유기체를 지칭하는데, 이에는 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말 및 인간이 포함된다. 본 발명의 한 양태에서는, 포유류가 마우스이다. 본 발명의 또 다른 양태에서는, 포유류가 인간이다.
용어 "전이성 전립선 암" 및 "전이성 질병"은 국부 림프절 또는 원위 부위로 확산된 전립선 암을 지칭하고, 이에는 AUA 시스템 하의 병기 D 질병 및 TNM 시스템 하의 병기 TxNxM+가 포함된다. 국소적으로 진행된 전립선 암의 경우와 같이, 전이성 질병을 나타내는 환자에 대해서는 수술이 일반적으로 지시되지 않고, 호르몬 (안드로겐 제거) 요법이 바람직한 치료 양식이다. 전이성 전립선 암 환자는 궁극적으로, 치료를 개시한지 12 내지 18개월 내에 안드로겐-난치성 상태로 발전한다. 이러한 안드로겐-난치성 환자의 대략 절반 정도가 이러한 상태 발생 후 6개월 내에 사망한다. 전립선 암 전이가 가장 흔히 일어나는 부위가 뼈(골)이다. 전립선 암 골전이는 종종, 골용해성이 아니라 골형성성이다 (즉, 순 골형성 발생). 골전이는 가장 빈번하게는 척추에서 발견되고, 그 다음으로는 대퇴골, 골반, 흉곽, 두개골 및 상박골에서 발견된다. 전이가 일어나는 기타 부위로는 림프절, 폐, 간 및 뇌가 있다. 전이성 전립선 암은 전형적으로, 개복 또는 복강경 골반 림프절절제술, 전신 방사성핵종 스캔, 골격 방사선촬영 및(또는) 골병변 생검에 의해 진단한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조정제(조정인자)", "시험 화합물" 또는 "약물 후보", 또는 문법적 등가 용어는 암 표현형 또는 암 서열 (예: 핵산 또는 단백질 서열)의 발현, 또는 암 서열의 효과 (예: 신호 전달, 유전자 발현, 단백질 상호 작용 등)를 직접 또는 간접적으로 변경시킬 수 있는 능력을 알아보기 위해 시험하고자 하는 모든 분자, 예를 들어 단백질, 올리고펩티드, 유기 소분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 등을 기재한다. 한 국면에서는, 조정제가 본 발명의 암 단백질의 효과를 중화시킬 것이다. "중화시키는" 것이란, 특정 단백질의 활성을 억제 또는 차단시킴으로써, 세포에 대한 후속 효과도 가져다 주는 것을 의미한다. 또 다른 국면에서는, 조정제가 단백질의 수준을 표준화시킴으로써, 본 발명의 유전자 및 그의 상응하는 단백질을 중화시킬 것이다. 바람직한 양태에서는, 조정제가 본원에 제공된 핵산 또는 단백질의 발현 프로파일(들), 또는 하단 효과기 경로를 변경시킨다. 한 양태에서는, 조정제가 암 표현형을, 예를 들어 정상 조직 지문으로 저해시킨다. 또 다른 양태에서는, 조정제가 암 표현형을 유도시켰다. 일반적으로, 복수 개의 검정 혼합물을 상이한 작용제 농도와 병행해서 수행하여 각종 농도에 대한 시차 반응을 수득한다. 전형적으로는, 이들 농도 중의 하나가 음성 대조군으로서 제공되는데, 즉 제로 농도 또는 탐지 수준 이하로 제공된다.
조정제, 약물 후보 또는 시험 화합물에는 수 많은 화학적 부류가 포괄되지만, 전형적으로는 이들이 유기 분자, 바람직하게는 분자량이 100 이상 약 2,500 달톤 미만인 작은 유기 화합물이다. 바람직한 소분자는 2000 D 미만, 1500 D 미만, 1000 D 미만, 또는 500 D이다. 후보 작용제는 단백질과 구조적으로 상호작용하는데 필요한, 특히 수소 결합하는데 필요한 관능기를 포함하고, 이에는 전형적으로, 적어도 아민기, 카보닐기, 히드록실기 또는 카복실기가 포함되고, 바람직하게는 이들 화학적 관능기들 중의 2개 이상이 포함된다. 후보 작용제는 종종, 상기 관능기 중의 하나 이상에 의해 치환된 환식 탄소 또는 헤테로사이클릭 구조 및(또는) 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함한다. 조정제는 또한, 생체 분자, 예를 들어 펩티드, 당류, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 유도체, 구조적 유사체 또는 이들의 조합물을 포함한다. 특히 바람직한 것은 펩티드이다. 한 가지 부류의 조정제는, 예를 들어 약 5 내지 약 35개 아미노산, 바람직하게는 약 5 내지 약 20개, 특히 바람직하게는 약 7 내지 약 15개 아미노산의 펩티드이다. 바람직하게는, 암 조정 단백질이 가용성이고, 비-막관통 영역을 포함하고/하거나 용해도를 보조하기 위한 N-말단 Cys를 갖는다. 한 양태에서는, 단편의 C-말단이 자유 산으로서 유지되고, N-말단이 시스테인과의 커플링을 보조하기 위한 자유 아민이다. 한 양태에서는, 본 발명의 암 단백질이 본원에 논의된 바와 같은 면역원성제와 접합된다. 한 양태에서는, 암 단백질이 BSA와 접합된다. 예를 들어, 바람직한 길이의 본 발명의 펩티드를 서로 연결시키거나 또는 다른 아미노산에 연결시켜 보다 긴 펩티드/단백질을 창출시킬 수 있다. 조정 펩티드는 상기 요약된 바와 같은 천연 발생적 단백질의 분해물, 무작위 펩티드, 또는 "편재된 (biased)" 무작위 펩티드일 수 있다. 바람직한 양태에서는, 펩티드/단백질계 조정제가 본원에 정의된 바와 같은 항체, 및 그의 단편이다.
암의 조정제는 핵산일 수도 있다. 핵산 조정제는 천연 발생적 핵산, 무작위 핵산, 또는 "편재된" 무작위 핵산일 수 있다. 예를 들어, 원핵성 또는 진핵성 게놈의 분해물을 상기 단백질에 대해 요약된 바와 유사한 접근법에 사용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원성 에피토프에 대항하여 지시된다. 이와는 달리, 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제에는 전형적으로, 상이한 에피토프에 대항하여 지시된 (또는 이에 대해 특이적인) 다수의 항체가 포함된다. 한 양태에서는, 폴리클로날 항체가 다중 항원성 에피토프를 함유하는, 단일 항원 내에 상이한 에피토프 특이성, 친화성 또는 결합 친화도를 나타내는 복수 개의 모노클로날 항체를 함유한다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 지시하고, 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [참고: Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법 [미국 특허 제4,816,567호 참고]에 의해 만들 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [참고: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol.Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 이들 모노클로날 항체는 통상적으로 ELISA에 의해 측정된, 통상적으로 약 1 M 이상, 보다 통상적으로는 약 300 nM 이상, 전형적으로는 약 30 nM 이상, 바람직하게는 약 10 nM 이상, 보다 바람직하게는 약 3 nM 이상의 Kd로 결합할 것이다.
STEAP-1-관련 단백질의 생물학적 모티프에서와 같은 "모티프"는 특정한 기능 (예: 단백질-단백질 상호작용, 단백질-DNA 상호작용 등) 또는 변형 (즉, 인산화, 당화 또는 아미드화) 또는 국재 (예: 분비성 서열, 핵 국재 서열 등)과 연관되는 단백질의 일차 서열, 또는 체액성 또는 세포적으로 면역원성인 것과 상관이 있는 서열의 모든 패턴의 아미노산 형성 부분을 지칭한다. 모티프는 연속된 것일 수 있거나, 또는 일반적으로 특정 기능이나 성질과 상관이 있는 특정 위치와 정렬될 수 있는 것이다. HLA 모티프와 관련하여 "모티프"는 펩티드 내의 규정된 길이의 잔기 패턴, 통상적으로 특정한 HLA 분자에 의해 인식되는 부류 I HLA 모티프의 경우에는 약 8 내지 약 13개 아미노산의 펩티드, 및 부류 II HLA 모티프의 경우에는 약 6 내지 약 25개 아미노산의 펩티드를 지칭한다. HLA 결합에 대한 펩티드 모티프는 전형적으로, 각 인간 HLA 대립 유전자에 의해 코딩된 각 단백질에 대해 상이하고, 일차 및 이차 고정 잔기의 패턴에 있어 상이하다.
"제약 부형제"는 아주반트, 담체, pH-조정제 및 완충제, 등장성 조정제, 습윤제, 방부제 등의 물질을 포함한다.
"제약상 허용 가능한"이란 비-독성, 불활성, 및(또는) 인간 또는 기타 포유류와 생리적으로 화합성인 조성물을 지칭한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드인, 길이가 10개 이상 염기 또는 염기쌍인 뉴클레오티드의 중합체성 형태, 또는 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태를 의미하고, 이에는 단일 가닥 및 이중 가닥 형태의 DNA 및(또는) RNA가 포함된다. 당해 분야에서는, 상기 용어가 "올리고뉴클레오티드"와 상호 교환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 도 2에 제시된 바와 같은 티미딘 (T)이 우라실 (U)일 수도 있는 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데; 이러한 정의는 DNA와 RNA의 화학적 구조 간의 차이에 속하며, 특히 RNA 내의 4개 주요 염기 중의 하나가 티미딘 (T) 대신 우라실 (U)이라는 관찰 결과에 따른 것이다.
용어 "폴리펩티드"는 약 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산의 중합체를 의미한다. 본 명세서 전반에 걸쳐, 아미노산에 대한 표준 3 문자 또는 단일 문자 명칭을 사용한다. 당해 분야에서는, 상기 용어가 종종 "펩티드" 또는 "단백질"과 상호 교환적으로 사용된다.
HLA "일차 고정 잔기"는 면역원성 펩티드와 HLA 분자 간의 접촉점을 제공하는 것으로 인식되는 펩티드 서열을 따라 특이적 위치에서의 아미노산이다. 규정된 길이의 펩티드 내의 1 내지 3개, 통상적으로 2개의 일차 고정 잔기는 면역원성 펩티드에 대한 "모티프"를 규정한다. 이들 잔기는 HLA 분자의 펩티드 결합성 홈과 밀접하게 접촉하여 피팅되는 것으로 인식되는데, 이들의 측쇄는 상기 결합성 홈의 특이적 포켓에 숨겨져 있다. 예를 들어, 한 양태에서는 HLA 부류 I 분자에 대한 일차 고정 잔기가, 본 발명에 따르는 8, 9, 10, 11 또는 12개 잔기 펩티드 에피토프의 카복실 말단 위치 및 위치 2 (아미노 말단 위치로부터)에 위치한다. 또 다른 한편, 또 다른 양태에서는 HLA 부류 II 분자와 결합하는 펩티드의 일차 고정 잔기가, 특정 펩티드 (이러한 펩티드는 일반적으로 길이가 9개 이상 아미노산이다)의 말단에 대해서 보다는 서로에 대해 격리되어 있다. 각 모티프 및 슈퍼모티프 (supermotif)에 대한 일차 고정 위치는 표 IV(a)에 제시되어 있다. 예를 들어, 표 IV에 제시된 일차 및(또는) 이차 고정 위치 내의 특정한 잔기의 존재 또는 부재를 변경시킴으로써, 유사한 펩티드를 창출시킬 수 있다. 이러한 유사체를 사용하여 특정한 HLA 모티프 또는 슈퍼모티프를 포함하는 펩티드의 결합 친화성 및(또는) 집단 적용 범위를 조정한다.
"방사성 동위원소"에는 다음이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다 (비-제한적 예시 용도가 표 IV(I)에 제시되기도 한다).
핵산 및 단백질에 대해 본원에서 적용된 바와 같은 "무작위화" 또는 문법적 동의어는 각 핵산 및 단백질이 본질적으로 무작위 뉴클레오티드 및 아미노산으로 각각 이루어진다는 것을 의미한다. 이들 무작위 펩티드 (또는 본원에 논의된 핵산)에는 모든 뉴클레오티드 또는 아미노산이 어느 위치에서도 혼입될 수 있다. 합성 과정은 무작위화 단백질 또는 핵산이 생성되도록 고안하여, 서열 길이 전반에 걸쳐 모든 또는 거의 모든 가능한 조합물이 형성될 수 있도록 함으로써, 무작위화 후보 생체활성 단백질성 작용제의 라이브러리가 형성되도록 할 수 있다.
한 양태에서는, 라이브러리가 어떠한 위치에서도 일정되거나 선호되는 서열을 수반하지 않은 "완전히 무작위화"된 것이다. 또 다른 양태에서는, 라이브러리가 "편재된 무작위" 라이브러리이다. 즉, 서열 내의 몇몇 위치가 일정하게 유지되거나, 또는 제한된 수의 가능성 중에서 선택된다. 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기는 규정된 부류, 예를 들어 소수성 아미노산, 친수성 잔기, 입체적으로 편재된 (소 또는 대) 잔기 내에서 무작위화되거나, 또는 핵산 결합성 도메인을 창출시키기 위해, 가교 결합을 위한 시스테인을 창출시키기 위해, SH-3 도메인에 대한 프롤린을 창출시키기 위해, 인산화 부위를 위한 세린, 트레오닌, 티로신 또는 히스티딘을 창출시키기 위해, 또는 퓨린에 대해 무작위화시킨다.
"재조합" DNA 또는 RNA 분자는 시험관 내에서 분자 조작을 수행한 DNA 또는 RNA 분자이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 또는 "단일쇄" 항체는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 지칭하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있게 해주는, VH 도메인과 VL 도메인 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv에 관한 고찰은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)].
"소분자"의 비-제한적 예에는 STEAP-1과 결합하거나 상호 작용하는 화합물, 호르몬 포함 리간드, 뉴로펩티드, 케모카인, 방향제, 인지질, 및 결합하여 바람직하게는 STEAP-1 단백질 기능을 억제시키는 그의 기능적 등가물이 포함된다. 이러한 비-제한적 소분자는 분자량이 바람직하게 약 10 kDa 미만, 보다 바람직하게 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5 또는 약 4 이하 kDa이다. 특정 양태에서는, 소분자가 STEAP-1 단백질과 물리적으로 연합되거나 또는 결합되고; 천연 발생적 대사 경로에서는 발견되지 않고/않거나 비수성 용액에서 보다는 수성 용액에서 더 가용성이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "특이적"은 표적 항원 에피토프에 대한 항체의 선택적 결합을 지칭한다. 항체를 대상으로 하여 적당한 항원에 대한 결합성을 소정의 조건 하에 무관한 항원 또는 항원 혼합물에 대한 결합성과 비교함으로써 결합 특이성에 대해 시험할 수 있다. 항체가 무관한 항원 또는 항원 혼합물 보다 2배, 5배, 7배, 및 바람직하게는 10배 이상 더 적당한 항원과 결합하는 경우에는, 이것이 특이적인 것으로 간주된다. 한 양태에서는, 특이적 항체가 STEAP-1과만 결합하고, 무관한 항원과는 결합하지 않는 것이다. 또 다른 양태에서는, 특이적 항체가 인간 STEAP-1 항원과 결합하지만, 이러한 STEAP-1 항원과의 아미노산 상동률이 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상인 비-인간 STEAP-1 항원과는 결합하지 않는 것이다. 또 다른 양태에서는, 특이적 항체가 인간 STEAP-1 항원과 결합하고 뮤린 STEAP-1 항원과 결합하는 것이지만, 인간 항원과는 보다 높은 결합도로 결합한다. 또 다른 양태에서는, 특이적 항체가 인간 STEAP-1 항원과 결합하고 영장류 STEAP-1 항원과 결합하는 것이지만, 인간 항원과는 보다 높은 결합도로 결합한다. 또 다른 양태에서는, 특이적 항체가 인간 STEAP-1 항원과 결합하고 비-인간 STEAP-1 항원과 결합하는 것이지만, 인간 항원과는 보다 높은 결합도로 결합한다. 그 밖의 어떠한 조합도 가능하다.
혼성화 반응의 "엄격성"은 당업자에 의해 용이하게 결정할 수 있고, 이는 일반적으로, 프로브 길이, 세척 온도, 및 염 농도에 따라서 실험적으로 계산한다. 일반적으로, 보다 긴 프로브는 적당한 어닐링을 위해 보다 고온이 요구되는 반면, 보다 짧은 프로브는 보다 저온을 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로, 상보성 쇄가 그의 융점 아래 환경에 존재하는 경우에는 변성 핵산 서열을 재어닐링시킬 수 있는 능력에 좌우된다. 프로브와 혼성화 가능한 서열 간의 목적하는 상동률이 보다 높을 수록, 사용될 수 있는 상대 온도는 더 높아진다. 그 결과, 보다 높은 상대 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 만드는 경향이 있는 반면, 보다 낮은 온도는 이런 경향이 덜하다. 혼성화 반응의 엄격성에 관한 부가의 상세 내역 및 설명에 대해서는, 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)].
본원에 규정된 바와 같은 "엄격한 조건" 또는 "고도로 엄격한 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도와 고온을 이용하는 조건: 50℃ 하에 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 나트륨 시트레이트/0.1% 나트륨 도데실 술페이트; (2) 혼성화 동안 변성제 (예: 포름아미드)를 이용하는 조건: 42℃ 하에 750 mM 염화나트륨, 75 mM 나트륨 시트레이트를 수반한, 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜 (Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5)를 수반한 50% (v/v) 포름아미드; 또는 (3) 42℃ 하에 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 나트륨 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x 덴하르츠 (Denhardt's) 용액, 초음파 처리한 연어 정액 DNA (50 ㎍/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 술페이트를 이용하고, 42℃ 하에 0.2 x SSC (염화나트륨/나트륨 시트레이트) 및 55℃ 하에 50% 포름아미드 중에서 세척한 다음, 55℃ 하에 0.1 x SSC 함유 EDTA로 이루어진 고-엄격성 세척을 수행하는 조건으로써 확인되지만, 이에 제한되지 않는다. "적당한 수준 (중간 수준)으로 엄격한 조건"은 문헌 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재되어 있고, 이에는 상기 언급된 조건 보다 덜 엄격한 세척 용액 및 혼성화 조건 (예: 온도, 이온 강도 및 % SDS)을 사용하는 것이 포함된다. 적당한 수준으로 엄격한 조건의 예는 1% 소 혈청 알부민, 0.5 M 인산나트륨 pH 7.5, 1.25 mM EDTA, 및 7% SDS 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 삼나트륨 시트레이트)를 포함하는 용액 중에서 65℃ 하에 밤새 항온 배양한 다음, 약 50℃ 하에 2 x SSC/1% SDS 및 50℃ 하에 0.2 X SSC/0.1% SDS 중에서 필터를 세척하는 것이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조절하기에 필요한 정도로 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인지할 것이다.
HLA "슈퍼모티프"는 2개 이상의 HLA 대립 유전자에 의해 코딩된 HLA 분자에 의해 공유된 펩티드 결합 특이성이다. 상이한 인종 집단에서 HLA-초유형의 전반적인 표현형 빈도가 표 IV(f)에 제시되었다. 각종 초유형의 비-제한적 구성 성분은 다음과 같다:
A2 : A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*6802, A*6901, A*0207
A3 : A3, A11, A31, A*3301, A*6801, A*0301, A*1101, A*3101
B7 : B7, B*3501-03, B*51, B*5301, B*5401, B*5501, B*5502, B*5601, B*6701, B*7801, B*0702, B*5101, B*5602
B44 : B*3701, B*4402, B*4403, B*60 (B*4001), B61 (B*4006)
A1 : A*0102, A*2604, A*3601, A*4301, A*8001
A24 : A*24, A*30, A*2403, A*2404, A*3002, A*3003
B27 : B*1401-02, B*1503, B*1509, B*1510, B*1518, B*3801-02, B*3901, B*3902, B*3903-04, B*4801-02, B*7301, B*2701-08
B58 : B*1516, B*1517, B*5701, B*5702, B58
B62 : B*4601, B52, B*1501 (B62), B*1502 (B75), B*1513 (B77)
상이한 HLA-초유형 조합물에 의해 제공된 집단 적용 범위 계산치가 표 IV(g)에 제시되었다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료" 또는 "치료적" 및 문법적으로 관련된 용어는 모든 질병에 따른 결과를 개선시키는 것, 예를 들어 생존율을 연장시키고/시키거나, 사망률을 감소시키고/시키거나 대체 치료 양식의 부산물인 부작용을 경감시키는 것을 지칭하고; 당업자에 용이하게 인지되는 바와 같이, 해당 질병을 완전히 소멸시키는 것이 바람직하긴 하지만, 의료 행위에 반드시 요구되는 것은 아니다.
"트랜스제닉 동물" (예: 마우스 또는 랫트)은 출생전에, 예를 들어 배아 단계에서 해당 동물 또는 이 동물의 선조 내로 도입되는 트랜스유전자 (transgene)를 함유하는 세포를 갖는 동물이다. "트랜스유전자"는 트랜스제닉 동물이 발생한 세포의 게놈 내로 통합된 DNA이다.
본원에 사용된 바와 같은 HLA 또는 세포성 면역 반응 "백신"은 본 발명의 하나 이상의 펩티드를 함유하거나 코딩하는 조성물이다. 이러한 백신의 수 많은 양태가 있는데, 예를 들면 하나 이상의 개개 펩티드의 칵테일; 폴리에피토프성 펩티드로써 구성된 하나 이상의 펩티드; 또는 상기 개개의 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 예를 들어 폴리에피토프성 펩티드를 코딩하는 미니유전자가 있다. "하나 이상의 펩티드"에는 본 발명의 1 내지 150개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 또는 150개 이상 펩티드로부터의 모든 단위 정수가 포함될 수 있다. 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드는, 예를 들어 지질화, 표적화 또는 기타 서열의 부가에 의해 임의로 변형시킬 수 있다. 본 발명의 HLA 부류 I 펩티드를 HLA 부류 II 펩티드와 혼합하거나 연결시켜, 세포독성 T 림프구와 조력 T 림프구 둘 다의 활성화를 촉진시킬 수 있다. HLA 백신은 또한, 펩티드-펄싱된 항원 제시 세포, 예를 들어 수지상 세포를 포함할 수 있다.
용어 "변이체"는 기재된 유형 또는 정상 유형으로부터의 변이를 나타내는 분자, 예를 들어 구체적으로 기재된 단백질의 상응하는 위치(들)에 1개 이상의 상이한 아미노산 잔기를 갖는 단백질이다 (예를 들면, 도 2 또는 도 3에 도시된 STEAP- 1 단백질). 유사체가 변이체 단백질의 한 예이다. 스플라이스 이소형 및 단일 뉴클레오티드 다형체 (SNPs)가 변이체의 추가 예이다.
본 발명의 "STEAP-1-관련 단백질"에는 본원에서 구체적으로 확인된 것 뿐만 아니라, 본원에 요약되거나 당해 분야에서 용이하게 이용 가능한 방법에 따라서 과도한 실험 없이 분리/생성 및 성상 확인할 수 있는 대립 유전자성 변이체, 보존적 치환 변이체, 유사체 및 동족체가 포함된다. 상이한 STEAP-1 단백질 또는 그의 단편의 부분들을 조합한 융합 단백질 뿐만 아니라 STEAP-1 단백질과 이종 폴리펩티드의 융합 단백질이 또한 포함된다. 이러한 STEAP-1 단백질은 집합적으로, STEAP-1-관련 단백질, 본 발명의 단백질 또는 STEAP-1로서 지칭된다. 용어 STEAP-1-관련 단백질은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 25개 이상 아미노산; 또는 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339개 이상 아미노산의 STEAP-1 단백질 서열, 또는 폴리펩티드 단편을 지칭한다.
II.) STEAP-1 폴리뉴클레오티드
본 발명의 한 국면은 바람직하게는 분리된 형태의, STEAP-1 유전자, mRNA, 및(또는) 코딩 서열의 전부 또는 일부에 상응하거나 상보적인 폴리뉴클레오티드를 제공하는데, 이에는 STEAP-1-관련 단백질 및 그의 단편, DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드 및 관련 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, STEAP-1 유전자 또는 mRNA 서열 또는 그의 일부와 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 및 STEAP-1, mRNA와 혼성화하거나 STEAP-1 코딩 폴리뉴클레오티드 (집합적으로, "STEAP-1 폴리뉴클레오티드")와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 본 섹션과 관련한 모든 경우에 있어, T는 도 2에서 U일 수도 있다.
STEAP-1 폴리뉴클레오티드의 양태에는 도 2에 도시된 서열, 도 2에 도시된 바와 같은 STEAP-1의 뉴클레오티드 서열 (여기서, T는 U이다); 도 2에 도시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드의 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드; 또는 도 2에 도시된 바와 같은 서열 (여기서 T는 U이다)을 갖는 폴리뉴클레오티드의 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드를 갖는 STEAP-1 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 예를 들어, STEAP-1 뉴클레오티드의 양태는 제한 없이 다음을 포함한다:
(I) 도 2에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(II) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 66에서 뉴클레오티드 잔기 번호 1085까지의, 도 2A에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(III) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 872까지의, 도 2B에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(IV) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 944까지의, 도 2C에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(V) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 872까지의, 도 2D에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(VI) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 872까지의, 도 2E에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(VII) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 872까지의, 도 2F에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(VIII) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 872까지의, 도 2G에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(IX) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 872까지의, 도 2H에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(X) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 872까지의, 도 2I에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(XI) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 872까지의, 도 2J에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(XII) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 872까지의, 도 2K에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(XIII) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 872까지의, 도 2L에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(XIV) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 872까지의, 도 2M에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(XV) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 872까지의, 도 2N에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(XVI) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 872까지의, 도 2O에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(XVII) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 872까지의, 도 2P에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(XVIII) 정지 코돈을 포함한 뉴클레오티드 잔기 번호 96에서 뉴클레오티드 잔기 번호 872까지의, 도 2Q에 도시된 바와 같은 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 폴리뉴클레오티드 (여기서, T는 U일 수도 있다);
(XIX) 도 2A-Q에 도시된 전체 아미노산 서열과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 상동성인 STEAP-1-관련 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XX) 도 2A-Q에 도시된 전체 아미노산 서열과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 STEAP-1-관련 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXI) 미국 특허원 제10/236,878호 (2002년 9월 6일자로 출원됨) (그의 전문이 본원에 참고로 삽입된다)에 제시된 바와 같은 표 V-XVIII 및 XXII-LI에 제시된 하나 이상의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXII) 도 5의 친수성 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 339까지 정수 단위로 증가하는, 도 3A의 펩티드의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산의 펩티드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXIII) 도 6의 수친화도 프로파일에서 0.5 미만 값을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 339까지 정수 단위로 증가하는, 도 3A의 펩티드의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산의 펩티드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXIV) 도 7의 이용 가능한 잔기 비율 (%) 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 339까지 정수 단위로 증가하는, 도 3A의 펩티드의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산의 펩티드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXV) 도 8의 평균 가요성 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 339까지 정수 단위로 증가하는, 도 3A의 펩티드의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상아미노산의 펩티드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXVI) 도 9의 베타-회전 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하는, 339까지 정수 단위로 증가하는, 도 3A의 펩티드의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산의 펩티드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXVII) 도 5의 친수성 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 258까지 정수 단위로 증가하는, 도 3B 및 3D의 펩티드의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산의 펩티드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXVIII) 도 6의 수친화도 프로파일에서 0.5 미만 값을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 258까지 정수 단위로 증가하는, 도 3B 및 3D의 펩티드의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산의 펩티드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXIX) 도 7의 이용 가능한 잔기 비율 (%) 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 258까지 정수 단위로 증가하는, 도 3B 및 3D의 펩티드의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산의 펩티드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXX) 도 8의 평균 가요성 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 258까지 정수 단위로 증가하는, 도 3B 및 3D의 펩티드의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산의 펩티드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXXI) 도 9의 베타-회전 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 258까지 정수 단위로 증가하는, 도 3B 및 3D의 펩티드의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산의 펩티드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXXII) 도 5의 친수성 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 282까지 정수 단위로 증가하는, 도 3C의 펩티드의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산의 펩티드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXXIII) 도 6의 수친화도 프로파일에서 0.5 미만 값을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 282까지 정수 단위로 증가하는, 도 3C의 펩티드의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산의 펩티드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXXIV) 도 7의 이용 가능한 잔기 비율 (%) 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 282까지 정수 단위로 증가하는, 도 3C의 펩티드의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산의 펩티드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXXV) 도 8의 평균 가요성 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 282까지 정수 단위로 증가하는, 도 3C의 펩티드의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산의 펩티드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXXVI) 도 9의 베타-회전 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 282까지 정수 단위로 증가하는, 도 3C의 펩티드의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산의 펩티드 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(XXXVII) (I) 내지 (XXXVI) 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 완전히 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(XXXVIII) (I) 내지 (XXXVII) 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 완전히 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(XXXIX) (I) 내지 (XXXVIII) 중의 어느 것에 의해 코딩되는 펩티드; 및
(XL) (I) 내지 (XXXVIII) 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 (XXXIX)의 펩티드를 제약 부형제와 함께 및(또는) 인간 단위 투여형으로 포함하는 조성물;
(XLI) STEAP-1을 발현하는 세포를 조정하기 위한 방법에서, (I) 내지 (XXXVIII) 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 (XXXIX)의 펩티드 또는 (XL)의 조성물을 사용하는 방법;
(XLII) STEAP-1을 발현하는 세포를 보유하고 있는 개개인을 진단, 예방, 예후 또는 치료하기 위한 방법에서, (I) 내지 (XXXVIII) 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 (XXXIX)의 펩티드 또는 (XL)의 조성물을 사용하는 방법;
(XLIII) STEAP-1을 발현하는 세포 (이러한 세포는 표 I에 열거된 조직의 암으로부터의 것이다)를 보유하고 있는 개개인을 진단, 예방, 예후 또는 치료하기 위한 방법에서, (I) 내지 (XXXVIII) 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 (XXXIX)의 펩티드 또는 (XL)의 조성물을 사용하는 방법;
(XLIV) 암을 진단, 예방, 예후 또는 치료하기 위한 방법에서, (I) 내지 (XXXVIII) 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 (XXXIX)의 펩티드 또는 (XL)의 조성물을 사용하는 방법;
(XLV) 표 I에 열거된 조직의 암을 진단, 예방, 예후 또는 치료하기 위한 방법에서, (I) 내지 (XXXVIII) 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 (XXXIX)의 펩티드 또는 (XL)의 조성물을 사용하는 방법;
(XLVI) STEAP-1을 발현하는 세포의 조정제를 확인하거나 성상 확인하기 위한 방법에서, (I) 내지 (XXXVIII) 중의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 (XXXIX)의 펩티드 또는 (XL)의 조성물을 사용하는 방법.
본원에 사용된 바와 같은 특정 범위는 구체적으로는 그의 모든 완전한 단위 위치를 기재하는 것으로 인식된다.
본원에 기재된 본 발명의 전형적인 양태에는 STEAP-1 mRNA 서열의 특이적 부분 (및 이러한 서열에 상보적인 부분)을 코딩하는 STEAP-1 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 상기 단백질 및(또는) 그의 단편, 예를 들면, STEAP-1 변이체의 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339개 이상 연속된 아미노산을 코딩하는 것이 포함되는데, 기타 변이체에 대한 관련된 최대 길이는 변이체 2의 경우에는, 258개 아미노산이고; 변이체 3의 경우에는, 282개 아미노산이며; 변이체 4의 경우에는, 258개 아미노산이다.
예를 들어, 본원에 기재된 본 발명의 대표적인 양태에는 다음이 포함된다: 약 10개 아미노산 단위로 증가하여, 도 2 또는 도 3에 제시된 카복실 말단 아미노산에서 종결되는, 도 2 또는 도 3에 도시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 10을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 코딩된 펩티드 자체; 도 2 또는 도 3에 도시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 10 내지 약 아미노산 20을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 도 2 또는 도 3에 도시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 20 내지 약 아미노산 30을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 도 2 또는 도 3에 도시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 30 내지 약 아미노산 40을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 도 2 또는 도 3에 도시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 40 내지 약 아미노산 50을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 도 2 또는 도 3에 도시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 50 내지 약 아미노산 60을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 도 2 또는 도 3에 도시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 60 내지 약 아미노산 70을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 도 2 또는 도 3에 도시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 70 내지 약 아미노산 80을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 도 2 또는 도 3에 도시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 80 내지 약 아미노산 90을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 도 2 또는 도 3에 도시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 90 내지 약 아미노산 100을 코딩하는 폴리뉴클레오티드. 따라서, STEAP-1 단백질의 아미노산 100 내지 카복실 말단 아미노산의 아미노산 서열 (약 10개 아미노산) 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 양태이다. 각각의 특정의 아미노산 위치는 ±5개 아미노산 잔기 위치를 기재하는 것으로 인지해야 한다.
STEAP-1 단백질의 비교적 긴 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명의 범위 내에 속한다. 예를 들어, 도 2 또는 도 3에 도시된 STEAP-1 단백질 또는 "변이체"의 약 아미노산 1 (또는 20 또는 30 또는 40 등) 내지 약 아미노산 20 (또는 30 또는 40 또는 50 등)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 당해 분야에 널리 공지된 각종 기술에 의해 생성시킬 수 있다. 이들 폴리뉴클레오티드 단편에는 도 2에 도시된 바와 같은 STEAP-1 서열의 어느 부분도 포함될 수 있다.
본원에 기재된 본 발명의 부가의 예시 양태에는 STEAP-1 단백질 또는 "변이체" 서열 내에 함유된 하나 이상의 생물학적 모티프, 예를 들어 표 V-XVIII 및 XXII-LI에 제시된 STEAP-1 단백질 또는 "변이체"의 하나 이상의 모티프-보유 아서열을 코딩하는 STEAP-1 폴리뉴클레오티드 단편이 포함된다. 또 다른 양태에서는, 본 발명의 전형적인 폴리뉴클레오티드 단편이, 공지된 분자와 상동성을 나타내는 STEAP-1 단백질 또는 변이체의 하나 이상의 영역을 코딩한다. 본 발명의 또 다른 양태에서는, 전형적인 폴리뉴클레오티드 단편이 STEAP-1 단백질 또는 변이체 N-당화 부위, cAMP 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위, 카세인 키나제 II 인산화 부위 또는 N-미리스토일화 부위 및 아미드화 부위 중의 하나 이상을 코딩한다.
그의 모 단백질, 예를 들어 변이체 1, 변이체 2 등에 대한 각각의 표 V-XVIII 및 표 XXII 내지 LI (집합적으로, HLA 펩티드 표)에 제시된 모든 펩티드의 출발 위치는 다음 3가지 요인을 참고하여 결정한다는 것을 인지해야 한다: 특정한 변이체, HLA 펩티드 표에서의 펩티드 길이, 및 표 LII에 열거된 조사 펩티드. 일반적으로, 독특한 조사 펩티드를 사용하여 특별한 변이체에 대한 HLA 펩티드를 수득한다. 그의 각각의 모 분자와 비교한 각 조사 펩티드의 위치가 표 LII에 열거되었다. 따라서, 조사 펩티드가 위치 "X"에서 시작하는 경우, 그의 모 분자 내에서의 HLA 펩티드의 실제 위치를 수득하기 위해서는 표 V-XVIII 및 표 XXII-LI에서의 각 위치에 "X 마이너스 1" 값을 부가해야만 한다. 예를 들어, 특정한 조사 펩티드가 그의 모 분자의 위치 150에서 시작하는 경우, 모 분자 내의 해당 아미노산의 위치를 계산하기 위해서는 각 HLA 펩티드 아미노산 위치에 150-1, 즉 149를 부가해야만 한다.
II.A.) STEAP-1 폴리뉴클레오티드의 용도
II. A.1.) 유전적 이상의 모니터링
앞서 단락의 폴리뉴클레오티드는 수 많은 상이한 구체적 용도를 지닌다. 인간 STEAP-1 유전자가 몇번 염색체에 위치하는지가 "STEAP-1의 염색체성 지도화"란 표제의 실시예에 제시되어 있다. 예를 들어, STEAP-1 유전자가 해당 염색체에 위치하기 때문에, STEAP-1 단백질의 상이한 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 상기 염색체 장소의 세포유전적 이상, 예를 들어 각종 암과 연관된 것으로서 확인되는 이상을 성상 확인한다. 특정의 유전자에서는, 재배열을 포함한 각종 염색체 이상이 수 많은 상이한 암에서 빈번히 세포유전적 이상으로서 확인되었다 [참고: 예를 들어, Krajinovic et al., Mutat. Res. 382 (3-4): (1998); Johansson et al., Blood 86 (10): (1995) and Fingeret al., P.N.A.S. 85 (23): 9158-9162 (1988)]. 따라서, STEAP-1 단백질의 특이적 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 악성 표현형에 기여할 수 있는 STEAP-1을 코딩하는 염색체 영역 내의 세포유전적 이상을, 기존에 가능한 것 보다 더 큰 정확도로 묘사하기 위해 사용할 수 있는 신규한 도구를 제공한다. 이러한 맥락에서, 이들 폴리뉴클레오티드는 포착하기 더 어렵고 덜 통상적인 염색체 이상을 확인하기 위해 염색체 스크리닝의 민감도를 확대시키기 위한 당해 분야의 필요성을 충족시켜 준다 [참고: Evans et al., Am. J. Obstet. Gynecol 171 (4): 1055-1057 (1994)].
더우기, STEAP-1은 전립선 및 기타 암에서 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌기 때문에, STEAP-1 폴리뉴클레오티드는 정상 조직 대 암성 조직에서 STEAP-1 유전자 생성물의 상태를 평가하는 방법에 사용된다. 전형적으로는, STEAP-1 단백질의 특이적 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여, STEAP-1 유전자의 특이적 영역, 예를 들어 하나 이상의 모티프를 함유하는 영역에 섭동 (예를 들어, 항원 상실 등을 가져다 주는 결실, 삽입, 점 돌연변이 또는 변경)이 존재하는지를 평가한다. 예시 검정에는 RT-PCR 검정 뿐만 아니라 단일-가닥 입체 형태 다형성 (SSCP) 분석 둘 다가 포함되는데 [참고: 예를 들어, Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999)], 이들 둘 다는 특정 단백질의 특이적 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 활용하여 단백질 내의 이들 영역을 검사한다.
II.A.2.) 안티센스 양태
본원에 기재된 본 발명의 기타 구체적으로 고려된 핵산 관련 양태는 게놈 DNA, cDNAs, 리보자임, 및 안티센스 분자 뿐만 아니라 (천연 공급원으로부터 유래되든지 아니면 합성되든지 간에) 대체 주쇄에 기초하거나 대체 염기를 포함하는 핵산 분자이고, 이에는 STEAP-1의 단백질 발현 또는 RNA를 억제할 수 있는 분자가 포함된다. 예를 들어, 안티센스 분자는 RNAs 또는 기타 분자, 예를 들면 펩티드 핵산 (PNAs) 또는 비-핵산 분자, 예를 들면 DNA 또는 RNA와 염기 쌍-의존적 방식으로 특이적으로 결합하는 포스포로티오에이트 유도체일 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 STEAP-1 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 이들 부류의 핵산 분자를 용이하게 수득할 수 있다.
안티센스 기술은 세포 내에 위치한 표적 폴리뉴클레오티드와 결합하는 외인성 올리고뉴클레오티드의 투여를 수반한다. 용어 "안티센스"는 이러한 올리고뉴클레오티드가 그의 세포내 표적, 예를 들어 STEAP-1에 상보적이란 사실을 지칭한다. [참고: 예를 들어, Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; and Synthesis 1: 1-5 (1988)]. 본 발명의 STEAP-1 안티센스 올리고뉴클레오티드에는 증강된 암 세포 성장 억제 작용을 나타내는 S-올리고뉴클레오티드 등의 유도체 (포스포로티오에이트 유도체 또는 S-올리고: Jack Cohen, 상기 참고)가 포함된다. S-올리고 (뉴클레오시드 포스포로티오에이트)는 포스페이트기의 비-브릿징 산소 원자를 황 원자로 대체시킨 올리고뉴클레오티드의 등전자수 유사체 (O-올리고)이다. 본 발명의 S-올리고는 상응하는 O-올리고를 황 전이 시약인 3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1-디옥사이드로 처리함으로써 제조할 수 있다 [참고: 예를 들어, lyer, R. P. et al., J. Org. Chem. 55: 4693-4698 (1990); and lyer, R. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1253-1254 (1990)]. 본 발명의 부가의 STEAP-1 안티센스 올리고뉴클레오티드에는 당해 분야에 공지된 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포함된다 [참고: 예를 들어, Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175].
본 발명의 STEAP-1 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, STEAP-1 게놈 서열 또는 상응하는 mRNA의 처음 100개 5' 코돈 또는 마지막 100개 3' 코돈에 상보적이고 이와 안정적으로 혼성화하는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 절대 상보성이 요구되는 것은 아니지만, 고도의 상보성이 바람직하다. 이러한 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이, STEAP-1 mRNA에 대한 선택적 혼성화를 허용하지만, 단백질 키나제의 기타 조절성 소단위체를 명시하는 mRNA에 대해서는 그렇치 못하다. 한 양태에서는, 본 발명의 STEAP-1 안티센스 올리고뉴클레오티드가 STEAP-1 mRNA와 혼성화하는 서열을 갖는 안티센스 DNA 분자의 15 내지 30량체 단편이다. 임의로는, STEAP-1 안티센스 올리고뉴클레오티드가 STEAP-1의 처음 10개 5' 코돈 또는 마지막 10개 3' 코돈 내의 영역과 상보적인 30량체 올리고뉴클레오티드이다. 또 다른 한편으론, 안티센스 분자를 변형시켜 STEAP-1 발현을 억제시키는데 리보자임을 이용한다 [참고: 예를 들어, L. A. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996)].
II.A.3.) 프라이머 및 프라이머 쌍
본 발명의 이들 뉴클레오티드의 추가의 구체적 양태에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 특이적 부분의 특이적 증폭을 허용해 주는 프라이머 및 프라이머 쌍; 및 본 발명의 핵산 분자 또는 그의 일부와 선택적 또는 특이적으로 혼성화하는 프로브가 포함된다. 프로브는 탐지 가능한 마커, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광성 화합물, 생물발광성 화합물, 화학발광성 화합물, 금속 킬레이트제 또는 효소로 표지시킬 수 있다. 이러한 프로브와 프라이머를 사용하여 특정 샘플 중에서 STEAP-1 폴리뉴클레오티드의 존재 여부를 탐지하고, TEAP-1 단백질을 발현하는 세포를 탐지하기 위한 수단으로서 사용한다.
이러한 프로브의 예에는 도 2에 도시된 인간 STEAP-1 cDNA 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. STEAP-1 mRNAs를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍의 예가 또한 본 실시예에 기재되어 있다. 당업자에 의해 잘 인지되는 바와 같이, 본원에 제공된 서열에 기초하여 상당히 많은 상이한 프라이머 및 프로브를 제조할 수 있고, STEAP-1 mRNA를 증폭 및(또는) 탐지하는데 효과적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 STEAP-1 폴리뉴클레오티드는 각종 목적에 유용한데, 이러한 용도에는 STEAP-1 유전자(들), mRNA(s) 또는 그의 단편을 증폭 및(또는) 탐지하기 위한 프로브 및 프라이머로서의 용도; 전립선 암 및 기타 암을 진단 및(또는) 예후하기 위한 시약으로서의 용도; STEAP-1 폴리펩티드의 발현을 지시할 수 있는 코딩 서열로서의 용도; STEAP-1 유전자(들)의 발현 및(또는) STEAP-1 전사체(들)의 해독을 조정하거나 억제하기 위한 도구로서의 용도; 및 치료제로서의 용도가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에는 천연 발생적 공급원, 예를 들어 인간 또는 기타 포유류로부터 STEAP-1 또는 STEAP-1-관련 핵산 서열을 확인 및 분리하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 모든 프로브의 용도 뿐만 아니라 사용된 프로브에서 발견된 서열 전부 또는 대부분을 포함할 수 있는 분리된 핵산 서열 그 자체가 포함된다.
II.A.4.) STEAP-1-코딩 핵산 분자의 분리
본원에 기재된 STEAP-1 cDNA 서열은 STEAP-1 유전자 생성물(들)을 코딩하는 기타 폴리뉴클레오티드를 분리시켜 줄 뿐만 아니라, STEAP-1 유전자 생성물 동족체, 대체 스플라이싱된 이소형, 대립 유전자성 변이체, 및 STEAP-1 유전자 생성물의 돌연변이체 형태를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 STEAP-1-관련 단백질의 유사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 분리시켜 준다. STEAP-1 유전자를 코딩하는 완전한 길이 cDNA를 분리하기 위해 이용될 수 있는 각종 분자 클로닝 방법이 널리 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., Eds., Wiley and Sons, 1995]. 예를 들어, 시판용 클로닝 시스템 [예를 들어, Lambda ZAP Express, Stratagene]을 사용하여, 람다 파아지 클로닝 방법론을 편리하게 이용할 수 있다. STEAP-1 유전자 cDNA를 함유하는 파아지 클론을 표지된 STEAP-1 cDNA 또는 그의 단편으로 프로빙함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서는, STEAP-1 cDNA (예: 도 2) 또는 그의 일부를 합성할 수 있고, 이를 프로브로서 사용하여 STEAP-1 유전자에 상응하는 중복 및 완전한 길이 cDNA를 검색할 수 있다. 게놈 DNA 라이브러리, 세균성 인공 염색체 라이브러리 (BAC), 효모 인공 염색체 라이브러리 (YAC) 등을 STEAP-1 DNA 프로브 또는 프라이머로 스크리닝함으로써, STEAP-1 유전자 자체를 분리할 수 있다.
II.A.5.) 재조합 핵산 분자 및 숙주-벡터 시스템
본 발명은 또한, STEAP-1 폴리뉴클레오티드, 그의 단편, 유사체 또는 상동체를 함유하는 재조합 DNA 또는 RNA 분자, 예를 들어 파아지, 플라스미드, 파아지미드, 코스미드, YAC, BAC, 뿐만 아니라 당해 분야에 널리 공지된 각종 바이러스성 및 비-바이러스성 벡터, 및 이러한 재조합 DNA 또는 RNA 분자로 형질전환 또는 형질감염시킨 세포를 제공한다. 이러한 분자의 생성 방법은 널리 공지되어 있다 [예를 들어, Sambrook et al., 1989, 상기 참고].
본 발명은 추가로, 적합한 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포 내에 STEAP-1 폴리뉴클레오티드, 그의 단편, 유사체 또는 상동체를 함유하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 숙주-벡터 시스템을 제공한다. 적합한 진핵성 숙주 세포의 예에는 효모 세포, 식물 세포, 또는 동물 세포, 예를 들어 포유류 세포 또는 곤충 세포 [예: 바쿨로바이러스-감염성 세포, 예를 들면 Sf9 또는 하이파이브 (HighFive) 세포]가 포함된다. 적합한 포유류 세포의 예에는 각종 전립선 암 세포주, 예를 들어 DU145 및 TsuPr1, 기타 형질감염 가능하거나 형질도입 가능한 전립선 암 세포주, 일차 세포 (PrEC), 뿐만 아니라 재조합 단백질의 발현을 위해 통상적으로 사용되고 있는 수 많은 포유류 세포 (예: COS, CHO, 293, 293T 세포)가 포함된다. 보다 특히, STEAP-1의 코딩 서열 또는 그의 단편, 유사체 또는 상동체를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 당해 분야에 통상적으로 이용되고 있고 광범위하게 공지되어 있는 수 많은 숙주-벡터 시스템을 사용하여 STEAP-1 단백질 또는 그의 단편을 생성시킬 수 있다.
STEAP-1 단백질 또는 그의 단편을 발현시키는데 적합한 광범위한 숙주-벡터 시스템이 이용 가능하다 [예를 들어, Sambrook et al., 1989, 상기 참고; Current Protocols in MolecularBiology, 1995, 상기 참고]. 포유류 발현을 위해 바람직한 벡터에는 pcDNA 3.1 myc-His-태그 (공급처: Invitrogen) 및 레트로바이러스성 벡터 pSRαtkneo [참고: Muller et al., 1991, MCB 11:1785]가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 발현 벡터를 사용하여, STEAP-1을 몇 가지 전립선 암 및 비-전립선 세포주, 예를 들어 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 및 TsuPr1에서 발현시킬 수 있다. 본 발명의 숙주-벡터 시스템은 STEAP-1 단백질 또는 그의 단편을 생성시키는데 유용하다. 이러한 숙주-벡터 시스템을 이용하여 STEAP-1 및 STEAP-1 돌연변이물 또는 유사체의 기능적 특성을 연구할 수 있다.
재조합 인간 STEAP-1 단백질, 또는 그의 유사체 또는 상동체 또는 단편은 STEAP-1-관련 뉴클레오티드를 코딩하는 구조물로 형질감염시킨 포유류 세포에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 293T 세포는 STEAP-1 또는 그의 단편, 유사체 또는 상동체를 코딩하는 발현 플라스미드로 형질감염시킬 수 있고; STEAP-1-관련 단백질은 293T 세포에서 발현되며; 재조합 STEAP-1 단백질은 표준 정제 방법 (예: 항-STEAP-1 항체를 이용한 친화 정제)를 이용하여 분리시킨다. 또 다른 양태에서는, STEAP-1 코딩 서열을 레트로바이러스성 벡터 pSRαMSVtkneo 내로 아클로닝하고, 이를 사용하여 각종 포유류 세포주, 예를 들어 NIH 3T3, TsuPr1, 293 및 rat-1을 감염시켜 STEAP-1 발현성 세포주를 확립시킨다. 당해 분야에 널리 공지된 각종의 기타 발현 시스템을 이용할 수도 있다. 동일 프레임 내에서 STEAP-1 코딩 서열과 연결된 리더 펩티드를 코딩하는 발현 구조물을, 재조합 STEAP-1 단백질의 분비된 형태를 생성시키기 위해 사용할 수 있다.
본원에 논의된 바와 같이, 유전자 암호 과잉은 STEAP-1 유전자 서열 상의 변이를 허용해준다. 특히, 특이적 숙주 종은 종종 특이적 암호 선호도를 지니므로, 기재된 서열을 목적하는 숙주에 대해 바람직한 것으로 적응시킬 수 있다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 바람직한 유사체 코돈 서열은 전형적으로, 보다 높은 빈도의 코돈으로 대체시킨 희귀 코돈 (즉, 목적하는 숙주의 공지된 서열 내에 약 20% 미만의 활용 빈도를 나타내는 코돈)을 갖는다. 특이적 종에 대한 코돈 선호도는, 예를 들어 인터넷 (URL dna.affrc.go.jp/~nakamura/codon.html) 상에서 입수 가능한 코돈 활용 표를 활용함으로써 계산한다.
세포성 숙주에서의 단백질 발현을 증강시키는 부가의 서열 변형이 공지되어 있다. 이에는 가짜의 폴리아데닐화 신호, 엑손/인트론 스플라이스 부위 신호, 트랜스포손-유사 반복 서열, 및(또는) 유전자 발현에 유해한 기타 널리-성상 확인된 서열을 코딩하는 서열을 제거하는 것이 포함된다. 이들 서열의 GC 함량을, 숙주 세포에서 발현된 공지된 유전자를 기준으로 하여 계산된 바와 같이, 소정의 세포성 숙주에 대한 평균 수준이 되도록 조정한다. 가능한 경우, 예측된 헤어핀 이차 mRNA 구조를 피하도록 상기 서열을 변형시킨다. 기타 유용한 변형에는 다음 문헌에 기재된 바와 같이, 오픈 리딩 프레임의 시작부에 해독 개시 컨센서스 서열을 부가하는 것이 포함된다 [참고: Kozak, Mol. Cell Biol., 9: 5073-5080 (1989)]. 당업자는 진핵성 리보솜이 5' 근접 AUG 코돈에서만 해독을 개시한다는 일반적인 규칙이, 드문 조건 하에서만 폐기된다는 것을 이해한다 [참고: 예를 들어, Kozak PNAS 92 (7): 2662-2666, (1995) and Kozak NAR 15 (20): (1987)].
III.) STEAP-1-관련 단백질
본 발명의 또 다른 국면은 STEAP-1-관련 단백질을 제공한다. STEAP-1 단백질의 구체적 양태는 도 2 또는 도 3, 바람직하게는 도 2A에 도시된 바와 같은 인간 STEAP-1의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 한편, STEAP-1 단백질의 양태는 도 2 또는 도 3에 도시된 STEAP-1의 아미노산 서열 상의 변경을 지닌 변이체, 동족체 또는 유사체 폴리펩티드를 포함한다.
STEAP-1 폴리펩티드의 양태에는 도 2에 도시된 서열, 도 2에 도시된 바와 같은 STEAP-1의 뉴클레오티드 서열 (여기서, T는 U이다); 도 2에 도시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드의 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드; 또는 도 2에 도시된 바와 같은 서열 (여기서 T는 U이다)을 갖는 폴리펩티드의 10개 이상의 연속된 펩티드를 갖는 STEAP-1 폴리펩티드가 포함된다. 예를 들어, STEAP-1 펩티드의 양태는 제한 없이 다음을 포함한다:
(I) 도 2A-Q 또는 도 3A-D에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 단백질;
(II) 도 2A-Q 또는 도 3A-D에 도시된 전체 아미노산 서열과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 상동성인 STEAP-1-관련 단백질;
(III) 도 2A-Q 또는 도 3A-D에 도시된 전체 아미노산 서열과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 STEAP-1-관련 단백질;
(IV) 미국 특허원 제10/236,878호 (2002년 9월 6일자로 출원됨) (그의 전문이 본원에 참고로 삽입된다)에 제시된 바와 같은 표 V 내지 LI에 제시된 하나 이상의 펩티드를 포함하는 단백질 (단, 이는 임의로 도 2의 완전한 단백질이 아니다);
(V) 집합적으로 표 V-XVIII에 제시된 하나 이상의 펩티드 (이러한 펩티드는 또한, 집합적으로 표 XXII 내지 LI에 제시된다)를 포함하는 단백질 (단, 이는 임의로 도 2의 완전한 단백질이 아니다);
(VI) 표 V-LI에 제시된 펩티드들 중에서 선택된 2개 이상의 펩티드를 포함하는 단백질 (단, 이는 임의로 도 2의 완전한 단백질이 아니다);
(VII) 집합적으로 표 V 내지 LI에 제시된 펩티드들 중에서 선택된 2개 이상의 펩티드를 포함하는 단백질 (단, 이는 도 2의 아미노산 서열로부터의 연속된 서열이 아니다);
(VIII) 표 V-XVIII에 제시된 펩티드들 중에서 선택된 하나 이상의 펩티드; 및 표 XXII 내지 LI에 제시된 펩티드들 중에서 선택된 하나 이상의 펩티드를 포함하는 단백질 (단, 이는 도 2의 아미노산 서열로부터의 연속된 서열이 아니다);
(IX) 도 5의 친수성 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 각각 339까지 정수 단위로 증가하는, 도 3A의 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(X) 도 6의 수친화도 프로파일에서 0.5 미만 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 각각 339까지 정수 단위로 증가하는, 도 3A의 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(XI) 도 7의 이용 가능한 잔기 비율 (%) 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 각각 339까지 정수 단위로 증가하는, 도 3A의 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(XII) 도 8의 평균 가요성 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 각각 339까지 정수 단위로 증가하는, 도 3A의 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(XIII) 도 9의 베타-회전 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 각각 339까지 정수 단위로 증가하는, 도 3A의 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(XIV) 도 5의 친수성 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 각각 258까지 정수 단위로 증가하는, 도 3B 및 3D의 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(XV) 도 6의 수친화도 프로파일에서 0.5 미만 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 각각 258까지 정수 단위로 증가하는, 도 3B 및 3D의 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(XVI) 도 7의 이용 가능한 잔기 비율 (%) 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 각각 258까지 정수 단위로 증가하는, 도 3B 및 3D의 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(XVII) 도 8의 평균 가요성 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 각각 258까지 정수 단위로 증가하는, 도 3B 및 3D의 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(XVIII) 도 9의 베타-회전 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 각각 258까지 정수 단위로 증가하는, 도 3B 및 3D의 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(XIX) 도 5의 친수성 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 각각 282까지 정수 단위로 증가하는, 도 3C의 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(XX) 도 6의 수친화도 프로파일에서 0.5 미만 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 각각 282까지 정수 단위로 증가하는, 도 3C의 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(XXI) 도 7의 이용 가능한 잔기 비율 (%) 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 각각 282까지 정수 단위로 증가하는, 도 3C의 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(XXII) 도 8의 평균 가요성 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 각각 282까지 정수 단위로 증가하는, 도 3C의 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(XXIII) 도 9의 베타-회전 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 아미노산 위치(들)를 포함하고, 각각 282까지 정수 단위로 증가하는, 도 3C의 단백질의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(XXIV) 집합적으로 표 V-XVIII 및 XXII 내지 LI에 2회 이상 존재하는 펩티드;
(XXV) 집합적으로 표 VI-XVIII 및 XXII 내지 LI에 3회 이상 존재하는 펩티드;
(XXVI) 집합적으로 표 V-XXVIII 및 XXII 내지 LI에 4회 이상 존재하는 펩티드;
(XXVII) 집합적으로 표 V-XVIII 및 XXII 내지 LI에 5회 이상 존재하는 펩티드;
(XXVIII) 표 V-XVIII에 1회 이상 존재하고, 표 XXII 내지 LI에 1회 이상 존재하는 펩티드;
(XXIX) 표 V-XVIII에 1회 이상 존재하고, 표 XXII 내지 LI에 2회 이상 존재하는 펩티드;
(XXX) 표 V-XVIII에 2회 이상 존재하고, 표 XXII 내지 LI에 1회 이상 존재하는 펩티드;
(XXXI) 표 V-XVIII에 2회 이상 존재하고, 표 XXII 내지 LI에 2회 이상 존재하는 펩티드;
(XXXII) 다음 특징들 중의 1가지, 2가지, 3가지, 4가지 또는 5가지를 포함하는 펩티드, 또는 이러한 펩티드를 코딩하는 올리고뉴클레오티드:
i) 도 5의 친수성 프로파일에서 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 이상의 값을 나타내거나 1.0 등가 값을 나타내는 아미노산 위치를 포함하고, 도 3에 제시된 단백질의 완전한 길이까지 정수 단위로 증가하는, 도 3의 특정한 펩티드의 5개 이상 아미노산의 펩티드 영역;
ii) 도 6의 수친화도 프로파일에서 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 이하의 값을 나타내거나 0.0 등가 값을 나타내는 아미노산 위치를 포함하고, 도 3에 제시된 단백질의 완전한 길이까지 정수 단위로 증가하는, 도 3의 특정한 펩티드의 5개 이상 아미노산의 펩티드 영역;
iii) 도 7의 이용 가능한 잔기 비율 (%) 프로파일에서 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 이상의 값을 나타내거나 1.0 등가 값을 나타내는 아미노산 위치를 포함하고, 도 3에 제시된 단백질의 완전한 길이까지 정수 단위로 증가하는, 도 3의 특정한 펩티드의 5개 이상 아미노산의 펩티드 영역;
iv) 도 8의 평균 가요성 프로파일에서 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 이상의 값을 나타내거나 1.0 등가 값을 나타내는 아미노산 위치를 포함하고, 도 3에 제시된 단백질의 완전한 길이까지 정수 단위로 증가하는, 도 3의 특정한 펩티드의 5개 이상 아미노산의 펩티드 영역; 또는
v) 도 9의 베타-회전 프로파일 프로파일에서 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 이상의 값을 나타내거나 1.0 등가 값을 나타내는 아미노산 위치를 포함하고, 도 3에 제시된 단백질의 완전한 길이까지 정수 단위로 증가하는, 도 3의 특정한 펩티드의 5개 이상 아미노산의 펩티드 영역;
(XXXIII) (I)-(XXXII)의 펩티드 또는 항체 또는 그의 결합성 영역을 제약 부형제와 함께 및(또는) 인간 단위 투여형으로 포함하는 조성물;
(XXXIV) STEAP-1을 발현하는 세포를 조정하기 위한 방법에서, (I)-(XXXII)의 펩티드 또는 항체 또는 그의 결합성 영역 또는 (XXXIII)의 조성물을 사용하는 방법;
(XXXV) STEAP-1을 발현하는 세포를 보유하고 있는 개개인을 진단, 예방, 예후 또는 치료하기 위한 방법에서, (I)-(XXXII)의 펩티드 또는 항체 또는 그의 결합성 영역 또는 (XXXIII)의 조성물을 사용하는 방법;
(XXXVI) STEAP-1을 발현하는 세포 (이러한 세포는 표 I에 열거된 조직의 암으로부터의 것이다)를 보유하고 있는 개개인을 진단, 예방, 예후 또는 치료하기 위한 방법에서, (I)-(XXXII)의 펩티드 또는 항체 또는 그의 결합성 영역 또는 (XXXIII)의 조성물을 사용하는 방법;
(XXXVII) 암을 진단, 예방, 예후 또는 치료하기 위한 방법에서, (I)-(XXXII)의 펩티드 또는 항체 또는 그의 결합성 영역 또는 (XXXIII)의 조성물을 사용하는 방법;
(XXXVIII) 표 I에 열거된 조직의 암을 진단, 예방, 예후 또는 치료하기 위한 방법에서, (I)-(XXXII)의 펩티드 또는 항체 또는 그의 결합성 영역 또는 (XXXIII)의 조성물을 사용하는 방법;
(XXXIX) STEAP-1을 발현하는 세포의 조정제를 확인하거나 성상 확인하기 위한 방법에서, (I)-(XXXII)의 펩티드 또는 항체 또는 그의 결합성 영역 또는 (XXXIII)의 조성물을 사용하는 방법.
본원에 사용된 바와 같은 특정 범위는 구체적으로는 그의 모든 완전한 단위 위치를 기재하는 것으로 인식된다.
본원에 기재된 본 발명의 전형적인 양태에는 STEAP-1 mRNA 서열의 특이적 부분 (및 이러한 서열에 상보적인 부분)을 코딩하는 STEAP-1 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 상기 단백질 및(또는) 그의 단편, 예를 들면,
(a) STEAP-1 변이체 1의 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339개 이상 연속된 아미노산을 코딩하는 것이 포함되는데, 기타 변이체에 대한 관련된 최대 길이는 변이체 2의 경우에는, 258개 아미노산이고; 변이체 3의 경우에는, 282개 아미노산이며; 변이체 4의 경우에는, 258개 아미노산이다.
일반적으로, 인간 STEAP-1의 천연 발생적 대립 유전자성 변이체는 고도의 구조적 동일성과 상동성을 공유하고 있다 (예를 들어, 90% 이상 상동률). 전형적으로, STEAP-1 단백질의 대립 유전자성 변이체는 본원에 기재된 STEAP-1 서열 내에 보존적 아미노산 치환물을 함유하거나, 또는 STEAP-1의 상동체 내의 상응하는 위치로부터 아미노산의 치환물을 함유한다. 한 부류의 STEAP-1 대립 유전자성 변이체는 특정한 STEAP-1 아미노산 서열의 적어도 작은 영역과 고도의 상동성을 공유하지만, 이러한 서열로부터의 완전한 이탈, 예를 들어 비-보존적 치환, 절단, 삽입 또는 프레임 이동을 추가로 함유하는 단백질이다. 단백질 서열과 비교하면, 용어 유사성, 동일성 및 상동성은 각각, 유전학 분야에 인지된 바와 같이 별개의 의미를 갖는다. 더우기, 올바른 기술 (orthology) 및 논리오류 (paralogy)는 한 유기체 내의 소정의 단백질 계열 구성원과 기타 유기체 내의 동일한 계열 구성원과의 상관 관계를 기술하는데 있어 중요한 개념일 수 있다.
아미노산 약어가 표 II에 제공된다. 보존적 아미노산 치환물은 종종, 단백질의 입체 형태 또는 기능을 변경시키지 않고서 이러한 단백질 내에서 만들어질 수 있다. 본 발명의 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 보존적 치환물을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 본 발명의 양태에는 당해 분야에서 허용되는 STEAP-1 단백질의 광범위한 변이체 또는 유사체, 예를 들어 아미노산 삽입물, 결실물 및 치환물을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. STEAP-1 변이체는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 부위-지시된 돌연변이 유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이 유발을 이용하여 만들 수 있다. 부위-지시된 돌연변이 유발 [참고: Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)], 카세트 돌연변이 유발 [참고: Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)], 제한 선택 돌연변이 유발 [참고: Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)] 또는 기타 공지된 기술을 클로닝된 DNA 상에서 수행하여 STEAP-1 변이체 DNA를 생성시킬 수 있다.
스캐닝 아미노산 분석을 또한 이용하여, 특이적 생물학적 활성, 예를 들어 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 연속된 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 특히 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산에는 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인이 포함된다. 이러한 군 중에서 알라닌이 전형적으로 바람직한 스캐닝 아미노산인데, 이는 이것이 베타-탄소 이외의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 입체 형태를 변경시키는 경향이 덜하기 때문이다. 알라닌은 이것이 가장 흔한 아미노산이기 때문에 또한 전형적으로 바람직하다. 추가로, 이는 숨겨진 위치와 노출된 위치 둘 다에서 종종 발견된다 [참고: Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N. Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. 알라닌 치환이 적당한 양의 치환체를 산출시키지 못한다면, 등비체적 (isosteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
본원에 정의된 바와 같은 STEAP-1 변이체, 유사체 또는 동족체는 도 3의 아미노산 서열을 갖는 STEAP-1 단백질과 "교차 반응성"인 하나 이상의 에피토프를 갖는다는 점에서 두드러진 특징을 나타낸다. 본 문장에 사용된 바와 같은 "교차 반응성"은 STEAP-1 변이체와 특이적으로 결합하는 항체 또는 T 세포가 또한, 도 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 STEAP-1 단백질과 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 특정 폴리펩티드가 출발 STEAP-1 단백질과 특이적으로 결합하는 항체 또는 T 세포에 의해 인식될 수 있는 에피토프를 더 이상 함유하지 않는 경우, 이는 도 3에 제시된 단백질의 변이체이길 그만두었다. 당업자는 다양한 크기의 에피토프, 및 연속되거나 연속되지 않은 약 4개 또는 5개 아미노산 차수의 특정 집단과 결합하는 단백질을 인식하는 항체가 최소 에피토프 내의 전형적 수의 아미노산으로서 간주된다는 것을 인지한다 [참고: 예를 들어, Nair et al., J. Immunol 2000 165 (12): 6949-6955; Hebbeset al., Mol Immunol (1989) 26(9): 865-73; Schwartz et al., J Immunol (1985) 135(4): 2598-608].
기타 부류의 STEAP-1-관련 단백질 변이체는 도 3의 아미노산 서열 또는 그의 단편과 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 이상 유사성을 공유한다. 또 다른 구체적 부류의 STEAP-1 단백질 변이체 또는 유사체는 본원에 기재되거나 당해 분야에 현재 공지된 하나 이상의 STEAP-1 생물학적 모티프를 포함한다. 따라서, 출발 단편과 비교해서 기능적 (예: 면역원성) 특성을 변경시킨 STEAP-1 단편의 유사체 (핵산 또는 아미노산)가 본 발명에 포괄된다. 현재 또는 당해 분야의 일부가 된 모티프를 도 2 또는 도 3의 핵산 또는 아미노산 서열에 적용해야 한다는 것을 인지해야 한다.
본원에 논의된 바와 같이, 청구된 본 발명의 양태에는 도 2 또는 도 3에 제시된 STEAP-1 단백질의 완전한 아미노산 서열 보다 적은 서열을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 대표적인 양태는 도 2 또는 도 3에 제시된 STEAP-1 단백질의 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 연속된 아미노산을 갖는 펩티드/단백질을 포함한다.
더우기, 본원에 기재된 본 발명의 대표적인 양태에는 전체 STEAP-1 아미노산 서열 전반에 걸쳐, 도 2 또는 도 3에 제시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 10으로 이루어진 폴리펩티드, 도 2 또는 도 3에 제시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 10 내지 약 아미노산 20으로 이루어진 폴리펩티드, 도 2 또는 도 3에 제시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 20 내지 약 아미노산 30으로 이루어진 폴리펩티드, 도 2 또는 도 3에 제시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 30 내지 약 아미노산 40으로 이루어진 폴리펩티드, 도 2 또는 도 3에 제시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 40 내지 약 아미노산 50으로 이루어진 폴리펩티드, 도 2 또는 도 3에 제시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 50 내지 약 아미노산 60으로 이루어진 폴리펩티드, 도 2 또는 도 3에 제시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 60 내지 약 아미노산 70으로 이루어진 폴리펩티드, 도 2 또는 도 3에 제시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 70 내지 약 아미노산 80으로 이루어진 폴리펩티드, 도 2 또는 도 3에 제시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 80 내지 약 아미노산 90으로 이루어진 폴리펩티드, 도 2 또는 도 3에 제시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 90 내지 약 아미노산 100으로 이루어진 폴리펩티드가 포함된다. 더우기, 도 2 또는 도 3에 제시된 STEAP-1 단백질의 약 아미노산 1 (또는 20 또는 30 또는 40 등) 내지 약 아미노산 20 (또는 130 또는 140 또는 150 등)으로 이루어진 폴리펩티드가 본 발명의 양태이다. 상기 단락 내의 출발 및 정지 위치는 지정된 위치 뿐만 아니라 이러한 위치 ±5개 잔기를 지칭한다는 것을 인지해야 한다.
STEAP-1-관련 단백질은 당해 분야에 널리 공지된 표준 펩티드 합성 기술을 사용하거나 화학적 절단 방법을 사용하여 생성시킨다. 또 다른 한편으론, 재조합 방법을 사용하여 STEAP-1-관련 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 생성시킬 수 있다. 한 양태에서는, 핵산 분자가 STEAP-1 단백질의 규정된 단편 (또는 그의 변이체, 상동체 또는 유사체)를 생성시키는 수단을 제공한다.
III.A) 모티프-보유 펩티드 양태
본원에 기재된 본 발명의 부가의 예시 양태에는 도 2 또는 도 3에 제시된 STEAP-1 폴리펩티드 서열 내에 함유된 하나 이상의 생물학적 모티프의 아미노산 잔기를 포함하는 STEAP-1 폴리펩티드가 포함된다. 각종 모티프가 당해 분야에 공지되어 있고, 공개적으로 이용 가능한 수 많은 인터넷 주소 [참고: 예를 들어, URL addresses: pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html; psort.ims.u-tokyo.ac.jp/; cbs.dtu.dk/; ebi.ac.uk/interpro/scan.html; expasy.ch/tools/scnpsit1.html; Epimatrix™ and Epimer™, Brown University, brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; and BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/.]를 이용하여 이들 모티프의 존재를 알아보기 위해 단백질을 평가할 수 있다.
모든 STEAP-1 변이체 단백질의 모티프 보유 아서열이 표 V-XVIII 및 XXII- LI에 제시되고 확인되었다.
표 IV(h)에는 pfam 조사 [참고: URL address pfam.wustl.edu/]를 기준으로 하여 빈번하게 발생하는 몇 가지 모티프가 제시되어 있다. 표 IV(h)의 칼럼에는 다음 사항이 열거되어 있다: (1) 모티프 명칭 약어, (2) 상이한 모티프 계열 구성원들 간에 발견된 동일률, (3) 모티프 명칭 또는 설명 및 (4) 가장 통상적인 기능; 모티프가 위치와 관련된 경우에는 위치 정보가 포함된다.
상기 논의된 하나 이상의 STEAP-1 모티프를 포함하는 폴리펩티드는, 상기 논의된 STEAP-1 모티프가 성장 조절이상과 연관이 있다는 관찰 결과 측면에서, 그리고 STEAP-1이 특정 암에서 과발현되기 때문에 (표 I 참고), 악성 표현형의 고유 특징을 밝히는데 있어 유용하다. 예를 들어, 카세인 키나제 II, cAMP 및 camp-의존성 단백질 키나제, 및 단백질 키나제 C가 악성 표현형 발생과 연관된 것으로 공지된 효소이다 [참고: 예를 들어, Chen et al., Lab Invest., 78(2): 165-174 (1998); Gaiddon et al., Endocrinology 136 (10): (1995); Hall et al., Nucleic Acids Research 24(6): 1119-1126 (1996); Peterzielet al., Oncogene 18 (46): (1999) and O'Brian, Oncol. Rep. 5 (2): (1998)]. 더우기, 당화와 미리스토일화 둘 다가 암 및 암 진행과 또한 연관된 단백질 변형이다 [참고: 예를 들어, Dennis et al., Biochem. Biophys. Acta 1473(1): 21-34 (1999); Raju et al., Exp. Cell Res. 235(1): 145-154 (1997)]. 아미드화는 암 및 암 진행과 또한 연관된 또 다른 단백질 변형이다 [참고: 예를 들어, Treston et al., J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (13): 169-175 (1992)].
또 다른 양태에서, 본 발명의 단백질은 당해 분야에 허용된 방법에 따라서 확인된 하나 이상의 면역반응성 에피토프, 예를 들어 표 V-XVIII 및 XXII-LI에 제시된 펩티드를 포함한다. CTL 에피토프는 지정된 HLA 대립 유전자와 최적으로 결합할 수 있는 STEAP-1 단백질 내의 펩티드를 확인하기 위한 특이적 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다 [참고: 표 IV; Epimatrix™ and Epimer™, Brown University, URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; and BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/]. 더우기, HLA 분자에 대한 충분한 결합 특이성을 지니고 있고 면역원성 에피토프와 상관이 있는 펩티드를 확인하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 과도한 실험없이 수행한다. 또한, 면역원성 에피토프인 펩티드를 확인하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 시험관내 또는 생체 내에서 과도한 실험없이 수행한다.
면역원성 조정하기 위해 이러한 에피토프의 유사체를 창출시키기 위한 원리 역시 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, CTL 또는 HTL 모티프를 보유하고 있는 에피토프를 이용하여 시작한다 [참고: 예를 들어, 표 IV의 HLA 부류 I 및 HLA 부류 II 모티프/슈퍼모티프]. 상기 에피토프는 지정된 위치들 중의 한 위치에서 아미노산을 치환시키고, 이를 해당 위치에 대해 지정된 또 다른 아미노산으로 대체함으로써 유사하게 만든다. 예를 들어, 표 IV에 규정된 잔기를 기준으로 하여, 기타 잔기, 예를 들어 바람직한 잔기를 위하여 유해한 잔기를 치환시키거나; 덜 바람직한 잔기를 바람직한 잔기로 치환시키거나; 또는 본래 존재하는 바람직한 잔기를 또 다른 바람직한 잔기로 치환시킬 수 있다. 치환은 펩티드 내의 일차 고정 위치 또는 기타 위치에서 이루어질 수 있다 (예를 들어, 표 IV 참고).
각종 참고 문헌은 관심있는 단백질 내의 에피토프 뿐만 아니라 그의 유사체의 확인 (동정) 및 생성에 관한 분야를 반영하고 있다 [참고: 예를 들어, WO 97/33602 to Chesnut et al.; Sette, Immunogenetics 1999 50(3-4): 201-212; Sette et al., J. Immunol. 2001 166(2): 1389-1397; Sidney et al., Hum. Immunol. 1997 58(1): 12-20; Kondoet al., Immunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidneyet al., J. Immunol. 1996 157(8): 3480-90; and Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255: 1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152: 163-75 (1994)); Kast et al., 1994 152(8): 3904-12; Borras-Cuesta et al., Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278; Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1633; Alexanderet al., PMID: 7895164, UI: 95202582; O'Sullivan et al., J. Immunol. 1991 147(8): 2663-2669; Alexander et al., Immunity 19941 (9): 751-761 and Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18 (2): 79-92].
본 발명의 관련 양태에는 표 IV(a), IV(b), IV(c), IV(d), 및 IV(h)에 제시된 상이한 모티프의 조합물, 및(또는) 표 V-XVIII 및 XXII-LI의 하나 이상의 예측 CTL 에피토프, 및(또는) 표 XLVIII-LI의 하나 이상의 예측 HTL 에피토프, 및(또는) 당해 분야에 공지된 하나 이상의 T 세포 결합 모티프를 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. 바람직한 양태는 상기 모티프 내에 또는 폴리펩티드의 개재 서열 내에 삽입물, 결실물 또는 치환물을 전혀 함유하지 않는다. 또한, (예를 들어, 모티프가 위치하는 폴리펩티드 구조의 보다 큰 부분을 포함시키기 위해서는) 이들 모티프의 어느 한 측면 상에 일정 수의 N-말단 및(또는) C-말단 아미노산 잔기를 포함하는 양태가 요망될 수 있다. 전형적으로는, 특정 모티프의 어느 한 측면 상의 N-말단 및(또는) C-말단 아미노산 잔기 수는 약 1 내지 약 100개 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 5 내지 약 50개 아미노산 잔기이다.
STEAP-1-관련 단백질은 많은 형태, 바람직하게는 분리된 형태로 구체화된다. 정제된 STEAP-1 단백질 분자에는 항체, T 세포 또는 기타 리간드에 대한 STEAP-1의 결합을 손상시키는 기타 단백질 또는 분자가 실질적으로 없을 것이다. 분리 및 정제 정도 및 본질은 의도한 용도에 좌우될 것이다. STEAP-1-관련 단백질의 양태에는 정제된 STEAP-1-관련 단백질 및 기능적, 가용성 STEAP-1-관련 단백질이 포함된다. 한 양태에서는, 기능적, 가용성 STEAP-1 단백질 또는 그의 단편이 항체, T 세포 또는 기타 리간드에 의해 결합될 수 있는 능력을 보유하고 있다.
본 발명은 또한, 도 2 또는 도 3에 제시된 STEAP-1 아미노산 서열의 생물학적 활성 단편을 포함하는 STEAP-1 단백질을 제공한다. 이러한 단백질은 출발 STEAP-1 단백질의 특성, 예를 들어 출발 STEAP-1 단백질과 연합된 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체의 생성을 유도시킬 수 있는 능력; 이러한 항체에 의해 결합될 수 있는 능력; HTL 또는 CTL의 활성화를 유도시킬 수 있는 능력; 및(또는) 출발 단백질과도 특이적으로 결합하는 HTL 또는 CTL에 의해 인식될 수 있는 능력을 나타낸다.
특히 흥미로운 구조를 함유하는 STEAP-1-관련 폴리펩티드는 당해 분야에 널리 공지된 각종 분석 기술, 예를 들어 초우-파스만 (Chou-Fasman), 가르니어-롭슨 (Garnier-Robson), 키트-돌리틀 (Kyte-Doolittle), 아이젠버그 (Eisenberg), 카르플러스-슐츠 (Karplus-Schultz) 또는 제임슨-볼프 (Jameson-Wolf) 분석 방법을 사용하거나 또는 면역원성에 기초하여 예측 및(또는) 확인할 수 있다. 이러한 구조를 함유하는 단편은 소단위체-특이적 항-STEAP-1 항체 또는 T 세포를 생성시키는데 있어 특히 유용하거나 또는 STEAP-1과 결합하는 세포성 인자를 확인하는데 있어 특히 유용하다. 예를 들어, 친수성 프로파일은 문헌 [참고: Hopp, T. P. and Woods, K. R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 78: 3824-3828]의 방법을 사용하여 생성시킬 수 있고, 면역원성 펩티드 단편을 확인할 수 있다. 수친화도 프로파일은 문헌 [참고: Kyte, J. and Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132]의 방법을 사용하여 생성시킬 수 있고, 면역원성 펩티드 단편을 확인할 수 있다. 이용 가능한 잔기 비율 (%) 프로파일은 문헌 [참고: Janin J., 1979, Nature 277: 491-492]의 방법을 사용하여 생성시킬 수 있고, 면역원성 펩티드 단편을 확인할 수 있다. 평균 가요성 프로파일은 문헌 [참고: Bhaskaran R., Ponnuswamy P. K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255]의 방법을 사용하여 생성시킬 수 있고, 면역원성 펩티드 단편을 확인할 수 있다. 베타-회전 프로파일은 문헌 [참고: Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1: 289-294]의 방법을 사용하여 생성시킬 수 있고, 면역원성 펩티드 단편을 확인할 수 있다.
CTL 에피토프는 지정된 HLA 대립 유전자와 최적으로 결합할 수 있는 STEAP-1 단백질 내의 펩티드를 확인하기 위한 특이적 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다 [예를 들어, SYFPEITHI site at World Wide Web URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; 표 IV(A)-(E); Epimatrix™ and Epimer™, Brown University, URL (brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); and BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/를 사용함]. 이를 예시하면, 인간 MHC 부류 I 분자, 예를 들어 HLA-A1, A2, A3, A11, A24, B7 및 B35와 관련하여 제시되는 STEAP-1로부터의 펩티드 에피토프를 예측한다 [참고: 예를 들어, 표 V-XVIII, XXII-LI]. 구체적으로 언급하면, STEAP-1 단백질의 완전한 아미노산 서열 및 기타 변이체의 관련 부분, 즉 HLA 부류 I 예측물의 경우에는 점 돌연변이 또는 엑손 연접부의 어느 한 측면 상의 9개 플랭킹 잔기, 및 HLA 부류 II 예측물의 경우에는 해당 변이체에 상응하는 엑손 연접부 또는 점 돌연변이의 어느 한 측면 상의 14개 플랭킹 잔기를, 사이트 SYFPEITHI (URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/) 이외에, 상기 열거된 웹 사이트 [Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS) 웹 사이트]에서 발견된 HLA 펩티드 모티프 조사 알고리즘 내로 유입하였다.
이러한 HLA 펩티드 모티프 조사 알고리즘은 HLA 부류 I 분자, 특히 HLA-A2 홈 내의 특이적 펩티드 서열의 결합을 기초로 하여 켄 파커 박사 (Dr. Ken Parker)에 의해 개발되었다 [참고: 예를 들어, Falk et al. , Nature 351: 290-6 (1991); Hunted, Science 255: 1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152: 163-75 (1994)]. 이 알고리즘은 완전한 단백질 서열로부터의 8량체, 9량체 및 10량체 펩티드의 위치 및 순위가, HLA-A2 뿐만 아니라 수 많은 기타 HLA 부류 I 분자에 대한 결합을 예측할 수 있게 해준다. 많은 HLA 부류 I 결합성 펩티드는 8량체, 9량체, 10량체 또는 11량체이다. 예를 들어, 부류 I HLA-A2의 경우예, 에피토프가 바람직하게, 위치 2에 루이신 (L) 또는 메티오닌 (M)을 함유하고, C-말단에 발린 (V) 또는 루이신 (L)을 함유한다 [참고: 예를 들어, Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992)]. STEAP-1 예측 결합성 펩티드의 선별된 결과가 본원의 표 V-XVIII 및 XXII-LI에 나타나 있다. 표 V-XVIII 및 XXII-XLVIII에서는, 각 계열 구성원에 대해 선별된 후보, 9량체 및 10량체가 그들의 위치, 각 특이적 펩티드의 아미노산 서열, 및 평가된 결합 스코어와 함께 제시된다. 표 XLVIII-LI에서는, 각 계열 구성원에 대해 선별된 후보, 15량체가 그들의 위치, 각 특이적 펩티드의 아미노산 서열, 및 평가된 결합 스코어와 함께 제시된다. 결합 스코어는 pH 6.5에서 37℃ 하에 해당 펩티드를 함유하는 복합체 해리의 절반으로 평가된 값에 상응한다. 가장 높은 결합 스코어를 나타내는 펩티드는 가장 긴 시간 동안 세포 표면 상에서 HLA 부류 I과 가장 단단하게 결합되는 것으로 예측되므로, T-세포 인식을 위한 가장 우수한 면역원성 표적을 나타낸다.
HLA 대립 유전자에 대한 펩티드의 실제적 결합은 항원-프로세싱 결함성 세포주 T2 상에서 HLA 발현을 안정화시킴으로써 평가할 수 있다 [참고: 예를 들어, Xue et al., Prostate 30: 73-8 (1997) and Peshwa et al., Prostate 36: 129-38 (1998)]. 특이적 펩티드의 면역원성은 CD8+ 세포독성 T 림프구 (CTL)를 항원 제시 세포, 예를 들어 수지상 세포의 존재 하에 자극함으로써 시험관 내에서 평가할 수 있다.
BIMAS 사이트, Epimer™ 및 Epimatrix™ 사이트에 의해 예측되거나, 또는 당해 분야에서 입수 가능하거나 당해 분야의 일부가 된, 예를 들어 표 IV에 제시된 (또는 World Wide Web 사이트 URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/, 또는 BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/를 사용하여 결정된) HLA 부류 I 또는 부류 II 모티프에 의해 지정된 모든 에피토프를 본 발명에 따라서 STEAP-1 단백질에 "적용"해야 한다는 것을 인지해야 한다. 이러한 맥락에서 사용된 바와 같은 "적용"은 관련 분야의 전문가에 의해 인지되는 바와 같이, STEAP-1 단백질을 가시적으로 평가하거나 또는 컴퓨터에 의거한 패턴 발견 방법에 의해 평가한다는 것을 의미한다. HLA 부류 I 모티프를 보유하고 있는 8, 9, 10, 또는 11개 아미노산 잔기의 STEAP-1 단백질의 모든 아서열, 또는 HLA 부류 II 모티프를 보유하고 있는 9개 이상 아미노산 잔기의 아서열이 본 발명의 범위 내에 속한다.
III.B.) STEAP-1-관련 단백질의 발현
다음 실시예에 기재된 양태에서는, STEAP-1을, 시판용 발현 벡터, 예를 들어 C-말단 6XHis 및 MYC 태그를 수반한 STEAP-1을 코딩하는 CMV-구동된 발현 벡터 (pcDNA3.1/mycHIS; 공급처: Invitrogenor Tags, GenHunter Corporation, Nashville TN)로 형질감염시킨 세포 (예: 293T 세포)에서 편리하게 발현시킬 수 있다. Tag5 벡터는 형질감염된 세포에서 분비된 STEAP-1 단백질의 생성을 촉진시키기 위해 사용될 수 있는 IgGK 분비 신호를 제공한다. 이와 같이 배양 배지에서 분비된 HIS-태그화 STEAP-1은, 예를 들어 표준 기술을 사용하여 니켈 칼럼을 이용하여 정제할 수 있다.
III.C.) STEAP-1-관련 단백질의 변형
STEAP-1-관련 단백질의 변형, 예를 들어 공유적 변형이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 한 가지 유형의 공유적 변형에는 STEAP-1 폴리펩티드의 표적화 아미노산 잔기를, STEAP-1 단백질의 선별된 측쇄 또는 N 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것이 포함된다. 본 발명의 범위 내에 포함된 STEAP-1 폴리펩티드의 또 다른 유형의 공유적 변형은 본 발명의 단백질의 본래의 당화 패턴을 변경시키는 것을 포함한다. STEAP-1의 또 다른 유형의 공유적 변형은 STEAP-1 폴리펩티드를 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 제시된 방식으로, 각종 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 연결시키는 것을 포함한다.
본 발명의 STEAP-1-관련 단백질은 또한, 서로 융합되거나 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 융합된 STEAP-1을 포함하는 키메라 분자를 형성하도록 변형시킬 수 있다. 이러한 키메라 분자는 화학적 또는 재조합적으로 합성할 수 있다. 키메라 분자는 또 다른 종양 관련 항원과 융합된 본 발명의 단백질 또는 그의 단편을 가질 수 있다. 또 다른 한편, 본 발명에 따르는 단백질은 STEAP-1 서열 (아미노산 또는 핵산) 단편의 융합물을 포함할 수 있으므로, 그의 길이 처음부터 끝까지가 도 2 또는 도 3에 제시된 아미노산 또는 핵산 서열과 직접적으로 상동성이지 않은 분자가 창출된다. 이러한 키메라 분자는 STEAP-1의 동일한 아서열의 다중체를 포함할 수 있다. 키메라 분자는 STEAP-1-관련 단백질과, 폴리히스티딘 에피토프 태그 (이는 고정화 니켈이 선택적으로 결합될 수 있는 에피토프를 제공한다), 사이토킨 또는 성장 인자와의 융합물을 포함할 수 있다. 상기 에피토프 태그는 일반적으로, STEAP-1 단백질의 아미노- 또는 카복실 말단에 위치시킨다. 대체 양태에서는, 키메라 분자가 STEAP-1-관련 단백질과 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정한 영역과의 융합물을 포함할 수 있다. 2가 형태의 키메라 분자 ("면역부착인자"로서 지칭되기도 함)의 경우에는, 이러한 융합물이 IgG 분자의 Fc 영역과 이루어질 수 있다. Ig 융합물은 바람직하게, Ig 분자 내의 하나 이상의 가변 영역 대신 가용성 (막관통 도메인이 결실되거나 활성화됨) 형태의 STEAP-1 폴리펩티드의 치환물을 포함한다. 바람직한 양태에서는, 면역글로불린 융합물에 IgG1 분자의 힌지 (hinge), CH2 및 CH3, 또는 힌지, CHI, CH2 및 CH3 영역이 포함된다. 면역글로불린 융합물의 생성에 관해서는, 미국 특허 제5,428,130호 (1995년 6월 27일자로 허여됨)를 참고할 수 있다.
III.D.) STEAP-1-관련 단백질의 용도
본 발명의 단백질은 수 많은 상이한 구체적 용도를 지닌다. STEAP-1은 전립선 및 기타 암에서 고도로 발현되기 때문에, STEAP-1-관련 단백질은 정상 조직 대 암성 조직에서의 STEAP-1 유전자 생성물의 상태를 평가함으로써, 악성 표현형을 밝혀 내는 방법에 사용된다. 전형적으로, STEAP-1 단백질의 특이적 영역으로부터의 폴리펩티드를 사용하여, 이들 영역 (예를 들어, 하나 이상의 모티프를 함유하는 영역)에서 섭동 (예를 들어, 결실, 삽입, 점 돌연변이 등)의 존재 여부를 평가한다. 예시 검정은 STEAP-1 폴리펩티드 서열 내에 함유된 하나 이상의 생물학적 모티프의 아미노산 잔기를 포함하는 STEAP-1-관련 단백질을 표적화하는 항체 또는 T 세포를 활용하여, 정상 조직 대 암성 조직에서 상기 영역의 특징을 평가하거나 또는 해당 에피토프에 대한 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 또 다른 한편으론, STEAP-1 단백질 내에 하나 이상의 생물학적 모티프의 아미노산 잔기를 함유하는 STEAP-1-관련 단백질을 사용하여, STEAP-1의 상기 영역과 상호작용하는 인자에 대해 스크리닝한다.
STEAP-1 단백질 단편/아서열은 도메인-특이적 항체 (예: STEAP-1 단백질의 세포외 또는 세포내 에피토프를 인식하는 항체)를 생성 및 성상 확인하는데 있어; STEAP-1 또는 그의 특정한 구조적 도메인과 결합하는 작용제 또는 세포성 인자를 확인하기 위해; 및 각종 치료적 및 진단적 맥락에서, 예를 들면 진단 검정, 암 백신 및 이러한 백신의 제조 방법에 특히 유용하다.
STEAP-1 유전자, 또는 그의 유사체, 상동체 또는 단편에 의해 코딩된 단백질은 각종 용도를 지니는데, 이에는 항체를 생성시키는데 있어서의 용도, 및 STEAP-1 유전자 생성물과 결합하는 리간드 및 기타 작용제 및 세포성 구성분을 확인하기 위한 방법에 있어서의 용도가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. STEAP-1 단백질 또는 그의 단편에 대항하여 생성된 항체는 진단 및 예후 검정에 유용하고, 표 I에 열거된 바와 같은, STEAP-1 단백질의 발현을 특징으로 하는 인간 암의 관리에 있어서의 영상화 (조영) 방법론에 유용하다. 이러한 항체는 세포내적으로 발현될 수 있고, 상기 암 환자를 치료하는 방법에 사용할 수 있다. STEAP-1-관련 핵산 또는 단백질은 또한, HTL 또는 CTL 반응을 생성시키는데 사용한다.
STEAP-1 단백질을 탐지하는데 유용한 각종 면역학적 검정이 사용되는데, 이에는 각종 유형의 방사성 면역검정, 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 효소 결합 면역형광 검정 (ELIFA), 면역세포화학 방법 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 항체를 표지시킬 수 있고, 이를 (예를 들어, 방사성 섬광조영술 영상화 방법에서) STEAP-1-발현성 세포를 탐지할 수 있는 면역학적 영상화 시약으로서 사용할 수 있다. STEAP-1 단백질은 또한, 다음에 추가로 기재되는 바와 같이 암 백신을 생성시키는데 특히 유용하다.
IV.) STEAP-1 항체
본 발명의 또 다른 국면은 STEAP-1-관련 단백질과 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 항체는 STEAP-1-관련 단백질과 특이적으로 결합하고, 생리적 조건 하에 STEAP-1-관련 단백질이 아닌 펩티드 또는 단백질과는 결합하지 않는다 (또는 약하게 결합한다). 이와 관련하여, 생리적 조건의 예에는 1) 인산염 완충 식염수; 2) 25 mM 트리스 및 150 mM NaCl을 함유하는 트리스-완충 식염수; 또는 정상 식염수 (0.9% NaCl); 4) 동물 혈청, 예를 들어 인간 혈청; 또는 5) 1) 내지 4)의 모든 조합이 포함되고; 이들 반응은 바람직하게 pH 7.5, 또 다른 한편으론 pH 7.0 내지 8.0의 범위, 또는 또 다른 한편으론 pH 6.5 내지 8.5의 범위에서 이루어지고; 또한 이들 반응은 4 내지 37℃에서 수행된다. 예를 들어, STEAP-1과 결합하는 항체는 STEAP-1-관련 단백질, 예를 들어 그의 동족체 또는 유사체와 결합할 수 있다.
본 발명의 STEAP-1 항체는 암 (예를 들어, 표 I 참고) 진단 및 예후 검정, 및 영상화 방법론에 특히 유용하다. 유사하게, 이러한 항체는 전립선 및 기타 암의 치료, 진단 및(또는) 예후에 있어, STEAP-1이 이들 기타 암에서 발현 또는 과발현되는 정도로 유용하다. 더우기, 세포내적으로 발현된 항체 (예: 단일쇄 항체)는 STEAP-1의 발현과 관계가 있는 암, 예를 들어 진행성 또는 전이성 전립선 암 또는 기타 진행성 또는 전이성 암을 치료하는데 있어 치료적으로 유용하다.
본 발명은 또한, STEAP-1 및 돌연변이체 STEAP-1-관련 단백질의 탐지 및 정량화에 유용한 각종 면역학적 검정을 제공한다. 이러한 검정은 필요에 따라, STEAP-1-관련 단백질을 인식하고 이와 결합할 수 있는 하나 이상의 STEAP-1 항체를 포함할 수 있다. 이들 검정은 당해 분야에 널리 공지된 각종 면역학적 검정 포맷 내에서 수행하는데, 이에는 각종 유형의 방사성 면역검정, 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 효소 결합 면역형광 검정 (ELIFA) 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 면역학적 비-항체 검정은 또한, T 세포 면역원성 검정 (억제성 또는 자극성) 뿐만 아니라 조직적합성 복합체 (MHC) 결합 검정을 포함한다.
STEAP-1을 발현하는 전립선 암 및 기타 암을 탐지할 수 있는 면역학적 영상화 방법이 또한 본 발명에 의해 제공되는데, 이에는 표지된 STEAP-1 항체를 이용하는 방사성 섬광조영술 영상화 방법이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 검정은 STEAP-1 발현성 암, 예를 들어 전립선 암을 탐지, 모니터링 및 예후하는데 있어 임상적으로 유용하다.
STEAP-1 항체는 또한, STEAP-1-관련 단백질을 정제하는 방법, 및 STEAP-1 상동체 및 관련 분자를 분리하는 방법에 사용한다. 예를 들어, STEAP-1-관련 단백질을 정제하는 방법은 고형 매트릭스와 커플링시킨 STEAP-1 항체를, STEAP-1 항체가 STEAP-1-관련 단백질과 결합할 수 있도록 해주는 조건 하에 STEAP-1-관련 단백질을 함유하는 용해물 또는 기타 용액과 함께 항온 배양하고; 이러한 고형 매트릭스를 세척하여 불순물을 제거한 다음; 상기 커플링된 항체로부터 STEAP-1-관련 단백질을 용출시키는 것을 포함한다. 본 발명에 따르는 STEAP-1 항체의 기타 용도에는 STEAP-1 단백질을 모방하는 항-개체특이형 (anti-idiotypic) 항체를 생성시키는 것이 포함된다.
항체를 제조하기 위한 각종 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 항체는 적합한 포유류 숙주 세포를 분리된 또는 면역접합된 형태의 STEAP-1-관련 단백질, 펩티드 또는 단편으로 면역시킴으로써 제조할 수 있다 [참고: Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, and Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)]. 또한, STEAP-1의 융합 단백질, 예를 들어 STEAP-1 GST-융합 단백질을 사용할 수도 있다. 특정한 양태에서는, 도 2 또는 도 3의 아미노산 서열 전부 또는 대부분을 포함하는 GST 융합 단백질을 생성시킨 다음, 이를 적당한 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서 사용한다. 또 다른 양태에서는, STEAP-1-관련 단백질을 합성하고, 이를 면역원으로서 사용한다.
또한, 당해 분야에 공지된 노출된 (naked: 있는 그대로의) DNA 면역 기술을 사용하여 (정제된 STEAP-1-관련 단백질 또는 STEAP-1 발현성 세포를 수반하거나 수반하지 않음) 코딩된 면역원에 대한 면역 반응을 생성시킨다 [참고: Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648].
도 2 또는 도 3에 도시된 바와 같은 STEAP-1 단백질의 아미노산 서열을 분석하여, 항체를 생성하기 위한 STEAP-1 단백질의 특이적 영역을 선별할 수 있다. 예를 들어, STEAP-1 아미노산 서열의 소수성 및 친수성 분석을 이용하여, STEAP-1 구조 내의 친수성 영역을 확인한다. 면역원성 구조를 나타내는 STEAP-1 단백질 영역 뿐만 아니라 기타 영역 및 도메인은 당해 분야에 공지된 기타 각종 방법, 예를 들어 초우-파스만, 가르니어-롭슨, 키트-돌리틀, 아이젠버그, 카르플러스-슐츠 또는 제임슨-볼프 분석 방법을 사용하여 용이하게 확인할 수 있다. 친수성 프로파일은 문헌 [참고: Hopp, T.P. and Woods, K. R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 78: 3824-3828]의 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 수친화도 프로파일은 문헌 [참고: Kyte, J. and Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132]의 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 이용 가능한 잔기 비율 (%) 프로파일은 문헌 [참고: Janin J., 1979, Nature 277:491-492]의 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 평균 가요성 프로파일은 문헌 [참고: Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255]의 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 베타-회전 프로파일은 문헌 [참고: Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1: 289-294]의 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 따라서, 이들 프로그램이나 방법에 의해 확인된 각 영역은 본 발명의 범위 내에 속한다. STEAP-1 항체를 생성시키기 위한 바람직한 방법이 본원에 제공된 실시예를 통하여 추가로 예시된다. 면역원으로서 사용하기 위한 단백질 또는 폴리펩티드의 제조 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 특정 단백질과 캐리어, 예를 들어 BSA, KLH 또는 기타 캐리어 단백질과의 면역원성 접합체를 제조하는 방법 또한 널리 공지되어 있다. 몇몇 상황 하에서는, 예를 들어 카보디이미드 시약을 이용한 직접적인 접합을 사용하고; 기타 경우에는 연결성 시약 [예를 들어, Pierce Chemical Co., Rockford, IL에 의해 공급된 시약]이 유효하다. STEAP-1 면역원을 투여하는 것은 종종, 당해 분야에 인지되는 바와 같이 적합한 아주반트를 사용하여 적합한 기간에 걸쳐 주사함으로써 수행한다. 면역 스케쥴 동안, 항체 역가를 취하여 항체 형성의 타당성을 결정할 수 있다.
당해 분야에 널리 공지된 각종 수단에 의해 STEAP-1 모노클로날 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 목적하는 모노클로날 항체를 분비하는 불멸화 세포주는, 일반적으로 공지된 바와 같이 항체-생산성 B 세포를 불멸화시키는 코흘러 (Kohler) 및 밀슈타인 (Milstein)의 표준 하이브리도마 기술 또는 변형법을 사용하여 제조한다. 목적하는 항체를 분비하는 불멸화 세포주를 대상으로 하여, 항원이 STEAP-1-관련 단백질인 면역검정에 의해 스크리닝한다. 적당한 불멸화 세포 배양물이 확인되면, 세포를 확장시킬 수 있고 항체를 시험관내 배양물 또는 복수로부터 생성시킬 수 있다.
본 발명의 항체 또는 단편을 재조합 수단에 의해 생성시킬 수도 있다. STEAP-1 단백질의 목적하는 영역과 특이적으로 결합하는 영역은, 다중 종 기원의 키메라 또는 상보성-결정 영역 (CDR) 그래프트화 항체와 관련하여 생성시킬 수도 있다. 인간화 또는 인간 STEAP-1 항체를 생성시킬 수도 있는데, 이는 치료적 맥락에서 사용하기에 바람직하다. 상응하는 인간 항체 서열을 비-인간 항체 CDRs 중의 하나 이상으로 치환시킴으로써, 뮤린 및 기타 비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 널리 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmannet al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyenet al., 1988, Science 239: 1534-1536; Carteret al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 and Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296].
완전한 인간 모노클로날 항체를 생성시키는 방법에는 파아지 디스플레이 및 트랜스제닉 방법이 포함된다 [참고: Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539]. 완전한 인간 STEAP-1 모노클로날 항체는 큰 인간 Ig 유전자 조합 라이브러리 (즉, 파아지 디스플레이)를 이용하는 클로닝 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다 [참고:Griffiths and Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. In: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, pp 45-64 (1993); Burton and Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Id., pp 65-82]. 완전한 인간 STEAP-1 모노클로날 항체는 또한, 다음 문헌에 기재된 바와 같이 인간 면역글로불린 유전자 자리를 함유하도록 공학적으로 처리시킨 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다 [참고: PCT Patent Application W0 98/24893, Kucherlapati and Jakobovits et al., published December 3,1997; Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614; 미국 특허 제6,162,963호 (2000년 12월 19일자로 허여됨; 제6,150,584호 (2000년 11월 12일자로 허여됨); 제6,114,598호 (2000년 9월 5일자로 허여됨)]. 상기 방법은 파아지 디스플레이 기술을 이용하는 경우에 요구되는 시험관내 조작을 피하게 해주고, 고 친화성의 본래 인간 항체를 효율적으로 생성시킨다.
STEAP-1 항체와 STEAP-1-관련 단백질의 반응성은 수 많은 널리 공지된 수단, 예를 들어 필요에 따라, STEAP-1-관련 단백질, STEAP-1-발현성 세포 또는 그의 추출물을 사용하는 웨스턴 블롯, 면역침전, ELISA, 및 FACS 분석법에 의해 확립할 수 있다. STEAP-1 항체 또는 그의 단편을 탐지 가능한 마커로 표지시키거나 또는 제2 분자에 접합시킬 수 있다. 적합한 탐지 가능한 마커에는 방사성 동위원소, 형광성 화합물, 생물발광성 화합물, 화학발광성 화합물, 금속 킬레이트제 또는 효소가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 추가로, 2개 이상의 STEAP-1 에피토프에 대해 특이적인 이중-특이적 항체는 당해 분야에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 생성시킨다. 동종-이량체성 항체는 또한, 당해 분야에 공지된 가교결합 기술에 의해 생성시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565].
한 양태에서, 본 발명은 2004년 2월 6일자로 기탁기관 [American Type Culture Collection, located at 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209]에 기탁되어 ATCC 승인 번호 PTA-5802 및 PTA-5803로 각각 지정된, 마우스 하이브리도마 X92.1.30.1.1(1) 및 마우스 하이브리도마 X120.545.1.1로서 확인된 모노클로날 항체를 제공한다.
V.) STEAP-1 세포성 면역 반응
T 세포가 항원을 인식하는 기전이 서술되었다. 본 발명의 효능있는 펩티드 에피토프 백신 조성물은 전세계적으로 극히 광범위한 집단에서 치료적 또는 예방적 면역 반응을 유도시킨다. 세포성 면역 반응을 유도시키는 본 발명의 가치 및 효능을 이해하기 위해, 면역학 관련 기술에 관한 간단한 고찰이 제공된다.
HLA 분자와 펩티드 항원의 복합체는 HLA-제한된 T 세포에 의해 인식된 리간드로서 작용한다 [참고: Buus, S.et al., Cell 47: 1071, 1986; Babbitt, B. P. et al., Nature 317: 359, 1985; Townsend, A. and Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7:601, 1989; Germain, R. N., Annu. Rev. Immunol. 11: 403, 1993]. 단일 아미노산 치환된 항원 유사체에 관한 연구 및 내적으로 결합되고 천연적으로 프로세싱된 펩티드의 서열 분석을 통하여, HLA 항원 분자에 대한 특이적 결합에 요구된 모티프에 상응하는 결정적 잔기를 확인하였고, 이것이 표 IV에 제시되어 있다 [참고: 예를 들어, Southwood,et al., J. lmmunol. 160: 3363, 1998; Rammensee,et al., Immunogenetics 41:178, 1995; Rammensee et al., SYFPEITHI, access via World Wide Web at URL (134.2.96.221/scripts.hiaserver.dii/home.htm); Sette, A. and Sidney, J. Curr. Opin. lmmunol 10: 478, 1998; Engelhard, V. H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994; Sette, A. and Grey, H. M., Curr. Opin. Immunol. 4: 79, 1992; Sinigaglia, F. and Hammer, J. Curr. Biol. 6:52, 1994; Ruppert et al., Cell 74: 929-937, 1993; Kondo et al, J. Immunol 155: 4307-4312, 1995; Sidney et al., J. Immunol. 157: 3480-3490, 1996; Sidney et al., Human Immunol. 45: 79-93, 1996; Sette, A. and Sidney, J. Immunogenetics 1999 Nov; 50 (3-4):201-12, Review].
더우기, HLA-펩티드 복합체를 X선 결정학 연구한 결과, 펩티드 리간드에 의해 생성된 잔기를 대립 유전자-특이적 양식으로 수용하는 HLA 분자의 펩티드 결합성 갈라진 틈/홈 내에 포켓이 있는 것으로 밝혀졌는데, 이들 잔기는 결국, 이들이 존재하는 펩티드의 HLA 결합 능력을 결정해준다 [참고: 예를 들어, Madden, D.R. Annu. Rev. Immunol. 13:587, 1995; Smith, et al., Immunity 4:203, 1996; Fremont et al., Immunity 8:305, 1998; Stern et al., Structure 2:245, 1994; Jones, E.Y. Curr. Opin. Immunol. 9:75, 1997; Brown, J. H. et al., Nature 364:33, 1993; Guo, H. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8053, 1993; Guo, H. C. et al., Nature 360:364, 1992; Silver, M. L. et al., Nature 360:367, 1992; Matsumura, M. et al., Science 257:927, 1992; Madden et al., Cell 70:1035, 1992; Fremont, D. H. et al., Science 257: 919, 1992; Saper, M. A., Bjorkman, P. J. and Wiley, D. C., J. Mol. Biol. 219: 277, 1991].
따라서, 부류 I 및 부류 II 대립 유전자-특이적 HLA 결합 모티프, 또는 부류 I 또는 부류 II 슈퍼모티프를 규정함으로써, 특정한 HLA 항원(들)에 대한 결합과 상관이 있는 단백질 내의 영역을 확인할 수 있다.
따라서, HLA 모티프 확인 공정에 의해, 에피토프에 의거한 백신에 대한 후보를 확인하였는데; 이러한 후보를 HLA-펩티드 결합 검정에 의해 추가로 평가하여 에피토프와 그의 상응하는 HLA 분자의 연합 시간 및(또는) 결합 친화성을 결정할 수 있다. 부가의 확인 작업을 수행하여 이들 백신 후보 중에서, 집단 적용 범위 및(또는) 면역원성 측면에서 바람직한 특징을 지닌 에피토프를 선별할 수 있다.
각종 전략을 활용하여 세포성 면역원성을 평가할 수 있는데, 이에는 다음이 포함된다:
1) 정상 개개인으로부터의 일차 T 세포 배양물의 평가 [참고: 예를 들어, Wentworth, P. A. et al., Mol. Immunol. 32:603, 1995; Celis, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2105, 1994; Tsai, V. et al., J. lmmunol 158:1796, 1997; Kawashima, I. et al., Human Immunol. 59:1, 1998]. 이 과정은 정상 대상체로부터의 말초혈 림프구 (PBL)를 몇 주에 걸쳐 시험관 내에서 항원 제시 세포의 존재 하에 시험용 펩티드로 자극하는 것을 포함한다. 이 동안에, 상기 펩티드에 대해 특이적인 T 세포가 활성화되었고, 예를 들어 펩티드 감작화 표적 세포와 관련된, 림포카인- 또는 51Cr-방출 검정을 사용하여 탐지하였다.
2) HLA 트랜스제닉 마우스의 면역화 [참고: 예를 들어, Wentworth, P. A. et al., J. lmmunol. 26:97, 1996; Wentworth, P. A. et al., Int. Immunol. 8:651, 1996; Alexander, J. et al., J. Immunol 159:4753, 1997]. 예를 들어, 이러한 방법에서는 불완전 프로인트 아주반트 중의 펩티드를 HLA 트랜스제닉 마우스에게 피하 투여한다. 면역시킨지 몇 주 후에, 비장세포를 꺼내고, 이를 대략 1주 동안 시험용 펩티드의 존재 하에 시험관 내에서 배양한다. 예를 들어, 펩티드 감작화 표적 세포 및 내인적으로 생성된 항원을 발현하는 표적 세포와 관련된 51Cr-방출 검정을 사용하여, 펩티드-특이적 T 세포를 탐지한다.
3) 효과적으로 백신 접종한 면역 개개인으로부터 및(또는) 만성 질환 환자로부터의 회상 (recall) T 세포 반응 입증 [참고: 예를 들어, Rehermann, B. et al., J. Exp. Med. 181:1047, 1995; Doolan, D. L. et al., Immunity 7:97, 1997; Bertoni, R. et al., J. Clin. Invest. 100:503, 1997; Threlkeld, S. C. et al., J. Immunol. 159:1648, 1997; Diepolder, H. M. et al., J. ViroL 71:6011, 1997]. 따라서, 회상 반응은 질병으로 인해 항원에 노출되었으므로, "천연적"으로 면역 반응을 생성시킨 대상체로부터의 PBL, 또는 해당 항원에 대항하여 백신 접종한 환자로부터의 PBL을 배양함으로써 탐지한다. 대상체로부터의 PBL을 1 내지 2주 동안 시험관 내에서, 시험용 펩티드 + 항원 제시 세포 (APC)의 존재 하에 배양하여, "타고난 본래의" T 세포와 비교해서 "기억" T 세포를 활성화시킬 수 있다. 배양이 끝날 무렵, 펩티드-감작화 표적과 관련한 51Cr 방출, T 세포 증식 또는 림포카인 방출을 포함한 검정을 사용하여 T 세포 활성을 탐지한다.
VI.) STEAP-1 트랜스제닉 동물
STEAP-1-관련 단백질을 코딩하는 핵산을 또한 사용하여 트랜스제닉 동물 또는 "녹아웃 (knock-out)" 동물을 생성시킬 수 있는데, 이는 궁극적으로, 치료적으로 유용한 시약의 개발과 스크리닝에 유용하다. 확립된 기술에 따라서, STEAP-1을 코딩하는 cDNA를 사용하여 STEAP-1을 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝시킬 수 있다. 이어서, 이와 같이 클로닝된 게놈 서열을 사용하여, STEAP-1을 코딩하는 DNA를 발현하는 세포를 함유하는 트랜스제닉 동물을 생성시킬 수 있다. 트랜스제닉 동물, 특히 마우스 또는 랫트 등의 동물을 생성시키는 방법은 당해 분야에 통상적인 것이고, 이는 예를 들어, 미국 특허 제4,736,866호 (1988년 4월 12일자로 허여됨) 및 제4,870,009호 (1989년 9월 26일자로 허여됨)에 기재되었다. 전형적으로는, 조직-특이적 증강인자를 이용하여 STEAP-1 트랜스유전자를 혼입시키기 위해 특정한 세포를 표적화할 것이다.
STEAP-1을 코딩하는 트랜스유전자의 카피 (copy)를 포함하는 트랜스제닉 동물을 사용하여, STEAP-1을 코딩하는 DNA의 발현 증가 효과를 조사할 수 있다. 이러한 동물은, 예를 들어 그의 과발현과 연관된 병리적 질환로부터의 보호를 부여해주는 것으로 여겨지는 시약에 대한 시험용 동물로서 사용할 수 있다. 이러한 본 발명의 국면에 따르면, 특정 동물을 특정 시약으로 처리하고, 트랜스유전자를 보유하고 있는 미처리 동물과 비교해서 병리적 질환의 발생률 저하가, 이러한 병리적 질환에 대해 효능있는 치료적 개입을 지시할 것이다.
또 다른 한편으론, STEAP-1의 비-인간 상동체를 사용하여, STEAP-1을 코딩하는 내인성 유전자와 동물의 배아 세포 내로 도입된 STEAP-1을 코딩하는 변경된 게놈 DNA 간의 상동 재조합의 결과로서, STEAP-1을 코딩하는 결함있거나 변경된 유전자를 갖는 STEAP-1 "녹아웃" 동물을 구축할 수 있다. 예를 들어, 확립된 기술에 따라서, STEAP-1을 코딩하는 cDNA를 사용하여, STEAP-1을 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. STEAP-1을 코딩하는 게놈 DNA의 일부를 결실시키거나 또는 또 다른 유전자, 예를 들어 통합을 모니터링하기 위해 사용될 수 있는 선별성 마커를 코딩하는 유전자로 대체시킬 수 있다. 전형적으로는, 수 킬로염기의 변경되지 않은 플랭킹 DNA (5' 말단과 3' 말단 둘 다에서)가 벡터 내에 포함된다 [상동성 재조합 벡터에 관해서는 문헌 (Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987))을 참고할 수 있다]. 이 벡터를 배아 줄기 세포주 내로 도입하고 (예를 들어, 전기천공에 의해 수행됨), 도입된 DNA를 내인성 DNA와 상동적으로 재조합시킨 세포를 선별한다 [참고: 예를 들어, Li et al., Cell, 69: 915 (1992)]. 이어서, 이와 같이 선별된 세포를 동물 (예: 마우스 또는 랫트)의 배반포 내로 주사하여 응집 키메라를 형성시킨다 [참고: 예를 들어, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. 이어서, 키메라 배아를 적합한 거짓임신 암컷 양육 동물에게 이식할 수 있고, 배아를 만기까지 이르게 하여 "녹아웃" 동물을 창출시켰다. 그의 생식 세포에 상동적으로 재조합시킨 DNA를 정착시킨 자손을 표준 기술에 의해 확인할 수 있고, 이를 사용하여, 동물의 모든 세포가 상동적으로 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 번식시킬 수 있다. 예를 들어, 특정의 병리적 질환에 대항하여 방어할 수 있는 능력을 알아보기 위해, 또는 STEAP-1 폴리펩티드의 부재로 인한 병리적 질환 발생을 알아보기 위해, 녹아웃 동물을 성상 확인할 수 있다.
VII.) STEAP-1의 탐지 방법
본 발명의 또 다른 국면은 STEAP-1 폴리뉴클레오티드 및 STEAP-1-관련 단백질을 탐지하는 방법 뿐만 아니라 STEAP-1을 발현하는 세포를 확인하는 방법에 관한 것이다. STEAP-1의 발현 프로파일은 이를 전이된 질병에 대한 진단 마커로 만든다. 따라서, STEAP-1 유전자 생성물의 상태는 각종 요인들, 예를 들어 진행된 병기에 대한 감수성, 진행 속도, 및(또는) 종양 침습성 (공격성)을 예측하는데 있어 유용한 정보를 제공해준다. 본원에 상세히 논의된 바와 같이, 환자 샘플 중에서의 STEAP-1 유전자 생성물의 상태는 당해 분야에 널리 공지된 각종 프로토콜, 예를 들어 면역조직화학 분석, 계내 혼성화를 포함한 각종 노던 블롯팅 기술, RT-PCR 분석 (예를 들어, 레이저 포획 미소-절개된 샘플 상에서의 분석), 웨스턴 블롯 분석 및 조직 어레이 분석에 의해 분석할 수 있다.
보다 특히, 본 발명은 생물학적 샘플, 예를 들어, 혈청, 뼈, 전립선 및 기타 조직, 뇨, 정액, 세포 제제 등 중에서 STEAP-1 폴리뉴클레오티드를 탐지하기 위한 검정을 제공한다. 탐지 가능한 STEAP-1 폴리뉴클레오티드에는, 예를 들어 STEAP-1 유전자 또는 그의 단편, STEAP-1 mRNA, 대체 스플라이스 변이체, STEAP-1 mRNAs, 및 STEAP-1 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 DNA 또는 RNA 분자가 포함된다. STEAP-1 폴리뉴클레오티드를 증폭시키고/시키거나 이의 존재를 탐지하는 수 많은 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이를 본 발명의 상기 국면을 실시하는데 이용할 수 있다.
한 양태에서, 생물학적 샘플 중에서 STEAP-1 mRNA를 탐지하는 방법은, 하나 이상의 프라이머를 사용하여 역전사시킴으로써 상기 샘플로부터 cDNA를 생성시키고; 이로써 생성된 cDNA를, 내부에 STEAP-1 cDNAs를 증폭시키기 위한 센스 및 안티센스 프라이머로서 STEAP-1 폴리뉴클레오티드를 사용하여 종폭시킨 다음; 증폭시킨 STEAP-1 cDNA의 존재를 탐지하는 것을 포함한다. 임의로는, 증폭시킨 STEAP-1 cDNA의 서열을 결정할 수 있다.
또 다른 양태에서, 생물학적 샘플 중에서 STEAP-1 유전자를 탐지하는 방법은, 먼저 상기 샘플로부터 게놈 DNA를 분리시키고; 이와 같이 분리시킨 게놈 DNA를, 센스 및 안티센스 프라이머로서 STEAP-1 폴리뉴클레오티드를 사용하여 증폭시킨 다음; 증폭시킨 STEAP-1 유전자의 존재를 탐지하는 것을 포함한다. 어떠한 수의 적당한 센스 및 안티센서 프로브 조합물도 STEAP-1 뉴클레오티드 서열 (도 2 참고)로부터 고안할 수 있고, 상기 목적에 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, 특정 조직이나 기타 생물학적 샘플, 예를 들어 혈청, 정액, 뼈, 전립선, 뇨, 세포 제제 등에서 STEAP-1 단백질의 존재를 탐지하기 위한 검정을 제공한다. STEAP-1-관련 펩티드를 탐지하는 방법 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이에는 예를 들어, 면역침전, 면역조직화학 분석, 웨스턴 블롯 분석, 분자 결합성 검정, ELISA, ELIFA 등이 포함된다. 예를 들어, 생물학적 샘플 중에서 STEAP-1-관련 단백질의 존재를 탐지하는 방법은 먼저, 상기 샘플을 STEAP-1 항체, 그의 STEAP-1-반응성 단편, 또는 STEAP-1 항체의 항원 결합 영역을 함유하는 재조합 영역과 접촉시킨 다음; 상기 샘플 중에서 STEAP-1-관련 단백질의 결합을 탐지하는 것을 포함한다.
STEAP-1을 발현하는 세포를 확인하는 방법 또한, 본 발명의 범위 내에 속한다. 한 양태에서는, STEAP-1 유전자를 발현하는 세포를 확인하기 위한 검정이 이러한 세포 중에서 STEAP-1 mRNA의 존재를 탐지하는 것을 포함한다. 세포 중에서 특정한 mRNAs를 탐지하는 방법은 널리 공지되어 있고, 이에는 예를 들어, 상보적 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 검정 (예: 표지된 STEAP-1 리보프로브를 사용하는 계내 혼성화, 노던 블롯 및 관련 기술) 및 각종 핵산 증폭 검정 (예: STEAP-1에 대해 특이적인 상보적 프라이머를 이용한 RT-PCR, 및 기타 증폭 유형 탐지 방법, 예를 들면, 분지된 DNA, SISBA, TMA 등)이 포함된다. 또 다른 한편, STEAP-1 유전자를 발현하는 세포를 확인하기 위한 검정은 특정 세포 중에서 또는 이러한 세포에 의해 분비된 STEAP-1-관련 단백질의 존재를 탐지하는 것을 포함한다. 단백질을 탐지하기 위한 각종 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 STEAP-1-관련 단백질 및 STEAP-1-관련 단백질을 발현하는 세포를 탐지하는데 이용한다.
STEAP-1 발현 분석은 또한, STEAP-1 유전자 발현을 조정하는 작용제를 확인 및 평가하기 위한 도구로서 유용하다. 예를 들어, STEAP-1 발현은 전립선 암에서 상당히 상향 조절되고, 표 I에 열거된 조직의 암에서 발현된다. 암 세포에서 STEAP-1 발현 또는 과발현을 억제하는 분자 또는 생물학적 작용제를 확인 (동정)하는 것이 치료적으로 가치가 있다. 예를 들어, 이러한 작용제는 RT-PCR, 핵산 혼성화 또는 항체 결합에 의해 STEAP-1 발현을 정량화하는 스크린을 사용하여 확인할 수 있다.
VIII.) STEAP-1-관련 유전자 및 그의 생성물의 상태를 모니터링하는 방법
종양형성은 세포성 성장이 점진적으로 조절이상되고, 세포가 정상 생리적 상태에서 전암성 상태로 진행된 다음 암성 상태로 진행되는 다단계 공정인 것으로 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Alers et al., Lab Invest. 77 (5): (1997) and Isaacs et al., Cancer Surv. 23:19-32 (1995)]. 이와 관련하여, 조절이상된 세포성 성장 (예: 암에서의 이상한 STEAP-1 발현)의 명백한 증거를 알아보기 위해 생물학적 샘플을 검사함으로써, 암과 같은 병리적 상태가 치료적 선택권이 보다 더 제한되고/되거나 예후가 더 악화되는 상태로 진행되기 전에, 상기와 같은 이상한 생리기능을 조기 검진할 수 있다. 이러한 검사에서는, 관심있는 생물학적 샘플 중에서의 STEAP-1의 상태를, 예를 들어 상응하는 정상 샘플 (예: 해당 개개인 또는 특정 병리상태를 앓고 있지 않은 또 다른 개개인으로부터의 샘플)에서의 STEAP-1의 상태와 비교할 수 있다. (정상 샘플과 비교해서) 상기 생물학적 샘플 중에서의 STEAP-1 상태 변경은 조절이상된 세포성 성장의 명백한 증거를 제공한다. 정상 샘플로서 특정 병리상태를 앓고 있지 않은 생물학적 샘플을 사용하는 것 이외에도, 예정된 규범 값, 예를 들어 예정된 정상 수준의 mRNA 발현을 또한 사용하여 [참고: 예를 들어, Grever et al., J. Comp. Neurol. 1996 Dec 9; 376(2): 및 미국 특허 제5,837,501호] 샘플 중에서의 STEAP-1 상태를 비교할 수 있다.
이와 관련하여 용어 "상태"는 당해 분야에서 허용되고 있는 그의 의미에 따라서 사용되고, 유전자 및 그의 생성물의 상태를 지칭한다. 전형적으로, 당업자는 특정 유전자 및 그의 생성물의 상태를 평가하기 위한 수 많은 파라미터를 이용하고 있다. 이에는 발현된 유전자 생성물의 위치 (STEAP-1 발현성 세포의 위치 포함) 뿐만 아니라 발현된 유전자 생성물 (예: STEAP-1 mRNA, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드)의 수준 및 생물학적 활성이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, STEAP-1 상태의 변경은 STEAP-1 및(또는) STEAP-1 발현 세포의 위치 변화 및(또는) STEAP-1 mRNA 및(또는) 단백질 발현의 증가를 포함한다.
특정 샘플 중에서의 STEAP-1 상태는 당해 분야에 널리 공지된 수 많은 수단, 예를 들어 면역조직화학 분석, 계내 혼성화, 레이저 포획 미소-절개된 샘플 상에서의 RT-PCR 분석, 웨스턴 블롯 분석, 및 조직 어레이 분석에 의해 분석할 수 있다. STEAP-1 유전자 및 유전자 생성물의 상태를 평가하기 위한 전형적인 프로토콜이, 예를 들어 다음 문헌에 보고되었다 [참고: Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis)]. 따라서, 생물학적 샘플 중에서의 STEAP-1의 상태는 당업자에 의해 활용되고 있는 각종 방법, 예를 들어 게놈 서던 분석 (예를 들어, STEAP-1 유전자 내의 섭동을 검사하기 위함), STEAP-1 mRNA의 노던 분석 및(또는) PCR 분석 (예를 들어, STEAP-1 mRNAs의 발현 수준 또는 폴리뉴클레오티드 서열 상의 변경을 검사하기 위함), 및 웨스턴 및(또는) 면역조직화학 분석 (예를 들어, 폴리펩티드 서열 상의 변경, 샘플 내의 폴리펩티드 국재 상의 변경, STEAP-1 단백질의 발현 수준 상의 변경 및(또는) STEAP-1 단백질과 폴리펩티드 결합 파트너와의 연합 상의 변경을 검사하기 위함)에 의해 평가한다. 탐지 가능한 STEAP-1 폴리뉴클레오티드에는, 예를 들어 STEAP-1 유전자 또는 그의 단편, STEAP-1 mRNA, 대체 스플라이스 변이체, STEAP-1 mRNAs, 및 STEAP-1 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 DNA 또는 RNA 분자가 포함된다.
STEAP-1의 발현 프로파일은 이를 국소 및(또는) 전이된 질병에 대한 진단 마커로 만들고, 특정 생물학적 샘플의 성장 또는 발암 가능성에 관한 정보를 제공해준다. 특히, STEAP-1의 상태는 특정한 병기에 대한 감수성, 진행, 및(또는) 종양 침습성을 예측하는데 있어 유용한 정보를 제공해준다. 본 발명은 STEAP-1 상태를 결정하고 STEAP-1을 발현하는 암, 예를 들어 표 I에 열거된 조직의 암을 진단하기 위한 방법 및 검정을 제공한다. 예를 들어, STEAP-1 mRNA는 정상 전립선 조직과 비교해서 전립선 암 및 기타 암에서 고도로 발현되기 때문에, 생물학적 샘플 중에서 STEAP-1 mRNA 전사체 또는 단백질의 수준을 평가하는 검정을 사용하여 STEAP-1 조절이상과 연관된 질병을 진단할 수 있고, 적당한 치료적 선택권을 규정하는데 있어 유용한 예후 정보를 제공할 수 있다.
STEAP-1의 발현 상태는 이형성, 전암성 및 암성 세포의 존재, 병기 및 위치를 포함한 정보를 제공하므로, 각종 병기에 대한 감수성을 예측하고/하거나 종양 침습성을 평가할 수 있게 해준다. 더우기, 발현 프로파일은 전이된 질병에 대한 영상화 시약으로서 유용하도록 만든다. 결과적으로, 본 발명의 한 국면은 생물학적 샘플, 예를 들어 조절이상된 세포성 성장을 특징으로 하는 병리상태 (예: 암)로 인해 고통받고 있거나 고통받는 것으로 의심되는 개개인으로부터의 샘플 중에서 STEAP-1의 상태를 검사하기 위한 각종 분자상 예후 및 진단 방법에 관한 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 생물학적 샘플 중에서의 STEAP-1의 상태는 당해 분야에 널리 공지된 수 많은 과정에 의해 검사할 수 있다. 예를 들어, 체내 특이적 위치로부터 취한 생물학적 샘플 중에서의 STEAP-1 상태는, 이러한 샘플을 대상으로 하여 STEAP-1 발현 세포 (예: STEAP-1 mRNAs 또는 단백질을 발현하는 세포)의 존재 또는 부재 여부를 평가함으로써 검사할 수 있다. 이러한 검사는, 예를 들어 STEAP-1 발현성 세포가 정상적으로는 이러한 세포를 함유하지 않는 생물학적 샘플 (예: 림프절)에서 발견된 경우에, 조절이상된 세포성 성장의 명백한 증거를 제공할 수 있는데, 이는 이러한 생물학적 샘플 중에서의 STEAP-1 상태의 변경이 종종 조절이상된 세포성 성장과 연관되기 때문이다. 구체적으로 언급하면, 조절이상된 세포성 성장의 한 가지 지표는 암 세포가 기원 기관 (예: 전립선)으로부터 상이한 신체 부위 (예: 림프절)로 전이되는 것이다. 이와 관련하여, 조절이상된 세포성 성장의 명백한 증거가 중요한데, 이는 잠재성 림프절 전이가 대부분의 전립선 암 환자에게서 탐지될 수 있고 이러한 전이가 질병 진행의 공지된 예측요인과 연관이 있기 때문이다 [참고: Murphy et al., Prostate 42(4): 315-317 (2000); Su et al., Semin. Surg. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) and Freemanet al., J Urol 1995 Aug 154(2 Pt 1 ): 474-8].
한 국면에서, 본 발명은 조절이상된 세포 성장과 연관된 질병 (예; 과다형성 또는 암)이 있는 것으로 의심되는 개개인으로부터의 세포에 의해 발현된 STEAP-1 유전자 생성물의 상태를 결정한 다음, 이와 같이 결정된 상태를 상응하는 정상 샘플 중에서의 STEAP-1 유전자 생성물의 상태와 비교함으로써, STEAP-1 유전자 생성물을 모니터링하는 방법을 제공한다. 정상 샘플과 비교해서 시험용 샘플에 이상한 STEAP-1 유전자 생성물이 존재한다는 것은 해당 개개인의 세포 내에 조절이상된 세포 성장이 존재한다는 지표을 제공한다.
또 다른 국면에서는, 본 발명이 상응하는 정상 세포 또는 조직 중에서의 발현 수준과 비교해서 시험용 세포 또는 조직 샘플 중에서의 STEAP-1 mRNA 또는 단백질 발현의 상당한 증가를 탐지하는 것을 포함하여, 특정 개개인에게서 암이 존재하는지를 결정하는데 유용한 검정을 제공한다. STEAP-1 mRNA의 존재는, 예를 들어 표 I에 열거된 것을 포함하지만 그에 제한되지 않는 조직에서 평가할 수 있다. 이들 조직에서 상당한 STEAP-1 발현이 존재하는 것은 암의 출현, 존재 및(또는) 중증도를 지시하는데 유용한데, 이는 상응하는 정상 조직은 STEAP-1 mRNA를 발현하지 않거나 보다 낮은 수준으로 발현하기 때문이다.
관련 양태에서는, STEAP-1 수준을 핵산 수준이 아닌 단백질 수준에서 결정한다. 예를 들어, 이러한 방법은 시험용 조직 샘플에서 세포에 의해 발현된 STEAP-1 단백질 수준을 결정하고, 이와 같이 결정된 수준을 상응하는 정상 샘플에서 발현된 STEAP-1 수준과 비교하는 것을 포함한다. 한 양태에서는, 예를 들어 면역조직화학 방법을 사용하여 STEAP-1 단백질의 존재를 평가한다. STEAP-1 단백질 발현을 탐지할 수 있는 STEAP-1 항체 또는 결합 파트너는 본 목적을 위해 당해 분야에 널리 공지된 각종 검정 포맷으로 사용한다.
추가 양태에서는, 생물학적 샘플 중에서의 STEAP-1 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 상태를 평가하여, 이들 분자 구조 내에서의 섭동을 확인할 수 있다. 이들 섭동에는 삽입, 결실, 치환 등이 포함된다. 이러한 평가는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 내의 섭동이 성장 조절이상된 표현형과 연관된 다수의 단백질에서 관찰되기 때문에 유용하다 [참고: 예를 들어, Marrogi et al., 1999, J. Cutan. Pathol. 26 (8):369-378]. 예를 들어, STEAP-1 서열 상의 돌연변이는 종양의 존재 또는 촉진을 지시할 수 있다. 따라서, 이러한 검정은 STEAP-1 상의 돌연변이가 잠재적 기능 상실이나 종양 성장 증가를 지시하는 경우에 진단적 및 예측 가치를 지닌다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열 내의 섭동을 관찰하기 위한 광범위한 검정이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, STEAP-1 유전자 생성물의 핵산 또는 아미노산 서열의 크기 및 구조는 본원에 논의된 노던, 서던, 웨스턴, PCR 및 DNA 서열 분석 프로토콜에 의해 관찰한다. 또한, 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 내의 섭동을 관찰하기 위한 기타 방법, 예를 들어 단일 가닥 입체 형태 다형성 분석이 당해 분야에 널리 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,382,510호 (1999년 9월 7일자로 허여됨) 및 제5,952,170호 (1995년 1월 17일자로 허여됨)].
부가적으로, 생물학적 샘플 중에서 STEAP-1 유전자의 메틸화 상태를 검사할 수 있다. 유전자 5' 조절성 영역에서 CpG 아일랜드 (섬)의 이상한 탈메틸화 및(또는) 과메틸화가 종종 불멸화 세포 및 형질전환된 세포에서 일어나며, 이로써 각종 유전자의 발현이 변경될 수 있다. 예를 들어, pi-부류 글루타치온 S-트랜스퍼라제 (정상 전립선에서는 발현되지만, 전립선 암종의 >90%에서는 발현되지 않는 단백질)의 프로모터 과메틸화는 상기 유전자의 영구적 침묵 전사인 것으로 여겨지며, 전립선 암종에서 가장 자주 탐지되는 게놈 변경이다 [참고: De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)]. 또한, 이러한 변경은 고 악성도 전립선 상피내 종양 (PIN) 증례의 70% 이상에서 존재한다 [참고: Brooks et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7: 531-536]. 또 다른 예에서는, LAGE-I 종양 특이적 유전자의 발현 (이는 정상 전립선에서는 발현되지 않지만, 전립선 암의 25 내지 50%에서 발현된다)이 림프아구성 세포에서 데옥시-아자시티딘에 의해 유도되는데, 이는 종양 발현이 탈메틸화에 기인된 것이란 사실을 제안한다 [참고: Lethe et al., lnt. J. Cancer 76 (6): (1998)]. 유전자의 메틸화 상태를 검사하기 위한 각종 검정이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 서던 혼성화 접근법에서, 메틸화 CpG 부위를 함유하는 서열을 절단할 수 없는 메틸화-민감성 제한 효소를 활용하여 CpG 섬의 메틸화 상태를 평가할 수 있다. 또한, MSP (메틸화 특이적 PCR)는 소정의 유전자의 CpG 섬에 존재하는 모든 CpG 부위의 메틸화 상태를 신속하게 프로파일할 수 있다. 이러한 과정은 중아황산나트륨에 의해 DNA를 초기 변형시키고 (이는 모든 비메틸화 시토신을 우라실로 전환시킬 것이다), 이어서 비메틸화 DNA에 비해 메틸화 DNA에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭시키는 것을 포함한다. 메틸화 간섭을 포함하는 프로토콜이 또한, 다음 문헌에 보고되었다 [참고: Current Protocols In Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel et al, eds., 1995].
유전자 증폭은 STEAP-1의 상태를 평가하기 위한 부가의 방법이다. 유전자 증폭은, 예를 들어 본원에 제공된 서열을 기초로 하여, 적당하게 표지된 프로브를 사용하여, mRNA의 전사를 정량화하기 위한 통상적인 서던 블롯팅 또는 노던 블롯팅 [참고: Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205], 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 계내 혼성화에 의해 샘플 중에서 직접적으로 측정한다. 또 다른한편으론, DNA 이중 나선, RNA 이중 나선, 및 DNA-RNA 하이브리드 이중 나선 또는 DNA-단백질 이중 나선을 포함한 특이적 이중 나선을 인식하는 항체를 이용한다. 이어서, 항체를 표지시키고, 이중 나선이 표면에 결합되는 경우에 검정을 수행하기 때문에, 이러한 표면 상에 이중 나선이 형성되면 이 이중 나선에 결합된 항체의 존재 여부를 탐지할 수 있다.
생검을 실시한 조직 또는 말초혈을 대상으로 하여, 예를 들어 노던, 도트 블롯 또는 RT-PCR 분석을 사용하여 암 세포의 존재에 대해 편리하게 검정하여 STEAP-1 발현을 탐지할 수 있다. RT-PCR 증폭 가능한 STEAP-1 mRNA의 존재는 암이 존재한다는 지표를 제공한다. RT-PCR 검정은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 말초혈에서 종양 세포에 대한 RT-PCR 탐지 검정은 현재, 수 많은 인간 고형 종양의 진단 및 관리에 사용하는 것으로 평가되고 있다. 전립선 암 분야에서는, PSA 및 PSM을 발현하는 세포를 탐지하기 위한 RT-PCR 검정이 포함된다 [참고: Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25: 373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687-1688].
본 발명의 추가 국면은 특정 개개인이 암 발생에 대한 감수성을 지니고 있는지를 평가하는 것이다. 한 양태에서는, 암에 대한 감수성을 예측하는 방법이 특정 조직 샘플 중에서 STEAP-1 mRNA 또는 STEAP-1 단백질을 탐지하는 것을 포함하는데, 그의 존재가 암에 대한 감수성을 지시하며, STEAP-1 mRNA 발현 정도는 감수성 정도와 상관이 있다. 구체적 양태에서는, 전립선 또는 기타 조직에서의 STEAP-1의 존재 여부를 검사하는데, 이러한 샘플 중에 STEAP-1가 존재하는 것은 전립선 암 감수성 (또는 전립선 종양의 출현 또는 존재)의 지표를 제공한다. 유사하게, 생물학적 샘플 중에서 STEAP-1 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 완전성을 평가하여, 이들 분자의 구조 내의 섭동, 예를 들어 삽입, 결실, 치환 등을 확인할 수 있다. 상기 샘플 중에 STEAP-1 유전자 생성물 상의 한 가지 이상 섭동이 존재하는 것은 암 감수성 (또는 종양의 출현 또는 존재)에 대한 지표이다.
본 발명은 또한, 종양 침습성을 평가하기 위한 방법을 포함한다. 한 양태에서는, 종양의 침습성을 평가하는 방법이 종양 세포에 의해 발현된 STEAP-1 mRNA 또는 STEAP-1 단백질의 수준을 결정하고, 이와 같이 결정된 수준을, 동일한 개개인 또는 정상 조직 기준 샘플로부터 취한 상응하는 정상 조직에서 발현된 STEAP-1 mRNA 또는 STEAP-1 단백질의 수준과 비교하는 것을 포함하는데, 정상 샘플과 비교해서 종양 샘플에서의 STEAP-1 mRNA 또는 STEAP-1 단백질 발현 정도가 침습성 정도를 지시한다. 구체적 양태에서는, 종양 세포에서 발현되는 STEAP-1 정도를 결정함으로써 종양 침습성을 평가하는데, 보다 높은 발현 수준은 보다 침습성인 종양을 지시한다. 또 다른 양태는 생물학적 샘플 중에서 STEAP-1 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 완전성을 평가하여, 이들 분자의 구조 내의 섭동, 예를 들어 삽입, 결실, 치환 등을 확인하는 것이다. 한 가지 이상 섭동이 존재하는 것은 보다 침습성인 종양을 지시한다.
본 발명의 또 다른 양태는 시간 경과에 따른 특정 개개인에게서의 악성 종양의 진행을 관찰하는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서는, 시간 경과에 따른 개개인에게서의 악성 종양의 진행을 관찰하는 방법이 종양 샘플 중의 세포에 의해 발현된 STEAP-1 mRNA 또는 STEAP-1 단백질의 수준을 결정하고; 이와 같이 결정된 수준을, 상이한 시간에 동일한 개개인으로부터 취한 등가의 조직 샘플에서 발현된 STEAP-1 mRNA 또는 STEAP-1 단백질의 수준과 비교하는 것을 포함하는데, 시간 경과에 따른 종양 샘플에서의 STEAP-1 mRNA 또는 STEAP-1 단백질 발현 정도가 암의 진행에 관한 정보를 제공한다. 구체적 양태에서는, 시간 경과에 따른 종양 세포에서의 STEAP-1 발현을 결정함으로써 암의 진행을 평가하는데, 시간 경과에 따른 발현 증가는 암의 진행을 지시한다. 또한, 생물학적 샘플 중에서 STEAP-1 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 완전성을 평가하여, 이들 분자의 구조 내의 섭동, 예를 들어 삽입, 결실, 치환 등을 확인할 수 있는데, 한 가지 이상 섭동이 존재하는 것은 암의 진행을 지시한다.
상기 진단 접근법을 당해 분야에 공지된 광범위한 예후 및 진단 프로토콜 중의 어느 한 가지와 병용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 또 다른 양태는 특정 조직 샘플의 상태를 진단 및 예후하기 위한 수단으로서, 악성 종양과 연관이 있는 특정 요인과 STEAP-1 유전자 및 STEAP-1 유전자 생성물 발현 (또는 STEAP-1 유전자 및 STEAP-1 유전자 생성물 내의 섭동의 발현)의 동시 발생을 관찰하는 방법에 관한 것이다. 악성 종양과 연관된 광범위한 요인, 예를 들어 악성 종양과 연관된 유전자의 발현 (예를 들어, 전립선 암의 경우에는 PSA, PSCA 및 PSM 발현 등) 뿐만 아니라 거시적 세포학적 관찰사항 [참고: 예를 들어, Bocking et al., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2):74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2):223-9; Thorson et al., 1998, Mod. Pathol. 11(6):543-51; Baisden et al., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23 (8):918-24]을 활용할 수 있다. 악성 종양과 연관이 있는 또 다른 요인과 STEAP-1 유전자 및 STEAP-1 유전자 생성물 발현 (또는 STEAP-1 유전자 및 STEAP-1 유전자 생성물 내의 섭동의 발현)의 동시 발생을 관찰하는 방법이 유용한데, 이는 예를 들어, 질병과 동시 발생하는 일정 세트의 특이적 요인의 존재가 조직 샘플의 상태를 진단 및 예후하는데 있어 중요한 정보를 제공하기 때문이다.
한 양태에서는, 악성 종양과 연관된 또 다른 요인과 STEAP-1 유전자 및 STEAP-1 유전자 생성물 발현 (또는 STEAP-1 유전자 및 STEAP-1 유전자 생성물 내의 섭동의 발현)의 동시 발생을 관찰하는 방법이, 조직 샘플 중에서 STEAP-1 mRNA 또는 단백질의 과발현을 탐지하는 단계; 조직 샘플 중에서 PSA mRNA 또는 단백질의 과발현 (또는 PSCA 또는 PSM 발현)을 탐지하는 단계; 및 STEAP-1 mRNA 또는 단백질의 과발현과 PSA mRNA 또는 단백질의 과발현의 동시 발생을 관찰하는 단계를 수반한다. 구체적 양태에서는, 전립선 조직에서 STEAP-1 및 PSA mRNA의 발현을 검사하는데, 이러한 조직에서 STEAP-1 및 PSA mRNA 과발현이 동시 발생하는 것은 전립선 암의 존재, 전립선 암 감수성, 또는 전립선 종양의 출현 또는 상태를 지시한다.
STEAP-1 mRNA 또는 단백질의 발현을 탐지 및 정량화하는 방법이 본원에 기재되어 있고, 표준 핵산 및 단백질 탐지 및 정량화 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. STEAP-1 mRNA를 탐지 및 정량화하기 위한 표준 방법에는 표지된 STEAP-1 리보프로브를 이용하는 계내 혼성화, STEAP-1 폴리뉴클레오티드 프로브를 이용하는 노던 블롯 및 관련 기술, STEAP-1에 대해 특이적인 프라이머를 사용하는 RT-PCR 분석, 및 기타 증폭 유형 탐지 방법, 예를 들어 분지된 DNA, SISBA, TMA 등이 포함된다. 구체적 양태에서는, 반정량적 RT-PCR을 사용하여 STEAP-1 mRNA 발현을 탐지 및 정량화한다. STEAP-1을 증폭시킬 수 있는 어떠한 수의 프라이머도 이러한 목적을 위해 사용할 수 있는데, 이에는 본원에 구체적으로 기재된 각종 프라이머 세트가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 구체적 양태에서는, 야생형 STEAP-1 단백질과 특이적으로 반응성인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를, 생검을 실시한 조직의 면역조직화학 검정에 사용할 수 있다.
IX.) STEAP-1과 상호 작용하는 분자의 확인 (동정)
본원에 기재된 STEAP-1 단백질 및 핵산 서열을 이용하여, 당업자는 STEAP-1과 상호 작용하는 단백질, 소분자 및 기타 작용제 뿐만 아니라 당해 분야에 허용된 각종 프로토콜 중의 어느 한 가지를 통하여 STEAP-1에 의해 활성화된 경로를 확인할 수 있다. 예를 들어, 소위 상호 작용 트랩 시스템 ("투-하이브리드 검정"으로서 지칭되기도 함) 중의 하나를 활용할 수 있다. 이러한 시스템에서는, 분자가 상호 작용하여, 리포터 유전자의 발현 검정시, 이러한 리포터 유전자의 발현을 지시하는 전사 인자를 재구성한다. 기타 시스템은 진핵성 전사 활성인자의 재구성을 통하여 생체내 단백질-단백질 상호 작용을 확인시켜 준다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,955,280호 (1999년 9월 21일자로 허여됨), 제5,925,523호 (1999년 7월 20일자로 허여됨), 제5,846,722호 (1998년 12월 8일자로 허여됨), 및 제6,004,746호 (1999년 12월 21일자로 허여됨)]. 게놈에 의거한 단백질 기능 예측을 위한 알고리즘이 또한 이용 가능하다 [참고: 예를 들어, Marcotte, et al., Nature 402: 4 November 1999, 83-86].
또 다른 한편, STEAP-1 단백질 서열과 상호 작용하는 분자를 확인하기 위해 펩티드 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 이러한 방법에서는, 무작위 또는 제어 컬렉션의 아미노산을 코딩하는 라이브러리를 스크리닝함으로써, STEAP-1과 결합하는 펩티드를 확인한다. 이러한 라이브러리에 의해 코딩된 펩티드는 박테리오파아지 외피 단백질의 융합 단백질로서 발현되므로, 이때 박테리오파아지 입자를 STEAP-1 단백질(들)에 대항하여 스크리닝한다.
따라서, 예측된 리간드 또는 수용체 분자의 구조에 관한 어떠한 선행 정보도 없이, 광범위한 용도를 지닌 펩티드, 예를 들어 치료적, 예후적 또는 진단적 시약으로서의 펩티드를 확인한다. STEAP-1 단백질 서열과 상호 작용하는 분자를 확인하기 위해 사용될 수 있는 전형적인 펩티드 라이브러리 및 스크리닝 방법이, 예를 들어 미국 특허 제5,723,286호 (1998년 3월 3일자로 허여됨) 및 제5,733,731호 (1998년 3월 31일자로 허여됨)에 기재되어 있다.
또 다른 한편으론, STEAP-1을 발현하는 세포주를 사용하여 STEAP-1에 의해 매개된 단백질-단백질 상호 작용을 확인한다. 이러한 상호 작용은 면역침전 기술을 사용하여 검사할 수 있다 [참고: 예를 들어, Hamilton B.J., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261:646-51]. STEAP-1 단백질은 항-STEAP-1 항체를 사용하여 STEAP-1-발현성 세포주로부터 면역침전시킬 수 있다. 또 다른 한편으론, His-태그에 대항한 항체를, STEAP-1과 His-태그의 융합물 (상기 언급된 벡터)을 발현하도록 공학적으로 처리시킨 세포주에 사용할 수 있다. 면역침전된 복합체를 대상으로 하여, 웨스턴 블롯팅, 단백질의 35S-메티오닌 표지화, 단백질 미소서열 분석, 은 염색 및 2차원적 겔 전기영동 등의 과정에 의해 단백질 연합에 대해 검사할 수 있다.
STEAP-1과 상호 작용하는 소분자 및 리간드는 상기 스크리닝 검정의 관련 양태를 통하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 단백질 기능을 방해하는 소분자, 예를 들면, 인산화 및 탈인산화를 매개하거나, 세포 주기 조절의 지표로서 DNA 또는 RNA 분자와의 상호 작용을 매개하거나, 제2 메신저 신호 전달을 매개하거나 또는 종양형성을 매개할 수 있는 STEAP-1의 능력을 방해하는 분자를 확인할 수 있다. 유사하게, STEAP-1-관련 이온 채널, 단백질 펌프 또는 세포 통신 기능을 조정하는 소분자를 확인하고, 이를 사용하여 STEAP-1을 발현하는 암을 갖는 환자를 치료한다 [참고: 예를 들어, Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes 2nd Ed., Sinauer Assoc., Sunderland, MA, 1992]. 더우기, STEAP-1 기능을 조절하는 리간드는, STEAP-1과 결합하고 리포터 구조물을 활성화시킬 수 있는 그의 능력에 기초하여 확인할 수 있다. 전형적인 방법이, 예를 들어 미국 특허 제5,928,868호 (1999년 7월 27일자로 허여됨)에 논의되었고, 이에는 적어도 하나의 리간드가 소분자인 하이브리드 리간드의 형성 방법이 포함된다. 예시 양태에서는, STEAP-1과 DNA-결합성 단백질의 융합 단백질을 발현하도록 공학적으로 처리시킨 세포를 사용하여, 하이브리드 리간드/소분자와 cDNA 라이브러리 전사 활성인자 단백질의 융합 단백질을 동시 발현시킨다. 이 세포는 리포터 유전자를 추가로 포함하는데, 그의 발현은 제1 융합 단백질과 제2 융합 단백질의 서로에 대한 근접성에 기초하여 조정되며, 이는 하이브리드 리간드가 양 하이브리드 단백질 상의 표적 부위와 결합하는 경우에만 일어나는 사건이다. 리포터 유전자를 발현하는 세포를 선별하고, 공지되지 않은 리간드에 대한 공지되지 않은 소분자를 확인한다. 이 방법은 STEAP-1을 활성화 또는 억제시키는 조정제를 확인하는 수단을 제공한다.
본 발명의 특정 양태는 도 2 또는 도 3에 도시된 STEAP-1 아미노산 서열과 상호 작용하는 분자에 대해 스크리닝하는 방법을 포함하는데, 이러한 방법은 특정 분자 집단을 STEAP-1 아미노산 서열과 접촉시키는 단계; 이러한 분자 집단과 STEAP-1 아미노산 서열이 상호 작용하는 것을 촉진시켜 주는 조건 하에, 이러한 상호 작용을 허용하는 단계; STEAP-1 아미노산 서열과 상호 작용하는 분자의 존재를 결정하는 단계; 및 STEAP-1 아미노산 서열과 상호 작용하지 않은 분자를, STEAP-1 아미노산 서열과 상호 작용하는 분자로부터 격리시키는 단계를 포함한다. 구체적 양태에서는, 상기 방법이 STEAP-1 아미노산 서열과 상호 작용하는 분자를 정제, 성상 확인 및 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 이로써 확인된 분자를 사용하여, STEAP-1에 의해 수행된 기능을 조정할 수 있다. 바람직한 양태에서는, STEAP-1 아미노산 서열을 펩티드 라이브러리와 접촉시킨다.
X.) 치료적 방법 및 조성물
제한된 세트의 조직에서 정상적으로 발현되지만, 표 I에 열거된 바와 같은 암에서도 발현되는 단백질로서 STEAP-1을 확인 (동정)함으로써, 이러한 암에 대한 수 많은 치료적 접근법 개발이 개시된다.
주목할만한 것은, 표적화 단백질이 정상 조직, 심지어 생명 유지에 필요한 정상 기관 조직 상에서 발현된 경우에도 표적화 항종양 요법이 유용하였다. 생명 유지에 필요한 기관은 삶을 지속시키는데 필요한 것, 예를 들어 심장 또는 결장이다. 생명 유지에 필요한 기관이 아닌 것은 개개인이 여전히 생존할 수 있기 때문에 제거될 수도 있는 것이다. 생명 유지에 필요한 기관이 아닌 것은 난소, 유방 및 전립선이다.
예를 들어, 헤르셉틴 (Herceptin®)은 HER2, HER2/neu, 및 erb-b-2로서 다양하게 공지된 단백질과 면역반응성인 항체로 이루어진 FDA 승인 제약이다. 이는 제넨테크 (Genentech)에 의해 판매되고 있고, 상업적으로 성공적인 항종양제이다. 헤르셉틴 판매액은 2002년도에 거의 4억 달러에 도달하였다. 헤르셉틴은 HER2 양성 전이성 유방암 치료제이다. 그러나, HER2의 발현은 이러한 종양에 제한되지 않는다. 동일한 단백질이 수 많은 정상 조직에서도 발현된다. 특히, HER2/neu은 정상 신장과 심장에 존재하므로, 이들 조직이 헤르셉틴의 모든 인간 수용자에 존재하는 것으로 공지되어 있다. HER2/neu이 정상 신장에 존재한다는 것이 또한 다음 문헌에 의해 확인되었다 [참고: Latif, Z., et al., B.J.U. International (2002) 89: 5-9]. 이 문헌에 나타낸 바와 같이 (신세포 암종이 항-HER2 항체, 예를 들어 헤르셉틴에 대한 바람직한 지표이어야 하는지를 평가함), 단백질과 mRNA 둘 다가 양성 신 조직에서 생성된다. 현저하게는, HER2/neu 단백질이 양성 신 조직에서 강력하게 과발현되었다. HER2/neu가 심장 및 신장과 같은 생명 유지에 필요한 조직에서 발현된다는 사실에도 불구하고, 헤르셉틴은 극히 유용하고, FDA 승인을 얻었으며, 상업적으로 성공적인 약물이다. 심장 조직에 대한 헤르셉틴의 효과, 즉 "심장독성"은 단순히 치료 부작용이었다. 환자를 헤르셉틴 단독으로 치료한 경우에는, 환자의 매우 낮은 비율에서 상당한 심장독성이 발생하였다. 심장독성을 최소화하기 위해, HER2/neu를 이용한 치료에 대한 보다 엄격한 등록 필요조건이 존재한다. 치료에 앞서, 심장 질환에 대한 소인과 같은 요인을 평가해야 한다.
특히 주목할 것은, 신장 조직이 정상 발현을 나타내도록 지시되고, 가능하게는 심장 조직 보다 훨씬 더 높은 발현을 나타내도록 지시된다 할지라도, 신장은 인지할 만한 어떠한 헤르셉틴 부작용도 나타내지 않는다는 것이다. 더우기, HER2가 발현되는 정상 조직의 다양한 어레이 중에서, 부작용을 나타낸 것은 거의 없다. 단지 심장 조직에서만 인지할 만한 부작용이 약간 발현되었다. HER2/neu 발현이 특히 두드러진 신장과 같은 조직은 어떠한 부작용에 대한 근거가 되지 못하였다.
더우기, 선호되는 치료 효과는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 표적으로 하는 항종양 요법 [Erbitux (ImClone)]에 대해 발견되었다. EGFR은 또한, 수 많은 정상 조직에서도 발현된다. 항-EGFR 치료제를 사용한 후에는 정상 조직에서 극히 제한된 부작용만 있었다. EGFR 치료를 이용한 경우에 나타나는 일반적인 부작용은 치료가 진행중인 환자의 100%에게서 관찰되는 중증의 피부 발진이다.
따라서, 정상 조직, 심지어 생명 유지에 필요한 정상 조직에서의 표적 단백질의 발현이, 이러한 단백질이 과발현되기도 하는 특정 종양에 대한 치료제로서 상기 단백질에 대한 표적화 작용제의 유용성을 헛되게 하지 않는다. 예를 들어, 생명 유지에 필요한 기관에서의 발현 자체가 해롭진 않다. 또한, 없어도 되는 것으로 간주되는 기관, 예를 들어 전립선 및 난소는 사망률에 영향을 미치지 않으면서 제거할 수 있다. 최종적으로, 몇몇 생명 유지에 필요한 기관은 면역특권 때문에 정상 기관 발현에 의해 영향을 받지 않는다. 면역특권 기관은 혈액-기관 장벽에 의해 혈액으로부터 보호되므로, 면역요법에 이용 가능하지 않는 기관이다. 면역특권 기관의 예는 뇌 및 고환이다.
따라서, STEAP-1 단백질의 활성을 억제하는 치료적 접근법이 STEAP-1을 발현하는 암으로 고통받고 있는 환자에 유용하다. 이들 치료적 접근법은 일반적으로, 3가지 부류로 나눈다. 제1 부류는 종양 세포 성장과 관계가 있기 때문에 STEAP-1 기능을 조정하여, 종양 세포 성장의 억제 또는 지연을 유발시키거나 그의 사멸을 유도시킨다. 제2 부류는 STEAP-1 단백질과 그의 결합 파트너 또는 기타 단백질과의 결합이나 연합을 억제시키기 위한 각종 방법을 포함한다. 제3 부류는 STEAP-1 유전자의 전사 또는 STEAP-1 mRNA의 해독을 억제하기 위한 각종 방법을 포함한다.
X.A.) 항암 백신
본 발명은 STEAP-1-관련 단백질 또는 STEAP-1-관련 핵산을 포함하는 암 백신을 제공한다. STEAP-1 발현 측면에서 보면, 암 백신은 비-표적 조직에 대해서는 최소한의 효과를 나타내거나 효과를 전혀 나타내지 않으면서 STEAP-1-발현성 암을 예방 및(또는) 치료한다. 항암 요법으로서 세포-매개된 체액성 면역 반응을 생성시키는 백신에서의 종양 항원의 용도는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 인간 PSMA 및 설치류 PAP 면역원을 사용하여 전립선 암에 이용하여 왔다 [참고: Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63: 231-237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159:3113-3117].
이러한 방법은 STEAP-1-관련 단백질을 이용하거나, 또는 STEAP-1 면역원 (이는 전형적으로, 수 많은 T-세포 에피토프 또는 항체를 포함한다)을 발현 및 제시할 수 있는 STEAP-1-코딩 핵산 분자 및 재조합 벡터를 이용함으로써 용이하게 실시할 수 있다. 당업자는 면역반응성 에피토프를 전달하기 위한 광범위한 백신 시스템이 당해 분야에 공지되어 있다는 것을 이해한다 [참고: 예를 들어, Heryln et al., Ann Med 1999 Feb 31(1):66-78; Maruyama et al., Cancer Immunol Immunother 2000 Jun 49(3):123-32]. 간단하게 언급하면, 이러한 면역 반응 (예: 세포-매개성 및(또는) 체액성)을 생성시키는 방법은 포유류의 면역계를 면역반응성 에피토프 (예: 도 3에 도시된 STEAP-1 또는 그의 유사체 또는 동족체에 존재하는 에피토프)에 노출시켜, 이러한 포유류가 상기 에피토프에 대해 특이적인 면역 반응을 생성시키도록 (예를 들면, 해당 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체를 생성시키도록) 하는 단계를 포함한다. 바람직한 방법에서는, STEAP-1 면역원이 생물학적 모티프 [참고: 예를 들어, 표 V-XVIII 및 XXII-LI], 또는 도 5, 도 6, 도 7, 도 8 및 도9에 지시된 STEAP-1로부터의 일정 크기 범위의 펩티드를 함유한다.
전체 STEAP-1 단백질, 그의 면역원성 영역 또는 에피토프를 합하고 각종 수단에 의해 전달할 수 있다. 이러한 백신 조성물에는, 예를 들어 리포펩티드 [참고: 예를 들어, Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95: 341, 1995], 폴리(DL-락티드-코-글리콜리드) ("PLG") 미소구에 피막형성된 펩티드 조성물 [참고: 예를 들어, Eldridge, et al., Molec. Immunol. 28: 287-294, 1991: Alonso et al., Vaccine 12: 299-306, 1994; Jones et al., Vaccine 13: 675-681, 1995], 면역 자극 복합체 (ISCOMS) 내에 함유된 펩티드 조성물 [참고: 예를 들어, Takahashi et al., Nature 344: 873-875, 1990; Hu et al., Clin Exp Immunol. 113: 235-243, 1998], 다중 항원 펩티드 시스템 (MAPs) [참고: 예를 들어, Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5409-5413, 1988; Tam, J. P., J. Immunol. Methods 196: 17-32, 1996], 다가 펩티드로서 제형화된 펩티드; 탄도 전달 시스템에 사용하기 위한 펩티드, 전형적으로 결정화 펩티드, 바이러스성 전달 벡터 [참고: Perkus, M. E. et al., In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 379, 1996; Chakrabarti, S. et al., Nature 320:535, 1986; Hu, S. L. et al., Nature 320:537, 1986; Kieny, M.-P. et al., AIDS Bio/Technology 4:790, 1986; Top, F. H. et al., J. Infect. Dis. 124:148, 1971; Chanda, P. K.et al., Virology 175:535, 1990], 바이러스성 또는 합성 기원 입자 [참고: 예를 들어, Kofler, N. et al., J. lmmunol. Methods, 192:25, 1996; Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993; Falo, L. D., Jr. et al., Nature Med. 7: 649, 1995], 아주반트 [참고: Warren, H. S., Vogel, F. R., and Chedid, L. A. Annu. Rev. Immunol. 4: 369, 1986; Gupta, R. K. et al., Vaccine 11:293, 1993], 리포솜 [참고: Reddy, R. et al., J. Immunol. 148:1585, 1992; Rock, K. L., Immunol. Today 17:131, 1996], 또는 노출된 (있는 그대로의) 또는 입자 흡수된 cDNA [참고: Ulmer, J. B. et al., Science 259:1745, 1993; Robinson, H. L., Hunt, L. A., and Webster, R. G., Vaccine 11:957, 1993; Shiver, J. W. et al., In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 423, 1996; Cease, K. B., and Berzofsky, J. A., Annu. Rev. Immunol. 12:923, 1994 and Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993]가 포함될 수 있다. 수용체 매개된 표적화로서 공지되기도 한, 독소-표적화 전달 기술, 예를 들어 공급처 [Avant Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachusetts)]의 전달 기술을 사용할 수도 있다.
STEAP-1-관련 암 환자에서는, 본 발명의 백신 조성물을 기타 암 치료법, 예를 들어 수술, 화학요법, 약물 요법, 방사선 요법 등과 연계해서 사용할 수도 있는데, 이에는 면역 아주반트, 예를 들어 IL-2, IL-12, GM-CSF 등과 병용해서 사용하는 것이 포함된다.
세포성 백신:
CTL 에피토프는 상응하는 HLA 대립 유전자와 결합하는 STEAP-1 단백질 내의 펩티드를 확인하기 위한 특이적 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다 [참고: 표 IV; Epimatrix™ and Epimer™, Brown University (URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); and BIMAS, (URL bimas.dcrt.nih.gov/; SYFPEITHI at URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/)]. 바람직한 양태에서는, STEAP-1 면역원이 당해 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 확인된 하나 이상의 아미노산 서열, 예를 들어 표 V-XVIII 및 XXII-LI에 제시된 서열, 또는 HLA 부류 I 모티프/슈퍼모티프에 의해 지정된 8, 9, 10 또는 11개 아미노산의 펩티드 [예: 표 IV (A), 표 IV (D), 또는 표 IV (E)] 및(또는) HLA 부류 II 모티프/슈퍼모티프를 포함하는 9개 이상 아미노산의 펩티드 [예: 표 IV (B) 또는 표 IV (C)]를 함유한다. 당해 분야에 인지된 바와 같이, HLA 부류 I 결합 홈은 본질적으로 말단이 폐쇄되었기 때문에, 단지 특정한 크기 범위의 펩티드가 이러한 홈에 맞춰져 결합될 수 있으며, 일반적으로 HLA 부류 I 에피토프는 길이가 8, 9, 10 또는 11개 아미노산이다. 이와는 달리, HLA 부류 II 결합 홈은 본질적으로 말단이 개방되었기 때문에, 약 9개 이상 아미노산의 펩티드가 HLA 부류 II 분자에 의해 결합될 수 있다. HLA 부류 I과 HLA 부류 II 간의 결합 홈 차이로 인해, HLA 부류 I 모티프는 길이 특이적인데, 즉 부류 I 모티프의 위치 2가 펩티드의 아미노에서 카복실 방향으로 두 번째 아미노산이다. 부류 II 모티프 내의 아미노산 위치는 전체 펩티드가 아니라, 단지 서로에 대해서만 상대적인데, 즉 부가의 아미노산을 모티프-보유 서열의 아미노 및(또는) 카복실 말단에 부착시킬 수 있다. HLA 부류 II 에피토프는 종종, 길이가 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 이상 아미노산이다.
포유류에서 면역 반응을 생성시키기 위한 광범위한 방법은 (예를 들어, 하이브리도마 생성에 있어서의 제1 단계로서) 당해 분야에 공지되어 있다. 포유류에서 면역 반응을 생성시키는 방법은 포유류의 면역계를 단백질 (예: STEAP-1 단백질) 상의 면역원성 에피토프에 노출시켜 면역 반응이 생성되도록 하는 것을 포함한다. 전형적인 양태는 특정 숙주를 충분한 양의 하나 이상의 STEAP-1 B 세포 또는 세포독성 T-세포 에피토프 또는 그의 유사체와 접촉시키고; 그 후 1회 이상의 주기적 간격으로 상기 숙주를 STEAP-1 B 세포 또는 세포독성 T-세포 에피토프 또는 그의 유사체와 재접촉시킴으로써, 상기 숙주에서 STEAP-1에 대한 면역 반응을 생성시키는 방법으로 이루어진다. 구체적 양태는 백신 제제 중의 STEAP-1 면역원 (예: STEAP-1 단백질 또는 그의 펩티드 단편, STEAP-1 융합 단백질 또는 유사체 등)을 인간 또는 또 다른 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, STEAP-1-관련 단백질 또는 인공 다중-에피토프성 펩티드에 대항한 면역 반응을 생성시키는 방법으로 이루어진다. 전형적으로, 이러한 백신 제제는 적합한 아주반트 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제6,146,635호] 또는 만능 조력 에피토프, 예를 들어 PADRE™ 에피토프 [공급처: Epimmune Inc., San Diego, CA; 참고: 예를 들어, Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1633; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 and Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92]를 추가로 함유한다. 또 다른 방법은 STEAP-1 면역원을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자를 개개인의 신체 근육 또는 피부로 생체내 투여함으로써, 이러한 STEAP-1 면역원에 대항하여 개개인에게서 면역 반응을 생성시키는 것을 포함하는데, 상기 DNA 서열은 이러한 DNA 서열의 발현을 제어하는 조절성 서열과 작동적으로 연결되고, 상기 DNA 분자는 세포에 의해 흡수되며, DNA 서열은 이들 세포에서 발현되고 면역 반응은 상기 면역원에 대항하여 생성된다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,962,428호]. 임의로는, 유전적 백신 촉진제, 예를 들어 음이온성 지질; 사포닌; 렉틴; 에스트로겐성 화합물; 히드록시화 저급 알킬; 디메틸 설폭사이드; 및 우레아를 또한 투여한다. 또한, 표적 항원에 대한 반응을 생성시키기 위해, STEAP-1을 모방하는 항-개체특이형 항체를 투여할 수 있다.
핵산 백신:
본 발명의 백신 조성물에는 핵산-매개된 양식이 포함된다. 본 발명의 단백질(들)을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 환자에게 투여할 수 있다. 유전적 면역화 방법을 이용하여, STEAP-1을 발현하는 암 세포에 대항하여 지시된 예방적 또는 치료적 체액성 및 세포성 면역 반응을 생성시킬 수 있다. STEAP-1-관련 단백질/면역원을 코딩하는 DNA 및 적당한 조절성 서열을 포함하는 구조물을 개개인의 근육 또는 피부에 직접 주사하여, 이러한 근육 또는 피부 세포가 상기 구조물을 흡수하고 코딩된 STEAP-1 단백질/면역원을 발현하도록 한다. 또 다른 한편으론, 백신이 STEAP-1-관련 단백질을 포함한다. STEAP-1-관련 단백질 면역원의 발현으로 인해, STEAP-1 단백질을 보유하고 있는 세포에 대항한 예방적 또는 치료적 체액성 및 세포성 면역이 생성된다. 당해 분야에 공지된 각종 예방적 및 치료적 유전적 면역화 기술을 사용할 수 있다 [이에 대한 고찰은 인터넷 주소 genweb.com에 공개된 정보와 참고 문헌을 참고할 수 있다]. 핵산에 의거한 전달이, 예를 들어, 다음 문헌에 기재되었다 [참고: Wolff et. al., Science 247: 1465 (1990), 및 미국 특허 제5,580,859호; 제5,589,466호; 제5,804,566호; 제5,739,118호; 제5,736,524호; 제5,679,647호; WO 98/04720]. DNA에 의거한 전달 기술의 예에는 "노출된 DNA", 촉진된 (부피비카인, 중합체, 펩티드-매개된) 전달, 양이온성 지질 복합체, 및 입자-매개된 ("유전자 총") 또는 압력-매개된 전달이 포함된다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,922,687호].
치료적 또는 예방적 면역화 목적을 위해, 본 발명의 단백질을 바이러스성 또는 세균성 벡터를 통하여 발현시킬 수 있다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 각종 바이러스성 유전자 전달 시스템에는 백시니아, 조류폭스 (fowlpox), 카나리폭스 (canarypox), 아데노바이러스, 인플루엔자, 폴리오바이러스, 아데노 관련 바이러스, 렌티바이러스, 및 신드비스 (sindbis) 바이러스가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다 [참고: 예를 들어, Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 658-663; Tsang et al. J. Natl. Cancer Inst. 87: 982-990 (1995)]. STEAP-1-관련 단백질을 코딩하는 노출된 DNA를 환자에게 도입하여 (예를 들어, 근육내 또는 피내) 항종양 반응을 유도시킴으로써, 비-바이러스성 전달 시스템을 이용할 수도 있다.
예를 들어, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현하기 위한 벡터로서 백시니아 바이러스를 사용한다. 숙주 내로의 도입시, 재조합 백시니아 바이러스는 단백질 면역원성 펩티드를 발현함으로써, 숙주 면역 반응을 유발시킨다. 면역화 프로토콜에 유용한 백시니아 벡터 및 방법이, 예를 들어 미국 특허 제4,722,848호에 기재되었다. 또 다른 벡터는 BCG (Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 문헌 [참고: Stover et al., Nature 351:456-460 (1991)]에 기재되었다. 본 발명의 펩티드를 치료적으로 투여하거나 면역화하는데 유용한 기타 광범위한 벡터, 예를 들어 아데노 및 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스성 벡터, 살모넬라 티피 (Salmonella typhi) 벡터, 해독된 안트락스 독소 벡터 등이 본원의 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
따라서, 유전자 전달 시스템을 사용하여 STEAP-1-관련 핵산 분자를 전달한다. 한 양태에서는, 완전한 길이 인간 STEAP-1 cDNA를 이용한다. 또 다른 양태에서는, 특이적 세포독성 T 림프구 (CTL) 및(또는) 항체 에피토프를 코딩하는 STEAP-1 핵산 분자를 이용한다.
생체외 백신:
각종 생체외 전략을 또한 이용하여 면역 반응을 생성시킬 수 있다. 한 가지 접근법은 STEAP-1 항원을 환자의 면역계에 제시하기 위해 항원 제시 세포 (APCs), 예를 들어 수지상 세포 (DC)를 사용하는 것을 포함한다. 수지상 세포는 MHC 부류 I 및 II 분자, B7 공-자극인자, 및 IL-12를 발현하므로, 고도의 특수 항원 제시 세포이다. 전립선 암에서는, 전립선-특이적 막 항원 (PSMA)의 펩티드로 펄싱된 자기 유래 수지상 세포를 제I상 임상 시험에 사용하여 전립선 암 환자의 면역계를 자극한다 [참고: Tjoa et al., 1996, Prostate 28:65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29: 371-380]. 따라서, 수지상 세포를 사용하여 STEAP-1 펩티드를 MHC 부류 I 또는 II 분자와 관련하여 T 세포에 제시할 수 있다. 한 양태에서는, 자기 유래 수지상 세포를 MHC 부류 I 및(또는) II 분자와 결합할 수 있는 STEAP-1 펩티드로 펄싱한다. 또 다른 양태에서는, 수지상 세포를 완전한 STEAP-1 단백질로 펄싱한다. 또 다른 양태는 당해 분야에 공지된 각종 이행 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 [참고: Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 17-25], 레트로바이러스 [참고: Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56: 3763-3770], 렌티바이러스, 아데노 관련 바이러스, DNA 형질감염 [참고: Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57: 2865-2869], 또는 종양-유래 RNA 형질감염 [참고: Ashley et al.,1997, J. Exp. Med. 186: 1177-1182]을 사용하여 수지상 세포에서의 STEAP-1 유전자의 과발현을 공학적으로 처리하는 것을 포함한다. STEAP-1을 발현하는 세포를 또한 공학적으로 처리하여, 면역 조정인자, 예를 들어 GM-CSF를 발현하도록 할 수 있고, 이를 면역화제로서 사용할 수 있다.
X.B.) 항체에 의거한 요법에 대한 표적으로서의 STEAP-1
STEAP-1은 항체에 의거한 치료적 전략에 대한 흥미로운 표적이다. 세포외 분자와 세포내 분자 둘 다를 표적화하기 위한 수 많은 항체 전략이 당해 분야에 공지되어 있다 [예를 들어, 보체 및 ADCC 매개된 사멸 뿐만 아니라 인트라보디 (intrabody)의 사용]. STEAP-1은 상응하는 정상 세포에 비해 각종 계통의 암 세포에 의해 발현되기 때문에, 면역반응성 조성물이 비-표적 기관 및 조직과 결합됨으로써 유발되는 독성, 비-특이적 및(또는) 비-표적 효과를 수반하지 않으면서, 탁월한 민감도를 나타내는 STEAP-1-면역반응성 조성물의 전신 투여물을 제조한다. STEAP-1의 도메인과 특이적으로 반응성인 항체는, 독소 또는 치료제와의 접합체로서 또는 세포 증식 또는 기능을 억제할 수 있는 노출된 항체로서 STEAP-1-발현성 암을 전신 치료하는데 유용하다.
STEAP-1 항체를 환자에게 도입하여, 이러한 항체가 STEAP-1과 결합하여 특정 기능, 예를 들어 결합 파트너와의 상호 작용을 조정하고, 결과적으로 종양 세포의 파괴를 매개하고/하거나 종양 세포의 성장을 억제하도록 할 수 있다. 이러한 항체가 치료적 효과를 발휘하는 기전에는 보체-매개된 세포용해, 항체-의존성 세포성 세포독성, STEAP-1의 생리적 기능 조정, 리간드 결합 또는 신호 전달 경로의 억제, 종양 세포 분화의 조정, 종양 혈관형성 인자 프로파일의 변경, 및(또는) 세포소멸이 포함될 수 있다. 이의 예에는 비호지킨 림프종 (Non-Hodgkins Lymphoma)에 대한 리툭산 (Rituxan®), 전이성 유방암에 대한 헤르셉틴, 및 결장직장암에 대한 에르비툭스 (Erbitux®)가 포함된다.
당업자는 항체를 사용하여 면역원성 분자, 예를 들어 도 2 또는 도 3에 도시된 STEAP-1 서열의 면역원성 영역을 특이적으로 표적화하고 이와 결합할 수 있다는 것을 인지하고 있다. 또한, 당업자는 항체를 세포독성제에 접합시키는 것이 통상적이란 사실도 인지하고 있다 [참고: 예를 들어, Sievers et al. Blood 93: 11 3678-3684 (June 1, 1999)]. 세포독성제 및(또는) 치료제를 세포에 직접 전달하는 경우, 예를 들어 이들을 상기 세포에 의해 발현된 분자 (예: STEAP-1)에 대해 특이적 항체와 접합시킴으로써 직접 전달하는 경우에는, 세포독성제가 이들 세포 상에서 자신의 공지된 생물학적 효과 (즉, 세포독성)을 발휘할 것이다.
세포를 사멸시키기 위해 항체-세포독성제 접합체를 사용하는 광범위한 조성물 및 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 암과 관련하여, 전형적인 방법은 세포 표면 상에 국재되거나 결합하기 위해 이용 가능한, 발현된 마커 (예: STEAP-1)와 결합하는 표적화제 (예: 항-STEAP-1 항체)와 연결된 선택된 세포독성제 및(또는) 치료제를 포함하는 접합체의 생물학적 유효량을, 종양이 있는 동물에게 투여하는 것을 수반한다. 전형적인 양태는 세포독성제를 STEAP-1 에피토프와 면역특이적으로 결합하는 항체와 접합시키고, 이 세포를 항체-작용제 접합체에 노출시키는 것을 포함하여, 세포독성제 및(또는) 치료제를 STEAP-1을 발현하는 세포에 전달하는 방법이다. 또 다른 예시 양태는 세포독성제 및(또는) 치료제와 접합된 항체의 치료상 유효량을 포함하는 제약 조성물을, 전이된 암으로 고통받고 있는 것으로 의심되는 개개인에게 비경구 투여하는 단계를 포함하여, 이러한 전이된 암으로 고통받고 있는 것으로 의심되는 개개인을 치료하는 방법이다.
항-STEAP-1 항체를 이용하는 암 면역요법은 기타 유형의 암, 예를 들어 결장암 [참고: Arlen et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138], 다발성 골수종 [참고: Ozaki et al., 1997, Blood 90:3179-3186, Tsunenari et al., 1997, Blood 90: 2437-2444], 위암 [참고: Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52:2771-2776], B-세포 림프종 [참고: Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101], 백혈병 [참고: Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20:581-589], 결장직장암 [참고: Moun et al., 1994, Cancer Res. 54: 6160-6166; Velders et al., 1995, Cancer Res. 55: 4398-4403], 및 유방암 [참고: Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127]을 치료하는데 성공적으로 이용되어 온 각종 접근법에 따라서 수행할 수 있다. 몇몇 치료적 접근법은 노출된 항체를 독소 또는 방사성 동위원소에 접합시키는 것, 예를 들어 Y91 또는 I131를 각각 항-CD20 항체 [예: Zevalin™; 공급처: IDEC Pharmaceuticals Corp. 또는 Bexxar™; 공급처: Coulter Pharmaceuticals)]에 접합시키는 것을 포함하는 반면, 기타 접근법은 항체와 기타 치료제를 동시 투여하는 것을 포함하는데, 예를 들어 헤르셉틴 [트라스투주마브 (trastuzuMAb)]을 파클리탁셀 (공급처: Genentech, Inc.)과 동시 투여하는 것이다. 항체를 특정 치료제와 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 전립선 암을 치료하기 위해, STEAP-1 항체를 방사선, 화학요법 또는 호르몬 제거와 연계해서 투여할 수 있다. 또한, 항체를 독소, 예를 들어 칼리케아미신 (calicheamicin) [에: Mylotarg™; 공급처: Wyeth-Ayerst, Madison, NJ; 항종양 항생제 칼리케아미신과 접합된 재조합 인간화 IgG4 카파 항체] 또는 마이탄시노이드 (maytansinoid) [예: 탁산계 종양 활성화 프로드럭, TAP, 플랫폼; 공급처: ImmunoGen, Cambridge, MA; 미국 특허 제5,416,064호 참고] 또는 아우리스타틴 (Auristatin) E (공급처: Seattle Genetics)와 접합시킬 수 있다.
STEAP-1 항체 요법이 모든 병기의 암에 유용하긴 하지만, 항체 요법은 진행된 암 또는 전이성 암에 특히 적당할 수 있다. 본 발명의 항체 요법을 이용한 치료는 화합요법을 한 차례 이상 받은 적이 있는 환자에 대해 지시된다. 또 다른 한편, 본 발명의 항체 요법은 화학요법 치료를 받은 적이 없는 환자에 대해 화학요법 또는 방사선 섭생과 병용한다. 부가적으로, 항체 요법은 특히 화학요법제의 독성을 잘 견디지 못하는 환자에 대해, 수반되는 화학요법의 투여량을 감소시킬 수 있다. 문헌 [참고: Fan et al., Cancer Res. 53:4637-4642, 1993, Prewett et al., International J. of Onco. 9:217-224, 1996, and Hancock et al., Cancer Res. 51: 4575-4580, 1991]에는 각종 항체를 화학요법제와 함께 사용하는 것이 기재되어 있다.
STEAP-1 항체 요법이 모든 병기의 암에 유용하긴 하지만, 항체 요법은 진행된 암 또는 전이성 암에 특히 적당할 수 있다. 본 발명의 항체 요법을 이용한 치료는 화합요법을 한 차례 이상 받은 적이 있는 환자에 대해 지시된다. 또 다른 한편, 본 발명의 항체 요법은 화학요법 치료를 받은 적이 없는 환자에 대해 화학요법 또는 방사선 섭생과 병용한다. 부가적으로, 항체 요법은 특히 화학요법제의 독성을 잘 견디지 못하는 환자에 대해, 수반되는 화학요법의 투여량을 감소시킬 수 있다.
암 환자를 대상으로 하여, 특히 종양 조직의 면역조직화학적 평가, 정량적 STEAP-1 영상화, 또는 STEAP-1 발현의 존재 및 정도를 신뢰할 만한 수준으로 지시해주는 기타 기술을 사용하여, STEAP-1 발현의 존재 및 수준에 대해 평가할 수 있다. 종양 생검 또는 외과적 표본을 면역조직화학적으로 분석하는 것이 이러한 목적에 바람직하다. 종양 조직의 면역조직화학적 분석 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
전립선 암 및 기타 암을 치료하는 항-STEAP-1 모노클로날 항체에는 해당 종양에 대항하여 강력한 면역 반응을 개시시키는 항체, 또는 직접적으로 세포독성인 항체가 포함된다. 이와 관련하여, 항-STEAP-1 모노클로날 항체 (MAbs)는 보체-매개된 또는 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 기전 [이들 둘 다는 보체 단백질 상의 효과기 세포 Fc 수용체 부위와 상호 작용하기 위해 면역글로불린 분자의 본래의 Fc 부분을 요구한다]에 의해 종양 세포 용해를 유발시킬 수 있다. 또한, 종양 성장에 대해 직접적인 생물학적 효과를 발휘하는 항-STEAP-1 MAbs는 STEAP-1을 발현하는 암을 치료하는데 유용하다. 직접적으로 세포독성 MAbs가 작용하는 기전에는 세포 성장의 억제, 세포성 분화의 조정, 종양 혈관형성 인자 프로파일의 조정, 및 세포소멸의 유도가 포함된다. 특별한 항-STEAP-1 MAb가 항종양 효과를 발휘하는 기전은 당해 분야에 일반적으로 공지된 바와 같이, 세포 사멸을 평가하는 수 많은 시험관내 검정, 예를 들어 ADCC, ADMMC, 보체-매개된 세포 용해 등을 이용하여 평가한다.
몇몇 환자에서는, 뮤린 또는 기타 비-인간 모노클로날 항체, 또는 인간/마우스 키메라 MAbs를 사용하는 것이 비-인간 항체에 대항하여 적당한 수준 내지 강력한 수준의 면역 반응을 유도시킬 수 있다. 이로써, 항체가 순환계로부터 제거될 수 있고 효능이 저하될 수 있다. 대부분의 중증 증례에서는, 이러한 면역 반응이 잠재적으로 신부전증을 유발시킬 수 있는 면역 복합체를 광범위하게 형성시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 치료 방법에 사용된 바람직한 모노클로날 항체는 완전한 인간 또는 인간화이고 표적 STEAP-1 항원과 고 친화성으로 특이적으로 결합하지만, 해당 환자에게서 낮은 항원성을 나타내거나 항원성을 전혀 나타내지 않는 것이다.
본 발명의 치료 방법은 단일 항-STEAP-1 MAbs 뿐만 아니라 상이한 MAbs의 조합물 또는 칵테일을 투여하는 것을 고려한다. 이러한 MAb 칵테일은 이들이 상이한 에피토프를 표적으로 하거나, 상이한 효과기 기전을 이용하거나 또는 직접 세포독성인 MAbs를 면역 효과기 기능성에 의존하는 MAbs와 조합한 MAbs를 함유하는 한은, 특정의 이점을 지닐 수 있다. 이러한 조합한 MAbs는 상승적 치료 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 항-STEAP-1 MAbs는 기타 치료 양식, 예를 들어 각종 화학요법제, 안드로겐-차단제, 면역 조정제 (예: IL-2, GM-CSF), 수술 또는 방사선과 병용하여 투여할 수 있다. 항-STEAP-1 MAbs는 그들의 "노출된" 형태 또는 접합되지 않은 형태로 투여하거나, 또는 이들과 접합된 치료제(들)를 가질 수 있다.
항-STEAP-1 항체 제형은 이러한 항체를 종양 세포에 전달할 수 있는 모든 경로를 통하여 투여한다. 투여 경로에는 정맥내, 복강내, 근육내, 종양내, 피내 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 치료는 일반적으로, 항-STEAP-1 항체 제제를 허용 가능한 투여 경로, 예를 들어 정맥내 주사 (IV)를 통하여, 전형적으로 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 25mg/체중 kg 범위의 용량으로 반복 투여하는 것을 포함한다. 일반적으로, 매주 10 내지 1000 mg MAb 범위의 용량이 유효하고 잘 관용된다.
전이성 유방암을 치료하는데 있어서 헤르셉틴™ MAb를 이용하는 임상 실험에 기초하여, 항-STEAP-1 MAb 제제를 환자 체중 kg당 대략 4 mg의 초기 부하 용량으로 정맥내 투여한 다음, 매주 약 2 mg/kg으로 정맥내 투여하는 것이 허용 가능한 투약 섭생을 나타낸다. 바람직하게는, 초기 부하 용량이 90분 이상 주입제로서 투여된다. 이러한 초기 용량이 잘 관용된다면, 주기적 유지 용량을 30분 이상 주입제로서 투여한다. 당업자에 의해 인지된 바와 같이, 각종 요인이 특별한 경우의 이상적 용량 섭생에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 요인에는, 예를 들어 사용된 Ab 또는 MAbs의 결합 친화성 및 반감기, 환자에게서 STEAP-1 발현 정도, 순환성 유출된 STEAP-1 항원의 정도, 목적하는 정지 상 항체 농도 수준, 치료 횟수, 및 본 발명의 치료 방법과 병용해서 사용된 화학요법제 또는 기타 작용제의 영향 뿐만 아니라 특정 환자의 건강 상태가 포함된다.
임의로는, 가장 유효한 투약 섭생 등을 결정하는 것을 도와주기 위해, 환자를 대상으로 하여 소정의 샘플 중에서의 STEAP-1 수준 (예를 들어, 순환성 STEAP-1 항원 및(또는) STEAP-1 발현성 세포의 수준)을 평가해야 한다. 이러한 평가는 또한, 요법 전반에 걸쳐 모니터링하기 위해 사용되고, 기타 파라미터 [예를 들어, 방광암 요법에서 뇨 세포진 및(또는) 면역세포 수준, 또는 유추에 의함, 전립선 암 요법에서 혈청 PSA 수준]을 평가한 것과 조합하여 치료적 성공을 평가하는데 유용하다.
항-개체특이형 항-STEAP-1 항체는 또한, STEAP-1-관련 단백질을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도시키기 위한 백신으로서 항암 요법에 사용할 수 있다. 특히, 항-개체특이형 항체의 생성 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고; 이러한 방법론은 STEAP-1-관련 단백질 상의 에피토프를 모방하는 항-개체특이형 항-STEAP-1 항체를 생성하도록 용이하게 적응시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foonet al., 1995, J. Clin. Invest. 96: 334-342; Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol. Immunother. 43: 65-76]. 이러한 항-개체특이형 항체를 암 백신 전략에 사용할 수 있다.
X.C.) 세포성 면역 반응에 대한 표적으로서의 STEAP-1
본원에 기재된 바와 같은 면역학적 유효량의 하나 이상의 HLA-결합성 펩티드를 함유하는 백신 및 이의 제조 방법은 본 발명의 추가 양태이다. 더우기, 본 발명에 따르는 백신은 하나 이상의 청구된 펩티드의 조성물을 포괄한다. 펩티드는 백신에 개별적으로 존재할 수 있다. 또 다른 한편으론, 펩티드가 동일한 펩티드의 다중 카피를 포함하는 동종-중합체, 또는 상이한 펩티드의 이종-중합체로서 존재할 수 있다. 중합체는 면역학적 반응을 증가시킨다는 이점을 지니고 있고, 상이한 펩티드 에피토프를 사용하여 중합체를 구성하는 경우에는, 면역 반응을 위해 표적화된 종양 관련 펩티드 또는 병원성 유기체의 상이한 항원 결정기와 반응하는 항체 및(또는) CTLs를 유도시킬 수 있는 부가의 능력을 지니고 있다. 조성은 특정 항원의 천연 발생적 영역일 수 있거나, 또는 예를 들어, 재조합적으로 또는 화학적 합성에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 백신과 함께 사용될 수 있는 캐리어는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이에는 예를 들어, 티로글로불린, 알부민, 예를 들면, 인간 혈청 알부민, 파상풍 톡소이드, 폴리아미노산, 예를 들면, 폴리 L-리신, 폴리 L-글루탐산, 인플루엔자, B형 간염 바이러스 코어 단백질 등이 포함된다. 본 발명의 백신은 생리적으로 관용되는 (즉, 허용 가능한) 희석제, 예를 들어 물 또는 식염수, 바람직하게는 인산염 완충 식염수를 함유할 수 있다. 백신은 또한 전형적으로 아주반트를 포함한다. 불완전 프로인트 아주반트 등의 아주반트, 인산알루미늄, 수산화알루미늄 또는 백반이 당해 분야에 널리 공지된 물질의 예이다. 부가적으로, 본원에 기재된 바와 같이, CTL 반응은 본 발명의 펩티드를 지질, 예를 들어 트리팔미토일-S-글리세릴시스테이닐세릴-세린 (P3CSS)에 접합시킴으로써 개시시킬 수 있다. 더우기, 합성 시토신-포스포로티올화-구아닌-함유 (CpG) 올리고뉴클레오티드 등의 아주반트가 CTL 반응을 10배 내지 100배 증가시키는 것으로 밝혀졌다 [참고: 예를 들어, Davila and Celis, J. Immunol. 165: 539-547 (2000)].
주사, 에어로솔, 경구, 경피, 경근육, 흉막내, 수막강내 또는 기타 적합한 경로를 통하여 본 발명에 따르는 펩티드 조성물로 면역시키면, 숙주의 면역계는 목적하는 항원에 대해 특이적인 다량의 CTLs 및(또는) HTLs을 생성시킴으로써 해당 백신에 반응한다. 결과적으로, 숙주는 STEAP-1 항원을 발현 또는 과발현하는 세포의 나중 발생에 대해 적어도 부분적으로 면역이 되었거나, 또는 항원이 종양 관련된 경우에는 적어도 몇몇 치료적 이점을 얻는다.
몇몇 양태에서는, 표적 항원에 대해 지시된 중화 항체 및(또는) 조력 T 세포 반응을 유도시키거나 촉진시키는 성분을 부류 I 펩티드 성분과 조합하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 조성물의 바람직한 양태는 본 발명에 따르는 부류 I 및 부류 II 에피토프를 포함한다. 이러한 조성물의 또 다른 양태는 본 발명에 따르는 부류 I 및(또는) 부류 II 에피토프를, 교차 반응성 HTL 에피토프, 예를 들어 PADRE™ (공급처: Epimmune, San Diego, CA) 분자 (예를 들어, 미국 특허 제5,736,142호에 기재됨)와 함께 포함한다.
본 발명의 백신은 또한, 본 발명의 펩티드를 제시하기 위한 비히클로서 항원-제시 세포 (APC), 예를 들어 수지상 세포 (DC)를 포함할 수 있다. 백신 조성물은 수지상 세포를 고정화 및 수거함으로써, 수지상 세포의 부하가 시험관 내에서 일아나도록 하여 시험관 내에서 창출시킬 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포를, 예를 들면, 본 발명에 따르는 미니유전자로 형질감염시키거나, 또는 펩티드로 펄싱한다. 이어서, 수지상 세포를 환자에게 투여하여 생체내 면역 반응을 유발시킬 수 있다. DNA에 의거하거나 펩티드에 의거한 백신 조성물은 또한, 수지상 세포 고정화와 병용해서 생체내 투여함으로써, 수지상 세포의 부하가 생체 내에서 일어나도록 할 수 있다.
바람직하게는, 백신에 사용하기 위한 폴리에피토프성 조성물에 포함시키기 위해 에피토프 어레이를 선별하는 경우, 또는 백신에 포함되고/되거나 미니유전자 등의 핵산에 의해 코딩될 별개의 에피토프를 선별하기 위해 다음 원리를 활용한다. 이와 같이 선별하기 위해서는, 다음 원리 각각이 균형을 이루는 것이 바람직하다. 소정의 백신 조성물 내로 혼입될 다중 에피토프는, 이러한 에피토프가 유래되는 본래의 항원 내에서 서열상 연속될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.
1.) 투여시, 종양 제거와 상관이 있는 것으로 관찰된 면역 반응을 모방하는 에피토프를 선별한다. HLA 부류 I의 경우, 이에는 하나 이상의 종양 관련 항원 (TAA)으로부터 유래되는 3 내지 4개의 에피토프가 포함된다. HLA 부류 II의 경우에는, 유사한 이론적 근거가 이용되는데; 하나 이상의 TAA로부터 3 내지 4개의 에피토프가 다시 선별된다 [참고: 예를 들어, Rosenberg et al., Science 278: 1447-1450]. 하나의 TAA로부터의 에피토프를 하나 이상의 부가의 TAAs로부터의 에피토프와 병용해서 사용하여, 자주 발현된 TAAs의 다양한 발현 패턴을 지닌 종양을 표적으로 하는 백신을 생성시킬 수 있다.
2.) 면역원성과 상관이 있는 것으로 확립된 필수 결합 친화도를 지닌 에피토프를 선별하는데; HLA 부류 I의 경우에는, 500 nM 이하, 종종 200 nM 이하의 IC50을 나타내고 부류 II의 경우에는, 1000 nM 이하의 IC50을 나타낸다.
3.) 광범위한 집단 적용 범위를 제공하기 위해, 충분한 슈퍼모티프 보유 펩티드, 또는 대립 유전자-특이적 모티프-보유 펩티드의 충분한 어레이를 선별한다. 예를 들어, 80% 이상 집단 적용 범위를 갖는 것이 바람직하다. 당해 분야에 공지된 통계적 평가 방법인 몬테 카를로 (Monte Carlo) 분석을 이용하여 집단 적용 범위의 폭 또는 여분을 평가할 수 있다.
4.) 암 관련 항원으로부터 에피토프를 선별하는 경우에는, 유사체를 선별하는 것이 종종 유용한데, 이는 환자에게 본래의 에피토프에 대한 관용이 발생했을 수도 있기 때문이다.
5.) 특히 관련된 것은 "축소 (nested) 에피토프"로서 지칭된 에피토프이다. 축소 에피토프는 2개 이상의 에피토프가 소정의 펩티드 서열에서 중복되는 경우에 발생한다. 축소 펩티드 서열은 B 세포, HLA 부류 I 및(또는) HLA 부류 II 에피토프를 포함할 수 있다. 축소 에피토프를 제공하는 경우에는, 총괄적인 목적이 서열당 가장 큰 수의 에피토프를 제공하는 것이다. 따라서, 특정 국면은 펩티드 내의 아미노 말단 에피토프의 아미노 말단 및 카복실 말단 에피토프의 카복실 말단 보다 더 긴 펩티드가 제공되는 것을 피하는 것이다. 다중-에피토프성 서열, 예를 들어 축소 에피토프를 포함하는 서열을 제공하는 경우에는, 이것이 병리적 또는 기타 열악한 생물학적 특성을 지니지 않도록 보장하기 위해 상기 서열을 스크리닝하는 것이 일반적으로 중요하다.
6.) 폴리에피토프성 단백질이 창출되거나, 또는 미니유전자를 창출시키는 경우에는, 관심있는 에피토프를 포괄하는 가장 작은 펩티드를 생성시키는 것이 목표이다. 이러한 원리는, 축소 에피토프를 포함하는 펩티드를 선별하는 경우에 이용된 것과 동일하지는 않지만 유사하다. 그러나, 인공 폴리에피토프성 펩티드를 이용하는 경우에는, 크기 최소화 목표가 폴리에피토프성 단백질 내의 에피토프들 간의 모든 스페이서 서열을 통합할 필요성과 평형을 이루어 밸런스를 유지한다. 스페이서 아미노산 잔기는, 예를 들어 연접부 에피토프 (표적 항원에는 존재하지 않는 면역계에 의해 인식되고, 에피토프의 인공 위치근방에 의해서만 창출되는 에피토프)를 피하기 위해, 또는 에피토프들 간의 절단을 촉진시킴으로서 에피토프 표시를 증강시키기 위해 도입할 수 있다. 연접부 에피토프는 일반적으로 피해지는데, 이는 수용자가 비-본래의 에피토프에 대한 면역 반응을 생성시킬 수 있기 때문이다. 특히 우려할만한 것은 "우성 에피토프"인 연접부 에피토프이다. 우성 에피토프는 이러한 열광적인 반응을 유발시켜 다른 에피토프에 대한 면역 반응이 감소 또는 억제되도록 할 수 있다.
7.) 동일한 표적 단백질의 다중 변이체의 서열이 존재하는 경우에는, 그들의 (자연) 보존을 근거로 하여 잠재적 펩티드 에피토프를 선별할 수도 있다. 예를 들어, 보존에 대한 기준은 HLA 부류 I 결합성 펩티드의 전체 서열 또는 부류 II 결합성 펩티드의 전체 9량체 코어가, 특이적 단백질 항원에 대해 평가된 지정된 비율의 서열에 보존적인 것으로 규정할 수 있다.
X.C.1. 미니유전자 백신
다중 에피토프의 동시 전달을 허용해주는 수 많은 상이한 접근법이 이용 가능하다. 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산이 특히 유용한 본 발명의 양태이다. 미니유전자 내에 포함시키기 위한 에피토프는 바람직하게, 앞서 섹션에 기재된 지침에 따라서 선별한다. 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산을 투여하는 바람직한 수단은 본 발명의 1개 또는 다중 에피토프를 포함하는 펩티드를 코딩하는 미니유전자 구조물을 이용한다.
다중-에피토프 미니유전자의 용도가 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Ishioka et al., J. Immunol. 162:3915-3925, 1999; An, L. and Whitton, J. L., J. Virol. 71:2292, 1997; Thomson, S. A. et al., J. Immunol. 157:822, 1996; Whitton, J. L. et al., J. Virol. 67:348, 1993; Hanke, R. et al., Vaccine 16:426, 1998]. 예를 들어, 슈퍼모티프- 및(또는) 모티프-보유 에피토프 유래된 STEAP-1를 코딩하는 다중-에피토프 DNA 플라스미드, STEAP-1로부터의 PADRE® 만능 조력 T 세포 에피토프 또는 다중 HTL 에피토프 [참고: 예를 들어, 표 V-XVIII 및 XXII 내지 LI], 및 내형질 세망-전위성 신호 서열을 공학적으로 처리할 수 있다. 백신은 또한, 기타 TAAs로부터 유래되는 에피토프를 포함할 수 있다.
다중-에피토프성 미니유전자의 면역원성을 트랜스제닉 마우스에서 확인하여, 시험된 에피토프에 대항한 CTL 유도 반응 크기를 평가할 수 있다. 추가로, 생체내 DNA-코딩된 에피토프의 면역원성을, DNA 플라스미드로 형질감염시킨 표적 세포에 대항한 특이적 CTL 계열의 시험관내 반응과 상관지을 수 있다. 따라서, 이들 실험은 1) 미니유전자가 CTL 반응을 생성시키는 작용을 하고, 2) 유도된 CTLs이 코딩된 에피토프를 발현하는 세포를 인식하였다는 것을 보여줄 수 있다.
예를 들어, 인간 세포에서 발현하기 위해 선별된 에피토프를 코딩하는 DNA 서열 (미니유전자)를 창출시키기 위해, 이러한 에피토프의 아미노산 서열을 역해독할 수 있다. 인간 코돈 활용 표를 사용하여 각 아미노산에 대한 코돈 선택을 안내할 수 있다. 이들 에피토프-코딩 DNA 서열을 직접적으로 연결시켜, 해독된 경우에 연속된 폴리펩티드 서열이 창출되도록 할 수 있다. 발현 및(또는) 면역원성을 최적화하기 위해, 부가의 요소를 미니유전자 디자인 내로 혼입시킬 수 있다. 역해독될 수 있고 미니유전자 서열 내에 포함될 수 있는 아미노산 서열의 에에는 HLA 부류 I 에피토프, HLA 부류 II 에피토프, 항체 에피토프, 유비퀴틴화 (ubiquitination) 신호 서열, 및(또는) 내형질 세망 표적화 신호가 포함된다. 또한, CTL 및 HTL 에피토프의 HLA 제시는 CTL 또는 HTL 에피토프에 인접한 합성 (예: 폴리-알라닌) 또는 천연 발생적 플랭킹 서열을 포함시킴으로써 개선시킬 수 있고; 에피토프(들)를 포함하는 이들 보다 큰 펩티드도 본 발명의 범위 내에 있다.
미니유전자의 플러스 및 마이너스 가닥을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 어셈블리함으로써, 미니유전자 서열을 DNA로 전환시킬 수 있다. 중복 올리고뉴클레오티드 (30 내지 100개 염기 길이)를 널리 공지된 기술을 이용하여 적당한 조건 하에, 합성, 인산화, 정제 및 어닐링할 수 있다. 예를 들어, T4 DNA 리가제를 사용하여, 상기 올리고뉴클레오티드의 말단을 연결시킬 수 있다. 이어서, 에피토프 폴리펩티드를 코딩하는 이러한 합성 미니유전자를 목적하는 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있다.
당업자에게 널리 공지된 표준 조절성 서열이 표적 세포 내에서의 발현을 보장하기 위해 벡터에 포함되는 것이 바람직하다. 몇 가지 벡터 요소가 요망된다: 미니유전자 삽입을 위한 하단 클로닝 부위를 수반한 프로모터; 효율적인 전사 종결을 위한 폴리아데닐화 신호; 이. 콜라이 (E. coli) 복제 기점; 및 이. 콜라이 선별성 마커 (예: 앰피실린 또는 카나마이신 내성). 이를 위해 수 많은 프로모터, 예를 들어 인간 시토메갈로바이러스 (hCMV) 프로모터를 사용할 수 있다. 기타 적합한 프로모터 서열에 관해서는 미국 특허 제5,580,859호 및 제5,589,466호를 참고할 수 있다.
미니유전자 발현 및 면역원성을 최적화하기 위해서는 부가의 벡터 변형이 요망될 수 있다. 몇몇 경우에는, 효율적인 유전자 발현을 위해 인트론이 요구되고, 하나 이상의 합성 또는 천연 발생적 인트론을 미니유전자의 전사된 영역 내로 혼입할 수 있다. 포유류 세포에서 복제하기 위한 서열 및 mRNA 안정화 서열을 포함시키는 것 역시 미니유전자 발현을 증가시키기 위해 고려될 수 있다.
발현 벡터가 일단 선별되면, 미니유전자를 프로모터의 폴리링커 영역 하단 내로 클로닝한다. 이러한 플라스미드를 적당한 이. 콜라이 균주 내로 형질전환시키고, 표준 기술을 사용하여 DNA를 제조한다. 미니유전자의 배향 및 DNA 서열 뿐만 아니라 벡터 내에 포함된 기타 모든 요소를, 제한 지도화 및 DNA 서열 분석을 이용하여 확인한다. 정확한 플라스미드가 정착한 세균성 세포를 마스터 세포 은행 및 활동중인 세포 은행으로서 저장할 수 있다.
또한, 면역자극 서열 (ISSs 또는 CpGs)은 DNA 백신의 면역원성에 일정 역할을 하는 것으로 여겨진다. 이들 서열은 경우에 따라 면역원성을 증강시키기 위해, 미니유전자 코딩 서열을 벗어나서 벡터 내에 포함될 수 있다.
몇몇 양태에서는, 미니유전자-코딩된 에피토프와 제2 유전자 (면역원성을 증강시키거나 감소시키기 위해 포함됨) 둘 다를 생성시켜 주는 바이-시스트론성 (bi-cistronic) 발현 벡터를 사용할 수 있다. 공동-발현되는 경우에 면역 반응을 유리하게 증강시킬 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드의 예에는 사이토킨 (예: IL-2, IL-12, GM-CSF), 사이토킨-유도성 분자 (예: LeIF), 공-자극성 분자, 또는 HTL 반응의 경우에는, 범-DR 결합성 단백질 (PADRE™; 공급처: Epimmune, San Diego, CA)이 포함된다. 조력 (HTL) 에피토프를 세포내 표적화 신호에 연결시킬 수 있고, 이를 발현된 CTL 에피토프와 별개로 발현시킬 수 있는데; 이로써, HTL 에피토프의 방향이 CTL 에피토프와는 상이한 세포 구획을 향할 수 있다. 경우에 따라, 이는 HTL 에피토프가 HLA 부류 II 경로 내로 보다 효율적으로 유입되도록 촉진시킴으로서, HTL 유도를 개선시킬 수 있다. HTL 또는 CTL 유도와는 달리, 면역억제성 분자 (예: TGF-β)의 공동-발현에 의해 면역 반응을 특이적으로 저하시키는 것이 특정 질병에 유익할 수 있다.
예를 들어, 이. 콜라이에서 발효시킨 다음 정제함으로써, 치료량의 플라스미드 DNA를 생성시킬 수 있다. 활동중인 세포 은행으로부터의 분취량을 사용하여 성장 배지에 접종하고, 이를 널리 공지된 기술에 따라서 진탕 플라스크 또는 생물 반응기에서 포화되도록 성장시킨다. 표준 생물분리 기술, 예를 들어 고체 상 음이온 교환 수지 [공급처: QIAGEN, Inc. (Valencia, California)]를 사용하여 플라스미드 DNA를 정제할 수 있다. 경우에 따라, 겔 전기영동 또는 기타 방법을 사용하여 개방 환상 및 선형 형태로부터 초나선 DNA를 분리할 수 있다.
각종 제형을 사용하여 주사하기 위한 정제된 플라스미드 DNA를 제조할 수 있다. 이들 중 가장 간단한 것은 동결건조된 DNA를 멸균성 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 재구성하는 것이다. "노출된 DNA"로서 공지된 이러한 접근법은 현재, 임상 시험에서 근육내 (IM) 투여하기 위해 사용되고 있다. 미니유전자 DNA 백신의 면역요법 효과를 최대화하기 위해, 정제된 플라스미드 DNA를 제형화하기 위한 대체 방법이 요망될 수 있다. 각종 방법이 보고되었고, 새로운 기술도 이용가능할 수 있다. 양이온성 지질, 당지질 및 융합 리포솜을 제형에 사용할 수도 있다 [참고: 예를 들어, WO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6 (7): 682 (1988) ; 미국 특허 제5,279,833호; WO 91/06309; and Felgner, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84: 7413 (1987)]. 또한, 집합적으로 보호성, 상호 작용성, 비-축합성 화합물 (PINC)로서 지칭된 펩티드 및 화합물을 정제된 플라스미드 DNA와 복합체 형성시켜, 안정성, 근육내 분산성, 또는 특이적 기관 또는 세포 유형에 대한 트래픽킹 (trafficking)과 같은 변수에 영향을 미칠 수도 있다.
미니유전자-코딩된 CTL 에피토프의 HLA 부류 I 제시 및 발현을 알아보기 위한 기능적 검정으로서 표적 세포 감작화를 사용할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA를 표준 CTL 크롬 방출 검정에 대한 표적으로 적합한 포유류 세포주 내로 도입한다. 사용된 형질감염 방법은 최종 제형에 좌우될 것이다. "노출된" DNA에 대해서는 전기천공을 사용할 수 있는 반면, 양이온성 지질은 시험관내 형질감염을 허용해준다. 녹색 (그린) 형광성 단백질 (GFP)을 발현하는 플라스미드를 공동-형질감염시켜, 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 이용하여 형질감염된 세포를 강화시킬 수 있다. 이어서, 이들 세포를 크롬-51 (51Cr) 표지시키고, 에피토프-특이적 CTL 주에 대한 표적 세포로서 사용하는데; 51Cr 방출에 의해 탐지된 세포용해는 미니유전자-코딩된 CTL 에피토프의 HLA 제시와 생성 둘 다를 지시한다. HTL 에피토프의 발현은 HTL 활성을 평가하는 검정을 사용하여 유사한 방식으로 평가할 수 있다.
생체내 면역원성은 미니유전자 DNA 제형의 기능적 시험을 위한 제2의 접근법이다. 적당한 인간 HLA 단백질을 발현하는 트랜스제닉 마우스를 DNA 생성물로 면역시킨다. 투여 용량과 경로는 제형 의존적이다 [예를 들어, PBS 중의 DNA의 경우에는 근육내 경로이고, 지질-복합체 형성된 DNA의 경우에는 복강내 경로이다]. 면역시킨지 21일 후, 비장 세포를 수거하고, 이를 시험하고자 하는 각 에피토프를 코딩하는 펩티드의 존재 하에 1주 동안 재자극시킨다. 그 후, CTL 효과기 세포에 대해, 표준 기술을 이용하여 펩티드-부하되고 51Cr-표지된 표적 세포의 세포용해를 알아보기 위한 검정을 수행한다. 미니유전자-코딩된 에피토프에 상응하는 펩티드 에피토프가 부하된 HLA에 의해 감작시킨 표적 세포의 용해는, CTLs를 생체내 유도시키기 위한 DNA 백신 기능을 입증해준다. HTL 에피토프의 면역원성을 유사한 방식으로 트랜스제닉 동물에서 확인한다.
또 다른 한편으론, 예를 들어 미국 특허 제5,204,253호에 기재된 바와 같은 탄도 전달을 이용하여 핵산을 투여할 수 있다. 이러한 기술을 사용하여, DNA로만 구성된 입자를 투여한다. 추가의 대체 양태에서는, DNA를 금 입자와 같은 입자에 부착시킬 수 있다.
당해 분야에 널리 공지된 기타 세균성 또는 바이러스성 전달 시스템을 사용하여 미니유전자를 전달할 수도 있는데, 예를 들어, 본 발명의 에피토프를 코딩하는 발현 구조물을 바이러스성 벡터, 예를 들어 백시니아 내로 혼입할 수 있다.
X.C.2. CTL 펩티드와 조력 펩티드의 조합물
본 발명의 CTL 펩티드를 포함하는 백신 조성물은 목적하는 특성, 예를 들어 혈청 반감기 개선, 집단 적용 범위 확대 또는 면역원성 증강을 제공하도록 변형시킬 수 있는데, 예를 들어 유추시킬 수 있다.
예를 들어, CTL 활성을 유도시킬 수 있는 펩티드의 능력은 이러한 펩티드를 T 조력 세포 반응을 유도할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 함유하는 서열에 연결시킴으로써 증강시킬 수 있다. CTL 펩티드를 T 조력 펩티드에 직접 연결시킬 수도 있지만, 종종 CTL 에피토프/HTL 에피토프 접합체를 스페이서 분자에 의해 연결시킨다. 이러한 스페이서는 전형적으로, 생리적 조건 하에서는 실질적으로 전하를 띠지 않는, 비교적 작은 중성 분자, 예를 들어 아미노산 또는 아미노산 모방체로 구성된다. 이 스페이서는 전형적으로, Ala, Gly, 또는 비극성 아미노산 또는 중성 극성 아미노산의 기타 중성 스페이서 중에서 선택된다. 임의로 존재하는 스페이서가 반드시 동일한 잔기로 구성될 필요는 없으므로, 이종-올리고머 또는 동종-올리고머일 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다. 존재하는 경우, 스페이서는 통상적으로 1개 또는 2개 이상 잔기, 보다 통상적으로는 3개 내지 6개 잔기, 종종 10개 이상 잔기일 것이다. CTL 펩티드 에피토프를, CTL 펩티드의 아미노 또는 카복시 말단에서 스페이서를 통하여 또는 직접적으로 T 조력 펩티드 에피토프에 연결시킬 수 있다. 면역원성 에피토프 또는 T 조력 펩티드의 아미노 말단을 아실화시킬 수 있다.
특정 양태에서는, T 조력 펩티드가 유전적으로 다양한 대다수의 집단에 존재하는 T 조력 세포에 의해 인식되는 것이다. 이는 HLA 부류 II 분자의 대부분 또는 전부와 결합하는 펩티드를 선별함으로써 수행할 수 있다. 많은 HLA 부류 II 분자와 결합하는 아미노산의 예에는 위치 830-843에서 파상풍 톡소이드와 같은 항원으로부터의 서열 QYIKANSKFIGITE (서열 64); 위치 378-398에서 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum) 시르쿰스포로조이트 (circumsporozoite: CS) 단백질로부터의 서열 DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS (서열 65); 및 위치 116-131에서 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 18kD 단백질로부터의 서열 GAVDSILGGVATYGAA (서열 66)이 포함된다. 기타 예에는 DR 1-4-7 슈퍼모티프를 보유하거나, 또는 DR3 모티프 중의 어느 하나를 보유하는 펩티드가 포함된다.
또 다른 한편, 천연상 발견되지 않는 아미노산 서열을 사용하여, 느슨하게 HLA-제한된 방식으로 T 조력 림프구를 자극할 수 있는 합성 펩티드를 제조할 수 있다 [참고: 예를 들어, PCT 공개공보 WO 95/07707]. 범-DR-결합성 에피토프 (예: PADRE™; 공급처: Epimmune, Inc., San Diego, CA)로 불리우는 이들 합성 화합물을, 가장 바람직하게는 대부분의 HLA-DR (인간 HLA 부류 II)분자와 결합하도록 고안한다. 예를 들어, 서열식 XKXVAAWTLKAAX (서열 67) [여기서, "X"는 시클로헥실알라닌, 페닐알라닌 또는 티로신이고, A는 D-알라닌 또는 L-알라닌이다]을 갖는 범-DR-결합성 에피토프 펩티드가 대부분의 HLA-DR 대립 유전자와 결합하고, 그들의 HLA 유형과 상관없이 대부분의 개개인으로부터의 T 조력 림프구의 반응을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 범-DR-결합성 에피토프의 대체물은 모든 "L" 천연 아미노산을 포함하고, 이러한 에피토프를 코딩하는 핵산 형태로 제공될 수 있다.
HTL 펩티드 에피토프를 또한 변형시켜 그들의 생물학적 특성을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 이들 에피토프가 D-아미노산을 포함하도록 변형시켜 프로테아제에 대한 그들의 내성을 증가시켜 혈청 반감기를 연장시킬 수 있거나, 또는 이들 에피토프를 기타 분자, 예를 들어 지질, 단백질, 탄수화물 등과 접합시켜 그들의 생물학적 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, T 조력 펩티드를 아미노 또는 카복실 말단에서 하나 이상의 팔미트산 쇄와 접합시킬 수 있다.
X.C.3. CTL 펩티드와 T 세포 프라이밍 작용제의 조합물
몇몇 양태에서는, 본 발명의 제약 조성물 내에, B 림프구 또는 T 림프구를 프라이밍하는 하나 이상의 성분을 포함시키는 것이 요망될 수 있다. 지질이 생체 내에서 CTL을 프라이밍할 수 있는 작용제로서 확인되었다. 예를 들어, 팔미트산 잔기를 리신 잔기의 ε- 및 α-아미노기에 부착시킨 다음, 예를 들어 하나 이상의 연결성 잔기, 예를 들면, Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser 등을 통하여 면역원성 펩티드에 연결시킬 수 있다. 이어서, 이와 같이 지질화된 펩티드를 미셀 또는 입자 중에서 직접 투여하거나, 리포솜 내로 혼입시켜 투여하거나, 또는 아주반트 (예: 불완전 프로인트 아주반트)에 유화된 채로 투여할 수 있다. 바람직한 양태에서는, 특히 유효한 면역원성 조성물이 Lys의 ε- 및 α-아미노기에 부착된 팔미트산을 포함하는데, 이는 연쇄, 예를 들어 Ser-Ser를 통하여 면역원성 펩티드의 아미노 말단에 부착된다.
CTL 반응의 지질 프라이밍의 또 다른 예로서, 이. 콜라이 지단백질, 예를 들어 트리팔미토일-S-글리세릴시스테이닐세릴-세린 (P3CSS)을 사용하여, 적당한 펩티드에 공유적으로 부착된 경우에 바이러스 특이적 CTL을 프라이밍할 수 있다 [참고: 예를 들어, Deres, et al., Nature 342:561, 1989]. 본 발명의 펩티드를, 예를 들어 P3CSS와 커플링시킬 수 있고, 이러한 지단백질을 개개인에게 투여하여 표적 항원에 대한 면역 반응을 특이적으로 프라이밍한다. 더우기, 중화 항체의 유도는 P3CSS-접합된 에피토프를 이용하여 프라이밍할 수도 있기 때문에, 이러한 조성물 2가지를 합하여 체액성 반응과 세포-매개된 반응 둘 다를 보다 효율적으로 유도시킬 수 있다.
X.C.4. CTL 및(또는) HTL 펩티드로 펄싱된 DC를 포함하는 백신 조성물
본 발명에 따르는 백신 조성물의 양태는 에피토프-보유 펩티드의 칵테일을 환자 혈액으로부터의 PBMC, 또는 이로부터 분리된 DC로 생체외 투여하는 것을 포함한다. DC 수거를 촉진시키는 제약, 예를 들어 프로게니포이에틴 (Progenipoietin™) (공급처: Pharmacia-Monsanto, St. Louis, MO) 또는 GM-CSF/IL-4을 사용할 수있다. 이러한 DC를 펩티드로 펄싱한 후, 및 환자에게 재관류하기 전에, DC를 세척하여 결합되지 않은 펩티드를 제거한다. 이러한 양태에서는, 백신이 표면 상에 HLA 분자와 복합체를 형성한 펄싱된 펩티드 에피토프를 제시하는 펩티드-펄싱된 DCs를 포함한다.
이 DC를 생체 외에서 펩티드의 칵테일로 펄싱하는데, 이들 중의 몇몇은 STEAP-1에 대한 CTL 반응을 자극한다. 임의로는, 조력 T 세포 (HTL) 펩티드, 예를 들어 느슨하게 제한된 천연 또는 인공 HLA 부류 II 펩티드를 포함시켜 CTL 반응을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 백신을 사용하여 STEAP-1을 발현 또는 과발현하는 암을 치료한다.
X.D. 양자 면역요법
항원성 STEAP-1-관련 펩티드를 사용하여 또한, 생체 외에서 CTL 및(또는) HTL 반응을 유도시킨다. 이로써 생성된 CTL 또는 HTL 세포를 사용하여, 기타 통상적인 형태의 요법에는 반응하지 않거나 또는 본 발명에 따르는 치료적 백신 펩티드 또는 핵산에 반응하지 않을 환자에게서 종양을 치료할 수 있다. 특정한 항원에 대한 생체외 CTL 또는 HTL 반응은, 환자의 CTL 또는 HTL 전구체 세포, 또는 유전적으로 화합성인 CTL 또는 HTL 전구체 세포를 항원 제시 세포 (APC), 예를 들어 수지상 세포의 공급원 및 적당한 면역원성 펩티드와 함께, 조직 배양물에서 항온 배양함으로써 유도시킨다. 적당한 항온 배양 시간 (전형적으로, 약 7 내지 28일) 후 (이때, 상기 전구체 세포가 활성화되고 효과기 세포 내로 확장된다), 세포를 환자에게 다시 주입하는데, 이들 세포는 그들의 특이적 표적 세포 (예: 종양 세포)를 파괴시키거나 (CTL) 파괴를 촉진시킬 것이다 (HTL). 형질감염된 수지상 세포를 항원 제시 세포로서 사용할 수도 있다.
X.E. 치료 또는 예방 목적을 위한 백신 투여
본 발명의 제약 및 백신 조성물을 전형적으로 사용하여, STEAP-1을 발현 또는 과발현하는 암을 치료 및(또는) 예방한다. 치료적 적용에서는, 펩티드 및(또는) 핵산 조성물을, 항원에 대한 유효한 B 세포, CTL 및(또는) HTL 반응을 유발시키고 증상 및(또는) 합병증을 치유하거나, 적어도 부분적으로 억제시키거나 또는 느리게 진행되도록 하기에 충분한 양으로 환자에게 투여한다. 이를 수행하는데 적당한 양이 "치료상 유효 용량"으로서 규정된다. 이러한 용도에 유효한 양은, 예를 들어 투여되는 특정한 화합물, 투여 방식, 치료하고자 하는 질병의 병기 및 중증도, 환자의 체중 및 일반적인 건강 상태, 및 담당의의 판단에 좌우될 것이다.
제약 조성물의 경우에는, 본 발명의 면역원성 펩티드, 또는 이를 코딩하는 DNA를 일반적으로, STEAP-1을 발현하는 종양을 이미 보유하고 있는 개개인에게 투여한다. 상기 펩티드 또는 이를 코딩하는 DNA는 개별적으로 투여하거나, 또는 하나 이상의 펩티드 서열의 융합물로서 투여할 수 있다. 환자를 면역원성 펩티드로 별개로 치료하거나, 또는 기타 요법, 예를 들어 경우에 따라 수술과 연계해서 치료할 수 있다.
치료적으로 사용하는 경우에는, 일반적으로 STEAP-1-관련 암의 처음 진단시 투여를 시작해야 한다. 이어서, 적어도 증상이 실질적으로 경감될 때까지 그리고 그후 일정 기간 동안 용량을 증대시킨다. 환자에게 전달된 백신 조성물의 양태 (즉, 이에는 펩티드 칵테일, 폴리에피토프성 폴리펩티드, 미니유전자, 또는 TAA-특이적 CTLs 또는 펄싱된 수지상 세포와 같은 양태가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다)는 병기 또는 환자의 건강 상태에 따라서 다양할 수 있다. 예를 들어, STEAP-1을 발현하는 종양이 있는 환자에게는, STEAP-1-특이적 CTL을 포함하는 백신이, 진행된 질병 환자에게서 종양 세포를 사멸시키는데 있어 대체 양태 보다 더 효능적일 수 있다.
세포독성 T 세포 반응을 효과적으로 자극하는데 충분한 투여 방식에 의해 전달된 펩티드 에피토프의 양을 제공하는 것이 일반적으로 중요하고; 조력 T 세포 반응을 자극하는 조성물이 이러한 본 발명의 양태에 따라서 제공될 수 있다.
초기 치료적 면역화를 위한 투여량은 일반적으로, 단위 투여량 범위 내에 존재하는데, 보다 낮은 값은 약 1, 5, 50, 500, 또는 1,000 ㎍이고 보다 높은 값은 약 10,000; 20,000; 30,000; 또는 50,000 ㎍이다. 인간에 대한 투여량 값은 전형적으로, 환자 70 kg당 약 500 ㎍ 내지 약 50,000 ㎍이다. 수 주 내지 수 개월에 걸친 부스팅 (증대: boosting) 섭생에 따라서 펩티드 약 1.0 ㎍ 내지 약 50,000 ㎍의 부스팅 투여량을, 환자의 혈액으로부터 수득한 CTL 및 HTL의 특이 활성을 측정함으로써 결정된 바와 같은 환자의 반응 및 조건에 따라서 투여할 수 있다. 적어도 임상 증상 또는 실험실 시험이 종양이 제거되거나 감소되었고 그 후 일정 기간 동안 그런 채로 유지되었다는 것을 지시할 때까지 투여를 지속해야 한다. 투여량, 투여 경로 및 용량 스케쥴은 당해 분야에 공지된 방법론에 따라서 조정한다.
특정 양태에서는, 본 발명의 펩티드 및 조성물을 심각한 질병 상태, 즉 생명을 위협하거나 잠재적으로 생명을 위협하는 상황에 이용한다. 이러한 경우에는, 본 발명의 바람직한 조성물 내에 관계없는 물질이 최소량으로 존재하고 펩티드가 비교적 비독성이기 때문에, 상기 언급된 투여량에 비해 실질적으로 과량의 이들 펩티드 조성물을 투여하는 것이 가능하고 담당의는 이러한 투여를 바람직한 것으로 느낄 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 순수하게 예방제로서 사용될 수도 있다. 초기 예방적 면역화를 위한 투여량은 일반적으로, 단위 투여량 범위 내에 존재하는데, 보다 낮은 값은 약 1, 5, 50, 500, 또는 1,000 ㎍이고 보다 높은 값은 약 10,000; 20,000; 30,000; 또는 50,000 ㎍이다. 인간에 대한 투여량 값은 전형적으로, 환자 70 kg당 약 500 ㎍ 내지 약 50,000 ㎍이다. 그 다음, 백신의 초기 투여 후 약 4주 내지 6개월의 일정한 간격으로 펩티드 약 1.0 ㎍ 내지 약 50,000 ㎍의 부스팅 투여량을 투여한다. 백신의 면역원성은 환자의 혈액 샘플로부터 수득한 CTL 및 HTL의 특이 활성을 측정함으로써 평가할 수 있다.
치료적 처치를 위한 제약 조성물은 비경구, 국부, 경구, 비내, 수막강내 또는 국소 (예를 들어, 크림 또는 국소용 연고) 투여용으로 의도된다. 바람직하게는, 제약 조성물을 비경구, 예를 들어 정맥내, 피하, 피내 또는 근육내 투여한다. 따라서, 본 발명은 허용 가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체 내에 용해되거나 현탁된 면역원성 펩티드의 용액을 포함하는 비경구 투여용 조성물을 제공한다.
각종 수성 담체, 예를 들어 물, 완충수, 0.8% 식염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 등을 사용할 수 있다. 이들 조성물은 널리 공지된 통상적인 멸균화 기술에 의해 멸균시킬 수 있거나, 또는 멸균 여과시킬 수 있다. 이로써 생성된 수성 용액을 그 자체로 사용하거나 또는 동결건조된 상태로 패키징할 수 있는데, 동결건조된 제제는 투여하기 전에 멸균성 용액과 합한다.
본 발명의 조성물은 생리적 조건에 근접하도록 요구되는 바와 같은 제약상 허용 가능한 보조 물질, 예를 들어 pH 조정제 및 완충제, 긴장성 조정제, 습윤제, 방부제 등, 예를 들면, 나트륨 아세테이트, 나트륨 락테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 솔비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 함유할 수 있다.
제약 조성물 중의 본 발명의 펩티드의 농도는 광범위하게 다양할 수 있는데, 즉 약 0.1% 미만, 통상적으로 약 2% 이상 내지 20% 내지 50% 중량% 이상일 수 있으며, 이는 주로, 선택된 특정한 투여 방식에 따라서 유체 용적, 점도 등에 의해 선택될 것이다.
특정 조성물의 인간 단위 투여형은 전형적으로, 허용 가능한 담체, 한 양태에서는 수성 담체의 인간 단위 용량을 포함하는 제약 조성물 내에 포함되고, 이는 이러한 조성물을 인간에게 투여하기 위해 사용되는 것으로 당업자에게 공지된 용적/양으로 투여한다 [참고: 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, A. Gennaro, Editor, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1985]. 예를 들어, 초기 면역화를 위한 펩티드 용량은 70 kg 환자의 경우 약 1 내지 약 50,000 ㎍, 일반적으로 100 내지 5,000 ㎍일 수 있다. 예를 들어, 핵산에 대해서는 여러 부위에 0.5 내지 5 mg의 양으로 근육내 (또는 피하 또는 피내) 투여된 노출된 핵산 형태의 발현 벡터를 사용하여 초기 면역화를 수행할 수 있다. 유전자 총을 사용하여 핵산 (0.1 내지 1000 ㎍)을 투여할 수도 있다. 3 내지 4주 동안 항온 배양한 후, 부스터 용량을 투여한다. 이러한 부스터는 5 x 107 내지 5 x 109 pfu의 용량으로 투여된 재조합 조류폭스 바이러스일 수 있다.
항체의 경우에는, 치료가 일반적으로, 허용 가능한 투여 경로, 예를 들어 정맥내 주사 (IV)를 통하여 전형적으로 약 0.1 내지 약 10 mg/체중 kg 범위의 용량으로 항-STEAP-1 항체 제제를 반복 투여하는 것을 포함한다. 일반적으로, 매주 10 내지 500 mg MAb 범위의 용량이 유효하고 잘 관용된다. 더우기, 항-STEAP-1 MAb 제제를 환자 체중 kg당 대략 4 mg의 초기 부하 용량으로 정맥내 투여한 다음, 매주 약 2 mg/kg으로 정맥내 투여하는 것이 허용 가능한 투약 섭생을 나타낸다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 각종 요인들이 특별한 경우의 이상적 용량에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 요인에는, 예를 들어 조성물의 반감기, Ab의 결합 친화성, 특정 물질의 면역원성, 환자에게서 STEAP-1의 발현 정도, 순환성 유출된 STEAP-1 항원의 정도, 목적하는 정지 상 농도 수준, 치료 횟수, 및 본 발명의 치료와 병용해서 사용된 화학요법제 또는 기타 작용제의 영향 뿐만 아니라 특정 환자의 건강 상태가 포함된다. 비-제한적인 바람직한 인간 단위 용량은, 예를 들어 500 ㎍ - 1 mg, 1 mg - 50 mg, 50 mg - 100 mg, 100 mg - 200 mg, 200 mg - 300 mg, 400 mg - 500 mg, 500 mg - 600 mg, 600 mg - 700 mg, 700 mg - 800 mg, 800 mg - 900 mg, 900mg - 1g, 또는 1 mg - 700 mg이다. 특정 양태에서는, 이러한 용량이 2 내지 5 mg/체중 kg의 범위인데, 예를 들어 매주 1 내지 3 mg/kg의 용량; 2, 3 또는 4주간 매주 0.5mg, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mg/체중 kg의 용량; 2, 3, 또는 4주간 매주 0.5 내지 10 mg/체중 kg의 용량; 매주 체면적 ㎡당 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400mg 용량; 매주 체면적 ㎡당 1 내지 600 mg 용량; 매주 체면적 ㎡당 225 내지 400 mg 용량이고; 이들 용량에 이어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 19, 11, 12주 이상 동안 매주 투여할 수 있다.
한 양태에서는, 폴리뉴클레오티드의 인간 단위 투여형이 어떠한 치료 효과도 제공해주는데 적합한 투여량 범위 또는 유효한 양을 포함한다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 치료 효과는 폴리뉴클레오티드의 서열, 폴리뉴클레오티드의 분자량 및 투여 경로를 포함한 수 많은 요인들에 의해 좌우된다. 투여량은 일반적으로, 당해 분야에 공지된 각종 파라미터, 예를 들어 증상 중증도, 환자의 병력 등에 따라서 담당의 또는 전문 의료진에 의해 선택된다. 일반적으로, 약 20개 염기의 폴리뉴클레오티드의 경우에는, 투여량 범위가, 예를 들어 독립적으로 선택된 하한치, 예를 들면, 약 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 또는 500 mg/kg 내지 독립적으로 선택된, 하한치 보다 큰 상한치, 예를 들면, 약 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 10,000 mg/kg 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 용량은 대략 다음과 같을 수 있다: 0.1 내지 100 mg/kg, 0.1 내지 50 mg/kg, 0.1 내지 25 mg/kg, 0.1 내지 10 mg/kg, 1 내지 500 mg/kg, 100 내지 400 mg/kg, 200 내지 300 mg/kg, 1 내지 100 mg/kg, 100 내지 200 mg/kg, 300 내지 400 mg/kg, 400 내지 500 mg/kg, 500 내지 1000 mg/kg, 500 내지 5000 mg/kg, 또는 500 내지 10,000 mg/kg. 일반적으로, 비경구 투여 경로는 증가 길이의 폴리뉴클레오티드 처럼, 병든 조직에 뉴클레오티드를 보다 직접적으로 적용하는 것과 비교해서 보다 고용량의 폴리뉴클레오티드를 요구할 수 있다.
한 양태에서는, T-세포의 인간 단위 투여형이 어떠한 치료 효과도 제공해주는데 적합한 투여량 범위 또는 유효한 양을 포함한다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 치료 효과는 수 많은 요인들에 의해 좌우된다. 투여량은 일반적으로, 당해 분야에 공지된 각종 파라미터, 예를 들어 증상 중증도, 환자의 병력 등에 따라서 담당의 또는 전문 의료진에 의해 선택된다. 용량은 약 104개 세포 내지 약 106개 세포, 약 106개 세포 내지 약 108개 세포, 약 108개 세포 내지 약 1011개 세포, 또는 약 108개 세포 내지 약 5 x 1010개 세포일 수 있다. 용량은 또한, 약 106개 세포/㎡ 내지 약 1010개 세포/㎡, 또는 약 106개 세포/㎡ 내지 약 108개 세포/㎡일 수 있다.
본 발명의 단백질(들), 및(또는) 이러한 단백질(들)을 코딩하는 핵산은 1) 이 단백질(들)이 특정한 조직, 예를 들어 림프계 조직을 표적으로 하게 하거나; 2) 질병 세포를 선택적으로 표적으로 하게 하거나; 또는 3) 펩티드 조성물의 반감기를 증가시키도록 할 수 있는 리포솜을 통하여 투여할 수도 있다. 리포솜에는 에멀션, 포말, 미셀, 불용성 단층, 액상 결정, 인지질 분산제, 층상 층 등이 포함된다. 이들 제제에서는, 전달시키고자 하는 펩티드를 단독으로, 또는 림프계 세포 중에 우세한 수용체와 결합하는 분자, 예를 들어 CD45 항원과 결합하는 모노클로날 항체와 연계해서 또는 기타 치료적 또는 면역원성 조성물과 연계해서, 리포솜의 일부로서 혼입시킨다. 따라서, 본 발명의 펩티드로 충진시켰거나 이러한 펩티드로 장식한 리포솜이 림프계 세포 부위를 향하도록 할 수 있는데, 이때 리포솜이 펩티드 조성물을 전달한다. 본 발명에 따라서 사용하기 위한 리포솜은 표준 소포-형성 지질로부터 형성하는데, 이러한 지질에는 일반적으로, 중성 및 음전하를 띤 인지질 및 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤이 포함된다. 지질의 선택은 일반적으로, 예를 들어 리포솜 크기, 혈류 내에서의 리포솜의 산 불안정 및 안정성을 고려하여 이루어진다. 리포솜을 제조하기 위한 각종 방법이 이용 가능하고, 이는 다음 문헌에 기재된 바와 같다 [참고: Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), 및 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호].
면역계 세포를 표적화하기 위해, 리포솜 내로 혼입될 리간드에는, 예를 들어 목적하는 면역계 세포의 세포 표면 결정기에 대해 특이적인 항체 또는 그의 단편이 포함될 수 있다. 펩티드를 함유하는 리포솜 현탁제를, 특히 투여 방식, 전달되는 펩티드, 및 치료하고자 하는 질병의 병기에 따라서 다양한 용량으로 정맥내, 국소, 국부 등으로 투여할 수 있다.
고형 조성물의 경우에는, 통상적인 비독성 고형 담체를 사용할 수 있는데, 이에는 예를 들어, 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 삭카린, 탈크, 셀룰로스, 글루코스, 슈크로스, 탄산마그네슘 등이 포함된다. 경구 투여의 경우에는, 정상적으로 이용되고 있는 부형제, 예를 들어 앞서 열거된 담체와, 일반적으로 10 내지 95%의 활성 성분, 즉 본 발명의 하나 이상의 펩티드를 보다 바람직하게는 25% 내지 75%로 혼입시킴으로써, 제약상 허용 가능한 비독성 조성물을 형성시킨다.
에어로솔 투여의 경우에는, 면역원성 펩티드가 계면활성제 및 추진체와 함께 미분된 형태로 공급되는 것이 바람직하다. 펩티드의 전형적인 비율은 약 0.01 내지 20 중량%, 바람직하게는 약 1 내지 10 중량%이다. 계면활성제는 물론, 비독성이어야만 하고, 바람직하게는 추진체에 가용성이다. 이러한 작용제의 대표적인 것이 약 6 내지 22개의 탄소 원자를 함유하는 지방산, 예를 들어 카프로산, 옥타노산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레스테르산 및 올레산과 지방족 다가 알코올 또는 그의 사이클릭 무수물과의 에스테르 또는 부분 에스테르이다. 혼합 에스테르, 예를 들어 혼합 또는 천연 글리세라이드를 이용할 수 있다. 계면활성제는 조성물의 약 0.1 내지 20 중량%, 바람직하게는 약 0.25 내지 5 중량%를 차지할 수 있다. 조성물의 나머지 부분은 임의의 추진체이다. 경우에 따라 특정 담체, 예를 들어 비내 전달의 경우 레시틴을 포함할 수도 있다.
XI.) STEAP-1의 진단 및 예후 양태
본원에 기재된 바와 같은 STEAP-1 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 반응성 세포독성 T 세포 (CTL), 반응성 조력 T 세포 (HTL) 및 항-폴리펩티드 항체는, 조절이상된 세포 성장과 연관된 질환, 예를 들어 암, 특히 표 I에 열거된 암을 검사하는 것으로 널리 공지된 진단, 예후 및 치료 검정에 사용한다 [예를 들어, "정상 조직 및 환자 표본에서의 STEAP-1 발현 분석"이란 표제의 실시예에 기재된 바와 같은 특정 암에서의 그의 발현 뿐만 아니라 그의 특이적 패턴의 조직 발현을 참고할 수 있다].
STEAP-1은 전립선 암의 존재를 확인하고 모니터링하기 위해 수년 동안 의사들에 의해 사용되어 온 전형적인 마커인 전립선 관련 항원 PSA로 유추될 수 있다 [참고: 예를 들어, Merrill et al., J. Urol. 163(2): 503-5120 (2000); Polascik et al., J. Urol. Aug; 162(2): 293-306 (1999) and Fortier et al., J. Nat. Cancer Inst. 91(19): 1635-1640 (1999)]. 유사한 맥락에서 각종의 기타 진단 마커가 사용되기도 하는데, 이에는 p53 및 K-ras가 포함된다 [참고: 예를 들어, Tulchinsky et al., Int J Mol Med 1999 Jul 4(1):99-102 and Minimoto et al., Cancer Detect Prev 2000; 24(1):1-12]. 따라서, STEAP-1 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 (뿐만 아니라 이들 분자의 존재를 확인하기 위해 사용되는 STEAP-1 폴리뉴클레오티드 프로브 및 항-STEAP-1 항체) 및 그들의 특성에 관한 설명으로 인해, 당업자는 이들 분자를, 예를 들어 암과 관련된 질환을 검사하도록 지시된 각종 진단 검정에서 사용되는 방법과 유사한 방법에 활용할 수 있다.
STEAP-1 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 반응성 T 세포 및 항체를 활용하는 진단 방법의 전형적인 양태는, 예를 들어 PSA 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 반응성 T 세포 및 항체를 이용하는 널리 확립된 진단 검정으로부터의 방법과 유사하다. 예를 들어, PSA 폴리뉴클레오티드는 단지, PSA 과발현 또는 전립선 암의 전이를 모니터링하는 방법에서 PSA mRNAs의 존재 및(또는) 수준을 관찰하기 위해 프로브로서 사용하고 [예를 들어, 노던 분석에 사용함; 참고: Sharief et al., Biochem. Mol. Biol. lnt. 33 (3):567-74 (1994)], 프라이머로서 사용하기 때문에 [예를 들어, PCR 분석에 사용함; 참고: Okegawa et al., J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)], 본원에 기재된 STEAP-1 폴리뉴클레오티드를 동일한 방식으로 활용하여 STEAP-1 과발현, 또는 이러한 유전자를 발현하는 전립선 및 기타 암의 전이를 탐지할 수 있다. 또 다른 한편, PSA 폴리펩티드를 사용하여, PSA에 대해 특이적인 항체를 생성시킨 다음, 이를 사용하여 PSA 단백질 과발현을 모니터링하는 방법 [참고: Stephan et al., Urology 55 (4): 560-3 (2000)] 또는 전립선 세포의 전이를 모니터링하는 방법 [참고: Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3):233-7 (1996)]에서 PSA 단백질의 존재 및(또는) 수준을 관찰할 수 있기 때문에, 본원에 기재된 STEAP-1 폴리펩티드를 활용하여, STEAP-1 과발현, 또는 이러한 유전자를 발현하는 전립선 세포 및 기타 암 세포의 전이를 탐지하는데 사용하기 위한 항체를 생성시킬 수 있다.
구체적으로 언급하면, 전이는 암 세포가 기원 기관 (예: 폐 또는 전립선 등)에서 상이한 신체 부위 (예: 림프절)로 이동하는 것과 관계가 있기 때문에, STEAP-1 폴리뉴클레오티드 및(또는) 폴리펩티드를 발현하는 세포가 존재하는 지를 알아보기 위해 생물학적 샘플을 검사하는 검정을 이용하여 전이의 명백한 증거를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정상적으로는 STEAP-1-발현성 세포를 함유하지 않는 조직 (림프절)로부터의 생물학적 샘플이 STEAP-1-발현성 세포를 함유하는 것으로 밝혀진 경우, 예를 들어 STEAP-1 발현이 림프절 및 골 전이 각각으로부터 분리된 이종이식편인 LAPC4 및 LAPC9에서 관찰된 경우에는, 이러한 발견이 전이의 지표이다.
또 다른 한편으론, STEAP-1 폴리뉴클레오티드 및(또는) 폴리펩티드를 사용하여, 예를 들어 정상적으로는 STEAP-1을 발현하지 않거나 상이한 수준으로 STEAP-1을 발현하는 생물학적 샘플 중의 세포가 STEAP-1을 발현하거나 STEAP-1의 발현 증가를 나타내는 것으로 밝혀진 경우에 암의 명백한 증거를 제공할 수 있다 [예를 들어, 표 I에 열거된 암에서의 STEAP-1 발현 및 첨부 도면에 도시된 환자 샘플 등에서의 STEAP-1 발현을 참고할 수 있다]. 이러한 검정에서, 당업자는 (STEAP-1 이외의) 제2의 조직 제한된 마커, 예를 들어 PSA, PSCA 등의 존재를 알아보기 위해 생물학적 샘플을 시험함으로써 전이의 보충 증거를 추가로 획득하고자 할 수 있다 [참고: 예를 들어, Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192 (3): 237 (1996)].
특정 조직 박편 내에 STEAP-1 폴리펩티드가 존재하는 지를 확인하기 위해 면역조직화학을 이용하는 것이, 이러한 조직 내에서 특정 세포의 변경된 상태를 지시할 수 있다. 암 세포에서 발현되는 폴리펩티드를 국재할 수 있는 항체의 능력이 질병의 존재, 병기, 진행 및(또는) 종양 침습성을 진단하기 위한 한 가지 방식이라는 사실은 당해 분야에 널리 인지되고 있다. 이러한 항체는 상응하는 비-악성 조직과 비교해서, 암 세포 내에서의 이들 폴리펩티드의 변경된 분포도를 탐지할 수도 있다.
STEAP-1 폴리펩티드 및 면역원성 조성물은 질병 상태에서 변경된 세포하 단백질 국재 현상 측면에서 보면 또한 유용하다. 세포가 정상 상태에서 병든 상태로 변경되면, 세포 형태에 있어서의 변화가 유발되고, 이는 종종 세포하 단백질 국재/분포 상의 변화와 연관된다. 예를 들어, 정상 세포에서 편광 방식으로 발현되는 세포 막 단백질은 질병에서 변경되어, 완전 세포 표면 전반에 걸쳐 비-극성 방식으로 단백질이 분포된다.
질병 상태에서 변경된 세포하 단백질 국재 현상은 면역조직화학적 수단을 사용함으로써 MUC1 및 Her2 단백질 발현으로 입증되었다. 정상 상피 세포는 당단백질의 몇몇 핵상 국재 이외에도, MUC1의 전형적인 첨단 분포를 나타내는 반면, 악성 병변은 종종 비극성 염색 패턴을 나타낸다 [참고: Diaz et al, The Breast Journal, 7; 40-45 (2001); Zhang et al, Clinical Cancer Research, 4; 2669-2676 (1998): Cao, et al, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 45:1547-1557 (1997)]. 또한, 정상 유방 상피는 Her2 단백질에 대해 음성이거나 또는 기저외측 분포만을 나타내는 반면, 악성 세포는 완전 세포 표면 전반에 걸쳐 상기 단백질을 발현할 수 있다 [참고: De Potter, et al, International Journal of Cancer, 44; 969-974 (1989): McCormick, et al, 117; 935-943 (2002)]. 또 다른 한편, 상기 단백질의 분포는 단지 국재 표면으로부터 질병 상태의 확산성 세포질성 발현을 포함하도록 변경될 수 있다. 이러한 한 예가 MUC1의 경우에 관찰될 수 있다 [참고: Diaz, et al, The Breast Journal, 7: 40-45 (2001)].
면역조직화학 방법에 의해 탐지된 바와 같은, 특정 단백질의 세포 내에서의 국재/분포 상의 변경은 특정 치료 양식의 호감도에 관한 유용한 정보를 제공할 수도 있다. 이와 같이 마지막으로 언급한 사항은 특정 단백질이 정상 조직에서는 세포내일 수 있지만, 악성 세포에서는 세포 표면 상에 존재할 수 있는 상황에 의해 예시되는데, 세포 표면 위치는 세포가 항체에 의거한 진단 및 치료 섭생을 더 잘 받을 수 있게 해준다. 이러한 단백질 국재 상의 변경이 STEAP-1에 대해 일어나면, STEAP-1 단백질 및 이와 관계된 면역 반응은 극히 유용하다. 따라서, 세포하 단백질 국재의 변경이 24P4C12에 대해서 일어났는지를 결정할 수 있는 능력으로 인해, STEAP-1 단백질 및 이와 관계된 면역 반응은 극히 유용해진다. STEAP-1 조성물을 사용함으로써 당업자는 중요한 진단 및 치료적 결정을 할 수 있다. STEAP-1에 대해 특이적인 면역조직화학 시약이 또한, STEAP-1이 정상적으로 생성되지 않는 조직에 해당 폴리펩티드가 나타난 경우에 STEAP-1을 발현하는 종양의 전이를 탐지하는데 유용하다.
따라서, STEAP-1 폴리펩티드 및 이에 대한 면역 반응으로부터 비롯된 항체는 중요한 각종 맥락, 예를 들어 당업자에게 공지된 진단, 예후, 예방 및(또는) 치료 목적으로 유용하다.
PSA 폴리뉴클레오티드 단편 및 폴리뉴클레오티드 변이체는 당업자에 의해 PSA를 모니터링하는 방법에 사용하기 위해 이용되기 때문에, STEAP-1 폴리뉴클레오티드 단편 및 폴리뉴클레오티드 변이체를 유사한 방식으로 사용한다. 특히, PSA의 모니터링 방법에 사용된 전형적인 PSA 폴리뉴클레오티드는 PSA cDNA 서열의 단편들로 이루어진 프로브 또는 프라이머이다. 이를 예시하면, PSA 폴리뉴클레오티드를 PCR 증폭시키기 위해 사용된 프라이머는 폴리머라제 연쇄 반응에서 기능하기 위한 완전한 PSA 서열 보다 적은 서열을 포함해야만 한다. 이러한 PCR 반응과 관련하여, 당업자는 일반적으로, 관심있는 폴리뉴클레오티드의 상이한 부분을 증폭시키거나 또는 증폭 반응을 최적화하기 위해 프라이머로서 사용될 수 있는 각종의 상이한 폴리뉴클레오티드 단편을 창출시킨다 [참고: 예를 들어, Caetano-Anolles, G. Biotechniques 25 (3): (1998); Robertson et al. , Methods Mol. Biol. 98: 121-154 (1998)]. 이러한 단편의 사용에 관한 부가의 예시가 "정상 조직 및 환자 표본에서의 STEAP-1 발현 분석"이란 표제의 실시예에 제공되는데, 여기서는 STEAP-1 폴리뉴클레오티드 단편을 프로브로서 사용하여 암 세포에서의 STEAP-1 RNAs의 발현을 나타낸다. 또한, 변이체 폴리뉴클레오티드 서열이 전형적으로, PCR 및 노던 분석에서 상응하는 mRNAs에 대한 프라이머 및 프로브로서 사용된다 [참고: 예를 들어, Sawai et al., Fetal Diagn. Ther. 1996 Nov-Dec 11 (6):407-13 and Current Protocols In Molecular Biology, Volume 2, Unit 2, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995)]. 폴리뉴클레오티드 단편 및 변이체는 이들이 고 엄격성 조건 하에 표적 폴리뉴클레오티드 서열 (예: 도 2에 도시된 STEAP-1 폴리뉴클레오티드 또는 그의 변이체)과 결합할 수 있다는 맥락에서 유용하다.
추가로, 특정 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체 또는 T 세포에 의해 인식될 수 있는 에피토프를 함유하는 PSA 폴리펩티드를 PSA 모니터링 방법에 사용한다. STEAP-1 폴리펩티드 단편 및 폴리펩티드 유사체 또는 변이체를 또한 유사한 방식으로 사용할 수 있다. 이와 같이 항체 (예: 항-PSA 항체 또는 T 세포)를 생성시키기 위해 폴리펩티드 단편 또는 폴리펩티드 변이체를 사용하는 것은 광범위한 시스템을 사용하는 분야에서 전형적인 일인데, 예를 들어 의사들은 융합 단백질을 사용한다 [참고: 예를 들어, Current Protocols In Molecular Biology, Volume 2, Unit 16, Frederick M. Ausubelet al. eds., 1995]. 이와 관련하여, 각 에피토프(들)는 항체 또는 T 세포와 반응성인 구조를 제공하는 기능을 한다. 전형적으로, 당업자는 관심있는 폴리펩티드의 상이한 부분에 대해 특이적인 면역 반응을 생성시키기 위해 사용될 수 있는 각종의 상이한 폴리펩티드 단편을 창출시킨다 [참고: 에를 들어, 미국 특허 제5,840,501호 및 미국 특허 제5,939,533호]. 예를 들어, 당해 분야에서 입수 가능한 모티프를 근거로 하여 당업자에 의해 용이하게 확인되는 모티프-보유 서열 또는 본원에 논의된 STEAP-1 생물학적 모티프 중의 하나를 포함하는 폴리펩티드를 활용하는 것이 바람직할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 단편, 변이체 또는 유사체는 이들이 표적 폴리펩티드 서열 (예: 도 3에 도시된 STEAP-1 폴리펩티드)에 대해 특이적인 항체 또는 T 세포를 생성시킬 수 있는 에피토프를 포함하는 한은 전형적으로 유용하다.
본원에 나타낸 바와 같이, STEAP-1 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 (뿐만 아니라 이들 분자의 존재를 확인하기 위해 사용되는 STEAP-1 폴리뉴클레오티드 프로브 및 항-STEAP-1 항체 또는 T 세포)는 이들이 표 I에 열거된 바와 같은 암을 진단하는데 유용하도록 만드는 특이 성질을 나타낸다. 본원에 기재된 질환 (예: 전립선 암)의 존재 또는 발병을 평가하기 위해 STEAP-1 유전자 생성물의 존재를 측정하는 진단 검정을 사용하여, PSA를 이용하여 성공적으로 수행된 바와 같이, 예방적 조치를 위한 또는 추가의 모니터링을 위한 환자를 확인한다. 더우기, 이들 물질은, 예를 들어 PSA 단독에 대한 시험을 근거로 해서는 전립선 기원의 전이를 명확히 진단할 수 없는 상황에서 PSA와 유사하거나 상보적인 특징을 지닌 분자에 대한 당해 분야의 요구를 충족시키므로 [참고: 예를 들어, Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)], 결과적으로 STEAP-1 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 (뿐만 아니라 이들 분자의 존재를 확인하기 위해 사용되는 STEAP-1 폴리뉴클레오티드 프로브 및 항-STEAP-1 항체 또는 T 세포)와 같은 물질을 이용하여 전립선 기원의 전이를 확인할 필요가 있다.
최종적으로, 진단 검정에 사용하는 것 이외에도, 본원에 기재된 STEAP-1 폴리뉴클레오티드는 STEAP-1 유전자가 위치하는 염색체 영역 내의 발암성 관련 염색체 이상을 확인하는데 있어서의 그의 용도와 같은 수 많은 기타 용도를 지니고 있다 [하기 "STEAP-1의 염색체 지도화"란 표제의 실시예 참고]. 더우기, 진단 검정에 사용하는 것 이외에도, 본원에 기재된 STEAP-1-관련 단백질 및 폴리뉴클레오티드는 공지되지 않은 기원 조직의 법의학적 분석에 있어서의 그의 용도와 같은 기타 용도를 지니고 있다 [참고: Takahama K Forensic Sci Int 1996 Jun 28; 80 (1-2): 63-9].
부가적으로, 본 발명의 STEAP-1-관련 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여, STEAP-1의 과발현을 특징으로 하는 병리적 질환을 치료할 수 있다. 예를 들어, 도 2 또는 도 3의 아미노산 또는 핵산 서열, 또는 이들 중의 어느 하나의 단편을 사용하여, STEAP-1 항원에 대한 면역 반응을 생성시킬 수 있다. STEAP-1과 반응하는 항체 또는 기타 분자를 사용하여 이러한 분자의 기능을 조정함으로써, 치료 이점을 제공할 수 있다.
XII.) STEAP-1 단백질 기능의 억제
본 발명은 STEAP-1이 그의 결합 파트너와 결합하거나 다른 단백질(들)과 연합되는 것을 억제하기 위한 각종 방법 및 조성물 뿐만 아니라 STEAP-1 기능을 억제하는 방법을 포함한다.
XII.A.) 세포내 항체를 이용한 STEAP-1의 억제
한 가지 접근법에서는, STEAP-1와 특이적으로 결합하는 단일쇄 항체를 코딩하는 재조합 벡터를 유전자 전이 기술을 통하여 STEAP-1 발현성 세포 내로 도입한다. 따라서, 코딩된 단일쇄 항-STEAP-1 항체를 세포내적으로 발현시키고, STEAP-1 단백질과 결합시킴으로써 그의 기능을 억제시킨다. 이러한 세포내 단일쇄 항체를 공학적으로 처리하는 방법은 널리 공지되어 있다. "인트라보디"로서 공지되기도 한 상기 세포내 분자를 세포 내의 특별한 구획에 대해 특이적으로 표적화시켜, 억제 활성의 치료에 관심을 집중시킨 부분 전반에 걸쳐 제어를 제공한다. 이러한 기술은 당해 분야에서 성공적으로 적용되어 왔다 [참고: Richardson and Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13]. 인트라보디는 풍부한 세포 표면 수용체의 발현을 사실상 제거하는 것으로 밝혀졌다 [참고: 예를 들어, Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141; Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931-23936; Deshane et al., 1994, Gene Ther.1: 332-337].
단일쇄 항체는 가요성 링커 폴리펩티드에 의해 연결된 중쇄와 경쇄의 가변 도메인을 포함하고, 단일 폴리펩티드로서 발현된다. 임의로는, 단일쇄 항체가 경쇄 불변 영역과 연결된 단일쇄 가변 영역 단편으로서 발현된다. 널리 공지된 세포내 트래픽킹 신호를, 상기 단일쇄 항체를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 벡터 내로 공학적으로 처리하여, 인트라보디가 목적하는 세포내 구획을 정확하게 표적화하도록 한다. 예를 들어, 내형질 세망 (ER)을 표적으로 한 인트라보디를 공학적으로 처리시켜, 리더 펩티드, 및 임의로는 C-말단 ER 잔류 신호, 예를 들어 KDEL 아미노산 모티프를 혼입시킨다. 핵에서 활성을 발휘하도록 의도된 인트라보디를 공학적으로 처리시켜 핵 국재 신호를 포함하도록 한다. 지질 부분을 인트라보디에 연결시켜 인트라보디를 혈장 막의 시토졸 측면부에 매어둔다. 인트라보디가 시토졸에서 기능을 발휘하도록 표적화할 수도 있다. 예를 들어, 시토졸성 인트라보디를 사용하여 시토졸 내의 인자를 봉쇄시킴으로써, 이들이 그들의 천연 세포내 목적지로 수송되지 못하게 한다.
한 양태에서는, 인트라보디를 사용하여 STEAP-1을 핵에 포획시킴으로써, 핵 내에서의 그의 활성을 방지시킨다. 핵 표적화 신호를 이러한 STEAP-1 인트라보디 내로 공학적으로 처리시켜 목적하는 표적화를 달성시킨다. 상기 STEAP-1 인트라보디는 특정한 STEAP-1 도메인과 특이적으로 결합하도록 고안한다. 또 다른 양태에서는, STEAP-1 단백질과 특이적으로 결합하는 시토졸성 인트라보디를 사용하여 STEAP-1이 핵에 접근하지 못하도록 함으로써, 이러한 핵 내에서 어떠한 생물학적 활성도 발휘하지 못하게 한다 (예를 들어, STEAP-1이 다른 인자들과 전사 복합체를 형성하지 못하게 한다).
특정한 세포에 대한 상기 인트라보디의 발현을 특이적으로 지시하기 위해, 이러한 인트라보디의 전사를 적당한 종양-특이적 프로모터 및(또는) 증강인자의 조절성 제어 하에 둔다. 예를 들어, 전립선에 대해 특이적으로 인트라보디 발현을 표적화하기 위해, PSA 프로모터 및(또는) 프로모터/증강인자를 활용할 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,919,652호 (1999년 7월 6일자로 허여됨)].
XII.B.) 재조합 단백질을 이용한 STEAP-1의 억제
또 다른 접근법에서는, 재조합 분자가 STEAP-1과 결합함으로써 STEAP-1 기능을 억제시킨다. 예를 들어, 이들 재조합 분자는 STEAP-1이 기타 단백질(들)과 연합하는 그의 결합 파트너(들)에 접근하거나 이와 결합하는 것을 방지 또는 억제시킨다. 이러한 재조합 분자는, 예를 들어 STEAP-1 특이적 항체 분자의 반응성 부분(들)을 함유할 수 있다. 특정한 양태에서는, STEAP-1 결합 파트너의 STEAP-1 결합 도메인을 이량체성 융합 단백질 내로 공학적으로 처리시킴으로써, 이러한 융합 단백질이 인간 IgG, 예를 들어 인간 IgG1의 Fc 부분과 연결된 2개의 STEAP-1 리간드 결합 도메인을 포함한다. 이러한 IgG 부분은, 예를 들어 CH2 및 CH3 도메인과 힌지 영역을 함유할 수 있지만, CH1 도메인은 함유하지 않는다. 상기 이량체성 융합 단백질은 STEAP-1의 발현과 연관된 암으로 고통받고 있는 환자에게 가용성 형태로 투여함으로써, 이량체성 융합 단백질이 STEAP-1과 특이적으로 결합하여 STEAP-1과 결합 파트너 간의 상호 작용을 차단시킨다. 이러한 이량체성 융합 단백질은 공지된 항체 연결 기술을 사용하여 다량체성 단백질과 추가로 합한다.
XII.C.) STEAP-1 전사 또는 해독 억제
본 발명은 또한, STEAP-1 유전자의 전사를 억제하기 위한 각종 방법 및 조성물을 포함한다. 유사하게, 본 발명은 또한, STEAP-1 mRNA의 단백질로의 해독을 억제하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
한 가지 접근법에서는, STEAP-1 유전자의 전사를 억제하는 방법이 STEAP-1 유전자를 STEAP-1 안티센스 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 접근법에서는, STEAP-1 mRNA 해독을 억제시키는 방법이 STEAP-1 mRNA를 안티센스 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 접근법에서는, STEAP-1 특이적 리보자임을 사용하여 STEAP-1 메시지를 절단시킴으로써, 해독을 억제시킨다. 이러한 안티센스 및 리보자임에 의거한 방법이 STEAP-1 유전자의 조절성 영역, 예를 들어 STEAP-1 프로모터 및(또는) 증강인자 요소에 대해 지시될 수도 있다. 유사하게, STEAP-1 유전자 전사 인자를 억제할 수 있는 단백질을 사용하여 STEAP-1 mRNA 전사를 억제시킨다. 전술된 방법에 유용한 각종 폴리뉴클레오티드 및 조성물은 상기 언급된 바와 같다. 전사 및 해독을 억제하기 위해 안티센스 및 리보자임 분자를 사용하는 것은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
STEAP-1 전사 활성화를 방해함으로써 STEAP-1의 전사를 억제시키는 기타 인자들이 또한, STEAP-1을 발현하는 암을 치료하는데 유용하다. 유사하게, STEAP-1 프로세싱을 방해하는 인자가, STEAP-1을 발현하는 암을 치료하는데 유용하다. 이러한 인자를 활용하는 암 치료 방법 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
XII.D.) 치료 전략을 위한 일반적 고려 사항
유전자 전이 및 유전자 요법 기술을 사용하여 치료적 폴리뉴클레오티드 분자를, STEAP-1을 합성하는 종양 세포에 전달시킬 수 있다 (즉, 인트라보디 및 기타 STEAP-1 억제성 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 안티센스, 리보자임). 수 많은 유전자 요법 접근법이 당해 분야에 공지되어 있다. STEAP-1 전사 등을 방해할 수 있는 STEAP-1 안티센스 폴리뉴클레오티드, 리보자임, 인자를 코딩하는 재조합 벡터를, 상기 유전자 요법 접근법을 이용하여 표적 종양 세포에 전달할 수 있다.
상기 치료적 접근법을 광범위한 수술, 화학요법 또는 방사선 요법 섭생 중의 어느 한 가지와 병용할 수 있다. 본 발명의 치료적 접근법은 화학요법 (또는 기타 요법)의 투여량을 감소시킬 있게 하고/하거나 투여 횟수를 줄여줄 수 있는데, 이는 모든 환자, 특히 화학요법제의 독성을 잘 견디지 못하는 환자에게 유리하다.
각종 시험관내 및 생체내 검정 시스템을 사용하여, 특정한 조성물 (예: 안티센스, 리보자임, 인트라보디), 또는 이러한 조성물의 조합물의 항종양 활성을 평가할 수 있다. 치료 활성을 평가하는 시험관내 검정에는 종양 증진 활성을 시사하는 세포 성장 검정, 연질 한천 검정 및 기타 검정, 치료 조성물이 결합 파트너에 대한 STEAP-1의 결합을 억제시키는 정도를 측정할 수 있는 결합 검정 등이 포함된다.
생체 내에서는, STEAP-1 치료 조성물의 효과를 적합한 동물 모델에서 평가할 수 있다. 예를 들어, 이종 전립선 암 모델을 사용할 수 있는데, 여기서는 인간 전립선 암 외식편 또는 계대접종된 이종이식편 조직을 면역기능저하된 동물, 예를 들어 누드 또는 SCID 마우스 내로 도입한다 [참고: Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408]. 예를 들어, PCT 공개공보 W0 98/16628 및 미국 특허 제6,107,540호에는 원발성 종양의 발생, 전이, 및 말기 질병의 특징인 골형성성 전이물의 형성을 반복할 수 있는 인간 전립선 암의 각종 이종이식편 모델이 기재되어 있다. 종양 형성, 종양 퇴행 또는 전이 등의 억제를 측정하는 검정을 이용하여 효능을 예측할 수 있다.
세포소멸 증진을 평가하는 생체내 검정은 치료 조성물을 평가하는데 있어 유용하다. 한 가지 양태에서는, 치료 조성물로 처치한 종양 보유 마우스로부터의 이종이식편을 대상으로 하여 세포소멸성 병소의 존재를 알아보기 위해 검사할 수 있고, 이를 처치하지 않은 대조군 이종이식편 보유 마우스와 비교할 수 있다. 세포소멸성 병소가 처치된 마우스의 종양에서 발견되는 정도가 해당 조성물의 치료 효능의 지표를 제공한다.
전술된 방법을 실시하는데 사용된 치료 조성물을, 목적하는 전달 방법에 적합한 담체를 포함하는 제약 조성물로 제형화시킬 수 있다. 적합한 담체에는 치료 조성물과 합한 경우에 치료 조성물의 항종양 기능을 유지시켜 주고 일반적으로 환자의 면역계와 반응성이지 않는 모든 물질이 포함된다. 이의 예에는 수 많은 표준 제약 담체, 예를 들어 멸균성 인산염 완충 식염수, 정균 수 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed., 1980].
치료 제형을 가용화시킬 수 있고, 이는 치료 조성물을 종양 부위로 전달할 수 있는 모든 경로를 통하여 투여할 수 있다. 잠재적으로 유효한 투여 경로에는 정맥내, 비경구, 복강내, 근육내, 종양내, 피내, 기관내, 동소 (같은 자리) 투여 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 정맥내 주사용 제형은 보존 정균수, 멸균성 비보존수 용액 중에 있고/있거나 주사용 0.9% 멸균성 염화나트륨, USP를 함유하는 폴리비닐클로라이드 또는 폴리에틸렌 봉지 중에 용해된 치료 조성물을 포함한다. 치료 단백질 제제를 동결건조시키고, 이를 바람직하게는 진공 하에 멸균성 산제로서 저장한 다음, 주사하기에 앞서 정균수 (예를 들어, 벤질 알코올 방부제를 함유한다) 또는 멸균수에서 재구성할 수 있다.
전술된 방법을 사용하여 암을 치료하기 위한 투여량 및 투여 프로토콜은 이러한 방법과 표적 암에 따라서 다양할 것이며, 일반적으로 당해 분야에 인지된 수 많은 기타 요인들에 의해 좌우될 것이다.
XIII.) STEAP-1의 조정제의 확인, 성상 확인 및 용도
조정제를 확인 및 사용하기 위한 방법
한 양태에서는, 특정한 발현 프로파일을 유도 또는 억제시키고, 특이적 경로를 억제 또는 유도시킴으로써 바람직하게는 이와 연관된 표현형을 생성시키는 조정제를 확인하기 위한 스크리닝을 수행한다. 또 다른 양태에서는, 특정 상태에 있어 중요한 시차적으로 발현된 유전자가 확인되면, 개개 유전자의 발현을 변경시키는 (증가 또는 감소시키는) 조정제를 확인하기 위한 스크린을 수행한다. 또 다른 양태에서는, 시차적으로 발현된 유전자의 발현 생성물의 생물학적 기능을 변경시키는 조정제를 확인하기 위한 스크리닝을 수행한다. 다시, 특정 상태에 있어 중요한 유전자를 확인하면, 유전자 생성물과 결합하고/하거나 이의 생물학적 활성을 조정하는 작용제를 확인하기 위한 스크린을 수행한다.
또한, 후보 작용제에 반응하여 유도되는 유전자에 대한 스크린을 수행한다. 조정제 (암 발현 패턴을 억제시켜 정상 발현 패턴을 유발시키는 조정제, 또는 정상 조직에서와 같은 유전자의 발현을 유발시키는 암 유전자의 조정제)를 확인한 후, 이러한 작용제에 반응하여 특이적으로 조정되는 유전자를 확인하기 위한 스크린을 수행한다. 정상 조직과 작용제-처리된 암 조직 간의 발현 프로파일을 비교한 결과, 정상 조직이나 암 조직에서는 발현되지 않지만, 작용제 처리된 조직에서 발현되는 유전자, 또는 그 반대로 발현되는 유전자를 밝혀내었다. 이들 작용제-특이적 서열을 확인하고, 이를 암 유전자 또는 단백질에 대해 본원에 기재된 방법에 의해 사용한다. 특히, 이들 서열 및 이들이 코딩하는 단백질은 작용제-처리된 세포를 만들거나 확인하는데 사용한다. 또한, 작용제-유도된 단백질에 대항한 항체를 생성시키고, 이를 사용하여 신규 치료제가 처리된 암 조직 샘플을 표적으로 하도록 한다.
조정제-관련 확인 및 스크리닝 검정:
유전자 발현-관련 검정
본 발명의 단백질, 핵산 및 항체를 스크리닝 검정에 사용한다. 암 관련 단백질, 항체, 핵산, 변형된 단백질, 및 이들 서열을 함유하는 세포를 스크리닝 검정, 예를 들어 "유전자 발현 프로파일", 폴리펩티드의 발현 프로파일 또는 생물학적 기능 변경에 대한 약물 후보의 효과를 평가하는 스크리닝 검정에 사용한다. 한 양태에서는, 발현 프로파일을, 바람직하게는 후보 작용제로의 처리 후 발현 프로파일 유전자에 대해 모니터링을 허용해 주는 고 처리능력 스크리닝 기술과 연계해서 사용한다 [참고: 예를 들어, Davis, GF, et al, J Biol Screen 7: 69 (2002); Zlokarnik, et al., Science 279: 84-8 (1998); Heid, Genome Res 6:986-94, 1996].
암 단백질, 항체, 핵산, 변형된 단백질, 및 본래의 또는 변형된 암 단백질 또는 유전자를 함유하는 세포를 스크리닝 검정에 사용한다. 즉, 본 발명은 본 발명의 암 단백질의 생리학적 기능 또는 암 표현형을 조정하는 조성물에 대한 스크리닝 방법을 포함한다. 이는 유전자 자체 상에서 수행하거나 또는 "유전자 발현 프로파일" 또는 생물학적 기능에 대한 약물 후보의 효과를 평가함으로써 수행한다. 한 양태에서는, 발현 프로파일을, 바람직하게는 후보 작용제로의 처리 후 모니터링을 허용해 주는 고 처리능력 스크리닝 기술과 연계해서 사용한다 [Zlokamik, 상기 참고].
본 발명의 유전자 및 단백질에 대한 각종 검정을 실행한다. 검정은 개개 핵산이나 단백질 수준으로 수행한다. 즉, 암에서 상향조절된 특정한 유전자를 확인한 후, 시험 화합물을 대상으로 하여 유전자 발현을 조정할 수 있는 능력을 알아보거나 본 발명의 암 단백질에 대한 결합성을 알아보기 위해 스크리닝한다. 이와 관련한 "조정"에는 유전자 발현의 증가 또는 저하가 포함된다. 바람직한 조정 양은 정상 조직 대 암이 진행되고 있는 조직에서의 유전자 발현 상의 본래의 변화에 의해 좌우될 것인데, 이러한 변화는 10% 이상, 바람직하게는 50%, 보다 바람직하게는 100 내지 300%이고, 몇몇 경우에는 300 내지 1000% 이상이다. 따라서, 유전자가 정상 조직과 비교해서 암 조직에서 4배 증가를 나타내는 경우에는, 약 4배의 감소가 종종 요망되고; 유사하게, 정상 조직과 비교해서 암 조직을 10배 감소시키기 위해서는, 시험 화합물에 의한 발현 10배 증가를 목표로 하는 것이 종종 요망된다. 암에서 관찰된 유전자 발현 유형을 악화시키는 조정제는 또한, 추가 분석에서 상향 조절된 표적으로서 유용하다.
유전자 발현 양은 핵산 프로브 및 유전자 발현 수준 정량화를 이용하여 모니터링하거나, 또는 암 단백질에 대한 항체를 사용하고 표준 면역검정을 통하여 유전자 생성물 자체를 모니터링한다. 프로테오믹 (proteomics) 및 분리 기술 또한, 발현 정량화를 고려한다.
유전자 발현을 변경시키는 화합물을 확인하기 위한 발현 모니터링
한 양태에서는, 유전자 발현 모니터링, 즉 발현 프로파일이 수 많은 실재물에 대해 동시에 모니터링한다. 이러한 프로파일은 전형적으로, 도 2의 유전자들 중의 하나 이상을 포함할 것이다. 이 양태에서는, 예를 들어 암 핵산 프로브를 바이오칩에 부착시켜 특정한 세포 내의 암 서열을 탐지 및 정량화한다. 또 다른 한편으론, PCR을 사용할 수 있다. 따라서, 목적하는 웰에 투여된 프라이머를 수반한 시리즈, 예를 들어 미세역가 판의 웰을 사용할 수 있다. 이어서, PCR 반응을 수행하고, 각 웰에 대해 분석할 수 있다.
하나 이상의 암 관련 서열, 예를 들어 도 2에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 변형시키는 화합물을 확인하기 위한 발현 모니터링을 수행한다. 일반적으로, 분석에 앞서 시험 조정제를 세포에 부가한다. 더우기, 암을 조정하거나, 본 발명의 암 단백질을 조정하거나, 본 발명의 암 단백질과 결합하거나, 또는 본 발명의 암 단백질과 항체 또는 기타 결합 파트너와의 결합을 방해하는 작용제를 확인하기 위한 스크린을 또한 제공한다.
한 양태에서는, 고 처리능력 스크리닝 방법이 다수의 잠재적 치료 화합물 (후보 화합물)을 함유하는 라이브러리를 제공하는 것을 포함한다. 이어서, 이러한 "조합 화학적 라이브러리"를 대상으로 하여, 목적하는 특징적 활성을 표시하는 라이브러리 구성원 (특히 화학적 종 또는 아부류)을 확인하기 위한 한 가지 이상의 검정에서 스크리닝한다. 이로써 확인된 화합물은 통상적인 "선도 화합물"로서, 스크리닝하기 위한 화합물로서, 또는 치료제로서 제공될 수 있다.
특정 양태에서는, 잠재적 조정제의 조합 라이브러리를 대상으로 하여, 암 폴리펩티드와 결합할 수 있거나 활성을 조정할 수 있는 능력에 대해 스크리닝한다. 통상적으로는, 몇몇 바람직한 특성이나 활성, 예를 들어 억제 활성을 지닌 화학적 화합물 ("선도 화합물"로 불리운다)을 확인하여, 선도 화합물의 변이체를 창출시키고; 이들 변이체 화합물의 특성이나 활성을 평가함으로써, 유용한 특성을 지닌 신규한 화학적 실재물을 생성시킨다. 종종, 이러한 분석을 위해 고 처리능력 스크리닝 (HTS) 방법을 이용한다.
상기 인지된 바와 같이, 유전자 발현 모니터링을 이용하여 후보 조정제 (예: 단백질, 핵산 또는 소분자)를 시험하는 것이 편리하다. 후보 작용제를 부가하고 세포를 일정 기간 동안 항온 배양한 후, 분석하고자 하는 표적 서열을 함유하는 샘플을, 예를 들어 바이오칩에 가한다.
경우에 따라, 공지된 기술을 사용하여 표적 서열을 제조한다. 예를 들어, 공지된 용해 완충제, 전기천공 등을 사용하여 샘플을 처리하여 세포를 용해시키고, 경우에 따라 정제 및(또는) 증폭 (예: PCR)을 수행한다. 예를 들어, 뉴클레오티드에 공유적으로 부착된 표지를 이용한 시험관내 전사를 수행한다. 일반적으로, 핵산을 바이오틴-FITC 또는 PE로 표지시키거나 cy3 또는 cy5로 표지시킨다.
표적 서열을, 예를 들어 형광성, 화학발광성, 화학적, 또는 방사성 신호로 표지시켜 특정 프로브에 대한 표적 서열의 특이적 결합을 탐지하는 수단을 제공할 수 있다. 이러한 표지는 또한, 적당한 기질에 제공될 때 탐지되는 생성물을 생성시키는 효소, 예를 들어 알칼리성 포스파타제 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제일 수 있다. 또 다른 한편으론, 표지가 표지된 화합물 또는 소분자, 예를 들어 효소와 결합하지만 이러한 효소에 의해 촉매되거나 변경되지 않는 효소 억제제이다. 표지는 또한, 스트렙타비딘과 특이적으로 결합하는 바이오틴 또는 에피토프 태그 등의 특정 부분 또는 화합물일 수 있다. 바이오틴의 경우에는, 스트렙타비딘을 상기 언급된 바와 같이 표지시킴으로써, 결합된 표적 서열에 대한 탐지 가능한 신호를 제공한다. 결합되지 않은 표지된 스트렙타비딘은 전형적으로, 분석에 앞서 제거한다.
당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 이들 검정은 직접적인 혼성화 검정일 수 있거나, 또는 다중 프로브의 사용을 포함하는 "샌드위치 검정"을 포함할 수 있는데, 이는 일반적으로 미국 특허 제5,681,702호; 제5,597,909호; 제5,545,730호; 제5,594,117호; 제5,591,584호; 제5,571,670호; 제5,580,731호; 제5,571,670호; 제5,591,584호; 제5,624,802호; 제5,635,352호; 제5,594,118호; 제5,359,100호; 제5,124,246호; 및 제5,681,697호에 기재된 바와 같다. 이러한 양태에서는, 일반적으로 표적 핵산을 상기 언급된 바와 같이 제조한 다음, 이를 혼성화 복합체를 형성시켜 주는 조건 하에 복수 개의 핵산 프로브를 포함하는 바이오칩에 가한다.
상기 언급된 바와 같은 높은, 적당한 수준 및 낮은 엄격성 조건을 포함한 각종 혼성화 조건을 본 발명에 사용한다. 검정은 일반적으로, 표적의 존재 하에서도 표지 프로브 혼성화 복합체를 형성시켜 주는 엄격성 조건 하에 수행한다. 엄격성은 열역학적 변수인 단계 파라미터 (이에는 온도, 포름아미드 농도, 염 농도, 카오트로픽 염 농도 pH, 유기 용매 농도 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다)를 변경시킴으로써 제어할 수 있다. 이들 파라미터를 또한 사용하여, 미국 특허 제5,681,697에 기재된 바와 같이 비-특이적 결합을 제어할 수 있다. 따라서, 비-특이적 결합을 감소시키는 보다 높은 엄격성 조건 하에 특정 단계들을 수행하는 것이 요망될 수 있다.
본원에 기재된 반응들은 각종 방식으로 수행할 수 있다. 반응 성분들은 동시에 가하거나, 또는 상이한 순서로 순차적으로 가할 수 있는데, 바람직한 양태는 다음에 기재되어 있다. 또한, 반응에는 각종의 기타 시약이 포함될 수 있다. 이에는 염, 완충제, 중성 단백질, 예를 들어 알부민, 세정제 등이 포함되는데, 이들은 최적의 혼성화 및 탐지를 촉진시키고/시키거나 비-특이적 또는 배경 상호작용을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 검정 효율을 개선시키는 시약, 예를 들어 프로테아제 억제제, 뉴클레아제 억제제, 항미생물제 등을 경우에 따라, 샘플 제조 방법 및 표적의 순도에 따라서 사용할 수도 있다. 검정 데이터를 분석하여 개개 유전자의 발현 수준을 결정하고, 유전자 발현 프로파일을 형성하는 어느 한쪽 상태의 발현 수준 변화를 결정한다.
생물학적 활성 관련 검정
본 발명은 본 발명의 암 관련 유전자 또는 단백질의 활성을 조정하는 화합물에 대한 확인 또는 스크리닝 방법을 제공한다. 이러한 방법은 상기 규정된 바와 같은 시험 화합물을, 본 발명의 암 단백질을 포함하는 세포에 부가하는 것을 포함한다. 이러한 세포는 본 발명의 암 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 함유한다. 또 다른 양태에서는, 후보 작용제의 라이브러리를 복수 개의 세포 상에서 시험한다.
한 국면에서는, 본 검정을 생리학적 신호, 예를 들어 호르몬, 항체, 펩티드, 항원, 사이토킨, 성장 인자, 활동 전위물, 약리학적 작용제, 예를 들면, 화학요법제, 방사선, 발암물질, 또는 기타 세포 (즉, 세포-세포 접촉물)의 존재 또는 부재하에, 또는 이전 노출 또는 후속 노출 하에 평가한다. 또 다른 예에서는, 세포 주기 공정의 상이한 단계에서 결정을 수행한다. 이러한 방식으로, 본 발명의 유전자 또는 단백질을 조정하는 화합물을 확인한다. 약리학적 활성을 지닌 화합물은 본 발명의 암 단백질의 활성을 증강시키거나 방해할 수 있다. 일단 확인되면, 유사한 구조를 평가하여 해당 화합물의 중요한 구조적 특징을 확인한다.
한 양태에서는, 암 세포 분할을 조정하는 (예를 들어, 억제하는) 방법이 제공되는데; 이러한 방법은 암 조정제를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 양태에서는, 암을 조정하는 (예를 들어, 억제하는) 방법이 제공되는데; 이러한 방법은 암 조정제를 투여하는 것을 포함한다. 추가 양태에서는, 암을 수반한 개개인 또는 세포를 치료하는 방법이 제공되는데; 이러한 방법은 암 조정제를 투여하는 것을 포함한다.
한 양태에서는, 본 발명의 유전자를 발현하는 세포의 상태를 조정하는 방법이 제공된다. 본원에 사용된 바와 같은 상태는 세포의 성장, 증식, 생존, 기능, 세포소멸, 노화, 국재, 효소적 활성, 신호 전달 등과 같이 당해 분야에 허용되는 파라미터를 포함한다. 한 양태에서는, 암 억제제가 상기 논의된 바와 같은 항체이다. 또 다른 양태에서는, 암 억제제가 안티센스 분자이다. 본원에 기재된 바와 같은 각종 세포 성장, 증식 및 전이 검정이 당업자에게 공지되어 있다.
조정제를 확인하기 위한 고 처리능력 스크리닝
적합한 조정제를 확인하기 위한 검정은 고 처리능력 스크리닝을 받을 수 있다. 따라서, 바람직한 검정은 암 유전자 전사의 증강 또는 억제, 폴리펩티드 발현의 억제 또는 증강, 및 폴리펩티드 활성의 억제 또는 증강을 탐지한다.
한 양태에서는, 고 처리능력 스크리닝 방법에서 평가된 조정제가 단백질, 종종 천연 발생적 단백질, 또는 천연 발생적 단백질의 단편이다. 따라서, 예를 들어 단백질을 함유하는 세포성 추출물, 또는 단백질성 세포성 추출물의 무작위 또는 지정 분해물을 사용한다. 이러한 방식으로, 본 발명의 방법에서 스크리닝하기 위한 단백질의 라이브러리를 만든다. 이러한 양태에서 특히 바람직한 것은 세균성, 진균성, 바이러스성, 및 포유류 단백질의 라이브러리인데, 후자가 바람직하고, 인간 단백질이 특히 바람직하다. 특히 유용한 시험 화합물은 표적이 속하는 단백질 부류, 예를 들어 효소에 대한 기질, 또는 리간드 및 수용체에 관한 것이다.
조정제를 확인(동정)하고 성상 확인하기 위해 연질 한천 성장 및 집락 형성을 이용함
정상 세포는 이들이 부착 및 성장하기 위한 고형 기질을 필요로 한다. 세포를 형질전환시키면, 이들은 이러한 표현형을 상실하여 상기 기질로부터 분리되어 성장한다. 예를 들어, 형질전환된 세포는 교반된 현탁 배양물에서 성장하거나 반고형 배지, 예를 들어 반고형 또는 연질 한천에서 현탁된 채로 성장할 수 있다. 형질전환된 세포를 종양 억제인자 유전자로 형질감염시키면, 이들 세포는 정상 표현형을 재생할 수 있어, 부착 및 성장하기 위한 고형 기질을 다시 요구하게 된다. 검정 중의 연질 한천 성장 또는 집락 형성을 사용하여, 숙주 세포에서 발현된 경우에 비정상적인 세포성 증식과 형질전환을 억제시키는, 암 서열의 조정제를 확인한다. 조정제는 고형 또는 반고형 배지, 예를 들어 한천에서 현탁된 채로 성장할 수 있는 숙주 세포의 능력을 저하시키거나 없애준다.
현탁 검정에서 연질 한천 성장 또는 집락 형성에 대한 기술은 문헌 [참고: Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3rd ed., 1994)]에 기재되었다. 또한, 문헌 [Garkavtsev et al. (1996), 상기 참고]의 방법 센셕을 참고할 수 있다.
조정제를 확인하고 성상 확인하기 위한 접촉 억제 및 성장 밀도 제한의 평가
정상 세포는 전형적으로, 이들 세포가 다른 세포를 건드릴 때까지 세포 배양물에서 편평하고 조직화된 패턴으로 성장한다. 세포가 서로 부딪히면, 이들은 접촉 억제되어 성장을 멈춘다. 그러나, 형질전환된 세포는 접촉 억제되지 않고 지리멸렬한 병소에서 고 밀도로 성장을 지속한다. 따라서, 형질전환된 세포는 상응하는 정상 세포 보다 높은 포화 밀도로 성장한다. 이는 방향 감각을 잃은 세포 단층 또는 병소내 세포의 형성에 의해 형태학적으로 탐지된다. 또 다른 한편, 포화 밀도에서 (3H)-티미딘을 이용한 표지화 지수를 사용하여 성장의 밀도 제한을 측정하고, 유사하게 MTT 또는 알라마르 블루 (Alamar blue) 검정 결과, 세포의 증식 능력과, 이에 영향을 미치는 조정제의 능력이 밝혀질 것이다 [Freshney (1994), 상기 참고]. 형질전환된 세포를 종양 억제인자 유전자로 형질감염시키면, 정상 표현형이 재생되어 접촉 억제되고 보다 낮은 밀도로 성장할 것이다.
이러한 검정에서는, 포화 밀도에서 (3H)-티미딘을 이용한 표지화 지수가 성장 밀도 제한을 측정하는 바람직한 방법이다. 형질전환된 숙주 세포를 암 관련 서열로 형질감염시키고, 비-제한 배지 조건 하에 포화 밀도로 24시간 동안 성장시킨다. (3H)-티미딘으로 표지화되는 세포 비율은 혼입된 cpm에 의해 결정된다.
접촉 비의존성 성장을 이용하여, 비정상적인 세포 증식과 형질전환을 유발시킨 암 서열의 조정제를 확인한다. 조정제는 접촉 비의존성 성장을 저하시키거나 없애고, 세포를 정상 표현형으로 복귀시킨다.
조정제를 확인하고 성상 확인하기 위한 성장 인자 또는 혈청 의존성의 평가
형질전환된 세포는 그의 정상 대응물 보다 낮은 혈청 의존성을 나타낸다 [참고: 예를 들어, Temin, J. Natl. Cancer Inst. 37: 167-175 (1966); Eagle et al., J. Exp. Med 131:836-879 (1970); Freshney, 상기 참고]. 이는 부분적으로, 형질전환된 세포에 의한 각종 성장 인자의 방출에 기인한다. 형질전환된 숙주 세포의 성장 인자 또는 혈청 의존도를 대조군과 비교할 수 있다. 예를 들어, 특정 세포의 성장 인자 또는 혈청 의존성은 본 발명의 암 관련 서열을 조정하는 화합물을 확인하고 성상 확인하기 위한 방법에서 모니터링한다.
조정제를 확인하고 성상 확인하기 위해 종양-특이적 마커 수준을 이용함
종양 세포는 그의 정상 대응물 보다 증가된 양의 특정 인자 ("종양 특이적 마커"로 후술됨)를 방출한다. 예를 들어, 플라스미노겐 활성화제 (PA)는 정상 뇌 세포로부터 방출되는 수준 보다 더 높은 수준으로 인간 신경아교종으로부터 방출된다 [참고: 예를 들어, Gullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth, in Biological Responses in Cancer, pp. 178-184 (Mihich (ed.) 1985)]. 유사하게, 종양 혈관형성 인자 (TAF)는 그의 정상 대응물 보다 더 높은 수준으로 종양 세포에서 방출되는 반면 [참고: 예를 들어, Folkman, Angiogenesis and Cancer, Sem Cancer Biol. (1992)], bFGF는 내피 종양으로부터 방출된다 [참고: Ensoli, B et al].
이들 인자의 방출을 측정하는 각종 기술이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Freshney (1994), 상기 참고; Unkless et al., J. Biol. Chem. 249: 4295-4305 (1974); Strickland & Beers, J. Biol. Chem. 251:5694-5702 (1976); Whur et al., Br. J. Cancer 42: 305 312 (1980); Gullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth, in Biological Responses in Cancer, pp. 178-184 (Mihich (ed.) 1985); Freshney, Anticancer Res. 5: 111-130 (1985)]. 예를 들어, 종양 특이적 마커 수준은 본 발명의 암 관련 서열을 조정하는 화합물을 확인하고 성상 확인하기 위한 방법에서 모니터링한다.
조정제를 확인하고 성상 확인하기 위한 마트리겔 내로의 침습성
마트리겔 또는 세포외 매트릭스 구성분 내로의 침습성 정도를, 암 관련 서열을 조정하는 화합물을 확인하고 성상 확인하기 위한 검정으로서 사용할 수 있다. 종양 세포는 마트리겔 또는 몇몇 기타 세포외 매트릭스 구성분 내로의 세포 침습성과 악성도 간의 분명한 상관 관계를 나타낸다. 이러한 검정에서는, 종양형성성 세포가 전형적으로 숙주 세포로서 사용된다. 이들 숙주 세포에서의 종양 억제인자 유전자의 발현은 숙주 세포의 침습력을 저하시킬 것이다. 문헌 [참고: Cancer Res. 1999; 59: 6010; Freshney (1994), 상기 참고]에 기재된 기술을 사용할 수 있다. 간단하게 언급하면, 마트리겔 또는 몇몇 기타 세포외 매트릭스 구성분으로 피복시킨 필터를 사용함으로써, 숙주 세포의 침습 정도를 측정한다. 겔 내로의 침투, 또는 필터의 말단 측면을 통한 침투가 침습력으로서 평가되고, 이동된 거리 및 세포 수에 의해, 또는 세포를 125I 예비표지시키고 필터 말단측 또는 디쉬 바닥 상의 방사능을 계수함으로써 조직학적으로 평가한다 [Freshney (1984), 상기 참고].
조정제를 확인하고 성상 확인하기 위한 생체내 종양 성장의 평가
세포 성장에 대한 암 관련 서열의 효과를 트랜스제닉 또는 면역억제된 유기체에서 시험한다. 트랜스제닉 유기체는 당해 분야에 허용되는 각종 방식으로 제조한다. 예를 들어, 암 유전자를 붕괴시키거나 암 유전자를 삽입한 녹아웃 트랜스제닉 유기체, 예를 들어 마우스 등의 포유류를 만든다. 녹아웃 트랜스제닉 마우스는 마커 유전자 또는 기타 이종 유전자를 상동 재조합을 통하여 마우스 게놈 내의 내인성 암 유전자 부위 내로 삽입함으로써 만든다. 이러한 마우스는 내인성 암 유전자를 이러한 암 유전자의 돌연변이된 버젼으로 치환시키거나, 또는 내인성 암 유전자를, 예를 들어 발암물질에 노출시켜 돌연변이시킴으로서 만들 수도 있다.
트랜스제닉 키메라 동물 (예: 마우스)를 제조하기 위해, DNA 구조물을 배아 줄기 세포의 핵에 도입한다. 새로이 공학적 처리시킨 유전적 병변을 함유하는 세포를 숙주 마우스 배아에 주사하고, 이를 암컷 수용자에게 재이식한다. 이들 배아 중의 몇몇은 생식 세포 (이들 중의 일부는 돌연변이체 세포주로부터 유래된다)를 보유하고 있는 키메라 마우스로 진화된다. 따라서, 이러한 키메라 마우스를 번식시킴으로써, 상기와 같이 도입된 유전적 병변을 함유하는 새로운 계열의 마우스를 수득하는 것이 가능하다 [참고: 예를 들어, Capecchi et al., Science 244: 1288 (1989)]. 키메라 마우스는 다음 문헌에 따라서 유도시킬 수 있다 [참고: 미국 특허 제6,365,797호 (2002년 4월 2일자로 허여됨); 미국 특허 제6,107,540호 (2000년 8월 22일자로 허여됨); Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) and Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed., IRL Press, Washington, D. C., (1987)].
또 다른 한편으론, 각종 면역억제되거나 면역결핍된 숙주 동물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 유전적 무흉선 "누드" 마우스 [참고: 예를 들어, Giovanella et al., J. Natl. Cancer Inst. 52: 921 (1974)], SCID 마우스, 흉선절제된 마우스 또는 조사된 마우스 [참고: 예를 들어, Bradley et al., Br. J. Cancer 38: 263 (1978); Selby et al., Br. J. Cancer 41:52 (1980)]를 숙주로서 사용할 수 있다. 동종 숙주 내로 주사된 이식 가능한 종양 세포 (전형적으로 약 106개 세포)는 고 비율의 증례에서 침습성 종양을 생성시키는 반면, 유사한 기원의 정상 세포는 그렇치 않을 것이다. 침습성 종양이 발생한 숙주에서는, 암 관련 서열을 발현하는 세포를 피하 또는 동소적으로 주사한다. 이어서, 마우스를 대조군과 특정 조정제로 처리한 처리된 실험군을 포함한 여러 군으로 나눈다. 적당한 시간, 바람직하게는 4 내지 8주 후, 종양 성장을 측정하고 (예를 들어, 용량에 의해, 또는 그의 2가지 가장 큰 치수로써, 또는 종양에 의해 측정한다), 대조군과 비교한다. (예를 들어, 스튜던츠 T 시험을 사용하여) 통계상 유의적 감소를 나타내는 종양이 성장 억제된 것으로 간주된다.
조정제를 확인하고 성상 확인하기 위한 시험관내 검정
조정 활성을 나타내는 화합물을 확인하기 위한 검정을 시험관 내에서 수행할 수 있다. 예를 들어, 암 폴리펩티드를 먼저, 잠재적 조정제와 접촉시키고, 이를 적당한 시간, 예를 들어 0.5 내지 48시간 동안 항온 배양한다. 한 양태에서는, 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정함으로써, 암 폴리펩티드 수준을 시험관 내에서 결정한다. 단백질 수준은 암 폴리펩티드 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하는 항체를 수반하는 면역검정, 예를 들어 웨스턴 블롯팅, ELISA 등을 사용하여 측정한다. mRNA를 측정하기 위해서는, 예를 들어 PCR, LCR을 이용한 증폭, 또는 혼성화 검정, 예를 들면, 노던 혼성화, RNAse 보호, 도트 블롯팅이 바람직하다. 단백질 또는 mRNA의 수준은 본원에 기재된 바와 같이, 직접 또는 간접적으로 표지된 탐지제, 예를 들어 형광성 또는 방사성 표지된 핵산, 방사성 또는 효소적으로 표지된 항체 등을 사용하여 탐지한다.
또 다른 한편으론, 루시퍼라제, 녹색 형광성 단백질, CAT, 또는 P-gal 등의 리포터 유전자에 작동적으로 연결된 암 단백질 프로모터를 사용하는 리포터 유전자 시스템을 고안할 수 있다. 이러한 리포터 구조물을 전형적으로, 세포 내로 형질감염시킨다. 잠재적 조정제로 처리한 후, 리포터 유전자 전사, 해독 또는 활성 량을 당업자에게 공지된 표준 기술에 따라서 측정한다 [참고: Davis GF, 상기 참고; Gonzalez, J. & Negulescu, P. Curr. Opin. Biotechnol. 1998: 9:624].
상기 언급된 바와 같이, 시험관내 스크린을 개개 유전자 및 유전자 생성물 상에서 수행한다. 즉, 특정 상태에 있어 중요한 것으로서 시차적으로 발현된 유전자를 확인하면, 유전자 또는 유전자 생성물 자체 발현의 조정제에 대한 스크리닝을 수행한다.
한 양태에서는, 특이적 유전자(들)의 발현 조정제에 대한 스크리닝을 수행한다. 전형적으로, 단지 1개 또는 몇개 유전자의 발현을 평가한다. 또 다른 양태에서는, 시차적으로 발현된 단백질과 결합하는 화합물을 처음 발견하기 위한 스크린을 고안한다. 이어서, 이들 화합물을 대상으로 하여, 시차적으로 발현된 활성을 조정할 수 있는 능력에 대해 평가한다. 더우기, 초기 후보 화합물이 일단 확인되면, 변이체를 추가로 스크리닝하여 구조 활성 관계를 보다 잘 평가할 수 있다.
조정제를 확인하고 성상 확인하기 위한 결합 검정
본 발명에 따르는 결합 검정에서는, 본 발명의 정제되거나 분리된 유전자 생성물을 일반적으로 사용한다. 예를 들어, 본 발명의 단백질에 대한 항체를 생성시키고, 면역검정을 수행하여 단백질의 양 및(또는) 위치를 결정한다. 또 다른 한편, 암 단백질을 포함하는 세포를 본 검정에 사용한다.
따라서, 상기 방법은 본 발명의 암 단백질을 후보 화합물 (예: 리간드)과 합하고, 본 발명의 암 단백질에 대한 상기 화합물의 결합을 결정하는 것을 포함한다. 바람직한 양태는 인간 암 단백질을 활용하고; 인간 질병의 동물 모델을 또한 발생시켜 이를 사용할 수도 있다. 또한, 기타 유사한 포유류 단백질을 당업자에 의해 인지되는 바와 같이 사용할 수도 있다. 더우기, 몇몇 양태에서는 변이체 또는 유도체 암 단백질을 사용한다.
일반적으로, 본 발명의 암 단백질, 또는 리간드는 불용성 지지체에 비-확산적으로 결합된다. 이러한 지지체는, 예를 들어 분리된 샘플 수용 영역을 갖는 것일 수 있다 (예: 미세역가 판, 어레이 등). 불용성 지지체는 해당 조성물이 결합될 수 있는 어떠한 조성으로도 만들 수 있고, 불용성 물질로부터 용이하게 격리시키며, 전반적인 스크리닝 방법과 화합성이다. 이러한 지지체의 표면은 고형 또는 다공성일 수 있고, 편리한 모든 외형을 지닐 수 있다.
적합한 불용성 지지체의 예에는 미세역가 판, 어레이, 막 및 비드가 포함된다. 이들은 전형적으로, 유리, 플라스틱 (예: 폴리스티렌), 다당류, 나일론, 니트로셀룰로스, 또는 테플론 (Teflon™) 등으로 만든다. 미세역가 판 및 어레이가 특히 편리한데, 이는 소량의 시약 및 샘플을 사용해서도 다수의 어레이를 동시에 수행할 수 있기 때문이다. 조성물을 지지체에 결합시키는 특정한 방식이 중요하지는 않는데, 단 이러한 방식은 본 발명의 시약 및 전반적인 방법과 화합성이고, 조성물의 활성을 유지시켜야 하며, 비-확산성이어야 한다. 바람직한 결합 방법에는 단백질을 지지체에 부착시킬 때 활성화 서열 또는 리간드 결합 부위를 입체적으로 차단시키지 않는 항체의 사용; "점착성" 또는 이온성 지지체에 대한 직접적인 결합; 화학적 가교결합; 표면 상에서의 단백질 또는 작용제의 합성 등이 포함된다. 단백질 또는 리간드/결합제를 지지체에 결합시킨 후, 결합되지 않은 과량의 물질을 세척에 의해 제거한다. 이어서, 샘플 수용 영역을 소 혈청 알부민 (BSA), 카세인 또는 기타 독이없는 단백질 또는 기타 부분과 함께 항온 배양함으로써 차단시킬 수 있다.
일단 본 발명의 암 단백질이 지지체에 결합되면, 시험 화합물을 본 검정에 가한다. 또 다른 한편으론, 후보 결합제를 지지체에 결합시킨 다음, 본 발명의 암 단백질을 가한다. 결합제에는 특이적 항체, 화학적 라이브러리의 스크린에서 확인된 비-천연 결합제, 펩티드 유사체 등이 포함된다.
특히 관심있는 것은 인간 세포에 대한 독성이 낮은 작용제를 확인하는 검정이다. 이를 위해 광범위한 검정을 사용할 수 있는데, 이에는 증식 검정, cAMP 검정, 시험관 내에서 표지된 단백질-단백질 결합 검정, 전기영동 이동도 변동 검정, 단백질 결합에 대한 면역검정, 기능적 검정 (인산화 검정 등) 등이 포함된다.
본 발명의 암 단백질에 대한 시험 화합물 (리간드, 결합제, 조정제 등)의 결합 결정은 수 많은 방식으로 수행할 수 있다. 시험 화합물을 표지시킬 수 있고; 예를 들어 본 발명의 암 단백질의 전부 또는 일부를 고형 지지체에 부착시키고, 표지된 후보 화합물 (예: 형광성 표지)를 부가하며, 과량의 시약을 세척 제거하고, 표지가 고형 지지체 상에 존재하는지를 결정함으로써, 결합을 직접적으로 결정하였다. 필요에 따라, 각종 차단 및 세척 단계를 활용할 수 있다.
특정 양태에서는, 단지 하나의 구성분 만을 표지시키는데, 예를 들어 본 발명의 단백질 또는 리간드를 표지시킨다. 또 다른 한편으론, 한 가지 이상 구성분을 상이한 표지로 표지시키는데, 예를 들어 단백질에 대해서는 125I로 표지시키고, 화합물에 대해서는 형광단으로 표지시킨다. 근접 시약, 예를 들어 켄칭 또는 에너지 전이 시약이 또한 유용하다.
조정제를 확인하고 성상 확인하기 위한 경쟁적 결합
한 양태에서는, "경쟁인자"를 이용한 경쟁 결합 검정에 의해 "시험 화합물"의 결합을 결정한다. 이러한 경쟁인자는 표적 분자 (예: 본 발명의 암 단백질)와 결합하는 결합 부분이다. 경쟁인자에는 항체, 펩티드, 결합 파트너, 리간드 등의 화합물이 포함된다. 특정 상황 하에서는, 시험 화합물과 경쟁인자 간의 경쟁적 결합이 시험 화합물을 전위시킨다. 한 양태에서는, 시험 화합물을 표지시킨다. 시험 화합물 또는 경쟁인자, 또는 둘 다를 결합시키기에 충분한 시간 동안 단백질에 가한다. 최적 활성을 촉진시키는 온도, 전형적으로 4 내지 40℃에서 항온 배양을 수행한다. 항온 배양 기간은 전형적으로, 신속한 고 처리능력 스크리닝을 촉진시키기 위해 최적화하는데; 전형적으로는, 0 내지 4시간이 충분할 것이다. 과량의 시약은 일반적으로 제거하거나 세척 제거한다. 그 다음, 제2 성분을 가하고, 이어서 결합을 지시하기 위해 표지된 성분이 존재하거나 부재한다.
한 양태에서는, 경쟁인자를 먼저 가한 다음, 시험 화합물을 가한다. 경쟁인자의 전위는 시험 화합물이 암 단백질과 결합하고 있으므로, 이러한 암 단백질과 결합하여 잠재적으로 이의 활성을 조정할 수 있다는 지표이다. 이러한 양태에서는, 어느 한 성분을 표지시킬 수 있다. 따라서, 예를 들어 경쟁인자를 표지시킨 경우에, 후-시험 화합물 세척 용액 중에 표지가 존재한다는 것은 시험 화합물에 의한 전위를 지시한다. 또 다른 한편, 시험 화합물을 표지시킨 경우에, 지지체 상에 표지가 존재한다는 것은 전위를 지시한다.
대체 양태에서는, 시험 화합물을 먼저, 항온 배양 및 세척과 함께 가한 다음, 경쟁인자를 가한다. 경쟁인자에 의한 결합이 존재하지 않는다는 것은 시험 화합물이 경쟁 인자 보다 더 높은 친화도로 암 단백질과 결합한다는 것을 지시한다. 따라서, 시험 화합물을 표지시킨 경우에, 지지체 상에 표지가 존재한다는 것은 경쟁인자 결합의 결여와 연계해서, 시험 화합물이 본 발명의 암 단백질과 결합하여 이의 활성을 잠재적으로 조정한다는 것을 지시한다.
따라서, 경쟁적 결합 방법은 본 발명의 암 단백질의 활성을 조정할 수 있는 작용제를 확인하기 위한 시차 스크리닝을 포함한다. 이러한 양태에서는, 상기 방법이 암 단백질을 제1 샘플 중에서 경쟁인자와 합하는 것을 포함한다. 제2 샘플은 시험 화합물, 본 발명의 암 단백질 및 경쟁인자를 포함한다. 경쟁인자의 결합은 양 샘플에 대해 결정하고, 두 샘플 간의 결합 상의 변화 또는 차이는 상기 암 단백질과 결합하여 그의 활성을 조정할 수 있는 작용제가 존재한다는 것을 지시한다. 즉, 경쟁인자의 결합이 제1 샘플에 비해 제2 샘플에서 상이한 경우에는, 해당 작용제가 암 단백질과 결합할 수 있다.
또 다른 한편, 시차 스크리닝을 사용하여 본래의 암 단백질과는 결합하지만, 변형된 암 단백질과는 결합할 수 없는 약물 후보를 확인한다. 예를 들어, 암 단백질의 구조를 모델링하고 이를 합리적 약물 고안에 사용하여, 부위-변형된 단백질과는 일반적으로 결합하지 않는 작용제와 상호 작용하는 작용제를 합성한다. 더우기, 본래의 암 단백질의 활성에 영향을 미치는 상기 약물 후보는 또한, 상기 단백질의 활성을 증강 또는 저하시킬 수 있는 능력에 대해 스크리닝함으로써 확인한다.
양성 대조군과 음성 대조군을 본 검정에 사용할 수 있다. 바람직하게는, 대조군과 시험 샘플을 적어도 세 번 되풀이 수행하여 통계상 유의적 결과를 수득한다. 작용제가 단백질과 결합할 수 있기에 충분한 시간 동안 모든 샘플을 항온 배양한다. 항온 배양 후, 샘플을 세척하여 비-특이적으로 결합된 물질을 제거하고, 결합된, 일반적으로 표지된 작용제의 양을 결정한다. 예를 들어, 방사성표지를 이용한 경우에는, 샘플을 신틸레이션 계수기에서 계수하여 결합된 화합물의 양을 결정할 수 있다.
각종의 기타 시약이 스크리닝 검정에 포함될 수 있다. 이에는 염, 중성 단백질, 예를 들어 알부민, 세정제 등의 시약이 포함되는데, 이들은 최적의 단백질-단백질 결합을 촉진시키고/시키거나 비-특이적 또는 배경 상호작용을 감소시키기 위해 사용된다. 검정 효율을 개선시키는 시약, 예를 들어 프로테아제 억제제, 뉴클레아제 억제제, 항미생물제 등을 사용할 수도 있다. 성분 혼합물은 필수 결합을 제공해주는 순서로 부가한다.
본 발명의 단백질을 하향 조절하거나 억제하기 위한 폴리뉴클레오티드의 사용
폴리뉴클레오티드 암 조정제를 WO 91/04753에 기재된 바와 같이, 리간드-결합 분자와의 접합체를 형성함으로써 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포 내로 도입할 수 있다. 적합한 리간드-결합 분자에는 세포 표면 수용체, 성장 인자, 기타 사이토킨, 또는 세포 표면 수용체와 결합하는 기타 리간드가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 리간드 결합 분자의 접합이, 리간드 결합 분자가 그의 상응하는 분자 또는 수용체와 결합할 수 있는 능력을 실질적으로 방해하지 않거나, 또는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 접합된 버젼이 세포 내로 유입되는 것을 실질적으로 차단하지 않는다. 또 다른 한편으론, 폴리뉴클레오티드 암 조정제를 WO 90/10448에 기재된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드-지질 복합체를 형성함으로써 표적 핵산 서열을 함유하는 세포 내로 도입할 수 있다. 안티센스 분자를 사용하거나 모델에서 녹아웃 및 녹 (knock)을 또한, 치료 방법 이외에도 상기 논의된 바와 같은 스크리닝 검정에 사용할 수 있다.
억제성 및 안티센스 뉴클레오티드
특정 양태에서는, 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 억제성 소 핵 RNA (snRNA), 즉 코딩 mRNA 핵산 서열, 예를 들어 본 발명의 암 단백질, mRNA 또는 그의 아서열과 상보적이고 이러한 핵산 서열과 바람직하게 특이적으로 혼성화할 수 있는 핵산을 사용함으로써, 암 관련 단백질의 활성을 하향 조절하거나 완전히 억제시킨다. 안티센스 폴리뉴클레오티드를 mRNA과 결합시키면, 이러한 mRNA의 해독 및(또는) 안정성이 저하된다.
본 발명의 맥락에서, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 천연 발생적 뉴클레오티드, 또는 천연 발생적 소단위체 또는 그의 근접한 동족체로부터 형성된 합성 종을 포함할 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 또한, 변경된 당 부분 또는 당간 연쇄를 가질 수도 있다. 이들 중에서, 당해 분야에 사용하는 것으로 공지되어 있는 포스포로티오에이트 및 기타 황 함유 종이 예시된다. 본 발명의 뉴클레오티드와 효과적으로 혼성화하도록 기능하는 한은, 유사체도 본 발명에 포괄된다 [참고: 예를 들어, Isis Pharmaceuticals, Carlsbad, CA; Sequitor, Inc., Natick, MA].
이러한 안티센스 폴리뉴클레오티드는 재조합 수단을 사용하여 용이하게 합성할 수 있거나, 또는 시험관 내에서 합성할 수 있다. 이러한 합성을 위한 장비는 몇몇 매도인 (예: Applied Biosystems)에 의해 판매되고 있다. 기타 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체의 제조 또한, 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 안티센스 분자에는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 안티센스 쇄와의 결합에 의해 전사를 차단시키기 위해 이용될 수 있다. 안티센스 및 센스 올리고뉴클레오티드는 암 분자에 대한 표적 mRNA (센스) 또는 DNA (안티센스) 서열과 결합할 수 있는 단일 가닥 핵산 서열 (RNA 또는 DNA)을 포함한다. 본 발명에 따르는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 약 12개 이상 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 12 내지 30개 뉴클레오티드를 포함한다. 소정의 단백질을 코딩하는 cDNA 서열에 기초하여 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 유도시킬 수 있는 능력이, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Stein & Cohen (Cancer Res. 48: 2659 (1988 and van der Krol et al. (BioTechniques 6: 958 (1988))].
리보자임
안티센스 폴리뉴클레오티드 이외에도, 리보자임을 사용하여 암 관련 뉴클레오티드 서열의 전사를 표적화하고 억제시킬 수 있다. 리보자임은 기타 RNA 분자를 촉매적으로 절단시키는 특정 RNA 분자이다. I군 리보자임, 해머헤드 리보자임, 헤어핀 리보자임, RNase P, 및 도끼두 (axhead) 리보자임을 포함한 상이한 종류의 리보자임이 보고되었다 [상이한 리보자임의 특성에 관한 일반적은 고찰은 문헌 (Castanotto et al., Adv. in Pharmacology 25: 289-317 (1994))을 참고할 수 있다].
헤어핀 리보자임의 일반적인 특징이, 예를 들어 다음 문헌에 기재되었다 [참고: Hampel et al., Nucl. Acids Res. 18:299-304 (1990); European Patent Publication No. 0360257; U. S. Patent No. 5,254,678]. 제조 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, WO 94/26877; Ojwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6340-6344 (1993); Yamada et al., Human Gene Therapy 1:39-45 (1994); Leavitt et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 92: 699-703 (1995); Leavitt et al., Human Gene Therapy 5:1151-120 (1994); and Yamada et al., Virology 205:121-126 (1994)].
표현형별 스크리닝에 있어서의 조정제의 용도
한 양태에서는, 시험 화합물을 연관된 암 발현 프로파일을 나타내는 암 세포 집단에게 투여한다. 본원에서의 "투여" 또는 "접촉"은 조정제가 흡수 및 세포성 작용에 의해서든 아니면 세포 표면에서의 작용에 의해서든지 간에 세포 상에서 작용할 수 있도록 해주는 방식으로 세포에 부가되는 것을 의미한다. 몇몇 양태에서는, 단백질성 작용제 (즉, 펩티드)를 코딩하는 핵산을 바이러스성 구조물, 예를 들어 아데노바이러스성 또는 레트로바이러스성 구조물에 놓아두고 세포에 부가하여, 이러한 펩티드 작용제의 발현이 달성되도록 한다 [참고: 예를 들어, PCT US97/01019]. 조절 가능한 유전자 요법 시스템을 사용할 수도 있다. 조정제가 일단 세포에 투여되면, 세포를 경우에 따라 세척하고, 일정 기간 동안 바람직하게는 생리적 조건 하에 항온 배양한다. 그 다음 세포를 수거하고, 새로운 유전자 발현 프로파일을 생성시킨다. 따라서, 예를 들어 암 조직을 대상으로 하여, 암 표현형을 조정하는, 예를 들어 유도시키거나 억제하는 작용제에 대해 스크리닝한다. 하나 이상, 바람직하게는 많은 유전자의 발현 프로파일 상의 변화는 해당 작용제가 암 활성에 대한 효과를 지니고 있다는 것을 지시한다. 유사하게, 생물학적 기능이나 신호 전달 경로의 변경은 조정제 활성을 시사한다. 암 표현형에 대한 이러한 사인 (signature)을 규정함으로써, 이 표현형을 변경시키는 신규 약물에 대한 스크린을 고안한다. 이러한 접근법을 이용하면, 약물 표적이 공지될 필요가 없고 본래의 유전자/단백질 발현 스크리닝 플랫폼에 표시될 필요도 없을 뿐만 아니라 표적 단백질에 대한 전사 수준을 변경시킬 필요도 없다. 조정제 억제 기능이 대리 마커로서 제공될 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 유전자 또는 유전자 생성물을 평가하기 위한 스크린을 수행한다. 즉, 특정 상태에 있어 중요한 것으로서 시차적으로 발현된 특정한 유전자를 확인하면, 유전자 또는 유전자 생성물 자체 발현의 조정제에 대한 스크리닝을 수행한다.
본 발명의 펩티드에 영향을 미치기 위한 조정제의 용도
각종 검정을 이용하여 암 폴리펩티드 활성 또는 암 표현형의 측정을 수행한다. 예를 들어, 암 폴리펩티드(들)의 기능에 대한 조정제의 효과는 상기 언급된 파라미터를 검사함으로써 측정한다. 활성에 영향을 미치는 생리적 변화를 이용하여 본 발명의 폴리펩티드에 대한 시험 화합물의 영향력을 평가한다. 본래의 세포 또는 동물을 이용하여 기능적 결과를 결정하는 경우에, 각종 효과를 평가할 수 있는데, 예를 들어 고형 종양과 연관된 암의 경우에는, 종양 성장, 종양 전이, 신생혈관증식, 호르몬 방출, 공지된 유전 마커와 성상 확인되지 않은 유전 마커 둘 다에 대한 전사 변화 (예를 들어, 노던 블롯에 의해 수행됨), 세포 대사 상의 변화 (예: 세포 성장 또는 pH 변화), 및 세포내 제2 메신저 (예: cGNIP) 상의 변화를 평가할 수 있다.
암 관련 서열을 확인하고 성상 확인하는 방법
각종 유전자 서열의 발현은 암과 상관이 있다. 따라서, 돌연변이체 또는 변이체 암 유전자에 근거한 장애를 결정한다. 한 양태에서, 본 발명은 변이체 암 유전자를 함유하는 세포를 확인하는 방법, 예를 들어 특정 세포 중에 하나 이상의 내인성 암 유전자 서열의 전부 또는 일부가 존재하는 지를 결정하는 방법을 제공한다. 이는 수 많은 서열 분석 기술을 사용하여 수행한다. 본 발명은 개개인의 암 유전자형을 확인하는 방법, 예를 들어 이러한 개개인에게서 본 발명의 하나 이상의 유전자 서열의 전부 또는 일부를 결정하는 방법을 포함한다. 이는 일반적으로, 개개인의 하나 이상의 조직, 예를 들어 표 I에 제시된 조직에서 수행하고, 이에는 수 많은 조직 또는 동일한 조직의 상이한 샘플을 평가하는 것이 포함될 수 있다. 상기 방법은 서열 분석된 유전자의 서열을 공지된 암 유전자, 즉 야생형 유전자와 비교하여 계열 구성원, 동족체, 돌연변이물 또는 변이체의 존재를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이어서, 상기 유전자의 전부 또는 부분 서열을 공지된 암 유전자의 서열과 비교하여 어떤 차이점이 존재하는지를 결정할 수 있다. 이는 수 많은 공지된 상동성 프로그램, 예를 들어 BLAST, 베스트피트 (Bestfit) 등을 사용하여 수행한다. 환자의 암 유전자 서열과 공지된 암 유전자 서열 간에 차이가 존재하는 것은 본원에 기재된 바와 같이, 특정 질병 상태, 또는 특정 질병 상태에 대한 성향과 상관이 있다.
바람직한 양태에서는, 암 유전자를 프로브로서 사용하여 게놈 내의 암 유전자의 카피 수를 결정한다. 암 유전자를 프로브로서 사용하여 암 유전자의 염색체 국재화를 결정한다. 염색체 국재화와 같은 정보는 특히 염색체 이상, 예를 들어 전위 등이 암 유전자 자리에서 확인된 경우에 진단 또는 예후를 제공하는데 사용된다.
XIV.) RNAi, 및 저분자 간섭 RNA (siRNAs)의 치료적 용도
본 발명은 또한, siRNA 올리고뉴클레오티드, 특히 STEAP-1 코딩 영역 또는 5" UTR 영역의 단편을 적어도 포괄하는 이중 가닥 RNAs, 또는 보체, 또는 STEAP-1 서열에 대해 특이적인 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 한 양태에서는, 이러한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 STEAP-1의 기능을 밝히거나, 또는 STEAP-1 기능 또는 발현의 조정제에 대해 스크리닝하거나 이를 평가한다. 또 다른 양태에서는, siRNA 형질감염을 사용함으로써 STEAP-1의 유전자 발현을 저하시키는데, 이로써 해당 항원을 내적으로 발현하는 형질전환된 암 세포의 증식 능력이 상당히 저하되며; 특이적 STEAP-1 siRNAs로 처리시킨 세포는, 예를 들어 세포 생육성에 관한 대사 판독정보에 의해 측정된 바와 같은 생존률 감소를 나타내었는데, 이는 증식 능력 저하와 상관이 있다. 따라서, STEAP-1 siRNA 조성물은 STEAP-1 단백질의 핵산 ORF 서열 또는 그의 아서열에 상응하는 siRNA (이중 가닥 RNA)를 포함하고; 이들 아서열은 일반적으로, 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상의 연속된 RNA 뉴클레오티드이고, mRNA 코딩 서열의 적어도 일부와 상보적인 서열 및 상보적이지 않은 서열을 함유한다. 바람직한 양태에서는, 상기 아서열이 19 내지 25개 뉴클레오티드 길이, 가장 바람직하게는 21 내지 23개 뉴클레오티드 길이다.
RNA 간섭은 시험관내 및 생체 내에서 유전자를 침묵시키는 새로운 접근법이므로, 저분자 이중 가닥 RNAs (siRNAs)는 유용한 치료제이다. 특이적 유전자 활성을 침묵시킬 수 있는 siRNAs의 능력은 현재 질병 동물 모델에서 활용되고 있으며, 인간에게도 마찬가지로 사용되고 있다. 예를 들어, 특정한 표적에 대항한 siRNA을 수반한 마우스에게 siRNA 용액을 유체역학적으로 주입하는 것이 치료상 유효한 것으로 입증되었다.
송 (Song) 등에 의한 선구적인 연구 활동은 한 가지 유형의 완전한 천연 핵산, 저분자 간섭 RNAs (siRNAs)가 추가의 화학적 변형을 수행하지 않은 경우라도 치료제로서 제공되었다는 것을 지시하고 있다 [참고: Song, E., et al. "RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis" Nat. Med. 9(3): 347-51 (2003)]. 이러한 연구 활동은 siRNAs를 동물에게 주입하는 것이 질병을 완화시킬 수 있다는 것을 처음으로 입증한 생체내 증거를 제공하였다. 이러한 경우, 상기 문헌의 저자는 FAS 단백질 (염증 반응 동안 과활성화될 때, 간세포 및 기타 세포의 사멸을 유도시키는 세포 사멸 수용체)를 침묵시키기 위해 고안된 siRNA를 마우스에게 주사하였다. 그 다음날, 이 동물에게 Fas에게 특이적인 항체를 투여하였다. 대조군 마우스는 급성 간부전증으로 인해 수일 내에 사망한 반면, siRNA-처리된 마우스의 80% 이상이 심각한 질병없이 생존하였다. 그들의 간 세포의 약 80 내지 90%가 노출된 siRNA 올리고뉴클레오티드에 혼입되었다. 더우기, RNA 분자는 3주 후 효과를 상실하기 전 10일 동안 기능하였다.
인간 요법에 사용하는 경우에는, siRNA를 장시간 지속되는 RNAi 활성을 유도시키는 효율적인 시스템에 의해 전달한다. 임상적으로 사용하기 위한 대부분의 가출원은 siRNAs를 적당한 세포에 전달하는 것이다. 간세포가 외인성 RNA를 특히 잘 받아 들이는 것으로 보인다. 오늘날, 간에 위치한 표적에 관심이 집중되고 있는데, 이는 간이 핵산 분자 및 바이러스성 벡터에 의해 용이하게 표적화될 수 있는 기관이기 때문이다. 그러나, 기타 조직 및 기관 표적도 마찬가지로 바람직하다.
세포 막을 가로지른 통과를 증진시키는 화합물로 siRNAs를 제형화하여, 요법에서 siRNAs의 투여를 개선시킨다. 뉴클레아제에 대해 내성이 있고 혈청 안정성을 지니며 이와 동시에 RNAi 효과 지속 기간이 증가된, 화학적으로 변형된 siRNA가 부가의 양태이다.
따라서, siRNA 기술은 STEAP-1에 대한 siRNA 분자를 표 I에 기재된 바와 같은 암이 있는 개개인에게 전달함으로써, 인간 악성 종양을 치료한다. 이러한 siRNAs 투여로 인해, STEAP-1을 발현하는 암 세포의 성장이 저하되고, 항종양 요법을 제공하여 악성 종양과 연관된 발병률 및(또는) 사망률을 저하시킨다.
이러한 유전자 생성물 녹다운 양식의 효능은 시험관내 또는 생체 내에서 측정하는 경우에 유의적이다. 시험관내 효능은 siRNAs를 배양 중인 세포에 적용하거나, 또는 STEAP-1 단백질의 발현 저하를 탐지하기 위해 시험관내 방법을 사용하는 경우에는 암 환자 생검 분취물에 적용하는 것을 통하여 용이하게 입증 가능하다.
XV.) 키트/제조품
본원에 기재된 실험실, 예후, 예방, 진단 및 치료적 적용에 사용하기 위한 키트가 본 발명의 범위 내에 속한다. 이러한 키트는 담체, 패키지, 또는 1개 이상의 용기를 수용하도록 구획화되는 용기 (각 용기는 본 발명의 방법에 사용될 별개 요소들 중의 하나를 포함한다), 예를 들어 바이알, 튜브 등을, 본원에 기재된 바와 용도에 대한 지시 사항을 포함하는 라벨 또는 삽입물과 함께 포함할 수 있다. 예를 들어, 용기(들)는 탐지 가능하게 표지되거나 표지될 수 있는 프로브를 포함할 수 있다. 이러한 프로브는 본 발명의 단백질, 또는 유전자 또는 메시지에 대해 각각 특이적인 항체 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 해당 방법이 표적 핵산을 탐지하기 위해 핵산 혼성화를 활용하는 경우에는, 키트가 표적 핵산 서열을 증폭시키기 위한 뉴클레오티드(들)를 함유하는 용기를 가질 수도 있다. 키트는 리포터 분자 (예: 효소적, 형광성 또는 방사성 동위원소 표지)에 결합된 리포터, 예를 들어 바이오틴 결합 단백질, 예를 들면, 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하는 용기를 포함할 수 있는데; 이러한 리포터는, 예를 들어 핵산 또는 항체와 함께 사용할 수 있다. 키트는 도 2 또는 도 3에 도시된 아미노산 서열 또는 그의 유사체, 또는 이러한 아미노산을 코딩하는 핵산 분자의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 전형적으로, 상기 언급된 용기들과, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 물질, 예를 들어 완충제, 희석제, 충진제, 바늘, 주사기, 담체, 패키지, 용기, 바이알 및(또는) 튜브 라벨 (사용에 관한 지시 사항 및(또는) 함량이 기재되어 있다), 및 사용에 관한 지시 사항을 수반하는 패키지 삽입물을 포함하는 것과 연관된 하나 이상의 기타 용기를 포함할 것이다.
라벨은 해당 조성물이 특이 요법이나 비-치료적 적용, 예를 들어 예후, 예방, 진단 또는 실험실 적용을 위해 사용된다는 것을 표시하기 위해 용기 상에 또는 용기와 함께 제시될 수 있고, 생체내 또는 시험관내 사용, 예를 들어 본원에 기재된 용도에 대한 지시 사항을 표시할 수도 있다. 지시 사항 및(또는) 기타 정보가 본 발명의 키트 상에 또는 키트 내에 포함되는 삽입물(들) 또는 표지(들) 상에 포함될 수도 있다. 라벨은 용기 상에 존재하거나 용기와 연합될 수 있다. 라벨은 이러한 라벨을 형성하는 문자, 숫자 또는 기타 기호가 용기 자체 내로 성형 또는 에칭되는 경우에 용기 상에 존재할 수 있고; 라벨이 용기에 또한 보유된 저장소 또는 캐리어 내에 존재하는 경우에는, 예를 들어 패키지 삽입물로서 용기와 연합될 수 있다. 라벨은 해당 조성물이 특정 질환, 예를 들어 표 I에 기재된 조직의 종양을 진단, 치료, 예방 또는 예후하는데 사용된다는 것을 나타낼 수 있다.
용어 "키트" 및 "제조품"은 동의어로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 조성물, 예를 들어 아미노산 서열(들), 소분자(들), 핵산 서열(들) 및(또는) 항체(들), 예를 들면, 표 I에 기재된 바와 같은 조직의 종양을 진단, 예후, 예방 및(또는) 치료하는데 유용한 물질을 함유하는 제조품(들)이 제공된다. 이러한 제조품은 전형적으로, 1개 이상의 용기와 1개 이상의 라벨을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험용 튜브가 포함된다. 용기는 각종 재료, 예를 들어 유리, 금속 또는 플라스틱으로부터 형성할 수 있다. 용기는 아미노산 서열(들), 소분자(들), 핵산 서열(들), 세포 집단(들) 및(또는) 항체(들)를 보유할 수 있다. 한 양태에서는, 용기가 특정 세포의 mRNA 발현 프로파일을 검사하는데 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드를, 이러한 목적을 위해 사용된 시약과 함께 보유한다. 또 다른 양태에서는, 용기가 세포 및 조직에서의 STEAT-1의 단백질 발현을 평가하는데 사용하기 위한, 또는 관련 실험실, 예후, 진단, 예방 및 치료적 목적을 위한 항체, 그의 결합성 단편 또는 특이적 결합성 단백질을 포함하는데; 이러한 용도에 대한 표시 및(또는) 지시 사항이, 이들 목적에 사용된 시약 및 기타 조성물 또는 도구와 마찬가지로, 상기 용기 상에 또는 용기와 함께 포함될 수 있다. 또 다른 양태에서는, 용기가 세포성 또는 체액성 면역 반응을 유도시키기 위한 물질을, 이와 연관된 표시물 및(또는) 지시사항과 함께 포함한다. 또 다른 양태에서는, 용기가 양자 면역요법, 예를 들어 세포독성 T 세포 (CTL) 또는 조력 T 세포 (HTL)에 대한 물질을, 이와 연관된 표시물 및(또는) 지시사항과 함께 포함하는데; 이러한 목적을 위해 사용된 시약 및 기타 조성물 또는 도구가 포함될 수도 있다.
용기는 또한, 특정 질환을 치료, 진단, 예후 또는 예방하는데 유효한 조성물을 보유할 수 있고, 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 활성제는 STEAP-1과 특이적으로 결합할 수 있고 STEAP-1의 기능을 조정할 수 있는 항체일 수 있다.
본 발명의 제조품은 제약상 허용 가능한 완충제, 예를 들어 인산염 완충 식염수, 링거 용액 및(또는) 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 충진제, 교반제, 바늘, 주사기, 및(또는) 사용에 관한 표시물 및(또는) 지시사항을 수반한 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 각종 국면이 다음 몇 가지 실시예를 통하여 추가로 기재되고 예시되지만, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.
실시예 1: STEAP-1 유전자의 cDNA 단편의 SSH-생성된 분리
재료 및 방법
LAPC 이종이식편:
LAPC 이종이식편을 공급처 [Dr. Charles Sawyers (UCLA)]로부터 수득하고, 문헌 [참고: Klein et al, 1997, Nature Med. 3: 402-408; Craft et al., 1999, Cancer Res. 59: 5030-5036]에 기재된 바와 같이 생성시켰다. 안드로겐 의존성 및 비의존성 LAPC-4 이종이식편 (각각 LAPC-4 AD 및 AI) 및 LAPC-9 이종이식편 (각각 LAPC-9 AD 및 Al)을 본래의 숫컷 SCID 마우스 또는 거세된 숫컷에서 각각 성장시키고, 수용자 숫컷에서 작은 조직 조각으로서 계대접종하였다. LAPC-4 Al 이종이식편은 LAPC-4 AD 종양으로부터 유래되었고, LAPC-9 Al 이종이식편은 LAPC-9 AD 종양으로부터 유래되었다. Al 이종이식편을 생성시키기 위해, LAPC AD 종양을 보유하고 있는 숫컷 마우스를 거세시키고, 2 내지 3개월 동안 유지시켰다. LAPC 종양이 다시 성장한 후에는, 이 종양을 수거하고, 이를 거세된 숫컷 또는 암컷 SCID 마우 스에 계대접종하였다.
LAPC-4 AD 이종이식편을 다음과 같이 경골내적으로 성장시켰다. 피하 성장시킨 LAPC-4 AD 이종이식편 종양 조직을 1 내지 2 ㎣ 박편으로 잘게 썰고, 이 조직을 1X 이스코브스 (Iscoves) 배지에 담가둔 다음, 잘게 썬 조직을 4분 동안 1.3K rpm을 원심분리시키며, 상등액을 10 ml 빙냉 1X 이스코브스 배지에 재현탁시키고 4분 동안 1.3K rpm으로 원심분리시켰다. 이어서, 펠릿을 1% 프로나제 E와 함께 1X 이스코브스에 재현탁시키고, 온화하게 진동 교반시키면서 실온에서 20분 동안 항온 배양한 다음, 얼음 상에서 2 내지 4분 동안 항온 배양하였다. 여액을 4분 동안 1.3K rpm으로 원심분리시키고, 프로나제를 10 ml 이스코브스에 재현탁시키고 재원심분리시킴으로써, 흡인된 펠릿으로부터 제거하였다. 이어서, 세포 덩어리를 PrEGM 배지에 도말하고 밤새 성장시켰다. 그 다음, 세포를 수거하고, 여과시키며, 2X RPMI으로 세척한 다음, 계수하였다. 대략 50,000개 세포를 등용적의 얼음 상의 빙냉 마트리겔과 혼합하고, 27 게이지 바늘을 통하여 SCID의 근위 경골 골격단 내로 외과적으로 주사하였다. 10 내지 12주 후, 골수에서 성장하고 있는 LAPC-4 종양을 회수하였다.
세포주 및 조직:
인간 세포주 (예: HeLa)는 ATCC로부터 수득하였고, 이를 5% 태아 송아지 혈청을 수반한 DMEM에서 유지시켰다. RNA 및 단백질 분석을 위한 인간 조직은 공급처 [UCLA (Los Angeles, CA)에 있는 Human Tissue Resource Center (HTRC); 및 QualTek, Inc. (Santa Barbara, CA)]로부터 수득하였다.
RNA 분리:
종양 조직 및 세포주를, 10 ml/g 조직 또는 10 ml/108개 세포를 이용하여 트리졸 시약 (공급처: Life Technologies, Gibco BRL)에서 균질화시켜 총 RNA를 분리하였다. 다음 키트 [Qiagen's Oligotex mRNA 미니 및 미디 키트]를 사용하여 총 RNA로부터 폴리 A RNA를 정제하였다. 총 및 mRNA를 분광광도측정 분석 (O.D. 260/280 nm)에 의해 정량화하고, 겔 전기영동에 의해 분석하였다.
올리고뉴클레오티드:
다음 HPLC 정제된 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.
DPNCDN (cDNA 합성 프라이머):
5'TTTTGATCAAGCTT303' (서열 68)
적응인자 1:
5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3' (서열 69)
3'GGCCCGTCCTAG5' (서열 70)
적응인자 2:
5'GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3' (서열 71)
3'CGGCTCCTAG5' (서열 72)
PCR 프라이머 1:
5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3' (서열 73)
축소 프라이머 (NP)1:
5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3' (서열 74)
축소 프라이머 (NP)2:
5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3' (서열 75).
억제 감법적 혼성화
억제 감법적 혼성화 (SSH)를 사용하여, 양성 전립선 비대증 (BPH)과 비교해서 안드로겐 의존성 전립선 암에서 상향 조절될 수 있는 유전자에 상응하는 cDNAs를 확인하였다.
LAPC-4 AD 이종이식편 (테스터: tester) 및 BPH 조직 (드라이버: driver)에 상응하는 이중 가닥 cDNAs를, 프라이머로서의 1 ng의 올리고뉴클레오티드 RSACDN 및 CLONTECH의 PCR-선별 cDNA 감산 키트를 사용하여, 상기 언급된 바와 같이 이종이식편 및 BPH 조직으로부터 분리한 2 ㎍의 폴리(A)+ RNA로부터 합성하였다. 상기 키트의 사용자 매뉴얼 프로토콜 (CLONTECH Protocol No. PT1117-1, Catalog No. K1804-1)에 기재된 바와 같이, 제1 가닥 및 제2 가닥 합성을 수행하였다. 이로써 생성된 DNA를 37℃ 하에 3시간 동안 RsaI로 분해시켰다. 분해된 cDNA를 페놀/클로로포름 (1:1)으로 추출하고, 에탄올 침전시켰다.
뮤린 유전자가 테스터 cDNA (LAPC-4 AD)로부터 감수되도록 하기 위해, Rsa I 분해시킨 BPH cDNA를 마우스 간으로부터 분해된 cDNA와 4 대 1 비율로 합함으로써 드라이버 cDNA (BPH)를 생성시켰다.
1 ㎕의 Rsa I 분해시킨 LAPC-4 AD cDNA (400 ng)을 5 ㎕의 물에 희석시킴으로써 테스터 cDNA (LAPC-4 AD)를 생성시켰다. 이어서, 이와 같이 희석시킨 cDNA (2 ㎕, 160 ng)를, 400 μ의 T4 DNA 리가제 (CLONTECH)를 사용하여 16℃ 하에 밤새 총 용적 10 ㎕으로 별개의 연결 반응에서, 2 ㎕의 적응인자 1 및 적응인자 2 (10 μM)과 연결시켰다. 1 ㎕의 0.2 M EDTA를 사용하고 72℃ 하에 밤새 가열함으로써 연결을 종결시켰다.
1.5 ㎕ (600 ng)의 드라이버 cDNA를, 1.5 ㎕ (20 ng) 적응인자 1- 및 적응인자 2-연결된 테스터 cDNA를 함유하는 2개의 튜브 각각에 부가함으로써, 제1 혼성화를 수행하였다. 4 ㎕의 최종 용적으로, 샘플을 광유로 덮고, 98℃ 하에 1.5분 동안 MJ 리서치 열 사이클러에서 변성시킨 다음, 68℃ 하에 8시간 동안 혼성화하였다. 이어서, 2가지 혼성화물을 부가 1 ㎕의 신선한 변성 드라이버 cDNA와 함께 혼합하고, 68℃ 하에 밤새 혼성화시켰다. 그 다음, 제2 혼성화물을 200 ㎕의 20 mM Hepes, pH 8.3, 50 mM NaCl, 0.2 mM EDTA에서 희석시키고, 7분 동안 70℃ 하에 가열한 다음, -20℃ 하에 저장하였다.
SSH로부터 생성된 유전자 단편의 PCR 증폭, 클로닝 및 서열 분석:
SSH 반응으로부터 발생한 유전자 단편을 증폭시키기 위해, 2가지 PCR 증폭을 수행하였다. 일차 PCR 반응에서는 1 ㎕의 희석된 최종 혼성화 혼합물을 1 ㎕의 PCR 프라이머 1 (10 μM), 0.5 ㎕ dNTP 혼합물 (10 μM), 2.5 ㎕ 10 x 반응 완충액 (CLONTECH) 및 0.5 ㎕ 50 x 어드밴티지 (Advantage) cDNA 폴리머라제 혼합물 (CLONTECH)에 최종 용적 25 ㎕으로 부가하였다. 다음 조건을 사용하여 PCR 1을 수행하였다: 72℃에서 5분, 94℃에서 25초에 이어, 94℃에서 10초, 66℃에서 30초, 72℃에서 1.5분을 27주기 수행함. 각 실험에 대해 5번의 별개의 일차 PCR 반응을 수행하였다. 생성물을 모으고 물로 1:10 희석시켰다. 이차 PCR 반응을 위해, 상기와 같이 모은 희석된 일차 PCR 반응물로부터의 1 ㎕을, PCR 프라이머 1 대신 프라이머 NP1 및 NP2 (10 μM)을 사용하는 것을 제외하고는 PCR 1에 대해 사용된 바와 동일한 반응 혼합물에 부가하였다. 94℃에서 10초, 68℃에서 30초, 72℃에서 1.5분을 10 내지 12 주기 사용하여 PCR 2를 수행하였다. 2% 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 PCR 생성물을 분석하였다.
T/A 벡터 클로닝 키트 (공급처: Invitrogen)를 사용하여, 상기 PCR 생성물을 pCR2.1 내로 삽입하였다. 형질전환된 이. 콜라이를 대상으로 하여, 블루/화이트 및 앰피실린 선별을 수행하였다. 화이트 집락을 골라내고, 96 웰 판 내로 어레이한 다음, 액상 배양물에서 밤새 성장시켰다. 삽입물을 확인하기 위해, 프라이머로서 NP1 및 NP2와 PCR1의 조건을 사용하여 1 ml의 세균성 배양물 상에서 PCR 증폭을 수행하였다. 2% 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 PCR 생성물을 분석하였다.
세균성 클론을 20% 글리세롤에 96 웰 포맷으로 저장하였다. 플라스미드 DNA를 제조하고, 서열 분석한 다음, 이를 대상으로 하여 유전자 은행, dbEST, 및 NCI-CGAP 데이터베이스의 핵산 상동성 조사를 수행하였다.
RT-PCR 발현 분석:
시스템 [Gibco-BRL Superscript Preamplification 시스템]을 이용한 올리고 (dT)12-18 프라이밍으로 1 ㎍의 mRNA로부터 제1 가닥 cDNAs를 생성시켰다. 제조업자의 프로토콜을 사용하고, 42℃ 하에 50분 동안 역전사효소와 함께 항온 배양한 다음, 37℃에서 20분 동안 RNase H 처리하였다. 이 반응을 완료시킨 후, 표준화시 키기 전에 물을 이용하여 용적을 200 ㎕으로 증가시켰다. 16개의 상이한 정상 인간 조직으로부터의 제1 가닥 cDNAs를 다음 공급처 (Clontech)로부터 수득하였다.
다중 조직으로부터의 제1 가닥 cDNAs의 표준화는 프라이머 5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3' (서열 76) 및 5'agccacacgcagctcattgtagaagg3' (서열 77)을 사용하여 β-악틴을 증폭시킴으로써 수행하였다. 제1 가닥 cDNA (5 ㎕)를, 0.4 μM 프라이머, 각 dNTPs 0.2 μM, 1X PCR 완충액 (공급처: Clontech; 10 mM 트리스-HCl, 1.5 mM MgC12, 50 mM KCl, pH 8.3) 및 1X 클렌타크 (Klentaq) DNA 폴리머라제 (공급처: Clontech)를 함유하는 총 50 ㎕의 용적으로 증폭시켰다. 5 ㎕의 PCR 반응물을 18, 20, 및 22 주기에서 제거하였고, 이를 아가로스 전기영동에 사용하였다. PCR을 다음 조건 하에 MJ 리서치 열 사이클러를 사용하여 수행하였다: 초기 변성을 94℃에서 15초간 수행한 다음, 94℃에서 15초, 65℃에서 2분, 72℃에서 5초의 18, 20 및 22 주기를 수행하였다. 72℃에서의 최종 연장을 2분 동안 수행하였다. 아가로스 겔 전기영동 후, 다중 조직으로부터의 283 bp β-악틴 밴드의 밴드 세기를 가시적으로 검사함으로써 비교하였다. 제1 가닥 cDNAs에 대한 희석 인자는, PCR 22 주기 후 모든 조직에서 동등한 β-악틴 밴드 세기를 가져다 주는 것으로 계산되었다. PCR 22 주기 후 모든 조직에서 동등한 밴드 세기를 달성하기 위해서는 표준화 3회전이 요구되었다.
STEAP-1 유전자의 발현 수준을 결정하기 위해, 5 ㎕의 표준화시킨 제1 가닥 cDNA를, 다음 프라이머 쌍을 사용하는 증폭 25, 30, 및 35 주기를 이용하여 PCR함 으로써 분석하였다:
5' ACT TTG TTG ATG ACC AGG ATT GGA 3' (서열 78)
5' CAG AAC TTC AGC ACA CAC AGG AAC 3' (서열 79)
밝은 밴드 세기를 제공해주는 주기 수에서 PCR 생성물을 비교함으로써, 반-정량적 발현 분석을 달성하였다.
결과
몇 가지 SSH 실험을 상기 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 수행하였는데, 이로써 수 많은 후보 유전자 단편 클론이 분리되었다. 모든 후보 클론을 서열 분석하고, 주요 공개 유전자 및 EST 데이터베이스 내의 모든 서열에 대항한 상동성 분석을 수행하여, 상응하는 유전자의 실체에 관한 정보를 제공해주고 시차 발현에 대한 특정한 유전자를 분석하기 위한 결정에 도움을 주었다. 일반적으로, 조사된 모든 데이터베이스 내의 어떠한 공지된 서열과도 상동성을 나타내지 않으므로, 신규 유전자를 나타내는 것으로 간주되는 유전자 단편 뿐만 아니라, 기존에 서열 분석되고 발현된 서열 태그 (ESTs)와 상동성을 보여주는 유전자 단편을 대상으로 하여, RT-PCR 및(또는) 노던 분석에 의한 시차 발현 분석을 수행하였다.
STEAP-1로 명명된, 이러한 cDNA 클론 중의 하나는 길이가 436 bp이고, NCI-CGAP 종양 유전자 데이터베이스 내의 EST 서열과 상동성을 나타내었다. STEAP-1을 코딩하는 완전한 길이의 cDNA를, 이러한 cDNA를 사용하여 후속 분리하고 STEAP-1로 재명명하였다. STEAP-1 cDNA 뉴클레오티드 서열은 도 1에 도시된 바와 같은 STEAP-1 cDNA 서열 내의 뉴클레오티드 잔기 150 내지 585에 상응한다. 28P3E1로 명명된 또 다른 클론은 길이가 561 bp이고, NCI-CGAP 종양 유전자 데이터베이스 또는 기타 데이터베이스 내의 수 많은 EST 서열과 상동성을 나타내었다. 28P3E1 서열의 일부 (356 bp)가 인간 태아 조직으로부터 유래된 EST와 동일하였다. 완전한 길이 STEAP-1 cDNA를 수득하고 서열 분석한 후, 이러한 클론이 또한 STEAP-1 (보다 구체적으로는, 도 1에 도시된 바와 같은 STEAP-1 뉴클레오티드 서열의 잔기 622 내지 3' 말단)에 상응한다는 사실이 명백해졌다.
실시예 2: 완전한 길이 STEAP-1 코딩 cDNA의 분리
436 bp STEAP-1 유전자 단편 ["STEAP-1 유전자의 cDNA 단편의 SSH-생성된 분리"란 표제의 실시예 참고]를 사용하여, 8P1D4/STEAP-1 유전자를 코딩하는 부가의 cDNAs를 분리하였다. 간략하게 언급하면, 정상 인간 전립선 cDNA 라이브러리 (공급처: Clontech)를, 436 bp STEAP-1 cDNA로부터 생성시킨 표지된 프로브를 이용하여 스크리닝하였다. 양성 클론 중의 하나인 클론 10은 1195 bp 길이이고, 공지된 모든 인간 유전자 또는 단백질과의 상동성 (국제공개공보 W0 98/53071에 기재된 랫트 신장 손상 단백질과의 상동성)을 실재적으로 나타내지 않는 코딩된 아미노산 서열 및 뉴클레오티드를 갖는 339개 아미노산 단백질을 코딩였다. 이와 같이 코딩된 단백질은 세포 표면 배향을 암시하는 6개 이상의 예측된 막관통 모티프를 함유하였다. 이들 구조적 특징으로 인해, "전립선의 6개 막관통 상피 항원 (Six Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate"에 대해 "STEAP"로 명명되었다.
부가의 "STEAP" 단백질을 후속 확인한 결과, STEAP-1 유전자 생성물을 "STEAP-1"로 재명명하였다. STEAP-1 cDNA 및 코딩된 아미노산 서열이 도 2A-Q에 제시되었다. STEAP-1 cDNA 클론 10은 1998년 8월 26일자로 기탁 기관 [American Type Culture Collection ("ATCC") (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA)]에 플라스미드 STEAP-1 클론 10.1로서 ATCC 승인 번호 98849로 기탁되었다. 이로부터, EcoRI/Xbal 이중 분해 (5' 말단에서 EcoRI 및 3' 말단에서 XbaI)를 이용하여 STEAP-1 cDNA 클론을 절제할 수 있다.
실시예 3: STEAP-1의 염색체 지도화
염색체 국재화는 질병 발병 기전의 유전자에 밀접한 영향을 미칠 수 있다. 형광성 계내 혼성화 (FISH), 인간/햄스터 방사선 하이브리드 (RH) 패널 [참고: Walter et al., 1994; Nature Genetics 7: 22; Research Genetics, Huntsville Al], 인간-설치류 체세포 하이브리드 패널, 예를 들어 공급처 [Coriell Institute (Camden, New Jersey)]로부터 입수 가능한 패널, 및 게놈 클론을 서열 분석하고 지도화하기 위해 BLAST 상동성을 활용하는 게놈 뷰어 (genomic viewer) (NCBI, Bethesda, Maryland)를 포함한 몇 가지 염색체 지도화 접근법이 이용 가능하다.
STEAP-1는 STEAP-1 서열 및 NCBI BLAST 도구 [World Wide Web at (.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seqlpage.cgi?F=HsBlast.html&&ORG=Hs)]를 사용하여 염색체 7q21에 위치시켰다.
실시예 4: STEAP-1의 발현 분석
위암 환자 표본에서의 STEAP-1 발현이 도 14(a)-(e)에 도시되었다. 도 14(a). 정상 위 (N) 및 10개의 상이한 위암 환자 표본 (T)으로부터 RNA를 추출하였 다. 레인당 10 ㎍의 총 RNA를 수반한 노던 블롯을 STEAP-1 서열로 프로빙하였다. 그 결과, 위 종양 조직에서 대략 1.6 kb STEAP-1가 강력히 발현되었다. 하부 패널은 RNA 샘플의 질을 보여주는 블롯의 에티듐 브로마이드 염색을 나타낸다.
도 14b는 STEAP-1이 직장암 환자 조직에서 발현되었다는 것을 도시한 것이다. 정상 직장 (N), 직장암 환자 종양 (T), 및 직장암 전이 (M)로부터 RNA를 추출하였다. 10 ㎍의 총 RNA를 수반한 노던 블롯을 STEAP-1 서열로 프로빙하였다. 그 결과, 직장암 환자 조직에서 STEAP-1가 강력히 발현되었다. 하부 패널은 RNA 샘플의 질을 보여주는 블롯의 에티듐 브로마이드 염색을 나타낸다.
RT-PCR에 의한 STEAP-1의 발현은 STEAP-1이 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)에서 강력하게 발현되었다는 것을 입증하였다. 제1 가닥 cDNA를 HUVEC 세포, LAPC-4AD 및 LAPC-9AD 전립선 암 이종이식편 뿐만 아니라 인간 뇌 조직으로부터 제조하였다. 악틴 및 GAPDH에 대한 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 표준화를 수행하였다. STEAP-1에 대한 프라이머를 사용하는 반정량적 PCR을 증폭 27 주기 및 30 주기에 수행하였다. 대조군으로서, 악틴에 대한 프라이머를 사용하는 PCR이 제시된다. 그 결과, 전립선 암 이종이식편 조직에서 탐지된 발현과 유사하게 HUVEC 세포에서도 STEAP-1이 강력히 발현되었다. HUVEC 세포에서의 STEAP-1의 발현은 표적화 STEAP-1이 상기 종양의 신생혈관계의 표적 내피 세포일 수도 있다는 것을 지시한다. 도 14d에는, RT-PCR 아가로스 겔 사진이 도시되어 있다. 도 14e에서는, 알팔마거 소프트웨어를 사용하여 PCR 생성물을 정량화하였다. 그 결과, 시험된 모든 정상 조직 중에서 정상 전립선에서 STEAP-1이 강력히 발현되었다. STEAP-1 발현의 상향 조절이 전립선암 풀, 방광암 풀, 신장암 풀, 결장암 풀, 폐암 풀, 난소암 풀 및 유방암 풀에서 탐지되었다. STEAP-1의 강력한 발현이 암 전이 풀, 전립선암 이종이식편 풀, 및 림프절로의 전립선 전이 풀에서 탐지되었다.
림프종 환자 표본에서의 STEAP-1 발현 (도 14(f)). 제1 가닥의 cDNA를 림프종 환자 표본 패널로부터 제조하였다. 악틴에 대한 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 표준화를 수행하였다. STEAP-1에 대한 프라이머를 사용하는 반정량적 PCR을 증폭 26 주기 및 30 주기에 수행하였다. 샘플을 아가로스 겔 상에서 수행하고, 알팔마거 소프트웨어를 사용하여 PCR 생성물을 정량화하였다. 신호가 증폭 26 주기 또는 30 주기로서 각각 탐지된 경우에는, 발현이 강하거나 중간 수준인 것으로 기록되고, 신호가 증폭 30 주기에서도 전혀 탐지되지 않는 다면, 발현되지 않은 것으로 기록되었다. 결과는 시험된 11개 종양 표본 중의 8개 (72.7%)에서 STEAP-1이 발현된 것으로 나타났다.
실시예 5: STEAP-1의 스플라이스 변이체
전사체 변이체는 대체 (선택적) 전사 또는 대체 스플라이싱에 의해 발생되는 동일한 유전자로부터의 성숙한 mRNA의 변이체이다. 대체 전사체는 동일한 유전자로부터의 전사체이긴 하지만, 상이한 지점에서 전사를 개시하는 것이다. 스플라이스 변이체는 동일한 전사체로부터 상이하게 스플라이싱된 mRNA 변이체이다. 진핵생물에서는, 다중-엑손 유전자가 게놈 DNA로부터 전사되는 경우에는, 초기 RNA를 스플라이싱하여 엑손 만을 갖고 아미노산으로 해독하는데 사용되는 기능적 mRNA를 생성시킨다. 따라서, 소정의 유전자는 제로 내지 많은 대체 전사체를 가질 수 있 고, 각 전사체는 제로 내지 많은 스플라이스 변이체를 가질 수 있다. 각 전사체는 독특한 엑손 구성을 지니고, 본래의 전사체로부터 상이한 코딩 및(또는) 비-코딩 (5' 또는 3' 말단) 부분을 가질 수 있다. 전사체 변이체는 동일하거나 유사한 기능을 지닌 유사하거나 상이한 단백질을 코딩할 수 있거나, 또는 상이한 기능을 지닌 단백질을 코딩할 수 있고, 동일한 조직에서 동일한 시간에 발현될 수 있거나, 상이한 조직에서 동일한 시간에 발현될 수 있거나, 동일한 조직에서 상이한 시간에 발현될 수 있거나, 또는 상이한 조직에서 상이한 시간에 발현될 수 있다. 전사체 변이체에 의해 코딩된 단백질은 유사하거나 상이한 세포성 또는 세포외 국재화 (예를 들어, 분비된 국재화 대 세포내 국재화)를 지닐 수 있다.
전사체 변이체는 당해 분야에서 허용되는 각종 방법에 의해 확인하였다. 예를 들어, 대체 전사체 및 스플라이스 변이체는 완전한 길이 코딩 실험에 의해 확인하거나, 또는 완전한 길이 전사체 및 EST 서열을 사용함으로써 확인하였다. 첫째, 모든 인간 ESTs를 서로 직접적인 일체감 또는 간접적인 일체감을 보여주는 군집으로 나누었다. 두 번째, 동일한 군집 내의 ESTs를 아군집으로 추가로 나누고 컨센서스 서열로 어셈블리하였다. 본래의 유전자 서열을 컨센서스 서열(들) 또는 기타 완전한 길이 서열과 비교하였다. 각 컨센서스 서열은 상기 유전자에 대한 잠재적 스플라이스 변이체였다 [참고: 예를 들어, Kan, Z., et al., Gene structure prediction and alternative splicing analysis using genomically aligned ESTs, Genome Research, 2001 May, 11 (5):889-900]. 특정 변이체가 완전한 길이 클론이 아닌 것으로 확인된 경우일지라도, 이러한 변이체 부분은 당해 분야에 공지된 기술 을 사용하여 항원을 발생시키고 완전한 길이 스플라이스 변이체를 추가로 클로닝하는데 매우 유용하다.
더우기, 게놈 서열에 기초하여 전사체 변이체를 확인하는 컴퓨터 프로그램이 당해 분야에 입수 가능하다. 게놈에 의거한 전사체 변이체 확인 프로그램에는 FgenesH [참고: A. Salamov and V. Solovyev, "Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA," Genome Research. 2000 April; 10(4):516-22]; Grail [참고: URL compbio.ornlgov/Grail-bin/EmptyGrailForm] 및 GenScan [참고: URL genes.mit.edu/GENSCAN.html]이 포함된다. 스플라이스 변이체 확인 프로토콜에 관한 일반적인 논의는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: 예를 들어, Southan, C., A genomic perspective on human proteases, FEBS Lett. 2001 Jun 8; 498 (2-3):214-8; de Souza, S. J., et al., Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags, Proc. Natl Acad Sci U S A. 2000 Nov 7; 97(23):12690-3].
전사체 변이체의 파라미터를 추가로 확인하기 위해, 각종 기술, 예를 들어 완전한 길이 클로닝, 프로테오믹 검증, PCR에 의거한 검증, 및 5' RACE 검증 등이 당해 분야에서 이용 가능하다 [참고: 예를 들어, 프로테오믹 검증: Brennan, S. O., et al., Albumin banks peninsula: a new termination variant characterized by electrospray mass spectrometry, Biochem Biophys Acta. 1999 Aug 17;1433(1-2):321-6; Ferranti P, et al., Differential splicing of pre-messenger RNA produces multiple forms of mature caprine alpha(s1)-casein, Eur J Biochem. 1997 Oct 1;249(1):1-7. PCR에 의거한 검증: Wellmann S, et al., Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycler technology, Clin Chem. 2001 Apr; 47(4):654-60; Jia, H.P., et al, Discovery of new human betadefensins using a genomics-based approach, Gene. 2001 Jan 24; 263 (1-2):211-8. PCR에 의거한 검증 및 5' RACE 검증: Brigle, K. E., et al., Organization of the murine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms, Biochem Biophys Acta. 1997 Aug 7; 1353(2): 191-8].
게놈 영역이 암에서 조정되는 것으로 당해 분야에 공지되어 있다. 유전자가 위치하는 게놈 영역이 특정한 암에서 조정되는 경우에는, 이러한 유전자의 대체 전사체 또는 스플라이스 변이체도 마찬가지로 조정된다. STEAP-1이 암과 관련된 특정한 발현 프로파일을 갖는 것으로 본원에 기재되었다. STEAP-1의 대체 전사체 및 스플라이스 변이체가 또한, 동일하거나 상이한 조직에서 암에 관여할 수 있으므로, 이는 종양 관련 마커/항원으로서 제공될 수 있다.
STEAP-1 v.1로서 명명된, 본래의 전사체의 엑손 조성이 표 LIII에 제시되었다. 완전한 길이 유전자 및 EST 서열을 사용하여, STEAP-1 v.2 및 v.3으로서 명명된 2가지 전사체 변이체를 확인하였다. STEAP-1 v.1과 비교해서, 전사체 변이체 STEAP-1 v.2는 도 11에 도시된 바와 같이, STEAP-1 v.1의 인트론 4를 스플라이싱하지 못하였고, 변이체 STEAP-1 v.3은 STEAP-1 v.1의 인트론 4로부터의 하나의 부가의 엑손을 스플라이싱하였다. 이론적으로는, 공간적 순서 엑손의 각 상이한 조합, 예를 들어 엑손 2와 3이 잠재적 스플라이스 변이체이다. 도 11은 전사체 변이체 엑손의 도식적 정렬을 도시한 것이다.
실시예 6: STEAP-1의 단일 뉴클레오티드 다형성
단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)은 특이적 위치에서 뉴클레오티드 서열 상의 단일 염기 쌍 변이이다. 게놈의 소정의 어떠한 지점에서도, 4개의 가능한 뉴클레오티드 염기 쌍이 존재한다: A/T, C/G, G/C 및 T/A. 유전자형은 개개인의 게놈 내의 하나 이상 부위의 특이적 염기 쌍 서열을 지칭한다. 일배체형 (haplotype)은 종종 하나의 유전자와 관련하여 또는 몇 개의 단단하게 연결된 유전자와 관련해서, 동일한 DNA 분자 (또는 고등 동물에서는 동일한 염색체) 상의 하나 이상 부위의 염기 쌍 서열을 지칭한다. cDNA 상에서 일어나는 SNPs는 cSNPs로 불리운다. 이들 cSNPs는 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산을 변화시킬 수 있으므로, 이러한 단백질의 기능을 변화시킬 수 있다. 몇몇 SNPs이 유전병을 유발시키고; 기타 유발 원인으로는 개개인들 간의 식이와 약물을 포함한 환경 요인에 대한 반응과 표현형 상의 정량적 변동이 있다. 따라서, SNPs 및(또는) 대립 유전자의 조합물 (일배체형으로 불리운다)는 유전병 진단, 약물 반응 및 투여량 결정, 질병에 대해 책임이 있는 유전자 확인, 및 개개인들 간의 유전적 관계 분석을 포함한 수 많은 분야에 적용된다 [참고: P. Nowotny, J. M. Kwon and A. M. Goate, " SNP analysis to dissect human traits," Curr. Opin. Neurobiol. 2001 Oct; 11(5):637-641; M. Pirmohamed and B. K. Park, "Genetic susceptibility to adverse drug reactions, " Trends Pharmacol. Sci. 2001 Jun; 22(6):298-305; J. H. Riley, C. J. Allan, E. Lai and A. Roses, " The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes," Pharmacogenomics. 2000 Feb; 1(1):39-47; R. Judson, J. C. Stephens and A. Windemuth, "The predictive power of haplotypes in clinical response," Pharmacogenomics. 2000 Feb.; 1(1):15-26].
SNPs는 당해 분야에서 허용되는 각종 방법에 의해 확인한다 [참고: P. Bean, "The promising voyage of SNP target discovery, " Am. Clin. Lab. 2001 Oct-Nov; 20 (9):18-20; K. M. Weiss, "In search of human variation," Genome Res. 1998 Jul; 8 (7):691-697; M. M. She, "Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies," Clin. Chem. 2001 Feb; 47 (2):164-172]. 예를 들어, SNPs는 겔에 의거한 방법, 예를 들어 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 및 변성 구배 겔 전기영동 (DGGE)에 의해 다형성을 나타내는 DNA 단편을 서열 분석함으로써 확인한다. 이들은 또한, 상이한 개개인으로부터 모은 DNA 샘플을 직접 서열 분석함으로써 발견할 수 있거나, 또는 상이한 DNA 샘플로부터의 서열들을 비교함으로써 발견할 수 있다. 공공 및 사적 데이터베이스 내의 서열 데이터를 신속하게 축적하는 경우에는, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열들을 비교함으로써 SNPs를 발견할 수 있다 [참고: Z. Gu, L. Hillier and P. Y. Kwok, "Single nucleotide polymorphism hunting in cyberspace," Hum. Mutat. 1998; 12(4):221-225]. SNPs는 입증할 수 있고, 특정 개개인의 유전자형 또는 일배체형은, 직접 서열 분석 및 고 처리능력 마이크로어레이를 포함한 각종 방법에 의해 결정할 수 있다 [참고: P. Y. Kwok, "Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms, " Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2: 235-258; M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hines and A. Duesterhoeft, "High-throughput SNP genotyping with the Masscode system," Mol. Diagn. 2000 Dec; 5(4):329-340].
상기 언급된 방법을 사용하여, 위치 602 (C/G), 386 (C/T), 1087 (T/G), 1447 (T/C), 1621 (A/T), 1625 (G/T), 1716 (C/A), 2358 (C/T), 2646 (T/G), 2859 (T/G), 2908 (A/T), 3006 (G/C), 3107 (C/T), 및 3180 (A/T)에서, STEAP-1 v.2로서 명명된 클론 GTH9로부터의 전사체에서 14개 SNPs을 확인하였다. 대체 대립 유전자를 수반한 전사체 또는 단백질이 변이체 STEAP-1 v.4, v.5, v.6, v.7, v.8, v.9, v.10, v.11, v.12, v.13, v.14, v.15, v.16 및 v.17로 각각 명명되었다. 도 10은 SNP 변이체의 도식적 정렬을 도시한 것이다. 도 12는 뉴클레오티드 변이체에 상응하는 단백질 변이체의 도식적 정렬을 도시한 것이다. 이들 SNPs의 대립 유전자가 별개로 도시되긴 하였지만, 상이한 조합물에서 발생할 수 있고 (일배체형), SNPs의 서열 맥락을 함유하는 전사체 변이체 (예: STEAP-1 v.1 및 v.3) 중의 어느 하나에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 처음 2개의 SNP는 또한, STEAP-1 v.3 상에서는 동일한 위치에 존재하지만, STEAP-1 v.1 상에서는 각각 572 및 356에 존재하였다.
실시예 7: 원핵성 시스템에서 재조합 STEAP-1의 생성
재조합 STEAP-1 및 STEAP-1 변이체를 원핵 세포에서 발현시키기 위해, 완전한 길이 또는 부분 길이의 STEAP-1 및 STEAP-1 변이체 cDNA 서열을 당해 분야에 공지된 각종 발현 벡터들 중의 어느 하나 내로 클로닝하였다. STEAP-1, 그의 변이체 또는 유사체로부터의 완전한 길이 cDNA, 또는 모든 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상 연속된 아미노산을 사용한다.
A. 시험관내 전사 및 해독 구조물:
pCRII: RNA 계내 연구를 위한 STEAP-1 센스 및 안티센스 RNA 프로브를 생성시키기 위해, STEAP-1 cDNA의 전부 또는 단편을 코딩하는 pCRII 구조물 (공급처: Invitrogen, Carlsbad CA)을 생성시켰다. 이러한 pCRII 벡터는 RNA 계내 혼성화 실험에서 프로브로서 사용하기 위한 STEAP-1 RNA의 전사를 구동시키기 위해 삽입물을 플랭킹하는 Sp6 및 T7 프로모터를 갖고 있다. 이들 프로브를 사용하여 STEAP-1의 세포 및 조직 발현을 RNA 수준으로 분석하였다. STEAP-1 유전자의 cDNA 아미노산 코딩 영역을 나타내는 전사된 STEAP-1 RNA를 시험관내 해독 시스템, 예를 들어 TnT™ 커플된 레티쿨로리세이트 (Reticulolysate) 시스템 (공급처: Promega, Corp., Madison, WI)에 사용하여 STEAP-1 단백질을 합성하였다.
B. 세균성 구조물:
pGEX 구조물: 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (GST) 단백질과 융합되는 재조합 STEAP-1 단백질을 세균에서 생성시키기 위해, STEAP-1 cDNA 또는 변이체의 전부 또는 일부를 pGEX 계열의 GST-융합 벡터 (공급처: Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)내로 클로닝하였다. 이들 구조물은 아미노 말단에서 융합된 GST와 카복실 말단에서 융합된 6개 히스티딘 에피토프 (6X His)를 수반한 재조합 STEAP-1 단백질 서열의 발현을 제어하였다. 이러한 GST와 6X His 태그로 인해, 적당한 친 화 매트릭스를 이용하여 유도된 세균으로부터 재조합 융합 단백질를 정제할 수 있게 되었고, 항-GST 및 항-His 항체를 이용하여 융합 단백질을 인식할 수 있게 되었다. 6X His 태그는 6개 히스티딘 코돈을, 예를 들어 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 3' 말단에서 클로닝 프라이머에 부가함으로써 생성시켰다. 단백질분해적 절단 부위, 예를 들어 pGEX-6P-1 내의 PreScission™ 인식 부위를 이용할 수 있으므로, STEAP-1-관련 단백질로부터 GST 태그를 절단할 수 있게 되었다. 앰피실린 내성 유전자와 pBR322 기원은 pGEX 플라스미드가 이. 콜라이에서 선별 및 유지되도록 해주었다.
pMAL 구조물: 말토스-결합성 단백질 (MBP)과 융합되는 재조합 STEAP-1 단백질을 세균에서 생성시키기 위해, STEAP-1 cDNA 단백질 코딩 서열의 전부 또는 일부를 pMAL-c2X 및 pMAL-p2X 벡터 (공급처: New England Biolabs, Beverly, MA) 내로 클로닝시킴으로써 MBP 유전자와 융합시켰다. 이들 구조물은 아미노 말단에서 융합된 MBP와 카복실 말단에서 융합된 6X His 에피토프 태그를 수반한 재조합 STEAP-1 단백질 서열의 발현을 제어하였다. 이러한 MBP와 6X His 태그로 인해, 적당한 친화 매트릭스를 이용하여 유도된 세균으로부터 재조합 융합 단백질를 정제할 수 있게 되었고, 항-MBP 및 항-His 항체를 이용하여 융합 단백질을 인식할 수 있게 되었다. 6X His 에피토프 태그는 6개 히스티딘 코돈을 3' 클로닝 프라이머에 부가함으로써 생성시켰다. 인자 Xa 인식 부위는 STEAP-1로부터 pMAL 태그를 절단시켜 주었다. pMAL-c2X 및 pMAL-p2X 벡터를 최적화하여, 재조합 단백질을 세포질 또는 주변세포질에 각각 발현시켰다. 주변세포질 발현은 디설파이드 결합을 수반한 단백질의 폴딩을 증강시켰다.
pET 구조물: STEAP-1을 세균성 세포에서 발현시키기 위해, STEAP-1 cDNA 단백질 코딩 서열의 전부 또는 일부를 pET 계열의 벡터 (공급처: Novagen, Madison, WI) 내로 클로닝하였다. 이들 벡터는 용해도를 증강시키는 단백질, 예를 들어 NusA 및 티오레독신 (Trx), 및 재조합 단백질의 정제와 탐지를 도와주는 에피토프 태그, 예를 들면, 6X His 및 S-Tag™과 융합되거나 융합되지 않는 재조합 STEAP-1 단백질의 세균에서의 발현을 강력히 제어할 수 있다. 예를 들어, pET NusA 융합 시스템 43.1을 활용하는 구조물을 만들어, STEAP-1 단백질 영역이 NusA와의 아미노 말단 융합물로서 발현되도록 하였다.
C. 효모 구조물:
pESC 구조물: 재조합 단백질 발생과 기능적 연구를 위해 효모 종 삭카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)에서 STEAP-1을 발현시키기 위해, STEAP-1 cDNA 단백질 코딩 서열의 전부 또는 일부를, 각각 4가지 선별성 마커 HIS3, TRP1, LEU2, 및 URA3 (공급처: Stratagene, La Jolla, CA) 중의 1가지를 함유하는 pESC 계열의 벡터 내로 클로닝하였다. 이들 벡터는 동일한 효모 세포 내에 Flag™ 또는 Myc 에피토프 태그를 함유하는 2개 이하의 상이한 유전자 또는 클로닝된 서열의 동일한 플라스미드로부터의 발현을 제어하였다. 이러한 시스템은 STEAP-1의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는데 있어 유용하였다. 또한, 효모에서의 발현으로 인해, 유사한 해독 후 변형, 예를 들어 진핵 세포에서 발현되는 경우에 발견되는 당화 및 인산화가 야기되었다.
pESP 구조물: 효모 종 삭카로마이세스 폼베 (Saccharomyces pombe)에서 STEAP-1을 발현시키기 위해, STEAP-1 cDNA 단백질 코딩 서열의 전부 또는 일부를 pESP 계열의 벡터 내로 클로닝하였다. 이들 벡터는 재조합 단백질의 정제를 도와주는 GST와 아미노 말단 또는 카복실 말단에서 융합되는 STEAP-1 단백질 서열의 고 발현 수준을 제어하였다. Flag™ 에피토프 태그는 항-Flag™ 항체를 이용하여 재조합 단백질를 탐지할 수 있게 해주었다.
실시예 8: 고등 진핵성 시스템에서의 재조합 STEAP-1 생성
A. 포유류 구조물:
재조합 STEAP-1을 진핵 세포에서 발현시키기 위해, 완전한 길이 또는 부분 길이의 STEAP-1 cDNA 서열을 당해 분야에 공지된 각종 발현 벡터 중의 어느 하나 내로 클로닝할 수 있다. 다음 STEAP-1 영역 중의 하나 이상이 이들 구조물에서 발현되었다: STEAP-1 v.1, v.4의 아미노산 1 내지 339, v.2의 아미노산 1 내지 258, v.3의 아미노산 1 내지 282, 또는 STEAP-1, 그의 변이체 또는 유사체로부터의 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 연속된 아미노산. 특정 양태에서는, 특이적 위치에서 발견된 기타 변이체의 아미노산과는 상이한, 해당 위치에서의 특정 아미노산을 코딩하는, STEAP-1의 특이적 변이체 영역이 발현된다. 기타 양태에서는, STEAP-1의 변이체에 대해 독특한 서열 내에 전적으로 포함되거나 부분적으로 포함되는, 이러한 STEAP-1 변이체 영역이 발현된다.
구조물을 광범위한 포유류 세포 중의 하나, 예를 들어 293T 세포 내로 형질 감염시킬 수 있다. 형질감염시킨 293T 세포 용해물을 본원에 기재된 항-STEAP-1 폴리클로날 혈청으로 프로빙시킬 수 있다.
pcDNA4/HisMax 구조물 : STEAP-1을 포유류 세포에서 발현시키기 위해, STEAP-1 ORF, 또는 그의 일부를 pcDNA4/HisMax 버젼 A (공급처: Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 클로닝하였다. 단백질 발현을 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 및 SP16 해독 증강인자로부터 구동시켰다. 재조합 단백질은 아미노 말단과 융합된 6개 히스티딘 (6X His) 에피토프 및 Xpress™을 갖는다. pcDNA4/HisMax 벡터는 또한, mRNA 안정성을 증강시키기 위한 전사 종결 서열과 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호를, 고분자 T 항원을 발현하는 세포주에서 단순 벡터 구조 및 에피솜성 복제를 위한 SV40 기점과 함께 함유하였다. 제오신 (Zeocin) 내성 유전자는 해당 단백질을 발현하는 포유류 세포를 선별시켜 주었고, 앰피실린 내성 유전자 및 ColEl 기점은 이. 콜라이에서 상기 플라스미드를 선별 및 유지시켜 주었다.
pcDNA3.1/MycHis 구조물 : STEAP-1을 포유류 세포에서 발현시키기 위해, 컨센서스 코작 (Kozak) 해독 개시 부위를 수반한 STEAP-1 ORF, 또는 그의 일부를 pcDNA3.1/MycHis 버젼 A (공급처: Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 클로닝하였다. 단백질 발현을 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터로부터 구동시켰다. 재조합 단백질은 카복실 말단과 융합된 6X His 에피토프와 myc 에피토프를 갖는다. pcDNA3.1/MycHis 벡터는 또한, mRNA 안정성을 증강시키기 위한 전사 종결 서열과 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호를, 고분자 T 항원을 발현하는 세포주에서 단순 벡터 구조 및 에피솜성 복제를 위한 SV40 기점과 함께 함유하였다. 네오마이 신 (Neomycin) 내성 유전자는 해당 단백질을 발현하는 포유류 세포를 선별시켜 주었고, 앰피실린 내성 유전자 및 ColEl 기점은 이. 콜라이에서 상기 플라스미드를 선별 및 유지시켜 주었다.
pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO 구조물 : STEAP-1을 포유류 세포에서 발현시키고 형광을 이용하여 재조합 단백질을 탐지할 수 있게 하기 위해, 컨센서스 코작 해독 개시 부위를 수반한 STEAP-1 ORF, 또는 그의 일부를 pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO (공급처: Invitrogen, CA) 내로 클로닝하였다. 단백질 발현을 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터로부터 구동시켰다. 재조합 단백질은 비-침습성의 생체내 탐지와 세포 생물학 연구를 촉진시키는 카복실 말단과 융합된 녹색 형광성 단백질 (GFP)을 갖는다. pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO 벡터는 또한, mRNA 안정성을 증강시키기 위한 전사 종결 서열과 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호를, 고분자 T 항원을 발현하는 세포주에서 단순 벡터 구조 및 에피솜성 복제를 위한 SV40 기점과 함께 함유하였다. 네오마이신 내성 유전자는 해당 단백질을 발현하는 포유류 세포를 선별시켜 주었고, 앰피실린 내성 유전자 및 ColEl 기점은 이. 콜라이에서 상기 플라스미드를 선별 및 유지시켜 주었다. 아미노-말단 GFP 융합물을 수반한 부가의 구조물은 STEAP-1 단백질의 전체 길이에 걸쳐 있는 pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO에서 만들었다.
PAPtag : STEAP-1 ORF, 또는 그의 일부를 pAPtag-5 (공급처: GenHunter Corp. Nashville, TN) 내로 클로닝하였다. 이러한 구조물은 STEAP-1 단백질의 카복실 말단에 알칼리성 포스파타제 융합물을 생성시키는 반면, 아미노 말단에는 IgGκ 신호 서열을 융합시켰다. 아미노 말단 IgGκ 신호 서열을 수반한 알칼리성 포스파타제 를 STEAP-1 단백질의 아미노 말단에 융합시킨 구조물을 또한 생성시켰다. 이로써 생성된 재조합 STEAP-1 단백질은 형질감염된 포유류 세포 배지 내로 분비하도록 최적화시키고, 이를 사용하여 STEAP-1 단백질과 상호작용하는 리간드 또는 수용체 등의 단백질을 확인할 수 있다. 단백질 발현을 CMV 프로모터로부터 구동시키고, 이러한 재조합 단백질은 또한, 탐지와 정제를 촉진시키는 카복실 말단에 융합된 myc 및 6X His 에피토프를 갖는다. 벡터 내에 존재하는 제오신 내성 유전자는 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포를 선별할 수 있게 해주고, 앰피실린 내성 유전자는 이. 콜라이에서 상기 플라스미드를 선별시켜 주었다.
ptag5 : STEAP-1 ORF, 또는 그의 일부를 ptag-5 내로 클로닝하였다. 이 벡터는 알칼리성 포스파타제 융합을 수반하지 않는다는 것을 제외하고는 pAPtag와 유사하였다. 이러한 구조물은 탐지와 친화 정제를 촉진시키는 카복실 말단에 myc 및 6X His 에피토프 및 아미노 말단 IgGκ 신호 서열을 수반한 STEAP-1 단백질을 생성시켰다. 이로써 생성된 재조합 STEAP-1 단백질은 형질감염된 포유류 세포 배지 내로 분비하도록 최적화시키고, 이를 STEAP-1 단백질과 상호작용하는 리간드 또는 수용체 등의 단백질을 확인하기 위한 면역원 또는 리간드로서 사용한다. 단백질 발현을 CMV 프로모터로부터 구동시켰다. 벡터 내에 존재하는 제오신 내성 유전자는 해당 단백질을 발현하는 포유류 세포를 선별할 수 있게 해주고, 앰피실린 내성 유전자는 이. 콜라이에서 상기 플라스미드를 선별시켜 주었다.
PsecFc : STEAP-1 ORF, 또는 그의 일부를 psecFc 내로 클로닝하였다. 이러한 psecFc 벡터는 인간 면역글로불린 G1 (IgG) Fc (힌지, CH2, CH3 영역)을 pSecTag2 (공급처: Invitrogen, California) 내로 클로닝함으로써 어셈블리하였다. 이 구조물은 STEAP-1 단백질의 카복실 말단에 IgG1 Fc 융합물을 생성시키는 반면, N-말단에는 IgGκ 신호 서열을 융합시켰다. 뮤린 IgG1 Fc 영역을 활용하는 STEAP-1 융합물을 또한 사용하였다. 이로써 생성된 재조합 STEAP-1 단백질은 형질감염된 포유류 세포 배지 내로 분비하도록 최적화시키고, 이를 STEAP-1 단백질과 상호작용하는 리간드 또는 수용체 등의 단백질을 확인하기 위한 면역원 또는 리간드로서 사용할 수 있다. 단백질 발현을 CMV 프로모터로부터 구동시켰다. 벡터 내에 존재하는 히그로마이신 내성 유전자는 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포를 선별할 수 있게 해주고, 앰피실린 내성 유전자는 이. 콜라이에서 상기 플라스미드를 선별시켜 주었다.
pSRα 구조물 : STEAP-1을 구성적으로 발현하는 포유류 세포주를 생성하기 위해, STEAP-1 ORF, 또는 그의 일부를 pSRα 구조물 내로 클로닝하였다. pSRα 구조물을 293T-10A1 패키징 주 내로 형질감염시키거나 또는 pSRα와 조력 플라스미드 (결실된 패키징 서열을 함유함)를 293 세포 내로 각각 공동-형질감염시킴으로써, 양생 (amphotropic) 및 동종숙주역 (ecotropic) 레트로바이러스를 생성시켰다. 이러한 레트로바이러스를 사용하여 각종 포유류 세포주를 감염시키면, 클로닝된 유전자 STEAP-1이 숙주 세포주로 통합되었다. 단백질 발현을 장 말단 반복 서열 (LTR)로부터 구동시켰다. 벡터 내에 존재하는 네오마이신 내성 유전자는 해당 단백질을 발현하는 포유류 세포를 선별시켜 주었고, 앰피실린 내성 유전자 및 ColEl 기점은 이. 콜라이에서 상기 플라스미드를 선별 및 유지시켜 주었다. 그 후, 레트로바이 러스성 벡터를, 예를 들어, PC3, NIH 3T3, TsuPr1, 293 또는 rat-1 세포 등의 각종 세포주를 감염 및 발생시키기 위해 사용하였다.
에피토프 태그, 예를 들어 FLAG™ 태그를 STEAP-1 서열의 카복실 말단에 융합시켜 항-Flag 항체를 이용하여 탐지할 수 있게 해준 부가의 pSRα 구조물을 제조하였다. 예를 들어, FLAG™ 서열 5' gat tac aag gat gac gac gat aag 3' (서열 80)을 ORF의 3' 말단에서 클로닝 프라이머에 부가하였다. 완전한 길이 STEAP-1 단백질의 아미노 말단 및 카복실 말단 GFP 및 myc/6X His 융합 단백질을 생성시키기 위한 부가의 pSRα 구조물을 제조하였다.
부가의 바이러스성 벡터 : STEAP-1의 바이러스-매개된 전달 및 발현을 위한 부가의 구조물을 제조하였다. STEAP-1을 고 수준으로 발현시켜 주는 고 바이러스 역가는 아데노바이러스성 벡터 및 헤르페스 앰플리콘 벡터 등의 바이러스성 전달 시스템에서 달성하였다. STEAP-1 코딩 서열 또는 그의 단편을 PCR에 의해 증폭시키고, 이를 AdEasy 셔틀 벡터 (공급처: Stratagene) 내로 아클로닝하였다. 재조합 및 바이러스 패키징을 제조업자의 지시에 따라서 수행하여 아데노바이러스성 벡터를 생성시켰다. 또 다른 한편으론, STEAP-1 코딩 서열 또는 그의 단편을 HSV-1 벡터 (공급처: Imgenex) 내로 클로닝하여 헤르페스 바이러스성 벡터를 생성시켰다. 그 후, 이 바이러스성 벡터를, 예를 들어, PC3, NIH 3T3, 293 또는 rat-1 세포와 같은 각종 세포주를 감염시키기 위해 사용하였다.
조절된 발현 시스템 : 포유류 세포에서의 STEAP-1의 발현을 제어하기 위해, STEAP-1의 코딩 서열 또는 그의 일부를 조절된 포유류 발현 시스템, 예를 들어 T- Rex 시스템 (공급처: Invitrogen), GeneSwitch 시스템 (공그처: Invitrogen) 및 강력하게 조절된 Ecdysone 시스템 (공급처: Sratagene) 내로 클로닝하였다. 이들 시스템은 재조합 STEAP-1의 시간적 및 농도 의존성 효과를 연구할 수 있게 해주었다. 그 후, 이들 벡터를 사용하여 각종 세포주, 예를 들어 PC3, NIH 3T3, 293 또는 rat-1 세포에서의 STEAP-1의 발현을 제어하였다.
B. 바쿨로바이러스 (Baculovirus) 발현 시스템
바쿨로바이러스 발현 시스템에서 재조합 STEAP-1 단백질을 생성시키기 위해, STEAP-1 ORF, 또는 그의 일부를, N-말단에 His-태그를 제공해주는 바쿨로바이러스 전이 벡터 pBlueBac 4.5 (공급처: Invitrogen) 내로 클로닝하였다. 구체적으로 언급하면, pBlueBac-STEAP-1을 조력 플라스미드 pBac-N-Blue (공급처: Invitrogen)와 함께 SF9 [스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda)] 곤충 세포 내로 공동-형질감염시켜 재조합 바쿨로바이러스를 생성시켰다 [상세한 내역에 대해서는 Invitrogen 지시 사항 매뉴얼을 참고할 수 있다]. 이어서, 세포 상등액으로부터 바쿨로바이러스를 수집하고, 플라크 검정에 의해 정제하였다. 그 다음, 하이파이브 (HighFive) 곤충 세포 (공급처: Invitrogen)를 정제된 바쿨로바이러스로 감염시킴으로써, 재조합 STEAP-1 단백질을 생성시켰다. 항-STEAP-1 또는 항-His-태그 항체를 사용하여 재조합 STEAP-1 단백질을 탐지할 수 있다. STEAP-1 단백질을 정제할 수 있고, 이를 각종 세포에 의거한 검정에 사용하거나 또는 STEAP-1에 대해 특이적인 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서 사용할 수 있다.
실시예 9: 항원성 프로파일 및 이차 구조
도 5(a) 내지 9(a) 및 5(b) 내지 9(b)는 STEAP-1 변이체 1 및 3 각각의 5개 아미노산 프로파일을 그래프로 도시한 것인데, 각 평가치는 ExPasy 분자 생물학 서버 상의 World Wide Web (URL.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) 상에 위치한 ProtScale 웹사이트를 평가함으로써 입수 가능하였다.
이들 프로파일은 다음과 같다: 도 5(a) 및 (b), 친수성 [참고: Hopp T. P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824-3828]; 도 6(a) 및 (b), 수친화도 [참고: Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132]; 도 7(a) 및 (b), 이용 가능한 잔기 비율 (%) [참고: Janin J., 1979 Nature 277: 491-492]; 도 8(a) 및 (b), 평균 가요성 [참고: Bhaskaran R., and Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255]; 도 9(a) 및 (b), 베타-회전 [참고: Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294]. 임의로, 당해 분야에 이용 가능한 기타 프로파일, 예를 들어 ProtScale 웹사이트 상의 기타 프로파일을 사용하여 STEAP-1 단백질의 항원성 영역을 확인하였다. 상기 STEAP-1의 아미노산 프로파일 각각은 분석을 위한 다음 ProtScale 파라미터를 사용하여 생성시켰다: 1) 윈도우 크기 9; 2) 윈도우 센터와 비교한 윈도우 엣지 100 중량%; 및 3) 0 내지 1이 되도록 표준화시킨 아미노산 프로파일 값.
친수성 [도 5(a) 및 (b)], 수친화도 [도 6(a) 및 (b)], 및 이용 가능한 잔기 비율 (%) [도 7(a) 및 (b)] 프로파일을 사용하여 친수성 아미노산의 연장물을 결정하였다 (즉, 친수성 및 이용 가능한 잔기 비율 (%) 프로파일에 대한 0.5 초과 값, 및 수친화도 프로파일에 대한 0.5 미만 값). 이러한 영역은 수성 환경에 노출되고, 단백질의 표면 상에 존재하므로, 예를 들어 항체에 의한 면역 인식에 이용 가능한 것으로 예상된다.
평균 가요성 [도 8(a) 및 (b)] 및 베타-회전 [도 9(a) 및 (b)] 프로파일은 베타 시트 및 알파 나선과 같은 이차 구조로 제한되지 않는 아미노산 연장물을 제결정하였다 (즉, 베타-회전 프로파일 및 평균 가요성 프로파일에 대한 0.5 초과 값). 이러한 영역은 또한, 단백질 상에 보다 잘 노출되므로, 예를 들어 항체에 의한 면역 인식에 이용 가능한 것으로 예상된다.
예를 들어, 도 5(a) 및 (b), 도 6(a) 및 (b), 도 7(a) 및 (b), 도 8(a) 및 (b), 및(또는) 도 9(a) 및 (b)에 제시된 프로파일에 의해 지시된 STEAP-1 단백질 및 변이체 단백질의 항원성 서열을 사용하여, 펩티드 또는 이를 코딩하는 핵산인 면역원을 제조하여 치료적 및 진단적 항-STEAP-1 항체를 생성시킨다. 이 면역원은 도 2 및 도 3에 열거된 STEAP-1 단백질 변이체로부터의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 연속된 아미노산, 또는 이를 코딩하는 상응하는 핵산일 수 있다. 특히, 본 발명의 펩티드 면역원은 도 5(a) 및 (b)의 친수성 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 아미노산 위치를 포함하고 정수 단위로 증가하는, 도 2 및 도 3의 5개 이상 아미노산의 펩티드 영역; 도 6(a) 및 (b)의 수친화도 프로파일에서 0.5 미만 값을 갖는 아미노산 위치를 포함하고 정수 단위로 증가하는, 도 2 및 도 3의 5개 이상 아미노산의 펩티드 영역; 도 7(a) 및 (b)의 이용 가능한 잔기 비율(%) 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 아미노산 위치를 포함하고 정수 단위로 증가하는, 도 2 및 도 3의 5개 이상 아미노산의 펩티드 영역; 도 8(a) 및 (b)의 평균 가요성 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 아미노산 위치를 포함하고 정수 단위로 증가하는, 도 2 및 도 3의 5개 이상 아미노산의 펩티드 영역; 및 도 9(a) 및 (b)의 베타-회전 프로파일에서 0.5 초과 값을 갖는 아미노산 위치를 포함하고 정수 단위로 증가하는, 도 2 및 도 3의 5개 이상 아미노산의 펩티드 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 펩티드 면역원은 또한, 전술된 것을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 모든 면역원 펩티드 또는 핵산은 인간 단위 투여형에 봉입시킬 수 있거나, 또는 인간 생리 기능과 화합성인 제약 부형제를 포함하는 조성물에 의해 포함된다.
STEAP-1 변이체 1 및 변이체 3의 이차 구조, 즉 알파 나선, 연장된 가닥, 및 무작위 코일의 예측 존재 및 위치는 World Wide Web at (.expasy.ch/tools/) 상에 위치한 ExPasy 분자 생물학 서버로부터 입수한, HNN - 계층적 신경 회로망 (Hierarchical Neural Network) 방법 [참고: Guermeur, 1997, http://pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html]을 사용하여 각각의 일차 아미노산 서열로부터 예측하였다. 분석 결과는 STEAP-1 변이체 1이 64.60% 알파 나선, 4.72% 연장된 가닥, 및 30.68% 무작위 코일로 구성되었다 (도 13a). STEAP-1 변이체 2는 62.79% 알파 나선, 3.10% 연장된 가닥, 및 34.11% 무작위 코일로 구성되었다 (도 13b). STEAP-1 변이체 3은 58.87% 알파 나선, 5.32% 연장된 가닥, 및 35.82% 무작위 코일로 구성되었다 (도 13c).
STEAP-1 변이체 중에 막관통 단백질이 잠재적으로 존재하는지에 대한 분석은 World Wide Web at (.expasy.ch/tools/) 상에 위치한 ExPasy 분자 생물학 서버로부터 입수한 각종 막관통 예측 알고리즘을 사용하여 수행하였다. TMpred 프로그램 (도 13d) 및 TMHMM 프로그램 (도 13e)을 사용하여 6개 막관통 도메인의 존재 및 위치를 나타낸 변이체 1의 분석 결과가 그래프로 도시되었다. 또한, TMpred을 사용한 4개 막관통 도메인의 존재와 위치 (도 13f) 및 TMHMM을 사용한 3개 막관통 도메인의 존재 및 위치 (도 13g)를 나타낸 변이체 2의 분석 결과가 도시되었다. 변이체 3의 분석 결과는 TMpred을 사용한 4개 막관통 도메인의 존재와 위치 (도 13h) 및 TMHMM을 사용한 3개 막관통 도메인의 존재 및 위치 (도 13i)를 나타내었다. 각 프로그램의 결과, 즉 막관통 도메인을 코딩하는 아미노산이 표 XX에 요약되었다.
실시예 10: STEAP-1 폴리클로날 항체의 생성
예를 들어, 면역제와, 경우에 따라 아주반트를 1회 이상 주사함으로써 포유류에서 폴리클로날 항체를 생성시킬 수 있다. 전형적으로는, 면역제 및(또는) 아주반트를 포유류에게 수회 피하 또는 복강내 주사할 것이다. 완전한 길이 STEAP-1 단백질 변이체로 면역시키는 것 이외에도, 아미노산 서열 분석에 기초하여, 면역시킨 숙주의 면역계에 의한 인식에 이용 가능하고 항원성인 특징들을 함유하는 면역원을 고안하는데 있어 컴퓨터 알고리즘을 이용한다 ["항원성 프로파일 및 이차 구조"란 표제의 실시예 참고]. 이러한 영역은 친수성, 가요성, 베타-회전 입체 형태인 것으로 예측되며, 단백질의 표면 상에 노출될 것이다 [예를 들어, 이러한 STEAP-1 단백질 변이체 1 및 3의 영역을 지시하는 아미노산 프로파일에 대해서는 도 5(a) 및 (b), 도 6(a) 및 (b), 도 7(a) 및 (b), 도 8(a) 및 (b), 및(또는) 도 9(a) 및 (b)를 참고할 수 있다].
예를 들어, STEAP-1 단백질 변이체의 친수성, 가요성, 베타-회전 영역을 함유하는 재조합 세균성 융합 단백질 또는 펩티드를 항원으로서 사용하여, 뉴질랜드 화이트 토끼에서 폴리클로날 항체를 생성시키거나 또는 ["STEAP-1 모노클로날 항체 (MAbs)의 생성"]이란 표제의 실시예에 기재된 바와 같이 모노클로날 항체를 생성시켰다. 예를 들어, 이러한 영역에는 STEAP-1 변이체 1, 2 및 3의 아미노산 1-40, 아미노산 143-165, 아미노산 180-220; STEAP-1 변이체 1의 아미노산 312-339; 및 STEAP-1 변이체 3의 아미노산 250-282이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 면역시킨 포유류에서 면역원성인 것으로 공지된 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용하다. 이러한 면역원성 단백질의 예에는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 및 대두 트립신 억제제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 한 양태에서는, STEAP-1 변이체 3의 아미노산 250-282를 코딩하는 펩티드를 KLH에 접합시킨다. 이어서, 이러한 펩티드를 면역원으로서 사용하였다. 또 다른 한편으론, 면역제가 STEAP-1 변이체 단백질, 그의 유사체 또는 융합 단백질의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, STEAP-1 변이체 1 아미노산 서열은 재조합 DNA 기술을 사용하여, 당해 분야에 널리 공지되어 있는 각종 융합 단백질 파트너, 예를 들어 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (GST) 및 HIS 태그된 융합 단백질 중의 어느 하나와 융합시킬 수 있다. 또 다른 양태에서는, STEAP-1 변이체 1의 아미노산 250-282를, 재조합 기술 및 pGEX 발현 벡터를 사용하여 GST에 융합시키고, 발현 시키며, 정제한 다음 사용하여 토끼를 면역시켰다. 이러한 융합 단백질은 적당한 친화 매트릭스를 사용하여 유도시킨 세균으로부터 정제하였다.
이용될 수 있는 기타 재조합 세균성 융합 단백질에는 말토스 결합성 단백질, LacZ, 티오레독신, NusA, 또는 면역글로불린 불변 영역이 포함된다 ["원핵성 시스템에서 STEAP-1의 생성"이란 표제의 섹션 및 문헌 (Current Protocols In Molecular Biology, Volume 2, Unit 16, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995; Linsley, P. S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L., Damle, N., and Ledbetter, L. (1991) J. Exp. Med. 174, 561-566) 참고].
세균성 유래된 융합 단백질 이외에도, 포유류 발현된 단백질 항원을 또한 사용하였다. 이들 항원은 포유류 발현 벡터, 예를 들어 Tag5 및 Fc-융합 벡터로부터 발현되었고 [참고: "진핵성 시스템에서 재조합 STEAP-1의 생성"이란 표제의 섹션], 해독 후 변형, 예를 들어 본래의 단백질에서 발견된 당화가 유지되었다. 한 양태에서는, STEAP-1 변이체 1의 아미노산 185-218을 Tag5 포유류 분비 벡터 내로 클로닝하고, 293T 세포에서 발현시켰다. 재조합 단백질은 재조합 벡터를 안정적으로 발현하는 293T 세포의 조직 배양 상등액으로부터 금속 킬레이트제 크로마토그래피함으로써 정제하였다. 이어서, 이와 같이 정제된 Tag5 STEAP-1 변이체 1 단백질을 면역원으로서 사용하였다.
면역 프로토콜 동안, 숙주 동물의 면역 반응을 증강시키는 아주반트 내에 항원을 유화시키거나 이들을 혼합하는 것이 유용하다. 아주반트의 예에는 완전 프로인트 아주반트 (CFA) 및 MPL-TDM 아주반트 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
전형적인 프로토콜에서는, 완전 프로인트 아주반트 (CFA)에서 혼합된 KLH와 접합시킨 융합 단백질 또는 펩티드 200 ㎍ 이하, 전형적으로는 100 내지 200 ㎍으로 토끼를 초기에 피하 면역시켰다. 이어서, 토끼에게 불완전 프로인트 아주반트 (IFA) 중의 면역원 200 ㎍ 이하, 전형적으로는 100 내지 200 ㎍을 2주 마다 피하 주사하였다. 각 면역 후 대략 7 내지 10일 째에 시험용 방혈물을 취하고, 이를 사용하여 ELISA에 의한 항혈청의 역가를 모니터링하였다.
면역 혈청, 예를 들어 STEAP-1 변이체 1 단백질의 GST-융합물로 면역시킨 것으로부터 유래된 토끼 혈청의 반응성과 특이성을 시험하기 위해, 완전한 길이 STEAP-1 변이체 1 cDNA를 pCDNA3.1 myc-his 발현 벡터 [공급처: Invitrogen; 참고: "진핵성 시스템에서 재조합 STEAP-1의 생성"이란 표제의 실시예] 내로 클로닝하였다. 이 구조물을 293T 세포 내로 형질감염시킨 후, 세포 용해물을 항-STEAP-1 혈청으로 프로빙하고 항-His 항체 (공급처: Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA)로 프로빙하여, 웨스턴 블롯 기술을 사용하여 변성 STEAP-1 단백질에 대한 특이 반응성을 결정하였다. 또한, 면역 혈청을 대상으로 하여, 293T 및 기타 재조합 STEAP-1-발현성 세포에 대항한 면역침전, 형광 현미경 검사 및 유동 세포계수법으로 시험하여 본래 단백질의 특이적 인식을 결정하였다. STEAP-1을 내적으로 발현하는 세포를 사용하는 웨스턴 블롯, 면역침전, 형광 현미경 검사 및 유동 세포계수 기술을 또한 수행하여 반응성과 특이성을 시험하였다.
STEAP-1 변이체 융합 단백질, 예를 들어 GST 및 MBP 융합 단백질로 면역시킨 토끼로부터의 항-혈청은, 융합 파트너를 단독으로 함유하거나 무관한 융합 단백질과 관련하여 함유하는 친화 칼럼 상으로 통과시킴으로써 융합 파트너 서열에 대해 반응성인 항체를 고갈시킴으로써 정제하였다. 예를 들어, GST-STEAP-1 변이체 1 융합 단백질로부터 유래된 항혈청은 먼저, 아피켈 (AffiGel) 매트릭스 (공급처: BioRad, Hercules, Calif.)와 공유적으로 커플링시킨 GST 단백질 칼럼 상으로 통과시킴으로써 친화 정제하였다. 이어서, 아피겔 매트릭스와 공유적으로 커플링시킨 MBP-STEAP-1 융합 단백질로 구성된 칼럼 상으로 통과시킴으로써 상기 항혈청을 친화 정제하였다. 그 다음, 이 혈청을 단백질 G 친화 크로마토그래피함으로써 추가로 정제하여 IgG 분획을 분리하였다. 기타 His-태그된 항원 및 펩티드 면역시킨 토끼로부터 유래된 혈청 뿐만 아니라 융합 파트너 고갈시킨 혈청을, 본래 단백질 면역원 또는 자유 펩티드로 구성된 칼럼 매트릭스 상으로 통과시킴으로써 친화 정제하였다.
실시예 11: STEAP-1 모노클로날 항체 (MAbs)의 생성
한 양태에서는 STEAP-1 변이체에 대한 치료적 MAbs가, STEAP-1 변이체와 결합하거나, 내재화하거나, 붕괴시키거나 또는 이의 생물학적 기능을 조정할 지도 모르는 변이체, 예를 들어 리간드 및 결합 파트너와의 상호작용을 붕괴시킬 수도 있는 변이체들 간에 공통적인 서열에 대해 특이적이거나 또는 각 변이체 단백질에 대해 특이적인 에피토프와 반응하는 것을 포함한다. 이러한 MAbs를 생성시키기 위한 면역원에는 세포외 도메인 또는 완전한 STEAP-1 단백질 변이체 서열을 코딩하거나 함유하도록 고안된 것, 기능적 모티프를 함유하는 것으로 예측된 영역, 및 아미노 산 서열의 컴퓨터 분석으로부터 항원성인 것으로 예측된 STEAP-1 단백질 변이체 영역이 포함된다 [참고: 예를 들어, 도 5(a)-(b), 6(a)-(b), 7(a)-(b), 8(a)-(b), 도 9(a)-(b); 및 "항원성 프로파일 및 이차 구조"란 표제의 실시예]. 면역원에는 펩티드, 재조합 세균성 단백질, 및 포유류 발현된 Tag5 단백질 및 인간 및 뮤린 IgG FC 융합 단백질이 포함된다. 또한, pTAG5 단백질, 각각의 STEAP-1 변이체를 고수준으로 발현하도록 공학적으로 처리시킨 pTAG5 세포, 예를 들어 293T-STEAP-1 변이체 1 또는 3T3, RAT, 또는 300.19-STEAP-1 변이체 1 뮤린 프리-B 세포를 코딩하는 DNA 벡터를 사용하여 마우스를 면역시켰다.
STEAP-1 변이체에 대한 MAbs를 생성시키기 위해, 마우스를 먼저, 전형적으로 완전 프로인트 아주반트 중에서 혼합된 10 내지 50 ㎍의 단백질 면역원 또는 107개 STEAP-1-발현성 세포로 복강내 면역시키거나 또는 발바닥에 투여함으로써 면역시켰다. 사용된 기타 아주반트의 예는 티터맥스 (Titermax; 공급처: Sigma) 및 임뮤네아시 (Immuneasy; 공급처: Qiagen)이다. 이어서, 마우스를 대상으로 하여, 전형적으로 불완전 프로인트 아주반트 중에서 혼합된 10 내지 50 ㎍의 단백질 면역원 또는 107개 세포로 2 내지 4주마다 복강내 면역시켰다. 또 다른 한편, MPL-TDM 아주반트를 면역화에 사용하였다. 상기 단백질 및 세포에 의거한 면역화 전략 이외에도, STEAP-1 변이체 서열을 코딩하는 포유류 발현 벡터를 플라스미드 DNA에 직접 주사함으로써 마우스를 면역시키는 DNA에 의거한 면역화 프로토콜을 이용하였다. 예를 들어, STEAP-1 변이체 1의 아미노산 185-218을 Tag5 포유류 분비 벡터 내로 클로닝하고 재조합 벡터를 면역원으로서 사용하였다. 또 다른 예에서는, STEAP-1 변이체 1 서열을 아미노 말단에서 IgK 리더 서열과 융합시키고 카복실 말단에서 인간 또는 뮤린 IgG Fc 영역과 융합시킨 Fc-융합 분비 벡터 내로 동일한 아미노산을 클로닝하였다. 이어서, 이러한 재조합 벡터를 면역원으로서 사용하였다. 플라스미드 면역화 프로토콜을 동일한 벡터로부터 발현된 정제된 단백질 및 각각의 STEAP-1 변이체를 발현하는 세포와 병용해서 사용하였다. 또 다른 예에서는, 아미노산 250-282를 코딩하는 펩티드를 사용함으로써, STEAP-1 변이체 3에 대한 모노클로날 항체를 생성시켰다. 이 펩티드를 KLH과 접합시키고, 이를 면역원으로서 사용하였다. 자유 펩티드 상에서의 ELISA를 사용하여 면역반응성 클론을 확인하였다. 완전한 길이 STEAP-1 변이체 1 단백질에 대한 모노클로날 항체의 반응성과 특이성은, 재조합 및 내인성-발현성 STEAP-1 변이체 1 세포 둘 다를 사용하여 웨스턴 블롯팅, 면역침전, 및 유동 세포계수법에 의해 모니터링하였다.
면역화 프로토콜 동안, 주사한지 7 내지 10일 후에 시험용 방혈물을 취하여 면역 반응 역가 및 특이성을 모니터링하였다. ELISA, 웨스턴 블롯팅, 면역침전, 형광 현미경 검사 및 유동 세포계수 분석에 의해 측정된 바와 같은 적당한 반응성과 특이성이 수득되면, 당해 분야에 널리 공지되고 확립된 과정을 사용하여 융합 및 하이브리도마 생성을 수행하였다 [참고: 예를 들어, Harlow and Lane, 1988].
표준 기술을 이용하여 STEAP-1 변이체 1 특이적 모노클로날 항체의 결합 친화성을 결정하였다. 친화 측정하여 에피토프에 대한 항체의 결합 강도를 정량화하고, 이를 사용하여 당업자에 의해 인지된 바와 같이 진단 또는 치료 용도에 바람직 한 STEAP-1 변이체 모노클로날 항체를 규정하는데 도움을 주었다. BlA코어 시스템 (공급처: Uppsala, Sweden)이 결합 친화성을 결정하는데 있어 바람직한 방법이다. BlA코어 시스템은 표면 플라스몬 공명 [SPR; 참고: WelfordK. 1991, Opt. Quant. Elect. 23: 1; Morton and Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268]을 이용하여 생체 분자 상호작용을 실시간으로 모니터링한다. BlA코어 분석은 편리하게, 연합 속도 상수, 해리 속도 상수, 평형 해리 상수 및 친화 상수를 생성시킨다.
기타 STEAP-1 변이체에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 생성하기 위해, 이러한 변이체에 대해 독특한 아미노산 서열을 코딩하는 면역원을 고안하였다. 한 양태에서는, STEAP-1 변이체에 대해 독특한 아미노산을 코딩하는 펩티드를 합성하고, KLH과 커플링시킨 다음, 이를 면역원으로서 사용하였다. 또 다른 양태에서는, 변이체에서 대체 스플라이싱함으로써 생성된 독특한 서열을 포괄하는 펩티드 또는 세균성 융합 단백질을 만들었다. 이어서, 각각의 변이체 특이적 항원을 인식하고, 또는 세포에서 발현된 완전한 길이 변이체 단백질을 인식하는 하이브리도마를 선별하였다. 이러한 선별은 상기 언급된 면역검정, 예를 들어 웨스턴 블롯팅, 면역침전 및 유동 세포계수법을 활용하였다.
한 양태에서는, 본 발명이 X92.1.30.1.1(1) (a.k.a. M2/92.30) 및 X120.545.1.1 (a.k.a. M2.120.545)로 명명된 모노클로날 항체를 제공한다. M2/92.30 및 M2/120.545를 확인한 결과, 이는 세포 표면 STEAP-1과 반응 및 결합하는 것으로 밝혀졌다 (도 15 및 18 참고). 도 16은 항-STEAP-1 MAb M2/92.30이 방광 및 전립선 암 이종이식편 세포에서 발현된 내인성 세포 표면 STEAP-1과 결합한 다는 것을 도시한 것이다. 부가적으로, M2/92.30은 도 17에 도시된 바와 같이 뮤린 STEAP-1과 반응 및 결합하였다.
X92.1.30.1.1(1) (a.k.a. M2/92.30) 및 X120.545.1.1 (a.k.a. M2.120.545)로 명명된 항체를 2004년 2월 6일자로 기탁기관 [American Type Culture Collection (ATCC), P. O. Box 1549, Manassas, VA 20108]에 (Feral Express를 통하여) 송부하였고, 승인 번호 PTA-5802 및 PTA-5803으로 각각 지정되었다.
M2/X92.30 및 M2/X120.545 항체를 클로닝하기 위해, 다음 프로토콜을 사용하였다. 하이브리도마 세포를 트리졸 시약 (공급처: Life Technologies, Gibco BRL)로 용해시켰다. 총 RNA를 정제하고 정량화하였다. 시스템 [Gibco-BRL Superscript Preamplification 시스템]을 이용한 올리고 (dT)12-18 프라이밍으로 총 RNA로부터 제1 가닥 cDNAs를 생성시켰다. PCR 생성물을 pCRScript 벡터 (공급처: Stratagene, La Jolla) 내로 클로닝하였다. 몇 가지 클론을 서열 분석하고, 가변 중쇄 ("VH") 및 가변 경쇄 ("VL") 영역을 결정하였다. M2/X92.30 및 M2/X120.545 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 핵산 및 아미노산 서열이 도 19(a)-19(d) 및 도 20(a)-(e)에 열거되었다.
실시예 12: STEAP-1 항체의 성상 확인
A. 세포 표면 결합
STEAP-1 항체와 STEAP-1-관련 단백질의 반응성은, 경우에 따라 STEAP-1-관련 단백질, STEAP-1-발현성 세포 또는 그의 추출물을 사용하여 널리 공지된 수 않은 방법, 예를 들어 웨스턴 블롯, 면역침전, ELISA, 및 FACS 분석에 의해 확립할 수 있다. 도 15에 도시된 바와 같이, STEAP-1 또는 대조군을 안정적으로 발현하는 재조합 3T3 및 Rat-1 세포의 FACS 분석물을 항-STEAP MAb M2/92.30 (10 ㎍/ml)으로 염색시키고, 세포 표면 결합된 MAb를 염소 항-마우스 IgG-PE 접합체 이차 시약으로 탐지하였다. 이어서, 염색된 세포를 대상으로 하여, FACS 분석을 수행하였다. 각각의 대조군 세포와 비교한 Rat1-STEAP1 및 3T3-STEAP1 세포의 형광 이동에 의해 지시된 바와 같이, M2/92.30은 세포 표면 STEAP1과 특이적으로 결합하였다.
또한, UGB1 방광암 세포 및 LAPC9 전립선 암 세포를 10 ㎍/ml의 MAb M2/92.30 또는 대조군 항-KLH MAb로 염색하였다. 표면 결합된 MAb 92.30을 염소-항-마우스 IgG-PE 접합된 이차 Ab로 탐지하였다. 이어서, 염색된 세포를 대상으로 하여 FACS 분석을 수행하였다. 이들 결과는 항-STEAP1 MAb M2/92.30이 방광 및 전립선 암 이종이식편 세포에서 발현된 내인성 세포 표면 STEAP1과 특이적으로 결합하였다는 것을 입증하였다 (도 21).
STEAP-1 M2/92.30은 또한, 뮤린 STEAP-1 단백질과 결합하는 것으로 밝혀졌다 (도 17 참고). 이러한 실험에서는, 293T 세포를 뮤린 STEAP1 cDNA를 코딩하는 pCDNA3.1 또는 빈 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 수거하고, 이를 항-STEAP1 MAb M2/92.30 (10 ㎍/ml)으로 염색시키고, 세포 표면 결합된 MAb 92.30을 염소 항-마우스 IgG-PE 접합체 이차 시약으로 탐지하였다. 이어서, 세포를 대상으로 하여 FACS 분석을 수행하였다. STEAP-1 M2/92.30은 STEAP-1-발현된 293T 세포와 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다.
STEAP-1 M2/120.545이 또한, STEAP-1과 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌 다 (도 18 참고). 3T3-neo (패널 A, 검은색 히스토그램) 및 3T3-STEAP1 세포 (패널 A, 흰색 히스토그램) 및 Rat1-neo (패널 B, 검은색 히스토그램) 및 Rat1-STEAP 세포 (패널 B, 흰색 히스토그램)를 MAb M2/120.545 (10 ㎍/ml)으로 염색시키고, 표면 결합된 MAb를 염소 항-마우스 IgG-PE 접합된 이차 Ab로 탐지하였다. 이어서, 세포를 대상으로 하여 FACS 분석을 수행하였다. 그들 각각의 neo 대조군과 비교한 3T3-STEAP1 및 Rat1-STEAP1 세포의 형광 이동에 의해 지시된 바와 같이, MAb M2/120.545는 세포 표면 STEAP1과 특이적으로 결합하였다. 패널 C에서는, LNCaP 세포를 MAb M2/120.545 또는 대조군 항-KLH MAb로 염색시키고 상기와 같이 FACS 분석하였다. 패널 D에서는, M2/120.545 염색된 LNCaP 세포의 형광 현미경이 밝은 세포 표면 형광을 보여주었다.
M2/92.30 및 M2/120.545의 반응성과 특이성을 또한 면역침전에 의해 결정하였다. 도 25에서는, 3T3-STEAP1 및 3T3-neo 세포를 RIPA 완충액 (25 mM Tris-Cl pH 7.4; 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1% 트리톤 X-100, 0.5% 데옥시콜산, 0.1% SDS, 및 프로테아제 억제제 칵테일)에서 용해시켰다. 세포 용해물을 단백질 G 세파로스 비드로 예비청정시킨 다음, 5 ㎍의 MAb M2/92.30 또는 M2/120.545와 함께 실온에서 2시간 동안 항온 배양하였다. 단백질 G 비드를 가하고, 혼합물을 1시간 동안 추가로 항온 배양하였다. 면역 복합체를 세척하고, SDS-PAGE 샘플 완충액에서 가용화시켰다. 이어서, 이로써 가용화된 샘플을 대상으로 하여, 토끼 항-STEAP pAb를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. STEAP1로 형질감염시킨 293T 세포의 완전 세포 용해물을 또한 양성 대조군으로서 수행하였다. 대략 37 kD의 면 역반응성 밴드가 3T3-STEAP1 세포로부터 유래된 샘플에서만 관찰되었는데, 이는 M2/92.30와 M2/120.545 MAbs 둘 다에 의해 STEAP1이 특이적으로 면역침전되었다는 지표이다.
B. STEAP-1 항체 내재화
모노클로날 항체를 이용하여 독소를 특이적 세포 표적에 전달하는 것에 기초한 면역요법은 악성 종양 요법의 한 양식인 것으로 간주된다. 일반적인 원리는 정상 조직에 비해 표적 세포 상에서 독특하게 발현되거나 과발현되는 항원 또는 수용체와 결합하는 분자를 사용하여 독소 또는 항종양제를 암 세포에 전달하는 것이다.
면역독소는 독소와 공유적으로 연결된 세포 선택적 리간드 (통상적으로, 모노클로날 항체 또는 사이토킨)으로 이루어진다. 항체 또는 리간드와 세포 표면 수용체와의 상호작용이 내재화를 촉발시킨다. 규정된 세포내 소포 구획에서는, 독소 부분이 시토졸로 배출되는데, 여기서 이는 중요한 세포 기능을 촉매적으로 변경시켜 세포 사멸에 이르게한다 [참고: Frankel AE., Increased Sophistication of Immunotoxins, Clinical cancer research 8: 942-944, (2002) and Allen TM, Ligand-Targeted Therapeutics in Anti-cancer Therapy. Nature Reviews. 2: 750-760, (2002)].
사포린은 큰 리보솜성 RNAs에서 특이적 아데닌 잔기의 시험관내 퓨린제거를 촉매하는 리보솜-불활성화 단백질 (RIP)이다 [참고: EndoY, et. al., Mechanism of Action of the Toxin Lectin Ricin on Eukaryotic Cells; The Site and Characteristics of the Modification in 28S RNA Caused by the Toxin, J. Biol. Chem. 262, 5908-5912, (1987)]. 통상적으로, 적당한 캐리어 분자와 복합체를 형성하지 않는 한은 세포를 유입시킬 수 없다. 종양 항원을 인식하는 모노클로날 항체에 사포린을 공유적으로 접합시키면, 양 암 세포 선택성을 보유하고 있고 내재화되는 면역독소가 생성된다 [참고: Flavell, DJ, Sapoin Immunotoxins, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 234: 51-61, (1998) and Flavell DJ, et. al., Therapy of Human T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia with a Combination of Anti-CD7 and Anti-CD38-Saporin Immunotoxins is Significantly Better than Therapy with Each IndividualImmunotoxins. Br. J. Cancer 84: 571-578, (2001)]. 이들 분자는 최근에, 백혈병과 다발성 골수종에 대한 제I상 임상 시험에 들어갔다 [참고: Foon KA. Monoclonal Antibody Therapies for Lymohomas. Cancer J. 6: 273-278, (2000)].
STEAP-1 M2/92.30의 내재화가 도 22에 도시되었다. 이러한 실험에서는, PC3-STEAP1 세포를 4℃에서 M2/120.545 MAb (10 ㎍/ml)으로 염색시키고, 세척한 다음, 염소 항-마우스 IgG-PE 접합체 이차 Ab와 함께 항온 배양하였다. 이 세포의 절반을 30분 동안 37℃로 이동시키고, 나머지 절반은 4℃ 하에 유지시켰다. 이어서, 각 처리로부터의 세포를 형광 현미경으로 검사하였다. 4℃ 하에 유지시킨 세포는 세포 표면 원주 상에 밝은 염색을 나타내었다. 37℃로 이동시킨 세포는 세포 원주 상의 염색을 상실하였고, 캡핑과 내재화의 지표인 작은 반점의 응집된 형광 외관을 나타내었다.
STEAP1 M2/120.545 MAb에 의한 STEAP-1 내재화가 도 23에 도시되었다. PC3-STEAP1 세포를 4℃에서 M2/120.545 MAb (10 ㎍/ml)로 염색시키고, 세척한 다음, 염 소 항-마우스 IgG-PE 접합체 이차 Ab와 함께 항온 배양하였다. 이 세포의 절반을 30분 동안 37℃로 이동시키고, 나머지 절반은 4℃ 하에 유지시켰다. 이어서, 각 처리로부터의 세포를 형광 현미경으로 검사하였다. 4℃ 하에 유지시킨 세포는 밝은 "고리 모양" 세포 표면 형광을 나타내었다. 37℃로 이동시킨 세포는 "고리 모양" 세포 표면 형광을 상실하였고, 캡핑과 내재화의 지표인 작은 반점의 응집된 형광 외관을 나타내었다.
면역독소 전달에 적당한 항체 후보를 선별하기 위한 한 가지 접근법은 특정 약물 또는 독소 분자와 접합된 이차 항체를 이용하여 사멸시키는 것을 이용한다. 이차 접합된 항체를 일차 항체 상으로 피기백 방식으로 수송하여, 내재화할 수 있는 일차 항체 및 적당한 세포내 구획에 대한 트래픽을 평가할 수 있다. 일단 접합체가 내재화되면, 사포린은 표적화제로부터 절단 제거되고 리보솜을 불활성화시켜 표적 세포를 제거하였다 [참고: Kohls MD and Lappi DA. MAb-ZAP: A Tool for Evaluating Antibody Efficacy for Use in an Immunotoxin. Bio Techniques. 28(1): 162-165 (2000)].
상기 접근법을 사용하여 적당한 항체 후보를 선별하기 위해, 이차 면역독소인 항-마우스 IgG - 사포린 접합체 [공급처: Advanced Targeting Systems, San Diego, CA]를 사용하여, 뮤린 Steap-1 M2/120.545가 LNCaP 세포 표면 상에서의 Steap-1의 발현을 통하여 표적 세포 내로 유입된다는 사실을 입증하였다. 다음 프로토콜을 사용하였다. LNCaP 세포를 96-웰 판에서 5000개 세포/90 ㎕/웰로 도말하고 밤새 항온 배양하였다. 이차 면역독소 접합체 (항-마우스 IgG-사포린 및 항-염 소 IgG-사포린) 및 항-마우스 IgG를, 100 ng/ml의 최종 농도를 함유하는 세포 배지에서 만들었다. 10 ㎕을 각 웰에 가하였다. 일차 항체를 1 내지 1000 ng/ml 범위의 농도로 부가하였다. 상기 판을 72시간 동안 항온 배양하고, 생육성을 MTT 검정에 의해 결정하였다. 도 24에 도시된 결과는 LNCaP 세포가 항-마우스 IgG-사포린의 존재 하에 사멸된 것으로 나타났다. 이차 항체 단독 (항-마우스 IgG)을 이용하거나 비특이적 이차 항체 접합체 (항-염소 IgG 사포린)을 이용한 경우에는 어떠한 효과도 탐지되지 않았다. 1 ㎍/ml 이하로 시험된 일차 항체 (M2/120.545) 단독을 이용한 경우에는 독성이 전혀 관찰되지 않았다.
실시예 13: HLA 부류 I 및 부류 II 결합 검정
정제된 HLA 분자를 이용하는 HLA 부류 I 및 부류 II 결합 검정을 당해 분야에 보고된 프로토콜에 따라서 수행하였다 [참고: 예를 들어, PCT 공개공보 WO 94/20127 및 WO 94/03205; Sidney et al., Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney, et al., J. Immunol. 154: 247 (1995); Sette, et al., Mol. Immunol. 31: 813 (1994)]. 간략하게 언급하면, 정제된 MHC 분자 (5 내지 500 nM)를 기재된 바와 같은 1 내지 10 nM 125I-방사성표지된 프로브 펩티드 및 표지되지 않은 각종 펩티드 억제제와 함께 항온 배양하였다. 항온 배양 후, MHC-펩티드 복합체를 자유 펩티드로부터 겔 여과에 의해 격리시키고, 결합된 펩티드 분획을 결정하였다. 전형적으로, 예비 실험에서는 각 MHC 제제를 고정 량의 방사성표지된 펩티드의 존재 하에 역가측정하여 총 방사능의 10 내지 20%와 결합하는데 필 요한 HLA 분자 농도를 결정하였다. 이들 HLA 농도를 이용하여, 모든 후속 억제 및 직접 결합 검정을 수행하였다.
이들 조건 하에서는 [표지]<[HLA] 및 IC50≥[HLA]이기 때문에, 측정된 IC50 값은 진짜 KD 값에 온당한 근사치이다. 펩티드 억제제는 전형적으로, 120 ㎍/ml 내지 1.2 ng/ml 범위의 농도에서 시험하였고, 2 내지 4가지 완전히 독립적으로 실험으로 시험하였다. 상이한 실험에서 수득한 데이터를 비교하기 위해, 억제를 위한 양성 대조군의 IC50을 각 시험된 펩티드 (전형적으로는, 방사성표지된 프로브 펩티드의 표지되지 않은 버젼)에 대한 IC50으로 나눔으로써 상대적 결합 수를 계산하였다. 데이터베이스 목적, 및 실험간 비교를 위해서는, 상대적 결합 값을 편집하였다. 이들 값은 연속해서, 억제를 위한 양성 대조군의 IC50 nM을 관심있는 펩티드의 상대적 결합으로 나눔으로써 다시 IC50 nM으로 전환시킬 수 있다. 이러한 데이터 편집 방법은 정확하고, 다른 날에 시험하였거나 상이한 로트의 정제된 MHC를 사용하여 시험한 펩티드를 비교하는데 에도 일관성이 있다.
상기 언급된 바와 같은 결합 검정을 사용하여 HLA 슈퍼모티프 및(또는) HLA 모티프-보유 펩티드 (표 IV 참고)를 분석할 수 있다.
실시예 14: "미니유전자" 다중-에피토프 DNA 플라스미드의 구축
본 실시예에는 미니유전자 발현 플라스미드의 구축이 논의되었다. 미니유전자 플라스미드는 물론, 본원에 기재된 바와 같은 B 세포, CTL 및(또는) HTL 에피토 프 또는 에피토프 유사체의 각종 입체 배치를 함유할 수 있다.
미니유전자 발현 플라스미드는 전형적으로, 다중 CTL 및 HTL 펩티드 에피토프를 포함한다. 본 실시예에서는, HLA-A2, -A3, -B7 슈퍼모티프-보유 펩티드 에피토프 및 HLA-A1 및 -A24 모티프-보유 펩티드 에피토프를 DR 슈퍼모티프-보유 에피토프 및(또는) DR3 에피토프와 연계해서 사용하였다. 다중 슈퍼모티프/모티프가 광범위한 집단 적용 범위 보장을 위해 표시되도록, HLA 부류 I 슈퍼모티프 또는 모티프-보유 펩티드 에피토프 유래된 STEAP-1을 선별하였다. 유사하게, 광범위한 집단 적용 범위를 제공하기 위해 STEAP-1로부터 HLA 부류 II 에피토프를 선별하였는데, 즉 HLA DR-1-4-7 슈퍼모티프-보유 에피토프와 HLA DR-3 모티프-보유 에피토프를 미니유전자 구조물에 포함시키기 위해 선별하였다. 이어서, 이와 같이 선별된 CTL 및 HTL 에피토프를 발현 벡터에서의 발현을 위해 미니유전자 내로 혼입시켰다.
이러한 구조물은 HTL 에피토프가 내형질 세망을 향하도록 하는 서열을 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 리 (li) 단백질을 당해 분야에 기재된 바와 같이 하나 이상의 HTL 에피토프에 융합시킬 수 있는데, 여기서 리 단백질의 CLIP 서열을 제거하고 HLA 부류 II 에피토프 서열로 대체시켜, HLA 부류 II 에피토프가 내형질 세망을 향하도록 하는데, 이 에피토프는 HLA 부류 II 분자와 결합하였다.
본 실시예에는 미니유전자-보유 발현 플라스미드 구축을 위해 사용될 방법이 예시되어 있다. 미니유전자 조성물에 사용될 수 있는 기타 발현 벡터가 당업자에게 공지되어 있고 입수 가능하다.
본 실시예의 미니유전자 DNA 플라스미드는 컨센서스 코작 서열 및 컨센서스 뮤린 카파 Ig-경쇄 신호 서열에 이어 본원에 기재된 원리에 따라서 선별된 CTL 및(또는) HTL 에피토프를 함유하고 있다. 이 서열은 pcDNA 3.1 Myc-His 벡터에 의해 코딩된 Myc 및 His 항체 에피토프 태그와 융합된 오픈 리딩 프레임을 코딩한다.
예를 들어, 평균 길이가 약 70개 뉴클레오티드이고 이중 15개가 중복될 수 있는 중복 올리고뉴클레오티드를 합성하고, HPLC-정제하였다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 선별된 펩티드 에피토프 뿐만 아니라 적당한 링커 뉴클레오티드, 코작 서열 및 신호 서열을 코딩한다. PCR을 이용하여 상기 중복 올리고뉴클레오티드를 반응 3세트로 연장시킴으로써 최종 다중-에피토프 미니유전자를 어셈블리하였다. 퍼킨/엘머 (Perkin/Elmer) 9600 PCR 기계를 사용하고, 다음 조건을 이용하여 총 30주기를 수행하였다: 95℃에서 15초, 어닐링 온도 (각 프라이머 쌍의 가장 낮은 것으로 계산된 Tm 보다 5℃ 아래이다)에서 30초, 및 72℃에서 1분.
예를 들어, 미니유전자를 다음과 같이 제조하였다. 제1 PCR 반응에 대해서는, 2개 올리고뉴클레오티드 각각 5 ㎍을 어닐링하고 연장하였다: 8개 올리고뉴클레오티드, 즉 프라이머 4쌍을 이용하는 실시예에서는, 올리고뉴클레오티드 1+2, 3+4, 5+6, 및 7+8을, Pfu 폴리머라제 완충액 (1x= 10 mM KCL, 10 mM (NH4)2S04, 20 mM 트리스-클로라이드, pH 8.75, 2 mM MgSO4, 0.1% 트리톤 X-100, 100 ㎍/ml BSA), 0.25 mM 각 dNTP, 및 2.5 U의 Pfu 폴리머라제를 함유하는 100 ㎕ 배양물에서 합하였다. 완전한 길이 이량체 생성물을 겔 정제하고, 1+2 및 3+4의 생성물, 및 5+6 및 7+8의 생성물을 함유하는 2가지 반응물을 혼합하고, 어닐링한 다음, 10주기 동 안 연장시켰다. 이러한 2가지 반응물의 절반을 혼합하고, 플랭킹 프라이머를 가하여 완전한 길이 생성물을 증폭시키기 전에, 어닐링과 연장 5주기를 수행하였다. 완전한 길이 생성물을 겔 정제하고, pCR-blunt (공급처: Invitrogen) 내로 클로닝한 다음, 개개 클론을 서열 분석함으로써 스크리닝하였다.
실시예 15: 플라스미드 구조물 및 이것이 면역원성을 유도시키는 정도
플라스미드 구조물, 예를 들어 본 발명에 따르는 플라스미드 구조물이 면역원성을 유도시킬 수 있는 정도는 APC를 에피토프-발현성 핵산 구조물로 형질도입 또는 형질감염시킨 후 APC에 의한 에피토프 제시를 결정함으로써 시험관 내에서 확인하였다. 이러한 연구는 "항원성"을 결정해주고 인간 APC를 사용할 수 있게 해준다. 본 검정은 세포 표면 상의 에피토프-HLA 부류 I 복합체의 밀도를 정량화함으로써 T 세포에 의해 인식되는 것과 관련해서 APC에 의해 제시될 수 있는 에피토프의 능력을 결정해준다. APC로부터 용출된 펩티드의 양을 직접 측정함으로써 정량화를 수행할 수 있거나 [참고: 예를 들어, Sijts et al., J. Immunol. 156:683-692, 1996; Demotz et al., Nature 342:682-684, 1989]; 또는 병들었거나 형질감염된 표적 세포에 의해 유도된 용해 또는 림포카인 방출 양을 측정한 다음, 등가 수준의 용해 또는 림포카인 방출을 수득하는데 필요한 펩티드 농도를 결정함으로써, 펩티드-HLA 부류 I 복합체의 수를 평가할 수 있다 [참고: 예를 들어, Kageyama et al., J. Immunol. 154:567-576, 1995].
또 다른 한편으론, 마우스 내로 생체내 주사한 다음, CTL 및 HTL 활성을 시험관 내에서 후속 평가함으로써 면역원성을 확인하였는데, 이러한 활성은 예를 들 어, 문헌 [참고: Alexander et al., Immunity 1:751-761, 1994]에 기재된 바와 같은 세포독성 및 증식 검정을 각각 사용하여 분석하였다.
예를 들어, 생체 내에서 CTLs를 유도시킬 수 있는, 하나 이상의 HLA-A2 슈퍼모티프를 함유하는 DNA 미니유전자 구조물의 능력을 확인하기 위해, 예를 들어 HLA-A2.1/Kb 트랜스제닉 마우스를 노출된 (있는 그대로의) cDNA 100 ㎍으로 근육내 면역시켰다. cDNA 면역화에 의해 유도된 CTLs 수준을 비교하는 수단으로서, 동물 대조군을 또한, 미니유전자에 의해 코딩되는 바와 같은 단일 폴리펩티드로서 합성된 다중 에피토프를 포함하는 실제 펩티드 조성물로 면역시켰다.
면역시킨 동물로부터의 비장 세포를 각각의 조성물 (미니유전자 또는 폴리에피토프성 펩티드 내에 코딩된 펩티드 에피토프)로 2회 자극한 다음, 51Cr 방출 검정에서 펩티드-특이적 세포독성 활성에 대해 검정하였다. 그 결과는 A2-제한된 에피토프에 대항한 CTL 반응 정도를 나타내므로, 미니유전자 백신 및 폴리에피토프성 백신의 생체내 면역원성을 나타낸다.
따라서, 미니유전자가 폴리에피토프성 펩티드 백신 처럼 HLA-A2 슈퍼모티프 펩티드 에피토프에 대한 면역 반응을 유발시키는 것으로 밝혀졌다. HLA-A3 및 HLA-B7 모티프 또는 슈퍼모티프 에피토프에 의한 CTL 유도를 평가하기 위해 HLA-A3 및 HLA-B7 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 유사한 분석을 또한 수행함으로써, 미니유전자가 제공된 에피토프에 대한 적당한 면역 반응을 유발시킨다는 사실이 또한 밝혀졌다.
생체 내에서 HTLs를 유도시킬 수 있는 부류 II 에피토프-코딩 미니유전자의 능력을 확인하기 위해서는, DR 트랜스제닉 유전자를 다음과 같이 면역시키고, 또는 적당한 마우스 MHC 분자와 교차 반응하는 에피토프에 대해서는, I-Ab-제한된 마우스를 100 ㎍의 플라스미드 DNA로 근육내 면역시켰다. DNA 면역화에 의해 유도된 HTLs 수준을 비교하는 수단으로서, 동물 대조군을 또한, 완전 프로인트 아주반트에 유화시킨 실제 펩티드 조성물로 면역시켰다. CD4+ T 세포, 즉 HTLs을 면역시킨 동물의 비장세포로부터 정제하고, 각각의 조성물 (미니유전자 내에 코딩된 펩티드)로 자극하였다. HTL 반응은 3H-티미딘 혼입 증식 검정을 이용하여 측정하였다 [참고: 예를 들어, Alexander et al. Immunity 1:751-761, 1994]. 그 결과는 HTL 반응 정도를 나타내므로, 미니유전자의 생체내 면역원성을 입증하였다.
앞서 실시예에 기재된 바와 같이 구축된 DNA 미니유전자는, 프라임 부스트 프로토콜을 이용하여 부스팅제와 조합하여 백신으로서 확인할 수도 있다. 이러한 부스팅제는 재조합 단백질로 이루어질 수 있거나 [참고: 예를 들어, Barnett et al., Aids Res. and Human Retroviruses 14, Supplement 3:S299-S309, 1998], 또는 예를 들어 관심있는 완전한 단백질을 코딩하는 미니유전자 또는 DNA를 발현하는 재조합 백시니아로 이루어질 수 있다 [참고: 예를 들어, Hanke et al., Vaccine 16: 439-445, 1998; Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:7648-53, 1998; Hanke and McMichael, Immunol. Letters 66:177-181, 1999; and Robinson et al., Nature Med. 5:526-34, 1999].
예를 들어, 프라임 부스트 프로토콜에 사용된 DNA 미니유전자의 효능을 트랜스제닉 마우스에서 초기에 평가하였다. 본 실시예에서는, A2.1/Kb 트랜스제닉 마우스를, 하나 이상의 HLA-A2 슈퍼모티프-보유 펩티드를 포함하는 면역원성 펩티드를 코딩하는 DNA 미니유전자 100 ㎍으로 근육내 면역시켰다. 항온 배양 기간 (3 내지 9주) 후, 이러한 DNA 미니유전자에 의해 코딩된 동일한 서열을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 107 pfu/마우스로 마우스를 복강내 추가 면역시켰다. 대조군 마우스를, 미니유전자를 수반하지 않거나, 미니유전자를 코딩하는 DNA를 수반하지만, 백시니아를 부스팅하지 않은, 재조합 백시니아 또는 DNA 100 ㎍으로 면역시켰다. 2주간을 더 항온 배양한 후, 마우스로부터의 비장 세포를 대상으로 하여 ELISPOT 검정에서 펩티드-특이적 활성에 대해 즉시 검정하였다. 부가적으로, 비장세포를, 미니유전자 및 재조합 백시니아에서 코딩된 A2-제한된 펩티드 에피토프로 시험관내 자극한 다음, 알파, 베타 및(또는) 감마 IFN ELISA에서 펩티드-특이적 활성에 대해 검정하였다.
프라임 부스트 프로토콜에 활용된 미니유전자가 DNA 단독을 이용한 경우 보다 HLA-A2 슈퍼모티프 펩티드에 대한 더 큰 면역 반응을 유발시킨다는 사실이 밝혀졌다. 이러한 분석은 또한, HLA-A3 및 HLA-B7 모티프 또는 슈퍼모티프 에피토프에 의한 CTL 유도를 평가하기 위해 HLA-A11 및 HLA-B7 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 수행할 수 있다. 인간에게 프라임 부스트 프로토콜을 사용하는 것은 "프라임 부스트 프로토콜을 사용한 CTL 반응 유도"란 표제의 다음 실시예에 기재되었다.
실시예 16: 다중 항원으로부터의 폴리에피토프성 백신 조성물
본 발명의 STEAP-1 펩티드 에피토프를 기타 표적 종양-관련 항원과 연계해서 사용하여, STEAP-1 및 기타 항원을 발현하는 암을 진단 또는 치료하는데 유용한 백신 조성물을 창출시켰다. 예를 들어, 백신 조성물은 STEAP-1 뿐만 아니라 STEAP-1 발현과 연관된 표적 암의 경우에 종종 발현되는 종양 관련 항원으로부터의 다중 에피토프를 혼입시킨 단일 폴리펩티드로서 제공될 수 있거나, 또는 하나 이상의 별개의 에피토프의 칵테일을 포함하는 조성물로서 투여될 수 있다. 또 다른 한편, 상기 백신을 미니유전자 구조물로서, 또는 시험관 내에서 펩티드 에피토프를 부하시킨 수지상 세포로서 투여할 수 있다.
실시예 17: 면역 반응을 평가하기 위한 펩티드의 용도
본 발명의 에피토프를 사용하여 STEAP-1에 대한 특이적 항체, CTL 또는 HTL의 존재에 대한 면역 반응을 분석할 수 있다. 이러한 분석은 문헌 [참고: Ogg et al., Science 279:2103-2106, 1998]에 기재된 방식으로 수행할 수 있다. 본 실시예에서는, 본 발명에 따르는 펩티드를 면역원으로서가 아닌 진단 또는 예후용 시약으로서 사용하였다.
본 실시예에서는, 예를 들어 상이한 병기에 있거나 또는 면역화 후에 A*0201 모티프를 함유하는 STEAP-1 펩티드를 포함하는 HLA A*0201-양성 개개인으로부터의 STEAP-1 HLA-A*0201-특이적 CTL 빈도를 단면 분석하기 위해, 고 민감도 인간 백혈구 항원 사량체성 복합체 ("사량체")를 사용하였다. 사량체성 복합체는 다음 문헌에 기재된 바와 같이 합성하였다 [참고: Musey et al., N. Engl. J. Med. 337:1267, 1997]. 간략하게 언급하면, 정제된 HLA 중쇄 (본 실시예에서는 A*0201) 및 β2-마이크로글로불린을 원핵성 발현 시스템에 의해 합성하였다. 이러한 중쇄를, BirA 효소적 바이오티닐화 부위를 함유하는 서열의 COOH-말단 부가물과 막관통-시토졸 꼬리를 결실시킴으로서 변형시켰다. 이러한 중쇄, β2-마이크로글로불린 및 펩티드를 희석시킴으로써 재폴딩하였다. 이로써 재폴딩된 45-kD 생성물을 신속 단백질 액체 크로마토그래피함으로써 분리시킨 다음, 바이오틴 (공급처: Sigma, St. Louis, Missouri), 아데노신 5' 트리포스페이트 및 마그네슘의 존재 하에 BirA에 의해 바이오티닐화하였다. 스트렙타비딘-피코에리트린 접합체를 1:4 몰비로 가하고, 사량체성 생성물을 1 mg/ml이 되도록 농축시켰다. 이로써 생성된 생성물을 사량체-피코에리트린으로 지칭하였다.
환자 혈액 샘플을 분석하기 위해, 대략 1백개 PBMCs를 5분 동안 300 g으로 원심분리시키고, 50 ㎕의 찬 인산염 완충 식염수에 재현탁시켰다. 상기 사량체-피코에리트린을 항-CD8-트리클로르, 및 항-CD38과 함께 사용하여 삼색 분석을 수행하였다. PBMCs를 사량체 및 항체와 함께, 얼음 상에서 30 내지 60분 동안 항온 배양한 다음, 포름알데히드 고정시키기 전에 2회 세척하였다. 대조군 샘플을 >99.98% 함유하도록 게이트를 적용하였다. 사량체에 대한 대조군에는 A*0201-음성 개개인과 A*0201-양성의 병들지 않은 공여자 둘 다가 포함된다. 이어서, 사량체로 염색된 세포 비율을 유동 세포계수법으로 결정하였다. 그 결과는 에피토프-제한된 CTLs를 함유하는 PBMC 샘플 내의 세포 수를 나타냄으로써, STEAP-1 에피토프에 대한 면역 반응 정도를 용이하게 나타내고, 이로써 STEAP-1에 대한 노출 상태, 또는 예방 또는 치료적 반응을 유발시키는 백신에 대한 노출 상태를 나타낼 수 있다.
실시예 18: 프라임 부스트 프로토콜을 이용한 면역 반응 유도
상기 "플라스미드 구조물 및 이것이 면역원성을 유도시키는 정도"란 표제의 실시예에 기재된 바와 같이, 트랜스제닉 마우스에 DNA 백신의 효능을 확인하기 위해 사용된 것과 기본 원리 면에서 유사한 프라임 부스트 프로토콜을 또한 사용하여, 백신을 인간에게 투여할 수 있다. 이러한 백신 섭생은, 예를 들어 노출된 DNA를 초기에 투여한 다음, 이러한 백신을 코딩하는 재조합 바이러스, 또는 아주반트 중에서 투여된 재조합 단백질/폴리펩티드 또는 펩티드 혼합물을 사용하여 부스팅 (추가면역)하는 것을 포함할 수 있다.
예를 들어, 여러 부위에서 0.5 내지 5 mg의 양으로 근육내 (또는 피하 또는 피내) 투여된 노출된 핵산 형태로 "미니유전자 다중-에피토프 DNA 플라스미드의 구축"이란 표제의 실시예에서 구축된 바와 같은 발현 벡터를 사용하여 초기 면역화를 수행할 수 있다. 유전자 총을 사용하여 핵산 (0.1 내지 1000 ㎍)을 투여할 수도 있다. 3 내지 4주 동안 항온 배양한 후, 부스터 용량을 투여하였다. 이러한 부스터는 5 x 107 내지 5 x 109 pfu의 용량으로 투여된 재조합 조류폭스 바이러스일 수 있다. 또 다른 (대체) 재조합 바이러스, 예를 들어 MVA, 카나리폭스, 아데노바이러스, 또는 아데노 관련 바이러스를 상기 부스트에 사용할 수도 있거나, 또는 폴리에피토프성 단백질 또는 펩티드 혼합물을 투여할 수 있다. 백신 효능을 평가하기 위해, 환자 혈액 샘플을 면역시키기 전에 수득할 뿐만 아니라 초기 백신과 부스터 용량의 백신을 투여한 후 일정한 간격으로 수득하였다. 말초혈 단핵 세포를 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque) 밀도 구배 원심분리에 의해 헤파린 처리시킨 신선한 혈액으로부터 분리하고, 냉동 배지에 등분한 다음, 동결 저장할 수 있다. 샘플을 대상으로 하여 CTL 및 HTL 활성에 대해 검정하였다.
분석 결과는 STEAP-1에 대항한 치료 또는 예방 면역이 달성되기에 충분한 반응 크기 (정도)가 생성되었다는 것을 나타낸다.
실시예 19: 상보적 폴리뉴클레오티드
STEAP-1-코딩 서열에 상보적인 서열, 또는 그의 일부를 사용하여 천연 발생적 STEAP-1의 발현을 탐지, 감소 또는 억제시켰다. 약 15 내지 30개 염기 쌍을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 언급되긴 하였지만, 이 보다 작거나 큰 서열 단편을 사용하여 본질적으로 상기와 동일한 과정을 수행하였다. 예를 들어, OLIGO 4.06 소프트웨어 (공급처: National Biosciences) 및 STEAP-1의 코딩 서열을 사용하여 적당한 올리고뉴클레오티드를 고안하였다. 전사를 억제하기 위해, 가장 독특한 5' 서열로부터 상보적 올리고뉴클레오티드를 고안하고, 이를 사용하여 코딩 서열에 대한 프로모터 결합을 방지시켰다. 해독을 억제하기 위해서는, STEAP-1-코딩 전사체에 대한 리보솜성 결합을 방지시키는 상보적 올리고뉴클레오티드를 고안하였다.
실시예 20: STEAP-1-특이적 항체를 이용한 천연 발생적 또는 재조합 STEAP-1의 정제
천연 발생적 또는 재조합 STEAP-1은 실질적으로, STEAP-1에 대해 특이적 항 체를 사용하는 면역친화 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 항-STEAP-1 항체를 활성화 크로마토그래피 수지, 예를 들어 CNBr-활성화 SEPHAROSE (공급처: Amersham Pharmacia Biotech)와 공유적으로 커플링시킴으로써 면역친화 칼럼을 구축하였다. 커플링 후, 수지를 제조업자의 지시에 따라서 차단 및 세척하였다.
STEAP-1을 함유하는 배지를 상기 면역친화 칼럼 상으로 통과시키고, 이 칼럼을 STEAP-1이 우선적으로 흡수될 수 있게 하는 조건 (예를 들어, 세정제의 존재 하에서의 고 이온 강도 완충제) 하에 세척하였다. 항체/STEAP-1 결합을 붕괴시키는 조건 (예를 들어, pH 2 내지 3의 완충제, 또는 고농도의 카오트로프, 예를 들어 우레아 또는 티오시아네이트 이온) 하에 상기 칼럼을 용출시키고, GCR.P를 수집하였다.
실시예 21: STEAP-1과 상호 작용하는 분자의 확인
STEAP-1, 또는 그의 생물학적 활성 단편을 121 1 볼튼-헌터 (Bolton-Hunter) 시약으로 표지시켰다 [참고: 예를 들어, Bolton et al. (1973) Biochem. J. 133: 529]. 다중-웰 판의 웰에 미리 어레이시킨 후보 분자를 상기 표지시킨 STEAP-1과 함께 항온 배양하고, 세척한 다음, 표지시킨 STEAP-1 복합체를 수반하는 모든 웰을 검정하였다. 상이한 농도의 STEAP-1을 사용하여 수득한 데이터를 사용하여 STEAP-1과 후보 분자와의 연합, 친화도 및 수에 대한 값을 계산하였다.
실시예 22: STEAP-1 종양 성장 증진을 알아보기 위한 생체내 검정
종양 세포 성장에 대한 STEAP-1 단백질의 효과는 종양 발생과 STEAP-1을 발현하거나 STEAP-1이 결여된 세포의 성장을 평가함으로써 생체 내에서 평가하였다. 예를 들어, SCID 마우스의 각 옆구리에, tkNeo 빈 벡터 또는 STEAP-1을 함유하는 전립선 암 세포주 (예: PC3 세포), 또는 3T3 1 x 106개를 피하 주사하였다. 적어도 2가지 전략을 사용할 수 있다: (1) 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스 [참고: 1989년 7월 5일자로 공개된 UK 2,211,504], 아데노바이러스 (예: 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV 40) 등의 바이러스의 게놈으로부터 수득한 구성성 프로모터, 또는 이종 포유류 프로모터, 예를 들어 악틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터 등의 프로모터 (단, 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 화합성이어야 한다) 조절 하에서의 구성성 STEAP-1 발현; 및 (2) 엑디손 (ecdysone), 테트라사이클린 등의 유도성 벡터 시스템 (단, 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 화합성이어야 한다) 제어 하에서의 조절된 발현. 이어서, 촉진 가능한 종양 외관에서 캘리퍼 측정함으로써 종양 용적을 모니터링한 다음, STEAP-1-발현성 세포가 보다 신속한 속도로 성장하고 있는지와, STEAP-1-발현성 세포에 의해 생성된 종양이 변경된 공격성 특징 (예: 전이 증강, 혈관신생, 화학요법제에 대한 반응성 저하)를 나타내는지를 시간 경과에 따라 결정하였다.
부가적으로, 마우스에게 1 x 105개의 동일한 세포를 동소적으로 (같은 자리에) 이식하여, STEAP-1이 전립선 내에서의 국소 성장에 효과를 지니고 있는지와, STEAP-1이 상기 세포를 전이, 구체적으로는 림프절 및 뼈로 전이시킬 수 있는 능력에 영향을 미치는지를 결정할 수 있다 [참고: Miki T et al, Oncol Res. 2001, 12:209; Fu X et al, Int J Cancer. 1991, 49:938]. 골 종양 형성과 성장에 대한 STEAP-1의 효과는 전립선 종양 세포를 경골내 주사함으로써 평가할 수 있다.
본 검정은 후보 치료적 조성물, 예를 들어 STEAP-1 인트라보디, STEAP-1 안티센스 분자 및 리보자임의 STEAP-1 억제성 효과를 결정하는데 또한 유용하다.
실시예 23: 생체 내에서 종양의 STEAP-1 모노클로날 항체-매개된 억제
암 조직에서의 STEAP-1의 상당한 발현과 표면 국재는 정상 조직에서의 그의 제한적 발현과 함께, STEAP-1을 항체 요법에 대한 우수한 표적으로 만들었다. 유사하게, STEAP-1은 T 세포에 의거한 면역요법에 대한 표적이다. 따라서, 인간 전립선 암 이종이식편 마우스 모델에서 항-STEAP-1 MAbs의 치료적 효능은, 재조합 세포주, 예를 들어 PC3-STEAP-1, 및 3T3-STEAP-1 [참고: 예를 들어, Kaighn, M.E., et al., Invest Urol, 1979. 17(1): 16-23] 뿐만 아니라 인간 전립선 이종이식편 모델, 예를 들어 LAPC 9AD [참고: Saffran et al PNAS 1999, 10:1073-1078]를 사용함으로써 평가하였다.
종양 성장과 전이 형성에 대한 항체 효능을, 예를 들어 마우스 동소 전립선 암 이종이식편 모델에서 연구하였다. 이러한 항체는 본 실시예에서 논의되는 바와 같이 접합되지 않은 것이거나, 또는 당해 분야에 인지되는 바와 같이 치료 양식과 접합시킬 수 있다. 항-STEAP-1 MAbs는 폐 이종이식편과 전립선 이종이식편 둘 다의 형성을 억제하였다. 항-STEAP-1 MAbs는 또한, 정착된 동소 종양의 성장을 지연시켰고, 종양 보유 마우스의 생존을 연장시켰다. 이들 결과는 국소 및 진행된 병기의 전립선 암을 치료하는데 있어서의 항-STEAP-1 MAbs의 유용성을 나타낸다 [참 고: 예를 들어, Saffran, D., et al., PNAS 10: 1073-1078 or world wide web URL pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698].
항-STEAP-1 MAbs을 투여하면, 정착된 동소 종양 성장이 지연되었고, 원위 부위로의 전이가 억제되어, 종양 보유 마우스의 생존이 상당히 상당히 연장되었다. 이들 연구 결과는 STEAP-1이 면역요법에 대한 매력있는 표적이란 사실을 나타내고, 국소 및 전이성 전립선 암을 치료하기 위한 항-STEAP-1 MAbs의 치료적 효능을 입증하였다. 본 실시예는 접합되지 않은 STEAP-1 모노클로날 항체가 SCID 마우스에서 성장시킨 인간 전립선 종양 이종이식편의 성장을 억제시키는데 유효하므로, 이러한 효능있는 모노클로날 항체의 조합물이 또한 유효하다는 것을 입증하였다.
접합되지 않은 다중 STEAP-1 MAbs를 사용한 종양 억제
재료 및 방법:
STEAP-1 모노클로날 항체:
"STEAP-1 모노클로날 항체 (MAbs)의 생성"이란 표제의 실시예에 기재된 바와 같이 STEAP-1에 대항하여 모노클로날 항체를 생성시켰다. 이 항체를 ELISA, 웨스턴 블롯, FACS, 및 면역침전에 의해 성상 확인하여, STEAP-1와 결합할 수 있는 그의 능력을 알아 보았다. ELISA 및 웨스턴 분석에 의해 결정된 바와 같이, 항-STEAP-1 MAbs에 대한 에피토프 지도화 데이터는 STEAP-1 단백질 상의 에피토프를 인식하였다. 이들 항체를 이용하여 전립선 암 조직 및 세포를 면역조직화학적으로 분석하였다.
상기 모노클로날 항체를 단백질 G 세파로스 크로마토그래피함으로써 복수 또 는 하이브리도마 조직 배양 상등액으로부터 정제하고, PBS에 대해 투석시키며, 필터 멸균시킨 다음, -20℃ 하에 저장하였다. 브래드포드 (Bradford) 검정 (공급처: Bio-Rad, Hercules, CA)에 의해 단백질 결정을 수행하였다. 치료적 모노클로날 항체, 또는 개개 모노클로날 항체의 혼합물을 포함하는 칵테일을 제조하고, 이를 UM-UC3 및 CaLu1 종양 이종이식편을 피하 또는 동소 주사한 마우스를 치료하기 위해 사용하였다.
세포주 및 이종이식편:
전립선 암 세포주, PC3 및 LNCaP 세포주 뿐만 아니라 섬유아세포 주 NIH 3T3 (공급처: American Type Culture Collection)를, L-글루타민 및 10% FBS로 보충시킨 RPMI 및 DMEM에서 각각 유지시켰다.
다음 문헌에 기재된 바와 같이 레트로바이러스성 유전자 전이에 의해 PC3-STEAP-1 및 3T3-STEAP-1 세포 집단을 생성시켰다 [참고: Hubert, R. S., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96(25): 14523].
야생형 안드로겐 수용체를 발현하고 전립선-특이적 항원 (PSA)을 생성시키는 LAPC-9 이종이식편을 피하 투관침 (trocar) 이식체에 의해 6 내지 8주생 숫컷 ICR-중증 복합 면역결핍증 (SCID) 마우스 (Taconic Farms)에서 계대접종하였다 [참고: Craft, N., et al., Nat Med. 1999, 5:280]. LAPC-9 종양 세포의 단일-세포 현탁물을 크래프트 (Craft) 등에 의해 기재된 바와 같이 제조하였다.
이종이식편 마우스 모델
숫컷 SCID 마우스의 우측 옆구리에 마트리겔 (공급처: Collaborative Research)과 1:1 희석율로 혼합한 1 x 106개 암 세포를 주사함으로써 피하 종양을 생성시켰다. 종양 형성에 대한 항체 효능을 시험하기 위해, 종양 세포를 주사한 날과 동일한 날에 항체를 주사하기 시작하였다. 대조군으로서, 마우스에게 정제된 마우스 IgG (ICN) 또는 PBS를 주사하거나, 또는 인간 세포에서는 발현되지 않는 무관한 항원을 인식하는 정제된 모노클로날 항체를 주사하였다. 예비 연구에서는, 종양 성장에 대한 마우스 IgG 또는 PBS 간의 차이가 전혀 발견되지 않았다. 종양 크기를 캘리퍼 측정하여 결정하고, 종양 용적을 길이 x 폭 x 높이로서 계산하였다. 직경이 1.5 cm을 초과하는 피하 종양을 수반한 마우스를 희생시켰다.
케타민/크실라진을 이용하여 마취시킨 상태에서 동소 주사를 수행하였다. 전립선 동소 연구를 위해, 복부를 관통하는 절개선을 만들어 전립선을 노출시키고, 마트리겔과 혼합된 LAPC 또는 PC3 종양 세포 (5 x 105개)를 10 ㎕ 용적으로 전립선 피막 내로 주사하였다. 종양 성장을 모니터링하기 위해, 마우스를 촉진하고, 매주마다 혈액을 수집하여 PSA 수준을 측정하였다. 적당한 치료를 위해 상기 마우스를 여러 군으로 분리하였는데, 이때 항-STEAP-1 또는 대조군 MAbs을 복강내 주사하였다.
항-STEAP-1 MAbs는 STEAP-1-발현성 이종이식편-암 종양의 성장을 억제한다
종양 형성에 대한 항-STEAP-1 MAbs의 효과는 LNCaP 및 LAPC9 동소 모델을 사용함으로써 시험하였다. 피하 종양 모델과 비교되는 바와 같이, 종양 세포를 마우스 전립선에 각각 직접적으로 주사하는 것을 요구하는 동소 모델에서는, 국소 종양 성장이 이루어졌고, 원위 부위에서 전이가 발생하였으며, 마우스 건강이 악화되었고, 이어서 상기 모델이 사망하였다 [Saffran, D., et al., PNAS 상기 참고]. 이러한 특징들로 인해, 동소 모델이 인간 질병 진행을 보다 잘 나타내기 때문에, 본 발명자들은 임상적으로 관련된 종말점에 대한 MAbs의 효과에 따를 수 있었다.
따라서, 종양 세포를 마우스 전립선에 주사하고, 2일 후에, 마우스를 2개 군으로 분리시킨 다음, a) 200 내지 500 ㎍의 항-STEAP-1 Ab, 또는 b) PBS로 2 내지 5주 동안 매주 3회씩 처리하였다.
동소 암 모델의 주요 이점은 전이 발생을 연구할 수 있는 능력이다. 정착된 동소 종양을 보유하고 있는 마우스에서의 전이 형성은 종양-특이적 세포 표면 단백질에 대항한 항체, 예를 들어 전립선 암에 대한 항-CK20을 사용하여 폐 박편 상에서 IHC 분석함으로써 연구하였다 [참고: Lin S et al, Cancer Detect Prev. 2001, 25:202].
이종이식편 암 모델의 또 다른 이점은 신생혈관증식 및 혈관형성을 연구할 수 있는 능력이다. 종양 성장은 부분적으로, 신규 혈관 발생에 의존적이다. 모세혈관계와 발생중인 혈관망이 숙주 기원이긴 하지만, 신생혈관계의 개시와 구조는 이종이식편 종양에 의해 조절된다 [참고: Davidoff AM et al, Clin Cancer Res. 2001; 7:2870; Solesvik 0 et al., Eur J Cancer Clin Oncol. 1984, 20: 1295]. 신생혈관증식에 대한 항체 및 소분자의 효과는 당해 분야에 공지된 과정에 따라서, 예를 들어 종양 조직 및 그들의 주변 환경을 IHC 분석함으로써 연구하였다.
정착된 동소 종양을 보유하고 있는 마우스에게 항-STEAP-1 MAb 또는 PBS 1000 ㎍ 주사제를 4주간에 걸쳐 투여하였다. 이들 두 무리의 마우스에게 종양을 고부하하여 마우스 폐에서의 전이 형성이 자주 일어나도록 하였다. 그 다음, 마우스를 사멸시키고, 그들의 방광, 간, 뼈 및 폐를 대상으로 하여 종양 세포가 존재하는지를 알아보기 위해 IHC 분석하였다. 이들 연구 결과, 이종이식편 마우스 모델에서 전립선 암의 개시와 진행에 대한 항-STEAP-1 항체의 넓은 항종양 효능이 입증되었다. 항-STEAP-1 항체는 종양 형성을 억제시킬 뿐만 아니라 이미 정착된 종양의 성장을 지연시켰고 처치된 마우스의 생존율을 연장시켰다. 더우기, 항-STEAP-1 MAbs는 심지어 종양 고부하 하에서도 국소 전립선 종양이 원위 부위로 확산되는 것을 상당히 억제시킨 것으로 입증되었다. 따라서, 항-STEAP-1 MAbs는 대부분 임상적으로 무관한 종말점 (종양 성장)에 대해 효능이 있고, 생존을 연장시키며 건강하게 해준다.
마우스에서 인간 전립선 암 이종이식편의 성장에 대한 STEAP-1 MAbs의 효과
5 내지 6주생 숫컷 ICR-SCID 마우스 (공급처: Charles River Laboratory, Wilmington, MA)를 사용하였다. 이 마우스를 문헌 [참고: NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals]에 기재된 프로토콜을 사용하여 제어된 환경 하에서 유지시켰다. LAPC-9AD 안드로겐-의존성 인간 전립선 암 종양을 사용하여 이종이식편 모델을 확립시켰다. SCID 마우스에서 규칙적으로 유지시킨 스톡 종양을 멸균적으로 절개하고, 잘게 썬 다음, 프로나제 (Pronase; 공급처: Calbiochem, San Diego, CA)를 사용하여 분해시켰다. 이로써 생성된 세포 현탁물을 37℃ 하에 밤새 항온 배양하여 균질한 단일 세포 현탁물을 수득하였다.
STEAP-1 M2/92.30 및 M2/120.545를 2가지 상이한 용량 100 ㎍ 및 500 ㎍에서 시험하였다. PBS 및 항-KLH MAb를 대조군으로서 사용하였다. 연구 코호트는 6개 군으로 이루어지는데, 각 군은 10마리 마우스로 구성되었다. MAbs를 종양 세포 주사와 동일한 날부터 시작하여, 매주 2회씩 총 12회분을 복강내 (IP) 투약하였다.
매주 2회씩 캘리퍼 측정을 통하여 종양 크기를 모니터링하였다. 가장 긴 치수 (L) 및 이에 직각인 치수 (W)를 취하여, 다음 식을 이용하여 종양 용적을 계산하였다: W2 x L/2. 각 동물에 대해 처리한지 40일 째에 혈청 PSA 농도를 시판용 ELISA 키트로 측정하였다. 크루스칼-왈리스 (Kruskal-Wallis) 시험 및 만-위트니 (Mann-Whitney) U 시험을 사용하여, 군들 간의 PSA 수준과 종양 성장의 차이를 평가하였다. 모든 시험은 양측 시험이었다 (a=0.05).
도 26 및 도 27에 나타낸 실험 결과는 STEAP-1 M2/92.30 및 M2/120.545가 인간 전립선 이종이식편의 성장을 용량-의존적 방식으로 상당히 지연시켰다는 것을 보여준다.
실시예 24: 인간에게서 항-STEAP-1 항체의 치료적 및 진단적 용도
항-STEAP-1 모노클로날 항체는 인간에게서 진단, 예방, 예후 및(또는) 치료 목적을 위해 안전하고도 유효하게 사용된다. 항-STEAP-1 MAb를 사용하여 암 조직 및 암 이종이식편을 웨스턴 블롯 및 면역조직화학적 분석한 결과, 암종에서는 강력하고 광범위한 염색이 이루어졌지만, 정상 조직에서는 상당히 더 낮거나 탐지 불가능한 수준으로 염색된 것으로 나타났다. 암종 및 전이성 질환에서 STEAP-1이 탐지 되었다는 것은 진단 및(또는) 예후 지표로서의 상기 MAb의 유용성을 입증해준다. 따라서, 항-STEAP-1 항체를 진단 적용, 예를 들어 암이 있는 것으로 의심되는 환자로부터 암을 발견하기 위한 신장 생검 표본의 면역조직화학에 사용한다.
유동 세포계수법에 의해 결정된 바와 같이, 항-STEAP-1 MAb는 암종 세포와 특이적으로 결합하였다. 따라서, 항-STEAP-1 항체는 STEAP-1의 발현을 나타내는 국소 및 전이성 암을 탐지하기 위한 진단적 전혈 영상 적용 분야, 예를 들어 방사선면역 섬광조영술 및 방사선면역요법 [참고: 예를 들어, Potamianos S., et. al. Anticancer Res 20 (2A):925-948]에 사용하였다. 예를 들어 알칼리성 포스포디에스테라제 B10 [참고: Meerson, R., Hepatology 27:563-568 (1998)]에 대해 관찰된 바와 같은, STEAP-1의 세포외 도메인을 세포외 환경 내로 유출 또는 방출시키면, 의심 환자로부터의 혈청 및(또는) 뇨 샘플에서 항-STEAP-1 항체에 의해 STEAP-1을 진단적으로 탐지할 수 있게 된다.
STEAP-1과 특이적으로 결합하는 항-STEAP-1 항체를, STEAP-1을 발현하는 암을 치료하기 위한 치료적 적용에 사용하였다. 항-STEAP-1 항체를 접합되지 않은 양식으로서 사용하고, 항체를 당해 분야에 널리 공지된 각종 치료적 또는 영상화 양식들 중의 하나, 예를 들어 프로드럭, 효소 또는 방사성동위원소에 부착시킨 접합된 형태로서 사용하였다. 예비임상 연구에서는, 접합되지 않은 항-STEAP-1 항체 및 접합된 항-STEAP-1 항체를 대상으로 하여, SCID 마우스 암 이종이식편 모델, 예를 들어 신장 암 모델 AGS-K3 및 AGS-K6에서 종양 예방 및 성장 억제 효능에 대해 시험하였다 [참고: 예를 들어, "생체 내에서 방광 및 폐 종양의 STEAP-1 모노클로 날 항체-매개된 억제"란 표제의 실시예]. 접합된 항-STEAP-1 항체 및 접합되지 않은 항-STEAP-1 항체 중의 어느 하나를 단독으로, 또는 다음 실시예에 기재되는 바와 같이 기타 치료와 병용해서, 인간 임상 시험에서 치료적 양식으로서 사용하였다.
실시예 25: 생체 내에서 인간 항-STEAP-1 항체의 사용을 통하여 인간 암종을 치료 및 진단하기 위한 인간 임상 시험
STEAP-1 상의 에피토프를 인식하고, 표 I에 열거된 바와 같은 특정 종양을 치료하는데 사용되는 항체를 본 발명에 따라서 사용하였다. STEAP-1 발현 수준을 포함한 수 많은 요인들에 근거하여, 표 I에 열거된 바와 같은 종양이 현재 바람직한 징후이다. 이들 징후와 연계해서, 다음 3가지 임상적 접근법이 성공적으로 추구되었다:
I.) 보조 요법: 보조 요법에서는, 항-STEAP-1 항체를 화학요법제 또는 항종양제 및(또는) 방사선 요법과 병용해서 환자를 치료하였다. 원발성 암 표적, 예를 들어 표 I에 열거된 암은 항-STEAP-1 항체를 표준 1차 치료 및 2차 치료에 부가함으로써 표준 프로토콜 하에 치료하였다. 프로토콜 고안은 종양 덩어리 감소 뿐만 아니라 통상적인 표준 화학요법 용량을 감소시킬 수 있는 능력으로써 평가된 바와 같은 유효성에 역점을 두었다. 이러한 투여량 감소로 인해, 화학요법제의 용량 관련 독성이 저하됨으로써 부가 치료 및(또는) 장기 치료가 가능해졌다. 항-STEAP-1 항체를 몇 가지 부가 임상 시험에서 화학요법제 또는 항종양제 아드리아마이신 (진행 전립선 암종), 시스플라틴 (진행 두경부 및 폐 암종), 탁솔 (유방암), 및 독소 루비신 (예비임상)과 병용해서 활용하였다.
II.) 단일제요법 (monotherapy): 종양의 단일제요법에서 항-STEAP-1 항체를 사용하는 것과 연계해서는, 이러한 항체를 화학요법제 또는 항종양제를 수반하지 않고서 환자에게 투여하였다. 한 양태에서는, 단일제요법을 광범위한 전이성 질환이 있는 말기 암 환자에게서 임상적으로 수행하였다. 환자는 몇몇 질병 안정화를 보인다. 시험 결과는 암성 종양이 있는 난치성 환자에게서 효과가 있는 것으로 입증되었다.
III.) 조영제: 방사성핵종 [예: 요오드 또는 이트륨 (I131, Y90)]을 항-STEAP-1 항체에 결합시킴으로써 방사성 표지시킨 항체를 진단제 및(또는) 조영제로서 활용하였다. 이러한 역할 하에서는, 표지된 항체가 고형 종양 뿐만 아니라 STEAP-1을 발현하는 세포의 전이성 병변 둘 다에 국재한다. 항-STEAP-1 항체를 조영제로서 사용하는 것과 연계해서는, 상기 항체를 수술전 스크린으로서 뿐만 아니라 어떤 종양이 남아 있고/있거나 재발되었는지를 결정하기 위한 수술후 후처리로서, 고형 종양의 외과적 처치에 대한 부가제로서 사용하였다. 한 양태에서는, (111In)-STEAP-1 항체를, STEAP-1을 발현하는 암종을 갖는 환자에서의 제I상 인간 임상 시험에서 조영제로서 사용하였다 [참고: 예를 들어, Divgi et al J. Natl. Cancer Inst. 83: 97-104 (1991)]. 표준 전방 및 후방 감마 카메라를 이용하여 환자의 임상 경과를 관찰하였다. 그 결과, 원발성 병변과 전이성 병변이 확인된 것으로 나타났다.
투여 용량 및 경로
당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 임상중인 유사한 제품과의 비교를 통하여 투약 고려사항을 결정할 수 있다. 따라서, 항-STEAP-1 항체를 5 내지 400 mg/㎡ 범위의 용량을 투여할 수 있는데, 예를 들어 안전성 연구와 관련해서는 보다 낮은 용량을 사용하였다. 그의 표적에 대한 공지된 항체의 친화성과 비교한 항-STEAP-1 항체의 친화성이, 유사한 용량 섭생을 결정하기 위해 당업자에 의해 사용되는 하나의 파라미터이다. 추가로, 완전한 인간 항체인 항-STEAP-1 항체는 키메라 항체와 비교해서 보다 느린 청소율 (제거율)을 나타내므로; 이러한 완전한 인간 항-STEAP-1 항체가 환자에게 투여되는 양은 대략 50 내지 300 mg/㎡ 범위로 더 낮을 수 있지만, 여전히 효능적이다. 통상적인 용량 측정치인 mg/kg과는 달리, mg/㎡로 나타낸 용량은 표면적을 기초로 한 측정치이고, 유아부터 성인까지 모든 크기의 환자를 포함하도록 고안된 편리한 용량 측정치이다.
3가지 별개의 전달 접근법이 항-STEAP-1 항체를 전달하는데 유용하다. 통상적인 정맥내 전달이 많은 종양에 대한 한 가지 표준 전달 기술이다. 그러나, 복강 내의 종양, 예를 들어 난소, 담관, 기타 도관 등의 종양과 관련해서는, 이러한 종양에서 고용량의 항체를 수득하고 또한 항체 제거율을 최소화시키기 위해서는 복강내 투여가 선호되는 것으로 입증될 수 있다. 유사한 방식으로, 특정 고형 종양은 국소 관류에 적당한 혈관계를 보유하고 있다. 국소 관류는 종양 부위에 고용량의 항체가 존재할 수 있게 해주고 단기간의 항체 제거를 최소화시켜 준다.
임상 개발 계획 (CDP)
개요: CDP는 보조 요법, 단일제요법, 및 조영제로서의 요법과 연계한 항-STEAP-1 항체의 치료법을 개발한 것이다. 시험는 초기에 안전성을 입증하였고, 그 후 반복 투여시 효능에 대해 확인하였다. 시험은 표준 화학요법과 표준 요법 + 항-STEAP-1 항체를 비교하는 개방 표지 시험이다. 인지되는 바와 같이, 환자 등록과 관련해서 활용될 수 있는 한 가지 기준은 생검에 의해 결정된 바와 같은 그들의 종양에서의 STEAP-1 발현 수준이다.
모든 단백질 또는 항체 주입에 의거한 치료와 같이, 안전성 우려는 주로, (i) 사이토킨 방출 증후군, 예를 들어 저혈압, 발열, 전율, 오한; (ii) 해당 물질에 대한 면역원성 반응 발생 (즉, 항체 치료제, 또는 HAHA 반응에 대한 환자에 의한 인간 항체 발생); 및 (iii) STEAP-1을 발현하는 정상 세포에 대한 독성과 관계가 있다. 표준 시험 및 후처리를 활용하여 이들 안전성 우려 사항 각각을 모니터링하였다. 항-STEAP-1 항체가 인간 투여시 안전한 것으로 밝혀졌다.
실시예 26: 인간 임상 시험: 인간 항-STEAP-1 항체를 이용한 단일제요법
항-STEAP-1 항체는 상기 논의된 보조 시험과 연계해서 안전하고, 제II상 인간 임상 시험은 단일제요법에 대한 효능과 최적 용량을 확인시켜준다. 이러한 시험을 수행하고; 환자에게 일정 용량의 항-STEAP-1 항체를 투여함과 동시에 화학요법을 투여하지 않는 것을 제외하고는, 상기 언급된 보조 시험에 대한 동일한 안전성 및 결과 분석을 수반하였다.
실시예 27: 인간 임상 시험: 항-STEAP-1 항체를 이용한 영상 진단
다시 한번, 상기 논의된 보조 요법은 상기 논의된 안전성 기준 내에서 안전 하기 때문에, 항-STEAP-1 항체를 영상 진단제로서 사용하는 것에 관한 인간 임상 시험을 수행하였다. 당해 분야에 보고된, 예를 들어 문헌 [참고: Divgi et al. J. Natl. Cancer Inst. 83: 97-104 (1991)]에 기재된 바와 실질적으로 유사한 방식으로 프로토콜을 고안하였다. 상기 항체는 진단 양식으로서 사용된 경우에 안전하면서도 효능이 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 28: 인간 항-STEAP-1 항체와 화학요법, 방사선 및(또는) 호르몬 제거 요법을 이용한 인간 임상 시험 보조 요법
제I상 인간 임상 시험을 개시하여, 고형 종양, 예를 들어 표 I에 열거된 조직의 암을 치료하는 것과 관련하여 인간 항-STEAP-1 항체의 6가지 정맥내 용량의 안전성을 평가하였다. 본 연구에서는, 본원에 규정된 바와 같은 항종양제 또는 화학요법제 또는 호르몬 제거제, 예를 들어 시스플라틴, 토포테칸, 독소루비신, 아드리아마이신, 탁솔, 루프론 (Lupron), 졸라덱스 (Zoladex), 에울렉신 (Eulexin), 카소덱스 (Casodex), 아난드론 (Anandron) 등에 대한 보조 요법으로서 활용된 경우의 항-STEAP-1 항체 단일 용량의 안전성을 평가하였다. 시험 고안에는 항-STEAP-1 항체의 6가지 단일 용량을 전달하는 것이 포함되는데, 항체 투여량은 다음 스케쥴에 따라서 처리 과정 전반에 걸쳐 대략 약 mg/㎡에서 약 275 mg/㎡으로 상승시켰다:
0일째 7일째 14일째 21일째 28일째 35일째
MAb 용량 25 75 125 175 225 275
mg/㎡ mg/㎡ mg/㎡ mg/㎡ mg/㎡ mg/㎡
화학요법 + + + + + +
(표준 용량)
항체와 화학요법을 각각 투여한 후 1주 동안 환자의 임상 과정을 면밀히 관찰하였다. 특히, 환자를 대사으로 하여 상기 언급된 안전성 우려에 대해 평가하였다: (i) 사이토킨 방출 증후군, 예를 들어 저혈압, 발열, 전율, 오한; (ii) 해당 물질에 대한 면역원성 반응 발생 (즉, 인간 항체 치료제, 또는 HAHA 반응에 대한 환자에 의한 인간 항체 발생); 및 (iii) STEAP-1을 발현하는 정상 세포에 대한 독성. 표준 시험 및 후처리를 활용하여 이들 안전성 우려 사항 각각을 모니터링하였다. 환자를 대상으로 하여, 임상 결과를 또한 평가하였는데, 특정하게는 MRI 또는 기타 영상화에 의해 입증된 바와 같은 종양 덩어리 감소를 평가하였다.
항-STEAP-1 항체는 안전하고 효능이 있는 것으로 입증되었고, 제II상 시험은 이러한 효능을 확인시켜 주고 최적 용량을 세밀히 규정한다.
실시예 29: 잠재적 신호 전달 경로의 확인 및 확정
많은 포유류 단백질이 신호 전달 분자와 상호작용하고 신호 전달 경로를 조절하는데 참여하는 것으로 보고되었다 [참고: J Neurochem. 2001; 76: 217-223]. 특히 피브로넥틴이 세포 유사분열유발을 제어하는 MAPK 신호 전달 케스케이드와 연관이 있다 [참고: Jiang F, Jia Y, Cohen I. Blood. 2002, 99:3579]. 또한, STEAP-1 단백질은 특이적 신호 전달 케스케이드와의 연관성을 나타내는 몇 가지 인산화 부위 (표 XXI 참고)를 함유하고 있다. 면역침전 및 웨스턴 블롯팅 기술을 사용하여, STEAP-1과 연합하고 신호 전달 사건을 매개하는 단백질을 확인하였다. 암 생물학에 있어 일정 역할을 하는 것으로 공지된 몇 가지 경로가 STEAP-1에 의해 조 절될 수 있는데, 이러한 경로에는 인지질 경로, 예를 들어 PI3K, AKT 등; 부착 및 이동 경로, 예를 들어 FAK, Rho, Rac-1, 카테닌 등 뿐만 아니라 분열촉진/생존 케스케이드, 예를 들어 ERK, p38 등이 포함된다 [참고: Cell Growth Differ. 2000, 11: 279; J Biol Chem. 1999, 274: 801; Oncogene. 2000, 19:3003, J. Cell Biol. 1997, 138:913]. STEAP-1의 발현이 휴지기 PC3 세포에서는 활성이 아닌 특이적 신호 전달 경로를 조절하는데 충분한지를 결정하기 위해, p38 MAPK 케스케이드의 활성화에 대한 이들 유전자의 효과를 전립선 암 세포주 PC3에서 연구 조사하였다. p38 키나제의 활성화는 티로신 및 세린 잔기 상에서의 그의 인산화에 의존적이다. 인산화된 p38은 포스포-p38 MAb에 의해 비-인산화 상태와 구별될 수 있다. 이러한 포스포-특이적 Ab를 사용하여, 공학적으로 처리시킨 PC3 세포주에서 p38의 인산화 상태를 연구하였다.
PC3 세포를 네오마이신 내성 유전자 단독으로, 또는 pSRα 벡터 중의 STEAP-1와 함께 형질감염시켰다. 세포를 0.5% FBS에서 밤새 성장시킨 다음, 10 ㎍/ml MEK 억제제 PD98058의 존재 또는 부재 하에 5분 동안 10% FBS로 자극시켰다. 세포 용해물을 12.5% SDS-PAGE에 의해 분해시키고, 항-포스포-ERK (Cell Signaling) 및 항-ERK (Zymed)로 웨스턴 블롯팅하였다. NIH-3T3 세포를 네오마이신 내성 유전자 단독으로, 또는 pSRα 벡터 중의 STEAP-1와 함께 형질감염시켰다. 세포를 MEK 억제제의 부재 하에 상기와 같이 처리하였다. 또한, NIH-3T3-Neo 세포를 10 mg/ml Na 살리실레이트로 처리하였다. STEAP-1의 발현은 혈청에서 ERK-1 및 ERK-2의 인산화를 유도시키고, 이는 상단 MEK 키나제 억제제 PD98058에 의해 억제되었다.
또 다른 실험 세트에서는, 전립선 암 세포주 PC3에서의 STEAP-1 발현이 분열촉진 MAPK 경로, 즉 ERK 케스케이드를 활성화시키기에 충분한지를 조사하였다. ERK의 활성화는 티로신 및 세린 잔기 상에서의 그의 인산화에 의존적이다. 인산화된 ERK은 포스포-ERK MAb에 의해 비-인산화 상태와 구별될 수 있다. 이러한 포스포-특이적 Ab를 사용하여, 공학적으로 처리시킨 PC3 세포주에서 ERK의 인산화 상태를 연구하였다. 활성화 형태의 Ras를 발현하는 PC3 세포를 양성 대조군으로서 사용하였다.
그 결과, 대조군 neo 유전자의 발현은 ERK 인산화에 전혀 영향을 미치지 못하였지만, PC3 세포에서의 STEAP-1 발현은 ERK 인산화 증가를 유도시키기에 충분한 것으로 밝혀졌다 (도 28). 이들 결과는 항-ERK 웨스턴 블롯팅을 사용하여 확증하였고, STEAP-1에 의한 ERK 경로의 활성화를 확정시켜 준다.
FBS는 수용체-매개된 ERK 활성화에 기여할 수 있는 몇 가지 구성분을 함유하기 때문에, 본 발명자들은 저수준 및 최적 수준의 FBS 중에서의 STEAP-1 효과를 조사하였다. neo 또는 STEAP-1을 발현하는 PC3 세포를 0.1% 또는 10% FBS에서 밤새 성장시켰다. 이 세포를 항-포스포-ERK 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 이 실험은 STEAP-1이 0.1% FBS 중에서의 ERK의 인산화를 유도시킨다는 것을 나타내며, STEAP-1의 발현이 부가의 자극 부재 하에서 ERK 신호 전달 케스케이드의 활성화를 유도시키기에 충분하다는 것으로 확정시켜 준다.
STEAP-1이 세포에서 공지된 신호 전달 경로를 직접 또는 간접적으로 활성화시키는 지를 확정하기 위해, 루시퍼라제 (luc)에 의거한 전사 리포터 검정을 개개 유전자를 발현하는 세포에서 수행하였다. 이들 전사 리포터는 잘 정립된 신호 전달 경로의 하단에 있는 공지된 전사 인자에 대한 컨센서스-결합성 부위를 함유한다. 상기 리포터, 및 이들과 연관된 전사 인자, 신호 전달 경로 및 활성화 자극의 예가 다음에 기재되었다:
1. NFkB-luc, NFkB/Rel; Ik-키나제/SAPK; 성장/세포소멸/스트레스
2. SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; 성장/분화
3. AP-1-luc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; 성장/세포소멸/스트레스
4. ARE-luc, 안드로겐 수용체; 스테로이드/MAPK; 성장/분화/세포소멸
5. p53-luc, p53; SAPK; 성장/분화/세포소멸
6. CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; 성장/세포소멸/스트레스
7. TCF-luc, TCF/Lef; catenin, 부착/침습.
mRNA 발현을 나타내는 세포에서 유전자-매개된 효과를 검정할 수 있다. 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 지질-매개된 형질감염 (TFX-50, Promega)에 의해 도입할 수 있다. 상대 전사 활성의 지표인 루시퍼라제 활성은 세포 추출물을 루시페린 지질과 함께 항온 배양함으로써 측정하고, 반응물의 발광을 발광계에서 모니터링하였다.
STEAP-1에 의해 활성화된 신호 전달 경로를 지도화하고, 이를 치료적 표적의 확인 및 검증을 위해 사용하였다. STEAP-1이 세포 신호 전달에 관여하는 경우에는, 이를 진단, 예후, 예방 및(또는) 치료 목적을 위해 표적으로서 사용하였다.
실시예 30: 소분자 수송체 및 세포-세포 소통에 있어서의 STEAP-1의 관여
세포-세포 소통은 기관 원형 보존과 생체 항상성 (이들 둘 다는 종양 형성 및 진행 동안 탈제어된다)을 유지하는데 있어 필수적이다. 세포간 소통은 2가지 유형의 검정을 이용하여 측정할 수 있다 [참고: J. Biol. Chem. 2000, 275:25207]. 첫 번째 검정에서는, 형광 염료가 부하된 세포를 표지되지 않은 수용자 세포의 존재 하에 항온 배양하고, 세포 집단을 형광 현미경 검사하여 조사하였다. 이러한 정성적 검정은 인접한 세포들 간의 염료 교환을 측정한다. 두 번째 검정 시스템에서는, 공여자 및 수용자 세포 집단을 상기와 같이 처리하고, 수용자 세포 집단의 정량적 측정을 FACS 분석에 의해 수행하였다. 이들 2가지 검정 시스템을 사용하여, STEAP-1을 발현하는 세포를, STEAP-1을 발현하지 않는 대조군과 비교한 결과, STEAP-1이 세포 소통을 증강시키는 것으로 밝혀졌다. 도 29는 STEAP-1이 인접한 세포들 간의 소분자 칼세인의 전이를 매개함으로써, 전립선 암 세포에서 세포-세포 소통을 조절하였다는 것을 나타낸다. 이 실험에서는, 수용자 PC3 세포를 덱스트란-텍사스 적색으로 표지시키고, 공여자 PC3 세포는 칼세인 AM (녹색)으로 표지시켰다. 공여자 (녹색) 및 수용자 (적색) 세포를 37℃ 하에 공동-배양하고, 텍사스 적색와 칼세인의 공동-국재를 알아보기 위해 현미경으로 분석하였다. 그 결과, PC3 대조군 세포 (탐지 가능한 수준의 STEAP-1 단백질 발현을 전혀 나타내지 않음)가 칼세인 전이를 거의 나타내지 않았지만, STEAP-1 발현은 세포들 간의 소분자 전이를 유발시킴으로써, 초기에 적색인 수용자 세포가 갈색을 띄게 되고, 갈색 분자와 녹색 분자를 공동-국재시키는 것으로 입증되었다. STEAP-1에 의해 매개된 세포-세포 소통을 조정하는 소분자 및(또는) 항체를, STEAP-1을 발현하는 암에 대한 치료 제로서 사용한다. 도 30은 STEAP-1 발현이 소분자 전이가 일어나도록 공여자 집단과 수용자 집단 둘 다에 필요하다는 것을 나타낸다. 이 실험에서는, PC3 세포를 네오마이신 내성 유전자 단독으로, 또는 pSRα 벡터 중의 STEAP-1와 함께 형질감염시켰다. 수용자 세포를 1 mg/ml 덱스트란-텍사스 적색으로 표지시키고, 공여자 세포를 2.5 ㎍/ml 칼세인 AM으로 표지시켰다. 공여자 (녹색) 및 수용자 (적색) 세포를 37℃ 하에 18 내지 24 시간 동안 공동 배양하고, 형광성 염료의 공동-국재를 알아보기 위해 현미경으로 분석하였다. 상부 패널: 광 현미경; 하부 패널: UV 형광. 좌측 패널: PC3-Neo 세포를 공여자와 수용자 둘 다로서 사용하였다. 중앙 패널: PC3-Neo가 공여자 세포이고 PC3-STEAP-1가 수용자 세포이다. 우측 패널: PC3-STEAP-1 세포를 공여자와 수용자 둘 다로서 사용하였다. STEAP-1이 공여자와 수용자 둘 다 상에서 발현된 경우에만 세포-세포 소통이 탐지되었다.
그 결과, 대조군 PC3과 PC3 세포를 공동-배양하는 것이 칼세인 전이를 매개하지 못한 것으로 나타났다. 유사하게, 대조군 PC3과 PC3-STEAP-1을 공동-항온 배양하는 것도 칼세인의 전이를 허용하지 못하였다. 그러나, PC3-STEAP-1 공여자 세포와 PC3-STEAP-1 수용자 세포를 공동-배양하는 것은, 동일한 세포에서 녹색 및 적색 안료의 공동-국재에 의해 표시되는 바와 같이 소분자 전이를 매개하였다. 취합해 보면, 도 29 및 30에 도시된 데이터는 STEAP-1이 소분자 전이를 매개하고, 갭 결합에 대한 기능 면에서 유사한 세포간 소통 채널을 형성함으로써 세포-세포 소통을 조절한다는 사실을 나타낸다.
부가적으로, 갭 결합에 대한 STEAP-1/120.545 효과를 확인하였다 (도 31 참 고). 이 실험에서는, PC3 세포를 네오마이신 내성 유전자 단독으로, 또는 pSRα 벡터 중의 STEAP-1과 함께 형질감염시켰다. 수용자 세포를 1 mg/ml 덱스트란-텍사스 적색으로 표지시키고, 공여자 세포를 2.5 ㎍/ml 칼세인 AM으로 표지시켰다. 공여자 (녹색) 및 수용자 (적색) 세포를 37℃ 하에 18 내지 24 시간 동안 공동 배양하고, 형광성 염료의 공동-국재를 알아보기 위해 현미경으로 분석하였다. 모든 실험에서는, 동일한 세포를 공여자 및 수용자로서 사용하였다. 세포를 도말하기에 앞서, 10분 동안 지시된 양의 STEAP-1/120.545 MAb와 함께 항온 배양하고, 분석하기에 앞서 MAb를 배지 내에 24시간 동안 유지시켰다. STEAP1/120.545는 STEAP-1 매개된 갭 결합을 용량-의존적 방식으로 저하시킨다. 그 결과, STEAP1/120.545가 STEAP-1 매개된 갭 결합을 용량-의존적 방식으로 저하시킨 것으로 밝혀졌다.
따라서, STEAP-1은 세포-세포 소통과 소분자 전이에 기능하기 때문에, 이를 진단, 예후, 예방 및(또는) 치료 목적을 위한 표적 또는 마커로서 사용하였다.
실시예 31: RNA 간섭 (RNAi)
RNA 간섭 (RNAi) 기술은 종양학과 관련된 각종 세포 검정에 대해 수행하였다. RNAi는 이중 가닥 RNA (dsRNA)에 의해 활성화된 전사 후 유전자 침묵 기전이다. RNAi는 특이적 mRNA 분해를 유도시켜 단백질 발현 상의 변화를 가져다 주고, 연속해서 유전자 기능 상의 변화를 유발시킨다. 포유류 세포에서는, 저분자 간섭 RNA (siRNA)으로 불리우는 이들 dsRNAs가 구체적으로는 몇몇 mRNAs를 분해시키기 위한 RNAi 경로 표적화를 활성화시키는 정확한 조성을 지니고 있다 [참고: Elbashir S. M., et. al., Duplexes of 21-nucleotide RNAs Mediate RNA interference in Cultured Mammalian Cells, Nature 411(6836):494-8 (2001)]. 따라서, RNAi 기술은 표적화 유전자를 침묵시키기 위해 포유류 세포에서 성공적으로 사용되고 있다.
세포 증식 제어 상실이 암성 세포의 특징이므로, 세포 생존/증식 검정에서 STEAP-1의 역할을 평가하는 것이 관계가 있다. 따라서, RNAi을 사용하여 STEAP-1 항원의 기능을 연구 조사하였다. STEAP-1에 대한 siRNA을 생성시키기 위해, 결정적 분자상 파라미터 (G:C 함량, 융점 등)를 나타내고, 세포 내로 도입될 때 STEAP-1 단백질의 발현 수준을 상당히 저하시킬 수 있는 능력을 지니고 있는 올리고뉴클레오티드를 예측하는 알고리즘을 사용하였다. 따라서, TEAP-1 siRNA에 대한 하나의 표적화 서열은 5' AAGCTCATTCTAGCGGGAAAT 3' (서열 81)이다. 본 실시예에 따르면, STEAP-1 단백질의 핵산 ORF 서열 또는 그의 아서열에 상응하는 siRNA (이중 가닥, 저분자 간섭 RNA)를 포함하는 STEAP-1 siRNA 조성물을 사용한다. 따라서, 이러한 방식으로 사용되는 siRNA 아서열은 일반적으로, 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상의 연속된 RNA 뉴클레오티드이다. 이들 siRNA 서열은 mRNA 코딩 서열의 적어도 일부분과 상보적 및 비-상보적이다. 바람직한 양태에서는, 상기 아서열이 길이가 19 내지 25개 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 길이가 21 내지 23개 뉴클레오티드이다. 바람직한 양태에서는, 이들 siRNA가 상기 단백질을 발현하는 세포에서 STEAP-1 항원의 녹다운을 달성시키고, 다음에 기재된 바와 같은 기능적 효과를 지닌다.
선별된 siRNA (STEAP-1.b 올리고)를 수 많은 세포주에서 생존/증식 MTS 검정 (세포성 대사 활성을 측정함)으로 시험하였다. 테트라졸륨에 의거한 비색 검정 (즉, MTS)은 살아있는 세포 만을 탐지하는데, 이는 살아있는 세포가 대사적으로 활성이므로, 테트라졸륨 염을 착색 포르마잔 화합물로 환원시킬 수 있지만, 죽은 세포는 그렇치 못하기 때문이다. 더우기, 이러한 STEAP-1.b 올리고는 상기 단백질을 발현하는 세포에서 STEAP-1 항원의 녹다운을 달성시켰고, 다음 프로토콜을 사용하여 다음에 기재되는 바와 같은 기능적 효과를 지녔다.
포유류 siRNA 형질감염 : siRNA 형질감염하기 전날, 생존/MTS 검정을 위해 상이한 세포주를 80 ㎕ 중에서 2 x 103개/웰로 배지 (항생제 부재 하에 10% FBS를 수반한 RPMI 1640)에 도말하였다 (96 웰 판 포맷). STEAP-1 특이적 siRNA 올리고와 병행해서, 다음 서열을 대조군으로서 모든 실험에 포함시켰다: a) 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000 (공급처: Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 어닐링 완충제 (siRNA 없음)로 모의 형질감염시킨 세포; b) 루시퍼라제-4 특이적 siRNA (표적화 서열: 5'-AAGGGACGAAGACGAACACUUCTT-3') (서열 82); 및 c) Eg5 특이적 siRNA (표적화 서열: 5'-AACTGAAGACCTGAAGACAATAA-3') (서열 83). SiRNAs를 10 nM 및 1 ㎍/ml 리포펙타민 2000 최종 농도로 사용하였다.
그 과정은 다음과 같다: siRNAs를 먼저, OPTIMEM (혈청 무함유 형질감염용 배지; 공급처: Invitrogen)에서 0.1 μM (10-배 농축됨)로 희석시키고 실온에서 5 내지 10분 동안 항온 배양하였다. 리포펙타민 2000을 형질감염 총수에 대해 10 ㎍ /ml (10배 농축됨)으로 희석시키고, 실온에서 5 내지 10분 동안 항온 배양하였다. 적당량의 희석된 10배 농축된 리포펙타민 2000을 희석된 10배 농축된 siRNA와 1:1로 혼합하고, 실온에서 20 내지 30초 동안 항온 배양하였다 (5배 농축된 형질감염 용액). 20 ㎕의 5배 농축된 형질감염 용액을 각각의 샘플에 가하고, 분석하기 전에 37℃에서 96시간 동안 항온 배양하였다.
MTS 검정 : MTS 검정은 테트라졸륨화합물 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨, 내부 염; MTS(b)] 및 전자 커플링 시약 (페나진 에토술페이트; PES)을 기초로 하여, 증식, 세포독성 또는 화학민감성 검정에서 살아있는 세포 수를 결정하기 위한 비색 방법이다. 소량의 상기 용액 시약을 배양 웰에 직접 가하고, 1 내지 4시간 동안 항온 배양한 다음, 96-웰 판 판독기로 490 nm에서의 흡광도를 기록함으로써 검정을 수행하였다. 490 nm 흡광도 양으로써 측정된 바와 같은 착색된 포르마잔 생성물의 양은 미토콘드리아 활성 및(또는) 배양 중인 살아있는 세포 수와 정비례한다.
세포에서의 STEAP-1 기능에 역점을 두기 위해, 내적으로 발현하는 STEAP-1 세포주를 형질감염시킴으로써 STEAP-1을 침묵시켰다. 도 32에 도시된 바와 같이, ERK-1 인산화와 ERK-2 인산화 둘 다를 10% 혈청에 의해 유도시키고, 이를 STEAP-1에 대한 M2/92.30 MAb 및 siRNA에 의해 억제시켰다. 이 실험에서는, PC3 세포를 네오마이신 내성 유전자 단독으로, 또는 pSRα 벡터 중의 STEAP-1 및 MAb과 함께 형질감염시켰다. RNAi 녹다운의 경우에는, PC3-STEAP-1 세포를, STEAP-1에 대한 siRNA를 함유하는 pPUR-U6-27-STEAP-1 벡터로 안정적으로 형질감염시켰다. 세포를 0.1% FBS에서 37℃ 하에 18시간 동안 고갈시키고, 10 ㎍/ml M2/92.30 MAb의 존재 또는 부재 하에 10분 동안 얼음 위에 놓아둔 다음, 3분 동안 실온 하에 놓아둔 후, 10% FBS로 5분 동안 자극하였다. 세포를 RIPA 완충액에 용해시키고, 완전 세포 용해물을 12.5% SDS-PAGE에 의해 분해시킨 다음, 단백질을 웨스턴 블롯팅하여 탐지하였다. 토끼 항혈청 (Cell Signaling)을 사용하여 포스포-ERK를 탐지하고, 토끼 항-ERK (Zymed)를 사용하여 ERK를 탐지하였다. 양 (sheep) 항-STEAP-1을 사용하여 STEAP-1을 탐지하고, 항-악틴 MAb (Santa Cruz)를 사용하여 악틴을 탐지하였다.
부가적으로 도 33에 도시된 바와 같이, PC3-STEAP-1 세포에서 안정적으로 발현된 특이적 STEAP-1 RNAi는 STEAP-1 유도된 세포-세포 소통을 저하시킨다. 이 실험에서는, PC3 세포를 네오마이신 내성 유전자 단독으로, 또는 pSRα 벡터 중의 STEAP-1과 함께 형질감염시켰다. RNAi 녹다운의 경우에는, PC3-STEAP-1 세포를, STEAP-1에 대한 siRNA를 함유하는 pPUR-U6-27-STEAP-1 벡터 또는 빈 벡터로 안정적으로 형질감염시켰다. 수용자 세포를 1 mg/ml 덱스트란-텍사스 적색으로 표지시키고, 공여자 세포를 2.5 ㎍/ml 칼세인 AM으로 표지시켰다. 공여자 (녹색) 및 수용자 (적색) 세포를 37℃ 하에 18 내지 24 시간 동안 공동 배양하고, 형광성 염료의 공동-국재를 알아보기 위해 현미경으로 분석하였다. 모든 실험에서는, 동일한 세포를 공여자 및 수용자로서 사용하였다.
본 발명의 또 다른 양태는 STEAP-1 관련 세포 증식이 증식에 대한 마커로서의 DNA 합성 측정이라는 것을 분석하는 방법이다. 표지된 DNA 전구체 (즉, 3H-티미 딘)을 사용하고, DNA 내로의 혼입을 정량화하였다. 표지된 DNA의 DNA 내로의 혼입 양은 배양 중에 발생하는 세포 분할 양과 정비례한다. 세포 증식을 측정하기 위해 사용된 또 다른 방법은 클론원성 검정을 수행하는 것이다. 이들 검정에서는, 규정된 수의 세포를 적당한 매트릭스 상에 놓아두고, siRNA 처리하여 일정 기간 성장시킨 후 형성된 집락의 수를 계수하였다.
STEAP-1 암 표적 검증에서는, 세포 생존/증식 분석을 세포소멸 및 세포 주기 프로파일링 연구로 보완하는 것이 고려된다. 세포소멸 과정의 생화학적 특징은 게놈성 DNA 단편화 (분절)인데, 이는 세포를 사멸시키는 비가역적 사건이다. 세포에서 단편화된 DNA를 관찰하기 위한 방법은, 세포소멸성 세포의 세포질 내에서의 히스톤-착화된 DNA 단편 (모노- 및 올리고-뉴클레오솜) 강화를 측정하는 면역검정 (즉, 세포 사멸 탐지 ELISA)에 의해 히스톤-착화된 DNA 단편을 면역학적으로 탐지하는 것이다. 이러한 검정은 세포의 예비-표지화를 요구하지 않으며, 시험관 내에서는 증식되지 않는 세포 (즉, 신선하게 분리된 종양 세포)에서의 DNA 분해를 탐지할 수 있다.
세포소멸성 세포 사멸을 촉발시키는데 있어 가장 중요한 효과기 분자가 카스파제이다. 카스파제는 활성화될 때, 극히 초기 단계의 세포소멸을 매개하는 아스파르테이트 잔기의 카복시-말단 부위에서 수 많은 기질을 절단시키는 프로테아제이다. 모든 카스파제는 프로-효소로서 합성하고, 활성화는 아스파르테이트 잔기에서의 절단을 포함한다. 특히, 카스파제 3은 세포성 세포소멸 사건 개시에 있어 중추적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 카스파제 3 활성화를 측정하기 위한 검정은 세포소멸의 초기 사건을 탐지한다. RNAi 처리 후, 세포소멸성 세포에서 발견된 생성물 (즉, PARP)의 단백질 분해적 절단 또는 활성 카스파제 3 존재를 웨스턴 블롯 탐지한 결과, 이는 세포소멸의 적극적 유도를 추가로 뒷받침해준다. 세포소멸을 야기시키는 세포성 기전은 복잡하기 때문에, 각각은 장단점이 있다. 기타 기준/종말점, 예를 들어 세포 형태, 염색질 응축, 막 수포형성을 고려하면, 세포소멸체는 세포 사멸이 세포소멸이란 것을 추가로 뒷받침하는데 도움을 준다. 세포 성장을 조절하는 모든 유전자 표적이 항-세포소멸성이 아니기 때문에, 침투된 세포의 DNA 함량을 측정하여 DNA 함량 프로파일 또는 세포 주기 프로파일을 수득한다. 세포소멸성 세포의 핵은 세포질 (서브-G1 집단)로의 누출 때문에 DNA를 덜 함유한다. 또한, DNA 염색물 (즉, 프로피듐 요오다이드)을 사용하면, GO/G1, S 및 G2/M에서의 상이한 양의 DNA 존재로 인한 세포 집단에서의 상이한 상의 세포 주기를 구별할 수 있다. 이들 연구에서는, 아집단을 정량화할 수 있다.
STEAP-1 유전자의 경우에는, RNAi 연구가 암 경로에 있어서의 상기 유전자 생성물의 기여도를 이해하는데 도움을 준다. 이러한 활성 RNAi 분자는 활성 항종양 치료제인 MAbs를 스크린하는 검정을 확인하는데 사용된다. 더우기, siRNA는 표 I에 열거된 것을 포함한 몇 가지 암 유형의 악성 성장을 저하시키기 위해 암 환자에게 치료제로서 투여한다. STEAP-1이 세포 생존, 세포 증식, 종양형성 또는 세포소멸에 있어 일정 역할을 한다면, 이를 진단, 예후, 예방 및(또는) 치료 목적을 위한 표적으로서 사용한다.
실시예 32: STEAP-1 기능 조정
이온 수송은 세포 성장, 세포내 침투성, 분자상 트래픽킹, 및 신호 전달을 조절하는데 있어 중요한 역할을 한다 [참고: Minke B. Cell Mol Neurobiol. 2001, 21:629; Golovina et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001, 280:H746]. 특히 종양 질환과 관계가 있는 여러 기능이 있다. 세포-세포 소통은 생체 항상성, 세포 증식 및 세포 사멸을 조절하는데 [참고: Evans WH, Martin PE. Mol Membr Biol. 2002, 19:121; Carruba G, et al, Ann N Y Acad Sci. 2002, 963:156], 이들 기능 역시 종양 질환과 특히 관계가 있다.
대조군 세포주와 STEAP-1을 발현하는 세포주를 사용하여, STEAP-1 기능 억제제를 확인하였다. 예를 들어, PC3 및 PC3-STEAP-1 세포를 MAb 또는 소분자 억제제의 존재 및 부재 하에 항온 배양할 수 있다. 상기 언급된 이온 유출, 세포 소통, 증식 및 신호 전달 검정을 이용하여, 이들 MAb 또는 소분자 억제제의 효과를 연구 조사하였다.
수송제에 의해 매개된 신호 전달과 생물학적 산출량은 각종 기전, 예를 들어 수용체 및 리간드 결합 억제, 이온 길항제, 단백질 상호작용, 이온 및 소분자 수송 조절 등을 통하여 조정할 수 있다 [참고:Tang W et al, Front Biosci 2002, 7:1583]. 대조군 세포주와 STEAP-1을 발현하는 세포주를 사용하여, STEAP-1 기능 조정제 (억제제 또는 증강제)를 확인하였다. 예를 들어, PC3 및 PC3-STEAP-1 세포를 MAb 또는 소분자 조정제의 존재 및 부재 하에 항온 배양할 수 있다. 본원에 기재된 STEAP-1의 기능 측면에서, 본 발명과 관련하여 사용된 이온 채널 차단제인 조정제에는 암로디핀, 아줄렌, 디히드로피리딘, 티아닌, 니페딘, 베라파밀 및 그의 유도체와 같은 화합물이 포함되고 [참고: Tanaka Y, Shigenobu K. Cardiovasc Drug Rev. 2001, 19:297; Djuric D, Mitrovic V, Jakovljevic V. Arzneimittelforschung. 2002, 52:365; Kourie JI, Wood HB. Prog Biophys Mol Biol. 2000, 73:91]; 본 발명과 관련하여 사용된 세포 소통의 억제제인 조정제에는 베타-글리시레틴산, 레티노이드, TPA와 같은 화합물이 포함된다 [참고: Krutovskikh VA et al, Oncogene. 2002, 21:1989; Rudkin et al, J Surg Res. 2002, 103: 183; Ruch J et al, J Cell Biochem. 2001, 83:163]. 따라서, 상기 실시예에 기재된 이온 유출, 세포 소통, 증식 및 신호 전달 검정을 이용하여, MAb 또는 소분자 억제제의 효과(들)를 연구 조사하였다.
MAb 및 소분자가 STEAP-1에 의한 수송 및 종양형성 기능을 조정 (예: 억제)하는 경우에는, 이들을 예방, 예후, 진단 및(또는) 치료 목적에 사용한다.
본원 전반에 걸쳐, 각종 웹사이트 데이터, 공개문헌, 및 특허원 및 특허가 참고된다 [웹사이트는 World Wide Web상의 URL (Uniform Resource Locator) 주소로써 인용된다]. 이들 참고 문헌 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다.
본 발명은 본 발명의 개개 국면의 단일 예시로서 나타낸, 본원에 기재된 양태들로써 그 범위가 제한되지 않고, 기능적으로 등가인 모든 양태가 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에 기재된 것 이외에도, 본 발명의 모델 및 방법에 대한 각종 변형이 전술된 설명과 교시로부터 당업자에게 명백할 것이며, 이 또한 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다. 이러한 변형 또는 각종 양태는 본 발명의 요지와 범위를 벗어나지 않고서도 실시할 수 있다.
<표>
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<표 4>
HLA 부류 I/II 모티프/슈퍼모티프
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<표 V 내지 XVIII>
본원에 그 전문의 내용이 포함되는, 2002월 9월 6일자로 출원된 미국 특허출원 제10/236,878호에 제시되었다.
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<표 XXII 내지 LI>
본원에 그 전문의 내용이 포함되는, 2002월 9월 6일자로 출원된 미국 특허출원 제10/236,878호에 제시되었다.
Figure 112006085338726-PCT00020
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SEQUENCE LISTING <110> Agensys, Inc. Jakobovits, Aya Etessami, Soudabeh Challita-Eid, Pia M. Perez-Villar, Juan Meyrick Morrison, Karen Jane Jia, Xiao-Chi Faris, Mary Gudas, Jean Raitano, Arthur B. <120> Antibodies and Molecules Derived therefrom that Bind to STEAP-1 Proteins <130> 51158-20016.61 <140> PCT/US04/12625 <141> 2004-04-22 <150> 09/323,873 <151> 1999-06-01 <150> 10/010,667 <151> 2001-12-06 <150> 10/011,095 <151> 2001-12-06 <150> 10/236,878 <151> 2002-09-06 <150> 10/165,044 <151> 2002-06-06 <150> 09/455,486 <151> 1999-12-06 <150> 60/091,183 <151> 1998-06-30 <150> 60/317,840 <151> 2001-09-06 <150> 60/370,387 <151> 2002-04-05 <150> 60/296,656 <151> 2001-06-06 <150> 60/087,520 <151> 1998-06-01 <160> 103 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 436 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtacagcaaa aaagaaactg agaagcccaa actgctttct tgttaacatc cacttatcca 60 accaatgtgg aaacttctta tacttggttc cattatgaag ttggacaatt gctgctatca 120 cacctggcag gtaaaccaat gccaagagag tgatggaaac cattggcaag actttgttga 180 tgaccaggat tggaatttta taaaaatatt gttgatggga agttgctaaa gggtgaatta 240 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70 75 80 Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His 85 90 95 Pro Leu Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu 100 105 110 Val Ile Asn Lys Val Leu Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu 115 120 125 Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly 130 135 140 Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr 145 150 155 160 Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala 165 170 175 Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu 180 185 190 Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp 195 200 205 Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile 210 215 220 Val Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser 225 230 235 240 Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Ser Lys 245 250 255 Leu Gly Ile Val Ser Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Leu Ile Phe 260 265 270 Ala Trp Asn Lys Trp Ile Asp Ile Lys Gln Phe Val Trp Tyr Thr Pro 275 280 285 Pro Thr Phe Met Ile Ala Val Phe Leu Pro Ile Val Val Leu Ile Phe 290 295 300 Lys Ser Ile Leu Phe Leu Pro Cys Leu Arg Lys Lys Ile Leu Lys Ile 305 310 315 320 Arg His Gly Trp Glu Asp Val Thr Lys Ile Asn Lys Thr Glu Ile Cys 325 330 335 Ser Gln Leu <210> 4 <211> 3627 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (96)...(872) <400> 4 ggggcccgca cctctgggca gcagcggcag ccgagactca cggtcaagct aaggcgaaga 60 gtgggtggct gaagccatac tattttatag aatta atg gaa agc aga aaa gac 113 Met Glu Ser Arg Lys Asp 1 5 atc aca aac caa gaa gaa ctt tgg aaa atg aag cct agg aga aat tta 161 Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met Lys Pro Arg Arg Asn Leu 10 15 20 gaa gaa gac gat tat ttg cat aag gac acg gga gag acc agc atg cta 209 Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr Gly Glu Thr Ser Met Leu 25 30 35 aaa aga cct gtg ctt ttg cat ttg cac caa aca gcc cat gct gat gaa 257 Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gln Thr Ala His Ala Asp Glu 40 45 50 ttt gac tgc cct tca gaa ctt cag cac aca cag gaa ctc ttt cca cag 305 Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Pro Gln 55 60 65 70 tgg cac ttg cca att aaa ata gct gct att ata gca tct ctg act ttt 353 Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile Ile Ala Ser Leu Thr Phe 75 80 85 ctt tac act ctt ctg agg gaa gta att cac ccc tta gca act tcc cat 401 Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His Pro Leu Ala Thr Ser His 90 95 100 caa caa tat ttt tat aaa att cca atc ctg gtc atc aac aaa gtc ttg 449 Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu Val Ile Asn Lys Val Leu 105 110 115 cca atg gtt tcc atc act ctc ttg gca ttg gtt tac ctg cca ggt gtg 497 Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu Val Tyr Leu Pro Gly Val 120 125 130 ata gca gca att gtc caa ctt cat aat gga acc aag tat aag aag ttt 545 Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly Thr Lys Tyr Lys Lys Phe 135 140 145 150 cca cat tgg ttg gat aag tgg atg tta aca aga aag cag ttt ggg ctt 593 Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr Arg Lys Gln Phe Gly Leu 155 160 165 ctc agt ttc ttt ttt gct gta ctg cat gca att tat agt ctg tct tac 641 Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr 170 175 180 cca atg agg cga tcc tac aga tac aag ttg cta aac tgg gca tat caa 689 Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Gln 185 190 195 cag gtc caa caa aat aaa gaa gat gcc tgg att gag cat gat gtt tgg 737 Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp Ile Glu His Asp Val Trp 200 205 210 aga atg gag att tat gtg tct ctg gga att gtg gga ttg gca ata ctg 785 Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile Val Gly Leu Ala Ile Leu 215 220 225 230 gct ctg ttg gct gtg aca tct att cca tct gtg agt gac tct ttg aca 833 Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser Val Ser Asp Ser Leu Thr 235 240 245 tgg aga gaa ttt cac tat att cag gta aat aat ata taa aataacccta 882 Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Val Asn Asn Ile * 250 255 agaggtaaat cttctttttg tgtttatgat atagaatatg ttgactttac cccataaaaa 942 ataacaaatg tttttcaaca gcaaagatct tatacttgtt ccaattaata atgtgctctc 1002 ctgttgtttt ccctattgct tctaattagg acaagtgttt cctagacata aataaaaggc 1062 attaaaatat tctttgtttt tttttttttg tttgtttgtt ttttgtttgt ttgtttgttt 1122 ttttgagatg aagtctcgct ctgttgccca tgctggagta cagtggcacg atctcggctc 1182 actgcaacct gcgcctcctg ggttcaggcg attctcttgc ctcagcctcc tgagtagctg 1242 ggattacagg cacccatcac catgtccagc taatttttgt atttttagta gagacagggt 1302 tttcccatgt tggccaggct ggtctcgatc tcctgacctc aaatgatccg cccacctcgg 1362 cctcccaaag tgctgggatg acagttgtga gccaccacac tcagcctgct ctttctaata 1422 tttgaaactt gttagacaat ttgctaccca tctaatgtga tattttagga atccaatatg 1482 catggtttat tatttcttaa aaaaaatatt cttttacctg tcacctgaat ttagtaatgc 1542 cttttatgtt acacaactta gcactttcca gaaacaaaaa ctctctcctt gaaataatag 1602 agtttttatc taccaaagat atgctagtgt ctcatttcaa aggctgcttt ttccagctta 1662 cattttatat acttactcac ttgaagtttc taaatattct tgtaatttta aaactatctc 1722 agatttactg aggtttatct tctggtggta gattatccat aagaagagtg atgtgccaga 1782 atcactctgg gatccttgtc tgacaagatt caaaggacta aatttaattc agtcatgaac 1842 actgccaatt accgtttatg ggtagacatc tttggaaatt tccacaaggt cagacattcg 1902 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tgttaataaa atgattattc aaggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 3627 <210> 5 <211> 258 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Glu Ser Arg Lys Asp Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met 1 5 10 15 Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gln 35 40 45 Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gln His Thr 50 55 60 Gln Glu Leu Phe Pro Gln Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile 65 70 75 80 Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His 85 90 95 Pro Leu Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu 100 105 110 Val Ile Asn Lys Val Leu Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu 115 120 125 Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly 130 135 140 Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr 145 150 155 160 Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala 165 170 175 Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu 180 185 190 Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp 195 200 205 Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile 210 215 220 Val Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser 225 230 235 240 Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Val Asn 245 250 255 Asn Ile <210> 6 <211> 1365 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (96)...(944) <400> 6 ggggcccgca cctctgggca gcagcggcag ccgagactca cggtcaagct aaggcgaaga 60 gtgggtggct gaagccatac tattttatag aatta atg gaa agc aga aaa gac 113 Met Glu Ser Arg Lys Asp 1 5 atc aca aac caa gaa gaa ctt tgg aaa atg aag cct agg aga aat tta 161 Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met Lys Pro Arg Arg Asn Leu 10 15 20 gaa gaa gac gat tat ttg cat aag gac acg gga gag acc agc atg cta 209 Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr Gly Glu Thr Ser Met Leu 25 30 35 aaa aga cct gtg ctt ttg cat ttg cac caa aca gcc cat gct gat gaa 257 Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gln Thr Ala His Ala Asp Glu 40 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155 160 165 ctc agt ttc ttt ttt gct gta ctg cat gca att tat agt ctg tct tac 641 Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr 170 175 180 cca atg agg cga tcc tac aga tac aag ttg cta aac tgg gca tat caa 689 Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Gln 185 190 195 cag gtc caa caa aat aaa gaa gat gcc tgg att gag cat gat gtt tgg 737 Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp Ile Glu His Asp Val Trp 200 205 210 aga atg gag att tat gtg tct ctg gga att gtg gga ttg gca ata ctg 785 Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile Val Gly Leu Ala Ile Leu 215 220 225 230 gct ctg ttg gct gtg aca tct att cca tct gtg agt gac tct ttg aca 833 Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser Val Ser Asp Ser Leu Thr 235 240 245 tgg aga gaa ttt cac tat att cag att atc cat aag aag agt gat gtg 881 Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Ile Ile His Lys Lys Ser Asp Val 250 255 260 cca gaa tca ctc tgg gat cct tgt ctg aca aga ttc aaa gga cta aat 929 Pro Glu Ser Leu Trp Asp Pro Cys Leu Thr Arg Phe Lys Gly Leu Asn 265 270 275 tta att cag tca tga acactgccaa ttaccgttta tgggtagaca tctttggaaa 984 Leu Ile Gln Ser * 280 tttccacaag agcaagctag gaattgtttc ccttctactg ggcacaatac acgcattgat 1044 ttttgcctgg aataagtgga tagatataaa acaatttgta tggtatacac ctccaacttt 1104 tatgatagct gttttccttc caattgttgt cctgatattt aaaagcatac tattcctgcc 1164 atgcttgagg aagaagatac tgaagattag acatggttgg gaagacgtca ccaaaattaa 1224 caaaactgag atatgttccc agttgtagaa ttactgttta cacacatttt tgttcaatat 1284 tgatatattt tatcaccaac atttcaagtt tgtatttgtt aataaaatga ttattcaagg 1344 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1365 <210> 7 <211> 282 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Glu Ser Arg Lys Asp Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met 1 5 10 15 Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gln 35 40 45 Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gln His Thr 50 55 60 Gln Glu Leu Phe Pro Gln Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile 65 70 75 80 Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His 85 90 95 Pro Leu Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu 100 105 110 Val Ile Asn Lys Val Leu Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu 115 120 125 Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly 130 135 140 Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr 145 150 155 160 Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala 165 170 175 Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu 180 185 190 Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp 195 200 205 Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile 210 215 220 Val Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser 225 230 235 240 Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Ile Ile 245 250 255 His Lys Lys Ser Asp Val Pro Glu Ser Leu Trp Asp Pro Cys Leu Thr 260 265 270 Arg Phe Lys Gly Leu Asn Leu Ile Gln Ser 275 280 <210> 8 <211> 3627 <212> DNA <213> Homo 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Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His Pro Leu Ala Thr Ser His 90 95 100 caa caa tat ttt tat aaa att cca atc ctg gtc atc aac aaa gtc ttg 449 Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu Val Ile Asn Lys Val Leu 105 110 115 cca atg gtt tcc atc act ctc ttg gca ttg gtt tac ctg cca ggt gtg 497 Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu Val Tyr Leu Pro Gly Val 120 125 130 ata gca gca att gtc caa ctt cat aat gga acc aag tat aag aag ttt 545 Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly Thr Lys Tyr Lys Lys Phe 135 140 145 150 cca cat tgg ttg gat aag tgg atg tta aca aga aag cag ttt ggg ctt 593 Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr Arg Lys Gln Phe Gly Leu 155 160 165 ctc agt ttg ttt ttt gct gta ctg cat gca att tat agt ctg tct tac 641 Leu Ser Leu Phe Phe Ala Val Leu His Ala Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr 170 175 180 cca atg agg cga tcc tac aga tac aag ttg cta aac tgg gca tat caa 689 Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Gln 185 190 195 cag gtc caa caa aat aaa gaa gat gcc tgg att gag cat gat gtt tgg 737 Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp Ile Glu His Asp Val Trp 200 205 210 aga atg gag att tat gtg tct ctg gga att gtg gga ttg gca ata ctg 785 Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile Val Gly Leu Ala Ile Leu 215 220 225 230 gct ctg ttg gct gtg aca tct att cca tct gtg agt gac tct ttg aca 833 Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser Val Ser Asp Ser Leu Thr 235 240 245 tgg aga gaa ttt cac tat att cag gta aat aat ata taa aataacccta 882 Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Val Asn Asn Ile * 250 255 agaggtaaat cttctttttg tgtttatgat atagaatatg ttgactttac cccataaaaa 942 ataacaaatg tttttcaaca gcaaagatct tatacttgtt ccaattaata atgtgctctc 1002 ctgttgtttt ccctattgct tctaattagg acaagtgttt cctagacata aataaaaggc 1062 attaaaatat tctttgtttt tttttttttg tttgtttgtt ttttgtttgt ttgtttgttt 1122 ttttgagatg aagtctcgct ctgttgccca tgctggagta cagtggcacg atctcggctc 1182 actgcaacct gcgcctcctg ggttcaggcg attctcttgc ctcagcctcc tgagtagctg 1242 ggattacagg cacccatcac catgtccagc taatttttgt atttttagta gagacagggt 1302 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Pro Val Leu Leu His Leu His Gln 35 40 45 Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gln His Thr 50 55 60 Gln Glu Leu Phe Pro Gln Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile 65 70 75 80 Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His 85 90 95 Pro Leu Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu 100 105 110 Val Ile Asn Lys Val Leu Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu 115 120 125 Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly 130 135 140 Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr 145 150 155 160 Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Leu Phe Phe Ala Val Leu His Ala 165 170 175 Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu 180 185 190 Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp 195 200 205 Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile 210 215 220 Val Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser 225 230 235 240 Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His 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1242 ggattacagg cacccatcac catgtccagc taatttttgt atttttagta gagacagggt 1302 tttcccatgt tggccaggct ggtctcgatc tcctgacctc aaatgatccg cccacctcgg 1362 cctcccaaag tgctgggatg acagttgtga gccaccacac tcagcctgct ctttctaata 1422 tttgaaactt gttagacaat ttgctaccca tctaatgtga tattttagga atccaatatg 1482 catggtttat tatttcttaa aaaaaatatt cttttacctg tcacctgaat ttagtaatgc 1542 cttttatgtt acacaactta gcactttcca gaaacaaaaa ctctctcctt gaaataatag 1602 agtttttatc taccaaagat atgctagtgt ctcatttcaa aggctgcttt ttccagctta 1662 cattttatat acttactcac ttgaagtttc taaatattct tgtaatttta aaactatctc 1722 agatttactg aggtttatct tctggtggta gattatccat aagaagagtg atgtgccaga 1782 atcactctgg gatccttgtc tgacaagatt caaaggacta aatttaattc agtcatgaac 1842 actgccaatt accgtttatg ggtagacatc tttggaaatt tccacaaggt cagacattcg 1902 caactatccc ttctacatgt ccacacgtat actccaacac tttattaggc atctgattag 1962 tttggaaagt atgcctccat ctgaattagt ccagtgtggc ttagagttgg tacaacattc 2022 tcacagaatt tcctaatttt gtaggttcag cctgataacc actggagttc tttggtcctc 2082 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353 Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile Ile Ala Ser Leu Thr Phe 75 80 85 ctt tac act ctt ctg agg gaa gta att cac ccc tta gca act tcc cat 401 Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His Pro Leu Ala Thr Ser His 90 95 100 caa caa tat ttt tat aaa att cca atc ctg gtc atc aac aaa gtc ttg 449 Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu Val Ile Asn Lys Val Leu 105 110 115 cca atg gtt tcc atc act ctc ttg gca ttg gtt tac ctg cca ggt gtg 497 Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu Val Tyr Leu Pro Gly Val 120 125 130 ata gca gca att gtc caa ctt cat aat gga acc aag tat aag aag ttt 545 Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly Thr Lys Tyr Lys Lys Phe 135 140 145 150 cca cat tgg ttg gat aag tgg atg tta aca aga aag cag ttt ggg ctt 593 Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr Arg Lys Gln Phe Gly Leu 155 160 165 ctc agt ttc ttt ttt gct gta ctg cat gca att tat agt ctg tct tac 641 Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr 170 175 180 cca atg agg cga tcc tac aga tac aag ttg cta aac tgg gca 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1182 actgcaacct gcgcctcctg ggttcaggcg attctcttgc ctcagcctcc tgagtagctg 1242 ggattacagg cacccatcac catgtccagc taatttttgt atttttagta gagacagggt 1302 tttcccatgt tggccaggct ggtctcgatc tcctgacctc aaatgatccg cccacctcgg 1362 cctcccaaag tgctgggatg acagttgtga gccaccacac tcagcctgct ctttctaata 1422 tttgaaactt gttagacaat ttgctaccca tctaatgtga tattttagga atccaatatg 1482 catggtttat tatttcttaa aaaaaatatt cttttacctg tcacctgaat ttagtaatgc 1542 cttttatgtt acacaactta gcactttcca gaaacaaaaa ctctctcctt gaaataatag 1602 agtttttatc taccaaagat atgctagtgt ctcatttcaa aggctgcttt ttccagctta 1662 cattttatat acttactcac ttgaagtttc taaatattct tgtaatttta aaactatctc 1722 agatttactg aggtttatct tctggtggta gattatccat aagaagagtg atgtgccaga 1782 atcactctgg gatccttgtc tgacaagatt caaaggacta aatttaattc agtcatgaac 1842 actgccaatt accgtttatg ggtagacatc tttggaaatt tccacaaggt cagacattcg 1902 caactatccc ttctacatgt ccacacgtat actccaacac tttattaggc atctgattag 1962 tttggaaagt atgcctccat ctgaattagt ccagtgtggc ttagagttgg tacaacattc 2022 tcacagaatt tcctaatttt gtaggttcag cctgataacc actggagttc tttggtcctc 2082 attaaatagc tttcttcaca cattgctctg cctgttacac atatgatgaa cactgctttt 2142 tagacttcat taggaattta ggactgcatc ttgacaactg agcctattct actatatgta 2202 caatacctag cccataatag gtatacaata cacatttggt aaaactaatt ttcaaccaat 2262 gacatgtatt tttcaactag taacctagaa atgtttcact taaaatctga gaactggtta 2322 cactacaagt taccttggag attcatatat gaaaacgcaa acttagctat ttgattgtat 2382 tcactgggac ttaagaatgc gcctgaataa ttgtgagttc gatttgttct ggcaggctaa 2442 tgaccatttc cagtaaagtg aatagaggtc agaagtcgta taaaagaggt gttgtcagaa 2502 caccgttgag attacatagg tgaacaacta tttttaagca actttatttg tgtagtgaca 2562 aagcatccca atgcaggctg aaatgtttca tcacatctct ggatctctct attttgtgca 2622 gacattgaaa aaattgttca tattatttcc atgttatcag aatatttgat tttttaaaaa 2682 cataggccaa gttcattcac ttcattattc atttatcaaa atcagagtga atcacattag 2742 tcgccttcac aactgataaa gatcactgaa gtcaaattga tttttgctat aatcttcaat 2802 ctacctatat ttaattgaga atctaaaatg tacaaatcat tgtgttgatt ctgcagtgat 2862 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Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met 1 5 10 15 Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gln 35 40 45 Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gln His Thr 50 55 60 Gln Glu Leu Phe Pro Gln Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile 65 70 75 80 Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His 85 90 95 Pro Leu Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu 100 105 110 Val Ile Asn Lys Val Leu Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu 115 120 125 Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly 130 135 140 Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr 145 150 155 160 Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala 165 170 175 Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu 180 185 190 Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp 195 200 205 Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu 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60 65 70 tgg cac ttg cca att aaa ata gct gct att ata gca tct ctg act ttt 353 Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile Ile Ala Ser Leu Thr Phe 75 80 85 ctt tac act ctt ctg agg gaa gta att cac ccc tta gca act tcc cat 401 Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His Pro Leu Ala Thr Ser His 90 95 100 caa caa tat ttt tat aaa att cca atc ctg gtc atc aac aaa gtc ttg 449 Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu Val Ile Asn Lys Val Leu 105 110 115 cca atg gtt tcc atc act ctc ttg gca ttg gtt tac ctg cca ggt gtg 497 Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu Val Tyr Leu Pro Gly Val 120 125 130 ata gca gca att gtc caa ctt cat aat gga acc aag tat aag aag ttt 545 Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly Thr Lys Tyr Lys Lys Phe 135 140 145 150 cca cat tgg ttg gat aag tgg atg tta aca aga aag cag ttt ggg ctt 593 Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr Arg Lys Gln Phe Gly Leu 155 160 165 ctc agt ttc ttt ttt gct gta ctg cat gca att tat agt ctg tct tac 641 Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala Ile Tyr Ser Leu Ser 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1122 ttttgagatg aagtctcgct ctgttgccca tgctggagta cagtggcacg atctcggctc 1182 actgcaacct gcgcctcctg ggttcaggcg attctcttgc ctcagcctcc tgagtagctg 1242 ggattacagg cacccatcac catgtccagc taatttttgt atttttagta gagacagggt 1302 tttcccatgt tggccaggct ggtctcgatc tcctgacctc aaatgatccg cccacctcgg 1362 cctcccaaag tgctgggatg acagttgtga gccaccacac tcagcctgct ctttctaata 1422 tttgaaactt gttagacaat ttgccaccca tctaatgtga tattttagga atccaatatg 1482 catggtttat tatttcttaa aaaaaatatt cttttacctg tcacctgaat ttagtaatgc 1542 cttttatgtt acacaactta gcactttcca gaaacaaaaa ctctctcctt gaaataatag 1602 agtttttatc taccaaagat atgctagtgt ctcatttcaa aggctgcttt ttccagctta 1662 cattttatat acttactcac ttgaagtttc taaatattct tgtaatttta aaactatctc 1722 agatttactg aggtttatct tctggtggta gattatccat aagaagagtg atgtgccaga 1782 atcactctgg gatccttgtc tgacaagatt caaaggacta aatttaattc agtcatgaac 1842 actgccaatt accgtttatg ggtagacatc tttggaaatt tccacaaggt cagacattcg 1902 caactatccc ttctacatgt ccacacgtat actccaacac tttattaggc atctgattag 1962 tttggaaagt atgcctccat ctgaattagt ccagtgtggc ttagagttgg tacaacattc 2022 tcacagaatt tcctaatttt gtaggttcag cctgataacc actggagttc tttggtcctc 2082 attaaatagc tttcttcaca cattgctctg cctgttacac atatgatgaa cactgctttt 2142 tagacttcat taggaattta ggactgcatc ttgacaactg agcctattct actatatgta 2202 caatacctag cccataatag gtatacaata cacatttggt aaaactaatt ttcaaccaat 2262 gacatgtatt tttcaactag taacctagaa atgtttcact taaaatctga gaactggtta 2322 cactacaagt taccttggag attcatatat gaaaacgcaa acttagctat ttgattgtat 2382 tcactgggac ttaagaatgc gcctgaataa ttgtgagttc gatttgttct ggcaggctaa 2442 tgaccatttc cagtaaagtg aatagaggtc agaagtcgta taaaagaggt gttgtcagaa 2502 caccgttgag attacatagg tgaacaacta tttttaagca actttatttg tgtagtgaca 2562 aagcatccca atgcaggctg aaatgtttca tcacatctct ggatctctct attttgtgca 2622 gacattgaaa aaattgttca tattatttcc atgttatcag aatatttgat tttttaaaaa 2682 cataggccaa gttcattcac ttcattattc atttatcaaa atcagagtga atcacattag 2742 tcgccttcac aactgataaa gatcactgaa gtcaaattga tttttgctat aatcttcaat 2802 ctacctatat ttaattgaga atctaaaatg tacaaatcat tgtgttgatt ctgcagtgat 2862 cctgctataa gtaagactca gtccctgatt ttaggtatcc tgtgaaaagc agaattaaga 2922 caaatacaca agagacaaag cacaaaaaat aaatatcata aggggatgaa caaaatggtg 2982 gagaaagagt agacaaagtt tttgatcacc tgccttcaaa gaaaggctgt gaattttgtt 3042 cacttagaca gcttggagac aagaaattac ccaaaagtaa ggtgaggagg ataggcaaaa 3102 agagcagaaa gatgtgaatg gacattgttg agaaatgtga taggaaaaca atcatagata 3162 aaggatttcc aagcaacaga gcatatccag atgaggtagg atgggataaa ctcttattga 3222 accaatcttc accaattttg tttttctttt gcagagcaag ctaggaattg tttcccttct 3282 actgggcaca atacacgcat tgatttttgc ctggaataag tggatagata taaaacaatt 3342 tgtatggtat acacctccaa cttttatgat agctgttttc cttccaattg ttgtcctgat 3402 atttaaaagc atactattcc tgccatgctt gaggaagaag atactgaaga ttagacatgg 3462 ttgggaagac gtcaccaaaa ttaacaaaac tgagatatgt tcccagttgt agaattactg 3522 tttacacaca tttttgttca atattgatat attttatcac caacatttca agtttgtatt 3582 tgttaataaa atgattattc aaggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 3627 <210> 15 <211> 258 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1062 attaaaatat tctttgtttt tttttttttg tttgtttgtt ttttgtttgt ttgtttgttt 1122 ttttgagatg aagtctcgct ctgttgccca tgctggagta cagtggcacg atctcggctc 1182 actgcaacct gcgcctcctg ggttcaggcg attctcttgc ctcagcctcc tgagtagctg 1242 ggattacagg cacccatcac catgtccagc taatttttgt atttttagta gagacagggt 1302 tttcccatgt tggccaggct ggtctcgatc tcctgacctc aaatgatccg cccacctcgg 1362 cctcccaaag tgctgggatg acagttgtga gccaccacac tcagcctgct ctttctaata 1422 tttgaaactt gttagacaat ttgctaccca tctaatgtga tattttagga atccaatatg 1482 catggtttat tatttcttaa aaaaaatatt cttttacctg tcacctgaat ttagtaatgc 1542 cttttatgtt acacaactta gcactttcca gaaacaaaaa ctctctcctt gaaataatag 1602 agtttttatc taccaaagtt atgctagtgt ctcatttcaa aggctgcttt ttccagctta 1662 cattttatat acttactcac ttgaagtttc taaatattct tgtaatttta aaactatctc 1722 agatttactg aggtttatct tctggtggta gattatccat aagaagagtg atgtgccaga 1782 atcactctgg gatccttgtc tgacaagatt caaaggacta aatttaattc agtcatgaac 1842 actgccaatt accgtttatg ggtagacatc tttggaaatt tccacaaggt cagacattcg 1902 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Gly Leu 155 160 165 ctc agt ttc ttt ttt gct gta ctg cat gca att tat agt ctg tct tac 641 Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr 170 175 180 cca atg agg cga tcc tac aga tac aag ttg cta aac tgg gca tat caa 689 Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Gln 185 190 195 cag gtc caa caa aat aaa gaa gat gcc tgg att gag cat gat gtt tgg 737 Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp Ile Glu His Asp Val Trp 200 205 210 aga atg gag att tat gtg tct ctg gga att gtg gga ttg gca ata ctg 785 Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile Val Gly Leu Ala Ile Leu 215 220 225 230 gct ctg ttg gct gtg aca tct att cca tct gtg agt gac tct ttg aca 833 Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser Val Ser Asp Ser Leu Thr 235 240 245 tgg aga gaa ttt cac tat att cag gta aat aat ata taa aataacccta 882 Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Val Asn Asn Ile * 250 255 agaggtaaat cttctttttg tgtttatgat atagaatatg ttgactttac cccataaaaa 942 ataacaaatg tttttcaaca gcaaagatct tatacttgtt ccaattaata 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agaattactg 3522 tttacacaca tttttgttca atattgatat attttatcac caacatttca agtttgtatt 3582 tgttaataaa atgattattc aaggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 3627 <210> 19 <211> 258 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Glu Ser Arg Lys Asp Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met 1 5 10 15 Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gln 35 40 45 Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gln His Thr 50 55 60 Gln Glu Leu Phe Pro Gln Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile 65 70 75 80 Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His 85 90 95 Pro Leu Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu 100 105 110 Val Ile Asn Lys Val Leu Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu 115 120 125 Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly 130 135 140 Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr 145 150 155 160 Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala 165 170 175 Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu 180 185 190 Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp 195 200 205 Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile 210 215 220 Val Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser 225 230 235 240 Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Val Asn 245 250 255 Asn Ile <210> 20 <211> 3627 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (96)...(872) <400> 20 ggggcccgca cctctgggca gcagcggcag ccgagactca cggtcaagct aaggcgaaga 60 gtgggtggct gaagccatac tattttatag aatta atg gaa agc aga aaa gac 113 Met Glu Ser Arg Lys Asp 1 5 atc aca aac caa gaa gaa ctt tgg aaa atg aag cct agg aga aat tta 161 Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met Lys Pro Arg Arg Asn Leu 10 15 20 gaa gaa gac gat tat ttg cat aag gac acg gga gag acc agc atg cta 209 Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr Gly Glu Thr Ser Met Leu 25 30 35 aaa aga cct gtg ctt ttg cat ttg cac caa aca 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Gln Leu His Asn Gly 130 135 140 Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr 145 150 155 160 Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala 165 170 175 Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu 180 185 190 Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp 195 200 205 Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile 210 215 220 Val Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser 225 230 235 240 Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Val Asn 245 250 255 Asn Ile <210> 24 <211> 3627 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (96)...(872) <400> 24 ggggcccgca cctctgggca gcagcggcag ccgagactca cggtcaagct aaggcgaaga 60 gtgggtggct gaagccatac tattttatag aatta atg gaa agc aga aaa gac 113 Met Glu Ser Arg Lys Asp 1 5 atc aca aac caa gaa gaa ctt tgg aaa atg aag cct agg aga aat tta 161 Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met Lys Pro Arg Arg Asn Leu 10 15 20 gaa gaa gac gat tat 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Leu Leu Ala Leu 115 120 125 Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly 130 135 140 Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr 145 150 155 160 Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala 165 170 175 Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu 180 185 190 Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp 195 200 205 Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile 210 215 220 Val Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser 225 230 235 240 Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Val Asn 245 250 255 Asn Ile <210> 26 <211> 3627 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (96)...(872) <400> 26 ggggcccgca cctctgggca gcagcggcag ccgagactca cggtcaagct aaggcgaaga 60 gtgggtggct gaagccatac tattttatag aatta atg gaa agc aga aaa gac 113 Met Glu Ser Arg Lys Asp 1 5 atc aca aac caa gaa gaa ctt tgg aaa atg aag cct agg aga aat tta 161 Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met Lys Pro Arg Arg Asn Leu 10 15 20 gaa gaa gac gat tat ttg cat aag gac acg gga gag acc agc atg cta 209 Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr Gly Glu Thr Ser Met Leu 25 30 35 aaa aga cct gtg ctt ttg cat ttg cac caa aca gcc cat gct gat gaa 257 Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gln Thr Ala His Ala Asp Glu 40 45 50 ttt gac tgc cct tca gaa ctt cag cac aca cag gaa ctc ttt cca cag 305 Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Pro Gln 55 60 65 70 tgg cac ttg cca att aaa ata gct gct att ata gca tct ctg act ttt 353 Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile Ile Ala Ser Leu Thr Phe 75 80 85 ctt tac act ctt ctg agg gaa gta att cac ccc tta gca act tcc cat 401 Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His Pro Leu Ala Thr Ser His 90 95 100 caa caa tat ttt tat aaa att cca atc ctg gtc atc aac aaa gtc ttg 449 Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu Val Ile Asn Lys Val Leu 105 110 115 cca atg gtt tcc atc act ctc ttg gca ttg gtt tac ctg cca ggt gtg 497 Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu Val Tyr Leu Pro Gly Val 120 125 130 ata gca gca att gtc caa ctt cat aat gga acc aag tat aag aag ttt 545 Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly Thr Lys Tyr Lys Lys Phe 135 140 145 150 cca cat tgg ttg gat aag tgg atg tta aca aga aag cag ttt ggg ctt 593 Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr Arg Lys Gln Phe Gly Leu 155 160 165 ctc agt ttc ttt ttt gct gta ctg cat gca att tat agt ctg tct tac 641 Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr 170 175 180 cca atg agg cga tcc tac aga tac aag ttg cta aac tgg gca tat caa 689 Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Gln 185 190 195 cag gtc caa caa aat aaa gaa gat gcc tgg att gag cat gat gtt tgg 737 Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp Ile Glu His Asp Val Trp 200 205 210 aga atg gag att tat gtg tct ctg gga att gtg gga ttg gca ata ctg 785 Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile Val Gly Leu Ala Ile Leu 215 220 225 230 gct ctg ttg gct gtg aca tct att cca tct gtg agt gac tct ttg aca 833 Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser Val Ser Asp Ser Leu Thr 235 240 245 tgg aga gaa ttt cac tat att cag gta aat aat ata taa aataacccta 882 Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Val Asn Asn Ile * 250 255 agaggtaaat cttctttttg tgtttatgat atagaatatg ttgactttac cccataaaaa 942 ataacaaatg tttttcaaca gcaaagatct tatacttgtt ccaattaata atgtgctctc 1002 ctgttgtttt ccctattgct tctaattagg acaagtgttt cctagacata aataaaaggc 1062 attaaaatat tctttgtttt tttttttttg tttgtttgtt ttttgtttgt ttgtttgttt 1122 ttttgagatg aagtctcgct ctgttgccca tgctggagta cagtggcacg atctcggctc 1182 actgcaacct gcgcctcctg ggttcaggcg attctcttgc ctcagcctcc tgagtagctg 1242 ggattacagg cacccatcac catgtccagc taatttttgt atttttagta gagacagggt 1302 tttcccatgt tggccaggct ggtctcgatc tcctgacctc aaatgatccg cccacctcgg 1362 cctcccaaag tgctgggatg acagttgtga gccaccacac tcagcctgct ctttctaata 1422 tttgaaactt gttagacaat ttgctaccca tctaatgtga tattttagga atccaatatg 1482 catggtttat tatttcttaa aaaaaatatt cttttacctg tcacctgaat ttagtaatgc 1542 cttttatgtt acacaactta 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tcc atc act ctc ttg gca ttg gtt tac ctg cca ggt gtg 497 Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu Val Tyr Leu Pro Gly Val 120 125 130 ata gca gca att gtc caa ctt cat aat gga acc aag tat aag aag ttt 545 Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly Thr Lys Tyr Lys Lys Phe 135 140 145 150 cca cat tgg ttg gat aag tgg atg tta aca aga aag cag ttt ggg ctt 593 Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr Arg Lys Gln Phe Gly Leu 155 160 165 ctc agt ttc ttt ttt gct gta ctg cat gca att tat agt ctg tct tac 641 Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr 170 175 180 cca atg agg cga tcc tac aga tac aag ttg cta aac tgg gca tat caa 689 Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Gln 185 190 195 cag gtc caa caa aat aaa gaa gat gcc tgg att gag cat gat gtt tgg 737 Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp Ile Glu His Asp Val Trp 200 205 210 aga atg gag att tat gtg tct ctg gga att gtg gga ttg gca ata ctg 785 Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile Val Gly Leu Ala Ile Leu 215 220 225 230 gct ctg ttg gct gtg aca tct att cca tct gtg agt gac tct ttg aca 833 Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser Val Ser Asp Ser Leu Thr 235 240 245 tgg aga gaa ttt cac tat att cag gta aat aat ata taa aataacccta 882 Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Val Asn Asn Ile * 250 255 agaggtaaat cttctttttg tgtttatgat atagaatatg ttgactttac cccataaaaa 942 ataacaaatg tttttcaaca gcaaagatct tatacttgtt ccaattaata atgtgctctc 1002 ctgttgtttt ccctattgct tctaattagg acaagtgttt cctagacata aataaaaggc 1062 attaaaatat tctttgtttt tttttttttg tttgtttgtt ttttgtttgt ttgtttgttt 1122 ttttgagatg aagtctcgct ctgttgccca tgctggagta cagtggcacg atctcggctc 1182 actgcaacct gcgcctcctg ggttcaggcg attctcttgc ctcagcctcc tgagtagctg 1242 ggattacagg cacccatcac catgtccagc taatttttgt atttttagta gagacagggt 1302 tttcccatgt tggccaggct ggtctcgatc tcctgacctc aaatgatccg cccacctcgg 1362 cctcccaaag tgctgggatg acagttgtga gccaccacac tcagcctgct ctttctaata 1422 tttgaaactt gttagacaat ttgctaccca tctaatgtga tattttagga atccaatatg 1482 catggtttat tatttcttaa aaaaaatatt cttttacctg tcacctgaat ttagtaatgc 1542 cttttatgtt acacaactta gcactttcca gaaacaaaaa ctctctcctt gaaataatag 1602 agtttttatc taccaaagat atgctagtgt ctcatttcaa aggctgcttt ttccagctta 1662 cattttatat acttactcac ttgaagtttc taaatattct tgtaatttta aaactatctc 1722 agatttactg aggtttatct tctggtggta gattatccat aagaagagtg atgtgccaga 1782 atcactctgg gatccttgtc tgacaagatt caaaggacta aatttaattc agtcatgaac 1842 actgccaatt accgtttatg ggtagacatc tttggaaatt tccacaaggt cagacattcg 1902 caactatccc ttctacatgt ccacacgtat actccaacac tttattaggc atctgattag 1962 tttggaaagt atgcctccat ctgaattagt ccagtgtggc ttagagttgg tacaacattc 2022 tcacagaatt tcctaatttt gtaggttcag cctgataacc actggagttc tttggtcctc 2082 attaaatagc tttcttcaca cattgctctg cctgttacac atatgatgaa cactgctttt 2142 tagacttcat taggaattta ggactgcatc ttgacaactg agcctattct actatatgta 2202 caatacctag cccataatag gtatacaata cacatttggt aaaactaatt ttcaaccaat 2262 gacatgtatt tttcaactag taacctagaa atgtttcact taaaatctga gaactggtta 2322 cactacaagt 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aagcaacaga gcatatccag atgaggtagg atgggataaa ctcttattga 3222 accaatcttc accaattttg tttttctttt gcagagcaag ctaggaattg tttcccttct 3282 actgggcaca atacacgcat tgatttttgc ctggaataag tggatagata taaaacaatt 3342 tgtatggtat acacctccaa cttttatgat agctgttttc cttccaattg ttgtcctgat 3402 atttaaaagc atactattcc tgccatgctt gaggaagaag atactgaaga ttagacatgg 3462 ttgggaagac gtcaccaaaa ttaacaaaac tgagatatgt tcccagttgt agaattactg 3522 tttacacaca tttttgttca atattgatat attttatcac caacatttca agtttgtatt 3582 tgttaataaa atgattattc aaggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 3627 <210> 29 <211> 258 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Met Glu Ser Arg Lys Asp Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met 1 5 10 15 Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gln 35 40 45 Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gln His Thr 50 55 60 Gln Glu Leu Phe Pro Gln Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile 65 70 75 80 Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr 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Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu Val Ile Asn Lys Val Leu 105 110 115 cca atg gtt tcc atc act ctc ttg gca ttg gtt tac ctg cca ggt gtg 497 Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu Val Tyr Leu Pro Gly Val 120 125 130 ata gca gca att gtc caa ctt cat aat gga acc aag tat aag aag ttt 545 Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly Thr Lys Tyr Lys Lys Phe 135 140 145 150 cca cat tgg ttg gat aag tgg atg tta aca aga aag cag ttt ggg ctt 593 Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr Arg Lys Gln Phe Gly Leu 155 160 165 ctc agt ttc ttt ttt gct gta ctg cat gca att tat agt ctg tct tac 641 Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr 170 175 180 cca atg agg cga tcc tac aga tac aag ttg cta aac tgg gca tat caa 689 Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Gln 185 190 195 cag gtc caa caa aat aaa gaa gat gcc tgg att gag cat gat gtt tgg 737 Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp Ile Glu His Asp Val Trp 200 205 210 aga atg gag att tat gtg tct ctg gga att gtg gga ttg gca ata ctg 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cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt gca 288 Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 aga ccc tgg ttt gct tac tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc 336 Arg Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110 tca 339 Ser <210> 50 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly 20 25 30 Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly 35 40 45 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 51 <211> 435 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(435) <400> 51 gga ctg ttc gaa gcc gcc acc atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg 48 Gly Leu Phe Glu Ala Ala Thr Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val 1 5 10 15 ctc tgg att cgg gaa acc aac ggt gat gtt gtg atg acc cag act cca 96 Leu Trp Ile Arg Glu Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro 20 25 30 ctc act ttg tcg gtt acc att gga caa cca gcc tcc atc tct tgc aag 144 Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys 35 40 45 tca agt cag agc ctc tta gat agt gat gga aag aca tat ttg aat tgg 192 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp 50 55 60 ttg tta cag agg cca ggc cag tct cca aag cgc cta atc tat ctg gtg 240 Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val 65 70 75 80 tct aaa ctg gac tct gga gtc cct gac agg ttc act ggc agt gga tca 288 Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 85 90 95 ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat ttg 336 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu 100 105 110 gga gtt tat tat tgc tgg caa ggt aca cat ttt cca ttc acg ttc ggc 384 Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly 115 120 125 tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgt acg gat gct gca cca act gta 432 Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val 130 135 140 tcc 435 Ser 145 <210> 52 <211> 145 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Gly Leu Phe Glu Ala Ala Thr Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Trp Ile Arg Glu Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro 20 25 30 Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys 35 40 45 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp 50 55 60 Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val 65 70 75 80 Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 85 90 95 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu 100 105 110 Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly 115 120 125 Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val 130 135 140 Ser 145 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aca 336 Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr 100 105 110 aag ttg gaa ata aaa cgt acg gat gct gca cca act gta tcc 378 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 115 120 125 <210> 54 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Gly Leu Phe Glu Ala Ala Thr Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Thr Leu 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln 20 25 30 Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln 35 40 45 Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu 50 55 60 Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75 80 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr 100 105 110 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 115 120 125 <210> 55 <211> 438 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(438) <400> 55 atg ggc ttc aag atg gag tca cag gcc cag gtt ctt atg tta ctg ctg 48 Met Gly Phe Lys Met Glu Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu 1 5 10 15 cta tgg gta tct ggt acc tgt ggg gac att gtg atg tca cag tct cca 96 Leu Trp Val Ser Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro 20 25 30 tcc tcc cta gct gtg tca gtt gga gag aag gtt acc atg agc tgc aag 144 Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys 35 40 45 tcc agt cag agc ctt tta tat agg agc aat caa aag aac tac ttg gcc 192 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala 50 55 60 tgg tac cag cag aaa cca ggg cag tct cct aaa ctg ctg att tat tgg 240 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp 65 70 75 80 gcc tcc act agg gaa tct ggg gtc cct gat cgc ttc aca ggc agt gga 288 Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 85 90 95 tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt gtg aag gct gaa gac 336 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp 100 105 110 ctg gca gtt tat tac tgt cag caa tat tat aac tat cct cgg acg ttc 384 Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe 115 120 125 ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgt acg gat gct gca cca act 432 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr 130 135 140 gta tcc 438 Val Ser 145 <210> 56 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Met Gly Phe Lys Met Glu Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Trp Val Ser Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro 20 25 30 Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys 35 40 45 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala 50 55 60 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp 65 70 75 80 Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 85 90 95 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp 100 105 110 Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe 115 120 125 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr 130 135 140 Val Ser 145 <210> 57 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly 20 25 30 Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly 35 40 45 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 58 <211> 145 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Gly Leu Phe Glu Ala Ala Thr Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Trp Ile Arg Glu Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro 20 25 30 Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys 35 40 45 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp 50 55 60 Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val 65 70 75 80 Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 85 90 95 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu 100 105 110 Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly 115 120 125 Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val 130 135 140 Ser 145 <210> 59 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(378) <400> 59 gga ctg ttc gaa gcc gcc acc atg gaa gcc cca gct cag ctc act ttg 48 Gly Leu Phe Glu Ala Ala Thr Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Thr Leu 1 5 10 15 tcg gtt acc att gga caa cca gcc tcc atc tct tgc aag tca agt cag 96 Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln 20 25 30 agc ctc tta gat agt gat gga aag aca tat ttg aat tgg ttg tta cag 144 Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln 35 40 45 agg cca ggc cag tct cca aag cgc cta atc tat ctg gtg tct aaa ctg 192 Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu 50 55 60 gac tct gga gtc cct gac agg ttc act ggc agt gga tca ggg aca gat 240 Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75 80 ttc aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat ttg gga gtt tat 288 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 85 90 95 tat tgc tgg caa ggt aca cat ttt cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca 336 Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr 100 105 110 aag ttg gaa ata aaa cgt acg gat gct gca cca act gta tcc 378 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 115 120 125 <210> 60 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Gly Leu Phe Glu Ala Ala Thr Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Thr Leu 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln 20 25 30 Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln 35 40 45 Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu 50 55 60 Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75 80 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr 100 105 110 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 115 120 125 <210> 61 <211> 145 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Gly Leu Phe Glu Ala Ala Thr Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Trp Ile Arg Glu Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro 20 25 30 Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys 35 40 45 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp 50 55 60 Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val 65 70 75 80 Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 85 90 95 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu 100 105 110 Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly 115 120 125 Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val 130 135 140 Ser 145 <210> 62 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Gly Leu Phe Glu Ala Ala Thr Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Thr Leu 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln 20 25 30 Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln 35 40 45 Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu 50 55 60 Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75 80 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr 100 105 110 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 115 120 125 <210> 63 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Met Gly Phe Lys Met Glu Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Trp Val Ser Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro 20 25 30 Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys 35 40 45 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala 50 55 60 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp 65 70 75 80 Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 85 90 95 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp 100 105 110 Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe 115 120 125 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr 130 135 140 Val Ser 145 <210> 64 <211> 14 <212> PRT <213> Tetanus toxoid <400> 64 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 <210> 65 <211> 21 <212> PRT <213> plasmodium falciparum <400> 65 Asp Ile Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn Ser 20 <210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Streptococcus <400> 66 Gly Ala Val Asp Ser Ile Leu Gly Gly Val Ala Thr Tyr Gly Ala Ala 1 5 10 15 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = cyclohexyalanine, phenylalanine, or tyrosine <221> VARIANT <222> 1, 13 <223> Xaa = D-alanine or L-alanine <223> pan-DR-binding epitope <400> 67 Xaa Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Xaa 1 5 10 <210> 68 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 68 ttttgatcaa gctt 14 <210> 69 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 69 ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc ag 42 <210> 70 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 70 gatcctgccc gg 12 <210> 71 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 71 gtaatacgac tcactatagg gcagcgtggt cgcggccgag 40 <210> 72 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 72 gatcctcggc 10 <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 73 ctaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 74 tcgagcggcc gcccgggcag ga 22 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 75 agcgtggtcg cggccgagga 20 <210> 76 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 76 atatcgccgc gctcgtcgtc gacaa 25 <210> 77 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 77 agccacacgc agctcattgt agaagg 26 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 78 actttgttga tgaccaggat tgga 24 <210> 79 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 79 cagaacttca gcacacacag gaac 24 <210> 80 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG tag <400> 80 gattacaagg atgacgacga taag 24 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 aagctcattc tagcgggaaa t 21 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 aagggacgaa gacgaacacu uctt 24 <210> 83 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 aactgaagac ctgaagacaa taa 23 <210> 84 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Asn Gly Thr Lys 1 <210> 85 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Asn Lys Thr Glu 1 <210> 86 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Ser Arg Lys Asp 1 <210> 87 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Thr Asn Gln Glu 1 <210> 88 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Ser Val Ser Asp 1 <210> 89 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Thr Trp Arg Glu 1 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr 1 5 <210> 91 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Gly Val Ile Ala Ala Ile 1 5 <210> 92 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Gly Thr Ile His Ala Leu 1 5 <210> 93 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Arg Lys Asp Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met Lys Pro Arg 1 5 10 15 Arg <210> 94 <211> 339 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Met Glu Ser Arg Lys Asp Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met 1 5 10 15 Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gln 35 40 45 Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gln His Thr 50 55 60 Gln Glu Leu Phe Pro Gln Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile 65 70 75 80 Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His 85 90 95 Pro Leu Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu 100 105 110 Val Ile Asn Lys Val Leu Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu 115 120 125 Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly 130 135 140 Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr 145 150 155 160 Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala 165 170 175 Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu 180 185 190 Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp 195 200 205 Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile 210 215 220 Val Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser 225 230 235 240 Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Ser Lys 245 250 255 Leu Gly Ile Val Ser Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Leu Ile Phe 260 265 270 Ala Trp Asn Lys Trp Ile Asp Ile Lys Gln Phe Val Trp Tyr Thr Pro 275 280 285 Pro Thr Phe Met Ile Ala Val Phe Leu Pro Ile Val Val Leu Ile Phe 290 295 300 Lys Ser Ile Leu Phe Leu Pro Cys Leu Arg Lys Lys Ile Leu Lys Ile 305 310 315 320 Arg His Gly Trp Glu Asp Val Thr Lys Ile Asn Lys Thr Glu Ile Cys 325 330 335 Ser Gln Leu <210> 95 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Val Asn Asn Ile 1 5 10 <210> 96 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Val Asn Asn Ile 1 5 10 <210> 97 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Val Asn 1 5 10 15 Asn Ile <210> 98 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Ile Ile His Lys Lys Ser Asp Val 1 5 10 15 Pro Glu Ser Leu Trp Asp Pro Cys Leu Thr Arg Phe Lys Gly Leu Asn 20 25 30 Leu Ile Gln Ser 35 <210> 99 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Ile Ile His Lys Lys Ser Asp 1 5 10 15 Val Pro Glu Ser Leu Trp Asp Pro Cys Leu Thr Arg Phe Lys Gly Leu 20 25 30 Asn Leu Ile Gln Ser 35 <210> 100 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Ile Ile 1 5 10 15 His Lys Lys Ser Asp Val Pro Glu Ser Leu Trp Asp Pro Cys Leu Thr 20 25 30 Arg Phe Lys Gly Leu Asn Leu Ile Gln Ser 35 40 <210> 101 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Leu Phe Phe Ala Val Leu His Ala 1 5 10 15 Ile <210> 102 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Thr Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Leu Phe Phe Ala Val Leu His 1 5 10 15 Ala Ile Tyr <210> 103 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Asp Lys Trp Met Leu Thr Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Leu Phe 1 5 10 15 Phe Ala Val Leu His Ala Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro 20 25

Claims (44)

  1. STEAP-1 단백질 (서열 1)과 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체 또는 그의 단편.
  3. 제2항에 있어서, X92.1.30.1.1(1)로 명명되고, ATCC 승인 번호 PTA-5802로 지정된 항체 또는 그의 단편.
  4. 제2항에 있어서, X120.545.1.1로 명명되고, ATCC 승인 번호 PTA-5803으로 지정된 항체 또는 그의 단편.
  5. 제2항에 있어서, 모노클로날 항체가 인간화 항체인 항체 또는 그의 단편.
  6. 제1항에 있어서, 단편이 Fab, F(ab')2, Fv 또는 Sfv 단편인 항체 또는 그의 단편.
  7. 제1항에 있어서, 인간 항체인 항체 또는 그의 단편.
  8. 제1항에 있어서, 항원 결합 부위가 뮤린 항원 결합 도메인인 항체 또는 그의 단편.
  9. 제1항에 있어서, 재조합적으로 생성되는 항체 또는 그의 단편.
  10. 제9항에 있어서, 재조합 단백질이 항원 결합 영역을 포함하는 항체 또는 그의 단편.
  11. 제1항에 있어서, 탐지 가능한 마커, 독소 또는 치료제와 커플링되는 항체 또는 그의 단편.
  12. 제11항에 있어서, 탐지 가능한 마커가 방사성 동위원소, 금속 킬레이트제, 효소, 형광성 화합물, 생물발광성 화합물 또는 화학발광성 화합물인 항체 또는 그의 단편.
  13. 제12항에 있어서, 방사성 동위원소가 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 186Re, 211At, 125I, 188Re, 153Sm, 213Bi, 32P, 또는 Lu를 포함하는 것인 항체 또는 그의 단편.
  14. 제11항에 있어서, 독소가 리신, 리신 A-쇄, 독소루비신, 다우노루비신, 마이탄시노이드, 탁솔, 에티듐 브로마이드, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 디히드록시 안트라신 디온, 악티노마이신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소 (PE) A, PE40, 아브린, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 겔로닌, 미토겔린, 레트스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 쿠리신, 크로틴, 칼리케아미신, 사파오나리아 오피시날리스 (Sapaonaria officinalis) 억제제, 글루코코르티코이드, 아우리스타틴, 아우로마이신, 이트륨, 비스무트, 콤브레스타틴, 두오카르마이신, 돌로스타틴, cc1065, 또는 시스플라틴을 포함하는 것인 항체 또는 그의 단편.
  15. 제1항에 있어서, 항원 결합 부위가 도 2 중의 단백질 (서열 2 내지 35)의 아미노산 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편.
  16. 제2항의 모노클로날 항체를 생산하는 트랜스제닉 동물.
  17. 제2항의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
  18. 제2항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 단일쇄인 벡터.
  20. 제1항의 항체 또는 그의 단편을 인간 단위 투여형으로 포함하는 제약 조성물.
  21. 특정 생물학적 샘플을 제1항의 항체와 접촉시키고; 이러한 샘플 중에서 STEAP-1 단백질 (서열 1)의 결합을 탐지하는 것을 포함하여, 상기 생물학적 샘플 중에서 STEAP-1 단백질의 존재를 탐지하기 위한 검정.
  22. STEAP-1 단백질과 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 단일쇄 모노클로날 항체를 코딩하는 벡터를 특정 대상체에게 투여하여, 이러한 벡터가 단일쇄 모노클로날 항체 코딩 서열을 암 세포에 전달하도록 하고, 코딩된 단일쇄 항체가 그 내부에서 세포내적으로 발현되도록 하는 것을 포함하는, 상기 대상체에게서 STEAP-1 (서열 1)을 발현하는 세포의 성장을 억제시키는 방법.
  23. 제1항의 항체 또는 그의 단편과 접합된 세포독성제 또는 진단제를 제공하여, 항체-작용제 또는 단편-작용제 접합체를 형성시키는 단계; 및
    STEAP-1 단백질을 발현하는 세포를, 상기 항체-작용제 또는 단편-작용제 접합체에 노출시키는 단계
    를 포함하는, STEAP-1 단백질을 발현하는 세포에 세포독성제 또는 진단제를 전달하 는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 세포독성제 또는 진단제가 탐지 가능한 마커, 독소 및 치료제로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 탐지 가능한 마커가 방사성 동위원소, 금속 킬레이트제, 효소, 형광성 화합물, 생물발광성 화합물 또는 화학발광성 화합물인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 방사성 동위원소가 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 186Re, 211At, 125I, 188Re, 153Sm, 213Bi, 32P, 또는 Lu를 포함하는 것인 방법.
  27. 제24항에 있어서, 독소가 리신, 리신 A-쇄, 독소루비신, 다우노루비신, 마이탄시노이드, 탁솔, 에티듐 브로마이드, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 디히드록시 안트라신 디온, 악티노마이신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소 (PE) A, PE40, 아브린, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 겔로닌, 미토겔린, 레트스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 쿠리신, 크로틴, 칼리케아미신, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 글루코코르티코이드, 아우리스타틴, 아우로마이신, 이트륨, 비스무트, 콤브레스타틴, 두오카르마이신, 돌로스타틴, cc1065, 또는 시스플라틴을 포함하는 것인 방법.
  28. 생물학적 샘플 및 대조군 샘플을 제공하는 단계;
    이러한 생물학적 샘플 및 대조군 샘플을, STEAP-1 단백질과 특이적으로 결합하는 제1항의 항체와 접촉시키는 단계; 및
    생물학적 샘플 및 대조군 샘플에 존재하는 항체 및 STEAP-1 단백질과의 복합체 양을 결정하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 샘플 중에서 STEAP-1 단백질 (서열 1)을 탐지하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 표 I에 열거된 암을 갖고 있거나 또는 이러한 암을 갖고 있는 것으로 의심되는 환자로부터 생물학적 샘플 및 대조군 샘플을 취하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  30. 도 2에 제시된 단백질 또는 그의 아서열을 코딩하는 핵산에 상응하는 STEAP-1 siRNA (이중 가닥 RNA)를 포함하는 조성물로서, 이러한 아서열이 길이가 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 연속된 RNA 뉴클레오티드이고, mRNA 코딩 서열의 적어도 일부와 상보적 및 비-상보적인 서열을 함유하는 조성물.
  31. (a) (i) 서열 1의 뉴클레오티드 서열;
    (ii) 도 3에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
    (iii) 도 3에 제시된 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
    (iv) (i), (ii) 또는 (iii)의 뉴클레오티드 서열의 단편
    으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 시스템에 특정 분자를 도입하거나; 또는 (i), (ii), (iii) 또는 (iv)의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질을 포함하는 시스템에 시험 분자를 도입하는 단계; 및
    (b) 상기 분자와 뉴클레오티드 서열 또는 단백질 간에 상호작용이 존재 또는 부재하는 지를 결정함으로써, 상기 분자와 뉴클레오티드 서열 또는 단백질 간에 상호작용이 존재하면, 이러한 분자를 세포 증식을 조정하는 분자로서 확인 (동정)하는 단계
    를 포함하는, 세포 증식을 조정하는 분자를 확인하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 시스템이 생체내인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 시스템이 시험관내인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 분자가, (i), (ii), (iii) 또는 (iv)의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질과 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것인 방법.
  35. 제31항에 있어서, 분자가, 도 2에 제시된 단백질 또는 그의 아서열을 코딩하는 핵산에 상응하는 STEAP-1 siRNA (이중 가닥 RNA)를 포함하는 조성물 (상기 아서열은 길이가 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 연속된 RNA 뉴클레오티드이고, mRNA 코딩 서열의 적어도 일부와 상보적 및 비-상보적인 서열을 함유한다)인 것인 방법.
  36. 제31항의 방법에 의해 확인된 분자를, 암이 있는 것으로 진단된 대상체에게 투여함으로써, 이러한 분자가 상기 대상체에게서 암을 억제하거나 지연시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에게서 암을 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 암이 표 I에 기재된 암인 방법.
  38. (a) (i) 서열 1의 뉴클레오티드 서열;
    (ii) 도 3에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
    (iii) 도 3에 제시된 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
    (iv) (i), (ii) 또는 (iii)의 뉴클레오티드 서열의 단편
    으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함 하는 시스템에 특정 분자를 도입하거나; 또는 (i), (ii), (iii) 또는 (iv)의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질을 포함하는 시스템에 시험 분자를 도입하는 단계; 및
    (b) 상기 분자와 뉴클레오티드 서열 또는 단백질 간에 상호작용이 존재 또는 부재하는 지를 결정함으로써, 상기 분자와 뉴클레오티드 서열 또는 단백질 간에 상호작용이 존재하면, 이러한 분자를 표 I에 열거된 조직의 암을 치료하기 위한 치료제로서 확인 (동정)하는 단계
    를 포함하는, 표 I에 열거된 암을 치료하기 위한 치료제를 확인하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 시스템이 시험관내인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 시스템이 생체내인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 분자가, (i), (ii), (iii) 또는 (iv)의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질과 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 분자가, 도 2에 제시된 단백질 또는 그의 아서열을 코딩하는 핵산에 상응하는 STEAP-1 siRNA (이중 가닥 RNA)를 포함하는 조성물 (상기 아서열은 길이가 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 연속된 RNA 뉴클레오티드이고, mRNA 코딩 서열의 적어도 일부와 상보적 및 비-상보적인 서열을 함유한다)인 것인 방법.
  43. 제38항의 방법에 의해 확인된 분자를, 암이 있는 것으로 진단된 대상체에게 투여함으로써, 이러한 분자가 상기 대상체에게서 암을 억제하거나 지연시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에게서 암을 치료하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 암이 표 I에 기재된 암인 방법.
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