KR20060041416A

KR20060041416A - 고정화된 금속-리간드 복합체에 의한 세포 용해 방법

Info

Publication number: KR20060041416A
Application number: KR1020040090497A
Authority: KR
Inventors: 유창은; 김준호; 황규연; 임희균; 이헌주; 마수민; 허남; 이수석
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2004-11-08
Filing date: 2004-11-08
Publication date: 2006-05-12
Anticipated expiration: 2024-11-08
Also published as: US7648838B2; US20060099711A1; KR100612869B1

Abstract

본 발명은 고체 지지체 상에 금속-리간드 복합체를 고정시키는 단계; 및 상기 지지체 상에 고정된 복합체와 세포 또는 바이러스 용액을 혼합하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 용해 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 고체 지지체에 화학 물질을 고정화시켜 세포 용해를 수행함으로써, 세포 용해 용액 첨가에 따른 희석 문제를 해소할 수 있으며, 또한 별도의 화학 물질의 제거 공정이 필요 없어 LOC 구현시 단계를 줄일 수 있다. 또한, 칩, 비드, 나노입자 등과 같은 다양한 종류의 고체 지지체를 사용할 수 있기 때문에 여러 가지 형태의 세포 용해 장치의 제작이 가능하다.

Description

고정화된 금속-리간드 복합체에 의한 세포 용해 방법{Cell lysis method by immobilized metal-ligand complex}

도 1 은 일례로 기판 상에 Cu-시클렌(1,4,7,11-테트라아자시클로도데칸) 복합체를 고정화시키는 과정을 나타낸 것이다.

도 2 는 일례로 폴리스티렌 비드 상에 Cu-시클렌 복합체를 고정화시키는 과정을 나타낸 것이다.

도 3 은 pH 7 및 9 에서 슬라이드 글라스 상에 고정화된 Cu-시클렌 복합체 처리 후의 세포 생존능을 보여준다.

도 4 는 pH 7 에서 폴리스티렌 비드 상에 고정화된 Cu-시클렌 복합체 처리 후의 세포 생존능을 보여준다.

도 5 는 시료 제조 방법에 따른 PCR 결과를 Ct 로 나타낸 것이다.

도 6은 시료 제조 방법에 따라 PCR 에 의해 증폭된 DNA의 농도를 나타낸 것이다.

도 7은 세포와 상호작용을 할 수 있는 카르복시기가 도입된 유리 기판에 대장균 용액을 적용하고, 염색하여 기판 표면에 결합되어 있는 세포를 관찰한 사진이다.

본 발명은 고정화된 금속-리간드 복합체에 의한 세포 용해 방법에 관한 것이다.

세포로부터 DNA의 분리 방법은 DNA를 결합하는 경향을 갖는 물질을 이용하여 수행되었다. DNA의 분리를 위한 물질의 예는 실리카, 유리섬유, 음이온교환수지, 및 자성 비드이다(Rudi, K. 등, Biotechniqures 22, 506-511 (1997); 및 Deggerdal, A. 등, Biotechniqures 22, 554-557 (1997)). 수작업 단계를 피하고, 작업자 오차를 제거하기 위해, 몇 가지 자동화 기계가 대량 DNA 추출을 위해 개발되었다.

세포 용해는 통상적으로 기계적, 화학적, 열적, 전기적, 초음파 및 마이크로웨이브 방법으로 수행된다 (Michael T. Taylor 등, Anal.Chem., 73, 492-496 (2001)).

가열은 세포벽 또는 세포막을 파괴하는 대안적인 방법이다. 간단한 가열의 단점은 방출된 DNA 에 부착될 수 있는 단백질을 변성시킨다는 것이다. 이들은 DNA 증폭을 방해할 수 있다. 물리적인 방법은 부피가 크고, 비싼 압력 장치를 이용하는데, 이는 LOC (Lab-on-a-Chip) 적용에 적합하지 않다.

초음파처리는 대안적인 물리적 방법인데, 세포 용액 또는 현탁액을 초음파 수조에 위치한 챔버내에 위치한다. 초음파 파괴는 세포 용해에서 많은 단점을 가진다. 우선, 초음파의 에너지 분포는 균일하지 않다. 초음파 에너지의 불균일한 분포는 또한 일관성 없는 결과를 초래한다. 두번째로, 초음파 수조는 용기에 에너지를 집중시키지 못하므로, 세포의 파괴를 완성하는데 종종 수 분이 소요된다. 마지막으로, 초음파 방법은 인간 귀에 불쾌한 소리를 가진다.

화학적 방법은 세포를 파괴하고 DNA 를 방출하기 위해 용해제를 포함한다. 용해제는 세제(detergent), 알칼리 처리, 카오트로픽 물질(chaotropic agent) 등이 있다.

세제는 지질 이중층을 파괴하여 세포의 내용물을 방출시키며, 막 단백질을 용해하는데, 이는 동물 세포를 용해하기 위해 가장 일반적으로 사용되며, 많은 세제는 단백질을 변성시킨다. 그러나, 세포 용해 용액의 첨가가 필요하며, 후속 제거공정이 필요하며, 기포가 발생하는 문제점이 있으므로, LOC 구현에는 적합하지 않다.

알칼리 처리는 세포막의 인지질 및 단백질 성분을 가용화하는데, 이는 용이하고, 저렴한 화학적 세포 용해 방법이며, 세포로부터 DNA를 수득하기 위한 빠르고, 신뢰성이 있으며, 비교적 깨끗한 방법이다. 그러나, 세포 용해를 위해 알칼리 용해 용액을 첨가해야 하고, 또한, DNA 안정화 및 다음 공정 적용을 위해 용해 후 중화 과정이 필요하므로, LOC 구현시 단계가 증가하며, 첨가한 용액만큼 희석되는 문제가 있다.

카오트로픽 물질은 소수성 상호작용을 파괴하는 능력을 가지므로 단백질을 변성시키나, DNA 또는 RNA 를 변성시키지는 않는다. 그러나, 세포 용해 용액의 첨가가 필요하며, 물질 자체가 매우 독성이 있으며, PCR 저해제로서 작용하기 때문에 후속 제거공정이 필요하다는 문제점이 있으므로, LOC 구현에는 적합하지 않다.

따라서, 기존의 화학적 용해 방법의 가장 큰 문제점은 용해 시약이 첨가됨으로써 용액이 희석되어 부피가 증가하고, 또한 용해가 완료된 후에 이들 시약을 제거하기 위해 별도의 제거 공정이 추가되어야 한다는 것이다.

미국 특허 제 5,304,487 호에는 세포를 기계적으로 용해하기 위해 마이크로채널 내에 물리적인 돌출(protrusion) 또는 챔버 또는 채널 내에 예리한 날(sharp edged)의 입자를 이용한 것이 기재되어 있다. 그러나, 고체 지지체에 대한 기재는 있으나, 금속-리간드 복합체를 고체 지지체에 고정하여 세포를 용해하는 방법에 대한 기재는 없다.

본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술을 바탕으로 세포 또는 바이러스의 용해 방법을 연구하던 중, 고체 표면상에 세포 용해 능력이 있는 물질을 고정화함으로써 용해 용액 첨가에 따른 희석 문제를 해소할 수 있으며, 또한 별도의 시약의 제거 공정이 필요 없어 LOC 구현에 적합하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 세포 용해시, 희석에 의한 용액의 부피 증가를 막고, 용해 후 세포 용해 물질의 제거 과정이 필요 없이 바로 PCR 과정을 수행함으로써 LOC 구현시 단계를 단축할 수 있는 고정화된 금속-리간드 복합체에 의한 세포 용해 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

고체 지지체 상에 금속-리간드 복합체를 고정시키는 단계; 및

상기 지지체 상에 고정된 복합체와 세포 또는 바이러스 용액을 혼합하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 용해 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서, 상기 고체 지지체는 슬라이드 글라스, 실리콘 웨이퍼, 자성 비드, 폴리스티렌, 막, 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 금속-리간드 복합체의 금속이 Cu(II), Co(III), Ni(II), Zn(II), Fe(III)과 같은 전이금속 이온으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 금속-리간드 복합체의 리간드가 시클렌과 같은 고리형 폴리아민 화합물, 트리스-(2-아미노에틸아민)과 같은 사슬형 폴리아민 화합물, EDTA와 같은 폴리 카르복시 화합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 혼합 단계는 상기 혼합물을 진동시키는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 진동은 초음파세척기, 자기장을 이용한 진동기, 전기장을 이용한 진동기 및 기계적 진동기로 구성된 군으로부터 선택되는 진동기에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

고체 지지체 상에 금속-리간드 복합체를 고정시키는 단계;

상기 고체 지지체 상에 세포 또는 바이러스와 상호작용할 수 있는 화학물질 을 고정시키는 단계; 및

상기 복합체 및 화학물질이 고정된 지지체와 세포 또는 바이러스 용액을 혼합하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 용해 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서, 상기 화학물질은 소수성기, 친수성기 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 작용기를 갖는 화합물일 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 친수성기는 카르복실산, 술폰산, 아민 및 구아니딘으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 소수성기는 지방족 탄소 사슬 또는 방향족 고리일 수 있다.

이하, 본 발명을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

고체 지지체 상에 금속-리간드 복합체를 고정화시키는 단계; 및

상기 지지체 상에 고정된 복합체와 세포 또는 바이러스 용액을 혼합하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 용해 방법에 관한 것이다.

본 발명은 금속-리간드 복합체를 기판 또는 비드와 같은 고체 지지체에 고정화시키면, 고정된 금속-리간드 복합체의 금속이온에 물이 배위된 후 이 물이 수산화이온으로 활성화되고, 상기 수산화이온이 배위 결합된 복합체에 세포 또는 바이러스 용액을 혼합하면 결합된 수산화이온이 용액 중의 세포 또는 바이러스를 용해하는 것이다.

금속-리간드 복합체를 고체 지지체에 고정화시키는 기술은 공지된 기술로서, 고체 지지체로서 유리 기판을 이용한 기술을 예로 들 수 있다. 도 1 은 일례로 유리 기판 상에 Cu-시클렌 복합체를 고정화시키는 과정을 나타낸 것이다. 먼저 기판 상에 리간드인 시클렌을 처리하면, 물이 탈수되면서 시클렌이 상기 기판에 결합된다. 여기에, 염산 및 디이소프로필에틸아민(DIEA)을 첨가하여 보호기인 boc 를 제거하고, CuCl₂ 를 첨가하면 Cu-시클렌 복합체가 완성된다.

금속-리간드 복합체를 고체 지지체에 고정화시키는 공지된 기술로서, 고체 지지체로서 비드를 이용한 기술을 예로 들 수 있다. 도 2 는 일례로 스티렌 비드 상에 Cu-시클렌 복합체를 고정화시키는 과정을 나타낸 것이다. 평평한 기판 상에 금속-리간드 복합체를 고정화시키는 경우에는 표면적이 작기 때문에 도입된 금속-리간드 복합체의 양이 적을뿐만 아니라 세포 또는 바이러스와의 접촉도 한계가 있다. 따라서, 금속-리간드 복합체를 비드에 고정화함으로써, 기판을 사용하는 경우에 비해 금속-리간드 복합체의 도입량을 증가시킬 수 있으며, 고체 지지체와 세포의 접촉 면적을 증가시킬 수 있다. 고정화 방법은 도 2에 보여준 바와 같이, 먼저 스티렌 비드 상에 리간드인 시클렌, 디이소프로필에틸아민(DIEA)을 녹인 디메틸포름아미드(DMF)를 첨가하면, 시클렌이 결합된다. 여기에, CuCl₂ 를 첨가하면 Cu-시클렌 복합체가 완성된다.

고체 지지체 상에 금속-리간드 복합체가 고정되면, 여기에 세포 또는 바이러스 용액을 첨가하게 된다. 첨가된 세포 또는 바이러스 용액이 금속-리간드 복합체와 접촉하게 되면, 금속 이온에 배위 결합된 수산화이온이 활성 자리로 작용하여 세포를 용해하는 것이다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 고체 지지체는 슬라이드 글라스, 실리콘 웨이퍼, 자성 비드, 폴리스티렌, 막, 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 고체 지지체는 금속-리간드 복합체가 고정될 수 있는 것이면 어느 것이라도 가능하나, 물에 용해되지 않는 특성을 가져야 한다. 만약 물에 용해된다면 세포 용해 후에 핵산 함유 용액과 고체 지지체를 분리하기가 어렵기 때문이다. 또한, 상기 고체 지지체는 표면적이 넓은 것이 금속-리간드 복합체를 많이 결합할 수 있어서 바람직할 수 있으며, 표면적을 넓히기 위해 글라스나 웨이퍼 같은 평평한 지지체의 경우 기둥(pillar) 형태로 표면을 가공하는 것도 가능하다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 금속-리간드 복합체의 금속이 Cu(II), Co(III), Ni(II), Zn(II), Fe(III)과 같은 전이금속 이온으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 리간드와 복합체를 형성할 수 있는 금속이면 어느 것이라도 가능하다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 금속-리간드 복합체의 리간드가 시클렌과 같은 고리형 폴리아민 화합물, 트리스-(2-아미노에틸아민)과 같은 사슬형 폴리아민 화합물, EDTA와 같은 폴리 카르복시 화합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 리간드는 비공유 전자쌍을 가지고 있는 화합물로서, 착화합물 속에서 중심원자에 결합되어 있는 이온 또는 분자를 총칭하며, 배위자라고도 한다. 예를 들면, ［Co(NH₃)₆]Cl₃, K₃[FeCl₆], [Cu(NH₂CH₂COO)₂］등에 있어서 NH₃, Cl^-, NH₂CH ₂COO^- 등은 각각 중심원자인 Co³⁺, Fe³⁺, Cu²⁺ 등과 결합된 이온 또는 분자로서 리간드이다. 리간드는 단원자이온 또는 다원자단의 어느 것이라도 가능하다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 혼합 단계는 상기 혼합물을 진동시키는 것을 포함할 수 있다. 세포 또는 바이러스 용액과 금속-리간드 복합체를 혼합한 상태로 정치하면, 상기 용액 중의 세포 또는 바이러스의 움직임이 적어지게 되어 세포 용액과 복합체의 접촉 기회가 감소한다. 따라서, 상기 용액과 상기 복합체의 접촉 기회를 증가시키기 위해 진동이 필요한 것이다. 상기 진동은 초음파세척기, 자기장을 이용한 진동기, 전기장을 이용한 진동기, 및 기계적 진동기로 구성된 군으로부터 선택되는 진동기에 의해 수행될 수 있다. 상기 용액 및/또는 상기 복합체를 진동시킬 수 있으면 어느 장치라도 가능하다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

고체 지지체 상에 금속-리간드 복합체를 고정시키는 단계;

상기 고체 지지체 상에 세포 또는 바이러스와 상호작용할 수 있는 화학물질을 고정시키는 단계; 및

금속-리간드 복합체와 세포 또는 바이러스 용액을 혼합하여 세포 또는 바이러스를 용해하기 위해서는, 세포 또는 바이러스와 고체 지지체에 고정화된 상기 복합체가 접촉해야 한다. 세포 또는 바이러스와 상기 복합체의 접촉은 세포 또는 바이러스와 상호작용할 수 있는 화학물질을 고정화시킴으로써 촉진될 수 있다. 상기 세포 또는 바이러스와 상호작용할 수 있는 물질은 세포 또는 바이러스를 상기 복합 체가 고정화되어 있는 고체 지지체 표면쪽으로 끌어당기는 역할을 하므로 상기 복합체에 접촉 기회를 증가시키는 기능을 하는데, 이러한 접촉 기회의 증가에 의해 세포 또는 바이러스의 용해는 증가하는 것이다. 세포 또는 바이러스와 상기 화학물질의 상호작용은 소수성 상호작용, 정전기적 상호작용, 수소 결합 등에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 화학물질은 소수성기, 친수성기 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 작용기를 갖는 화합물일 수 있다. 소수성기를 갖는 화합물은 세포 또는 바이러스와 소수성 상호작용 등을 통해 세포 또는 바이러스와 상호작용할 수 있으며, 친수성기를 갖는 화합물은 세포 또는 바이러스와 전기적 상호작용, 수소 결합 등을 통해 상호작용할 수 있다. 소수성기를 갖는 화합물은 사슬형 탄소화합물 및 방향족 탄소화합물 등이 있으며, 친수성기를 갖는 화합물은 아미노산 유도체 등이 있다. 또한, 바이러스와 상호작용할 수 있는 화학물질은 바이러스 수용체, 바이러스 표면 항원에 대한 항체 등이 있을 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 친수성기는 카르복실산, 술폰산, 아민, 및 구아니딘으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 카르복실산, 술폰산 등의 음전하를 갖는 작용기는 세포 또는 바이러스 표면상의 양전하를 갖는 작용기와 정전기적 상호작용, 수소 결합 등이 가능하며, 아민, 구아니딘 등의 양전하를 갖는 작용기는 세포 또는 바이러스 표면상의 음전하를 갖는 작용기와 정전기적 상호작용, 수소 결합 등이 가능하다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 소수성기는 지방족 탄소 사슬 또는 방향 족 고리일 수 있다. 상기 소수성기를 갖는 화합물은 세포 또는 바이러스 표면상의 소수성기와 소수성 상호작용을 통해 상호작용이 가능하다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 금속-리간드 복합체의 리간드가 시클렌과 같은 고리형 폴리아민 화합물, 트리스-(2-아미노에틸아민)과 같은 사슬형 폴리아민 화합물, EDTA와 같은 폴리 카르복시 화합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 리간드는 비공유 전자쌍을 가지고 있는 화합물로서, 착화합물 속에서 중심원자에 결합되어 있는 이온 또는 분자를 총칭하며, 배위자라고도 한다. 예를 들 면, ［Co(NH₃)₆]Cl₃, K₃[FeCl₆], [Cu(NH₂CH₂COO)₂］등에 있어서 NH₃, Cl^-, NH₂CH ₂COO^- 등은 각각 중심원자인 Co³⁺, Fe³⁺, Cu²⁺ 등과 결합된 이온 또는 분자로서 리간드이다. 리간드는 단원자이온 또는 다원자단의 어느 것이라도 가능하다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 혼합 단계는 상기 혼합물을 진동시키는 것을 포함할 수 있다. 세포 또는 바이러스 용액과 금속-리간드 복합체를 혼합한 상태로 정치하면, 상기 용액 중의 세포 또는 바이러스가 바닥에 가라 앉게 되어 세포 용액과 복합체의 접촉 기회가 감소한다. 따라서, 상기 용액과 상기 복합체의 접촉 기회를 증가시키기 위해 진동이 필요한 것이다. 상기 진동은 초음파세척기, 자기장을 이용한 진동기, 전기장을 이용한 진동기, 및 기계적 진동기로 구성된 군으로부터 선택되는 진동기에 의해 수행될 수 있다. 상기 용액 및/또는 상기 복합체를 진동시킬 수 있으면 어느 장치라도 가능하다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

제조예 1: 기판 상에 금속-리간드 복합체의 고정화

아미노기로 활성화된 기판 상에 금속-리간드 복합체를 고정화하기 위해, γ-아미노프로필실란으로 코팅된 유리 기판을 사용하였다. 상기 유리 기판에 리간드 인 boc(t-부톡시카르보네이트)로 보호된 시클렌 0.5g과 HBTU 0.2g 을 5ml의 DMF에 녹인 후 이 용액을 첨가하여 리간드를 기판에 고정하였다. 이어서, 0.1 M HCl 5ml 을 첨가하여 보호기인 boc를 제거하고 다시 10% 디이소프로필렌아민 용액으로 처리하여 염을 제거하였다. 여기에 CuCl₂ 0.1g을 DMF에 녹인 후 이 용액을 기판에 첨가하여 Cu-시클렌 복합체를 제조하였다.

제조예 2: 비드 상에 금속-리간드 복합체의 고정화

비드 상에 금속-리간드 복합체를 고정하기 위해, 폴리스티렌 비드를 사용하였다. 클로로메틸로 활성화된 폴리스티렌 비드(Aldrich사 제조) 1g 에 리간드인 시클렌을 0.1g, 디이소프로필에틸아민 10㎕ 가 용해된 디에틸포름아미드 10ml 용액을 첨가하여 리간드를 스티렌 비드에 고정하였다. 이어서, CuCl₂ 0.1g을 DMF에 녹인 후 이 용액을 첨가하여 Cu²⁺를 시클렌에 결합시킴으로써 비드상에 고정화된 Cu-시클렌 복합체를 제조하였다.

제조예 3: 박테리아, 프라이머 및 중합효소 연쇄반응

인간 간염 바이러스(HBV) 유전자가 재조합된 플라스미드로 형질전환된 대장균 균주 DH5α(3 ml)를 37℃에서 대수기까지(OD₆₀₀=0.64) LB 배지(Sambrook 등, 1989)에서 호기 조건하에 배양하였다. 박테리아 세포를 원심분리로 수합하고, 3 ml의 인산염 완충액(PBS)으로 2회 세정하였다. 세포를 PBS 에서 재현탁하였다 (세포 밀도; 1 x 10⁶ 세포/ml).

모든 PCR 증폭은 LightCycler 기기 (Roche Diagnostics, Mannheim, 독일)를 이용하여 20㎕ 에서 수행하였으며 정방향 프라이머(서열 번호 1) 및 역방향 프라이머(서열 번호 2)를 이용하여 인간 간염 바이러스(HBV) 게놈의 코아 영역을 증폭하였다. LightCycler 반응의 마스터믹스는 다음과 같이 제조하였다: 2 ㎕ LightCycler 마스터 (Fast start DNA master SYBR Green I; Roche Diagnostics), 3.2㎕ MgCl₂ (5 mM), 1.0㎕ 정방향-역방향 프라이머 혼합물 (1.0 μM), 4.0㎕ UNG (Uracil-N-Glycosylase, 0.2 유닛) 및 4.8㎕ H₂O. 분석할 5㎕ 시료를 상기 혼합물에 첨가하였다. 두 종류의 Taq DNA 중합효소(Roche Hot-start Taq DNA 중합효소 및 Solgent Taq DNA 중합효소)를 LightCycler 마스터를 준비하는데 사용하였다.

Taq DNA 중합효소(Roche Hot-start Taq DNA 중합효소)의 경우에는 50℃에서 10분, 95℃에서 10분 동안 예비변성 후, 35 사이클(95℃에서 5초 동안 변성, 62℃에서 15초 동안 어닐링 및 신장)동안 수행하였고, Taq DNA 중합효소(Solgent)의 경우에는 50℃에서 10분, 95℃에서 1분 동안 예비변성 후, 35 사이클(95℃에서 5초 동안 변성, 62℃에서 15초 동안 어닐링 및 신장)동안 수행하였다.

증폭된 DNA 를 시판되는 DNA 500 분석 규모의 시약 세트를 이용하여 Agilent BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)에서 분석하였다.

제조예 4: 세포 생존능의 측정

생존 세포수를 콜로니를 형성하는 단일 세포의 능력으로 측정하였다. 재조합 대장균 저장 용액 (ATCC #45020) 또는 박테리아 저장 용액을 50 mg/l 암피실린 을 포함하고 있는 LB (10 g/l 트립톤, 5 g/l 효모 추출액, 15 g/l 한천 및 10 g/l NaCl) 한천 플레이트에 분주하였다. 37℃에서 12시간 배양한 후, 콜로니를 한천 플레이트 표면에서 씻어내고 이를 50 mg/l 암피실린을 가진 10ml LB 배지로 옮겼다. 세포를 100ml 진탕 플라스크에 100ml 넣고 37℃, 250rpm 에서 6-8시간동안 배양하였다. 대장균 세포의 진탕 플라스크 배양을을 수행하였다. Gibco (NY, USA)사에서 구입한 1X PBS 로 세포를 세정한 후 재현탁하고, Eppendorf 5810R 원심분리기(Eppendorf AG, Hamburg, 독일)를 이용하여 10분 동안 6,000g, 4℃ 에서 원심분리하였다.

기판 또는 비드를 이용하여 세포를 용해한 후, 용액을 13,200rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 취하고 남은 침전물을 1X PBS 로 재현탁한 후, 한천 플레이트에 분주하고 37℃에서 12시간 배양한 후 콜로니를 관찰하였다.

실시예 1: 기판 상에 고정된 Cu-시클렌 복합체의 세포 용해 효과

기판 상에 고정된 Cu-시클렌 복합체의 세포 용해에 대한 효과를 조사하기 위해, Cu-시클렌 복합체에 상기 제조된 세포 용액(1 x 10⁶ 세포/ml)을 처리하였다. 먼저, 박테리아 세포를 배양한 후, 세포 용액과 PBS 완충액을 1:5 로 혼합하고, 상기 혼합물을 Cu-시클렌 복합체가 고정화되어 있는 기판에 상온에서 60㎕를 적용하였다. 이어서, 50℃에서 20분 동안 진동을 가하면서 pH 7 및 9 에서 처리하여 세포를 용해하였다. 세포 용해 후 용액을 분리하여 원심분리에 의해 세포를 침전시킨 후, 침전된 세포를 재현탁하여 세포 생존능을 조사하였다.

도 3 은 pH 7 및 9 에서 Cu-시클렌 복합체 처리 후의 세포 생존능을 보여준다. 세포를 상기 용해 시간 동안 시클렌의 존재(A 패널), Cu-시클렌 복합체의 존재(B 패널) 및 기판 없이 용액만 존재(C 패널)하에 세포 용해 후에 LB 플레이트 상에 도말하였다. 각 조건에 대해 3중으로 실험하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 생성된 콜로니의 수를 계산하였다.

각 시료의 제조 방법은 하기 표와 같다.

플레이트 번호	기판	pH
4	시클렌	7
5	시클렌	7
6	시클렌	7
7	Cu-시클렌	7
8	Cu-시클렌	7
9	Cu-시클렌	7
13	시클렌	9
14	시클렌	9
15	시클렌	9
16	Cu-시클렌	9
17	Cu-시클렌	9
18	Cu-시클렌	9
19	-	7
20	-	9
21	보일링 용해	-
22	양성 대조군	-

도 3에 보여준 바와 같이, 기판 상에 시클렌만 고정된 경우(A 패널)에는 세포가 거의 용해되지 않았다는 것을 알 수 있다(플레이트 번호 4 내지 6 (pH 7) 및 13 내지 15(pH 9)). 반면에, 기판 상에 Cu-시클렌 복합체가 고정된 경우(B 패널)에는 대부분의 세포가 용해되어 콜로니 수가 현저하게 감소되었다는 것을 알 수 있다(플레이트 번호 7 내지 9 (pH 7) 및 16 내지 18(pH 9)). 또한, 기판 없이 용액만 첨가한 경우(C 패널)에는 세포가 거의 용해되지 않았으며(플레이트 번호 19 및 20), 대조군으로 보일링(95℃ 1분, 40℃ 30초, 5회 반복)에 의해 세포를 용해한 경 우에는 대부분의 세포가 용해됨을 알 수 있다(플레이트 번호 21). 또한, 양성 대조군(플레이트 번호 22)은 상기 과정을 거치지 않고, 세포 저장 용액을 그대로 플레이트에 도말한 것으로 세포가 거의 용해되지 않았다는 것을 알 수 있다. 또한, 처리 완충액의 pH 를 7 또는 9 로 처리한 경우에 양자 사이에 큰 차이는 없는 것으로 보인다.

따라서, 기판 상에 시클렌만 고정되거나 용액만 존재하는 경우에 비해, Cu-시클렌 복합체가 고정된 본 발명의 경우에 세포 용해 효율이 급격하게 증가되는 것을 알 수 있다. 물론, 보일링에 의한 세포 용해도 효율이 높으나, 이는 높은 온도를 요구하기 때문에, 랩온어칩에 적용하기에는 어려움이 있다.

실시예 2: 비드 상에 고정된 Cu-시클렌 복합체의 세포 용해 효과

비드 상에 고정된 Cu-시클렌 복합체의 세포 용해에 대한 효과를 조사하기 위해, Cu-시클렌 복합체에 세포 용액(1 x 10⁶ 세포/ml)을 처리하였다. 먼저, 박테리아 세포를 배양한 후, 세포 배양액을 원액과 1/10 희석액의 두 종류를 준비하였다. 상기 두 종류의 세포 용액과 PBS 완충액을 각각 1:5 로 혼합하고, 상기 혼합물을 Cu-시클렌 복합체가 고정화된 스티렌 비드에 상온에서 60㎕를 적용하였다. 이어서, 50℃에서 15분 동안, pH 7 및 9 에서 5분 간격으로 진동을 가하면서 세포를 용해하였다. 세포 용해 후 원심분리에 의해 세포를 침전시킨 후, 침전된 세포를 재현탁하여 세포 생존능을 조사하였다.

도 4 는 pH 7 에서 Cu-시클렌 복합체 처리 후의 세포 생존능을 보여준다. 세포를 상기 용해 시간 동안 Cu-시클렌 복합체의 존재(A 패널), Cu-시클렌 복합체 없이 비드만 존재(B 패널), 용액만 존재(C 패널) 및 대조군(D 패널)하에 세포 용해 후에 LB 플레이트 상에 도말하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 생성된 콜로니의 수를 계산하였다.

각 시료의 제조 방법은 하기 표와 같다.

플레이트 번호	희석 정도	비드 상태
11	원액	Cu-시클렌-비드
12	1/10	Cu-시클렌-비드
21	원액	비드
22	1/10	비드
31	원액	완충액
32	1/10	완충액
311	원액	대조군
322	1/10	대조군

도 4에 보여준 바와 같이, 비드 상에 Cu-시클렌 복합체가 고정된 경우(A 패널)에는 대부분의 세포가 용해되어 콜로니 수가 현저하게 감소되었다는 것을 알 수 있다(플레이트 번호 11 및 12). 반면에, Cu-시클렌 복합체 고정 없이 비드만 사용한 경우(B 패널)에는 세포가 거의 용해되지 않았다는 것을 알 수 있다(플레이트 번호 21 및 22). 또한, 비드 없이 용액만 첨가한 경우(C 패널)에는 세포가 거의 용해되지 않았으며(플레이트 번호 31 및 32), 대조군으로 상기 과정을 거치지 않고, 세포 저장 용액을 그대로 플레이트에 도말한 것으로 세포가 거의 용해되지 않았다는 것을 알 수 있다.

따라서, 비드만 사용하거나 비드 없이 용액만 존재하는 경우에 비해, Cu-시클렌 복합체가 고정된 본 발명의 경우에 세포 용해 효율이 급격하게 증가되는 것을 알 수 있다.

실시예 3: 비드 상에 고정된 Cu-시클렌 복합체의 DNA 방출 효과

비드 상에 고정된 Cu-시클렌 복합체가 세포로부터 DNA 를 효율적으로 방출시키는지를 알아보기 위해, 세포 용해물로부터 PCR 을 이용하여 용해물 중에 존재하는 DNA 의 양을 조사하였다. 실시예 1 및 2에 기재된 방법에 의해 세포를 용해한 후, 상등액을 이용하여 실시간 PCR 을 수행하였다. 도 5 는 시료 제조 방법에 따른 PCR 결과를 Ct 로 나타낸 것이다. A 는 세포 배양 원액을 사용한 결과이고, B 는 세포 배양액의 1/10 희석액을 사용한 결과이다. PCR 결과를 Ct(Count of thereshold)로서 나타내었는데, Ct는 실시간 PCR 반응에서 최초의 형광 신호가 나타나는 사이클 수를 말하며, PCR 반응에서 초기 주형 DNA 분자수가 많을수록 Ct는 낮게 나오고, DNA 분자수가 적을수록 Ct는 높게 나온다. 도 5에 보여주는 바와 같이, Cu-시클렌-비드를 사용하는 본 발명의 경우에 Cu-시클렌이 고정되지 않은 비드를 사용하는 경우나 비드 없이 완충액만 사용하는 경우나 대조군으로서 세포 저장 용액을 그대로 사용하는 경우에 비해 Ct 값이 매우 낮다는 것을 알 수 있다. 또한, 1/10 희석액(B)의 경우에는 Ct 값에 큰 차이는 없지만, 본 발명의 경우에 다른 시료 제조 방법에 비해 Ct 값이 상대적으로 낮다는 것을 알 수 있다.

상기 Ct 값이 원하는 PCR 생성물의 생성과 직접적인 연관이 있는지를 알아보기 위해, 즉, 원하는 PCR 생성물이 많이 생성되어 Ct 값이 낮게 나왔는지를 확인하기 위해, 원하는 PCR 생성물의 농도를 측정하였다. 도 6은 시료 제조 방법에 따라 PCR 에 의해 증폭된 DNA의 농도를 나타낸 것이다. A 는 세포 배양 원액을 사용한 결과이고, B 는 세포 배양액의 1/10 희석액을 사용한 결과이다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. PCR 생성물의 양은 Agilent BioAnalyzer 2100 의 사용으로 정량화되었다. 도 6에 보여주는 바와 같이, 세포 배양 원액(A) 및 1/10 희석액(B) 모두, Cu-시클렌-비드를 사용하는 본 발명의 경우에 Cu-시클렌이 고정되지 않은 비드를 사용하는 경우나 비드 없이 완충액만 사용하는 경우나 대조군으로서 세포 저장 용액을 그대로 사용하는 경우에 비해 PCR 생성물 양이 상대적으로 많다는 것을 알 수 있다.

따라서, 상기 결과로부터 Cu-시클렌-비드를 사용하는 본 발명의 경우에 다른 방법에 비해 세포 용해에 의한 초기 DNA 의 농도가 높다는 것을 의미하며, 이는 세포가 효율적으로 용해되었다는 것을 의미하는 것이다.

실시예 4: 카르복시기가 도입된 유리 기판과 세포와의 상호작용

카르복시기가 도입된 유리 기판과 세포와의 상호작용을 알아보기 위해, 대장균 세포를 이용하였다. 도 7은 세포와 상호작용을 할 수 있는 카르복시기가 도입된 유리 기판에 대장균 용액을 60㎕ 적용하고, 당업계에 공지된 대장균 염색용 염료로 염색하여 기판 표면에 결합되어 있는 세포를 관찰한 사진이다. 도 7에 보여주는 바와 같이, 카르복시기가 도입되어 있는 유리 기판 표면에 세포가 붙어있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 카르복시기와 Cu-시클렌 복합체를 유리 기판 또는 비드에 동시에 도입하면 세포와 카르복시기의 상호 작용에 의해 세포가 표면쪽으로 더 잘 끌려오므로, Cu-시클렌과 세포의 반응기회가 증가하기 때문에 더 높은 세포 용해 효율을 보여 줄 것으로 예상된다.

본 발명에 따르면, 고체 지지체에 화학 물질을 고정화시켜 세포 용해를 수행함으로써, 세포 용해 용액 첨가에 따른 희석 문제를 해소할 수 있으며, 또한 별도의 화학 물질의 제거 공정이 필요 없어 LOC 구현시 단계를 줄일 수 있다. 더욱이, 비교적 마일드한 조건(pH 7.0, 50℃)에서 세포 용해를 수행할 수 있으며, 화학 물질의 변화를 통하여 단백질 분해 등과 같은 세포 용해 이외의 다른 화학 반응에도 응용이 가능하다. 또한, 칩, 비드, 나노입자 등과 같은 다양한 종류의 고체 지지체를 사용할 수 있기 때문에 여러 가지 형태의 세포 용해 장치의 제작이 가능하다.

<110> Samsung Electronics Co, Ltd. <120> Cell lysis method by immobilized metal-ligand complex <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 agtgtggatt cggcactcct 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gagttcttct tctaggggac ctg 23

Claims

하기 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 용해 방법:

고체 지지체 상에 금속-리간드 복합체를 고정화시키는 단계; 및

상기 지지체 상에 고정된 복합체와 세포 또는 바이러스 용액을 혼합하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 슬라이드 글라스, 실리콘 웨이퍼, 자성 비드, 폴리스티렌, 막, 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 금속-리간드 복합체의 금속이 Cu(II), Co(III), Ni(II), Zn(II), 및 Fe(III)과 같은 전이금속 이온으로 구성된 군으로부터 선택되 는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 금속-리간드 복합체의 리간드가 시클렌과 같은 고리형 폴리아민 화합물, 트리스-(2-아미노에틸아민)과 같은 사슬형 폴리아민 화합물, 및 EDTA와 같은 폴리 카르복시 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 혼합 단계는 상기 혼합물을 진동시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 진동은 초음파세척기, 자기장을 이용한 진동기, 전기장을 이용한 진동기, 및 기계적 진동기로 구성된 군으로부터 선택되는 진동기에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
하기 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 용해 방법:

고체 지지체 상에 금속-리간드 복합체를 고정화시키는 단계;

상기 고체 지지체 상에 세포 또는 바이러스와 상호작용할 수 있는 화학물질을 고정시키는 단계; 및

상기 복합체 및 상기 화학물질이 고정된 지지체와 세포 또는 바이러스 용액을 혼합하는 단계.
제 7 항에 있어서, 상기 화학물질은 소수성기, 친수성기 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 친수성기는 카르복실산, 술폰산, 아민, 및 구아니딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
제 8 항에 있어서, 상기 소수성기는 지방족 탄소 사슬 또는 방향족 고리인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 슬라이드 글라스, 실리콘 웨이퍼, 자성 비드, 폴리스티렌, 막, 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 금속-리간드 복합체의 금속이 Cu(II), Co(III), Ni(II), Zn(II), 및 Fe(III)과 같은 전이금속 이온으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 금속-리간드 복합체의 리간드가 시클렌과 같은 고리형 폴리아민 화합물, 트리스-(2-아미노에틸아민)과 같은 사슬형 폴리아민 화합물, 및 EDTA와 같은 폴리 카르복시 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 혼합 단계는 상기 혼합물을 진동시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 진동은 초음파세척기, 자기장을 이용한 진동기, 전기장을 이용한 진동기, 및 기계적 진동기로 구성된 군으로부터 선택되는 진동기에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.