KR20060008643A

KR20060008643A - 효소적 방법에 의한 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤의 제조 방법

Info

Publication number: KR20060008643A
Application number: KR1020040057426A
Authority: KR
Inventors: 황순욱; 유혜연; 정선호; 이태임
Original assignee: 엔자이텍 주식회사
Priority date: 2004-07-23
Filing date: 2004-07-23
Publication date: 2006-01-27
Also published as: KR100657204B1

Abstract

본 발명은 하기 [반응식 1]에서 일반식 1로 표시되는 라세믹 4-클로로-3-히드록시부틸산 알킬 에스테르(4-chloro-3-hydroxybutyric acid alkyl ester)로 부터 효소적 방법에 의해 일반식 3으로 표시되는 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤(3-hydroxy-r-butyrolactone)의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 수용액상 또는 수용액을 포함하는 용매상에서 반응물인 라세믹 4-클로로-3-히드록시부틸산 알킬 에스테르를 리파제 또는 리파제 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 입체 선택적으로 가수분해 반응하여 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 기존에 보고된 방법들에 비해 공정이 쉽고, 분리 및 회수가 간편하여 실제 공정에 유용할 것으로 판단된다.

메틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트, 에틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트, 부틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트, 3-히드록시-감마-부티로락톤, 리파제, 가수분해반응, 광학활성

Description

효소적 방법에 의한 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤의 제조 방법 {The method of making optically active 3-hydroxy-r-butyrolactone by enzymatic method}

본 발명은 라세믹 4-클로로-3-히드록시부틸산 알킬 에스테르 (ethyl 4-chloro-3-hydroxybutyric acid alkyl ester)로 부터 효소적 방법에 의해 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 수용액상에서 리파제 또는 리파제 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 [반응식 1]에서 일반식 1로 표시되는 라세믹 4-클로로-3-히드록시부틸산 알킬 에스테르를 입체 선택적으로 가수분해 반응하여 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기에서 언급한 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤은 L-카르니틴(L-carnitine), 감마-아미노-베타-히드록시부틸산 (r-amino-beta-hydroxybutyric acid), 고지혈증 치료제, 에이즈 치료제 등의 의약품 중간체나 농약 중간체로서 활용범위가 넓다. 또한 본 발명에 의한 제조방법은 기존의 방법에 비해 간편하고, 반응 후 분리 및 회수가 쉽기 때문에 실제 공정에 유리하게 이용될 수 있다.

현재까지 보고된 (S)-3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 기술은 다음과 같다.

Yuasa등 (Liebigs Ann. IRecueil. 1997, 1877-1879)은 에틸 4-클로로-3-옥소부타노에이트(ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate)를 Ru-(R)-p-tolyl-BINAP촉매를 이용하여 94%ee 광학순도를 갖는 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부타노에이트(ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate)를 합성하고 여기에 염산을 처리하여 (S)-3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하였다. 이때 수율은 83%이었고, 광학순도는 유지가 되었다. 하지만 상기의 공정은 (S)-에틸 4-클로로-3-히드록시부타노에이트의 광학순도에 따라 (S)-3-히드록시-감마-부티로락톤의 품질이 결정되어지며 실제 공정에 적용하기는 어렵다.

Suzuki등(Enzyme Microbiology and Technology, 1999, 24. 13-20)은 탈염소화능을 갖는 미생물을 이용하여 라세믹 에틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트로 부터 99.8%ee의 광학순도를 갖는 (R)-에틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트와 92.4%ee의 광학순도를 갖는 (S)-3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하였다.

한편, 천종필등(특10-0310935, 미국특허 제6,122,122호)은 아밀로펙틴을 효소와 반응시켜 올리고당을 제조하고 이를 염기성 음이온 교환수지 및 산화제와 반응시켜 (S)-3,4-디히드록시-부틸산을 얻고, 이를 탈착하여 에스테르화 반응과 고리화 반응을 통하여 광학순도가 높게 유지되는 (S)-베타-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법을 개발하였다. 상기의 방법 이외에도 녹말이나 테트리고(말토올리고 당)를 원료물질로 사용하여 보다 높은 수율로 제조하는 방법(미국특허 제6,124,122)이 알려져 있으나 이러한 방법들은 다당의 분자들을 분해하여 제조하는 방법이기 때문에 분해 과정 중에 원하지 않는 여러가지 화합물이 생성되며 이때 생성되는 화합물들의 대부분은 목적 화합물과의 구조적 유사성으로 인해 물리적 성질이 비슷하여 정제나 제거가 매우 어려워 순도가 떨어지는 단점이 있다.

또한 곽병성 등(특2003-0004902)은 치환된 사과산(malic acid) 유도체를 수소화하여 생성되는 디-히드록시-부틸산 메틸 에스테르를 산촉매 존재하에서 고리화 반응시켜 (S)-베타-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하였다. 그러나 이러한 방법은 고온 고압 반응으로 정해진 압력과 온도 범위가 벗어날 경우 생성물의 광학순도와 수율이 낮아지고 촉매의 비활성화 속도가 증가 되는 단점이 있다.

이호성 등(특2003-0065192)은 고순도의 (S)-에피클로로하이드린(epichlorohydrin)으로 부터 (S)-4-클로로-3-히드록시부티로니트릴(4-chloro-3-hydroxybutyronitrile)을 합성하고 이것을 원료물질로 하여 (S)-3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하였다. 그러나 상기의 제조방법은 최초의 원료물질인 (S)-에피클로로하이드린의 가격이 비싸기 때문에 제조원가가 높은 단점이 있다.

다이셀(Daicel)사에서 발표한 일본특허(공개번호2002-204699)의 경우 미생물을 이용하여 광학활성 에틸 4-클로로-3-히드록시-부티레이트로 부터 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하였다. 이 때 광학순도는 93.9%ee 이상이었으나 반응물의 농도가 낮아서 실제 공정에 적용하기는 힘들다. 또한 이들은 라세믹 에틸 4-클로로-3-히드록시-부티레이트로부터 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하였으나 반응물의 농도 및 광학순도가 매우 낮았다. 또한 미생물을 이용하여 에틸 4-클로로-3-히드록시-부티레이트로 부터 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하는데 있어서 반응 메카니즘을 정확하게 설명하지 못하고 있다.

본 발명에 의한 제조방법은 리파제 또는 리파제 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 4-클로로-3-히드록시부틸산 알킬 에스테르를 가수분해 반응하여 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법으로 현재까지 보고된 바가 없는 새로운 공정이다.

이에 본 발명자들은 일반식 1로 표시되는 4-클로로-3-히드록시부틸산 알킬 에스테르를 반응함에 있어서 리파제 또는 리파제 생산능을 갖는 미생물을 사용하여 가수분해 반응으로 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하고자 하였다.

본 발명에 의한 방법은 기존의 방법과는 달리 가수분해 반응에 의한 방법으로, 공정이 매우 간단하고 높은 광학순도를 갖는 3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 효소 또는 미생물을 사용하여 일반식 1로 표시되는 에스테르 화합물로 부터 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 공정을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 제조 방법은 수용액상 또는 수용액을 포함하는 용매상에서 라세믹 에스테르 화합물을 리파제 또는 리파제 생산능을 갖는 미생물을 촉매로 사용하여 입체선택적으로 가수분해 반응시키는 것으로 이루어진다.

이하 본 발명을 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다. 전술한 바와 같이, 본 발명은 일반식 1로 표시되는 에스테르 화합물에 생촉매로서 효소 또는 미생물을 첨가하여 가수분해 반응을 하여 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 사용되는 라세믹 4-클로로-3-히드록시부틸산 알킬 에스테르는 메틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트, 에틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트, 부틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 [반응식 1]의 일반식 1에서 R은 이소프로필(isopropyl), n-프로필(n-propyl), 이소부틸(isobutyl)과 벤질(benzyl) 등이 가능하다.

본 발명에 사용되는 리파제로는 아마노사의 PS, AK, 노보자임스사의 CALB 등이며 균주로는 Candida rugosa, Rhodococcus butanica, Cunninghamella echinylata, Candida magnoliae, Burkhlderia cepacia, Geotrichum candidum 등 리파제 생산능을 갖는 여러 종의 미생물이 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 반응물 및 생성물들은 기체크로마토그래피(도남 인스트루먼트사, 모델 DS6200)를 이용하여 분석하였으며, 반응후 반응물을 아세트산 에틸(ethyl acetate)로 추출하여 분석하였다.

라세믹 4-클로로-3-히드록시부틸산 알킬 에스테르는 모세관(capillary) 칼럼인 G-TA(Astec 사, 30m×0.32mm)을 100℃에서 5분간 가열 후 170℃까지 분당 20℃ 씩 올려주었고, 170℃에서 15분을 유지하였다. 담체로는 헬륨기체를 사용하였으며 칼럼 헤드 압력을 6 psi로 유지하면서 170℃에서 FID를 사용하여 검출하였다. 이때 메틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트는 9.31분, 에틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트는 10.05분, 부틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트는 12.92분에서 각각 검출되었다.

광학활성 (R)- 및 (S)-3-히드록시-감마-부티로락톤은 모세관(capillary) 칼럼인 G-TA(Astec 사, 30m×0.32mm)를 120℃에서 10분간 가열 후 170℃까지 분당 10℃씩 올려주었고, 170℃에서 15분을 유지하였다. 담체로는 헬륨기체를 사용하였으며 칼럼 헤드 압력을 10 psi로 유지하면서 170℃에서 FID를 사용하여 검출하였다. 이때 (R)-3-히드록시-감마-부티로락톤은 25.83분, (S)-3-히드록시-감마-부티로락톤은 26.52분에서 각각 검출되었다.

또한 메틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트, 에틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트, 부틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트는 FT-NMR(Burker사, 모델 DPX300)로 확인을 하였으며, 각각의 분석결과는 다음과 같다.

메틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트 :

¹H-NMR (CDCl₃) δ (ppm) = 2.64 (2H,d), 3.61 (2H,d), 3.72 (3H,s)

4.15 (1H,br), 4.26 ~ 4.31 (1H,m)

에틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트 :

¹H-NMR (CDCl₃) δ (ppm) = 1.28 (3H,t), 2.62 (2H,d), 3.53 (1H,br),

3.60 (2H,d), 4.20 (2H,q), 4.33 (1H,m)

n-부틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트 :

¹H-NMR (CDCl₃) δ (ppm) = 0.94 (3H,t), 1.36 ~ 1.43 (2H,m), 1.59 ~1.66

(2H,m), 2.64 (2H,d), 3.45 (1H,br), 3.63 (2H,d), 4.12 (2H,t), 4.24 ~

4.29 (1H,m)

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하지만, 하기 예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

0.1 M 인산 완충용액(potassium phosphate buffer, pH 8.0) 4.5 ml이 들어있는 바이알에 라세믹 메틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트가 10 %(v/v)가 되도록 첨가하고 리파제 CAL B 를 2 %(w/v)가 되도록 넣은 다음 30 ℃에서 반응을 수행하였다. 10분 반응 후 반응액을 아세트산 에틸로 추출하여 상기의 분석방법에 따라 분석하였다. 이 때 전환율은 21.2 % 이었으며 (S)-3-히드록시-감마-부티로락톤의 광학순도는 94.6 % e.e 이었다.

실시예 2-3

실시예 1에서 반응물로 사용된 메틸 3-히드록시부티레이트 대신 에틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트와 부틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트를 사용하여 반응을 수행하였으며, 각 반응의 전환율과 광학순도는 표1에 나타내었다.

실시예	반응물	반응시간 (분)	전환율 (%)	(S)-3-히드록시-감마-부티로락톤광학순도 (% e.e)
2	에틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트	10	39.9	90.4
3	부틸 4-클로로-3-히드록시부티레이트	10	59.1	63.5

실시예 4-5

실시예 1에서 리파제 CAL B대신 하기 표2에 명시한 리파제를 사용하여 반응을 수행하였으며, 각 반응의 전환율과 광학순도는 표2에 나타내었다

실시예	리파제 종류	반응시간 (시간)	전환율 (%)	(R)-3-히드록시-감마-부티로락톤광학순도 (% e.e)
4	PS	9	39.1	51.8
5	AK	24	34.5	52.6

실시예 6-12

실시예 1에서 리파제 CAL B대신 하기 표2에 명시한 미생물을 사용하여 반응을 수행하였으며, 이때 기질은 5%, 미생물 균체는 20%가 되도록 하였다. 각 반응의 전환율과 광학순도는 표3에 나타내었다

실시예	미생물	반응시간 (시간)	전환율 (%)	3-히드록시-감마-부티로락톤광학순도 (% e.e)
6	Candida rugosa KTCC 7292	6	13.4	63.4(R)
7	Cunninghamella echinylata ATCC 26269	4.5	20.4	45.4(S)
8	Rhodococcus butanica ATCC 21197	4.5	36.8	85.4(S)
9	Burkholderia cepacia ATCC 21808	32	16.8	78.7(S)
10	Candida magnoliae KCCM 50046	72	21.9	80.7(S)
11	Candida magnoliae KCCM 50567	100	6.1	92.0(S)
12	Geotrichum candidum IFO 4597	2	8.4	50.7(S)

상기 실시예 1-12을 통해 알 수 있는 것과 같이, 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법에 있어서 본 발명에 따른 리파제 또는 리파제 생산능을 갖는 미생물을 사용하는 가수분해 반응은 매우 간단하다. 또한 적절한 리파제 효소나 군주를 사용하면 높은 광학순도의 3-히드록시-감마-부티로락톤을 합성할 수가 있다. 본 발명의 방법은 효소 및 미생물을 이용한다는 점에서 환경친화적이고, 고정화 효소나 고정화 균주의 경우 반복사용이 가능하여 제조 공정에서 비용을 줄일 수 있다는 장점이 있다.

Claims

일반식 1로 표시되는 라세믹 4-클로로-3-히드록시부틸산 알킬 에스테르를 리파제 또는 리파제 생성능을 갖는 미생물을 사용하여 가수분해 반응시키는 것을 특징으로 하는 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법
제 1항에 있어서 일반식 1의 R은 메틸, 에틸, n-부틸임을 특징으로 하는 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법
제 1항에 있어서, 미생물 균주는 Candida rugosa KTCC 7292, Rhodococcus butanica ATCC 21197, Cunninghamella echinylata ATCC 26269, Candida magnoliae KCCM 50046, Candida magnoliae KCCM 50567, Burkhlderia cepacia ATCC 21808, Geotrichum candidum IFO 4597 임을 특징으로 하는 광학활성 3-히드록시-감마-부티로락톤을 제조하는 방법