KR20020089351A - 신규 스캐빈저 리셉터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 매크로파지 및 기초면역의 기능 해명, 동맥경화, 당뇨병성 합병증, 혈관 형성 후 재협착, 세균 감염증 등의 각종 질환의 발증 기구의 해명, 및 그 진단, 예방, 및 치료법과, 이를 위한 시약이나 의약의 개발에 이용할 수 있는 SR구조 및 컬렉틴 구조를 갖는 신규 스캐빈저 리셉터에 관한 것이다. 서열 번호 2, 4 또느 24인 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이와 동등한 성질을 갖는 단백질, 또는 이들의 유도체 내지는 단편과 그것을 코드하는 염기 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 및 항체, 안타고니스트 등의 관련 분자를 제공한다. 이들을 이용한 처리 방법도 개시한다.

Description

신규 스캐빈저 리셉터{Novel scavenger receptors}

죽종(atheroma)성 동맥경화증의 초기 병성에 있어서의 병리학적인 특징은 포말 세포가 동맥벽에서 증가하는 현상이다. 매크로파지(macrophage)의 세포막 상에 존재하는 스캐빈저 수용체(이하, SR이라고 칭한다)(Krieger, M. et al.; Annu. Rev. Biochem., 63, 601-637, 1994)는 LDL 수용체와는 달리 콜레스테롤에 의한 음의 피드백 조절을 소홀히하고, 변성된 LDL(콜레스테롤과 지단백질과의 복합체인 저비중지단백질)을 적극적으로 세포내로 유입시킴으로써, 자신은 포말 세포로 변화하여 혈관내피세포하에 축적한다. 이 때문에, 매크로파지 및 그 SR은 죽종성 동맥 경화의 병태 형성에 중요한 역할을 한다고 생각된다(Brown, M. S. et al; Nature, 343, 508-509, 1990, Kurihara, Y. A. et al.; Current Opinion in Lipidoloty, 2, 295-300, 1991, Krieger, M.; TIBS, 17, 141-146, 1992, Krieger, M. et al.; J. Biol. Chem., 268(7), 4569-4572, 1993).

당뇨병에 의해 발생하는 생체내에서의 지속적인 고혈당은 여러가지 단백의 비효소적 당화를 초래하고, 시프염기(Schiff base)·아마도리(amadori)화합물을 거쳐 당화 과정에 있어서의 최종 산물인 마일라드 반응 후기 생성물(AGE: advanced glycation end products)을 생산시킨다. 세포 장해 작용을 갖는 AGE는 AGE 수용체를 개재하여 매크로파지, 혈관내피세포, 간세포, 신장 메산지움 세포 등에 결합하여 생체에 악영향을 준다. 예를 들어 AGE가 매크로파지에 결합하면 TNF(Tumor Necrosis Factor), IL-1(Interleukine-1) 및 혈소판 유래 증식 인자(PDGF) 등의 사이토킨의 분비를 촉진하고, 당뇨병성 합병증에 특징적인 세포 장해를 야기시키는 것이 알려져 있다. SR이 AGE의 유입·분해에 관여하는 수용체의 하나라는 것(Araki, N. et al.; Eur. J. Biochem., 230, 408-415, 1995, Suzuki, H. et al.; Circulation, 92, I-428, 1995), SR더블 녹아웃 마우스(knockout mouse)에서는 AGE의 분해활성이 1/3으로 저하했다는 것으로부터, SR은 당뇨병성 신증, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경장해 등의 당뇨병성 합병증에도 깊게 관여하고 있다고 생각된다. 또한, 생쥐에게 AGE 알부민을 과잉으로 투여하면 신장에 AGE가 침착하여 사구체 경화증을 야기한다는 점에서(Vlassara, H. et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 11704-11708, 1994), AGE를 인식하는 SR이 사구체 경화증에 깊게 관여한다고 예상된다.

또한, SR은 알츠하이머병에도 관여하고 있다고 생각된다. 알츠하이머병의 병리학적 특징은 β아밀노이드가 침착한 노인반이다. β아밀노이드는 소교 세포 상에 발현하고 있는 SR을 개재하여 소교 세포를 활성화하여 활성 효소를 발생시키고, 신경 독성을 발현하는 것이 보고되고 있다(Nature, 382, 716-719, 1996).

SR의 배위자로서는 SR 분자종이 달라서 특이성에 차이가 존재하지만, 음성 전하를 갖는 배위자, 예를 들어 아세틸화 LDL(AcLDL), 산화 LDL(OxLDL) 등의 변성 LDL, 말레일화 BSA 등의 변성 단백질, 폴리이노신산 등의 4중 나선 핵산, 덱스트란황산 및 푸코이단 등의 다당류, 포스파티딜세린 및 포스파티딜이노시톨 등의 산성 인지질, 내독소성(LPS), AGE, 노화 세포 및 아포토시스 세포 등을 들 수 있다. 또한 SR은 생체내에서 여러가지의 변성물, 바이러스 등의 이물 등을 넓게 인식한다는 점에서 이물 및 노폐물의 제거 등에 중요한 역할을 담당하고 있다고 생각된다(Hampton, R. Y. et al.; Nature, 352, 342-344, 1991, Tokuda, H. et al.; Biochem. Biophys. Res. Commun., 196(1), 8-24, 1993, Pearson, A. M. et al.; J. Biol. Chem., 267, 3546-3554, 1993, Dunne, D. W. et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 1863-1867, 1994, Freeman, M. W.; Current Opinion in Lipidology, 5, 143- 148, 1994).

SR은 매크로파지 이외에 간류동 내피 세포(Eskild, W. et al.; Elsevier Biomedical N. Y., 255-262, 1982), 혈관내피세포(Baker, D. P. et al.;Arteriosclerosis, 4, 248-255, 1984, Bickel, P. E. et al.; J. Clin. Invest., 90, 1450-1457, 1992), 혈관 평활근 세포(Pitas, R. E. et al.; J. Biol. Chem., 265, 12722-12727, 1990, Bickel, P. E. et al.; J. Clin. Invest., 90, 1450-1457, 1992), 섬유아세포(Pitas, R. E. et al.; J. Biol. Chem., 265, 12722-12727, 1990) 등에 발현하고 있다. 또한. SR은 SRA, SRB, SRC(Peason, A. et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4056-4060, 1995), FcγRIIB2(Stanton, L. W. et al.; J. Biol. Chem., 270, 22446-22451, 1992) 및 macrosialin(CD68)(Ramprasad, M. P. et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 9580-9584, 1995), 인간의 혈관내피 OxLDL 수용체(LOX-1: lectin-like oxidized LDL receptor)(Sawamura, T. et al.; Nature, 386, 73, 1997)로 분류되고, 또한 SRA는 SR-AI 및 SR-AII(Kodama, T. et al.; Nature, 343, 531-535, 1990) 및 MARCO () (Elomaa, O. et al.;p Cell, 80, 603-609, 1995), SRB는 CD36(Endemann, G. et al.; J. Biol. Chem., 268, 11811-11816, 1993) 및 SR-BI(Acton, S. L. et al; J. Biol. Chem., 269, 21003-12009, 1994)로 분류된다.

SR-AI 및 SR-AII는 호모트리머이고, N 말단측을 세포내에 갖는 inside-out형의 막관통 단백질이다. 상기 단백질의 세포 밖에는 콜라겐 같은 도메인, α-helical coiled coil 도메인 및 시스테인릿치도메인 등의 구조상 수개의 도매인이 인식된다(Rohrer, L. et al.; Nature, 343, 570, 1990, Matsumoto, A. et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9133, 1990). 콜라겐 같은 도메인은 콜라겐에 특유한(Gly-Xaa-Yaa)n 구조(Xaa 및 Yaa는 어떠한 아미노산 잔기이라도 된다)를 가지고, 상기 도메인은 배위자 결합 부위로서 기능하고 있다. α-helical coiled coil 도메인은 7아미노산 마다 2회전하는 오른쪽 회전의 헵티드리피드, 즉 α-helical coiled coil 구조를 취하고, 3개의 폴리펩티드는 7아미노산 마다 존재하는 류신(leucine)이나 이소류신(iso leucine) 등의 소수성 아미노산을 내측을 향하고, 극성 아미노산이나 당쇄결합 부위를 외측으로 하여(류신 지퍼) 호모트리머를 형성하고 있다. 상기 도메인이 갖는 역할로서, 호모트리머 구조의 유지 또는 변성 LDL 등의 배위자와 결합하여 세포내에 넣고, 엔도솜 내의 pH의 저하에 의존하여 수용체의 3차 구조를 변화시켜 배위자를 해리시키는 역할을 갖는다.

상기 단백질의 세포질내 도매인은 LDL 수용체나 인슐린 수용체로 보여지는 NPXY 서열 및 트랜스페린 수용체로 보여지는 YXRF 서열과 동일한 엔도시토시스 시그널로 보여지는 특징적인 타이트탄 구조를 가지고, 이들의 서열을 결손시키면 엔도시토시스가 억제되는 것이 나타난다.

SR-A1 및 SR-A2은 시스테인릿치도메인을 코드하는 mRNADML의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 발생하고, SR-AI은 상기 도메인이 110개의 아미노산으로 이루어지고, SR-AII는 적어도 말초 단구 유래 매그로파지, 폐포 매그로파지 및 간 Kupffer 세포에 발현하고 있고, 생체 방어·동맥 경화·Ca 이온 비의존성의 세포 접착 등에 관여한다는 것이 명확해져 있다(Krieger, M. et al.; Annu. Rev. Biochem., 63, 601-637, 1994, Wada, Y et al.; Ann. N.Y. Acad. Sci., 748, 226-239, 1995, Fraser, I. P. et al.; Nature, 364, 343, 1993). 또한, OxLDL은 동맥 경화의 매크로파지 세포내에 존재하고, 상기 매크로파지의 세포막 상에는 SR-AI 및SR-AII이 강하게 발현하는 것, SR-AI의 형질전환(transgenic) 마우스에 있어서는 지질부하에 의한 혈중 지단백질의 상승이 억제되는 것, OxLDL의 유입에는 SR-AI 및 SR-AII의 역할이 중요하다고 생각된다.

한편, SRA로 분류되는 MACRO는 SR-AI과 유사한 구조를 가지고 있지만, α-helical coiled coil 도메인은 존재하지 않고, 긴 콜라겐 같은 도메인을 가지고 있는 것을 특징으로 한다. MACRO는 비장 매크로파지나 임파절 매크로파지 등에 있어서 발현되고 있고, 그 배위자의 특이성으로부터 세균 감염에 대한 생체 방어 기구로서 기능하고 있다고 생각된다.

스즈키는 SR-AI 및 SR-AII의 공통 부분인 제 4 엑손 오마이신 내성 유전자로 치환하고, SRA 녹아웃 마우스의 제조에 성공하였다(Suzuki, H. et al.; Nature, 386, 292-296, 1997). SRA 녹아웃 마우스는 야생형과 비교하여 면역 장해가 인정되고, 리스테리아 및 단순 헤르페스바이러스의 감염율이 높다. 또한, 아포토시스를 일으킨 T세포의 탐식에는 SRA가 관여하고, SRA 녹아웃 마우스에 있어서는 야생형과 비교하여 그 탐식성이 저하하는 것이 나타나 있다(Platt, N. et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 12456, 1996). 또한, SRA 녹아웃 마우스와 동맥 경화의 동물 모델인 아포 E 결손 마우스(Plump, A. S. et al.; Cell, 71, 343, 1992, Zhag, S. H. et al,; J. Clin. Invest., 94, 937, 1994)를 교배함으로써 얻어지는 더블 녹아웃 마우스에서는 동맥경화의 면적이 아포 E 결손 마우스보다 작은 것이 나타나 있다(Suzuki, H. et al.; Nature, 386, 292-296, 1997).

이와 같이, SR은 매크로파지의 기능의 해명, 동맥 경화, 당뇨병성 합병증 및AD, 고β지단백혈증, 고콜레스테롤혈증, 고트리글리세라이드혈증, 저α지단백혈증, 이식, 죽종절제술(atherectomy) 및 혈관 형성 후 재협착 등을 비롯한 각종 질환 등의 발증기구의 해명, 그 진단, 예방 및 치료법과 이를 위한 시약이나 의약의 개발에 이용할 수 있는 것으로, 이 패밀리에 속하는 신규 분자종의 발현은 상기 과제를 해결하는 수단이 될 수 있다.

한편, 생체 방어에 중요한 역할을 담당하고 있는 보체계는 면역 글로불린을 인식 분자로 하고, 보체 제1성분인 C1이 활성화되는 고전적 경로 및 세균 등의 이물에 보체 제3성분인 C3이 직접 결합하는 제2경로가 알려져 있다. 최근 이들의 보체 활성화 경로 이외에, 혈청 렉틴인 만노오스 결합 단백질(이하, MBP라고 한다)이 이물 표면의 당쇄를 직접 인식하여 결합함으로써 보체계를 활성화시키는 렉틴 경로가 명확해졌다(Sato, T. et al.; Int. Immunol., 6, 665-669, 1994).

MBP는 Ca 이온 존재하, 만노오스나 N-아세틸글루코사민 등에 특이하게 결합하는 C형 렉틴이고, 그 구조는 적어도(Gly-Xaa-Yaa)n으로 이루어지는 콜라겐 같은 영역, 당쇄 인식 영역(CRD)을 포함하고 있다. MBP와 동일하게 콜라겐 같은 영역 및 CRD를 갖는 렉틴은 컬렉틴(collectin)이라고 총칭되고(Malhotora, R. et al.; Eur. J. Immunol., 22, 1437-1445, 1992), MBP이외에 컬렉틴-43(CL-43), 계면활성제 단백질 A(SP-A), 계면활성제 단백질 D(SP-D) 및 소 혈청 단백(BKg) 등을 들 수 있다. 컬렉틴은 옵소닌 활성을 가지고, 세균 바이러스를 비롯한 각종 미생물에 대한 기초 면역에 관여하고 있다고 생각된다(Kawasaki, N. et al.; J. Biochem., 106, 483-489, 1989, Ikeda, K. et al.; J. Biol. Chem., 262, 7451-7454, 1987, Ohta, M. etal.; J. Biol. Chem., 265, 1980-1984, 1990, Summerfield, J. A. et al.; Lancet, 345, 886, 1995).

이들의 컬렉틴은 도 1a에 나타낸 바와 같은 (1)CRD 및 (2)콜라겐 같은 영역 등의 특징적인 영역을 포함하는 기본 구조로 구성되어 있다는 것이 알려져 있고(Malhortra et al.; Eur. J. Immunol., 22, 1437-1445, 1992), 이 기본 구조가 콜라겐 같은 영역에 있어서 삼중 나선을 구성함으로써 서브유닛을 형성하고, 또한 이 서브유닛이 3량체, 4량체, 6량체 등의 올리고머 구조를 형성하고 있다.

최근, 컬렉틴에 의한 비특이적인 면역 반응으로의 관여가 시사되고, 예를 들어 모친의 이행 항체나 특이적 방어 시스템이 충분히 발달되어 있지 않은 어린이에 대하여, 각종 미생물의 중화 작용이나 배제에 중요한 역할을 하고 있다는 보고가 있다(Super et al.; Lancet, 2, 1236-1239, 1989). 또한, 숙주의 생체 방어에 있어서의 이들의 컬렉틴의 역할에 대하여 예를 들어 MBP의 유전자 상의 변이에 기인한 MBP의 혈중 농도의 저하에 의해, 숙주가 감염되기 쉽다는 연구결과가 보고되어 있다(Sumiya et al.; Lancet, 337, 1569-1570, 1991). 또한, 옵소닌화 부전의 혈청중 MBP함량은 낮은 값을 나타내고(Madsen, H. O. et al.; Immuno genetics, 40, 37-44, 1994) 세균 감염을 일으키기 쉽다는 보고가 있어(Garred. P. et al.; Lancet, 346, 941-943, 1995), MBP는 면역기구에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다고 생각할 수 있다.

본 발명자들은 이전에 BKg 및 MBP가 H1 및 H3타입의 인플루엔자 A형 바이러스의 감염이나 적혈구 응집 활성을 저해하는 것을 발견하였다(Wakamiya et al.;Glycoconjugate J., 8, 235, 1991, Wakamiya et al.; Biochem. Biophys. Res. Comm., 187, 1270-1278, 1992). 그 후 다시 BKg를 코드하는 cDNA 클론을 취득하고, BKg와 SP-D 등과의 관련성도 발견되었다(Suzuki et al.; Biochem. Biophys. Res. Comm., 191, 335-342, 1993).

이처럼 컬렉틴은 생체 방어기구의 해명에 있어서의 유용성 및 생리활성물질로서의 유용성 등이 기대되는 물질이고, 이 패밀리에 속하는 신규 분자종의 발견은 감염증의 치료 이외에, 각종 의료 분야 및 생물학 분야에도 기여하는 바가 크다.

본 발명은 단리된 인간 또는 마우스의 신규 스캐빈저 리셉터(본 명세서에 있어서 각각 ‘hSRCL-P1’ 및 ‘mSRCL-P1’이라 칭하고, 양자를 구별하지 않는 경우는 간단히 ‘SRCL-P1’이라고 한다) 유전자 및 단백질, 그들의 상동체, 변이체, 수식체 및 다형성 변종(이들을 총칭하여‘유전체’라고 칭한다), 이들의 단편(이하, 그들 전체를 ‘SRCL-P1s’라고 칭한다) 및 그들의 검출에 관한 것이다. 또한, SRCL-P1s를 포함하는 의약용, 진단용, 연구용 조성물, 그들의 제조방법 및 사용에 관한 것이다. SRCL-P1s 단백질의 아고니스트 및 안타고니스트, SRCL-P1s를 이용한 약물의 스크리닝(screening) 방법에 관한 것이다. 또한, SRCL-P1s 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 세포, SRCL-P1 단백질에 대한 항체 및 상기 항체를 생산하는 세포에 관한 것이다.

도 1은 종래 보고된 주요 컬렉틴의 기본 구조 및 단백질의 개관을 나타내는 도면이다.

도 2는 종래 보고된 3종의 컬렉틴의 아미노산 서열의 얼라인먼트의 전반 부분을 나타내는 도면이다.

도 3은 도 2와 동일한 얼라인먼트의 후반 부분을 나타내는 도면이다.

도 4b는 본 발명의 신규 스캐빈저 리셉터의 염기 서열을 결정하기 위하여 사용한 각 프라이머의 명칭과, 시퀀서에 의해 해독된 염기 서열을 나타내는 도면이고, 도 4a는 얻어진 신규 스캐빈저 리셉터의 ORF를 나타내는 도면이다.

도 5는 A: 효모, B: 그람 음성 세균(Escherichia coli), 및 C: 그람 양성 세균(Staphylococcus aureus)이 hSRCL-P1을 발현하고 있는 세포에 특이적으로 결합하는 모습을 나타내는 도면이다.

도 6은 A: 산화 LDL, B: 만노오스, 및 C: AGE가 hSRCL-P1을 발현하고 있는 세포에 특이적으로 결합하는 모습을 나타내는 도면이다.

도 7은 효모가 hSRCL-P1을 발현하고 있는 세포 내에 유입되어 있는 모습을 나타내는 도면이다.

도 8은 A: 건강한 정상인 및 B: 마우스의 심장의 혈관내피세포에 hSRCL-P1이 발현되어 있는 모습을 나타내는 도면이다.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

본 발명자는 인간 및 마우스의 신규 SR의 클로닝(cloning)에 성공하였다. 신규 SR(SRCL-P1)의 C말단측에는 기초 면역에 관여한다고 생각되는 CRD 함유의 컬렉틴 도메인이 존재하고, 또한 그 전체 구조는 SRA, 특히 SR-AI에 유사하다. 구체적으로는 N 말단측보다 류신 단위가 4회 반복되는 류신 지퍼 구조를 포함하는 막통과 도메인, α-helical coiled coil 도메인, 콜라겐 같은 도메인, 넥 도메인, CRD 도메인으로 적어도 구성된 것이다. 상기 특징을 갖는 3분자가 coiled coil 도메인에서 α힐릭스를 형성하고, 콜라겐 같은 도메인으로 삼중 나선을 형성함으로써 호모트리머를 형성하고 있다고 생각된다. 또한 콜라겐 같은 도메인은 생리적 pH의 조건하에서는 양전하를 띠고 있다고 추측된다. 또한 SRCL-P1 단백질은 많은 당쇄 결합 부위를 가지고 있다.

본 명세서에 있어서 사용하는 hSRCL-P1 유전자 및 mSRCL-P1 유전자는 특별히 기재하지 않는 한, 서열 번호 1 또는 3으로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 그들의 유도체(상동체, 변이체, 수식체 및 다형성 변종), 및 그들의 단편을 포함하는 것으로 한다. 또한 본 명세서에 있어서 사용하는 hSRCL-P1 단백질 및 mSRCL-P1 단백질은 특별히 기재하지 않는 한, 서열 번호 2 또는 4로 나타내는 아미노산 서열(폴리펩티드), 그들의 유도체, 그들의 단편을 포함하는 것으로 한다. 이들은 천연 또는 인공적이라도 상관없다. 본 발명에는 상기 기재된 모든 것이 포함된다.

hSRCL-P1의 예로서, 서열 번호 24로 나타내는 아미노산을 갖는 단백질(서열 번호 1로 나타내는 단백질에 있어서, 콜라겐 영역의 일부와 넥 영역, 즉 제 483∼606번째의 아미노산 잔기가 결실한 변이체)을 들 수 있고, 서열 번호 1로 나타내는 폴리뉴클레오타이드의 변이체의 예로서, 서열 번호 24인 단백질을 코드하는, 서열 번호 23으로 나타내는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.

또한, 본 발명에는 실질적으로 서열 번호 2 또는 4로 나타내는 아미노산 서열에 유사한 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열도 포함된다. 또한 이들의 아미노산 서열을 갖는 단백질도 포함된다. 서열 번호 2 또는 4로 나타내는 아미노산 서열에 실질적으로 유사한 아미노산 서열이란, 서열 번호 2 또는 4로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동등한 성질, 즉 SR에 특이적인 류신 지퍼 구조를 포함하는 막관통 도메인, α-helical coiled coil 도메인, 콜라겐 같은 도메인을 소유함으로 인한 활성, 기능 및 3차 구조 등을 갖는 범위내에서 1 내지는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등의 변경을 갖는 아미노산 서열을 말한다. 이들은 천연 또는 인공적이어도 된다.

또한, 본 발명에는 서열 번호 1 또는 3 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열이나 그 단편을 포함하는 핵산 서열, 또는 이들에 상보적인 핵산 서열(이하, 특정 서열이라 칭한다)과 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열도 포함된다. 본 발명에 있어서의 엄격한 조건이란 예를 들어, 5×SSC, 5% 덴하트 용액(0.1% BSA,0.1% Ficoll400, 0.1% PVP), 0.5% SDS 및 20㎍/㎖ 변성 연어 정자 DNA를 함유하는 용액 중에서, 37℃에서 하룻밤 인큐베이트하고, 다음으로 실온에서 0.1% SDS 함유 2×SSC로 세정하는 조건이다. SSC대신에 적당한 SSPE를 사용해도 된다. 이와 같이 하여 얻어진 핵산 서열은 적어도 특정 서열과 50% 이상의 상동 검색을 갖는다고 생각된다. 특정 서열과 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열에 의해 코드되는 단백질은 SRCL-P1 단백질과 동등한 성질을 갖는 것이 많다고 생각되고, RCL-P1 단백질과 동등한 성질을 갖는 한 그 단백질도 본 발명에 포함된다.

특히, 배여 번호 2로 나타내는 hSRCL-P1(아미노산 번호 1∼742)인 아미노산 서열은 아미노산 742개로 이루어진 단백질이고, 그것을 코드하는 염기 서열은 염기수 2226개로 이루어진다. 그 서열에는 류신 지퍼 도메인, α-helical coiled coil 도메인, 콜라겐 같은 도메인, 넥 도메인, CRD 도메인 등의 특징적인 아미노산 서열이 존재한다. 즉 아미노산 번호 36∼57로 나타내는 류신 지퍼 도메인, 아미노산 번호 72∼426(COILS Program) 또는 81∼431(MultiCoil Program)으로 나타내는 α-helical coiled coil 도메인, 아미노산 번호 443∼589로 나타내는 콜라겐 같은 도메인, 아미노산 번호 590∼606으로 나타내는 넥 도메인, 아미노산 번호 609∼742로 나타내는 CRD 도메인 등이 존재하고 있다. 그 외의 도메인으로서는 예를 들어, 아미노산 번호 63∼742(TMHMM 0.1 program) 또는 58∼742(TMpred program)으로 나타내는 세포외 도메인, 아미노산 번호 1∼39(TMHMM 0.1 PROGRAM) 또는 1∼37(TMpred program)으로 나타내는 세포내 도메인, 아미노산 번호 40∼62(TMHMM 1.0 program) 또는 38∼57(TMpred program)으로 나타내는 막관통 도메인, 아미노산 번호443∼742로 나타내는 컬렉틴 같은 도메인 등을 들 수 있다. 또한 C형 렉틴모티브인 아미노산 번호 708∼730이 포함되어 있다. 이 단백질을 코드하는 염기 서열을 서열 번호 1로 나타내었다.

또한, 서열 번호 4로 나타낸 mSRCL-P1(아미노산 번호 1∼742)의 아미노산 서열은 아미노산 742개로 이루어진 단백질이고, 그것을 코드하는 염기 서열은 염기수 2226개로 이루어진다. 상기 서열에는 서열 번호 2로 나타낸 hSRCL-P1 과 동일하고, 류신 지퍼 도메인, α-helical coiled coil 도메인, C형 렉틴모티브 등의 특징적인 아미노산 서열이 존재하였다. 이 단백질을 코드하는 염기 서열을 서열 번호 3으로 나타내었다.

본 명세서 중에서 사용하는 상동체란 상동성(homology)이 높은 핵산 서열 또는 아미노산 서열이고, 호몰로지가 적어도 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 것을 말한다. 서열 중에 결실이나 삽입이 존재하는 경우에는 갭 결합을 허락한 상동성 검색을 행하면 좋다. 예를들어, 멀티플·얼라이먼트(상품명:SODHO, 후지쯔)의 방법을 이용하여 검색할 수 있다. 또한 상동성 검색의 알고리즘에는 가장 엄밀한 Smith-Waterman 알고리즘을 이용할 수 있다. 그 외에 FASTA나 BLAST 등의 인터넷을 통하여 이용할 수 있다.

본 명세서 중에서 사용하는 변이체란 예를 들어, 대립 유전자(allele), Single Nucleotide Polymorphism(SNP) 등을 들 수 있다. 또한 핵산 서열의 변이는 코돈의 일부 개변은 상법을 따라 소망의 개변을 코드하는 합성 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)로 이루어진 프라이머를 이용한 부위 특이적 변이도입법(Mark, D. F. et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, 5662, 1984) 등에 따라 행할 수 있다. 얻어진 인공적 유전자 변이체도 본 발명의 핵산 서열에 포함된다. 또한 코돈의 축중의 범위를 초과한 경우라도 변이한 코돈에 의해 번역된 변이 아미노산이 정상 아미노산과 유사한 성질인 것이 바람직하다. 예를 들어, 지방족 아미노산인 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신 사이에서의 변이, 중성 아미노산인 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 발린, 류신, 이소류신, 시스테인, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 프로린, 트립토판, 아스파라긴 및 글루타민 사이에서의 변이, 산성 아미노산인 아스파라긴산 및 글루타민산 사이에서의 변이, 염기성 아미노산인 아르기닌, 리신 및 히스티딘 사이에서의 변이, 수산기를 갖는 세린 및 트레오닌 사이에서의 변이, 방향환을 갖는 페닐알라닌 및 타이로신 사이에서의 변이 등, 아미노산의 성질·기능·특성 등이 유사한 것이 바람직하다. 이들 인공적 또는 천연적으로 변이한 단백질도 본 발명의 단백질에 포함된다. 인공적으로는 PCR법을 이용하여 부위 특이적 변이를 일으킬 수 있다. 그 외 공지의 방법을 이용하여 임의의 장소에 변이를 일으킬 수 있다.

본 명세서 중에서 사용하는 수식체란 예를들어, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 미리스토일화, 글리코실화, 수산화, 인산화, 황산화, 포밀화, 메틸화, 폴리에틸렌글리콜화, 지질결합, 뉴클레오타이드 결합, 금속 결합(칼슘 부가체 등), 다른 단백질(알부민 등)과의 융합체, 이량체 등의 개변을 통상의 기술을 이용하여 실시할 수 있다. 예를들어, 글리코실화는 숙주가 대장균에서는 일어나지 않기 때문에 글리코실화를 기도하는 경우에는 진핵세포에 발현하면 좋다. 곤충세포도 포유세포와 마찬가지로 번역 후에 글리코실화를 행하기 위해 사용할 수 있다.

본 명세서 중에서 사용하는 다형성 변종이란 예를들어, 염색체 DNA의 구조나 형태의 변이에 따라 발생하는 다형성, 어떤 유전자가 대립 유전자로 변화하였기 때문에 발생하는 다형성 등을 말한다. 일반적으로 진핵 생물의 유전자는 다형 현상을 나타내는 경우가 많고, 이 현상에 의해 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환되는 경우도 있으며, 또한 그 경우라도 단백질의 활성이 유지되는 경우도 있다. 때문에, 서열 번호 2 또는 4 중 어느 하나에 나타난 아미노산 서열을 코드하는 유전자를 인공적으로 개변한 것을 이용하여 얻어진 단백질을 코드하는 유전자는, 상기 단백질이 본 발명의 유전자의 특징적인 기능을 갖는 한, 모두 본 발명에 포함된다. 개변이란 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 포함한다고 해석한다.

본 명세서 중에서 사용하는 단편이란 예를들어, 상술한 SRCL-P1이 갖는 아미노산 서열 중의 임의의 단편을 의미하고, 예를들어 세포외 도메인, 세포내 도메인, 막관통 도메인, 류신 지퍼 도메인, α-helical coiled coil 도메인, 콜라겐 같은 도메인, 넥 도메인, CRD 도메인, 컬렉틴 같은 도메인, 소수성 도메인(넥 도메인, 막관통 도메인 등), 친수성 도메인(소수성 도메인 이외) 등을 들 수 있고, 또한 이들 단편을 융합시킨 단편을 들 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 2로 나타낸 hSRCL-P1 아미노산 서열에 있어서, 막관통 도메인이 부족하여 가용성 수용체를 형성하는 58 내지 63번째부터 742번째의 아미노산을 갖는 단편, CRD 도메인이 부족하여 막관통형 스캐빈저 리셉터를 형성하는 약 1∼606번째의 아미노산을 갖는 단편, 류신 지퍼 도메인과 α-helical coiled coil 도메인으로 이루어진 가용성 스캐빈저 리셉터를 형성하는 약 36번째부터 426 내지 431번째의 아미노산을 갖는 단편, 및 CRD 도메인과 넥 도메인을 제외하는 제 1∼589번째의 아미노산을 갖는 단편 등을 들 수 있다.

SRCL-P1 유전자 취득 방법

본 발명의 SRCL-P1 유전자는 어떠한 방법으로 얻어진 것이라도 된다. 예를 들어, 본 발명의 SRCL-P1를 코드하는 염기 서열은 그 단백질을 발현하고 있는 세포로부터 mRNA를 조제하여, 상법에 의해 이중 사슬 DNA로 변환하여 얻을 수 있다. MRNA의 조제에는 구아니딘이소티오시아네이트·염화칼슘법(Chirwin, et al., Biochemistry, 18, 5294, 1979) 등을 이용할 수 있다. 모든 RNA로부터의 폴리(A)^＋RNA의 조제는 올리고(dT)를 결합한 담체, 예를 들어 세파로스 또는 라텍스 입자 등을 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 등을 이용하여 행할 수 있다. 상기와 같이 하여 얻어진 RNA를 주형으로 하여, 3’말단에 존재하는 폴리(A)사슬에 상보적인 올리고(dT) 또는 랜덤 프라이머 또는 SRCL-P1의 아미노산 서열의 일부에 상응하는 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 역전사효소로 처리하고(Mol. Cell Biol., 2, 161, 1982, Mol. Cell Biol., 3, 280, 1993, Gene, 25, 263, 1983), 이와 같이 하여 얻어진 cDNA 사슬을 예를 들어, coli RNaseH, E. coli polymerase 1, E. coli DNA ligase 로 처리하고, DNA사슬로 변환함으로써 이중 사슬 cDNA를 얻을 수 있다. 이 cDNA를 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 코스미드 벡터에 조합하여, 대장균을 형질 변환하고, 또는 시험관내 충진을 실시한 후, 대장균으로 트랜스펙터(transfactor)함으로써 cDNA라이브러리를 제조할 수 있다.

여기에서 이용할 수 있는 플라스미드 벡터로서는 숙주내에서 복제 유지되는 것이라면 특별히 제한받지 않으며, 파지 벡터에 대해서도 숙주내에서 증식할 수 있는 것이라면 특별히 제한받지 않는다. 클로닝용 벡터로서 예를 들어, pBR322, pUC19, λgt10, λgt11 등을 들 수 있다. 또한 면역학적 스크리닝에 제공하는 경우에는 숙주내에서 SRCL-P1 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터를 갖는 벡터인 것이 바람직하다.

플라스미드에 cDNA를 조합하는 방법으로서는 Maniatis들의 방법(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition) 등을 참고로 할 수 있다. 또한 파지 벡터에 cDNA를 조합하는 방법으로서는 Hyunh들의 방법(DNA cloning, a practical approach, 1, 49, 1985) 등을 참고로 할 수 있다.

상기 발현 벡터의 숙주 세포로의 도입법으로서는 예를 들어, 리포폴리아민법, DEAE-덱스트란법, 하나한법, 리포펙틴법, 인산칼슘법에 의한 트랜스펙션(transfaction), 미크로주사법(microinjection) 및 일렉트로포레이션(electroporation) 등의 방법(Molecular Cloning, AL aboratory Manual, second edition)이 있다. 시험관내 충진은 시판의 Kit(Stratagene사 제품, Amersham사 제품)를 이용함으로써 간단하게 행할 수 있다.

상기 방법에 의해 제조된 cDNA 라이브러리로부터 SRCL-P1 단백질을 코드하는 cDNA를 단리하는 방법은 일반적인 cDNA 스크리닝 방법을 조합하여 행할 수 있다. 예를 들어, 32P에서 표식한 프로브를 제조하고, 콜로니 하이브리다이제이션(colony hybridization)법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961, 1975),프라그법(Molecular Cloning, A laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 2, 108, 1989)에 의해 목적하는 cDNA를 함유하는 클론을 스크리닝할 수 있다. 또한, PCR법에 의해 클론을 선택할 수도 있다. 또한, cDNA를 발현할 수 있는 벡터를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제조한 경우에는 SRCL-P1을 인식하는 항체를 이용함으로써 목적하는 클론을 선택할 수 있다.

또한, SRCL-P1 유전자를 발현하는 세포로부터 SRCL-P1 유전자를 단리하는 경우에는 예를 들어, 상기 발현 세포를 SDS 또는 단백질 가수 분해 효소 K를 이용하여 용해하고, 페놀 처리를 행한다. 사용할 수 없는 RNA를 리보뉴클레아제에 의해 소화한다. 얻어지는 DNA를 제한 효소에 의해 소화하고, 얻어지는 DNA 단편을 파지 또는 코스미드로 증폭하여 라이브러리를 제조한다. 그 후, 목적의 클론을 선택하고 SRCL-P1 유전자를 취득할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 DNA의 염기 서열은 맥섬킬버드법(Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 74, 560, 1977) 또는 쌍거법(Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 74, 5463, 1977)에 의해 결정할 수 있다. SRCL-P1 유전자는 상기 얻어진 클론으로부터 제한 효소 등에 의해 잘라남으로써 얻을 수 있다.

SRCL-P1 염기 서열을 바탕으로 합성한 프라이머를 이용하여 SRCL-P1 발현 세포 폴리(A)^＋RNA를 주형으로 하여 RT-PCR법에 의해 클로닝할 수도 있다. 또한 PCR에 의하지 않고, SRCL-P1 염기 서열을 바탕으로 프로브를 제조·합성하고, 직접 cDNA라이브러리를 스크리닝하고, 목적으로 하는 cDNA를 얻을 수도 있다. 본 발명의 유전자를 이들의 방법에 의해 얻어진 유전자 중에서, 그 유전자의 염기 서열을 인식함으로써 선택할 수 있다. 본 발명의 유전자를 예를 들어, 포스포이미다이트법(Mattencci, M. D. et al., J, Am, Chem, Soc., 130, 3185, 1981) 등의 핵산 화학 합성을 이용하는 상법에 따라서 제조할 수도 있다.

발현 벡터의 제조방법

본 발명은 또한 SRCL-P1s 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터에 관한 것이다. 벡터는 예를 들어, SRCL-P1s 단백질을 발현할 수 있는 것이라면 특별히 제한받지 않지만, 플라스미드 벡터, RNA 벡터, DNA 벡터, 바이러스 벡터, 파지 벡터 등을 이용할 수 있다. 구체적으로는 Invitrogen사 제품인 pBAD/His, pRSETA, pcDNA2.1, pTrcHis2A, pYES2, pBlueBac4,5. pcDNA3.1, pSecTag2, Novagen사 제품인 pET, pBAC, Promega사 제품인 pGEM, Stratagene사 제품은 pBluescriptII, pBS, Phagescript, pSG, pSV2CAT 내지는 Pharmacia사 제품인 pGEX, pUC18/19, pBPV, pSVK3, pSVL 등을 들 수 있다.

발현 벡터에 결찰(ligation)한 SRCL-P1scDNA 서열은 프로모터에 기계적으로 연결시킨다. 프로모터는 예를 들어, 파지 λPL 프로모터, E.coli lac, trp, tra 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, T7 및 T3 프로모터, 레트로 바이러스 LTR 프로모터를 들 수 있다. 특히, 진핵 세포에 사용하는 프로모터로서는 CMV 프로모터, HSV 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 레트로 바이러스 LTR 프로모터, RSV 프로모터, 메탈로티오네인프로모터가 있다. 또한, 발현 벡터는 형질전환한 숙주를 선택 가능하게 하기 위하여 마커 및 인핸서를 함유해도 된다. 마커에는 디히드로폴산환원효소 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자 등이 있다. 인핸서에는 SV40 인핸서, 거대세포바이러스 초기 인핸서 프로모터, 아데노바이러스 인핸서 등이 있다.

형질전환 세포의 제조방법

또한, 본 발명은 상기와 같은 벡터에 의해 이들이 보유하는 본 발명의 염기 서열을 발현 가능하게 유지하는 형질전환 세포를 제공한다. 본 명세서에 있어서의 형질전환 세포에 이용하는 숙주 세포로서는 바람직하게는 동물 세포 및 곤충 세포이지만, 본 발명의 발현 벡터 중의 SRCL-P1s 단백질을 발현하는 것이 가능한 모든 세포(미생물을 포함한다)를 들 수 있다.

본 명세서에 있어서의 동물 세포 내지는 곤충 세포로서는 각각 인간 유래의 세포, 파리 내지는 누에 유래의 세포를 들 수 있다. 예를 들어, CHO세포, COS세포, BHK세포, Vero세포, 골수종 세포, HEK293세포, HeLa세포, Jurkat세포, 마우스L세포, 마우스C127세포, 마우스FM3A세포, 마우스 섬유아 세포, 골아 세포, 연골 세포, S2, Sf9, Sf21, High Five_TM(등록 상표)세포 등이 있다. 본 명세서에 있어서의 미생물이란 대장균 내지는 효모 등이 포함된다. 이들 숙주로의 도입은 상기 기재한 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 SR발현 세포는 동맥 경화 발증 등에 관한 SR경로에 대하여, 이 경로로부터 세포로 유입되는 수식된 LDL의 특이성을 해석하기 위하여 이용할 수 있다. 또한, 물질의 수용체를 개재한 세포로의 유입 해석을 위한 모델로서 유용하다.또한, 본 발명의 세포는 동맥 경화증의 치료약, 예를 들어 LDL변성의 억제제, 아실 Co-A콜레스테롤아실트랜스페라제(ACAT) 활성 저해제 등의 개발 과정에 있어서의 약제의 스크리닝에 이용할 수 있다. 또한, 당쇄가 있는 인간 SR 단백질의 제조에 이용할 수 있다. 또한 SR을 개재하는 이물 또는 변성물의 처리과정의 실험계, 또는 변성 알부민에 동반하여 감염을 일으키는 B형 바이러스 등의 감염 실험계로서 이용할 수 있다.

단백질 취득 방법

본 발명은 상술한 바와 같은 본 발명의 염기 서열로 형질전환한 세포를 배양하여, 생산된 SRCL-P1을 채취하는 SRCL-P1의 제조방법에 관한 것이다. 세포의 배양, 단백질의 분리, 정제도 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.

본 발명의 단백질은 그 자체, 단리·정제·인식하기 쉽도록 재조합 융합 단백질로서 발현시킬 수 있다. 재조합 융합 단백질이란 목적 단백질을 코드하는 핵산 서열에 의해 발현된 단백질의 N말단측 또는/ 및 C말단측에 적당한 펩티드 사슬을 부가하여 발현시킨 단백질이다. 발현한 단백질의 정제를 용이하게 하는 목적으로 세포외 분비 시그널을 갖는 융합 단백질로서 발현시켜도 된다. 또한, 단백질은 각종 원료, 예를 들어 배양 세포, 배양 조직, 형질전환 세포 등의 단백질 생산 원료로부터 종래 공지의 방법, 예를 들어 황산 암모늄 침전법 등의 염석, 세파덱스 등에 의한 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피법, 소수성 크로마토그래피법, 색소겔 크로마토그래피법, 전기영동법, 투석, 한외여과법, 친화성 크로마토그래피법 및 고속 액체 크로마토그래피법 등의 공지의 정제 방법을 이용하여 얻을 수 있다.

유전자 이용 방법

서열 번호 1 또는 3중 어느 하나에 기재된 염기 서열에 기초하여, SRCL-P1 유전자를 검출하기 위한 프로브를 설정할 수 있다. 또는 이들의 염기 서열을 포함하는 DNA나 RNA를 증폭하기 위한 프라이머를 설정할 수 있다. 주어진 서열을 바탕으로 프로브 또는 프라이머를 설정하는 것은 당업자가 일상적으로 행하고 있다. 설정된 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 화학 합성에 의해 얻을 수 있다. 그리고 그 올리고뉴클레오타이드에 적당한 표식을 부가하면, 여러 가지 형식의 하이브리다이제이션 어세이(hybridization assay)로 이용할 수 있다. 또는 PCR 같은 핵산의 합성 반응에 이용할 수 있다. 프라이머로 이용하는 올리고뉴클레오타이드는 적어도 10염기, 바람직하게는 15∼50염기의 길이로 하는 것이 좋다. 또한 SRCL-P1 단백질을 코드하는 유전자 변이의 검출 및 SNP의 검출 등에 이용할 수 있다는 점에서, SRCL-P1 유전자 변이에 의해 발생하는 질환의 진단에 이용할 수 있다. 예를 들어, 동맥경화, 당뇨병성 합병증 및 알츠하이머병, 고β지단백혈증, 고콜레스테롤혈증, 고트리글리세라이드혈증, 저α지단백혈증, 이식, 죽종절제술 및 혈관 형성 후 재협착, 세균 감염 등을 비롯한 각종 질환 등의 진단에 이용할 수 있다고 예상된다. 또한, SRCL-P1 유전자를 생체 내에 도입하여 발현시킴으로 인한 유전자 치료에도 유용하다.

본 발명에 제공하는 SRCL-P1의 cDNA 염기 서열에 기초하여, 게놈 중에 존재하는 SRCL-P1 유전자의 프로모터 영역, 인핸서 영역을 취득하는 것도 가능하다. 구체적으로는 일본국 특허 공개공보 (평)6-181767호, (J. Immunol., 155, 2477, 1995,Proc. Natl. Acad, Sci, USA., 92, 3561, 1995) 등과 동일한 방법으로 이들의 제어 영역을 취득할 수 있다. 본 명세서 중에서 말하는 프로모터 영역이란 전사 개시 부위에 상류에 존재하는 유전자의 발현을 제어하는 DNA영역을 인핸서 영역이란 인트론, 5’비번역 영역 또는 3’비번역 영역에 존재하는 유전자의 발현을 증강하는 DNA영역을 말한다.

단백질 이용 방법

본 발명의 SRCL-P1s 단백질은 매크로파지 및 기초면역의 기능 해명, 동맥경화, 당뇨병성 합병증 및 알츠하이머병, 고β지단백혈증, 고콜레스테롤혈증, 고트리글리세라이드혈증, 저α지단백혈증, 이식, 죽종절제술 및 혈관 형성 후 재협착, 세균 감염 등을 비롯한 각종 질환 등의 발증 기구의 해명, 그 진단, 예방 및 치료법과, 그를 위한 시약이나 의약의 개발에 이용할 수 있는 가능성이 있다. 또한 SRCL-P1s에 대한 항체를 제작할 때의 항원으로서 이용할 수 있다. 또한 아고니스트 및 안타고니스트의 스크리닝 방법에도 이용할 수 있다.

아고니스트 및 안타고니스트

본 발명은 또한 본 발명의 SRCL-P1의 활성 또는 활성화를 자극하는 아고니스트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 SRCL-P1의 활성 또는 활성화를 저해하는 안타고니스트에 관한 것이다. 안타고니스트의 스크리닝은 예를 들어, SRCL-P1 단백질을 발현시킨 세포에 후보 저해제와 OxLDL 또는 항체를 작용시키는 경합적 실험계를 이용할 수 있고, OxLDL이 결합 비율로부터 후보 저해제를 스크리닝할 수 있다. 그 외, 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 또한 안타고니스트에는 SRCL-P1 유전자의 발현을 저해하는 안티센스(antisense) 핵산도 포함된다. 다른 스크리닝 방법으로서 수용체의 활성화에 의해 발생하는 세포외 pH의 변화를 측정하는 방법(Science, 246, 181-296, 1989)이 있다.

이와 같이 스크리닝한 안타고니스트는 산화 LDL 축적이나 세포로의 AGE의 결합에 관한 병태에 대하여, 치료, 예방 등의 처리를 행하기 위한 약물로서 이용할 수 있다. 그 스크리닝 방법은 본 발명의 SRCL-P1과 산화 LDL 또는 AGE와의 결합량을, 후보 약물의 존재하 및 비존재하에서 비교하여 이 후보 약물이 양자의 결합을 저해하는 능력에 의해 목적으로 하는 병태를 처리하기 위한 약물을 동정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

형질전환 비인간 동물

본 발명은 SRCL-P1 유전자의 발현 레벨을 변화시킨 형질전환 비인간 동물에 관한 것이다. 여기에서 SRCL-P1 유전자란 hSRCL-P14 내지 SRCL-P1을 코드하는 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA를 포함한다. 또한, 유전자의 발현에는 전사와 번역 중 어느 한 스텝도 포함된다. 본 발명에 의한 형질전환 비인간 동물은 SRCL-P1의 기능 또는 발현 조절의 연구, SRCL-P1이 관여한다고 예상되는 질환의 메카니즘 해명, 의약품의 스크리닝·안정성 실험에 이용하는 질환 모델 동물의 개발에 유용하다.

본 발명에 있어서는 유전자의 발현을 정상으로 조절하는 몇 개의 중요한 부위(인핸서, 프로모터, 인트론 등)의 일부에 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입 등의 변이를 일으키게 함으로써, 본래의 유전자의 발현 레벨과 비교하여 상승 또는 하강하도록 인공적으로 수식할 수 있다. 이 변이의 도입은 공지의 방법에 의해 행할 수있고, 형질전환 동물을 얻을 수 있다.

형질전환 동물이란 협의는 유전자 전환에 의해 외래 유전자가 생식 세포에 인위적으로 도입된 동물을 말하고, 광의는 안티센스 RNA를 이용하여 특정 유전자의 기능을 억제한 안티센스·형질전환 동물이나, 배아 줄기세포(embryo-stem cell)(ES세포)를 이용하여 특정 유전자를 녹아웃한 동물, 점돌연변이 DNA를 도입한 동물을 포함하고, 개체 발생의 초기에 외래 유전자가 안정적으로 염색체에 도입되어, 그 자계에 유전 형질로서 전달될 수 있는 동물을 말한다.

본 명세서 중에서 말하는 형질전환 동물이란 인간 이외의 모든 척추동물을 포함하는 광의의 의미로 해석된다. 본 발명에 있어서의 형질전환 동물은 SRCL-P1의 기능 또는 발현 조절의 연구, 인간에 있어서 발현하는 세포에 관련한 질환의 메카니즘의 해명, 의약품의 스크리닝·안전성 실험에 이용하는 질환 모델 동물의 개발에 유용하다.

형질전환 동물의 제작 방법은 위상차 현미경 하에서 전핵기란자의 핵에, 미소 피펫으로 유전자를 도입하는 방법(미크로주사법, 미국 특허 제4873191호), 배아 줄기세포(ES세포)를 사용하는 방법 등이 있다. 그 외, 레트로 바이러스벡터 또는 아데노 바이러스벡터에 유전자를 삽입하여, 계란에 감염시키는 방법, 또는 정자를 통하여 유전자를 계란에 도입하는 정자벡터법 등이 개발되고 있다.

정자벡터법이란 정자에 외래 유전자를 부착 또는 전기충격요법(electroporation) 등의 방법으로 정자 세포 내에 유입시킨 후에, 계란에 수정시킴으로써 외래 유전자를 도입하는 유전자 재조합법이다(M. Lavitranoet,Cell, 57, 717, 1989). 또는 박테리오파지 P1의 cre/loxP 리콘비나아제계나 사카로마이세스·세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)의 FLP 리콘비나아제계 등에 의한 in vivo에 있어서의 부위 특이적 유전자 전환을 이용할 수도 있다. 또한 레트로 바이러스를 사용하여 비인간 동물에 목적 단백질의 트랜스진을 도입하는 방법도 보고되고 있다.

미크로주사법에 의한 형질전환 동물 제작 방법은 예를 들어, 이하에 나타내는 바와 같이 행하여진다.

우선, 발현 제어에 관한 프로모터, 특정 단백질을 코드하는 유전자, 폴리A시그널로 기본적으로 구성되는 트랜스진이 필요하다. 프로모터 활성에 의해 특정 분자의 발현 양식이나 발현양이 좌우되고, 또한 도입 트랜스진의 카피 수나 염색체 상의 도입 부위에 의해 제작된 형질전환 동물이 계통간에서 다르기 때문에, 각 계통간에 발현 양식·발현양을 확인한다. 비번역 영역이나 스플라이싱에 의해 발현양이 변화하는 것이 판명되어 있기 때문에, 미리 폴리A시그널의 앞에 스플라이싱되는 인트론 서열을 도입해도 된다. 수정란에 도입하는 유전자는 되도록 순도가 높은 것을 사용하는 것이 중요하다. 사용하는 동물로서는 수정란 채취용 마우스(5∼6주), 교배용 수컷 마우스, 임신용 암컷 마우스, 수정관 결찰 수컷 마우스 등이 이용된다.

효율적으로 수정란을 얻기 위하여, 고나도트로핀(gonadotropin) 등에 의해 배란을 유발하여도 된다. 수정란을 회수하여 미크로주사법에 의해 계란의 웅성 전핵에 인젝션 피펫 중의 유전자를 주입한다. 주입한 계란을 수정관에 되돌리기 위한 동물(임신용 암컷 마우스 등)을 준비하고, 한 마리에 대하여 약 10∼15개를 이식한다. 그 후, 탄생한 마우스에 트랜스진이 도입되었는가의 여부를 꼬리의 선단부에서 게놈 DNA를 추출하여, southern법 또는 PCR법에 의해 트랜스진을 검출하거나, 또는 상동 재조합이 일어났을 때만 활성화하는 마커 유전자를 삽입한 포지티브 클로닝법에 이해 확인할 수 있다. 또한, 트랜스진의 발현을 확인하기 위하여, northern법 내지 RT-PCR법에 의해 트랜스진 유래 전사 산물을 검출한다. 또한 단백질 또는 그 단편에 대한 특이적 항체에 의하여 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 행하여도 된다.

녹아웃 마우스

본 발명의 녹아웃 마우스는 SRCL-P1 유전자의 기능이 손실되도록 처리된 것이다. 녹아웃 마우스란 상동 재조합 기술에 의해 임의의 유전자를 파괴하여 기능을 결손시킨 형질전환 마우스를 말한다. ES세포를 이용하여 상동 전환을 행하고, 한쪽의 대립 유전자를 개변·파괴한 배아 줄기세포를 선벽하여 녹아웃 마우스를 제작할 수 있다. 예를 들어, 수정란의 배반 세포나 상실 배기에 유전자를 조작한 배아 줄기세포를 주입하고, 배아 줄기세포 유래의 세포와 배아 유래의 세포가 혼합된 키메라 마우스를 얻는다. 이 키메라 마우스(키메라란 2개 이상의 수정란에 기초한 체세포로 형성된 단일 개체를 말한다)와 정상 마우스를 교배하면, 한 쪽의 대립 유전자의 전부가 개변·파괴된 헤테로 접합체 마우스를 제작할 수 있다. 또한 헤테로 접합체 마우스끼리를 교배하여 호모 접합체 마우스를 제작할 수 있다.

상동 재조합이란 유전자 전환 기구로 염기 서열이 동일하고, 또한 매우 유사한 2개의 유전자 사이에서 일어나는 전환을 말한다. 상동 전환을 일으킨 세포의 선별에는 PCR을 사용할 수 있다. 삽입 유전자의 일부와 삽입이 기대되는 영역의 일부를 프라이머로서 이용하는 PCR 반응을 행하고, 증폭 산물이 생긴 세포에서 상동 전환을 일으키고 있다는 것을 판명할 수 있다. 또한 배아 줄기세포로 발현하고 있는 유전자에 상동 재조합을 일으키는 경우에는, 도입 유전자에 네오마이신 내성 유전자를 결합시켜 두고, 도입 후에 세포를 네오마이신 내성으로 시킴으로써 선택할 수 있는 등, 공지의 방법 및 그들의 변법을 이용하여 용이하게 선택할 수 있다.

항체의 제조방법

본 발명은 SRCL-P1 또는 그 단편을 인식하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체에는 예를 들어, 서열 번호 2 또는 4중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그 단편에 대한 항체가 포함된다. SRCL-P1 또는 그 단편에 대한 항체(예를 들어, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 펩티드 항체) 또는 항혈청은 본 발명의 SRCL-P1 또는 그 단편 등을 항원으로 이용하고, 자체 공지의 항체 또는 항혈청의 제조방법에 따라 제조할 수 있다. 특히, SRCL-P1의 기능을 제어할 수 있는 항체(예를 들어, CRD, 콜라겐 같은 도메인 및 α-helial coiled coil 도메인 등을 인식하는 항체)는 항체 함유 의약품으로서 유용하다.

본 발명의 SRCL-P1 또는 그 단편은 투여에 의해 항체 생산이 가능한 부위에 그 자체 또는 희석제, 항체와 함께 온혈 동물에 대하여 투여된다. 투여할 때 항체 생산을 높이기 위하여, 완전 항원(complete Freund's adjuvant)이나 불완전 항원(incomplete Freund's adjuvant)을 투여하여도 된다. 투여는 통상 1∼6 주마다 1회씩, 합계 2∼10회 정도 행하여진다. 이용되는 온혈 동물로서는 예를 들어, 원숭이, 토끼, 개, 마못, 마우스, 생쥐, 양, 염소, 닭 등을 들 수 있지만, 마우스 및 생쥐가 바람직하게 이용된다. 생쥐에는 Wistar 및 SD계 생쥐 등이 바람직하고, 마우스에는 BALB/c. C57BL/6 및 ICR계 마우스 등이 바람직하게 이용된다.

단클론성 항체 생산 세포의 제조시에, 항원으로 면역된 혈온 동물, 예를 들어 마우스에서 항체값이 인정되는 고체를 선택하고, 최종 면역된 2∼5일 후에 비장 또는 임파절을 채취하고, 그들에 포함되는 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합시킴으로써, 단클론성 항체 생산 하이브리도마를 조제할 수 있다. 항혈청 중의 항체값의 측정은 예를 들어, 후술하는 표식화 SRCL-P1과 항혈청을 반응시킨 후, 항체에 결합한 표식제의 활성을 측정함으로써 이루어진다. 융합 조작은 기지의 방법, 예를 들어 케라와 밀스타인의 방법(Nature, 256, 495, 1975)이나 그 변법(J. Immunol. Method, 39, 285, 1980, Eur. J. Biochem., 118, 437, 1981, Nature, 285, 446, 1980)에 따라 실시할 수 있다. 융합 촉진제로서는 폴리에틸렌글리콜(PEG)이나 센다이바이러스 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 PEG가 이용된다. 또한, 융합 효율을 높이기 위하여 적당한 렉틴, 폴리-L-리신 내지는 DMSO를 첨가할 수도 있다.

골수종 세포로서는 예를 들어, X-63Ag8, NS-1, P3U1, SP2/0, AP-1 등을 들 수 있다. 바람직하게는 SP2/0이 이용된다. 이용되는 항체 생산 세포(비장 세포)수와 골수종 세포수의 바람직한 비율은 1:20∼20:1이고, PEG(바람직하게는 PEG1000∼PEG6000)를 10∼80% 정도의 농도로 첨가하고, 20∼40℃, 바람직하게는 30∼37℃에서 1∼10분간 인큐베이트함으로써 효율적으로 세포 융합을 실시할 수 있다. 항SRCL-P1 항체 생산 하이브리도마의 스크리닝에는 여러가지 방법을 사용할 수있지만, 예를 들어 SRCL-P1항원을 직접 또는 담체와 함께 흡착시키는 고상(예를 들어, 마이크로플레이트)에 하이브리도마 배양 상청을 첨가하고, 다음으로 방사성 물질이나 효소 등으로 표식한 항면역 글로불린 항체(세포 융합에 이용되는 세포가 마우스인 경우, 항마우스 면역 글로불린 항체가 이용된다) 또는 프로테인 A를 첨가하고, 고상으로 결합한 항SRCL-P1 항체를 검출하는 방법, 항면역 글로불린 항체 또는 프로테인 A를 흡착시킨 고상에 하이브리도마 배양 상청을 첨가하고, 방사성 물질이나 효소 등으로 표식한 SRCL-P1을 첨가하고, 고상으로 결합한 항SRCL-P1 또는 단클론성 항체를 검출하는 방법 등을 들 수 있다.

항SRCL-P1 단클론성 항체의 선별 및 클로닝은 자체 공지 또는 그것에 준하는 방법에 따라 행할 수 있다. 통상 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘)을 첨가한 동물 세포용 배지로 행하여진다. 선별, 클로닝 및 육종용 배지로서는 하이브리도마가 생육할 수 있는 것이라면 어떠한 배지를 이용하여도 된다. 예를 들어, 1∼20%, 바람직하게는 10∼20%인 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 배지, 10∼20%의 소 태아 혈청을 포함하는 GIT 배지, 또는 하이브리도마 배양용 무혈청 배지 등을 이용할 수 있다. 배양 온도는 바람직하게는 약 37℃이다. 배양 시간은 통상 5일∼3주간, 바람직하게는 1주간∼2주간이다. 배양은 통상 5% 탄산가스하에서 행하여진다. 하이브리도마 배양 상청의 항체값은 상기 항혈청 중의 항SRCL-P1 항체값의 측정과 동일하게 측정할 수 있다. 즉, 측정 방법으로서는 방사면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소면역 측정법(ELISA), FIA(면역형광 분석방법), 프라그(plaque) 측정법, 응집 반응법 등을 이용할 수 있지만, 이하에 나타내는 ELISA법이 바람직하다.

ELISA법에 의한 스크리닝은 이하의 방법에 따라 행할 수 있다. 면역항원과 동일한 조작으로 조제한 단백질을 ELISA 플레이트의 각 웰의 표면에 고정화한다. 다음으로, 비특이적 흡착을 방지할 목적으로, BSA, MSA, OVA, KLH, 젤라틴 내지는 탈지유 등을 각 웰에 고정화한다. 이 각 웰에 하이브리도마 배양 상청액을 첨가하고, 일정 시간 방치하여 면역 반응을 행하게 한다. PBS 등을 세정액으로 하여 각 웰을 세정한다. 이 세정액 중에는 계면 활성제를 첨가하는 것이 바람직하다. 효소 표식 2차 항체를 첨가하여 일정 시간 방치한다. 표식 효소로서는 β-갈락토시다아제, 알칼리포스파다아제, 퍼옥시다아제 등을 이용할 수 있다. 동일 세정액으로 각 웰을 세정 후, 사용한 표식 효소의 기질 용액을 첨가하여 효소 반응을 행하게 한다. 첨가한 하이브리도마 배양 상청액 중에 목적으로 하는 항체가 존재하는 경우는, 효소 반응이 진행되어 기질 용액의 색이 변화한다.

클로닝은 통상 반고체 아거법이나 한계 희석법 등의 그 자체 공지의 방법으로 행할 수 있고, 구체적으로는 전기의 방법으로 목적으로 하는 항체를 생산하는 웰을 확인한 후, 클로닝을 행하여 단일 클론을 얻는다. 단일 클론법으로서는 배양 플레이트 1웰 당 1개의 콜로니가 형성되도록 하이브리도마 세포를 희석하여 배양하는 한계 희석법 등을 이용하면 좋다. 한계 희석법에 의한 클로닝에는 콜로니 형성 기능을 높이기 위하여 지지 세포를 이용하거나, 인터로이킨6 등의 세포 증식 인자를 첨가하여도 된다. 그 외 FACS 및 단일셀매니플레이션법을 이용하여 클로닝할 수 있다. 클론화된 하이브리도마를 바람직하게는 무혈청 배지 중에서 배양하고, 적량의 항체를 그상청에 첨가한다. 이와 같이 하여 얻어진 단일 하이브리도마는 플라스크나 세포 배양 장치를 이용하여 대량 배양을 행하거나, 동물의 복강내에서 배양함으로써(J. Immunol. Meth., 53, 313, 1982), 단클론성 항체를 얻을 수 있다. 플라스코 내에서 배양을 행하는 경우는 0∼20%의 FCS를 포함하는 세포 배양용 배지(IMDA, DMEM, RPMI1640 및 MEM 등)를 이용하여 행할 수 있다. 동물의 복강내에서 배양하는 경우는 세포 융합에 사용한 골수종 세포의 유래가 된 동물과 동종, 동계통의 동물 또는 뇌선 결손 누드 마우스 등을 사용하는 것이 바람직하고, 미리 프리스테인 등의 광물 오일을 투여하고나서 하이브리도마를 이식한다. 1∼2주간 후 복강내에 골수종 세포가 증식하고, 단클론성 항체를 포함하는 복수를 얻을 수 있다.

본 발명에 의한 단클론성 항체는 SRCL-P1에 특이적인 에피토프(epitope)를 인식하는 것을 선별함으로써, 다른 단백질과 교차하지 않도록 할 수 있다. 일반적으로 그 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중에서 연속하는 적어도 5이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 7∼20의 아미노산의 아미노 서열에 의해 제시된 에피토프는 그 단백질에 고유의 에피토프를 나타낸다고 한다. 따라서, 서열 번호 2 및 4중 어느 하나에 기재된 아미노산에서 선택되고, 또한 연속하는 적어도 5아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 의해 구성되는 에피토프를 인식하는 단클론성 항체는 본 발명에 있어서의 hSRCL-P1 내지는 mSRCL-P1 특이적인 단클론성 항체라고 할 수 있다. 서열 번호 2 및 4에 기재된 아미노산 서열 중에 보존된 아미노산 서열을 선택하면 SRCL-P1에 공통의 에피토프를 선택할 수 있다. 또는 각 서열에 특이적인 아미노산 서열을 포함하는 영역이라면, 각각의 단백질의 식별이 가능한 단클론성 항체를 선택할 수 있다.

항SRCL-P1 단클론성 항체의 분리 정제는 통상의 다클론성 항체의 분리 정제와 동일하게 면역 글로불린의 분리 정제법에 따라서 행할 수 있다. 공지의 정제법으로서는 예를 들어, 염석법, 알콜 침전법, 등전점 침전법, 전기영동법, 황산암모늄 침전법, 이온 교환법(예를 들어, DEAE)에 의한 흡착탈법, 초원심법, 겔여과법, 항원결합고상 또는 프로테인A 내지는 프로테인G 등의 활성 흡착제에 의해 항체만을 채취하고, 결합을 해리시켜서 항체를 얻는 특이적 정제법과 같은 수법을 실시할 수 있다. 정제 과정에 있어서 응집물의 형성이나 항체값의 저하를 방지할 목적으로, 예를 들어 인간 혈정 알부민을 0.05∼2%의 농도로 첨가한다. 그 외, 글리신, α-알라니 등의 아미노산류, 특히 리신, 아르기닌 및 히스티딘 등의 염기성 아미노산, 글루코스나 만니톨 등의 당류 또는 염화나트륨 등의 염류를 첨가하여도 된다. IgM 항체의 경우, 특히 응집하기 쉽다고 알려져 있기 때문에 β-프로피오락톤 및 무수초산으로 처리하여도 된다.

본 발명의 다클론성 항체는 그 자체 공지 또는 그것에 준하는 방법에 따라서 제조할 수 있다. 예를 들어, 면역항원(단백질 항원) 자체 또는 그것과 캐리어 단백질과의 복합체를 만들고, 상기의 다클론성 항체의 제조방법과 동일하게 온혈 동물에 면역을 행하고, 상기 면역 동물로부터 본 발명의 단백질 또는 그 단편에 대한 항체 함유물을 채위하고, 항체의 분리 정제를 행함으로써 제조할 수 있다. 온혈 동물을 면역하기 위하여 이용되는 면역 항원과 캐리어 단백질과의 복합체에 관하여, 캐리어 단백질의 종류 및 캐리어와 합텐과의 혼합비는 캐리어에 가교시켜서 면역한 합텐에대하여 항체가 효율적으로 생기면, 어떠한 것을 어떠한 비율로 가교시켜도 좋지만, 예를 들어 소혈청 알부민이나 소 티로글로불린(thyroglobulin), 헤모시아닌 등을 중량비로 합텐 1에 대하여, 약 0.1∼20, 바람직하게는 1∼5의 비율로 결합시키는 방법이 이용된다. 합텐과 캐리어의 결합에는 여러가지 결합제를 이용할 수 있지만, 글루타르알데히드나 카르보디이미드(carbodiimide), 말레이미드 활성 에스테르, 티올기, 디티오피리질기를 함유하는 활성 에스테르 시약 등이 이용된다. 축합 생성물은 온혈 동물에 대하여 항체 생산이 가능한 부위에 그 자체 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여시에 항체 생산을 높이기 위하여 완전 항원이나 불완전 항원을 투여하여도 된다. 투여는 통상 2∼6주마다 1회씩, 합계 약 3∼10회 정도 행하여진다. 다클론성 항체는 상기 방법으로 면역된 온혈 동물의 혈액, 복수(腹水) 등, 바람직하게는 혈액에서 채취할 수 있다. 항혈청 중의 다클론성 항체값의 측정은 상기 혈청 중의 항체값의 측정과 동일하게 하여 측정할 수 있다. 다클론성 항체의 분리 정제는 상기 단클론성 항체의 분리 정제와 동일한 면역 글로불린의 분리 정제법에 따라 행할 수 있다.

항체의 이용 방법

SRCL-P1 또는 그 단편에 대한 단클론성 항체 및 다클론성 항체는 SRCL-P1을 발현하고 있는 세포에 관련된 질병의 진단이나 치료에 이용하는 것이 가능하다. 이들의 항체를 이용하여 본 발명의 SRCL-P1 또는 그 단편과의 면역학적인 결합에 기초하여, SRCL-P1 또는 그 단편을 측정할 수 있다. 구체적으로 이들의 항체를 이용하여 SRCL-P1 또는 그 단편을 측정하는 방법으로서는 예를 들어, 불용성 담체에 결합시킨항체와 표식화 항체에 의해 SRCL-P1 또는 그 단편을 반응시켜서 생성한 샌드위치 복합체를 검출하는 샌드위치법, 또는 표식화 SRCL-P1와 검체 중의 SRCL-P1 또는 그 단편을 항체와 경합적으로 반응시키고, 항체와 반응한 표식 항원량에서 검출 중의 SRCL-P1 또는 그 단편을 측정하는 경합법을 이용하여 검출 중의 SRCL-P1 또는 그 단편을 측정하는 방법을 들 수 있다.

샌드위치법에 의한 SRCL-P1 또는 그 단편의 측정에 있어서는 우선, 고정화 항체와 SRCL-P1 또는 그 단편을 반응시킨 후, 미반응물을 세정에 의해 완전히 제거하고, 표식화 항체를 첨가하여 고정화 항체-SRCL-P1 표식화 항체를 형성시키는 2단계법 내지는 고정화 항체, 표식화 항체 및 SRCL-P1 또는 그 단편을 동시에 혼합하는 1단계법 등을 이용할 수 있다.

측정에 사용되는 불용성 담체는 예를 들어, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리염화비닐, 폴리에스테르, 폴리아크릴산에스테르, 나이론, 폴리아세탈, 불소수지 등의 합성 수지, 셀룰로오스, 아가로스 등의 다당류, 유리, 금속 등을 들 수 있다. 불용성 담체의 형상으로서는 예를 들어, 트레이 형상, 구 형상, 섬유 형상, 막대 형상, 체커판 형상, 용기 형상, 셀, 시험관 등의 여러 형상을 이용할 수 있다. 항체를 흡착한 담체는 적당한 아자이드나트륨 등의 방부제의 존재하, 시원한 곳에 보존한다.

항체의 고층화에는 공지의 화학적 결합법 또는 물리적 흡착법을 이용할 수 있다. 화학적 결합법으로서는 예를 들어, 글루타르알데히드를 이용하는 방법, N-숙신이미딜-4-(N-말레이미드메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 및 N-숙신이미딜-2-말레이미드아세테이트 등을 이용하는 말레이미드법, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르복시이미드 염산 등을 이용하는 카르보디이미드법을 들 수 있다. 그 외, 말레이미드벤조일-N-하이드록시숙신이미드에스테르법, N-숙시미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피온산법, 비스디아조화벤지딘법, 디팔미틸리진법을 들 수 있다. 또는 앞서 피검출 물질과 에피토프가 다른 2종류의 항체를 반응시켜서 형성시킨 복합체를, 항체에 대한 제 3 항체를 상기 방법으로 고층화시켜 두어 포착하는 것도 가능하다.

표식 물질로서는 효소, 형광 물질, 발광 물질, 방사성 물질 및 금속 킬레이트 등을 사용하는 것이 바람직하다. 효소로서는 예를 들어, 퍼옥시다아제, 알칼리포스파다아제, β-D-갈락토시다아제, 사과산 디하이드로게나아제, 포도산 구균 뉴클레아제, δ-5-스테로이드이소메라아제, α-글리세롤포스페이트디하이드로게나아제, 트리오스포스페이트이소메라아제, 호스라디쉬 퍼옥시다아제, 아스파라기나아제, 글루코스옥시다아제, 리보뉴클레아제, 요소 분해 효소, 카탈라아제, 글루코스-6-포스페이트디하이드로게나아제, 글루코아밀라아제, 아세틸콜린에스라아제 등을 들 수 있고, 형광 물질로서는 예를 들어, 플루오레세인이소시아네이트, 피코빌리프로테인, 로다민, 피코에리스린, 피코시아닌, 아로피코시아닌, 오르토푸탈알데히드 등을 들 수 있고, 발광 물질로서는 이소누미놀, 루시게닌, 루미놀, 방향족아크리디늄에스테르, 이미다졸, 아크리디늄염 및 그 수식 에스테르, 루시페린, 루시페라아제, 에크오린 등을 들 수 있고, 방사성 물질로서는¹²⁵I,¹²⁷I,¹³¹I,¹⁴C,³H,³²P,³⁵S 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않고 면역학적 측정법에 사용할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 또한, 항체에 비오틴, 디니트로페닐, 피리독살 또는 플루오레사민 같은 저분자 합텐을 결합시켜도 된다. 바람직하게는 호스라디쉬 퍼옥시다아제를 표식화 효소로서 이용한다. 본 효소는 많은 기질과 반응할 수 있어 과요드산법에 의해 용이하게 항체에 결합시킬 수 있다.

표식화제가 효소인 경우에는 그 활성을 측정하기 위하여 기질, 필요에 따라 발색제를 이용한다. 효소로서 퍼옥시다아제를 이용하는 경우에는 기질 용액으로서 H2O2를 이용하고, 발색제로서 2,2’-아미노-디-[3-에틸벤즈티아졸린술폰산]암모늄염 (ABTS), 5-아미노살리실산, 오르토페닐렌디아민, 4-아미노안티피린, 3,3’,5,5’-테트라메틸벤지딘 등을 사용할 수 있고, 효소에 알칼리포스파타아제를 이용하는 경우는 기질로서 오르토니트로페닐포스페이트, 파라니트로페닐린산 등을 사용할 수 있고, 효소에 β-D-갈락토시다아제를 이용하는 경우는 기질로서 플루오레세인-디-(β-D-갈락토피라노시드), 4-메틸운베리페닐-β-D-갈락토피라노시드 등을 사용할 수 있다. 본 발명에는 또한 전술의 단클론성 항체, 다클론성 항체 및 시약류를 키트화한 것도 포함된다.

가교제로서는 N,N’-오르토페닐렌디말레이미드, 4-(N-말레이미드메틸)시클로헥산산·N-숙신이미드에스테르, 6-말레이미드헥산산·N-숙신이미드에스테르, 4,4’-디티오피리딘, 그 외 공지의 가교제가 이용 가능하다. 이들의 가교제와 효소 및 항체와의 반응은 각각의 가교제의 성질에 따라 기지의 방법에 따라 행하면 된다. 또한, 항체로서는 경우에 따라서는 그 프래그먼트, 예를 들어 Fab’, Fab,F(ab’)₂를 이용한다. 또한 다클론성 항체, 단클론성 항체에 상관없이 동일한 처리에 의해 효소 표식체를 얻을 수 있다. 상기 가교제를 이용하여 얻어지는 효소 표식체를 친화성 크로마토그래피법 등의 공지의 방법으로 정제하면, 더욱 감도가 높은 면역 측정계가 가능해진다. 정제한 효소 표식화 항체는 안정제로서 티메로살 내지는 글리세린 등을 첨가하고, 또는 동결 건조하여 냉암소에 보존한다.

측정 대상은 혈장, 혈청, 혈액, 소변, 조직액, 뇌척수액 등의 체액, 각종 세포, 조직 등, SRCL-P1을 포함하는 시료라면 한정되지 않는다.

인간화 항체의 제조방법

인간에 임의의 항원을 면역하여 항체를 제조하는 것은 윤리상 불가능하다. 또한, 마우스 단클론성 항체를 인간의 체내에 투여하면, 인간에게 있어서 이종 단백질이기 때문에 여러가지 부작용이 생길 위험성이 있다. 그래서 인간에게 항체를 투여하는 경우에는 인간에 대하여 항원성을 낮게 한 항체가 바람직하다.

인간 단클론성 항체의 제조 방법에는 세포 융합법 이외에도, 포진 바이러스(Epstein-Barr virus)로 형질전환하는 방법, 그 형질전환한 세포를 친세포와 융합시키는 방법, 유전자 공학을 이용하여 키메라 항체, 인간화 항체를 제조하는 방법 등이 있다. 키메라 항체란 이종의 동물의 면역 글로불린 유전자 단편을 연결하여 제조된 항체이고, 인간화 항체란 마우스 등에 인간에게 있어서 이종의 항체를 개변하여 H 사슬과 L 사슬의 상보성 결정부(CDR) 이외의 1차 구조를 인간의 항체가 대응하는 1차 구조로 치환한 항체를 말한다.

키메라 항체의 제조방법으로서 우선, 마우스에 면역하여 그 마우스 단클론성 항체의 유전자에서 항원과 결합하는 항체 가변부(V 영역)를 절단하고, 인간 골수종 유래의 항체 정상부(C 영역) 유전자와 결합하여 키메라 유전자를 제조한다. 이 키메라 유전자를 숙주 세포에서 발현시키면 인간·마우스·단클론성 항체를 생산할 수 있다. 키메라 항체는 인간에 대한 항원성이 적기 때문에 인간 체내에 투여하는 치료용이나 화상 진단용 단클론성 항체 등으로서 이용할 수 있다. 공지의 키메라 항체의 관련 기술로서, 일본국 특허 공개공보 (평)05-304989호, (평)04-330295호, WO9106649, (소)63-036786호, 일본국 등록공보 (평)06-98021호 등이 있다.

또한, 최근 키메라 항체보다도 유용하다는 인간화 항체가 개발되었다. 인간화 항체란 항체 분자의 항원 결합 부위(CDR: Complementary determining reagion, 상보성 결정 영역)의 유전자 서열만을 인간 항체 유전자에 이식(CDR 그래프팅)하고, 항체 분자의 CDR을 제외한 모든 분자를 인간화한 항체이다. 본 항체는 인간·마우스·키메라 항체보다 마우스의 항체 부분이 적기 때문에 항원성이 적고 안전성이 높다고 알려져 있다. 인간 단클론성 항체 제조용의 친세포는 인간/마우스의 헤테로 골수종(myeloma)인 SHM-D 33주(ATCC CRL 1668) 또는 RF-S1 주를 이용하면 마우스의 친세포와 동등한 높은 융합 효율이 얻어진다. 이들의 친세포를 이용하여 얻어진 하이브리도마는 피더 세포없이 클로닝이 가능하고, IgG 타입의 항체를 비교적 안정하게 대량으로 생산할 수 있다. 친세포의 배양에는 15% FCS를 첨가한 ERDF 배지를 이용하고, 그 외의 조작은 마우스의 경우와 동일하다. 또한, IgG 타입의 인간 단클론성 항체를 제조하려면 항원으로 충분히 감작된 인간 임파구를 말소혈에서 채취하여이용하는 것이 바람직하다. 충분히 항원으로 감작된 임파구의 취득이 곤란한 경우에는 in vitro로 항원 감작을 행할 수도 있다. 일본에서는 현재, 성인성 T세포 백혈병에 대한 인간화 항체의 임상 시험이 행하여지고 있다. 인간화 항체의 제조방법 및 그 관련 기술에 대해서는 예를 들어, 미국 Genentech사(WO9222653, WO9845332, WO9404679, WO9837200, WO9404679) 및 영국 Celltech사(WO9429451, WO9429351, WO9413805, WO9306231, WO9201059, WO9116927, WO9116928, WO9109967, WO8901974, WO8901783) 등에 개시된 기술을 이용할 수 있다.

상기 나타낸 방법 등을 이용함으로써 본 발명의 항체를 인간화할 수 있고, 인간에게 투여하는 경우에는 매우 유용하다.

조성물

SRCL-P1 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질, 및 항체 물질, 그리고 SRCL-P1의 안타고니스트 등은 산화 LDL(변성 LDL)축적에 관한 병태, 예를 들어 죽종성 동맥경화증 등의 동맥경화를 비롯하여, 세포로의 AGE의 결합에 관한 사구체 경화증 등의 장해, 당뇨병성 합병증 및 AD, 고β지단백혈증, 고콜레스테롤혈증, 고트리글리셀라이드혈증, 저α지단백혈증, 이식, 죽종절제술 및 혈관 형성후 재협착, 세균 감염증 등을 비롯한 각종 질환 등의 진단, 예방 및 치료법과, 그들을 위한 시약이나 의약의 개발에 이용할 수 있는 가능성이 있다. 또한, 이들 공지의 의약과의 병용 또는 배합도 할 수 있다. 예를 들어, 죽종성 동맥결화증의 치료약, 예를 들어 ACAT 억제제, HMG-CoA 환원효소 저해제, 지질 조절제, 담즙산 조절제와 병용 또는 배합할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 SRCL-P1 폴리뉴클레오타이드 및 단백질, SRCL-P1 단백질의 활성 또는 활성화를 자극하는 물질 또는 저해하는 물질, SRCL-P1 단백질에 대한 항체 등의 물질(이하, SRCL-P1 관련 물질)이 포함된다. SRCL-P1 관련 물질은 그대로 또는 물에 희석하는 등의 각종 처리를 실시하여 사용할 수 있지만, 의약품, 의약품 외품 등에 배합하여 사용할 수 있다. 이 경우, 상기 물질의 배합량은 제품에 따라 적당히 선택되지만, 통상 전신 투여 제제의 경우에는 0.001∼50중량%, 특히 0.01∼10중량%로 할 수 있고, 0.001%보다 적으면 만족할 누액 분비 촉진 작용이 인정되지 않을 가능성이 있으며, 또한 50%를 초과하면 제품 그 자체의 안정성이나 향미 등의 특성이 손상될 가능성이 있다.

투여 경로는 전술한 경구 투여 및 정맥내 투여 이외에, 경점막 투여, 경피 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 직장내 투여, 안국소 투여 등을 적당히 선택할 수 있다.

본 발명의 SRCL-P1 관련 물질은 염으로서 제제 중에 함유되어 있어도 된다. 약제학적으로 허용되는 염으로서는 예를 들어, 무기염기, 유기염기 등의 염기와의 염, 무기산, 유기산, 염기성 또는 산성 아미노산 등의 산부가염 등을 들 수 있다. 무기염기로서는 예를 들어, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 칼슘, 마그네슘 등의 알칼리토류 금속, 알루미늄, 암모늄 등을 들 수 있다. 유기염기로서는 예를 들어, 에탄올아민 등의 1차 아민, 디에틸아민, 디에탄올아민, 디시클로헥실아민, N,N’-트리벤질에틸렌디아민 등의 2차 아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 트리에탄올아민 등의 3차 아민 등을 들 수 있다. 무기산으로서는 예를 들어, 염산,브롬화산, 질산, 황산, 인산 등을 들 수 있다. 유기산으로서는 예를 들어, 포름산, 초산, 젖산, 트리플루오로초산, 포말산, 수산, 주석산, 말레인산, 안식향산, 구연산, 호박산, 사과산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등을 들 수 있다. 염기성 아미노산으로서는 예를 들어, 아르기닌, 리신, 오르니틴 등을 들 수 있다. 산성 아미노산으로서는 예를 들어, 아스파라긴산, 글루타민산 등을 들 수 있다.

경구 투여를 행하는 경우의 제형으로서, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 정제, 엘릭서제, 현탁제, 유제 및 시럽제 등이 있고, 적당히 선택할 수 있다. 또한 이들 제제에 대하여 서방화, 안정화, 붕괴 용이화, 난붕괴화, 장용성화, 흡수 용이화 등의 수식을 실시할 수 있다. 또한, 구강내 국소 투여를 행하는 경우의 제형으로서, 저작제, 혀밑샘제, 구강제, 트로키제, 연고제, 첩포제, 액제 등이 있고, 적당히 선택할 수 있다. 또한, 이들 제제에 대하여 서방화, 안정화, 붕괴 용이화, 난붕괴화, 장용성화, 흡수 용이화 등의 수식을 실시할 수 있다.

전술한 제형에 대하여, 공지의 약물 전달 시스템(DDS)의 기술을 채용할 수 있다. 본 명세서에서 말하는 DDS 약제란 제법화 제제, 국소적용 제제(트로키, 구강정, 혀밑샘정 등), 약물 방출 제어 제제, 부작용 등을 감안한 후에 최적의 제제 형태로 한 제제를 말한다.

DDS의 구성 요소에는 기본적으로 약물, 약물 방출 모듈, 치료 프로그램으로 이루어지고, 각각의 구성 요소에 대하여 특히 방출을 정지시켰을 때에 신속히 혈중 농도가 저하하는 반감기가 짧은 약물이 바람직하고, 투여 부위의 생체 조직과 반응하지 않는 것이 바람직하고, 또한, 설정된 기간에 있어서 최적의 약물 농도를 유지하는 치료 프로그램을 갖는 것이 바람직하다.

약물 방출 모듈은 기본적으로 약물 저장고, 방출 제어부, 에너지원 및 방출 구멍 또는 방출 표면을 가지고 있다. 이들 기본적 구성 요소를 전부 갖출 필요는 없고, 적당히 추가 또는 삭제 등을 행하여 최적의 형태를 선택할 수 있다.

DDS로 사용할 수 있는 재료로서는 고분자, 시클로덱엄격한유도체, 레시틴 등이 있다. 고분자에는 불용성 고분자(실리콘, 에틸렌·초산비닐 공중합체, 에틸렌·비닐알콜 공중합체, 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트 등), 수용성 고분자 및 하이드록실겔 형성 고분자(폴리아크릴아미드, 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트 가교체, 폴리아크릴 가교체, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌옥사이드, 수용성 셀룰로오스 유도체, 가교 폴록사머, 키틴, 키토산 등), 서용해성 고분자(에틸셀룰로오스, 메틸비닐에테르, 무수말레인산 공중합체의 부분 에스테르 등), 위용성 고분자(하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 카멜로스나트륨, 마크로골, 폴리비닐피롤리돈, 메타아크릴산디메틸아미노에틸·메타아크릴산메틸코폴리머 등), 지용성 고분자(하이드록시프로필메틸셀룰로오스푸탈레이트, 초산푸탈셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스아세테이트석시네이트, 카르복실메틸에틸셀룰로오스, 아크릴산계 폴리머 등), 생분해성 고분자(열응고 또는 가교 알부민, 가교 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리β하이드록시초산, 폴리카프로락톤 등)이 있고, 제형에 따라 적당히 선택할 수 있다.

특히, 실리콘, 에틸렌·초산비닐 공중합체, 에틸렌-비닐알콜 공중합체, 메틸비닐에테르·무수말레인산 공중합체의 부분 에스테르는 약물의 방출 제어에 사용할 수 있고, 셀룰로오스아세테이트는 침투압 펌프의 재료로서 사용할 수 있으며, 에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스는 서방성 제제의 막 효소로소 사용할 수 있고, 폴리아크릴 가교체는 구강 점막 또는 안점막 부착제로서 사용할 수 있다.

또한, 제제 중에는 그 제형(경구 투여제, 주사제, 좌제 등의 공지의 제형)에 따라서, 용제, 부형제, 코팅제, 기제, 결합제, 활택제, 붕괴제, 용해보조제, 현탁화제, 점조제, 유화제, 안정제, 완충제, 등장화제(等張化劑), 무통화제(無痛化劑), 보존제, 교미제, 방향제, 착색제 등의 첨가제를 첨가하여 제조할 수 있다.

각각 구체예를 들어 예시하지만, 본 발명은 이들에 특별히 한정되지 않는다.

[용제] 정제수, 주사용수, 생리식염수, 땅콩 기름, 에탄올, 글리세린, [부형제] 전분류, 젖당, 백당, 결정 셀룰로오스, 황산 칼슘, 탄산 칼슘, 탈크, 산화티탄, 트레할로스, 크실리톨, [코팅제] 백당, 젤라티나 초산푸탈산셀룰로오스 및 상기 기재한 고분자, [기제] 바셀린, 식물기름, 마크로골, 오일인워터(oil-in-water) 타입 에멜젼 기제, 워터인오일 타입 에멀젼 기제, [결합제] 전분 및 그 유도체, 셀룰로오스 및 그 유도체, 젤라틴, 알긴산나트륨, 트라간트(traganth), 아라비아 고무 등의 천연 고분자 화합물, 폴리비닐피롤리돈 등의 합성 고분자 화합물, 덱엄격한 하이드록시프로필스타치, [활택제] 스테아린산 및 그 염류, 탈크, 왁스류, 밀가루 전분, 마크로골, 수소첨가식물 기름, 수크로오스지방산에스테르, 폴리에틸렌글리콜, [붕괴제] 전분 및 그 유도체, 한천, 젤라틴, 탄산수소나트륨, 셀룰로오스 및 그 유도체, 카멜로오스칼슘, 하이드록시프로필스타치, 카르복시메틸셀룰로오스 및 그 염류와, 그 가교체, 저치환형 하이드록시프로필셀룰로오스, [용해보조제] 시클로덱엄격한 에탄올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, [현탁화제] 아라비아 고무, 트라간트, 알킨산나트륨, 모노스테아린산알루미늄, 구연산, 각종 계면활성제, [점조제] 카멜로스나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐알콜, 트라간트, 아라비아 고무, 알킨산나트륨, [유화제] 아라비아 고무, 콜레스테롤, 트라간트, 메틸셀룰로오스, 각종 계면활성제, 레시틴, [안정제] 아황산수소나트륨, 아스코르빈산, 토코페롤, 킬레이트제, 불활성 가스, 환원성 물질, [완충제] 인산수소나트륨, 초산나트륨, 붕산, [등장화제] 염화나트륨, 포도당, [무통화제] 염산프로카인, 리도케인, 벤질알콜, [보존제] 안식향산 및 그 염류, 파라옥시안식향산에스테르류, 클로로부탄올, 역성비누, 벤질알콜, 페놀, 티로메살, [교미제] 백당, 사카린, 감초 엑기스, 솔비톨, 크실리톨, 글리세린, [방향제] 두피 팅크제, 장미유, [착색제] 수용성 식용 색소, 레이크 색소.

본 발명은 매크로파지 및 기초면역의 기능의 해명, 동맥경화, 당뇨병성 합병증 및 알츠하이머병, 고β지단백혈증, 고콜레스테롤혈증, 고트리글리세라이드혈증, 저α지단백혈증, 이식, 죽종절제술 및 혈관 형성 후 재협착, 세균 감염증 등을 비롯한 각종 질환 등의 발증 기구의 해명, 및 그 진단과 예방, 및 치료법과, 이를 위한 시약이나 의약의 개발에 이용할 수 있는 신규 스캐빈저 리셉터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명은

(1)서열 번호 2인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 742개로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열에 있어서 1개 내지는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 서열 번호 2인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질과 동등한 성질을 갖는 단백질, 또는 이들의 유도체 내지는 단편,

(2)서열 번호 1인 염기 번호 74∼2299로 나타낸 염기 서열, 서열 번호 2인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 서열 또는 그 단편을 코드하는 염기 서열, 또는 이들 염기 서열 내지는 이들 염기 서열과 상보적인 염기 서열, 및 엄격한 조건하에서 하이브리드화(hybridize)하고, 또한 서열 번호 2인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질과 동등한 성질을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드,

(3)서열 번호 24인 아미노산 번호 1∼618로 나타낸 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 서열 번호 24로 나타낸 아미노산 서열에 있어서 1개 내지는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 서열 번호 24인 아미노산 번호 1∼618로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질과 동등한 성질을 갖는 단백질, 또는 이들의 유도체 내지는 단편,

(4)서열 번호 23인 염기 번호 74∼1933으로 나타낸 염기 서열, 서열 번호 24인 아미노산 번호 1∼618로 나타낸 아미노산 서열 또는 그 단편을 코드하는 염기 서열, 또는 이들 염기 서열 내지는 이들 염기 서열과 상보적인 염기 서열, 및 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 또한 서열 번호 24인 아미노산 번호 1∼618로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질과 동등한 성질을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드,

(5)서열 번호 4인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 742개로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열에 있어서 1개 내지는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 서열 번호 2인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질과 동등한 성질을 갖는 단백질, 또는 이들의 유도체 내지는 단편,

(6)서열 번호 3인 염기 번호 74∼2299로 나타낸 염기 서열, 서열 번호 2인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 서열 또는 그 단편을 코드하는 염기 서열, 또는 이들 염기 서열 내지는 이들 염기 서열과 상보적인 염기 서열, 및 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 또한 서열 번호 2인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질과 동등한 성질을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드,

(7) (2), (4) 또는 (6)에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터,

(8) (2), (4) 또는 (6)에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 발현 가능하게 유지하는 형질전환 세포,

(9) (2) 또는 (4)에 기재된 폴리뉴클레오타이드로 형질전환한 세포를 배양하고, 생산된 hSRCL-P1 단백질을 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 제조방법,

(10) (6)에 기재된 염기 서열로 형질전환한 세포를 배양하고, 생산된 mSRCL-P1 단백질을 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 제조방법,

(11)세포가 대장균, 동물 세포 또는 곤충 세포인, (9) 또는 (10)에 기재된 제조방법,

(12)SRCL-P1 유전자의 발현 레벨을 변화시킨 형질전환 비인간 동물,

(13)SRCL-P1 유전자가 SRCL-P1을 코드하는 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA인 (12)에 기재된 형질전환 비인간 동물,

(14)유전자 발현 조절 부위에 변이를 일으킴으로써 발현 레벨을 변화시킨 (13)에 기재된 형질전환 비인간 동물,

(15)mSRCL-P1 유전자의 기능을 결손시킨 녹아웃 마우스,

(16)(1), (3) 또는 (5)에 기재된 단백질 또는 그 단편에 대한 항체,

(17)다클론성 항체(polyclonal antibody), 단클론성 항체(single clonal antibody) 또는 펩티드 항체인 (16)에 기재된 항체,

(18)인간 이외의 온혈 동물에 (1), (3) 또는 (5)에 기재된 단백질 또는 그 단편을 투여하고, 항체값이 인정되는 상기 동물을 선택하여 비장 또는 임파절을 채취하고, 그들에 포함되는 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합시킴으로써, 단클론성 항체 생산 하이브리도마(hybridoma)를 조절하는 것을 포함하는, (1), (3) 또는 (5)에 기재된 단백질 또는 그 단편에 대한 단클론성 항체의 제조방법,

(19)(16) 또는 (17)에 기재된 항체와 SRCL-P1 단백질 또는 그 단편과의 면역학적인 결합에 기초하여, 상기 단백질 또는 그 단편을 정량하는 방법,

(20)(16) 또는 (17)에 기재된 항체와 SRCL-P1 단백질 또는 그 단편과의 면역학적인 결합에 기초하여, 상기 단백질 또는 그 단편을 검출하는 방법,

(21)(1), (3) 또는 (5)에 기재된 단백질의 활성을 자극하는 아고니스트,

(22)(1), (3) 또는 (5)에 기재된 단백질의 활성 또는 활성화를 저해하는 안타고니스트,

(23)(1), (3) 또는 (5)에 기재된 단백질을 이용하는 것을 특징으로 하는 약물의 스크리닝 방법,

(24)(23)에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어진 약물,

(25)산화 LDL축적에 관여하는 병태를 처리하기 위한 약물의 스크리닝 방법으로서, (1), (3) 또는 (5)에 기재된 단백질과 산화 LDL와의 결합량을 후보 약물의 존재하 및 비존재하에서 비교함으로써 평가되는, 상기 단백질과 산화 LDL와의 결합에 대한 후보 약물의 저해 기능에 의해, 산화 LDL 축적에 관여하는 병태를 처리하기 위한 약물을 동정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물의 스크리닝 방법,

(26)(25)에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어진 약물,

(27)산화 LDL 축적에 관여하는 병태를 처리하는 방법으로, (26)에 기재된 약물을 이용하여, SRCL-P1 단백질 또는 그 단편과 산화 LDL와의 결합을 저해하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법,

(28)산화 LDL 축적에 관여하는 병태를 처리하기 위한 의약 조성물로, (26)에 기재된 약물을 포함하는 의약 조성물,

(29)세포로의 AGE의 결합에 관여하는 병태를 처리하기 위한 약물의 스크리닝 방법으로, (1), (3) 또는 (5)에 기재된 단백질과 AGE와의 결합량을 후보 약물의 존재하 및 비존재하에서 비교함으로써 평가되는, 상기 단백질과 AGE와의 결합에 대한 후보 약물의 저해 기능에 의해, 세포로의 AGE의 결합에 관여하는 병태를 처리하기 위한 약물을 동정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물의 스크리닝 방법,

(30)(29)에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어진 약물,

(31)세포로의 AGE의 결합에 관여하는 병태를 처리하는 방법으로, (30)에 기재된 약물을 이용하여, SRCL-P1 단백질 또는 그 단편과 AGE와의 결합을 저해하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법, 및

(32)AGE의 세포로의 결합에 관여하는 병태를 처리하기 위한 의약 조성물로, (30)에 기재된 약물을 포함하는 의약 조성물을 제공한다.

이하에, 본 발명의 신규 스캐빈저 리셉터에 관하여 실시에에 따라서 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시에의 개시에 의해 본 발명이 한정적으로 해석되지는 않는다.

즉, EST 데이터베이스의 검색(실시예 1), 스크리닝용 프로브의 제작(실시예 2), 인간 태반 유래 cDNA 라이브러리의 스크리닝(실시예 3), 신규 인간 스캐빈저 리셉터의 염기 서열의 결정(실시예 4), 및 신규 스캐빈저 리셉터를 일과성으로 발현하는 트랜스펙턴트(transfectant)의 제조방법(실시예 6 및 7), 신규 인간 스캐빈저 리셉터를 안정적으로 발현하는 트랜스펙턴트의 제조방법(실시예 8 및 9), 신규 인간 스캐빈저 리셉터의 결합 특이성의 검증(실시예 10), 탐식 기능의 증명(실시예 11), 그리고 혈관내피세포에서의 발현의 증명(실시예 12)을 예증하여 이하에 설명한다.

실시예 1: EST 데이터베이스의 검색

기지의 컬렉틴 즉, 인간 MBP, 인간 SP-A 및 인간 SP-D의 아미노산 서열(도 2 및 3참조, 도면에서 상동이라고 인정되는 아미노산 잔기 부분에 박스로 표시)을 비교함으로써, 분자 사이에 보존성이 높은 영역의 검색을 행하였다. 그 결과, 인간 MBP의 아미노산 서열에 있어서의 제 220번째부터 246번째까지의 27아미노산(도 3, 흰글씨 부분, 서열 번호 5)에 보존성이 높다는 것이 명확해졌기 때문에, 이 영역에 상당하는 컨센서스 서열을 몇개 작성하고, EST(Expressed Sequence Tags) 데이터베이스의 검색을 행하였다. EST 데이터베이스는 1996년 10월 11일에 676750건의 서열을 포함하는 것을 사용하였다.

그 결과, 상기 27아미노산의 서열과 상동성이 높은 아미노산 서열을 포함하는 데이터를 몇 개 얻을 수 있었다. 얻어진 데이터의 아미노산 서열에 대하여 GenBank/EST 데이터베이스의 검색을 행하고, 기지의 물질인가 또는 미지의 물질인가를 판정한 결과, 컨센서스 서열로서,

Glu-Lys-Cys-Val-Glu-Met-Tyr-Thr-Asp-Gly-Lys-Trp-Asn-Asp-Arg-Asn-Cys-Leu-Gln-Ser-Arg-Leu-Ala-Ile-Cys-Glu-Phe(서열 번호 6)으로 나타낸 아미노산 서열을 이용하여 검색하였을 때 얻어진 데이터 중에, 상동성은 높지만 미지의 염기 서열을 포함하느 2종의 데이터(등록번호: W72977 및 R74387)를 얻을 수 있었다. 이들은 각각 태반 유래 및 태아 심장 유래이고, 신규 컬렉틴의 염기 서열의 일부를 나타내는 클론이었다.

그래서, 그 중 태아 심장 유래의 클론(I.M.A.G.E. Consortium Clone ID 34472)을 ATCC(American Type Culture Collection)에 의해 구입하고, 이하의 신규 스캐빈저 리셉터 취득을 위한 스크리닝용 프로브 제작에 이용하였다.

실시예 2: 스크리닝용 프로브의 제작

상기 클론의 인서트 DNA의 염기 서열을 프라이머(팔마시아사 제품, M13 Universal Primer(서열 번호 7,5’-플루오레세인-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3’) 및 M13 Reverse Primer(서열 번호 8,5’-플루오레세인-caggaaacagctatgac-3’))로 결정하였다.

이 염기 서열로부터 해독 프레임을 컬렉틴의 아미노산 서열에 합쳐서, 그것으로부터 해독할 수 있는 아미노산 서열에 상당하는 염기 서열을 추출하고, 이 일부분에 상당하는 디곡시게닌(DIG)라벨 cDNA 프로브용 프라이머(Reverse 프라이머, caatctgatgagaaggtgatg(서열 번호 9) 및 Forward 프라이머, acgaggggctggatgggacat(서열 번호 10)을 어프라이드바이오 시스템즈사 제품 392A DNA/RNA 신시사이저를 이용하여 제작하였다. DIG 라벨은 PCR DIG프로브 합성 키트(베링거·만하임사 제품)을 이용하여 행하였다. 반응 조성은 이하와 같다(플라스미드 DNA(클론 W72977, 50ng/㎕): 2㎕(100ng), 10 × 완충액: 5㎕, 25mM MgCl₂: 5㎕,dNTP(PCR 라벨링 믹스): 5㎕, 20μM Reverse 프라이머: 2.5㎕, 20μM Forward 프라이머: 5㎕, H₂O: 28㎕, Taq폴리메라아제: 0.5㎕). PCR 반응은 아토사 제품 지모리액터를 이용하여, 92℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분의 사이클을 35회 행하였다.

실시예 3: 인간 태반 유래 cDNA 라이브러리의 스크리닝

우선, 이하와 같이 인간 태반 유래 파지 cDNA라이브러리의 타이트레이션을 행하였다. mLB배지(10mM MgSO₄및 0.2% 말토오스를 포함하는 배지(1g 트립톤, 0.5g 이스트엑스트랙트, 0.5g NaCl/100㎖)로 37℃에서 16시간 배양하였다Escherichia coliY1090r- 0.2㎖과, SM 완충액(5.8g NaCl, 2g MgSO₄·7H₂O, 2M Tris-HCl(pH 7.5)25㎖, 5㎖ 2% 젤라틴/L)으로 계층 희석한 cDNA 라이브러리 0.1㎖을 37℃에서 15분 인큐베이트하고, 그 후 2.5㎖의 LB-TOP 아가로스(0.75% 아가로스/LB배지)에 첨가하여 균일하게 하고, 90mmφLB 배지 플레이트(이와시로가라스사 제품)(1.5% 아가/LB 배지)에 감았다. 15분간 실온에서 고화시키고 42℃에서 5시간 인큐베이션하였다. 각 플레이트의 프라그를 합계한 후, 파지의 타이타를 계산에 의해 구하였다. 그 결과, 타이타는 2.1×10¹⁰pfu/㎖이었다. 이와 같이 타이트레이션을 행한 cDNA 라이브러리에 대하여, 실시예 2에서 제작한 프로브를 이용하여 이하와 같이 스크리닝을 행하였다.

mLB 배지로 37℃에서 16시간 배양한Escherichia coliY1090r- 0.6㎖과 SM 완충액으로 희석한 cDNA 라이브러리×10⁵pfu를 37℃에서 15분간 인큐베이트하고, 그 후7.5㎖ LB-TOP 아가로스(0.75% 아가로스)에 첨가하여 균일하게 하였댜. 이것을 140mm²의 LB 배지각 플레이트(일본제약사 제품)에 감은 것을 10장 제작하여, 15분간 실온에서 고화시키고, 42℃에서 5시간 인큐베이션하였다. 프라그 형성을 확인 후, 다음으로 나일론막으로 전사를 행하였다. 전사는 나이트란(Nytran) 13N(쉴러커 앤 쉬웰사 제품))을 이용하여 행하였다. 12.5cm×9.0cm의 필터를 증류수에 담가서 10분간 적신 후, 와트만지 3MM 상에 있어서 여분의 수분을 제거하고, 프라그를 형성한 플레이트 상에 필터를 두었다. 2분간 방치한 후, 필터를 벗겨내고 10분간 바람으로 건조시켰다. 0.2M NaOH/1.5 M NaCl에 의해 2분간 파지 DNA를 변성시키고, 0.4 M Tris-HCl(pH7.6)/2×SSC로 2분간 중화하여, 2×SSC로 2분간 세정을 행하였다. 그 후, GS GENE LINKER(바이오래드사 제품)으로 자외선 조사함으로써 파지 DNA를 막으로 고정하였다. 하이브리다이제이션 및 시그널의 검출은 이하와 같이 행하였다. 필터를 2×SSC에 침지하고, 여분의 수분을 와트만지 3mm으로 제거하고, 하이브리다이제이션 백으로 옮겨 하이브리다이제이션 용액(5×SSC, 1% 블로킹제, 0.1% N-라우로일살코신, 0.02% SDS)와 68℃에서 1시간 프레하이브리다이제이션을 행하였다. 이어서, 뒤에서부터 하이브리다이제이션 용액을 제거하고, 거기에 DIG로 라벨한 cDNA 프로브를 10ng/㎖이 되도록 조제한 하이브리다이제이션 용액을 첨가하고, 55℃에서 16시간 하이브리다이제이션을 행하였다. 하이브리다이제이션 종료 후, 필터는 상온에서 2×SSC/0.1% SDS용액에서 5분간, 2회 세정하고, 55℃에서 0.5×SSC/0.1% SDS용액에서 15분간 2회 세정하였다. 다음으로 DIG 완충액 Ⅰ(100mM Tris-HCl, 150mMNaCl(pH7.5))에서 1분간, SDS를 제거하고, DIG 완충액 Ⅱ(1% 블로킹제, DIG 완충액 Ⅰ)에서 30분간 필터의 블로킹을 행하였다. DIG 완충액 Ⅰ에서 1분간 세정하고, 다음으로 DIG 완충액 Ⅱ에서 항DIG 알칼리포스파다아제 표식 항체(베링거·만하임사 제품)를 5000배 희석한 용액을 첨가하고, 30분간 항체 반응을 실온에서 행한 후, 실온에서 DIG 완충액Ⅰ에서 15분간 2회 세정하였다. DIG 완충액Ⅲ(100mM Tris-HCl, 100mM NaCl(pH9.5), 50mM MgCl₂)에서 3분간 처리함으로써 Mg^2＋의 농도를 높이고, NBT/BCIP(와코준야쿠사 제품)을 DIG 완충액Ⅲ에 첨가한 용액으로 발색시켜 10개의 양성 클론이 얻어졌다. 이들의 클론에 상당하는 프라그를 플레이트로부터 절단하고, SM 완충액 1㎖을 넣은 튜브에 첨가하여 10분간 교반한 후, SM완충액으로 단계 희석하고, 이 희석액 0.1㎖와 mLB 배지에서 37℃ 16시간 배양한Escherichia coliY1090r-0.2㎖을 혼합하여, 37℃에서 15분간 인큐베이트하였다. 그 후, 혼합액을 2.5㎖ LB-TOP 아가로스에 첨가하여 균일하게 하고, 90mmφ LB배지 플레이트에 감은 것을 10장 제작하고, 15분간 실온에서 고화시켜서 42℃에서 5시간 인큐베이션하고, 몇 개의 프라그를 얻고, 1차 스크리닝과 동일하게 하여 2차 스크리닝을 행하였다.

실시예 4: 신규 인간 스캐빈저 리셉터의 염기 서열의 결정

2차 스크리닝에서 얻어진 양성 클론 중 적절하다고 생각되는 클론의 프라그를 플레이트로부터 절단하고, 증류수 200㎕을 넣은 튜브에 첨가하여 30분간 실온에서 교반한 후, 15000rpm에서 5분간 원심분리하여 상청을 얻었다.

얻어진 상청을 주형으로 하고, TaKaRa LA PCR Kit Ver.2(다카라주조사 제품)를 이용하고, PCR에 의해 인서트 DNA를 증폭시켰다. PCR의 반응 조성은 이하와 같다(상청: 27㎕, 10×LA PCR 완충액Ⅱ(Mg^2＋불포함): 5㎕, dNTP믹스: 8㎕, 20μM λgt11 Reverse 프라이머(서열 번호 11, 5’-ttgacaccagaccaactggtaatg-3’): 2.5㎕, 20μM λgt11 Forward 프라이머(서열 번호 12,5’-ggtggctacgactcctggagcccg-3’): 2.5㎕, LA Taq 폴리메라아제: 0.5㎕, H₂O: 전체 용량 50㎕이 되도록 첨가). PCR반응은 아프라이드바이오시스템즈사 제품 진 Amp PCR시스템 9600을 이용하여, 98℃ 20초, 68℃ 5분의 사이클을 30회 행하였다. PCR산물은 1% 아가로스겔 전기영동으로 확인한 후, 겔로부터의 절단에 의해 정제하였다. 정제에는 팔마시아사 제품 Sephaglas BandPrep Kit를 이용하였다.

절단한 DNA단편은 인비트로젠사 제품 TA클로닝 키트의 pCR2.1 벡터에 조합하였다. 재조성한 벡터는 인비트로젠사 제품 TA클로닝 키트에 포함되는 TOP10F’세포로 형질전환하였다. 형질전환체를 LB배지(100㎍/㎖ 암피실린)으로 배양하고, 알칼리 SDS법에 의해 각 클론마다 3종류의 플라스미드 DNA를 추출하였다.

얻어진 DNA를 적당하다고 생각되는 제한 효소로 절단하고, 각 DNA단편을 pUC18벡터에 조합하고, XL1-Blue cell로 형질전환하였다. 형질전환체를 LB배지(100㎍/㎖ 암피실린)으로 배양하고, 알칼리 SDS법에 의해 플라스미드를 추출하였다. CL-P1-2-1로부터는EcoR I-Hind Ⅲ프라그멘트,Hind Ⅲ-EcoR Ⅰ프라그멘트를 포함하는 플라스미드, CL-P1-3-4로부터는EcoR Ⅰ-BamH Ⅰ프라그멘트,BamH Ⅰ-SmaⅠ프라그멘트,SmaⅠ-Hind Ⅲ 프라그멘트,KpnⅠ -Sau3A Ⅰ 프라그멘트,Sau3H Ⅰ-EcoR Ⅰ프라그멘트,EcoR Ⅰ-KpnⅠ프라그멘트,EcoR Ⅰ-SmaⅠ프라그멘트를 포함하는 플라스미드, CL-P1-3-7로부터는EcoR Ⅰ-BamH Ⅰ프라그멘트,BamH Ⅰ-SmaⅠ프라그멘트,SmaⅠ-Hind Ⅲ 프라그멘트,KpnⅠ -Sau3A Ⅰ 프라그멘트,Sau3A Ⅰ-EcoR Ⅰ프라그멘트,EcoR Ⅰ-KpnⅠ프라그멘트,KpnⅠ프라그멘트,EcoR Ⅰ프라그멘트를 포함하는 플라스미드를 얻었다. 프라이머는 AutoRead Sequencing Kit(팔마시아사 제품) 첨부의 M13 Universal Primer(서열 번호 7), M13 Reverse Primer(서열 번호 8) 및 FITC(팔마시아사 제품 FluorePrime)로 라벨한 이하의 프라이머를 DNA/RNA 신시사이저를 이용하여 작성하고, 팔미시아사 제품인 오토리드·식엔싱·키트 및 A. L. F. 오토시퀀서로 전 영역의 염기 서열을 결정하였다.

HPP 1 : 5’-플루오로세인-cgtgaaaatgaatggaagtgg-3’(서열 번호 13),

HPP 2 : 5’-플루오로세인-ttttatccattgctgttcctc-3’(서열 번호 14),

HPP 3 : 5’-플루오로세인-ctggcagtccccgaggtccag-3’(서열 번호 15),

HPP 5 : 5’-플루오로세인-gctggtccccccggagagcgt-3’(서열 번호 16),

이상 실시한염기 서열 결정에 있어서의 개략은 도 4에 나타낸 바와 같다. 도 4a에 얻어진, 스캐빈저 리셉터의 컬렉틴 구조 부분의 ORF를 나타내고, 이 중의 G-X-Y(G는 글리신을 나타내고, X 및 Y는 어떠한 아미노산 잔기여도 된다)는 콜라겐 같은 영역을 나타내는 것이다. 또한 도 4b에 상기 각 프라이머명, 시퀀서에 의해 해독된 염기 서열(화살표로 표시) 및 M13 Universal Primer(U로 표시) 및 M13 Reverse Primer(R로 표시)를 나타낸다.

또한, Cap site cDNA를 이용하여 이 서열의 전사 개시점을 포함하는 5’말단영역의 염기 서열을 결정하였다.

Cap site cDNA, Human Liver(NIPPON GENE사 제품)에 의해 첨부의 ICR2 Primer(5’-caaggtacgccacagcgtatg-3’(서열 번호 17)) 및 Applied Biosystems사 제품 392A DNA/RNA신시사이저에 의해 합성한 TGP1 Primer(5’-tcttcagtttccctaatccc-3’(서열 번호 18))을 이용하여 제 1회 PCR을 행하였다. 반응 혼합액은 총액량 50㎕로, LA PCR Buffer Ⅱ(Mg^2＋를 포함하지 않음), 2.5mM MgCl₂, 각각 200μM dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP(이상, 다카라주조사 제품)을 1㎕: Cap Site cDNA Human Liver, 0.5μM 1RC2 Primer(이상, NIPPON GENE사 제품), 및 0.5μM TGP1 Primer을 포함한 것으로 하였다. PCR은 열변성 95℃에서 20초, 어닐링 60℃에서 20초, 신장 반응 72℃에서 20초를 35싸이클, 또는 반복 반응전에 열변성 95℃에서 5분, 마지막에 신장 반응 72℃에서 10분을 포함하는 프로그램으로 행하였다. 제 1회 PCR종료 후, nested PCR을 행하였다. 제 1회 PCR산물 1㎕을 주형으로 하고, 프라이머는 첨부의 2RC2 Primer(5’-gtacgccacagcgtatgatgc-3’(서열 번호 19)) 및 합성 TGP2 Primer(5’-cattcttgacaaacttcatag-3’(서열 번호 20)) (TGP1 Primer과 동일하게 하여 합성한 것)을 이용하여, 제 1회 PCR과 동일한 반응 조성, 프로그램(단, 싸이클수는 25싸이클)으로 행하였다. 이상의 PCR 반응은 다카라주조사 TaKaRa PCR Thermal Cycler 480에 의해 행하였다. 얻어진 PCR산물을 아가로스겔 전기영동에 의해 확인한 후, 산화알루미늄을 겔에 의해 절단하고, -80℃, 10분, 동결하고, 15000rpm, 10분, 원심분리 후, 상청을 에탄올 침전함으로써 정제하였다.

정제한 DNA단편은 Novagen사 제품 pT7Blue Vector에 조합하고, 이 벡터를 컨피덴트셀 XL1-Blue 세포로 형질전환하였다. 형질전환체를 LB배지(100㎍/㎖ 암피실린)로 배양하고, 알칼리 SDS법에 의해 플라스미드를 추출하고 Pharmacia사 제품 AutoRead Sequencing Kit 및 A. L. F. DNA Sequencer로 염기 서열의 결정을 행하였다. 프라이머는 AutoRead Sequencing Kit 첨부의 M13 Universal Primer(서열 번호 7) 및 M13 Reverse Primer(서열 번호 8)를 이용하였다.

또한, N말단의 확인을 위하여 얻어진 cDNA클론의 N말단 부분의 시퀀스로부터 상류 방향의 프라이머: 5’-atcttgctgcagattcgtgac-3’(서열 번호 21)을 합성하고, 태반 유래 cDNA라이브러리(클론텍크사 제품)의 스크리닝을 행하였다. 스크리닝은 합성한 상류 방향의 프라이머: 5’-atcttgctgcagattcgtgac-3’(서열 번호 21)과 벡터에 포함되는 일부분의 프라이머 λgt11 5’Sequencing Primer: 5’-gactcctggagcccg-3’(서열 번호 22)를 이용하여 PCR에 의해 행하였다. 2.5mM MgCl2, 1×LA PCR Buffer Ⅱ(Mg^2＋포함하지 않음), 2U TaKaRa LV Taq, 프라이머 2종(5’-atcttgctgcagattcgtgac-3’(서열 번호 21), λgt11 5’Sequencing Primer: 5’-gactcctggagcccg-3’(서열 번호 22))을 각각 0.2μM, 태반 유래 cDNA라이브러리 1㎕, 물을 전체량 50㎕이 되도록 첨가하여 반응액을 조제하고, 94℃에서 2분간을 1싸이클, 94℃에서 30초간, 60℃에서 30초간, 72℃에서 1분 30초간을 50싸이클 행하였다.

얻어진 cDNA를 아가로스겔 전기영동에 의해 분리하고, 에티듐브로마이드용액(0.1㎍/㎖)으로 염색을 행하고, 트랜스일루미네이터로 영동 패턴을 확인한 바, 약 600bp 상당의 인서트가 증폭되어 있다는 것을 알았다. 그래서, 이 증폭된 부분을 아가로스겔에 의해 절단하고, -80℃에서 10분간 동결하고, 15000rpm, 10분, 원심분리한 후, 상청을 얻고, 에탄올 침존함으로써 정제하였다. 정제된 DNA단편을 Novagen사 제품 pT7BlueVector에 조합하여, 이 벡터를 대장균 XLI-Blue의 컨피덴트셀로 형질전환하였다. 형질전환체는 LB배지(50㎍/㎖ 암피실린)으로 배양하고, 알칼리 SDS법으로 플라스미드를 추출하고, PE Applied Biosystems사 제품 DNA Sequencing Kit 및 시퀀서 ABI PRISM 377로 염기 서열의 결정을 행하였다. 프라이머는 Pharmacia사 제품 AutoRead Sequencing Kit 첨부의 M13 Universal Primer(서열 번호 7) 및 M13 Reverse Primer(서열 번호 8)을 이용하였다.

그 결과, 얻어진 염기 서열로부터 N말단측에 604염기도 긴 서열이라는 것이 명확해졌다. 이상의 점에서 여기에서 얻어진 hSRCL-P1의 cDNA는 2628염기를 포함하고, 2226염기의 ORF(전사 해독 프레임)을 가지고(서열 번호 1), 서열 번호 2로 나타낸 742의 아미노산을 코드하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, GenBank 데이터베이스에서 DNA 및 아미노산에 대한 상동성의 검색을 행한 결과, 얻어진 아미노산 서열은 종래 발견되었던 컬렉틴/스캐빈저 리셉터와 다른 신규 단백질의 서열이라는 것이 확실해졌다.

또한, 서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열의 제 483∼606번째의 아미노산이 결실한, 서열 번호23으로 나타낸 염기 서열의 제 74∼1933번째에 의해 코드되는 변이체(서열 번호 24)가 얻어졌다.

실시예 5: 신규 마우스 스캐빈저 리셉터의 cDNA의 취득

hSRCL-P1과 동일한 방법에 의해 마우스 간장 cDNA 라이브러리의 스크리닝을 행함으로써 mSRCL-P1 유전자를 얻을 수 있었다. 얻어진 mSRCL-P1의 cDNA 클론은 2637 염기를 포함하고, 2226염기의 ORF(전사 해독 프레임)을 가지고(서열 번호 3), 서열 번호 4로 나타낸 742의 아미노산을 코드하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: hSRCL-P1의 일과성 발현 벡터 pEGFP-N1-hSRCL-P1의 구성

우선, 서열 번호 1로 나타낸 hSRCL-P1의 개시 코돈에서부터 종료 코돈까지를 ccgctcgagcggtcaccatgaaagacgact의 염기 서열(서열 번호 25)로 이루어진 프라이머와 tccccgcggtaatgcagatgacagtgacagtactgt의 염기 서열(서열 번호 26)로 이루어진 프라이머를 이용하여, 인간 태반 유래 cDNA라이브러리를 주형으로 하여 PCR(타카라사 제품: Takara Thermal Cycler MP)에 의해 증폭시킨다. 얻어진 hSRCL-P1cDNA를 pT7Blue T-Vector(Novagen사 제품)에 결찰하고, 대장균 XLI-Blue에 트랜스포메이션을 행하였다. 얻어진 클론에서 hSRCL-P1cDNA를 포함하는 플라스미드를 정제하였다. 시퀀서에 의해 얻어진 플라스미드의 염기 서열을 확인한 후, 이상이 없는 플라스미드를 제한 효소XhoⅠ과SacⅡ로 소화하고, 동일한 효소로 소화하여 정제한 pEGFP-N1벡터(클론텍크사 제품)에 결찰을 행하였다. 결찰한 플라스미드는 대장균 XLI-Blue에 트랜스포메이션한 후, 얻어진 클론을 배양하고, 플라스미드를 정제하여 일과성 발현 벡터pEGFP-P1으로 하였다.

실시예 7: 일과성 발현 시스템을 이용한 hSRCL-P1의 발현

실시예 6에서 얻어진 발현 벡터 pEGFP-N1-hSRCL-P1과LIPOFECTAMINE2000(LF2000) Reagent(GIBCOBRL사 제품)을 이용하여, CHO세포에 있어서의 일과성 발현을 시도하였다. 우선, LF2000 Reagent용액(LF2000 Reagent 12㎕, Nutrient Mixture F-12 Ham(Ham’s F-12배지, (시그마사 제품))) 0.2㎖을 준비하고, 5분간 실온에서 인큐베이트한 후, 벡터 용액 0.2㎖(pEGFP-N1-hSRCL-P1벡터 4㎍, Ham’s F-12배지)와 혼합하고, 20분간 인큐베이트하였다. 그 후, 35mm 페트리 접시로 2㎖ Ham’s F-12배지(5% FCS 포함)에서 고밀도에까지 배양한 CHO세포에 첨가하였다. 4시간, 37℃, 5% CO₂하에서 배양을 행하였다. 발현의 유무에 관해서는 올림퍼스사 제품 도립형 시스템 현미경 IX70의 형광 관찰 시스템에 의해, GFP의 형광상의 관찰을 행하여 확인할 수 있었다. 이와 같이 하여 얻어진 세포를 일과성으로 hSRCL-P1을 발현한 세포라고 하였다.

실시예 8: hSRCL-P1의 안정발현 세포주 작성용 벡터 pcDNA3.1ℓMyc-His A-hSRCL-P1의 구성

우선, 서열 번호 1로 나타낸 hSRCL-P1의 개시 코돈에서부터 종료 코돈까지를 aatgcggccgcaccatgaaagacgacttcgcagag의 염기 서열(서열 번호 27)로 이루어진 프라이머와 gctctagaccgcggtaatgcagatgacagtac의 염기 서열(서열 번호 28)로 이루어진 프라이머를 이용하여, 인간 태반 유래 cDNA라이브러리를 주형으로 하여 PCR(타카라사 제품: Takara Thermal Cycler MP)에 의해 증폭시킨다. 얻어진 hSRCL-P1cDNA를 pT7Blue T-Vector(Novagen사 제품)에 결찰하고, 대장균 XLI-Blue에 트랜스포메이션을 행하였다. 얻어진 클론에서 hSRCL-P1cDNA를 포함하는 플라스미드를 정제하고, 시퀀서에 의해 얻어진 플라스미드의 염기 서열을 확인한 후, 이상이 없는 플라스미드를 제한 효소NotⅠ과SacⅡ로 소화하고, 동일한 효소로 소화하여 정제한 pcDNA3.1/Myc-His A벡터(Invitorogen 제품)에 결찰을 행하였다. 결찰한 플라스미드는 대장균 XLI-Blue에 트랜스포메이션한 후, 얻어진 클론을 배양하고, 플라스미드를 정제하여 안정 세포주 작성용 벡터 pcDNA3.1/Myc-His A-hSRCL-P1으로 하였다.

실시예 9: SRCL-P1의 안정 발현 세포주의 작성

실시예 8에서 얻어진 발현 벡터 pcDNA3.1/Myc-His A-hSRCL-P1과 LIPOFECTAMINE2000(LF2000) Reagent(GIBCOBRL사 제품)을 이용하여, hSRCL-P의 안정 발현을 시도하였다. 우선, LF2000 Reagent용액 0.5㎖(LF2000 Reagent 30㎕, Ham’s F-12배지)를 준비하고, 5분간 실온에서 인큐베이트한 후, 벡터 용액 0.5㎖(벡터 10㎍, Nutrient Mixture F-12 Ham(Ham’s F-12배지)(시그마사 제품)과 혼합하고, 20분간 인큐베이트하였다. 그 후, 25cm²플라스크에서 5㎖ Ham’s F-12배지(5% FCS포함)로 고밀도에까지 배양한 CHO세포에 첨가하였다. 4시간, 37℃, 5% CO₂하에서 배양을 행하였다. 새로운 배지와 교환하고, 다시 계속하여 20시간, 37℃, 5% CO₂하에서 배양을 행하였다. 다음으로, 배지를 Ham’s F-12배지(5% FCS포함, 0.4㎎/㎖ Geneticin(GIBCOBRL사 제품)포함)로 교환하고, 다시 10일간 배양을 행하였다. 도중에 한번 배지를 교환하였다.

이 10일간의 약제 선택에 의해 형질전환 세포만이 생존하고 증식하였지만, 형질전환되지 않은 세포는 사멸하였다. 얻어진 형질전환 세포로부터 고발현의 세포를얻기 위하여, 셀 소터(Becton Dickinson사 제품)에 의해 소팅을 행하였다. 우선, 세포 표면에 발현시킨 hSRCL-P1의 염색을 행하였다. 형질전환한 25cm²플라스크의 세포를 5㎖ PBS(-)에서 2회 세정한 후, EDTA solution 0.02%(나카라이테스크사 제품) 0.3㎖로 세포를 벗겨서 10㎖ PBS(-)에 현탁한 후, 200×g, 7분간, 4℃에서 원심 후, 상청을 제거하였다. 남은 세포에 항myc 항체(Invitorogen사 제품)를 2% FCS/PBS(-)로 10배 희석한 용액을 50㎕첨가하고, 세포를 현탁한 후, 4℃에서 20분간 인큐베이션하였다. 그 후, 2% FCS/PBS(-)를 10㎖ 첨가하여 현탁한 후, 200×g, 7분간, 4℃에서 원심 후, 상청을 제거하여 세정을 행하였다. 남은 세포에 FCS/PBS(-)로 10배 희석한 2차항체 Alexa488표식 항마우스IgG(H＋L) 용액을 50㎕첨가하고, 세포를 현탁한 후, 4℃에서 20분간 인큐베이션하였다. 그 후, 2% FCS/PBS(-)를 10㎖ 첨가하여 현탁한 후, 200×g, 7분간, 4℃에서 원심 후, 상청을 제거하여 세정을 행하였다. 남은 세포를 2% FCS/PBS(-)를 0.5㎖에 현탁하고, 소팅 샘플로 하였다. 샘플은 셀트레이너캡 부착 5㎖ 튜브(Becton Dickinson사 제품)를 통한 후에 셀 소터에 의해 소팅하였다. 동일하게 처리한 형질전환되지 않은 CHO세포를 컨트롤하여 형광 강도가 10배 이상 높은 것을 선택하였다.

이들의 세포를 미리 Ham’s F-배지(5% FCS, 0.4㎎/㎖ Geneticin포함)를 100㎕씩 넣어둔 96혈세포 배지용 플레이트에 1혈당 세포 1개씩 분배하였다. 37℃, 5% CO₂하에서 배양을 행하여 1주간 배양한 후, 다시 100㎕씩 배양액을 첨가하고, 1주간 배양을 행하였다. Geneticin에 의한 약제 선택에 의해 증식하여 왔던 클론을 2분할하고, 12혈 및 24혈 세포 배양용 플레이트에 2차 배양하였다. 이 때 1혈에 2세포 이상 증식해온 클론을 제거하고, 12혈 및 24혈 세포 배양용 플레이트에는 9:1의 세포비로 세포를 뿌려두었다. 37℃, 5% CO₂하에서 배양을 행하고 12혈의 플레이트 세포가 고밀로까지 도달하였을 때, 다시 개개의 클론을 소팅시와 동일하게 염색한 후, FACSCalibur(Becton Dickinson사 제품)에 의해 발현량의 확인을 행하였다. 발현량이 많은 클론을 확인한 후, 각각 대응하는 24혈의 플레이트 세포를 안정 발현 세포주(CHO/hSRCL-P1)로 하였다.

실시예 10: hSRCL-P1의 결합 특이성

실시예 9에서 얻어진 안정 발현 세포주의 CHO/hSRCL-P1을 이용하여 (1)효모(Zymosan A Bioparticles, Molecular Probes사 제품), 그람 음성(gram-negative) 세균(Escherichia coli Bioparticles, Molecular Probes사 제품) 내지는 그람 양성 세균(Staphylococcus aureus Bioparticles, Molecular Probes사 제품), (2)산화 LDL(2.0㎎/㎖ LDL에 50μM의 CuSO₄를 첨가하여 24시간 반응시킨 것을 PBS(-)에 투석한 것이다), (3)AGE-HSA(AGE-인간 혈청 알부민, Ikeda, K. et al., Biochemistry 35(240, 8075-8083(1996)에 따라서 조제), 또는 (4)만노오스(α-D-Mannose BP-Probe, 생화학공업사 제품) 내지는 푸코오스(α-L-Fucose BP-Probe, 생화학공업사 제품)에 대한 hSRCL-P1의 결합 특이성을 조사하였다.

우선, CHO/hSRCL-P1을 35mm 바텀디슈(마츠로가라스사 제품)에 1×10⁵세포를 뿌리고, 3일간 37℃, 5% CO₂하에서 배양을 행하였다. 배양은 Ham’s F-12배지(5%FCS, 0.4㎎/㎖ Geneticin포함) 2㎖에서 행하였다. 3일 후, 2% FCS를 포함하는 Minium Essential Medium Alpha Medium(αMEM/2% FCS) 1㎖에서 2회 세정한 후, 25㎍/㎖ 그람 음성 세균, 25㎍/㎖ 그람 양성 세균, 5㎍/㎖ 산화 LDL, 10㎍/㎖ AGE, 또는 10㎍/㎖ 만노오스 내지는 10㎍/㎖ 푸코오스를 포함하는 αMEM/2% FCS를 각각 1㎖ 첨가하고, 4℃에서 3시간 반응시키고 그 후 1㎖ αMEM/2% FCS에서 5회 세정하였다.

결합은 이하와 같이 하여 확인하였다. 우선, (2), (3) 및 (4)에 관해서는 각각 항산화포스파티딜콜린항체(2), 항HSA항체(BIOSYS사 제품)(3), streptavidin, Alexa594 conjugate(Molecular Probes사 제품)(4)를 각각 αMEM/2% FCS에서 100배 희석하여 1㎖첨가하고, 다시 4℃에서 30분간 인큐베이트하고, 그 후 1㎖ αMEM/2% FCS에서 3회 세정하였다. 다음으로, (1)에서 (4) 전체에 대하여 4% 파라포름알데히드/PBS(-) 용액 0.2㎖을 첨가하고, 실온에서 20분간 인큐베이션함으로써 고정을 행하고, 1㎖ TBSC(다카라주조사 제품 TBS(Tris-Buffered Saline)Power를 규정량으로 멸균 증류수에서 조정한 것으로 최종 농도 5mM이 되도록 CaCl₂를 첨가한 완충액)으로 3회 세정하였다. 다음으로, (2) 및 (3)에 관해서는 2차 항체와의 반응을 행하였다. 즉, 각각 로다민 표식 항마우스 IgM Mu Chain(Chemicon International사 제품)(2) 및 Alexa 594 항염소 IgG(H＋L)(Molecular Probes사 제품)(3)을 25% BlockAce(대일본제약사 제품)/TBSC로 200배 희석하여 1㎖ 첨가하고, 다시 실온에서 30분간 인큐베이션한 후, 1㎖ TBSC에서 3회 세정하였다. 다음으로, (1)에서 (4)에 대해서SlowFade Light Antifade Kit(Molecular Probers사 제품)을 이용하여 마운트하고, 형광 현미경으로의 관찰 샘플로 하였다. 각 샘플에 대하여 올림퍼스사 제품 도립형 시스템 현미경 IX70의 형광 관찰 시스템에 의해 형광상의 관찰을 행하였다. 그 결과를 (1)에 대해서는 도 5(A: 효모, B: 그람 음성 세균(Escherichia coli), 및 C: 그람 양성 세균(Staphylococcus aureus))에, (2)∼(4)에 관해서는 도 6(A: 산화 LDL, B:만노오스, 및 C: AGE)에 각각 나타낸다. 이들의 도면으로부터 명확한 바와 같이, (1)에서 (4) 전체에 있어서 hSRCL-P1을 안정하게 발현하고 있는 CHO세포에 특이적인 결합상을 관찰할 수 있고, 미생물을 이용한 도 5a∼도 5c에 나타낸 결과에서는 각각 hSRCL-P1의 염색 부위(각 왼쪽 도면, 녹색 염색)와 각 미생물의 존재 부위(각 중앙도, 적색 염색)이 중복(Overlap, 각 오른쪽 도면)하고 있어, 각 미생물은 hSRCL-P1에 특이적으로 결합하고 있다는 것이 명시되었다.

또한, 일과성으로 hSRCL-P1을 발현시킨 세포(실시예 7 참조)에 있어서도 마찬가지로 특이적 결합을 나타내는 결과가 얻어졌다.

실시예 11: hSRCL-P1의 식균작용(phagocytosis)에 의한 결합물의 세포내 유입

실시예 7 및 9에서 얻어진 hSRCL-P1의 일과성 발현 세포 및 안정 발현 세포주를 이용하고, 실시예 10에 이용한 각 결합물의 세포내 유입을 관찰하였다. 실시예 10에 기재된 방법을 개량하여 결합물과의 반응 온도를 37℃로 하여 행함으로써, 결합물의 유입을 확인하였다. 염색 후, 세포내로의 유입 상태는 올림퍼스사 제품 공촛점 레이저 현미경을 이용한 3차원 화상 처리에 의해 관찰하였다. 일과성 발현 세포를 이용한 경우의 결과를 효모에 대하여 얻어진 것을 도 7에 나타내지만, 효모(적색염색)가 hSRCL-P1(녹색 염색)을 발현하고 있는 세포내에 유입되어 있다는 것이 명확해졌다. 또한, 안정 발현 세포주를 이용하여도 동일한 결과가 얻어졌다.

실시예 12: 혈관내피세포에서의 SRCL-P1 발현의 증명

hSRCL-P1의 조직에서의 발현·국재를 확인하기 위하여, 건강한 정상인 및 마우스 유래 심장 파라핀 포매 절편(Novagen사 제품)을 이용하고, 이하의 조작에 의해 형광 면역 염색을 실시하였다.

파라핀 포매 절편의 슬라이드를 염색 중에 크실렌에 실온에서 10분간, 3회 침지고, 탈파라핀 처리를 행하였다. 그 후 100% -90&% -80% -70% 에탄올에 실온에서 10분간씩, PBS(-) 용액에 10분간의 순서대로 침지고, 하이드레이션 처리를 행하였다.

다음으로 조직 절편 상의 내인성의 퍼옥시다아제 활성을 억제하기 위하여, 슬라이드를 3% 과산화수소 함유 PBS(-) 용액에 실온에서 10분간 침지한 후, 블록에스(대일본제약사 제품)에 실온에서 1시간 침지하고 블로킹 처리를 행하였다.

다음으로, 습윤 상자 안에서 1차 항체로서 항hSRCL-P1 토끼 다클론성 항체(IgG fraction, 100㎍/㎖)100㎕을 조성 절편에 도포하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. 1차 항체를 염색 중에, 세정액(Tris-HCl;pH7.5, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20)에 침지하고, 실온에서 10분간 천천히 진동시키면서 3회 세정한 후, 2차 항체로서 POD(퍼옥시다아제) 표식 항토끼 IgG 양항체(Boehringer Mannheim사 제품)를 5U/㎖의 농도로 1차 항체와 동일하게 반응시키고 세정하였다. 그 후 Biotinyl Tyramide Amplification Reagent(NEN(상표명), Life Science Products사 제품)을 슬라이드에 도포하고, 실온에서 10분간 반응시켜서 1차 항체와 동일하게 세정하였다. Avidin Alexa Fluor(상표명) 488 conjugate(Molecular Probes사 제품) 1㎎/㎖을 PBS(-) 용액으로 100배 희석하고, 그 100㎕을 습윤 상자 안에서 슬라이드 상의 조직 절편에 도포하고, 실온에서 30분간 반응시켜서 1차 항체와 동일하게 세정한 후, SlowFade Light Antifade Kit(Molecular Probes사 제품)을 이용하여 마운트하고, 형광 현미경(니콘사 제품)에서의 관찰 샘플로 하였다. 또한 1차 항체 대신에 정상 토끼 혈청을 반응시켜서 동일한 처리를 행한 슬라이드를 음성 컨트롤으로 하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 A: 건강한 정상인 B: 마우스 양쪽에 심장의 혈관내피세포에 염색상이 관찰되고(각 오른쪽 도면), 이러한 염색상은 음성 컨트롤(각 왼쪽 도면)에는 전혀 발견되지 않았다. 따라서, SRCL-P1은 심장에서는 혈관내피세포에 발현되고 있다는 것이 명확해져, 여기에서 혈관벽으로의 산화 LDL이나 AGE등의 결합에 관여하고 있을 가능성이 시사되었다.

본 발명의 SRCL-P1 단백질은 SR 구조 및 컬렉틴 구조를 가지고 있다는 점에서, 그들에 특유한 효과를 나타내는 물질이라고 생각되고, 매크로파지 및 기초면역의 기능 해명, 동맥경화, 당뇨병성 합병증 및 알츠하이머병, 고β지단백혈증, 고콜레스테롤혈증, 고트리글리세라이드혈증, 저α지단백혈증, 이식, 죽종절제술 및 혈관 형성 후 재협착, 세균 감염증 등을 비롯한 각종 질환 등의 발증 기구의 해명, 및 그 진단, 예방, 및 치료법과, 이를 위한 시약이나 의약의 개발에 이용할 수 있다.

Claims (32)

1. 서열 번호 2인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 742개로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열에 있어서 1개 내지는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 서열 번호 2인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질과 동등한 성질을 갖는 단백질, 또는 이들의 유도체 내지는 단편.
2. 서열 번호 1인 염기 번호 74∼2299로 나타낸 염기 서열, 서열 번호 2인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 서열 또는 그 단편을 코드하는 염기 서열, 또는 이들 염기 서열 내지는 이들 염기 서열과 상보적인 염기 서열, 및 엄격한 조건하에서 하이브리드화(hybridize)하고, 또한 서열 번호 2인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질과 동등한 성질을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
3. 서열 번호 24인 아미노산 번호 1∼618로 나타낸 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 서열 번호 24로 나타낸 아미노산 서열에 있어서 1개 내지는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 서열 번호 24인 아미노산 번호 1∼618로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질과 동등한 성질을 갖는 단백질, 또는 이들의 유도체 내지는 단편
4. 서열 번호 23인 염기 번호 74∼1933으로 나타낸 염기 서열, 서열 번호 24인 아미노산 번호 1∼618로 나타낸 아미노산 서열 또는 그 단편을 코드하는 염기 서열, 또는 이들 염기 서열 내지는 이들 염기 서열과 상보적인 염기 서열, 및 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 또한 서열 번호 24인 아미노산 번호 1∼618로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질과 동등한 성질을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
5. 서열 번호 4인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 742개로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열에 있어서 1개 내지는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 서열 번호 2인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질과 동등한 성질을 갖는 단백질, 또는 이들의 유도체 내지는 단편
6. 서열 번호 3인 염기 번호 74∼2299로 나타낸 염기 서열, 서열 번호 2인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 서열 또는 그 단편을 코드하는 염기 서열, 또는 이들 염기 서열 내지는 이들 염기 서열과 상보적인 염기 서열, 및 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 또한 서열 번호 2인 아미노산 번호 1∼742로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질과 동등한 성질을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
7. 제 2항, 제 4항 또는 제 6항에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
8. 제 2항, 제 4항 또는 제 6항에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 발현 가능하게 유지하는 형질전환 세포.
9. 제 2항 또는 제 4항에 기재된 폴리뉴클레오타이드로 형질전환한 세포를 배양하고, 생산된 hSRCL-P1 단백질을 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 제조방법.
10. 제 6항에 기재된 염기 서열로 형질전환한 세포를 배양하고, 생산된 mSRCL-P1 단백질을 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 제조방법.
11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 세포가 대장균, 동물 세포 또는 곤충 세포인 단백질의 제조방법.
12. SRCL-P1 유전자의 발현 레벨을 변화시킨 형질전환(transgenic) 비인간 동물.
13. 제 12항에 있어서, 상기 SRCL-P1 유전자가 SRCL-P1을 코드하는 cDNA, 게놈DNA 또는 합성 DNA인 형질전환 비인간 동물.
14. 제 13항에 있어서, 유전자 발현 조절 부위에 변이를 일으킴으로써 발현 레벨을 변화시킨 형질전환 비인간 동물.
15. mSRCL-P1 유전자의 기능을 결손시킨 녹아웃 마우스(knockout mouse).
16. 제 1항, 제 3항 또는 제 5항에 기재된 단백질 또는 그 단편에 대한 항체.
17. 제 16항에 있어서, 다클론성 항체(polyclonal antibody), 단클론성 항체(single clonal antibody) 또는 펩티드 항체인 항체.
18. 인간 이외의 온혈 동물에 제 1항, 제 3항 또는 제 5항에 기재된 단백질 또는 그 단편을 투여하고, 항체값이 인정되는 상기 동물을 선택하여 비장 또는 임파절을 채취하고, 그들에 포함되는 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합시킴으로써, 단클론성 항체 생산 하이브리도마(hybridoma)를 조절하는 것을 포함하는, 제 1항, 제 3항 또는 제 5항에 기재된 단백질 또는 그 단편에 대한 단클론성 항체의 제조방법.
19. 제 16항 또는 제 17항에 기재된 항체와 SRCL-P1 단백질 또는 그 단편과의 면역학적인 결합에 기초하여, 상기 단백질 또는 그 단편을 정량하는 방법.
20. 제 16항 또는 제 17항에 기재된 항체와 SRCL-P1 단백질 또는 그 단편과의 면역학적인 결합에 기초하여, 상기 단백질 또는 그 단편을 검출하는 방법.
21. 제 1항, 제 3항 또는 제 5항에 기재된 단백질의 활성을 자극하는 아고니스트(agonist).
22. 제 1항, 제 3항 또는 제 5항에 기재된 단백질의 활성 또는 활성화를 저해하는 안타고니스트(antagonist).
23. 제 1항, 제 3항 또는 제 5항에 기재된 단백질을 이용하는 것을 특징으로 하는 약물의 스크리닝(screening) 방법.
24. 제 23항에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어진 약물.
25. 산화 LDL축적에 관여하는 병태를 처리하기 위한 약물의 스크리닝 방법으로서,

    제 1항, 제 3항 또는 제 5항에 기재된 단백질과 산화 LDL와의 결합량을 후보 약물의 존재하 및 비존재하에서 비교함으로써 평가되는, 상기 단백질과 산화 LDL와의 결합에 대한 후보 약물의 저해 기능에 의해, 산화 LDL 축적에 관여하는 병태를처리하기 위한 약물을 동정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물의 스크리닝 방법.
26. 제 25항에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어진 약물.
27. 산화 LDL 축적에 관여하는 병태를 처리하는 방법으로,

    제 26항에 기재된 약물을 이용하여, SRCL-P1 단백질 또는 그 단편과 산화 LDL와의 결합을 저해하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 산화 LDL 축적에 관여하는 병태를 처리하기 위한 의약 조성물로,

    제 26항에 기재된 약물을 포함하는 의약 조성물.
29. 세포로의 AGE의 결합에 관여하는 병태를 처리하기 위한 약물의 스크리닝 방법으로,

    제 1항, 제 3항 또는 제 5항에 기재된 단백질과 AGE와의 결합량을 후보 약물의 존재하 및 비존재하에서 비교함으로써 평가되는, 상기 단백질과 AGE와의 결합에 대한 후보 약물의 저해 기능에 의해, 세포로의 AGE의 결합에 관여하는 병태를 처리하기 위한 약물을 동정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물의 스크리닝 방법.
30. 제 29항에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어진 약물.
31. 세포로의 AGE의 결합에 관여하는 병태를 처리하는 방법으로,

    제 30항에 기재된 약물을 이용하여, SRCL-P1 단백질 또는 그 단편과 AGE와의 결합을 저해하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 세포로의 AGE의 결합에 관여하는 병태를 처리하기 위한 의약 조성물로, 제 30항에 기재된 약물을 포함하는 의약 조성물.