KR20020032593A - Ｉｖｆ를 위한 조성물 - Google Patents
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Abstract
감수분열 활성 물질을 함유하는 고체 조성물은 단백질 또는 포스페르글리시드를 첨가하여 제조될 수 있다.
Description
몇몇의 감수분열 활성 물질(이하 MAS로 명명)이 발견되어왔다. MAS가 난모세포를 함유하는 배지에 있을때, 난모세포는 더 잘 수정되는 경향이 있게된다. 그러나, MAS를 사용에 있어 주요한 문제는 통상적으로 그들은 매우 낮은 용해도를 갖는다는 것이다.
본 발명은 시험관내 수정과 연관되어 사용될 수 있는 고체 생성물에 관계된다.
발명의 개요
본 발명의 한가지 목적은 수성 배지에 용해될 수 있는 MAS 또는 그들의 유도체를 함유하는 조성물을 개발하는 것이다.
또 다른 목적은 가열, 교반 또는 초음파 처리와 같은 물리적 영향없이 수성 배지에 용해될 수 있는 MAS 또는 그들의 유도체를 함유하는 조성물을 개발하는 것이다.
본 발명의 상세한 설명
바람직한 MAS, 즉, FF-MAS,의 물에서의 용해도는 매우 낮으며, 즉, 대략 20피코그램/ml (2 × 10-5㎍/ml에 상당)이고, 에탄올에서의 용해도는 상당히 높다, 즉, 대략 4 mg/ml이다. 본 발명자들의 예비 조사에 따르면, 에탄올과 물(1: 2.5) 혼합물에서의 FF-MAS의 가장높은 용해도는 대략 0.4 mg/ml이다. 몇몇의 다른 MAS도 물에서 유사하게 낮은 용해도를 갖는다.
놀랍게도, MAS와 첨가제를 함유하는 고체 조성물이 물에서 좋은 용해도를 갖는다는 것이 발견되었다. 첨가제는 MAS에 첨가시, MAS를 함유하는 수용액을 제조하는데 사용될 수 있는 조성물을 제공하는 성분이다. 첨가제의 예는 선택적으로는 그 재조합형으로 혈청 알부민, 예를 들면, 사람 혈청 알부민(이하, HSA로 칭함)과 같은 수용성 단백질, 효소 그리고 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜노시톨과 같은 포스페르글리세리더이다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물의 물의 함량은 10 % 미만, 바람직하게는 5%미만, 더욱 바람직하게는 1 % 미만 (중량/중량)이다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물의 유기 용매의 함량은 10 % 미만, 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 1 % 미만 (중량/중량)이다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물의 MAS의 함량은 1 % 미만, 바람직하게는 0.1%미만, 더욱 바람직하게는 0.05% 미만 (중량/중량)이다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물의 첨가제의 함량은 99% 이상, 더욱 바람직하게는 99.9% 이상이다.
본 발명의 바람직한 조성물은 유기 용매를 함유하지 않거나, 낮은 농도로 함유하는 수성 배지로 처리되어 MAS를 함유하는 용액으로 이를 수 있는 것들이다. 바람직하게는, 이들 수성 배지는 1 % 미만, 바람직하게는 0.5% 미만, 더욱 바람직하게는 0.1% 미만의 유기용매를 함유한다(중량/중량).
이러한 요건을 만족시키는 조성물을 달성하기 위한 초기의 몇몇의 시도는 실패하였다.
본원에서, 용어 MAS 화합물은 난모세포의 감수분열을 조절하는 화합물을 나타낸다. 더욱 구체적으로는, MAS 화합물은 하기의 실시예 1에 개시된 시험에서 대조군 보다 상당히 높은 배아 소포 분해율(이하, GVB 로 명명)을 가지는 화합물이다. 바람직한 MAS 화합물은 적어도 50 %, 바람직하게는 적어도 80 % 의 GVB 를 가지는 것이다. 바람직한 MAS의 예는 4,4-디메틸-5α-콜레스타-8,14,24-트리엔-3β-올(이하, FF-MAS로 명명); 4,4-디메틸-5α-콜레스트-8,14,24-트리엔-3β-올 헤미숙시네이트; 5α-콜레스트-8,14-디엔-3β-올; 5α-콜레스트-8,14-디엔-3β-올 헤미숙시네이트; (20S)콜레스트-5-엔-3β,20-디올; 3β-히드록시-4,4-디메틸-5α-콜라-8, 14-디엔-24-오익 산-N- (메티오닌)아미드;및 콜레스트-5-엔-16β-올이다. MAS의 다른 예는 WO 98/28323, 98/54965 및 98/55498, 더욱 구체적으로는 그들의 청구항 1에 언급된다.
본 발명의 조성물을 제조하는 한가지 방법은 에탄올과 같은 유기 용매내의 MAS 용액을 첨가제 수용액과 혼합하고, 그후, 용매가 증발할 때까지 기다리는 것이다. 증발은 생성물에 연속적으로 공기를 흐르게 하거나, 진공을 이용하거나, 용매를 제거할 수 있는 다른 실행가능한 방법을 이용하여 가속화될 수 있다. 시중에서판매되는 생성물은 하나이상의 함요 또는 중공을 가지는 송달 시스템일 수 있다. 이후에, 이러한 함요 및 중공을 공통적으로 중공이라고 명명한다. 이러한 중공중에 적어도 한개는 본 발명에 따르는 조성물을 함유한다. 고체 MAS를 그곳에 넣는 편리한 방법은 MAS 및 첨가제를 함유하는 용액을 우선 중공에 넣고, 그후, 용액을 증발시키는 것이다. 이러한 방식으로, 증발 잔류물, 즉, 본 발명에 따르는 조성물을 상기 장치(송달 시스템)에 직접 넣는것이다.
본 발명의 조성물은 난모세포의 처리에 사용될 수 있으므로, 본 발명의 조성물이 난모세포에 부정적으로 영향을 미치는 성분을 함유하지 않는 것이 중요하다.
본 발명의 조성물을 사용하는 한가지 방식은 조성물을 물과 같은 수성 배지에 용해시킨후, 원한다면, 난모세포의 성숙에 좋은 효과를 가질 수 있는 다른 성분을 첨가하는 것이다.
조성물을 사용하는 또 다른 방식은 통상적으로 시험관내 성숙에 사용되는 배지에 조성물을 용해시키는 것이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 예증되나, 이것이 발명의 보호 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 전술한 설명 및 하기의 실시예에서 개시되는 특성은 그것들의 어느 조합하여 그 다양한 형태로 본발명을 실현시키기 위한 재료일 수 있다.
실시예 1
화합물이 MAS인지의 여부를 결정하는데 사용되는 방법.
난모세포를 조절된 온도(20-22℃), 빛(점등시간 06.00-18.00) 및 상대습도(50-70%)하에서 유지된 13-16 그램의 무게가 나가는 미성숙 암컷 마우스(C57BL6J × DBA/2J F1, Bomholtgaard, Denmark)로부터 얻었다. 마우스에 20 IU FSH 를 포함하는 0.2 ml 성선자극호르몬(Gonal-F,Serono) 의 복강내 주사를 했고, 48 시간후에 동물을 경추탈골로 죽였다. 난소를 해부했고, 난모세포를 한 쌍의 27 게이지 니들을 사용하여 여포의 용수 파괴에 의해 입체현미경하에서 Hx-배지(하기참조)에서 분리했다. 완전한 배아 소포를 나타내는 구형 난모세포(이하, GV 라고 명명) 를 포획된 난모세포구(이하, CEO 로 명명) 및 나 난모세포(이하, NO 로 명명)로 나누었고, α- 최소 필수 배지 (리보뉴클레오사이드가 없는 α-MEM, Gibco BRL, Cat.No.22561)에 놓았고, 3 mg/ml 소 혈청 알부민(BSA, Sigma Cat.No.A-7030), 5 mg/ml 사람 혈청 알부민 (HSA, Statens Seruminstitut, Denmark), 0.23 mM 피루베이트(Sigma, Cat. No S-8636), 2mM 글루타민(Flow Cat.No.16-801), 100 IU/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 (Flow, Cat No.16-700) 으로 보충했다. 이 배지를 3 mM 히포크산틴(Sigma Cat.No.H-9377) 으로 보충했고 Hx-배지로 명명했다.
난모세포를 Hx-배지에서 3 번 린스했고, 균일 크기의 난모세포를 CEO 및 NO 의 군으로 나누었다. CEO 및 NO 를 각각의 웰은 0.4 ml 의 Hx-배지 및 10 μM 의 농도로 시험될 화합물을 포함하는 4-웰 다중디쉬에서 (Nunclon, Denmark) 배양했다. 하나의 대조 웰(즉, 시험 화합물의 첨가 없이 동일한 배지에서 배양된 35-45 난모세포) 을 항상 3 개의 시험 웰(시험 화합물로 보충된 웰마다 35-45 난모세포)로 동시에 배양했다.
난모세포를 37℃ 에서 24 시간동안 공기중에서 5 % CO2의 습한 분위기에서 배양했다. 배양 말기마다, 각각 GV, GVB 및 극체(이하 PB 로 명명) 를 가진 난모세포의 수를 입체 현미경(Wildt, Leica MZ 12) 을 사용하여 계수했다. 그 웰내의 총 난모세포의 수마다 GVB 를 겪는 난모세포의 비율로서 규정된 GVB 의 비율을 하기와 같이 계산했다:
% GVG=((GVB 의 수 + PB 의 수)/난모세포의 총수) ×100.
실시예 2
화합물이 본 발명의 조성물내의 첨가제로 사용될 수 있는지 여부를 결정하는데 사용되는 방법.
FF-MAS 조성물을 위한 첨가제는 다음으로 특성화되어진다:
에탄올/물(1:2.5 v/v)내에서 FF-MAS의 용해도 개선.
MEM 알파 배지내에서 조성물의 복원후 투명한 FF-MAS 용액으로 확실히 됨.
미성숙 암컷 마우스 난모세포로 시험시 % GVB을 적어도 50% 바람직하게는 80%로 확보.
FF-MAS의 포화 에탄올 용액 제조. 첨가제 수용액을 1: 2,5 의 비율로 혼합. 잉여의 FF-MAS가 용액에서 이용가능한 것을 육안 검사로 조절한다. 그 용액을 실온에서 24시간동안 회전시킨다. 그 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과시키고, FF-MAS의 함량을 HPLC로 결정하고 용해도를 계산한다. 350 ㎕ 를 4-웰 디쉬로 옮기고실온에서 증발시켜 건조시킨다. 500㎕ MEM ALPHA 배지 (Gibcobal)첨가. 투명한 용액이 30분 이내에 얻어지면, 그 조성물을 미성숙 암컷 마우스에서 얻은 난모세포에 시험한다. 얻어진 % GVB 는 적어도 50%, 바람직하게는 80%이다, 실시예 1 참조.
실시예 3
사람 혈청 알부민 (HSA)을 함유하는 조성물.
본 실시예에서, 생성물 3개가 제조되었다. 아래의 표를 참조하면, 생성물 1, 2, 및 3에 사용된 FF-MAS 원료용액이 50, 500 및 3330 ㎍/ml를 각각 함유하였다. 각각의 생성물에 대해, HSA 원료용액은 20% HSA를 함유한다. 사용된 상기 원료용액의 양이 표에 기술되어 있다. 예를들면, FF-MAS 원료용액 생성물 1,400 ㎕를 HSA 원료용액 1,000㎕와 혼합하였다. 이들 원료용액을 혼합한 후, 그 용액은 투명하였고, 거기에서 침전이 관찰되지 않았다. 혼합후, 표에 기술된 양을 4-웰 디쉬로 옮겼다(Nuclon, Denmark). 예를들면, 혼합물의 생성물 1,350 ㎕를 다중-디쉬로 옮기고, 마지막으로 그 용액을 실온에서 증발시켜 건조하였다. 증발후, 약간의 생성물은 디쉬내에서 유백광의 투명한 필름으로 보이며, 다른것들은 육안으로 분간할 수 없다. 이 실시예에 용해된 최대 FF-MAS 농도는 0.95 mg/ml이다.
사용전에, 500 ㎕ MEM ALPHA Medium (Gibcobal) 을 첨가하고, 실온에서 30분이내에 FF-MAS 및 HSA의 투명 용액을 얻는다.
| 4-웰- 다중디쉬No. 1 | 4-웰- 다중디쉬No. 2 | 4-웰- 다중디쉬No. 3 | |
| 에탄올내 FF-MAS 용액,50㎕/㎖에탄올내 FF-MAS 용액,500㎕/㎖에탄올내 FF-MAS 용액,3.33㎎/㎖물내 HSA 용액,20% | 400㎕--1000㎕ | -400㎕-1000㎕ | --450㎕1125㎕ |
| 다중-디쉬로 옮겨진 양 | 350㎕ | 350㎕ | 525㎕ |
| FF-MAS 및 HSA 의 비율 | 1:10,000 | 1:1,000 | 1:150 |
| 증발전 용액의 외형 | 침전이 없는 무색 투명한 용액 |
실시예 4
사람 혈청 알부민 (HSA)을 함유하는 조성물.
앞서의 실시예에서와 유사하게, HSA를 함유하는 물/에탄올내 FF-MAS 용액을 실온에서 혼합하여 하기 샘플 농도로 제조하였다. 제조후, 그 용액은 투명하였고, 침전이 관찰되지 않았다. 그 용액을 4-웰 다중-디쉬로 옮기고(Nuclon, Denmark). 마지막으로, 그 용액을 실온에서 증발시켜, 건조하였다.
사용전에, 500 ㎕ MEM ALPHA Medium (Gibcobal)을 첨가하고, 실온에서 30분 이내에, 투명한 FF-MAS 및 HSA 용액을 얻는다.
미성숙 암컷 마우스의 난모세포로 그 조성물을 시험하였다. 각각의 조성물에 대한 % GVB를 하기하였다.
| 4-웰- 다중디쉬No. 1 | 4-웰- 다중디쉬No. 2 | 4-웰- 다중디쉬No. 3 | |
| 에탄올내 FF-MAS 용액,5.22㎕/㎖에탄올내 FF-MAS 용액,26.1㎕/㎖에탄올내 FF-MAS 용액,261㎎/㎖물내 HSA 용액,20% | 100㎕--250㎕ | -100㎕-250㎕ | --100㎕250㎕ |
| FF-MAS 및 HSA의 비율 | 1:10,000 | 1:2,000 | 1:200 |
| 웰당 FF-MAS의이론적인 양 | 0.5㎍ | 2.5㎍ | 25㎍ |
| % GVB | 72 | 93 | 91 |
실시예 5
사람 혈청 알부민 (HSA)을 함유하는 조성물.
앞서의 실시예에서와 유사하게, HSA를 함유하는 물/에탄올내 FF-MAS 용액을 실온에서 혼합하여 하기 샘플 농도로 제조하였다. 제조후, 그 용액은 투명하였고, 침전이 관찰되지 않았다. 그 용액을 4-웰 다중-디쉬로 옮기고(Nuclon, Denmark). 마지막으로, 그 용액을 실온에서 증발시켜, 건조하였다.
사용전에, 500 ㎕ MEM ALPHA Medium (Gibcobal)을 첨가하고, 실온에서 30분 이내에, 투명한 FF-MAS 및 HSA 용액을 얻는다.
재구성후, FF-MAS의 농도를 HPLC로 결정하였고, 결과를 하기하였다. 미성숙 암컷 마우스의 난모세포에서 그 조성물을 시험하였다. 각각의 조성물에 대한 % GVB를 하기 하였다.
| 4-웰-다중-디쉬 | |||||
| No. 1 | No. 2 | No. 3 | No. 4 | No. 5 | |
| 에탄올내 FF-MAS 용액26.1㎍/㎖에탄올내 FF-MAS 용액7.83㎍/㎖에탄올내 FF-MAS 용액5.22㎍/㎖에탄올내 FF-MAS 용액2.5㎍/㎖에탄올내 FF-MAS 용액0.5㎍/㎖물내 HSA용액20% | 100㎕----250㎕ | -100㎕---250㎕ | --100㎕--250㎕ | ---100㎕-250㎕ | ----100㎕250㎕ |
| FF-MAS 및 HSA의 비율 | 1:100,000 | 1:20,000 | 1:10,000 | 1:6667 | 1:2000 |
| 웰당 FF-MAS의이론적인 양 | 0.05㎍ | 0.25㎍ | 0.5㎍ | 0.75㎍ | 2.5㎍ |
| % GVB | 13 | 52 | 78 | 82 | 90 |
Claims (13)
- MAS 및 첨가제를 함유하는 고체 생성물.
- 제 1 항에 있어서, 물의 함량은 10 % 미만, 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 1 % (중량/중량) 미만인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 상기항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매의 함량은 10 % 미만, 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 1 % 미만(중량/중량)인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 상기항 중 어느 한 항에 있어서, MAS의 함량은 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만 (중량/중량)인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 상기항 중 어느 한 항에 있어서, MAS 는 4,4-디메틸-5α-콜레스타-8,14,24-트리엔-3β-올; 4,4-디메틸-5α-콜레스트-8,14,24-트리엔-3β-올 헤미숙시네이트; 5α-콜레스트-8,14-디엔-3β-올; 5α-콜레스트-8,14-디엔-3β-올 헤미숙시네이트; (20S)콜레스트-5-엔-3β,20-디올; 3β-히드록시-4,4-디메틸-5α-콜라-8, 14-디엔-24-오익 산-N- (메티오닌)아미드;및 콜레스트-5-엔-16β-올인 것을 특징으로 하는조성물.
- 상기항 중 어느 한 항에 있어서, 첨가제는 단백질 또는 포스페르글리시드인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 상기항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 청구항중 어느 하나에 언급된 특성을 갖는 수용액 제조에 사용될 수 있는것을 특징으로 하는 조성물.
- 상기항 중 어느 한 항에 있어서, MAS가 FF-MAS일때, 난모세포 처리에 사용시, 배아 소포 분해율(GVB)은 적어도 50%, 바람직하게는 80%인 수용액을 제조하는데 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
- MAS의 함량이 적어도 0.001 ㎍/㎖, 바람직하게는 0.01 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 적어도 0.1 ㎍/㎖, 더욱더 바람직하게는 0.5 ㎍/㎖ 인 것을 특징으로 하는 MAS 수용액.
- 상기항에 있어서, MAS의 함량은 0.1 g/㎖ 이하, 바람직하게는 0.01 g/㎖ 이하인 것을 특징으로 하는 MAS 수용액.
- 상기 두개의 항중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매의 함량은 0.1 % 미만, 바람직하게는 0.05% 미만, 가장 바람직하게는 0.01% 미만인 것을 특징으로 하는 MAS 수용액.
- 상기항 중 어느 한 항에 따르는 고체 생성물 또는 용액을 함유하는 중공을 가지는 장치.
- 본원에 기술된 어떤 신규한 특징 또는 특징들의 조합.
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