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KR20000023695A - 절두된 가용성 종양 괴사 인자 ⅰ형 및 ⅱ형 수용체 - Google Patents

절두된 가용성 종양 괴사 인자 ⅰ형 및 ⅱ형 수용체 Download PDF

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KR20000023695A
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피셔에릭에프
에드워즈칼케이
키프트게리엘
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스티븐 엠. 오드레
암젠 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 종양 괴사 인자 결합 단백질로 명명되는 단백질에 관한 것으로, 이 단백질은 종양 괴사 인자의 활성도를 조절한다. 또한 본 발명은 재조합 유전공학 기술에 의해 종양 괴사 결합 단백질을 수득하는 방법에 관한 것이다.

Description

절두된 가용성 종양 괴사 인자 Ⅰ형 및 Ⅱ형 수용체{TRUNCATED SOLUBLE TUMOR NECROSIS FACTOR TYPE-I AND TYPE-II RECEPTORS}
발명의 배경
염증은 예를들어 기계적 손상, 감염 또는 항원 자극에 의해 유발되는 손상에 대한 신체의 방어 반응이다. 염증 반응은 자가항원과 같은 부적절한 자극에 의해 염증이 유발될때 병리학적으로 악화되어 나타나거나 또는 해로운 약물을 제거한 후에도 지속적으로 유지된다. 이러한 염증 반응은 특정 시토킨 생산을 포함할 것이다.
염증의 원인은 제대로 밝혀지지 않았으나, 최근에는 분자 측면에서의 염증에 관한 상당한 자료들이 수집되었다. 이러한 연구로, 특히 염증 조정 역할을 할 것으로 여겨지는 특정 시토킨을 확인할 수 있었다. 시토킨은 특히 시토킨을 합성하고 방출하는 부위의 근접 부위에서 세포 작용을 변화시키는 세포외 단백질이다. 종양 괴사 인자(TNF)는 단핵구와 대식세포를 포함한 다수의 세포 형태에서 생산되는 시토킨에 속한다.
적어도 두 개의 TNF, 즉 TNF 알파(TNF-α) 및 TNF 베타(TNF-β 또는 림프독소)에 대하여 전술하였으며, 이들 각각은 삼중 분자로 작용하며 교차 결합 수용체에 의해 세포내 시그널을 개시하는 것으로 여겨진다[Engelmann 등의(1990), J. Biol. Chem., 265 : 14497 - 14504 참조].
일부 문헌에서는 TNF-α 와 TNF-β 가 주요 염증 시토킨임을 시사하고 있다. 이들 공지된 TNF 는 손상과 감염과 같은 여러 자극에 대한 염증 반응과 관련된 다수의 상이한 표적 세포에 대해 중요한 생리학적 효과를 갖는다. 이 단백질은 잠재적인 콜라게나제와 프로스타글란딘 E2를 분비하는 활액 세포와 섬유아세포 둘다를 유도하며, 골흡수를 촉진시키는 골세포를 유도한다. 이들 단백질은 내피 세포가 호중구 표면에 부착되는 성질을 강화시킨다. 또한 응고 활성을 분비하는 내피 세포를 유도하고 응괴를 용해하는 능력을 감소시킨다. 또한 효소 리포단백 리파아제의 발현을 저해함으로써 지방이 저장되는 것으로부터 지방세포의 활성을 재정립한다. TNF 는 또한 "급성상 반응물질" 로 공지된 일군의 단백질을 합성하는 세포를 유도하는데, 이 단백질은 발열물질로서 시상하부에 작용한다[Selby 등의 (1988), Lancet, 1(8583): 483 ; Starnes, Jr. et al. (1988), J. Clin, Invest., 82 : 1321 ; Oliff 등의 (1987), Cell, 50 : 555 ; 및 Waage 등의 (1987), Lancet, 1 (8529) : 355 참조]. 부가적으로 류마티스성관절염을 포함한, 염증성일 것으로 예상되는 다양한 동물 모델에서 나타나는 초기 증상 이전의 결과에서는 TNF 를 저해함으로써 질병의 진행과 정도에 중요한 영향을 미치는 것으로 나타났다[Dayer 등의 (1994), European Cytokine Network, 5(6) : 563 - 571 및 Feldmann 등의 (1995), Annals Of The New York Academy of Science, 66 : 272 - 278 참조]. 더욱이, TNF 저해제에 의한 최근의 예비 인체 임상 시험에서 류마티스성관절염에 대하여 유망한 결과가 나왔다[Rankin 등의(1995), British Journal Of Rheumatology, 3(4) : 4334 - 4342 ; Elliott 등의 (1995), Lancet, 344 : 1105 - 1110 ; Tak 등의 (1996), Arthritis and Rheumatism, 39 : 1077 - 1081 ; 및 Paleolog 등의 (1996), Arthritis and Rheumatism, 39 : 1082 - 1091 참조].
TNF 의 단백질 저해제는 본 분야에 기술되어 있다. 제 EP 308 378 호에는, 고열 환자의 뇨에서 추출한 단백질이 TNF 저해 활성을 갖는다고 기재되어 있다. 이 단백질의 효과는 아마도 수용체 수준에서의 경쟁 메카니즘에서 기인할 것이다. 제 EP 308 378 호는 단백질에 대해 기술하고 있다. 그러나, 이 문헌은 특정 DNA 서열이나 재조합적으로 생산된 TNF 저해제에 대해서 언급하지는 않았다.
재조합으로 생산된 TNF 저해제는 본 분야에서도 알려져 있다. 예를들어, 제 EP 393 438 호와 제 EP 422 399 호는 성숙한 재조합 인체 "30 kDa TNF 저해제"(p55 수용체와 sTNFR-I 으로도 알려져 있음) 및 성숙한 재조합 인체 "40 kDa 저해제" (p75 수용체와 sTNFR-II 로도 공지됨)뿐만 아니라 그것의 변이 형태, 예를들어 단편, 기능성 유도체 및 변이체의 아미노산 서열과 핵산 서열을 제시한다. 제 EP 393 438 호 및 제 EP 422 339 호는 저해제를 코딩하는 유전자의 분리 방법, 적당한 벡터와 세포 형태에서 유전자를 클로닝하는 방법 및 저해제를 생산하는 유전자의 발현 방법에 대하여도 기술하고 있다. 성숙한 재조합 인체 30 kDa TNF 저해제 및 성숙한 재조합 인체 40 kDa TNF 저해제는 TNF 를 저해할 수 있는 것으로 입증되었다[제 EP 393 438 호, 제 EP 422 339 호, PCT 공개 번호 제 WO 92/16221 호 및 PCT 공개 번호 제 WO 95/34326 호 참조].
sTNFR-I 및 sTNFR-II 는 수용체들 중 신경 성장 인자/TNF 수용체 상과의 멤버로서, 신경 성장 인자 수용체(NGF), B 세포 항체 CD40, 4-1BB, 랫의 T-세포 항원 MRC OX40, Fas 항원 및 CD27 항원과 CD30 항원을 포함한다[Smith 등의 (1990), Science, 248 : 1019 - 1023 참조]. 이러한 세포 표면 수용체군 중 가장 보존적인 특징은 시스테인 - 풍부 세포외 리간드 결합 도메인으로서, 이것은 보존적인 위치에 4 - 6 개의 시스테인 잔기를 포함하는 약 40 개의 아미노산으로 이루어진 네개의 반복 모티프로 나뉘어질 수 있다[Smith 등의 (1990), 상기문헌 참조].
제 EP 393 438 호는 또한 완전한 길이의 재조합 40 kDa TNF 저해제 단백질의 절두 형태인 40 kDa TNF 저해제 △51 및 40 kDa TNF 저해제 △53 에 대해서도 기술하고 있는데, 여기에서 51 또는 53 아미노산 잔기는 각각 성숙한 단백질의 카르복시 말단에서 제거된다. 따라서, 본 분야의 숙련자들은 30 kDa TNF 저해제와 40 kDa 저해제 각각의 네 번째 도메인이 TNF 저해에 필수적이지 않음을 인지할 것이다. 여러 실험자들이 이것을 입증하기도 하였다. 30 kDa 및 40 kDa TNF 저해제의 도메인 - 결실 유도체를 생성시킨 결과, 네 번째 도메인이 없는 유도체는 완전한 TNF 결합 활성을 갖는 반면에, 첫 번째, 두 번째 또는 세 번째 도메인을 각각 결실시킨 유도체는 TNF 결합 활성을 갖지 않는다[Corcoran 등의 (1994), Eur. J. Biochem., 233 : 831-840 ; Chih - Hsueh 등의 (1995), The Jornal of Biological Chemistry, 270(6): 2874-2878 ; 및 Scallon 등의 (1995), Cytokine, 7(8): 759-770 참조].
30 kDa TNF 저해제와 40 kDa TNF 저해제에 의해 나타나는 세포독성 저해가 상대적으로 낮기 때문에[Butler 등의 (1994), Cytokin, 6(6) : 616 - 623 참조], 실험자들은 이량체의 TNF 저해제 단백질을 생성시켰다[Butler 등의 (1994), 상기문헌; 및 Martin 등의(1995), Exp. Neurol., 131 : 221 - 228 참조]. 그러나 이량체는 항체 반응을 일으킬 것이다[Martin 등의 (1995), 상기문헌 ; 및 Fisher 등의 (1996), The New England Journal of Medicine, 334(26) : 1697-1702 참조].
본 발명의 목적은 기능상 활성인 절두 sTNFR 을 제공하는 것이다. 이러한 본 발명의 목적과 그외의 목적은 하기 상세한 설명에서 자명해질 것이다.
발명의 요약
본 발명은 sTNFR-I 및 sTNFR-II 의 기능상 활성인 각각의 절두형에 관한 것이며, 본원에서는 이것을 "절두 sTNFR"로 기재한다. 절두 sTNFR 은 sTNFR-I 및 sTNFR-II 의 변이체로서, 네 번째 도메인(sTNFR-I의 아미노산 잔기 Thr127-Asn161및 sTNFR-II 의 아미노산 잔기 Pro141-Thr179); 세번째 도메인의 일부 (sTNFR-I 의 아미노산 잔기 Asn111-Cys126및 sTNFR-II 의 아미노산 잔기 Pro123-Lys140) ; 및 선택적으로 첫번째 도메인의 일부(sTNFR-I의 아미노산 잔기 Asp1-Cys19및 sTNFR-II 의 아미노산 잔기 Leu1-Cys32)를 함유하지 않는다. 이들 신규한 TNF 저해제 (예를들어, TNF-α 및/또는 TNF-β) 가 일반적으로 적당하다.
본 발명의 절두 sTNFR 은 식 R1-[Cys19-Cys103] - R2및 R4- [Cys32-Cys115] - R5로 표현되는 단백질을 포함한다. 이들 단백질은 각각 sTNFR-I 및 sTNFR-II의 절두형이다.
"R1- [Cys19-Cys103]-R2"는 하나 또는 그 이상의 단백질 및 그것의 변이체를 의미하는데, [Cys19-Cys103]은 용이하게 비교할 수 있도록 도 1 (서열 2)에 제공한 아미노산 잔기 번호도에 나타나 있는 바와 같이 sTNFR-I 의 잔기 19 내지 103 이고;
R1은 Cys19또는 다음 중에서 선택한 아미노-말단 아미노산 잔기의 메티오닐화된 아민기나 메티오닐화되지 않은 아민기를 나타내고:
R2는 Cys103또는 다음 중에서 선택한 카르복시-말단 아미노산 잔기의 카르복시기를 나타내며:
그러나 만약, R1이 아미노산 서열 VCPQGKYIHPQNNSIC의 메티오닐화된 아민기이거나 메티오닐화되지 않은 아민기 또는 잔기 1 내지 15 의 N-말단이 절두된 형태를 나타낸다면, R1-[Cys19-Cys103] - R2단백질은 식 R1- [Cys19-Cys103] - FCCSLCL - R3를 갖는 부가 변이체가 아니며, 여기에서 R3는 도 1 의 아미노산 서열 Asn111-Asn161의 카르복시기 또는 그것의 카르복시-말단이 절두됨을 나타낸다.
본 발명의 절두 sTNFR-I의 예는 메티오닐화되거나 메티오닐화되지 않은 다음 분자 및 그것의 변이체와 유도체를 포함한다: NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC - [Cys19-Cys103] - FC - COOH (sTNFR-I 2.6 D/C105 로도 언급함); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC - [Cys19-Cys103] - FNCSL - COOH (sTNFR-I 2.6 D/N106 으로도 언급함); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC - [Cys19-Cys103] - FN-COOH (sTNFR-I 2.6 D/N105 로도 언급함); NH2-MYIHPQNNSIC - [Cys19-Cys103] - FNCSL - COOH [sTNFR-I 2.3 D/d8 로도 언급함); NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2.3 D/d18 로도 언급함); 및 NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2.3 D/d15 로도 언급함).
"R4-[Cys32-Cys115]-R5" 는 하나 또는 그 이상의 단백질 및 그것의 변이체를 의미하는데, 여기에서 [Cys32-Cys115]는 비교하기 용이하도록 도 8 (서열 35)에 제시한 아미노산 잔기 번호도에 나타나 있는 바와 같이 잔기 Cys32내지 Cys115를 나타내며;
R4는 Cys32또는 다음 중에서 선택한 아미노-말단 아미노산 잔기의 메티오닐화되거나 메티오닐화되지 않은 아민기를 나타내고:
R5는 Cys115또는 다음 중에서 선택한 카르복시-말단 아미노산 잔기의 카르복시기를 나타낸다:
그러나 만약, R4가 아미노산 서열 TCRLREYYDQTAQMAC 의 메티오닐화된 아민기나 메티오닐화되지 않은 아민기 또는 잔기 1 내지 15 의 N-말단이 절두된 형태를 나타낸다면, R4-[Cys32-Cys115]-R5는 식 R4-[Cys32-Cys115]-APLRKCR-R6를 갖는 부가 변이체가 아니며, 여기에서 R6는 도 8 의 아미노산 서열 Pro123-Thr179의 카르복시기를 나타내거나 그것의 카르복시-말단이 절두됨을 나타낸다.
본 발명의 한 양상에 있어서, 절두 sTNFR 은 글리코실화된 형태 또는 글리코실화되지 않은 형태로 제조할 수 있다. 절두 sTNFR 은 재조합 유전공학 기술로 생산한다. 선택적인 실시형태에 있어서, 절두 sTNFR은 화학 기술에 의해 합성하거나 재조합 기술과 화학 기술을 조합하여 합성한다.
본 발명의 다른 양상에 있어서, 절두 sTNFR 은 수용성 중합체에 절두 sTNFR을 결합시킴으로써 유도할 수 있다. 예를들어, 분자의 겉보기 분자량을 증가시킴으로써 약동력학적 능력을 높이기 위해 하나 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 절두 sTNFR을 결합시킬 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 절두 sTNFR 을 코드하는 각각의 폴리누클레오티드를 포함한다. 적당한 핵산 서열은 예를들어 도면에 특정하여 기술한 서열 뿐만 아니라 그것의 동의 서열과 자연발생적인 대립형질 변이체를 포함한다. 이러한 핵산 서열은 진핵 숙주 세포와 원핵 숙주 세포에서 절두 sTNFR 을 발현시키는 데 사용하는데, 발현 산물이나 그것의 유도체는 TNF 활성을 조절하는 능력으로 특정화된다.
본 발명의 다른 양상은 절두 sTNFR 을 코드하는 폴리누클레오티드를 함유하는 벡터를 포함하는데, 이 벡터는 증폭 및/또는 발현 조절 서열과 작동적으로 결합한다. 이 벡터로 원핵 숙주 세포와 진핵 숙주 세포를 안정하게 형질전환시키거나 형질감염시켜 절두 sTNFR 을 발현시킨다. 본 발명은 또한 절두 sTNFR 의 재조합 산물을 포함하는데, 이러한 폴리펩티드를 함유하는 숙주 세포를 적당한 영양 배지에서 성장시키고, 선택적으로 이 세포에서 발현된 절두 sTNFR 을 숙주 세포 및/또는 영양 배지에서 분리한다.
본 발명의 또다른 양상은 절두 sTNFR 또는 그것의 유도체를 함유하는 제약학적 조성물을 포함한다. 일반적으로, 절두 sTNFR 또는 그것의 유도체는 제약학적으로 용인가능한 운반체와 함께 제형화할 수 있다. 절두 sTNFR 또는 그것의 유도체의 보관, 취급, 운반 및/또는 효율이 용이하도록 그외의 다양한 제제형 물질을 사용할 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 TNF 활성 조절방법에 관한 것이다. 특히, 절두 sTNFR 또는 그것의 유도체의 치료학적 유효량을 환자에게 투여함으로써 TNF - 매개 질환(예를들어, TNF - α 및/또는 TNF - β 에 의해 매개되는 질환)을 치료할 수 있다.
세포 치료나 유전자 치료를 위해 절두 sTNFR 을 코드하는 폴리누클레오티드를 사용할 것이다.
본 발명의 절두 sTNFR 은 대규모의 단백질 생산에 특히 적합하다. 예를들어, sTNFR - I 은 아미노산 서열 111 내지 126 (아미노산 Asn111-Gly126)내에 아마이드분해 부위를 갖는다. 이 부위가 없으면 정제된 단백질의 생화학적 안정성이 증가할 것으로 기대되어, 산물이 분해될 가능성이 적어지고 단백질 보관시에 더 안정하다. 절두 sTNFR 은 전술한 다른 TNF 저해제 단백질보다 적은 수의 이황화물 다리를 갖는다. 예를들어, sTNFR - I 은 아미노산 서열 111 내지 126 내에 두 개의 이황화물 다리를 가지며, 아미노산 서열 127 내지 161 내에 세개의 이황화물 다리를 갖는다; 또한 sTNFR - II 는 Cys121과 Cys139, Cys142와 Cys157, Cys163과 Cys178사이에 이황화물 다리를 갖는다. 이황화물 다리의 수가 증가하면 단백질 되접힘 과정이 복잡해질 수 있으므로 이황화물 다리의 수의 감소가 중요하다. 놀랍게도, 절두 sTNFR 이 전술한 다른 TNF 저해제 단백질보다 적은 수의 항원성 에피토프 부위를 가지므로 [예를들어, 최초 세개의 도메인을 갖는 sTNFR - I 의 단형(shortened form)은 특정 잔기를 노출시킴으로써 야기되는 네오-에피토프를 갖는다, 실시예 3 참조], 비교적 낮은 항원성을 가지고 반복 투여로 인한 제거율의 감소가 눈에 띄지 않는다. 면역원성이 낮은 절두 sTNFR 은 특히 만성 염증 질환을 포함한 TNF - 매개 질환 치료에 적합할 것으로 기대된다.
본 발명의 부가적인 양상과 이점은 하기 발명의 상세한 설명을 고려하면 본 분야의 숙련자들에게 자명해질 것이다.
발명의 분야
본 발명은 염증 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 절두된 종양 괴사 인자 수용체(sTNFR)에 관한 것이다.
본 발명의 여러 양상과 이점은 도면에 의하여 자명해질 것이다.
도 1 은 완전한 길이의 재조합 인체 sTNFR - I 인 Asp1-Asn161을 코드하는 핵산 서열(서열 1)을 나타낸다. 또한 Asp1-Asn161의 아미노산 서열(서열 2)도 나타낸다.
도 2 는 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH (sTNFR-I 2. 6D/C105 로도 언급함)를 코드하는 핵산 서열(서열 3)을 나타낸다. 또한 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH 의 아미노산 서열(서열 4)도 나타낸다.
도 3 은 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(sTNFR-I 2.6 D/C106 으로도 언급함)를 코드하는 핵산 서열(서열 5)을 나타낸다. 또한 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH 의 아미노산 서열(서열 6)을 나타낸다.
도 4 는 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH(sTNFR-1 2.6 D/N105 로도 언급함)를 코드하는 핵산 서열(서열 7)을 나타낸다. 또한 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH 의 아미노산 서열(서열 8)을 나타낸다.
도 5 는 NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(sTNFR-I 2.3 D/d8 로도 언급함)를 코드하는 핵산 서열(서열 11)을 나타낸다. 또한 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH 의 아미노산 서열(서열 12)도 나타낸다.
도 6 은 NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(sTNFR-I 2.3 D/d18 로도 언급함)를 코드하는 핵산 서열(서열 9)을 나타낸다. 또한 NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH 의 아미노산 서열(서열 10)도 나타낸다.
도 7 은 NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(sTNFR-I 2.3 D/d15 로도 언급함)를 코드하는 핵산 서열(서열 13)을 나타낸다. 또한 NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH 의 아미노산 서열(서열 14)도 나타낸다.
도 8 은 성숙한 재조합 인체 sTNFR-II 인 Leu1-Thr179를 코드하는 핵산 서열(서열 34)을 나타낸다. 또한 Leu1-Thr179의 아미노산 서열(서열 35)도 나타낸다.
도 9 는 실시예 2 에 기술한 바와 같이 연쇄상구균 세포벽 - 유도 재활성화 모델에서 유도한 종창의 양을 나타낸 것이다.
도 10 은 실시예 3 에 기술한 바와 같이 0.2 mg/kg 을 정맥내 주사한 지 2 분 후에 건강한 비비(baboon)에서의 sTNFR-I 4D/C105db 의 플라스마 프로필을 나타낸 것이다.
도 11 은 실시예 3 에 기술한 바와 같이 0.2 mg/kg 을 정맥내 주사한 지 2 분 후에 건강한 비비에서의 sTNFR-I 3D/C105db 의 플라스마 프로필을 나타낸 것이다.
도 12 는 실시예 3 에 기술한 바와 같이 0.2 mg/kg 을 정맥내 주사한 지 2 분 후에 건강한 비비에서의 sTNFR-I 2.6D/C105db 의 플라스마 프로필을 나타낸 것이다.
도 13 은 실시예 3 에 기술한 바와 같이 상이한 이량체 sTNFR-I 구성물의 투여량과 제거율 간의 관계를 나타낸 것이다.
발명은 sTNFR-I 및 sTNFR-II 각각의 네번째 도메인과 세 번째 도메인의 일부 및 선택적으로 첫 번째 도메인의 일부를 결실시키면 크기가 감소하지만 생물학적 활성도를 보유할 뿐만 아니라 항원성이 감소한다는 예상외의 발견에 기초한 것이다. 적어도 하기한 이유에 대하여, 생물학적으로 활성인 이들 절두 sTNFR 또는 그것의 유도체를 생산하는 것이 바람직할 것으로 생각된다. 첫째, 이들 분자는 잠재적으로 덜 약화된 아마이드분해 부위를 가질 것이다. 둘째, 이들 분자는 더 적은 수의 이황화물 다리를 가지며, 이로 인해 보다 용이하게 되접히고 정제할 수 있다. 셋째, 이들 분자는 감소된 잠재적인 항원성 에피토프 부위를 갖는다.
하기한 바와 같이, 본원에 사용한 용어 "절두 sTNFR"은 식 R1-[Cys19-Cys103]-R2또는 R4-[Cys32-Cys115]-R5를 갖는 생물학적으로 활성인 합성 분자나 재조합 분자 중 하나 또는 그 이상 및 그것의 변이체(삽입 변이체, 치환 변이체와 결실 변이체 포함)를 포함한다.
본원에 사용한 용어 "생물학적으로 활성"은 절두 sTNFR 이 유사한 TNF 저해 특성을 가짐을 의미하며, sTNFR-I 및/또는 sTNFR-II 와 완전히 동일하거나 같은 정도일 필요는 없다. 일반적으로, 절두 sTNFR 과 그것의 유도체는 TNF 를 저해하는 능력을 갖는다. 절두 sTNFR 의 생검정에 대해서는 하기 실시예 2 에 더 자세히 기술되어 있다. 어떤 특정 TNF-저해 특성을 선택하는지 여부는 절두 sTNFR 의 원하는 용도에 좌우된다.
본 발명의 한 양상에 있어서, 절두 sTNFR 은 박테리아 세포계, 포유동물 세포계 또는 곤충 세포계에서 재조합 기술을 통해 생산하는 것이 유리하며, 글리코실화된 형태의 단백질이거나 글리코실화되지 않은 형태일 수 있다. 선택적으로, 절두 sTNFR 을 화학적으로 합성할 수도 있다. 현재 바람직한 생산 방법은 하기에 더 자세히 기술할 것이다.
각각의 절두 sTNFR 에 다른 단백질성 물질(즉, 비 - 절두 sTNFR)이 존재하지 않도록 전형적으로 분리정제한다. 절두 sTNFR 제조시에 사용하는 생산 기술로 인해 존재하는 다른 단백질의 약 80 % 가 제거되는 것이 바람직하다. 다른 단백질의 약 90 % 가 제거되는 것이 더욱 바람직하며, 특히 약 95 % 가 바람직하고, 가장 바람직하게는 약 98 % 를 넘는 것이다. 그러나, 하기에 보다 상세히 기술하는 바와 같이 투여하기 전에 다른 활성 성분, 화학 조성물 및/또는 적당한 제약학적 제제형 물질과 함께 원하는 단백질을 조합할 수 있음은 자명할 것이다.
절두 sTNFR
기본적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 절두 sTNFR 은 다음 식을 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질 및 그것의 변이체일 것이다 :
R1-[Cys19-Cys103]-R2
여기에서 [Cys19-Cys103]은 용이하게 비교할 수 있도록 도 1(서열 2)에 나타낸 아미노산 잔기 번호도에 나타나 있는 sTNFR-I 의 잔기 19 내지 103 을 나타내고 ;
R1은 Cys19또는 다음 중에서 선택한 아미노-말단 아미노산 잔기의 메티오닐화된 아민기 또는 메티오닐화되지 않은 아민기를 나타내며 :
R2는 Cys103또는 다음 중에서 선택한 카르복시-말단 아미노산 잔기 의 카르복시기를 나타낸다 :
그러나 만약 R1이 아미노산 서열 VCPQGKYIHPQNNSIC 의 메티오닐화된 아민기이거나 메티오닐화되지 않은 아민기 또는 잔기 1 내지 15 의 N - 말단이 절두된 형태를 나타낸다면, R1-[Cys19-Cys103]-R2는 식 R1-[Cys19-Cys103]-FCCSLCL-R3를 갖는 부가 변이체가 아니며, 여기에서 R3는 도 1 의 아미노산 서열 Asn111-Asn161의 카르복시기 또는 그것의 카르복시-말단이 절두됨을 나타낸다.
또다른 기본적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 절두 sTNFR 은 다음 식을 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질 및 그것의 변이체일 수 있다 :
R4-[Cys32-Cys115]-R5
여기에서 [Cys32-Cys115] 는 용이하게 비교할 수 있도록 도 8 (서열 35)에 제시한 아미노산 잔기 번호도에 나타나 있는 sTNFR-II 의 Cys32내지 Cys115잔기를 나타내며 ;
R4는 Cys32또는 다음 중에서 선택한 아미노-말단 아미노산 잔기의 메티오닐화되거나 그렇지 않은 아민기를 나타내고 :
여기에서 R5는 Cys115또는 다음 중에서 선택한 카르복시-말단 아미노산 잔기의 카르복시기이다 :
그러나 만약 R4가 아미노산 서열 TCRLREYYDQTAQMC 의 메티오닐화되거나 그렇지 않은 아민기 또는 잔기 1 내지 15 의 N - 말단이 절두된 형태를 나타낸다면, R4-[Cys32-Cys115]-R5는 식 R4-[Cys32-Cys115]-APLRKCR-R6를 갖는 부가 변이체가 아니며, 여기에서 R6는 도 8 의 아미노산 잔기 Pro123-Thr179의 카르복시기를 나타내거나 그것의 카르복시-말단이 절두됨을 나타낸다.
본 발명의 다른 양상은 메티오닐화되거나 그렇지 않은 R1-[Cys19-Cys103]-R2및 R4-[Cys32-Cys115]-R5의 하나 또는 그 이상의 변이체를 포함한다. 따라서 용어 "절두 sTNFR" 은 R1-[Cys19-Cys103]-R2및R4-[Cys32-Cys115]-R5의 자연발생적인 대립형질 변이체 중 하나 또는 그 이상을 포함하며, R1-[Cys19-Cys103]-R2또는R4-[Cys32-Cys115]-R5서열에서 아미노산 잔기를 삭제하거나("결실 변이체"), 잔기내로 삽입하거나("부가 변이체")잔기를 치환한("치환 변이체") 그외의 변이 단백질 중 하나 또는 그 이상도 포함한다.
일반적으로 약 20 개 범위에서 아미노산 잔기를 삭제하며, 보다 일반적으로는 약 1 내지 10개, 가장 일반적으로는 약 1 내지 5 개의 잔기를 삭제하는데, 이는 단백질 접힘을 망가뜨리지 않기 위해서이다. N - 말단 삭제, C-말단 삭제와 서열내부 삭제가 포함된다. 총 삭제 수 및/또는 연속 삭제 수는 예를들어 시스테인 교차결합에 영향을 미치는 도메인에서 단백질의 3 차 구조를 유지하는 차원에서 선택할 것이다.
R1-[Cys19-Cys103]-R2아미노산 서열내 삭제 및R4-[Cys32-Cys115]-R5아미노산 서열내 삭제는 세포 표면 항원 단백질군의 NGF/TNF 수용체과 중 다른 멤버의 서열과 낮은 상동성을 갖는 부위에서 이루어질 것이다. R1-[Cys19-Cys103]-R2아미노산 서열 삭제와R4-[Cys32-Cys115]-R5아미노산 서열 삭제는 NGF/TNF 수용체과 중 다른 멤버의 서열과 실질적으로 상동인 부위에서 이루어지며, 생물학적 활성도가 상당히 변할 것이다. 특히,
NGF/TNF 수용체과 멤버 간의 서열 유사성은 도메인 1 의 처음 두 개의 이황화물 루프와 도메인 2 의 전부위, 도메인 3 의 첫 번째 이황화물 루프에 해당하는 부위에서 특히 높다[Banner 등의 (1993), Cell, 73 : 431 - 445 참조]. 예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2의 두 전형적인 결실 변이체는 R1-[Cys19(△Thr20]-Cys103]-R2와 R1-[Cys19(△Cys19-Lys21)-Cys103]-R2이며, 여기에서 R1과 R2는 상기한 바와 같다. 예를들어, R4-[Cys32-Cys115]-R5의 전형적인 세 결실 변이체는 R4-[Cys32(△Cys115) Cys115]-R5;R1-[Cys19(△Cys115-Lys115)-Cys103]-R2및R4-[Cys32-(△Cys115- Arg113- Cys115]-R5인데, 여기에서 R1및 R2는 상기한 바와 같다.
아미노산 서열 부가는 1 내지 100 개의 잔기 또는 그 이상의 잔기에 걸쳐 아미노 - 말단 및/또는 카르복시 - 말단 융합 뿐만 아니라 하나 또는 여러 개의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 내부 부가는 일반적으로 약 1 내지 10 개의 아미노산 잔기에 의해 이루어지며, 약 1 내지 5 개의 아미노산 잔기가 더욱 일반적이고, 가장 일반적으로는 약 1 내지 3 개의 아미노산 잔기에 의해 이루어진다.
아미노 - 말단 부가 변이체는 메티오닌 부가(예를들어, 박테리아 재조합 세포 배양액내 단백질의 직접 발현 합성물로서) 또는 부가적인 아미노산 잔기나 서열을 포함한다. 재조합 숙주 세포로부터 용이하게 단백질이 분비될 수 있도록, 아미노-말단 삽입의 또다른 예로서 다른 프리-프로 서열 뿐만 아니라 시그널 서열 융합을 포함한다. 천연 sTNFR-I 이나 sTNFR-II 시그널 서열을 인식하여 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 시그널 서열은 예를들어 알칼린 포스파타제, 페니실리나제 또는 열 - 안정 엔테로톡신 II 리더스 중에서 선택한 원핵 시그널 서열로 대체할 수 있다. 효모 세포의 경우, 시그널 서열은 예를들어 효모 인베르타제, 알파 인자 또는 산 포스파타제 리더 서열 중에서 선택할 수 있다. 포유동물 세포 발현에 있어서, sTNFR-I 또는 sTNFR-II 의 천연 시그널 서열(제 EP 393 438 호 및 제 EP 422 339 호 참조)이 적당하기는 하나, 그외의 포유동물 시그널 서열(예를들어, 그외의 NGF/TNF 수용체과 멤버에서 유래한 서열)도 적합하다.
카르복시 - 말단 부가 변이체는 sTNFR-I 또는 sTNFR-II 각각을 재구성하는, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 부가와는 관계가 없다. 카르복시 - 말단 부가 변이체가 sTNFR-I 또는 sTNFR-II 의 세 번째 도메인이나 네 번째 도메인을 재구성하는 하나 또는 그 이상의 카르복시산 잔기 부가를 포함하지 않음은 인지될 것이다. 카르복시 - 말단 부가 변이체의 예에는 인체 면역글로불린 중쇄나 경쇄의 불변 영역의 일부 또는 전부와 R1-[Cys19-Cys103]-R2또는 R4-[Cys32-Cys115]-R5융합을 포함한 키메라 단백질이 포함된다. 이러한 키메라 단백질이 바람직한데, 여기에서 각각의 면역글로불린 중 일부는 인체 면역글로불린, 예를들어 IgG, IgA, IgM 또는 IgE, 특히 IgG, 예를들어 IgG1 또는 IgG3 중쇄의 불변 영역의 첫 번째 도메인을 제외한 모든 도메인을 포함한다. 본 분야의 숙련자들은 TNF 결합부가 TNF 에 결합하고 면역글로불린이 그것의 특성 중 하나 또는 그 이상을 나타내는 한도내에서 각각의 면역글로불린 중 일부의 어떤 아미노산이 하나 또는 그 이상의 아미노산으로 치환되거나 결실될 수 있으며 하나 또는 그 이상의 아미노산이 부가될 수 있음을 인지할 것이다. 다른 변이체군은 아미노산 치환 변이체이다. 각각의 이들 변이체는 R1-[Cys19-Cys103]-R2또는 R4-[Cys32-Cys115]-R5에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삭제되고 그 위치에 다른 잔기가 삽입된다. 치환 변이체는 대립형질 변이체를 포함하는데, 이것은 아미노산을 치환시키거나 그렇지 않은 종의 집단에서 일어나는 자연발생적인 누클레오티드 서열 변화를 특징으로 한다. 본 분야의 숙련자들은 가능한 변이 부위를 선택하는 데 있어서 폴리펩티드의 결합 부위나 활성 부위에 관하여 공지된 모든 정보를 이용할 수 있다.
단백질의 돌연변이유발 부위나 아미노산 잔기를 확인하는 방법 중 하나를 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 한다[Cunningham and Wells(1989), Science, 244 : 1081 - 1085 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 이 방법으로 단백질의 아미노산 잔기나 표적 잔기군을 확인한 다음(예를들어, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu 와 같은 치환 잔기), 세포내외의 주변 수성 환경과 아미노산 상호작용에 영향을 미치는 중성 아미노산이나 음전하 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌이나 페닐알라닌)으로 치환한다. 치환에 민감한 이들 잔기는 치환 부위에 부가적인 잔기나 대체 잔기를 도입함으로써 순화된다. 따라서, 주어진 부위에서의 돌연변이 실시를 최적화히기 위해 아미노산 서열 변이 도입 부위를 미리 결정하고, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이나 무작위 돌연변이유발을 실시하여 생성된 변이 폴리펩티드에 대해 원하는 활성도와 활성 정도의 최적 배합을 스크리닝할 것이다.
치환 돌연변이유발시에 중요한 부위는, R1-[Cys19-Cys103]-R2또는 R4-[Cys32-Cys115]-R5에서 발견되는 아미노산이 다양한 여러 종이나 NGF/TNF 수용체과 멤버의 sTNFR 과 같은 sTNFR- 유사 단백질과 곁사슬 크기, 변이 및/또는 소수성 차원에서 실질적으로 다른 부위를 포함한다.
다른 중요한 부위는 특정 잔기가 sTNFR-I - 유사 단백질과 sTNFR-II-유사 단백질의 잔기와 유사하거나 동일한 부위를 포함한다. 이러한 위치는 일반적으로 단백질의 생물학적 활성도에 중요하다. 예를들어 숙련자들은, sTNFR-I 과 sTNFR-II 를 절두하는 것이 그들 각각의 3 차원적 구조에 미치는 영향을 예상할 수 없음을 본 발명 전에 인지하였을 것이다. 그러나, 본원의 결과에서는 변이체 제조 방법을 개발하는 주요 요소가 완전한 길이의 sTNFR-I 과 sTNFR-II 에서 미리 밝혀진 정보에 부분적으로는 의존할 수 있었다. 따라서, 하기 정보는 sTNFR-I 에 대해 밝혀진 것이었다[Banner 등의(1993) 상기문헌 및 Fu 등의(1995) Protein Engineering, 8(12) : 1233 - 1241 참조]. 도메인 1의 잔기 Tyr9, Thr39, His55, 도메인 2 의 잔기 Phe49, Ser63, Asp82및 도메인 3 의 잔기 Tyr92와 Ser107이 각각 도메인 1, 2, 3 의 구조적 안정성에 중요한 것으로 잠재적으로 확인되었다. 잔기 Pro12와 His55가 TNFα 아단위 C 의 Ser86- Tyr87과 상호작용하는 것으로 잠재적으로 확인되었다. 잔기 Glu45-Phe49는 TNFα 아단위 A 의 잔기 Leu29-Arg32와 잠재적으로 상호작용하는 루프에 존재하는 것으로 확인되었다. 잔기 Gly48은 TNFα 아단위 A 의 Asn19- Pro20와 잠재적으로 상호작용하는 것으로 확인되었다. 잔기 His58- Leu60은 연장된 가닥 입체형태에 존재하는 것으로 확인되었고, TNFα 아단위 A 의 잔기 Arg31-Ala33과의 결사슬 상호작용은 잔기 Arg31과 특이하게 상호작용하는 sTNFR-I 의 잔기 His58과 잠재적으로 동일하였다. 잔기 Lys64-Arg66은 연장된 가닥 입체형태에 존재하는 것으로 확인되었고, TNFα 아단위 A 상의 잔기 Ala145-Glu146및 잔기 Glu46과 곁사슬 상호작용하고 주사슬 상호작용하는 것으로 확인되었다. 잔기 Met69는 TNFα 아단위 A 상의 잔기 Tyr115와 잠재적으로 상호작용하는 것으로 확인되었다. 잔기 His94-Phe101은 루프를 형성하는 것으로 확인되었는데, 이 루프는 TNFα 상의 아단위 C 의 Asn137과 잔기 Thr72-Leu75와 상호작용하며, TNFα 의 아단위 C 의 잔기 Ser71- Thr72와 특이하게 상호작용하는 sTNFR-I 의 잔기 Trp96과 상호작용하고, TNFα 의 아단위 C 상의 잔기 Asn137과 매우 근접해 있는 sTNFR-I 의 Leu100과 상호작용하며, TNFα 의 아단위 A 상의 잔기 Pro113과 특이하게 상호작용하는 sTNFR-I 의 잔기 Gln102와 상호작용한다. 따라서, 본 분야의 숙련자들은 비교적 보존적인 방법으로 이들 부위를 치환 변이시켜야 함을 인지할 것이다.
이러한 보존적인 치환은 "바람직한 치환"이라는 표제하에 표 1 에 나타나 있다. 이러한 치환으로 생물학적 활성도가 변한다면, 보다 실질적인 치환(전형적인 치환)을 도입할 수 있으며/있거나 그외의 부가/결실을 실시할 수 있으며 결과적으로 생성된 산물을 스크리닝하였다.
아미노산 치환
원래의 잔기 바람직한 치환 전형적인 치환
Ala(A) Val Val ; Leu ; Ile
Arg(R) Lys Lys ; Gln ; Asn
Asn(N) Gln Gln ; His ; Lys ;Arg
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro Pro
His(H) Arg Asn ; Gln ; Lys ;Arg
Ile(I) Leu Leu ; Val ; Met ;Ala ; Phe ;노르로이신
Leu(L) Ile 노르로이신 ;Ile ; Val ; Met ;Ala ; Phe
Lys(K) Arg Arg ; Gln ; Asn
Met(M) Leu Leu ; Phe ; Ile
Phe(F) Leu Leu ; Val ; Ile ;Ala
Pro(P) Gly Gly
Ser(S) Thr The
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr Tyr
Tyr(Y) Phe Trp ; Phe ; Thr ;Ser
Val(V) Leu Ile ; Leu ; Met ;Phe ; Ala ;노르로이신
동일한 성질로 치환할 때에는 아미노산의 수치료 지표를 고려할 수 있다. 각 아미노산은 그들의 소수성과 변이 특성에 근거하여 수치료 지표가 지정되었다 : 이소로이신(+4.5); 발린(+4.2); 로이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루탐산(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르트산(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9) ; 및 아르기닌(-4.5).
단백질에 대해 상호작용하는 생물학적 기능을 부여하는 수치료 아미노산 지표의 중요성은 본 분야에 널리 알려져 있다[Kyte 및 Dottle(1982), J. Mol. Biol., 157: 105-131 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 특정 아미노산을 유사한 수치료 지표를 갖는 다른 아미노산으로 치환해도 여전히 유사한 생물학적 활성도를 유지한다는 것은 공지되어 있다. 수치료 지표에 근거하여 치환할 경우, 아미노산의 수치료 지표가 ±2 이내인 치환이 바람직하며, ± 1 이내인 치환이 특히 바람직하고, ± 0.5 이내인 치환이 더더욱 바람직하다.
특히 이로 인해 생성된, 생물학적 기능면에서 동일한 단백질이나 펩티드를 본 경우에서처럼 면역학적 실시형태에 사용하고자 할 경우에, 그것의 친수성에 근거하여 효과적으로 유사 아미노산을 치환할 수 있음은 본 분야에 알려져 있다.
본원에서 참고문헌으로 인용한 미국 특허 번호 제 4,554,101 호에는, 인접 아미노산의 친수성에 의해 좌우되는 단백질의 최대 평균 국부 친수성은 그것의 면역원성과 항원성, 예를들어 단백질의 생물학적 특성과 관계가 있는 것으로 기술되어 있다.
미국 특허 제 4,554,101 호에 기술되어 있는 바와 같이, 아미노산 잔기에 대하여 하기 친수성 값이 지정되었다 : 아르기닌(+3.0) ; 리신(+3.0); 아스파르트산(+3.0 ± 1); 글루탐산(+3.0 ± 1) ; 세린 (+ 0.3) ; 아스파라긴(+ 0.2) ; 글루타민 (+ 0.2) ; 글리신(0) ; 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5) ; 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 로이신(-1.8); 이소로이신(-1.8) ; 티로신(-2.3) ; 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
유사한 친수성 값에 의해 변이시킬 경우, 친수성 값이 ± 2 이내인 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하며 ± 1 이내인 아미노산이 특히 바람직하고, ± 0.5 이내인 아미노산으로 치환하는 것이 더더욱 바람직하다.
미국 특허 제 4,554,101 호는, 친수성에 의해 1 차 아미노산 서열로 부터 에피토프를 확인하고 제조하는 것에 관해 기술하고 있다. 미국 특허 제 4,554,101 호에 기술된 방법을 통해 본 분야의 숙련자들은 본원에 기술한 sTNFR 서열과 같은 아미노산 서열에서 에피토프를 확인할 수 있을 것이다. 이들 부위는 "에피토프 코어 부위(epitopic core regions)" 로도 언급한다.
아미노산 서열 분석으로 에피토프를 확인하고 그것의 2 차 구조를 예상하는 다수의 과학 간행물이 있다[Chou 및 Fasman(1974), Biochemistry, 13(2) : 222 - 245 ; Chou 및 Fasman, Biochemistry, 113(2) : 211 - 222 ; Chou 및 Fasman(1978), Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47 : 45-148 ; Chou 및 Fasman, Ann. Rev. Biochem., 47 : 251-276 및 Chou 및 Fasman(1979), Biophys, J., 26 : 367-284 참조, 이들 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 또한 최근에는 단백질의 에피토프 코어 부위와 항원부를 예상하는 데 도움이 되는 컴퓨터 프로그램을 입수할 수 있다. 그 예로서는 제임슨 - 울프 분석에 기초한 프로그램[Jameson 및 Wolf(1988), Comput. Appl. Biosci., 4(1) : 187-191 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함], 프로그램 PepPlot[Brutlag 등의 (1990) CABS, 6 : 237-245 및 Weinberger 등의(1985), Science, 228 : 740-742 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함], 그외에 단백질 3 차 구조 예상을 위한 새로운 프로그램[Fetrow 및 Bryant(1993), BIOTECHNOLOGY, 11 : 479 - 483 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함]이 포함된다.
R1-[Cys19-Cys103]-R2및 R4-[Cys32-Cys115]-R5의 아미노산 서열에 대한 보존적 변이(및 핵산 서열을 코드하는 상응 변이)로 기능과 화학적 특성이 유사한 변이 단백질이 생산된다.
이와는 대조적으로, R1-[Cys19-Cys103]-R2와 R4-[Cys32-Cys115]-R5의 기능상 및/또는 화학적 특성을 상당히 변화시키는 것은 다음을 유지하기 위한 그들의 효과와는 상당히 다른 치환을 선택함으로써 이루어질 것이다 :
(a) 치환 영역내 폴리펩티드 골격 구조, 예를들어 쉬트나 나선형 입체형태, (b) 표적 부위에서의 단백질의 전하나 소수성 또는 (c) 곁사슬 크기. 자연발생적인 잔기는 일반적인 곁사슬 특성에 따라 다음 군으로 나뉘어진다 :
1) 소수성 : 노르로이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile ;
2) 중성 친수성 : Cys, Ser, Thr ;
3) 산성 : Asp, Glu ;
4) 염기성 : Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기 : Gly, Pro ; 및
6) 방향성 : Trp, Tyr, Phe.
비 - 보존적인 치환은 이들 군 중 한 군의 멤버를 다른 군의 멤버로 치환하는 것이다. 이러한 치환 잔기는 그외의 NGF/TNF 수용체과 멤버와 상동이거나 그렇지 않은 R1-[Cys19-Cys103]-R2및 R4-[Cys32-Cys115]-R5부위내로 도입될 것이다.
R1-[Cys19-Cys103]-R2및 R4-[Cys32-Cys115]-R5서열의 특이 돌연변이는 N-말단이나 C-말단에서의 비-천연 아미노산 치환을 포함하며, N-결합 탄수화물이나 O-결합 탄수화물 부가로 변이시킨 단백질 부위에서의 아미노산 치환도 포함한다. 이러한 변이는 아미노산(예를들어, 시스테인) 부가와 같이 특정하게 사용할 수 있는데, 이것은 하기한 바와 같이 수용성 중합체와 결합하여 유도체를 형성하는 것이 바람직하다. 예를들어 도 5 를 참조하라. 여기에서 자연발생적인 sTNFR-I 의 Asn105는 폴리에틸렌 글리콜 분자에 용이하게 결합할 수 있도록 Cys 로 치환한다(실시예 1 참조).
또한, 글리코실화 부위를 부가하거나 N - 결합 글리코실화 부위 또는 0 - 결합 글리코실화 부위를 삭제하기 위해 R1-[Cys19-Cys103]-R2및 R4-[Cys32-Cys115]-R5를 변이시킬 수 있다. 아스파라긴 - 결합 글리코실화 인식 부위는 적당한 세포 글리코실화 효소에 의해 특이하게 인식되는 트리펩티드 서열을 포함한다. 이들 트리펩티드 서열은 Asn-Xaa-Thr 이거나 Asn-Xaa-Ser 인데, Xaa 는 Pro 를 제외한 모든 아미노산일 수 있다. sTNFR-I 내에서 확인되거나 예상되는 아스파라긴 잔기의 위치는 14, 105 및 111 이다. sTNFR-II 내에서 확인되거나 예상되는 아스파라긴 잔기의 위치는 149 및 171 이다. 여러 다양한 아미노산 치환이나 결실을 실시하여 N - 결합 글리코실화 부위나 O-결합 글리코실화 부위를 변이시키거나 부가할 수 있으며, 이로 인해 단백질의 글리코실화가 변화된다.
특정 실시형태에 있어서, 변이체는 R1-[Cys19-Cys103]-R2또는 R4-[Cys32-Cys115]-R5의 아미노산 서열과 실질적으로 상동이다. 본원에 사용한 용어 "실질적으로 상동"은 상동성이 바람직하게 70 % 이상임을 의미하고, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 더더욱 바람직하게는 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95 % 임을 의미한다. 본원에 기술한 상동성 백분율은, 본원에서 참고문헌으로 인용한 Dayhoff(1972), Atlas of Protein Sequence and Structure, 5 : 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. 에 기술된 바와 같이, 비교 서열내 동일한 아미노산 잔기로 정렬시킨 두 서열 중 작은 서열에서 발견되는 아미노산 잔기의 백분율로 정하는데, 이때 정렬을 돕기 위해 100 개 아미노산에 네 개의 갭을 도입할 수 있다. 서열 2 와 서열 35 의 아미노산 서열에 대한 항체와의 교차 반응성에 의해 분리한 절두 sTNFR 이나 서열 1 또는 서열 34 의 DNA 또는 그것의 단편과의 혼성화를 통해 그 유전자를 분리하는 sTNFR 또한 실질적으로 상동인 것에 포함된다.
본 발명의 전형적인 sTNFR 은 메티오닐화되거나 그렇지 않은 다음 분자 또는 그것의 변이체와 유도체를 포함한다 : NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH(sTNFR-I 2.6 D/C105 로도 언급함); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(sTNFR-I2.6 D/C106 로도 언급함); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH(sTNFR-I 2.6 D/C105 로도 언급함); NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(sTNFR-I 2.3 D/d8 로도 언급함); NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(sTNFR-I 2.3 D/d18 로도 언급함); 및 NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(sTNFR-I 2.3 D/d15 로도 언급함).
절두 sTNFR 의 변이체 산물은 하기에 더 자세히 기술되어 있다. 이러한 변이체는 절두된 sTNFR 을 코드하는 DNA 내에서 적당한 누클레오티드를 치환함으로써 제조하거나 원하는 절두 sTNFR 의 시험관내 화학 합성을 통해 제조할 수 있다. 최종적으로 절두 sTNFR 이 생물학적으로 활성인 한도내에서 결실, 삽입 및 치환 조합을 실시할 수 있음은 본 분야의 숙련자들에게 자명할 것이다.
하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 선택하여 치환하거나 삽입 또는 결실시키는 돌연변이유발 기술은 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다(예를들어, 본원에서 참고문헌으로 인용한 미국 특허 제 4,518,584 호를 참조하라). 각각의 아미노산 서열 변이체 구성시에 두개의 중요한 변수가 존재하는데, 이 두가지는 돌연변이 부위의 위치와 돌연변이의 성질이다. 각 변이체를 고안함에 있어서, 각 돌연변이 부위의 위치와 성질은 변이되는 생물학적 특성에 따라 좌우될 것이다. 각 돌연변이 부위는 개별적으로 또는 연속적으로 다음과 같이 변이시킬 수 있다 : (1) 우선 보존적인 아미노산 선택물로 치환한 다음 덜 보존적인 선택물로 치환함, (2) 표적 아미노산 잔기를 삭제하거나 (3) 그 위치에 인접한 아미노산 잔기를 삽입함.
본 분야의 숙련자들은 절두 sTNFR 을 화학적으로 변이시킨 유도체를 제조할 수 있다. 글리코실화되거나 그렇지 않은 절두 sTNFR 이나 탈글리코실화된 절두 sTNFR 을 이용하여 복합체를 제조할 수 있다. 일반적으로, 글리코실화되지 않은 절두 sTNFR 을 사용할 것이다. 절두 sTNFR 의 유도체화에 적당한 화학적 부분은 수용성 중합체를 포함한다.
수용성 중합체는 그것이 결합하는 단백질이 생리학적 환경과 같은 수성 환경에서 침전되지 않기 때문에 바람직하다. 중합체는 치료학적 산물이나 조성물 제조시에 제약학적으로 용인가능한 것이 바람직하다. 본 분야의 숙련자들은 중합체/단백질 복합체를 치료학적으로 사용할 것인지와, 만일 그렇다면 바람직한 투여량, 순환시간 및 단백질 가수분해에 대한 내성 등의 고려사항들을 고려하여 바람직한 중합체를 선택할 수 있을 것이다.
임상적으로 용인가능한 적합한 수용성 중합체는 다음을 포함하지만 다음으로 제한되지는 않는다 : 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥소란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리(β-아미노산)(단독중합체 또는 무작위 공중합체), 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체(PPG) 및 그외의 폴리알킬렌 산화물, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(POG)(예를들어, 글리세롤) 및 그외의 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리옥시에틸화된 소르비톨 또는 폴리옥시에틸화된 글루코스, 콜론산 또는 그외의 탄수화물 중합체, 피콜 또는 덱스트란 및 그 혼합물.
본원에 사용한 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 모노-(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴록시-폴리에틸렌 글리콜과 같이 다른 단백질을 유도하는데 사용해왔던 모든 형태를 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 그것이 물에서 안정하기 때문에 제조에 유리하다.
각각의 수용성 중합체는 모든 분자량일 수 있으며, 가지난 것이거나 그렇지 않은 것일 수 있다. 각각의 수용성 중합체는 일반적으로 평균 분자량이 약 2 kDa 내지 약 100 kDa 이다(용어 "약"은 수용성 중합체 제조시에 일부 분자의 분자량이 언급한 분자량보다 조금 더 크거나 작을 수 있음을 의미한다). 각 수용성 중합체의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 50 kDa 이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 약 12 kDa 내지 약 40 kDa, 가장 바람직하게는 약 20 kDa 내지 약 35 kDa 이다.
일반적으로, 분자량이 크거나 더 많이 분지되었을 경우에는 중합체 : 단백질 비가 커진다. 원하는 치료학적 프로필(예를들어, 지속적인 방출 기간 ; 만약 있다면, 생물학적 활성도에 대한 효과 ; 취급의 용이성 ; 치료 단백질에 대하여 공지된 수용성 중합체의 효과 및 항원성 정도 또는 결핍)에 따라 다른 크기를 사용할 수 있다.
각 수용성 중합체는 단백질의 기능성 도메인이나 항원성 도메인에 미치는 영향을 고려하여 단백질에 결합시켜야 한다. 일반적으로, 활성화된 중합체 분자와 단백질을 반응시키는 데 사용하는 모든 적당한조건하에서 화학적 유도체화를 실시할 것이다. 하나 또는 그 이상의 단백질에 수용성 중합체를 결합시키는 데 사용할 수 있는 활성기는 다음을 포함한다 : 술폰, 말레이미드, 설프히드릴, 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지디린, 옥시란 및 5-피리딜.
각 수용성 중합체는 일반적으로 아미노산의 α-아미노기나 ε-아미노기 또는 반응성 티올기에서 단백질에 결합하지만, 수용성기는 적당한 반응 조건하에서 수용성기에 결합할 수 있을 정도로 반응성인 모든 단백질 반응기에 결합할 수 있을 것으로 여겨진다. 따라서, 수용성 중합체는 유리 아미노기 또는 카르복시기와 같은 반응기를 통해 단백질에 공유결합할 수 있다. 유리 아미노기를 갖는 아미노산 잔기는 리신 잔기와 N-말단 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 유리 카르복시기를 갖는 잔기는 아스파르트산 잔기, 글루탐산 및 C-말단 아미노산 잔기를 포함한다. 반응성 티올기를 갖는 잔기는 시스테인 잔기를 포함한다.
단백질이 수용성 중합체와 복합체를 이루도록 하는 방법은 일반적으로 각각 다음 단계를 포함한다 : (a) 하나 또는 그 이상의 수용성 중합체와 단백질이 결합되는 조건하에서 단백질과 수용성 중합체를 반응시키는 단계 및 (b) 반응 산물을 수득하는 단계. 각 결합에 대한 반응 조건은 본 분야에 공지된 모든 조건이나 계속적으로 개발되어 온 조건 중에서 선택할 수 있으나, 변이되는 단백질이 불활성화되는 온도, 용매, pH 값 등의 반응 조건에 노출되는 것은 피하거나 제한하여야 한다. 일반적으로, 최적 반응 조건은 바람직한 결과와 공지된 변수들에 따라 경우에 따라 결정할 것이다. 예를들어, 수용성 중합체 : 단백질 복합체의 비가 커지면, 복합 산물의 백분율도 커진다. 최적비(반응하지 않은 단백질이나 중합체 잉여분이 없는 반응 효율)는 바람직한 유도체화 정도(예를들어, 모노-, 디-, 트리- 등), 선택한 중합체의 분자량, 중합체가 가지난 것인지 여부 및 사용된 반응 조건 등의 인자에 의해 결정될 것이다. 단백질에 대한 수용성 중합체(예를들어, PEG)의 비는 일반적으로 1 : 1 내지 100 : 1 일 것이다. 투석, 염석, 한외여과, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 전기영동을 포함한 표준 정제 기술에 의해 각 혼합물로부터 하나 또는 그 이상의 정제된 복합체를 제조할 수 있다.
N - 말단을 화학적으로 변이시킨 단백질이 특히 바람직할 것이다. 분자량, 분지 여부, 반응 혼합물내 단백질(또는 펩티드) 분자에 대한 수용성 중합체의 비율, 반응 실시 유형 및 N-말단을 화학적으로 변이시킨 단백질의 수득 방법에 따라 수용성 중합체를 선택할 수 있다. N - 말단을 화학적으로 변이시킨 단백질 제제의 수득 방법(즉, 필요에 따라 모노유도체화 부분 중에서 이 부분을 분리하는 방법)은 화학변이 단백질 분자 집단에서 N - 말단을 화학적으로 변이시킨 단백질 물질을 정제하는 것이다. 선택적인 N - 말단 화학 변이는 환원성 알킬화에 의해 이루어지는데, 이 환원성 알킬화는 특정 단백질 유도체화에 이용할 수 있는 상이한 형태의 1 차 아미노기(리신 대 N - 말단)의 차등적 반응성을 이용하는 것이다. 적당한 반응 조건하에서 중합체를 함유하는 카르보닐기로 단백질의 N - 말단을 선택적으로 유도체화시킨다. 예를들어, 단백질의 N - 말단에 수용성 중합체를 선택적으로 결합시킬 수 있는데 이것은 단백질의 리신 잔기의 ε-아미노기와 N - 말단 잔기의 α-아미노기 간의 pKa 차이를 이용할 수 있는 pH 에서 반응을 실시함으로써 가능하다. 이러한 선택적 유도체화에 의해 단백질과 수용성 중합체 간의 결합이 조절된다 : 중합체와의 결합은 단백질의 N - 말단에서 주로 일어나며, 리신 곁사슬 아미노기와 같은 다른 반응기의 주목할만한 변이는 일어나지 않는다. 환원성 알킬화 반응시에, 수용성 중합체는 상기한 형태일 것이고 단백질에 결합하기 위해서는 단일 반응성 알데히드여야 한다. 단일 반응성 알데히드를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드를 사용할 것이다.
본 발명은 특히 모노-또는 폴리-(예를들어, 2-4) PEG 부분을 함유하는, 화학적으로 유도한 단백질을 포함한다. 본 분야에 공지된 모든 폴리에틸렌 글리콜화 반응을 통해 폴리에틸렌 글리콜화를 실시할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질 산물의 제조방법은 일반적으로 다음 단계를 포함할 것이다 : (a) 하나 또는 그 이상의 PEG 기가 단백질에 결합하는 조건하에서 폴리에틸렌 글리콜(예를들어, PEG 의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체)과 반응 산물을 반응시키는 단계 및 (b) 반응 산물을 수득하는 단계. 일반적으로, 최적 반응 조건은 공지된 변수와 원하는 결과에 의해 경우에 따라 결정할 것이다.
본 분야의 숙련자들은 다수의 결합 방법을 이용할 수 있다. 예를들어, 본원에서 참고문헌으로 인용한 제 EP O 401 384 호, Malik 등의 (1992), Exp. Hematol., 20 : 1028 - 1035 ; Francis (1992), Focus on Growth Factors, 3(2) : 4 - 10 (영국 런던 엔20 오엘디 프리에른 바넷 레인 마운틴 코트 소재 메디스크립트에서 발간); 제 EP O 154 316 호 ; 제 EP O 401 384 호 ; 제 WO 92/16221 호 ; 제 WO 95/34326 호 ; 및 그외에 폴리에틸렌 글리콜화에 관한 문헌을 참조하라.
폴리에틸렌 글리콜화는 특히 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자를 이용한 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질 산물은 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질을 포함하는데, PEG 기는 아실기나 알킬기를 통해 결합된다. 이러한 산물은 모노-폴리에틸렌 글리콜화되거나 폴리-폴리에틸렌 글리콜화된 것일 수 있다(예를들어, 2 - 6 개의 PEG 기, 바람직하게는 2 - 5 개의 PEG 기를 함유할 수 있다). PEG 기는 일반적으로 아미노산의 α-아미노기나 ε-아미노기에서 단백질에 결합하지만, 적당한 반응 조건하에서 PEG 기가 단백질에 결합할 수 있을 정도로 반응성인 모든 아미노기에 결합할 수 있을 것으로 여겨진다.
아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 일반적으로 단백질과 폴리에틸렌 글리콜의 활성 에스테르 유도체를 반응시킴으로 포함한다. 아실화 반응의 경우, 선택된 중합체는 단일 반응성 에스테르기여야 한다. 모든 공지된 반응성 PEG 분자나 계속 발견되는 반응성 PEG 분자는 폴리에틸렌 글리콜화 반응을 실시하는 데 사용할 것이다. 바람직한 활성 PEG 에스테르는 N - 히드록시숙시니미드(NHS)로 PEG 를 에스테르화한 것이다. 본원에 사용한 바와 같이, "아실화" 는 PEG 등의 수용성 중합체와 치료 단백질 간에 아미드, 카바메이트, 우레탄 등의 결합 형태를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다[Chamow (1994), Bioconjugate Chem., 5(2) :133-140 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 반응 조건은 폴리에틸렌 글리콜화 분야에 공지된 모든 조건이나 그 후에 지속적으로 개발된 조건 중에서 선택할 수 있지만, 변이되는 단백질이 불활성되는 온도, 용매, pH 등의 조건은 피해야 한다.
아실화를 통한 폴리에틸렌 글리콜화는 일반적으로 폴리-폴리에틸렌 글리콜화된 단백질을 생산한다. 바람직한 연결 고리는 아미드일 것이다. 또한 반응 산물은 실질적으로 모노-폴리에틸렌 글리콜화된 것(95 %), 디 - 또는 트리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 것만 존재할 것이다. 그러나, 사용하는 특정 반응 조건에 따라 보다 높은 정도로 폴리에틸렌 글리콜화된 종이 형성될 수도 있다. 원한다면, 투석, 염석, 한외여과, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 전기영동을 포함한 표준 정제 기술을 통해 혼합물(특히 비반응 종)에서 더 정제된 폴리에틸렌 글리콜화 종을 분리할 수 있다.
알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 일반적으로 환원제 존재하에 단백질과 PEG 의 말단 알데히드 유도체를 반응시킴을 포함한다. 환원성 알킬화 반응의 경우, 선택된 중합체는 단일 반응성 알데히드기여야 한다. 전형적인 반응성 PEG 알데히드는 물에 안정한 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드 또는 그것의 모노 C1-C10 알콕시 또는 아릴록시 유도체이다(미국 특허 제 5,252,714 호 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함).
알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화 또한 폴리-폴리에틸렌 글리콜화된 단백질을 생산한다. 부가적으로 단백질(즉 모노 - 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질)의 N-말단 α-아미노기에서만 실질적으로 폴리에틸렌 글리콜화되는 반응 조건을 조작할 수 있다. 모노폴리에틸렌 글리콜화 또는 폴리폴리에틸렌 글리콜화되는 경우에 있어서, PEG 기는 -CH2-CH-기를 통해 단백질에 결합하는 것이 바람직하다. 특히 - CH2-기에 관한 이 형태의 결합을 본원에서는 "알킬" 결합이라 한다.
실질적으로 균일한 모노 - 중합체 /단백질 산물을 생산하는 환원성 알킬화는 일반적으로 다음 단계를 포함한다 : (a) 단백질의 아미노 말단에서 α-아미노기가 선택적으로 변이되기에 적당한 pH 의 환원성 알킬화 반응하에서 반응성 PEG 분자와 단백질을 반응시키는 단계 및 (b) 반응 산물을 수득하는 단계. 모노폴리에틸렌 글리콜화된 산물을 생산하는 환원성 알킬화를 통한 유도체화는 N - 말단의 α-아미노기와 리신 아미노기 간의 pKa 차이(50 % 의 아미노기가 양성자 첨가되고 50 % 는 그렇지 않은 pH 에서의 pKa)를 이용하는 것이다.
반응은 단백질의 N - 말단 잔기의 α-아미노기와 리신 잔기의 ε-아미노기 간의 pKa 차이를 이용할 수 있는 pH 에서 실시한다. 일반적으로 pH 가 낮으면 단백질에 대한 중합체 잉여분이 큰 것이 바람직할 것이다(즉, N - 말단 α-아미노기의 반응성이 낮으면, 최적 조건에 도달하기 위해 더 많은 양의 중합체가 필요하다). pH 가 높으면, 중합체 : 단백질 비가 클 필요가 없다(즉, 보다 반응성이 높은 기를 이용할 수 있으므로 많은 양의 중합체 분자가 필요없다). 본 발명의 목적을 이루기 위해서는 일반적으로 pH 3 - 9 이내, 바람직하게는 3 - 6 일 것이다. 환원성 알킬화의 경우, 환원제는 수성 용액에서 안정해야 하며 환원성 알킬화 반응 초기에 형성되는 쉬프 염기만을 환원시킬 수 있어야 바람직하다. 적당한 환원제는 소듐 보로하이드리드, 소듐 시아노보로하이드리드, 디메틸아민 보란, 트리메틸아민 보란 및 피리딘 보란 중에서 선택할 수 있다. 특히 적합한 환원제는 소듐 시아노보로하이드리드이다. 그외에 용매, 반응 시간, 온도와 산물 정제방법 등의 반응 변수는 수용성 중합체와 단백질의 유도체화에 관해 공개된 정보에 의해 경우에 따라 결정할 수 있다.
이러한 선택적인 유도체화에 의해, 단백질과 수용성 중합체의 결합이 조절된다 : 중합체와의 결합은 단백질의 N - 말단에서 현저하게 나타나며, 리신 곁사슬 아미노기와 같은 다른 반응기에서의 주목할만한 변이는 일어나지 않는다. 제제의 90 % 이상은 일반적으로 모노중합체/단백질 복합체일 것이며, 95 % 이상의 모노중합체/단백질 복합체와 함께 반응하지 않는 관찰가능한 분자 잔여물(즉, 중합체 부분이 없는 단백질)을 포함하는 것이 더욱 일반적일 것이다.
본 발명의 특정 실시형태는 환원성 알킬화를 통해 sTNFR-I 2.6D/N105 에 결합되는, 평균 분자량이 약 20 kDa 또는 약 33 kDa(예를들어, 30 kDa 내지 35 kDa)인 가지안난 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜 알데히드 또는 평균 분자량이 약 33 kDa(예를들어, 30 kDa 내지 35 kDa)인 삼차-부틸 폴리에틸렌 글리콜 알데히드이다.
또한 폴리에틸렌 글리콜화는 특히 적어도 하나의 반응성 히드록시기를 갖는 수용성 중합체(예를들어, 폴리에틸렌 글리콜)를 통해 실시할 수 있으며, 히드록시기가 반응성 미카엘 수용체로 전환되도록 반응성 카르보닐기, 니트릴기 또는 술폰기를 갖는 시약과 반응함으로써 여러 단백질을 변이시키는 데 유용한 "활성 링커"가 형성되어 개선된 생물학적 활성 복합체가 제공된다. "반응성 카르보닐, 니트릴 또는 술폰"은 두개의 탄소기가 카르보닐기, 니트릴기 또는 술폰기의 두 번째 탄소에 대한 티올 - 특이 결합 부위에 반응성을 갖도록 결합되어 있는 카르보닐기, 니트릴기 또는 술폰기를 의미한다(제 WO 92/16221 호 참조).
활성 링커는 단기능성이거나 이기능성 또는 다기능성일 수 있다. 본 방법에 사용할수 있는 반응성 술폰기를 갖는 유용한 시약은 클로로술폰, 비닐술폰 및 디비닐술폰을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
특정 실시형태에 있어서, 수용성 중합체는 미카엘 수용체로 활성화시킨다. 특히 제 WO 95/13312 호에는 수용성 술폰-활성 PEG 에 대해 기술되어 있는데, 이 PEG 는 분자와 표면에 대한 아미노 부분 대신에 티올 부분 결합에 매우 선택적이다. 이들 PEG 유도체는 pH 가 약 11 또는 그 이하인 수성 환경에서 장기간에 걸쳐 가수분해에 대해 안정하며, 분자와 결합하여 가수분해적으로 안정한 복합체를 형성한다. 생물학적으로 활성인 분자와 PEG 의 결합은 티올 부분에 결합하는 술폰 부분을 포함하며, 구조 PEG-SO2-CH2-CH2-S-W 를 갖는데 여기에서 W 는 생물학적으로 활성인 분자를 나타내며 술폰 부분은 비닐 술폰이나 활성 에틸 술폰이다. 특히 유용한 두 호모이기능성 유도체는 PEG-비스-클로로술폰과 PEG-비스-비닐술폰이다.
본원에서 참고문헌으로 인용한 PCT 국제 출원 번호 제 US 96/19459 호에는 전환 용매로서의 테트라히드로푸란(THF)의 용도와 함께, 반응성 히드록시기를 가지며 히드록시기를 반응성 미카엘 수용체로 전환시켜 활성 링커를 만드는 화합물을 수득함으로써 술폰 - 활성 링커를 제조하는 방법에 대하여 기술하고 있다. 본원에서 참고문헌으로 인용한 PCT 국제출원 번호 제 US 96/19459 호에는 활성 링커를 정제하는 방법에 대하여 기술하고 있는데, 이 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 그 크기나 말단기 작용에 따라 링커를 분리하는 것이다.
특히, 본 발명은 모노-또는 폴리-(예를들어, 2-4) PEG 부분을 포함하도록 화학적으로 유도한, 메티오닐화되거나 그렇지 않은 하기 원핵세포 - 발현 분자 및 그것의 변이체와 유도체를 포함한다 : sTNFR-I 2.6D/C105, sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 2.6D/N105, sTNFR-I 2.3D/d8, sTNFR-I 2.3D/d18, 및 sTNFR-I 2.3D/d15.
다가 형태(Polyvalent Form)
하나 이상의 활성 부분을 함유하는 분자인 다가 형태를 구성할 수 있다. 한 실시형태에 있어서, 분자는 TNF 리간드(예를들어, 절두 sTNFR 산물의 조합)에 대하여 여러 개의 종양 괴사 인자가 결합하는 부위를 가질 것이다. 또한 분자는 적어도 하나의 종양 괴사 인자 결합 부위를 가지며, 바람직한 다가 형태의 특성에 따라 다른 분자[예를들어, 하기하는 바와 같이 적어도 하나의 절두 sTNFR 산물과 적어도 하나의 인터루킨 -1 수용체 길항물질("IL-1ra")의 조합]에 결합하는 부위 중 적어도 하나를 갖는다.
한 실시형태에 있어서, 다가 형태는 예를들어 적어도 하나의 절두 sTNFR 산물에 다른 부분을 화학적으로 결합시킴으로써 구성할 수 있으며, 임상적으로 용인가능한 링커(예를들어, 상기한 수용성 중합체)와 그외의 절두 sTNFR 산물을 결합시키는 것이 바람직하다. 원칙적으로, 링커는 새로운 아미노산 잔기에 의해 새로운 면역원성을 부가하거나 소수성을 변화시거나 생물학적 분포와 제거율에 해로운 영향을 미치는 구조의 균형을 변화시켜서는 안된다.
링커로 사용하는 중합체는 상기 나열한 단량체를 기초로 한 단독중합체, 무작위 공중합체나 차단 공중합체 및 삼중합체일 수 있으며, 이것은 곧은 사슬이거나 가지난 것, 치환되거나 그렇지 않은 것일 수 있다. 중합체는 어떤 길이, 어떤 분자량이든 상관없지만, 이러한 특성은 생물학적 성질에 영향을 미칠 수 있다. 제약학적으로 적용할 때 제거율을 감소시키는 데 특히 유용한 중합체의 평균 분자량은 2,000 내지 35,000 달톤이다. 또한 바람직한 생물학적 활성을 부여하거나 최적화하기 위해 중합체의 길이를 변화시킬 수 있다.
하나 또는 그 이상의 단백질에 수용성 중합체를 결합시키는 데 사용할 수 있는 활성기는 다음을 포함한다 : 술폰, 말레이미드, 설프히드릴, 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지디린, 옥시란 및 5-피리딜.
특정 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 반응성 미카엘 수용체를 갖는 이기능성 활성 링커나 다기능성 활성 링커는 미국 특허 출원 번호 제 08/473,809 호에 의해 제조할 수 있고, 미국 특허 출원 번호 제 08/611,918 호에 기술된 내용에 따라 정제할 수 있다.
활성 부분은 종래의 결합 기술을 이용하여 결합시킬 수 있다(본원에서 참고문헌으로 인용한 PCT 공개 번호 제 WO 92/16221 호 및 PCT 공개 번호 제 WO 95/34326 호 참조). 더욱이, PCT 공개 번호 제 WO 92/16221 호는 이량체화된 각각의 sTNFR-I 저해제 분자, 예를들어 이량체화된 c105 sTNFR-I 의 제조에 대해 기술하고 있다. 식(sTNFR-I 2.6D/C106)2- (20 kDa PEG)를 갖는 실시예 1 에 기술되어 있다.
선택적으로, 2 가 분자는 폴리펩티드 링커 부위에서 분리한 절두 sTNFR 산물의 두 직렬식 반복체로 이루어진다. 폴리펩티드 링커는 단백질의 데 노보 제조시 도메인 사이에 짧은 루프 서열을 삽입하여 제조하는 것과 유사한 방법으로 제조한다[Mutter (1988), TIBS, 13 : 260 - 265 및 Regan 및 DeGrado (1988), Science, 241 : 976 - 978 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 단일 사슬 항체에 적합한 링커는 이량체의 재조합 인체 sTNFR-Ⅱ 로 생산하는 것이 효과적인 것으로 나타났다[Neve 등의 (1996), Cytokine, 8(5) : 365 - 370 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 수 개의 상이한 링커 구성물을 제조하였으며 이것은 항체에 유용한 것으로 나타났다 ; 대부분의 기능성 링커는 그 크기가 12 내지 25 개 아미노산(비반응성 곁기를 갖는 알라닌, 세린 및 글리신 등의 아미노산) 으로서 이 서열들은 친수성 서열을 이루고, 용해도를 높이기 위해 수 개의 반대 하전 잔기를 가지고 유연성이 있다[Whitlow 및 Filpula (1991), Methods : A Companion to methods in Enzymology, 2 : 97 - 105 및 Brigido 등의 (1993), J. Immunol., 150 : 469 - 479 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함].
다른 실시형태에 있어서, 절두 sTNFR 을 비오틴에 화학적으로 결합시킨 다음 비오틴/절두 sTNFR 복합체가 아비딘에 결합하도록 하여 4 가 아비딘/비오틴/절두 sTNFR 분자를 생산한다. 절두 sTNFR 은 또한 디니트로페놀(DNP)이나 트리니트로페놀(TNP)과 공유결합시키고 결과적으로 생성된 복합체를 항-DNP 나 항-TNP-IgM 으로 침전시켜 TNF 결합 부위에 대하여 원자가 10 을 갖는 10 량체 복합체를 형성시킨다.
또다른 실시형태에 있어서, 재조합 융합 단백질은 절두 sTNFR 을 갖도록 제조하는데 여기에서 각 재조합 키메라 분자는 상기한 바와 같이 면역글로불린 분자 중쇄와 경쇄 중 하나 또는 둘다의 가변 도메인으로 sTNFR 서열을 치환한다. 재조합 융합 단백질은 또한 인체 면역글로불린 중쇄나 경쇄의 불변 도메인 중 최소한 하나의 불변 도메인을 제외한 일부 또는 전부를 갖도록 제조한다. 예를들어, 이러한 각각의 절두된 키메라 sTNFR/IgG1 융합 단백질을 두 개의 키메라 유전자로부터 제조할 수 있다 : 절두 sTNFR/인체 카파 경쇄 키메라(절두 sTNFR/Ck) 및 절두 sTNFR/인체 감마-1 중쇄 키메라(절두 sTNFR/Cg-1). 유전자 산물인 두 키메라 유전자의 전사와 번역은 하기하는 바와 같이 2 가의 절두 sTNFR 을 갖는 단일 키메라 분자내로 삽입될 것이다. 이러한 키메라 분자의 구성에 관한 보다 상세한 설명은 본원에서 참고문헌으로 인용한 미국 특허 제 5,116,964 호, PCT 공개 번호 제 WO 89/09622 호, PCT 공개 번호 제 WO 91/16437 호 및 제 EP 315062 호에 기술되어 있다.
다른 실시형태에서, 재조합 융합 단백질은 절두 sTNFR 을 갖도록 생산하는데 여기에서 각각의 재조합 키메라 분자는 상기한 바와 같이 sTNFR 서열과 오스테오프로테게린(OPG) 186 - 401 부위의 적어도 일부를 가지며, 이는 유럽 특허 출원 번호 제 96309363.8 호에 기술되어 있다.
폴리누클레오티드
본 발명은 또한 절두 sTNFR 을 코드하는 폴리누클레오티드를 제공한다. 본 상세한 설명과 일반적인 코돈 표를 근거로, 본 분야의 숙련자들은 절두 sTNFR 의 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열 전부를 용이하게 결정할 수 있다. 현재로서 바람직한 핵산 서열은 sTNFR-I 2.6D/C105, sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 2.6D/N105, sTNFR-I 2.3D/d8, sTNFR-I 2.3D/d18 및 sTNFR-I 2.3D/d15 를 코드하는 폴리누클레오티드를 포함한다. 여러 폴리누클레오티드의 예는 도 2, 3, 4, 5, 6, 7 에 나타나 있다.
하기 상세한 설명에 따라 실시하는 재조합 발현 기술은 이들 폴리누클레오티드를 생산하고 코드된 단백질을 발현시키는 것에 관한 것이다. 예를들어 절두 sTNFR 을 코드하는 핵산 서열을 적당한 벡터내로 삽입함으로써, 본 분야의 숙련자들은 원하는 누클레오티드 서열을 대량으로 용이하게 생산할 수 있다. 그런 다음 검출 프로브나 증폭 프라이머를 생성시키기 위하여 이 서열을 사용할 수 있다. 선택적으로, 절두 sTNFR 을 코드하는 폴리누클레오티드를 발현 벡터내로 삽입시킬 수 있다. 적당한 숙주내로 발현 벡터를 도입하여 바람직한 절두 sTNFR 을 대량으로 생산할 수 있다.
본원에 보다 상세히 기술하는 바와 같이, 원하는 핵산 서열 증식 및/또는 절두 sTNFR 생산에 이용할 수 있는 숙주/벡터계가 다수 존재한다. 이 계는 플라스미드, 바이러스 벡터, 삽입 벡터, 원핵 숙주 및 진핵 숙주를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 본 분야의 숙련자들은 비정형 DNA 를 증식시키거나 발현시킬 수 있는 숙주/벡터계로 변형시켜 본 발명의 서열을 생산하거나 발현시킬 수 있다.
더욱이, 신규한 핵산 서열이 도면에 나타낸 서열을 갖는 절두 sTNFR 을 코드하는 동의성 핵산 서열을 포함하며 이들 아미노산 서열의 상대물에 혼성되는(바람직하게 엄격한 혼성 조건하에서) 핵산 서열을 포함한다는 것은 본 명세서에 비추어 본 분야의 숙련자들에게 인지될 것이다[Maniatis 등의 (1982), Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, p387 - 389 참조]. 엄격한 혼성 조건은 일반적으로 62 - 67 ℃, 4 × SSC 로 혼성화한 다음 62 - 67 ℃, 0.1 × SSC 로 약 1 시간 동안 세척하는 것이다. 선택적으로, 전형적인 엄격한 혼성 조건은 45 - 55 % 포름아미드, 4 × SSC, 40 - 55 ℃ 에서 혼성화하는 것이다. 완화된 혼성 조건하에서 도 1 및 9 에 기술한 핵산 서열에 혼성되고 절두 sTNFR 을 코드하는 DNA 서열도 포함한다. 이러한 완화된 혼성 조건의 예로는 4 × SSC, 45 - 55 ℃ 에서 혼성화하거나 40 - 45 ℃ 에서 30 - 40 % 포름아미드로 혼성화하는 것이 있다.
본 발명은 또한 절두 sTNFR 을 코드하는 DNA 서열과 함께 벡터 DNA 를 포함하는 재조합 DNA 구성물을 제공한다. 이러한 각각의 DNA 구성물에 있어서, 절두 sTNFR(시그널 펩티드의 존재 여부에 상관없이)을 코드하는 핵산 서열은 선택 숙주내 절두 sTNFR 의 증식 및/또는 발현을 조절할 수 있는 적당한 발현 조절 서열과 작동적으로 결합한다.
재조합 발현
폴리누클레오티드의 제조
절두 sTNFR 을 코드하는 핵산 서열은 다음 방법들을 이용하여 용이하게 수득할 수 있지만, 다음으로 한정되지는 않는다 : 화학 합성, cDNA 라이브러리 스크리닝, 게놈 라이브러리 스크리닝, 발현 라이브러리 스크리닝 및/또는 cDNA 의 PCR 증폭. 이러한 핵산 서열을 분리하는 데 유용한 방법과 그외의 방법들은 본원에서 참고문헌으로 인용한 Sambrook 등의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) ; Ausubel 등의 eds Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press, (1994) ; 및 Berger 및 Kimmel, Methods in Enzymology : Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1987) 문헌에 기술되어 있다.
절두 sTNFR 을 코드하는 핵산 서열은 본 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 화학 합성할 수 있다[Engels 등의 (1989), Angew. Chem. Intl. Ed., 28 : 716 - 734 및 Wells 등의 (1985), Gene, 34 : 315 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 그 중에서도 이러한 방법들은 포스포트리에스테르, 포스포라미디트 및 H - 포스포네이트 핵산 서열 합성 방법을 포함한다. 예를들어 그 길이가 약 100 개 누클레오티드 이상인 핵산 서열은 수 개의 단편으로 합성할 수 있다. 이 단편들을 서로 결합시킨 다음 절두된 sTNFR 을 코드하는 핵산 서열을 생산한다. 바람직한 방법은 표준 포스포아미디트 화학을 이용한 중합체 - 지지 합성 방법이다.
선택적으로, 적당한 핵산 서열은 적합한 cDNA 라이브러리(즉, 단백질을 발현할 것으로 여겨지는 하나 또는 그 이상의 조직원에서 제조한 라이브러리) 또는 게놈 라이브러리(총 게놈 DNA 에서 제조한 라이브러리)를 스크리닝하여 수득할 수 있다. cDNA 라이브러리의 원료는 일반적으로 원하는 단백질을 상당량 발현할 것으로 여겨지는 모든 종의 조직이다. 게놈 라이브러리의 원료는 절두 sTNFR 을 코드하는 유전자를 함유할 것으로 여겨지는 모든 포유동물이나 그외의 종의 모든 조직일 수 있다.
하나 또는 그 이상의 핵산 프로브(올리고누클레오티드, 클로닝될 cDNA 나 유전자와 상동인 용인가능한 수준의 cDNA 또는 게놈 DNA 단편)를 이용하여 절두 sTNFR 을 코드하는 DNA 존재에 대해 혼성 배지를 스크리닝하는데, 이 핵산 프로브는 라이브러리에 존재하는 cDNA 나 유전자와 선택적으로 혼성될 것이다. 이러한 스크리닝에 일반적으로 사용하는 프로브는 라이브러리를 제조하는 종과 동일하거나 유사한 종의 DNA 서열 중 작은 부위를 코드한다. 선택적으로, 프로브는 본원에 기술한 바와 같이 동의적이다.
혼성화는 일반적으로 비특이 결합은 막지만 프로브나 프라이머와 상당한 상동성을 갖는 클론의 결합은 허용하는 엄격한 조건하에서 클론을 올리고누클레오티드 프로브나 cDNA 와 어닐링시킴으로써 이루어진다. 전형적인 혼성화 및 세척 조건은 cDNA 나 올리고누클레오티드 프로브의 크기(즉, 누클레오티드의 수)와 프로브의 동의성 여부에 따라 부분적으로 달라진다. 혼성 배지 제조시에는 클론 확인 가능성도 고려된다(예를들어, cDNA 라이브러리를 스크리닝할 것인지 게놈 라이브러리를 스크리닝할 것인지의 여부).
프로브로 DNA 단편(cDNA 와 같은)을 사용하는 경우, 전형적인 혼성 조건은 Ausubel 등의 (1994), eds., 상기문헌에 기술된 조건을 포함한다. 혼성화시킨 후에 프로브 크기, 클론에 대해 예상되는 프로브 상동성, 스크리닝할 혼성 배지, 스크리닝할 클론의 수 등과 같은 여러 인자를 고려하여 혼성 배지를 적당한 조건에서 세척한다. 엄격한 세척 용액의 예로는 다음이 포함되며, 이 용액은 보통 이온 강도가 낮고 상대적으로 높은 온도에서 사용한다 : 0.015 M NaCl, 0.005 M 시트르산나트륨 및 0.1 % SDS, 55 - 65 ℃ ; 약 40 - 50 ℃ 의 1 mM Na2EDTA, 40 mM NaHPO4, pH 7.2 및 1 % SDS ; 및 약 50 - 65 ℃ 의 0.2 × SSC 및 0.1 % SDS.
올리고누클레오티드 프로브를 혼성 배지 스크리닝에 사용할 경우, 엄격한 세척 조건에 대하여 전형적인 프로토콜이 존재한다. 예를들어, 첫번째 프로토콜은 프로브의 길이에 따라 약 35 ℃ ∼ 63 ℃ 의 온도에서 0.05 % 소듐 피로포스페이트를 함유하는 6 × SSC 를 이용한다. 예를들어, 14 개 염기 프로브는 35 - 40 ℃ 에서 세척하고, 20 개 염기 프로브는 52 - 57 ℃ 에서, 23 개 염기 프로브는 57 - 63 ℃ 에서 세척한다. 배경 비특이 결합이 높게 나타날 경우 온도는 2 - 3 ℃ 높아질 수 있다. 두 번째 프로토콜은 세척액으로 테트라메틸암모늄 클로라이드(TMAC)를 사용한다. 엄격한 세척 용액 중 하나는 3 M TMAC, 50 mM 트리스 - HCl, pH 8.0 및 0.2 % SDS 이다.
그외에 적당한 핵산 서열을 수득하는 적당한 방법은 폴리메라제 연쇄 반응법(PCR)이다. 이 방법에 있어서, cDNA 는 역전사효소를 이용하여 폴리(A)+RNA 또는 총 RNA 에서 제조한다. 일반적으로 절두 sTNFR 을 코드하는 cDNA(올리고누클레오티드)의 두 부위에 상보적인 두 프라이머를 Taq 폴리메라제 같은 폴리메라제와 함께 cDNA 에 가하면 폴리메라제가 두 프라이머 간의 cDNA 부위를 증폭시킨다.
프로브나 프라이머로 선택한 올리고누클레오티드 서열은 스크리닝이나 PCR 증폭 도중에 발생하는 비특이 결합량을 최소화하기에 충분히 명확하고 적당한 길이여야 한다. 프로브나 프라이머의 실질적인 서열은 보통 보존적이거나 고도로 상동인 서열 또는 부위를 기초로 한다. 선택적으로, 프로브나 프라이머는 상이한 코돈을 이용하는 것을 제외하고는 동일한 아미노산 서열을 코드하는 모든 것과 완전히 또는 부분적으로 동의적일 수 있다. 즉, 프로브/프라이머 혼합물을 함유할 수 있다. 동의 프로브를 제조하는 대안은 종에 따라 달라지는 일부 코돈 위치나 모든 코돈 위치에 이노신을 넣는 것이다. 올리고누클레오티드 프로브나 프라이머는 상기한 바와 같이 DNA 화학 합성 방법에 의해 제조할 수 있다.
상기한 바와 같이, 변이 서열은 도 2, 3, 4, 5, 6, 7 의 서열에서 하나 또는 그 이상의 누클레오티드가 치환, 삭제 및/또는 삽입된 천연 서열 또는 합성 서열이며 이로 인해 야생형 아미노산 서열과 비교하여 변이된 아미노산 서열이 발현된다. 합성 변이체 서열의 제조에 관해서는 본 분야에 공지되어 있으며, 예를들어 Sambrook 등의 (1989), 상기문헌과 Wells 등의 (1985), Gene, 34 : 315 문헌에 기술되어 있고 이 문헌들은 본원에서 참고문헌으로 인용한다.
벡터
클로닝(DNA 증폭)이나 발현을 위해 절두 sTNFR 을 코드하는 DNA 를 벡터내로 삽입할 수 있다. 통상적으로 적합한 벡터는 입수가능하며 벡터를 특이하게 구성할 수 있다. 적합한 벡터는 (1) DNA 발현에 사용하는 지 증폭에 사용하는 지 여부 (2) 벡터내로 삽입되는 DNA 의 크기 및 (3) 벡터내로 형질전환시키고자 하는 숙주 세포에 따라 선택하거나 구성할 것이다.
각 벡터는 발현 조절 서열 중 하나 또는 그 이상과 작동적으로 결합하는 단백질을 코드하는 핵산 서열을 포함하는데, 이 발현 조절 서열은 선택한 숙주 세포에 의한 단백질 발현에 영향을 미치거나 관리, 조절할 수 있다. 각 벡터는 그것의 기능(DNA 증폭이나 발현)과 숙주 세포에 대한 적합성에 따라 여러 성분을 포함한다. 벡터 성분들은 일반적으로 다음 중 하나 또는 그 이상을 함유하지만 이것으로 제한되지는 않는다 : 시그널 서열, 기원이나 복제, 마커 유전자에서 선택한 하나 또는 그 이상, 프로모터, 인핸서 성분, 전사 종결 서열 등. 이들 성분은 천연원에서 수득하거나 공지된 방법으로 합성할 수 있다.
적당한 원핵 클로닝 벡터의 예에는 람다 유도체와 같은 박테리오파지 또는 E. coli 의 플라스미드[예를들어, pBR322, colE1, pUC, F - 인자 및 Bluescript플라스미드 유도체(미국 캘리포니아 라졸라 소재 스트라타진에서 입수)]가 포함된다. 그외에 적당한 발현 벡터로서 하기하는 숙주 세포에 대해 본 분야에 공지된 다수의 세포 형태도 본 목적에 사용할 수 있다.
시그널 서열
시그널 서열을 코드하는 핵산을 절두 sTNFR 을 코드하는 서열의 5' 에 삽입할 수 있다. 예를들어, 이것은 벡터의 성분이거나 절두 sTNFR 을 코드하는 핵산의 일부일 수 있다. sTNFR-I 및 sTNFR-Ⅱ 의 천연 시그널 서열을 코드하는 핵산은 공지되어 있다(제 EP 393 438 호 및 제 EP 422 339 호 참조).
복제 기원
각 발현 벡터와 클로닝 벡터는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 선택 숙주 세포에 벡터를 증폭시킬 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 클로닝 벡터에 있어서, 이 서열은 일반적으로 숙주 염색체 DNA 에 대해 독립적으로 벡터를 복제시킬 수 있으며, 복제 기원이나 자가 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322 의 복제 기원은 대부분의 그람-음성 박테리아에 대해 적합하고, 다양한 기원(예를들어, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포내에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기원이 포유동물 발현 벡터에 필수적이지는 않다(예를들어, SV40 기원은 그것이 시발 프로모터를 함유한다는 이유만으로 종종 사용된다).
선택 유전자
각 발현 벡터와 클로닝 벡터는 일반적으로 선택 유전자를 함유한다. 이 유전자는, 선택적인 배양 배지에서 성장할 경우 형질전환된 숙주 세포의 생존이나 성장에 필수적인 "마커" 단백질을 코드한다. 벡터로 형질전환시키지 않은 숙주 세포는 선택 유전자를 함유하지 않으며, 따라서 배양 배지에서 생존하지 못할 것이다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린 등의 독소나 항생물질에 대한 내성을 부여하고 (b) 영양요구성 결함을 보충하거나 (c) 배양 배지에서 입수할 수 없는 임계 영양소를 공급해 주는 단백질을 코드한다.
발현 유전자를 증폭시키기 위해 다른 선택 유전자를 사용할 수 있다. 증폭은, 성장에 중요한 단백질 생산에 보다 많이 필요한 유전자가 연속적으로 생성되는 재조합 세포의 염색체내에 일렬로 반복되는 과정이다. 포유동물 세포의 경우에 선택할 수 있는 적당한 마커는 디히드로엽산 환원효소(DHFR)와 티미딘 키나아제를 포함한다. 벡터에 존재하는 마커에 의해 생존하도록 변형시키는 압력하에 세포 형질전환체를 둔다. 이러한 압력은, 배지내 선택 약물의 농도가 지속적으로 변화되는 조건하에서 형질전환 세포를 배양하여 절두 sTNFR 을 코드하는 DNA 와 선택 유전자 둘다를 증폭시킴으로써 부과된다. 결과적으로, 증폭된 DNA 로부터 증가량의 절두 sTNFR 이 합성된다.
예를들어, DHFR 의 경쟁적 길항물질인 메토트렉세이트를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양시킴으로써 선택 유전자로 형질전환시킨 세포를 확인한다. 야생형 DHFR 을 사용할 경우 적당한 숙주 세포는 DHFR 활성도가 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 세포주이다[Urlaub 및 Chasin(1980), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77(7) : 4216 - 4220 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 형질전환 세포를 증가된 수준의 메토트렉세이트에 노출시킨다. 이로써 DHFR 유전자의 다중 복사물과 부수적으로 발현 벡터에 존재하는 절두 sTNFR 을 코드하는 DNA 등의 그외의 DNA 다중 복사물이 합성된다.
프로모터
각 발현 벡터와 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되는 프로모터를 포함하며, 절두 sTNFR 을 코드하는 핵산 서열과 작동적으로 결합한다. 프로모터는 구조 유전자(일반적으로 약 100 내지 1000 bp 이내)의 개시 코돈 상류(5')에 위치하는 비번역 서열로서, 절두 sTNFR 을 코드하는 특정 핵산 서열의 전사와 번역을 조절한다. 프로모터는 통상적으로 유도가능한 프로모터와 구성 프로모터 두 군 중 하나로 나뉘어진다. 유도가능한 프로모터는 영양분의 존재 여부나 온도 변화와 같은 배양 조건을 일부 변화시킴으로써 프로모터 조절하에 DNA 전사량을 증가시킨다. 잠재적인 여러 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 공지되어 있다. 제한 효소 절단을 통해 원료 DNA 에서 프로모터를 제거하고 원하는 프로모터 서열을 삽입함으로써 절두 sTNFR 을 코드하는 DNA 와 프로모터가 작동적으로 결합할 수 있다. 천연 sTNFR-I 프로모터 서열이나 sTNFR-Ⅱ 프로모터 서열은 절두 sTNFR 을 코드하는 DNA 증폭 및/또는 발현을 조절하는 데 사용할 수 있다. 그러나 천연 프로모터에 비해 발현 단백질의 전사량이 증가하고 수득량이 높으며 사용하는 숙주 세포계에 적합하다면, 이형 프로모터가 바람직하다. 예를들어, 다른 NGF/TNF 과의 멤버 중 천연 프로모터 서열은 절두 sTNFR 을 코드하는 DNA 증폭 및/또는 발현을 조절하는 데 사용할 수 있다.
원핵 숙주에 사용하기에 적당한 프로모터는 베타-락타마제와 락토스 프로모터계를 포함한다 : 알칼린 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터계 ; 박테리아 발광(luxR) 유전자계 및 tac 프로모터와 같은 혼성 프로모터. 그외에 공지된 박테리아 프로모터 또한 적합하다. 이들의 누클레오티드 서열이 공개됨으로써, 본 분야의 숙련자들은 모든 필요한 제한 부위를 공급하기에 필요한 만큼의 링커나 어댑터를 이용하여 원하는 DNA 서열에 이 누클레오티드 서열을 결합시킬 수 있게 되었다.
효모 숙주에 사용하기에 적당한 프로모터 서열도 본 분야에 공지되어 있다. 포유동물 숙주 세포에 사용하기에 적당한 프로모터는 공지되어 있으며, 다음의 바이러스 게놈에서 수득한 것들을 포함한다 : 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 계두 바이러스(fowlpox virus), 아데노바이러스(adenovirus, 아데노바이러스 2 와 같은), 소의 유두종바이러스(bovine papilloma virus), 닭의 육종바이러스(avian sarcoma virus), 사이토메갈로 바이러스(cytomegalovirus), 레트로바이러스(retrovirus), B형 간염 바이러스(hepatitis - B virus), 및 가장 바람직한 시미안 바이러스 40(Simian Virus 40, SV40). 그외에 적당한 포유동물 프로모터는 이형 포유동물 프로모터, 예를들어 열-쇽 프로모터와 액틴 프로모터를 포함한다.
인핸서 성분
각 발현 벡터와 클로닝 벡터는 일반적으로 고등 동물에서 절두 sTNFR 을 코드하는 DNA 서열의 전사량을 증가시키는 인핸서 서열을 함유한다. 인핸서는 DNA 의 시스-액팅 성분이며 그 길이는 일반적으로 약 10 - 300 bp 이고, 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용한다. 인핸서는 그 방향과 위치가 비교적 독립적이다. 그것은 전사 단위의 5' 과 3' 에서 발견되었다. 효모 프로모터에 사용하기에는 효모 인핸서가 바람직하다. 포유동물 유전자에서 입수할 수 있는 수 개의 인핸서 서열이 공지되어 있다(예를들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파 - 페토 - 단백질 및 인슐린). 부가적으로 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 시발 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서와 같은 바이러스 인핸서는 진핵 프로모터 활성을 위한 전형적인 인핸서 성분이다. 절두 sTNFR 을 코드하는 DNA 의 5' 또는 3' 위치에서 벡터내로 인핸서를 스플라이싱할 수 있지만, 프로모터의 5' 부위에 위치하는 것이 보통이다.
전사 종결
진핵 숙주 세포에 사용하는 각 발현 벡터는 일반적으로 전사를 종결시키고 mRNA 를 안정시키는 데 필요한 서열을 포함한다. 이러한 서열은 일반적으로 진핵 DNA 나 cDNA 의 비번역 부위 중 5' 에서 입수가능하며 때로는 3' 에서도 입수할 수 있다. 이들 부위는 절두 sTNFR 을 코드하는 mRNA 의 비번역 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로 전사되는 누클레오티드 단편을 포함한다.
벡터의 구성
상기 나열한 성분 중 하나 또는 그 이상을 (절두 sTNFR 을 코드하는 코딩 서열과 함께) 함유하는 적당한 벡터는 표준 결합 기술에 의해 구성한다. 필요한 벡터를 원하는 대로 생산하기 위해, 분리된 플라스미드나 DNA 단편을 절단하여 조건에 맞도록 고친 다음 재결합시킨다. 서열이 제대로 구성되었는지 확인하기 위해, 결합 혼합물로 E. coli 를 형질전환시킨 다음 성공적으로 형질전환된 세포를 상기한 공지 기술을 통해 선택할 수 있다. 형질전환체에서 다량의 벡터를 준비한 다음 제한 엔도누클레아제 절단으로 분석하고/하거나 원하는 구성물의 존재를 확인하기 위해 서열을 결정한다.
포유동물 세포내에서 절두 sTNFR 을 코드하는 DNA 의 일시적인 발현을 위해 제공되는 벡터도 사용할 수 있다. 일반적으로, 일시적 발현은 숙주 세포에서 효율적으로 복제될 수 있는 발현 벡터의 사용과 관계가 있는데, 숙주 세포는 발현 벡터의 다수 복제물을 축적하고 발현 벡터에 의해 코드되는 원하는 단백질을 고도로 합성한다. 적당한 발현 벡터와 숙주 세포를 함유하는 각각의 일시적 발현계는 클로닝되는 DNA 에 의해 코드되는 단백질을 간편하게 확인할 수 있게 할 뿐만 아니라 바람직한 생물학적 특성이나 생리학적 특성에 대하여 이 단백질을 신속하게 스크리닝할 수 있게 한다. 즉, 생물학적으로 활성인 절두 sTNFR 을 확인할 수 있다.
숙주 세포
본 발명은 원하는 단백질을 발현시키는 데 사용하는 핵산 서열을 각각 함유하는 다수의 재조합 숙주 세포를 제공한다. 전형적인 원핵 및 진핵 숙주 세포는 박테리아 세포, 포유동물 세포, 진균류, 곤충, 효모 또는 식물 세포를 포함한다.
원핵 숙주 세포는 그람 - 음성 유기체나 그람 양성 유기체와 같은 진정세균[예를들어, E. coli(HB101, DH5a, DH10 및 MC1061)] ; 바실루스 섭티리스(B. subtilis)와 같은 바실리(Bacilli) ; 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)과 같은 슈도모나스 종 ; 스트렙토마이시즈 에스피피.(Streptomyces spp.) ; 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium) ; 또는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescans)를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 특정 실시형태로서, 원하는 단백질을 E. coli 에서 발현시킬 수 있다.
원핵 숙주 세포 이외에, 사상 진균류(filamentous fungi)나 효모와 같은 진핵 미생물이 절두 sTNFR 의 발현에 적당한 숙주일 수 있다. 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)나 일반적인 베이커 효모가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 사용하는 것 중 가장 일반적이지만, 그외의 속이나 종도 공지되어 있으며 통상적으로 입수가능하다.
다세포 유기체에서 유도한 적당한 숙주 세포 중 하나로 글리코실화된 형태에서 절두 sTNFR 을 발현시킬 수 있다. 이러한 숙주 세포는 복잡한 프로세싱 능력이 있으며 글리코실화 활성을 갖는다. 원칙적으로, 배양액이 척추 세포를 포함하든 무척추 세포를 포함하든 간에 식물 세포와 곤충 세포를 포함한 특정 고등 진핵 세포 배양액을 사용할 수 있다. 특정 실시형태로서, 원하는 단백질을 바쿨로바이러스 (baculovirus) 세포에서 발현시킬 수 있다.
배양액(조직 배양액)내 척추 세포 증식은 잘 알려진 과정이므로 척추 세포를 사용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 SV40 으로 형질전환시킨 원숭이 신장 CV1 주(COS - 7), 인체 배 신장주(293 세포 또는 현탁 배양액에서 성장시켜 섭클론한 293 세포), 베이비 햄스터 신장 세포 및 차이니즈 햄스터 난소 세포를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 다른 적당한 포유동물 세포주는 헬라(HeLa), 마우스 L - 929 세포, 스위스에서 유도한 3T3 주, Balb - c 또는 NIH 마우스 및 BHK 햄스터 세포주나 Hak 햄스터 세포주를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 특정 실시형태로서, 원하는 단백질을 COS 세포에서 발현시킬 수 있다.
핵산이 발현되는 적당한 조건하에서 원하는 핵산으로 숙주 세포를 형질감염시키고 바람직하게는 형질전환시킬 수 있다. 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 산물의 생산과 정제에 알맞은 숙주 세포와 방법의 선택은 본 분야에 공지되어 있다[Gething 및 Sambrook (1981), Nature, 293 : 620 - 625 또는 선택적으로 Kaufman 등의 (1985), Mol. Cell. Biol., 5(7) : 1750 - 1759, 또는 미국 특허 번호 제 4,419,446 호 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 예를들어, 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우 칼슘 포스페이트 침전법을 사용할 수 있다. 일렉트로포레이션, 미량주사 및 그외의 공지 기술도 사용할 수 있다.
절두 sTNFR 을 코드하는 DNA 를 이미 함유하는 세포내로 조절 성분을 도입시키는 재조합 생산 방법이나 상동 재조합을 통해 절두 sTNFR 을 생산하는 것이 가능하다. 상동 재조합은 원래 전사적으로 활성인 유전자에서 돌연변이를 유발하거나 바로잡기 위해 표적 유전자에 대해 개발된 기술이다[Kucherlapati (1989), Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol., 36 : 301 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 기본 기술 은 포유동물 게놈의 특정 부위내로 특이 돌연변이를 도입하는 방법으로 개발되거나 [Thomas 등의 (1986), Cell, 44 : 419 - 428 ; Thomas 및 Capecchi (1987), Cell, 51 : 503 - 512 및 Doetschman 등의 (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., 85 : 8583 - 8587 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 결함이 있는 유전자에서 특이 돌연변이를 바로잡는 방법으로 개발되었다 [Doetschman 등의 (1987), Nature, 330 : 576 - 578 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 전형적인 기술은 본원에서 참고문헌으로 인용한 미국 특허 번호 제 5,272,071 호 ; 제 WO 92101069 호 ; 제 WO 93/03183 호 ; 제 WO 94/12650 호 및 제 WO 94/31560 호에 기술되어 있다.
상동 재조합을 통해, 게놈내로 삽입되는 DNA 서열을 표적 DNA 에 결합시킴으로써 관심있는 유전자의 특정 부위를 관리할 수 있다. 표적 DNA 는 게놈 DNA 부위와 상보적인(상동인) DNA 이다. 게놈의 특이 부위에 상보적인 표적 DNA 소단편을 DNA 복제 과정중에 모가닥과 접촉되도록 둔다. 세포내로 삽입되는 DNA 의 일반적인 특성은 공유되는 상동 부위를 통해 내생 DNA 의 다른 단편과 혼성되어 재조합되는 것이다. 이러한 상보 가닥이 상이한 DNA 서열이나 돌연변이를 함유하는 올리고누클레오티드와 결합된다면, 재조합 결과 새로이 합성된 가닥 내로 도입된다. 교정 기능 결과로서, 새로운 DNA 서열이 주형으로 작용하는 것이 가능하다. 따라서, 전이 DNA 가 게놈내로 결합된다.
특정 유전자 서열이 공지되어 있다면, 절두 sTNFR 의 핵산 서열과 같은 발현 조절 서열(유전자의 선택 부위와 상보적인 DNA 단편)을, 예를들어 관심있는 부위에 결합하는 특이 인식 부위에서 천연 DNA 의 적당한 제한에 의해 합성하거나 그외의 방법으로 수득할 수 있다. 이 단편은 세포내로 삽입될 때 표적 서열로서 작용하며, 게놈내 상동 부위에 혼성될 것이다. DNA 복제중에 이러한 혼성화가 일어난다면, 이 DNA 단편과 여기에 결합하는 다른 모든 서열은 오카자키 단편으로 작용할 것이며 새로이 합성된 DNA 딸가닥내로 백스티치될 것이다.
이러한 표적 DNA 단편에 결합되는 것은 절두 sTNFR 발현과 상관이 있는 DNA 부위이다. 예를들어, 프로모터/인핸서 요소, 억제자 또는 외생 전사 조절 요소는 바람직한 절두 sTNFR 을 코드하는 DNA 전사에 영향을 미치기에 충분한 위치와 배향으로 숙주 세포 게놈내로 삽입된다. 조절 요소는 절두 sTNFR 을 코드하지는 않지만, 숙주 세포 게놈내에 존재하는 DNA 부분을 조절한다. 따라서, 절두 sTNFR 의 발현은 절두 sTNFR 을 코드하는 DNA 의 형질감염에 의해 이루어지는 것이 아니라, DNA 조절 단편과 결합하는 표적 DNA (관심있는 내생 유전자와 상동인 부위를 함유)를 이용하여 이루어지며, 이 DNA 조절 단편은 절두 sTNFR 의 전사에 대한 시그널을 인식할 수 있는 내생 유전자 서열을 제공한다.
숙주 세포 배양
원하는 단백질 생산을 위한 재조합 숙주 세포 중 하나 또는 그 이상을 각각 배양하는 방법은 여러 인자와 고려사항들에 따라 달라질 것이다 ; 주어진 상황에서의 최적 생산방법은 최소한의 실험을 통해 본 분야의 숙련자들에게 지명할 것이다. 이러한 재조합 숙주 세포를 적당한 배지에서 배양한 다음, 발현된 절두 sTNFR 을 배양 배지로부터 (세포내에 발현되었다면 세포에서) 본 분야의 숙련자들에게 공지된 적당한 방법에 의해 임의로 회수하여 분리하고 정제한다.
특히, 바람직한 절두 sTNFR 을 생산하는 데 사용하는 재조합 세포 각각을, 바람직한 절두 sTNFR 을 코드하는 유전자를 증폭시키거나 적당한 재조합 세포를 선택하고 프로모터를 유도하기에 적당한 배지에서 배양할 수 있다. 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 그외의 성장 호르몬(예, 인슐린, 트란스페린 또는 표피 성장 인자), 염(예, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 인산염), 완충액(예, HEPES), 누클레오시드 (예, 아데노신 및 티미딘), 항생물질 (예, 젠타마이신), 미량 원소(보통 최종 농도에서 마이크로몰 범위로 존재하는 무기 화합물로 정의됨) 및 글루코스나 그외의 에너지원으로 보충될 수 있다. 그외의 보충물도 적당한 농도로 포함될 수 있으며, 이것은 본 분야의 숙련자들에게 인지될 것이다. 선택한 숙주 세포에 이용할 수 있는 온도, pH 등과 같은 적당한 배양 조건 또한 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다.
본 분야에 공지된 방법을 이용하여 결과적으로 발현될 산물을 거의 균질하게 정제할 수 있다. 일반적인 정제 기술은 본원에서 참고문헌으로 인용한 제 EP 393 438 호와 제 EP 422 339 호에 기술되어 있다.
제약학적 조성물
각 제약학적 조성물은 운반체(vehicle)와 혼합된 치료학적 유효량의 절단된 sTNFRs 및 화학적으로 변형된 절단된 sTNFRs 의 유도체 (총괄적으로, "절단된 sTNFR 산물(들)" 이라 함) 를 포함할 것이다. 바람직하게 운반체는 절단된 sTNFR 산물(들) 및 조절된 방출 물질 (controlled release material) 과 혼합된 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 및 생리학적으로 용인가능한 제제형 물질을 포함한다.
운반체내 일차 용매는 자연상태에서 수성이거나 아니면 비-수성일 수 있다. 게다가, 운반체는 그외 제약학적으로 용인가능한, pH 를 바람직하게 5 - 6.5 , 더 바람직하게는 5.5 - 6.0 으로 변화시키거나 유지시키기 위한 부형제 (예를들어, 시트르산염, 인산염 및 글리신 같은 아미노산과 같은 완충제) ; 동결건조된 제제형을 위한 부피조정제 (예를들어, 만니톨 및 글리신) ; 삼투몰농도 (예를들어, 만니톨 및 염화나트륨) ; 계면활성제 (예를들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤 및 플루로닉스) ; 점성도 ; 정화도 ; 색체 ; 멸균성 ; 안정성 (예를들어, 수크로스 및 소르비톨); 항산화제 (예를들어 아황산 나트륨 및 아황산수소 나트륨) ; 방부제 (예를들어, 벤조산 및 살리실산) ; 제제형의 냄새 ; 향료 및 희석제 ; 용해속도 (예를들어, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 염화나트륨 같은 용해제 또는 가용화제) ; 방출률 ; 유화제 ; 현탁제 ; 용매 ; 충진제 ; 운반체 ; 희석제 ; 부형제 및/또는 제약학적 보조제를 함유할 수도 있다. 비경구적인 완용성 (slow-release) 제제형, 흡입 합제, 경구적으로 활성인 제제형 또는 좌약 같은 그외 효과적인 투여 형태도 포함한다. 또한 조성물은 부피 침식 중합체 (bulk erosin polymer) [예를들어, 폴리(라틱 - 코 - 글리콜산) (PLGA) 공중합체, PLGA 중합체 혼합물, PEG 의 차단 공중합체 및 락트산 및 글리콜산, 폴리(시아노아크릴산염)] ; 표면 침식 중합체 [예를들어, 폴리(무수물) 및 폴리 (오르토 에스테르)] ; 하이드로 겔 에스테르 [예를들어, 플루로닉 폴리올류, 폴리 (비닐 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 말레익 무수물 - 알킬 비닐 에테르 공중합체, 셀룰로스, 하이알루론산 유도체, 알긴산염, 콜라겐, 젤라틴, 알부민, 및 전분 및 덱스트란] 및 그것의 조성물계 ; 또는 리포좀이나 중심체 제제 같은 중합성 화합물의 미립자 제제도 포함할 수 있다. 그와 같은 조성물은 본 발명의 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출률, 생체내 정화율에 영향을 미칠 수도 있다. 원하는 단백질에 대한 최적의 제약학적 제제형은 투여경로 및 원하는 투여량에 좌우하여 본 분야의 숙련된 기술자들에 의해 결정될 것이다. 전형적인 제약학적 조성물은, 그 명세서를 본원에서 참고로 인용한 다음 문헌들에 기술되어 있다. : Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, pages 1435 - 1712 ; Gombotz and Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6 : 332 - 351 ; Leone - Bay, et al. (1995), Journal of Medicinal Chemistry, 38 : 4263 - 4269 ; Haas, et al. (1995), Clinical Immunology and Immunopathology, 76(1) : 93 ; WO 94/06457 ; WO 94/21275 ; FR 2706772 및 WO 94/21235.
특이적인 지속된 방출 조성물은 다음 공급자로 부터 용이하게 입수할 수 있다 : 데포테크 (DepofoamTM, 다소포성 리포좀) ; 알커메스 (ProLeaseTM, PLGA 중심체). 본원에 사용된 바와 같은 하이알루로난은 하이알루로난, 하이알루론산, 그의 염 (이를테면 하이알루론산 나트륨), 에스테르, 에테르, 효소적 유도체 및 하이알루론산의 교차 - 결합된 겔 및 하이알루론산의 화학적으로 변형된 유도체 (이를테면 하일란) 를 포함하고자 한다. 하이알루로난의 전형적인 형태는, 그 명세서를 본원에서 참고로 인용한 다음 문헌들에 기술되어 있다 :
Peyron and Balazs (1974), Path. Biol., 22(8) : 731 - 736 ; Isdale et al. (1991), J. Drug Dev., 4(2) : 93 - 99 ; Larsen et al. (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27 : 1129 - 1134 ; Namiki, et al. (1982), International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 20(11) : 501 - 507 ; Meyer et al. (1995), Journal of Controlled Release, 35 : 67 - 72 ; Kikuchi et al. (1996), Osteoarthritis and Cartilage, 4 : 99 - 110 ; Sakakibara et al. (1994), Clinical Orthopaedics and Related Research, 299 : 282 - 292 ; Meyers and Brandt (1995), 22(9) ; 1732 - 1739 ; Laurent et al. (1995), Acta Orthop Scand, 66(266) : 116 - 120 ; Cascone et al. (1995), Biomaterials, 16(7) : 569 - 574 ; Yerashalmi et al. (1994), Archives of Biochemistry and Biophysics, 313(2) : 267 - 273 ; Bernatchez et al. (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27(5) : 677 - 681 ; Tan et al. (1990), Australian Journal of Biotechnology, 4(1) : 38 - 43 ; Gombotz and pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6 : 332 - 351 ; 미국 특허 번호 제 4,582,865 호, 제 4,605,691 호, 제 4,636,524 호, 제 4,713,448 호, 제 4,716,154 호, 제 4,716,224 호, 제 4,772,419 호, 제 4,851,521 호, 제 4,957,774 호, 제 4,863,907 호, 제 5,128,326 호, 제 5,202,431 호, 제 5,336,767 호, 제 5,356,883 호; 유럽 특허 출원 번호 제 0 507 604 A2 호 및 제 0 718 312 A2 호 ; 및 제 WO 96/055845 호. 특이적인 하이알루로난 조성물은 다음 공급자로 부터 용이하게 입수할 수 있다 : 미국 뉴저지 리지필드 소재의 바이오매트릭스, 인코포레이티드 (SynviscTM, 하일란 유체와 하일란 겔의 90 : 10 혼합물) ; 이탈리아 아바노 테르메 소재의 피디아 에스.피.에이. [HyalganTM, 수탉 볏 - 유래 하이알루론산의 나트륨 염 (~500,000 내지 ~700,000 MW)] ; 일본 도쿄 소재의 카켄 파마슈티컬 컴파니., 리미티드 (ArtzTM, 수탉 볏 - 유래 하이알루론산의 1 % 용액, ~700,000 MW) ; 스웨덴 스톡홀름 소재의 파마시아 에이비(HealonTM, 수탉 볏 - 유래 하이알루론산, ~ 4 X 106MW) ; 미국 메사츄세츠 캠브리지 소재의 겐자임 코포레이션 (SurgicoatTM, 재조합 하이알루론산) ; 미국 뉴햄프셔 포츠마우스 소재의 프로노바 바이오폴리머, 인코포레이티드 [하이알루로닉 에시드 FCH, 고분자량 (예를들어, ~ 1.5 - 2.2 X 106MW)스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 (Streptococcus zooepidemicus) 배양물로 부터 제조된 하이알루론산 ; 소디움 하이알루로네이트 MV, ~ 1.0 - 1.6 X 106MW 및 소디움 하이알루로네이트 LV, ~ 1.5 - 2.2 X106MW] ; 스위스 라우텔피겐 소재의 칼바이오켐-노바바이오켐 에이비 [하이알루로닉 에시드, 스트렙토코쿠스 에스피. 로 부터 제조된 나트륨 염 (1997년 컴파니 카탈로그 번호 제 385908 호 )] ; 미국 뉴욕 퍼처스 소재의 인터겐 컴파니 (수탉 볏 - 유래 하이알루론산, > 1 X 106MW) ; 미국 일리노이 시카고 소재의 디오신스 인코포레이티드 ; 미국 뉴저지 에디슨 소재의 애머콜 코포레이션 및 일본 도쿄 소재의 교와 하코 고교 컴파니, 리미티드.
일단 제약학적 조성물이 제형화되면, 용액, 현탁액, 겔, 에멀션, 고체, 또는 탈수되거나 동결 건조된 분말로서 뮤균 용기에 저장할 수 있다. 그와 같은 제제형은 바로 사용할 수 있는 형태나 아니면 투여전 재구성이 필요한 형태 (예를들어, 동결건조된 형태)로 저장할 수도 있다.
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 단일 - 투여량 투여 (unit) 를 생산하는 키트를 제공한다. 이 키트는 각각 건조된 단백질을 갖는 제 1 용기와 수성 제제형을 갖는 제 2 용기 둘 다를 함유한다. 본 발명의 범위 내에 포함되는 키트는 단일 및 다중 - 챔버의 예비 충진된 주사기 ; 전형적인 예비 - 충진된 주사기 [ 예를들어, 액체 주사기, 및 Lyo - Ject, 이중 - 챔버 예비 - 충진된 용해주사기 같은 용해주사기 (lyosyringe)] 이며 독일 라벤스버그 소재의 베테르 게엠베하로 부터 용이하게 입수할 수 있다.
용도
절단된 sTNFR 산물은 연구용 시약으로서, 치료제 및 진단제로서 유용할 수 있다. 따라서 절단된 sTNFRs 는 조직 또는 기관 시료내 천연 sTNFR - I 또는 sTNFR - Ⅱ 의 양을 정량하기 위해, 또는 TNF 를 발현하는 세포 [Scallon 등의 (1995), 상기문헌 참조]를 결정하고/결정하거나 분리하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 진단 검정에 사용될 수도 있다. 조직 또는 기관 검정에 있어, TNF 에 결합하는125Ⅰ - 절단된 sTNFRs 의 방사능은125Ⅰ- 절단된 sTNFRs 의 표준화된 결합곡선에 비해 더 적을 것인데, 이것은 TNF 에 결합하는 비표지된 천연 sTNFR - Ⅰ 또는 sTNFR - Ⅱ 에 기인하는 것이다. 유사하게,125Ⅰ - 절단된 sTNFRs 의 용도는 다양한 세포 유형에 있어 TNF 의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 항체 생성시 절단된 sTNFR 산물의 용도 및 결과적으로 생성된 항체 (특히 천연 sTNFR - Ⅰ 또는 sTNFR -Ⅱ 에 결합하는 항체 또한 포함) 에 관한 것이다. 절단된 sTNFRs, 이를테면 R1- [Cys19-Cys103] -R2아미노산 서열 이내에서나 R4-[Cys32-Cys115]- R5아미노산 서열 이내에서의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생성시킬 수 있다. 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는, 본 발명의 아미노산 서열에 의해 코딩되는 다양한 단백질을 특이하게 인식하여 결합하는 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 또는 재조합 항체를 수득하기 위해 공지된 공개 방법을 이용할 수 있다. 그와 같은 항체는 전체 길이의 성숙한 30 kDa TNF 저해제 및 전체 길이의 성숙한 40 kDa TNF 저해제를 정제하고 특정화하는 데 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 TNF 에 의해 매개되는 특정 질병 및 내과 증상 (염증성 질병으로 간주될 수 있는 많은 증상)의 치료방법에 관한 것이다. 자발적이거나 실험적인 질병이 신체내 질병 또는 전조 병소에 인접한 체액내 또는 조직내의 상승된 수준의 TNF 와 관련될 경우에 질병 또는 내과 증상을 "TNF - 매개 질병" 이라고 간주한다. TNF - 매개 질병은 다음 두 증상에 의해서도 인지될 수 있다 : (1) 질병과 관련된 병리학적 소견은 TNF 투여에 의해 동물에서 실험적으로 모조될 수 있고 (2) 이 질병의 실험 동물 모델에서 유도된 병리학은 TNF 의 작용을 저해하는 인자로 치료함으로써 저해되거나 소멸될 수 있다. 많은 TNF - 매개 질병은 이들 세 조건 중 둘을 만족시키며, 다른 질병들은 세 조건 모두를 만족시킬 것이다. 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는, TNF - 매개 질병 뿐만 아니라 관련된 후유증 및 그것과 관련된 증상에 관한 비 - 배타적 목록은 다음과 같다 : 어른 호흡곤란 증후군 ; 악액질/식욕부진 ; 암 (예를들어, 백혈병) ; 만성피로 증후군 ; 이식편 대 숙주 거부반응 ; 통각과민 ; 염증성장질환 ; 신경염증성 질환 ; 대뇌 국소빈혈을 포함하는 국소빈혈/재관류 손상 (각각 신경변성을 초래할 수도 있는 외상, 간질, 출혈 또는 발작의 결과로서의 뇌 손상) ; 당뇨병 (예를들어, 제 1 형 연소성 당뇨병) ; 다발성경화증 ; 안 질환 ; 동통 ; 췌장염 ; 폐섬유증 ; 류마티스성 질환 [예를들어, 류마티스양 관절염, 골관절염, 연소성(류마티스양)관절염, 혈청반응음성 다발성관절염, 강직성 척추염, 라이터 증후군 및 반응성 관절염, 건선성 관절염, 장질환성 관절염, 다발성근염, 피부근염, 공피증, 전신성 경화증, 맥관염, 대뇌 맥관염, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 발열, 다연골염 및 다발성근육통, 류마티스성 및 거대세포 동맥염) ; 패혈증성 쇽 ; 방사선요법으로 인한 부작용 ; 전신성 홍반성루푸스 ; 측두 하악골 관절 질환 ; 갑상선염 및 조직이식.
상기한 바와 같은 TNF - 매개 질병, 이를테면 류마티스성 질병 [예를들어 라임병, 연소성(류마티스양) 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 류마티스양 관절염 및 스타필로코컬 - 유도성 (패혈증성) 관절염] 같은 TNF - 매개 질병을 치료하기 위해, 절단된 sTNFR 산물 각각의 치료학적 유효량을 환자에게 투여할 수 있다. 용어 '환자'는 사람 뿐만 아니라 동물(예를들어, 고양이, 개 및 말)도 포함하고자 한다.
절단된 sTNFR 산물은 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는 국소적, 경소장 또는 비경구 투여를 통해 투여될 수 있다 : 정맥내, 근육내, 동맥내, 초내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 심실내 및 흉골내 주사 및 주입. 또한 절단된 sTNFR 산물은 경구투여를 통해 투여될 수 있거나 점막을 통해, 즉 전신 전달을 위해 비강내, 설하, 협측 또는 직장으로 투여될 수 있다.
절단된 sTNFR 산물은 관절내, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사로 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 절단된 sTNFR 산물은 투여가 지속되는 동안 혈액내에 절단된 sTNFR 산물의 원하는 수준을 연속적으로 제공하기 위해 연속주입 (예를들어, 일정한 또는 간헐적인 이식 또는 외부 주입 흐름 - 조절 장치)으로써 투여될 수도 있다. 이것은 삼투 미니 - 펌프 같은 미니 - 펌프를 통한 연속 주입 수단에 의해 수행하는 것이 바람직하다. 이러한 방법으로, 당업자는 약물의 양이 원하는 수준으로 유지된다는 것을 확인할 수 있으며 혈액 시료를 취하여 혈류내 약물의 양을 모니터할 수 있다. 미국 캘리포니아 실머 소재의 미니메트 인코포레이티드 (예를들어, MT507) 및 미국 캘리포니아 팔로 알토 소재의 알자 코포레이션 (예를들어, 알제트 삼투압 펌프, 모델 2 MLI) 과 같은 공급자들로 부터 여러가지 펌프들을 상업적으로 입수할 수 있다.
또한 연속적이거나 거의 연속적인 그외 투여 양식도 실행할 수 있다. 예를들어, 화학적 유도체화가 지속되는 방출 형태의 단백질을 생성시킬 수 있는데, 이것은 결정된 투여량 양생법을 기초로 하는 예측가능한 양으로 혈류내에 연속적으로 존재하는 효과를 갖는다.
관절의 염증성 증상 (예를들어, 골관절염, 건선성 관절염 및 류마티스양 관절염) 을 포함하는 TNF - 매개 질병 치료를 위해 절단된 sTNFR 산물을 사용하는 방식은 본원에서 참고로 인용한 유럽 특허 출원 제 567566 호에 기술되어 있다. 예로서, 한 특정 실시구체형태에 있어 절단된 sTNFR 산물은 류마티스양 관절염 및 골관절염 치료를 위해 관절내 투여될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예로서, 다른 특정 실시구체형태에 있어, 절단된 sTNFR 산물은 류마티스양 관절염, 염증성장질환, 악액질/식욕부진 또는 다발성경화증 치료를 위해 피하적으로나 근육내로 투여될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 예로서, 또 다른 특정 실시구체형태에 있어 절단된 sTNFR 산물은 외상, 간질, 출혈 또는 발작의 결과로서 나타나는 뇌손상 치료를 위해 정맥내 투여할 수 있거나 ; 외상의 결과로서 나타나는 뇌손상 치료를 위해 심실내 투여될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 관절염 치료를 위한 바람직한 양식은 다음을 포함한다 : (1) 관절염 재발의 예방 또는 치료에 필요하므로 정기적으로 제공되는 절단된 sTNFR 산물의 단일 관절내 주사 및 (2) 절단된 sTNFR 산물의 정기적인 피하 주사. 패혈증쇽에 대한 초기 치료는 패혈증 또는 패혈증의 기회가 진단된 후에 가능한한 빨리 시작되어야 한다. 예를들어, 패혈증쇽을 개시하는 위험인자를 지니고 있는 우연한 일이나 어떤 다른 사건 또는 외과수술 후 즉시 치료를 시작한다. 성인 호흡곤란 증후군 치료를 위한 바람직한 양식은 다음을 포함한다 : (1) 절단된 sTNFR 산물의 단일 또는 다중 기관내 투여 및 (2) 절단된 sTNFR 산물의 환괴 또는 연속 정맥내 주입.
다른 실시구체형태에 있어, 세포요법, 예를들어 절단된 sTNFR 을 생산하는 세포의 이식 또한 계획한다. 본 발명에 관한 이 실시구체형태는 생물학적 활성 형태의 절단된 sTNFR 을 합성하고 분비할 수 있는 환자의 세포를 이식하는 것을 포함한다. 절단된 sTNFR 을 생산하는 그와 같은 세포는 보통은 절단된 sTNFR 을 생산하지 않지만 절단된 sTNFR 을 생산하도록 변형된 세포일 수 있거나, 절단된 sTNFR 의 발현 및 분비에 적합한 폴리누클레오티드로 형질전환시킴으로써 증가되어진 절단된 sTNFR 을 생산하는 능력을 갖는 세포일 수 있다. 외래 종의 절단된 sTNFR 을 투여함으로써 환자의 잠재적인 면역학적 반응을 최소화하기 위해서는 세포가 환자 (예를들어 , 사람) 와 동일한 종이거나, 세포가 면역 인식에 대한 장벽을 제공하는 물질로 캡슐화되거나, 세포가 면역학적으로 특별한 혜택이 주어지는 해부학적 위치, 이를테면 고환, 눈 또는 중추신경계에 위치하는 것이 바람직하다.
절단된 sTNFR 은 방출시키지만, 환자의 면역계에 의한 또는 주변 조직으로 부터의 다른 유해 인자에 의한 세포 파괴를 예방하기 위해 인체 또는 비-인체 동물 세포를 생체적합성, 반투과성의 중합성 동봉물이나 막내에 함유시켜 환자에 이식시킬 수 있다. 택일적으로, 절단된 sTNFR 을 생산하도록 생체외 형질전환된 환자 자신의 세포를 상기와 같은 캡슐화없이 환자내로 직접 이식시킬 수 있다. 살아있는 세포의 막 캡슐화에 대한 방법학은 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에게 공지되어 있으므로, 캡슐화된 세포의 제조와 환자에 대한 이식을 수행할 수 있다.
다른 실시구체형태에 있어, 생체내 유전자 요법 역시 계획하고 있는 데, 여기서 절단된 sTNFR 을 코딩하는 핵산 서열을 환자에 직접 도입한다. 예를들어, 절단된 sTNFR 을 코딩하는 핵산 서열은, 적당한 운반 벡터, 이를테면 아데노 - 관련 바이러스 벡터와 함께 또는 이것 없이, 핵산 구성물을 국소 주사함으로써 표적세포내로 도입시킨다. 택일적인 바이러스 벡터에는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 단순 허피스 바이러스 및 유두종바이러스 벡터가 포함되지만 이것으로 제한되는 것은 아니다. 원하는 핵산 구성물 또는 원하는 핵산 서열을 함유하는 그외 적당한 운반 벡터를 국소 주사함으로써, 리포좀 - 매개 전달, 직접 주사 (누드 DNA), 수용체 - 매개 전달 (리간드 - DNA 복합체) 또는 미량입자 충격 (유전자 총) 에 의해 생체내에서 물리적으로 전달시킬 수 있다.
전형적인 세포 및 유전자 요법 기술은 그 명세서를 본원에서 참고로 인용한 미국 특허 번호 제 4,892,538 호 ; 미국 특허 번호 제 5,011,472 호 ; 미국 특허 번호 제 5,106,627 호 ; 제 DE 4219626 호, 제 WO 94/20517 호 및 제 96/22793 호에 기술되어 있다.
투여방식에도 불구하고, TNF - 매개 질병 치료는 이 질병의 증상을 감소시키거나 경감시키기에 효과적인 절단된 sTNFR 의 투여량 또는 총투여량 섭생을 필요로 한다. 고유 투여량을 결정하는 그외 인자들로는 치료되거나 예방될 질병이나 증상, 질병의 심각성, 투여 경로, 및 환자의 연령, 성별 및 의학 조건이 포함될 수 있다. 치료를 위한 고유 투여량을 결정하는 데 필요한 더 세분된 계산은 본 기술분야의 숙련된 기술자들에게, 특히 본원에 기술된 투여량 정보 및 검정에 비추어 일상적으로 수행된다. 또한 투여량은 고유의 투여량 - 반응 데이터와 관련하여 사용되는 투여량을 결정하는 공지의 검정법을 사용함으로써 결정할 수 있다. 특히 투여량은 환자의 어림 체중 또는 체표면적에 따라 계산한다.
투여 빈도는 사용되는 제제형에 있어 절단된 sTNFR 의 약력학 변수에 달려있다. 절단된 sTNFR 은 1 회 투여될 수 있거나, 질병이 심각하고 연장된 경우는 덜 빈번한 투여량으로 매일 투여되거나, 초기에 환괴 투여한 다음 연속적 투여량이나 지속된 전달로 투여될 수 있다. 비경구적으로 투여할 때, 비경구 단위 투여량은 예를들어 각각 10 mg 까지, 일반적으로 15 mg 까지 및 더 일반적으로 20 mg 까지 일 수 있다. 관절강내로 투여할 때, 제약학적 조성물이 단일 주사로서, 예를들어, 투여량을 함유하는 3 내지 10 ml 주사기로, 예를들어 등장성 인산염 완충 식염수에 용해되어 있는 약 5 mg/ml 내지 10 mg/ml 의 절단된 sTNFR 이 투여되는 것이 바람직하다. 예를들어 7 내지 10 일 마다 1 회의 빈도로 제제를 관절강내로 투여할 수도 있다. 그와 같은 방식에 있어, 필요할 경우 투여량을 변화시키는 동안 투여는 4 내지 5 배 연속적으로 수행된다.
어떤 경우에 있어서, 절단된 sTNFR 산물은 다른 요법에 대한 부가물로서 투여될 수 있으며 또한 치료될 전조(indication) 에 적합한 그외 제약학적 조성물과 함께 투여될 수 있다. 절단된 sTNFR 산물과 하나 또는 그 이상의 전통적이거나 새로운 항염증성 약물 중 어떠한 약물을 개별적으로 또는 함께 투여할 수 있다.
절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1- [Cys19- Cys103]- R2단백질) 과 하나 또는 그 이상의 부가적인 항 - 염증성 약물 중 어떠한 약물을 개별적으로 또는 함께 투여할 수도 있다. 다음의 화합물에 관련된 정보는 The Merck, Manual of Diagnosis and Therapy, Sixteenth Edition, Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, NJ (1992) 및 파마프로젝츠, 피제이비 퍼블리케이션 리미티드에서 찾을 수 있다.
류마티스성 질병 [예를들어, 라임병, 연소성 (류마티스양) 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 류마티스양 관절염 및 스타필로코컬 - 유도성 ("패혈증성") 관절염] 과 같은 급성 및 만성 염증을 포함하는, 상기 정의한 바와 같은 본 TNF - 매개 질병 치료는 동통 및 비 - 스테로이드성, 항 - 염증성 약물 (NSAIDs) 로서 분류되는 염증 조절을 위한 제 1 선 약물을 포함한다. 이차적 치료는 코르티코스테로이드, 서서히 작용하는 항류마티스성 약물 (SAARDs) 또는 질병 변형 (DM) 약물을 포함한다.
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 류마티스성 질병 [예를들어, 라임병, 연소성 (류마티스양) 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 류마티스양 관절염 및 스타필로코컬 - 유도성 ("패혈증성") 관절염] 과 같은 급성 또는 만성 염증을 포함하는, 상기 정의한 바와 같은 TNFR - 매개 질병 치료를 위한 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 및 하나 또는 그 이상의 NSAIDs 중 어떠한 것의 용도에 관한 것이다. NSAIDs 는 프로스타글라딘 합성 저해에 대해 최소한 일부분 그것의 항 - 염증성 작용을 지니고 있다 [Goodman and Gilman in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", MacMillan, 7 th Edition (1985)]. NSAIDs 는 다음의 9 개 군으로 특징지을 수 있다 : (1) 살리실산 유도체 ; (2) 프로피온산 유도체 ; (3) 아세트산 유도체 ; (4) 페남산 유도체 ; (5) 카르복실산 유도체 ; (6) 낙산 유도체 ; (7) 옥시케임 ; (8) 피라졸 및 (9) 피라졸론.
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 살리실산 유도체, 약물전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다. 그와 같은 살리실란 유도체, 약물 전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 아세트아미노살롤, 알록시프린, 아스피린, 베노릴레이트, 브로모살리게닌, 칼슘 아세틸살리실레이트, 콜린 마그네슘 트리살리실레이트 디플루시날, 에테르살레이트, 펜도살, 젠티식 에시드, 글리콜 살리실레이트, 이미다졸 살리실레이트, 리신 아세틸살리실레이트, 메살라민, 모르폴린 살리실레이트, 1 - 나프틸 살리실레이트, 올살라진, 파르살미드, 페닐 아세틸살리실레이트, 페닐 살리실레이트, 살아세타미드, 살리실아미드 0 - 아세틱 에시드, 살살레이트 및 술파살라진. 유사한 진통성 및 항 - 염증성을 갖는 구조적으로 관련된 살리실산 유도체 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특별한 실시구체형태에 있어서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 프로피온산 유도체, 약물전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후 - 치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물(예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질)의 용도에 관한 것이다. 프로피온산 유도체, 약물전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 알미노프로펜, 베녹사프로펜, 불클록식 에시드, 카르프로펜, 덱신도프로펜, 페노프로펜, 플루녹사프로펜, 플루프로펜, 플루르비프로펜, 푸르클로프로펜, 이부프로펜, 이부프로펜 알미늄, 이부프록삼, 인도프로펜, 이소프로펜, 케토프로펜, 록소프로펜, 미로프로펜, 나프록센, 옥사프로진, 피케토프로펜, 피메프로펜, 피르프로펜, 프라노프로펜, 프로티지닉 에시드, 피리독시프로펜, 수프로펜, 티아프로페닉 에시드 및 티옥사프로펜.
유사한 진통성 및 항 - 염증성을 갖는 구조적으로 관련된 프로피온산 유도체 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특별한 실시구체형태에 있어서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 아세트산 유도체, 약물전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시 치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다. 아세트산 유도체, 약물 전구체 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 아세메타신, 알클로페낙, 암페낙, 부펙사막, 신메타신, 클로피락, 델메타신, 디클로페낙 소디움, 에토돌락, 펠비낙, 펜클로페낙, 펜클로락, 펜클로직 에시드, 펜티아작, 푸로페낙, 글루카메타신, 이부페낙, 인도메타신, 이소페졸락, 이소세팍, 로나졸락, 메티아지닉 에시드, 옥사메타신, 옥스피낙, 피메타신, 프로글루메타신, 술린닥, 탈메타신, 티아라미드, 티오피낙, 톨메틴, 지도메타신 및 조메피락. 유사한 진통성 및 항 - 염증성을 갖는 구조적으로 관련된 아세트산 유도체 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특별한 실시구체형태에 있어서, 본 발명은 페나믹 에시드 유도체, 약물전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후 - 치료 또는 동시 치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다. 페나믹 에시드 유도체, 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 엔페나믹 에시드, 에토페나메이트, 플루페나믹 에시드, 이소닉신, 메클로페나믹 에시드, 메클로페나메이트 소디움, 메도페나믹 에시드, 메파나믹 에시드, 니플루믹 에시드, 탈니플루메이트, 테로페나메이트, 톨페나믹 에시드 및 우페나메이트. 유사한 진통성 및 항 - 염증성을 갖는 구조적으로 관련된 페나믹 에시드 유도체 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 카르복실산 유도체, 약물전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다. 사용될 수 있는 카르복실산 유도체, 약물 전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 클리다낙, 디플루니살, 플루페니살, 이노리딘, 케토록락 및 티노리딘. 유사한 진통성 및 항 - 염증성을 갖는 구조적으로 관련된 카르복실산 유도체 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 낙산 유도체, 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후 - 치료 또는 동시 치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다. 낙산 유도체, 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 부마디존, 부티부펜, 펜부펜 및 젠부신. 유사한 진통성 및 항 - 염증성을 갖는 구조적으로 관련된 낙산 유도체 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 옥시캄, 약물 전구체 에스테르, 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후 - 치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물(예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다. 옥시캄, 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 드록시캄, 에놀리캄, 이속시캄, 피록시캄, 수독시캄, 테녹시캄 및 4 - 히드록실 - 1,2 - 벤조티아진 1,1 - 디옥사이드 4 - (N - 페닐)- 카르복사미드. 유사한 진통성 및 항 - 염증성을 갖는 구조적으로 관련된 옥시캄 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 피라졸, 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다. 사용될 수 있는 피라졸, 약물 전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 디페나미졸 및 에피리졸. 유사한 진통성 및 항 - 염증성을 갖는 구조적으로 관련된 피라졸 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 피라졸론, 약물전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시 치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다. 사용될 수 있는 피라졸론, 약물 전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 아파존, 아자프로파존, 벤즈피페릴론, 페프라존, 모페부타존, 모라존, 옥시펜부타존, 페닐부타존, 피페부존, 프로필페나존, 라미페나존, 숙시부존 및 티아졸리노부타존. 유사한 진통성 및 항 - 염증성을 갖는 구조적으로 관련된 피라졸론 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 다음의 NSAIDs 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다 : ε - 아세타미도카프로익 에시드, 아믹세트린, 안티트라자펜, 안트라페닌, 벤다작, 벤다작 리시네이트, 벤지다민, 베프로진, 브로페라몰, 부콜로메, 부페졸락, 시프로쿠아존, 클록시메이트, 다지다민, 데복사메트, 데토미딘, 디펜피라미드 (difenpiramide), 디펜파이라미드 (difenpyramide), 디피살라민, 디타졸, 에모르파존, 파네티졸 메실레이트, 펜플루미졸, 플록타페닌, 플루미졸, 플루닉신, 플루프로쿠아존, 포피르톨린, 포스포살, 구아이메살, 구아이아졸렌, 이소닉시른, 레페타민 HCl, 레플루노미드, 로페미졸, 로티파졸, 리신 클로닉시네이트, 메세클라존, 나부메톤, 닉틴돌, 니메술리드, 오르고테인, 오르파녹신, 옥사세프롤름, 옥사파돌, 파라닐린, 페리속살, 페리속살 시트레이트, 피폭심, 피프록센, 피라졸락, 피르페니돈, 프로쿠아존, 프록사졸, 티에라빈 B, 티플라미졸, 티메가딘, 톨렉틴, 톨파돌, 트립타미드 및, 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITE182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (4-벤조일-1-인단카르복실 에시드), TVX2706, U60257, UR2301 및 WY41770 같이 회사 코드 번호로 명명된 것들. 상기 NSAIDs 와 유사한 진통성 및 항 - 염증성을 갖는 구조적으로 관련된 NSAIDs 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 류마티스성 질병 [예를들어, 라임병, 연소성(류마티스양) 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 류마티스양 관절염 및 연쇄상구균 - 유도성 ("패혈증성") 관절염] 같은 급성 및 만성 염증을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 TNF-매개 질병 ; 및 다발성 경화증 치료를 위한, 하나 또는 그 이상의 코르티코스테로이드, 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다. 코르티코스테로이드, 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음과 같은 히드로코르티손 및 히드로코르티손으로 부터 유래된 화합물을 포함한다 : 21 - 아세톡시프레그네놀론, 알클로메라손, 알게스톤, 암시노니드, 베클로메타손, 베클로메타손, 베타메타손 발레레이트, 부데소니드, 클로로프레드니손, 클로베타솔, 클로베타솔 프로피오네이트, 클로베타손, 클로베타손 부티레이트, 클로코르톨론, 클로프레드놀, 코르티코스테론, 코르티손, 코르티바졸, 데플라자콘, 데소니드, 덱속시메라손, 덱사메타손, 디플로라손, 디플루코르톨론, 디플루프레드네이트, 에녹솔론, 플루아자코르트, 플루클로로니드, 플루메타손, 플루메타손 피발레이트, 플루니솔리드, 플루시놀론 아세토니드, 플루오시노니드, 플루오로시놀론 아세토니드, 플루오코르틴 부틸, 플루오코르톨론, 플루오로코르톨론 헥사노에이트, 디플루코르톨론 발레레이트, 플루오로메톨론, 플루페롤론 아세테이트, 플루프레드니덴 아세테이트, 플루프레드니솔론, 플루란데놀리드, 포르모코르탈, 할시노니드, 할로메타손, 할로프레돈 아세테이트, 히드로코르타메이트, 히드로코르티손, 히드로코르티손 아세테이트, 히드로코르티손 부티레이트, 히드로코르티손 포스페이트, 히드로코르티손 21 - 소디움 숙시네이트, 히드로코르티손 테부테이트, 마지프레돈, 메드리손, 메프레드니손, 메틸프레드니콜론, 모메타손 푸로레이트, 파라메타손, 프레드니카르베이트, 프레드니솔론, 프레드니솔론 21 - 디에드리아미노아세테이트, 프레드니솔론 소디움 포스페이트, 프레드니솔론 소디움 숙시네이트, 프레드니솔론 소디움 21 - m - 술포벤조에이트, 프레드니솔론 소디움 21 - 스테아로글리콜레이트, 프레드니솔론 테부테이트, 프레드니솔론 21 - 트리메틸아세테이트, 프레드니손, 프레드니발, 프레드닐리덴, 프레드닐리덴 21 - 디에틸아미노아세테이트, 틱소코르톨, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토니드, 트리암시놀론, 베네토니드 및 트리암시놀론 헥사세토니드. 유사한 진통성 및 항 - 염증성을 갖는 구조적으로 관련된 코르티코스테로이드 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 류마티스성 질병 [예를들어, 라임병, 연소성 (류마티스양) 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 류마티스양 관절염 및 스타필로코컬 - 유도성 ("패혈증성") 관절염]과 같은 TNF - 매개 질병 ; 및 다발성 경화증 치료를 위한 하나 또는 그 이상의 서서히 작용하는 항류마티스성 약물 (SAARDs) 또는 질병 변형 항류마티스성 약물 (DMARDS), 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시 치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다.
SAARDs 또는 DMARDS, 약물 전구체 에스테르 및 제약학적으로 용인가능한 그것의 염은 다음을 포함한다 : 알로쿠프레이드 소디움, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아우로티오글리카니드, 아자티오프린, 브레퀴나르 소디움, 부실라민, 칼슘 3 - 아우로티오 - 2 - 프로판올 - 1 - 술포네이트, 클로람부실, 클로로퀸, 클로부자리트, 쿠프록솔린, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 답손, 15 - 데옥시스퍼구알린, 디아세레인, 글루코사민, 골드 솔트 (예를들어, 시클로퀸 골드 솔트, 골드 소디움 티오말레이트, 골드 소디움 티오술페이트), 히드록시클로로퀸, 히드록시우레아, 케부존, 레바미솔, 로벤자리트, 멜리틴, 6 - 머캅토푸린, 메토트렉세이트, 미조리빈, 마이코페놀레이트 모페틸, 미오랄, 니트로겐 무스타드, 0 - 페니실라민, SKNF86002 및 SB203580 같은 피리디놀 이미다졸, 라파마이신, 티올류, 티모포이에틴 및 빈크리스틴. 유사한 진통성 및 항 - 염증성을 갖는 구조적으로 관련된 SAARDs 또는 DMARDs 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 급성 및 만성 염증을 포함하는, 상기 정의한 바와 같은 TNF-매개 질병 치료를 위한 하나 또는 그 이상의 COX2 저해제, 그것의 약물 전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다. COX2 저해제, 약물전구체 에스테르 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염의 예로는 셀레콕시브를 포함한다. 유사한 진통성 및 항 - 염증성을 갖는 구조적으로 관련된 COX2 저해제 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특별한 실시형태에 있어, 본 발명은 급성 및 만성 염증을 포함하는, 상기 정의한 바와 같은 TNF - 매개 질병 치료를 위한 하나 또는 그 이상의 항균약, 약물 전구체 에스테르, 또는 제약학적으로 용인가능한 그것의 염 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다. 항균약은, 예를들어 다음을 포함한다 : 암피실린, 아목시실린, 아우레오미신, 박시트라신, 세프타지딤, 세프트리악손, 세포탁심, 세파클로어, 세파렉신, 세프라딘, 시프로플록사신, 클라불라닉 에시드, 클록사실린, 디클록사실란, 에리트로마이신, 플루클록사실란, 젠타미신, 그라미시딘, 메티실란, 네오마이신, 옥사실란, 페니실린, 및 반코마이신. 유사한 진통성 및 항 - 염증성을 갖는 구조적으로 관련된 항균약 역시 이 군에 포함시키고자 한다.
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 급성 및 만성 염증을 포함하는, 상기 정의한 바와 같은 TNF - 매개 질병 치료를 위한 하나 또는 그 이상의 다음 화합물 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다 : 과립구 군체 자극인자 ; 탈리도미드 ; BN50730 ; 테니답 ; E5531 ; 티아파판트 PCA4248 ; 니메술리드 ; 파나비어 ; 롤리프람 ; RP73401 ; 펩티드 T ; MDL201, 449A ; CIR,3S) - 시스 - 1 - [9- (2,6 - 디아미노푸리닐)]- 3- 히드록시 - 4 - 시클로펜텐 히드로클로라이드 ; (1R, 3R) - 트란스 - 1 - [9 - (2,6 - 디아미노) 푸린] - 3 - 아세톡시사이클로펜탄 (1R, 3R) - 트란스 - 1- [9 - 아데닐] - 3 - 아지도사이클로펜탄 히드로클로라이드 및 (1R,3R) - 트란스 - 1- [6 - 히드록시 - 푸린 - 9 - 일]- 3 - 아지도사이클로펜탄.
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 급성 및 만성 염증을 포함하는, 상기 정의한 바와 같은 TNF - 매개 질병 치료를 위한 하나 또는 그 이상의 부가적 TNF 저해제와 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시 치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다. TNF 저해제는 다음의 화합물을 포함하는, TNF 의 생체내 합성 또는 세포외 방출을 차단시키는 화합물 및 단백질을 포함한다.
부가적인 TNF 저해제는 다음을 포함한다 : 항 - TNF 항체 [예를들어, MAK 195F Fab 항체 (Holler et al. (1993), 1st International Symposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation, 147) ; CDP 571 항 - TNF 모노클로날 항체 (Rankin et al. (1995), British Journal of Rheumatology, 34 : 334 - 342, 이 명세서는 본원에 참고로서 인용됨) ; BAY X 1351 쥐의 항 - 종양 괴사인자 모노클로날 항체 (Kieft et al. (1995), 7th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 9, 이 명세서는 본원에 참고로서 인용됨) ; CenTNF cA2 항 - TNF 모노클로날 항체 (Elliott et al. (1994), Lancet, 344 : 1125 - 1127 and Elliott et al. (1994), Lancet, 344 : 1105 - 1110, 이 명세서는 본원에 참고로서 인용됨)].
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 가용성 재조합 인체 Fas 항원 또는 그것의 재조합 변형체 (제 WO 96/20206 호 및 Mountz et al., J. Immunology, 155 : 4829 - 4837 ; 및 제 EP 510 691 호, 이들 명세서는 본원에 참고로서 인용됨) 와 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다. 제 WO96/20206 호는 분비된 인체 Fas 항원 (Ig 융합 단백질을 포함하는, 천연 및 재조합 항원), 가용성 재조합 인체 Fas 항원을 코딩하는 유전자를 분리하는 방법, 적합한 벡터 및 세포 유형에 유전자를 클로닝하는 방법 및 저해제를 생산하도록 유전자를 발현시키는 방법을 기술하고 있다. 제 EP 510 691 호는 가용성 Fas 항원을 포함하는 인체 Fas 항원을 코딩하는 DNAs, 상기 DNAs 를 발현시키는 벡터 및 그 벡터로 형질감염된 형질전환체를 기술하고 있다. 비경구적으로 투여할 때, Fas 항원 융합 단백질 각각의 투여량은 대개 1 마이크로그람/kg 내지 100 마이크로그람/kg 이다.
특별한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 류마티스성 질병 [예를들어, 라임병, 연소성 (류마티스양) 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 류마티스양 관절염 및 스타필로코컬 - 유도성 ("패혈증성") 관절염] 과 같은 급성 및 만성 염증을 포함하는, 상기 정의한 바와 같은 TNF - 매개 질병 ; 외상, 간질, 출혈 또는 발작의 결과로서 나타나는 뇌손상 ; 및 다발성경화증 치료를 위한 하나 또는 그 이상의 인터루킨 - 1 저해제 중 어떠한 것과 함께 (전치료, 후 - 치료 또는 동시 치료) 절단된 sTNFR 산물 (예를들어 R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 의 용도에 관한 것이다. 인터루킨 - 1 저해제의 종류에는 하기한 바와 같은, IL-1ra 같은 인터루킨 - 1 수용체 길항물질 (IL-1 에 대한 세포성 수용체의 작용을 특이적으로 방지할 수 있는 어떠한 화합물) 을 포함한다 : 항 - IL - 1 수용체 모노클로날 항체 (예를들어, 제 EP 623674 호, 이 명세서는 본원에 참고로 인용됨) ; 가용성 IL-1 수용체 같은 IL-1 결합 단백질 (예를들어, 미국 특허 번호 제 5,492,888 호, 제 5,488,032 호, 제 5,464,937 호, 제 5,319,071 호 및 제 5,180,812 호, 이들 명세서는 본원에 참고로 인용됨) ; 항 - IL-1 모노클로날 항체 (예를들어, 제 WO 9501997 호, 제 WO 9402627 호, 제 WO 9006371 호, 미국 특허 번호 제 4935343 호, 제 EP 364778 호, 제 EP 267611 호 및 제 EP 220063 호, 이들 명세서는 본원에 참고로 인용됨) ; IL-1 수용체 보조 단백질, 예를들어, 제 WO 96/23067 호 (이 명세서는 본원에 참고로 인용됨) 및 IL-1 의 생체내 합성 또는 세포외 방출을 차단시키는 그외 화합물 및 단백질.
인터루킨-1 수용체 길항물질 (IL-1ra) 은 인터루킨-1 의 천연 저해제로서 작용하는 인체 단백질이다. 바람직한 수용체 길항물질 뿐만 아니라 그것의 제조방법 및 사용 방법에 관하여는 미국 특허 번호 제 5,075,222 호 (본원에서는 '222 특허라고 언급함) ; 제 WO 91/08285 호 ; 제 WO 91/17184 호 ; 제 AU 9173636 호 ; 제 WO 92/16221 호 ; 제 WO 93/21946 호 ; (a) 유효량의 조절된 방출 중합체 (예를들어, 하이알루론산) 및 (b) 유효량의 IL-1ra 를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 PCT 국제 출원 번호 제 US 97/02131 호 ; 제 WO 94/06457 호 ; 제 WO 94/21275 호 ; 제 FR 2706772 호 ; 제 WO 94/21235 호 ; 제 DE 4219626 호 ; 제 WO 94/20517 호 ; 및 제 WO 96/22793 호에 기술되어 있으며, 이들 명세서는 본원에 참고로 인용되어 있다. 이 단백질은 글리코실화된 IL-1 수용체 길항물질 뿐만 아니라 비-글리코실화된 IL-1 수용체 길항물질을 포함한다.
특히, 각각 동일한 DNA 코딩 서열로 부터 유래된, IL-1ra 의 바람직한 세 가지 형태 (IL-1raα, IL-1raβ 및 IL-1rax) 가 발명의 명칭이 "인터루킨-1 저해제"인 Hannum 등의 미국 특허 번호 제 5,075,222 호에 기술되어 있다. 본원에서 '222 특허라고 언급한 이 미국 특허 문헌은 특별히 본원에 참고로 인용되어 있다. 이들 세 인터루킨-1 저해제 모두 유사한 기능적 및 면역학적 활성도를 소유하고 있다. IL-1 저해제, 특히 IL-1ras 를 생산하는 방법 역시 '222 특허 문헌에 기술되어 있다. 기술되어 있는 한 방법은 인체 단핵구 (monocyte) 로 부터 저해제를 분리하는 것에 관한 것이다 (단핵구가 자연적으로 생산되는 경우). 두 번째 기술되어 있는 방법은 IL-1ras 를 코딩하는 유전자를 분리하고, 적합한 벡터 및 세포 유형에 그 유전자를 클로닝하고, IL-1ras 가 생산되도록 그 유전자를 발현시켜 IL-1ras 를 수확하는 것에 관한 것이다. 일반적으로 재조합 DNA 방법의 전형인 마지막 방법이 본 발명의 방법으로서 바람직하다. 특별한 실시구체형태에 있어, IL-1ra 는 E.coli 내 발현의 공동서열로서 N - 말단 메티오닐기를 포함한다. 또한 본 발명은 변형된 IL-1ras 를 포함한다. 변형된 IL-1ras 는 예를들어, 자연발생적인 저해제 아미노산 서열의 하나 또는 그 이상 부위에서의 아미노산이 시스테인 잔기로 치환된 그와 같은 저해제 뮤테인을 포함한다. 그와 같은 뮤테인은 기능화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 단위 또는 다른 설프히드릴 - 함유 폴리에스테르와 부위 - 선택적으로 반응하여 IL-1ra PEG 종을 생성할 수 있다. PCT 공개 번호 제 92/16221 호는 다수의 변형된 IL-1ra 종과 그와 같은 PEG 변형된 저해제의 제조방법을 기술하고 있다.
부가적인 인터루킨-1 저해제의 종류는 IL-1 에 대한 세포성 수용체의 활성화를 특이적으로 방지할 수 있는 화합물을 포함한다. 그와 같은 화합물은 IL-1 결합 단백질, 이를테면 가용성 수용체 및 모노클로날 항체를 포함한다. 또한 그와 같은 화합물은 그 수용체에 대한 모노클로날 항체도 포함한다.
인터루킨-1 저해제의 또 다른 종류는 IL-1 의 생체내 합성 및/또는 세포외 방출을 차단하는 화합물 및 단백질을 포함한다. 그와 같은 화합물은 IL-1 유전자의 형질전환 또는 IL-1 프리단백질의 프로세싱에 영향을 미치는 인자를 포함한다.
상기한 것은 예로 든 것이지, 본 기술분야의 숙련된 기술자들에 공지되어 있으며 본 기술분야의 숙련된 기술자들이 본 명세서에 기술되어 있는 지침을 이용하여 도달할 수 있는 항 - 염증성 화합물과 동시에 사용될 수 있는 그외 치료제를 배제하는 것은 아니다.
투여하기 용이하며 투여량이 일정한 투여량 단위 형태로 부가적인 항 - 염증성 화합물의 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 "투여량 단위 형태"란 치료될 포유동물 피검자에게 적합한 단일 투여량으로서 물리적으로 분리된 단위를 말하는 데, 각 단위는 필요한 제약학적 담체와 함께 원하는 치료효과를 나타내도록 계산된 미리정한 부가적인 항 - 염증성 화합물의 양을 함유한다. 본원에 사용된 바와 같은 "제약학적으로 용인가능한 담체" 는 활성 성분과 투여방식 및 제제형의 다른 성분과 양립할 수 있지만 수용자에게 해롭지 않은 어떤 및 모든 용매, 분산 매개물, 피복제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 그와 같은 매개물 및 제제의 용도는 본 기술분야에 공지되어 있다 [예를들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, pages 1435-1712, 이 명세서는 본원에 참고로 인용됨]. 보조 활성 성분 역시 조성물내에 포함시킬 수 있다
치료학적인 경구 투여를 위해, 부가 항-염증성 화합물은 부형제와 함께 포함될 수 있고 경구섭취용 정제, 구강정, 구내정, 캡슐, 일릭서, 현탁제, 시럽, 웨이퍼등의 형태로 사용될 수 있거나, 식이 음식과 함께 직접 삽입될 수도 있다. 또한 정제, 트로케, 환제, 캡슐등은 다음을 포함할 수도 있다 : 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 녹말 또는 젤라틴 같은 결합제 ; 디칼슘 포스페이트 같은 부형제 ; 옥수수 녹말, 알긴산등과 같은 붕괴제 ; 마그네슘 스테아레이트 같은 윤활제 ; 수크로스, 락토스 또는 사카린 같은 감미제 ; 또는 페퍼민트, 노루발풀 오일 또는 체리나 오렌지 향료와 같은 향료. 투여량 단위 형태가 캡슐일 때는 상기 유형의 물질 이외에도 액체 담체를 함유할 수 있다. 피복제로서, 그렇지 않으면 투여량 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위해 다양한 그외 물질이 존재할 수 있다. 예를들어, 정제, 환제 또는 캡슐은 쉘락, 당 또는 이 둘 다로 피복될 수 있다. 물론, 어떠한 투여량 단위 형태를 제조하는 데 사용되는 어떠한 물질도 제약학적으로 순수해야 하고 사용되는 양은 실질적으로 비-독성이어야 한다. 게다가, 부가 항-염증성 화합물은 지속되는 - 방출 제제 및 제제형내에 포함될 수도 있다. 그와 같은 치료학적으로 유용한 조성물내 부가 항 - 염증성 화합물의 양은 적합한 투여량이 수득될 양이다.
치료학적 비경구 투여를 위해, 각 부가 항-염증성 화합물은 무균 주사용액과 함께 포함될 수 있다. 무균 주사용액은 제약학적으로 용인가능한 적당한 담체내에 필요한 양의 부가 항-염증성 화합물을 하기한 (필요한) 여러가지 다른 성분들과 함께 삽입시켜 제조한 다음 멸균여과할 수 있다. 분산의 경우에는 기초 분산 매개물과 상기한 성분들 중에서 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 운반체내에 부가 항-염증성 화합물을 삽입함으로써 각각을 제조할 수 있다. 멸균 주사용액의 경우, 부가 항-염증성 화합물의 분말과, 임의적으로, 미리 멸균-여과된 그것의 용액 중에서 원하는 어떠한 부가 성분을 삽입함으로써 각각을 제조할 수 있는데, 여기서 분말은 어떠한 적합한 기술 (예를들어, 진공건조 및 동결건조) 로써 제조된 것이다.
부가 항-염증성 화합물의 특이 투여량은 환자의 어림 체중이나 체표면적에 따라 계산된다. 고유 투여량을 결정하는 그외 인자로는 치료되거나 예방될 급성 또는 만성 염증성 질병이나 증상, 투여경로, 및 환자의 연령, 성별 및 의학조건이 포함될 수 있다. 상기 언급한 각 제제형과 관련된 치료를 위한 고유 투여량을 결정하는 데 필요한 더 세밀한 계산은 본 기술분야의 숙련된 기술자들에 의해 일반적으로 이루어 진다. 또한 투여량은 고유의 투여량-반응 데이터와 관련하여 사용되는 투여량 결정을 위한 공지된 검정을 이용함으로써 결정될 수 있다.
따라서 , 예를들어, 류마티스성 질병 [예를들어, 라임병, 연소성 (류마티스양) 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 류마티스양 관절염 및 스타필로코컬-유도성 ("패혈증성") 관절염] 과 같은 급성 또는 만성 염증성 질병 치료를 위해 선택한 부가 항- 염증성 화합물의 투여량이 원하는 치료효과를 획득하기 위해 변화될 수 있다는 것은 본 발명의 범위내이다. 부가 항-염증성 화합물 중 하나가 부작용을 갖고 있을 경우에는 조합 요법 (combination therapy) 의 선택적 치료 기간 중에 환자에게 제공될 수 있다. 예를들어, 만성 메토트렉세이트 치료가 위장, 간, 골수 및 폐 독성과 관련된다 [Sandoval 등의 (1995), British Journal of Rheumatology, 34 : 49-56, 이 명세서는 본원에서 참고로 인용됨].
질병이 호전됨을 모니터하기 위한 시험은 예를들어, 혈구침강속도(ESR) 및 급성기반응물질 (APR) 을 포함하는, 염증에 대한 전신 반응 결정에 관한 특이 시험을 포함할 수 있다. 고통받는 신체 일부의 종창등을 관찰한다. 또한 환자에게서 경직성이 호전되고, 꽉 쥐며 (응용가능할 경우) 고통이 감소되는 것을 관찰한다. 환자의 상태가 안정된다면, 동일 투여량으로 매주 재치료하고 매주 평가한다. 환자의 상태가 안정된다면, 치료는 계속될 수도 있다. 치료 여섯 달 후, 방사선학 영상으로써, 예를들어 X - 방사선촬영하여 골격의 해부학적 변화를 측정한다.
각 기간이 끝났을 때 환자를 다시 평가한다. 전-치료 및 후-치료 방사선학 평가를 비교한 결과 ESR 및 APR 이 치료의 효능을 나타낸다. 치료의 효능과 환자의 상태에 따라 치료 중에 투여량은 증가될 수 있거나 일정하게 유지될 수 있다.
바람직하게, 본 발명은 류마티스성 질병 [예를들어, 라임병, 연소성 (류마티스양) 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 류마티스양 관절염 및 스타필로코컬-유도성 ("패혈증성") 관절염] 과 같은, 상기 정의한 바와 같은 급성 또는 만성 염증성 질병을 치료하거나 예방하기 위한, 임의적으로 다음의 조합물 중 하나를 수반한 방법에 관한 것이다 : 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 과 메토트렉세이트 ; 절단된 sTNFR 단백질 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질), 메토트렉세이트 및 IL-1 저해제, 바람직하게 IL-1ra ; 절단된 sTNFR 단백질 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질, 및 하나 또는 그 이상의 메토트렉세이트, 면역억제제 (예를들어, 사이클로스포린), 시프로플록사신, Fas 항원 및 IL-1 저해제, 바람직하게 IL-1ra 중 어떠한 것 ; 절단된 sTNFR 산물, (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 메토트렉세이트 및 면역억제제 (예를들어, 사이클로스포린) ; 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질), 메토트렉세이트 및 시프로플록사신 ; 및 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질), 메토트렉세이트 및 IL-1 저해제, 바람직하게 IL-1ra ; 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질) 및 하나 또는 그 이상의 메토트렉세이트, 술파사진 및 히드록시클로로퀸 중 어떠한 것 ; 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질), 메토트렉세이트 및 히드록시클로로퀸 및 절단된 sTNFR 산물 (예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질), 메토트렉세이트 및 술파사진.
특히 바람직한 실시구체형태에 있어, 본 방법은 상기 정의한 바와 같은 류마티스성 질병 [예를들어, 라임병, 연소성 (류마티스양) 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 류마티스양 관절염 및 스타필로코컬 - 유도성 ("패혈증성") 관절염] 및 이와 관련된 증상을 치료하기 위해, 임의적으로 메토트렉세이트 및/또는 IL-1 저해제 (예를들어, IL-1ra) 및/또는 가용성 재조합 인체 Fas 항원과 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시 치료) 절단된 sTNFR 산물 {예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질, 임의적으로, 지속되는 방출 제제형 (예를들어, 하이알루로난) 으로 제형화된 것}을 투여함 (예를들어, 관절내, 피하 또는 근육내)을 포함한다.
특히 바람직한 실시구체형태에 있어, 본 방법은 각각 신경변성을 초래할 수도 있는 외상, 간질, 출혈 또는 발작의 결과로서 나타나는 뇌손상 치료를 위해, 임의적으로 조직 플라스미노젠 활성화제 및/또는 IL-1 저해제 (예를들어, IL-1ra) 와 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물 {예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질, 임의적으로, 지속되는 방출 제제형 (예를들어, 하이알루로난) 으로 제형화된 것} 을 투여함 (예를들어, 정맥내 또는 심실내) 을 포함한다.
특히 바람직한 실시구체형태에 있어, 본 발명은 다발성경화증 치료를 위해 임의적으로, 하나 또는 그 이상의 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, FK-506, 또는 인터페론 (예를들어, 알파 인터페론, 베타 인터페론, 감마 인터페론 또는 칸센서스 인터페론) 및/또는 IL-1ra 와 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물 {예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질, 임의적으로, 지속되는 방출 제제형 (예를들어, 하이알루로난) 으로 제형화된 것} 을 투여함 (예를들어, 피하 또는 근육내) 을 포함한다.
특히 바람직한 실시구체형태에 있어, 본 방법은 염증성장질환 치료를 위해 임의적으로, G-CSF 및/또는 IL-1ra 와 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물 {예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질, 임의적으로, 지속되는 방출 제제형 (예를들어, 하이알루로난) 으로 제형화된 것} 을 투여함 (예를들어, 피하 또는 근육내) 을 포함한다.
특히 바람직한 실시구체형태에 있어, 본 방법은 악액질/식욕부진 치료를 위해 임의적으로 렙틴, MarinolTM또는 MegaceTM과 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물 {예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질, 임의적으로, 지속되는 방출 제제형 (예를들어, 하이알루로난) 으로 제형화된 것} 을 투여함 (예를들어, 피하 또는 근육내) 을 포함한다.
특히 바람직한 실시구체형태에 있어, 본 방법은 알쯔하이머병 치료를 위해 임의적으로, NSAID (예를들어, 인도메타신) 및/또는 IL-1 저해제 (예를들어, IL-1ra) 와 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물 {예를들어, R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질, 임의적으로, 지속되는 방출 제제형 (예를들어, 하이알루로난) 으로 제형화된 것}을 투여함(예를들어, 피하, 심실내 또는 초내) 을 포함한다.
특히 바람직한 실시구체형태에 있어, 본 방법은 암 (예를들어, 백혈병) ; 당뇨병 (예를들어, 제 1 형 연소성 당뇨병) ; 이식편 대 숙주 거부반응 ; 간염 ; 대뇌 국소빈혈 (각각 신경변성을 초래할 수도 있는 외상, 간질, 출혈 또는 발작의 결과로서 나타나는 뇌손상) 을 포함하는 국소빈혈/ 재관류 손상 ; 신경염증 질병 ; 상기 정의한 바와 같은 류마티스성 질병 [예를들어, 라임병, 연소성 (류마티스양) 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 류마티스양 관절염 및 스타필로코컬 - 유도성 ("패혈증성") 관절염] 및 조직이식 치료를 위해 임의적으로, 가용성 재조합 인체 Fas 항원과 함께 (전치료, 후-치료 또는 동시치료) 절단된 sTNFR 산물 {예를들어,R1-[Cys19-Cys103]-R2단백질, 임의적으로, 지속되는 방출 제제형 (예를들어, 하이알루로난) 으로 제형화된 것} 을 투여함 (예를들어, 피하, 심실내 또는 초내) 을 포함한다.
다음의 실례를 고려하면 본 발명의 다른 양상 및 잇점이 이해될 것이다.
다음 실시예에 기술되어 있는 많은 과정, 또는 적합한 택일적 과정에 대한 표준방법은 예를들어, Sambrook et al. (1989), 상기문헌 Ausubel et al. (1990), 상기문헌과 같은 널리 알려진 분자생물학 입문서에 제공되어 있다. 당업자의 편의를 위해, 밀리리터를 "mL", 리터를 "L" 이라고 언급한다.
실시예 I
다음 실시예는 다양한 형태의 절단된, 재조합 가용성 TNFR-I 의 생산에 관하여 기술하고 있다 :
NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH (sTNFR-I 2.6D/C105) ; NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-CO0H (sTNFR-I 2.6D/C106) ; NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH (sTNFR-I 2.6D/C105) ; NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2.3D/d8) ; NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2.3D/d18) ; and NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2.3D/d15).
A. DNA 제조 :
1. sTNFR - I 2.6D/C106
주형으로서, 클론 람다 - gt 107 ctnfbp 로 부터 유도된 클로닝된 cDNA 와 다음의 PCR 프라이머를 사용하여 sTNFR - I 2.6D/C106 을 PCR 증폭시킨다 :
5' OLIGO#1 : (서열 68)
5' -GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA- 3'
3' OLIGO#2 : (서열 69)
5' -CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG- 3'
상기 클론 람다-gt107 ctnfbp 는 제 EP 422 339 호에 이미 상세히 기술되어 있는 바와 같이 제조할 수 있다. 즉, PMA/PHA 로 처리한 U937 세포 (ATCC 번호 제 CRL-1593 호) 로부터 수득한 폴리 A+RNA 에서 cDNA 라이브러리를 제조한다. 이 cDNA 는 Gubler, U. 및 Hoffman, B. J., 1983, Gene, 25 : 263 문헌에 기술된 바와 같이 수득하였다. 수득한 약 1 μg 의 이중 가닥 cDNA 를 효소 EcoRI 메틸라아제로 처리하였고, 서열 d(pCCGGAATTCCGG) (미국 메사츄세츠 비버리 소재 뉴 잉글랜드 바이오랩스에서 입수) 를 갖는 EcoRI 링커를 T4 DNA 리가아제로 결합시킨 다음, 엔도누클레아제 EcoRI 으로 절단하였다. EcoRI 으로 절단시켜 놓은 람다 박테리오 파지 클로닝 벡터 gt 10 (ATCC 번호 제 97537 호) 에 상기 DNA 를 결합시켰다.
OLIGO#1 과 OLIGO#2 는 각각 NdeI 및 Hind Ⅲ 를 코딩하며 절단된 유전자의 5' 및 3' 말단과 어닐링한다. PCR 증폭은 25 순환 동안 진행시킨다 ; 각 순환은 변성을 위해 94 ℃ 에서 30 초, 어닐링을 위해 55 ℃ 에서 15 초 및 신장을 위해 72 ℃` 에서 1 분으로 이루어 진다 [모델 2400 열순환기 (미국 코네티컷 노르웍 소재의 퍼킨-엘머 시투스에서 구입)]. 제조자의 지시에 따라 QIAquickTM피시알 퓨리피케이션 키트 (PCR Purification Kit) (미국 캘리포니아 채츠워드 소재의 퀴아겐에서 구입) 를 사용하여 PCR 산물을 정제한다. 정제된 PCR 산물을 NdeI
및 HindⅢ 로 절단한 다음 제조자의 지시에 따라 QIAquickTM겔 익스트렉션 키트 (Gel Extraction Kit) (미국 캘리포니아 채츠워드 소재의 퀴아겐에서 구입) 를 사용하여 겔 정제한다. 겔 분리된 PCR 산물을 pAMG11 내에 결합시켜 FM15 E. coli 세포 (입수처 ATCC 제 55765 호) 내로 형질전환시킨다. pAMG11 벡터는 pR100 - 유도된 복제 기원을 갖는 저복제수 플라스미드이다. 이 발현 플라스미드 pAMG11 은 제 WO 95/26746 호에 기술된 바와 같이 PCR 중복 올리고 돌연변이유발에 의한 일련의 부위 특이 염기 변화를 일으킴으로써 플라스미드 pCFM1656 (입수처 : ATCC 번호 제 69576 호, 1994년 2월 24일자로 기탁됨) 으로 부터 유도할 수 있다. 즉, 플라스미드 복제 프로모터 PcopB 에 5' 인접한 BglⅡ 부위 (플라스미드 bp #180) 에서 시작하여 플라스미드 복제 유전자 쪽으로 진행하는데, 염기쌍 변화는 다음과 같다 :
pAMG11 bp # pCFM1656 에서의 bp pAMG11 에서 변화된 bp
#204 T/A C/G
#428 A/T G/C
#509 G/C A/T
#617 - - 2 개의 G/C bp 삽입
#679 G/C T/A
#980 T/A C/G
#994 G/C A/T
#1004 A/T C/G
#1007 C/G T/A
#1028 A/T T/A
#1047 C/G T/A
#1178 G/C T/A
#1466 G/C T/A
#2028 G/C bp 삭제
#2187 C/G T/A
#2480 A/T T/A
#2499-2502 AGTG GTCA
TCAC CAGT
#2642 TCCGAGC bp 삭제
AGGCTCG
#3435 G/C A/T
#3446 G/C A/T
#3643 A/T T/A
#4489-4512 - - bps 삽입
GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG
CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC
그런다음 유일한 AatⅡ 와 ClaⅠ 제한부위 사이의 DNA 서열을 다음의 올리고누클레오티드로 치환함으로써 결과적으로 pAMG11 을 제조한다 :
AatII (#4358)
5' CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT-
3' TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA-
-GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT 3'
-CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGC 5'
ClaI (#4438)
2. sTNFR - I 2.6D/C105
주형으로서, sTNFR - I 2.6D/C106 플라스미드 DNA 와 다음의 PCR 프라이머를 사용하여 sTNFR - I 2.6D/C105 를 PCR 증폭시킨다 :
OLIGO#3 : (서열 : 70)
5' -ACTCGA GGATCCGCGGATAAATAAGTAACGATCCGGTCCA-3'
OLIGO#4 : (서열 : 71)
5' -CAGGTCGGATCCTATCAGCAGAAGCACTGGAAAAGGTTTTC-3'
OLIGO#3 과 OLIGO#4 는 BamHI 및 돌연변이 N(105)C 다음의 정지코돈을 코딩한다. 결합을 위한 새로운 BamHI 부위를 삽입시키기 위해 주형 주변에서 완전히 연장되도록 OLIGOS 를 고안한다. PCR 증폭은 35 순환 - 각 순환은 변성을 위해 92 ℃ 에서 10 초, 어닐링을 위해 55 ℃ 에서 30 초, 및 신장을 위해 68 ℃ 에서 4 분으로 이루어 짐 - 동안 진행시킨 다음 25 순환 - 각 순환은 변성을 위해 92 ℃ 에서 10 초, 어닐링을 위해 55 ℃ 에서 30 초 및 신장을 위해 68 ℃ 에서 4 분 + 20 초로 이루어짐-을 진행시킨다 [모델 2400 열순환기 (미국 코네티컷 노르웍 소재의 퍼킨 - 엘머 시투스에서 구입]. 제조자의 지시에 따라 QIAquickTM겔 익스트렉션 키트 (미국 캘리포니아 채츠워드 소재의 퀴아겐에서 구입) 를 사용하여 PCR 산물을 겔 정제하여, BamHI 으로 절단하고 페놀/클로로포름 추출한 다음 에탄올 침전시켰다. 그것을 재현탁한 다음, pAMG11 내에 결합시켜 FM15 E. coli 세포내로 형질전환시킨다.
3. sTNFR-I 2.6D/N105
주형으로서 sTNFR-I 2.6D/C106 플라스미드 DNA 와 다음의 PCR 프라이머를 사용하여 sTNFR-I 2.6D/N105 를 PCR 증폭시킨다 :
5' OLIGO#5 : (서열 : 72)
5' -GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
3' OLIGO#6 : (서열 : 73)
5' -CGCGGATCCCTATTAATTGAAGCACTGGAAAAGG-3'
OLIGO#5 와 OLIGO#6 는 각각 NdeI 및 BamHI 을 코딩하고 절단된 유전자의 5' 및 3' 말단과 어닐링한다. PCR 증폭은 30 순환 진행시킨다 ; 각 순환은 변성을 위해 95 ℃ 에서 45 초, 어닐링을 위해 65 ℃ 에서 1 분, 및 신장을 위해 72 ℃ 에서 2 분으로 이루어 진다 [모델 2400 열순환기 (미국 코네티컷 노르웍 소재의 퍼킨-엘머 시투스에서 구입)].
제조자의 지시에 따라 WizardTM디엔에이 클린-업 시스템 (DNA Clean-Up System) (미국 위스콘신 매디슨 소재의 프로메가에서 구입) 을 이용하여 PCR 산물을 정제한다. 정제된 PCR 산물을 NdeI 및 BamHI 으로 절단하고, 페놀/클로로포름 추출한 다음 에탄올 침전시킨다. 그런다음 그것을 재현탁하고, pAMG11 내에 결합시켜 FM15 E. coli 세포 내로 형질전환시킨다.
본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들은 본 발명의 상세한 설명을 기초로 하여, 숙주세포 (예를들어, E. coli 및 그외 박테리아) 내 적합한 발현을 위해 다양한 물질 및 방법이 용이하게 사용될 수 있거나 이에 적응될 수 있다는 것을 인정할 것이다.
4. sTNFR 2.3D/d18 ; sTNFR-I 2.3D/d8 및 sTNFR-I 2.3D/d15
주형으로서 2.6D/C106 플라스미드 DNA 와 다음의 PCR 프라이머를 사용하여 sTNFR-I 2.3D/d18 ; sTNFR-I 2.3D/d8 및 sTNFR-I 2.3D/d15 각각을 PCR 증폭시킨다 :
sTNFR-I 2.3D/d8 PCR 프라이머 :
5' OLIGO#7 : (서열 : 74)
5' -CCCCATATGTATATCCACCCTCAAAATAAT-3'
3' OLIGOT#8 : (서열 : 75)
5' -CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
sTNFR-I 2.3D/d15 PCR 프라이머
5' OLIGO#9 (서열 ; 76)
5' -CCCCATATGTCGATTAGCTGTACCAAGTGCCACAAAGG-3'
3' OLIGO#10 : (서열 : 77)
5' -CCCAAGCTTTTCAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
sTNFR-I 2.3D/d18 PCR 프라이머
5' OLIGO#11 : (서열 : 78)
5' -CCCCATATGTGTACCAAGTGCCACAAAGGA-3'
3' OLIGO#12 : (서열 : 79)
5' -CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
OLIGO#7, OLIGO#9 및 OLIGO#11 은 각각 NdeI 를 코딩하고 OLIGO#8, OLIGO#10 및 OLIGO#12 는 각가 HindⅢ 를 코딩한다. PCR 증폭은 25 순환 동안 진행시킨다 ; 각 순환은 변성을 위해 95 ℃ 에서 45 초, 어닐링을 위해 65 ℃ 에서 1 분 및 신장을 위해 72 ℃ 에서 2 분으로 이루어진다 [모델 2400 열순환기 (미국 코네티컷 노르웍 소재의 퍼킨-엘머 시투스에서 구입)]. 제조자의 지시에 따라 WizardTM디엔에이 클린-업 시스템 (미국 위스콘신 매디슨 소재의 프로메가에서 구입)을 사용하여 PCR 산물을 정제한다. 정제된 PCR 산물을 NdeI 및 HindⅢ 로 절단하고, 페놀/클로로포름으로 추출한 다음 에탄올 침전시킨다. 그것들을 재현탁하고, pAMG11 내에 결합시켜 E. coli 세포내로 형질전환시킨다.
B. E.coli 내 생산 :
처음에, sTNFR-I 2.6D/N105, sTNFR-I 2.6D/C105, sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR 2.3D/d18, sTNFR-I 2.3D/d8 및 sTNFR-I 2.3D/d15 에 대한 원하는 구성물을 함유하고 있는 원하는 재조합 E.coli 클론의 신선하게 배양된 한 적은 접종물은, 동결된 글리세롤 저장 접종 앰플의 전체 함유물 (용량 1.5 mL) 을 500 mL 의 루리아 육즙을 함유하고 있는 2 L 플라스크내로 옮김으로써 시작된다. 선회진탕기내에서 그 배양물을 350 rpm 으로 작동시켜 37 ℃ 에서 배양한다. 660 nm 에서 흡광도 (OD660) 를 측정함으로써 배양물의 밀도를 측정한다. 접종 배양물을 ≥ 2.0 OD660의 밀도까지 성장시키고, 그 때에 125 mL 를, 10 L 의 무균 성장배지를 함유하는 15 L 생산 발효조로 무균적으로 옮긴다.
생산 발효를 위한 배치 배지와 발효조건은, 콜로라도 스테이트 유니버시티의 학위논문인 Sniff (1993) 의 "E. coli 내에서 재조합 단백질을 과생산하기 위한 화학적으로 - 특정된 배지"에 기술되어 있는 바와 같은 복합 배지 발효조건이다. 일반적으로, 이 참고문헌은 발효조내에서 멸균되는, 카세인 가수분해물, 염, 글리세린 및 거품억제제를 함유하는 복합배지 (complex medium) 의 용도에 관하여 기술하고 있다. 발효조를 40 ℃ 이하로 식힌 후에 미량의 미네랄을 멸균여과한 다음 티아민 히드로클로라이드를 가한다.
배지온도가 37 ℃ 로 안정화될 때 접종 배양물로 배지를 접종한다. OD660을 측정하여 배양성장을 모니터한다. 5 M 소디움 히드록사이드와 5 M 히드로클로릭 에시드를 자동부가하여 배양물을 pH 6.0 으로 유지시킨다. OD660이 9.5 내지 10.5 일 때, 무균 이소프로필 β-D 티오갈락토피라노시드 (IPTG) 를 무균부가하여 배양물을 0.50 mM 의 최종 농도로 유도시킨다. 성장이 멈추면 배양물을 수확한다.
배양 배지 및 성장조건은 다음을 제외하고는 Sniff (1993), 상기문헌에 기술되어 있다 : 암모니움 설페이트 (2.0 g/L) 와 L - 시스테인 히드로클로라이드 모노하이드레이트 (1.0 g/L) 를 배지에 가한다 ; 배지로 부터 테트라사이클린 히드로클로라이드를 제외한다 ; 소디움 히드록시드 만을 사용하여 pH 를 7.0 으로 유지시키기 보다는, 소디움 히드록시드와 히드로클로릭 에시드를 사용하여 pH 를 6.0 으로 유지시킨다 ; 성장온도는 37 ℃ 로 증가시킨다 ; 유도농도는 0.15 mM 에서 0.50 mM IPTG 로 증가되었다 ; 및 수확 기준은 유도 후의 시기 보다는 성장이 멈출 때를 기준으로 한다.
발효가 완료되었을 때, 세포를 원심분리하여 500 mL 병에 모은다. 10,000 rpm 에서 30 분간 원심분리하여 세포를 펠릿화한다. 회수된 세포 페이스트를 50 mM 트리스와 5 mM EDTA, pH 8.0 으로 이루어진 파괴 완충액 (breaking buffer) 에 15 % 고형물로 희석시킨다. 그런 다음 8000 psi 압력으로 작동하는 균질기 (미국 메사츄세츠 에버렛 소재의 에이피브이 가울린, 인코포레이티드에서 구입) 에 상기 용액을 3 회 통과시켜서 현탁 세포를 용해한다. 세포 봉입체 (IBs) 를 회수하기 위해 균질물을 10,000 rpm 에서 30 분간 원심분리한다. IBs 를 파괴 완충액에 재현탁하고 그 용액을 10,000 rpm 에서 30 분간 3 회 원심분리함으로써 세척하였다 두 번째 세척을 위해 IBs 를 탈염수에 재현탁하고 (1 : 1 비율) 10,000 rpm 에서 30 분간 원심분리하였다. 각 단백질에 대해 회수한, 세척된 세포 봉입체는 가용화, 재접힘 (refold) 및 정제할 준비가 되어 있다. 각각의 런 (run) 은 대략 200 - 250 g 의 IBs 를 산출한다.
선택적인 실시구체형태에 있어, 절단된 sTNFR-I 은 다음과 같이 발효시킬 수 있다 :
처음에, sTNFR-I 2.6D/N105 또는 sTNFR-I 2.6D/C106 에 대한 원하는 구성물을 함유하는 원하는 재조합 E.coli 클론의 신선하게 배양된 적은 접종물은 동결된 글리세롤 저장 접종 앰플의 전체 함유물 (용량 1.5 mL)을 500 mL 의 10 g/L BBL 효모 추출물, pH 7.0 을 함유하는 2 L 플라스크내로 옮김으로써 시작한다. 33 ℃ , 300 rpm 으로 작동하는 선회진탕기에서 배양물을 배양한다. 600 nm 에서 흡광도를 측정함으로써 (OD600) 배양물의 밀도를 측정한다. 이 접종 배양물을 ≥ 2.0 OD600의 밀도로 성장시키고, 이 때에 7 L 의 무균 성장배지를 함유하는 15 L 생산 발효조에 무균적으로 옮긴다 (80 mL).
생산 발효는 유가배양 (fed-batch) 과정을 이용한다. 배치배지는 발효조내에서 멸균되는, 효모추출물, 염 및 거품억제제를 함유하는 복합배지이다. 발효조를 40 ℃ 이하로 식힌 후에 미량의 미네랄을 멸균여과하고, 글루코스, 마그네슘 설페이트 및 헥사메타포스페이트를 가한다. 두 가지 공급물(feed) 을 사용하는 데, 첫 번째는 탄소 함유 공급물 (글루코스/마그네슘 설페이트)이고 두 번째는 질소 공급물 함유 효소 추출물이다.
배치배지 온도가 33 ℃ 로 안정화되면, 접종 배양물로 배지를 접종한다. 배양 성장은 OD600을 측정함으로써 모니터한다. 암모니움 히드록시드와 48.7 % 시트르산을 자동 부가시킴으로써 배양물을 pH 7.0 으로 유지한다. OD600이 8.0 내지 12.0 이면, 지수 공급속도를 이용하여 공급물 I 을 개시한다. OD600이 30 내지 40 이면, 일정한 공급속도를 이용하여 공급물Ⅱ 를 개시한다. OD600이 67 - 83 에 도달하면, 무균의 자가유도물질 (호모세린 락톤) 을 무균 부가하여 최종 농도가 0.6 mg/L 가 되도록 배양물을 유도한다. 공급물 I 과 공급물 Ⅱ 둘 다의 속도는 유도시에 일정속도로 변화된다. 유도 후 16 ± 2 시간에서 배양물을 수확한다.
발효가 완료되었을 때, 세포를 원심분리하여 500 mL 병에 모은다. 10,000 rpm 에서 30 분간 세포를 원심분리하여 펠릿화한다. 50 mM 트리스와 5 mM EDTA, pH 8.0 으로 이루어진 파괴 완충액내에 회수된 세포 페이스트를 15 % 고형물로 희석시킨다. 그런다음 8000 psi 압력으로 작동하는 균질기 (미국 메사츄세츠 에버렛 소재의 에이피브이 가울린, 인코포레이티드에서 구입) 에 그 용액을 3 회 통과시킴으로써 현탁 세포를 용해한다. 세포 봉입체 (IBs) 를 회수하기 위해 10,000 rpm 에서 30 분간 균질물을 원심분리한다. 파괴 완충액에 재현탁하고 그 용액을 10,000 rpm 에서 30 분간 3 회 원심분리함으로써 IBs 를 세척한다. 두 번째 세척을 위해 IBs 를 탈염수에 재현탁하고 (1 : 1 비율) 10,000 rpm 에서 30 분간 원심분리한다. 회수한, 세척된 세포 봉입체는 가용화, 재접힘 및 정제할 준비가 되어 있다.
C. 가용화/재접힘 :
각각 전체 10 L 발효로 부터의 세척된 IBs 를 800 mL 의 가용화 완충액 (50 mM 트리스, 8 M 우레아, 160 mM 시스테인, pH 9.5) 에 가용화시킨다. 10 N NaOH 를 가하여 가용화 혼합물의 pH 를 9.5 로 맞추고 실온에서 2 - 3 시간 동안 교반시켰다. 각 런은 대략 200 - 250 g 의 IBs 를 산출했다.
각 가용화 혼합물을 차가운 재생 완충액 (Renaturation Buffer) (50 mM 트리스, 1.1 M 우레아) 내에 1 : 20 으로 희석한다. 각 최종부피는 약 16 L 이다. 그 후 각 혼합물을 6 N HCl 을 가하여 pH 9.7 로 조정하고, 2 - 3 일간 4 ℃ 에서 서서히 교반시킨다.
빙초산과 6 N HCl 을 가하여 각 혼합물의 pH 를 5.0 으로 조정한다. 각 혼합물에 형성된 침전물은 벡크만 모델 J2 - HS 원심분리기를 사용하여 10,000 X g 에서 원심분리하여 제거한다. 그런 다음 각 물질을 5 μm 및 0.22 μm 필터를 통해 여과한다.
D. 정제 :
재접힌 물질은 IX-1 SP-Sepharose Big BeadTM컬럼 (미국 뉴저지 피스카타웨이 소재의 파마시아 바이오테크, 인코포레이티드에서 구입) 상에서 컬럼 정제할 준비가 되어 있다.
IX-1 SP-Sepharose Big BeadTM컬럼 (4.4 cm X 20 cm)
완충액 A 완충액 B
25 mM 아세테이트 25 mM 아세테이트
50 mM NaCl 375 mM NaCl
pH 5.0 pH 5.0
각 재접힌 물질의 부하물 (loading) 을 분리하기 전에 4-5 컬럼 부피 완충액 A 로 컬럼을 평형화시킨다. 재접힌 물질을 정제용 컬럼 상에 개별적으로 부하한다. 각 부하물에 대해서 오직 수지 1 리터 당 12 그람의 단백질로 컬럼을 부하한다. 그런다음 각 부하물에 대해, 3-4 컬럼 부피의 완충액 A 로 컬럼을 세척한다 (U.V. 가 기준선으로 되돌아 올 때까지). 각 부하물에 대해, 50-375 mM NaCl 이 흐르는 8 컬럼 부피의 선형 증가 염 기울기를 이용하여 컬럼으로부터 단백질을 용리시킨다. 각 부하물에 대한 완전한 단백질 피크를 하나의 풀로 모은다. U.V. 흡광도가 피크 최대치의 약 20 % 로 증가하면 각 단백질 피크를 모으기 시작한다. U.V. 흡광도가 피크 최대치의 약 50 % 에 도달했을 때나 아니면 흡광도 감소가 멈출 때 중 더 빠른 때에 풀로 모으는 것을 정지한다.
유속 - 평형화, 세척시 7.5 cv/hr
부하시, 15 cv/hr
용리시 6 cv/hr
각 컬럼 정제는 4 ℃ 에서 진행한다.
각 IX-1 풀은 Toyo PearlTMButyl 650 M HIC 컬럼 (미국 펜실베니아 필라델피아 소재의 토소 하스에서 구입) 상에서 정제될 준비가 되어 있다.
300 mL-Toyo Pearl ButylTM650 M 컬럼 (4.4 cm X 20 cm)
완충액 A 희석 완충액 완충액 B
20 mM NaPO4 40 mM Na NaPO4 밀리 Q H20
1.8 M NaCl, pH 6.0 4 M NaCl pH 6.0
각 IX-1 풀 물질의 부하물을 분리하기 전에 4-5 컬럼 부피의 완충액 A 로 컬럼을 평형화시킨다. 각 IX-1 풀을 희석 완충액으로 1 : 1 희석하고 pH 를 6.0 으로 맞춘다. 각 부하물에 대해, 희석된 IX-1 풀을 컬럼상에 부하한다. 각 부하물에 대해, 오직 수지 1 리터당 10 그람의 단백질을 컬럼에 부하한다. 각 부하물에 대해, 3 컬럼 부피의 완충액으로 컬럼을 세척한다. 각 부하물에 대해, 1.8 M NaCl 에서 H20 까지 흐르는 8 컬럼 부피의 선형 감소 염 기울기를 이용하여 컬럼으로 부터 단백질을 용리한다. U. V. 흡광도가 피크 최대치의 약 15-20 % 로 증가하면 각 단백질 피크를 모으기 시작한다. U.V. 흡광도가 피크 최대치의 약 50 % 에 도달할 때나 아니면 흡광도 감소가 멈출 때 중에서 더 이른 때에 풀 모으기를 정지한다.
유속 - 평형화, 부하 및 세척시 6 cv/hr
용리시 3 cv/hr
각 컬럼 정제는 실온에서 진행한다.
각 HIC 풀은 농축/투석여과할 준비가 되어 있다.
농축/투석여과 (C/D)
1 평방 피트 (30.48 cm2) PLCCTM회복 셀룰로스 5,000 M.W. 차단 막 (미국 메사츄세츠 베드포드 소재의 밀리-포어에서 구입) 을 각 HIC 풀에 대한 C/D 단계에 사용한다. 각 HIC 풀을 약 200 mL 까지 농축한 다음 전도도가 < 4 mm 시간이 될 때까지 6 - 7 부피의 20 mM NaPO4, pH 6.0 에 대해 투석여과한다. 각 농축/투석여과 단계는 실온에서 수행한다.
각 C/D 풀은 IX - 2 - 365 mL SP - Sepharose HPTM컬럼 (미국 뉴저지 피스카타웨이 소재의 파마시아 바이오텍 인코포레이티드에서 구입) 상에서 정제할 준비가 되어 있다.
IX-2-365 mL SP-Sepharose HPTM컬럼 (5 cm X 18.5 cm)
평형화 완충액 완충액 A 완충액 B
20 mM NaNaPO4 20 mM NaPO4 20 mM NaPO4
pH 6.0 pH 6.3 50 mM NaCl pH 6.8
각 C/D 풀의 부하물을 분리하기 전에 4 컬럼 부피의 평형화 완충액으로 컬럼을 평형화시킨다. 오직 수지 1 리터 당 8 그람의 단백질을 사용하여 각 C/D 풀을 컬럼상에 부하한다. 각 부하물에 대해, 3 컬럼 부피의 평형화 완충액으로 컬럼을 세척한 다음 3 컬럼 부피의 완충액 A 로 세척한다. 각 부하물에 대해, pH 6.3 - 6.8 의 pH 기울기와 0 - 50 mM NaCl (완충액 B) 이 흐르는 염 기울기로 이루어진 8 컬럼 부피의 선형 기울기를 이용하여 컬럼으로 부터 단백질을 용리한다. 피크 전면이 1.0 0.D 이상일 때 풀로 모으는 것을 시작하고 후면이 피크 최대치의 50 % 일 때 정지한다.
선택적인 실시구체형태에 있어, 절단된 sTNFR 을 다음과 같이 가용화 및 재접히게 하여 정제할 수 있다 :
C. 1 가용화/재접힘 :
세척된 IBs 를 8 M 우레아, 60 mM 트리스, 100 mM 시스테인과 함께 가용화하여 최종농도가 6.5 M 우레아, 50 mM 트리스 및 80 mM 시스테인, pH 9.4 인 5 - 10 mg/mL 절단된 sTNFR-1 을 제공한다 (후자는 g/L 기준의 세척된 IBs 내 절단된 sTNFR -1 의 양을 정량하는 것을 기초로 한 것이다). 실온에서 90 분간 상기 물질을 교반한 다음 차가운 (4 - 8 ℃) 0.85 M 우레아, 50 mM 트리스, pH 9.8 (pH 측정은 4 - 8 ℃ 에서 함) 내에 1 : 10 희석함으로써 재접히게 한다.
재접힌 용액을 4 - 8 ℃ 에서 24 - 72 시간 동안 교반시킨다. 이 시간이 끝나면, 빙초산을 가하여 (~ 20 mM) pH 를 5.0 으로 맞춘다. 형성된 침전물은 원심분리하여 제거하고 상청액은 제 1 컬럼 부하를 위해 모은다.
D. 1 정제
20 mM 소디움 아세테이트, 75 mM NaCl, pH 5.0 으로 평형화시켜 놓은 SP-Sepharose Big BeadTM컬럼 (미국 뉴저지 피스카타웨이 소재의 파마시아 바이오텍, 인코포레이티드에서 구입) 상에, 맑아진 산 침전물 풀을 부하한다. 오직 L 베드 부피당 15 g 의 절단된 sTNFR-I 을 컬럼에 부하한다. 부하 후 컬럼을 3 컬럼 부피의 20 mM 소디움 아세테이트, 75 mM NaCl, pH 5.0 으로 세척하고 20 mM 소디움 아세테이트, pH 5.0 내의 75 mM 에서 450 mM NaCl 까지의 선형 9 컬럼 기울기로 용리하였다. 전체 SP-Sepharose Big BeadTM컬럼 (SP-BB) 단계는 4 - 8 ℃ 에서 진행한다.
2 M NaCl, 60 mM 아세테이트, pH 4.5 로 SP-BB 풀을 1 : 1 희석하고 필요하다면 pH 를 4.5 로 맞춘다. 1 M NaCl, 30 mM 아세테이트, pH 4.5 로 평형화시켜 놓은 ToyopearlTM부틸 650 M 컬럼 (미국 펜실베니아 필라델피아 소재의 토소 하스에서 구입) 상에 희석된 SP-BB 풀을 부하한다. 리터 베드 부피당 ~ 10 - 13 그람의 절단된 sTNFR-I 을 컬럼에 부하한다. 부하 후, 3 컬럼 부피의 1 M NaCl, 30 mM 아세테이트, pH 4.5 로 컬럼을 세척하고 30 mM 아세테이트, pH 4.5 내 1 M - 0 M NaCl 의 선형 8 컬럼 부피 기울기로 용리한다.
부틸 650 M 컬럼으로 부터 정제된, 절단된 sTNFR-I 분획을 모으고, 물로 1: 5 희석한 다음 30 mM 아세테이트, pH 4.5 (단지 ~ 15 g/L 베드 부피) 로 평형화시켜 놓은 SP-Sepharose High PerformanceTM컬럼 (SP-HP) 상에 부하하였다. 그런 다음 컬럼 3 부피의 30 mM 아세테이트, pH 4.5 로 컬럼을 세척하고 30 mM 아세테이트, pH 4.5 내의 100 mM 에서 400 mM NaCl 의 선형 12 컬럼 부피 기울기로 용리하였다. 정제된 절단된 sTNFR-I 분획을 풀로 모으고 NaOH 를 가하여 pH 5.0 으로 맞추었다.
C. 폴리에틸렌 글리콜레이션 :
1. sTNFR-I 2.6D/N105 - t - BuPEG (33 kDa) 제조
50 mM 소디움 아세테이트, pH 4 내의 차가운 (4 ℃ ), 교반된 sTNFR- 2.6 D/N105 (3.5 mg/ml) 용액에 3 배 몰과량의 t - BuPEG (모노 - t - 부톡시 - 폴리에틸렌 글리콜, 평균 분자량 = 33 kDa, 쉐어워터 폴리머즈, 인코포레이티드에서 구입) 를 부가한다. 최종 농도가 20 mM 이 되도록 NaCNBH3를 가하고, 이 반응 혼합물을 7 ℃ 에서 18 - 24 시간 교반한다.
반응이 진행되는 동안 단백질 변형 정도는, 0.7 ml/분으로 0.1 M 소디움 포스페이트 완충액 pH 6.9, 0.5 M NaCl, 및 10 % 에탄올과 함께 용리하는 TSKG3000swXL컬럼 (미국 펜실베니아 몬트고메리빌 소재의 토소 하스에서 구입) 을 이용하여 SEC HPLC 로써 모니터한다.
반응 혼합물의 pH 는 1 M HCl 을 가하여 3.5 로 맞추고, 최종 단백질 농도가 1.5 mg/ml 가 되도록 반응 혼합물을 물로 희석한다.
SP Sepharose HP 16/10TM이온-교환 크로마토그래피 (미국 뉴저지 피스카타웨이 소재의 파마시아 바이오텍, 인코포레이티드에서 구입) 를 사용하여 과량의 t-BuPEG 와 그외 반응 부산물로 부터 sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) 을 분리한다.
반응 혼합물을 컬럼상에 부하하고 3 컬럼 부피의 출발 완충액 A (20 mM 소디움 아세테이트, pH 4.0) 로 비반응된 t-BuPEG 를 용리한다. 0 - 30 % 완충액 B (20 mM 아세테이트내 1 M NaCl, pH 4.0) 의 선형 20 컬럼 부피의 기울기를 이용하여 sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) 를 용리한다.
280 nm 에서 용리액을 모니터한다. sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) 를 함유하는 각 분획은 4 - 20 % 의 미리만든 기울기 겔 (미국 캘리포니아 샌디에고 소재의 노벡스에서 구입)을 이용하여 SDS - PAGE 로써 분석한다. SDS-PAGE 분석 결과를 기초로 하여 분획들을 풀로 모으고, 농축시켜 무균여과하였다. 정제된 sTNFR-1 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) 의 각각의 최종 풀을 다시 SDS-PAGE 및 SEC HPLC 로 분석한다. 이 단백질을 10 mM 소디움 포스페이트, pH 6.5 및 20 mM NaCl 과 함께 제형화한다.
2. sTNFR-I 2.6D/N105 - 33 kDa (MePEG)의 제조
차가운 (7 ℃), 교반된 sTNFR-I 2.6D/N105 용액 (4 mg/ml) 에 pH가 5.0 이 될 때까지 10 % 아세트산을 가한다. 이 용액에 15 mM NaCNBH3와 2 배 몰 과량의 t-부톡시 PEG (t-부톡시 폴리에틸렌 글리콜, 평균 MW = 33 kDa, 쉐어워터 폴리머즈, 인코포레이티드에서 구입) 를 가한다. 동일한 온도에서 간단히 반응 혼합물을 교반한 다음 ~ 18 시간 동안 항온하였다.
18 시간 후 반응 혼합물내 단백질 농도를 시트르산을 가하여 pH 3.0 으로 조정한다.
SP Sepharose HPTM컬럼 (미국 뉴저지 피스카타웨이 소재의 파마시아 바이오텍, 인코포레이티드에서 구입) 을 사용하여 이온 교환 크로마토그래피함으로써 과량의 MePEG 와 그외 반응 부산물로 부터 sTNFR-I 2.6D/N105 - MePEG (33 kDa) 를 분리한다.
반응 혼합물을 컬럼상에 부하하고 (단지 8 mg/ml 수지) 출발 완충액 A (20 mM 소디움 시트레이트, pH 3.0) 의 3 컬럼 부피로 비반응된 MePEG 를 용리한다. 20 mM 시트레이트, pH 3.0 내의 0.1 - 0.5 M NaCl 의 선형 16 컬럼 부피 기울기를 이용하여 sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33 kDa) 를 용리한다. 280 nm 에서 용리액을 모니터한다. 미리 만든 4 - 20 % 기울기 겔 (미국 캘리포니아 샌디에고 소재의 노벡스에서 구입) 을 사용하여 SDS - PAGE 함으로써 sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33 kDa) 을 함유하는 각 분획을 분석한다. SDS - PAGE 분석 결과를 기초로 하여 분획들을 풀로 모으고, 농축하여 무균여과한다. 정제된 sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33 kDa) 의 각 최종 풀을 SDS - PAGE 로써 다시 분석한다. 정제된 sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33 kDa) 를 5 - 20 mg/mL 로 농축하고 PBS, pH 6.5 (10 mM 소디움 포스페이트, 35 - 100 mM NaCl) 이나 아니면 20 mM 아세테이트, 100 mM NaCl, pH 5.0 에 제형화한다.
3. sTNFR-I 2.6D/N105 - MePEG (20 kDa) 제조
sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33 kDa) 제조를 위한 A 단계의 과정을, MePEG (모노 - 메톡시 - 폴리에틸렌 글리콜, 평균 MW = 33 kDa, 쉐어워터 폴리머즈, 인코포레이티드에서 구입) 대신에 MePEG (모노 - 메톡시 - 폴리에틸렌 글리콜, 평균 MW = 20 kDa, 쉐어워터 폴리머즈, 인코포레이티드에서 구입) 를 사용하는 것을 제외하고는 실질적으로 반복한다. 이 단백질은 10 mM 소디움 포스페이트, pH 6.5 및 20 mM NaCl 내에 제형화시킨다.
4. 부가 결합체의 제조
sTNFR-I 2.6D/N105 의 부가 결합체는 다음 유형의 PEG 알데히드 (쉐어워터 폴리머즈, 인코포레이티드에서 구입) 를 사용하는 것을 제외하고는 실질적으로 sTNFR-I 2.6D/N105 - MePEG (33 kDa) 와 같이 제조한다 :
선형 단작용성 - MW 5 kDa, 6 kDa, 및 57 kDa ;
분지된 단작용성 - MW 10 kDa, 20 kDa 및 40 kDa ;
선형 이작용성 - MW 8 kDa, 및 20 kDa ;
분지된 삼작용성 - MW 10 kDa.
이들 단백질은 10 mM 소디움 포스페이트, pH 6.5 및 20 mM NaCl 에 제형화시킨다.
5. 선택적인 폴리에틸렌 글리콜화 방법
선택적인 실시구체형태에 있어, 절단된 sTNFR-I 분자를 다음 기술에 의해 폴리에틸렌 글리콜화하고 정제할 수도 있다 :
SP-HP 용리물 (pH 5.0 으로 맞춘 3 - 5 mg/mL) 을 sTNFR-I 2.6D/N105 분자 (sTNFR-I 2.6D/N105 1 그람 당 t-BuPEG ~ 5 그람) 당 2 몰의 폴리에틸렌 글리콜 (예를들어, MePEG 또는 t-BuPEG) 과 반응시킨다. 폴리에틸렌 글리콜을 용해시킨 후, 10 - 20 mM 소디움 시아노보로하이드리드를 가하고 그 용액을 7 - 15 ℃ 에서 밤새 배양한다. 폴리에틸렌 글리콜 반응이 끝나면 ( ~ 18 시간) 10 mM 글리신을 가하여 반응을 멈춘다.
폴리에틸렌 글리콜화 혼합물을 4 부피의 50 mM 아세테이트, pH 4.0 으로 희석하고, 필요하다면 pH 4.0 으로 조정한 다음, 50 mM 아세테이트, pH 4.0 으로 평형화시켜 놓은 SP-HP 컬럼상에 부하한다. 단지 리터 베드 부피 당 ~ 8 그람의 sTNFR - 2.6D/N105 를 컬럼에 부하한다. 부하 후, 컬럼을 3 컬럼 부피의 평형화 완충액으로 세척하고 50 mM 아세테이트, pH 4.0 내 선형 0 - 0.3 M NaCl 기울기로 용리한다. sTNFR - 2.6D/N105 - 30 kDa 모노폴리에틸렌 글리콜화된 분획을 모으고, pH 5.0 으로 조정하여 농축시킨 다음 등장성 제형화 완충액으로 투석여과한다. 모든 정제 단계는 실온에서 수행한다. 이 단백질은 PBS, pH 6.5 (10 mM 소디움 포스페이트, 35 - 100 mM NaCl) 이나 아니면 20 mM 아세테이트, 100 mM NaCl, pH 5.0 내에 제형화시킨다.
6. sTNFR-I 2.6D/N105 아령체 및 sTNFR-I 2.6D/C106 아령체 제조
환원 및 반응 조건을 제외하고는 실질적으로 PCT 공개번호 제 WO 95/34326 호에 기술된 방법에 따라 단백질을 이합체화 하기 위해 술폰 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (1995년 6월 7일자 제출한 미국 특허 출원 번호 제 08/473,809 호 및 1996년 3월 6일자 제출한 미국 특허 출원 번호 제 08/611,918 호에 따라 실질적으로 제조하고 정제한 것) [PEG-20,000 - 비스 - 비닐 술폰] 을 사용한다. 폴리에틸렌 글리콜을 부가하기 전에 5 - 6 ℃, pH 7.6 에서 1 몰의 단백질 당 4 몰의 DTT 로 단백질을 환원시킨다. 30 % 글리세롤의 존재하에서 모든 반응을 수행한다. 이 이합체와 단백질을 sTNFR-I 2.6D/C105db 및 sTNFR-I 2.6D/C106db 라 언급한다. 각 단백질을 PBS, pH 6.5 (10 mM 소디움 포스페이트, 35 - 100 mM NaCl) 나 아니면 20 mM 아세테이트, 100 mM NaCl, pH 5.0 에 제형화시킨다.
7. 비교 sTNFR-I 분자의 제조
(i) 제 EP 422339 호에 기술되어 있는 바와 같이 sTNFR-I 4D/N105 를 제조한다. sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) 의 폴리에틸렌 글리콜화에 대해 상기한 과정에 따라 실질적으로 sTNFR-I 4D/N105 를 폴리에틸렌 글리콜화함으로써 sTNFR-I 4D/N105-t-BePEG (33 kDa) 를 제조한다.
sTNFR-I 4D/N105-t-MePEG (33 kDa) 는 sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33 kDa) 의 폴리에틸렌 글리콜화에 대해 제시한 과정에 따라 실질적으로 sTNFR-I 4D/N105 를 폴리에틸렌 글리콜화함으로써 제조한다. sTNFR-I 4D/C105 및 sTNFR-I 4D/C105bd 는 PCT 공개 번호 제 WO 95/34326 호에 기술된 바와 같이 제조한다. 이 단백질은 10 mM 소디움 포스페이트, pH 6.5 및 20 mM NaCl 내에 제형화시킨다.
(ii) sTNFR-I 4D/C105 - 33 kDa (MePEG) 는, sTNFR-I 1 몰당 1.3 몰의 DTT 와 함께 ~ 5-6 시간 동안 pH 7.5 에서 반응을 일으킨 다음, SP-SepharoseTMFF 컬럼상에서 DTT 를 제거하고 실온에서 최소한 15 시간 동안 단백질 1 몰당 1.5 - 3 몰의 PEG 로 폴리에틸렌 글리콜화시키는 것을 제외하고는, sTNFR-I 2.6D/C105 - 33 kDa (MePEG) 의 폴리에틸렌 글리콜화에 대해 상기한 과정에 따라 실질적으로 4D/C105 를 폴리에틸렌 글리콜화함으로써 제조한다. 이 단백질은 PBS, pH 6.5 (10 mM 소디움 포스페이트, 35 - 100 mM NaCl) 나 아니면 20 mM 아세테이트, 100 mM NaCl, pH 5.0 내에 제형화시킨다.
(iii) sTNFR-I 3D/N105 (sTNFR-I 4D/N105 의 C - 말단 34 아미노산 절단) 는 다음과 같이 제조한다. 주형으로서 sTNFR-I 4D/N105 와, 각각 NdeI 및 HindⅢ 를 코딩하는 OLIGO#13 과 OLIGO#14 를 사용하여 PCR증폭을 수행하고, 각각, 절단된 유전자의 5' 및 3' 말단에 어닐링한다.
PCR 증폭은 25 순환 동안 진행시킨다 ; 각 순환은 변성을 위해 94 ℃ 에서 30 초, 어닐링을 위해 60 ℃ 에서 15 초 및 신장을 위해 72 ℃ 에서 1 분으로 이루어 진다 [모델 2400 열순환기 (미국 코네티컷 노르웍 소재의 퍼킨 - 엘머 시투스에서 구입)]. PCR 산물은 QIAquickTMPCR 증폭 키트 (미국 캘리포니아 채츠워드 소재의 퀴아겐에서 구입) 를 사용하여 정제한다. 정제된 PCR 산물을 NdeI 및 HindⅢ 로 절단한 다음 QIAquickTM겔 익스트렉션 키트 (미국 캘리포니아 채츠워드 소재의 퀴아겐에서 구입)를 사용하여 겔 정제한다. 겔 분리된 PCR 산물을 pAMG11 내에 결합시켜 FM15 E.coli 세포내로 형질전환시킨다.
5' OLIGO#13 : (서열 : 80)
5'-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
3' OLIGO#14 : (서열 : 81)
5'-CCCAAGCTTTTAGGTGCACACGGTGTTCTGTTT'-3'
이 단백질은 10 mM 소디움 포스페이트, pH 6.5 및 20 mM NaCl 내에 제형화시킨다.
(iv). sTNFR-I 3D/C105 (sTNFR-I 4D/C105 의 c - 말단 34 아미노산 절단) 는, 주형으로서 sTNFR-I 4D/C105 를 사용하는 것을 제외하고는, sTNFR-I 3D/N105 와 실질적으로 동일하게 제조한다. sTNFR-I 3D/C105 는 PBS, pH 6.5 (10 mM 소디움 포스페이트, 35 - 100 mM NaCl) 나 아니면 20 mM 아세테이트, 100 mM NaCl, pH 5.0 내에 제형화시킨다.
(v). sTNFR-I 3D/C105db 는, 출발물질로서 sTNFR-I 4D/C105 대신 sTNFR-I 3D/C105 를 사용하는 것을 제외하고는, sTNFR-I 4D/C105db 와 실질적으로 동일하게 제조한다. sTNFR-I 3D/C105db 는 PBS, pH 6.5 (10 mM 소디움 포스페이트, 35 - 100 mM NaCl) 나 아니면 20 mM 아세테이트, 100 mM NaCl, pH 5.0 내에 제형화시킨다.
실시예 Ⅱ
다양한 형태의 절단된, 재조합 가용성 TNFR-I 을 TNF 활성도를 저해시키는 그들의 능력에 대해 평가한다.
A. WEHI 세포독성 검정 :
WEHI 검정은 시험관내 세포증식 검정이다 [Edwards et al. (1991), Endocrinology. 128 : 989 - 996]. 이 세포주는 TNF-α 에 감수성이다 ( 즉, TNF-α 세포독성이다). TNF-α 저해제의 존재하에서, 이 세포는 세포독성 효과로 부터 보호되므로 증식될 수 있다.
프로토콜 :
TNF-감수성 WEHI 164 클론 13 세포 (미국 버지니아 20110 - 2209 매너사스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 ATCC 에서 입수, ATCC 번호 제 CRL - 1751 호) 를, 5 % 우태아 혈청 (미국 유타 오그덴 소재의 하이클론에서 구입) 과 페니실린 50 u/mL : 스트렙토마이신 50 mg/mL 를 보충한 RPMI (미국 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재의 집코에서 구입) 배지내에 20 X 104세포/mL 의 농도로 현탁한다. 이 세포 현탁액 100 마이크로리터를 평평한 바닥의 96 - 세포 미량역가 평판의 각 웰에 옮기고, 이 세포를 5 % C02, 37 ℃ 에서 4 - 6 시간 점착시킨다. 각 웰에 0.0060 mg/mL 액티노마이신 - D (미국 미주리 세인트 루이스 소재의 시그마 케미컬 캄파니에서 구입) 10 μL 를 가한다. 50 ng/mL 의 재조합 인체 TNFα (5 ng/ml 최종농도) 10 마이크로리터를 각 웰에 가한다. 계열희석된 2 - 배 농도의 다양한 sTNFR 형태 (sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 4D/C105 및 sTNFR-I 4D/C105db) 를 PBS 희석한 다음 재조합 인체 TNF-α 부가 후 점착된 WEHI 164 세포를 함유하는 이중 웰 (duplicate well) 에 가한다 (10 μL/웰). WEHI-164 클론 13 세포를 5 % CO2, 37 ℃ 에서 18 시간 동안 배양한다. 배양 후, 2 mg/mL 용액의 유기 염료 MTT 테트라졸리움 (3-[4,5-디메틸티오졸-2-일]-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드 ; 미국 미주리 세인트 루이스 소재의 시그마 케미컬 캄파니에서 구입) 10 mL 를 가하여, 세포를 4 - 6 시간 더 배양한다. 50 μL DMF/SDS 용액을 가하여 세포를 가용화한다 (20 % SDS 및 50 % N, N 디메틸포름아미드, pH 4.7). MTT 결정이 모두 용해될 때까지 DMF/SDS 용액을 수회 상하로 피펫으로 옮긴 다음 2 - 22 시간 더 세포를 배양한다. 570 의 Vmax 판독기를 이용하여 흡광도 (abs) 를 읽는다. 특이 세포독성 백분율은 다음 식을 사용하여 광학밀도로 부터 계산한다 : % 특이 세포독성 = 100 % X [abs (세포 + 배지) - abs (세포 + 시료)]/abs (세포 + 배지) - abs (세포 + TX-100)]. 각 시료내 TNF 단위 수는 이미 기술한 바와 같이, 쥐 표준의 백분율 특이 독성을 이용하여 결정한다.
WEHI 검정 결과는 표 2 에 하기되어 있다 :
WEHI 검정시 시험관내 활성도
화합물 IC50 (ng/mL)
sTNFR-I2.6D/C106 208
sTNFR-I4D/C105 238
sTNFR-I4D/C105db 비측정
WEHI 검정 결과를 기초로 하면, 시험관내 생체효능 (bioefficacy) 면에서 sTNFR-I 2.6D/C106 과 sTNFR-I 4D/C105 사이에 유의차는 없다.
B. L929 세포독성 검정 :
L929 세포독성 검정은 TNF-α-감수성 사멸의 세포독성을 평가하는 시험관내 세포 증식 [Parmely et al. (1993), J. Immunol., 151 : 389 - 396 참조] 이다. 이 세포주는 TNF-α 에 감수성이다 (즉, TNF-α 는 세포독성이다). 가용성 TNF-α 저해제의 존재하에서, 이 세포는 세포독성 효과로 부터 보호되므로 증식될 수 있다.
프로토콜 :
L929 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (카탈로그 번호 제 CCL 1 호, NCTC 클론 929, 마우스 결합조직 균주 L 의 클론)으로 부터 입수한다. 신장 (propagation) 용으로 사용된 배지는 10 % FBS + 1 % L - 글루타민 용액 + 1 % 페니실린 - 스트렙토마이신 용액을 보충한 RPMI 배지 1640 이다.
이 검정에는 96 - 웰 미량역가 평판 (코닝에서 구입) 을 사용하는 데 단지 내부 60 웰을 이용한다. 표준 및 시험 시료는 동일 평판을 3 중으로 시험한다.
이 검정에 사용한 TNFα 은 알 앤드 디 시스템즈 (미국 미네소타 미니애폴리스 소재) 로 부터 입수한 것이다. 이 검정에 사용된 TNFα 의 최종 농도는 모든 검정 웰이 1 ng/mL 이다.
검정 희석제는 L929 성장 배지, 10 ng/mL 의 TNFα 및 10 μg/mL 의 액티노마이신 D (미국 미주리 세인트 루이스 소재의 시그마 케미컬 캄파니에서 구입) 이다.
XTT/MEN 용액 (1.5 mg/mL XTT + 75 mM MEN) 을 사용하여 평판을 수확한다.
1 일 째에, 검정 평판에 세포를 평판화한다. 세포를 트립신처리하여 3.33 X 104세포/mL 로 재현탁함으로써 세포 현탁액을 제조한다. 이 세포 현탁액 180 mL 를 검정 평판의 내부 60 웰 각각내에 평판화한다. 검정시 인위적인 증발을 피하는 데 도움을 주기 위해 200 mL 의 성장배지를 외부 36 웰내에 분배한다. 평판을 실온에 두고, 약 1 시간 동안 옮김없이 박으로 덮어 둔다. 검정 평판을 37 ± 2 ℃ 고습도 5 ± 1 % CO2배양기로 옮긴다. sTNFR-I 계열 희석물을 부가하기 전에 약 20 - 22 시간 동안 평판을 배양한다.
2 일 째에, sTNFR-I 4D/C105 표준과 시험 시료를 다음과 같이 제조한다 : sTNFR-I 4D/N105 표준과 시험 시료를 약 2.0 mg/mL 농도로 (또는 다른 적합한 농도) 희석한다. 0 ng/mL (단지 검정 희석제) 포인트를 포함하는, 약 1.0 X 106ng/mL 내지 1.0 X 10-3ng/mL 범위의 10 - 포인트 희석곡선을 만들기 위해 상기 농도의 계열 희석물을 만든다. 다른 농도가 적당하다면, 그것을 사용할 수도 있다. 각 검정 평판에 3 중으로 각 희석물 1000 μL 를 가한다. 이 검정 평판으로 계열 희석물 분취량을 옮긴 후 20 ± 1 시간 동안 37 ℃ ± 2 ℃ 고습도 5 ± 1 % CO2배양기에서 평판을 배양한다.
3 일째에, 50 μL/웰의 XTT/MEN 용액을 검정 평판의 내부 60 웰에 가한다. 37 ℃ ± 2 ℃ 고습도 5 ± 1 % CO2배양기 (미국 뉴욕 뉴욕에 소재하는 팔콘에서 구입) 에서 24 ± 0.5 시간 동안 평판을 배양한다.
4 일째에, ELISA 평판 리더 (SpectraMAX, 미국 캘리포니아 풀러톤 소재의 베크만 인스트루먼츠, 인코포레이티드에서 구입) 의 450 nm - 650 nm 에서 검정 평판을 읽는다. 이들 파장에서 평판내 웰이 4.000 0D 값을 얻는다면, 즉시 490 nm - 650 nm 에서 평판을 다시읽어야 하며, 이 490 nm - 650 nm 데이터를 계산시 사용해야 한다.
4 개의 변수 로지스틱 곡선 피트 (logistic curve fit) 를 이용하여 표준 투여량 - 반응 고선 대 로그 (log) 를 만든다. 미지 시료의 본래 농도 계산은 표준 곡선으로 부터 계산하고 표준에 대한 ED50과 표준 곡선 피트에 대한 상호 공동계수를 계산한다.
결과 :
L929 세포독성 검정 결과는 하기 표 3 에 나타나 있다 :
L929 세포독성 검정시 시험관내 활성도
화합물 농도 (mg/mL) ED50(ng/mL)
sTNFR-I 4D/C105db 7.8 1.0 ± 0.1
sTNFR-I 2.6D/C105db 2.6 1.1 ± 0.0
sTNFR-I 2.6D/C106db 2.2 1.0 ± 0.1
sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa) 2.0 229.2 ± 8
sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa) 1.1 325.5 ± 147
sTNFR-I 2.6D/C105-t-BuPEG(33kDa) 1.7 210.2 ± 147
국내표준:sTNFR-I 4D/C105 3.5 314.8 ± 188.1
이 데이터는 sTNFR-I 4D/C105db 와 sTNFR-I 2.6D/C105db 및 sTNFR-I 2.6D/C106db 가 활성이며 표준과 비교했을 때 유사한 투여량 반응을 갖는다는 것을 나타낸다. 또한 이 데이터는 sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33 kDa) 및 sTNFR-I 2.6D/C105-t-BuPEG (33 kDa) 가, sTNFR-I 4D/C105db 와 비교했을 때 활성도에서 거의 2 로그 더 낮음에도 불구하고, 이 검정에서 활성임을 나타낸다.
런 #2:
sTNFR-I 3D/C105db 0.2 2.27±0.3
sTNFR-I 3D/C105db 0.2 2.0*
sTNFR-I 3D/C105db 1.9 1.8*
sTNFR-I 3D/N105 2.4 413.3*
국내표준sTNFR-I 4D/C105 3.5 115.9±42.1
* 단일 데이터 포인트
이들 데이터는 sTNFR-I 3D/C105db 가 활성이며 ED50값은 sTNFR-I 4D/C105db(런 #1), sTNFR-I 2.6D/C105db(런 #1) 및 sTNFR-I 2.6D/C106db(런 #1)의 범위내 임을 나타낸다. 또한 이 데이터는 sTNFR-I 3D/N105 가 sTNFR-I 4D/C105 국내 표준보다 덜 활성임을 나타낸다.
C. 연쇄상구균 세포벽 유도 재활성화 모델 :
랫 검정에서 연쇄상구균 세포벽 유도 관절염 재활성화 모델은 공지되어 있는 프로토콜[Esser et al.(1985), Arthritis And Rheumatism, 28 : 1402 - 1411 and Makarov et al.(1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 : 402 - 406 참조]을 이용하여 수행한다.
프로토콜 :
각각 체중이 175 내지 185 그람인 암컷 루이스 랫(미국 메사츄세츠 윌밍톤 소재의 챨스 리버 라보라토리스, 인코포레이티드에서 구입)에게, 펩티도글리칸 - 폴리사카라이드를 함유하는 연쇄상구균 세포벽 산물(SCW)(미국 조지아 그레이손 소재의 리 라보라토리에서 구입)의 무균 현탁액을 관절당 1.5 mg/10 mg 의 투여량으로 오른쪽 발목 관절에 관절내 주사한다. 대측 관절내에 식염수를 주사하여 대조를 만든다. SCW 의 관절내 주사는 주사 후 1 - 2 일 째에 피크가 나타나며 관절이 팽화하면서 비교적 짧은 기간동안 급성 관절염이 유발된다. 12 일 후, 급성 염증반응이 소멸되는 중에, 랫 당 200 mg/ 200 mL 의 투여량으로 SCW 를 다시 정맥내 주사함으로써 투여한다. 두 번째 SCW 투여량은 미리 SCW 를 주사한 발목 관절의 염증을 재활성화시키기에 충분하며 식염수 - 주사 발목에는 거의 효과를 나타내지 않는다. SCW 의 정맥내 주사후 72 - 시간의 기간중에 염증의 정도를 평가하기 위해, 관절염의 재활성화 후 0, 24, 36, 48 및 72 시간 째에 뒷쪽 발목의 발목 칼리퍼스 측정치에 의해 발목 관절의 디멘션(dimension)을 측정한 다음 조직학(예를들어, 염증, 판누스 형성, 연골 손상 및 뇌손상)용으로 대측성의 뒤쪽 사지를 수확한다.
결과 :
관절염의 재활성화 중에 관절이 팽화되는 현상에 대해 sTNFR-I 2.6D/C106db 투여 효과를 시험한다. SCW 로 재활성화시키기 24 시간 전에 저해제 및 운반체 각각을 단일 정맥내 주사하여 투여한다.
재활성화 후 2 및 3 일 째에 4 투여량 모두 및 1 일 째에 한 투여량(1.5 mg/kg)을 제외한 모두에서 sTNFR-I 2.6D/C106db 가 관절 팽화를 감소시키는데 통계적으로 유의한 효능을 나타낸다는 것이 분산 분석(ANOVA) 피셔의 포스트 - 혹 검정(Statview ) 에 의해 입증된다. 이와 같은 팽화의 감소는, 전 - 재활성화 1 일 내지 후 - 재활성화 3 일에 시작하여 매일 0.5 mg/kg 을 투여한(즉 ; 8.8 nM) sTNFR-I 4D/C105db 의 양성대조에 필적한다. 또한 sTNFRs 는 팽화량을 전체 3 일 동안 고려할 때 상당한 효능을 보여준다. 곡선하 면적(AUC)은 모든 투여량에서 투여량 - 반응 관계를 나타낸다(도 9 참조, 여기서 sTNFR-I 2.6D/C106db 는 "sTNFR-I 2.6D" 라고 명명하고, sTNFR-I 4D/C105db 는 "sTNFR-I 4D" 라고 명명함).
sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa)는 이 모델의 질병 대조군과 비교했을때 발목 폭 및 조직학적 지수가 상당히 감소하였음을 나타낸다.
D. D - 갈락토사민/리포폴리사카라이드 모델 :
D - 갈락토사민(D-GalNH2)/리포폴리사카라이드(LPS) 모델[Parmely 등의 (1993), 상기문헌 참조]은 치사율을 갖는 생체내, 고 TNF--의존성 동물 모델이다. 부가적으로, MRL-lpr/lpr 자가면역 마우스는 LPS- 또는 SEB- 유도된 TNF-에 매우 감수성임을 나타냈다[Mountz et al.(1995), J. Immunol., 155 : 4829 - 4837 참조].
프로토콜 :
6 - 8 주된 암컷 MRL-lpr/lpr 마우스(미국 메인 바 하버 소재의 잭슨 라보라토리에서 입수)를 밤새 단식시킨 후, 다음의 약리학적 시약으로 I.P. 항원투여한다 : 행크스 밸런시드 솔트 솔루션(Hank's Balanced Salt Solution)(미국 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재의 깁코 라보라토리스, 인코포레이티드에서 구입)내에 현탁된 25 ㎎ 의 D - GalNH2(미국 미주리 세인트 루이스 소재의 시그마 케미컬 캄파니에서 구입)(50 ㎎/mL) ; 및 무균의, 무내독소 인산염 완충 식염수(PBS)내의 E. coli 세로타입 0127 : B8(미국 미주리 세인트 루이스 소재의 시그마 케미컬 캄파니에서 구입)(25 ㎎/마우스) 또는 보통 식염수내의 SEB(미국 플로리다 사라소타 소재의 톡신 테크놀로지스에서 구입)(50 ㎎/마우스)로 부터의 리포폴리사카라이드(LPS). 매킨토시용 통계 소프트웨어(Statview, 미국 캘리포니아 마우튼 뷰에서 구입)로 작성된 ED50곡선을 획득하기 위해 다양한 형태의 sTNFR 을 무균의 2 배 희석물(mg/kg 투여량)로 만든다. 치사율은 항원투여 후 +48 시간에 이른다.
결과 :
하기 표 4 에 나타나 있는 바와 같이, sTNFR-I 2.6D/C106db 를 상기한 바와 같이 LPS/DGalNH2항원투여 1 시간 전에 투여하면 48 시간에서 ED50(즉, 50 % 보호를 위해 필요한 sTNFR-I 2.6D/C106db 의 투여량)은 ~ 50 ㎍/kg 이다(N = 8 마리 마우스). sTNFR-I 4D/C105db 와 비교하면, 이 형태의 치사율 예방 능력에 있어 유의(P > 0.05)차는 없다(ED50= ~ 50 ㎍/kg ; N = 8 마리 마우스).
LPS/D-GalNH2모델에 있어 sTNFR 및 최적의 절단된 sTNFR 의 비교
제제 ED100 ED50
sTNFR-I 4D/C105db ~ 100 ㎍/kg ~ 50 ㎍/kg
sTNFR-I 2.6D/C106db ~ 100 ㎍/kg ~ 50 ㎍/kg
sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) ~ 2 mg/kg ~ 400 ㎍/kg
sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(20kda) ~ 800 - 1000 ㎍/kg ~ 1 mg/kg
sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(20kda 분지됨) 2 mg/kg ~ 1 - 1.5 mg/kg
sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(40kda 분지됨) 1.5 mg/kg ~ 1 mg/kg
이 데이터는 sTNFR-I 2.6D/C106db 가 sTNFR-I 4D/C105db 와 비교할 때 동등한 활성도를 갖지만, sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa)는 ~ 400 ㎍/kg 의 ED50(n = 5 마리 마우스)을 갖는 이 모델보다 덜 활성임을 나타낸다. 부가적으로, sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(20 kDa 분지됨)와 2.6D/N105-MePEG(40 kDa 분지됨)의 활성도는 이 모델보다 덜 활성이다.
E. 보조제 유도된 관절염 모델 :
보조제로 랫에 유도시킨 류마티스양 관절염은 인체 류마티스양 관절염과 매우 유사하다. 이 실험의 목적은 절단된 sTNFRs 의 전신 투여가 마우스의 보조제 - 유도된 관절염 병인론에 완화 효과를 나타낸다는 것을 입증하기 위한 것이다.
프로토콜 :
체중이 최소한 200 g 인 수컷 루이스 랫(5 - 7 마리/군)(미국 메사츄세츠 윌밍톤 소재의 찰스 리버 라보라토리스, 인코포레이티드에서 입수)에 SQ 카테터와 함께 캐뉼라삽입하고 수일 동안 회복되도록 한다. 그런 다음 주입 우리에 두고 식염수 주입을 개시하기 전 일주일 동안 순응시킨다.
0 일 째에, 합성 보조제, N, N - 디옥틸데실데실 - N', N - 비스(2 - 히드록시 - 에틸)프로판디아민, 50 mg/ml 를 부가한 100 ㎕ 의 프로인트 완전 보조제(미국 미주리 세인트 루이스 소재의 시그마 케미컬 캄파니에서 구입)를 모든 랫에 주사한다. 8 일 째에, 다른 군의 랫에 sTNFR-I 4D/C105 및 sTNFR-I 2.6D/N105 를 연속 SQ 주입함으로써 투여한다.
결과는 표 5 에 나타나 있다.
보조제 유도성 관절염
화합물 투여량(mg/kg/hr) AUC%(% 저해율) 발 중량(% 저해율) 염증조직병리학(% 저해율) 골흡수조직병리학(% 저해율)
연구 #1sTNFR-I 4D/C105 510.2 614933 464540 372614 8985534
sTNFR-I 2.6D/N105 1 55 53 33 51
연구 #2sTNFR-I 2.6D/N105 51 4238 비측정비측정 1913 6749
연구 #3sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(20kda) 931 503536 403430 1390 27220
sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kda) 931 433824 373320
놀랍게도, sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) 및 sTNFR-I 4D/C105db 는 루이스 랫의 보조제 관절염에서 유사한 항 - 관절 활성도를 갖지만, sTNFR-I 4D/C105db 는 WEHI-164 및 L929 시험관 내 세포독성 검정 뿐만 아니라 LPS/GalN 모델에서 더 유력하다.
F. 콜라겐 유도성 관절염 모델 :
랫의 제 2 형 콜라겐 - 유도성 관절염이 인체 류마티스양 관절염과 매우 유사하다. 이 실험의 목적은 절단된 sTNFRs 의 전신 투여가 랫 및 마우스의 제 2 형 콜라겐 - 유도성 관절염 병인론에 완화 효과를 나타낸다는 것을 입증하기 위한 것이다.
랫 프로토콜 :
암컷 루이스 랫(미국 메사츄세츠 윌밍톤 소재의 찰스 리버 라보라토리스, 인코포레이티드에서 구입)에 SQ 캐뉼라를 삽입한 다음 연속 주입을 위해 밧줄로 매어두어 순응시킨다. 이어서 프로인트 불완전 보조제내의 소 제 2 형 콜라겐으로 면역시킨다. 면역화 후 13, 14 또는 15 일 째에, 관절염이 발생된 동물을 한 군당 8 마리 씩 다시 나눈다. 표 6 에 기재된 바와 같이 7 일간 운반체 또는 여러 투여량의 sTNFR-I 을 실험군에 주입한다. 발목 관절을 매일 칼리퍼스 측정함으로써 발 염증을 평가한다. 7 일 째에, 동물을 안락사시키고 염증 지수와 같은 중량 측정을 위해 발들을 모은다. 관절염 변수의 조직병리학적 평가를 위해 발목 및 무릎 관절을 모은다.
이 결과는 표 6A 에 나타나 있다.
콜라겐 유도성 관절염
화합물 투여량(mg/kg/hr) AUC%(% 저해율) 발 중량(% 저해율) 염증조직병리학(% 저해율) 골흡수조직병리학(% 저해율)
연구 #1sTNFR-I 4D/C105 510.2 653519 813422 비측정비측정비측정 비측정비측정비측정
sTNFR-I 2.6D/N105 1 39 41 비측정 비측정
연구 #2sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kDa) (mg/kg/day)3 50 60 76 46
sTNFR-I 4D/N105-MePEG(33kDa) 3 47 50 비측정 비측정
연구 #3sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kDa) (mg/kg/day)9 25 44 비측정 비측정
sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kDa) 3 25 37 비측정 비측정
sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(20kDa) 9 35 52 비측정 비측정
sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(20kDa) 3 35 37 비측정 비측정
흥미있게도, 콜라겐 확립된 랫 모델의 모든 처리군은 거의 동일한 효능을 갖는다[예를들어, 곡선 모양, 30 - 59 % 범위의 곡선하 면적(AUC)의 저해율(%), 및 40 - 64 % 범위의 발 중량 저해율(%)]. 비처리군은 관절염이 있는 이 모델의 어떠한 다른 모델과도 통계학적으로 다르다.
마우스 프로토콜 :
수컷 DBA/1(미국 메인 바 하버 소재의 잭슨 라보라토리스, 인코포레이티드에서 입수)를 프로인트 불완전 보조제내의 소의 제 2 형 콜라겐(미국 미주리 세인트 루이스 소재의 시그마 케미컬 캄파니에서 구입)으로 면역시킨다. 면역화 후, 24, 25 및 26 일 째에, 관절염이 발생된 동물을 한 군당 8 마리씩 다시 나눈다. 실험군에는, 식염수나 아니면 sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33 kDa)를 3 일간 연속적으로(+27 일, +28 일, +29 일) IP 경로로써 매일 2 회 투여한다. 발목 관절을 매일 칼리퍼스 측정하여 발 염증을 평가한다. +34 일 째에, 동물을 안락사시킨 다음 염증 지수와 같은 중량 측정을 위해 발을 모은다. 관절염 변수의 조직병리학적 평가를 위해 발목 및 무릎 관절을 모은다.
결과는 표 6B 에 나타나 있다.
콜라겐 유도성 관절염
화합물 투여량(mg/kg/2D) AUC %(% 저해율) 총 조직병리학(% 저해율)
연구 #1sTNFR-I 4D/C105db 3 49 39
sTNFR- 4D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3 63 55
연구 #2sTNFR-I 4D/N105-MePEG(33kDa) 9 73 비측정
sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kDa) 3 75 비측정
G. 연속 주입 랫 모델의 LPS - 유도된 TNF-α 생성 :
sTNFR-I 2.6D/C105db 및 sTNFR-I 2.6D/C106db, sTNFR-I 2.6D/N105 및 sTNFR-I 4D/N105 를 제조자의 지시에 따라, 48 - 시간 동안 연속 주입으로(1 mg/kg) AlzetTM미니 - 펌프(미국 캘리포니아 팔로 알토 소재의 알자 코포레이션에서 구입)를 이용하여 경정맥내 이식한다. ELISA(미국 메사츄세츠 캠브리지 소재의 겐자임에서 구입)로써 측정된, 혈청 TNF-α 수준은 고투여량 LPS 항원투여 후 +2 시간 째에 대조에 비해 상당히 감소한다.
실시예 Ⅲ : 면역원성 연구
여러 동물 모델에서, 다양한 형태의 절단된, 재조합 가용성 TNFR-I 을 면역원성에 대해 평가한다.
A. 설치동물 :
실험 1 일 및 5 일 째에 암컷 스프래그 돌레이 랫(미국 메샤츄세츠 윌밍톤 소재의 찰스 리버스 라보라토리스에서 수득)(n = 6 - 8/군)에 sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) 및 sTNFR-I 4D/C105db(대조)를 피하투여한다(4 mg/kg). 초기 투여 후 21 일 째에 안와후(retro-orbital) 혈액 시료를 매주 모아, 시료를 IgM 및 IgG 항체 생성에 대해 평가한다.
설치동물 면역원성
시간 [일] 0.01 7 14 21
군 + 동물 # 역가 IgM 역가 IgM 역가 IgM 역가 IgM
sTNFR-I 2.6D/N105-33kdaPEG
1 NEG 0 0 0
2 NEG 0 0 0
3 NEG 0 0 0
4 NEG 0 0 0
6 NEG 0 0 0
sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) 0 0.00 0.00 0.00
SEM 0 0.00 0.00 0.00
대조
7 0 0 50 0
8 0 0 50 0
3 0 0 100 0
9 0 0 0 0
10 0 0 100 50
11 0 0 100 0
12 0 0 100 0
13 0 0 0 0
대조 0 0 62.5 6.3
SEM 0 0 15.7 6.3
시간 [일] 0.01 7 14 21
군 + 동물 # 역가 IgG 역가 IgG 역가 IgG 역가 IgG
sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)
1 NEG NEG 0 0
2 NEG NEG 0 0
3 NEG NEG 0 0
4 NEG NEG 0 0
6 NEG NEG 0 0
sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) 0.00 0.00 0.00 0.00
SEM 0.00 0.00 0.00 0.00
대조
7 NEG NEG 0 200
8 NEG NEG 0 200
9 NEG NEG 0 0
10 NEG NEG0 0
11 NEG NEG 200 400
12 NEG NEG 0 200
13 NEG NGE 200 800
14 NEG NEG 0 50
대조 0 0 50 231.3
SEM 0 0 32.7 4.0
표 7 에 나타나 바와 같이, +1 일 및 +5 일 째에 피하투여된(SC) sTNFR-I 4D/C105db 는, sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa)가 만일 있다면, 매우 약한 항체역가를 갖는 것 보다 +21 일 내내 더 높은 랫 항-sTNFR-I IgG 항체역가를 갖는다. +21 일 내내 랫 항 - sTNFR-I IgM 항체를 나타내는 랫에서도 유사한 면역원성 경향이 관찰된다. sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa)는 +21 일 내내 랫 항 - sTNFR-I IgM 항체를 생성하지 않는다.
B. 파피오 아누비스(Papio anubis) :
1 부, A 상 연구의 목적은, 21 일 간 별개로 건강한 비비(baboon)에 2 회 IV 투여할 때, sTNFR-I 3D/C105db(0.2 mg/kg BW) 나 아니면 sTNFR-I 2.6D/C105db(0.2 mg/kg BW) 각각의 약력학 및 면역원성을 측정하기 위한 것이다.
1 부(Part 1) 연구는 2 개의 상(Phase)으로 나눈다. 1 부, A 상은 두 주사에 반응하는 건강한 비비의 다른 sTNFR-I 구성물의 약력학 및 면역원성을 결정하기 위한 것이다. 12 마리의 비비를 세 군으로 다시 나눈다. 마취시킨 동안, 각 군에게 sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 3D/C105db 또는 sTNFR-I 2.6D/C105db 중 하나를 0.2 mg/kg BW 로 주입한다.
세 비비군을 각각에 대해 연구한다. 21 일 후에 이 동물에게 단백질을 두 번째로 동일하게 IV 주사하고 21 일간 더 연구한다. 그 후 간격을 두고 약력학 및 면역원성을 측정한다.
1 부, B 상 연구는 TNFα - 매개 치사율(Espat et al., J. Surg. Reg., 59 : 153 - 158, 1995 참조)을 갖는 잘 확립된 모델에서 이들 제제의 효능을 평가하기 위한 것이다. 5 - 10 × 1010cfu/kg 의 살아있는 E. coli 를 투여하여, 4 군 16 마리 동물에게 치명적인 E. coli 균혈증을 유도시킨다. 위약 군은, sTNFR-I 4D/C105db(0.2 mg/kg 체중[BW]), sTNFR-I 3D/C105db(0.2 mg/kg BW) 또는 sTNFR-I 2.6D/C105db 중 하나를 1 mg/kg BW 투여하여 IV 전치료한 비비와 비교한다.
1 부 연구 중 두 상에 있어, 어린 수컷 및 암컷 비비 파피오 아누비스(6 - 11 kg)(미국 텍사스 샌 안토니오 소재의 바이오메디컬 리서치 파운데이션에서 수득)를 밤새 단식시킨다. 동물을 케타민(10 mg/kg i.m.)으로 마취시키고 두부 정맥(cephalic vein)을 피부를 통해 캐뉼라 삽입시킨다. 35 mg/kg 까지의 소디움 펜토바르비탈을 초기 투여하여 마취를 유지시킨 다음 3 - 5 mg/kg/hr 의 소디움 펜토바르비탈을 반복 주사한다. 수구양연형성된 기관내 튜브를 위치시켜서 상기도(upper airway)를 안전하게 하여 동물이 자발적으로 호흡하도록 유지한다. 전신 동맥혈을 반복 샘플링하고 데이터스코프 2000 마취 모니터(미국 텍사스 샌 안토니오 소재의 데이터스코프에서 구입) 심장 모니터를 통해 심박수 및 평균 동맥혈압을 연속 모니터한 대퇴골 동맥내에 피부를 통해 카테터를 위치시킨다. 간헐적으로 동맥혈 시료를 모아 EDTA 나 헤파린으로 항 - 응고시키고 드로잉(drawing) 후 즉시 얼음에 식힌다.
4 ℃ 에서 원심분리하여 혈장 분획을 분리하고 검정할 때까지 - 70 ℃ 에 저장한다. 직장 소식자를 통해 중핵(core) 온도를 모니터한다. 요를 모으고 요 유출 및 크레아티닌 청소율을 모니터하기 위해 내재성 요 폴리 - 형 카테터를 위치시킨다. 15 분 마다 혈류역학 변수를 모니터한다. 모든 동물에게 정맥내 유체 유지물로서 0.9 % 염화나트륨(4 ml/kg)을 주입한다. B 상 연구에 있어, 다음의 생리학적 기준 중 두 가지가 부합된다면 동물에게 부가 유체(15 분 마다 10 mg/kg)를 주입한다 :
1) 30 % 이상 까지 평균 동맥혈압이 떨어짐 ; 2) 심박수가 30 % 이상 까지 증가함 및 3) 요 유출이 < 1 ml/kg/hr 까지 떨어짐. 기준선 시료를 샘플링하고 평형화되도록 최소한 1 시간 기다린 후에 단백질 주입을 시작한다.
1 부 A 상 세트의 연구에 있어, 재조합 단백질을 두부 정맥을 통해 주입한 다음, 모든 카테터를 제거한 후 8 시간 동안 동물을 관찰한 다음 21 일간 그들의 우리로 되돌려 보낸다. 24 및 48 시간 및 3, 5, 8, 11, 16 및 21 일 째에, IM 케타민(10 mg/kg)으로 동물을 간단히 마취시키고 정맥혈 시료를 수득한다. 21 일 째에, 동물을 재마취시키고, 단백질을 두 번째 주입한 다음 0 일 째에 수행된 전 과정을 21 일간 더 반복하는 데, 이때에 동물은 안락사시킨다.
1 부 B 상 연구에 있어, E. coli 주입 1 시간 전에, 위약이나 아니면 이미 언급한 구성물 중 하나를 주입하기 전에 4 마리의 동물을 무작위로 나눈다. 모든 카테터를 제거한 후 8 시간 동안 동물을 관찰한 다음, 그 동물을 다시 우리로 돌려 보내고 이어서 치사, 즉 균혈증에 대해 생존하는 동물을 관찰한다. 지나치게 불안한 동물은 안락사시킨다. 지나치게 불안함은 다음과 같이 IACUC 에 의해 정의된 바와 같다 : 1) 사전 12 시간 동안 앉아 있거나 똑바로 서 있지 못함, 2) 사전 12 시간 이내에 먹이나 물을 섭취하지 못함, 3) 카테터 부위에서 제어 불가능한 출혈이 발생, 또는 4) 외부 자극에 대한 무반응.
-1, 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 24 시간, 48 시간, 및 3, 5, 8, 11, 16 및 21 일 째에 정맥혈 시료를 수득한다.
21 일 째에, 살아있는 동물을 안락사시킨다.
투여된 재조합 단백질에 대한 파피오 항체의 존재는 샌드위치 ELISA 로써 측정한다. 매우 간단히 설명하면, sTNFR-I 구성을 ELISA 평판에 피복시키고(1 ㎍/ml) 희석된 비비(1 : 50 내지 1 : 100,000) 혈장(100 ㎕)을 가한다. 시료를 세척한 후, 호스 래디시퍼옥시다제(HRP) 결합된 단백질 A 를 가하고(0.5 ㎍/ml) 검정을 TMB 로 가시화시킨다.
결과(I 부) :
세 구성물 간에 혈장 반감기는 상당히 다르다. 모델 - 독립 방법을 이용하여 소멸 곡선을 측정하며 분명한 반감기는 일반적으로 8 내지 172 시간에서 평가된다. 원시 동물에 있어, 혈장 반감기는 4.0 도메인 구성물로 처리한 비비에서 가장 길며(29 시간) sTNFR-I 3D/C105db(24.7 시간) 및 sTNFR-I 2.6D/C105db(21.5 시간)로 처리한 비비에서는 연속적으로 감소한다. 통계학적 유의차는 단지 26 % 이다.
뜻밖에, 각 비비에 단백질을 제 2 투여한 후에 혈장 반감기는 훨씬 더 짧아지는 경향을 보였는 데, 이것은 보다 급속한 청소율을 나타내는 것이다. 이와 같은 반감기 감소는, 그것이 48 % 까지 단축될 경우(P < 0.01) sTNFR-I 4D/C105db 를 주입시킨 비비에서 가장 우세하다[도 10]. 반감기 감소는 sTNFR-I 3D/C105db(31 %)로 처리한 비비에서는 중간정도이며[도 11] sTNFR-I 2.6D/C105db(14 %)로 처리한 동물에서 가장 적었다[도 12]. sTNFR-I 2.6D/C105db 로 처리한 비비에서는 반감기 감소가 통계학적으로 다르지 않다.
모든 제제는 비비에 면역원성이다. 그러나, 면역원성 빈도는 sTNFR-I 4D/C105db 로 처리한 비비에서 최대이고, sTNFR-I 3D/C105db 로 처리한 동물에서 중간정도이며, sTNFR-I 2.6D/C105db 를 주입한 동물에서는 최저이다(표 8).
피크 항체 반응1
첫 번째 21 일 두 번째 21 일
중간치 25 % - 75 % 중간치 25 % - 75 %
sTNFR-I4D/C105db (n = 4) 3.20 3.20 3.20 3.95 3.50 4.40
sTNFR-I3D/C105db (n = 4) 1.60 0.00 3.65 3.50 1.30 4.75
sTNFR-I2.6D/C105db (n = 4) 0.00* 0.00 1.75 1.45 0.00 3.50
1대수 계산자(샌드위치 ELISA 에 대한 ½ - 최대 흡광도를 나타내는 데필요한 혈장의 역희석 ; Experimental Methods 참조)*p = 0.056, 크루스칼 - 월리스 2 중 ANOVA 에 의함(로그 변환값이 실패한 정규성 시험)
일반적으로 항체 반응은 구성물 투여 후 약 8 일 째에 나타나며 21 일의 연구기간 내내 존재한다. 더욱이, 항체 반응은 단백질 구성물의 두 번째 주사에 대한 반응 중에 더 강하게 되는 경향이 있다.
sTNFR-I 4D/C105db 를 주입한 4 마리 비비 모두, sTNFR-I 3D/C105db 를 주입한 동물 4 마리 중 2 마리 및 sTNFR-I 2.6D/C105db 를 주입한 비비 4 마리 중 1 마리가 항체를 발생한다. 크루스칼 - 월리스 ANOVA 에 의해, 항체반응(로그 변환됨)의 크기는 시간 함수에 따라 세 군 사이에 상당히 다르다(p < 0.05). 포스트 - 혹(Post - hoc) 분석은, 항체 반응의 유의차가 sTNFR-I 4D/C105db 및 sTNFR-I 2.6D/C105db 를 주입한 동물들 간에서 일반적이며, sTNFR-I 3D/C105db 로 처리한 동물에서는 중간정도(및 비유의) 반응임을 암시한다.
두 21 일 연구(p < 0.01) 간에 항체 생성 및 청소율 변화 사이의 상호관계를 관찰한다. 뜻밖에, 이들 동물은 구성물의 첫 번째 투여 후 강한 항체 반응을 나타내지 않으며, 단백질은 두 번째 투여 후 신속히 더 청소된다. 첫 번째 및 두 번째 주사 간의 청소율 변화는 항체 반응을 나타내는 동물(n = 7)과 나타내지 않는 동물(n = 5)간을 비교한다[도 13].
비비의 혈장에서 검출되는 항체를, ME - 180 세포주(입수처 : ATCC 제 HTB - 33 호)의 직접 세포독성 및 L - 929 검정시 능력 중화에 대해 선택한 수의 동물에서 평가한다. 세 구성물 중 어떠한 구성물에서도 생성된 항체와 함께 세포독성 또는 중성화 둘 다 나타나지 않는다.
I 상 A 부 비비 연구에 있어, 가장 강한 항체 반응을 나타내는 동물이 또한 그들의 두 번째 투여 후에 가장 신속히 구성물의 청소율이 증가한다. 따라서, 그와 같은 발견은, 항체 반응이 생물학적 반감기 및 이에 따른 구성물의 치료 효능을 감소시킬 수 있으므로, 투여량 보조제가 필요할 수도 있음을 암시한다. 그러나, 구성물을 두 번째 투여할 때 항체 존재에 대한 어떠한 역임상 반응도 분명하지 않다. 따라서, 반감기나 효능에 상당히 영향을 미치지 않고서, 면역원성을 감소시키도록 그와 같은 구성물을 변형시키고자 하는 치료학적 노력은 첫 째로 역반응에 대한 위험 보다는 투여량 보조제 증가에 대한 필요성을 감소시키고자 하는 것이다.
1 부 B 상 결과 :
최종적으로, 원시 비비에 있어, 세 구성물 모두가 1.0 mg/kg BW 의 투여량을 투여할 때 E. coli 균혈증 후 시토킨 매개 손상을 예방하는 데 있어서 거의 동일하게 효과적이다. 각각, 4 마리의 위약 - 처리 비비 중 한 마리가 생존하고 ; 4 마리의 sTNFR-I 4D/C105db 및 sTNFR-I 3D/C105db- 처리 비비 중 4 마리가 생존하며 ; 4 마리의 sTNFR-I 2.6D/C105db- 처리 비비 중 3 마리가 생존한다. 세 구성물 모두 TNFα 생물활성도를 방지하고 과량의 중성화 능력을 제공한다.
2 부 :
2 부 비비 연구의 특별한 목적은, 다양한 sTNF-RI 구성물에 동물을 반복 노출시킬 때(즉 3 회 개별 주사) 면역원성 및 반감기의 감소가 초래되는지를 결정하고자 하는 것이다. 부가적으로, 이 연구는 sTNFR-I 2.6D/C105db 및 sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) 및 sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa)를 포함하는 여러 sTNFR-I 구성물의 면역원성 및 약력학을 비교하도록 고안한다. 최종적으로, 이 연구는 항체 반응의 임상 유의성을 평가하고 TNFα- 매개 손상 항원투여(E. coli 균혈증)에 대한 후속 반응에 대해 청소율을 변경시키도록 고안한다.
0, 21 및 42 일 째에, 다양한 구성물[sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 2.6D/C105db, sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) 또는 sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) 각각] 0.2 mg/kg 을 비비에게 I.V. 투여한다. +63 일 째에, 비비에게 그들의 각 구성물 2.0 mg/kg BW 를 주입한다. +65 일 째에(즉, 48 시간 후), 상기 1 부에 기재한 바와 같이 치사량의 E. coli 를 비비에 항원투여 한다. 2 부에 대한 주요 발견은 다음과 같다 :
결과(2 부) :
일반적으로, 원시 비비에 있어, 도메인 수에 상관없이 sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) 및 sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) 는 TNFR-I 4D/C105db 및 sTNFR-I 2.6D/C105db 보다 더 긴 반감기를 갖는다. 이합체 폴리에틸렌 글리콜화된 형태에 대한 10 - 20 시간 범위와 비교해 볼 때 모노폴리에틸렌 글리콜화된 sTNFR-I 형태에 대한 반감기는 30 - 35 시간 범위이다. 부가적으로, 원시 동물에 있어 sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) 및 TNFR-I 4D/C105db 는 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) 및 sTNFR-I 2.6D/C105db 보다 더 긴 반감기를 갖는다.
sTNFR-I 4D/C105db 및 sTNFR-I 2.6D/C105db 역시 면역원성인데, sTNFR-I 2.6D/C105db 와 같이 감소된 면역원성을 갖는 것이 적당하다. 그러나, TNFR-I 4D/C105db 만이 반복 투여에 따라 감소된 청소율을 나타낸다. sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) 및 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa)는 항원성이 아니며, 반복 투여에 따라 그들의 청소율 역시 상당히 변하지 않는다.
+21 일, +42 일 및 +61 일 째에 다른 화합물로 처리한 각 비비(N = 3)로 부터 수득한 혈청을, 포획 항원과 같은 다른 구성물을 사용함으로써 다른 구성물에 대한 시험관내 면역반응성에 대해 평가한다(샌드위치 포획 ELISA 에 의해). 예를들어, +21 일 째에(표 9) 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa)를 투여한 비비로 부터 수득한 혈청은 ELISA 평판에 포획 항원으로서 이들 화합물을 사용할 때 sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 4D/N105 중 어느 것과도 "반응" 하지 않는다.
비비 항체 반응 IgG(≥ 1 : 400 역가) 21 일 째
제공된 동물:n = 3 sTNFR-I2.6D/C105db sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa) sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa) sTNFR-I4D/C105db sTNFR-I4D/N105
sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg
sTNFR-I2.6D/C105db 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg
sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg
sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa)
sTNFR-I4D/C105db 1/3 반응(400) 3/3 neg
양성 반응은 > 1 : 400 역가의 항체 반응이다. +42 일 및 +61 일 째의 데이터는 표 10 및 11 에 나타나 있다. 중요하게도, sTNFR-I 4D/C105db 포획 항원에 대항하여 시험했을 때 미리 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa)로 처리한 1 비비로 부터 수득한 혈청과의 시험관내 양성 반응이 존재한다.
비비 항체 반응 IgG(≥ 1 : 400 역가) 42 일 째
제공된 동물:n = 3 sTNFR-I2.6D/C105db sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa) sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa) sTNFR-I4D/C105db sTNFR-I4D/N105
sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg
sTNFR-I2.6D/C105db 1/3 반응(1600) 3/3 neg 3/3 neg
sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg
sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa)
sTNFR-I4D/C105db 2/3 반응(3200) 2/3 반응(800)
비비 항체 반응 IgG(≥ 1 : 400 역가) 61 일 째
제공된 동물:n = 3 sTNFR-I2.6D/C105db sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa) sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa) sTNFR-I4D/C105db sTNFR-I4D/N105
sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3 neg 1/3 반응(1600) 3/3 neg
sTNFR-I2.6D/C105db 2/3 반응(204800) 1/3 반응(1600) 1/3 반응(3200)
sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3 neg 1/3 반응(6400) 1/3 반응(6400)
sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa)
sTNFR-I4D/C105db 1/3 반응(6400) 3/3 반응(12800)
구성물에 3 회 미리 노출된 비비에 있어, TNFα - 매개 손상 반응에 대한 효능은 (1) sTNFR-I 4D/C105db, (2) sTNFR-I 2.6D/C105db, (3) sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) 및 (4) 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) 에서 최대이다[생존, 다중 - 계 기관 부전(MSOF), 혈청 IL - 6 및 WBC 반응에 의해 측정된 바와 같음). "주의할 사항" 은 이 연구가 다른 구성물의 TNF 중성화 능력의 차이를 고려하지 않았다는 것이다.
C. 챔팬지 :
이 연구의 목적은 1 달 동안 침팬지에 I.V. 경로를 통해 반복 주사한 다른 sTNFR-I 형태의 면역원성을 평가하기 위한 것이다. 이 연구에 시험된 sTNFR-I 형태는 다음과 같다 : sTNFR-I 2.6D/C105db, sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33 kDa), sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) 및 sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa). 치료군 당 총 3 마리의 침팬지이다.
이 연구의 투여량 섭생/변수는 다음과 같다 : 각 침팬지에 0.1 ㎎/㎏ 의 정맥내 환괴 주사로서 시험물질을 4 주간 월요일과 금요일에 매주 2 회 주입한다(총 8 투여량). 투여량 부피는 공급된 시험물질의 농도에 좌우하여 변할 수 있다. 치료 전 0 일째에 각 동물로 부터 5 mL 혈청 시료를 수득한다. 7, 14, 21 및 28 일 째 약물 투여 직전에 부가 혈청 시료를 수득한다.
침팬지 면역원성 발 데이터는 표 12 에 나타나 있다.
항체 결과 IgG 역가(침팬지수)
0 일(전-투여량) 7 일(2 투여량) 14 일(4 투여량) 21 일(6 투여량) 28 일(8 투여량)
sTNFR-I2.6D/C106db 100(1) 400(1)1600(1)3200(1) 800(1)3200(2)
sTNFR-I4D/C105db 3200(1) 400(1)1600(1) 800(2)12800(1)
sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa)
sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)
sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa) 200(1)*1600(1) 100(1)*400(1)
* 주해 : 역가는 포획 항원으로서 sTNFR-I 4D/C105db 를 사용하여관찰함
+28 일 째에, sTNFR-I 4D/C105db 나 아니면 sTNFR-I 2.6D/C105db 로 처리한 모든 동물(N = 3)은 양성 반응을 나타내는 데(ELISA 로써 측정), 각각 1 : 12,800 또는 1 : 3200 으로서 최고 역가가 관찰된다(표 12)(주해 : 이 실험 부문에서 모든 "면역화" 항원은 ELISA 평판에 고정된 상응 포획 항원으로서 사용된다). sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa)으로 처리한 한 동물은 +21 및 +28 일 째에 양성 항체 반응을 갖는다 (표 12). 중요하게도, sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33 kDa)나 아니면 sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa)로 처리한 어떠한 동물도 실험 전체를 통해 항-sTNFR-I 항체 발생이 관찰되지 않는다(표 12).
상기 비비 실험 부문에 기술된 바와 같이, +28 일 째에 다른 sTNFR-I 형태로 치료한 각 침팬지(N = 3)로 부터 수득한 혈청을 포획 항원으로서 sTNFR-I 형태를 사용하여 다른 구성물에 대한 시험관내 면역반응성에 대해 평가한다(ELISA 로써). 양성 반응은 > 1 : 400 역가의 항체 반응이다. 중요하게도, sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa)을 투여한 침팬지로 부터 수득한 혈청은, 포획 항원으로서 이들 화합물을 ELISA 평판에 사용할 때 sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 4D/N105 중 어느 하나와 "반응" 하지 않는다(표 13).
침팬지 항체 결과 IgG (≥ 1 : 400 역가)
제공된 동물:n = 3 sTNFR-I2.6D/C105db sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa) sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa) sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa) sTNFR-I4D/C105db sTNFR-I4D/N105
sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg
sTNFR-I2.6D/C105db 3/3 반응(3200) 2/3 반응(3200) 1/3 반응(400)
sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3 neg 2/3반응(1600) 2/3 반응(3200)
sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa) 3/3 neg 1/3 반응(400) 3/3 neg
sTNFR-I4D/C105db 3/3 반응(12800) 3/3 반응(6400)
이것은 또한 sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG (33 kDa) 또는 sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33 kDa) 중 하나로 처리한 동물도 관찰한 것이다(표 13).
실시예 IV
EAE 는 마이엘린 기저 단백질(MBP)같은 신경항원으로 일반적으로 감수성인 동물을 감작시킴으로써 발생하는 CNS 의 급성 또는 만성 재발 염증 탈수질 질병이다. EAE 는 기술적으로 용인된 것이며 종종 급성 인체 MS 에 대한 동물 모델에 사용된다.
0 일 째에 암컷 루이스 랫(미국 메인 바 하버 소재의 잭슨 라보라토리스에서 수득)을 마취시키고, 5 ㎎/ml 의 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37Ra(미국 미시간 소재의 딥코 라보라토리에서 입수)를 함유하는 프로인트 완전 보조제(CFA)의 동일 부피와 함께, 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해되어 있는 프로인트 완전 보조제내 마이엘린 기저 단백질(MBP)을 함유하는 에멀션 0.1 mL 로 왼쪽 뒤쪽 사지의 풋패드(footpad)에 면역화시킨다. 대조 랫에는 뒤쪽 좌 사지의 풋패드에 MBP 없이 0.1 ml 의 PBS/CFA 에멀션을 주입한다.
임상 질병의 평가는 종래의 0 - 5 스코어 시스템을 기초로 한다. 스펙트럼 등급은 다음과 같다 : 0, 정상 ; 0.5, 꼬리 상태의 부분 손실 ; 1, 꼬리 상태의 완전 손실 ; 2, 뒤쪽 사지 하나의 끌림 ; 3, 뒤쪽 사지 둘 다 마비 ; 4, 병적임 ; 및 5, 사망. sTNFR-I 구성물 또는 운반체의 모든 주사는 면역화 후 9 일 째에 시작하여 격일로 1 ㎎/㎏ S.C. 투여한다. 모든 동물은 21 일 째에 종결시킨다. 결과는 두 형태로 나타나는 데, 시간 함수로서 임상 심각성 스코어 및 질병의 전과정 중에 각 랫에 대한 임상 적분 스코어는 매일 임상 스코어 대 시간의 곡선하 면적으로서 계산한다. 임상 적분 스코어에 대한 처리군의 값은 맨 - 휘트니(Mann - Whitney)시험을 이용하는 대조군의 값에 대해 통계학적으로 유사하다.
운반체 처리된 동물은 약 10 일 째에 질병이 나타나는 데, 이 질병은 6 일 째에 피크에 도달한 다음 감소한다. sTNFR-I 4D/C106db 는 운반체 처리 동물과 비교할 때 약 73 % 까지 임상 증상을 감소시킨다. sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33 kDa) 역시 약 85 % 까지 임상 증상을 감소시킨다. sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33 kDa) 및 sTNFR-I 2.6 DN105-t-BuPEG(33 kDa)는 임상 증상을 감소시키는 데 있어 동일한 능력을 갖는다(각각 64 및 57 %).
결론적으로, 이 MS 동물 모델에 있어 절단된 sTNFRs 가 임상 후유증의 일부를 중개하는 데 효과적이라는 것이 분명하다.
본 발명은 일반적이고, 바람직한 실시구체형태 면에서 상기에 기술되어 있지만, 본 분야의 숙련된 기술자들에 의해 상기 상세한 설명의 범위내에서 그외 수정 및 변형이 일어날 것임은 물론이다.

Claims (31)

  1. 다음 식을 갖는 절두 sTNFR 및 그것의 변이체와 유도체 :
    R1- [Cys19- Cys103] - R2
    여기에서 [Cys19- Cys103]은 용이하게 비교할 수 있도록 도 1(서열 2)에 제시한 아미노산 잔기 번호도에 나타나 있는 sTNFR-I 의 잔기 19 내지 103 을 나타내는 것이고 ;
    R1은 Cys19또는 다음 중에서 선택한 아미노 - 말단 아미노산 잔기의 메티오닐화되거나 그렇지 않은 아민기를 나타내고 :
    R2는 Cys103또는 다음 중에서 선택한 카르복시 - 말단 아미노산 잔기의 카르복시기를 나타내며 :
    그러나 만약 R1이 아미노산 서열 VCPQGKYIHPQNNSIC 의 메티오닐화되거나 그렇지 않은 아민기 또는 잔기 1 내지 15 의 N - 말단이 절두된 형태를 나타낸다면, R1- [Cys19- Cys103] - R2는 식 R1- [Cys19- Cys103] - FCCSLCL - R3를 갖는 부가 변이체가 아니고, 여기에서 R3는 도 1 의 아미노산 잔기 Asn111- Asn161의 카르복시기를 나타내거나 도 1 의 Asn111- Asn161의 카르복시 말단이 절두됨을 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, sTNFR-I 2.6D/C105, sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 2.6D/N105, sTNFR-I 2.3D/d8, sTNFR-I 2.3D/d18 및 sTNFR-I 2.3D/d15 중에서 선택함을 특징으로 하는 종양 괴사 결합 단백질 또는 그것의 변이체나 유도체.
  3. 다음 식을 갖는 절두 sTNFR 및 그것의 변이체 :
    R4- [Cys32- Cys115] - R5
    여기에서 [Cys32- Cys115] 는 용이하게 비교할 수 있도록 도 8(서열 35)에 제시한 아미노산 잔기 번호도에 나타나 있는 완전한 길이의 성숙한 40 kDa TNF 저해제의 잔기 Cys32내지 Cys115를 나타내며 ;
    R4는 Cys32또는 다음 중에서 선택한 아미노 - 말단 아미노산 잔기의 메티오닐화되거나 그렇지 않은 아민기를 나타내고 :
    R5는 Cys115또는 다음 중에서 선택한 카르복시 - 말단 아미노산 잔기의 카르복시기를 나타내며 :
    그러나 만약 R4가 아미노산 서열 TCRLREYYDQTAQMC 의 메티오닐화되거나 그렇지 않은 아민기 또는 잔기 1 내지 15 의 N - 말단이 절두된 형태를 나타낸다면, R4- [Cys32- Cys115] - R5는 식 R4- [Cys32- Cys115] - APLRKCR - R6를 갖는 부가 변이체가 아니며, 여기에서 R6는 도 8 의 아미노산 잔기 Pro123- Thr179의 카르복시기를 나타내거나 도 8 의 Pro123- Thr179의 카르복시 - 말단이 절두됨을 나타낸다.
  4. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 글리코실화되지 않음을 특징으로 하는 종양 괴사 결합 단백질.
  5. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 글리코실화됨을 특징으로 하는 종양 괴사 결합 단백질.
  6. 제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 수용성 중합체와 결합함을 특징으로 하는 종양 괴사 결합 단백질.
  7. 제 1 항 내지 6 항 중 어느 한 항의 종양 괴사 결합 단백질 중 적어도 하나를 포함하는 다가(polyvalent) 종양 괴사 결합 단백질.
  8. 식 R1- X - R2를 갖는 다가 종양 괴사 결합 단백질로서, X 는 수용성 중합체인 링커를 포함하며 ; R1과 R2는 상기 수용성 중합체와 공유결합하는 생물학적으로 활성인 분자이며 R1과 R2중 적어도 하나는 제 1 항 내지 6 항 중 어느 한 항의 종양 괴사 결합 단백질인 다가 종양 괴사 결합 단백질.
  9. 제 8 항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜임을 특징으로 하는 다가 종양 괴사 결합 단백질.
  10. 제 9 항에 있어서, 단백질은 sTNFR-I 2.6D/C105db 및 sTNFR-I 2.6D/C106db 중에서 선택함을 특징으로 하는 다가 종양 괴사 결합 단백질.
  11. 제 1 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 있어서, TNF - 매개 질환 치료에 사용함을 특징으로 하는 종양 괴사 결합 단백질.
  12. 제 1 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 관절염 치료에 사용함을 특징으로 하는 종양 괴사 결합 단백질.
  13. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항의 종양 괴사 결합 단백질을 코드하는 폴리누클레오티드.
  14. (a) 도 2 에 나타나 있는 cDNA 서열 ;
    (b) 도 3 에 나타나 있는 cDNA 서열 ;
    (c) 도 4 에 나타나 있는 cDNA 서열 ;
    (d) 도 5 에 나타나 있는 cDNA 서열 ;
    (e) 도 6 에 나타나 있는 cDNA 서열 ;
    (f) 도 7 에 나타나 있는 cDNA 서열 ;
    (g) (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f) 의 코딩 부위 또는 그 일부에 동의적인 서열 ;
    (h) (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (g) 에 혼성되는 서열 ; 및
    (i) (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (h) 에 상보적인 서열 중에서 선택한 누클레오티드 서열에 의해 코드되는 종양 괴사 인자 결합 단백질을 포함하는 핵산 서열로서, 상기 핵산 서열은 다음 식을 갖는 단백질을 코드하지 않는 핵산 서열 :
    R1- [Cys19- Cys103] - FCCSLCL - R3
    여기에서 [Cys19- Cys103] 은 용이하게 비교할 수 있도록 도 1(서열 2)에 제시한 아미노산 잔기 번호도에 나타나 있는 sTNFR-I 의 잔기 19 내지 103 을 나타내며 ;
    R1은 NNSIC 를 포함하는 아미노산 서열의 메티오닐화되거나 그렇지 않은 아민기를 나타내고 ;
    R3는 도 1 의 아미노산 잔기 Asn111- Asn161의 카르복시기를 나타내거나 도 1 의 Asn111- Asn161의 카르복시 - 말단이 절두됨을 나타낸다.
  15. 도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 에 나타나 있는 서열 또는 그 일부를 갖는 폴리누클레오티드.
  16. 발현 조절 서열과 작동적으로 결합하는 제 13 항 내지 15 항 중 어느 한 항의 폴리누클레오티드를 함유하는 벡터.
  17. 제 13 항 내지 15 항 중 어느 한 항의 폴리누클레오티드를 함유하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  18. 적합한 영양 배지에서 제 17 항의 숙주 세포를 성장시키고 선택적으로, 상기 세포나 상기 영양 배지로부터 상기 절두 sTNFR 을 분리하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 E. coli 임을 특징으로 하는 종양 괴사 결합 단백질 생산방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포임을 특징으로 하는 종양 괴사 인자 결합 단백질 생산방법.
  21. 다음 단계를 포함하는 방법 :
    (a) 제 17 항의 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 배양하는 단계 ;
    (b) 상기 숙주 세포가 절두 sTNFR 을 발현하는 조건하에서 상기 숙주 세포를 보존하는 단계 ; 및
    (c) 선택적으로, 상기 숙주 세포에 의해 발현되는 절두 sTNFR 을 분리하는 단계.
  22. 제 13 항 내지 15 항 중 어느 한 항의 외생 폴리누클레오티드를 함유하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포의 재조합 발현 산물인 종양 괴사 결합 단백질.
  23. 제 1 항 내지 10 항 중 어느 한 항의 종양 괴사 인자 결합 단백질과 함께 제약학적으로 용인가능한 부형제를 포함하는 제약학적 조성물.
  24. 제 18 항의 방법으로 생산한 종양 괴사 인자 결합 단백질과 함께 제약학적으로 용인가능한 부형제를 포함하는 제약학적 조성물.
  25. 제 21 항의 방법으로 생산한 종양 괴사 인자 결합 단백질과 함께 제약학적으로 용인가능한 부형제를 포함하는 제약학적 조성물.
  26. 제 23 항 내지 25 항의 제약학적 조성물을 환자에게 투여함을 포함하는 TNF - 매개 질환 치료방법.
  27. 제 26 항에 있어서, TNF - 매개 질환은 관절염임을 특징으로 하는 치료방법.
  28. 제 1 항 내지 10 항 중 어느 한 항의 종양 괴사 인자 결합 단백질의 치료학적 유효량을 제약학적으로 용인가능한 부형제 중 하나 또는 그 이상과 혼합하는, 제약학적 조성물의 제조방법.
  29. TNF - 매개 질환 치료를 위한, 제 1 항 내지 10 항 중 어느 한 항의 종양 괴사 인자 결합 단백질의 용도.
  30. 제 29 항에 있어서, TNF - 매개 질환 치료는 관절염 치료임을 특징으로 하는 종양 괴사 인자 결합 단백질의 용도.
  31. 제 1 항 내지 10 항 중 어느 한 항의 종양 괴사 인자 결합 단백질과 생리학적으로 용인가능한 용매가 담긴 다른 용기를 포함하는 수성 단백질 제제형 제조용 키트.
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