KR102738971B1 - 건조된 증폭 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 무기염이 본질적으로 존재하지 않는, 핵산 증폭을 위한 시약을 제공하는 건조된 조성물을 제공한다. 무기염의 결여는 이러한 조성물의 안정성을 증가시키고, 부산물의 형성을 감소시킨다. 상기 조성물에서 효소의 사용을 위해서 요구되는 염은 재구성 시에 공급된다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 참고로 포함된, 2016년 2월 5일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/291,770호의 이익을 주장한다.
핵산 증폭 및/또는 검출 반응을 수행하기 위한 시판 키트는 흔히 시약, 예컨대, 중합효소, 예컨대, DNA 의존형 DNA 중합효소 또는 RNA 의존형 DNA 중합효소(예를 들어, 역전사효소) 중 1종 이상을 비롯한 효소, 뉴클레오타이드, 세정제(detergent), 완충제, 프라이머, 프로브 및 MnCl2, MgCl2, NaCl, 및 KCl을 비롯한 무기염을 함유한다(Innis et al, (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Ch. 1, Optimizations of PCRs). 무기염은 핵산 반응 혼합물의 특정 성분을 안정화시키고, 핵산 기반 반응의 특정 단계를 수행하는 데 유용하다. 그러나 이들 동일한 염은 사용 전에 동결건조되고/되거나 저장되려는 제형의 바람직하지 않은 성분인데, 그 이유는 이들 염이 동결건조된 조성물의 안정성 및 건조에 대한 악영향을 갖기 때문이다.
마그네슘 이온은 중합효소 및 다른 효소의 활성도를 증가시킨다고 보고되어 있다. 염화칼륨은 핵산 혼성화를 용이하게 하는 것으로 보고되어 있다. 마그네슘을 갖는 것을 비롯한 다수의 무기염이 또한 열, 카오트로픽제(chaotropic agent) 노출 및 동결건조를 비롯한 다양한 스트레스 조건 하에서 단백질을 보호한다고 보고되어 있다(예를 들어 문헌[Liu et al (2007) FEBS Letters. 581:1047; Kanaya et al (1996) J. Biol. Chem. 271:32729; Innis et al, (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Ch. 1, Optimizations of PCRs; Menendez et al (1998) J. Biol. Chem. 273:167; Janeway et al (1993) Biochemistry. 32:1601; Fox et al (1971) J. Biol. Chem. 246:5739; Chang et al (2002) J. Biol. Chem. 277:277:4663; Rutter et al (1958) J. Biol. Chem. 233:374; Huszar et al (1981) J. Virol. 37:580-588; Wang (2000) Int. J. Pharmaceutics. 203:1-60] 참고).
반응 혼합물 중의 염의 존재는 효소의 변성을 회피하는 데 필요하다고 여겨진다. 그러나, 동결건조된 물질의 안정성은 동결건조된 케이크 중에 존재하는 임의의 염의 흡습성에 의해서 영향을 받는다. 동결건조된 물질의 흡습성은 결국 동결건조된 물질을 포장하는 데 사용 가능한 시간에 영향을 주고, 동결건조된 물질이 저장 및 수송될 수 있는 기간 및 조건에 영향을 준다. 동결건조된 물질의 바람직하지 않은 재수화는 동결건조된 성분의 활성도에 부정적으로 영향을 미친다. 동결건조된 물질의 바람직하지 않은 재수화로부터의 부정적인 영향을 최소화하기 위해서, 이러한 물질의 장기간 저장은 통상적으로 냉동과 함께 수행된다.
본 명세서에는 중합효소 및/또는 역전사효소, 벌크화제(bulking agent), 세정제 및 유기 완충제를 함유하는 수용액을 포함하는 조성물이 개시되고, 여기서 수용액은 7mM 이하의 무기염 농도를 갖는다.
수용액의 일부 실시형태에서, 수용액은 분자 검정을 수행하는 데 유용한 적어도 1종의 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 멀티플렉스 분자 검정을 수행하기 위해서 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 올리고뉴클레오타이드는 증폭 올리고머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 올리고뉴클레오타이드는 검출 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브는 올리고뉴클레오타이드에 공유 결합된 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표지는 형광 또는 화학발광 분자이다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브는 택맨(taqman) 검출 프로브이다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브 올리고뉴클레오타이드는 헤어핀을 형성하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 올리고뉴클레오타이드는 어댑터 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 올리고뉴클레오타이드는 헤어핀을 형성하도록 구성된 어댑터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 올리고뉴클레오타이드는 표적 포획 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 포획 프로브는 스트린전트 조건(stringent condition) 하에서 표적 핵산에 특이적으로 혼성화되는 표적 혼성화 부분을 갖는다. 일부 실시형태에서, 분자 검정은 핵산 증폭 검정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자 검정은 핵산 검출 검정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자 검정은 핵산 서열결정 검정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자 검정은 핵산 혼성화 검정을 포함한다.
수용액의 일부 실시형태에서, 벌크화제는 트레할로스, 라피노스 또는 이들의 조합물이다. 일부 실시형태에서, 벌크화제는 약 0.16M 내지 약 0.32M 농도로 존재한다.
수용액의 일부 실시형태에서, 무기염은 약 0.029ug/ul 내지 약 0.373ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.029ug/ul의 염화나트륨 내지 약 0.292ug/ul의 염화나트륨을 함유한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.019ug/ul의 염화칼륨 내지 약 0.373ug/ul의 염화칼륨을 함유한다 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.006ug/ul의 나트륨 이온 내지 약 0.115ug/ul의 나트륨 이온을 함유한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.010ug/ul의 칼륨 이온 내지 약 0.196ug/ul의 칼륨 이온을 함유한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.009ug/ul의 클로라이드 이온 내지 약 0.355ug/ul의 클로라이드 이온을 함유한다.
수용액의 일부 실시형태에서, 수용액은 4mM 이하의 무기염 농도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.234ug 내지 약 0.298ug의 질량/마이크로리터의 무기염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.071ug 내지 약 0.284ug의 질량/마이크로리터의 클로라이드 이온을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 3mM 이하의 무기염 농도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.175ug 내지 약 0.224ug의 질량/마이크로리터의 무기염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.053ug 내지 약 0.213ug의 질량/마이크로리터의 클로라이드 이온을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 2mM 이하의 무기염 농도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.117ug 내지 약 0.149ug의 질량/마이크로리터의 무기염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.036ug 내지 약 0.142ug의 질량/마이크로리터의 클로라이드 이온을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 1mM 이하의 무기염 농도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.058ug 내지 약 0.075ug의 질량/마이크로리터의 무기염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.018ug 내지 약 0.071ug의 질량/마이크로리터의 클로라이드 이온을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 500uM 이하의 무기염 농도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.029ug 내지 약 0.037ug의 질량/마이크로리터의 무기염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.009ug 내지 약 0.036ug의 질량/마이크로리터의 클로라이드 이온을 포함한다.
수용액의 일부 실시형태에서, 수용액의 무기염 농도는 1mM 미만의 염화나트륨이다. 일부 실시형태에서, 수용액은 염화나트륨을 함유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 수용액은 1mM 미만의 마그네슘 이온을 함유한다. 일부 실시형태에서, 수용액은 0.1mM 미만의 마그네슘 이온을 함유하고, 적합하게는 마그네슘 이온을 함유하지 않는다.
수용액의 일부 실시형태에서, 수용액은 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트(dNTP)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, dNTP는 수용액 중에 0.1mM 내지 0.3mM의 농도로 dATP를 포함한다. 일부 실시형태에서, dATP는 수용액 중에 0.2mM의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, dNTP는 수용액 중에 0.1mM 내지 0.3mM의 농도로 dGTP를 포함한다. 일부 실시형태에서, dGTP는 수용액 중에 0.2mM의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, dNTP는 수용액 중에 0.1mM 내지 0.3mM의 농도로 dCTP를 포함한다. 일부 실시형태에서, dCTP는 수용액 중에 0.2mM의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, dNTP는 수용액 중에 0.2mM 내지 0.6mM의 농도로 dTTP를 포함한다. 일부 실시형태에서, dNTP는 수용액 중에 0.2mM 내지 0.6mM의 농도로 dUTP를 포함한다. 일부 실시형태에서, dNTP는 표지된 dNTP를 포함한다.
수용액의 일부 실시형태에서, 중합효소는 약 0.20U/ul 내지 약 0.72U/ul의 농도로 수용액 중에 존재한다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 하기로부터 선택된 농도로 수용액 중에 존재한다: 0.25U/ul, 0.30U/ul 내지 0.32U/ul, 0.4U/ul, 0.5U/ul, 0.45U/ul 및 0.72U/ul. 일부 실시형태에서, 중합효소는 핫-스타트(hot-start) 중합효소이다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 중합효소의 중합효소 활성도를 특이적으로 차단하는 항체에 의해서 결합된 재조합 Taq DNA 중합효소이다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 화학적으로 변형된 재조합 Taq DNA 중합효소인데, 여기서 화학적 변형은 중합효소의 중합효소 활성도를 저해한다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 표지된 dNTP를 핵산 연장 반응 산물 내에 혼입하기 위해서 변형된다.
수용액의 일부 실시형태에서, 수용액은 약 0.1U/ul 내지 약 0.6U/ul 농도의 역전사효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 역전사효소는 AMV 역전사효소이다. 일부 실시형태에서, 역전사효소는 MMLV 역전사효소이다.
수용액의 일부 실시형태에서, 수용액은 RNase 저해제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, RNase 저해제는 수용액 중에 약 0.12U/ul 내지 약 0.20U/ul의 농도로 존재한다.
수용액의 일부 실시형태에서, 수용액은 킬레이팅제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 킬레이팅제는 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌다이아민-N,N'-다이석신산(EDDS), 메틸글라이신다이아세트산(MGDA), 다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(DTPA), 및 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에터)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 킬레이팅제는 EDTA이고, 수용액 중에 1.5mM 내지 2.0mM의 농도로 존재한다.
본 명세서에는 상기에 기술된 수용액의 건조된 형태가 개시된다.
본 명세서에는 중합효소 및 역전사효소로 이루어진 군으로부터 선택된 효소, 벌크화제, 유기 완충제, 및 세정제를 포함하는 건조된 조성물이 개시된다. 건조된 조성물은 또한 1종 이상의 무기염을 포함하고, 여기서 1종 이상의 무기염은 건조된 조성물의 총 질량의 0.350% 이하인 질량으로 건조된 조성물 중에 존재한다.
건조된 조성물의 일부 실시형태에서, 1종 이상의 무기염은 건조된 조성물의 총 질량의 약 0.311% 내지 약 0.024%인 질량으로 건조된 조성물 중에 존재한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 무기염은 염화나트륨, 염화칼륨 및 염화나트륨과 염화칼륨 둘 모두로 이루어진 군으로부터 선택된다.
건조된 조성물의 일부 실시형태에서, 건조된 조성물은 분자 검정을 수행하는 데 유용한 적어도 1종의 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 건조된 조성물은 멀티플렉스 분자 검정을 수행하기 위해서 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 올리고뉴클레오타이드는 증폭 올리고머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 올리고뉴클레오타이드는 검출 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브는 올리고뉴클레오타이드에 공유 결합된 표지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표지는 형광 또는 화학발광 분자이다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브는 택맨 검출 프로브이다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브 올리고뉴클레오타이드는 헤어핀을 형성하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 올리고뉴클레오타이드는 어댑터 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 올리고뉴클레오타이드는 헤어핀을 형성하도록 구성된 어댑터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 올리고뉴클레오타이드는 표적 포획 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 포획 프로브는 스트린전트 조건 하에서 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 혼성화 부분을 갖는다. 일부 실시형태에서, 분자 검정은 핵산 증폭 검정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자 검정은 핵산 검출 검정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자 검정은 핵산 서열결정 검정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자 검정은 핵산 혼성화 검정을 포함한다.
건조된 조성물의 일부 실시형태에서, 벌크화제는 트레할로스, 라피노스 또는 이들의 조합물이다.
건조된 조성물의 일부 실시형태에서, 건조된 조성물은 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트(dNTP)를 추가로 포함한다.
건조된 조성물의 일부 실시형태에서, 중합효소는 핫-스타트 효소이다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 중합효소 활성도를 특이적으로 차단하는 항체에 결합된 재조합 Taq DNA 중합효소이다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 화학적으로 변형된 재조합 Taq DNA 중합효소이다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 표지된 dNTP를 핵산 연장 반응 산물 내에 혼입하기 위해서 변형된다.
건조된 조성물의 일부 실시형태에서, 역전사효소는 AMV 역전사효소이거나, 또는 역전사효소는 MMLV 역전사효소이다.
건조된 조성물의 일부 실시형태에서, 건조된 조성물은 RNase 저해제를 추가로 포함한다.
건조된 조성물의 일부 실시형태에서, 건조된 조성물은 킬레이팅제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 킬레이팅제는 EDTA, EGTA, EDDS, DTPA 및 MGDA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에는 핵산 기반 증폭 반응을 수행하는 데 사용하기 위한 혼합물을 형성하는 방법이 개시되며, 이 방법은 재구성 용액 및 상기에 기술된 바와 같은 건조된 조성물을 조합하는 단계를 포함하고, 여기서 재구성 용액은 적어도 1종의 무기염을 포함한다.
방법의 일부 실시형태에서, 재구성 용액은 1mM 미만의 무기염 농도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재구성 용액은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 망간 이온, 클로라이드 이온 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 무기염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재구성 용액은 MgCl2를 약 3.8mM 내지 약 4.4mM의 농도로 포함하거나, 또는 KCl을 약 50mM 내지 약 80mM의 농도로 포함하거나 또는 둘 모두이다. 일부 실시형태에서, 재구성 용액은 재구성된 건조된 조성물에 필요한 MgCl2 농도보다 과량으로 존재하는 MgCl2 농도를 포함한다(재구성된 건조된 조성물에 필요한 MgCl2의 양은 다수의 인자, 예컨대, 효소 요건, 분자 검정 요건, 및 분자 검정 최적화 결과를 기반으로 결정된다). 과량의 McCl2를 포함하는 이들 재구성 용액은 범용 재구성 용액이라 지칭된다. 범용 재구성 용액은 상이한 분자 검정을 수행하기 위한 다양한 성분을 함유하는 건조된 조성물을 재구성하기에 유용하다. 단지 예의 방식에 의해서, 범용 재구성 용액은 MgCl2를 농도 X로 포함할 수 있다. 건조된 조성물 #1은 MgCl2에 대한 요건이 0.8X의 농도인 반면, 건조된 조성물 #2는 MgCl2에 대한 요건이 0.95X의 농도이다. 건조된 조성물 #1 및 건조된 조성물 #2 둘 모두는 동일한 범용 재구성 용액으로 재구성되고, 재구성된 건조된 조성물 중의 MgCl2 농도는 킬레이팅제의 사용에 의해서 목적하는 수준으로 감소된다. 바람직하게는, 건조된 조성물 #1 및 #2는 후속으로 사용되는 범용 재구성 용액으로부터 과량의 MgCl2를 겪리시킬 양의 킬레이팅제를 포함하도록 각각 (예를 들어, 미리-건조된 벌크 시약 중에) 제형화된다. 재구성 시, 킬레이팅제는 MgCl2 중 일부를 격리시킬 것이고, 이에 의해서 용액 중에는 목적하는 농도만의 MgCl2(예를 들어, 이러한 예시적인 설명의 경우에는 각각 0.8X 및 0.95X)가 용액 중에서 유리되어 남아있을 것이다.
방법의 일부 실시형태에서, 재구성 용액은 메틸 파라벤을 약 0.012% w/v 내지 약 0.020% w/v의 질량 농도로 포함하거나, 또는 프로필 파라벤을 약 0.006% w/v 내지 약 0.010% w/v의 질량 농도로 포함하거나, 또는 무수 에탄올(absolute ethanol)을 약 0.20% v/v 내지 약 0.30% v/v의 부피 농도로 포함하거나 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 재구성 용액 중의 메틸 파라벤의 농도는 0.016% w/v이다. 일부 실시형태에서, 재구성 용액 중의 프로필 파라벤의 농도는 0.008% w/v이다. 일부 실시형태에서, 무수 에탄올은 재구성 용액 중에 약 0.26% v/v로 존재한다.
본 명세서에는 분자 검정, 예컨대, 핵산 기반 증폭 반응, 핵산 기반 검출 반응, 핵산 기반 서열결정 반응, 핵산 기반 혼성화 반응 및 이들의 조합을 수행하는 데 사용하기 위한 건조된 조성물의 제조 방법이 개시된다. 일부 실시형태에서, 방법은 탈수, 건조, 동결건조 및 분무 건조로 이루어진 군으로부터 선택된 건조 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (i) 본 명세서에 기술된 바와 같은 수용액 조성물을 동결시켜, 조성물의 동결된 형태를 형성하는 단계; 및 (ii) 조성물의 동결된 형태를 동결건조 조건에 노출시켜, 조성물의 건조된 형태를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수성 조성물을 동결건조기에서 건조시켜 동결건조된 조성물을 생성한다.
건조된 조성물은 재구성 이후에 핵산 기반 반응(예를 들어, 증폭 및/또는 검출 반응)에 유용하다. 습한 환경에 대한 장기적인 노출에 적용된 건조된 조성물은 놀랍게도 재구성 및 핵산 증폭 및/또는 검출 검정에 사용되는 경우 강력한 증폭 및/또는 검출 결과를 제공한다. 습한 환경(여기서 습한 환경의 절대 습도 수준은 최대 3시간의 시간 기간 동안; 바람직하게는 90분 내지 180분; 바람직하게는 약 90분; 또는 바람직하게는 약 180분의 시간 기간 동안 2.3그램 물/공기 세제곱미터 초과임)에 노출된 조성물의 건조된 형태는 이어서 재구성되고, 핵산 증폭 및/또는 검출 검정에 유용하다. 특정 실시형태에서, 건조된 조성물의 재구성된 형태는 건조된 조성물이 습한 환경(여기서 습한 환경의 상대 습도 수준은 최대 8시간의 시간 기간 동안 10% 이하임)에 노출되는 경우에도 증폭 및/또는 검출 반응에 유용하다. 특정 실시형태에서, 건조된 조성물의 재구성된 형태는 건조된 조성물이 습한 환경(여기서 습한 환경의 절대 습도 수준은 최대 8시간의 시간 기간 동안 25℃에서 2.3그램 물/공기 세제곱미터 이하임)에 노출되는 경우에도 증폭 및/또는 검출 반응에 유용하다. 특정 실시형태에서 수성 벌크 시약은 장기적인 시간 기간 동안 인큐베이션되고, 이어서 수성 벌크 시약의 전부 또는 일부는 건조되어 건조된 조성물을 형성하고, 건조된 조성물의 재구성 시, 놀랍게도 핵산 증폭 및/또는 검출 검정에서 사용되는 경우 강력한 핵산 증폭 및/또는 검출 결과를 제공한다.
일부 실시형태에서, 건조된 조성물은 밀봉된 용기에 저장된다. 일부 실시형태에서, 건조된 조성물은 건조된 조성물을 밀봉된 용기에 저장하는 단계 이전에 습한 환경에 노출되고, 여기서 습한 환경의 절대 습도 수준은 2.3그램 물/공기 세제곱미터를 초과한다. 일부 실시형태에서, 미리-건조된 수용액은 건조 단계가 개시되기 전 최대 8시간 동안 실온에서 저장된다. 일부 실시형태에서, 미리-건조된 수용액은 건조 단계가 개시되기 전 약 45분 내지 약 8시간의 시간 기간 동안 실온에서 저장된다. 일부 실시형태에서, 건조된 조성물은 건조된 조성물을 밀봉된 용기에 저장하는 단계 이전에 습한 환경에 노출되고, 여기서 습한 환경의 상대 습도 수준은 10% 미만이다. 일부 실시형태에서, 건조된 조성물은 건조된 조성물을 밀봉된 용기에 저장하는 단계 이전에 습한 환경에 노출되고, 여기서 습한 환경의 절대 습도 수준은 2.3그램 물/25℃ 공기 세제곱미터 이하이다. 일부 실시형태에서, 건조된 수용액은 밀봉된 용기에서 건조된 조성물을 저장하는 단계 전에 실온에서 최대 8시간 동안 저장된다.
본 명세서에는 분자 검정을 수행하는 데 사용하기 위한 키트가 개시된다. 일부 실시형태에서, 키트는 핵산 기반 증폭 반응을 수행하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 키트는 핵산 기반 검출 반응을 수행하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 키트는 핵산 기반 서열결정 반응을 수행하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 키트는 핵산 기반 혼성화 반응을 수행하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 키트는 분자 검정의 조합, 예컨대, 예를 들어, 핵산 기반 증폭 및 검출 반응을 수행하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 키트는 용기 내에 본 명세서에 기술된 바와 같은 건조된 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 용기 내에 분자 검정, 예컨대, 예를 들어, 증폭 반응 및/또는 검출 반응에서 사용하기 위해서 건조된 조성물을 재구성하기 위한 용액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 건조된 조성물을 함유하는 제1 용기, 및 MgCl2를 농도 약 3.8mM 내지 약 4.4mM의 농도로 포함하는 재구성 용액을 함유하는 제2 용기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 용기는 하나 이상의 웰을 포함하는 멀티웰 플레이트이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 웰 중 적어도 하나는 건조된 조성물을 함유한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 웰 각각은 건조된 조성물을 함유한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 웰 중 2개 이상은 상이한 분자 검정을 수행하기 위한 건조된 조성물을 함유한다. 이러한 실시형태의 일 양상에서, 2개 이상의 웰 중의 각각의 건조된 펠릿은 상이한 MgCl2 농도 요건을 갖는다. 추가로 이러한 실시형태의 양상에서, 상이한 MgCl2 농도 요건을 갖는 각각의 건조된 펠릿은 각각의 분자 검정에 요구되는 추가적인 MgCl2과 동일하거나 또는 과량의 MgCl2 농도를 갖는 범용 재구성으로 재구성된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 웰 중 적어도 하나는 0.311% 이하의 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%를 함유하는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 웰 각각은 0.311% 이하의 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%를 함유하는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유한다. 일부 실시형태에서, 제1 용기는 낮은 수증기 전달률을 갖거나, 광학적으로 투명하거나, 낮은 자가형광을 제공하거나 또는 이들의 조합인 재료로부터 구성된다. 일 실시형태에서, 제1 용기는 용기의 개구부를 밀봉하기 위한 뚜껑을 포함한다. 일부 실시형태에서, 뚜껑은 포일, 플러그 또는 엘라스토머 물질이다. 일부 실시형태에서, 뚜껑은 낮은 수증기 전달률을 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 용기 및 제2 용기는 재구성 용액의 제2 용기로부터 제1 용기로의 자동 전달을 위해서 개작된 장치 내에 혼입된다.
도 1은 마그네슘을 갖거나 또는 갖지 않는 동결건조되고, 이어서 다양한 온도에서 건조 저장된 샘플 중에서 결정된 활성도를 나타낸 도면.
도 2는 동결건조된 펠릿으로부터 회복된 활성도에 대한 실온 저장 시간(동결건조 전 벌크 시약의 저장)의 영향을 나타낸 도면. 벌크 시약을 다수의 조건 하에서 저장하고, 건조시키고, 핵산 증폭 및 검출 반응에서 사용하여 샘플로부터 인플루엔자 A를 확인하였다.
도 3A, 3B, 및 3C는 KCl 없이, MgCl2가 있거나 또는 없이 벌크 시약으로부터 제조된 건조된 단일 단위 용량(SUD) 펠릿 조성물의 재구성된 형태를 사용하여 수행되고, 일정 시간 기간 동안 실온에서 또는 얼음 상에서 인큐베이션된 증폭 검정 및 검출 검정에 대한 상대적인 형광 단위(RFU)를 나타낸 히스토그램 플롯.
도 4는 MgCl2의 존재 또는 부재 하에서 미리-건조된 벌크 시약을 인큐베이션시키는 것이 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 호흡기세포 융합 바이러스(RSV)에 대한 후속 핵산 멀티플렉스 증폭 검정에 대해서 갖는 효과를 나타낸 생물분석기 젤-유사 영상. MgCl2가 없고, 그 다음 건조되어 MgCl2가 없는 건조된 조성물을 생성하는 벌크 시약은 증폭 반응 전에 첨가된 MgCl2를 가졌다. 미리-건조된 벌크 시약 중에서 MgCl2와 함께 인큐베이션된 시약은 비-특이적 저분자량 증폭(스미어(smear))을 나타내는데, 이것은 프라이머-이량체 및 이어서 의도된 핵산 표적의 더 낮은 증폭 효율로 이어지는 다른 비논리적인 사건을 나타내는 저분자량 부산물의 형성을 나타낸다. 미리-건조된 벌크 시약 중에서 MgCl2 없이 인큐베이션된 시약은 MgCl2이 미리-건조된 벌크 시약 중에 존재하는 조건과 비교해서 더 강한 구별되는 표적 밴드 및 낮은 부산물 형성을 나타내는데, 이는 MgCl2를 제외시킴으로써 벌크 형성 마스터 믹스에서 안정성이 개선됨을 나타낸다. 레인 1은 마스터 믹스에서 2.5mM MgCl2를 갖는 얼음 냉각된 플레이트 상에서 90분 후 수득된 결과이고; 레인 2는 마스터 믹스에서 MgCl2 없이 얼음 플레이트 상에서 90분 후 수득된 결과이고; 레인 3은 마스터 믹스에서 2.5mM MgCl2가 있는 미리-냉각된 플레이트 상에서 실온에서 90분 후 수득된 결과이고; 레인 4는 마스터 믹스에서 MgCl2 없이 미리 냉각된 플레이트 상에서 실온에서 90분 후 수득된 결과이고; 레인 5는 마스터 믹스에서 2.5mM MgCl2를 갖는 얼음 냉각된 플레이트 상에서 180분 후에 수득된 결과이고; 레인 6은 마스터 믹스에서 MgCl2 없이 얼음 냉각된 플레이트 상에서 180분 후 수득된 결과이고; 레인 7은 마스터 믹스에서 2.5mM MgCl2와 함께 실온에서 180분 후 수득된 결과이고; 레인 8은 마스터 믹스에서 MgCl2 없이 실온에서 180분 후 수득된 결과이다.
도 5는 마커로서 인플루엔자 A를 사용한, MgCl2가 없는 벌크 제형의 더 긴 안정성을 나타낸 도면. 실온에서 3.75 내지 7.75시간 동안 인큐베이션된 벌크 시약의 상대적인 형광 단위(RFU)로서 측정된, 증폭 반응은 새로운 액체 대조군과 대등하였는데, 이는 MgCl2가 마스터 믹스로부터 제외되는 경우 실온에서 7.75시간 초과 동안 벌크 시약의 안정성을 확인해준다.
도 6은 5170cm-1(A5170)의 공간 파장에서 푸리에 변환 근적외선(FT-nIR) 분광학에 의해서 결정되는 바와 같은 3종의 제형의 상대적인 흡광도로서 측정된 동결건조된 시약의 평균 잔류 수분을 나타낸 도면.
도 7은 흡광도로서 측정된, 잔류 수분에 대한 KCl 농도의 영향을 나타낸 도면.
도 2는 동결건조된 펠릿으로부터 회복된 활성도에 대한 실온 저장 시간(동결건조 전 벌크 시약의 저장)의 영향을 나타낸 도면. 벌크 시약을 다수의 조건 하에서 저장하고, 건조시키고, 핵산 증폭 및 검출 반응에서 사용하여 샘플로부터 인플루엔자 A를 확인하였다.
도 3A, 3B, 및 3C는 KCl 없이, MgCl2가 있거나 또는 없이 벌크 시약으로부터 제조된 건조된 단일 단위 용량(SUD) 펠릿 조성물의 재구성된 형태를 사용하여 수행되고, 일정 시간 기간 동안 실온에서 또는 얼음 상에서 인큐베이션된 증폭 검정 및 검출 검정에 대한 상대적인 형광 단위(RFU)를 나타낸 히스토그램 플롯.
도 4는 MgCl2의 존재 또는 부재 하에서 미리-건조된 벌크 시약을 인큐베이션시키는 것이 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 호흡기세포 융합 바이러스(RSV)에 대한 후속 핵산 멀티플렉스 증폭 검정에 대해서 갖는 효과를 나타낸 생물분석기 젤-유사 영상. MgCl2가 없고, 그 다음 건조되어 MgCl2가 없는 건조된 조성물을 생성하는 벌크 시약은 증폭 반응 전에 첨가된 MgCl2를 가졌다. 미리-건조된 벌크 시약 중에서 MgCl2와 함께 인큐베이션된 시약은 비-특이적 저분자량 증폭(스미어(smear))을 나타내는데, 이것은 프라이머-이량체 및 이어서 의도된 핵산 표적의 더 낮은 증폭 효율로 이어지는 다른 비논리적인 사건을 나타내는 저분자량 부산물의 형성을 나타낸다. 미리-건조된 벌크 시약 중에서 MgCl2 없이 인큐베이션된 시약은 MgCl2이 미리-건조된 벌크 시약 중에 존재하는 조건과 비교해서 더 강한 구별되는 표적 밴드 및 낮은 부산물 형성을 나타내는데, 이는 MgCl2를 제외시킴으로써 벌크 형성 마스터 믹스에서 안정성이 개선됨을 나타낸다. 레인 1은 마스터 믹스에서 2.5mM MgCl2를 갖는 얼음 냉각된 플레이트 상에서 90분 후 수득된 결과이고; 레인 2는 마스터 믹스에서 MgCl2 없이 얼음 플레이트 상에서 90분 후 수득된 결과이고; 레인 3은 마스터 믹스에서 2.5mM MgCl2가 있는 미리-냉각된 플레이트 상에서 실온에서 90분 후 수득된 결과이고; 레인 4는 마스터 믹스에서 MgCl2 없이 미리 냉각된 플레이트 상에서 실온에서 90분 후 수득된 결과이고; 레인 5는 마스터 믹스에서 2.5mM MgCl2를 갖는 얼음 냉각된 플레이트 상에서 180분 후에 수득된 결과이고; 레인 6은 마스터 믹스에서 MgCl2 없이 얼음 냉각된 플레이트 상에서 180분 후 수득된 결과이고; 레인 7은 마스터 믹스에서 2.5mM MgCl2와 함께 실온에서 180분 후 수득된 결과이고; 레인 8은 마스터 믹스에서 MgCl2 없이 실온에서 180분 후 수득된 결과이다.
도 5는 마커로서 인플루엔자 A를 사용한, MgCl2가 없는 벌크 제형의 더 긴 안정성을 나타낸 도면. 실온에서 3.75 내지 7.75시간 동안 인큐베이션된 벌크 시약의 상대적인 형광 단위(RFU)로서 측정된, 증폭 반응은 새로운 액체 대조군과 대등하였는데, 이는 MgCl2가 마스터 믹스로부터 제외되는 경우 실온에서 7.75시간 초과 동안 벌크 시약의 안정성을 확인해준다.
도 6은 5170cm-1(A5170)의 공간 파장에서 푸리에 변환 근적외선(FT-nIR) 분광학에 의해서 결정되는 바와 같은 3종의 제형의 상대적인 흡광도로서 측정된 동결건조된 시약의 평균 잔류 수분을 나타낸 도면.
도 7은 흡광도로서 측정된, 잔류 수분에 대한 KCl 농도의 영향을 나타낸 도면.
정의
용어 "약"은 조성물의 활성도 또는 안정성에 어떠한 유의한 효과도 없는 조성물의 성분의 양의 비실질적인 변동을 나타내다.
"벌크화제"는 건조 및 저장 동안 단백질 및 다른 시약의 침착을 위한 매트릭스를 제공한다(Carpenter et al (2002) Rational design of stable lyophilized protein formulations. Kluwer Academic/Plenum, New York, pp. 109-133). 벌크화제는 생성물 "케이크" 또는 다른 구조를 형성하기 위해서 사용될 수 있고, 단백질이 건조 동안 바이알로부터 손실되는 것을 예방하고, 단백질 안정성을 증가시킬 수 있다.
킬레이팅제는 효소 활성도를 위해서 요구되는 2가 이온, 예컨대, Mg2+ 이온 또는 Mn2+ 이온을 비롯한, 2가 이온을 겪리시키는 작용제이다.
용어 "동결건조", "동결건조된", 및 "냉각-건조된"은, 건조될 물질이 먼저 동결되고, 이어서 얼음 또는 동결된 용매가 진공 환경에서 승화에 의해서 제거되는 공정을 지칭한다.
핵산 혼성화와 관련하여 용어 "스트린전트"("스트린전트 혼성화 조건" 또는 "스트린전트 조건" 포함)는 특정 올리고뉴클레오타이드가 시험 샘플 중에 존재하는 다른 핵산에 비해서 이의 표적 핵산과 혼성화될 수 있는 조건을 지칭한다. 이들 조건은 추구되는 올리고뉴클레오타이드의 GC 함량 및 길이, 혼성화 온도, 혼성화 시약 또는 용액의 조성, 및 혼성화 특이성도를 비롯한 인자에 따라서 달라질 수 있다는 것이 인지될 것이다. 적절한 혼성화 조건은 프로브, 증폭 올리고뉴클레오타이드, 표적 포획 올리고뉴클레오타이드, 차단제 및 다른 올리고뉴클레오타이드에 대해서 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있거나; 서열 조성을 기반으로 예측될 수 있거나; 또는 일상적인 시험 방법을 사용함으로써 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), §§ 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 및 11.47-11.57, 특히 §§ 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 및 11.55-11.57] 참고).
증폭 올리고머는 표적 핵산의 템플레이트-의존형 복제를 지지할 수 있는 프라이머 또는 프로모터 프라이머이다. 증폭 올리고머 쌍은 템플레이트의 반대 가닥의 템플레이트 의존형 복제를 지지하는 이러한 올리고머의 쌍이다. 멀티플렉스 증폭은 다수의 증폭 올리고머 쌍을 사용하여 동시에 수행되는 증폭이다.
프로브는 증폭 산물에 혼성화되어 증폭 산물의 존재 또는 양을 드러낼 수 있는 올리고뉴클레오타이드이다. 이러한 프로브는 흔히 형광 또는 다른 검출 신호를 제공하는 분자를 혼입하는데, 이러한 경우에 이들은 검출 가능하게 표지된 프로브로서 지칭된다.
프라이머-프로브 세트는 템플레이트 핵산으로부터 증폭 산물을 생성하고, 템플레이트 핵산으로부터 증폭 산물을 검출하도록 구성된 프라이머와 프로브의 조합물이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "표지"는 검출 가능하거나 검출 가능한 신호로 이어지는 프로브 또는 dNTP에 직접 또는 간접적으로 연결된 모이어티 또는 화합물을 지칭한다. 직접 표지화는 공유 결합 또는 비공유 상호작용, 예를 들어 수소 결합, 소수성 상호작용 및 이온 상호작용, 또는 킬레이트 또는 배위 복합체의 형성을 비롯한, 표지를 프로브에 연결시키는 결합 또는 상호작용을 통해서 일어날 수 있다. 간접 표지화는 직접 또는 간접적으로 표지되고, 검출 가능한 신호를 증폭시킬 수 있는 브릿징 모이어티 또는 "링커", 예컨대, 결합 쌍 부재, 항체 또는 추가적인 올리고머의 사용을 통해서 일어날 수 있다. 표지는 임의의 검출 가능한 모이어티, 예컨대, 방사성핵종, 리간드(예를 들어, , 아비딘), 효소 또는 효소 기질, 반응성 기, 또는 발색단(예를 들어, 검출 가능한 색상을 부여하는 염료, 입자 또는 비드), 발광 화합물(예를 들어, 생물발광, 인광 또는 화학발광 표지), 또는 형광단을 포함한다. 표지는, 혼합물 중의 결합된 표지된 프로브가 결합되지 않은 표지된 프로브의 것과 상이한 검출 가능한 변화, 예를 들어 안정성 또는 차동 분해 특성을 나타내는 균질 검정에서 검출 가능할 수 있다. 표지를 핵산에 부착하고, 표지를 검출하는 합성법 및 방법은 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Chapter 10]; 미국 특허 제5,658,737호, 제5,656,207호, 제5,547,842호, 제5,283,174호, 및 제 4,581,333호 참고). 하나를 초과하는 표지 및 하나를 초과하는 유형의 표지가 특정 프로브 상에 존재할 수 있거나, 또는 검출은 각각의 프로브가 검출 가능한 신호를 생성하는 화합물로 표지된 프로브의 혼합물을 사용할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,180,340호 및 제6,350,579호).
"재구성 시간"은 건조된 제형을 용액으로 재수화시켜 용액을 생성하는 데 요구되는 시간이다. 바람직하게는, 그러나 항상 그렇지는 않지만, 제형에 따라서, 재구성된 용액은 육안으로 입자 또는 탁도가 없는 것이다.
상대적인 형광 단위(RFU)는 증폭 산물의 척도이고, 증폭 산물을 생성하는 샘플 중의 핵산 분석물의 영향에 의한 것이다.
Ct는 실시간 PCR에서 지수기에 도달하는데 요구되는 사이클의 수를 지칭한다. Ct는 샘플 중의 분석물의 양에 반비례한다.
양성도(positivity)는, 검정 반응 결과와 관련된 경우, 샘플로부터 생성되고, 역치값(예컨대 RFU 값)을 초과한 실험 데이터를 지칭한다. 역치값은 사용자에 의해서 설정되고, 전형적으로 주어진 검정에 대해서 수득된 경험적인 데이터를 기반으로 결정된다. 전형적으로, 핵산 증폭 검정의 경우, 역치값은 양성 샘플이 역치를 넘어, 검정의 지수 성장기로 이동하도록 설정된다. 양성도 값은 역치값을 넘은 단일 샘플 또는 역치값을 넘은 복수의 샘플의 백분율을 기준으로 한다. 예를 들어, 복수의 샘플이 12개인 경우, 그리고 넘은 샘플의 수가 6인 것으로 결정된 경우, 양성도는 "50%"이다. 역치값은 흔히 배경 값을 제외하도록 설정된다.
"단일 단위 용량" 또는 "SUD"는 단일 샘플 상에서 분자 검정을 수행하기 위해서 사용되는 반응 혼합물의 부피를 지칭한다. 단일 단위 용량은 액체 형태 또는 건조된 형태로 존재할 수 있다. 예의 방식으로, 단일 단위 용량은 단일 용기 중에서 단일 샘플의 증폭에 유용한 시약을 함유하는 건조된 펠릿일 수 있다.
LOD는 분석물의 검출 한계치이다. LOD + 1은 사용자가 + 1 로그를 검출한 LOD이다. 즉, LOD + 1은 LOD인 분석물의 수의 10배이다.
본 명세서에서 값의 범위는 그 내의 모든 정수, 및 실용적인 경우 그 내의 모든 분수를 포함한다. 예를 들어, pH 2.0 내지 pH 5.0의 pH 값의 범위는 그 내의 모든 정수 및 분수를 포함할 것이지만, 23 내지 30개의 인접 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드에 대한 길이 범위는 그 내의 모든 정수 만을 포함할 것이다.
본 개시내용이 명시된 성분을 포함하는 조성물을 지칭하는 경우에는 언제든, 본 개시내용은 명시된 성분으로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 조성물을 또한 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
상세한 설명
I. 일반
본 개시내용은 분자 검정, 예컨대, 핵산 증폭을 수행하기 위한 미리 동결건조된 키트의 불안정성이 무기염의 존재로 인한 것이라는 이해를 부분적으로 전제로 한다. 이들 염은 건조 전, 건조 동안 및 건조 후에 바람직하지 않은 혼성화 산물 또는 다른 부산물을 생성할 수 있다. 이들 염은 또한 건조된 조성물을 흡습성으로 만들어서 조성물이 그의 주변 환경으로부터 물을 흡수하게 한다. 따라서, 건조된 조성물 중의 염 함량으로 인해서, 습도에 대한 제한된 노출, 냉동 또는 급속 냉동 저장 및/또는 건조제의 존재 하에서의 저장이 요구된다. 물 및 염의 존재는 건조된 조성물의 중합효소 성분이 조기에 활성도를 잃게 하고, 또한 서로에 대한 핵산의 혼성화를 용이하게 할 수 있다. 염의 존재는 또한 예를 들어, 동결건조에 의해서 건조된 시약을 제조하는 능력을 감소시킬 수 있다. 이에 반해서, 효소 함유 조성물 중에서의 염의 부재는 효소 성분의 변성으로 이어지고, 따라서 이들 효소의 무염 조성물이 바람직하지 않게 된다. 본 개시내용은 무기염이 본질적으로 존재하지 않는 벌크 시약으로부터 핵산 기반 반응 혼합물을 수행하기 위한 건조 벌크 시약에 의해서 이러한 문제점을 극복하였다. 이러한 염은 건조된 조성물의 재구성 시에 공급된다. 무기염이 중합효소의 안정성에 필수적이라는 예상과 달리, 무기염이 본질적으로 존재하지 않는 건조된 핵산 기반 반응 혼합물이 재구성 시 활성도를 완전히 또는 실질적으로 보유하면서 장기간 동결 저장될 수 있다는 것을 발견하였다.
II. 벌크 시약 및 건조된 펠릿.
본 개시내용에 따른 벌크 시약(때로는 미리동결건조된 혼합물, 용액, 수용액 또는 조성물이라 지칭됨)은 전형적으로 중합효소, 핵산 기반 증폭 반응에서 사용하기 위한 뉴클레오타이드, 유기 완충제, 바람직하게는 Tris, 및 벌크화제, 예컨대, 트레할로스 또는 라피노스 또는 이들의 조합물을 포함한다. 벌크 시약은 1종 이상의 핵산을 또한 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 벌크 시약은 역전사효소 효소, 킬레이트제 및 RNase 저해제를 추가로 포함할 수 있다. 용어 벌크 시약은 상기에 기술된 바와 같은 수용액과 관련하여 사용되는데, 여기서 수용액은 실질적으로 동일한 농도의 시약을 갖는 2개 이상의 분취물로 분리될 것이다. 또한, 벌크 시약의 분취된 분획은 벌크 시약이라고 지칭될 수 있다. 그 맥락과 관계없이, 벌크 시약은 본 명세서에 기술된 바와 같은 수용액이다.
이러한 벌크 시약은 무기염이 본질적으로 존재하지 않는데, 이는 무기염의 농도가 개별적으로 그리고 총괄적으로 7mM 미만, 바람직하게는 1mM 미만이라는 것을 의미한다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 1mM 미만, 0.5mM 미만, 0.1mM 미만 또는 0.05mM 미만이다. 바람직하게는, Na+의 농도는 1mM 미만, 0.5mM 미만, 0.1mM 미만 또는 0.05mM 미만이다. 바람직하게는, K+의 농도는 1mM 미만, 0.5mM 미만, 0.1mM 미만 또는 0.05mM 미만이다. 바람직하게는, Cl-의 농도는 1mM 미만, 0.5mM 미만, 0.1mM 미만 또는 0.05mM 미만이다.
바람직하게는, Mg2+의 농도는 1mM 미만이고, Na+의 농도는 1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.5mM 미만이고, Na+의 농도는 0.5mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.1mM 미만이고, Na+의 농도는 0.1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.05mM 미만이고, Na+의 농도는 0.05mM 미만이다.
바람직하게는, Mg2+의 농도는 1mM 미만이고, K+의 농도는 1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.5mM 미만이고, K+의 농도는 0.5mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.1mM 미만이고, K+의 농도는 0.1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.05mM 미만이고, K+의 농도는 0.05mM 미만이다.
바람직하게는, Mg2+의 농도는 1mM 미만이고, Cl-의 농도는 1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.5mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.5mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.1mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.05mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.05mM 미만이다.
바람직하게는, Na+의 농도는 1mM 미만이고, K+의 농도는 1mM 미만이다. 바람직하게는, Na+의 농도는 0.5mM 미만이고, K+의 농도는 0.5mM 미만이다. 바람직하게는, Na+의 농도는 0.1mM 미만이고, K+의 농도는 0.1mM 미만이다. 바람직하게는, Na+의 농도는 0.05mM 미만이고, K+의 농도는 0.05mM 미만이다.
바람직하게는, Na+의 농도는 1mM 미만이고, Cl-의 농도는 1mM 미만이다. 바람직하게는, Na+의 농도는 0.5mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.5mM 미만이다. 바람직하게는, Na+의 농도는 0.1mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.1mM 미만이다. 바람직하게는, Na+의 농도는 0.05mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.05mM 미만이다.
바람직하게는, K+의 농도는 1mM 미만이고, Cl-의 농도는 1mM 미만이다. 바람직하게는, K+의 농도는 0.5mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.5mM 미만이다. 바람직하게는, K+의 농도는 0.1mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.1mM 미만이다. 바람직하게는, K+의 농도는 0.05mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.05mM 미만이다.
바람직하게는, Mg2+의 농도는 1mM 미만이고, Na+의 농도는 1mM 미만이고, K+의 농도는 1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.5mM 미만이고, Na+의 농도는 0.5mM 미만이고, K+의 농도는 0.5mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.1mM 미만이고, Na+의 농도는 0.1mM 미만이고, K+의 농도는 0.1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.1mM 미만이고, Na+의 농도는 0.1mM 미만이고, K+의 농도는 0.1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.05mM 미만이고, Na+의 농도는 0.05mM 미만이고, K+의 농도는 0.05mM 미만이다.
바람직하게는, Na+의 농도는 1mM 미만이고, K+의 농도는 1mM 미만이고, Cl-의 농도는 1mM 미만이다. 바람직하게는, Na+의 농도는 0.5mM 미만이고, K+의 농도는 0.5mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.5mM 미만이다. 바람직하게는, Na+의 농도는 0.1mM 미만이고, K+의 농도는 0.1mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.1mM 미만이다. 바람직하게는, Na+의 농도는 0.1mM 미만이고, K+의 농도는 0.1mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.1mM 미만이다. 바람직하게는, Na+의 농도는 0.05mM 미만이고, K+의 농도는 0.05mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.05mM 미만이다.
바람직하게는, Mg2+의 농도는 1mM 미만이고, K+의 농도는 1mM 미만이고, Cl-의 농도는 1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.5mM 미만이고, K+의 농도는 0.5mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.5mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.1mM 미만이고, K+의 농도는 0.1mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.1mM 미만이고, K+의 농도는 0.1mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.05mM 미만이고, K+의 농도는 0.05mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.05mM 미만이다.
바람직하게는, Mg2+의 농도는 1mM 미만이고, Na+의 농도는 1mM 미만이고, Cl-의 농도는 1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.5mM 미만이고, Na+의 농도는 0.5mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.5mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.1mM 미만이고, Na+의 농도는 0.1mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.1mM 미만이고, Na+의 농도는 0.1mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.05mM 미만이고, Na+의 농도는 0.05mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.05mM 미만이다.
바람직하게는, Mg2+의 농도는 1mM 미만이고, Na+의 농도는 1mM 미만이고, K+의 농도는 1mM 미만이고, Cl-의 농도는 1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.5mM 미만이고, Na+의 농도는 0.5mM 미만이고, K+의 농도는 0.5mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.5mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.1mM 미만이고, Na+의 농도는 0.1mM 미만이고, K+의 농도는 0.1mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.1mM 미만이다. 바람직하게는, Mg2+의 농도는 0.05mM 미만이고, Na+의 농도는 0.05mM 미만이고, K+의 농도는 0.05mM 미만이고, Cl-의 농도는 0.05mM 미만이다.
증폭 반응으로의 혼입을 위한 뉴클레오타이드는 전형적으로 dNTP로서 제공된다. dNTP에 대한 예시적인 농도는 0.1 내지 0.3mM의 dATP; 0.1 내지 0.3mM의 dGTP; 0.1 내지 0.3mM의 dCTP; 0.2 내지 0.6mM의 dTTP; 0.2 내지 0.6mM의 dUTP; 바람직하게는 약 0.2mM의 dATP; 약 0.2mM의 dGTP; 약 0.2mM의 dCTP 및 0.4mM의 dTTP 또는 dUTP이다. 증폭 반응으로의 혼입을 위한 뉴클레오타이드는 또한 표지된 dNTP로서 제공될 수 있고, 예컨대, 서열결정 반응에 유용하다.
이러한 혼합물은 효소 및 다른 성분의 선택에 의해서 PCR, RT-PCR 및 전사 매개된 증폭을 비롯한 상이한 유형의 증폭을 위해서 맞춤 조정될 수 있다.
DNA 중합효소 효소는 상업적으로 입수 가능하거나 사용자에 의해서 제조될 수 있다. 중합효소 효소의 일례는 퀴아젠(Qiagen)(미국 메릴랜드주 저먼타운 소재, cat# 201203)로부터 상업적으로 입수 가능한 Taq 중합효소를 포함한다. Taq 중합효소의 또 다른 예는 고태크(GoTaq)(등록상표) G2 Flexi DNA 중합효소(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재, cat# M7801)로서 상업적으로 입수 가능하다. 상업적으로 입수 가능한 다른 DNA 중합효소는 Tth DNA 중합효소(예를 들어, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재, cat# 11480022001) 및 키메라 DNA 중합효소, 예컨대, 퓨전(Phusion)(등록상표) 하이-피델리티(High-Fidelity) DNA 중합효소(NEB, 미국 메사추세츠주 입스위치 소재, cat# M0530S)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 핫-스타트 DNA 중합효소 효소가 또한 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, Taq 중합효소는 고태크(등록상표) 핫 스타트 중합효소(프로메가, cat# M5001)로서 상업적으로 입수 가능하다. 고태크(등록상표) 핫 스타트 중합효소는 항체 매개된 핫 스타트 효소이고, 여기서 Taq 중합효소는 중합효소 활성도를 차단하는 항체에 결합된다. 차단 항체는 고온을 사용하여 변성되고, 따라서 PCR 반응의 초기 가열 단계 동안, 항체는 변성되고, 중합효소 활성도가 회복된다. 다양한 항체, 예를 들어, TAQSTART 항체(클론테크 래보러토리즈(Clontech Laboratories), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재, cat#R028A)가 핫 스타트 방법과 함께 사용될 수 있다. 유사하게, 화학적으로 매개되는 핫 스타트 중합효소를 비롯한 다른 핫 스타트 중합효소 효소가 입수 가능하다. 동등한 중합효소 및 항체가 다양한 상업적 공급원으로부터 입수 가능하고, 대안적으로 사용자에 의해서 제조될 수 있다.
역전사효소 효소는 상업적으로 입수 가능하거나 사용자에 의해서 제조될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 역전사효소의 예는 MMLV(말로니 뮤린 백혈병 바이러스(Maloney Murine Leukemia Virus)) 역전사효소 및 슈퍼스크립트(SuperScript)(등록상표) III 역전사효소(예를 들어, 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재, cat# 28025-013 및 18080-044), MMLV RT(시그마-알드리치, cat# M1302), AMV 역전사효소(NEB, 미국 메사추세츠주 입스위치 소재 cat# M0277S), 및 고스크립트(GoScript)(상표명) 역전사효소(프로메가, cat# A50003)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 고스크립트 역전사효소는 역전사효소 및 정량 PCR 증폭에 대해서 최적화된 제1-가닥 cDNA의 합성을 위한 시약 세트를 포함한다. 동등한 역전사효소 및 시약이 다양한 상업적 공급원으로부터 입수 가능하고, 대안적으로 사용자에 의해서 제조될 수 있다.
단일 단위 용량에서 DNA 중합효소 효소에 대한 예시적인 농도는 0.01 내지 1.0U/ul이다. 예를 들어 0.32U/ul, 또는 0.4U/ul 또는 0.72U/ul, 또는 0.32 내지 0.4U/ul, 또는 0.4 내지 0.72U/ul, 또는 0.05 내지 0.3U/ul, 또는 0.8 내지 1.0U/ul. DNA 중합효소 1 단위는 30분 동안 74℃에서 10나노몰의 dNTP가 산-불용성 물질 내로 혼입되는 것을 촉매작용하는 데 요구되는 효소의 양으로서 정의된다. 단일 단위 용량 중의 역전사효소 효소의 예시적인 농도는 0.01U/ul 내지 1.0U/ul이다. 역전사효소 1 단위는 10분 동안 37℃에서 데옥시뉴클레오타이드 1nmol이 산 침전 가능한 물질 내로 이동하는 것을 촉매작용하는 데 요구되는 효소의 양으로서 정의된다.
바람직한 유기 완충제는 Tris이다. 본 개시내용의 벌크 시약 내에 혼입될 수 있는 대안적인 유기 완충제는 인산염, 시트르산염, 아세트산염, CHES, 히스티딘 및 굳(Good) 완충제, 예컨대, HEPES, MES, MOPS, 트리신 및 글라이신아마이드, 뿐만 아니라 완충제 조합물을 포함한다. 다른 유기 완충제는 석신산염, 스트르산염, 글루콘산염, 인산염 등을 포함한다. 바람직한 완충제는 약 5.5 내지 약 7.0 또는 약 6.0 내지 약 7.5의 pH 범위; 바람직하게는 약 6.5의 pH에서 효과적이다. pH를 이러한 범위로 제어하는 완충제의 예는 석신산염(예컨대 석신산나트륨), 글루콘산염, 히스티딘, 시트르산염 및 다른 유기산 완충제를 포함한다.
바람직한 벌크화제는 트레할로스 또는 라피노스 또는 이들의 조합물이다. 사용될 수 있는 다른 벌크화제는 수크로스, 만니톨, 트레할로스와 만니톨, 수크로스와 만니톨, 수크로스와 글라이신, 및 하이드록시에틸 전분을 포함한다(문헌[Cleland et al (2001) J. Pharm. Sci. 90:310; Meyer et al (2009) Eur. J. Pharm. Sci. 38:29; Webb et al (2003) J. Pharm. Sci. 92:715; Garzon Rodrigues et al (2004) J. Pharm. Sci. 93:684; Qiu et al (2012) Int. J. Pharmaceuticals. 437:51; Van Dijk-Wolthuis et al (1997) Polymer. 38:6235 6242] 참고). 하이드록시에틸 전분은 헵타전분, 헥사전분, 펜타전분, 및 테트라전분으로 분류된다(예를 들어, 국제 특허 제WO2014/099198호(Chow) 참고). 벌크화제는 바람직하게는 0.16M 내지 0.32M, 또는 대안적으로는 0.04 내지 0.12M, 0.08 내지 0.16M, 0.12 내지 0.20M, 0.16 내지 0.24M, 0.20 내지 0.28M, 0.24 내지 0.32M, 0.28 내지 0.36M, 0.32 내지 0.40M, 또는 상기 범위의 임의의 조합, 예컨대, 0.08 내지 0.24M의 농도로 존재한다.
벌크 시약은 1종 이상의 핵산, 예컨대, 예를 들어, 증폭 올리고머(예를 들어, 프라이머, T7 프로모터 올리고뉴클레오타이드), 포획 프로브, 검출 프로브, 택맨 프로브, 헤어핀 검출 프로브, 어댑터, 헤어핀 어댑터, 양성 대조군 템플레이트, 및 음성 대조군 템플레이트를 포함할 수 있다.
벌크 시약의 임의적인 추가적인 성분은 RNase 저해제, PCR 시약, 세정제, 쯔비터이온성 세정제, 음이온성 세정제, 양이온성 세정제, 비이온성 세정제, 계면활성제, 프라이머, 프로브, 템플레이트, 킬레이팅제, 메틸 파라벤 및 프로필 파라벤을 포함한다. 메틸 파라벤에 대한 예시적인 농도는 0.01 내지 0.024중량%, 예를 들어 약 0.016%, 또는 대안적으로, 약 0.010%, 약 0.014%, 약 0.016%, 약 0.020%, 약 0.024%, 및 이들 값에 포함되는 임의의 범위이다. 프로필 파라벤의 예시적인 농도 범위는 0.002 내지 0.016% 또는 0.008%, 또는 대안적으로, 약 0.002%, 약 0.004%, 약 0.006%, 약 0.008%, 약 0.010%, 약 0.012%, 약 0.014%, 약 0.016% 또는 이들 값에 포함되는 임의의 범위이다. 1단위는 5ng의 리보뉴클레아제 A의 활성도를 50% 저해하는 데 요구되는 RNasin(등록상표) 리보뉴클레아제 저해제의 양으로서 정의된다. 활성도는 리보뉴클레아제 A에 의한 사이티딘 2',3'-사이클릭 모노포스페이트의 가수분해의 저해에 의해서 측정된다.
킬레이팅제는 EDTA(에틸렌다이아민테트라아세트산), EGTA(에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에터)-N,N,N',N'-테트라아세트산), EDDS(에틸렌다이아민-N,N'-다이석신산), MGDA(메틸글라이신다이아세트산), 및 DTPA(다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산) 중 1종 이상을 포함한다. 킬레이팅제에 대한 예시적인 농도는 1.0mM 내지 2.5mM이다.
RNase 저해제 단백질은 1:1비에서 RNases에 대한 비공유 결합에 의해서 RNase A 패밀리 및 인간 태반 RNases를 저해하는 네이티브 및 재조합 50kDa 단백질(프로메가 코프., 미국 위스콘슨주 매디슨 소재)이다(문헌[Botella-Estrada et al (2001) Cancer Gene Ther. 8:278; Polakowski et al (1992) EXS. 61:428] 참고). RNase 저해제 단백질은 재조합 단백질 또는 네이티브 단백질 중 어느 하나일 수 있다. RNase 저해제의 예시적인 농도는 약 0.04U/ul 내지 약 0.4U/ul이다.
벌크 시약은 세정제를 낮은 농도로 함유할 수 있다. 세정제는 다수의 판매사(예를 들어 제노 테크놀로지, 인크.(Geno Technology, Inc.), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수 가능한 이온성(양이온성 또는 음이온성), 비이온성 및 쯔비터이온성 세정제를 포함한다. 예는 리튬 라우릴 설레이트, 암프롤륨 하이드로클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 콜린 p-톨루엔설포네이트 염, 도데실트라이메틸암모늄 클로라이드, 3-[(3-콜아미도프로필)다이메틸암모니오]-1-프로판설포네이트, 에틸헥사데실다이메틸암모늄 브로마이드, 헥사데실피리디늄 클로라이드, 헥사데실트라이메틸암모늄 클로라이드, 나트륨 도데실 설페이트, 헥사데실트라이메틸암모늄 p-톨루엔설포네이트, 루비쿼트(luviquat)(상표명), 메틸벤제토늄 클로라이드, 미리스틸트라이메틸암모늄 브로마이드, N,N',N'-폴리옥시에틸렌 (10)-N-탈로우-1,3-다이아미노프로판 액체, 옥시페노늄 브로마이드, 테트라헵틸암모늄 브로마이드, 테트라키스(데실)암모늄 브로마이드, 트라이카프릴릴메틸암모늄 클로라이드, 아미도설포베타인-16, 트라이도데실메틸암모늄 클로라이드, 트라이메틸옥타데실암모늄 브로마이드, 노니뎃(Nonidet) P-40(등록상표), 트윈(Tween)-20(등록상표), 트윈-80(등록상표), 브리즈(Brij)-35(등록상표), 트리톤(Triton) X-100(등록상표)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
벌크 시약의 예시적인 부피는 약 1ul, 약 5ul, 약 10ul, 약 20ul, 약 24ul, 약 50ul, 약 100ul, 약 200ul, 약 300ul, 약 400ul, 약 500ul약 600ul, 약 700ul, 약 800ul, 약 900ul, 약 1,000ul(1㎖), 약 2㎖, 약 5㎖, 약 10㎖, 약 20㎖, 약 50㎖ 등을 포함한다. 단일 단위 용량의 예시적인 부피는 약 1ul 내지 약 1㎖를 포함한다. 재구성된 건조된 조성물은 건조된 조성물을 형성하는 데 사용된 것과 동일한 부피로, 더 적은 부피로, 또는 더 많은 부피로 형성될 수 있다. 더 적은 부피는 벌크 시약에 대해서 약 90%, 약 80%, 약 60%, 약 40%, 약 20%, 약 10% 또는 약 5%일 수 있다. 더 많은 부피는 벌크 시약의 부피의 약 120%, 140%, 160%, 180%, 200%(2-배), 약 4-배, 약 6-배, 약 8-배, 약 10-배, 약 20-배일 수 있다.
가수분해될 샘플은 재구성 이전에, 재구성과 동시에, 또는 재구성 후에 벌크 시약에 첨가될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 재구성 후 전체 건조된 조성물이 샘플과의 조합을 위해서 사용되고, 여기서 재구성 용액/샘플의 상대적인 부피는 예를 들어, 약 9.9/0.1, 9.8/0.2, 9.5/0.5, 9/1, 8/2, 7/3, 6/4, 5/5 등일 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 벌크 시약 중의 시약의 농도는 예를 들어, 0.0%(시약 없음), 0.001%, 0.004%, 0.008%, 0.0012%, 0.0016%, 0.0020%, 0.0030%, 0.0040%, 0.0050%, 0.0060%, 0.0080%, 0.01%, 0.02%, 0.04%, 0.06%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.8%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5% 등일 수 있다. 또한 "대략적으로" 상기 농도이고, 상기 농도보다 낮고, 상기 농도보다 높고, 상기 농도 중 임의의 둘을 포함하는 임의의 범위가 제공된다.
예시적인 벌크 시약 조성물은 0.1 내지 0.3mM, 보다 바람직하게는 0.2mM의 dATP, dGTP 및 dCTP, 뿐만 아니라 0.2 내지 0.6mM, 보다 바람직하게는 0.4mM의 dUTP 또는 dTTP, 및 0.3 내지 0.8U/㎕의 중합효소를 갖는다. 일부 조성물에서, 중합효소는 핫 스타트 Taq 중합효소이다. 일부 조성물에서, 중합효소는 고태크(등록상표)MDx 핫 스타트 중합효소이다. 일부 조성물은 또한 RNAasin(등록상표) RNAase 저해제를 0.12 내지 0.20U/㎕로 포함한다. 일부 조성물은 또한 EDTA를, 임의로 1.5 내지 2.0mM로 포함한다. 이러한 조성물은 또한 트레할로스를 0.16 내지 0.32M로, EDTA를 1.5 내지 2.0mM로 포함하고, 중합효소는 0.3 내지 0.45U/㎕의 Taq이다.
본 개시내용은 실시간 PCR 반응을 비롯한 PCR 반응을 위한 시약을 제공한다(Real-time PCR Handbook, Life Technologies (2014); Kutyavin et al (2000) Nucleic Acids Res. 28:655; Afonina et al (2002) Biotechniques. 32:940). 실시간 PCR에서, 마그네슘 염은 전형적으로 최종 농도 3 내지 6mM로 사용된다(상기 문헌[Real-time PCR Handbook]). 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 멀티플렉스 PCR 반응을 위한 시약을 제공하며, 즉 여기서 복수의 프라이머 쌍이 복수의 표적의 증폭 및 검출을 위해서 제공된다. 본 개시내용은 PCR 반응을 위한 프라이머 및 프로브를 제공한다. 프라이머 및/또는 프로브는 표적 혼성화 서열을 포함하고, 비-표적 혼성화 서열, 뉴클레오타이드 유사체, 검출 가능한 모이어티 및 비-뉴클레오타이드 링커 중 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, 국제 특허 제WO 2010/151566호 및 제WO 2013/126793호 참고). 써모사이클러(Thermocycler)가 사용 가능하다(어플라이드 바이오시스템즈 프로플렉스(Applied Biosystems ProFlex)(등록상표) PCR 시스템 및 베리티(Veriti)(등록상표) 열순환기(Thermal Cycler)). PCR 산물을 정량화하기 위한 젤 스캐너가 사용 가능하다(애질런트(Agilent)(등록상표) 2100 바이오어날라이저(Bioanalyzer)(등록상표), 바이오-라드(Bio-Rad)(등록상표) 덴시오메터(densitometer)).
벌크 시약의 형성 후, 그것을 건조 전에 상당한 기간 동안 실온에서 방치할 수 있다. 그 기간은 건조 단계가 개시되기 전 최대 8시간 동안, 또는 대안적으로, 건조 단계가 개시되기 전 최대 1시간, 최대 2시간, 최대 4시간, 최대 6시간, 최대 10시간, 최대 12시간, 최대 14시간 동안일 수 있다. 벌크 시약 중의 염의 포함은 이러한 인큐베이션 기간 동안 바람직하지 않은 혼성화 산물 및 다른 부산물을 유발한다. 이러한 바람직하지 않은 혼성화 및 부산물은 본 개시내용에 따라서, 7mM 이하의 무기염 농도를 갖고, 예를 들어 본질적으로 무기염이 없는 벌크 시약 조성물을 형성함으로써 감소 또는 제거된다.
벌크 시약 중의 무기염의 존재는 하기 바람직하지 않은 특성 중 하나 이상을 유발한다. 핵산은 함께 혼성화될 수 있고, 혼성화는 무기염, 예컨대, 칼륨, 나트륨, 망간, 마그네슘 및/또는 클로라이드의 존재에 의해서 자극된다. 또한 무기염, 예컨대, 망간 및 마그네슘의 존재 하에서, 바람직하지 않은 효소 활성도, 예컨대, 중합효소 진행도(processivity) 및/또는 트라이포스페이트 소모가 일어날 수 있다. 이러한 바람직하지 않은 활성도는 비-핫-스타트 효소를 사용하여 그리고 핫-스타트 효소를 사용하여 일어날 수 있다. 염의 존재 하에서의 핵산 혼성화 및 효소 활성도의 결과로서, 바람직하지 않은 부산물이 형성되기 시작할 수 있다. 추가로, 무기염은 흡습성이어서, 건조된 펠릿 내로 수분을 빨아들일 것이다. 건조된 펠릿의 재수화는 저장 안정성, 효소 안정성을 감소시키고, 추가적인 비논리적인 부생성물 형성을 허용한다.
건조된 펠릿은 시약을 함유하여 단일 단위 용량(SUD), 또는 임의로 2개 이상의 SUD를 제공할 수 있다. 단일 단위 용량은 하나를 초과하지 않는 단일 샘플에 대한 증폭 및/또는 검출 반응을 수행하는 데 필요한 시약의 수집물이다. 단일 단위 용량은 액체 시약 또는 건조된 펠릿을 지칭할 수 있다. 본 명세서에서 지칭되는 바와 같은 단일 단위 용량은 단일 샘플에 대한 증폭 및/또는 검출 반응을 수행하는 데 필요한 시약 모두를 함유할 필요는 없다는 것이 주목할 만하다. 단일 단위 용량은 증폭 및/또는 검출 반응을 수행하는 데 필요한 시약이 결여될 수 있다. 유사하게 단일 단위 용량은 증폭 및/또는 검출 반응을 수행하기에 불충분한 양의 시약을 함유할 수 있다. 단지 예의 방식으로, 건조된 단일 단위 용량 펠릿은 증폭 반응을 수행하기에 적절한 단위의 Taq 중합효소를 포함할 수 있지만, 마그네슘을 함유하지 않을 수 있다. 특정 실시형태에서, EDTA가 건조된 단일 단위 용량 펠릿에 첨가되어 펠릿 중에 존재하거나 재구성 용액에 의해서 첨가된 과량의 2가 이온(예를 들어, 마그네슘 및/또는 망간)을 킬레이팅할 수 있다. 이와 같은 예에서, 마그네슘 및/또는 망간이 후속으로 예컨대, 재구성 용액의 방식에 의해서, 건조된 단일 단위 용량 펠릿에 첨가될 수 있다. 또한 예의 방식으로, 건조된 단일 단위 용량은 증폭 반응을 수행하기에 부적절한 양의 dNTP를 포함할 수 있다. 이와 같은 예에서, dNTP의 나머지는 예컨대, 재구성 용액의 방식에 의해서, 건조된 단일 단위 용량 펠릿에 첨가될 수 있다. 본 개시내용에 속한 통상의 기술자는 이들 예가 비제한적인 바와 같이 상이한 조성을 갖는 SUD 및 건조된 펠릿 SUD를 쉽게 생성시킬 것이다.
바람직한 실시형태에서, 벌크 시약은 7mM 이하의 무기염 함량, 보다 바람직하게는 6mM 이하의 무기염 함량, 보다 바람직하게는 5mM 이하의 무기염 함량, 보다 바람직하게는 4mM 이하의 무기염 함량, 보다 바람직하게는 3mM 이하의 무기염 함량, 보다 바람직하게는 2mM 이하의 무기염 함량, 보다 바람직하게는 1mM 이하의 무기염 함량, 또는 보다 바람직하게는 500uM 이하의 무기염 함량을 포함한다. 따라서 벌크 시약 중의 무기염의 바람직한 농도 범위는 약 0mM 내지 7mM의 무기염 함량이다. 또 다른 벌크 시약 중의 무기염의 바람직한 농도 범위는 약 0mM 내지 6mM의 무기염 함량이다. 또 다른 벌크 시약 중의 무기염의 바람직한 농도 범위는 약 0mM 내지 7mM의 무기염 함량이다. 또 다른 벌크 시약 중의 무기염의 바람직한 농도 범위는 약 0mM 내지 4mM의 무기염 함량이다. 또 다른 벌크 시약 중의 무기염의 바람직한 농도 범위는 약 0mM 내지 3mM의 무기염 함량이다. 또 다른 벌크 시약 중의 무기염의 바람직한 농도 범위는 약 0mM 내지 2mM의 무기염 함량이다. 또 다른 벌크 시약 중의 무기염의 바람직한 농도 범위는 약 0mM 내지 1mM의 무기염 함량이다. 또 다른 벌크 시약 중의 무기염의 바람직한 농도 범위는 약 0mM 내지 0.5mM의 무기염 함량이다. 증폭 및 검출 반응 혼합물을 위한 일반적인 무기염은 몇몇 예를 들자면 나트륨, 칼륨, 망간, 마그네슘 및 클로라이드 중 1종 이상을 포함한다.
일 양상에서, 벌크 시약은 5mM 이하의 무기염을 포함하고, 무기염은 0.373ug/ul 이하, 또는 0.332ug/ul 이하, 또는 0.292ug/ul 이하의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 5mM 이하의 무기염을 포함하고, 염화나트륨은 0.292ug/ul 이하, 0.146ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 5mM 이하의 무기염을 포함하고, 나트륨은 0.115ug/ul 이하, 0.057ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 5mM 이하의 무기염을 포함하고, 염화칼륨은 0.373ug/ul 이하, 0.186ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 5mM 이하의 무기염을 포함하고, 칼륨은 0.196ug/ul 이하, 0.098ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 5mM 이하의 무기염을 포함하고, 클로라이드는 0.355ug/ul 이하, 0.178ug/ul 이하, 또는 0.089ug/ul 이하 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다.
또 다른 양상에서, 벌크 시약은 5mM 이하의 무기염을 포함하고, 염화나트륨은 0.292ug/ul 이하, 0.146ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 나트륨은 0.115ug/ul 이하, 0.057ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 염화칼륨은 0.373ug/ul 이하, 0.186ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 칼륨은 0.196ug/ul 이하, 0.098ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 클로라이드는 0.355ug/ul 이하, 0.178ug/ul 이하, 0.089ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다.
추가 양상에서, 건조된 펠릿은 5mM 이하의 무기염을 포함하는 액체 벌크 시약을 건조시켜서 제조되며, 펠릿의 질량에 대한 무기염의 질량%는 0.311% 이하, 0.277% 이하, 또는 0.244% 이하이다. 추가 양상에서, 0.311% 이하, 0.277% 이하, 또는 0.244% 이하의 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%를 갖는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유하는 용기가 제공된다. 추가 양상에서, 하나 이상의 웰을 포함하는 멀티웰 플레이트가 제공되며, 여기서 하나 이상의 웰 각각은 0.311% 이하, 0.277% 이하, 또는 0.244% 이하의 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%를 함유하는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유한다.
일 양상에서, 벌크 시약은 4mM 이하의 무기염을 포함하고, 무기염은 0.298ug/ul 이하, 또는 0.266ug/ul 이하, 또는 0.234ug/ul 이하의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 4mM 이하의 무기염을 포함하고, 염화나트륨은 0.234ug/ul 이하, 0.117ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다 추가 양상에서, 벌크 시약은 4mM 이하의 무기염을 포함하고, 나트륨은 0.092ug/ul 이하, 0.046ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 4mM 이하의 무기염을 포함하고, 염화칼륨은 0.298ug/ul 이하, 0.149ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 4mM 이하의 무기염을 포함하고, 칼륨은 0.156ug/ul 이하, 0.078ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 4mM 이하의 무기염을 포함하고, 클로라이드는 0.284ug/ul 이하, 0.142ug/ul 이하, 0.071ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다.
또 다른 양상에서, 벌크 시약은 4mM 이하의 무기염을 포함하고, 염화나트륨은 0.234ug/ul 이하, 0.117ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 나트륨은 0.092ug/ul 이하, 0.046ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 염화칼륨은 0.298ug/ul 이하, 0.149ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 칼륨은 0.156ug/ul 이하, 0.078ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 클로라이드는 0.284ug/ul 이하, 0.142ug/ul 이하, 0.071ug/ul 이하, 또는 0.0ug/u의 질량/마이크로리터로 존재한다.
추가 양상에서, 건조된 펠릿은 4mM 이하의 무기염을 포함하는 액체 벌크 시약을 건조시켜서 제조되며, 펠릿의 질량에 대한 무기염의 질량%는 0.249% 이하, 0.222% 이하, 또는 0.195% 이하이다. 추가 양상에서, 0.249% 이하, 0.222% 이하, 또는 0.195% 이하의 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%를 갖는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유하는 용기가 제공된다. 추가 양상에서, 하나 이상의 웰을 포함하는 멀티웰 플레이트가 제공되며, 여기서 하나 이상의 웰 각각은0.249% 이하, 0.222% 이하, 또는 0.195% 이하의 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%를 함유하는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유한다.
일 양상에서, 벌크 시약은 3mM 이하의 무기염을 포함하고, 무기염은 0.224ug/ul 이하, 또는 0.199ug/ul 이하, 또는 0.175ug/ul 이하의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 3mM 이하의 무기염을 포함하고, 염화나트륨은 0.175ug/ul 이하, 0.088ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 3mM 이하의 무기염을 포함하고, 나트륨은 0.069ug/ul 이하, 0.034ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 3mM 이하의 무기염을 포함하고, 염화칼륨은 0.224ug/ul 이하, 0.112ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 3mM 이하의 무기염을 포함하고, 칼륨은 0.117ug/ul 이하, 0.059ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 3mM 이하의 무기염을 포함하고, 클로라이드는 0.213ug/ul 이하, 0.107ug/ul 이하, 0.053ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다.
또 다른 양상에서, 벌크 시약은 3mM 이하의 무기염을 포함하고, 염화나트륨은 0.175ug/ul 이하, 0.088ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 나트륨은 0.069ug/ul 이하, 0.034ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 염화칼륨은 0.224ug/ul 이하, 0.112ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 칼륨은 0.117ug/ul 이하, 0.059ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 클로라이드는 0.213ug/ul 이하, 0.107ug/ul 이하, 0.053ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다.
추가 양상에서, 건조된 펠릿은 3mM 이하의 무기염을 포함하는 액체 벌크 시약을 건조시켜 제조되며, 펠릿의 질량에 대한 무기염의 질량%는 0.186% 이하, 0.166% 이하, 또는 0.146% 이하이다. 추가 양상에서, 0.186% 이하, 0.166% 이하, 또는 0.146% 이하의 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%를 갖는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유하는 용기가 제공된다. 추가 양상에서, 하나 이상의 웰을 포함하는 멀티웰 플레이트가 제공되며, 여기서 하나 이상의 웰 각각은 0.186% 이하, 0.166% 이하, 또는 0.146% 이하의 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%를 함유하는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유한다.
일 양상에서, 벌크 시약은 2mM 이하의 무기염을 포함하고, 무기염은 0.149ug/ul 이하, 또는 0.133ug/ul 이하, 또는 0.117ug/ul 이하의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 2mM 이하의 무기염을 포함하고, 염화나트륨은 0.117ug/ul 이하, 0.058ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 2mM 이하의 무기염을 포함하고, 나트륨은 0.046ug/ul 이하, 0.023ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 2mM 이하의 무기염을 포함하고, 염화칼륨은 0.149ug/ul 이하, 0.075ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 2mM 이하의 무기염을 포함하고, 칼륨은 0.078ug/ul 이하, 0.039ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 2mM 이하의 무기염을 포함하고, 클로라이드는 0.142ug/ul 이하, 0.071ug/ul 이하, 0.036ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다.
또 다른 양상에서, 벌크 시약은 2mM 이하의 무기염을 포함하고, 염화나트륨은 0.117ug/ul 이하, 0.058ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 나트륨은 0.046ug/ul 이하, 0.023ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 염화칼륨은 0.149ug/ul 이하, 0.075ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 칼륨은 0.078ug/ul 이하, 0.039ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 클로라이드는 0.142ug/ul 이하, 0.071ug/ul 이하, 0.036ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다.
추가 양상에서, 건조된 펠릿은 2mM 이하의 무기염을 포함하는 액체 벌크 시약을 건조시켜 제조되며, 펠릿의 질량에 대한 무기염의 질량%는 0.124% 이하, 0.111% 이하, 또는 0.097% 이하이다. 추가 양상에서, 0.124% 이하, 0.111% 이하, 또는 0.097% 이하의 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%를 갖는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유하는 용기가 제공된다. 추가 양상에서, 하나 이상의 웰을 포함하는 멀티웰 플레이트가 제공되며, 여기서 하나 이상의 웰 각각은 0.124% 이하, 0.111% 이하, 또는 0.097% 이하의 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%를 함유하는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유한다.
일 양상에서, 벌크 시약은 1mM 이하의 무기염을 포함하고, 무기염은 0.075ug/ul 이하, 또는 0.066ug/ul 이하, 또는 0.058ug/ul 이하의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 1mM 이하의 무기염을 포함하고, 염화나트륨은 0.058ug/ul 이하, 0.029ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 1mM 이하의 무기염을 포함하고, 나트륨은 0.023ug/ul 이하, 0.011ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 1mM 이하의 무기염을 포함하고, 염화칼륨은 0.075ug/ul 이하, 0.037ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 1mM 이하의 무기염을 포함하고, 칼륨은 0.039ug/ul 이하, 0.020ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 1mM 이하의 무기염을 포함하고, 클로라이드는 0.071ug/ul 이하, 0.036ug/ul 이하, 0.018ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다.
또 다른 양상에서, 벌크 시약은 1mM 이하의 무기염을 포함하고, 염화나트륨은 0.058ug/ul 이하, 0.029ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 나트륨은 0.023ug/ul 이하, 0.011ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 염화칼륨은 0.075ug/ul 이하, 0.037ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 칼륨은 0.039ug/ul 이하, 0.020ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 클로라이드는 0.071ug/ul 이하, 0.036ug/ul 이하, 0.018ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다.
추가 양상에서, 건조된 펠릿은 1mM 이하의 무기염을 포함하는 액체 벌크 시약을 건조시켜 제조되며, 펠릿의 질량에 대한 무기염의 질량%는 0.062% 이하, 0.055% 이하, 또는 0.049% 이하이다. 추가 양상에서, 0.062% 이하, 0.055% 이하, 또는 0.049% 이하의 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%를 갖는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유하는 용기가 제공된다. 추가 양상에서, 하나 이상의 웰을 포함하는 멀티웰 플레이트가 제공되며, 여기서 하나 이상의 웰 각각은 0.062% 이하, 0.055% 이하, 또는 0.049% 이하의 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%를 함유하는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유한다.
일 양상에서, 벌크 시약은 500uM 이하의 무기염을 포함하고, 무기염은 0.037ug/ul 이하, 또는 0.033ug/ul 이하, 또는 0.029ug/ul 이하의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 500uM 이하의 무기염을 포함하고, 염화나트륨은 0.029ug/ul 이하, 0.015ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 500uM 이하의 무기염을 포함하고, 나트륨은 0.011ug/ul 이하, 0.006ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 500uM 이하의 무기염을 포함하고, 염화칼륨은 0.037ug/ul 이하, 0.019ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 500uM 이하의 무기염을 포함하고, 칼륨은 0.020ug/ul 이하, 0.010ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 500uM 이하의 무기염을 포함하고, 클로라이드는 0.036ug/ul 이하, 0.018ug/ul 이하, 0.009ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다.
또 다른 양상에서, 벌크 시약은 500uM 이하의 무기염을 포함하고, 염화나트륨은 0.029ug/ul 이하, 0.015ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 나트륨은 0.011ug/ul 이하, 0.006ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 염화칼륨은 0.037ug/ul 이하, 0.019ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 칼륨은 0.020ug/ul 이하, 0.010ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 클로라이드는 0.036ug/ul 이하, 0.018ug/ul 이하, 0.009ug/ul 이하, 또는 0.0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다.
추가 양상에서, 건조된 펠릿은 500uM 이하의 무기염을 포함하는 액체 벌크 시약을 건조시켜 제조되며, 펠릿의 질량에 대한 무기염의 질량%는 0.031% 이하, 0.028% 이하, 또는 0.024% 이하이다. 추가 양상에서, 0.031% 이하, 0.028% 이하, 또는 0.024% 이하의 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%를 갖는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유하는 용기가 제공된다. 추가 양상에서, 하나 이상의 웰을 포함하는 멀티웰 플레이트가 제공되며, 여기서 하나 이상의 웰 각각은 0.031% 이하, 0.028% 이하, 또는 0.024% 이하의 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%를 함유하는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유한다.
일 양상에서, 벌크 시약은 약 5mM 내지 약 500uM의 무기염을 포함하고, 무기염은 약 0.373ug/ul 내지 약 0.029ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 약 5mM 내지 약 500uM의 무기염을 포함하고, 염화나트륨은 0.292ug/ul 내지 약 0.029ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 약 5mM 내지 약 500uM의 무기염을 포함하고, 나트륨은 0.115ug/ul 내지 약 0.006ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 약 5mM 내지 약 500uM의 무기염을 포함하고, 염화칼륨은 약 0.373ug/ul 내지 약 0.019ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 약 5mM 내지 약 500uM의 무기염을 포함하고, 칼륨은 0.196ug/ul 내지 약 0.010ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 약 5mM 내지 약 500uM의 무기염을 포함하고, 클로라이드는 0.355ug/ul 내지 약 0.009ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 약 5mM 내지 약 500uM의 무기염을 포함하고, 무기염은 약 0.373ug/ul 내지 약 0.029ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 염화나트륨은 약 0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 벌크 시약은 약 5mM 내지 약 500uM의 무기염을 포함하고, 무기염은 약 0.373ug/ul 내지 약 0.029ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 염화칼륨은 약 0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다. 추가 양상에서, 건조된 펠릿은 5mM 내지 500uM의 무기염을 포함하는 액체 벌크 시약을 건조시켜 제조되며, 펠릿의 질량에 대한 무기염의 질량%는 약 0.311% 내지 0.024%이다.
추가 양상에서, 벌크 시약은 약 5mM 내지 약 500uM의 무기염을 포함하고, 염화나트륨은 0.292ug/ul 내지 약 0.029ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 나트륨은 0.115ug/ul 내지 약 0.006ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 염화칼륨은 약 0.373ug/ul 내지 약 0.019ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 칼륨은 0.196ug/ul 내지 약 0.010ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 클로라이드는 0.355ug/ul 내지 약 0.009ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다.
추가 양상에서, 벌크 시약은 약 5mM 내지 약 500uM의 무기염을 포함하고, 무기염은 약 0.373ug/ul 내지 약 0.029ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 염화나트륨은 약 0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재하고, 염화칼륨은 약 0ug/ul의 질량/마이크로리터로 존재한다.
추가 양상에서, 건조된 펠릿은 5mM 내지 500uM의 무기염을 포함하는 액체 벌크 시약을 건조시켜 제조되며, 펠릿의 질량에 대한 무기염의 질량%는 약 0.311% 내지 0.024%이고, 펠릿 질량에 대한 염화나트륨의 질량%는 약 0%이고, 펠릿 질량에 대한 칼륨의 질량%는 약 0%이다. 추가 양상에서, 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유하는 용기가 제공되며, 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%는 약 0.311% 내지 0.024%이고, 펠릿 질량에 대한 염화나트륨의 질량%는 약 0%이고/이거나 펠릿 질량에 대한 염화칼륨의 질량%는 약 0%이다. 추가 양상에서, 하나 이상의 웰을 포함하는 멀티웰 플레이트가 제공되며, 여기서 하나 이상의 웰 각각은 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%이 약 0.311% 내지 0.024%이고, 펠릿 질량에 대한 염화나트륨의 질량%가 약 0%이고/이거나 펠릿 질량에 대한 염화칼륨의 질량%가 약 0%인 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유한다.
일 실시형태에서, 제1 용기는 하나 이상의 웰을 포함하는 멀티웰 플레이트가 제공된다. 일 양상에서, 하나 이상의 웰은 낮은 수증기 전달률, 열 전도성, 광학 투명도, 낮은 자가형광 또는 이들의 조합을 포함하는 재료로부터 구성된 웰을 포함한다. 일 양상에서, 하나 이상의 웰은 원뿔 형상의 벽을 포함한다. 일 양상에서, 하나 이상의 웰은 웰 내에 함유된 반응 혼합물 상에서 PCR 증폭 반응을 수행하기 위해서 PCR 열순환기에 정합하도록 구성된 벽을 포함한다. 일 양상에서, 웰은 PCR, TMA 또는 다른 핵산 증폭 반응을 수행하기 위한 장치의 면적을 수용하는 열 전도성 튜브에 정합하도록 구성된 벽을 포함한다. 일 양상에서, 하나 이상의 웰은 가열 블록(예를 들어, 써던 랩웨어(Southern Labware)(미국 조지아주 구밍 소재)로부터 제품명 SKUs BSH100G로서 입수 가능한 디지털 건조 블록 가열기와 함께 사용하기 위한 건조 블록)에 정합하도록 구성된 벽을 포함한다. 일 양상에서, 멀티웰 플레이트의 하나 이상의 웰은 웰의 챔버에 접근하기 위한 개구부를 포함한다. 일 양상에서, 하나 이상의 웰 각각은 연관된 웰의 개구부를 밀봉하기 위한 뚜껑을 포함한다. 일 양상에서, 하나 이상의 웰 각각의 개구부는 낮은 수증기 전달율 포일인 뚜껑으로 밀봉된다. 일 양상에서, 하나 이상의 웰 각각의 개구부는 낮은 수증기 전단율 엘라스토머 물질인 뚜껑으로 밀봉된다. 일 양상에서, 멀티웰 플레이트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 웰을 포함하고, 여기서 웰의 챔버는 중합효소 효소 및 무기염을 포함하는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유하고, 여기서 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%는 약 0.311% 내지 0.024%이다. 일 양상에서, 멀티웰 플레이트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 웰을 포함하고, 여기서 웰의 챔버는 역전사효소 효소 및 무기염을 포함하는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유하고, 여기서 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%는 약 0.311% 내지 0.024%이다. 일 양상에서, 멀티웰 플레이트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 웰을 포함하고, 여기서 웰의 챔버는 중합효소 효소, 역전사효소 효소, 및 무기염을 포함하는 건조된 단일 단위 용량 펠릿을 함유하고, 여기서 펠릿 질량에 대한 무기염의 질량%는 약 0.311% 내지 0.024%이다.
반응 혼합물은 조립되고, 반응은 자동화 샘플링 취급 장비, 예컨대, 홀로직(Hologic)(등록상표) 팬터(Panther) 기기(홀로직, 인크.(Hologic, Inc.), 미국 메사추세츠주 소재)에서 수행될 수 있는데, 이것은 예를 들어, PCR 반응, 전사 매개된 증폭 및 표적 포획 혼성화를 사용하는 동시 다중 검정을 수행할 수 있는 피펫터, 혼합기, 인큐베이터 및 세척 스테이션이 구비된 로보트 장치이다.
III. 건조 장비 및 방법
벌크 시약은 표준 방법 및 장비를 사용하여 동결건조될 수 있다. 동결 건조기는 예를 들어, GEA 프로세스 엔지니어링(GEA)(미국 매릴랜드주 컬럼비아 소재)으로부터 입수 가능하다. 컨트랙트(contract) 동결 건조 서비스가 다수의 회사(예를 들어, 바이오파마 테크놀로지 엘티디.(Biopharma Technology Ltd.), 영국 햄프셔 윈체스터 소재) 및 바이오파마 솔루션즈 스터릴 컨트랙트 매뉴팩처링(BioPharma Solutions Sterile Contract Manufacturing), 박스터 헬쓰케어 코프(Baxter Healthcare Corp), 미국 일리노이주 디어필드 소재)에 의해서 제공된다. 동결건조에 대한 지침은 다수의 문헌으로부터 입수 가능하다(예를 들어, 문헌[L. Rey, J.C. May (eds.) (2010) Freeze Drying/Lyophilization of Pharmaceuticals and Biological Products, 3 rd . ed. Informa Healthcare, NY or Methods in Enzymology, Vol. 22, Pages 33-39, Academic Press, New York (1971); 또는 Freeze-Drying, E. W. Flosdorf, Rheinhold, New York (1949)]). 임의로, 산소 함량은 냉동-건조 동안 감소될 수 있다(Phillips et al (2001) Biologics. 19:219).
다양한 용기가 건조에 적합하다. 용기는 용기가 부분적인 감압 하에서 밀봉 및 저장되는 경우 외부 압력을 견딜 수 있어야 한다. 용기는 외부로부터 내부로의 타당한 열 전달을 허용하는 재료로 제조되어야 한다. 용기의 크기는 바람직하게는 넘치는 것을 방지하기 위해서 건조될 용액이 총 부피의 20% 이하를 차지하도록 하는 크기이다.
샘플은 별개의 용기 또는 멀티시료(multispecimen) 용기에서 저장될 수 있다. 멀티시료 용기는 이들이 동시에 하지만 별개로 저장 및 조작될 수 있도록 적어도 2개의 시료를 함유할 수 있는 인접 용기를 의미한다. 멀티시료 그릇에 대한 표준 포맷은 6, 24, 96, 384 또는 1536웰을 포함한다. 96웰 포맷의 예에서 각각의 웰의 부피는 약 75 내지 200마이크로리터의 작동 부피를 갖는 약 300 내지 400마이크로리터이다. 부피는 일반적으로 웰의 수와 반비례로 달라지는데, 전형적으로는 각각의 웰에 대해서 1nL 내지 10㎖ 범위이지만, 다른 크기가 또한 고려된다. 예시적인 웰은 특히 편평한 바닥, 둥근 바닥 또는 V-자형 바닥을 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용기는 또한 웰이라고 지칭된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 멀티시료 용기는 멀티웰 플레이트라고 지칭된다. 또한, 웰은 때때로 반응 웰이라고 추가로 지칭된다. 용어 반응 웰은 임의의 반응이 반응 웰에서 실제로 일어나는 것을 요구하지는 않는다. 오히려, 이 용어는 시약을 함유하고, 그 내에서 반응하지 않거나, 그 내에서 부분적으로 반응하거나, 또는 그 내에서 완전히 반응하는 용기 또는 웰을 지칭하는 데 사용된다.
멀티웰 플레이트는, 본 명세서 일부 실시형태에서, 동결건조를 겪어서 수용액으로부터 건조된 조성물을 형성할 수 있다. 동결건조는 네스트 장치(nest device)에서 일어날 수 있다(국제 특허 출원 제PCT/US2016/045166호에 상응함). 네스트는 멀티웰 플레이트를 보유하기 위한 용기이고, 네스트는 밀봉된 동결건조 챔버 외부로부터 작동 가능한 메커니즘에 의해서 폐쇄될 수 있는 배기구를 포함한다. 멀티웰 플레이트를 함유하는 네스트는 개방된 위치의 하나 이상의 배기구와 함께 동결건조 챔버 내에 위치된다. 이어서 챔버는 밀봉되고, 동결건조 분위기가 네스트 내의 공간을 비롯한 챔버 전체에 적용된다. 이어서 하나 이상의 배기구가 폐쇄되고, 이에 의해서 네스트를 밀봉시킨다. 동결건조 챔버에 대한 밀봉은 이후에 해제되고, 멀티웰 플레이트를 함유하는 네스트가 제거된다. 이어서 네스트는 조작자가 그 내에 위치된 동결건조된 조성물을 사용할 준비가 되거나 또는 추가 저장 또는 판매를 위해서 동결건조된 시료를 함유하는 멀티웰 플레이트를 재밀봉할 때까지 그 내에 위치된 멀티웰 플레이트와 함께 재배치 및 저장될 수 있다. 이어서 멀티웰 플레이트의 웰은 밀봉되어 주변 공기로부터의 수분의 도입을 실질적으로 저해할 수 있다. 밀봉된 멀티웰 플레이트로 내로의 소량의 수분 도입은 건조제를 함유하는 파우치 내에 밀봉된 멀티웰 플레이트를 저장함으로써 예방될 수 있다. 유사하게, 별개의 용기가 동결건조를 겪을 수 있고, 네스트 내에서 동결건조를 겪을 수 있다.
다른 건조 방법은 분무 건조, 유동층 건조, 제습기, 및 회분식 접촉 건조를 포함하는데, 여기서 필터 케이크는 저온에서 진공 하에서 자유롭게 유동하는 건조 생성물로 건조된다(NP Cheremisinoff (2000) Handbook of Chemical Preocessing Equipment, butterworth Heinemann, Boston, MA). 제습기는 브라이 에어, 인크.(Bry Air, Inc.)(미국 오하이오주 선베리 소재) 및 DST 사이부 지켄(DST Seibu Giken)(미국 펜실베니아주 와이오미싱 소재)으로부터 입수 가능하다. 회전식 건조기, 원뿔형 건조기 및 선반 건조기가 입수 가능하다(맥길 에어프레서 엘엘씨(McGill AirPressure LLC)(미국 오하이오주 컬럼버스 소재)). 일 실시형태에서, 진공 건조기는 물질을 감압에 노출시킴으로써 수분을 제거하며, 여기서 증발을 통해서 손실된 것을 대체하기 위해서 충분한 열이 사용된다. 건조제는 실리카젤 건조제, 분자체 건조제, 예컨대, 알루미노실리케이트 및 합성 제올라이트, 및 벤토나이트 건조제를 포함한다.
반응 혼합물은 바람직하게는 이것이 사용을 위해서 재구성될 용기와 동일한 용기에서 건조된다.
동결건조되거나 또는 달리 건조되는 제형은 낮은 수분 함량, 예를 들어, 중량 기준으로 5% 미만의 물, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1.0% 미만, 0.5% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.05% 미만, 0.02% 미만, 0.01중량% 미만 등, 또는 중량 기준으로 5% 미만 내지 0.01중량% 미만, 4% 미만 내지 0.01% 미만, 3% 미만 내지 0.01% 미만, 2% 미만 내지 0.01% 미만, 1.0% 미만 내지 0.01% 미만, 0.5% 미만 내지 0.01% 미만, 0.2% 미만 내지 0.01% 미만, 0.1% 미만 내지 0.01% 미만, 0.05% 미만 내지 0.01% 미만, 0.02% 미만 내지 0.01% 미만의 물을 갖는다.
IV. 저장
동결건조되거나 또는 달리 건조된 조성물은 사용 전에 저장에 적용된다. 저장 기간은 건조된 조성물이 주변 공기에 노출되는 실온에서 저장되는 시간 기간을 포함할 수 있다. 이러한 기간은 최대 3시간, 또는 대안적으로, 최대 1.0시간, 최대 1.5시간, 최대 2.0시간, 최대 2.5시간, 최대 3.5시간, 최대 4.0시간, 최대 5.0시간, 최대 6.0시간, 최대 8.0시간 동안, 또는 이들 시간 중 임의의 범위, 예컨대, 90분 내지 180분일 수 있다. 이러한 저장 동안 절대 습도는 적어도 2.3그램 물/25℃ 공기 세제곱미터, 또는 대안적으로, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3.0그램 물/공기 세제곱미터일 수 있다. 대안적으로 상대 습도는 예를 들어, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 상대 습도일 수 있다. 특정 실시형태에서, 상대 습도는 약 10%일 수 있고, 저장 시간 기간은 최대 8시간일 수 있다. 특정 실시형태에서, 절대 습도는 약 2.3그램/25℃ 공기 세제곱미터일 수 있고, 저장 시간 기간은 최대 8시간일 수 있다.
저장은 또한 건조된 조성물이 밀봉되어 밀봉부 외부의 주변 공기와의 접촉을 실질적으로 예방하는 더 긴 기간을 포함할 수 있다. 저장 기간은 긴 시간, 예를 들어, 적어도 1주, 적어도 1개월, 적어도 6개월, 적어도 1년 또는 적어도 2년 동안일 수 있다. 1개월 내지 2년의 기간이 예시적이다.
장기간 저장 또는 장기간 또는 단기간 안정성 연구를 위한 저장 온도는 예를 들어, 0 내지 2℃, 0 내지 4℃, 2 내지 4℃, 2 내지 6℃, 20℃, 25℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 뿐만 아니라 영하 온도, 예컨대, -4 내지 -2℃, -6 내지 -2℃, -8 내지 -2℃, -10 내지 -2℃, -20℃, -40℃, -60℃, -80℃, 액체 질소에서의 저장을 포함한다. 바람직하게는, 저장은 동결점을 초과하고, 약 4 내지 8℃ 범위이다. 가속화 분해 연구는 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃에서, 예를 들어, 1시간, 2시간, 4시간, 24시간, 2일, 4일, 8일, 1개월 등의 기간 동안 수행될 수 있다. 저장을 위한 조건 또는 대안적으로 안정성 시험을 위한 조건은 온도를 변동시킨 것, 예컨대, 동결점 초과 내지 동결점 미만으로 변동시킨 것일 수 있다.
무기염의 부재는 건조 전 벌크 시약의 저장 동안, 밀봉 전 건조된 조성물의 단기간 저장 동안 그리고 밀봉 후 장기간 저장 동안 효소 활성도의 손실 및 부산물의 형성을 감소시킨다. 바람직하게는 모든 저장 후 효소 활성도는 저장을 개시하기 직전의 이전 값의 적어도 99%, 저장을 개시하기 전 값 대안적으로, 최적의 조건 하에서 저장된 대응 샘플의 값의 적어도 98%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 적어도 30%, 적어도 20% 및 이들 백분율이 경계가 되는 범위이다.
V. 재구성
바람직한 재구성 용액은 물 중에서 3.8 내지 4.4mM의 MgCl2 및 50 내지 80mM의 KCl을 제공한다. 재구성 용액은 또한 다른 성분 중에서 0.012 내지 0.020%의 메틸 파라벤, 0.006 내지 0.010%의 프로필 파라벤, 및/또는 0.26%의 무수 에탄올을 함유할 수 있다.
재구성 시간은 건조된 조성물의 의도된 용도에 적합한 수용액의 첨가가 건조된 조성물과 접촉된 후 1초 미만, 2초 미만, 5초 미만, 10초 미만, 15초 미만, 20초 미만, 50초 미만, 또는 60초(1분) 미만일 수 있고, 접촉은 임의로는 진탕, 탭핑(tapping), 보텍싱(vortexing), 락킹(rocking), 피펫 팁의 흡입 및 배출, 또는 유연성 바이알의 접음 또는 짜냄 중 임의의 것에 의해서 용이해진다. 예시적인 재구성 시간은 2 내지 10초이다. 재구성 시간은 냉장고 온도(약 4℃)에서의 재구성 용액, 주변 온도 용액(약 23℃), 또는 따뜻한 용액(약 37℃)으로 측정될 수 있다. 전형적으로, 건조된 조성물은 냉장고로부터 제거되고, 재구성 용액의 첨가 이전에 냉각된다. 이들 절차 중 임의의 것을 위한 환경(공간)은 전형적으로 약 23℃의 주변 온도이다. 물질이 재구성된 것으로 결정되는 시간은 예를 들어, 물질이 완전히 가용화된 것으로 결정된 시간일 수 있다. 완전한 가용화는 시각적 검사에 의해서 결정될 수 있고, 예를 들어 여기서 탁도의 부재 또는 슐리렌(schlieren) 패턴의 부재가 완전한 가용화의 척도이다. 대안적으로, 완전한 가용화는 광학 기기, 예컨대, 광 산란을 측정하는 기계에 의해서 결정될 수 있다.
VI. 조성물의 안정성
조성물의 안정성은 전형적으로 건조된 생성물의 재구성 후에 활성도(즉, 증폭 속도 또는 수율) 또는 부산물의 형성으로부터 평가된다. 안정성의 결여는 건조 전 또는 후에 저장 동안 활성도의 손실 또는 부산물의 형성으로부터 유래할 수 있다. 활성도 또는 부산물의 형성은 절대적 또는 상대적 측정치일 수 있다. 상대적인 경우, 비교를 위한 기준선은 건조 및 재구성 전 벌크 시약 혼합물 또는 정의된 방식(예를 들어, 마그네슘 또는 이의 다른 염 또는 이온의 존재)에서의 시험 하에서의 것과 상이한 재구성된 대조군 혼합물일 수 있다. 활성도는 실시간 증폭의 속도 또는 증폭 산물의 최종 수율 또는 히트율에 의해서 평가될 수 있다. 부생성물은 젤 전기영동, 젤 스캐너, 아가로스 젤, 모세관 전기영동 등 중 하나 이상에 의해서 검정될 수 있다.
재구성된 증폭 혼합물의 활성도(필요한 경우 미리-건조된 시약의 부피에 대한 재구성물의 상이한 부피로 인한 임의의 차이에 대해서 보정됨)는 바람직하게는 75, 80, 85, 90, 또는 95% 이내이거나 또는 건조 전 시약의 것으로부터 실험 오차 내에서 구별 가능하다. 재구성된 증폭 혼합물 중에 존재하는 부생성물(필요한 경우 미리-건조된 시약의 부피에 대한 재구성물의 상이한 부피로 인한 임의의 차이에 대해서 보정됨)은 바람직하게는 중량 또는 평균 몰 기준으로 건조 전 벌크 시약 중에 존재하는 본래 화합물의 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1중량% 미만이다. 바람직하게는 부생성물은 검출 한계치보다 적다.
VII. 키트
상기에 기술된 건조된 조성물은 키트 내에 제공될 수 있다. 이러한 키트는 용기, 예컨대, 튜브 내에 건조된 조성물을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 웰을 포함하는 멀티웰 플레이트를 함유한다. 일부 키트는 별개의 용기 내에 공급된 복수의 건조된 조성물을 함유한다. 일부 키트는 멀티웰 플레이트의 하나 이상의 밀봉된 웰 부재 내에 다수의 건조된 조성물을 포함하는 하나 이상의 멀티웰 플레이트를 포함한다.
일부 키트는 또한 건조된 조성물과 별개의 용기 내에 재구성 용액을 포함한다. 재구성 용액은 분취물을 개별 건조된 조성물 용기로 분배하기 위해서 벌크로 제공될 수 있거나 또는 각각 건조된 조성물을 함유하는 단일 용기와의 조합을 위해서, 하나 이상의 단위 용량의 형태로 제공될 수 있다.
임의로 건조된 조성물을 함유하는 용기 및 재구성 용액을 함유하는 용기는 약한 재료에 의해서 분리될 수 있다. 약한 재료는 알루미늄 포일, 폴리프로필렌, 폴리에스터, 폴리비닐클로라이드(PVC), 폴리에틸렌 또는 다른 유사한 재료일 수 있다. 장벽은 1개, 2개, 3개 또는 그 초과의 층을 포함할 수 있고, 각각의 층은 동일한 조성물을 갖거나, 또는 각각의 층은 상이한 조성물을 갖고, 예컨대, PVC 층과 접촉된 포일 층을 갖는다. 필름은 예를 들어, 다우 케미컬 코.(Dow Chemical Co.)(미국 미시간주 미들랜드 소재) 또는 아르케마, 인크.(Arkema, Inc.)(미국 펜실베니아주 킹 오프 프루시아 소재)로부터 획득될 수 있다. 약한 재료를 뚫는 것이 재구성 용액이 동결건조된 조성물과 접촉하는 것을 가능하게 한다.
키트는 효소 반응이 키트의 대응부에서 직접 일어나서 조성물을 상이한 반응 용기 또는 이러한 용기를 보유하는 컨테이너로 옮길 필요성이 회피되도록 써모사이클러 내에 또는 인큐베이터 내에 정합하도록 설계될 수 있다.
키트는 예를 들어, 포트, 호스, 셉텀을 구멍내는 시린지의 방식에 의해서 사용자-공급된 시약을 키트 내의 용기 내에 도입하기 위해서 개작될 수 있거나(미국 특허 제US2014/0121515호 및 제US2014/0276356호 참고) 또는 대안적으로 사용자-공급자 시약, 예컨대, 핵산 템플레이트는 사용자-공급된 용기 내에서 본 개시내용의 시약과 혼합될 수 있다. 키트의 하나 이상의 대응부는 빈 상태로 공급되어, 혼합 챔버로서 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1. 벌크 시약
실시예 1 내지 실시예 3은 벌크 시약의 제조, 용기 내에서 SUD 건조된 펠릿을 얻기 위한 벌크 시약의 단일 단위 용량 부피의 건조, 및 SUD 증폭 및 검출 혼합물을 얻기 위한 건조된 펠릿의 재구성을 예시한다. 표 1 및 표 2는 건조를 위한 예시적인 벌크 시약의 성분을 개시한다. 두 표는 또한 예시적인 단일 단위 용량 농도를 개시한다. 마스터 믹스 1은 각각 0.4mM의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP; 0.8mM의 dUTP; BSA를 포함하하고, 무기염이 실질적으로 없는 2X 마스터 믹스였다. 표 1에서 Taq 중합효소는 양이온성 세정제를 함유하는 글리세롤 무함유 TRIS 완충제 중에 존재하였다.
2X 마스터 믹스 2는 0.4mM의 dATP, dGTP, dCTP, 0.8mM의 dUTP, Tris 및 비-아세틸화 BSA를 함유하는 소유권이 있는 완충제(글리세롤 무함유) 중의 0.74단위/㎕ 고태크(등록상표) MDx 핫 스타트 중합효소, 0.48M 트레할로스이다.
50X 고스크립트 RT Mix는 다음과 같다: 표 2에서 20U/㎕ 고스크립트(등록상표), 8단위/㎕ RNasin(등록상표)플러스 RNase 저해제; 표 1에서 10U/㎕ 고스크립트(등록상표), 8단위/㎕ RNasin(등록상표)플러스.
고스크립트(등록상표) RT 커스텀은 160U/㎕의 고스크립트 RT, 글리세롤 무함유, 무-RNase 저해제의 농축된 용액이다.
포함될 수 있는 안정화제, 탈아미드화 저해제, 항산화제, 세정제 및 계면활성제, 예컨대, 계면활성제: 소르비탄 폴리에톡실레이트의 지방산 에스터(예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80), 및 폴록사머 188.
각각 표 1 내지 표 3에 대한 벌크 증폭 시약에서 10X 올리고뉴클레오타이드 믹스는 하기 실시예에서 증폭 및 검출 반응을 수행하기 위해서 프라이머 및 프로브의 수집물을 포함하였다. 당업자는 증폭 반응을 위한 프라이머 및 프로브 혼합물의 제조 방법을 이해할 것이다(예를 들어, 문헌[Innis, Michael A. et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)] 참고). 하기 실시예의 경우, 프라이머 및 프로브는 벌크 시약 중에 약 8uM 내지 약 12uM의 벌크 농도로 존재하였다.
실시예 2. 동결건조
본 실시예에서, 벌크 반응 혼합물을 동결건조기를 사용하여 건조한다. 실시예 1에 일반적으로 기술된 벌크 증폭 시약 24마이크로리터를 용기에 첨가하고, 이어서 동결건조 챔버에 적재시킨다. 본 명세서에서 실시예를 위해서, 24ul는 단일 샘플(또한 단일 단위 용량 또는 SUD라고도 지칭됨)에 대해서 증폭 및 검출 반응을 수행하는 데 사용되는 벌크 시약의 양을 나타낸다. 본 실시예에서, 멀티웰 플레이트(구체적으로 12-웰 플레이트)를 동결건조 반응 및 멀티웰 플레이트의 웰 내에 존재하는 동결건조된 펠릿의 저장 둘 모두를 위해서 사용하였다. 12-웰 플레이트의 12개의 웰 각각에 벌크 반응 혼합물 24ul 분취물을 제공하였다. 웰 각각 내의 시약은 표적 핵산에 대한 증폭 및 검출 반응을 수행하기 위한 단일 단위 용량을 나타내었다. 동결건조 사이클을 시작하였다(약 36시간 실시). 동결건조 사이클 후, 12-웰 플레이트를 회수하고, 12-웰 플레이트의 개별 용기가 밀봉되는 위치로 옮긴다. 용기를 용기 개구부 상의 금속 포일로 밀봉한다. 금속 포일은 낮은 수증기 전달률 포일이다. 이어서, 밀봉된 12-웰 플레이트를 건조제를 갖는 파우치에 넣는다. 증폭 반응에서의 사용을 위해서, 12-웰 플레이트를 기기 상에 직접 적재한다. 각각의 용기 내의 건조된 조성물은 수동으로 재구성되거나 또는 재구성 용액이 구비되고 건조된 조성물의 자동화 재구성이 프로그래밍된 기기의 경우에는, 건조된 조성물이 기기에 의해서 재구성된다. 샘플을 시약과 조합하고, 증폭 및 검출 반응을 수행한다.
실시예 3. 재구성 용액.
본 실시예는 하나의 재구성 용액을 기술하였다. 재구성 용액의 목적은 샘플에 대한 증폭 및 검출 반응을 수행하기 위해서 재구성된 펠릿을 사용하기 위한 준비 시에 건조된 펠릿을 재수화시키는 것이다. 실시예 2로부터의 12-웰 플레이트의 12-웰 각각에, 웰 상의 포일 커버를 미리 뚫고, 이어서 완충제를 웰에 분배함으로써 24ul의 재구성 완충제를 분배하였다. 표 4는 이들 실시예에서 사용된 재구성 용액을 개시하고, 벌크 재구성 용액 농도 및 최종 검정 농도 둘 모두를 제공한다. 건조된 것의 재구성 후, 샘플로부터의 표적 핵산을 웰에 첨가하고, PCR 증폭 및 검출 반응을 수행하였다.
실시예 4. 벌크 시약에 대한 무기염의 부정적인 영향
본 실시예는 벌크 시약에 대한 무기염의 부정적인 영향을 기술한다. 두 벌크 시약 혼합물을 실시예 1 및 표 5에 따라서 일반적으로 제조한다. 표 5에서 벌크 시약 A와 벌크 시약 B 간의 차이는 반응 혼합물에서 MgCl2의 존재 또는 부재였다.
액체 벌크 시약 A 및 B 각각을 얼음 상에서 제조하였다. 이어서 벌크 시약 A 및 B를 각각 별개로 다수의 멀티웰 플레이트(구체적으로 여기에서는 12-웰 플레이트를 사용하였음)의 웰에 분취하였다. 벌크 시약 A의 12개의 분취물 또는 벌크 시약 B의 12개의 분취물 중 어느 하나를 함유하는 이들 12-웰 플레이트를 4개의 상이한 인큐베이션 조건으로 분리하였다: (1) 얼음 상에서 90분 인큐베이션; (2) 실온에서 90분 인큐베이션; (3) 얼음 상에서 180분 인큐베이션; 또는 (4) 실온에서 180분 인큐베이션. 따라서, 각각의 벌크 시약 혼합물의 하나의 분획을 실온에서 180분 동안 인큐베이션시키고, 나머지 부분을 얼음 상에서 180분 동안 인큐베이션시켰다. 마찬가지로, 각각의 벌크 시약 혼합물의 하나의 분획을 실온에서 90분 동안 인큐베이션시키고, 나머지 부분을 얼음 상에서 90분 동안 인큐베이션시켰다. 모든 경우에, 핵산 성분을 반응 혼합물에 첨가하는 것(최종 성분으로서 첨가됨)은 인큐베이션 시간의 시작을 나타내었다.
인큐베이션 시간 이후에, 이어서 12-웰 플레이트 내의 분취된 증폭 반응물을 실질적으로 건조 조성물이 수득될 때까지 동결건조시켰다. 12-웰 플레이트의 웰 내의 생성된 건조된 조성물 각각은 샘플에서 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 호흡기세포 융합 바이러스 B 중 하나 이상을 식별하기 위한 트리플렉스 증폭 및 검출 반응을 위한 건조된 단일 단위 용량을 나타내었다.
건조된 조성물을 65mM의 KCl, 각각 0.02% w/v 및 0.01% w/v의 메틸 및 프로필 파라벤, 및 0.33% v/v의 에틸 알코올(무수)를 함유하는 완충제로 재구성하였다. 벌크 시약 A로부터 제조된 건조된 조성물을 위한 재구성 용액은 또한 2.5mM의 MgCl2를 함유하였다.
인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 호흡기세포 융합 바이러스 B 양성 샘플 3종 모두를 이들의 LoD의 3배로 재구성된 반응 혼합물 중에서 조합하여, 재구성된 믹스의 모든 성분은 이의 벌크 시약 농도의 약 80%로 존재하였다. 이들 양성 샘플을 수송 배지와 조합된 음성 혈장 중에서 바이러스 추출하고, 목적하는 농도로 연속 희석하였다(RSVB 샘플 연속 희석이 10배만큼 감소된 경우 제외). 표 6에 나타낸 바와 같이, 단일 분자 반응임에도 불구하고 3종의 바이러스 표적, 즉 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 또는 호흡기세포 융합 바이러스 타입 B 각각을 별개의 형광 채널에서 특이적으로 검출하도록 프라이머 및 프로브 믹스를 설계하였다.
샘플을 실시간 PCR 호환 열순환기(ABI 7500FAST, 어플라이드 바이오시스템즈(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재))를 사용하여 검정하였다. 결과는 하기와 같다(표 6, 도 3A 내지 C). 표에서의 % 양성 값은 시험된 12개의 샘플의 백분율로서 역치값을 초과한 RFU 값을 갖는 샘플의 수를 나타낸다. 검정의 설계 및 조립 시에, 바이러스의 양(검정당 바이러스 입자)이 양성 대조군으로서 설계된 특정 검정에 대해서 적어도 95% 양성을 제공하기에 충분한 양인 것이 바람직하다.
이들 결과는 벌크 시약(MgCl2 및 KCl이 없는 사전동결건조 용액)이 실온에서 적어도 180분에 대해서 안정함을 나타낸다. 일단 샘플과 재구성 및 조합되면, 벌크 시약 A로부터의 건조된 SUD 펠릿은 벌크 시약 B로부터의 건조된 SUD 펠릿에 의해서 제공된 것보다 더 강력한 증폭 및 검출 반응을 제공한다. 벌크 시약 B는, 실온 또는 심지어는 얼음 상에서 겨우 90분 동안 인큐베이션되고, 이어서 건조되고, 재구성되어 증폭 반응 혼합물을 생성하는 경우, 증폭 반응에서 동일한 조건 하에서 벌크 시약 A보다 작은 부생성물의 비교적 더 낮은 신호 및 풍부도를 제공하였다. 무기염을 거의 또는 전혀 함유하지 않는 벌크 시약은 중합효소 효소 성분, dNTP 및 핵산을 비롯한, 증폭 반응을 위한 성분을 함유하는 건조된 조성물을 생성하기 위한 건조에 유용하다.
실시예 5. 염을 갖거나 또는 갖지 않는 건조된 펠릿의 안정성
본 실시예는 염을 함유하는 단일 단위 용량 건조된 펠릿과 염을 함유하지 않는(본 실시예에서 5mM 미만의 무기염) 단일 단위 용량 건조된 펠릿의 안정성을 비교한다. 단일 단위 용량 펠릿은 일반적으로 상기에 기술된 바와 같은 벌크 시약을 건조시킴으로써 제조되었다. 합성 직후에, 벌크 시약 A 및 벌크 시약 B 각각을 별개의 멀티웰 반응 플레이트(12-웰)에 분취하고, 동결건조기를 사용하여 건조시켰다. 동결건조 이후에, 건조된 펠릿을 함유하는 멀티웰 플레이트를 약 5%의 습도를 갖는 질소 기체 환경에 넣고, 웰 개구부를 포일로 피복함으로써 멀티웰 플레이트를 밀봉하였다. 밀봉된 플레이트를 건조제를 함유하는 알루미늄 파우치에 넣고, 이어서 파우치를 밀봉하였다. 멀티웰 플레이트 내에 건조된 펠릿을 함유하는 밀봉된 파우치를 8일 동안 4℃에서 저장하였다.
8일 후, 파우치에 내의 멀티웰 플레이트를 하기와 같은 3개의 조건 중 하나로 옮겼다: 조건 #1 - 벌크 시약 A로부터의 건조된 펠릿을 함유하는 파우치 내의 멀티웰 플레이트의 1개의 하위세트 및 벌크 시약 B로부터의 건조된 펠릿을 함유하는 파우치 내의 멀티웰 플레이트의 1개의 하위세트를 파우치로부터 꺼내고, 70% 상대 습도를 갖는 15℃ 환경에 놓았음; 조건 #2 - 벌크 시약 A로부터의 건조된 펠릿을 함유하는 파우치 내의 멀티웰 플레이트의 1개의 하위세트 및 벌크 시약 B로부터의 건조된 펠릿을 함유하는 파우치 내의 멀티웰 플레이트의 1개의 하위세트를 파우치로부터 꺼내고, 15% 상대 습도를 갖는 45℃ 환경(가속 안정성)에 놓았음; 및 조건 #3 - 벌크 시약 A로부터의 건조된 펠릿을 함유하는 파우치 내의 멀티웰 플레이트의 1개의 하위세트 및 벌크 시약 B로부터의 건조된 펠릿을 함유하는 파우치 내의 멀티웰 플레이트의 1개의 하위세트를 4℃에 놓았음(멀티웰 플레이트는 건조제를 갖는 파우치 내에 존재하였고, 따라서 습도는 0%임). 플레이트를 추가의 30일 동안 이들 조건에서 두었다.
인큐베이션이 끝나면, 조건 각각으로부터의 건조된 펠릿을 100mM의 KCl 및 2.5mM의 최종 농도를 위해서 충분한 MgCl2를 함유하는 완충제 중에서 재구성하고, 실시간 PCR 열 순환기(ABI PRISM 7000, 어플라이드 바이오시스템즈(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재))를 사용하여 인플루엔자 A 표적의 증폭 및 검출을 위해서 시험하였다. 간략하면, 인플루엔자 A 표적을 대등한 액체 대조군과 함께 LOD 10^0(+ / - 1 log)에서 음성 풀 중에서 추출하였다. 결과를 표 7 및 도 1에 나타낸다.
이들 결과는, 5mM 미만의 무기염을 함유하는 단일 증폭 반응 건조된 펠릿이 5mM 초과의 무기염을 함유하는 단일 증폭 반응 건조된 펠릿과 비교할 때 다수의 상이한 온도 및 습도 조건에서 저장 후에 더 높은 RFU 값을 가짐을 나타낸다.
실시예 6. 시약으로 카트리지를 충전시키기 전 보유 시간의 영향
표 8은 안정성 연구로부터의 결과를 개시하며, 여기서 모든 동결건조된 샘플은 동일한 벌크 시약으로부터 제조되었다. 본 실시예는 일반적으로 상기에 나타낸 바와 같이 제조된 건조된 펠릿의 안정성을 기술한다. 중합효소 효소, dNTP 및 핵산을 함유하는 벌크 시약을 MgCl2 없이 그리고 KCl 없이 제조하였다. 벌크 시약을 동등한 조성물의 4개의 별개 분획으로 나누었고, 4개의 분획 각각은 하기 중 어느 하나였다: (1) 실온에서 45분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 건조시킴; (2) 실온에서 4시간 동안 인큐베이션시키고, 이어서 건조시킴, (3) 실온에서 8시간 동안 인큐베이션시키고, 이어서 건조시킴; 또는 (4) 인큐베이션시키지 않고 즉시 건조시킴.
이어서, 생성된 건조된 조성물을 1.5g의 건조제 필로(pillow)를 함유하는 알루미늄 파우치로 옮기고, 이어서 파우치를 밀봉하였다. 밀봉된 파우치를 5℃에서 22.5개월과 동등한 가속화 안정성을 모의시험하기 위한 조건 하에서 저장하였다. 가속화 안정성 인큐베이션 후에, 건조된 조성물을 재구성하고, 생성된 증폭 반응물을 인플루엔자 A 샘플(TCID50/㎖ = 1)의 증폭 및 검출을 위한 검정에서 사용하였다. 표 8에서의 결과는, MgCl2를 함유하지 않고, KCl을 함유하지 않은 벌크 용액이 건조 이전에 실온에서 최대 8시간 동안 인큐베이션되는 경우 증폭 및 검출 검정 성능이 방해되지 않은 것을 입증한다. 재구성된 건조된 조성물은 낮은 바이러스 역가를 함유하는 샘플 상에서 시험되는 경우에도, 강력하고 재현 가능한 결과를 제공하는 증폭 및 검출 반응을 제공한다.
본 연구는 용기의 충전 동안 액체 리오(lyo) 시약을 위해서 벌크 보유 시간을 변화시키는 것이 효소 활성도를 감소시키지 않는다는 것을 보여준다(도 2). 용기의 충전 동안 벌크 시약의 안정성을 시험하기 위해서, 동결건조 이전에 벌크 믹스를 최대 8시간 동안 주변 온도에 노출시키는 연구를 수행하였다. 개별 Flu A/B/RSV 벌크 액체 리오 시약 믹스를 제조하고, 실온에서 45분, 4시간, 및 8시간 동안 인큐베이션시키고, 이어서 이를 사용하여 리오 펠릿을 생성하였다. 이어서 이들 펠릿을 파우치에 넣고, 낮은 수준의 바이러스 역가를 사용한 시험 이전에, 5℃에서 22.5개월의 저장 수명에 동등한 가속화 안정성을 모의실험하기 위해서 22일 동안 45℃에 노출시켰다. 결과(도 2)는 액체 리오 벌크가 주변 조건에서 최대 8시간 동안 저장되는 경우 검정 성능이 방해되지 않음을 나타낸다.
히스토그램 막대에 대한 각각의 RFU는 824,895; 806,570; 855,772; 및 1,162,967이다. Ct(출현 시간)에 대한 값은 다음과 같았다. 액체 대조군의 경우(평균 Ct= 34.3), 45분의 경우(평균 Ct= 34.5), 4시간의 경우(평균 Ct= 34.4), 및 8시간의 경우(평균 Ct= 33.9). Ct 값에 대한 각각의 표준 편차는 0.39, 0.58, 0.32 및 0.60이었다(도 2).
실시예 7. 재구성 시간 과정 연구
이것은 표 9에 나타낸 실험에 관한 것이다. 재구성 용액 중에 KCl을 포함하지 않고, 2.5mM의 MgCl2를 포함하는 건조된 펠릿을 인큐베이션시키는 것이 검정 활성도에 영향을 주는지를 결정하기 위해서 실험을 설정하였다. 요약하면, KCl을 갖지 않지만 2.5mM MgCl2를 갖는 건조된 펠릿 SUD를 상기에 일반적으로 기술된 바와 같이, 벌크 시약의 동결건조에 의해서 제조하였다. 동결건조 이후에, 건조된 펠릿 SUD를 5% 상대 습도에서 질소 하에서 밀봉하고, 건조제와 함께 파우치에 넣고, 이어서 4℃에서 27일 동안 저장하였다. 27일 인큐베이션 후, 건조된 펠릿을 재구성하고, 이를 사용하여 샘플로부터 Flu-A를 검출하였고, 여기서 모든 검정은 반응 혼합물 중에서 최종 농도로서 100mM의 KCl 및 2.0mM의 MgCl2를 가졌다.
KCl 무함유/2.5mM MgCl2 SUD를 125mM KCl로 재구성하고, 0, 5, 10 또는 15분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시킨 후에 사전-냉각된 PCR 플레이트로 옮기고, 표적에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 샘플을 1분 동안 회전시켰다. 이어서, 플레이트를 사전-가온된 ABI 7500 FAST 기기(어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)로 옮겼다. 54분 열 프로파일 하에서 ABI 상에서 검정을 실시하고, N=4 반복시험하고, 역치를 25,000으로 설정하였다. 표 9는 결과를 개시한다.
실시예 8. 안정화에 대한 염화마그네슘의 영향
본 실시예는, 안정화에 대한, 완충제, 트레할로스, EDTA, 뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 프라이머, 프로브 및 효소를 포함하는, 벌크 시약 마스터 믹스로부터의 MgCl2의 제거의 영향을 조사하였다. 벌크 시약으로부터의 MgCl2의 제거는 물 및 MgCl2와의 재구성 후 활성도에 의해서 측정되는 바와 같이, 동결건조 이전에 실온에서 90분으로부터 최대 7.75시간 동안 제형을 안정화시키는 것을 발견하였다. 동결건조된 펠릿에 EDTA를 첨가하는 것은 재구성 완충제 중에서 과량의 MgCl2를 킬레이팅하는 데 유용하다.
프라이머, 프로브, 및 트라이포스페이트는 완충된 마스터 믹스로 제공될 수 있고, 효소는 증폭 반응 이전에 스파이킹된다. 일부 증폭 반응의 경우, 최종 마스터 믹스 중에 효소를 갖고, 그것을 물 및 MgCl2의 범용 재구성 용액을 갖는 "즉시 사용" 형태로 동결건조시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 증폭 반응 이전에 혼합물을 스파이킹할 필요성을 회피한다. 마그네슘은 중합 반응을 위한 복합화제(촉매)로서 기능한다. 표적이 존재하지 않으면, 필요한 트라이포스페이트의 반응 믹스를 고갈시킬 수 있는 비-특이적 증폭이 일어날 수 있다. 물질을 2 내지 8℃에서 유지시키고, 사전냉각된 동결건조기에 적재시켜 반응 속도를 늦출 수 있고, 이것은 반응 믹스로부터의 트라이포스페이트의 고갈을 늦출 수 있다. 그러나, 2 내지 8℃에서도 반응 믹스의 안정성은 단지 90분일 수 있다. 더욱이, 일상적인 제조 동안 이들 한계를 준수하기 위해서는 사전 냉각 단계 등뿐만 아니라 벌크 용액 온도를 목적하는 온도로 유지시키기 위해서 냉각 시스템의 사용이 요구된다.
완충제, 트레할로스, 트라이포스페이트, EDTA, 프라이머, 프로브 및 효소를 포함하는 벌크 시약으로부터의 MgCl2의 제거 및 물 및 MgCl2를 함유하는 재구성 용액 내로의 배치는, 그것이 중합 반응을 위한 촉매로서 기능하더라도, 비-특이적 증폭을 예방하거나 최소화하기 위한 방식으로서 간주되었다. 완충제, 트레할로스, 트라이포스페이트, 프라이머, 프로브 및 효소를 함유하는 마스터 믹스에 EDTA 용액을 첨가하여 각각의 분석물에 대한 범용 레콘에서 과량의 마그네슘을 킬레이팅할 수 있다. MgCl2를 갖거나 또는 갖지 않는 짝을 이룬 증폭 반응을 습식 화학 조건 하에서 수행 및 실시하여 안정성에 대한 영향을 평가하였다. 결과를 도 4에 나타낸다. 완충제, 트레할로스, 트라이포스페이트, EDTA, 프라이머, 프로브 및 효소를 함유하는 벌크 시약 중에 마그네슘이 없는 연구는 180분 동안 실온 안정성을 나타내었다(레인 6 및 8 참고, 이것은 MgCl2가 존재하는 레인 5 및 7에서의 비특이적 스미어와 비교할 때 생물분석기 젤 상에서 동일한 밴드를 나타냄). 추적 연구를 도 2에 나타낸다. 여기서, 표적의 핵산 증폭을 3개의 상이한 조건 하에서 수행하였다: (1) 완충제, 트레할로스, 트라이포스페이트, EDTA, 프라이머, 프로브, MgCl2 및 효소를 포함하고, PCR 반응 개시 직전 효소가 스파이킹된 새로운 액체 대조군; (2) 완충제, 트레할로스, 트라이포스페이트, EDTA, 프라이머, 프로브 및 효소를 포함하는 리오 67 RT, 3.75시간 동안. 용액을 3.75시간 동안 보유하고, 이어서 동결건조시켰다. 동결건조 후, PCR 반응 개시 직전에 펠릿을 물 및 MgCl2 중에 재구성함; 및 (3) 완충제, 트레할로스, 트라이포스페이트, EDTA, 프라이머, 프로브 및 효소를 포함하는 리오 67 RT, 7.75시간 동안. 용액을 7.75시간 동안 보유하고, 이어서 동결건조시켰다. 동결건조 후, PCR 반응 개시 직전에 펠릿을 물 및 MgCl2 중에 재구성하였다. 본 실험은 비특이적 증폭 없이 동결건조 이전에 실온에서 7.75시간 동안 완충제, 트레할로스, 트라이포스페이트, EDTA, 프라이머, 프로브 및 효소를 함유하는 벌크 시약의 안정성을 확립하였다.
벌크 시약으로부터의 MgCl2의 제거는 완충제, 트레할로스, 트라이포스페이트, EDTA, 프라이머, 프로브 및 효소를 함유하는 실온 안정한 마스터 믹스를 제공한다.
실시예 9 동결건조 동안 승화에 대한 염화칼륨(KCl)의 효과.
본 실시예는 동결건조 동안 승화에 대한 염화칼륨(KCl)의 효과를 조사하였다. PCR은 PCR 증폭을 위해서 KCl을 요구한다. 본 연구의 결과는 낮은 농도의 KCl(10mM 미만, 0.391㎍/㎕ 칼륨)은 동결건조에 유의하게 영향을 주지 않음을 나타내었다. 이에 반해서, 126mM(4.92㎍/㎕ 칼륨)의 높은 KCl 농도는 동결건조 동안 펠릿으로부터의 물의 제거를 저해한다. 잔류하는 물은 안정성에 악영향을 주는 "불순물"로서 간주된다. 동결건조된 벌크 시약 중에서 KCl의 양을 제외 또는 최소화시키는 것이 특정 실시형태에서 바람직하다.
동결건조 후 그 내에 잔류하는 수분 함량을 측정함으로써 3가지 농도의 KCl의 존재 하에서 동결건조의 효율을 조사하였다. 더 높은 수준의 잔류 수분은 승화 과정을 저해한다고 공지되어 있다.
푸리에 변환 근적외선(FT-nIR) 분광학을 사용하여 동결건조된 벌크 시약에서 상대적인 수분 함량을 측정하였다. 물-OH 결합은 5170cm-1(A5170)의 nIR 공간 파장에서 에너지를 흡수한다고 공지되어 있다.
3종의 수성 벌크 시약 제형을 제조하였다. 각각의 조성을 표 10에 나타낸다.
각각의 제형 1.45㎖를 각각의 KCl 농도에 대해서 2개의 10㎖ 유리 바이알에 충전시켰다. 바이알을 부틸 마개로 부분적으로 폐쇄시켰다. 모든 바이알을 함께 동결건조시켰다. 동결건조 후에, 바이알을 무수 질소 기체 하에서 밀봉하였다. 밀봉된 바이알 모두를 동결건조기에서 꺼내고, 크림프 시일을 적용하였다. 이어서 바이알을 FT-nIR 분광학에 의해서 잔류 수분 함량에 대해서 측정하였다. 수분 수준 지연 시간 드래프트를 설명하기 위해서, 측정치를 10일에 걸쳐서 수득하였다. 시간 지점은 다음과 같았다: 0일, 1일, 3일, 7일 및 10일. 잔류 수분 함량을 FT-nIR 분광학에 의해서 측정하였고, 5170cm-1에서 nIR 흡광도 파라미터를 산출하였다. 각각의 제형에 대해서 흡광도 파라미터를 평균내고, 이어서 참조 샘플, 제형 1(0㎍/㎕ KCl)로부터 수득된 평균 파라미터에 정규화시켰다. 하기 계산을 사용하였다.
표 11 및 12는 FT-nIR 흡광도 결과를 나타낸다.
도 6 및 7은 KCl의 농도 증가의 효과를 나타낸다. 그래프는 6.3mM의 KCl의 존재가 정규화된 흡광도 파라미터를 유의하게 증가시키지 않았음을 나타낸다. 따라서 이들 데이터로부터, 저농도의 KCl은 동결건조 동안 물의 제거를 유의하게 저해하지 않았다. 이에 반해서, 126mM의 KCl(20 배 증가)은 정규화된 흡광도 파라미터에서 2배 증가를 유도하였는데, 이는 참조군과 비교할 때 더 높은 잔류하는 수분 수준을 나타낸다. 따라서 더 높은 농도의 KCl이 수분 제거에 영향을 준다.
수성 벌크 시약의 동결건조는 소량의 KCl을 용인한다(본 실시예에서 대략 6.3mM). 더 높은 농도의 KCl은 건조된 펠릿의 흡습성에 영향을 주어, 환경으로부터의 물의 흡수를 유발하고, 결국 강력한 반응 혼합물을 생성할 수 없다.
실시예 10
동결건조된 벌크 시약의 동결건조 후 안정성 결정
벌크 시약의 동결건조 후 분취물을 사용한 주변 및 제어된 글러브 박스 실험은, 8시간 미만 동안 10% 상대 습도에 노출된 염 최소화/무함유 제형이 허용 가능한 검정 성능을 생성하였다는 것을 나타내었다. 염-포함 제형 및/또는 동결건조 후 더 높은 상대 습도에 노출된 제형은 허용 가능한 검정 성능을 생성하지 않았다.
본 실시예의 목적은 멀티웰 플레이트 내에 밀봉되고, 주변 습도 조건 하에서 그리고 제어된 10% 상대 습도 조건 하에서 주변 수분(파우치 내)으로부터 보호하기 위해서 완전 밀봉된 동결건조된 벌크 시약의 동결건조 후 안정성을 결정하는 것이었다. 여기서 기술된 특정 실험에 더하여, 추가적인 시간 지점 및 제형 변형을 사용하여 다수의 추가적인 연구를 완결하였다.
플레이트를 얼음 상에서 2℃ 내지 8℃에서 유지시키면서, 멀티웰 플레이트에 벌크 시약의 분취물을 채웠다. 충분한 양의 모든 요구된 성분을 혼합하여 30개의 멀티웰 플레이트 및 충전시키기에 충분한 부피와 5% 과잉량을 갖는 벌크 시약을 생성하였다. 혼합을 하기 지시에 따라서 수행하였다. 뉴클레아제-무함유 물, 2X 글리세롤-무함유 고태크 마스터 믹스(제형은 하기에 나타냄), 1.2M 트레할로스, 10X 프로브/프라이머 믹스, 및 50X 프로메가 RT(동결건조를 위한 0.5% 글리세롤 제형)를 순서대로 첨가한다. 다수의 멀티웰 플레이트의 웰을 1시간 내에 웰당 24uL 벌크 시약으로 충전시켰다. 튜브를 충전시키기 전에 멀티웰 플레이트를 얼음 상에 놓고 2℃ 내지 8℃에서 사전-평형화시켰다. 액체 벌크 시약을 각각의 튜브의 바닥에서 분배하였다. 1시간 충전 윈도우 동안, 멀티웰 플레이트를 얼음 상에서 유지시켰다. 충전된 멀티웰 플레이트를 충전 완결 후에 30분 이내에 동결건조 챔버에 적재하였다. 이어서, 충전된 멀티웰 플레이트를 동결건조 조건에 노출시켰다. 동결건조 공정 이후에, 동결건조 챔버로부터의 회수 이전에 멀티웰 플레이트를 피복/닫았다. 2개의 멀티웰 플레이트를 랩 벤치에 옮겼다. 남아있는 멀티웰 플레이트를 10% 상대 습도 사전-평형화된 글로브 박스로 옮겨서 T=0 샘플로서 제공하였고; 이것을 열고/개방하고, 이어서 표 13에 제시된 바와 같은 다양한 시간 기간 후에 열-밀봉하였다. 6초의 밀봉 시간 및 169℃의 밀봉 온도가 사용된다. 5분 내에, 밀봉된 멀티웰 플레이트를 건조제 필로를 함유하는 지프-락 포일 파우치(zip-lock foil pouch)로 옮기고, 이어서 열-밀봉하였다. 랩 벤치 상의 다른 멀티웰 플레이트의 경우, 이것을 열고/개방하여 하기 표 13에 제시된 바와 같이 다양한 시간 기간 동안 주변 대기에 노출하였다.
노출 시간에서 상대 습도 및 온도, 밀봉 및 파우칭을 기록하였다. 노출 후, 멀티웰 플레이트를 6초의 밀봉 시간 및 169℃의 밀봉 온도를 사용하여 포일 스톡으로 열 밀봉하였다. 상기와 동일한 밀봉 시간/온도 파라미터를 사용하여, 열 밀봉 공정을 노출 조건에서 수행하였다(즉, 실험실 분위기에 노출된 멀티웰 플레이트를 실험실에서 밀봉하고, 제습 조건에 노출된 멀티웰 플레이트를 제습 조건에서 밀봉하였다). 5분 내에, 밀봉된 멀티웰 플레이트를 건조제 필로를 함유하는 지프-락 포일 파우치로 옮기고, 이어서 파우치를 열 밀봉하였다. 이어서 모든 밀봉된 파우치를 2 내지 8℃에서 저장하였다.
시간 지점당 2개의 멀티웰 플레이트를 실시하였다. 주변 조건 하에서, 동결건조 후, 멀티웰 플레이트를 0, 4 및 8시간 동안 밀봉하였다(표 13 참고). 10% 상대 습도 하에서, 동결건조 후, 멀티웰 플레이트를 0, 4, 8 및 24시간 동안 밀봉하였다(표 13 참고). 각각, 시간 지점당 2개의 멀티웰 플레이트 x 조건의 수 = 2 * 3(주변 = 6), 및 2 * 4(10% 상대 습도 글러브 박스 = 8).
2X 고태크 마스터 믹스, 글리세롤 무함유 + 10x 프로브/프라이머 + 트레할로스 + 50X RT를 사용하여 염이 없는 제형을 제조하였다. 예를 들어, 30개의 멀티웰 플레이트의 경우, 순서대로 하기를 첨가하고: 449㎖ 뉴클레아제 무함유 수, 4.81㎖의 2X 고태크 마스터 믹스(B, 염 없음)(1.25X 최종), 1.28㎖의 1.2M 트레할로스(0.2M 최종), 963㎖의 10X 프로브/프라이머 믹스(1.25X 최종), 193㎖의 50X RT(1.25X 최종) = 7.70㎖의 무-염 믹스; 300개의 튜브에 대해서 24ul를 분배하고, 반복 피펫터를 사용한다.
2X 고태크 마스터 믹스, 글리세롤 무함유 + 10x 프로브/프라이머 + 트레할로스 + 50X RT를 사용하여 염을 갖는 제형을 제조하였다. 예를 들어, 38개의 멀티웰 플레이트의 경우, 순서대로 하기를 첨가한다: 560㎖의 뉴클레아제 무함유 수, 6.00㎖의 2X 고태크 마스터 믹스(B, 염 함유)(1.25X 최종), 1.60㎖의 1.2M 트레할로스(0.2M 최종), 1.20㎖의 10X 프로브/프라이머 믹스(1.25X 최종), 240㎖의 50X RT(1.25X 최종) = 9.60㎖의 염-함유 믹스; 380개의 튜브에 대해서 24ul를 분배하고, 반복 피펫터를 사용한다.
멀티웰 플레이트를 표 13에 따른 성능에 대해서 시험하였다. 표 13의 단계 A에서, 염을 갖지 않는 제형을 멀티웰 플레이트에 충전시키고, 동결건조시켰다. 동결건조 후, 멀티웰 카트리지를 조건에 제시된 기간 동안 노출시킨 후 밀봉하였다. 표 13의 단계 B에서, 염을 갖지 않는 제형을 멀티웰 카트리지에 충전시키고, 동결건조시켰다. 동결건조 후, 멀티웰 카트리지를 조건에 제시된 기간 동안 노출시킨 후 밀봉하였다. 표 13의 단계 C에서, 염을 갖는 제형을 멀티웰 카트리지에 충전시키고, 동결건조시켰다. 동결건조 후, 멀티웰 카트리지를 조건에 제시된 기간 동안 노출시킨 후 밀봉하였다.
주변 및 글러브박스 온도는 대략 25℃였다. 본 실험 및 관련 실험의 결과는 무-염 제형을 10% 상대 습도에 8시간 미만 동안 노출시키는 것은 허용 가능한 검정 성능을 유발하였다는 것을 나타내었다. 본 실시예에서, 최소/무염 제형에서의 10% 상대 습도(2.3g/㎥, 25℃에서)에서 8시간 미만의 기간은 허용 가능한 검정 성능을 유발한다.
본 개시내용은 본 개시내용의 조성물, 시약, 방법, 진단, 실험 데이터 등에 제한되지 않고, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 임의의 바람직한 실시형태에 의해서 제한되지 않는다. 맥락으로부터 달리 명백하지 않는 한, 임의의 실시형태, 단계, 특징부, 양상 등이 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 본 명세서에 언급된 모든 문헌은 각각의 개별 특허 및 공개 특허 출원, 뿐만 아니라 도, 도면, 서열 목록, 컴팩트 디스크 등이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것을 나타내는 것처럼 동일한 정도로 참고로 포함된다.
Claims (127)
- (a) 역전사효소 및 이와 다른 중합효소,
(b) 0.16M 내지 0.32M의 농도의 트레할로스로 본질적으로 구성된 벌크화제(bulking agent),
(c) 세정제(detergent),
(d) (i) 수용액 중 0.1mM 내지 0.3mM의 농도의 dATP,
(ii) 수용액 중 0.1mM 내지 0.3mM의 농도의 dGTP,
(iii) 수용액 중 0.1mM 내지 0.3mM의 농도의 dCTP,
(iv) 수용액 중 0.2mM 내지 0.6mM의 농도의 dTTP, 및
(v) 수용액 중 0.2mM 내지 0.6mM의 농도의 dUTP
중 하나 이상을 포함하는 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트(dNTP),
(e) RNase 저해제,
(f) 유기 완충제,
(g) 킬레이팅제, 및
(h) 검정을 수행하는 데 유용한 적어도 2종의 올리고뉴클레오타이드
를 함유하는 수용액을 포함하고,
수용액이 1mM 미만의 칼륨 농도 및 0.1mM 미만의 마그네슘 이온 농도를 갖는, 핵산 기반 증폭 또는 검출을 위한 동결건조전 제형(pre-lyophilized formulation). - 삭제
- 제1항에 있어서,
적어도 2종의 올리고뉴클레오타이드가 증폭 올리고뉴클레오타이드, 검출 프로브 올리고뉴클레오타이드, 표적 포획 프로브 올리고뉴클레오타이드, 어댑터 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 동결건조전 제형. - 제1항에 있어서,
수용액이 무기염을 0.075ug/ul 내지 0.058ug/ul의 질량/마이크로리터로 포함하는, 동결건조전 제형. - 제1항에 있어서,
수용액이 클로라이드 이온을 0.142ug/ul 내지 0.036ug/ul의 질량/마이크로리터로 포함하는, 동결건조전 제형. - 제1항에 있어서,
수용액의 무기염 농도가 1mM 미만의 염화나트륨인, 동결건조전 제형. - 제4항에 있어서,
수용액이 마그네슘 이온을 함유하지 않는, 동결건조전 제형. - 제1항에 있어서,
다른 중합효소가 수용액 중 0.20U/ul 내지 0.72U/ul의 농도로 수용액 중에 존재하는, 동결건조전 제형. - 제8항에 있어서,
다른 중합효소가 0.25U/ul, 0.30U/ul, 0.32U/ul, 0.4U/ul, 0.5U/ul, 0.45U/ul 및 0.72U/ul로부터 선택된 농도로 수용액 중에 존재하는, 동결건조전 제형. - 제9항에 있어서,
역전사효소가 0.1U/ul 내지 0.6U/ul의 농도로 수용액 중에 존재하는, 동결건조전 제형. - 제1항에 있어서,
RNase 저해제가 0.12U/ul 내지 0.20U/ul의 농도로 존재하는, 동결건조전 제형. - 제1항에 있어서,
킬레이팅제가 EDTA이고, 킬레이팅제가 1.5mM 내지 2.0mM의 농도로 수용액 중에 존재하는, 동결건조전 제형. - 제1항 및 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항의 동결건조전 제형으로부터 동결건조된, 동결건조 제형.
- 재구성 용액 및 제13항의 동결건조 제형을 조합하는 단계를 포함하되, 재구성 용액이 적어도 1종의 무기염을 포함하는, 핵산 기반 증폭 반응을 수행하는 데 사용하기 위한 혼합물의 형성 방법.
- 제14항에 있어서,
재구성 용액이 3.8mM 내지 4.4mM의 농도의 MgCl2, 50mM 내지 80mM의 농도의 KCl, 또는 둘 모두를 포함하는, 방법. - 제15항에 있어서,
재구성 용액이 0.012% w/v 내지 0.020% w/v의 농도의 메틸 파라벤, 0.006% w/v 내지 0.010% w/v의 농도의 프로필 파라벤, 0.20% v/v 내지 0.30% v/v의 농도의 무수 에탄올(absolute ethanol) 또는 이들의 조합물을 포함하는, 방법. - 제16항에 있어서,
재구성 용액 중의 메틸 파라벤의 농도가 0.016% w/v이고, 재구성 용액 중의 프로필 파라벤의 농도가 0.008% w/v이고, 재구성 용액 중의 무수 에탄올의 농도가 0.26% v/v인, 방법. - 제13항의 동결건조 제형을 함유하는 제1 용기, 및 재구성 용액을 함유하는 제2 용기를 포함하되, 재구성 용액이 적어도 1종의 무기염을 포함하는, 분자 검정을 수행하는 데 사용하기 위한 키트.
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