KR102727407B1

KR102727407B1 - L-이소루신 생산 미생물 및 이를 이용한 l-이소루신 생산 방법

Info

Publication number: KR102727407B1
Application number: KR1020210184151A
Authority: KR
Inventors: 김희정; 정기용; 김희영; 최우성
Original assignee: 씨제이제일제당 주식회사
Filing date: 2021-12-21
Publication date: 2024-11-08

Abstract

본 출원은 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈(Glutamate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입된 L-이소루신 생산능을 가지는 미생물, 상기 미생물을 이용한 L-이소루신 생산방법 및 상기 미생물을 포함하는 L-이소루신 생산용 조성물에 관한 것이다.

Description

L-이소루신 생산 미생물 및 이를 이용한 L-이소루신 생산 방법{MICROORGANISMS FOR PRODUCING L-ISOLEUCINE AND PROCESS FOR PRODUCING L-ISOLEUCINE USING THE SAME}

L-이소루신(L-isoleucine)은 총 20가지의 아미노산 중 분지쇄 아미노산 (branched-chain amino acid)의 한 종류로 필수아미노산으로 분류되어 동물 사료, 식품 첨가물 및 의약 분야에 사용된다. L-이소루신은 대사 후 에너지 생성, 헤모글로빈 생성, 혈당 조절, 근육 생성 및 보수 등의 기능을 하기 때문에 수액제, 영양제, 스포츠 영양제뿐만 아니라 동물 사료에도 사용이 증가되고 있다.

L-이소루신 생산을 위해서는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)과 대장균 (Escherichia coli)이 대표적인 미생물로 이용되고 있다. 이 미생물들에서 L-이소루신은 다른 분지쇄 아미노산인 L-발린, L-류신과 주된 생합성 경로를 공유하고 있다. L-이소루신의 생합성 경로를 살펴보면 해당 과정 (Glycolysis)에서 생성되는 피루브산 (pyruvate)과 아스파르트산 (Aspartate, Aspartic acid) 유래 아미노산인 L-쓰레오닌으로부터 생성된 2-케토부티르산(2-ketobutyrate)이 전구체로 사용되어 최종적으로 L-이소루신이 생산된다.

L-아미노산 생산을 위해 다양한 미생물 및 이의 변이체를 이용하는 방법이 알려져 있다(미국 등록특허 제10113190호). 그러나, 변이체를 사용한 방법의 경우, L-이소루신을 제외한 부산물이 다수 생성되며, 이는 정제 단계에서 L-이소루신의 순도를 낮추는 문제점이 있다.

이와 관련하여, L-이소루신의 순도를 높이기 위해 L-이소루신 정제방법 등이 알려져 있으나(미국 등록특허 제6072083호), 상기 정제방법은 별도의 추가적인 정제 과정이 요구되는 단점이 있어, L-이소루신의 순도를 증가시키는 방법의 개발이 필요한 실정이다.

한편, L-글루타메이트는 L-이소루신을 포함한 아미노산을 합성하는데 있어 아민기를 제공하는 전구체이다. 아미노산을 생산하는데 있어서 전구체인 L-글루타메이트 합성 강화가 필수적이나, L-이소루신을 생산하는 미생물에서 글루타메이트를 생성하는 것으로 알려져 있는 글루타메이트 디하이드로게네이즈(Glutamate dehydrogenase)를 강화하는 경우, 이소루신의 중간물질인 2-케토부티르산(2-ketobutyrate)의 탈수소반응을 통해 부산물인 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid, AABA)을 생성하는 부반응이 일어나므로 (Microb Cell Fact. 2017 Mar 23;16(1):51), 이에 따라, L-이소루신 순도 및 생합성 효율이 낮아지는 문제점이 있다.

본 출원의 하나의 목적은 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈(Glutamate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입된 L-이소루신 생산능을 가지는 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 L-이소루신의 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 포함하는 L-이소루신 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.

본 출원의 하나의 양태는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈(Glutamate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입된 L-이소루신 생산능을 가지는 미생물을 제공한다.

본 출원에서 용어, "L-이소루신"은 필수 아미노산의 하나로 구조적으로 L-발린, L-루신과 함께 분지쇄 아미노산에 해당하는 화학식 HO2CCH(NH2)CH(CH3)CH2CH3인 L-아미노산을 의미한다.

본 출원에서 용어, "균주(또는, 미생물)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.

본 출원에서 용어, "L-이소루신 생산능을 가지는 미생물"이란, 자연적으로 L-이소루신의 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 L-이소루신의 생산능이 없는 모균주에 L-이소루신의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 구체적으로 상기 미생물은 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈(Glutamate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입된, L-이소루신을 생산하는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 "L-이소루신을 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함한다. 더욱 구체적으로, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 L-이소루신 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 L-이소루신 생산 활성을 강화시킨 미생물일 수 있다. 본 출원의 목적상, 상기 L-이소루신 생산능을 가지는 미생물은 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈(Glutamate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어, 목적하는 L-이소루신 생산능이 증가된 것을 특징으로 하며, 유전적으로 변형된 미생물 또는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어, 활성의 "도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 유전자가 그 미생물내에서 발현됨에 따라 특정 단백질의 활성을 나타나게 되는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 증가 또는 향상된 활성을 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다.

일 예로, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 gdh 단백질의 내재적 활성을 가지는 비변형 미생물의 L-이소루신 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 1% 이상, 약 2% 이상, 약 3% 이상, 약 4% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 8.1% 이상, 약 8.2% 이상 또는 약 8.3% 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 15% 이하 또는 약 10% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, L-이소루신 생산능이 약 1.01배 이상, 약 1.02배 이상, 약 1.03배 이상, 약 1.04배 이상, 약 1.05배 이상, 약 1.06배 이상, 약 1.07배 이상 또는 약 1.08배 이상(상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 약 2배 이하, 약 1.5배 이하 또는 약 1.1배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈 유전자가 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.

본 출원의 또 다른 일 예로, 본 출원의 미생물은 L-이소루신을 생산할 수 있는 미생물 일 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 출원의 미생물은 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하나, 구체적으로 원핵세포일 수 있다. 상기 원핵세포는, 일 예로 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Seratia) 속, 프로비덴시아(Providencia)속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주를 포함할 수 있으며, 구체적으로 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물일 수 있다.

본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 더욱 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

본 출원에서 용어, “글루타메이트 디하이드로게네이즈 (Glutamate dehydrogenase)"는 L-이소루신 생합성의 전구체인 글루타메이트를 합성하는 효소로서, 본 출원에서 상기 "글루타메이트 디하이드로게네이즈"는 "gdh", "rocG"와 혼용될 수 있다.

본 출원에서 용어, "글루타메이트 디하이드로게네이즈 활성을 가지는 단백질" 및 "글루타메이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자"에는 상기와 같은 글루타메이트 디하이드로게네이즈 활성을 가지는 임의의 단백질 및 이를 코딩하는 임의의 유전자가 제한 없이 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 글루타메이트 디하이드로게네이즈는 당업계에 공지되어 있으며, 상기 글루타메이트 디하이드로게네이즈의 단백질 및 유전자 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, L-글루타메이트는 L-이소루신을 포함한 아미노산을 합성하는데 있어 아민기를 제공하는 전구체이다. 아미노산을 생산하는데 있어서 전구체인 L-글루타메이트 합성 강화가 필수적이나, L-이소루신을 생산하는 미생물에서 글루타메이트를 생성하는 것으로 알려져 있는 상기 글루타메이트 디하이드로게네이즈(Glutamate dehydrogenase)를 강화하는 경우, 이소루신의 중간물질인 2-케토부티르산(2-ketobutyrate)의 탈수소반응을 통해 부산물인 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid, AABA)을 생성하는 부반응이 일어나므로 (Microb Cell Fact. 2017 Mar 23;16(1):51), 이에 따라, L-이소루신 순도 및 생합성 효율이 낮아지는 문제점이 있다.

본 출원의 L-이소루신 생산능을 가지는 미생물은 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈(Glutamate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입됨으로써, 부산물 생성량이 감소될 수 있다. 상기 부산물은 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid, AABA)일 수 있다. 상기 부산물 생성량의 감소는, 야생형 미생물에 비해, L-이소루신 생성량 대비 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid, AABA)의 생성량이 감소된 것을 의미할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 목적상, 상기 글루타메이트 디하이드로게네이즈 활성을 가지는 단백질은 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 유래일 수 있다. 구체적으로, 상기 글루타메이트 디하이드로게네이즈는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 가지거나 및/또는 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어지거나(essentially consisting of), 구성될 수 있다.

또한, 본 출원의 글루타메이트 디하이드로게네이즈는 상기 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 글루타메이트 디하이드로게네이즈에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 글루타메이트 디하이드로게네이즈도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 단백질' 또는 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질'라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.

예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 글루타메이트 디하이드로게네이즈의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.

본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파테이트를 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소루신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다. 또한, 아미노산은 전하를 띠는(electrically charged) 곁사슬을 갖는 아미노산과 전하를 띠지 않는(uncharged) 곁사슬을 갖는 아미노산으로 분류할 수 있으며, 전하를 띠는 곁사슬을 갖는 아미노산은 아스르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 히스티딘을 포함하고, 전하를 띠지 않는 곁사슬을 갖는 아미노산은 다시 비극성(nonpolar) 아미노산 또는 극성 아미노산(polar)으로 분류할 수 있으며, 비극성 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소루신. 메티오닌, 페닐알라닌. 트립토판, 프롤린, 극성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민을 포함하는 것으로 분류할 수 있다. 통상적으로, 보존성 치환은 생성된 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않는다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.

또한, 글루타메이트 디하이드로게네이즈는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널 (또는 리더)서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.

본 출원에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math(1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al.(1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358(1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.

본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.

예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.

이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needleman 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.

본 출원에서 용어, "내재적" 활성은 본래 미생물이 천연의 상태 또는 해당 단백질의 변형 이전에 가지고 있는 단백질의 활성 상태를 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다.

본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.

상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.

상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).

구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 강화는

1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;

2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역의 변형(예를 들어, 발현조절영역 내 변이 발생, 더욱 강한 활성을 갖는 서열로의 교체, 또는 더욱 강한 활성을 갖는 서열 삽입);

3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;

4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;

5) 폴리펩티드 활성이 강화도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);

6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;

7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;

8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는

9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로,

상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.

상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.

상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.

상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.

상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.

이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 출원의 목적상, 상기 미생물은 글루타메이트 디하이드로게네이즈 단백질 활성을 강화시키기 위해 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 유래의 글루타메이트 하이드로게네이즈의 활성을 가지는 외래 폴리뉴클레오티드를 도입시킬 수 있다.

본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

본 출원에 따른 폴리뉴클레오티드는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 유래인 것을 특징으로 하며, 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 상기 바실러스 서브틸러스 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자; 및 로도스피릴라레스 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자;는 각각 서열번호 2 및 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 2 또는 서열번호 4의 염기 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서, 상기 서열번호 2 또는 서열번호 4의 염기 서열을 포함하는 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 염기 서열을 가지는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드와 혼용하여 사용될 수 있다.

본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 6% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).

본 출원의 목적상, 상기 미생물은 상기 외래 폴리뉴클레오티드를 숙주에서 발현시키기 위한 발현 벡터를 포함함으로써, 상기 글루타메이트 디하이드로게네이즈 단백질 활성이 내재적 활성에 비해 강화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원의 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계, pSK계, pSKH계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pSK, pSKH130, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 출원의 구체적 실시양태에서 코리네박테리움 속 미생물은 추가적으로 활성이 강화된 L-이소루신 생합성 경로에 관여하는 효소를 포함할 수 있다.

본 출원에서 용어 "L-이소루신 생합성 경로에 관여하는 효소"에는 아스파르테이트 키나아제(aspartate kinase, lysC 유전자), 아스파르테이트-β-세미알데히드 디하이드로게나아제(aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase, asd 유전자), 호모세린 디하이드로게나아제(homoserine dehydrogenase, hom 유전자), 호모세린 키나아제(homoserine kinase, thrB 유전자), 쓰레오닌 신타아제(threonine synthase, thrC 유전자), 쓰레오닌 디하이드라타아제(threonine dehydratase, ilvA 유전자), 아미노트랜스퍼라제(aminotransferase, ilvE 유전자) 등이 포함될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 L-이소루신의 생산 방법을 제공한다.

상기 미생물, L-이소루신에 대해서는 전술한 바와 같다.

구체적으로, 상기 바실러스 서브틸러스 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자; 및 로도스피릴라레스 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자;는 각각 서열번호 2 및 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 방법은 L-이소루신 생성량 대비 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid, AABA)의 생성량이 감소되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 용어, "배양"은 본 출원의 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원에서는 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

배양물의 온도는 25℃내지 40℃일 수 있으며, 보다 구체적으로는 28℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 1 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 배양에 의하여 생산된 L-이소루신은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.

본 출원의 L-이소루신 생산 방법은, 본 출원의 미생물을 준비하는 단계, 상기 미생물을 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.

본 출원의 L-이소루신 생산 방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 미생물로부터 L-이소루신을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.

상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 L-이소루신을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-이소루신을 회수할 수 있다.

또한, 본 출원의 L-이소루신 생산 방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 L-이소루신 생산 방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 미생물을 포함하는 L-이소루신 생산용 조성물을 제공한다.

상기 미생물, L-이소루신에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 출원의 조성물은 L-이소루신 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈(Glutamate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입된 L-이소루신 생산능을 가지는 미생물의 L-이소루신 생산 용도를 제공하는 것이다.

본 출원의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈(Glutamate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입된 L-이소루신 생산능을 가지는 미생물은, 부산물이 적게 생성되어 고수율로 L-이소루신을 생산할 수 있어 L-이소루신의 산업적 생산에 유용하게 활용될 수 있다.

이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈(Glutamate dehydrogenase) 도입을 위한 재조합 벡터 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 염색체 내에 외래 gdh 과발현 벡터를 삽입하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰에서 트랜스포존을 코딩하는 유전자로 알려진 NCgl2872를 삽입 site로 이용하였다(Journal of Biotechnology 104, 5-25 Jorn Kalinowski et al, 2003). NCgl2872 유전자를 외래 gdh로 치환하기 위하여 NCgl2872 결손 및 타겟 유전자 삽입 벡터를 제작하였다. 벡터를 제작하기 위해 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 5 와 서열번호 6, 서열번호 7 과 서열번호 8의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 각각 수행하였다 PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 변성; 및 72℃ 1분 중합반응이며, 이러한 조건의 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하였다. 그 결과 각각 623bp, 620bp의 DNA 단편을 수득하였다. 수득한 DNA 산물을 PCR 정제 키트(PCR Purification kit, QUIAGEN)를 사용하여 정제하고, 열처리한 pDCM2 벡터(대한민국 공개특허 제10-2020-0136813호)와 인퓨전 클로닝 키트(Infusion Cloning Kit, TaKaRa)를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 NCgl2872 결손 및 타겟 유전자 삽입용 벡터 pDCM2△N2872을 제작하였다.

모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰의 gdh 프로모터를 가진 외래 gdh가 도입된 균주를 제작하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATC13032, 대장균, 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis), 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 및 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)의 염색체를 각각 주형으로 하여 각각 서열번호 9 및 서열번호 10; 또는 서열번호 9 및 서열번호 11; 또는 서열번호 12 및 서열번호 13; 또는 서열번호 14 및 서열번호 15; 또는 서열번호 16 및 서열번호 17; 또는 서열번호 18 및 서열번호 19;의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. 상기 각각의 PCR을 수행하기 위해 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

서열번호	명칭	서열
5	primer	tgaattcgagctcggtacccAGGCGCAGGGCCGGG
6	primer	gggCAACGCCCACACGCAGCG
7	primer	AgggGCCCCGCTGAAGTCATC
8	primer	gactctagaggatccccGCAGATCCAGTCCATCCC
9	primer	CTGCGTGTGGGCGTTGcccTACCAATTCCATTTGAGGGC
10	primer	GATTTCCTCGTTCCCA
11	primer	ATGACTTCAGCGGGGCcccTTAGATGACGCCCTGTGCCA
12	primer	GATGGGAACGAGGAAATCATGGATCAGACATATTCTCT
13	primer	GATGACTTCAGCGGGGCcccTTAAATCACACCCTGCGCC
14	primer	GATGGGAACGAGGAAATCATGTCAGCAAAGCAAGTCTC
15	primer	GATGACTTCAGCGGGGCcccTTAGACCCATCCGCGGAA
16	primer	GATGGGAACGAGGAAATCATGTCTAAAAGCCACAGCGG
17	primer	GATGACTTCAGCGGGGCcccTTAAACCACACCTTCCGC
18	primer	GATGGGAACGAGGAAATCATGAGCGAACTACACCCCAA
19	primer	GATGACTTCAGCGGGGCcccTCAGATGAGCCCGAGTGCG

PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 변성; 및 72℃ 1분 중합반응이며, 이러한 조건의 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하였다. 그 결과, gdh 프로모터 부위의 519bp DNA 단편, 프로모터를 포함한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATC13032 gdh 부위의 1882bp DNA 단편, 대장균의 gdh 부위의 1382bp DNA 단편, 바실러스 서브틸러스 gdh(rocG) 부위의 1313bp DNA 단편, Rhodospirillales gdh 부위의 1424bp DNA 단편, Mychobacterium smegmatis gdh 부위의 1388bp DNA 단편을 각각 수득하였다.

증폭된 프로모터와 외래 gdh DNA 절편을 주형으로 하여 서열번호 9 및 서열번호 13; 또는 서열번호 9 및 서열번호 15; 또는 서열번호 9 및 서열번호 17; 또는 서열번호 9 및 서열번호 19;의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건으로 95℃에서 5분간 변성 이후, 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 2분 중합을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

그 결과 코리네박테리움 글루타미쿰 ATC13032 gdh 프로모터를 가지고 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 2Kb의 외래 gdh DNA 단편이 증폭되었다. 증폭 산물을 PCR 정제 키트(PCR Purification kit, QUIAGEN)를 사용하여 정제하고, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 정제한 증폭 산물을 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDCM2△N2872 벡터와 상기 증폭 산물인 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하고, 인퓨전 클로닝 키트(Infusion Cloning Kit, TaKaRa)를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 외래 gdh를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2△N2872::Pn_gdh(c.gl), pDCM2△N2872::Pn_gdh(E.coli), pDCM2△N2872::Pn_rocG(B.su), pDCM2△N2872::Pn_gdh(rhodospirillales), pDCM2△N2872::Pn_gdh(m.sm)를 제작하였다.

실시예 2: L-이소루신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 균주 제작

야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰은 L-이소루신을 생산하는 능력은 있으나, 과량 생산하지는 않는다. 이에, 본 출원의 목적에 따라 L-이소루신 생산능을 증가시키는 유전 형질을 확인하기 위하여, L-이소루신 생산능이 증가된 균주를 활용하고자 하였다.

먼저, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 L-이소루신 생산 균주를 개발하였다. 구체적으로, L-이소루신 생합성 경로에서 이소루신의 전구체인 쓰레오닌의 피드백 저해 해소를 위해, 호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 hom를 변이하여, 호모세린 디하이드로게나제의 407번째 아미노산인 아르기닌을 히스티딘으로 치환하였다(대한민국 등록특허 제10-1996769호). 구체적으로, hom(R407H)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20에 나타내었다.

구체적으로, hom(R407H) 변이가 도입된 균주들을 제작하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 21 및 서열번호 22; 또는 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. 상기 각각의 PCR을 수행하기 위해 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.

서열번호	명칭	서열
21	primer	TCGAGCTCGGTACCCCGCTTTTGCACTCATCGAGC
22	primer	CACGATCAGATGTGCATCATCAT
23	primer	ATGATGATGCACATCTGATCGTG
24	primer	CTCTAGAGGATCCCCGAGCATCTTCCAAAACCTTG

PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 중합반응 72℃ 1분 중합반응이며, 이러한 조건의 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하였다. 그 결과, hom 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 1000 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 1000 bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다.

증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 21 및 서열번호 24의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건으로 95℃ 5분간 변성 이후, 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 2분 중합을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

그 결과, 407번째 아르기닌이 히스티딘으로 치환된 호모세린 디하이드로게나제 변이체를 코딩하는 hom 유전자의 변이를 포함하는 2 kb의 DNA 단편이 증폭되었다. 증폭 산물을 PCR 정제 키트(PCR Purification kit, QUIAGEN)를 사용하여 정제하고 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 정제한 증폭 산물을 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDCM2 벡터와 상기 증폭 산물인 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하고, 인퓨전 클로닝 키트(Infusion Cloning Kit, TaKaRa)를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 hom(R407H) 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2-R407H를 제작하였다.

제작된 벡터를 전기천공법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 hom(R407H) 변이를 포함하는 균주를 얻었으며, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 hom(R407H)로 명명하였다.

제작한 ATCC13032 hom(R407H) 균주에 L-이소루신에 대한 피드백 해제와 활성을 증가시키기 위해, L-쓰레오닌 디하이드라타아제(L-threonine dehydratase)를 코딩하는 유전자인 ilvA를 변이하여, L-쓰레오닌 디하이드라타아제(서열번호 25)의 381번째 아미노산인 쓰레오닌을 알라닌으로 치환 및 383번째 아미노산인 페닐알라닌을 알라닌으로 치환하였다. 또한, ilvA(T381A+F383A)가 도입된 균주를 제작하였다.

구체적으로, 상기 ilvA(T381A+F383A) 변이가 도입된 균주들을 제작하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 26 및 서열번호 27; 또는 서열번호 28 및 서열번호 29의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. 상기 각각의 PCR을 수행하기 위해 사용된 프라이머 서열은 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.

서열번호	명칭	서열
26	primer	TCGAGCTCGGTACCCATGAGTGAAACATACGTGTC
27	primer	GCGCTTGAGGTACTCtgcCAGCGcGATGTCATCATCCGG
28	primer	CCGGATGATGACATCgCGCTGgcaGAGTACCTCAAGCGC
29	primer	CTCTAGAGGATCCCCCGTCACCGACACCTCCACA

PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 변성; 및 72℃ 1분 중합반응이며, 이러한 조건의 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하였다. 그 결과, ilvA 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 1126 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 286 bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다.

증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 26 및 서열번호 29의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건으로 95℃에서 5분간 변성 이후, 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 2분 중합을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

그 결과, 381번째 쓰레오닌이 알라닌으로 및 383번째 페닐알라닌이 알라닌으로 치환된 L-쓰레오닌 디하이드라타아제 변이체를 코딩하는 ilvA 유전자의 변이를 포함하는 1.4 kb의 DNA 단편이 증폭되었다. 증폭 산물을 PCR 정제 키트(PCR Purification kit, QUIAGEN)를 사용하여 정제하고, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 정제한 증폭 산물을 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDCM2 벡터와 상기 증폭 산물인 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하고, 인퓨전 클로닝 키트(Infusion Cloning Kit, TaKaRa)를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 ilvA(T381A+F383A) 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2-ilvA(T381A+F383A)를 제작하였다.

제작된 벡터를 전기천공법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 hom(R407H)에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 ilvA(T381A+F383A) 변이를 포함하는 균주를 얻었으며, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101이라 명명하였다.

참고로, 상기 ilvA(T381A+F383A)을 L-이소루신 생산 균주에 도입하는 것이 L-이소루신에 대한 피드백 해제와 활성을 증가시켜 L-이소루신 생산성 효율을을 증가시키는 것인지 확인하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로, NTG(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 처리된 L-이소루신 생산 균주인 KCJI-38(KCCM11248P, 대한민국 등록특허 제10-1335789호) 균주에 상기 ilvA(T381A+F383A) 변이를 전기펄스법으로 도입한 KCCM11248P/pECCG117-ilvA(T381A+F383A) 균주 배양액 중의 L-이소루신 및 L-쓰레오닌 농도를 측정한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

균주명	L-이소루신(g/L)	L-쓰레오닌(g/L)
KCCM11248P	1.5	0.5
KCCM11248P/pECCG117-ilvA(F383A)	2.8	0.6
KCCM11248P/pECCG117-ilvA(T381A+F383A)	4.0	0.0

상기 표 3에 나타난 바와 같이, ilvA(T381A+F383A) 변이를 도입한 KCCM11248P/pECCG117-ilvA(T381A+F383A) 균주는 KCCM11248P 또는 KCCM11248P/pECCG117-ilvA(F383A) 균주에 비해 L-이소루신 생산이 현저히 증가하고, L-쓰레오닌 분해율이 높은 것을 확인하였다. 다시 말해서, 본 출원의 목적상 ilvA(T381A+F383A) 변이는 L-이소루신에 대한 피드백 해제와 활성을 증가시키기 위해 도입한 것임이 확인되었다.

실시예 3: 외래 gdh가 도입된 L-이소루신 균주 제작 및 이소루신 생산능 평가

상기 실시예 1에서 제작된 벡터를 전기천공법으로 상기 실시예 2에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 외래 gdh가 도입된 균주를 얻었으며, 서열번호 30 및 서열번호 31을 통해 도입여부를 확인하였다. 상기 PCR을 수행하기 위해 사용된 프라이머 서열은 하기 표 에 나타낸 바와 같다.

서열번호	명칭	서열
30	primer	AACTGATGCCTGAGGACAAG
31	primer	GCTTGATACCGAAGCAAACC

CA10-3101△N2872가 도입된 균주를 CA10-3135로, CA10-3101△N2872::Pn_gdh(C.gl)가 도입된 균주를 CA10-3136로, CA10-3101△N2872::Pn_gdh(eco)가 도입된 균주를 CA10-3137로, CA10-3101△N2872::Pn_rocG(B.su)가 도입된 균주를 CA10-3138로, CA10-3101△N2872::Pn_gdh(rhodospirillales)가 도입된 균주를 CA10-3139로, CA10-3101△N2872::Pn_gdh(m.sm)가 도입된 균주를 CA10-3140로 명명하였다.

제작된 6종의 균주의 L-이소루신 생산성 증가 및 부산물 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid, AABA)의 저감효과를 확인하기 위해 각각의 균주를 하기와 같은 방법으로 발효역가 평가를 진행하였다. 이소루신 생산배지 25㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주 및 상기 변이주를 접종한 후, 32℃에서 60시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-이소루신을 제조하였다.

본 실시예 에서 사용한 생산배지의 조성은 하기와 같다.

<생산배지>

포도당 10%, 효모추출물 0.2%, 황산암모늄 1.6%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.1%, 황산철7수염 10mg/ℓ, 황산망간1수염 10 mg/ℓ, 비오틴 200 ㎍/ℓ, pH 7.2

배양종료 후, 액체고속크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 L-이소루신, α-아미노부티릭산(AABA) 생산량을 측정하였고, 농도는 하기 표 6에 나타내었다.

	L-이소루신 농도 (g/L)	AABA 농도 (g/L)
CA10-3101(모균주)	2.4	0.8
CA10-3135	2.5	1.6
CA10-3136	2.6	1.4
CA10-3137	2.5	1.7
CA10-3138	2.6	0.8
CA10-3139	2.5	0.7
CA10-3140	2.7	2.1

그 결과, 상기 표 6에 나타난 바와 같이, 모균주 대비 L-이소루신은 CA10-3136, CA10-3138은 8.3%, CA10-3135, CA10-3137, CA10-3139은 4.2%, CA10-3140은 12.5% 증가함을 확인하였다. 부산물인 AABA는 모균주 대비 CA10-3135은 100%, CA10-3136은 75%, CA10-3137은 112.5%, CA10-3140은 162.5% 증가하였으며, CA10-3138은 모균주와 동일하며, CA10-3139은 12.5% 감소하였음을 확인하였다.

이에 따라, 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101 대비 rocG(b.su) 및 gdh(rhodospirillales) 도입주(CA10-3138, CA10-3139)에서 L-이소루신 생성량 대비 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid, AABA)의 생성량이 감소된 것을 확인하였다. 또한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATC13032 gdh 도입주 CA10-3135 대비 L-이소루신 생성량은 동등 수준이나 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid, AABA)의 생성량이 감소된 것을 확인하였다. 따라서, 다양한 외래 gdh 유전자 중 rocG(b.su) 및 gdh(rhodospirillales) 유래의 글루타메이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자가 도입되는 경우, L-이소루신 생산은 유지하면서 부산물을 감소시켜 L-이소루신의 발효 순도를 높일 수 있음을 확인하였다.

실시예 4: L-이소루신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P 균주에서 외래 gdh 강화주의 제작 및 평가

상기 실시예 3에서 확인한 L-이소루신 생산능 증가 및 부산물의 감소에 효과적인 rocG (b.su 유래) 및 gdh(rhodospirillales 유래)를 NTG(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 처리된 L-이소루신 생산균주인 KCJI-38(KCCM11248P, 대한민국 등록특허 제10-1335789호) 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별배지에 도말하여 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 외래 gdh 도입주를 획득하였다. 그 후 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 배양액 중의 L-이소루신과 부산물 농도를 측정하고, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

	L-이소루신 농도 (g/L)	AABA 농도 (g/L)
KCCM11248P (모균주)	1.4	0.7
KCCM11248P△N2872::Pn_gdh(C.gl)	1.6	1.4
KCCM11248P△N2872::Pn_ rocG(B.su)	1.6	0.7
KCCM11248P △N2872::Pn_gdh(rhodospirillales)	1.7	0.6

상기 표 7에 나타난 바와 같이, 모균주인 KCCM11248P 대비 rocG(b.su) 및 gdh(rhodospirillales) 도입주에서 부산물 AABA가 감소함을 확인하였다. 구체적으로는 L-이소루신의 농도와 AABA의 농도 모두 증가하는 KCCM11248P△N2872::Pn_gdh(C.gl) 균주와 달리 KCCM11248P△N2872::Pn_rocG(B.su), KCCM11248P△N2872::Pn_gdh(rhodospirillales) 균주의 경우에는 L-이소루신 생산성을 유지하며 부산물인 AABA가 감소하였고, L-이소루신의 발효 순도를 높일 수 있음이 확인되었다.

이에 따라, 본 출원의 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈(Glutamate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입된 미생물이 L-이소루신의 순도를 증가시켜 고수율로 L-이소루신을 생산할 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> MICROORGANISMS FOR PRODUCING L-ISOLEUCINE AND PROCESS FOR PRODUCING L-ISOLEUCINE USING THE SAME <130> KPA211639-KR <160> 31 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 424 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 1 Met Ser Ala Lys Gln Val Ser Lys Asp Glu Glu Lys Glu Ala Leu Asn 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ser Thr Gln Thr Ile Ile Lys Glu Ala Leu Arg Lys Leu 20 25 30 Gly Tyr Pro Gly Asp Met Tyr Glu Leu Met Lys Glu Pro Gln Arg Met 35 40 45 Leu Thr Val Arg Ile Pro Val Lys Met Asp Asn Gly Ser Val Lys Val 50 55 60 Phe Thr Gly Tyr Arg Ser Gln His Asn Asp Ala Val Gly Pro Thr Lys 65 70 75 80 Gly Gly Val Arg Phe His Pro Glu Val Asn Glu Glu Glu Val Lys Ala 85 90 95 Leu Ser Ile Trp Met Thr Leu Lys Cys Gly Ile Ala Asn Leu Pro Tyr 100 105 110 Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ile Ile Cys Asp Pro Arg Thr Met Ser Phe 115 120 125 Gly Glu Leu Glu Arg Leu Ser Arg Gly Tyr Val Arg Ala Ile Ser Gln 130 135 140 Ile Val Gly Pro Thr Lys Asp Ile Pro Ala Pro Asp Val Tyr Thr Asn 145 150 155 160 Ser Gln Ile Met Ala Trp Met Met Asp Glu Tyr Ser Arg Leu Arg Glu 165 170 175 Phe Asp Ser Pro Gly Phe Ile Thr Gly Lys Pro Leu Val Leu Gly Gly 180 185 190 Ser Gln Gly Arg Glu Thr Ala Thr Ala Gln Gly Val Thr Ile Cys Ile 195 200 205 Glu Glu Ala Val Lys Lys Lys Gly Ile Lys Leu Gln Asn Ala Arg Ile 210 215 220 Ile Ile Gln Gly Phe Gly Asn Ala Gly Ser Phe Leu Ala Lys Phe Met 225 230 235 240 His Asp Ala Gly Ala Lys Val Ile Gly Ile Ser Asp Ala Asn Gly Gly 245 250 255 Leu Tyr Asn Pro Asp Gly Leu Asp Ile Pro Tyr Leu Leu Asp Lys Arg 260 265 270 Asp Ser Phe Gly Met Val Thr Asn Leu Phe Thr Asp Val Ile Thr Asn 275 280 285 Glu Glu Leu Leu Glu Lys Asp Cys Asp Ile Leu Val Pro Ala Ala Ile 290 295 300 Ser Asn Gln Ile Thr Ala Lys Asn Ala His Asn Ile Gln Ala Ser Ile 305 310 315 320 Val Val Glu Ala Ala Asn Gly Pro Thr Thr Ile Asp Ala Thr Lys Ile 325 330 335 Leu Asn Glu Arg Gly Val Leu Leu Val Pro Asp Ile Leu Ala Ser Ala 340 345 350 Gly Gly Val Thr Val Ser Tyr Phe Glu Trp Val Gln Asn Asn Gln Gly 355 360 365 Tyr Tyr Trp Ser Glu Glu Glu Val Ala Glu Lys Leu Arg Ser Val Met 370 375 380 Val Ser Ser Phe Glu Thr Ile Tyr Gln Thr Ala Ala Thr His Lys Val 385 390 395 400 Asp Met Arg Leu Ala Ala Tyr Met Thr Gly Ile Arg Lys Ser Ala Glu 405 410 415 Ala Ser Arg Phe Arg Gly Trp Val 420 <210> 2 <211> 1275 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 2 atgtcagcaa agcaagtctc gaaagatgaa gaaaaagaag ctcttaactt atttctgtct 60 acccaaacaa tcattaagga agcccttcgg aagctgggtt atccgggaga tatgtatgaa 120 ctcatgaaag agccgcagag aatgctcact gtccgcattc cggtcaaaat ggacaatggg 180 agcgtcaaag tgttcacagg ctaccggtca cagcacaatg atgctgtcgg tccgacaaag 240 gggggcgttc gcttccatcc agaagttaat gaagaggaag taaaggcatt atccatttgg 300 atgacgctca aatgcgggat tgccaatctt ccttacggcg gcgggaaggg cggtattatt 360 tgtgatccgc ggacaatgtc atttggagaa ctggaaaggc tgagcagggg gtatgtccgt 420 gccatcagcc agatcgtcgg tccgacaaag gatattccag ctcccgatgt gtacaccaat 480 tcgcagatta tggcgtggat gatggatgag tacagccggc tgcgggaatt cgattctccg 540 ggctttatta caggtaaacc gcttgttttg ggaggatcgc aaggacggga aacagcgacg 600 gcacagggcg tcacgatttg tattgaagag gcggtgaaga aaaaagggat caagctgcaa 660 aacgcgcgca tcatcataca gggctttgga aacgcgggta gcttcctggc caaattcatg 720 cacgatgcgg gcgcgaaggt gatcgggatt tctgatgcca atggcgggct ctacaaccca 780 gacggccttg atatccctta tttgctcgat aaacgggaca gctttggtat ggtcaccaat 840 ttatttactg acgtcatcac aaatgaggag ctgcttgaaa aggattgcga tattttagtg 900 cctgccgcga tctccaatca aatcacagcc aaaaacgcac ataacattca ggcgtcaatc 960 gtcgttgaag cggcgaacgg cccgacaacc attgatgcca ctaagatcct gaatgaaaga 1020 ggcgtgctgc ttgtgccgga tatcctagcg agtgccggcg gcgtcacggt ttcttatttt 1080 gaatgggtgc aaaacaacca aggatattat tggtcggaag aagaggttgc agaaaaactg 1140 agaagcgtca tggtcagctc gttcgaaaca atttatcaaa cagcggcaac acataaagtg 1200 gatatgcgtt tggcggctta catgacgggc atcagaaaat cggcagaagc atcgcgtttc 1260 cgcggatggg tctaa 1275 <210> 3 <211> 461 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Rhodospirillales <400> 3 Met Ser Lys Ser His Ser Gly Ala Lys Thr Gln Glu Tyr Leu Glu Arg 1 5 10 15 Tyr Met Glu Gly Val Thr Lys Arg Asn Pro Gly Gln Pro Glu Phe Val 20 25 30 Gln Ala Val Tyr Glu Val Ala Ser Thr Ile Phe Pro Tyr Ile Ser Asp 35 40 45 Lys Pro Gln Tyr His Glu Asn Gln Ile Leu Glu Arg Met Ala Glu Pro 50 55 60 Glu Arg Val Ile Ser Phe Arg Val Pro Trp Thr Asp Asp Ser Gly Asn 65 70 75 80 Ile Arg Thr Asn Arg Gly Trp Arg Val Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly 85 90 95 Pro Tyr Lys Gly Leu Arg Phe His Pro Ser Val Asn Leu Gly Ile Ile 100 105 110 Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Thr Leu 115 120 125 Ala Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys 130 135 140 Ser Asp Leu Glu Val Met Lys Phe Thr Gln Ser Phe Met Arg Glu Leu 145 150 155 160 Phe Arg His Ile Gly Ala Asp Val Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly 165 170 175 Val Gly Gly Arg Glu Ile Gly Phe Leu Tyr Gly Tyr Tyr Lys Lys Ile 180 185 190 Arg Asn Glu Phe Thr Gly Val Leu Thr Gly Arg Ala Leu Glu Phe Gly 195 200 205 Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Ala Val Tyr Phe 210 215 220 Gly Ala Glu Met Leu Ala Thr Arg Lys Lys Asp Tyr Lys Gly Leu Arg 225 230 235 240 Cys Leu Val Ser Gly Lys Gly Asn Val Thr Gln Tyr Thr Ile Glu Lys 245 250 255 Ile Asn Gln Leu Gly Gly Lys Ala Ile Ser Ile Ser Asp Ser Gly Gly 260 265 270 Thr Ile Ile Asp Glu Asp Gly Ile Ser Ala Glu Arg Leu Asn Tyr Val 275 280 285 Met Glu Leu Glu Asn Val Arg Arg Gly Arg Ala Lys Glu Tyr Ala Glu 290 295 300 Lys Tyr Lys Ser Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Lys Ser Val Trp Asp Val 305 310 315 320 Val Lys Asp Glu Gly Leu Gln Phe Asp Cys Ala Phe Pro Ser Ala Thr 325 330 335 Gln Asn Glu Ile Asp Glu Gln His Ala Thr Ala Met Val Lys Asn Gly 340 345 350 Cys Phe Leu Val Ser Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Asn Leu Ala Ala 355 360 365 Ile Lys Val Tyr Gln Gly Ala Asn Ile Leu Tyr Gly Pro Ala Lys Ala 370 375 380 Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ala Gln Gln 385 390 395 400 Ser Ala Arg Trp Tyr Trp Ser Arg Glu Glu Val Asp Gln Lys Leu His 405 410 415 Arg Ile Met Gln Ala Ile His Lys Gln Cys Leu Asp Ala Ser Lys Ala 420 425 430 Tyr Ala Thr Glu Gly Asp Tyr Leu Ala Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe 435 440 445 Ile Lys Val Ala His Ala Met Val Ala Glu Gly Val Val 450 455 460 <210> 4 <211> 1386 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Rhodospirillales <400> 4 atgtctaaaa gccacagcgg cgctaaaacc caggaatatc tggaacgtta catggaaggt 60 gttaccaaac gtaatccggg ccagccggaa tttgttcagg cagtttatga agttgctagc 120 accatcttcc cgtacatttc tgataaaccg cagtaccatg aaaaccagat cctggaacgt 180 atggctgaac cggaacgcgt tatctccttc cgtgttccgt ggaccgatga ctctggtaat 240 attcgtacca accgtggttg gcgtgtgcag ttcaactccg cgatcggccc gtacaaaggt 300 ctgcgtttcc acccgtctgt gaacctgggt atcatcaaat tcctgggctt cgaacagatc 360 tttaaaaact ccctgaccac cctggctatg ggcggtggca aaggtggcag cgactttgat 420 ccgaaaggca aaagcgatct ggaagttatg aaattcaccc agtcgtttat gcgcgaactg 480 ttccgtcaca ttggcgcgga tgttgatgtt ccggcgggtg atatcggtgt tggtggccgt 540 gaaatcggct tcctgtacgg ctattataag aaaatccgta atgaatttac cggtgtgctg 600 accggccgtg ctctggaatt cggtggcagc ctgatccgtc cggaagcgac cggctacggc 660 gcggtttatt ttggcgcaga aatgctggcc acccgtaaaa aagactataa aggcctgcgt 720 tgcctggttt ctggtaaagg caacgtcacc cagtacacca ttgaaaaaat taaccagctg 780 ggcggcaaag ctatctctat ctccgactct ggcggtacca ttatcgatga agatggcatt 840 tctgcagaac gtctgaacta tgtaatggaa ctggaaaacg ttcgtcgcgg ccgtgcaaaa 900 gaatacgctg aaaaatataa atctgcgaaa tattacgaag gtaaatccgt ttgggacgtt 960 gttaaggacg aaggtctgca gttcgattgc gcgttcccgt ctgcaaccca gaacgaaatc 1020 gatgaacagc acgcaaccgc gatggtgaaa aacggctgct tcctggttag cgaaggtgcg 1080 aacatgccgt ccaacctggc agcgattaaa gtttaccagg gtgctaacat tctgtacggt 1140 ccggctaaag cagcaaacgc aggtggtgtt gcggttagcg gtctggaaat ggctcagcag 1200 agcgcgcgtt ggtactggtc tcgtgaagaa gttgatcaaa aattacaccg tattatgcag 1260 gcaattcata aacagtgttt agacgcttct aaagcgtacg cgaccgaagg tgattatctg 1320 gcgggtgcta acattgctgg ttttattaaa gttgcgcacg ccatggttgc ggaaggtgtg 1380 gtttaa 1386 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgaattcgag ctcggtaccc aggcgcaggg ccggg 35 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gggcaacgcc cacacgcagc g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aggggccccg ctgaagtcat c 21 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gactctagag gatccccgca gatccagtcc atccc 35 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ctgcgtgtgg gcgttgccct accaattcca tttgagggc 39 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gatttcctcg ttccca 16 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 atgacttcag cggggcccct tagatgacgc cctgtgcca 39 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gatgggaacg aggaaatcat ggatcagaca tattctct 38 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gatgacttca gcggggcccc ttaaatcaca ccctgcgcc 39 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gatgggaacg aggaaatcat gtcagcaaag caagtctc 38 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gatgacttca gcggggcccc ttagacccat ccgcggaa 38 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gatgggaacg aggaaatcat gtctaaaagc cacagcgg 38 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gatgacttca gcggggcccc ttaaaccaca ccttccgc 38 <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gatgggaacg aggaaatcat gagcgaacta caccccaa 38 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gatgacttca gcggggcccc tcagatgagc ccgagtgcg 39 <210> 20 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R407H <400> 20 atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 60 attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 120 ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 180 gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240 ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 300 cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360 cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420 tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480 gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540 gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 600 ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 660 gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 720 ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 780 aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 840 cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 900 aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 960 ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1020 gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1080 ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gggggttttg 1140 gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1200 gagcgcgatg atgatgcaca tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260 tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320 cgcctcgaaa gggactaa 1338 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tcgagctcgg taccccgctt ttgcactcat cgagc 35 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cacgatcaga tgtgcatcat cat 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 atgatgatgc acatctgatc gtg 23 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ctctagagga tccccgagca tcttccaaaa ccttg 35 <210> 25 <211> 436 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 25 Met Ser Glu Thr Tyr Val Ser Glu Lys Ser Pro Gly Val Met Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ala Glu Leu Ile Arg Ala Ala Asp Ile Gln Thr Ala Gln Ala Arg 20 25 30 Ile Ser Ser Val Ile Ala Pro Thr Pro Leu Gln Tyr Cys Pro Arg Leu 35 40 45 Ser Glu Glu Thr Gly Ala Glu Ile Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln 50 55 60 Asp Val Arg Ser Tyr Lys Ile Arg Gly Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln 65 70 75 80 Leu Thr Gln Glu Gln Arg Asp Ala Gly Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly 85 90 95 Asn His Ala Gln Gly Val Ala Tyr Val Cys Lys Ser Leu Gly Val Gln 100 105 110 Gly Arg Ile Tyr Val Pro Val Gln Thr Pro Lys Gln Lys Arg Asp Arg 115 120 125 Ile Met Val His Gly Gly Glu Phe Val Ser Leu Val Val Thr Gly Asn 130 135 140 Asn Phe Asp Glu Ala Ser Ala Ala Ala His Glu Asp Ala Glu Arg Thr 145 150 155 160 Gly Ala Thr Leu Ile Glu Pro Phe Asp Ala Arg Asn Thr Val Ile Gly 165 170 175 Gln Gly Thr Val Ala Ala Glu Ile Leu Ser Gln Leu Thr Ser Met Gly 180 185 190 Lys Ser Ala Asp His Val Met Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu Leu 195 200 205 Ala Gly Val Val Ser Tyr Met Ala Asp Met Ala Pro Arg Thr Ala Ile 210 215 220 Val Gly Ile Glu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Met Gln Ala Ala Leu His 225 230 235 240 Asn Gly Gly Pro Ile Thr Leu Glu Thr Val Asp Pro Phe Val Asp Gly 245 250 255 Ala Ala Val Lys Arg Val Gly Asp Leu Asn Tyr Thr Ile Val Glu Lys 260 265 270 Asn Gln Gly Arg Val His Met Met Ser Ala Thr Glu Gly Ala Val Cys 275 280 285 Thr Glu Met Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Ile Ile Ala Glu Pro 290 295 300 Ala Gly Ala Leu Ser Ile Ala Gly Leu Lys Glu Met Ser Phe Ala Pro 305 310 315 320 Gly Ser Val Val Val Cys Ile Ile Ser Gly Gly Asn Asn Asp Val Leu 325 330 335 Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Val His Arg Gly Leu Lys 340 345 350 His Tyr Phe Leu Val Asn Phe Pro Gln Lys Pro Gly Gln Leu Arg His 355 360 365 Phe Leu Glu Asp Ile Leu Gly Pro Asp Asp Asp Ile Thr Leu Phe Glu 370 375 380 Tyr Leu Lys Arg Asn Asn Arg Glu Thr Gly Thr Ala Leu Val Gly Ile 385 390 395 400 His Leu Ser Glu Ala Ser Gly Leu Asp Ser Leu Leu Glu Arg Met Glu 405 410 415 Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Arg Leu Glu Pro Gly Thr Pro Glu Tyr 420 425 430 Glu Tyr Leu Thr 435 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tcgagctcgg tacccatgag tgaaacatac gtgtc 35 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gcgcttgagg tactctgcca gcgcgatgtc atcatccgg 39 <210> 28 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ccggatgatg acatcgcgct ggcagagtac ctcaagcgc 39 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 ctctagagga tcccccgtca ccgacacctc caca 34 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 aactgatgcc tgaggacaag 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gcttgatacc gaagcaaacc 20

Claims

바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈(Glutamate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입된, L-이소루신 생산능을 가지는 미생물로서,
상기 미생물은 L-이소루신 생성량 대비 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid, AABA)의 생성량이 감소된 것이고,
상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인, 미생물.
제1항에 있어서, 상기 바실러스 서브틸러스 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자; 및 로도스피릴라레스 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 2 및 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인, 미생물.
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바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈(Glutamate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입된 L-이소루신 생산능을 가지는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-이소루신의 생산 방법으로서,
상기 방법은 L-이소루신 생성량 대비 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid, AABA)의 생성량이 감소되는 것이고,
상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 L-이소루신을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제6항에 있어서, 상기 바실러스 서브틸러스 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자; 및 로도스피릴라레스 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 2 및 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인, 방법.
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바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 또는 로도스피릴라레스(Rhodospirillales) 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈(Glutamate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입된 L-이소루신 생산능을 가지는 미생물을 포함하는, L-이소루신 생산용 조성물로서,
상기 조성물은 L-이소루신 생성량 대비 α-아미노부티릭산(α-aminobutyric acid, AABA)의 생성량이 감소되는 것이고,
상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인, 조성물.
제10항에 있어서, 상기 바실러스 서브틸러스 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자; 및 로도스피릴라레스 유래의 외래 글루타메이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 2 및 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인, 조성물.
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