Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

KR102470602B1 - 신규한 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법 - Google Patents

신규한 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102470602B1
KR102470602B1 KR1020200173736A KR20200173736A KR102470602B1 KR 102470602 B1 KR102470602 B1 KR 102470602B1 KR 1020200173736 A KR1020200173736 A KR 1020200173736A KR 20200173736 A KR20200173736 A KR 20200173736A KR 102470602 B1 KR102470602 B1 KR 102470602B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
isoleucine
gly
ala
val
Prior art date
Application number
KR1020200173736A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220083464A (ko
Inventor
김희영
심지현
김경림
이광우
최우성
Original Assignee
씨제이제일제당 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to KR1020200173736A priority Critical patent/KR102470602B1/ko
Application filed by 씨제이제일제당 주식회사 filed Critical 씨제이제일제당 주식회사
Priority to US18/266,500 priority patent/US20240101977A1/en
Priority to AU2021398494A priority patent/AU2021398494A1/en
Priority to PCT/KR2021/018224 priority patent/WO2022124708A1/ko
Priority to CN202180093153.3A priority patent/CN117321193A/zh
Priority to JP2023535387A priority patent/JP2023553135A/ja
Priority to EP21903754.6A priority patent/EP4245849A4/en
Priority to BR112023011537A priority patent/BR112023011537A2/pt
Priority to MX2023006957A priority patent/MX2023006957A/es
Priority to ARP210103428A priority patent/AR124300A1/es
Publication of KR20220083464A publication Critical patent/KR20220083464A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102470602B1 publication Critical patent/KR102470602B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C12Y206/01042—Branched-chain-amino-acid transaminase (2.6.1.42)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 출원은 L-이소류신 생산 시 발생하는 부산물을 감소시키는 신규한 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 변이체, 이를 포함하는 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 L-이소류신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법{Novel Branched-chain amino acid aminotransferase variant and method of producing L-isoleucine using the same}
본 출원은 L-이소류신 생산 시 발생하는 부산물을 감소시키는 신규한 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 변이체, 이를 포함하는 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 L-이소류신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-이소류신은 총 20가지의 아미노산 중 분지쇄 아미노산 (branched-chain amino acid)의 한 종류로서, 필수아미노산으로 분류되어 동물 사료, 식품 첨가물 및 의약 분야에 사용된다. L-이소류신은 대사 후 에너지 생성, 헤모글로빈 생성, 혈당 조절, 근육 생성 및 보수 등의 기능을 하기 때문에 수액제, 영양제, 스포츠 영양제뿐만 아니라 동물 사료 분야에서도 사용이 증가되고 있다.
이러한 경향에 기반하여, L-아미노산 생산을 위해 다양한 미생물 및 이의 변이체가 사용되는데(미국 등록특허 제10113190호), 이런 경우에도 L-이소류신을 제외한 부산물이 다수 생성되며, 이는 정제 단계에서 L-이소류신의 순도에 영향을 많이 미치는 물질이므로, 부산물을 제거할 수 있는 방법이 필요하다. 관련하여, L-이소류신의 순도를 높이기 위해 개발된 L-이소류신 정제방법 등은 별도의 추가적인 정제 과정 요구되는 단점이 있어(미국 등록특허 제6072083호), L-이소류신의 순도를 증가시키는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
이러한 배경 하에, 미생물을 이용한 L-이소류신 생산 시 순도를 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, 부산물인 알파-아미노부티르산 및 L-발린 등을 감소시키고 L-이소류신 생산에 기여할 수 있는 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase)를 코딩하는 유전자 ilvE를 확인하고, 보다 L-이소류신의 순도를 더욱 증가시킬 수 있는 변이를 확보함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나 이상을 포함하는, 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 L-이소류신 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 L-이소류신 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 미생물의 L-이소류신 생산 용도를 제공하는 것이다.
이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 일 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 변이체를 제공한다.
상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 31번째 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 아미노산이 발린으로 치환된 것일 수 있으며, 이들의 조합으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 31번째에 상응하는 위치의 아미노산이 류신으로 치환; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 98번째에 상응하는 위치의 아미노산이 이소류신으로 치환; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 256번째에 상응하는 위치의 아미노산이 발린으로 치환; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 31번째에 상응하는 위치의 아미노산이 류신으로 치환 및 98번째에 상응하는 위치의 아미노산이 이소류신으로 치환; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 31번째에 상응하는 위치의 아미노산이 류신으로 치환 및 256번째에 상응하는 위치의 아미노산이 발린으로 치환; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 98번째에 상응하는 위치의 아미노산이 이소류신으로 치환 및 256번째에 상응하는 위치의 아미노산이 발린으로 치환; 또는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 31번째에 상응하는 위치의 아미노산이 류신으로 치환, 98번째에 상응하는 위치의 아미노산이 이소류신으로 치환, 및 256번째에 상응하는 위치의 아미노산이 발린으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 31번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 치환, 98번째 아미노산인 아르기닌이 이소류신으로 치환, 256번째 아미노산인 세린이 발린으로 치환된 것일 수 있으며, 이들의 조합으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 31번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 치환; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 98번째 아미노산인 아르기닌이 이소류신으로 치환; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 256번째 아미노산인 세린이 발린으로 치환; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 31번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 치환 및 98번째 아미노산인 아르기닌이 이소류신으로 치환; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 31번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 치환 및 256번째 아미노산인 세린이 발린으로 치환; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 98번째 아미노산인 아르기닌이 이소류신으로 치환 및 256번째 아미노산인 세린이 발린으로 치환; 또는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 31번째에 상응하는 위치의 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 아미노산인 아르기닌이 이소류신으로 치환, 및 256번째 아미노산인 세린이 발린으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 변이체는 서열번호 2 내지 서열번호 7로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 31번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 치환된 변이체는 서열번호 2, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 98번째 아미노산인 아르기닌이 이소류신으로 치환된 변이체는 서열번호 3, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 256번째 아미노산인 세린이 발린으로 치환된 변이체는 서열번호 4, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 31번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 치환 및 98번째 아미노산인 아르기닌이 이소류신으로 치환된 변이체는 서열번호 5, 서열에서 31번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 치환 및 256번째 아미노산인 세린이 발린으로 치환된 변이체는 서열번호 6, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 98번째 아미노산인 아르기닌이 이소류신으로 치환 및 256번째 아미노산인 세린이 발린으로 치환된 변이체는 서열번호 7로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환되어, 부산물인 L-발린 또는 AABA가 감소하여 L-이소류신 생산성이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "L-이소류신"은 필수아미노산의 하나로, 구조적으로 L-발린, L-류신과 함께 분지쇄 아미노산에 해당하는 화학식 HO2CCH(NH2)CH(CH3)CH2CH3인 L-아미노산을 의미한다.
본 출원에서 용어 "분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(branched-chain amino acid aminotransferase, IlvE)"는 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질이며, L-이소류신 생합성 경로에 있는 효소이다. 일 예로, L-이소류신 생합성 경로 후반부에 디하이드록시산 디하이드라타제 (dihydroxy acid dehydratase)를 통해 2-케토-3-메틸발레르산(2-keto-3-methylvalerate)을 거쳐 분지 연쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase, IlvE)의 반응으로 최종적으로 L-이소류신이 생산될 수 있다. 상기 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제는 IlvE와 혼용될 수 있다.
상기 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제는 L-이소류신의 전구체인 2-케토부티르산(2-keto butyrate, 2-keto butyric acid)으로부터 아미노부티르산(α-aminobutyrate) 또는 L-발린도 생산하는 바, L-이소류신 순도에 영향을 크게 미치는 물질 중 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 혼용되어 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 서열번호 1은 ilvE 유전자에 의해 코딩되는 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제의 아미노산 서열일 수 있으며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI GenBank 등 다양한 데이터 베이스에서 그 서열을 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 에스케리키아 속(Escherichia sp.) 유래일 수 있으며, 에스케리키아 콜라이(대장균, Escherichia coli) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 동일한 활성을 갖는 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 본 출원에서의 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 활성을 갖는 단백질은 비록 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질로 기재하였으나, 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 또는 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질에 해당됨은 당업자에게 자명할 수 있다. 구체적인 예를 들어, 본 출원의 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제의 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 폴리펩티드에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 본 출원의 폴리펩티드의 범위 내에 포함됨은 자명할 수 있다.
본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 단백질' 또는 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질'라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
본 출원에 있어서, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase)를 확보하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법이 적용 가능하다. 그 방법의 예로는 효소 발현에 통상적으로 널리 이용되는 미생물에서 효소를 고효율로 확보할 수 있도록 코돈 최적화가 포함된 유전자 합성 기술 그리고 미생물의 대량 유전체 정보를 기반으로 생물정보학적 방법에 의해 유용 효소자원의 스크리닝 방법을 통해 변이주를 확보할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "변이" 또는 "변이체"는 유전적 또는 비유전적으로 하나의 안정적인 표현형적 변화를 나타내는 배양물이나 개체를 뜻하며, 구체적으로 본 출원에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase)의 아미노산이 변이되어 그 활성이 야생형과 비교하여 효율적으로 증가한 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)" 또는 "변이형 폴리펩티드(modified polypeptide)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열(the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 단백질을 지칭한다. 상기 변이체는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)과 상이하다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이형 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질 (mature protein) 의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체" 또는 "변이형 폴리펩티드"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이 등의 용어(modification, modified protein, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 목적상, 상기 변이체는 천연의 야생형 또는 비변형 단백질 대비 변이된 단백질의 활성이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이체는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다.
예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged side chain)을 갖는 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민을 포함하는 것으로 분류할 수 있다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원의 변이체는 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 활성을 가질 수 있으며, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 활성이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 활성을 갖는 변이체는 비록 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된 폴리펩티드 또는 단백질로 기재하였으나, 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 또는 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 활성을 갖는 폴리펩티드, 단백질, 또는 변이체에 해당됨은 당업자에게 자명할 수 있다. 구체적인 예를 들어, 본 출원의 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제의 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 폴리펩티드에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 본 출원의 폴리펩티드의 범위 내에 포함됨은 자명할 수 있다.
본 출원에서 용어 "상응하는(corresponding)" 또는"상응하는 위치(corresponding position)"는, 단백질 또는 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 단백질 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 레퍼런스 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
본 출원에서, 본 출원에 사용되는 단백질 내의 아미노산 잔기 위치에 특정 넘버링이 사용될 수 있다. 예를 들면, 비교하고자 하는 대상 단백질과 본 출원의 단백질의 폴리펩티드 서열을 정렬함으로써, 본 출원의 단백질의 아미노산 잔기 위치에 상응하는 위치에 대해 재넘버링 하는 것이 가능하다.
본 출원에서 용어, '상동성 (homology)' 또는 '동일성 (identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체를 코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 제공한다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제, 및 변이체에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은, 예를 들어, 서열번호 30의 염기서열(nucleic acid sequence)을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다. 본 출원에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 폴리뉴클레오티드는, 본 출원에 따른 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제의 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드라면 제한없이 포함될 수 있다. 본 출원에서 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 ilvE 유전자이며, 상기 유전자는 에스케리키아 속(Escherichia sp.) 미생물 유래일 수 있으며, 구체적으로 에스케리키아 콜라이(대장균, Escherichia coli) 유래일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 1 또는 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된 아미노산을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 서열번호 30의 염기서열을 포함할 수 있으며, 이와 상동성 또는 동일성이 80%, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 더욱 구체적으로 99% 이상인 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된 아미노산 서열을 코딩하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환된 변이체를 코딩하는 서열은 서열번호 31, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환된 변이체를 코딩하는 서열은 서열번호 32, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환된 변이체를 코딩하는 서열은 서열번호 33, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환 및 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환된 변이체를 코딩하는 서열은 서열번호 34, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환 및 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환된 변이체를 코딩하는 서열은 서열번호 35, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환 및 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환된 변이체를 코딩하는 서열은 서열번호 36을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 40% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.×ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제, 변이체, 폴리뉴클레오티드는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDCM2(한국 공개특허번호 제10-2020-0136813호), pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 "발현 카세트"는 프로모터와 목적 유전자를 포함하고 있어서, 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미한다. 이와 같은 유전자 발현 카세트의 내부 또는 외부에는 상기 목적 유전자의 효율적인 발현을 도울 수 있는 다양한 인자가 포함될 수 있다. 상기 유전자 발현 카세트는 통상 상기 목적 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter) 외에 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, 미생물을 제공한다.
하나의 구체예로, 본 출원의 미생물은 L-이소류신을 생산하는 미생물 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 출원의 미생물은 목적 산물로 L-이소류신을 생산하는 미생물일 수 있으며, 본 출원의 상기 변이체, 폴리뉴클레오티드; 및 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하여 L-이소류신 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 L-이소류신은 전술한 바와 같다
본 출원에서 용어 "미생물"은 야생형 미생물이나, 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 약화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물을 모두 포함하는 개념이다. 본 출원에서 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 하나 이상이 도입되거나 포함되는 미생물이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원의 미생물은 상기 폴리펩티드; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하여, 목적 단백질 또는 상기 목적 단백질이 생산에 관여하는 목적 산물의 생산능을 갖는 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 미생물은, 자연적으로 목적 단백질 또는 목적산물 생산능을 가지고 있는 미생물, 또는 목적 단백질 또는 목적산물 생산능이 없는 모균주에 목적 단백질 또는 목적산물 생산능이 부여된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 미생물은, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 예를 들어 목적 단백질을 발현하는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 상기 숙주세포 또는 미생물은 상기 목적 단백질을 포함하여 목적산물을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다.
상기 미생물은 재조합 미생물일 수 있고, 상기 재조합은 형질전환과 같은 유전적 변형(genetically modification)에 의해 이루어질 수 있다.
본 출원에서 용어, "목적 단백질 또는 목적산물을 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
해당 미생물은 상기 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 통해 유전적으로 변형된 미생물; 상기 폴리펩티드, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 변형된 미생물; 상기 폴리펩티드, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 재조합 미생물; 또는 상기 폴리펩티드 활성을 갖는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 목적상 상기 목적 단백질 또는 목적산물을 생산하는 미생물은 상기 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하여, 목적 단백질 또는 목적 산물 생산능이 증가된 것을 특징으로 하는 미생물일 수 있다. 구체적으로, 본 출원에서 목적 단백질 또는 목적산물을 생산하는 미생물, 또는 목적 단백질 또는 목적산물 생산능을 갖는 미생물은, 목적 단백질 또는 목적산물 생합성 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화되거나, 목적 단백질 또는 목적산물 분해 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화된 미생물 일 수 있다.
본 출원의 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 하나 이상을 포함하는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 출원의 미생물은 목적 산물로 L-이소류신을 생산하는 미생물일 수 있으며, 비변형 또는 야생형 미생물에 비해 L-이소류신 생산성 증가 또는 L-이소류신 생산 시 발생하는 부산물이 감소된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, 단백질이 "발현되도록/되는"은 목적 단백질이 미생물 내에 도입되거나, 미생물 내에서 발현되도록 변형된 상태를 의미한다. 상기 목적 단백질이 미생물 내 존재하는 단백질인 경우 내재적 또는 변형전에 비하여 그 활성이 강화된 상태를 의미한다.
본 출원의 단백질 변이체를 발현하는 미생물은 단백질 변이체를 발현하도록 변형된 미생물일 수 있고, 따라서 본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 단백질 변이체를 발현하는 미생물의 제조 방법을 제공한다.
본 출원에서 "단백질의 도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성을 나타나게 되는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 단백질이 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 또는 단백질 활성의 "강화"는, 폴리펩티드 또는 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드 또는 단백질의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드 또는 단백질의 활성에 비하여 향상된 것을 의미한다. 일 예로, 상기 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물의 단백질 활성에 비하여 최소 1%, 3%, 5%, 7%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 향상된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어 "약(about)"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "활성 증가"는 외래의 폴리펩티드 또는 단백질을 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드 또는 단백질의 활성 강화를 통해 달성할 수 있으나, 구체적으로는 내재적인 폴리펩티드 또는 단백질의 활성 강화를 통해 달성하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드 또는 단백질의 활성 정도, 발현량 또는 해당 단백질로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드 또는 단백질의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드 또는 단백질의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않을 수 있다. 상기 방법은 이로 제한되는 것은 아니나, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있다(Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
상기 유전자 공학을 이용하여 폴리펩티드 또는 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면,
1) 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가,
2) 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법,
3) 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법,
4) 상기 폴리펩티드 또는 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법,
5) 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는
6) 상기 방법들의 조합 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질 공학을 이용하여 폴리펩티드 또는 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면, 폴리펩티드 또는 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 해당 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있다. 또는, 상기 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 상기 방법은 구체적으로 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터를 연결시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 내지 cj7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터 및 yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드 또는 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 내재적 개시코돈을 상기 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 또는 단백질 발현율이 더 높은 다른 개시코돈으로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 상기 폴리펩티드 또는 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 상기 유전자를 염색체내로 삽입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 5) 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리펩티드 또는 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드 또는 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드 또는 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
마지막으로, 6) 상기 방법들의 조합은 상기 1) 내지 5) 중 어느 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 또는 단백질 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드 또는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드 또는 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드 또는 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "변형 전 균주" 또는 "변형 전 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 상기 "변형 전 균주" 또는 "변형 전 미생물"은 "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물", "비변형 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 "코리네박테리움 속 미생물"은 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 크레나툼(Corynebacterium crenatum), 또는 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti)일 수 있다.
본 출원에서 상기 미생물의 모균주는 L-이소류신의 생산량을 증가시키기 위해 추가적으로 L-이소류신의 생합성 경로를 강화시킨 미생물일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 미생물은 상기 L-이소류신의 생합성 경로를 강화시키기 위해, 예를 들면, ilvE 프로모터를 gdh 프로모터로 치환하여 프로모터의 기능을 강화시키거나, 이소류신의 전구체인 쓰레오닌의 피드백 저해 해소를 위해 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 hom 유전자에 유전적 변이(R407H)(대한민국 등록특허 제10-1996769호)를 추가로 도입하거나, L-쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 ilvA 유전자에 유전적 변이(T381A, F383A)가 도입하거나(대한민국 특허출원 제10-2020-0078669호), 아스파르토키나아제를 코딩하는 lysC 유전자에 유전적 변이(L377K)(미국등록공보 US 10662450 B2)를 추가로 도입한 미생물일 수 있다. 그러나, 상기에 제한되지 않고 당업계에 공지된 유전자 발현 조절 방법으로 L-이소류신의 생산량을 증가시킬 수 있다.
L-이소류신의 생산량을 증가시키기 위한 또 하나의 예로, 본 출원에서 상기 미생물의 모균주는 L-이소류신의 생산량을 증가시키기 위해 추가적으로 L-이소류신의 생합성 경로를 약화시키는 유전자를 불활성화시킨 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 또는 단백질의 "불활성화" 또는 "약화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 불활성화 또는 약화는 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 상기 불활성화 또는 약화는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 변이 등으로 단백질 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우와, 이를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질 활성 정도가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 유전자의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및 발현이 되더라도 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드 또는 단백질의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 "감소"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드 또는 단백질의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다. 상기 용어 "약(about)"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이러한 단백질의 불활성화 또는 활성의 약화는, 이로 제한되는 것은 아니나, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
상기 방법의 예로,
1) 상기 단백질을 코딩하는 상기 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법;
2) 상기 단백질을 코딩하는 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형,
3) 상기 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 단백질을 코딩하는 상기 유전자 서열의 변형,
4) 상기 단백질을 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
5) 상기 단백질을 코딩하는 상기 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열을 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착을 불가능하게 만드는 방법;
6) 상기 단백질을 코딩하는 상기 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터를 부가하는 방법(Reverse transcription engineering, RTE) 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 단백질을 코딩하는 상기 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 일부 뉴클레오티드 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 상기 유전자의 일부 또는 전체를 결손시키는 방법은 자외선과 같은 빛 또는 화학물질을 이용하여 돌연변이를 유발하고, 얻어진 돌연변이체로부터 목적 유전자가 결손된 균주를 선별하여 수행될 수 있다. 상기 유전자 결손 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함된다. 상기 DNA 재조합 기술에는 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 이루어질 수 있다. 또한, 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터에는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 활성을 더욱 약화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 폴리펩티드의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 유전자 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 L-이소류신 생산 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 하나 이상을 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
상기 L-이소류신, 서열번호 1의 아미노산, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물은 전술한 바와 같다.
상기 미생물은 상기 미생물은 코리네박테리움 속일 수 있고, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
배지의 온도는 20℃ 내지 50℃ 구체적으로는 30℃ 내지 37℃ 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 상기 L-이소류신 생산 방법 또는 제조방법은 상기 배지 또는 미생물로부터 L-이소류신을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 L-이소류신을 회수하는 방법은 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 L-이소류신을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-이소류신을 회수할 수 있다.
상기 생산 방법은, 추가적인 정제 공정을 포함할 수 있다. 상기 정제공정은 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 회수된 L-이소류신을 정제할 수 있다. 상기의 회수되는 L-이소류신은 정제된 형태, 혹은 목적 산물을 함유한 미생물 발효액일 수 있다(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A J Nair, 2008)
하나의 구체예로, 상기 L-이소류신 생산 방법은 L-이소류신 생산 시 발생하는 부산물을 감소시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "부산물"은 L-이소류신 생산 시 발생할 수 있는 모든 물질을 포함한다. 상기 부산물은 알파-아미노 부티르산(α-aminobutyrate; AABA) 및 L-이소류신 외의 다른 아미노산인 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H), 글루탐산(Glu, E), 아르파르트산(Asp, D), 글리신(Gly, G), 알라닌(Ala, A), 발린(Val, V), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 프롤린(Pro, P), 세린(Ser, S), 시스테인(Cys, C), 티로신(Tyr, Y), 아스파라긴(Asn, N) 및 글루타민(Gln, Q)에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상 상기 부산물은 알파-아미노 부티르산(α-aminobutyrate; AABA), 발린, 페닐알라닌, 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로, 알파-아미노 부티르산 또는 발린일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 L-이소류신 생산용 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 하나 이상을 포함하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 것을 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물, 및 배양에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 L-이소류신 생산용 조성물은 본 출원의 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체에 의해 L-이소류신을 고효율로 생산할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다. 상기 조성물은 상기 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제의 변이체 또는 상기 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체를 작동시킬 수 있는 구성을 제한없이 포함할 수 있다. 상기 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제의 변이체는 도입된 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있도록 벡터 내에 포함된 형태일 수 있다.
상기 조성물은 동결보호제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 동결보호제 또는 부형제는 비자연적으로 발생한(non-naturally occurring) 물질 또는 자연적으로 발생한 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 하나의 구체 예로, 상기 동결보호제 또는 부형제는 상기 균주가 자연적으로 접촉하지 않는 물질, 또는 상기 균주와 자연적으로 동시에 포함되지 않는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, 미생물의 L-이소류신 생산 용도를 제공하는 것이다.
상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물, 및 이소류신은 전술한 바와 같다.
본 출원의 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체를 발현하는 미생물은 이를 발현하지 않는 균주에 비해 L-이소류신 순도를 현저히 향상시킬 수 있으므로, 이를 이용하여 L-이소류신을 효과적으로 생산할 수 있다. 이에, L-이소류신을 활용하는 식품, 사료, 및 의약 등 광범위한 산업적 활용을 기대할 수 있다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1: ilvE 유전자 과발현을 위한 벡터 제작
본 출원의 목적에 따라 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase)를 코딩하는 ilvE 유전자 및 이의 변이체로 인한 형질 변화를 더욱 명확히 확인하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에서 ilvE 유전자가 과발현되도록 하였다.
분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제를 코딩하는 ilvE 유전자를 과발현하면서 대장균 유래 ilvE 유전자를 도입하기 위해, ilvE 유전자 프로모터를 gdh 프로모터로 교체하여 ilvE 프로모터를 강화한 플라스미드 벡터를 제작하였다.
ilvE 프로모터를 gdh 프로모터로 치환한 균주를 제작하기 위해 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 8 및 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13, 또는 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. 상기 각각의 PCR을 수행하기 위해 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
서열번호 명칭 서열
8 primer GAATTCGAGCTCGGTACCCAGACATCCTTGTCGTCCTTGCC
9 primer CCCTCAAATGGAATTGGTTAGTCAGCCCCATTTTATGGGA
10 primer ACCAATTCCATTTGAGGGCGCTCA
11 primer CAGCTTTCTTCGTGGTCATGATTTCCTCGTTCCCATCTCG
12 primer GTTAGATCAAGTTAATCAATAAATCAACCGGTTTTAAGACCCCG
13 primer GTCGACTCTAGAGGATCCCCCCTGGATCGATCTCAGATAC
14 primer ATGACCACGAAGAAAGCTGATTACA
15 primer TTATTGATTAACTTGATCTAACCAGC
상기 PCR 반응을 위한 중합효소로 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 1분 중합반응이며, 이러한 조건의 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하였다. 그 결과 ATCC13032 ilvE 유전자 개시코돈을 중심으로 5' 상단 737bp DNA 단편, ATCC13032 gdh 유전자 개시코돈을 중심을 5' 상단 499bp DNA 단편, ATCC13032 ilvE 유전자 종결코돈을 중심으로 3' 하단 742bp DNA 단편과 MG1655 ilvE 유전자 930bp DNA 단편을 각각 수득하였다. 증폭된 세 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 8 및 서열번호 13의 프라이머로 PCR을 다시 수행하였다. PCR 조건으로 95℃ 5분 변성 이후, 95℃ 30초 변성; 어닐링 및 72℃ 2분 중합을 6회 반복한 후, 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 2분 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, gdh 프로모터 및 대장균 ilvE 유전자를 코딩하는 2868bp의 DNA 단편이 증폭되었다. 증폭산물을 QUIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다.
한편, 벡터에 제한효소 smaI를 처리한 후, 65℃ 에서 20분간 열처리한 pDCM2벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 코리네박테리움의 ilvE 유전자 및 ilvE 프로모터가 코리네박테리움 글루타미쿰의 gdh 프로모터 및 대장균의 ilvE로 치환되어 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2-Pgdh-ilvE(eco)를 제작하였다.
참고예 2: L-이소류신 생산 균주 제작
야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰은 L-이소류신을 생산하는 능력은 있으나, 과량 생산하지는 않는다. 이에, 본 출원의 목적에 따라 L-이소류신 생산능을 증가시키는 유전 형질을 확인하기 위하여, L-이소류신 생산능이 증가된 균주를 활용하였다.
먼저, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 L-이소류신 생산 균주를 개발하였다. 구체적으로, L-이소류신 생합성 경로에서 이소류신의 전구체인 쓰레오닌의 피드백 저해 해소를 위해, 호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 hom을 변이하여, 호모세린 디하이드로게나제의 407번째 아미노산인 아르기닌을 히스티딘으로 치환하였다(대한민국 등록특허 제10-1996769호). 구체적으로, hom(R407H)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 16에 나타내었다.
구체적으로, hom(R407H) 변이가 도입된 균주들을 제작하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 17 및 서열번호 18 또는 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. 상기 각각의 PCR을 수행하기 위해 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
서열번호 명칭 서열
17 primer TCGAGCTCGGTACCCCGCTTTTGCACTCATCGAGC
18 primer CACGATCAGATGTGCATCATCAT
19 primer ATGATGATGCACATCTGATCGTG
20 primer CTCTAGAGGATCCCCGAGCATCTTCCAAAACCTTG
PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 중합반응 72℃ 1분 중합반응이며, 이러한 조건의 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하였다. 그 결과, hom 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 1000 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 1000 bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 17 및 서열번호 20의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건으로 95℃ 5분간 변성 이후, 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 2분 중합을 28회 반복한 후, 72℃ 에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, 407번째 아르기닌이 히스티딘으로 치환된 호모세린 디하이드로게나제 변이체를 코딩하는 hom 유전자의 변이를 포함하는 2 kb의 DNA 단편이 증폭되었다. 증폭 산물을 PCR 정제 키트(PCR Purification kit, QUIAGEN)를 사용하여 정제하고 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 정제한 증폭 산물을 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDCM2 벡터한국 공개특허번호 제10-2020-0136813호)와 상기 증폭 산물인 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하고, 인퓨전 클로닝 키트(Infusion Cloning Kit, TaKaRa)를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 hom(R407H) 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2-R407H를 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 hom(R407H) 변이를 포함하는 균주를 얻었으며, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 hom(R407H)로 명명하였다.
제작한 ATCC13032 hom(R407H) 균주에 L-이소류신에 대한 피드백 해제와 활성을 증가시키기 위해, L-쓰레오닌 디하이드라타아제(L-threonine dehydratase)를 코딩하는 유전자인 ilvA를 변이하여, L-쓰레오닌 디하이드라타아제(서열번호 35)의 381번째 아미노산인 쓰레오닌을 알라닌으로 치환 및 383번째 아미노산인 페닐알라닌을 알라닌으로 치환하였다. 또한, ilvA(T381A, F383A)가 도입된 균주를 제작하였으며, ilvA(T381A, F383A)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 21에 나타내었다.
구체적으로, 상기 ilvA(T381A, F383A) 변이가 도입된 균주들을 제작하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 22 및 서열번호 23 또는 서열번호 24 및 서열번호 25의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. 상기 각각의 PCR을 수행하기 위해 사용된 프라이머 서열은 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.
서열번호 명칭 서열
22 primer TCGAGCTCGGTACCCATGAGTGAAACATACGTGTC
23 primer GCGCTTGAGGTACTCtgcCAGCGcGATGTCATCATCCGG
24 primer CCGGATGATGACATCgCGCTGgcaGAGTACCTCAAGCGC
25 primer CTCTAGAGGATCCCCCGTCACCGACACCTCCACA
PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 변성; 및 72℃ 1분 중합반응이며, 이러한 조건의 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하였다. 그 결과, ilvA 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 1126 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 286 bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 22 및 서열번호 25의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건으로 95℃에서 5분간 변성 이후, 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 2분 중합을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, 381번째 쓰레오닌이 알라닌으로 및 383번째 페닐알라닌이 알라닌으로 치환된 L-쓰레오닌 디하이드라타아제 변이체를 코딩하는 ilvA 유전자의 변이를 포함하는 1.4 kb의 DNA 단편이 증폭되었다. 증폭 산물을 PCR 정제 키트(PCR Purification kit, QUIAGEN)를 사용하여 정제하고, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 정제한 증폭 산물을 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDCM2 벡터 (한국 공개특허번호 제10-2020-0136813호)와 상기 증폭 산물인 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하고, 인퓨전 클로닝 키트(Infusion Cloning Kit, TaKaRa)를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 hom(R407H) 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2-ilvA(T381A, F383A)를 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 hom(R407H)에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 ilvA(T381A, F383A) 변이를 포함하는 균주를 얻었으며, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101이라 명명하였다.
상기 균주 CA10-3101은 2020년 5월 27일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여 KCCM12739P로 기탁번호를 부여 받았다.
참고로, 상기 ilvA(T381A, F383A)을 L-이소류신 생산 균주에 도입하는 것이 L-이소류신에 대한 피드백 해제와 활성을 증가시켜 L-이소류신 생산성 효율을을 증가시키는 것인지 확인하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로, NTG(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 처리된 L-이소류신 생산 균주인 KCJI-38(KCCM11248P, 대한민국 등록특허 제10-1335789호) 균주에 상기 ilvA(T381A, F383A) 변이를 전기펄스법으로 도입한 KCCM11248P/pECCG117-ilvA(T381A, F383A) 균주 배양액 중의 L-이소류신 및 L-쓰레오닌 농도를 측정한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
균주명 L-이소류신(g/L) L-쓰레오닌(g/L)
KCCM11248P 1.5 0.5
KCCM11248P/pECCG117-ilvA(F383A) 2.8 0.6
KCCM11248P/pECCG117-ilvA(T381A, F383A) 4.0 0.0
상기 표 4에 나타난 바와 같이, ilvA(T381A, F383A) 변이를 도입한 KCCM11248P/pECCG117-ilvA(T381A, F383A) 균주는 KCCM11248P 또는 KCCM11248P/pECCG117-ilvA(F383A) 균주에 비해 L-이소류신 생산이 현저히 증가하고, L-쓰레오닌 분해율이 높은 것을 확인하였다. 다시 말해서, 본 출원의 목적상 ilvA(T381A, F383A) 변이는 L-이소류신에 대한 피드백 해제와 활성을 증가시키기 위해 도입한 것임이 확인되었다.
실시예 1: ilvE 유전자가 과발현된 L-이소류신 생산 균주 제작 및 ilvE가 L-이소류신의 발효 순도에 미치는 영향 확인
L-이소류신 생산 시, ilvE 과발현 또는 변이가 부산물을 감소시키고 L-이소류신의 순도를 증가시키는지 여부를 확인하기 위해, ilvE 유전자를 강화하였다. 이를 위하여, 상기 참고예 2에서 제작한 L-이소류신 생산 균주인 CA10-3101을 대상으로 하였다. 구체적으로. 참고예 1에서 제작한 벡터를 전기천공법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 코리네박테리움 글루타미쿰 ilvE 프로모터 및 ilvE 유전자가 코리네박테리움 글루타미쿰 gdh 프로모터 및 대장균 ilvE 유전자로 치환 및 강화된 균주를 얻었으며, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3119로 명명하였다. 모균주(CA10-3101) 및 상기 ilvE 강화주(CA10-3119)를 이소류신 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 각각 접종한 후, 32℃에서 60시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-이소류신을 제조하였다. 본 실시예에서 사용한 생산배지의 조성은 하기와 같다.
<생산배지>
포도당 10%, 효모추출물 0.2%, 황산암모늄 1.6%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.1%, 황산철7수염 10㎎/ℓ, 황산망간1수염 10㎎/ℓ, 비오틴 200㎍/ℓ, pH 7.2
배양 종료 후, 액체고속크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 L-이소류신 및 부산물의 생산량을 측정하였고, 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-이소류신과 부산물의 농도는 하기 표 5에 나타내었다.
균주명 L-이소류신 농도(g/L) AABA 농도(g/L) L-발린 농도(g/L)
CA10-3101(모균주) 2.4 0.9 1.4
CA10-3119(ilvE 강화주) 2.7 0.8 1.2
그 결과, 상기 표 5에 나타난 바와 같이, 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101은 2.4 g/ℓ의 농도로 L-이소류신을 생산하며, 주요 부산물인 알파-케토부티르산(AABA) 및 L-발린이 각각 0.9 g/L 및 1.4 g/L 검출되는 반면, 본 실시예에서 제작한 대장균 ilvE 강화주 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3119는 2.7 g/ℓ의 농도로 L-이소류신을 생산하여, 모균주에 비해 L-이소류신 생산성이 12% 증가한 것을 확인하였다. 또한, 부산물인 알파-케토부티르산 및 발린이 각각 0.8 g/L 및 1.2 g/L 검출되어, 모균주에 비해 부산물인 알파-케토부티르산 및 발린이 각각 12% 및 15% 감소함을 확인하였다.
상기의 결과를 바탕으로, ilvE 유전자가 L-이소류신의 부산물을 감소시키고 L-이소류신의 생산성을 증가시켜 L-이소류신의 발효 순도를 증가시키는 대상이 될 수 있음을 확인하였다. 이에, ilvE를 더 개량하여 우수한 ilvE 변이형을 개발하기 위해 무작위 돌연변이법을 이용하였다.
실시예 2: 변이형 ilvE 라이브러리 벡터 제작
상기 참고예 1에서 제작한 벡터를 기반으로, ilvE 변이 라이브러리를 제작하였다. 이를 위하여, 라이브러리는 error-prone PCR kit (clontech Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit)를 이용하여 제작하였으며, 변이가 발생할 수 있는 조건에서 서열번호 14 및 서열번호 15를 프라이머로 하여 PCR 반응을 수행하였다.
구체적으로, 1000bp 당 0에서 3개의 변이가 발생하는 조건으로 94 ℃에서 30초 pre-heating 후, 94℃에서 30초, 68℃에서 1분 30초의 과정을 25회 반복 수행하였다. 이 때, 수득한 산물을 megaprimer(500~125ng)를 이용하여 95℃에서 50초, 60℃에서 50초, 68℃에서 12분의 과정을 25회 반복 수행한 후 DpnI 처리하여, 대장균 DH5α에 형질 전환하고, 카나마이신(25mg/L)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질전환된 콜로니 20종을 선별한 후 플라스미드를 획득하여 폴리뉴클레오티드 서열을 분석한 결과 2mutations/kb 빈도로 서로 다른 위치에 변이가 도입된 것을 확인하였다. 약 20,000개의 형질전환 된 대장균 콜로니를 취하여 플라스미드를 추출하였고, 이를 pTOPO-ilvE-library로 명명하였다.
실시예 3: ilvE 라이브러리가 도입된 L-이소류신 균주 제작
상기 실시예 2에서 제작된 pTOPO-ilvE-library를 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicun) CA10-3101 에 전기천공법으로 형질 전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 영양배지에 도말하여 변이 유전자가 삽입된 균주 5,000개의 콜로니를 확보하였으며, 각 콜로니를 CA10-3101/pTOPO-ilvEm1부터 CA10-3101/pTOPO-ilvEm5000 까지로 명명하였다.
확보된 5,000개의 콜로니 중 L-이소류신 생산성 증가 및 부산물이 저감되는 콜로니를 확인하기 위해 각각의 콜로니에 대해 하기와 같은 방법으로 발효역가 평가를 진행하였다. 이소류신 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주 및 상기 변이주를 접종한 후, 32
Figure 112020134972293-pat00001
에서 60시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-이소류신을 제조하였다. 본 실시예에서 사용한 생산배지의 조성은 하기와 같다.
<생산배지>
포도당 10%, 효모추출물 0.2%, 황산암모늄 1.6%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.1%, 황산철7수염 10㎎/ℓ 황산망간1수염 10 ㎎/ℓ 비오틴 200 ㎍/ℓ pH 7.2
배양 종료 후, 액체고속크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 L-이소류신 및 L-쓰레오닌의 생산량을 측정하였고, 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-이소류신과 L-발린 및 AABA 농도는 하기 표 6에 나타내었다.
균주명 L-이소류신 농도(g/L) AABA 농도(g/L) L-발린 농도(g/L) 이소류신+부산물(AABA, Valine) 대비 부산물비율
CA10-3101(모균주) 2.51 0.9 1.2 0.45
CA10-3101/pTOPO-ilvEm1251 2.34 0.3 0.5 0.25
CA10-3101/pTOPO-ilvEm3528 2.40 0.4 0.6 0.29
CA10-3101/pTOPO-ilvEm4401 2.52 0.7 1.0 0.40
- 부산물 비율: 부산물(AABA, Valine) 농도 / (이소류신 + 부산물) 농도
그 결과, 상기 표 6에 나타난 바와 같이, 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101에 비해 L-이소류신 생산성이 유사하며 부산물인 AABA 및 L-발린이 감소된 변이 3종 균주를 확인하였다. 상기 변이 3종 균주에 대한 시퀀싱을 진행하여, ilvE 유전자를 야생형 MG1655와 비교한 결과, 상기 변이 3종 균주는 ilvE 유전자에 변이를 포함하고 있음을 확인하였다.
구체적으로, CA10-3101/pTOPO-ilvEm1251 균주는 ilvE의 아미노산 서열에서 98번째 아미노산인 아르기닌이 이소류신으로 치환(R98I), CA10-3101/pTOPO-ilvEm3528 균주는 ilvE의 아미노산 서열에서 31번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 치환(H31L), 및 CA10-3101/pTOPO-ilvEm4401 균주는 ilvE의 아미노산 서열에서 256번째 아미노산인 세린이 발린으로 치환(S256V)됨을 확인하였다. 상기 결과를 바탕으로, 상기 변이 3종 균주(R98I, H31L, S256V)가 모균주에 비해 고효율 및 고수율로 L-이소류신을 생산할 수 있음을 확인하였다. 더욱 구체적으로, ilvE(R98I), ilvE(H31L), 및 ilvE(S256V)가 도입된 각각의 균주를 모균주와 비교하면, L-이소류신은 유사한 농도로 생산하였으나, AABA 농도는 각각 약67%, 56%, 및 22%, L-발린은 각각 약 58%, 50%, 및 27% 감소하며, 부산물(AABA, L-발린)비율이 각각 44%, 26%, 및 11% 감소하여, 변이 균주 3종의 부산물 저감 효과가 우수함을 확인하였다.
실시예 4: 변이형 ilvE가 도입된 L-이소류신 균주 제작
상기 실시예 3에서 제작한 변이형 ilvE 3종을 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101에 형질전환하였다.
구체적으로, 참고예 1과 같이 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 8 및 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머를 이용하고 CA10-3101/pTOPO-ilvEm1251(R98I), CA10-3101/pTOPO-ilvEm3528(H31L), CA10-3101/pTOPO-ilvEm4401(S256V)의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 어닐링 55℃ 30초 변성; 및 중합반응 72℃ 1분이며, 이러한 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하였다. 그 결과, ATCC13032 ilvE 유전자 개시코돈을 중심으로 5' 상단 737bp DNA 단편, ATCC13032 gdh 유전자 개시코돈을 중심으로 5' 상단 499bp DNA 단편, ATCC13032 ilvE 유전자 종결코돈을 중심으로 3' 하단 742bp DNA 단편, CA10-3101/pTOPO-ilvEm1251, CA10-3101/pTOPO-ilvEm3528, CA10-3101/pTOPO-ilvEm4401의 각 ilvE 유전자의 930bp 단편을 각각 수득하였다. 증폭된 세 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 8 및 서열번호 13의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃초 변성; 및 72℃ 2분 중합을 6회 반복한 후 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 2분 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, gdh 프로모터를 포함하는 ilvE 유전자를 코딩하는 2868bp의 DNA 단편 3종이 증폭되었다. 증폭산물을 QUIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하고 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다. 한편, 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDCM2벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 코리네박테리움 글루타미쿰의 ilvE 유전자 및 ilvE 프로모터가 대장균 ilvE 유전자 및 코리네박테리움 글루타미쿰 gdh 프로모터로 치환되어 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, H31L), pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, R98I), 및 pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, S256V)를 제작하였다.
상기에서 제작된 벡터를 전기천공법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 변이형 ilvE 프로모터가 강화되고 변이형 ilvE가 치환된 균주를 얻었으며, CA10-3101::Pgdh-ilvE(eco, H31L) 균주를 CA10-3120, CA10-3101::Pgdh-ilvE(eco, R98I) 균주를 CA10-3121, 및 CA10-3101::Pgdh-ilvE(eco, S256V) 균주를 CA10-3122로 명명하였다. L-이소류신 생산 모균주(CA10-3101), 및 본 실시예에서 제작한 변이체 도입 균주 3종 (CA10-3120, CA10-3121, CA10-3122)에 대하여, L-이소류신 생산성 증가 및 부산물 저감 효과를 확인하기 위해, 각각의 균주를 하기와 같은 방법으로 발효역가 평가를 수행하였다. 이소류신 생산배지를 25㎖ 함유하는 250㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주 및 상기 변이주 3종을 접종한 후, 32℃에서 60시간동안 200rpm으로 진탕 배양하여 L-이소류신을 제조하였다. 본 실시예에서 사용한 생산배지의 조성은 하기에 나타내었다.
<생산배지>
포도당 10%, 효모추출물 0.2%, 황산암모늄 1.6%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.1%, 황산철7수염 10㎎/ℓ, 황산망간1수염 10 ㎎/ℓ, 비오틴 200 ㎍/ℓ, pH7.2
배양 종료 후, 액체고속크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 L-이소류신, AABA, L-발린 농도를 측정한 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
균주명 L-이소류신 농도(g/L) AABA 농도(g/L) L-발린 농도(g/L) 이소류신+부산물(AABA, L-발린) 대비 부산물비율
CA10-3101(모균주) 2.6 0.9 1.2 0.44
CA10-3120(H31L 도입 균주) 2.5 0.5 0.7 0.32
CA10-3121(R98I 도입 균주) 2.3 0.4 0.6 0.30
CA10-3122(S256V 도입 균주) 2.6 0.8 1.0 0.40
- 부산물 비율: 부산물(AABA, L-발린) 농도 / (이소류신 + 부산물) 농도
상기 표 7에 나타난 바와 같이, 모균주(CA10-3101)에 비해 ilvE(H31L) 도입 균주(CA10-3120), ilvE(R98I) 도입 균주(CA10-3121), 및 ilvE(S256V) 도입 균주 (CA10-3122)에서 생산된 L-이소류신은 유사하며, 부산물인 AABA 및 L-발린의 농도는 감소함을 확인하였다. 더 나아가서, ilvE(H31L), ilvE(R98I), ilvE(S256V) 변이체 도입 균주가 생산하는 AABA는 모균주에 비해 약 56%, 44%, 89% 수준에 불과할 뿐만 아니라, L-발린은 모균주에 비해 약 58%, 50%, 83% 수준에 불과함을 확인하였다. 또한, 부산물(AABA, L-발린) 비율은 모균주에 비해 약 27%, 32%, 9% 감소하여 ilvE(H31L), ilvE(R98I), ilvE(S256V) 변이체 도입 균주에서의 부산물은 감소하고, L-이소류신 생산성 및 순도는 현저히 증가함을 확인하였다.
상기 균주 CA10-3125는 2020년 12월 1일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 KCCM12859P로 기탁번호를 부여받았다.
실시예 5: 조합된 변이형 ilvE 플라스미드 제작
실시예 3에서 확인된 대장균 ilvE 변이형이 2가지씩 조합하여 L-이소류신 균주에 도입하기 위하여 하기 표 8 의 프라이머를 이용하여 플라스미드를 제작하였다.
서열번호 명칭 서열
26 primer GAGTCGTAGCAACGGATGCCTTC
27 primer GGCATCCGTTGCTACGACTCGC
28 primer TGGGAGTAAACCCGCCAGCGGGA
29 primer TCCCGCTGGCGGGTTTACTCCCA
구체적으로, pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, H31L)를 주형으로 하여 서열번호 8 및 서열번호 26의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였으며, pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, R98I)를 주형으로 하여 서열번호 27 및 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 1분 중합반응을 조건으로 하여, 이러한 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하였다. 그 결과, pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, H31L)의 1370bp DNA 단편, pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, R98I)의 1558bp DNA 단편을 수득하였다. 증폭된 두 가지의 DNA절편을 주형으로 하여, 서열번호 8 및 서열번호 13의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성; 및 72℃ 2분 중합을 6회 반복한 후 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 2분 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, gdh 프로모터 및 대장균 ilvE 유전자를 코딩하는 2868bp의 DNA 단편 1종이 증폭되었다. 증폭산물을 QUIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDCM2벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 코리네박테리움 글루타미쿰의 ilvE 유전자 및 ilvE 프로모터가 코리네박테리움 글루타미쿰의 gdh 프로모터 및 대장균의 ilvE 유전자로 치환되어 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, H31L, R98I) 를 제작하였다.
추가적으로 pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, H31L)를 주형으로 하여 서열번호 8 및 서열번호 26, pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, S256V)를 주형으로 하여 서열번호 27 및 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 1분 중합반응이고, 이러한 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하였다. 그 결과, pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, H31L)의 1370bp DNA 단편, pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, S256V)의 1558bp DNA 단편을 수득하였다. 증폭된 두 가지의 DNA절편을 주형으로 하여, 서열번호 8 및 서열번호 13의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성; 및 72℃ 2분 중합을 6회 반복한 후 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 2분 중합을 20회 반복한 후, 72℃ 에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, gdh 프로모터 및 대장균 ilvE 유전자를 코딩하는 2868bp의 DNA 단편 1종이 증폭되었다. 증폭산물을 QUIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDCM2벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 코리네박테리움 글루타미쿰의 ilvE 유전자 및 ilvE 프로모터가 코리네박테리움 글루타미쿰의 gdh 프로모터 및 대장균의 ilvE로 치환되어 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, H31L, S256V) 를 제작하였다.
마지막으로는 pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, R98I)를 주형으로하여 서열번호 8 및 서열번호 28의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였으며, pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, S256V)를 주형으로하여 서열번호 29 및 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 1분 중합반응이고, 이러한 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하였다. 그 결과, pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, R98I의 1581bp DNA 단편, pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, S256V))의 1350bp DNA 단편을 수득하였다. 증폭된 두 가지의 DNA절편을 주형으로 하여, 서열번호 8 및 서열번호 13의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성; 및 72℃ 2분 중합을 6회 반복한 후 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 2분 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, gdh 프로모터 및 대장균 ilvE 유전자를 코딩하는 2868bp의 DNA 단편 1종이 증폭되었다. 증폭산물을 QUIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDCM2벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 코리네박테리움 글루타미쿰의 ilvE 유전자 및 ilvE 프로모터가 코리네박테리움 글루타미쿰의 gdh 프로모터 및 대장균의 ilvE로 치환되어 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2-Pgdh-ilvE(eco, R98I, S256V) 를 제작하였다.
실시예 6: 조합된 변이형 ilvE가 도입된 L-이소류신 균주 제작
실시예 5에서 제작된 벡터를 전기천공법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 변이형 대장균 ilvE가 치환 및 프로모터 강화된 균주를 얻었으며, CA10-3101::Pgdh- ilvE(eco, H31L, R98I)를 CA10-3124로, CA10-3101::Pgdh- ilvE(eco, H31L, S256V)를 CA10-3125로, CA10-3101::Pgdh- ilvE(eco, R98I, S256V)를 CA10-3126으로 명명하였다.
제작된 3종의 균주의 L-이소류신 생산성 증가 및 부산물이 저감효과를 확인하기 위해 각각의 균주에 대한 발효역가 평가를 진행하였다. 이를 위하여, 이소류신 생산배지 25㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주 및 상기 변이주를 접종한 후, 32℃에서 60시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-이소류신을 제조하였다. 본 실시예 에서 사용한 생산배지의 조성은 하기와 같다.
<생산배지>
포도당 10%, 효모추출물 0.2%, 황산암모늄 1.6%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.1%, 황산철7수염 10㎎/ℓ 황산망간1수염 10 ㎎/ℓ 비오틴 200 ㎍/ℓ pH 7.2
배양종료 후, 액체고속크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 L-이소류신, 알파-아미노부티릭산(AABA) 및 L-발린의 생산량을 측정하였고, 농도는 하기 표 9에 나타내었다.
균주명 L-이소류신 농도(g/L) AABA 농도(g/L) L-발린 농도(g/L) 이소류신+부산물(AABA, L-발린) 대비 부산물 비율
CA10-3101(모균주) 2.4 0.8 1.0 0.42
CA10-3124(H31L, R98I) 1.9 0.3 0.4 0.26
CA10-3125(H31L, S256V) 2.1 0.5 0.7 0.36
CA10-3126(R98I, S256V) 2.1 0.6 0.6 0.36
- 부산물 비율: 부산물(AABA, L-발린) 농도 / (이소류신 + 부산물) 농도
그 결과, 상기 표 9에 나타난 바와 같이, 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101대비 조합 변이형 대장균 ilvE가 도입된 변이주에서 L-이소류신은 유사하나, 부산물이 감소함을 확인하였다. 구체적으로, 부산물인 AABA는 모균주 대비 CA10-3124가 62%, CA10-3125가 37.5%, CA10-3126이 25% 감소되었으며, L-발린은 모균주 대비 CA10-3124가 60%, CA10-3125가 30%, CA10-3126이 40% 감소함을 확인하였다. 또한, 부산물(AABA, L-발린) 비율은 CA10-3124가 38%, CA10-3125가 14%, CA10-3126이 14% 감소함을 확인하였다.
상기의 결과로부터, 조합 변이형 대장균 ilvE 유전자가 L-이소류신 생산에 있어, 부산물을 감소시켜 L-이소류신의 발효 순도를 높일 수 있음을 확인하였다.
실시예6: L-이소류신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P 균주에서 변이형 대장균 ilvE 강화주 및 조합 변이형 대장균 ilvE 강화주의 제작
실시예 4 및 5에서 L-이소류신 생산능 증가 및 부산물의 감소에 효과적인 대장균 ilvE의 변이 3종 및 조합 변이 3종을 NTG(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 처리된 L-이소류신 생산균주인 KCJI-38(KCCM11248P, 대한민국 등록특허 제10-1335789호) 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신 25㎎m/L를 함유한 선별배지에 도말하여 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 프로모터 강화된 변이형 대장균 ilvE 및 조합 변이형 대장균 ilvE 강화주를 획득하였다. 그 후 실시예 3과 동일한 방법으로 배양액 중의 L-이소류신과 부산물 농도를 측정하고, 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
L-이소류신 농도(g/L) AABA 농도(g/L) L-발린 농도(g/L) 이소류신+부산물(AABA, L-발린) 대비 부산물 비율
KCCM11248P (모균주) 1.4 0.7 1.2 0.57
KCCM11248P△Pn-ilvE::Pgdh-ilvE(Eco, H31L) 1.4 0.4 0.8 0.46
KCCM11248P△Pn-ilvE::Pgdh-ilvE(Eco, R98I) 1.3 0.3 0.7 0.43
KCCM11248P△Pn-ilvE::Pgdh-ilvE(Eco, 256V) 1.5 0.6 1.0 0.51
KCCM11248P△Pn-ilvE::Pgdh-ilvE(Eco, H31L, R98I) 1.0 0.3 0.6 0.47
KCCM11248P△Pn-ilvE::Pgdh-ilvE(Eco, H31L, S256V) 1.3 0.5 1.0 0.53
KCCM11248P△Pn-ilvE::Pgdh-ilvE(Eco, R98I, S256V) 1.1 0.5 1.0 0.57
- 부산물 비율: 부산물(AABA, L-발린) 농도 / (이소류신 + 부산물) 농도
상기 표 10에 나타난 바와 같이, 변이형 및 조합 변이형 대장균 ilvE를 도입한 KCCM11248P 균주들이 모균주 대비하여 부산물인 AABA 및 L-발린이 감소함이 확인되었다. 구체적으로는 KCCM11248P△Pn-ilvE::Pgdh-ilvE(Eco, H31L), KCCM11248P△Pn-ilvE::Pgdh-ilvE(Eco, S256V) 균주들이 특히 모균주 대비하여 L-이소류신 생산성을 유지하며 부산물인 AABA 및 L-발린이 감소하였고, KCCM11248P△Pn-ilvE::Pgdh-ilvE(Eco, R98I) 및 조합 변이형 대장균 ilvE가 도입된 KCCM11248P 균주들은 L-이소류신 생산량은 감소하나, 부산물을 감소시켜 L-이소류신의 발효 순도를 높일 수 있음을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 출원의 변이형 대장균 ilvE 및 이의 조합 강화주가 L-이소류신의 생산을 증가시킬 수 있음을 시사하는 것이다. 또한, 변이형 대장균 ilvE 및 이의 조합이 강화주가 L-이소류신의 생산 및 정제 공정에서의 순도 증가에 기여하는 변이이므로, 상기 변이는 L-이소류신의 생산을 증가시키는 역할을 하는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12739P 20200527 한국미생물보존센터(국외) KCCM12859P 20201201
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Novel Branched-chain amino acid aminotransferase variant and method of producing L-isoleucine using the same <130> KPA201358-KR <160> 37 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 309 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ilvE <400> 1 Met Thr Thr Lys Lys Ala Asp Tyr Ile Trp Phe Asn Gly Glu Met Val 1 5 10 15 Arg Trp Glu Asp Ala Lys Val His Val Met Ser His Ala Leu His Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Val Phe Glu Gly Ile Arg Cys Tyr Asp Ser His Lys Gly 35 40 45 Pro Val Val Phe Arg His Arg Glu His Met Gln Arg Leu His Asp Ser 50 55 60 Ala Lys Ile Tyr Arg Phe Pro Val Ser Gln Ser Ile Asp Glu Leu Met 65 70 75 80 Glu Ala Cys Arg Asp Val Ile Arg Lys Asn Asn Leu Thr Ser Ala Tyr 85 90 95 Ile Arg Pro Leu Ile Phe Val Gly Asp Val Gly Met Gly Val Asn Pro 100 105 110 Pro Ala Gly Tyr Ser Thr Asp Val Ile Ile Ala Ala Phe Pro Trp Gly 115 120 125 Ala Tyr Leu Gly Ala Glu Ala Leu Glu Gln Gly Ile Asp Ala Met Val 130 135 140 Ser Ser Trp Asn Arg Ala Ala Pro Asn Thr Ile Pro Thr Ala Ala Lys 145 150 155 160 Ala Gly Gly Asn Tyr Leu Ser Ser Leu Leu Val Gly Ser Glu Ala Arg 165 170 175 Arg His Gly Tyr Gln Glu Gly Ile Ala Leu Asp Val Asn Gly Tyr Ile 180 185 190 Ser Glu Gly Ala Gly Glu Asn Leu Phe Glu Val Lys Asp Gly Val Leu 195 200 205 Phe Thr Pro Pro Phe Thr Ser Ser Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Asp 210 215 220 Ala Ile Ile Lys Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ile Glu Val Arg Glu Gln 225 230 235 240 Val Leu Ser Arg Glu Ser Leu Tyr Leu Ala Asp Glu Val Phe Met Ser 245 250 255 Gly Thr Ala Ala Glu Ile Thr Pro Val Arg Ser Val Asp Gly Ile Gln 260 265 270 Val Gly Glu Gly Arg Cys Gly Pro Val Thr Lys Arg Ile Gln Gln Ala 275 280 285 Phe Phe Gly Leu Phe Thr Gly Glu Thr Glu Asp Lys Trp Gly Trp Leu 290 295 300 Asp Gln Val Asn Gln 305 <210> 2 <211> 309 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ilvE <400> 2 Met Thr Thr Lys Lys Ala Asp Tyr Ile Trp Phe Asn Gly Glu Met Val 1 5 10 15 Arg Trp Glu Asp Ala Lys Val His Val Met Ser His Ala Leu Leu Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Val Phe Glu Gly Ile Arg Cys Tyr Asp Ser His Lys Gly 35 40 45 Pro Val Val Phe Arg His Arg Glu His Met Gln Arg Leu His Asp Ser 50 55 60 Ala Lys Ile Tyr Arg Phe Pro Val Ser Gln Ser Ile Asp Glu Leu Met 65 70 75 80 Glu Ala Cys Arg Asp Val Ile Arg Lys Asn Asn Leu Thr Ser Ala Tyr 85 90 95 Ile Arg Pro Leu Ile Phe Val Gly Asp Val Gly Met Gly Val Asn Pro 100 105 110 Pro Ala Gly Tyr Ser Thr Asp Val Ile Ile Ala Ala Phe Pro Trp Gly 115 120 125 Ala Tyr Leu Gly Ala Glu Ala Leu Glu Gln Gly Ile Asp Ala Met Val 130 135 140 Ser Ser Trp Asn Arg Ala Ala Pro Asn Thr Ile Pro Thr Ala Ala Lys 145 150 155 160 Ala Gly Gly Asn Tyr Leu Ser Ser Leu Leu Val Gly Ser Glu Ala Arg 165 170 175 Arg His Gly Tyr Gln Glu Gly Ile Ala Leu Asp Val Asn Gly Tyr Ile 180 185 190 Ser Glu Gly Ala Gly Glu Asn Leu Phe Glu Val Lys Asp Gly Val Leu 195 200 205 Phe Thr Pro Pro Phe Thr Ser Ser Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Asp 210 215 220 Ala Ile Ile Lys Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ile Glu Val Arg Glu Gln 225 230 235 240 Val Leu Ser Arg Glu Ser Leu Tyr Leu Ala Asp Glu Val Phe Met Ser 245 250 255 Gly Thr Ala Ala Glu Ile Thr Pro Val Arg Ser Val Asp Gly Ile Gln 260 265 270 Val Gly Glu Gly Arg Cys Gly Pro Val Thr Lys Arg Ile Gln Gln Ala 275 280 285 Phe Phe Gly Leu Phe Thr Gly Glu Thr Glu Asp Lys Trp Gly Trp Leu 290 295 300 Asp Gln Val Asn Gln 305 <210> 3 <211> 309 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ilvE <400> 3 Met Thr Thr Lys Lys Ala Asp Tyr Ile Trp Phe Asn Gly Glu Met Val 1 5 10 15 Arg Trp Glu Asp Ala Lys Val His Val Met Ser His Ala Leu His Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Val Phe Glu Gly Ile Arg Cys Tyr Asp Ser His Lys Gly 35 40 45 Pro Val Val Phe Arg His Arg Glu His Met Gln Arg Leu His Asp Ser 50 55 60 Ala Lys Ile Tyr Arg Phe Pro Val Ser Gln Ser Ile Asp Glu Leu Met 65 70 75 80 Glu Ala Cys Arg Asp Val Ile Arg Lys Asn Asn Leu Thr Ser Ala Tyr 85 90 95 Ile Ile Pro Leu Ile Phe Val Gly Asp Val Gly Met Gly Val Asn Pro 100 105 110 Pro Ala Gly Tyr Ser Thr Asp Val Ile Ile Ala Ala Phe Pro Trp Gly 115 120 125 Ala Tyr Leu Gly Ala Glu Ala Leu Glu Gln Gly Ile Asp Ala Met Val 130 135 140 Ser Ser Trp Asn Arg Ala Ala Pro Asn Thr Ile Pro Thr Ala Ala Lys 145 150 155 160 Ala Gly Gly Asn Tyr Leu Ser Ser Leu Leu Val Gly Ser Glu Ala Arg 165 170 175 Arg His Gly Tyr Gln Glu Gly Ile Ala Leu Asp Val Asn Gly Tyr Ile 180 185 190 Ser Glu Gly Ala Gly Glu Asn Leu Phe Glu Val Lys Asp Gly Val Leu 195 200 205 Phe Thr Pro Pro Phe Thr Ser Ser Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Asp 210 215 220 Ala Ile Ile Lys Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ile Glu Val Arg Glu Gln 225 230 235 240 Val Leu Ser Arg Glu Ser Leu Tyr Leu Ala Asp Glu Val Phe Met Ser 245 250 255 Gly Thr Ala Ala Glu Ile Thr Pro Val Arg Ser Val Asp Gly Ile Gln 260 265 270 Val Gly Glu Gly Arg Cys Gly Pro Val Thr Lys Arg Ile Gln Gln Ala 275 280 285 Phe Phe Gly Leu Phe Thr Gly Glu Thr Glu Asp Lys Trp Gly Trp Leu 290 295 300 Asp Gln Val Asn Gln 305 <210> 4 <211> 309 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ilvE <400> 4 Met Thr Thr Lys Lys Ala Asp Tyr Ile Trp Phe Asn Gly Glu Met Val 1 5 10 15 Arg Trp Glu Asp Ala Lys Val His Val Met Ser His Ala Leu His Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Val Phe Glu Gly Ile Arg Cys Tyr Asp Ser His Lys Gly 35 40 45 Pro Val Val Phe Arg His Arg Glu His Met Gln Arg Leu His Asp Ser 50 55 60 Ala Lys Ile Tyr Arg Phe Pro Val Ser Gln Ser Ile Asp Glu Leu Met 65 70 75 80 Glu Ala Cys Arg Asp Val Ile Arg Lys Asn Asn Leu Thr Ser Ala Tyr 85 90 95 Ile Arg Pro Leu Ile Phe Val Gly Asp Val Gly Met Gly Val Asn Pro 100 105 110 Pro Ala Gly Tyr Ser Thr Asp Val Ile Ile Ala Ala Phe Pro Trp Gly 115 120 125 Ala Tyr Leu Gly Ala Glu Ala Leu Glu Gln Gly Ile Asp Ala Met Val 130 135 140 Ser Ser Trp Asn Arg Ala Ala Pro Asn Thr Ile Pro Thr Ala Ala Lys 145 150 155 160 Ala Gly Gly Asn Tyr Leu Ser Ser Leu Leu Val Gly Ser Glu Ala Arg 165 170 175 Arg His Gly Tyr Gln Glu Gly Ile Ala Leu Asp Val Asn Gly Tyr Ile 180 185 190 Ser Glu Gly Ala Gly Glu Asn Leu Phe Glu Val Lys Asp Gly Val Leu 195 200 205 Phe Thr Pro Pro Phe Thr Ser Ser Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Asp 210 215 220 Ala Ile Ile Lys Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ile Glu Val Arg Glu Gln 225 230 235 240 Val Leu Ser Arg Glu Ser Leu Tyr Leu Ala Asp Glu Val Phe Met Val 245 250 255 Gly Thr Ala Ala Glu Ile Thr Pro Val Arg Ser Val Asp Gly Ile Gln 260 265 270 Val Gly Glu Gly Arg Cys Gly Pro Val Thr Lys Arg Ile Gln Gln Ala 275 280 285 Phe Phe Gly Leu Phe Thr Gly Glu Thr Glu Asp Lys Trp Gly Trp Leu 290 295 300 Asp Gln Val Asn Gln 305 <210> 5 <211> 309 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ilvE <400> 5 Met Thr Thr Lys Lys Ala Asp Tyr Ile Trp Phe Asn Gly Glu Met Val 1 5 10 15 Arg Trp Glu Asp Ala Lys Val His Val Met Ser His Ala Leu Leu Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Val Phe Glu Gly Ile Arg Cys Tyr Asp Ser His Lys Gly 35 40 45 Pro Val Val Phe Arg His Arg Glu His Met Gln Arg Leu His Asp Ser 50 55 60 Ala Lys Ile Tyr Arg Phe Pro Val Ser Gln Ser Ile Asp Glu Leu Met 65 70 75 80 Glu Ala Cys Arg Asp Val Ile Arg Lys Asn Asn Leu Thr Ser Ala Tyr 85 90 95 Ile Ile Pro Leu Ile Phe Val Gly Asp Val Gly Met Gly Val Asn Pro 100 105 110 Pro Ala Gly Tyr Ser Thr Asp Val Ile Ile Ala Ala Phe Pro Trp Gly 115 120 125 Ala Tyr Leu Gly Ala Glu Ala Leu Glu Gln Gly Ile Asp Ala Met Val 130 135 140 Ser Ser Trp Asn Arg Ala Ala Pro Asn Thr Ile Pro Thr Ala Ala Lys 145 150 155 160 Ala Gly Gly Asn Tyr Leu Ser Ser Leu Leu Val Gly Ser Glu Ala Arg 165 170 175 Arg His Gly Tyr Gln Glu Gly Ile Ala Leu Asp Val Asn Gly Tyr Ile 180 185 190 Ser Glu Gly Ala Gly Glu Asn Leu Phe Glu Val Lys Asp Gly Val Leu 195 200 205 Phe Thr Pro Pro Phe Thr Ser Ser Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Asp 210 215 220 Ala Ile Ile Lys Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ile Glu Val Arg Glu Gln 225 230 235 240 Val Leu Ser Arg Glu Ser Leu Tyr Leu Ala Asp Glu Val Phe Met Ser 245 250 255 Gly Thr Ala Ala Glu Ile Thr Pro Val Arg Ser Val Asp Gly Ile Gln 260 265 270 Val Gly Glu Gly Arg Cys Gly Pro Val Thr Lys Arg Ile Gln Gln Ala 275 280 285 Phe Phe Gly Leu Phe Thr Gly Glu Thr Glu Asp Lys Trp Gly Trp Leu 290 295 300 Asp Gln Val Asn Gln 305 <210> 6 <211> 309 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ilvE <400> 6 Met Thr Thr Lys Lys Ala Asp Tyr Ile Trp Phe Asn Gly Glu Met Val 1 5 10 15 Arg Trp Glu Asp Ala Lys Val His Val Met Ser His Ala Leu Leu Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Val Phe Glu Gly Ile Arg Cys Tyr Asp Ser His Lys Gly 35 40 45 Pro Val Val Phe Arg His Arg Glu His Met Gln Arg Leu His Asp Ser 50 55 60 Ala Lys Ile Tyr Arg Phe Pro Val Ser Gln Ser Ile Asp Glu Leu Met 65 70 75 80 Glu Ala Cys Arg Asp Val Ile Arg Lys Asn Asn Leu Thr Ser Ala Tyr 85 90 95 Ile Arg Pro Leu Ile Phe Val Gly Asp Val Gly Met Gly Val Asn Pro 100 105 110 Pro Ala Gly Tyr Ser Thr Asp Val Ile Ile Ala Ala Phe Pro Trp Gly 115 120 125 Ala Tyr Leu Gly Ala Glu Ala Leu Glu Gln Gly Ile Asp Ala Met Val 130 135 140 Ser Ser Trp Asn Arg Ala Ala Pro Asn Thr Ile Pro Thr Ala Ala Lys 145 150 155 160 Ala Gly Gly Asn Tyr Leu Ser Ser Leu Leu Val Gly Ser Glu Ala Arg 165 170 175 Arg His Gly Tyr Gln Glu Gly Ile Ala Leu Asp Val Asn Gly Tyr Ile 180 185 190 Ser Glu Gly Ala Gly Glu Asn Leu Phe Glu Val Lys Asp Gly Val Leu 195 200 205 Phe Thr Pro Pro Phe Thr Ser Ser Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Asp 210 215 220 Ala Ile Ile Lys Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ile Glu Val Arg Glu Gln 225 230 235 240 Val Leu Ser Arg Glu Ser Leu Tyr Leu Ala Asp Glu Val Phe Met Val 245 250 255 Gly Thr Ala Ala Glu Ile Thr Pro Val Arg Ser Val Asp Gly Ile Gln 260 265 270 Val Gly Glu Gly Arg Cys Gly Pro Val Thr Lys Arg Ile Gln Gln Ala 275 280 285 Phe Phe Gly Leu Phe Thr Gly Glu Thr Glu Asp Lys Trp Gly Trp Leu 290 295 300 Asp Gln Val Asn Gln 305 <210> 7 <211> 309 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ilvE <400> 7 Met Thr Thr Lys Lys Ala Asp Tyr Ile Trp Phe Asn Gly Glu Met Val 1 5 10 15 Arg Trp Glu Asp Ala Lys Val His Val Met Ser His Ala Leu His Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Val Phe Glu Gly Ile Arg Cys Tyr Asp Ser His Lys Gly 35 40 45 Pro Val Val Phe Arg His Arg Glu His Met Gln Arg Leu His Asp Ser 50 55 60 Ala Lys Ile Tyr Arg Phe Pro Val Ser Gln Ser Ile Asp Glu Leu Met 65 70 75 80 Glu Ala Cys Arg Asp Val Ile Arg Lys Asn Asn Leu Thr Ser Ala Tyr 85 90 95 Ile Ile Pro Leu Ile Phe Val Gly Asp Val Gly Met Gly Val Asn Pro 100 105 110 Pro Ala Gly Tyr Ser Thr Asp Val Ile Ile Ala Ala Phe Pro Trp Gly 115 120 125 Ala Tyr Leu Gly Ala Glu Ala Leu Glu Gln Gly Ile Asp Ala Met Val 130 135 140 Ser Ser Trp Asn Arg Ala Ala Pro Asn Thr Ile Pro Thr Ala Ala Lys 145 150 155 160 Ala Gly Gly Asn Tyr Leu Ser Ser Leu Leu Val Gly Ser Glu Ala Arg 165 170 175 Arg His Gly Tyr Gln Glu Gly Ile Ala Leu Asp Val Asn Gly Tyr Ile 180 185 190 Ser Glu Gly Ala Gly Glu Asn Leu Phe Glu Val Lys Asp Gly Val Leu 195 200 205 Phe Thr Pro Pro Phe Thr Ser Ser Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Asp 210 215 220 Ala Ile Ile Lys Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ile Glu Val Arg Glu Gln 225 230 235 240 Val Leu Ser Arg Glu Ser Leu Tyr Leu Ala Asp Glu Val Phe Met Val 245 250 255 Gly Thr Ala Ala Glu Ile Thr Pro Val Arg Ser Val Asp Gly Ile Gln 260 265 270 Val Gly Glu Gly Arg Cys Gly Pro Val Thr Lys Arg Ile Gln Gln Ala 275 280 285 Phe Phe Gly Leu Phe Thr Gly Glu Thr Glu Asp Lys Trp Gly Trp Leu 290 295 300 Asp Gln Val Asn Gln 305 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gaattcgagc tcggtaccca gacatccttg tcgtccttgc c 41 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ccctcaaatg gaattggtta gtcagcccca ttttatggga 40 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 accaattcca tttgagggcg ctca 24 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cagctttctt cgtggtcatg atttcctcgt tcccatctcg 40 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gttagatcaa gttaatcaat aaatcaaccg gttttaagac cccg 44 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gtcgactcta gaggatcccc cctggatcga tctcagatac 40 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 atgaccacga agaaagctga ttaca 25 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ttattgatta acttgatcta accagc 26 <210> 16 <211> 1338 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> hom <400> 16 atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 60 attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 120 ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 180 gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240 ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 300 cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360 cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420 tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480 gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540 gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 600 ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 660 gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 720 ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 780 aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 840 cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 900 aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 960 ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1020 gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1080 ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gggggttttg 1140 gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1200 gagcgcgatg atgatgcaca tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260 tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320 cgcctcgaaa gggactaa 1338 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tcgagctcgg taccccgctt ttgcactcat cgagc 35 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cacgatcaga tgtgcatcat cat 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 atgatgatgc acatctgatc gtg 23 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ctctagagga tccccgagca tcttccaaaa ccttg 35 <210> 21 <211> 1311 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvA <400> 21 atgagtgaaa catacgtgtc tgagaaaagt ccaggagtga tggctagcgg agcggagctg 60 attcgtgccg ccgacattca aacggcgcag gcacgaattt cctccgtcat tgcaccaact 120 ccattgcagt attgccctcg tctttctgag gaaaccggag cggaaatcta ccttaagcgt 180 gaggatctgc aggatgttcg ttcctacaag atccgcggtg cgctgaactc tggagcgcag 240 ctcactcagg agcagcgcga tgcaggtatc gttgccgcat ctgcaggtaa ccatgcccag 300 ggcgtggcct atgtgtgcaa gtccttgggc gttcagggac gcatctatgt tcctgtgcag 360 actccaaagc aaaagcgtga ccgcatcatg gttcacggcg gagagtttgt ctccttggtg 420 gtcactggca ataacttcga cgaagcatcg gctgcagcgc atgaagatgc agagcgcacc 480 ggcgcaacgc tgatcgagcc tttcgatgct cgcaacaccg tcatcggtca gggtacagtg 540 gctgctgaga tcttgtcgca gctgacttcc atgggcaaga gtgcagatca cgtgatggtt 600 ccagtcggcg gtggcggact tcttgcaggt gtggtcagct acatggctga tatggcacct 660 cgcactgcga tcgttggtat cgaaccagcg ggagcagcat ccatgcaggc tgcattgcac 720 aatggtggac caatcacttt ggagactgtt gatccctttg tggacggcgc agcagtcaaa 780 cgtgtcggag atctcaacta caccatcgtg gagaagaacc agggtcgcgt gcacatgatg 840 agcgcgaccg agggcgctgt gtgtactgag atgctcgatc tttaccaaaa cgaaggcatc 900 atcgcggagc ctgctggcgc gctgtctatc gctgggttga aggaaatgtc ctttgcacct 960 ggttctgtcg tggtgtgcat catctctggt ggcaacaacg atgtgctgcg ttatgcggaa 1020 atcgctgagc gctccttggt gcaccgcggt ttgaagcact acttcttggt gaacttcccg 1080 caaaagcctg gtcagttgcg tcacttcctg gaagatatcc tgggaccgga tgatgacatc 1140 gcgctggcag agtacctcaa gcgcaacaac cgtgagaccg gtactgcgtt ggtgggtatt 1200 cacttgagtg aagcatcagg attggattct ttgctggaac gtatggagga atcggcaatt 1260 gattcccgtc gcctcgagcc gggcacccct gagtacgaat acttgaccta a 1311 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tcgagctcgg tacccatgag tgaaacatac gtgtc 35 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gcgcttgagg tactctgcca gcgcgatgtc atcatccgg 39 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ccggatgatg acatcgcgct ggcagagtac ctcaagcgc 39 <210> 25 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ctctagagga tcccccgtca ccgacacctc caca 34 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gagtcgtagc aacggatgcc ttc 23 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ggcatccgtt gctacgactc gc 22 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tgggagtaaa cccgccagcg gga 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 tcccgctggc gggtttactc cca 23 <210> 30 <211> 930 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ilvE <400> 30 atgaccacga agaaagctga ttacatttgg ttcaatgggg agatggttcg ctgggaagac 60 gcgaaggtgc atgtgatgtc gcacgcgctg cactatggca cttcggtttt tgaaggcatc 120 cgttgctacg actcgcacaa aggaccggtt gtattccgcc atcgtgagca tatgcagcgt 180 ctgcatgact ccgccaaaat ctatcgcttc ccggtttcgc agagcattga tgagctgatg 240 gaagcttgtc gtgacgtgat ccgcaaaaac aatctcacca gcgcctatat ccgtccgctg 300 atcttcgtcg gtgatgttgg catgggagta aacccgccag cgggatactc aaccgacgtg 360 attatcgctg ctttcccgtg gggagcgtat ctgggcgcag aagcgctgga gcaggggatc 420 gatgcgatgg tttcctcctg gaaccgcgca gcaccaaaca ccatcccgac ggcggcaaaa 480 gccggtggta actacctctc ttccctgctg gtgggtagcg aagcgcgccg ccacggttat 540 caggaaggta tcgcgctgga tgtgaacggt tatatctctg aaggcgcagg cgaaaacctg 600 tttgaagtga aagatggtgt gctgttcacc ccaccgttca cctcctccgc gctgccgggt 660 attacccgtg atgccatcat caaactggcg aaagagctgg gaattgaagt acgtgagcag 720 gtgctgtcgc gcgaatccct gtacctggcg gatgaagtgt ttatgtccgg tacggcggca 780 gaaatcacgc cagtgcgcag cgtagacggt attcaggttg gcgaaggccg ttgtggcccg 840 gttaccaaac gcattcagca agccttcttc ggcctcttca ctggcgaaac cgaagataaa 900 tggggctggt tagatcaagt taatcaataa 930 <210> 31 <211> 930 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ilvE <400> 31 atgaccacga agaaagctga ttacatttgg ttcaatgggg agatggttcg ctgggaagac 60 gcgaaggtgc atgtgatgtc gcacgcgctg ctgtatggca cttcggtttt tgaaggcatc 120 cgttgctacg actcgcacaa aggaccggtt gtattccgcc atcgtgagca tatgcagcgt 180 ctgcatgact ccgccaaaat ctatcgcttc ccggtttcgc agagcattga tgagctgatg 240 gaagcttgtc gtgacgtgat ccgcaaaaac aatctcacca gcgcctatat ccgtccgctg 300 atcttcgtcg gtgatgttgg catgggagta aacccgccag cgggatactc aaccgacgtg 360 attatcgctg ctttcccgtg gggagcgtat ctgggcgcag aagcgctgga gcaggggatc 420 gatgcgatgg tttcctcctg gaaccgcgca gcaccaaaca ccatcccgac ggcggcaaaa 480 gccggtggta actacctctc ttccctgctg gtgggtagcg aagcgcgccg ccacggttat 540 caggaaggta tcgcgctgga tgtgaacggt tatatctctg aaggcgcagg cgaaaacctg 600 tttgaagtga aagatggtgt gctgttcacc ccaccgttca cctcctccgc gctgccgggt 660 attacccgtg atgccatcat caaactggcg aaagagctgg gaattgaagt acgtgagcag 720 gtgctgtcgc gcgaatccct gtacctggcg gatgaagtgt ttatgtccgg tacggcggca 780 gaaatcacgc cagtgcgcag cgtagacggt attcaggttg gcgaaggccg ttgtggcccg 840 gttaccaaac gcattcagca agccttcttc ggcctcttca ctggcgaaac cgaagataaa 900 tggggctggt tagatcaagt taatcaataa 930 <210> 32 <211> 930 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ilvE <400> 32 atgaccacga agaaagctga ttacatttgg ttcaatgggg agatggttcg ctgggaagac 60 gcgaaggtgc atgtgatgtc gcacgcgctg cactatggca cttcggtttt tgaaggcatc 120 cgttgctacg actcgcacaa aggaccggtt gtattccgcc atcgtgagca tatgcagcgt 180 ctgcatgact ccgccaaaat ctatcgcttc ccggtttcgc agagcattga tgagctgatg 240 gaagcttgtc gtgacgtgat ccgcaaaaac aatctcacca gcgcctatat catcccgctg 300 atcttcgtcg gtgatgttgg catgggagta aacccgccag cgggatactc aaccgacgtg 360 attatcgctg ctttcccgtg gggagcgtat ctgggcgcag aagcgctgga gcaggggatc 420 gatgcgatgg tttcctcctg gaaccgcgca gcaccaaaca ccatcccgac ggcggcaaaa 480 gccggtggta actacctctc ttccctgctg gtgggtagcg aagcgcgccg ccacggttat 540 caggaaggta tcgcgctgga tgtgaacggt tatatctctg aaggcgcagg cgaaaacctg 600 tttgaagtga aagatggtgt gctgttcacc ccaccgttca cctcctccgc gctgccgggt 660 attacccgtg atgccatcat caaactggcg aaagagctgg gaattgaagt acgtgagcag 720 gtgctgtcgc gcgaatccct gtacctggcg gatgaagtgt ttatgtccgg tacggcggca 780 gaaatcacgc cagtgcgcag cgtagacggt attcaggttg gcgaaggccg ttgtggcccg 840 gttaccaaac gcattcagca agccttcttc ggcctcttca ctggcgaaac cgaagataaa 900 tggggctggt tagatcaagt taatcaataa 930 <210> 33 <211> 930 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ilvE <400> 33 atgaccacga agaaagctga ttacatttgg ttcaatgggg agatggttcg ctgggaagac 60 gcgaaggtgc atgtgatgtc gcacgcgctg cactatggca cttcggtttt tgaaggcatc 120 cgttgctacg actcgcacaa aggaccggtt gtattccgcc atcgtgagca tatgcagcgt 180 ctgcatgact ccgccaaaat ctatcgcttc ccggtttcgc agagcattga tgagctgatg 240 gaagcttgtc gtgacgtgat ccgcaaaaac aatctcacca gcgcctatat ccgtccgctg 300 atcttcgtcg gtgatgttgg catgggagta aacccgccag cgggatactc aaccgacgtg 360 attatcgctg ctttcccgtg gggagcgtat ctgggcgcag aagcgctgga gcaggggatc 420 gatgcgatgg tttcctcctg gaaccgcgca gcaccaaaca ccatcccgac ggcggcaaaa 480 gccggtggta actacctctc ttccctgctg gtgggtagcg aagcgcgccg ccacggttat 540 caggaaggta tcgcgctgga tgtgaacggt tatatctctg aaggcgcagg cgaaaacctg 600 tttgaagtga aagatggtgt gctgttcacc ccaccgttca cctcctccgc gctgccgggt 660 attacccgtg atgccatcat caaactggcg aaagagctgg gaattgaagt acgtgagcag 720 gtgctgtcgc gcgaatccct gtacctggcg gatgaagtgt ttatggtggg tacggcggca 780 gaaatcacgc cagtgcgcag cgtagacggt attcaggttg gcgaaggccg ttgtggcccg 840 gttaccaaac gcattcagca agccttcttc ggcctcttca ctggcgaaac cgaagataaa 900 tggggctggt tagatcaagt taatcaataa 930 <210> 34 <211> 930 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ilvE <400> 34 atgaccacga agaaagctga ttacatttgg ttcaatgggg agatggttcg ctgggaagac 60 gcgaaggtgc atgtgatgtc gcacgcgctg ctgtatggca cttcggtttt tgaaggcatc 120 cgttgctacg actcgcacaa aggaccggtt gtattccgcc atcgtgagca tatgcagcgt 180 ctgcatgact ccgccaaaat ctatcgcttc ccggtttcgc agagcattga tgagctgatg 240 gaagcttgtc gtgacgtgat ccgcaaaaac aatctcacca gcgcctatat catcccgctg 300 atcttcgtcg gtgatgttgg catgggagta aacccgccag cgggatactc aaccgacgtg 360 attatcgctg ctttcccgtg gggagcgtat ctgggcgcag aagcgctgga gcaggggatc 420 gatgcgatgg tttcctcctg gaaccgcgca gcaccaaaca ccatcccgac ggcggcaaaa 480 gccggtggta actacctctc ttccctgctg gtgggtagcg aagcgcgccg ccacggttat 540 caggaaggta tcgcgctgga tgtgaacggt tatatctctg aaggcgcagg cgaaaacctg 600 tttgaagtga aagatggtgt gctgttcacc ccaccgttca cctcctccgc gctgccgggt 660 attacccgtg atgccatcat caaactggcg aaagagctgg gaattgaagt acgtgagcag 720 gtgctgtcgc gcgaatccct gtacctggcg gatgaagtgt ttatgtccgg tacggcggca 780 gaaatcacgc cagtgcgcag cgtagacggt attcaggttg gcgaaggccg ttgtggcccg 840 gttaccaaac gcattcagca agccttcttc ggcctcttca ctggcgaaac cgaagataaa 900 tggggctggt tagatcaagt taatcaataa 930 <210> 35 <211> 930 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ilvE <400> 35 atgaccacga agaaagctga ttacatttgg ttcaatgggg agatggttcg ctgggaagac 60 gcgaaggtgc atgtgatgtc gcacgcgctg ctgtatggca cttcggtttt tgaaggcatc 120 cgttgctacg actcgcacaa aggaccggtt gtattccgcc atcgtgagca tatgcagcgt 180 ctgcatgact ccgccaaaat ctatcgcttc ccggtttcgc agagcattga tgagctgatg 240 gaagcttgtc gtgacgtgat ccgcaaaaac aatctcacca gcgcctatat ccgtccgctg 300 atcttcgtcg gtgatgttgg catgggagta aacccgccag cgggatactc aaccgacgtg 360 attatcgctg ctttcccgtg gggagcgtat ctgggcgcag aagcgctgga gcaggggatc 420 gatgcgatgg tttcctcctg gaaccgcgca gcaccaaaca ccatcccgac ggcggcaaaa 480 gccggtggta actacctctc ttccctgctg gtgggtagcg aagcgcgccg ccacggttat 540 caggaaggta tcgcgctgga tgtgaacggt tatatctctg aaggcgcagg cgaaaacctg 600 tttgaagtga aagatggtgt gctgttcacc ccaccgttca cctcctccgc gctgccgggt 660 attacccgtg atgccatcat caaactggcg aaagagctgg gaattgaagt acgtgagcag 720 gtgctgtcgc gcgaatccct gtacctggcg gatgaagtgt ttatggtggg tacggcggca 780 gaaatcacgc cagtgcgcag cgtagacggt attcaggttg gcgaaggccg ttgtggcccg 840 gttaccaaac gcattcagca agccttcttc ggcctcttca ctggcgaaac cgaagataaa 900 tggggctggt tagatcaagt taatcaataa 930 <210> 36 <211> 930 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ilvE <400> 36 atgaccacga agaaagctga ttacatttgg ttcaatgggg agatggttcg ctgggaagac 60 gcgaaggtgc atgtgatgtc gcacgcgctg cactatggca cttcggtttt tgaaggcatc 120 cgttgctacg actcgcacaa aggaccggtt gtattccgcc atcgtgagca tatgcagcgt 180 ctgcatgact ccgccaaaat ctatcgcttc ccggtttcgc agagcattga tgagctgatg 240 gaagcttgtc gtgacgtgat ccgcaaaaac aatctcacca gcgcctatat catcccgctg 300 atcttcgtcg gtgatgttgg catgggagta aacccgccag cgggatactc aaccgacgtg 360 attatcgctg ctttcccgtg gggagcgtat ctgggcgcag aagcgctgga gcaggggatc 420 gatgcgatgg tttcctcctg gaaccgcgca gcaccaaaca ccatcccgac ggcggcaaaa 480 gccggtggta actacctctc ttccctgctg gtgggtagcg aagcgcgccg ccacggttat 540 caggaaggta tcgcgctgga tgtgaacggt tatatctctg aaggcgcagg cgaaaacctg 600 tttgaagtga aagatggtgt gctgttcacc ccaccgttca cctcctccgc gctgccgggt 660 attacccgtg atgccatcat caaactggcg aaagagctgg gaattgaagt acgtgagcag 720 gtgctgtcgc gcgaatccct gtacctggcg gatgaagtgt ttatggtggg tacggcggca 780 gaaatcacgc cagtgcgcag cgtagacggt attcaggttg gcgaaggccg ttgtggcccg 840 gttaccaaac gcattcagca agccttcttc ggcctcttca ctggcgaaac cgaagataaa 900 tggggctggt tagatcaagt taatcaataa 930 <210> 37 <211> 436 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ilvA <400> 37 Met Ser Glu Thr Tyr Val Ser Glu Lys Ser Pro Gly Val Met Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ala Glu Leu Ile Arg Ala Ala Asp Ile Gln Thr Ala Gln Ala Arg 20 25 30 Ile Ser Ser Val Ile Ala Pro Thr Pro Leu Gln Tyr Cys Pro Arg Leu 35 40 45 Ser Glu Glu Thr Gly Ala Glu Ile Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln 50 55 60 Asp Val Arg Ser Tyr Lys Ile Arg Gly Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln 65 70 75 80 Leu Thr Gln Glu Gln Arg Asp Ala Gly Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly 85 90 95 Asn His Ala Gln Gly Val Ala Tyr Val Cys Lys Ser Leu Gly Val Gln 100 105 110 Gly Arg Ile Tyr Val Pro Val Gln Thr Pro Lys Gln Lys Arg Asp Arg 115 120 125 Ile Met Val His Gly Gly Glu Phe Val Ser Leu Val Val Thr Gly Asn 130 135 140 Asn Phe Asp Glu Ala Ser Ala Ala Ala His Glu Asp Ala Glu Arg Thr 145 150 155 160 Gly Ala Thr Leu Ile Glu Pro Phe Asp Ala Arg Asn Thr Val Ile Gly 165 170 175 Gln Gly Thr Val Ala Ala Glu Ile Leu Ser Gln Leu Thr Ser Met Gly 180 185 190 Lys Ser Ala Asp His Val Met Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu Leu 195 200 205 Ala Gly Val Val Ser Tyr Met Ala Asp Met Ala Pro Arg Thr Ala Ile 210 215 220 Val Gly Ile Glu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Met Gln Ala Ala Leu His 225 230 235 240 Asn Gly Gly Pro Ile Thr Leu Glu Thr Val Asp Pro Phe Val Asp Gly 245 250 255 Ala Ala Val Lys Arg Val Gly Asp Leu Asn Tyr Thr Ile Val Glu Lys 260 265 270 Asn Gln Gly Arg Val His Met Met Ser Ala Thr Glu Gly Ala Val Cys 275 280 285 Thr Glu Met Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Ile Ile Ala Glu Pro 290 295 300 Ala Gly Ala Leu Ser Ile Ala Gly Leu Lys Glu Met Ser Phe Ala Pro 305 310 315 320 Gly Ser Val Val Val Cys Ile Ile Ser Gly Gly Asn Asn Asp Val Leu 325 330 335 Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Val His Arg Gly Leu Lys 340 345 350 His Tyr Phe Leu Val Asn Phe Pro Gln Lys Pro Gly Gln Leu Arg His 355 360 365 Phe Leu Glu Asp Ile Leu Gly Pro Asp Asp Asp Ile Thr Leu Phe Glu 370 375 380 Tyr Leu Lys Arg Asn Asn Arg Glu Thr Gly Thr Ala Leu Val Gly Ile 385 390 395 400 His Leu Ser Glu Ala Ser Gly Leu Asp Ser Leu Leu Glu Arg Met Glu 405 410 415 Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Arg Leu Glu Pro Gly Thr Pro Glu Tyr 420 425 430 Glu Tyr Leu Thr 435

Claims (13)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 변이체.
  2. 제1항의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  4. 제1항의 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나 이상을 포함하는, 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 미생물은 L-이소류신을 생산하는, 미생물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.)인, 미생물.
  7. 제4항에 있어서. 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
  8. 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 하나 이상을 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-이소류신 생산 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 방법은 상기 배지 또는 미생물로부터 L-이소류신을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, L-이소류신 생산 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.)인, L-이소류신 생산 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 방법은 L-이소류신 생산 시 발생하는 부산물을 감소시키는 것인, L-이소류신 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 부산물은 알파-아미노 부티르산(α-aminobutyrate; AABA), 발린, 페닐알라닌, 및 류신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, L-이소류신 생산 방법.
  13. 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 31번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환, 98번째 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환, 256번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환, 또는 이들의 조합으로 치환된, 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제(Branched-chain amino acid aminotransferase) 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 하나 이상을 포함하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는, L-이소류신 생산용 조성물.
KR1020200173736A 2020-12-11 2020-12-11 신규한 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법 KR102470602B1 (ko)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200173736A KR102470602B1 (ko) 2020-12-11 2020-12-11 신규한 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법
AU2021398494A AU2021398494A1 (en) 2020-12-11 2021-12-03 Novel branched-chain amino acid aminotransferase mutant and isoleucine production method using same
PCT/KR2021/018224 WO2022124708A1 (ko) 2020-12-11 2021-12-03 신규한 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법
CN202180093153.3A CN117321193A (zh) 2020-12-11 2021-12-03 新型支链氨基酸转氨酶变体及使用其生产异亮氨酸的方法
US18/266,500 US20240101977A1 (en) 2020-12-11 2021-12-03 Novel branched-chain amino acid aminotransferase variant and method for producing isoleucine using the same
JP2023535387A JP2023553135A (ja) 2020-12-11 2021-12-03 新規な分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ変異体及びこれを用いたイソロイシン生産方法
EP21903754.6A EP4245849A4 (en) 2020-12-11 2021-12-03 NOVEL MUTANT BRANCHED-CHAIN AMINO ACID AMINOTRANSFERASE AND METHOD FOR PRODUCING ISOLEUCINE USING SAME
BR112023011537A BR112023011537A2 (pt) 2020-12-11 2021-12-03 Nova variante de aminotransferase de aminoácido de cadeia ramificada e método para produzir isoleucina usando a mesma
MX2023006957A MX2023006957A (es) 2020-12-11 2021-12-03 Novedosa variante de aminoacido aminotransferasa de cadena ramificada y procedimiento para la produccion de isoleucina mediante el uso de la misma.
ARP210103428A AR124300A1 (es) 2020-12-11 2021-12-10 Nueva variante de aminoácido aminotransferasa de cadena ramificada y procedimiento para producir isoleucina utilizando la misma

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200173736A KR102470602B1 (ko) 2020-12-11 2020-12-11 신규한 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220083464A KR20220083464A (ko) 2022-06-20
KR102470602B1 true KR102470602B1 (ko) 2022-11-25

Family

ID=81974730

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200173736A KR102470602B1 (ko) 2020-12-11 2020-12-11 신규한 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20240101977A1 (ko)
EP (1) EP4245849A4 (ko)
JP (1) JP2023553135A (ko)
KR (1) KR102470602B1 (ko)
CN (1) CN117321193A (ko)
AR (1) AR124300A1 (ko)
AU (1) AU2021398494A1 (ko)
BR (1) BR112023011537A2 (ko)
MX (1) MX2023006957A (ko)
WO (1) WO2022124708A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4353077A1 (en) 2022-10-14 2024-04-17 Lasemilla Co., Ltd. Osbcat2 gene controlling drought tolerance of plant and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100832740B1 (ko) 2007-01-17 2008-05-27 한국과학기술원 분지쇄 아미노산 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를이용한 분지쇄 아미노산의 제조방법
KR102143964B1 (ko) 2019-12-06 2020-08-12 씨제이제일제당 주식회사 신규한 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 류신 생산방법

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3975470B2 (ja) * 1994-05-30 2007-09-12 味の素株式会社 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法
JPH10237030A (ja) 1997-02-26 1998-09-08 Ajinomoto Co Inc 分岐鎖アミノ酸の精製法
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
KR101335789B1 (ko) 2012-01-13 2013-12-02 씨제이제일제당 (주) Ｌ-이소루신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-이소루신 제조방법
EP2811028B1 (de) 2013-06-03 2017-02-01 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Valin unter Verwendung rekombinanter Corynebakterien enthaltend das durch Propionat induzierbare ilvBN-Operon
KR101632642B1 (ko) 2015-01-29 2016-06-22 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 그의 용도
KR101747542B1 (ko) * 2015-10-23 2017-06-15 씨제이제일제당 (주) L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 l-이소루신을 생산하는 방법
KR101751967B1 (ko) * 2015-10-29 2017-06-30 대상 주식회사 부산물의 생성이 감소된 이소루이신 생산능 변이 균주
ES2907694T3 (es) 2016-08-31 2022-04-26 Cj Cheiljedang Corp Nuevo promotor y uso del mismo
US20200239897A1 (en) * 2017-06-07 2020-07-30 Zymergen Inc. Promoters from corynebacterium glutamicum and uses thereof in regulating ancillary gene expression
KR102011994B1 (ko) 2017-06-30 2019-08-20 씨제이제일제당 주식회사 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법
JP6951291B2 (ja) 2017-11-22 2021-10-20 川崎重工業株式会社 船尾フィンおよびそれを備えた船舶
KR101996769B1 (ko) 2018-12-21 2019-10-01 씨제이제일제당 (주) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법
KR102278000B1 (ko) 2020-03-17 2021-07-15 씨제이제일제당 주식회사 프리페네이트 디하이드라타아제 활성 강화를 통한 l-트립토판을 생산하는 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100832740B1 (ko) 2007-01-17 2008-05-27 한국과학기술원 분지쇄 아미노산 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를이용한 분지쇄 아미노산의 제조방법
KR102143964B1 (ko) 2019-12-06 2020-08-12 씨제이제일제당 주식회사 신규한 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 류신 생산방법

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021398494A9 (en) 2024-09-05
AU2021398494A1 (en) 2023-07-06
WO2022124708A1 (ko) 2022-06-16
AR124300A1 (es) 2023-03-15
CN117321193A (zh) 2023-12-29
BR112023011537A2 (pt) 2023-12-05
JP2023553135A (ja) 2023-12-20
KR20220083464A (ko) 2022-06-20
EP4245849A1 (en) 2023-09-20
US20240101977A1 (en) 2024-03-28
MX2023006957A (es) 2023-06-23
EP4245849A4 (en) 2024-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114402070B (zh) 新的l-苏氨酸脱水酶变体及使用其生产l-异亮氨酸的方法
KR102527096B1 (ko) 프리페네이트 탈수 효소 (Prephenate dehydratase) 변이체 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산 생산 방법
KR102470602B1 (ko) 신규한 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법
KR102147381B1 (ko) 아세토하이드록시산 신타제 신규 변이체 및 이를 포함하는 미생물
EP4321622A1 (en) L-arginine-producing corynebacterium sp. microorganism and l-arginine production method using same
EP4276177A1 (en) Novel citrate synthase variant and method for producing o-acetyl-l-homoserine or l-methionine using same
KR20220069864A (ko) L-글루타민 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-글루타민 생산 방법
KR102464883B1 (ko) 신규한 감마-아미노부티르산 퍼미에이즈 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법
KR102727406B1 (ko) 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법
KR102673796B1 (ko) 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법
RU2826168C1 (ru) Новый вариант гамма-аминобутиратпермеазы и способ получения изолейцина с его использованием
KR102495918B1 (ko) aroG 알돌라아제 (Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase) 변이체 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산 생산 방법
JP7550315B2 (ja) 変異型ａｔｐ依存性プロテアーゼ及びそれを用いたｌ－アミノ酸の生産方法
KR102527102B1 (ko) 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
KR20230045990A (ko) 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법
AU2022260752A1 (en) L-amino-acid-producing corynebacterium sp. microorganism, and method for producing l-amino acids by using same
KR20230094761A (ko) L-이소루신 생산 미생물 및 이를 이용한 l-이소루신 생산 방법
EP4282959A1 (en) Novel citrate synthase variant and method for producing l-amino acids using same
CN114981289A (zh) 新蛋白变体及使用其生产l-赖氨酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant