KR102717732B1 - Compositions for detecting porcine epidemic diarrhea virus and method for detecting porcine epidemic diarrhea virus using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV) 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물 및 진단키트; 및, 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 PEDV 검출용 프라이머 세트를 이용하여 vRT-LAMP법을 수행할 경우, 낮은 시료의 농도만으로도 PEDV만을 특이적으로 검출하는 민감도가 우수하고, 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간이 단축될 뿐만 아니라 항온수조와 같은 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 기존의 RT-PCR 기반 진단법과는 달리 vRT-LAMP 법은 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장에서도 PEDV의 특이적인 진단에 효과적으로 이용할 수 있다. The present invention relates to a primer set for detecting porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), a composition and diagnostic kit for detecting porcine epidemic diarrhea virus comprising the same, and a method for detecting porcine epidemic diarrhea virus using the same.
When the vRT-LAMP method is performed using the primer set for PEDV detection according to the present invention, the sensitivity for specifically detecting only PEDV is excellent even with a low sample concentration, and since gene amplification is performed under isothermal conditions without temperature change, not only is the testing time shortened, but also the reaction is possible with inexpensive equipment such as a constant temperature water bath. Unlike the existing RT-PCR-based diagnostic method, the vRT-LAMP method can be effectively used for the specific diagnosis of PEDV not only in specialized diagnostic laboratories but also in small-scale diagnostic laboratories or on-site diagnostic laboratories that do not have expensive equipment, reagents, and specialized personnel.
Description
본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV) 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물 및 진단키트; 및, 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스의 검출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for detecting porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), a composition and diagnostic kit for detecting porcine epidemic diarrhea virus comprising the same, and a method for detecting porcine epidemic diarrhea virus using the same.
돼지 유행성 설사병(porcine epidemic diarrhea; PED)은 돼지에 감염되는 고전염성의 소화기 질병으로 모든 연령의 돼지에 감염되어 설사 증상을 유발하지만 어린 돼지 특히 어린 포유 자돈에 감염되면 심한 설사와 구토 및 탈수 증상을 나타내며, 100%에 가까운 높은 폐사율을 나타내는 것이 특징이다. Porcine epidemic diarrhea (PED) is a highly contagious digestive disease that infects pigs. It infects pigs of all ages and causes diarrhea, but when it infects young pigs, especially young suckling piglets, it causes severe diarrhea, vomiting, and dehydration, and is characterized by a high mortality rate of close to 100%.
현재 PED는 미국, 캐나다, 멕시코, 유럽 각국과 한국 및 중국을 포함한 대부분의 아시아국가에서 발생하고 있어 세계 양돈 산업에 막대한 경제적 피해를 야기하고 있다 (Lee 와 Lee, 2014; Lin 등, 2014; Mole, 2013; Stevenson 등, 2013; Van Diep 등, 2015; Vlasova 등, 2014). PED의 원인체인 PED 바이러스 (PEDV)는 감염된 돼지의 설사분변을 통하여 대량으로 배설되며, 이러한 설사 분변에 오염된 각종 기구, 차량과 오염물건 또는 설치류 등 야생동물을 통하여 돼지간 또는 농장간에 급속하게 전파 및 확산된다. Currently, PED occurs in the United States, Canada, Mexico, European countries, and most Asian countries including Korea and China, causing enormous economic damage to the global swine industry (Lee and Lee, 2014; Lin et al., 2014; Mole, 2013; Stevenson et al., 2013; Van Diep et al., 2015; Vlasova et al., 2014). The causative agent of PED, PED virus (PEDV), is excreted in large quantities through the diarrheal feces of infected pigs, and is rapidly transmitted and spread between pigs or farms through various equipment, vehicles, and contaminated objects or wild animals such as rodents contaminated with the diarrheal feces.
따라서 PED 발생 농장 및 돼지를 신속하게 찾아내어 조기에 적절한 방역조치를 이행해야 더 큰 피해를 막을 수 있으며, 이를 위해서는 감염된 돼지의 장이나 분변 시료에서 PEDV를 신속, 정확하게 진단할 수 있는 진단법의 개발 및 적용이 PED의 방역에 필수적인 요소이다. Therefore, to prevent further damage, it is necessary to quickly identify farms and pigs where PED has occurred and implement appropriate quarantine measures early. To this end, the development and application of a diagnostic method that can quickly and accurately diagnose PEDV in intestine or fecal samples from infected pigs is an essential element in the quarantine of PED.
현재 임상시료에서 PEDV의 신속, 정확한 진단을 위하여 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction: RT-PCR)이나 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(Real-time RT-PCR; qRT-PCR)과 같은 PCR-기반의 유전자 진단법을 가장 많이 사용하고 있다(Kim 등, 2007; Kim 등, 2001; Miller 등, 2016; Zhao 등, 2014). 그러나 이들 PCR 기반의 진단법들은 증폭된 DNA를 검출하기 위해 정교한 장비, 전문 인력 및 복잡한 절차가 필요하므로 개발도상국과 같은 장비가 부족한 실험실에는 활용하기가 곤란하다. 따라서 PEDV 감염이 의심되는 임상시료에서 PEDV를 높은 민감도와 특이도로 검출할 수 있으며, 기존 PCR 방법에 비해 더 간편하고 신속하면서도 비용-효율적인 새로운 진단법의 개발이 요구되고 있다.Currently, PCR-based genetic diagnostic methods such as reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) or real-time RT-PCR (qRT-PCR) are the most widely used for rapid and accurate diagnosis of PEDV in clinical samples (Kim et al., 2007; Kim et al., 2001; Miller et al., 2016; Zhao et al., 2014). However, these PCR-based diagnostic methods require sophisticated equipment, specialized personnel, and complex procedures to detect the amplified DNA, making them difficult to use in laboratories lacking equipment, such as in developing countries. Therefore, there is a need for the development of a new diagnostic method that can detect PEDV with high sensitivity and specificity in clinical samples suspected of PEDV infection, and that is simpler, faster, and more cost-effective than the existing PCR method.
본 발명의 목적은, 서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및 서열번호 5 내지 8로 이루어진 제3프라이머 세트; 를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus) 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.The purpose of the present invention is to provide a primer set for detecting porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), comprising: a first primer set consisting of sequence numbers 1 and 2; a second primer set consisting of sequence numbers 3 and 4; and a third primer set consisting of sequence numbers 5 to 8.
본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및 서열번호 5 내지 8로 이루어진 제3프라이머 세트; 를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus) 검출용 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition or kit for detecting porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), comprising: a first primer set consisting of sequence numbers 1 and 2; a second primer set consisting of sequence numbers 3 and 4; and a third primer set consisting of sequence numbers 5 to 8.
본 발명의 또 다른 목적은, (a) 시료의 DNA를 추출하는 단계; 및 (b) 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 상기 단계 (a)의 DNA를 주형으로 하는 등온 증폭 반응을 수행함과 동시에 등온 증폭 산물을 검출하는 단계; 를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus) 검출 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), comprising: (a) a step of extracting DNA from a sample; and (b) a step of performing an isothermal amplification reaction using the DNA of step (a) as a template using the primer set of claim 1, while simultaneously detecting an isothermal amplification product.
본 발명은 서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및 서열번호 5 내지 8로 이루어진 제3프라이머 세트; 를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.The present invention provides a primer set for detecting porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), comprising: a first primer set consisting of sequence numbers 1 and 2; a second primer set consisting of sequence numbers 3 and 4; and a third primer set consisting of sequence numbers 5 to 8.
상기 프라이머 세트는 vRT-LAMP(visual Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification)용 또는 프로브 기반의 rLAMP(Probe-based real-time Loop Mediated Isothermal Amplification)용일 수 있다.The above primer set can be for vRT-LAMP (visual Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification) or probe-based rLAMP (Probe-based real-time Loop Mediated Isothermal Amplification).
상기 프라이머 세트는 PEDV의 ORF6(open reading frame 6) 유전자를 표적으로 할 수 있다.The above primer set can target the ORF6 (open reading frame 6) gene of PEDV.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for detecting porcine epidemic diarrhea virus comprising the primer set.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for detecting porcine epidemic diarrhea virus comprising the primer set.
또한, 본 발명은 (a) 시료의 DNA를 추출하는 단계; 및 (b) 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 단계 (a)의 DNA를 주형으로 하는 등온 증폭 반응을 수행함과 동시에 등온 증폭 산물을 검출하는 단계; 를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for detecting porcine epidemic diarrhea virus, comprising: (a) a step of extracting DNA from a sample; and (b) a step of performing an isothermal amplification reaction using the DNA of step (a) as a template using the primer set, while simultaneously detecting an isothermal amplification product.
상기 단계 (a)의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.The sample of the above step (a) may be at least one selected from the group consisting of tissue, blood, saliva, urine, and body fluid.
상기 단계 (b)의 등온 증폭 반응은 56 내지 68℃에서 수행하는 것일 수 있다.The isothermal amplification reaction of the above step (b) may be performed at 56 to 68°C.
상기 단계 (b)의 증폭 반응은 30분 내지 60분 동안 이루어지는 것일 수 있다.The amplification reaction of step (b) above may be carried out for 30 to 60 minutes.
상기 단계 (b)의 등온 증폭 반응은 vRT-LAMP 방법일 수 있다.The isothermal amplification reaction of the above step (b) may be a vRT-LAMP method.
상기 단계 (b)의 검출은 겔 전기영동, 반응산물의 탁도 측정, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 발색 지시제를 이용한 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수행하는 것일 수 있다.The detection of the above step (b) may be performed by at least one selected from the group consisting of gel electrophoresis, turbidity measurement of a reaction product, radioactivity measurement, fluorescence measurement, phosphorescence measurement, and measurement using a colorimetric indicator.
상기 발색 지시제는 칼세인(calcein), 하이드록시나프톨블루(hydroxy naphthol blue, HNB), 페놀레드(phenol red), 크레졸레드(cresol red), 말라키이트 그린(malachite green) 및 메틸 그린(methyl green)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.The above color indicator may be at least one selected from the group consisting of calcein, hydroxy naphthol blue (HNB), phenol red, cresol red, malachite green, and methyl green.
본 발명에 따른 PEDV 검출용 프라이머 세트를 이용하여 vRT-LAMP법을 수행할 경우, 낮은 시료의 농도만으로도 PEDV만을 특이적으로 검출하는 민감도가 우수하고, 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간이 단축될 뿐만 아니라 항온수조와 같은 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 기존의 RT-PCR 기반 진단법과는 달리 vRT-LAMP 법은 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장에서도 PEDV의 특이적인 진단에 효과적으로 이용할 수 있다. When the vRT-LAMP method is performed using the primer set for PEDV detection according to the present invention, the sensitivity for specifically detecting only PEDV is excellent even with a low sample concentration, and since gene amplification is performed under isothermal conditions without temperature change, not only is the testing time shortened, but also the reaction is possible with inexpensive equipment such as a constant temperature water bath. Unlike the existing RT-PCR-based diagnostic method, the vRT-LAMP method can be effectively used for the specific diagnosis of PEDV not only in specialized diagnostic laboratories but also in small-scale diagnostic laboratories or on-site diagnostic laboratories that do not have expensive equipment, reagents, and specialized personnel.
도 1은 본 발명의 vRT-LAMP용 프라이머 세트의 증폭 부위를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법 수행 시, 최적 조건을 확립하기 위하여, 56℃(레인 1), 58℃(레인 2), 60℃(레인 3), 62℃(레인 4), 64℃(레인 5), 66℃(레인 6), 68℃(레인 7) 및 NC(음성대조군)의 반응 온도 범위에서 양성 반응을 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)는 시약 반응, (B)는 PCR 증폭 결과이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법 수행 시, 최적 조건을 확립하기 위하여, 30, 40, 50 및 60분의 반응 시간 범위에서 양성 반응을 확인한 결과를 나타낸 도이다.(레인 1 내지 3 : PEDV의 DNA를 10배수 단계 희석한 것(5×102-0copies).
도 4는 PEDV, 돼지 관련 바이러스에 대하여 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법 수행 시, 특이도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.(레인 1 내지 15는 표 1의 돼지 병원체 각각에 대한 반응)
도 5는 본 발명의 프라이머 세트 중 루프 프라이머를 제외한 vRT-LAMP법(A 및 B), 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법(C 및 D), 다른 서열의 프라이머 세트를 이용한 conventional RT-PCR법(E) 및 real-time RT-PCR법(F)의 수행시, PEDV의 검출 민감도를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (각 레인 1 내지 7 : PEDV의 DNA를 10배수 단계 희석한 것(106-0copies 희석농도)Figure 1 is a diagram showing the amplification region of the primer set for vRT-LAMP of the present invention.
Figure 2 is a diagram showing the results of confirming positive reactions in a reaction temperature range of 56°C (lane 1), 58°C (lane 2), 60°C (lane 3), 62°C (lane 4), 64°C (lane 5), 66°C (lane 6), 68°C (lane 7), and NC (negative control) to establish optimal conditions when performing the vRT-LAMP method using the primer set of the present invention. (A) is the reagent reaction, and (B) is the PCR amplification result.
Figure 3 is a diagram showing the results of confirming positive reactions in the reaction time ranges of 30, 40, 50, and 60 minutes to establish optimal conditions when performing the vRT-LAMP method using the primer set of the present invention. (Lanes 1 to 3: 10-fold step dilution of PEDV DNA (5×10 2-0 copies))
Figure 4 is a diagram showing the results of confirming the specificity when performing the vRT-LAMP method using the primer set of the present invention for PEDV and pig-related viruses. (Lanes 1 to 15 are reactions for each pig pathogen in Table 1)
Figure 5 is a diagram showing the results of confirming the detection sensitivity of PEDV when performing the vRT-LAMP method (A and B) excluding the loop primer among the primer sets of the present invention, the vRT-LAMP method using the primer set of the present invention (C and D), the conventional RT-PCR method (E) using a primer set of a different sequence, and the real-time RT-PCR method (F). (Each lane 1 to 7: 10-fold step dilution of PEDV DNA ( 106-0 copies dilution concentration)
본 발명자는 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV)를 신속하고 정확하게 진단하기 위한 RT-LAMP 진단법에 대한 연구를 진행하던 중, PEDV를 표적으로 하는 프라이머 세트를 제작하고 이를 이용하여 RT-LAMP 방법을 수행한 결과, 낮은 농도에서도 PEDV 만을 검출하여 민감도가 높고, 돼지에서 발생하는 다른 병원체를 제외하고 오직 PEDV 만을 검출하는 특이도가 우수함을 확인하였다. 또한, 금속 색깔 지시제인 HNB를 적용하여 별도의 판독기 없이도 반응 결과를 육안으로 바로 확인 가능하여 오염 가능성이 낮은 특징이 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.The present inventors, while conducting research on an RT-LAMP diagnostic method for rapid and accurate diagnosis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), created a primer set targeting PEDV and performed an RT-LAMP method using the same, confirming that the method has high sensitivity by detecting only PEDV even at low concentrations and excellent specificity by detecting only PEDV while excluding other pathogens occurring in pigs. In addition, by applying HNB, a metal color indicator, the reaction results can be confirmed with the naked eye without a separate reader, thereby confirming that there is a low possibility of contamination, thereby completing the present invention.
본 발명은 서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및 서열번호 5 내지 8로 이루어진 제3프라이머 세트; 를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus) 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for detecting porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), comprising: a first primer set consisting of sequence numbers 1 and 2; a second primer set consisting of sequence numbers 3 and 4; and a third primer set consisting of sequence numbers 5 to 8.
본 발명에 있어서, "PEDV"는 Coronaviridae과에 속하며 외피를 보유한 단일 가닥의 정방향 RNA 바이러스이다. PEDV는 1970년대 초반 유럽에서 최초로 발견되었다. 그 이후로 질병은 다른 유럽이나 아시아 국가들에서 보고되었고, 더욱 심한 유행병으로 일본, 중국, 한국, 필리핀, 태국, 대만 그리고 베트남을 포함하는 아시아 국가들에서 주요하게 발생되고 있다.In the present invention, "PEDV" is a single-stranded positive RNA virus belonging to the Coronaviridae family and has an envelope. PEDV was first discovered in Europe in the early 1970s. Since then, the disease has been reported in other European and Asian countries, and more severe epidemics are occurring mainly in Asian countries including Japan, China, Korea, the Philippines, Thailand, Taiwan, and Vietnam.
본 발명에 있어서, “검출”은 화학 분석에서, 시료 속에 화학종이나 미생물 따위의 존재 유무를 알아내는 것으로, 본 발명에서는 PEDV를 검출하는 것을 의미한다.In the present invention, “detection” means, in chemical analysis, finding out the presence or absence of chemical species or microorganisms in a sample, and in the present invention, means detecting PEDV.
본 발명에 있어서, “프라이머”는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. In the present invention, “primer” refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be amplified, and can act as an initiation point for the synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primer should allow for the initiation of synthesis of an extension product. The specific length and sequence of the primer will depend on the complexity of the desired DNA or RNA target as well as the primer utilization conditions, such as temperature and ionic strength.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.In the present invention, the oligonucleotide used as a primer may include a nucleotide analogue, for example, phosphorothioate, alkyl phosphorothioate or peptide nucleic acid, or may include an intercalating agent.
본 발명의 구체예에서, 상기 제1 프라이머 세트는 2종의 외부 프라이머 N-F3(Forward, 서열번호 1) 및 N-B3((Backward, 서열번호 2)로 구성되고, 상기 제2 프라이머 세트는 2종의 루프(loop) 프라이머 N-LF(Forward loop primer, 서열번호 3) 및 N-LB(Backward loop primer, 서열번호 4)로 구성되고, 상기 제3 프라이머 세트는 2종의 내부 프라이머 N-FIP((Forward inner primer) 및 N-BIP(Backward inner primer)로 구성된다. 상기 내부 프라이머 N-FIP는 N-F1c(서열번호 5) 및 N-F2(서열번호 6)로 구성되고, N-BIP는 N-B1c(서열번호 7) 및 N-B2(서열번호 8)로 구성된다.In a specific embodiment of the present invention, the first primer set is composed of two types of outer primers N-F3 (Forward, SEQ ID NO: 1) and N-B3 (Backward, SEQ ID NO: 2), the second primer set is composed of two types of loop primers N-LF (Forward loop primer, SEQ ID NO: 3) and N-LB (Backward loop primer, SEQ ID NO: 4), and the third primer set is composed of two types of inner primers N-FIP (Forward inner primer) and N-BIP (Backward inner primer). The inner primer N-FIP is composed of N-F1c (SEQ ID NO: 5) and N-F2 (SEQ ID NO: 6), and N-BIP is composed of N-B1c (SEQ ID NO: 7) and N-B2 (SEQ ID NO: 8).
상기 3쌍의 프라이머 세트는 vRT-LAMP(visual Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification)용 또는 프로브 기반의 rLAMP(Probe-based real-time Loop Mediated Isothermal Amplification)용인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 vRT-LAMP용이나, 이에 제한되는 것은 아니다.The above three pairs of primer sets are preferably for vRT-LAMP (visual Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification) or probe-based rLAMP (Probe-based real-time Loop Mediated Isothermal Amplification), more preferably for vRT-LAMP, but are not limited thereto.
본 발명에 있어서, "RT-LAMP(Reverse Transcription-Loop Mediated Isothermal Amplification)"는 박테리아 또는 바이러스로 야기된 질병을 진단하고, PCR법의 단점을 보완한 진단법으로, RT-PCR법과는 달리 일정한 온도(등온)에서 어닐링(annealing) 및 신장(extension)이 가능하여 온도조절장치가 필요하지 않으며, 일정한 온도조건에서 유전자를 증폭할 수 있다. 또한 신속성, 특이성 및 검출 감도가 높아 1시간 이내에 109 copy의 유전자를 증폭시킬 수 있다. In the present invention, "RT-LAMP (Reverse Transcription-Loop Mediated Isothermal Amplification)" is a diagnostic method that diagnoses diseases caused by bacteria or viruses and complements the shortcomings of the PCR method. Unlike the RT-PCR method, it enables annealing and extension at a constant temperature (isotherm), so a temperature control device is not required, and genes can be amplified under constant temperature conditions. In addition, it has high speed, specificity, and detection sensitivity, so 10 9 copies of genes can be amplified within 1 hour.
RT-LAMP 기법은 기존의 PCR 기반 진단법에서 사용되는 Taq DNA polymerase와 달리 목표유전자를 가닥 변위(strand displacement) 방식에 의해 대량 증폭할 수 있는 Bst DNA 중합효소를 이용함으로써 유전자 증폭효율이 월등하게 높다. The RT-LAMP technique has a much higher gene amplification efficiency by using Bst DNA polymerase, which can mass amplify target genes through strand displacement, unlike Taq DNA polymerase used in conventional PCR-based diagnostic methods.
또한 기존의 PCR 기반 진단법과는 달리 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간이 단축될 뿐만 아니라 항온수조와 같은 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 따라서 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장 진단용 등으로 이용 가능하다. 또한 프로브 세트를 추가하여 실시간 LAMP을 수행할 수 있으며, 증폭산물 검출은 실시간 형광검출 장비를 이용하고, 병원체의 양에 따라 유전자 증폭량을 실시간으로 확인할 수 있다.In addition, unlike the existing PCR-based diagnostic method, since gene amplification is performed under isothermal conditions without temperature change, not only is the testing time shortened, but also the reaction is possible with low-cost equipment such as a constant temperature water bath. Therefore, it can be used not only in specialized diagnostic laboratories, but also in small-scale diagnostic laboratories that do not have expensive equipment, reagents, and professional personnel, or for field diagnostics. In addition, real-time LAMP can be performed by adding a probe set, and the amplification product can be detected using real-time fluorescence detection equipment, and the amount of gene amplification can be confirmed in real time depending on the amount of pathogen.
본 발명의 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 PEDV의 ORF6(open reading frame 6) 유전자를 표적으로 하는 것이 바람직하다. In a specific embodiment of the present invention, it is preferable that the primer set targets the ORF6 (open reading frame 6) gene of PEDV.
본 발명에 있어서, ORF(open reading frame)는 아미노산의 서열로 번역되는 DNA 염기서열을 의미한다. 즉, 번역개시코돈(start codon; ATG)에서 정지코돈(stop codon; TGA, TAA, TAG)에 이르는 염기서열을 의미한다. PEDV의 S(Spike) 유전자보다 변이가 적은 ORFs 유전자를 표적으로 할 때 바이러스의 검출을 보다 안정적으로 유도할 수 있으며, 그 중 ORF6를 표적으로 할 때 다른 돼지 병원체를 구분하여 돼지 유행성 설사병 바이러스의 검출 특이도가 우수하게 나타났다.In the present invention, ORF (open reading frame) refers to a DNA base sequence that is translated into an amino acid sequence. That is, it refers to a base sequence from a translation initiation codon (start codon; ATG) to a stop codon (TGA, TAA, TAG). When targeting an ORFs gene with less mutation than the S (Spike) gene of PEDV, detection of the virus can be induced more stably, and among them, when targeting ORF6, the detection specificity of porcine epidemic diarrhea virus was excellent by distinguishing other porcine pathogens.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물; 및 상기 조성물을 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 키트;를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for detecting porcine epidemic diarrhea virus comprising the primer set; and a kit for detecting porcine epidemic diarrhea virus comprising the composition.
본 발명의 PEDV 검출용 조성물은 통상적으로 PEDV의 검출에 사용되는 공지의 구성을 더 포함할 수 있다. The composition for detecting PEDV of the present invention may further include a known component commonly used for detecting PEDV.
본 발명의 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.The kit of the present invention may include reagents for performing an amplification reaction. In addition, the kit of the present invention may additionally include a user guide describing optimal reaction performance conditions. The guide is a printed matter that explains how to use the kit, for example, a method for preparing a PCR buffer, suggested reaction conditions, etc. The guide includes a guide booklet in the form of a pamphlet or leaflet, a label attached to the kit, and a description on the surface of a package containing the kit. In addition, the guide includes information that is disclosed or provided through an electronic medium such as the Internet.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 시료의 DNA를 추출하는 단계; 및 (b) 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 단계 (a)의 DNA를 주형으로 하는 등온 증폭 반응을 수행함과 동시에 등온 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for detecting porcine epidemic diarrhea virus, comprising the steps of: (a) extracting DNA from a sample; and (b) performing an isothermal amplification reaction using the DNA of step (a) as a template using the primer set, while simultaneously detecting an isothermal amplification product.
상기 단계 (a)의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이나, 이에 제한되지 않는다.The sample of step (a) above is at least one selected from the group consisting of tissue, blood, saliva, urine, and body fluid, but is not limited thereto.
본 발명의 구체예에서, PEDV 검출에 적합한 최적 vRT-LAMP 반응 조건을 확립하기 위하여 표준 RNA를 이용하여 반응온도(56-68 ℃)와 반응시간 (30-60 분)을 달리하여 vRT-LAMP를 실시한 결과 vRT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상은 육안으로는 60, 62, 64 및 66 ℃에서 연청색(sky blue)의 HNB 특유 양성 색상이 관찰되었으며, 62 ℃의 반응 온도에서 특유의 사다리꼴 모양의 양성밴드가 가장 뚜렷하게 나타났다. 40 분간 반응시켰을 때 민감도 한계 값인 5×101 copy/μL의 양성 밴드가 뚜렷하게 관찰됨을 확인하였다. In a specific example of the present invention, in order to establish the optimal vRT-LAMP reaction conditions suitable for PEDV detection, vRT-LAMP was performed by varying the reaction temperature (56-68 °C) and reaction time (30-60 minutes) using standard RNA. As a result, the color of the reaction solution in the tube where the vRT-LAMP reaction was completed was observed as a sky blue HNB-specific positive color at 60, 62, 64, and 66 °C with the naked eye, and a characteristic trapezoidal positive band was most distinct at the reaction temperature of 62 °C. When the reaction was performed for 40 minutes, it was confirmed that a positive band of 5 × 10 1 copies/μL, which is the sensitivity limit value, was distinctly observed.
따라서, 상기 단계 (b)의 등온 증폭 반응은 56 내지 68℃에서 수행하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 60 내지 66℃, 더욱 바람직하게는 62℃일 수 있다.Therefore, the isothermal amplification reaction of step (b) is preferably performed at 56 to 68°C, more preferably 60 to 66°C, and even more preferably 62°C.
또한, 상기 단계 (b)의 증폭 반응은 30분 내지 60분 동안 이루어지는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 40분일 수 있다.In addition, the amplification reaction of step (b) is preferably performed for 30 to 60 minutes, and more preferably for 40 minutes.
본 발명의 구체예에서, 상기 (b) 단계의 등온 증폭 반응은 vRT-LAMP(visual Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification) 또는 프로브 기반 rLAMP(Probe-based real-time Loop Mediated Isothermal Amplification)일 수 있고, 바람직하게는 vRT-LAMP 법이나, 당업계에서 일반적으로 사용되는 등온 증폭 반응이라면 제한 없이 적용 가능하다.In a specific embodiment of the present invention, the isothermal amplification reaction of step (b) may be vRT-LAMP (visual Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification) or probe-based rLAMP (Probe-based real-time Loop Mediated Isothermal Amplification), and preferably, the vRT-LAMP method or any isothermal amplification reaction generally used in the art may be applied without limitation.
본 발명의 "vRT-LAMP"는 전술한 바와 같다. The "vRT-LAMP" of the present invention is as described above.
상기 단계 (b)의 검출은 겔 전기영동, 반응산물의 탁도 측정, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 발색지시제를 이용한 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수행하는 것일 수 있다.The detection of the above step (b) may be performed by at least one selected from the group consisting of gel electrophoresis, turbidity measurement of a reaction product, radioactivity measurement, fluorescence measurement, phosphorescence measurement, and measurement using a colorimetric indicator.
구체적으로, 상기 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 젤 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 상기 반응산물의 탁도 측정법은 LAMP 반응 양성반응 시에 생성되는 피로인산 마그네슘(magnesium pyrophosphate) 침전물에 의해 반응산물의 탁도가 증가하는 현상을 이용한 측정방법으로 육안 관찰 또는 탁도계를 이용하여 실시간으로 탁도를 측정할 수 있는 방법을 의미할 수 있다. 또한 상기 형광측정에는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 형광 염색 물질을 적용할 수 있으며 바람직하게는 SYTO 9과 SYBR Green I, Quant-iT PicoGreen, GeneFinder, Ethdium bromide, 더욱 바람직하게는 SYTO 9과 SYBR Green I을 사용할 수 있다. 기 형광 염색 물질은 이중가닥에 선택적으로 결합하는 특성을 이용하여 추가적 실험을 필요로 하지 않고도 결과의 여부를 판독할 수 있도록 첨가한 물질일 수 있으며 특히, 상기 SYTO 9과 SYBR 그린I은 RT-LAMP 생성물에 삽입되어 자연광에서 혹은 자외선 조사 시 녹색의 형광을 발현하는 물질을 의미한다. Specifically, the gel electrophoresis may utilize agarose gel electrophoresis or acrylamide gel electrophoresis depending on the size of the amplification product. The turbidity measurement method of the reaction product is a measurement method that utilizes the phenomenon in which the turbidity of the reaction product increases due to magnesium pyrophosphate precipitate generated when the LAMP reaction is positive, and may mean a method that can measure turbidity in real time using visual observation or a turbidimeter. In addition, the fluorescence measurement can apply a fluorescent dye generally used in the relevant field, and preferably SYTO 9 and SYBR Green I, Quant-iT PicoGreen, GeneFinder, Ethdium bromide, and more preferably SYTO 9 and SYBR Green I can be used. The fluorescent dye may be a substance added so that the result can be read without the need for additional experiments by utilizing the characteristic of selectively binding to double strands, and in particular, the SYTO 9 and SYBR Green I refer to substances that are inserted into the RT-LAMP product and exhibit green fluorescence under natural light or when irradiated with ultraviolet rays.
예컨대 돼지 유행성 설사병 바이러스 핵산을 검출 방법을 이용하여 vRT-LAMP법으로 증폭시키고, 증폭된 LAMP 생성물에 상기 SYTO 9이나 SYBR Green I을 첨가하면 녹색 형광을 나타내게 된다. 따라서 상기 형광 측정방법을 이용하면 전기영동 등 별도의 추가적인 실험을 거치지 않고도, 형광을 인지함에 따라 돼지 유행성 설사병 바이러스에 감염된 것을 파악할 수 있다. 즉, 녹색 형광을 나타내지 않으면 비감염을 의미하므로 시료가 돼지 유행성 설사병 바이러스에 감염되었는지에 여부를 고감도로 신속하게 육안으로 확인할 수 있다. For example, when the porcine epidemic diarrhea virus nucleic acid is amplified by the vRT-LAMP method using a detection method and the SYTO 9 or SYBR Green I is added to the amplified LAMP product, green fluorescence is exhibited. Therefore, by using the fluorescence measurement method, infection with the porcine epidemic diarrhea virus can be determined by recognizing fluorescence without performing additional experiments such as electrophoresis. That is, since the absence of green fluorescence indicates non-infection, it is possible to quickly and sensitively confirm with the naked eye whether a sample is infected with the porcine epidemic diarrhea virus.
또한, 상기 발색 지시제(colorimetric indicator) 측정 방법에서 발색 지시제로는 칼세인(calcein), 하이드록시나프톨블루(hydroxy naphthol blue, HNB), 페놀레드(phenol red), 크레졸레드(cresol red), 말라키이트 그린(malachite green), 메틸 그린(methyl green) 등을 사용할 수 있으나 바람직하게는 HNB를 사용할 수 있다. In addition, in the colorimetric indicator measuring method, calcein, hydroxy naphthol blue (HNB), phenol red, cresol red, malachite green, methyl green, etc. can be used as the colorimetric indicator, but HNB can be preferably used.
상기 발색지시제를 첨가할 경우 LAMP 증폭 과정 중에 생성된 반응산물(pyrophosphate, Mg2+)에 의해 반응액의 색깔이 오렌지색 또는 청색으로 변화되는 특성을 이용하여 검출할 수 있는 바, 추가적 실험을 거치지 않고도 검출 여부를 신속하게 판독할 수 있다. 또한 상기 HNB는 증폭 이전의 반응액에 미리 첨가하여 반응을 진행할 수 있다. HNB를 증폭 이전의 반응액에 혼합하면, 반응튜브를 개봉하지 않고도 반응 결과의 확인이 가능하기 때문에, 반응 후에 염색액을 첨가해주어야 하는 방법에 비해 교차오염을 방지할 수 있는 장점이 있다.When the above color indicator is added, the color of the reaction solution changes to orange or blue due to the reaction product (pyrophosphate, Mg 2+ ) generated during the LAMP amplification process, which can be used for detection, so that detection can be quickly determined without additional experiments. In addition, the HNB can be added to the reaction solution before amplification to proceed with the reaction. If HNB is mixed into the reaction solution before amplification, the reaction result can be confirmed without opening the reaction tube, so there is an advantage in preventing cross-contamination compared to the method where the dye solution must be added after the reaction.
본 발명에서는, PEDV의 ORF6 유전자를 표적으로 하여, 돼지 유행성 설사병 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였다. 구체적으로, 3쌍의 프라이머 세트를 제작하고, 2종의 외부 프라이머 N-F3(Forward, 서열번호 1) 및 N-B3((Backward, 서열번호 2)로 구성된 제1 프라이머 세트, 2종의 루프(loop) 프라이머 N-LF(Forward loop primer, 서열번호 3) 및 N-LB(Backward loop primer, 서열번호 4)로 구성된 제2 프라이머 세트, 2종의 내부 프라이머 N-FIP((Forward inner primer) 및 N-BIP(Backward inner primer)로 구성된 제3 프라이머 세트를 제작하였다. 상기 내부 프라이머 N-FIP는 N-F1c(서열번호 5) 및 N-F2(서열번호 6)로 구성되고, N-BIP는 N-B1c(서열번호 7) 및 N-B2(서열번호 8)로 구성된다.In the present invention, a primer set capable of detecting porcine epidemic diarrhea virus was produced targeting the ORF6 gene of PEDV. Specifically, three pairs of primer sets were produced, and a first primer set composed of two external primers N-F3 (Forward, SEQ ID NO: 1) and N-B3 (Backward, SEQ ID NO: 2), a second primer set composed of two loop primers N-LF (Forward loop primer, SEQ ID NO: 3) and N-LB (Backward loop primer, SEQ ID NO: 4), and a third primer set composed of two internal primers N-FIP (Forward inner primer) and N-BIP (Backward inner primer) were produced. The internal primer N-FIP is composed of N-F1c (SEQ ID NO: 5) and N-F2 (SEQ ID NO: 6), and N-BIP is composed of N-B1c (SEQ ID NO: 7) and N-B2 (SEQ ID NO: 8).
상기 프라이머 세트를 이용하여 vLAMP의 최적 반응 조건을 확립한 결과, vRT-LAMP법은 62℃의 일정한 온도 조건으로 1시간 이내에(40분) PEDV를 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 vRT-LAMP 수행 시, 낮은 농도의 시료만으로도 PEDV를 검출할 수 있어 민감도가 높고, 돼지에서 발생하는 다른 병원체를 제외하고 오직 PEDV만을 검출하는 특이도가 우수하다. As a result of establishing the optimal reaction conditions of vLAMP using the above primer set, it was confirmed that the vRT-LAMP method can detect PEDV within 1 hour (40 minutes) under a constant temperature condition of 62℃. In addition, when performing vRT-LAMP using the primer set of the present invention, PEDV can be detected even with a low concentration sample, so the sensitivity is high, and the specificity is excellent in detecting only PEDV while excluding other pathogens occurring in pigs.
또한, 야외 시료에 대한 검출 효율이 기존의 conventional PCR 및 Real-time PCR에 비하여 우수함을 확인하였다. 따라서, 기존의 PCR 기반 진단법과는 달리 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간이 단축될 뿐만 아니라 실시간으로 반응산물을 확인할 수 있다. 따라서, 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장에서 PEDV의 검출에 효과적으로 이용할 수 있다. In addition, it was confirmed that the detection efficiency for outdoor samples was superior to that of conventional PCR and Real-time PCR. Therefore, unlike conventional PCR-based diagnostic methods, since gene amplification is performed under isothermal conditions without temperature change, not only is the testing time shortened, but the reaction product can be confirmed in real time. Therefore, it can be effectively used for the detection of PEDV in small-scale diagnostic laboratories or on-site diagnostic laboratories that do not have expensive equipment, reagents, and professional personnel, as well as specialized diagnostic laboratories.
본 발명을 설명함에 있어서, 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.In describing the present invention, redundant contents are omitted in consideration of the complexity of this specification, and terms not otherwise defined in this specification have meanings commonly used in the technical field to which the present invention belongs.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. It will be apparent to those skilled in the art that these examples are intended only to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예 1. PEDV의 핵산 추출Example 1. Nucleic acid extraction of PEDV
표준 양성 바이러스는 돼지 유행성 설사 바이러스(이하 PEDV)의 분리주(KNU141112)를 이용하였으며, 표준유전자는 ORF6 전체 유전자가 포함되도록 시판 클로닝 키트(pTOPcloner™ TA Core Kit, Enzynomics, Korea)에 포함된 pTOP TA V2 벡터에 클로닝하여 표준 유전자로 사용하였으며, 음성 대조군은 PEDV 음성이 확인된 돼지 신장세포(PK-15)와 아프리카 초록원숭이 신장세포(Vero)를 사용하였다. The standard positive virus used was an isolate (KNU141112) of porcine epidemic diarrhea virus (hereinafter referred to as PEDV), and the standard gene was cloned into the pTOP TA V2 vector included in a commercial cloning kit (pTOPcloner™ TA Core Kit, Enzynomics, Korea) so that the entire ORF6 gene was included and used as a standard gene. As a negative control, porcine kidney cells (PK-15) and African green monkey kidney cells (Vero) confirmed to be PEDV negative were used.
야외시료는 양돈장의 질병이 있는 돼지로부터 조직(소장) 55점 및 분변 94점을 채취하여 실험에 이용하였다. 분변시료는 3,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 채취한 다음, -20℃에 보관하여 이용하였고, 조직시료는 세절하여 PBS로 10% 유제액을 만든 다음, 조직균질기(Bertin technologies, France)을 사용하여 파쇄하였다. 이후, 8,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 채취한 다음, -20℃에 보관하였다. Field samples were collected from diseased pigs in a pig farm, and 55 tissues (small intestine) and 94 feces were used in the experiment. The fecal samples were centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes to collect the supernatant, and then stored at -20℃ for use. The tissue samples were minced, made into a 10% emulsion with PBS, and then pulverized using a tissue homogenizer (Bertin technologies, France). After that, the supernatant was collected by centrifuging at 8,000 rpm for 10 minutes, and then stored at -20℃.
또한, LAMP 및 PCR을 위한 핵산 추출은 실험 당일 보관 혈청 및 조직시료로부터 시판 자동 핵산 추출키트(TAN Bead, Taiwan)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 병원체, 이의 분리주 및 이의 제공처를 표 1에 나타내었다.In addition, nucleic acid extraction for LAMP and PCR was performed by extracting RNA from stored serum and tissue samples on the day of the experiment using a commercially available automated nucleic acid extraction kit (TAN Bead, Taiwan). Pathogens, their isolates, and their sources are shown in Table 1.
(Porcine epidemic diarrhea virus)porcine epidemic diarrhea virus
(Porcine epidemic diarrhea virus)
(Porcine epidemic diarrhea virus)porcine epidemic diarrhea virus
(Porcine epidemic diarrhea virus)
(Porcine epidemic diarrhea virus)porcine epidemic diarrhea virus
(Porcine epidemic diarrhea virus)
(Porcine epidemic diarrhea virus)porcine epidemic diarrhea virus
(Porcine epidemic diarrhea virus)
(Transmissible gastroenteritis virus)Infectious gastroenteritis virus
(Transmissible gastroenteritis virus)
(Porcine delta coronavirus)Swine Delta Coronavirus
(Porcine delta coronavirus)
(Porcine rotavirus)Porcine rotavirus
(Porcine rotavirus)
(Porcine circovirus type 2)Porcine circovirus type 2
(Porcine circovirus type 2)
(PRRS virus, genotype 1)Porcine reproductive and respiratory syndrome virus genotype 1
(PRRS virus, genotype 1)
(PRRS virus, genotype 2)Porcine reproductive and respiratory syndrome virus genotype 2
(PRRS virus, genotype 2)
(Classical swine fever virus)swine cholera virus
(Classical swine fever virus)
(Swine influenza virus)swine influenza virus
(Swine influenza virus)
(Porcine parvovirus)porcine parvovirus
(Porcine parvovirus)
실시예 2. vRT-LAMP용 프라이머 설계Example 2. Primer design for vRT-LAMP
vRT-LAMP법을 이용하여 PEDV를 검출하기 위한 프라이머 세트를 설계하였다. A primer set was designed to detect PEDV using the vRT-LAMP method.
구체적으로, PEDV KNU141112 바이러스주의 유전자 염기서열(GenBank accession number KR873431)을 표준으로 하여 기 보고된 서로 다른 PEDV 유전자 그룹의 오픈 리딩 프레임 6(ORF6, open reading frame 6) 유전자 염기서열 정보를 확보하여 BioEdit Sequence Alignment Editor program (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/ bioedit.html) 프로그램으로 비교 분석하고 가장 안정적인 부위를 선발하였다.Specifically, using the gene base sequence of the PEDV KNU141112 virus strain (GenBank accession number KR873431) as a standard, the open reading frame 6 (ORF6) gene sequence information of different PEDV gene groups previously reported was obtained and compared and analyzed using the BioEdit Sequence Alignment Editor program (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/ bioedit.html) to select the most stable region.
그 다음, LAMP용 프라이머 설계 프로그램인 프라이머-익스플로러 V5 소프트웨어(Primer-Explorer V5 software; Fujitsu System Solutions Ltd., Japan)를 이용하여 2종의 외부 프라이머 N-F3(Forward) 및 N-B3((Backward), 2종의 루프(loop) 프라이머 N-LF(Forward loop primer) 및 N-LB(Backward loop primer) 그리고 2종의 내부 프라이머 N-FIP((Forward inner primer) 및 N-BIP(Backward inner primer)를 설계하고 프라이머 제조업체(Bionics, Korea)에 의뢰하여 합성하였다. 2종의 내부 프라이머 N-FIP는 N-F1c 및 N-F2로 구성되고, N-BIP는 N-B1c 및 N-B2로 구성된다.Next, using Primer-Explorer V5 software (Fujitsu System Solutions Ltd., Japan), a primer design program for LAMP, two outer primers N-F3 (Forward) and N-B3 (Backward), two loop primers N-LF (Forward loop primer) and N-LB (Backward loop primer), and two inner primers N-FIP (Forward inner primer) and N-BIP (Backward inner primer) were designed and synthesized by a primer manufacturer (Bionics, Korea). The two inner primers N-FIP are composed of N-F1c and N-F2, and N-BIP is composed of N-B1c and N-B2.
설계된 프라이머 세트의 부위 및 구체적인 서열을 도 1 및 표 2에 나타내었다.The regions and specific sequences of the designed primer sets are shown in Figure 1 and Table 2.
(외부 프라이머)1st primer set
(External primer)
(루프 프라이머)2nd primer set
(loop primer)
(내부 프라이머)
3rd primer set
(Inner primer)
실시예 3. vRT-LAMP법 수행 시 최적 반응조건 확립Example 3. Establishment of optimal reaction conditions when performing the vRT-LAMP method
상기 실시예 2에서 제작한 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법의 최적 반응조건을 확립하였다.The optimal reaction conditions for the vRT-LAMP method using the primer set produced in Example 2 above were established.
구체적으로, RT-LAMP를 수행하기 위한 반응액의 조성은 8 unit의 Bst DNA 중합효소(NEW England Biolabs, USA), 10 U /μL AMV 역전사 효소(Promega), 0.8 M 베타인(Sigma-Aldrich, USA), 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM 염화칼륨, 8 mM 황산마그네슘, 10 mM 황산암모늄, 0.1 % 트리톤 X-100, 1.4 mM의 dNTPs, 0.12 mM HNB(Lemongreen, Shanghai, China), 서열번호 1 및 2의 제 1프라이머 세트 각각 2.5 pmol, 서열번호 3 및 4의 제2 프라이머 세트 각각 10 pmol, 서열번호 5 내지 8의 제3 프라이머 세트 각각 20 pmol 첨가하여 제조하였다.Specifically, the composition of the reaction solution for performing RT-LAMP was prepared by adding 8 units of Bst DNA polymerase (NEW England Biolabs, USA), 10 U /μL AMV reverse transcriptase (Promega), 0.8 M betaine (Sigma-Aldrich, USA), 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM potassium chloride, 8 mM magnesium sulfate, 10 mM ammonium sulfate, 0.1% Triton X-100, 1.4 mM dNTPs, 0.12 mM HNB (Lemongreen, Shanghai, China), 2.5 pmol each of the first primer set of SEQ ID NOs: 1 and 2, 10 pmol each of the second primer set of SEQ ID NOs: 3 and 4, and 20 pmol each of the third primer set of SEQ ID NOs: 5 to 8.
제조한 반응액에 상기 실시예 1에서 추출한 RNA 시료 5μL를 첨가한 다음, 멸균 증류수로 최종 용량을 25μL로 조절하였다. PEDV 검출에 적합한 최적 vRT-LAMP 조건을 확립하기 위하여 표준 RNA를 이용하여 반응온도(56-68 ℃)와 반응시간 (30-60 분)을 달리하여 vRT-LAMP를 실시한 다음, 80 ℃에서 5 분간 처리하여 반응액 내의 효소 활성을 제거하였다. 5 μL of the RNA sample extracted in Example 1 was added to the prepared reaction solution, and the final volume was adjusted to 25 μL with sterile distilled water. In order to establish the optimal vRT-LAMP conditions suitable for PEDV detection, vRT-LAMP was performed using standard RNA at different reaction temperatures (56-68 °C) and reaction times (30-60 minutes), and then the enzyme activity in the reaction solution was removed by treating it at 80 °C for 5 minutes.
반응이 끝난 튜브의 반응액을 육안으로 관찰하여 색깔 변화를 관찰하여 양성 여부를 판독하였다(도 2 및 3의 (A)). The reaction solution in the tube where the reaction was completed was visually observed to determine whether it was positive or not by observing the color change ((A) of Figures 2 and 3).
또한, 동시에 2.0 % 아가로스 겔에 전기영동을 실시한 다음, 자외선판독기(Bio-Rad, USA)를 이용하여 LAMP 반응에서 특이적으로 나타나는 사다리 모양의 증폭 유전자 밴드를 확인하여 양성 여부를 판정하였다(도 2 및 3의 (B)). In addition, electrophoresis was performed on a 2.0% agarose gel at the same time, and then a ladder-shaped amplified gene band specifically appearing in the LAMP reaction was confirmed using an ultraviolet reader (Bio-Rad, USA) to determine whether it was positive or not (Figs. 2 and 3 (B)).
도 2는 53∼66℃의 반응 온도 조건에서 실시된 vRT-LAMP법의 양성 반응을 확인한 결과를 나타낸 것이다. Figure 2 shows the results of confirming the positive reaction of the vRT-LAMP method performed under reaction temperature conditions of 53 to 66°C.
도 2(A)를 참고하면, vRT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상은 육안으로는 60, 62, 64 및 66 ℃에서 연청색(sky blue)의 HNB 특유 양성 색상이 관찰되었다. 도 2(B)를 참고하면, 레인 4의 62 ℃의 반응 온도에서 특유의 사다리꼴 모양의 양성밴드가 가장 뚜렷하게 나타났다.Referring to Fig. 2(A), the color of the reaction solution in the tube where the vRT-LAMP reaction was completed was observed to be a sky blue HNB-specific positive color at 60, 62, 64, and 66°C with the naked eye. Referring to Fig. 2(B), a characteristic trapezoidal positive band was most distinct at the reaction temperature of 62°C in Lane 4.
도 3은 30, 40, 50 및 60분 조건의 반응시간으로 양성 반응을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 3(A)의 레인 1 내지 3은 PEDV의 RNA를 10배수 단계 희석함(5×102-0 copies)을 나타낸다.Figure 3 shows the results of confirming positive reactions with reaction times of 30, 40, 50, and 60 minutes. Lanes 1 to 3 of Figure 3(A) show 10-fold step dilutions of PEDV RNA (5×10 2-0 copies).
도 3(B)를 참고하면, 40 분간 반응시켰을 때 민감도 한계 값인 5×101 copy/μL의 양성 밴드가 뚜렷하게 관찰됨을 확인하였다. Referring to Figure 3(B), it was confirmed that a positive band of 5×10 1 copy/μL, which is the sensitivity limit, was clearly observed when reacting for 40 minutes.
따라서, 이후의 모든 vRT-LAMP 실험은 62 ℃의 반응온도와 40 분의 반응시간으로 최적 반응조건을 고정하여 실시하였다.Therefore, all subsequent vRT-LAMP experiments were performed under optimal reaction conditions fixed at a reaction temperature of 62 °C and a reaction time of 40 min.
실시예 4. vRT-LAMP법 수행 시 PEDV 검출 특이도 분석Example 4. Analysis of PEDV detection specificity when performing vRT-LAMP method
상기 표 2의 프라이머 세트를 이용하여 vRT-LAMP법 진단 시 돼지 유래 병원체를 제외하고 오직 PEDV를 검출하는지 확인하기 위하여, 실시예 1에서 핵산 추출한 PEDV 및 돼지 호흡기 및 전신성 질병의 병원체를 대상으로 PEDV 검출 특이도를 분석하였다.In order to confirm that only PEDV is detected, excluding porcine pathogens, when diagnosing with the vRT-LAMP method using the primer set in Table 2 above, the specificity for detecting PEDV was analyzed for PEDV and pathogens of porcine respiratory and systemic diseases extracted from nucleic acids in Example 1.
구체적으로, 상기 실시예1에서 추출하고 표 1에 개시된 PEDV 및 돼지 소회기 및 전신성 질병의 병원체에 대하여, 상기 실시예 3에서 확립한 62℃ 및 40분 반응 조건으로 프라이머 세트(서열번호 1 내지 8)를 이용하여 vRT-LAMP를 수행했고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.Specifically, vRT-LAMP was performed using the primer sets (SEQ ID NOs: 1 to 8) for the pathogens of PEDV and swine small intestinal and systemic diseases extracted in Example 1 and disclosed in Table 1 under the reaction conditions of 62°C and 40 minutes established in Example 3, and the results are shown in Fig. 4.
도 4의 튜브 1은 돼지 유행성 설사병 바이러스(SM-98), 튜브 2는 돼지 유행성 설사병 바이러스(DR13), 튜브 3은 돼지 유행성 설사병 바이러스(CV777), 튜브 4는 돼지 유행성 설사병 바이러스(KNU1305), 튜브 5는 전염성 위장염 바이러스(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV), 튜브 6은 돼지 델타코로나바이러스(Porcine deltacoronavirus, PDCoV), 튜브 7은 돼지 로타 바이러스(Porcine rotavirus, PRV), 튜브 8은 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus 2, PCV2), 튜브 9는 돼지 생식기호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 유전형 1, 튜브 10은 돼지생식기호흡기증후군바이러스 유전형 2, 튜브 11은 돼지 콜레라 바이러스(classical swine fever virus), 튜브 12는 돼지 인플루엔자 바이러스(Swine influenza virus, SIV), 튜브 13은 돼지 파보바이러스(porcine parvovirus), 튜브 14는 돼지 신장 세포(porcine kidney cell-15), 튜브 15는 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(Vero cell), NC는 음성 대조군을 나타낸다. Tube 1 of Figure 4 is porcine epidemic diarrhea virus (SM-98), tube 2 is porcine epidemic diarrhea virus (DR13), tube 3 is porcine epidemic diarrhea virus (CV777), tube 4 is porcine epidemic diarrhea virus (KNU1305), tube 5 is transmissible gastroenteritis virus (TGEV), tube 6 is porcine deltacoronavirus (PDCoV), tube 7 is porcine rotavirus (PRV), tube 8 is porcine circovirus 2 (PCV2), tube 9 is porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) genotype 1, tube 10 is porcine reproductive and respiratory syndrome virus genotype 2, tube 11 is classical swine fever virus, and tube 12 is swine influenza. Tube 13 represents swine influenza virus (SIV), tube 14 represents porcine parvovirus, tube 15 represents porcine kidney cells (porcine kidney cell-15), tube 15 represents African green monkey kidney cells (Vero cells), and NC represents negative control.
도 4를 참고하면, vRT-LAMP용 프라이머 세트는 PEDV ORF6 유전자만을 특이적으로 증폭하여 PEDV에 해당하는 튜브 1 내지 튜브 4에서 HNB 특유의 양성 색상(푸른색)이 나타남을 확인하였다.Referring to Fig. 4, the primer set for vRT-LAMP specifically amplified only the PEDV ORF6 gene, confirming that a positive color (blue) characteristic of HNB appeared in tubes 1 to 4 corresponding to PEDV.
따라서, 표 2의 프라이머 세트를 이용 시, PEDV만을 특이적으로 증폭하며, HNB을 이용하여 양성 반응을 판독 시, 젤 전기영동이나 DNA 염색액 첨가를 통하여 확인하는 경우 보다 오염률이 낮고 간편함을 확인하였다. Therefore, when using the primer set in Table 2, only PEDV was specifically amplified, and when reading a positive reaction using HNB, it was confirmed that the contamination rate was lower and it was simpler than when confirming through gel electrophoresis or adding DNA dye.
실시예 5. cRT-PCR 법 및 RT-PCR법을 이용한 PEDV 검출 민감도 비교 분석Example 5. Comparative analysis of PEDV detection sensitivity using cRT-PCR and RT-PCR methods
표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법과 다른 서열의 프라이머를 이용한 conventional RT-PCR 및 Real-time PCR법을 수행하여, 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출에 대한 민감도의 차이를 확인하였다.The difference in sensitivity for detection of porcine epidemic diarrhea virus was confirmed by performing vRT-LAMP method using the primer set in Table 2 and conventional RT-PCR and Real-time PCR methods using primers of different sequences.
5-1. conventional RT-PCR(cRT-PCR) 수행 조건5-1. Conditions for performing conventional RT-PCR (cRT-PCR)
cRT-PCR은 시판 RT-PCR 키트 (PrimeScriptTM one-step RT-PCR kit, TAKARA, Japan)를 이용하여 제조사의 추천 방법에 따라 검사하였다. 정방향 프라이머(TTCCCAGCGTAGTTGAGATTG; cRT-PCR-Forward primer;서열번호9) 및 역방향 프라이머(CGAAGTGGCTCTGGATTTGTT; cRT-PCR-Backward primer;서열번호10)를 이용하여 실시예 1에서 추출한 RNA 5μL를 PCR premix에 첨가한 다음, PCR 증폭기(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 50℃에서 30 분간 역전사를 수행하고, 94℃에서 2 분간 처리하고, 35 회전의 PCR 과정(denaturation 94℃, 30 초; annealing 55℃, 30 초; extension 72℃에서 40 초)를 수행하였으며, 72℃에서 2 분간 최종 반응하였다. cRT-PCR was performed using a commercial RT-PCR kit (PrimeScriptTM one-step RT-PCR kit, TAKARA, Japan) according to the manufacturer's recommended method. 5 μL of the RNA extracted in Example 1 was added to the PCR premix using the forward primer (TTCCCAGCGTAGTTGAGATTG; cRT-PCR-Forward primer; SEQ ID NO: 9) and the reverse primer (CGAAGTGGCTCTGGATTTGTT; cRT-PCR-Backward primer; SEQ ID NO: 10), and reverse transcription was performed at 50°C for 30 min using a PCR amplifier (Applied Biosystems, USA), followed by treatment at 94°C for 2 min, 35 cycles of PCR (denaturation 94°C, 30 sec; annealing 55°C, 30 sec; extension 72°C, 40 sec), and a final reaction was performed at 72°C for 2 min.
PCR 증폭산물은 NEO green 염색액(NEO science, Korea)을 첨가하여 1.5 % 아가로스 겔에 전기 영동한 다음, 자외선판독기 (Bio-Rad, USA)로 428 bp의 특이 밴드를 관찰하여 판독하였다.The PCR amplification product was electrophoresed on a 1.5% agarose gel with the addition of NEO green dye (NEO science, Korea), and then read by observing the specific band of 428 bp using an ultraviolet reader (Bio-Rad, USA).
5-2. Real-time PCR(rRT-PCR) 수행 조건5-2. Real-time PCR (rRT-PCR) performance conditions
Real-time RT-PCR은 기 발표된 방법을 참고하여, 정방향 프라이머(CGCAAAGACTGAACCCACTAA; rRT-PCR-Forward primer;서열번호11), 역방향 프라이머(TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT; rRT-PCR-Backward primer;서열번호12) 및 프로브(FAM-TGTTGCCATTRCCACGACTCCTGC-BHQ1; rRT-PCR-Probe;서열번호13)를 시판 RT-PCR 키트 (PrimeScriptTM one-step RT-PCR kit, TaKaRa, Japan)를 사용하여 수행하였다. Real-time RT-PCR was performed using a commercial RT-PCR kit (PrimeScriptTM one-step RT-PCR kit, TaKaRa, Japan) with reference to a previously published method, using a forward primer (CGCAAAGACTGAACCCACTAA; rRT-PCR-Forward primer; SEQ ID NO: 11), reverse primer (TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT; rRT-PCR-Backward primer; SEQ ID NO: 12), and probe (FAM-TGTTGCCATTRCCACGACTCCTGC-BHQ1; rRT-PCR-Probe; SEQ ID NO: 13).
10μL의 2X Reaction buffer, 0.5μL의 DNA polymerase, 0.5μL의 RT Enzyme mix, 0.4μM의 각 프라이머 및 프로브를 첨가한 반응액에 실시예 1에서 추출한 RNA template 5 μL를 첨가한 다음, 멸균증류수로 최종 용량을 20μL로 조정하였다. rRT-PCR 반응은 실시간핵산증폭기(Bio-Rad, USA)를 이용하여 50℃에서 10 분간 역전사과정을 수행하고, 95℃에서 1 분간 처리한다음, 40 회전의 PCR 과정(denaturation 95℃에서 15 초, annealing 58℃에서 45 초)을 거친 다음, CT값이 37 이하일 경우 양성으로 판정하였다.5 μL of RNA template extracted in Example 1 was added to the reaction solution containing 10 μL of 2X Reaction buffer, 0.5 μL of DNA polymerase, 0.5 μL of RT Enzyme mix, and 0.4 μM of each primer and probe, and the final volume was adjusted to 20 μL with sterile distilled water. The rRT-PCR reaction was performed using a real-time nucleic acid amplifier (Bio-Rad, USA) with a reverse transcription process at 50°C for 10 minutes, followed by 95°C for 1 minute, 40 cycles of PCR process (denaturation at 95°C for 15 seconds, annealing at 58°C for 45 seconds), and then the CT value was determined to be positive if it was 37 or less.
5-3. 각 진단법의 PEDV 검출 민감도 측정5-3. Measurement of PEDV detection sensitivity of each diagnostic method
표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법과 다른 서열의 프라이머를 이용한 conventional RT-PCR법 및 Real-time RT-PCR법 간의 민감도를 비교하였다.The sensitivity of the vRT-LAMP method using the primer set in Table 2 was compared with that of the conventional RT-PCR method and the Real-time RT-PCR method using primers of different sequences.
구체적으로, PEDV 표준 플라스미드를 NFW(Nuclease free water)로 10 배수 단계 희석하고, 민감도 측정에 사용된 유전자는 시판 플라스미드 추출키트(Gene All, Korea)를 이용하여 제조사의 방법대로 플라스미드를 추출하여 50 μL의 증류수에 용출한 후 그 중 5 μL를 채취하여 실험에 사용하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.Specifically, the PEDV standard plasmid was diluted 10-fold with NFW (Nuclease free water), and the gene used for sensitivity measurement was extracted using a commercial plasmid extraction kit (Gene All, Korea) according to the manufacturer's method, eluted into 50 μL of distilled water, and 5 μL of it was collected and used in the experiment. The results are shown in Fig. 5.
도 5의 (A)는 표 2의 프라이머 세트 중 제2 프라이머 세트(루프 프라이머)를 제외한 vRT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 산물을 전기영동 한 결과이다. (B)는 표 2의 프라이머 세트 중 제2 프라이머 세트(루프 프라이머)를 제외한 vRT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화를 나타내고, (C)는 표 2의 프라이머 세트 전체를 이용한 vRT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 산물을 전기영동 한 결과이다. (D)는 표 2의 프라이머 세트 전체를 이용한 vRT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화를 나타내고, (E)는 cRT-PCR을 실시한 결과이며, (F)는 qRT-PCR을 실시한 결과이다. (A) of Figure 5 shows the result of electrophoresis of the reaction solution of a tube in which the vRT-LAMP reaction was completed excluding the second primer set (loop primer) among the primer sets in Table 2. (B) shows the color change of the reaction solution of a tube in which the vRT-LAMP reaction was completed excluding the second primer set (loop primer) among the primer sets in Table 2. (C) shows the result of electrophoresis of the reaction solution of a tube in which the vRT-LAMP reaction was completed using all of the primer sets in Table 2. (D) shows the color change of the reaction solution of a tube in which the vRT-LAMP reaction was completed using all of the primer sets in Table 2. (E) shows the result of cRT-PCR, and (F) shows the result of qRT-PCR.
상기 (A) 내지 (F)의 레인 1 내지 7은 PEDV의 표준 플라스미드 유전자를 10 배수 단계 희석한 것을 나타낸다. Lanes 1 to 7 of (A) to (F) above represent 10-fold serial dilutions of the standard plasmid gene of PEDV.
도 5에 나타낸 바와 같이, 표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP 방법과 기존의 일반 PCR 방법(cRT-PCR) 및 real time PCR(qRT-PCR) 방법과 민감도를 비교한 결과, 각각 101 copy/μL (도 5의 C의 6번 레인 및 D의 6번 튜브까지), 103 copy/μL (도 5의 E의 4번 레인까지) 및 101 copy/μL (도 5의 F의 6번 검출선까지) 희석농도까지 검출됨을 확인하여, 표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP 방법을 이용할 경우, 기존의 cRT-PCR보다 100배 더 민감하고 qRT-PCR과 유사함을 확인하였다. As shown in Fig. 5, the sensitivity of the vRT-LAMP method using the primer sets of Table 2 was compared with that of the conventional general PCR method (cRT-PCR) and real time PCR (qRT-PCR) methods. As a result, it was confirmed that detection was possible up to dilution concentrations of 10 1 copy/μL (up to lane 6 of C and tube 6 of D of Fig. 5), 10 3 copy/μL (up to lane 4 of E of Fig. 5), and 10 1 copy/μL (up to detection line 6 of Fig. 5 F), respectively. Therefore, it was confirmed that the vRT-LAMP method using the primer sets of Table 2 was 100 times more sensitive than the conventional cRT-PCR and similar to qRT-PCR.
5-4. 야외시료에 대한 cRT-PCR, qRT-PCR 및 vRT-LAMP의 PEDV 검출 효율 비교5-4. Comparison of PEDV detection efficiency of cRT-PCR, qRT-PCR, and vRT-LAMP for outdoor samples
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 vLAMP법과 다른 서열의 프라이머를 이용한 cRT-PCR법 및 qRT-PCR법 간의 야외시료 검출 효율을 확인하였다.The detection efficiency of field samples was confirmed between the vLAMP method using the primer set of the present invention and the cRT-PCR and qRT-PCR methods using primers of different sequences.
구체적으로, 2020년 9월부터 2021년 8월까지 경북대학교 수의전염병제어센터에 검사 의뢰되어 보관하고 있던 PEDV 양성 국내 돼지 농장의 조직 55점과 분변 시료 94점을 대상으로 실시예 1의 방법으로 핵산을 추출하였다. 그 후, vRT-LAMP법, cRT-PCR법 및 qRT-PCR법을 실시하여 그 결과를 비교하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.Specifically, nucleic acids were extracted from 55 tissue samples and 94 fecal samples from PEDV-positive domestic pig farms that were requested for testing and stored at the Kyungpook National University Veterinary Infectious Disease Control Center from September 2020 to August 2021 using the method of Example 1. Then, vRT-LAMP method, cRT-PCR method, and qRT-PCR method were performed and the results were compared. The results are shown in Table 3.
/테스트 수Number of positive reactions
/test number
(%)Positive rate
(%)
/테스트 수Number of positive reactions
/test number
(%)Positive rate
(%)
/테스트 수Number of positive reactions
/test number
(%)Positive rate
(%)
(Feces)Fecal sample
(Feces)
(Intestine)Intestinal tissue
(Intestine)
표 3에 나타낸 바와 같이, 총 149개의 야외시료에 대하여 기존의 cRT-PCR은 149점 중에서 80점이 양성으로 확인되었으나, 표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법을 수행 시, 기존 cRT-PCR에서 음성인 시료로 판정된 19점을 더 포함한 총 99점이 양성으로 확인되어, 표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법은 기존의 cRT-PCR 검출 방법보다 검출 효율이 우수함을 확인하였다. As shown in Table 3, out of 149 total field samples, 80 were confirmed positive by the conventional cRT-PCR, but when the vRT-LAMP method using the primer set in Table 2 was performed, a total of 99 were confirmed positive, including 19 additional samples that were determined to be negative by the conventional cRT-PCR. Therefore, it was confirmed that the vRT-LAMP method using the primer set in Table 2 had a superior detection efficiency than the conventional cRT-PCR detection method.
또한 기존의 qRT-PCR은 총 149점 중에서 97점이 양성으로 확인되었으나, 표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법을 수행 시, 기존 qPCR에서 음성인 시료로 판정된 2점을 더 포함한 총 99점이 양성으로 확인되어, 표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법은 기존의 qRT-PCR 검출 방법보다 검출 효율이 우수함을 확인하였다.In addition, while the existing qRT-PCR confirmed 97 out of 149 points as positive, when the vRT-LAMP method using the primer set in Table 2 was performed, a total of 99 points, including 2 more points that were determined as negative samples in the existing qPCR, were confirmed as positive, confirming that the vRT-LAMP method using the primer set in Table 2 has a superior detection efficiency than the existing qRT-PCR detection method.
따라서, 표 2의 프라이머 세트를 이용하여 vRT-LAMP를 수행 시, 낮은 농도에서도 PEDV 만을 검출하여 민감도가 높고, 돼지에서 발생하는 다른 병원체를 제외하고 오직 PEDV 만을 검출하는 특이도가 우수함을 확인하였다. Therefore, when performing vRT-LAMP using the primer set in Table 2, it was confirmed that the sensitivity was high because only PEDV was detected even at low concentrations, and the specificity was excellent because only PEDV was detected while excluding other pathogens occurring in pigs.
또한, HNB를 적용하여 별도의 판독기 없이도 반응 결과를 육안으로 바로 확인 가능하여 오염 가능성이 낮음을 확인하였다.In addition, by applying HNB, it was confirmed that the reaction results could be checked visually without a separate reader, thereby reducing the possibility of contamination.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다. Above, specific parts of the present invention have been described in detail. It will be obvious to those skilled in the art that such specific description is only a preferred embodiment and that the scope of the present invention is not limited thereby. Accordingly, it will be said that the actual scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Compositions for detecting porcine epidemic diarrhea virus and method for detecting porcine epidemic diarrhea virus using the same <130> 2021-0588(1.338P) <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-F3 <400> 1 cttcgaarga acgtgacct 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-B3 <400> 2 caatgctgca acatttggt 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-LF <400> 3 gctattttcg cccttggga 19 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-LB <400> 4 aggtgttgat gcstcagg 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-F1c <400> 5 tgggtccgaa gcaagctg 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-F2 <400> 6 agacatccca gagtggagg 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-B1c <400> 7 ttggagatgc ggaatttgtc g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-B2 <400> 8 aactggcgat ctgagcatag 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cRT-PCR-Forward primer <400> 9 ttcccagcgt agttgagatt g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cRT-PCR-Backward primer <400> 10 cgaagtggct ctggatttgt t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rRT-PCR-Forward primer <400> 11 cgcaaagact gaacccacta a 21 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rRT-PCR-Backward primer <400> 12 ttgcctctgt tgttacttgg agat 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rRT-PCR-Probe <400> 13 tgttgccatt rccacgactc ctgc 24 <110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Compositions for detecting porcine epidemic diarrhea virus and method for detecting porcine epidemic diarrhea virus using the same <130> 2021-0588(1.338P) <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-F3 <400> 1 cttcgaarga acgtgacct 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-B3 <400> 2 caatgctgca acatttggt 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-LF <400> 3 gctattttcg cccttggga 19 <210> 4 <211> 18 <212> DNA < 213> Artificial Sequence <220> <223> N-LB <400> 4 aggtgttgat gcstcagg 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-F1c <400> 5 tgggtccgaa gcaagctg 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-F2 <400> 6 agacatccca gagtggagg 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-B1c <400> 7 ttggagatgc ggaatttgtc g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-B2 <400> 8 aactggcgat ctgagcatag 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cRT-PCR-Forward primer <400> 9 ttcccagcgt agttgagatt g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cRT-PCR-Backward primer <400> 10 cgaagtggct ctggatttgt t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rRT-PCR-Forward primer <400> 11 cgcaaagact gaacccacta a 21 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rRT-PCR-Backward primer <400> 12 ttgcctctgt tgttacttgg agat 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rRT-PCR-Probe <400> 13 tgttgccatt rccacgactc ctgc 24
Claims (12)
서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및
서열번호 5 내지 8로 이루어진 제3프라이머 세트; 를 포함하는,
돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus) 검출용 프라이머 세트.A first primer set consisting of sequence numbers 1 and 2;
A second primer set consisting of sequence numbers 3 and 4; and
A third primer set consisting of sequence numbers 5 to 8; comprising;
Primer set for detection of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV).
상기 프라이머 세트는 vRT-LAMP(visual Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification)용 또는 프로브 기반의 rLAMP(Probe-based real-time Loop Mediated Isothermal Amplification)용인,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 프라이머 세트.In the first paragraph,
The above primer set is for vRT-LAMP (visual Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification) or probe-based rLAMP (Probe-based real-time Loop Mediated Isothermal Amplification).
Primer set for detection of porcine epidemic diarrhea virus.
상기 프라이머 세트는 PEDV의 ORF6(open reading frame 6) 유전자를 표적으로 하는,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 프라이머 세트.In the first paragraph,
The above primer set targets the ORF6 (open reading frame 6) gene of PEDV.
Primer set for detection of porcine epidemic diarrhea virus.
(b) 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 상기 단계 (a)의 DNA를 주형으로 하는 등온 증폭 반응을 수행함과 동시에 등온 증폭 산물을 검출하는 단계; 를 포함하는,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법.(a) a step of extracting DNA from a sample; and
(b) a step of performing an isothermal amplification reaction using the DNA of step (a) as a template using the primer set of paragraph 1, and simultaneously detecting the isothermal amplification product;
Method for detecting porcine epidemic diarrhea virus.
상기 단계 (a)의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법. In Article 6,
The sample of the above step (a) is at least one selected from the group consisting of tissue, blood, saliva, urine, and body fluid.
Method for detecting porcine epidemic diarrhea virus.
상기 단계 (b)의 등온 증폭 반응은 56 내지 68℃에서 수행하는 것인,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법.In Article 6,
The isothermal amplification reaction of the above step (b) is performed at 56 to 68°C.
Method for detecting porcine epidemic diarrhea virus.
상기 단계 (b)의 증폭 반응은 30분 내지 60분 동안 이루어지는 것인,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법.In Article 6,
The amplification reaction of the above step (b) is carried out for 30 to 60 minutes.
Method for detecting porcine epidemic diarrhea virus.
상기 단계 (b)의 등온 증폭 반응은 vRT-LAMP 방법인,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법.In Article 6,
The isothermal amplification reaction of the above step (b) is a vRT-LAMP method.
Method for detecting porcine epidemic diarrhea virus.
상기 단계 (b)의 검출은 겔 전기영동, 반응산물의 탁도 측정, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 발색 지시제를 이용한 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수행하는 것인,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법. In Article 6,
The detection of the above step (b) is performed by at least one selected from the group consisting of gel electrophoresis, turbidity measurement of the reaction product, radioactivity measurement, fluorescence measurement, phosphorescence measurement, and measurement using a colorimetric indicator.
Method for detecting porcine epidemic diarrhea virus.
상기 발색 지시제는 칼세인(calcein), 하이드록시나프톨블루(hydroxy naphthol blue, HNB), 페놀레드(phenol red), 크레졸레드(cresol red), 말라키이트 그린(malachite green) 및 메틸 그린(methyl green)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법. In Article 11,
The above color indicator is at least one selected from the group consisting of calcein, hydroxy naphthol blue (HNB), phenol red, cresol red, malachite green, and methyl green.
Method for detecting porcine epidemic diarrhea virus.
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