KR101729977B1 - Compositions for detecting swine influenza virus and method for detecting swine influenza virus using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지인플루엔자바이러스 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 돼지인플루엔자바이러스 검출용 조성물 및 키트; 및, 이를 이용한 돼지인플루엔자바이러스의 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 돼지인플루엔자바이러스 검출용 프라이머 세트를 이용하여 RT-LAMP법을 수행할 경우, 낮은 농도의 시료만으로도 다양한 돼지인플루엔자바이러스의 아형을 검출 할 수 있어 민감도가 높고, 돼지에서 발생하는 다른 병원체를 제외하고 오직 돼지인플루엔자바이러스만을 검출하는 특이도가 우수하다. 또한, 기존의 PCR 기반 진단법과는 달리 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간이 단축될 뿐만 아니라 항온 수조와 같은 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 따라서, 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장에서 돼지인플루엔자바이러스의 검출에 효과적으로 이용할 수 있다.The present invention relates to a primer set for detecting swine influenza virus, a composition and kit for detecting swine influenza virus including the same, And a method for detecting swine influenza virus using the same. When the RT-LAMP method is performed using the primer set for detecting swine influenza virus of the present invention, it is possible to detect subtypes of various swine influenza viruses only at a low concentration of the sample, so that sensitivity is high and other pathogenic agents occurring in pigs are excluded And has excellent specificity for detecting only swine influenza virus. In addition, unlike conventional PCR-based diagnostic methods, gene amplification is performed under isothermal conditions with no temperature change, which shortens the inspection time and can also be achieved with low-cost equipment such as a constant temperature bath. Therefore, it can be effectively used for the detection of swine influenza virus in a small-scale diagnostic room or a field where high-priced equipments, reagents and professional manpower are not secured as well as a professional diagnosis room.
Description
본 발명은 돼지인플루엔자바이러스 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 돼지인플루엔자바이러스 검출용 조성물 및 키트; 및, 이를 이용한 돼지인플루엔자바이러스의 검출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for detecting swine influenza virus, a composition and kit for detecting swine influenza virus including the same, And a method for detecting swine influenza virus using the same.
A형 인플루엔자 바이러스(influenza A virus; IAV)는 조류와 포유동물 집단에 교차감염 되면서 유전적 변이가 지속되고 있어, 과거 여러 차례 있어 왔던 유행성 인플루엔자(pandemic influenza)의 발생 예에서 보듯이 인류의 보건을 위협하는 새로운 변이주가 출현할 가능성이 상존한다(Vijaykrishna 등, Science(2010), 328, 1529). 이에 따라 세계보건기구나 세계동물보건기구에서는 사람 및 동물집단에 감염되는 IAV에 대한 지속적인 감시활동의 필요성을 제기하여 왔으며, 특히 2009년 대유행한 2009 pandemic influenza virus H1N1(pH1N1)이 유럽 및 북미지역의 돼지 집단에서 유행하던 돼지 인플루엔자 바이러스(swine influenza virus; SIV)간 유전자 재조합에 의해 진화되었음이 밝혀진 이후에는 돼지 집단에 대한 SIV 감시활동이 특별히 강화되고 있다[(OIE(2012) Manual of diagnostic test and Vaccines for terrestrial Animals),(Vincent 등, Zoonoses Public Health(2014), 61, 4~17), (WHO(2010), Pandemic (H1N1)2009~update100)]. 한국에서도 2009년 이후 국가 가축방역사업의 일환으로서 국내 양돈장을 대상으로 SIV에 대한 양돈장 모니터링 사업을 실시해오고 있으며, 이를 통하여 국내 양돈장 돼지에서 pH1N1 및 유전자재조합 변이주의 감염이 확인된 바 있다[(Kim 등, Virol J(2013), 10,85), (Kim 등, Vet Rec(2011), 169, 155a)].Influenza A virus (IAV), a type of influenza A virus, is cross-infected with a group of birds and mammals, and the genetic variation is continuing. As shown in the cases of pandemic influenza, There is a possibility that a new mutant threat will emerge (Vijaykrishna et al., Science (2010), 328, 1529). Thus, the World Health Organization and the World Animal Health Organization have raised the need for ongoing monitoring of IAVs infecting humans and animals, and the 2009 pandemic influenza virus H1N1 (pH1N1) After SIV has been shown to have evolved by genetic recombination between swine influenza virus (SIV), which is prevalent in the swine populations, SIV monitoring activities have been particularly intensified in the pig population [OIE (2012) Manual of diagnostic test and Vaccines for terrestrial Animals, (Vincent et al., Zoonoses Public Health (2014), 61, 4-17), WHO (2010), Pandemic (H1N1) 2009 ~ update100). In Korea, since 2009, as a part of the national livestock pest control project, the pig farm monitoring project for SIV has been conducted in domestic pig farms, and the infection of pH1N1 and recombinant mutants has been confirmed in domestic pig farm pigs (Kim et al. , Virol J (2013), 10,85), (Kim et al., Vet Rec (2011), 169, 155a)].
동물집단에 감염되는 IAV에 대한 효율적인 감시활동을 위해서는 특이도와 민감도가 높으면서도 일선 실험실에서 편리하게 이용할 수 있는 이용자-친화적인 진단법의 개발 및 적용이 필요하다. 세계보건기구나 세계동물보건기구에서는 IAV 진단법으로 전통적인 바이러스 배양법과 분자생물학적 진단법을 공통적으로 추천하고 있으나, 최근에는 대부분의 실험실에서 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)이나 real-time RT-PCR(rRT-PCR)과 같은 PCR 기반 유전자진단법을 1차적인 진단법으로 이용하고 있다[(Kim 등, Virol J(2013), 10, 85), (OIE(2012) Manual of diagnostic test and Vaccines for terrestrial Animals), (WHO(2010), Pandemic (H1N1)2009~update100)]. 그러나 현재 상용되고 있는 PCR 기반 진단법들은 검사비용이 많이 들고, 특수한 장비와 시약을 필요로 하기 때문에 전문 진단기관 이외 일선 임상 진단실이나 현장에서는 쉽게 적용하기 어려운 단점이 있다. 따라서 이를 극복할 수 있는 새로운 방식의 유전자진단법에 대한 개발이 다각도로 진행되어 왔다(Sakurai와 Shibasaki, 2012, Viruses 4: 1235~1257).For effective monitoring of IAV infected with an animal population, it is necessary to develop and apply a user-friendly diagnostic method that has high specificity and sensitivity, and can be conveniently used in a frontline laboratory. In recent years, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) has been widely used in most laboratories. However, in most laboratories, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) PCR-based genetic testing methods such as real-time RT-PCR (rRT-PCR) have been used as primary diagnostic methods [Kim et al., Virol J (2013) diagnostic test and Vaccines for terrestrial Animals, (WHO (2010), Pandemic (H1N1) 2009 ~ update100)]. However, currently commercially available PCR-based diagnostic methods have a drawback in that they are expensive to test and require special equipment and reagents, making it difficult to apply them easily in a clinical diagnosis room or field. Therefore, the development of a new method of gene diagnosis that can overcome this has been progressing in various ways (Sakurai and Shibasaki, 2012, Viruses 4: 1235 ~ 1257).
최근 개발된 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)은 반응 온도에 변화를 주어야 하는 기존의 PCR 기반 진단법과 달리 일정한 온도조건에서 유전자를 증폭할 수 있는 새로운 방식의 유전자진단법으로써 고도의 특이도와 민감도를 가지면서도 신속하게 목표 유전자를 증폭할 수 있는 것으로 알려져 있다(Notomi 등, 2000, Nucleic Acids Res 28, 63-69). 특히 등온조건에서 반응이 이루어지는 LAMP의 특성상 일정한 온도가 유지되는 항온 수조만 있어도 활용이 가능하기 때문에, 향후 고가의 특수 장비가 없는 일선 임상 진단실이나 임상 현장에서의 간편 진단법으로도 응용될 수 있다.The recently developed loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a new method of gene diagnosis that can amplify genes under constant temperature conditions, unlike conventional PCR-based diagnostic methods that require a change in reaction temperature. (Notomi et al., 2000, Nucleic Acids Res 28, 63-69). Especially, because of the characteristics of the LAMP that reacts under isothermal conditions, it can be used even in a constant temperature water tank in which a constant temperature is maintained. Therefore, it can be applied as a simple diagnosis method in a clinical diagnosis room or a clinical site without expensive special equipment in the future.
최근 한국에서는 LAMP 기법을 이용하여 병원체 진단에 응용한 보고가 있으나, 주로 세균성 질병인 결핵, 살모넬라 및 대장균에 대하여 적용되어 왔다. 바이러스성 질병에 대해서는 개 홍역(Cho등, 2005), 낭충봉아부패병(Yoo 등, 2012)에 적용된 바가 있으나 아직 동물이나 조류의 IAV 진단에는 적용된 연구는 미미하다.Recently, in Korea, there have been reports on the use of LAMP technique for pathogen diagnosis, but it has been mainly applied to bacterial diseases such as tuberculosis, salmonella and E. coli. For viral diseases, there have been some applications in dogs (Cho et al., 2005) and acanthosis (Yoo et al., 2012), but the studies applied to IAV diagnosis of animals and birds are still insignificant.
이에 본 발명자는 SIV를 신속하고 정확하게 진단하기 위하여 연구하던 중, SIV의 다양한 아형을 표적으로 하는 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 RT-LAMP법을 수행한 결과, 낮은 농도의 시료만으로도 다양한 돼지인플루엔자바이러스의 아형을 검출 할 수 있어 민감도가 높고, 돼지에서 발생하는 다른 병원체를 제외하고 오직 돼지인플루엔자바이러스만을 검출하는 특이도가 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.Therefore, the inventors of the present invention prepared a primer set targeting various subtypes of SIV, and performed RT-LAMP using the primer set as a target for rapid and accurate diagnosis of SIV. As a result, a variety of swine influenza It is possible to detect subtypes of viruses. Therefore, the present invention has been completed upon confirming that the sensitivity is high and the specificity for detecting only swine influenza virus is excellent except for the other pathogens occurring in pigs.
본 발명의 목적은 돼지인플루엔자바이러스(swine influenza virus, SIV) 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a primer set for detecting swine influenza virus (SIV).
또한 본 발명의 목적은 상기 프라이머를 포함하는 돼지인플루엔자바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a composition for detecting swine influenza virus comprising the primer.
또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 돼지인플루엔자바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a kit for detecting swine influenza virus comprising the composition.
또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 돼지인플루엔자바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a method for detecting swine influenza virus comprising the composition.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및, 서열번호 5 및 6으로 이루어진 제3프라이머 세트;를 포함하는, 돼지인플루엔자바이러스(swine influenza virus, SIV) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a primer set comprising a first primer set consisting of SEQ ID NOS: 1 and 2; A second primer set consisting of SEQ ID NOS: 3 and 4; And a third primer set consisting of SEQ ID NOS: 5 and 6, and a primer set for swine influenza virus (SIV) detection.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 돼지인플루엔자바이러스 검출용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for detecting swine influenza virus comprising the primer set.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 돼지인플루엔자바이러스 검출용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for detecting swine influenza virus comprising the composition.
또한 본 발명은 (1) 시료의 RNA를 추출하는 단계; 및 (2) 상기 (1)의 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및, 서열번호 5 및 6으로 이루어진 제3프라이머 세트;를 이용하여 등온 증폭 반응을 수행한 후, 등온 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 돼지인플루엔자바이러스 검출 방법을 제공한다.(1) extracting RNA of a sample; And (2) a first primer set consisting of SEQ ID NOS: 1 and 2, using the RNA of (1) as a template; A second primer set consisting of SEQ ID NOS: 3 and 4; And a third primer set consisting of SEQ ID NOS: 5 and 6, and then detecting the isothermal amplification product. The present invention also provides a method for detecting swine influenza virus.
본 발명의 돼지인플루엔자바이러스 검출용 프라이머 세트를 이용하여 RT-LAMP법을 수행할 경우, 낮은 농도의 시료만으로도 다양한 돼지인플루엔자바이러스의 아형을 검출할 수 있어 민감도가 높고, 돼지에서 발생하는 다른 병원체를 제외하고 오직 돼지인플루엔자바이러스만을 검출하는 특이도가 우수하다. 또한, 기존의 PCR 기반 진단법과는 달리 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간이 단축될 뿐만 아니라 항온 수조와 같은 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 따라서, 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장에서 돼지인플루엔자바이러스의 검출에 효과적으로 이용할 수 있다. When the RT-LAMP method is performed using the primer set for detecting swine influenza virus of the present invention, it is possible to detect subtypes of various swine influenza viruses only at a low concentration of the sample, so that sensitivity is high and other pathogenic agents occurring in pigs are excluded And has excellent specificity for detecting only swine influenza virus. In addition, unlike conventional PCR-based diagnostic methods, gene amplification is performed under isothermal conditions with no temperature change, which shortens the inspection time and can also be achieved with low-cost equipment such as a constant temperature bath. Therefore, it can be effectively used for the detection of swine influenza virus in a small-scale diagnostic room or a field where high-priced equipments, reagents and professional manpower are not secured as well as a professional diagnosis room.
도 1은 본 발명의 RT-LAMP용 프라이머 세트의 증폭 부위를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법 수행 시, 최적 조건을 확립하기 위하여, 45~65℃의 반응 온도 범위에서 양성 반응을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법 수행 시, 최적 조건을 확립하기 위하여, 20, 30, 40 및 50분의 반응 시간 범위에서 양성 반응을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 SIV의 아형 4종, 돼지 관련 바이러스 또는 세균 7종에 대하여 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법 수행 시, 특이도를 확인한 결과를 나타낸 도이다
도 5는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법(A 및 B), 다른 서열의 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR법(C) 및 real time RT-PCR법(D)의 수행 시, SIV 검출 민감도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing an amplification site of a RT-LAMP primer set of the present invention. FIG.
FIG. 2 is a graph showing a result of confirming a positive reaction at a reaction temperature range of 45 to 65 ° C. in order to establish an optimal condition in the RT-LAMP method using the primer set of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the results of confirming the positive reaction in the reaction time range of 20, 30, 40, and 50 minutes in order to establish an optimal condition in the RT-LAMP method using the primer set of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the results of confirming the specificity of RT-LAMP using the primer set of the present invention for four subtypes of SIV, seven pig-related viruses or bacteria
FIG. 5 is a graph showing the results of the RT-LAMP (A and B) using the primer set of the present invention, the RT-PCR method (C) using the primer set of another sequence and the real time RT- And the result of confirming the sensitivity.
본 발명은 서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및, 서열번호 5 및 6으로 이루어진 제3프라이머 세트;를 포함하는, 돼지인플루엔자바이러스(swine influenza virus, SIV) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.The present invention relates to a first primer set consisting of SEQ ID NOS: 1 and 2; A second primer set consisting of SEQ ID NOS: 3 and 4; And a third primer set consisting of SEQ ID NOS: 5 and 6, and a primer set for swine influenza virus (SIV) detection.
본 발명에 있어서, "돼지인플루엔자바이러스(swine influenza virus, SIV)"는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) 인플루엔자바이러스속에 속하는 A형 인플루엔자바이러스의 아형(subtype)을 의미한다. 바이러스에 감염된 돼지의 예후는 양호하지만 전파성은 강하며, 발열, 호흡속박(速迫), 기침, 눈물, 쇠약 및 식욕부진 등이 나타난다. In the present invention, "swine influenza virus (SIV)" refers to a subtype of influenza A virus belonging to the genus Orthomyxoviridae. The prognosis of the virus-infected pigs is good, but the spread is strong, fever, breathing difficulties (cramps), coughing, tears, weakness and anorexia.
본 발명에 있어서, "검출"은 화학 분석에서, 시료(試料) 속에 화학종이나 미생물 따위의 존재 유무를 알아내는 것으로, 본 발명에서는 돼지인플루엔자바이러스를 검출하는 것을 의미한다.In the present invention, "detection" refers to the presence or absence of a chemical species or a microorganism in a sample in a chemical analysis. In the present invention, it means detection of swine influenza virus.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.In the present invention, the term "primer" refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be amplified, and may serve as a starting point for synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primer should allow the synthesis of the extension product to begin. The specific length and sequence of the primer will depend on the primer usage conditions such as temperature and ionic strength, as well as the complexity of the desired DNA or RNA target.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.In the present invention, an oligonucleotide used as a primer may comprise a nucleotide analogue such as phosphorothioate, alkylphosphorothioate or peptide nucleic acid, And may include an intercalating agent.
본 발명의 프라이머 세트는 총 3쌍으로 이루어져 있으며, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열은 외부 프라이머 쌍으로서 제1프라이머 세트이고, 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열은 루프 프라이머 쌍으로서 제2프라이머 세트이다. 또한, 서열번호 5 및 6으로 표시되는 염기서열은 내부 프라이머 쌍으로서 제3프라이머 세트이다. The base sequence represented by SEQ ID NOS: 1 and 2 is the first primer set as the pair of external primers and the base sequence represented by SEQ ID NOS: 3 and 4 is the pair of loop primers as the pair of
상기 프라이머 세트는 RT-LAMP(Reverse Transcription-Loop Mediated Isothermal Amplification)법에 이용하기 위한 것이 바람직하며, RNA를 대상으로 RT를 선 수행하여 만들어진 cDNA을 이용하여 2차적으로 LAMP법을 수행할 경우에 이용할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.The primer set is preferably used for the RT-LAMP (Reverse Transcription-Loop Mediated Isothermal Amplification) method, and is used when the LAMP method is secondarily performed using cDNA prepared by performing RT on RNA But is not limited thereto.
본 발명에 있어서, "RT-LAMP(Reverse Rranscription-Loop Mediated Isothermal Amplification)"는 박테리아 또는 바이러스로 야기된 질병을 진단하고, PCR법의 단점을 보완한 진단법으로, PCR법과는 달리 일정한 온도(등온)에서 어닐링(annealing) 및 신장(extension)이 가능하여 온도조절장치가 필요하지 않으며, 일정한 온도조건에서 유전자를 증폭할 수 있다. 또한 신속성, 특이성 및 검출 감도가 높아 1시간 이내에 109 copy의 유전자를 증폭시킬 수 있다. 또한, LAMP 기법은 기존의 PCR 기반 진단법에서 사용되는 Taq DNA polymerase와 달리 목표유전자를 strand displacement 방식에 의해 대량 증폭할 수 있는 Bst DNA polymerase를 이용함으로써 유전자 증폭효율이 월등하게 높다. 또한 기존의 PCR 기반 진단법과는 달리 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간이 단축될 뿐만 아니라 항온수조와 같은 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 따라서 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장 진단용 등으로 이용 가능하다.In the present invention, "RT-LAMP (Reverse Transcription-Loop Mediated Isothermal Amplification)" is a diagnostic method that diagnoses diseases caused by bacteria or viruses and complements the shortcomings of the PCR method. Unlike the PCR method, Annealing and extension are possible, so that a temperature regulator is not required, and the gene can be amplified under a constant temperature condition. In addition, the rapidity, specificity and detection sensitivity are high, so that 10 9 copies of the gene can be amplified within 1 hour. Unlike the Taq DNA polymerase used in PCR-based diagnostic methods, the LAMP technique uses Bst DNA polymerase, which can amplify a target gene by a strand displacement method. In addition, unlike conventional PCR-based diagnostics, gene amplification is performed under isothermal conditions with no temperature change, which can shorten the inspection time and enable low-cost equipment such as a constant temperature bath. Therefore, it can be used not only for a specialized diagnosis room, but also for a small-scale diagnosis room or a field diagnosis for which high-priced equipment, reagents and professional manpower are not secured.
상기 프라이머 세트는 H1N1, pH1N1, H1N2 및 H3N2으로 이루어진 1종 이상의 돼지인플루엔자바이러스 아형(subtype)을 검출하나, 이에 제한되지 않는다.The primer set detects one or more swine influenza virus subtypes consisting of H1N1, pH1N1, H1N2 and H3N2, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, "돼지인플루엔자바이러스 아형"은 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, NP) 및 매트릭스(matrix) 단백질의 항원성 차이에 의해 크게 A, B 및 C형으로 구분된다. 이중 A형은 혈구응집소(hemagglutinin, HA) 단백질의 항원 특성에 따라 H1형에서 H15형까지, NA 단백질 항원 특성에 따라 N1형에서 N9형의 아형으로 분류 된다. In the present invention, "swine influenza virus subtype" is largely divided into A, B, and C types due to antigenicity differences of nucleocapsid (NP) and matrix proteins. Among them, type A is classified as H1 type to H15 type according to antigenic characteristics of hemagglutinin (HA) protein, and N1 type to N9 type according to the nature of NA protein antigen.
상기 프라이머 세트는 돼지인플루엔자바이러스의 매트릭스(matrix) 유전자를 표적으로 하나, 이에 제한되지 않는다. The primer set targets, but is not limited to, a matrix gene of swine influenza virus.
본 발명에 있어서, "돼지인플루엔자바이러스의 매트릭스(matrix) 유전자"는 돼지인플루엔자바이러스의 외막을 구성하는 유전자이다. 매트릭스 유전자는 인플루엔자바이러스를 구성하는 유전자 중에서 가장 변이가 적은 안정적인 유전자로서 인플루엔자바이러스의 다양한 아형에 관계없이 높은 안정성을 가지기 때문에 유전자 진단법 개발에 주요 표적이 되고 있는 유전자이다. 따라서 본 발명에서도 다양한 아형의 돼지인플루엔자바이러스를 공통적으로 진단할 수 있는 유전자진단법을 개발하기 위하여 상기 돼지인플루엔자바이러스 진단용 프라이머 세트를 매트릭스 유전자의 염기서열 부위에서 선발하였다.In the present invention, "matrix gene of swine influenza virus" is a gene constituting the outer membrane of swine influenza virus. The matrix gene is the most stable gene among the genes constituting the influenza virus and has a high stability regardless of various subtypes of influenza virus, and thus is a gene that is a main target in the development of gene diagnosis methods. Therefore, in order to develop a gene diagnosis method capable of commonly diagnosing swine influenza viruses of various subtypes in the present invention, the primer set for diagnosing swine influenza virus was selected at the base sequence region of the matrix gene.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 돼지인플루엔자바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
The present invention also provides a composition for detecting swine influenza virus comprising the primer set.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 돼지인플루엔자바이러스 검출용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for detecting swine influenza virus comprising the composition.
본 발명의 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다
The kit of the present invention may contain a reagent for carrying out an amplification reaction. In addition, the kit of the present invention may further include a user guide describing optimal reaction performing conditions. The manual is a printed document that explains how to use the kit, for example, how to prepare PCR buffer, the reaction conditions presented, and so on. The brochure includes instructions on the surface of the package including the brochure or leaflet in the form of a brochure, a label attached to the kit, and a kit. In addition, the brochure includes information that is disclosed or provided through an electronic medium such as the Internet
또한 본 발명은 (1) 시료의 RNA를 추출하는 단계; 및 (2) 상기 (1)의 RNA 를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및, 서열번호 5 및 6으로 이루어진 제3프라이머 세트;를 이용하여 등온 증폭 반응을 수행한 후, 등온 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 돼지인플루엔자바이러스 검출 방법을 제공한다.(1) extracting RNA of a sample; And (2) a first primer set consisting of SEQ ID NOS: 1 and 2, using the RNA of (1) as a template; A second primer set consisting of SEQ ID NOS: 3 and 4; And a third primer set consisting of SEQ ID NOS: 5 and 6, and then detecting the isothermal amplification product. The present invention also provides a method for detecting swine influenza virus.
상기 (1) 단계의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이나, 이에 제한되지 않는다.The sample of step (1) may be at least one selected from the group consisting of tissue, blood, saliva, urine and body fluid, but is not limited thereto.
상기 (2) 단계의 등온 증폭 반응은 45 내지 65℃에서 수행할 수 있으나, 바람직하게는 50 내지 60℃이고, 더욱 바람직하게는 55 또는 58℃이나, 이에 제한되지 않는다.The isothermal amplification reaction in step (2) may be carried out at 45 to 65 ° C, but is preferably 50 to 60 ° C, more preferably 55 or 58 ° C, but is not limited thereto.
상기 (2) 단계의 등온 증폭 반응은 20 내지 60분간 수행할 수 있으며, 바람직하게는 40분 이상이나, 이에 제한되지 않는다.The isothermal amplification reaction in step (2) may be performed for 20 to 60 minutes, preferably 40 minutes or more, but is not limited thereto.
상기 (2) 단계의 등온 증폭 반응은 RT-LAMP법을 이용하여 수행할 수 있으며, 당업계에서 일반적으로 사용되는 증폭 반응을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The isothermal amplification reaction in the step (2) can be performed using the RT-LAMP method, and the amplification reaction commonly used in the art can be used, but is not limited thereto.
상기 (2) 단계의 검출은 겔 전기영동, 반응산물의 탁도 측정, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 발색 지시제 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수행할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.The detection of step (2) may be performed by one or more kinds selected from the group consisting of gel electrophoresis, turbidity measurement of reaction products, radioactive measurement, fluorescence measurement, phosphorescence measurement and color development indicator measurement, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 증폭산물 검출은 겔 전기영동을 이용하여 수행할 수 있으며, 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 젤 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. In the present invention, amplification product detection can be performed using gel electrophoresis, and agarose gel electrophoresis or acrylamide gel electrophoresis can be used depending on the size of the amplification product.
또한, 증폭산물 검출은 반응산물의 탁도 측정법을 이용하여 수행할 수 있으며, LAMP 반응 양성반응 시에 생성되는 피로인산 마그네슘(magnesium pyrophosphate) 침전물에 의해 반응산물의 탁도가 증가하는 현상을 이용한 측정방법으로 육안 관찰 또는 탁도계를 이용하여 탁도를 측정할 수 있다.In addition, the amplification product detection can be performed using a turbidity measurement method of the reaction product, and a measurement method using the phenomenon that the turbidity of the reaction product increases due to the precipitate of magnesium pyrophosphate produced during the LAMP reaction positive reaction Turbidity can be measured using a visual observation or a turbidimeter.
또한, 증폭산물 검출은 상기 형광 측정 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 이는 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광을 형광 측정기를 이용하여 측정하는 방법이다. 상기 방사성 측정 방법은 증폭 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하여 증폭산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.In addition, the amplification product detection can be performed using the fluorescence measurement method. When Cy-5 or Cy-3 is labeled at the 5'-end of the primer and amplification is performed, the target is detected as a fluorescent marker capable of detecting the target sequence. And the fluorescence thus labeled is measured using a fluorescence meter. In the above radioactive measurement method, a radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to an amplification reaction solution to mark the amplification product, and then a radioactive measurement instrument, for example, a Geiger counter or a liquid scintillation counter the radioactivity can be measured using a liquid scintillation counter.
또한, 증폭산물 검출은 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 형광 염색 물질을 적용할 수 있으나, 바람직하게는, SYBR 그린I과 GeneFinder, 페놀 레드를 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 SYBR 그린I과 GeneFinder을 사용할 수 있다. 상기 형광 염색 물질은 DNA 이중가닥 또는 RNA 단일가닥에 결합하는 특성을 이용하여 추가적 실험을 필요로 하지 않고도 결과의 여부를 판독할 수 있도록 하기 위하여 첨가한 것이다. 특히, 상기 SYBR 그린I 또는 GeneFinder는 DNA 이중가닥 또는 RNA 단일가닥에 삽입되어 자외선 조사 시 녹색의 형광을 발현하는 물질이다. 따라서 돼지인플루엔자바이러스를 본 발명에 따라 RT-LAMP법으로 증폭시키고, 증폭된 RT-LAMP 생성물에 SYBR 그린I 또는 GeneFinder을 첨가한 후 자외선을 조사하게 되면 녹색 형광을 나타내게 된다. 즉, 본 발명은 전기영동 등 별도의 추가적 실험을 하지 않고도, RT-LAMP 증폭실험 후 SYBR 그린I 또는 GeneFinder 염색에서 녹색형광을 나타내면 질병에 감염된 것을 의미하고, 녹색형광을 나타내지 않으면 비감염을 의미하므로 시료가 돼지인플루엔자바이러스에 감염되었는지의 여부를 고감도이면서 신속하게 육안으로 확인할 수 있다.The detection of the amplified product can be performed using fluorescent dye materials commonly used in the art, but preferably SYBR Green I, GeneFinder and phenol red can be used, and more preferably, SYBR Green I and GeneFinder can be used . The fluorescent dye material is added to the DNA double strand or RNA single strand so as to make it possible to read out the result without requiring additional experimentation. In particular, SYBR Green I or GeneFinder is a substance that is inserted into DNA double strand or single strand of RNA and expresses green fluorescence when irradiated with ultraviolet light. Therefore, when swine influenza virus is amplified by the RT-LAMP method according to the present invention, and SYBR Green I or GeneFinder is added to the amplified RT-LAMP product, when the UV light is irradiated, green fluorescence appears. That is, the present invention means that when green fluorescence is expressed by SYBR Green I or GeneFinder staining after RT-LAMP amplification experiment without any additional experiment such as electrophoresis, it means that it is infected with a disease, and when it does not show green fluorescence, Can be visually confirmed with a high sensitivity and quickly whether or not the virus has been infected with the swine influenza virus.
또한, 증폭산물 검출은 발색지시제(colorimetric indicator)를 이용하여 측정할 수 있으며, 바람직하게는, calcein, HNB(hydroxy naphthol blue) 더욱 바람직하게는 HNB를 사용할 수 있다. 상기 발색지시제를 첨가할 경우 LAMP 증폭 과정 중에 생성된 반응산물 (pyrophosphate, Mg2 +)에 의해 반응액의 색갈이 오렌지색 또는 청색으로 변화되는 특성을 이용한 것으로 추가적 실험을 필요로 하지 않고도 결과의 여부를 판독할 수 있도록 하기 위하여 첨가한 것이다. 또한 HNB는 증폭 이전의 반응액에 미리 첨가하여 반응을 진행할 수 있다. 따라서, HNB를 증폭 이전의 반응액에 혼합하면, 반응튜브를 개봉하지 않고도 반응 결과의 확인이 가능하기 때문에, 반응 후에 염색액을 첨가해주어야 하는 방법에 비해 교차오염을 방지할 수 있는 장점이 있다.In addition, the amplification product detection can be performed using a colorimetric indicator. Preferably, calcein, HNB (hydroxy naphthol blue) and more preferably HNB can be used. When the coloring indicator is added, the color of the reaction solution changes to orange or blue due to the reaction product (pyrophosphate, Mg 2 + ) generated during the LAMP amplification process. In order to make them readable. In addition, HNB can be added to the reaction solution before amplification to proceed the reaction. Therefore, when HNB is mixed with the reaction solution before amplification, it is possible to confirm the reaction result without opening the reaction tube. Therefore, cross-contamination can be prevented as compared with a method in which a dyeing solution is added after the reaction.
본 발명의 일실시예에서는, SIV의 아형 4종(H1N1, pH1N1, H1N2, H3N2)을 모두 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였다. 구체적으로, 본 발명의 프라이머 세트는 총 3쌍으로 이루어져 있으며, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열은 외부 프라이머 쌍으로서 제1프라이머 세트이고, 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열은 루프 프라이머 쌍으로서 제2프라이머 세트이다. 또한, 서열번호 5 및 6으로 표시되는 염기서열은 내부 프라이머 쌍으로서 제3프라이머 세트이다. 상기 프라이머 세트를 이용하여 RT-LAMP법의 최적 반응 조건을 확립한 결과, 58℃의 일정한 온도 조건으로 1시간 이내에(40분) SIV를 검출함을 확인하였다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 RT-LAMP법을 수행 시, 낮은 농도의 시료만으로도 다양한 돼지인플루엔자바이러스의 아형을 검출 할 수 있어 민감도가 높고, 돼지에서 발생하는 다른 병원체를 제외하고 오직 돼지인플루엔자바이러스만을 검출하는 특이도가 우수하다. 또한, 기존의 PCR 기반 진단법과는 달리 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간이 단축될 뿐만 아니라 항온수조와 같은 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 따라서, 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장에서 돼지인플루엔자바이러스의 검출에 효과적으로 이용할 수 있다.
In one embodiment of the present invention, a primer set capable of detecting all four subtypes of SIV (H1N1, pH1N1, H1N2, H3N2) was prepared. Specifically, the primer set of the present invention comprises a total of 3 pairs, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and 2 is the first primer set as the pair of external primers, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and 4 is the loop primer And a second primer set as a pair. In addition, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 is a third primer set as an inner primer pair. As a result of establishing the optimal reaction conditions of the RT-LAMP method using the above primer set, it was confirmed that SIV was detected within one hour (40 minutes) at a constant temperature condition of 58 ° C. In addition, when the RT-LAMP method is performed using the primer set of the present invention, it is possible to detect subtypes of various swine influenza viruses only with a low concentration of samples, and the sensitivity is high, and only the swine influenza The specificity of detecting virus only is excellent. In addition, unlike conventional PCR-based diagnostic methods, gene amplification is performed under isothermal conditions with no temperature change, which shortens the inspection time and can also be achieved with low-cost equipment such as a constant temperature bath. Therefore, it can be effectively used for the detection of swine influenza virus in a small-scale diagnostic room or a field where high-priced equipments, reagents and professional manpower are not secured as well as a professional diagnosis room.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. It is to be understood that the following examples are illustrative only and are not intended to limit the scope of the invention in any way to the scope of the invention as defined by the appended claims. It will be obvious.
실시예Example 1. 돼지 인플루엔자 바이러스(swine influenza virus; 1. Swine influenza virus (swine influenza virus; SIVSIV )의 핵산 추출) Of nucleic acid extraction
SIV의 아형 4종(H1N1, pH1N1, H1N2, H3N2) 및 돼지 유래 병원체 8종에 대한 핵산을 추출하였다. Nucleic acids were extracted from four subtypes of SIV (H1N1, pH1N1, H1N2 and H3N2) and eight pig-derived pathogens.
보다 구체적으로, 시험에 사용한 SIV는 A/Korea/D180-2/2009(H1N1), A/Korea/103/2009 (H1N2), A/Korea/A18/2011 (H3N2) 및 A/Korea/VD01/2009 (pH1N1)인 한국의 돼지 분리주 4종이며, 상기 A/Korea/VD01/2009 (pH1N1)은 2009년 한국의 양돈장에서 분리하였다. 상기 공시 바이러스를 이용한 모든 실험은 농림축산검역본부에서 수행하였다. 공시 바이러스는 세계동물보건기구에서 추천하는 표준 방법에 준하여 발육란에 접종하여 5일간 배양하였으며, 발육란에서 채취한 뇨막강액에 대하여 혈구응집반응(hemagglutination test; HAT)을 실시하여 바이러스 역가를 측정한 다음, 80℃에 보관한 후 시험에 이용하였다[(Kim 등, Virus Genes 48(2014), 193~198)(OIE(2014), Manual of diagnostic test and Vaccines for terrestrial Animals)(WHO(2010), Pandemic (H1N1)2009-update100)]. 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 특이도 검증을 위하여 경북대학교 수의전염병제어센터에서 보관하고 있는 SIV 이외에 돼지 호흡기에 감염되는 바이러스와 세균 배양액으로부터 동일하게 핵산을 추출한 다음, 80℃에 보관한 후 시험에 이용하였다. 병원체, 이의 분리주 및 이의 제공처를 표 1에 나타내었다. More specifically, the SIV used in the test was A / Korea / D180-2 / 2009 (H1N1), A / Korea / 103/2009 (H1N2) 2009 (pH1N1) was separated from the pig farm in Korea in 2009. A / Korea / VD01 / 2009 (pH1N1) was separated from the pig farm in Korea in 2009. All experiments using the above mentioned viruses were carried out at the agriculture, forestry and livestock quarantine headquarters. The viruses were incubated for 5 days in the developmental field according to the standard method recommended by the World Animal Health Organization. The viral titers were measured by hemagglutination test (HAT) on the urine collected from the developmental field (OIE (2014), Manual of diagnostic tests and Vaccines for terrestrial Animals (WHO (2010), Pandemic (1984)), were used for the test after storage at 80 ° C (H1N1) 2009-update100)]. In order to verify the specificity of the RT-LAMP method using the primer set of the present invention, the same nucleic acids were extracted from the viruses and bacterial cultures of pig respiratory viruses other than the SIV stored at the Veterinary Infectious Diseases Control Center of Kyungpook National University, And then used for the test. The pathogen, its isolate, and the source of the pathogen are shown in Table 1.
실시예Example 2. RT-LAMP용 2. For RT-LAMP 프라이머primer 설계 design
RT-LAMP법에 이용하고, 다양한 아형의 SIV를 공통적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 설계하였다. RT-LAMP method, and a primer set capable of amplifying SIV of various subtypes in common was designed.
구체적으로, 2012~2014년 사이에 Influenza equence Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)에 등록된 SIV의 매트릭스(matrix) 유전자 염기서열 정보를 검색하여 pH1N1을 포함한 H1N1형 856개, H1N2아형 623개, H3N2아형 736개 및 타 아형의 SIV 65개 등 총 2,280개의 매트릭스(matrix) 유전자 염기서열 정보를 확보하였다. 확보된 정보를 유전자 염기서열 분석 프로그램인 DNASTAR® Lasergene(DNASTAR, Inc, USA)으로 비교 분석하여 가장 안정적인 부위를 선발한 다음, LAMP용 프라이머 설계 프로그램인 Primer-Explorer V3 software(http://primerexplorer. jp/e/index.html; Eiken Chemical Co. Ltd, Japan)를 이용하여 2종의 내부 프라이머[forward inner primer (FIP) 및 backward inner primer (BIP)], 2종의 외부 프라이머(F3와 B3) 및 2종의 루프 (loop) 프라이머[F loop primer(LF)와 B loop primer (LB)]를 설계하였다. 설계한 프라이머 세트를 프라이머 제조업체(Bioneer Co, Korea)에 의뢰하여 합성하였다. 설계된 프라이머 세트의 부위 및 구체적인 서열을 도 1 및 표 2에 나타내었다.More specifically, matrix gene sequence information of SIV registered in the Influenza equence database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html) between 2012 and 2014 is searched , We obtained a total of 2,280 matrix nucleotide sequence information including 856 H1N1, 623 H1N2, 736 H3N2 and SIV of the subtype including pH1N1. Of the information obtained gene sequence analysis program DNASTAR ® Lasergene (DNASTAR, Inc, USA) compared to the most reliable one selected a site, then the primer design program for LAMP Primer-Explorer V3 software (http to: // primerexplorer. two inner primers (FIP) and a backward inner primer (BIP), two outer primers (F3 and B3), and two outer primers (F3 and B3) And two kinds of loop primers (F loop primer (LF) and B loop primer (LB)) were designed. The designed primer set was synthesized with a primer manufacturer (Bioneer Co, Korea). The site and specific sequence of the designed primer set are shown in FIG. 1 and Table 2.
(F1c+F2)SIV-FIP
(F1c + F2)
(B1+B2c)SIV-BIP
(B1 + B2c)
실시예Example 3. 본 발명의 3. The 프라이머primer 세트를 이용한 RT-LAMP법 수행 시 최적 반응조건 확립 Establishment of optimal reaction conditions for RT-LAMP method using set
상기 실시예 2에서 제작한 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법의 최적 반응조건을 확립하였다.Optimal reaction conditions of the RT-LAMP method using the primer set of the present invention prepared in Example 2 were established.
구체적으로, RT-LAMP법을 위한 반응액은 1μL의 Bst DNA polymerase(8 U/L, New England Biolabs, USA), 1μL AMV reversed transcriptase(10 U/L, Promega, USA), 2.5μL dNTPs (10 mM), 8μL Betaine(250 mM), 1μL MgSO4, (150 mM), 1μL HNB (3mM, Lemongreen, Shanghai, China) 및 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 프라이머 1μL[각 5 pmol/μL의 외부 프라이머 F3 및 B3(서열번호 1 및 2); 각 20 pmol/μL의 루프 프라이머 LF 및 LB(서열번호 3 및 4); 각 40 pmol/μL의 내부 프라이머 FIP 및 BIP(서열번호 5 및 6)]를 첨가하여 제조하였다. 상기 제조한 반응액에 상기 실시예 1에서 추출한 5μL의 SIV 아형 pH1N1의 RNA 시료를 첨가한 다음, 멸균증류수로 최종 용량을 25μL로 조정하였다. SIV 검출에 적합한 최적 RT-LAMP법 조건을 확립하기 위하여, 공시 바이러스(pH1N1) 배양액으로부터 추출한 RNA을 이용하여 반응온도(45~65℃)와 반응시간(20~50분)을 달리하여 RT-LAMP법을 실시한 다음, 80℃에서 5분간 처리하여 반응액 내의 효소 활성을 제거하였다. 반응이 끝난 튜브의 반응액을 육안으로 관찰하여 색깔 변화를 관찰하는 것으로 양성 여부를 판독하였다(도 2의 (A)). 또한, 2.0% 아가로스 젤에 전기영동을 실시한 다음, 자외선판독기(Bio-Rad, USA)를 이용하여 LAMP 반응에서 특이적으로 나타나는 사다리 모양의 유전자 증폭 밴드 형성 여부를 확인하였다(도 2의 (B)). 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.For the RT-LAMP method, 1 μL of Bst DNA polymerase (8 U / L, New England Biolabs, USA), 1 μL of AMV reversed transcriptase (10 U / L, Promega, USA), 2.5 μL of
도 2는 45~65℃의 반응 온도 조건에서 양성 반응을 확인한 결과로서, (A)는 RT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화를 나타내고, (B)는 전기영동을 실시한 결과를 나타낸 것이다. 레인 1 내지 7은 각 45, 50, 55, 58, 60, 62 및 65℃를 나타낸다. 도 3은 20, 30, 40 및 50분 조건의 반응시간으로 양성 반응을 확인한 결과로서, 레인 1 내지 4는 24, 20, 2-4 및 2-8의 희석 계수를 나타낸다.FIG. 2 shows the result of confirming the positive reaction at a reaction temperature of 45 to 65 ° C. (A) shows the color change of the reaction solution of the tube after RT-LAMP reaction, and (B) will be.
도 2에 나타낸 바와 같이, 반응온도는 55~60℃일때, 양성반응이 나타남을 확인하였다. 구체적으로, 육안으로는 58 및 60℃에서 가장 뚜렷하게 양성반응의 색상 변화를 확인하였다(A). 또한, 전기영동 상으로는 55, 58 및 60℃에서 LAMP 특유의 양성밴드를 확인하였다(B). As shown in FIG. 2, when the reaction temperature was 55 to 60 ° C., it was confirmed that a positive reaction was observed. Specifically, the color change of the positive reaction was observed most visually at 58 and 60 ° C (A). In addition, positive bands unique to LAMP were observed at 55, 58 and 60 ° C in the electrophoresis (B).
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 반응시간은 40분에 양성반응이 뚜렷하게 나타남을 확인하였다. Further, as shown in Fig. 3, it was confirmed that the positive reaction was evident in the reaction time of 40 minutes.
따라서, 이후의 모든 실험은 58℃의 반응온도와 40분의 반응시간으로 반응조건을 고정하여 실시하였다.
Therefore, all subsequent experiments were carried out with fixed reaction conditions at a reaction temperature of 58 ° C and a reaction time of 40 minutes.
실시예Example 4. 본 발명의 4. The 프라이머primer 세트를 이용한 RT-LAMP법 수행 시 RT-LAMP method using set SIVSIV 검출 특이도 분석 Detection specificity analysis
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 RT-LAMP법 진단 시, 돼지 유래 병원체를 제외하고 오직 SIV의 주요 아형을 검출하는지 확인하기 위하여, 실시예 1에서 핵산 추출한 SIV의 아형 4종(H1N1, pH1N1, H1N2, H3N2) 및 돼지 유래 병원체 8종을 대상으로 SIV 검출 특이도를 분석하였다.In order to confirm the detection of only the major subtypes of SIV except the pig-derived pathogen in the RT-LAMP method using the primer set of the present invention, four subtypes of nucleic acid-extracted SIV (H1N1, pH1N1, H1N2 , H3N2) and 8 pig - derived pathogens were analyzed for SIV detection specificity.
구체적으로, 상기 실시예1에서 추출하고 표 1에 개시된 SIV의 아형 4종(H1N1, pH1N1, H1N2, H3N2) 및 돼지 유래 병원체 8종의 핵산에 대하여, 상기 실시예 3에서 확립한 58℃ 및 40분 반응 조건으로 본 발명의 프라이머 세트(서열번호 1 내지 6)를 이용하여 RT-LAMP을 수행하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.Specifically, the nucleotide sequences of the four subtypes (H1N1, pH1N1, H1N2, H3N2) of the SIVs extracted in Example 1 and listed in Table 1 and the eight kinds of pathogen-derived pathogens were determined at 58 ° C and 40 RT-LAMP was carried out using the primer sets (SEQ ID NOS: 1 to 6) of the present invention as reaction conditions. The results are shown in Fig.
도 4의 레인 1은 PRRSV 유전자형 1, 레인 2는 PRRSV 유전자형 2, 레인 3은 돼지콜레라바이러스(classical swine fever virus), 레인 4는 돼지써코바이러스(porcine circovirus type 2), 레인 5는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumoniae), 레인 6은 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 레인 7은 헤모필러스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 레인 8은 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 레인 9는 SIV 아형 H1N1, 레인10은 SIV 아형 pH1N1, 레인 11은 SIV 아형 H1N2, 레인 12는 SIV 아형 H3N2을 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트는 SIV 아형 4종에서만 증폭 반응이 나타남을 확인하였다(레인 9 내지 12). As shown in FIG. 4, it was confirmed that the primer set of the present invention showed amplification reaction only in four SIV subtypes (
따라서, 본 발명의 프라이머 세트를 이용 시, SIV만을 특이적으로 증폭할 수 있음을 확인하였다.
Therefore, it was confirmed that only the SIV can be amplified specifically by using the primer set of the present invention.
실시예Example 5. 본 발명의 5. The 프라이머primer 세트를 이용한 RT-LAMP법과 다른 서열의 RT-LAMP method using different sets of 프라이머를Primer 이용한 RT- The RT- PCRPCR 법 및 Real-time RT-Law and Real-time RT- PCRPCR 법의 Legal SIVSIV 검출 민감도 분석 Detection sensitivity analysis
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법과 다른 서열의 프라이머를 이용한 RT-PCR 및 Real-time RT-PCR법을 수행하여, SIV 검출에 대한 민감도의 차이를 확인하였다.
RT-PCR and real-time RT-PCR using primers of other sequences than the RT-LAMP method using the primer set of the present invention were performed to confirm the difference in sensitivity to SIV detection.
5-1. RT-5-1. RT- PCRPCR 수행 조건 Performance condition
RT-PCR은 Shin 등(J Vet Med Sc 73: 55-63)의 내용을 참고하여, 모든 아형의 SIV를 검출할 수 있는 프라이머 세트(M30F2/08-1 프라이머는 ATGAGYCTTYTAACCGAGGTCGAAACG, M264R3/08-242 프라이머는 TGGACAAANCGTCTACGCTGCAG임)를 이용하였고, 시판 one-step RT-PCR kit(Qiagen, USA)를 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 5μL의 5 X RT-PCR buffer(2.5mM MgCl2 포함), 0.4 mM의 dNTPs, 0.5M의 각 프라이머 및 1μL의 enzyme mix를 첨가한 RT-PCR 반응액에 검사용 RNA template 5μL를 첨가한 다음, 멸균 증류슈로 최종 용량을 25μL로 조정하였다. RT-PCR 반응은 핵산증폭기(Genetech, USA)를 이용하여 50℃에서 30분간의 RT 과정을 거친 다음 95℃에서 15분간 처리하였고, 40 회전의 PCR 과정(변성은 94℃에서 40초, 어닐링은 55℃에서 40초, 연장은 72℃에서 50초로 수행)를 거친 다음, 72℃에서 10분간 최종 반응하였다. RT-PCR 증폭산물을 2.0 % 아가로스 겔에 전기 영동한 후 자외선 판독기(Bio-Rad, USA)로 판독하여 242 bp의 특이 밴드를 확인하였다.
RT-PCR was carried out by using a primer set (M30F2 / 08-1 primer: ATGAGYCTTYTAACCGAGGTCGAAACG, M264R3 / 08-242 primer) capable of detecting all subtypes of SIV by reference to the contents of Shin et al. (J Vet Med Sc 73: 55-63) (TGGACAAANCGTCTACGCTGCAG) and was performed using a commercially available one-step RT-PCR kit (Qiagen, USA). Specifically, 5 μL of 5 × RT-PCR buffer (2.5 mM MgCl 2 ), 0.4 mM dNTPs, 0.5M each primer, and 1 μL enzyme mix were added to the RT-PCR reaction mixture. 5 μL of the RNA template for the test was added to the reaction mixture, and the final volume was adjusted to 25 μL with a sterile distillation shoe. The RT-PCR reaction was carried out using a nucleic acid amplifier (Genetech, USA) for 30 minutes at 50 ° C followed by 15 minutes at 95 ° C, 40 cycles of PCR (denaturation at 94 ° C for 40 seconds, annealing 55 ° C for 40 seconds and extension at 72 ° C for 50 seconds), followed by final reaction at 72 ° C for 10 minutes. RT-PCR amplification products were electrophoresed on a 2.0% agarose gel and read with a UV reader (Bio-Rad, USA) to identify a 242 bp specific band.
5-2. Real-time RT-5-2. Real-time RT- PCRPCR 수행 조건 Performance condition
Real-time RT-PCR은 Kim 등(Virol J 10(2013), 85)의 내용을 참고하여, 모든 아형의 IAV를 검출할 수 있는 프라이머(M-Kr 정방향 프라이머는 AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA, M-Kr 역방향 프라이머는 CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC임) 및 프로브 세트(FAM-TTTGTNTTYACGCTCACCGTGCC-TAMRA) 및 시판 one-step PrimeScriptTM RT-PCR kit(TaKaRa, Japan)를 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 12.5 μL 의 2 X One-Step RT-PCR buffer Ⅲ, 0.5μL 의 TaKaRa Ex TaqTM HS, 0.5 μL의 PrimeScriptTMRT enzyme Mix Ⅱ, 0.4 μM의 각 프라이머 및 0.2 μM 의 프로브를 첨가한 반응액에 검사용 RNA template 5 μL를 첨가한 다음, 멸균증류수로 최종 용량을 25μL로 조정하였다. Real time RT-PCR 반응은 실시간 핵산증폭기(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 42 ℃ 에서 5분간의 RT 과정을 거친 다음, 95 ℃ 에서 10초간 처리하였고, 40 회전의 PCR 과정(denaturation 95℃ 에서 10초, annealing 60℃에서 20초)을 거친 다음, CT값이 38 이상인 경우 음성으로 판독하였다.
Real-time RT-PCR was performed using primers (M-Kr forward primer: AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA, M-Kr reverse primer: SEQ ID NO: 1) capable of detecting all subtypes of IAV CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC) and a probe set (FAM-TTTGTNTTYACGCTCACCGTGCC-TAMRA) and a commercially available one-step PrimeScript RT-PCR kit (TaKaRa, Japan). Specifically, 12.5 μL of 2 × One-Step RT-PCR buffer III, 0.5 μL of TaKaRa Ex TaqTM HS, 0.5 μL of PrimeScript ™ RT enzyme mix II, 0.4 μM of each primer and 0.2 μM of probe were added to the
5-3. 각 진단법의 5-3. Of each diagnostic method SIVSIV 검출 민감도 측정 Detection Sensitivity Measurement
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법과 다른 서열의 프라이머를 이용한 RT-PCR법 및 Real-time RT-PCR법 간의 민감도를 확인하기 위하여 클로닝한 SIV의 matrix 유전자와 공시 바이러스를 희석하여 이용하였고, SIV를 배양한 발육란의 뇨막강액을 이용하여 확인하였다.In order to confirm the sensitivity between the RT-LAMP method using the primer set of the present invention and the RT-PCR method and the real-time RT-PCR method using the primers of other sequences, the cloned SIV matrix gene and the secretory virus were diluted and used, SIV were cultured in the same manner.
구체적으로, 표 1의 SIV의 아형 H1N1의 배양액으로부터 RNA를 추출하여 Hoffmann 등(Arch Virol 146(2001), 2275-2289)의 방법으로 1,027 bp의 매트릭스(matrix) 유전자를 증폭한 다음, PCR purification kit(Inclone, Korea)를 사용하여 정제하였다. 그 후, TOPO vector system(Enzynomics, Korea)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 클로닝한 다음, 시판 추출 kit(inclone, Korea)를 사용하여 플라스미드를 추출하였다. 추출한 플라스미드에 목표 유전자가 올바르게 삽입되었는지 확인하기 위하여 전문업체(Cosmogenetech, Korea)에 유전자염기서열 분석을 의뢰하여 해당 SIV의 매트릭스(matrix) 유전자가 정확히 클로닝되었음을 확인하였다. 정제 플라스미드의 농도를 Nanodroplite(Thermo Scientific, USA)를 이용하여 측정한 다음, Parida 등(J. Mol Diagn 13(2011), 100-107)의 방법에 따라 "플라스미드의 농도(g/μL)/[(플라스미드의 길이 〉660)×(6.022×1023)]"의 수학식으로 매트릭스(matrix) 유전자의 카피수를 측정하였고, 이를 108-100 copy/μL 농도가 되게 하기 위하여, 10배수 단계 희석하였다. 상기 각 희석액을 대상으로 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP는 상기 실시예 3의 반응조건으로, RT-PCR은 상기 5-1의 조건으로, real time RT-PCR는 상기 5-2의 조건으로 각각 실시하여 검출한계를 비교하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.Specifically, RNA was extracted from the culture medium of subtype H1N1 of SIV in Table 1, amplified with a 1,027 bp matrix gene by the method of Hoffmann et al. (Arch Virol 146 (2001), 2275-2289) (Inclone, Korea). Then, the plasmid was extracted using TOPO vector system (Enzynomics, Korea) according to the manufacturer's instructions and then using a commercial kit (inclone, Korea). In order to confirm whether the target gene was inserted correctly into the extracted plasmid, gene sequence analysis was requested by a specialized company (Cosmogenetech, Korea) to confirm that the matrix gene of the corresponding SIV was cloned correctly. The concentration of the plasmid was determined by using Nanodroplite (Thermo Scientific, USA) and then the concentration of the plasmid (g / L) / [ (Length of the plasmid> 660) x (6.022 x 10 23 )], the number of copies of the matrix gene was measured and diluted 10-fold in order to obtain a concentration of 108-100 copies / μL . RT-PCR using the primer set of the present invention was performed under the reaction conditions of Example 3, RT-PCR was performed under the conditions of the above 5-1, real time RT-PCR was performed under the conditions of the above 5-2 Respectively, to compare the detection limits. The results are shown in Fig.
도 5의 (A)는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화를 나타내고, (B)는 전기영동을 실시한 결과를 나타낸 것이다. (C)는 RT-PCR을 실시한 결과이고, (D)는 real time RT-PCR을 실시한 결과이다. 상기 (A) 내지 (D)의 1 내지 9는 클로닝한 아형 H1N1의 matrix 유전자를 10배수 단계 희석한 108 내지 100 copy/μL을 나타낸다. FIG. 5A shows the color change of the reaction solution of the RT-LAMP-reacted tube using the primer set of the present invention, and FIG. 5B shows the result of electrophoresis. (C) is the result of RT-PCR, and (D) is the result of real-time RT-PCR. The (A) to (D) 1 to 9 shows the matrix of gene cloning of a subtype
도 5에 나타낸 바와 같이, 다른 서열의 프라이머를 이용한 RT-LAMP법을 수행할 경우 10 copy/μL까지 검출 가능함을 확인하였다. 반면, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 RT-LAMP법을 수행할 경우, 1 copy/μL까지 검출됨을 확인하여, 기존에 공지된 방법보다 10배 이상 민감도가 높음을 확인하였다.
As shown in FIG. 5, it was confirmed that up to 10 copies / μL could be detected by RT-LAMP using primers of other sequences. On the other hand, when the RT-LAMP method was performed using the primer set of the present invention, it was confirmed that 1 copy / μL was detected, and it was confirmed that the sensitivity was 10 times higher than the known method.
또한, 핵산 추출한 SIV의 아형 4종(H1N1, pH1N1, H1N2, H3N2) 각각을 배양한 발육란의 뇨막강액을 대상으로 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 RT-LAMP법과 다른 서열의 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR법 및 real time RT-PCR법 간의 검출 민감도를 비교하였다. 구체적으로, SIV 아형 4종을 각각 접종한 발육란에서 뇨막강액을 채취한 후, HAT를 실시하여 HA 역가를 26으로 조정한 다음, 4배수로 단계 희석하였다. 그 후, 상기 각 희석액에서 추출한 핵산을 이용하여 RT-LAMP법, RT-PCR법 및 real time RT-PCR법을 실시하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.In addition, RT-LAMP method using the primer set of the present invention and RT-LAMP method using the primer set of different sequences were performed on the urine membrane fluid of the developing field in which the four subtypes of the nucleic acid-extracted SIV (H1N1, pH1N1, H1N2, H3N2) PCR and real-time RT-PCR. Specifically, the urine membrane fluid was collected from the developmental field inoculated with each of the four SIV subtypes, and HAT was performed to adjust the HA activity to 26, followed by stepwise dilution with 4 times. Then, RT-LAMP method, RT-PCR method and real time RT-PCR method were performed using the nucleic acid extracted from each of the above dilutions. The results are shown in Table 3 below.
표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 RT-LAMP법을 수행한 결과, H1N1 아형은 2-12 HA/25 μL, H1N2 아형은 2-10 HA/25μL, H3N2 아형은 2-10 HA/25μL 및 pH1N1 아형은 2-10 HA/25μL까지 명확하게 관찰됨을 확인하였다. 반면, 다른 서열의 프라이머를 이용한 RT-PCR법은 본 발명의 RT-LAMP법보다 각 SIV 아형에 따라 4~16배 낮게 검출됨을 확인하였다.As shown in Table 3, the results of the RT-LAMP method using a primer set of the present invention,
따라서, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 RT-LAMP법을 수행 시, 돼지 유래 병원체 8종을 검출하지 않고 SIV의 아형 4종(H1N1, pH1N1, H1N2, H3N2)만을 정확하게 검출하여 특이도가 높음을 확인하였다. 특히, 본 발명의 프라이머를 세트를 이용하여 RT-LAMP법을 수행할 경우, 기존의 RT-PCR 및 real time RT-PCR법을 이용할 때 보다 민감도가 더 높음을 확인하였다.Therefore, when the RT-LAMP method is performed using the primer set of the present invention, only the four subtypes of the SIV (H1N1, pH1N1, H1N2, H3N2) are detected without detecting 8 pig-derived pathogens and the specificity is high Respectively. In particular, when the RT-LAMP method was performed using the primer set of the present invention, it was confirmed that the sensitivity was higher than that using the conventional RT-PCR or real time RT-PCR method.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Compositions for detecting swine influenza virus and method for detecting swine influenza virus using the same <130> 1-269 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Outer Primer SIV-F3 <400> 1 agtcttctaa ccgaggtcga 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Outer Primer SIV-B3 <400> 2 tgcagtcctc gctcactg 18 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> loop primer SIV-LF <400> 3 gcaaagacat cttcaagtct ctgc 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> loop primer SIV-LB <400> 4 gactaagggg attttagggt ttgt 24 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> inner primer SIV-FIP(F1c+F2) <400> 5 acatcttcaa gtctctgcgc gatcacgttc tctctatcgt cccg 44 <210> 6 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> inner primer SIV-BIP(B1+B2c) <400> 6 agacaagacc aatcctgtca cctcttgcag tcctcgctca ctg 43 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV-F1c primer <400> 7 acatcttcaa gtctctgcgc gatc 24 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV-F2 primer <400> 8 acgttctctc tatcgtcccg 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV-B1 primer <400> 9 agacaagacc aatcctgtca cctct 25 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV-B2c primer <400> 10 tgcagtcctc gctcactg 18 <110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Compositions for detecting swine influenza virus and method for detecting swine influenza virus using the same <130> 1-269 <160> 10 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Outer Primer SIV-F3 <400> 1 agtcttctaa ccgaggtcga 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Outer Primer SIV-B3 <400> 2 tgcagtcctc gctcactg 18 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> loop primer SIV-LF <400> 3 gcaaagacat cttcaagtct ctgc 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> loop primer SIV-LB <400> 4 gactaagggg attttagggt ttgt 24 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Inner primer SIV-FIP (F1c + F2) <400> 5 acatcttcaa gtctctgcgc gatcacgttc tctctatcgt cccg 44 <210> 6 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > inner primer SIV-BIP (B1 + B2c) <400> 6 agacaagacc aatcctgtca cctcttgcag tcctcgctca ctg 43 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV-F1c primer <400> 7 acatcttcaa gtctctgcgc gatc 24 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV-F2 primer <400> 8 acgttctctc tatcgtcccg 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV-B1 primer <400> 9 agacaagacc aatcctgtca cctct 25 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV-B2c primer <400> 10 tgcagtcctc gctcactg 18
Claims (11)
상기 프라이머 세트는 RT-LAMP(Reverse Rranscription-Loop Mediated Isothermal Amplification)용인 것을 특징으로 하는 돼지인플루엔자바이러스 검출용 프라이머 세트.The method according to claim 1,
Wherein the primer set is for RT-LAMP (Reverse Transcription-Loop Mediated Isothermal Amplification) primer set for swine influenza virus detection.
상기 프라이머 세트는 H1N1, pH1N1, H1N2 및 H3N2으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 돼지인플루엔자바이러스 아형(subtype)을 검출하는 것을 특징으로 하는 돼지인플루엔자바이러스 검출용 프라이머 세트.The method according to claim 1,
Wherein the primer set detects at least one porcine influenza virus subtype selected from the group consisting of H1N1, pH1N1, H1N2 and H3N2.
상기 프라이머 세트는 돼지인플루엔자바이러스의 매트릭스(matrix) 유전자를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 돼지인플루엔자바이러스 검출용 프라이머 세트.The method according to claim 1,
Wherein the primer set is targeted to a matrix gene of swine influenza virus.
(2) 상기 (1)의 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및, 서열번호 5 및 6으로 이루어진 제3프라이머 세트;를 이용하여 등온 증폭 반응을 수행한 후, 등온 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 돼지인플루엔자바이러스 검출 방법. (1) extracting RNA of a sample; And
(2) a first primer set consisting of SEQ ID NOS: 1 and 2, using the RNA of (1) as a template; A second primer set consisting of SEQ ID NOS: 3 and 4; And a third primer set consisting of SEQ ID NOS: 5 and 6, and then detecting the isothermal amplification product of the swine influenza virus.
상기 (1) 단계의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 돼지인플루엔자바이러스 검출 방법. 8. The method of claim 7,
Wherein the sample of step (1) is at least one selected from the group consisting of tissue, blood, saliva, urine, and body fluids.
상기 (2) 단계의 등온 증폭 반응은 45 내지 65℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 돼지인플루엔자바이러스 검출 방법. 8. The method of claim 7,
Wherein the isothermal amplification reaction in step (2) is performed at 45 to 65 ° C.
상기 (2) 단계의 등온 증폭 반응은 RT-LAMP를 수행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 돼지인플루엔자바이러스 검출 방법.8. The method of claim 7,
Wherein the isothermal amplification reaction in step (2) is performed by RT-LAMP.
상기 (2) 단계의 검출은 겔 전기영동, 반응산물의 탁도 측정, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 발색 지시제 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수행하는 것을 특징으로 하는 돼지인플루엔자바이러스 검출 방법.
8. The method of claim 7,
Wherein the detection of step (2) is carried out with at least one member selected from the group consisting of gel electrophoresis, turbidity measurement of reaction products, radioactivity measurement, fluorescence measurement, phosphorescence measurement and color development indicator measurement. Way.
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|---|---|---|---|---|
| KR20230118753A (en) | 2022-02-04 | 2023-08-14 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | Diagnostic kit and diagnostic method capable of distinguishing HA and NA genotypes of Swine influenza virus |
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Parida 등. JMD. Vol. 13, No. 1, 페이지 100-107 (2011.01.) |
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| KR20230118752A (en) | 2022-02-04 | 2023-08-14 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | Diagnostic kit and diagnostic method capable of distinguishing major genotypes of Swine influenza virus |
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