Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

KR102706554B1 - 선택적 TREG 자극제 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물 - Google Patents

선택적 TREG 자극제 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102706554B1
KR102706554B1 KR1020207033346A KR20207033346A KR102706554B1 KR 102706554 B1 KR102706554 B1 KR 102706554B1 KR 1020207033346 A KR1020207033346 A KR 1020207033346A KR 20207033346 A KR20207033346 A KR 20207033346A KR 102706554 B1 KR102706554 B1 KR 102706554B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pegylated
rur
conjugate
pharmaceutical composition
composition
Prior art date
Application number
KR1020207033346A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210002577A (ko
Inventor
피터 베네딕트 커크
존 엘 랭고우스키
조나단 잘레브스키
Original Assignee
넥타르 테라퓨틱스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 넥타르 테라퓨틱스 filed Critical 넥타르 테라퓨틱스
Priority to KR1020247030258A priority Critical patent/KR20240137713A/ko
Publication of KR20210002577A publication Critical patent/KR20210002577A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102706554B1 publication Critical patent/KR102706554B1/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

본 개시내용은 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물, 및 예를 들어, 자가면역 질환, 및/또는 이펙터 T 세포에 비해 조절성 T 세포의 수 및 활성화에서의 선택적 증가를 제공하는데 효과적인 요법에 반응하는 다른 상태를 치료하기 위해 이들 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

선택적 TREG 자극제 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물
본 출원은 이펙터 T 세포에 비해 조절성 T 세포의 수 및 활성화를 선택적으로 증가시키는 장기 작용 인터류킨-2 수용체 (IL-2 R) 효능제 Treg 자극제 조성물, 및 자가면역 및 염증성 질환, 및/또는 Treg 자극 요법에 반응하는 다른 상태의 치료에서 이들 Treg 자극제 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 선택적 Treg 자극제 조성물 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물, 및 그의 제조 방법, 그의 제형, 및 자가면역 질환 및 염증성 장애의 치료를 위해 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
면역 체계는 감염성 유기체에 의한 침입에 대한 신체의 주요 방어선이다. 정상적으로 기능하는 면역 체계에서 면역 반응은 자기-항원에 대해서는 일어나지 않으며; 이를 자기-관용이라고 한다. 자가면역 질환은 자기-항원에 대한 관용 상실로 인해 신체 조직이 신체 자신의 면역 체계에 의해 공격을 받을 때 발생한다 (Dejaco, C., et al., Immunology. 2006; 117(3): 289-300). 자가면역 질환을 갖는 대상체에서, 신체 조직은 항원-특이적 세포독성 T 세포 또는 자가-항체에 의해 파괴되며, 여기서 동반하는 염증은 기능 장애 및 일부 경우에 사망을 초래할 수 있다. 자가면역 질환은 인구의 대략 6 퍼센트에 영향을 미치는 광범위한 증상을 갖는 이질적 질환의 모음이다 (Siatskas, C., et al., Curr Gene Ther. 2006; 6(1): 45-58). 자가면역 질환의 임상적 특징은 매우 다양하지만, 면역-매개 메카니즘은 표적 항원에 대한 적응 면역 반응의 생성과 연관이 있다 (Kuby, J., 1994: Autoimmunity. Immunology, 2nd ed., p 445-467. WH Freeman and Company, New York).
다양한 통상적 치료, 예컨대 코르티코스테로이드, 시클로포스파미드, 아자티오프린 및 메토트렉세이트가 자가면역 질환을 갖는 일부 환자에서 약간 효과적이었지만, 균일하게 효과적이지 않고 부작용 및 독성과 연관이 있다 (Jantunen, E., et al., Bone Marrow Transplant. 2000; 25(4): 351-6). 이러한 통상적 접근법은 자가반응성 면역과 연관된 근본적인 병리를 해결하지 못한다.
최근 자가면역 질환의 병태생리학에 대한 이해가 발전함에 따라, 세포 또는 분자 표적에 초점을 맞춘 잠재적인 새로운 요법이 개발되었고 현재 평가되고 있다. 자가면역 질환의 병인은 공지되어 있지 않지만, 유전 인자, 부적절한 면역 조절, 및 호르몬 및 환경 인자 간의 잠재적인 상호작용으로 유발되는 것으로 여겨진다. 격리된 항원, 분자 모방, MHC 클래스 II 분자의 불규칙 발현, 시토카인 불균형, 이디오타입 네트워크 조절 경로의 기능장애, 일반적인 조절성 T 세포 결함, 및 폴리클로날 B 세포 활성화를 포함하여 자가면역 질환의 유도를 위한 다양한 메카니즘이 제안되었다 (Kuby, 1994, ibid). B 세포 고갈, 항-시토카인 요법 및 줄기 세포 요법을 포함하여 자가면역 질환의 치료를 위해 여러 접근법이 연구되어 왔지만, 이들 접근법은 효능, 안전성 및/또는 바람직하지 않은 부작용과 관련하여 단점을 갖는다. 자가면역 질환을 치료하기 위한 통상적 요법은 전반적인 면역 체계를 저해함으로써 기능하며, 이에 의해 감염 및 다른 심각한 부작용의 상당한 위험을 초래한다. 그러므로, 자가면역 질환의 치료를 위한 효능, 안전성 및/또는 내약성의 개선된 조합을 제공하기 위한 추가 치료법이 여전히 필요하다.
수년 동안, 자가면역 반응에서의 IL-2의 역할은 프로-염증성 시토카인으로 확립되었다. 그러나, 보다 최근의 연구는 IL-2가 특정 조건 하에 만성 자가면역 염증에 보호 역할을 할 수 있음을 시사하였다. 특히, 조절성 T 세포 (Treg) 및 이펙터 T 세포 (Teff) 사이의 붕괴된 균형은 다양한 자가면역 질환의 공통적인 특징으로 확인되었으며, 이러한 붕괴된 균형은 항상성 시토카인, 예컨대 IL-2에 의해 영향을 받는 것으로 고려된다. 그의 약동학 프로파일로 인해 자가면역 요법을 위한 비변형된 IL-2의 투여는 빈번한 매일 또는 격일 투여를 필요로 하며, 이는 종종 고통스러운 주사 부위 반응을 동반한다. 더욱이, 빈번한 주사에 대한 필요성은 종종 불쾌감 및 불편함으로 인해 불량한 환자 순응도를 동반한다. IL-2의 장기간 반복된 투여는 또한 IL-2의 원치않는 다면발현성 및 전신 활성의 상승된 위험 및 연관된 위험 및 유해 효과를 동반한다. 또한, 제한된 치료 창으로 인해, 면역 항상성 및 원하는 Treg/Teff 균형의 유지를 달성하기 위한 비변형된 IL-2의 사용은 장기간에 걸쳐 달성할 수 없는 경우에는 어려운 것으로 입증될 수 있다. 또한, 자가면역 질환 요법을 위한 그의 좁은 치료 경계는 극히 저용량의 IL-2의 투여를 필요로 하며, 이에 의해 그의 효능에 유해한 영향을 미친다. 저용량 IL-2가 일부 임상적 이점을 위해 Treg를 자극하는데 사용될 수 있지만, 유해 사건은 용량-제한적이며, Treg 증가는 보통이고 수명이 짧다. 예를 들어, 자가면역 질환 요법을 위한 비변형된 IL-2의 투여는 IL-5에서의 바람직하지 않은 증가 및 호산구 수준의 후속적 상승을 유도하며, 이는 염증을 유발할 수 있다. 그러므로, 다양한 자가면역 질환에서 조절성 T 세포 및 이펙터 T 세포 활성의 질환 완화 균형을 촉진하는 방식으로 IL-2 신호전달을 선택적으로 조정할 수 있는 작용제가 여전히 필요하다.
특정한 자가면역 질환은 손상된 IL-2 생성 및/또는 조절성 T 세포 결핍을 포함하는 근본적인 병인병리를 가지며, 이는 질환 발병 이전의 면역학적 메카니즘으로 연루되어 있다. 자가면역 증상을 효과적으로 감소시키고, 삶의 질을 개선하고, 바람직하게는 다양한 자가면역 질환에서 연장된 관해를 제공하기 위한 대안적이고 보다 효과적인 치료 조성물 및 치료 레지멘에 대한 필요성이 남아있다. 본 개시내용은 만성 자가면역 질환을 치료하기 위한 현재 옵션의 제한된 이용가능성 및 관련 단점을 다룬다.
본 개시내용은 선택적 Treg 자극제 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물의 발견에 기초한다. RUR20kD-IL-2의 선택적 Treg 자극제 조성물은 정의된 이질성의 IL-2-PEG 접합체 혼합물이다. 이는 다른 면역 세포에 미치는 영향을 최소화하면서 Treg 항상성을 선택적으로 복원하기 위한 저용량 피하 투여용으로 의도된다. RUR20kD-IL-2 선택적 Treg 자극제 조성물은 20kDa 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 안정적으로 공유결합으로 접합된 재조합 인간 인터류킨-2 (rhIL-2, 및 특히 추가의 아미노산 돌연변이 또는 치환을 갖지 않는 알데스류킨 아미노산 서열)를 포함하는 접합체의 혼합물이며, 여기서 혼합물은 IL-2 모이어티당 특정 정도의 PEG화를 갖는 정의된 분획을 갖는다. 본 개시내용의 조성물은 우세하게 디-PEG화 및 트리-PEG화 IL-2의 정의된 분획, 및 모노-PEG화 IL-2 및/또는 테트라 이상의 PEG화 IL-2의 정의된 더 적은 분획을 갖는 IL-2 PEG 접합체의 선택된 혼합물을 포함한다. 특히, 본 개시내용의 조성물은 선택적 Treg 자극제 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물, 그의 제조 방법, 그의 제형, 및 자가면역 질환 및 염증성 장애의 치료를 위해 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. RUR20kD-IL-2 조성물은 항원 특이적 T 조절성 세포를 활성화시키고 확장함으로써 면역 염증성 장애에서 지속적인 반응을 유도한다. RUR20kD-IL-2 조성물의 저용량 피하 투여에 의한 자가면역 장애의 치료는 통상적 T 세포 기능에 미치는 영향을 최소화하면서 Treg 항상성을 선택적으로 복원하는 수단을 제공하여, 이에 의해 이들 장애를 경감시키기 위한 대안 및/또는 개선된 접근법을 제공할 수 있다.
도 1A 및 1B는 RUR20kD-IL-2 조성물의 일반적인 조성을 예시하는 대표적인 역상 HPLC 플롯이며, 그의 제조는 실시예 1 및 1A에 기재되어 있다. x-축 (용출 시간, 분)을 따라 왼쪽에서 오른쪽으로 이동하여, 정제된 접합체 조성물은 주로 디-PEG화 및 트리-PEG화 rIL-2를 포함한다.
도 2는 알데스류킨 (125-L-세린-2-133 인터류킨-2, 이. 콜라이(E. coli)에서 발현된 재조합 비-글리코실화된 인터류킨-2)의 아미노산 서열이다.
도 3A 및 3B는 실시예 2에 기재된 바와 같이 마우스에서 RUR20kD-IL-2 조성물의 단일-용량의 투여 후 혈액 (도 3A) 및 비장 (도 3B)에서 마우스 Treg의 약력학적 분석의 결과를 나타내는 플롯이다.
도 4A, 4B 및 4C는 실시예 2에 기재된 바와 같이 마우스에서 RUR20kD-IL-2 조성물의 단일-용량의 투여 후 혈액에서 NK 세포, CD4 T 세포 및 CD8 T 세포 각각의 수준을 제시하는 플롯이다.
도 5A 및 5B는 실시예 2에 기재된 바와 같이 마우스에서 RUR20kD-IL-2 조성물의 단일-용량의 투여 후 CD25 및 Foxp3의 평균 형광 세기 (MFI)에 의해 측정된 바와 같은 Treg 기능 및 활성의 플롯이다.
도 6A-D는 실시예 3에 기재된 바와 같이 시험관내 Treg 저해 검정에서 1일 및 4일에 비히클 처리된 마우스로부터 단리된 비장 Treg의 플롯이다.
도 7은 실시예 3에 기재된 바와 같이 시간 경과에 따라 평가된 1:2의 비로 Tcon (통상적 T 세포)과 함께 배양된 단리된 Treg의 상대적 저해 능력을 나타내는 플롯이다.
도 8A 및 8B는 RUR20kD-IL-2 조성물로 처리된 마우스에서 귀 부종 정도를 나타내고; 실시예 4에 기재된 바와 같이 지연형 과민증 (DTH)의 마우스 모델에서 T-세포 항원-유도 염증을 저해하는 RUR20kD-IL-2 투여에 의한 Treg 유도의 능력을 평가하기 위해 연구를 수행하였다.
도 9A-C는 실시예 5에 기재된 바와 같이 시노몰구스 원숭이에서 RUR20kD-IL-2 조성물의 단일 용량의 투여 후 혈액 중 Treg 수준 (각각 CD4, CD25, FOXP3)의 플롯이다.
도 10A 및 10B는 실시예 7에 기재된 바와 같이 마우스에서 RUR20kD-IL-2 조성물 또는 비변형된 IL-2 (알데스류킨)의 투여 후 마우스 Treg의 약력학적 분석 결과를 나타내는 플롯이다.
도 11은 실시예 8에 상세히 기재된 바와 같이 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)의 마우스 모델에서 평가될 때 RUR20kD-IL-2 조성물 (0.3 mg/kg)이 투여된 마우스에 대한 시간 경과에 따른 소변 단백질 수준 (g/L)의 플롯이다.
도 12는 RUR20kD-IL-2 조성물의 다양한 투여량의 단일 투여 후 시간 (일) 경과에 따른 말초 혈액 (세포/μL) 샘플 중 CD4+FoxP3+CD25bright Treg의 약력학적 분석 결과를 나타내는 플롯이다.
도 13은 실시예 10에 기재된 바와 같이 인간 대상체에게 RUR20kD-IL-2 조성물의 다양한 투여량의 단일 투여 후 시간 (일) 경과에 따른 말초 혈액 (세포/μL) 샘플 중 총 CD4+FoxP3+CD25+ Treg의 약력학적 분석 결과를 나타내는 플롯이다.
도 14A-D는 실시예 10에 기재된 바와 같이 인간 대상체에게 RUR20kD-IL-2 조성물의 다양한 투여량의 단일 투여 후 시간 (일) 경과에 따른 말초 혈액 샘플 중 CD3 세포의 백분율로 표시된 Tcon 세포 집단, CD4+ (도 14A) 및 CD8+ Tcon 세포 (도 14B)의 플롯이다. 도 14C 및 14D는 실시예 10에 기재된 바와 같이 인간 대상체에게 RUR20kD-IL-2 조성물의 다양한 투여량의 단일 투여 후 시간 (일) 경과에 따른 말초 혈액 샘플 중 CD8+ T 세포 (세포/μL) 및 Ki67+CD8+ T 세포 (CD8의 백분율로 표시됨)의 수를 각각 예시하는 플롯이다.
도 15A, 15B는 유동 세포계측법을 사용하여 열거된 CD25bright+/FoxP3+ Treg의 플롯이다. 실시예 10에 기재된 바와 같이 RUR20kD-IL-2의 다양한 투여량의 단일 투여에 의한 치료전 및 치료후 다수의 시점에 인간 대상체로부터 전혈을 수집하였다. 도 15A는 CD25bright+/FoxP3+ Treg의 수 (세포/μl)에 대한 각각의 투여량에 대한 중위수 피크 효과를 예시하는 반면, 도 15B는 치료 후 시간 (일) 경과에 따른 CD25bright+/FoxP3+ Treg의 절대 수를 제공한다.
도 16A, 16B는 유동 세포계측법을 사용하여 열거된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 각각의 플롯이다. 실시예 10에 기재된 바와 같이 RUR20kD-IL-2의 다양한 투여량의 단일 투여에 의한 치료전 및 치료후 다수의 시점에 인간 대상체로부터 전혈을 수집하였다. 결과는 치료전 값에 기초하여 계산된 각각의 세포 집단의 비 (%) 및 배수 변화로서 나타낸다.
도 17A, 17B는 유동 세포계측법을 사용하여 열거된 Treg 대 Tcon 용량-반응 비 (도 17A), 및 CD25bright+/FoxP3+ Treg 및 CD8+ T 세포 (도 17B)의 플롯이다. 실시예 10에 기재된 바와 같이 RUR20kD-IL-2의 다양한 투여량의 단일 투여에 의한 치료전 및 치료후 다수의 시점에 인간 대상체로부터 전혈을 수집하였다. 결과는 치료전 값에 기초하여 계산된 각각의 세포 집단의 비 (%) 및 배수 변화로서 나타낸다. Tcon 세포는 CD8+ T 세포이다.
본 개시내용은 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물을 제공한다. 일반적으로, 본원에 제공된 화학적으로 변형된 IL-2 접합체 조성물은 그의 아미노 기를 통해 IL-2에 안정적으로 공유결합으로 연결된 특정하고 우세한 수의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 갖는 것으로 특징으로 한다. 본원에 제공된 조성물은 우세하게 디-PEG화 및 트리-PEG화 IL-2의 정의된 분획, 및 모노-PEG화 IL-2 및/또는 테트라 이상의 PEG화 IL-2의 정의된 더 적은 분획을 갖는 IL-2 PEG 접합체의 선택된 혼합물을 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 하기 구조를 갖는 PEG화 IL-2 접합체를 포함하는 조성물을 제공한다:
Figure 112020124239333-pct00001
여기서:
IL-2는 인터류킨-2이고;
n은 각각의 경우에 독립적으로 약 3 내지 약 4000의 정수이다.
상기 조성물의 특정한 실시양태에서, IL-2는 알데스류킨이다. 상기 조성물의 특정한 실시양태에서, 각각의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 공칭 평균 분자량은 약 20,000 달톤이다. 상기 조성물의 추가 특정한 실시양태에서, 조성물의 PEG화 IL-2 접합체는 리신 31에 부착된 PEG 모이어티를 갖는다.
한 측면에서, 하기 화학식의 접합체를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다:
Figure 112020124239333-pct00002
여기서 IL-2는 인터류킨-2이고, n은 약 3 내지 약 4000의 정수이고, n'는 2 및 3이다. 화학식 (I)의 중합체 부분은 또한 1,3-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜) MW 10,000 카르바모일)-2-프로판옥시)-4-부타노일 (IL-2 모이어티의 아미노 질소에 공유결합으로 부착된 카르보닐 기까지 포함)로 지칭된다. 화학식 (I)에 따른 혼합물 조성물은 일반적으로 본원에서 일정 범위의 PEG 크기를 포괄하는 RUR-IL2로 지칭된다. n의 예시적인 범위는 예를 들어, 약 3 내지 약 4000에 추가하여, 약 5-2000, 또는 약 10-1000, 또는 약 10-750, 또는 약 10-500, 또는 약 10-400, 또는 약 10-300, 또는 약 10-250, 또는 약 20-250을 포함한다. 일부 실시양태에서, n은 평균 약 226이다.
또 다른 측면에서, 하기 화학식의 조성물이 본원에 제공된다:
Figure 112020124239333-pct00003
여기서 IL-2는 인터류킨-2이고, n은 약 3 내지 약 4000의 정수이고, n'는 1 및 2 및 3이다.
일부 실시양태에서, 화학식 I의 선택적 Treg 자극제 조성물은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티와 안정적으로 공유결합으로-연결된 IL-2R을 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티당 분지형 PEG 모이어티의 수 (PEG화 정도)는 1-mer (모노-PEG화) 및 4-mer (테트라-PEG화)를 포함하는 소량의 분획과 혼합물 중 우세하게 2 및 3-mer (디- 및 트리- PEG화)의 분포이다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 화학식 I에 따른 조성물 중 소량의 분획은 n'가 1, 4, 5 이상이지만 11 이하인 접합체를 포함할 것이다.
예를 들어, 한 실시양태에서 선택적 Treg 자극제 조성물은 하기 구조에 포괄된다:
Figure 112020124239333-pct00004
여기서 IL-2는 IL-2의 아미노산 잔기 중 하나이고, 구조 (Ib)에 제시된 "NH"는 상기 IL-2 잔기의 아미노 기이고; 여기서 "n"은 약 3 내지 약 4000의 정수이고; n'는 2 및 3이다.
일부 실시양태에서 RUR20kD-IL-2로 지칭되는 선택적 Treg 자극제 조성물 및 관련 조성물이 본원에 제공된다. 이들 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 총 약 20 kD의 공칭 분자량을 갖는 개별 공유결합 PEG 부착을 갖는 IL-2 접합체를 포함한다. 바람직하게는, IL-2 모이어티는 알데스류킨이다. 이들 조성물은 우세하게 디-PEG화 및 트리-PEG화 IL-2의 정의된 분획, 및 모노-PEG화 IL-2 및/또는 테트라 이상의 PEG화 IL-2의 정의된 더 적은 분획을 갖는 IL-2 PEG 접합체의 선택된 혼합물을 추가로 포함한다. RUR20kD-IL-2 조성물의 특정한 제제는 하기 및 본 출원 전반에 걸쳐 기재되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 포뮬라 A의 RUR20kD-IL-2의 조성물, 포뮬라 B의 RUR20kD-IL-2의 조성물, 포뮬라 C의 RUR20kD-IL-2의 조성물, 포뮬라 D의 RUR20kD-IL-2의 조성물, 및/또는 포뮬라 E의 RUR20kD-IL-2의 조성물은 선택적 Treg 자극제 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물의 특정 실시양태를 나타내고, 이들 실시양태에서 IL-2 모이어티는 알데스류킨 (본원에 기재된 바와 같음)이다. 임의로 이들 조성물은 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.
한 실시양태에서, 포뮬라 A의 RUR20kD-IL-2의 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 조성물은, 몰 기준으로, 약 5 mol% 이하의 모노-PEG화 IL-2 접합체, 및 약 28 mol% 내지 약 60 mol% 디-PEG화 IL-2 접합체, 및 약 24 mol% 내지 약 65 mol% 트리-PEG화 IL-2 접합체, 및 약 12 mol% 이하의 고급 PEG화 IL-2 접합체를 포함하고, 여기서 각각의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 공칭 평균 분자량은 약 20,000 달톤이다. 바람직하게는 포뮬라 A의 RUR20kD-IL-2의 조성물은 80 mol% 이상의 조합된 디- 및 트리-PEG화 IL-2 접합체를 포함한다.
한 실시양태에서, 포뮬라 B의 RUR20kD-IL-2의 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 조성물은, 몰 기준으로, 약 2.5 내지 약 4.5 mol% 모노-PEG화 IL-2 접합체, 및 약 35 내지 약 50 mol% 디-PEG화 IL-2 접합체, 및 약 38 내지 약 46 mol% 트리-PEG화 IL-2 접합체, 및 약 3 내지 약 10 mol% 고급 PEG화 IL-2 접합체를 포함하고, 여기서 각각의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 공칭 평균 분자량은 약 20,000 달톤이다. 바람직하게는 포뮬라 B의 RUR20kD-IL-2의 조성물은 약 80 내지 약 95 mol%의 조합된 총 디-PEG화 및 트리-PEG화 IL-2 접합체를 포함한다.
한 실시양태에서, 포뮬라 C의 RUR20kD-IL-2의 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 조성물은, 몰 기준으로, 약 2.8 내지 약 3.8 mol% 모노-PEG화 IL-2 접합체, 및 약 44 내지 약 48 mol% 디-PEG화 IL-2 접합체, 및 약 41 내지 약 44 mol% 트리-PEG화 IL-2 접합체, 및 약 7 내지 약 9 mol% 고급 PEG화 IL-2 접합체를 포함하고, 여기서 각각의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 공칭 평균 분자량은 약 20,000 달톤이다. 바람직하게는 포뮬라 C의 RUR20kD-IL-2의 조성물은 약 87 내지 약 90 mol%의 조합된 총 디-PEG화 및 트리-PEG화 IL-2 접합체를 포함한다.
한 실시양태에서, 포뮬라 D의 RUR20kD-IL-2의 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 조성물은, 몰 기준으로, 약 2.8 내지 약 3.8 mol% 모노-PEG화 IL-2 접합체, 및 약 44 내지 약 48 mol% 디-PEG화 IL-2 접합체, 및 약 41 내지 약 44 mol% 트리-PEG화 IL-2 접합체, 및 약 7 내지 약 9 mol% 고급 PEG화 IL-2 접합체를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 리신 K7 또는 K8 또는 K31 또는 K75 중 하나에 부착된 PEG 모이어티를 갖는 모노-PEG화 IL-2 접합체의 혼합물을 포함하고, 여기서 각각의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 공칭 평균 분자량은 약 20,000 달톤이다. 바람직하게는 포뮬라 D의 RUR20kD-IL-2의 조성물은 약 87 내지 약 90 mol%의 조합된 총 디-PEG화 및 트리-PEG화 IL-2 접합체를 포함한다.
한 실시양태에서, 포뮬라 E의 RUR20kD-IL-2의 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 조성물은, 몰 기준으로, 약 2.8 내지 약 3.8 mol% 모노-PEG화 IL-2 접합체, 및 약 44 내지 약 48 mol% 디-PEG화 IL-2 접합체, 및 약 41 내지 약 44 mol% 트리-PEG화 IL-2 접합체, 및 약 7 내지 약 9 mol% 고급 PEG화 IL-2 접합체를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 리신 K7에 부착된 PEG 모이어티를 갖는 모노-PEG화 IL-2 접합체를 포함하고, 여기서 각각의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 공칭 평균 분자량은 약 20,000 달톤이다. 바람직하게는 포뮬라 E의 RUR20kD-IL-2의 조성물은 약 87 내지 약 90 mol%의 조합된 총 디-PEG화 및 트리-PEG화 IL-2 접합체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물"은 포뮬라 A의 RUR20kD-IL-2, 및/또는 포뮬라 B의 RUR20kD-IL-2, 및/또는 포뮬라 C의 RUR20kD-IL-2, 및/또는 포뮬라 D의 RUR20kD-IL-2, 및/또는 포뮬라 E의 RUR20kD-IL-2 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 조성물, 및/또는 이들 조성물의 제약상 허용되는 염을 지칭할 수 있다. 실시예 1 및/또는 실시예 1A의 제조는 본 개시내용의 "RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물"의 비제한적인 예이다.
본원에 제공된 선택적 Treg 자극제 조성물의 추가 실시양태:
본원에 제공된 조성물은 n이 2인 접합체, 예를 들어, 디-PEG화 접합체를 포함할 수 있으며, 여기서 각각 상기 제시된 1,3-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)10kD카르바모일)-2-프로판옥시)-4-부타노일 구조를 갖는 2개의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 중합체는 조성물에서 실질적으로 모든 디-PEG화 IL-2 접합체에 대한 동일한 상대적 위치에 부착된다. 대안적으로, 디-PEG화 접합체는 디-PEG화 접합체의 혼합물, 예를 들어, 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 부착이 IL-2 상의 2개의 부위에서 발생하고 특정한 부착 부위가 조성물에 포함된 모든 디-PEG화 IL-2 접합체에 대해 동일하지 않은 디-PEG화 접합체의 혼합물을 포함할 수 있다. 그러므로, 이러한 디-PEG화 조성물은 PEG화 정도, 특히 부착된 분지형 PEG 모이어티의 수 (예를 들어, 2-mer) 측면에서 동질적이지만, IL-2 분자 상의 PEG 부착 위치 측면에서 이질적이고, 이 경우 PEG 부착의 위치 이성질체를 나타낸다.
조성물은 또한 n이 3인 단일 접합체, 예를 들어, 트리-PEG화 접합체를 포함할 수 있으며, 여기서 3개의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 조성물에서 실질적으로 모든 IL-2 접합체에 대한 동일한 상대적 위치에 부착된다. 대안적으로, 트리-PEG화 접합체는 트리-PEG화 접합체의 혼합물, 예를 들어, 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 부착 부위가 조성물에 포함된 접합체에 대한 IL-2 상의 상이한 부위에서 발생하는 트리-PEG화 접합체의 혼합물을 포함할 수 있다. 그러므로, 이러한 트리-PEG화 조성물은 PEG화 정도, 특히 부착된 분지형 PEG 모이어티의 수 측면에서 동질적이지만, IL-2 분자 상의 PEG 부착 위치 측면에서 이질적이고, 이 경우 PEG 부착의 위치 이성질체를 나타낸다.
조성물은 또한 n이 1인 단일 접합체, 예를 들어, 모노-PEG화 접합체를 포함할 수 있으며, 여기서 1개의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 조성물에서 실질적으로 모든 IL-2 접합체에 대한 동일한 상대적 위치에 부착된다. 대안적으로, 모노-PEG화 접합체는 모노-PEG화 접합체의 혼합물, 예를 들어, 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 부착 부위가 조성물에 포함된 접합체에 대한 IL-2 상의 상이한 부위에서 발생하는 모노-PEG화 접합체의 혼합물을 포함할 수 있다. 그러므로, 이러한 모노-PEG화 조성물은 PEG화 정도, 특히 부착된 분지형 PEG 모이어티의 수 측면에서 동질적이지만, IL-2 분자 상의 PEG 부착 위치 측면에서 이질적이고, 이 경우 PEG 부착의 위치 이성질체를 나타낸다.
IL-2 분자 상의 PEG 부착의 특정 위치가 본원에 기재된 조성물에서 더 우세하다. 예를 들어, 리신 K7 또는 K8 또는 K31 또는 K75는 일반적으로 PEG화된 부위이다. RUR20kD-IL-2의 조성물 및 관련 조성물은 리신 K7 또는 K8 또는 K31 또는 K75가 PEG화된 부위인 접합체를 포함할 수 있다. RUR20kD-IL-2의 조성물 및 관련 조성물은 리신 K7 또는 K8 또는 K31 또는 K75가 PEG화된 부위인 모노-PEG화 접합체를 포함할 수 있다. RUR20kD-IL-2의 조성물 및 관련 조성물은 리신 K7이 PEG화된 부위인 모노-PEG화 접합체를 포함할 수 있다. RUR20kD-IL-2의 조성물 및 관련 조성물은 리신 K31이 PEG화된 부위인 모노-PEG화 접합체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은, 총괄적으로 고려 시, 화학식 (I)에 의해 포괄되는 접합체를 약 20 mol% 이하, 및 바람직하게는 약 15 mol% 이하로 함유하며, 여기서 n'는 1, 4, 5로부터 선택된 정수, 또는 5 초과의 정수이고, 몰 백분율은 총 PEG-IL-2 접합체를 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 조성물은, 총괄적으로 고려 시, 화학식 (I)에 의해 포괄되는 접합체를 약 10 mol% 이하로 함유하며, 여기서 n'는 1, 4, 5로부터 선택된 정수, 또는 5 초과의 정수이고, 몰 백분율은 총 PEG-IL-2 접합체를 기준으로 한다. 일부 추가 실시양태에서, 조성물은 약 10 mol% 이하의 단량체, 및 바람직하게는 약 7 mol% 이하의 단량체, 또는 약 5 mol% 이하의 단량체 (즉, n이 1인 구조 (I)에 따름)를 함유한다. 일부 추가 실시양태에서, 조성물은 약 10 mol% 이하의 사량체, 및 바람직하게는 약 7 mol% 이하의 사량체, 또는 약 5 mol% 이하의 사량체 (즉, n이 4인 구조 (I)에 따름)를 함유한다. 특정 추가 실시양태에서, 조성물은 약 10 mol% 이하의 단량체 및 약 10 mol% 이하의 사량체를 포함한다. 대안적으로, 조성물은 약 7 mol% 이하의 단량체 및 약 7 mol% 이하의 사량체를 포함하거나, 또는 약 5 mol% 이하의 단량체 및 약 5 mol% 이하의 사량체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물 중 PEG화 IL-2와 관련하여, 조성물은 일반적으로 다음 특징 중 하나 이상을 충족할 것이다: 조성물 중 접합체의 적어도 약 80%는 디-PEG화 및 트리-PEG화 접합체의 혼합물을 포함할 것이며, 일부는 IL-2 모이어티에 부착된 상기 화학식 (I)에 제시된 구조를 갖는 분지형 중합체를 2개 갖고 일부는 3개 가지며; 조성물 중 접합체의 적어도 약 85%는 디-PEG화 및 트리-PEG화 접합체의 혼합물을 포함할 것이며, 일부는 IL-2 모이어티에 부착된 상기 화학식 (I)에 제시된 구조를 갖는 분지형 중합체를 2개 갖고 일부는 3개 가지며; 조성물 중 접합체의 적어도 약 90%는 디-PEG화 및 트리-PEG화 접합체의 혼합물을 포함할 것이며, 일부는 IL-2 모이어티에 부착된 상기 화학식 (I)에 제시된 구조를 갖는 분지형 중합체를 2개 갖고 일부는 3개 가지며; 조성물 중 접합체의 적어도 약 95%는 디-PEG화 및 트리-PEG화 접합체의 혼합물을 포함할 것이며, 일부는 IL-2 모이어티에 부착된 상기 화학식 (I)에 제시된 구조를 갖는 분지형 중합체를 2개 갖고 일부는 3개 가지며; 조성물 중 접합체의 약 20% 이하는 IL-2 모이어티에 부착된 상기 화학식 (I)에 제시된 구조를 갖는 분지형 중합체를 1개 또는 4개 이상 가질 것이고; 조성물 중 접합체의 약 15% 이하는 IL-2 모이어티에 부착된 상기 화학식 (I)에 제시된 구조를 갖는 분지형 중합체를 1개 또는 4개 이상 가질 것이고; 조성물 중 접합체의 약 10% 이하는 IL-2 모이어티에 부착된 상기 화학식 (I)에 제시된 구조를 갖는 분지형 중합체를 1개 또는 4개 이상 가질 것이고; 조성물 중 접합체의 약 7% 이하는 IL-2 모이어티에 부착된 상기 화학식 (I)에 제시된 구조를 갖는 분지형 중합체를 1개 또는 4개 이상 가질 것이다.
일부 실시양태에서, 조성물은, 총괄적으로 고려 시, 화학식 (I)에 의해 포괄되는 화합물을 약 20 mol% 이하, 및 바람직하게는 약 15 mol% 이하로 함유하며, 여기서 n'는 1, 4, 5로부터 선택된 정수, 또는 5 초과의 정수이고, 몰 백분율은 총 PEG-IL-2 접합체를 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 조성물은, 총괄적으로 고려 시 화학식 (I)에 의해 포괄되는 접합체를 약 10 mol% 이하로 함유하며, 여기서 n'는 1, 4, 5로부터 선택된 정수, 또는 5 초과의 정수이고, 몰 백분율은 총 PEG-IL-2 접합체를 기준으로 한다. 일부 추가 실시양태에서, 조성물은 약 10 mol% 이하의 단량체, 및 바람직하게는 약 7 mol% 이하의 단량체, 또는 약 5 mol% 이하의 단량체 (즉, n이 1인 구조 (I)에 따름)를 함유한다. 일부 추가 실시양태에서, 조성물은 약 10 mol% 이하의 사량체, 및 바람직하게는 약 7 mol% 이하의 사량체, 또는 약 5 mol% 이하의 사량체 (즉, n이 4인 구조 (I)에 따름)를 함유한다. 특정 추가 실시양태에서, 조성물은 약 10 mol% 이하의 단량체 및 약 10 mol% 이하의 사량체를 포함한다. 대안적으로, 조성물은 약 7 mol% 이하의 단량체 및 약 7 mol% 이하의 사량체를 포함하거나, 또는 약 5 mol% 이하의 단량체 및 약 5 mol% 이하의 사량체를 포함할 수 있다.
일부 추가 실시양태에서, 조성물은 대략 등몰량의 하기를 포함한다:
Figure 112020124239333-pct00005
예를 들어, 예시적인 조성물은 디-PEG화 종 대 트리-PEG화 종의 다음의 대략 비 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다: 1.4:1; 1.3:1; 1.2:1; 1.1:1; 1:1; 1:1.1; 1:1.2; 1:1.3; 또는 1:1.4. 이러한 조성물에 대한 IL-2당 PEG 모이어티의 평균 수는 예를 들어, 2; 2.1; 2.2; 2.3; 2.4; 2.5; 2.6; 2.6; 2.7; 2.8; 2.9; 및 3으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, IL-2당 PEG 모이어티의 평균 수는 약 2.5이다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물은, 총괄적으로 고려 시, 하기 화학식에 의해 포괄되는 IL-2 접합체를 약 20 몰 퍼센트 (mol%) 이하로 포함한다.
Figure 112020124239333-pct00006
여기서 n'는 1, 4, 5, 또는 5 초과의 정수로부터 선택된다.
또 다른 일부 추가 실시양태에서, 조성물은, 총괄적으로 고려 시, 하기 화학식에 의해 포괄되는 IL-2 접합체를 약 15 몰 퍼센트 (mol%) 이하로 포함한다.
Figure 112020124239333-pct00007
여기서 n'는 1, 4, 5, 또는 5 초과의 정수로부터 선택된다.
또 다른 일부 추가 실시양태에서, 조성물은, 총괄적으로 고려 시, 하기 화학식에 의해 포괄되는 IL-2 접합체를 약 10 몰 퍼센트 (mol%) 이하로 포함한다.
Figure 112020124239333-pct00008
여기서 n'는 1, 4, 5, 또는 5 초과의 정수로부터 선택된다.
전술한 것의 일부 추가 실시양태에서, 조성물은 1인 n'를 갖는 IL-2 접합체를 약 10 mol% 이하로 포함한다. 일부 또 다른 실시양태에서, 조성물은 1인 n'를 갖는 IL-2 접합체를 약 7 mol% 이하로 포함한다.
또 다른 일부 추가 실시양태에서, 조성물은 1인 n'를 갖는 IL-2 접합체를 약 5 mol% 이하로 포함한다. 또 다른 일부 대안적인 실시양태에서, 조성물은 1인 n'를 갖는 IL-2 접합체를 약 5 mol% 미만으로 포함한다.
전술한 것 중 어느 하나 이상과 관련된 일부 추가 실시양태에서, 조성물은 4인 n'를 갖는 IL-2 접합체를 약 10 mol% 이하로 포함한다. 또는, 일부 다른 실시양태에서, 조성물은 4인 n'를 갖는 IL-2 접합체를 약 7 mol% 이하로 포함한다. 또 다른 일부 추가 실시양태에서, 조성물은 4인 n'를 갖는 IL-2 접합체를 약 5 mol% 이하로 포함한다.
대략 등몰량의 하기를 포함하는 조성물이 또한 본원에 제공된다:
Figure 112020124239333-pct00009
또 다른 추가 실시양태에서, 하기 화학식의 IL-2 접합체를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다:
Figure 112020124239333-pct00010
여기서 diPEG/triPEG 접합체의 몰비는 1.4:1; 1.3:1; 1.2:1; 1.1:1; 1:1; 1:1.1; 1:1.2; 1:1.3; 및 1:1.4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 일부 추가 실시양태에서, 조성물은 2; 2.1; 2.2; 2.3; 2.4; 2.5; 2.6; 2.6; 2.7; 2.8; 2.9; 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 IL-2 잔기당 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 (상기 제시된 구조를 가짐)의 평균 수를 갖는다. 특정한 실시양태에서, IL-2 모이어티당 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 (상기 제시된 구조를 가짐)의 평균 수는 약 2.5이다. 전술한 것 중 하나 이상과 관련된 일부 실시양태에서, n의 값은 5-2000 범위이다. 일부 다른 실시양태에서, n의 값은 10-1000 범위이다. 또 다른 일부 추가 실시양태에서, n의 값은 10-750 범위이다. 일부 실시양태에서 n의 값은 10-500 또는 20-250 범위이다.
본원에 제공된 실시양태에서 n의 값은 각각의 경우에 독립적으로 다양할 수 있다. 본원에 기재된 하나 이상의 실시양태에서, 분지형 중합체의 폴리에틸렌 글리콜 아암 각각에서 n의 값은 실질적으로 동일하다. 일부 추가 실시양태에서, 분지형 중합체를 포함하는 중합체 아암 각각에서 n의 값은 약 170 내지 285 범위이다. 또 다른 일부 추가 실시양태에서, 분지형 중합체를 포함하는 중합체 아암 각각에서 n의 값은 약 204 내지 약 250 범위이다. 하나 이상의 특정한 실시양태에서, 분지형 중합체를 포함하는 중합체 아암 각각에서 n의 값은 약 226이다.
본원에 제공된 측면 또는 실시양태 중 어느 하나 이상과 관련된 하나 이상의 실시양태에서, 각각의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 공칭 평균 분자량은 약 250 달톤 내지 약 90,000 달톤 범위이다. 일부 다른 실시양태에서, 각각의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 공칭 평균 분자량은 약 1000 달톤 내지 약 60,000 달톤 범위이다. 또 다른 추가 실시양태에서, 각각의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 공칭 평균 분자량은 약 5,000 달톤 내지 약 60,000 달톤 범위이다. 일부 다른 실시양태에서, 각각의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 공칭 평균 분자량은 약 10,000 달톤 내지 약 55,000 달톤 범위이다.
또 다른 일부 추가 실시양태에서, 각각의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 공칭 평균 분자량은 약 15,000 달톤 내지 약 25,000 달톤 범위이다. 또 다른 하나 이상의 추가 실시양태에서, 각각의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 공칭 평균 분자량은 약 18,000 달톤 내지 약 22,000 달톤 범위이다. 또 다른 일부 추가 실시양태에서, 각각의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 공칭 평균 분자량은 약 20,000 달톤이다.
추가의 예시적인 조성물은 상기 화학식에 따른 조성물을 포함하며, 여기서 분자의 전체 중합체 부분은 약 250 달톤 내지 약 90,000 달톤 범위의 공칭 평균 분자량을 갖는다. 분자의 중합체 부분에 대한 추가의 적합한 범위는 약 1,000 달톤 내지 약 60,000 달톤으로부터 선택된 범위, 약 5,000 달톤 내지 약 60,000 달톤 범위, 약 10,000 달톤 내지 약 55,000 달톤 범위, 약 15,000 달톤 내지 약 50,000 달톤 범위, 및 약 20,000 달톤 내지 약 50,000 달톤 범위의 공칭 평균 분자량을 포함한다.
폴리에틸렌 글리콜 중합체 부분에 대한 추가의 예시적인 중량 평균 분자량은 약 200 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 약 600 달톤, 약 700 달톤, 약 750 달톤, 약 800 달톤, 약 900 달톤, 약 1,000 달톤, 약 1,500 달톤, 약 2,000 달톤, 약 2,200 달톤, 약 2,500 달톤, 약 3,000 달톤, 약 4,000 달톤, 약 4,400 달톤, 약 4,500 달톤, 약 5,000 달톤, 약 5,500 달톤, 약 6,000 달톤, 약 7,000 달톤, 약 7,500 달톤, 약 8,000 달톤, 약 9,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 11,000 달톤, 약 12,000 달톤, 약 13,000 달톤, 약 14,000 달톤, 약 15,000 달톤, 약 20,000 달톤, 약 22,500 달톤, 약 25,000 달톤, 약 30,000 달톤, 약 35,000 달톤, 약 40,000 달톤, 약 45,000 달톤, 약 50,000 달톤, 약 55,000 달톤, 약 60,000 달톤, 약 65,000 달톤, 약 70,000 달톤, 및 약 75,000 달톤을 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 분지형 폴리에틸렌 글리콜 중합체의 중량 평균 분자량은 약 20,000 달톤이다. 각각의 분지형 PEG 모이어티가 약 20,000 달톤의 공칭 분자량을 갖는 일부 특정한 실시양태에서, 전체 조성물에 대해 특징화될 때, 조성물의 생성된 분자량 범위는 약 55 내지 75 kDa이다.
본원에 제공된 선택적 Treg 자극제 조성물의 추가 실시양태는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다. 상기 기재된 바와 같이, IL-2 접합체 조성물은 제약상 허용되는 염의 형태일 수 있다. 전형적으로, 이러한 염은 제약상 허용되는 산 또는 산 등가물과의 반응에 의해 형성된다. 이와 관련하여 용어 "제약상 허용되는 염"은 일반적으로 상대적으로 무독성인 무기산 및 유기산 부가 염을 지칭할 것이다. 이들 염은 투여 비히클 또는 투여 형태 제조 공정에서 계내에서 제조될 수 있거나, 또는 본원에 기재된 바와 같은 장기 작용 인터류킨-2 조성물을 적합한 유기 또는 무기산과 별도로 반응시키고 이렇게 형성된 염을 단리함으로써 제조될 수 있다. 대표적인 염은 히드로브로마이드, 히드로클로라이드, 술페이트, 바이술페이트, 포스페이트, 니트레이트, 아세테이트, 발레레이트, 올레에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 나프틸레이트, 옥실레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락토비오네이트, 및 라우릴술포네이트 염 등을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 그러므로, 기재된 바와 같은 염은 무기산, 예컨대 히드로클로라이드, 브로민화수소산, 황산, 술팜산, 인산, 질산 등으로부터 유도될 수 있거나; 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 팔미트산, 말레산, 히드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 술파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 에탄 디술폰산, 옥살산, 이소티온산 등으로부터 제조될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "조성물" 또는 "조성물들" (본원에 기재된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함함)은 PEG화 IL-2 접합체의 임의의 및/또는 모든 제약상 허용되는 염을 포함한다. 이 설명은 용어 "또는 그의 제약상 허용되는 염"이 조성물의 설명에 추가되는지 여부에 관계없이 적용된다.
사용 방법 실시양태
비변형된 IL-2와 대조적으로, 본원에 기재된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물은 자가반응성 면역과 연관된 기저 병리, 뿐만 아니라 유익한 T 세포 기능을 생성하기 위한 표적 특이적 메카니즘을 다루고, 비변형된 IL-2의 투여에 비해 상당한 개선을 제공한다. 기존 자가면역 질환 요법의 결핍을 해결하기 위해, 본 조성물은 투여 시 지속적인 노출을 제공하고 독특한 약리학 프로파일을 갖는다. 본 조성물은 통상적 T 세포 및/또는 자연 살해 세포의 제한된 확장과 함께 생체내에서 내인성 Treg를 선택적으로 확장하고 활성화시키고, 이에 의해 자가면역 질환의 치료를 위한 우수한 접근법을 제공한다.
보다 특히, 그의 아미노 기를 통해 IL-2에 안정적으로 공유결합으로 연결된 특정하고 우세한 수의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 갖는, 본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물은 저용량으로 투여될 때 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다. 본 조성물은 T 이펙터 세포 (Teff)에 대한 최소 자극 효과를 가지면서 조절성 T 세포 (Treg)의 세포 집단 및 면역-저해 기능을 우선적으로 증가시키기 위해 IL-2 수용체를 결합하고 활성화시키는데 효과적이다. 설치류, 비인간 영장류 연구 및 인간 임상 연구에서 본 조성물 (일반적으로 본원에서 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물 또는 다른 경우에 RUR-IL-2 조성물로 지칭됨)에 대한 지속적인 노출은 등가 용량의 비변형된 IL-2로 달성될 수 없었던 Treg 대 Teff 반응의 크기, 지속기간 및 특이성을 제공하는데 효과적이었다.
인간에게 선택적 Treg 자극제 조성물 RUR20kD-IL-2 (뒷받침하는 실시예에 기재된 바와 같음)의 단일 낮은 오름차순 피하 용량의 투여는 용량-제한 독성, 심각한 유해 사건 또는 임상적으로 유의한 이상을 초래하지 않았다. 예비 약동학적 분석은 조성물이 대부분의 대상체에서 용량후 약 4-6일에 최대 농도에 도달하였고, 용량후 대략 2주까지 농도에서의 변화가 거의 없었으며, 그후 농도는 대략 8-9일의 반감기로 하락하였음을 제시하였다. 예비 약력학적 평가는 선택적 장기 작용 IL-2 수용체 효능제 Treg 자극제 조성물의 투여가 순환 CD4+FoxP3+CD25bright Treg에서의 용량-의존적 증가를 초래하였으며, 즉, 투여 후 대략 20 내지 25일까지 기준선으로 복귀하지 않는 수준으로 순환 CD4+FoxP3+CD25bright Treg의 절대 수에서의 지속적인 증가가 있었음을 나타내었다. 용량전과 비교하여 수배 (용량에 따른 크기로)의 CD4+FoxP3+CD25bright Treg의 수에서의 평균 증가가 있었다. CD4+FoxP3+CD25bright Treg에 대해 관찰된 것보다 변화 크기는 더 작았지만, 총 CD4+ FoxP3+CD25+Treg 집단에서의 증가도 있었다. 가장 낮은 용량의 경우, 치료된 대상체 대 플라세보 대상체에서 Treg 수에서의 변화가 없었다. T 세포 집단 (CD4+, CD8+)의 백분율 또는 수에서의 변화가 RUR20kD-IL-2 조성물에서 어떠한 용량에서도 관찰되지 않았기 때문에 1차 효과가 Treg에 나타났다. 그러므로, 본 조성물 및 방법은 다음 섹션에서 다른 특징과 함께 기재된 바와 같이, 생체내/생체외 생물검정 (대안적인 화학적으로-변형된 IL-2 화합물과 비교하는 경우에도) 및 인간 연구에서도 Treg의 저해 능력을 증가시키는데 놀랍게도 효과적이다.
본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물은 (다른 것들 중에서) 자가면역 질환 및 장애를 치료하는데 유용하다. 본원에 기재된 바와 같은 RUR-IL-2 또는 RUR20kD-IL-2 조성물의 투여에 의해 치료될 수 있는 예시적인 자가면역 질환은 전신성 상태, 예컨대 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 궤양성 대장염, 크론병, 류마티스성 관절염, 아토피성 피부염, 전신성 경화증, 강직성 척추염, 이식편 대 숙주 질환, 및 다발성 근염을 포함하거나; 또는 장기-특이적 자가면역 질환은 제1형 당뇨병, 애디슨병, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 쇼그렌 증후군, 백반증, 악성 빈혈, 사구체 신염, 중증 근무력증, 굿파스처 증후군, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판감소성 자반증, 땅콩 알레르기, 및 폐 섬유증을 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료될 상태는 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)이다. 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)는 대부분 중년 여성에게 영향을 미치는 자가면역 염증성 질환이다. SLE의 특징은 예를 들어, 피부 발진, 관절 통증, 재발성 흉막염 및 신장 질환을 포함한다. Tcon에 비해 Treg의 진행성 항상성 불균형은 SLE를 포함하는 많은 자가면역 질환에 의해 공유된다. 종합하면, Treg 항상성을 SLE의 병리와 관련시키는 치료 가설, SLE 환자에서 저용량 IL-2의 활성, 및 IL-2에 비해 본원에 기재된 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물의 우수한 Treg 유도 특성은 SLE 및 다른 자가면역 질환 및 상태를 치료하기 위한 본 RUR-IL-2 또는 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물의 용도에 대한 충분한 지원을 제공한다. 하나 이상의 추가 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 RUR-IL-2 또는 RUR20kD-IL-2 관련 조성물을 투여함으로써 상태를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 상태는 예를 들어, 알레르기, GVHD, 크론병, 궤양성 대장염, 류마티스성 관절염, 제1형 당뇨병, 다발성 경화증 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 일부 추가 실시양태에서, RUR-IL-2 또는 RUR20kD-IL-2 관련 조성물은 통상적 T 세포 및 자연 살해 세포에 비해 조절성 T 세포를 우선적으로 확장하고 활성화시키기 위해 대상체에게 치료 유효 용량으로 투여될 때 효과적이다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 RUR-IL-2 또는 RUR20kD-IL-2 관련 조성물의 치료 유효 용량을 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 조절성 T 세포 대 이펙터 T 세포의 비를 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
전술한 방법과 관련된 일부 실시양태에서, 조절성 T 세포는 Foxp3+ 및 CD25+ 세포로부터 선택된다. 이전 실시양태 또는 방법과 관련된 하나 이상의 실시양태에서, 이펙터 T 세포는 CD4+ 및 CD8+ 세포로부터 선택된다.
상기 방법 또는 관련 실시양태와 관련된 일부 추가 실시양태에서, 조절성 T 세포에서의 배수-증가는, 기준선과 비교 시, 생체내 마우스 모델에서 평가될 때 적어도 약 2, 또는 적어도 약 4, 또는 심지어 적어도 약 6의 값에 도달한다.
방법의 일부 실시양태에서, 조절성 T 세포 수에서의 증가는 투여후 적어도 3일 동안 기준선 수준 초과로 지속된다. 일부 추가 실시양태에서, 조절성 T 세포 수에서의 증가는 투여후 적어도 5일 동안 기준선 수준 초과로 지속된다. 바람직하게는, 조절성 T 세포 수에서의 증가는 적어도 7일 동안 기준선 수준 초과로 지속된다.
또 다른 추가 측면에서, 상기 또는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 RUR-IL-2 또는 RUR20kD-IL-2 관련 조성물 실시양태를 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 추가 측면에서, RUR20kD-IL-2 포뮬라 A, RUR20kD-IL-2 포뮬라 B, RUR20kD-IL-2 포뮬라 C, RUR20kD-IL-2 포뮬라 D 및 RUR20kD-IL-2 포뮬라 E로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 추가 측면에서, RUR20kD-IL-2 포뮬라 A, RUR20kD-IL-2 포뮬라 B 및 RUR20kD-IL-2 포뮬라 C로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 추가 측면에서, RUR20kD-IL-2 포뮬라 A의 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 추가 측면에서, RUR20kD-IL-2 포뮬라 B의 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 추가 측면에서, RUR20kD-IL-2 포뮬라 C의 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 추가 측면에서, RUR20kD-IL-2 포뮬라 A, RUR20kD-IL-2 포뮬라 B, RUR20kD-IL-2 포뮬라 C, RUR20kD-IL-2 포뮬라 D 및 RUR20kD-IL-2 포뮬라 E로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물의 요법에서의 용도가 본원에 제공된다.
또 다른 추가 측면에서, RUR20kD-IL-2 포뮬라 A의 조성물의 요법에서의 용도가 본원에 제공된다.
또 다른 추가 측면에서, RUR20kD-IL-2 포뮬라 B의 조성물의 요법에서의 용도가 본원에 제공된다.
또 다른 추가 측면에서, RUR20kD-IL-2 포뮬라 C의 조성물의 요법에서의 용도가 본원에 제공된다.
또 다른 추가 측면에서, RUR20kD-IL-2 포뮬라 D의 조성물의 요법에서의 용도가 본원에 제공된다.
또 다른 추가 측면에서, RUR20kD-IL-2 포뮬라 E의 조성물의 요법에서의 용도가 본원에 제공된다.
또 다른 추가 측면에서, 자가면역 질환 치료용 약제의 제조를 위한, RUR20kD-IL-2 포뮬라 A, RUR20kD-IL-2 포뮬라 B, RUR20kD-IL-2 포뮬라 C, RUR20kD-IL-2 포뮬라 D 및 RUR20kD-IL-2 포뮬라 E로 이루어진 군으로부터 선택된 선택적 Treg 자극제 조성물의 용도가 본원에 제공된다.
보다 특정한 실시양태에서, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)의 치료는 치료 유효량의 RUR-IL-2 또는 RUR20kD-IL-2 관련 조성물을 포함하는 제형의 피하 투여를 포함한다. 예를 들어, SLE의 대표적인 동물 모델에서 생리적 면역 반응 및 질환 진행의 제어에 대한 RUR20kD-IL-2 조성물-유도 Treg의 효과를 예시하는 실시예 8에 기재된 결과를 참조한다. 거기에 기재된 바와 같이, RUR20kD-IL-2 조성물은 신장 손상 (SLE를 갖는 환자의 특징 중 하나)의 바이오마커를 정상 마우스에서 관찰된 바와 거의 동일한 수준으로 저해하는데 효과적이었다.
본원에 기재된 바와 같은 치료 방법을 언급하는 실시양태에서, 이러한 실시양태는 또한 해당 치료에 사용하기 위한 추가 실시양태, 또는 대안적으로 해당 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 추가 실시양태이다. 본 개시내용은 요법에 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 그의 제형을 포함하는 조성물의 실시양태 중 어느 하나에 따른 조성물을 추가로 제공한다. 본 개시내용은 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 그의 제형을 포함하는 조성물의 실시양태 중 어느 하나에 따른 조성물을 추가로 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 요법에 사용하기 위한, 하기 구조를 갖는 PEG화 IL-2 접합체를 포함하는 조성물을 제공한다:
Figure 112020124239333-pct00011
여기서:
IL-2는 인터류킨-2이고;
n은 각각의 경우에 독립적으로 약 3 내지 약 4000의 정수이다.
요법에 사용하기 위한 상기 조성물의 특정한 실시양태에서, IL-2는 알데스류킨이다. 요법에 사용하기 위한 상기 조성물의 특정한 실시양태에서, 각각의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 공칭 평균 분자량은 약 20,000 달톤이다. 요법에 사용하기 위한 상기 조성물의 추가 특정한 실시양태에서, 조성물의 PEG화 IL-2 접합체는 리신 31에 부착된 PEG 모이어티를 갖는다. 요법에 사용하기 위한 상기 조성물의 특정한 실시양태에서, 요법은 자가면역 질환에 사용하기 위한 것이다.
용어
본 개시내용의 특정 특징을 설명하고 청구함에 있어서, 달리 명시되지 않는 한 하기 기재된 정의에 따라 다음 용어가 사용될 것이다.
본원에 사용되고 기재된 바와 같은 용어 "선택적"은 유도된 면역 세포의 특징 또는 면역학적 신호 반응을 일부 면에서는 구현하지만 다른 면에서는 구현하지 않는 생체내 면역학적 반응을 지칭한다. 특히, Treg 유도 및/또는 활성화와 관련하여 "선택적"은 하나 이상의 활성화 마커, 예컨대 ICOS 또는 Ki67 또는 Stat5에 의해 표시된 바와 같이 Treg 세포 수에서의 증가 (유동 세포계측법에 의해 CD25 높음 및 총), 및/또는 Treg 활성화 상태에서의 증가를 나타내는 면역 반응을 지칭하고/거나, 활성화는 특정 다른 면역 반응이 결여된 동안 하류 유도된 면역-저해 반응 및/또는 유도된 면역학적 관용 반응을 지칭한다. 이러한 맥락에서, "선택적 Treg 유도"는 유의한 및/또는 임상적으로 물질적인 이펙터 T 세포 및 연관된 면역학적 활성화 반응이 동시에 결여된 동안 기재된 바와 같은 Treg의 면역 반응을 지칭한다. 유의한 및/또는 임상적으로 물질적인 이펙터 T 세포 및 연관된 면역학적 활성화 반응은 예를 들어 CD4 양성 T 이펙터 세포, 및/또는 CD8 양성 T 이펙터 세포 증식, 및/또는 활성화 마커, 예컨대 ICOS 또는 Ki67, 또는 다른 널리 공지된 이펙터 면역 반응을 포함한다. 다른 이펙터 면역 반응 신호는 특정 프로-염증성 시토카인, 예컨대 "시토카인 증후군"으로 공지된 것, 및/또는 예컨대 IL-5, INF감마, IL-6, IFN알파, IL-17, IL-22, IL-19의 상승을 포함할 수 있다. 선택적 Treg 자극은 또한 평균 Treg:Tcon 비에 반영될 수 있다. 바람직하게는, 본원에 기재된 RUR-IL-2 또는 RUR20kD-IL-2 관련 조성물에 반응하여 달성되는 평균 Treg:Tcon 비는 적어도 5배, 및 바람직하게는 7배, 및 보다 바람직하게는 10배 이상이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "PEG화 정도"는 개별 알데스류킨 폴리펩티드의 아미노 기(들)에 공유결합으로 연결된 안정한 PEG 치환체의 수를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 언급된 수치의 합리적 부근, 예컨대 언급된 수치의 플러스 또는 마이너스 10%를 의미한다. 바람직하게는, 본원에서 사용된 바와 같은 "약" 또는 "대략"은 주어진 양의 플러스 또는 마이너스 5% 이내를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "n'는 2 및 3이다"는 IL-2 접합체의 혼합물을 지칭하며, 여기서 혼합물은 본원에 기재된 바와 같은 디-PEG화 및 트리-PEG화 접합체를 포함한다.
용어 "조절성 T 세포" 또는 "Treg"는 CD4+FoxP3+CD25bright 표현형과 같은 T 세포를 지칭한다. (예를 들어, 문헌 [Jeffrey A. Bluestone and Qizhi Tang, Treg cells-the next frontier of cell therapy, Science, 12 October 2018 · Vol. 362 Issue 6411, p154-155] 참조.)
용어 "T con" 또는 "통상적 T 세포"는 aβ T 세포 수용체 (TCR), 뿐만 아니라 공동-수용체 CD4 또는 CD8을 발현하고 잘-확립된 적응 면역 이펙터 기능, 예컨대 T 헬퍼 세포 기능 및 세포독성 T 세포 이펙터 기능을 수행하는 T 림프구를 지칭한다. 예를 들어, Tcon은 CD4+CD25- 나이브 통상적 T 세포를 지칭할 수 있다. "이펙터 T 세포 (Teff)"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 CD4+ 및 CD8+ 세포 이펙터 표현형, 예컨대 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포 등을 지칭한다. "자연 살해 세포", "K 세포" 또는 "살해 세포"로도 공지된 "NK 세포"는 림프구 (백혈구)의 한 유형이며 선천 면역 체계의 구성성분이다. NK 세포는 종양 및 바이러스 감염된 세포의 숙주-거부에서 중요한 역할을 한다.
"IL-2 중간체"는 IL-2 폴리펩티드, 특히 알데스류킨을 지칭한다. "RUR20kD-IL-2"는 IL-2 PEG 접합체를 지칭하며, 여기서 IL-2 부분은 본원에 기재된 바와 같은 알데스류킨이고, PEG 부분은 본원에 기재된 바와 같다. RUR20kD-IL-2 조성물은 또한 일반적인 방법으로 화학명 (1,3-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)10kD카르바모일)-2-프로판옥시)-4-부탄아미드)인터류킨-2)로 지칭될 수 있으며, 이에 대한 인식이 조성물을 완전히 설명하는 것은 아니다. 본원에서 사용된 바와 같은 알데스류킨은 이. 콜라이에서 발현되는 재조합 비-글리코실화된 인터류킨-2인 125-L-세린-2-133 인터류킨-2를 지칭한다. 알데스류킨의 아미노산 서열의 서열은 도 2에 제시되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 숙주 시스템에서 발현되는 알데스류킨은 또한 본원에서 사용된 바와 같은 용어의 의미 내에 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "IL-2"는 인간 IL-2 활성을 갖는 모이어티를 지칭한다. 용어 "IL-2 모이어티"는 분지형 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 부착되기 전의 IL-2 모이어티 뿐만 아니라 공유결합 부착 후 IL-2 모이어티를 지칭한다. 원래 IL-2 모이어티가 폴리에틸렌 글리콜 중합체, 예컨대 본원에 제공된 분지형 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 부착될 때, IL-2 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 대한 연결과 연관된 하나 이상의 공유결합의 존재로 인해 약간 변경된다는 것이 이해될 것이다. 또 다른 분자에 부착된 IL-2 모이어티의 이러한 약간 변경된 형태는 본원에서 IL-2 모이어티의 "잔기"로 지칭된다. IL-2의 잔기의 맥락에서 용어 '잔기'는 본원의 화학식에 제시된 바와 같이 하나 이상의 공유결합 부착 부위에서 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜에 공유결합 부착 후 남아있는 IL-2 분자의 부분을 의미한다. 전형적으로 부착 부위는 IL-2에서 리신의 11개의 아민 기 중 하나일 것이다.
비변형된 IL-2가 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜에 부착될 때, IL-2는 중합체(들)에 대한 연결과 연관된 하나 이상의 공유결합의 존재로 인해 약간 변경된다는 것이 이해될 것이다. 또 다른 분자, 예컨대 분지형 PEG 모이어티에 부착된 IL-2의 이러한 약간 변경된 형태는 일부 경우에 IL-2의 "잔기"로 지칭될 수 있거나, 또는 단순히 "IL-2" 등으로 지칭될 수 있으며, 이러한 중합체 접합체에 포함된 IL-2는 각각 분지형 PEG 모이어티를 IL-2에 연결하는 하나 이상의 공유결합의 존재로 인해 약간 변경된다는 것이 이해될 것이다. 용어 "고급 PEG화 IL-2 접합체"는 테트라 PEG 접합체 또는 펜타 PEG 접합체 또는 최대 11개의 PEG 모이어티의 접합체를 지칭한다. 바람직하게는 "고급 PEG화 IL-2 접합체"는 테트라 PEG 접합체 또는 펜타 PEG 접합체를 지칭한다.
예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 2012/065086에 기재된 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 내지 4 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 단백질은 이에 실질적으로 상동성인 임의의 단백질 또는 폴리펩티드와 마찬가지로 예시적인 IL-2 단백질이다. 용어 실질적으로 상동성은 특정한 대상체 서열, 예를 들어, 돌연변이체 서열이 하나 이상의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 참조 서열과 다르며, 그의 순 효과는 참조 및 대상체 서열 간에 유해 기능적 차이를 초래하지 않음을 의미한다. 본원의 목적을 위해, 95 퍼센트 초과의 상동성, 동등한 생물학적 활성 (반드시 생물학적 활성의 동등한 강도는 아니지만) 및 동등한 발현 특징을 갖는 서열은 실질적으로 상동성인 것으로 간주된다. 상동성을 결정하기 위해, 성숙 서열의 말단절단은 무시되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "IL-2"는 예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발에 의해 또는 우연히 돌연변이를 통해 의도적으로 변형된 이러한 단백질을 포함한다. 이들 용어는 또한 1 내지 6개의 추가 글리코실화 부위를 갖는 유사체, 단백질의 카르복시 말단 종결부에 적어도 하나의 추가 아미노산을 갖는 유사체 (여기서 추가 아미노산(들)은 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함함), 및 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 유사체를 포함한다. 용어는 천연 및 재조합적으로 생성된 모이어티 둘 다를 포함한다. 또한, IL-2는 인간 공급원, 동물 공급원, 및 식물 공급원으로부터 유래될 수 있다. 하나의 예시적인 IL-2는 알데스류킨 (도 2 참조)으로 지칭되는 인간 재조합 IL-2이다. 본원에 기재된 바와 같은 장기 작용 IL-2R 효능제에 대한 언급은 그의 제약상 허용되는 염 형태를 포괄하는 것을 의미한다.
본원에 기재된 RUR-IL-2 또는 RUR20kD-IL-2 관련 조성물은 한 면에서 장기 작용 작용제이다. 본원에 제공된 바와 같은 RUR-IL-2 또는 RUR20kD-IL-2 관련 조성물과 관련하여 장기 작용은 비변형된 동일한 IL-2R 효능제 (예를 들어, 알데스류킨 또는 다른 적합한 인터류킨-2 서열)의 것보다 연장된 혈장 중 순환 반감기를 갖는 이러한 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 비교기 효능제는 하나 이상의 수용성 중합체 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 대한 공유결합 부착에 의해 변형되지 않으며, 동일한 대상체에게 IL-2R 효능제의 단백질 등가 용량으로 투여된 것과 비교되고, 동일한 약동학적 분석에 의해 평가된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "PEG" 또는 "폴리에틸렌 글리콜"은 임의의 수용성 폴리(에틸렌 옥시드)를 포괄하는 것을 의미한다. 달리 명시되지 않는 한, "PEG 중합체" 또는 폴리에틸렌 글리콜은 실질적으로 모든 (바람직하게는 모든) 단량체 서브유닛이 에틸렌 옥시드 서브유닛인 것이지만, 중합체는 예를 들어, 접합을 위해 별개의 말단 캡핑 모이어티 또는 관능기를 함유할 수 있다. 본 개시내용에 사용하기 위한 PEG 중합체는 예를 들어 합성 전환 동안 말단 산소(들)가 변위되었는지 여부에 따라 다음 두 구조: "-(CH2CH2O)n-" 또는 "-(CH2CH2O)n-1CH2CH2-" 중 하나를 포함할 것이다. PEG 중합체에 대해 상기 언급된 바와 같이, 변수 (n)는 약 3 내지 4000 범위이고, 전반적인 PEG의 말단 기 및 구조는 다양할 수 있다. 바람직하게는 PEG는 본원에 상세히 기재된 바와 같은 특정한 의미를 갖는다.
중합체의 기하학 또는 전반적인 구조와 관련하여 "분지형"은 분지점 또는 중심 구조적 특징으로부터 연장되는 2개 이상의 중합체 "아암" 또는 "쇄"를 갖는 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 예시적인 PEG 시약, mPEG2-부탄산, N-히드록시숙신이미드 에스테르 (1,3-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)카르바모일)-2-프로판옥시)-4-숙신이미딜 부타노에이트)는 2개의 선형 PEG 쇄로 구성된 분지형 폴리에틸렌 글리콜 중합체이며, 각각은 카르바메이트 연결 (~NHC(O)O~)을 통해 각각 중심 프로필 기의 1- 및 3-탄소에 공유결합으로 부착되며, 이로부터 옥시부타노에이트 숙신이미딜 에스테르를 연장한다.
수용성 중합체, 예컨대 PEG의 맥락에서 분자량은 수 (공칭) 평균 분자량 또는 중량 평균 분자량으로 표시될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 분자량에 대한 모든 언급은 공칭 평균 분자량을 지칭한다. 수 평균 및 중량 평균 분자량 둘 다의 결정은 겔 투과 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 또는 다른 액체 크로마토그래피 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 분자량 값을 측정하기 위한 다른 방법, 예컨대 말단 기 분석의 사용 또는 수 평균 분자량을 결정하기 위한 총괄성 (예를 들어, 어는점 내림, 끓는점 오름, 또는 삼투압)의 측정, 또는 중량 평균 분자량을 결정하기 위한 광 산란 기술, 초원심분리 또는 점도측정의 사용이 또한 사용될 수 있다. 겔 여과 크로마토그래피는 종종 분지형 중합체의 평균 분자량을 결정하는데 사용된다. PEG 중합체는 전형적으로 다분산 (즉, 중합체의 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량이 동일하지 않음)이며, 바람직하게는 약 1.2 미만, 보다 바람직하게는 약 1.15 미만, 보다 더 바람직하게는 약 1.10 미만, 보다 더욱 더 바람직하게는 약 1.05 미만, 및 가장 바람직하게는 약 1.03 미만의 낮은 다분산성 값을 갖는다.
"안정한" 연결 또는 결합은 물에서 실질적으로 안정한 화학적 결합을 지칭하며, 즉, 생리적 조건 하에 장기간에 걸쳐 임의의 상당한 정도로 가수분해되지 않는다. 가수분해적으로 안정한 연결의 예는 일반적으로 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 탄소-탄소 결합 (예를 들어, 지방족 쇄), 에테르, 아미드, 아민 등. 일반적으로, 안정한 연결은 생리적 조건 하에 1일당 약 1-2% 미만의 가수분해 속도를 나타내는 것이다. 대표적인 화학적 결합의 가수분해 속도는 대부분의 표준 화학 교과서에서 찾을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수형은 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.
"실질적으로" 또는 "본질적으로"는 달리 대조적으로 언급되지 않는 한, 거의 전적으로 또는 완전히, 예를 들어, 주어진 양의 95% 이상을 의미한다.
제조 및 실시예
제조 및 실시예는 제한이 아닌 예시의 방식으로 제시되며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물의 제조 방법이 본원에 기재되어 있고/거나 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 시약 및 출발 물질은 쉽게 입수가능하거나 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 합성될 수 있다. 이들 방법의 단계에 적합한 조건은 널리 공지되어 있으며, 완충액 및 시약의 적절한 치환은 관련 기술분야의 기술 내에 있다. 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 일부 상황에서 조성물이 생성되는 단계 및 순서가 변형될 수 있고, 숙련된 생화학자에 의해 잘 이해된다는 것을 이해할 것이다. 마찬가지로, 제제는 필요에 따라 또는 원하는대로 다양한 널리 공지된 기술에 의해 단리 및/또는 정제될 수 있음을 이해할 것이다.
IL-2 중간체의 제조:
IL-2 모이어티는 비-재조합 방법 및/또는 재조합 방법으로부터 유도될 수 있으며, 본 개시내용은 이와 관련하여 제한되지 않는다. IL-2 모이어티는 인간 공급원, 동물 공급원 및 식물 공급원으로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 시스템으로부터 IL-2를 단리하고 그렇지 않으면 배양된 배지로부터 IL-2를 얻을 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,401,756 및 문헌 [Pauly et al. (1984) J. Immunol Methods 75(1):73-84]에 기재된 절차를 참조한다.
시험관내 및 원핵생물 및 진핵생물 숙주 세포에서 재조합 폴리펩티드를 생산하고 발현하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,614,185를 참조한다. IL-2 모이어티는 박테리아 [예를 들어, 이. 콜라이, 예를 들어, 문헌 [Fischer et al. (1995) Biotechnol. Appl. BioIL-2m. 21(3):295-311] 참조], 포유류 [예를 들어, 문헌 [Kronman et al. (1992) Gene 121:295-304] 참조], 효모 [예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 예를 들어, 문헌 [Morel et al. (1997) Biochem. J. 328(1):121-129] 참조], 및 식물 [예를 들어, 문헌 [Mor et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 75(3):259-266] 참조]에서 발현될 수 있다. 단백질을 제조하기 위한 재조합 기반 방법은 상이할 수 있지만, 재조합 방법은 전형적으로 원하는 폴리펩티드 또는 단편을 코딩하는 핵산을 구축하고, 핵산을 발현 벡터로 클로닝하고, 숙주 세포 (예를 들어, 식물, 박테리아, 효모, 트랜스제닉 동물 세포, 또는 포유류 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포 또는 신생 햄스터 신장 세포)를 형질전환시키고, 핵산을 발현하여 원하는 폴리펩티드 또는 단편을 생성하는 것을 수반한다. 다양한 단백질 정제 방법을 사용하여 본 개시내용의 조성물을 정제할 수 있으며, 이러한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, NY (1994)]에 기재되어 있다. 재조합 폴리펩티드의 확인 및 정제를 용이하게 하기 위해, 에피토프 태그를 코딩하는 핵산 서열 또는 다른 친화성 결합 서열은 코딩 서열과 함께 인-프레임으로 삽입되거나 첨가되며, 이에 의해 원하는 폴리펩티드 및 결합에 적합한 폴리펩티드로 구성된 융합 단백질을 생성할 수 있다.
IL-2 활성을 갖는 단백질을 발현하는데 사용되는 시스템에 따라, IL-2 모이어티는 비글리코실화되거나 글리코실화될 수 있으며, 둘 중 하나를 사용할 수 있다. 즉, IL-2 모이어티는 비글리코실화될 수 있거나, IL-2 모이어티는 글리코실화될 수 있고, 하나 이상의 바람직한 실시양태에서 IL-2 모이어티는 비글리코실화된다. IL-2 모이어티는 또한 유리하게는 중합체를 아미노산의 측쇄 내의 원자에 쉽게 부착시키기 위해 하나 이상의 아미노산 잔기, 예컨대, 예를 들어, 리신, 시스테인 및/또는 아르기닌을 포함 및/또는 치환하도록 변형될 수 있다. IL-2 모이어티의 치환의 예는 미국 특허 번호 5,206,344에 기재되어 있다. 또한, IL-2 모이어티는 비자연 발생 아미노산 잔기를 포함하도록 변형될 수 있다. 아미노산 잔기 및 비자연 발생 아미노산 잔기를 첨가하는 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
또한, IL-2 모이어티는 유리하게는 관능기의 부착을 포함하도록 변형될 수 있다 (아미노산 잔기를 함유하는 관능기의 첨가를 통한 것 제외). 예를 들어, IL-2 모이어티는 티올 기를 포함하도록 변형될 수 있다. 또한, IL-2 모이어티는 N-말단 알파 탄소를 포함하도록 변형될 수 있다. 또한, IL-2 모이어티는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 포함하도록 변형될 수 있다. 또한, IL-2 모이어티는 알데히드 기를 포함하도록 변형될 수 있다. 또한, IL-2 모이어티는 케톤 기를 포함하도록 변형될 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, IL-2 모이어티는 티올 기, N-말단 알파 탄소, 탄수화물, 알데히드 기 및 케톤 기 중 하나 이상을 포함하도록 변형되지 않는 것이 바람직하다.
예시적인 IL-2 모이어티는 문헌 및 예를 들어 미국 특허 번호 5,116,943, 5,153,310, 5,635,597, 7,101,965 및 7,567,215 및 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0036097 및 2004/0175337에 기재되어 있다. 바람직한 IL-2 모이어티는 도 2에 제공된 아미노산 서열을 가지며, 본원에서 사용된 바와 같은 알데스류킨의 아미노산 서열을 나타낸다.
일부 경우에, IL-2 모이어티는 "단량체" 형태일 것이며, 여기서 상응하는 펩티드의 단일 발현은 별개의 단위로 조직화된다. 다른 경우에, IL-2 모이어티는 "이량체" (예를 들어, 재조합 IL-2의 이량체)의 형태일 것이며, 여기서 단백질의 2개의 단량체 형태는 (예를 들어, 디술피드 결합에 의해) 서로 회합된다. 예를 들어, 재조합 인간 IL-2의 이량체의 맥락에서, 이량체는 각각의 단량체의 Cys125 잔기로부터 형성된 디술피드 결합에 의해 서로 회합된 2개의 단량체 형태일 수 있다.
임의의 주어진 펩티드 또는 단백질 모이어티 또는 조성물에 대해, 해당 모이어티가 IL-2 활성을 갖는지 여부를 결정하는 것이 가능하다. 시험관내 IL-2 활성을 결정하기 위한 다양한 방법이 관련 기술분야 및 본원에 기재되어 있다. 예시적인 접근법은 본원에 기재된 CTTL-2 세포 증식 검정이다. 예시적인 접근법은 또한 문헌 [Moreau et al. (1995) Mol. Immunol. 32:1047-1056]에 기재되어 있다. 간단히 말해서, 비특이적 결합 검정에서, 제안된 IL-2 모이어티 또는 조성물은 IL-2의 수용체를 보유하는 세포주의 존재 하에 4℃에서 1시간 동안 미리 인큐베이션되도록 허용된다. 그 후, 125I-표지된 IL-2는 4℃에서 3시간 동안 시스템에서 인큐베이션되도록 허용된다. 데이터는 야생형 IL-2에 대한 제안된 IL-2 모이어티 활성의 억제 능력 %로 표시된다. 전기측정, 분광광도측정, 크로마토그래피 및 방사측정 방법을 포함하여 관련 기술분야에 공지된 다른 방법이 또한 IL-2 기능을 평가하는데 사용될 수 있다.
RUR 20kD -IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물의 제조:
RUR20kD-IL-2의 예시적인 선택적 Treg 자극제 조성물은 일반적으로 정제된 IL-2를 약 9의 높은 pH의 비신 용액에서 몰 과량의 PEG 시약 (IL-2에 대한 몰 당량 초과), mPEG2(20kD)-부탄산, N-히드록시숙신이미드 에스테르 (또는 임의의 다른 적합하게 활성화된 에스테르) (1,3-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜) MW 10,000 카르바모일)-2-프로판옥시)-4-숙신이미딜 부타노에이트와 반응시킴으로써 제조된다. 반응물을 약 30분 내지 약 5시간, 또는 약 30분 내지 4시간, 또는 약 30분 내지 2시간, 또는 약 30분 내지 1시간 동안 일반적으로 온화한 조건 하에, 예를 들어, 약 20℃ 내지 약 65℃, 또는 약 20℃ 내지 약 40℃, 또는 상온 또는 실온에서 혼합한다. 적합한 산, 예컨대 아세트산의 첨가에 의해 낮은 pH로 산성화함으로써 반응을 켄칭한다.
그 후, PEG화 rIL-2 반응 생성물을 적합한 방법, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피를 사용할 때, RUR20kD-IL-2 조성물은 수지에 결합한 후, 적합한 구배, 예컨대 염화나트륨 구배로 용출한다. 그 후, 크로마토그래피 생성물 풀을 농축시키고, 예를 들어, 접선 유동 여과 (TFF)를 사용하여 적합한 제형 완충액 (예를 들어, 수크로스를 함유하는 아세트산나트륨 완충액)으로 투석여과한다.
원하는 경우, 생성물 풀을 적합한 칼럼 (예를 들어, 회사, 예컨대 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences) 또는 바이닥(Vydac)으로부터 시판되는 C18 칼럼 또는 C3 칼럼)을 사용하는 역상-고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)를 사용하는 역상 크로마토그래피에 의해, 또는 이온 교환 칼럼, 예를 들어, 아머샴 바이오사이언시스로부터 입수가능한 세파로스(Sepharose)™ 이온 교환 칼럼을 사용하는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 위치 이성질체로 추가로 분리할 수 있다. 동일한 분자량을 갖는 중합체-활성제 이성질체 (즉, 위치 이소형)를 분리하기 위해 어느 접근법이든 사용할 수 있다.
RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물을, 분석용 HPLC, SDS-Page, LCMS, 및 생물검정, 예컨대 CTLL-2 증식, 및 생체내 Treg 유도를 포함하여 본원에 기재되고/거나 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 분석적인 및 생물검정 기술에 의해 특징화할 수 있다.
제형:
또 다른 하나 이상의 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 접합체 조성물을 포함하는 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물이 본원에 제공된다. "제약상 허용되는 부형제" 또는 "제약상 허용되는 담체"는 본원에 기재된 조성물에 포함될 수 있고 대상체에게 유의한 유해한 독성학적 효과를 초래하지 않는 구성성분을 지칭한다. 본 개시내용의 조성물은 바람직하게는 조성물을 생체이용가능하게 만드는 임의의 경로, 예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하를 포함하는 비경구 투여에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제형화된다. 이러한 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)] 참조). 임의로, 본원에 제공된 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 예시적인 부형제는 제한없이 탄수화물, 무기 염, 항미생물제, 항산화제, 계면활성제, 완충제, 산, 염기, 아미노산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것들을 포함한다. 조성물 중 임의의 개별 부형제의 양은 부형제의 활성 및 조성물의 특정한 요구에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 임의의 개별 부형제의 최적의 양은 실험을 통해, 즉, 다양한 양의 부형제 (낮은 것부터 높은 것까지)를 함유하는 조성물을 제조하고, 안정성 및 다른 파라미터를 검사한 후, 유의한 유해 효과 없이 최적의 성능이 획득되는 범위를 결정함으로써 결정된다. 탄수화물, 예컨대 당, 유도체화된 당, 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당, 및/또는 당 중합체가 부형제로서 존재할 수 있다. 특정 탄수화물 부형제는 예를 들어: 모노사카라이드, 예컨대 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 디사카라이드, 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 폴리사카라이드, 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 소르비톨 (글루시톨), 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨, 시클로덱스트린 등을 포함한다. 부형제는 또한 무기 염 또는 완충제, 예컨대 시트르산, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 질산칼륨, 일염기성 인산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 미생물 성장을 방지하거나 억제하기 위한 항미생물제를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 하나 이상의 실시양태에 적합한 항미생물제의 비제한적인 예는 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 벤질 알콜, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알콜, 질산페닐제2수은, 티머졸, 및 이들의 조합을 포함한다. 항산화제가 또한 조성물에 존재할 수 있다. 항산화제는 산화를 방지하는데 사용되며, 이에 의해 접합체 또는 제제의 다른 구성성분의 열화를 방지한다. 본 개시내용의 하나 이상의 실시양태에 사용하기에 적합한 항산화제는 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 히드록시아니솔, 부틸화된 히드록시톨루엔, 하이포아인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 나트륨 비술파이트, 나트륨 포름알데히드 술폭실레이트, 나트륨 메타비술파이트, 및 이들의 조합을 포함한다. 계면활성제가 부형제로서 존재할 수 있다. 예시적인 계면활성제는 다음을 포함한다: 폴리소르베이트, 예컨대 "Tween 20" 및 "Tween 80," 및 플루로닉, 예컨대 F68 및 F88 (둘 다 BASF (미국 뉴저지 마운트 올리브)로부터 입수가능함); 소르비탄 에스테르; 지질, 예컨대 인지질, 예컨대 레시틴 및 다른 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 (바람직하게는 리포솜 형태는 아니지만), 지방산 및 지방 에스테르; 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤; 및 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 아연 및 다른 이러한 적합한 양이온. 산 또는 염기가 조성물에 부형제로서 존재할 수 있다. 사용될 수 있는 산의 비제한적인 예는 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 산을 포함한다. 적합한 염기의 예는 제한없이 수산화나트륨, 아세트산나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 아세트산암모늄, 아세트산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨, 포름산나트륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 푸마르산칼륨, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기를 포함한다. 하나 이상의 아미노산이 본원에 기재된 조성물에 부형제로서 존재할 수 있다. 이와 관련하여 예시적인 아미노산은 아르기닌, 리신 및 글리신을 포함한다. 추가의 적합한 제약상 허용되는 부형제는 예를 들어, 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7th ed., Rowe, R.C., Ed., Pharmaceutical Press, 2012]에 기재된 것들을 포함한다. 본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물의 바람직한 제형은 1.5 mg/ml 단백질 등가물, 10 mM 아세트산나트륨, 110 mM 염화나트륨, 2% 수크로스 (w/v), pH 5.0이다. RUR20kD-IL-2 조성물은 실리콘 라이너를 갖는 폴리프로필렌 캡이 장착된 적절한 부피의 멸균 일회용 폴리카르보네이트 병에 저장될 수 있으며, 멸균 및 바로 사용가능한 상태로 공급될 수 있다.
투약:
본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물의 투여량은 수많은 인자에 따라 달라질 것이나, 조성물이 단위 용량 컨테이너 (예를 들어, 바이알)에 저장될 때 최적의 치료 유효 용량이 될 것이다. 또한, 제약 제제는 주사기에 보관될 수 있다. 치료 유효 용량은 본원에 기재된 바와 같이 임상적으로 원하는 종점, 예컨대 자가면역 증상 완화 및/또는 면역저해, 및/또는 관용 유도를 생성하는 양을 결정하기 위해 본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물의 증가하는 양의 반복된 투여에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.
바람직한 투여량은 대상체에서 통상적 T 세포 및 자연 살해 세포에 비해 조절성 T 세포를 우선적으로 확장하고 활성화시키는데 효과적인 낮은 투여량이다. 조절성 T 세포의 활성화는 수많은 다양한 접근법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, IL-2-의존적 T 세포 프로세스에서 STAT5의 필수적인 역할이 주어지면, 림프구에서 증가된 STAT5의 검출이 Treg 활성화의 핵심 마커로서 활용될 수 있다. 표현형적으로, Treg의 활성화는 또한 증가된 세포 표면 IL-2Rα(CD25), 및/또는 Treg 계통의 마스터 조절인자인 단백질 포크헤드 박스 P3 (Foxp3)의 증가된 세포내 발현, 및/또는 세포 증식과 연관된 단백질 Ki67의 증가된 발현을 통해 유동 세포계측법에 의해 측정될 수 있다. 총괄적으로, 이들 마커는 Treg 세포의 기능성과 연결되어 있으며, 종종 자가면역 질환에서 이러한 세포에 조절장애가 있다. 본원에서, Treg 세포 유도 및 활성화의 바람직한 검출은 유동 세포계측법에 의한 것이다. Treg의 기능성은 또한 통상적 T 세포의 증식을 억제하는 능력을 측정하는 생체외 저해 검정을 통해 평가될 수 있다. Treg 동원 및 활성화의 결과는 또한 항원-유도 염증 모델을 사용하여 생체내에서 직접 측정될 수 있다.
본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물의 투여는 전형적으로 주사를 통해 이루어진다. 다른 투여 방식, 예컨대 폐, 비강, 협측, 직장, 설하 및 경피가 또한 고려된다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 동맥내, 종양내, 림프내, 복강내, 심장내, 경막내 및 근육내 주사, 뿐만 아니라 주입 주사를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 주사는 피하이다. 예를 들어, 환자에게의 투여는 본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물 및 희석제를 포함하는 조성물의 주사를 통해 달성될 수 있다. 가능한 희석제와 관련하여, 희석제는 예를 들어, 주사용 정균수, 물 중 덱스트로스 5%, 포스페이트 완충 염수, 링거 용액, 락테이트화된 링거 용액, 염수, 멸균수, 탈이온수, 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 2개의 주어진 약리학적 구성성분이 주어진 제형에서 함께 상용성이 있는지 여부를 시험을 통해 결정할 수 있다. 환자에게 투여하기 위한 예시적인 조성물, 예를 들어, 피하 제형은 예를 들어, 치료 유효 용량의 본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물, 물, 아세트산나트륨, 염화나트륨 및 수크로스를 포함한다. 액체 조성물은 약 4.5-7.5; 또는 약 4.5 - 6 범위의 pH를 가질 것이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물은 고체 형태이다. 바람직한 고체 형태는 예를 들어, 5 중량 퍼센트 미만의 물, 또는 바람직하게는 2 중량 퍼센트 미만의 물을 함유하는 고체 건조 형태인 것들이다. 고체 형태는 일반적으로 수성 희석제에서 재구성에 적합하다. 바람직한 고체 제형은 약 0-10℃의 온도에서 밀봉된 컨테이너에 저장될 때 적어도 약 24개월 동안 안정하다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에 제공된 바와 같은 조성물의 투여에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 상태, 예컨대 자가면역 질환을 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 살아있는 유기체를 지칭하며, 인간 및 동물 둘 다를 포함한다. 대상체는 포유동물 (예를 들어, 뮤린, 유인원, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 바람직하게는 인간이다. 특정 실시양태에서, 환자, 바람직하게는 인간은 본 개시내용의 조성물의 투여로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 장애 또는 상태, 예컨대 자가면역 상태를 추가로 특징으로 한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 이러한 상태의 증상 및 합병증을 퇴치 또는 경감시킬 목적으로 본 개시내용의 조성물의 투여가 지시되는 상태를 갖는 환자의 관리 및 케어를 지칭한다. 치료는 증상 또는 합병증의 발병을 예방하거나, 증상 또는 합병증을 경감시키거나, 질환, 상태 또는 장애, 예를 들어 자가면역 장애를 제거하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 본 개시내용의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 치료는 면역저해 및/또는 관용을 유발하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 본 개시내용의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 치료될 환자는 동물이며, 바람직하게는 인간이다. 본원에서 사용된 바와 같은 투여는 환자가 조성물을 소비하는 경우 및/또는 환자가 조성물을 소비하도록 지시받는 경우를 포함한다.
어구 "제약 유효량" 및 "약리 유효량" 및 "치료 유효량" 및 "생리 유효량"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 혈류 또는 표적 조직 중 물질의 원하는 수준을 달성하는데 필요한 본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물의 양을 지칭한다. 정확한 양은 수많은 인자, 예컨대 예를 들어, 치료될 특정한 상태, 의도된 환자 집단, 개별 환자 고려사항, 투여될 치료 조성물의 구성성분 및 물리적 특징 등에 따라 달라질 것이다.
본 개시내용의 화합물을 포함하는 제약 조성물은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 주사기, 임의로 펜형 주사기 또는 기계적 구동된 주입기를 사용하여 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여는 주입 펌프에 의해 수행될 수 있다. 본 개시내용의 실시양태는 치료 유효량의 본 개시내용의 조성물 및 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에게 투여하기에 적합한 제약 조성물을 제공한다. 이러한 제약 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지된 제약 생성물을 위한 통상적 부형제를 사용하여 다양한 기술 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Edition, University of the Sciences in Philadelphia, Philadelphia, PA, USA (2006)).
본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물의 용량, 뿐만 아니라 방법 및 조성물과 연관된 투여 레지멘은 대상체의 연령, 체중 및 일반적인 상태, 뿐만 아니라 치료될 상태의 유형 및 상태, 의료 전문가의 판단, 및 투여될 특정한 선택적 Treg 자극제 조성물에 따라 달라질 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 환자 또는 대상체에게 단일 또는 다중 용량 투여 시 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의가 찾고 있는 조직, 시스템, 동물, 포유동물 또는 인간에 대한 생물학적 또는 의학적 반응 또는 원하는 치료 효과를 유도할 본 개시내용의 조성물의 양 또는 용량을 지칭한다. 바람직하게는 유효량은 환자 또는 대상체에게 단일 또는 다중 투여 시 용량전 수준에 비해 적어도 10배의 선택적 Treg 세포 증가를 유도할 본 개시내용의 조성물의 양 또는 용량을 지칭한다. 용량은 더 높은 초기 로딩 용량, 이어서 더 낮은 용량을 포함할 수 있다. 하나 이상의 예에서 본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물의 치료 유효량은 IL-2의 양으로 표시된 다음 범위 중 하나 이상에 포괄된 양이다: 약 0.10 내지 약 700 μg/kg; 약 0.20 내지 약 650 μg/kg, 약 0.30 내지 약 600 μg/kg; 약 1.0 내지 약 550 μg/kg, 약 2.0 내지 약 500 μg/kg, 약 10 내지 약 450 μg/kg, 약 25 내지 약 400 μg/kg, 약 50 내지 약 350 μg/kg 또는 약 100 내지 약 300 μg/kg (각각의 및 모든 전술한 범위로부터의 전술한 시작 값 및 종료 값의 임의의 및 모든 조합 포함). 일부 실시양태에서, 예를 들어, 대상체에서 통상적 T 세포 및 자연 살해 세포에 비해 조절성 T 세포의 우선적 확장 및 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 상태 또는 자가면역 질환을 치료하기 위해, 본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물은 용량으로, 예를 들어, 500 μg/kg 이하의 용량으로 투여된다. 본 개시내용의 바람직한 용량 레지멘은 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물, 및 특히 포뮬라 A-E의 것이 2주마다 1회 3-24 μg/kg의 용량으로 투여되는 것이다. 본 개시내용의 또 다른 바람직한 용량 레지멘은 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물, 및 특히 포뮬라 A-E의 것이 2주마다 1회 3-18 μg/kg의 용량으로 투여되는 것이다. 본 개시내용의 또 다른 바람직한 용량 레지멘은 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물, 및 특히 포뮬라 A-E의 것이 2주마다 1회 3-12 μg/kg의 용량으로 투여되는 것이다. 본 개시내용의 또 다른 바람직한 용량 레지멘은 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물, 및 특히 포뮬라 A-E의 것이 2주마다 1회 3-6 μg/kg의 용량으로 투여되는 것이다. 본 개시내용의 또 다른 바람직한 용량 레지멘은 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물, 및 특히 포뮬라 A-E의 것이 2주마다 1회 3 μg/kg의 용량으로 투여되는 것이다.
본원에 제공된 조성물은 면역 체계의 항상성 능력을 복원하는데 효과적이며, 예를 들어 Treg 기능장애가 자가면역 질환, 알레르기, 및 이식 거부와 같은 역할을 하는 질환에 긍정적인 영향을 미치는 능력을 갖는다. 한 실시양태에서, 본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물을 투여함으로써 생체내 내인성 Treg를 선택적으로 확장하는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 용량 범위는 예를 들어, 약 100 μg/kg 내지 약 500 μg/kg, 또는 약 150 μg/kg 내지 약 450 μg/kg, 또는 약 175 μg/kg 내지 약 400 μg/kg, 또는 심지어 약 175 μg/kg 내지 약 350 μg/kg을 포함한다. 바람직한 용량 및 투여 레지멘은 본원에 제공된 실시예에 기재되어 있다. 적합한 용량은 Teff 세포 및 NK 세포의 최소 자극으로 Treg 세포의 최대 증폭을 달성하는데 효과적이며; 이는 Treg 세포, 이펙터 CD4+ 및 CD8+ T 세포, 및 NK 세포의 유병률을 확인하기 위해 유동 세포계측법 분석을 위한 말초 혈액의 수집에 의해 모니터링될 수 있다. 이들 숫자를 기반으로 투여량은 적절하게 조정될 수 있다.
투여량 레지멘은 최적의 원하는 반응 (예를 들어, 치료 효과)을 제공하도록 조정될 수 있다. 정맥내 (i.v.) 또는 비-정맥내 투여, 국소 또는 전신, 또는 이들의 조합을 위한 투여 스케쥴은 전형적으로 단일 볼루스 투여량 또는 연속적인 주입 내지 1일당 다중 투여 (예를 들어, 4-6시간마다)의 범위, 또는 치료 의사 및 환자의 상태에 의해 지시된 바와 같다. 본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물의 투여 빈도 및 스케쥴과 관련하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 적절한 투여 레지멘을 결정할 수 있다. 예를 들어, 치료 사이클에서, 임상의는 단일 용량 또는 일련의 용량으로 (예를 들어, 수일 또는 수주의 과정에 걸쳐) 조성물을 투여하기로 결정할 수 있다. 조성물의 장기 작용 성질에 기초하여, 이는 전형적으로 상대적으로 드물게 투여되는 것이 바람직하다 (예를 들어, 3주마다 1회, 2주마다 1회, 8-10일마다 1회, 1주마다 1회 등). 요법 과정과 연관된 예시적인 시간 길이는 약 1주; 약 2주; 약 3주; 약 4주; 약 5주; 약 6주; 약 7주; 약 8주; 약 9주; 약 10주; 약 11주; 약 12주; 약 13주; 약 14주; 약 15주; 약 16주; 약 17주; 약 18주; 약 19주; 약 20주; 약 21주; 약 22주; 약 23주; 약 24주; 약 7개월; 약 8개월; 약 9개월; 약 10개월; 약 11개월; 약 12개월; 약 13개월; 약 14개월; 약 15개월; 약 16개월; 약 17개월; 약 18개월; 약 19개월; 약 20개월; 약 21개월; 약 22개월; 약 23개월; 약 24개월; 약 30개월; 약 3년; 약 4년 및 약 5년을 포함한다. 본원에 기재된 치료 방법은 전형적으로 환자의 치료를 감독하는 임상의가 치료 방법이 효과적이라고 판단하는 한, 즉, 환자가 치료에 반응하는 한, 또는 상태의 관련 증상이 가라앉을 때까지 계속된다. 치료 방법이 효과적임을 나타내는 비제한적인 파라미터는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 조절성 T 세포, 예컨대 CD25+ Treg 및 FoxP3+ Treg 수의 증가, 및/또는 NK 세포 및 CD4+ 및 CD8+ 이펙터 세포 수의 저하.
본원에 제공된 조성물은 치료 유효 용량으로 대상체에게 투여될 때 조절성 T 세포, 예컨대 Foxp3+ 및 CD25+ 세포 대 이펙터 T 세포, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ 세포의 비를 증가시키는데 유용하다. 예를 들어, 본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물의 투여는, 기준선과 비교 시, 생체내 마우스 모델에서, 예를 들어, 예컨대 본원에 기재된 모델에서 평가될 때 조절성 T 세포에서의 적어도 2배-증가를 유발하는데 효과적일 수 있다. 방법은 또한 일부 실시양태에서, 기준선과 비교 시, 생체내 마우스 모델에서, 예를 들어, 예컨대 본원에 기재된 모델에서 평가될 때 조절성 T 세포에서의 적어도 4배-증가를 유발하는데 효과적일 수 있다. 일부 경우에, 조절성 T 세포 수에서의 증가는 투여후 적어도 3일 동안, 또는 심지어 투여후 적어도 5일 동안 기준선 수준 초과로 지속된다.
첨부된 실시예에 제시된 바와 같이, 본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물은 적합한 투여량 범위 내로 투여될 때, T 이펙터 세포에 대한 최소 자극 효과를 가지면서 조절성 T 세포의 세포 집단 및 면역-저해 기능을 우선적으로 증가시키는데 효과적이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물은 천연 IL-2의 등가 용량으로 획득될 수 없는 Treg 대 Teff 반응의 크기, 지속기간 및 특이성을 제공하기 위해 지속적인 노출을 달성할 수 있다.
실시예
전술한 설명 뿐만 아니라 다음의 실시예는 본원에 제공된 본 개시내용(들)의 범위를 예시하려는 것이고 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 한다. 본 개시내용의 범위 내의 다른 측면, 장점 및 변형은 본 개시내용이 속한 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
재료 및 방법
알데스류킨 (데스-알라닐-1, 세린-125 인간 인터류킨-2, 도 2 참조)과 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 인간 IL-2를 클로닝 및 발현하고 본원에서 RUR20kD-IL-2로 지칭되는 예시적인 선택적 Treg 자극제 조성물을 제조하는데 사용한다. 서열은 천연 성숙 인간 IL-2 서열로부터 아미노산 #1 (알라닌)을 제외하고, 아미노산 # 125의 시스테인에서 세린으로의 아미노산 돌연변이가 있다. 서열에서 첫번째 아미노산은 직접적인 박테리아 발현을 위한 메티오닌이다 (코딩된 신호 펩티드 없음). 발현 시, N-말단 메티오닌은 숙주 메티오닌 아미노 펩티다제에 의해 제거된다. 아미노산 위치 #58 및 #105에서 시스테인 사이에 단일 디술피드 연결이 형성된다. 단백질은 이.콜라이로부터 유래된 것이므로 글리코실화되지 않는다. 일부 기재에서 접합된 IL-2 조성물은 일부 면에서 (1,3-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)카르바모일)-2-프로판옥시)-4-부탄아미드)인터류킨-2)로 기재될 수 있으며, 이 명명법은 PEG화 패턴 또는 혼합물을 완전히 기재하지 않음을 주목한다.
폴리에틸렌 글리콜 시약, mPEG2(20kD)-부탄산, N-히드록시숙신이미드 에스테르 (1,3-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)10kD카르바모일)-2-프로판옥시)-4-숙신이미딜 부타노에이트 (본원에서 mPEG2-ru-20K NHS라고도 함)를 미국 특허 번호 7,887,789의 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조한다. 외관: 백색 내지 회백색 과립형 분말; 분자량 (Mn) 18-22 kDa (중합체 다분산성으로 인해). 1,3-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)10kD카르바모일)-2-프로판옥시)-4-숙신이미딜 부타노에이트의 구조는 하기에 제시되어 있다.
Figure 112020124239333-pct00012
달리 특정되지 않는 한, 본원에 제공된 RUR20kD-IL-2 실시양태 및 관련 조성물을 포함하는 선택적 Treg 자극제 조성물의 농도, 양 및 투여 수준은 단백질 구성성분에 의해 기여된 질량만 계수하고 PEG 모이어티에 의해 기여된 질량은 계수하지 않은 단백질 기준으로 보고된다. 단백질 기준을 사용하여, 계산에 사용된 효과적 RUR20kD-IL-2 조성물 분자량은 rIL-2 단백질만 계수되기 때문에 다양한 정도의 PEG화를 갖는 접합된 rIL-2 분자의 혼합물에 대해서도 15.3 kDa이다.
RUR20kD-IL-2 관련 조성물은 리신 기에 공유결합으로 결합된 다중 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 접합된 rhIL-2 (알데스류킨 서열)로 이루어진 PEG화 접합체 혼합물 조성물이다. rhIL-2 분자당 PEG 모이어티의 수 (PEG화 정도)는 분자당 우세하게 2개 및 3개 PEG 모이어티 (디- 또는 트리- PEG화)의 분포이며, 미량의 종은 1개 PEG (모노-PEG화) 및 4개 PEG (테트라-PEG화) 및/또는 고급 PEG화 분자를 함유하여, rhIL-2당 평균 약 2.5개 PEG 모이어티를 생성한다. 각각의 PEG 모이어티는 20 kDa의 공칭 분자량을 갖고, rhIL-2는 15.3 kDa의 분자량을 가지며, 결과적으로 공칭 RUR20kD-IL-2 분자량은 65 kDa이다.
실시예 1
RUR 20kD -IL-2 및 관련 조성물의 제조
mPEG2-ru-20K NHS의 스톡 용액 (100 mg/mL)을 2 mM HCl에서 제조하였다. IL-2의 전형적인 PEG화 반응을 다음과 같이 수행하였다: 115 mL의 IL-2 (알데스류킨) 스톡 용액 (1.3 mg/mL)을 250 mL 플라스틱 병에 옮기고, 15 mL의 0.5 M 비신 (N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신), pH 9.2 및 0.5 mL의 물을 IL-2의 용액에 첨가하였다. 19.5 mL의 mPEG2-ru-20K NHS 스톡 용액을 IL-2-함유 용액에 적가함으로써 PEG화를 개시하였다. 생성된 반응 혼합물은 1 mg/mL IL-2, 50 mM 비신 및 10 몰 당량의 mPEG2-ru-20K NHS (단백질 기준)를 함유하고 8.7의 pH를 가졌다. 반응이 상온에서 40분 동안 온화한 교반 하에 진행되게 하였다. 반응 pH를 4.1로 감소시키기 위해 2.2 mL 아세트산을 첨가함으로써 반응을 종결시켰다.
생성된 IL-2 접합체 생성물을 SP FF 세파로스를 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 접합 반응이 완료되면, 반응 혼합물을 20 부피의 10 mM 아세트산나트륨 완충액 (pH 4.0)에 대해 투석하였다. 투석된 샘플을 물로 1:4로 희석하고, SP FF 세파로스 수지로 패킹된 칼럼 상에 로딩하였다. 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 버퍼는 다음과 같았다: 버퍼 A: 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.0), 및 버퍼 B: 10 mM 아세트산나트륨, 1.0 M 염화나트륨 (pH 4.0). 수지를 버퍼 B로 세척하고, 샘플 로딩 전에 버퍼 A로 평형화하였다. 로딩 후, 수지를 3 칼럼 부피의 버퍼 A로 세척하였다. 28 cm/h의 유속으로 5 칼럼 부피에 걸쳐 0 내지 50% 버퍼 B, 1 칼럼 부피에 걸쳐 25% 내지 50% 버퍼 B, 1 칼럼 부피에 걸쳐 50% 버퍼 B, 1 칼럼 부피에 걸쳐 50% 내지 100% 버퍼 B 및 1 칼럼 부피에 걸쳐 100% 버퍼 B로 이루어진 4-단계 구배를 사용하여 접합된 및 비-접합된 IL-2를 용출시켰다. 2 및 3 (즉, 이량체 및 삼량체)의 PEG화 정도 (dP)를 갖는 IL-2 접합체를 함유하는 분획을 SDS-PAGE에 의해 확인하고 풀링하였다.
이량체 및 삼량체를 함유하는 풀링된 분획을 교반된 한외여과 셀 (아미콘(Amicon)) 및 질소 기체를 사용하여 농축시켰다. 이동상: A, 물 중 0.09% TFA 및 B, 아세토니트릴 중 0.04% TFA를 사용하여 RP-HPLC에 의해 최종 생성물의 조성을 결정하였다. 인트라다(Intrada) WP-RP C18 칼럼 (3 x 150 mm)을 0.5 ml/분의 유속 및 50℃의 칼럼 온도로 사용하였다. 정제된 접합체 혼합물은 약 4.6% (mol)의 모노-PEG화 rIL-2, 약 47.7% (mol)의 디-PEG화 rIL-2, 약 42.9% (mol)의 트리-PEG화 rIL-2 및 약 4.8% (mol)의 테트라-PEG화 IL-2를 포함하는 것으로 결정되었다. 도 1을 참조하며, 여기서 용출 시간은 x-축에 제공된다. 최종 생성물 혼합물의 평균 PEG화 정도는 2.48 (즉, 약 2.5)로 결정되었다. 최종 생성물 혼합물에서 유리 IL-2가 검출되지 않았다. 이 제조는 포뮬라 A의 RUR20kD-IL-2의 조성물의 예이다.
실시예 1-A
RUR 20kD -IL-2 및 관련 조성물의 대안적인 제조
원하는 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물의 제조는 다음으로 이루어진다: rhIL-2 단백질 공정 중간체의 발효 및 정제, PEG 시약 출발 물질 mPEG2-ru-20K NHS와 rhIL-2의 접합, 특정된 PEG화 정도를 갖는 IL-2 접합체 분획의 정제, 및 본원에 기재된 실시양태에 따른 원하는 분포의 RUR20kD-IL-2 조성물을 생성하기 위한 PEG화 rhIL-2 접합체의 최종 제형화.
1,3-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)10kD카르바모일)-2-프로판옥시)-4-숙신이미딜 부타노에이트 (본원에서 mPEG2-ru-20K NHS라고도 함)를 인터류킨-2 (IL-2) 단백질 (알데스류킨 서열) 상의 리신 잔기와 반응시켜 PEG화 IL-2 접합체의 분포를 생성함으로써 원하는 RUR20kD-IL-2 조성물을 제조하였다. 생성물은 주로 디-PEG화 및 트리-PEG화 종을 함유하였으며, 모노- 및/또는 테트라-PEG화 종의 양은 더 낮았다.
동결된 IL-2 출발 물질 (-70℃에서 저장된 10 mM 아세테이트, 5% 트레할로스, pH 4.5 완충액 중 정제된 재조합 IL-2 (알데스류킨 서열))을 실온으로 해동하였다. PEG 반응물인 mPEG2-ru-20K NHS (분말)를 실온에서 ~90 g/L로 2 mM HCl 용액에 첨가함으로써 가용화하고, 최소 15분 동안 진탕하였다. 그 후, 용액을 반응 용기에 충전하였다. 해동된 IL-2를 반응 용기에 첨가하고, 물로 적절하게 희석한 다음, 0.75 M 비신 pH 9.7 완충액을 첨가하였다. 반응 혼합물 중 최종 IL-2 농도는 대략 1.0 g/L이고, 비신 농도는 대략 50 mM이며, 8.7의 표적 pH에 도달하였다. 일반적으로, PEG:rhIL-2 질량비는 단백질을 PEG화하기 위해 pH 8.5 내지 9.5의 비신 완충된 용액에서 약 10:1 내지 13:1이다. 반응물을 mPEG2-ru-20K NHS 용액 첨가의 완료로부터 측정된 바와 같이 22℃에서 40분 동안 계속 진탕하면서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간의 끝에, 1 N 아세트산의 첨가로 반응물을 켄칭하여, pH를 급속히 낮추고, 즉시 추가 1 N 아세트산을 사용하여 pH 4.0으로 추가 단계적 적정하였다. 켄칭된 반응물을 물을 첨가하여 10X 희석하였다. 희석된 켄칭된 반응물을 0.22 μm 필터를 통해 여과하여, 조질 생성물을 제공하였다.
그 후, PEG화 반응 분획을 부분적으로 분리하기 위해 SP 세파로스® 고속 유동 양이온 교환 크로마토그래피를 조질 생성물에서 수행하였다. SP 세파로스® 고속 유동 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 평형화하고, ~5분의 체류 시간으로 실온에서 공급물을 로딩한 다음, 5 CV (칼럼 부피)를 로딩 버퍼로 세척하였다. PEG화 rhIL-2는 수지에 결합하지만, 유리 PEG는 세척되었다. 그 후, 10 mM 아세트산나트륨 pH 4.0 완충액 배경 중 0-500 mM 염화나트륨으로 선형 구배 용출을 사용하여 생성물을 용출시켰다. 용출로 ~1 CV로 시작하여 각각 0.15 CV의 분획을 수집하였다. 280 nm에서의 흡광도가 최대 피크의 <5%이면 분획 수집을 종료하였다. 각각의 분획 중 PEG화 분획 농도 (즉, 모노-PEG화 IL-2 (단량체), 디-PEG화 IL-2 (이량체), 트리-PEG화 IL-2 (삼량체), 테트라-PEG화 IL-2 (사량체) 등)를 280 nm의 파장에서 흡광도에 의해 측정하였다. PEG화 분획의 분포를 본원에 기재된 바와 같이 RP-HPLC에 의해 측정하고, 모노-PEG, 디-PEG, 트리-PEG 및 고급 구성성분을 함유하는 분획을 확인하고, 본원에 제공된 바와 같은 RUR20kD-IL-2 조성물, 및 특히 포뮬라 A-E에 기재된 바와 같이 표적 PEG화 분획 분포 프로파일을 갖는 조성물을 생성하기 위해 필요한 분획의 재풀링을 결정하는데 사용하였다. 확인된 조성물의 선택된 분획의 분취액, 예를 들어 디-PEG-IL-2 및 트리-PEG-IL-2, 및/또는 모노-PEG 또는 고급 PEG를 본원에 제공된 바와 같이 표적 프로파일을 달성하기 위해 계산한 다음, 필요에 따라 재풀링하여, PEG화 분획의 원하는 분포를 갖는 생성물을 갖는 RUR20kD-IL-2 조성물을 얻었다. 대안적으로, 정제 계획을 고안할 수 있으며, 이에 의해 용출 및 수집은 재풀링 필요 없이 본원에 기재된 실시양태에 따라 원하는 프로파일을 제공할 수 있다. 그 후, 원하는 (및/또는 재풀링된) 크로마토그래피 정제된 제제를 농축시키고, 접선 유동 여과 (TFF)를 사용하여 10 mM 아세트산나트륨, 150 mM 염화나트륨, 2% w/v 수크로스, pH 5.0으로 투석여과하여, RUR20kD-IL-2 조성물 약물 물질의 1 mg/mL (단백질 기준)의 최종 표적 농도를 달성하였다.
재풀링된 및/또는 표적 생성물을 분석하고, PEG 분획의 프로파일을 평가하기 위해 RP-HPLC를 포함하여 본원에 기재된 방법에 의해 조성물 분포를 확인하였다. 포뮬라 A-E의 RUR20kD-IL-2 조성물에 대한 본원 명세서에 따른 조성물의 제조는 하기 표 1에 나열된 1-4 번호가 매겨진 예시 생성물 배치에 의해 예시된다. 속성에 대한 검정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고/거나 실시예 1-B 내지 실시예 1-I, 또는 달리 본원에 기재되어 있다. 적절한 역사적 참조 샘플 조성물을 확립하고, 후속적 제조에서 비교를 위해 사용하였다.
표 1. RP-HPLC 및 SEC-HPLC에 의한 RUR 20kD -IL-2 조성물의 여러 배치로부터의 샘플의 예시적인 분석의 요약
Figure 112020124239333-pct00013
Figure 112020124239333-pct00014
ND는 검출가능하지 않음이고, NMT는 이하이다.
일부 실시양태에서 RUR20kD-IL-2 조성물 생성물은, 몰 기준으로, 1% 미만의 유리, 비접합된 IL-2 (보다 바람직하게는 검출가능한 유리 IL-2 없음), 5% 이하의 모노-PEG화 IL-2, 28% 내지 약 60% 디-PEG화 IL-2, 약 24% 내지 약 65% 트리-PEG화 IL-2, 12% 이하의 고급 PEG화 IL-2 종, 및 80% 이상의 조합된 디- 및 트리-PEG화 IL-2 종을 함유할 것이다.
일부 실시양태에서, RUR20kD-IL-2 조성물 생성물은 예를 들어, 0.5 mol% 미만의 유리 IL-2, 약 2.5 내지 약 4.5 mol% 모노-PEG화 IL-2, 약 35 내지 약 50 mol% 디-PEG화 IL-2, 약 38 내지 약 46 mol% 트리-PEG화 IL-2, 약 3 내지 약 10 mol% 고급 PEG화 IL-2 종, 및 약 80 내지 약 95 mol%의 조합된 총 디-PEG화 및 트리-PEG화 IL-2를 함유할 것이다.
일부 실시양태에서, RUR20kD-IL-2 조성물 생성물은 예를 들어, 몰 기준으로, 5% 이하의 모노-PEG화 IL-2, 및 28% 내지 약 60% 디-PEG화 IL-2, 및 약 24% 내지 약 65% 트리-PEG화 IL-2, 및 12% 이하의 고급 PEG화 IL-2 종을 함유할 것이다. 바람직하게는 조성물은 80% 이상의 조합된 디- 및 트리-PEG화 IL-2 종을 포함한다.
일부 실시양태에서, RUR20kD-IL-2 조성물 생성물은 다음을 함유할 것이다: 예를 들어, 약 2.5 내지 약 4.5 mol%가 모노-PEG화 IL-2로 구성되고, 약 35 내지 약 50 mol%가 디-PEG화 IL-2로 구성되고, 약 38 내지 약 46 mol%가 트리-PEG화 IL-2로 구성되고, 약 3 내지 약 10 mol%가 고급 PEG화 IL-2 종으로 구성된다. 바람직하게는 조성물은 약 80 내지 약 95 mol%의 조합된 총 디-PEG화 및 트리-PEG화 IL-2를 포함한다.
일부 실시양태에서, RUR20kD-IL-2 조성물 생성물은 다음을 함유할 것이다: 예를 들어, 약 2.8 내지 약 3.8 mol%가 모노-PEG화 IL-2로 구성되고, 약 44 내지 약 48 mol%가 디-PEG화 IL-2로 구성되고, 약 41 내지 약 44 mol%가 트리-PEG화 IL-2로 구성되고, 약 7 내지 약 9 mol%가 고급 PEG화 IL-2 종으로 구성된다. 바람직하게는 조성물은 약 87 내지 약 90 mol%의 조합된 총 디-PEG화 및 트리-PEG화 IL-2를 포함한다.
일부 실시양태에서, RUR20kD-IL-2 조성물 생성물은 다음을 함유할 것이다: 예를 들어, 약 2.8 내지 약 3.8 mol%가 모노-PEG화 IL-2로 구성되고, 약 44 내지 약 48 mol%가 디-PEG화 IL-2로 구성되고, 약 41 내지 약 44 mol%가 트리-PEG화 IL-2로 구성되고, 약 7 내지 약 9 mol%가 고급 PEG화 IL-2 종으로 구성되고, 여기서 상기 조성물은 리신 K7 또는 K8 또는 K31 또는 K75 중 하나에 부착된 PEG 모이어티를 갖는 모노-PEG화 IL-2 접합체의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는 조성물은 약 87 내지 약 90 mol%의 조합된 총 디-PEG화 및 트리-PEG화 IL-2를 포함한다.
일부 실시양태에서, RUR20kD-IL-2 조성물 생성물은 다음을 함유할 것이다: 예를 들어, 약 2.8 내지 약 3.8 mol%가 모노-PEG화 IL-2로 구성되고, 약 44 내지 약 48 mol%가 디-PEG화 IL-2로 구성되고, 약 41 내지 약 44 mol%가 트리-PEG화 IL-2로 구성되고, 약 7 내지 약 9 mol%가 고급 PEG화 IL-2 종으로 구성되고, 여기서 상기 조성물은 리신 K7에 부착된 PEG 모이어티를 갖는 모노-PEG화 IL-2 접합체를 포함한다. 바람직하게는 조성물은 약 87 내지 약 90 mol%의 조합된 총 디-PEG화 및 트리-PEG화 IL-2를 포함한다.
실시예 1-B
역상 고성능 액체 크로마토그래피를 통한 RUR 20kD -IL-2 조성물의 순도 및 특징화
다이오드 어레이 검출기 (215 nm의 UV)가 장착된 애질런트(Agilent) 1200 시리즈 기기를 사용하여 RUR20kD-IL-2 조성물의 샘플의 크로마토그래피 순도 및 정체성을 평가하는데 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)를 사용하였다. 사용된 칼럼은 0.6 mL/분의 용출액 유속으로 ACE 3 페닐-300 칼럼 (맥-모드 애널리티컬 인크.(Mac-Mod Analytical Inc.)) (또는 다른 적합한 칼럼)일 수 있다. 2개의 이동상의 혼합물을 함유하는 구배를 사용하여 RP-HPLC를 수행하였다: (1) 이동상 A, 물 중 0.1% 포름산의 용액, 및 (2) 이동상 B, 아세토니트릴 중 0.1% 포름산의 용액. 선형 구배는 60% 이동상 A/40% 이동상 B 내지 40% 이동상 A/60% 이동상 B, 내지 20% 이동상 A/80% 이동상 B, 내지 60% 이동상 A/40% 이동상 B의 범위였다. 희석제/제형 완충액의 구성성분은 10 mM 아세트산나트륨, 200 mM 염화나트륨, 2% 수크로스, 5.0의 pH였다.
동결된 RUR20kD-IL-2 조성물 참조 물질 및 샘플을 해동하고, 제형 완충액을 사용하여 1.0 mg/mL로 희석하였다. RUR20kD-IL-2-조성물 관련된 피크의 분석에 간섭이 없도록 보장하기 위해 제형 완충액의 적어도 하나의 블랭크 대조군을 먼저 주사를 통해 RP-HPLC에 적용하였다. 다음, RUR20kD-IL-2 조성물 참조 물질 또는 대조군을 5회 주사하였다. RUR20kD-IL-2 조성물 샘플을 다음에 주사하였다. RUR20kD-IL-2 조성물 참조 물질/대조군을 6회 마다 샘플 주사 후 및 주사 순서의 끝에 주사하였다.
디-PEG화 (디-PEG) 및 트리-PEG화 (트리-PEG) RUR20kD-IL-2 조성물을 포함하는 처음 5개의 참조 물질 주사에 대한 체류 시간의 % 상대 표준 편차 (RSD)는 2.0% 이하였다. 디-PEG 및 트리-PEG 구성성분의 모든 참조 물질 RUR20kD-IL-2 조성물 주사에 대한 % RSD 면적 퍼센트는 5.0% 이하였다. 참조 및 샘플 주사로부터의 모든 RUR20kD-IL-2 조성물 피크를 통합하였다. 구체적으로, 1.0 mg/mL 농도의 RUR20kD-IL-2 조성물의 경우, 0.5% 검출 한계 (LOD)를 초과하는 디-PEG 및 트리-PEG RUR20kD-IL-2 조성물 종 및 0.3% LOD 초과의 rhIL-2 피크를 각각 통합하였다. 1.0 mg/mL 농도의 RUR20kD-IL-2의 경우, 정량 한계 (LOQ)는 디-PEG 및 트리-PEG RUR20kD-IL-2 종의 경우 1.0% 및 rhIL-2의 경우 0.5%였다. 분석 결과는 하기 표 2 (6개 샘플) 및 표 3 (12개 샘플)에 제시되어 있다.
표 2: RP-HPLC에 의해 분석된 6개의 RUR 20kD -IL-2 조성물 복제 샘플로부터의 모노-PEG, 디-PEG, 트리-PEG, 테트라-PEG 및 펜타-PEG 분획에 대한 면적 퍼센트
Figure 112020124239333-pct00015
표 3: RP-HPLC에 의해 분석된 12개의 RUR 20kD -IL-2 조성물 복제 샘플로부터의 모노-PEG, 디-PEG, 트리-PEG, 테트라-PEG 및 펜타-PEG 분획에 대한 면적 퍼센트
Figure 112020124239333-pct00016
실시예 1-C
크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피를 통한 RUR 20kD -IL-2 조성물의 순도 및 특징화
다이오드 어레이 검출기 (280 nm의 UV) 및 야라(Yarra) SEC-2000 칼럼 (페노메넥스(Phenomenex))이 장착된 애질런트 1200 시리즈 기기, 및 0.225 mL/분의 용출액 유속을 사용하여 순도를 결정하고 RUR20kD-IL-2 조성물을 특징화하는데 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SEC-HPLC)를 또한 사용할 수 있었다. 이동상은 80:20의 부피비로 0.2M 아세트산암모늄 (pH 5.5)과 아세토니트릴이었다. 희석제/제형 완충액은 5.0의 pH에서 10 mM 아세트산나트륨, 200 mM 염화나트륨, 2% 수크로스를 함유하였다. 동결된 RUR20kD-IL-2 조성물 참조 물질 및 분석용 샘플을 해동하고, 제형 완충액을 사용하여 1.0 mg/mL로 희석하였다. 샘플은 용액에서 5℃에서 최대 5일까지 안정하였다.
절차적으로, RUR20kD-IL-2-관련 피크의 분석에 간섭이 없도록 보장하기 위해 제형 완충액의 적어도 하나의 블랭크 대조군을 먼저 주사를 통해 RP-HPLC에 적용하였다. 다음, 응집체 또는 고분자량 종이 테트라-PEG RUR20kD-IL-2 분획으로부터 분할되도록 보장하기 위해 시스템 적합성 솔루션인 RUR20kD-IL-2 조성물을 주사하였다. 후속적으로, RUR20kD-IL-2 조성물 참조 물질 또는 대조군을 5회 주사하였다. RUR20kD-IL-2 조성물 샘플을 다음에 주사하였다. RUR20kD-IL-2 조성물 참조 물질/대조군을 6회 마다 샘플 주사 후 및 주사 순서의 끝에 주사하였다.
처음 5개의 참조 물질 주사에 대한 디-PEG 및 트리-PEG RUR20kD-IL-2 분획의 체류 시간의 % RSD는 2.0% 이하였다. 모든 참조 물질 주사에 대한 디-PEG 및 트리-PEG RUR20kD-IL-2의 % RSD 면적 퍼센트는 5.0% 이하였다. 참조 및 샘플 주사로부터의 모든 RUR20kD-IL-2 분획 피크를 통합하였다. 구체적으로, 1.0 mg/mL 농도의 RUR20kD-IL-2 조성물의 경우, 1.0% 검출 한계 (LOD)를 초과하는 디-PEG 및 트리-PEG RUR20kD-IL-2 분획을 통합하였다. 1.0 mg/mL 농도의 RUR20kD-IL-2의 경우, 3.0% LOQ를 초과하는 디-PEG 및 트리-PEG RUR20kD-IL-2만이 보고되었다.
RUR20kD-IL-2 조성물의 복제 샘플의 분석은 하기 표 4 및 5에 제시되어 있으며, 여기서 RUR20kD-IL-2 조성물의 모노-PEG, 디-PEG, 트리-PEG, 테트라-PEG 및 펜타-PEG 분획에 대한 피크 면적이 제공된다.
표 4: SEC-HPLC에 의한 RUR 20kD -IL-2의 모노-PEG, 디-PEG, 트리-PEG, 테트라-PEG 및 펜타-PEG 구성성분에 대한 % 피크 면적
Figure 112020124239333-pct00017
표 5: SEC-HPLC에 의한 RUR 20kD -IL-2 조성물 샘플의 모노-PEG, 디-PEG, 트리-PEG, 테트라-PEG 및 펜타-PEG 분획에 대한 % 피크 면적
Figure 112020124239333-pct00018
RP-HPLC 및 SEC-HPLC 둘 다에 의한 RUR20kD-IL-2 조성물의 여러 샘플의 대표적인 분석 요약은 표 1에 제시되어 있다. 알 수 있는 바와 같이, RUR20kD-IL-2 조성물 제조는 PEG화 분획의 혼합물 (즉, 모노-PEG화, 디-PEG화, 트리-PEG화, 테트라-PEG화, 펜타-PEG화 등)과 관련하여 양호한 배치-투-배치 일관성을 나타낸다.
실시예 1-D
SDS-Page
RUR20kD-IL-2 조성물 정체성을 확증하는데 SDS-PAGE를 사용하였다. RUR20kD-IL-2 조성물의 샘플, 분자량 마커 및 적절한 RUR20kD-IL-2 조성물 참조 물질을 NuPAGE Bis-Tris 겔에 로딩하고, 겔을 통해 이동시켰다. 전기영동 후, 겔코드(GelCode)™ 블루 세이프 프로틴 스테인(Blue Safe Protein Stain)을 사용하여 겔을 염색하였다. 참조 물질과 겔 이동 밴딩 패턴의 비교 및 샘플 중 새로운 밴드 없음의 확증으로 샘플의 정체성을 확증하였다. 2개의 가장 진한 밴드는 트리-PEG화 & 디-PEG화 분획에 해당하였다. 레인의 가장 위쪽 밴드는 고급 PEG화 변이체에 해당하고, 가장 아래쪽 밴드는 모노-PEG화 변이체에 해당하였다.
실시예 1-E
표면 플라스몬 공명 (SPR)을 사용한 IL-2Rαβ에 대한 친화성, 및 인간 IL-2Rαβα 복합체를 발현하는 U-2 OS 세포에서의 효력
편광 검출 기능이 있는 비아코어(Biacore) X-100 표면 플라스몬 공명을 사용하여 RUR20kD-IL-2 조성물의 결합 친화성을 결정하였다. 기술은 비아코어 CM5 센서 칩의 표면을 N-히드록시숙신이미드 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 (NHS EDC)의 1:1 복합체로 활성화하여 활성 NHS 에스테르를 생성하는 것을 수반한다. 아세트산나트륨, pH 4.0 완충액 중 염소 항-인간 Fc 항체가 칩의 표면에 공유결합으로 부착되었다. 잔류 NHS 에스테르를 1 M 에탄올아민으로 켄칭하였다. 0.1% BSA를 포함한 HBS-EP 완충액 (1 mM HEPES, pH 7.4, 15 mM NaCl, 0.3 mM EDTA, 0.0005% v/v 계면활성제 P20)을 사용하여 IL-2-Rα-Fc (인간 IL-2Rα-Fc 키메라; 시만시스(Symansis)) 및 IL-2Rβ-Fc (인간 IL-2Rβ-Fc 키메라; 시만시스)의 1:1 혼합물을 칩에 포획하였다. RUR20kD-IL-2 조성물을 0.1% BSA를 포함한 HBS-EP 완충액에 계열 희석하고, 센서 칩 위에 주사하였다. 3분 동안 용액의 적용 (kon), 이어서 3분 세척 (koff) 동안 동역학적 결합 친화성을 측정하였다. koff 및 kon 간의 비를 사용하여, 동역학적 결합 친화성, KD를 계산하였다. RUR20kD-IL-2 조성물의 두 배치의 삼중 분석으로부터의 결과는 표 6에 나열되어 있다. 결합 친화성 및 속도는 두 약물 물질 로트에 대해 일관되었다.
표 6: SPR을 사용한 IL-2Rαβ에 대한 RUR 20kD -IL-2 조성물 결합 친화성
Figure 112020124239333-pct00019
대안적으로, 동결보존된 바로 사용가능한 세포 검정 포맷인 패스헌터(PathHunter)® 플랫폼은 배양된 세포보다 더 강력하고 일관된 세포 반응을 제공한다. 효소 (β-갈락토시다제) 단편 상보성 검정 (디스커버엑스 코포레이션(DiscoverX Corporation)(미국 캘리포니아주)에 의한 패스헌터® 플랫폼)을 사용하여 약물/리간드-수용체 상호작용을 측정하였다. RUR20kD-IL-2 조성물의 효력을 인간 IL-2Rαβα 복합체를 발현하는 U-2 OS 세포에서 측정하였다. 검정의 기초는 단리에서 비활성인 분할된 효소 단편을 사용하였다. 2개의 효소 단편은 IL-2Rβ 또는 IL-2Rγ 서브유닛의 세포내 도메인에 융합되고, 수용체와 리간드 상호작용 시 수용체 서브유닛은 효소 활성을 복원하기 위해 인접하게 되었다. 기질을 첨가하면, 효소가 작용하여 발광 신호를 생성하였다. 샘플 및 참조를 세포와 ~6시간 동안 인큐베이션한 다음, 효소 단편 상보성을 통한 수용체 활성화를 측정하였다. RUR20kD-IL-2 조성물은 고친화성 이종삼량체 αβγ IL-2 수용체 (IL-2R)를 통해 저용량 신호전달을 제공하였다.
실시예 1-F
RUR 20kD -IL-2 조성물의 PEG화 부위 점유율
펩티드 맵핑에 의해 rhIL-2와 RUR20kD-IL-2 조성물의 직접 비교에 의해 2개의 로트로부터 RUR20kD-IL-2 조성물의 PEG화 부위 점유율을 특징화하였다. RUR20kD-IL-2 소화물에서, 리신-함유 펩티드는 PEG화될 수 있으며, 참조 rhIL-2 소화물 중 동일한 펩티드와 비교하여 더 낮은 풍부도를 갖는 그의 상응하는 천연 리신-함유 펩티드에 의해 반영될 수 있다. 그러므로, 분석된 RUR20kD-IL-2 소화물에서 천연 펩티드의 풍부도 감소에 기초하여 PEG화 부위 점유율을 계산할 수 있었다. 또한, 부위 점유율의 추가 확증을 위해 대용 물질의 펩티드 맵핑을 사용할 수 있었다.
일반적으로, 이 분석을 다음과 같이 수행할 수 있었다. 직접 펩티드 맵핑 비교 연구에서, RUR20kD-IL-2 조성물 및 rhIL-2 참조 대조군 샘플을 GluC 및 GluC/트립신에 의해 동시에 소화시킨 후, LC-UV/MS/MS 분석을 수행하여 펩티드 확인 및 풍부도를 제공하였다. RUR20kD-IL-2 조성물 및 rhIL-2의 펩티드 맵핑 비교를 사용하여 PEG화 부위 점유율을 결정하였다.
간단히 말해서, 리신이 없는 일반적인 펩티드 또는 펩티드들을 RUR20kD-IL-2 조성물 및 rhIL-2 분석 둘 다에서 참조 또는 참조들로서 선택하였다. 펩티드의 상대적 세기를 이들의 참조(들)로 정규화하였다. 리신이 있는 천연 펩티드의 상대적 풍부도 감소 (RR)를 펩티드 상대적 세기에 의해 계산하였다 (방정식 1). 리신에서 PEG화 부위 점유율은 리신을 함유하는 펩티드로부터의 평균 RR이다.
방정식 1:
Figure 112020124239333-pct00020
RUR20kD-IL-2 조성물 대용물로서 사용된 물질은 모노-분산 4kD PEG를 rhIL-2의 리신에 접합하여 얻어진 생성물이다. RUR20kD-IL-2 조성물의 PEG화 프로파일을 모방하기 위해, 동일한 접합 링커를 사용하여 대용물을 제조하고, RUR20kD-IL-2 조성물을 제조하는데 사용된 동일한 반응 조건 하에 접합 반응을 수행하였다. 대용물의 LC MS/MS-기반 GluC 맵핑 및 트립신 맵핑은 PEG화 리신을 확인하고 RUR20kD-IL-2에 대한 지원 정보를 제공한다.
RUR20kD-IL-2 (GMP 로트)의 GluC 맵은 rhIL-2의 95% 서열 범위를 갖는다. rhIL-2와 RUR20kD-IL-2의 GluC 맵의 직접 비교는 RUR20kD-IL-2에서 11개 리신 중 4개의 상대적 정량을 제공하며 (표 7 참조), 여기서 리신 7 및 8은 펩티드 맵의 한 부위로 계수하였다. GluC 맵에서 리신의 나머지를 함유하는 펩티드는 부위 분화 없이 PEG화의 증거를 제시하였다. GluC/트립신 맵에서 리신을 함유하는 펩티드의 추가 트립신 절단은 K31, K34, K42 및 K47에서 PEG 점유율을 제공하였다. RUR20kD-IL-2 및 rhIL-2로부터의 GluC/트립신 맵핑 크로마토그램의 비교는 해당 펩티드의 유의한 감소를 제시하였다 (표 7 참조). K48 부위 PEG화 점유율은 효소적 착오-절단으로 인해 트립신/GluC 맵에서 해당 없음 (N/A)이다.
4k PEG화 rhIL-2 대용물의 펩티드 맵핑은 높은 질량 정확도 (< 5 ppm)로 4k PEG-표지된 리신을 갖는 펩티드를 확인하였다. RUR20kD-IL-2 및 4k PEG화 rhIL-2 대용물의 직접 펩티드 맵핑으로부터의 결과의 조합은 K7, K31 및 K75가 우세한 PEG화 부위임을 제시하였다 (표 8 참조). RUR20kD-IL-2 조성물의 덜 우세한 PEG화 부위는 K8, K34, K42, K47, K53 및 K63일 수 있었다. K48은 PEG화될 수 있고, K96은 결정되지 않았다.
PEG화 부위 점유율은 제2 RUR20kD-IL-2 조성물 GMP 제제 및 개발 로트에서 비교가능하였다 (표 7 참조). GluC 맵핑 및 트립신/GluC 맵핑의 조합된 접근법은 RUR20kD-IL-2 조성물에서 접합체의 일부 우세한 PEG화 부위에 대한 로트-대-로트 정보를 제공하였다.
표 7.
RUR 20kD -IL-2 조성물에서의 PEG화 부위 점유율: GMP 로트 및 DEMO 로트
Figure 112020124239333-pct00021
DEMO 로트는 생산 공정의 작동을 입증하기 위해 만들어진 제제를 지칭한다.
표 8. RUR 20kD -IL-2 조성물 및 4k PEG화 rhIL-2 대용물에서의 PEG화 부위 점유율의 요약
Figure 112020124239333-pct00022
실시예 1-G
RUR20kD-IL-2 조성물의 용액 상 안정성
1.0 mg/mL의 RUR20kD-IL-2 조성물 용액 (2% (w/v) 수크로스를 함유하는 10 mM 아세트산나트륨, 200 mM 염화나트륨, pH 5 중 ~1 mg/mL의 rhIL-2 등가물)의 안정성을 이전에 기재된 바와 같이 RP-HPLC에 의해 1, 3, 5 및 7-일 시점에 3개의 상이한 저장 조건 하에 (실온 (주변 실험실 조건), 5℃ (냉장된), 및 -20℃) 평가하였다.
대조군인 신선하게 준비한 RUR20kD-IL-2 조성물 샘플 용액에 대해 RUR20kD-IL-2 조성물 용액 간의 차이를 평가하였다. RT, 5℃ 및 -20℃에서 최대 7일까지 저장된 RUR20kD-IL-2 조성물 샘플의 디-PEG 및 트리-PEG 종은 공칭 -70℃ 샘플 저장과 비교하여 최대 1%의 상대적 차이를 나타내었다. RUR20kD-IL-2의 더 작은 백분율 구성성분 PEG화 종 (모노-PEG, 테트라-PEG 및 펜타-PEG 종)에 대한 상대적 차이 (Rel. Diff.)는 최대 8%였다. 이는 이들 대표적인 저장 조건 하에 저장된 용액 샘플이 안정함을 나타낸다.
시험관내 생물검정:
IL-2 수용체 복합체를 대표하는 수용체의 활성화 후 생물활성을 특징화하는 세포-기반 검정을 포함하여 RUR20kD-IL-2 조성물의 생물학적 효력 및 생물학적 특징화의 추가 측정을 위해 시험관내 방법을 사용할 수 있었다:
생물검정 방법
Figure 112020124239333-pct00023
3개의 검정 모두에서, 용량-반응 곡선 (반응 대 농도)으로부터의 데이터를 비선형 회귀 모델을 사용하여 평가하였다. 절반-최대 유효 농도 (EC50) 비를 통해 참조 물질에 비해 RUR20kD-IL-2 조성물 샘플의 효력을 측정하였다.
실시예 1-H
CTLL-2 세포 증식 검정
세포 증식 검정에서, ~26시간 동안 샘플 및 참조의 인큐베이션 후 CTLL-2 세포를 사용하여 세포 성장을 시험관내에서 측정하였으며, 여기서 세포 증식을 발광 아데노신 트리포스페이트-기반 검정 (셀타이터-글로(CellTiter-Glo)®, 프로메가(Promega), 미국 위스콘신주)을 통해 측정하였다. 예를 들어, 이 세포-기반 증식 검정은 CTLL-2 세포주를 사용하였으며, 이는 rhIL-2 단백질에 대한 용량-의존적 증식 반응을 나타내었다. rhIL-2를 검정 대조군으로 사용하고, 이 방법에서 RUR20kD-IL-2 조성물과 상이한 농도 범위에서 제조하였다. 이 검정을 96-웰 플레이트 포맷으로 수행하였다. 기아 배지에서 CTLL-2 세포에게 rhIL-2를 주지 않고, 37 ℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 20 ± 3시간 동안 밤새 인큐베이션하였다. 굶주린 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, RUR20kD-IL-2 조성물의 계열 희석물을 세포에 공급하고, 추가 25 ± 3시간 동안 37 ℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 각각의 웰에서 RUR20kD-IL-2 조성물 유도된 세포 성장을 프로메가에 의한 셀타이터 글로® 검출 키트를 사용하여 측정하였다. 셀타이터 글로®는 각각의 웰에 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 신호를 생성하며, 이는 존재하는 생존가능 세포에 정비례하였다. 발광 신호를 스펙트라맥스(SpectraMax) M5 플레이트 판독기에서 판독하였다. RUR20kD-IL-2 조성물 참조 물질 및 각각의 샘플의 용량 반응 곡선은 발광 신호 (y-축)를 농도 (x-축)에 대해 플롯팅하여 생성하였다. 플롯을 4-파라미터 로지스틱 비선형 회귀 모델에 적합화시켰다. 평행선 분석 (PLA) 소프트웨어를 사용하여, 회귀 유의성인 기울기 차이에 대한 동등성 시험 (평행성)을 평가하고, 동일한 플레이트에서 참조 물질과 관련된 샘플의 효력 비를 계산하였다.
실시예 1-I
포스포-STAT5 활성화
수용체 결합 후 포스포-STAT5 검정에서, 하류 세포 신호전달은 그 후 인산화를 통해 신호 도입제 및 전사 활성화제 5 (STAT5)를 활성화시켜 유전자 발현을 촉진하여 세포 증식을 유도할 수 있다. 포스포-STAT5의 활성화를 IL-2-의존적 뮤린 T 림프구 세포주인 CTLL-2 세포에서 포스포-STAT5/총 STAT5 멀티플렉스 검정 (메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery), 미국 메릴랜드주)을 사용하여 ~10분 동안 샘플 및 참조 처리에 반응하여 측정하였다.
실시예 2
생체내 연구: 마우스에서의 단일-용량 PK/PD 연구
RUR20kD-IL-2 조성물에 의한 Treg의 선택적인 자극을 마우스에서 입증할 수 있었다. C57BL/6 마우스 (n=4/그룹)에게 0.03, 0.1 및 0.3 mg/kg의 용량으로 RUR20kD-IL-2 조성물의 단일 피하 용량을 투여하였다. 투여 후, 혈액 및 비장 샘플을 투여후 1-7일차 및 10일차에 수집하였다. 보다 특히, 각각의 시점에, 혈액 및 비장 샘플을 수집하고; 비히클 대조군에 대한 배수 변화로 표시된, 유동 세포계측법 (예를 들어 실시예 5 참조)에 의한 림프구 세포 집단에 대한 약물 작용의 약력학적 분석을 위해 샘플을 풀링하고 평가하였다. 세포 수에서의 변화 이외에, 기능적 마커 및 활성 마커를 정량화하였다. 최종적으로, 혈장 약물 농도를 또한 평가하였다.
도 3A 및 3B에 제시된 바와 같이, RUR20kD-IL-2 조성물의 투여는 혈액 및 비장 둘 다에서 CD4+ Treg에서의 용량-의존적 증가를 초래하고, 투여 후 4일에 세포 수에서의 피크 증가를 초래하였다. 시험된 최고 용량 (0.3 mg/kg)에서, Treg 동원에 대한 지속적인 효과가 달성되며, Treg 수준은 투여후 7-10일까지 기준선 수준으로 복귀하지 않았다. 혈액에서, NK 세포는 시험된 최고 용량의 투여 후 상승된 반면, CD4 T 세포에 대한 변화는 완만하고, CD8 T 세포의 약간 저하가 발생하였다 (도 4A-C). B 세포 및 CD8 T 세포는 시험된 최고 용량의 투여후 약간 저하되었으며, 이 용량은 또한 NK 세포에서의 2배 미만 증가를 초래하였다. Treg 기능 및 활성의 마커 (도 5A 및 5B)는 시험된 최고 용량에서 RUR20kD-IL-2 조성물의 투여가 CD25 및 Foxp3의 평균 형광 세기 (MFI)에 의해 측정된 바와 같이 Treg 활성화에서의 증가를 초래함을 입증한다. Treg 수는 투여후 4일까지 최대 값에 도달하지 않지만, 이들 활성화 마커는 투여후 처음 2일 내에 그의 최대치를 달성하며, RUR20kD-IL-2의 혈장 노출에 따라 천천히 저하하였다. Ki67에 의해 측정된 바와 같은 급속히 증식하는 Treg의 백분율은 투여후 2일에 급속히 상승하고, 백분율은 기준선 수준으로 복귀하기 전에 6일차까지 지속되었다. 또한, 세포-표면 마커 유도성 T 세포 공동자극제 (ICOS)를 발현하는 Treg의 백분율이 또한 증가되며, 이는 ICOS 발현이 자가면역 설정에서 Treg의 증가된 저해성 활성과 관련되어 있다는 점에서 주목할만한 발견이다. Ki67 및 ICOS에서의 증가는 피크 RUR20kD-IL-2 조성물 농도에 비해 다소 지연된 것으로 보이지만, 기준선 수준으로의 복귀는 이 전임상 마우스 연구에서 혈장 농도 저하와 일치한다.
실시예 3
시험관내 Treg 저해 검정
이 연구의 목적은 조절성 T 세포의 억제성 기능을 평가하는 것이다. 피하 투여후 1-7 및 10일차에 나이브 및 RUR20kD-IL-2 조성물 처리된 C57BL/6 마우스로부터 Treg를 자기적으로 단리하였다. Treg 및 Tcon을 3일 동안 1:2 내지 1:512 범위의 비로 공동-배양하였다. 세포 증식을 검정의 최종 16시간에 걸쳐 3H-티미딘 혼입에 의해 평가하고, 플레이트 대조군에 대한 증식 세포의 %를 계산하였다.
간단히 말해서, 용량 투여후 지시된 시간에 다양한 용량 수준 (0.03, 0.1, 및 0.3 mg/kg)의 RUR20kD-IL-2 조성물 또는 비히클로 처리된 암컷 C57BL/6 마우스로부터 비장을 수집하였다 (n = 4마리 마우스/처리 그룹/시간). 단일-세포 단리물을 각각의 비장에 대해 준비하고, 생성된 비장세포 혼합물을 각각의 시점에 각각의 용량 그룹에 대해 풀링하였다. 하나의 비장과 동등한 풀링된 샘플의 일부를 면역 세포 프로파일링을 위해 분취하였다. 나머지 비장세포 제제를 조절성 T 세포 (Treg)의 단리에 사용하였다. 제조사의 권장사항에 따라 CD4+CD25+ 조절성 T 세포 단리, 마우스, 키트 (밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotec), 독일 베르기슈 글라트바흐)를 사용하여 자기-활성화 세포 분류법 (MACS)에 의해 CD4+CD25+ Treg를 마우스 비장으로부터 단리하였다. CD4+ T 세포를 음성으로 선택한 다음, CD4+CD25- T 세포 및 CD4+CD25+ Treg로 분리하였다. 나이브 통상적 CD4+CD25- T 세포 (Tcon)를 제조사의 권장 절차에 따라 나이브 CD4+ T 세포 단리 키트 (밀테니 바이오테크)를 사용하여 미처리된 동물로부터 수확된 마우스 비장으로부터 MACS에 의해 단리하였다.
시험관내 저해 검정을 10% 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 0.5 μM β-머캅토에탄올, 및 1X 항생제/항진균제 (100 단위/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 250 ng/mL 암포테리신 B)로 보충된 RPMI 1640 배지에서 수행하였다. 5 x 104 Tcon을 96-웰 둥근바닥 플레이트에서 100 μL 배양 배지에서 각각의 Tcon에 대한 2개의 비드의 비로 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 비드 (T 세포 활성화/확장 키트, 마우스, 밀테니 바이오테크)로 자극하였다. 상이한 비 (2:1 내지 1:512의 Treg:Tcon 비)의 Treg 대 Tcon의 첨가에 의해 Treg의 저해 능력을 평가하였다. 각각의 Treg:Tcon 비를 삼중으로 시험하였다. 세포를 72시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 가습 대기에서 공동-배양하였으며; 검정 종료 16시간 전에, 0.5 μCi [3H]-티미딘을 웰에 첨가하였다. 혼입되지 않은 [3H]-티미딘이 없는 세포를 세척한 후, 티미딘 흡수를 마이크로플레이트 섬광 계수기 (탑카운트(TopCount) NXT, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 분당 카운트 (CPM)로 측정하였다. 개별 CPM 값을 4개의 가장 낮은 Treg:Tcon 희석에 대해 기록된 평균 CPM으로 나누어 최대 증식으로 정규화하였다. 프리즘(Prism)® 6.03 (그래프패드(GraphPad) 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고)에서 4-파라미터 비선형 회귀 및 1/y2 가중치를 사용하여 농도-반응 곡선을 그래프로 표시하였다.
도 6A-D에 제시된 바와 같이, 연구 개시후 1 및 4일에 비히클 처리된 마우스로부터 단리된 비장 Treg는 저해 능력을 나타내며, 가장 큰 저해는 1:2의 비에서 발생하였다. 그러나, RUR20kD-IL-2 조성물의 투여후 이들 시점에 단리된 Treg는 특히 1:8 초과의 비에서 저하된 Tcon 증식에 의해 입증된 바와 같이 크게 증가된 저해 능력을 나타내었다. 1:2의 비로 Tcon과 함께 배양된 단리된 Treg의 상대적 저해 능력을 또한 시간 경과에 따라 평가하였다 (도 7). RUR20kD-IL-2 투여 후, 증가된 Treg 저해성 활성은 비히클 대조군 처리 그룹에 의해 나타난 기준선 활성으로 복귀하기 전에 4일 동안 유지되었다.
실시예 4
마우스 KLH DTH 효능 모델에서의 RUR 20kD -IL-2 조성물의 평가
T-세포 항원-유도 염증을 저해하는 RUR20kD-IL-2 조성물의 투여에 의한 Treg 유도 능력을 평가하기 위해, Balb/c 마우스 (n=6-10/그룹)를 지연형 과민증 (DTH)의 모델에 사용하였다. 각각 1:1:1의 비로 완전 프로인트 아쥬반트 (CFA) 및 불완전 프로인트 아쥬반트를 함유하는 에멀젼에 100 μg 키홀 림핏 헤모시아닌 (KLH)을 함유하는 100 μl 피하 주사로 등쪽 구역에 피하로 마우스를 감작하였다. 5일 후, 시험감염 전에 기준선 귀 두께를 측정하였으며, 왼쪽 귀를 10 μg의 KLH로 피내로 시험감염시키고 오른쪽 귀는 미처리된 상태로 유지시킨다. 귀 두께 측정은 모든 그룹에서 KLH 시험감염 후 24, 48, 72 및 96시간에 캘리퍼로 측정하였다. RUR20kD-IL-2 조성물을 0일차에 투여하였으며, 감작 시 피하 용량은 3일마다 0.003 mg/kg 내지 0.3 mg/kg 범위였다. 시클로스포린 (10 mg/kg, 단일 용량)으로 이루어진 양성 대조군을 0일차에 투여하였다.
도 8A, 8B에 제시된 바와 같이, 항원 시험감염 후, 48시간에 최대 14 mm 초과에 도달하는 귀 두께에서의 평균 증가로 귀 부종이 유도되었다. 나이브, 비-시험감염된 귀는 연구 과정 동안 두께에서의 변화를 나타내지 않았다. 이 연구에서 감작 및 시험감염 기간에 걸친 RUR20kD-IL-2 조성물의 투여는 비히클 대조군에 비해 각각의 시점에 감소된 염증에 의해 입증된 바와 같이 귀 부종의 유의한 용량-의존적 저하를 초래하였다. 시험감염후 효과를 보다 정량적으로 평가하기 위해, 각각의 치료 그룹에 대해 두께에서의 변화의 AUC를 계산하였다 (AUC0-96h). 도 8A 및 8B에 제시된 바와 같이, 최소 유효 용량은 0.01 mg/kg q3d이고, 최대 효과는 0.3 mg/kg q3d로 달성되었다. 비히클 그룹으로부터 통계적으로 유의한 AUC 값은 별표로 표시된다 (p<0.05; ANOVA, 튜키). 종합하면, 이 데이터는 투여후 달성된 Treg의 향상된 동원 및 활성화가 생체내 항원-유도 염증성 메카니즘을 저해할 수 있음을 입증한다.
실시예 1의 RUR20kD-IL-2 조성물의 활성을 설치류 및 시노몰구스 원숭이에서 생체내 투여후 평가하였다. 마우스에서, RUR20kD-IL-2 조성물은 투여후 최대 4일에 도달하는 Treg에서의 용량-의존적 증가를 초래하였다. 마우스에서 RUR20kD-IL-2 조성물에 의해 유도된 Treg의 유동 세포계측법 분석은 Treg 활성화 마커, 예컨대 Foxp3 및 CD25 평균 형광 세기 (MFI)가 투여후 처음 2일 이내에 최대 값에 도달하고, RUR20kD-IL-2 조성물의 혈장 노출에 따라 시간 경과에 따라 점진적으로 저하됨을 제시하였다. 활발하게 증식하는 Treg의 백분율은 또한 투여후 2일 이내에 최대 값을 달성하고 6일차까지 지속되었다. Treg 기능적 마커 ICOS의 발현은 3일차에 피크에 도달한 후 7일차까지 기준선으로 복귀하였다. 처리된 마우스의 비장으로부터 단리된 Treg는 기본 활성 수준으로 복귀하기 전에 투여후 처음 4일에 저해 능력을 크게 증가시켰다. 실시예 1의 RUR20kD-IL-2 조성물은 3일마다 투여될 때 지연형 과민증 (DTH) 마우스 모델에서 항원-유도 염증 반응을 저해하였다.
실시예 5
시노몰구스 원숭이에서의 단일-용량 연구
이 연구에서, 시노몰구스 원숭이, 1마리의 암컷 및 1마리의 수컷에게 25 μg/kg의 RUR20kD-IL-2 조성물을 피하로 투여하였다. Treg 세포 수 및 활성화 상태의 유동 세포계측법에 의한 평가를 위해 일련의 혈액 샘플을 처리전 (-6 및 -1일차) 및 처리 후 다중 간격으로 각각의 동물로부터 채취하였다.
면역표현형 분석을 위해, 혈액 샘플 (대략 1.0 mL)을 다음 시점에 각각의 원숭이로부터 수집하였다: 처리전 (-6 및 -1일차), 처리후 2일차, 3일차, 4일차, 5일차, 6일차, 7일차, 10일차, 14일차 및 21일차. 정맥천자 샘플을 항응고제, K2EDTA를 함유하는 튜브에 수집하였다. 튜브를 옮길 때까지 습식 얼음 위에 위치시켰다. 전혈 샘플을 다음 패널을 사용하여 유동 세포계측법에 의해 분석하고, 샘플을 다음에 대해 분석하였다:
T 세포 패널: CD45/CD3/CD4/CD8/ICOS
T/B/NK 패널: CD45/CD3/CD16/CD20
pSTAT5 패널: CD3/CD4/CD8/CD25/CD127/pSTAT5
Treg 패널 1: CD3/CD4/CD8/CD25/FoxP3/Ki67
Treg 패널 2: CD3/CD4/CD8/CD25/FoxP3/Helios
컴퓨터화된 시스템을 연구 수행에 사용할 수 있으며, 예를 들어 유동 세포계측법 데이터 획득은 BD FACSCanto II/FACSDiva LEGENDPlex 데이터 분석 소프트웨어를 사용할 수 있으며, 유동 세포계측법 데이터 분석은 드 노보 FCS 익스프레스(De Novo FCS Express) 소프트웨어를 사용할 수 있다.
수컷 및 암컷으로부터의 값은 평균을 내고, 변화 크기는 점선으로 표시된 d-1 값에 상대적으로 제시하였다. 도 9에 제시된 바와 같이, Treg 세포 수는 투여후 실질적으로 상승하고, 투여후 7일에 최대 수준에 도달하고, 14-21일차까지 d-1 수준으로 복귀하였다. 도 9A에 열린 삼각형으로 제시된 바와 같이, RUR20kD-IL-2 조성물에 의해 유도된 거의 모든 Treg는 Ki67에 의해 측정된 바와 같이 증식성이었다.
RUR20kD-IL-2 조성물의 투여에 의해 자극된 Treg의 상대적 활성화 상태를 FoxP3 및 CD25의 평균 형광 세기 (MFI)에 의해 추가로 측정하였다. CD25 MFI는 6일차에 최대 값에 도달한 다음, 10일차까지 정체되어 21일차까지 거의 용량전 수준으로 복귀하였다. FoxP3 MFI는 또한 투여후 최대 6일에 도달한 후, 14-21일차에 거의 용량전 수준으로 복귀하였다. 종합하면, 이들 데이터는 증가된 Treg 활성화를 동반하는 혈액에서 Treg 유도의 유사한 크기가 보여지듯이 마우스에서 발견된 결과의 시노몰구스 원숭이로의 번역가능성을 나타낸다. 그러나, 마우스에서 발견된 것과는 대조적으로, 시노몰구스 원숭이에서 효과는 자연적으로 더 지속되었다.
실시예 6
마우스, 래트 및 원숭이에서의 단일 용량 약동학 및 독성동태학
마우스, 래트 및 원숭이에서 RUR20kD-IL-2 조성물의 단일 용량 약동학/독성동태학의 결과가 요약되어 있다. 투여량 레지멘의 세부사항은 표 10에 제공된다.
표 10: RUR 20kD -IL-2 조성물 단일-용량 약동학 및 독성동태학 연구의 개요
Figure 112020124239333-pct00024
마우스 연구의 경우, RUR20kD-IL-2 조성물에 대한 비히클은 10 mM 아세트산나트륨, 200 mM 염화나트륨 및 2% 수크로스 (pH 5)이다. 래트 및 원숭이 연구의 경우, RUR20kD-IL-2 조성물에 대한 비히클은 50 mM 아세트산나트륨, 200 mM 염화나트륨 및 2% 수크로스 (pH 5)이다.
피하 투여 후, RUR20kD-IL-2 조성물은 마우스, 래트 및 원숭이에서 각각 0.33-1.0, 1.0-2.3 및 2.0의 Tmax로 천천히 흡수되었다 (표 11). RUR20kD-IL-2 조성물 혈장 노출은 마우스 및 래트에서 다소 용량 비례적으로 증가하였다. 생체이용률은 래트에서 29.8-46.0% 및 원숭이에서 86.2%의 범위 내에 있다.
RUR20kD-IL-2 조성물의 정상 상태에서의 분포 부피 (Vss)는 용량에 따라 래트에서 증가하는 것으로 보이며, 25.1 (0.01 mg/kg) 내지 52.6 mL/kg (1.0 mg/kg)의 범위였다 (표 12). 전반적으로, Vss는 래트 및 원숭이에서 종-특이적 혈장 부피보다 각각 1-2배 및 2-4배 더 크며, 이는 RUR20kD-IL-2가 대부분 혈관 공간에 머무르는 것을 시사한다.
혈장 청소율 (CL)은 매우 낮았다 (래트에서 0.560 - 1.14 mL/hr/kg 및 원숭이에서 0.245 mL/hr/kg) (표). 정맥내 또는 피하 투여 후, RUR20kD-IL-2 조성물 농도는 마우스에서 1.85-2.24일, 래트에서 1.25-2.44일, 및 원숭이에서 10.4-12.9일의 반감기로 단일-지수 붕괴를 나타내는 것으로 보였다 (표 11 및 12 및 도 10A, 10B). RUR20kD-IL-2의 신장 배설은 사구체 여과에 대한 분자량 컷오프에 가까운 63 kDa의 평균 분자량으로 인해 낮은 것으로 예상되었다.
표 11: C57BL/6 마우스, 스프라그-돌리 래트 또는 시노몰구스 원숭이에게 RUR 20kD -IL-2 조성물의 단일 피하 용량의 투여 후 평균 ± SE 혈장 약동학/독성동태학 파라미터
Figure 112020124239333-pct00025
AUCinf: 시간 0에서 무한대 시간까지 혈장 농도-시간 곡선하 면적; AUClast: 시간 0에서 마지막 측정가능한 농도까지 혈장 농도-시간 곡선하 면적; Cmax: 관찰된 최대 혈장 농도; MRTinf: 평균 체류 시간; Tmax: 관찰된 최대 혈장 농도의 시간
1. PK 파라미터는 시점당 3마리 래트의 평균 값을 기반으로 한다.
2. 수컷 및 암컷 원숭이의 평균.
표 12: 스프라그-돌리 래트 또는 시노몰구스 원숭이에게 RUR 20kD -IL-2 조성물의 단일 정맥내 용량의 투여 후 평균 ± SE 혈장 약동학 파라미터
Figure 112020124239333-pct00026
ND: 결정되지 않음; AUCinf: 시간 0에서 무한대 시간까지 혈장 농도-시간 곡선하 면적; AUClast: 시간 0에서 마지막 측정가능한 농도까지 혈장 농도-시간 곡선하 면적; CL: 청소율; MRTinf: 평균 체류 시간; Vss: 정상-상태에서의 겉보기 분포 부피. *수컷 및 암컷 원숭이의 평균.
실시예 7
마우스에서의 비교 연구
실시예 2에 기재된 바와 본질적으로 유사한 연구를 수행하였으며, 여기서 C57BL/6 마우스에 RUR20kD-IL-2 조성물의 단일 피하 용량을 0.03, 0.1 및 0.3 mg/kg으로 투여하거나, 비변형된 IL-2 (알데스류킨)를 0.03 mg/kg (qddx5), 0.1 mg/kg (qdx5) 및 1 mg/kg (qdx5)의 투여량으로 투여하였다. 투여 후, 혈액 및 비장 샘플을 수집하고 유동 세포계측법에 의해 림프구 세포 집단에 대한 약물 작용의 약력학적 분석에 대해 분석하였으며, 이는 비히클 대조군에 대한 배수 변화로 표시하였다. 결과는 도 10A 및 10B에 제시되어 있다 (RUR20kD-IL-2 조성물은 "RUR-IL-2"로 표시되고 알데스류킨은 "IL-2"로 표시됨).
실시예 8
전신성 홍반성 루푸스 (SLE)의 마우스 모델에서의 RUR 20kD -IL-2 조성물의 효능의 조사
이 질환의 가장 일반적으로 연구된 마우스 모델인 MRL/MpJ-Faslpr 마우스 모델을 사용하여 SLE의 발병 및 진행 및 그의 연관 특징에 대한 RUR20kD-IL-2 조성물의 효능을 결정하기 위해 이 연구를 수행하였다 (Perry, D., et al., J Biomed Biotechnol 2011:271694). MRL/MpJ-Faslpr 마우스 모델은 림프절 확대, 증가된 IgG 수준, 항핵 항체 생성, 단백뇨, 및 사구체의 염증으로 인한 신부전을 포함하여 인간 SLE의 병리를 반영하는 자가면역 질환을 발병한다. 실시예 1에 기재된 바와 같은 RUR20kD-IL-2 조성물의 스톡 용액을 비히클 (투명한 액체; 10 mM 아세트산나트륨 / 200 mM 염화나트륨 / 2% (w/v) 수크로스), 주사용 멸균수 (SWFI)에서 제조, USP; pH 5.0 ± 0.1)에 공급된 시험 물품 (1.58 mg/mL)으로 사용하였다. 투여일에, 적합한 양의 시험 물품을 회수하고, 원하는 투여 농도 (0.03 mg/kg 용량 및 0.3 mg/kg 용량)에 도달하도록 비히클로 희석하고; 용량 부피는 5 mL/kg이었다. 연구에 사용된 동물은 6-8주령의 MRL/MpJ-Faslpr 마우스 및 MRL/MpJ 나이브 암컷 마우스였다. 동물을 무작위화에 의해 치료 그룹으로 할당하였다. 치료 그룹은 하기 표 13에 기재되어 있다. 45마리의 MRL/MpJ-Faslpr 마우스를 실험 시작 전에 체중 및 소변 중 단백질 함량 수준을 기준으로 3개의 그룹 (그룹 2-4의 경우 각각 15마리)으로 무작위화하였다. 그룹 2 - 4의 동물은 표 6에 기재된 바와 같이 피하로 전달된 비히클 또는 시험 물품을 받았다. 그룹 1- MRL/MpJ 마우스는 음성 대조군으로서 비히클을 받았다. 8주차에 첫번째 용량 투여후 3일에, 그룹 2 - 4로부터의 3마리의 마우스를 인도적으로 희생시키고, 혈액 샘플을 수집하여 가공하였다. 체중을 연구 시작부터 1주마다 2회 측정하고, 연구 내내 계속하였다. 피부 병변 사진을 처음 관찰했을 때 및 그 후 1주 간격으로 촬영하였다. 투여 전날 (기준선에) 소변을 채취한 다음, 그 후 매주 수집하였다. 소변 중 단백질 수준을 지멘스 클리니테크 스테이터스(Siemens Clinitek Status) 분석기를 사용하여 측정하였다. 희생일 (20주차의 말에 마지막 용량 후 3일)에, 모든 마우스를 클로랄 수화물 (50 mg/kg)의 복강내 주사에 의해 마취시켰다. 혈액 샘플을 수집하고, 10000 r/분에서 10분 동안 원심분리하여 혈청 샘플을 얻었다. 혈청을 임상 생화학 시험까지 -80℃에 저장하였다. 혈청 샘플 (100 μl)을 ELISA (마우스 항-dsDNA IgG-특이적 ELISA 키트, 알파 디아그노스틱 인터내셔널(Alpha Diagnostic International), Cat. No. 5120)에 의해 항-dsDNA 수준에 대해 분석하고, 혈청을 히타치(Hitachi) 7020 자동 생화학 분석기를 사용하여 BUN 농도에 대해 시험하였다. 림프구 분석을 위해, 혈액 샘플을 EDTA-K 튜브에 수집하고, 유동 세포계측법에 의해 CD3/CD4/CD8/Treg/NK/B 세포%에 대해 시험하였다. 결과는 도 11에 제시되어 있다. 거기에 제시된 바와 같이, 0.3 mg/kg의 용량으로 RUR20kD-IL-2 조성물의 투여는 신장 손상의 바이오마커 (즉, 소변내 단백질 수준)를 정상 마우스에서 관찰되는 바와 거의 동일한 수준으로 저해하는데 효과적이었다. 이 연구는 SLE의 대표적인 동물 모델에서 생리적 면역 반응 및 질환 진행의 제어에 대한 RUR-IL-2-유도 Treg의 효과를 추가로 설명한다.
표 13 - 치료 그룹
Figure 112020124239333-pct00027
a: 시험 물품의 비히클
실시예 9
항원 의존적, T 세포-매개, 지연형 과민증 (DTH) 모델에서의 RUR 20kD -IL-2 조성물의 연구
이 연구는 RUR20kD-IL-2 조성물에 의한 생체내 Treg 자극 및 확장이 높은 정도의 아나필락시스가 확립된 음식 알레르기 모델에서 항원 의존적 방식으로 T 세포-매개 지연형 과민증 (DTH) 반응을 어떻게 하향조절할 수 있는지를 모델링한다.
DTH 모델을 개발하기 위해, Balb/c 마우스를 완전 및 불완전 프로인트 아쥬반트에 유화된 모델 항원 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)의 피하 투여로 감작시켰다. RUR20kD-IL-2 조성물 (0.003, 0.01,0.3,0.1 또는 0.3 mg/kg, q3d) 또는 시클로스포린 A (10 mg/kg, qd)의 피하 투여를 0일차에 개시하고 8일차까지 계속하였으며, KLH의 피내 시험감염을 5일차에 투여하고, 귀 부종을 4일 동안 측정하였다. 염증이 있는 귀를 KLH 시험감염 후 FoxP3+ Treg 세포의 퍼센트를 정량화하기 위해 면역조직화학 (IHC)에 적용하였다. KLH 재시험감염 또는 비관련된 항원 오발부민 (OVA)에 의한 감작 및 시험감염의 수행에 의한 처리 없이 반응의 특이성을 추가 3-4주 후에 평가하였다. 식품 알레르겐에 대한 RUR20kD-IL-2 조성물-확장된 Treg의 효과를 이해하기 위해, Balb/C 마우스를 OVA를 명반으로 유화하여 1주마다 2회 복강내로 감작시켰다. 두번째 감작 10일 후, 마우스를 격일로 경구로 8회 OVA로 시험감염시켰다. RUR20kD-IL-2 조성물 (0.1 mg/kg, q3dx3) 또는 시클로스포린 A (10 mg/kg, qd)의 피하 투여를 0일차에 개시하고 8일차까지 계속하였다. 8번째 시험감염 후 30-45분 이내에 임상 스코어링에 의해 알레르기 반응의 중증도를 평가하였다. 또한, 혈청 비만 세포 프로테아제 1 (MCPT 1) 및 OVA 특이적 IgE 역가를 정량화하였다. 퍼센트 Treg를 말초 혈액 및 비장에서 유동 세포계측법에 의해 결정하였다.
이 DTH 마우스 모델에서, RUR20kD-IL-2 조성물 투여는 용량 의존적 방식으로 KLH 재시험감염에 대한 염증 반응을 저해하였다. 염증이 있는 귀의 IHC 분석은 FoxP3+ Treg 세포의 유의한 침윤을 제시한다. 염증에 대한 저해 효과는 더 이상의 RUR20kD-IL-2 조성물 투여 없이 동일한 항원 및 비관련된 항원 감작 후 3-4주 후 재시험감염에 의해 예시된 바와 같이 지속적이고 항원-특이적이다. 최종적으로, RUR20kD-IL-2 조성물의 투여는 모델 식품 알레르겐, OVA의 반복된 투여로 인한 높은 정도의 아나필락시스 증상을 저하시키는데 효능있는 것으로 밝혀졌다. 아나필락시스의 임상 스코어의 저하는 MCPT1 및 항-OVA 특이적 IgE 역가 수준의 유의한 저하 뿐만 아니라 Treg에서의 유의한 증가와 상관관계가 있다. RUR20kD-IL-2 조성물은 마우스의 이 KLH 과민증 모델에서 항원 특이적이고 지속적인 Treg 확장 및 치료 반응을 나타내었다. 또한, RUR20kD-IL-2 조성물은 식품 알레르기 모델에서 효능있는 것으로 밝혀졌다. 이 데이터는 자가면역 및/또는 염증성 질환에서와 같이 항원 특이적 염증에 대한 RUR20kD-IL-2 조성물의 사용을 뒷받침한다.
본원에 제공된 전임상 증거는 IL-2 접합체 Treg 자극제 RUR20kD-IL-2 조성물이 자가면역 및 염증성 장애의 치료를 위해 조절성 T 세포의 수 및 저해 기능을 증가시킨다는 개념을 뒷받침한다. 손상된 IL-2 생성 및 조절성 T 세포 기능장애는 여러 자가면역 질환에서 면역학적 메카니즘으로 연루되어 왔다. 저용량 IL-2는 임상적 이점을 위해 Treg를 자극하는데 사용될 수 있지만, 불량한 약동학은 매일 전달을 필요로 하고, 유해 사건은 용량-제한적이며, Treg 증가는 완만하고 수명이 짧다. RUR20kD-IL-2 조성물은 통상적 T 세포 기능에 미치는 영향을 최소화하면서 Treg 항상성을 선택적으로 복원하기 위해 저용량 피하 투여용으로 의도된 IL-2 접합체 Treg 자극제를 제공한다. 마우스 및 비인간 영장류 모델에서 Treg의 수 및 활성을 선택적으로 확장하고 자가면역 모델에서 RUR20kD-IL-2 조성물의 효능을 평가하는 RUR20kD-IL-2 조성물의 능력을 특징화하는 데이터가 본원에 제공된다. IL-2 수용체에 대한 친화성을 표면 플라스몬 공명에 의해 평가하였다. 유동 세포계측법 및 비행 시간 질량 세포계측법 (CyToF)을 사용하여 다중 림프구 집단에서 pSTAT5 유도에 의해 인간 PBMC에서의 활성을 측정할 수 있었다. C57BL/6 마우스 또는 시노몰구스 원숭이에서 피하 투여 후 생체내 활성을 유동 세포계측법에 의해 림프구 수에서의 변화 및 활성화에 의해 측정하였다. 단리된 비장 Treg에 의한 Tcon 증식의 억제에 의해 생체외 Treg 기능을 결정하였다. MRL/MpJ-Faslpr 마우스를 사용하여 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)의 모델에서 효능을 평가하였다. RUR20kD-IL-2 조성물은 IL-2Rα 및 IL-2Rαβ 복합체에 비해 인간 IL-2Rβ에 대한 크게 감쇠된 친화성을 가지며, 이는 저친화성 IL-2Rβγ를 발현하는 Tcon보다 고친화성 IL-2Rαβγ를 발현하는 Treg의 우선적 활성화를 시사한다. 시험관내에서, Treg는 RUR20kD-IL-2 조성물 자극에 더 민감하여, 인간 PBMC에서 다른 림프구 서브세트에 비해 증가된 STAT5 인산화를 제시한다. 마우스에서, 단일 투여는 Tcon 활성화 없이 혈액 및 비장에서 7-10일 동안 지속적인 Treg 동원을 초래하며, 이는 Treg 활성화 마커의 유도 및 증가된 생체외 저해 능력과 수반되는 효과이다. 시노몰구스 원숭이에서, 혈장 노출은 단일 투여 후 14일 이상 동안 지속적인 Treg 동원 및 활성으로 더 연장되며, 5일 동안 매일 투여된 rhIL-2의 동등한 총 용량과 비교하여 크기, 지속기간 및 특이성이 우수한 반응이다. 최종적으로, RUR20kD-IL-2 조성물은 SLE 마우스 모델에서 효능있다. SLE 모델에서, 12주에 걸친 RUR20kD-IL-2 조성물의 반복 투여는 Treg 상승을 지속시키고 혈액 우레아 질소를 감소시키고 소변 단백질 수준 및 신장 조직병리를 정상으로 복귀시킨다. cGVHD 모델에서, RUR20kD-IL-2 조성물의 반복 투여는 Treg를 증가시키고 비장에서 배 중심 B 세포를 저하시키고 폐 기능장애를 역전시킨다. RUR20kD-IL-2 조성물은 Treg의 지속적이고 우선적인 활성화를 전달하고 SLE의 모델 시스템에서 효능을 나타낸다.
실시예 10
건강한 지원자에서 RUR 20kD -IL-2 조성물의 단일 오름차순 피하 용량의 안전성, 내약성, 약동학 및 약력학을 평가하기 위한 I상, 이중-맹검, 무작위 플라세보-대조 연구
건강한 지원자에서 RUR20kD-IL-2 조성물 (RUR20kD-IL-2)의 단일 오름차순 낮은 피하 용량의 안전성, 내약성, 약동학 및 약력학을 평가하기 위해 이중-맹검, 무작위, 플라세보-대조 연구를 수행하였다. 연구를 7개의 코호트로 나누며, 여기서 대상체는 0.3, 1.0, 3.0, 6.0, 9.0, 13.5 또는 20.0 μg/kg RUR20kD-IL-2를 받았다. 12명의 대상체를 각각의 용량 코호트로 무작위화하였으며, 이 중 9명은 RUR20kD-IL-2의 단일 피하 용량을 받았지만, 3명은 플라세보를 받았다. RUR20kD-IL-2를 멸균 0.9% 염화나트륨 용액으로 희석된 피하 주사용 멸균 액체로서 제형화하였다. 의약품을 일회용 유리 바이알로 공급하고, 2-8℃에 저장하였다. 의약품의 각각의 바이알은 0.75 ± 0.1 mg의 rhIL-2 (RUR20kD-IL-2 기준)를 함유하였다. RUR20kD-IL-2를 10 mM 아세트산나트륨, 150 mM 염화나트륨, 2% (w/v) 수크로스, pH 5.0에 대략 1.0 mg/mL 단백질의 농도로 제형화하였다. 플라세보는 시판되는 0.9% 염화나트륨 용액이었다. 최소 예상 생물학적 효과 수준 (MABEL) 접근법을 사용하여 0.3 μg/kg의 출발 용량을 선택하고, 비임상적 독성 연구로부터 가장 민감한 종에서 무관찰 유해 효과 수준 (NOAEL: no observed adverse effect level)에 의해 뒷받침되었다. RUR20kD-IL-2 약동학 및 안전성의 평가를 허용하기 위해 출발 용량을 0.3 μg/kg으로 설정하였다. 2명의 대상체 (1명은 RUR20kD-IL-2를 받았고 1명은 플라세보를 받음)에게 이중-맹검 방식으로 투여하고, 연구 개시전 적어도 7일의 기간 동안 가능한 부작용에 대해 모니터링하였다.
연구의 1차 목적은 단일 피하 용량으로 투여되는 RUR20kD-IL-2의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이다. 연구의 2차 목적은 (1) 조절성 T 세포 (Treg)의 수 및/또는 활성에서의 변화 정도 및 시간 경과를 관찰하고, (2) 단일 피하 용량으로 투여되는 RUR20kD-IL-2의 약동학 (PK) 프로파일을 특징화하고, (3) 시토카인, T 세포, 다른 말초 혈액 집단, 다른 혈청 단백질, 유전자 발현에서의 변화, 및 항-약물 항체에 대한 효과를 포함하여 혈액에서 RUR20kD-IL-2의 면역학적 효과를 평가하는 것이다. 연구의 첫번째 단계에서, 면역 마커를 용량전부터 용량후 최대 20시간까지 시험하였다. 구체적으로, Treg, CD4+-T 세포, CD8+-T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 시토카인, 가용성 CD25, 및 RNA를 RUR20kD-IL-2- 및 플라세보-투여 코호트에서 시험하였다. 후속 단계에서, 동일한 면역 마커를 용량후 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 10-, 12-, 15-, 18-, 20-, 25-, 30-, 40- 및 50-일에 또한 시험하였다.
용량-제한 독성 (DLT), 심각한 유해 사건 (SAE), 사망, 또는 임상적으로 유의한 이상은 보고되지 않았다. 유해 사건 (AE)은 경증 (등급 1) 주사 부위 반응으로 제한되며, 고용량 IL-2와 연관된 것으로 공지된 AE에 대한 증거는 관찰되지 않았다.
예비 PK 분석은 RUR20kD-IL-2가 대부분의 대상체에서 용량후 약 4-6일에 최대 농도에 도달하였으며, 용량후 최대 대략 2주까지 농도에서의 변화가 거의 없었으며, 그 후 농도는 대략 8-9일의 반감기로 하락하였음을 제시한다.
약력학 (PD) 평가는 RUR20kD-IL-2가 순환 CD4+FoxP3+CD25bright Treg에서의 용량-의존적 증가를 초래함을 나타낸다. 3.0, 6.0, 9.0, 13.5 및 20.0 μg/kg 단일-용량 코호트에서, 순환 CD4+FoxP3+CD25bright Treg의 절대 수에서의 지속적인 증가가 있었으며, 수준은 투여후 대략 20 내지 25일까지 기준선으로 복귀되지 않았다. 용량전과 비교하여 3.0, 6.0, 9.0, 13.5 및 20.0 μg/kg 용량에 각각 3배, 3.5배, 4.1배, 5배 및 8.1배의 CD4+FoxP3+CD25bright Treg의 수에서의 평균 증가가 있었다. 또한, 3.0, 6.0, 9.0, 13.5 및 20.0 μg/kg 용량에서 총 CD4+ FoxP3+CD25+Treg 집단에서의 증가가 있었으며, 변화 크기는 CD4+FoxP3+CD25bright Treg에서 관찰된 것보다 더 작았다. 플라세보를 받은 사람들과 비교하여 0.3 및 1.0 μg/kg 용량에서 RUR20kD-IL-2-치료된 대상체 대 플라세보 대상체에서 Treg의 수에서의 변화가 없었다. T 세포 집단 (CD4+, CD8+)의 백분율 또는 수에서의 변화가 RUR20kD-IL-2에서 어떤 용량에서도 관찰되지 않았기 때문에 RUR20kD-IL-2의 1차 효과가 Treg에서 나타났다. 고용량 IL-2와 연관된 AE의 증거 없이 13.5 및 20.0 μg/kg에서 NK 세포의 백분율 및 절대 수가 약간 증가하였다.
도 12에 제시된 바와 같이, RUR20kD-IL-2 조성물은 CD4+FoxP3+CD25bright Treg에서의 용량-의존적 증가를 초래하였다. 3.0, 6.0, 9.0 및 13.5 μg/kg에서, CD4+FoxP3+CD25bright Treg의 절대 수에서의 지속적인 증가가 있었으며, 수준은 투여 후 20-25일까지 기준선으로 복귀되지 않았다. 플라세보와 비교하여 3.0, 6.0, 9.0, 및 13.5 μg/kg 용량에서 각각 3.0배, 3.5배, 4.1배 및 5.0배의 CD4+FoxP3+CD25bright Treg의 수의 평균 증가가 있었으며, 최대 반응은 3.0 μg/kg에서 84시간에 피크로부터 이동하여, 보다 연장된 피크 반응이 20-25일차까지 기준선 수준으로 복귀하기 전까지 13.5 μg/kg에서 7 내지 12일에 지속되었다. 도 13에 제시된 바와 같이, 3.0, 6.0, 9.0, 및 13.5 μg/kg 용량에서 총 CD4+FoxP3+CD25+ Treg 집단에서의 용량-의존적 증가가 또한 있었지만, 변화 크기는 CD4+FoxP3+CD25bright Treg에서 관찰된 것보다 더 작았다. RUR20kD-IL-2 치료된 대상체 대 플라세보 대상체에서 총 CD4+Treg에서의 변화가 0.3 μg/kg 및 1 μg/kg 용량에서 관찰되지 않았다 (도 13).
중요하게는, RUR20kD-IL-2 또는 플라세보-치료된 대상체에서 Tcon 세포 집단 (CD4+, CD8+)의 백분율에서의 변화가 관찰되지 않았기 때문에, RUR20kD-IL-2의 1차 효과가 Treg에서 나타났다. 그러나, RUR20kD-IL-2 대상체에서 CD8+ T 세포의 절대 수 및 Ki67+ CD8+ T 세포의 백분율은 13.5 μg/kg에서 약간 증가되는 것으로 관찰되었다 (도 14A-D). 어떤 용량 수준에서도 CD4+ T 세포 절대 수에서의 변화가 없었다.
CD56+ NK 세포 집단을 또한 분석하였다. 순환 NK 세포의 절대 수에서의 증가가 주목되었으며, 13.5 μg/kg 용량 수준에서 이 세포 서브세트의 백분율에서의 유사한 증가가 있었으나, 더 낮은 용량 수준에서는 그렇지 않았다. 또한, 3.0, 6.0, 9.0 및 13.5 μg/kg에서 증식 마커 및 따라서 활성화 마커인 Ki67을 발현하는 CD56+ NK 세포의 백분율에서의 용량-의존적 증가를 주목하였다. 3.0, 6.0 및 9.0 μg/kg에서, Ki67 발현 백분율은 RUR20kD-IL-2 투여 후 각각 대략 10%, 20-30%, 및 30-40%였다. 13.5 μg/kg 용량에서 Ki67 발현 백분율은 더 이상 증가하지 않았으며, 이는 30-40%에서 유지되었다.
SAD 연구에 따른 RUR20kD-IL-2 치료는 CD4+FoxP3+CD25bright Treg의 수에서의 지속적인 증가를 초래하였으며, 수준은 투여후 20-25일까지 기준선으로 복귀되지 않았다. 또한, 총 CD4+FoxP3+CD25+ Treg 집단에서의 증가가 있었지만, 변화 크기는 CD4+FoxP3+CD25bright Treg에서 관찰된 것보다 더 작았다. CD8+ T 세포 및 NK 세포의 수에서의 증가가 13.5 μg/kg에서 관찰되었다.
RUR20kD-IL-2, 20.0 mg/kg (n=13); 플라세보 (n=3), 및 RUR20kD-IL-2, 28.0 mg/kg (n=9); 플라세보 (n=3)의 추가 코호트를 또한 수행하였다. 각각의 코호트를 50일 동안 추적하여, 유해 사건, 활력 징후 및 임상 실험실 평가에 의해 평가된 바와 같은 대상체에서의 안전성 및 내약성, 뿐만 아니라 Treg, Tcon, 및 NK 세포 및 서브세트의 수 및 활성에서의 변화, RUR20kD-IL-2의 약동학, 및 다른 면역학적 효과, 예컨대 시토카인 수준, 말초 혈액 세포 집단, 혈청 단백질 및 유전자 발현의 시간 경과 및 정도에 대한 건강한 지원자에서 RUR20kD-IL-2의 단일 오름차순 용량의 피하 투여의 효과를 평가하였다.
일반적으로, 안전성 결과에서는 연구 중단으로 이어지는 용량-제한 독성, 사망 또는 유해 사건이 없었으며, 임상적으로 유의한 활력 징후, ECG, 또는 신체 검사 이상이 발견되지 않았다. 유해 사건은 주로 경증 또는 중등도 (등급 1 또는 2) 주사 부위 반응으로 제한되었으며, 4명의 대상체는 등급 1 두통 사건을 경험하였고, 1명의 대상체는 시험된 최고 용량 (28.0 μg/kg)에서 상승된 시토카인 수준 및 항-약물 항체의 유발 없음으로 인한 발열, 식욕감퇴, 구토, 설사, 빈맥 및 근육통 (중증도가 모두 등급 1임)의 경증 (등급 1) 징후 및 증상을 경험하였다.
일반적으로, CD25-bright Treg에서의 지속적인 용량-의존적 증가가 RUR20kD-IL-2에 대한 반응으로 관찰되었다 (도 15 참조). RUR20kD-IL-2 조성물의 28 μg/kg에서, 용량전 값보다 높은 CD25-bright Treg의 수의 17배 평균 피크 증가가 관찰되었다. Treg 수준은 10-12일차에 피크에 도달하며, 투여후 20-25일차까지 기준선으로 복귀하지 않았다. Treg 활성화 마커 ICOS 및 CTLA4에서의 증가가 ≥13.5 μg/kg 용량에서 관찰되었다.
Tcon 세포의 백분율의 실질적인 변화가 관찰되지 않았고, RUR20kD-IL-2에 반응하여 CD56+ NK 세포의 최소 증가가 관찰되었다 (도 16 참조). (CD16+CD56+ NK 세포가 또한 열거되었으며, 데이터는 제시되지 않음). NK 세포에서의 증가는 용량-의존적이지 않았다. RUR20kD-IL-2의 최고 농도에서 NK 세포에서의 2배 증가가 관찰되었다. RUR20kD-IL-2는 최대 28 μg/kg까지 CD8+ T 세포의 유도 없이 Treg에서의 용량-의존적 증가를 유도하였다. RUR20kD-IL-2 투여는 28 μg/kg에서 기준선에 비해 평균 피크 Treg:CD8 비에서의 15배 증가를 초래하였다 (도 17 참조).
연구 목적은 단일 오름차순 용량이 피하로 (SC) 투여된 인간에서 RUR20kD-IL-2의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이었다. 또한, Treg의 수 및 백분율, 통상적 CD4+ 및 CD8+ T 세포, NK 세포, 시토카인 수준, 및 말초 혈액에서 RUR20kD-IL-2 조성물의 약동학 (PK)의 시간 경과 및 변화 정도를 조사하였다. 이러한 최초 인간, 이중-맹검, 단일 오름차순 용량 연구에서, 건강한 지원자는 0.3 내지 28 ug/kg 범위의 SC 용량을 받았으며 (코호트당 9명 활성제:3명 플라세보), 대상체를 50일 동안 추적하였다. 모든 8개의 계획된 코호트는 투여를 완료하였다. 용량-제한 독성, 심각한 유해 사건, 사망, 또는 활력 징후, 심전도, 또는 실험실 시험 값에서의 임상적으로 유의한 이상이 없었다. RUR20kD-IL-2로 인한 유해 사건은 주로 경증 (등급 1) 주사 부위 반응으로 제한되었다. 시험된 최고 용량에서 1명의 대상체는 상승된 시토카인 수준 및 림프구감소증의 일시적 및 경증 (등급 1) 증상을 나타내었으며, 이는 치료 없이 해결되었다. 어떤 용량 수준에서도 다른 개인은 IL-2 요법과 연관된 것으로 공지된 전신 징후 또는 증상을 갖지 않았다. 처음 6개 코호트는 현재까지 항-약물 항체에 대해 시험받았지만 검출된 적은 없었다. RUR20kD-IL-2는 투여후 4-6일에 최대 혈장 수준에 도달하였으며, ~2주 동안 거의 변화가 없었으며, 그 후 ~ 8-9일의 반감기로 저하되었다. RUR20kD-IL-2의 1차 효과가 Treg에서 나타났다. 3.0 내지 28.0 ug/kg 용량 코호트에서, 순환 CD4+FoxP3+CD25bright Treg에서의 절대 수 및 백분율의 용량 의존적이고 지속적인 증가가 관찰되었다. 상승된 수준은 10-12일차에 피크에 도달하였고, 투여후 ~ 20 내지 25일까지 기준선으로 복귀되지 않았다. 28.0 ug/kg에서, 이들 CD25bright Treg의 수에서의 평균 피크 증가는 기준선보다 17배 높았으며, 평균 피크 백분율은 0.5%에서 7.4%로 증가하였다. 또한, 용량 ≥13.5 ug/kg에서 Treg 활성화 마커에서의 증가가 있었다. 시험된 최고 용량에서 NK 세포의 백분율 및 수에서의 3.5배의 평균 증가가 있었지만, 통상적 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 백분율 또는 수에서의 변화가 관찰되지 않았다. RUR20kD-IL-2 조성물은 Treg를 선택적으로 유도하였으며, 이는 28.0 ug/kg 그룹에서 기준선에 비해 평균 피크 Treg:CD8 비에서의 15배 증가에 의해 입증되었다. 결론적으로, IL-2 접합체 T-reg 자극제, RUR20kD-IL-2의 단일 용량은 시험된 용량 범위에서 잘 관용되고 안전하였다. RUR20kD-IL-2는 통상적 T 세포에 대한 효과를 최소화하고 NK 세포에 대한 효과를 상대적으로 작게 하면서 순환 CD25bright Treg에서의 현저하고 선택적인 용량-의존적 증가를 초래하였다. 이들 임상적 결과는 RUR20kD-IL-2의 장기간 및 Treg 선택적인 작용을 제시하는 이전 동물 연구를 확장하고, 자가면역 질환, 예컨대 전신성 루푸스에서 새로운 치료제로 RUR20kD-IL-2 시험에 대한 강한 지원을 제공한다.
RUR20kD-IL-2 조성물은 이러한 최초 인간 단일 오름차순 용량 연구에서 안전하고 잘 관용되었으며, 순환 CD25-bright Treg 세포에서의 현저하고 선택적인 용량-의존적 증가를 초래하였다. Tcon 및 NK 세포에 대한 최소 효과가 있었으며, 이 연구 데이터는 자가면역 및 염증성 질환에서 RUR20kD-IL-2 시험에 대한 지원을 제공한다.
실시예 11
전신성 홍반성 루푸스를 갖는 환자에서 피하 RUR 20kD -IL-2의 안전성, 내약성, 약동학 및 약력학을 평가하기 위한 I상, 이중-맹검, 무작위 플라세보-대조 오름차순 다중-용량 연구
최소 내지 중등도 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 갖는 환자의 4개의 용량 코호트에서 RUR20kD-IL-2의 오름차순 다중 용량의 안전성, 내약성, PK 및 면역학적 효과를 평가하기 위한 이중-맹검, 무작위, 플라세보-대조 연구를 수행하였다. SLE 질환 활성에 대한 효과를 또한 평가하였다. 최소 내지 중등도 질환 활성을 갖는 12명의 SLE 환자를 4개의 용량 코호트 각각에 무작위화하고, 그 중 9명은 RUR-IL-2-20kD의 다중 1.0 mg/mL 수용액 피하 용량을 받았지만, 3명은 플라세보를 받았다. RUR20kD-IL-2 약물 및 플라세보를 예를 들어 실시예 1-A에서와 같이 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 활성 임상 SLE 질환 활성은 포함 기준으로 필요하지 않았다. 코호트 1에서, 3.0 μg/kg의 출발 용량을 2주 간격으로 3회 투여하였다 (1, 15 및 29일차). 이러한 출발 용량은 상기 기재된 연구에서 이전에 결정된 RUR20kD-IL-2의 단일 피하 용량의 유리한 안전성 및 PD 프로파일을 기초로 하였다. 코호트 2, 3 및 4에서 후속 용량 수준은 각각 이전 용량 코호트의 최대 2배였다. 코호트 1-3에서 환자는 총 4주에 걸쳐 2주 간격으로 3개의 용량의 연구 약물을 받았다. 연구 과정에 걸쳐 평가되는 용량은 3.0 μg/kg 내지 24 μg/kg 범위였다. 코호트 4에서 환자는 1, 15, 29, 43, 57, 71 및 85일차에 투여된 RUR20kD-IL-2에 의한 12주 치료를 받았다. 이러한 코호트는 RUR20kD-IL-2 치료의 더 긴 지속기간에 걸친 투여 안전성 및 PK 및 PD 프로파일에 대한 데이터를 제공한다. RUR20kD-IL-2 또는 플라세보의 최종 용량을 받은 후, 안전성, PK, PD 및 예비 효능을 평가하기 위해 환자를 추가 50일 동안 추적하였다. 각각의 코호트에서 12명의 대상체 중 8명은 가능한 안전성 이슈에 대해 안전성 검토 위원회에 의해 최종 환자의 제3 용량 후 2주에 평가되었다. 또한, 코호트 4에서 모든 환자는 안전성 검토 위원회에 의해 2회 평가되었다: (1) 처음 8명의 대상체가 제3 용량을 받은 후 2주 및 (2) 모든 대상체가 연구 약물의 모든 용량을 받은 후 2주. 안전성 결과 이외에 Treg, CD4+-T 세포, CD8+-T 세포, 및 NK 세포 반응, 시토카인 수준, 및 입수가능한 PK 데이터를 포함하는 면역학적 변화를 사용하여 용량 수준을 결정하였다. 연구의 1차 목적은 SLE를 갖는 환자에게 다중 오름차순 피하 용량으로 투여된 RUR20kD-IL-2의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이었다. 연구의 2차 목적은 (1) SLE를 갖는 환자에서 다중 피하 용량 후 RUR20kD-IL-2의 PK 프로파일을 특징화하고, (2) SLE를 갖는 환자에서 Treg 및 Treg 서브세트의 수 및 기능, CD4+-T 세포, CD8+-T 세포, NK 세포, 및 시토카인 수준을 포함하는 PD 바이오마커에서의 변화 정도 및 시간 경과에 대한 RUR20kD-IL-2의 효과를 평가하고, (3) SLE를 갖는 환자에서 이중-가닥 DNA에 대한 항체의 존재 및 수준, 및 보체 C3 및 C4의 수준에 대한 RUR20kD-IL-2의 효과를 평가하고, (4) SLE 환자에서 질환 활성에 대한 RUR20kD-IL-2의 효과를 평가하는 것이었다. 오름차순 다중-용량 연구로부터의 예비 PK 데이터를 나타내는 결과를 하기 표 15에서 단일 피하 연구로부터의 데이터와 비교한다:
표 15. 단일 및 다중-용량 인간 연구에서의 PK 데이터
Figure 112020124239333-pct00028
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> Long-Acting IL-2 Receptor Agonist <130> X21700 <150> 62/424798 <151> 2016-11-21 <150> 62/468207 <151> 2017-03-07 <150> 62/674244 <151> 2018-05-21 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aldesleukin; Synthetic Construct <400> 1 Met Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130

Claims (58)

  1. 하기 화학식 (I)의 폴리(에틸렌 글리콜)-인터류킨-2(PEG화 IL-2) 접합체를 포함하는 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물:
    ;
    여기서:
    IL-2는 인터류킨-2이고;
    n은 각각의 경우에 독립적으로 3 내지 4000의 정수이고;
    n'는 1 및 2 및 3이고;
    조성물은, 몰 기준으로, n'이 1인 모노-PEG화 IL-2 접합체를 2.25 몰 퍼센트 내지 4.95 몰 퍼센트 포함하고, n'이 2인 디-PEG화 IL-2 접합체를 31.5 몰 퍼센트 내지 55 몰 퍼센트 포함하고, n'이 3인 트리-PEG화 IL-2 접합체를 34.2 몰 퍼센트 내지 50.6 몰 퍼센트 포함한다.
  2. 제1항에 있어서, 인터류킨-2가 알데스류킨인 제약 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 4, 5, 또는 5 초과 11 이하의 정수로부터 선택되는 값의 n'을 갖는, 하기 화학식 (I)의 폴리(에틸렌 글리콜)-인터류킨-2(PEG화 IL-2) 접합체를 추가로 포함하는 제약 조성물:
    ,
    여기서 n은 각각의 경우에 독립적으로 3 내지 4000의 정수이고;
    IL-2는 알데스류킨이고;
    조성물은, 총괄적으로 고려 시, 화학식 (I)에 의해 포괄되는 PEG화 IL-2 접합체를 0 몰 퍼센트 초과 10 몰 퍼센트 이하 포함하고, 여기서 n'는 1, 4, 5, 또는 5 초과 11 이하의 정수로부터 선택된다.
  4. 제2항에 있어서, 4, 5, 또는 5 초과 11 이하의 정수로부터 선택되는 값의 n'을 갖는, 하기 화학식 (I)의 폴리(에틸렌 글리콜)-인터류킨-2(PEG화 IL-2) 접합체를 추가로 포함하는 제약 조성물:
    ,
    여기서 n은 각각의 경우에 독립적으로 3 내지 4000의 정수이고;
    IL-2는 알데스류킨이고;
    조성물은, 4인 n'를 갖는 화학식 (I)의 PEG화 IL-2 접합체를 0 몰 퍼센트 초과 10 몰 퍼센트 이하로 포함한다.
  5. 제4항에 있어서, 4인 n'를 갖는 화학식 (I)의 PEG화 IL-2 접합체를 0 몰 퍼센트 초과 7 몰 퍼센트 이하로 포함하는 제약 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 4인 n'를 갖는 화학식 (I)의 PEG화 IL-2 접합체를 0 몰 퍼센트 초과 5 몰 퍼센트 이하로 포함하는 제약 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 등몰량의 하기를 포함하는 제약 조성물:
    화학식 (II), 및
    화학식 (III)
    여기서 n은 각각의 경우에 독립적으로 3 내지 4000의 정수이고;
    IL-2는 인터류킨-2 또는 알데스류킨이다.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물은 하기 화학식 (II)의 PEG화 IL-2 접합체 및 화학식 (III)의 PEG화 IL-2 접합체를 포함하고:
    화학식 (II), 및
    화학식 (III)
    여기서 n은 각각의 경우에 독립적으로 3 내지 4000의 정수이고;
    IL-2는 인터류킨-2 또는 알데스류킨이고;
    화학식 (II)의 PEG화 IL-2 접합체/ 화학식 (III)의 PEG화 IL-2 접합체의 몰비는 1.4:1; 1.3:1; 1.2:1; 1.1:1; 1:1; 1:1.1; 1:1.2; 1:1.3; 및 1:1.4로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  9. 제2항에 있어서, 조성물 내에 포함되는 PEG화 IL-2 접합체에 대하여, 알데스류킨당 하기 화학식의 분지형 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티의 평균 수가 2.5인 제약 조성물:
    Figure 112024044064020-pct00035
    ,
    여기서 n은 각각의 경우에 독립적으로 3 내지 4000의 정수이고;
    IL-2는 알데스류킨이다.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, n의 평균 값이 226이고, 화학식 (I)에서의 각각의 분지형 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티의 공칭 평균 분자량이 20,000 달톤인 제약 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 몰 기준으로, 2.5 몰 퍼센트 내지 4.5 몰 퍼센트의 모노-PEG화 IL-2 접합체, 35 몰 퍼센트 내지 50 몰 퍼센트의 디-PEG화 IL-2 접합체, 및 38 몰 퍼센트 내지 46 몰 퍼센트의 트리-PEG화 IL-2 접합체를 포함하고,
    추가로 3 몰 퍼센트 내지 10 몰 퍼센트의 화학식 (I)의 고급 PEG화 IL-2 접합체를 포함하며, 여기서 n'은 4, 5, 또는 5 초과 11 이하로부터 선택되는 값의 정수이고,
    여기서 화학식 (I)에서의 각각의 분지형 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티의 공칭 평균 분자량이 20,000 달톤인 제약 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 몰 기준으로, 2.8 몰 퍼센트 내지 3.8 몰 퍼센트의 모노-PEG화 IL-2 접합체, 44 몰 퍼센트 내지 48 몰 퍼센트의 디-PEG화 IL-2 접합체, 및 41 몰 퍼센트 내지 44 몰 퍼센트의 트리-PEG화 IL-2 접합체를 포함하고,
    추가로 7 몰 퍼센트 내지 9 몰 퍼센트의 화학식 (I)의 고급 PEG화 IL-2 접합체를 포함하며, 여기서 n'은 4, 5, 또는 5 초과 11 이하로부터 선택되는 값의 정수이고,
    여기서 화학식 (I)에서의 각각의 분지형 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티의 공칭 평균 분자량이 20,000 달톤인 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 디-PEG화 및 트리-PEG화 IL-2 접합체의 조합된 몰 퍼센트가 87 몰 퍼센트 내지 90 몰 퍼센트인 제약 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 여기서 인터류킨-2가 알데스류킨이고, 여기서 상기 조성물이, 알데스류킨 아미노산 서열의 K7 또는 K8 또는 K31 또는 K75 로부터 선택된 리신에 부착된 분지형 PEG 모이어티를 갖는 모노-PEG화 IL-2 접합체의 혼합물을 포함하는 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 디-PEG화 및 트리-PEG화 IL-2 접합체의 조합된 몰 퍼센트가 87 몰 퍼센트 내지 90 몰 퍼센트인 제약 조성물.
  16. 제2항에 있어서, 몰 기준으로, 2.8 몰 퍼센트 내지 3.8 몰 퍼센트의 모노-PEG화 IL-2 접합체, 44 몰 퍼센트 내지 48 몰 퍼센트의 디-PEG화 IL-2 접합체, 및 41 몰 퍼센트 내지 44 몰 퍼센트의 트리-PEG화 IL-2 접합체를 포함하고,
    추가로 7 몰 퍼센트 내지 9 몰 퍼센트의 화학식 (I)의 고급 PEG화 IL-2 접합체를 포함하며, 여기서 n'은 4, 5, 또는 5 초과 11 이하로부터 선택되는 값의 정수이고,
    여기서 상기 조성물이, 알데스류킨 아미노산 서열의 리신 K7에 부착된 분지형 PEG 모이어티를 갖는 모노-PEG화 IL-2 접합체를 포함하고, 여기서 화학식 (I)에서의 각각의 분지형 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티의 공칭 평균 분자량이 20,000 달톤인 제약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 디-PEG화 및 트리-PEG화 IL-2 접합체의 조합된 몰 퍼센트가 87 몰 퍼센트 내지 90 몰 퍼센트인 제약 조성물.
  18. 제1항 내지 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  19. 제10항에 있어서, 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  20. 제1항 내지 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 비경구 투여에 적합한 형태인 제약 조성물.
  21. 제1항 내지 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 피하 투여에 적합한 형태인 제약 조성물.
  22. 제18항에 있어서, 수성 희석제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 5의 pH를 갖는 제약 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제가 아세트산나트륨, 염화나트륨 및 수크로스를 포함하는 제약 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 1.5 mg/ml 인터류킨-2 단백질 등가물, 10 mM 농도의 아세트산나트륨, 110 mM 농도의 염화나트륨, 및 2% 농도의 수크로스 (w/v) 를 포함하는 조성물로서, 5.0의 pH를 갖는 제약 조성물.
  26. 제10항에 있어서, 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물로서, 대상체에서 조절성 T 세포 대 이펙터 T 세포의 비를 증가시키는데 효과적인 제약 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 조절성 T 세포가 Foxp3+ 및 CD25+ 세포로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 이펙터 T 세포가 CD4+ 및 CD8+ 세포로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  29. 제26항에 있어서, 조절성 T 세포에서의 배수-증가가, 기준선과 비교 시, 생체내 마우스 모델에서 평가될 때 적어도 2의 값에 도달하는 것인 제약 조성물.
  30. 제26항에 있어서, 조절성 T 세포에서의 배수 증가가, 기준선과 비교 시, 생체내 마우스 모델에서 평가될 때 적어도 4의 값에 도달하는 것인 제약 조성물.
  31. 제26항에 있어서, 조절성 T 세포 수에서의 증가가 투여후 적어도 3일 동안 기준선 수준 초과로 지속되는 것인 제약 조성물.
  32. 제26항에 있어서, 조절성 T 세포 수에서의 증가가 투여후 적어도 5일 동안 기준선 수준 초과로 지속되는 것인 제약 조성물.
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 제10항에 있어서, 조성물이 피하 주사에 의해 대상체에 치료 유효 용량으로 투여되는 것인 제약 조성물.
  36. 제10항에 있어서, 조성물이 2주마다 1회 또는 4주마다 1회 대상체에게 치료 유효 용량으로 투여되는 것인 제약 조성물.
  37. 제10항에 있어서, 조성물이 2주마다 1회 3-24 μg/kg의 용량으로 대상체에게 투여되는 것이고, 여기서 대상체는 사람인 것인 제약 조성물.
  38. 제10항에 있어서, 전신성 홍반성 루푸스의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  39. 제10항에 있어서, 아토피성 피부염의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  40. 제10항에 있어서, 궤양성 대장염 및 크론병으로부터 선택되는 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
KR1020207033346A 2018-05-21 2019-05-20 선택적 TREG 자극제 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물 KR102706554B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020247030258A KR20240137713A (ko) 2018-05-21 2019-05-20 선택적 TREG 자극제 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862674244P 2018-05-21 2018-05-21
US62/674,244 2018-05-21
PCT/US2019/033100 WO2019226538A1 (en) 2018-05-21 2019-05-20 SELECTIVE TREG STIMULATOR RUR20kD-IL-2 AND RELATED COMPOSITIONS

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020247030258A Division KR20240137713A (ko) 2018-05-21 2019-05-20 선택적 TREG 자극제 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210002577A KR20210002577A (ko) 2021-01-08
KR102706554B1 true KR102706554B1 (ko) 2024-09-12

Family

ID=67002369

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207033346A KR102706554B1 (ko) 2018-05-21 2019-05-20 선택적 TREG 자극제 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물
KR1020247030258A KR20240137713A (ko) 2018-05-21 2019-05-20 선택적 TREG 자극제 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020247030258A KR20240137713A (ko) 2018-05-21 2019-05-20 선택적 TREG 자극제 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물

Country Status (20)

Country Link
US (1) US20210205413A1 (ko)
EP (1) EP3796940A1 (ko)
JP (3) JP7235772B2 (ko)
KR (2) KR102706554B1 (ko)
CN (1) CN112399859A (ko)
AU (1) AU2019274409B2 (ko)
BR (1) BR112020021564A2 (ko)
CA (1) CA3100204A1 (ko)
CL (1) CL2020003008A1 (ko)
CO (1) CO2020014510A2 (ko)
CR (1) CR20200546A (ko)
DO (1) DOP2020000212A (ko)
EA (1) EA202092489A1 (ko)
EC (1) ECSP20074392A (ko)
IL (2) IL278528B2 (ko)
JO (1) JOP20200290A1 (ko)
PE (1) PE20211307A1 (ko)
PH (1) PH12020551976A1 (ko)
SG (1) SG11202011242SA (ko)
WO (1) WO2019226538A1 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115315436A (zh) 2020-01-10 2022-11-08 明峰治疗股份公司 修饰的il-2多肽及其用途
CN113121670B (zh) * 2020-01-15 2022-11-22 天津键凯科技有限公司 二取代peg化白细胞介素2及其制备方法、应用
EP4092048A4 (en) * 2020-01-15 2023-07-26 Jenkem Technology Co. Ltd. (Tianjin) METHOD FOR PREPARING PEGYLATED BIOMOLECULES HAVING CONTROLLABLE BINDING SITES
JP2021143142A (ja) * 2020-03-11 2021-09-24 花王株式会社 制御性ｔ細胞誘導剤
US20230272001A1 (en) * 2020-05-22 2023-08-31 Merck Sharp & Dohme Llc Novel processes for preparing conjugates of the il-2 protein
TW202228784A (zh) 2020-09-23 2022-08-01 奧地利商艾柏力維亞生技有限公司 用以於一患者中螯合非預期的抗ｐｅｇ抗體的化合物
WO2022109477A1 (en) * 2020-11-23 2022-05-27 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Use of insulin-like growth factors with gamma-chain cytokines to induce homeostatic proliferation of lymphocytes
WO2023114833A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Eli Lilly And Company Dosing regimens for selective treg stimulator rur20kd-il-2 and related compositions

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012065086A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Nektar Therapeutics Conjugates of an il-2 moiety and a polymer

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4401756A (en) 1981-04-14 1983-08-30 Immunex Corporation Process for preparing human interleukin 2
US4569790A (en) 1984-03-28 1986-02-11 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US5153310A (en) 1989-02-28 1992-10-06 Du Pont Merck Pharmaceutical Company Il-2 analogs containing n-linked glycosylation sites
US5635597A (en) 1994-05-27 1997-06-03 Affymax Technologies, N.V. Peptides that bind IL-2 receptors
US6168785B1 (en) 1998-07-16 2001-01-02 Institut Pasteur Biological applications of new peptides of IL-2 and derivatives and use as therapeutic agents
FR2826365B1 (fr) 2001-06-20 2003-09-26 Oreal Compositions cosmetiques photoprotectrices contenant des derives amides, sulfonamides ou carbamates aromatiques d'acrylonitrile et nouveaux derives amides, sulfonamides ou carbamates d'acrylonitrile
CA2510040C (en) 2003-05-23 2012-01-03 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymeric reagents and polymer-biomolecule conjugates comprising carbamate linkages
WO2005007121A2 (en) 2003-07-18 2005-01-27 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides
US7567215B1 (en) 2007-10-23 2009-07-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Portable and inflatable antenna device
EP2683395B1 (en) 2011-03-11 2018-08-01 Assistance Publique - Hôpitaux de Paris Use of low dose il-2 for treating type 1 diabetes
US10898576B2 (en) 2016-03-16 2021-01-26 Yanhui Xie Glucocorticoid combined with polyethylene glycol-modified interleukin 2 for treating respiratory disease

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012065086A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Nektar Therapeutics Conjugates of an il-2 moiety and a polymer

Also Published As

Publication number Publication date
DOP2020000212A (es) 2021-03-15
CO2020014510A2 (es) 2021-03-08
IL312646A (en) 2024-07-01
JP2021523922A (ja) 2021-09-09
AU2022246440A1 (en) 2022-11-03
EA202092489A1 (ru) 2021-03-16
US20210205413A1 (en) 2021-07-08
IL278528A (ko) 2021-01-31
PE20211307A1 (es) 2021-07-20
SG11202011242SA (en) 2020-12-30
JP7235772B2 (ja) 2023-03-08
JP2023052053A (ja) 2023-04-11
KR20210002577A (ko) 2021-01-08
EP3796940A1 (en) 2021-03-31
JP2024116272A (ja) 2024-08-27
AU2019274409A1 (en) 2020-11-12
CN112399859A (zh) 2021-02-23
IL278528B2 (en) 2024-10-01
AU2019274409B2 (en) 2022-07-14
CR20200546A (es) 2021-05-18
JOP20200290A1 (ar) 2020-11-15
KR20240137713A (ko) 2024-09-20
IL278528B1 (en) 2024-06-01
CL2020003008A1 (es) 2021-07-30
BR112020021564A2 (pt) 2021-03-02
PH12020551976A1 (en) 2021-09-13
WO2019226538A1 (en) 2019-11-28
CA3100204A1 (en) 2019-11-28
ECSP20074392A (es) 2021-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102706554B1 (ko) 선택적 TREG 자극제 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물
AU2022203691B2 (en) Long-acting interleukin-15 receptor agonists and related immunotherapeutic compositions and methods
KR102591732B1 (ko) Ｉｌ-2 부분 및 중합체의 접합체
US11827684B2 (en) Human interleukin-2 conjugates biased for the interleukin-2 receptor beta GAMMAc dimer and conjugated to a nonpeptidic, water-soluble polymer
CA2150925C (en) Improved synthesis of polymer bio-active conjugates
JP2017511322A (ja) Ｉｌ−１５部分とポリマーとのコンジュゲート
ZA200105932B (en) GCSF conjugates.
KR20110008075A (ko) 콜린에스테라아제 부분 및 폴리머의 콘쥬게이트
KR20070115602A (ko) 폴리에틸렌글리콜 또는 이의 유도체로 단일 수식된 엑센딘,이의 제조방법 및 이의 용도
Thomas et al. Design of glycoengineered IL-4 antagonists employing chemical and biosynthetic glycosylation
EA043667B1 (ru) Длительно действующие агонисты рецептора интерлейкина-15, связанные с ними композиции и способы их получения и применения
JPWO2021195508A5 (ko)

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
AMND Amendment
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
A107 Divisional application of patent
GRNT Written decision to grant