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CN112399859A - 选择性TREG刺激剂RUR20kD-IL-2和相关组合物 - Google Patents

选择性TREG刺激剂RUR20kD-IL-2和相关组合物 Download PDF

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J·L·兰戈夫斯基
J·扎列夫斯基
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Nektar Therapeutics
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Abstract

本公开提供了选择性Treg刺激剂组合物，包括RUR20kD‑IL‑2和相关组合物，以及使用这些组合物例如用于治疗自身免疫性疾病和/或对疗法应答的其他病况的方法，所述疗法有效地提供调节性T细胞的数目和活化相比于效应T细胞的选择性增加。

Description

选择性TREG刺激剂RUR20kD-IL-2和相关组合物
本申请涉及相对于效应T细胞选择性增加调节性T细胞的数目和活化的长效白介素-2受体(IL-2 R)激动剂Treg刺激剂组合物，并且涉及使用这些Treg刺激剂组合物以治疗自身免疫性疾病和炎性疾病和/或对Treg刺激疗法应答的其他病况的方法。具体而言，本申请涉及选择性Treg刺激剂组合物RUR20kD-IL-2和相关组合物，及其制备方法，其制剂以及使用RUR20kD-IL-2和相关组合物用于治疗自身免疫性疾病和炎性病症的方法。
免疫系统是机体针对感染性生物的入侵的主要防线。在正常发挥功能的免疫系统中，不针对自身抗原发生免疫应答；这被称为自我耐受性。当机体的自身免疫系统由于对自身抗原的耐受性丧失而攻击机体组织时，发生自身免疫性疾病(Dejaco, C., 等人, Immunology. 2006; 117(3): 289-300)。在具有自身免疫性疾病的受试者中，抗原特异性的细胞毒性T细胞或自身抗体破坏机体组织，其中伴随的炎症可以引起功能失能，并在一些情况下引起死亡。自身免疫性疾病是影响近似6%人群的具有广泛范围的症状的疾病的异质性集合(Siatskas, C., 等人,Curr Gene Ther. 2006; 6(1): 45-58)。尽管自身免疫性疾病的临床特征非常不同，但免疫介导的机制与针对靶标抗原的适应性免疫应答的生成相关(Kuby, J., 1994: Autoimmunity. Immunology, 第2版, p 445-467.WH Freeman andCompany, New York)。
尽管各种常规治疗，诸如皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤和甲氨蝶呤在具有自身免疫性疾病的一些患者中略微有效，但它们并不一致地有效，并且与副作用和毒性相关(Jantunen, E., 等人, Bone Marrow Transplant.2000; 25(4): 351-6)。此类常规方法不能解决与自身反应性免疫相关的潜在病理学。
鉴于对自身免疫性疾病的病理生理学的理解的进来进展，潜在的聚焦于细胞或分子靶标的新疗法已经开发并且目前正在评估。尽管自身免疫性疾病的病因是未知的，但相信其由遗传因素、不当的免疫调节以及激素和环境因素之间的潜在相互作用引起。已经提出诱导自身免疫性疾病的各种机制，包括螯合的抗原，分子模拟，MHC II类分子的不规则表达，细胞因子失衡，独特型网络调节途径的功能障碍，一般调节性T细胞缺陷和多克隆B细胞活化(Kuby, 1994, 同上)。已经研究了几种用于治疗自身免疫疾病的方法，包括B细胞耗竭，抗细胞因子疗法和干细胞疗法，然而这些方法就效力、安全性和/或不期望的副作用而言具有不足。用于治疗自身免疫性疾病的常规疗法通过抑制总体免疫系统而发挥功能，由此导致明显的感染和其他严重副作用的风险。因此，仍然需要额外的治疗以提供用于治疗自身免疫性疾病的效力、安全性和/或耐受性的改进的组合。
持续多年，IL-2在自身免疫性应答中的作用被确立为促炎性细胞因子。然而，更近来的研究已经表明，IL-2在某些条件下可以在慢性自身免疫性炎症中发挥保护作用。具体而言，调节性T细胞(Treg)和效应T细胞(Teff)之间的破坏的平衡已被鉴定为各种自身免疫性疾病的共同特征，其中这种破坏的平衡被认为被内稳态细胞因子、诸如IL-2影响。由于其药代动力学概况，施用未修饰的IL-2用于自身免疫性疗法需要频繁的每天或每隔一天给药，这经常伴随着疼痛的注射部位反应。此外，由于不适和不便，频繁的注射的必要性经常伴随着不良的患者依从性。IL-2的长期重复施用还伴随着IL-2的不想要的多效性和全身性活性的风险升高以及相关风险和不良作用。此外，由于治疗窗口受限，使用未修饰的IL-2来实现免疫内稳态和维持期望的Treg/Teff平衡可以证明在延长的时间段内有挑战性，如果不是无法实现的话。此外，其自身免疫性疾病疗法的狭窄治疗边界需要施用极低剂量的IL-2，由此不利地影响其效力。尽管低剂量IL-2可用于刺激Treg以得到一些临床益处，但不良事件是剂量限制性的，并且Treg增加是适度且短期的。例如，施用未修饰的IL-2用于自身免疫性疾病疗法诱导IL-5的不期望的增加和随后嗜酸性粒细胞水平的升高，其可以导致炎症。因此，仍然需要可以以促进各种自身免疫性疾病中的调节性T细胞和效应T细胞活性的疾病减轻平衡的方式选择性调节IL-2信号传导的药剂。
特定的自身免疫性疾病具有潜在的病因，包括IL-2产生受损和/或调节性T细胞缺陷，其已被牵涉为疾病发作之前的免疫学机制。仍然需要替代的和更有效的治疗组合物和治疗方案，以有效地减轻自身免疫性症状、提高生活质量，和优选在各种自身免疫性疾病中提供延长的缓解。本公开解决了用于治疗慢性自身免疫性疾病的当前选项的有限的可获得性和相关的缺点。
概述
本公开基于选择性Treg刺激剂RUR20kD-IL-2和相关组合物的发现。RUR20kD-IL-2的选择性Treg刺激剂组合物是具有限定异质性的IL-2-PEG缀合物混合物。它们意欲用于低剂量皮下施用，以选择性恢复Treg内稳态，而对其他免疫细胞的影响最小。RUR20kD-IL-2选择性Treg刺激剂组合物是包含稳定地共价缀合至20kDa聚乙二醇(PEG)部分的重组人白介素-2(rhIL-2，和特别是无额外氨基酸突变或取代的阿地白介素氨基酸序列)的缀合物混合物，其中所述混合物具有限定的级分，其每个IL-2部分具有特定程度的PEG化。本公开的组合物包含IL-2 PEG缀合物的选定混合物，其具有限定的主要是二-PEG化和三-PEG化的IL-2的级分，和限定的较少的单-PEG化的IL-2和/或四或更高PEG化的IL-2的级分。具体而言，本公开的组合物提供了选择性Treg刺激剂RUR20kD-IL-2和相关组合物，其制备方法，其制剂和使用RUR20kD-IL-2和相关组合物用于治疗自身免疫性疾病和炎性病症的方法。RUR20kD-IL-2组合物通过活化和扩增抗原特异性T调节性细胞来诱导免疫炎性疾病中的持久应答。用低剂量皮下施用RUR20kD-IL-2组合物治疗自身免疫性疾病可以提供一种选择性恢复Treg内稳态的方式，而对常规T细胞功能的影响最小，由此提供了一种替代和/或改进的减轻这些病症的方法。
附图的简要说明
图1A和1B是代表性反相HPLC图，其举例说明RUR20kD-IL-2组合物的一般组合物，其制备描述于实施例1和1A中。沿x-轴从左到右移动(洗脱时间，分钟)，纯化的缀合物组合物主要包含二-PEG化和三-PEG化的rIL-2。
图2是阿地白介素(125-L-丝氨酸-2-133白介素2，在大肠杆菌中表达的重组的非糖基化白介素-2)的氨基酸序列。
图3A和3B是表明如实施例2中所述在小鼠中施用单剂量的RUR20kD-IL-2组合物后在血液(图3A)和脾脏(图3B)中的小鼠Treg的药效动力学分析的结果的图。
图4A、4B和4C是显示如实施例2中所述在小鼠中施用单剂量的RUR20kD-IL-2组合物后血液中分别NK细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞的水平的图。
图5A和5B是如实施例2中所述在小鼠中施用单剂量的RUR20kD-IL-2组合物后如通过CD25和Foxp3的平均荧光强度(MFI)所测量的Treg功能和活性的图。
图6A-D是如实施例3中所述的体外Treg抑制测定中在1和4天从媒介物处理的小鼠分离的脾Treg的图。
图7是表明如实施例3中所述随时间评价的以1:2的比率与Tcon(常规T细胞)培养的分离的Treg的相对抑制能力的图。
图8A和8B表明用RUR20kD-IL-2组合物治疗的小鼠中的耳肿胀的程度；进行该研究以评价通过RUR20kD-IL-2施用的Treg诱导抑制延迟型超敏性(DTH)的小鼠模型中的T-细胞抗原驱动的炎症的能力，如实施例4中所述。
图9A-C是如实施例5中所述在食蟹猴中施用单剂量的RUR20kD-IL-2组合物后血液中的Treg水平(分别为CD4、CD25、FOXP3)的图。
图10A和B是表明如实施例7中所述在小鼠中施用RUR20kD-IL-2组合物或未修饰的IL-2(阿地白介素)后小鼠Treg的药效动力学分析的结果的图。
图11是如实施例8中详细描述当在系统性红斑狼疮(SLE)的小鼠模型中评估时，施用RUR20kD -IL-2组合物(0.3 mg/kg)的小鼠的尿蛋白水平(g/L)随时间的图。
图12是表明在单次施用各种剂量的量的RUR20kD-IL-2组合物后，随时间(天数)的外周血样品中的CD4+FoxP3+CD25亮 Treg(细胞数/μL)的药效动力学分析的结果的图。
图13是表明如实施例10中所述在向人受试者单剂量施用各种剂量的量的RUR20kD-IL-2组合物后随时间(天数)的外周血样品中的总CD4+FoxP3+CD25+ Treg(细胞数/μL)的药效动力学分析的结果的图。
图14A-D是如实施例10中所述向人受试者单次施用各种剂量的量的RUR20kD-IL-2组合物后随时间(天数)的外周血样品中的Tcon细胞群体、CD4+(图14A)和CD8+ Tcon细胞(图14B)(表示为CD3细胞的百分比)的图。图14C和14D是举例说明如实施例10中所述向人受试者单次施用各种剂量的量的RUR20kD-IL-2组合物后随时间(天数)的外周血样品中的分别CD8+ T细胞的数目(细胞数/μL)和Ki67+CD8+ T细胞的数目(表示为CD8的百分比)的图。。
图15A、15B是使用流式细胞术计数的CD25亮+/FoxP3+ Treg的图。在治疗前和用单次施用各种剂量的量的RUR20kD-IL-2治疗后的多个时间点，从人受试者收集全血，如实施例10中所述。图15A举例说明每种剂量的量对CD25亮+/FoxP3+Treg的数目(细胞数/μl)的中值峰值影响，而图15B提供了治疗后随时间(天数)的CD25亮+/FoxP3+Treg的绝对数目。
图16A、16B是分别使用流式细胞术计数的CD4+和CD8+ T细胞的图。在治疗前和用单次施用各种剂量的量的RUR20kD-IL-2治疗后的多个时间点，从人受试者收集全血，如实施例10中所述。结果呈现为每个细胞群体的比例(%)和基于治疗前值计算的倍数变化。
图17A、17B是使用流式细胞术计数的Treg与Tcon剂量-应答比率(图17A)以及CD25亮+/FoxP3+ Treg和CD8+ T细胞(图17B)的图。在治疗前和用单次施用各种剂量的量的RUR20kD-IL-2治疗后的多个时间点，从人受试者收集全血，如实施例10中所述。结果呈现为每个细胞群体的比例(%)的比率和基于治疗前值计算的倍数变化。Tcon细胞是CD8+ T细胞。
详述
本公开提供了选择性Treg刺激剂组合物，包括RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物。通常，本文提供的化学修饰的IL-2缀合物组合物的特征在于具有特定和占优势数目的支链聚乙二醇部分，其经由其氨基基团稳定地共价连接至IL-2。本文提供的组合物包含IL-2 PEG缀合物的选定混合物，其具有限定的主要是二-PEG化和三-PEG化的IL-2的级分，和限定的较少的单-PEG化的IL-2和/或四或更高PEG化的IL -2的级分。
在一个方面，本公开提供了包含具有以下结构的PEG化的IL-2缀合物的组合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure 435360DEST_PATH_IMAGE002
其中：
IL-2是白介素-2；
n在每次出现时独立地是约3至约4000的整数。
在所述组合物的一个具体实施方案中，IL-2是阿地白介素。在所述组合物的一个具体实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。在所述组合物的一个进一步具体实施方案中，所述组合物的PEG化的IL-2缀合物具有在赖氨酸31处附接的PEG部分。
在一个方面，本文提供了包含下式的缀合物的组合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
其中IL-2是白介素-2，n是约3至约4000的整数，且n’是2和3。
式(I)的聚合物部分也被称为1,3-双(甲氧基聚(乙二醇) MW 10,000氨基甲酰基)-2-丙氧基)-4-丁酰基(最多达且包括与IL-2部分的氨基氮共价附接的羰基基团)。根据式(I)的混合物组合物在本文中通常被称为RUR-IL2，其涵盖一定范围的PEG大小。除了约3至约4000以外，n的说明性范围包括，例如，约5-2000，或约10-1000，或约10-750，或约10-500，或约10-400，或约10-300，或约10-250，或约20-250。在一些实施方案中，n平均为约226。
在另一个方面，本文提供了下式的组合物：
Figure 572075DEST_PATH_IMAGE004
其中IL-2是白介素-2，n是约3至约4000的整数，且n’是1和2和3。
在一些实施方案中，式I的选择性Treg刺激剂组合物包含与支链的聚乙二醇部分稳定地共价连接的IL-2R，其中每个IL-2部分的支链的PEG部分的数目(PEG化程度)是混合物中的主要2和3-聚体(二-和三-PEG化的)的分布，其中次要级分包括1-聚体(单-PEG化的)和4-聚体(四-PEG化的)。因此，在一些实施方案中，根据式I的组合物中的次要级分将包括其中n’是1、4、5或更高、但不大于11的缀合物。
例如，在一个实施方案中，所述选择性Treg刺激剂组合物由以下结构涵盖：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
其中IL-2是IL-2的氨基酸残基之一，且结构(Ib)中显示的“NH”是所述IL-2残基的氨基基团；其中“n”是约3至约4000的整数；且n’是2和3。
在一些实施方案中，本文提供了被称为RUR20kD-IL-2的选择性Treg刺激剂组合物和相关组合物。这些组合物包含具有单独的共价PEG附接的IL-2缀合物，其具有总共约20kD的标称分子量，如本文所述。优选地，所述IL-2部分是阿地白介素。这些组合物进一步包含IL-2 PEG缀合物的选定混合物，其具有限定的主要是二-PEG化和三-PEG化的IL-2的级分，和限定的较少的单-PEG化的IL-2和/或四或更高PEG化的IL-2的级分。RUR20kD-IL-2组合物的特定制剂在下文和整个申请中描述。如本文所用，配方A的RUR20kD-IL-2的组合物、配方B的RUR20kD-IL-2的组合物、配方C的RUR20kD-IL-2的组合物、配方D的RUR20kD-IL-2的组合物和/配方E的RUR20kD-IL-2的组合物代表选择性Treg刺激剂RUR20kD-IL-2和相关组合物的某些实施方案，并且在这些实施方案中，所述IL-2部分是阿地白介素(如本文所述)。任选地，这些组合物包含其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本文提供了配方A的RUR20kD-IL-2的组合物，其中在摩尔基础上，所述组合物包含约5 mol %或更少的单-PEG化的IL-2缀合物，和约28 mol %至约60 mol%的二-PEG化的IL-2缀合物，和约24 mol %至约65 mol %的三-PEG化的IL-2缀合物，和约12mol %或更少的更高PEG化的IL-2缀合物，且其中每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。优选地，配方A的RUR20kD-IL-2的组合物包含80 mol %或更高的组合的二-和三-PEG化的IL-2缀合物。
在一个实施方案中，本文提供了配方B的RUR20kD-IL-2的组合物，其中在摩尔基础上，所述组合物包含约2.5至约4.5 mol %的单-PEG化的IL-2缀合物，和约35至约50 mol %的二-PEG化的IL-2缀合物，和约38至约46 mol %的三-PEG化的IL-2缀合物，和约3至约10mol%的更高PEG化的IL-2缀合物，且其中每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。优选地，配方B的RUR20kD-IL-2的组合物包含约80至95 mol %的组合总量的二-PEG化和三-PEG化的IL-2缀合物。
在一个实施方案中，本文提供了配方C的RUR20kD-IL-2的组合物，其中在摩尔基础上，所述组合物包含约2.8至约3.8 mol %的单-PEG化的IL-2缀合物，和约44至约48 mol %的二-PEG化的IL-2缀合物，和约41至约44 mol %的三-PEG化的IL-2缀合物，和约7至约9mol%的更高PEG化的IL-2缀合物，且其中每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。优选地，配方C的RUR20kD-IL-2的组合物包含约87至90 mol %的组合总量的二-PEG化和三-PEG化的IL-2缀合物。
在一个实施方案中，本文提供了配方D的RUR20kD-IL-2的组合物，其中在摩尔基础上，所述组合物包含约2.8至约3.8 mol %的单-PEG化的IL-2缀合物，和约44至约48 mol %的二-PEG化的IL-2缀合物，和约41至约44 mol %的三-PEG化的IL-2缀合物，和约7至约9mol%的更高PEG化的IL-2缀合物，且其中所述组合物包含具有在赖氨酸K7或K8或K31或K75之一处附接的PEG部分的单-PEG化的IL-2缀合物的混合物，且其中每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。优选地，配方D的RUR20kD-IL-2的组合物包含约87至90 mol %的组合总量的二-PEG化和三-PEG化的IL-2缀合物。
在一个实施方案中，本文提供了配方E的RUR20kD-IL-2的组合物，其中在摩尔基础上，所述组合物包含约2.8至约3.8 mol %的单-PEG化的IL-2缀合物，和约44至约48 mol %的二-PEG化的IL-2缀合物，和约41至约44 mol %的三-PEG化的IL-2缀合物，和约7至约9mol%的更高PEG化的IL-2缀合物，且其中所述组合物包含具有在赖氨酸K7处附接的PEG部分的单-PEG化的IL-2缀合物，其中每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。优选地，配方E的RUR20kD-IL-2的组合物包含约87至90 mol %的组合总量的二-PEG化和三-PEG化的IL-2缀合物。
如本文所用，“RUR20kD-IL-2和相关组合物”可以指根据配方A的RUR20kD-IL-2和/或配方B的RUR20kD-IL-2和/或配方C的RUR20kD-IL-2和/或配方D的RUR20kD-IL-2和/或配方E的RUR20kD-IL-2中任一项的一种或多种组合物和/或这些组合物的药学上可接受的盐。实施例1和/或实施例1A的制剂是本公开的“RUR20kD-IL-2和相关组合物”的非限制性实例。
本文提供的选择性Treg刺激剂组合物的进一步实施方案：
本文提供的组合物可以包含其中n等于2的缀合物，例如，这样的二-PEG化的缀合物，其中两个支链聚乙二醇聚合物(其各自具有上文显示的1,3-双(甲氧基聚(乙二醇)10kD氨基甲酰基)-2-丙氧基)-4-丁酰基结构)对于所述组合物中的实质上所有二-PEG化的IL-2缀合物在相同的相对位置处附接。或者，二-PEG化的缀合物可以包含二-PEG化的缀合物的混合物，例如这样的二-PEG化的缀合物的混合物，其中支链聚乙二醇部分的附接发生在IL-2上的两个位点处，其中特定的附接位点对于所述组合物中包含的所有二-PEG化的IL-2缀合物不是相同的。因此，此类二-PEG化的组合物在PEG化的程度、特别是附接的支链PEG部分(例如，2-聚体)的数目方面是均质的，但在PEG附接在IL-2上的位置方面是异质的，并且在这种情况下代表PEG附接的位置异构体。
所述组合物还可以包含其中n等于3的单一缀合物，例如，这样的三-PEG化的缀合物，其中三个支链聚乙二醇部分对于所述组合物中的实质上所有IL-2缀合物在相同的相对位置处附接。或者，三-PEG化的缀合物可以包含三-PEG化的缀合物的混合物，例如这样的三-PEG化的缀合物的混合物，其中支链聚乙二醇部分的附接位点对于所述组合物中包含的缀合物存在于IL-2上的不同位点处。因此，此类三-PEG化的组合物在PEG化的程度、特别是附接的支链PEG部分的数目方面是均质的，但在PEG附接在IL-2上的位置方面是异质的，并且在这种情况下代表PEG附接的位置异构体。
所述组合物还可以包含其中n等于1的单一缀合物，例如，这样的单-PEG化的缀合物，其中一个支链聚乙二醇部分对于所述组合物中的实质上所有IL-2缀合物在相同的相对位置处附接。或者，单-PEG化的缀合物可以包含单-PEG化的缀合物的混合物，例如这样的单-PEG化的缀合物的混合物，其中支链聚乙二醇部分的附接位点对于所述组合物中包含的缀合物存在于IL-2上的不同位点处。因此，此类单-PEG化的组合物在PEG化的程度、特别是附接的支链PEG部分的数目方面是均质的，但在PEG附接在IL-2上的位置方面是异质的，并且在这种情况下代表PEG附接的位置异构体。
IL-2分子上的PEG附接的某些位置在本文所述的组合物中更普遍。例如，赖氨酸K7或K8或K31或K75通常是PEG化的位点。RUR20kD-IL-2的组合物和相关组合物可以包含其中赖氨酸K7或K8或K31或K75是PEG化的位点的缀合物。RUR20kD-IL-2的组合物和相关组合物可以包含其中赖氨酸K7或K8或K31或K75是PEG化的位点的单-PEG化的缀合物。RUR20kD-IL-2的组合物和相关组合物可以包含其中赖氨酸K7是PEG化的位点的单-PEG化的缀合物。RUR20kD-IL-2的组合物和相关组合物可以包含其中赖氨酸K31是PEG化的位点的单-PEG化的缀合物。
在一些实施方案中，所述组合物含有不超过约20 mol %，和优选不超过约15 mol%的当共同考虑时由式(I)涵盖的缀合物，其中n’是选自1、4、5的整数，或大于5的整数，其中摩尔百分比基于总PEG-IL-2缀合物。在一些实施方案中，所述组合物含有不超过约10 mol%的当共同考虑时由式(I)涵盖的缀合物，其中n’是选自1、4、5的整数，或大于5的整数，其中摩尔百分比基于总PEG-IL-2缀合物。在一些额外实施方案中，所述组合物含有不超过约10mol %的单体，且优选不超过约7 mol %的单体，或不超过约5 mol%的单体(即，根据结构(I)，其中n等于1)。在一些进一步实施方案中，所述组合物含有不超过约10 mol %的四聚体，且优选不超过约7 mol %的四聚体，或不超过约5 mol%的四聚体(即，根据结构(I)，其中n等于4)。在某些额外实施方案中，所述组合物包含不超过约10 mol %的单体和不超过约10mol %的四聚体。或者，所述组合物包含不超过约7 mol %的单体和不超过约7 mol %的四聚体，或者可以包含不超过约5 mol %的单体和不超过约5 mol %的四聚体。
在一些实施方案中，关于所述组合物中的PEG化的IL-2，所述组合物通常将满足以下特征中的一种或多种：所述组合物中的至少约80%的缀合物将包含二-PEG化和三-PEG化缀合物的混合物，一些具有2个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物，且一些具有3个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物；所述组合物中的至少约85%的缀合物将包含二-PEG化和三-PEG化缀合物的混合物，一些具有2个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物，且一些具有3个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物；所述组合物中的至少约90%的缀合物将包含二-PEG化和三-PEG化缀合物的混合物，一些具有2个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物，且一些具有3个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物；且所述组合物中的至少约95%的缀合物将包含二-PEG化和三-PEG化缀合物的混合物，一些具有2个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物，且一些具有3个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物；所述组合物中的不超过约20%的缀合物将具有1或4或更多个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物；所述组合物中的不超过约15%的缀合物将具有1或4或更多个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物；所述组合物中的不超过约10%的缀合物将具有1、4或更多个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物；所述组合物中的不超过约7%的缀合物将具有1或4或更多个具有附接至IL-2部分的上面式(I)中显示的结构的支链聚合物。
在一些实施方案中，所述组合物含有不超过约20 mol %，和优选不超过约15 mol%的当共同考虑时由式(I)涵盖的化合物，其中n’是选自1、4、5的整数，或大于5的整数，其中摩尔百分比基于总PEG-IL-2缀合物。在一些实施方案中，所述组合物含有不超过约10 mol%的当共同考虑时由式(I)涵盖的缀合物，其中n’是选自1、4、5的整数，或大于5的整数，其中摩尔百分比基于总PEG-IL-2缀合物。在一些额外实施方案中，所述组合物含有不超过约10mol %的单体，且优选不超过约7 mol %的单体，或不超过约5 mol%的单体(即，根据结构(I)，其中n等于1)。在一些进一步实施方案中，所述组合物含有不超过约10 mol %的四聚体，且优选不超过约7 mol %的四聚体，或不超过约5 mol%的四聚体(即，根据结构(I)，其中n等于4)。在某些额外实施方案中，所述组合物包含不超过约10 mol %的单体和不超过约10mol %的四聚体。或者，所述组合物包含不超过约7 mol %的单体和不超过约7 mol %的四聚体，或者可以包含不超过约5 mol %的单体和不超过约5 mol %的四聚体。
在一些进一步实施方案中，所述组合物包含近似等摩尔量的
Figure 476445DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE007
。
例如，说明性组合物可以包含任何一种或多种以下近似比率的二-PEG化种类与三-PEG化种类：1.4:1；1.3:1；1.2:1；1.1:1；1:1；1:1.1；1:1.2；1:1.3；或1:1.4。此类组合物的每个IL-2的PEG部分的平均数目选自例如2；2.1；2.2；2.3；2.4；2.5；2.6；2.6；2.7；2.8；2.9；和3。在某些实施方案中，每个IL-2的PEG部分的平均数目为约2.5。
例如，在一些实施方案中，所述组合物包含不超过约20摩尔%(mol %)的当共同考虑时由下式涵盖的IL-2缀合物
Figure 703945DEST_PATH_IMAGE008
其中n’选自1、4、5，或大于5的整数。
还在一些额外实施方案中，所述组合物包含不超过约15摩尔%(mol %)的当共同考虑时由下式涵盖的IL-2缀合物
Figure DEST_PATH_IMAGE009
且其中n’选自1、4、5，或大于5的整数。
还在一些进一步实施方案中，所述组合物包含不超过约10摩尔%(mol %)的当共同考虑时由下式涵盖的IL-2缀合物
Figure 642951DEST_PATH_IMAGE010
且其中n’选自1、4、5，或大于5的整数。
在前述的一些额外实施方案中，所述组合物包含不超过约10 mol %的n’等于1的IL-2缀合物。在还有一些其他实施方案中，所述组合物包含不超过约7 mol %的n’等于1的IL-2缀合物。
在还有一些进一步实施方案中，所述组合物包含不超过约5 mol %的n’等于1的IL-2缀合物。在还有一些替代实施方案中，所述组合物包含少于约5 mol %的n’等于1的IL-2缀合物。
在与前述中的任何一项或多项相关的一些进一步实施方案中，所述组合物包含不超过约10 mol %的n’等于4的IL-2缀合物。或者，在一些其他实施方案中，所述组合物包含不超过约7 mol %的n’等于4的IL-2缀合物。在还有一些进一步实施方案中，所述组合物包含不超过约5 mol %的n’等于4的IL-2缀合物。
本文还提供了组合物，其包含近似等摩尔量的
Figure DEST_PATH_IMAGE011
Figure 560354DEST_PATH_IMAGE012
。
在还有额外实施方案中，本文提供了包含下式的IL-2缀合物的组合物，
Figure DEST_PATH_IMAGE013
Figure 952021DEST_PATH_IMAGE014
其中二PEG/三PEG缀合物的摩尔比选自1.4:1；1.3:1；1.2:1；1.1:1；1:1；1:1.1；1:1.2；1:1.3；和1:1.4。
在还有一些进一步实施方案中，所述组合物的每个IL-2残基的支链聚乙二醇部分(具有如上所示的结构)的平均数目选自2；2.1；2.2；2.3；2.4；2.5；2.6；2.6；2.7；2.8；2.9；和3。在一个具体实施方案中，每个IL-2部分的支链聚乙二醇部分(具有如上所示的结构)的平均数目为约2.5。在与前述中的一项或多项相关的一些实施方案中，n的值范围为5-2000。在一些其他实施方案中，n的值范围为10-1000。在还有一些额外实施方案中，n的值范围为10-750。在一些实施方案中，n的值范围为10-500，或20-250。
在本文提供的实施方案中，n的值可以在每次出现时独立地变化。在本文所述的一个或多个实施方案中，支链聚合物的每个聚乙二醇臂中的n的值是实质上相同的。在一些进一步实施方案中，构成支链聚合物的每个聚合物臂中的n的值范围为约170至285。在还有一些进一步实施方案中，构成支链聚合物的每个聚合物臂中的n的值范围为约204至约250。在一个或多个具体实施方案中，构成支链聚合物的每个聚合物臂中的n的值为约226。
在与本文提供的方面或实施方案中的任何一个或多个相关的一个或多个实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约250道尔顿至约90,000道尔顿的范围内。在一些其他实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约1000道尔顿至约60,000道尔顿的范围内。在又进一步实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约5,000道尔顿至约60,000道尔顿的范围内。在一些其他实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约10,000道尔顿至约55,000道尔顿的范围内。
在还有一些额外实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约15,000道尔顿至约25,000道尔顿的范围内。在还有一个或多个进一步实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约18,000道尔顿至约22,000道尔顿的范围内。在还有一些进一步实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。
额外的示例性组合物包括根据上式的组合物，其中所述分子的总体聚合物部分具有约250道尔顿至约90,000道尔顿的范围内的标称平均分子量。所述分子的聚合物部分的额外合适的范围包括选自约1,000道尔顿至约60,000道尔顿的范围内、约5,000道尔顿至约60,000道尔顿的范围内、约10,000道尔顿至约55,000道尔顿的范围内、约15,000道尔顿至约50,000道尔顿的范围内和约20,000道尔顿至约50,000道尔顿的范围内的标称平均分子量。
所述聚乙二醇聚合物部分的额外的说明性重均分子量包括约200道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约800道尔顿、约900道尔顿、约1,000道尔顿、约1,500道尔顿、约2,000道尔顿、约2,200道尔顿、约2,500道尔顿、约3,000道尔顿、约4,000道尔顿、约4,400道尔顿、约4,500道尔顿、约5,000道尔顿、约5,500道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约55,000道尔顿、约60,000道尔顿、约65,000道尔顿、约70,000道尔顿和约75,000道尔顿。在一些优选实施方案中，支链聚乙二醇聚合物的重均分子量是约20,000道尔顿。在其中每个支链PEG部分具有约20,000道尔顿的标称分子量的一些具体实施方案中，当针对总体组合物进行表征时，所述组合物的所得分子量范围为约55至75 kDa。
本文提供的选择性Treg刺激剂组合物的进一步实施方案包含其药学上可接受的盐。如上所述，IL-2缀合物组合物可以呈药学上可接受的盐的形式。通常，此类盐通过与药学上可接受的酸或酸等效物反应而形成。在这方面，术语“药学上可接受的盐”通常是指相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或通过使如本文所述的长效白介素-2组合物与合适的有机或无机酸反应并分离因此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、氧酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。(参见，例如，Berge等人 (1977) "Pharmaceutical Salts",J. Pharm. Sci. 66:1-19)。因此，所描述的盐可以衍生自无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；或由有机酸制备，所述有机酸诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、异硫羰酸(isothionic acid)等。如本文所用，术语“组合物(composition)”或“组合物(compositions)”，包括本文所述的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物，包含PEG化的IL-2缀合物的任何和/或所有药学上可接受的盐。该描述适用于是否将术语“或其药学上可接受的盐”添加至所述组合物的描述中。
使用方法实施方案
与未修饰的IL-2相比，选择性Treg刺激剂组合物(包括本文所述的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)解决与自身反应性免疫相关的潜在病理学，以及产生有益T细胞功能的靶标特异性机制，并且提供了相比于未修饰的IL-2的施用的显著改进。为了解决现有自身免疫性疾病疗法中的缺陷，本发明的组合物在施用后提供持续的暴露并且具有独特的药理学概况。本发明的组合物在体内选择性扩增和活化内源Treg，其中常规的T细胞和/或自然杀伤细胞的扩增受限，并且由此提供了用于治疗自身免疫性疾病的优异方法。
更具体地，已经发现具有经由其氨基基团稳定地共价连接至IL-2的特定和主要数目的支链聚乙二醇部分的选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)当以低剂量施用时特别有效。本发明的组合物有效地结合并活化IL-2受体以优先增加调节性T细胞(Treg)的细胞群体和免疫抑制功能，同时对T效应细胞(Teff)具有最小的刺激作用。在啮齿动物、非人灵长类动物研究和人临床研究中持续暴露于本发明的组合物(在本文中通常称为RUR20kD-IL-2和相关组合物，或在其他情况下称为RUR-IL-2组合物)有效地提供Treg对Teff应答的幅度、持续时间和特异性，其用等剂量的未修饰的IL-2无法实现。
向人施用单次低递增皮下剂量的选择性Treg刺激剂组合物RUR20kD-IL-2(如在支持实施例中所述)不导致剂量限制性毒性、严重的不良事件或临床上明显的异常。初步药代动力学分析显示，在大多数受试者中，所述组合物在给药后约4-6天左右达到最大浓度，其中在给药后最长达近似2周的浓度变化很小，其后浓度下降，其中半衰期为近似8-9天。初步药效动力学评价揭示，选择性长效IL-2受体激动剂Treg刺激剂组合物的施用导致循环CD4+FoxP3+CD25亮 Treg的剂量依赖性增加，即，循环CD4+FoxP3+CD25亮 Treg的绝对数量持续增加，其中水平直至施用后近似20至25天才恢复至基线。与给药前相比，CD4+FoxP3+CD25亮Treg的数目平均增加几倍(其中幅度取决于剂量)。总体CD4+ FoxP3+CD25+Treg群体也增加，尽管变化的幅度小于对于CD4+FoxP3+CD25亮Treg所观察到的。对于最低剂量，与安慰剂受试者相比，治疗的受试者中的Treg数量没有变化。看到对Treg的主要作用，因为在任何剂量下用RUR20kD-IL-2组合物未观察到T细胞群体(CD4+，CD8+)的百分比或数量的变化。因此，本发明的组合物和方法令人惊讶地有效地增加Treg在体内/离体生物测定中(甚至当与替代的化学修饰的IL-2化合物相比时)和同样在人研究中的抑制能力(如将描述)，连同在以下部分中的其他特征。
本文提供的选择性Treg刺激剂组合物(包括RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)可用于(除了其他事情以外)治疗自身免疫性疾病和病症。可以通过施用如本文所述的RUR-IL-2或RUR20kD-IL-2组合物治疗的示例性自身免疫性疾病包括全身性病况，诸如系统性红斑狼疮(SLE)、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、特应性皮炎、全身性硬化症、强直性脊柱炎、移植物抗宿主病和多发性肌炎；或器官特异性的自身免疫性疾病包括1型糖尿病、艾迪生氏病、桥本甲状腺炎、格雷夫斯氏病、Sjogren氏综合征、白癜风、恶性贫血、肾小球肾炎、重症肌无力、古德帕斯彻氏综合征、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、花生过敏症和肺纤维化。
在一些实施方案中，所治疗的病况是系统性红斑狼疮(SLE)。系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性炎性疾病，其主要影响中年妇女。SLE的特征包括，例如皮肤出疹、关节疼痛、复发性胸膜炎和肾脏疾病。Treg相对于Tcon的进行性体内平衡失衡被许多自身免疫性疾病(包括SLE)所共有。总体而言，将Treg体内稳态与SLE的病理关联的治疗假说，SLE患者中的低剂量IL-2的活性以及本文所述的RUR20kD-IL-2和相关组合物相对于IL-2的优异的Treg诱导特性，为本发明的RUR-IL-2或RUR20kD-IL-2及其相关组合物在治疗SLE和其他自身免疫性疾病和病况中的用途提供了充足的支持。在一个或多个进一步实施方案中，本文提供了通过施用如本文所述的RUR-IL-2或RUR20kD-IL-2相关的组合物来治疗病况的方法，其中所述病况选自例如过敏症、GVHD、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、类风湿关节炎、1型糖尿病、多发性硬化症和牛皮癣。
在还有一些进一步实施方案中，当以治疗有效剂量施用于受试者时，所述RUR-IL-2或RUR20kD-IL-2相关的组合物有效地相比于常规T细胞和天然杀伤细胞优先扩增和活化调节性T细胞。
在另一个方面，本文提供了通过向受试者施用治疗有效剂量的如本文所述的RUR-IL-2或RUR20kD-IL-2相关的组合物来增加所述受试者中的调节性T细胞与效应T细胞的比率的方法。
在与前述方法相关的一些实施方案中，所述调节性T细胞选自Foxp3+和CD25+细胞。在与先前的实施方案或方法相关的一个或多个实施方案中，所述效应T细胞选自CD4+和CD8+细胞。
在与上述方法或相关实施方案相关的一些进一步实施方案中，当在体内小鼠模型中评估时，当与基线相比时，调节性T细胞中的倍数增加达到至少约2、或至少约4或甚至至少约6的值。
在该方法的一些实施方案中，在施用后，调节性T细胞数目的增加维持高于基线水平，持续至少3天。在一些额外实施方案中，在施用后，调节性T细胞数目的增加维持高于基线水平，持续至少5天。优选地，调节性T细胞数目的增加维持高于基线水平，持续至少7天。
在又一个进一步方面，本文提供了治疗具有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的选择性Treg刺激剂组合物，包括如上文或本文别处所述的RUR-IL-2或RUR20kD-IL-2相关的组合物实施方案。
在又一个进一步方面，本文提供了治疗具有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的选自以下的组合物：RUR20kD-IL-2配方A、RUR20kD-IL-2配方B、RUR20kD-IL-2配方C、RUR20kD-IL-2配方D和RUR20kD-IL-2配方E。
在又一个进一步方面，本文提供了治疗具有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的选自以下的组合物：RUR20kD-IL-2配方A、RUR20kD-IL-2配方B和RUR20kD-IL-2配方C。
在又一个进一步方面，本文提供了治疗具有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的RUR20kD-IL-2配方A的组合物。
在又一个进一步方面，本文提供了治疗具有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的RUR20kD-IL-2配方B的组合物。
在又一个进一步方面，本文提供了治疗具有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的RUR20kD-IL-2配方C的组合物。
在又一个进一步方面，本文提供了选自以下的组合物在疗法中的用途：RUR20kD-IL-2配方A、RUR20kD-IL-2配方B、RUR20kD-IL-2配方C、RUR20kD-IL-2配方D和RUR20kD-IL-2配方E。
在又一个进一步方面，本文提供了RUR20kD-IL-2配方A的组合物在疗法中的用途。
在又一个进一步方面，本文提供了RUR20kD-IL-2配方B的组合物在疗法中的用途。
在又一个进一步方面，本文提供了RUR20kD-IL-2配方C的组合物在疗法中的用途。
在又一个进一步方面，本文提供了RUR20kD-IL-2配方D的组合物在疗法中的用途。
在又一个进一步方面，本文提供了RUR20kD-IL-2配方E的组合物在疗法中的用途。
在又一个进一步方面，本文提供了选自以下的选择性Treg刺激剂组合物用于制备用于治疗自身免疫性疾病的药物的用途：RUR20kD-IL-2配方A、RUR20kD-IL-2配方B、RUR20kD-IL-2配方C、RUR20kD-IL-2配方D和RUR20kD-IL-2配方E。
在一个更具体实施方案中，系统性红斑狼疮(SLE)的治疗包括皮下施用包含治疗有效量的RUR-IL-2或RUR20kD-IL-2相关的组合物的制剂。参见例如，实施例8中所述的结果，其举例说明RUR20kD-IL-2组合物诱导的Treg对SLE的代表性动物模型中的生理免疫应答和疾病进展的控制的作用。如其中所述，RUR20kD-IL-2组合物有效地将肾损伤(具有SLE的患者的特征之一)的生物标志物抑制至与正常小鼠中观察到的接近相同的水平。
在涉及如本文所述的治疗方法的实施方案中，此类实施方案也是用于该治疗中或可替代地用于制备用于该治疗中的药物的进一步实施方案。本公开进一步提供了根据如本文所述的组合物(包括其制剂)的实施方案中的任一个的组合物，其用于疗法中。本公开进一步提供了根据如本文所述的组合物(包括其制剂)的实施方案中的任一个的组合物，其用于治疗自身免疫性疾病。
在一个方面，本公开提供了包含具有以下结构的PEG化的IL-2缀合物的组合物：
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其中：
IL-2是白介素-2；
n在每次出现时独立地是约3至约4000的整数；
其用于疗法中。在所述用于疗法中的组合物的一个具体实施方案中，IL-2是阿地白介素。在所述用于疗法中的组合物的一个具体实施方案中，每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。在所述用于疗法中的组合物的一个进一步具体实施方案中，所述组合物的PEG化的IL-2缀合物具有在赖氨酸31处附接的PEG部分。在所述用于疗法中的组合物的一个具体实施方案中，疗法用于自身免疫性疾病中。
术语
在描述和请求保护本公开的某些特征时，将根据以下描述的定义使用以下术语，除非另外指出。
如本文所用和描述的术语“选择性”是指体内免疫应答，其在一些方面体现诱导的免疫细胞或免疫信号应答的特征，但在其他方面则没有。具体而言，就Treg诱导和/或活化而言的“选择性”是指免疫应答，其呈现Treg细胞数增加(通过流式细胞术，CD25高且总体)，和/或Treg活化状态增加，如通过一种或多种活化标志物、诸如ICOS或Ki67或Stat5所示，和/或活化是指下游诱导的免疫抑制应答和/或诱导的免疫耐受应答，而缺乏某些其他免疫应答。在该上下文中，“选择性Treg诱导”是指如所述的Treg的免疫应答，而同时缺乏显著和/或临床重要的效应T细胞和相关的免疫活化应答。重要和/或临床重要的效应T细胞和相关的免疫活化应答包括，例如CD4阳性T效应细胞和/或CD8阳性T效应细胞增殖，和/或活化标志物，诸如ICOS或Ki67，或其他众所周知的效应免疫应答。其他效应免疫应答信号可能包括某些促炎性细胞因子、诸如被称为“细胞因子综合征”的那些和/或诸如IL-5、INFγ、IL-6、IFNα、IL-17、IL-22、IL-19的升高。选择性Treg刺激也可以反映于平均Treg:Tcon比率。优选地，响应于本文所述的RUR-IL-2或RUR20kD-IL-2相关的组合物而实现的平均Treg:Tcon比率为至少5倍，且优选7倍，且更优选10倍或更多倍。
如本文所用的术语“PEG化程度”是指与个别阿地白介素多肽的一个或多个氨基基团共价连接的稳定PEG取代基的数目。
如本文所用的术语“约”意指在所述数值的合理附近、诸如所述数值的正负10%内。优选地，如本文所用的“约”或“近似”意指给定量的正负5%内。
如本文所用的术语“n’是2和3”是指IL-2缀合物的混合物，其中所述混合物包含如本文所述的二-PEG化和三-PEG化的缀合物。
术语“调节性T细胞”或“ Treg”是指T细胞、诸如CD4+FoxP3+CD25亮表型。(参见例如Jeffrey A. Bluestone和Qizhi Tang, Treg cells—the next frontier of celltherapy, Science, 12 October 2018 • Vol. 362 Issue 6411, p154-155.)
术语“T con”或“常规T细胞”是指表达αβ T细胞受体(TCR)以及共受体CD4或CD8并实施良好确立的适应性免疫效应子功能、诸如T辅助细胞功能和细胞毒性T细胞效应子功能的T淋巴细胞。例如，Tcon可以指CD4+CD25-幼稚的常规T细胞。“效应T细胞(Teff)”是指CD4+和CD8+细胞效应子表型，诸如辅助性T细胞、细胞毒性T细胞和其他，如技术人员已知。“NK细胞”，也称为“自然杀伤细胞”、“K细胞”或“杀伤细胞”，是一种类型的淋巴细胞(白血细胞)和先天免疫系统的一种组分。NK细胞在肿瘤和病毒感染的细胞的宿主排斥中发挥主要作用。
“IL-2中间体”是指IL-2多肽，特别是阿地白介素。“RUR20kD-IL-2”是指IL-2 PEG缀合物，其中IL-2部分是如本文所述的阿地白介素，且PEG部分如本文所述。RUR20kD-IL-2组合物也可以以通用方式通过化学名称(1,3-双(甲氧基聚(乙二醇)10kD氨基甲酰基)-2-丙氧基)-4-丁酰胺)白介素-2)来指称，承认这不完全描述所述组合物。如本文所用，阿地白介素是指125-L-丝氨酸-2-133白介素-2，在大肠杆菌中表达的重组非糖基化的白介素-2。阿地白介素的氨基酸序列的序列显示于图2中。在技术人员已知的其他宿主系统中表达的阿地白介素也在如本文所用的术语的含义内。
如本文所用的术语“IL-2”是指具有人IL-2活性的部分。术语“IL-2部分”是指在附接至支链聚乙二醇部分之前的IL-2部分以及共价附接之后的IL-2部分。应当理解，当原始IL-2部分附接至聚乙二醇聚合物、诸如本文提供的支链聚乙二醇聚合物时，由于存在一个或多个与至聚乙二醇部分的连接相关的共价键，IL-2部分被稍微改变。与另一分子附接的IL-2部分的这种稍微改变的形式在本文中被称为IL-2部分的“残基”。在IL-2的残基的上下文中，术语‘残基’意指IL-2分子在一个或多个共价附接位点处共价附接至聚合物、诸如聚乙二醇后保留的部分，如在本文的式中所示。通常，附接的位点将是IL-2中的赖氨酸的11个胺基团之一。
应理解的是，当未修饰的IL-2附接至聚合物、诸如聚乙二醇时，由于存在一个或多个与至聚合物的连接相关的共价键，IL-2被稍微改变。与另一分子、诸如支链PEG部分附接的IL-2的这种稍微改变的形式在一些情况下可以称为IL-2的“残基”，或者可以简称为“IL-2”等，其中理解这种聚合物缀合物中包含的IL-2由于一个或多个共价键(每个共价键将支链PEG部分连接至IL-2)的存在而稍微改变。术语“更高的PEG化的IL-2缀合物”是指四PEG缀合物或五PEG缀合物或最多达11个PEG部分的缀合物。优选地，“更高的PEG化的IL-2缀合物”是指四PEG缀合物或五PEG缀合物。
例如，具有对应于国际专利公开号WO 2012/065086中描述的SEQ ID NO:1至4中任一个的氨基酸序列的蛋白是示例性IL-2蛋白，与之实质上同源的任何蛋白或多肽也是如此。术语实质上同源意指特定的主题序列，例如突变体序列，与参考序列相差一个或多个取代、缺失或添加，其净效应不导致参考序列和主题序列之间的不利功能差异。为了本文的目的，具有大于95%同源性、等效的生物学活性(尽管不一定具有等效强度的生物学活性)和等效的表达特征的序列被认为是实质上同源的。为了确定同源性的目的，应当忽略成熟序列的截短。如本文所用，术语“IL-2”包括如例如通过定点诱变或偶然地通过突变故意修饰的此类蛋白。这些术语还包括具有1至6个额外的糖基化位点的类似物，在蛋白的羧基末端具有至少一个额外氨基酸的类似物(其中所述额外氨基酸包括至少一个糖基化位点)，以及具有包括至少一个糖基化位点的氨基酸序列的类似物。该术语包括天然和重组产生的部分两者。另外，IL-2可以源自人来源、动物来源和植物来源。一种示例性IL-2是称为阿地白介素的人重组IL-2(参见图2)。对如本文所述的长效IL-2R激动剂的提及意在涵盖其药学上可接受的盐形式。
在一个方面，本文描述的RUR-IL-2或RUR20kD-IL-2相关的组合物是长效剂。关于如本文提供的RUR-IL-2或RUR20kD-IL-2相关的组合物的长效是指这种组合物在血浆中具有的循环半衰期相对于未修饰的相同的IL-2R激动剂(例如，阿地白介素或其他合适的IL-2序列)的循环半衰期是延长的。例如，比较剂激动剂未通过与一个或多个水溶性聚合物部分、诸如聚乙二醇部分的共价附接而修饰，并且与以蛋白等效剂量的IL-2R激动剂施用于同一受试者时进行比较，并通过相同的药代动力学分析进行评价。
如本文所用的“PEG”或“聚乙二醇”意在涵盖任何水溶性聚(环氧乙烷)。除非另有指示，否则“PEG聚合物”或聚乙二醇是其中实质上所有(优选所有)单体亚基都是环氧乙烷亚基的聚乙二醇，但是，该聚合物可以含有不同的封端部分或官能团，例如用于缀合。用于本公开中的PEG聚合物将包含两个以下结构之一："-(CH2CH2O)n-"或"-(CH2CH2O)n- 1CH2CH2-,"，这取决于末端氧是否已经被替换，例如，在合成转化期间。如上所述，对于PEG聚合物，变量(n)范围为约3至4000，并且总体PEG的末端基团和结构可以变化。优选地，PEG具有如本文详细描述的特定含义。
关于聚合物的几何形状或总体结构的“支链的”是指具有两个或更多个从支链点或中心结构特征延伸的聚合物“臂”或“链”的聚合物。作为一个实例，说明性PEG试剂，mPEG2-丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯(1,3-双(甲氧基聚(乙二醇)氨基甲酰基)-2-丙氧基)-4-琥珀酰亚胺基丁酸酯)是由两条线性PEG链构成的支链聚乙二醇聚合物，每条线性PEG链分别经由氨基甲酸酯连接(~NHC(O)O~)共价附接至中央丙基基团的1-和3-碳，从其延伸琥珀酰亚胺氧基丁酸酯。
在水溶性聚合物、诸如PEG的背景下的分子量可以表示为数均(标称平均)分子量或重均分子量。除非另有指明，否则本文中对分子量的所有提及均是指标称平均分子量。两种分子量测定(数均和重均)均可以使用凝胶渗透色谱、凝胶过滤色谱或其他液相色谱技术来测量。也可以使用用于测量分子量值的其他方法，诸如使用端基分析或测量依数性特性(例如，凝固点降低、沸点升高或渗透压)以测定数均分子量或使用光散射技术、超速离心或粘度测定法以测定重均分子量。凝胶过滤色谱法经常用于测定支链聚合物的平均分子量。PEG聚合物通常是多分散的(即，聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，具有优选小于约1.2、更优选小于约1.15、仍更优选小于约1.10、又仍更优选小于约1.05且最优选小于约1.03的低多分散性值。
“稳定的”连接或键是指这样的化学键，其在水中是实质上稳定的，也就是说，在生理条件下在延长的时间段内不在任何可感知程度上经历水解。水解稳定的连接的实例通常包括但不限于以下：碳-碳键(例如，在脂族链中)、醚、酰胺、胺等。通常，稳定的连接是在生理条件下表现出每天小于约1-2%的水解速率的连接。代表性化学键的水解速率可以在大多数标准化学教科书中找到。
如本说明书中所用，单数形式 “一个/种(a)”、 “一个/种(an)”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。
“实质上”或“基本上”意指接近总体或全部，例如，给定量的95%或更多，除非相反地指出。
制备和实施例
应当理解，制备和实施例是通过举例说明而非限制的方式记载，并且本领域普通技术人员可以进行各种修改。本文描述和/或技术人员已知制备选择性Treg刺激剂组合物(包括RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)的方法。试剂和起始材料是容易得到的或可以由本领域普通技术人员容易地合成。这些方法的步骤的合适条件是众所周知的，并且缓冲液和试剂的合适取代在本领域的技术之内。此外，技术人员将理解，在一些情况下，产生组合物的步骤和顺序可以进行修改，并且由有技术的生物化学家良好地理解。同样，应理解，根据需要或期望，可以通过各种众所周知的技术分离和/或纯化制剂。
IL-2中间体的制备：
IL-2部分可以源自非重组方法和/或重组方法，并且本公开不限于此方面。IL-2部分可以源自人来源、动物来源和植物来源。例如，可能从生物系统分离IL-2，并且以其他方式从培养基获得IL-2。参见，例如，美国专利号4,401,756和Pauly等人 (1984) J. Immunol Methods 75(1):73-84中描述的程序。
用于在体外以及在原核和真核宿主细胞中产生和表达重组多肽的方法是本领域普通技术人员众所周知的。参见，例如，美国专利号5,614,185。IL-2部分可以在细菌[例如，大肠杆菌，参见，例如，Fischer等人 (1995) Biotechnol. Appl. BioIL-2m. 21(3):295-311]、哺乳动物[参见，例如，Kronman等人 (1992) Gene 121:295-304]、酵母[例如，巴斯德毕赤酵母，参见，例如，Morel等人 (1997) Biochem. J. 328(1):121-129]和植物[参见，例如，Mor等人 (2001) Biotechnol. Bioeng. 75(3):259-266]表达系统中表达。尽管基于重组的蛋白制备方法可以不同，但重组方法通常涉及构建编码期望的多肽或片段的核酸，将核酸克隆至表达载体中，转化宿主细胞(例如，植物、细菌、酵母、转基因动物细胞或哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞)，和表达核酸以产生期望的多肽或片段。可以采用各种蛋白纯化方法来纯化本公开的组合物，并且此类方法是本领域中已知的，并且例如描述于Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 第3版,Springer, NY (1994)。为了促进重组多肽的鉴定和纯化，可以将编码表位标签或其他亲和结合序列的核酸序列与编码序列符合读框地插入或添加，由此产生由期望的多肽和适合于结合的多肽构成的融合蛋白。
取决于用于表达具有IL-2活性的蛋白的系统，IL-2部分可以是未糖基化的或糖基化的，并且可以使用任一种。也就是说，IL-2部分可以是未糖基化的，或者IL-2部分可以是糖基化的，并且在一个或多个优选的实施方案中，IL-2部分是未糖基化的。IL-2部分也可以有利地被修饰以包括和/或取代一个或多个氨基酸残基，诸如例如赖氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸，以便提供聚合物与氨基酸的侧链内的原子的容易附接。IL-2部分的取代的实例描述于美国专利号5,206,344中。另外，IL-2部分可以被修饰为包括非天然存在的氨基酸残基。用于添加氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基的技术是本领域普通技术人员众所周知的。
另外，IL-2部分可以有利地被修饰为包括官能团的附接(除了通过添加含有官能团的氨基酸残基以外)。例如，IL-2部分可以被修饰为包括巯基。另外，IL-2部分可以被修饰为包括N-末端α碳。另外，IL-2部分可以被修饰为包括一个或多个碳水化合物部分。另外，IL-2部分可以被修饰为包括醛基。另外，IL-2部分可以被修饰为包括酮基。在本公开的一些实施方案中，优选IL-2部分不被修饰为包括巯基、N-末端α碳、碳水化合物、醛基和酮基中的一种或多种。
示例性的IL-2部分描述于文献，和例如，美国专利号5,116,943、5,153,310、5,635,597、7,101,965和7,567,215以及美国专利申请公开号2010/0036097和2004/0175337中。优选的IL-2部分具有图2中提供的氨基酸序列，并且代表如本文所用的阿地白介素的氨基酸序列。
在一些情况下，IL-2部分将呈“单体”形式，其中相应肽的单一表达被组织成离散单元。在其他情况下，IL-2部分将呈“二聚体”(例如，重组IL-2的二聚体)的形式，其中蛋白的两个单体形式与彼此缔合(例如，通过二硫键键合)。例如，在重组人IL-2的二聚体的背景下，所述二聚体可以呈通过二硫键与彼此缔合的两个单体的形式，所述二硫键由每个单体的Cys125残基形成。
对于任何给定的肽或蛋白部分或组合物，可能确定该部分是否具有IL-2活性。用于确定体外IL-2活性的各种方法描述于本领域和本文中。一种示例性方法是本文所述的CTTL-2细胞增殖测定。示例性方法也描述于Moreau等人 (1995) Mol. Immunol. 32:1047-1056)。简而言之，在非特异性结合测定中，允许提出的IL-2部分或组合物在4℃下在携带IL-2的受体的细胞系存在的情况下预孵育1小时。此后，使125I-标记的IL-2在系统中在4℃下孵育3小时。数据表示为提出的IL-2部分活性相比于野生型IL-2的%抑制能力。本领域中已知的其他方法也可用于评价IL-2功能，包括测电法、分光光度法、色谱法和辐射测定法。
选择性Treg刺激剂组合物(包括RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)的制备：
RUR20kD-IL-2的示例性选择性Treg刺激剂组合物通常通过如下制备：使纯化的IL-2与摩尔过量的PEG试剂(相对于IL-2摩尔当量过量)、mPEG2(20kD)-丁酸、N-羟基丁二酰亚胺酯(或任何其他合适活化的酯)(1,3-双(甲氧基聚(乙二醇) MW 10,000氨基甲酰基)-2-丙氧基)-4-琥珀酰亚胺丁酸酯在bicine溶液中在约9的高pH下反应。通常在温和的条件下，例如约20℃至约65℃，或约20℃至约40℃，或在环境温度或室温下，将反应物混合约30分钟至约5小时，或约30分钟至4小时，或约30分钟至2小时，或约30分钟至1小时。通过经由添加合适的酸、诸如乙酸酸化至低pH来淬灭反应。
然后通过合适的方法、诸如离子交换色谱法纯化PEG化的rIL-2反应产物。例如，当采用离子交换色谱法时，RUR20kD-IL-2组合物结合树脂，且然后用合适的梯度、诸如氯化钠梯度洗脱。然后将色谱产物合并物浓缩，并使用例如切向流过滤(TFF)渗滤至合适的制剂缓冲液(例如，具有蔗糖的乙酸钠缓冲液)中。
如果期望，通过使用利用合适的柱(例如，C18柱或C3柱，商业可得自公司、诸如Amersham Biosciences或Vydac)的反相高效液相色谱(RP-HPLC)的反相色谱或通过使用离子交换柱(例如，可得自Amersham Biosciences的Sepharose™离子交换柱)的离子交换色谱，可以将产物合并物进一步分离成位置异构体。任一方法可用于分离具有相同分子量的聚合物-活性剂异构体(即，位置同种型)。
选择性Treg刺激剂组合物(包括RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)可以通过本文所述和/或技术人员已知的各种分析和生物测定技术(包括分析型HPLC，SDS-Page，LCMS和生物测定，诸如CTLL-2增殖和体内Treg诱导)来表征。
制剂：
在又一个或多个实施方案中，本文提供了选择性Treg刺激剂组合物，包括RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物，其包含如本文所述的IL-2缀合物组合物，和药学上可接受的赋形剂。
“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”是指可以包括在本文所述的组合物中并且对受试者没有引起明显的有害毒理作用的组分。本公开的组合物优选被配制为通过使组合物生物可利用的任何途径施用(诸如肠胃外施用，包括静脉内、肌肉内或皮下)的药物组合物。此类药物组合物及其制备方法是本领域中众所周知的(参见，例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, 编辑, 第21版,Lippincott, Williams & Wilkins, 2006))。任选地，本文提供的组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂，且示例性的赋形剂包括，但不限于，选自以下的那些：碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱、氨基酸及其组合。所述组合物中的任何单独的赋形剂的量将取决于赋形剂的活性和组合物的特定需要而变化。通常，任何单独的赋形剂的最佳量通过实验，即，通过制备含有不同量的赋形剂(范围从低到高)的组合物，检查稳定性和其他参数，和然后确定达到最佳性能而没有显著的不利影响的范围，进行确定。碳水化合物、诸如糖，衍生的糖、诸如醛醇、醛糖酸、酯化糖和/或糖聚合物可以作为赋形剂存在。特定的碳水化合物赋形剂包括，例如：单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和醛醇，诸如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡萄糖醇)、吡喃糖基山梨醇、肌醇、环糊精等。所述赋形剂还可以包括无机盐或缓冲剂，诸如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠及其组合。所述组合物还可以包括用于预防或阻止微生物生长的抗微生物剂。适合于本公开的一个或多个实施方案的抗微生物剂的非限制性实例包括苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、苯基硝酸汞、硫柳汞及其组合。抗氧化剂同样可以存在于所述组合物中。抗氧化剂用于防止氧化，由此防止制剂的缀合物或其他组分的变质。用于本公开的一个或多个实施方案中的合适的抗氧化剂包括例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠及其组合。表面活性剂可以作为赋形剂存在。示例性的表面活性剂包括：聚山梨醇酯，诸如“Tween 20”和“Tween 80”，以及普朗尼克，诸如F68和F88(其两者可得自BASF,Mount Olive, New Jersey)；脱水山梨醇酯；脂质，诸如磷脂，诸如卵磷脂和其他磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(尽管优选不是呈脂质体形式)、脂肪酸和脂肪酯；类固醇，诸如胆固醇；和螯合剂，诸如EDTA；锌和其他此类合适的阳离子。酸或碱可以作为赋形剂存在于组合物中。可以使用的酸的非限制性实例包括选自以下的那些酸：盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸及其组合。合适的碱的实例包括但不限于选自以下的碱：氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾及其组合。一种或多种氨基酸可以作为赋形剂存在于本文所述的组合物中。在这方面，示例性的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和甘氨酸。额外的合适的药学上可接受的赋形剂包括例如Handbook of PharmaceuticalExcipients, 第7版, Rowe, R.C., 编, Pharmaceutical Press, 2012中描述的那些。选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)的优选制剂是1.5 mg/ml蛋白当量，10 mM乙酸钠，110 mM氯化钠，2%蔗糖(w/v)，pH 5.0。可以将RUR20kD-IL-2组合物储存于无菌且随时可用提供的具有带有硅酮衬垫的聚丙烯盖的适当体积的无菌一次性使用聚碳酸酯瓶中。
给药：
选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)的给药量将取决于许多因素而变化，但当该组合物储存于单位剂量容器(例如，小瓶)中时，将最佳地是治疗有效剂量。另外，药物制剂可以容纳在注射器中。可以通过重复施用增加量的选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)来实验确定治疗有效剂量，以确定产生如本文所述的临床期望终点(诸如缓解自身免疫症状和/或免疫抑制，和/或诱导耐受性)的量。
优选的剂量的量是在受试者中相比于常规T细胞和自然杀伤细胞有效地优先扩增和活化调节性T细胞的低剂量。调节性T细胞的活化可以通过许多不同的方法来测量。例如，鉴于STAT5在IL-2-依赖性T细胞过程中的整体作用，在淋巴细胞中增加的STAT5的检测可以用作Treg活化的关键标志物。在表型上，Treg的活化还可以通过流式细胞术通过增加的细胞表面IL-2Rα(CD25)和/或增加的蛋白叉头盒P3 (Foxp3)(Treg谱系的主要调节子)的细胞内表达和/或增加的与细胞增殖相关的蛋白Ki67的表达来测量。共同地，这些标志物与Treg细胞的功能相关，并且在自身免疫性疾病中的此类细胞中经常失调。本文中，Treg细胞诱导和活化的优选检测通过流式细胞术进行。Treg的功能性也可以通过离体抑制测定法来评价，所述离体抑制测定法测量其抑制常规T细胞的增殖的能力。还可以使用抗原驱动的炎症模型在体内直接测量Treg动员和活化的结果。
本文提供的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物的施用通常经由注射进行。也考虑其他施用模式，诸如肺、鼻、颊、直肠、舌下和经皮。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、动脉内、肿瘤内、淋巴内、腹膜内、心脏内、鞘内和肌肉内注射，以及输注注射。在一个具体实施方案中，注射是皮下的。例如，可以通过注射包含本文提供的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物以及稀释剂的组合物来实现向患者的施用。关于可能的稀释剂，稀释剂可以选自例如注射用抑菌水、5%葡萄糖水溶液、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、乳酸林格氏溶液、盐水、无菌水、去离子水及其组合。本领域普通技术人员可以通过测试来确定两种给定的药理组分在给定制剂中在一起是否相容。用于向患者施用的示例性组合物，例如皮下制剂，包含例如治疗有效剂量的本文提供的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物、水、乙酸钠、氯化钠和蔗糖。所述液体组合物将具有约4.5-7.5；或约4.5-6的范围内的pH。
在某些实施方案中，选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)呈固体形式。优选的固体形式是作为固体干燥形式、例如含有少于5重量%的水或优选地少于2重量%的水的那些。所述固体形式通常适合于在水性稀释剂中重构。优选的固体制剂当在约0-10℃的温度下储存于密封容器中时稳定至少约24个月。
如本文所用的术语“患者”或“受试者”是指患有或易患可以通过施用如本文提供的组合物预防或治疗的病况、诸如自身免疫性疾病的活生物体，并且包括人和动物两者。受试者包括但不限于哺乳动物(例如，鼠、猿猴、马、牛、猪、犬、猫等)，并且优选是人。在某些实施方案中，所述患者、优选人的进一步特征在于具有疾病、病症或病况，诸如自身免疫性疾病，其将受益于本公开的组合物的施用。
如本文所用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指具有病况的患者的管控和护理，为了抗击或缓解那些病况的症状和并发症的目的，本公开的组合物的施用被指示用于所述病况。治疗包括向有此需要的患者施用本公开的组合物以预防症状或并发症的发作，减轻所述症状或并发症，或消除所述疾病、病况或病症。例如自身免疫病症。优选地，治疗包括向有此需要的患者施用本公开的组合物以导致免疫抑制和/或耐受。待治疗的患者是动物，且优选人类。如本文所用的施用包括所述患者服用所述组合物的情况和/或所述患者被指导服用所述组合物的情况。
短语“药学有效量”和“药理学有效量”和“治疗有效量”和“生理有效量”在本文中可互换使用，并且是指本文提供的RUR20kD-IL-2和相关组合物在血流或靶标组织中实现所述物质的期望水平所需的量。精确的量将取决于许多因素，诸如例如，所治疗的具体病况，预期的患者群体，个体患者考量，待施用的治疗组合物的组分和物理特征等。
包含本公开的化合物的药物组合物可以肠胃外施用于需要这种治疗的患者。肠胃外施用可以通过皮下、肌肉内或静脉内注射通过注射器、任选笔样注射器或机械驱动的喷射器的方式来进行。或者，肠胃外施用可以通过输注泵的方式来进行。本公开的实施方案提供适合于施用于患者的药物组合物，所述施用包括向有此需要的患者施用治疗有效量的本公开的组合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。此类药物组合物可以使用本领域中众所周知的用于药物产品的常规赋形剂通过各种技术中的任一种来制备。(Remington’sPharmaceutical Sciences, 第21版, University of the Sciences in Philadelphia,Philadelphia, PA, USA (2006))。
选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR20kD-IL-2和相关组合物)的剂量以及与所述方法和组合物相关的给药方案将取决于受试者的年龄、重量和总体状况以及所治疗的病况的类型和状态、健康护理专业人员的判断和待施用的特定选择性Treg刺激剂组合物而不同。
如本文所用，术语“有效量”是指本公开的组合物在单剂量或多剂量施用于患者或受试者后将引发由研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在寻求的组织、系统、动物、哺乳动物或人的生物学或医学应答或对组织、系统、动物、哺乳动物或人的期望的治疗效果的量或剂量。优选地，有效量是指本公开的组合物在单次或多次施用于患者或受试者后将诱导选择性Treg细胞比给药前水平增加至少10倍的量或剂量。剂量可以包括较高的初始负荷剂量，随后为较低的剂量。在一种或多种情况下，选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR20kD-IL-2和相关组合物)的治疗有效量是由以IL-2的量表示的以下一个或多个范围涵盖的量：约0.10至约700 µg/kg；约0.20至约650 μg/kg，约0.30至约600 μg/kg；约1.0至约550 μg/kg，约2.0至约500 μg/kg，约10至约450 μg/kg，约25至约400 μg/kg，约50至约350μg/kg或约100至约300 μg/kg，包括来自前述范围的每一和每个的前述起始值和终止值的任何和所有组合。在一些实施方案中，例如，为了治疗受试者中的自身免疫性疾病或可以受益于调节性T细胞相比于常规T细胞和自然杀伤细胞的优先扩增和活化的疾病或病症，选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)以一定剂量、例如小于或等于500 μg/kg的剂量施用。本公开的一个优选剂量方案是其中每两周一次以3-24 μg/kg之间的剂量施用RUR20kD-IL-2和相关组合物，和特别是配方A-E的那些。本公开的另一个优选剂量方案是其中每两周一次以3-18 μg/kg之间的剂量施用RUR20kD-IL-2和相关组合物，和特别是配方A-E的那些。本公开的另一个优选剂量方案是其中每两周一次以3-12 μg/kg之间的剂量施用RUR20kD-IL-2和相关组合物，和特别是配方A-E的那些。本公开的另一个优选剂量方案是其中每两周一次以3-6 μg/kg之间的剂量施用RUR20kD-IL-2和相关组合物，和特别是配方A-E的那些。本公开的另一个优选剂量方案是其中每两周一次以3 μg/kg的剂量施用RUR20kD-IL-2和相关组合物，和特别是配方A-E的那些。
本文提供的组合物有效地恢复免疫系统的体内平衡能力，例如具有积极影响其中Treg功能障碍发挥作用的疾病(诸如自身免疫性疾病、过敏症和移植排斥)的能力。在一个实施方案中，本文提供了通过施用选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)在体内选择性地扩增内源性Treg的方法。说明性给药范围包括例如约100 μg/kg至约500 μg/kg，或约150 μg/kg至约450 μg/kg，或约175 μg/kg至约400 μg/kg，或甚至约175 μg/kg至约350 μg/kg。优选的剂量和给药方案描述于本文提供的实施例中。合适的剂量有效地实现Treg细胞的最大扩增，而对Teff细胞和NK细胞的刺激最小；这可以通过如下进行监测：收集外周血用于流式细胞术分析以鉴定Treg细胞、效应CD4+和CD8+ T细胞以及NK细胞的发生率。基于这些数字，可以适当地调整剂量。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗效果)。对于静脉内(i.v.)或非静脉内施用，局部或全身或其组合，给药时间表通常范围为单次推注剂量或连续输注至每天多次施用(例如，每4-6小时)，或如由主治医师和患者的病况所指示。关于施用选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)的频率和时间表，本领域普通技术人员能够确定适当的给药方案。例如，在治疗周期中，临床医生可以决定作为单个剂量或一系列剂量、例如在几天或几周的过程中施用所述组合物。基于所述组合物的长效性质，优选通常相对不频繁地施用(例如，每三周一次，每两周一次，每8-10天一次，每周一次等)。与疗法的过程相关的示例性时间长度包括约一周；约两周；约三周；约四周；约五周；约六周；约七周；约八周；约九周；约十周；约十一周；约十二周；约十三周；约十四周；约十五周；约十六周；约十七周；约十八周；约十九周；约二十周；约二十一周；约二十二周；约二十三周；约二十四周；约七个月；约八个月；约九个月；约十个月；约十一个月；约十二个月；约十三个月；约十四个月；约十五个月；约十六个月；约十七个月；约十八个月；约十九个月；约二十个月；约二十一个月；约二十二个月；约二十三个月；约二十四个月；约三十个月；约三年；约四年和约五年。通常继续本文所述的治疗方法，只要监督患者的护理的临床医生认为该治疗方法有效，即患者对治疗应答，或直至病况的相关症状减弱。指示治疗方法有效的非限制性参数可以包括以下中的一种或多种：增加的调节性T细胞、诸如CD25+Treg和FoxP3+ Treg的数目，和/或减少的NK细胞以及CD4+和CD8+效应细胞的数目。
当以治疗有效剂量施用于受试者时，本文提供的组合物可用于增加调节性T细胞(诸如Foxp3+和CD25+细胞)与效应T细胞(诸如CD4+和CD8+细胞)的比率。例如，当与基线比较并在体内小鼠模型中评估(例如，诸如本文所述)时，选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR20kD-IL-2和相关组合物)的施用可以有效地导致调节性T细胞增加至少两倍。在一些实施方案中，当与基线比较并在体内小鼠模型中评估(例如，诸如本文所述)时，所述方法也可以有效地导致调节性T细胞增加至少四倍。在一些情况下，调节性T细胞数目的增加维持高于基线水平，在施用后持续至少3天，或甚至在施用后持续至少5天。
如所附实施例中所示，当在合适的剂量范围内施用时，选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)有效地优先增加调节性T细胞的细胞群体和免疫抑制功能，而对T效应细胞的刺激作用最小。在某些实施方案中，选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)能够实现持续暴露，用于提供Treg对Teff应答的幅度、持续时间和特异性，其用等效剂量的天然IL-2无法实现。
实施例
应理解，前述描述以及随后的实施例意欲举例说明而非限制本文提供的公开内容的范围。在本公开的范围内的其他方面、优点和修改对于本公开所属领域的技术人员将是显而易见的。
材料和方法
克隆并表达具有与阿地白介素(des-丙氨酰-1，丝氨酸-125人白介素-2，参见图2)的氨基酸序列相同的氨基酸序列的重组人IL-2，并用于制备本文称为RUR20kD-IL-2的示例性选择性Treg刺激剂组合物。该序列从天然成熟的人IL-2序列排除氨基酸#1 (丙氨酸)，并且在氨基酸#125处存在半胱氨酸至丝氨酸的氨基酸突变。该序列中的第一个氨基酸是用于直接细菌表达的甲硫氨酸(未编码信号肽)。在表达后，N-末端甲硫氨酸被宿主甲硫氨酸氨基肽酶除去。在氨基酸位置#58和#105处的半胱氨酸之间形成单个二硫键。该蛋白未糖基化，因为其源自大肠杆菌。在一些描述中，缀合的IL-2组合物可以在一些方面被描述为(1,3-双(甲氧基聚(乙二醇)氨基甲酰基)-2-丙氧基)-4-丁酰胺)白介素-2)，注意该命名法并不完全描述PEG化模式或混合物。
聚乙二醇试剂，mPEG2(20kD)-丁酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯(1,3-双(甲氧基聚(乙二醇)10kD氨基甲酰基)-2-丙氧基)-4-琥珀酰亚胺丁酸酯(在本文中也称为mPEG2-ru-20KNHS)如美国专利号7,887,789的实施例2中所述制备。外观：白色至灰白色颗粒状粉末；分子量(Mn) 18-22 kDa(由于聚合物多分散性)。下面显示1,3-双(甲氧基聚(乙二醇)10kD氨基甲酰基)-2-丙氧基)-4-琥珀酰亚胺基丁酸酯的结构。
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除非另有指明，否则选择性Treg刺激剂组合物(包括本文提供的RUR20kD-IL-2实施方案和相关组合物)的浓度、量和给药水平在蛋白基础上报告，其仅计数由蛋白组分贡献的质量，而不计数由PEG部分贡献的质量。通过使用蛋白基础，甚至对于具有各种PEG化程度的缀合的rIL-2分子的混合物，用于计算的有效RUR20kD-IL-2组合物分子量也为15.3 kDa，因为仅计数rIL-2蛋白。
RUR20kD-IL-2相关组合物是由与在赖氨酸基团处共价结合的多个聚乙二醇(PEG)部分缀合的rhIL-2(阿地白介素序列)组成的PEG化的缀合物混合物组合物。每个rhIL-2分子的PEG部分的数目(PEG化程度)是每个分子主要2和3个PEG部分(二-或三-PEG化的)的分布，其中次要种类含有1个PEG(单-PEG化的)和4个PEG(四-PEG化的)和/或更高PEG化的分子，导致每个rhIL-2平均约2.5个PEG部分。每个PEG部分具有20 kDa的标称分子量，并且rhIL-2具有15.3 kDa的分子量，导致RUR20kD-IL-2的标称分子量为65kDa。
实施例1
RUR20kD-IL-2和相关组合物的制备
在2 mM HCl中制备mPEG2-ru-20K NHS的储备溶液(100 mg/mL)。典型的IL-2 PEG化反应如下实施：将115 mL IL-2(阿地白介素)储备溶液(1.3 mg/mL)转移至250 mL塑料瓶中，并将15 mL 0.5 M Bicine (N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸)), pH 9.2和0.5 mL水添加至IL-2的溶液中。通过向含有IL-2的溶液中逐滴添加19.5 mL的mPEG2-ru-20K NHS储备溶液来引发PEG化。所得反应混合物含有1 mg/mL IL-2、50 mM Bicine和10摩尔当量的mPEG2-ru-20KNHS(就蛋白而言)，且具有8.7的pH。使反应在环境温度下在温和搅拌下进行40 min。通过添加2.2 mL乙酸将反应pH降低至4.1来终止反应。
通过使用SP FF Sepharose的阳离子交换色谱法纯化所得的IL-2缀合物产物。在缀合反应完成后，将反应混合物针对20倍体积的10 mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0)进行透析。透析样品用水1:4稀释，并负载至装有SP FF Sepharose树脂的柱上。用于阳离子交换色谱的缓冲液如下：缓冲液A：10 mM乙酸钠(pH 4.0)，和缓冲液B：10 mM乙酸钠，1.0 M氯化钠(pH4.0)。在样品负载之前，将树脂用缓冲液B洗涤并用缓冲液A平衡。在负载之后，将树脂用3倍柱体积的缓冲液A洗涤。缀合和未缀合的IL-2使用由以下组成的四步梯度洗脱：经5倍柱体积的0至50%缓冲液B，经1倍柱体积的25%至50%缓冲液B，经1倍柱体积的50%缓冲液B，经1倍柱体积的50%至100%缓冲液B和经1倍柱体积的100%缓冲液B，其中流速为28 cm/h。含有具有2和3(即，二聚体和三聚体)的PEG化程度(dP)的IL-2缀合物的级分通过SDS-PAGE鉴定并合并。
使用搅拌的超滤室(Amicon)和氮气浓缩含有二聚体和三聚体的合并的级分。通过RP-HPLC使用以下流动相确定最终产物的组成：A，0.09% TFA/水，和B，0.04% TFA/乙腈。使用Intrada WP-RP C18柱(3 x 150 mm)，其中流速为0.5 ml/min，且柱温度为50℃。确定纯化的缀合物混合物包含约4.6% (mol)的单-PEG化的rIL-2，约47.7% (mol)的二-PEG化的rIL-2，约42.9% (mol)的三-PEG化的rIL-2和约4.8% (mol)的四-PEG化的IL-2。参见图1，其中在x轴上提供洗脱时间。最终产物混合物的平均PEG化程度被确定为2.48(即，约2.5)。在最终产物混合物中未检测到游离的IL-2。该制剂是配方A的RUR20kD-IL-2的组合物的一个实例。
实施例1-A
RUR20kD-IL-2和相关组合物的替代制备
期望的RUR20kD-IL-2和相关组合物的制备由以下组成：发酵和纯化rhIL-2蛋白过程中间体，缀合rhIL-2与PEG试剂起始材料mPEG2-ru-20K NHS，纯化具有指定的PEG化程度的IL-2缀合物级分，和最终配制PEG化的rhIL-2缀合物，以生成根据本文所述的实施方案的期望分布的RUR20kD-IL-2组合物。
期望的RUR20kD-IL-2组合物通过如下制备：使1,3-双(甲氧基聚(乙二醇)10kD氨基甲酰基)-2-丙氧基)-4-琥珀酰亚胺基丁酸酯(本文也称为mPEG2-ru-20K NHS)与白介素2(IL-2)蛋白(阿地白介素序列)上的赖氨酸残基反应，导致PEG化的IL-2缀合物的分布。该产物主要含有二-PEG化和三-PEG化的种类，具有较少量的单-PEG化和/或四-PEG化的种类。
将冷冻的IL-2起始材料(已经在-70℃下储存的10 mM乙酸盐，5%海藻糖，pH 4.5缓冲液中的纯化重组IL-2(阿地白介素序列))解冻至室温。PEG反应物mPEG2-ru-20K NHS(粉末)通过在室温下以~90 g/L添加至2mM HCl溶液中而溶解，并搅拌最少15分钟。然后将溶液装入反应容器中。将解冻的IL-2添加至反应容器中，用水适当稀释，随后添加0.75 Mbicine pH 9.7缓冲液。反应混合物中的最终IL-2浓度为近似1.0 g/L，且bicine浓度为近似50 mM，以达到8.7的目标pH。通常，在pH 8.5至9.5的bicine缓冲溶液中，PEG:rhIL-2质量比为约10:1至13:1，以使蛋白PEG化。将反应物在22℃下在连续搅拌下孵育40分钟，如从完成mPEG2-ru-20K NHS溶液添加所测量。在孵育时段结束时，反应通过添加1N乙酸以迅速降低pH来淬灭，并且随后立即使用额外的1N乙酸进一步逐步滴定至pH 4.0。将淬灭的反应物通过添加水稀释10倍。将稀释的淬灭反应物过滤通过0.22µm过滤器，以提供粗产物。
然后对粗产物进行SP SEPHAROSE®快速流动阳离子交换色谱，以部分分离PEG化的反应级分。将SP SEPHAROSE®快速流动阳离子交换色谱柱平衡，并在室温下负载进料，停留时间为~5分钟，随后用负载缓冲液洗涤5 CV(柱体积)。PEG化的rhIL-2结合树脂，而游离的PEG被洗掉。然后使用线性梯度洗脱用10 mM乙酸钠pH 4.0缓冲液背景中的0-500 mM氯化钠洗脱产物。收集各自0.15 CV的级分，开始~1 CV进入洗脱。当在280 nm处的吸光度为最大峰的<5%时，结束级分收集。通过在280 nm的波长处的吸光度测量每种级分中的PEG化级分浓度(即，单-PEG化的IL-2(单体)，二-PEG化的IL-2(二聚体)，三-PEG化的IL-2(三聚体)，四-PEG化的IL-2(四聚体)等)。PEG化的级分的分布通过如本文所述的RP-HPLC进行测量，并且鉴定含有单-PEG、二-PEG、三-PEG和更高组分的级分，并用于确定生成将具有目标PEG化的级分分布概况(如本文所提供的RUR20kD-IL-2组合物中所述，并且尤其是在配方A-E中)的组合物所必需的级分的重新合并。计算鉴定的组合物的选择级分(例如，二-PEG-IL-2和三-PEG-IL-2，和/或单-PEG或更高的PEG)的等份试样，以便实现如本文所提供的目标概况，且然后根据需要重新合并以获得具有带有期望的PEG化级分分布的产物的RUR20kD-IL-2组合物。或者，可以设计纯化方案，由此根据本文描述的实施方案，洗脱和收集可以提供期望的概况，而无需重新合并。然后将期望的(和/或重新合并的)色谱纯化的制剂浓缩，并使用切向流过滤(TFF)渗滤至10 mM乙酸钠，150 mM氯化钠，2% w/v蔗糖，pH 5.0中，以实现1 mg/mL(基于蛋白)的RUR20kD-IL-2组合物原料药的最终目标浓度。
分析重新合并的和/或目标产物，并通过本文所述的方法(包括RP-HPLC)验证组合物分布，以评价PEG级分的概况。通过下表1中列出的编号为1-4的实施例产品批次举例说明根据本文说明书的式A-E的RUR20kD-IL-2组合物的组合物的制备。属性的测定是技术人员已知的，和/或描述于实施例1-B至实施例1-I中或本文中的另外描述中。建立适当的历史参考样品组合物，并用于后续制备中的比较。
表1. 通过RP-HPLC和SEC-HPLC的RUR20kD-IL-2组合物的不同批次的样品的说明性分析的概述
Figure DEST_PATH_IMAGE019
ND检测不到，NMT不超过。
在一些实施方案中，在摩尔基础上，所述RUR20kD-IL-2组合物产物将含有少于1%的游离、未缀合的IL-2(更优选地没有可检测的游离IL-2)，5%或更少的单-PEG化的IL-2，约28%至约60%的二-PEG化的IL-2，约24%至约65%的三-PEG化的IL-2，12%或更少的更高-PEG化的IL-2种类，和80%或更多的组合的二-和三-PEG化的IL-2种类。
在一些实施方案中，所述RUR20kD-IL-2组合物产物将含有例如少于0.5 mol %的游离的IL-2，约2.5至约4.5 mol %的单-PEG化的IL-2，约35至约50 mol %的二-PEG化的IL-2，约38至约46 mol %的三-PEG化的IL-2，约3至约10 mol%的更高PEG化的IL-2种类，和约80至约95 mol %的组合总量的二-PEG化和三-PEG化的IL-2。
在一些实施方案中，在摩尔基础上，所述RUR20kD-IL-2组合物产物将含有例如5%或更少的单-PEG化的IL-2，和28%至约60%的二-PEG化的IL-2，和约24%至约65%的三-PEG化的IL-2，和约12%或更少的更高PEG化的IL-2种类。优选地，所述组合物包含80%或更多的组合的二-和三-PEG化的IL-2种类。
在一些实施方案中，所述RUR20kD-IL-2组合物产物将含有例如约2.5至约4.5 mol%的单-PEG化的IL-2，和约35至约50 mol %的二-PEG化的IL-2，和约38至约46 mol %的三-PEG化的IL-2，和约3至约10 mol%的更高PEG化的IL-2种类。优选地，所述组合物包含约80至95 mol %的组合总量的二-PEG化和三-PEG化的IL-2。
在一些实施方案中，所述RUR20kD-IL-2组合物产物将含有例如约2.8至约3.8 mol%的单-PEG化的IL-2，和约44至约48 mol %的二-PEG化的IL-2，和约41至约44 mol %的三-PEG化的IL-2，和约7至约9 mol%的更高PEG化的IL-2种类。优选地，所述组合物包含约87至90 mol %的组合总量的二-PEG化和三-PEG化的IL-2。
在一些实施方案中，所述RUR20kD-IL-2组合物产物将含有例如约2.8至约3.8 mol%的单-PEG化的IL-2，和约44至约48 mol %的二-PEG化的IL-2，和约41至约44 mol %的三-PEG化的IL-2，和约7至约9 mol%的更高PEG化的IL-2种类，且其中所述组合物包含具有在赖氨酸K7或K8或K31或K75之一处附接的PEG部分的单-PEG化的IL-2缀合物的混合物。优选地，所述组合物包含约87至90 mol %的组合总量的二-PEG化和三-PEG化的IL-2。
在一些实施方案中，所述RUR20kD-IL-2组合物产物将含有例如约2.8至约3.8 mol%的单-PEG化的IL-2，和约44至约48 mol %的二-PEG化的IL-2，和约41至约44 mol %的三-PEG化的IL-2，和约7至约9 mol%的更高PEG化的IL-2种类，且其中所述组合物包含具有在赖氨酸K7处附接的PEG部分的单-PEG化的IL-2缀合物。优选地，所述组合物包含约87至90 mol%的组合总量的二-PEG化和三-PEG化的IL-2。
实施例1-B
经由反相高效液相色谱的RUR20kD-IL-2组合物的纯度和表征
使用配备有二极管阵列检测器(215 nm处的UV)的Agilent 1200系列仪器，使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)来评价RUR20kD-IL-2组合物的样品的色谱纯度和身份。使用的柱可以是ACE 3 Phenyl-300柱(Mac-Mod Analytical Inc.) (或其他合适的柱)，其中洗脱液流速为0.6 mL/min。RP-HPLC使用含有以下两种流动相的混合物的梯度实施：(1)流动相A，0.1%甲酸于水中的溶液，和(2)流动相B，0.1%甲酸于乙腈中的溶液。线性梯度范围为60%流动相A/40%流动相B至40%流动相A/60%流动相B，至20%流动相A/80%流动相B，至60%流动相A/40%流动相B。稀释液/配制缓冲液的组分是10 mM乙酸钠，200 mM氯化钠，2%蔗糖，pH为5.0。
将冷冻的RUR20kD-IL-2组合物参考材料和样品解冻，并用配制缓冲液稀释至1.0mg/mL。首先经由注射使制剂缓冲液的至少一种空白对照经历RP-HPLC，以确保不干扰RUR20kD-IL-2-组合物相关峰的分析。接下来，将RUR20kD-IL-2组合物参考材料或对照注入五次。接下来，注入RUR20kD-IL-2组合物样品。在每六次样品注入后和注入顺序结束时，注入RUR20kD-IL-2组合物参考材料/对照。
包含二-PEG化的(二-PEG)和三-PEG化的(三-PEG)RUR20kD-IL-2组合物的前五次参考材料注入物的保留时间的%相对标准偏差(RSD)不超过2.0%。二-PEG和三-PEG组分的所有参考材料RUR20kD-IL-2组合物注入物的% RSD面积百分比不超过5.0%。将来自参考和样品注入物的所有RUR20kD-IL-2组合物峰积分。具体地，对于1.0 mg/mL浓度的RUR20kD-IL-2组合物，分别将高于0.5%检出限值(LOD)的二-PEG和三-PEG RUR20kD-IL-2组合物种类和高于0.3%LOD的rhIL-2峰积分。对于1.0 mg/mL浓度的RUR20kD-IL-2，定量限值(LOQ)对于二-PEG和三-PEG RUR20kD-IL-2种类为1.0%，且对于rhIL-2为0.5%。来自分析的结果显示于下表2(6份样品)和表3(12份样品)中。
表 2：通过RP-HPLC分析的六份RUR20kD-IL-2组合物重复样品的单-PEG、二-PEG、三-PEG、四-PEG和五-PEG级分的面积百分比
Figure 364340DEST_PATH_IMAGE020
表 3：通过RP-HPLC分析的十二份RUR20kD-IL-2组合物重复样品的单-PEG、二-PEG、三-PEG、四-PEG和五-PEG级分的面积百分比
Figure DEST_PATH_IMAGE021
实施例1-C
经由大小排阻高效液相色谱法的RUR20kD-IL-2组合物的纯度和表征
使用配备有二极管阵列检测器(在280 nm处的UV)和Yarra SEC-2000柱(Phenomenex)的Agilent 1200系列仪器，大小排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)也可用于测定纯度和表征RUR20kD-IL-2组合物，并且洗脱液流速为0.225 mL/分钟。流动相是0.2M乙酸铵(pH 5.5)，其与乙腈的体积比为80:20。稀释液/制剂缓冲液含有10 mM乙酸钠，200 mM氯化钠，2%蔗糖，pH为5.0。将冷冻的RUR20kD-IL-2组合物参考材料和分析样品解冻并用制剂缓冲液稀释至1.0mg/mL。样品在溶液中在5℃下稳定最多达5天。
在程序上，首先经由注入使制剂缓冲液的至少一种空白对照经历RP-HPLC，以确保不干扰RUR20kD-IL-2-相关峰的分析。接下来，注入RUR20kD-IL-2组合物，系统适合性溶液，以确保从四-PEG RUR20kD-IL-2级分解析聚集体或更高分子量种类。随后将RUR20kD-IL-2组合物参考材料或对照注入五次。接下来，注入RUR20kD-IL-2组合物样品。在每六次样品注入后和注入顺序结束时，注入RUR20kD-IL-2组合物参考材料/对照。
前五次参考材料注入物的二-PEG和三-PEG RUR20kD-IL-2级分的保留时间的% RSD不超过2.0%。所有参考材料注入物的二-PEG和三-PEG RUR20kD-IL-2的% RSD面积百分比不超过5.0%。将来自参考和样品注入物的所有RUR20kD-IL-2级分峰积分。具体地，对于1.0 mg/mL浓度的RUR20kD-IL-2组合物，将高于1.0%检出限值(LOD)的二-PEG和三-PEG RUR20kD-IL-2级分积分。对于1.0 mg/mL浓度的RUR20kD-IL-2，仅报告高于3.0% LOQ的二-PEG和三-PEGRUR20kD-IL-2。
RUR20kD-IL-2组合物的重复样品的分析显示于下表4和5中，其中提供了RUR20kD-IL-2组合物的单-PEG、二-PEG、三-PEG、四-PEG和五-PEG级分的峰面积。
表 4：通过SEC-HPLC的RUR20kD-IL-2的单-PEG、二-PEG、三-PEG、四-PEG和五-PEG组分的峰面积%
Figure 187065DEST_PATH_IMAGE022
表 5：通过SEC-HPLC的RUR20kD-IL-2组合物样品的单-PEG、二-PEG、三-PEG、四-PEG和五-PEG级分的峰面积%
Figure DEST_PATH_IMAGE023
通过RP-HPLC和SEC-HPLC两者的RUR20kD-IL-2组合物的不同样品的代表性分析的概述显示于表1中。如可见，RUR20kD-IL-2组合物制剂表明关于PEG化的级分(即，单-PEG化的，二-PEG化的，三-PEG化的，四-PEG化的，五-PEG化的等)混合物的良好的批次间一致性。
实施例1-D
SDS-Page
SDS-PAGE用于证实RUR20kD-IL-2组合物身份。将RUR20kD-IL-2组合物、分子量标记和适当的RUR20kD-IL-2组合物参考材料的样品负载至NuPAGE Bis-Tris凝胶上，并通过凝胶迁移。在电泳后，使用GelCodeTM Blue Safe Protein Stain对凝胶进行染色。凝胶迁移条带化模式与参考材料的比较以及样品中没有新条带的证实证实了样品的身份。两个最强的条带将对应于三-PEG化的和二-PEG化的级分。泳道中最上面的条带对应于更高PEG化的变体，并且最低的条带对应于单-PEG化的变体。
实施例1-E
使用表面等离振子共振(SPR)的对IL-2Rαβ的亲和力，以及在表达人IL-2Rαβα复合物的U-2 OS细胞中的功效。
使用具有偏振光检测的Biacore X-100表面等离振子共振，测定RUR20kD-IL-2组合物的结合亲和力。该技术涉及用N-羟基琥珀酰亚胺1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(NHS EDC)的1:1复合物活化Biacore CM5传感器芯片的表面，以生成活性NHS酯。将乙酸钠、pH 4.0缓冲液中的山羊抗人Fc抗体共价附接至芯片的表面。残余的NHS酯用1M乙醇胺淬灭。使用具有0.1% BSA的HBS-EP缓冲液(1mM HEPES，pH 7.4，15 mM NaCl，0.3 mM EDTA，0.0005% v/v表面活性剂P20)将IL-2-Rα-Fc(人IL-2Rα-Fc嵌合体；Symansis)和IL-2Rβ-Fc(人IL-2Rβ-Fc嵌合体；Symansis)的1:1混合物捕获在芯片上。将RUR20kD-IL-2组合物在具有0.1% BSA的HBS-EP缓冲液中连续稀释，并注入传感器芯片上。动力学结合亲和力通过使用如下进行测量：应用所述溶液3分钟(kon)，随后洗涤3分钟(koff)。koff和kon之间的比率用于计算动力学结合亲和力KD。来自两批RUR20kD-IL-2组合物的一式三份分析的结果列于表6中。两种原料药批次的结合亲和力和速率是一致的。
表6：使用SPR的RUR20kD-IL-2组合物与IL-2Rαβ的结合亲和力
Figure 534870DEST_PATH_IMAGE024
或者，PathHunter®平台，低温保存的即用型细胞测定形式，提供的细胞应答比培养的细胞的细胞应答更稳健和一致。酶(β-半乳糖苷酶)片段互补测定(由DiscoverXCorporation, CA的PathHunter®平台)用于测量药物/配体-受体相互作用。在表达人IL-2Rαβα复合物的U-2 OS细胞中测量RUR20kD-IL-2组合物的功效。该测定法的基础利用分离的酶片段，分离的所述酶片段是无活性的。将两个酶片段融合至IL-2Rβ或IL-2Rγ亚基的细胞内结构域，并且在配体与受体相互作用后，使受体亚基紧密接近以恢复酶活性。在添加底物的情况下，所述酶起作用并产生发光信号。在将样品和参考与细胞孵育~6小时后，测量经由酶片段互补的受体活化。RUR20kD-IL-2组合物通过高亲和力异源三聚的αβγIL-2受体(IL-2R)提供低剂量信号传导。
实施例1-F
RUR20kD-IL-2组合物的PEG化位点占用率
通过肽作图通过直接比较RUR20kD-IL-2组合物与rhIL-2，来表征来自两批的RUR20kD-IL-2组合物的PEG化位点占用率。在RUR20kD-IL-2消化物中，含有赖氨酸的肽可以被PEG化，并被其具有较低丰度(与参考rhIL-2消化物中的相同肽相比)的相应天然的含有赖氨酸的肽所反映。因此可以基于分析的RUR20kD-IL-2消化物中的天然肽的丰度降低来计算PEG化位点占用率。此外，替代材料的肽作图可用于额外证实位点占用率。
通常，该分析可以如下进行。在直接肽作图比较研究中，RUR20kD-IL-2组合物和rhIL-2参考对照样品通过GluC和GluC/胰蛋白酶同时消化，随后进行LC-UV/MS/MS分析，以提供肽鉴定和丰度。RUR20kD-IL-2组合物和rhIL-2的肽作图比较用于测定PEG化位点占用率。
简而言之，在RUR20kD-IL-2组合物和rhIL-2两者分析中选择一种或多种没有赖氨酸的普通肽作为一种或多种参考。肽的相对强度是对其一种或多种参考的归一化。具有赖氨酸的天然肽(RR)的相对丰度降低通过肽的相对强度进行计算(公式1)。赖氨酸处的PEG化位点占用率是来自含有赖氨酸的肽的平均RR。
Figure DEST_PATH_IMAGE025
肽相对强度(Pep/Ref)= UV峰面积(肽)/UV峰面积(参考肽)。
用作RUR20kD-IL-2组成替代物的材料是由单分散4kD PEG与rhIL-2的赖氨酸缀合产生的产物。为了模拟RUR20kD-IL-2组合物的PEG化概况，使用相同的缀合接头制备替代物，并且在用于制备RUR20kD-IL-2组合物的相同的反应条件下实施缀合反应。替代物的基于LCMS/MS的GluC作图和胰蛋白酶作图鉴定PEG化的赖氨酸，并且为RUR20kD-IL-2提供支持信息。
RUR20kD-IL-2(GMP批次)的GluC图谱具有95%的rhIL-2序列覆盖率。RUR20kD-IL-2与rhIL-2的GluC图谱的直接比较提供了RUR20kD-IL-2中的11个赖氨酸中的4个的相对定量(参见表7)，其中赖氨酸7和8被计数为肽图谱中的一个位点。GluC图谱中含有剩余的赖氨酸的肽显示PEG化的证据，而没有位点差异。GluC/胰蛋白酶图谱中的含有赖氨酸的肽的额外胰蛋白酶切割提供了在K31、K34、K42和K47处的PEG占用。来自RUR20kD-IL-2和rhIL-2的GluC/胰蛋白酶作图色谱图的比较显示那些肽的显著减少(参见表7)。由于酶促错误切割，在胰蛋白酶/GluC图谱中没有K48位点PEG化占用可得(N/A)。
4k PEG化的rhIL-2替代物的肽作图以高质量准确度(<5ppm)鉴定具有4k PEG标记的赖氨酸的肽。RUR20kD-IL-2和4k PEG化的rhIL-2替代物的直接肽作图的组合结果显示，K7、K31和K75是主要的PEG化位点(参见表8)。RUR20kD-IL-2组合物的不太主要的PEG化位点可以是K8、K34、K42、K47、K53和K63。K48可以被PEG化，而K96未确定。
在第二RUR20kD-IL-2组合物GMP制剂中以及在开发批次中，PEG化位点占用率是相当的(参见表7)。GluC作图和胰蛋白酶/GluC作图的组合方法为RUR20kD-IL-2组合物中的缀合物的一些主要PEG化位点提供了批次间信息。
表7.
RUR20kD-IL-2组合物中的PEG化位点占用率：GMP批次和DEMO批次
Figure 166489DEST_PATH_IMAGE026
DEMO批次是指为了证明生产过程的可操作性而进行的制备。
表8. RUR20kD-IL-2组合物和4k PEG化rhIL-2替代物中的PEG化位点占用的概述
来自直接消化的主要PEG位点(GluC和GluC/胰蛋白酶图谱) 来自替代PEG化的rhIL-2的主要PEG位点(GluC和胰蛋白酶图谱) 来自组合结果的主要PEG位点
K7/K8 K7 K7
K31 K31 K31
K34 (可能) K34 (未优选) N\A
K48 (未知) K48 K48 (可能)
K75 K75 K75
实施例1-G
RUR20kD-IL-2组合物的溶液相稳定性
通过如前所述的RP-HPLC在三种不同的储存条件(室温(环境实验室条件)、5℃(冷藏)和-20℃)下在1、3、5和7-天时间点评估1.0 mg/mL的RUR20kD-IL-2组合物的溶液(含有2%(w/v)蔗糖的10 mM乙酸钠、200 mM氯化钠(pH 5)中的~1 mg/mL的rhIL-2当量)的稳定性。
针对对照、新鲜制备的RUR20kD-IL-2组合物样品溶液评估RUR20kD-IL-2组合物溶液之间的差异。在室温、5℃和-20℃下储存最多达7天的RUR20kD-IL-2组合物样品的二-PEG和三-PEG种类与标称-70℃样品储存相比显示最高达1%的相对差异。RUR20kD-IL-2的较小百分比组分PEG化种类(单-PEG、四-PEG和五-PEG种类)的相对差异(Rel. Diff.)为最高达8%。这表明在这些代表性储存条件下储存的溶液样品是稳定的。
体外生物测定：
体外方法可用于进一步测量RUR20kD-IL-2组合物的生物学功效和生物学表征，包括基于细胞的测定法来表征活化受体(这是IL-2受体复合物代表性的)后的生物活性：
生物测定方法
Figure DEST_PATH_IMAGE027
在所有三种测定中，来自剂量-应答曲线(应答相比于浓度)的数据使用非线性回归模型评估。RUR20kD-IL-2组合物样品的功效通过半数最大有效浓度(EC50)比率相对于参考材料进行测量。
实施例1-H
CTLL-2细胞增殖测定
在细胞增殖测定中，在将样品和参考孵育~26小时后，在体外使用CTLL-2细胞测量细胞生长，其中细胞增殖经由基于发光三磷酸腺苷的测定(CellTiter-Glo®, Promega, WI)进行测量。例如，这种基于细胞的增殖测定使用CTLL-2细胞系，所述CTLL-2细胞系表现出对rhIL-2蛋白的剂量依赖性增殖应答。rhIL-2用作测定对照，并且在该方法中以不同的浓度范围从RUR20kD-IL-2组合物制备。该测定以96-孔板形式进行。CTLL-2细胞在饥饿培养基中针对rhIL-2进行饥饿，和在37℃下和5% CO2培养箱中孵育过夜，持续20±3小时。将饥饿的细胞铺板于96-孔板中并将RUR20kD-IL-2组合物的稀释系列进料至细胞，并在37℃下和5%CO2培养箱中再孵育25±3小时。使用Promega的CellTiter Glo®检测试剂盒测量每个孔中的RUR20kD-IL-2组合物诱导的细胞生长。CellTiter Glo®生成与每个孔中存在的ATP的量成比例的发光信号，这与存在的活细胞直接成比例。在SpectraMax M5读板器上读取发光信号。通过针对浓度(x-轴)绘制荧光信号(y-轴)来生成RUR20kD-IL-2组合物参考材料和各样品的剂量应答曲线。将该图拟合至4-参数逻辑非线性回归模型。平行线分析(PLA)软件用于评价对于斜率差异(平行度)的等效检验，回归的显著性，并且计算样品相对于同一板中的参考材料的功效比率。
实施例1-I
磷酸化-STAT5活化
在受体结合后的磷酸化-STAT5测定中，下游细胞信号传导然后可以通过磷酸化活化信号传导子及转录激活子5 (Signal Transducer and Activator of Transcription 5,STAT5)以促进基因表达以诱导细胞增殖。在CTLL-2细胞(一种IL-2-依赖性鼠T淋巴细胞细胞系)中，使用磷酸化-STAT5/总STAT5多重化测定(Meso Scale Discovery, MD)，测量响应于样品和参考处理~10分钟的磷酸化-STAT5的活化。
实施例2
体内研究：小鼠中的单剂量PK/PD研究
可以在小鼠中证明RUR20kD-IL-2组合物对Treg的选择性刺激。以0.03、0.1和0.3 mg/kg的剂量向C57BL/6小鼠(n=4/组)施用RUR20kD-IL-2组合物的单次皮下给药。在施用后，在施用后第1-7天和第10天收集血液和脾脏样品。更具体地，在每个时间点，收集血液和脾脏样品；合并样品并通过流式细胞术进行评价用于药效动力学分析对淋巴细胞细胞群的药物作用(参见例如实施例5)，表示为相对于媒介物对照的倍数变化。除了细胞数目的变化以外，定量功能标志物和活性的标志物。最后，还评价血浆药物浓度。
如图3A和3B中所示，RUR20kD-IL-2组合物的施用导致血液和脾脏两者中的CD4+ Treg的剂量依赖性增加，其中在施用后四天细胞数增加达到峰值。在测试的最高剂量(0.3mg/kg)下，实现对Treg动员的持续作用，其中Treg水平直至施用后7-10天才恢复至基线水平。在血液中，在施用测试的最高剂量后，NK细胞升高，而CD4 T细胞的变化是适度的，而CD8T细胞略微下降(图4A-C)。在施用测试的最高剂量(也导致NK细胞增加小于2倍的剂量)后，B细胞和CD8 T细胞略微减少。Treg功能和活性的标志物(图5A和5B)表明，在测试的最高剂量下，RUR20kD-IL-2组合物的施用导致Treg活化的增加，如通过CD25和Foxp3的平均荧光强度(MFI)所测量。尽管Treg数目直至施用后四天才达到最大值，但这些活化标志物在施用后的前两天内达到其最大值，根据RUR20kD-IL-2的血浆暴露而缓慢降低。如通过Ki67所测量的快速增殖的Treg的百分比在施用后两天快速上升，并且该百分比保持维持，到第6天，然后回复至基线水平。另外，表达细胞表面标志物诱导性T细胞共刺激物(ICOS)的Treg的百分比也增加，这是值得注意的发现，因为ICOS表达与自身免疫环境中的Treg的抑制活性增加相关。尽管Ki67和ICOS的增加看起来相对于峰值RUR20kD-IL-2组合物浓度有点延迟，但在该临床前小鼠研究中，它们恢复至基线水平确实与血浆浓度降低相一致。
实施例3
体外Treg抑制测定
该研究的目标是评价调节性T细胞的抑制功能。在皮下施用后的第1-7天和第10天，从未处理和RUR20kD-IL-2组合物处理的C57BL/6小鼠磁性分离Treg。将Treg和Tcon以1:2至1:512的比率范围共培养三天。通过在测定的最后16小时内并入3H-胸苷来评估细胞增殖，并且计算相对于板对照的增殖细胞的%。
简而言之，在剂量施用后的所示时间从用各种剂量水平(0.03、0.1和0.3 mg/kg)的RUR20kD-IL-2组合物或媒介物处理的雌性C57BL/6小鼠收集脾脏(n=4只小鼠/处理组/时间)。对于每个脾脏制备单细胞分离物，并且在每个时间点对于每个剂量组合并所得的脾细胞混合物。将合并样品等同于一个脾脏的部分等分，用于免疫细胞概况分析。剩余的脾细胞制备物用于分离调节性T细胞(Treg)。根据制造商的建议，通过利用CD4+CD25+调节性T细胞分离小鼠试剂盒(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)的磁活化的细胞分选(MACS)从小鼠脾脏分离CD4+CD25+ Treg。对CD4+ T细胞进行负选择，且然后分为CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+ Treg。使用未处理的CD4+ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，并遵循制造商建议的程序，通过MACS从收获自未处理的动物的小鼠脾脏分离未处理的常规CD4+CD25-T细胞(Tcon)。
在补充有10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、0.5 μM β-巯基乙醇和1X抗生素/抗真菌剂(100单位/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和250 ng/mL两性霉素B)的RPMI1640培养基中实施体外抑制测定。在96-孔圆底板中，在100 μL培养基中，将5 x 104个Tcon用以抗CD3和抗CD28(T细胞活化/扩增试剂盒，小鼠，Miltenyi Biotec)包被的珠粒以2个珠粒:每个Tcon的比率刺激。通过以不同比率(2:1至1:512的Treg:Tcon比率)将Treg添加至Tcon来评价Treg的抑制能力。每种Treg:Tcon比率一式三份测试。将细胞在湿润气氛中在37℃和5% CO2下共培养72小时；在测定终止前16小时，将0.5 μCi [3 H]-胸苷添加至孔中。将细胞洗掉未并入的[3H]-胸苷之后，使用微孔板闪烁计数器(TopCount NXT, PerkinElmer)作为每分钟计数(CPM)测量胸苷摄取。通过除以对于四种最低的Treg:Tcon稀释度记录的平均CPM，将个别CPM值针对最大增殖归一化。在Prism® 6.03 (GraphPad Software,San Diego, California)中，使用四参数非线性回归和1/y2加权绘制浓度-应答曲线。
如图6A-D中所示，在研究开始后1天和4天从媒介物处理的小鼠分离的脾脏的Treg表现出抑制能力，其中最大抑制发生在1:2的比率。然而，在施用RUR20kD-IL-2组合物后的这些时间点分离的Treg表现出大大增加的抑制能力，如通过Tcon增殖减少所证明，尤其是在大于1:8的比率。还随时间评价用Tcon以1:2的比率培养的分离的Treg的相对抑制能力(图7)。在RUR20kD-IL-2施用后，在回复至由媒介对照处理组表现出的基线活性之前，增加的Treg抑制活性被维持四天。
实施例4
小鼠KLH DTH效力模型中的RUR20kD-IL-2组合物的评估
为了通过施用RUR20kD-IL-2组合物以抑制T-细胞抗原驱动的炎症来评价Treg诱导的能力，在延迟型超敏反应(DTH)的模型中利用Balb/c小鼠(n=6-10/组)。将小鼠用100 µl皮下注射剂在其背部区域中皮下致敏，所述皮下注射剂含有乳剂中的100 µg钥孔
Figure 17771DEST_PATH_IMAGE028
血蓝蛋白(KLH)，所述乳剂含有完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂，比率分别为1:1:1。五天后，在左耳中用10 μg KLH皮下攻击前，测量基线耳厚度，其中右耳保持未处理。在所有组中，在KLH攻击后24、48、72和96小时用卡尺测量耳厚度测量值。RUR20kD-IL-2组合物在第0天、在致敏时施用，其中皮下剂量范围为每三天0.003 mg/kg至0.3mg/kg。在第0天施用由环孢菌素(10mg/kg，单一剂量)组成的阳性对照。
如图8A、8B中所示，在抗原攻击后，诱导耳肿胀，其中耳厚度的平均增加在48小时时达到超过14 mm的最大值。在研究过程期间，未处理的未攻击的耳没有表现出厚度的变化。在该研究中贯穿致敏和攻击时段中的RUR20kD-IL-2组合物的施用导致耳肿胀的显著剂量-依赖性降低，如通过在每个时间点的炎症相对于媒介物对照的减少所证明。为了更定量评价攻击后的效果，对于每个治疗组计算厚度的变化的AUC (AUC0-96h)。如图8A和8B中所示，最小有效剂量是0.01mg/kg q3d，而用0.3 mg/kg q3d实现最大效果。来自媒介物组的统计学显著的AUC值用星号注明(p<0.05;ANOVA, Tukey’s)。总之，该数据表明在施用后实现的Treg的增强的动员和活化可以在体内抑制抗原驱动的炎性机制。
在啮齿动物和食蟹猴中，在体内施用后评价实施例1的RUR20kD-IL-2组合物的活性。在小鼠中，RUR20kD-IL-2组合物导致Treg的剂量依赖性增加，其在施用后四天达到最大值。在小鼠中由RUR20kD-IL-2组合物诱导的Treg的流式细胞术分析显示，Treg活化的标志物，诸如Foxp3和CD25的平均荧光强度(MFI)在施用的前两天内达到其最大值，并且根据RUR20kD-IL-2组合物的血浆暴露随着时间逐渐降低。活跃增殖的Treg的百分比也在施用后2天内达到其最大值，并且维持到第6天。Treg功能标志物ICOS的表达在第3天达到峰值，然后到7天回复至基线。从处理的小鼠的脾分离的Treg在施用后前四天内大大增加其抑制能力，然后回复至基线活性水平。当每三天施用时，实施例1的RUR20kD-IL-2组合物抑制延迟型超敏反应(DTH)小鼠模型中的抗原驱动的炎性反应。
实施例5
食蟹猴中的单剂量研究
在该研究中，向食蟹猴(一只雌性和一只雄性)皮下施用25 µg/kg RUR20kD-IL-2组合物。在处理前(第-6天和第-1天)和处理后多个间隔，从每只动物取一系列血液样品，用于通过流式细胞术评价Treg细胞数目和活化状态。
对于免疫表型分析，在以下时间点从每只猴收集血液样品(近似1.0 mL)：处理前(第-6天和第-1天)，处理后第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第10天、第14天和第21天。将静脉穿刺样品收集至含有抗凝剂K2EDTA的管中。将管置于等待转移的湿冰上。全血样品通过流式细胞术使用以下组进行分析，并且针对以下分析样品：
T细胞组：CD45/CD3/CD4/CD8/ICOS
T/B/NK组：CD45/CD3/CD16/CD20
pSTAT5组：CD3/CD4/CD8/CD25/CD127/pSTAT5
Treg组1：CD3/CD4/CD8/CD25/FoxP3/Ki67
Treg组2：CD3/CD4/CD8/CD25/FoxP3/Helios
计算机化的系统可用于研究的进行，例如，流式细胞术数据采集可以使用BDFACSCanto II/FACSDiva LEGENDPlex数据分析软件，并且流式细胞术数据分析可以使用DeNovo FCS Express软件。
将来自雄性和雌性的值平均化，并且显示相对于d-1值的变化幅度，用虚线标记。如图9中所示，Treg细胞数在施用后显著增加，在施用后7天达到其最大水平，并且到第1421天回复至接近d-1水平。如图9A中的空心三角形所示，由RUR20kD-IL-2组合物诱导的接近所有Treg都是增殖的，如通过Ki67所测量。
通过施用RUR20kD-IL-2组合物刺激的Treg的相对活化状态进一步通过FoxP3和CD25的平均荧光强度(MFI)来测量。CD25 MFI在第6天达到其最大值，且然后到第10天达到平稳，然后到第21天回复至接近给药前水平。FoxP3 MFI在施用后6天也达到最大值，然后在第14-21天接近回复至给药前水平。总之，这些数据表明小鼠中的发现可转化至食蟹猴，因为看到血液中的相似幅度的Treg诱导，其伴随有Treg活化增加。然而，与小鼠中的发现相比，食蟹猴中的作用天然更持久。
实施例6
小鼠、大鼠和猴中的单剂量药代动力学和毒物动力学
概述RUR20kD-IL-2组合物在小鼠、大鼠和猴中的单剂量药代动力学/毒物动力学的结果。给药方案的细节提供于表10中。
表10：RUR20kD-IL-2组合物单剂量药代动力学和毒物动力学研究的概览
Figure DEST_PATH_IMAGE029
对于小鼠研究，RUR20kD-IL-2组合物的媒介物是10 mM乙酸钠，200 mM氯化钠和2%蔗糖(pH5)。对于大鼠和猴研究，RUR20kD-IL-2组合物的媒介物是50 mM乙酸钠，200 mM氯化钠和2%蔗糖(pH 5)。
在皮下施用后，RUR20kD-IL-2组合物在小鼠、大鼠和猴中缓慢吸收，Tmax分别为0.33-1.0、1.0-2.3和2.0天(表11)。RUR20kD-IL-2组合物血浆暴露在小鼠和大鼠中或多或少剂量成比例地增加。大鼠中的生物利用度在29.8-46.0%的范围内，且猴中的生物利用度为86.2%。
在大鼠中，RUR20kD-IL-2组合物的稳态下的分布体积(Vss)看起来随着剂量增加，且范围在25.1 (0.01 mg/kg)和52.6 mL/kg (1.0 mg/kg)之间(表12)。总体而言，在大鼠和猴中，Vss分别比物种特异性血浆体积大1-2倍和2-4倍，表明RUR20kD-IL-2主要停留在血管空间中。
血浆清除率(CL)非常低(大鼠中为0.560-1.14 mL/hr/kg，且猴中为0.245 mL/hr/kg)(表)。在静脉内或皮下给药后，RUR20kD-IL-2组合物浓度看起来表现出单指数衰减，其中半衰期在小鼠中为1.85-2.24天，在大鼠中为1.25-2.44天，且在猴中为10.4-12.9天(表11和12以及图10A、10B)。预期RUR20kD-IL-2的肾脏排泄低，这是由于其平均分子量为63 kDa，其接近肾小球过滤膜的分子量截止值。
表11：向C57BL/6小鼠、Sprague-Dawley大鼠或食蟹猴施用单一皮下剂量的RUR20kD-IL-2组合物后的平均值±SE血浆药代动力学/毒物动力学参数
Figure DEST_PATH_IMAGE031
AUCinf：从时间零至无限时间的血浆浓度-时间曲线下的面积；
AUClast：从时间零至最后可测量浓度的血浆浓度-时间曲线下的面积；Cmax：观察到的最大血浆浓度；MRTinf：平均停留时间；Tmax：观察到最大血浆浓度的的时间
1. PK参数基于每个时间点三只大鼠的平均值。
2. 雄性和雌性猴的平均值。
表12：向Sprague-Dawley大鼠或食蟹猴施用单一静脉内剂量的RUR20kD-IL-2组合物后的平均值±SE血浆药代动力学参数
Figure DEST_PATH_IMAGE033
ND：未测定；AUCinf：从时间零至无限时间的血浆浓度-时间曲线下的面积；AUClast：从时间零至最后可测量浓度的血浆浓度-时间曲线下的面积；CL：清除率；MRTinf：平均停留时间；Vss：稳态下的分布的表观体积。*雄性和雌性猴的平均值。
实施例7
小鼠中的比较研究
进行与实施例2中描述的研究基本上相似的研究，其中向C57BL/6小鼠施用单一皮下剂量的0.03、0.1和0.3 mg/kg的RUR20kD-IL-2组合物或施用0.03 mg/kg (qddx5)、0.1 mg/kg(qdx5)和1 mg/kg (qdx5)的剂量的未修饰的IL-2 (阿地白介素)。在施用后，收集血液和脾脏样品并通过流式细胞术分析用于对淋巴细胞细胞群体的药物作用的药效动力学分析，表示为相对于媒介物对照的倍数变化。结果显示于图10A和10B中(RUR20kD-IL-2组合物被标记为“RUR-IL-2”，阿地白介素被标记为“IL-2”)。
实施例8
RUR20kD-IL-2组合物在系统性红斑狼疮(SLE)的小鼠模型中的效力的研究
进行该研究以使用MRL/MpJ-Faslpr小鼠模型(该疾病的最通常研究的小鼠模型)测定RUR20kD-IL-2组合物对SLE的发展和进展及其相关特征的效力(Perry, D., 等人, J Biomed Biotechnol 2011:271694)。MRL/MpJ-Faslpr小鼠模型发展自身免疫性疾病，其反映人SLE的病理，包括淋巴结肿大，IgG水平升高，抗核抗体产生，蛋白尿，和由肾小球的炎症引起的肾衰竭。如实施例1中所述的RUR20kD-IL-2组合物的储备溶液用作在媒介物(透明液体； 10mM乙酸钠/200mM氯化钠/2% (w/v)蔗糖)中提供的测试物品(1.58 mg/mL)，在无菌注射用水(SWFI), USP; pH 5.0 ± 0.1)中制备。在给药日，取出合适量的测试物品并用媒介物稀释以达到期望的给药浓度(0.03 mg/kg剂量和0.3 mg/kg剂量)；剂量体积为5 mL/kg。用于该研究的动物是MRL/MpJ-Faslpr小鼠和MRL/MpJ未处理的雌性小鼠，周龄为6-8周。通过随机将动物分配至治疗组中。治疗组描述于下表13中。基于开始实验前的体重和尿液中的蛋白含量水平，将45只MRL/MpJ-Faslpr小鼠随机分为3组(对于第2-4组，每组15只)。第2-4组中的动物接受如表6中所述的皮下递送的媒介物或测试物品。第1组 - MRL/MpJ小鼠接受作为阴性对照的媒介物。在第8周第一次剂量施用后三(3)天，将来自第2-4组的3只小鼠人道处死，并收集和处理血液样品。从开始研究起，每周两次测量体重，并连续整个过程。当第一次观察到时拍摄皮肤病变照片，且然后以一周间隔拍摄。在给药前一天(在基线时)获得尿液，且然后其后每周收集。尿液中的蛋白水平使用Siemens Clinitek Status分析仪进行测量。在处死日(在第20周末的最后一次给药后3天)，通过腹膜内注射水合氯醛(50 mg/kg)麻醉所有小鼠。收集血液样品，并以10000 r/min离心10 min以获得血清样品。将血清储存在-80℃，直至临床生物化学测试。通过ELISA(小鼠抗dsDNA IgG-特异性ELISA试剂盒，Alpha Diagnostic International，目录号5120)分析血清样品(100 μl)的抗dsDNA水平，并使用Hitachi 7020自动生物化学分析仪测试血清的BUN浓度。对于淋巴细胞分析，将血液样品收集在EDTA-K管中，并通过流式细胞术针对CD3/CD4/CD8/Treg/NK/B细胞%进行测试。结果显示于图11中。如其中所示，以0.3mg/kg的剂量施用RUR20kD-IL-2组合物有效地将肾损害的生物标志物(即，尿液中的蛋白水平)抑制至与正常小鼠中观察到的接近相同的水平。该研究进一步阐明了在SLE的代表性动物模型中，RUR-IL-2-诱导的Treg对生理免疫应答和疾病进展的控制的作用。
表13-治疗组
Figure DEST_PATH_IMAGE035
a：测试物品的媒介物。
实施例9
RUR20kD-IL-2组合物在抗原依赖性T细胞介导的延迟型超敏反应(DTH)模型中的研究
该研究模拟在食物过敏模型(其中建立高程度的过敏反应)中，通过RUR20kD-IL-2组合物的体内Treg刺激和扩增可以如何以抗原依赖性方式下调T细胞介导的延迟型超敏反应(DTH)应答。
为了开发DTH模型，将Balb/c小鼠用在完全和不完全弗氏佐剂中乳化的模型抗原钥孔
Figure 198347DEST_PATH_IMAGE028
血蓝蛋白(KLH)的皮下施用进行致敏。RUR20kD-IL-2组合物(0.003、0.01、0.3、0.1或0.3 mg/kg，q3d)或环孢菌素A(10 mg/kg，qd)的皮下施用在第0天开始，并继续至第8天，在第5天用施用的KLH进行皮内攻击，并且测量耳肿胀四天。对发炎的耳进行免疫组织化学(IHC)，以定量KLH攻击后FoxP3+ Treg细胞的百分比。在额外的3-4周后，在未通过KLH再攻击进行处理或用不相关抗原卵清蛋白(OVA)进行致敏和攻击的情况下，评价应答的特异性。为了理解RUR20kD-IL-2组合物扩增的Treg对食物过敏原的作用，将Balb/C小鼠一周内两次通过用明矾乳化OVA腹膜内致敏两次。第2次致敏十天后，将小鼠每隔一天用OVA口服攻击八次。RUR20kD-IL-2组合物(0.1 mg/kg，q3dx3)或环孢菌素A(10 mg/kg，qd)的皮下施用在第0天开始，并继续到第8天。通过第8次攻击后的30-45 min内的临床评分评价过敏应答的严重程度。此外，定量血清肥大细胞蛋白酶1 (MCPT 1)和OVA特异性IgE滴度。通过流式细胞术测定外周血和脾中的% Treg。
在DTH的该小鼠模型中，RUR20kD-IL-2组合物施用以剂量依赖的方式抑制对KLH再攻击的炎性应答。发炎的耳的IHC分析显示FoxP3+ Treg细胞的明显浸润。对炎症的抑制作用是持久的并且是抗原特异性的，如在3-4周后用相同的抗原再攻击和在致敏后用不相关的抗原再攻击(而不进一步施用RUR20kD-IL-2组合物)所例举。最后，发现RUR20kD-IL-2组合物的施用在减少由重复施用模型食物变应原OVA引起的高度过敏反应症状中是有效的。过敏性反应的临床评分的降低与MCPT1和抗OVA特异性IgE滴度的水平的显著降低以及Treg的显著增加相关。RUR20kD-IL-2组合物在这种KLH超敏小鼠模型中表明抗原特异性和持久性的Treg扩增以及治疗应答。此外，发现RUR20kD-IL-2组合物在食物过敏模型中是有效的。该数据支持将RUR20kD-IL-2组合物用于抗原特异性炎症，如自身免疫性和/或炎性疾病中的情况一样。
本文提供的临床前证据支持以下概念：IL-2缀合物Treg刺激剂RUR20kD-IL-2组合物增加调节性T细胞的数量和抑制功能，用于治疗自身免疫性和炎性病症。IL-2产生受损和调节性T细胞功能障碍已被牵涉为多种自身免疫性疾病中的免疫机制。尽管低剂量的IL-2可用于刺激Treg以得到临床益处，但不良的药代动力学需要每天递送，不良事件是剂量限制的，并且Treg增加是适度且短期的。RUR20kD-IL-2组合物提供了意欲用于低剂量皮下施用以选择性恢复Treg内稳态、而对常规T细胞功能的影响最小的IL-2缀合物Treg刺激剂。本文提供了表征RUR20kD-IL-2组合物选择性扩增小鼠和非人灵长类动物模型中的Treg的数目和活性的能力以及评价RUR20kD-IL-2组合物在自身免疫性模型中的效力的数据。通过表面等离振子共振来评价对IL-2受体的亲和力。可以使用流式细胞术和飞行时间质量细胞术(CyToF)在多个淋巴细胞群体中通过pSTAT5诱导来测量人PBMC中的活性。通过流式细胞术通过淋巴细胞数目和活化的变化来测量C57BL/6小鼠或食蟹猴中皮下施用后的体内活性。离体Treg功能通过分离的脾脏Treg对Tcon增殖的抑制来确定。使用MRL/MpJ-Faslpr小鼠在系统性红斑狼疮(SLE)的模型中评价效力。相对于IL-2Rα和IL-2Rαβ复合物，RUR20kD-IL-2组合物对人IL-2Rβ的亲和力大大减弱，表明表达高亲和力IL-2Rαβγ的Treg相比于表达低亲和力IL-2Rβγ的Tcon的优先活化。在体外，Treg对RUR20kD-IL-2组合物刺激更敏感，显示STAT5磷酸化相对于人PBMC中的其他淋巴细胞亚群的增加。在小鼠中，单次施用导致血液和脾脏中的Treg动员持续7-10天，而没有Tcon活化，与Treg活化标志物的诱导和增加的离体抑制能力相一致的效果。在食蟹猴中，与持续五天每天施用的等效总剂量的rhIL-2相比，血浆暴露更延长，其中单次施用后Treg动员和活性持续超过14天 – 在幅度、持续时间和特异性中优异的应答。最后，RUR20kD-IL-2组合物在SLE的小鼠模型中是有效的。在SLE模型中，在12周内重复施用RUR20kD-IL-2组合物维持Treg升高，降低血液尿素氮并使尿蛋白水平和肾脏组织病理学回复至正常。在cGVHD模型中，RUR20kD-IL-2组合物的重复施用增加Treg并减少脾脏中的生发中心B细胞，并逆转肺功能障碍。RUR20kD-IL-2组合物提供Treg的持续、优先的活化，并且证明在SLE模型系统中的效力。
实施例10
I期、双盲、随机化的安慰剂对照研究，以评估健康志愿者中的RUR20kD-IL-2组合物的单次递增皮下剂量的安全性、耐受性、药代动力学和药效动力学
进行一项双盲、随机化、安慰剂对照的研究，以评估健康志愿者中的单次递增低皮下剂量的RUR20kD-IL-2组合物(RUR20kD-IL-2)的安全性、耐受性、药代动力学和药效动力学。该研究分为七个群组，其中受试者接受0.3、1.0、3.0、6.0、9.0、13.5或20.0 µg/kg RUR20kD-IL-2。将十二个受试者随机分至每个剂量群组，其中九个接受单次皮下剂量的RUR20kD-IL-2，而三个接受安慰剂。RUR20kD-IL-2被配制为用于皮下注射的无菌液体，其用无菌0.9%氯化钠溶液稀释。药物产品在一次性使用的玻璃小瓶中提供，并储存在2-8℃下。每个小瓶药物产品含有0.75±0.1 mg的rhIL-2(基于RUR20kD-IL-2)。将RUR20kD-IL-2配制于10 mM乙酸钠，150mM氯化钠，2% (w/v)蔗糖，pH 5.0中，浓度为近似1.0 mg/mL蛋白。安慰剂是商业可得的0.9%氯化钠溶液。0.3 μg/kg的起始剂量使用最低预期的生物学效应水平(MABEL)方法选择，并且得到来自非临床毒理学研究的最敏感物种中未观察到的不利效应水平(NOAEL)支持。起始剂量设定为0.3 µg/kg，以允许评估RUR20kD-IL-2药代动力学和安全性。向两个受试者(一个接受RUR20kD-IL-2且一个接受安慰剂)以双盲方式进行给药，并且监测可能的副作用，持续至少7天的时段，然后开始研究。
该研究的主要目标是评估作为单次皮下剂量施用的RUR20kD-IL-2的安全性和耐受性。该研究的次要目标是(1)观察调节性T细胞(Treg)的数目和/或活性的变化的时间过程和程度，(2)表征作为单次皮下剂量施用的RUR20kD-IL-2的药代动力学(PK)概况，和(3)评价RUR20kD-IL-2在血液中的免疫学作用，包括对细胞因子、T细胞、其他外周血群体、其他血清蛋白、基因表达的变化和抗药物抗体的影响。在研究的第一期，在给药前直至给药后20小时，测试免疫标志物。具体地，在RUR20kD-IL-2和安慰剂接受群组中测试Treg、CD4+-T细胞、CD8+-T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子、可溶性CD25和RNA。在后续期中，还在给药后4-、5-、6-、7-、8-、10-、12-、15-、18-、20-、25-、30-、40和50-天测试相同的免疫标志物。
没有报告剂量限制性毒性(DLT)、严重不良事件(SAE)、死亡或临床明显的异常。不良事件(AE)限于轻度(1级)注射部位反应，并且没有观察到已知与高剂量IL-2相关的AE的证据。
初步PK分析显示，在大多数受试者中，RUR20kD-IL-2在给药后约4-6天达到最大浓度，浓度几乎没有变化，直至给药后近似2周，其后浓度下降，其中半衰期为近似8-9天。
药效动力学(PD)评价揭示RUR20kD-IL-2导致循环CD4+FoxP3+CD25亮 Treg的剂量依赖性增加。在3.0、6.0、9.0、13.5和20.0 μg/kg单剂量群组中，循环CD4+FoxP3+CD25亮 Treg的绝对数目持续增加，其中水平直至施用后近似20至25天才回复至基线。在3.0、6.0、9.0、13.5和20.0 μg/kg剂量下，与给药前相比，CD4+FoxP3+CD25亮 Treg的数目分别平均增加3-倍、3.5-倍、4.1-倍、5-倍和8.1-倍。在3.0、6.0、9.0、13.5和20.0 μg/kg剂量下，总CD4+FoxP3+CD25+Treg群体也增加，但变化幅度小于对于CD4+FoxP3+CD25亮 Treg的观察值。在0.3和1.0 μg/kg剂量下，与接受安慰剂的受试者相比，RUR20kD-IL-2治疗的受试者中的Treg的数目相比于安慰剂受试者没有变化。看到RUR20kD-IL-2对Treg的主要作用，因为在任何剂量下，用RUR20kD-IL-2未观察到T细胞群体(CD4+，CD8+)的百分比或数目的变化。在13.5和20.0 μg/kg下，NK细胞的百分比和绝对数目增加较小，而没有与高剂量IL-2相关的AE的证据。
如图12中所示，RUR20kD-IL-2组合物导致CD4+FoxP3+CD25亮 Treg的剂量依赖性增加。在3.0、6.0、9.0和13.5 μg/kg下，CD4+FoxP3+CD25亮Treg的绝对数目持续增加，其中水平没有回复至基线，直至施用后20-25天。在3.0、6.0、9.0和13.5 μg/kg剂量下，与安慰剂相比，CD4+FoxP3+CD25亮 Treg的数目分别平均增加3.0-倍、3.5-倍、4.1-倍和5.0-倍，其中最大应答从3.0 μg/kg下的84小时时的峰值转变至13.5 μg/kg下持续7至12天的更延长的峰值应答，然后到第20-25天回复至基线水平。如图13中所示，在3.0、6.0、9.0和13.5 μg/kg剂量下，总CD4+FoxP3+CD25+ Treg群体也存在剂量依赖性增加，但变化的幅度小于CD4+FoxP3+CD25亮 Treg的观察值。在0.3 μg/kg和1 μg/kg剂量下，没有观察到RUR20kD-IL-2治疗的受试者中的总CD4+Treg相比于安慰剂受试者的变化(图13)。
重要地，看到RUR20kD-IL-2对Treg的主要作用，因为在RUR20kD-IL-2或安慰剂治疗的受试者中没有观察到Tcon细胞群体(CD4+，CD8+)的百分比的变化。然而，在13.5 μg/kg下，在RUR20kD-IL-2受试者中观察到CD8+ T的绝对数目和Ki67+ CD8+ T细胞的百分比的小量增加(图14A-D)。在任何剂量水平下，CD4+ T细胞绝对数目都没有变化。
还分析CD56+ NK细胞群体。注意到循环NK细胞的绝对数目的增加，其中该细胞亚群的百分比在13.5 μg/kg剂量水平下增加较小，但在较低剂量水平下则不是。此外，在3.0、6.0、9.0和13.5 μg/kg下还注意到表达Ki67(增殖的标志物，且因此是活化的标志物)的CD56+ NK细胞的百分比的剂量依赖性增加。在3.0、6.0和9.0 μg/kg下，在施用RUR20kD-IL-2后，表达Ki67的百分比分别近似为10%、20-30%和30-40%。在13.5 μg/kg剂量下，表达Ki67的百分比没有进一步增加，其维持在30-40%。
根据SAD研究的RUR20kD-IL-2治疗导致CD4+FoxP3+CD25亮 Treg的数目的持续增加，其中水平直至施用后20-25天才回复至基线。总CD4+FoxP3+CD25+ Treg群体也增加，尽管变化的幅度小于CD4+FoxP3+CD25亮 Treg的观察值。在13.5 μg/kg下观察到CD8+ T细胞和NK细胞的数目增加。
还计算RUR20kD-IL-2,20.0 mg/kg (n=13)；安慰剂(n=3)，和RUR20kD-IL-2，28.0 mg/kg (n=9)；安慰剂(n=3)的额外群组。追踪每个群组50天，以评价在健康志愿者中皮下施用单次递增剂量的RUR20kD-IL-2对受试者中的安全性和耐受性的影响，如通过不良事件、生命体征和临床实验室评价以及Treg、Tcon和NK细胞和亚群的数目和活性的变化的时间进程和程度、RUR20kD-IL-2的药代动力学和其他免疫学效应、诸如细胞因子水平、外周血细胞群体、血清蛋白和基因表达所评估。
通常，安全性结果发现没有剂量限制性毒性，死亡或导致研究中断的不良事件，没有临床上明显的生命体征，ECG或身体检查异常。不良事件主要限于轻度或中度(1级或2级)注射部位反应，4个受试者经历1级头痛事件，1个测试最高剂量(28.0 µg/kg)的受试者经历轻度(1级)体征以及发热、厌食、呕吐、腹泻、心动过速和肌痛(严重程度均为1级)的症状(其归因于细胞因子水平升高)，且未诱发抗药物抗体。
通常，观察到响应于RUR20kD-IL-2的CD25-亮Treg的持续剂量依赖性增加(参见图15)。在28 µg/kg的RUR20kD-IL-2组合物时，在CD25-亮Treg的数目中观察到高于给药前值的17倍平均峰值增加。Treg水平在第10-12天达到峰值，并且直至施用后20-25天才回复至基线。在剂量>13.5 µg/kg，观察到Treg活化标志物ICOS和CTLA4的增加。
在Tcon细胞的百分比中未观察到实质性变化，并且观察到CD56+ NK细胞响应于RUR20kD-IL-2的最小增加(参见图16)。(还列举CD16+CD56+ NK细胞，数据未显示)。NK细胞的增加不是剂量依赖性的。在最高浓度的RUR20kD-IL-2下，观察到NK细胞增加2倍。RUR20kD-IL-2诱导Treg的剂量依赖性增加，而不诱导CD8+ T细胞，最高达28 µg/kg。在28 µg/kg下，RUR20kD-IL-2施用导致平均峰值Treg:CD8相比于基线增加15倍(参见图17)。
研究目标评价RUR20kD-IL-2在皮下(SC)施用单次递增剂量的人中的安全性和耐受性。此外，研究外周血中的Treg、常规CD4+和CD8+ T细胞、NK细胞的数目和百分比、细胞因子水平和药代动力学(PK)的变化的时间进程和程度。在这项人类中首次、双盲、单次递增剂量研究中，健康志愿者接受范围为0.3至28 ug/kg的SC剂量(每个群组9个活性剂：3个安慰剂)，并且追踪受试者50天。所有8个计划的群组都完成给药。没有剂量限制性毒性，严重不良事件，死亡或生命体征、心电图或实验室测试值的临床明显的异常。归因于RUR20kD-IL-2的不良事件主要限于轻度(1级)注射部位反应。一个测试最高剂量的受试者表明细胞因子水平升高和淋巴细胞减少的短暂和轻度(1级)症状，其不经治疗即缓解。任何剂量水平的其他个体都没有已知与IL-2疗法相关的全身体征或症状。迄今为止，前6个群组已针对抗药物抗体进行测试，并且无一检测到。RUR20kD-IL-2在施用后4-6天达到最高血浆水平，其中持续~2周几乎没有变化，且然后下降，其中半衰期为~ 8‐9天。看到RUR20kD-IL-2对Treg的主要作用。在3.0至28.0 ug/kg剂量群组中，观察到循环CD4+FoxP3+CD25亮 Treg的绝对数目和百分比的剂量依赖性和持续的增加。升高的水平在第10-12天达到峰值，并且直至施用后~20至25天才回复至基线。在28.0 ug/kg下，这些CD25亮Treg的数目的平均峰值增加高于基线17倍，并且平均峰值百分比从0.5%增加至7.4%。另外，在≥13.5ug/kg的剂量下，Treg活化标志物增加。在测试的最高剂量下，NK细胞的百分比和数目平均增加3.5-倍，但没有观察到常规CD4+或CD8+ T细胞的百分比或数目的变化。RUR20kD-IL-2组合物选择性诱导Treg，这由28.0 ug/kg组中的平均峰值Treg:CD8比率比基线增加15倍来证明。总之，在测试的剂量范围内，单一剂量的IL-2缀合物T-reg刺激剂RUR20kD-IL-2被良好耐受，并且是安全的。RUR20kD-IL-2导致循环CD25亮Treg的显著和选择性的剂量依赖性增加，其中对常规T细胞的影响最小，且对NK细胞的影响相对小。这些临床结果扩展先前的显示RUR20kD-IL-2的持久和Treg选择性作用的动物研究，并且为测试RUR20kD-IL-2作为自身免疫性疾病、诸如系统性狼疮的新治疗剂提供了强烈的支持。
RUR20kD-IL-2组合物在这项人类中首次的单次递增剂量研究中是安全的且被良好耐受，并且导致循环CD25-亮Treg细胞的显著和选择性的剂量依赖性增加。对Tcon和NK细胞的影响最小，并且该研究数据为在自身免疫性和炎性疾病中测试RUR20kD-IL-2提供了支持。
实施例11
I期、双盲、随机化的安慰剂对照的递增多剂量研究，以评估皮下RUR20kD-IL-2在具有系统性红斑狼疮的患者中的安全性、耐受性、药代动力学和药效动力学
进行一项双盲、随机化、安慰剂对照的研究，以评估4个剂量群组的具有最小至中度系统性红斑狼疮(SLE)的患者中的递增多剂量的RUR20kD-IL-2的安全性、耐受性、PK和免疫学效应。还评估对SLE疾病活动的影响。将12个具有最小至中度疾病活动的SLE患者随机分为4个剂量群组的每个，其中9个接受多次1.0 mg/mL水溶液皮下剂量的RUR-IL-2-20kD，而3个接受安慰剂。如本文所述，例如如实施例1-A中所述，制备RUR20kD-IL-2药物和安慰剂。不需要活跃的临床SLE疾病活动作为纳入标准。在群组1中，以两周间隔(第1、15和29天) 3次施用3.0μg/kg的起始剂量。该起始剂量基于先前在上述研究中确定的单次皮下剂量的RUR20kD-IL-2的有利的安全性和PD概况。群组2、3和4中的随后剂量水平分别是先前剂量群组的剂量水平的最高达两倍。群组1-3中的患者以两周间隔接受三个剂量的研究药物，经总共四周。在研究过程中待评估的剂量范围为3.0 μg/kg至24 μg/kg。群组4中的患者接受在第1、15、29、43、57、71和85天施用的用RUR20kD-IL-2治疗十二周。该群组提供了关于施用的安全性以及在RUR20kD-IL-2治疗的较长持续时间内的PK和PD概况的数据。在接受最终剂量的RUR20kD-IL-2或安慰剂后，追踪患者额外50天，以评估安全性、PK、PD和初步效力。安全性审查委员会在最后患者的第三次给药后两周针对可能的安全性问题评估每个群组中的十二个受试者中的八个。此外，安全性审查委员会评估群组4中的所有患者两次：(1)在前八个受试者接受其第三剂量后两周，和(2)在所有受试者接受所有剂量的研究药物后两周。除了安全性发现以外，还使用免疫学变化，包括Treg、CD4+-T细胞、CD8+-T细胞和NK细胞应答、细胞因子水平以及可用的PK数据，来确定剂量水平。该研究的主要目标是评估作为多次递增皮下剂量向具有SLE的患者施用的RUR20kD-IL-2的安全性和耐受性。该研究的次要目标是(1)在具有SLE的患者中多次皮下给药后表征RUR20kD-IL-2的PK概况，(2)评价RUR20kD-IL-2对具有SLE的患者中的PD生物标志物(包括Treg和Treg亚群、CD4+-T细胞、CD8+-T细胞、NK细胞的数目和功能，和细胞因子水平)的变化的时间进程和程度的影响，(3)评价RUR20kD-IL-2对具有SLE的患者中的针对双链DNA的抗体的存在和水平以及补体C3和C4的水平的影响，和(4)评价RUR20kD-IL-2对SLE患者中的疾病活动的影响。在下表15中，将描绘来自递增多剂量研究的初步PK数据的结果与来自单次皮下研究的数据进行比较：
表15. 单剂量和多剂量人研究中的PK数据
Figure 767869DEST_PATH_IMAGE036
Figure IDA0002789069800000011
Figure IDA0002789069800000021

Claims (56)

1.包含具有以下结构的PEG化IL-2缀合物的组合物：
Figure 3750DEST_PATH_IMAGE001
Figure 124153DEST_PATH_IMAGE002
其中：
IL-2是白介素-2；
n在每次出现时独立地是约3至约4000的整数。
2.权利要求1的组合物，其中IL-2是阿地白介素。
3.权利要求2的组合物，其中所述组合物包含不超过约20摩尔%的当共同考虑时由下式涵盖的PEG化IL-2缀合物
Figure 497365DEST_PATH_IMAGE003
其中n’选自1、4、5，或大于5的整数。
4.权利要求3的组合物，其中所述组合物包含不超过约15摩尔%的当共同考虑时由下式涵盖的PEG化IL-2缀合物
Figure 220471DEST_PATH_IMAGE004
其中n’选自1、4、5，或大于5的整数。
5.权利要求3的组合物，其中所述组合物包含不超过约10摩尔%的当共同考虑时由下式涵盖的PEG化IL-2缀合物
Figure 503684DEST_PATH_IMAGE005
其中n’选自1、4、5，或大于5的整数。
6.权利要求3-5中任一项的组合物，其包含不超过约10 mol %的n’等于1的PEG化IL-2缀合物。
7.权利要求3-5中任一项的组合物，其包含不超过约7 mol %的n’等于1的PEG化IL-2缀合物。
8.权利要求3-5中任一项的组合物，其包含不超过约5 mol %的n’等于1的PEG化IL-2缀合物。
9.权利要求3-8中任一项的组合物，其包含不超过约10 mol %的n’等于4的PEG化IL-2缀合物。
10.权利要求3-8中任一项的组合物，其包含不超过约7 mol %的n’等于4的PEG化IL-2缀合物。
11.权利要求3-8中任一项的组合物，其包含不超过约5 mol %的n’等于4的PEG化IL-2缀合物。
12.权利要求1的包含PEG化IL-2缀合物的混合物的组合物，其中所述组合物包含近似等摩尔量的
Figure 654043DEST_PATH_IMAGE006
Figure 389918DEST_PATH_IMAGE007
。
13.权利要求2的包含PEG化IL-2缀合物的混合物的组合物，其中所述组合物包含具有下式的PEG化IL-2缀合物：
Figure 588818DEST_PATH_IMAGE008
Figure 585593DEST_PATH_IMAGE009
其中(II)/(III)的摩尔比选自1.4:1；1.3:1；1.2:1；1.1:1；1:1；1:1.1；1:1.2；1:1.3；和1:1.4。
14.权利要求13的组合物，其每个阿地白介素的支链聚乙二醇部分
Figure 172432DEST_PATH_IMAGE010
的平均数目选自2；2.1；2.2；2.3；2.4；2.5；2.6；2.6；2.7；2.8；2.9；和3。
15.权利要求13的组合物，其中每个阿地白介素的支链聚乙二醇部分的平均数目为约2.5。
16.权利要求1-15中任一项的组合物，其中n的值范围为5-2000。
17.权利要求1-15中任一项的组合物，其中n的值范围为10-1000。
18.权利要求1-15中任一项的组合物，其中n的值范围为10-750。
19.权利要求1-15中任一项的组合物，其中n的值范围为10-500。
20.权利要求1-15中任一项的组合物，其中n的值范围为20-250。
21.权利要求1-15中任一项的组合物，其中n的平均值为约226。
22.权利要求1-15中任一项的组合物，其中每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约250道尔顿至约90,000道尔顿的范围内。
23.权利要求1-15中任一项的组合物，其中每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约1000道尔顿至约60,000道尔顿的范围内。
24.权利要求1-15中任一项的组合物，其中每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约5,000道尔顿至约60,000道尔顿的范围内。
25.权利要求1-15中任一项的组合物，其中每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量在约10,000道尔顿至约55,000道尔顿的范围内。
26.权利要求1或2的组合物，在摩尔基础上，所述组合物包含约5 mol %或更少的单-PEG化的IL-2缀合物，和约28 mol %至约60 mol %的二-PEG化的IL-2缀合物，和约24 mol %至约65 mol %的三-PEG化的IL-2缀合物，和约12 mol %或更少的更高PEG化的IL-2缀合物，且其中每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。
27.权利要求26的组合物，其进一步包含80%或更多的组合的二-和三-PEG化的IL-2缀合物。
28.权利要求1或2的组合物，在摩尔基础上，所述组合物包含约2.5至约4.5 mol %的单-PEG化的IL-2缀合物，和约35至约50 mol %的二-PEG化的IL-2缀合物，和约38至约46mol %的三-PEG化的IL-2缀合物，和约3至约10 mol%的更高PEG化的IL-2缀合物，且其中每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。
29.权利要求28的组合物，其进一步包含约80至95 mol %的组合总量的二-PEG化和三-PEG化的IL-2缀合物。
30.权利要求1或2的组合物，在摩尔基础上，所述组合物包含约2.8至约3.8 mol %的单-PEG化的IL-2缀合物，和约44至约48 mol %的二-PEG化的IL-2缀合物，和约41至约44mol %的三-PEG化的IL-2缀合物，和约7至约9 mol%的更高PEG化的IL-2缀合物，且其中每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。
31.权利要求30的组合物，其进一步包含约87至90 mol %的组合总量的二-PEG化和三-PEG化的IL-2缀合物。
32.权利要求1或2的组合物，在摩尔基础上，所述组合物包含约2.8至约3.8 mol %的单-PEG化的IL-2缀合物，和约44至约48 mol %的二-PEG化的IL-2缀合物，和约41至约44mol %的三-PEG化的IL-2缀合物，和约7至约9 mol%的更高PEG化的IL-2缀合物，且其中所述组合物包含具有在赖氨酸K7或K8或K31或K75之一处附接的PEG部分的单-PEG化的IL-2缀合物的混合物，且其中每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。
33.权利要求32的组合物，其进一步包含约87至90 mol %的组合总量的二-PEG化和三-PEG化的IL-2缀合物。
34.权利要求1或2的组合物，在摩尔基础上，所述组合物包含约2.8至约3.8 mol %的单-PEG化的IL-2缀合物，和约44至约48 mol %的二-PEG化的IL-2缀合物，和约41至约44mol %的三-PEG化的IL-2缀合物，和约7至约9 mol%的更高PEG化的IL-2缀合物，且其中所述组合物包含具有在赖氨酸K7处附接的PEG部分的单-PEG化的IL-2缀合物，其中每个支链聚乙二醇部分的标称平均分子量是约20,000道尔顿。
35.权利要求34的组合物，其进一步包含约87至90 mol %的组合总量的二-PEG化和三-PEG化的IL-2缀合物。
36.权利要求1-35中任一项的组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂。
37.权利要求1-35中任一项的组合物，其呈适合于肠胃外施用的形式。
38.权利要求1-35中任一项的组合物，其呈适合于皮下施用的形式。
39.权利要求36的组合物，其包含水性稀释剂。
40.权利要求39的组合物，其具有约5的pH。
41.权利要求39或权利要求40的组合物，其进一步包含乙酸钠、氯化钠和蔗糖。
42.权利要求37的组合物，其包含1.5mg/ml蛋白当量、10 mM乙酸钠、110 mM氯化钠、2%蔗糖(w/v)，pH 5.0。
43.通过向受试者施用治疗有效剂量的权利要求1-42中任一项的组合物来增加所述受试者中的调节性T细胞与效应T细胞的比率的方法。
44.权利要求43的方法，其中所述调节性T细胞选自Foxp3+和CD25+细胞。
45.权利要求44的方法，其中所述效应T细胞选自CD4+和CD8+细胞。
46.权利要求43-45中任一项的方法，其中当在体内小鼠模型中评估时，当与基线相比时，调节性T细胞中的倍数增加达到至少约2的值。
47.权利要求43-45中任一项的方法，其中当在体内小鼠模型中评估时，当与基线相比时，调节性T细胞中的倍数增加达到至少约4的值。
48.权利要求43-47中任一项的方法，其中在施用后，调节性T细胞数目的增加维持高于基线水平，持续至少3天。
49.权利要求43的方法，其中在施用后，调节性T细胞数目的增加维持高于基线水平，持续至少5天。
50.治疗具有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-42中任一项的组合物。
51.权利要求50的方法，其中所述施用通过皮下注射进行。
52.权利要求50-51中任一项的方法，其中所述施用每2周一次或每4周一次实施。
53.权利要求50-52中任一项的方法，其中所述施用包括每两周一次在3-24μg/kg之间的剂量。
54.根据权利要求1-42中任一项所述的组合物，其用于疗法中。
55.根据权利要求1-42中任一项所述的组合物，其用于治疗自身免疫性疾病。
56.根据权利要求1-42中任一项所述的组合物用于制备用于治疗自身免疫性疾病的药物的用途。
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