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KR102675219B1 - Ｓｉｒｐ-알파 변이체 구성체 및 이의 용도 - Google Patents

Ｓｉｒｐ-알파 변이체 구성체 및 이의 용도 Download PDF

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KR102675219B1
KR102675219B1 KR1020160100696A KR20160100696A KR102675219B1 KR 102675219 B1 KR102675219 B1 KR 102675219B1 KR 1020160100696 A KR1020160100696 A KR 1020160100696A KR 20160100696 A KR20160100696 A KR 20160100696A KR 102675219 B1 KR102675219 B1 KR 102675219B1
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코레이 굿맨
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마리자 브를직
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알렉소 온콜로지 인크.
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Abstract

본 발명은 SIRP-α 변이체를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체의 조성물 및 방법에 관한 것이다. SIRP-α 변이체 구성체는 환경 인자, 예컨대 pH, 저산소, 및/또는 종양-연관 효소 또는 종양-연관 항원의 존재에 반응하도록 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체는 다양한 질환, 예컨대 암, 바람직하게는 고형 종양 또는 혈액학적 암을 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

ＳＩＲＰ-알파 변이체 구성체 및 이의 용도{SIRP-ALPHA VARIANT CONSTRUCTS AND USES THEREOF}
본 발명은 SIRP-α 변이체 구성체 및 이의 용도에 관한 것이다.
신호-조절 단백질 α(SIRP-α)는 골수성 세포의 막 상에서 광범위하게 발현되는 단백질이다. SIRP-α는 체내 많은 세포 유형에서 폭넓게 발현되는 단백질인, CD47과 상호작용한다. SIRP-α와 CD47의 상호작용은 그렇지 않으면 면역계에 의해 인식될 수 있는, "자기" 세포의 흡입을 방지한다. SIRP-α는 SHP-2(SH-2 도메인 함유 티로신 포스파타제)의 결합제로 처음 발견되었다. CD47은 난소 암종 세포 상에서 과발현되는 항원으로서 초기에 특징규명되었다.
2000년에, Oldenborg 등은 마우스 모델에서 CD47-결핍 적혈 세포(RBC)의 투여가 체내에서 RBC의 신속한 제거를 일으킬 수 있음을 보여주어, CD47이 "자기" 세포의 일부 서브셋에 대한 "보호성" 신호임을 입증하였다. 이후에, SIRP-α와 암 간의 잠재적인 연결성이 더욱 연구되었다. 종양 세포 상에서 높은 CD47 발현이 급성 골수성 백혈병(AML) 및 몇몇 고형 암에서, 생존을 위한 음성 예후 인자로 작용함을 발견하였다. CD47와 SIRP-α 간 상호작용을 파괴하는데 집중하는 전략, 예컨대 CD47 또는 SIRP-α를 차폐하는 작용제의 투여가 잠재적인 항암 요법으로 검토되었다.
그러나, 이들 치료 전략을 고려시, SIRP-α가 인간 체내의 많은 상이한 세포 유형 상의 CD47에 결합할 수 있다는 것이 고려할 문제이다. 따라서, 질환 세포 또는 질환 부위의 세포에서만 CD47에 우선적으로 결합하도록 SIRP-α를 조작할 필요가 존재한다.
본 발명은 신호-조절성 단백질 α(SIRP-α) 변이체 구성체를 특징으로 한다. SIRP-α 변이체 구성체는 SIRP-α 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 질환 부위(예를 들어, 비질환 부위 보다는 종양 부위)에서 우선적인 활성을 갖는다. 일정 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 질환 세포(예를 들어, 종양 세포) 상의 CD47에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 생리적 조건 하에서 보다는 산성 pH(예를 들어, 대략 pH 7 미만) 및/또는 저산소 상태 하에서 CD47에 대해 더 높은 친화성으로 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 히스티딘 잔기로 또는 질환 부위에서 SIRP-α 변이체 구성체의 우선 결합을 허용하는 다른 아미노산으로의 아미노산의 1 이상의 치환을 함유한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 차단 펩티드에 의해 비질환 부위의 CD47과의 결합이 방지된다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 표적화 모이어티(예를 들어, 종양-연관 항원에 대한 항체 또는 항체-결합 펩티드)에 의해 질환 부위(예를 들어, 종양)에 표적화된다. 본 발명은 또한 다양한 질환, 예컨대 암, 바람직하게는 고형 종양 암 및 혈액학적 암을 치료하기 위한 SIRP-α 변이체 구성체를 함유하는 방법 및 약학 조성물을 특징으로 한다.
일 측면에서, 본 발명은 신호-조절성 단백질 α(SIRP-α) 변이체 구성체를 특징으로 하고, 여기서 SIRP-α 변이체 구성체는 비질환 세포보다는 질환 세포 또는 질환 부위 상의 CD47에 우선적으로 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 비질환 세포 상의 CD47에 결합하는 것보다 높은 친화성으로 질환 부위 또는 질환 세포 상의 CD47에 결합한다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 차단 펩티드에 부착된 SIRP-α를 포함한다. 일부 구체예에서, 차단 펩티드는 SIRP-α 변이체에 대한 것보다 야생형 SIRP-α에 대해 더 높은 친화성으로 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 차단 펩티드에 대한 것보다 야생형 CD47에 대해 더 높은 친화성으로 결합한다.
일부 구체예에서, 차단 펩티드는 CD47-기반 차단 펩티드이다. 일부 구체예에서, CD47-기반 차단 펩티드는 CD47의 야생형, IgSF 도메인(서열번호 35)의 서열 또는 이의 단편과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, CD47-기반 차단 펩티드는 서열번호 38 또는 40의 서열을 갖는다.
본원은 본원에 기술된 SIRP-α 변이체를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체를 제공하고, 여기서 상기 SIRP-α 변이체는 적어도 하나의 링커(예를 들어, 절단성 링커)의 사용을 통해 본원에 기술된 차단 펩티드에 부착된다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 야생형 SIRP-α와 동일한 CD47 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 야생형 SIRP-α와 비교하여 1 또는 그 이상의 돌연변이, 또는 삽입을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 야생형 SIRP-α의 절단형일 수 있다. 일부 구체예에서, 차단 펩티드는 CD47 모방체, 변이체, 또는 본원에 기술된 단편일 수 있다. 일부 구체예에서, 차단 펩티드는 SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체와 비교하여, 야생형 SIRP-α에 대해 더 높은 친화성을 나타낼 수 있다. 일부 구체예에서, 차단 펩티드는 야생형 CD47과 비교하여 SIRP-α 변이체에 대해 더 낮은 친화성이 입증된 CD47 변이체 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체와 차단 펩티드 사이의 링커는 1 이상의 프로테아제에 의해 경우에 따라 절단될 수 있는 적어도 하나의 링커일 수 있다. 일부 구체예에서, 링커는 경우에 따라 또한 1 이상의 스페이서를 포함한다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 절단성 링커 및 선택적으로 1 이상의 스페이서에 의해 차단 펩티드에 부착된다. 일부 구체예에서, 절단성 링커는 산성 pH 및/또는 저산소 상태에서 절단된다. 일부 구체예에서, 절단성 링커는 종양-연관 효소에 의해 절단된다. 일부 구체예에서, 종양-연관 효소는 프로테아제이다. 일부 구체예에서, 프로테아제는 마트립타제(matriptase)(MTSP1), 비뇨기형 플라스미노겐 활성인자(uPA), 레구마인(legumain), PSA(또한 KLK3, 칼리크레인-관련 펩티다제-3이라고도 함), 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2), MMP9, 인간 호중구 엘라스타제(HNE), 및 프로테이나제 3(Pr3)으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 프로테아제는 마트립타제이다. 일부 구체예에서, 절단성 링커는 LSGRSDNH(서열번호 47)의 서열 또는 표 7에 열거된 서열 중 어느 하나를 갖는다. 일부 구체예에서, 절단성 링커는 다음의 서열(예를 들어, 표 7을 참조함) 중 하나 또는 이의 조합을 포함한다: PRFKIIGG, PRFRIIGG, SSRHRRALD, RKSSIIIRMRDVVL, SSSFDKGKYKKGDDA, SSSFDKGKYKRGDDA, IEGR, IDGR, GGSIDGR, PLGLWA, GPLGIAGI, GPEGLRVG, YGAGLGVV, AGLGVVER, AGLGISST, DVAQFVLT, VAQFVLTE, AQFVLTEG, PVQPIGPQ, L/S/G-/R--/S-/D/N/H, -/s/gs/Rk-/rv/-/-/-, SGR-SA, L/S/G-/R--/S-/D/N/H, r/-/-/Rk-/v-/-/g/-, RQAR-VV, r/-/-/Rk/v/-/g, /Kr/RKQ/gAS/RK/A, L/S/G-/R-/S-/D/N/H, -/-/-/N/-/-/-, AAN-L, ATN-L, si/sq/-/yqrs/s/-/-, S/S/K/L/Q, -/p/-/- /li/-/-/-, g/pa/-/gl/-/g/-, G/P/L/G/I/A/G/Q, P/V/G/L/I/G, H/P/V/G/L/L/A/R, -/-/-/viat-/-/-/-, 및 -/y/y/vta -/-/-/-, 여기서 "-"는 임의의 아미노산(즉, 임의의 천연 유래 아미노산)을 의미하고, 대문자는 그 아미노산에 대한 강력한 선호도를 나타내며, 소문자는 그 아미노산에 대한 적은 선호도를 의미하며, "/"는 "/"에 인접한 위치에서 1보다 많은 아미노산이 가능한 경우에서 아미노산 위치들을 분리한다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 항체-결합 펩티드에 부착된다. 일부 구체예에서, 항체-결합 펩티드는 가역적으로 또는 비가역적으로 항체의 불변 영역에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체-결합 펩티드는 항체의 단편 항원-결합(Fab) 영역에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 항체-결합 펩티드는 항체의 가변 영역에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 항체는 세툭시맙이다. 일부 구체예에서, 항체-결합 펩티드는 질환 국재화(localization) 펩티드(DLP)의 서열(CQFDLSTRRLKC(서열번호 64) 또는 CQYNLSSRALKC(서열번호 65)) 또는 이의 단편과 적어도 75% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 항체-결합 펩티드는 서열번호 64의 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 Fc 도메인 단량체에 부착된다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 인간 혈청 알부민(HSA)에 부착된다. 일부 구체예에서, HSA는 서열번호 67과 비교하여, 차미노산 치환 C34S 및/또는 K573P를 포함한다. 일부 구체예에서, HSA는 다음의 서열번호 68의 서열을 갖는다:
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 알부민-결합 펩티드에 부착된다. 일부 구체예에서, 알부민-결합 펩티드는 서열번호 2의 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 중합체에 부착되고, 여기서 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬 또는 폴리시알산 사슬이다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 항체에 부착된다. 일부 구체예에서, 항체는 종양-특이적 항체이다. 일부 구체예에서, 항체(예를 들어, 종양-특이적 항체)는 세툭시맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, MEDI0680, MEDI6469, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, 반틱투맙, 발릴루맙, 모가말리주맙, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CS1 항체, 허셉틴, 트라스투주맙, 및 퍼투주맙으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 항체(예를 들어, 종양-특이적 항체)는 다음 중 1 이상에 결합할 수 있다: 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, 피브로넥틴, FR-알파, GCC, GD2, 글리피칸-3, GPNMB, HER-2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, 메소텔린, MUC16, MUC1, NaPi2b, 넥틴-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, 및/또는 CSF-1R.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는 서열번호 3-12 및 24-34 중 어느 하나의 서열과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(서열번호 13)의 서열을 가지며, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는, I이며; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이며; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이며; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이며; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이며; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이며; X15는 F, L, 또는 V이고; X16은 F 또는 V이다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는
EEGX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(서열번호 16)의 서열을 가지며, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는, I이며; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이며; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이며; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이며; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; X16은 F 또는 V이다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는
EEEX1QX2IQPDKFVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(서열번호 17)의 서열을 가지며, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는, I이며; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이며; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이며; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이며; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이며; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; X16은 F 또는 V이다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFPIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(서열번호 18)의 서열을 가지며, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는, I이며; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이며; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이며; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이며; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이며; X15는 F, L, 또는 V이고; X16은 F 또는 V이다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(서열번호 21)의 서열을 가지며, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는, I이며; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이며; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이며; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이며; X15는 F, L, 또는 V이고; X16은 F 또는 V이다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS(서열번호 14)의 서열을 가지며, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는, I이며; X3은 A 또는 V이고; X4는 V, I, 또는 L이며; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이며; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 S, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이며; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; X16은 F 또는 V이다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILLCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS(서열번호 15)의 서열을 가지며, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는, I이며; X3은 A 또는 V이고; X4는 V, I, 또는 L이며; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이며; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 S, T, 또는 G이며; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이며; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; X16은 F 또는 V이다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRGKPS(서열번호 19)의 서열을 가지며, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는, I이며; X3은 A 또는 V이고; X4는 V, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이며; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이며; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 S, T, 또는 G이며; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이며; X15는 F, L, 또는 V이고; X16은 F 또는 V이다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는
EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS(서열번호 22)의 서열을 가지며, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는, I이며; X3은 A 또는 V이고; X4는 V, I, 또는 L이며; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이며; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이며; X10은 S, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이며; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; X16은 F 또는 V이다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는
EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KSGAGTELSVRAKPS(서열번호 20)의 서열을 가지며, 여기서 X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는, I이며; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이며; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이며; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이며; X10은 S, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이며; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이고; X16은 F 또는 V이다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는
EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LIYNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23X24ITX25ADAGTYYCX26KX27RKGSPDX28X29EX30KSGAGTELSVRX31KPS(서열번호 23)의 서열을 가지며, 여기서 X1은 E 또는 G이고; X2는 L, I, 또는 V이며; X3은 V, L, 또는, I이고; X4는 S 또는 F이며; X5는 L 또는 S이고; X6은 S 또는 T이고; X7은 A 또는 V이며; X8은 I 또는 T이고; X9는 H 또는 R이고; X10은 A, V, I, 또는 L이고; X11은 I, T, S, 또는 F이며; X12는 A 또는 G이고; X13은 E, V, 또는 L이고; X14는 K 또는 R이며; X15는 E 또는 Q이고; X16은 H, P, 또는 R이고; X17은 D 또는 E이며; X18은 S, L, T, 또는 G이고; X19는 K 또는 R이며; X20은 E 또는 N이고; X21은 S 또는 P이고; X22는 S 또는 R이고; X23은 S 또는 G이고; X24는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X25는 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이며; X26은 V 또는 I이고; X27은 F, L, V이고; X28은 D이거나 부재하고; X29는 T 또는 V이고; X30은 F 또는 V이며; X31은 A 또는 G이다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는 서열번호 13-23 중 어느 하나의 서열과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 서열 동일성을 갖는다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는 서열번호 3-12 및 24-34 중 어느 하나의 서열을 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는 히스티딘 잔기로의 아미노산 잔기의 1 이상의 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 히스티딘 잔기로의 아미노산 잔기의 1 이상의 치환은 다음의 아미노산 위치 중 1 이상에 존재한다: 서열번호 3-12 중 어느 하나의 서열에 대해, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 52, 53, 54, 66, 67, 68, 69, 74, 93, 96, 97, 98, 100, 4, 6, 27, 36, 39, 47, 48, 49, 50, 57, 60, 72, 74, 76, 92, 94, 103.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 비질환 세포 보다 질환 세포 또는 질환 부위 상의 CD47에 대해 적어도 2배, 적어도 4배, 또는 적어도 6배 더 높은 친화성으로 결합한다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 중성 pH 보다는 산성 pH 하에서 CD47에 적어도 2배, 적어도 4배, 또는 적어도 6배 더 높은 친화성으로 결합한다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 생리학적 상태 하에서 보다 저산소 상태 하에서 CD47에 적어도 2배, 적어도 4배, 또는 적어도 6배 더 높은 친화성으로 결합한다.
일부 구체예에서, 질환 세포는 암 질환의 암 세포이다.
일부 구체예에서, 산성 pH는 약 4 내지 약 7의 pH이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술한 SIRP-α 변이체 구성체를 코딩하는 핵산 분자를 특징으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술한 SIRP-α 변이체 구성체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 특징으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술한 SIRP-α 변이체 구성체를 발현하는 숙주 세포를 특징으로 하며, 여기서 숙주 세포는 본원에 기술한 SIRP-α 변이체 구성체를 코딩하는 핵산 분자 또는 그 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하고, 이때 핵산 분자와 벡터가 숙주 세포에서 발현된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술한 SIRP-α 변이체 구성체를 제조하는 방법을 특징으로 하고, 여기서 방법은 a) 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체를 코딩하는 핵산 분자 또는 그 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; b) SIRP-α 변이체 구성체의 형성을 허용하는 조건 하에서 숙주 세포의 핵산 분자 또는 벡터를 발현시키는 단계; 및 c) SIRP-α 변이체 구성체를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체의 치료 유효량을 포함하는 약학 조성물을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 약학 조성물은 1 이상의 약학적 허용 담체 또는 부형제를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체 또는 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체의 치료 유효량을 포함하는 약학 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체에서 표적 세포의 식세포작용을 증가시키는 방법을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 표적 세포는 암 세포이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체 또는 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체의 치료 유효량을 포함하는 약학 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체에서 조절성 T-세포를 제거하는 방법을 특징으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 암 세포를 사멸하기 위한 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체 또는 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체의 치료 유효량을 포함하는 약학 조성물과 암 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 피험체에서 SIRP-α 및/또는 CD47 활성과 연관된 질환을 치료하기 위한 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체의 치료 유효량 또는 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체의 치료 유효량을 포함하는 약학 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 피험체에서 SIRP-α 및/또는 CD47 활성과 연관된 질환을 치료하는 방법을 특징으로 하고, 이 방법은 (a) 피험체의 SIRP-α의 아미노산 서열을 결정하는 단계; 및 (b) 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체의 치료 유효량을 피험체에게 투여하는 단계로서, 여기서 SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는 피험체의 SIRP-α와 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 피험체에서 SIRP-α 및/또는 CD47 활성과 연관된 질환을 치료하는 방법을 특징으로 하고, 이 방법은 (a) 피험체의 SIRP-α의 아미노산 서열을 결정하는 단계; 및 (b) 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체의 치료 유효량을 피험체에게 투여하는 단계로서, 여기서 SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는 피험체에서 최소의 면역원성을 갖는 것인 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 피험체에서 SIRP-α 및/또는 CD47 활성과 연관된 질환을 치료하는 방법을 특징으로 하고, 이 방법은 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 SIRP-α 변이체 구성체는 비질환 세포 상의 CD47보다 질환 세포 또는 질환 부위의 CD47에 우선적으로 결합하는 것인 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 질환은 암이다. 일부 구체예에서, 암은 고형 종양 암, 혈액학적 암, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 방광암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 폐암, 기관지암, 간암, 난소암, 결장 및 직장암, 위암, 위장암, 담낭암, 위장관 기질 종양 암, 갑상선암, 두경부암, 구강인두암, 식도암, 흑색종, 비흑색종 피부암, 메르켈 세포 암종, 바이러스 유도성 암, 신경아세포종, 유방암, 전립선암, 신장암, 신장 세포 암, 신우암, 백혈병, 림프종, 육종, 신경교종, 뇌종양, 및 암종에서 선택된다. 일부 구체예에서, 암은 고형 종양 암이다. 일부 구체예에서, 암은 혈액학적 암이다.
일부 구체예에서, 질환은 면역학적 질환이다. 일부 구체예에서, 면역학적 질환은 자가면역 질환 또는 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 자가면역 또는 염증성 질환은 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반 루푸스, 항체-매개 염증성 또는 자가면역 질환, 이식편 대 숙주 질환, 패혈증, 당뇨병, 건선, 아테롬성 동맥 경화증, 쇠그렌 증후군, 진행성 전신 경화증, 경피증, 급성 관상 증후군, 허혈성 재관류, 크론병, 자궁내막증, 사구체신염, 중증 근무력증, 특발성 폐섬유증, 천식, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 혈관염, 또는 염증성 자가면역 근육염이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 또는 본원에 기술된 SIRP-α 변이체의 치료 유효량을 포함하는 약학 조성물을 피험체에게 투여하여 피험체에서 SIRP-α와 CD47 간 상호작용을 조정하는 단계를 포함하는 피험체에서 조혈 줄기 세포 생착(engraftment)을 증가시키는 방법을 특징으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체 또는 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체의 치료 유효량을 포함하는 약학 조성물을 피험체에게 투여하여, 피험체의 면역 반응을 변경시키는 단계를 포함하는 피험체에서 면역 반응을 변경시키는 방법을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 면역 반응은 면역 반응의 억제를 포함한다.
일부 구체예에서, 피험체는 포유동물이고, 바람직하게, 포유동물은 인간이다.
정의
본 명세서에서 사용되는 용어 "질환 세포" 및 "질환 조직"은 예를 들어 암 세포 및 조직을 의미한다. 구체적으로, 암은 고형 종양 암이거나 또는 혈액학적 암일 수 있다. 예를 들어, 암이 고형 종양 암이면, 질환 세포는 고형 종양의 세포이다. 질환 세포는 종종 질환 부위의 특징적인 상태, 예컨대 산성 pH 및 저산소 하에서 생존한다. "질환 세포" 및 "질환 조직"은 또한 제한없이, 암을 포함한 다른 질환과 연관될 수 있다. "질환 세포" 및 "질환 조직"은 또한 면역학적 질환 또는 질병(장애), 심혈관 질환 또는 질병, 대사 질환 또는 질병, 또는 증식성 질환 또는 질병과 연관될 수 있다. 면역학적 질병은 염증성 질환 또는 질병 및 자가면역 질환 또는 질병을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비질환 세포"는 신체의 정상적인, 건강한 세포를 의미한다. 비질환 세포는 종종 생리학적 상태, 예컨대 세포의 정상적인 물질대사 및 조절 기능을 유지하는 적절한 산소 농도 및 중성 pH 하에서 생존한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "질환 부위"는 신체 내 질환의 위치에 인접한 영역 또는 위치를 의미한다. 예를 들면, 질환이 간에 위치하는 고형 종양 암이면, 질환 부위는 간의 종양 부위 및 간의 종양에 가까운 영역이다. 질환 부위의 세포는 질환 세포뿐만 아니라 질환 부위의 질환을 지원하는 세포도 포함할 수 있다. 예를 들면, 질환 부위가 종양의 부위이면, 종양 부위의 세포는 질환 세포(예를 들어, 종양 세포) 및 종양 부위의 종양 성장을 지원하는 세포 둘 모두를 포함한다. 유사하게, 용어 "암 부위"는 체내 암의 위치를 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "SIRP-α D1 도메인" 또는 "D1 도메인"은 SIRP-α의 막 원위의, 세포외 도메인을 의미한다. SIRP-α D1 도메인은 전체 길이, 야생형 SIRP-α의 N-말단에 위치하고 CD47에 대한 결합을 매개한다. D1 도메인의 아미노산 서열을 표 1에 나타내었다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "SIRP-α D2 도메인" 또는 "D2 도메인"은 SIRP-α의 제2 세포외 도메인을 의미한다. SIRP-α D2 도메인은 전체 길이, 야생형 SIRP-α의 대략 아미노산 119 내지 220을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "SIRP-α D3 도메인" 또는 "D3 도메인"은 SIRP-α의 제3 세포외 도메인을 의미한다. SIRP-α D3 도메인은 전체 길이, 야생형 SIRP-α의 대략 아미노산 221 내지 320을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "SIRP-α 폴리펩티드"는 야생형 SIRP-α를 비롯하여 SIRP-α 변이체를 의미하고, 각각의 용어는 본원에 정의되고 기술된 바와 같다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "SIRP-α 변이체"는 SIRP-α D1 도메인, 또는 전체 길이 SIRP-α의 CD47-결합부를 함유하는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 서열번호 3-12 및 24-34 중 어느 하나의 서열과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%.) 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 야생형 SIRP-α 보다 CD47에 대해 더 높은 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 야생형 인간 SIRP-α의 일부분(바람직하게 야생형 SIRP-α의 CD47-결합부)을 함유하고/하거나 1 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 예를 들면, SIRP-α 변이체는 야생형 SIRP-α에 대해 1 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등 최대 20)의 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, SIRP-α 변이체는 히스티딘으로 1 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등, 최대 20)의 아미노산 잔기의 치환을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 야생형 인간 SIRP-α의 서열 또는 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 중 어느 하나의 서열(예를 들어, 야생형 인간 SIRP-α의 CD47-결합부의 서열)과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 아미노산 서열 동일성을 갖는다. SIRP-α의 CD47-결합부는 야생형 SIRP-α의 D1 도메인(서열번호 3-12 중 어느 하나의 서열)을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "SIRP-α 변이체 구성체"는 예를 들어, 차단 펩티드, Fc 도메인 단량체, HSA, 알부민-결합 펩티드, 중합체, 항체-결합 펩티드, 항체에 부착된 SIRP-α 변이체를 함유하는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 질환 부위에서 우선적인 활성을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 질환 부위에서 우선적인 활성을 가지며 야생형 인간 SIRP-α의 서열 또는 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 중 어느 하나의 서열(예를 들어, 야생형 인간 SIRP-α의 CD47-결합부의 서열)과 적어도 80%(예를 들어, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 아미노산 서열 동일성을 갖는 SIRP-α 변이체를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "동일률(%)"은 필요하다면, 최대 동일률을 획득하기 위해서, 서열을 정렬하고 갭을 도입시킨 후(즉, 최적 정렬을 위해 후보 및 기준 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭을 도입시키고 비상동성 서열은 비교 목적을 위해 무시할 수 있음), 기준 서열, 예를 들어 야생형 인간 SIRP-α 또는 이의 CD47-결합부의 아미노산(또는 핵산) 잔기와 동일한 후보 서열, 예를 들어 SIRP-α 변이체의 아미노산(또는 핵산) 잔기의 백분율을 의미한다. 동일률을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당분야의 기술 내에서, 예를 들어 공공 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, ALIGN, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여, 다양한 방식으로 수행할 수 있다. 당업자는 비교하려는 서열들의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 획득하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하는데 적절한 변수들을 결정할 수 있다. 일부 구체예에서, 주어진 기준 서열(대안적으로 주어진 기준 서열에, 그와의, 또는 그에 대항해 일정 비율의 아미노산(또는 핵산) 서열 동일률을 갖거나 또는 포함하는 소정 후보 서열이라고 할수 있음)에 대해, 또는 그와의, 또는 그에 대항한 소정 후보 서열의 아미노산(또는 핵산) 서열 동일률은 다음과 같이 계산한다:
100 x (A/B의 분율)
식에서 A는 후보 서열과 기준 서열의 정렬에서 동일하게 점수매겨진 아미노산(또는 핵산) 잔기의 수이고, B는 기준 서열의 아미노산(또는 핵산) 잔기의 총 개수이다. 후보 서열의 길이가 기준 서열의 길이와 동일하지 않은 일부 구체예에서, 기준 서열에 대한 후보 서열의 아미노산(또는 핵산) 서열의 동일률은 후보 서열에 대한 기준 서열의 아미노산(또는 핵산) 서열 동일률과 같지 않을 수 있다.
특정 구체예에서, 후보 서열과의 비교를 위해 정렬된 기준 서열은 후보 서열이 후보 서열의 전체 길이 또는 후보 서열의 연속하는 아미노산(또는 핵산) 잔기의 선택 부분에 걸쳐 50% 내지 100% 동일성을 보임을 나타낼 수 있다. 비교 목적으로 정렬되는 후보 서열의 길이는 기준 서열 길이의 적어도 30%, 예를 들어, 적어도 40%, 예를 들어 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%이다. 후보 서열의 위치가 기준 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산(또는 핵산) 잔기로 채워진 경우면, 그 분자는 그 위치에서 동일하다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "종양-연관 프로테아제" 또는 "종양 효소"는 암, 예를 들어 고형 종양 암에서 높은 수준으로 존재하는 효소, 예를 들어 프로테아제를 의미한다. 일부 구체예에서, 종양-연관 프로테아제는 절단성 링커를 절단할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "차단 펩티드"는 SIRP-α 변이체에 결합하여 SIRP-α 변이체의 CD47-결합부를 차단 또는 "차폐"할 수 있는 펩티드를 의미한다. SIRP-α 변이체 구성체에서, 차단 펩티드는 경우에 따라 절단가능하고, 경우에 따라 1 이상의 스페이서인 링커에 의해 SIRP-α 변이체에 부착될 수 있다. 차단 펩티드는 비공유 결합을 통해서 SIRP-α 변이체에 커플링되고 질환 부위 또는 질환 세포에서 절단된다. 일부 구체예에서, 차단 펩티드는 질환 부위 또는 질환 세포에서 야생형 SIRP-α에 결합할 수 있다. 차단 펩티드는 정상적인 생리학적 상태 하에서 또는 비질환 부위에서 야생형 CD47과 SIRP-α 변이체의 결합을 감소시키거나 또는 최소화시키는데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 차단 펩티드는 SIRP-α 변이체보다 야생형 SIRP-α에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖는다. 차단 펩티드는 예를 들어 질환 부위 또는 비생리학적 상태하에서, 야생형 SIRP-α와 결합하기 위해 SIRP-α 변이체로부터 해리될 수 있다. 차단 펩티드의 예는 CD47에서 유도된 펩티드 또는 그의 단편인, CD47-기반 차단 펩티드이다. 일부 구체예에서, CD47-기반 차단 펩티드는 CD47의 세포외, SIRP-α 결합부(즉, CD47의 IgSF 도메인)이다. 일부 구체예에서, CD47-기반 차단 펩티드는 야생형 CD47에 비해서 1 이상의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "절단성 링커"는 SIRP-α 변이체 구성체의 2개 부분 사이의 링커를 의미한다. 일부 구체예에서, 절단성 링커는 생리학적 상태 하에서 CD47에 대한 SIRP-α 변이체의 결합을 차단하도록 SIRP-α 변이체에 차단 펩티드를 공유적으로 부착시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 절단성 링커는 생리학적 상태 하에서 CD47에 대한 SIRP-α 변이체의 결합을 차단하도록 SIRP-α 변이체와 비공유적으로 회합될 수 있는, 차단 펩티드 내에 장착될 수 있다. 절단성 링커는 일정 조건 하에서 절단될 수 있다. 절단성 링커가 차단 펩티드 내에 존재하면, 링커의 절단은 차단 펩티드를 불활성화시키게 된다. 절단성 링커는 질환 부위, 예컨대 암 부위, 예를 들어 고형 종양 내부의 특징적인 상태 하에서 링커를 절단하거나 또는 링커의 절단을 유도하도록 작용하는 모이어티를 함유할 수 있다. 절단성 링커는 건강한 생리학적 상태(예를 들어, 중성 pH 및 적절한 산소 농도)하에서는 안정하다. 모이어티는 산성 pH 하에서 가수분해될 수 있는 pH-감응성 화학 작용기(예를 들어, 아세탈, 케탈, 티오말리어메이트, 히드라존, 디설피드 결합)일 수 있다. 모이어티는 또한 저산소 상태 하에서 환원될 수 있는 저산소-감응성 화학 작용기(예를 들어, 퀴논, N-옥시드, 및 헤테로방향족 니트로기) 또는 아미노산일 수 있다. 절단성 링커의 모이어티는 종양-연관 프로테아제, 효소, 또는 펩티다제에 의해 인식되어 절단될 수 있는 단백질 기질일 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "스페이서"는 SIRP-α 변이체 구성체의 2개 부분, 에컨대 링커(예를 들어, 절단성 링커) 및 SIRP-α 변이체, 또는 항체-결합 펩티드 및 SIRP-α 변이체 사이의 공유 또는 비공유 연결부를 의미한다. 바람직하게, 스페이서는 공유 연결부이다. 스페이서는 단순한 화학 결합, 예를 들어 아미드 결합, 또는 아미노산 서열(예를 들어, 3-200 아미노산 서열)일 수 있다. 아미노산 스페이서는 폴리펩티드의 1차 서열의 일부분(예를 들어, 폴리펩티드 골격을 통해서 공간을 차지한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인에 연결됨)이다. 스페이서는 2 부분 간에 공간 및/또는 탄력성을 제공한다. 스페이서는 질환 부위의 특징적인 상태, 예를 들어 산성 pH 및 저산소 상태를 비롯하여 생리학적 상태(예를 들어, 중성 pH 및 적절한 산소 농도) 하에서 안정하다. 스페이서는 질환 부위, 에컨대 암 부위, 예를 들어 종양 내부에서 안정하다. 스페이서의 설명은 본원에서 더욱 상세하게 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "항체"는 온전한 항체, 그들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편, 단일클론 항체, 다클론 항체, 단일특이성 항체, 및 적어도 2개의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 이특이적 항체)를 의미한다. 바람직하게, 항체는 질환 세포, 예를 들어 종양 세포에 특이적이다. 예를 들어, 항체는 질환 세포, 예를 들어 종양 세포 상의 세포 표면 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "알부민-결합 펩티드"는 혈청 알부민에 대한 친화성 및 그에 결합하는 기능을 갖는 12 내지 16개 아미노산의 아미노산 서열을 의미한다. 알부민-결합 펩티드는 상이한 기원, 예를 들어 인간, 마우스, 또는 래트의 것일 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 SIRP-α 변이체의 혈청 반감기를 증가시키도록 SIRP-α 변이체의 C-말단에 융합된 알부민-결합 펩티드를 포함할 수 있다. 알부민-결합 펩티드는 SIRP-α 변이체에 직접적으로 또는 스페이서를 통해 융합될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "인간 혈청 알부민(HSA)"은 인간 혈장에 존재하는 알부민 단백질을 의미한다. 인간 혈청 알부민은 혈액 중 가장 풍부한 단백질이다. 이는 혈청 단백질의 대략 절반을 구성한다. 일부 구체예에서, 인간 혈청 알부민은 UniProt 수탁 번호 P02768의 아미노산 25-609의 서열(서열번호 67)을 갖는다. 일부 구체예에서, 인간 혈청 알부민은 서열번호 67의 서열에 대해 C34S를 더 함유한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "Fc 도메인 단량체"는 제2 및 제3 항체 불변 도메인(CH2 및 CH3)을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 의미한다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단량체는 또한 힌지 도메인을 포함한다. Fc 도메인 단량체는 IgG, IgE, IgM, IgA, 또는 IgD를 포함하는, 임의의 면역글로불린 항체 이소타입일 수 있다. 부가적으로, Fc 도메인 단량체는 IgG 서브타입(예를 들어, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 또는 IgG4)일 수 있다. Fc 도메인 단량체는 항원-인식 영역, 예를 들어 가변 도메인 또는 상보성 결정 영역(CDR)으로 작용할 수 있는 면역글로불린의 임의 부분을 포함하지 않는다. Fc 도메인 단량체는 Fc 도메인과 Fc 수용체 간 상호작용을 변경하는, 야생형 Fc 도메인 단량체 서열로부터 10가지의 변화(예를 들어, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 아미노산 치환, 부가, 또는 결실)를 포함할 수 있다. 적합한 변화의 예는 당분야에 공지이다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "Fc 도메인"은 2개 Fc 도메인 단량체의 이량체를 의미한다. 야생형 Fc 도메인에서, 2개의 Fc 도메인 단량체은 2개의 CH3 항체 불변 도메인 간 상호작용에 의해서뿐만 아니라, 2개의 이량체화된 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 사이에 형성된 1 이상의 디설피드 결합에 의해 이량체화된다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 돌연변이되어 이펙터 기능이 결여될 수 있고, "죽은 Fc 도메인"이 대표적이다. 일정 구체예에서, Fc 도메인의 각각의 Fc 도메인 단량체는 Fc 도메인과 Fcγ 수용기 간 상호작용 또는 결합을 감소시키도록 CH2 항체 불변 도메인에 아미노산 치환을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "친화성" 또는 "결합 친화성"은 2개 분자 간 결합 상호작용의 강도를 의미한다. 대체로, 결합 친화성은 분자와 그 결합 파트너, 예컨대 SIRP-α 변이체와 CD47 간 비공유 상호작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 언급하지 않으면, 결합 친화성은 결합쌍의 구성원간 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화성을 의미한다. 2개 분자 간 결합 친화성은 통상적으로 해리 상수 (KD) 또는 친화성 상수(KA)로 설명된다. 서로에 대해 결합 친화성이 낮은 2개 분자는 대체로 서서히 결합하고, 쉽게 해리되는 경향이 있고, 큰 KD를 나타낸다. 서로에 대해 높은 친화성을 갖는 2개 분자는 대체로 신속하게 결합하고, 결합된 상태로 길게 유지되는 경향이 있으며, 작은 KD를 나타낸다. 2개의 상호작용하는 분자의 KD는 당분야에 잘 알려진 방법 및 기술, 예를 들어 표면 플라스몬 공명법을 사용해 결정할 수 있다. KD는 koff/kon의 비율로서 계산된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 그들의 상응하는 핵산으로부터 단백질을 발현하는데 필요한, 필수 세포내 성분들, 예를 들어 세포기관을 포함하는 비히클을 의미한다. 핵산은 전형적으로 당분야에 알려진 통상의 기술(예를 들어, 형질전환, 형질감염, 전기천공, 인산칼슘 침전법, 직접 미세주사법 등)에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있는 핵산 벡터에 포함된다. 숙주 세포는 원핵생물 세포, 예를 들어 박테리아 세포, 또는 진핵생물 세포, 예를 들어 포유동물 세포(예를 들어, CHO 세포)일 수 있다. 본 명세서에서 기술하는 바와 같이, 숙주 세포는 1 이상의 SIRP-α 변이체 구성체를 발현시키는데 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학 조성물"은 활성 성분을 비롯하여 활성 성분을 투여 방법에 적합하도록 하는 부형제 및 희석제를 함유하는 의학적 또는 약학적 제제를 의미한다. 본 발명의 약학 조성물은 SIRP-α 변이체 구성체와 상용성인 약학적 허용 성분들을 포함한다. 약학 조성물은 경구 투여용 정제 또는 캡슐 형태이거나 또는 정맥내 또는 피하 투여용 수성 형태로 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "SIRP-α 및/또는 CD47 활성과 연관된 질환"은 SIRP-α 및/또는 CD47 활성에 의해 초래되고/되거나 그와 관련된 임의의 질환 또는 질병을 의미한다. 예를 들어, SIRP-α 및/또는 CD47 활성의 증가 및/또는 감소에 의해 초래되고/되거나 그와 관련된 임의의 질환 또는 질병이다. SIRP-α 및/또는 CD47 활성과 연관된 질환의 예에는, 제한없이, 암 및 면역학적 질환(예를 들어, 자가면역 질환 및 염증성 질환)이 포함된다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "치료 유효량"은 질환, 예컨대 암, 예를 들어 고형 종양 또는 혈액학적 암을 갖는 환자를 치료시 바람직한 치료 효과를 획득하는데 효과적인 본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체 또는 본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체를 함유하는 약학 조성물의 양을 의미한다. 구체적으로, SIRP-α 변이체 구성체의 치료 유효량은 부정적인 부작용을 피한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "최적 친화성" 또는 "최적 결합 친화성"은 SIRP-α 변이체와 CD47 간 결합 상호작용의 최적 강도를 의미한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 주로 또는 보다 높은 친화성으로 질환 부위의 세포(즉, 암 세포) 상의 CD47에 결합하고 비질환 부위의 세포(즉, 비암 세포) 상의 CD47에는 실질적으로 결합하지 않거나 또는 낮은 친화성으로 결합한다. SIRP-α 변이체와 CD47 간 결합 친화성은 그 상호작용이 임상적으로 관련된 독성을 초래하지 않도록 최적화된다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체와 CD47 간 최적 결합 친화성을 달성하기 위해서, SIRP-α 변이체는 최대로 달성할 수 있는 것보다 CD47에 대해 보다 낮은 결합 친화성을 갖도록 개발될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "면역원성"은 외래 항원처럼 숙주에서 면역 반응을 야기하는 단백질(예를 들어, 치료 단백질)의 특성을 의미한다. 단백질의 면역원성은 다양한 상이한 방식으로, 구체적으로 일부는 상업적으로 입수(예를 들어, Proimmune이 제공하는 면역원성 검정 서비스를 참조함)할 수 있는, 시험관내 T-세포 증식 검정법(예를 들어, 문헌 [Jawa et al., Clinical Immunology 149:534-555, 2013]을 참조함)을 통해 검정할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "최소 면역원성"은 아미노산 치환이 도입되기 전보다 낮아지도록(예를 들어, 적어도 10%, 25%, 50%, 또는 100% 낮아지도록), 즉 아미노산 치환을 통해, 개질시킨 단백질(예를 들어, 치료 단백질)의 면역원성을 의미한다. 단백질(예를 들어, 치료 단백질)이 최소 면역원성을 갖도록 개질된다는 것은 그것이 외래 항원이더라도 숙주 면역 반응을 초래하지 않거나 거의 초래하지 않음을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "최적 약동학"은 대체로 단백질의 약동학과 연관된 변수들이 시험관내 및/또는 생체내 용도를 위한 최적의 단백질을 생산하도록 개선되고 개질된 것을 의미한다. 단백질의 약동학과 연관된 변수들은 예를 들어, KD, 원자가, 및 반감기를 포함해, 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에서, 본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체의 약동학은 치료적 정황에서 사용하기 위해 CD47과 그의 상호작용에 대해 최적화된다.
도 1은 CD47:SIRP-α의 공결정화 구조의 일부분(PDB: 4KJY, 4CMM)을 도시한 도면이고, CD47의 N-말단은 파이로-글루타메이트로서 존재하고 SIRP-α 변이체의 Thr66 또는 야생형 SIRP-α의 Leu66과 수소 결합 상호작용을 만든다.
도 2는 T102Q를 갖는 CD47과 A27을 갖는 야생형 SIRP-α 간의 상호작용 부위(좌측) 및 T102Q를 갖는 CD47와 I27을 갖는 SIRP-α 변이체 간 상호작용 부위의 컴퓨터산출 모델을 도시한다.
도 3은 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 48-56)의 SDS-PAGE를 도시한다.
도 4A는 uPA 및 마트립타제로 시험관내 절단 후 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 54)의 SDS-PAGE를 도시한다.
도 4B는 상이한 양의 마트립타제로 시험관내 절단 후 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 54)의 SDS-PAGE를 도시한다.
도 4C는 마트립타제로 시험관내 절단 후 다양한 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 57-63)의 SDS-PAGE를 도시한다.
도 5A는 마트립타제로 시험관내 절단 전 및 후에 CD47에 대한 다양한 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 48-55)의 상이한 결합 친화성을 보여주는 막대 그래프를 도시한다.
도 5B는 마트립타제로 시험관내 절단 전 및 후에 CD47에 대한 다양한 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 52-63) 및 SIRP-α 변이체(서열번호 31)의 상이한 결합 친화성을 보여주는 막대 그래프를 도시한다.
도 6은 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 66)가 세툭시맙 및 CD47에 동시에 결합함을 입증한 센서그램을 도시한다.
도 7A는 EGFR, 세툭시맙, SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 66), 및 CD47을 함유하는 4차원 복합체의 개략도를 도시한다.
도 7B는 도 7A에 도시된 4차원 복합체의 형성을 입증한 센서그램을 도시한다.
도 7C는 도 7B에 도시된 센서그램의 이미지이다.
도 8은 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 66) 및 SIRP-α 변이체(서열번호 31)에 의해 유도된 식세포작용을 도시한 산점도이다.
본 발명은 질환 부위(예를 들어, 비질환 부위 보다 종양 부위)에서 우선적인 활성을 갖는 신호-조절성 단백질 α(SIRP-α) 변이체 구성체를 특징으로 한다. 일정 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 질환 세포(예를 들어, 종양 세포), 세포 상의 CD47에 대해 보다 높은 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 1 이상의 아미노산 치환을 함유한다. 일부 구체예에서, 아미노산은 히스티딘 잔기로 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, 아미노산은 다른 히스티딘 이외의 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 질환 부위, 예컨대 암 부위, 예를 들어 종양 부위 또는 종양 내부의 특징적인 상태 하에서 비질환 세포 보다 질환 세포 또는 질환 부위의 CD47에 더 높은 친화성으로 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 생리학적 상태보다 산성 pH(예를 들어, 대략 pH 7 미만) 및/또는 저산소 상태에서 CD47에 더 높은 친화성으로 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 SIRP-α 변이체 및 차단 펩티드를 포함하고, SIRP-α 변이체는 질환 부위의 특징적인 상태 하에서가 아니면 차단 펩티드에 의해 CD47과의 결합이 방지된다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 Fc 도메인 단량체, 인간 혈청 알부민(HSA), 알부민-결합 펩티드, 또는 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체)에 융합된다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 치료 정황에서 사용하기 위해 최적화된 그들의 면역원성, 친화성, 및/또는 약동학을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 표적화 모이어티, 예를 들어 표적-특이적 항체에 의해, 질환 부위, 예를 들어 종양에 우선적으로 표적화된다. 본 발명은 다양한 질환, 예컨대 암, 바람직하게 고형 종양 또는 혈액학적 암을 치료하기 위한 SIRP-α 변이체 구성체를 함유하는 방법 및 약학 조성물을 비롯하여, 암 세포를 사멸하는 방법 및 SIRP-α 변이체 구성체 및 이러한 SIRP-α 변이체 구성체를 함유하는 약학 조성물을 제조하는 방법을 특징으로 한다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 차단 펩티드에 부착된 SIRP-α 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체의 질환 세포 또는 질환 부위의 CD47에 대한 우선적인 결합은 질환 세포 또는 질환 부위에서 절단되는, 절단성 링커의 사용에 의해 차단 펩티드를 SIRP-α 변이체에 부착시켜 얻을 수 있다. 일부 구체예에서, 질환 세포 또는 질환 부위의 CD47에 대한 SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체의 우선적인 결합은 차단 펩티드를 SIRP-α 변이체에 부착시켜 얻을 수 있고, 여기서 차단 펩티드는 질환 세포 또는 질환 부위에서 SIRP-α 변이체로부터 탈착되거나 또는 단순하게 해리될 수 있다.
I. SIRP-α 변이체
야생형 인간 SIRP-α에 대해 적어도 10개의 천연 변이체가 존재한다. 10개의 야생형 인간 SIRP-α 변이체의 D1 도메인의 아미노산 서열을 서열번호 3-12로 나타내었다(표 1 참조). 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 서열번호 3-12 중 어느 하나의 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%.) 서열 동일성을 갖는다. 표 2는 각각의 D1 도메인 변이체(서열번호 13-23)의 가능한 아미노산 치환을 열거한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 CD47에 최적의 결합 친화성으로 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체는 암 세포 상의 CD47에 주로 또는 더 높은 친화성으로 결합하고 비암 세포 상의 CD47에 대해서는 실질적으로 결합하지 않거나 또는 낮은 친화성으로 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체와 CD47 간 결합 친화성은 그 상호작용이 임상적으로 관련된 독성을 초래하지 않도록 최적화된다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 최소의 면역원성을 갖는다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 SIRP-α 변이체의 친화성을 증가시키기 위해 도입된 아미노산 변화를 제외하고, 피험체의 생물학적 샘플 중 SIRP-α 폴리펩티드와 동일한 아미노산을 갖는다. SIRP-α 변이체를 생성시키고 CD47에 대한 그들의 결합 친화성을 결정하는 기술 및 방법을 본원에서 더욱 상세하게 설명한다.
표 2는 각각의 D1 도메인 변이체 서열에 대한, SIRP-α 변이체의 특이적 아미노산 치환을 열거한다. SIRP-α 변이체는 표 2에 열거한 치환 중 1 또는 그 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 야생형 D1 도메인에 비해 많아야 10개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 야생형 D1 도메인에 비해 많아야 7개의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 2 또는 그 이상의 야생형 D1 도메인 변이체의 일부분(예를 들어, 하나의 야생형 D1 도메인 변이체의 일부분 및 다른 야생형 D1 도메인 변이체의 일부분)을 포함하는 키메라 SIRP-α 변이체이다. 일부 구체예에서, 키메라 SIRP-α 변이체는 야생형 D1 도메인 변이체의 적어도 2개 부분(예를 들어, 3, 4, 5, 등)을 포함하고, 각각의 부분은 상이한 야생형 D1 도메인 변이체에서 유래된다. 일부 구체예에서, 키메라 SIRP-α 변이체는 표 2에 열거된 1 이상의 아미노산 치환을 더 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 표 3의 서열번호 24-34 중 어느 하나의 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%.) 서열 동일성을 갖는다.
바람직하게, 본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체는 생리학적 상태(예를 들어, 중성 pH 및 적절한 산소 농도) 하에서보다, 질환 부위, 예컨대 암 부위, 예를 들어 종양 내부의 특징적인 상태 하에서 CD47에 더 높은 친화성으로 결합한다. 질환 부위, 예컨대 암 부위, 예를 들어 종양 내부의 특징적인 상태는 예를 들어, 산성 pH 및 저산소이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체는 비질환 세포보다 질환 세포에 우선적으로 결합하도록 조작될 수 있다. 구체적으로, 질환 세포는 암 질환, 예를 들어 고형 종양 또는 혈액학적 암의 암 세포일 수 있다. 바람직하게, SIRP-α 변이체 구성체는 중성 pH, 예를 들어 pH 7.4에서 보다 산성 pH(예를 들어, 대략 pH 7 미만) 하에서 CD47에 더 높은 친화성으로 결합한다. 바람직하게, SIRP-α 변이체 구성체는 산소 농도가 적절한 상태하에서보다 저산소 상태 하에서 CD47에 더 높은 친화성으로 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 차단 펩티드에 부착된 SIRP-α 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, 질환 세포 또는 질환 부위 상의 CD47에 대한 SIRP-α 변이체 구성체 내 SIRP-α 변이체의 우선적인 결합은 질환 세포 또는 질환 부위에서 절단되는, 절단성 링커의 사용에 의해 차단 펩티드를 SIRP-α 변이체에 부착시켜 얻을 수 있다. 일부 구체예에서, 질환 세포 또는 질환 부위 상의 CD47에 대한 SIRP-α 변이체 구성체 내 SIRP-α 변이체의 우선적인 결합은 차단 펩티드를 SIRP-α 변이체에 부착시켜 얻을 수 있고, 여기서 차단 펩티드는 질환 세포 또는 질환 부위에서 SIRP-α 변이체에서 탈착되거나 또는 단순히 그로부터 해리될 수 있다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 SIRP-α 변이체 및 차단 펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 링커(예를 들어, 절단성 링커)를 통해 차단 펩티드에 부착될 수 있다. 차단 펩티드는 생리학적 상태(예를 들어, 중성 pH 및 적절한 산소 농도) 하에서 CD47에 대한 SIRP-α 변이체의 결합을 방지하도록 SIRP-α 변이체의 CD47 결합 부위를 차단하기 위해 제공된다. 절단성 링커는 질환 부위(예컨대 암 부위, 예를 들어 종양 내부)에 특징적인 상태, 예컨대 산성 pH 및 저산소 하에서만 절단될 수 있는 링커이다. 일부 구체예에서, 절단성 링커는 질환 부위에서 종양-연관 프로테아제에 의해 절단된다. 일부 구체예에서, 링커는 절단되지 않고 차단 펩티드는 단순히 질환 부위에서 SIRP-α 변이체로부터 해리되어 SIRP-α 변이체가 질환 세포, 예를 들어 종양 세포 상의 인근 CD47에 결합할 수 있게 한다. 따라서, 오직 SIRP-α 변이체가 질환 부위에 있는 경우, 차단 펩티드가 방출되어, 질환 세포, 예를 들어 종양 세포 상의 인근 CD47에 자유롭게 결합하게 된다. 차단 펩티드 및 링커(예를 들어, 절단성 링커)는 본 명세서에서 더욱 상세하게 설명한다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 SIRP-α 변이체 및 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 질환 세포에 대한 결합 친화성을 보이는, 표적화 모이어티, 예컨대 항체, 예를 들어, 종양-특이적 항체, 또는 다른 단백질 또는 펩티드, 예를 들어, 항체-결합 펩티드에 부착될 수 있다. 투여 후, 종양-특이적 항체 또는 항체-결합 펩티드는 SIRP-α가 질환 세포 상의 CD47과 특이적으로 상호작용할 수 있는, 질환 부위, 예컨대 암 부위, 예를 들어 고형 종양 내부로 SIRP-α 변이체를 가져가게 하는 표적화 모이어티로서 기능한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 항체(예를 들어, 종양-특이적 항체)에 결합할 수 있는, 즉 항체의 불변 또는 가변 영역에 결합할 수 있는, 단백질 또는 펩티드, 예를 들어, 항체-결합 펩티드에 융합될 수 있다. 1 이상의 항체에 결합할 수 있는 SIRP-α 변이체는 본 명세서에서 더욱 상세하게 설명한다. 다른 구체예에서, 다른 SIRP-α 변이체, 예컨대 국제 공개 특허 출원 WO2013109752(참조로 본원에 편입됨)에 기술된 것들은 종양-특이적 항체에 결합할 수 있는, 종양-특이적 항체 또는 단백질 또는 펩티드, 예를 들어, 항체-결합 펩티드에 부착될 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 시험관내(인간에 투여 전) 또는 생체내(투여 후)에서 항체에 부착될 수 있다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 야생형 인간 SIRP-α의 D2 및/또는 D3 도메인을 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 SIRP-α 변이체의 약동학적 특성을 개선시키기 위해, 예를 들어 혈청 반감기를 증가시키기 위해, Fc 도메인 단량체, 인간 혈청 알부민(HSA), 혈청-결합 단백질 또는 펩티드, 또는 유기 분자, 예를 들어, 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG))에 부착될 수 있다. 본 발명의 SIRP-α 변이체의 혈청 반감기를 증가시키는 작용을 하는 Fc 도메인 단량체, HSA 단백질, 혈청-결합 단백질 또는 펩티드, 및 유기 분자 예컨대 PEG는 본 명세서에서 더욱 상세하게 설명한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 서열번호 3-12 및 24-34 중 어느 하나의 서열을 포함하지 않는다.
II. SIRP-α 변이체에서 히스티딘 잔기로의 아미노산 치환
일부 구체예에서, 표 2에 열거된 SIRP-α 변이체의 아미노산 치환이외에도, SIRP-α 변이체는 히스티딘 잔기로의 1 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. SIRP-α 변이체를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체는 비질환 세포보다 질환 세포 또는 질환 부위의 CD47에 생리학적 상태 하에서보다 질환 부위에 특징적인 상태(예를 들어, 산성 pH 및 저산소) 하에서 더 높은 친화성으로 결합한다. 히스티딘 잔기로 치환되는 아미노산 잔기는 히스티딘 스캐닝 돌연변이유발법, 단백질 결정 구조, 및 컴퓨터 디자인 및 모델링 방법을 사용해 동정될 수 있다. SIRP-α 변이체를 생성시키는데 사용될 수 있는 기술 및 방법 및 질환 및 비질환 세포 상의 CD47에 대한 그들의 결합 친화성을 결정하는 방식은 본 명세서에서 더욱 상세하게 설명한다. 히스티딘 잔기 치환은 SIRP-α 변이체와 CD47의 경계면에 위치하거나 또는 SIRP-α 변이체의 내부 영역에 위치할 수 있다. 우선적으로, 히스티딘 잔기 치환은 SIRP-α 변이체와 CD47의 경계면에 위치한다. 표 4는 히스티딘 잔기로 치환될 수 있는 특별한 SIRP-α 아미노산을 열거한다. 표 4의 아미노산 번호매김은 서열번호 3의 서열에 대한 것이고, 서열번호 4-12의 서열 중 어느 하나의 상응하는 위치의 1 이상의 아미노산도 역시 히스티딘 잔기로 치환될 수 있다. 접촉 잔기는 SIRP-α 변이체와 CD47의 경계면에 위치하는 아미노산이다. 코어 잔기는 SIRP-α 변이체와 CD47 간 결합에 직접적으로 관여하지 않는 내부 아미노산이다. SIRP-α 변이체는 표 4에 열거한 치환 중 1 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등)을 포함할 수 있다. SIRP-α 변이체는 최대 20개 히스티딘 치환을 함유할 수 있다.
표 4: SIRP-α 아미노산 치환(아미노산 번호는 서열번호 3의 서열에 대함)
접촉 잔기 S29H, L30H, I31H, P32H, V33H, G34H, P35H, Q52H, K53H, E54H, L66H, T67H, K68H, R69H, F74H, K93H, K96H, G97H, S98H, D100H
코어 잔기 L4H, V6H, A27H, I36H, F39H, E47H, L48H, I49H, Y50H, F57H, V60H, M72H, F74H, I76H, V92H, F94H, E103H
III. pH-의존적 결합
연구들은 종양 세포 매개 발암성 물질대사가 대량의 락트산 및 양성자를 생성시켜서, 세포외 pH값을 종양 조직의 pH 6만큼 낮게 저하시키는 것을 보여주었다(Icard et al., Biochim. Biophys. Acta. 1826:423-433, 2012). 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체는 중성 pH(예를 들어, 대략 pH 7.4)보다 산성 pH 하에서 CD47에 더 높은 친화성으로 결합하도록 조작된다. 따라서, 본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체는 비질환 세포 상의 CD47에 비해서, 질환 세포(예를 들어, 종양 세포) 또는 질환 부위의 세포(예를 들어, 종양 성장을 지원하는 종양 미세환경 하의 세포) 상의 CD47에 선택적으로 결합하도록 조작된다.
일 구체예에서, 본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체의 pH-의존적 결합을 조작하기 위해서, 히스티딘 돌연변이유발법을 SIRP-α 변이체, 특히 CD47과 상호작용하는 SIRP-α의 영역 상에 수행할 수 있다. SIRP-α 및 CD47 복합체의 결정 구조(예를 들어, PDB ID No. 2JJS 참조) 및 컴퓨터 모델링을 사용하여 SIRP-α 및 CD47의 3차원 결합 부위를 시각화할 수 있다. pH-감응성 결합 특성을 갖는 단백질을 디자인하는데 유용한 컴퓨터 디자인 및 모델링 방법은 문헌에 공지되어 있고, 예를 들어 그 전체를 본원에 참조해 편입시키는, 문헌 [Strauch et al., Proc Natl Acad Sci 111:675-80, 2014]에 설명되어 있다. 일부 구체예에서, 컴퓨터 모델링을 사용하여 SIRP-α와 CD47의 경계면에서 핵산 접촉 잔기를 동정할 수 있다. 동정된 핵심 접촉 잔기는 컴퓨터화 결합 에너지 및 형상 상보성을 기준으로 최적화, 여과 및 등급화된 다양한 단백질 디자인을 생성할 수 있는 이용가능한 단백질 디자인 소프트웨어(예를 들어, RosettaDesign)를 사용해 히스티딘 잔기로 치환될 수 있다. 따라서, 일정 아미노산 위치에서 에너지적으로 선호되는 히스티딘 치환을 컴퓨터 디자인 방법을 사용해 동정할 수 있다. 컴퓨터 모델링을 또한 사용하여 SIRP-α의 3차원 구조에서 변화를 예측할 수 있다. SIRP-α의 3차원 구조에 유의한 변화를 일으키는 히스티딘 치환을 피할 수 있다.
에너지 및 구조적으로 최적화된 아미노산 치환이 동정되면, 그 아미노산을 체계적으로 히스티딘 잔기로 치환할 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α의 1 이상의 아미노산(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등, 최대 20개)이 히스티딘 잔기로 치환될 수 있다. 구체적으로, SIRP-α 및 CD47의 경계면에 위치하는 아미노산, 바람직하게, CD47에 대한 SIRP-α의 결합에 직접적으로 관여하는 아미노산이 히스티딘 잔기로 치환될 수 있다. SIRP-α 변이체는 1 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등, 최대 20개)의 히스티딘 잔기 치환을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, SIRP-α의 천연 발생 히스티딘 잔기는 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 또 다른 구체예에서, SIRP-α의 1 이상의 아미노산은 CD47과 천연 발생 또는 치환된 히스티딘 잔기의 결합에 영향을 주기 위해서 히스티딘 이외의 잔기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 천연 발생 히스티딘 잔기 주변의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 것은 천연 발생 히스티딘 잔기를 "매장"시킬 수 있다. 일부 구체예에서, CD47와의 결합에 직접적으로 관여하지 않는 아미노산, 즉 내부 아미노산(예를 들어, SIRP-α의 코어에 위치하는 아미노산)이 또한 히스티딘 잔기로 치환될 수 있다. 표 4는 히스티딘 또는 히스티딘 이외의 잔기로 치환될 수 있는 특정한 SIRP-α 아미노산을 열거한다. 접촉 잔기는 SIRP-α와 CD47의 경계면에 위치하는 아미노산이다. 코어 잔기는 SIRP-α와 CD47 간 결합에 직접적으로 관여하지 않는 내부 아미노산이다. SIRP-α 변이체는 표 4에 열거된 치환 중 1 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등, 또는 전부)을 포함할 수 있다.
1 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등, 최대 20개)의 히스티딘 잔기 치환을 함유하는 SIRP-α 변이체는 상이한 pH 상태(예를 들어, pH 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.4, 8) 하에서 CD47에 대한 그들의 결합을 시험받을 수 있다. 일부 구체예에서, 정제된 CD47 단백질을 결합을 시험하는데 사용할 수 있다. 당업자에게 알려진 다양한 기술을 사용해 상이한 pH 상태(예를 들어, pH 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.4, 8) 하에서 SIRP-α 변이체/CD47 복합체의 친화성 상수(KA) 또는 해리 상수(KD)를 측정할 수 있다. 바람직한 구체예에서, CD47에 대한 SIRP-α 변이체의 결합 친화성은 표면 플라스몬 공명법(예를 들어, Biacore3000™ 표면 플라스몬 공명(SPR) 시스템, Biacore, INC, Piscataway N.J.)을 사용해 결정할 수 있다. 예시적인 구체예에서, pH 7.4에서보다 pH 6에서 더 높은 친화성으로 CD47에 특이적으로 결합하는, pH-의존적 결합성의 SIRP-α 변이체는 pH 7.4에서 보다 pH 6에서 더 낮은 KD를 나타낸다.
IV. 저산소-의존적 결합
종양 저산소는 종양 세포가 산소가 고갈된 상태이다. 종양이 성장하면서, 그 혈액 공급이 종양의 가장 빨리 성장하는 부분으로 일정하게 전용되어, 종양 부분은 건강한 조직보다 산소 농도가 상당히 낮게 유지된다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체를 저산소-활성화 프로드러그에 부착시키면, 이는 특히 저산소 상태 하에서 관련 질환 세포에 대한 SIRP-알파 변이체의 효율을 증가시키도록 작용할 수 있다. 저산소-활성화 프로드러그는 문헌, 예컨대 [Kling et al. (Nature Biotechnology, 30:381, 2012)]에 기술된 것들이 알려져 있고, 이를 참조하여 본원에 편입시킨다.
V. 항체 결합
비질환 부위보다 질환 부위에서 선택적인 SIRP-α 활성을 제공하는 다른 전략은 항체의 영역에 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드에 SIRP-α 단백질을 부착시키는 것이다. 바람직하게, 항체는 질환 세포, 예를 들어 종양 세포에 특이적이다. 예를 들어, 항체는 질환 세포, 예를 들어 종양 세포 상의 세포 표면 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. SIRP-α 단백질은 항체에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합할 수 있다.
일반적인 항체 결합
일부 구체예에서, 항체 특이성과 무관하게 상이한 항체에 결합할 수 있는 SIRP-α 단백질을 조작하기 위해서, SIRP-α 단백질을 항체의 불변 영역, 예를 들어 항체의 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 불변 도메인을 인식하는 단백질 또는 펩티드에 융합시킬 수 있다. SIRP-α 단백질은 CD47에 결합할 수 있고, 야생형 SIRP-α의 서열(예를 들어, 변이체 1(하기에 나타낸 서열번호 1)) 또는 야생형 SIRP-α의 CD47-결합부의 서열(예를 들어, 표 1에 열거된 서열번호 3-12 중 어느 하나의 서열)에 대해 적어도 50% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
야생형 SIRP-α의 CD47-결합부는 야생형 SIRP-α의 D1 도메인(예를 들어, 표 1에 열거된 서열번호 3-12 중 어느 하나의 서열)을 포함한다. 항체의 불변 영역에 대한 일반적 결합을 나타내는 단백질 및 펩티드는 당분야에 공지이다. 예를 들어, 박테리아 항체-결합 단백질, 예를 들어, 단백질 A, G, 및 L은 항체의 불변 영역에 결합한다. 단백질 A 및 G는 Fc 도메인에 결합하는 반면, 단백질 L은 경쇄의 불변 영역에 결합한다. 예시적인 구체예에서, 단백질 A, G, 또는 L은 SIRP-α 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 우선적으로, 이러한 구체예에서, 단백질 A, G, 또는 L 및 SIRP-α 단백질의 융합 단백질은 즉, 화학적 접합을 통해서, 이러한 융합 단백질이 혈청 내 다른 다양한 항체에 결합하는 것을 방지하도록 투여 전에, 항체에 부착될 수 있다. 단백질 A, G, 또는 L은 또한 항체의 불변 영역에 대한 더 높은 결합 친화성을 위해 당분야의 통상적인 기술(즉, 직접 진화 및 디스플레이 라이브러리)을 사용해 진화 및 스크리닝될 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α 단백질은 당분야의 통상적인 유전자 또는 화학적 접합법을 사용해 항체에 직접 부착될 수 있다. 다른 구체예에서, SIRP-α 단백질은 단백질의 추가적인 구조적 및 공간적 탄력성을 허용하는, 스페이서에 의해 항체에 부착될 수 있다. 다양한 스페이서를 본원에서 더욱 상세하게 기술한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 단백질은 직접적으로 또는 항체-결합 단백질 또는 펩티드를 통해서, 항체에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합할 수 있다. 또한 본원에 기술된 본 발명의 구체예에 따라서 이용할 수 있는 개질된 항체의 스크리닝은 미국 공개 특허 출원 제20100189651호에 기술된 대로 수행할 수 있다.
항체의 불변 영역에 결합할 수 있는 다른 단백질 또는 펩티드 및 그러한 단백질 또는 펩티드를 스크리닝하는 방법은 그 전체로 본원에 참조로 편입시키는, 미국 공개 특허 출원 제20120283408호에 기술되어 있다.
특이적 항체 결합
일부 구체예에서, 질환 부위에서 SIRP-α 변이체의 선택적 표적화를 제공하고 특이적 항체, 예를 들어 종양-특이적 항체에 결합할 수 있는 SIRP-α 변이체를 조작하기 위해서, SIRP-α 변이체 구성체는 SIRP-α 변이체 및 항체-특이적 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. SIRP-α 변이체는 항체-특이적 단백질 또는 펩티드(예를 들어, 항체-결합 펩티드)에 융합될 수 있다. 바람직하게, 이러한 단백질 또는 펩티드는 종양-특이적 항체에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 및 항체-결합 단백질 또는 펩티드의 융합 단백질을 병용 요법으로 종양-특이적 항체와 공동투여할 수 있다. 다른 구체예에서, 융합 단백질 및 종양-특이적 항체는 개별적으로, 즉 서로 수 시간 내에, 투여될 수 있고, 바람직하게, 항체가 먼저 투여된다. 또 다른 구체예에서, 투여 전에, 융합 단백질을 당분야에 통상적으로 알려진 유전자 또는 화학 방법을 사용해 종양-특이적 항체에 공유적으로 부착될 수 있다.
항체-결합 펩티드의 예는 세툭시맙의 단편 항원-결합(Fab) 영역의 중심부에 결합할 수 있는 소형 펩티드인, 질환 국재화 펩티드(DLP)(서열번호 64 또는 65)를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Donaldson et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 110: 17456-17461, 2013]을 참조함). 세툭시맙은 항-상피 성장 인자 수용기(EGFR) IgG1 항체이다. SIRP-α 변이체에 융합될 수 있는 항체-결합 펩티드는 또한 제한없이, DLP의 서열(서열번호 64 또는 65) 또는 이의 단편에 대해 적어도 75% 아미노산 서열 동일성을 갖는 펩티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 항체-결합 펩티드는 서열번호 64의 서열을 갖는다.
최근의 연구에서, SIRP-α는 항체 세툭시맙과 조합하여 DLd-1 세포의 시험관내 식세포작용을 향상시키는 것으로 확인되었다(Weiskopf et al., Science 341: 88-91, 2013). 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 특이적 항체-결합 펩티드, 예를 들어 서열번호 64의 서열을 갖는 DLP에 융합될 수 있다. 이들 구체에에서, SIRP-α 변이체 및 DLP를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체는 세툭시맙-결합된, EGFR 발현 종양에서 그 활성을 표적화할 수 있다. 이어 이는 항-EGFR 반응성 환자에게 SIRP-α 변이체 및 DLP를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체 및 세툭시맙의 전달을 더욱 개선시킬 수 있다. SIRP-α 변이체 및 DLP를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체는 서열번호 66으로 나타내었으며, 여기서 한줄로 밑줄쳐진 부분은 DLP를 나타내고 굵은 부분은 SIRP-α 변이체를 나타낸다. 서열번호 66에서 SIRP-α 변이체의 서열(굵은 부분)은 본원에 기술된 임의의 SIRP-α 변이체의 서열로 교체될 수 있다. 다른 항체-결합 펩티드가 또한 SIRP-α 변이체에 융합될 수 있다. 이러한 항체-결합 펩티드는 제한없이, 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드 예컨대 세툭시맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, MEDI0680, MEDI6469, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, 반틱투맙, 발릴루맙, 모가말리주맙, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CS1 항체, 허셉틴, 트라스투주맙, 및/또는 퍼투주맙을 포함한다.
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 및 DLP를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체는 절단성 링커가 절단되는 질환 부위에 구성체가 도달하기 전에 구성체 내 SIRP-α 변이체의 결합을 차단하기 위해 본원에 기술된 CD47-기반 차단 펩티드와 더욱 조합될 수 있다. 이들 구체예에서, SIRP-α 변이체, CD47-기반 차단 펩티드, 및 DLP를 함유하는 SIRP-α 변이체 구성체가 질환 부위에 축적되고 프로테아제(예를 들어, 종양-특이적 프로테아제) 또는 질환 부위의 다른 특징(예를 들어, 산성 pH, 저산소)에 의해 유도되는 링커 절단 후 질환 부위에서만 활성화되므로 치료창이 확장될 수 있다.
일부 구체예에서, 종양-특이적 항체에 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드는 당분야에서 통용되는 기술, 예컨대 직접 진화 및 디스플레이 라이브러리, 예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리를 사용해 동정될 수 있다. 종양-특이적 항체에 결합할 수 있는 단백질 및 펩티드를 동정하는 방법 및 기술은, 당분야에 알려져 있으며, 예컨대 그 전체로 본원에 참조로 편입되는 문헌 [Donaldson et al. (Proc Natl Acad Sci 110:17456-61, 2013)]에 기술된 것들이 있다. 파지 디스플레이 라이브러리에서, 전형적으로 잠재적인 항체-특이적 단백질 또는 펩티드는 박테리오파지 코트 단백질에 공유 연결된다. 이러한 연결은 코트 단백질에 융합된 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산의 번역에 의한다. 펩티드를 전시하는 박테리오파지를 표준 파지 준비 방법, 예를 들어 성장 배지로부터 PEG 침전법을 사용해 성장 및 회수할 수 있다. 이들 전시된 파지를 이어서 전시된 단백질과 종양-특이적 항체 간 상호작용을 검출하기 위해, 다른 단백질, 예를 들어 종양-특이적 항체에 대해 스크리닝할 수 있다. 종양-특이적 단백질 또는 펩티드가 동정되면, 선택된 종양-특이적 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산을 증폭 후, 선택된 파지로 감염된 세포 또는 파지 자체로부터 단리할 수 있다. 개별 콜로니 또는 플라크를 선택하고 핵산을 단리하고 서열분석할 수 있다. 항체-특이적 단백질 또는 펩티드를 동정 및 단리한 후, 단백질 또는 펩티드는 SIRP-α 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 당분야의 통상적인 유전자 또는 화학 접합 기술을 사용해 종양-특이적 항체에 직접 부착될 수 있다. 다른 구체예에서, SIRP-α 변이체는 또한 단백질의 추가적인 구조적 및 공간적 탄력성을 허용하는, 스페이서에 의해 종양-특이적 항체에 부착될 수 있다. 다양한 스페이서를 본원에서 더욱 상세하게 설명한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 직접적으로 또는 항체-결합 단백질 또는 펩티드를 통해서 항체에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합될 수 있다.
다른 구체예에서, 야생형 SIRP-α 또는 야생형 SIRP-α의 세포외 D1 도메인(예를 들어, 표 1에 열거된 서열번호 3-12 중 어느 하나의 서열)은 종양-특이적 항체에 부착될 수 있다. 바람직하게, SIRP-α의 D1 도메인은 종양-특이적 항체에 부착된다. 종양-특이적 항체는 야생형 SIRP-α 또는 D1 도메인이 질환 세포 상의 CD47과 상호작용할 수 있는, 질환 부위, 예를 들어 암 부위, 예를 들어 고형 종양 내부로 야생형 SIRP-α 또는 D1 도메인을 데리고 가는 표적화 모이어티로서 제공된다. 일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α 또는 야생형 SIRP-α의 세포외 D1 도메인은 당분야의 통상적인 유전자 또는 화학 접합 기술을 사용해 종양-특이적 항체에 직접 부착될 수 있다. 다른 구체예에서, 야생형 SIRP-α 또는 야생형 SIRP-α의 세포외 D1 도메인은 또한 단백질의 추가적인 구조적 및 공간적 탄력성을 허용하는, 스페이서에 의해 종양-특이적 항체에 부착될 수 있다. 다양한 스페이서를 본원에서 더욱 상세하게 기술한다. 다른 구체예에서, 야생형 SIRP-α 또는 야생형 SIRP-α의 세포외 D1 도메인은 종양-특이적 항체에 결합할 수 있는 상기에 언급한 단백질 또는 펩티드에 융합될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 다른 SIRP-α 폴리펩티드, 예컨대 국제 공개 특허 출원 WO2013109752(참조로 본원에 편입됨)에 기술된 것들은 종양-특이적 항체 또는 종양-특이적 항체에 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드에 부착될 수 있다. 일부 구체예에서, 야생형 SIRP-α 또는 D1 도메인은 직접적으로 또는 항체-결합 단백질 또는 펩티드를 통해서, 항체에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합될 수 있다.
VI. 차단 펩티드
차단 펩티드는 절단성 링커를 통해 SIRP-α 변이체를 부착시킨다. 일부 구체예에서, 차단 펩티드는 또한 비공유적으로 SIRP-α 변이체에 부착될 수 있다. 차단 펩티드는 SIRP-α 변이체가 생리학적 상태(예를 들어, 중성 pH 및 적절한 산소 농도 하에서 비질환 세포의 세포 표면 상의 CD47에 결합할 수 없도록 SIRP-α 변이체의 CD47 결합 부위를 차단하게 기능한다. 질환 부위, 예컨대 암 부위, 예를 들어 종양 내부의 비정상적인 상태(즉, 산성 및/또는 저산소 환경 또는 프로테아제 발현이 높은 환경)에서, 절단성 링커가 절단되어 차단 펩티드로부터 SIRP-α 변이체를 방출시킬 수 있다. SIRP-α 변이체는 종양 세포 근처의 CD47에 자유롭게 결합할 수 있다. 절단성 링커의 예를 본원에 더욱 상세하게 기술한다.
일부 구체예에서, 차단 펩티드는 조작된 SIRP-α 변이체보다 야생형 SIRP-α에 대해 더 높은 친화성을 갖는다. 링커가 절단되면, 차단 펩티드는 SIRP-α 변이체로부터 해리되어 야생형 SIRP-α에 결합할 수 있다. 야생형 SIRP-α 및 SIRP-α 변이체에 대해 다른 결합 친화성을 갖는 차단 펩티드를 당분야에 일반적으로 알려진 방법 및 기술, 예를 들어 직접 진화법 및 디스플레이 라이브러리(예를 들어, 파지 또는 효모 디스플레이)를 사용해 동정할 수 있다. 예시적인 일 구체예에서, CD47의 SIRP-α 결합 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 또는 항-SIRP-α 항체의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드는 예를 들어 에러-프론 PCR 및 DNA 셔플링과 같은 기술을 사용해 유전자 변이체의 거대 라이브러리를 생성하도록 무작위적으로 돌연변이 및/또는 재조합될 수 있다. 유전자 라이브러리가 생성되면, 그 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 돌연변이체 펩티드는 예를 들어 파지 또는 효모 디스플레이를 사용해 야생형 SIRP-α 및 SIRP-α 변이체에 결합하는 그들 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 야생형 SIRP-α 및 SIRP-α 변이체 둘 모두에 결합할 수 있는 동정된 펩티드는 SIRP-α 변이체보다 야생형 SIRP-α에 더 높은 친화성으로 결합하는 단백질이 단리될 수 있게 2차 스크리닝 과정을 겪을 수 있다. 동정된 펩티드는 야생형 SIRP-α 또는 SIRP-α 변이체에 결합되면, 야생형 SIRP-α 또는 SIRP-α 변이체에 CD47의 결합을 방지해야 한다. 당업자에게 알려진 다양한 기술을 사용하여 SIRP-α 변이체/차단 펩티드 복합체 또는 야생형 SIRP-α/차단 펩티드 복합체의 친화성 상수(KA) 또는 해리 상수(KD)를 측정할 수 있다. 차단 펩티드는 SIRP-α 변이체보다 야생형 SIRP-α에 적어도 3배 더 높은 친화성으로 결합할 수 있다.
CD47-기반 차단 펩티드
차단 펩티드는 본원에 기술된 SIRP-α 변이체에 결합할 수 있는 CD47 모방 폴리펩티드, 또는 CD47 단편일 수 있다. 일부 차단 펩티드는 CD47 결합 부위와 상이한 부위에서 SIRP-α 변이체에 결합할 수 있다. 일부 차단 펩티드는 CD47과 다른 방식으로 SIRP-α 변이체에 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 차단 펩티드는 적어도 하나의 안정화 디설피드 결합을 포함할 수 있다. 차단 펩티드는 CERVIGTGWVRC의 폴리펩티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 변이체 차단 펩티드는 1 이상의 보존성 또는 비보존성 개질을 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 변이체 차단 펩티드는 시스테인에서 세린으로의 개질 및/또는 아스파라긴에서 글루타민으로의 1 이상의 개질을 함유할 수 있다. 차단 펩티드는 CERVIGTGWVRC의 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 펩티드와 동일한 부위에서 SIRP-α 변이체에 결합할 수 있다. 차단 펩티드는 GNYTCEVTELTREGETIIELK의 폴리펩티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 차단 펩티드는 GNYTCEVTELTREGETIIELK의 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 펩티드와 동일한 부위에서 SIRP-α 변이체에 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 차단 펩티드는 EVTELTREGE의 폴리펩티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 차단 펩티드는 EVTELTREGE의 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 펩티드와 동일한 부위에서 SIRP-α 변이체에 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 차단 펩티드는 CEVTELTREGEC의 폴리펩티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 차단 펩티드는 CEVTELTREGEC의 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 펩티드와 동일한 부위에서 SIRP-α 변이체에 결합할 수 있다.
본원은 SIRP-α 변이체 및 차단 펩티드를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체를 제공하고, 여기서 차단 펩티드는 SEVTELTREGET의 폴리펩티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 차단 펩티드는 SEVTELTREGET의 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 펩티드와 동일한 부위에서 SIRP-α 변이체에 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 차단 펩티드는 GQYTSEVTELTREGETIIELK의 폴리펩티드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 차단 펩티드는 GQYTSEVTELTREGETIIELK의 폴리펩티드 서열, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 펩티드와 동일한 부위에서 SIRP-α 변이체에 결합할 수 있다.
일부 경우에서, 차단 펩티드는 SIRP-α 변이체와 비교하여, 야생형 SIRP-α에 더 높은 친화성을 나타내는, CD47 변이체 폴리펩티드일 수 있다. 야생형 CD47과 비교하여, 차단 폴리펩티드는 다음의 돌연변이 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: T102Q, T102H, L101Q, L101H, 및 L101Y. 야생형 CD47과 비교하여, 차단 폴리펩티드는 N-말단에 또는 그 근처에 추가의 글리신 잔기의 도입을 포함할 수 있다. 글리신은 CD47의 N-말단 또는 그 근처의 글루타민 및/또는 류신에 인접하여 도입될 수 있다. 일부 경우에서, 차단 펩티드는 야생형 CD47과 비교하여 SIRP-α 변이체에 더 낮은 친화성이 입증된 CD47 변이체 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 CD47 변이체 폴리펩티드는 본원에서 기술한 방법들로 쉽게 동정 및 시험될 수 있다.
본원은 본원에 기술된 SIRP-α 변이체를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체를 제공하고, 이때 상기 SIRP-α 변이체는 적어도 하나의 링커 사용에 의해 본원에 기술된 차단 펩티드에 연결된다. SIRP-α 변이체는 야생형 SIRP-α와 동일한 CD47 결합 부위를 포함할 수 있다. SIRP-α 변이체는 야생형 SIRP-α와 비교하여 1 이상의 돌연변이, 또는 삽입을 포함할 수 있다. SIRP-α 변이체는 야생형 SIRP-α의 절단형일 수 있다. 차단 펩티드는 본원에 기술된 CD47 모방체, 변이체 또는 단편일 수 있다. 차단 펩티드는 SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체와 비교하여, 야생형 SIRP-α에 대해 더 높은 친화성을 나타낼 수 있다. 차단 펩티드는 야생형 CD47과 비교하여 SIRP-α 변이체에 대해 더 낮은 친화성이 입증된 CD47 변이체 폴리펩티드일 수 있다. 링커는 1 이상의 프로테아제에 의해 선택적으로 절단될 수 있는 적어도 하나의 링커일 수 있고, 경우에 따라 1 이상의 스페이서를 또한 포함한다. 절단성 링커는 서열 LSGRSDNH을 포함할 수 있다. 스페이서는 각각의 유닛이 서열 GGGGS를 포함하는, 1 이상의 글리신-세린 스페이서 유닛을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 절단성 링커에 의해 SIRP-α 변이체에 부착되는 차단 펩티드는 CD47에서 유래된 SIRP-α-결합 펩티드(즉, CD47-기반 차단 펩티드)일 수 있다. 일부 구체예에서, CD47-기반 차단 펩티드는 CD47의 SIRP-α 결합부에서 유래된다. CD47의 SIRP-α 결합부는 종종 CD47의 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF) 도메인이라고 하며, 이의 서열을 이하에 나타낸다(서열번호 35; Ref. NP_0017681).
일부 구체예에서, CD47-기반 차단 펩티드는 CD47의 전체 길이, IgSF 도메인(서열번호 35) 또는 이의 단편을 함유한다. 일부 구체예에서, CD47-기반 차단 펩티드는 CD47의 야생형, IgSF 도메인(서열번호 35) 또는 이의 단편에 비해 1 이상의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 부가를 함유한다. 일부 구체예에서, CD47-기반 차단 펩티드는 CD47의 야생형, IgSF 도메인의 서열(서열번호 35) 또는 이의 단편에 대해 적어도 80%(예를 들어, 83%, 86%, 90%, 93%, 96% 등)의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
일부 구체예에서, CD47-기반 차단 펩티드의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 부가는 SIRP-α 변이체에 대해 낮은 결합 친화성 및 야생형 SIRP-α에 대해 비교적 높은 결합 친화성을 갖는 CD47-기반 차단 펩티드를 생성시킨다. 일부 구체예에서, CD47-기반 차단 펩티드의 아미노산 치환은 CD47와 SIRP-α의 경계면에 위치한다. 예를 들어, CD47 IgSF 도메인의 아미노산 치환 T102Q은 SIRP-α 변이체의 아미노산 치환 A27I와 입체적으로 충돌하는 반면, A27을 갖는 야생형 SIRP-α는 아미노산 치환 T102Q와 입체적으로 충돌하지 않는다(도 2 참조). 따라서, T102Q를 갖는 CD47-기반 차단 펩티드는 A27I를 갖는 SIRP-α 변이체보다 A27을 갖는 야생형 SIRP-α에 더 높은 친화성으로 결합하게 된다. SIRP-α 변이체의 특정 아미노산과 입체적 충돌을 일으킬 수 있는 CD47-기반 차단 펩티드 내 아미노산 치환의 예를 표 5에 열거하였다. CD47-기반 차단 펩티드 내 이들 아미노산 치환 각각은 SIRP-α-CD47 상호작용 부위에서 SIRP-α 변이체의 특정 아미노산에 의존적으로, SIRP-α 변이체에 대한 CD47-기반 차단 펩티드의 결합 친화성을 감소시킬 수 있다.
표 5: SIRP-α 변이체의 특이적 아미노산과 입체 충돌을 생성시킬 수 있는 CD47-기반 차단 펩티드 내 아미노산 치환의 예
CD47-기반 차단 펩티드의 아미노산 치환
(아미노산 번호는 서열번호 35에 대함)		 SIRP-α 변이체의 아미노산
(아미노산 번호는 서열번호 13-23 중 어느 하나에 대함)
T102Q 27I
T102H 27I
L101Q 31F
L101H 31F
L101Y 31F
CD47-기반 차단 펩티드와 SIRP-α 변이체 간 입체 충돌을 생성시키는 이외에도, 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 또한 사용해 CD47-기반 차단 펩티드와 SIRP-α 변이체 사이의 특이적인 비공유 상호작용을 파괴하여, SIRP-α 변이체에 대한 CD47-기반 차단 펩티드의 결합 친화성을 감소시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 1 이상의 아미노산을 N-말단에 직접 부가하고/하거나 N-말단의 다른 아미노산 사이에 1 이상의 아미노산을 삽입하여, 1 이상의 아미노산(예를 들어, 하나의 아미노산)만큼 CD47-기반 차단 펩티드의 N-말단이 확장되면, CD47-기반 차단 펩티드의 N-말단과 SIRP-α 변이체 사이의 비공유 상호작용(예를 들어, 수소 결합 상호작용)이 파괴된다. 예를 들어, CD47-기반 차단 펩티드의 N-말단에 아미노산 부가, 예를 들어 글리신 부가는 N-말단에서 글루타민의 파이로글루타메이트로의 환화를 방지하고 또한 CD47-기반 차단 펩티드의 N-말단 파이로글루타메이트와 야생형 SIRP-α의 아미노산 L66 또는 SIRP-α 변이체의 아미노산 치환 L66T 간 수소 결합 상호작용을 파괴할 수도 있는 원치않는 접촉 및 상호작용을 생성시키게된다(예를 들어, 실시예 5 참조). 일부 구체예에서, CD47의 N-말단이 QLLFNK에서 GQLLFNK 또는 QGLLFNK로 변화되도록 아미노산 잔기, 예를 들어, 글리신을 CD47-기반 차단 펩티드의 N-말단에 부가한다. CD47-기반 차단 펩티드에서 아미노산 치환, 결실, 및/또는 부가의 선택은 SIRP-α 변이체의 특정 아미노산 치환에 의존적이다.
또한, 절단성 링커 및 선택적으로 1 이상의 스페이서를 통한 SIRP-α 변이체의 C-말단에 CD47-기반 차단 펩티드의 N-말단의 융합은 또한 CD47-기반 차단 펩티드와 SIRP-α 변이체 간 결합 상호작용에 영향을 미치고 SIRP-α 변이체에 대한 CD47-기반 차단 펩티드의 결합 친화성을 감소시킨다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체에서, CD47-기반 차단 펩티드의 N-말단은 절단성 링커 및 경우에 따라 1 이상의 스페이서에 의해 SIRP-α 변이체의 C-말단에 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체에서, CD47-기반 차단 펩티드의 C-말단은 절단성 링커 및 경우에 따라 1 이상의 스페이서에 의해 SIRP-α 변이체의 N-말단에 융합될 수 있다. 절단성 링커 및 스페이서의 예는 본원에서 더욱 상세하게 기술한다.
CD47-기반 차단 펩티드의 예를 표 6에 나타내었다. 일부 구체예에서, CD47-기반 차단 펩티드는 서열 SEVTELTREGET(서열번호 38)을 갖거나 또는 포함한다. 일부 구체예에서, CD47-기반 차단 펩티드는 서열 GQYTSEVTELTREGETIIELK(서열번호 40)을 갖거나 또는 포함한다.
VII. 절단성 링커
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 차단 펩티드에 부착된 SIRP-α 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 차단 펩티드에 부착된 야생형 SIRP-α를 포함한다. 변이체 또는 야생형 SIRP-α 및 차단 펩티드를 융합시키는데 사용되는 링커는 절단성 링커 또는 비절단성 링커일 수 있다. 일부 구체예에서, 질환 세포 또는 질환 부위 상의 CD47에 대한 SIRP-α 변이체 구성체 내 SIRP-α 변이체의 우선적인 결합은 질환 세포 또는 질환 부위에서 절단되는, 절단성 링커의 사용에 의해 차단 펩티드를 SIRP-α 변이체에 부착시켜 얻을 수 있다.
일부 구체예에서, 절단성 링커는 SIRP-α 변이체와 차단 펩티드 사이에 사용된다. 일부 구체예에서, 절단성 링커는 생리학적 상태 하에서 CD47에 대한 SIRP-α 변이체의 결합을 차단하도록 SIRP-α 변이체와 비공유적으로 회합될 수 있는, 차단 펩티드 내에 설치될 수 있다. 절단성 링커는 일정 상태 하에서 절단될 수 있다. 절단성 링커가 차단 펩티드 내에 위치하면, 링커의 절단이 차단 펩티드를 불활성화시키게 된다. 질환 부위, 예컨대 암 부위, 예를 들어 종양 내부에 특징적인 상태 하에서, 링커는 SIRP-α 변이체가 질환 세포, 예를 들어 종양 세포의 세포 표면 상의 근처 CD47에 결합할 수 있도록 차단 펩티드로부터 SIRP-α 변이체를 방출하게 절단된다. 이러한 방식으로, SIRP-α 변이체 및 차단 펩티드를 포함하는 SIRP-α 구성체에서, SIRP-α 변이체는 질환 세포(예를 들어, 종양 세포) 또는 질환 부위의 세포(예를 들어, 종양 성장을 지원하는 종양 미세 환경의 세포) 상의 CD47에만 결합할 수 있고, 생리학적 상태의 비질환 세포 상의 CD47에는 결합할 수 없는데, 절단성 링커가 생리학적 상태 하에서는 안정하게 유지되고 SIRP-α 변이체의 CD47-결합 부위가 차단 펩티드에 의해 차단되어 있기 때문이다. 절단성 링커는 질환 부위의 특징적인 상태, 예컨대 산성 pH, 저산소, 및 높은 프로테아제 발현 하에서 링커의 절단을 유도하거나 또는 절단되는 아미노산, 유기 소형 분자, 또는 아미노산과 유기 소형 분자의 조합을 포함한다. 절단성 링커는 생리학적 상태(예를 들어, 중성 pH 및 적절한 산소 농도)에서 안정하다. 일부 구체예에서, 절단성 링커는 절단되지 않고 차단 펩티드는 질환 부위에서 SIRP-α 변이체로부터 단순하게 해리되어 SIRP-α 변이체가 질환 세포, 예를 들어 종양 세포 상의 근처 CD47에 자유롭게 결합한다. 이들 구체예에서, SIRP-α 변이체는 CD47에 pH-의존적으로 결합하게 조작될 수 있으며, 그 상세 사항은 앞서 기술되어 있다. SIRP-α 변이체는 비질환 부위의 중성 pH(예를 들어, 대략 pH 7.4)에서보다 질환 부위의 산성 pH 하에서 CD47에 높은 친화성으로 결합하게 조작될 수 있다. 따라서, 차단 펩티드(예를 들어, CD-47 기반 차단 펩티드 또는 CD47 IgSF 도메인 차단 단백질)는 질환 부위의 산성 pH 하에서 SIRP-α 변이체로부터 멀리 해리될 수 있다. 일부 구체예에서, 질환 부위에서 CD47에 대한 SIRP-α 변이체의 pH-의존적 결합을 조작하기 위해서, 히스티딘 돌연변이유발법을 SIRP-α, 특히 CD47과 상호작용하는 SIRP-α의 영역에 대해 수행할 수 있다.
pH-의존적 절단성 링커
암 부위, 예를 들어 종양 내부의 특징 중 하나는 산성 pH이다. 일부 구체예에서, 링커는 산성 pH(예를 들어, 대략 pH 7 미만) 하에서 절단될 수 있다. 산-감응성 링커는 생리학적 pH(예를 들어, 대략 pH 7.4)에서 안정하다. 산성 pH에서의 절단은 질환 부위, 예컨대 암 부위, 예를 들어 종양 내부의 산성 pH에서 존재하고 활성있는 단백질에 의하거나 또는 산 가수분해를 통해서 된다. 산-감응성 링커는 산성 pH 하에서 가수분해될 수 있는, 모이어티, 예컨대 화학 작용기 또는 화합물을 포함한다. 산-감응성 화학 작용기 및 화합물은 제한없이, 예를 들어, 아세탈, 케탈, 티오말레아메이트, 히드라존, 및 디설피드 결합을 포함한다. 산-감응성 링커의 제작에 사용할 수 있는, 산-감응성 화학기 및 화합물을 비롯하여, 산-감응성 링커는 당분야에 알려져 있고, 미국 특허 제8,748,399호, 제5,306,809호, 및 제5,505,931호, 문헌 [Laurent et al., (Bioconjugate Chem. 21:5-13, 2010)], [Castaneda et al. (Chem. Commun. 49:8187-8189, 2013)], 및 [Ducry et al. (Bioconjug. Chem. 21:5-13, 2010)]에 기술되어 있으며, 이들 각각을 그 전체로 참조로 본원에 편입시키다. 일 구체예에서, 디설피드 결합은 펩티드 합성기 및/또는 통상의 화학 합성 기술을 사용해 절단성 링커에 장착될 수 있다. 다른 구체예에서, 티오말레암산 링커(Castaneda et al. Chem. Commun. 49:8187-8189, 2013)가 절단성 링커로 사용될 수 있다. 이러한 구체예에서, SIRP-α 변이체와 차단 펩티드 사이에 티오말렘산 링커를 삽입시키기 위해, 티오말렘산 링커의 2개 티올 기 중 하나(예를 들어, 도식 2, Castaneda et al.)는 SIRP-α 변이체의 C-말단에 부착되는 한편, 티아말렘산 링커의 에스테르기는 차단 펩티드의 N-말단에 부착될 수 있다. 참조된 간행물의 내용을 그들 전체로 참조로 본원에 편입시킨다.
저산소-의존적 절단성 링커
일부 구체예에서, 링커는 암 부위, 예를 들어 종양 내부의 다른 특징인, 저산소 상태 하에서 절단될 수 있다. 생리학적 상태(예를 들어, 중성 pH 및 적절한 산소 농도) 하에서 링커는 안정하게 유지되면서 저산소-감응성 링커에 의해 차단 펩티드에 부착된 SIRP-α 변이체는 비질환 세포 상의 CD47에 대한 결합이 방지된다. 융합 단백질이 건강한 조직보다 산소 농도가 유의하게 낮은, 암의 부위, 예를 들어 종양 내부에 위치하면, 링커가 절단되어 차단 펩티드로부터 SIRP-α 변이체가 방출되고, 이어 종양 세포 상의 세포 표면 CD47에 결합할 수 있다. 저산소-감응성 링커는 저산소 상태 하에서 절단될 수 있는 모이어티, 예를 들어 아미노산 또는 화학 작용기를 포함할 수 있다. 저산소 상태 하에서 절단, 즉 환원을 통해 절단될 수 있는 화학 모이어티의 일부 예는 제한없이, 퀴논, N-옥시드, 및 이종방향성 니트로 기를 포함한다. 이들 화학 모이어티는 통상의 화학 및 펩티드 합성 기술을 사용해 절단성 링커에 장착될 수 있다. 저산소-감응성 아미노산의 예는 당분야에 공지이고, 예컨대 문헌 [Shigenaga et al. (European Journal of Chemical Biology 13:968-971, 2012)]에 기술된 것들이 있으며, 이 문헌을 그 전체로 참조로 본원에 편입시킨다.
바람직한 구체예에서, 문헌 [Shigenaga et al. (European J. Chem, Biol. 13:968-971, 2012)]에 기술된 저산소-감응성 아미노산을 SIRP-α 변이체와 차단 펩티드 사이에 삽입시킬 수 있다. 예를 들어, 저산소-감응성 아미노산의 아미노 기를 펩티드 결합을 통해 SIRP-α 변이체의 C-말단에 부착시키고, 유사하게, 저산소-감응성 아미노산의 카르복실산 기를 펩티드 결합을 통해 차단 펩티드의 N-말단에 부착시킬 수 있다. 저산소 상태 하에서, 니트로 기의 환원은 저산소-감응성 아미노산과 차단 펩티드의 N-말단 사이 펩티드 결합의 절단을 유도하여, 차단 펩티드로부터 SIRP-α 변이체가 성공적으로 방출된다. 이어서 SIRP-α 변이체가 종양 세포 상의 CD47에 결합할 수 있다.
다른 구체예에서, 문헌 [Duan et al. (J. Med. Chem. 51:2412-2420, 2008)]에 기술된 저산소-감응성 2-니트로이미다졸 기를 SIRP-α 변이체와 차단 펩티드 사이에 삽입하거나 또는 SIRP-α 변이체와 차단 펩티드 사이에 삽입된 절단성 링커에 장착시킬 수 있다. 저산소 상태 하에서, 니트로 기의 환원은 추가 환원을 유도하고, 궁극적으로 그의 부착물, 예를 들어, SIRP-α 변이체, 차단 펩티드, 또는 절단성 링커로부터 2-니트로이미다졸 기의 제거를 초래한다.
종양-연관 효소-의존적 절단성 링커
다른 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 링커 및 경우에 따라 1 이상의 스페이서(스페이서의 예는 본원에 더욱 상세하게 기술함)에 의해 차단 펩티드에 부착된 SIRP-α 변이체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 링커(예를 들어, 절단성 링커)는 종양-연관 효소에 의해 절단될 수 있다. 일부 구체예에서, 종양-연관 효소에 의해 절단될 수 있는, 링커는 SIRP-α 변이체에 비공유적으로 부착된, 차단 펩티드 내에 함유될 수 있다. 융합 단백질이 암의 부위, 예를 들어 종양 내부에 존재하면, 링커는 종양-연관 효소에 의해 절단되어 차단 펩티드로부터 SIRP-α 변이체를 방출시키고, 이어 종양 세포 상의 세포 표면 CD47에 결합할 수 있다. 종양-연관 효소에 감응성인 링커는 암 부위, 예를 들어 종양 내부에만 존재하는, 효소, 예를 들어 프로테아제에 의해 특이적으로 절단될 수 있는 모이어티, 예를 들어 단백질 기질을 함유할 수 있다. 모이어티는 암 부위, 예를 들어 종양 내부에 존재하는 효소, 예를 들어 프로테아제의 유형을 기초로 선택될 수 있다. 종양-연관 효소에 의해 절단될 수 있는 예시적인 절단성 링커는 다수의 프로테아제, 예를 들어, 마트립타제(MTSP1), 비뇨기형 플라스미노겐 활성인자(uPA), 레구마인, PSA(KLK3, 칼리크레인-관련 펩티다제-3이라고도 함), 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2), MM9, 인간 호중구 엘라스타제(HNE), 및 프로테이나제 3(Pr3)에 의해 절단될 수 있는 LSGRSDNH(서열번호 47)이다. 효소(예를 들어, 프로테아제)에 의한 절단에 감수성인 다른 절단성 링커가 또한 이용가능하다. 상기 언급한 프로테아제 이외에도, 절단성 링커를 절단할 수 있는 다른 효소(예를 들어, 프로테아제)는 제한없이, 우로키나제, 조직 플라스미노겐 활성인자, 트립신, 플라스민, 및 다른 단백질가수분해성 활성을 갖는 효소를 포함한다. 본 발명의 일부 구체예에 따라서, SIRP-α 변이체 또는 야생형 SIRP-α는 단백질가수분해성 활성을 갖는 효소, 예컨대 우로키나제, 조직 플라스미노겐 활성인자, 플라스민, 또는 트립신에 의한 절단에 감수성인 링커(예를 들어, 절단성 링커)에 의해 차단 펩티드에 부착된다.
일부 구체예에서, 절단성 링커의 서열은 상이한 효소 선호도를 기반으로 몇몇 서열을 함께 모아 유도시키고 선택할 수 있다. 몇몇 가능한 프로테아제 및 그들의 상응하는 프로테아제 부위의 비제한적인 예를 표 7에 나타내었다. 표 7에서, "-"는 임의의 아미노산(즉, 임의의 천연 발생 아미노산)을 나타내고, 대문자는 그 아미노산에 대한 강한 선호도를 나타내며, 소문자는 그 아미노산에 대한 미미한 선호도를 나타내며, "/"는 "/"에 인접한 위치에서 1보다 많은 아미노산이 가능한 경우에 아미노산 위치를 분리시킨다. 다른 절단성 서열은 제한없이, 인간 간 콜라겐 유래 서열(α1(III) 사슬(예를 들어, GPLGIAGI(서열번호 100))), 인간 PZP 유래 서열(예를 들어, YGAGLGVV(서열번호 101), AGLGVVER(서열번호 102), 또는 AGLGISST(서열번호 103)), 및 자가분해성의 다른 서열(예를 들어, VAQFVLTE(서열번호 104), AQFVLTEG(서열번호 105), 또는 PVQPIGPQ(서열번호 106))을 포함한다.
프로테아제 가능한 프로테아제 부위
uPA: L/S/G-/R--/S-/D/N/H (서열번호 69); -/s/gs/Rk-/rv/-/-/- (서열번호 70); SGR-SA (서열번호 71)
마트립타제: L/S/G-/R--/S-/D/N/H (서열번호 72); r/-/--/Rk-/v-/-/g/- (서열번호 73); RQAR-VV (서열번호 74); r/-/-/Rk/v/-/g (서열번호 75); /Kr/RKQ/gAS/RK/A (서열번호 76)
레구마인: L/S/G-/R--/S-/D/N/H (서열번호 77); ---/--/-/N/-/-/- (서열번호 78); AAN-L (서열번호 79); ATN-L (서열번호 80)
PSA si/sq/-/yqr s/s/-/- (서열번호 81); S/S/K/L/Q (서열번호 82)
MMP2 -/p/-/- /li/-/-/- (서열번호 83)
MMP9 g/pa/-/gl/-/g/- (서열번호 84); G/P/L/G/I/A/G/Q (서열번호 85); P/V/G/L/I/G (서열번호 86); H/P/V/G/L/L/A/R (서열번호 87)
HNE -/-/-/viat-/-/-/- (서열번호 88)
Pr3 -/y/y/vta -/-/-/- (서열번호 89)
프로-우로키나제 PRFKIIGG (서열번호 90); PRFRIIGG (서열번호 91)
TGFβ SSRHRRALD (서열번호 92)
플라스미노겐 RKSSIIIRMRDVVL (서열번호 93)
스타필로키나제 SSSFDKGKYKKGDDA (서열번호 94); SSSFDKGKYKRGDDA (서열번호 95)
인자 Xa IEGR; IDGR (서열번호 96); GGSIDGR (서열번호 97)
젤라티나제 PLGLWA (서열번호 98)
인간 섬유아세포 콜라게나제 DVAQFVLT (서열번호 99)
다양한 유형의 암, 예를 들어 고형 종양에서 기지의 기질을 갖는 높은 농도의 효소에 대한 문헌 보고가 존재한다. 예를 들어, 문헌 [La Rocca et al., Brit. J. Cancer 90:1414-1421] 및 [Ducry et al., Bioconjug. Chem. 21:5-13, 2010]을 참조하며, 이들 각각을 그 전체로 참조로 본원에 편입시킨다. 종양-연관 효소는 또한 당분야에 공지된 통상의 기술, 예를 들어 종양 세포의 면역조직화학법을 사용해 동정할 수 있다. 예시적인 일 구체예에서, 링커의 효소-감응성 모이어티는 암 부위, 예를 들어 종양 내 부에 존재하는 MMP에 의해 절단될 수 있는, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 기질일 수 있다. 예시적인 다른 구체예에서, 링커의 효소-감응성 모이어티는 일정 종양에서 높은 수준으로 존재하는 프로테아제(예를 들어, 카텝신 또는 플라스민)에 의한 단백질가수분해를 통해 절단될 수 있는 말레이미도-함유 디펩티드 링커(예를 들어, 문헌 [Ducry et al.]의 표 1 참조)일 수 있다(Koblinski et al., Chim. Acta 291:113-135, 2000). 이러한 구체예에서, 말레이미도-함유 디펩티드 링커의 말레이미드 기는 SIRP-α 변이체의 시스테인 잔기에 접합될 수 있고 말레이미도-함유 디펩티드 링커의 C-말단의 카르복실산 기는 차단 펩티드의 N-말단의 아미논 기에 접합될 수 있다. 유사하게, 말레이미도-함유 디펩티드 링커의 말레이미드 기는 차단 펩티드의 시스테인 잔기에 접합될 수 있고 말레이미도-함유 디펩티드 링커의 C-말단의 카르복실산 기는 SIRP-α 변이체의 N-말단의 아미노 기에 접합될 수 있다. 질량 분광법 및 단백질체학 분야의 다른 이용가능한 기술을 사용해 종양-연관 효소-의존적 절단성 링커의 절단을 확인할 수 있다. 다른 효소-감응성 모이어티는 미국 특허 제8,399,219호에 기술되어 있고, 이를 전체로 참조로 본원에 편입시킨다. 일부 구체예에서, 종양-연관 효소에 감응성인 모이어티, 예를 들어 단백질 기질을 당분야에 잘 알려진 통상의 분자 세포 생물학 및 화학 접합 기술을 사용해 SIRP-α 변이체와 차단 펩티드 사이에 삽입시킬 수 있다.
VIII. 혈청 알부민
혈청 알부민과의 융합은 단백질 약제의 약동학을 개선시킬 수 있고, 구체적으로 본원에 기술한 SIRP-α 변이체를 혈청 알부민과 연결시킬 수 있다. 혈청 알부민은 포유동물의 가장 풍부한 혈액 단백질인 구형 단백질이다. 혈청 알부민은 간에서 생산되며 혈청 단백질의 대략 절반을 구성한다. 단량체이고 혈액중에서 가용성이다. 혈청 알부민의 가장 핵심적인 기능 중 일부는 체내에서 호르몬, 지방산 및 다른 단백질의 수송, pH 완충, 및 혈관과 신체 조직 간 체액의 적절한 분포에 필요한 삼투압 유지를 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 혈청 알부민에 융합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)이다. 본 발명의 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 HSA의 N-말단을 SIRP-α 변이체의 C-말단에 연결시킬 수 있다. HSA는 직접적으로 또는 링커를 통해서, SIRP-α 변이체의 C-말단에 연결될 수 있다. SIRP-α 변이체의 C-말단에 HSA의 N-말단의 연결은 CD47과 상호작용하도록 SIRP-α 변이체의 N-말단을 자유롭게 유지시키고 HSA의 C-말단의 근위 말단이 FcRn과 상호작용하게 한다. 본원에 기술한 방법 및 조성물에서 사용할 수 있는 HSA는 대체로 당분야에 공지이다. 일부 구체예에서, HSA는 UniProt ID NO: P02768의 서열의 아미노산 25-609(서열번호 67)을 포함한다. 일부 구체예에서, HSA는 서열번호 67에 비해, 1 이상의 아미노산 치환(예를 들어, C34S 및/또는 K573P)을 포함한다. 일부 구체예에서, HSA는 서열번호 68의 서열을 갖는다.
IX. 알부민-결합 펩티드
혈청 단백질과의 결합은 단백질 약제의 약동학을 개선시키며, 구체적으로, 본원에 기술된 SIRP-α 변이체는 혈청 단백질-결합 펩티드 또는 단백질과 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 SIRP-α 변이체의 반감기를 증가시키기 위해 혈청 알부민에 결합 활성을 전시하는 알부민-결합 펩티드에 융합될 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 조성물에서 사용할 수 있는 알부민-결합 펩티드는 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Dennis et al., J. Biol. Chem. 277:35035-35043, 2002] 및 [Miyakawa et al., J. Pharm. Sci. 102:3110-3118, 2013]을 참조한다. 일 구체예에서, 알부민 결합 펩티드는 서열 DICLPRWGCLW(서열번호 2)을 포함한다. 알부민-결합 펩티드는 유전적으로 SIRP-α 변이체에 융합되거나 또는 화학적 수단, 예를 들어 화학 접합을 통해 SIRP-α 변이체에 부착될 수 있다. 바람직하다면, 스페이서가 SIRP-α 변이체와 알부민-결합 펩티드 사이에 삽입되어 융합 단백질의 추가적인 구조적 및 공간적 탄력성을 허용한다. 특이적인 스페이서 및 그들의 아미노산 서열은 본원에서 더욱 상세하게 기술한다. 일부 구체예에서, 알부민-결합 펩티드는 SIRP-α 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 일례에서, 알부민-결합 펩티드의 C-말단은 펩티드 결합을 통해 SIRP-α 변이체의 N-말단에 직접 융합될 수 있다. 다른 예에서, 알부민-결합 펩티드의 N-말단은 펩티드 결합을 통해 SIRP-α 변이체의 C-말단에 직접 융합될 수 있다. 또 다른 예에서, 알부민-결합 펩티드의 C-말단의 카르복실산은 통상의 화학 접합 기술을 사용하여 SIRP-α 변이체의 내부 아미노산 잔기, 즉 리신 잔기의 측쇄 아미노 기에 융합될 수 있다. 이론에 국한되지 않고, SIRP-α 변이체에 알부민-결합 펩티드의 융합은 혈청 알부민에 그 결합을 통해 치료 단백질의 장기간 체류를 유도할 것으로 기대된다.
X. Fc 도메인
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 SIRP-α 변이체 및 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 면역글로불린의 Fc 도메인 단량체 또는 Fc 도메인 단량체의 단편에 융합될 수 있다. 당분야에서 통상적으로 알려진 바와 같이, Fc 도메인은 면역글로불린의 C-말단에 존재하는 단백질 구조이다. Fc 도메인은 CH3 항체 불변 도메인 간의 상호작용에 의해 이량체화된 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 야생형 Fc 도메인은 Fc 수용기에 결합하는 최소 구조, 예를 들어, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb, FcγRIV를 형성한다. 본 발명에서, SIRP-α 변이체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 SIRP-α 변이체에 융합된 Fc 도메인 단량체 또는 Fc 도메인의 단편은 2개의 Fc 도메인 단량체 또는 Fc 도메인 단량체의 이량체를 포함할 수 있는데, Fc 도메인 단량체가 Fc 수용기(예를 들어, FcRn 수용기)에 결합할 수 있는 것을 조건으로 한다. 또한, SIRP-α 변이체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 SIRP-α 변이체에 융합된 Fc 도메인 또는 Fc 도메인의 단편은 임의의 면역계-관련 반응을 유도하지 않는다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 이펙터 기능이 결여되도록 돌연변이될 수 있고, "죽은" Fc 도메인이 대표적이다. 예를 들어, Fc 도메인은 Fc 도메인과 Fcγ 수용기 간 상호작용을 최소화하는 것으로 알려진 특별한 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 단량체 또는 Fc 도메인의 단편은 통상의 유전자 또는 화학 수단, 예를 들어 화학 접합을 통해 SIRP-α 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 바람직하다면, 링커(예를 들어, 스페이서)가 SIRP-α 변이체와 Fc 도메인 단량체 사이에 삽입될 수 있다.
Fc 도메인 단량체의 이종이량체화
일부 구체예에서, Fc 도메인의 2개 Fc 도메인 단량체 각각은 2개 단량체의 이종이량체화를 촉진하는 아미노산 치환을 포함한다. Fc 도메인 단량체의 이종이량체화는 2개의 Fc 도메인 단량체에 상이하지만, 상용성인, 치환, 예컨대 "구멍에 손잡이(knob-into-hole)" 잔기 쌍 및 전하 잔기 쌍에 의해 촉진할 수 있다. "구멍에 손잡이" 잔기 쌍의 사용은 Carter 및 그의 동료가 기술하였다(Ridgway et al., 단백질 Eng. 9:617-612, 1996; Atwell et al., J Mol Biol. 270:26-35, 1997; Merchant et al., Nat Biotechnol. 16:677-681, 1998). 손잡이와 구멍 상호작용은 이종이량체 형성을 선호하는 반면, 손잡이-손잡이 및 구멍-구멍 상호작용은 입체 충돌 및 선호하는 상호작용의 결실로 인해 이종이량체 형성을 방해한다. "구멍에 손잡이" 기술은 또한 미국 특허 제8,216,805호, 문헌 [Merchant et al., Nature Biotechnology 16:677-681, 1998], 및 [Merchant et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 110:E2987-E2996, 2013]에 개시되어 있으며, 이들 각각을 그 전체로 참조로 본원에 편입시킨다. 구멍은 단백질의 본래 아미노산이 보다 작은 측쇄 용적을 갖는 상이한 아미노산으로 치환될 때 생기는 공극이다. 손잡이는 단백질의 본래 아미노산이 보다 큰 측쇄 용적을 갖는 상이한 아미노산으로 치환될때 생기는 요철이다. 구체적으로, 치환된 아미노산은 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인에 있고 2개 Fc 도메인 단량체의 이량체화에 관여한다. 일부 구체예에서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 구멍이 생성되어 다른 CH3 항체 불변 도메인의 손잡이를 수용하여서, 이러한 손잡이와 구멍 아미노산이 2개 Fc 도메인 단량체의 이종이량체화를 촉진하거나 또는 선호하도록 작용한다. 일부 구체예에서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 구멍이 생성되어 다른 CH3 항체 불변 도메인의 본래 아미노산을 더욱 잘 수용한다. 일부 구체예에서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 손잡이가 형성되어 다른 CH3 항체 불변 도메인의 본래 아미노산과의 추가적인 상호작용이 형성된다.
구멍은 거대 측쇄를 갖는 아미노산 예컨대 티로신 또는 트립토판을 작은 측쇄를 갖는 아미노산 예컨대 알라닌, 발린 또는 트레오닌으로 치환시켜 만들어지고, 예컨대 CH3 항체 불변 도메인의 Y407V 돌연변이가 있다. 유사하게, 손잡이는 작은 측쇄를 갖는 아미노산을 큰 측쇄를 갖는 아미노산으로 치환하여 생성되며, 예컨대 CH3 항체 불변 도메인의 T366W 돌연변이가 있다. 바람직한 구체예에서, 하나의 Fc 도메인 단량체는 손잡이 돌연변이 T366W를 포함하고 다른 Fc 도메인 단량체는 구멍 돌연변이 T366S, L358A, 및 Y407V를 포함한다. 본 발명의 SIRP-α D1 변이체는 원치않는 손잡이-손잡이 동종이량체 형성을 제한하기 위해 손잡이 돌연변이 T366W를 포함하는 Fc 도메인 단량체에 융합될 수 있다. 구멍에 손잡이 아미노산 쌍의 예는 제한없이, 표 8을 포함한다.
Fc 도메인 단량체 1 Y407T Y407A F405A T394S T366S L358A Y407V T394W
Y407T		 T394S
Y407A		 T366W T394S
Fc 도메인 단량체 2 T366Y T366W T394W F405W T366W T366Y F405A T366W F405W F405W Y407A
구멍에 손잡이 전략이외에도, Fc 도메인 단량체의 이량체화를 제어하는데 정전기 조향 전략이 또한 사용될 수 있다. 정전기 조향은 고도로 정돈된 단백질 분자의 형성을 제어하기 위해 펩티드, 단백질 도메인, 및 단백질 내 반대로 하전된 아미노산 간에 호의적인 정전기적 상호작용을 이용하는 것이다. 구체적으로, 정전기 조향을 사용해 Fc 도메인 단량체의 이량체화를 제어하기 위해서, CH3-CH3 경계면을 구성하는 1 이상의 아미노산 잔기를 양으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기로 치환시켜서 그 상호작용이 도입된 특정하게 하전된 아미노산에 따라 정전기적으로 호의적이거나 또는 비호의적이게 한다. 일부 구체예에서, 경계면의 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘은 음으로 하전된 아미노산 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환된다. 일부 구체예에서, 경계면의 음으로 하전된 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다. 하전된 아미노산은 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인 중 하나, 또는 둘 모두에 도입될 수 있다. 2개의 Fc 도메인 단량체의 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인에 하전된 아미노산의 도입은 하전된 아미노산 간 상호작용으로 인한 정전기적 조향 효과에 의해 제어됨에 따라 Fc 도메인 단량체의 이종이량체의 선택적 형성을 촉진시킬 수 있다. 정전기적 조향 기술은 또한 미국 공개 특허 출원 제20140024111호, 문헌 [Gunasekaran et al., J Biol Chem. 285:19637-46, 2010], 및 [Martens et al., Clin Cancer Res. 12:6144-52, 2006]에 개시되어 있으며, 이들 각각을 전체로 참조로 본원에 편입시킨다. 정전기적 조향 아미노산 쌍의 예는 제한없이 표 9에 포함된다.
Fc 도메인 단량체 1 K409D K409D K409E K409E K392D K392D K392E K392E K409D
K392D		 K370E
K409D
K439E
Fc 도메인 단량체 2 D399K D399R D399K D399R D399K D399R D399K D399R D399K
D356K		 D356K E357K
D399K
XI. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체
일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 또한 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 융합될 수 있다. 단백질 약제에 중합체의 부착은 숙주 면역계로부터 단백질 약제를 "차폐"시킬 수 있다(Milla et al., Curr Drug Metab. 13:105-119, 2012). 또한, 일정 중합체, 예를 들어 친수성 중합체는 또한 소수성 단백질 및 약물에 수용성을 제공할 수 있다(Gregoriadis et al., Cell Mol. Life Sci. 57:1964-1969, 2000; Constantinou et al., Bioconjug. Chem. 19:643-650, 2008). 다양한 중합체, 예컨대 PEG, 폴리시알산 사슬(Constantinou et al., Bioconjug. Chem. 19:643-650, 2008), 및 PAS 사슬(Schlapschy et al., Protein Eng. Des. Sel. 26:489-501, 2013)이 당분야에 공지되어 있고 본 발명에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 중합체, 예를 들어, PEG는 통상의 화학 방법, 예를 들어 화학 접합을 사용해, N-말단 또는 C-말단 또는 내부 위치에서, SIRP-α 변이체에 공유적으로 부착될 수 있다. 일부 구체예에서, 중합체, 예를 들어, PEG는 SIRP-α 변이체의 시스테인 치환 또는 부가에 공유적으로 부착될 수 있다. SIRP-α 변이체의 시스테인 치환은, 서열번호 13-23 중 어느 하나의 서열에 대해, I7C, A16C, S20C, T20C, A45C, G45C, G79C, S79C, 또는 A84C일 수 있다. SIRP-α 변이체에 시스테인 잔기의 부가는 당분야에서 통상적인 기술, 예를 들어 펩티드 합성, 유전자 개질, 및/또는 분자 클로닝을 사용해 도입될 수 있다. 중합체, 예를 들어, PEG는 당업자에게 잘 알려진 시스테인-말레이미드 접합을 사용해 시스테인 잔기에 부착될 수 있다. 참조된 간행물의 내용을 그들 전체로 참조로 본원에 편입시킨다.
상기 기술된 구체예 이외에도, 다른 반감기 연장 기술이 또한 이용가능하고 SIRP-α 변이체의 혈청 반감기를 증가시키는데 사용될 수 있다. 반감기 연장 기술은 제한없이, EXTEN(Schellenberger et al., Nat. Biotechnol. 27:1186-1192, 2009) 및 Albu 태그(Trussel et al., Bioconjug Chem. 20:2286-2292, 2009)를 포함한다. 참조된 간행물의 내용을 그들 전체로 참조로 본원에 편입시킨다.
XII. 스페이서
일부 구체예에서, 스페이서가 SIRP-α 변이체 구성체에 사용될 수 있다. 예를 들어, SIRP-α 변이체 구성체는 링커(예를 들어, 절단성 링커)를 통해 차단 펩티드에 부착된 SIRP-α 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 SIRP-α 구성체에서, 스페이서가 SIRP-α 변이체와 링커(예를 들어, 절단성 링커) 사이, 및/또는 링커(예를 들어, 절단성 링커)와 차단 펩티드 사이에 삽입될 수 있다. SIRP-α 변이체와 링커 간 공간화, 및/또는 링커와 차단 펩티드 간 공간화를 최적화하기 위해서, 이하에 기술된 스페이서 중 어느 하나 또는 그 이상을 사용할 수 있다.
링커(예를 들어, 절단성 링커)에 의해 차단 펩티드에 부착된 SIRP-α 변이체를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체의 일부 구체예에서, 스페이서는 절단성 링커가 절단을 담당하는 효소에 보다 잘 접근할 수 있도록 SIRP-α 변이체 및 차단 펩티드의 코어로부터 멀리 절단성 링커를 위치시킨다. SIRP-α 변이체 구성체에서 2 성분, 예를 들어 (이러한 순서로) SIRP-α 변이체, 링커, 및 차단 펩티드를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체 및 링커(예를 들어, 절단성 링커)의 부착은 구체적인 부착 방식 또는 특정 반응을 통한 방식을 필요로 하지 않음을 이해한다. 적합한 안정성 및 생물학적 상용성의 SIRP-α 변이체 구성체를 제공하는 임의의 반응이 허용된다.
스페이서는 SIRP-α 변이체 구성체의 2개 성분, 예를 들어, (예를 들어, 이 순서로) SIRP-α 변이체, 링커, 및 차단 펩티드를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체 및 링커(예를 들어, 절단성 링커), (예를 들어, 이 순서로) SIRP-α 변이체, 링커, 및 차단 펩티드를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체의 링커(예를 들어, 절단성 링커) 및 차단 펩티드, SIRP-α 변이체 및 혈청 단백질-결합 펩티드 또는 단백질, 예를 들어, 알부민-결합 펩티드 간 연결부를 의미한다. 스페이서는 또한 SIRP-α 변이체 또는 야생형 SIRP-α 및 항체, 예를 들어, 종양-특이적 항체, 또는 항체-결합 펩티드 사이에 삽입될 수 있는 연결부를 의미한다. 스페이서는 SIRP-α 변이체 구성체의 부가적인 구조적 및/또는 공간적 탄력성을 제공한다. 스페이서는 단순한 화학 결합, 예를 들어, 아미드 결합, 소형, 유기 분자(예를 들어, 탄화수소 사슬), 아미노산 서열(예를 들어, 3-200개 아미노산 서열), 또는 소형, 유기 분자(예를 들어, 탄화수소 사슬) 및 아미노산 서열(예를 들어, 3-200개 아미노산 서열)의 조합일 수 있다. 스페이서는 질환 부위의 특징적인 상태, 예를 들어, 산성 pH 및 저산소 하에서 뿐만 아니라 생리학적 상태(예를 들어, 중성 pH 및 적절한 산소 농도) 하에서 안정하다. 스페이서는 암 부위와 같은 질환 부위에서, 예를 들면 종양 내에서 안정하다.
스페이서는 3-200개 아미노산을 포함할 수 있다. 안정한 펩티드 스페이서는 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 탄성 아미노산 잔기, 예컨대 글리신 및 세린을 함유한 펩티드 링커를 포함할 수 있다. 일정 구체예에서, 스페이서는 모티프, 예를 들어, GS, GGS, GGGGS, GGSG, 또는 SGGG의 복수 또는 반복 모티프를 함유할 수 있다. 일정 구체예에서, 스페이서는 GS의 모티프를 포함하는 2 내지 12개 아미노산, 예를 들어, GS, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, 또는 GSGSGSGSGSGS를 함유할 수 있다. 일정한 다른 구체예에서, 스페이서는 GGS의 모티프를 포함하는 3 내지 12개 아미노산, 예를 들어, GGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, 및 GGSGGSGGSGGS를 함유할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 스페이서는 GGSG의 모티프를 포함하는 4 내지 12개 아미노산, 예를 들어, GGSG, GGSGGGSG, 또는 GGSGGGSGGGSG를 함유할 수 있다. 다른 구체예에서, 스페이서는 (GGGGS)n의 모티프를 함유하고, 여기서 n은 1 내지 10의 정수이다. 다른 구체예에서, 스페이서는 또한 글리신 및 세린 이외의 아미노산, 예를 들어, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, 또는 GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS를 함유할 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 1 또는 그 이상의 12- 또는 20-아미노산 펩티드 스페이서가 SIRP-α 변이체 구성체에 사용될 수 있다. 12- 및 20-아미노산 펩티드 스페이서는 각각 서열 GGGSGGGSGGGS 및 SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG를 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 서열 GGSGGGSGGGSGGGSGGS를 함유하는 1 또는 그 이상의 18-아미노산 펩티드 스페이서가 SIRP-α 변이체 구성체에서 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 스페이서는 또한 다음의 일반 구조식을 가질 수 있다:
상기 식에서, W는 NH 또는 CH2이고, Q는 아미노산 또는 펩티드이며, n은 0 내지 20의 정수이다.
XIII. SIRP-α 변이체에 차단 펩티드의 융합
차단 펩티드(예를 들어, 표 6의 서열번호 36-46 중 어느 하나의 서열을 갖는 CD47-기반 차단 펩티드)는 링커, 예를 들어, 절단성 링커(예를 들어, LSGRSDNH(서열번호 47)), 및 경우에 따라 1 이상의 스페이서(예를 들어, 링커의 N-말단 또는 C-말단에 유전적으로 융합된, (GGGGS)n, 여기서 n은 1 내지 10의 정수임)에 의해 SIRP-α 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 절단성 링커 및 1 이상의 스페이서에 의해 SIRP-α 변이체에 융합된 CD47-기반 차단 펩티드를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체의 예시적인 서열은 서열번호 48-63의 서열로 나타내었다. 스페이서의 길이는 CD47-기반 차단 펩티드와 SIRP-α 변이체 간 최고의 최적 결합을 획득하도록 변화될 수 있다.
XIV. SIRP-α 변이체 구성체의 제조 방법
본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체는 숙주 세포로부터 생성될 수 있다. 숙주 세포는 그들의 상응하는 핵산으로부터 본원에 기술한 폴리펩티드 및 구성체를 발현하는데 필요한, 필수 세포 성분, 예를 들어, 세포기관을 포함하는 비히클을 의미한다. 핵산은 당분야에 통상적인 기술(예를 들어, 형질전환, 형질감염, 전기천공, 인산칼슘 침전법, 직접 미세주사법, 감염 등)에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있는 핵산 벡터에 포함될 수 있다. 핵산 벡터의 선택은 부분적으로 사용되는 숙주 세포에 의존적이다. 대체로, 바람직한 숙주 세포는 원핵생물(예를 들어, 박테리아) 또는 진핵생물(예를 들어, 포유동물) 기원의 것이다.
핵산 벡터 제작 및 숙주 세포
SIRP-α 변이체 구성체의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 당분야에 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 이들 방법은 제한없이, 올리고뉴클레오티드-매개(또는 부위-지정) 돌연변이유발법 및 PCR 돌연변이유발법을 포함한다. 본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 표준 기술, 예를 들어, 유전자 합성법을 사용해 얻을 수 있다. 대안적으로, 야생형 SIRP-α를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 당분야의 표준 기술 예를 들어, QuikChange™ 돌연변이유발법을 사용해 특정 히스티딘 치환을 함유하게 돌연변이될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 사용해 합성될 수 있다.
SIRP-α 변이체 구성체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드를 복제하고 발현시킬 수 있는 벡터에 삽입될 수 있다. 많은 벡터가 당분야에서 이용가능하고 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 각각의 벡터는 특정 숙주 세포와 상용성이도록 조정되고 최적화되는 다양한 성분들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 벡터 성분은 제한없이, 복제 기원, 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 신호 서열, 본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 전사 종결 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 벡터는 다수의 SIRP-α 변이체 구성체를 발현할 수 있게 하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함할 수 있다. 박테리아 발현 벡터의 일부 예는 제한없이, pGEX 시리즈 벡터(예를 들어, pGEX-2T, pGEX-3X, pGEX-4T, pGEX-5X, pGEX-6P), pET 시리즈 벡터(예를 들어, pET-21, pET-21a, pET-21b, pET-23, pET-24), pACYC 시리즈 벡터(예를 들어, pACYDuet-1), pDEST 시리즈 벡터(예를 들어, pDEST14, pDEST15, pDEST24, pDEST42), 및 pBR322 및 이의 유도체(예를 들어, 미국 특허 제5,648,237호 참조)를 포함한다. 포유동물 발현 벡터의 일부 예는 제한없이, pCDNA3, pCDNA4, pNICE, pSELECT, 및 pFLAG-CMV를 포함한다. 핵산 벡터의 다른 유형은 세포(예를 들어, 피험체의 세포)에서 단백질을 발현시키기 위한 바이러스 벡터를 포함한다. 이러한 바이러스 벡터는 제한없이, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터(예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터, 예컨대 개질형 백시니아 앙카라(MVA)), 아데노-회합 바이러스 벡터, 및 알파바이러스 벡터를 포함한다.
일부 구체예에서, 이.콜라이(E. coli) 세포가 본 발명을 위한 숙주 세포로 사용된다. 이.콜라이 균주의 예는 제한없이, 이.콜라이 294(ATCC® 31,446), 이.콜라이 λ 1776 (ATCC® 31,537), 이.콜라이 BL21(DE3)(ATCC® BAA-1025), 및 이.콜라이 RV308(ATCC® 31,608)를 포함한다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포가 본 발명의 숙주 세포로 사용된다. 포유동물 세포 유형의 예는 제한없이, 인간 배아 신장(HEK) 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, PC3 세포, Vero 세포, 및 MC3T3 세포를 포함한다. 상이한 숙주 세포들은 단백질 생성물의 번역후 처리 및 개질에 대한 특징적이고 특이한 기전을 갖는다. 발현되는 단백질의 올바른 개질 및 처리를 보장하도록 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 상기 기술된 발현 벡터를 당분야의 통상적인 기술, 예를 들어 형질전환, 형질감염, 전기천공, 인산칼슘 침전법, 및 직접 미세주입법을 사용해 적절한 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 벡터가 단백질 생성용 숙주 세포로 도입되면, 숙주 세포는 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 바람직한 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하는데 적절하게 개질된 통상의 영양 배지에서 배양된다.
단백질 생성, 회수, 및 정제
본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체를 생성시키는데 사용된 숙주 세포는 당분야에 알려진 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장될 수 있다. 박테리아 숙주 세포용으로 적합한 배지의 예는 필수 보조제, 예컨대 선별제, 예를 들어 암피실린이 더해진 루리아(Luria) 액체배지(LB)를 포함한다. 포유동물 숙주 세포에 적합한 배지의 예는 최소 필수 배지(MEM), 둘베코의 변형 이글(Dulbecco's Modified Eagle) 배지(DMEM), 태아 소 혈청(FAB)이 보충된 DMEM, 및 RPMI-1640을 포함한다.
숙주 세포는 적합한 온도, 에컨대 약 20℃∼약 39℃, 예를 들어, 25℃∼약 37℃에서 배양된다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라서, 대체로 약 6.8 내지 7.4, 예를 들어, 7.0이다. 유도성 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용되면, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 상태 하에서 유도된다.
전형적으로 단백질 회수는, 일반적으로 삼투압 쇼크, 초음파처리, 또는 용해 등과 같은 수단으로 숙주 세포를 파괴하는 것을 포함한다. 세포가 파괴되면, 세포 찌꺼기를 원심분리 또는 여과를 통해 제거한다. 단백질은 친화성 수지 크로마토그래피를 통해 더 정제될 수 있다. 당분야에 알려진 표준 단백질 정제 방법을 채택할 수 있다. 다음의 절차는 적합한 정제 절차의 예이다: 면역친화성 또는 이온-교환 컬럼 상에서 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온-교환 수지 상에서 크로마토그래피, SDS-PAGE, 및 겔 여과법.
대안적으로, SIRP-α 변이체 구성체는 피험체(예를 들어, 인간)의 세포에 의해, 예를 들어, 요법의 상황에서, SIRP-α 변이체 구성체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터(예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터, 예컨대 개질형 백시니아 안카라(MVA)), 아데노-회합 바이러스 벡터, 및 알파바이러스벡터)를 투여하여 생산될 수 있다. 벡터는 피험체의 세포 내부(예를 들어, 형질전환, 형질감염, 전기천공, 인산칼슘 침전법, 직접 미세주사법, 감염 등)에 존재하면, SIRP-α 변이체 구성체의 발현을 촉진하며, 이것이 이후 세포로부터 분비된다.
XV. 약학 조성물 및 조제물
일부 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 치료 단백질로서 본 발명의 1 이상의 SIRP-α 변이체 구성체를 함유할 수 있다. 단백질의 치료량이외에도, 약학 조성물은 당업자에게 알려진 방법에 의해 제제화할 수 있는 약학적 허용 담체 또는 부형제를 함유할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 1 이상의 SIRP-α 변이체 구성체를 코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 벡터, 예컨대 바이러스 벡터에)를 함유할 수 있다. SIRP-α 변이체 구성체를 코딩하는 핵산 분자는 유전자 요법에서 잘 알려진 방법을 통해 전달될 수 있는, 적절한 발현 벡터에 클로닝될 수 있다.
약학 조성물에 허용되는 담체 및 부형제는 적용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이다. 허용되는 담체 및 부형제는 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, HEPES, 및 TAE, 항산화제 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌, 보존제 예컨대 헥사메토늄 클로라이드, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 레소르시놀, 및 벤즈알코늄 클로라이드, 단백질 예컨대 인간 혈청 알부민, 젤라틴, 덱스트란, 및 면역글로불린, 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 히스티딘, 및 리신, 및 탄수화물 예컨대 포도당, 만노스, 수크로스, 및 솔비톨을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 주사용 제제의 형태로 비경구적으로 투여될 수 있다. 주사용 약학 조성물은 비히클로서 멸균액 또는 임의의 약학적 허용 액체를 사용해 제제화될 수 있다. 약학적 허용 비히클은 제한없이, 멸균수, 생리학적 염수, 및 세포 배양 배지(예를 들어, 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM), α-변형 이글 배지(α-MEM), F-12 배지)를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 미세캡슐, 예컨대 히드록실메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐로 제조될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 다른 약물 전달 시스템 예컨대 리포솜, 알부민 미세구, 미세에멀션, 나노입자, 및 나노캡슐로 제조될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)]에 설명되어 있다. 생체내 투여에 사용하기 위한 약학 조성물은 멸균되어야만 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과를 통해 용이하게 수행된다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 지속-방출형 제제로 제조될 수 있다. 지속-방출형 조제물의 적합한 예는 본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과 매트릭스를 포함한다. 지속 방출형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리악티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT™, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 일부 지속-방출형 제제는 수 개월 동안, 예를 들어 1 내지 6개월 동안 분자를 방출할 수 있는 반면, 다른 제제들은 본 발명의 약학 조성물을 단기간 동안, 예를 들어 수 일 내지 수 주 동안 방출한다.
약학 조성물은 필요에 따라 단위 제형으로 형성될 수 있다. 약학 조성물에 포함되는, 본 발명의 활성 성분, 예를 들어, SIRP-α 변이체 구성체의 양은 지정된 범위 내에서 적합한 용량이 제공되도록 한다(예를 들어, 체중 기준으로 0.01-100 mg/kg 범위 내의 용량).
유전자 요법용 약학 조성물은 허용되는 희석제에 존재하거나, 또는 유전자 전달 비히클이 내포되는 서방형 매트릭스를 포함한다. 생체내 유전자 전달 비히클로 사용될 수 있는 벡터는 제한없이, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터(예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터, 예컨대 개질 백시니아 안카라(MVA)), 아데노-회합 바이러스 벡터, 및 알파바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구체예에서, 벡터는 다수의 SIRP-α 변이체 구성체의 발현을 허용하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함할 수 있다. 유전자 전달을 위한 다른 비히클 및 방법은 미국 특허 제5,972,707호, 제5,697,901호, 및 제6,261,554호에 기술되어 있고, 이들 각각을 전체로 참조로 본원에 편입시킨다.
약학 조성물을 생산하는 다른 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,478,925호, 제8,603,778호, 제7,662,367호, 및 제7,892,558호에 기술되어 있고, 이들 전부를 그들 전체로 참조로 본원에 편입시킨다.
XVI. 투여 경로, 용량, 및 시기
치료 단백질로서 1 이상의 SIRP-α 변이체 구성체를 함유하는 본 발명의 약학 조성물은 비경구 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 척추강내 투여, 또는 복강내 투여용으로 제제화될 수 있다. 약학 조성물은 또한, 코, 분무, 경구, 에어로졸, 직장, 또는 질 투여용으로 제제화되거나, 그를 통해 투여될 수 있다. 치료 단백질을 투여하는 방법은 당분야에 공지이다. 예를 들어, 미국 특허 제6,174,529호, 제6,613,332호, 제8,518,869호, 제7,402,155호, 및 제6,591,129호, 및 미국 공개 특허 출원 제US20140051634호, 제WO1993000077호, 및 제US20110184145호를 참조하며, 이들 내용을 그들 전체로 참조로 본원에 편입시킨다. 이들 방법 중 1 이상을 사용하여 본 발명의 1 이상의 SIRP-α 변이체 구성체를 함유하는 약학 조성물을 투여할 수 있다. 주사용 제제를 위해서, 다양한 유효한 약학 담체가 당분야에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, Pa., Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982)], 및 [ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)]을 참조한다.
본 발명의 약학 조성물의 용량은 투여 경로, 치료하려는 질환, 및 피험체의 신체 특징, 예를 들어, 연령, 체중, 일반 건강 상태를 포함한 요인들에 의존적이다. 전형적으로, 단일 용량에 함유된 본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체의 양은 유의한 독성을 유도하지 않고 질환을 효과적으로 치료하는 양일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 0.001 내지 500 mg(예를 들어, 0.05, 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 0.8, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg, 또는 500 mg) 범위, 보다 특정한 구체예에서, 약 0.1 내지 약 100 mg 범위, 더욱 특정한 구체예에서, 약 0.2 내지 약 20 mg 범위의 SIRP-α 변이체 구성체 용량을 포함할 수 있다. 이러한 용량은 통상의 요인들 예컨대 질환 정도 및 피험체의 상이한 변수들에 따라서 임상의가 조정할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약 0.001 mg 내지 약 500 mg/kg/일(예를 들어, 0.05, 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 0.8, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg, 또는 500 mg/kg/일)의 양으로 투여될 수 있다. SIRP-α 변이체 구성체를 함유하는 본 발명의 약학 조성물은 이를 필요로하는 피험체에게, 예를 들어 매일, 매주, 매월, 반년, 매년, 또는 의학적으로 필요시, 1회 또는 그 이상의 횟수(예를 들어, 1-10회 또는 그 이상)로 투여될 수 있다. 용량은 단일 용량 계획 또는 다수 용량 계획으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 유효량은 약 0.1 내지 약 100 mg/kg/일, 1일 당 약 0.2 mg 내지 약 20 mg의 SIRP-α 변이체 구성체, 1일 당 약 1 mg 내지 약 10 mg의 SIRP-α 변이체 구성체, 1주당 약 0.7 mg 내지 약 210 mg의 SIRP-α 변이체 구성체, 1주당 1.4 mg 내지 약 140 mg의 SIRP-α 변이체 구성체, 3일마다 약 0.3 mg 내지 약 300 mg의 SIRP-α 변이체 구성체, 격일마다 약 0.4 mg 내지 약 40 mg의 SIRP-α 변이체 구성체, 및 격일마다 약 2 mg 내지 약 20 mg의 SIRP-α 변이체 구성체 범위의 양이다. 투여 사이의 기간은 의학적 상태가 호전되면 감소시키거나 환자의 건강이 악화되면 증가시킬 수 있다.
XVII. 치료 방법
본 발명은 SIRP-α 및/또는 CD47 활성과 연관된 질환 및 질병, 예컨대 암 및 면역학적 질환을 앓는 환자를 치료하는데 사용할 수 있는 약학 조성물 및 치료 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 SIRP-α 변이체 구성체는 피험체에서 표적 세포(예를 들어, 암 세포)의 식세포작용을 증가시키는 방법에서 피험체에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 피험체에서 조절성 T-세포를 제거하는 방법에서 피험체에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 피험체에서 암 세포를 사멸시키는 방법에서 피험체에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 피험체에서 SIRP-α 및/또는 CD47 활성과 연관된 질환을 치료하는 방법에서 피험체에 투여될 수 있고, 여기서 SIRP-α 변이체 구성체는 비질환 세포의 CD47 보다 질환 세포 또는 질환 부위의 CD47에 우선적으로 결합한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체는 피험체에서 조혈 줄기 세포 생착을 증가시키는 방법에서 피험체에게 투여될 수 있고, 여기서 이 방법은 피험체에서 SIRP-α와 CD47 간 상호작용을 조정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, SIRP-α 변이체 구성체는 피험체에서 면역 반응을 변경(즉, 면역 반응을 억제)하는 방법에서 피험체에게 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 피험체에서 질환(예를 들어, 암)을 치료하기 전에, 피험체의 SIRP-α의 아미노산 서열(들)을 예를 들어, SIRP-α 유전자를 코딩하는 2개의 대립유전자 각각으로부터 결정한다. 본 발명의 이러한 방법에서, 이 방법은 피험체 유래의 생물학적 샘플 중 SIRP-α 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정한 후, 피험체에게 SIRP-α 변이체 구성체의 치료 유효량을 투여한다. 이 방법에서, SIRP-α 변이체 구성체의 SIRP-α 변이체는 SIRP-α 변이체의 친화성을 증가시키기 위해 도입된 아미노산 변화를 제외하고, 피험체의 생물학적 샘플 내 SIRP-α 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는다. SIRP-α 변이체 구성체는 투여 후에 피험체에서 최소 면역원성을 갖는다.
본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체 및 약학 조성물은 다양한 암 요법에서 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 치료할 수 있는 암은 제한없이, 고형 종양 암, 혈액학적 암, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 방광암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 폐암, 기관지암, 간암, 난소암, 결장 및 직장 암, 위암, 위장암, 담낭암, 위장관 기질 종양 암, 갑상선암, 두경부암, 구강인두암, 식도암, 흑색종, 비흑색종 피부암, 메르켈 세포 암종, 바이러스 유도성 암, 신경아세포종, 유방암, 전립선암, 신장암, 신장 세포 암, 신우암, 백혈병, 림프종, 육종, 신경교종, 뇌종양, 및 암종을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 치료할 수 있는 암성 병태는 전이성 암을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 치료할 수 있는 암은 고형 종양 또는 혈액학적 암이다.
본 발명의 SIRP-α 변이체 구성체 및 약학 조성물은 면역학적 질환을 치료하기 위한 다양한 요법에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 면역학적 질환은 자가면역 질환 또는 염증성 질환, 예컨대 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반 루푸스, 항체-매개 염증성 또는 자가면역 질환, 이식편 대 숙주 질환, 패혈증, 당뇨병, 건선, 아테롬성 동맥 경화증, 쇠그렌 증후군, 진행성 전신 경화증, 경피증, 급성 관상 증후군, 허혈성 재관류, 크론병, 자궁내막증, 사구체신염, 중증 근무력증, 특발성 폐섬유증, 천식, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 혈관염, 또는 염증성 자가면역 근육염이다.
실시예
실시예 1 - 방법
SIRP-α 변이체 구성체의 생성
모든 유전자 구성체는 유전자 합성 및 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 코돈(DNA2.0)을 사용해 생성시켰다. 유전자들을 포유동물 발현 벡터에 클로닝하고 CMVa-인트론 프로모터를 사용해 발현시켰다. 분비를 위한 적절한 신호전달 및 프로세싱을 보장하도록 구성체의 N-말단에 리더 서열을 조작하였다. SIRP-α 융합 단백질의 발현은 Expi293F™ 세포(Life Technologies)를 사용해 수행하였다. 이 세포는Expi293F™ 발현 배지 내 고밀도, 무혈청 현탁 배양에 적합하고 재조합 단백질을 높은 수준으로 생성시킬 수 있다. 제조사의 매뉴얼에 따라 형질감염을 수행하였다. 상등액은 전형적으로 형질감염 후 5-7일에 회수한다. 단백질 구성체는 6x히스티딘 친화성 태그를 보유하여 이것이 친화성 크로마토그래피에 의한 정제를 가능케하도록 디자인하였다. 컬럼은 먼저 5 mM 이미다졸, 100 mM Tris HCl(pH 8), 500 mM NaCl로 평형화시켰다. 다양한 SIRP-α 변이체 구성체를 발현하는 투명한 배지를 Avant 25 상의 Hi-Trap Ni 세파로스 엑셀 친화성 수지(GE Healthcare) 위에 적재하였다. 다른 평형화 단계를 수행하였다. 이후, 컬럼을 40 mM 이미다졸, 100 mM 트리스, 500 mM NaCl로 세척하고, 이어서 250 mM 이미다졸, 100 mM 트리스, 500 mM NaCl로 용리하였다. SIRP-α 변이체 구성체를 함유하는 용리 분획을 모으고 이후 1X PBS로 완충액을 교환하였다.
SIRP-α 단백질의 시험관내 절단
재조합 인간 uPA 및 마트립타제를 R&D systems에서 구입하였다. 3 μM의 SIRP-α 단백질을 기술된 바와 같이 50 mM 트리스 HCl(pH 8.5), 0.01% Tween 중 개별량의 uPA 및 마트립타제(0.1 내지 44 ng)에 부가하였다. 분해 반응은 전형적으로 18-24시간 동안 37℃에서 항온반응시켰다. 반응을 중지시키기 위해서, SDS-PAGE 적재 염료를 반응물에 부가하고 95℃에서 3분간 가열하였다. 절단을 평가하기 위해서, 분해된 샘플을 4-20% 트리스-글리신 SDS-PAGE 상에서 분리하였다.
실시예 2 - 종양 조직에서 특이적으로 활성화되는 SIRP-α 변이체 구성체의 디자인
목표는 종양 조직의 CD47에 결합하도록 국소적으로 활성화될때까지 불활성으로 남아 있는 SIRP-α 변이체 구성체를 디자인하는 것이다. 이는 비질환 세포의 세포 표면 상의 CD47에 대한 SIRP-α의 결합을 제한하고, 원치않는 "표적위", "표적 밖" 독성을 방지한다. 이러한 SIRP-α 변이체 구성체를 생성시키기 위해서, 차단 펩티드(예를 들어, CD47-기반 차단 펩티드)를 절단성 링커를 통해 유전자적으로 SIRP-α 변이체에 융합시켰다. 사용된 차단 펩티드는 SIRP-α에 대한 CD47 상호작용 부위를 기반으로 하고 그 서열은 이하에 기술한다(섹션 (a)-(c)). GGGGS의 반복 유닛을 함유하는 스페이서를 디자인하여, 종종 프로테아제 인식 부위를 코딩하는, 절단성 링커에 측접시켰다. 일부 구체예에서, 선택된 프로테아제 절단 부위는 LSGRSDNH이지만, 많은 다른 것도 가능하다. 프로테아제 절단 부위 LSGRSDNH는 다양한 인간 암종에서 상향 조절되는 수많은 프로테아제, 예를 들어 마트립타제 (MTSP1), 비뇨기형 플라스미노겐 활성인자(uPA), 레구마인, PSA(KLK3, 칼리크레인-관련 펩티다제-3이라고도 함), 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2), MMP9, 인간 호중구 엘라스타제(HNE), 및 프로테이나제 3(Pr3)에 대한 그 감응성때문에 선택하였다(Ulisse et al., Curr. Cancer Drug Targets 9:32-71, 2009; Uhland et al., Cell. Mol. Life Sci. 63:2968-2978, 2006; LeBeau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:93-98, 2013; Liu et al., Cancer Res. 63:2957-2964, 2003).
(a) CD47-기반 차단 펩티드에 의한 SIRP-α의 차단
CD47-기반 차단 펩티드는 앞서 설명하였다. 이들 펩티드는 상이한 친화성으로 SIRP-α에 결합하고 그 기능을 차단한다. CD47의 N-말단은 SIRP-α와의 상호작용에 중요하고, 따라서 구조 분석은 CD47의 C-말단에 SIRP-α의 융합을 예측하였다. 결과를 더욱 잘 이해하기 위해서, N-말단 및 C-말단 융합 둘 모두를 상이한 길이의 스페이서로 실험하였다. 상이한 CD-47 기반 차단 펩티드(예를 들어, 표 6에 열거한 펩티드)를 절단성 링커 및 1 이상의 스페이서와 함께 SIRP-α 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 융합시켰다. 절단성 링커 및 1 이상의 스페이서에 의해 SIRP-α 변이체에 융합된 CD47-기반 차단 펩티드를 함유하는 융합 단백질의 예시적인 서열은 서열번호 48-56의 서열로 나타내었으며, 여기서 한줄 밑줄 부분은 CD47-기반 차단 펩티드를 의미하고, 이중 밑줄 부분은 절단성 링커를 나타내며, 굵은 부분은 SIRP-α 변이체를 나타낸다. 서열번호 48-51의 서열은 12개 또는 21개 아미노산을 포함하는 CD47-기반 차단 펩티드 및 GGGGS의 2-3개 반복부의 스페이서를 함유한다. 서열번호 52-56의 서열은 C15S 치환을 갖는 CD47 IgSF 도메인(VVS에서 절단)을 포함하는 CD47-기반 차단 펩티드 및 GGGGS의 2-5개 반복부 또는 GGS의 3-6개 반복부의 스페이서를 함유한다. 부가적으로, 일부 구체예에서, HSA가 서열번호 48-56의 서열 중 어느 하나의 C-말단에 융합될 수 있다. 또한, 일부 구체예에서, Fc 도메인 단량체 또는 HSA(서열번호 68)는 표 10에 열거된 융합 단백질 중 어느 하나의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
(b) 연장된 N-말단을 갖는 저 친화성 CD47 돌연변이체에 의한 SIRP-α 변이체의 차단
CD47에 대한 SIRP-α 변이체의 높은 친화성 덕분에, 링커를 절단 후, 융합 단백질이 해리되지 않고 SIRP-α 변이체가 차단된 채로 남을 가능성이 존재한다. 이를 해결하기 위해, 본 발명자는 SIRP-α-CD47 복합체의 구조를 조사하고 야생형 SIRP-α에 대한 결합 친화성에 비해 SIRP-α 변이체에 대한 결합 친화성이 감소된 CD47 돌연변이체를 디자인하였다. 따라서, 링커의 프로테아제 절단 후, CD47 돌연변이체가 SIRP-α 변이체로부터 멀리 해리된다. 디자인된 CD47 돌연변이체를 이하에 기술한다. 야생형 CD47에 SIRP-α 변이체를 융합시키는 초기 실험을 수행하였다. SIRP-α 변이체 및 야생형 CD47 또는 CD47 돌연변이체를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체를 시험관내에서 절단하고, 절단을 확인하기 위해 SDS-PAGE로 분석하며, CD47에 대한 그들의 결합 능력(즉, CD47 돌연변이체가 SIRP-α 변이체로부터 해리된 후 야생형 CD47에 대한 SIRP-α 변이체의 결합)을 확인하기 위해 비아코어를 통해 측정한다. 야생형 CD47에 융합된 SIRP-α 변이체를 함유하는 초기 SIRP-α 변이체 구성체가 발현되고, 프로테아제 절단 전에 CD47 결합을 차단할 수 있고, 프로테아제 절단 후에 CD47에 결합할 수 있으면, CD47 돌연변이체는 필요하지 않다. 이들 SIRP-α 변이체 구성체가 불활성(즉, 절단될 수 있지만 해리 결여로 인해 프로테아제 절단 후에 CD47에 결합하지 않음)이면, 저친화성 CD47 돌연변이체에 융합된 SIRP-α 변이체를 함유하는 다른 융합 단백질을 시험하게 된다.
CD47:SIRP-의 공동결정화 구조(PDB: 4KJY, 4CMM)에서, CD47의 N-말단은 파이로-글루타메이트로서 존재하고 SIRP-α 변이체의 Thr66 및 야생형 SIRP-α의 Leu66와 수소 결합 상호작용을 만든다(도 1). 아미노산, 예를 들어 글리신을 부가하여 CD47의 N-말단을 연장시키면, 글루타민에서 파이로글루타메이트로의 환화를 방지하게 되고 또한 Thr66 또는 Leu66과의 수소 결합 상호작용이 파괴되는 원치않는 다른 접촉 및 상호작용이 생성되어, SIPR-α에 대한 CD47의 결합이 방해된다고 가정한다. 저친화성 CD47 IgSF 도메인 돌연변이체 및 SIRP-α 변이체를 함유하는 융합 단백질의 서열은 표 11의 서열번호 57-59로 나타내었고, 여기서 한줄 밑줄은 표 6의 서열번호 46에 대해, 아미노산 1-118 및 C15S를 함유하는 저 친화성 CD47 IgSF 도메인 돌연변이체를 나타내고, 이중 밑줄 부분은 절단성 링커를 나타내며, 굵은 부분은 SIRP-α 변이체를 나타낸다. 서열번호 x10-x12는 또한 GGGGS의 3-5개 반복부의 스페이서를 포함한다. 서열번호 x10-x12와 유사한 서열을 디자인하고 발현시켰는데 여기서는 저친화성 CD47 IgSF 도메인 돌연변이체가 절단성 링커 및 1 이상의 스페이서에 의해 SIRP-α 변이체의 C-말단에 융합된다.
(c) 아미노산 치환을 갖는 저친화성 CD47 IgSF 도메인 돌연변이체에 의한 SIRP-α의 차단
CD47은 SIRP-α에 대해 깊은 주머니에 결합한다(PDB 코드: 4KJY 및 4CMM). 컴퓨터 모델링을 수행하여 돌연변이시 SIRP-α 변이체에 대한 CD47의 결합 친화성을 감소시키지만, 야생형 SIRP-α에 대한 CD47의 결합 친화성은 유지하는 CD47의 주머니 영역 내 아미노산 잔기를 동정하였다. 동정된 CD47 잔기는 L101Q, L101H, L101Y, T102Q, 및 T102H이다. 이들 치환 중 하나를 함유하는 저친화성 CD47 IgSF 도메인 돌연변이체가 속박된 방식으로 효과적으로 SIRP-α 변이체를 차단할 수 있다고 가정한다. 그러나, 종양 부위에 도달하고 링커에서 국소적으로 프로테아제에 의해 절단시, 저친화성 CD47 IgSF 도메인 돌연변이체는 야생형 SIRP-α에 결합하도록 SIRP-α 변이체로부터 해리되어, SIRP-α 변이체가 종양 세포의 세포 표면 상의 CD47에 자유롭게 결합하게 둔다. 해리된, 저친화성 CD47 IgSF 도메인 돌연변이체는 이제 야생형 SIRP-α의 활성을 차단할 수 있다. 이는 잠재적으로 저친화성CD47 IgSF 도메인 돌연변이체 및 SIRP-α 변이체로부터 강화된 이중 차단 활성을 생성시키게 된다. 아미노산 잔기를 어떻게 선택하고 어떻게 이것이 야생형 SIRP-α 및 SIRP-α 변이체의 차등적 차단을 일으키는지에 대한 원리를 설명하기 위해서, 야생형 SIRP-α의 Ala27을 사용해 그 예를 도시한다(도 2). 예를 들어, 야생형 SIRP-α의 Ala27는 SIRP-α 변이체의 Il327보다 작은 잔기이다. 따라서, 야생형 CD47의 Thr102를 보다 큰 아미노산 예컨대 Gln102로 돌연변이시켜서, 저친화성 CD47 IgSF 도메인 돌연변이체의 Gln102이 상응하는 상호작용 부위에서 SIRP-α 변이체의 Ile27과 입체 충돌을 일으키게 된다. 그러나, Thr102Gln 치환을 갖는 CD47 돌연변이체 및 Ala27을 갖는 야생형 SIRP-α 사이의 상호작용은 보존된다. 따라서, CD47 돌연변이체는 SIRP-α 변이체에 대해 낮은 친화성을 가지며 야생형 SIRP-α에 대해서는 비교적 높은 친화성을 갖는다. 일부 예시적인 저친화성 CD47 IgSF 도메인 돌연변이체의 서열을 표 6의 서열번호 41-45로 나타내었다. 아미노산 치환을 갖는 저친화성 CD47 IgSF 도메인 돌연변이체 및 SIRP-α 변이체를 함유하는 SIRP-α 변이체 구성체의 서열을 표 12의 서열번호 60-63으로 나타내었으며, 여기서 한줄 밑줄부분은 각각 아미노산 치환 L101Q, L101Y, T102Q, 및 T102H를 함유하는 저친화성 CD47 IgSF 도메인 돌연변이체를 나타내고, 이중 밑줄 부분은 절단성 링커를 나타내며, 굵은 부분은 SIRP-α 변이체를 나타낸다. 서열번호 60-63은 또한 GGGGS의 3-5개 반복부의 스페이서를 포함한다. 저친화성 CD47 IgSF 도메인 돌연변이체를 절단성 링커 및 1 이상의 스페이서에 의해 SIRP-α 변이체의 C-말단에 융합시킨 서열번호 60-63과 유사한 서열을 디자인하고 발현시켰다.
실시예 3 - 시험관내 연구를 위한 SIRP-α 변이체 구성체의 발현 및 생성
SIRP-α 변이체 및 CD47-기반 차단 펩티드를 포함하는 다양한 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 48-56)를 Expi293-F 포유동물 세포에서 발현시켰다. 모든 구성체는 배지로 분비되는 단백질로서 그들을 발현시키는 리더 서열을 갖게 디자인하였다. 모든 구성체는 가용성 형태로 발현되었고 높은 순도로 1단계 IMAC 단리로 정제되었다(도 3A 및 3B). 도 3A는 서열번호 48-56의 SIRP-α 변이체 구성체의 환원된, SDS-PAGE 겔을 도시하며, 도 3B는 SIRP-α 변이체 구성체의 비환원된, SDS-PAGE 겔을 도시한다. 크기 배제 데이타는 SIRP-α 변이체 구성체가 응집되지 않음을 보여주었다(데이타 도시하지 않음).
실시예 4 - SIRP-α 및 CD47 융합 단백질의 시험관내 절단
SIRP-α 변이체 구성체(예를 들어, 서열번호 48-63)가 생체내 종양 조직에서 특이적으로 절단되는지 여부를 확인하기 위해서, SIRP-α 변이체 구성체를 절단하기 위해, 암에서 상향조절되는 것으로 알려져 있는 프로테아제 uPA 및 마트립타제를 사용해 시험관내 실험을 수행하였다. 프로테아제 절단성을 확인하고 절단 조건을 최적화하기 위해 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 54)를 사용해 초기 실험을 수행하였다. 도 4A는 uPA 및 마트립타제에 의한 절단성을 시험한 결과를 도시한다. 3 μM SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 54)를 과량의 uPA 또는 마트립타제를 사용해 18시간 동안 37℃에서 항온반응시켰다. 도 4A의 레인 1은 프로테아제를 부가하지 않은 대조군 실험을 나타내고 레인 2 및 3은 각각 uPA 및 마트립타제와 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 54)의 항온반응을 보여준다. 도 4A에 도시하여 얻은 데이타는 분명하게 18시간 동안 37℃에서 과량의 uPA 및 마트립타제로 SIRP-α 변이체 구성체가 분해되어서 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 54)가 시험관내에서 절단되어 방출되었음을 보여주었다. 절단된 SIRP-α 변이체는 ∼17 KDa 분자량 밴드로서 이동하였다. 절단된 CD47은 아마도 당화에 의해서, 대략 36-40 kDa의 지저분한 밴드로 이동하였다. 도 4A의 레인 2 및 3에서 절단되지 않은 SIRP-α 변이체 구성체의 양을 비교하여, uPA를 사용한 것과 비교해 마트립타제를 사용해 보다 완벽한 절단이 이루어진 것으로 확인되었다.
따라서, 절단 조건의 추가적인 최적화를 오직 마트립타제를 사용해 수행하였고 그 결과를 도 4B에 나타내었다. 상이한 양의 마트립타제를 사용하였고, 절단은 18시간 동안 37℃에서 수행하였다. 도 4B의 레인 1은 마트립타제를 부가하지 않은 대조군 실험을 나타내고 각각의 레인 2-4는 각각 44 ng, 0.44 ng, 및 0.167 ng의 마트립타제로 수행한 절단을 보여준다. 얻어진 결과는 0.44 ng 효소가 현행 조건 하에서 완전한 절단에 충분함을 보여주었다. 다음으로, 본 발명자는 최적 절단 조건을 사용해 나머지 SIRP-α 변이체 구성체의 절단을 시험하였다. 실시예 및 도 4C에 도시한 바와 같이, 각각의 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 57-63)는 최적의 절단 조건을 사용하여 마트립타제에 의해 시험관내에서 성공적으로 절단되었다. 도 4C의 레인 1-7은 각각 서열번호 57-63의 미절단된 융합 단백질에 해당된다. 도 4C의 레인 8-14는 마트립타제로 절단된, 각각 서열번호 57-63의 융합 단백질에 해당된다.
실시예 5 - SIRP-α 변이체 구성체의 결합 친화성
SIRP-α 변이체 구성체에 대한 인간 CD47-hFc(R & D 시스템, 카탈로그 번호 4670-CD)의 결합은 러닝 완충제로서 0.01% Tween-20이 보충된 인산염 완충 염수(pH 7.4)를 사용해 Biacore T100 장비(GE Healthcare) 상에서 분석하였다.
370 공명 유닛(RU)의 CD47-hFc를 표준 아민 커플링을 통해 CM4 센서 칩(GE Healthcare)의 플로우 셀 2 상에 고정시켰다. 플로우 셀 1은 EDC/NHS로 활성화 및 차단(에탄올아민 사용)시켜 참조용으로 제공하였다. 모든 SIRP-α 변이체 구성체는 30 ㎕/분의 유속으로 2분 동안 50 nM 또는 100 nM을 주입하였고 이후 10분의 해리 시간을 후속하였다. 각각의 주입 후, 표면은 Pierce IgG 용리 완충액(Life Technologies, 카탈로그 번호 21004) 및 4 M NaCl의 2:1 혼합물을 사용해 재생시켰다. 표면의 완전한 재생은 실험 시작과 종료 시에 SIRP-α 변이체를 주입하여 확인하였다. 모든 센서 그램은 플로우 셀 1 및 완충제 주입을 사용해 이중 참조하였다.
모든 샘플에 대해, 50초 회합 후 100 nM에서 결합 신호를 결정하였고, SIRP-α 변이체 구성체의 분자량으로 정규화시켰으며, 최대 결합 반응의 비율로 표시하였다. 그 MW으로 정규화시킨 100 nM에서 SIRP-α 변이체(서열번호 31)의 결합이 최대 결합 반응으로 사용되었다. 도 5A의 결과는 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 48-51)가 칩 상의 CD47에 대한 결합으로부터 SIRP-α 변이체를 차단하지 않음을 보여주었다. 링커로 절단 후, 결합 활성이 적당히 증가하였다. SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 52-54)는 칩 상의 CD47에 대한 SIRP-α 변이체의 결합을 효과적으로 차단하였다. 그러나, 링커의 절단 후, 칩 상의 CD47에 대한 SIRP-α 변이체의 결합 활성이 오직 온화하게 증가하여서, SIRP-α 변이체와 CD47의 IgSF 도메인 간 상호작용의 높은 친화성이 함께 복합체를 유지하고 따라서 CD47의 IgSF 도메인이 링커가 절단된 후에도 계속적으로 SIRP-α 변이체를 차단하고 있음을 시사하였다. 놀랍게도, CD47의 IgSF 도메인을 SIRP-α(서열번호 55)의 C-말단에 융합시킨 경우, 온전한 SIRP-α 변이체 구성체가 칩 상의 CD47에 대한 결합을 효과적으로 차단시켰지만(서열번호 52-54의 융합 단백질과 동일), 링커의 절단은 칩 상의 CD47에 대한 SIRP-α 변이체의 결합을 100% 복원시켜서, 링커 절단 후 CD47의 IgSF 도메인이 SIRP-α 변이체로부터 해리되어, SIRP-α 변이체가 칩 상의 CD47에 자유롭게 결합함을 시사한다. SIRP-α 변이체의 C-말단에 융합된 CD47을 갖는 다른 구성체를 이후에 시험하였다(도 5B 참조). 보다 긴 스페이서를 함유하는 이 구성체(서열번호 56)도 역시 절단 후 활성이 회복되어, SIRP-α 변이체의 C-말단에 CD47-기반 차단 펩티드의 N-말단을 연결하는 일반적인 접근법이 절단성 링커의 절단 후 CD47-기반 차단 펩티드가 SIRP-α 변이체를 효과적으로 차단하고 해리시키는 SIRP-α 구성체를 얻음을 입증하였다.
SIRP-α 변이체 구성체의 결합 친화성을 더욱 조사하기 위해서, 서열번호 52-63의 SIRP-α 변이체 구성체는 이전에 기술된 동일한 프로토콜에 따라 비아코어 장비에서 분석하였다. 서열번호 52-54의 SIRP-α 변이체 구성체는 절단성 링커 LSGRSDNH 및 상이한 길이의 복수개 스페이서를 통해 SIRP-α 변이체(서열번호 31)에 융합된 야생형 CD47(서열번호 35)에 대해, 아미노산 1-117 및 C15S를 갖는 CD47 IgSF 도메인을 함유한다. 서열번호 55 및 56의 SIRP-α 변이체 구성체는 절단성 링커 LSGRSDNH 및 복수개의 상이한 길이의 스페이서를 통해서 SIRP-α 변이체(서열번호 31)의 C-말단에 융합된 야생형 CD47(서열번호 35)에 대해, 아미노산 1-117 및 C15S를 갖는 CD47 IgSF 도메인을 함유한다. 서열번호 57-59의 SIRP-α 변이체 구성체는 절단성 링커 LSGRSDNH 및 상이한 길이의 복수개의 스페이서를 통해 SIRP-α 변이체(서열번호 31)의 N-말단에 융합된 표 6의 서열번호 46에 대해, 아미노산 1-118 및 C15S를 갖는 CD47 IgSF 도메인을 함유한다. 서열번호 60-63의 SIRP-α 변이체 구성체는 절단성 링커 LSGRSDNH 및 상이한 길이의 복수개 스페이서를 통해 SIRP-α 변이체(서열번호 31)의 N-말단에 융합된, 각각이 표 6의 서열번호 41, 42, 44, 및 45의 아미노산 1-117을 갖는 CD47 IgSF 도메인을 함유한다.
도 5B는 서열번호 55 및 56의 SIRP-α 변이체 구성체가 링커 절단 전에 칩 상의 CD47에 대한 결합을 효과적으로 차단하였지만, 링커의 절단이 결합 활성의 100%를 복원시켰음을 보여준다. 유사한 결과를 서열번호 57-63의 SIRP-α 변이체 구성체에 대해 관찰하였다. 본 발명자는 1개의 글리신 잔기만큼 CD47-기반 차단 펩티드의 N-말단 연장이 링커가 절단 된 후 효과적으로 차단하고 이후 프로테아제 처리 후 CD47 결합 활성의 100%에 가깝게 회복된 SIRP-α 변이체 구성체가 생성(서열번호 57-59)됨을 관찰하였고, 이는 링커 절단 후, SIRP-α 변이체로부터 CD47-기반 차단 펩티드가 해리됨을 입증하는 것이다.
이러한 결과는 절단성 링커 및 스페이서를 통해 CD47-기반 차단 펩티드의 N-말단에 융합된 SIRP-α 변이체가 충분히 작동함을 시사한다. 절단성 링커는 융합 복합체를 안정화시키고 절단되면, CD47-기반 차단 펩티드의 N-말단에 부착된 절단성 링커의 단편을 포함하는, CD47-기반 차단 펩티드의 연장된 N-말단은 SIRP-α 변이체와 CD47-기반 차단 펩티드의 결합을 방지한다. CD47-차단 펩티드의 N-말단에서, 1 이상의 아미노산 부가, 예를 들어 1개의 글리신 부가(예를 들어, 표 6의 서열번호 46의 서열)를 갖는 CD47-기반 차단 펩티드을 절단성 링커 및 1 이상의 스페이서를 통해 SIRP-α 변이체의 C-말단에 융합시켜 동일한 효과를 얻었다. 또한, 절단성 링커 및 1 이상의 스페이서를 통해서 SIRP-α 변이체의 C-말단에, 1 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 L101Q, L101Y, L101H, T102Q, 또는 T102H(예를 들어, 표 6의 서열번호 41-45의 서열)를 갖는 CD47-기반 차단 펩티드를 융합시켜 동일한 효과를 관찰하였다. 본 발명자는 CD47-기반 차단 펩티드를 SIRP-α 변이체의 C-말단에 융합시킬 수 있고 링커 절단 전에 CD47에 대한 SIRP-α 변이체의 결합을 차단하고 링커 절단 후 SIRP-α 변이체를 방출할 수 있음을 입증하였다(예를 들어, 도 5A의 서열번호 55, 및 도 5B의 서열번호 55 및 56 참조).
이러한 정보를 기반으로, 본 발명자는 생성물의 약동학, 효능, 안전성, 생산, 및 안정성에 보다 양호한 결과를 부여하는 배향(예를 들어, N-말단 또는 C-말단 융합)을 선택하여, CD47-차단된 SIRP-α 변이체의 융합 단백질, 즉, SIRP-α 변이체에 Fc 도메인 단량체 또는 HSA를 융합한 것을 생성시킬 수 있다.
실시예 6 - 항체-결합 펩티드를 통한 SIRP-α 변이체의 특이적 표적화
첫번째, 본 발명자는 SIRP-α 변이체 및 DLP를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체가 결합된 항체에 농축될 수 있는지 여부를 검토하기 위해서, 서열번호 64의 서열을 갖는 DLP에 대한 결합 부위를 함유하는 것으로 알려진, 세툭시맙을 사용하였다. 본 발명자는 CM4 비아코어 칩(2000RU) 상에 EDC/NHS 화학을 사용해 세툭시맙을 고정시켰고 칩(biacore T100) 상에 30 ㎕/분으로 러닝 및 샘플 완충액으로서 PBS 0.01% P20을 사용하여 100 nM 및 50 nM의 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 66)를 흘려주었다. 도 6은 칩 상에 SIRP-α 변이체 구성체의 결합을 보여주지만, SIRP-α 변이체 단독은 그렇지 않았다. 본 발명자는 이어서 CD47-ECD를 주입하고 SIRP-α 변이체 구성체가 사용된 경우 CD47의 결합을 확인하였으며, SIRP-α 변이체 구성체가 EGFR 및 CD47에 동시에 결합할 수 있음을 입증하였다(도 6). 따라서, 암 환자에 주사된 SIRP-α 변이체 및 DLP를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체는 치료 항체(예를 들어, 세툭시맙)가 축적되는 부위에서 농축되어, 효능은 증가되고 독성은 감소된다.
두번째로, 본 발명자는 SIRP-α 변이체 및 DLP를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체가 EGFR에 결합한 세툭시맙에 먼저 결합하고, 이어서 CD47에 결합함을 보여주었다. 결합 복합체의 개략도를 도 7A에 도시하였다. 본 발명자는 3000 RU의 hrEGFR-Fc(R&D Systems)를 CM4 칩 상에 EDC/NHS 화학법을 사용해 고정시켰다. 30 ㎕/분으로 샘플 및 러닝 완충액으로 PBS 0.01% P20(biacore T100)을 사용하여, 본 발명자는 상이한 농도(4, 20, 및 100 nM)의 세툭시맙을 주입하였다. 고정된 hrEGFR-Fc에 세툭시맙의 결합이 관찰되었다. 이어서 본 발명자가 100 nM의 SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 66)를 주입하고 결합을 관찰하였다. SIRP-α 변이체를 단독으로 주입한 경우에는 결합이 관찰되지 않았다. 다음으로 본 발명자는 100 nM의 CD47-ECD를 주입하고 결합을 관찰하였다. 데이타를 도 7B 및 7C에 도시하였다. 따라서, 본 발명자는 EGFR-세툭시맙-서열번호 66의 SIRP-α 변이체 구성체-CD47의 4차원 복합체의 형성이 가능함을 입증하였다. SIRP-α 변이체 및 DLP를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체는 종양-특이적 항체(예를 들어, 세툭시맙)에 특이적으로 결합하여 질환 부위에 구성체가 사전 농축시 CD47에 결합해 이를 억제할 수 있다. 또한, 동일한 개념을 따라서, SIRP-α 변이체, DLP, 및 CD47-기반 차단 펩티드를 포함하는 SIRP-α 변이체 구성체는 종양-특이적 항체(예를 들어, 세툭시맙)에 특이적으로 결합하여 구성체가 질환 부위에 사전 농축시 CD47에 결합해 이를 억제할 수 있다.
실시예 7 - 식세포작용 검정
스페이서를 통해 DLP에 부착된 SIRP-α 변이체를 포함하는, SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 66), 및 SIRP-α 변이체(서열번호 31)를 DLD1 세포 상에서 식세포작용 검정으로 시험하였다(도 8). 식세포작용 검정법은 예를 들어, 문헌 [Weiskofp et al, Science 341:88-91, 2013]에 기술된 대로 수행하였다. 실험 프로토콜은 다음에 기술하였다. SIRP-α 변이체 구성체(서열번호 66)는 아마도 질환 세포 상에서 높은 축적으로 인해, SIRP-α 변이체(서열번호 31) 단독보다 더 높은 역가를 나타내었다.
익명의 제공자로부터 스탠포드 혈액 센터에서 버피 코트를 입수하였고, 말초 혈액 단핵 세포를 Ficoll-Paque Premium(GE Healthcare) 상에서 밀도 구배 원심분리로 농축시켰다. 단핵구는 제조사의 설명서에 따라 Macs Miltenyi Biotec 단핵구 단리 키트 II를 사용해 정제하였다. 이는 인간 PBMC로부터 단핵구의 단리를 위한 간접 자성 표지화 시스템이다. 단리된 단핵구는 10% 열-불활성화 인간 AB 혈청 및 1% GlutaMax 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지(GIBCO Life Technologies)에서 6-10일 동안 배양하여 마크로파지로 분화시켰다. 식세포작용 검정을 위해서, 100,000 GFP+ DLD-1 세포를 초저 부착 U 바닥 96웰(Corning 7007)의 웰 상에 플레이팅하였다. 50 ㎕/웰의 4 ㎍/ml IgG1k 이소타입 대조군 또는 4 ㎍/ml 세툭시맙(절대 항체, Ab00279-10.0)을 DLD-1 종양 세포에 부가하고 실온에서 30분간 사전-항온반응시켰다. 이후, 50 ㎕/웰의 SIRP-a 변이체를 부가하고 50 ㎕/웰의 마크로파지(1 x 106/ml)(50,000 마크로파지)를 또한 각 웰에 부가하였다. 항체와 SIRP-α 구성체 샘플의 최종 희석률은 1:4였다. 세툭시맙 최종 농도는 1 ㎍/ml이었다. 마크로파지, 종양 세포, 항체 및 SIRP-α 변이체 구성체의 공동 배양을 2시간 동안 37℃에서 수행하였다. 분석을 위해, 세포 샘플을 고정시키고, 염색하였으며, BD FACS Canto로 분석하였다. 초대 인간 마크로파지는 항-CD14, 항-CD45, 또는 항-CD206 항체(BioLegend)를 사용해 유세포분석으로 동정하였다. 죽은 세포는 DAPI(Sigma) 염색을 통해 분석에서 제외시켰다. 식세포작용은 GFP+ 마크로파지의 비율로 평가하고 각 세포주에 대한 각각의 독립적인 도너에 의한 최대 반응에 대해 정규화하였다.
실시예 8 - CD47에 대한 SIRP-α 변이체의 pH 의존적 결합의 모델링
본 발명의 SIRP-α 변이체의 pH-의존적 결합을 조작하기 위해서, 히스티딘 돌연변이유발법을 SIRP-α, 특히 CD47과 상호작용하는 SIRP-α의 영역에 대해 수행하였다. SIRP-α 및 CD47 복합체의 결정 구조(예를 들어, PDB ID No. 2JJS 참조) 및 컴퓨터 모델링을 사용하여 SIRP-α 및 CD47의 3차원 결합 부위를 시각화하였다. pH-감응성 결합 특성을 갖는 단백질을 디자인하는데 유용한 컴퓨터 디자인 및 모델링 방법은 문헌에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Strauch et al., Proc Natl Acad Sci 111:675-80, 2014]에 기술되어 있고, 이 전체를 참조로 본원에 편입시킨다. 일부 구체예에서, 컴퓨터 모델링을 사용하여 SIRP-α와 CD47의 경계면의 핵심 접촉 잔기를 동정하였다. 동정된 핵심 접촉 잔기는 산출된 결합 에너지 및 형상 상보성을 기초로 최적화, 여과, 및 등급화된 다양한 단백질 디자인을 생성할 수 있는 이용가능한 단백질 디자인 소프트웨어(예를 들어, RosettaDesign)를 사용해 히스티딘 잔기로 치환할 수 있다. 따라서, 일정 아미노산 위치에서 에너지적으로 호의적인 히스티딘 치환을 컴퓨터 디자인 방법을 사용해 동정할 수 있다. 컴퓨터 모델링을 또한 사용하여 SIRP-α의 3차원 구조의 변화를 예측할 수 있다. SIRP-α의 3차원 구조에 유의한 변화를 일으키는 히스티딘 치환은 피한다.
에너지 및 구조적으로 최적화된 아미노산 치환을 동정하면, 아미노산은 히스티딘 잔기로 체계적으로 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, SIRP-α의 1 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등, 최대 20개)의 아미노산이 히스티딘 잔기로 치환될 수 있다. 구체적으로, SIRP-α와 CD47의 경계면에 위치한 아미노산, 바람직하게, SIRP-α와 CD47의 결합에 직접 관여하는 아미노산이 히스티딘 잔기로 치환될 수 있다. 본 발명의 SIRP-α 변이체는 1 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등, 최대 20개)의 히스티딘 잔기 치환을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, SIRP-α의 천연 발생 히스티딘 잔기는 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 또 다른 구체예에서, SIRP-α의 1 이상의 아미노산은 CD47과 천연 발생 또는 치환된 히스티딘 잔기의 결합에 영향을 미치도록 히스티딘 잔기 이외의 잔기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 천연 발생 히스티딘 잔기 주변의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하면 천연 발생 히스티딘 잔기가 "매장"될 수 있다. 일부 구체예에서, CD47과의 결합에 직접적으로 관여하지 않는 아미노산, 즉 내부 아미노산(예를 들어, SIRP-α의 코어에 위치하는 아미노산)이 또한 히스티딘 잔기로 치환될 수 있다. 표 4는 히스티딘 잔기로 치환될 수 있는 특정한 SIRP-α 아미노산을 열거한다. 접촉 잔기는 SIRP-α와 CD47의 경계면에 위치한 아미노산이다. 코어 잔기는 SIRP-α와 CD47 간 결합에 직접적으로 관여하지 않는 내부 아미노산이다. 본 발명의 SIRP-α 변이체는 표 4에 열거한 치환 중 1 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등, 또는 전부)을 포함할 수 있다.
실시예 9 - CD47에 pH-의존적 결합을 하는 SIRP-α 변이체의 생성 및 스크리닝
히스티딘 잔기로 아미노산의 1 또는 그 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등, 최대 20개)의 치환을 함유하는 SIRP-α 변이체를 통상적인 분자 클로닝 및 단백질 발현 기술을 사용해 생성시켰다. 본 발명의 SIRP-α 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 잘 알려진 분자 생물학 기술을 사용해 박테리아에서의 발현에 최적인 벡터에 클로닝하였다. 이 벡터를 이후 박테리아 세포(예를 들어, 이.콜라이 세포)에 형질전환시키고, 단백질 발현 유도 전에 최적 밀도로 성장시켰다. 단백질의 발현 유도(즉, IPTG를 사용) 후, 박테리아 세포를 추가 24시간 동안 성장하게 두었다. 세포를 회수하고 발현된 SIRP-α 변이체 단백질은 예를 들어, 친화성 컬럼 크로마토그래피를 사용해 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 정제된 SIRP-α 변이체를 SDS-PAGE로 분석 후 쿠마시 블루 염색하여 예상 크기의 단백질 밴드의 존재를 확인하였다.
정제된 SIRP-α 변이체는 당분야에서 이용가능한 기술, 예컨대 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 표면 플라스몬 공명, 섬광 근접 검정법, ELISA, ORIGEN 면역검정법(IGEN), 형광발광 급랭법, 및/또는 형광발광 전달법을 사용해 CD47에 대한 pH=의존적 결합에 대해 스크리닝하였다. 결합은 또한 적합한 생물검정법으로 스크리닝하였다. 바람직한 SIRP-α변이체는 중성 pH(예를 들어, pH 7.4)보다 산성 pH(예를 들어, pH 7 미만(예를 들어, pH 6)) 하에서 CD47에 더 높은 친화성으로 결합하였다. pH 6에서 SIRP-α/CD47 복합체의 KD는 pH 7.4에서 SIRP-α/CD47 복합체의 KD보다 낮았다.
실시예 10 - 마우스에서 CD47에 대해 pH-의존적 결합을 하는 SIRP-α 변이체 시험
다양한 암, 예를 들어, 고형 종양 및 혈액학적 암의 유전자 조작된 마우스 모델을 사용하여 마우스 모델의 질환 부위 CD47에 대한 본 발명의 SIRP-α 변이체의 pH-의존적 결합을 시험하였다. SIRP-α 변이체를 마우스의 질환 부위에 직접 또는 간접 주사하고, 이를 이후 시점에 질환 부위에서 CD47과 SIRP-α 변이체의 복합체의 존재를 검출하기 위해 절개하였다. SIRP-α 변이체 또는 CD47에 특이적인 항체가 검출에 사용된다.
다른 구체예
상기 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 참조로 본원에 편입된다. 본 발명의 기술된 조성물 및 방법의 다양한 변형 및 별법은 본 발명의 범주 및 사조를 벗어나지 않고 당업자에게 자명하다. 본 발명을 특정 구체예와 관련하여 설명하였지만, 청구되는 본 발명이 이러한 특정 구체예에 과도하게 제한되어서는 않된다는 것을 이해해야 한다. 게다가 당업자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위해 기술된 방식의 다양한 변형은 본 발명의 범주에 포함시키고자 한다. 다른 구체예들은 이하의 청구항 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> ALEXO THERAPEUTICS INTERNATIONAL <120> SIRP-ALPHA VARIANT CONSTRUCTS AND USES THEREOF <130> 47819-702.601 <140> US 14/971,931 <141> 2015-12-16 <150> PCT/US2015/044528 <151> 2015-08-10 <150> 62/035,057 <151> 2014-08-08 <160> 142 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 504 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu 20 25 30 Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly 35 40 45 Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly 50 55 60 Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu 85 90 95 Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr 100 105 110 Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser 115 120 125 Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val 130 135 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(54)..(54) <223> E or Q <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> H, P or R <220> <221> MOD_RES <222> (66)..(66) <223> S, T or G <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (80)..(80) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (83)..(83) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(92) <223> V or I <220> <221> MOD_RES <222> (94)..(94) <223> F, L or V <220> <221> MOD_RES <222> (103)..(103) <223> F or V <400> 14 Glu Glu Glu Xaa Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Xaa Ile Leu His Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Xaa Thr Xaa Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Xaa Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Xaa Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Xaa Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro 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(53)..(53) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(54) <223> E or Q <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> H, P or R <220> <221> MOD_RES <222> (66)..(66) <223> L, T or G <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (80)..(80) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (83)..(83) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(92) <223> V or I <220> <221> MOD_RES <222> (94)..(94) <223> F, L or V <220> <221> MOD_RES <222> (104)..(104) <223> F or V <400> 16 Glu Glu Gly Xaa Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Xaa Ile Leu His Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Xaa Thr Xaa Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Xaa Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Xaa Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Xaa Lys Ser Gly Ala 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(104)..(104) <223> F or V <400> 17 Glu Glu Glu Xaa Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Phe Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Xaa Thr Leu Arg Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Xaa Thr Xaa Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Xaa Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Xaa Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Xaa Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 18 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> L, I or V <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> V, L or I <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> A or V <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> A, I or L <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> I, T, S or F <220> <221> MOD_RES <222> 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(94)..(94) <223> F, L or V <220> <221> MOD_RES <222> (103)..(103) <223> F or V <400> 19 Glu Glu Glu Xaa Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Xaa Ile Leu His Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Xaa Thr Xaa Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Xaa Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Xaa Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Xaa Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Gly Lys Pro Ser 115 <210> 20 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> L, I or V <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> V, L or I <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> A or V <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> A, I or L <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> I, T, S or F <220> <221> MOD_RES <222> (47)..(47) <223> E, V or L <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(54) <223> E or Q <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> H, P or R <220> <221> MOD_RES <222> (66)..(66) <223> S, T or G <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (80)..(80) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (83)..(83) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(92) <223> V or I <220> <221> MOD_RES <222> (94)..(94) <223> F, L or V <220> <221> MOD_RES <222> (103)..(103) <223> F or V <400> 20 Glu Glu Glu Xaa Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Xaa Thr Leu Arg Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Xaa Thr Xaa Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Xaa Ala Asp Ala 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<223> V or I <220> <221> MOD_RES <222> (94)..(94) <223> F, L or V <220> <221> MOD_RES <222> (104)..(104) <223> F or V <400> 21 Glu Glu Glu Xaa Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Xaa Thr Leu Arg Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Xaa Thr Xaa Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Xaa Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Xaa Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Xaa Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 22 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> L, I or V <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> V, L or I <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> A or V <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> V, I or L <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> I, T, S or F <220> <221> MOD_RES <222> (47)..(47) <223> E, V or L <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(54) <223> E or Q <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> H, P or R <220> <221> MOD_RES <222> (66)..(66) <223> S, T or G <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (80)..(80) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (83)..(83) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(92) <223> V or I <220> <221> MOD_RES <222> (94)..(94) <223> F, L or V <220> <221> MOD_RES <222> (103)..(103) <223> F or V <400> 22 Glu Glu Glu Xaa Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Xaa Ile Leu His Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Xaa Thr Xaa Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Xaa Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Xaa Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Xaa Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 23 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> E or G <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> L, I or V <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> V, L or I <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> S or F <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> L or S <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> S or T <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> A or V <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> I or T <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> H or R <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> A, V, I or L <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> I, T, S or F <220> <221> MOD_RES <222> (45)..(45) <223> A or G <220> <221> MOD_RES <222> (47)..(47) <223> E, V or L <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(54) <223> E or Q <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> H, P or R <220> <221> MOD_RES <222> (65)..(65) <223> D or E <220> <221> MOD_RES <222> (66)..(66) <223> S, L, T or G <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (70)..(70) <223> E or N <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(75) <223> S or P <220> <221> MOD_RES <222> (77)..(77) <223> S or R <220> <221> MOD_RES <222> (79)..(79) <223> S or G <220> <221> MOD_RES <222> (80)..(80) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (83)..(83) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(92) <223> V or I <220> <221> MOD_RES <222> (94)..(94) <223> F, L or V <220> <221> MOD_RES <222> (101)..(101) <223> D or absent <220> <221> MOD_RES <222> (102)..(102) <223> T or V <220> <221> MOD_RES <222> (104)..(104) <223> F or V <220> <221> MOD_RES <222> (116)..(116) <223> A or G <400> 23 Glu Glu Xaa Xaa Gln Xaa Ile Gln Pro Asp Lys Xaa Val Xaa Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Cys Thr Xaa Thr Ser Leu Xaa Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Xaa Arg Xaa Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Xaa Xaa Gly Xaa Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Xaa Xaa Thr Xaa Arg Xaa Asn Met Asp Phe Xaa Ile Xaa Ile Xaa Xaa 65 70 75 80 Ile Thr Xaa Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Xaa Lys Xaa Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Xaa Xaa Glu Xaa Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Xaa Lys Pro Ser 115 <210> 24 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Thr Thr Arg Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Val Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 25 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Glu Glu Glu Val Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Leu Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Gly Thr Arg Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 26 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Glu Glu Val Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Val Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Thr Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly 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Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Val Ile Ile His Cys Thr Val Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Arg Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Gly Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Val Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Val Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 29 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Glu Glu Glu Val Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ile Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly Arg Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Gly Thr Arg Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Leu Arg Lys 85 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Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Ile Ser 50 55 60 Glu Thr Thr Arg Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 34 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Thr Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Gly Thr Arg Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Cys 1 5 10 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Ser Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr 1 5 10 <210> 39 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr 1 5 10 15 Ile Ile Glu Leu Lys 20 <210> 40 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Gly Gln Tyr Thr Ser Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr 1 5 10 15 Ile Ile Glu Leu Lys 20 <210> 41 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn 1 5 10 15 Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe 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<400> 44 Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn 1 5 10 15 Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn 20 25 30 Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr 35 40 45 Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser 50 55 60 Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys 85 90 95 Glu Val Thr Glu Leu Gln Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys 100 105 110 Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu 115 120 <210> 45 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn 1 5 10 15 Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn 20 25 30 Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr 35 40 45 Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser 50 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<211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Cleavable peptide <400> 47 Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His 1 5 <210> 48 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 48 Ser Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln 35 40 45 Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg 50 55 60 Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg 65 70 75 80 Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro 85 90 95 Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met 100 105 110 Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr 115 120 125 Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe 130 135 140 Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 145 150 155 <210> 49 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 49 Ser Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Gly Arg Ser 20 25 30 Asp Asn His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Glu Glu 35 40 45 Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu 50 55 60 Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly Pro 65 70 75 80 Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu Ile Tyr Asn 85 90 95 Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Thr Thr 100 105 110 Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro 115 120 125 Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro 130 135 140 Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg 145 150 155 160 Ala Lys Pro Ser <210> 50 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 50 Gly Gln Tyr Thr Ser Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr 1 5 10 15 Ile Ile Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu 20 25 30 Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ser Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val 50 55 60 Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe 65 70 75 80 Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val 85 90 95 Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val 100 105 110 Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly 115 120 125 Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg 130 135 140 Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu 145 150 155 160 Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 165 <210> 51 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 51 Gly Gln Tyr Thr Ser Glu Val Thr Glu Leu 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys 1 5 10 <210> 65 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Cys Gln Tyr Asn Leu Ser Ser Arg Ala Leu Lys Cys 1 5 10 <210> 66 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 66 Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 35 40 45 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 50 55 60 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu 65 70 75 80 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 85 90 95 Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 100 105 110 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg 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Unknown: MMP9 cleavable peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Any amino acid <400> 84 Gly Pro Ala Xaa Gly Leu Xaa Gly Xaa 1 5 <210> 85 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: MMP9 cleavable peptide <400> 85 Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln 1 5 <210> 86 <211> 6 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: MMP9 cleavable peptide <400> 86 Pro Val Gly Leu Ile Gly 1 5 <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: MMP9 cleavable peptide <400> 87 His Pro Val Gly Leu Leu Ala Arg 1 5 <210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: HNE cleavable peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(3) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(11) <223> Any amino acid <400> 88 Xaa Xaa Xaa Val Ile Ala Thr Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> 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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser

Claims (76)

  1. 절단성 링커에 의해 CD47-기반 차단 펩티드에 부착된 신호-조절성 단백질 α(SIRPα) 변이체를 포함하는, SIRPα 변이체 구성체로서, 상기 절단성 링커는 산성 pH 하에서, 저산소 상태 하에서, 및/또는 종양-연관 효소에 의해 절단되는 것이고,
    상기 CD47-기반 차단 펩티드는 서열번호 38 및 40 내지 46 중 어느 하나에 따르는 아미노산 서열 또는 C15S 치환을 포함하는 서열번호 35의 아미노산 1-117을 포함하고,
    상기 SIRPα 변이체는 다음에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, SIRPα 변이체 구성체.
    EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(서열번호 13)
    상기에서, X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는, I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이며; X16은 F 또는 V이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 SIRPα 변이체는 서열번호 3 내지 12 및 24 내지 34 중 어느 하나에 따르는 서열에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는, SIRPα 변이체 구성체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 절단성 링커는 하나 이상의 스페이서를 포함하는, SIRPα 변이체 구성체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 종양-연관 효소는 마트립타제(MTSP1), 비뇨기형 플라스미노겐 활성인자(uPA), 레구마인, PSA, 칼리크레인-관련 펩티다제-3(KLK3), 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2), MMP9, 인간 호중구 엘라스타제(HNE), 및 프로테이나제 3(Pr3)으로 이루어진 군에서 선택되는 프로테아제인, SIRPα 변이체 구성체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 종양-연관 효소는 마트립타제(MTSP1)인, SIRPα 변이체 구성체.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 절단성 링커는 서열번호 47 또는 69 내지 99 중 어느 하나에 따르는 서열을 포함하는, SIRPα 변이체 구성체.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 절단성 링커는 LSGRSDNH(서열번호 47)을 포함하는, SIRPα 변이체 구성체.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 SIRPα 변이체 구성체는 서열번호 48 내지 63 중 어느 하나에 따르는 서열을 포함하는, SIRPα 변이체 구성체.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 SIRPα 변이체는 항체-결합 펩티드에 부착되는 것인, SIRPα 변이체 구성체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항체-결합 펩티드는 질환 국재화 펩티드(DLP)의 서열(서열번호 64 또는 65) 또는 이의 단편에 대해 적어도 75%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, SIRPα 변이체 구성체.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 SIRPα 변이체는 Fc 도메인 단량체에 부착되는 것인, SIRPα 변이체 구성체.
  12. 항체-결합 펩티드에 부착된 SIRPα 변이체를 포함하는 구성체로서,
    상기 SIRPα 변이체는 다음에 제시된 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 SIRPα 변이체는 서열번호 3 내지 12 및 24 내지 34 중 어느 하나에 따르는 서열에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는, 구성체.
    EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(서열번호 13)
    상기에서, X1은 L, I, 또는 V이고; X2는 V, L, 또는, I이고; X3은 A 또는 V이고; X4는 A, I, 또는 L이고; X5는 I, T, S, 또는 F이고; X6은 E, V, 또는 L이고; X7은 K 또는 R이고; X8은 E 또는 Q이고; X9는 H, P, 또는 R이고; X10은 L, T, 또는 G이고; X11은 K 또는 R이고; X12는 N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X13은 P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y이고; X14는 V 또는 I이고; X15는 F, L, 또는 V이며; X16은 F 또는 V이다.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체-결합 펩티드는 (a) 항체의 불변 영역에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합하거나, (b) 항체의 단편 항원-결합(Fab) 영역에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합하거나, (c) 항체의 가변 영역에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합하는, 구성체.
  14. 제12항에 있어서, 상기 항체-결합 펩티드는 종양-특이적 항체에 결합하는, 구성체.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-결합 펩티드는 세툭시맙에 결합하는, 구성체.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-결합 펩티드는 서열번호 64 또는 65에 적어도 75% 아미노산 서열 동일성을 갖는, 구성체.
  17. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체-결합 펩티드는 서열번호 64를 포함하는, 구성체.
  18. a) 제1항, 제2항, 및 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따르는 구성체, 및 b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 암, 면역학적 질환, 자가면역 질환, 또는 염증성 질환 치료용 약제학적 조성물.
  19. 제1항, 제2항, 및 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따르는 구성체를 포함하는, 암 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 암은 고형 종양 암, 혈액학적 암, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 방광암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 폐암, 기관지암, 간암, 난소암, 결장 및 직장암, 위암, 위장암, 담낭암, 위장관 기질 종양 암, 갑상선암, 두경부암, 구강인두암, 식도암, 흑색종, 비흑색종 피부암, 메르켈 세포 암종, 바이러스 유도성 암, 신경아세포종, 유방암, 전립선암, 신장암, 신장 세포 암, 신우암, 백혈병, 림프종, 육종, 신경교종, 뇌종양, 및 암종에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  21. 제1항, 제2항, 및 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따르는 구성체를 포함하는, 면역학적 질환, 자가면역 질환, 또는 염증성 질환 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 자가면역 또는 염증성 질환은 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반 루푸스, 항체-매개 염증성 또는 자가면역 질환, 이식편 대 숙주 질환, 패혈증, 당뇨병, 건선, 아테롬성 동맥 경화증, 쇠그렌 증후군, 진행성 전신 경화증, 경피증, 급성 관상 증후군, 허혈성 재관류, 크론병, 자궁내막증, 사구체신염, 중증 근무력증, 특발성 폐섬유증, 천식, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 혈관염, 또는 염증성 자가면역 근육염인, 약제학적 조성물.
  23. 제1항, 제2항, 및 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따르는 구성체를 코딩하는, 핵산.
  24. 제23항에 따르는 핵산을 포함하는, 벡터.
  25. 제23항에 따르는 핵산, 또는 제23항에 따르는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  26. 제1항, 제2항, 및 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따르는 구성체를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 상기 구성체를 코딩하는 핵산, 또는 상기 구성체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 상기 구성체가 생성되는 조건하에서 배양하는 단계; 및
    b) 상기 숙주 세포에 의해 생성된 상기 구성체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 구성체의 제조 방법.
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