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TWI759810B - 信號調節蛋白α(signal-regulatory proteinα, SIRP-α)變體構築物及其用途 - Google Patents

信號調節蛋白α(signal-regulatory proteinα, SIRP-α)變體構築物及其用途 Download PDF

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TWI759810B
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cancer
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蘿拉 戴明
柯瑞 古德曼
強 波恩
邦 簡尼特 西姆
馬利嘉 維勒基奇
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美商Ａｌｘ腫瘤技術股份有限公司
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Abstract

本發明係關於包括SIRP-α變體之SIRP-α變體構築物的組合物及方法。該SIRP-α變體構築物可以各種方式設計以應對環境因子，例如pH、低氧及/或腫瘤關連酵素或腫瘤關連抗原之存在。本發明之SIRP-α變體構築物可用於治療各種疾病，例如癌，較佳為固體腫瘤或血液性癌。

Description

信號調節蛋白α　(signal-regulatory　protein　α,　SIRP-α)變體構築物及其用途
信號調節蛋白α(SIRP-α)係在骨髓細胞的膜上廣泛表現的蛋白質。SIRP-α會與CD47交互作用，CD47為一種在體內許多類型的細胞廣泛表現之蛋白質。SIRP-α與CD47之交互作用會防止“自體”細胞的吞噬，否則該自體細胞會被免疫系統辨識。SIRP-α首先是以SHP-2(一種含有酪胺酸磷酸酶的SH-2分域(domain))之結合子被發現。CD47已被表徵為卵巢癌細胞中過度表現的抗原。
於西元2000年，Oldenborg等人顯示將CD47缺損的紅血球(RBCs)投予(administration)於小鼠模型中會造成紅血球從系統中快速被清除，證明CD47在某些”自體”細胞之次組(subset)為一“保護”信號。因此，SIRP-α與癌症間的潛在關係進一步被了解。據發現已作用的癌細胞上有高度表現的CD47，其在急性骨髓性白血病(AML)和數種固體腫瘤癌症之中作為存活的負預後因子(negative prognostic factor)。針對破壞CD47與SIRP-α間交互作用的策略，例如投予會遮蔽CD47或SIRP-α之藥劑，已被發現是一種有潛力的抗癌療法。
然而，考量到這些治療策略時，有一課題在於：SIRP-α可能會結合至人體內多種不同細胞類型上的CD47。因此，需要設計SIRP-α使其只優先結合於患病細胞或細胞上的患病部位之CD47。
本發明係關於信號調節蛋白α(SIRP-α)變體構築物(variant construct)。該SIRP-α變體構築物包括SIRP-α變體。於一些實施例，該SIRP-α變體構築物在患病的部位有優先的活性(例如在腫瘤部位優先於非患病的部位)。於特定實施例，該SIRP-α變體構築物對於患病的細胞(例如癌細胞)上的CD47具有較高的結合親和性。於一些實施例，相較於在生理條件下，該SIRP-α變體在酸性pH(例如低於約pH 7)及/或在缺氧條件下對於CD47有較高之親和性。於一些實施例，該SIRP-α變體包括以組胺酸殘基或其他胺基酸取代之一或多個胺基酸取代，可容許SIRP-α變體構築物優先結合於患病的部位。於一些實施例，該SIRP-α變體構築物可藉由阻斷胜肽以防止其在非患病的部位結合至CD47。於一些實施例，該SIRP-α變體構築物藉由靶向結構(targeting moiety)(例如導向腫瘤相關抗原或抗體結合胜肽之抗體)以靶向至(target to)患病的部位(例如腫瘤)。本發明也關於含有SIRP-α變體構築物之方法及醫藥組合物，以用於治療諸如癌的各種疾病，特別是固體腫瘤癌及血液性癌。
於一態樣，本發明係關於信號調節蛋白α(SIRP-α)變體構築物，其中該SIRP-α變體構築物優先結合於患病細胞或患病部位上之CD47而不是非患病的細胞。於一些實施例，該SIRP-α變體構築物對於患病細胞或患病部位的CD47之結合親和性高於對非患病的細胞。
於一些實施例，該SIRP-α變體構築物包括附著於阻斷胜肽之SIRP-α變體。於一些實施例，該阻斷胜肽對於野生型(wild-type)SIRP-α之結合親和性高於對SIRP-α變體。於一些實施例，該SIRP-α變體對於野生型CD47之結合親和性高於對阻斷胜肽。
於一些實施例，該阻斷胜肽為CD47系阻斷胜肽。於一些實施例，該CD47系阻斷胜肽包括與CD47之IgSF分域(SEQ ID NO: 35)或其片段之野生型序列至少有80%胺基酸序列同一性(identity)之部分。於一些實施例，該CD47系阻斷胜肽之序列為SEQ ID NO: 38或40。
在此提供一種SIRP-α變體構築物，包括在此敘述之SIRP-α變體，其中該SIRP-α變體利用至少一連結子(linker)(例，可裂解的連結子)附著於所述之阻斷胜肽。於一些實施例，該SIRP-α變體可包括與野生型SIRP-α相同的CD47結合部位。於一些實施例，該SIRP-α變體相較於野生型SIRP-α可包括一或多個突變或插入。於一些實施例，該SIRP-α變體可為野生型SIRP-α之截短形(truncated form)。於一些實施例，該阻斷胜肽可為CD47模擬物(mimic)、變體、或在此描述之片段。於一些實施例，該阻斷胜肽對於野生型SIRP-α之親和性高於對SIRP-α變體結構中之SIRP-α變體之親和性。於一些實施例，該阻斷胜肽可為CD47變體多肽，相較於野生型CD47，其對於SIRP-α變體具有較低之親和性。於一些實施例，SIRP-α變體與阻斷胜肽間之連結子可為被一或多種蛋白酶選擇性地裂解之至少一連結子。於一些實施例，該連結子亦可選擇性地包括一或多個分隔子。
於一些實施例，該SIRP-α變體藉由可裂解的連結子及可選的一或多個分隔子來附著於阻斷胜肽。於一些實施例，該可裂解的連結子在酸性pH及/或缺氧條件下被裂解。於一些實施例，該可裂解的連結子被腫瘤關連酵素裂解。於一些實施例，該腫瘤關連酵素為蛋白酶。於一些實施例，該蛋白酶選自以下構成的群組：蛋白裂解酶(matriptase, MTSP1)、尿型胞漿素元活化劑(plasminogen activator, uPA)、天冬氨酸内肽酶(legumain)、前列腺特定抗原(PSA)(也稱為KLK3，激肽釋放酶關連肽酶-3(kallikrein-related peptidase-3))、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP9、人類嗜中性彈性蛋白酶(neutrophil elastase, HNE)及蛋白酶3(Pr3)。於一些實施例，該蛋白酶為蛋白裂解酶(matriptase)。於一些實施例，該可裂解的連結子之序列為LSGRSDNH(SEQ ID NO: 47)或表7列出之任一序列。於一些實施例，該可裂解的連結子包括以下序列的一種或其組合(例如：見表7)：PRFKIIGG (SEQ ID NO: 90)、PRFRIIGG (SEQ ID NO: 91)、SSRHRRALD (SEQ ID NO: 92)、RKSSIIIRMRDVVL (SEQ ID NO: 93)、SSSFDKGKYKKGDDA (SEQ ID NO: 94)、SSSFDKGKYKRGDDA (SEQ ID NO: 95)、IEGR (SEQ ID NO: 107)、IDGR (SEQ ID NO: 96)、GGSIDGR (SEQ ID NO: 97)、PLGLWA (SEQ ID NO: 98)、GPLGIAGI (SEQ ID NO: 100)、GPEGLRVG (SEQ ID NO: 108)、YGAGLGVV (SEQ ID NO: 101)、AGLGVVER (SEQ ID NO: 102)、AGLGISST (SEQ ID NO: 103)、DVAQFVLT (SEQ ID NO: 99)、VAQFVLTE (SEQ ID NO: 104)、AQFVLTEG (SEQ ID NO: 105)、PVQPIGPQ (SEQ ID NO: 106)、LSGX1 RX2 X3 SX4 DNH (SEQ ID NO: 69)其中X1 -X4 各者係任意自然存在的胺基酸、X1 SGSRKX2 RVX3 X4 X5 (SEQ ID NO: 70)其中X1 -X5 各者係任意自然存在的胺基酸、SGRXSA (SEQ ID NO: 71)其中X係任意自然存在的胺基酸、LSGX1 RX2 X3 SX4 DNH (SEQ ID NO: 69)其中X1 -X4 各者係任意自然存在的胺基酸、RX1 X2 X3 RKX4 VX5 X6 GX7 (SEQ ID NO: 73)其中X1 -X7 各者係任意自然存在的胺基酸、RQARXVV (SEQ ID NO: 74)其中X係任意自然存在的胺基酸、RX1 X2 RKVX3 G (SEQ ID NO: 75)其中X1 -X3 各者係任意自然存在的胺基酸、KRRKQGASRKA (SEQ ID NO: 76)、X1 X2 X3 NX4 X5 X6 (SEQ ID NO: 78)其中X1 -X6 各者係任意自然存在的胺基酸、AANXL (SEQ ID NO: 79)其中X係任意自然存在的胺基酸、ATNXL (SEQ ID NO: 80)其中X係任意自然存在的胺基酸、SISQX1 YQRSSX2 X3 (SEQ ID NO: 81) 其中X1 -X3 各者係任意自然存在的胺基酸、SSKLQ (SEQ ID NO: 82)、X1 PX2 X3 LIX4 X5 X6 (SEQ ID NO: 83)其中X1 -X6 各者係任意自然存在的胺基酸、GPAX1 GLX2 GX3 (SEQ ID NO: 84)其中X1 -X3 各者係任意自然存在的胺基酸、GPLGIAGQ (SEQ ID NO: 85)、PVGLIG (SEQ ID NO: 86)、HPVGLLAR (SEQ ID NO: 87)、X1 X2 X3 VIATX4 X5 X6 X7 (SEQ ID NO: 88)其中X1 -X7 各者係任意自然存在的胺基酸、及X1 YYVTAX2 X3 X4 X5 (SEQ ID NO: 89)其中X1 -X5 各者係任意自然存在的胺基酸。
於一些實施例，該SIRP-α變體附著於抗體結合胜肽。於一些實施例，該抗體結合胜肽可逆或不可逆地結合於抗體的不變區(constant region)。於一些實施例，該抗體結合胜肽以可逆或不可逆地結合於抗體之抗原結合片段(Fab)區。於一些實施例，該抗體結合胜肽以可逆或不可逆地結合於抗體之可變區。於一些實施例，該抗體為爾必得舒(Cetuximab)。於一些實施例，該抗體結合胜肽與疾病局部化胜肽(disease localization peptide, DLP)(CQFDLSTRRLKC(SEQ ID NO: 64)或CQYNLSSRALKC (SEQ ID NO: 65))或其片段之序列有至少75%胺基酸序列同一性。於一些實施例，該抗體結合胜肽之序列為SEQ ID NO: 64。
於一些實施例，該SIRP-α變體附著於Fc分域單元體。於一些實施例，該SIRP-α變體附著於人類血清白蛋白(HSA)。於一些實施例，HSA包括C34S及/或K573P之胺基酸取代，對應於SEQ ID NO: 67。於一些實施例，該HSA之序列為： DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO: 68)。
於一些實施例，該SIRP-α變體附著於白蛋白結合(albumin-binding)胜肽。於一些實施例，該白蛋白結合胜肽之序列為SEQ ID NO: 2。於一些實施例，該SIRP-α變體附著於聚合物，其中該聚合物為聚乙烯二醇(PEG)鏈或聚唾液酸鏈。
於一些實施例，該SIRP-α變體附著於抗體。於一些實施例，該抗體為腫瘤專一性抗體。於一些實施例，該抗體(例如腫瘤專一性抗體)選自由以下構成的群組：cetuximab、pembrolizumab、nivolumab、pidilizumab、MEDI0680、MEDI6469、Ipilimumab、tremelimumab、urelumab、vantictumab、varlilumab、mogamalizumab、抗CD20抗體、抗CD19抗體、抗CS1抗體、herceptin、trastuzumab及pertuzumab。於一些實施例，該抗體(例如腫瘤專一性抗體)可結合於以下之一或多種分子：5T4、AGS-16、ALK1、ANG-2、B7-H3、B7-H4、c-fms、c-Met、CA6、CD123、CD19、CD20、CD22、EpCAM、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD70、CD74、CD79b、CD98、CEA、CEACAM5、CLDN18.2、CLDN6、CS1、CXCR4、DLL-4、EGFR、EGP-1、ENPP3、EphA3、ETBR、FGFR2、纖網蛋白(fibronectin)、FR-alpha、GCC、GD2、glypican-3、GPNMB、HER-2、HER3、HLA-DR、ICAM-1、IGF‑1R、IL-3R、LIV-1、mesothelin、MUC16、MUC1、NaPi2b、Nectin-4、Notch 2、Notch 1、PD-L1、PD-L2、PDGFR-α、PS、PSMA、SLTRK6、STEAP1、TEM1、VEGFR、CD25、CD27L、DKK-1及/或CSF-1R。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物中之SIRP-α變體與SEQ ID NO: 3-12及24-34之任一序列有至少80%(例如至少85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)之序列同一性。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物之SIRP-α變體之序列為： EEEX1 QX2 IQPDKSVLVAAGETX3 TLRCTX4 TSLX5 PVGPIQWFRGAGPGRX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSDX10 TX11 RNNMDFSIRIGX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO: 13)，其中X1 為L、I或V；X2 為V、L，或I；X3 為A或V；X4 為A、I或L；X5 為I、T、S或F；X6 為E、V或L；X7 為K或R；X8 為E或Q；X9 為H、P或R；X10 為L、T或G；X11 為K或R；X12 為N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X13 為P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；X14 為V或I；X15 為F、L或V；X16 為F或V。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物中之該SIRP-α變體之序列為：EEGX1 QX2 IQPDKSVSVAAGESX3 ILHCTX4 TSLX5 PVGPIQWF RGAGPGRX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSDX10 TX11 RNNMDFSIRIGX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO: 16)，其中X1 為L、I或V；；X2 為V、L或I；；X3 為A或V；X4 為A、I或L；X5 為I、T、S或F；X6 為E、V或L；X7 為K或R；X8 為E或Q；X9 為H、P或R；X10 為L、T或G；X11 為K或R；X12 為N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X13 為P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；X14 為V或I；X15 為F、L或V；X16 為F或V。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物中之該SIRP-α變體之序列為：EEEX1 QX2 IQPDKFVLVAAGETX3 TLRCTX4 TSLX5 PVGPIQWF RGAGPGRX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSDX10 TX11 RNNMDFSIRIGX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO: 17)，其中X1 為L、I或V；X2 為V、L或I；X3 為A或V；X4 為A、I或L；X5 為I、T、S或F；X6 為E、V或L；X7 為K或R；X8 為E或Q；X9 為H、P或R；X10 為L、T或G；X11 為K或R；X12 為N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X13 為P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；X14 為V或I；X15 為F、L或V；X16 為F或V。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物中之該SIRP-α變體之序列為：EEEX1 QX2 IQPDKSVLVAAGETX3 TLRCTX4 TSLX5 PVGPIQWF RGAGPGRX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSDX10 TX11 RNNMDFPIRIGX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO: 18)，其中X1 為L、I或V；X2 為V、L，或I；X3 為A或V；X4 為A、I或L；X5 為I、T、S或F；X6 為E、V或L；X7 為K或R；X8 為E或Q；X9 為H、P或R；X10 為L、T或G；X11 為K或R；X12 為N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X13 為P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；X14 為V或I；X15 為F、L或V；X16 為F或V。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物中之該SIRP-α變體之序列為：EEEX1 QX2 IQPDKSVLVAAGETX3 TLRCTX4 TSLX5 PVGPIQWF RGAGPGRX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSDX10 TX11 RNNMDFSIRISX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO: 21)，其中X1 為L、I或V；X2 為V、L，或I；X3 為A或V；X4 為A、I或L；X5 為I、T、S或F；X6 為E、V或L；X7 為K或R；X8 為E或Q；X9 為H、P或R；X10 為L、T或G；X11 為K或R；X12 為N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X13 為P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；X14 為V或I；X15 為F、L或V；X16 為F或V。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物中之該SIRP-α變體之序列為：EEEX1 QX2 IQPDKSVSVAAGESX3 ILHCTX4 TSLX5 PVGPIQWF RGAGPARX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSEX10 TX11 RENMDFSISISX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDTEX16 KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO: 14)，其中X1 為L、I或V；X2 為V、L，或I；X3 為A或V；X4 為V、I或L；X5 為I、T、S或F；X6 為E、V或L；X7 為K或R；X8 為E或Q；X9 為H、P或R；X10 為S、T或G；X11 為K或R；X12 為N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X13 為P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；X14 為V或I；X15 為F、L或V；X16 為F或V；
於一些實施例，SIRP-α變體構築物中之該SIRP-α變體之序列為：EEEX1 QX2 IQPDKSVSVAAGESX3 ILLCTX4 TSLX5 PVGPIQWF RGAGPARX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSEX10 TX11 RENMDFSISISX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDTEX16 KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO: 15)，其中X1 為L、I或V；X2 為V、L或I；X3 為A或V；X4 為V、I或L；X5 為I、T、S或F；X6 為E、V或L；X7 為K或R；X8 為E或Q；X9 為H、P或R；X10 為S、T或G；X11 為K或R；X12 為N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X13 為P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；X14 為V或I；X15 為F、L或V；X16 為F或V。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物中之該SIRP-α變體之序列為：EEEX1 QX2 IQPDKSVSVAAGESX3 ILHCTX4 TSLX5 PVGPIQWF RGAGPARX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSEX10 TX11 RENMDFSISISX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDTEX16 KSGAGTELSVRGKPS(SEQ ID NO: 19)，其中X1 為L、I或V；X2 為V、L或I；X3 為A或V；X4 為V、I或L；X5 為I、T、S或F；X6 為E、V或L；X7 為K或R；X8 為E或Q；X9 為H、P或R；X10 為S、T或G；X11 為K或R；X12 為N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X13 為P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；X14 為V或I；X15 為F、L或V；X16 為F或V。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物中之該SIRP-α變體之序列為：EEEX1 QX2 IQPDKSVSVAAGESX3 ILHCTX4 TSLX5 PVGPIQWF RGAGPARX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSEX10 TX11 RENMDFSISISX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDTEX16 KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO: 22)，其中X1 為L、I或V；X2 為V、L或I；X3 為A或V；X4 為V、I或L；X5 為I、T、S或F；X6 為E、V或L；X7 為K或R；X8 為E或Q；X9 為H、P或R；X10 為S、T或G；X11 為K或R；X12 為N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X13 為P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；X14 為V或I；X15 為F、L或V；X16 為F或V。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物中之該SIRP-α變體之序列為：EEEX1 QX2 IQPDKSVLVAAGETX3 TLRCTX4 TSLX5 PVGPIQWF RGAGPARX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSEX10 TX11 RENMDFSISISX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDTEX16 KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO: 20)，其中X1 為L、I或V；X2 為V、L或I；X3 為A或V；X4 為A、I或L；X5 為I、T、S或F；X6 為E、V或L；X7 為K或R；X8 為E或Q；X9 為H、P或R；X10 為S、T或G；X11 為K或R；X12 為N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X13 為P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；X14 為V或I；X15 為F、L或V；X16 為F或V。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物中之該SIRP-α變體之序列為： EEX1 X2 QX3 IQPDKX4 VX5 VAAGEX6 X7 X8 LX9 CTX10 TSLX11 PVGPIQWFRGAGPX12 RX13 LIYNQX14 X15 GX16 FPRVTTVSX17 X18 TX19 RX20 NMDFX21 IX22 IX23 X24 ITX25 ADAGTYYCX26 KX27 RKGSPDX28 X29 EX30 KSGAGTELSVRX31 KPS(SEQ ID NO: 23)，其中X1 為E或G；X2 為L、I或V；X3 為V、L，或I；X4 為S或F；X5 為L或S；X6 為S或T；X7 為A或V；X8 為I或T；X9 為H或R；X10 為A、V、I或L；X11 為I、T、S或F；X12 為A或G；X13 為E、V或L；X14 為K或R；X15 為E或Q；X16 為H、P或R；X17 為D或E；X18 為S、L、T或G；X19 為K或R；X20 為E或N；X21 為S或P；X22 為S或R；X23 為S或G；X24 為N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X25 為P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；X26 為V或I；X27 為F、L、V；X28 為D或不存在；X29 為T或V；X30 為F或V；X31 為A或G。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物之SIRP-α變體與SEQ ID NO: 13-23之任一序列有至少80%(例如至少85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)之序列同一性。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物之SIRP-α變體不包括SEQ ID NO: 3-12及24-34之任一序列。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物中之SIRP-α變體包括以組胺酸殘基取代之一或多個胺基酸殘基取代。於一些實施例，該以組胺酸殘基取代之一或多個胺基酸殘基取代位在以下一或多個胺基酸位置：29、30、31、32、33、34、35、52、53、54、66、67、68、69、74、93、96、97、98、100、4、6、27、36、39、47、48、49、50、57、60、72、74、76、92、94、103，對應於SEQ ID NO: 3-12之任一序列。
於一些實施例，該SIRP-α變體構築物對於在患病細胞或患病部位之CD47的結合親和性相對於非患病細胞為至少2倍，至少4倍或至少6倍。
於一些實施例，該SIRP-α變體構築物在酸性pH下對於CD47之結合親和性相對於在中性pH下為至少2倍，至少4倍或至少6倍。
於一些實施例，該SIRP-α變體構築物在缺氧條件下對於CD47之結合親和性相對於在生理條件下為至少2倍，至少4倍或至少6倍。
於一些實施例，該患病細胞為患癌的癌細胞。
於一些實施例，該酸性pH介於約4至約7。
於另一態樣，本發明係關於一核酸分子，其編碼為在此記載的SIRP-α變體構築物。
於另一態樣，本發明係關於一載體，其包括編碼為在此記載的之SIRP-α變體構築物的核酸分子。
於另一態樣，本發明關於一寄主細胞，其表現於在此記載的SIRP-α變體構築物，其中該寄主細胞包括編碼為在此記載的SIRP-α變體構築物之核酸分子或具有此核酸分子之載體，其中該核酸分子或載體在該寄主細胞中表現。
於另一態樣，本發明係關於在此記載的SIRP-α變體構築物之製備方法，其中該方法包括：a)提供一寄主細胞，其包括編碼為在此記載的SIRP-α變體構築物之核酸分子或具有該核酸分子之載體；b)於容許該SIRP-α變體構築物形成的條件下在該寄主細胞中表現該核酸分子或載體；及c)回復(recover)該SIRP-α變體構築物。
於另一態樣，本發明係關於一種醫藥組合物，包括具有治療有效量的在此記載之SIRP-α變體構築物。於一些實施例，該醫藥組合物包括一或多種醫藥上可接受之載具(carrier)或賦形劑。
於另一態樣，本發明關於一種增加受試者之標靶細胞的吞噬作用之方法，包括對受試者投予在此記載的SIRP-α變體構築物或含有治療有效量的SIRP-α變體構築物之醫藥組合物。於一些實施例，該標靶細胞為癌細胞。
於另一態樣，本發明係關於一種消除受試者之調節性T細胞之方法，包括：對該受試者投予在此記載的SIRP-α變體構築物或含有治療有效量的在此記載之SIRP-α變體構築物的醫藥組合物。
於另一態樣，本發明係關於殺死癌細胞之方法，該方法包括使該癌細胞接觸在此記載的SIRP-α變體構築物或該含有治療有效量的SIRP-α變體構築物之醫藥組合物。
於另一態樣，本發明係關於治療一受試者其與SIRP-α及/或CD47活性相關之疾病的方法，該方法包括對該受試者投予治療有效量之在此記載的SIRP-α變體構築物或含有治療有效量的在此記載之SIRP-α變體構築物的醫藥組合物。
於另一態樣，本發明係關於治療受試者其與SIRP-α及/或CD47活性關連之疾病的方法，該方法包括：(a)決定該受試者的SIRP-α之胺基酸序列；及(b)對該受試者投予治療有效量的在此記載之SIRP-α變體構築物；其中SIRP-α變體構築物之SIRP-α變體與該受試者之SIRP-α具有相同的胺基酸序列。
於另一態樣，本發明係關於治療一受試者其與SIRP-α及/或CD47活性相關之疾病的方法，該方法包括：(a)決定該受試者的SIRP-α之胺基酸序列；(b)對該受試者投予治療有效量的在此記載之SIRP-α變體構築物；其中SIRP-α變體構築物之SIRP-α變體在該受試者中具有最小的免疫原性(immunogenicity)。
於另一態樣，本發明係關於一種治療受試者其與SIRP-α及/或CD47活性有關之疾病的方法，該方法包括：對該受試者投予在此記載的SIRP-α變體構築物，其中該SIRP-α變體構築物會優先結合於患病細胞或患病部位上之CD47而不是非患病細胞上之CD47。
於一些實施例，該疾病為癌。於一些實施例，該癌選自於：固體腫瘤癌、血液性癌、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴細胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、膀胱癌、胰腺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、肺癌、支氣管癌、肝癌、卵巢癌、結腸和直腸癌、胃癌、胃癌、膽囊癌、胃腸道間質腫瘤癌、甲狀腺癌、頭和頸癌、口咽癌、食道癌、黑色素瘤、非黑色素瘤皮膚癌、默克爾細胞癌、病毒誘導的癌症、神經母細胞瘤、乳癌、前列腺癌、腎癌、腎細胞癌、腎盂癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、神經膠質瘤、腦腫瘤及肝癌。於一些實施例，該癌為固體腫瘤癌。於一些實施例，該癌為血液性癌。
於一些實施例，該疾病為免疫疾病。於一些實施例，該免疫疾病為自體免疫疾病或發炎性疾病。於一些實施例，該自體免疫疾病或發炎性疾病為：多發性硬化症、類風濕關節炎、脊柱關節病、全身性紅斑狼瘡、抗體中介之發炎性或自體免疫疾病、移植物抗宿主病、膿毒症、糖尿病、牛皮癬、動脈粥樣硬化、Sjogren氏綜合症、進行性全身性硬化症、硬皮病、急性冠狀動脈症候群、缺血再灌注、克羅恩病、子宮內膜異位症、腎小球腎炎、重症肌無力、特發性肺纖維化、哮喘、急性呼吸窘迫症候群（ARDS）、血管炎或發炎性自體免疫肌炎。
於另一態樣，本發明係關於增加一受試者之造血幹細胞植入(hematopoietic stem cell engraftment)之方法，包括：藉由對該受試者投予在此記載之SIRP-α變體或含有治療有效量的在此記載之SIRP-α變體之醫藥組合物，以調控該受試者中SIRP-α與CD47之交互作用。
於另一態樣，本發明係關於改變一受試者之免疫反應(response)之方法，包括：對該受試者投予在此記載的SIRP-α變體構築物或含有治療有效量的在此記載之SIRP-α變體構築物的醫藥組合物，從而改變該受試者之免疫反應。於一些實施例，該免疫反應包括抑制該免疫反應。
於一些實施例，受試者為哺乳動物，較佳為人。
定義 在此使用的用語“患病的細胞”及“患病的組織”係指例如癌細胞及組織。具體而言，該癌可為固體腫瘤癌或血液性癌。例如，若該癌為固體腫瘤癌，該患病的細胞為固體腫瘤的細胞。患病的細胞通常生活在患病部位之特定條件下，例如酸性pH與缺氧。“患病的細胞”與“患病的組織”常會和其他疾病相關，包括但不限於癌。“患病的細胞”與”患病的組織”也可和免疫疾病或失調、關連心血管疾病或失調、代謝疾病或失調或增殖性疾病或失調關連。免疫失調包括發炎性疾病或失調及自體免疫疾病或失調。
在此使用的用語“非患病的細胞”係指身體正常、健康的細胞。非患病的細胞通常生活在生理條件，例如中性pH及充足的氧濃度，以維持細胞的正常代謝及調節性功能。
在此使用的用語“患病的部位”係指接近體內患病處的位置或區域。例如，若該疾病為位在肝的固體腫瘤癌，則患病的部位為肝中接近腫瘤的部位和區域。患病的部位之細胞可包括患病的細胞以及在該患病的部位支持該疾病的細胞。例如，若該患病的部位為腫瘤部位，則在腫瘤部位之細胞包括患病的細胞(例如癌細胞)及在該腫瘤部位支持腫瘤生長的細胞。同樣地，用語“癌部位”係指體內的癌之位置。
在此使用的用語“SIRP-α D1分域”或“D1分域”係指SIRP-α之膜末端及胞外分域。該SIRP-α D1分域位在全長、野生型SIRP-α的N-端且間接結合至CD47。D1分域之胺基酸序列顯示於表1。
在此使用的用語“SIRP-α D2分域”或“D2分域”係指SIRP-α之第二胞外分域。該SIRP-α D2分域包括全長、野生型SIRP-α其約胺基酸119至220。
在此使用的用語“SIRP-α D3分域”或“D3分域”係指SIRP-α之第三胞外分域。該SIRP-α D3分域包括全長、野生型SIRP-α其約胺基酸221至320。
在此使用的用語“SIRP-α多肽”係指野生型SIRP-α及SIRP-α變體，各用語在此分別定義及記載。
在此使用的用語“SIRP-α變體(variant)”係指含有SIRP-α D1分域或全長SIRP-α之CD47結合部分的多肽。於一些實施例，該SIRP-α變體與SEQ ID NO: 3-12及24-34中任一序列具有至少80%(例如至少85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)之序列同一性。於一些實施例，相較於野生型SIRP-α，SIRP-α變體對於CD47具有更高之親和性。於一些實施例，SIRP-α變體包括部分野生型人類SIRP-α(較佳為野生型SIRP-α之CD47結合部分)及/或具有一或多個胺基酸取代。例如，SIRP-α變體相對於野生型SIRP-α可能含有一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等，最多20)胺基酸殘基之取代。例如，SIRP-α變體可能含有以組胺酸取代之一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等，最多20)胺基酸殘基取代。於一些實施例，SIRP-α變體與野生型人類SIRP-α或在此記載的任一SIRP-α變體(例如野生型人類SIRP-α之CD47結合部分之序列)之序列具有至少80%(例如至少85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)的胺基酸序列同一性。野生型SIRP-α之CD47結合部分包括野生型SIRP-α之D1分域(SEQ ID NO: 3-12中任一序列)。
在此使用的用語“SIRP-α變體構築物(variant construct)”係指一多肽，其含有，附著於例如阻斷胜肽、Fc分域單元體、HAS、白蛋白結合胜肽、聚合物、抗體結合胜肽、抗體的SIRP-α變體。於一些實施例，SIRP-α變體構築物在患病的部位具有優先的活性。於一些實施例，SIRP-α變體構築物在患病的部位有優先的活性，且包括SIRP-α變體，其部分與野生型人類SIRP-α或在此記載之任一SIRP-α變體之序列(例如與野生型人類SIRP-α之CD47結合部分之序列)具有至少80%(例如至少85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)的胺基酸序列同一性。
在此使用的用語“同一性百分比(% identity)”係指諸如SIRP-α變體的候選序列(candidate sequence)之胺基酸(或核酸)殘基，其相同於諸如野生型人類SIRP-α或其CD47結合部分的參考序列之胺基酸(或核酸)殘基；若有需要，在排列序列並導入缺口(gaps)之後可達成最大的同一性百分比(即，可對候選和參考序列其中之一或二者導入缺口以供最佳排列，且為了比較之目的，可忽略非同源序列)。為了達成決定同一性百分比之排列目的可利用該技術領域中已知的多種方式，例如，使用諸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體等公開可取得之電腦軟體。該技術領域中有通常知識者可決定適當的參數以供測量排列，包括任意演算法，其須達到超過待比對之全長序列的最大排列。於一些實施例，給定的候選序列相比(to)、以及(with)或相對(against)於給定的參考序列之胺基酸(或核酸)序列同一性百分比(或也可說成：給定的候選序列相比、以及或相對於給定的參考序列具有或包括特定的胺基酸(或核酸)序列同一性百分比)可依以下方式計算： 100 x (A/B之比例) 其中，A代表在候選序列與參考序列之排列中被評定為相同之胺基酸(或核酸)殘基數，B代表在參考序列中胺基酸(或核酸)殘基之總數。於一些實施例，若候選序列長度與參考序列長度不相等，則候選序列對參考序列之胺基酸(或核酸)序列同一性百分比可能不等於參考序列對候選序列之胺基酸(或核酸)序列同一性百分比。
於特定實施例，為了與候選序列比較而排列之參考序列可顯示：候選序列在候選序列之全長或選定的鄰近部分之胺基酸(或核酸)殘基中呈現50%至100%的同一性。用以比較而排列之候選序列長度為參考序列長度之至少30%，例如至少40%，例如至少50%，60%，70%，80%，90%或100%。若候選序列之位置和相對應之參考序列之位置被相同胺基酸(或核酸)殘基佔據，則該位置具有相同的分子。
在此使用的用語“腫瘤關連蛋白酶(tumor-associated protease)”或“腫瘤酵素(tumor enzyme)”係指諸如蛋白酶的酵素，其於諸如固體腫瘤癌的癌中之存在水平增加。於一些實施例，該腫瘤關連蛋白酶可裂解可裂解的連結子。
在此使用的用語“阻斷胜肽(blocking peptide)”係指可結合於SIRP-α變體並阻斷或“遮蔽”SIRP-α變體之CD47結合部分的胜肽。於SIRP-α變體構築物中，該阻斷胜肽可藉由可選擇性裂解之連結子及可選的一或多個分隔子來附著於SIRP-α變體。阻斷胜肽可藉由非共價鍵來偶合(couple)至SIRP-α變體，並在患病的部位或患病的細胞處被裂解。於一些實施例，該阻斷胜肽可於該患病的部位或患病的細胞處結合至野生型SIRP-α。可利用阻斷胜肽以減少或最小化SIRP-α變體與野生型CD47結合於正常生理條件下或非患病的部位。於一些實施例，該阻斷胜肽對於野生型SIRP-α較SIRP-α變體具有更高的結合親合性。阻斷胜肽可於諸如患病的部位或非生理條件下，從SIRP-α變體解離並結合至野生型SIRP-α。阻斷胜肽的實例為CD47系阻斷胜肽，其係來自CD47或其片段之胜肽。於一些實施例，CD47系阻斷胜肽為CD47之胞外SIRP-α結合部分(即CD47之IgSF分域)。於一些實施例，CD47系阻斷胜肽包括相對於野生型CD47之一或多個胺基酸取代，加成，及/或刪除。
在此使用的用語“可裂解的連結子(cleavable linker)”係指介於SIRP-α變體構築物兩個部分之間的連結子。於一些實施例，可裂解的連結子能將阻斷胜肽共價地附著於SIRP-α變體以阻斷SIRP-α變體於生理條件下結合至CD47。於一些實施例，可裂解的連結子可被設置於阻斷胜肽之中，其可與SIRP-α變體非共價地連繫以阻斷生理條件下SIRP-α變體對CD47之結合。可裂解的連結子可於特定條件下裂解。可裂解的連結子若在阻斷胜肽之中，則連結子之裂解可能使阻斷胜肽失活(inactivate)。該可裂解的連結子包含一基團(moiety)，其作用為在諸如癌部位的患病部位(例如固體腫瘤內)之特性條件下裂解或誘導連結子的裂解。該可裂解的連結子在健康的生理條件下(例如中性pH及充足氧濃度)為安定。該基團可為能夠在酸性pH水解的pH敏感性化學官能基(例如縮醛、縮酮、硫順丁烯醯胺酸根(thiomaleamate)、腙(hydrazones)、雙硫鍵)。該基團也可為能夠在缺氧條件下還原的缺氧敏感性化學官能基(例如醌(quinones)、N-氧化物及雜芳族性硝基)或胺基酸。可裂解的連結子之該基團也可為能夠被腫瘤關連蛋白酶、酵素或肽解酶辨識並裂解的蛋白質受質。
在此使用的用語“分隔子(spacer)”係指介於SIRP-α變體構築物兩個部分之間的共價或非共價連結，例如連結子(例如可裂解的連結子)及SIRP-α變體或抗體結合胜肽及SIRP-α變體。該分隔子較佳為共價連結。分隔子可為例如醯胺鍵的簡單化學鍵，或為胺基酸序列(例如3-200個胺基酸序列)。胺基酸分隔子為多肽的一級序列之一部分(例如經由多肽骨架接合至分隔的多肽或多肽分域)。分隔子在兩個部分間提供空間及/或可撓性(flexibility)。分隔子在生理條件下(例如中性pH及充足氧濃度)以及患病部位的特定條件下(例如酸性pH與缺氧)為安定。分隔子在諸如癌部位的患病部位(例如腫瘤內)為安定。之後將在此對分隔子提供進一步的詳述。
在此使用的用語“抗體”係指完整的抗體、前提是有顯示所期望的活性之抗體片段、單株抗體、多株抗體、單專一性抗體，及由至少2個完整抗體所形成的多專一性抗體(例如雙專一性抗體)。抗體較佳為對諸如腫瘤細胞的特定患病細胞專一。例如，該抗體可專一性地結合於諸如腫瘤細胞的患病細胞上之細胞表面蛋白質。
在此使用的用語“白蛋白結合胜肽(albumin-binding peptide)”係指12至16個胺基酸之胺基酸序列，其具有親和性且作用為結合血清白蛋白。白蛋白結合胜肽可以有不同的來源，例如人類、小鼠或大鼠。於本發明一些實施例，SIRP-α變體構築物可包括一白蛋白結合胜肽，其融合(fuse)至SIRP-α變體之C端以增加該SIRP-α變體之血清半衰期。白蛋白結合胜肽可直接或經由分隔子而融合至SIRP-α變體。
在此使用的用語“人類血清白蛋白(human serum alnumin, HSA)”係指存在於人類血漿中的白蛋白蛋白質。人類血清白蛋白是血液中最豐富的蛋白質。其構成約為一半的血液血清蛋白質。於一些實施例，人類血清白蛋白具有UniProt ID NO: P02768之胺基酸25-609(SEQ ID NO: 67)的序列。於一些實施例，人類血清白蛋白更包含對應於SEQ ID NO: 67之序列的C34S。
在此使用的用語“Fc分域單元體(Fc domain monomer)”係指包括第二及第三抗體的不變分域(CH 2及CH 3)之多肽鏈。於某些實施例，該Fc分域單元體還包括鉸鏈(hinge)分域。該Fc分域單元體可為任意的免疫球蛋白抗體構造同型(isotype)，包括IgG、IgE、IgM、IgA或IgD。此外，該Fc分域單元體可為IgG次型(例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)。Fc分域單元體不包括能夠作為諸如可變分域或互補決定區(CDR)的抗原辨識區之免疫球蛋白的任意部分。Fc分域單元體可包括至多十個來自野生型Fc分域單元體序列(例如1-10，1-8，1-6，1-4胺基酸取代、加成或刪除)之改變，其改變Fc分域與Fc受體之間的交互作用。適當改變之實例為該技術領域中之習知技術。
在此使用的用語“Fc分域”係指2個Fc分域單元體之二元體。於野生型Fc分域中，該2個Fc分域單元體藉由2個CH 3抗體不變分域間之交互作用以及一或多個形成於此2個二聚化的Fc分域單元體之鉸鏈分域的雙硫鍵以形成二元體。於一些實施例，Fc分域可突變以缺少效應子(effector)功能，一般為“死Fc分域”。於特定的實施例，Fc分域中的Fc分域單元體包括在CH 2抗體不變分域中的胺基酸取代，以減少該Fc分域與Fcγ受體之間的交互作用或結合。
在此使用的用語“親和性(affinity)”或“結合親和性(binding affinity)”係指2個分子間之結合交互作用的強度。一般而言，結合親和性係指分子與其諸如SIRP-α變體及CD47的結合對象之間的非共價交互作用之總強度。若未特別指明，結合親和性係指固有的結合親和性，其反映出結合分子對之間的1:1交互作用。2個分子間的結合親和性通常以解離常數(KD )或親和性常數(KA )表示。若兩個分子彼此的結合親和性低，通常結合慢且易解離，呈現較大的KD 。若兩個分子彼此的結合親和性高，通常結合快且結合較久，呈現較小的KD 。兩個交互作用分子的KD 可使用該技術領域習知的方法及技術決定，例如表面電漿共振(surface plasmon resonance)。KD 係以koff /kon 之比值計算。
在此使用的用語“寄主細胞(host cell)”係指包括諸如胞器的必要細胞成分之載運體(vehicle)，其需從對應的核酸中表現蛋白質。該核酸一般包括在核酸載體，其能藉由技術領域中的習知技術導入寄主細胞(例如轉形、轉染(transfection)、電穿孔、磷酸鈣沉澱、直接微注射等)。寄主細胞可為原核細胞，例如細菌細胞或諸如哺乳動物細胞的真核細胞(例如CHO細胞)。如在此所述，寄主細胞被用來表現一或更多SIRP-α變體構築物。
在此使用的用語“醫藥組合物(pharmaceutical composition)”係指一種醫學或藥學配方，包括有效成分及賦形劑並稀釋使有效成分能夠適合於投藥的方法。本發明之醫藥組合物包括與SIRP-α變體構築物相容之醫藥上可接受的成分。該醫藥組合物可為口服投予之錠劑或膠囊，或靜脈或皮下投予之水性劑型。
在此使用的用語“和SIRP-α及/或CD47活性關連疾病”係指由SIRP-α及/或CD47活性所導致及/或與其相關之任何疾病症或失調。例如，由SIRP-α及/或CD47活性所導致及/或與其增加及/或減少相關之疾病或失調。與SIRP-α及/或CD47活性關連之疾病的實例包括但不限於癌及免疫疾病(例如自體免疫疾病及發炎性疾病)。
在此使用的用語“治療有效量(therapeutically effective amount)”係指本發明之SIRP-α變體構築物或含有本發明SIRP-α變體構築物之醫藥組合物的量，其在治療具有諸如癌(例如固體腫瘤或血液性癌)的疾病之患者時能有效地達到期望的療效。具體而言，SIRP-α變體構築物之治療有效量可避免不利的副作用。
在此使用的用語“最佳親和性(optimized affinity)”或“最佳結合親和性(optimized binding affinity)”係指SIRP-α變體與CD47間之結合交互作用的最佳強度。於一些實施例，該SIRP-α變體構築物主要對於患病部位(即癌細胞)之細胞上的CD47結合或以較高親和性結合，且對於非患病部位(即非癌細胞)之細胞上的CD47基本上不結合或以較低親和性結合。最佳化SIRP-α變體與CD47間之結合親和性使得交互作用不會導致臨床相關的毒性。於一些實施例，為了達成SIRP-α變體與CD47間之最佳結合親和性，可發展SIRP-α變體使其較最大可達到之對CD47的結合親和性具有更低之親和性。
在此使用的用語“免疫原性(immunogenicity)”係指蛋白質(例如治療蛋白質)其在寄主中被視為外來抗原而造成免疫反應的性質。蛋白質之免疫原性可在活體外(in vitro)以各種不同方式分析，特別係藉由活體外T細胞增殖分析(見例如Jawa et al.,Clinical Immunology 149:534-555,2013)，其中有些分析為市面上可得(見例如Proimmune提供的免疫原性分析服務)。
在此使用的用語“最小免疫原性(minimal immunogenicity)”係指蛋白質(例如治療蛋白質)之免疫原性，其可被修飾(即胺基酸取代)以使其較導入胺基酸之前具有更低的免疫原性(例如至少低10%、25%、50%或100%)。蛋白質(例如治療蛋白質)被修飾成具有最小之免疫原性，係指即便為外來抗原也不會或極少造成寄主產生免疫反應。
在此使用的用語“最佳藥物動力學(optimized pharmacokinetics)”係指一般和蛋白質之藥物動力學有關之參數被改善及修飾以產生供活體外及/或活體內(in vivo)使用的最佳蛋白質。與蛋白質之藥物動力學關連之參數對該技術領域中有通常知識者為習知技術，包括例如KD 、價數及半衰期。於本發明中，本發明之SIRP-α變體構築物的藥物動力學最佳於使用在治療脈絡中與CD47交互作用。
本發明係關於信號調節蛋白α(SIRP-α)變體構築物，其在患病的部位具有優先活性(例如在腫瘤部位優先於非患病的部位)。於特定實施例，該SIRP-α變體構築物對患病細胞(例如癌細胞)上的CD47有較高的結合親和性。於一些實施例，該SIRP-α變體可包括一或更多胺基酸取代。於一些實施例，該胺基酸可被取代成組胺酸殘基。於一些實施例，該胺基酸可被取代成其他非組胺酸之胺基酸殘基。於一些實施例，該SIRP-α變體構築物對患病細胞或患病部位上之CD47較非患病的細胞有較高之親和性，且於諸如癌部位的患病部位(例如腫瘤部位或腫瘤內部)之特性條件下，具有較高之親和性。於一些實施例，該SIRP-α變體構築物對CD47在酸性pH(例如低於約pH 7)及/或缺氧條件下較在生理條件下具有較高之親和性。於一些實施例，該SIRP-α變體構築物包括SIRP-α變體及阻斷胜肽；除非在患病部位之特性條件下，否則該SIRP-α變體會藉由阻斷胜肽防止其結合於CD47。於一些實施例，該SIRP-α變體融合至Fc分域單元體、人類血清白蛋白(HSA)、白蛋白結合胜肽或聚合物(例如聚乙二醇(PEG)聚合物)。於一些實施例，該SIRP-α變體構築物具有用於治療情境中最佳的免疫原性、親和性及/或藥物動力學。於一些實施例，該SIRP-α變體構築物藉由諸如靶向專一性抗體的靶向結構而優先靶向於諸如腫瘤的患病部位。本發明係關於方法及包含SIRP-α變體構築物之醫藥組合物以治療各種疾病，例如癌，較佳為固體腫瘤或血液性癌，及殺死癌細胞之方法，及製造SIRP-α變體構築物及含有此SIRP-α變體構築物之醫藥組合物的方法。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物包括附著於阻斷胜肽之SIRP-α變體。於一些實施例，可藉由使用可裂解的連結子將該阻斷胜肽附著於該SIRP-α變體，使得該SIRP-α變體構築物中之該SIRP-α變體優先結合至患病細胞或患病部位上的CD47，該連結子可於該患病的細胞或患病的部位被裂解。於一些實施例，可藉由將該阻斷胜肽附著於該SIRP-α變體，使得該SIRP-α變體構築物中之該SIRP-α變體優先結合至患病細胞或患病部位上的CD47，其中於該患病的細胞或患病的部位之該阻斷胜肽可從該SIRP-α變體脫離或簡單地解離。
I. SIRP-α變體 野生型人類SIRP-α至少存在10種天然的變體。此10種野生型人類SIRP-α變體之D1分域的胺基酸序列顯示於SEQ ID NO: 3-12(見表1)。於一些實施例，該SIRP-α變體與SEQ ID NO: 3-12中之任一序列具有至少80%(例如至少85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)的序列同一性。表2列出在各個D1分域變體(SEQ ID NO: 13-23)中可能的胺基酸取代。於一些實施例，該SIRP-α變體以最佳結合親和性與CD47結合。於一些實施例，含有SIRP-α變體之該SIRP-α變體構築物主要以較高親和性與癌細胞上之CD47結合，且基本上不結合或以較低親和性與非癌細胞上之CD47結合。於一些實施例，最佳化該SIRP-α變體構築物與CD47之間的結合親和性使得交互作用不會導致臨床相關的毒性。於一些實施例，該SIRP-α變體構築物具有最小免疫原性。於一些實施例，除了導入以增加SIRP-α變體之親和性的胺基酸改變以外，該SIRP-α變體與受試者的生物樣本中之SIRP-α多肽具有相同的胺基酸。以下進一步詳述用來產生SIRP-α變體及決定其對CD47之結合親和性的技術及方法。
表2列出相對於各個D1分域變體序列之SIRP-α變體中的特定胺基酸取代。SIRP-α變體可包括列於表2之一或更多(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)取代。於一些實施例，SIRP-α變體相對於野生型D1分域包括至多10個胺基酸取代。於一些實施例，SIRP-α變體相對於野生型D1分域包括至多7個胺基酸取代。
於一些實施例，SIRP-α變體為嵌合SIRP-α變體，其包括2或更多個野生型D1分域變體之一部分(例如一部分是野生型D1分域變體，一部分是另一野生型D1分域變體)。於一些實施例，嵌合SIRP-α變體包括野生型D1分域變體之至少2個部分(例如3、4或5等)，其中各部分係來自不同的野生型D1分域變體。於一些實施例，嵌合SIRP-α變體更包括列於表2的一或更多胺基酸取代。於一些實施例，該SIRP-α變體與表3之SEQ ID NO: 24-34中任一序列具有至少80%(例如至少85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)之序列同一性。
表1 野生型SIRP-α D1分域之序列
野生型D1分域變體1 (SEQ ID NO: 3) EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
野生型D1分域變體2 (SEQ ID NO: 4) EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
野生型D1分域變體3 (SEQ ID NO: 5) EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILLCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
野生型D1分域變體4 (SEQ ID NO: 6) EEGLQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
野生型D1分域變體5 (SEQ ID NO: 7) EEELQVIQPDKFVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
野生型D1分域變體6 (SEQ ID NO: 8) EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFPIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
野生型D1分域變體7 (SEQ ID NO: 9) EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRGKPS
野生型D1分域變體8 (SEQ ID NO: 10) EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
野生型D1分域變體9 (SEQ ID NO: 11) EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
野生型D1分域變體10 (SEQ ID NO: 12) EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
表2. 相對於各D1分域變體，在SIRP-α變體中之胺基酸取代
D1分域 v1 (SEQ ID NO: 13) EEEX1 QX2 IQPDKSVLVAAGETX3 TLRCTX4 TSLX5 PVGPIQWFRGAGPGRX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSDX10 TX11 RNNMDFSIRIGX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS
相對於SEQ ID NO: 13之胺基酸取代 X1 =L、I、V; X2 =V、L、I; X3 =A、V; X4 =A、I、L; X5 =I、T、S、F; X6 =E、V、L; X7 =K、R; X8 =E、Q; X9 =H、P、R; X10 =L、T、G; X11 =K、R; X12 =N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y; X13 =P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y; X14 =V、I; X15 =F、L、V; X16 =F、V
D1分域v2 (SEQ ID NO: 14) EEEX1 QX2 IQPDKSVSVAAGESX3 ILHCTX4 TSLX5 PVGPIQWFRGAGPARX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSEX10 TX11 RENMDFSISISX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDTEX16 KSGAGTELSVRAKPS
相對於SEQ ID NO: 14之胺基酸取代 X1 =L、I、V; X2 =V、L、I; X3 =A、V; X4 =V、I、L; X5 =I、T、S、F; X6 =E、V、L; X7 =K、R; X8 =E、Q; X9 =H、P、R; X10 =S、T、G; X11 =K、R; X12 =N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y; X13 =P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y; X14 =V、I; X15 =F、L、V; X16 =F、V
D1分域v3 (SEQ ID NO: 15) EEEX1 QX2 IQPDKSVSVAAGESX3 ILLCTX4TSLX5 PVGPIQWFRGAGPARX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSEX10 TX11 RENMDFSISISX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDTEX16 KSGAGTELSVRAKPS
相對於SEQ ID NO: 15之胺基酸取代 X1 =L、I、V; X2 =V、L、I; X3 =A、V; X4 =V、I、L; X5 =I、T、S、F; X6 =E、V、L; X7 =K、R; X8 =E、Q; X9 =H、P、R; X10 =S、T、G; X11 =K、R; X12 =N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y; X13 =P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y; X14 =V、I; X15 =F、L、V; X16 =F、V
D1分域v4 (SEQ ID NO: 16) EEGX1 QX2 IQPDKSVSVAAGESX3 ILHCTX4 TSLX5 PVGPIQWFRGAGPGRX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSDX10 TX11 RNNMDFSIRIGX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS
相對於SEQ ID NO: 16之胺基酸取代 X1 =L、I、V; X2 =V、L、I; X3 =A、V; X4 =A，I，L; X5 =I、T、S、F; X6 =E、V、L; X7 =K、R; X8 =E、Q; X9 =H、P、R; X10 =L、T、G; X11 =K、R; X12 =N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y; X13 =P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y; X14 =V、I; X15 =F、L、V; X16 =F、V
D1分域v5 (SEQ ID NO: 17) EEEX1 QX2 IQPDKFVLVAAGETX3 TLRCTX4 TSLX5 PVGPIQWFRGAGPGRX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSDX10 TX11 RNNMDFSIRIGX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS
相對於SEQ ID NO: 17之胺基酸取代 X1 =L、I、V; X2 =V、L、I; X3 =A、V; X4 =A，I，L; X5 =I、T、S、F; X6 =E、V、L; X7 =K、R; X8 =E、Q; X9 =H、P、R; X10 =L、T、G; X11 =K、R; X12 =N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y; X13 =P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y; X14 =V、I; X15 =F、L、V; X16 =F、V
D1分域v6 (SEQ ID NO: 18) EEEX1 QX2 IQPDKSVLVAAGETX3 TLRCTX4 TSLX5 PVGPIQWFRGAGPGRX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSDX10 TX11 RNNMDFPIRIGX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS
相對於SEQ ID NO: 18之胺基酸取代 X1 =L、I、V; X2 =V、L、I; X3 =A、V; X4 =A，I，L; X5 =I、T、S、F; X6 =E、V、L; X7 =K、R; X8 =E、Q; X9 =H、P、R; X10 =L、T、G; X11 =K、R; X12 =N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y; X13 =P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y; X14 =V、I; X15 =F、L、V; X16 =F、V
D1分域v7 (SEQ ID NO: 19) EEEX1 QX2 IQPDKSVSVAAGESX3 ILHCTX4 TSLX5 PVGPIQWFRGAGPARX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSEX10 TX11 RENMDFSISISX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDTEX16 KSGAGTELSVRGKPS
相對於SEQ ID NO: 19之胺基酸取代 X1 =L、I、V; X2 =V、L、I; X3 =A、V; X4 =V、I、L; X5 =I、T、S、F; X6 =E、V、L; X7 =K、R; X8 =E、Q; X9 =H、P、R; X10 =S、T、G; X11 =K、R; X12 =N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y; X13 =P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y; X14 =V、I; X15 =F、L、V; X16 =F、V
D1分域v8 (SEQ ID NO: 20) EEEX1 QX2 IQPDKSVLVAAGETX3 TLRCTX4 TSLX5 PVGPIQWFRGAGPARX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSEX10 TX11 RENMDFSISISX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDTEX16 KSGAGTELSVRAKPS
相對於SEQ ID NO: 20之胺基酸取代 X1 =L、I、V; X2 =V、L、I; X3 =A、V; X4 =A，I，L; X5 =I、T、S、F; X6 =E、V、L; X7 =K、R; X8 =E、Q; X9 =H、P、R; X10 =S、T、G; X11 =K、R; X12 =N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y; X13 =P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y; X14 =V、I; X15 =F、L、V; X16 =F、V
D1分域v9 (SEQ ID NO: 21) EEEX1 QX2 IQPDKSVLVAAGETX3 TLRCTX4 TSLX5 PVGPIQWFRGAGPGRX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSDX10 TX11 RNNMDFSIRISX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS
相對於SEQ ID NO: 21之胺基酸取代 X1 =L、I、V; X2 =V、L、I; X3 =A、V; X4 =A，I，L; X5 =I、T、S、F; X6 =E、V、L; X7 =K、R; X8 =E、Q; X9 =H、P、R; X10 =L、T、G; X11 =K、R; X12 =N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y; X13 =P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y; X14 =V、I; X15 =F、L、V; X16 =F、V
D1分域v10 (SEQ ID NO: 22) EEEX1 QX2 IQPDKSVSVAAGESX3 ILHCTX4 TSLX5 PVGPIQWFRGAGPARX6 LIYNQX7 X8 GX9 FPRVTTVSEX10 TX11 RENMDFSISISX12 ITX13 ADAGTYYCX14 KX15 RKGSPDTEX16 KSGAGTELSVRAKPS
相對於SEQ ID NO: 22之胺基酸取代 X1 =L、I、V; X2 =V、L、I; X3 =A、V; X4 =V、I、L; X5 =I、T、S、F; X6 =E、V、L; X7 =K、R; X8 =E、Q; X9 =H、P、R; X10 =S、T、G; X11 =K、R; X12 =N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y; X13 =P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y; X14 =V、I; X15 =F、L、V; X16 =F、V
Pan D1分域 (SEQ ID NO: 23) EEX1 X2 QX3 IQPDKX4 VX5 VAAGEX6 X7 X8 LX9 CTX10 TSLX11 PVGPIQWFRGAGPX12 RX13 LIYNQX14 X15 GX16 FPRVTTVSX17 X18 TX19 RX20 NMDFX21 IX22 IX23 X24 ITX25 ADAGTYYCX26 KX27 RKGSPDX28 X29 EX30 KSGAGTELSVRX31 KPS
相對於SEQ ID NO: 23之胺基酸取代 X1 =E、G; X2 =L、I、V; X3 =V、L、I; X4 =S，F; X5 =L、S; X6 =S，T; X7 =A、V; X8 =I、T; X9 =H，R; X10 =A、V、I、L; X11 =I、T、S、F; X12 =A、G; X13 =E、V、L; X14 =K、R; X15 =E、Q; X16 =H、P、R; X17 =D，E; X18 =S、L、T、G; X19 =K、R; X20 =E、N; X21 =S，P; X22 =S、R; X23 =S、G; X24 =N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y; X25 =P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y; X26 =V、I; X27 =F、L、V; X28 =D或不存在; X29 =T、V; X30 =F、V; 及X31 =A、G
表3. SEQ ID NO: 24-34
SEQ ID NO 序列
24 EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTITSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQREGHFPRVTTVSETTRRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEVKSGAGTELSVRAKPS
25 EEEVQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTLTSLIPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQRQGHFPRVTTVSEGTRRENMDFSISISNITPADAGTYYCIKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
26 EEEVQIIQPDKSVSVAAGESVILHCTITSLTPVGPIQWFRGAGPARLLIYNQREGPFPRVTTVSETTRRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKLRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
27 EEELQIIQPDKSVSVAAGESAILHCTITSLSPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQRQGPFPRVTTVSEGTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCIKLRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
28 EEEIQVIQPDKSVSVAAGESVIIHCTVTSLFPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQRQGRFPRVTTVSEGTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKVRKGSPDTEVKSGAGTELSVRAKPS
29 EEEVQIIQPDKSVSVAAGESIILHCTVTSLFPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQREGRFPRVTTVSEGTRRENMDFSISISNITPADAGTYYCIKLRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
30 EEEVQLIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLFPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQREGPFPRVTTVSEGTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCIKFRKGSPDTEVKSGAGTELSVRAKPS
31 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
32 EEELQIIQPDKSVSVAAGESAILHCTITSLFPVGPIQWFRGAGPARLLIYNQRQGPFPRVTTVSETTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
33 EEEVQIIQPDKSVSVAAGESAILHCTITSLFPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQKQGPFPRVTTISETTRRENMDFSISISNITPADAGTYYCIKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS
34 EEELQIIQPDKSVSVAAGESAILHCTITSLTPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQRQGPFPRVTTVSEGTRRENMDFSISISNITPADAGTYYCIKFRKGSPDTEVKSGAGTELSVRAKPS
理想地，該本發明之SIRP-α變體構築物在諸如癌部位的患病部位(例如腫瘤內)之特性條件下對CD47之親和性高於在生理條件下(例如中性pH及充足氧濃度)。諸如癌部位的患病部位(例如腫瘤內)之特性條件為例如酸性pH及缺氧。於一些實施例，本發明之SIRP-α變體構築物可設計成優先結合於患病的細胞而非患病的細胞。具體而言，該患病的細胞可為癌疾病之癌細胞，例如固體腫瘤或血液性癌。較佳地，該SIRP-α變體構築物對CD47之親和性在酸性pH(例如低於約pH 7)高於中性pH，例如pH 7.4。較佳地，該SIRP-α變體構築物對CD47之親和性在缺氧條件高於充足氧濃度之條件。於一些實施例，SIRP-α變體構築物包括附於阻斷胜肽之SIRP-α變體。於一些實施例，可藉由使用可裂解的連結子將該阻斷胜肽附著於該SIRP-α變體，使得該SIRP-α變體構築物之該SIRP-α變體可優先結合至患病細胞或患病部位上的CD47，其中該可裂解的連結子在該患病的細胞或患病的部位會被裂解。於一些實施例，可藉由附著該阻斷胜肽於該SIRP-α變體，使得該SIRP-α變體構築物之該SIRP-α變體優先結合至患病細胞或患病部位上的CD47，其中於該患病的細胞或患病的部位之該阻斷胜肽可從該SIRP-α變體脫離或簡單地解離。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物包括SIRP-α變體與阻斷胜肽。於一些實施例，SIRP-α變體可經由連結子(例如可裂解的連結子)而附著於阻斷胜肽。該阻斷胜肽之功用為阻斷該SIRP-α變體之CD47結合部位以防止SIRP-α變體在生理條件下(例如中性pH與充足氧濃度)結合於CD47。該可裂解的連結子為只能在患病的部位(例如癌部位，例如腫瘤內)之特性條件下被裂解之連結子，例如在酸性pH與缺氧下。於一些實施例，該可裂解的連結子在患病的部位被腫瘤關連蛋白酶裂解。於一些實施例，該連結子在患病的部位未被裂解而只是該阻斷胜肽簡單地從患病部位的該SIRP-α變體解離，以使該SIRP-α變體可自由地結合至鄰近患病細胞(例如腫瘤細胞)上的CD47。因此，只有當在患病的部位，該SIRP-α變體才會從阻斷胜肽中釋放且能自由地結合至鄰近患病細胞(例如癌細胞)上的CD47。之後將對阻斷胜肽與連結子(例如可裂解的連結子)做進一步的詳述。
於一些實施例，SIRP-α變體構築物包括SIRP-α變體及靶向結構。於一些實施例，SIRP-α變體可附著於諸如抗體的靶向結構(例如腫瘤專一性抗體)或其他的蛋白質或胜肽(例如能對患病的細胞顯示其結合親和性之抗體結合胜肽)。在投予後，該腫瘤專一性抗體或抗體結合胜肽作為靶向結構以將該SIRP-α變體帶到諸如癌部位的患病部位(例如固體腫瘤內)，於此處該SIRP-α能與患病細胞上的CD47專一性地交互作用。於一些實施例，SIRP-α變體可融合至蛋白質或胜肽，例如能結合於抗體(例如腫瘤專一性抗體)之抗體結合胜肽，即結合於該抗體之不變區或可變區。能夠與一或更多抗體結合之SIRP-α變體將於後做進一步詳述。於其他實施例，其他的SIRP-α變體，例如International Publication No. WO2013109752(在此引入作為參考)所記載，其可附於腫瘤專一性抗體或蛋白質或胜肽，例如能結合於腫瘤專一性抗體之抗體結合胜肽。於一些實施例，該SIRP-α變體可於活體外(於對人類投予前)或於活體內(投予後)附於該抗體。
於一些實施例，SIRP-α變體可更包括野生型人類SIRP-α之D2及/或D3分域。於一些實施例，SIRP-α變體可附著於Fc分域單元體、人類血清白蛋白(HSA)、血清結合蛋白質或胜肽或諸如聚合物(例如聚乙烯二醇(PEG))的有機分子，以便改善該SIRP-α變體之藥物動力學性質，例如增加半衰期。作用為增加本發明之SIRP-α變體之血清半衰期的Fc分域單元體、HSA蛋白質、血清結合蛋白質或胜肽及諸如PEG的有機分子將於後做進一步詳述。於一些實施例，SIRP-α變體不包括SEQ ID NO:3-12與24-34中任一序列。
II. SIRP-α變體中之以組胺酸殘基取代之胺基酸取代 於一些實施例，除了表2列出之SIRP-α變體中之胺基酸取代，該SIRP-α變體可包括以組胺酸殘基取代之一或更多胺基酸取代。包括SIRP-α變體之該SIRP-α變體構築物在患病的細胞或患病的部位比起在非患病的細胞對CD47具有較高之親和性，且在患病的部位之特性條件下(例如酸性pH，缺氧)比在生理條件下具有較高之親和性。欲以組胺酸殘基取代之胺基酸殘基可利用組胺酸掃描突變法、蛋白質晶體結構及模擬設計與模型建立法來鑑別(identify)。可用在產生SIRP-α變體之技術與方法及用來決定其在患病與非患病細胞上與CD47的結合親和性之方法將於後做進一步詳述。組胺酸殘基取代可位在SIRP-α變體與CD47之交界，或位在SIRP-α變體之內部區域。較佳地，組胺酸殘基取代位在SIRP-α變體與CD47之交界。表4列出可以用組胺酸殘基取代之特定SIRP-α胺基酸。表4之胺基酸號碼係相對於SEQ ID NO: 3之序列；SEQ ID NO: 4-12中任一序列之對應位置的一或更多胺基酸也可被取代為組胺酸殘基。接觸殘基係指位在SIRP-α變體與CD47交界的胺基酸。核心殘基係指未直接涉及SIRP-α變體與CD47間之結合的內部胺基酸。該SIRP-α變體可包括一或更多(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等或全部)表4列出之取代。該SIRP-α變體可包括最多20個組胺酸取代。
表4. SIRP-α胺基酸取代(胺基酸編號係相對於SEQ ID NO: 3之序列)
接觸殘基 S29H，L30H，I31H，P32H，V33H，G34H，P35H，Q52H，K53H，E54H，L66H，T67H，K68H，R69H，F74H，K93H，K96H，G97H，S98H，D100H
核心殘基 L4H，V6H，A27H，I36H，F39H，E47H，L48H，I49H，Y50H，F57H，V60H，M72H，F74H，I76H，V92H，F94H，E103H
III. pH依存性(pH-dependent)結合 研究顯示腫瘤細胞媒介的致癌代謝會產生大量乳酸和質子，造成腫瘤組織中胞外pH值降至6之低(Icard et al.，Biochim. Biophys. Acta . 1826:423-433，2012)。於一些實施例，設計(engineer)包括SIRP-α變體之該SIRP-α變體構築物使其在酸性pH比起在中性pH(例如約pH 7.4)對CD47有較高親和性。因此，設計本發明之SIRP-α變體構築物使其選擇性地結合至患病細胞(例如癌細胞)或患病部位之細胞(例如在支持腫瘤生長之腫瘤微環境中的細胞)上的CD47而不是非患病細胞上之CD47。
於一實施例，為了設計本發明之SIRP-α變體構築物的pH依存性結合，可對該SIRP-α變體實行組胺酸突變，特別是在與CD47交互作用的SIRP-α之區域。可使用SIRP-α與CD47複合體(見例如PDB ID No. 2JJS)之晶體結構及電腦模型使SIRP-α與CD47之三維結合部位可視化(visualize)。對於設計具有pH敏感性結合特性的蛋白質之有用的電腦設計與模型化方法在文獻已為習知，並記載於例如Strauch et al.,Proc Natl Acad Sci 111:675-80,2014，在此將其全文引入作為參考。於一些實施例，可使用電腦模擬來鑑別SIRP-α與CD47之交界的關鍵接觸殘基。可使用能取得之蛋白質設計軟體(例如RosettaDesign)將被鑑別出的關鍵接觸殘基以組胺酸殘基取代，其可產生各種蛋白質設計，且可基於計算出的結合能量及外觀互補性來最佳化、過濾及排序。因此，可使用電腦設計方法來鑑別特定胺基酸位置上其能量上有利之組胺酸取代。也可使用電腦模擬以預測SIRP-α之三維結構的改變。可避免SIRP-α之三維結構中會產生明顯改變的組胺酸取代。
一旦鑑別出能量上及結構上最佳的胺基酸取代，可將此等胺基酸系統性地取代為組胺酸殘基。於一些實施例，可將SIRP-α之一或更多(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等，最大為20)胺基酸取代成組胺酸殘基。具體而言，可以將位在SIRP-α與CD47交界處的胺基酸，較佳為直接涉及於SIRP-α與CD47之結合的胺基酸取代成組胺酸殘基。該SIRP-α變體可包括一或更多(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等，最多為20)組胺酸殘基取代。於其他實施例，可將SIRP-α之自然存在的組胺酸殘基取代成其他的胺基酸殘基。於其他的實施例，可以將SIRP-α之一或更多胺基酸取代成非組胺酸殘基，以影響自然存在或被取代的組胺酸殘基與CD47之結合。例如，將圍繞自然存在之組胺酸殘基的氨基酸取代成其他的胺基酸可能會“掩藏(bury)”此自然存在之組胺酸殘基。於一些實施例，亦可將未直接涉及與CD47結合之胺基酸(即內部胺基酸，例如位在SIRP-α之核心之胺基酸)取代為組胺酸殘基。表4列出可以取代成組胺酸或非組胺酸殘基的特定SIRP-α胺基酸。接觸殘基係位在SIRP-α與CD47之交界的胺基酸。核心殘基為未直接涉及SIRP-α與CD47之結合的內部胺基酸。該SIRP-α變體可包括一或更多(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等或全部)表4列出之取代。
可以於不同的pH條件(例如pH 5、5.5、6、6.5、7、7.4、8)測試包括一或更多(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等，最多數目為20)組胺酸殘基取代之SIRP-α變體其對CD47之結合。於一些實施例，可使用純化的CD47蛋白質來測試結合。可使用本技術領域中具有通常知識者已知的各種技術以在不同的pH條件下(例如pH 5、5.5、6、6.5、7、7.4、8)測量SIRP-α變體/CD47複合體之親和性常數(KA )或解離常數(KD )。於較佳的實施例中，可使用表面電漿共振(surface plasmon resonance)(例如Biacore 3000™ surface plasmon resonance (SPR) system，Biacore，INC，Piscataway N.J.)來決定SIRP-α變體對CD47之結合親和性。於一例示性實施例，在pH 6較在pH 7.4對CD47具有較高專一性親和性之具有pH依存性結合的SIRP-α變體，其在pH 6較在pH 7.4呈現較低的KD 。
IV. 缺氧依存性(Hypoxia-dependent)結合
腫瘤缺氧係指癌細胞的氧氣被剝奪的狀態。隨著腫瘤生長，其血液供給會持續地重新導向腫瘤生長最快的部分，而使腫瘤部分的氧濃度明顯低於健康的組織。
於一些實施例，可以將SIRP-α變體附著於缺氧-活化(hypoxia-activated)的前驅藥，其作用為增加SIRP-alpha變體在特定缺氧條件下對抗相關疾病的細胞之功效。缺氧-活化的前驅物在諸如Kling等人(Nature Biotechnology , 30:381,2012)的文獻中為已知，在此將引入作為參考。
V. 抗體結合 另一種提供選擇性SIRP-α活性於患病的部位而非非患病的部位之策略係將該SIRP-α蛋白質附著於會結合抗體之區域的蛋白質或胜肽。較佳地，該抗體對諸如腫瘤細胞的患病細胞具有專一性。例如，該抗體可專一地結合於諸如腫瘤細胞的患病細胞上之細胞表面蛋白質。該SIRP-α蛋白質可以可逆或不可逆地結合於該抗體。
一般抗體結合 於一些實施例，為了設計能夠結合於不同抗體而不管抗體專一性之SIRP-α蛋白質，可以將該SIRP-α蛋白質融合於會辨識抗體之不變區的蛋白質或胜肽，例如辨識抗體之Fc分域的CH 2或CH 3不變分域。SIRP-α蛋白質能結合於CD47並對野生型SIRP-α的序列(例如變體1(SEQ ID NO: 1，如下所示))或野生型SIRP-α之CD47結合部分的序列(例如表1列出之SEQ ID NO: 3-12之任一序列)具有至少50%的胺基酸序列同一性。 SEQ ID NO: 1 1 mepagpapgr lgpllcllla ascawsgvag eeelqviqpd ksvlvaaget atlrctatsl 61 ipvgpiqwfr gagpgreliy nqkeghfprv ttvsdltkrn nmdfsirign itpadagtyy 121 cvkfrkgspd dvefksgagt elsvrakpsa pvvsgpaara tpqhtvsftc eshgfsprdi 181 tlkwfkngne lsdfqtnvdp vgesvsysih stakvvltre dvhsqvicev ahvtlqgdpl 241 rgtanlseti rvpptlevtq qpvraenqvn vtcqvrkfyp qrlqltwlen gnvsrtetas 301 tvtenkdgty nwmswllvnv sahrddvklt cqvehdgqpa vskshdlkvs ahpkeqgsnt 361 aaentgsner niyivvgvvc tllvallmaa lylvrirqkk aqgstsstrl hepeknarei 421 tqdtnditya dlnlpkgkkp apqaaepnnh teyasiqtsp qpasedtlty adldmvhlnr 481 tpkqpapkpe psfseyasvq vprk
野生型SIRP-α之CD47結合部分包括野生型SIRP-α之D1分域(例如表1列出之SEQ ID NO: 3-12之任一序列)。對抗體不變區呈一般結合的蛋白質與胜肽在該技術領域為已知。例如，諸如蛋白質A、G及L的細菌性抗體結合蛋白質會結合於抗體之不變區。蛋白質A與G結合至該Fc分域，而蛋白質L結合至輕鏈之不變區。於一例示性實施例，蛋白質A、G或L可融合至SIRP-α蛋白質之N-或C端。較佳地，於此實施例，可以將蛋白質A、G或L及SIRP-α蛋白質之融合蛋白質(fusion protein)在投予前經由化學接合使其附著於抗體，以防止該融合蛋白質在血清中結合於其他的各種抗體。也可使用此領域習知的技術(即，導向的發展(evolution)及展示庫)來開發及篩選蛋白質A、G或L，以使其對抗體不變區具有更高之結合親和性。於一些實施例，可使用該技術領域習知的基因或化學接合技術直接將SIRP-α蛋白質附著於抗體。於其他實施例，也可利用分隔子將SIRP-α蛋白質附著於抗體，其容許該蛋白質有額外的結構及空間上的可撓性(flexibility)。在此將進一步詳述各種分隔子。於一些實施例，該SIRP-α蛋白質可以可逆或非可逆地直接或經由抗體-結合蛋白質或胜肽而結合於該抗體。再者，可利用於本發明實施例之經過修飾的抗體之篩選可依如美國專利公開號US 20100189651所記載之方式實施。
能結合於抗體不變區之其他蛋白質或胜肽以及篩選蛋白質或胜肽之方法，記載於美國專利公開號US20120283408，在此將其全文引入作為參考。
專一性抗體結合
於一些實施例，為了提供選擇性靶向SIRP-α變體於患病的部位並設計SIRP-α變體使其能夠結合於諸如腫瘤專一性抗體的特定抗體，該SIRP-α變體構築物可包括SIRP-α變體及抗體專一性蛋白質或胜肽。該SIRP-α變體可融合於抗體專一性蛋白質或胜肽(例如抗體結合胜肽)。較佳地，該蛋白質或胜肽專一性地結合於腫瘤專一性抗體。於一些實施例，該SIRP-α變體與該抗體結合蛋白質或胜肽的融合蛋白質可以於組合療法中與腫瘤專一性抗體共同投予。於其他實施例，該融合蛋白質與該腫瘤專一性抗體可以分開投予(即，彼此間隔數小時內)，較佳為先投予該抗體。於其他的實施例，在投予前先使用該技術領域習知的基因或化學方法將融合蛋白質共價地附著於該腫瘤專一性抗體。
抗體結合胜肽的實例包括患病的局部化胜肽(DLP)(SEQ ID NO: 64或65)，其係能結合於Cetuximab之片段抗原結合(Fab)區之中心的小胜肽(見例如Donaldson et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 110: 17456-17461,2013)。Cetuximab為抗上皮生長因子受體(EGFR)IgG1抗體。可融合於SIRP-α變體之抗體結合胜肽也包括但不限於與DLP(SEQ ID NO: 64或65)或其片段之序列具有至少75%的胺基酸序列同一性之胜肽。於一些實施例，該抗體結合胜肽具有SEQ ID NO: 64之序列。
在最近的研究中，顯示SIRP-α與抗體Cetuximab組合時會增強DLD-1細胞之活體外吞噬作用(Weiskopf et al.,Science 341: 88-91,2013)。於一些實施例，SIRP-α變體可融合於特定的抗體結合胜肽，例如具有SEQ ID NO: 64之序列的DLP。於這些實施例，包括SIRP-α變體及DLP之SIRP-α變體構築物可靶向其活性於已結合Cetuximab並表現EGFR之腫瘤。此現象能進一步促進將包括SIRP-α變體、DLP及Cetuximab之SIRP-α變體構築物運送到抗EGFR反應性的病患。包括SIRP-α變體及DLP之SIRP-α變體構築物的實例顯示於SEQ ID NO: 66，其中畫單底線的部分代表DLP，畫粗線的部分代表該SIRP-α變體。SEQ ID NO: 66中該SIRP-α變體(粗線部分)之序列可以取代成在此記載之SIRP-α變體之任一序列。也可以將其他的抗體結合胜肽融合於SIRP-α變體。此類抗體結合胜肽包括但不限於能專一性地結合於抗體的胜肽，例如cetuximab、pembrolizumab、nivolumab、pidilizumab、MEDI0680、MEDI6469、Ipilimumab、tremelimumab、urelumab、vantictumab、varlilumab、mogamalizumab、抗CD20抗體、抗CD19抗體、抗CS1抗體、herceptin、trastuzumab及/或pertuzumab。 SEQ ID NO: 66CQFDLSTRRLKC GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSCQFDLSTRRLKC
於一些實施例，包括SIRP-α變體與DLP之SIRP-α變體構築物可以進一步與在此記載之CD47系阻斷胜肽組合，以使構築物在到達該患病的部位之前阻斷構築物中該SIRP-α變體之結合，可裂解的連結子可能於該患病的部位裂解。於這些實施例，當包括SIRP-α變體、CD47系阻斷胜肽及DLP之該SIRP-α變體構築物在該患病的部位累積時，治療窗(therapeutic window)可以擴張，且其在只在連結子被蛋白酶(例如腫瘤專一性蛋白酶)誘發後或於該患病部位之其他特徵(例如酸性pH，缺氧)下會具有活性。
於一些實施例，有能力結合於腫瘤專一性抗體之蛋白質或胜肽可使用該技術領域習知的技術來鑑別，例如導向的發展及展示庫(例如噬菌體展示庫)。鑑別有能力結合於腫瘤專一性抗體之方法和技術為該技術領域所習知，例如Donaldson等(Proc Natl Acad Sci 110:17456-61,2013)所記載，在此將引入其全文作為參考。於噬菌體展示庫，有潛力的抗體專一性蛋白質或胜肽通常會共價連結在細菌噬菌體包覆蛋白質。此連結是由於編碼為融合於該包覆蛋白質之蛋白質或胜肽的核酸轉譯。呈現該胜肽之細菌噬菌體可使用標準的噬菌體製備方法來生長及收集，例如從生長培養基進行PEG沉澱。這些呈現的噬菌體可於之後用其他諸如腫瘤專一性抗體的蛋白質來篩選以檢測該呈現的蛋白質與該腫瘤專一性抗體之間的交互作用。一旦鑑別出腫瘤專一性蛋白質或胜肽，可於放大後將該編碼為選出之腫瘤專一性蛋白質或胜肽的核酸從被選出之噬菌體或噬菌體本身所感染的細胞中分離。可挑取個別的菌落或溶菌斑(plaques)且可分離出核酸並定序。當鑑別及分離出該抗體-專一性蛋白質或胜肽後，可將該蛋白質或胜肽融合於SIRP-α變體之N-或C端。於一些實施例，可以使用該技術領域習知的基因或化學接合技術將SIRP-α變體直接附著到腫瘤專一性抗體。於其他實施例，可將SIRP-α變體利用分隔子附著於腫瘤專一性抗體，此分隔子能容許該蛋白質有更多結構及空間上的可撓性。之後將進一步詳述各種分隔子。於一些實施例，該SIRP-α變體可直接或經由抗體結合蛋白質或胜肽以可逆或不可逆地結合於該抗體。
於其他實施例，野生型SIRP-α或野生型SIRP-α之胞外D1分域(例如表1列出之SEQ ID NO: 3-12中之任一序列)可附著於腫瘤專一性抗體。較佳地，SIRP-α之D1分域附著於該腫瘤專一性抗體。該腫瘤專一性抗體作為靶向結構以將野生型SIRP-α或該D1分域帶到諸如癌部位的患病部位(例如固體腫瘤內)，其中該野生型SIRP-α或該D1分域能與患病細胞上的CD47交互作用。於一些實施例，野生型SIRP-α或該野生型SIRP-α之胞外D1分域能使用該技術領域習知的基因或化學接合技術而直接附著於腫瘤專一性抗體。於其他實施例，野生型SIRP-α或該野生型SIRP-α之胞外D1分域可藉由分隔子附著於腫瘤專一性抗體，分隔子能容許該蛋白質有更多的結構及空間可撓性。以下將進一步詳述各種分隔子。於其他實施例，野生型SIRP-α或該野生型SIRP-α之胞外D1分域可融合於能結合於腫瘤專一性抗體之前述蛋白質或胜肽。於其他實施例，諸如國際公開號WO2013109752(在此引入作為參考)所述之其他SIRP-α多肽可附著於腫瘤專一性抗體或能結合於腫瘤專一性抗體之蛋白質或胜肽。於一些實施例，該野生型SIRP-α或該D1分域可直接或經由抗體結合蛋白質或胜肽以可逆或不可逆地結合於該抗體。
VI. 阻斷胜肽 阻斷胜肽可藉由可裂解的連結子附著於SIRP-α變體。於一些實施例，阻斷胜肽也可非共價地附著於SIRP-α變體。該阻斷胜肽之作用為阻斷該SIRP-α變體之CD47結合部位，以使得該SIRP-α變體在生理條件下(例如中性pH及充足氧濃度)無法結合於非患病細胞之細胞表面上的CD47。在諸如癌部位的患病部位(例如腫瘤內)之異常條件下(即，在酸性及/或缺氧環境或蛋白酶表現增加之環境)，該可裂解的連結子可被裂解以將該SIRP-α變體從該阻斷胜肽釋出。該SIRP-α變體便能自由地接合鄰近癌細胞上的CD47。以下將進一步詳述可裂解的連結子之實例。
於一些實施例，該阻斷胜肽對野生型SIRP-α較對設計後的SIRP-α變體具有更高之親和性。一旦連結子被裂解，阻斷胜肽從該SIRP-α變體中解離且可結合於野生型SIRP-α。對野生型SIRP-α及SIRP-α變體具有不同結合親和性的阻斷胜肽可使用該技術領域中一般的方法及技術來鑑別，例如導向的發展及展示庫(例如噬菌體或酵母菌庫)。於一例示性實施例，可將編碼為該SIRP-α之CD47結合區之核苷酸或編碼為抗SIRP-α抗體可變區之核苷酸使用諸如錯誤傾向(error-prone)PCR與DNA曳步(shuffling)的技術加以突變及/或隨機重組以創造基因變體的大型資料庫。一旦製作出基因庫，核苷酸編碼之突變胜肽可使用諸如噬菌體或酵母菌呈現來篩選其結合於野生型SIRP-α及SIRP-α變體的能力。可將被鑑別出能結合至野生型SIRP-α及SIRP-α變體的胜肽進行第二次篩選處理，以分離出對野生型SIRP-α較對SIRP-α變體具有較高親和性的蛋白質。一旦該被鑑別出的胜肽結合於野生型SIRP-α或SIRP-α變體，會防止CD47結合於野生型SIRP-α或SIRP-α變體。可使用各種該技術領域中具有通常知識者已知的各種技術來測量SIRP-α變體/阻斷胜肽複合體或野生型SIRP-α/阻斷胜肽複合體之親和性常數(KA )或解離常數(KD )。阻斷胜肽對野生型SIRP-α較對SIRP-α變體具有高出至少3倍的親和性。
CD47 系阻斷胜肽 阻斷胜肽可為能結合於在此記載之SIRP-α變體的CD47模擬多肽或CD47片段。有些阻斷胜肽可結合至SIRP-α變體其不同於CD47結合部位的位置。有些阻斷胜肽能以不同於CD47結合位置的方式結合至SIRP-α變體。在一些情況下，該阻斷胜肽可包含至少一個安定的雙硫鍵。阻斷胜肽可包含CERVIGTGWVRC (SEQ ID NO: 110)之多肽序列或其片段或變體。變體阻斷胜肽可包括一或更多保守(conservative)或非保守的修飾。在一些情況下，變體阻斷胜肽可包括將半胱胺酸修飾為絲胺酸及/或將一或更多天冬醯胺酸修飾為麩醯胺酸。阻斷胜肽可結合至SIRP-α變體其相同於包含CERVIGTGWVRC (SEQ ID NO: 110)之多肽序列或其變體或片段之胜肽的同一位置。阻斷胜肽可包含GNYTCEVTELTREGETIIELK (SEQ ID NO: 39)之多肽序列或其片段或變體。阻斷胜肽可結合至SIRP-α變體其相同於包含GNYTCEVTELTREGETIIELK (SEQ ID NO: 39)之多肽序列或其變體或片段之多肽的同一位置。在一些情況下，阻斷胜肽可包含EVTELTREGE (SEQ ID NO: 36)之多肽序列或或其片段或變體。阻斷胜肽可結合至SIRP-α變體其相同於包含EVTELTREGE (SEQ ID NO: 36)之多肽序列或其變體或片段之胜肽的同一位置。在一些情況下，阻斷胜肽可包含CEVTELTREGEC (SEQ ID NO: 37)之多肽序列或其片段或變體。阻斷胜肽可結合至SIRP-α變體其相同於包含CEVTELTREGEC (SEQ ID NO: 37)之多肽序列或其變體或片段之胜肽的同一位置。
在此提供一SIRP-α變體構築物，其包含SIRP-α變體及阻斷胜肽，其中該阻斷胜肽可包含SEVTELTREGET (SEQ ID NO: 38)之多肽序列或其片段或變體。阻斷胜肽可結合至SIRP-α變體其相同於包含SEVTELTREGET (SEQ ID NO: 38)之多肽序列或其變體或片段之胜肽的同一位置。在一些情況下，該阻斷胜肽可包含GQYTSEVTELTREGETIIELK (SEQ ID NO: 40)之多肽序列或其片段或變體。阻斷胜肽可結合至SIRP-α變體其相同於包含GQYTSEVTELTREGETIIELK (SEQ ID NO: 40)之多肽序列或其變體或片段之胜肽的同一位置。
在一些情況下，該阻斷胜肽可為CD47變體多肽，其對野生型SIRP-α較對SIRP-α變體顯示較高之親和性。相較於野生型CD47，該阻斷多肽可包含至少一種下列之突變：T102Q、T102H、L101Q、L101H，及L101Y。相較於野生型CD47，該阻斷多肽可包括在N端或接近N端處導入額外的甘胺酸殘基。可導入甘胺酸於CD47的N端或接近N端處之臨近麩醯胺酸及/或白胺酸的位置。在一些情況下，阻斷胜肽可為CD47變體多肽，其相較於野生型CD47對SIRP-α變體具有較低之親和性。此類CD47變體多肽可輕易地使用在此記載的方法來鑑別及測試。
在此提供之SIRP-α變體構築物包括在此記載之SIRP-α變體，其中該SIRP-α變體利用至少一個連結子連接至在此記載之阻斷胜肽。該SIRP-α變體可包括如同於野生型SIRP-α之相同CD47結合部位。該SIRP-α變體相較於野生型SIRP-α可包含一或更多突變或插入。該SIRP-α變體可為野生型SIRP-α之截短形。該阻斷胜肽可為在此記載之CD47模擬物、變體或片段。相較於該SIRP-α變體構築物之SIRP-α變體，該阻斷胜肽對野生型SIRP-α顯示較高之親和性。該阻斷胜肽可為CD47變體多肽，其對SIRP-α變體較對野生型CD47具有較低之親和性。該連結子可為至少一個連結子，其選擇性地被一或更多蛋白酶裂解並選擇性地包含一或更多分隔子。該可裂解的連結子可包含序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 47)。該分隔子可包含一或更多甘胺酸-絲胺酸分隔子單元，其各單元可包含序列GGGGS (SEQ ID NO: 111)。
於一些實施例，藉由可裂解的連結子附著於SIRP-α變體之該阻斷胜肽為衍生自CD47之SIRP-α-結合胜肽(即，CD47系阻斷胜肽)。於一些實施例，該CD47系阻斷胜肽係衍生自CD47之SIRP-α結合部分。CD47的SIRP-α結合部分經常被稱為CD47之免疫球蛋白超家族(IgSF)分域，其序列顯示於下方(SEQ ID NO: 35; Ref. NP_0017681)。 SEQ ID NO: 35: 野生型，人類CD47之IgSF分域 1-50 QLLFNKTKSV EFTFCNDTVV IPCFVTNMEA QNTTEVYVKW KFKGRDIYTF 51-100 DGALNKSTVP TDFSSAKIEV SQLLKGDASL KMDKSDAVSH TGNYTCEVTE 101-123 LTREGETIIE LKYRVVSWFS PNE
於一些實施例，該CD47系阻斷胜肽包括CD47(SEQ ID NO: 35)之全長、IgSF分域或其片段。於一些實施例，該CD47系阻斷胜肽相對於野生型CD47的IgSF分域(SEQ ID NO: 35)或其片段，包括一或更多的胺基酸取代，刪除及/或加成。於一些實施例，CD47系阻斷胜肽和野生型CD47之IgSF分域(SEQ ID NO: 35)或其片段之序列具有至少80%(例如83%、86%、90%、93%、96%等)的胺基酸序列同一性。
於一些實施例，CD47系阻斷胜肽中之胺基酸取代、刪除及/或加成造成CD47系阻斷胜肽對SIRP-α變體具有較低之結合親和性且對野生型SIRP-α具有相對較高之結合親和性。於一些實施例，CD47系阻斷胜肽中之胺基酸取代位在CD47與SIRP-α之交界。例如，CD47的IgSF分域之胺基酸取代T102Q與SIRP-α變體之胺基酸取代A27I在空間上產生衝突，而具有A27之野生型SIRP-α與胺基酸取代T102Q在空間上沒有衝突(見第2圖)。因此，相較於對具有A27I之SIRP-α變體，具有T102Q之CD47系阻斷胜肽對具有A27之野生型SIRP-α具有較高之結合親和性。CD47系阻斷胜肽中可能會和SIRP-α變體之特定胺基酸產生空間上衝突的胺基酸取代之實例列於表5。CD47系阻斷胜肽中的每個此類胺基酸取代可能會減小CD47系阻斷胜肽對SIRP-α變體之結合親和性，取決於該SIRP-α變體在該SIRP-α-CD47交界處的特定胺基酸。
表5：CD47系阻斷胜肽中可能與SIRP-α變體之特定胺基酸產生空間上衝突的胺基酸取代之實例
CD47系阻斷胜肽中之胺基酸取代 (胺基酸號係相對於SEQ ID NO: 35) SIRP-α變體中之胺基酸 (胺基酸號係相對於SEQ ID NO: 13-23中任一者)
T102Q 27I
T102H 27I
L101Q 31F
L101H 31F
L101Y 31F
除了在CD47系阻斷胜肽與SIRP-α變體之間產生空間上衝突之外，也可使用胺基酸取代、加成及/或刪除來破壞CD47系阻斷胜肽與SIRP-α變體間的特定非共價交互作用，以減少CD47系阻斷胜肽對該SIRP-α變體之結合親和性。於一些實施例，藉由一或更多胺基酸(例如一個胺基酸)、或直接增加一或更多胺基酸到N端及/或插入一或更多胺基酸於N端之其他胺基酸之間來延長CD47系阻斷胜肽之N端，會破壞CD47系阻斷胜肽之N端與SIRP-α變體之間的非共價交互作用(例如氫鍵交互作用)。例如，於CD47系阻斷胜肽N端之諸如甘胺酸加成的胺基酸加成，將會阻止麩醯胺酸在N端環化成焦麩胺酸鹽，並且會產生不期望之接觸及交互作用，其可能會破壞CD47系阻斷胜肽之N-端焦麩胺酸鹽與野生型SIRP-α之胺基酸L66或SIRP-α變體之胺基酸取代L66T之間的氫鍵交互作用(亦見實施例5)。於一些實施例，諸如甘胺酸的胺基酸殘基係加成在CD47系阻斷胜肽之N端，以使CD47之N端從QLLFNK (SEQ ID NO: 112)轉變為GQLLFNK (SEQ ID NO: 113)或QGLLFNK (SEQ ID NO: 114)。CD47系阻斷胜肽之胺基酸取代、刪除及/或加成之選擇係取決於SIRP-α變體之特定胺基酸取代。
此外，將CD47系阻斷胜肽之N端經由可裂解的連結子及可選的一或更多分隔子融合於SIRP-α變體之C端亦會影響CD47系阻斷胜肽與該SIRP-α變體間之結合交互作用，並減低CD47系阻斷胜肽對該SIRP-α變體的結合親和性。於一些實施例，SIRP-α變體構築物中，CD47系阻斷胜肽之N端係藉由可裂解的連結子及可選的一或更多分隔子融合於SIRP-α變體之C端。於一些實施例，SIRP-α變體構築物中，CD47系阻斷胜肽之C端藉由可裂解的連結子及可選的一或更多分隔子融合於SIRP-α變體之N端。以下將進一步詳述可裂解的連結子及分隔子。
CD47系阻斷胜肽之顯示於表6。於一些實施例，該CD47系阻斷胜肽具有或包括序列SEVTELTREGET(SEQ ID NO: 38)。於一些實施例，該CD47系阻斷胜肽具有或包括序列GQYTSEVTELTREGETIIELK(SEQ ID NO: 40)。 表6
SEQ ID NO CD47 系阻斷胜肽 CD47 IgSF 分域之部分
36 EVTELTREGE SEQ ID NO: 35之胺基酸97-106
37 CEVTELTREGEC SEQ ID NO: 35之胺基酸96-107，帶有T125C
38 S EVTELTREGET SEQ ID NO: 35之胺基酸96-107，帶有C96S
39 GNYTCEVTELTREGETIIELK SEQ ID NO: 35之胺基酸92-112
40 GQ YTS EVTELTREGETIIELK    SEQ ID NO: 35之胺基酸92-112，帶有N93Q與C96S
41 QLLFNKTKSV EFTFCNDTVV IPCFVTNMEA QNTTEVYVKW KFKGRDIYTF DGALNKSTVP TDFSSAKIEV SQLLKGDASL KMDKSDAVSH TGNYTCEVTEQ TREGETIIE LKYRVVSWFS PNE CD47 IgSF分域，帶有L101Q
42 QLLFNKTKSV EFTFCNDTVV IPCFVTNMEA QNTTEVYVKW KFKGRDIYTF DGALNKSTVP TDFSSAKIEV SQLLKGDASL KMDKSDAVSH TGNYTCEVTEY TREGETIIE LKYRVVSWFS PNE CD47 IgSF分域，帶有L101Y
43 QLLFNKTKSV EFTFCNDTVV IPCFVTNMEA QNTTEVYVKW KFKGRDIYTF DGALNKSTVP TDFSSAKIEV SQLLKGDASL KMDKSDAVSH TGNYTCEVTEH TREGETIIE LKYRVVSWFS PNE CD47 IgSF分域，帶有L101H
44 QLLFNKTKSV EFTFCNDTVV IPCFVTNMEA QNTTEVYVKW KFKGRDIYTF DGALNKSTVP TDFSSAKIEV SQLLKGDASL KMDKSDAVSH TGNYTCEVTE LQ REGETIIE LKYRVVSWFS PNE CD47 IgSF分域，帶有T102Q
45 QLLFNKTKSV EFTFCNDTVV IPCFVTNMEA QNTTEVYVKW KFKGRDIYTF DGALNKSTVP TDFSSAKIEV SQLLKGDASL KMDKSDAVSH TGNYTCEVTE LH REGETIIE LKYRVVSWFS PNE CD47 IgSF分域，帶有T102H
46 G QLLFNKTKSV EFTFCNDTVV IPCFVTNMEA QNTTEVYVKW KFKGRDIYTF DGALNKSTVP TDFSSAKIEV SQLLKGDASL KMDKSDAVSH TGNYTCEVTE LTREGETIIE LKYRVVSWFS PNE CD47 IgSF分域，N端附加甘胺酸
VII. 可裂解的連結子 於一些實施例，SIRP-α變體構築物包括附於阻斷胜肽之SIRP-α變體。於一些實施例，SIRP-α變體構築物包括附於阻斷胜肽之野生型SIRP-α。用於融合SIRP-α變體或野生型SIRP-α與阻斷胜肽之連結子可為可裂解的連結子或非可裂解的連結子。於一些實施例，可藉由使用可裂解的連結子附著該阻斷胜肽到該SIRP-α變體，使得SIRP-α變體構築物中之SIRP-α變體優先結合至患病細胞或患病部位上之CD47，該可裂解的連結子會在該患病的細胞或患病的部位被裂解。
於一些實施例，使用可裂解的連結子於SIRP-α變體與阻斷胜肽之間。於一些實施例，可設置可裂解的連結子於阻斷胜肽之中，其能與SIRP-α變體非共價地連繫以阻斷生理條件下SIRP-α變體對CD47之結合。可裂解的連結子能在特定條件下被裂解。若可裂解的連結子位在阻斷胜肽中，則連結子之裂解會使該阻斷胜肽失活。在諸如癌部位(例如腫瘤內)的患病部位之特性條件下，連結子會被裂解以將該SIRP-α變體從該阻斷胜肽中釋放，使得該SIRP-α變體能結合於鄰近諸如癌細胞的患病細胞其細胞表面上的CD47。在這種方式下，在包括SIRP-α變體與阻斷胜肽之SIRP-α構築物中，SIRP-α變體只能結合於患病細胞(例如癌細胞)或患病部位細胞(例如於腫瘤微環境下支持腫瘤生長之細胞)上之CD47，且無法在生理條件下結合於非患病細胞上之CD47，原因是可裂解的連結子在生理條件會保持安定，且該阻斷胜肽會阻斷SIRP-α變體之CD47-結合部位。可裂解的連結子可包括胺基酸、有機小分子或胺基酸與有機小分子的組合，其能在患病部位諸如酸性pH、缺氧及蛋白酶表現增加之特性條件下，裂解或誘導連結子之裂解。可裂解的連結子在生理條件下(例如中性pH及充足氧濃度)為安定。於一些實施例，可裂解的連結子並不會裂解，且阻斷胜肽在患病的部位可簡單地從該SIRP-α變體中解離，使得SIRP-α變體自由地結合至鄰近諸如癌細胞的患病細胞，上之CD47。於這些實施例，該SIRP-α變體可設計成對CD47有pH依存性結合，其細節已於前方描述。可設計該SIRP-α變體使其在患病部位之酸性pH下較在非患病部位之中性pH(例如約pH 7.4)下對CD47具有較高之親和性。因此，該阻斷胜肽(例如CD-47系阻斷胜肽或CD47 IgSF分域阻斷蛋白質)可在患病部位之酸性pH下從SIRP-α變體中解離出來。於一些實施例，為了設計tSIRP-α變體對CD47其在患病部位之pH依存性結合，可實行組胺酸突變於該SIRP-α，特別是實行於SIRP-α與CD47交互作用的區域。
pH 依存性可裂解的連結子 諸如腫瘤內的癌部位之特性之一為酸性pH。於一些實施例，連結子會於酸性pH(例如低於約pH 7)下裂解。酸敏感性連結子在生理pH(例如約pH 7.4)下係為安定。在酸性pH下之裂解可藉由酸水解或藉由在存在蛋白質且諸如癌部位的患病部位，(例如腫瘤內)之酸性pH的情況下活化。酸敏感性連結子可包括諸如能在酸性pH下水解的化學官能基或化合物之結構。酸敏感性化學官能基及化合物包括但不限於例如：縮醛、縮酮、硫順丁烯二酸醯胺鹽(thiomaleamate)、腙及雙硫鍵。酸敏感性連結子以及可用在構築酸敏感性連結子之酸敏感性化學基及化合物係該技術領域所習知，且記載於美國專利號8,748,399、5,306,809，及5,505,931、Laurent等人(Bioconjugate Chem. 21:5–13,2010)、Castaneda等人(Chem. Commun. 49:8187- 8189,2013)、Ducry等人(Bioconjug. Chem. 21:5-13,2010)，在此分別引入其全文作為參考。於一實施例，可使用胜肽合成器及/或習知的化學合成技術於可裂解的連結子中置入雙硫鍵。於其他實施例，可使用硫順丁烯二酸醯胺酸連結子(Castaneda et al.Chem. Commun. 49:8187-8189,2013)作為可裂解的連結子。於此實施例，為了將硫順丁烯二酸醯胺酸連結子插入SIRP-α變體與胜肽之間，可將硫順丁烯二酸醯胺酸連結子的兩個硫醇基之一(見例如圖示2，Castaneda等人)附著於SIRP-α變體之C端，而將硫順丁烯二酸醯胺酸連結子之酯基附著於該阻斷胜肽之N端。將於此引入參考出版品的完整內容作為參考。
缺氧依存性可裂解的連結子 於一些實施例，連結子可於缺氧條件下裂解，其為諸如腫瘤內的癌部位之另一特性。藉由缺氧敏感性連結子附著於阻斷胜肽之SIRP-α變體會防止其結合於非患病的細胞之CD47，該連結子在生理條件(例如中性pH及充足氧濃度)下為安定。一旦融合蛋白質位在諸如腫瘤內的癌部位，此處的氧濃度明顯低於健康組織，則該連結子會被裂解以將該SIRP-α變體從該阻斷胜肽中釋放，使其能進而結合於癌細胞的細胞表面上之CD47。該缺氧敏感性連結子可包括諸如胺基酸或能在缺氧條件下裂解的化學官能基之結構。可在缺氧條件下被裂解(即可藉由還原而裂解)的化學結構之一些實例包括但不限於：醌、N-氧化物及雜芳香族硝基。可使用傳統的化學及胜肽合成技術以將這些化學結構置於可裂解的連結子中。缺氧敏感性胺基酸之實例為該技術領域所習知，例如Shigenaga等人(European Journal of Chemical Biology 13:968–971,2012)所記載，在此引入其全文作為參考。
於較佳實施例，可將Shigenaga等人(European J. Chem ， Biol. 13:968–971,2012)記載之缺氧敏感性胺基酸插入SIRP-α變體與阻斷胜肽之間。例如，該缺氧敏感性胺基酸之胺基可藉由胜肽鍵附著於該SIRP-α變體之C端，同樣地，該缺氧敏感性胺基酸之羧酸基可藉由胜肽鍵附著於該阻斷胜肽之N端。於缺氧條件下，硝基的還原會誘發該缺氧敏感性胺基酸與該阻斷胜肽N端之間的胜肽鍵之裂解，因此能成功地將該SIRP-α變體從該阻斷胜肽中釋出。該SIRP-α變體可結合於癌細胞上之CD47。
於另一實施例，可將Duan等人(J. Med. Chem. 51:2412–2420,2008)記載之缺氧敏感性2-硝基咪唑基插入到SIRP-α變體與阻斷胜肽之間，或置入已插入到SIRP-α變體與阻斷胜肽間之可裂解的連結子內。於缺氧條件下，硝基之還原會誘發進一步的還原，最終導致2-硝基咪唑基從其諸如SIRP-α變體、阻斷胜肽或可裂解的連結子之附著體中消失。
腫瘤關連酵素依存性可裂解的連結子 於其他實施例，SIRP-α變體構築物可包括SIRP-α變體，其藉由連結子(例如可裂解的連結子)及可選的一或更多分隔子(分隔子之實例將於後進一步詳述)附著於阻斷胜肽。於一些實施例，該連結子(例如可裂解的連結子)可被腫瘤關連酵素裂解。於一些實施例，可被腫瘤關連酵素裂解的連結子可被包括在阻斷胜肽中，該阻斷胜肽可非共價地附於SIRP-α變體。一旦融合蛋白質位在諸如腫瘤內的癌部位，則該連結子會被腫瘤關連酵素裂解，以將該SIRP-α變體從該阻斷胜肽中釋出，接著其可結合於癌細胞之細胞表面上之CD47。對於連結子敏感的腫瘤關連酵素可包括諸如蛋白質受質的結構，其可專一性地被諸如蛋白酶的酵素裂解，其只存在於諸如的癌部位。該結構可依酵素類型選擇，例如存在於諸如腫瘤內的癌部位之蛋白酶。可被腫瘤關連酵素裂解之例示性可裂解的連結子為LSGRSDNH(SEQ ID NO: 47)，其可被多種蛋白酶裂解，例如matriptase(MTSP1)、尿型胞漿素原活化因子(uPA)、legumain、PSA(也稱為KLK3，激肽釋放素相關肽解酶-3)，基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP9、人嗜中性彈性酶(HNE)，及蛋白酶3(Pr3)。亦可獲得其它容易被酵素(例如蛋白酶)裂解的可裂解連結子。除了上提及之蛋白酶，其它可裂解可裂解的連結子之酵素(例如蛋白酶)包括但不限於尿激酶、組織胞漿素原活化因子、胰蛋白酶、胞漿質及其它有蛋白分解活性的酵素。根據本發明之一些實施例，藉由容易被諸如尿激酶、組織胞漿素原活化因子、胞漿質或胰蛋白酶等具有蛋白分解活性之酵素所裂解的連結子(例如可裂解的連結子)，可將SIRP-α變體或野生型SIRP-α附著於阻斷胜肽。
於一些實施例，可藉由將數個序列依不同酵素優先性放在一起，以衍生並選擇可裂解的連結子之序列。數種有潛力的蛋白酶及其對應之蛋白酶部位的非限定實例顯示於表7。其他可裂解的序列包括但不限於來自人肝膠原蛋白(α1(III)鏈之序列(例如GPLGIAGI(SEQ ID NO: 100))、來自人肝膠原蛋白(α1(III)鏈之序列(例如GPLGIAGI))、來自人PZP之序列(例如YGAGLGVV(SEQ ID NO: 101)；AGLGVVER(SEQ ID NO: 102)或AGLGISST(SEQ ID NO: 103))，及其他自溶的序列(例如VAQFVLTE(SEQ ID NO: 104)、AQFVLTEG(SEQ ID NO: 105)或PVQPIGPQ(SEQ ID NO: 106))。
表7
蛋白酶 有潛力的蛋白酶部位
uPA: LSGX1 RX2 X3 SX4 DNH  (SEQ ID NO: 69)其中X1 -X4 各者係任意自然存在的胺基酸; X1 SGSRKX2 RVX3 X4 X5 (SEQ ID NO: 70)其中X1 -X5 各者係任意自然存在的胺基酸; SGRXSA (SEQ ID NO: 71)其中X係任意自然存在的胺基酸
Matriptase: LSGX1 RX2 X3 SX4 DNH (SEQ ID NO: 72)其中X1 -X4 各者係任意自然存在的胺基酸; RX1 X2 X3 RKX4 VX5 X6 GX7 (SEQ ID NO: 73)其中X1 -X7 各者係任意自然存在的胺基酸; RQARXVV (SEQ ID NO: 74)其中X係任意自然存在的胺基酸; RX1 X2 RKVX3 G (SEQ ID NO: 75)其中X1 -X3 各者係任意自然存在的胺基酸; KRRKQGASRKA (SEQ ID NO: 76)
Legumain: LSGX1 RX2 X3 SX4 DNH (SEQ ID NO: 77)其中X1 -X4 各者係任意自然存在的胺基酸; X1 X2 X3 X4 X5 X6 NX7 X8 X9 (SEQ ID NO: 78)其中X1 -X9 各者係任意自然存在的胺基酸; AANXL (SEQ ID NO: 79)其中X係任意自然存在的胺基酸; ATNXL (SEQ ID NO: 80)其中X係任意自然存在的胺基酸
PSA SISQX1 YQRSSX2 X3 (SEQ ID NO: 81)其中X1 -X3 各者係任意自然存在的胺基酸; SSKLQ (SEQ ID NO: 82)
MMP2 X1 PX2 X3 LIX4 X5 X6 (SEQ ID NO: 83)其中X1 -X6 各者係任意自然存在的胺基酸
MMP9 GPAX1 GLX2 GX3 (SEQ ID NO: 84)其中X1 -X3 各者係任意自然存在的胺基酸; GPLGIAGQ (SEQ ID NO: 85); PVGLIG (SEQ ID NO: 86); HPVGLLAR (SEQ ID NO: 87)
HNE X1 X2 X3 VIATX4 X5 X6 X7 (SEQ ID NO: 88)其中X1 -X7 各者係任意自然存在的胺基酸
Pr3 X1 YYVTAX2 X3 X4 X5 (SEQ ID NO: 89)其中X1 -X5 各者係任意自然存在的胺基酸
尿激酶原 PRFKIIGG(SEQ ID NO: 90); PRFRIIGG(SEQ ID NO: 91)
TGFβ SSRHRRALD(SEQ ID NO: 92)
胞漿素原 RKSSIIIRMRDVVL(SEQ ID NO: 93)
葡萄球菌激酶(Staphylokinase) SSSFDKGKYKKGDDA(SEQ ID NO: 94); SSSFDKGKYKRGDDA(SEQ ID NO: 95)
Xa因子 IEGR (SEQ ID NO: 107); IDGR(SEQ ID NO: 96); GGSIDGR(SEQ ID NO: 97)
明膠酶 PLGLWA(SEQ ID NO: 98)
人纖維母細胞膠原蛋白酶 DVAQFVLT(SEQ ID NO: 99)
文獻中有報導指出在諸如固體腫瘤的的各種癌症類型中，中，具有已知受質的酵素水平增加。請參見例如La Rocca et al.,Brit. J. Cancer 90:1414-1421及Ducry et al.,Bioconjug. Chem. 21:5-13,2010，將於此引入其全文作為參考。亦可使用該技術領域習知的傳統技術來鑑別腫瘤關連酵素，例如癌細胞之免疫組織化學技術。於一例示性實施例，連結子中之酵素敏感性結構可為基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)受質，其可被存在於諸如腫瘤內的癌部位之MMP裂解。於另一例示性實施例，連結子中之該酵素敏感性結構可為含馬來醯亞胺基之二胜肽連結子(見例如Ducry et al.之表1)，其可藉由存在於特定腫瘤中水平增加之蛋白酶(例如細胞自溶酵素(cathepsin)或胞漿質)的蛋白分解作用而裂解(Koblinski et al.，Chim. Acta 291:113–135,2000)。於此實施例，該含馬來醯亞胺基之二胜肽連結子(maleimido-containing dipeptide linker)之馬來醯亞胺基可接合於(conjugate to)該SIRP-α變體之半胱胺酸殘基，且該含馬來醯亞胺基之二胜肽連結子C端之羧酸基可接合於該阻斷胜肽N端之胺基。同樣地，該含馬來醯亞胺基之二胜肽連結子的馬來醯亞胺基可接合於該阻斷胜肽的半胱胺酸殘基，且該含馬來醯亞胺基之二胜肽連結子C端之羧基可接合於該SIRP-α變體N端之胺基。可使用質譜及其他在蛋白質體學領域可得之技術以確認該腫瘤關連酵素依存性的可裂解連結子之裂解。其他酵素敏感性結構記載於美國專利號8,399,219，在此引入其全文作為參考。於一些實施例，可藉由該技術領域習知的傳統分子細胞生物學及化學接合技術將諸如蛋白質受質的腫瘤關連酵素敏感之結構插入到SIRP-α變體與阻斷胜肽之間。
VIII. 血清白蛋白 融合於血清白蛋白能改善蛋白質醫藥之藥物動力學，特別是在此記載之SIRP-α變體可與血清白蛋白連接。血清白蛋白為球蛋白，其為哺乳動物最多的血液蛋白質。血清白蛋白係於肝生產且佔約一半的血清蛋白質。其為單元體且可溶於血液。血清白蛋白一些最關鍵的功能包括運送荷爾蒙、脂肪酸及其他體內的蛋白質、緩衝pH，以及維持在血管及體組織間適當分配體液所需之滲透壓。於一些實施例，SIRP-α變體可融合於血清白蛋白。於較佳實施例，血清白蛋白為人類血清白蛋白(HSA)。於本發明之一些實施例，將HSA之N端連接於該SIRP-α變體之C端以增加該SIRP-α變體之血清半衰期。HAS可直接或經由連結子連接到該SIRP-α變體之C端。連接HSA之N端到該SIRP-α變體之C端可維持該SIRP-α變體之N端自由地與CD47交互作用，且HASC端之近端可與FcRn交互作用。可使用在此處記載之方法與組合物之HAS為該技術領域一般所習知。於一些實施例，該HSA包括UniProt ID NO: P02768之序列之胺基酸25-609(SEQ ID NO: 67)。於一些實施例，該HAS相對於SEQ ID NO: 67包括一或更多胺基酸取代(例如C34S及/或K573P)。於一些實施例，該HSA有SEQ ID NO: 68之序列。
IX. 白蛋白結合胜肽 結合於血清蛋白質能改善蛋白質醫藥之藥物動力學，特別是在此記載之該SIRP-α變體可與血清蛋白質結合胜肽或蛋白質融合。於一些實施例，SIRP-α變體可融合至對血清白蛋白呈現結合活性的白蛋白結合胜肽，以增加該SIRP-α變體之半衰期。可用在此處記載之方法及組合物的白蛋白結合胜肽為該技術領域一般所習知。請參見例如Dennis et al.，J. Biol. Chem. 277:35035-35043,2002及Miyakawa et al.，J. Pharm. Sci. 102:3110-3118,2013。於一實施例，白蛋白結合胜肽包括序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO: 2)。白蛋白結合胜肽可基因上地融合於SIRP-α變體或經由諸如化學接合的化學方式附著於SIRP-α變體。若有需要，可將分隔子插入該SIRP-α變體與白蛋白結合胜肽之間以容許融合蛋白質有更多結構及空間上的可撓性。特定的分隔子及其胺基酸序列將於之後進一步詳述。於一些實施例，白蛋白結合胜肽可融合於SIRP-α變體之N-或C端。於一實例，白蛋白結合胜肽之C端可直接或經由胜肽鍵融合於該SIRP-α變體之N端。於另一實例，白蛋白結合胜肽之N端可直接或經由胜肽鍵融合於該SIRP-α變體之C端。於另一實例，白蛋白結合胜肽C端之羧酸可使用習知的化學接合技術以融合於內部胺基酸殘基，即該SIRP-α變體之離胺酸殘基之側鏈殘基。不拘泥於理論，可期待將白蛋白結合胜肽融合於SIRP-α變體能藉由結合於血清白蛋白以導致治療蛋白質之長期保存。
X. Fc分域 於一些實施例，SIRP-α變體構築物可包括SIRP-α變體及Fc分域單元體。於一些實施例，SIRP-α變體可融合於免疫球蛋白之Fc分域單元體或Fc分域單元體之片段。如同該技術領域所習知，Fc分域為在免疫球蛋白之C端發現的蛋白質結構。Fc分域包括2個Fc分域單元體，其藉由CH 3抗體不變分域間的交互作用而二聚化(dimerized)。野生型Fc分域形成最小結構，其結合於諸如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcγRIV之Fc受體。於本發明，融合於SIRP-α變體以增加該SIRP-α變體之血清半衰期的Fc分域單元體或Fc分域之片段可包括2個Fc分域單元體之二聚體或1個Fc分域單元體，使得該Fc分域單元體能結合於該Fc受體(例如FcRn受體)。再者，融合於SIRP-α變體以增加該SIRP-α變體之血清半衰期的Fc分域單元體或Fc分域之片段不會引起任何免疫系統相關的反應。於一些實施例，可將Fc分域突變成缺乏效應子功能，通常為“死”Fc分域。例如，Fc分域可包括已知會使該Fc分域與Fcγ受體間之交互作用最小化的特定胺基酸取代。於一些實施例，可利用習知的基因或諸如化學接合的化學方法以將Fc分域單元體或該Fc分域之片段融合於SIRP-α變體之N-或C端。若有需要，可將連結子(例如分隔子)插入至該SIRP-α變體與該Fc分域單元體之間。
Fc 分域單元體之異二聚化 於一些實施例，Fc分域中之2個Fc分域單元體中各自包括會促進此2個單元體異二聚化的胺基酸取代。可藉由在2個Fc分域單元體中導入不同但可相容的取代(例如“旋鈕-進入-孔洞(knob-into-hole)”殘基對及帶電殘基對)以促進Fc分域單元體之異二聚化。“旋鈕-進入-孔洞”殘基對的使用記載於Carter及共同作者之文獻(Ridgway et al., ProteinEng. 9:617-612, 1996; Atwell et al.,J Mol Biol. 270:26-35,1997; Merchant et al.，Nat Biotechnol. 16:677-681,1998)。該旋鈕與孔洞的交互作用有利於形成異二元體，而旋鈕-旋鈕與孔洞-孔洞交互作用阻礙異二元體的形成，原因是空間上的衝突並消除了有利的交互作用。“旋鈕-進入-孔洞”的技術也記載於美國專利申請案公開號8,216,805, Merchant et al.,Nature Biotechnology 16:677-681,1998及Merchant et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 110:E2987–E2996,2013，在此各自引入其全文作為參考。孔洞為當蛋白質中原始胺基酸被取代成具有較小側鏈體積之不同胺基酸而產生之空隙。旋鈕為當蛋白質中原始胺基酸被取代成具有較大側鏈體積之不同胺基酸而產生之突塊。具體而言，被取代之胺基酸係位在Fc分域單元體之CH 3抗體不變分域，且涉及2個Fc分域單元體之二聚化。於一些實施例，於CH 3抗體不變分域中形成孔洞以容納另一CH 3抗體不變分域中之旋鈕，使得此旋鈕及孔洞胺基酸具有促進或有利於該2個Fc分域單元體之異二聚化的作用。於一些實施例，於CH 3抗體不變分域中形成孔洞使其更能容納另一CH 3抗體不變分域中之原始胺基酸。於一些實施例，在CH 3抗體不變分域中形成旋鈕以與另一CH 3抗體不變分域之原始胺基酸形成額外的交互作用。
可藉由具有較大側鏈之諸如酪胺酸或色胺酸的胺基酸取代成具有較小側鏈之諸如丙胺酸、纈胺酸或蘇胺酸的胺基酸來建構孔洞，例如CH 3抗體不變分域之Y407V突變。同樣地，可藉由將具有較小側鏈之胺基酸取代成具有較大側鏈之胺基酸以建構旋鈕，例如CH 3抗體不變分域之T366W。於較佳實施例，一Fc分域單元體包括旋鈕突變T366W，另一Fc分域單元體包括孔洞突變T366S、L358A及Y407V。本發明之SIRP-α D1變體可融合於包括旋鈕突變T366W的Fc分域單元體以限制不期望的旋鈕-旋鈕同二元體(homodimer)之形成。旋鈕-進入-孔洞胺基酸對之實例包括但不限於表8所示。
表8
Fc分域單元體1 Y407T Y407A F405A T394S T366S L358A Y407V T394W Y407T T394S Y407A T366W T394S
Fc分域單元體2 T366Y T366W T394W F405W T366W T366Y F405A T366W F405W F405W Y407A
除了旋鈕-進入-孔洞策略，也可使用靜電操縱(electrostatic steering)策略以控制Fc分域單元體之二聚化。靜電操縱係利用胜肽、蛋白質分域，及蛋白質帶正電胺基酸間有利之靜電交互作用以控制更高階蛋白質分子的形成。具體而言，為了以靜電操縱控制Fc分域單元體之二聚化，將組成CH 3-CH 3交界的一或更多胺基酸殘基取代成帶正電或帶負電的胺基酸殘基，使得交互作用變為靜電上有利或不利取決於導入的特定電荷之胺基酸。於一些實施例，將交界處之諸如離胺酸、精胺酸或組胺酸的帶正電胺基酸取代成諸如天冬胺酸或麩胺酸的帶負電胺基酸。於一些實施例，將交界的帶負電胺基酸取代成帶正電胺基酸。可將該帶電胺基酸導入相互作用的CH 3抗體不變分域其中之一或兩者。將帶電胺基酸導入2個Fc分域單元體之交互作用的CH 3抗體不變分域可促進選擇性形成Fc分域單元體之異二聚體，如同利用帶電胺基酸間之交互作用所產生之靜電操縱作用所控制。該靜電操縱技術亦揭示於美國專利申請公開號20140024111,Gunasekaran et al.,J Biol Chem. 285:19637-46,2010，及Martens et al.,Clin Cancer Res. 12:6144-52,2006，在此各自引入其全文作為參考。靜電操縱胺基酸對之實例包括但不限於表9所示。
表9
Fc分域單元體1 K409D K409D K409E K409E K392D K392D K392E K392E K409D K392D K370E K409D K439E
Fc分域單元體2 D399K D399R D399K D399R D399K D399R D399K D399R D399K D356K D356K E357K D399K
XI. 聚乙二醇(PEG)聚合物 於一些實施例，SIRP-α變體可融合於諸如聚乙二醇(PEG)的聚合物。將聚合物附著於蛋白質醫藥能“遮蔽(mask)”該蛋白質醫藥使其遠離寄主免疫系統(Milla et al.,Curr Drug Metab. 13:105-119,2012)。此外，特定諸如親水性聚合物的聚合物也可對於疏水性蛋白質及藥物提供水溶性(Gregoriadis et al.,Cell Mol. Life Sci. 57:1964-1969,2000；Constantinou et al.,Bioconjug. Chem. 19:643-650,2008)。各種諸如PEG、聚唾液酸鏈(Constantinou et al.，Bioconjug. Chem. 19:643-650,2008)及PAS鏈(Schlapschy et al., ProteinEng. Des. Sel. 26:489-501,2013)的聚合物為該技術領域所習知且可使用在本發明。於一些實施例，諸如PEG的聚合物可使用諸如化學接合的傳統化學方法，共價地附著於SIRP-α變體之N-或C端或內部位置。於一些實施例，諸如PEG的聚合物可共價地附著於該SIRP-α變體之半胱胺酸取代或加成物。該SIRP-α變體之半胱胺酸取代可為相對於SEQ ID NO: 13-23中任一序列之I7C、A16C、S20C、T20C、A45C、G45C、G79C、S79C或A84C。可使用該技術領域習知的技術(例如胜肽合成、基因修飾及/或分子選殖)來導入SIRP-α變體中半胱胺酸殘基之加成。可使用該技術領域中具有通常知識者所習知的半胱胺酸-馬來醯亞胺接合以將諸如PEG的聚合物附著於半胱胺酸殘基。在此將引入參考出版物的內容之全文作為參考。
除了上述實施例，也可在本發明中使用其他半衰期延長技術以增加SIRP-α變體之血清半衰期。半衰期延長技術包括但不限於EXTEN(Schellenberger et al.,Nat. Biotechnol. 27:1186-1192,2009)及Albu tag(Trussel et al.,Bioconjug Chem. 20:2286-2292,2009)。在此將引入參考出版物的內容之全文作為參考。
XII. 分隔子 於一些實施例，分隔子可用於該SIRP-α變體構築物。例如，SIRP-α變體構築物可包括藉由連結子(例如可裂解的連結子)附著於阻斷胜肽之SIRP-α變體。於此類SIRP-α構築物，分隔子可插入該SIRP-α變體與連結子(例如可裂解的連結子)之間及/或連結子(例如可裂解的連結子)與該阻斷胜肽之間。為了最佳化該SIRP-α變體與連結子之間的空間及/或連結子與該阻斷胜肽之間的空間，可使用下述任意之一或更多分隔子。
於包括藉由連結子(例如可裂解的連結子)附著於阻斷胜肽之SIRP-α變體之SIRP-α變體構築物的實施例，該分隔子作用為使可裂解的連結子遠離該SIRP-α變體及該阻斷胜肽之核心，使得可裂解的連結子更容易被負責裂解的酵素接近。應當瞭解的是，SIRP-α變體構築物中2個元件的附著，例如SIRP-α變體構築物中SIRP-α變體與連結子(例如可裂解的連結子)包括SIRP-α變體、連結子及阻斷胜肽(例如依此順序)，其不須為附著之特定模式或經由特定之反應。能提供SIRP-α變體構築物有適當安定性及生物可相容性的任意反應均可接受。
分隔子係指SIRP-α變體構築物之2個元件間之連結，例如含有SIRP-α變體、連結子及阻斷胜肽(例如以此順序)之SIRP-α變體構築物中之SIRP-α變體及連結子(例如可裂解的連結子)，含有SIRP-α變體、連結子及阻斷胜肽(例如以此順序)之SIRP-α變體構築物中之阻斷胜肽，以及諸如白蛋白結合胜肽的血清蛋白質結合胜肽或蛋白質。。分隔子也可指能夠插入於SIRP-α變體或野生型SIRP-α與諸如腫瘤專一性抗體或抗體結合胜肽的抗體之間的連結。分隔子可對該SIRP-α變體構築物提供額外結構上及/或空間上的可撓性。分隔子可為簡單的化學鍵，例如醯胺鍵、小的有機分子(例如碳氫鏈)、胺基酸序列(例如3-200個胺基酸的序列)或小的有機分子(例如碳氫鏈)與胺基酸序列(例如3-200個胺基酸之序列)之組合。分隔子在生理條件(例如中性pH及充足氧濃度)下及在患病部位之特性條件(例如酸性pH與缺氧)下為安定。分隔子在諸如癌部位的患病部位(例如腫瘤內)中為安定。
分隔子可包括3-200個胺基酸。適合的胜肽分隔子為該技術領域所習知，包括例如含有諸如甘胺酸及絲胺酸的可撓性胺基酸殘基之之胜肽連結子。於特定實施例，分隔子可包括模體(motifs)，例如GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO: 111)、GGSG (SEQ ID NO: 115)或SGGG (SEQ ID NO: 116)之多個或重複的模體。於某些實施例，分隔子可包括含有GS的模體(例如GS、GSGS (SEQ ID NO: 117)、GSGSGS (SEQ ID NO: 118)、GSGSGSGS (SEQ ID NO: 119)、GSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 120)或GSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 121))之2至12個胺基酸，於其他特定實施例，分隔子可包括含有GGS的模體(例如GGS、GGSGGS (SEQ ID NO: 122)、GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 123)及GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 124))之3至12個胺基酸。於其他實施例，分隔子可包括含有GGSG (SEQ ID NO: 115)之模體(例如GGSG (SEQ ID NO: 115)、GGSGGGSG (SEQ ID NO: 125)或GGSGGGSGGGSG (SEQ ID NO: 126))之4至12個胺基酸。於其他實施例，分隔子可包括(GGGGS)n (SEQ ID NO: 127)之模體，其中n為1至10之整數。於其他實施例，分隔子可包括甘胺酸及絲胺酸以外的胺基酸，例如GENLYFQSGG (SEQ ID NO: 128)、SACYCELS (SEQ ID NO: 129)、RSIAT (SEQ ID NO: 130)、RPACKIPNDLKQKVMNH (SEQ ID NO: 131)、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (SEQ ID NO: 132)、AAANSSIDLISVPVDSR (SEQ ID NO: 133)或GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (SEQ ID NO: 134)。於本發明之一些實施例，可使用一或更多之12-或20-胺基酸胜肽分隔子於SIRP-α變體構築物中。該12-與20-胺基酸胜肽分隔子可分別包括序列GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 135)與SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 136)。於一些實施例，可使用含有序列GGSGGGSGGGSGGGSGGS (SEQ ID NO: 137)之一或更多18-胺基酸胜肽分隔子於SIRP-α變體構築物中。
於一些實施例，分隔子亦可具有一般結構
Figure 02_image001
，其中W為NH或CH2 ，Q為胺基酸或胜肽，n為0至20之整數。
XIII. 將阻斷胜肽融合於SIRP-α變體 可利用諸如可裂解的連結子(例如LSGRSDNH(SEQ ID NO: 47))之連結子，及可選的一或更多分隔子(例如(GGGGS)n (SEQ ID NO 127)，基因上地融合於連結子之N-或C端，其中n為1至10之整數)將阻斷胜肽(例如表6中SEQ ID NO: 36-46任一序列之CD47系阻斷胜肽)融合於SIRP-α變體之N-或C端。包括藉由可裂解的連結子與一或更多分隔子以將CD47系阻斷胜肽融合於SIRP-α變體的SIRP-α變體構築物之序列如SEQ ID NO: 48-63所示。可改變分隔子的長度以達成CD47系阻斷胜肽與該SIRP-α變體之間的最佳結合。
XIV.生產SIRP-α變體構築物之方法 本發明之SIRP-α變體構築物可由寄主細胞產生。寄主細胞係指一載運體，其包括從對應的核酸中表現在此記載之多肽與構築物所需的必要細胞元件(例如胞器)。核酸可包括在核酸載體中，該載體可利用該技術領域習知的技術(例如轉形、轉染、電穿孔、磷酸鈣沉澱、直接微注射、感染等)導入到寄主細胞內。核酸載體的選擇有一部分取決於所使用的寄主細胞。一般而言，較好的寄主細胞為原核(例如細菌性)或真核(例如哺乳動物)起源。
核酸載體構築及寄主細胞 可利用該技術領域已知的各種方法製備編碼為SIRP-α變體構築物之胺基酸序列的多核苷酸序列。此等方法包括但不限於寡核苷酸媒介(或部位導向)突變及PCR突變。編碼為本發明之SIRP-α變體構築物的多核苷酸分子可使用諸如基因合成的標準技術以獲得。另外，可將編碼為野生型SIRP-α之多核苷酸分子使用該技術領域諸如QuikChangeTM 突變法的標準技術突變成含有特定的組胺酸取代。多核苷酸可使用核苷酸合成器或PCR技術合成。
可以將編碼為SIRP-α變體構築物之多核苷酸序列插入到能在原核或真核寄主細胞內複製及表現此多核苷酸之載體。該技術領域有許多可得的載體可用於本發明之用途。各載體可含有各種元件，其可調整並最佳化以與特定的寄主細胞相容。例如，載體元件包括但不限於複製起點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合部位、信號序列、編碼為本發明SIRP-α變體構築物之多核苷酸序列，及轉錄中止序列。於一些實施例，載體可包括內部核糖體進入部位(IRES)，此部位能容許多種SIRP-α變體構築物的表現。一些細菌表現載體例如包括但不限於pGEX系列載體(例如pGEX-2T、pGEX-3X、pGEX-4T、pGEX-5X，pGEX-6P)、pET系列載體(例如pET-21、pET-21a、pET-21b、pET-23、pET-24)、pACYC系列載體(例如pACYDuet-1)、pDEST系列載體(例如pDEST14、pDEST15、pDEST24、pDEST42)，及pBR322及其衍生物(見例如美國專利號5,648,237)。哺乳動物表現載體之例包括但不限於pCDNA3、pCDNA4、pNICE、pSELECT及pFLAG-CMV。其他類型的核酸載體包括用於在細胞(例如受試者之細胞)內表現蛋白質病毒載體。此類病毒載體包括但不限於反轉錄病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體(例如牛痘病毒載體，例如經修飾的安卡拉牛痘病毒(Modified Vaccinia Ankara(MVA))、腺關連病毒載體及alpha病毒載體。
於一些實施例，使用E. coli 細胞作為本發明之寄主細胞。E. coli 菌株包括但不限於E. coli 294(ATCC® 31,446)、E. coli λ 1776(ATCC® 31,537、E. coli BL21(DE3)(ATCC® BAA-1025)及E. coli RV308(ATCC® 31,608)。於其他實施例，使用哺乳細胞作為本發明之寄主細胞。哺乳動物細胞的類型之實例包括但不限於人類胚胎腎(HEK)細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、PC3細胞、綠猴腎(Vero)細胞及MC3T3細胞。不同的寄主細胞對蛋白質產物之轉譯後處理及修飾具有特有且特定的機制。可選擇適當的細胞株或寄主系統以確保表現的蛋白質有正確的修飾及處理。上述表現載體可使用該技術領域習知的技術(例如轉形、轉染、電穿孔、磷酸鈣沉澱及直接微注射)以導入適當的寄主細胞。一旦將載體導入寄主細胞以供蛋白質生產，將寄主細胞培養於傳統的營養培養基，其被修飾以使其適於誘導啟動子、選擇性轉形體或放大編碼為期望之序列。
蛋白質生產、回收及純化 用於生產本發明之SIRP-α變體構築物之寄主細胞可生長於該技術領域已知並適於培養選定寄主細胞的培養基。適合細菌寄主細胞之培養基的實例包括諸如選擇劑(例如安比西林(ampicilin))之Luria broth(LB)附加必要補充物。適於哺乳動物寄主細胞之培養基之實例包括：Minimal Essential Medium MEM)、Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium (DMEM)、具有補充胎牛血清(FBS)的DMEM及RPMI-1640。
培養寄主細胞於適當的溫度，例如約20℃至約39℃(例如25℃至約37℃)。培養基之pH主要取決於寄主有機體，一般約6.8至7.4，例如7.0。若表現載體係使用本發明之可誘導的啟動子，則蛋白質表現會被誘導於適合活化此啟動子之環境。
蛋白質回復一般涉及寄主細胞的破壞，通常藉由滲透壓衝擊、音振作用(sonication)或溶解作用(lysis)。一旦細胞被破壞，可利用離心或過濾以去除細胞碎片。可將該蛋白質藉由諸如親和性樹脂層析的方法以進一步純化。可採用此技術領域已知的標準蛋白質純化方法。以下程序為適當純化程序之示範例：在免疫親和性或離子交換管柱上分餾(fractionation)、乙醇沉澱、反相HPLC、在矽膠或陽離子交換樹脂上層析、SDS-PAGE及凝膠過濾。
另外，SIRP-α變體構築物可利用受試者(例如人)之細胞生產，例如上下文之治療，藉由投予含有編碼為該SIRP-α變體構築物之核酸分子的載體(例如反轉錄病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體(例如諸如Modified Vaccinia Ankara (MVA)的牛痘病毒載體)、腺關連病毒載體，及alpha病毒載體)。一旦載體在受試者之細胞內時(例如藉由轉形、轉染、電穿孔、磷酸鈣沉澱、直接微注射、感染等)，將會促進表現該SIRP-α變體構築物，然後從細胞分泌出來。
XV. 醫藥組合物及製備 於一些實施例，本發明之醫藥組合物可包括一或更多本發明之SIRP-α變體構築物作為治療蛋白質。除了治療量之該蛋白質，該醫藥組合物尚可包括醫藥上可接受的載具(carrier)或賦形劑，其可藉由該技術領域習知的方法來配製。於其他實施例，本發明之醫藥組合物可包括編碼為一或更多本發明之SIRP-α變體構築物之核酸分子(例如於諸如病毒載體的載體中)。可將編碼為SIRP-α變體構築物之核酸分子選殖(clone)到適當的表現載體，其可藉由基因療法中所習知的方法被遞送。
該醫藥組合物中可接受之載具及賦形劑於所採用的劑量及濃度中對受試者為無毒性。可接受之載具與賦形劑可包括諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、HEPES及TAE的緩衝液，諸如抗壞血酸及甲硫胺酸的抗氧化劑，諸如氯化六羥季銨(hexamethonium chloride)、十八基二甲基苄基氯化銨、間苯二酚，羥基氯苯銨(benzalkonium chloride)的保存劑，諸如人血清白蛋白、明膠、葡聚糖及免疫球蛋白的蛋白質，諸如聚乙烯基吡咯酮(polyvinylpyrrolidone)的親水性聚合物，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、組胺酸及離胺酸的胺基酸，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖及山梨醇的碳水化合物。本發明之醫藥組合物可用可注射劑型的形式以非口服地投予。供注射之醫藥組合物可使用無菌溶液或任意醫藥上可接受之液體作為載運體來配製。醫藥上可接受之載運體包括但不限於無菌水、生理鹽液及細胞培養基(例如Dulbecco’ Modified Eagle Medium(DMEM)、α-Modified EaglesMedium(α-MEM)、F-12 medium)。
該本發明之醫藥組合物可製備成諸如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊的微膠囊。該本發明之醫藥組合物也可於其他藥物遞送系統製備，例如微脂體、白蛋白微球、微乳劑、奈米顆粒及奈米膠囊。此類技術記載於Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th edition(2000)。用於活體內投予之該醫藥組合物必須為無菌。此條件可藉由無菌濾膜過濾而輕易達成。
該本發明之醫藥組合物也可製備成持續釋放的劑型。持續釋放的配方之適當實例包括：含有本發明之SIRP-α變體構築物的固體疏水聚合物之半通透性基質。持續釋放基質的實例包括：聚酯、水凝膠、聚乳酸(polyactides)(美國專利號3,773,919)、L-麩胺酸與γL-麩胺酸乙酯的共聚物、非降解性乙烯-乙酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOTTM 的降解性乳酸-甘醇酸共聚物及聚D-(-)-3-羥基丁酸。有些持續釋放劑型能夠在數個月期間，例如1~6個月的期間釋放分子，其他配方則在較短期間，例如數天至數週釋放本發明之醫藥組合物。
該醫藥組合物若有必要可形成單劑的劑型。包括在醫藥製備物的活性成分(例如本發明之SIRP-α變體構築物)之量係使其能提供設計範圍內的適當劑量(例如在0.01-100 mg/kg體重的範圍之劑量)。
用於基因治療的醫藥組合物可在能接受的稀釋劑內或可包含緩慢釋放的基質，於其中包覆有基因遞送載運體。可用於活體內之基因遞送載運體的載體包括但不限於反轉錄病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體(例如例如Modified Vaccinia Ankara(MVA)的牛痘病毒載體)、腺關連病毒載體及alpha病毒載體。於一些實施例，載體可包括內部核糖體進入部位(IRES)，此部位能容許表現多種SIRP-α變體構築物。其他用於基因遞送的載運體及方法記載於美國專利號5,972,707、5,697,901，及6,261,554，在此各自引入其全文作為參考。
生產醫藥組合物的其他方法記載於例如美國專利號5,478,925、8,603,778、7,662,367，及7,892,558，均在此引入其全文作為參考。
XVI. 投予的途徑、劑量及時機
本發明之醫藥組合物包括一或更多SIRP-α變體構築物以作為治療蛋白質，可配製成非口服投予、皮下投予、靜脈內投予、肌肉內投予、動脈內投予、脊髓腔投予或腹膜內投予。該醫藥組合物也可配製或經由鼻、噴灑、口服、氣溶膠、直腸或陰道來投予。投予治療蛋白質之方法係該技術領域所習知。請參見例如美國專利號6,174,529、6,613,332、8,518,869、7,402,155及6,591,129，及美國專利申請公開號US20140051634、WO1993000077及US20110184145，且將於此引入其全文作為參考。這些方法之一或更多可用於投予本發明之醫藥組合物，其包含本發明之一或更多SIRP-α變體構築物。針對可注射劑型，各種有效的醫藥載具為該技術領域所習知。請參見例如Pharmaceutics and Pharmacy Practice,J. B. Lippincott Company,Philadelphia,Pa.,Banker and Chalmers,eds., pages 238-250 (1982)及ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel,4th ed.,pages 622-630 (1986)。
本發明之醫藥組合物之劑量取決於一些因子，包括投予途徑、欲治療之疾病及生理特性，例如受試者之年紀、體重、總體健康。典型地，包含在單劑劑量內之本發明之SIRP-α變體構築物的含量可為有效治療疾病而不會誘導顯著毒性之含量。本發明之醫藥組合物可包括之SIRP-α變體構築物劑量為以下範圍：0.001至500 mg(例如0.05、0.01、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.8、1 mg、2 mg、3 mg、4 mg、5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、30 mg、50 mg、100 mg、250 mg或500 mg)，於一更特定實施例，為約0.1至約100 mg，於一更特定實施例，約0.2至約20 mg。劑量可由臨床醫師依照諸如疾病的程度及受試者的不同參數之習知因子加以調整。
本發明之醫藥組合物之投予量可為約0.001 mg至約500 mg/kg/day(例如0.05、0.01、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.8、1 mg、2 mg、3 mg、4 mg、5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、30 mg、50 mg、100 mg、250 mg或500 mg/kg/day)。含有SIRP-α變體構築物的本發明之醫藥組合物可對須投予之受試者以每日、每周、每半年、每年或醫療上所需時投予一或更多次(例如1-10次或更多次)。可以單次或多劑量投予方案提供劑量。例如，於一些實施例，有效量的劑量為每日約0.1至約100 mg/kg/day之範圍，約0.2 mg至約20 mg之SIRP-α變體構築物，每日約1 mg至約10 mg之SIRP-α變體構築物，每周約0.7 mg至約210 mg之SIRP-α變體構築物，每周約1.4 mg至約140 mg之SIRP-α變體構築物，每3天約0.3 mg至約300 mg之SIRP-α變體構築物，每隔一天約0.4 mg至約40 mg之SIRP-α變體構築物，每隔一天約2 mg至約20 mg之SIRP-α變體構築物。投予的間隔時間可隨醫療條件改善而減少或隨病患健康惡化而增加。
XVII. 治療方法 本發明提供醫藥組合物及治療方法，其可用於治療罹患與SIRP-α及/或CD47活性關連之疾病及失調症的病患，例如癌症及免疫疾病。於一些實施例，可將該在此記載的SIRP-α變體構築物投予至受試者以增加該對象之靶向細胞(例如癌細胞)之吞噬作用。於一些實施例，可將該SIRP-α變體構築物投予至受試者以消除該受試者的調節性T細胞。於一些實施例，可將該SIRP-α變體構築物投予至受試者以殺死該對象之癌細胞。於一些實施例，可將該SIRP-α變體構築物投予至受試者以治療該對象之SIRP-α及/或CD47活性關連之疾病，其中該SIRP-α變體構築物會優先結合於患病的細胞或患病的部位上之CD47而不是非患病的細胞上之CD47。於一些實施例，可將該SIRP-α變體投予至受試者以增加該受試者之造血幹細胞植入(hematopoietic stem cell engraftment)，其中該方法包括調節該受試者之SIRP-α與CD47間之交互作用。於一些實施例，可將該SIRP-α變體構築物投予至受試者以改變該對象之免疫反應(即，抑制免疫反應)。
於一些實施例，在治療受試者之疾病(例如癌)之前，會先決定該受試者之SIRP-α的胺基酸序列，例如，從編碼為該SIRP-α基因的2個對偶基因。於本發明之方法，該方法決定來自該受試者之生物樣本中SIRP-α多肽之胺基酸序列，接著對受試者投予治療有效量的SIRP-α變體構築物。於此方法中，除了被導入以增加該SIRP-α變體之親和性的胺基酸改變之外，SIRP-α變體構築物之該SIRP-α變體與該受試者之生物樣本的SIRP-α多肽具有相同的胺基酸序列。該SIRP-α變體構築物在投予後，該受試者具有最小免疫原性。
該SIRP-α變體構築物與本發明之醫藥組合物可使用於各種癌治療。適合依本發明治療之癌包括但不限於：固體腫瘤癌、血液性癌、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴細胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、膀胱癌、胰臟癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、肺癌、支氣管癌、肝癌、卵巢癌、大腸和直腸癌、胃癌、胃癌、膽囊癌、胃腸道間質腫瘤癌、甲狀腺癌、頭頸癌、口咽癌、食道癌、黑色素瘤、非黑色素皮膚癌、Merkel細胞瘤、病毒引起之癌、神經胚細胞瘤、乳癌、前列腺癌、腎癌、腎細胞癌、腎盂癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、神經膠質瘤、腦瘤，瘤(carcinoma)。於一些實施例，適合依本發明治療之癌病症包括轉移性癌。於一些實施例，適合依本發明治療之癌為固體腫瘤或血液性癌。
本發明之SIRP-α變體構築物與醫藥組合物可用於治療免疫疾病的各種療法。於一些實施例，該免疫疾病為自體免疫疾病或發炎性疾病，例如多發性硬化症、類風濕性關節炎、脊椎關節患病的、全身性紅斑狼瘡、抗體媒介之免疫或自體免疫疾病、移植物抗寄主疾病、敗血症、糖尿病、牛皮癬、動脈粥樣硬化、Sjogren氏症候群、進行性系統性硬化症、硬皮病、急性冠狀動脈症候群、缺血再灌注、Crohn氏病、子宮內膜異位症、腎小球腎炎、重症肌無力、特發性肺纖維化、哮喘、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、血管炎或發炎性自體免疫肌炎。
實施例 實施例1–方法SIRP-α 變體構築物之生產 使用最適合在哺乳動物細胞表現之基因合成及密碼子(DNA2.0)來產生所有的基因構築物。將此等基因選殖到哺乳動物表現載體，並使用CMVa-內子(intron)啟動子表現。於構築物之N端設計一引導(leader)序列以確保有適當用於分泌的信號及處理。SIRP-α融合蛋白質之表現係使用Expi293FTM 細胞(Life Technologies)來實行。細胞株適應於高密度、無血清的懸浮培養液於Expi293FTM Expression Medium，且能生產高產量的重組蛋白質。轉染程序依製造手冊實行。通常在轉染後5~7天收集上清液。該蛋白質構築物設計成帶有6個組胺酸(6xhistidine (SEQ ID NO: 138))親和性標籤(tag)，且此可容許其藉由親和性層析純化。先將管柱以5 mM咪唑、100 mM TrisHCl(pH 8)、500 mM NaCl平衡。將表現各種SIRP-α變體構築物之澄清培養基載入Avant 25(GE Healthcare)之Hi-Trap Ni Sepharose excel親和性樹脂。亦實行另一平衡步驟。之後，將管柱以40 mM咪唑、100 mM Tris、500mM NaCl洗滌，接著以250 mM咪唑、100 mM Tris、500 mM NaCl洗提(elute)。匯集(pool)含有該SIRP-α變體構築物之洗提組分(fraciton)，然後將緩衝液交換成1X PBS。
活體外裂解SIRP-α 蛋白質 重組人類uPA及matriptase購買自R&D systems公司。如上所述，將3 µM之SIRP-α蛋白質加入各別量之uPA與matriptase(0.1 to 44 ng)於50 mM TrisHCl(pH 8.5)，0.01% Tween。一般會將分解(digestion)反應物在37℃溫育(incubate)18-24小時。將SDS-PAGE載入染料(loding dye)添加到反應物並於95℃加熱3分鐘以停止反應。將已分解的樣本在4-20% Tris-Glycine SDS-PAGE分離以鑑定其裂解。
實施例2–設計會專一性在腫瘤組織活化的SIRP-α變體構築物 目標為設計SIRP-α變體構築物，其將保持惰性直到局部活化以結合腫瘤組織中之CD47。此將限制SIRP-α結合於非患病細胞之細胞表面上之CD47，並防止不期望之“標靶上(on-target)”“組織外(off tissue)”的毒性。為了產生此類SIRP-α變體構築物，將該阻斷胜肽(例如CD47系阻斷胜肽)藉由可裂解的連結子基因地融合於該SIRP-α變體。該阻斷胜肽之探究係基於CD47對SIRP-α之交互作用部位，且此序列將記載於下方((a)-(c)段)。設計含有重複單元GGGGS (SEQ ID NO: 111)之分隔子於可裂解的連結子之兩側，該可裂解的連結子之編碼通常為蛋白酶辨識部位。於一些實施例，選定的該蛋白酶裂解部位為LSGRSDNH (SEQ ID NO: 47)，但有許多其他可能性。選擇蛋白酶裂解部位LSGRSDNH (SEQ ID NO: 47)係由於其對許多蛋白酶之敏感性，其對許多人類癌具有正調節之功用，例如matriptase(MTSP1)、尿型胞漿素元活化劑(plasminogen activator(uPA))、legumain、PSA(也稱為KLK3，激肽釋放酶關連肽酶-3(kallikrein-related peptidase-3))、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP9、人類嗜中性彈性蛋白酶(neutrophil elastase(HNE)及蛋白酶3(Pr3)(Ulisse et al.,Curr. Cancer Drug Targets 9:32-71,2009; Uhland et al.，Cell. Mol. Life Sci. 63:2968-2978,2006; LeBeau et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:93-98,2013; Liu et al.,Cancer Res . 63:2957-2964,2003)。
(a) 利用 CD47 系阻斷胜肽阻斷 SIRP-α CD47系阻斷胜肽已於前述。這些胜肽以不同的親和性與SIRP-α結合並阻斷其功能。CD47之N端與SIRP-α之交互作用為重要，故使用結構分析預測SIRP-α對CD47C端之融合。為了更瞭解結果，以不同長度的分隔子探究N端與C端之融合。將不同的CD-47系阻斷胜肽(例如表6列出之胜肽)以可裂解的連結子及一或更多分隔子融合於SIRP-α變體之N-或C端。藉由可裂解的連結子及一或更多分隔子將含有融合至SIRP-α變體之CD47系阻斷胜肽的融合蛋白質之序列顯示於SEQ ID NO: 48-56，其中，單底線部分代表CD47系阻斷胜肽，雙底線部分代表可裂解的連結子，粗線部分代表該SIRP-α變體。SEQ ID NO: 48-51之序列包括CD47系阻斷胜肽，其包括12或21個胺基酸及2-3次GGGGS重複(SEQ ID NO: 140)的分隔子。SEQ ID NO: 52-56之序列包括CD47系阻斷胜肽，其包括具有C15S取代之CD47 IgSF分域(於VVS處截短)及2-5次GGGGS重複(SEQ ID NO: 141)或3-6次GGS重複(SEQ ID NO: 142)的分隔子。此外，於一些實施例，可以將HAS融合於SEQ ID NO: 48-56中任一序列之C端。再者，於一些實施例，可將Fc分域單元體或HSA(SEQ ID NO: 68)融合於表10列出之任一融合蛋白質之N-或C端。
表10
SEQ ID NO CD47 系阻斷胜肽與 SIRP-α 變體之融合蛋白質
48 SEVTELTREGET GGGGSGGGGSLSGRSDNH GGGGSGGGGSEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
49 SEVTELTREGET GGGGSGGGGSGGGGSLSGRSDNH GGGGSGGGGSEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
50 GQYTSEVTELTREGETIIELK GGGGSGGGGSLSGRSDNH GGGGSGGGGSEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
51 GQYTSEVTELTREGETIIELK GGGGSGGGGSGGGGSLSGRSDNH GGGGSGGGGSEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
52 QLLFNKTKSVEFTFS NDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVS GGGGSGGGGSGGGGSLSGRSDNH GGGGSGGGGSEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
53 QLLFNKTKSVEFTFS NDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLSGRSDNH GGGGSGGGGSEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
54 QLLFNKTKSVEFTFS NDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLSGRSDNH GGGGSGGGGSEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
55 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS GGSGGSGGSLSGRSDNH GGSGGSGGSGGSQLLFNKTKSVEFTFS NDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVS
56 EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS GGSGGSGGSGGSLSGRSDNH GGSGGSGGSGGSGGSGGSQLLFNKTKSVEFTFS NDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVS
(b) 利用具有延長 N 端的低親和性 CD47 突變體來阻斷 SIRP-α 變體 由於該SIRP-α變體對CD47之高親和性，有可能在裂解連結子之後，該融合蛋白質未解離而該SIRP-α變體仍然被阻斷。為解決此問題，研究該SIRP-α-CD47複合體之結構，並設計出相較於對野生型SIRP-α，對SIRP-α變體具有降低的結合親合性之CD47突變體。因此，在連結子被蛋白酶裂解之後，CD47突變體將從該SIRP-α變體中解離。以下記載設計的CD47突變體。起初的實驗係將該SIRP-α變體融合於野生型CD47。這些包括SIRP-α變體及野生型CD47或CD47突變體的SIRP-α變體構築物將於活體外裂解，以SDS-page分析以確保其裂解，並由biacore測量以測定其對CD47的結合能力(即，在CD47突變體從該SIRP-α變體中解離之後，該SIRP-α變體結合至野生型CD47)。若表現出含有融合於野生型CD47之SIRP-α變體的起始SIRP-α變體構築物，其能夠在蛋白酶裂解前阻斷CD47結合並且能夠在蛋白酶裂解後結合CD47，則可不須使用CD47突變體。若這些起始SIRP-α變體構築物失活(即，可被裂解但由於在蛋白酶裂解後不解離而不結合CD47)，則測定其他含有融合於低親和性CD47突變體之SIRP-α變體的融合蛋白質。
於CD47:SIRP-α(PDB: 4KJY，4CMM)之共結晶結構中，CD47之N端以焦麩胺酸鹽之形式存在且使SIRP-α變體之Thr66與野生型SIRP-α之Leu66產生氫鍵交互作用(第1圖)。假設藉由加成諸如甘胺酸的胺基酸來延長CD47之N端，將可防止麩醯胺酸環化成焦麩胺酸鹽，並防止產生其他不期望的接觸及交互作用其可能破壞其與Thr66或Leu66的氫鍵交互作用，因而擾亂CD47對SIPR-α之結合。含有低親和性CD47 IgSF分域突變體及SIRP-α變體序列之融合蛋白質之序列顯示於表11之SEQ ID NO: 57-59，其中，單底線部分指相對於表6之SEQ ID NO: 46，含有胺基酸1-118及C15S之低親和性CD47 IgSF分域突變體，雙底線部分代表可裂解的連結子，粗線部分代表該SIRP-α變體。SEQ ID NO: 57-59也包括3-5次GGGGS重複(SEQ ID NO: 139)之分隔子。也可設計及表現類似SEQ ID NO: 57-59之序列，其中，低親和性CD47 IgSF分域突變體係經由可裂解的連結子及一或更多分隔子以融合於SIRP-α變體之C端。
表11
SEQ ID NO 有延長之 N 端甘胺酸之低親和性 CD47 IgSF 分域突變體與 SIRP-α 變體之融合蛋白質
57 G QLLFNKTKSVEFTFS NDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVS GGGGSGGGGSGGGGSLSGRSDNH GGGGSGGGGSEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
58 G QLLFNKTKSVEFTFS NDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLSGRSDNH GGGGSGGGGSEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
59 G QLLFNKTKSVEFTFS NDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLSGRSDNH GGGGSGGGGSEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
(c) 利用具有胺基酸取代之低親和性 CD47 IgSF 分域突變體來阻斷 SIRP-α CD47結合於一深袋(deep pocket)至SIRP-α(PDB碼：4KJY及4CMM)。已實行電腦模擬以鑑別CD47袋區之胺基酸殘基，其中，其被突變成可能減小CD47對SIRP-α變體之結合親和性，但仍維持CD47對野生型SIPR-α之結合親和性。鑑別出的CD47殘基為L101Q、101H、101Y、102Q及T102H。假設含有這些取代之一的低親和性CD47 IgSF分域突變體能夠有效率地以栓繩模式(tethered mode)阻斷該SIRP-α變體。然而，一旦到達該腫瘤部位且於該連結子處被蛋白酶裂解，該低親和性CD47 IgSF分域突變體將從該SIRP-α變體中解離並結合至野生型SIRP-α，使得該SIRP-α變體可自由地結合於癌細胞之細胞表面上之CD47。該解離的低親和性CD47 IgSF分域突變體此時可阻斷野生型SIRP-α之活化。此將有可能造成來自釋放的低親和性CD47 IgSF分域突變體與該SIRP-α變體加強其雙重阻斷活性。為了說明如何選擇胺基酸殘基及其如何造成野生型SIRP-α與SIRP-α變體的區別阻斷之原理，使用野生型SIRP-α之Ala27的實例顯示於下方(第2圖)。舉例來說，野生型SIRP-α之Ala27比起SIRP-α變體之Ile27為較小之殘基。因此，藉由將野生型CD47之Thr102突變成較大諸如Gln102的胺基酸，低親和性CD47 IgSF分域突變體中的Gln102可能造成其與Ile27在相應的交互作用位置處之SIRP-α變體有空間上的衝突。然而，仍會保留具有Thr102Gln取代的CD47突變體與具有Ala27的野生型SIRP-α之間的交互作用。因此，CD47突變體對該SIRP-α變體會有低的結合親和性且對野生型SIRP-α有相對較高的結合親和性。一些例示性低親和性的CD47 IgSF分域突變體之序列顯示於表6之SEQ ID NO: 41-45。含有胺基酸取代之低親和性CD47 IgSF分域突變體與SIRP-α變體之該SIRP-α變體構築物之序列顯示於表12之SEQ ID NO: 60-63，其中，單底線部分代表分別含有胺基酸取代L101Q、101Y、T102Q及T102H之低親和性CD47 IgSF分域突變體，雙底線部分代表可裂解的連結子，粗線部分代表該SIRP-α變體。SEQ ID NO: 60-63也包括3-5次GGGGS重複的分隔子。可設計並表現類似SEQ ID NO: 60-63之序列，其中，低親和性CD47 IgSF分域突變體藉由可裂解的連結子及一或更多分隔子而融合於SIRP-α變體之C端。
表12
SEQ ID NO 具有胺基酸取代之低親和性 CD47 IgSF 分域突變體與 SIRP-α 變體之融合蛋白質
60 QLLFNKTKSVEFTFSNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTEQTREGETIIELKYRVVS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLSGRSDNH GGGGSGGGGSEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
61 QLLFNKTKSVEFTFSNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTEYTREGETIIELKYRVVS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLSGRSDNH GGGGSGGGGSEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
62 QLLFNKTKSVEFTFSNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELQREGETIIELKYRVVS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLSGRSDNH GGGGSGGGGSEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
63 QLLFNKTKSVEFTFSNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELHREGETIIELKYRVVS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLSGRSDNH GGGGSGGGGSEEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPS
實施例3–表現及生產供活體外研究的SIRP-α變體構築物 將包括SIRP-α變體與CD47系阻斷胜肽之各種SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 48-56)於Expi293-F哺乳動物細胞中表現。所有的構築物均設計成帶有引導序列，此序列能使其表現成會分泌到培養基之蛋白質。所有的構築物均以可溶解的形式表現，並使用單步驟IMAC分離來純化以得高純度(第3A及3B圖)。第3A圖顯示SEQ ID NO: 48-56之SIRP-α變體構築物之還原的SDS-PAGE凝膠，第3B圖顯示該SIRP-α變體構築物之非還原的SDS-PAGE凝膠。尺寸排除數據指出該SIRP-α變體構築物未聚集(數據未顯示)。
實施例4–SIRP-α與CD47融合蛋白質之活體外裂解 為了決定該SIRP-α變體構築物(例如SEQ ID NO: 48-63)是否會專一地於腫瘤組織活體內裂解，使用蛋白酶uPA與matriptase實行活體外實驗以裂解該SIRP-α變體構築物，其中此類蛋白酶在癌中為正調節已為習知。起始實驗使用SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 54)以決定蛋白酶之裂解能力並最佳化裂解條件。第4圖顯示uPA與matriptase之裂解能力的測試結果。使用過量的uPA或matriptase在37℃將3 µM SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 54)溫育18小時。第4圖第1行顯示未添加蛋白酶的對照實驗，第2行與第3行分別顯示該SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 54)分別以uPA及matriptase溫育。第4圖獲得之數據明確證明藉由在37℃下以過量uPA及matriptase分解SIRP-α變體構築物18小時以裂解該SIRP-α變體構築物(SEQ ID No: 54)並於活體外釋放。該裂解的SIRP-α變體遷移(migrate)成~17 KDa之分子量帶。裂解的CD47以油污(smeary)帶狀遷移，可能是由於約36-40 kDat處之糖化作用。藉由比對第4圖之第2及3行之未裂解的SIRP-α變體構築物的量，顯示使用matriptase較使用Upa會獲得更完整的裂解。
因此只使用matriptase實行裂解條件之進一步的最佳化，其結果顯示於第4B圖。測試不同量的matriptase，且於37℃實行裂解18小時。第4B圖之第1行顯示無添加matriptase的對照實驗，第2-4行分別顯示以44 ng、0.44 ng及0.167 ng的matriptase來實行裂解。獲得之數據顯示0.44 ng酵素足以在目前條件下完整裂解。接著，使用最佳的裂解條件來裂解其餘的SIRP-α變體構築物。實例顯示於第4C圖，使用最佳的裂解條件以將各個SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 57-63)利用matriptase於活體外成功地裂解。第4C圖之第1-7行分別相應於SEQ ID NO: 57-63之未裂解的融合蛋白質。第4C圖之第8-14行分別對應於以matriptase裂解之SEQ ID NO: 57-63之融合蛋白質。
實施例5–SIRP-α變體構築物之結合親和性 人類CD47-hFc(R & D Systems，型錄號4670-CD)對SIRP-α變體構築物之結合係使用補充0.01% Tween-20之磷酸緩衝鹽液(pH 7.4)作為運行緩衝液以在Biacore T100儀器(GE Healthcare)上進行分析。
藉由標準胺偶合將CD47-hFc之370諧振單元(Resonance Unit,RU)固定於CM4感應晶片(GE Healthcare)的流動槽(flow cell)2。將流動槽1以EDC/NHS活化並阻斷(以乙醇胺)以供作參考。將所有的SIRP-α變體構築物以50 nM或100 nM並以流速30 µL/min注射2分鐘，接著為10分鐘解離時間。在每次注射之後，使用Pierce IgG提取緩衝液(Life Technologies，型錄號21004)與4 M NaCl之2:1混合物以再生(regenerate)該表面。藉由在開始及結束實驗時注射該SIRP-α變體以確認已完全地再生該表面。所有的感應圖係利用流動槽1及緩衝液注射以雙重參照。
針對所有的樣本，藉由SIRP-α變體構築物之分子量來決定並標準化結合50秒後於100 nM之結合信號，並以最大結合反應之百分比來表現。使用藉由分子量(MW)標準化之於100 nM的該SIRP-α變體(SEQ ID NO: 31)之結合作為最大結合反應。第5A圖之結果顯示SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 48-51)不會阻斷SIRP-α變體在晶片上結合於CD47。將連結子裂解後，結合活性適度地增加。SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 52-54)有效地阻斷該SIRP-α變體在晶片上結合於CD47。然而連結子裂解後，該SIRP-α變體在晶片上對CD47之結合只有適度地增加，指出該SIRP-α變體與CD47之IgSF分域間的交互作用之高親和性維持該複合體在一起，因此CD47之IgSF分域即使在連結子裂解後仍持續阻斷該SIRP-α變體。令人意外地，當CD47之IgSF分域融合於SIRP-α之C端(SEQ ID NO: 55)，會有效地阻斷完整的SIRP-α變體構築物結合於晶片上之CD47(SEQ ID NO: 52-54之融合蛋白質亦同)，但連結子之裂解回復了100%之該SIRP-α變體在晶片上對CD47之結合，指出CD47之IgSF分域在連結子裂解後從該SIRP-α變體中解離，因此該SIRP-α變體自由地結合於晶片上之CD47。之後測試另一構築物，其具有融合於SIRP-α變體C端之CD47(見第5B圖)。含有較長分隔子之此構築物(SEQ ID NO: 56)也於裂解後回復活性，確認了連結CD47系阻斷胜肽N端到SIRP-α變體C端的一般方法獲得SIRP-α構築物，其中CD47系阻斷胜肽有效地阻斷該SIRP-α變體，且於可裂解的連結子裂解後解離。
為了進一步檢查SIRP-α變體構築物之結合親和性，依照前述同樣程序在Biacore儀器上分析SEQ ID NO: 52-63之SIRP-α變體構築物。SEQ ID NO: 52-54之SIRP-α變體構築物包括具有胺基酸1-117及C15S的CD47 IgSF分域，其相對於經由可裂解的連結子LSGRSDNH (SEQ ID NO: 47)及不同長度的多個分隔子融合於該SIRP-α變體(SEQ ID NO: 31)之N端的野生型CD47(SEQ ID NO: 35)。SEQ ID NO: 55及56之SIRP-α變體構築物包括具有胺基酸1-117及C15S的CD47 IgSF分域，其相對於經由可裂解的連結子LSGRSDNH (SEQ ID NO: 47)及不同長度的多個分隔子融合於該SIRP-α變體(SEQ ID NO: 31)之C端的野生型CD47(SEQ ID NO: 35)。SEQ ID NO: 57-59之SIRP-α變體構築物包括具有胺基酸1-118及C15S的CD47 IgSF分域，其相對於經由可裂解的連結子LSGRSDNH (SEQ ID NO: 47)及不同長度的多個分隔子融合於該SIRP-α變體(SEQ ID NO: 31)之N端的表6之SEQ ID NO: 46。SEQ ID NO: 60-63之SIRP-α變體構築物包括具有表6之SEQ ID NO: 41、42、44及45之胺基酸1-117的CD47 IgSF分域，其分別經由可裂解的連結子LSGRSDNH (SEQ ID NO: 47)及不同長度的多個分隔子融合於該SIRP-α變體(SEQ ID NO: 31)之N端。
第5B圖顯示有效地阻斷SEQ ID NO: 55及56之SIRP-α變體構築物在連結子裂解前結合於晶片上之CD47，但連結子裂解後則回復100%的結合活性。類似的結果可於SEQ ID NO: 57-63之SIRP-α變體構築物中觀察到。可觀察到藉由1個甘胺酸殘基使CD47系阻斷胜肽之N端延長，所產生的SIRP-α變體構築物會在連結子裂解前有效率地被阻斷，且於蛋白酶處理後回復接近100%的CD47結合活性(SEQ ID NO: 57-59)，證明連結子裂解後，CD47系阻斷胜肽會從該SIRP-α變體中解離。
此結果指出經由可裂解的連結子與分隔子融合於CD47系阻斷胜肽之N端的SIRP-α變體可良好地運作。此可裂解的連結子使融合複合體安定，且一旦被裂解，包括附著於CD47系阻斷胜肽N端的可裂解的連結子片段之CD47系阻斷胜肽的延長N端會阻止CD47系阻斷胜肽結合於該SIRP-α變體。同樣效果也可藉由由可裂解的連結子及一或更多分隔子以將具有一或更多諸如甘胺酸附加的胺基酸附加(例如表6中SEQ ID NO: 46之序列)於其N端之CD47系阻斷胜肽融合到SIRP-α變體之C端而獲得。同樣效果也可藉由可裂解的連結子及一或更多分隔子以融合CD47系阻斷胜肽至SIRP-α變體之C端而獲得，該CD47系阻斷胜肽包括一或更多胺基酸取代，例如L101Q、L101Y、L101H、T102Q或T102H(例如表6之SEQ ID NO: 41-45)。證明了CD47系阻斷胜肽能融合於SIRP-α變體之C端，並在結合子裂解前阻斷SIRP-α變體結合於CD47，且於連結子裂解後釋放SIRP-α變體(見例如第5A圖之SEQ ID NO: 55及第5B圖之SEQ ID NO: 55及56)。
基於上述資訊，可以製作CD47阻斷之SIRP-α變體融合蛋白質，即藉由選擇提供較佳藥物動力學、效力、安全性、產量及產物安定性之結果的取向(例如N-或C端融合)來融合Fc分域單元體或HAS於SIRP-α變體。
實施例6–經由抗體結合胜肽之SIRP-α變體之特定靶向 首先，使用已知其包括對具有SEQ ID NO: 64序列之DLP的結合部位之Cetuximab來檢驗包括SIRP-α變體及DLP之該SIRP-α變體構築物是否能集中於結合抗體。使用EDC/NHS化學藥品於CM4 biacore晶片(2000RU)上以固定Cetuximab，並使用PBS 0.01% P20作為運行及樣本緩衝液以將100 nM及50 nM的該SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 66)以30 µL/min流動到晶片(biacore T100)上。第6圖顯示該SIRP-α變體構築物而非僅有SIRP-α變體結合至晶片上。接著，注射CD47-ECD並觀察到當使用該SIRP-α變體構築物時會有CD47結合，證明該SIRP-α變體構築物能同時結合EGFR與CD47(第6圖)。因此，包括SIRP-α變體與及注射至癌病患的DLP之SIRP-α變體構築物可集中在治療抗體(例如Cetuximab)的部位，以增加療效並減少毒性。
接著，證明了包括SIRP-α變體及DLP之該SIRP-α變體構築物能可先結合於已結合到EGFR之Cetuximab，然後再結合CD47。結合複合體之圖顯示於第7圖。使用EDC/NHS化學藥品將3000 RU之hrEGFR-Fc(R&D Systems)固定於CM4晶片。使用PBS 0.01% P20作為樣本及運行緩衝液，以30 µL/min(Biacore T100)注射不同濃度(4、20及100 nM)之Cetuximab。可觀察到Cetuximab結合於固定化的hrEGFR-Fc。然後注射100 nM之該SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 66)並觀察其結合。當只單獨注射該SIRP-α變體時，並未觀察到其結合。接著注射100 nM之CD47-ECD並觀察到其結合。數據顯示於第7B圖及第7C圖。因此，證明了形成SEQ ID NO: 66-CD47之四級複合體EGFR-Cetuximab-SIRP-α變體構築物之為可能的。當構築物藉由專一性結合於腫瘤專一性抗體(例如Cetuximab)以預先集中於該患病部位時，包括SIRP-α變體與DLP之SIRP-α變體構築物能結合並抑制CD47。此外，依照同樣的概念，當構築物藉由專一性結合於腫瘤專一性抗體(例如Cetuximab)以預先集中於該患病的部位時，包括SIRP-α變體、DLP及CD47系阻斷胜肽之SIRP-α變體構築物能夠結合並抑制CD47。
實施例7–吞噬作用分析 測試包括經由分隔子附著於DLP之SIRP-α變體的SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 66)及SIRP-α變體(SEQ ID NO: 31)其在DLD1細胞之吞噬作用(第8圖)。吞噬作用分析依照例如Weiskofp et al,Science 341:88-91,2013之記載來實行。實驗流程記載如下。推測由於在疾病細胞中之堆積較多，故該SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 66)較單一SIRP-α變體(SEQ ID NO: 31)顯示較高之效力。
棕黃層(Buffy coat)係從史丹福血液中心之匿名捐贈者獲得，利用Ficoll-Paque Premium(GE Healthcare)以密度梯度離心大量收集(enrich)周邊血液單核細胞。單核球使用Macs Miltenyi Biotec Monocyte Isolation Kit II依製造指示純化。此為間接的磁性標記系統以將單核球從人類PBMC中分離。將分離的單核球利用培養於補充10%熱失活人類AB血清及1% GlutaMax及1%盤尼西林及鏈黴素(GIBCO Life Technologies)的RPMI 1640培養基中6-10天以分化成巨噬體(macrophage)。為了吞噬作用分析，將100,000 GFP+ DLD-1細胞接種(plate)在超低附著U底96井盤(Corning 7007)之井中。將50 µL/well之4 µg/ml IgG1k同型對照或4 µg/ml之Cetuximab(Absolute Antibody，Ab00279-10.0)添加到DLD-1癌細胞，並在室溫預先溫育30分鐘。接著，添加50 µL/well SIRP-a變體，亦添加50 µL/well巨噬體(1 x 106 /ml)(50,000巨噬體)到各個井中。抗體與SIRP-α構築物樣本之最終稀釋比為1:4。Cetuximab最終濃度為1µg/ml。巨噬體、癌細胞、抗體及SIRP-a變體構築物在37℃共同溫育2小時。為了分析，將細胞樣本固定、染色並以BD FACS Canto分析。使用抗CD14，抗CD45或抗CD206抗體(BioLegend)以流式細胞儀鑑別一級人類巨噬體。利用DAPI(Sigma)染色以排除死細胞於分析之外。吞噬作用係以GFP+ 巨噬體之百分比來評估，並藉由各個獨立捐贈者對各個細胞株來標準化至最大反應。
實施例8–模擬SIRP-α變體對CD47之pH依存性結合 為了設計本發明之SIRP-α變體之pH依存性結合，可對該SIRP-α，特別對SIRP-α中與CD47交互作用之部分進行組胺酸突變。可使用SIRP-α與CD47複合體之晶體結構(見例如PDB ID No. 2JJS)及電腦模擬以將SIRP-α與CD47之三維結合部位可見化。有用於設計蛋白質使其具有pH敏感結合性質之計算設計及模擬方法的文獻已為該技術領域所習知，並記載於例如Strauch et al.,Proc Natl Acad Sci 111:675-80,2014，在此引入其全文作為參考。於一些實施例，可使用電腦模擬以鑑別SIRP-α與CD47之交界的關鍵接觸殘基。鑑別出的關鍵接觸殘基可使用蛋白質設計軟體(例如RosettaDesign)以將其取代成組胺酸殘基，此軟體能產生各種蛋白質設計，其可被最佳化、過濾並以計算的結合能量及形狀互補性加以排序。因此，可使用計算設計法來鑑別出在特定胺基酸部位之能量上有利的組胺酸取代。也可使用電腦模擬以預測SIRP-α之三維結構的改變。可避免會使SIRP-α之三維結構產生顯著改變的組胺酸取代。
一旦鑑別出能量上及結構上最佳的胺基酸取代，可將胺基酸系統性地取代為組胺酸殘基。於一些實施例，可將SIRP-α之一或更多(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等，最多20個)胺基酸取代成組胺酸殘基。具體而言，可將位在SIRP-α與CD47之交界的胺基酸，較佳為直接涉及SIRP-α結合於CD47之胺基酸，可被取代為組胺酸殘基。本發明之該SIRP-α變體可包括一或更多(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等，最多20個)組胺酸殘基取代。於其他實施例，可將SIRP-α之自然存在的組胺酸殘基取代成其他胺基酸殘基。於其他實施例，為了影響自然存在或取代的組胺酸殘基與CD47結合，可以將SIRP-α之一或更多胺基酸取代成非組胺酸殘基。例如，將圍繞自然存在之組胺酸殘基的胺基酸取代成其他的胺基酸可能會“掩藏(bury)”此自然存在之組胺酸殘基。於一些實施例，亦可將未直接涉及與CD47之結合之胺基酸，即內部胺基酸(例如位在SIRP-α之核心之胺基酸)取代為組胺酸殘基。表4列出可以取代成組胺酸的特定SIRP-α胺基酸。接觸殘基係位在SIRP-α與CD47之交界的胺基酸。核心殘基為未直接涉及SIRP-α與CD47間之結合的內部胺基酸。該SIRP-α變體可包括一或更多(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等或全部)表4列出之取代。 實施例9–產生及篩選對CD47具有pH依存性結合之SIRP-α變體
包括一或更多(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等，最多20個)以組胺酸殘基取代之胺基酸取代之SIRP-α變體可使用傳統的分子選殖及蛋白質表現技術來產生。可將編碼為本發明之SIRP-α變體的核酸分子使用習知的分子生物技術選殖到最適合在細菌表現的載體。接著可將該載體轉形到細菌細胞(例如E. coli 細胞)，其可於蛋白質表現誘導前生長成最佳的密度。蛋白質表現誘導後(即，使用IPTG)，可以使細菌細胞再生長額外的24小時。可收集細胞並將表現的SIRP-α變體蛋白質使用例如親和性管柱層析使其從細胞培養基之上清液純化。已純化的SIRP-α變體可利用SDS-PAGE分析，再利用Coomassie Blue染色以確認存在有期望的大小之蛋白質染色帶(band)。
已純化的SIRP-α變體可使用該技術領域可得的技術篩選其對CD47之pH依存性結合，例如噬菌體呈現、酵母菌呈現、表面電漿共振、鄰近閃爍分析(scintillation proximity assays)、ELISA，ORIGEN免疫分析(IGEN)、螢光淬滅(fluorescence quenching)及/或螢光轉移。也可使用適當的生物分析來篩選其結合。期望的SIRP-α變體在酸性pH(例如低於pH 7(例如pH 6))下比起在中性pH(例如pH 7.4)對CD47具有較高之結合親和性。SIRP-α/CD47複合體在pH 6之KD低於SIRP-α/CD47複合體在pH 7.4之KD。
實施例10–在大鼠中測試對於CD47有pH依存性結合之SIRP-α變體 可使用諸如固體腫瘤與血液性癌之各種癌之基因改造小鼠模型以測定本發明之SIRP-α變體對CD47在小鼠模型之患病的部位之pH依存性結合。可將SIRP-α變體直接或間接注射到小鼠的患病部位，其可被解剖以檢測是否於該患病的部位存在SIRP-α變體與CD47之複合體。可使用專一於SIRP-α變體或CD47之抗體於檢測中。
其他實施例 所有以上提及的出版物、專利及專利申請案皆在此引入作為參考。對該技術領域中有通常知識者而言，不偏離本發明範疇及精神之本發明所記載之組合物及方法的各種修飾及變形係為顯而易見。雖然本發明已與特定實施例連結以描述，但應了解本發明並非意在限制此類特定實施例。事實上，用於實行本發明之對該技術領域中有通常知識者為顯而易見的發明上述方法之各種修飾意在本發明之範疇內。其他實施例包括在以下的申請專利範圍內。
第1圖顯示CD47:SIRP-α(PDB: 4KJY，4CMM)之部分共結晶結構，CD47的N端以焦麩胺酸根(pyro-glutamate)的形式存在且使氫鍵與SIRP-α變體的Thr66或與野生型SIRP-α的Leu66之間交互作用。 第2圖顯示具T102Q的CD47與具A27(左)的野生型SIRP-α間之交互作用部位的電腦模型，以及具T102Q的CD47與具I27的SIRP-α變體間之交互作用部位的電腦模型。 第3圖顯示SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 48-56)之SDS-PAGE。 第4A圖顯示於活體外以uPA及matriptase裂解後之SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 54)的SDS-PAGE。 第4B圖顯示於活體外以不同量的matriptase裂解後之SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 54)的SDS-PAGE。 第4C圖顯示於活體外以matriptase裂解後之各種SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 57-63)的SDS-PAGE。 第5A圖顯示在活體外以matriptase裂解前和後，各種SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 48-55)對CD47之不同結合親和性的棒狀圖。 第5B圖顯示在活體外以matriptase裂解前和後，各種SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 52-63)及SIRP-α變體(SEQ ID NO: 31)對CD47之不同結合親和性的棒狀圖。 第6圖顯示證明SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 66)能同時結合於Cetuximab及CD47之感應圖。 第7A圖顯示包括EGFR、Cetuximab、SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 66)及CD47的四級複合物之圖示。 第7B圖顯示證明形成第7圖所示之四級複合物之感應圖。 第7C圖係第7B圖所示感應圖之圖像。 第8圖是顯示由SIRP-α變體構築物(SEQ ID NO: 66)及SIRP-α變體(SEQ ID NO: 31)誘發之吞噬作用的散佈圖。
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Claims (12)

  1. 一種包含信號調節蛋白α(SIRP-α)變體之構築物，其中該SIRP-α變體附著於抗體結合胜肽，且其中該SIRP-α變體包含下列胺基酸序列：EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS(SEQ ID NO：13)，其中X1為L、I或V；X2為V、L或I；X3為A或V；X4為A、I或L；X5為I、T、S或F；X6為E、V或L；X7為K或R；X8為E或Q；X9為H、P或R；X10為L、T或G；X11為K或R；X12為N、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X13為P、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；X14為V或I；X15為F、L或V；以及X16為F或V；或其中該SIRP-α變體與SEQ ID NO：3-12及24-34之任一者之序列具有至少80%序列同一性。
  2. 如請求項1之構築物，其中該抗體結合胜肽(a)可逆或不可逆地結合於抗體之不變區；(b)可逆或不可逆地結合於抗體之片段抗原結合(Fab)區；或(c)可逆或不可逆地結合於抗體之可變區。
  3. 如請求項1之構築物，其中該抗體結合胜肽結合於腫瘤專一性抗體。
  4. 如請求項1至3中任一項之構築物，其中該抗體結合胜肽結合於 Cetuximab。
  5. 如請求項1至3中任一項之構築物，其中該抗體結合胜肽與SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65具有至少75%之胺基酸序列同一性，視情況其中該抗體結合胜肽包含SEQ ID NO：64。
  6. 一種核酸，其編碼如請求項1至5中任一項之構築物。
  7. 一種載體，其包含如請求項6之核酸。
  8. 一種宿主細胞，其包含如請求項6之核酸或如請求項7之載體。
  9. 一種製備如請求項1至5中任一項之構築體之方法，其包含：(a)在生產該構築體之條件下培養如請求項9之宿主細胞，以及(b)回收該宿主細胞所生產之該構築體。
  10. 一種醫藥組合物，其包含(a)治療有效量之如請求項1至5中任一項之SIRP-α變體構築物，以及(b)醫藥上可接受之賦形劑。
  11. 一種如請求項1至5中任一項之構築物或如請求項10之醫藥組合物用於製備藥劑之用途，其中該藥劑係用於治療在受試者中與SIRP-α及/或CD47活性關連之疾病。
  12. 一種如請求項1至5中任一項之構築物或如請求項10之醫藥組合物用於製備藥劑之用途，其中該藥劑係用於治療癌症，視情況其中該癌症係選自由以下構成的群組：固體腫瘤癌、血液性癌、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴細胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、膀胱癌、胰腺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、肺癌、支氣管癌、肝癌、卵巢癌、結腸和直腸癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、膽囊癌、胃腸道間質腫瘤癌、甲狀腺癌、頭和頸癌、口咽癌、食道癌、黑色素瘤、非黑色素瘤皮膚癌、默克爾細胞癌、病毒誘導的癌症、神經母細胞瘤、乳癌、前列腺癌、腎癌、腎細胞癌、腎盂癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、神經膠質瘤、腦腫瘤及上皮癌(carcinoma)。
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Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3575326T (pt) 2012-12-17 2022-05-30 Pf Argentum Ip Holdings Llc Tratamento de células de doença cd47+ com fusões sirp alfa-fc
BR102016018074A2 (pt) * 2015-08-07 2021-11-16 ALX Oncology Inc. Construção variante de sirp-alfa, seu método de preparação e seus usos, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, e composição farmacêutica
GEP20217326B (en) 2015-08-07 2021-11-25 Alx Oncology Inc Constructs having a sirp-alpha domain or variant thereof
US10894831B2 (en) 2015-08-26 2021-01-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhanced depletion of targeted cells with CD47 blockade and an immune costimulatory agonist
AU2016331076B2 (en) 2015-10-01 2020-12-03 Kopfkino Ip, Llc Compositions and methods for adjoining type i and type ii extracellular domains as heterologous chimeric proteins
IL290425B2 (en) 2016-01-11 2024-02-01 Forty Seven Inc Humanized, murine or chimeric anti-CD47 monoclonal antibodies
WO2017184553A1 (en) * 2016-04-18 2017-10-26 Baylor College Of Medicine Cancer gene therapy targeting cd47
US11560433B2 (en) 2016-05-27 2023-01-24 Albert Einstein College Of Medicine Methods of treatment by targeting VCAM1 and MAEA
JOP20190009A1 (ar) 2016-09-21 2019-01-27 Alx Oncology Inc أجسام مضادة ضد بروتين ألفا منظم للإشارات وطرق استخدامها
US11446315B2 (en) 2016-11-03 2022-09-20 Pf Argentum Ip Holdings Llc Enhancement of CD47 blockade therapy by proteasome inhibitors
IL268346B2 (en) 2017-02-06 2024-08-01 Orionis Biosciences BV Targeted chimeric proteins and their uses
MX2019010173A (es) 2017-02-27 2019-11-21 Shattuck Labs Inc Proteínas quiméricas basadas en el csf1r.
WO2018157162A1 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Shattuck Labs, Inc. Tigit- and light-based chimeric proteins
CA3057718A1 (en) * 2017-03-28 2018-10-04 Trillium Therapeutics Inc. Cd47 blockade therapy
IL271587B2 (en) 2017-06-22 2024-05-01 Catalyst Biosciences Inc Modified membrane-type serine protease 1 polypeptides (MTSP-1) and methods of use
MX2020001309A (es) 2017-08-02 2020-08-20 Phanes Therapeutics Inc Anticuerpos anti-cd47 y sus usos.
WO2019061012A1 (zh) * 2017-09-26 2019-04-04 南京凯地生物科技有限公司 靶向cd47的特异性嵌合抗原受体t细胞的制备及其应用
CA3090489A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Forty Seven, Inc. Anti-cancer regimen using anti-cd47 and anti-cd20 antibodies
EP3762406A2 (en) * 2018-03-09 2021-01-13 Askgene Pharma, Inc. Cytokine prodrugs
CN112040979A (zh) 2018-03-21 2020-12-04 Alx肿瘤生物技术公司 针对信号调控蛋白α的抗体和使用方法
WO2019200462A1 (en) * 2018-04-16 2019-10-24 Adaerata, Limited Partnership Methods of preventing or treating non-hematopoietic slamf7 positive and slamf7 negative cancers
CA3108795A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Orionis Biosciences, Inc. Sirp1a targeted chimeric proteins and uses thereof
US10780121B2 (en) 2018-08-29 2020-09-22 Shattuck Labs, Inc. FLT3L-based chimeric proteins
US20210347848A1 (en) 2018-08-31 2021-11-11 ALX Oncology Inc. Decoy polypeptides
SG11202106251UA (en) 2018-12-21 2021-07-29 Ose Immunotherapeutics Bifunctional anti-pd-1/sirpa molecule
AU2020233058A1 (en) 2019-03-06 2021-09-30 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Bifunctional fusion protein and pharmaceutical use thereof
CN111763261B (zh) * 2019-04-02 2022-08-09 杭州尚健生物技术有限公司 一种融合蛋白及其用途
SG11202112733XA (en) 2019-05-31 2021-12-30 Alx Oncology Inc Methods of treating cancer with sirp alpha fc fusion in combination with an immune checkpoint inhibitor
WO2020247820A1 (en) 2019-06-07 2020-12-10 ALX Oncology Inc. Methods and reagents for reducing the interference of drugs that bind cd47 in serological assays
WO2021007428A2 (en) * 2019-07-09 2021-01-14 The Johns Hopkins University Molecules, compositions and methods for treatment of cancer
AU2020315598A1 (en) 2019-07-16 2022-03-03 Gilead Sciences, Inc. HIV vaccines and methods of making and using
PL4045083T3 (pl) 2019-10-18 2024-05-13 Forty Seven, Inc. Terapie skojarzone do leczenia zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej
MX2022005123A (es) 2019-10-31 2022-05-30 Forty Seven Inc Tratamiento basado en anti-cd47 y anti-cd20 para cancer hematologico.
BR112022008817A2 (pt) 2019-11-27 2022-07-26 Alx Oncology Inc Terapias combinadas para tratamento de câncer
CR20220303A (es) 2019-12-24 2022-09-02 Gilead Sciences Inc Compuestos moduladores de la diacilglicerol quinasa
PE20231067A1 (es) 2020-02-14 2023-07-17 Jounce Therapeutics Inc Anticuerpos y proteinas de fusion que se unen a ccr8 y usos de estos
CA3172449A1 (en) 2020-03-27 2021-09-30 Erik Hans MANTING Ex vivo use of modified cells of leukemic origin for enhancing the efficacy of adoptive cell therapy
US20220401516A1 (en) 2020-06-01 2022-12-22 ALX Oncology Inc. Combination therapies comprising a hypomethylation agent for treating cancer
CN111548424A (zh) * 2020-06-05 2020-08-18 上海科弈药业科技有限公司 一种靶向egfr与cd47的多功能融合蛋白及其应用
WO2022010806A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 ALX Oncology Inc. Methods for reducing the interference of drugs that bind therapeutic targets expressed on blood cells in serological assays
CN114057888A (zh) * 2020-07-30 2022-02-18 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种SIRPα-Fc融合蛋白
AU2021343594A1 (en) * 2020-09-17 2023-05-11 Shanghai Lyn-Crest Enterprise Management Co., Ltd. Bispecific recombinant protein and use thereof
US20220196651A1 (en) 2020-12-06 2022-06-23 ALX Oncology Inc. Multimers for reducing the interference of drugs that bind cd47 in serological assays
EP4304633A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Mendus B.V. Methods of vaccination and use of cd47 blockade
TW202302145A (zh) 2021-04-14 2023-01-16 美商基利科學股份有限公司 ＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合及ＮＥＤＤ８活化酶Ｅ１調節次單元之共抑制以用於治療癌症
KR20240007913A (ko) 2021-05-13 2024-01-17 알렉소 온콜로지 인크. 암 치료를 위한 병용 요법
AU2022297373A1 (en) 2021-06-23 2024-01-04 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
US11976072B2 (en) 2021-06-23 2024-05-07 Gilead Sciences, Inc. Diacylglycerol kinase modulating compounds
US11999733B2 (en) 2021-06-23 2024-06-04 Gilead Sciences, Inc. Diacylglycerol kinase modulating compounds
US11926628B2 (en) 2021-06-23 2024-03-12 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
CN113425671A (zh) * 2021-07-05 2021-09-24 郑州大学 一种调控肿瘤微环境免疫凝胶的制备方法及其应用
CN118139858A (zh) 2021-10-28 2024-06-04 吉利德科学公司 吡地嗪-3(2h)-酮衍生物
EP4422756A1 (en) 2021-10-29 2024-09-04 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
CN118139874A (zh) * 2021-11-01 2024-06-04 山东先声生物制药有限公司 SIRPa突变体及其应用
CN118302437A (zh) * 2021-11-19 2024-07-05 杭州尚健生物技术有限公司 SIRPα变体及其应用
EP4319796A2 (en) * 2021-12-21 2024-02-14 FBD Biologics Limited ENGINEERED SIRPalpha VARIANTS AND METHODS OF USE THEREOF
KR20240125012A (ko) 2021-12-22 2024-08-19 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 이카로스 아연 핑거 패밀리 분해제 및 이의 용도
AU2022419982A1 (en) 2021-12-22 2024-06-06 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
WO2023154578A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Sana Biotechnology, Inc. Methods of treating patients exhibiting a prior failed therapy with hypoimmunogenic cells
DK4245756T3 (da) 2022-03-17 2024-10-21 Gilead Sciences Inc Ikaros zinkfinger-familiens nedbrydere og anvendelse heraf
WO2023183313A1 (en) 2022-03-22 2023-09-28 Sana Biotechnology, Inc. Engineering cells with a transgene in b2m or ciita locus and associated compositions and methods
IL315706A (en) 2022-03-24 2024-11-01 Bitterroot Bio Inc SIRP - alpha fusion polypeptides with modified FC regions
US20230355796A1 (en) 2022-03-24 2023-11-09 Gilead Sciences, Inc. Combination therapy for treating trop-2 expressing cancers
WO2023183890A1 (en) 2022-03-24 2023-09-28 Bitterroot Bio, Inc. Multivalent sirp-alpha fusion polypeptides
CN116836281A (zh) * 2022-03-25 2023-10-03 英诺湖医药(杭州)有限公司 B7h3抗体及包含其的双功能抗体
TW202345901A (zh) 2022-04-05 2023-12-01 美商基利科學股份有限公司 用於治療結腸直腸癌之組合療法
IL316058A (en) 2022-04-21 2024-11-01 Gilead Sciences Inc Compounds modulate KRAS G12D
WO2023235754A1 (en) 2022-06-01 2023-12-07 ALX Oncology Inc. Combination therapies for treating urothelial carcinoma
WO2024006929A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
WO2024015741A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Gilead Sciences, Inc. Hiv immunogenic polypeptides and vaccines and uses thereof
WO2024064668A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Gilead Sciences, Inc. FOCAL IONIZING RADIATION AND CD47/SIRPα DISRUPTION ANTICANCER COMBINATION THERAPY
US20240254118A1 (en) 2022-12-22 2024-08-01 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2024193635A1 (en) * 2023-03-22 2024-09-26 Wangzhi LI Sirp variants and uses thereof
WO2024215754A1 (en) 2023-04-11 2024-10-17 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
WO2024213119A1 (en) * 2023-04-14 2024-10-17 Adaptocue, Llc Ph-sensitive cd47-binding domains and uses thereof
WO2024220917A1 (en) 2023-04-21 2024-10-24 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013109752A1 (en) * 2012-01-17 2013-07-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High affinity sirp-alpha reagents
WO2014094122A1 (en) * 2012-12-17 2014-06-26 Trillium Therapeutics Inc. Treatment of cd47+ disease cells with sirp alpha-fc fusions

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8377448B2 (en) * 2006-05-15 2013-02-19 The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders
DK3056515T3 (da) * 2008-01-15 2019-07-01 Univ Leland Stanford Junior Fremgangsmåder til at manipulere fagocytose medieret af cd47
JP2012512640A (ja) * 2008-12-19 2012-06-07 ノバルティス アーゲー 自己免疫および炎症性障害の処置に使用するための可溶性ポリペプチド
ES2973099T3 (es) * 2009-05-15 2024-06-18 Univ Health Network Composiciones y procedimientos para el tratamiento de cánceres hematológicos dirigidos a la interacción entre SIRP alfa y CD47
CN102939303A (zh) * 2009-12-22 2013-02-20 诺瓦提斯公司 四价cd47-抗体恒定区融合蛋白用于治疗
WO2012109267A2 (en) * 2011-02-07 2012-08-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel peptides and methods using same
WO2012172521A1 (en) * 2011-06-16 2012-12-20 Novartis Ag Soluble proteins for use as therapeutics
WO2013063076A1 (en) * 2011-10-25 2013-05-02 Indiana University Research & Technology Corporation Compositions for and methods of modulating complications, risks and issues with xenotransplantation
US9428553B2 (en) * 2012-02-10 2016-08-30 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
CA2876904C (en) * 2012-06-22 2019-12-03 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-jagged 1/jagged 2 cross-reactive antibodies, activatable anti-jagged antibodies and methods of use thereof
GB201216649D0 (en) * 2012-09-18 2012-10-31 Univ Birmingham Agents and methods
WO2014121093A1 (en) * 2013-01-31 2014-08-07 Thomas Jefferson University Fusion proteins that facilitate cancer cell destruction

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013109752A1 (en) * 2012-01-17 2013-07-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High affinity sirp-alpha reagents
WO2014094122A1 (en) * 2012-12-17 2014-06-26 Trillium Therapeutics Inc. Treatment of cd47+ disease cells with sirp alpha-fc fusions

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Weiskopf, Kipp, et al. "Engineered SIRPα variants as immunotherapeutic adjuvants to anticancer antibodies." Science 341.6141 (2013): 88-91. *

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Publication number Publication date
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