KR102540804B1 - 비자나무 추출물을 포함하는 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비자나무 추출물을 포함하는 바이오필름 형성 억제 효능이 있는 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 구강세균의 바이오필름 형성 억제 효과를 갖는 비자나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치태, 치석, 치은염 또는 치주염과 같은 구강질환의 예방 및 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

비자나무 추출물을 포함하는 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물{Composition containing Torreya nucifera extracts for preventing the formation of biofilm of mmicroorgaism}

본 발명은 비자나무 추출물을 포함하는 바이오필름 형성 억제 효능이 있는 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 구강세균의 바이오필름 형성 억제 효과를 갖는 비자나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 치태, 치석, 치은염 또는 치주염과 같은 구강질환의 예방, 완화 및 개선용 조성물에 관한 것이다.

바이오필름(Biofilm)이란, 미생물에 의해 형성된 다양한 폴리머 물질로 싸인 미생물 복합체로 생물막 또는 균막이라고도 불린다. 이러한 바이오필름은 미생물이 다양한 환경에 적응하는데 도움을 주는 보호막의 역할을 하며 바이오필름 내의 균체들은 서로 대사(metabolism)을 공유하기도 하고, 유전자 전달(gene transfer)을 통해 생존에 유리한 성질들을 획득하기도 한다. 따라서 바이오필름을 형성한 균체들은 일반적인 부유균 상태로 존재할 때보다 가혹한 환경과 항생제에 대해 훨씬 강한 저항력을 가지며, 장기에 형성된 바이오필름은 다양한 병증을 야기한다. 이러한 병증이나 발병 위치를 예로 들면, 충치(dental caries), 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 중이염(otitis media), 인공후두(voice prostheses), 뇌수종(hydrocephalus hunts), 낭포성섬유증(cystic fibrosis), 심내막염(valvular endocarditis), 인공심장판막(prosthetic heart valves), 중심정맥관(central venous catheter), 인공고관절(prosthetic hip joint), 인공슬관절(prosthetic knee joint), 만성 세균성 전립선염(chronic bacterial prostatitis), 자궁내 장치(intrauterine devices), 요도관(urinarycatheter) 등을 들 수 있다.

한편, 구강은 약 1,000여종의 세균이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 이에 서식하는 많은 세균은 구강 바이오필름을 형성한다. 그 중 초기 구강 바이오필름 형성과 관련된 세균으로는 스트렙토코커스 종(Streptococcus spp.)으로 알려져 있다. 이들 스트렙토코커스 종은 치아표면의 초기 부착균으로, 특히 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis)는 치석의 원인이 되는 구강 바이오필름의 형성이 시작되는데 중요한 역할을 한다. 또한 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)는 치주염, 치은염과 같은 잇몸 질환을 유발하는 주요 원인균으로 알려져 있다. 따라서 치석 형성을 억제함에 있어 이들 균을 제어하고자 하는 노력이 지속되고 있다.

치아 표면에 형성된 바이오필름에 타액 내의 칼슘이나 마그네슘 등의 금속 이온이 결합되면 석회화된 치석을 형성하게 된다. 치석이 적절하게 제거되지 못하면 치은염, 치주염과 같은 잇몸 질환을 야기하며 심각하게는 치아의 손실을 유발한다. 치주질환의 발생을 예방하기 위한 노력으로 클로로헥시딘 글루코네이트, 세틸피리디움 클로라이드, 생귀나린 및 트리클로산과 같은 항균제가 개발되어 양치약 및 치약과 같은 구강제품에 적용되어 왔으나, 아직까지도 치은염증의 발생은 근본적으로 예방하지 못하고 있는 실정이다. 또한 이러한 합성 항생제는 장기간 사용할 경우, 구강 내 점막을 자극할 뿐만 아니라, 정상균도 파괴시켜 오히려 구강 내 병원균에 대한 내성을 증가시키며, 치아착색 및 미각을 해치는 등의 인체에 대한 부작용이 크다.

따라서 합성 화합물을 사용하는 기존제품들의 문제점을 극복할 수 있는, 천연 항균제를 포함하는 치주질환 예방용 구강제품이 요구된다.

비자나무(Torreya nucifera)는 구과목 주목과의 상록교목으로 우리나라 남부 지방 바닷가의 산에 서식한다. 열매, 뿌리껍질, 꽃을 약용으로 사용한다. 피부 보습 및 염증완화(대한민국 등록특허 10-1648466), 항 스트레스(대한민국 등록특허 10-1434449) 등의 효능도 보고된 바 있으나, 비자나무가 구강 치주 질환에 대하여 나타내는 효능에 대해서는 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자는 비자나무 추출물을 유효성분으로 함유하여 치석침착과 치주 질환의 예방 또는 개선에 효능이 있는 구강 조성물을 제공하고자 본 발명을 안출하였다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기한 바와 같이 종래 기술의 단점 및 문제점을 개선하기 위한 것으로서, 본 발명의 일측면은 바이오필름 형성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 비자나무 추출물을 포함하는 치석침착과 치주질환의 예방 및 개선에 효과가 있는 구강 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 것들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 이루기 위하여 본 발명의 일 측면은 비자나무 줄기 추출물, 비자나무 잎 추출물, 비자나무 꽃 추출물, 비자나무 열매 추출물 및 비자나무 종자 추출물로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 비자나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 미생물은 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii),스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 퓨소박테리움 뉴클레아텀(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia), 파비모나스 미크라(Parvimonasmicra; Peptostreptococcus micros) 및 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans; Actinobacillus actinomycetemcomitans)로 구성된 군에서 적어도 어느 하나를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 과제를 이루기 위하여 본 발명은, 치주질환 예방 및 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

상기 과제를 이루기 위하여 본 발명의 다른 측면으로 상기 구강 조성물은 바이오필름 형성 억제에 효과적이기 때문에 치석, 치은염 및 치주염 등의 치주질환 예방, 완화 및 개선용 구강 조성물을 제공한다. 상기 구강 조성물은 치약류, 츄잉껌, 구강 청정제, 구강 세정제 및 구강 스프레이 중 선택된 어느 하나 이상의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따르면, 비자나무 추출물을 포함하는 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물은, 구강세균에 대한 항균활성과 바이오필름 형성 억제 효과를 가짐으로써, 치석과 치은염, 치주염과 같은 치주질환을 예방 및 개선할 수 있다.

또한, 천연물질로 이루어져서 합성 물질에 의한 부작용이나 위험도가 없는 인체에 안전한 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 인체에 안전하므로, 기능성 식품 조성물, 치약, 구강용 가글과 같이 인체에 직접 닿거나 심지어 인체에 들어가는 제품으로 다양하게 응용할 수 있다.

본 발명의 기술적 효과들은 이상에서 언급한 것들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 비자나무 잎 추출물을 처리하지 않은 것과 비자나무 잎 추출물을 처리한 것의 바이오필름 형성 양상을 나타낸 사진이다.
도 2는 비자나무 잎 추출물을 처리하지 않은 것과 비자나무 추출물을 처리한 것의 하이드록시아파타이트 디스크에서의 바이오필름 형성 양상을 나타낸 그래프이다.
도 3은 비자나무 잎 추출물을 처리하지 않은 것과 비자나무 추출물을 처리한 것의 비수용성 글루칸 합성 양상을 나타낸 그래프이다.
도 4는 구강점막세포에 대한 비자나무 잎 추출물의 세포 독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 구체적으로 기재한 것뿐이며, 본 발명의 범위는 청구범위를 기초로 해석된다.

본 발명은, 비자나무 줄기 추출물, 비자나무 잎 추출물, 비자나무 꽃 추출물, 비자나무 열매 추출물 및 비자나무 종자 추출물로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 비자나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물을 제공한다.

상기 비자나무 추출물은 사용되는 부위에 따라 비자나무 줄기 추출물, 비자나무 잎 추출물, 비자나무 꽃 추출물, 비자나무 열매 추출물 및 비자나무 종자 추출물로 나눌 수 있다.

본 발명에서 "비자나무 줄기 추출물"은 비자나무 줄기를 추출 대상으로 하여 얻어지는 모든 형태의 추출물로서, 예를들어 식물 줄기에 직/간접적으로 열을 가해 얻는 진액 형태의 추출물, 살아있는 식물 줄기의 윗부분을 잘라 흘러나오는 진액 형태의 추출물, 식물을 유기용매, 또는 물로 추출하여 얻는 추출물, 식물 줄기를 연소시킬 때 기체를 냉각하여 얻는 추출물 등을 모두 포함하는 것이다.

본 발명에서 "비자나무 열매 추출물"은 유기 용매 또는 물을 사용하여 얻어지는 추출물과 비자나무 열매를 압착하여 얻어지는 진행 형태의 추출물, 용매 추출물을 감압하여 얻어지는 오일 추출물을 포함한다.

본 발명에서 "비자나무 종자 추출물"은, 유기 용매 또는 물을 사용하여 얻어진 추출물과, 비자나무 종자를 압착하여 얻어지는 진액 추출물, 또는 용매 추출물을 감압하여 얻어진 오일 추출물을 포함한다.

본 발명에서 "비자나무 잎 추출물"은 유기 용매 또는 물 추출물을 의미한다.

본 발명에서 "비자나무 꽃 추출물"은 유기 용매 또는 물 추출물을 의미한다.

예를 들어, 상기 비자나무 추출물은 각각의 줄기, 잎, 꽃, 열매 및 종자를 분쇄한 후 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 헥산, 클로로포름 등의 유기용매 및 물 또는 이들의 혼합용매로 추출된 추출물일 수 있다.

가장 바람직한 추출물로는 비자나무 잎의 에탄올 추출물이 사용될 수 있다.

상기 추출물의 제조방법은 냉침 추출법, 온침추출법 또는 열 추출법 등이 사용될 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파 분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다.

또 다른 예에 의하면, 상기 비자나무 추출물은 상기 열매 및/또는 종자의 유기용매 추출물을 감압하여 오일로 만든 것을 사용할 수도 있다.

상기 제조된 추출물은 여과하거나 농축 또는 건조하여 용매를 제거할 수 있으며, 구체적으로 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압 여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일예로 회전 증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있고, 상기 건조는 일예로 동결 건조법으로 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 미생물의 바이오필름 형성을 억제하는데 효과가 있다.

여기서 "미생물"이란 본 발명의 조성물이 미생물의 바이오필름 형성을 억제하는데 특히 효능이있는 모든 세균, 진균, 효모 및 조류를 포함하는 개념이다. 따라서, 하기 실시예 및 실험예에서 직접적으로 바이오필름 형성 억제가 확인된 미생물 이외에도 당업자가 통상의 능력 범위 내에서 본 명세서가 개시한 바를 기초로 바이오필름 형성을 억제할 것으로 예상되고 확인될 수 있는 모든 미생물이 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 특히 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 퓨소박테리움 뉴클레아텀(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia), 파비모나스 미크라(Parvimonas micra; Peptostreptococcus micros) 및 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans; Actinobacillus actinomycetemcomitans)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 균의 바이오필름 형성 억제에 효과가 있다.

본 발명에 따른 비자나무 추출물은 바이오필름 형성을 억제할 수 있는 한 그 사용되는 제품에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 통상적으로 본 발명에 따른 비자나무 추출물은 이 조성물을 포함하여 미생물의 바이오필름 형성 억제 효능을 나타내는 조성물에 대하여 그 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.001 ~ 5.0 중량%, 바람직하게는 0.2~2중량%로 포함될 수 있다.

상기 조성물은 치주질환 유발균에 대한 항균 활성을 가지며, 치아 표면에 바이오필름이 형성되는 것을 억제함으로써 치석 생성을 억제하여 치은염 또는 치주염 질환의 예방 및 개선 효과가 우수하다.

본 발명에서 치은염(gingivitis)는 구강 점막의 일부인 잇몸에 염증이 발생하는 것으로, 종창, 발적, 통증 또는 국소 열감의 증세가 나타나고, 심한 경우는, 궤양 또는 괴저가 발생할 수 있는 질환을 의미한다.

본 발명에서 치주염(periodontitis)는 치주위염이라고도 하며, 잇몸과 골성조직에 주로 발명하는 질병으로 만성 감염증이 될 경우, 세포 조직이 파괴됨으로서, 치아를 잃게되는 치주질환을 의미한다.

본 발명에 따른 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물은 인간을 포함하는 동물에 직접 적용할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물은 비자나무 추출물외에 사용방법 및 사용 목적에 따라 다양한 성분들을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 비자나무 추출물을 포함하는 기능성 식품 조성물을 제공할 수 있으며, 예를 들어 식품 또는 음료등을 들 수 있다.

본 명세서에서 식품이란 영양소를 한가지 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공물을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며 통상적 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하고자 하는 의도이며, 각종 식품, 음료, 껌, 캔디, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품등이 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 치주염 또는 치은염 예방 및 치료를 위한 조성물을 제공한다. 이러한 조성물의 예로는 치약, 양치용액, 구강세척제, 치약 크림 등이 있다.

본 발명에 따른 조성물이 치약인 경우, 비자추출물외에 연마제, 점결제, 보습제, 발포제, 감미료, 미백제 또는 향미제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물이 페이스트 상 조성물일 경우에는 상기 점결제는 가라기닌, 각종 점증용 셀룰로오스 유도체, 잔탄검, 트라가칸트검 등의 검류, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴산 나트륨, 폴리아크릴산/말레인산 공중합체, 카르복시비닐 폴리머 등의 합성 고분자 유도체 등의 유기계 점결제와 실리카, 라포나이트 등의 무기계 점결제 등을 단독 또는 복합적으로 사용할 수 있다.

상기 보습제는 솔비톨, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리에테르글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 등이 사용될 수 있다.

상기 감미료는 수크로오즈, 락토오즈, 말토오즈, 크실리톨, 나트륨시클라메이트, 사카린나트륨, 스테비오사이드, 아스파탐 등이 사용될 수 있다.

상기 향료는 페퍼민트, 멘톨, 아네톨, 오이게놀, 리모넨, 시트로네놀, 알파터피네올, 살리실메틸, 시네올, 리나롤, 이틸리나롤, 바닐린, 티몰, 스피아민트유, 세지유, 로즈마리유, 계피유등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물이 양치 용액인 경우에는 통상적인 용제에 비자나무 추출물을 혼합하고, 양치용액으로 제형화하여 제조할 수 있으며, 하루 2 내지 10회 구강을 세척하여 치주염 또는 치은염과 같은 치주질환을 예약 및 치료할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물이 치약 크림인 경우에는 물과 보습제를 포함하는 액체, 겔화제 또는 수불용성 광택제, 감미료, 향료 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물이 구강 세척제인 경우에는 , 치약 담체, 상세하게는 비독성 알코올을 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 상기 성분들외에도, 사용하고자 하는 목적에 따라 적절하게 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 충진제, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 증점제, pH 조절제, 풍미제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라서, 상기 비자나무 추출물을 함유하는 본 발명의 구강용 조성물은 치약류, 츄잉껌, 구강청정제, 구강세정제 및 구강스프레이 등의 제형으로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 치약류는 연마제, 점결제, 습윤제, 유효성분, 기포제, 감미료, 향미제로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실험예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실험예와 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

제조예 1 : 비자나무 추출물 제조

건조된 비자나무 잎을 분쇄하여 2배량의 에탄올에 침지시킨 상태로 초음파 장치에 30분간 노출시켰다. 24시간 침지 후 여과지에 거른 다음 회전감압농축기로 용매를 제거하여 추출물을 제조하였다.

실험예 1 : 구강 균주 및 배양조건

균주는 KCTC 생물자원센터에서 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 균을 분양받아 사용하였다.

상기 분양받은 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 균을 5 ug/mL hemin과 1 ug/ml vitamin K를 포함하는 BHI(brain heart infusion) broth 배지에 접종한 후 이를 37 ℃, 혐기조건에서 정치배양하여 실험에 사용하였다.

실험예 2 : 항균활성 확인

비자나무 추출물의 구강균에 대한 항균활성을 측정하기 위해 MIC(minimal inhibitory concentration) 테스트를 진행하였다.

96 well-plate에 최종 혼합액이 200 uL가 되도록 약 5x10^5 CFU/mL 농도의 세균 배양액에 각 농도에 따른 추출물을 처리하였다. 추출물의 경우 감압 농축된 비자나무 추출물을 DMSO에 50 mg/mL의 농도로 녹인 것을 사용하여, 멸균된 액체배지로 500, 250, 125, 62.5, 31.25 ug/mL 농도가 되도록 희석해서 사용하도록 했다.

세균 배양액, 추출물을 포함하는 상기 혼합액을 처리한 96-well plate를 37 ℃, 혐기조건에서 24~72 시간 배양하였다.

항균활성의 판정은 추출물 미처리 대조군 대비 실험군의 흡광도를 샘플 처리 직후와 24~72시간 배양 후 microplate reader를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 그 변화 값을 계산, 비교하여 진행하였다.

	S. gordonii	S. oralis	P. gingivalis	S. gordonii + S. oralis + P. gingivalis
MIC (ug/mL)	125	31.3	>500	>500

상기 표 1은 스트렙토코커스 고도니, 스트렙토코커스 오랄리스, 포피로모나스 진지발리스 단일 균주, 복합 균주에 대한 MIC 값을 나타낸 것으로, 비자나무 추출물이 스트렙토코커스 고도니균과 스트렙토코커스 오랄리스 균에 대하여 각각 125, 31.3 ug/mL 이상의 농도에서 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

실험예 3 : 바이오필름 형성 억제능 측정-Microplate

비자나무 추출물의 바이오필름 형성 억제능을 확인하기 위해 마이크로 플레이트를 이용한 실험을 진행하였다.

96 well-plate에 스트렙토코커스 고도니, 스트렙토코커스 오랄리스, 포피로모나스 진지발리스 복합균 약 5x10^5 CFU/mL, 비자나무 추출물을 각 200, 100, 50, 25, 10 ug/mL, 1% sucrose를 포함하는 액체배지 200 uL을 처리하였다. 상기 96 well-plate를 37 ℃, 혐기조건에서 72시간 동안 정치 배양하였다.

72시간 배양 후, 배지를 제거하고 각 웰에 정제수 200 uL를 가하여 부유균과 바이오필름에 약하게 결합되어 있는 균들을 제거하는 작업을 3회 반복하였다. 이후, 각 웰에 0.1% crystal violet 염색 시약을 200 uL씩 첨가하여 15분간 상온에서 반응시켰다. 15분 후 잔여 염색약을 제거하기 위해 정제수를 이용하여 3회 washing하였다. 염색된 바이오필름을 상온에서 건조시킨 뒤 각 웰의 바이오필름 생성정도를 확인하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 비자나무 추출물을 처리한 실험군에서는 대조군과 비교하여 200 ppm 이상의 농도에서 바이오필름 형성을 억제하였음을 확인하였다.

실험예 4 : 바이오필름 형성 억제능 측정-하이드록시아파타이트 디스크(Hydroxyapatite disc)

비자나무 추출물의 바이오필름 형성 억제능을 확인하기 위한 하이드록시아파타이트 디스크 실험을 진행하였다.

24 well-plate에 스트렙토코커스 고도니, 스트렙토코커스 오랄리스, 포피로모나스 진지발리스 복합균 약 5x10^5 CFU/ml, 비자나무 추출물을 각 200, 100, 50, 25 ug/mL, 1% sucrose를 포함하는 액체배지 1 mL을 처리하고, 인공침(artificial saliva)으로 코팅된 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 디스크를 침지시킨다. 상기 24 well-plate를 37 ℃, 혐기조건에서 3일간 정치배양하였다.

72시간 배양 후, 배지를 제거하고 각 웰에 정제수 1 mL를 가하여 부유균과 바이오필름에 약하게 결합되어 있는 균들을 제거하는 작업을 3회 반복하였다. 이후, 각 웰에 0.1% crystal violet 염색 시약을 1 mL씩 첨가하여 15분간 상온에서 반응시켰다. 15분 후 잔여 염색 시약을 제거하기 위해 정제수를 이용하여 3회 washing하였다. 염색된 바이오필름을 상온에서 건조시킨 뒤 95% 에탄올을 가하여 충분히 반응시켰다. 염색약이 녹아 나온 에탄올 100 uL를 96-well plate에 옮겨 microplate reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 추출물을 처리한 실험군에서는 대조군과 비교하여 100 ug/mL 이상의 농도에서 바이오필름 형성을 억제하였음을 확인하였다.

실험예 5 : 비수용성 글루칸 합성 저해능 측정

스트렙토코커스 고도니를 BHI 액체배지에 24시간 배양한 후, 원심분리(6,000 g, 4 ℃, 15분)하여 상층액을 취하였다. 스트렙토코커스 고도니 상층액에 추출물을 각 농도별로 처리함과 동시에 sucrose의 농도가 1%가 되도록 하였다.

37℃에서 18시간 배양한 후 동량의 메탄올을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 원심분리(6,000 g, 4 ℃, 15분)하여 정제수로 2회 washing하고, 70% 에탄올로 1회 washing하여 비수용성 글루칸 pellet을 얻었다.

잔여 용매를 건조시킨 후 pellet에 75% H₂SO₄에 anthrone을 2 mg/mL으로 용해시킨 시약을 처리하여 100 ℃에서 15분간 반응시켰다. 이후 반응물의 온도가 상온으로 떨어질 때까지 기다린 후 microplate reader를 이용하여 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 3과 같이 비자나무 추출물의 비수용성 글루칸 합성억제활성은 비자나무 추출물을 처리하지 않은 것과 비교하여 200, 100 ug/mL에서 각각 42.4%, 78.7%의 비수용성 글루칸 생성율을 나타내었다.

실험예 6 : 구강점막세포에 대한 세포독성

구강점막세포에 대한 비자나무 추출물의 독성을 측정하기 위해 MTT 실험을 진행하였다.

hTERT-OME(immortalized human oral mucosal epithelial cell)를 96 well plate에 약 1x10^4 cells/well로 처리한 다음 RPMI-1640, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin 배지에서 37℃, 5% CO₂조건으로 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 이전 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 200, 100, 50, 25, 12.5 ug/mL로 희석한 비자나무 추출물을 처리하여 37℃, 5% CO₂에서 24시간 반응시켰다. 처리 후 각 웰 당 5 mg/mL MTT 용액을 20 uL 씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응 후 상등액을 모두 제거하고 DMSO 150 uL 씩 첨가하여 상온에서 10분간 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 4와 같이 비자나무 추출물은 200 ug/mL 이하에서 구강 점막세포에 대하여 세포독성을 나타내지 않았다.

실시예 1 : 비자나무 추출물을 함유하는 치약 조성물 제조

실시예-치약 조성물을 하기 표 2와 같은 성분 및 조성비로 제조하였다.

구강 조성물 중 치약 조성물의 제조순서는 습윤제인 비결정성 소르비톨액에 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 사카린나트륨 등 분말 소량 성분을 분산시키고 정제수로 묽힌 다음 혼합기에서 1차 혼합하고, 그 다음에 실리카 및 탄산칼슘 등의 연마제를 넣고 2차 혼합했다. 그리고 마지막으로 기포제, 안정제, 향료 등을 넣고 3차 혼합함으로써 치약 조성물을 제조하였다.

성 분 명	실시예(중량%)
실리카	20.0
농글리세린(98%)	30.0
비결정성 소르비톨액(70%)	30.0
라우릴황산나트륨	1.0
카르복시메틸셀룰로오스나트륨	0.5
잔탄검	0.3
불화나트륨	0.22
향료	1.0
사카린나트륨	1.0
구연산	적량
탄산수소나트륨	2.0
비자나무 추출물	0.02
정제수	To 100

실시예의 치약 조성물은 바이오필름 생성을 억제하는 최소 농도인 200 ug/mL의 비자나무 추출물을 포함하여 제조하였다.

상기의 실험들로부터 비자나무 추출물이 치주질환의 근본원인인 바이오필름 형성의 초기 단계에서 중요한 역할을 하는 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis)와 잇몸질환을 유발시키는 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)의 세균막 형성을 억제시킴으로써 치주염, 치은염 등 잇몸질환을 예방 또는 개선하는 천연소재임을 확인하였다.

Claims (7)

1. 비자나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 비자나무 잎 추출물은 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 헥산, 클로로포름, 또는 이들의 혼합 용매로 추출되거나, 물로 추출된 추출물인 것을 특징으로 하는 바이오필름 형성 억제용 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 퓨소박테리움 뉴클레아텀(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia), 파비모나스 미크라(Parvimonas micra; Peptostreptococcus micros) 및 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans; Actinobacillus actinomycetemcomitans)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 균에 선택된 것을 특징으로 하는 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 비자나무 잎 추출물은 상기 미생물의 바이오필름 억제용 조성물의 전체 함량에 대하여 0.001 내지 5.0 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물의 바이오필름 억제용 조성물이 치주염 또는 치은염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물인 것을 특징으로 하는 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물의 바이오필름 억제용 조성물이 치주질환 예방 및 개선용 구강 조성물인 것을 특징으로 하는 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 치약류, 츄잉껌, 구강 청정제, 구강 세정제 및 구강 스프레이 중 선택된 어느 하나 이상의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 미생물의 바이오필름 형성 억제용 조성물.

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