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KR102546626B1 - 인플루엔자 바이러스 항원 정제 조건 신속 확인 시험 - Google Patents

인플루엔자 바이러스 항원 정제 조건 신속 확인 시험 Download PDF

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KR102546626B1
KR102546626B1 KR1020200052708A KR20200052708A KR102546626B1 KR 102546626 B1 KR102546626 B1 KR 102546626B1 KR 1020200052708 A KR1020200052708 A KR 1020200052708A KR 20200052708 A KR20200052708 A KR 20200052708A KR 102546626 B1 KR102546626 B1 KR 102546626B1
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influenza virus
virus
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influenza
culture
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정환의
김윤희
김훈
박용욱
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에스케이바이오사이언스(주)
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Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스 항원 정제 조건 신속 확인 시험에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 기존에 인플루엔자 백신 생산시 표준 시험법으로 사용되고 있는 방사면역확산법을 사용하지 않고도 본 발명 특유의 방법에 따라 신속하고 신뢰성 있게 인플루엔자 표면항원 수득(정제) 조건 확인이 가능하며, 이에 따라 인플루엔자 표면항원 서브유닛 백신 생산 기간이 현저하게 단축되어 신종 인플루엔자가 빠르게 대유행하는 상황에서도 신속하게 백신 개발/제조에 따른 대응이 신속하게 이루어질 수 있다.

Description

인플루엔자 바이러스 항원 정제 조건 신속 확인 시험{Rapid influenza virus antigen purification condition test}
본 발명은 인플루엔자 바이러스 항원 정제 조건 신속 확인 시험에 관한 것이다.
인플루엔자 관련 질환은, 치료도 중요하지 만 무엇보다도 백신 접종을 통한 예방이 현실적이고 효과적인 방법이라고 할 수 있으며, 만일 백신 개발이 보다 신속히 이루어졌다면 신종플루의 대 유행시에는, 피해를 그만큼 줄일 수 있었을 것으로 예측된다.
인플루엔자 바이러스는 매년 백신 생산 권고주가 변경되고, 불특정 시점에 전 세계적으로 감염이 증가하는 신종플루 발병의 특성에 따라, 인플루엔자 바이러스 백신개발은 단시간에 대량생산 조건을 확립하여 고수율 및 고순도로 백신을 생산하는 것이 관건이라 할 수 있다.
인플루엔자 백신의 주항원은 인플루엔자 바이러스 외피에 있는 헤마글루티닌(Haemagglutinin, HA)이며 백신의 역가 또한 헤마글루티닌 농도를 기준으로 한다. 현재, 인플루엔자 백신의 헤마글루티닌 농도를 측정하기 위해서 유럽약전과 세계보건기구(world health organization, WHO)에서 추천하는 방사면역확산법(single radial immunodiffusion technique, SRID)이 국내외에서 공통적으로 사용되고 있다(비특허문헌 1). 방사면역확산법을 이용한 헤마글루티닌의 함량 측정 시 NIBSC(National Institute for Biological Standards and Control)에서 분양하는 표준항원과 표준항체가 사용되는데, 인플루엔자 백신 항원과 표준항체가 응집된 환(環)의 크기를 표준항원과 표준항체가 응집된 환의 크기와 비교환산함으로써 인플루엔자 백신의 헤마글루티닌의 농도를 측정한다. 그러나, 이러한 방사면역확산법은 샘플을 처리하는데 24시간 이상이 소요되고, 대부분의 공정이 수작업으로 이루어져 처리량에 비하여 대단히 노동 집약적이다.
판데믹(pandemic)은 세계적으로 전염병이 대유행하는 상태를 의미하는 것으로, 판데믹 상황에서는 백신개발이 신속해야 하기 때문에, 인플루엔자 판데믹 상황에 대처하기 위한 백신 개발 시 헤마글루티닌의 함량 측정 또한 신속하게 이루어져야 할 것이다. 한국에서는 2009년도에 예기치 않은 H1N1 판데믹 상황에서 세계보건기구(World Health Organization, WHO)의 표준항원 및 표준항체의 공급 지연으로 백신제조 및 후속 임상시험이 전반적으로 지연된 경험을 하였다. 판데믹 상황과 같이 신속하게 백신이 개발되어야 할 경우 신속한 헤마글루티닌 함량 측정법이 요구되지만, 방사면역확산법에 사용되는 표준항원과 표준항체의 개발에 2~3개월이 소요되기 때문에 신속한 백신개발에 걸림돌이 되었던 것이다.
또한, 최근 새로운 물리화학적 시험방법에 대한 연구가 이루어지기 시작하였는데, 새롭게 시도되는 물리화학적 시험방법이 방사면역확산법 시험을 대체하기 위해서는 대체 시험법과 방사면역확산법 결과에 어떠한 상관관계가 있다는 데이터와 시험법의 확립, 인증 등이 필요하다.
현재 대체 시험법으로서 역상크로마토그래피 시험법(RP-HPLC), 동위원소희석액체크로마토그래피 질량분석법(ID-LC/MS), 탈당항원 SDS-PAGE 분석법 등이 알려졌으나, 방법에 따라서는 여전히 표준항원이 필요하기도 하고 고가의 장비 및 전문인력이 반드시 필요하거나 분석감도가 낮은 등의 단점들이 존재하는 것으로 알려졌다(비특허문헌 2)
여전히 당업계에는 백신 제조시에 손쉽게 SRID 방법 없이도 혹은 SRID 방법을 대체 가능한 방법들이 필요한 실정이다.
Wood JM, Schild GC, Newman RW, Seagroatt V. An improved Single-Radial-Immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen application for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J Biol Stand 1977;5:237-47. 왕진호, 대유행 인플루엔자 백신 항원 함량 신속 시험법 해설서, 식품의약품안전평가원, 2015
이에 본 발명자들은 방사면역확산법을 사용하지 않고도 백신 생산시 공정 조건 설정이 가능하도록 연구하던 중, 본 발명 특유의 방법에 의하면 신속하고 신뢰성 있게 인플루엔자 표면항원의 수득 조건 확인이 가능하며, 이에 따라 인플루엔자 항원을 포함하는 백신 생산 기간이 현저하게 단축된다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 계면활성제(Detergent)를 사용하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 방법에 있어서, 상기 계면활성제는 샘플링(sampling)한 인플루엔자 바이러스의 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 구한 후 하기 식 1에 대입하여 수득된 값으로 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스에 처리되는 계면활성제 처리량이 결정되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다:
[식 1]
계면활성제 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d
(상기 식에서,
a는 0.005~0.100(v/v%) 이고,
b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,
c는 처리되는 계면활성제 스탁(stock)의 농도(w/v%)이고,
d는 계면활성제를 처리할 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 용량(부피)이다.)
본 발명의 다른 목적은 하기 제1 정제 조건 결정법 및 제2 정제 조건 결정법을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인플루엔자 항원 정제 조건 신속 확인 시험 방법을 제공하는 것이다:
제1 정제 조건 결정법으로서, 인플루엔자 바이러스 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계에서 사용되는 것으로, 상기 인플루엔자 바이러스 정제 시의 조건은 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 기반하여 결정되는 제1 정제 조건 결정법; 및
제2 정제 조건 결정법으로서, 계면활성제를 사용하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계에서 사용되는 것으로, 상기 표면항원 단백질 정제 시의 계면활성제 처리량은 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 전체 단백질 정량법(Total protein quantification assay)에 기반하여 결정되는 제2 정제 조건 결정법
본 발명의 다른 목적은 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 백신 제조방법으로서, 상기 단계는 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 구한 후 하기 식 1에 대입하여 수득된 값으로 계면활성제를 처리하는 조건하에 수행되는 것인 방법을 제공하는 것이다. :
[식 1]
계면활성제 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d
(상기 식에서,
a는 0.005~0.100(v/v%) 이고,
b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,
c는 처리되는 계면활성제 스탁(stock)의 농도(w/v%)이고,
d는 계면활성제를 처리할 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 용량이다.)
본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법을 제공하는 것이다:
a) 인플루엔자 바이러스를 세포에 감염시키고 배양하여 바이러스 배양물을 수득하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하기 위하여, 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 기반하여 정제 조건을 결정하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 결정된 조건에 따라 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계;
d) 상기 c) 단계에서 정제된 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원을 정제하기 위하여, 표면항원 단백질 정제 시의 계면활성제 처리량을 인플루엔자 바이러스에 대한 전체 단백질 정량법(Total protein quantification assay)에 기반하여 결정하는 단계;
e) 상기 d) 단계에서 결정된 조건에 따라 계면활성제를 처리하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계.
본 발명의 다른 목적은 인플루엔자 표면항원을 포함하는 백신 제조 방법에 있어서, 백신 제조 기간이 단축된 것을 특징으로 하는, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것이다:
a) 인플루엔자 바이러스를 세포에 감염시키고 배양하여 바이러스 배양물을 수득하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하기 위하여, 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 기반하여 정제 조건을 결정하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 결정된 조건에 따라 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계;
d) 상기 c) 단계에서 정제된 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원을 정제하기 위하여, 표면항원 단백질 정제 시의 계면활성제 처리량을 인플루엔자 바이러스에 대한 전체 단백질 정량법(Total protein quantification assay)에 기반하여 결정하는 단계;
e) 상기 d) 단계에서 결정된 조건에 따라 계면활성제를 처리하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 계면활성제(Detergent)를 사용하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 방법에 있어서, 상기 계면활성제는 샘플링(sampling)한 인플루엔자 바이러스의 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 구한 후 하기 식 1에 대입하여 수득된 값으로 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스에 처리되는 계면활성제 처리량이 결정되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다:
[식 1]
계면활성제 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d
(상기 식에서,
a는 0.005~0.100(v/v%) 이고,
b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,
c는 처리되는 계면활성제 스탁(stock)의 농도(w/v%)이고,
d는 계면활성제를 처리할 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 용량이다.)
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 제1 정제 조건 결정법 및 제2 정제 조건 결정법을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인플루엔자 항원 정제 조건 신속 확인 시험 방법을 제공한다:
제1 정제 조건 결정법으로서, 인플루엔자 바이러스 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계에서 사용되는 것으로, 상기 인플루엔자 바이러스 정제 시의 조건은 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 기반하여 결정되는 제1 정제 조건 결정법; 및
제2 정제 조건 결정법으로서, 계면활성제를 사용하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계에서 사용되는 것으로, 상기 표면항원 단백질 정제 시의 계면활성제 처리량은 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 전체 단백질 정량법(Total protein quantification assay)에 기반하여 결정되는 제2 정제 조건 결정법
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 백신 제조방법으로서, 상기 단계는 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 구한 후 하기 식 1에 대입하여 수득된 값으로 계면활성제를 처리하는 조건하에 수행되는 것인 방법을 제공한다:
[식 1]
계면활성제 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d
(상기 식에서,
a는 0.005~0.100(v/v%) 이고,
b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,
c는 처리되는 계면활성제 스탁(stock)의 농도(w/v%)이고,
d는 계면활성제를 처리할 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 용량이다.)
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법을 제공한다:
a) 인플루엔자 바이러스를 세포에 감염시키고 배양하여 바이러스 배양물을 수득하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하기 위하여, 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 기반하여 정제 조건을 결정하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 결정된 조건에 따라 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계;
d) 상기 c) 단계에서 정제된 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원을 정제하기 위하여, 표면항원 단백질 정제 시의 계면활성제 처리량을 인플루엔자 바이러스에 대한 전체 단백질 정량법(Total protein quantification assay)에 기반하여 결정하는 단계;
e) 상기 d) 단계에서 결정된 조건에 따라 계면활성제를 처리하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인플루엔자 표면항원을 포함하는 백신 제조 방법에 있어서, 백신 제조 기간이 단축된 것을 특징으로 하는, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
a) 인플루엔자 바이러스를 세포에 감염시키고 배양하여 바이러스 배양물을 수득하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하기 위하여, 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 기반하여 정제 조건을 결정하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 결정된 조건에 따라 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계;
d) 상기 c) 단계에서 정제된 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원을 정제하기 위하여, 표면항원 단백질 정제 시의 계면활성제 처리량을 인플루엔자 바이러스에 대한 전체 단백질 정량법(Total protein quantification assay)에 기반하여 결정하는 단계;
e) 상기 d) 단계에서 결정된 조건에 따라 계면활성제를 처리하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 계면활성제(Detergent)를 사용하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 방법에 있어서, 상기 계면활성제는 샘플링(sampling)한 인플루엔자 바이러스의 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 구한 후 하기 식 1에 대입하여 수득된 값으로 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스에 처리되는 계면활성제 처리량이 결정되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다:
[식 1]
계면활성제 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d
(상기 식에서,
a는 0.005~0.100(v/v%) 이고,
b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,
c는 처리되는 계면활성제 스탁(stock)의 농도(w/v%)이고,
d는 계면활성제를 처리할 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 용량이다.)
인플루엔자 바이러스의 비리온(virion) 구조는 가장 바깥쪽에 이중 지방층으로 이루어진 외피(envelop)가 있고, 여기에 2 개의 표면 당단백질(glycoprotein)이 돌출되어 있는 데 하나는 기둥 모양의 혈구응집소인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)이고, 다른 하나는 버섯 모양의 뉴라민 분해효소인 뉴라미니다제(neuraminidase, NA)이다.
본 발명이 제공하는 상기 방법은 계면활성제를 처리하여 인플루엔자 바이러스의 표면 항원인 상기 헤마글루티닌과 뉴라미니다제를 분리하여 정제하는 방법에 있어서, 인플루엔자 바이러스의 표면 항원을 바이러스 코어(core)로부터 분리하는데 사용되는 계면활성제의 최적 처리량을 빠르게 산출하여 인플루엔자 바이러스 표면 항원 정제 조건을 단기간에 확립할 수 있도록 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 “계면활성제”는 “세제”와 상호 교환가능하게 사용되며, 상기 계면활성제는 당업계에서 바이러스의 표면 항원을 분리, 정제하기 위해 사용되는 것이라면 그 종류가 제한되지 않으며, 예를 들어 비-이온성 또는 이온성(예를 들어, 양이온성) 계면활성제가 포함될 수 있다. 상기 계면활성제의 비제한적인 예시로는 알킬글리코시드, 알킬티오글리코시드, 아실, 당, 술포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-글루카미드, 헤카메그(Hecameg), 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올, 4차 암모늄 화합물, 사르코실, CTAB(브롬화 세틸 트리메틸 암모늄), 트리-N-부틸 포스페이트, 세타블론(Cetavlon), 미리스틸트리메틸암모늄 염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOTMA, 옥틸- 또는 노닐-페녹시 폴리옥시에탄올 (예를 들어, Triton X-1OO 또는 Triton N101과 같은 Triton 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(Tween 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르가 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시양태에서, 상기 계면활성제는 양이온성 계면활성제일 수 있다.
본 발명의 더욱 바람직한 일 실시양태에서, 상기 계면활성제는 CTAB일 수 있다.
본 발명의 상기 인플루엔자 바이러스는 분자생물학적 특성에 따라 A, B 및 C 형을 포함한다. 바람직하게는, 상기 인플루엔자 바이러스는 A 또는 B형일 수 있다. 이 중에서 상기 A형 인플루엔자 바이러스는 표면 항원인 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다제(NA) 당단백질의 종류에 따라 다양한 아형으로 구분이 가능하다. 보다 구체적으로 A형 인플루엔자 바이러스의 표면 항원은 18종류의 헤마글루티닌 및 11종류의 뉴라미니다제가 공지되어 있기 때문에 산술적으로 총 198종의 A형 인플루엔자 바이러스 아형이 존재할 수 있으며, 이들 모두는 본 발명의 인플루엔자 바이러스에 포함이 되는 것으로 이해될 수 있다.
한편, 상기 주요 항원인 상기 HA 및 NA가 기존에 공지된 것과 전혀 다른 새로운 아형으로 변화되는 항원 대변이(antigenic shift), 또는 상기 HA 및 NA 유전자 수준에서 점상 돌연변이(point mutation)가 축적되어 소수의 아미노산이 변화되는 항원 소변이(antigenic drift)를 포함하여, 현재까지 공지된 아형 뿐 아니라 장래에 밝혀질 새로운 아형의 인플루엔자 바이러스가 제한없이 본 발명의 상기 인플루엔자 바이러스에 포함이 될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자일 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, H7N9, H6N1 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 “샘플링(sampling)한” 인플루엔자 바이러스란 표면 항원 단백질을 발현하는 인플루엔자 바이러스를 숙주세포에서 배양하여 배양물을 제공하는 단계, 상기 배양물을 정제 및/또는 농축하는 단계, 및 상기 배양물에 포함된 인플루엔자 바이러스를 불활성화 하는 단계로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단계를 거친 것을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 샘플링이란 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 인플루엔자 바이러스가 처리된 것을 의미하는 것일 수 있다:
(a) 인플루엔자 바이러스가 증식할 수 있는 세포 기반 바이러스 증식 배양액 또는 유정란 기반 바이러스 증식 배양액을 제공하는 단계;
(b) 상기 배양액을 청징화하여 인플루엔자 바이러스를 포함하는 배양물을 얻는 단계;
(c) 선택적으로, 상기 배양물을 정제하고, 선택적으로, 농축하는 단계; 및
(d) 선택적으로, 상기 배양물에 포함된 인플루엔자 바이러스를 불활성화하는 단계.
상기 (a)에서는 인플루엔자 바이러스를 포함하는 배양액이 제공된다. 이러한 배양액은 세포 기반 바이러스 증식 배양액 또는 유정란 기반 바이러스 증식 배양액으로부터 유래될 수 있다. 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 바와 같이, 바이러스는 세포-기반 배양 시스템에서 또는 유정란 기반 배양 시스템에서 증식될 수 있다. 인플루엔자 바이러스를 성장시키기 위해 사용되는 적합한 세포주는 전형적으로 포유동물 기원의 것이고, 따라서, 포유동물 세포주, 바람직하게는 동물 세포주를 나타낸다. 적합한 동물 세포주는 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있고, 햄스터, 소, 영장류(사람 및 원숭이 포함) 및 개 기원의 세포주를 포함할 수 있다. 상기 세포주의 비제한적인 예시로서, 포유동물 세포주의 세포는 Vero, PerC6, BHK, 293, COS, PCK, MRC-5, MDCK, MDBK, WI-38, 및 이들의 무혈청 적응 세포 등이 포함될 수 있다. 바람직하게 상기 세포주는 MDCK 세포일 수 있다.
또한, 상기 인플루엔자 바이러스는 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 임의의 적합한 방법에 따라 세포 상에 성장될 수 있다. 세포 기반 배양 시스템의 경우, 임의의 적합한 매질이 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 세포는 혈청-불포함 및/또는 단백질-불포함 매질에서 배양될 수 있다. 세포-기반 바이러스 증식의 경우, 일반적으로 바이러스 또는 생 바이러스 제제는 각각 이들이 증식하는 세포 배양액에 접종된다. 바이러스 증식은 뱃치 방식, 또는 공급-뱃치 방식, 또는 관류 방식으로 이루어질 수 있다.
대안적으로, 상기 인플루엔자 바이러스는 유정란 기반 시스템에서 증식될 수 있다. 유정란 기반 제조에 있어서, 일반적으로 종자 바이러스(working seed virus)를 산란계의 발육란에 주사한다. 바이러스는 상기 발육란의 요막액에서 증식하기 시작하여 바이러스의 양이 증가된다. 예를 들어, 2 내지 3일의 항온배양 후, 상기 발육란은 2 내지 8℃로 냉각시키고, 각각의 발육란의 요막액을 수확하고, 수동 또는 자동화된 진공 수확 시스템을 이용하여 풀링한다(pooling). 수집된 바이러스 함유 요막액은 바이러스를 포함하는 유정란-기반 배양액이고, 후속적인 정제 프로세스에서 더 프로세싱된다.
인플루엔자 바이러스 증식에 사용된 배양 시스템에 따라, 증식된 바이러스 입자를 포함하는 배양액은 상이한 오염물질을 함유할 수 있다. 예를 들면, 유정란 기반 배양액에 존재하는 잠재적 오염물질은 유정란 기반 단백질, 예를 들면, 유정란 알부민, 또는 항생제이고, 반면에 세포 기반 배양액에 존재하는 전형적인 오염물질은 잔존하는 숙주세포 DNA이다. 바람직하게는, 본 발명이 제공하는 방법은 인플루엔자 바이러스 증식에 사용되는 시스템과 관련하여 제한되지 않고; 세포 기반 배양 시스템에서 및 마찬가지로 유정란 기반 배양 시스템에서 증식된 바이러스를 포함하는 배양액을 처리한 것이 모두 적용이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 (a) 단계의 배양액은 일회용 생물반응기를 사용함으로써 제조될 수 있다. 이러한 일회용 생물반응기를 사용함으로써, 예를 들면, 얻어진 생성물 자체는 예를 들면, 품질 및/또는 순도의 관점에서 향상될 수 있다. 이는 특히 상기 방법이 대규모로, 예를 들면, 공업 규모로 수행되는 경우에 이로울 수 있다.
상기 인플루엔자 바이러스를 포함하는 세포-기반 또는 유정란-기반의 배양액은 청징화될 수 있다((b) 단계). 청징화 단계는 바이러스 입자를 포함한 배양액에 대해 수행되지만, 침강되거나 그 이외의 펠렛화된 물질에 대해서는 수행되지 않는다. 본 발명에서, 이러한 청징화 단계의 목적은 배양액으로부터 입자상 물질, 예를 들면, 세포 잔해, 단백질 불순물 및/또는 세포를 성장시키기 위해 사용된 지지 물질, 예를 들면, 미세담체를 제거하는 것이다. 상기 단백질 불순물은 예를 들면, 알란토인, 콜라겐 및/또는 알부민, 예를 들면, 오브알부민일 수 있다. 청징화를 위해, 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 임의의 적합한 수단 또는 방법이 사용될 수 있다. 특히, 접선 유동 여과(TFF), 심층 여과, 또는 원심분리를 적용할 수 있다. 이로써, 각각 적용된 청징화 수단(TFF, 심층 여과, 원심분리)의 각각의 설정은, 상기 나타내어진 목적이 도달되도록 하는 방식으로 선택된다. 일반적으로, 이러한 목적이 주어지는 경우, 각각의 수단에 대한 각각의 상기 설정은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있다.
본 발명에서, 상기 방법에 따라 얻어진 청징화된 배양액은 "바이러스 배양물"로서 지칭될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 바이러스 배양물이 본 발명에서 제공하는 상기 “샘플링한 인플루엔자 바이러스”일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 “샘플링한 인플루엔자 바이러스”는 상기 (b) 단계 이후에 이하의 (c) 단계 및/또는 (d) 단계를 추가로 수행한 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 (c) 단계 배양물의 정제는 바이러스 항원을 특이적으로 정제하기 위한 적합한 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 정제 방법은 예를 들면, 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 의사-친화성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 액체-액체 크로마토그래피 등이다. 한 실시형태에서, 바람직한 정제 방법은 친화성 크로마토그래피이며, 더 바람직한 정제 방법은 셀루핀 설페이트(cellufine sulfate, CS)를 담체로 사용한 친화성 크로마토그래피이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 (c) 단계에서 배양물을 정제할 때 CS 친화성 크로마토그래피를 이용할 경우 칼럼 치수의 선택은 숙련 기술자에 의해 결정될 수 있다. 상기 CS 친화성 크로마토그래피에서, CS 칼럼은 인플루엔자 바이러스 여과액을 로딩하기 위해 평형용완충액을 사용하여 평형화될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, CS 칼럼은 평형용 완충액을 사용하여 평형화 하는데, 평형용 완충액은 10 내지 20mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, pH는 7.0 내지 7.6 일 수 있다.
상기 정제과정에서 CS 칼럼에 부착된 인플루엔자 바이러스는 용출용 완충액으로 용출될 수 있다. 본 발명의 한 실시예에서, CS 칼럼에 부착된 인플루엔자 바이러스는 중성 pH에서 0.01 내지 1.0M 농도의 염화나트륨을 함유하는 용출용 완충액을 칼럼에 투입했을 때 칼럼에 결합된 인플루엔자 바이러스를 용출할 수 있었다. 용출용 완충액의 pH는 6.5내지 7.4일 수 있으며, 0.1 내지 6.0M 염화나트륨을 함유할 수 있다.
또한, 상기 정제 과정에서 CS 칼럼에 결합한 임의의 단백질을 세척 제거하기 위하여 1.0 내지 3.0 M 염화나트륨을 함유하는 용출용 완충액을 사용하여 세척할 수 있다. 사용이 완료된 CS 칼럼은 임의로 세척되고, 적절한 작용제 중에서 저장될 수 있으며, 임의로 재사용될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 (c) 단계의 농축은 적합한 방법에 의해 달성될 수 있다. 상기 방법은 바이러스 배양물의 용적을 감소시키는 것을 유도한다. 상기 농축 단계는 인플루엔자 바이러스를 포함하는 배양물의 용적을 감소시켜 농축된 배양물을 얻는 것을 목표로 한다.
바람직한 양태에서, TFF 한외여과 또는 단일 단계로의 TFF 한외여과와 투석여과(TFF 한외여과/투석여과)를 적용함으로써 용적을 감소시킬 수 있고, 용적을 감소시키기 위해 초원심분리 또는 침전, 바람직하게는 TFF 한외여과를 사용할 수 있다. 이로써, 각각 적용된 농축 수단(TFF, TFF 한외여과/투석여과, 초원심분리 또는 침전)의 각각의 설정은 상기 나타낸 목적, 즉 용적 감소 및 인플루엔자 바이러스의 농축이 달성되는 방식으로 선택된다.
다른 실시형태에서, 초원심분리를 사용하여 용적을 감소시키는 경우, 초원심분리의 조건은 예를 들면, 10분 초과 동안 30,000g 내지 200,000g일 수 있다.
다른 실시형태에서, 침전을 적용함으로써 농축이 수행되는 경우, 적합한 화학물질은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있고, 예를 들면, 각각 적절한 농도로의 염, 메틸 및 에틸 알콜 및 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 절적한 농도로의 적합한 화학물질은 생성물, 예를 들면, 바이러스 항원 함유 입자를 침전시키지만, 상기 바이러스 항원에 대한 부정적인 효과는 없거나 최소이다. 화학물질은, 목적하는 항원, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스 표면 항원 단백질과 반응하지 않고 원하는 항원의 면역원성을 변경하지 않도록 선별된다.
일 실시양태에서, 상기 농축 단계에서 바이러스 배양물의 용적은 4배 이상, 바람직하게 5배 이상, 또는 9배 이상, 또한 바람직하게 12배 이상, 또한 바람직하게 13배 이상, 또는 15배 이상, 또한 바람직하게 20배 이상, 또는 25배 이상 감소할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 (c) 단계 이후에 바이러스 정제 및/또는 농축된 바이러스 배양물은 불활성화 될 수 있다. 불활성화는 바이러스의 감염성 제거를 초래하고, 전형적으로는 바이러스를 하기 화학적 수단 중 하나 이상의 유효량으로 처리함으로써 수행될 수 있다: 계면활성제(detergent), 포름알데하이드, β-프로피오락톤, 메틸렌 블루, 프소랄렌, 카복시풀러렌(C60), 2급 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민 또는 이들의 조합. 또한, 불활성화 방법은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있고, 예를 들면, 바이러스를 물리적 수단, 예를 들면, 감마 조사 및/또는 UV 광으로 처리함을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 인플루엔자 바이러스의 표면 항원을 분리하기 위해 사용된 것과 동일한 계면활성제를 적용함에 의한 불활성화를 수행하지 않을 수 있다.
이후, 상기 (a) 내지 (d) 단계에 의해 샘플링된 인플루엔자 바이러스 배양물의 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(TPQV)을 구한 후 하기 식 1에 대입하여 수득된 값으로 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스에 처리되는 계면활성제 처리량이 결정되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 1]
계면활성제 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d
(상기 식에서,
a는 0.005~0.100(v/v%) 이고,
b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,
c는 처리되는 계면활성제 스탁(stock)의 농도(w/v%)이고,
d는 계면활성제를 처리할 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 용량이다.)
바이러스 표면항원 백신은 부작용이 적고 순도가 높은 고품질의 백신으로 적절한 계면활성제 처리량 설정이 매우 중요하다. 과량의 계면활성제를 처리할 경우 바이러스 전체가 파쇄되어 불순물인 바이러스 코어 내부 단백질이 외부로 노출되어 순도가 떨어지며, 계면활성제의 처리량이 부족할 경우 대부분의 표면항원이 가용화되지 않아 표면항원의 수율이 떨어진다.
따라서, 본 발명의 일 양태에서, 상기 식에 따라 산출된 계면활성제 처리량은 바이러스 코어(core) 비파괴 상태 또는 바이러스 코어의 파괴가 최소화된 상태로, 인플루엔자 바이러스의 표면 항원만을 선택적으로 가용화하기 위한 농도인 것을 특징으로 한다.
한편, 바이러스 표면 항원의 가용화를 위해 적절한 계면활성제 처리량을 빠른 시간 내에 확인하는 것이 인플루엔자 백신 생산 과정에서 중요한 요소이다. 현재, 인플루엔자 백신의 표면 항원 함량을 측정하기 위해 유럽약전과 세계보건기구(WHO)에서 추천하는 단일방사면역확산법(SRID, single radial immunodifussion)이 국내외에서 공통적으로 사용되고 있으나, 상기 SRID법은 결과를 산출하기까지 소요되는 시간이 지나치게 길다는 한계가 있다.
따라서, 본 발명은 상기 바이러스 배양물 내 헤마글루티닌(HA) 단백질 양에 대한 SRID에 의한 정량 과정이 필요하지 않고, 바이러스 배양물 단위 용량 당 전체 단백질 정량값에 기초하여 첨가하는 계면활성제의 처리량을 결정하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 방법에서 바이러스 배양물 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(TPQV)은 당업계에서 단백질 함량을 산출하기 위해 사용되는 임의의 방법에 따라 결정될 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로서 BCA assay, lowry assay 또는 Bradford assay가 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 식 1에서 a값은 단백함량을 기준으로 한 계면활성제 스탁(stock) 처리농도(%)를 의미하는 것으로서, 바이러스의 strain, 바이러스 특성 등에 따라 최적의 계면활성제 처리농도가 상이할 수 있으므로, 0.005~0.100(v/v%) 범위 내 임의의 값에 대하여 SDS-PAGE를 수행하여 바이러스에 따른 적절한 계면활성제 스탁(stock) 처리농도(%)를 확인할 수 있다. 구체적으로는, 바이러스 용액을 소량씩 소분하여 상기 수치범위 내 임의의 값에 대하여 계면활성제를 처리한 후, 초고속원심분리를 수행하여 표면항원 단백질은 상등액으로 회수되고, 바이러스 코어 단백질은 침전물로 분리되는 최적의 계면활성제 처리농도를 확인함으로써 결정될 수 있다.
본 발명에서 상기 b값은 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택된다. 예를 들어, 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 TPQV가 220 μg/mL이라면 상기 수치 중 가장 가까운 값인 200이 상기 b값이 되며, TPQV가 370 μg/mL이라면 상기 수치 중 가장 가까운 값인 400이 상기 b값이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 TPQV는 전술한 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 농축 정도에 따라서 달라질 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 식 1에 따라 최적의 계면활성제 처리량을 결정하기 위해서는 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 TPQV가 50 내지 950 μg/mL 일 수 있도록 농축된 인플루엔자 바이러스 배양물을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 하기 제1 정제 조건 결정법 및 제2 정제 조건 결정법을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인플루엔자 항원 정제 조건 신속 확인 시험 방법을 제공한다:
제1 정제 조건 결정법으로서, 인플루엔자 바이러스 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계에서 사용되는 것으로, 상기 인플루엔자 바이러스 정제 시의 조건은 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 기반하여 결정되는 제1 정제 조건 결정법; 및
제2 정제 조건 결정법으로서, 계면활성제를 사용하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계에서 사용되는 것으로, 상기 표면항원 단백질 정제 시의 계면활성제 처리량은 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 전체 단백질 정량법(Total protein quantification assay)에 기반하여 결정되는 제2 정제 조건 결정법.
본 발명의 일 양태에서, 상기 제1 정제는 전술한 (c) 단계의 바이러스 배양물 정제 단계와 대응된다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 제1 정제는 바이러스 배양물 내 헤마글루티닌(HA) 단백질의 양에 대하여 SRID(single radial immunodiffusion)에 의한 정량 과정이 필요하지 않은 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 인플루엔자 바이러스 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계는 크로마토그래피에 의해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 크로마토그래피는 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 의사-친화성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 액체-액체 크로마토그래피 등을 포함한다. 한 실시형태에서, 바람직한 상기 정제 방법은 친화성 크로마토그래피이며, 더 바람직한 정제 방법은 셀루핀 설페이트(cellufine sulfate, CS)를 담체로 사용한 친화성 크로마토그래피이다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 제1 정제는 칼럼을 통과한 인플루엔자 바이러스 배양물이 레진에 가장 잘 결합할 수 있는 조건을 확인 후, 최적의 수율과 순도로 결합된 바이러스를 분리 정제할 수 있는 용출조건까지 선정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 제1 정제 조건 결정법은 상기 인플루엔자 바이러스 배양물을 평형용 완충액으로 다양한 비율을 적용하여 희석하고 크로마토그래피 칼럼에 적용한 후, 서로 다른 조건에서 칼럼을 통과한 칼럼 통과액을 각각 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay)에 적용하여 헤마토글루티닌(HA) 역가가 가장 낮은 조건을 선정하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 적혈구 응집 반응법을 수행한 결과 상기 칼럼 통과액의 HA 역가가 높다면 바이러스 배양물 내 바이러스가 칼럼에 결합하지 못하고 그대로 통과하는 조건이므로 바람직하지 않다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 제1 정제 조건 결정법은 상기 인플루엔자 바이러스 배양물을 평형용 완충액으로 다양한 비율을 적용하여 희석하고 서로 다른 조건에서 크로마토그래피 칼럼에 적용한 후 용출용 완충액을 이용하여 칼럼과 결합된 인플루엔자 바이러스를 용출하고, 각 조건에 따른 용출액을 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 적용하여, HA 역가가 가장 높고 SDS-PAGE 상에서 헤마글루티닌 밴드가 가장 두꺼운 조건을 선정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 제1 정제 조건은 바이러스 배양물을 칼럼에 통과시켰을 때 바이러스가 레진과 가장 잘 결합하는 조건 및 레진에 결합한 바이러스를 용출하는 과정에서 바이러스를 가장 잘 용출할 수 있는 조건의 조합인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 바이러스가 레진과 가장 잘 결합하는 조건은 칼럼을 통과한 칼럼 통과액을 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 적용하여 선정할 수 있으며, 상기 레진에 결합한 바이러스를 용출하는 과정에서 바이러스를 가장 잘 용출할 수 있는 조건은 칼럼을 통과한 용출액을 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 적용하여 선정할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 제1 정제 조건 결정법은 서로 다른 조건에서 크로마토그래피 칼럼을 통과한 바이러스 배양물(즉, 칼럼 통과액)을 적혈구 응집 반응법, SDS-PAGE 또는 이의 조합에 적용하여 인플루엔자 바이러스가 가장 적게 손실이 되는 조건을 선정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 조건은 완충액의 종류, 완충액의 농도, 완충액의 pH 및 전도도로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는, 상기 조건은 완충액의 pH 또는 전도도일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 제1 정제에 사용되는 완충액의 pH를 7.0~7.4로 유지하여 단백질의 안정성을 높이며, 전도도를 낮춰가면서 바이러스가 레진과 가장 잘 결합하는 조건을 탐색하였다. 인플루엔자 바이러스 배양 공정에서 확보된 인플루엔자 바이러스 배양물의 전도도는 약 10.0~15.0 mS/cm으로, 이를 전도도가 낮은 인산나트륨 완충액으로 희석하여 칼럼에 로딩할 시료의 전도도를 낮춰가면서 결합능을 확인하였다. 신속한 정제 조건 확인을 위하여 정제 조건 중 하나로 설정되는 pH를 제외하고 전도도만 조정하는 방식으로 정제 조건 확인에 필요한 시간과 변수를 줄였다.
일반적으로 전도도를 낮출수록 인플루엔자 바이러스는 레진에 잘 결합하는 것으로 알려졌으나, 전도도를 낮출 경우 투입되는 인산나트륨 완충액 용량과 크로마토그래피 공정 시간이 증가하게 되어 생산기간과 생산비용도 증가하므로 적절한 전도도를 확인하는 것이 중요하다. 이에, 본 발명의 일 실시예에서는 인산나트륨 완충액을 이용하여 바이러스 배양액을 0.5~4배 희석하는 방식으로 10.0 mS/cm 이하로 전도도를 낮춰가면서, 결합능이 적절한지 확인하기 위하여 칼럼을 통과하는 바이러스 배양물에 대해서 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay)을 실시하였다. 적혈구 응집 반응법을 수행할 경우, 1시간 이내에 시험 결과를 확인할 수 있어 각 조건에 따른 정제 결과가 1일 이내에 확인이 되었다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 레진에 결합된 인플루엔자 바이러스의 용출은 레진과 인플루엔자 바이러스의 결합을 분리할 수 있는 적절한 농도의 완충용액을 이용하여 최적의 전도도를 탐색하는 방식으로 진행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 2~5 M 염화나트륨 완충액/linear gradient 조건으로 염농도를 높여 가며 완충액을 칼럼에 투입한 결과, 바이러스 및 단백질 등이 용출되면서 UV280 피크가 나타났으며, 상기 분획들을 회수 분석하여 바이러스가 포함되어 있는 분획의 전도도와 염농도를 확인하였다. 상기 2~5 M 염화나트륨 완충액과 평형용 완충액을 이용한 step gradient 조건으로 바이러스를 용출하여 해당 용출 농도에서 대부분의 인플루엔자 바이러스가 용출되는지 확인한 후 바이러스 용출 조건을 확립하였다. 바이러스가 고수율, 고순도로 용출되는지 확인하기 위하여 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay) 및/또는 SDS-PAGE를 수행하였다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 제2 정제 조건 결정법은 상기 제1 정제를 거쳐 수득된 인플루엔자 바이러스 배양물 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 구한 후 하기 식 1에 대입하여 수득된 값으로 바이러스 용액에 처리할 계면활성제의 처리량이 결정되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 1]
계면활성제 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d
(상기 식에서,
a는 0.005~0.100(v/v%) 이고,
b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,
c는 처리되는 계면활성제 스탁(stock)의 농도(w/v%)이고,
d는 계면활성제를 처리할 바이러스 용액의 용량이다.)
본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 백신 제조방법으로서, 상기 단계는 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 구한 후 하기 식 1에 대입하여 수득된 값으로 계면활성제를 처리하는 조건하에 수행되는 것인 방법을 제공한다:
[식 1]
계면활성제 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d
(상기 식에서,
a는 0.005~0.100(v/v%) 이고,
b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,
c는 처리되는 계면활성제 스탁(stock)의 농도(w/v%)이고,
d는 계면활성제를 처리할 바이러스 용액의 용량이다.)
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법을 제공한다:
a) 인플루엔자 바이러스를 세포에 감염시키고 배양하여 바이러스 배양물을 수득하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하기 위하여, 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 기반하여 정제 조건을 결정하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 결정된 조건에 따라 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계;
d) 상기 c) 단계에서 정제된 인플루엔자 바이러스 용액으로부터 표면항원을 정제하기 위하여, 표면항원 단백질 정제 시의 계면활성제 처리량을 인플루엔자 바이러스 용액에 대한 전체 단백질 정량법(Total protein quantification assay)에 기반하여 결정하는 단계;
e) 상기 d) 단계에서 결정된 조건에 따라 상기 바이러스 용액에 계면활성제를 처리하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계.
본 발명의 일 양태에서, 상기 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법은 b) 단계 이전에, 바이러스 배양물에서 세포(cell) 및 세포 잔해물(cell debris)을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 바이러스 배양물에서 세포(cell) 및 세포 잔해물(cell debris)의 제거는, 여과, 투석 및 원심분리로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 b) 단계는 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay) 및 SDS-PAGE에 기반하여 정제 조건을 결정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법은 c) 단계 이후에 한외여과 및 정용여과로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 방법에 의한 추가의 정제 과정을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 e) 단계는 계면활성제 처리 후 원심분리(바람직하게는, 초원심분리)하여 상등액을 회수하는 방법으로 표면 항원 단백질을 분리하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 계면활성제 처리에 의해 바이러스 코어로부터 분리된 표면 항원 단백질을 원심분리에 의해 효율적으로 분리할 수 있다. 이러한 분리는 바이러스 코어를 펠렛화함으로써, 예를 들면, 초원심분리에 의해 수행될 수 있다. 바이러스 표면 단백질, 예를 들면, 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제는 상등액에 존재하고, 바이러스 코어는 펠렛에 존재할 수 있다. 바이러스 코어를 펠렛화하기 위해 선택된 원심분리 조건은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들면, 초원심분리는 뱃치 방식, 또는 연속 방식 중 어느 하나일 수 있고, 사용된 초원심분리 조건은 각각 적합한 온도에서, 예를 들면, 2 내지 25℃, 보다 바람직하게는 2 내지 8℃에서 10분(min.) 초과 동안 30,000g 내지 10분 초과 동안 200,000g에서 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법은 e) 단계 이후에 계면활성제 제거 과정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 계면활성제의 제거는 이러한 목적에 적합한 임의의 방법에 의해, 예를 들면, 앰버라이트 또는 TFF 처리에 의해 수행될 수 있다. 앰버라이트 처리를 이용하는 경우, 단계 e) 단계가 수행된 후, 예를 들어, 바이러스 코어를 펠렛화한 후에 수집된 상등액에 앰버라이트를 양이온성 계면활성제의 질량에 대한 앰버라이트 질량비 약 1:1 내지 100:1로 첨가하고, 적합한 온도, 예를 들면, 2 내지 8℃의 범위 내인 온도에서 적합한 시간 동안, 예를 들면, 8 내지 24시간, 적합하게는 16시간 동안 항온배양한다. 이어서, 앰버라이트는 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들면, 종래 유동 여과/전량 여과(dead end filtration), 체, 또는 TFF를 사용함으로써 제거될 수 있다. 필터가 사용되는 경우, 5㎛ 보다 크거나 7㎛보다 큰 입자를 유지할 수 있는 방식으로 선택되는 것이 바람직하다. 또한, 앰버라이트는 체를 이용함으로써 제거될 수 있다. 적절한 체의 개구는 0.1 내지 200㎛의 범위 내이고, 바람직하게는 150㎛ 미만이고, 보다 바람직하게는 100㎛ 미만일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, Amberlite XAD-4(거대망상 가교 방향족 폴리머)를 첨가하여 계면활성제로 사용된 CTAB를 제거하였다. CTAB는 분자량이 크고 이온성을 띄는 관계로 직접 흡착 시켜 제거하는 방법을 실시하였다. 초고속원심분리 상층액에 Amberlite XAD-4를 처리하여 CTAB을 흡착시키며, 2~8℃ 냉장조건에서 3시간 이상 교반하며 반응시킨 후, 0.22μm 필터로 여과하여 Amberlite XAD-4를 제거하였다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법은 e) 단계 이후에 DNA와 같은 불순물 제거를 위한 추가의 크로마토그래피 수행 과정을 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 의사-친화성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 액체-액체 크로마토그래피 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피, 가장 바람직하게는 TMAE(트리메틸아미노에틸) 음이온 교환 크로마토그래피일 수 있다. DNA는 음이온을 띄고 있으므로 음이온 교환 레진에 결합하는 특성을 이용하여 용이하게 분리, 제거가 가능할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 TMAE 칼럼은 평형용 인산나트륨 완충액을 사용하여 평형화 할 수 있으며, 평형용 완충액은 1 내지 20mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, pH는 6.8 내지 7.6 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, DNA는 레진에 결합시키고 인플루엔자 표면항원을 칼럼 통과액으로 회수하기 위하여 pH는 6.5 내지 7.4, 및 1 내지 6M 염화나트륨을 포함하는 인산나트륨 완충액을 Amberlite XAD-4 흡착 여과 공정이 완료된 상태의 인플루엔자 표면 항원 공정액에 첨가하여 전도도를 조정하였고, 30 내지 120 mS/cm 전도도에서 적절한 수준의 표면 항원 회수율을 확인할 수 있었다.
본 발명의 다른 일 양태에서 상기 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법은, 상기 불순물 제거를 위한 크로마토그래피 이후에 한외여과 및 정용여과로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 방법에 의한 추가의 정제 과정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한 인플루엔자 표면항원을 포함하는 백신 제조 방법에 있어서, 백신 제조 기간이 단축된 것을 특징으로 하는, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
a) 인플루엔자 바이러스를 세포에 감염시키고 배양하여 바이러스 배양물을 수득하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하기 위하여, 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 기반하여 정제 조건을 결정하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 결정된 조건에 따라 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계;
d) 상기 c) 단계에서 정제된 인플루엔자 바이러스 용액로부터 표면항원을 정제하기 위하여, 표면항원 단백질 정제 시의 계면활성제 처리량을 인플루엔자 바이러스 용액에 대한 전체 단백질 정량법(Total protein quantification assay)에 기반하여 결정하는 단계;
e) 상기 d) 단계에서 결정된 조건에 따라 상기 바이러스 용액에 계면활성제를 처리하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계.
본 발명의 일 양태에서, 상기 a) 단계에서 바이러스 감염에 사용될 세포 또는 a) 단계에서 바이러스로 감염된 세포는 일회용 생물반응기(single-use bioreactor; SUB)에서 배양되는 것을 특징으로 할 수 있다. 일회용 생물반응기의 경우, 사용 전 세척 및 멸균하는 과정이 불필요하여 공정 준비시간이 단축되고 오염에 대한 우려가 매우 낮은 장점이 있다. 또한, 사용 후 세척 과정 없이 일회용 생물반응기를 폐기하고 새로운 일회용 생물반응기를 사용할 수 있으므로, 로트 또는 바이러스 strain 간의 교차오염을 방지할 수 있다. 특히, 인플루엔자 백신은 3가 또는 4가 백신으로 3 가지 또는 4 가지의 서로 다른 바이러스를 배양해야 하므로 일회용 생물반응기를 사용할 경우 공정이 매우 단순해지며 strain간의 교차오염을 방지할 수 있어 바람직할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 a) 단계의 바이러스를 세포에 감염시키기 전에, 바이러스 감염에 사용될 세포 배양액에서 연속식 저속원심분리기를 통해 배지의 일부를 신선한 배지로 교환하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이를 통해, 배양액의 회수 및 재투입 과정 없이 연속적으로 세포와 배지를 분리하여 배지를 폐기하고 다시 새로운 배지를 생물반응기에 투입하는 방식으로 배지를 교환할 수 있다. 배지를 전량 회수 후 용기에 소분하여 원심분리를 진행하는 일반적인 방식과 달리, 연속식 저속원심분리기를 사용할 경우 배지교환을 밀폐 시스템에서 진행할 수 있어 오염발생의 가능성을 크게 낮출 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 배지의 일부는 기존 배지의 50 내지 90%, 바람직하게는 60 내지 80%, 가장 바람직하게는 70 내지 80% 폐기하고, 동량의 신선한 배지를 주입하는 것이 특징일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법은 c) 단계 이후에 DNA 절단 효소 처리 과정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 인플루엔자 바이러스 배양에 사용된 세포 유래의 DNA가 상기 바이러스 배양물에 혼입되어 있을 가능성이 있기 때문에, DNA 절단 효소를 처리함으로써 DNA를 100bp 이하의 크기로 절단하여 제거하는 과정이 추가될 수 있다. 본 발명에서 상기 DNA 절단 효소는 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 벤조네이즈(Benzonase),엑소뉴크레아제(Exonuclease), 리보자임(Ribozyme), 또는 이의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법은 c) 단계 이후에 바이러스 불활성화 과정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 바이러스의 불활성화는 계면활성제(detergent), 포름알데하이드, β-프로피오락톤, 메틸렌 블루, 프소랄렌, 카복시풀러렌(C60), 2급 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민 또는 이들의 조합을 처리함으로써 수행될 수 있다. 또한, 상기 불활성화 방법은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 물리적 수단, 예를 들면, 감마 조사 및/또는 UV 광으로 처리함으로써 수행될 수 있다.
기존에 인플루엔자 백신 생산시 표준 시험법으로 사용되고 있는 방사면역확산법을 사용하지 않고도 본 발명 특유의 방법에 따라 신속하고 신뢰성 있게 인플루엔자 표면항원 수득(정제) 조건 확인이 가능하며, 이에 따라 인플루엔자 표면항원 서브유닛 백신 생산 기간이 현저하게 단축되어 신종 인플루엔자가 빠르게 대유행하는 상황에서도 신속하게 백신 개발/제조에 따른 대응이 신속하게 이루어질 수 있다는 기대효과를 가진다.
도 1은 본 발명의 방법에 따라 단백함량을 기준으로 바이러스(B/Maryland/15/2016)에 대한 CTAB 처리량을 결정하고, 이를 불활화 바이러스 배양액에 처리한 후 초고속원심분리 한 상등액 또는 불활화 바이러스액에 포함된 단백을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(HA: Hemagglutinin, NP: Nucleoprotein, M: Matrix protein).
도 2는 CS 칼럼 레진에 대한 바이러스 결합의 최적 조건을 결정하기 위하여 linear gradient 정제 공정 수행 후 SDS-PAGE 및 HA assay를 수행하여 칼럼 통과액으로 헤마글루티닌이 손실을 최소화하는 전도도 조건을 확인한 결과이다(IVR-190 virus, linear gradient purification - 크로마토그램).
도 3은 CS 칼럼 레진에 대한 바이러스 결합의 최적 조건을 결정하기 위하여 linear gradient 정제 공정 수행 후 SDS-PAGE 및 HA assay를 수행하여 칼럼 통과액으로 헤마글루티닌이 손실을 최소화하는 전도도 조건을 확인한 결과이다(IVR-190 virus, linear gradient - 크로마토그램 (Eluate 분획 확대)).
도 4는 CS 칼럼 레진에 대한 바이러스 결합의 최적 조건을 결정하기 위하여 linear gradient 정제 공정 수행 후 SDS-PAGE 및 HA assay를 수행하여 칼럼 통과액으로 헤마글루티닌이 손실을 최소화하는 전도도 조건을 확인한 결과이다(IVR-190 virus, linear gradient purification - SDS-PAGE 결과).
도 5는 본 발명의 방법에 사용되는 HA assay, SDS-PAGE를 수행하여 각 조건에서의 바이러스 용출액을 분석한 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 정제 공정 시, 정제 조건 신속 탐색 전략 신규 수립
인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 정제 공정 시 인플루엔자 바이러스에 계면활성제(이온성 또는 비이온성)를 첨가하여 원심분리 등의 분획수단을 통해 표면항원 단백질을 분리 정제할 수 있으며, 이때 일례로 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)과 같은 이온성 계면활성제를 사용하는 것이 일반적이다.
인플루엔자 바이러스에 처리하는 계면활성제 처리량은 기준은 바이러스 표면항원인 헤마글루티닌 함량에 따라 처리량을 결정하는 것이 바람직하나, 현재 일반적으로 사용되고 있는 표준 HA 함량 시험법인 SRID(단일방사면역확산법)은 약 2~3일 정도의 시간이 소요되므로 공정 중 확인시험으로서 적합하지 않은 측면이 있고, 특히 NIBSC 등에서 SRID 표준품 공급이 이뤄지지 않거나 늦어질 경우 시험을 수행할 수 없다는 단점이 있다.
한편, 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 정제 공정 시 바이러스 코어(core)는 파쇄하지 않고 표면항원인 헤마글루티닌과 뉴라미니데이즈만 선택적으로 분리할 수 있는 계면활성제 처리량은 각 바이러스마다 상이하다. 표면항원 백신은 부작용이 적고 순도가 높은 고품질의 백신으로 적절한 계면활성제 처리량 설정이 매우 중요하다. 과량의 계면활성제 처리는 바이러스 전체가 파쇄되어 불순물인 바이러스 코어 내부 단백질이 외부로 노출되기 때문에 정제 결과물 내의 표면항원 순도가 떨어지며, 계면활성제 처리량이 부족할 경우 대부분의 표면항원이 펠렛(pellet)에 존재하게 되어 표면항원의 수율이 떨어진다. 또한, 적절한 계면활성제 처리량을 빠른 시간 내에 확인하는 것이 인플루엔자 백신 생산 과정에서 중요한 요소가 된다.
본 발명자들은 다양한 분석 기법들을 이용하여 여러 가지 비교 실험 끝에 후술하는 본 발명의 방법을 최초로 발명하여, SRID 방법에 의존하지 않고도 신속하게 표면항원 분리에 적합한 계면활성제 처리 조건 설정이 가능할 뿐만 아니라 실질적으로 기존 표준시험법인 SRID에 기반한 방법과도 유의미한 관계성이 있으며 신뢰성 및 재현성이 뒷받침되는 것을 확인하였다. 이하의 실시예들은 본 발명 특유의 방법에 따른 효과가 기존의 통상적인 공정들로 부터는 예측하기 어려운 특별한 효과임을 뒷받침한다. 이하의 실시예는 대표적으로 계면활성제로서 CTAB를 사용한 일례를 보여주며, 이를 CTCCT(CTAB treatment concentration confirmation test; CTAB 처리량 확인 시험)으로 약칭한다.
1-1. SRID 비의존 표면항원 정제 공정 조건 설정 방법 신규 수립
본 발명자들은 불활화된 인플루엔자 바이러스 농축물로부터 샘플링(sampling)된 인플루엔자 바이러스의 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 이용하여 표면항원 정제 시 최적화된 계면활성제(여기에서 일례로 CTAB) 처리량을 산정하기 위한 알고리즘을 구현함으로써, 하기 식 1과 같은 계산식 관계를 도출하였다. 상기 전체 단백질 정량값(전체 단백질 함량값) 측정은, BCA assay (또는 lowry assay, Bradford assay 등)를 수행하여 1시간 이내로 확인할 수 있었다. 기준이 되는 전체 단백질 정량값은 바이러스의 strain에 따라 다를 수 있으나 본 연구에서 실험에 사용한 불활화 바이러스 농축물의 단백함량을 분석한 결과 200~600 μg/mL로 확인되었으며, 불활화 바이러스액의 단백함량을 측정 후 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900 μg/mL의 수치 중 TPQV 측정값의 근사치에 해당하는 수치를 CTAB 처리를 위한 단백함량의 기준치로 설정하였다. CTAB 처리량은 하기 식 1에 따라 구했으며, 불활화 바이러스액의 단백함량 대비 CTAB 스탁(stock) 처리농도(w/v%)는 0.005%~0.100%(v/v) 내에서 결정되었다.
[식 1]
계면활성제 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d
(상기 식에서,
a는 0.005~0.100(v/v%) 이고,
b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,
c는 처리되는 계면활성제 스탁(stock)의 농도(w/v%)이고,
d는 계면활성제를 처리할 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 용량이다.)
단백함량을 기준으로 한 CTAB 스탁(stock) 처리농도(w/v%)는 strain, 바이러스 특성에 따라 상이하므로 임의의 범위에 대하여 SDS-PAGE를 수행하여 적절한 CTAB 스탁(stock) 처리농도(w/v%)를 확인하여 결정하였다. 즉, 불활화 바이러스액을 소량씩 소분하여 임의의 범위에 대하여 CTAB을 처리 후, 스카이셀플루 제조공정에 따라 30,000rpm 이상 조건에서 초고속원심분리를 수행하여 표면항원 단백질은 상등액으로 회수되고, 바이러스 코어 단백질은 침전물로 분리되는 최적의 CTAB 처리농도를 확인하였다.
확인된 최적의 CTAB 처리농도를 이용하여 제조공정에 적용하였다. 전술한 공정을 수행하여 얻은 샘플(B/Maryland/15/2016 바이러스)을 이용하여 SDS-PAGE를 수행한 결과, 도 1과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 0.01%~0.10% 농도로 CTAB을 처리하였을 때 nucleoprotein, matrix protein 등의 불활화 바이러스액에서 확인되는 헤마글루티닌 외의 불순물이 CTAB 처리 후 초고속원심분리 공정을 진행하였을 때 제거되고 헤마글루티닌만 초고속원심분리 상등액으로 회수되는 것을 확인할 수 있었다.
1-2. 본 발명에 의한 표면항원 정제 공정 조건 설정 방법의 신뢰성 및 재현성 확인 _ 기존 SRID 방법에 기반한 방법과의 상관관계
Figure 112023034303585-pat00012
상기 표 1은 2,000L scale 상업생산 data를 정리한 것으로서 상기 식 1에 따라 계면활성제 처리량을 단백함량을 기준으로 구하고, CTAB 처리 공정을 수행하였다.
더불어 불활화 바이러스액의 HA함량과 불활화 바이러스액에 CTAB 처리 후 초고속원심분리 공정을 수행하여 획득한 초고속원심분리 상등액의 HA함량을 구하여 비교한 결과, 초고속원심분리 상등액의 HA함량이 불활화 바이러스액의 HA 함량 대비 70%~80% 수준으로 충분한 상업성을 확인하였다. HA 회수율을 높이기 위하여 과도하게 CTAB을 처리할 경우, 생산하고자 하는 서브유닛(subunit) 백신이 아닌 분할 백신(split vaccine) 형태로 제조가 될 수 있으므로 적절한 CTAB 처리량을 구하는 것이 매우 중요하다.
따라서, 본 발명에서 확립한 상기 식 1에 따른 계면활성제 처리량 산출 방식이 인플루엔자 바이러스의 표면항원을 정제 과정에서 필요한 CTAB 처리량을 신속하고 정확하게 확인할 수 있는 방식이라는 것이 확인되었다.
1-3. 기존 SRID 방법(비교예 1)에 기반한 정제 조건 설정과, 본 발명에 의한 정제조건 설정 수행시간 비교
상기 실시예 1-2에서 수행된 바와 같이 기존 SRID(방사면역확산법)에 의한 표면항원 정제 조건 설정과, 본 발명의 정제 조건 설정 방법(실시예 1-1 및 실시예 1-2 참조)에 의한 공정 수행시간을 비교한 결과, 하기 표 2에서처럼, 본 발명 방법에 의한 수행시간이 기존 방사면역확산법 보다 훨씬 짧아 인플루엔자 표면항원 정제 조건을 확인하는 데 더 효율적임을 확인할 수 있었다.
Figure 112020044723084-pat00002
실시예 2: 바이러스 배양 이후, 인플루엔자 바이러스 항원 정제 조건 신속 확인 시험 세트(Rapid influenza virus antigen purification condition test set; 약칭 RIVPCT)의 수립
인플루엔자 표면항원을 포함하는 서브유닛(subunit) 백신 생산 공정 중에서 정제 과정은, 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 세포 배양물로부터 인플루엔자 바이러스의 정제 공정 및 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질의 분리 공정의 크게 2개 공정 단계가 필요로 된다. 기존 백신 생산 공정은 상기 2개 공정 단계에서 표준시험법인 단일방사면역확산법(SRID)을 이용하여 공정 조건을 최적화 할 수 있으나, 전술한 바와 같이 SRID는 백신 생산에 있어서 여러 가지 단점이 존재한다. 이에 본 발명자들은 단일방사면역확산법(SRID) 없이 적합한 공정 조건을 설정할 수 있는 신규한 방법을 모색하여 하기 제1 정제 조건 결정법 및 제2 정제 조건 결정법(실시예 1에서 수립된 새로운 전략에 기반)을 세트로 포함하는 인플루엔자 바이러스 항원 정제 조건 신속 확인 시험 세트를 개발하였다. 본 발명에서 제1 정제 조건 결정법 및 제2 정제 조건 결정법의 세트를 본 명세서에서 RIVPCT로 칭한다.
2-1. 제1 정제 조건 결정법 _ 인플루엔자 바이러스 배양물로부터 인플루엔자 바이러스의 분리/정제/농축 시
인플루엔자 바이러스 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계에서 사용되는 정제 조건 설정에 있어서, SRID 측정 없이 바이러스 별로 신속하게 최적 조건을 설정하기 위한 결정법/판별법을 제공한다. 구체적으로, 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플들에 대해 후술하는 본 발명 특유의 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 및 판별기준에 기반하여, 상기 인플루엔자 바이러스 정제 시의 조건을 결정하는 시험법/판단법을 제공한다.
이하의 실시예에서는 대표적으로 바이러스 정제 수단으로서, 크로마토그래피를 사용한 일례를 보여준다. 바이러스 배양액을 크로마토그래피 칼럼에 투입하기 전에, 바이러스 배양액에서 세포 및 세포 잔해물(cell debris)이 1차적으로 제거되는 전처리가 수행될 수 있으며, 이러한 전처리에는 일례로 원심분리, 투석, 여과 등의 방법으로 수행될 수 있다.
크로마토그래피 공정을 진행하기 위하여 인플루엔자 바이러스마다 서로 다르게 조건을 설정할 필요가 있는데 매년 백신 생산 권고주가 변경되는 인플루엔자 바이러스의 특성상, 바이러스주 별로 신속하게 정제 조건을 확인할 필요가 있다. 크로마토그래피 정제 조건을 설정하기 위하여 인플루엔자 바이러스가 레진에 가장 잘 결합할 수 있는 조건을 확인 후, 최적의 수율과 순도로 결합된 바이러스를 분리 정제할 수 있는 용출조건에 대한 시험을 실시한다. 이하에서는 대표적 일례로 Cellufine sulfate(CS) 크로마토그래피 이용 시의 인플루엔자 바이러스 정제 조건(CS 크로마토그래피 컬럼 레진에 대한 목적물의 결합조건 및 용출조건) 결정법을 보여주며, 이를 CSPCT(CS chromatography purification condition test)로 약칭한다.
바이러스가 크로마토그래피 컬럼의 레진에 결합하는 원리는, 인플루엔자 바이러스의 표면단백질과 레진의 sulfate group간의 친화력에 의한 이온결합이며, 일반적으로 전도도와 pH에 따라서 결합능이 결정된다. 본 실시예는 공정에 사용되는 완충액의 pH를 7.0~7.4로 중성을 유지하여 단백질의 안정성을 높이며, 전도도를 낮춰가면서 바이러스가 최대한 결합 가능한 조건을 찾는 것을 예시적으로 보여준다. 일반적으로 수득되는 인플루엔자 바이러스 배양물(액)의 전도도는 약 10.0~15.0 mS/cm으로, 여기에 전도도가 낮은 인산나트륨 완충액으로 희석하여 칼럼에 로딩할 시료의 전도도를 낮춰가면서 결합능을 확인한다. 본 실시예에서는 신속한 공정 조건 확인을 위하여, 일반적으로 정제 조건 중 하나로 설정되는 pH를 제외하고 전도도만 조정하는 간단한 방식으로 정제 조건 확인에 필요한 시간과 변수를 줄이는 것을 예시적으로 보여준다.
일반적으로 전도도를 낮출수록 인플루엔자 바이러스는 CS 레진에 잘 결합하는 것으로 알려졌으나, 전도도를 낮추기 위해 투입되는 인산나트륨 완충액 용량과 CS 크로마토그래피 공정 시간이 증가하게 되어 생산기간과 생산비용도 증가하므로 적절한 전도도를 확인하는 것이 중요하다. 이에, 인산나트륨 완충액을 이용하여 바이러스 배양액을 0.5~4배 희석하는 방식으로 10.0 mS/cm 이하로 전도도를 낮춰가면서, 결합능이 적절한지 확인하기 위하여 칼럼 통과액에 대해서 헤마글루티닌 확인 시험(HA assay)을 실시하였다.
구체적으로, HA assay는 WHO에서 작성하여 배포한 ‘Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza’에 기술되어 있는 protocol을 따라서 수행했다. 상기 방법에 따라 칼럼 통과액의 HA titer 감소 경향을 토대로 로딩시료의 적정 전도도를 확인하였으며, SDS-PAGE도 동시에 수행하여 인플루엔자 바이러스가 칼럼 통과액으로 손실되는지 여부를 각 조건별로 확인하였다.
상기한 바와 같이 CS 컬럼 레진에 대한 바이러스 결합의 최적 조건을 결정한 후에는, 바이러스 용출에 적합한 조건을 찾는다. 레진에 결합된 인플루엔자 바이러스의 용출은 레진과의 결합을 분리할 수 있는 적절한 농도의 염화나트륨을 포함한 완충용액을 이용하여 최적의 전도도를 탐색하는 방식으로 진행하였다. 2~5M 염화나트륨 완충액으로 linear gradient 조건으로 염농도를 높여 가면서 칼럼에 투입하면 바이러스 및 단백질 등이 용출되면서 UV 피크가 나타나는데 이 분획들을 회수하여 바이러스가 포함되어 있는 분획의 전도도와 염농도를 HA assay 및 SDS-PAGE를 수행하여 확인했다. 여기서 확인된 바이러스 용출 조건과, 앞서 확인한 바 있는 바이러스 결합능이 적절할 것으로 판단되는 전도도 조건에 기반하여, 2~5 M 염화나트륨 완충액과 인산나트륨 완충액을 이용한 step gradient 조건으로 바이러스를 용출하여 해당 용출 농도에서 대부분의 인플루엔자 바이러스가 용출되는지 확인 후 바이러스 용출 조건을 확립했다. 바이러스가 고수율, 고순도로 용출되는지 확인하기 위하여 전술한 바와 동일한 방법 및 기준에 의하여 HA assay를 수행하여 확인했다. 상기 확인에는 SDS-PAGE를 동반하여 수행했다.
상기 기술한 바와 같은 일련의 과정으로 수행되는, 회수된 바이러스 배양액으로부터 바이러스를 정제하기 위한 CS 크로마토그래피 공정 조건 시험(CSPCT)은 약 6~12시간 내로 완료될 수 있으며, 매년 백신 생산용 strain이 변경되는 인플루엔자 백신의 특성상 이와 같은 시간 단축은 전체 생산기간 단축과도 연관된다.
크로마토그래피 조건 설정 시에 표준 시험법인 단일방사면역확산법(Single Radial Immunodiffusion technique, 이하 SRID)을 수행하여 칼럼 통과액에서 헤마글루티닌 함량을 확인하는 방식이 가장 정확한 방식이나, 1가지 정제 조건 확인을 위하여 2~3일 정도 소요되어 조건 시험 기간이 상당히 증가하게 되며 NIBSC(National Institute for Biological Standards and Control), TGA(Therapeutic Goods Administration) 등에서 SRID 표준품 공급이 이뤄지지 않거나 늦어질 경우 시험을 수행할 수 없다는 단점이 있다. 본 발명에 따라 HA assay와 SDS-PAGE를 수행할 경우, 3시간 이내에 시험 결과를 확인할 수 있어 각 바이러스에 대한 정제 조건 시험이 1일 이내에 이뤄지므로 매우 신속하며, 표준품 공급 등의 이슈가 없어서 시험 수행에 대한 제약사항이 거의 없다고 볼 수 있다. 전도도를 적절하게 낮추어 인플루엔자 바이러스의 결합능을 확인하고 고수율, 고순도로 바이러스를 용출하는 조건을 12시간 이내로 신속하게 확인하는 방식이 전술한 CSPCT의 특장점이라고 할 수 있으며, 원리와 절차는 전술한 바와 같다.
2-2. 제2 정제 조건 결정법_ 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 분리 정제
인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 분리 정제를 위하여, 대표적으로 본 실시예에서는 계면활성제로서 CTAB를 사용한 일례를 제시한다. CTAB 처리량은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 RIVPCT 중 CTCCT를 수행하여 신속하게 확인하였다.
2-3. 제1 정제 조건 결정법 및 제2 정제조건 결정법에 따른 표면항원 단백질의 정제 효과
SRID를 수행하여 확인한 HA함량을 기반으로 백신 생산에 필요한 정제 공정들에 있어서 필요한 조건을 구할 경우 보다 정확한 정제 조건을 설정할 수 있으나, 본 발명의 RIVPCT에 의하면 백신 생산에 필요한 정제 공정들에 있어서 필요한 조건들을 보다 신속하게 규명할 수 있다는 장점이 있다. SRID를 이용한 방식을 수행 시, 표준품 보유 여부 및 입고 기간을 제외하더라도 2일 이상 소요되므로, 이 소요시간을 단축하고자 SDS-PAGE, HA assay 등을 이용하는 RIVPCT 방식을 발명하게 되었다.
Figure 112020044723084-pat00003
실시예 3: 생산 기간이 단축된, 인플루엔자 서브유닛 백신 생산 공정
3-1. 세포에 인플루엔자 바이러스의 감염 및 배양
1) MDCK(Madin-Darby Canine Kidney cells) 세포 배양
동결 보관 중인 백신생산용 MDCK-Sky3851 세포주 1 바이알을 37℃ 항온수조에서 해동하고 배양 배지를 넣어 희석하였다. 다음에, 희석된 세포를 원심분리하여 배지로부터 세포를 분리한 다음, 다시 신선한 배지로 세포 펠렛을 풀어 주고 샘플을 취하여 세포수 및 생존율을 측정했다. 1x105 내지 5x105개 세포/㎖의 접종 농도로 125mL 스피너플라스크에 세포를 접종하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 80rpm으로 교반하며 3~4일 동안 배양했다.
상기 125mL 스피너플라스크에서 배양 중인 MDCK 세포의 세포수 및 생존율을 측정하고, 500mL 스피너플라스크에서 250mL 규모로 배양을 시작할 수 있을 만큼 세포 배양액을 접종하고 37℃, 5% CO2 조건에서 100rpm으로 교반하며 3~4일 동안 1차 종배양을 진행했다. 세포를 뱃치 과정에서 배양하였고, 세포 배양 배지로서 화학적으로 정의된 배지를 사용하였으며 L-glutamine을 3 내지 6mM/L 농도로 첨가하였다. 1차 종배양 후, 세포수 및 생존율을 측정한 후, 2개의 1L 스피너플라스크에 500mL 규모로 배양을 시작할 수 있을 만큼 세포를 접종하고 1차 종배양과 같은 조건으로 3~4일 동안 배양했다.
상기 500mL 배양 중인 1L 스피너플라스크에서 샘플을 취하여 세포수 및 생존율을 측정한 후, 10L 일회용 세포 배양기에서 5L 규모로 배양을 시작할 수 있을 만큼 1L 스피너플라스크의 배양액을 무균적으로 세포 배양기에 세포를 접종하고 3~4일 동안 배양했다. 스피너플라스크의 세포 배양액을 세포 배양기에 접종하기 위해 필요한 기구와 pH 및 DO probe를 미리 멸균하여 준비하며, pH와 DO probe를 장착하고 배양배지를 투입한 후 온도를 37±1℃로 설정하고 DO값을 보정하여 세포를 접종할 수 있도록 준비했다.
이와 동일한 방법으로, 순차적으로 50L 규모, 100L 규모, 500L 규모 및 2000L 규모까지 순차적으로 세포 배양을 진행하였다.
2) 바이러스 감염
상기 2000L 규모로 배양 중인 세포 배양기의 배양액을 취하여 세포수와 생존율을 측정하고 1x106 내지 3x106개 세포/㎖ 이상의 세포수가 확보되면 존재하는 배양배지를 신선한 배지로 교체하였다. 세포배양용 일회용 백에 연속식 저속원심분리기를 사용하여 세포 배양액 기준 70 내지 80%의 배지를 제거하고 신선한 배지를 다시 투입하는 방법으로 배양배지를 교환했다.
배지 교환 및 바이러스 감염 공정 중 세포 배양기는 내부는 밀폐된 환경이 유지되며, 배지교환에 사용되는 자재는 멸균된 상태의 일회용 백으로 오염발생 가능성이 매우 낮아진다. 해당 공정에 소요되는 공정시간은 10L 규모로 공정 수행 시 3~4시간, 2000L 규모의 상업생산의 경우 7~12시간 정도 소요되었다.
바이러스 감염 및 증식은 DO 50±10%, pH 7.2±0.2 조건에서 실시되었으며, 제조하고자 하는 인플루엔자 바이러스의 제조용 바이러스주를 녹여 0.0001~0.002 MOI로 계산된 만큼의 바이러스와 2.5 내지 20μg/mL 농도의 트립신을 세포 배양기에 무균적으로 투입하여 세포를 감염시키고, 약 3~4일간 배양하였으며 바이러스 역가와 세포수 및 생존율이 적정 수준에 이르면 배양을 종료하고 배양액을 회수했다.
상기 세포 배양 및 바이러스 감염 방법에서는 미세담체가 사용되지 않으며, 특히, 관류 시스템이 아닌 뱃치 세포 배양 시스템(batch cell culture system)으로 세포가 배양되고 바이러스가 증식되었다. 인플루엔자 바이러스는 상기 MDCK-Sky3851에 감염이 된 이후 세포 내에서 증식하여 세포를 터뜨리며 외부로 분출되는 양상을 나타내므로, 관류 시스템으로 세포를 배양할 경우 세포 수가 점점 감소하기 때문에 본 발명의 시스템에 적합하지 않았다.
3-2. 바이러스 배양물로부터 인플루엔자 바이러스 정제를 위한 조건 설정 및 바이러스 정제
1) 원심분리 및 여과
세포배양기 내의 바이러스 배양이 완료되면, 바이러스 배양액을 연속식 저속원심분리기를 이용하여 8,000 내지 20,000rpm 속도로 원심분리하여 상등액을 회수하는 방법으로 세포 및 세포 잔해물을 제거하였다. 회수한 상등액은 1.0/0.5μm 프리필터로 여과 후 0.45μm 크기의 필터로 다시 여과하여 일정한 크기 이상의 큰 입자를 제거하였다.
2) 정제 조건 설정 및 Cellufine sulfate(CS) 친화성 레진을 이용한 인플루엔자 바이러스 정제
여과된 바이러스 배양액은 인플루엔자 바이러스에 친화성이 있는 레진(cellufine sulfate)을 이용하여 1차 크로마토그래피 공정을 진행했다. 평형용 인산나트륨 완충액을 이용하여 칼럼을 평형화 한 후 바이러스 여과액을 투입하였다. 상기 실시예 2-1에 기술한 것과 같은 CSPCT 방법으로 신속하게 정제 조건을 설정하였다. IVR-190(A/Brisbane/02/2018(H1N1) pdm09-like virus)을 이용하여 정제 조건 설정 시험을 수행하였으며, CSPCT 방법과 SRID를 이용한 방법 간의 결과를 비교 분석하였다.
먼저, CS 칼럼 레진에 대한 바이러스 결합의 최적 조건을 결정하기 위하여 linear gradient 정제 공정 수행 후 SDS-PAGE 및 HA assay를 수행하여 칼럼 통과액으로 헤마글루티닌이 손실을 최소화하는 전도도 조건을 확인하였다(도 2 내지 도 4, 표 4).
Figure 112020044723084-pat00004
IVR-190 바이러스 배양액과 평형용 인산나트륨 완충액을 1:1로 희석하여 전도도를 13.03 mS/cm에서 7.54 mS/cm로 낮춰서 linear gradient 정제 조건 시험을 진행하였다. SDS-PAGE 상에서 칼럼 통과액으로 손실되는 HA는 없었으며, HA를 제외한 불순물이 용출되는 것을 확인할 수 있었다. 0.5% chicken RBC를 이용한 HA assay 결과도 모든 칼럼 통과액 분획에서 0 HAU/50μL 가 확인되어 시험에 사용된 로딩 시료의 전도도가 1차 크로마토그래피 정제에 적합함을 확인하였다.
바이러스 용출 농도 확인과 관련하여, 염화나트륨을 포함한 용출용 인산나트륨 완충액과 인산나트륨 완충액을 적절한 비율로 희석해서 투입하여 UV280 peak를 확인하며 용출된 바이러스 분획액을 수집한 결과, 0.1 M∼0.2 M NaCl 농도 조건에서 크로마토그램상 가장 높은 피크(UV280 value)와 HA titer가 확인되는 동시에 0.3 M NaCl 농도 조건까지 피크와 HA titer가 서서히 감소하는 것이 확인되어 수율을 높이기 위해서 바이러스 용출 농도로 0.4 M NaCl이 적당한 것으로 확인되었다. 시험 결과를 종합해보면 CS 칼럼에 로딩할 시료의 전도도로 7.54 mS/cm 수준이면 적당한 것으로 판단되었으며, 바이러스 용출 농도로 0.4 M NaCl이 적당한 것으로 판단되었다.
상기 기술된 CSPCT 방법에 따라 로딩 시료의 전도도 조건을 설정한 후, SRID를 기반으로 한 방법과 비교하기 위하여 바이러스 용출 농도를 0.3 M, 0.35 M, 0.4 M NaCl로 설정하여 step gradient 정제 공정 수행 후 각 batch의 바이러스 용출액의 HA 함량을 비교하였다. 더불어 SDS-PAGE와 HA assay를 수행하여 본 발명의 CSPCT 방법으로 도출되는 결과와 SRID를 이용한 방법 간의 상관관계를 확인하였다.
SRID 수행 결과, 0.4 M NaCl 농도로 바이러스를 용출했을 때 수율과 순도가 가장 좋은 것을 확인할 수 있었다(표 5).
Figure 112020044723084-pat00005
SRID에 사용된 샘플을 사용하여 CSPCT 방법에 사용되는 HA assay, SDS-PAGE를 수행하여 각 조건의 바이러스 용출액을 분석하였다.
도 5의 SDS-PAGE 결과를 참고하면, 바이러스 용출 농도가 증가할수록 HA 밴드가 두꺼워지는 것이 확인되며 이를 통하여 바이러스 용출액에 포함되어 있는 HA가 증가하고 있음을 알 수 있었다. 바이러스 용출액의 HA titer의 경우, 0.3 M, 0.35 M NaCl 농도 조건일 때 1,024 HAU/50μL로 동일하나 0.4 M 조건일 때 2,048 HAU/50μL로 증가하였다. 이와 같이 CSPCT 방법으로 확인된 바이러스 용출 조건 역시 SRID 방법과 동일하게 바이러스 용출 농도가 0.4 M NaCl 임을 확인할 수 있어서 두 방법 간의 상관관계를 확인할 수 있었다(표 6).
Figure 112020044723084-pat00006
한편, 정제과정에 사용되는 평형용 완충액의 pH는 7.0~7.4로 중성을 유지하며, 바이러스 여과액을 평형용 완충액으로 희석하여 바이러스가 최대한 결합 가능한 전도도까지 낮춰준다. 바이러스 배양 종료 시, 바이러스 배양액의 전도도는 약 10.0~15.0 mS/cm으로 여기에 전도도가 낮은 평형용 완충액으로 희석하여 전도도를 낮춰가면서 레진과의 결합능을 확인한 결과, 인플루엔자 바이러스 종류에 따라 차이가 있으나 약 4.0~10.0 mS/cm 조건에서 적절한 수준의 결합능을 보였다.
평형용 완충액으로 희석된 바이러스 여과액을 CS 칼럼에 투입 후, 칼럼에 결합하지 않고 흘러나온 칼럼 통과액은 샘플링 후 폐기하고, 평형용 완충액을 2~3CV 투입하여 칼럼을 충분히 세척한 후 염화나트륨을 포함한 용출용 인산나트륨 완충액과 인산나트륨 완충액을 적절한 비율로 희석해서 투입하여 UV280 peak를 확인하며 용출된 바이러스 분획액을 수집하였다. 인플루엔자 바이러스의 용출은 RIVPCT 중 CSPCT(실시예 2-1 참조)를 수행하여 바이러스와 레진의 결합을 분리할 수 있는 적절한 농도의 염화나트륨을 포함한 용출용 완충액을 확인하여 조건을 확립하였으며, 대부분의 바이러스는 1M 이하의 염화나트륨 농도에서 용출되었다.
3-3. 바이러스 농축 및 탈염
바이러스 용출액을 농축하고 PBS 완충액으로 교환하기 위하여 1차 한외여과를 실시한다. 300 kDa 내지 800 kDa 크기의 한외여과 필터를 사용하여 세포 배양액 부피 기준으로 10% 이하로 농축하고, 농축 부피의 8배 이상의 부피에 해당하는 PBS 완충액으로, PBS 완충액의 전도도와 동일하게 될 때까지 정용여과를 실시하였다.
3-4. 바이러스 농축액 내의 MDCK 세포 유래 DNA 제거
회수된 바이러스 농축액에서 세포주 유래 DNA를 제거하기 위하여 DNA 절단효소인 벤조네이즈(Merck 社)를 0.5 내지 50 U/mL로 처리하고 상온에서 30분~24시간 동안 천천히 교반하면서 반응시켰다. 벤조네이즈의 보조인자로 0.5 내지 5 mM 염화마그네슘육수화물을 첨가하여 벤조네이즈의 활성을 높여주었다.
3-5. 바이러스 불활화
벤조네이즈 반응이 완료된 인플루엔자 바이러스 농축액을 불활성화시켜서 감염성을 제거하였다. 바이러스를 불활화 시키는 화학적 수단은 공지된 수단이라면 무엇이든지 사용가능하며 예를들어 세척제, 포름알데히드, 베타프로피오락톤, 메틸렌 블루, 프소랄렌, 카르복시플러렌(C60) 등이 있으며, 본 실시예에서는 포름알데히드 용액을 0.01~0.1% 수준으로 처리하여 바이러스를 불활화하였다.
3-6. Detergent를 이용한 표면항원 분리
인플루엔자 바이러스에 계면활성제(이온성 또는 비이온성) 또는 용매를 처리함으로써 표면항원 단백질을 분리 정제할 수 있으며, 대표적 일례로서 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)과 같은 이온성 계면활성제를 사용하는 것이 일반적이다.
본 실시예에서도 불활화 바이러스 농축액의 단백함량을 기준으로 CTAB을 처리하였으며, CTAB 처리량은 상기 실시예 2-2에서와 같이 RIVPCT 중 CTCCT를 수행하여 확인하였다. 냉장 또는 상온에서 1시간 이상 반응시킨 후 연속식 초고속원심분리기를 이용하여 30,000rpm 이상 조건에서 원심분리 후 상등액을 회수하여 표면항원 단백질만 분리한다.
초고속원심분리 상등액 내의 CTAB을 제거하기 위하여 흡착용 레진(Amberlite XAD-4)을 상등액에 첨가하여 CTAB을 제거하였다. 그 다음 흡착용 레진은 필터로 여과하여 제거하였다.
3-7. TMAE 음이온교환레진을 이용한 잔류 DNA 제거
숙주제포 유래 DNA을 추가로 제거하기 위하여 음이온 교환 크로마토그래피 레진을 이용하여 2차 크로마토그래피 공정을 진행하였다. 평형용 인산나트륨 완충액을 이용하여 칼럼을 평형화 한 후, 바이러스 표면항원 회수 여과액을 투입한다. 이때 전도도가 높은 1 내지 6 M 염화나트륨이 포함된 인산나트륨 완충액으로 희석하여 표면항원은 레진에 결합하지 않고 DNA는 레진에 결합하는 전도도로 크로마토그래피 공정을 실시하며, 레진에 결합하지 않은 칼럼통과액을 표면항원 분획액으로 회수한다.
3-8. 표면항원 분획액의 농축 및 탈염
표면항원 분획액을 30 내지 50 kDa 크기의 한외여과 필터를 이용하여 농축을 실시하였다. 농축 공정이 완료되면 PBS 완충액을 이용하여 PBS 완충액의 전도도와 동일하게 될 때까지 버퍼교환을 실시하고 농축액을 회수하였다. 회수된 농축액을 0.5/0.2um 필터로 제균여과하여 원액을 생산하고 2~8℃에서 보관하였다.
기존에 인플루엔자 백신 생산시 표준 시험법으로 사용되고 있는 방사면역확산법을 사용하지 않고도 본 발명 특유의 방법에 따라 신속하고 신뢰성 있게 인플루엔자 표면항원 수득(정제) 조건 확인이 가능하며, 이에 따라 인플루엔자 표면항원 서브유닛 백신 생산 기간이 현저하게 단축되어 신종 인플루엔자가 빠르게 대유행하는 상황에서도 신속하게 백신 개발/제조에 따른 대응이 신속하게 이루어질 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

Claims (31)

  1. CTAB(브롬화 세틸 트리메틸 암모늄)를 사용하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 방법에 있어서, 상기 CTAB는 샘플링(sampling)한 인플루엔자 바이러스의 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 구한 후 하기 식 1에 대입하여 수득된 값으로 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스에 처리되는 CTAB 스탁(stock) 처리량이 결정되며, 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 TPQV는 50 내지 950 μg/mL 인 것을 특징으로 하는 방법:
    [식 1]
    CTAB 스탁(stock) 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d
    (상기 식에서,
    a는 0.04~0.08이고,
    b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,
    c는 처리되는 CTAB 스탁(stock)의 농도(w/v%)이고,
    d는 CTAB 스탁(stock)을 처리할 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 용량이다.)
  2. 제1항에 있어서, 상기 CTAB 스탁(stock) 처리량은,
    바이러스 코어(core) 비파괴 상태 또는 바이러스 코어의 파괴가 최소화된 상태로, 만을 선택적으로 분리하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CTAB 스탁(stock) 처리량 결정은,
    샘플 내 헤마글루티닌(HA) 단백질의 양에 대하여 SRID(Single Radial Immunodiffusion)에 의한 정량 과정이 필요하지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 전체 단백질 정량값(TPQV)은 BCA assay, lowry assay 또는 Bradford assay에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 삭제
  8. 하기 제1 정제 조건 결정법 및 제2 정제 조건 결정법을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인플루엔자 항원 정제 조건 신속 확인 시험 방법:
    제1 정제 조건 결정법으로서, 인플루엔자 바이러스 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계에서 사용되는 것으로, 상기 인플루엔자 바이러스 정제 시의 조건은 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 기반하여 결정되는 제1 정제 조건 결정법; 및
    제2 정제 조건 결정법으로서, CTAB를 사용하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계에서 사용되는 것으로, 상기 표면항원 단백질 정제 시의 CTAB 스탁(stock) 처리량은 상기 제1 정제를 거쳐 수득된 인플루엔자 바이러스 배양물 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 구한 후 하기 식 1에 대입하여 수득된 값으로 CTAB 스탁(stock)의 처리량이 결정되는 것을 특징으로 하는 제2 정제 조건 결정법:
    [식 1]
    CTAB 스탁(stock) 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d
    (상기 식에서,
    a는 0.04~0.08이고,
    b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,
    c는 처리되는 CTAB 스탁(stock)의 농도(w/v%)이고,
    d는 CTAB 스탁(stock)을 처리할 상기 인플루엔자 바이러스 배양물의 용량이고,
    상기 인플루엔자 바이러스 배양물의 TPQV는 50 내지 950 μg/mL이다.)
  9. 제8항에 있어서, 상기 인플루엔자 항원 정제 조건 신속 확인 시험 방법은 인플루엔자 바이러스 샘플 내 헤마글루티닌(HA) 단백질의 양에 대하여 SRID(Single Radial Immunodiffusion)에 의한 정량 과정이 필요하지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계는, 크로마토그래피로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 크로마토그래피는 셀루파인 설페이트(Cellufine Sulfate; CS)로 충전된 크로마토그래피로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 제1 정제 조건 결정법은 인플루엔자 바이러스 배양물 샘플을 서로 다른 조건에서 정제시킨 것들을 각각 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합을 수행하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조건은 완충액 종류, 완충액 농도, pH, 전도도를 포함하는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 조건은 전도도인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 삭제
  16. 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 백신 제조방법으로서, 상기 단계는 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 구한 후 하기 식 1에 대입하여 수득된 값으로 CTAB 스탁(stock)을 처리하는 조건하에 수행되며, 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 TPQV는 50 내지 950 μg/mL 인 것인 방법:
    [식 1]
    CTAB 스탁(stock) 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d
    (상기 식에서,
    a는 0.04~0.08 이고,
    b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,
    c는 처리되는 CTAB 스탁(stock)의 농도(w/v%)이고,
    d는 CTAB 스탁(stock)을 처리할 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 용량이다.)
  17. 하기 단계를 포함하는, 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법:
    a) 인플루엔자 바이러스를 세포에 감염시키고 배양하여 바이러스 배양물을 수득하는 단계;
    b) 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하기 위하여, 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 기반하여 정제 조건을 결정하는 단계;
    c) 상기 b) 단계에서 결정된 조건에 따라 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계;
    d) 상기 c) 단계에서 정제된 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원을 정제하기 위하여, 표면항원 단백질 정제 시의 CTAB 스탁(stock) 처리량을 상기 정제된 인플루엔자 바이러스 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 구한 후 하기 식 1에 대입하여 수득된 값으로 CTAB 스탁(stock)의 처리량을 결정하는 단계;
    [식 1]
    CTAB 스탁(stock) 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d
    (상기 식에서,
    a는 0.04~0.08 이고,
    b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,
    c는 처리되는 CTAB 스탁(stock)의 농도(w/v%)이고,
    d는 CTAB 스탁(stock)을 처리할 상기 인플루엔자 바이러스 배양물의 용량이고,
    상기 정제된 인플루엔자 바이러스의 TPQV는 50 내지 950 μg/mL이다.)
    e) 상기 d) 단계에서 결정된 조건에 따라 CTAB 스탁(stock)을 처리하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계.
  18. 제17항에 있어서, 상기 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법은 b) 단계 이전에, 바이러스 배양물에서 세포(cell) 및 세포 잔해물(cell debris)을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 바이러스 배양물에서 세포(cell) 및 세포 잔해물(cell debris)의 제거는, 여과, 투석 및 원심분리로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 수행되는 것인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법은 c) 단계 이후에 한외여과 및 정용여과로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 방법에 의한 추가의 정제 과정을 포함하는 것인 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 e) 단계는 CTAB 스탁(stock) 처리 후 원심분리하여 상등액을 회수하는 방법으로 표면항원 단백질을 분리하는 것인 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법은 e) 단계 이후에 CTAB 제거 과정을 추가로 포함하는 방법.
  23. 제17항에 있어서, 상기 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법은 e) 단계 이후에 불순물 제거를 위한 추가의 크로마토그래피 수행 과정을 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 크로마토그래피는 TMAE(트리메틸아미노에틸) 음이온 교환 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법은, 크로마토그래피 이후에 한외여과 및 정용여과로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 방법에 의한 추가의 정제 과정을 포함하는 것인 방법.
  26. 인플루엔자 표면항원을 포함하는 백신 제조 방법에 있어서, 백신 제조 기간이 단축된 것을 특징으로 하는, 하기 단계를 포함하는 방법:
    a) 인플루엔자 바이러스를 세포에 감염시키고 배양하여 바이러스 배양물을 수득하는 단계;
    b) 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하기 위하여, 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 기반하여 정제 조건을 결정하는 단계;
    c) 상기 b) 단계에서 결정된 조건에 따라 상기 a) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계;
    d) 상기 c) 단계에서 정제된 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원을 정제하기 위하여, 표면항원 단백질 정제 시의 CTAB 스탁(stock) 처리량을 상기 정제된 인플루엔자 바이러스 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 구한 후 하기 식 1에 대입하여 수득된 값으로 CTAB 스탁(stock)의 처리량을 결정하는 단계;
    [식 1]
    CTAB 스탁(stock) 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d
    (상기 식에서,
    a는 0.04~0.08 이고,
    b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,
    c는 처리되는 CTAB 스탁(stock)의 농도(w/v%)이고,
    d는 CTAB 스탁(stock)을 처리할 상기 인플루엔자 바이러스 배양물의 용량이고,
    상기 정제된 인플루엔자 바이러스의 TPQV는 50 내지 950 μg/mL이다.)
    e) 상기 d) 단계에서 결정된 조건에 따라 CTAB 스탁(stock)을 처리하여 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계.
  27. 제26항에 있어서, 상기 a) 단계에서 바이러스 감염에 사용될 세포 또는 a) 단계에서 바이러스로 감염된 세포는 일회용 생물반응기(single-use bioreactor; SUB)에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 a) 단계의 바이러스를 세포에 감염시키기 전에, 바이러스 감염에 사용될 세포 배양물에서 연속식 저속원심분리기를 통해 배지의 일부를 신선한 배지로 교환하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법은 c) 단계 이후에 벤조네이즈(Benzonase), 엑소뉴크레아제(Exonuclease), 리보자임(Ribozyme), 또는 이의 혼합물 처리 과정을 추가로 포함하는 방법.
  30. 제26항에 있어서, 상기 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법은 c) 단계 이후에 바이러스 불활성화 과정을 추가로 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 바이러스 불활화성는 계면활성제(detergent), 포름알데하이드, β-프로피오락톤, 메틸렌블루, 프소랄렌, 카복시풀러렌(C60), 2급 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민 또는 이들의 조합을 처리함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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