CN107603959A - 提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药工艺领域,具体涉及一种提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法。针对现有纯化病毒的方法成本高，不适宜工业化生产的问题，本发明提供一种提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法，包括以下步骤：a、接种并培养宿主细胞；b、将病毒感染宿主细胞，进行扩增后裂解宿主细胞获得含病毒的裂解液；c、将裂解液进行浓缩，得到浓缩裂解液；d、采用高盐离子缓冲液对浓缩裂解液进行滤洗，再采用离子交换层析纯化，得到纯化后的病毒。本发明方法能明显去除大量血清、宿主细胞蛋白等杂蛋白，增加层析的样品上样量，相对提高了填料的载量。本方法简单、经济、高效，适合工业化方法，具有很好的应用前景。

Description

提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法

技术领域

本发明属于生物制药工艺领域,具体涉及一种提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法。

背景技术

近年来，随着分子生物学、免疫学、细胞生物的快速发展，以免疫治疗、基因治疗为代 表的生物治疗有望成为治疗疾病新的手段。基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基 因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目 的的生物医学新技术。最常见的基因治疗导入系统包括非病毒载体和病毒载体。

非病毒载体导入系统是利用非病毒的载体材料的物化性质来介导基因的转移，主要包括 脂质体、阳离子多聚物、壳聚糖载体聚合物和无机纳米粒子载体。非病毒载体的转导效率低， 目的基因只能实现瞬间表达，其运送系统的颗粒较大，容易引发免疫反应和被机体所清除。 病毒载体利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞，进行感染的分子机制，可将遗传物质带 入细胞。常见的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和逆转录病毒等。病毒载体的转 导效率非常高，目的基因能实现长时间表达。

为满足需要临床试验，可扩展和强大的生产过程使病毒感染性得以维持，感染率高，需 要去除宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白质。目前实验室制备的病毒只能满足体外实验和小动 物体内实验，其纯化多采用传统的CsCl密度梯度超速离心法进行。由于CsCl密度梯度超速 离心法纯化病毒的样品量非常有限，产量不能满足临床基因治疗对病毒载体的需求；其次， CsCl价格昂贵，并且需要通过透析去除且存在残留等问题。由此可见，虽然CsCl密度梯度 超速离心方法已经证明作为研究手段使用是有效的，但是它价格昂贵、费时且不易放大用于 工业规模的生产，需要开发可用以工业生产的新方法。

层析是利用混合物中各组分的物理化学性质差异，使其以不同速度移动的一种物理分离 方法。层析在重组蛋白、抗体等生物大分子的纯化中应用非常广泛，具有快速、分辨率高、 线性放大和可回收利用等特点，因此层析特别适合生物大分子的规模化纯化。尽管层析技术 已经广泛用于纯化重组蛋白和抗体，但层析用于纯化病毒的报道比较少。

腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等病毒在生理pH条件下呈负电荷，可以采用离子交换层 析的方法高效除去血清、宿主蛋白等杂蛋白和宿主DNA，同时起到浓缩的作用。但腺病毒、 腺相关病毒、慢病毒等带负电荷的病毒采用离子交换层析方法进行纯化的研究较少，可能是 由于存在CsCl梯度超离心有效纯化病毒的方法，而没有进一步开展新的方法。

最近，有文献报道了用离子交换层析结合金属螯合亲和层析来纯化腺病毒载体的方法， 该方法能够得到与CsCl梯度超离心相近纯度的病毒，但在两次柱纯化过程后，只回收获得 23％的病毒，纯化病毒回收率低。导致低病毒回收率低的原因可能是在裂解细胞时采用的冻 融步骤以及两次柱纯化步骤。若减少纯化步骤，则需要采用分辨率高的离子交换填料，此类 填料载量有限，需要更大的层析柱和更多的离子交换填料，无疑会增加生产成本。因此，目 前急需一种简单有效、成本低、适用于工业的病毒载体生产方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：现有纯化病毒的方法成本高，不适宜工业化生产的问题。

本发明解决技术问题的技术方案为：提供一种提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法。 该方法包括以下步骤：

a、接种并培养宿主细胞；

b、将病毒感染宿主细胞，进行扩增后裂解宿主细胞获得含病毒的裂解液；

c、将步骤b中的裂解液进行浓缩，得到浓缩裂解液；

d、采用高盐离子缓冲液对浓缩裂解液进行滤洗，再采用离子交换层析纯化，得到纯化后 的病毒。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤a中所述的宿主细胞为细胞 系293、A549或PER.C6中的至少一种。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤a中所述的接种密度为2～ 5×10⁵个细胞/ml培养液。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤a中所述的培养为悬浮培养 或微载体培养。

进一步的，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤a中所述培养时培养液 为DMEM培养液。优选的，所述培养液为DMEM培养液+2～10％胎牛血清。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤b中所述的病毒为带负电荷 的病毒；进一步的，步骤b中所述的病毒为腺病毒、腺相关病毒或慢病毒中的至少一种。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤c中所述的裂解液在浓缩前 还加入了NaCl、NH₄Cl或CaCl₂中的至少一种，使裂解液中盐离子浓度为100～500mM。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤c中所述浓缩为切向流膜包 浓缩，切向流膜包浓缩的截留分子量为100～1000KD。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤d中所述的高盐离子缓冲液 盐离子浓度为100～500mM。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤d中所述滤洗时高盐离子缓 冲液体积为浓缩裂解液体积的10～20倍。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤d中所述离子交换层析所用 填料为普通阴离子交换填料，如Source 30Q，Source 15Q或Q Sepharose XL等。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤d中所述离子交换层析的上 样体积为填料柱体积的5～10倍。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种提高缓冲液盐离子浓度纯化 病毒的方法，通过将滤洗缓冲液的盐离子浓度提高到100～500mM，能明显去除大量血清、 宿主细胞蛋白等杂蛋白，为后续的离子交换层析提供杂蛋白相对少的病毒液样品，减轻离子 交换层析的负荷。另一方面，通过提高离子交换层析上样前的病毒液盐离子浓度，使一些带 低电荷的杂蛋白在上样时无法和离子交换填料结合而穿透，只有带强电荷的病毒和杂蛋白能 与离子交换填料结合，从而增加层析样品上样量，相对提高了填料的载量。本发明为病毒性 载体或疫苗的纯化提供了一种简单、经济、高效的纯化方法，具有很好的应用前景。

说明书附图

图1所示为HBx-hIL12重组腺病毒规模化的扩增图。A、B、C、D分别为HEK293细胞 在微载体上培养24h、48h、72h、96h图谱；E、F、G、H为加入重组腺病毒Ad-HBx-hIL12 分别在24h、48h、72h、96h扩增图谱；I为HEK293培养时葡萄糖含量变化；J为HEK293 培养时细胞密度图；K为重组腺病毒Ad-HBx-hIL12扩增时葡萄糖含量的变化；L为重组腺病 毒Ad-HBx-hIL12扩增时滴度结果。

图2所示为超滤浓缩过程中SDS-PAGE凝胶电泳检测，从左到右依次为：M Marker，1浓缩前，2浓缩，3滤出，4低盐滤洗，5低盐滤洗滤出，6高盐滤洗，7高盐滤洗滤出；结果 表明，高盐滤洗样品去除杂质蛋白比低盐滤洗样品要多；相反，低盐滤洗滤出样品中杂质蛋 白比高盐滤洗滤出样品中多。

图3所示为超滤浓缩过程中样品色谱分析，A低盐滤洗样品，B高盐滤洗样品，C低盐滤洗滤出样品，D高盐滤洗滤出样品；结果表明，经过不同盐离子浓度(高盐滤洗缓冲液和低盐滤洗缓冲液)，相同滤洗体积的高盐滤洗样品比低盐滤洗样品去除杂质蛋白多；相反，低 盐滤洗滤出样品中杂质蛋白要比高盐滤洗滤出样品中少。

图4所示为最适滤洗体积检测，A滤洗前，B 5倍滤洗，C10倍滤洗，D 15倍滤洗，E 20倍滤洗，K感染滴度分析，结果表明随着滤洗体积的增加，对病毒的活性影响不大，最适的滤洗体积为15～20倍；F滤洗前，G 5倍滤洗，H 10倍滤洗，I 15倍滤洗，J 20倍滤洗，L积 分杂蛋白峰统计，结果表明随着滤洗体积的增加，杂蛋白去除增多，最适的滤洗体积为15～20倍。M从左到右依次为：M，Marker；1，滤洗前；2，5倍滤洗；3，10倍滤洗；4，15倍 滤洗；5，20倍滤洗。

图5所示为未超载量纯化Ad-HBx-hIL12，A 10倍低盐滤洗，1倍柱体积低盐上样纯化图 谱；B 10倍高盐滤洗，1倍柱体积低盐上样纯化图谱；C 10倍高盐滤洗，1倍柱体积高盐上 样纯化图谱；D 10倍低盐滤洗，1倍柱体积低盐上样纯化SDS-PAGE凝胶检测；E 10倍高盐滤洗，1倍柱体积低盐上样纯化SDS-PAGE凝胶检测；F 10倍高盐滤洗，1倍柱体积高盐上 样纯化SDS-PAGE凝胶检测；G 10倍低盐滤洗1倍柱体积低盐纯化样品纯度检测图谱；H 10 倍高盐滤洗1倍柱体积低盐纯化样品纯度检测图谱；I 10倍高盐滤洗1倍柱体积高盐纯化样品纯度检测图谱。

图6所示为超载量纯化Ad-HBx-hIL12，A 15倍低盐滤洗，10倍柱体积低盐上样纯化图 谱；B 15倍高盐滤洗，10倍柱体积低盐上样纯化图谱；C 15倍高盐滤洗，10倍柱体积高盐上样纯化图谱；D 15倍低盐滤洗10倍柱体积低盐纯化样品纯度检测图谱；E 15倍高盐滤洗10 倍柱体积低盐纯化样品纯度检测图谱；F 15倍高盐滤洗10倍柱体积高盐纯化样品纯度检测图 谱；G低盐滤洗低盐纯化，以2cv、4cv、6cv、8cv、10cv收集穿透峰，用抗体染色法检测病 毒量；H高盐滤洗低盐纯化，以2cv、4cv、6cv、8cv、10cv收集穿透峰，用抗体染色法检测病毒量；I高盐滤洗高盐纯化，以2cv、4cv、6cv、8cv、10cv收集穿透峰，用抗体染色法检 测病毒量；J三种超载量纯化方式中穿透峰统计学分析；K三种超载量纯化方式下穿透峰病 毒损失率的统计。

具体实施方式

本发明提供了一种提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法，包括以下步骤：

a、接种并培养宿主细胞；

b、将病毒感染宿主细胞，进行扩增后裂解宿主细胞获得含病毒的裂解液；

c、将步骤b中的裂解液进行浓缩，得到浓缩裂解液；

d、采用高盐离子缓冲液对浓缩裂解液进行滤洗，再采用离子交换层析纯化，得到纯化后 的病毒。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤a中所述的宿主细胞为细胞 系293、A549或PER.C6中的至少一种。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤a中所述的接种密度为2～ 5×10⁵个细胞/ml培养液，接种密度过低，细胞培养时间过长，而且细胞在微载体上分布不均； 接种密度过高，耗费的种子细胞较多，增加经济成本。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤a中所述的培养为悬浮培养 或微载体培养。一般情况下，293细胞需要采用贴壁型培养，如需在生物反应器中培养，需 要添加微载体，使其贴在微载体上生长；本发明采用293细胞为宿主细胞时，经过驯化和筛 选后获得可悬浮生长的细胞，可直接在生物反应器中悬浮培养。

进一步的，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤a中所述培养时培养液 为DMEM培养液。优选的，所述培养液为DMEM培养液+2～10％胎牛血清。

在细胞扩增期间，为使细胞快速生长，胎牛血清的浓度多为10％，当细胞生长达到对数 生长期后可以加病毒种子扩增病毒，此时只需维持细胞的基本代谢即可，同时为减轻后续纯 化阶段血清的载量负荷，可将胎牛血清的浓度降为2％。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤b中所述的病毒为带负电荷 的病毒；进一步的，步骤b中所述的病毒为腺病毒、腺相关病毒或慢病毒中的至少一种。

盐离子浓度过低，在滤洗过程中除去杂质蛋白等减少，盐离子浓度过高，在纯化过程中 会影响病毒与柱填料的结合。在本发明中，步骤c中所述的裂解液在浓缩前还加入了NaCl、 NH₄Cl或CaCl₂中的至少一种，使裂解液中盐离子浓度为100～500mM。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤c中所述浓缩为切向流膜包 浓缩，切向流膜包浓缩的截留分子量为100～1000KD。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤d中所述的高盐离子缓冲液 盐离子浓度为100～500mM。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤d中所述滤洗时高盐离子缓 冲液体积为浓缩裂解液体积的10～20倍。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，步骤d中所述离子交换层析所用 填料为普通阴离子交换填料，如Source 30Q，Source 15Q或Q Sepharose XL等。

其中，上述提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法中，上样的体积过多，会影响到样品 中杂质样品与填料的结合，达到填料的载量后，部分腺病毒与柱填料将无法结合，流穿而损 失；上样量过少则需要多次反复上样，耗时长，增加了人力成本，本发明优选的离子交换层 析的上样体积为填料柱体积的5～10倍。

本发明提供了一种通过提高缓冲液盐离子浓度提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法。 病毒性载体或疫苗因携带电荷，可以通过离子交换层析进行纯化，但离子交换填料的载量相 对较小，如果想要得到很好的分辨率需提高离子交换填料的用量。但离子交换填料价格昂贵， 工业放大生产将提高生产成本。

因此，本发明在超滤浓缩和滤洗阶段提高超滤浓缩前病毒液样品的盐离子浓度和滤洗缓 冲液的盐离子浓度，提高到100～500mM。滤洗液浓度在100～500mM范围内逐渐提升，能 明显去除大量血清、宿主细胞蛋白等杂蛋白，这可能是由于增加盐离子后，改变了样品中病 毒和/或血清、宿主蛋白等杂蛋白电荷，减少了因超滤浓缩后杂蛋白浓度增加所致的蛋白聚集 或杂蛋白与病毒之间的聚集，因而血清和宿主蛋白大分子物质等易透过超滤膜上的孔，为后 续的离子交换层析提供杂蛋白相对少的病毒液样品，减轻离子交换层析的负荷。

另外，我们通过提高离子交换层析的上样前的病毒液盐离子浓度，使一些带低电荷的杂 蛋白在上样时无法和离子交换填料结合而穿透，只有带强电荷的病毒和杂蛋白能和离子交换 填料结合，该工艺环节也能增加层析的样品上样量，相对提高了填料的载量，进而降低了纯 化成本，适宜工业化生产。

下面通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保 护范围限制在实施例所述范围内。

实施例中所述的293细胞购至ATCC细胞库，其余所用材料均为普通市售产品。

实施例1 Ad-HBx-hIL12重组腺病毒的扩增

a)细胞种子的扩增：从液氮保存的HEK293细胞工作库中取出一支细胞，复苏至T175cm²方瓶中，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，细胞长满后逐级传代至细胞工厂中。

b)生物反应器扩增细胞：首先在生物反应器中加入细胞培养液，当运行条件稳定在37℃， pH 7.0，DO 50％，50rpm时，消化收集细胞工厂扩增的HEK293细胞，接种于生物反应器内， 接种细胞密度1.5×10⁵个细胞/ml，补充细胞培养液至5L，反应器细胞培养的条件为温度37℃、 转速为45rpm、pH 7.15～7.25之间、DO 30～50％，每天取样检测葡萄糖浓度、细胞密度和微 载体上细胞的形态。

c)接种病毒和病毒扩增：当生物反应器内的细胞密度达到2.0～5.0×10⁶个细胞/ml时， 排掉细胞培养基；反应器接种重组腺病毒Ad-HBx-hIL12毒种，MOI为25，最后用补充病毒 培养液至5L；接种后每天取样检测葡萄糖浓度、培养上清和细胞沉淀中的病毒滴度、和观察 微载体上细胞的形态。

d)收集病毒，向生物反应器中加入病毒裂解液，终浓度为0.25％，在条件为37℃，60rpm， DO 30～50％下裂解细胞，1h后收集病毒液。

实验结果如图1所示：HEK293细胞培养时，细胞密度随着时间的增加，密度变大；葡萄糖含量随着时间的增加而降低；重组腺病毒Ad-HBx-hIL12扩增时，上清液中的病毒滴度随着时间的增加而增加，沉淀中的病毒随着时间的增加，先增加后降低；葡萄糖含量随着时间的增加而降低。

实施例2、Ad-HBx-hIL12重组腺病毒的超滤浓缩和滤洗

取实施例1收集得到的病毒上清液6000rpm，4℃条件下高速离心，弃去沉淀，保留上 清液，离心后的病毒上清液经囊氏滤器过滤澄清；将澄清的病毒液用300KD膜包进行浓缩， 分别收集病毒浓缩液和滤出液。将浓缩的样品分成两份，分别用低盐滤洗缓冲液(100mM) 和高盐缓冲液(300mM)进行10倍体积滤洗，分别收集滤洗样品和滤洗滤出样品；将收集 的澄清样品、浓缩样品、滤出样品、低盐滤洗样品、低盐滤洗滤出样品、高盐滤洗样品、高 盐滤洗滤出样品分别取2ml，加入玻璃管中，在自然光下观察样品的酚红变化；同时将收集 的4℃条件下过夜透析(50mM Tris-HCl，2mM MgCl₂pH 8.0)后分别用12.5％聚丙烯酰胺凝 胶电泳和色谱分析。

自然光下，观察样品的酚红变化，高盐滤洗的样品比低盐滤洗的样品酚红去除多，相反， 低盐滤洗滤出样品中的酚红比高盐滤洗滤出的样品少；SDS-PAGE凝胶分析检测得知，高盐 滤洗比低盐滤洗去除的杂质蛋白多，低盐滤洗滤出比高盐滤洗滤出样品少，实验结果见图2； Source15Q分析检测得知，高盐滤洗样品去除杂质蛋白比低盐滤洗样品多，低盐滤洗滤出样 品比高盐滤洗滤出样品少，实验结果见图3。

实施例3 重组腺病毒Ad-HBx-hIL12最适滤洗体积

超滤浓缩的步骤与实施例2相同，其差别为：采用高盐滤洗缓冲液对浓缩的样品进行5 倍、10倍、15倍、20倍条件滤洗，分别收集5倍、10倍、15倍、20倍的滤洗样品，50mM Tris-HCl，2mM MgCl₂pH 8.0缓冲液透析后用12.5％SDS-PAGE凝胶电泳和Source15Q色谱 分析检测杂蛋白去除效果；抗体染色法和TCID50法检测滤洗体积对病毒活性的影响情况，

实验结果如图4：随着滤洗体积的增加，杂质蛋白去除增多，病毒的活性不会随着滤洗 体积的增加而变化，综合考虑滤洗效果和经济成本，滤洗体积以浓缩裂解液体积的10～20倍 为宜。

实施例4 重组腺病毒Ad-HBx-hIL12阴离子交换纯化

分别取50ml低盐滤洗、高盐滤洗和经低盐透析的高盐滤洗样品按照下述纯化方案进行分 离纯化：低盐缓冲液20ml/min流速平衡5个柱体积，平衡结束后10ml/min上样，上样结束 后低盐缓冲液平衡至电导水平；线性梯度洗脱样品，洗脱的条件为100％低盐缓冲液到100％ 高盐缓冲液，10V洗脱柱体积，流速为10ml/min，收集各个洗脱峰；洗脱结束后用2MNaCl 缓冲液对柱子进行再生5～10个柱体积，速度为20ml/min。收集穿透峰、洗脱峰和病毒峰， 进行12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析、病毒峰滴度检测和纯度的分析检测。

实验结果如图5所示：三种纯化图谱和SDS-PAGE说明高盐滤洗高盐上样纯化效果较好， 杂蛋白结合柱子比较少。1倍柱体积纯化得到的样品，用HPLC检测分析纯度大于99％以上。

实施例5 重组腺病毒Ad-HBx-hIL12超载量纯化

分别取10倍柱体积低盐滤洗、高盐滤洗和经低盐透析的高盐滤洗样品进行离子交换纯 化，纯化步骤与实施例4相同，收集2CV、4CV、6CV、8CV、10CV穿透峰样品，用抗体染 色法检测穿透峰中病毒量和病毒峰的纯度检测。

实验结果如图6所示，结果表明：随着纯化样品的体积增加，病毒损失增加，高盐滤洗 高盐纯化的损失率在同等柱体积下比低盐滤洗低盐纯化的损失率低；2个柱体积上样纯化时， 三种上样方式之间无差异；4～8个柱体积上样纯化时，高盐滤洗高盐上样纯化与高盐滤洗低 盐上样纯化之间无差异，高盐滤洗高盐上样纯化与低盐滤洗低盐上样纯化之间有差异、高盐 滤洗低盐上样纯化与低盐滤洗低盐上样纯化之间有差异；10倍柱体积上样纯化时，三种不同 方式上样纯化之间存在差异。

Claims (10)

1.提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、接种并培养宿主细胞；

b、将病毒感染宿主细胞，进行扩增后裂解宿主细胞获得含病毒的裂解液；

c、将步骤b中的裂解液进行浓缩，得到浓缩裂解液；

d、采用高盐离子缓冲液对浓缩裂解液进行滤洗，再采用离子交换层析纯化，得到纯化后的病毒。

2.根据权利要求1所述的提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法，其特征在于：步骤a中所述的接种密度为2～5×10⁵个细胞/ml培养液。

3.根据权利要求1或2所述的提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法，其特征在于：步骤a中所述的培养为悬浮培养或微载体培养。

4.根据权利要求1～3任一项所述的提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法，其特征在于：步骤a中所述培养时培养液为DMEM培养液。

5.根据权利要求1～4任一项所述的提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法，其特征在于：步骤b中所述的病毒为带负电荷的病毒。

6.根据权利要求1～5任一项所述的提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法，其特征在于：步骤c中所述的裂解液在浓缩前还加入了NaCl、NH₄Cl或CaCl₂中的至少一种，使裂解液中盐离子浓度为100～500mM。

7.根据权利要求1～6任一项所述的提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法，其特征在于：步骤c中所述浓缩为切向流膜包浓缩，切向流膜包浓缩的截留分子量为100～1000KD。

8.根据权利要求1～7任一项所述的提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法，其特征在于：步骤d中所述的高盐离子缓冲液盐离子浓度为100mM～500mM。

9.根据权利要求1～8任一项所述的提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法，其特征在于：步骤d中所述滤洗时高盐离子缓冲液体积为浓缩裂解液体积的10～20倍。

10.根据权利要求1～9任一项所述的提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法，其特征在于：步骤d中所述离子交换层析的上样体积为填料柱体积的5～10倍。