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KR102479432B1 - 자동화 반응 카트리지에서 DNA 메틸화의 통합 정제 및 측정 및 돌연변이 및/또는 mRNA 발현도의 동시 측정 - Google Patents

자동화 반응 카트리지에서 DNA 메틸화의 통합 정제 및 측정 및 돌연변이 및/또는 mRNA 발현도의 동시 측정 Download PDF

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KR102479432B1
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애타 루엘 밴
러셀 히구치
알렉산더 에이 골
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Abstract

DNA의 메틸화를 결정하는 방법이 제공된다. 예시적이지만, 비제한적인 일 실시형태에서, 방법은 i) 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 제1 컬럼 또는 필터를 포함하는 제1 매트릭스 재료에 접촉시키는 단계로서, 상기 매트릭스 재료는 상기 샘플 중 핵산에 결합하고/하거나 여과시켜서 DNA를 정제시키는 것인 단계; ii) 결합된 DNA를 제1 매트릭스 재료로부터 용리시키고 DNA를 변성시켜서 용리된 변성 DNA를 생성시키는 단계; iii) 바이술파이트 이온의 존재 하에서 용리된 DNA를 가열시켜서 탈아민화 핵산을 생성시키는 단계; iv) 상기 탈아민화 핵산을 제2 컬럼을 포함하는 제2 매트릭스 재료에 접촉시켜서 상기 탈아민화 핵산을 상기 제2 매트릭스 재료에 결합시키는 단계; v) 결합된 탈아민화 핵산을 탈술폰화시키고/시키거나 동시에 용리시키고 탈아민화 핵산을 알칼리 용액과 접촉시켜 핵산을 탈술폰화시켜 바이술파이트 전환된 핵산을 생성시키는 단계; vi) 상기 바이술파이트 전환된 핵산을 상기 제2 매트릭스 재료로부터 용리시키는 단계; 및 vii) 메틸화 특이적 PCR 및/또는 핵산 시퀀싱, 및/또는 고분해능 용융 분석 (HRM)을 상기 바이술파이트-전환된 핵산에 대해 수행하여 상기 핵산의 메틸화를 결정하는 단계를 포함하고, 적어도 단계 iv) 내지 vi)은 단일 반응 카트리지에서 수행된다.

Description

자동화 반응 카트리지에서 DNA 메틸화의 통합 정제 및 측정 및 돌연변이 및/또는 mRNA 발현도의 동시 측정
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 2016년 12월 12일에 출원된 이전의 미국 가출원 제62/433,165호의 이득을 청구한다.
고등 진핵생물의 게놈은 변형된 뉴클레오시드 5-메틸 시토신 (5-meC)을 함유한다. 이러한 변형은 일반적으로 메틸트랜스퍼라제 효소에 의한 S-아데노실메티오닌으로부터 메틸 기의 전달이 관여되는 반응에서 시토신이 5-메틸시토신으로 전환되는 디뉴클레오티드 CpG의 일부로서 확인된다 (예를 들어, 문헌 [Klimasauskas et al. (1994) Cell 76: 357-369] 참조). 이러한 효소적 전환은 척추동물에서 존재하는 것으로 알려진 DNA의 주요한 후생적 변형이고 정상적인 배아 발생에 필수적이다 (예를 들어, [Bird (1992) Cell 70: 5-8]; [Laird and Jaenisch (1994) Human Mol. Genet. 3: 1487-1495]; 및 [Li et al. (1992) Cell 69: 915-926] 참조).
진핵생물에서, DNA 메틸화는 정상적인 세포 프로세스 예컨대 유전체 각인, 염색체 불안정성, 및 X-염색체 불활성화를 조절한다. 전형적으로, DNA 메틸화는 CpG 섬 또는 해안 (shore)이라고 하는 유전자 프로모터 내 또는 그 근처의 디뉴클레오티드 5'-CpG-3' 부위에서 시토신의 5번째 탄소 위치에서 발생된다. 메틸화는 간접적으로 염색질 리모델링 단백질의 동원을 통해서 또는 직접적으로 전사 기구를 억제하여서 전사를 하향 조절함으로써 유전자 발현을 제어한다. 염색체 메틸화 패턴은 배아 발생 동안 역동적으로 변화되고, 개체의 일생을 통해 올바른 메틸화 패턴을 유지해야만 한다. 메틸화 패턴의 변화는 노화와 연결되어 있으며, DNA 메틸화의 오류는 종양발생 동안 발생되는 가장 빠른 변화 중 하나이다. 그러므로, 유전자 프로모터에서 메틸화의 검출은 암을 갖는 환자를 진단 및/또는 모니터링하는데 특히 중요하다.
DNA 메틸화를 포함한 후생적 변경은 유전 정보가 어떻게 메신저 RNA (mRNA)로 전사되는가를 설명하는 DNA-RNA-단백질축을 방해한다. 게놈 DNA 변이, mRNA 카피 개수 및 단백질 수준간 상관성은 DNA 메틸화 수준으로 설명될 수 있다. 따라서 DNA 메틸화 수준 및 상응하는 하류 mRNA 수준의 동시-측정은 후생적 세포 조절 기전을 이해하는데 중요할 수 있다.
메틸화를 효율적이고 정확하게 검출하여 정량하기 위한 몇가지 방법들이 개발되었다. 가장 일반적인 기술은 비메틸화 시토신을 우라실로 전환시키는 바이술파이트 전환 방법이다. 전환되면, DNA의 메틸화 프로파일은 표준 PCR 기술, 시퀀싱 방법 등을 통해서 결정될 수 있다.
바이술파이트 전환 및 DNA 클린업에 적합한 몇몇 DNA 메틸화 키트 (예를 들어, Zymo Research의 EZ DNA METHYLATION™)가 존재한다. 대부분의 키트는 수 회의 단계, 시약, 및 인큐베이션 시간이 수반되고, 종종 일부 키트가 출발 물질로서 조직 또는 혈장/혈청을 이용할 수 있지만 전환 전에 정제된 DNA를 필요로 한다.
전형적으로 바이술파이트 전환 방법은 다음과 같이 적어도 4개 단계를 필요로 한다: 1) DNA 변성; 2) 바이술파이트 인큐베이션; 3) DNA 정제; 및 4) 탈술폰화. 최종 탈술폰화 단계는 컬럼 상에서 또는 용액 중에서 완료될 수 있고 그 이후에 에탄올 침전이 후속될 수 있다. 현재 사용자가 전체 과정 - DNA 정제, 바이술파이트 인큐베이션, 탈술폰화, 2차 DNA 정제 및 메틸화-특이적 PCR을 전부 하나의 단계로 완료할 수 있게 하는 메틸화 키트는 존재하지 않는다.
본 명세서에서 고려되는 다양한 실시형태는 제한없이 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, 이에 제한할 필요는 없다.
본 명세서에서 고려되는 다양한 실시형태는 하기 중 하나 이상을 포괄할 수 있지만, 이에 제한할 필요는 없다.
실시형태 1: 핵산의 메틸화 상태를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 제1 컬럼 또는 필터를 포함하는 제1 매트릭스 재료에 접촉시키는 단계로서 상기 매트릭스 재료는 상기 샘플 중 핵산에 결합하고/하거나 여과시켜서 DNA를 정제시키는 것인 단계;
ii) 제1 매트릭스 재료로부터 결합된 DNA를 용리시키고 DNA를 변성시켜서 용리된 변성 DNA를 생성시키는 단계;
iii) 바이술파이트 시약의 존재 하에서 용리된 DNA를 가열시켜 탈아민화 핵산을 생성시키는 단계;
iv) 상기 탈아민화 핵산을 제2 컬럼을 포함하는 제2 매트릭스 재료에 접촉시켜서 상기 탈아민화 핵산을 상기 제2 매트릭스 재료에 결합시키는 단계;
v) 결합된 탈아민화 핵산을 탈술폰화시키고/시키거나 탈아민화 핵산을 알칼리 용액과 접촉시켜 핵산을 동시에 용리 및 탈술폰화시켜서 전환된 (예를 들어, 바이술파이트 전환된) 핵산을 생성시키는 단계;
vi) 상기 바이술파이트 전환된 핵산을 상기 제2 매트릭스 재료로부터 용리시키는 단계; 및
vii) 메틸화 특이적 PCR 및/또는 핵산 시퀀싱, 및/또는 고분해능 용융 분석 (high resolution melting analysis) (HRM)을 상기 전환된 핵산에 대해 수행하여 상기 핵산의 메틸화를 결정하는 단계
를 포함하고, 적어도 단계 iv) 내지 vi)은 단일 반응 카트리지에서 수행된다.
실시형태 2: 실시형태 1의 방법에 있어서, 적어도 단계 iv) 내지 vi)은 단일 반응 카트리지에서 수행된다.
실시형태 3: 실시형태 1의 방법에 있어서, 적어도 단계 iii) 내지 vi)은 단일 반응 카트리지에서 수행된다.
실시형태 4: 실시형태 1의 방법에 있어서, 적어도 단계 ii) 내지 vi)은 단일 반응 카트리지에서 수행된다.
실시형태 5: 실시형태 1의 방법에 있어서, 적어도 단계 i) 내지 vi)은 단일 반응 카트리지에서 수행된다.
실시형태 6: 실시형태 1-5 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 단계 vii)은 동일한 반응 카트리지에서 수행된다.
실시형태 7: 실시형태 1-6 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 제1 매트릭스 재료 및 상기 제2 매트릭스 재료는 동일한 컬럼을 형성하는 동일한 재료이다.
실시형태 8: 실시형태 1-7 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 제1 매트릭스 재료 및 상기 제2 매트릭스 재료는 상이한 컬럼을 형성한다.
실시형태 9: 실시형태 1-8 중 어느 하나의 실시형태에 따른 방법에 있어서, 상기 메틸화 특이적 PCR은 수행될 때, 상기 카트리지에서 수행된다.
실시형태 10: 실시형태 1-9 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 핵산 시퀀싱은 수행될 때, 상기 카트리지 또는 상기 카트리지에 커플링된 장치에서 수행된다.
실시형태 11: 실시형태 1-10 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 카트리지는 상기 제1 매트릭스 재료를 포함하는 컬럼, 샘플 수용 챔버, 온도 제어 채널 또는 챔버, 시약 및/또는 완충제를 함유하는 복수개의 챔버를 포함하고, 사용될 때에, 상기 챔버 중 적어도 하나는 탈술폰화/용리 완충제를 함유하고, 상기 카트리지는 임의로 상기 제2 매트릭스 재료를 포함하는 제2 컬럼을 포함한다.
실시형태 12: 실시형태 11의 방법에 있어서, 사용될 때에, 상기 챔버 중 적어도 하나는 바이술파이트 이온을 제공하는 시약을 함유한다.
실시형태 13: 실시형태 11-12 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 제2 컬럼은 부재한다.
실시형태 14: 실시형태 11-13 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 제2 컬럼은 존재한다.
실시형태 15: 실시형태 11-14 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 카트리지는 상기 온도 제어 채널 또는 챔버 이외에도 열순환 채널 또는 챔버를 포함한다.
실시형태 16: 실시형태 11-14 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 온도 제어 채널 또는 챔버는 열순환 채널 또는 챔버이다.
실시형태 17: 실시형태 11-16 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 카트리지는 메틸화 특이적 PCR 프라이머, 메틸화 특이적 PCR 프로브, PCR 효소(들), 및 PCR 반응 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시약을 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다.
실시형태 18: 실시형태 17의 방법에 있어서, 상기 카트리지는 바이술파이트-전환된 DNA의 전방향 가닥의 메틸화의 검출을 위한 하나 이상의 프라이머 및 프로브를 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다.
실시형태 19: 실시형태 17-18 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 카트리지는 바이술파이트-전환된 DNA의 역방향 가닥의 메틸화의 검출을 위한 하나 이상의 프라이머 및 프로브를 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다.
실시형태 20: 실시형태 11-19 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 샘플 수용 챔버, 상기 컬럼(들), 상기 복수개의 챔버, 및 존재할 경우, 상기 온도 제어 채널 또는 챔버 및/또는 열순환 채널 또는 챔버는 선택적으로 유체 연통된다.
실시형태 21: 실시형태 20의 방법에 있어서, 상기 샘플 수용 챔버, 상기 컬럼(들), 상기 복수개의 챔버, 및 존재할 경우, 상기 열순환 채널 또는 챔버는 선택적으로 미세유체 채널 및 밸브에 의해 유체 연통된다.
실시형태 22: 실시형태 20의 방법에 있어서, 상기 샘플 수용 챔버, 상기 컬럼(들), 상기 복수개의 챔버, 및 존재할 경우, 상기 열순환 채널 또는 챔버 또는 상기 열순환 채널 또는 챔버로의 포트는 중심 밸브 주변에 배치되고 선택적으로 상기 중심 밸브 내 채널과 유체 연통되고, 상기 중심 밸브는 상기 중심 밸브와 유체 연통되는 챔버의 내부 또는 외부로 유체를 유인시킬 수 있는 플런저를 수용하도록 구성된다.
실시형태 23: 실시형태 11-22 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 카트리지는 사용될 때에,
샘플을 함유하는 제1 챔버;
구아니디늄 티오시아네이트-에탄올 (GTC-EtOH) 용액을 함유하는 제2 챔버;
바이술파이트 시약을 함유하는 제3 챔버;
완충제를 함유하는 제4 챔버;
세정 용액을 함유하는 제5 챔버; 및
용리/탈술폰화 시약을 함유하는 제6 챔버
를 포함한다.
실시형태 24: 실시형태 23의 방법에 있어서, 제1 챔버는 GTC-EtOH-Tween 추출/침전 시약 중에 상기 샘플을 함유한다.
실시형태 25: 실시형태 23-24 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, GTC-ETOH-Tween 완충제는 샘플이 카트리지에 위치되는 시점에 또는 그 시점 가까이에 첨가된다.
실시형태 26: 실시형태 23-25 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 바이술파이트 시약은 샘플이 카트리지에 위치되는 시점에 또는 그 시점 가까이에 카트리지에 첨가된다.
실시형태 27: 실시형태 23의 방법에 있어서, GTC-ETOH-Tween 완충제는 카트리지의 성분으로서 제공된다.
실시형태 28: 실시형태 23-25 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 바이술파이트 시약은 카트리지의 성분으로서 제공된다.
실시형태 29: 실시형태 11-28 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 카트리지는 PCR 프라이머 및/또는 프로브 및/또는 PCR 효소를 함유하는 제7 챔버를 포함한다.
실시형태 30: 실시형태 11-29 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 카트리지는 PCR 프라이머 및/또는 프로브 및/또는 PCR 효소를 또한 함유하는 제8 챔버를 포함한다.
실시형태 31: 실시형태 29-30의 방법에 있어서, 상기 PCR 프라이머, 및/또는 프로브, 및/또는 효소는 비드로서 제공된다.
실시형태 32: 실시형태 1-31 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 세포, 조직, 및 핵산을 함유하는 생물학적 유체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 샘플을 포함한다.
실시형태 33: 실시형태 32의 방법에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 점액, 소변, 객담, 췌액, 및 뇌척수액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 유체를 포함한다.
실시형태 34: 실시형태 32의 방법에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 조직 샘플, 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직, 신선 냉동 조직, 세침 흡인물 (FNA), 및 코어 생검으로 이루어진 군으로부터 선택되는 샘플을 포함한다.
실시형태 35: 실시형태 1-34 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 용해 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다.
실시형태 36: 실시형태 35의 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 샘플 수용 챔버 중 상기 샘플을 제공하는 단계 및 상기 샘플을 추출/침전 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다.
실시형태 37: 실시형태 1-36 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 매트릭스 재료는 유리 또는 실리카, 이온 교환 수지, 셀룰로스, 및 히드록시아파타이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 컬럼 재료를 포함한다.
실시형태 38: 실시형태 37의 방법에 있어서, 상기 매트릭스 재료는 유리를 포함한다.
실시형태 39: 실시형태 1-38 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 바이술파이트 이온은 암모늄 바이술파이트, 소듐 메타바이술파이트, 포타슘 바이술파이트, 세슘 바이술파이트, 및 DABSO로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물로서 제공된다.
실시형태 40: 실시형태 39의 방법에 있어서, 상기 바이술파이트 이온은 암모늄 바이술파이트에 의해 제공된다.
실시형태 41: 실시형태 1-40 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 바이술파이트는 술파이트 산화를 방지하기 위한 스캐빈저 및/또는 촉매를 포함하는 시약 믹스로 제공된다.
실시형태 42: 실시형태 41의 방법에 있어서, 상기 바이술파이트는 트롤록스 (Trolox) 및 히드로퀴논으로 이루어진 군으로부터 선택되는 스캐빈저를 포함하는 시약 믹스로 제공된다.
실시형태 43: 실시형태 41-42 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 바이술파이트는 촉매로서 폴리아민을 포함하는 시약 믹스로 제공된다.
실시형태 44: 실시형태 1-43 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 결합된 DNA를 용리시키는 단계는 저농도의 포타슘 히드록시드 또는 다른 염기를 사용하여 상기 DNA를 용리 및 변성시키는 단계를 포함한다.
실시형태 45: 실시형태 44의 방법에 있어서, 상기 결합된 DNA를 용리시키는 단계는 약 pH 10.5를 초과하는 pH의 알칼리 용액으로 상기 DNA를 용리 및 변성시키는 단계를 포함한다.
실시형태 46: 실시형태 44의 방법에 있어서, 상기 결합된 DNA를 용리시키는 단계는 약 pH 12를 초과하는 pH의 알칼리 용액으로 상기 DNA를 용리 및 변성시키는 단계를 포함한다.
실시형태 47: 실시형태 45-46의 방법에 있어서, 상기 알칼리 용액은 10-15 mM의 KOH 용액이다.
실시형태 48: 실시형태 1-47 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 용리된 DNA를 바이술파이트 이온과 인큐베이션시켜서 탈아민화 핵산을 생성시키는 단계는 약 6 M 내지 약 7 M 범위인 농도를 갖는 암모늄 바이술파이트 용액 중에서 DNA를 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
실시형태 49: 실시형태 48의 방법에 있어서, 상기 용리된 DNA를 바이술파이트 이온과 인큐베이션시켜서 탈아민화 핵산을 생성시키는 단계는 약 6.5 M의 농도를 갖는 암모늄 바이술파이트 용액 중에서 DNA를 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
실시형태 50: 실시형태 49의 방법에 있어서, 상기 인큐베이션 단계는 농축된 바이술파이트 용액 중 DNA를 상기 카트리지 내 온도 제어 채널 또는 챔버로 이송시키는 단계 및 상기 혼합물을 가열시키는 단계를 포함한다.
실시형태 51: 실시형태 50의 방법에 있어서, 상기 인큐베이션 단계는 농축된 바이술파이트 용액을 약 60℃ 내지 약 95℃의 온도에서 열적으로 순환시키는 단계를 포함한다.
실시형태 52: 실시형태 1-51 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 탈아민화 핵산을 제2 매트릭스 재료에 접촉시키는 상기 단계는 DNA-바이술파이트 용액을 신선한 GTC-EtOH과 혼합시키는 단계 및 용액을 상기 제2 매트릭스 재료 상에 분배시키는 단계를 포함한다.
실시형태 53: 실시형태 52의 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 제2 매트릭스 재료 중 DNA를 신선한 GTC-EtOH, 및 이후에 세정 용액으로 세척시키는 단계를 포함한다.
실시형태 54: 실시형태 53의 방법에 있어서, 상기 세정 용액은 PEG200을 포함한다.
실시형태 55: 실시형태 1-54 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 결합된 탈아민화 핵산을 탈술폰화시키는 단계는 DNA를 상기 제2 컬럼으로부터 높은 pH의 탈술폰화 완충제를 사용해 용리시키는 단계 및 상기 용액을 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
실시형태 56: 실시형태 55의 방법에 있어서, 상기 인큐베이션 단계는 약 1분 내지 약 1시간, 또는 약 5분 내지 약 30분, 또는 약 10분 내지 약 20분의 범위의 기간 동안, 또는 약 15분 동안이다.
실시형태 57: 실시형태 55-56의 방법에 있어서, 상기 높은 pH 탈술폰화/용리 완충제는 KOH를 포함한다.
실시형태 58: 실시형태 55-57 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 인큐베이션 단계는 상기 높은 pH의 탈술폰화 완충제를 이전에 수용한 챔버 (예를 들어, 챔버 10) 내에서 존재한다.
실시형태 59: 실시형태 1-58 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 바이술파이트 이온과의 인큐베이션 단계 이후에, 온도 제어 채널 또는 챔버는 완충제로 세척하여 잔류 바이술파이트를 제거시키고 pH를 중화시킨다.
실시형태 60: 실시형태 1-59 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 바이술파이트-전환된 핵산에 대해 고분해능 용융 분석 (HRM)을 수행하여 상기 핵산의 메틸화를 결정한다.
실시형태 61: 실시형태 1-60 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 바이술파이트-전환된 핵산의 핵산 시퀀싱을 수행하여 상기 핵산의 메틸화를 결정한다.
실시형태 62: 실시형태 1-60 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 메틸화 특이적 PCR을 수행하여 표적 핵산 서열의 메틸화를 결정한다.
실시형태 63: 실시형태 62의 방법에 있어서, 상기 메틸화 특이적 PCR (MSP)은 메틸화 서열에 특이적인 프라이머 및/또는 비메틸화 서열에 특이적인 프라이머를 사용하여 수행된다.
실시형태 64: 실시형태 62의 방법에 있어서, 상기 메틸화 특이적 PCR은 MethyLight 프로토콜을 포함한다.
실시형태 65: 실시형태 62의 방법에 있어서, TaqMan PCR 반응은 바이술파이트-전환된 메틸화 및/또는 비메틸화 서열에 특이적인 프라이머에 의해 수행된다.
실시형태 66: 실시형태 62-65 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 MSP는 증폭된 메틸화 서열에 대한 마커인 하나 이상의 형광성 프로브 및/또는 증폭된 비메틸화 서열에 대한 마커인 하나 이상의 형광성 프로브를 활용한다.
실시형태 67: 실시형태 66의 방법에 있어서, 상기 형광성 프로브는 형광성 리포터 염료 및 소광제 염료를 포함하고, 프로브는 Taq DNA 중합효소의 5'에서 3'으로의 뉴클레아제 활성에 의한 절단 시 신호를 제공한다.
실시형태 68: 실시형태 66-67 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 메틸화 신호는 관심 증폭 영역 내의 상이한 메틸화 영역에 각각 특이적인 복수개의 프로브에 대한 조합된 신호에 의해 결정된다.
실시형태 69: 실시형태 66-67 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 메틸화 신호는 관심 증폭 영역 내의 동일한 메틸화 영역에 특이적인 복수개의 프로브에 의해 결정된다.
실시형태 70: 실시형태 66-67 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 복수개의 프로브는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 프로브를 포함한다.
실시형태 71: 실시형태 66-67 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 메틸화 신호는 관심 증폭 영역 내에서 단일 프로브에 의해 결정된다.
실시형태 72: 실시형태 66-71 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 프로브는 심플렉스 또는 멀티플렉스로 작동된다.
실시형태 73: 실시형태 66-71 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 프로브는 멀티플렉스 형식으로 작동된다.
실시형태 74: 실시형태 66-73 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 프로브는 네스티드 PCR 반응으로서 작동된다.
실시형태 75: 실시형태 66-74 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 PCR 반응은 바이술파이트가 반응에 존재하면 PCR 동안 바이술파이트-매개 절단을 겪는 바이술파이트 오염 제어 프로브를 포함한다.
실시형태 76: 실시형태 1-75 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, PCR은 하나 이상의 돌연변이된 유전자에 대해 수행된다.
실시형태 77: 실시형태 1-76 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, PCR은 대조군으로서 비전환된 DNA에 대해 수행된다.
실시형태 78: 실시형태 1-77 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, PCR은 대조군으로서 전환된 DNA에 대해 수행된다.
실시형태 79: 실시형태 77의 방법에 있어서, PCR은 비전환된 DNA가 상기 방법의 표적인 경우에 비전환된 DNA에 대해 수행된다.
실시형태 80: 실시형태 1-79 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 바이술파이트 반응 및 PCR 반응, 또는 탈술폰화 반응 및 PCR 반응, 또는 바이술파이트 반응, 탈술폰화 반응 및 PCR 반응은 전부가 동일한 반응 튜브 또는 챔버에서 수행된다.
실시형태 81: 실시형태 1-80 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 제1 매트릭스 재료에 접촉시키는 단계는 RNA를 함유하는 샘플을 상기 제1 매트릭스 재료에 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 매트릭스 재료는 상기 RNA에 결합되어서 RNA가 정제된다.
실시형태 82: 실시형태 81의 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 RNA를 실질적으로 DNA와 독립적인 상기 매트릭스 재료로부터 용리시키는 단계를 포함한다.
실시형태 83: 실시형태 82의 방법에 있어서, RNA는 상기 제1 매트릭스 재료로부터 Tris 완충된 용리를 사용해 용리된다.
실시형태 84: 실시형태 81-83 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 RNA는 용리되어 챔버에 저장된다.
실시형태 85: 실시형태 81-84 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 역전사 (RT)는 상기 RNA에 대해 수행되고 qRT-PCR은 표적 RNA 서열의 수준을 결정하기 위해 수행된다.
실시형태 86: 실시형태 82-85 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, RNA 분획은 바이술파이트 전환된 핵산을 상기 제2 매트릭스 재료로부터 용리시키고 바이술파이트-전환된 DNA와 혼합시키거나, 또는 용리된 바이술파이트-전환된 DNA와 혼합시키는데 사용된다.
실시형태 87: 실시형태 86의 방법에 있어서, RT는 바이술파이트-전환된 DNA와 조합 이전에, 또는 이후에 상기 RNA에 대해서 수행된다.
실시형태 88: 실시형태 86-87 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, qRT-PCR은 표적 RNA 서열의 수준을 결정하기 위해서 혼합물 중 RT RNA에 대해 수행되고, 메틸화 특이적 PCR은 표적 DNA 서열의 메틸화를 결정하기 위해 혼합물에 대해 수행된다.
실시형태 89: 실시형태 1-88 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 메틸화는 MGMT, RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, HOXB4, RASGRF2, TM6SF1, 및 AKR1B1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 프로모터 영역에 대해 결정된다.
실시형태 90: 실시형태 81-89 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, RNA의 발현 수준은 메틸트랜스퍼라제에 대해 결정된다.
실시형태 91: 실시형태 90의 방법에 있어서, RNA의 발현 수준은 DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B, 및 TNMT3L로 이루어진 군으로부터 선택되는 메틸트랜스퍼라제에 대해 결정된다.
실시형태 92: 핵산의 메틸화 상태를 결정하기 위한 카트리지로서, 상기 카트리지는 제1 매트릭스 재료를 포함하는 컬럼, 샘플 수용 챔버, 온도 제어 채널 또는 챔버, 시약 및/또는 완충제를 함유하는 복수개의 챔버를 포함하고, 사용될 때에, 상기 챔버 중 적어도 하나는 바이술파이트 시약을 함유하고, 상기 챔버 중 적어도 하나는 탈술폰화/용리 완충제를 함유하고, 상기 카트리지는 임의로 상기 제2 매트릭스 재료를 포함하는 제2 컬럼을 포함한다.
실시형태 93: 실시형태 92의 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는, 사용될 때에, 구아니디늄 티오시아네이트 에탄올 (GTC-EtOH)을 포함하는 시약을 함유하는 챔버를 포함한다.
실시형태 94: 실시형태 92-93 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 제2 컬럼은 부재한다.
실시형태 95: 실시형태 92-93 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 제2 컬럼은 존재한다.
실시형태 96: 실시형태 92-95 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 온도 제어 채널 또는 챔버는 열순환 채널 또는 챔버이다.
실시형태 97: 실시형태 92-96 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 제2 가열 채널 또는 챔버를 더 포함한다.
실시형태 98: 실시형태 92-97 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 바이술파이트 시약은 암모늄 바이술파이트, 소듐 메타바이술파이트, 포타슘 바이술파이트, 세슘 바이술파이트, 및 DABSO로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함한다.
실시형태 99: 실시형태 98의 카트리지에 있어서, 상기 바이술파이트 시약은 암모늄 바이술파이트를 포함한다.
실시형태 100: 실시형태 92-99의 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 바이술파이트는 술파이트 산화를 방지하기 위한 스캐빈저 및/또는 촉매를 포함하는 시약 믹스로 제공된다.
실시형태 101: 실시형태 100의 카트리지에 있어서, 상기 바이술파이트는 트롤록스 및 히드로퀴논으로 이루어진 군으로부터 선택되는 스캐빈저를 포함하는 시약 믹스로 제공된다.
실시형태 102: 실시형태 100-101 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 바이술파이트는 촉매로서 폴리아민을 포함하는 시약 믹스로 제공된다.
실시형태 103: 실시형태 92-102 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 제1 매트릭스 재료 및/또는 상기 제2 매트릭스 재료는 존재할 경우, 유리 또는 실리카, 이온 교환 수지, 및 히드록시아파타이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 재료를 포함한다.
실시형태 104: 실시형태 92-103 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 메틸화 특이적 PCR 프라이머, 메틸화 특이적 PCR 프로브, PCR 효소(들), 및 PCR 반응 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시약을 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다.
실시형태 105: 실시형태 104의 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 메틸화 특이적 PCR 프라이머, 메틸화 특이적 PCR 프로브, PCR 효소(들), 및 PCR 반응 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시약을 함유하는 적어도 2개 챔버를 함유한다.
실시형태 106: 실시형태 92-105 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 전환된 DNA의 전방향 가닥의 메틸화의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 함유하는 적어도 하나의 챔버를 함유한다.
실시형태 107: 실시형태 92-106 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 전환된 DNA의 역방향 가닥의 메틸화의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 함유하는 적어도 하나의 챔버를 함유한다.
실시형태 108: 실시형태 104-107 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 PCR 프라이머, 및/또는 프로브, 및/또는 효소는 비드로서 제공된다.
실시형태 109: 실시형태 92-108 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 샘플 수용 챔버, 상기 컬럼(들), 상기 복수개의 챔버, 및 상기 온도-제어 가열 채널 또는 챔버는 선택적으로 유체 연통된다.
실시형태 110: 실시형태 109의 카트리지에 있어서, 상기 샘플 수용 챔버, 상기 컬럼(들), 상기 복수개의 챔버, 및 상기 온도 제어 채널 또는 챔버는 미세유체 채널 및 밸브에 의해 선택적으로 유체 연통된다.
실시형태 111: 실시형태 109의 카트리지에 있어서, 상기 샘플 수용 챔버, 상기 컬럼(들), 상기 복수개의 챔버, 및 상기 온도 제어 채널 또는 챔버 또는 상기 온도 제어 채널 또는 챔버로의 포트는 중심 밸브 주변에 배치되고 상기 중심 밸브 내 채널과 선택적으로 유체 연통되며, 상기 중심 밸브는 상기 중심 밸브와 유체 연통되는 챔버의 내부 또는 외부로 유체를 유인시킬 수 있는 플런저를 수용하도록 구성된다.
실시형태 112: 실시형태 92-111 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는, 사용될 때에, 상기 카트리지가
샘플을 함유하는 제1 챔버;
구아니디늄 티오술페이트-에탄올 (GTC-EtOH) 용액을 함유하는 제2 챔버;
바이술파이트 시약을 함유하는 제3 챔버;
완충제를 함유하는 제4 챔버;
세정 용액을 함유하는 제5 챔버; 및
용리/탈술폰화 시약을 함유하는 제6 챔버
를 포함하도록 구성된다.
실시형태 113: 실시형태 112의 카트리지에 있어서, 상기 제1 챔버는 GTC-EtOH-Tween 추출/침전 시약 중에 상기 샘플을 함유한다.
실시형태 114: 실시형태 92-113 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 카트리지는 샘플이 카트리지에 위치되는 시점 또는 그 시점 가까이에 바이술파이트 시약이 카트리지에 첨가되도록 구성된다.
실시형태 115: 실시형태 92-113 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 바이술파이트 시약은 카트리지의 성분으로서 제공된다.
실시형태 116: 실시형태 92-115 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 카트리지는 샘플이 카트리지에 위치되는 시점 또는 그 시점 가까이에 GTC-ETOH-Tween 완충제의 첨가를 위해 구성된다.
실시형태 117: 실시형태 92-115 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, GTC-ETOH-Tween 완충제는 카트리지의 성분으로서 제공된다.
실시형태 118: 실시형태 92-117 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 PCR 프라이머 및/또는 프로브 및/또는 PCR 효소를 함유하는 제7 챔버를 포함한다.
실시형태 119: 실시형태 92-118 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 PCR 프라이머 및/또는 프로브 및/또는 PCR 효소를 또한 함유하는 제8 챔버를 포함한다.
실시형태 120: 실시형태 92-119 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 바이술파이트-전환된 메틸화 및/또는 비메틸화 서열에 특이적인 프라이머를 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다.
실시형태 121: 실시형태 92-120 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 TaqMan PCR 반응을 위한 시약을 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다.
실시형태 122: 실시형태 92-121 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 증폭된 메틸화 서열에 대한 마커인 하나 이상의 형광성 프로브 및/또는 증폭된 비메틸화 서열에 대한 마커인 하나 이상의 형광성 프로브를 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다.
실시형태 123: 실시형태 122의 카트리지에 있어서, 상기 프로브는 형광성 리포터 염료 및 소광제 염료를 포함하고, 프로브는 Taq DNA 중합효소의 5'에서 3'으로의 뉴클레아제 활성에 의한 절단 시 신호를 제공한다.
실시형태 124: 실시형태 122-123 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 관심 증폭 영역 내의 상이한 메틸화된 영역에 각각 특이적인 복수개의 프로브를 포함한다.
실시형태 125: 실시형태 122-123 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 관심 증폭 영역 내의 메틸화된 영역에 특이적인 단일 프로브를 포함한다.
실시형태 126: 실시형태 122-123 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 관심 증폭 영역 내의 동일한 메틸화된 영역에 각각 특이적인 복수개의 프로브를 포함한다.
실시형태 127: 실시형태 92-126 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 MGMT, RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, HOXB4, RASGRF2, TM6SF1, 및 AKR1B1로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 프로모터 영역의 메틸화를 결정하기 위한 프라이머 및/또는 프로브를 함유한다.
실시형태 128: 실시형태 92-126 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 표 5, 9, 또는 10에 표시된 하나 이상의 프라이머, 및/또는 표 5, 9, 또는 10에 표시된 하나 이상의 프로브를 함유한다.
실시형태 129: 실시형태 128의 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 네스티드 PCR 반응을 사용하여 MGMT 의 메틸화를 결정하기 위해 하기 프로브 및 프라이머를 함유한다:
뉴클레오티드 서열: GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT (SEQ ID NO:263)을 포함하는 외부 전방향 프라이머 (248b);
뉴클레오티드 서열: AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC (SEQ ID NO:265)을 포함하는 외부 역방향 프라이머 (249b);
뉴클레오티드 서열: TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC (SEQ ID NO:266)을 포함하는 내부 전방향 프라이머 (250);
뉴클레오티드 서열: GCACTCTTCCGAAAACGAAACG (SEQ ID NO:267)을 포함하는 내부 역방향 프라이머 (251); 및
뉴클레오티드 서열: 플루오르-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-차단제 (SEQ ID NO: 268)을 포함하는 프로브 (252a).
실시형태 130: 실시형태 128-129 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 네스티드 PCR 반응을 사용하여 (예를 들어, 대조군으로서) ACTB의 메틸화를 결정하기 위해 하기 프로브 및 프라이머를 함유한다:
뉴클레오티드 서열: GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT (SEQ ID NO:103)을 포함하는 외부 전방향 프라이머 (102);
뉴클레오티드 서열: CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (SEQ ID NO:104)을 포함하는 외부 역방향 프라이머 (103);
뉴클레오티드 서열: GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG (SEQ ID NO:149)을 포함하는 내부 전방향 프라이머 (148);
뉴클레오티드 서열: CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC (SEQ ID NO:150)을 포함하는 내부 역방향 프라이머 (149); 및
뉴클레오티드 서열: 플루오르-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-차단제 (SEQ ID NO:179)을 포함하는 프로브 (178).
실시형태 131: 실시형태 92-130 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 카트리지는 메틸트랜스퍼라제에 대한 RNA의 발현 수준의 결정을 위해 구성된다.
실시형태 132: 실시형태 131의 카트리지에 있어서, 상기 메틸트랜스퍼라제는 DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B, 및 TNMT3L로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태 133: 생물학적 샘플 중 핵산의 메틸화를 결정하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템은 하나 이상의 샘플 프로세싱 모듈을 함유하도록 구성된 인클로저를 포함하고, 각각의 샘플 프로세싱 모듈은 실시형태 92-132 중 어느 하나에 따른 탈착형 카트리지를 수용하도록 구성되며; 상기 시스템은 하나 이상의 표적 핵산의 메틸화를 결정하고 임의로 상응하는 탈착형 샘플 카트리지 내 하나 이상의 표적 DNA 서열의 수준을 결정하기 위해 샘플 프로세싱을 수행하도록 샘플 프로세싱 모듈을 가동시키도록 구성되고, 상응하는 탈착형 샘플 카트리지 내 샘플에 대한 상기 프로세싱은 실시형태 1-91 중 어느 하나에 따른 방법을 수행한다.
실시형태 134: 실시형태 133의 시스템에 있어서, 상기 시스템은 하나의 샘플 프로세싱 모듈을 함유하도록 구성된다.
실시형태 135: 실시형태 133의 시스템에 있어서, 상기 시스템은 적어도 2개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 4개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 8개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 12개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 16개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 20개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 24개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 28개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 32개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 64개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 128개의 샘플 프로세싱 모듈을 함유하도록 구성된다.
실시형태 136: 실시형태 133-135 중 어느 하나에 따른 시스템에 있어서, 상기 모듈은 상기 카트리지 내 온도 제어 챔버 또는 채널을 가열시키기 위한 하나 이상의 가열판을 포함한다.
실시형태 137: 실시형태 133-136 중 어느 하나에 따른 시스템에 있어서, 상기 모듈은 상기 카트리지 내 온도 제어 채널 또는 챔버를 냉각시키도록 구성된 팬을 포함한다.
실시형태 138: 실시형태 133-137 중 어느 하나에 따른 시스템에 있어서, 상기 모듈은 정보 (예를 들어, 광학 정보)를 분석용 컴퓨터로 전송하기 위한 회로를 포함한다.
실시형태 139: 실시형태 133-138 중 어느 하나에 따른 시스템에 있어서, 상기 모듈은 상기 카트리지 내의 반응에 의해 생성되는 하나 이상의 광학 신호의 여기 및/또는 검출을 제공하기 위한 광학 블록을 포함한다.
실시형태 140: 실시형태 133-139 중 어느 하나에 따른 시스템에 있어서, 상기 시스템은 실시형태 1-19 중 어느 하나에 따른 방법을 수행하기 위해 상기 카트리지를 가동시키도록 구성된다.
실시형태 141: 실시형태 133-139 중 어느 하나에 따른 시스템에 있어서, 상기 시스템은 샘플을 컬럼에 결합시키고; DNA를 컬럼으로부터 용리시키고 상기 DNA를 전환 시약과 배합시키고; 반응 챔버 또는 튜브 중 DNA/전환 시약 용액을 가열시켜 전환된 DNA를 생성시키고; 전환된 DNA를 컬럼에 결합시키고; DNA를 탈술폰화시키고 컬럼으로부터 용리시키고; 반응 챔버 또는 튜브에서 용리된 탈술폰화된 DNA에 대해 PCR을 수행하기 위해 상기 카트리지를 가동시키도록 구성된다.
실시형태 142: 실시형태 141의 시스템에 있어서, 상기 PCR는 동일한 반응 챔버 또는 튜브에서 수행되고 DNA/전환 시약 용액은 이전에 가열되었다.
실시형태 143: 샘플 제조를 위한 카트리지로서, 상기 카트리지는 DNA에 결합하는 친화성 매트릭스를 포함하는 채널 또는 챔버를 포함하고, 복수개의 챔버는 중심 밸브 어셈블리 주변에 배치되고 상기 중심 밸브 어셈블리와 선택적으로 유체 연통되며, 상기 중심 밸브 어셈블리는 상기 중심 밸브와 유체 연통되는 챔버의 내부 또는 외부로 유체를 유인시킬 수 있는 플런저를 수용하도록 구성되고, 상기 복수개의 챔버는 최대 약 5 mL 또는 최대 약 4 mL의 샘플 용액을 수용하도록 구성된 챔버; PEG를 함유하는 챔버; GTC-EtOH을 함유하는 챔버; 알칼리 용액을 함유하는 챔버; 및 완충제를 함유하는 챔버를 포함한다.
실시형태 144: 실시형태 143의 카트리지에 있어서, 상기 복수개의 챔버는 바이술파이트 시약을 함유하는 챔버를 더 포함한다.
실시형태 145: 실시형태 143-144 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 복수개의 챔버는 GTC-에탄올 세척 용액을 함유하는 챔버를 포함한다.
실시형태 146: 실시형태 145의 카트리지에 있어서, 상기 GTC-에탄올 세척 용액은 1.25 M의 구아니디늄 티오시아네이트, 25 mM의 Tris pH 7.0, 및 50%의 에탄올을 포함한다.
실시형태 147: 실시형태 143-146 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 PEG는 PEG200을 포함한다.
실시형태 148: 실시형태 143-147 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 알칼리 용액은 KOH를 포함한다.
실시형태 149: 실시형태 143-148 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 완충제는 Tris를 포함한다.
실시형태 150: 실시형태 143-149 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 복수개의 챔버는 하나 이상의 PCR 프라이머 및/또는 프로브를 포함하는 비드를 함유하는 챔버를 포함한다.
실시형태 151: 실시형태 143-150 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, PEG를 함유하는 상기 챔버는 약 1 mL의 PEG를 함유한다.
실시형태 152: 실시형태 143-151 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 알칼리 용액을 함유하는 상기 챔버는 약 500 ㎕의 용액을 함유한다.
실시형태 153: 실시형태 143-152 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, GTC-EtOH을 함유하는 상기 챔버는 약 2 mL의 GTC-EtOH을 함유한다.
실시형태 154: 실시형태 143-153 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 완충제를 함유하는 상기 챔버는 약 2 mL의 완충제를 함유한다.
실시형태 155: 고부피 샘플 제조 (HVSP)로서, 상기 카트리지는 DNA에 결합하는 친화성 매트릭스를 포함하는 채널 또는 챔버를 포함하고, 복수개의 챔버는 중심 밸브 어셈블리 주변에 배치되고 상기 중심 밸브 어셈블리와 선택적으로 유체 연통되며 상기 중심 밸브 어셈블리는 상기 중심 밸브와 유체 연통되는 챔버의 내부 또는 외부로 유체를 유인시킬 수 있는 플런저를 수용하도록 구성되고, 상기 복수개의 챔버는 각각이 최대 약 4.5 mL의 샘플 용액을 수용하도록 구성되는 적어도 2개의 상이한 챔버; PEG를 함유하는 챔버; 알칼리 용액을 함유하는 챔버; 및 완충제를 함유하는 챔버를 포함한다.
실시형태 156: 실시형태 155의 카트리지에 있어서, 상기 복수개의 챔버는 각각이 최대 4 mL의 샘플 용액을 수용하도록 구성된 적어도 3개의 상이한 챔버를 포함한다.
실시형태 157: 실시형태 155-156 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 PEG는 PEG200을 포함한다.
실시형태 158: 실시형태 155-157 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 염기성 용액은 KOH를 포함한다.
실시형태 159: 실시형태 155-158 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 완충제는 Tris를 포함한다.
실시형태 160: 실시형태 155-159 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 복수개의 챔버는 세척 용액을 함유하는 챔버를 포함한다.
실시형태 161: 실시형태 160의 카트리지에 있어서, 상기 세척 용액은 1.25 M의 구아니디늄 티오시아네이트, 25 mM의 Tris pH 7.0, 및 50%의 에탄올을 포함한다.
실시형태 162: 실시형태 155-161 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 프로세싱된 샘플의 제거를 위해 구성된 챔버를 포함한다.
실시형태 163: 실시형태 155-162 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 샘플 챔버는 사용될 때에, 샘플 용액, GTC 및 이소프로판올을 함유한다.
실시형태 164: 실시형태 163의 카트리지에 있어서, 상기 샘플 챔버는 사용될 때에, 실질적으로 동일한 부피로 샘플 용액, GTC 및 이소프로판올을 함유한다.
실시형태 165: 실시형태 155-164 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 사용될 때에, 샘플을 수용하도록 구성된 각각의 상기 챔버에 배치되는 4 mL의 샘플 용액을 포함한다.
실시형태 166: 실시형태 155-165 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 0.5 mL 내지 약 4 mL의 샘플의 샘플 부피에 대해서 실질적으로 직선인 DNA 또는 RNA 회수율을 제공한다.
실시형태 167: 실시형태 155-166 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 전환 시약을 함유하거나 또는 전환 시약을 수용하도록 구성된다.
실시형태 168: 실시형태 167의 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 사용될 때에, DNA의 바이술파이트 전환을 수행한다.
실시형태 169: 혈청 또는 혈장으로부터 DNA 샘플의 제조를 위한 용해 용액으로서, 상기 용해 용액은 GTC, 완충제, 세제, 및 임의로 소포제를 포함한다.
실시형태 170: 실시형태 169의 용해 용액에 있어서, 혈청 또는 혈장에 대한 상기 용해 용액은 GTC, Tris pH 7.0, Tween 20, 및 소포제 SE15를 포함한다.
실시형태 171: 실시형태 170의 용해 용액에 있어서, 혈청 또는 혈장에 대한 상기 용해 용액은 약 4.5 M의 GTC, 약 45 mM의 Tris pH 7.0, 약 1%의 Tween20, 및 약 0.01%의 소포제 SE15를 포함한다.
실시형태 172: FFPE 샘플로부터 DNA 샘플의 제조를 위한 용해 용액.
실시형태 173: 실시형태 172의 용해 용액에 있어서, FFPE 샘플에 대한 상기 용해 용액은 완충제, 세제, NaCl, MgCl2, 킬레이트화제, 소포제 SE15, 및 소듐 아자이드를 포함한다.
실시형태 174: 실시형태 173의 용해 용액에 있어서, FFPE 샘플에 대한 상기 용해 용액은 약 1%의 Tween20, 약 400 mM의 NaCl, 약 25 mM의 EDTA, 약 10 mM의 MgCl2, 약 50 mM의 HEPES pH 7.2, 약 0.01%의 소포제 SE15, 및 약 0.01%의 소듐 아자이드를 포함한다.
실시형태 175: DNA 메틸화의 결정을 위한 키트로서, 상기 키트는 실시형태 92-136 중 어느 하나에 따른 핵산의 메틸화 상태를 결정하기 위한 카트리지를 함유하는 컨테이너를 포함한다.
실시형태 176: 실시형태 175의 키트에 있어서, 상기 키트는 용해 용액을 함유하는 컨테이너를 더 포함한다.
실시형태 177: 실시형태 176의 키트에 있어서, 상기 용해 용액은 실시형태 169-171 중 어느 하나에 따른 혈청 또는 혈장에 대한 용해 용액이다.
실시형태 178: 실시형태 176의 키트에 있어서, 상기 용해 용액은 실시형태 172-174 중 어느 하나에 따른 FFPE 샘플에 대한 용해 용액이다.
실시형태 179: 실시형태 175-178 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 프로테이나제 K를 함유하는 컨테이너를 포함한다.
실시형태 180: 실시형태 175-179 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 상기 카트리지 또는 카트리지와 별개인 컨테이너 내에 전환 시약을 포함한다.
실시형태 181: 실시형태 180의 키트에 있어서, 상기 키트는 카트리지와 별개인 컨테이너 내에 상기 전환 시약을 포함한다.
실시형태 182: 실시형태 180의 키트에 있어서, 상기 키트는 카트리지의 챔버에 제공되는 상기 전환 시약을 포함한다.
실시형태 183: 실시형태 180-182 중 어느 하나에 따라서, 상기 전환 시약은 소듐 메타바이술파이트, 포타슘 바이술파이트, 세슘 바이술파이트, 암모늄 바이술파이트, 및 DABSO로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함한다.
실시형태 184: 실시형태 183의 키트에 있어서, 상기 전환 시약은 암모늄 바이술파이트를 포함한다.
실시형태 185: 실시형태 175-184 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 샘플 프로세싱 시약을 함유하는 컨테이너를 포함한다.
실시형태 186: 실시형태 185의 키트에 있어서, 상기 샘플 프로세싱 시약은 구아니듐 티오시아네이트를 포함한다.
실시형태 187: 실시형태 185-186 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 샘플 프로세싱 시약은 에탄올을 포함한다.
실시형태 188: 실시형태 175-187 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 실시형태 155-166 중 어느 하나에 따른 샘플 제조를 위한 카트리지를 함유하는 컨테이너를 포함한다.
실시형태 189: 실시형태 175-188 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 DNA 메틸화의 결정을 위한 상기 카트리지의 사용을 교시하는 지시 재료를 함유한다.
실시형태 190: 암의 메틸화 마커의 검출을 위한 카트리지로서, 상기 카트리지는 복수개의 챔버 및 열순환 채널 또는 챔버를 포함하고, 상기 복수개의 챔버 및 상기 열순환 채널 또는 챔버로의 포트는 중심 밸브 어셈블리 주변에 배치되고 상기 중심 밸브 어셈블리와 선택적으로 유체 연통되며, 상기 중심 밸브 어셈블리는 상기 중심 밸브와 유체 연통되는 챔버 또는 포트의 내부 또는 외부로 유체를 유인시킬 수 있는 플런저를 수용하도록 구성되고, 상기 복수개의 챔버는 샘플 수용 챔버; 바이술파이트 시약을 함유하거나 또는 그를 수용하도록 구성된 챔버; 세척 용액을 함유하는 챔버; Tris 완충제를 함유하는 챔버; KOH를 포함하는 알칼리 용액을 함유하는 챔버; PCR 마스터 믹스를 제공하는 비드를 함유하는 챔버; 및 그 메틸화 상태가 암에 대한 마커인 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 챔버를 포함한다.
실시형태 191: 실시형태 190의 카트리지에 있어서, 상기 복수개의 챔버는 폐기 용액을 수용하도록 배치된 챔버를 포함한다.
실시형태 192: 실시형태 190-191 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 바이술파이트 시약은 소듐 메타바이술파이트, 포타슘 바이술파이트, 세슘 바이술파이트, 암모늄 바이술파이트, 및 DABSO로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함한다.
실시형태 193: 실시형태 192의 카트리지에 있어서, 상기 바이술파이트 시약은 암모늄 바이술파이트를 포함한다.
실시형태 194: 실시형태 190-193 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 세척 용액은 1.25 M의 GTC, 25 mM의 Tris pH 7.0, 및 50%의 에탄올을 포함한다.
실시형태 195: 실시형태 190-194 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 그의 메틸화 상태가 유방암, 췌장암, 전립선암, 뇌암, 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암에 대한 마커인 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 196: 실시형태 195의 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 네스티드 PCR 반응을 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 197: 실시형태 196의 카트리지에 있어서, 상기 네스티드 PCR은 전환된 DNA에 특이적인 제1 PCR 반응 및 메틸화 CpG에 특이적인 제2 PCR 반응을 포함한다.
실시형태 198: 실시형태 190-197 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, PCR 프라이머 및 프로브 챔버를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 전환된 DNA의 전방향 가닥의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유한다.
실시형태 199: 실시형태 190-198 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, PCR 프라이머 및 프로브 챔버를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 전환된 DNA의 역방향 가닥의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유한다.
실시형태 200: 실시형태 190-199 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 RASSF1A, AKR1B1, HOXB4, HIST1H3C, RASGRF2, TM6SF1, BRCA1, BNC1, ADAMTS1, CDO1, SOX17, TAC1, HOXA7, 및 MGMT로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다
실시형태 201: 실시형태 190-200 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 그의 메틸화 상태가 췌장암에 대한 마커인 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 202: 실시형태 201의 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 ADAMTS1, 및/또는 BNC1의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 203: 실시형태 202의 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 ADAMTS1의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 204: 실시형태 202-203 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 BNC1의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 205: 실시형태 202의 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 표 5 또는 10에 표시된 ADAMTS1 및/또는 BNC1 에 대한 하나 이상의 PCR 프라이머 및/또는 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 206: 실시형태 190-200 중 어느 하나에 다른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 그의 메틸화 상태가 유방암에 대한 마커인 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 207: 실시형태 206의 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 BRCA1, RASSF1A, AKR1B1, HOXB4, HIST1H3C, RASGRF2, 및 TM6SF1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯개 또는 모든 유전자의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 208: 실시형태 207의 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 BRCA1 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 209: 실시형태 207-208 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 RASSF1A 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 210: 실시형태 207-209 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 AKR1B1 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 211: 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 HOXB4 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 212: 실시형태 207-211 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 HIST1H3C 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 213: 실시형태 207-212 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 RASGRF2 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 214: 실시형태 207-213 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 TM6SF1 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 215: 실시형태 207-214 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 표 5 또는 9에 표시된 하나 이상의 PCR 프라이머 및/또는 하나 이상의 PCR 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 216: 실시형태 206의 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 BRCA1 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 217: 실시형태 190-200 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 그의 메틸화 상태가 폐암에 대한 마커인 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 218: 실시형태 217의 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 CDO1, SOX17, TAC1, 및 HOXA7 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나, 둘, 세개 또는 모든 유전자의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 219: 실시형태 218의 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 CDO1 의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 220: 실시형태 218-219 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 SOX17 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 221: 실시형태 218-220 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 TAC1 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 222: 실시형태 218-221 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 HOXA7 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 223: 실시형태 190-200 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 그의 메틸화 상태가 뇌암에 대한 마커인 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 224: 실시형태 223의 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 MGMT 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 225: 실시형태 224의 카트리지에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 표 5 또는 10에 표시된 MGMT에 대한 하나 이상의 PCR 프라이머 및/또는 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 226: 실시형태 225의 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 네스티드 PCR 반응을 사용하는 MGMT 의 메틸화를 결정하기 위한 하기의 프로브 및 프라이머를 함유한다:
뉴클레오티드 서열: GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT (SEQ ID NO:263)을 포함하는 외부 전방향 프라이머 (248b);
뉴클레오티드 서열: AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC (SEQ ID NO:265)을 포함하는 외부 역방향 프라이머 (249b);
뉴클레오티드 서열: TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC (SEQ ID NO:266)을 포함하는 내부 전방향 프라이머 (250);
뉴클레오티드 서열: GCACTCTTCCGAAAACGAAACG (SEQ ID NO:267)을 포함하는 내부 역방향 프라이머 (251); 및
뉴클레오티드 서열: 플루오르-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-차단제 (SEQ ID NO: 268)을 포함하는 프로브 (252a).
실시형태 227: 실시형태 225-226 중 어느 하나에 따른 카트리지에 있어서, 상기 카트리지는 네스티드 PCR 반응을 사용하는 (예를 들어, 대조군으로서) ACTB의 메틸화를 결정하기 위한 하기의 프로브 및 프라이머를 함유한다:
뉴클레오티드 서열: GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT (SEQ ID NO:103)을 포함하는 외부 전방향 프라이머 (102);
뉴클레오티드 서열: CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (SEQ ID NO:104)을 포함하는 외부 역방향 프라이머 (103);
뉴클레오티드 서열: GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG (SEQ ID NO:149)을 포함하는 내부 전방향 프라이머 (148);
뉴클레오티드 서열: CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC (SEQ ID NO:150)을 포함하는 내부 역방향 프라이머 (149); 및
뉴클레오티드 서열: 플루오르-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-차단제 (SEQ ID NO:179)을 포함하는 프로브 (178).
실시형태 228: 혈청 또는 혈장으로부터 cfDNA의 샘플을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
프로테이나제 K 처리된 혈청 또는 혈장의 샘플을 실시형태 169-171 중 어느 하나에 따른 용해 용액, 및 알콜과 배합하여 샘플 용액을 형성시키는 단계;
실시형태 143-154 중 어느 하나에 따른 카트리지 내 샘플 수용 챔버, 또는 실시형태 155-168 중 어느 하나에 따른 카트리지 내 샘플 수용 챔버에 상기 샘플 용액을 로딩시키는 단계; 및
상기 샘플 중 DNA를 상기 친화성 매트릭스에 결합시킨 후에 세척하여 상기 DNA를 상기 매트릭스로부터 방출시키도록 상기 카트리지를 가동시키는 단계
를 포함한다.
실시형태 229: 실시형태 228의 방법에 있어서, 프로테이나제 K 처리된 혈청 또는 혈장의 샘플을 배합하는 상기 단계는 상기 샘플, 용해 용액 및 알콜을 약 1.3 mL의 프로테이나제 K 처리된 혈청 또는 혈장, 2.2 mL 용해 용액; 및 약 1.5 mL 알콜에 상응하는 비율로 배합시키는 단계를 포함한다.
실시형태 230: 실시형태 228-229 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 알콜은 이소프로판올을 포함한다.
실시형태 231: 실시형태 228-230 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 샘플은 혈청을 포함한다.
실시형태 232: 실시형태 228-231 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 샘플은 혈장을 포함한다.
실시형태 233: 실시형태 228-232 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 샘플은 혈청을 포함한다.
실시형태 234: 실시형태 228-233 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 카트리지를 가동시키는 단계는 실시형태 133-139 중 어느 하나에 따른 시스템 내 샘플 프로세싱 모듈에 상기 카트리지를 도입시키는 단계를 포함한다.
실시형태 235: 실시형태 228-234 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 방법은 메틸화 검출을 위해 상기 DNA를 전환시키도록 상기 카트리지를 가동시키는 단계를 포함한다.
실시형태 236: 실시형태 228-235 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 DNA 또는 전환된 DNA를 주형으로 사용하는 하나 이상의 PCR 반응을 수행하도록 상기 카트리지를 가동시키는 단계를 더 포함한다.
실시형태 237: 실시형태 228-234 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 로딩 단계는 실시형태 155-165 중 어느 하나에 따른 카트리지 중 하나 이상의 샘플 수용 챔버로 상기 샘플 용액을 로딩시키는 단계를 포함한다.
실시형태 238: 실시형태 237의 방법에 있어서, 상기 방법은 방출된 DNA를 메틸화 검출 및/또는 PCR을 위한 제2 카트리지로 수송시키는 단계를 더 포함한다.
실시형태 239: 실시형태 238의 방법에 있어서, 상기 제2 카트리지는 실시형태 92-132 중 어느 하나에 따른 카트리지이다.
실시형태 240: 실시형태 238-239 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 방법은 메틸화 검출을 위해 상기 DNA를 전환시키도록 상기 제2 카트리지를 가동시키는 단계를 더 포함한다.
실시형태 241: 실시형태 238-240 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 DNA 또는 전환된 DNA를 주형으로서 사용하는 하나 이상의 PCR 반응을 수행하도록 상기 제2 카트리지를 가동시키는 단계를 더 포함한다.
실시형태 242: 실시형태 238-241 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 제2 카트리지를 가동시키는 상기 단계는 실시형태 133-139 중 어느 하나에 따른 시스템 내 샘플 프로세싱 모듈에 상기 제2 카트리지를 도입시키는 단계를 포함한다.
실시형태 243: FFPE 샘플로부터 DNA를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
포르말린-고정 파라핀 포매 샘플을 실시형태 172-174 중 어느 하나에 따른 용해 용액과 배합시키는 단계;
상기 샘플을 함유하는 상기 용해 용액을 가열시키는 단계; 알콜을 상기 샘플에 첨가하여 샘플 용액을 형성시키는 단계; 상기 샘플 용액을 실시형태 143-154 중 어느 하나에 따른 카트리지 내 샘플 수용 챔버, 또는 실시형태 155-168 중 어느 하나에 따른 카트리지 내 샘플 수용 챔버에 로딩시키는 단계; 및
상기 샘플 중 DNA를 상기 친화성 매트릭스에 결합시키고 나서 세척하고 상기 DNA를 상기 매트릭스로부터 방출시키도록 상기 카트리지를 가동시키는 단계
를 포함한다.
실시형태 244: 실시형태 243의 방법에 있어서, 상기 가열 단계는 프로테이나제 K를 상기 샘플에 첨가하고 상기 샘플을 가열시키는 단계를 포함한다.
실시형태 245: 실시형태 244의 방법에 있어서, 상기 가열 단계는 약 50 ㎕의 프로테이나제 K를 FFPE 샘플을 함유하는 약 1.2 mL의 FFPE 용해 용액에 첨가하는 단계를 포함한다.
실시형태 246: 실시형태 243-245 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 가열 단계는 상기 용해 용액을 약 50℃ 내지 약 60℃ 범위의 온도로 가열시키는 단계를 포함한다.
실시형태 247: 실시형태 246의 방법에 있어서, 상기 가열 단계는 상기 용해 용액을 약 56℃의 온도로 가열시키는 단계를 포함한다.
실시형태 248: 실시형태 243-247 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 가열 단계는 최대 약 4시간, 또는 최대 약 5시간, 또는 최대 약 6시간 범위의 기간 동안이다.
실시형태 249: 실시형태 248의 방법에 있어서, 상기 가열 단계는 약 4시간 동안이다.
실시형태 250: 실시형태 243-249 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 알콜은 에탄올을 포함한다.
실시형태 251: 실시형태 243-250 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 방법은 약 1:1 용해 용액:알콜의 부피 비율로 상기 용해 용액에 알콜을 첨가시키는 단계를 포함한다.
실시형태 252: 실시형태 243-251 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 카트리지를 가동시키는 단계는 실시형태 133-139 중 어느 하나에 따른 시스템 내 샘플 프로세싱 모듈에 상기 카트리지를 도입시키는 단계를 포함한다.
실시형태 253: 실시형태 243-252 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 방법은 메틸화 검출을 위해 상기 DNA를 전환시키도록 상기 카트리지를 가동시키는 단계를 더 포함한다.
실시형태 254: 실시형태 243-253 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 DNA 또는 전환된 DNA를 주형으로서 사용하는 하나 이상의 PCR 반응을 수행하도록 상기 카트리지를 가동시키는 단계를 더 포함한다.
실시형태 255: 실시형태 243-251 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 로딩 단계는 실시형태 155-165 중 어느 하나에 따른 카트리지 내 하나 이상의 샘플 수용 챔버에 상기 샘플 용액을 로딩시키는 단계를 포함한다.
실시형태 256: 실시형태 255의 방법에 있어서, 상기 방법은 방출된 DNA를 메틸화 검출 및/또는 PCR을 위해 제2 카트리지로 수송시키는 단계를 더 포함한다.
실시형태 257: 실시형태 256의 방법에 있어서, 상기 제2 카트리지는 실시형태 92-132 중 어느 하나에 따른 카트리지이다.
실시형태 258: 실시형태 256-257 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 방법은 메틸화 검출을 위해 상기 DNA를 전환시키도록 상기 제2 카트리지를 가동시키는 단계를 더 포함한다.
실시형태 259: 실시형태 256-258 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 DNA 또는 전환된 DNA를 주형으로서 사용하는 하나 이상의 PCR 반응을 수행하도록 상기 제2 카트리지를 가동시키는 단계를 더 포함한다.
실시형태 260: 실시형태 256-259 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 제2 카트리지를 가동시키는 상기 단계는 실시형태 133-139 중 어느 하나에 따른 시스템 내 샘플 프로세싱 모듈로 상기 제2 카트리지를 도입시키는 단계를 포함한다.
실시형태 261: 대상체에서 암을 검출하고/하거나 암의 병기를 결정하고/하거나, 암에 대한 소인을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
상기 대상체 유래의 생물학적 샘플을 제공하는 단계로서, 상기 생물학적 샘플은 DNA를 포함하는 것인 단계;
그의 메틸화 상태가 암에 대한 마커인 상기 DNA에서 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위해 실시형태 190-225 중 어느 하나에 따른 카트리지를 활용하는 단계로서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화의 증가는 암 또는 암에 대한 소인의 존재 또는 암 또는 전암의 병기를 의미하는 것인 단계
를 포함한다.
실시형태 262: 실시형태 261의 방법에 있어서, 상기 대상체는 인간이다.
실시형태 263: 실시형태 261-262 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 암은 유방암, 췌장암, 전립선암, 뇌암, 폐암, B 세포 림프종, 기관지암, 직결장암, 위암, 난소암, 방광암, 뇌 또는 중추 신경계 암, 말초 신경계 암, 식도암, 자궁경부암, 흑색종, 자궁 또는 자궁내막 암, 구강 또는 인두의 암, 간암, 신장암, 담관암, 소장 또는 맹장 암, 타액선암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종, 지방육종, 고환암, 및 악성 섬유 조직구종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다.
실시형태 264: 실시형태 261-262 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 암은 유방암, 췌장암, 전립선암, 뇌암, 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다.
실시형태 265: 실시형태 261-264 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 샘플은 혈청 또는 혈장 유래의 샘플을 포함한다.
실시형태 266: 실시형태 261-264 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 샘플은 FFPE 샘플을 포함한다.
실시형태 267: 실시형태 261-266 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 RASSF1A, AKR1B1, HOXB4, HIST1H3C, RASGRF2, TM6SF1, BRCA1, BNC1, ADAMTS1, CDO1, SOX17, TAC1, HOXA7, 및 MGMT로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 프로모터를 포함한다.
실시형태 268: 실시형태 261-266 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 암은 췌장암이고, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 ADAMTS1, 및 BNC1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나, 둘, 셋 또는 네개 유전자의 프로모터를 포함한다.
실시형태 269: 실시형태 268의 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 ADAMTS1 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 270: 실시형태 268-269 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 BNC1의 프로모터를 포함한다.
실시형태 271: 실시형태 261-266 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 암은 유방암이고, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 BRCA1, RASSF1A, AKR1B1, HOXB4, HIST1H3C, RASGRF2, 및 TM6SF1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯개 또는 모든 유전자의 프로모터를 포함한다.
실시형태 272: 실시형태 271의 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 BRCA1 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 273: 실시형태 271-272 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 RASSF1A 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 274: 실시형태 271-273 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 AKR1B1 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 275: 실시형태 271-274 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 HOXB4 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 276: 실시형태 271-275 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 HIST1H3C 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 277: 실시형태 271-276 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 RASGRF2 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 278: 실시형태 271-277 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 TM6SF1 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 279: 실시형태 261-266 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 암은 유방암이고, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 BRCA1 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 280: 실시형태 261-266 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 암은 폐암이고, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 CDO1, SOX17, TAC1, 및 HOXA7 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나, 둘, 세개 또는 모든 유전자의 프로모터를 포함한다.
실시형태 281: 실시형태 280의 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 CDO1 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 282: 실시형태 280-281 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 SOX17 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 283: 실시형태 280-282 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 TAC1 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 284: 실시형태 280-283 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 HOXA7 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 285: 실시형태 261-266 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 암은 뇌암이고, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 MGMT 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 286: 5-메틸시토신 잔기는 실질적으로 영향받지 않은 채로 두면서, DNA의 시토신 잔기를 우라실로 전환시키는 방법으로서, 상기 방법은
DNA를 포함하는 샘플을 DABSO와 접촉시켜 상기 DNA를 전환시키는 단계;
전환된 DNA를 탈술폰화시켜서, 시토신 잔기가 우라실로 전환되지만, 5-메틸시토신 잔기는 실질적으로 영향받지 않은 DNA를 생성시키는 단계
를 포함한다.
실시형태 287: 실시형태 286의 방법에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 DNA를 약 2 M 내지 최대 약 5 M 범위의 농도의 DABSO와 접촉시키는 단계를 포함한다.
실시형태 288: 실시형태 286의 방법에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 DNA를 약 2.5 M 농도의 DABSO와 접촉시키는 단계를 포함한다.
실시형태 289: 실시형태 286-288 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 DABSO는 알칼리 수용액에 용해시킨다.
실시형태 290: 실시형태 289의 방법에 있어서, 상기 DABSO는 KOH를 포함하는 용액에 용해시킨다.
실시형태 291: 실시형태 286-290 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 접촉 단계는 DABSO/DNA 용액을 약 55℃ 내지 약 90℃ 범위의 온도로 가열시키는 단계를 포함한다.
실시형태 292: 실시형태 286-291 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 DABSO는 약 15분 내지 최대 약 90분 범위의 시간 기간 동안 DNA와 반응시킨다.
실시형태 293: 실시형태 286-292 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 탈술폰화 단계는 상기 전환된 DNA를 알칼리 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다.
실시형태 294: 실시형태 293의 방법에 있어서, 상기 알칼리 시약은 KOH를 포함한다.
실시형태 295: 실시형태 286-294 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 전환 및/또는 탈술폰화는 컬럼에 결합된 DNA 상에서 수행된다.
실시형태 296: 실시형태 286-294 중 어느 한 항에 따른 방법에 있어서, 상기전환 및/또는 탈술폰화는 용액 중 DNA에 대해 수행된다.
실시형태 297: DNA 메틸화를 분석하는 방법으로서, 상기 방법은
DNA 샘플을 제공하는 단계;
실시형태 286-296 중 어느 하나의 방법에 따른 상기 샘플 중 DNA를 전환시키는 단계; 및
메틸화 특이적 PCR 및/또는 핵산 시퀀싱, 및/또는 고분해능 용융 분석 (HRM)을 전환된 핵산에 대해 수행하여 상기 핵산의 메틸화를 결정하는 단계
를 포함한다.
실시형태 298: 실시형태 297의 방법에 있어서, 상기 DNA 샘플을 제공하는 단계는 실시형태 228-234 중 어느 하나에 따르거나 또는 실시형태 243-252 중 어느 하나에 따라서 샘플을 제조하는 단계를 포함한다.
실시형태 299: DNA의 메틸화 상태의 검출을 위한 키트로서, 상기 키트는
DABSO를 포함하는 전환 시약을 함유하는 컨테이너; 및
탈술폰화 시약을 함유하는 컨테이너
를 포함한다.
실시형태 300: 실시형태 299의 키트에 있어서, 상기 키트는 친화성 매트릭스를 포함하는 컬럼을 포함한다.
실시형태 301: 실시형태 299-300 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 결합 완충제를 함유하는 컨테이너를 포함한다.
실시형태 302: 실시형태 299-301 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 용리 완충제를 함유하는 컨테이너를 포함한다.
실시형태 303: 실시형태 299-302 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 세척 완충제를 함유하는 컨테이너를 포함한다.
실시형태 304: 실시형태 299-303 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 실시형태 169-171 중 어느 하나에 따른 용해 용액을 함유하는 컨테이너, 및/또는 실시형태 172-174 중 어느 하나에 따른 용해 용액을 함유하는 컨테이너를 포함한다.
실시형태 305: 실시형태 299-304 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 실시형태 143-155 중 어느 하나에 따른 카트리지 및/또는 실시형태 155-166 중 어느 하나에 따른 카트리지를 포함한다.
실시형태 306: 실시형태 299-305 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 상기 핵산의 메틸화 상태의 결정을 위해서 핵산을 전환시키기 위한 상기 키트의 사용을 교시하는 지시 재료를 포함한다.
실시형태 307: 네스티드 PCR 반응을 사용해 MGMT 의 메틸화의 결정을 위한 프라이머 및 프로브의 세트로서, 상기 세트는 하기의 프라이머 및 프로브를 포함한다:
뉴클레오티드 서열: GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT (SEQ ID NO:263)을 포함하는 외부 전방향 프라이머;
뉴클레오티드 서열: AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC (SEQ ID NO:265)을 포함하는 외부 역방향 프라이머;
뉴클레오티드 서열: TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC (SEQ ID NO:266)을 포함하는 내부 전방향 프라이머;
뉴클레오티드 서열: GCACTCTTCCGAAAACGAAACG (SEQ ID NO:267)을 포함하는 내부 역방향 프라이머; 및
뉴클레오티드 서열: 플루오르-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-차단제 (SEQ ID NO: 268)을 포함하는 프로브.
실시형태 308: 네스티드 PCR 반응을 사용하여 (예를 들어, 대조군으로서) ACTB의 메틸화를 결정하기 위한 프라이머 및 프로브의 세트로서, 상기 세트는 하기의 프라이머 및 프로브를 포함한다:
뉴클레오티드 서열: GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT (SEQ ID NO:103)을 포함하는 외부 전방향 프라이머 (102);
뉴클레오티드 서열: CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (SEQ ID NO:104)을 포함하는 외부 역방향 프라이머 (103);
뉴클레오티드 서열: GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG (SEQ ID NO:149)을 포함하는 내부 전방향 프라이머 (148);
뉴클레오티드 서열: CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC (SEQ ID NO:150)을 포함하는 내부 역방향 프라이머 (149); 및
뉴클레오티드 서열: 플루오르-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-차단제 (SEQ ID NO:179)을 포함하는 프로브 (178).
실시형태 309: 대조군으로서 ACTB의 메틸화의 결정과 함께 네스티드 PCR 반응을 사용하여 MGMT 의 메틸화의 결정을 위한 프라이머 및 프로브의 세트로서, 실시형태 307의 프라이머 및 프로브, 및 실시형태 308의 프라이머 및 프로브를 포함한다.
실시형태 310: 메틸화 특이적 PCR을 사용하여 MGMT 의 메틸화를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은
MGMT 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 전환된 (예를 들어, 바이술파이트 전환된) DNA를 제공하는 단계;
하기 프라이머 및 프로브를 포함하는 네스티드 PCR 반응을 사용하여 MGMT 메틸화에 대해 메틸화 특이적 PCR을 수행하는 단계:
뉴클레오티드 서열: GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(SEQ ID NO:263)을 포함하는 외부 전방향 프라이머;
뉴클레오티드 서열: AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC (SEQ ID NO:265)을 포함하는 외부 역방향 프라이머;
뉴클레오티드 서열: TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC (SEQ ID NO:266)을 포함하는 내부 전방향 프라이머;
뉴클레오티드 서열: GCACTCTTCCGAAAACGAAACG (SEQ ID NO:267)을 포함하는 내부 역방향 프라이머; 및
뉴클레오티드 서열: 플루오르-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-차단제 (SEQ ID NO: 268)을 포함하는 프로브; 및
PCR 증폭 생성물을 검출 및/또는 정량하여 상기 MGMT 유전자의 메틸화의 결정을 제공하는 단계
를 포함한다.
실시형태 311: 실시형태 310의 방법에 있어서, 상기 방법은
(예를 들어, 대조군으로서) ACTB 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 전환된 (예를 들어, 바이술파이트 전환된) DNA를 제공하는 단계;
하기 프라이머 및 프로브를 포함하는 네스티드 PCR 반응을 사용해 ACTB 메틸화에 대해 메틸화 특이적 PCR을 수행하는 단계:
뉴클레오티드 서열: GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT (SEQ ID NO:103)을 포함하는 외부 전방향 프라이머;
뉴클레오티드 서열: CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (SEQ ID NO:104)을 포함하는 외부 역방향 프라이머;
뉴클레오티드 서열: GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG (SEQ ID NO:149)을 포함하는 내부 전방향 프라이머;
뉴클레오티드 서열: CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC (SEQ ID NO:150)을 포함하는 내부 역방향 프라이머; 및
뉴클레오티드 서열: 플루오르-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-차단제 (SEQ ID NO:179)을 포함하는 프로브; 및
PCR 증폭 생성물을 검출 및/또는 정량하여 상기 ACTB 유전자의 메틸화의 결정을 제공하는 단계
를 더 포함한다.
실시형태 312: 실시형태 310-311 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, MGMT 메틸화에 대한 상기 메틸화 특이적 PCR 및 ACTB 메틸화에 대한 상기 메틸화 특이적 PCR은 단일 멀티플렉스 PCR 반응으로 수행된다.
실시형태 313: 실시형태 310-312 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 메틸화 특이적 PCR은 실시형태 92-132 중 어느 하나에 따른 카트리지를 사용해 수행된다.
실시형태 314: 실시형태 313의 방법에 있어서, MGMT 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 전환된 DNA를 제공하는 상기 단계는 MGMT 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 비전환된 DNA를 상기 카트리지에 도입시키는 단계 및 전환 시약을 사용하여 상기 카트리지 내 상기 DNA를 전환시키도록 상기 카트리지를 가동시키는 단계를 포함하고/하거나; 및/또는 ACTB 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 전환된 DNA를 제공하는 상기 단계는 ACTB 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 비전환된 DNA를 상기 카트리지에 도입시키는 단계 및 전환 시약을 사용하여 상기 카트리지 내 상기 DNA를 전환시키도록 상기 카트리지를 가동시키는 단계를 포함한다.
실시형태 315: 실시형태 314의 방법에 있어서, 상기 전환 시약은 암모늄 바이술파이트, 소듐 메타바이술파이트, 포타슘 바이술파이트, 세슘 바이술파이트, 및 DABSO로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함한다.
실시형태 316: 실시형태 313-315 중 어느 한 항에 따른 방법에 있어서, 상기 카트리지를 가동시키는 상기 단계는 상기 네스티드 PCR 반응을 수행하기 위해서 이후에 사용되는 열순환 채널 또는 챔버 중 상기 전환 시약 및 상기 DNA를 가열시키는 단계를 포함한다.
실시형태 317: 핵산의 메틸화 상태를 결정하기 위한 카트리지의 세트로서, 상기 카트리지의 세트는
샘플 수용 챔버;
제1 매트릭스 재료를 포함하는 컬럼;
온도 제어 채널 또는 챔버;
샘플 제거 챔버; 및
시약 및/또는 완충제를 함유하는 복수개의 챔버로서, 사용할 때에, 상기 챔버 중 적어도 하나는 바이술파이트 시약을 함유하는 것인 챔버
를 포함하는 제1 카트리지; 및
샘플 수용 챔버;
제2 매트릭스 재료를 포함하는 컬럼;
온도 제어 채널 또는 챔버; 및
시약 및/또는 완충제를 함유하는 복수개의 챔버로서, 사용될 때에, 상기 챔버 중 적어도 하나는 탈술폰화 및/또는 용리 시약을 함유하는 것인 챔버
를 포함하는 제2 카트리지
를 포함한다.
실시형태 318: 실시형태 317의 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제1 카트리지 내 온도 제어 채널 또는 챔버는 열순환 채널 또는 챔버이다.
실시형태 319: 실시형태 317-318 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트로서, 상기 제2 카트리지 내 온도 제어 채널 또는 챔버는 열순환 채널 또는 챔버이다.
실시형태 320: 실시형태 317-319 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 바이술파이트 시약은 암모늄 바이술파이트, 소듐 메타바이술파이트, 포타슘 바이술파이트, 세슘 바이술파이트, 및 DABSO로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함한다.
실시형태 321: 실시형태 320의 카트리지의 세트에 있어서, 상기 바이술파이트 시약은 암모늄 바이술파이트를 포함한다.
실시형태 322: 실시형태 317-321 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 바이술파이트는 술파이트 산화를 방지하기 위한 스캐빈저 및/또는 촉매를 포함하는 시약 믹스로 제공된다.
실시형태 323: 실시형태 322의 카트리지의 세트에 있어서, 상기 바이술파이트는 트롤록스 및 히드로퀴논으로 이루어진 군으로부터 선택되는 스캐빈저를 포함하는 시약 믹스로 제공된다.
실시형태 324: 실시형태 322-323 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 바이술파이트는 촉매로서 폴리아민을 포함하는 시약 믹스로 제공된다.
실시형태 325: 실시형태 317-324 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제1 카트리지는 샘플이 카트리지에 위치되는 시점 또는 그 시점 가까이에 바이술파이트 시약이 카트리지에 첨가되도록 구성된다.
실시형태 326: 실시형태 317-325 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 바이술파이트 시약은 상기 제1 카트리지 내 상기 복수개의 챔버 중 하나 중의 성분으로서 제공된다.
실시형태 327: 317-326 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제1 매트릭스 재료 및/또는 상기 제2 매트릭스 재료는 독립적으로, 유리 또는 실리카, 이온 교환 수지, 및 히드록시아파타이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 재료를 포함한다.
실시형태 328: 실시형태 327의 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제1 매트릭스 재료는 유리 섬유를 포함한다.
실시형태 329: 327-328 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 매트릭스 재료는 유리 섬유를 포함한다.
실시형태 330: 실시형태 317-329 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제1 카트리지는 2개의 샘플 수용 챔버를 포함한다.
실시형태 331: 317-330 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지 내 복수개의 챔버를 포함하는 적어도 하나의 챔버는 PCR 프라이머, 및/또는 PCR 프로브, 및/또는 PCR 마스터 믹스를 함유한다.
실시형태 332: 317-331 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 카트리지가 사용될 때에, 상기 제1 카트리지 내 복수개의 챔버를 포함하는 챔버는 완충제 중 GTC-EtOH을 함유한다.
실시형태 333: 317-332 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 카트리지가 사용될 때에, 상기 제2 카트리지 내 복수개의 챔버를 포함하는 챔버는 완충제 중 GTC-EtOH을 함유한다.
실시형태 334: 332-333 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 제1 카트리지는 샘플이 카트리지에 위치되는 시점 또는 그 시점 가까이에 완충제 중 GTC-ETOH의 첨가를 위해 구성된다.
실시형태 335: 332-333 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 완충제 중 GTC-ETOH은 제1 카트리지의 복수개의 챔버를 포함하는 챔버 중 성분으로서 제공된다.
실시형태 336: 332-335 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 제2 카트리지는 샘플이 카트리지에 위치되는 시점 또는 그 시점 가까이에 완충제 중 GTC-ETOH의 첨가를 위해 구성된다.
실시형태 337: 332-336 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 완충제 중 GTC-ETOH은 제2 카트리지의 복수개의 챔버를 포함하는 챔버 중 성분으로서 제공된다.
실시형태 338: 실시형태 317-337 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 메틸화 특이적 PCR 프라이머, 메틸화 특이적 PCR 프로브, PCR 효소(들), 및 PCR 반응 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시약을 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다.
실시형태 339: 실시형태 338의 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 메틸화 특이적 PCR 프라이머, 메틸화 특이적 PCR 프로브, PCR 효소(들), 및 PCR 반응 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시약을 함유하는 적어도 2개의 챔버를 함유한다.
실시형태 340: 실시형태 317-339 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 전환된 DNA의 전방향 가닥의 메틸화의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 함유하는 적어도 하나의 챔버를 함유한다.
실시형태 341: 실시형태 317-340 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 전환된 DNA의 역방향 가닥의 메틸화의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 함유하는 적어도 하나의 챔버를 함유한다.
실시형태 342: 실시형태 338-341 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 PCR 프라이머, 및/또는 프로브, 및/또는 효소는 비드로서 제공된다.
실시형태 343: 실시형태 317-342 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서,
상기 제1 카트리지에서 상기 샘플 수용 챔버, 상기 컬럼, 상기 복수개의 챔버, 상기 샘플 제거 챔버, 및 상기 온도-제어 가열 채널 또는 챔버는 선택적으로 유체 연통되고/되거나;
상기 제2 카트리지에서 상기 샘플 수용 챔버, 상기 컬럼, 상기 복수개의 챔버, 및 상기 온도-제어 가열 채널 또는 챔버는 선택적으로 유체 연통된다.
실시형태 344: 실시형태 343의 카트리지의 세트에 있어서,
상기 제1 카트리지에서, 상기 샘플 수용 챔버, 상기 컬럼, 상기 복수개의 챔버, 상기 샘플 제거 챔버, 및 상기 온도 제어 채널 또는 챔버는 미세유체 채널 및 밸브에 의해 선택적으로 유체 연통되고/되거나;
상기 제2 카트리지에서, 상기 샘플 수용 챔버, 상기 컬럼, 상기 복수개의 챔버, 및 상기 온도 제어 채널 또는 챔버는 미세유체 채널 및 밸브에 의해 선택적으로 유체 연통된다.
실시형태 345: 실시형태 343의 카트리지의 세트에 있어서,
상기 제1 카트리지에서, 상기 샘플 수용 챔버, 상기 컬럼, 상기 복수개의 챔버, 상기 샘플 제거 챔버, 및 상기 온도 제어 채널 또는 챔버 또는 상기 온도 제어 채널 또는 챔버로의 포트는 중심 밸브 주변에 배치되고, 상기 중심 밸브 내 채널과 선택적으로 유체 연통되고, 상기 중심 밸브는 상기 중심 밸브와 유체 연통되는 챔버의 내부 또는 외부로 유체를 유인할 수 있는 플런저를 수용하도록 구성되고/되거나;
상기 제2 카트리지에서, 상기 샘플 수용 챔버, 상기 컬럼, 상기 복수개의 챔버, 및 상기 온도 제어 채널 또는 챔버 또는 상기 온도 제어 채널 또는 챔버로의 포트는 중심 밸브 주변에 배치되고, 상기 중심 밸브 내 채널과 선택적으로 유체 연통되고, 상기 중심 밸브는 상기 중심 밸브와 유체 연통되는 챔버의 내부 또는 외부로 유체를 유인할 수 있는 플런저를 수용하도록 구성된다.
실시형태 346: 실시형태 317-345 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제1 카트리지는 사용될 때에, 상기 제1 카트리지가
샘플을 함유하는 제1 챔버;
구아니디늄 티오술페이트-에탄올 (GTC-EtOH) 용액을 함유하는 제2 챔버;
바이술파이트 시약을 함유하는 제3 챔버;
Tris 완충제를 함유하는 제4 챔버;
폴리에틸렌글리콜 (PEG)의 제5 챔버; 및
KOH를 함유하는 제6 챔버
를 포함하도록 구성된다.
실시형태 347: 실시형태 346의 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제1 카트리지 내 상기 제1 챔버는 GTC-EtOH-Tween 추출/침전 시약 중에 상기 샘플을 함유한다.
실시형태 348: 실시형태 346-347 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 구아니디늄 티오술페이트-에탄올 (GTC-EtOH) 용액을 함유하는 상기 제2 챔버는 GTC-Tris (pH 7), 에탄올을 함유한다.
실시형태 349: 실시형태 317-336 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 사용될 때에, 상기 제2 카트리지가
샘플을 함유하는 제1 챔버;
구아니디늄 티오술페이트-에탄올 (GTC-EtOH) 용액을 함유하는 제2 챔버;
Tris 완충제를 함유하는 제3 챔버;
폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 함유하는 제4 챔버;
KOH를 함유하는 제5 챔버; 및
PCR 효소 비드를 함유하는 제6 챔버
를 포함하도록 구성된다.
실시형태 350: 실시형태 349의 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 Tris 비드, 및 효소 비드를 함유하는 제7 챔버를 포함한다.
실시형태 351: 실시형태 349-350 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 구아니디늄 티오술페이트-에탄올 (GTC-EtOH) 용액을 함유하는 상기 제2 챔버는 GTC-Tris (pH 7), 에탄올을 함유한다.
실시형태 352: 실시형태 317-351 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 PCR 프라이머 및/또는 프로브 및/또는 PCR 효소를 함유하는 챔버를 포함한다.
실시형태 353: 실시형태 317-352 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 PCR 프라이머 및/또는 프로브 및/또는 PCR 효소를 또한 함유하는 제8 챔버를 포함한다.
실시형태 354: 실시형태 317-353 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 바이술파이트-전환된 메틸화 및/또는 비메틸화 서열에 특이적인 프라이머를 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다.
실시형태 355: 실시형태 317-354 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 TaqMan PCR 반응을 위한 시약을 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다.
실시형태 356: 실시형태 317-355 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 증폭된 메틸화 서열에 대한 마커인 하나 이상의 형광성 프로브 및/또는 증폭된 비메틸화 서열에 대한 마커인 하나 이상의 형광성 프로브를 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다.
실시형태 357: 실시형태 356의 카트리지의 세트에 있어서, 상기 프로브는 형광성 리포터 염료 및 소광제 염료를 포함하고, 프로브는 Taq DNA 중합효소의 5'에서 3'으로의 뉴클레아제 활성에 의한 절단 시 신호를 제공한다.
실시형태 358: 실시형태 356-357 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 관심 증폭 영역 내 상이한 메틸화된 영역에 대해 각각 특이적인 복수개의 프로브를 포함한다.
실시형태 359: 실시형태 356-357 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 관심 증폭 영역 내 메틸화된 영역에 특이적인 단일 프로브를 포함한다.
실시형태 360: 실시형태 356-357 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 관심 증폭 영역 내 동일한 메틸화된 영역에 각각 특이적인 복수개의 프로브를 포함한다.
실시형태 361: 실시형태 317-360 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 MGMT, RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, HOXB4, RASGRF2, TM6SF1, 및 AKR1B1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 프로모터 영역의 메틸화를 결정하기 위한 프라이머 및/또는 프로브를 함유한다.
실시형태 362: 실시형태 317-360 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 표 5, 9, 또는 10에 표시된 하나 이상의 프라이머, 및/또는 표 5, 9, 또는 10에 표시된 하나 이상의 프로브를 함유한다.
실시형태 363: 실시형태 362의 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 네스티드 PCR 반응을 사용하여 MGMT 의 메틸화를 결정하기 위해 하기 프로브 및 프라이머를 함유한다:
뉴클레오티드 서열: GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT (SEQ ID NO:263)을 포함하는 외부 전방향 프라이머 (248b);
뉴클레오티드 서열: AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC (SEQ ID NO:265)를 포함하는 외부 역방향 프라이머 (249b);
뉴클레오티드 서열: TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC (SEQ ID NO:266)을 포함하는 내부 전방향 프라이머 (250);
뉴클레오티드 서열: GCACTCTTCCGAAAACGAAACG (SEQ ID NO:267)을 포함하는 내부 역방향 프라이머 (251); 및
뉴클레오티드 서열: 플루오르-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-차단제 (SEQ ID NO:268)을 포함하는 프로브 (252a).
실시형태 364: 실시형태 362-363 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 네스티드 PCR 반응을 사용하여 (예를 들어, 대조군으로서) ACTB의 메틸화를 결정하기 위해 하기 프로브 및 프라이머를 포함한다:
뉴클레오티드 서열: GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT (SEQ ID NO:103)을 포함하는 외부 전방향 프라이머 (102);
뉴클레오티드 서열: CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (SEQ ID NO:104)을 포함하는 외부 역방향 프라이머 (103);
뉴클레오티드 서열: GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG (SEQ ID NO:149)을 포함하는 내부 전방향 프라이머 (148);
뉴클레오티드 서열: CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC (SEQ ID NO:150)을 포함하는 내부 역방향 프라이머 (149); 및
뉴클레오티드 서열: 플루오르-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-차단제 (SEQ ID NO:179)을 포함하는 프로브 (178).
실시형태 365: 실시형태 317-360 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다.
실시형태 366: 실시형태 365의 카트리지의 세트에 있어서, 상기 제2 카트리지는 그의 메틸화 상태가 유방암, 췌장암, 전립선암, 뇌암, 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암에 대한 마커인 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다.
실시형태 367: 실시형태 365-366 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 그의 메틸화 상태가 유방암, 췌장암, 전립선암, 뇌암, 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커인 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 368: 실시형태 367의 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 네스티드 PCR 반응을 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 369: 실시형태 368의 카트리지의 세트에 있어서, 상기 네스티드 PCR은 전환된 DNA에 특이적인 제1 PCR 반응 및 메틸화 CpG에 특이적인 제2 PCR 반응을 포함한다.
실시형태 370: 실시형태 349-369 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, PCR 프라이머 및 프로브 챔버를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 전환된 DNA의 전방향 가닥의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유한다.
실시형태 371: 실시형태 349-370 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, PCR 프라이머 및 프로브 챔버를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 전환된 DNA의 역방향 가닥의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유한다.
실시형태 372: 실시형태 349-371 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 RASSF1A, AKR1B1, HOXB4, HIST1H3C, RASGRF2, TM6SF1, BRCA1, BNC1, ADAMTS1, CDO1, SOX17, TAC1, HOXA7, 및 MGMT 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 373: 실시형태 349-372 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 그의 메틸화 상태가 췌장암에 대한 마커인 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 374: 실시형태 373의 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 ADAMTS1, 및/또는 BNC1 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 375: 실시형태 374의 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 ADAMTS1 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 376: 실시형태 374-375 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 BNC1 의 프로모터으 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 377: 실시형태 374의 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 표 5 또는 10에 표시된 ADAMTS1 및/또는 BNC1 에 대한 하나 이상의 PCR 프라이머 및/또는 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 378: 실시형태 349-372 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 그의 메틸화 상태가 유방암에 대한 마커인 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 379: 실시형태 378의 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 BRCA1, RASSF1A, AKR1B1, HOXB4, HIST1H3C, RASGRF2, 및 TM6SF1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯개 또는 모든 유전자의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 380: 실시형태 379의 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 BRCA1 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 381: 실시형태 379-380 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 RASSF1A 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 382: 실시형태 379-381 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 AKR1B1 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 383: 실시형태 379-382 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위해 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 HOXB4 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 384: 실시형태 379-383 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 HIST1H3C 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 385: 실시형태 379-384 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 RASGRF2 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 386: 실시형태 379-385 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 TM6SF1 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 387: 실시형태 379-386 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 표 5 또는 9에 표시된 하나 이상의 PCR 프라이머 및/또는 하나 이상의 PCR 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 388: 실시형태 378의 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 BRCA1 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 389: 실시형태 349-372 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 그의 메틸화 상태가 폐암에 대한 마커인 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 390: 실시형태 389의 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 CDO1 , SOX17 , TAC1, 및 HOXA7 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나, 둘, 세개 또는 모든 유전자의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 391: 실시형태 390의 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 CDO1 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 392: 실시형태 390-391 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 SOX17 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 393: 실시형태 390-392 중 어느 하나에 다른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 TAC1 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 394: 실시형태 390-393 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 HOXA7 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 395: 실시형태 349-372 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 그의 메틸화 상태가 뇌암에 대한 마커인 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 396: 실시형태 395의 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 MGMT 의 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 397: 실시형태 396의 카트리지의 세트에 있어서, 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 프로브를 제공하는 비드를 함유하는 상기 챔버는 표 5 또는 10에 표시된 MGMT에 대한 하나 이상의 PCR 프라이머 및/또는 프로브를 제공하는 비드를 포함한다.
실시형태 398: 실시형태 397의 카트리지의 세트에 있어서, 상기 카트리지는 네스티드 PCR 반응을 사용해 MGMT 의 메틸화를 결정하기 위한 하기 프로브 및 프라이머를 함유한다:
뉴클레오티드 서열: GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT (SEQ ID NO:263)을 포함하는 외부 전방향 프라이머 (248b);
뉴클레오티드 서열: AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC (SEQ ID NO:265)을 포함하는 외부 역방향 프라이머 (249b);
뉴클레오티드 서열: TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC (SEQ ID NO:266)을 포함하는 내부 전방향 프라이머 (250);
뉴클레오티드 서열: GCACTCTTCCGAAAACGAAACG (SEQ ID NO:267)을 포함하는 내부 역방향 프라이머 (251); 및
뉴클레오티드 서열: 플루오르-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-차단제 (SEQ ID NO: 268)를 포함하는 프로브 (252a).
실시형태 399: 실시형태 397-398 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트에 있어서, 상기 카트리지는 네스티드 PCR 반응을 사용하여 (예를 들어, 대조군으로서) ACTB의 메틸화를 결정하기 위한 하기 프로브 및 프라이머를 함유한다:
뉴클레오티드 서열: GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT (SEQ ID NO:103)을 포함하는 외부 전방향 프라이머 (102);
뉴클레오티드 서열: CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (SEQ ID NO:104)을 포함하는 외부 역방향 프라이머 (103);
뉴클레오티드 서열: GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG (SEQ ID NO:149)을 포함하는 내부 전방향 프라이머 (148);
뉴클레오티드 서열: CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC (SEQ ID NO:150)을 포함하는 내부 역방향 프라이머 (149); 및
뉴클레오티드 서열: 플루오르-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-차단제 (SEQ ID NO:179)을 포함하는 프로브 (178).
실시형태 400: 생물학적 샘플 중 핵산의 메틸화를 결정하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템은
하나 이상의 샘플 프로세싱 모듈을 함유하도록 구성된 인클로저를 포함하고, 각각의 샘플 프로세싱 모듈은 실시형태 317-399 중 어느 하나에 따른 상기 카트리지의 세트의 제1 카트리지 및/또는 제2 카트리지를 탈착형 카트리지로서 수용하도록 구성되고;
상기 시스템은
상기 제1 카트리지에 도입된 샘플 중 핵산의 바이술파이트 전환을 수행하도록 상기 카트리지의 세트의 제1 카트리지를 가동시키기 위해 샘플 프로세싱을 수행하고/하거나,
상응하는 탈착형 샘플 카트리지 내에서 탈술폰화를 수행하고 하나 이상의 표적 핵산의 메틸화를 결정하기 위해,
샘플 프로세싱 모듈을 가동시키도록 구성된다.
실시형태 401: 실시형태 400의 시스템에 있어서, 상기 시스템은 하나의 샘플 프로세싱 모듈을 함유하도록 구성된다.
실시형태 402: 실시형태 400의 시스템에 있어서, 상기 시스템은 적어도 2개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 4개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 8개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 12개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 16개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 20개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 24개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 28개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 32개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 64개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 128개의 샘플 프로세싱 모듈을 함유하도록 구성된다.
실시형태 403: 실시형태 400-402 중 어느 하나에 따른 시스템에 있어서, 상기 모듈은 상기 카트리지 내 온도 제어 챔버 또는 채널을 가열하기 위한 하나 이상의 가열판을 포함한다.
실시형태 404: 실시형태 400-403 중 어느 하나에 따른 시스템에 있어서, 상기 모듈은 상기 카트리지 내 온도 제어 채널 또는 챔버를 냉각시키도록 구성된 팬을 포함한다.
실시형태 405: 실시형태 400-404 중 어느 하나에 따른 시스템에 있어서, 상기 모듈은 정보 (예를 들어, 광학 정보)를 분석용 컴퓨터에 전달하기 위한 회로를 포함한다.
실시형태 406: 실시형태 400-405 중 어느 하나에 따른 시스템에 있어서, 상기 모듈은 상기 카트리지 내 반응에 의해 생성된 하나 이상의 광학 신호의 여기 및/또는 검출을 제공하기 위한 광학 블록을 포함한다.
실시형태 407: 실시형태 400-406 중 어느 하나에 따른 시스템에 있어서, 상기 시스템은
샘플을 컬럼에 결합시키고;
DNA를 컬럼으로부터 용리시키고 상기 DNA를 전환 시약과 배합시키고;
반응 챔버 또는 튜브 내 DNA/전환 시약 용액을 가열시켜 전환된 DNA를 생성시키고;
전환된 DNA를 제1 카트리지 내 샘플 제거 챔버로 전달시키기 위해서
상기 카트리지의 세트의 상기 제1 카트리지를 가동시키도록 구성된다;
실시형태 408: 실시형태 400-407 중 어느 하나에 따른 시스템에 있어서, 상기 시스템은
전환된 DNA를 컬럼에 결합시키고;
전환된 DNA를 세척, 세정 및 용리시키고;
DNA를 컬럼으로부터 용리시키고;
전환된 DNA를 탈술폰화시키기 위해서
상기 카트리지의 세트 내 상기 제2 카트리지를 가동시키도록 구성된다.
실시형태 409: 실시형태 408의 시스템에 있어서, 상기 시스템은 반응 챔버 또는 튜브 내에서 용리된 탈술폰화된 DNA에 대해 PCR를 수행하기 위해 상기 카트리지의 세트 내 상기 제2 카트리지를 가동시키도록 구성된다.
실시형태 410: 핵산의 메틸화 상태를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은
실시형태 317-399 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트 내 제1 카트리지의 샘플 챔버 중에 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
상기 샘플 중 DNA를 상기 제1 매트릭스 재료에 결합시키고;
결합된 DNA을 세척시키고; 결합된 DNA를 매트릭스 재료로부터 용리시키고; 용리된 DNA를 상기 바이술파이트 시약과 배합시키고;
상기 온도 제어 채널 또는 챔버 중 DNA 및 바이술파이트 시약의 혼합물을 가열시켜 상기 DNA의 바이술파이트 전환을 수행시키고;
바이술파이트-전환된 DNA를 상기 제1 카트리지의 샘플 제거 챔버에 전달시키도록 상기 제1 카트리지를 가동시키는 단계
를 포함한다.
실시형태 411: 실시형태 410의 방법에 있어서, 상기 방법은
실시형태 317-399 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트 내 제2 카트리지의 샘플 챔버 중에 바이술파이트 전환된 DNA를 제공하는 단계; 및
상기 바이술파이트 전환된 DNA를 상기 제2 매트릭스 재료에 결합시키고;
결합된 바이술파이트-전환된 DNA를 세척시키고;
세척된 바이술파이트-전환된 DNA를 상기 제2 매트릭스 재료로부터 용리시키고;
바이술파이트 전환된 DNA를 탈술폰화시키기 위해서 상기 제2 카트리지를 가동시키는 단계
를 더 포함한다.
실시형태 412: 실시형태 411의 방법에 있어서, 상기 제2 카트리지는 바이술파이트-전환된 DNA를 탈술폰화 이전에 상기 제2 매트릭스 재료로부터 용리시키도록 가동된다.
실시형태 413: 실시형태 411의 방법에 있어서, 상기 제2 카트리지는 바이술파이트-전환된 DNA를 탈술폰화 이후에 또는 그 동안에 상기 제2 매트릭스 재료로부터 용리시키도록 가동된다.
실시형태 414: 실시형태 411-413 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 핵산의 메틸화를 결정하기 위해 메틸화 특이적 PCR 및/또는 핵산 시퀀싱, 및/또는 고분해능 용융 분석 (HRM)을 상기 전환된 핵산에 대해 수행하도록 상기 제2 카트리지를 가동시키는 단계를 포함한다.
실시형태 415: 실시형태 410-414 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 샘플은 세포, 조직, 및 핵산을 함유하는 생물학적 유체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 샘플을 포함한다.
실시형태 416: 실시형태 415의 방법에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 점액, 소변, 객담, 췌액, 및 뇌척수액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 유체를 포함한다.
실시형태 417: 실시형태 415의 방법에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 조직 샘플, 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직, 신선 냉동 조직, 세침 흡인 (FNA), 및 코어 생검으로 이루어진 군으로부터 선택되는 샘플을 포함한다.
실시형태 418: 실시형태 410-417 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 용해 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다.
실시형태 419: 실시형태 410-418 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 제1 카트리지를 가동시키는 단계는 실시형태 400-409 중 어느 하나에 따른 시스템 내 샘플 프로세싱 모듈로 상기 제1 카트리지를 도입시키는 단계를 포함한다.
실시형태 420: 실시형태 410-419 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 제2 카트리지를 가동시키는 단계는 실시형태 400-409 중 어느 하나에 따른 시스템 내 샘플 프로세싱 모듈로 상기 제2 카트리지를 도입시키는 단계를 포함한다.
실시형태 421: 실시형태 410-420 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 제1 카트리지의 샘플 챔버 중에 생물학적 샘플을 제공하는 상기 단계는 상기 제1 카트리지 내 하나 이상의 샘플 수용 챔버로 샘플을 로딩시키는 단계를 포함한다.
실시형태 422: 실시형태 410-421 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 제2 카트리지의 샘플 챔버 중에 바이술파이트 전환된 DNA를 제공하는 상기 단계는 바이술파이트-전환된 DNA를 상기 제1 카트리지 내 샘플 제거 챔버로부터 상기 제2 카트리지의 샘플 수용 챔버로 수송시키는 단계를 포함한다.
실시형태 423: 실시형태 410-422 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 제1 카트리지 내 결합된 DNA를 용리시키는 상기 단계는 저농도의 포타슘 히드록시드 또는 다른 염기를 사용하여 상기 DNA를 용리 및 변성시키는 단계를 포함한다.
실시형태 424: 실시형태 423의 방법에 있어서, 상기 제1 카트리지 내 결합된 DNA를 용리시키는 상기 단계는 약 pH 10.5를 초과하는 pH의 알칼리 용액으로 용리 및 변성시키는 단계를 포함한다.
실시형태 425: 실시형태 423의 방법에 있어서, 상기 제1 카트리지 내 결합된 DNA를 용리시키는 상기 단계는 상기 DNA를 약 pH 12를 초과하는 pH의 알칼리 용액으로 용리 및 변성시키는 단계를 포함한다.
실시형태 426: 실시형태 424-425의 방법에 있어서, 상기 알칼리 용액은 10-15 mM의 KOH 용액이다.
실시형태 427: 실시형태 410-426 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 용리된 DNA를 상기 제1 카트리지 내 바이술파이트 시약과 배합시키는 상기 단계는 약 6 M 내지 약 7 M 범위의 농도를 갖는 암모늄 바이술파이트 용액 중에서 DNA를 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
실시형태 428: 실시형태 427의 방법에 있어서, 용리된 DNA를 상기 제1 카트리지 내 바이술파이트 시약과 배?u시키는 상기 단계는 약 6.5 M의 농도를 갖는 암모늄 바이술파이트 용액 중에서 DNA를 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
실시형태 429: 실시형태 428의 방법에 있어서, 용리된 DNA를 상기 제1 카트리지 내 바이술파이트 시약과 배합시키는 상기 단계는 농축된 바이술파이트 용액 내 DNA를 상기 제1 카트리지 내 온도 제어 채널 또는 챔버로 수송시키고 상기 혼합물을 가열시키는 단계를 포함한다.
실시형태 430: 실시형태 429의 방법에 있어서, 상기 인큐베이션 단계는 약 60℃ 내지 약 95℃의 온도에서 농축된 바이술파이트 용액을 열 순환시키는 단계를 포함한다.
실시형태 431: 실시형태 411-430 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 바이술파이트 전환된 DNA를 제2 매트릭스 재료에 결합시키는 상기 단계는 DNA-바이술파이트 용액을 상기 제2 컬럼 내 신선한 GTC-EtOH과 혼합시키고, 용액을 상기 제2 매트릭스 재료 상에 분배시키는 단계를 포함한다.
실시형태 432: 실시형태 431의 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 제2 매트릭스 재료 내 DNA를 신선한 GTC-EtOH, 및 이후에 세정 용액으로 세척시키는 단계를 포함한다.
실시형태 433: 실시형태 432의 방법에 있어서, 상기 세정 용액은 PEG200을 포함한다.
실시형태 434: 실시형태 411-433 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 전환된 DNA를 탈술폰화시키는 상기 단계는 DNA를 상기 제2 매트릭스 재료로부터 높은 pH의 탈술폰화 완충제를 사용하여 용리시키는 단계 및 상기 용액을 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
실시형태 435: 실시형태 434의 방법에 있어서, 상기 인큐베이션 단계는 약 1분 내지 약 1시간, 또는 약 5분 내지 약 30분, 또는 약 10분 내지 약 20분, 또는 약 15분의 범위의 시간 기간 동안이다.
실시형태 436: 실시형태 434-435의 방법에 있어서, 상기 높은 pH 탈술폰화/용리 완충제는 KOH를 포함한다.
실시형태 437: 실시형태 411-436 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 전환된 DNA를 주형으로서 사용하는 하나 이상의 PCR 반응을 수행하도록 상기 제2 카트리지를 가동시키는 단계를 포함한다.
실시형태 438: 실시형태 437의 방법에 있어서, 메틸화 특이적 PCR은 표적 핵산 서열의 메틸화를 결정하기 위해 수행된다.
실시형태 439: 실시형태 438의 방법에 있어서, 상기 메틸화 특이적 PCR (MSP)은 메틸화 서열에 특이적인 프라이머 및/또는 비메틸화 서열에 특이적인 프라이머를 사용해 수행된다.
실시형태 440: 실시형태 438의 방법에 있어서, 상기 메틸화 특이적 PCR은 MethyLight 프로토콜을 포함한다.
실시형태 441: 실시형태 438의 방법에 있어서, TaqMan PCR 반응은 바이술파이트-전환된 메틸화 및/또는 비메틸화 서열에 특이적인 프라이머에 의해 수행된다.
실시형태 442: 실시형태 438-441 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 메틸화 특이적 PCR (MSP)은 증폭된 메틸화 서열에 대한 마커인 하나 이상의 형광성 프로브 및/또는 증폭된 비메틸화 서열에 대한 마커인 하나 이상의 형광성 프로브를 활용한다.
실시형태 443: 실시형태 442의 방법에 있어서, 상기 형광성 프로브는 형광성 리포터 염료 및 소광제 염료를 포함하고, 프로브는 Taq DNA 중합효소의 5'에서 3'으로의 뉴클레아제 활성에 의한 절단 시 신호를 제공한다.
실시형태 444: 실시형태 442-443 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 메틸화 신호는 관심 증폭 영역 내 상이한 메틸화된 영역에 각각 특이적인 복수개의 프로브에 대한 조합된 신호에 의해 결정된다.
실시형태 445: 실시형태 442-443 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 메틸화 신호는 관심 증폭 영역 내 동일한 메틸화된 영역에 특이적인 복수개의 프로브에 의해 결정된다.
실시형태 446: 실시형태 442-443 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 복수개의 프로브는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 프로브를 포함한다.
실시형태 447: 실시형태 442-443 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 메틸화 신호는 관심 증폭 영역에서 단일 프로브에 의해 결정된다.
실시형태 448: 실시형태 442-447 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 프로브는 심플렉스 또는 멀티플렉스로 작동된다.
실시형태 449: 실시형태 442-447 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 프로브는 멀티플렉스 형식으로 작동된다.
실시형태 450: 실시형태 442-449 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 프로브는 네스티드 PCR 반응으로 작동된다.
실시형태 451: 실시형태 442-450 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 PCR 반응은, 바이술파이트가 반응에 존재한다면, PCR 동안 바이술파이트-매개 절단을 겪는 바이술파이트 오염 대조군 프로브를 포함한다.
실시형태 452: 실시형태 411-451 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, PCR은 하나 이상의 돌연변이된 유전자에 대해 수행된다.
실시형태 453: 실시형태 411-452 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, PCR은 대조군으로서 비전환된 DNA에 대해 수행된다.
실시형태 454: 실시형태 411-453 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, PCR은 대조군으로서 전환된 DNA에 대해 수행된다.
실시형태 455: 실시형태 453의 방법에 있어서, PCR은 비전환된 DNA가 상기 방법에 대한 표적인 비전환된 DNA에 대해 수행된다.
실시형태 456: 실시형태 410-455 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 메틸화는 MGMT, RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, HOXB4, RASGRF2, TM6SF1, 및 AKR1B1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 프로모터 영역에 대해 결정된다.
실시형태 457: 대상체에서 암 또는 암에 대한 소인을 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은
상기 대상체 유래의 생물학적 샘플을 제공하는 단계로서, 상기 생물학적 샘플은 DNA를 포함하는 것인 단계;
실시형태 317-399 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트를 활용하는 단계로서, 상기 카트리지의 세트의 상기 제1 카트리지는 상기 DNA의 바이술파이트 전환을 수행하기 위해 사용되고; 상기 카트리지의 세트의 상기 제2 카트리지는 전환된 DNA를 탈술폰화시키고 그의 메틸화 상태가 암에 대한 마커인 상기 DNA 내 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위해 사용되고, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화의 증가는 암 또는 암에 대한 소인의 존재 또는 암 또는 전암의 병기를 의미하는 것인 단계
를 포함한다.
실시형태 458: 실시형태 457의 방법에 있어서, 상기 대상체는 인간이다.
실시형태 459: 실시형태 457-458 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 암은 유방암, 췌장암, 전립선암, 뇌암, 폐암, B 세포 림프종, 기관지암, 직결장암, 위암, 난소암, 방광암, 뇌 또는 중추 신경계 암, 말초 신경계 암, 식도암, 자궁경부암, 흑색종, 자궁 또는 자궁내막 암, 구강 또는 인두의 암, 간암, 신장암, 담관암, 소장 또는 맹장 암, 타액선암, 갑상선암, 부신암, 골육종, 연골육종, 지방육종, 고환암, 및 악성 섬유 조직구종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다.
실시형태 460: 실시형태 457-458 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 암은 유방암, 췌장암, 전립선암, 뇌암, 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다.
실시형태 461: 실시형태 457-460 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 샘플은 혈청 또는 혈장 유래의 샘플을 포함한다.
실시형태 462: 실시형태 457-460 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 샘플은 FFPE 샘플을 포함한다.
실시형태 463: 실시형태 457-462 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 RASSF1A, AKR1B1, HOXB4, HIST1H3C, RASGRF2, TM6SF1, BRCA1, BNC1, ADAMTS1, CDO1, SOX17, TAC1, HOXA7, 및 MGMT 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 프로모터를 포함한다.
실시형태 464: 실시형태 457-462 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 암은 췌장암이고 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 ADAMTS1, 및 BNC1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나, 둘, 셋 또는 네개 유전자의 프로모터를 포함한다.
실시형태 465: 실시형태 464의 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 ADAMTS1 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 466: 실시형태 464-465 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 BNC1 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 467: 실시형태 457-462 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 암은 유방암이고, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 BRCA1, RASSF1A, AKR1B1, HOXB4, HIST1H3C, RASGRF2, 및 TM6SF1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯개 또는 모든 유전자의 프로모터를 포함한다.
실시형태 468: 실시형태 467의 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 BRCA1 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 469: 실시형태 467-468 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 RASSF1A 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 470: 실시형태 467-469 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 AKR1B1 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 471: 실시형태 467-470 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 HOXB4 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 472: 실시형태 467-471 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 HIST1H3C 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 473: 실시형태 467-472 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 RASGRF2 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 474: 실시형태 467-473 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 TM6SF1 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 475: 실시형태 457-462 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 암은 유방암이고, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 BRCA1 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 476: 실시형태 457-462 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 암은 폐암이고, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 CDO1 , SOX17 , TAC1, 및 HOXA7 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나, 둘, 세개 또는 모든 유전자의 프로모터를 포함한다.
실시형태 477: 실시형태 476의 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 CDO1 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 478: 실시형태 476-477 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 SOX17 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 479: 실시형태 476-478 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 TAC1 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 480: 실시형태 476-479 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 HOXA7 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 481: 실시형태 457-462 중 어느 하나에 따른 방법에 있어서, 상기 암은 뇌암이고, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터는 MGMT 의 프로모터를 포함한다.
실시형태 482: DNA 메틸화의 결정을 위한 키트로서, 상기 키트는 실시형태 317-399 중 어느 하나에 따른 카트리지의 세트의 제1 카트리지 및/또는 제2 카트리지를 함유하는 컨테이너를 포함한다.
실시형태 483: 실시형태 482의 키트에 있어서, 상기 제1 카트리지 및 상기 제2 카트리지는 동일한 컨테이너에 함유된다.
실시형태 484: 실시형태 482의 키트에 있어서, 상기 제1 카트리지 및 상기 제2 카트리지는 별개의 컨테이너에 존재한다.
실시형태 485: 실시형태 482의 키트에 있어서, 상기 키트는 용해 용액을 함유하는 컨테이너를 더 포함한다.
실시형태 486: 실시형태 485의 키트에 있어서, 상기 용해 용액은 혈청 또는 혈장에 대한 용해 용액이다.
실시형태 487: 실시형태 485의 키트에 있어서, 상기 용해 용액은 FFPE 샘플에 대한 용해 용액이다.
실시형태 488: 실시형태 482-487 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 프로테이나제 K를 함유하는 컨테이너를 포함한다.
실시형태 489: 실시형태 482-488 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 상기 카트리지 또는 카트리지와 별개의 컨테이너 내에 전환 시약을 포함한다.
실시형태 490: 실시형태 489의 키트에 있어서, 상기 키트는 카트리지와 별개의 컨테이너 내에 상기 전환 시약을 포함한다.
실시형태 491: 실시형태 489의 키트에 있어서, 상기 키트는 카트리지의 챔버에 제공되는 상기 전환 시약을 포함한다.
실시형태 492: 실시형태 489-491 중 어느 하나에 따라서, 상기 전환 시약은 소듐 메타바이술파이트, 포타슘 바이술파이트, 세슘 바이술파이트, 암모늄 바이술파이트, 및 DABSO로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함한다.
실시형태 493: 실시형태 492의 키트에 있어서, 상기 전환 시약은 암모늄 바이술파이트를 포함한다.
실시형태 494: 실시형태 482-493 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 샘플 프로세싱 시약을 함유하는 컨테이너를 포함한다.
실시형태 495: 실시형태 494의 키트에 있어서, 상기 샘플 프로세싱 시약은 구아니듐 티오시아네이트를 포함한다.
실시형태 496: 실시형태 494-495 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 샘플 프로세싱 시약은 에탄올을 포함한다.
실시형태 497: 실시형태 482-496 중 어느 하나에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 DNA 메틸화의 결정을 위한 상기 카트리지의 사용을 교시하는 지시 재료를 함유한다.
일정한 실시형태에서 방법 및/또는 카트리지는 자성 유리, 자성 히드록시아파타이트, 및 자성 매트릭스 재료를 포함하는 자성 재료는 명확하게 배제한다. 일정한 실시형태에서 방법 및/또는 카트리지는 DNA 단리를 위한 자성 재료는 명확하게 배제한다.
도 1A는 본 명세서에 기술된 방법에서 사용하기에 적합한 카트리지 카트리지 (예를 들어, GENEXPERT® 카트리지)의 주요 성분을 예시한다. 도 1B는 중심 밸브 주변에 배치된 챔버를 예시하는 카트리지의 상면도를 도시한다. 도 1C는 반응 카트리지를 활용하는 DNA 메틸화의 결정을 위한 예시적인 작업도를 도시한다.
도 2, 패널 A-C는 본 명세서에 기술된 바와 같은 DNA 메틸화의 결정에 적합한 GENEXPERT® 카트리지의 일 실시형태를 예시한다.
도 3A-3C는 DNA 메틸화의 결정을 위한 모듈 및 시스템 (예를 들어, 프로세싱 유닛)의 예시적이지만, 비제한적인 실시형태를 도시한다. 도 3A는 GENEXPERT® 카트리지의 가동을 위한 모듈을 예시한다. 도 3B는 DNA 메틸화의 분석을 위해 카트리지의 가동을 위한 모듈의 일 실시형태의 일부 성분을 예시한다. 도 3C는 다수의 모듈이 통합된 시스템 (예를 들어, 프로세싱 유닛)을 예시한다.
도 4A-4D는 DNA 인산화를 검출/정량하기 위한 MethyLight 프로토콜의 사용을 위한 다양한 전략을 예시한다. 도 4A (Eads et al. 92000 Nucleic Acids. Res., 28(8): e32로부터 변형)는 Methylight 기술을 개략적으로 예시한다. DNA는 비메틸화 시토신 잔기 (흰색 원형으로 표시된 위치)를 우라실로 전환시키는 한편, 메틸화 시토신 잔기 (검은색 원형으로 표시된 위치)는 시토신으로 유지되게 함으로써, 예를 들어 CpG 디뉴클레오티드에서 메틸화-의존적 서열 편차를 생성시키는 소듐 바이술파이트에 의해 변형된다. 다음으로 형광-기반 PCR는 메틸화 부위를 중복시키거나 또는 임의의 메틸화 부위를 중복시키지 않는 프라이머를 사용해 수행된다. 서열 구별은 PCR 증폭 프로세스의 수준 (패널 D) 또는 프로브 하이브리드화 프로세스의 수준 (패널 B), 또는 둘 모두 (패널 D)에서 발생될 수 있다. PCR 증폭 수준에서 서열 구별은 프라이머 및 프로브 (패널 D), 또는 단지 프라이머 (패널 C)를 활용하여 잠재적인 메틸화 부위 (예를 들어, CpG 디뉴클레오티드)를 중복시킨다. 많은 이론적 메틸화 과돌연변이 중 오직 2개 (완전 메틸화 (M) 및 완전 비메틸화 (U))를 도시한다. Methylight 어세이는 또한 서열 구별이 PCR 증폭 수준에서 발생되지 않도록 디자인될 수도 있다. 프라이머 또는 프로브가 메틸화의 부위 (예를 들어, CpG 디뉴클레오티드) (패널 A)를 중복시키지 않으면, 메틸화-의존적 서열 구별은 PCR 증폭 또는 프로브 하이브리드화 수준에서 일어나지 않는다. 이러한 반응은 입력 DNA의 양에 대한 대조군으로서 제공될 수 있는 메틸화 상태에 대한 편향없이 전환된 게놈 DNA의 증폭을 의미한다. 단지 프로브가 메틸화 부위와 중복될 때 (패널 B), 서열 구별은 프로브 하이브리드화를 통해서 일어날 수 있다. 도 4B는 메틸화 특이적 전방향 (FW) 및 역방향 (RV) 프라이머와 함께 단일한, 예를 들어 메틸화-특이적, 프로브 (PR3)를 사용하는 Methylight 접근법을 예시한다. 도 4C는 각각이 상이한 영역을 표적으로 하는 복수개의 프로브 (PR1...PR5)를 사용하는 Methylight 접근법을 예시한다. 도 4D는 각각이 동일한 영역을 표적으로 하지만, 상이한 메틸화 패턴에 대한 신호를 제공하는 복수개의 프로브 (PR1...PR5)를 사용하는 Methylight 접근법을 예시한다.
도 5는 ACTB qPCR 그래프 및 HMBS qPCR 그래프를 도시하는 300 ng의 HGDNA에 의해 작동된 대표적인 GeneXpert에 의한 결과를 예시한다.
도 6A 및 6B는 15회 사이클의 네스티드 qPCR (도 6A) 및 20회 사이클의 네스티드 qPCR (도 6B)에서 인간 게놈 DNA (hgDNA)를 사용한 바이술파이트-전환된 ACTB 에 대한 적정의 결과를 예시한다.
도 7A-7C는 6종 메틸화 표적 (AKR1B1, HOXB4, TM6SF1, RAASGRF2, 및 RASSF1A)에 대한 20회 사이클의 네스티드 qPCR (카트리지에서)의 결과를 도시한다. 도 7A는 바이술파이트 전환없이 25 ng의 HSDNA 또는 5000개 세포에 대한 결과를 도시한다. 도 7B는 MBA-453 세포 유래의 DNA를 사용한 바이술파이트 전환된 메틸화 표적에 대한 20회 사이클의 네스티드 qPCR의 결과를 도시한다. 도 7C는 캐리어 내 MBA-453 세포 유래의 DNA (1 μg의 SS 및 10 ng의 HS DNA)를 사용한 바이술파이트 전환된 메틸화 표적에 대한 20회 사이클의 네스티드 qPCR의 결과를 도시한다. 폴아웃은 대략 25-50 카피수 또는 대략 100개 세포에서 일어난다.
도 8은 전환 효율의 결정의 결과를 예시한다. 전환 효율은 비전환된 HMBS 및 전환된 ACTB 간에 약 66% (∼1 Ct)이다.
도 9는 네스티드 qPCR에 의해 생성된 전환된 DNA에 대한 특이도의 증가를 예시한다.
도 10은 메틸화 카트리지의 특이도를 예시한다. HIST1H3C를 제외하고 비전환된 DNA (상부 패널) 또는 비메틸화 DNA (하부 패널)의 프라이밍 오프가 존재하지 않는다.
도 11은 카트리지 (예를 들어, GENEXPERT® 카트리지)를 사용하는 메틸화의 분석을 위한 예시적이지만 비제힌적인 작업도를 예시한다. 상부는 혈청 또는 혈장 샘플 중 DNA 메틸화의 분석을 위한 하나의 작업 흐름도를 예시한다. 하부는 조직 절편 (예를 들어, 냉동 또는 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 절편)에서 DNA 메틸화의 분석을 위한 하나의 작업 흐름도를 예시한다.
도 12는 전환된 ALU (가장 왼쪽 그래프) 및 메틸화 RASSF1A (가장 오른쪽 그래프)에 대한 FFPE 세포 버튼에 대한 결과를 예시한다.
도 13A는 카트리지 레이아웃을 예시하고, 도 13B는 실시예 4에서 사용한 프로토콜의 흐름도를 예시한다.
도 14는 일부 샘플이 바이술파이트 오염을 함유하는 작업을 예시한다.
도 15A는 바이술파이트 전환에 의한 1000개 MBA-453 세포의 결과를 예시한다 (HOXB4가 최고 신호를 제공함). 도 15B는 25　ng의 HS DNA 대조군의 결과를 예시한다 (오직 HIST1H3C만이 검출가능한 신호를 보임).
도 16은 DABSO (1,4-디아조니아비시클로[2.2.2]옥탄-1,4-디술피네이트)의 구조를 예시한다.
도 17은 cfDNA 샘플 제조 카트리지의 일 실시형태를 예시한다. 카트리지는 DNA 및 RNA 단리 둘 모두에 효과적이다. 카트리지는 3회의 GTC-에탄올 세척 (GTC-에탄올 세척은 전형적으로 1.25 M의 구아니디늄 티오시아네이트, 25 mM의 Tris pH 7.0, 50%의 에탄올임), PEG200 세정, 및 15 mM의 KOH 용리를 제공한다.
도 18은 cfDNA 추출을 위한 대조군을 예시한다.
도 19A는 표준 튜브-필 (즉, 튜브-기반 키트) 제조 (가장 왼쪽 그래프)와 비교하여 본 명세서에 기술된 샘플 제조 카트리지를 사용한 cfDNA 제조의 비교를 도시한다. 카트리지 제조 수율은 튜브 필 방법 (가장 우측 그래프)을 사용하여 수득된 것과 매우 비슷하다. 도 19B는 DNA 양의 함수에 따른 표준 튜브-필과 비교하여 카트리지-기반 DNA 클린업을 사용해 검출된 추출된 DNA의 양의 비교를 도시한다. 카트리지-기반 방법은 튜브-필 방법의 1 Ct 내에서 보존적이고 더 높은 DNA 농도에서 더 가까워진다고 여겨진다.
도 20A는 qPCR 카트리지 및/또는 메틸화 검출 카트리지를 사용할 수 있는 고-부피 (예를 들어, 최대 12 mL) 샘플 제조 (HVSP) 카트리지의 일 실시형태를 예시한다. 도 20B는 메틸화 분석을 수행하기 위해 qPCR 카트리지와 조합하여 사용될 때 HVSP 카트리지에서의 작업 흐름도의 한가지 변형을 개략적으로 예시한다.
도 21은 적은 샘플 부피를 생성시키는 단일 PCR 분석 카트리지에 적용되는 샘플을 사용한 검출과 비교되는, 샘플을 고부피 카트리지에서 PCR 분석 카트리지로 수송하는 고부피 샘플 제조 카트리지 (예를 들어, 도 20 참조)를 사용한 2개 카트리지 클린업을 사용하는 HBMS 또는 β-글로빈의 검출을 예시한다.
도 22는 단일 가열 단계 (상부 패널)과 비교되는 다수 가열 단계 (하부 패널)를 사용한 바이술파이트 전환의 결과를 예시한다.
도 23A는 본 명세서에 기술된 메틸화 분석 카트리지를 사용하는 메틸화 분석과 비교되는 Zymo DNA 메틸화 키트 (우측)와 조합된 표준 Qiagen DNA 정제 키트를 사용한 메틸화 분석에 대한 단계 및 노동 시간을 예시한다. 도 23B는 2개의 상이한 프로토콜을 사용해 수득된 결과의 비교를 도시한다.
도 24는 Zymo 바이술파이트 전환 시약을 사용한 DNA 전환과 비교되는 전환 시약으로서 DABSO를 사용한 DNA 전환의 비교를 도시한다.
도 25, 패널 A 및 B는 메틸화 DNA의 검출의 감도를 예시한다. 패널 A는 메틸화 DNA (MGMT)의 연속 희석물을 도시한다 (그래프는 좌측의 최고 농도에서 우측의 최저 농도로 그려짐). 패널 B는 메틸화 췌장암 마커의 검출의 감도를 예시한다.
도 26은 양쪽 가닥에 대한 역방향 상보성 멀티플렉스 어세이에 대한 결과를 예시한다 (곡선은 최고에서 최저 형광도임: 상부 패널 - BNC1_2, BNC1_2, BG, ADAMTS1_1/ADAMTS1_2; 하부 패널 - BNC1_2, BNC1_2, ADAMTS1_1/ADAMTS1_2, BG, ADAMTS1_1/ADAMTS1_2).
도 27A는 동일한 카트리지 내에서 메틸화 DNA 및 돌연변이 둘 모두의 검출을 예시한다. 상부 패널은 하나의 카트리지에서 메틸화 DNA 및 Kras G12D 돌연변이의 검출을 예시하는 한편, 하부 패널은 하나의 카트리지에서 메틸화 DNA 및 야생형 Kras의 검출을 예시한다. 도 27B는 2종의 췌장암 세포주: PANC-1 세포 (상부 패널) 및 MIA-PaCa 세포 (하부 패널)의 동일 카트리지에서 메틸화 DNA 및 돌연변이 I의 검출을 예시한다.
도 28은 바이술파이트-전환된 DNA의 전방향 가닥 (상부) 및 역방향 가닥 (하부)의 ADAMTS1, 및 BNC1 의 멀티플렉스 메틸화 분석을 위한 온도 최적화를 예시한다.
도 29는 BNC1, ADAMTS1, 및 대조군 유전자 ACTB에 대한 MSP 프라이머 및 프로브 세트의 멀티플렉스 능력을 예시한다. 프로브는 바람직한 조건을 기반으로 2개 세트로 조합되었다.
도 30은 MGMT 메틸화의 검출에 사용된 프라이머 및 프로브의 한 세트를 예시한다. 내부 fwd 22150 (SEQ ID NO: 266); 외부 fwd 22422 (SEQ ID NO: 263); 프로브 22419 (SEQ ID NO: 268), 내부 rev 22151 (SEQ ID NO: 267); 외부 rev 22423 (SEQ ID NO: 265); 주형 (SEQ ID NO: 1).
도 31은 추출된 DNA (상부) 및 FFPET 샘플 (하부)에 대한 바이술파이트 파이로시퀀싱 및 MGMT 메틸화 카트리지 간 비교의 결과를 도시한다.
도 32는 메틸화 전환 및 비메틸화 전환 DNA 간 △Ct의 BRCA1 프라이머 및 프로브 세트 최적화를 예시한다.
도 33은 ACTB 대조군 유전자로 시험된 BRCA1 메틸화에 대한 하나의 표적 어세이를 예시한다. 도시된 바와 같이, 9개의 상이한 세포주를 시험하였고, NH4 의 첨가 효과를 비교하였다.
도 34는 정상 혈장의 배경 및 3종의 상이한 폐암 세포주에서 그의 메틸화가 폐암과 연관된 유전자 (SOX17, CD01, TAC1)에 대한 3회의 표적 메틸화 어세이의 결과를 예시한다.
도 35는 BNC1 및 ACTB의 2-카트리지 메틸화 분석의 결과를 도시한다.
도 36은 정상 소변 샘플의 바이술파이트 전환 분석의 결과를 도시한다.
도 37은 정상 및 암 객담 샘플의 메틸화 분석의 결과를 도시한다.
정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해서, 많은 용어 및 어구를 하기에 정의한다:
본 명세서에서 사용되는 용어 "검출하다", "검출하는" 또는 "검출"은 검출가능하게 표지된 조성물의 특별한 관찰을 발견하거나 또는 인식하는 일반 행위를 설명할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "검출가능하게 상이한" 또는 "스펙트럼이 구별가능한"은 동시에 검출하고 구별할 수 있는 표지 (예컨대 염료/형광단)의 세트를 의미한다.
DNA 메틸화 DNA 메틸화는 디뉴클레오티드 5'-CpG-3'에서 전형적으로 시토신 (C) 염기에 메틸 기(CH3)의 공유적 첨가를 의미한다. 용어 CpG는 DNA 뉴클레오티드 서열 내 구아닌 (G) 염기와 포스페이트 결합에 의해 연결된 시토신 (C) 염기를 의미한다.
용어 "전환 시약"은 단일 가닥 DNA에서 시토신을 우라실로 탈아민화시키는 한편, 5-MeC는 본질적으로 영향받지 않게 하는 시약을 의미한다. 예시적인 전환 시약은 바이술파이트 (예를 들어, 소듐 메타바이술파이트, 포타슘 바이술파이트, 세슘 바이술파이트, 암모늄 바이술파이트 등) 및/또는 적절한 반응 조건 하에서 바이술파이트를 생성시킬 수 있는 화합물 (예를 들어, DABSO)을 포함한다.
어구 " 유전자의 메틸화를 검출하는"은 일반적으로 유전자의 프로모터 영역 내에서, 전형적으로 CpG 섬 내의 시토신의 메틸화의 검출을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "환자" 및 "대상체"는 전형적으로 인간을 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 인간이외의 동물, 예를 들어 인간 이외의 영장류, 갯과, 말과, 고양잇과, 돼지류, 솟과동물, 토끼목 동물 등으로부터 유래된 샘플에 대해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드", "핵산 분자" 등은 제한없이 DNA를 포함하는 핵산-함유 분자를 의미한다. 이 용어는 제한없이, 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 슈도이소시토신, 5-(카복시히드록실메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸-구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노-메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 및 2,6-디아미노푸테린을 포함하는 DNA 및 RNA의 임의의 기지의 염기 유사체를 포함한 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 전형적으로 500개 뉴클레오티드보다 적은 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 8 내지 200개, 8 내지 100개, 12 내지 200개, 12 내지 100개, 12 내지 75개, 또는 12 내지 50개 뉴클레오티드 길이이다. 올리고뉴클레오티드는 그들의 길이에 따라 언급될 수 있고, 예를 들어 24개 잔기의 올리고뉴클레오티드는 "24-량체"라고 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 표적 유전자 (또는 이의 표적 영역)에 대한 "상보성", 및 표적 유전자 서열에 대한 프로브 서열의 "상보성"의 백분율은 표적 유전자의 서열 또는 표적 유전자의 서열의 상보체에 대한 "동일성"의 백분율이다. 본 명세서에 기술된 조성물에서 사용되는 프로브 (또는 이의 영역) 및 표적 유전자, 예컨대 본 명세서에 개시된 것들 간 "상보성"의 정도를 결정하는데 있어서, "상보성"의 정도는 프로브 (또는 이의 영역)의 서열 및 함께 최고로 정렬되는 표적 유전자의 서열 또는 표적 유전자의 서열의 상보체 간 동일성 백분율로서 발현된다. 백분율은 2개 서열 간에 동일한 정력된 염기의 수를 계측하고, 프로브 내 인접한 뉴클레오티드의 총수로 나누고, 100을 곱하여 계산된다. 용어 "상보성"이 사용될 때, 대상 올리고뉴클레오티드는 달리 표시하지 않으면 표적 분자와 적어도 90% 상보성이다. 일부 실시형태에서, 대상 올리고뉴클레오티드는 표적 분자와 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상보성이다.
본 명세서에서 사용되는 "프라이머" 또는 "프로브"는 표적 핵산 분자, 예컨대 표적 유전자의 적어도 8개의 인접한 뉴클레오티드의 서열과 상보성인 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 또는 프로브는 표적 분자의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개, 적어도 29개, 적어도 30개, 적어도 31개, 적어도 32개, 적어도 33개, 적어도 34개, 적어도 35개, 적어도 36개, 적어도 37개, 적어도 38개, 적어도 39개, 또는 적어도 40개의 인접한 뉴클레오티드의 서열과 상보성인 영역을 포함한다. 프라이머 또는 프로브가 "표적 분자의 적어도 x개의 인접한 뉴클레오티드와 상보성"인 영역을 포함할 때, 프라이머 또는 프로브는 표적 분자의 적어도 x개의 인접한 뉴클레오티드와 적어도 95% 상보성이다. 일부 실시형태에서, 프라이머 또는 프로브는 표적 분자와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상보성이다.
용어 "핵산 증폭"은 적어도 하나의 표적 핵산의 적어도 일부분이 전형적으로 제한없이, 선형적으로 또는 지수적으로, 핵산 서열을 증폭시키기 위한 광범위 기술을 포함한, 주형-의존적 방식으로 재생되는 임의의 수단을 포괄한다. 증폭 단계를 수행하기 위한 예시적인 수단은 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 리가제 검출 반응 (LDR), 멀티플렉스 결찰-의존적 프로브 증폭 (MLPA), 결찰 후 Q-레플리카제 증폭, 프라이머 연장법, 가닥 전위 증폭법 (SDA), 과분지형 가닥 전위 증폭법, 다중 전위 증폭법 (MDA), 핵산 가닥-기반 증폭법 (NASBA), 2-단계 멀티플렉스 증폭법, 롤링 사이클 증폭법 (RCA) 등을 포함하고, 이의 멀티플렉스 형태 및 이의 조합, 예를 들어 제한없이, OLA/PCR, PCR/OLA, LDR/PCR, PCR/PCR/LDR, PCR/LDR, LCR/PCR, PCR/LCR (조합 사슬 반응--CCR이라고도 함), 디지탈 증폭법 등을 포함한한다. 이러한 기술은 특히 다음의 문헌들에서 확인할 수 있다: Ausbel et al.; PCR Primer: A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed., Cold Spring Harbor Press (1995); The Electronic Protocol Book, Chang Bioscience (2002); Msuih et al., J. Clin. Micro. 34:501-07 (1996); The Nucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (2002); Abramson et al., Curr Opin Biotechnol. 1993 February; 4(1):41-7, U.S. 특허 제6,027,998호; U.S. 특허 제6,605,451호, Barany et al., PCT 공개 특허 출원 WO 97/31256; Wenz et al., PCT 공개 특허 출원 WO 01/92579; Day et al., Genomics, 29(1): 152-162 (1995), Ehrlich et al., Science 252:1643-50 (1991); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990); Favis et al., Nature Biotechnology 18:561-64 (2000); 및 Rabenau et al., Infection 28:97-102 (2000); Belgrader, Barany, and Lubin, Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay, Sixth International Symposium on Human Identification, 1995 (promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html의 월드 와이드 웹에서 입수가능); LCR Kit Instruction Manual, Cat. #200520, Rev. #050002, Stratagene, 2002; Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:188-93 (1991); Bi and Sambrook, Nucl. Acids Res. 25:2924-2951 (1997); Zirvi et al., Nucl. Acid Res. 27:e40i-viii (1999); Dean et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:5261-66 (2002); Barany and Gelfand, Gene 109:1-11 (1991); Walker et al., Nucl. Acid Res. 20:1691-96 (1992); Polstra et al., BMC Inf. Dis. 2:18-(2002); Lage et al., Genome Res. 2003 February; 13(2):294-307, 및 Landegren et al., Science 241:1077-80 (1988), Demidov, V., Expert Rev Mol Diagn. 2002 November; 2(6):542-8., Cook et al., J Microbiol Methods. 2003 May; 53(2):165-74, Schweitzer et al., Curr Opin Biotechnol. 2001 February; 12(1):21-7, U.S. 특허 제5,830,711호, U.S. 특허 제6,027,889호, U.S. 특허 제5,686,243호, PCT 공개 특허 출원 W00056927A3, 및 PCT 공개 특허 출원 W09803673A1.
일부 실시형태에서, 증폭은 적어도 하나의 프라이머를 적어도 하나의 표적 핵산 내 상보성 또는 실질적으로 상보성 서열과의 어닐링; 중합효소를 사용한 주형-의존적 방식으로 뉴클레오티드의 적어도 하나의 가닥의 합성; 및 가닥을 분리시키기 위해 새롭게 형성된 핵산 듀플렉스 변성의 순차적 절차의 적어도 1회 사이클을 포함한다. 사이클은 반복될 수도 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 증폭은 열순환을 포함할 수 있거나, 또는 일정한 실시형태에서, 등온적으로 수행될 수 있다.
용어 "하이브리드화하다"는 전형적으로 본 명세서에서 일부 실시형태에서, 엄격 조건 하에 특정한 뉴클레오티드 서열과 핵산 분자의 우선적인 결합, 듀플렉스화 또는 하이브리드화인 "특이적 하이브리드화"를 의미한다. 용어 "엄격 조건"은 프로브가 이의 표적 서열에 우선적으로 하이브리드화되게 하고, 다른 서열과는 낮은 정도로, 또는 전혀 하이브리드화하지 않게 되는 조건을 의미한다. 핵산 하이브리드화의 상황에서 "엄격 하이브리드화" 및 "엄격 하이브리드화 세척 조건"은 서열-의존적이고 상이한 환경 변수 하에서 상이하다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 지침은 예를 들어 다음의 문헌에서 확인한다: Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acids part I, Ch. 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," Elsevier, N.Y. ("Tijssen"). 일반적으로, 필터 하이브리드화를 위한 고도의 엄격 하이브리드화 및 세척 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 용융점 (Tm) 보다 약 5℃가 낮게 선택된다. Tm 은 표적 서열의 50%가 완벽하게 일치되는 프로브와 하이브리드화하는 온도 (정의된 이온 강도 및 pH에서)이다. 일정한 실시형태에서 매우 엄격한 조건은 특정한 프로브에 대한 Tm 과 동등하도록 선택된다. 완충제 조성, 온도 및 프로브 길이에 대한 하이브리드화 엄격도의 의존성은 당업자에게 충분히 공지되어 있다 (예를 들어, [Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY] 참조).
본 명세서에서 사용되는 "샘플"은 일반적으로 생물학적 유체 (예를 들어, 혈액 또는 혈액 분획, 혈청, 혈장, 췌액, 뇌척수액, 타액, 림프, 안내액 등)를 포함하는 생물학적 샘플 및/또는 유방 조직, 자궁경내 조직, 질 조직, 결장/직장 조직, 인후 조직, 및 다른 유형의 인간 샘플, 예컨대 혈액, 대변 및 생검 샘플을 포함하는 다양한 조직 유래의 생검 샘플, 냉동 조직 샘플, 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 샘플을 포함하는 조직 샘플을 의미한다. 용어 샘플은 또한 상기 샘플의 희석 및/또는 완충된 형태, 예를 들어, 면봉 샘플을 넣은 완충제, 완충제가 첨가된 소변 샘플 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 어구 "암 또는 암에 대한 소인의 존재를 의미하다"는 특정한 결과가 암이 존재하고/하거나, 전암성 병태가 존재하거나 또는 존재할 수 있다는 것을 의미하는 경향이 있다는 것을 의미한다. 이러한 어구는 병태가 존재한다는 확정적인 결정을 암시하는 것이 아니다. 확정적인 결정은 의사가 적절하다고 여기는 추가의 조사 또는 검사를 기반으로 할 수 있다. 더 나아가서, 이러한 어구는 오직 특정한 결과를 기반으로 어떠한 병태가 존재할 수 있는 가에 관해 결정하는 것을 요구하지 않는다. 그 보다는, 다른 조사 또는 검사 결과를 고려하여 감별 진단에 도달하기 위한 양성 결과로 간주될 것이라고 여겨진다.
용어 "튜브필 (tubefill) 절차"는 카세트 보다는 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 GENEXPERT®, 또는 변형된 GENEXPERT® 카트리지 보다는) 표준 실험실 장비를 사용해 작업되는 절차를 의미한다.
상세한 설명
다양한 실시형태에서 DNA 샘플 중 메틸화의 신속한 검출 및/또는 특징규명을 촉진하는 장치 및 방법을 제공한다. 일정한 실시형태에서 자동화 반응 카트리지가 DNA 샘플 중 메틸화의 분석을 촉진하고, 임의로, DNA 메틸화의 결정과 함께 mRNA 수준을 측정하기 위해 자동화 반응 카트리지(들)를 활용하는 방법으로서 제공된다. 다양한 실시형태에서 DNA 메틸화는 바이술파이트 전환 및 바이술파이트 전환된 DNA의 분석 (예를 들어, 메틸화 특이적 PCR, 핵산 시퀀싱, 융점 분석 등에 의함)을 통해 결정된다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 DNA의 바이술파이트 전환의 전부 또는 일부 및 바이술파이트 전환된 DNA의 분석의 전부 또는 일부를 수행한다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 바이술파이트 전환에 관여되는 단계의 전부 및 바이술파이트-전환된 DNA의 분석의 전부 또는 일부를 수행한다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 바이술파이트 전환에 관여되는 단계의 전부 및 바이술파이트-전환된 DNA의 분석의 전부를 수행한다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 분석하려는 DNA의 단리 및 정제를 추가적으로 수행한다.
예를 들어, 전체 프로세싱 시간의 절감, 효율성 개선, 사용자 오류 및 가변성 감소, 단계 사이의 손실 최소화 및 소량의 샘플을 사용하는 개선된 능력을 포함하여, 메틸화 분석을 자동화시키는 것은 몇몇 장점이 존재한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 카트리지-기반 프로세스의 사용은 복수의 샘플 유형뿐만 아니라 제한없이 유방암, 직결장암, 전립선암, 및 폐암을 포함한 몇몇 상이한 유형의 암에서 관찰되는 메틸화 변화를 평가하는 신속하고 용이한 검사를 가능하게 한다.
본 명세서에 기술된 카트리지-기반 방법은 동일한 샘플로부터 유래된 mRNA의 측정을 추가적으로 가능하게 한다. DNA 메틸화에 관여되는 상응하는 상류 및/또는 하류 mRNA의 측정은 후생적 변형의 기전 및 활성을 이해하는데 중요할 수 있다. 예를 들어, DNA 메틸트랜스퍼라제 (DNMT) mRNA의 측정은 몇몇 암에 대한 DNA 메틸화와 함께 연구되었다 (표 1 참조).
[표 1]
예시적인 DNA 메틸트랜스퍼라제 및 특정 암에서 그들의 중요도 ([Subramaniam et al. (2014) Front Oncol.], 4: Article 80, doi:10.3389/fonc.2014.00080 참조).
Figure 112019070348332-pct00001
DNA 또는 RNA에 대한 별개의 독립 추출이 유전자 및 전사물을 연구하고 측정하는데 종종 사용된다. 동일한 샘플 제조물로부터 동시-검출이 샘플 제조, 어세이 대 어세이, 샘플 대 샘플 및 세포 대 세포 가변성을 최소화시키는데 이상적일 것이다.
DNA의 카트리지-기반 바이술파이트 전환
일정한 실시형태에서 DNA의 추출, 바이술파이트 전환, 및 메틸화 특이적 PCR은 카트리지에서 전부 수행된다. 예시적인 일 실시형태에서, 사용자는 샘플을 용해/결합 시약에 첨가하고 나서, 시약을 잠시 혼합/와류시킨 후에, 샘플을 카트리지 내 샘플 포트 또는 챔버에 첨가하게 될 것이다. 예시적이지만 비제한적인 용해 시약 (FFPE 절편에 특히 충분히 적합한 시약 포함)은, 본 명세서에 기술된 시약을 참조하기 위해 본 명세서에 편입시킨 PCT 공개 특허 출원 번호 WO/2014/052551 (PCT/US2013/061863)에 기술되어 있다.
혈청 또는 혈장 및 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 샘플에 대한 추가의 예시적인 용해 시약은 실시예에 표시되어 있다 (각각 표 13, 및 14).
일정한 실시형태에서 카트리지가 프로세싱 모듈에 위치되고 어세이는 프로세싱 모듈을 제어하는 소프트웨어 내 선택 세트를 통해서 클릭하여 개시된다 (예를 들어, 도 11A 및 11B 참조). 그 다음으로 카트리지는 바이술파이트 전환 프로세스 및 바이술파이트-전환된 DNA의 분석을 수행한다. 일정한 실시형태에서 mRNA가 또한 결정된다. 일정한 실시형태에서, 모든 작업이 카트리지에서 수행되지만, 다른 실시형태에서, 다양한 작업의 서브셋이 하기 기술된 바와 같이 카트리지에서 수행된다.
샘플은 그의 메틸화 상태를 평가하려는 DNA를 함유하는 임의의 생물학적 샘플을 포함할 수 있다. 예시적인 샘플은 제한없이 단리된 DNA 및/또는 단리된 전체 핵산, 세포, 조직, 핵산을 함유하는 생물학적 유체 등을 포함한다. 일정한 실시형태에서 생물학적 샘플은 혈장, 혈청, 양수 타액, 점액, 소변, 췌액, 및 뇌척수액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 유체를 포함한다. 일정한 실시형태에서 샘플은 건강한 조직 유래의 조직 샘플, 또는 질환 샘플 유래의 조직 샘플을 포함한다. 일정한 실시형태에서 조직 샘플은 태아, 신생아, 유아, 청소년 또는 성인으로부터 유래된다. 일정한 실시형태에서 조직 샘플은 종양 세포를 포함하고/하거나, 종양 (예를 들어, 유방암, 전립선암, 뇌암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 결장암, 위암, 간세포암 등)의 생검으로부터 유래된다. 일정한 실시형태에서 샘플은 고정 조직, 예를 들어, 포르말린 고정 조직 샘플을 포함한다. 일정한 실시형태에서 샘플은 포매된 조직 샘플 (예를 들어, 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직 샘플)을 포함한다.
DNA의 바이술파이트 전환은 전형적으로 하기의 4개 단계를 포함한다:
1) DNA 정제;
2) DNA 변성;
3) DNA 전환 (예를 들어, 바이술파이트 탈아민화); 및
4) 알칼리 탈술폰화.
전형적으로 DNA 전환 (예를 들어, 전환 시약 예컨대 바이술파이트를 사용함)은 1) 술폰화 단계: 시토신의 5-6 이중 결합에 바이술파이트의 첨가 단계; 및 2) 가수분해적 탈아민화 단계: 생성된 시토신-바이술파이트 유도체의 가수분해적 탈아민화에 의해 우라실-바이술파이트 유도체 제공 단계를 포함한다. 이후에 알칼리 탈술폰화: 알칼리 처리에 의한 술포네이트 기의 제거를 후속하여 상기 표시된 바와 같은 우라실이 제공된다.
상기에 언급된 바와 같이, 일정한 실시형태에서, DNA 정제는 카트리지에 샘플을 위치시키기 전에 수행될 수 있거나, 또는 대안적으로 카트리지 그 자체에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 일정한 실시형태에서 샘플이 반응 카트리지에 직접 첨가되는데 반해, 다른 실시형태에서, 샘플은 하나 이상의 시약과 혼합된다. 일정한 실시형태에서 DNA 제조는 전형적으로 실질적으로 단리된 DNA를 제조하는 단계를 포함한다. 이것은 세포를 용해시켜 DNA를 방출시키는 단계, 미립자 및 세포 찌꺼기를 제거하는 단계, 및/또는 단백질 성분을 제거하어 실질적으로 순수한 핵산 (예를 들어, 실질적으로 순수한 DNA 및/또는 실질적으로 순수한 DNA 및 RNA의 조합)을 포함하는 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. 예시적이지만, 비제한적인 일 실시형태에서, 샘플 (예를 들어, 조직 샘플)은 용해 시약에 첨가되고, 교반되고 나서 추가 프로세싱을 위한 카트리지에 삽입된다.
일정한 실시형태에서, DNA의 바이술파이트 전환을 수행하는데 필요한 모든 시약은 카트리지에 제공된다. 일정한 실시형태에서, 카트리지 내에서 시간 경과에 따른 시약의 분해를 피하기 위해서, 일정 시약은 사용 직전에 카트리지에 첨가될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일정한 실시형태에서, 카트리지는 샘플이 카트리지에 로딩되는 시점 또는 대략 그 시점에 전환 시약 (예를 들어, 바이술파이트 시약) 및/또는 구아니듐 티오시아네이트 시약 (예를 들어, GTC-EtOH-Tween)이 로딩될 수 있다는 것을 고려한다. 일정한 실시형태에서, 구아니디늄 티오시아네이트 시약 (예를 들어, GTC-EtOH-Tween)은 샘플과 배합되어 샘플 수용 챔버 (예를 들어, GENEXPERT® 카트리지의 챔버 2) 내 카트리지에 첨가된다.
일정한 실시형태에서 반응 카트리지 (예를 들어, GENEXPERT® 카트리지)를 사용하여 DNA의 바이술파이트 전환을 수행할 때, 방법은
i) 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 제1 컬럼 또는 필터를 포함하는 제1 매트릭스 재료에 접촉시켜서 상기 매트릭스 재료가 상기 샘플 중 핵산에 결합하고/하거나 여과시켜 DNA를 정제하는 단계;
ii) 결합된 DNA를 제1 매트릭스 재료로부터 용리 (예를 들어, 알칼리 용액 사용)시키고 DNA를 변성시켜서 용리된 변성 DNA를 생성시키는 단계;
iii) 용리된 DNA를 전환 시약 (예를 들어, 바이술파이트 이온을 제공하는 시약)의 존재 하에서 가열시켜 전환된 (예를 들어, 탈아민화된) 핵산을 생성시키는 단계;
iv) 전환된 핵산을 제2 컬럼을 포함하는 제2 매트릭스 재료에 접촉시켜서 상기 탈아민화 핵산을 상기 제2 매트릭스 재료에 결합시키는 단계 (일정한 실시형태에서 제2 컬럼은 제1 컬럼과 상이한 컬럼일 수 있거나, 또는 다른 실시형태에서, 동일 컬럼이 두번째로 사용된다는 것을 주의함);
v) 결합된 탈아민화 핵산을 탈술폰화하고/하거나 탈아민화 핵산을 알칼리 용액과 접촉시켜 핵산을 동시에 용리 및 탈술폰화하여 전환된 (예를 들어, 바이술파이트 전환된) 핵산을 생성시키는 단계; 및
vi) 전환된 핵산을 상기 제2 매트릭스 재료로부터 용리시키는 단계
를 포함하고,
적어도 단계 iv) 내지 vi)은 하나의 반응 카트리지에서 수행된다.
일정한 실시형태에서 방법은 전환된 DNA의 분석 단계를 더 포함한다. 따라서, 일정한 실시형태에서, 방법은
vii) 메틸화 특이적 PCR 및/또는 핵산 시퀀싱, 및/또는 고분해능 용융 분석 (HRM)을 전환된 핵산에 대해 수행하여 핵산의 메틸화를 결정하는 단계를 더 포함하고, 적어도 단계 iv) 내지 vi)은 단일 반응 카트리지에서 수행된다.
일정한 실시형태에서 적어도 단계 iii) 내지 vi)은 하나의 반응 카트리지에서 수행된다.
일정한 실시형태에서 적어도 단계 ii) 내지 vi)은 하나의 반응 카트리지에서 수행된다.
일정한 실시형태에서 적어도 단계 i) 내지 vi)은 하나의 반응 카트리지에서 수행된다.
일정한 실시형태에서 적어도 단계 i) 내지 vii)은 하나의 반응 카트리지에서 수행된다.
제1 컬럼 및, 존재하는 경우에, 제2 컬럼은 개별 컬럼을 의미할 수 있다는 것을 주의한다. 그러나, 특히 반응 카트리지에 통합된 경우에, "컬럼"은 단순히 카트리지 내 챔버 또는 채널에 배치된 매트릭스 재료일 수 있다. 다양한 실시형태에서 "컬럼"은 핵산이 결합하는 친화성 컬럼 및/또는 필터로서 작용한다. 따라서, 일정한 실시형태에서 컬럼은 핵산 (예를 들어, DNA 및/또는 RNA)이 결합하는 매트릭스 재료를 함유한다. 예시적인 매트릭스 재료는 제한없이 유리 (실리카), 이온 교환 수지, 히드록시아파타이트 등을 포함한다. 매트릭스 재료가 다양한 형태를 취할 수 있다는 것을 인식하게 될 것이다. 따라서, 일정한 실시형태에서, 매트릭스 재료는 섬유성 재료, 미립자 재료 (예를 들어, 마이크로비드, 나노비드 등), 구조화 재료 (예를 들어, 다공성 "배플" 시스템, 서펜타인 채널 등)를 포함한다. 일정한 실시형태에서 제1 컬럼 및 제2 컬럼은 상이한 컬럼 (챔버 또는 채널)이다. 다른 실시형태에서 제1 컬럼 및 제2 컬럼은 2번 (예를 들어, 1차 및 2차) 사용되는 동일한 컬럼 (챔버 또는 채널)이다.
일정한 실시형태에서, 예를 들어, 제1 매트릭스 재료와 접촉시키기 전에 초기 샘플을 클린업하기 위해서, 하나 이상의 추가 필터의 사용이 고려된다. 따라서, 예를 들어, 일정한 실시형태에서, 필터 매트릭스 (예를 들어, 폴리카보네이트 필터, 나일론 필터, 폴리프로필렌 필터, 폴리에스테르 필터, 나일론 필터, 세라믹 필터, 폴리테트라플루오로에틸렌 필터 등)가 샘플 수용 챔버 또는 샘플 수용 챔버로부터 "하류" 및 제1 "컬럼" 앞에 배치된다. 또한, 일정한 실시형태에서, 샘플은 샘플 수용 챔버에 배치 전에 용해 및/또는 여과될 수 있다는 것을 인식한다.
일정한 예시적이지만, 비제한적인 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 GENEXPERT® 카트리지 (Cepheid, Inc., Sunnyvale, CA) 또는 이의 변형을 사용하여 수행될 수 있다. 다양한 실시형태에서 샘플 추출, 및/또는 증폭, 및/또는 DNA 전환, 및/또는 검출은 이러한 자체-함유된 "카트리지내 실험실" 내에서 전부 수행될 수 있다 (예를 들어, U.S. 특허 제5,958,349호, 제6,403,037호, 제6,440,725호, 제6,783,736호, 및 제6,818,185호를 참조하고, 이들 각각은 그 전문을 참조로 본 명세서에 편입시킴). 다양한 실시형태에서 카트리지의 성분은 제한없이 표적 핵산을 추출, 정제, 및 증폭시키는데 유용한 시약, 필터, 및 포획 기술을 함유하는 프로세싱 챔버를 포함할 수 있다. 밸브는 유체를 챔버에서 챔버로 수송시킬 수 있고 핵산 용해 및 여과 성분을 함유한다. 광학 윈도우는 (예를 들어, PCR 증폭 생성물의) 실시간 광학 검출을 가능하게 한다. 반응 튜브는 매우 신속한 가열 및/또는 열순환이 가능하게 제공될 수 있다.
일정한 실시형태에서 예시적인 GENEXPERT® 카트리지는 중심 밸브 어셈블리 주변에 배치되고 중심 밸브 어셈블리와 선택적으로 유체 연통되는 복수개의 챔버를 포함하며, 여기서 중심 밸브 어셈블리는 중심 밸브와 유체 연통되는 챔버의 내부 또는 외부로 유체를 유인시킬 수 있는 플런저를 수용하도록 구성된다. 밸브 어셈블리의 회전은 어떠한 챔버가 중심 밸브와 유체 연통되는가를 결정한다. 하나의 예시적인 GENEXPERT® 카트리지는 카트리지, 프로세싱/시약 챔버, 반응 튜브 (예를 들어, 가열 및/또는 열순환 튜브), 선택적 광학 윈도우, 및 챔버에서 챔버로 유체 수송을 용이하게 하는 밸브를 도시한 도 1A에 예시되어 있다.
다양한 챔버를 번호로 식별하는 카트리지의 상면도를 제공하는 도 1B에 카트리지의 예시적인 레이아웃이 도시되어 있다. 예시적이지만, 비제한적인 일 실시형태에서, 카트리지를 포함하는 챔버의 성분은 표 2에 열거된 바와 같다. 시약 및 챔버의 이러한 배치는 예시적이며 비제한적이라는 것을 인식하게 될 것이다. 본 명세서에 제공되는 교시를 사용하여 다른 시약 배치 및/또는 다른 챔버 구성이 당업자에게 이용가능하게 될 것이다.
[표 2]
DNA 메틸화의 측정을 위한 GENEXPERT® 카트리지의 사용을 위한 챔버 내용물을 표시하는 예시적인 일 실시형태.
Figure 112019070348332-pct00002
이러한 카트리지를 활용하여 DNA 메틸화의 결정을 위한 단계적인 작업흐름도의 일 실시형태는 도 1C에 도시되어 있다. 이러한 카트리지 구성에서, 사용될 때 (예를 들어, 카트리지가 DNA 메틸화를 결정하도록 가동될 때)에, 시약 및 완충제 (예를 들어, 챔버 3, 4, 5, 8, 및 10)를 수용하게 되는 5개 챔버가 존재하는데, 사용자가 첨가하는 샘플을 수용하게 되는 하나의 챔버 (예를 들어, 챔버 2), 및 분석 시약 (예를 들어, 비드로서, 예를 들어 MSP 시약 예컨대 효소 반응물, 주형 특이적 반응물, 및/또는 또는 200 mM Tris pH 7.0)을 수용하는 하나 또는 2개 (또는 그 이상의) 챔버 (예를 들어, 챔버 9, 및 11)가 존재한다. 일정한 실시형태에서, 시약 (예를 들어, 중합효소, 역전사효소, 프라이머, 프로브)은 용액으로 제공된다. 일정한 실시형태에서 시약은 동결건조 분말로서 제공된다. 일정한 실시형태에서 시약은 동결건조 비드로서 제공된다. 비드는 시약 안정성 및/또는 활성을 개선시키기 위한 작용제를 더 포함할 수 있다 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 비드, 비드 제작 및 비드 제제에 대해 본 명세서에서 참조로 편입시킨 미국 공개 특허 출원 번호 2006/0068399 참조).
일정한 실시형태에서 제공되는 바와 같은 카트리지는 카트리지를 작동시키는데 필요한 모든 시약을 함유하고 오직 샘플 (예를 들어, 완충제/용해/침전 용액 중 샘플)만이 카트리지에 첨가된다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 GTC-EtOH 및/또는 바이술파이트 시약없이 제공되어 하나 또는 둘 모두가 사용 시점에 첨가된다. 따라서, 일정한 실시형태에서, GTC-EtOH 시약은 카트리지에 사용 시점에 첨가되고, 일정한 실시형태에서 바이술파이트 시약 (샘플에 더하여)은 챔버에 사용 시점에 첨가되며, 일정한 실시형태에서, GTC-EtOH 및 바이술파이트 시약 (샘플에 더하여) 둘 모두는 카트리지에 사용 시점에 첨가된다. 일정한 실시형태에서 이들 시약은 바람직한 챔버에 직접적으로 첨가된다 (예를 들어, 표 2 참조). 일정한 실시형태에서 포트는 시약을 로딩하기 위해 제공되며 포트는 바람직한 챔버로 시약(들)을 전달하도록 구성된다.
어세이의 시작시에, 카트리지는 샘플을 예를 들어 챔버 2로부터 카트리지 내 유리 섬유 컬럼 (예를 들어, 제1 컬럼) 상에 분배한다. DNA는 컬럼으로부터 용리되고 동시에 알칼리 용액, 예를 들어, 챔버 10의 저농도 포타슘 히드록시드로부터 챔버 4의 농축된 바이술파이트 시약 (예를 들어, 농축된 암모늄 바이술파이트)에 의해 변성된다. 일정한 실시형태에서 DNA는 약 10.5를 초과하는 pH, 또는 약 pH 12를 초과하는 pH인 KOH의 알칼리 용액으로 용리된다. 일정한 실시형태에서 DNA는 10-15 mM의 KOH에 의해 용리된다.
상기에 표시된 바와 같이, DNA는 (임의로 초음파 파쇄 처리에 의함) 바이술파이트 시약으로 용리된다. 다양한 실시형태에서 전환 시약 (예를 들어, 바이술파이트 시약)은 약 4 M 내지 약 10 M, 또는 약 5 M 내지 약 8 M, 또는 약 6 M 또는 약 7 M 범위의 농도로 존재한다. 일정한 실시형태에서 바이술파이트 용액은 소듐 메타바이술파이트, 또는 포타슘 바이술파이트, 또는 암모늄 바이술파이트, 또는 세슘 바이술파이트, 또는 DABSO (1,4-디아조니아비시클로[2.2.2]옥탄-1,4-디술피네이트, 예를 들어, 도 16 참조)를 포함한다. 일정한 실시형태에서 전환 시약 (예를 들어, 바이술파이트 시약)은 제한없이 술페이트로 술파이트의 산화를 방지하기 위한 하나 이상의 화학물 (트롤록스 및 히드로퀴논)을 포함하는 라디칼 스캐빈저, 및/또는 촉매 (폴리아민)를 함유한다.
다음으로 DNA-바이술파이트 (DNA/전환 시약) 믹스가 온도 제어 챔버 또는 채널에 도입되고 약 40℃ 내지 약 95℃ 범위의 온도에서 인큐베이션된다. 일정한 실시형태에서 믹스는 일정 온도에서 인큐베이션되는 한편, 다른 실시형태에서, 예를 들어, 온도 제어 챔버 또는 채널이 열순환 챔버 또는 채널 (예를 들어, 카트리지 후면의 스마트사이클러 튜브)인 경우에, 믹스는 열적으로 순환된다 (예를 들어, 60℃ 내지 95℃). 믹스는 DNA가 전환 (예를 들어, 탈아민화)될 때까지 인큐베이션된다. 일정한 실시형태에서 인큐베이션은 약 5분 내지 최대 약 4시간, 또는 바람직하게 약 15분 내지 최대 약 45분 범위인 시간 기간 동안이다.
인큐베이션 이후에 DNA/전환 시약 (예를 들어, DNA-바이술파이트) 용액을 예를 들어, 챔버 3으로부터의 신선한 구아니디늄 티오시아네이트-EtOH과 혼합하고 매트릭스 재료 상에 분배한다. 일정한 실시형태에서 제1 컬럼은 재사용되며, 그리하여 오직 하나의 컬럼이 존재하고 제1 컬럼 및 제2 컬럼이 동일하다. 일정한 실시형태에서 제2 컬럼은 제1 컬럼과 상이한 별개의 컬럼이다.
제2 컬럼 매트릭스 재료에 결합된 DNA는 (예를 들어, 챔버 3으로부터의) 신선한 GTC-EtOH로 세척 및 세정 (예를 들어, 챔버 8로부터의 PEG200 세정제에 의함)된다. 다음으로 DNA는 컬럼 상에서 탈술폰화되거나, 또는 탈아민화 핵산을 알칼리 용액 (예를 들어, 챔버 10으로부터의 KOH)과 접촉시킴으로써 동시에 용리 및 탈술폰화시켜 바이술파이트 전환된 핵산을 생성시킨다. 일정한 실시형태에서 인큐베이션은 약 1분 내지 약 1시간, 또는 약 5분 내지 약 30분, 또는 약 10분 내지 약 20분 범위, 또는 약 15분의 시간 기간 동안이다.
초기 인큐베이션이 한층 더 사용하려는 열순환 챔버에서 일어난 경우에, 열순환 챔버 또는 채널은 완충제로 세척하여 잔류 바이술파이트를 제거하고 pH를 중화시킨다. 전환 시약 (예를 들어, 바이술파이트 시약)과의 인큐베이션, 및/또는 탈술폰화가 이후 PCR 반응(들)을 실질적으로 방해하는 바이술파이트 오염없이 PCR에서 이후에 사용되는 채널 또는 챔버에서 수행될 수 있다는 것은 놀라운 발견이었다.
용리된 탈술폰화 바이술파이트-전환된 DNA는 적절한 완충제와 혼합되어 메틸화에 대해 분석될 수 있다. 일정한 실시형태에서 전환된 DNA는 챔버 9 및 11 내 농축된 Tris, 효소 반응, 및 주형 특이적 비드 (예를 들어, PCR 또는 네스티드 PCR 반응(들)을 위한 프라이머 및/또는 프로브를 포함하는 비드)와 혼합되고, 최종 혼합물은 메틸화 특이적 정량적 PCR 반응을 위해 열순환 튜브 또는 챔버로 흡입된다.
qPCR 단계 동안 바이술파이트 오염은 메틸화 카트리지의 주요 실패 방식일 수 있다. 잔류 바이술파이트는 PCR 반응 튜브의 직접 오염 (예를 들어, 바이술파이트 전환 단계 동안) 또는 간접 오염 (예를 들어, 챔버 간 바이술파이트 유체 이동 동안 교차 오염)에 의해 초래될 수 있다. 잔류 바이술파이트 오염은 존재한다면, qPCR 단계 동안 바이술파이트-매개 프로브 절단에 의해 측정될 수 있고, 그 결과로 전형적으로 배경치 공제에 사용되는 보다 초기의 qPCR 사이클 (사이클 1-10) 동안 형광도의 증가를 일으킨다. 따라서, 일정한 실시형태에서, 카트리지는 바이술파이트가 존재한다면 PCR 동안 절단가능한 하나 이상의 프로브를 제공하는 비드를 포함한다. 바이술파이트 오염을 함유하는 작업 결과는 도 14에 도시되어 있다.
상기 방법 (및 실시예 4, 예를 들어 도 13A 참조)을 GENEXPERT® 카트리지 내 특별한 챔버에 대해서 설명하지만, 특정한 시약/챔버 배정은 적용되는 메틸화 분석 프로토콜의 특수성에 따라서 다양할 수 있다는 것을 인식하게 될 것이다.
따라서, 예를 들어, 메틸화 분석 카트리지 (예를 들어, GENEXPERT® 카트리지)의 가동은 일반적으로 흐름도 (예를 들어, 도 1C 및 13B 참조)로 설명될 수 있다. 도 13B에 도시된 예시적이지만, 비제한적인 실시형태에서, DNA 샘플은 결합 완충제 (예를 들어, GTC-EtoH을 포함하는 완충제, 일정한 실시형태에서 샘플이 프로테이나제 K 및/또는 용해 용액으로 처리된 이후)로 제공된다. 일정한 실시형태에서 샘플은 본 명세서에 기술된 바와 같은 샘플 제조 카트리지로부터 수득된다 (예를 들어, 도 20 참조).
결합 완충제 중 샘플은 카트리지의 샘플 수용 챔버로 도입된다. 가동시에 카트리지는 DNA가 결합하는 매트릭스 ("컬럼")로 샘플 용액을 전달하도록 가동된다. 다음으로 결합된 DNA는 바이술파이트 시약과 배합된 알칼리 시약 (예를 들어, KOH 용액)을 사용해 컬럼으로부터 용리되고, 바이술파이트 반응이 진행 (예를 들어, 이러한 예시적인 프로토콜에서, 약 50℃ 또는 약 60℃ 내지 약 90℃에서 약 45분 (또는 최대 약 90분) 동안)되는 카트리지 내 가열 튜브 (전형적으로 PCR 반응 튜브)로 이동된다. 반응된 DNA는 결합 완충제 (예를 들어, 2.25 M 구아니디늄 티오시아네이트, 22.5 mM Tris pH 7.0, 0.5% Tween20, 50% 에탄올, 및 0.005% SE-15 소포제 (활성 규소 소포제 및 비이온성 유화제의 10% 에멀션))와 배합되고, 동일한 컬럼, 또는 상이한 컬럼으로 다시 이동되어, 여기서 다시 컬럼 매트릭스에 결합된다. 반응된 DNA는 GTC-EtOH로 세척되고, PEG (예를 들어, PEG200)로 세정되어 다시 또한 DNA를 탈술폰화시키는 알칼리 시약 (예를 들어, KOH)을 사용해 컬럼으로부터 용리된다. DNA가 탈술폰화되는 한편 반응 튜브 (예를 들어, PCR 반응 튜브)는 가열 및 세정 (예를 들어, 10 x 세정)되어 임의의 바이술파이트 시약이 제거될 수 있다. 용리된 DNA (또는 이의 일부분)는 PCR 및/또는 네스티드 PCR을 위해 반응 튜브로 이동될 수 있다.
이들 가동이 전체 샘플 또는 DNA 샘플의 일부분에 대해 수행될 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 후자의 경우에서 샘플의 일부분을 하나 이상의 챔버에 저장하고 대조군으로서 사용할 수 있거나, 또는 상이한 분석/프로토콜을 수행할 수 있다.
RNA 발현 및 DNA 메틸화 둘 모두의 동시-정제 및 검출 .
일정한 실시형태에서 카트리지-기반 어세이 (예를 들어, GENEXPERT® 카트리지 활용)에서 DNA 메틸화 (MSP)와 함께 유전자의 변경된 RNA 발현 둘 모두의 동시-정제 및 검출을 위한 방법이 제공된다. 일정한 실시형태에서 이들 어세이는 예를 들어, 동일한 샘플 제조물로부터 종양-특이적 메틸화와 상관있는 DNMT의 변경된 발현을 식별하게 된다. 일정한 실시형태에서 이들 어세이는 발현 및 메틸화 상태를 검증하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명자는 컬럼 상에 핵산의 일부를 보유하는 Tris 완충된 용리를 사용해 컬럼으로부터 핵산을 용리할 수 있다는 것을 확인하였다. 예시적인 일 실시형태에서, RNA 분획은 예를 들어 Tris 용액을 사용해 카트리지 내 챔버에서 용리 및 유지된다.
RNA 분획을 저장한 후에, NaOH 또는 KOH 용리는 컬럼을 스트립핑시키게 되고 상기 기술된 바와 같이 전환을 위해 바이술파이트로 들어가게 되는 DNA를 용리 및 변성시킨다. 그리고 나서, 바이술파이트 전환된 DNA를 컬럼으로부터 용리시키기 위해 RNA 용리 분획을 사용하거나 또는 KOH 용리 믹스를 사용하여 2개 분획 (RNA 및 전환된 DNA 생성물)을 RNA와 바이술파이트 전환된 qRT-PCR을 위해 혼합한다. 이것은 동일한 샘플로부터 동일 튜브에서 RNA를 위한 역전사효소 (RT) 단계와 MSP (또는 다른 분석 방법)를 도입시키는 단계를 포함한다. 대안적인 방법은 제한없이, qPCR을 위해 DNA와 혼합 (cDNA 및 DNA를 배합) 이전에 독립적으로 RT 단계를 수행하는 단계를 포함하거나, 또는 DNA 또는 RT RNA에 대한 PCR은 하나의 열순환 튜브/챔버를 사용하여 독립적이고/연속적으로 또는 카트리지 내 복수개의 열순환 튜브/챔버를 사용하여 동시에 수행될 수 있다.
전환된 DNA의 분석
수많은 분석 방법이 DNA 메틸화를 평가하기 위해 카트리지에서 수행될 수 있다. 대안적으로, 일정한 실시형태에서, 카트리지는 전환된 (예를 들어, 바이술파이트 또는 DABSO 전환된) DNA의 추가 분석을 위해 다른 장치 및/또는 시스템에 커플링될 수 있다. 예시적인 방법은 제한없이 메틸화 특이적 PCR (MSP), 직접 시퀀싱, 고분해능 용융 분석법 (HRM), 파이로시퀀싱 (첨가에 의한 시퀀싱), 염기-특이적 절단 분석법 (예를 들어, 염기-특이적 MALDI-TOF) 등을 포함한다.
메틸화-특이적 PCR (MSP).
다양한 실시형태에서 메틸화-특이적 PCR을 사용하여 표적 DNA의 메틸화 상태를 평가할 수 있다. MSP는 오직 비전환된 5-메틸시토신에 상보적인 서열을 포함하여 "메틸화-특이적"이거나, 또는 반대로, 비메틸화 시토신으로부터 전환된 티민에 상보적이어서 "비메틸화-특이적"이도록 디자인된 프라이머 및/또는 프로브 세트를 활용하였다. 다음으로, 메틸화는 증폭을 일으키는 특이적 프라이머의 능력에 의해 결정된다. 이러한 방법은 메틸화 밀도가 높은 영역 내에서 조사되는 CpG 섬의 경우에 특히 효과적인데, 증폭시키려는 표적 내 비전환된 메틸시토신의 높은 수가 PCR의 특이도를 증가시키기 때문이다. 일정한 실시형태에서 CpG 쌍을 프라이머의 3'-말단에 위치시키는 것이 또한 특이도를 개선시킨다.
일정한 실시형태에서 메틸화는 Methylight 방법을 사용해 평가된다. Methylight 방법은 MSP를 기반으로 하지만, 정량적 PCR을 사용하여 정량적 분석을 제공한다 (예를 들어, [Eades et al. (2000) Nucleic Acids Res., 28(8): E32. doi:10.1093/nar/28.8.e32] 참조). 메틸화-특이적 프라이머가 사용되고, 또한, 메틸화-특이적 형광성 리포터 프로브는 증폭된 영역에 어닐링시키는데 사용된다. 대안적으로 방식으로, 프라이머 또는 프로브는 관여되는 서열 내에서 CpG 쌍 간 구별이 필요하면 메틸화 특이성없이 디자인될 수 있다. 메틸화 기준 DNA와 관련하여 정량을 수행할 수 있다. 성공적으로 바이술파이트-전환된 DNA에 대한 PCR의 특이도를 증가시키기 위한 이러한 프로토콜의 한가지 변형 (ConLight-MSP)은 이러한 비특이적 증폭을 정량하기 위해 바이술파이트-비전환된 DNA에 추가 프로브를 사용하는 것이다 (예를 들어, [Rand et al. (2002) Methods 27(2): 114-120] 참조).
다양한 실시형태에서 Methylight 방법은 TAQMAN® 기술을 활용하는데, 이 기술은 PCR 증폭 동안 Taq-중합효소의 5' 뉴클레아제 활성에 의한 이중-표지된 형광원성 하이브리드화 프로브의 절단을 기반으로 한다 (Eads et al. (1999) Cancer Res., 59: 2302-2306; Livak et al. (1995) PCR Meth. Appl., 4: 357-362; Lee et al. (1993) Nucleic Acids Res., 21: 3761-3766; Fink et al. (1998) Nat. Med., 4: 1329-1333). TAQMAN® 기술에서 3종의 상이한 올리고뉴클레오티드 (전방향 및 역방향 PCR 프라이머 및 형광원성 하이브리드화 프로브)의 사용은 몇몇 서열 검출 전략을 위한 기회를 제공한다.
예를 들어, 서열 구별은 PCR 증폭 프로세스의 수준 (예를 들어, 도 4A, 패널 C 참조) 및/또는 형광원성 프로브 하이브리드화의 수준 (예를 들어, 도 4A, 패널 B 참조)에서 일어날 수 있다. 양쪽 단계에서, 구별은 불일치하는 올리고뉴클레오티드 대비, 완벽하게 일치되는 올리고뉴클레오티드의 차등적 어닐링을 기반으로 한다. Methylight 기술에서, PCR 증폭 수준의 서열 구별은 프라이머 및 프로브, 또는 단지 프라이머, 또는 단지 프로브를 DNA 메틸화의 잠재적 부위 (예를 들어, CpG 디뉴클레오티드)가 중복되도록 디자인하여 일어난다. 일 접근법은 간단히 MSP 기술의 형광-기반 형태이다 (Herman et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9821-9826). 각각의 올리고뉴클레오티드 (프라이머 및 프로브)는 0부터 복수개의 CpG 디뉴클레오티드까지 어디든지 포괄할 수 있다. 각각의 CpG 디뉴클레오티드는 특정한 부위가 메틸화 (mCpG)되었는지 또는 비메틸화 (UpG)되었는지 여부에 따라서, 바이술파이트 전환 이후에 2개의 상이한 서열 변이를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드가 2개 CpG 디뉴클레오티드에서 중복되면, 그 올리고뉴클레오티드에 의해 포괄되는 영역 내 게놈 DNA에서 가능한 서열 변이체의 개수는 2 x 2 = 4이다. 프라이머 및 프로브 둘 모두가 각각 2개 CpG와 중복되면, 그 올리고뉴클레오티드에 의해 포괄되는 서열 내에 함유된 변이체의 총 개수는 4 x 4 x 4 = 64이다. 이론적으로, 각각의 이들 잠재적인 64개 서열 변이체의 상대량을 분석하기 위해 개별 PCR 반응을 디자인할 수 있다. 그러나, 상당한 메틸화 정보는 이러한 이론적 예로서 2개의 가장 극단의 서열 변이를 의미하는, 완전한 메틸화 및 완전한 비메틸화 분자에 대해 반응을 디자인함으로써 훨씬 더 적은 수의 변이의 분석으로부터 유래될 수 있다. 이들 2개 반응 간 비율 또는 메틸화 반응과 대조군 반응 간 비율은 이 유전자좌에서 메틸화 분자의 출현율의 척도를 제공한다.
Methylight 기술은 또한 PCR 증폭 수준에서 서열 구별을 피하도록 변형될 수 있다. 프라이머 또는 프로브가 임의의 CpG 디뉴클레오티드와 중복되지 않으면, 반응은 비편중 증폭을 의미하고 입력 DNA의 양에 대한 대조군으로서 제공될 수 있다. 하나의 예시적인 유용한 대조군 반응은 전체 앰플리콘이 비전환된 게놈 서열에 임의의 CpG 디뉴클레오티드가 없는 것이다. 프로브가 단지 CpG 디뉴클레오티드를 포괄하도록 디자인된 경우라면, 서열 구별은 프로브 하이브리드화의 수준에서 단독으로 발생된다. 이러한 형태에서, 소듐 바이술파이트 전환 단계에 의해 생성된 모든 서열 변이체는 그들이 증폭 편중이 없는 한, 동등한 효율로 증폭된다 (예를 들어, [Wamecke et al. (1997) Nucleic Acids Res., 25: 4422-1426] 참조). 이러한 경우에서, 특정한 메틸화 패턴과 연관된 상이한 서열 변이체 각각에 대한 개별 프로브의 디자인 (2개 CpG의 경우에 2 x 2 = 4 프로브)은 PCR 생성물의 혼합 풀에서 각 서열 과돌연변이의 상대적 출현율의 정량적 결정을 가능하게 한다.
일정한 실시형태에서 분석 방법은 또한 비전환된 DNA에 특이적인 PCR을 제공한다. 이러한 PCR은 SNP, 돌연변이, 및/또는 전좌 등을 조사할 수 있다. 이와 관련하여, 단일 카트리지에서 돌연변이 및 메틸화의 검출은 실시예 12 (예를 들어, 도 27A 및 27B)에 예시되어 있다는 것을 주목한다. SNP, 돌연변이, 전좌 등의 검출은 이들 표적의 검출에 특이적인 프라이머 및 프로브 세트의 포함에 의해 쉽게 수행될 수 있다.
네스티드 PCR 및 멀티플렉스 PCR 어세이.
일정한 실시형태에서 메틸화 DNA는 당업자에게 충분히 공지된 PCR 방법을 사용해 검출될 수 있다. 일정한 실시형태에서 네스티드 PCR 반응은 메틸화 표적을 검출하는데 사용된다. 예시적이지만, 비제한적인 일 실시형태 (예를 들어, 실시예 4)에서, 네스티드 PCR 프로토콜은 처음 15-20회 사이클의 PCR 반응이 메틸화에 특이적이지 않지만 전환된 DNA에 특이적인 경우 (즉, 그들이 CpG를 교차하지 않거나 또는 예를 들어 그들이 그러할 때 R= 푸린 또는 Y= 피리미딘이 메틸화 및 비메틸화 주형 서열 둘 모두를 포착하는데 사용됨)에 사용될 수 있다. 제2 qPCR 반응 (예를 들어, 45회 사이클 qPCR 반응)은 전형적으로 2-3 메틸화 CpG에 특이적인 프라이머 및 프로브 둘 모두를 함유할 수 있다.
일정한 실시형태에서, Methylight 분석은 단일 프로브를 사용해 수행된다는 것을 주의하게 될 것이다 (예를 들어, 도 4B 참조). 메틸화 특이적 전방향 (FW) 및 역방향 (RV) 프라이머와 함께, 단일, 예를 들어 메틸화-특이적, 프로브 (PR3)가 사용되는 이러한 접근법에서, 프로브 (PR3)에 대한 메틸화 특이적 PCR은 FW, RV 및 PR3 서열에 대한 메틸화 및 바이술파이트 전환에 의존적인 신호를 제공한다.
다양한 실시형태에서, 멀티플렉스화 PCR 어세이가 고려된다. 예시로서, 도 4C는 각각 상이한 영역을 표적으로 하는 다수의 프로브 (PR1, PR2...PR5)를 사용하는 Methylight 접근법을 예시한다. 모든 프로브 (PR1, PR2, PR3, PR4, 및 PR5)로부터의 조합된 신호는 메틸화의 양/정도의 척도를 산출한다. 일정한 실시형태에서 각각의 프로브는 그 자신의 특이적 염료/플루오르를 가지므로 다른 프로브와 독립적으로 검출가능하다. 따라서, 하나의 표적이 메틸화되지 않은 경우더라도, 신호가 여전히 검출될 수 있는데, 예를 들어, PR3이 메틸화되지 않으면 나머지 프로브로부터 신호가 없고/적을 것이다. 도 4D는 각각 동일한 영역을 표적으로 하지만, 상이한 메틸화 패턴에 대한 신호를 제공하는 복수개 프로브 (PR1...PR5)를 사용하는 Methylight 접근법을 예시한다. 도 4C에 예시된 접근법이 더 큰 영역으로부터의 검출을 제공할 수 있지만, 단일한 보다 작은 영역 상에서 이러한 복수-프로브 접근법은 바이술파이트 전환 이후에 특이적 서열에 걸쳐 메틸화의 정도를 조사하는 서열 특이적 프라이머 또는 프로브에 의해 수행될 수 있다.
일정한 실시형태에서 양쪽 가닥에 대한 역상보성 멀티플렉스 어세이 (예를 들어 도 26)가 사용될 수 있다. 바이술파이트 전환 이후에, 양쪽 가닥은 그들의 상보성을 상실한다. 따라서, 프라이머 및 프로브 세트는 한 가닥 또는 나머지에 대해 디자인될 수 있고, 고유한 앰플리콘을 생성시킬 수 있다. 검출에 대해 "더 많은 기회"를 제공하는 것 이외에도, 이러한 접근법은 잠재적으로 감도에 의해 도움을 줄 수 있다 (LOD에서, 오직 하나의 가닥 또는 그 나머지가 튜브에서 종결되면, 이러한 접근법은 신호를 입수하는 것을 보장하게 됨). 이러한 접근법은 멀티플렉스 어세이가 동일한 프로모터 부위에서 상이한 CpG를 검출하도록 확장될 수 있게 한다. 역상보성 멀티플렉스는 표적 메틸화를 검출하고 이종성 메틸화를 입수하도록 더 많은 기회를 제공한다.
전술한 방법은 예시적이고 비제한적이다. 본 명세서에서 제공하는 교시를 사용하여 당업자는 수많은 다양한 MSP 및/또는 Methylight 분석을 이용할 수 있게 될 것이고 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 반응 카트리지 상에서 실행가능하게 될 것이다.
직접 시퀀싱
일정한 실시형태에서 DNA의 메틸화 상태는 직접 시퀀싱 방법을 사용해 결정될 수 있다. 일정한 실시형태에서, 방법은 바이술파이트 전환에 내성인 뉴클레오티드를 직접 결정하기 위해서 PCR 및 표준 디데옥시뉴클레오티드 DNA 시퀀싱을 활용할 수 있다 (예를 들어, [Frommer et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (5): 1827-1831] 참조). 다양한 실시형태에서 프라이머는 관심 메틸화 부위에 측접 (포함하지는 않음)하여, 가닥-특이적이고 또는 바이술파이트-특이적 (예를 들어, 그들이 비-바이술파이트-처리된 DNA에 상보적이지 않도록 비-CpG 시토신을 함유하는 프라이머)이도록 디자인된다. 그러므로, 메틸화-특이적 PCR과 대조적으로, 메틸화 및 비메틸화 서열 둘 모두가 증폭될 것이다. 비메틸화 시토신의 모든 부위는 센스 가닥의 최종 증폭된 서열에서는 티민으로서, 그리고 증폭된 안티센스 가닥에서는 아데닌으로서 나타난다. 일정한 실시형태에서 네스티드 PCR 방법은 시퀀싱을 위한 생성물을 증강시키는데 사용될 수 있다.
일정한 실시형태에서 시퀀싱은 카트리지에서 수행될 수 있다. 다른 실시형태에서, 카트리지는 시퀀싱 분석을 제공하도록 시퀀싱 기계에 커플링 (예를 들어, 유체 커플링)될 수 있다. 대안적으로, 일정한 실시형태에서, 증폭된 생성물은 카트리지에서 시퀀싱 시스템으로 수동으로 옮겨질 수 있다.
고분해능 용융 분석 (HRM)
일정한 실시형태에서 고-분해능 용융 분석 (HRM)은 비전환된 바이술파이트-처리 DNA와 전환된 것을 구별하는데 사용될 수 있다. HRM은 PCR 앰플리콘을 온도 램핑 및 용융 동안 삽입된 형광성 염료의 최종 유리에 의해 직접적으로 분석하는 정량적 PCR 기술이다 (예를 들어, [Wojdacz and Dobrovic (2007) Nucleic Acids Res. 35(6): e41] 참조). 앰플리콘 내 C-대-T 함량으로 나타내는 메틸화의 정도는 용융의 신속함 및 그 결과에 다른 염료의 방출을 결정한다. 이 방법은 직접 정량을 가능하게 하지만, 특이적 CpG 부위보다는 전체로서 증폭된 영역의 메틸화를 평가한다.
파이로시퀀싱
일정한 실시형태에서 파이로시퀀싱 (합성에 의한 시퀀싱)은 메틸화-특이적 PCR (예를 들어, [Colella et al. (2003). BioTechniques 35(1): 146-150]; [Tost et al. (2003) BioTechniques 35(1): 152-156] 등 참조)을 사용하지 않고 바이술파이트-처리된 DNA를 분석하는데 사용될 수 있다. 합성에 의한 시퀀싱은 디데옥시뉴클레오티드에 의한 사슬 종결 대신에, 뉴클레오티드 도입 시에 포스페이트 방출의 검출을 활용한다는 점에서 생어 (Sanger) 시퀀싱과 다르다. DNA 서열은 전형적으로 가능한 A/T/C/G 뉴클레오티드의 4개 중에서 오직 하나만이 한번에 첨가되고 이용가능하여서 오직 하나의 글자만이 (서열을 결정하려는) 단일 가닥 주형 상에 도입될 수 있다는 사실에 의해 다음의 상보적 뉴클레오티드의 도입 시 발광되는 빛에 의해 결정될 수 있다.
관심 영역의 PCR 증폭 이후에, 파이로시퀀싱을 사용하여 특이적 영역 (예를 들어, CpG 부위)의 바이술파이트-전환된 서열을 결정할 수 있다. 일정한 실시형태에서 개별 부위에서 C-대-T의 비율은 서열 연장 동안 C 및 T 도입량을 기반으로 정량적으로 결정될 수 있다.
이러한 기술의 변형은 시퀀싱 프라이머(들)의 서열로 단일-뉴클레오티드 다형성 (SNP)를 도입시키는 대립유전자-특이적 프라이머를 활용할 수 있어서, 모계 및 부계 대립유전자의 개별 분석을 가능하게 한다 (예를 들어, [Wong et al. (2006) BioTechniques 41(6): 734-739] 참조). 이러한 변형은 특히 게놈 각인 분석에 사용된다.
염기-특이적 절단 분석.
일정한 실시형태에서, 염기-특이적 절단/MALDI-TOF는 뉴클레오티드 변화로부터 획득된 정보를 증강시키기 위해 염기-특이적 절단 단계를 첨가하여 바이술파이트-전환을 이용한다 (Ehrich et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102 (44): 15785-15790). RNA로 관심 영역의 시험관내 전사를 먼저 사용하여 (초기 증폭 시에 PCR 프라이머에 RNA 중합효소 프로모터 부위를 첨가하여), RNase A가 염기-특이적 부위에서 RNA 전사물을 절단시키는데 사용될 수 있다. RNase A는 시토신 및 우라실 리보뉴클레오티드에서 RNA를 특이적으로 절단하고 염기-특이도는 시토신-특이적 (C-특이적) 절단이 바람직할 때 절단-내성 dTTP를 도입하고, 우라실-특이적 (U-특이적) 절단이 바람직할 때 dCTP를 도입하여 첨가함으로써 획득된다. 다음으로 절단된 단편은 MALDI-TOF 또는 다른 방법을 통해 분석될 수 있다. 바이술파이트 처리는 C-에서-U 전환에 의한 절단 부위의 도입/제거 또는 증폭된 역방향 가닥에서 G-에서-A 전환에 의한 단편 질량의 이동을 야기시킨다. C-특이적 절단은 모든 메틸화 CpG 부위에서 특이적으로 절단될 것이다. 최종 단편의 크기를 분석하여 (예를 들어, MALDI-TOF, 모세관 전기영동, 마이크로칩 전기영동 등을 사용), 전체로서 영역의 메틸화의 정도를 결정하기 보다는, 영역 내 CpG 부위의 DNA 메틸화의 특이적 패턴을 결정하는 것이 가능하다.
메틸화 -감응성 단일-가닥 입체형태 분석 (MS-SSCA).
메틸화-감응성 단일 가닥 입체형태 분석 (MS-SSCA)은 단일-뉴클레오티드 다형성 (SNP) 분석에 대해 개발된 단일-가닥 입체형태 다형성 분석 (SSCA) 방법을 기반으로 한다 (Bianco et al. (1999) Hum. Mutat. 14(4): 289-293). SSCA는 비변성 전기영동에서의 차등적 이동을 기반으로 별개 서열이지만 동일한 크기의 단일-가닥 DNA 단편들 간에서 구별을 한다. MS-SSCA에서, 이것은 관심 CpG 부위를 함유하는 바이술파이트-처리된, PCR-증폭된 영역들 간에서 구별하는데 사용된다. SSCA가 오직 단일 뉴클레오티드 편차가 존재할 때 감도가 결여되지만, 바이술파이트 처리는 대부분의 관심 영역 내에서 많은 C-에서-T 전환을 빈번하게 만들고, 최종 감도가 높을 수 있다. 일정한 실시형태에서 MS-SSCA는 또한 밴드 강도의 비율을 기반으로 DNA 메틸화의 정도의 반정량 분석을 제공할 수 있다. 그러나, 전형적으로, MS-SSCA는 개별 메틸화 부위보다는 관심 영역에서 전체로서 모든 CpG 부위를 평가한다.
메틸화 표적.
상기에 언급한 바와 같이, DNA 메틸화는 광범위한 상황에서 관심이 있다. 일정한 실시형태에서, DNA 메틸화의 양은 종양학에서 특히 임상적으로 관심을 갖는다. 이상 DNA 메틸화 패턴 (정상 조직과 비교하여 과메틸화 및 저메틸화)은 많은 수의 인간 악성종과 연관되었다. 전형적으로 과메틸화는 프로모터 영역의 CpG 섬에서 발생되고 유전자 불활성화와 연관된다. 백혈구 DNA 메틸화의 낮은 수준은 많은 유형의 암과 연관된다 (Zhang et al. (2011) Epigenetics, 6(3): 293-299). 전반적인 저메틸화는 또한 상이한 기전을 통해서 암의 발생 및 진행에 연루되었다. 전형적으로 종양 억제인자 유전자의 과메틸화 및 발암유전자의 저메틸화가 존재한다 (예를 들어, [Lund et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(28): 29147-29154] 참조).
이와 관련하여, DNA 메틸화가 I기 비소세포 폐암 (NSCLC)에 대한 예후 지표를 제공한다는 것을 주목한다. 특히, 5개 유전자의 과메틸화가 I기 NSCLC에서 보다 짧은 무재발 생존 (RFS)과 상당히 연관되었다는 것을 발견하였다: HIST1H4F, PCDHGB6, NPBWR1, ALX1, 및 HOXA9. 과메틸화 사건의 수를 기반으로 하는 서명은 환자를 고위험 및 저위험 I기 NSCLC로 구분한다 (예를 들어, [Sandoval et al. (2013) J. Clin. Oncol., 4140-4147] 참조).
유사하게 악성 신경 교종은 그의 프로모터 영역의 메틸화에 기인하여 불활성화된 MGMT 유전자를 가질 수 있다는 것이 관찰되었다. 최근의 연구로 밝혀진 예측은 MGMT 유전자를 메틸화하여, 화학요법에 더 나은 반응이 발생될 수 있다는 것이다 (종양이 알킬화제에 의해 유도된 DNA 손상을 복구할 수단을 갖지 않으므로). 신경교종에서, MGMT 프로모터 메틸화는 방사선 또는 화학요법의 상황에서 바람직한 예후 마커이다 (예를 들어, //neurosurgery.ucsd.edu/brain-tumor-research-mgmt/ 참조).
추가의 예시로서, 표 3은 일정 암에서 과메틸화된 다양한 유전자를 예시한다.
[표 3]
산발성 암에서 과메틸화된 유전자의 예시적이지만, 비제한적인 예의 표시 (예를 들어, [Baylin (2005) Nature Clinical Practice Oncology, 2: S4-S11] 참조).
Figure 112019070348332-pct00003
다양한 예시적이지만, 비제한적인 실시형태에서, 하기 유전자들의 프로모터들 중 어느 하나 이상의 메틸화의 측정이 고려된다: APC, ARF, CDKN2B, CDKN2A, BRCA1, VLH, hMLH1, MGMT. RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, HOXB4, RASGRF2, TM6SF1, AKR1B1, HIST1H4F, PCDHGB6, NPBWR1, ALX1, 및 HOXA9.
췌장암 .
일정한 실시형태에서 메틸화 상태는 메틸화 상태가 췌장암의 존재 및/또는 예후에 대한 마커인 하나 이상의 프로모터에 대해 결정된다. ADAMTS1, 또는 BNC1 중 하나 이상의 메틸화의 빈도는 췌장암을 검출하고/하거나 병기구분하는데 사용될 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 췌장암에 대한 예시적이지만, 비제한적인 메틸화 마커는 제한없이 ADAMTS1 및/또는 BNC1 을 포함한다. 이들 유전자의 프로모터에서 메틸화의 검출을 위한 예시적인 프라이머 및 프로브는 하기 표 4 (특정한 서열의 경우 표 5 참조), 및 실시예 4의 표 12에 표시되어 있다. 일정한 실시형태에서 프라이머 및 프로브는 전환된 DNA의 전방향 가닥에서 메틸화의 검출 및/또는 전환된 DNA의 역방향 가닥에서 메틸화의 검출을 위해 제공된다.
유방암 .
일정한 실시형태에서 메틸화 상태는 그 메틸화 상태가 유방암의 존재 및/또는 예후에 대한 마커인 하나 이상의 프로모터에 대해 결정된다. 유방암에 대한 예시적인 메틸화 마커는 제한없이, RASSF1A, 및/또는 AKR1B1, 및/또는 HOXB4, 및/또는 HIST1H3C, 및/또는 RASGRF2, 및/또는 TM6SF1을 포함한다. 이들 유전자의 프로모터에서 메틸화의 검출을 위한 예시적인 프라이머 및 프로브는 하기 표 4 (특정 서열의 경우 표 5 참조), 및 실시예 4의 표 11에 표시되어 있다.
일정한 실시형태에서 메틸화 상태는 메틸화 상태가 폐암의 존재 또는 우도에 대한 마커인 하나 이상의 프로모터에 대해 결정된다. 폐암에 대한 예시적인 메틸화 마커는 제한없이 CDO1, SOX17, TAC1, 및/또는 HOXA7을 포함한다.
본 명세서에서 기술되는 방법은 이들 유전자의 프로모터의 메틸화를 결정하는데 국한되지 않는다. 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 본질적으로 임의의 관심 표적의 메틸화가 가능하다.
그러나 DNA 메틸화의 측정은 프로모터 내 CpG 섬에서 메틸화의 측정에 국한될 필요는 없다는 것을 주의하게 될 것이다. 예를 들어, 유전자 몸체 메틸화가 또한 유전자 발현을 변경시킬 수 있고 암의 치료 표적을 제공할 수 있다는 것이 입증되었다 (예를 들어, [Yang et al. (2014) Cancer Cell, 26(4): 577-590] 참조).
추가적으로, DNA 메틸화의 측정은 암 이외의 병상에 대한 예후적/치료적 적용성을 갖는다. 예를 들어, 염색체 13, 18, 21, X, 및 Y 상의 영역에서 이상 메틸화는 다운 증후군을 진단하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, [Patsalis et al. (2012) Exp. Opin. Biol. Ther. 12(Suppl. 1): S155-S161] 참조). 태아 DNA 및 모계 DNA는 차등적으로 메틸화되기 때문에, 모계 혈장 중 세포-무함유 DNA는 비침습적으로 수득될 수 있고 상기 언급된 염색체 (또는 다른 염색체 또는 유전자)의 메틸화 상태를 평가하는데 활용될 수 있는 태아 DNA의 공급원을 제공할 수 있다.
상기에 언급된 바와 같이, 일정한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 카트리지 및 방법은 또한 예를 들어 다양한 메틸트랜스퍼라제의 발현을 결정하기 위해서, mRNA 수준을 결정하는데 사용된다. 일정한 실시형태에서, RNA의 발현도는 DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B, 및 TNMT3L 로 이루어진 군으로부터 선택되는 메틸트랜스퍼라제에 대해 결정된다.
프라이머/프로브 및 멀티플렉스 분석
다양한 실시형태에서 본 명세서에 기술된 방법은 네스티드 PCR 반응을 포함할 수 있고 본 명세서에 기술된 카트리지는 이러한 네스티드 PCR 반응을 위한 시약 (예를 들어, 프라이머 및 프로브)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일정한 실시형태에서, 메틸화는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 유전자 (유전자 프로모터)에 대해 검출된다. DNA의 바이술파이트 전환이 시토신 잔기를 우라실로 변화시키지만, 5-메틸 시토신 잔기는 영향받지 않은 채로 남겨두므로, 전환된 (바이술파이트-전환된) DNA의 전방향 및 역방향 가닥은 더 이상 상보적이지 않다. 따라서, 메틸화 검출에 대한 추가의 특이도 및 감도를 제공하기 위해서 독립적으로 (예를 들어, 멀티플렉스 PCR 반응으로) 전방향 및 역방향 가닥을 조사하는 것이 가능하다. 이러한 예에서, 단일 표적의 어세이는 2-플렉스 멀티플렉스 어세이를 포함할 수 있는 한편, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 표적 유전자의 어세이는 4-플렉스, 6-플렉스, 8-플렉스, 10-플렉스, 또는 12-플렉스 멀티플렉스 어세이를 포함할 수 있다. 일정한 실시형태에서 어세이는 예를 들어 전방향 및 역방향 가닥을 독립적으로 어세이하기 위해서, 2회 멀티플렉스 반응으로 나뉠 수 있다. 그러나, 복수회의 멀티플렉스 어세이로 분할될 때, 어세이의 그룹화는 전방향 또는 역방향에 의해서일 필요는 없지만, 단순히 특정 PCR 반응 조건에 가장 상용성인 프라이머/프로브 세트를 포함시킬 수 있다는 것은 인식하게 될 것이다.
상기에 표시된 바와 같이, 수많은 암이 그의 메틸화 (또는 이의 결여)가 암과 연관된 유전자 프로모터의 전방향 및/또는 역방향 가닥 상에서 메틸화 상태의 검출/특징규명에 의해 결정되어 그에 의해 식별될 수 있고/있거나, 병기구분될 수 있고/있거나, 예후일 수 있다. 다양한 암과 연관된 예시적인 유전자 (프로모터) 표적은 상기에 기술되어 있고 하기 표 4에 표시되어 있다. 각각의 암에 대해 표 4에 표시된 유전자 중 하나 이상의 (전방향 가닥 및/또는 역방향 가닥의) 메틸화는 표시된 암을 식별하고/하거나, 병기구분하고/하거나, 예후를 제공하도록 결정될 수 있다는 것을 인식하게 될 것이다. 일정 실시형태에서, 특정한 암에 대해 표시된 유전자의 전부의 (전방향 및/또는 역방향 가닥의) 메틸화 상태는 단일 멀티플렉스 PCR 반응으로 결정될 수 있다.
[표 4]
본 명세서에 기술된 장치 및 방법을 사용하여 다양한 암과 연관된 유전자의 프로모터에서 메틸화의 검출을 위한 예시적인 프라이머 및 프로브.
프라이머 및 프로브 번호는 하기 표 5에 표시된 프라이머 및 프로브 번호 (프라이머/프로브 번호)를 의미한다.
Figure 112019070348332-pct00004
다양한 유전자의 프로모터에서 메틸화의 검출을 위한 예시적인 프라이머 및 프로브는 하기 표 5, 및 실시예 4의 표 11 및 12에 표시되어 있다. 일정한 실시형태에서 이들 프라이머 및/또는 프로브는 멀티플렉스 증폭에서 사용하기에 특히 적합하다.
[표 5]
다양한 유전자 프로모터의 메틸화의 검출을 위한 예시적인 프라이머 및 프로브. 주: Y는 C/T이고; R은 A/G이고; C*는 임의로 작용화된 (예를 들어, 프로브 Tm 의 변경을 위함) C이고; T*는 임의로 작용화된 (예를 들어, 프로브 Tm 의 변경을 위함) T이고; A*는 임의로 작용화된 (예를 들어, 프로브 Tm 의 변경을 위함) A이고; N*는 뉴클레오티드 임의로 소광제이고; dP는 범용 피리미딘이고; dK는 범용 푸린이다.
Figure 112019070348332-pct00005
Figure 112019070348332-pct00006
Figure 112019070348332-pct00007
Figure 112019070348332-pct00008
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Figure 112019070348332-pct00010
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Figure 112019070348332-pct00012
Figure 112019070348332-pct00013
Figure 112019070348332-pct00014
Figure 112019070348332-pct00015
Figure 112019070348332-pct00016
Figure 112019070348332-pct00017
Figure 112019070348332-pct00018
이들 프라이머 및 프로브는 다양한 형광단 및 소광제의 위치를 식별한다는 것을 주의한다. 그러나, 특정한 형광단 및 소광제는 예시적이며 제한적이지 않고 다양한 증폭 및/또는 검출 전략이 본 명세서에 기술된 카트리지에 적용될 수 있다는 것을 인식하게 될 것이다. 따라서, 다양한 실시형태에서 본 명세서에 기술된 방법 및 장치는 많은 상이한 핵산 하이브리드화 프로브를 적용할 수 있다. 전형적으로, 신호 발생을 위해서, 프로브는 형광단 및 그와 상호작용하는 분자 또는 모이어티 간 거리를 변화시켜 발생되는 다른 분자 또는 모이어티와 이의 상호작용의 변화에 기인한 형광단의 형광성 변화를 활용한다. 대안적으로, 제한없이, 방사능-표지된 프로브의 사용을 포함하는 샘플 중 폴리뉴클레오티드를 검출하는 다른 방법이 고려된다.
전형적으로 형광-기반 어세이는 신호 발생의 경우에 형광도 변화가 제1 형광단이 상호작용하는 공명 에너지 억셉터, 다른 형광단 또는 소광제로부터 떨어진 거리의 변화에 의해 야기된다는 것에 따라서, 형광 공명 에너지 전달, 또는 "FRET"에 의존적이다. 소광 분자 또는 모이어티를 포함하는 상호작용 분자 또는 모이어티 및 형광단의 조합은 "FRET 쌍"이라고 알려져 있다. FRET-쌍 상호작용의 기전은 전형적으로 쌍의 한 구성원의 흡광 스펩트럼이 다른 구성원, 제1 형광단의 발광 스펩트럼과 중복되는 것이 요구된다. 상호작용 분자 또는 모이어티가 소광제라면, 이의 흡광 스펩트럼은 전형적으로 형광단의 발광 스펙트럼과 중복된다 (예를 들어, [Stryer (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 819-846]; [Selvin (1995) Meth. Enzymol. 246: 300-335] 등 참조). 효율적인 FRET 상호작용은 전형적으로 쌍의 흡광 및 발광 스펙트럼이 큰 중복도를 갖는 경우에 획득된다. FRET 상호작용의 효율성은 그러한 중복에 선형으로 비례한다. 전형적으로, 대규모의 신호 (높은 중복도)가 바람직하다. 그러므로 형광단-소광제 쌍을 포함하는 FRET 쌍은 전형적으로 그러한 기준으로 선택된다.
FRET 및 FRET 쌍을 활용하는 다양한 표지된 핵산 하이브리드화 프로브 및 검출 어세이가 공지되어 있다. 한가지 이러한 계획은 [Cardullo et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8790-8794] 및 Heller 등의 EP 0070685에 기술되어 있다. 이것은 표적 DNA 가닥의 인접한 영역에 상보적인 올리고데옥시뉴클레오티드의 쌍을 포함하는 프로브를 사용한다. 하나의 프로브 분자는 이의 5' 말단 상에, 형광성 표지, 형광단을 함유하고, 나머지 프로브 분자는 이의 3' 말단 상에 상이한 형광성 표지, 역시 형광단을 함유한다. 프로브가 표적 서열과 하이브리드화될 때, 2개 표지는 서로 매우 가까워진다. 샘플은 적절한 주파수의 빛에 의해 자극될 때, 한 표지에서 다른 것으로 형광 공명 에너지 전달이 일어난다. FRET는 표적의 존재를 신호화하는, 표지로부터 스펙트럼 반응의 측정가능한 변화를 생성시킨다. 하나의 표지는 그 중에서도, 열로서 수용되는 에너지를 방출하는 상호작용성 모이어티 (또는 분자)일 수 있는 "소광제"일 수 있다.
FRET 쌍을 활용하는 다른 유형의 핵산 하이브리드화 프로브 어세이는 Gelfand 등의 U.S. 특허 제5,210,015호, 및 Livak 등의 U.S. 특허 제5,538,848호에 기술된 "TaqMan®"이다. 전형적으로 프로브는 FRET 쌍으로 표지된 단일-가닥 올리고뉴클레오티드이다. TaqMan® 어세이에서, DNA 중합효소는 표적 가닥과 하이브리드화될 때 올리고뉴클레오티드 프로브의 절단에 의해 단일 또는 다수개의 뉴클레오티드를 방출한다. 그러한 방출은 FRET 쌍의 소광제 표지 및 형광단 표지를 분리시키는 방법을 제공한다.
일정한 실시형태에서 비-FRET 형광성 프로브, 예컨대, 예를 들어 Tyagi 등의 U.S. 특허 제6,150,097호에 기술된 것들이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, Tiyagi 등의 특허는 표지 쌍의 흡광 스펙트럼의 변화가 어떻게 형광 변화에 대한 대안으로서 검출가능한 신호로서 사용될 수 있는지를 설명한다. 흡광 변화가 활용될 때, 표지쌍은 임의의 2개 발색단, 즉, 형광단, 소광제 및 다른 발색단을 포함할 수 있다. 표지쌍은 동일한 발색단일 수도 있다.
일부 실시형태에서, 염료 및 다른 모이어티, 예컨대 소광제는 본 명세서에 기술된 방법 및 카트리지에서 사용되는 프라이머 및/또는 프로브에 도입된다. 일정한 실시형태에서 이러한 염료 및 소광제는 제한없이 FRET 프로브로서 사용하기 적합한 염료 (플루오르)를 포함한다. 일정한 실시형태에서 염료 및/또는 소광제는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. "변형된 뉴클레오티드"는 화학적으로 변형되었지만, 여전히 뉴클레오티드로서 기능하는 뉴클레오티드를 의미한다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 공유적으로 부착되는, 화학적 모이어티, 예컨대 공유적으로 부착된, 염료 또는 소광제를 갖고, 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 고체상 합성에 의해서 폴리뉴클레오티드에 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 핵산에 변형된 뉴클레오티드의 도입 이전, 그 동안, 또는 그 이후에 염료 또는 소광제와 반응할 수 있는 하나 이상의 반응성 기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 아민-변형된 뉴클레오티드, 즉, 반응성 아민 기를 갖도록 변형된 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 염기 모이어티, 예컨대 우리딘, 아데노신, 구아노신, 및/또는 시토신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아민-변형된 뉴클레오티드는 5-(3-아미노알릴)-UTP; 8-[(4-아미노)부틸]-아미노-ATP 및 8-[(6-아미노)부틸]-아미노-ATP; N6-(4-아미노)부틸-ATP, N6-(6-아미노)부틸-ATP, N4-[2,2-옥시-비스-(에틸아민)]-CTP; N6-(6-아미노)헥실-ATP; 8-[(6-아미노)헥실]-아미노-ATP; 5-프로파르길아미노-CTP, 5-프로파르길아미노-UTP로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상이한 핵염기 모이어티를 갖는 뉴클레오티드는 유사하게 변형된, 예를 들어 5-(3-아미노알릴)-UTP 대신에 5-(3-아미노알릴)-GTP이다. 많은 아민 변형된 뉴클레오티드는 예를 들어, Applied Biosystems, Sigma, Jena Bioscience 및 TriLink로부터 상업적으로 입수가능하다. 적합한 플루오르의 예시적이지만, 비제한적인 목록은 표 6에 표시되어 있다.
[표 6]
본 명세서에 기술된 프라이머 및/또는 프로브에서 사용을 위한 예시적이지만, 비제한적인 형광단 (형광성 표지).
Figure 112019070348332-pct00019
Figure 112019070348332-pct00020
어세이가 하나의 표적 DNA 서열을 검출하도록 디자인되면 오직 하나의 형광성 하이브리드화 프로브를 사용하는 것이 필요하고, 일정한 실시형태에서, FAM, TET, 또는 HEX (또는 표 7에 열거된 그들의 대안 중 하나)는 프로브를 표지하기 위한 좋은 형광단이 될 것이다. 이들 형광단은 다양한 분광형광계 열순환기에서 쉽게 여기 및 검출될 수 있다. 또한, 이들 형광단의 포스포르아미다이트 유도체의 이용가능성 및 소광제-연결된 대조군-포어 유리 컬럼의 이용가능성 때문에, 이들 표지를 갖는 형광성 하이브리드화 프로브는 비교적 덜 비싸고 덜 노동 집약적인 프로브 제작의 장점으로, 자동화 DNA 합성 과정에서 전체적으로 합성될 수 있다.
[표 7]
형광성 하이브리드화 프로브를 위한 추가의 예시적인 형광단 표지.
Figure 112019070348332-pct00021
일정한 실시형태에서, 복수개의 표적 유전자가 단일 멀티플렉스 반응에서 검출된다. 일부 실시형태에서, 상이한 유전자를 표적으로 하는 각각의 프로브는 멀티플렉스 반응에서 활용하는 다른 프로브들과 스펙트럼이 구별가능하다 (검출가능하게 상이하다). 멀티플렉스 검출에 적합한 프로브 조합은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 4개 표적 멀티플렉스 시스템에서 검출가능하게 상이한 형광단의 예시적인 조합은 제한없이 다음을 포함한다:
1) FAM, TMR, 텍사스 레드, 및 Cy5;
2) FAM, TET, TMR, 및 텍사스 레드;
3) FAM, HEX, 텍사스 레드, 및 Cy5; 및
4) FAM, Cy3, 텍사스 레드, 및 Cy5.
5개의 표적 멀티플렉스 시스템에서 검출가능하게 상이한 형광단의 예시적인 조합은 FAM, TET, TMR, 텍사스 레드, 및 Cy5이다. 6개의 표적 멀티플렉스 시스템에서 검출가능하게 상이한 형광단의 예시적인 조합은 제한없이 다음을 포함한다:
1) FAM, TET, HEX, TMR, ROX, 및 텍사스 레드; 및
2) FAM, HEX, LC red 610, LC red 640, LC red 670, 및 LC red 705.
이들 형광단의 조합은 예시적이고 비제한적이며 수많은 다른 형광단을 당업자가 이용가능하다는 것을 인식하게 될 것이다.
상기에 언급된 바와 같이, 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 활용하는 형광성 하이브리드화 프로브의 디자인을 위해서, 충분한 스펙트럼이 중복되는 형광단-소광제 쌍이 선택되어야 한다. 500 내지 550 nm에서 최대 발광의 형광단, 예컨대 FAM, TET 및 HEX는 450 내지 550 nm에서 최대 흡광인 소광제, 예컨대 답실, BHQ-1 등 (예를 들어, 표 8의 예시적인 소광제 표지)에 의해 소광된다. 550 nm 이상에서 최대 발광인 형광단, 예컨대 로다민 (TMR, ROX 및 텍사스 레드 포함) 및 Cy 염료 (Cy3 및 Cy5 포함)는 550 nm 이상에서 최대 흡광인 소광제 (BHQ-2를 포함)에 의해 효율적으로 소광된다.
접촉 소광을 활용하는 형광성 하이브리드화 프로브의 디자인을 위해서, 임의의 비형광성 소광제는 형광단으로부터의 에너지의 양호한 억셉터로서 작용될 수 있다. 예를 들어, Cy3 및 Cy5는 BHQ-1 및 BHQ-2 소광제에 의해 효율적으로 소광된다.
[표 8]
형광성 하이브리드화 프로브를 위한 예시적인 소광제 표지.
Figure 112019070348332-pct00022
일정한 실시형태에서 뉴클레오티드가 형광단의 형광성을 소광시킬 수 있는데, 구아노신이 가장 효율적인 소광제이고, 그 다음으로 아데노신, 시티딘 및 티미딘이다. 일반적으로, 500 내지 550 nm의 여기 파장을 갖는 형광단은 보다 긴 여기 파장을 갖는 형광단보다 뉴클레오티드에 의해 더 효율적으로 소광된다. 형광성 하이브리드화 프로브를 디자인 시에, 형광단으로부터 더 높은 형광 신호를 보장하기 위해서, 형광단 표지를 구아노신 바로 옆에 두는 것은 피하는 것이 바람직할 수 있다.
접촉 소광에 의해서 상호작용하는 일부 형광단-소광제 쌍의 안정화 효과는 하이브리드화 프로브의 디자인을 위해 중요한 결과를 가질 수 있다 (예를 들어, [ Marras et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30: e122]; [Johansson et al.(2002) J. Am. Chem. Soc. 124: 6950-6956] 참조). 예를 들어, BHQ-1 또는 BHQ-2에 의해 소광되는 형광단으로 표시된 하이브리드화 프로브는 동일한 프로브 서열을 갖지만 답실에 의해 소광되는 형광단으로 표지된 하이브리드화 프로브와 비교하여, 약 4℃의 하이브리드 용융 온도의 증가를 보이는 것으로 관찰되었다. 강력한 친화성은 Cy 염료, Cy3 및 Cy5, 및 블랙홀 소광제, BHQ-1 및 BHQ-2 간에 관찰된다는 것을 역시 주의한다..
본 명세서에 제공되는 교시 및 실시예 및 전술한 내용의 관점에서, 다양한 프라이머/프로브 조합이 본 명세서에 기술된 방법 및 카트리지에서 사용을 위해 이용가능하게 될 것이다.
DNA 메틸화 분석을 위한 카트리지, 모듈, 및 시스템 .
일정한 실시형태에서 카트리지는 본 명세서에 기술된 방법 (예를 들어, DNA 메틸화, 및 임의로 RNA 발현의 결정)을 수행하기 위해 제공된다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 제1 매트릭스 재료를 포함하는 컬럼, 샘플 수용 챔버, 온도 제어 채널 또는 챔버, 시약 및/또는 완충제를 함유하는 복수개의 챔버를 포함하고, 사용될 때에, 상기 챔버 중 적어도 하나는 DNA 전환 시약 (예를 들어, DABSO 및/또는 바이술파이트 시약)을 함유하고, 상기 챔버 중 적어도 하나는 탈술폰화/용리 완충제를 포함하며, 상기 카트리지는 임의로 상기 제2 매트릭스 재료를 포함하는 제2 컬럼을 포함한다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 사용 시에, 카트리지가 구아니디늄 티오시아네이트 에탄올 (GTC-EtOH)을 포함하는 시약을 함유하는 챔버를 포함하도록 구성된다. 일정한 실시형태에서 제2 컬럼이 부재하는 한편, 다른 실시형태에서 제2 컬럼은 존재한다. 일정한 실시형태에서 온도 제어 채널 또는 챔버는 단순히 가열 채널 또는 챔버일 수 있거나, 또는 열순환 채널 또는 챔버일 수 있다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 제2 가열 채널 또는 챔버 (예를 들어, 제2 열순환 채널 또는 챔버)를 더 포함한다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 DNA 전환 단계 (예를 들어, 바이술파이트 인큐베이션) 및/또는 탈술폰화 단계가 하나 이상의 PCR 반응 이후에 수행되는 동일한 반응 튜브 또는 챔버에서 일어나도록 구성된다.
일정한 실시형태에서 바이술파이트 시약은 카트리지의 성분으로서 제공된다. 일정한 다른 실시형태에서 카트리지는 샘플이 카트리지에 위치되는 시점 또는 그 시점 가까이에 바이술파이트 시약이 카트리지에 첨가되도록 구성된다. 일정 예에서, 바이술파이트 시약은 카트리지 내 챔버로 직접 첨가되는 한편, 다른 실시형태에서, 바이술파이트 시약은 카트리지로 바이술파이트 시약을 도입시키기 위해서 카트리지 상의 로딩 포트 (예를 들어, 주입 포트)에 도입된다. 일정한 실시형태에서 바이술파이트 시약은 카트리지가 DNA 메틸화를 결정하도록 가동되면서 카트리지를 가동시키는 시스템 (예를 들어, 프로세싱 모듈)에 의해 카트리지에 도입된다.
일정한 실시형태에서 구아니디늄 티오시아네이트를 포함하는 시약 (예를 들어, GTC-EtOH)은 카트리지의 성분으로서 제공된다. 일정한 다른 실시형태에서 카트리지는 샘플이 카트리지에 위치되는 시점 또는 그 시점 가까이에 구아니디늄 티오시아네이트를 포함하는 시약을 카트리지에 첨가하도록 구성된다. 일정 예에서, 구아니디늄 티오시아네이트를 포함하는 시약은 카트리지 내 챔버로 직접 첨가되는 한편, 다른 실시형태에서, 구아니디늄 티오시아네이트를 포함하는 시약은 카트리지에 바이술파이트 시약을 도입시키기 위해 카트리지 상의 로딩 포트 (예를 들어, 주입 포트)에 도입된다. 일정한 실시형태에서 구아니디늄 티오시아네이트를 포함하는 시약은 카트리지가 DNA 메틸화를 결정하도록 가동되면서 카트리지를 가동시키는 시스템 (예를 들어, 프로세싱 모듈)에 의해 카트리지로 도입된다.
다양한 예시적이지만, 비제한적인 실시형태에서, 전환 시약 (예를 들어, 바이술파이트 시약)은 소듐 메타바이술파이트, 포타슘 바이술파이트, 세슘 바이술파이트, DABSO, 및 암모늄 바이술파이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함한다. 일정한 실시형태에서 바이술파이트는 술파이트 산화를 방지하기 위한 스캐빈저 (예를 들어, 트롤록스, 히드로퀴논 등) 및/또는 촉매를 포함하는 시약 믹스로 제공된다. 일정한 실시형태에서 바이술파이트는 촉매로서 폴리아민을 포함하는 시약 믹스로 제공된다.
다양한 실시형태에서 제1 매트릭스 재료 및/또는 상기 제2 매트릭스 재료는 존재할 때, 유리 또는 실리카, 이온 교환 수지, 및 히드록시아파타이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 재료를 포함한다.
다양한 실시형태에서 카트리지는 하나 이상의 챔버 (예를 들어, 1 챔버, 2 챔버, 3 챔버, 4 챔버 등)를 포함하고 그 각각은 메틸화 특이적 PCR 프라이머, 메틸화 특이적 PCR 프로브, PCR 효소(들) (예를 들어, 중합효소), 역전사효소, 및 PCR 반응 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시약을 함유한다.
일정한 실시형태에서 카트리지는 바이술파이트-전환된 메틸화 및/또는 비메틸화 서열에 특이적인 프라이머를 함유하는 하나 이상의 챔버를 함유한다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 Methylight PCR 프로토콜을 위한 프라이머 및 프로브를 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 TaqMan PCR 반응을 위한 시약을 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 증폭된 메틸화 서열에 대한 마커인 하나 이상의 형광성 프로브 및/또는 증폭된 비메틸화 서열에 대한 마커인 하나 이상의 형광성 프로브를 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함한다. 일정한 실시형태에서 프로브는 형광성 리포터 염료 및 소광제 염료를 포함하고, 프로브는 Taq DNA 중합효소의 5'에서 3'으로의 뉴클레아제 활성에 의해 절단 시 신호를 제공한다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 관심 증폭 영역 내 상이한 메틸화 영역에 대해 각각 특이적인 복수개의 프로브를 포함한다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 관심 증폭 영역 내 메틸화된 영역에 특이적인 단일 프로브를 포함한다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 관심 증폭 영역 내 동일한 메틸화된 영역에 각각 특이적인 복수개의 프로브를 포함한다.
예시적인 프라이머 및 프로브는 제한없이 APC, ARF, CDKN2B, CDKN2A, BRCA1, VLH, hMLH1, MGMT. RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, HOXB4, RASGRF2, TM6SF1, AKR1B1, HIST1H4F, PCDHGB6, NPBWR1, ALX1, 및 HOXA9 로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 프로모터 영역의 메틸화 영역을 결정하기 위한 프라이머 및/또는 프로브를 포함한다. 일정한 실시형태에서 프라이머 및/또는 프로브는 MGMT, RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, HOXB4, RASGRF2, TM6SF1, 및 AKR1B1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 프로모터 영역의 메틸화를 결정하기 위해 선택된다. 다양한 실시형태에서 PCR 프라이머, 및/또는 프로브, 및/또는 효소는 예를 들어 본 명세서에 기술되는 비드 및 비드 제제를 참조하기 위해 본 명세서에 편입시킨 US 공개 특허 출원 번호 2006/0068399에 기술된 바와 같은 비드로서 제공된다.
다양한 실시형태에서 카트리지는 샘플 수용 챔버, 상기 컬럼(들), 복수개의 챔버, 및 온도 제어 채널 또는 챔버가 선택적으로 유체 연통되도록 구성된다. 일정한 실시형태에서 선택적 유체 연통은 미세유체 채널 및 밸브에 의해 제공된다. 일정한 실시형태에서 선택적 유체 연통은 중심 밸브 주변에 배치되고 상기 중심 밸브 내 채널과 선택적으로 유체 연통되는, 샘플 수용 챔버, 상기 컬럼(들), 상기 복수개의 챔버, 가열 채널 또는 챔버 또는 채널 또는 챔버로의 포트를 제공하여 제공된다.
일정한 실시형태에서 카트리지는 사용될 때에, 카트리지가 샘플을 함유하는 제1 챔버; 구아니디늄 티오술페이트-에탄올 (GTC-EtOH) 용액을 함유하는 제2 챔버; 바이술파이트 시약을 함유하는 제3 챔버; 완충제를 함유하는 제4 챔버; 세정 용액을 함유하는 제5 챔버; 및 용리/탈술폰화 시약을 함유하는 제6 챔버를 포함하도록 구성된다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 PCR 프라이머 및/또는 프로브 및/또는 PCR 효소를 함유하는 제7 챔버를 포함한다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 PCR 프라이머 및/또는 프로브 및/또는 PCR 효소를 또한 함유하는 제8 챔버를 포함한다.
도 1A, 1B 및 2는 본 명세서에 기술된 방법의 실시에 적합한 하나의 카트리지를 예시한다. 예시되는 카트리지는 GENEXPERT® 카트리지 (Cepheid, Inc., Sunnyvale, CA)를 기반으로 한다. 도 2, 패널 A에 도시된 바와 같이, 카트리지 (200)는 다수개의 시약 및/또는 완충제 챔버 (208)를 함유하는 카트리지 몸체 (202)를 포함한다. 챔버는 밸브 몸체 (210) (패널 B 및 도 1B)와 유체 연통되고 가스켓 (204)으로 밀봉된 중심 시린지 배럴 (206) 주변에 배치된다. 밸브 몸체 (210)는 캡 (212)을 포함할 수 있고 전체 카트리지 몸체는 카트리지 베이스 (226) 상에 지지될 수 있다. 도시되지 않은 "플런저"는 시린지 배럴 (206)로 유체를 유인하도록 가동될 수 있고 시린지 배럴 (206) 및 결합된 밸브 몸체 (212)의 회전은 본 명세서에 기술된 바와 같은 매트릭스 재료를 함유할 수 있고 컬럼으로서 기능할 수 있는 내강 (208) 챔버 (214) 사이에 선택적인 유체 연통을 제공한다. 다양한 실시형태에서 카트리지는 일정한 실시형태에서, 열순환 챔버로서 기능할 수 있는 하나 이상의 온도 제어 채널 또는 챔버 (216)를 더 포함한다. 온도 제어 채널 또는 챔버는 또한 내강 (214) 및/또는 챔버 (208)와 선택적으로 유체 연통된다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 일정한 실시형태에서, 카트리지는 예를 들어, 증폭 생성물의 실시간 검출, 시퀀싱 가동 중 염기 정체성 등을 제공하기 위한 광학 윈도우를 제공한다.
일정한 실시형태에서 카트리지 (200)는 예를 들어 도 3A에 도시된 바와 같이 반응 모듈 (300)로 삽입되도록 구성된다. 도 3B에 예시된 바와 같이, 모듈은 카트리지 (200)를 수용하도록 구성된다. 일정한 실시형태에서 반응 모듈은 온도 제어 챔버 또는 채널을 가열시키기 위해 가열 판 (308)을 제공한다. 모듈은 임의로 온도 제어 채널 또는 챔버가 열순환 채널 또는 챔버인 경우에 냉각을 제공하도록 팬 (304)을 추가적으로 포함할 수 있다. 전자 회로 (302)는 분석을 위해 컴퓨터로 정보 (예를 들어, 광학 정보)를 전송하도록 제공될 수 있다. 일정한 실시형태에서 모듈은 예를 들어, 다양한 핵산 표적을 나타내는 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의) 광학 신호의 여기 및/또는 검출을 제공하도록 광학 블록 (306)을 함유할 수 있다. 다양한 실시형태에서 전기 접속기 (312)는 모듈을 시스템 (예를 들어, 시스템 제어기) 또는 개별 분석/제어기 유닛과 인터페이스시키기 위해 제공될 수 있다. 도 3B에 예시된 바와 같이, 샘플은 파이펫 (310)을 사용하여 카트리지에 도입될 수 있다.
일정한 실시형태에서, 모듈은 또한 시린지 배럴 및 밸브 몸체의 회전에서 플런저를 가동시키는 제어기를 함유한다.
일정한 실시형태에서 시스템 (예를 들어, 프로세싱 유닛)이 제공된다. 예시적이지만, 비제한적인 일 실시형태가 도 3C에 도시되어 있다. 일정한 실시형태에서, 프로세싱 유닛은 각각의 프로세싱 모듈이 본 명세서에 기술된 바와 같은 탈착형 카트리지를 수용하고 가동시키도록 구성된 하나 이상의 샘플 프로세싱 모듈을 함유하도록 구성된 인클로저를 포함한다. 일정한 실시형태에서 시스템은 하나 이상의 표적 핵산의 메틸화를 결정하고, 임의로 상응하는 탈착형 샘플 카트리지 내 하나 이상의 표적 RNA/DNA 서열의 수준을 결정하기 위해 샘플 프로세싱을 수행하기 위해 샘플 프로세싱 모듈을 가동시키도록 구성되고, 상응하는 탈착형 샘플 카트리지 내 샘플에 대한 프로세싱은 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법을 수행한다. 일정한 실시형태에서 시스템은 하나의 샘플 프로세싱 모듈을 함유하도록 구성된다. 일정한 실시형태에서 시스템은 적어도 2개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 4개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 8개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 12개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 16개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 20개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 24개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 28개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 32개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 64개의 샘플 프로세싱 모듈, 또는 적어도 128개의 샘플 프로세싱 모듈을 함유하도록 구성된다. 일정한 실시형태에서 시스템은 사용자가 가동 명령을 입력할 수 있고/있거나 DNA 메틸화를 결정하기 위한 카트리지의 가동을 모니터링할 수 있게 하는 인터페이스를 사용자에게 제공한다.
본 명세서에 기술된 방법이 Cepheid Inc. (Sunnyvale, CA)의 GENEXPERT® 카트리지를 참조하여 주로 설명되었지만 (예를 들어, 도 1A 참조), 본 명세서에 제공된 교시의 관점에서, 방법이 다른 카트리지/미세유체 시스템 상에서 실행될 수 있다는 것을 인식하게 될 것이다. 이러한 카트리지/미세유체 시스템은 예를 들어, 소프트 리쏘그래피를 사용하여 실행외든 미세유체 시스템, 하드 리쏘그래피를 사용해 실행되는 마이크로/나노-제작 미세유체 시스템 등을 포함할 수 있다.
고부피 샘플 제조 (HVSP) 카트리지.
다양한 실시형태에서 카트리지는 대량 샘플 부피의 제조를 위해 제공된다. 일정한 실시형태에서 샘플 제조 카트리지는 고부피 샘플 제조를 위해 변형된 GENEXPERT® 카트리지를 포함한다 (예를 들어, 도 20에 도시된 바와 같음). 일정한 실시형태에서, 예를 들어, 카트리지가 GENEXPERT® 카트리지를 기반으로 할 때, DNA에 결합하는 친화성 매트릭스를 포함하는 하나 이상의 채널 또는 챔버, 중심 밸브 어셈블리 주변에 배치되고 상기 중심 밸브 어셈플리와 선택적으로 유체 연통되는 복수개의 챔버를 포함하고, 중심 밸브 어셈블리는 중심 밸브와 유체 연통되는 챔버의 내부 또는 외부로 유체를 유인할 수 있는 플런저를 수용하도록 구성되고 상기 복수개의 챔버는 최대 약 4 mL (또는 최대 약 5 mL)의 샘플 용액 (일정한 실시형태에서 챔버 2는 약 4 mL의 최대 부피를 가지는 한편, 챔버 3은 약 4.5 mL의 최대 부피를 가짐), PEG를 함유하는 챔버 (예를 들어, PEG200), 알칼리 용액을 함유하는 챔버 (예를 들어, KOH 용액), 및 완충제를 함유하는 챔버 (예를 들어, Tris)를 수용하도록 각각 구성된 적어도 2개의 상이한 챔버를 포함한다. 일정한 실시형태에서 복수개의 챔버는 최대 약 4 mL (또는 최대 약 5 mL)의 샘플 용액을 수용하도록 각각 구성된 적어도 3개의 상이한 챔버를 포함한다. 일정한 실시형태에서 복수개의 챔버는 세척 용액 (예를 들어, 전형적으로 1.25 M의 구아니디늄 티오시아네이트, 25 mM의 Tris pH 7.0, 50%의 에탄올인 GTC-에탄올 세척 용액)을 함유하는 챔버를 포함한다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 프로세싱된 샘플의 제거를 위해 구성된 챔버를 포함한다. 일정한 실시형태에서 샘플 챔버는 사용될 때에, 샘플 용액, GTC 및 알콜 (예를 들어, 이소프로판올)을 함유한다. 일정한 실시형태에서 샘플 챔버는 사용될 때에, 실질적으로 동등한 부피로 샘플 용액, GTC 및 알콜을 함유한다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 사용될 때에, 샘플을 수용하도록 구성된 상기 챔버 각각에 배치된 4 mL의 샘플 용액 GTC 및 이소프로판올을 포함한다. 일정한 실시형태에서 카트리지는 0.5 mL 내지 약 4 mL의 샘플의 샘플 부피에 대해서 실질적으로 선형인 DNA 또는 RNA 회수율을 제공한다.
일정한 실시형태에서 HVSP 카트리지는 메틸화 분석을 제공하기 위해 DNA 전환 (예를 들어, 바이술파이트 전환)을 수행하도록 구성된다. 따라서, 일정한 실시형태에서, HVSP 카트리지는 전환 시약 (예를 들어, 바이술파이트 시약, DABSO 등)을 사용하기 직전에 또는 사용 바로 전에 함유하거나 또는 수용하도록 구성된다. 일정한 실시형태에서, HVSP 카트리지는 전환된 DNA의 탈술폰화를 위한 시약을 함유하고 전환된 DNA의 탈술폰화를 제공하도록 구성될 수 있다. 대안적으로, 일정한 실시형태에서, 전환은 탈술폰화 및 메틸화 분석 (예를 들어, PCR)을 제2 카트리지에서 수행하면서 HSVP 카트리지에서 수행된다 (예를 들어, 도 20B에 도시된 작업 흐름도에 예시된 바와 같음).
2-카트리지 메틸화 분석
다양한 실시형태에서 본 명세서에 기술된 메틸화 분석 방법은 예를 들어 도 20B에 예시된 바와 같은 2-카트리지 시스템 (2개 카트리지, 예컨대 "제1" 카트리지 (예를 들어, 고부피 샘플 제조 카트리지), 및 "제2" 카트리지 (예를 들어, qPCR 카트리지)의 세트)을 사용해 수행된다. 이 도면에 예시된 바와 같이, 일정한 실시형태에서, 샘플 제조 및 바이술파이트 전환은 제1 카트리지에서 수행될 수 있다. 그 다음으로 전환된 DNA는 제2 카트리지로 수송되고 여기서 세척 및 탈술폰화된다. 일정한 실시형태에서 제2 카트리지는 예를 들어, PCR (예를 들어, 메틸화-특이적 PCR)을 통해서 전환된 (또는 비전환된) DNA를 분석하기 위해 추가적으로 활용된다.
일정한 실시형태에서 제1 카트리지는 샘플 제조 카트리지가 본 명세서에 기술된 바와 같이 바이술파이트 전환 시약을 함유하는 상기 기술된 바와 같은 고부피 샘플 카트리지일 수 있다. 일정한 실시형태에서 고부피 카트리지는 대량의 DNA의 클린업 및 전환을 가능하게 하는 대량의 샘플 챔버 또는 복수개의 샘플 챔버를 제공한다.
일정한 실시형태에서 2-카트리지 세트 중 제1 카트리지는 샘플 수용 챔버, 제1 매트릭스 재료를 포함하는 "컬럼", 온도 제어 채널 또는 챔버, 샘플 제거 챔버, 및 시약 및/또는 완충제를 함유하는 복수개의 챔버를 포함한다. 전형적으로, 사용시에, 챔버 중 적어도 하나는 바이술파이트 시약을 함유한다 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음). 일정한 실시형태에서 2-카트리지 세트 중 제2 카트리지는 샘플 수용 챔버, 매트릭스 재료를 포함하는 "컬럼", 온도 제어 채널 또는 챔버, 시약 및/또는 완충제를 함유하는 복수개의 챔버를 포함한다. 전형적으로, 제2 카트리지 내 복수개의 챔버 중 적어도 하나는 탈술폰화 및/또는 용리 시약을 함유한다. 일정한 실시형태에서 제2 카트리지는 PCR 증폭 (예를 들어, 메틸화 특이적 PCR) 및 증폭 생성물의 검출을 위한 시약을 함유한다.
일정한 실시형태에서 예시적이지만, 비제한적인 실시형태에서, 제1 카트리지는 샘플 제조 (예를 들어, DNA를 제1 매트릭스 재료 (예를 들어, 유리 섬유)에 결합, 결합된 DNA의 세척 및 용리) 및 세척된 DNA의 바이술파이트 전환에 사용된다. 일정한 실시형태에서 바이술파이트 전환은 세척된 DNA를 바이술파이트 시약과 배합시키는 단계, 및 온도-제어 채널 또는 챔버에서 혼합물을 가열시키는 단계를 포함한다. 다음으로, 최종 전환된 DNA는 세척 완충제 (예를 들어, 1.25 M의 GTC, 25 mM의 Tris pH 7.0, 50%의 에탄올)와 혼합되어 샘플 제거 챔버 (예를 들어, 챔버 2)로 이동되어 거기서 제거될 수 있다 (예를 들어, 파이펫, 시린지 또는 시린지, 펌프 등을 사용해 제거).
일정한 실시형태에서 세척 완충제 중 바이술파이트 전환된 DNA는 제2 카트리지의 샘플 수용 챔버에 도입된다. 제2 카트리지는 DNA를 제2 매트릭스 재료 (예를 들어, 유리 섬유 "컬럼")에 결합시키고, 결합된 DNA를 세척시키고 용리시키고 DNA를 탈술폰화시키도록 가동된다. 일정한 실시형태에서 DNA는 컬럼 상에서 또는 제2 매트릭스 재료로부터 용리되면서 탈술폰화된다. 일정한 실시형태에서 DNA는 제2 매트릭스 재료로부터 제거 이후에 탈술폰화된다. 그 다음으로 일정한 실시형태에서 탈술폰화된 DNA는 예를 들어, 제2 카트리지 내에서 PCR을 위한 효소 및 프라이머/프로브 비드와 혼합된다. 일정한 실시형태에서 탈술폰화된 DNA가 제거되고 추가 분석 (예를 들어, 시퀀싱)을 위해 제3 카트리지 또는 다른 반응 시스템에 도입될 수 있다.
일정한 실시형태에서, 제1 카트리지에서, 샘플 수용 챔버, 컬럼, 복수개의 챔버, 샘플 제거 챔버, 및 온도-제어 가열 채널 또는 챔버는 선택적으로 유체 연통 (예를 들어, 미세유체 채널 및/또는 밸브에 의함)되고/되거나, 제2 카트리지에서, 샘플 수용 챔버, 컬럼, 복수개의 챔버, 및 온도-제어 가열 채널 또는 챔버는 선택적으로 유체 연통 (예를 들어, 미세유체 채널 및/또는 밸브에 의함)된다.
일정한 실시형태에서, 제1 카트리지에서, 샘플 수용 챔버, 컬럼, 복수개의 챔버, 샘플 제거 챔버, 및 온도 제어 채널 또는 챔버 또는 온도 제어 채널 또는 챔버로의 포트는 중심 밸브 주변에 배치되고 중심 밸브 내 하나 이상의 채널과 선택적으로 유체 연통된다. 중심 밸브는 중심 밸브와 유체 연통되는 챔버(들)의 내부 또는 외부로 유체를 유인시킬 수 있는 플런저를 수용하도록 구성될 수 있다. 일정한 실시형태에서, 제2 카트리지에서, 샘플 수용 챔버, 컬럼, 복수개의 챔버, 및 온도 제어 채널 또는 챔버 또는 온도 제어 채널 또는 챔버로의 포트는 중심 밸브 주변에 배치되고, 중심 밸브 내 하나 이상의 채널과 선택적으로 유체 연통된다. 일정한 실시형태에서 중심 밸브는 중심 밸브와 유체 연통되는 하나 이상의 챔버의 내부 또는 외부로 유체를 유인시킬 수 있는 플런저를 수용하도록 구성된다.
일정한 실시형태에서 제1 카트리지 및/또는 제2 카트리지는 GENEXPERT® 카트리지, 또는 변형된 GENEXPERT® 카트리지 (예를 들어, 도 1A, 1B, 2, 13A, 17, 및 20A에 예시된 바와 같음)이다. 일정한, 예시적이지만, 비제한적인 실시형태에서, 제1 카트리지는 표 9에 표시된 바와 같이 구성된다. 일정한 실시형태에서 챔버 번호는 도 1B에 예시된 챔버에 상응한다.
[표 9]
DNA 제조 및 바이술파이트 전환을 위한 "제1" 카트리지의 예시적이지만, 비제한적인 일 구성.
Figure 112019070348332-pct00023
일정한, 예시적이지만, 비제한적인 실시형태에서, 제2 카트리지는 표 10에 표시된 바와 같이 구성된다. 일정한 실시형태에서 챔버 번호는 도 1B에 예시된 챔버에 상응한다.
[표 10]
전환 DNA의 탈술폰화 및 탈술폰화 생성물의 선택적 PCR을 위한 "제2" 카트리지의 예시적이지만, 비제한적인 일 구성.
Figure 112019070348332-pct00024
일정한 실시형태에서 제2 카트리지는 대조군 유전자로서 하기 유전자 중 하나 이상을 사용하도록 구성된다: MYOD1, COL2A1, NONO, 및/또는 TUBB.
일정한 실시형태에서 2-카트리지 형식을 사용하는 것은, 특히 제2 카트리지 내에서 비-네스티드 PCR 반응 또는 메틸화 특이적 프리앰프를 작업하는 것을 가능하게 한다.
전술한 구성은 예시적이며 비제한적이다. 본 명세서에서 제공하는 교시를 사용하여, 수많은 다른 2-카트리지 형식을 당업자가 이용가능하게 될 것이다.
예시로서, 소변 및 객담 샘플의 2-카트리지 분석 결과를 도시한 데이타는 도 35, 36, 및 37에 도시되어 있다. 특히, 도 35는 BNC1 및 ACTB의 2-카트리지 메틸화 분석을 도시한다. 0, 25, 50, 및 100 카피수의 100% 메틸화 대조군 DNA를 혈청에 섞고 제1 샘플 제조 카트리지 (예를 들어, 표 9 참조)에서 프로세싱시키고 나서, 메틸화 BNC1 프로모터에 대한 프라이머 및 프로브 세트 및 ACTB 프로모터에 대한 메틸화 독립적 프라이머 및 프로브 세트를 함유하는 제2 카트리지 (예를 들어, 표 10 참조) 내에서 추출되고, 전환된 DNA 샘플에 대해 qPCR을 수행하였다.
도 36은 정상 소변 샘플의 바이술파이트 전환 분석 결과를 도시한다. 2.0 mL의 정상 소변을 조건 #6에서 1.5 mL의 용해 완충제 [4.5M GTC, 1% Tween20] 및 0.5 mL의 에탄올과 혼합하였다. 1.5 mL의 정상 소변은 조건 #7에서 1.25 mL의 용해 완충제 및 1.25 mL의 에탄올과 혼합하였다. 4.0 mL 샘플을 파이펫팅하여 메틸화 분석 카트리지 2의 챔버 2에 넣고 전환된 ACTB (우측) 및 비전환된 HMBS (좌측)에 대해 분석하였다.
도 37은 정상 및 암 객담 샘플의 메틸화 분석 결과를 도시한다. 7개의 객담 샘플은 SOX17, TAC1, 및 HOXA7 메틸화에 대해서 GENEXPERT® 메틸화 카트리지 (C) 및 비교 어세이 (M)를 사용해 시험되었다. 미가공 Ct 및 델타Ct (ACTB의 경우)가 이 도면에 기록되어 있다.
전술한 구성은 예시적이고 비제한적이다. 본 명세서에 제공된 교시를 사용하여, 수많은 다른 2-카트리지 형식을 당업자가 이용가능하게 될 것이다.
cfDNA 샘플 제조 카트리지.
일정한 실시형태에서 샘플 제조 카트리지는 혈장 또는 혈청 유래 핵산의 제조 (및 선택적 분석)에 특히 적합하다면 제공된다. 예시적이지만, 비제한적인 일 실시형태는 도 17에 도시되어 있다. 본 명세서에 예시된 바와 같이 일정한 실시형태에서 카트리지는 DNA에 결합하는 친화성 매트릭스를 포함하는 채널 또는 챔버, 중심 밸브 어셈블리 주변에 배치되고 중심 밸브 어셈블리와 선택적으로 유체 연통되는 복수개의 챔버를 포함하고 중심 밸브 어셈블리는 중심 밸브와 유체 연통하는 챔버의 내부 또는 외부로 유체를 유인시킬 수 있는 플런저를 수용하도록 구성되고 복수개의 챔버는 최대 약 5 mL 또는 최대 약 4 mL의 샘플 용액을 수용하도록 구성된 챔버; PEG를 함유하는 챔버 (예를 들어, PEG200); GTC-EtOH을 함유하는 챔버; 알칼리 용액을 함유하는 챔버 (예를 들어, KOH); 및 완충제를 함유하는 챔버 (예를 들어, Tris)를 포함한다. 일정한 실시형태에서 복수개의 챔버는 전환 시약 (예를 들어, 바이술파이트 시약)을 함유하는 챔버를 더 포함한다. 일정한 실시형태에서 복수개의 챔버는 세척 용액 (예를 들어, GTC-에탄올 세척제 (전형적으로 1.25 M의 구아니디늄 티오시아네이트, 25 mM의 Tris pH 7.0, 50%의 에탄올))을 함유하는 챔버를 포함한다. 일정한 실시형태에서 복수개의 챔버는 하나 이상의 PCR 프라이머 및/또는 프로브를 포함하는 비드를 함유하는 챔버를 포함한다. 일정한 실시형태에서 PEG를 함유하는 챔버는 약 1 mL의 PEG를 함유한다. 일정한 실시형태에서 알칼리 용액을 함유하는 챔버는 약 500 ㎕의 용액을 함유한다. 일정한 실시형태에서 GTC-EtOH을 함유하는 챔버는 약 2 mL의 GTC-EtOH을 함유한다. 일정한 실시형태에서 완충제를 함유하는 챔버는 약 2 mL의 완충제를 함유한다.
이러한 구성은 예시이고, 본 명세서에 제공된 교시를 사용하여, 수많은 다른 제조 카트리지 구성을 당업자가 이용가능하게 될 것임을 인식하게 될 것이다.
바이술파이트의 대안으로서 DABSO의 사용
DNA의 전환 및 메틸화의 검출을 위해 바이술파이트를 사용하는 것과 유사한 방식으로 DNA의 전환을 수행하는데 사용될 수 있다는 것은 놀라운 발견이었다. 따라서, 일정한 실시형태에서, 5-메틸시토신 잔기는 실질적으로 영향받지 않게 남겨두면서, DNA의 시토신 잔기를 우라실로 전환시키기 위해 DABSO를 활용하는 방법이 제공된다. 일정한 실시형태에서 방법은 DNA를 포함하는 샘플을 DABSO와 접촉시켜서 DNA를 전환시키는 단계, 및 전환된 DNA를 탈술폰화시켜서, 시토신 잔기가 우라실로 전환되지만, 5-메틸시토신 잔기는 실질적으로 영향받지 않은 DNA를 생성시키는 단계를 포함한다. 일정한 실시형태에서 DABSO는 약 2 M 최대 약 5 M 범위의 농도로 제공된다. 일정한 실시형태에서 DABSO는 약 2.5 M의 농도로 제공된다. 일정한 실시형태에서 DABSO는 알칼리 수용액 (예를 들어, KOH 용액)에 용해된다. 일정한 실시형태에서 DABSO를 포함하는 시약은 KOH를 포함하는 용액에 용해된 DABSO를 포함한다.
일정한 실시형태에서 방법은 DABSO/DNA 용액을 약 55℃ 내지 약 90℃ 범위의 온도로 가열시키는 단계를 포함한다. 일정한 실시형태에서 DABSO는 약 15분 내지 최대 약 90분 범위의 시간 기간 동안 DNA와 반응된다. DNA가 전환된 후에, 탈술폰화된다 (예를 들어, 전환된 DNA를 알칼리 시약 (예를 들어, KOH 용액)과 접촉시키는 단계에 의함). 일정한 실시형태에서 전환 및/또는 탈술폰화는 컬럼에 결합된 DNA 상에서 수행되는 한편, 다른 실시형태에서 전환 및/또는 탈술폰화는 용액 중 DNA에 대해 수행된다.
또한 DNa 메틸화를 분석하는 방법이 제공되고, 이 방법은 DNA 샘플을 제공하는 단계, 예를 들어, 상기 기술된 바와 같은 DABSO 시약을 사용해 샘플 중 DNA를 전환시키는 단계, 및 메틸화 특이적 PCR 및/또는 핵산 시퀀싱, 및/또는 고분해능 용융 분석 (HRM)을 전환된 핵산에 대해 수행하여 상기 핵산의 메틸화를 결정하는 단계를 포함한다. 일정한 실시형태에서 DNA 샘플을 제공하는 단계는 본 명세서에 기술된 바와 같이 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 용해 용액 및/또는 제조 카트리지를 사용하여) 샘플을 제조하는 단계를 포함한다.
키트.
메틸화 검출을 위한 키트.
일정한 실시형태에서 본 명세서에 기술된 방법을 수행하기 위한 키트가 제공된다. 예시적인 일 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 반응 카트리지를 함유하는 컨테이너, 본 명세서에 기술된 바와 같은 샘플 프로세싱 시약을 함유하는 컨테이너, 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 전환 시약 (예를 들어, 바이술파이트 시약)을 함유하는 컨테이너를 포함한다. 일정한 실시형태에서 바이술파이트 시약은 카트리지의 챔버에 제공된다. 일정한 실시형태에서 바이술파이트 시약은 카트리지와 별개인 컨테이너에 제공된다. 일정한 실시형태에서, 샘플 프로세싱 시약은 카트리지의 챔버에 제공된다. 일정한 실시형태에서, 특히 샘플 프로세싱 시약이 구아니디늄 티오시아네이트를 포함하는 경우에 샘플 프로세싱 시약은 카트리지와 별개인 컨테이너에 제공된다.
일정한 실시형태에서 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 2-카트리지 세트를 위한 카트리지를 함유할 수 있다. 따라서, 일정한 실시형태에서 키트는 샘플을 제조하고 샘플 중 DNA의 바이술파이트 전환을 수행하도록 구성된 샘플 제조 카트리지인 "제1" 카트리지 (예를 들어, 도 20B, 좌측 패널 참조), 및 전환된 DNA를 탈술폰화시키고, 일정한 실시형태에서, 후속 분석 (예를 들어, 메틸화-특이적 PCR)을 수행하도록 구성된 "제2" 카트리지 (예를 들어, 도 20B, 우측 패널)를 함유할 수 있다. 일정한 실시형태에서 제1 카트리지 및 제2 카트리지는 키트 내 별개 컨테이너에 제공되는 한편, 다른 실시형태에서, 제1 카트리지 및 제2 카트리지는 동일 컨테이너에 제공된다. 일정한 실시형태에서 2-카트리지 키트는 제1 카트리지의 샘플 제거 챔버로부터 제2 카트리지의 샘플 수용 챔버로 샘플의 수송을 촉진하는 장치 (예를 들어, 깔때기, 파이펫 팁 등)를 함유할 수 있다.
또한, 키트는 임의로 DNA 메틸화 및, 임의로, RNA 발현을 결정하기 위해 본 명세서에 기술된 카트리지의 사용을 위한 방향성 (즉, 프로토콜)을 제공하는 표지 및/또는 지시 재료를 포함한다.
일정한 실시형태에서 DNA 메틸화의 결정을 위한 키트는 이 키트가 본 명세서에 기술된 바와 같은 핵산의 메틸화 상태를 결정하기 위한 카트리지를 함유하는 컨테이너를 포함하는 것이 제공된다. 일정한 실시형태에서 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 용해 용액 (예를 들어, 혈청 또는 혈장용, 예를 들어, 표 13에 표시된 바와 같은 용해 용액, 및/또는 FFPE 샘플용, 예를 들어, 표 14에 표시된 바와 같은 용해 용액)을 더 포함한다. 일정한 실시형태에서 키트는 프로테이나제 K를 함유하는 컨테이너를 포함한다. 일정한 실시형태에서 키트는 카트리지 또는 카트리지와 별개인 컨테이너 내에 전환 시약 (예를 들어, 바이술파이트 시약)을 함유한다. 일정한 실시형태에서 별개 컨테이너는 카트리지의 한 "작업"에 적합한 전환 시약의 사전-측정된 부피를 함유할 수 있다. 일정한 실시형태에서 전환 시약은 소듐 메타바이술파이트, 포타슘 바이술파이트, 세슘 바이술파이트, 암모늄 바이술파이트, 및 DABSO로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함한다. 일정한 실시형태에서 키트는 샘플 프로세싱 시약을 함유하는 컨테이너를 포함한다. 일정한 실시형태에서 샘플 프로세싱 시약은 구아니듐 티오시아네이트 및/또는 에탄올을 포함한다.
다양한 실시형태에서 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 (예를 들어, 도 20에 예시된 바와 같은) 샘플을 위한 카트리지를 추가로 함유할 수 있다.
일정한 실시형태에서 키트는 DNA 메틸화의 결정을 위해 카트리지의 사용을 교시하는 지시 재료를 함유한다. 샘플 제조 카트리지가 키트에 포함되는 경우에 키트는 샘플 제조 카트리지의 가동 및 사용을 교시하는 지시 재료를 추가로 함유할 수 있다.
DABSO DNA 전환 및 메틸화 검출을 위한 키트.
일정한 실시형태에서 키트는 예를 들어 DNA의 메틸화 상태의 검출 시에 전환 시약으로서 DABSO의 사용을 위해 제공된다. 일정한 실시형태에서 키트는 DABSO를 포함하는 전환 시약을 함유하는 컨테이너, 및 탈술폰화 시약을 함유하는 컨테이너를 포함한다. 일정한 실시형태에서 키트는 친화성 매트릭스 (예를 들어, 실리카 매트릭스 재료)를 포함하는 컬럼을 포함한다. 일정한 실시형태에서 완충제를 함유하는 컨테이너 및/또는 용리 완충제를 함유하는 컨테이너를 포함한다. 일정한 실시형태에서 키트는 세척 완충제를 함유하는 컨테이너를 포함한다.
일정한 실시형태에서 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 용해 용액 (예를 들어, 혈청 또는 혈장용, 예를 들어, 표 13에 기술된 바와 같은 용해 용액, 및/또는 FFPE 샘플용, 예를 들어, 표 14에 기술된 바와 같은 용해 용액)을 더 포함한다. 일정한 실시형태에서 키트는 프로테이나제 K를 함유하는 컨테이너를 포함한다.
다양한 실시형태에서 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 (예를 들어, 도 20에 예시된 바와 같은) 샘플 제조를 위한 카트리지를 추가로 함유할 수 있다.
일정한 실시형태에서 키트는 핵산의 메틸화 상태의 결정을 위해 핵산을 전환시키기 위한 키트의 사용을 교시하는 지시 재료를 함유한다.
상기 기술된 키트의 지시 재료가 전형적으로 서면 또는 인쇄 재료를 포함하지만 그에 제한되지 않는다. 이러한 지시를 저장할 수 있고 그것을 최종 사용자에게 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 발명에서 고려된다. 이러한 매체는 제한없이 전자 저장 매체 (예를 들어, 자성 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체 (예를 들어, CD ROM) 등을 포함한다. 이러한 매체는 이러한 지시 재료를 제공하는 인터넷 사이트의 주소를 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 청구된 발명을 예시하기 위해 제공되며, 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1
방법을 검증하기 위해서 인간 게놈 DNA (HGDNA)를 출발 샘플로서 사용하여 Cepheid GENEXPERT® 카트리지에서 샘플 제조, 바이술파이트 전환, 샘플 클린업, 및 메틸화 특이적 qPCR을 모니터링하였다. 바이술파이트 전환 효율을 측정하기 위해서, DNA-바이술파이트 믹스의 절반을 로딩하였고 바이술파이트 전환 단계 동안 50 ㎕ 카트리지 튜브에서 가열하였다. 그러므로, 최적 전환 조건 하에서 대략 절반의 HGDNA가 전환되었고 나머지 절반은 비전환된 채로 남겨 두었다.
qPCR 단계를 위한 프라이머 및 Taqman 프로브는 하나의 비전환된 유전자 (HMBS (히드록시메틸비란 신타제 하우스키핑 유전자)) 및 하나의 전환된 유전자 (ACTB (베타 액틴))에 대해 디자인되었고, 그 다음으로 전환 효율은 사이클 한계 값 (Ct)의 비교를 통해 정량되었다. ACTB 및 HMBS 둘 모두는 단일 또는 저카피 기준 유전자로서 통용되며, 따라서 HGDNA의 ng 당 유사한 카피 개수가 예상된다.
300 ng의 HGDNA에 의한 대표적인 GENEXPERT® 작업을 하기 도 5에 도시하엿는데, ACTB qPCR 그래프는 녹색이고 HMBS qPCR 그래프는 파란색이다. qPCR 반응은 45회 사이클 동안 96℃에서 5초, 60℃에서 14초, 및 72℃에서 15초의 3개 온도 사이클로 작업되었다. 20 형광 유닛의 매뉴얼 한계값 설정에서, 전환된 ACTB 유전자에 대해 31.7의 Ct 및 비전환된 HMBS 유전자에 대해 32.7의 Ct를 관찰하였다. 중요하게, 이러한 결과는 FFPE 조직 조각 및 혈장/혈청 샘플에 존재하는 DNA의 생리적으로 관련된 농도에서, 카트리지에서 HGDNA의 거의 최적의 바이술파이트 전환 효율을 획득할 수 있다는 것을 입증한다. 더 나아가서, 완전하게 전환된 서열에 대한 특이도는 네스티드 qPCR 반응을 통해서 또는 전체 샘플을 가열하여 획득될 수 있다. 그러나, 어떠한 선택안도 GENEXPERT®에서의 메틸화 특이적 qPCR에 대해 절대적으로 요구되지 않는데 프라이머 및 프로브 세트가 오직 전환된 서열만을 증폭하도록 디자인되었기 때문이다. 따라서 남아있는 비전환된 DNA 서열은 특히 바이술파이트 전환, DNA 단리, 및 PCR 방법 동안 빈번하게 첨가되는 캐리어 DNA로서 작용된다.
실시예 2
도 6A 및 6B는 전환된 ACTB의 선형성을 도시한다. 특히, 도 6A는 hgDNA를 사용한 ACTB에 대한 15회 사이클의 네스티드 qPCR의 결과를 도시한다. 우측 패널에서 확인할 수 있듯이, 신호 (Ct 값)는 약 25,000 카피수 내지 약 100 카피수에서 실질적으로 직선이다. 도 6B는 hgDNA를 사용한 ACTB에 대한 20회 사이클의 네스티드 qPCR의 결과를 도시한다. 이들 그래프는 hgDNA에 대한 카트리지의 감도를 입증한다. 드롭아웃은 전환된 DNA의 약 25 카피수의 감도로 대략 20-25 카피수에서 일어나기 시작한다.
도 7A, 7B, 및 7C는 6개 메틸화 표적 (AKR1B1, HOXB4, TM6SF1, RASGRF2, 및 RASSF1A)에 대한 qPCR의 결과를 도시한다. 도 7A는 대조군 (25 ng의 HSDNA, 및 그의 DNA가 바이술파이트-전환된 5000 MBA-453 세포)에 대한 20회 사이클의 네스티드 qPCR의 결과를 도시한다. 도 7B는 바이술파이트 전환된 MBA-453 세포 유래 DNA를 사용한 6개 메틸화 표적에 대한 20회 사이클의 네스티드 qPCR의 결과를 도시한다. 강력한 신호가 모든 표적에 대해 도시된다. HIST1H3C는 신뢰할만하게 검출되지 않았다. 도 7C는 바이술파이트 전환되고, 1 ㎍의 SS 및 10 ng의 HS DNA를 포함하는 캐리어에 존재하는 MBA-453 세포 유래 DNA를 사용한 6개 메틸화 표적에 대한 20회 사이클의 네스티드 qPCR의 결과를 도시한다. 드롭아웃은 약 100개 세포 및 그 이하에서 관찰되었지만, 캐리어에서는 유의하게 더 적은 드롭아웃이 존재하였다.
실시예 3
도 8은 전환 효율의 결정 결과를 예시한다. 전환 효율은 비전환된 HMBS 및 전환된 ACTB 간 약 66% (∼1 Ct) 편차이다. 100% 결합/용리, 100% 전환, 및 100% 결합 용리의 이상적인 Ct는 약 24-25이다. 실험은 10배 감소 및 약 27의 Ct에 대해 50% 결합/용리, 50-66% 전환, 및 50% 결합/용리를 보이는 것으로 나타난다.
도 9는 네스티드 qPCR에 의해 생성된 전환된 DNA에 대한 특이도의 증가를 예시한다. 네스티드 PCR은 전환된 DNA에 대한 특이도를 증가시키고, 메틸화 DNA에 대한 특이도를 증가시키며 오염 문제는 감소시키는 것으로 나타난다.
도 10은 메틸화 카트리지의 특이도를 예시한다. HIST1H3C를 제외하고 비전환된 DNA (상층 패널) 또는 비메틸화 DNA (하층 패널)에 대한 특이도는 보이지 않는다.
도 11A 및 11B는 카트리지 (예를 들어, GENEXPERT® 카트리지)를 사용한 메틸화의 분석을 위한 일부 예시적이지만 비제한적인 작업흐름도를 도시한다. 도 11A는 혈청 샘플 중 DNA 메틸화의 분석을 위한 하나의 작업흐름도를 예시한다. 이러한 작업흐름도에 예시된 바와 같이, 혈청을 용해 시약 바이알에 첨가하고 혼합/와류시킨다. 그 다음으로 샘플은 카트리지 내 샘플 포트에 분배된다. 카트리지는 분석을 위한 시스템에 위치된다.
도 11A는 조직 절편 (예를 들어, 냉동 또는 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 절편)에서 DNA 메틸화의 분석을 위한 하나의 작업 흐름도를 예시한다. 여기에 도시된 바와 같이, 일 실시형태에서, 조직 절편 (예를 들어, 4 ㎛ FFPE 절편)이 제공된다. FFPE 용해 시약을 첨가하고 (예를 들어, PCT/US2013/061863 (예시적인 용해 시약의 경우 WO/2014/052551 참조), 혼합물을 가열시킬 수 있다. 에탄올을 첨가할 수 있고 혼합물을 와류시킨다. 다음으로 샘플을 카트리지 내 샘플 포트에 분배한다. 카트리지는 분석을 위한 시스템에 위치된다.
도 12는 전환된 ALU 및 메틸화 RASSF1A에 대한 FFPE 세포 버튼의 결과를 예시한다.
실시예 4
유방암 모니터링을 위한 마커의 검출
재료 및 방법:
1000 MBA-453 세포 또는 25 ng의 인간 정자 (HS) DNA를 2.5 mL의 결합 완충제 (2.25 M의 구아니디늄 티오시아네이트, 22.5 mM의 Tris pH 7.0, 0.5%의 Tween20, 50%의 에탄올, 및 0.005%의 SE-15 소포제)에 첨가하였다. 세포 또는 DNA의 2.5 mL 용액을 Cepheid 메틸화 카트리지의 챔버 2에 첨가하였다 (도 13A의 레이아웃). 메틸화 카트리지 내 나머지 챔버는 다음과 같이 충전시켰다: 챔버 3 - 3.2 mL의 세척 완충제 (1.25 M의 구아니디늄 티오시아네이트, 25 mM의 Tris pH 7.0, 50%의 에탄올), 챔버 4 - 90 ㎕의 7 M 암모늄 바이술파이트, 챔버 5 - 4 mL의 50 mM Tris pH 8.5, 챔버 8 - 1 mL의 PEG200 세척제, 챔버 9 - EZR (Taq) 및 TSR를 포함하는 정량적 PCR 비드 (RASSF1A, AKR1B1, HOXB4, HIST1H3C, RASGRF2, TM6SF1에 대한 6종 표적 유방암 멀티플렉스, 하기 표 11 참조), 챔버 10 - 500 ㎕의 15 mM KOH, 및 챔버 11 - EZR (Taq) 및 TSR을 포함하는 네스티드 비드 (RASSF1A, AKR1B1, HOXB4, HIST1H3C, RASGRF2, TM6SF1에 대한 6종 표적 유방암 멀티플렉스). 다음으로 메틸화 카트리지를 Cepheid GeneXpert에 로딩하였고 전체 메틸화 어세이는 GeneXpert에 의해 완료하였다 - 제1 DNA 샘플 제조, 바이술파이트 전환, 제2 전환 후 DNA 샘플 제조, 탈술폰화, 및 20회 사이클의 네스티드 및 정량적 PCR 반응.
메틸화 프로토콜을 예시하는 흐름도는 도 13B에 도시되어 있다. PEG200은 폐기 챔버 8에 충전되었고, 어세이를 시작한 이후에 PEG200은 챔버 1에 분배된다는 것을 언급한다. PEG200은 더 작은 챔버 1에 직접적으로 쉽게 로딩될 수 없는 점성 액체이다. 추가적으로, 챔버 1은 PEG200 챔버가 되기 전에 카트리지가 먼저 로딩될 때 공기 챔버로서 작용한다. 따라서, 어세이는 챔버 1 = 공기 및 챔버 8 = PEG200로 시작되어서 카트리지 로딩 이후에 신속하게 챔버 1 = PEG200 및 챔버 8 = 폐기물로 전환된다.
도 13A의 "초기 부피" 컬럼에 표시된 번호는 단지 액체 부피를 의미한다. 이 경우에 챔버 11 내에 단지 2×비드 - 1×TSR 비드 (6종 표적에 대한 프라이머 및 프로브) 및 1×EZR 비드 (Phoenix Taq)가 존재한다. 이들 비드는 최종 qPCR 반응을 위한 것이다. 유사하게, 챔버 9 내에 3×비드 - 1×TSR 비드 (6종 표적에 대한 프라이머), 1×Tris 비드 (KOH 켄칭을 위함) 및 1×EZR 비드 (Phoenix Taq)가 존재한다. 이들 비드는 처음 15-20회 사이클의 PCR 반응을 위한 것이다.
챔버 6은 전체 어세이 전반에서 공기 챔버이고 전혀 충전되지 않는다는 것을 또한 주의한다. 챔버 7은 카트리지의 후면 내 PCR 튜브에 대한 일종의 게이트웨이로서 사용된다. 어세이를 시작하기 위해 충전되지 않지만 튜브에 로딩되기 전에 3회 어세이 동안 충전된다 - 1) 전환을 위해 튜브 내에서 가열되는 DNA-바이술파이트, 2) 15-20회 사이클의 PCR 반응, 및 3) 최종 qPCR 반응.
제공된 표 11에 표시된 프라이머는 각각의 유전자를 위한 5종 서열을 도시한다 - 각각의 네스티드 증폭을 위한 2개의 연장 프라이머 및 2개의 qPCR 프라이머 및 하나의 프로브. 처음 15-20회 사이클 PCR 반응은 메틸화에 특이적이지 않았지만 전환된 DNA 서열에만 특이적이었다 (즉, 그들은 CpG를 교차시키지 않고 그들이 그러한 몇몇 예에서 메틸화 및 비메틸화 둘 모두를 포착하기 위해서 R = 푸린 또는 Y = 피리미딘을 사용함). 두번째 45회 사이클의 qPCR 반응은 전형적으로 2-3 메틸화 CpG에 특이적인 프라이머 및 프로브 둘 모두를 함유한다.
결과:
메틸화 카트리지는 바이술파이트 존재 및 부재 하에서 1000 MBA-453 세포 (도 15A-15B) 및 HIST1H3C를 제외하고 각각의 유전자 프로모터에서 주로 비메틸화된 25 ng의 HS DNA (도 15C)를 사용하여 작업되었다. 바이술파이트 무함유 또는 비메틸화 HS DNA 대조군 반응에서 임의 표적의 증폭은 거의 없거나 또는 전혀 없었다 (도 15A, 15C). 바이술파이트를 첨가하였을 경우에, 메틸화 카트리지는 1000개의 MBA-453 세포로부터 복수개의 유전자 프로모터, 특히 AKR1B1, RASSF1A, HOXB4, 및 RASGRF2에서 높은 수준의 메틸화를 발견하였다.
[표 11]
RASSF1A , AKR1B1 , HOXB4 , HIST1H3C , RASGRF2, 및 TM6SF1용 네스티드 프라이머. C*, T*는 임의로 작용화 (예를 들어, 프로브 Tm변경용)된 염기임.
Figure 112019070348332-pct00025
Figure 112019070348332-pct00026
Figure 112019070348332-pct00027
표 11에 표시된 프라이머는 예시적이며 제한적인 것이 아니다. 수많은 다른 프라이머 및 네스티드 프라이머 세트는 당업자에게 이용가능하게 될 것이다. 예로서, 췌장암과 연관된 ADAMTS1 및 BNC1 유전자의 메틸화의 검출 및 신경교종과 연관된 MGMT 유전자의 메틸화의 검출을 위한 예시적인 프라이머는 표 12에 표시되어 있다.
[표 12]
췌장암과 연관된 ADAMTS1 및 BNC1 유전자의 메틸화 검출용 및 신경교종과 연관된 MGMT 유전자의 메틸화 검출용의 예시적인 프라이머.
Figure 112019070348332-pct00028
실시예 5
혈장 및 FFPE 샘플을 위한 샘플 제조
도 17은 PCR 및/또는 메틸화 검출을 위한 DNA 샘플을 제조하는데 사용할 수 있는 카트리지의 일 구성을 예시한다. 혈청 또는 혈장으로부터 수득된 샘플, 또는 FFPE 샘플을 간단히 카트리지의 샘플 챔버 (예를 들어, 챔버 3)에 도입시킬 수 있고 본 명세서에 기술된 바와 같이 카트리지의 가동은 PCR 및/또는 메틸화 검출을 위해 준비된 샘플을 제공한다.
샘플 제조
예시적이지만, 비제한적인 일 실시형태에서, 혈청 또는 혈장 샘플은 (예를 들어, cfDNA의 분석을 위해) 혈청 또는 혈장을 프로테이나제 K로 처리하여 제조된다. 다음으로 프로테이나제 K 처리된 혈청/혈장은 구아니디늄 티오시아네이트 (GTC), 완충제 (예를 들어, Tris pH 7.0), 세제 (예를 들어, Tween 20), 및 임의의 소포제 (예를 들어, 소포제 SE15)를 포함하는 용해 용액과 혼합된다. 알콜 (예를 들어, 이소프로판올)은 이후에 샘플 프로세싱을 위한 카트리지에 도입되는 용액에 첨가된다. 일 실시형태에서, 용해 용액은 표 13에 표시된 바와 같이 배합된다. 프로테이나제 K 처리된 혈청/혈장은 1.3 mL의 프로테이나제 K 처리된 혈청/혈장, 2.2 mL의 용해 용액, 및 1.5 mL의 알콜에 상응하는 비율로 용해 용액 및 알콜과 혼합될 수 있다. 일정한 실시형태에서 혈청/혈장 샘플은 약 15분 동안 프로테이나제 K로 처리된다. 용해 용액은 차갑게 첨가되어 유지되고/약 10분 동안 혼합된다. 그리고 나서, 이소프로판올은 이후 프로세싱을 위한 카트리지에 로딩되는 혼합물에 첨가된다.
상기에 언급된 바와 같이, 혈청/혈장의 경우 알콜 (예를 들어, 이소프로판올) 침전은 전형적으로 RT에서 수행되고, 전형적으로 특히 "염류" 용액으로 수행되지 않는다. 일정한 실시형태에서 더 긴 실온 침전 시간이 사용될 수 있다.
[표 13]
혈청 또는 혈장용 용해 용액.
Figure 112019070348332-pct00029
다른 예시적이지만, 비제한적인 실시형태에서, 포르말린 고정 파라핀-포매 (FFPE) 샘플은 FFPE 샘플을 완충제 (예를 들어, HEPES), 킬레이터 (예를 들어, EDTA), NaCl, MgCl2, 및 임의로 소듐 아자이드 및/또는 소포제를 포함하는 용해 용액 및 프로테이나제 K와 배합하여 제조된다. 용액은 예를 들어 약 10분 내지 최대 약 4시간 범위의 기간 동안 가열된다 (예를 들어, 70℃ 내지 90℃). 알콜이 용액에 첨가되며 그 다음으로 용액이 샘플 프로세싱용 카트리지에 도입된다. 일 실시형태에서, 용해 용액은 표 14에 표시된 바와 같이 배합된다. 예시적이지만, 비제한적인 일 실시형태에서, 표 14에 표시된 1.2 mL의 용해 용액은 FFPE 절편(들)에 첨가된다. 프로테이나제 K를 첨가하고, 혼합물을 예를 들어 80℃에서 약 15분 동안 가열시킨다. 일정한 실시형태에서 가열은 56℃에서 2시간 동안, 그 이후에 90℃에서 30분 동안 수행된다. 다음으로, 1.2 mL의 에탄올을 혼합물에 첨가하고 혼합물은 프로세싱을 위한 카트리지의 샘플 챔버에 로딩된다.
[표 14]
포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 샘플용 용해 완충액.
Figure 112019070348332-pct00030
카트리지 가동 및 추출 성능.
cfDNA가 제조되면, 일정한 실시형태에서, DNA 제조 품질의 모니터링을 가능하게 하기 위해서 추출 대조군을 포함시키는 것이 가능하다. 도 18에 예시된 바와 같이, 2종의 상이한 비드 세트가 존재한다. 한 비드 세트는 SAC (샘플 어세이 대조군)에 대한 내생성 HMBS 프라이머 및 프로브 세트, 및 SPC에 대한 외생성 BG 프라이머 및 프로브 세트 (샘플 제조 대조군)를 함유한다. 나머지 세트는 BG SPC를 비롯하여 SAC에 대한 내생성 베타-글로빈 PP 세트를 함유한다.
그 중에서도, 카트리지에서 GTC의 사용은 혈장 샘플보다 혈청의 경우에 덜 중요할 수 있다는 것을 발견하였다. 특정한 이론에 국한하려는 것은 아니나, 이것은 혈청이 단백질을 덜 함유한다는 사실에 기인할 수 있다고 여겨진다. 따라서, 일정한 실시형태에서, 카트리지는 GTC를 덜 함유할 수 있거나 또는 GTC를 생략할 수 있다.
도 19A 및 19B는 통상의 "튜브필" 절차를 사용하여 수득된 결과와 비교한 본 명세서에 기술된 바와 같은 카트리지를 사용하여 수행된 cfDNA 제조의 결과의 비교를 도시한다. 도 19A에 도시된 qPCR 결과에 예시된 바와 같이, 카트리지를 사용하여 수득된 결합 및 용리 효율은 튜브필 프로토콜을 사용해 수득된 것과 극도로 밀접하다 (1 Ct 이내). 도 19B에 예시된 바와 같이, 샘플 농도의 적정은 약 10 pg 만큼 낮아진 샘플 농도에서 카트리지 제조가 튜브필 제조의 1 Ct 이내로 보존적이라는 것을 보여준다. 카트리지 제조는 더 높은 샘플 농도에서 튜브필 프로토콜과 훨씬 더 비슷하다고 여겨진다.
실시예 6
고-부피 샘플 제조 카트리지의 시험
일정한 실시형태에서 고부피 샘플 제조 (HSVP) 카트리지는 대규모 부피 (예를 들어, 약 12 mL 내지 15 mL)의 샘플의 제조를 위해 제공된다. 이것은 샘플이 낮은 농도로 DNA를 함유하는 경우 (예를 들어, 혈청 또는 혈장 중 cfDNA)에 특히 유용하다. 이러한 카트리지 중 하나가 도 20A에 개략적으로 예시되어 있다. 도면에 도시된 바와 같이 카트리지는 샘플을 수용하기 위해 사용될 수 있는 3개 챔버 (챔버 2, 3, 및 5)를 제공한다. 예시적인 실시형태에서, 이들 챔버 각각은 약 4 mL의 샘플을 수용할 수 있고, 일정한 실시형태에서, 샘플은 4 mL의 GTC 및 4 mL의 알콜 (예를 들어, 이소프로판올)과 배합된 4 mL의 혈장/혈청을 포함한다.
샘플을 이들 챔버에 도입시키고 카트리지는 PCR 및/또는 메틸화 분석을 위한 샘플을 제조하도록 본 명세서에 기술된 바와 같이 가동시킨다. 예시로서, 일정한 실시형태에서, 이러한 카트리지의 가동은 DNA를 (예를 들어, 클린업을 위해) 친화성 컬럼에 결합시키는 단계 및 DNA를 용리시키는 단계를 포함할 수 있다. 메틸화 분석을 수행하려는 일정한 실시형태에서, 카트리지의 가동은 전환 시약 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 바이술파이트)과 배합시키는 단계 및 혼합물을 가열하여 DNA를 전환시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 일정한 실시형태에서, HSVP 카트리지는 또한 전환된 DNA를 탈술폰화시키도록 구성될 수 있다. 다른 실시형태에서, DNA는 도 20B에 개략적으로 예시된 바와 같이 제2 (예를 들어, qPCR) 카트리지에서 탈술폰화될 수 있다. 제2 카트리지는 또한 메틸화 분석 (예를 들어, qPCR 분석)을 수행할 수 있다.
도 21은 HMBS 또는 β-글로빈 프라이머 및 프로브 세트를 사용하는 1 카트리지 및 2 카트리지 프로토콜 간 혈장 및 혈청 유래 DNA의 샘플 제조 결과의 비교를 도시한다. 도면에 도시된 바와 같이, 0.5 mL 및 4 mL의 혈청 또는 혈장 사이에 DNA 회수율의 선형 증가가 존재하였다. 게다가 제조 및 분석을 위해 하나의 카트리지를 사용하는 경우 또는 제조 및 분석을 위해 별개의 카트리지를 사용하는 경우에 손실이 거의 없거나 전혀 없었다.
실시예 7
바이술파이트 전환의 최적화
일정한 실시형태에서 본 명세서에 기술된 바와 같이 메틸화 분석을 위한 카트리지를 사용하는 경우에 한가지 잠재적인 문제는 가능한 최소 부피를 사용하여 용리 효율을 최적화하는 것이다. 적은 용리 부피는 스핀 컬럼을 사용해 다루는 것이 보다 용이하다. 이러한 문제는 더 큰 샘플 부피를 프로세싱하기 위해 다수의 가열 단계를 사용하여 해결될 수 있다.
두번째 기술적 관심은 더 작은 (예를 들어, 50 ㎕) 가열 튜브 또는 챔버를 사용하는 경우에 더 많은 샘플 (예를 들어, 최소 100 ㎕)을 가열할 때 재기된다. 일정한 예에서, 가열 단계 사이의 여압은 부피 흡입 및 분배를 재현가능하게 설명하는 것을 어렵게 만들 수 있다. 두번째로, 여압의 부재는 특히 더 높은 온도에서 부피 변화 및 기포를 초래할 수 있다. 세번째로, 가열 단계 사이에 포트 변화 동안 가열 및 미가열 샘플 간 공기를 정리하는 것이 가능하다.
50 ㎕ 튜브 중에서 바이술파이트 전환의 이들 최적화를 조사하기 위해서 단일 및 이중 가열 단계의 사용을 조사하였다. 이 실험은 다음과 같이 수행되었다:
75-80 ㎕의 바이술파이트-DNA 채취; 가열 95℃-10초, 65℃-300초 ×8;
나머지 + 5-10 ㎕ 채취; 가압; 가열 95℃-480초, 65℃-1800초 ×1.
0.5 mL의 혈청에 대한 결과는 도 22에 도시되어 있는데 여기서 상부 패널은 1× 가열 (전환된 33.0, 비전환된 34.4) N=4이고, 하부 패널은 2× 가열 (전환된 31.9, 비전환된 36.1) N=4이다.
1× 가열에서 2× 가열로 갔을 때 전환된 ACTB 신호에서 약 1 Ct의 획득이 존재한다. 이것은 거의 모든 DNA가 전환된 것을 의미한다. 이것은 또한 비전환된 HMBS 신호에서 약 2 Ct의 손실이 존재한다는 사실에 의해 뒷받침된다. 1 Ct 증가는 50/100 ㎕에서 100/100 ㎕의 DNA-바이술파이트 샘플을 가열시켜서 얻은 것이므로 타당하다.
실시예 8
튜브-기반 상업적 키트와 DNA 메틸화 카트리지의 비교
도 23A는 동일한 분석을 수행하기 위해서 상업적 키트 (QIAamp MinElute 바이러스 스핀 키트 (Qiagen, Inc.), 및 EZ DNA 메틸화-Lightning™ 키트 (Zymo Research, Inc.))를 사용할 때 필요한 단계와 비교하여 본 명세서에 기술된 바와 같은 카트리지 (좌측)를 사용해 메틸화 분석을 수행할 경우에 필요한 사용자 단계의 비교를 도시한다. 쉽게 확인할 수 있는 바와 같이 카트리지-기반 메틸화 분석은 키트를 사용하여 필요한 2 내지 3시간 노동 시간과 비교하여 약 5분의 노동 시간으로 훨씬 적은 사용자 단계를 필요로 한다.
상이한 방법으로 생성된 결과와 비교하여, 200 ㎕의 혈청은 Qiagen 키트를 사용해 정제하였다. DNA는 Zymo 키트를 사용해 전환시켰고, 제2 스핀 컬럼으로 정제하였으며 10 ㎕로 용리하였다. 전환된 비메틸화 ACTB 프라이머 및 프로브 (TSR)를 사용하여 10 ㎕ 전부를 작업하였다. 비교를 위해, 200 ㎕의 혈청을 본 명세서에 기술된 바와 같은 메틸화 카트리지에서 작업하였다. 결과는 도 23B에 도시되어 있다. 쉽게 알수 있는 바와 같이, 카트리지 방법은 상업적 키트를 사용하여 수득된 것과 매우 비슷한 결과를 생성시켰다. 그러나, 이것은 훨씬 적은 노동 및 시간으로 수행되었다.
실시예 9
DNA 전환을 위한 DABSO의 사용
초기에 5 mL H2O 중 5 g의 DABSO를 용해시키는 것을 시도하였다. 궁극적으로 약간의 mL의 10 M KOH 및 1 mL의 물을 첨가하였고 가열시키서 DABSO를 가용화시켰고 ∼2.5 M의 추정되는 최종 DABSO 농도에서 약 pH 5 내지 pH 5.5의 pH로 상승되었다.
도 24는 DABSO 또는 Zymo 전환 시약을 사용하여 전환된 750 ng의 DNA의 튜브필의 그래프를 도시한다. 물질들은 열순환기에서 오프보드 가열 (1 ㎍)시켰고 스핀 컬럼으로 정제하였으며 튜브필로서 작업하였다. 3종의 상이한 실험은 다음과 같다:
1) 120 ㎕ DABSO/30 ㎕ DNA;
2) 120 ㎕ Zymo/30 ㎕ DNA; 및
3) 70 ㎕ Zymo/30 ㎕ DNA (카트리지 내 현재 비율).
도 24에 도시된 바와 같이, DABSO는 Zymo 시약을 사용해 수득된 것과 거의 비슷한 양호한 전환성을 제공하였다.
실시예 10
메틸화 DNA의 검출 감도
DNA 메틸화 검출의 감도를 평가하기 위해서, 전환된 ACTB 유전자 프로모터는 본 명세서에 기술된 바와 같은 카트리지를 사용하여 카피 수의 함수에 따라 검출되었다. 목적은 25 카피수 미만의 전환된, 비메틸화 DNA를 검출하는 것이었다. 이전에 도시된 바와 같이, 폴아웃은 약 10-50 카피수에서 관찰되었다 (각각 1 폴아웃). 유사한 감도가 혈청 배경 중 메틸화 DNA 표적에 대해 관찰되었다.
도 25, 패널 A는 연속 희석물 중 메틸화 DNA (MGMT (O-6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제 유전자))의 검출을 예시한다. 도면에 도시된 바와 같이, MGMT는 78 pg 수준에 이르기까지 검출되었다.
MBA-453 세포에서 메틸화 유방암 마커 RASSF1A 및 AKR1B1 의 검출은 도 25, 패널 B에 도시되어 있다. 도면에 도시된 바와 같이, 유방암 마커는 100개 세포에 이르기까지 검출되었다.
연속 희석물 중 메틸화 췌장암 마커 ACTB, BNC1, 및 ADAMTS1 의 검출은 도 25, 패널 C에 도시되어 있다. 도면에 도시된 바와 같이, 췌장 마커는 25 카피수에 이르기까지 검출되었다.
표 15는 농도 함수에 따른 췌장암 마커 BNC1 및 ADAMTS1의 히트율을 표시한다. 이에 표시된 바와 같이, 이들 마커는 120 pg 이하에서 검출될 수 있었다. 양성 "히트율"은 복제물에 대한 어느 한 유전자에서의 증폭이다.
표 15는 농도 함수에 따른 췌장 마커 검출에 대한 히트율을 예시한다.
[표 15]
농도 함수에 따른 췌장 마커 검출에 대한 히트율의 예시.
Figure 112019070348332-pct00031
실시예 11
양쪽 가닥에 대한 역상보적 멀티플렉스 어세이
도 26은 양쪽 DNA 가닥에 대한 역상보성 멀티플렉스 어세이에 대한 결과를 예시한다. 바이술파이트 전환 이후에, 양쪽 가닥은 그들의 상보성을 상실한다. 따라서, 프라이머 및 프로브 세트는 한 가닥 또는 나머지 가닥에 대해 디자인되어야 하고, 그 결과로 고유한 앰플리콘이 생성된다. "더 많은 기회"를 제공하는 것 이외에도, 이러한 접근법은 잠재적으로 감도에 도움이 될 수 있다 (LOD에서, 오직 하나의 가닥 또는 나머지 가닥이 튜브에서 종료되면, 이 접근법은 신호 발견을 보장함).
멀티플렉스 어세이는 멀티플렉스가 동일한 프로모터 부위에서 상이한 CpG를 검출할 수 있게 한다. 역상보성 멀티플렉스는 표적에 대한 더 많은 질의 및 이성화 (heterogamous) 메틸화를 발견할 가능성을 제공한다.
실시예 12
단일 카트리지에서 DNA 메틸화 및 돌연변이의 검출.
일정한 실시형태에서 멀티플렉스 PCR 반응은 동일한 카트리지 내에서 메틸화 이외에도 돌연변이의 검출을 가능하게 하는 프라이머 및 프로브를 함유할 수 있다. 도 27A는 대조군 BG와 함께 KRAS G12D 돌연변이와 메틸화 BNC1 및 ADAMTS1 의 검출 (상부 패널) 및 대조군 BG와 함께 KRAS 야생형과 메틸화 BNC1 및 ADAMTS1 의 검출 (하부 패널)을 예시한다.
도 27B는 KRAS G12D 돌연변이와 함께 PANC-1 세포 (상부 패널) 및 MIA-PaCa 세포 (하부 패널)에서 BNC1 및 ADAMTS1 메틸화의 동시 검출을 예시한다.
실시예 13
췌장암의 멀티플렉스 최적화.
ADAMTS1, BNC1, (및 일정한 다른 유전자)의 메틸화 분석은 췌장암의 검출 및/또는 병기구분을 가능하게 하는 것으로 확인되었다. 따라서, BNC1 및 ADAMTS1 에 대한 초기 멀티플렉스 어세이는 다른 유전자에 대한 프로브의 도입을 촉진하기 위해 최적화되었다. 이러한 어세이를 최적화하기 위해서, 온도 구배를 전방향/역방향 바이술파이트 전환된 가닥에 대한 외부 및 내부 PCR에서 실시하였다. 단일-플렉스 (각 유전자에 대한 fwd/rev)는 56℃, 58℃, 및 60℃의 외부 온도 및 64℃, 66℃, 및 68℃의 내부 온도에서 작업되었다 (예를 들어, 도 28 참조). 일정한 실시형태에서 어세이는 BNC1 및 ADAMTS1 및 다른 2종의 유전자에 대해 2종 4-플렉스로서, 전방향 가닥의 메틸화 분석의 경우 하나의 4-플렉스로서 그리고 역방향 가닥의 메틸화 분석으로 위한 하나의 4-플렉스로서 개발되었다.
프로브는 바람직한 반응 조건 (염 조건 40 mM (LS), 60 mM (MS), 80 mM (HS) KCl. 15 mM NH4SO4)을 기반으로 2개 세트 (도 29 참조)로 조합되었고 특이도를 위해 최적화되었다. 멀티플렉스 1에 대해 최종 최적화된 염 조건은 80 mM의 KCl, 5 mM의 MgCl2, 20 mM의 Tris pH 8.5, 및 10 mM의 NH4 였고, 멀티플렉스 2의 경우에 62 mM의 KCl, 4 mM의 MgCl2, 20 mM의 Tris pH 8.5, 및 10 mM의 NH4 였다.
실시예 14
MGMT 메틸화의 검출
O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제 (MGMT) 유전자는 알킬화 화학요법 예컨대 테모졸아미드의 효과를 없앨 수 있는 DNA 복구 효소를 코딩한다. MGMT 유전자가 활성화되면, 손상이 신속하게 복구된다. 악성 신경교종은 MGMT 유전자가 이의 프로모터 영역의 메틸화로 인해 불활성화될 수 있다고 여겨진다. 메틸화 MGMT 유전자는 화학요법에 대한 더 나은 반응에 대한 예측 지표이다 (종양은 알킬화제에 의해 유도된 DNA 손상을 복구하기 위한 수단을 갖지 않기 때문).
프라이머 및 프로브는 도 30에 예시된 바와 같은 MGMT 메틸화의 검출을 위해 개발되었고 하기 표 16에 요약되어 있다. 특히, 도 30은 회색으로 표시된 CpG (파이로시퀀싱으로 결정됨)를 갖는 전환된 주형을 예시한다. 예시된 바와 같이 바이술파이트 전환 이후에 전방향 및 역방항 가닥은 더 이상 상보성이 아니어서 각 가닥의 개별 분석을 가능하게 한다.
[표 16]
MGMT 메틸화 검출용의 예시적인 프라이머/프로브 세트 (예를 들어, 도 30 참조).
Figure 112019070348332-pct00032
검출 감도를 평가하기 위해서 MGMT 연속 희석물 (20 ng의 HS DNA의 배경에서 5 ng 내지 78 pg의 MGMT DNA))은 대조군으로서 ACTB를 사용해 평가되었다. 예시적인 실험에서, 78 pg의 메틸화된 MGMT DNA는 단지 비메틸화된 HS DNA의 Ct에서 오직 약 10 사이클만 벗어났다.
도 31에 도시된 바와 같이 MGMT 메틸화의 검출을 위해 본 명세서에 기술된 메틸화 카트리지를 사용해 생성된 결과는 추출된 DNA (도 31, 위) 및 FFPE 샘플 (도 31, 아래)에 대한 파이로시퀀싱으로 생성된 결과와 비교하였다. 파이로시퀀싱은 전형적으로 환자 계층을 결정하기 위해 10 내지 15%의 컷오프를 사용한다. 가능한 밀접하게 파이로시퀀싱 결과를 일치시키기 위해서 (ACTB 및 MGMT 사이에) 12.5의 임의 컷오프를 사용하였다. 따라서, 이 실시예에서, 컷오프는 델타 Ct=12.5에서 설정되었고 일치도는 >15% 메틸화로 계산되었다. 추출된 DNA의 카트리지 분석은 90%의 감도 및 86%의 특이도를 보인데 반해 FFPE 샘플의 카트리지 분석은 88%의 감도 및 95%의 특이도를 보였다.
특이도는 다음과 같은 2가지 방식으로 개선될 수 있다는 것을 언급한다: 1) 어닐링 온도는 62℃ 어닐링 온도가 다소 낮았기 때문에 증가시킬 수 있다. 추가로 3개 (또는 그 이상) CpG를 포괄하는 메틸화 프로브를 활용할 수 있다.
실시예 15
BRCA1 메틸화의 검출
BRCA1는 DNA 복구를 담당하는 관리 유전자이다. BRCA1 가 상동성, 재조합, 비상동성 말단 연결, 및 뉴클레오티드 절개 복구에 관여된다고 여겨진다. 비정상적인 BRCA1 유전자를 갖는 여성은 80%의 유방암 발병 가능성을 갖는다.
특정한 이론에 국한하려는 것은 아니나, BRCA1 메틸화는 삼중 음성 BC 환자에서 화학요법에 대한 반응의 잠재적인 예측 마커인 것으로 여겨진다. 시스플라틴으로 처리된 NSCLC 환자의 연구는 BRCA1 발현이 낮은 환자들이 개선된 생존율을 갖는 것을 보여주었다. 높은 수준은 암 세포에 초래된 손상을 복구함으로써 화학요법의 유효성을 감소시켰다.
이들 및 다른 관찰의 관점에서, 카트리지 및 사용 방법이 BRCA1 메틸화의 검출을 위해 개발되었다. 특히, PCR 조건은 다음과 같이 최적화되었다: 1) 외부 온도는 56℃ 내지 62℃로 평가되었고 3 단계 56℃ 어닐링 PCR 프로토콜을 결정하였다; 2) 내부 온도는 64℃ 내지 70℃로 평가되었고 2-단계 68℃ 어닐링 PCR 프로토콜을 결정하였다. 결과는 도 32에 도시되어 있다.
BRCA1 의 경우에, 하나의 표적 어세이가 ACTB 대조군 유전자와 함께 검사되었다. 8종의 상이한 세포주가 시험되었고 NH4 첨가의 효과를 비교하였다 (도 33 참조). BRCA1 메틸화는 3199 세포주에서 관찰될 것으로 예상되었다.
실시예 16
폐암과 연관된 유전자 메틸화의 검출.
그 메틸화가 폐암과 연관된 유전자 (SOX17, CD01, TAC1)에 대한 3개 표적 메틸화 어세이는 ACTB 대조군 유전자와 함께 시험되었다. 도 34에 도시된 데이타는, 예상한 바와 같이, 3개 표적이 정상 혈장 배경에서는 나오지 않지만 3종의 상이한 폐암 세포주에서는 어느 정도로 존재한다는 것을 의미한다.
본 명세서에 기술된 실시예 및 실시형태는 단지 예시의 목적이고 이의 관점에서 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제시될 것이고 본 출원의 사조 및 영역 및 첨부된 청구항의 범주 내에 포함시키고자 한다는 것을 이해한다. 본 명세서에서 인용되는 모든 공개물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그들 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
SEQUENCE LISTING <110> CEPHEID <120> INTEGRATED PURIFICATION AND MEASUREMENT OF DNA METHYLATION AND CO-MEASUREMENT OF MUTATIONS AND/OR MRNA EXPRESSION LEVELS IN AN AUTOMATED REACTION CARTRIDGE <130> CPHDP011WO <140> PCT/US2017/065905 <141> 2017-12-12 <150> 62/433,165 <151> 2016-12-12 <160> 390 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1 cgcgtttcgg atatgttggg atagttcgcg tttttagaac gttttgcgtt tcgacgttcg 60 taggttttcg cggtgcgtat cgtttgcgat ttggtgagtg tttgggtcgt ttcgttttcg 120 gaagagtgcg gagttttttt tcgggacggt ggtagtttcg ag 162 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 gcgttgaagt cggggttc 18 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 35 ttagatgttg attggttgtg tttg 24 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 36 atcatcataa aactcaacaa tcaatt 26 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 37 ccaaacatca aatctttaac ttttaccaa 29 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 38 aggttgaaat tagtatgtgt tattttggta tgg 33 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 39 aggttgaaat tagtatgtgt tattttggta tgg 33 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 40 aggttgaaat tagtatgtgt tattttggta tgg 33 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 41 gttttatagt ttttgtattt agg 23 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 42 aactcaataa actcaaactc cc 22 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 43 gtgtgtgttt ttattgtaaa tgg 23 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 44 ataaaatttc ttcacrccac c 21 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 45 gagggagtta gttgggttat 20 <210> 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oligonucleotide" <400> 56 gcgttaatcg taggcgttt 19 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 57 gtttagcggg atgcggtg 18 <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 58 acacgaaaac cccgataac 19 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 59 gygtaattaa ttagaaggtt tttt 24 <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 60 tcgtacgaag taaatagttc gtaag 25 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 61 ggatttttga aatattatag gattaattag 30 <210> 62 <211> 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 98 gaggtaggag aattatttga atttagg 27 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 99 atttgagatt tttgagttgg 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 100 aaccctactc cctatctacg 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 101 gcgcgcgttt ttttttgaag 20 <210> 102 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 102 ggcgtagata gggagtaggg tt 22 <210> 103 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 103 gtgatggagg 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> Universal pyrimidine <400> 246 gttttngttt tggttgcgat gttgt 25 <210> 247 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> Universal pyrimidine <400> 247 gggatttttt agaagagngg t 21 <210> 248 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> Universal purine <400> 248 tactcactaa taacnaaaac tac 23 <210> 249 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> Universal pyrimidine <400> 249 ggttttgtgt tttattgngg ag 22 <210> 250 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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Synthetic oligonucleotide" <400> 254 ctaataacga aaactacgac gacg 24 <210> 255 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 255 ttgtgtttta ttgcggagtg c 21 <210> 256 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 256 aaccacatat cgatcacgta cg 22 <210> 257 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 257 gcgttttcgg attttagggt c 21 <210> 258 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 258 aactaatcgc cttaaataaa ataccg 26 <210> 259 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 376 ctccaacctc aactctaaac 20 <210> 377 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 377 gattttagtg tcgcgtattt tggttc 26 <210> 378 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 378 ctaaactaaa tcccgcgaac ctcg 24 <210> 379 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 379 ggttttattg ggggttnatt tcgggtag 28 <210> 380 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 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<213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 390 tctactcaaa actctcccct ctcc 24

Claims (31)

  1. 핵산의 메틸화 상태를 결정하기 위한 카트리지의 세트로서, 상기 카트리지의 세트는
    샘플 수용 챔버;
    제1 매트릭스 재료를 포함하는 컬럼;
    온도 제어 가능한 채널 또는 챔버;
    샘플 제거 챔버; 및
    시약 및/또는 완충제를 함유하는 복수개의 챔버로서, 사용될 때에, 상기 챔버 중 적어도 하나는 전환 시약을 함유하는 것인 챔버
    를 포함하는 제1 카트리지; 및
    샘플 수용 챔버;
    제2 매트릭스 재료를 포함하는 컬럼;
    온도 제어 가능한 채널 또는 챔버; 및
    시약 및/또는 완충제를 함유하는 복수개의 챔버로서, 사용될 때에, 상기 챔버 중 적어도 하나는 탈술폰화 및/또는 용리 시약을 함유하는 것인 챔버
    를 포함하는 제2 카트리지
    를 포함하는 것인 카트리지의 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 카트리지 내의 온도 제어 가능한 채널 또는 챔버는 열순환 가능한 채널 또는 챔버인 카트리지의 세트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제2 카트리지 내의 온도 제어 가능한 채널 또는 챔버는 열순환 가능한 채널 또는 챔버인 카트리지의 세트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 전환 시약은 암모늄 바이술파이트, 소듐 메타바이술파이트, 포타슘 바이술파이트, 세슘 바이술파이트, 및 DABSO로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 것인 카트리지의 세트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 전환 시약은 암모늄 바이술파이트를 포함하는 것인 카트리지의 세트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 전환 시약은 술파이트 산화를 방지하기 위한 스캐빈저 및/또는 촉매를 포함하는 시약 믹스로 제공되는 것인 카트리지의 세트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 전환 시약은 트롤록스 (Trolox) 및 히드로퀴논으로 이루어진 군으로부터 선택되는 스캐빈저를 포함하는 시약 믹스로 제공되는 것인 카트리지의 세트.
  8. 제6항에 있어서, 상기 전환 시약은 촉매로서 폴리아민을 포함하는 시약 믹스로 제공되는 것인 카트리지의 세트.
  9. 제1항에 있어서, 상기 제1 카트리지는 전환 시약이 사용자에 의해 카트리지에 첨가되도록 구성되는 것인 카트리지의 세트.
  10. 제1항에 있어서, 전환 시약은 상기 제1 카트리지 내 상기 복수개의 챔버 중 하나에서의 성분으로서 제공되는 것인 카트리지의 세트.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제2 카트리지 내 복수개의 챔버 중 적어도 하나의 챔버는 PCR 프라이머, PCR 프로브, 및/또는 PCR 마스터 믹스를 함유하는 것인 카트리지의 세트.
  12. 제1항에 있어서, 상기 제2 카트리지 내 복수개의 챔버는 메틸화 특이적 PCR 프라이머, 메틸화 특이적 PCR 프로브, PCR 효소(들), 및 PCR 반응 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시약을 함유하는 하나 이상의 챔버를 포함하는 것인 카트리지의 세트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제2 카트리지 내 복수개의 챔버는 메틸화 특이적 PCR 프라이머, 메틸화 특이적 PCR 프로브, PCR 효소(들), 및 PCR 반응 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시약을 함유하는 적어도 2개의 챔버를 포함하는 것인 카트리지의 세트.
  14. 제1항에 있어서, 상기 제2 카트리지 내 복수개의 챔버는 전환된 DNA의 전방향 가닥의 메틸화의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 함유하는 적어도 하나의 챔버를 포함하는 것인 카트리지의 세트.
  15. 제1항에 있어서, 상기 제2 카트리지 내 복수개의 챔버는 전환된 DNA의 역방향 가닥의 메틸화의 검출을 위한 프라이머 및 프로브를 함유하는 적어도 하나의 챔버를 포함하는 것인 카트리지의 세트.
  16. 제12항에 있어서, 상기 PCR 프라이머, 프로브, 및/또는 효소는 비드로서 제공되는 것인 카트리지의 세트.
  17. 제1항에 있어서, 상기 제2 카트리지는 하기 표 5, 11, 또는 12에 표시된 하나 이상의 프라이머, 및/또는 하기 표 5, 11, 또는 12에 표시된 하나 이상의 프로브를 함유하는 것인 카트리지의 세트:

    [표 5]
    Figure 112022056394959-pct00086

    Figure 112022056394959-pct00087

    Figure 112022056394959-pct00088

    Figure 112022056394959-pct00089

    Figure 112022056394959-pct00090

    Figure 112022056394959-pct00091

    Figure 112022056394959-pct00092

    Figure 112022056394959-pct00093

    Figure 112022056394959-pct00094

    Figure 112022056394959-pct00095

    Figure 112022056394959-pct00096

    Figure 112022056394959-pct00097

    Figure 112022056394959-pct00098

    Figure 112022056394959-pct00099


    [표 11]
    Figure 112022056394959-pct00100

    Figure 112022056394959-pct00101

    Figure 112022056394959-pct00102


    [표 12]
    Figure 112022056394959-pct00103
    .
  18. 제17항에 있어서, 상기 제2 카트리지는 네스티드 PCR 반응을 사용하여 MGMT 의 메틸화를 결정하기 위해 하기의 프로브 및 프라이머를 함유하는 것인 카트리지의 세트:
    뉴클레오티드 서열: GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT (SEQ ID NO: 263)을 포함하는 외부 전방향 프라이머 (248b);
    뉴클레오티드 서열: AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC (SEQ ID NO: 265)을 포함하는 외부 역방향 프라이머 (249b);
    뉴클레오티드 서열: TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC (SEQ ID NO: 266)을 포함하는 내부 전방향 프라이머 (250);
    뉴클레오티드 서열: GCACTCTTCCGAAAACGAAACG (SEQ ID NO:267)을 포함하는 내부 역방향 프라이머 (251); 및
    뉴클레오티드 서열: 플루오르-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-차단제 (SEQ ID NO:268)을 포함하는 프로브 (252a).
  19. 제17항에 있어서, 상기 제2 카트리지는 네스티드 PCR 반응을 사용하여 ACTB의 메틸화를 결정하기 위해 하기 프로브 및 프라이머를 함유하는 것인 카트리지의 세트:
    뉴클레오티드 서열: GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT (SEQ ID NO:103)을 포함하는 외부 전방향 프라이머 (102);
    뉴클레오티드 서열: CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (SEQ ID NO:104)을 포함하는 외부 역방향 프라이머 (103);
    뉴클레오티드 서열: GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG (SEQ ID NO:149)을 포함하는 내부 전방향 프라이머 (148);
    뉴클레오티드 서열: CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC (SEQ ID NO:150)을 포함하는 내부 역방향 프라이머 (149); 및
    뉴클레오티드 서열: 플루오르-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-차단제 (SEQ ID NO:179)을 포함하는 프로브 (178).
  20. 생물학적 샘플 중 핵산의 메틸화를 결정하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템은
    하나 이상의 샘플 프로세싱 모듈을 함유하도록 구성된 인클로저를 포함하고, 각각의 샘플 프로세싱 모듈은 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 상기 카트리지의 세트의 탈착형 제1 카트리지 및/또는 제2 카트리지를 수용하도록 구성되고;
    상기 시스템은
    상기 제1 카트리지로 도입된 샘플 중 핵산의 바이술파이트 전환이 수행되도록 상기 카트리지의 세트의 제1 카트리지를 가동시키기 위해 샘플 프로세싱을 수행하고/하거나,
    상응하는 탈착형 샘플 카트리지 내에서 탈술폰화를 수행하고 하나 이상의 표적 핵산의 메틸화를 결정하기 위해,
    샘플 프로세싱 모듈을 가동시키도록 구성되는 것인 시스템.
  21. 핵산의 메틸화 상태를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은
    제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 카트리지의 세트 내 제1 카트리지의 샘플 챔버 중에 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
    상기 제1 카트리지를
    상기 샘플 중 DNA를 상기 제1 매트릭스 재료에 결합시키고;
    결합된 DNA를 세척시키고;
    결합된 DNA를 매트릭스 재료로부터 용리시키고;
    용리된 DNA를 상기 전환 시약과 배합시키고;
    상기 온도 제어 가능한 채널 또는 챔버 중에서 DNA 및 전환 시약의 혼합물을 가열하여 상기 DNA의 바이술파이트 전환을 수행시키며;
    전환된 DNA를 상기 제1 카트리지의 샘플 제거 챔버로 전달시키도록 가동시키는 단계
    를 포함하는 것인 결정 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 방법은
    상기 카트리지의 세트 내 제2 카트리지의 샘플 챔버 중에 전환된 DNA를 제공하는 단계; 및
    상기 제2 카트리지를
    상기 전환된 DNA를 상기 제2 매트릭스 재료에 결합시키고;
    결합된 전환된 DNA를 세척시키고;
    세척된 전환된 DNA를 상기 제2 매트릭스 재료로부터 용리시키고;
    전환된 DNA를 탈술폰화시키도록 가동시키는 단계
    를 더 포함하는 것인 결정 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 제2 카트리지는 탈술폰화 이전에 전환된 DNA를 상기 제2 매트릭스 재료로부터 용리시키도록 가동되는 것인 결정 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 제2 카트리지는 탈술폰화 이후에 또는 그 동안에 전환된 DNA를 상기 제2 매트릭스 재료로부터 용리시키도록 가동되는 것인 결정 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 방법은 상기 제2 카트리지를 메틸화 특이적 PCR, 핵산 시퀀싱, 및/또는 고분해능 용융 분석 (HRM)이 상기 전환된 DNA에 대해 수행되어 상기 DNA의 메틸화를 결정하도록 가동되는 단계를 포함하는 것인 결정 방법.
  26. 대상체에서 암 또는 암에 대한 소인을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    상기 대상체 유래의 생물학적 샘플을 제공하는 단계로서, 상기 생물학적 샘플은 DNA를 포함하는 것인 단계;
    제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 카트리지의 세트를 활용하는 단계로서, 상기 카트리지의 세트의 상기 제1 카트리지는 상기 DNA의 바이술파이트 전환을 수행하기 위해 사용되고; 상기 카트리지의 세트의 상기 제2 카트리지는 전환된 DNA를 탈술폰화시키고, 그의 메틸화 상태가 암에 대한 마커인 상기 DNA 중 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화를 검출하기 위해 사용되며, 상기 하나 이상의 유전자 프로모터의 메틸화의 증가는 암 또는 암에 대한 소인의 존재 또는 암 또는 전암의 병기를 의미하는 것인 단계
    를 포함하는 것인 검출 방법.
  27. DNA 메틸화의 결정을 위한 키트로서, 상기 키트는
    제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 카트리지의 세트의 제1 카트리지 및/또는 제2 카트리지를 함유하는 컨테이너를 포함하는 것인 키트.
  28. 제27항에 있어서, 상기 키트는 상기 카트리지 또는 카트리지와 별개의 컨테이너에 전환 시약을 포함하는 것인 키트.
  29. 제28항에 있어서, 상기 키트는 카트리지와 별개의 컨테이너에 상기 전환 시약을 포함하는 것인 키트.
  30. 제28항에 있어서, 상기 키트는 카트리지의 챔버에 상기 전환 시약을 포함하는 것인 키트.
  31. 제28항에 있어서, 상기 전환 시약은 소듐 메타바이술파이트, 포타슘 바이술파이트, 세슘 바이술파이트, 암모늄 바이술파이트, 및 DABSO로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 것인 키트.
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