KR102440743B1

KR102440743B1 - 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선, 탄력개선 및 항산화용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102440743B1
Application number: KR1020210133049A
Authority: KR
Inventors: 박상훈
Original assignee: 주식회사 아이디플라코스메틱
Priority date: 2021-10-07
Filing date: 2021-10-07
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2041-10-07

Abstract

본 발명은 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 초음파 진공저온 추출법에 의하여 제조된 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물을 함유하여 우수한 피부 주름, 탄력 개선 및 항산화 활성을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선, 탄력개선 및 항산화용 화장료 조성물{Cosmetic composition for reducing skin wrinkles, improving skin elasticity and antioxidation containing the complex extracts of Diospyros Kaki Leaf, Scutellaria Baicalensis, Cimicifuga Dahurica and Sophora Japonica Flower}

본 발명은 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선, 탄력개선 및 항산화용 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 초음파 진공저온 추출에 의하여 제조되는 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물을 함유하여 우수한 피부 주름, 탄력 개선 및 항산화 활성을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 조직학적으로 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutis)의 3층으로 구성되어 있는데, 외부로부터의 다양한 자극에 대한 방어와 피부를 통한 체내수분의 과도한 발산을 막는 보호 기능을 하며 가장 외부에 존재함으로써 피부노화의 측면에서 가장 중요한 역할을 한다.

표피에서도 최외각층인 각질층을 구성하는 성분은 각질세포와 피부지질로서 피부지질은 피부의 장벽 기능을 담당하는데, 외부 유해물질로부터 피부를 보호하고 체내 물질의 유출을 방지하며 피부 수분증발을 방지하는 중요한 기능이라고 할 수 있다.

그러나 피부는 스트레스, 햇빛, 대기오염, 담배 등의 외부환경에 노출되어 활성 산소종이 발생하여, 과산화 지질이 생성되고 콜라겐과 엘라스틴 등의 피부 구성 단백질이 변형이 된다. 또한 나이가 들어감에 따라 피부 세포의 활성이 저하되면서 콜라겐과 엘라스틴의 생성 능력이 저하되고, 그 결과로 피부의 진피층이 파괴되면서 피부 내부 구조가 약해지고 피부가 얇아지게 되면서, 지방층이 엷은 얼굴에 주름의 형성이 촉진된다. 또한 진피층 내에서 피부보습을 담당하는 점다당질(Glycosaminoglycans, GAGs)이 피부 노화로 인하여 감소하면서 피부가 건조해지며 색소 침착, 탄력 감소 등의 노화 피부의 특징이 나타나게 된다.

그리고 사람 피부의 노화는 나이가 많아짐에 따라 섬유아세포 수가 감소하게 되면서 나타나게 된다. 자외선, 기후, 흡연 등에 의해 여러 가지 신호체계가 활성화됨으로써 피부 구성성분이 손상되면서 피부노화가 진행된다. 자외선에 의해 손상 받은 피부는 콜라겐의 양이 감소되어 있는데, 이는 자외선에 의해 피부 내에서 MMPs(matrix metalloproteinase)의 발현이 증가하기 때문이며, 이러한 MMPs는 피부 광노화 발생에 중요한 역할을 한다(Fisher et al., 1999). MMPs는 피부의 세포들(keratinocytes, fibroblasts)로부터 분비되어 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane, BM)을 구성하는 대부분의 단백질 성분을 분해함으로써 피부 탄력을 유지하는 결합조직을 파괴하여 주름과 탄력저하 및 피부 처짐의 원인이 되는 것으로 알려져 있다.

주름형성에 있어서 콜라겐 이외에 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)과 엘라스틴 분해에 관여하는 효소인 엘라스타제(elastase)에 대해서도 많은 연구가 진행되고 있는 것으로 보고되고 있다(Antonicelli et al., 2007; Isenburg et al., 2004; Seite et al., 2006). 특히, 만성적인 UV 조사에 의해 사람의 피부 표피의 각질형성세포(keratinocytes)에서도 엘라스틴의 전구체인 tropoelastin mRNA 발현이 증가한다는 보고가 있었으며, 선택적인 엘라스타제 활성의 억제를 통한 주름형성에서 엘라스타제의 역할이 보고되기도 하였다.

생활수준 향상에 따라 피부노화와 같은 미용과 건강에 관한 관심이 급증하는 가운데 기능성 화장품을 개발하려는 연구가 활발해지고 있으며, 식품의약품안전청의 기능성화장품 고시 품목으로서 주름개선 소재로 대표적으로 사용되는 레티놀(비타민 A), AHA(a-hydroxy acid), 아데노신 등은 콜라겐의 합성을 증가시키는 물질로 많이 사용되고 있지만 빛과 열에 불안정하고 피부에 자극이 있는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 안전한 천연물 소재로부터 피부 주름 개선, 탄력 개선 및 항산화 효과가 우수한 화장료를 제조하고자 노력하였으며, 이에 본 발명을 완성하였다.

(0001) 대한민국 공개특허 제10-2013-0023606호 (2013.03.08) (0002) 대한민국 공개특허 제10-2011-0112231호 (2011.10.12) (0003) 대한민국 공개특허 제10-2019-0070081호 (2019.06.20.) (0004) 대한민국 공개특허 제10-2019-0089748호 (2019.07.31)

본 발명은 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부 주름 개선, 탄력 개선 및 항산화 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 초음파 진공저온 추출에 의하여 제조된 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물을 유효성분으로서 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~30 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 초음파 진공저온 추출은 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 혼합물을 추출용매와 함께 밀폐용기에 넣어 진공포장하여 1~5시간 초음파 추출한 후, 30~60℃에서 1~10일 동안 추출하는 것으로 이루어지는 것임을 특징으로 한다.

이때, 상기 추출용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글라이콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이 사용될 수 있다.

상기 혼합물은 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃이 그 건조중량 기준으로 각각 1~10:1~10:1~10:1~10의 비로 혼합되어 이루어지며, 바람직하게는 각각 1~3:1~3:1~2:1~3의 비로 혼합되어 이루어진다.

상기 화장료 조성물은 피부 주름개선, 탄력개선 및 항산화용임을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물은 피부 주름 및 탄력개선 효능이 우수하여 피부 주름 개선, 탄력 개선 및 항산화용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 초음파 진공저온 추출방법에 의하여 제조된 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물이 우수한 피부 주름, 탄력 개선 및 항산화 활성을 나타낸다는 것을 기술적 특징으로 한다.

식품 조리법으로서 밀폐된 비닐봉지에 담긴 음식물을 미지근한 물속에서 오랫동안 가열하여 조리하는 진공저온 조리법이 알려져 있다. 진공을 통해 조리과정 중 발생할 수 있는 오염을 방지하고 재료 고유의 향과 수분을 지키며 영양소 파괴를 최소화할 수 있다는 장점을 가진다. 본 발명에서는 유효성분인 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물의 제조에 이러한 방법을 응용하여 추출물을 제조하였다.

감나무(Diospyros kaki Thunb)는 우리나라 중부 이남 지방에 주로 분포되어 있으며 생식하는 시자 이외에도 시엽, 시화, 시체 등은 예로부터 민간요법으로 사용되어 왔다. 그 중에서도 특히 감잎은 주로 차로 이용되어 동의보감에 혈관질환의 예방, 치료와 함께 자반증(혈관염증)에도 효과가 있다고 기록되어 있다. 감잎에는 비타민 C, 아미노산, 핵산, 페놀성 화합물, 유리당 등 여러 물질들이 다양하게 함유되어 있다. 감잎의 플라보노이드(flavonoid)로는 kaempferol의 배당체인 astragalin, myricetin의 배당체인 myricitrin, isoquercitrin 등의 배당체 형태가 존재한다. 감잎은 총 페놀성 화합물 함량이 0.1 ~ 5.8%로 다른 식물에 비하여 높으며, 우수한 항산화능과 항균성이 확인되었고, Superoxide dismutase(SOD)활성에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 그리고 피부 탄력유지와 감기 및 성인병 예방에는 약리작용 효과가 검증되었고, 다양한 물질이 인간의 생리기작에 영향을 줄 수 있는 가능성을 강력하게 시사하고 있다. 페놀성 화합물은 항산화의 기능뿐만 아니라 항균, 항알레르기, 충치예방, 심장질환 및 당뇨병 예방에도 효과가 있는 것으로 보고되고 있으며 플라보노이드, phenolic acid, phenyl propanoid, quinone류 등을 포함하고 있다.

황금(Scutellaria baicalensis)은 쌍떡잎식물 통화 식물목 꿀풀과(Labiatae/Lamiaceae)에 속하는 여러해살이풀로 높이는 20~26cm에 달한다. 주로 뿌리를 약용한다. 이 식물의 성상은 원주상-반관상 또는 평판상으로 이루고 길이 5-25cm, 지름 5-30mm정도 되며, 바깥면은 황갈색을 띠고 조잡하고 뚜렷한 세로의 주름이 있으며 군데군데 곁뿌리의 자국 및 갈색의 주피 파편이 남아 있다. 한방에서는 자금(子芩), 조금(條芩), 편금(片芩) 등으로 불리며 그 맛은 쓰고, 성질은 차갑고 무독성이며, 특히, 황금의 대표적인 효능은 사화해독(瀉火解毒, 화기(火氣)를 풀어 주면서 해독하는 것)과 청열조습(淸熱燥濕, 열기를 식히고 습기를 말림), 지혈 등이 있다. 한의학에서 황금은 생품에서 잡질을 제거하여 일정한 크기로 절편(切片)하여 사용하는데, 생용할 경우 청열사화(淸熱瀉火, 열기를 식히고 화기를 제거함)의 작용을 강화시키는 것으로 알려져 있다. 또한 황금초(炒, 약재를 화력으로 볶아서 가공함)는 황금이 본래 가지고 있는 차가운 성질을 완화하여 태기(胎氣)를 안정시키는데 주로 사용한다. 액체보료로서 널리 사용하고 있는 술(酒)은 상승하는 성질을 가지고 있어서 약재의 효능을 인체의 상부로 승강시키는데, 황금을 주초(酒炒)하면 상부의 열기를 식히는데 사용한다. 반대로 황금을 동변(童便)으로 초(炒)하면 인체 하부(下部)에 작용한다(한약포제학, 김기영외, 신일상사; 한약포제와 임상 응용, 최호영 외, 영림사). 또, 황금추출물에는 플라보노이드계 성분으로는 크리신(Chrysin), 바이카린(Baicalin), 바이카레인(Baicalein), 우고닌(Wogonin) 등이 있다.

눈빛승마(Cimicifuga Dahurica)는 미나리아재비과에 속하는 여러해살이풀로 끼멸가리라고도 불리며, 눈빛승마와 그 동속식물의 뿌리줄기는 약용으로 사용된다. 뿌리줄기는 굵은 마디 모양으로 고르지 않으며 길이 6~8cm, 지름 10~25cm이다. 바깥면은 갈색 혹은 흑색으로 뿌리줄기의 위쪽에 몇 개의 큰 줄기자국이 있고, 많은 뿌리의 잔기가 붙어 있다. 눈빛승마의 생리활성 성분으로는 페룰산(Ferulic Acid)을 함유하고 있으며 효과에 대해서는 눈빛승마 추출물이 인슐린 분비를 조절하는 것이 보고된 바 있고, 눈빛승마의 유효성분으로 알려진 비스나진이 혈압을 강화시키고 칼슘의 유입을 억제함으로써 혈관 평활근 수축을 억제하는 것으로 알려져 있다.

회화나무꽃(Sophora Japonica Flower)은 회화나무의 꽃으로서 회화나무는 콩과에 속하는 낙엽활엽교목으로 높이는 25m 정도이며, 소지는 녹색이고 자르면 냄새가 난다. 회화나무는 동맥경화, 장출혈, 자궁출혈, 잇몸염증, 부스럼, 화상, 고혈압, 뇌일혈, 중풍, 손발의 마비 등 순환기계 질병과 치질, 치루통에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 회화나무꽃의 유효성분으로 트록서루틴(Troxerutin)을 함유하고 있다.

본 발명에 따르면, 초음파 진공저온 추출에 의하여 제조된 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물을 유효성분으로서 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~30 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명에 있어서, 상기 초음파 진공저온 추출은 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 혼합물을 추출용매와 함께 밀폐용기에 넣어 진공포장하여 1~5시간 초음파 추출한 후, 30~60℃에서 1~10일 동안 추출하는 것으로 이루어지는 것이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 복합추출물은 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 혼합물을 추출용매인 물과 함께 밀폐용기에 넣어 진공포장한 후, 상온에서 1~5시간 초음파 추출하고, 30~60℃의 저온에서 1~10일 동안 추출하여 제조된다.

상기 혼합물은 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃이 그 건조중량 기준으로 각각 1~10:1~10:1~10:1~10의 비로 혼합되어 이루어지며, 바람직하게는 각각 1~3:1~3:1~2:1~3의 비로 혼합되어 이루어진다. 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃이 그 건조중량 기준으로 각각 1:2:2:3의 비로 혼합되어 추출되는 경우에 가장 우수한 피부 주름, 탄력 개선 및 항산화 활성을 나타내므로 가장 바람직하다.

초음파 진공저온 추출방법에 의하여 제조된 상기 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물은 우수한 엘라스타제 억제, 콜라겐 생합성 촉진 효과 및 MMP-1 생성억제효과(시험예 2, 3, 4)와 DPPH Free Radical 소거효과(시험예 5)를 나타내므로, 이를 유효성분으로 함유하는 상기 화장료 조성물은 피부 주름개선, 탄력개선 및 항산화용으로 유용하게 사용될 수 있다.

유효성분으로서의 상기 복합추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~30 중량% 함유된다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조 될 수 있으며, 그 예로는 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스 등을 들 수 있다.

[실시예]

이하, 하기의 실시예와 시험예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이 예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 감잎 추출물의 제조

건조된 감잎 1kg과 추출용매로서 70% 함수 에탄올 5배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter):30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출분말 200g을 얻었다.

제조예 2: 황금 추출물의 제조

건조된 황금뿌리 1kg과 추출용매로서 70% 함수 에탄올 5배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter):30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출분말을 얻었다.

제조예 3: 눈빛승마 추출물의 제조

건조된 눈빛승마 뿌리 1kg과 추출용매로서 70% 함수 에탄올 5배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

제조예 4: 회화나무꽃 추출물의 제조

건조된 회화나무꽃 1kg과 추출용매로서 70% 함수 에탄올 5배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

제조예 5~7: 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물의 제조

감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃을 아래의 표 1의 중량비로 혼합한 후, 정제수로 세척한 뒤 건조시킨 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 혼합물 1kg과 추출용매로서 70% 함수 에탄올 5배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 혼합물을 추출한 후, 추출액을 300메쉬 여과지로 여과하고 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기기(제품명: Coolace CCA-1100, 제조사: EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후, 스프레이드라이어(모델명:B-290, BUCHI사 제품)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 : 180 ℃, 흡입기(Aspirator) 효율 : 100% (35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 : 25% (7.5㎖/분), 노즐 클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter) : 30㎜ (357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출 분말을 얻었다.

중량비	제조예 5	제조예 6	제조예 7
감잎	1	1	1
황금	3	2	2
눈빛승마	1	2	2
회화나무꽃	1	1	3

실시예 1~3: 초음파 진공저온 추출 공법에 의한 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물의 제조

감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃을 아래의 표 2의 중량비로 혼합한 후, 정제수로 세척한 뒤 건조시킨 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 혼합물 1kg과 추출용매로서 5배 중량의 정제수를 밀폐용기에 넣어 진공 포장하여 초음파추출기로 약 2시간 동안 추출하였다. 이 후 45℃에서, 72시간 동안 저온 추출하였다.

중량비	실시예 1	실시예 2	실시예 3
감잎	1	1	1
황금	3	2	2
눈빛승마	1	2	2
회화나무꽃	1	1	3

시험예 1: 세포 독성 여부 확인

세포 생존율 측정 실험(MTT assay)

MTT assay법은 MTT[3-(4,5-dimethythiasol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 시약이 세포 내로 흡수된 후 미토콘드리아의 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase)에 의해 포마잔(formazan)을 형성하는데 이 물질의 세포 내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하는 것으로써 세포의 생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.

각각의 유전자 발현을 확인하기 위해 세포를 1×10⁵cell/well의 밀도로 96 well에 200㎕ 배지와 함께 분주한 뒤 5% CO₂,37℃ incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 0.1%에서 5.0%까지 다양한 농도에 따라 각 well에 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5㎎/㎖ MTT를 20㎕씩 각 well에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 3시간 동안 5% CO₂및 37℃ 조건의 incubator에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO용액 200㎕를 첨가하여 37℃ incubator에서 1시간 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다. 세포 생존율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

세포생존율(%)=시료첨가군의 흡광도 / 대조군의흡광도 × 100

시료 사용 농도 (㎍/㎖)	세포 생존율(%)
시료 사용 농도 (㎍/㎖)	0	50	100	500	1,000
제조예 1	100	101	101	100	100
제조예 2	101	100	101	100	100
제조예 3	100	100	100	100	100
제조예 4	100	101	100	101	100
제조예 5	101	100	101	100	100
제조예 6	100	100	100	100	100
제조예 7	100	101	100	100	100
실시예 1	101	101	101	100	101
실시예 2	101	100	101	100	100
실시예 3	100	100	100	101	100
대조군 Adenosine	100	100	100	101	101

상기 표 3에서 확인되는 바와 같이 제조예 및 실시예의 시료 모두 세포독성을 나타내지 않아 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.

시험예 2: 엘라스타제 활성 억제 확인

0.1 중량% Elastin-Congo red(Sigma, USA)가 포함된 2.5 중량% agar에 시험시료 및 엘라스타제 효소 용액(1,000 units/mL, Sigma, USA)을 혼합하고 상온에서 10분간 반응시킨 용액 10 ul씩 주입 후 37℃에서 18시간 배양하였다. 배양 종료 후 엘라스타제의 활성에 의해 Elastin-Congo red agar 주변에 투명대가 형성되면 그 헤일로(halo)의 직경을 측정하여 엘라스타제 활성 저해 효과를 측정할 수 있다.

엘라스틴을 포함하는 한천배지에 엘라스타제만을 적가하는 한편, 제조예, 실시예의 농도가 각각 0.5, 1.0 및 2.0% 되는 용액을 시료로 하여 엘라스타제와 함께 적가하여 배지 상에 나타나는 헤일로(halo)의 직경을 측정하여 시료의 엘라스타제 저해활성을 측정하였으며, 대조예로서 Retinol crystal을 엘라스타제와 함께 적가하여 비교하였다. 상기 시험결과를 하기의 표 4에 나타내었다.

시료농도 (%)	Halo diameter(cm)
시료농도 (%)	0.5	1.0	2.0
제조예 1	1.8	1.7	1.7
제조예 2	1.7	1.5	1.8
제조예 3	1.5	1.3	1.3
제조예 4	1.4	1.3	1.4
제조예 5	1.5	1.3	1.1
제조예 6	1.5	1.3	1.1
제조예 7	1.5	1.4	1.1
실시예 1	1.2	1.1	1.0
실시예 2	1.2	1.1	1.1
실시예 3	1.1	1.0	0.8
Elastase	1.8
Retinol crystal	0.8

헤일로 직경(Halo diameter)이 클수록 엘라스틴의 분해가 많이 된 것인데, 상기 표 4에서 확인되는 바와 같이, 제조예 2 내지 7 및 실시예 1 내지 3을 처리했을 때 헤일로 직경(halo diameter)이 감소하는 것으로 나타나 엘라스타제 억제활성을 가짐을 알 수 있었다. 진공 저온 추출공법에 의하여 제조된 실시예 1 내지 3의 복합추출물에서 더욱 우수한 억제활성을 나타내었으며, 실시예 3의 복합추출물에서 가장 우수한 효과를 나타내었다.

시험예 3: 콜라겐 생합성 촉진 효과 확인

섬유아세포를 10% FBS를 첨가한 IMDM 배지에 5×10⁵의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양하여 상기 제조예 및 실시예의 추출물을 농도가 각각 0.5, 1.0 및 2.0%가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 18시간 동안 동일 조건에서 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 섬유아세포를 회수하여 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 PROCOLLAGEN TYPEⅠ유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현 양을 확인하였으며, 유전자 증폭은 thermal cycler(GenePro, Hangzhou bioer tech., CHINA)를 사용하여 10x taq polymerase buffer, 10 mM dNTP, 10 pmol primer (F: AGC CAG CAG ATC GAG AAC AT, R: TCT TGT CCT TGG GGT TCT TG), taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 uL로 조정 후 95도 5분 1cycle/95도 1분/51도 2분/72도 1분 28 cycle 증폭, 72도에서 5분간 반응하는 조건으로 수행하였다. 생성된 procollagen의 발현율은 하기 식에 따라 계산하였으며, 대조군으로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사하지 않은 정상 섬유아세포를 사용하였다.

procollagen 발현율(%) = B/A × 100

A: 상기 대조군에서의 procollagen 발현 양

B: 시료 처리 및 UV조사 섬유아세포의 procollagen 발현 양

시료 농도(%)	procollagen 발현율
시료 농도(%)	0.5	1.0	2.0
제조예 1	32.2	46.5	59.6
제조예 2	35.6	39.1	46.5
제조예 3	41.2	49.5	60.3
제조예 4	45.6	56.8	69.5
제조예 5	48.6	59.5	65.3
제조예 6	34.6	41.3	62.3
제조예 7	50.2	60.3	75.3
실시예 1	70.3	81.2	89.6
실시예 2	75.6	82.3	91.3
실시예 3	152.3	160.5	180.2

상기 표 5에서 확인되는 바와 같이, 실시예의 복합추출물은 제조예의 시료와 비교하여 볼 때 더욱 우수한 콜라겐 생합성 촉진효과를 나타내었다.

시험예 4: MMP-1 생성억제효과 확인

인간 정상 피부세포인 섬유아세포(한국 세포주 은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc. 덴마크)에 각 웰 당 1st 10⁶세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후, 상기 제조예 및 실시예의 추출물을 농도가 100, 500, 1,000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가한 후 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(㎍/㎖)을 측정하였다. MMP-1 생성 억제율의 양성 대조군으로 TGF-β(10㎎/㎖, Roche, 미합중국)을 사용하였다. 하기 식에 따라 MMP-1 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

MMP-1 생성억제율(%) = [1-(B/A)] × 100

A : 대조군의 MMP-1의 양

B : 실험군의 MMP-1의 양

시료 농도 (㎍/㎖)	MMP-1 생성 억제율(%)
시료 농도 (㎍/㎖)	100	500	1,000
제조예 1	21.3	39.6	45.6
제조예 2	24.6	35.6	46.8
제조예 3	25.8	34.7	49.5
제조예 4	31.2	38.2	51.2
제조예 5	29.5	41.2	50.6
제조예 6	33.6	39.4	52.6
제조예 7	32.5	46.5	53.6
실시예 1	31.2	48.9	68.9
실시예 2	34.5	50.6	71.5
실시예 3	41.2	71.5	90.4
TGF-β	44.3	75.6	94.6

시험예 5 :DPPH free radical 소거능 측정

DPPH free radical 소거능은 Nanjo et al.(1996)의 방법에 따라 측정하였다. 시료 30㎕에 60μM DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 30㎕를 혼합 후, 반응액을 100㎕ quartz capillary tube에 옮겨 2분 후 electron spin resonance(ESR) spectrometer(JES-FA, JEOL Ltd., Tokyo, Japan)로 측정하였다. 실험조건은 다음과 같다. magnetic field, 336.5±5 mT; power, 5 mW; modulation frequency, 9.41 GHz; amplitude, 1×1,000; sweep time, 30 s; temperature, 298 K. DPPH radical 소거능은 H 와 H₀의 상대적인 radical signal peak 높이의 차에 의하여 계산하였다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 대조군으로 Ascorbic acid를 사용하였다.

시료 농도(%)	Radical scavenging activity(%)
시료 농도(%)	0.1	0.5	1
제조예 1	40	49	61
제조예 2	43	52	62
제조예 3	38	55	64
제조예 4	37	59	68
제조예 5	42	56	61
제조예 6	43	58	65
제조예 7	47	55	60
실시예 1	56	62	71
실시예 2	68	74	80
실시예 3	70	85	92
Ascorbic acid	95	97	98

상기 표 7에서 확인되는 바와 같이 진공 저온 추출공법에 의하여 제조된 실시예 1 내지 3의 복합추출물에서 더욱 우수한 억제활성을 나타내었으며, 실시예 3의 복합추출물에서 가장 우수한 항산화 효과를 나타내었다.

제형 실시예 1: 스킨로션의 제조

하기 표 8의 조성에 따라, 통상의 방법으로 본 발명 실시예의 복합추출물을 함유한 스킨로션 1kg을 제조하였다.

원료	함량(중량%)
복합추출물(실시예 3)	1.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제	미량
색소	미량
향료	미량
정제수	잔량

제형 실시예 2: 영양로션의 제조

하기 표 9의 조성에 따라, 통상의 방법으로 본 발명 실시예의 복합추출물을 함유한 영양로션 1kg을 제조하였다.

원료	함량(중량%)
복합추출물(실시예 3)	1.0
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
유동 파라핀	10.0
소르비탄 스테아레이트	1.0
친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제	미량
색소	미량
향료	미량
정제수	잔량

시험예 6: 제형안정도 확인

상기 제형 실시예에서 제조한 제형에 대하여 실온(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(50℃)으로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 분리)하며, 안정성을 확인 하였다. 결과는 표 10에 나타내었다.

온도조건	안정성 확인(변색, 변취 및 분리)
온도조건	제형 실시예 1	제형 실시예 2
실온(25℃)	0	0
냉장(4℃)	0	0
항온(50℃)	0	0

< 제형 안정 등급 >

0: 변화 없음 1: 미세한 변화 2: 변화 3: 극심한 변화

Claims

감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃이 그 건조중량 기준으로 각각 1:2:2:3의 비로 혼합되어 이루어지는 혼합물을 추출용매와 함께 밀폐용기에 넣어 진공포장하여 1~5시간 초음파 추출한 후, 30~60℃에서 1~10일 동안 추출하여 제조된 감잎, 황금, 눈빛승마 및 회화나무꽃 복합추출물을 유효성분으로서 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~30 중량% 함유하는 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글라이콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 주름개선, 탄력개선 및 항산화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.