KR102246644B1

KR102246644B1 - 그라실린을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102246644B1
Application number: KR1020180147241A
Authority: KR
Inventors: 양민혜
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2018-11-26
Filing date: 2018-11-26
Publication date: 2021-04-30
Also published as: KR20200061671A

Abstract

본 발명은 그라실린을 유효성분으로 함유하는 조성물을 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 그라실린은 2,4-디니트로클로로벤젠(DNCB)으로 유도된 아토피 피부염 동물모델에서 IgE 또는 IL-4의 발현을 저해시키고, β-헥소사미니데이스의 탈과립화를 억제하여 아토피 피부염의 증상을 완화시키는 것으로 확인됨에 따라, 상기 그라실린을 유효성분으로 함유하는 조성물은 아토피 피부염을 예방하거나 치료하기 위한 약학조성물, 화장료 조성물 및 건강식품으로 제공될 수 있다.

Description

그라실린을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising gracillin}

본 발명은 그라실린을 유효성분으로 함유하는 조성물을 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

아토피는 아토피 유발인자를 보유하고 있는 개인에게서 피부, 호흡기 점막, 안점막, 장점막 등에 나타나는 일련의 알레르기 증상을 의미한다.

아토피 유발인자를 보유하고 있는 사람은 집 먼지, 진드기, 동물의 털, 음식물, 꽃가루, 곰팡이와 같은 특정한 물질과 접촉하였을 때 가려움증, 피부발작, 두드러기, 혈관부종, 재채기, 콧물, 코막힘 등의 증상을 나타낸다.

아토피 유발인자에 의한 알레르기 질환으로는 아토피 피부염, 알레르기성 비염, 천식, 알레르기성 결막염, 아토피성 두드러기 등이 있으며, 이들 질환이 환자 개개인의 유전적 요인, 환경, 연령 등에 따라 단독 또는 여러 질환이 동시에 나타날 수 있으며, 아토피 피부염은 아토피 알레르기를 가진 사람에게서 나타나는 대표적인 알레르기 질환이다.

이러한 아토피성 피부염은 전세계적으로 널리 분포된 질환으로 현재 일반인의 0.7%, 5세 이하 소아의 3-5%가 앓고 있으며, 환경적인 요인으로 인하여 매년 그 수가 급증하고 있다.

아토피 피부염의 매거니즘을 살펴보면, 알레르겐이 각질층을 통해 침입하여 표피세포에 이르게 되면 마크로파지가 이를 포식하여 분해하게 된다. 이때 침입한 알레르겐의 양이 많아 마크로파지가 모두 처리하지 못한 경우, 미처 처리되지 못한 알르르겐의 존재에 대한 정도를 T 세포에 보내주고, T 세포는 그 정보를 호산구에 전하여 혈중에 널리 분포된 호산구를 알레르겐이 침입한 장소로 불러모으게 된다.

이렇게 환부에 집적된 호산구가 화학전달물질을 과잉으로 방출시켜 염증이 일어나게 되는데 이것이 바로 알레르기 반응의 원인이 된다.

현재 아토피 피부염의 유발 및 악화를 방지하기 위해 사용되고 있는 치료약 중 스테로이드제는 소염작용 및 면역억제 작용에 우수한 효과를 나타내고 있지만 장기간 사용할 경우 적용 부위에 털이 나고 피부가 위축될 수 있으며, 피부 색소가 적어지고 세균감염이 발생하여 여드름이 돋고 피부가 얇아지고 모세혈관이 두드러지는 등의 부작용이 발생할 수 있으며, 심한 경우 호르몬에 의한 전신증상이 나타날 수 있으며 약을 중지하면 증상이 악화되는 스테로이드제 내성이 나타낼 수 있다.

이에 따라, 종래의 아토피 피부염 치료제의 문제점을 해결하기 위해 인체에 안전하고 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있는 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2016-0103655호 (2016.09.02. 공개)

본 발명은 종래의 아토피 피부염 치료제로 사용되고 있는 스테로이드제의 부작용을 해결하기 위해, 천연물 유래 화합물인 그라실린을 이용하여 스테로이드 내성이 없는 안전하고 효과적인 아토피 피부염 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 그라실린(gracillin)을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명은 화학식 1로 표시되는 그라실린(gracillin)을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 그라실린(gracillin)을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 단풍마 추출물로부터 분리된 그라실린은 2,4-디니트로클로로벤젠(DNCB)으로 유도된 아토피 피부염 동물모델에서 IgE 또는 IL-4의 발현을 저해시키고, β-헥소사미니데이스의 탈과립화를 억제하여 아토피 피부염의 증상을 완화시키는 것으로 확인됨에 따라, 상기 그라실린을 유효성분으로 함유하는 조성물은 아토피 피부염을 예방하거나 치료하기 위한 약학조성물, 화장료 조성물 및 건강식품으로 제공될 수 있다.

도 1은 그라실린(gracillin) 화합물의 구조이다.
도 2는 DNCB 유도성 아토피 동물 모델을 이용한 동물실험 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 RBL-2H3 세포에서 PI로 유도된 염증성 인자들의 발현에 대한 그라실린 억제 효과를 확인한 결과로, 도 3(a)는 IL-4 mRNA 발현 억제 효과를 확인한 PCR 결과이며, 도 3(b)는 β-헥소사미니데이스(β-Hexosaminidase) 방출 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 DNCB 유도성 아토피 피부염 마우스에서 그라실린의 아토피 피부염 발병 저해 효과를 확인한 결과로, CON: 대조군; DNCB: 0.1% DNCB 적용군; DNCB/gracillin: 0.1% DNCB 적용 및 1% 그라실린 적용군을 나타낸다.
도 5는 DNCB 유도성 아토피 피부염 마우스에서 그라실린의 피부장벽개선활성을 확인한 결과로, CON: 대조군; DNCB: 0.1% DNCB 적용군; DNCB/gracillin: 0.1% DNCB 적용 및 1% 그라실린 적용군을 나타낸다.
도 6은 헤마톡실린 & 에오신(Hematoxylin & eosin) 및 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색한 마우스 등 조직 병변의 조직병리학적 특성을 확인한 결과로, CON: 대조군; DNCB: 0.1% DNCB 적용군; DNCB/gracillin: 0.1% DNCB 적용 및 1% 그라실린 적용군을 나타내며, 화살표는 비만세포를 나타내며, SC: 피부각질층(stretum corneum), SG: 과립층(stretum granulosum), SS: 유극층(stretum spinosum), SB: 표피 기저층(stretum basale)을 나타낸다.
도 7은 DNCB 유도성 아토피 피부염 마우스에서 그라실린의 혈장 내 IgE/IL-4 저해 활성을 확인한 결과로, CON: 대조군; DNCB: 0.1% DNCB 적용군; DNCB/gracillin: 0.1% DNCB 적용 및 1% 그라실린 적용군을 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 아토피 피부염 치료제로 사용되고 있는 스테로이드제의 부작용을 해결하기 위해, 보다 효과적이고 생체에 안전한 치료방법을 연구하던 중 단풍마 추출물로부터 분리한 그라실린이 면역 교란물질인 2,4-디니트로클로로벤젠(DNCB)으로 유도된 아토피 피부염 동물모델의 홍반, 출혈, 건조, 흉터, 태선화 및 짓무름과 같은 아토피 피부염 증상을 매우 효과적으로 완화시키는 것을 확인함에 따라, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 그라실린(gracillin)을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

[화학식 1]

상기 그라실린은 단풍마 추출물의 n-부탄올 분획으로부터 분리된 것일 수 있으며, 상기 단풍마 추출물은 물, C1 내지 C4의 알콜 또는 이들의 혼합용매에서 추출되는 것일 수 있다.

보다 상세하게는 건조된 단풍마(Dioscorea quinqueloba Thunb.)의 근경(rhizome) 20kg에 95% 에탄올을 가하여 3시간 동안 3회 초음파 추출하고, 상층액을 여과지로 여과한 후 40℃ 이하에서 감압 농축하여 670g의 추출물을 수득하였다.

수득한 단풍마 근경 95% 에탄올(EtOH) 추출물을 증류수에 현탁한 후 n-부탄올(butanol)로 분획하여 n-부탄올 분획물 300 g을 수득하고, 상기 n-부탄올 분획물에 대하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 14개의 소분획(DQB1~DQB14)으로 나누었다. 소분획 중 DQB8을 메탄올(MeOH)에 현탁한 후 여과지로 여과하여 도 1과 같은 그라실린(2.637 g)을 결정으로 분리하였다.

상기 그라실린은 IgE 또는 IL-4의 발현을 저해시키고, β-헥소사미니데이스의 탈과립화를 억제할 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 그라실린을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 그라실린을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 그라실린의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 그라실린(gracillin)을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 건강식품을 제공할 수 있다.

상기 건강식품은 상기 그라실린 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 그라실린(gracillin)을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 유효성분인 그라실린 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜,실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예 1> 세포배양

랫 호염기성 백혈구 세포(Rat basophilic leukemia cell)인 RBL-2H3 세포를 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank; Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였으며, 10% 태아소혈청(FBS; HyClone Laboratories, Logan, UT, USA)와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, PS; Hyclone)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle Medium; Hyclone)배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건하에 배양하였다.

<실험예 2> 통계

각 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, 평균치간의 유의성은 one-way analysis of variance (ANOVA) 를 이용한 후 p값이 0.05미만일 때 유의한 것으로 판단하였다.

< 실시예 1> 단풍마 근경으로부터 그라실린 ( grracillin ) 분리

건조된 단풍마(Dioscorea quinqueloba Thunb.)의 근경(rhizome) 20kg에 95% 에탄올을 가하여 3시간 동안 3회 초음파 추출하였다.

상층액을 여과지로 여과한 후 40℃ 이하에서 감압 농축하여 670g의 추출물을 수득하였다 (수율: 3.35%).

수득한 단풍마 근경 95% 에탄올(EtOH) 추출물을 증류수에 현탁한 후 n-부탄올(butanol)로 분획하여 n-부탄올 분획물 300 g을 수득하였다.

상기 n-부탄올 분획물에 대하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (CH₂Cl₂-MeOH 10:1 → MeOH 100%, gradient system)를 수행하여 14개의 소분획(DQB1~DQB14)으로 나누었다. 소분획 중 DQB8을 MeOH에 현탁한 후 여과지로 여과하여 도 1과 같은 화학식 구조의 그라실린(2.637 g)을 결정으로 분리하였다.

< 실시예 2> 그라실린의 IL-4 mRNA 발현 억제 효과 확인

활성화된 비만 세포에서 분비되는 Th2 사이토카인인 IL-4는 전염증신호분자(pro-inflammatory signal molecule)의 발현을 촉진시켜 알러지 반응을 유도하는 것으로 알려져있으므로, 단풍마로부터 분리된 그라실린이 RBL-2H3 세포에서 이오노마이신(PI)으로 유도된 IL-4의 발현에 미치는 영향을 확인하였다.

배양된 RBL-2H3 세포를 3×10⁵ cells/well의 밀도로 6-웰 플레이트에 분주하고 배양기에서 16시간 배양한 후, 그라실린을 1, 3, 10 및 30 μM의 농도로 첨가하여 30분 동안 반응시켰다. 이후 최종농도 50 ng/ml의 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)와 1 μM 이오노마이신(Ionomycin; PI)을 가하여 9시간 반응시키고, PBS로 세척한 후 easy-BlueTM total RNA extraction Kit(iNTRON Biotechnology, Seoul, Korea)을 사용하여 전체 RNA를 추출하였다.

추출한 RNA는 Agilent 2100 BioAnalyzer(Agilent Technologies, SantaClara, CA, USA)를 사용하여 무결성(integrity)을 확인하였으며, cDNA는 ImProm-II Reverse Transcription System(Promega, Madison, WI,USA)을 이용하여 합성하였다.

PCR은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 수행하였으며, PCR 산물을 1.2% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 유전자 발현 정도를 확인하였다. 밴드의 강도는 SigmaGel(Jandel Scientific, san Fafael, CA, USA) 소프트웨어로 분석 정량하였다. 사용된 프라이머의 염기서열은 IL-4 정방향: 5'-ACC TTG CTG TCA CCC TGT TC-3'; IL-4 역방향: 5'-TTG TGA GCG TGG ACTCAT TC-3'; β-actin 정방향: 5'-TCA TCA CCA TCG GCA ACG-3', β-actin 역방향: 5'-TTC CT GAT GTC CAC GTC GC-3'이었다.

그 결과, 도 3A와 같이 30 μM 농도의 그라실린이 첨가된 실험군에서 IL-4 mRNA 발현이 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> 그라실린의 β- 헥소사미니데이스 (β- Hexosaminidase ) 방출 억제 효과 확인

β-헥소사미니데이스(β-Hexosaminidase)는 비만세포나 호염구의 과립안에 존재하며 천식, 비염과 같은 알러지 반응에 의해 세포 밖으로 분비됨에 따라, 탈과립 지표로 이용되어 알러지 억제물질의 생리활성 측정에 유용하게 사용되고 있다.

이에 따라, 그라실린의 탈과립 억제 효과를 확인하기 위해 RBL-2H3 세포에서 β-헥소사미니데이스 방출 저해 활성을 확인하였다.

먼저, 0.5 μg/ml 농도의 디니트로페닐-면역글로불린 E (dinitrophenyl-immunoglobulin E; DNP-IgE)를 함유한 DMEM 배지를 사용하여, 24-웰 플레이트에 RBL-2H3 세포를 2×10⁵ cells/well의 밀도로 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 12시간 배양하였다. 각 세포들을 시라가니안 완충용액 (Siraganian buffer; 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 5.6 mM 글루코스, 0.4 mM MgCl₂, 25 mM PIPES, 1 mM CaCl₂, 0.1% BSA, pH 7.2)로 2회 세척하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 동일한 완충용액으로 10분간 사전 배양하였다.

사전 배양 후 그라실린을 1, 3, 10 및 30 μM의 농도로 세포에 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 DNP-BSA(DNP-bovine serum albumin)를 최종 농도 100 μg/ml이 되도록 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 2시간 반응시키고, 얼음 수조에서 10분간 배양시켜 반응을 종결시켰다.

상층액 40 μl를 96-웰 플레이트에 옮기고 기질 완충용액(substrate buffer; 2 mM 4-p-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글루코사미니드(4-p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide), 0.05 M 구연산 나트륨 (Sodium citrate, pH 4.5) 40 μl를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양시킨 다음 각 웰당 정지용액 (0.1 M Na₂CO₃/NaHCO₃, pH 10.5) 200 μl를 첨가하여 반응을 종결시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 3B와 같이 무처리 대조군과 비교하여 IgE와 DNP-BSA가 처리된 RBL-2H3 세포군에서는 약 3.2배 탈과립이 증가한 반면, 그라실린 30 μM가 처리된 RBL-2H3 세포군에서는 탈과립 증가가 31.8% 감소한 것을 확인되었다.

< 실시예 4> 그라실린의 아토피성 피부염 개선 효과 확인

1. 실험동물 준비

6주령 암컷 SKH-1 hairless mice를 오리엔트바이오(Orient Bio Inc., Seongnam, Republic of Korea)로부터 분양받아 대조군(CON), 0.1% 2,4-디니트로클로로벤젠(dinitrochlorobenzene; DNCB) 적용군 (DNCB), 0.1% DNCB 및 1% 그라실린 적용군(DNCB-gracillin)으로 나누어 1주일간 환경 및 먹이 적응 기간을 거친 후 사용하였으며, 물과 식이는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험의 모든 과정은 KIST 동물실험윤리위원회의 허가(승인번호: KIST-2016-011)를 얻은 후 가이드라인에 의거하여 실험을 진행하였다.

2. 아토피 동물모델을 이용한 아토피성 피부염 개선효과 확인

그라실린에 의한 아토피 염증 완화 효과를 in vivo에서 확인하기 위해 2,4-디니트로클로로벤젠 (DNCB)을 처리한 아토피 모델 마우스를 이용하였다.

먼저, 도 2와 같은 과정으로 SKH-1 hairless mouse의 등에 용매(프로필렌글리콜:EtOH = 7:3)에 1% 농도로 녹인 DNCB를 매일 1회 1주일간 도포하고, 1주일 후부터 0.1%의 DNCB를 3일 간격으로 2주간 도포하여 아토피성 유사 피부염을 유발시켰다.

그 후, 그라실린의 아토피 피부염 개선효과를 측정하기 위해 1% 농도의 그라실린을 매일 2회 2주간 도포하였다. 대조군(CON)에는 DNCB 대신 증류수를, 0.1% DNCB 적용군(DNCB)에는 부형제를 대조 시료로 사용하였으며, 실험 개시 3주 후에 피부염 상태를 육안으로 관찰하여 홍반, 부종, 찰과, 각질, 태선화, 습진 정도를 평가하였다.

그 결과, 도 4와 같이 DNCB 아토피성 피부염 유발군에서는 홍반, 건선, 짓무름 등이 발병하여 전형적인 아토피성 피부염 증상이 확인된 반면, 1% 그라실린 투여군에서는 아토피성 피부염의 증상이 현저하게 감소되는 것이 확인되었다.

또한, 그라실린 투여에 의한 피부장벽 개선효과를 확인하기 위해, 피부 장벽 상태를 경표피수분손실량으로 확인하였다.

경표피수분손실량은 Tewameter TM 210® (Courage-Khazaha, Kφln, Germany)을 사용하였으며, 보습효과를 SKIN-O-MAT (Cosmomed, Ruhr, Germany)로 매주 측정하였다.

그 결과, 도 5와 같이 그라실린 투여군에서 경표피수분손실량이 현저하게 개선되어 건조증이 대조군 수준으로 회복되는 되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5> 조직병리학적 분석을 통한 그라실린의 아토피성 피부염 개선 효과 확인

앞선 실험에서 사용된 SKH-1 hairless 아토피 피부염 마우스의 등 쪽 부분의 피부를 적출하여 포르말린에 고정 후 파라핀에 넣어 5㎛ 두께의 연속 절편 조직을 만들었다.

조직 부분을 사용하여 염증을 일으키는 표피(epidermis), 진피(dermis), 각질형성세포(keratinocytes), 호중구(neutrophils)/호산구(eosinophil) 그 외 다른 세포와 부종을 식별하기 위해 헤마톡실린 & 에오신 (H&E) 염색을 수행하였으며, 비만 세포 (mast cells)를 염색하는 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색을 수행하여 면역세포의 침윤을 확인하였다.

그 결과, 도 6과 같이 DNCB가 처리된 대조군의 등 두께가 정상군의 3.4배 이상인 것으로 확인되었으며, 정상군에 비해 혈관이 확장되어 있고 조직의 각질층 또한 확연히 두껍게 형성된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과는 피부에 아토피가 발병하였을 때 비만세포가 침윤되어 분비된 TNF-α 등이 각질 형성세포의 NF-κB를 활성화시켜 피부의 각질을 두껍게 형성하기 때문이다.

반면, 1% 그라실린이 처리된 경우, 마우스의 등 두께 증가 및 침윤된 임파구 수가 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었으며, 대조군과 비교하여 1% 그라실린 처리군이 혈관의 두께와 내부조직에 있어 훨씬 안정된 형태를 나타내었다.

상기 결과로부터 그라실린은 아토피 피부염의 조직 보호 유지에 영향을 미치는 것으로 확인되었다.

< 실시예 6> 아토피 피부염 마우스 동물의 혈장내 IgE 및 사이토카인 분비 억제 효과 확인

IgE의 과발현은 아토피 질환의 가장 대표적인 표식으로, B cell 에서 생성되는 IgE는 IL-4와 Th2 cell에 의해서 생산이 더욱 촉진된다. 3주간의 실험 후 SKH-1 hairless 마우스의 혈장으로부터 IgE 및 IL-4의 함량을 ELISA로 확인하였다.

먼저, 마우스의 복부 대동맥에서 혈액을 채취하여 10,000 rpm에서 15분간 원심 분리로 얻은 혈청을 모아 -70℃의 냉동고에 보관하였으며, 상용화된 ELISA set(eBioscience, San Diego, USA)를 이용하여 혈청 IgE 및 IL-4를 측정하였다.

그 결과, 도 7과 같이 DNCB에 의해 IgE 및 IL-4의 생성이 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다. 반면, 그라실린이 처리된 실험군에서는 혈중 IgE 및 IL-4 농도가 각각 36.9% 및 24.4%까지 감소되었다.

상기 결과로부터 그라실린은 알러지와 관련된 IgE 및 Th2 사이토카인인 IL-4를 억제함으로써 T 임파구의 과도한 증식을 억제하여 아토피 피부염 등의 알러지 질환에 치료 효과를 나타내는 것이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 그라실린(gracillin)을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물.
[화학식 1]
청구항 1에 있어서, 상기 그라실린은 단풍마 추출물의 n-부탄올 분획으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 단풍마 추출물은 물, C1 내지 C4의 알콜 또는 이들의 혼합용매에서 추출되는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 그라실린은 IgE 또는 IL-4의 발현을 저해시키고, β-헥소사미니데이스의 탈과립화를 억제하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 그라실린(gracillin)을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 건강식품.
[화학식 1]
하기 화학식 1로 표시되는 그라실린(gracillin)을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
[화학식 1]