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KR102220382B1 - 면역요법을 위한 매우 활성인 ｔ 세포를 조작하는 방법 - Google Patents

면역요법을 위한 매우 활성인 ｔ 세포를 조작하는 방법 Download PDF

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KR102220382B1
KR102220382B1 KR1020157035439A KR20157035439A KR102220382B1 KR 102220382 B1 KR102220382 B1 KR 102220382B1 KR 1020157035439 A KR1020157035439 A KR 1020157035439A KR 20157035439 A KR20157035439 A KR 20157035439A KR 102220382 B1 KR102220382 B1 KR 102220382B1
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아네스 구블
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앤드류 샤렌버그
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Abstract

본 발명은 면역요법을 위한 조작된 T-세포들의 개발 방법들, 그리고 더욱 특이적으로 T-세포 면역 활성을 증가시키기 위하여 면역 체크포인트 유전자들, 바람직하게는 다른 경로들로부터 선택되는 적어도 두 개를 불활성화시킴으로써, T-세포들을 변형하기 위한 방법들에 대한 것이다. 이 방법은 특이적 희귀 절단 엔도뉴클레아제들, 특히 일차(primary) 세포들의 배양으로부터 또는 도너들(donors)로부터 이용가능한, T-세포들에서 주요(key) 유전자들의 선택을 정확하게 타겟으로 하기 위하여, 이러한 폴리펩타이드들를 코드하는 폴리뉴클레오타이드들 및 TALE-뉴클레아제들 (TAL 이펙터(effector) 엔도뉴클레아제)의 사용을 포함한다. 본 발명은 암 및 바이러스 감염들을 치료하기 위한 매우 효율적인 입양 면역요법(immunotherapy) 전략으로의 길을 연다.

Description

면역요법을 위한 매우 활성인 Ｔ 세포를 조작하는 방법{METHODS FOR ENGINEERING HIGHLY ACTIVE T CELL FOR IMMUNOTHERAPY}
본 발명은 면역요법(immunotherapy)을 위한 조작된(engineered) T-세포들을 발달시키는 방법들, 그리고 더욱 특이적으로, T-세포 면역 활성을 증강시키고 억제 메커니즘들을 피하기 위하여, 다른 경로들로부터 선택되는, 바람직하게는 적어도 두 개인, 면역 체크포인트 유전자들을 불활성화시킴으로써 T-세포들을 변형(modify)하기 위한 방법들에 대한 것이다. 이 방법은 일차(primary) 세포들 또는 도너들(donors)로부터 이용가능한, T-세포들 내 주요(key) 유전자들의 선택가능한 것(selection)을 정확히 타겟하도록, 폴리뉴클레오타이드들 및 특히 TALE-뉴클레아제들 (TAL 이펙터(effector) 엔도뉴클레아제들(endonuclease))인, 특정 희귀 절단 엔도뉴클레아제들의 이용을 수반한다. 본 발명은 암(cancer) 및 바이러스 감염들을 치료하기 위한 매우 효율적인 입양(adoptive) 면역요법(immunotherapy) 전략들에의 길을 연다.
엑스 비보(ex vivo)에서 만들어지는 자가(autologous) 항원-특이적 T 세포들의 이동을 수반하는 입양(adoptive) 면역요법(immunotherapy)은 바이러스 감염들 및 암을 치료하는 유망한 전략이다. 입양 면역요법에 사용되는 T 세포들은 유전자 조작을 통한 T 세포들의 방향수정(redirection) 또는 항원-특이적 T 세포들의 확대(expansion)에 의하여 만들어질 수 있다(Park, Rosenberg et al. 2011). 바이러스 항원 특이적 T 세포들의 이동은 희귀 바이러스-관련 악성종양들(malignancies) 및 바이러스 감염들과 관련된 이식의 치료에 사용되는 잘 자리잡은 절차이다. 유사하게 종양(tumor) 특이적 T 세포들의 이동 및 분리는 흑색종(melanoma)을 치료하는데 성공적인 것으로 보여져 왔다.
T 세포들의 신규한 특이성들은 키메라(chimeric) 항원(antigen) 수용체들(receptors) (CARs) 또는 형질전환(transgenic) T 세포 수용체들의 유전적 이동을 통하여 성공적으로 만들어져왔다(Jena, Dotti et al. 2010). CAR들은 단일 융합(fusion) 분자 내 하나 또는 그보다 많은 신호 도메인들(domains)과 관련된 타겟팅 모이어티(moiety)로 구성되는 합성(synthetic) 수용체들이다. 일반적으로 CAR의 결합(binding) 모이어티는, 플렉시블(flexible) 링커(linker)에 의하여 연결된(join) 단일클론 항체의 가벼운(light) 가변(variable) 단편들(fragment)을 포함하는, 단일(single)-사슬(chain) 항체(antibody)(scFv)의 항원-결합 도메일으로 구성된다. 수용체 또는 리간드 도메인들에 기초한 결합 모이어티들은 또한 성공적으로 사용되어 왔다. 일 세대 CAR들을 위한 신호 도메인들은 Fc 수용체 감마 사슬들 또는 CD3제타(zeta)의 세포질 영역으로부터 유래된다. CAR들은 림프종들(lymphomas) 및 고형 종양들을 포함하는 다양한 악성 종양들로부터 종양 세포들의 표면에서 발현되는 항원들에 향하여 T 세포들이 전용되는(redirect) 것을 성공적으로 허용하여 왔다(Jena, Dotti et al. 2010).
T-세포 매개(mediated) 면역은 면역 반응을 미세조정하는 공자극 및 억제 신호들 사이의 균형에 의하여 조정되는 복수의 순차적 단계들을 포함한다. 면역 체크포인트들(checkpoints)로서 언급되는 억제 신호들은 면역-매개 부수적인(collateral) 조직 손상을 제한하는데 그리고 또한 자기면역관용(self-tolerance)에 결정적이다. 이들 억제 경로들을 끌어들이는(co-opt) 종양들의 능력은 면역 저항(resistance)의 중요한 메커니즘을 나타내고, 그리고 면역 요법의 성공을 제한한다. 치료적 T-세포 면역 반응을 활성화시키는 유망한 접근들 중 하나는 이들 면역 체크포인트들의 차단이다(Pardoll 2012). 면역 체크포인트들은 암에서 기능적 세포 면역의 활성화의 중요한 장벽들을 나타내며, 그리고 프로그램된(programmed) 죽음(death)-1 (PD-1) 및 CTLA4를 포함하는 T 세포들 상 억제 리간드들에 특이적인 길항적(antagonistic) 항체들은 임상에서 평가되는 타겟되는 제제들의 예들이다.
세포독성(Cytotoxic)-T-림프구(lymphocyte)-관련(associated) 항원(antigen) 4 (CTLA-4; CD152로도 알려져 있음)은 T 세포 활성화의 진폭(amplitude)을 하향조절하고 그리고 길항제(antagonist) CTLA4 항체들(이필리무맙(ipilimumab))은 흑색종을 가진 환자들에서 생존 이익을 보여 왔다(Robert and Mateus 2011). 프로그램된(Programmed) 세포(cell) 죽음(death) 단백질(protein) 1 (PD1 또는 CD279로도 알려진 PDCD1)은 면역요법의 또다른 매우 유망한 타겟을 나타낸다(Pardoll and Drake 2012; Pardoll 2012). CTLA-4과 대조적으로, PD1은 자가면역을 억제하고, 감염에 대한 염증 반응의 때에 말초(peripheral) 조직에서의 T 세포 이펙터(effector) 기능을 제한한다. PD1 항체로 하는 첫 번째 임상 실험은 종양 퇴보(regression)의 몇몇 케이스들을 보여준다 (Brahmer, Drake et al. 2010). 복수의 추가의 면역 체크포인트 단백질들은 최근 연구에 기초한 치료적 차단(blockade)에 대한 유망한 타겟들을 나타낸다.
이들 면역 체크포인트 단백질들 신호에 의한 정확한 분자적 경로들이 저조하게 이해됨에도 불구하고, 면역-체크포인트 단백질들은 T-세포 활성화(activation)를 억제하기 위한 분명한 메커니즘들을 이용하고 잠재적으로 불필요하지 않은(non-redundant) 것으로 보인다. 복수의 면역 체크포인트 리간드들(ligands) 또는 수용체들(receptors)을 차단하기 위한 적어도 두 개의 다른 항체들의 이용은 시너지적인(synergic) 항종양 활성들을 생산하는것으로 보여 왔다. 그럼에도 불구하고 유해사례들(adverse events)의 비율은 CTLA-4/PD-1 항체 요법(therapy) 조합으로 치료된 환자들에서 증가되었다(Wolchok, Kluger et al.).
항체 종양(tumor) 치료들의 유해사례들(adverse events)을 피하기 위하여, 본 발명자들은 면역-체크포인트 단백질들을 코드하는 적어도 두 개의 유전자들을 불활성화시킴으로써 면역요법(immunotherapy)을 위한 매우 활성인 T-세포들을 조작하기 위하여 시도하였다. 항체 치료에 의하여 매개되는 면역-체크포인트 차단(blockade)에 반하여, 체크포인트 신호 경로들은 면역요법(immunotherapy)을 위하여 사용되는 조작된 T-세포들에서 특이적으로 차단되고, 그리고 환자의 면역 체계에 대한 항체들의 비-특이적 효과들 때문인 유해사례들(adverse events)이 피해진다.
특히, 이것은 PD1 및 CTLA-4와 같은, 적어도 두 개의 면역 체크포인트 단백질들을 향하는(against) 특이적인 TALE-뉴클레아제들을 이용하는 유전자 불활성화(inactivation)에 의하여 가능하게 만들어졌다. T 림프구들 내 면역 체크포인트 유전자들의 불활성화는 도입된 림프구들의 중요한 증식 및 활성을 가능하게 한다. 그러므로 이들 변형된 T 세포들은 환자의 혈액 내에서 매우 활성으로 예상되며, 여기에서 그것들은 종양 세포들 또는 감염된 세포들을 타겟으로 할 수 있다.
매우 활성일 수 있는 유전적으로 변형된 T 세포들의 상기 컨셉에 추가하여, 본 발명자들은, 특이적 TALE-뉴클레아제들(nucleases)의 디자인 및 사용에 의하여, T-세포들 내 다른 유전자들을 부수하여 불활성화시켰고, 이로써 적어도 이중(double) 돌연변이들을 수득하였다. 사실, 이중-가닥 손상(break)에 의한 이중 유전자 타겟팅은, 시간이 지남에 따라 배양 내 T-세포들을 유지하고 생산하는 것의 어려움, 그것들의 낮은 형질전환(transformation) 비율들, 및 선택 절차들 동안 손실(loss) 때문에, 지금까지 T 세포들에서 달성되지 않았다. 이들 어려움들은 이러한 세포들을 수득하는 것에 대한 성공의 낮은 확률을 야기하였다.
그러므로, 본 발명의 하나의 중요한 부분은 본 발명에 따른 유전자들의 선택을 타겟으로 할 수 있고, (특히 공(co)-형질감염(transfection) 후), 세포들에 의하여 잘 견뎌지는, T-세포들 내 DSB 이벤트들의 더 높은 비율들을 가능하게 하는 디자인된 특이적 TALE-뉴클레아제들을 갖는 것이다. 여기에 기재된 TALE-뉴클레아제들과 같은, 희귀(rare)-절단(cutting) 엔도뉴클레아제들(endonucleases)을 이용함으로써, 형질감염된(transfected) T-세포들 내 유전자들의 이중 불활성화를 수득할 확률이 상당히 증가되고, 그래서 그것은 지금 표준 절차들을 이용하여, 정기적으로 도너들로부터 이용가능한 조작된 T 세포들을 생산할 수 있을 것으로 보인다.
본 발명은 면역요법을 위한 매우 활성인 Ｔ 세포를 조작하는 방법에 대한 것이다.
본 발명은 면역요법을 위한 조작된 T-세포들의 개발 방법들, 그리고 더욱 특이적으로 T-세포 면역 활성을 증가시키기 위하여 면역 체크포인트 유전자들, 바람직하게는 다른 경로들로부터 선택되는 적어도 두 개를 불활성화시킴으로써, T-세포들을 변형하기 위한 방법들에 대한 것이다.
이 방법은 특이적 희귀 절단 엔도뉴클레아제들, 특히 일차(primary) 세포들의 배양으로부터 또는 도너들(donors)로부터 이용가능한, T-세포들에서 주요(key) 유전자들의 선택을 정확하게 타겟으로 하기 위하여, 이러한 폴리펩타이드들를 코드하는 폴리뉴클레오타이드들 및 TALE-뉴클레아제들 (TAL 이펙터(effector) 엔도뉴클레아제)의 사용을 포함한다. 본 발명은 암 및 바이러스 감염들을 치료하기 위한 매우 효율적인 입양 면역요법(immunotherapy) 전략으로의 길을 연다.
도면들 및 표들의 간단한 설명
이전의 특징들에 추가하여, 본 발명은 첨부되는 도면과, 하기 설명으로부터 나올 다른 특징들을 더 포함한다. 본 발명의 더 완전한 평가 및 그것의 수반되는 많은 이익들은 동일한 것이 하기의 자세한 설명과 연결된 하기 도면들을 참고로 하여 더 잘 이해될 수 있기 때문에 쉽게 수득될 것이다.
도 1: T-세포들 및 항원 제시 세포 사이의 정상적인 관계의 도식 표시.
도 2: 환자의 종양 세포들 및 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 치료적 T-세포들의 도식 표시.
도 3: 다사슬(multi-chain) CAR의 도식 표시.
도 4: 다사슬(multi-chain) CAR들의 다른 버젼들의 도식. A. FcεRI 수용체의 도식. B-C FcεRI 알파 사슬의 막관통 도메인에 융합된 CD8 스토크 영역 및 scFv 을 포함하는, 다사슬(multi-chain) CAR들 (csm1 내지 csm10) 의 다른 버젼들. 적어도 하나의 41BB, CD28 및/또는 CD3 제타 도메인들이 FcεRI 알파, 베타 및/또는 감마 사슬에 융합될 수 있다.
도 5: 면역요법을 위하여 인간 동종이형(allogenic) 세포들을 조작하는 방법의 한 예의 도식 표시.
도 6: 대조군들 또는 보체(complement)로 항-CD52 항체 (CAMPATH1-H)로 처리된 후 살아있는 CD52-양성 또는 CD52-음성 세포들의 밀리리터(milliliter) 당 세포들 내 농도.
도 7: 및 대조군으로서 비활성화된 세포들 및, TCR-양성 및 TCR-음성 세포들 사이, 또는 CD52-양성 및 CD52-음성 세포들 사이의, 세포 크기의 표시,포워드( forward) 사이드(side) 스캐터(scatter) (FSC) 분포(distribution)의 비교
도 8: 타겟된 CD52 및 TCR알파 불활성화된 T 세포들 상 CD107a 발현 (탈과립화의 마커)의 유동세포분석법 분석. CD107 발현은 Daudi 세포들로 배양 전 (A) 및 후 (B)에 CD52+TCRαβ+ 세포들 (첫 번째 칼럼), CD52-TCRαβ- 세포들 (두 번째 칼럼), CD52-TCRαβ+ 세포들 (세 번째 칼럼) 및 CD52+TCRαβ- 세포들 (네 번째 칼럼) 상에서 분석되었다. C)는 CAR로 더 형질감염(transfect)되고 Daudi 세포들로 불활성화된 T 세포들의 유동세포분석법(flow cytometry) 분석을 나타낸다; D)는 CAR 로 형질감염(transfect)되었으나, Daudi 세포들로 배양되지 않은 T 세포들의 유동세포분석법(flow cytometry) 분석을 나타내고 그리고, E)는 CAR 로 형질감염(transfect)되고 PMA/이오노마이신(ionomycin)으로 처리된 T 세포들의 유동세포분석법(flow cytometry) 분석을 나타낸다(양성 대조군).
도 9: CD52 및 TRAC TALE-뉴클레아제들 잠재적 오프(off)-위치(site) 타겟들의 딥 시퀀싱 분석.
도 10: T7-엔도뉴클레아제 분석에 위한 PDCD1 및 CTLA-4 게놈 위치(locus) 의 분석. 화살표는 소화된 PCR 산물을 가리킨다.
도 11: 프리T알파(preTalpha) 구조체들의 몇몇 예들의 도식 표시.
도 12: TCR 알파 불활성화된 주르카트(Jurkat) 세포들에서 FL, △18, △48 pT알파(pTalpha) 구조체들의 활성(% CD3 표면 발현) 및 형질도입(transduction) 효율 (% BFP+ 세포들)의 유동세포분석 분석법
도 13: pT알파(pTalpha) 단백질 (preTCRα)을 코드하는 렌티바이러스(lentiviral) 구조체(construct)의 도식 표시.
도 14: A: 실험 프로토콜의 표시. B: 정제 전 및 후 대조군 BFP 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 (KO/BFP) 또는 BFP-2A-pTalpha△48 (KO/△48)로 형질도입된(transduced) TCR알파 불활성화된 T 세포들 (KO) 상 TCR 알파/베타, CD3 발현 및 BFP 발현의 유동세포분석법 분석. C. BFP-2A-pTalpha△48 렌티바이러스(lentiviral) 벡터로 형질도입되거나((BFPpos) 또는 되지 않은(BFPneg), 정제된 TCR 알파 불활성화된 세포들 상 TCR 알파/베타 및 CD3 발현의 유동세포 분석. NEP는 TRAC TALE-뉴클레아제들로 전기천공되지 않은 세포들을 나타낸다.
도 15: A-B. 대조군 BFP 벡터 (BFP) 또는 BFP-2A-pTα-△48 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 (pTα-△48), BFP-2A-pTα-△48.41BB 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 (pTα-△48.BB)로 형질도입된, 전기천공되지 않은 세포들 (NEP) 및 TCR알파 불활성화된 세포들 (KO) 상에 각각 항-CD3/CD28 비드들로 재활성화 24 및 48 시간 후 초기(early) 활성화(activation) 마커(marker) CD69 (A), 늦은(late) 활성화(activation) 마커(marker) CD25 (B) 발현의 유동세포분석법 분석. pTα-△48 막대그래프들은 pTα-△48 (BFP+ 세포들)를 발현시키는 TCR 불활성화된 세포들에서 검출되는 신호에 대응하는 반면, KO 막대그래프들은 pTα-△48 (BFP- 세포들) 를 발현하지 않는 TCR알파 불활성화된 세포들에 대응되고 pTα-△48.BB 막대그래프들은 pTα-△48.41BB (BFP+ 세포들)를 발현시키는 TCR 불활성화된 세포들에서 검출되는 신호에 대응되고 반면 KO 막대그래프들은 pTα-△48.41BB (BFP- 세포들)을 발현시키지 않는 TCR알파 불활성화된 세포들에 대응된다. NEP (비(non) 전기천공된(electroporated)) 막대그래프들은 조작되지 않은 세포들에서 검출되는 신호에 대응한다. C. 대조군 BFP 벡터 (BFP) 또는 BFP-2A-pTα-△48 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 (pTα-△48), BFP-2A-pTα-△48.41BB 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 (pTα-△48.BB)로 형질도입(transduced)된 TCR알파 불활성화된 세포들 (KO) 및 전기천공되지 않은(non electroporated) 세포들 (NEP) 상 항-CD3/CD28 비드들로 재활성화 72 시간 후 세포들의 크기의 유동세포분석법 분석. 각각의 그래프의 윗 부분에 표시된 값들은 각각의 개체군(population)의 형광의 기하평균에 대응된다.
도 16: 다른 시점(time point)들에서 (x-축) 항- CD3/CD28 비드들로 IL2에서 또는 IL2에서 유지되는 대조군 BFP 벡터 (BFP) 또는 pTalpha-△48 (pTa△48)로 형질도입된(transduced) TCR 알파 불활성화된 세포들 (KO)의 세포 성장 분석. BFP+ 세포들 수는 각 조건들에 대하여 다른 시점(time point)들에서 추정되었고 이들 세포들의 배수(fold) 유도(induction)(y-축)는 재활성화 2일 후에 수득된 값에 대하여 추정되었다. 결과들은 두 개의 독립적인 도너들로부터 수득되었다. 두 번째 도너를 위하여, 세포 성장이 또한 전장 pTalpha- (pTa-FL) 및 pTalpha-△48.41BB (pTa-△48.BB) 로 형질도입된 세포들에 대하여 결정되었다.
도 17: 다섯 개의 다른 사이토펄스(Cytopulse) 프로그램들로 전기천공된 PBMC들 상 GFP 양성 세포들의 유동세포분석법 분석. 윗선은 큐벳 당 6x106 세포들의 형질감염(transfection)에 대응되고, 반면 아래쪽 선은 큐벳 당 3x106 세포들의 형질감염(transfection)에 대응된다.
도 18: 대조군 pUC DNA 및 GFP mRNA, GFP DNA 으로 전기천공 후 살아있는 개체군 중 GFP 양성 세포들 및 생존능력(viability) 염료 (eFluor-450)를 이용하여 정제된 T 세포 사망(mortality)의 유동세포분석법 분석이다. NEP은 전기천공 버퍼 내 유지되나, 전기천공되지 않은 세포들에 대응되고, NT는 배양 배지 내 유지되는 전기천공되지 않은 세포들에 대응된다.
도 19: TRAC TALE-뉴클레아제 mRNA 전기천공법(electroporation) 후 인간 일차(primary) T 세포들 상 TCR 알파/베타 및 CD3 발현의 유동세포분석법 분석.(위) TRAC TALE-뉴클레아제 mRNA 전기천공법 후 인간 일차(primary) T 세포들로부터 추출된 게놈 DNA의 딥 시퀀싱 분석(아래).
도 20: A. 단일 사슬 CAR를 코드하는 mRNA로 또는 없이, T 세포들의 전기천공 후 CAR 발현 (항F(ab')2) 의 유동세포분석법 분석. B. daudi 세포들과 공배양된 전기천공된 T 세포들 상 CD107a 발현(탈과립화의 마커)의 유동세포분석법 분석.
도 21: A. 다사슬(multi-chain) CAR를 코드하는 mRNA 의 표시. B. 다사슬(multi-chain) CAR를 코드하는 포리시스트론 mRNA로, 또는 없이, 전기천공된 살아있는(viable) T 세포들 상 CAR 발현 (항 F(ab')2 )의 유동세포분석법 분석. C. daudi 세포들과 공배양된 전기천공된 T 세포들 상 CD107a 발현(탈과립화의 마커)의 유동세포분석법 분석.
도 22: 폴리시스트론 mRNA들의 전기천공법 후 인간 T 세포들 내 다(multi)-사슬 CAR들 발현.
도 23: 멀티서브유닛(multi-subunit) CAR들의 발현은 세 개 사슬들: α, β 및 γ의 발현에 의하여 컨디셔닝(condition)된다.
도 24 : 다사슬(multi-chain) CAR들을 일시적으로 발현시키는 인간 T 세포들은 타겟 세포들과의 공배양 후 탈과립된다(degranulate). A: csm1 내지 csm5 CAR 구조체들. B: csm6 내지 csm10 CAR 구조체들.
도 25: 다사슬(multi-chain) CAR들을 일시적으로 발현시키는 인간 T 세포들은 타겟 세포들과의 공배양 후 사이토카인들을 분비한다(T세포들 vs. Daudi 세포들 또는 K562). A:IL8 방출. B:IFNγ 방출. C:IL5 방출.
도 26: 다사슬(multi-chain) CAR들 (scm1 내지 csm10 구조체들) 를 일시적으로 발현시키는 인간 T 세포들은 타겟 세포들을 용해(lyse)한다.
도 27: 형광 항체 및 유동세포분석법(flow cytometry) 분석을 이용한 세포내 염색에 의하여 측정된 일차(primary) T 세포들 내 CTLA4 불활성화.
도 28: TALENs T1, T2 및 T3로 형질감염(transfection)된 CTLA4을 발현시키는 형광 T-세포들의 분포. CTLA4를 발현시키는 세포들의 비율은 대조군 세포들에 대하여 극적으로 감소된다.
도 29: 형광 항체 및 유동세포분석법(flow cytometry) 분석을 이용한 세포내 염색에 의하여 측정된 일차(primary) T 세포들 내 PD1 불활성화. PD1을 발현시키는 세포들의 비율은 대조군 세포들에 대하여 극적으로 감소된다.
도 30: PD1 유전자를 타겟팅하는 TALEN T01 및 T03 로 형질감염(transfection)된, T-세포들에서 관찰되는 결실들 빈도들을 보이는 도해.
도 31: 세포독성(cytotoxic) 활성이 실시예 3에 기재된 실험에 따라 PD1을 위하여 붕괴된 T-세포들에서 증강된다는 것을 보여주는 도해.
표 1: 면역요법에 더 활성인 동종이형(allogeneic) T-세포들을 만들기에 적합한 것으로 본 발명자들에 의하여 확인된 면역 체크포인트 유전자들의 리스트.
표 2: 인간 GR 유전자 내 TALE-뉴클레아제들 타겟 위치(sites)들의 서열들 및 GR TALE-뉴클레아제의 기재.
표 3: 효모에서 GR TALE-뉴클레아제들의 절단 활성. 값들은 0 및 1 사이에 포함된다. 최대값은 1이다.
표 4: 293 세포들에서 내생(endogenous) TALE-뉴클레아제 타겟 위치(sites)들에서 타겟된 돌연변이생성(mutagenesis)의 퍼센트.
표 5: 일차(primary) T 림프구들 내 내생(endogenous) TALE-뉴클레아제 타겟 위치(sites)들에서 타겟된 돌연변이생성(mutagenesis)의 퍼센트.
표 6: 인간 대응하는 유전자들에서 TALE-뉴클레아제들 타겟 위치(sites)들의 CD52, TRAC 및 TRBC TALE-뉴클레아제들 및 서열들의 기재.
표 7: TRAC 및 CD52 TALE-뉴클레아제들을 위한 추가의 타겟 서열들.
표 8: CD52_T02, TRAC_T01, TRBC_T01 및 TRBC_T02 타겟들을 타겟팅하는 TALE-뉴클레아제를 위한 삽입-결실들(indels)의 퍼센트.
표 9: 대응하는 TALE-뉴클레아제-발현 폴리뉴클레오타이드들의 형질감염(transfection) 후 CD52- 음성, TCR-음성 및 CD52/TCR-이중 음성 T 림프구들의 퍼센트.
표 10: TRBC TALE-뉴클레아제-발현 폴리뉴클레오타이드들의 형질감염(transfection) 후 TCR-음성 T 림프구들의 퍼센트.
표 11: 인간 대응하는 유전자들 내 TALE-뉴클레아제들 타겟 위치(sites)들의 CTLA4 및 PDCD1 TALE-뉴클레아제들 및 서열들의 기재.
표 12: pT알파(pTalpha) 구조체들의 서브셋(subset)의 기재.
표 13: 주르카트(Jurkat) TCR 알파 불활성화된 세포 내 다른 pT알파(pTalpha) 구조체들의 활성. 활성은 다른 프리T알파(preTalpha) 구조체들로 형질감염된 주르카트(jurkat_ TCR 알파 불활성화된 세포 상 CD3 발현의 유동세포분석법(flow cytometry) 분석에 의하여 측정되었다.
표 14: PBMC 유래된 T-세포들에서 전기천공에 요구되는 최소 전압을 결정하는데 사용되는 다른 사이토펄스(cytopulse) 프로그램들.
표 15: 정제된 T-세포들을 전기천공하기 위하여 사용되는 사이토펄스(Cytopulse) 프로그램.
표 16: 면역 체크포인트 단백질들을 코드하는 유전자들의 리스트.
본 발명의 개요
한 측면에서, 본 발명은 면역요법(immunotherapy) 목적들에 적합하게 그것들을 만들도록 T 세포들을 조작하는 방법들을 공개한다. 본 발명의 방법들은 더욱 특히 면역 체크포인트 단백질들을 코드하는 유전자들을 대체(replacing)하거나 또는 불활성화시킴으로써 면역요법(immunotherapy)에 관련있는 세포들의 게놈(genome)의 정확한 변형을 가능하게 한다. 특정 예들에서, 면역요법(immunotherapy)에 관련된 변형된 세포들은 특이적 세포 인식을 위한 키메라(Chimeric) 항원(Antigen) 수용체들(Receptors) (CAR)을 코드하는 외인성(exogenous) 재조합 폴리뉴클레오타이드들을 더 포함한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 면역 체크포인트 단백질들을 코드하는 상기 유전자들을 정확히 타겟하여, 면역요법(immunotherapy)을 위한 T-세포들의 유전적 변형을 가능하게 하기 위한, 희귀-절단 엔도뉴클레아제들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들 및 폴리펩타이드들에 대한 것이다. 본 발명은 더욱 특히 그들 유전자들을 타겟으로 하도록 각각 디자인된 ALE-뉴클레아제들 및 이들 유전자들 내 특이적 타겟 서열들을 제공한다.
본 발명은 또한 여기에 기재된 단백질들, 폴리펩타이드들 또는 벡터들 중 임의의 것을 포함하는 분리된 세포들 또는 세포주들에 대한 것이다. 특정 예들에서, 본 발명의 T 세포들은 면역요법에의 그것들의 사용을 위한 불활성화된 면역 체크포인트 유전자들을 포함한다.
바람직한 예에서, 변형된 T 세포들은, 이상적으로는 "규격품인(off the shelf)" 제품으로서의, 치료적 제품으로서 사용된다. 이 점에 있어서, 본 발명에 따른 T-세포들은 예를 들어 세포들을 동종이형(allogeneic)으로 만들어, 이로써 하나의 도너의 샘플로부터 다른 환자들의 치료에 적합하게 하기 위하여, TCR의 요소(component) (T 세포 수용체)를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써, 더 유전적으로 변형될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 상기 방법들에 의하여 수득가능한 조작된 T-세포를 투여함으로써 환자에서 감염들 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법에 대한 것이다.
본 발명의 자세한 설명
여기에서 특별히 정의하지 않으면, 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 유전자 치료, 생화학, 유전학 및 분자 생물학의 영역에서 당업자에 의하여 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
여기에 기재된 그것들과 유사하거나 또는 등가의 물질들 및 방법들 모두가 여기에 기재된 적절한 물질들 및 방법들과 함께 본 발명을 시험하거나 또는 실시하는데 사용될 수 있다. 여기에 언급된 모든 문헌들, 특허 출원들, 특허들, 및 다른 참조문헌들이 그 전체가, 특히 참고문헌이 인용된, 연결된 문장(들), 단락(들) 또는 절(section)(들)의 주제와 관련된 각각의 참고문헌에 의하여 공개된 주제에 대하여, 참조로서 포함된다. 상충되는 경우, 정의들을 포함하는 본 명세서에 따른다. 나아가, 물질들, 방법들 및 예들은 설명적일 뿐이며, 다르게 특정하지 않는 한, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 실시는, 다르게 표시되지 않는 한, 당업계의 기술 내인, 세포 생물학, 세포 배양학, 분자 생물학, 유전자이식 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 일반적인 기술들을 이용할 것이다. 이러한 테크닉들은 문헌에 완전히 설명된다. 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), specifically, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); 및 Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)을 참조하라.
일반적인 측면에서 본 발명은 암 및 감염들을 치료하는 새로운 입양 면역요법 전략들을 위한 방법들에 대한 것이다.
면역요법을 위한 매우 활성인 T 세포들
본 발명의 첫 번째 측면에 따라, 본 발명자들은 입양 면역요법(immunotherapy)에서 T 세포들의 효율을 증강시키기 위하여 개별적으로 붕괴(disrupted)될 수 있는, 소위 "면역 체크포인트들" 기능을 코드하는 신규 유전자들을 확인하였다. 하기 표 1은, 이들 신규 타겟된 유전자들을 목록화하는데, 이는 더욱 특히 공-자극(co-inhibitory) 수용체 기능, 세포사, 사이토카인 신호전달(signaling), 아르기닌(arginine) 트립토판(tryptophan) 결핍(starvation), TCR 신호전달(signaling), 유도된(Induced) T-reg 억제(repression), 면역성결핍(anergy) 또는 고갈(exhaustion)을 통제하는 전사 인자들, 및 저산소증(hypoxia) 매개 내성(tolerance)의 기능들과 연관된 것이다. 앞서 언급한 바와 같이, 하나의 이들 유전자들의 발현 통제 또는 붕괴(disruption)를 통한, 이들 후자의 기능 중 하나의 타겟팅은 자가(autologous) 또는 동종이형(allogeneic) 계획(scheme) 치료의 부분으로서 만들어질 수 있다.
그러므로 본 발명은 더욱 특히 이들 중 표 1에서 언급된 것과 동일성(identity)을 갖는 유전자들 중 적어도 하나가 면역요법을 수행하려는 목적을 위하여 억제되거나 또는 붕괴된(disrupted) 것인, 조작된 T-세포들에 대한 것이다.
T 세포-매개 면역력(immunity)은 다수의 이펙터(effector) 면역 세포들을 위한 (사이토카인들 및 막 리간드들을 통한) 도움의 제공 및 직접적인 이펙터(effector) 기능의 실행, 염증 및 항원의 위치들(sites)로의 그것들의 수송(trafficking), 이차 림프(lymphoid) 조직 내 그것들의 활성화 및 증식, 항원 특이적 세포들의 클론 선택을 포함하는 복수의 순차적(sequential) 단계들을 포함한다. 이들 단계들의 각각은 반응을 미세조정하는 자극 및 억제 신호들의 균형잡기를 통하여 조절된다. 대부분의 경우들에서 억제 신호들을 위한 분자적 메커니즘이 아직 정의되지 않은데도 불구하고, 연구들은 음성 조절 요소들은 하나보다 많은 방식으로 T-세포 반응을 약화시킬 수 있다는 것을 제안한다. 예를 들어, CTLA-4는 공자극 리간드들을 위하여 CD28과 경쟁할 수 있다. 반면, PD-1과 같은, 억제 모티프(motif)-포함 분자들은 신호전달을 약화시키고, TCR-인근의(proximal) 신호전달 복합체들(complexes)로 (SHP-1, SHP-2 또는 SHIP과 같은) 포스파타제들(phosphatases)을 모집할 수 있다. PD-1 및 CTLA-4 둘다 세린(serine)-트레오닌(threonine) 키나제(kinase) Akt에 의하여 신호전달을 억제할 수 있으나, 다른 분자적 메커니즘들을 통하여 그렇게 하는 것으로 보인다. 그러므로 유전자들 중 하나의 불활성화는 또다른 음성 조절 경로에 의하여 보상(compensate)될 수 있다. 이것을 피하기 위하여, 본 발명의 추가의 측면에 따라, 본 발명자들은 면역요법을 위한 T-세포들의 활성을 충분히 증가시키기 위하여, 면역-체크포인트 단백질들을 코드하는 적어도 두 개의 유전자들을 불활성화시키는 것을 시도하였다. 표 1에 보여진 분류에 기초하여, 그들은, 바람직하게는 면역 반응을 음성적으로(negatively) 조절하는 다른 억제 경로들에 관련된, 단백질들을 코드하는 다른 유전자들을 선택하였다.
본 발명은 T-세포들 내에서 면역요법을 위한 T-세포들의 활성을 충분히 증가시키기 위하여 면역-체크포인트 단백질들을 코드하는 유전자들 중 적어도 둘을 불활성화시킴으로써 면역요법을 위한 T-세포들을 제조하는(preparing) 방법에 대한 것이다. 특히 본 발명은 하기를 포함하는, 면역요법을 위한 T-세포들을 제조하는(preparing) 방법에 대한 것이다:
(a) 면역 체크포인트 단백질들을 코드하는 적어도 두 개의 유전자들을 불활성화시킴으로써 T-세포들을 변형시키는 단계;
(b) 상기 세포들을 확장(expanding)시키는 단계.
당업자는 용어 "면역(immune) 체크포인트들(checkpoints)"이 T 세포들에 의하여 발현되는 분자들의 그룹을 의미한다는 것을 이해할 것이다. 이들 분자들은 면역 반응을 억제하기 위하여 또는 하향-조절(down-modulate)하기 위하여 효과적으로 "브레이크들(brakes)"의 역할을 한다. 면역 체크포인트 분자들은 프로그램된(Programmed) 사망(Death) 1 (PD-1, 또한 PDCD1 또는 CD279로도 알려짐, 등록(accession) 번호: NM_005018), 세포독성(Cytotoxic) T-림프구(Lymphocyte) 항원(Antigen) 4 (CTLA-4, 또한 CD152로도 알려짐, GenBank 등록 번호 AF414120.1), LAG3 (CD223으로도 알려짐, 등록 번호: NM_002286.5), Tim3 (HAVCR2로도 알려짐, GenBank 등록 번호: JX049979.1), BTLA (CD272로도 알려짐, 등록 번호: NM_181780.3), BY55 (CD160 로도 알려짐, GenBank 등록 번호: CR541888.1), TIGIT (lVSTM3 로도 알려짐, 등록 번호: NM_173799), LAIR1 (CD305 로도 알려짐, GenBank 등록 번호: CR542051.1, (Meyaard, Adema et al. 1997)), SIGLEC10 (GeneBank 등록 번호: AY358337.1), 2B4 (CD244 로도 알려짐, 등록 번호: NM_001166664.1), PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, CD96, CRTAM, SIGLEC7 (Nicoll, Ni et al. 1999), SIGLEC9 (Zhang, Nicoll et al. 2000; Ikehara, Ikehara et al. 2004), TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF (Quigley, Pereyra et al. 2010), GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3로, 이는 면역 세포들을 직접적으로 억제하는 것, 을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, CTLA-4는 특정 CD4 및 CD8 T 세포들 상에 발현되는 세포-표면 단백질이다; 항원 제시 세포들 상 그것의 리간드들 (B7-1 및 B7-2)에 의하여 맞물릴(engage) 때, T-세포 활성화 및 이펙터(effector) 기능이 억제된다. 이와 같이, 본 발명은, 면역 체크-포인트 내 포함되는 적어도 하나의 단백질, 특히 PD1 및/또는 CTLA-4, 를 불활성화시킴으로써 T-세포들을 유전적으로 불활성화시키는 단계를 포함하는, 특히 면역요법을 위하여, T-세포들을 조작하는 방법에 대한 것이다.
하기 표 1은, 철저한(exhaustive) 것 없이, 조작된 T-세포들의 적합함 및 효율을 개선하기 위하여 본 발명의 가르침에 따라 불활성화될 수 있는 면역 체크포인트 유전자들을 보여준다. 면역 체크포인트들 유전자는 바람직하게는, 공-억제 수용체 기능, 세포사, 사이토카인 신호전달, 아르기닌(arginine) 트립토판(tryptophan) 결핍(starvation), TCR 신호전달(signaling), 유도된(Induced) T-reg 억제(repression), 면역성결핍(anergy) 또는 고갈(exhaustion)을 통제하는 전사 인자들, 및 저산소증(hypoxia) 매개 내성(tolerance)과 연관된, 이 표에 리스트된 것들에 동일성(identity)을 갖는 그러한 유전자들로부터 선택된다.
Figure 112015122363153-pct00001
Figure 112015122363153-pct00002
Figure 112015122363153-pct00003

표 1: 면역요법에 더욱 활성인 동종이형(allogeneic) T-세포들을 만드는데 적합한 면역 체크포인트 유전자들
바람직한 예에서, 면역 체크포인트 단백질들을 코드하는 상기 두 개의 유전자들은 하기로 구성되는 군으로부터 선택된다: CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3.
특정 예에서, 면역 체크포인트 단백질들을 코드하는 상기 두 개 유전자들은 BTLA 및 BATF ; CASP10 및 BATF ; CASP10 및 BTLA ; CASP3 및 BATF ; CASP3 및 BTLA ; CASP3 및 CASP10 ; CASP6 및 BATF ; CASP6 및 BTLA ; CASP6 및 CASP10 ; CASP6 및 CASP3 ; CASP7 및 BATF ; CASP7 및 BTLA ; CASP7 및 CASP10 ; CASP7 및 CASP3 ; CASP7 및 CASP6 ; CASP8 및 BATF ; CASP8 및 BTLA ; CASP8 및 CASP10 ; CASP8 및 CASP3 ; CASP8 및 CASP6 ; CASP8 및 CASP7 ; CD160 및 BATF ; CD160 및 BTLA ; CD160 및 CASP10 ; CD160 및 CASP3 ; CD160 및 CASP6 ; CD160 및 CASP7 ; CD160 및 CASP8 ; CD244 및 BATF ; CD244 및 BTLA ; CD244 및 CASP10 ; CD244 및 CASP3 ; CD244 및 CASP6 ; CD244 및 CASP7 ; CD244 및 CASP8 ; CD244 및 CD160 ; CD96 및 BATF ; CD96 및 BTLA ; CD96 및 CASP10 ; CD96 및 CASP3 ; CD96 및 CASP6 ; CD96 및 CASP7 ; CD96 및 CASP8 ; CD96 및 CD160 ; CD96 및 CD244 ; CRTAM 및 BATF ; CRTAM 및 BTLA ; CRTAM 및 CASP10 ; CRTAM 및 CASP3 ; CRTAM 및 CASP6 ; CRTAM 및 CASP7 ; CRTAM 및 CASP8 ; CRTAM 및 CD160 ; CRTAM 및 CD244 ; CRTAM 및 CD96 ; CSK 및 BATF ; CSK 및 BTLA ; CSK 및 CASP10 ; CSK 및 CASP3 ; CSK 및 CASP6 ; CSK 및 CASP7 ; CSK 및 CASP8 ; CSK 및 CD160 ; CSK 및 CD244 ; CSK 및 CD96 ; CSK 및 CRTAM ; CTLA4 및 BATF ; CTLA4 및 BTLA ; CTLA4 및 CASP10 ; CTLA4 및 CASP3 ; CTLA4 및 CASP6 ; CTLA4 및 CASP7 ; CTLA4 및 CASP8 ; CTLA4 및 CD160 ; CTLA4 및 CD244 ; CTLA4 및 CD96 ; CTLA4 및 CRTAM ; CTLA4 및 CSK ; EIF2AK4 및 BATF ; EIF2AK4 및 BTLA ; EIF2AK4 및 CASP10 ; EIF2AK4 및 CASP3 ; EIF2AK4 및 CASP6 ; EIF2AK4 및 CASP7 ; EIF2AK4 및 CASP8 ; EIF2AK4 및 CD160 ; EIF2AK4 및 CD244 ; EIF2AK4 및 CD96 ; EIF2AK4 및 CRTAM ; EIF2AK4 및 CSK ; EIF2AK4 및 CTLA4 ; FADD 및 BATF ; FADD 및 BTLA ; FADD 및 CASP10 ; FADD 및 CASP3 ; FADD 및 CASP6 ; FADD 및 CASP7 ; FADD 및 CASP8 ; FADD 및 CD160 ; FADD 및 CD244 ; FADD 및 CD96 ; FADD 및 CRTAM ; FADD 및 CSK ; FADD 및 CTLA4 ; FADD 및 EIF2AK4 ; FAS 및 BATF ; FAS 및 BTLA ; FAS 및 CASP10 ; FAS 및 CASP3 ; FAS 및 CASP6 ; FAS 및 CASP7 ; FAS 및 CASP8 ; FAS 및 CD160 ; FAS 및 CD244 ; FAS 및 CD96 ; FAS 및 CRTAM ; FAS 및 CSK ; FAS 및 CTLA4 ; FAS 및 EIF2AK4 ; FAS 및 FADD ; FOXP3 및 BATF ; FOXP3 및 BTLA ; FOXP3 및 CASP10 ; FOXP3 및 CASP3 ; FOXP3 및 CASP6 ; FOXP3 및 CASP7 ; FOXP3 및 CASP8 ; FOXP3 및 CD160 ; FOXP3 및 CD244 ; FOXP3 및 CD96 ; FOXP3 및 CRTAM ; FOXP3 및 CSK ; FOXP3 및 CTLA4 ; FOXP3 및 EIF2AK4 ; FOXP3 및 FADD ; FOXP3 및 FAS ; GUCY1A2 및 BATF ; GUCY1A2 및 BTLA ; GUCY1A2 및 CASP10 ; GUCY1A2 및 CASP3 ; GUCY1A2 및 CASP6 ; GUCY1A2 및 CASP7 ; GUCY1A2 및 CASP8 ; GUCY1A2 및 CD160 ; GUCY1A2 및 CD244 ; GUCY1A2 및 CD96 ; GUCY1A2 및 CRTAM ; GUCY1A2 및 CSK ; GUCY1A2 및 CTLA4 ; GUCY1A2 및 EIF2AK4 ; GUCY1A2 및 FADD ; GUCY1A2 및 FAS ; GUCY1A2 및 FOXP3 ; GUCY1A3 및 BATF ; GUCY1A3 및 BTLA ; GUCY1A3 및 CASP10 ; GUCY1A3 및 CASP3 ; GUCY1A3 및 CASP6 ; GUCY1A3 및 CASP7 ; GUCY1A3 및 CASP8 ; GUCY1A3 및 CD160 ; GUCY1A3 및 CD244 ; GUCY1A3 및 CD96 ; GUCY1A3 및 CRTAM ; GUCY1A3 및 CSK ; GUCY1A3 및 CTLA4 ; GUCY1A3 및 EIF2AK4 ; GUCY1A3 및 FADD ; GUCY1A3 및 FAS ; GUCY1A3 및 FOXP3 ; GUCY1A3 및 GUCY1A2 ; GUCY1B2 및 BATF ; GUCY1B2 및 BTLA ; GUCY1B2 및 CASP10 ; GUCY1B2 및 CASP3 ; GUCY1B2 및 CASP6 ; GUCY1B2 및 CASP7 ; GUCY1B2 및 CASP8 ; GUCY1B2 및 CD160 ; GUCY1B2 및 CD244 ; GUCY1B2 및 CD96 ; GUCY1B2 및 CRTAM ; GUCY1B2 및 CSK ; GUCY1B2 및 CTLA4 ; GUCY1B2 및 EIF2AK4 ; GUCY1B2 및 FADD ; GUCY1B2 및 FAS ; GUCY1B2 및 FOXP3 ; GUCY1B2 및 GUCY1A2 ; GUCY1B2 및 GUCY1A3 ; GUCY1B3 및 BATF ; GUCY1B3 및 BTLA ; GUCY1B3 및 CASP10 ; GUCY1B3 및 CASP3 ; GUCY1B3 및 CASP6 ; GUCY1B3 및 CASP7 ; GUCY1B3 및 CASP8 ; GUCY1B3 및 CD160 ; GUCY1B3 및 CD244 ; GUCY1B3 및 CD96 ; GUCY1B3 및 CRTAM ; GUCY1B3 및 CSK ; GUCY1B3 및 CTLA4 ; GUCY1B3 및 EIF2AK4 ; GUCY1B3 및 FADD ; GUCY1B3 및 FAS ; GUCY1B3 및 FOXP3 ; GUCY1B3 및 GUCY1A2 ; GUCY1B3 및 GUCY1A3 ; GUCY1B3 및 GUCY1B2 ; HAVCR2 및 BATF ; HAVCR2 및 BTLA ; HAVCR2 및 CASP10 ; HAVCR2 및 CASP3 ; HAVCR2 및 CASP6 ; HAVCR2 및 CASP7 ; HAVCR2 및 CASP8 ; HAVCR2 및 CD160 ; HAVCR2 및 CD244 ; HAVCR2 및 CD96 ; HAVCR2 및 CRTAM ; HAVCR2 및 CSK ; HAVCR2 및 CTLA4 ; HAVCR2 및 EIF2AK4 ; HAVCR2 및 FADD ; HAVCR2 및 FAS ; HAVCR2 및 FOXP3 ; HAVCR2 및 GUCY1A2 ; HAVCR2 및 GUCY1A3 ; HAVCR2 및 GUCY1B2 ; HAVCR2 및 GUCY1B3 ; HMOX2 및 BATF ; HMOX2 및 BTLA ; HMOX2 및 CASP10 ; HMOX2 및 CASP3 ; HMOX2 및 CASP6 ; HMOX2 및 CASP7 ; HMOX2 및 CASP8 ; HMOX2 및 CD160 ; HMOX2 및 CD244 ; HMOX2 및 CD96 ; HMOX2 및 CRTAM ; HMOX2 및 CSK ; HMOX2 및 CTLA4 ; HMOX2 및 EIF2AK4 ; HMOX2 및 FADD ; HMOX2 및 FAS ; HMOX2 및 FOXP3 ; HMOX2 및 GUCY1A2 ; HMOX2 및 GUCY1A3 ; HMOX2 및 GUCY1B2 ; HMOX2 및 GUCY1B3 ; HMOX2 및 HAVCR2 ; IL10RA 및 BATF ; IL10RA 및 BTLA ; IL10RA 및 CASP10 ; IL10RA 및 CASP3 ; IL10RA 및 CASP6 ; IL10RA 및 CASP7 ; IL10RA 및 CASP8 ; IL10RA 및 CD160 ; IL10RA 및 CD244 ; IL10RA 및 CD96 ; IL10RA 및 CRTAM ; IL10RA 및 CSK ; IL10RA 및 CTLA4 ; IL10RA 및 EIF2AK4 ; IL10RA 및 FADD ; IL10RA 및 FAS ; IL10RA 및 FOXP3 ; IL10RA 및 GUCY1A2 ; IL10RA 및 GUCY1A3 ; IL10RA 및 GUCY1B2 ; IL10RA 및 GUCY1B3 ; IL10RA 및 HAVCR2 ; IL10RA 및 HMOX2 ; IL10RB 및 BATF ; IL10RB 및 BTLA ; IL10RB 및 CASP10 ; IL10RB 및 CASP3 ; IL10RB 및 CASP6 ; IL10RB 및 CASP7 ; IL10RB 및 CASP8 ; IL10RB 및 CD160 ; IL10RB 및 CD244 ; IL10RB 및 CD96 ; IL10RB 및 CRTAM ; IL10RB 및 CSK ; IL10RB 및 CTLA4 ; IL10RB 및 EIF2AK4 ; IL10RB 및 FADD ; IL10RB 및 FAS ; IL10RB 및 FOXP3 ; IL10RB 및 GUCY1A2 ; IL10RB 및 GUCY1A3 ; IL10RB 및 GUCY1B2 ; IL10RB 및 GUCY1B3 ; IL10RB 및 HAVCR2 ; IL10RB 및 HMOX2 ; IL10RB 및 IL10RA ; IL6R 및 BATF ; IL6R 및 BTLA ; IL6R 및 CASP10 ; IL6R 및 CASP3 ; 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LAG3 및 GUCY1A3 ; LAG3 및 GUCY1B2 ; LAG3 및 GUCY1B3 ; LAG3 및 HAVCR2 ; LAG3 및 HMOX2 ; LAG3 및 IL10RA ; LAG3 및 IL10RB ; LAG3 및 IL6R ; LAG3 및 IL6ST ; LAIR1 및 BATF ; LAIR1 및 BTLA ; LAIR1 및 CASP10 ; LAIR1 및 CASP3 ; LAIR1 및 CASP6 ; LAIR1 및 CASP7 ; LAIR1 및 CASP8 ; LAIR1 및 CD160 ; LAIR1 및 CD244 ; LAIR1 및 CD96 ; LAIR1 및 CRTAM ; LAIR1 및 CSK ; LAIR1 및 CTLA4 ; LAIR1 및 EIF2AK4 ; LAIR1 및 FADD ; LAIR1 및 FAS ; LAIR1 및 FOXP3 ; LAIR1 및 GUCY1A2 ; LAIR1 및 GUCY1A3 ; LAIR1 및 GUCY1B2 ; LAIR1 및 GUCY1B3 ; LAIR1 및 HAVCR2 ; LAIR1 및 HMOX2 ; LAIR1 및 IL10RA ; LAIR1 및 IL10RB ; LAIR1 및 IL6R ; LAIR1 및 IL6ST ; LAIR1 및 LAG3 ; PAG1 및 BATF ; PAG1 및 BTLA ; PAG1 및 CASP10 ; PAG1 및 CASP3 ; PAG1 및 CASP6 ; PAG1 및 CASP7 ; PAG1 및 CASP8 ; PAG1 및 CD160 ; PAG1 및 CD244 ; PAG1 및 CD96 ; PAG1 및 CRTAM ; PAG1 및 CSK ; PAG1 및 CTLA4 ; PAG1 및 EIF2AK4 ; PAG1 및 FADD ; PAG1 및 FAS ; PAG1 및 FOXP3 ; PAG1 및 GUCY1A2 ; PAG1 및 GUCY1A3 ; PAG1 및 GUCY1B2 ; PAG1 및 GUCY1B3 ; PAG1 및 HAVCR2 ; PAG1 및 HMOX2 ; PAG1 및 IL10RA ; PAG1 및 IL10RB ; PAG1 및 IL6R ; PAG1 및 IL6ST ; PAG1 및 LAG3 ; PAG1 및 LAIR1 ; PDCD1 및 BATF ; PDCD1 및 BTLA ; PDCD1 및 CASP10 ; PDCD1 및 CASP3 ; PDCD1 및 CASP6 ; PDCD1 및 CASP7 ; PDCD1 및 CASP8 ; PDCD1 및 CD160 ; PDCD1 및 CD244 ; PDCD1 및 CD96 ; PDCD1 및 CRTAM ; PDCD1 및 CSK ; PDCD1 및 CTLA4 ; PDCD1 및 EIF2AK4 ; PDCD1 및 FADD ; PDCD1 및 FAS ; PDCD1 및 FOXP3 ; PDCD1 및 GUCY1A2 ; PDCD1 및 GUCY1A3 ; PDCD1 및 GUCY1B2 ; PDCD1 및 GUCY1B3 ; PDCD1 및 HAVCR2 ; PDCD1 및 HMOX2 ; PDCD1 및 IL10RA ; PDCD1 및 IL10RB ; PDCD1 및 IL6R ; PDCD1 및 IL6ST ; PDCD1 및 LAG3 ; PDCD1 및 LAIR1 ; PDCD1 및 PAG1 ; PPP2CA 및 BATF ; PPP2CA 및 BTLA ; PPP2CA 및 CASP10 ; PPP2CA 및 CASP3 ; PPP2CA 및 CASP6 ; PPP2CA 및 CASP7 ; PPP2CA 및 CASP8 ; PPP2CA 및 CD160 ; PPP2CA 및 CD244 ; PPP2CA 및 CD96 ; PPP2CA 및 CRTAM ; PPP2CA 및 CSK ; PPP2CA 및 CTLA4 ; PPP2CA 및 EIF2AK4 ; PPP2CA 및 FADD ; PPP2CA 및 FAS ; PPP2CA 및 FOXP3 ; PPP2CA 및 GUCY1A2 ; PPP2CA 및 GUCY1A3 ; PPP2CA 및 GUCY1B2 ; PPP2CA 및 GUCY1B3 ; PPP2CA 및 HAVCR2 ; PPP2CA 및 HMOX2 ; PPP2CA 및 IL10RA ; PPP2CA 및 IL10RB ; PPP2CA 및 IL6R ; PPP2CA 및 IL6ST ; PPP2CA 및 LAG3 ; PPP2CA 및 LAIR1 ; PPP2CA 및 PAG1 ; PPP2CA 및 PDCD1 ; PPP2CB 및 BATF ; PPP2CB 및 BTLA ; PPP2CB 및 CASP10 ; PPP2CB 및 CASP3 ; PPP2CB 및 CASP6 ; PPP2CB 및 CASP7 ; PPP2CB 및 CASP8 ; PPP2CB 및 CD160 ; PPP2CB 및 CD244 ; PPP2CB 및 CD96 ; PPP2CB 및 CRTAM ; PPP2CB 및 CSK ; PPP2CB 및 CTLA4 ; PPP2CB 및 EIF2AK4 ; PPP2CB 및 FADD ; PPP2CB 및 FAS ; PPP2CB 및 FOXP3 ; PPP2CB 및 GUCY1A2 ; PPP2CB 및 GUCY1A3 ; PPP2CB 및 GUCY1B2 ; PPP2CB 및 GUCY1B3 ; PPP2CB 및 HAVCR2 ; PPP2CB 및 HMOX2 ; PPP2CB 및 IL10RA ; PPP2CB 및 IL10RB ; PPP2CB 및 IL6R ; PPP2CB 및 IL6ST ; PPP2CB 및 LAG3 ; PPP2CB 및 LAIR1 ; PPP2CB 및 PAG1 ; PPP2CB 및 PDCD1 ; PPP2CB 및 PPP2CA ; PRDM1 및 BATF ; PRDM1 및 BTLA ; PRDM1 및 CASP10 ; PRDM1 및 CASP3 ; PRDM1 및 CASP6 ; PRDM1 및 CASP7 ; PRDM1 및 CASP8 ; PRDM1 및 CD160 ; PRDM1 및 CD244 ; PRDM1 및 CD96 ; PRDM1 및 CRTAM ; PRDM1 및 CSK ; PRDM1 및 CTLA4 ; PRDM1 및 EIF2AK4 ; PRDM1 및 FADD ; PRDM1 및 FAS ; PRDM1 및 FOXP3 ; PRDM1 및 GUCY1A2 ; PRDM1 및 GUCY1A3 ; PRDM1 및 GUCY1B2 ; PRDM1 및 GUCY1B3 ; PRDM1 및 HAVCR2 ; PRDM1 및 HMOX2 ; PRDM1 및 IL10RA ; PRDM1 및 IL10RB ; PRDM1 및 IL6R ; PRDM1 및 IL6ST ; PRDM1 및 LAG3 ; PRDM1 및 LAIR1 ; PRDM1 및 PAG1 ; PRDM1 및 PDCD1 ; PRDM1 및 PPP2CA ; PRDM1 및 PPP2CB ; PTPN22 및 BATF ; PTPN22 및 BTLA ; PTPN22 및 CASP10 ; PTPN22 및 CASP3 ; PTPN22 및 CASP6 ; PTPN22 및 CASP7 ; PTPN22 및 CASP8 ; PTPN22 및 CD160 ; PTPN22 및 CD244 ; PTPN22 및 CD96 ; PTPN22 및 CRTAM ; PTPN22 및 CSK ; PTPN22 및 CTLA4 ; PTPN22 및 EIF2AK4 ; PTPN22 및 FADD ; PTPN22 및 FAS ; PTPN22 및 FOXP3 ; PTPN22 및 GUCY1A2 ; PTPN22 및 GUCY1A3 ; PTPN22 및 GUCY1B2 ; PTPN22 및 GUCY1B3 ; PTPN22 및 HAVCR2 ; PTPN22 및 HMOX2 ; PTPN22 및 IL10RA ; PTPN22 및 IL10RB ; PTPN22 및 IL6R ; PTPN22 및 IL6ST ; PTPN22 및 LAG3 ; PTPN22 및 LAIR1 ; PTPN22 및 PAG1 ; PTPN22 및 PDCD1 ; PTPN22 및 PPP2CA ; PTPN22 및 PPP2CB ; PTPN22 및 PRDM1 ; PTPN6 및 BATF ; PTPN6 및 BTLA ; PTPN6 및 CASP10 ; PTPN6 및 CASP3 ; PTPN6 및 CASP6 ; PTPN6 및 CASP7 ; PTPN6 및 CASP8 ; PTPN6 및 CD160 ; PTPN6 및 CD244 ; PTPN6 및 CD96 ; PTPN6 및 CRTAM ; PTPN6 및 CSK ; PTPN6 및 CTLA4 ; PTPN6 및 EIF2AK4 ; PTPN6 및 FADD ; PTPN6 및 FAS ; PTPN6 및 FOXP3 ; PTPN6 및 GUCY1A2 ; PTPN6 및 GUCY1A3 ; PTPN6 및 GUCY1B2 ; PTPN6 및 GUCY1B3 ; PTPN6 및 HAVCR2 ; PTPN6 및 HMOX2 ; PTPN6 및 IL10RA ; PTPN6 및 IL10RB ; PTPN6 및 IL6R ; PTPN6 및 IL6ST ; PTPN6 및 LAG3 ; PTPN6 및 LAIR1 ; PTPN6 및 PAG1 ; PTPN6 및 PDCD1 ; PTPN6 및 PPP2CA ; PTPN6 및 PPP2CB ; PTPN6 및 PRDM1 ; PTPN6 및 PTPN22 ; SIGLEC7 및 BATF ; SIGLEC7 및 BTLA ; SIGLEC7 및 CASP10 ; SIGLEC7 및 CASP3 ; SIGLEC7 및 CASP6 ; SIGLEC7 및 CASP7 ; SIGLEC7 및 CASP8 ; SIGLEC7 및 CD160 ; SIGLEC7 및 CD244 ; SIGLEC7 및 CD96 ; SIGLEC7 및 CRTAM ; SIGLEC7 및 CSK ; SIGLEC7 및 CTLA4 ; SIGLEC7 및 EIF2AK4 ; SIGLEC7 및 FADD ; SIGLEC7 및 FAS ; SIGLEC7 및 FOXP3 ; SIGLEC7 및 GUCY1A2 ; SIGLEC7 및 GUCY1A3 ; SIGLEC7 및 GUCY1B2 ; SIGLEC7 및 GUCY1B3 ; SIGLEC7 및 HAVCR2 ; SIGLEC7 및 HMOX2 ; SIGLEC7 및 IL10RA ; SIGLEC7 및 IL10RB ; SIGLEC7 및 IL6R ; SIGLEC7 및 IL6ST ; SIGLEC7 및 LAG3 ; SIGLEC7 및 LAIR1 ; SIGLEC7 및 PAG1 ; SIGLEC7 및 PDCD1 ; SIGLEC7 및 PPP2CA ; SIGLEC7 및 PPP2CB ; SIGLEC7 및 PRDM1 ; SIGLEC7 및 PTPN22 ; SIGLEC7 및 PTPN6 ; SIGLEC9 및 BATF ; SIGLEC9 및 BTLA ; SIGLEC9 및 CASP10 ; SIGLEC9 및 CASP3 ; SIGLEC9 및 CASP6 ; SIGLEC9 및 CASP7 ; 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SIT1 및 PAG1 ; SIT1 및 PDCD1 ; SIT1 및 PPP2CA ; SIT1 및 PPP2CB ; SIT1 및 PRDM1 ; SIT1 및 PTPN22 ; SIT1 및 PTPN6 ; SIT1 및 SIGLEC7 ; SIT1 및 SIGLEC9 ; SKI 및 BATF ; SKI 및 BTLA ; SKI 및 CASP10 ; SKI 및 CASP3 ; SKI 및 CASP6 ; SKI 및 CASP7 ; SKI 및 CASP8 ; SKI 및 CD160 ; SKI 및 CD244 ; SKI 및 CD96 ; SKI 및 CRTAM ; SKI 및 CSK ; SKI 및 CTLA4 ; SKI 및 EIF2AK4 ; SKI 및 FADD ; SKI 및 FAS ; SKI 및 FOXP3 ; SKI 및 GUCY1A2 ; SKI 및 GUCY1A3 ; SKI 및 GUCY1B2 ; SKI 및 GUCY1B3 ; SKI 및 HAVCR2 ; SKI 및 HMOX2 ; SKI 및 IL10RA ; SKI 및 IL10RB ; SKI 및 IL6R ; SKI 및 IL6ST ; SKI 및 LAG3 ; SKI 및 LAIR1 ; SKI 및 PAG1 ; SKI 및 PDCD1 ; SKI 및 PPP2CA ; SKI 및 PPP2CB ; SKI 및 PRDM1 ; SKI 및 PTPN22 ; SKI 및 PTPN6 ; SKI 및 SIGLEC7 ; SKI 및 SIGLEC9 ; SKI 및 SIT1 ; SKIL 및 BATF ; SKIL 및 BTLA ; SKIL 및 CASP10 ; SKIL 및 CASP3 ; SKIL 및 CASP6 ; SKIL 및 CASP7 ; SKIL 및 CASP8 ; SKIL 및 CD160 ; SKIL 및 CD244 ; SKIL 및 CD96 ; SKIL 및 CRTAM ; SKIL 및 CSK ; SKIL 및 CTLA4 ; SKIL 및 EIF2AK4 ; SKIL 및 FADD ; SKIL 및 FAS ; SKIL 및 FOXP3 ; SKIL 및 GUCY1A2 ; SKIL 및 GUCY1A3 ; SKIL 및 GUCY1B2 ; SKIL 및 GUCY1B3 ; SKIL 및 HAVCR2 ; SKIL 및 HMOX2 ; SKIL 및 IL10RA ; SKIL 및 IL10RB ; SKIL 및 IL6R ; SKIL 및 IL6ST ; SKIL 및 LAG3 ; SKIL 및 LAIR1 ; SKIL 및 PAG1 ; SKIL 및 PDCD1 ; SKIL 및 PPP2CA ; SKIL 및 PPP2CB ; SKIL 및 PRDM1 ; SKIL 및 PTPN22 ; SKIL 및 PTPN6 ; SKIL 및 SIGLEC7 ; SKIL 및 SIGLEC9 ; SKIL 및 SIT1 ; SKIL 및 SKI ; SMAD10 및 BATF ; SMAD10 및 BTLA ; SMAD10 및 CASP10 ; SMAD10 및 CASP3 ; SMAD10 및 CASP6 ; SMAD10 및 CASP7 ; SMAD10 및 CASP8 ; SMAD10 및 CD160 ; SMAD10 및 CD244 ; SMAD10 및 CD96 ; SMAD10 및 CRTAM ; SMAD10 및 CSK ; SMAD10 및 CTLA4 ; SMAD10 및 EIF2AK4 ; SMAD10 및 FADD ; SMAD10 및 FAS ; SMAD10 및 FOXP3 ; SMAD10 및 GUCY1A2 ; SMAD10 및 GUCY1A3 ; SMAD10 및 GUCY1B2 ; SMAD10 및 GUCY1B3 ; SMAD10 및 HAVCR2 ; SMAD10 및 HMOX2 ; SMAD10 및 IL10RA ; SMAD10 및 IL10RB ; SMAD10 및 IL6R ; SMAD10 및 IL6ST ; SMAD10 및 LAG3 ; SMAD10 및 LAIR1 ; SMAD10 및 PAG1 ; SMAD10 및 PDCD1 ; SMAD10 및 PPP2CA ; SMAD10 및 PPP2CB ; SMAD10 및 PRDM1 ; SMAD10 및 PTPN22 ; SMAD10 및 PTPN6 ; SMAD10 및 SIGLEC7 ; SMAD10 및 SIGLEC9 ; SMAD10 및 SIT1 ; SMAD10 및 SKI ; SMAD10 및 SKIL ; SMAD2 및 BATF ; SMAD2 및 BTLA ; SMAD2 및 CASP10 ; SMAD2 및 CASP3 ; SMAD2 및 CASP6 ; SMAD2 및 CASP7 ; SMAD2 및 CASP8 ; SMAD2 및 CD160 ; SMAD2 및 CD244 ; SMAD2 및 CD96 ; SMAD2 및 CRTAM ; SMAD2 및 CSK ; SMAD2 및 CTLA4 ; SMAD2 및 EIF2AK4 ; SMAD2 및 FADD ; SMAD2 및 FAS ; SMAD2 및 FOXP3 ; SMAD2 및 GUCY1A2 ; SMAD2 및 GUCY1A3 ; SMAD2 및 GUCY1B2 ; SMAD2 및 GUCY1B3 ; SMAD2 및 HAVCR2 ; SMAD2 및 HMOX2 ; SMAD2 및 IL10RA ; SMAD2 및 IL10RB ; SMAD2 및 IL6R ; SMAD2 및 IL6ST ; SMAD2 및 LAG3 ; SMAD2 및 LAIR1 ; SMAD2 및 PAG1 ; SMAD2 및 PDCD1 ; SMAD2 및 PPP2CA ; SMAD2 및 PPP2CB ; SMAD2 및 PRDM1 ; SMAD2 및 PTPN22 ; SMAD2 및 PTPN6 ; SMAD2 및 SIGLEC7 ; SMAD2 및 SIGLEC9 ; SMAD2 및 SIT1 ; SMAD2 및 SKI ; SMAD2 및 SKIL ; SMAD2 및 SMAD10 ; SMAD3 및 BATF ; SMAD3 및 BTLA ; SMAD3 및 CASP10 ; SMAD3 및 CASP3 ; SMAD3 및 CASP6 ; SMAD3 및 CASP7 ; SMAD3 및 CASP8 ; SMAD3 및 CD160 ; SMAD3 및 CD244 ; SMAD3 및 CD96 ; SMAD3 및 CRTAM ; SMAD3 및 CSK ; SMAD3 및 CTLA4 ; SMAD3 및 EIF2AK4 ; SMAD3 및 FADD ; SMAD3 및 FAS ; SMAD3 및 FOXP3 ; SMAD3 및 GUCY1A2 ; SMAD3 및 GUCY1A3 ; SMAD3 및 GUCY1B2 ; SMAD3 및 GUCY1B3 ; SMAD3 및 HAVCR2 ; SMAD3 및 HMOX2 ; SMAD3 및 IL10RA ; SMAD3 및 IL10RB ; SMAD3 및 IL6R ; SMAD3 및 IL6ST ; SMAD3 및 LAG3 ; SMAD3 및 LAIR1 ; SMAD3 및 PAG1 ; SMAD3 및 PDCD1 ; SMAD3 및 PPP2CA ; SMAD3 및 PPP2CB ; SMAD3 및 PRDM1 ; SMAD3 및 PTPN22 ; SMAD3 및 PTPN6 ; SMAD3 및 SIGLEC7 ; SMAD3 및 SIGLEC9 ; SMAD3 및 SIT1 ; SMAD3 및 SKI ; SMAD3 및 SKIL ; SMAD3 및 SMAD10 ; SMAD3 및 SMAD2 ; SMAD4 및 BATF ; SMAD4 및 BTLA ; SMAD4 및 CASP10 ; SMAD4 및 CASP3 ; SMAD4 및 CASP6 ; SMAD4 및 CASP7 ; SMAD4 및 CASP8 ; SMAD4 및 CD160 ; SMAD4 및 CD244 ; SMAD4 및 CD96 ; SMAD4 및 CRTAM ; SMAD4 및 CSK ; SMAD4 및 CTLA4 ; SMAD4 및 EIF2AK4 ; SMAD4 및 FADD ; SMAD4 및 FAS ; SMAD4 및 FOXP3 ; SMAD4 및 GUCY1A2 ; SMAD4 및 GUCY1A3 ; SMAD4 및 GUCY1B2 ; SMAD4 및 GUCY1B3 ; SMAD4 및 HAVCR2 ; SMAD4 및 HMOX2 ; SMAD4 및 IL10RA ; SMAD4 및 IL10RB ; SMAD4 및 IL6R ; SMAD4 및 IL6ST ; SMAD4 및 LAG3 ; SMAD4 및 LAIR1 ; SMAD4 및 PAG1 ; SMAD4 및 PDCD1 ; SMAD4 및 PPP2CA ; SMAD4 및 PPP2CB ; SMAD4 및 PRDM1 ; SMAD4 및 PTPN22 ; SMAD4 및 PTPN6 ; SMAD4 및 SIGLEC7 ; SMAD4 및 SIGLEC9 ; SMAD4 및 SIT1 ; SMAD4 및 SKI ; SMAD4 및 SKIL ; SMAD4 및 SMAD10 ; SMAD4 및 SMAD2 ; SMAD4 및 SMAD3 ; TGFBR1 및 BATF ; TGFBR1 및 BTLA ; TGFBR1 및 CASP10 ; TGFBR1 및 CASP3 ; TGFBR1 및 CASP6 ; TGFBR1 및 CASP7 ; TGFBR1 및 CASP8 ; TGFBR1 및 CD160 ; TGFBR1 및 CD244 ; TGFBR1 및 CD96 ; TGFBR1 및 CRTAM ; TGFBR1 및 CSK ; TGFBR1 및 CTLA4 ; TGFBR1 및 EIF2AK4 ; TGFBR1 및 FADD ; TGFBR1 및 FAS ; TGFBR1 및 FOXP3 ; TGFBR1 및 GUCY1A2 ; TGFBR1 및 GUCY1A3 ; TGFBR1 및 GUCY1B2 ; TGFBR1 및 GUCY1B3 ; TGFBR1 및 HAVCR2 ; TGFBR1 및 HMOX2 ; TGFBR1 및 IL10RA ; TGFBR1 및 IL10RB ; TGFBR1 및 IL6R ; TGFBR1 및 IL6ST ; TGFBR1 및 LAG3 ; TGFBR1 및 LAIR1 ; TGFBR1 및 PAG1 ; TGFBR1 및 PDCD1 ; TGFBR1 및 PPP2CA ; TGFBR1 및 PPP2CB ; TGFBR1 및 PRDM1 ; TGFBR1 및 PTPN22 ; TGFBR1 및 PTPN6 ; TGFBR1 및 SIGLEC7 ; TGFBR1 및 SIGLEC9 ; TGFBR1 및 SIT1 ; TGFBR1 및 SKI ; TGFBR1 및 SKIL ; TGFBR1 및 SMAD10 ; TGFBR1 및 SMAD2 ; TGFBR1 및 SMAD3 ; TGFBR1 및 SMAD4 ; TGFBR2 및 BATF ; TGFBR2 및 BTLA ; TGFBR2 및 CASP10 ; TGFBR2 및 CASP3 ; TGFBR2 및 CASP6 ; TGFBR2 및 CASP7 ; TGFBR2 및 CASP8 ; TGFBR2 및 CD160 ; TGFBR2 및 CD244 ; TGFBR2 및 CD96 ; TGFBR2 및 CRTAM ; TGFBR2 및 CSK ; TGFBR2 및 CTLA4 ; TGFBR2 및 EIF2AK4 ; TGFBR2 및 FADD ; TGFBR2 및 FAS ; TGFBR2 및 FOXP3 ; TGFBR2 및 GUCY1A2 ; TGFBR2 및 GUCY1A3 ; TGFBR2 및 GUCY1B2 ; TGFBR2 및 GUCY1B3 ; TGFBR2 및 HAVCR2 ; TGFBR2 및 HMOX2 ; TGFBR2 및 IL10RA ; TGFBR2 및 IL10RB ; TGFBR2 및 IL6R ; TGFBR2 및 IL6ST ; TGFBR2 및 LAG3 ; TGFBR2 및 LAIR1 ; TGFBR2 및 PAG1 ; TGFBR2 및 PDCD1 ; TGFBR2 및 PPP2CA ; TGFBR2 및 PPP2CB ; TGFBR2 및 PRDM1 ; TGFBR2 및 PTPN22 ; TGFBR2 및 PTPN6 ; TGFBR2 및 SIGLEC7 ; TGFBR2 및 SIGLEC9 ; TGFBR2 및 SIT1 ; TGFBR2 및 SKI ; TGFBR2 및 SKIL ; TGFBR2 및 SMAD10 ; TGFBR2 및 SMAD2 ; TGFBR2 및 SMAD3 ; TGFBR2 및 SMAD4 ; TGFBR2 및 TGFBR1 ; TGIF1 및 BATF ; TGIF1 및 BTLA ; TGIF1 및 CASP10 ; TGIF1 및 CASP3 ; TGIF1 및 CASP6 ; TGIF1 및 CASP7 ; TGIF1 및 CASP8 ; TGIF1 및 CD160 ; TGIF1 및 CD244 ; TGIF1 및 CD96 ; TGIF1 및 CRTAM ; TGIF1 및 CSK ; TGIF1 및 CTLA4 ; TGIF1 및 EIF2AK4 ; TGIF1 및 FADD ; TGIF1 및 FAS ; TGIF1 및 FOXP3 ; TGIF1 및 GUCY1A2 ; TGIF1 및 GUCY1A3 ; TGIF1 및 GUCY1B2 ; TGIF1 및 GUCY1B3 ; TGIF1 및 HAVCR2 ; TGIF1 및 HMOX2 ; TGIF1 및 IL10RA ; TGIF1 및 IL10RB ; TGIF1 및 IL6R ; TGIF1 및 IL6ST ; TGIF1 및 LAG3 ; TGIF1 및 LAIR1 ; TGIF1 및 PAG1 ; TGIF1 및 PDCD1 ; TGIF1 및 PPP2CA ; TGIF1 및 PPP2CB ; TGIF1 및 PRDM1 ; TGIF1 및 PTPN22 ; TGIF1 및 PTPN6 ; TGIF1 및 SIGLEC7 ; TGIF1 및 SIGLEC9 ; TGIF1 및 SIT1 ; TGIF1 및 SKI ; TGIF1 및 SKIL ; TGIF1 및 SMAD10 ; TGIF1 및 SMAD2 ; TGIF1 및 SMAD3 ; TGIF1 및 SMAD4 ; TGIF1 및 TGFBR1 ; TGIF1 및 TGFBR2 ; TIGIT 및 BATF ; TIGIT 및 BTLA ; TIGIT 및 CASP10 ; TIGIT 및 CASP3 ; TIGIT 및 CASP6 ; TIGIT 및 CASP7 ; TIGIT 및 CASP8 ; TIGIT 및 CD160 ; TIGIT 및 CD244 ; TIGIT 및 CD96 ; TIGIT 및 CRTAM ; TIGIT 및 CSK ; TIGIT 및 CTLA4 ; TIGIT 및 EIF2AK4 ; TIGIT 및 FADD ; TIGIT 및 FAS ; TIGIT 및 FOXP3 ; TIGIT 및 GUCY1A2 ; TIGIT 및 GUCY1A3 ; TIGIT 및 GUCY1B2 ; TIGIT 및 GUCY1B3 ; TIGIT 및 HAVCR2 ; TIGIT 및 HMOX2 ; TIGIT 및 IL10RA ; TIGIT 및 IL10RB ; TIGIT 및 IL6R ; TIGIT 및 IL6ST ; TIGIT 및 LAG3 ; TIGIT 및 LAIR1 ; TIGIT 및 PAG1 ; TIGIT 및 PDCD1 ; TIGIT 및 PPP2CA ; TIGIT 및 PPP2CB ; TIGIT 및 PRDM1 ; TIGIT 및 PTPN22 ; TIGIT 및 PTPN6 ; TIGIT 및 SIGLEC7 ; TIGIT 및 SIGLEC9 ; TIGIT 및 SIT1 ; TIGIT 및 SKI ; TIGIT 및 SKIL ; TIGIT 및 SMAD10 ; TIGIT 및 SMAD2 ; TIGIT 및 SMAD3 ; TIGIT 및 SMAD4 ; TIGIT 및 TGFBR1 ; TIGIT 및 TGFBR2 ; TIGIT 및 TGIF1 ; TNFRSF10A 및 BATF ; TNFRSF10A 및 BTLA ; TNFRSF10A 및 CASP10 ; TNFRSF10A 및 CASP3 ; TNFRSF10A 및 CASP6 ; TNFRSF10A 및 CASP7 ; TNFRSF10A 및 CASP8 ; TNFRSF10A 및 CD160 ; TNFRSF10A 및 CD244 ; TNFRSF10A 및 CD96 ; TNFRSF10A 및 CRTAM ; TNFRSF10A 및 CSK ; TNFRSF10A 및 CTLA4 ; TNFRSF10A 및 EIF2AK4 ; TNFRSF10A 및 FADD ; TNFRSF10A 및 FAS ; TNFRSF10A 및 FOXP3 ; TNFRSF10A 및 GUCY1A2 ; TNFRSF10A 및 GUCY1A3 ; TNFRSF10A 및 GUCY1B2 ; TNFRSF10A 및 GUCY1B3 ; TNFRSF10A 및 HAVCR2 ; TNFRSF10A 및 HMOX2 ; TNFRSF10A 및 IL10RA ; TNFRSF10A 및 IL10RB ; TNFRSF10A 및 IL6R ; TNFRSF10A 및 IL6ST ; TNFRSF10A 및 LAG3 ; TNFRSF10A 및 LAIR1 ; TNFRSF10A 및 PAG1 ; TNFRSF10A 및 PDCD1 ; TNFRSF10A 및 PPP2CA ; TNFRSF10A 및 PPP2CB ; TNFRSF10A 및 PRDM1 ; TNFRSF10A 및 PTPN22 ; TNFRSF10A 및 PTPN6 ; TNFRSF10A 및 SIGLEC7 ; TNFRSF10A 및 SIGLEC9 ; TNFRSF10A 및 SIT1 ; TNFRSF10A 및 SKI ; TNFRSF10A 및 SKIL ; TNFRSF10A 및 SMAD10 ; TNFRSF10A 및 SMAD2 ; TNFRSF10A 및 SMAD3 ; TNFRSF10A 및 SMAD4 ; TNFRSF10A 및 TGFBR1 ; TNFRSF10A 및 TGFBR2 ; TNFRSF10A 및 TGIF1 ; TNFRSF10A 및 TIGIT ; TNFRSF10B 및 BATF ; TNFRSF10B 및 BTLA ; TNFRSF10B 및 CASP10 ; TNFRSF10B 및 CASP3 ; TNFRSF10B 및 CASP6 ; TNFRSF10B 및 CASP7 ; TNFRSF10B 및 CASP8 ; TNFRSF10B 및 CD160 ; TNFRSF10B 및 CD244 ; TNFRSF10B 및 CD96 ; TNFRSF10B 및 CRTAM ; TNFRSF10B 및 CSK ; TNFRSF10B 및 CTLA4 ; TNFRSF10B 및 EIF2AK4 ; TNFRSF10B 및 FADD ; TNFRSF10B 및 FAS ; TNFRSF10B 및 FOXP3 ; TNFRSF10B 및 GUCY1A2 ; TNFRSF10B 및 GUCY1A3 ; TNFRSF10B 및 GUCY1B2 ; TNFRSF10B 및 GUCY1B3 ; TNFRSF10B 및 HAVCR2 ; TNFRSF10B 및 HMOX2 ; TNFRSF10B 및 IL10RA ; TNFRSF10B 및 IL10RB ; TNFRSF10B 및 IL6R ; TNFRSF10B 및 IL6ST ; TNFRSF10B 및 LAG3 ; TNFRSF10B 및 LAIR1 ; TNFRSF10B 및 PAG1 ; TNFRSF10B 및 PDCD1 ; TNFRSF10B 및 PPP2CA ; TNFRSF10B 및 PPP2CB ; TNFRSF10B 및 PRDM1 ; TNFRSF10B 및 PTPN22 ; TNFRSF10B 및 PTPN6 ; TNFRSF10B 및 SIGLEC7 ; TNFRSF10B 및 SIGLEC9 ; TNFRSF10B 및 SIT1 ; TNFRSF10B 및 SKI ; TNFRSF10B 및 SKIL ; TNFRSF10B 및 SMAD10 ; TNFRSF10B 및 SMAD2 ; TNFRSF10B 및 SMAD3 ; TNFRSF10B 및 SMAD4 ; TNFRSF10B 및 TGFBR1 ; TNFRSF10B 및 TGFBR2 ; TNFRSF10B 및 TGIF1 ; TNFRSF10B 및 TIGIT ; TNFRSF10B 및 TNFRSF10A :로 구성되는 군으로부터 선택된다.
유전자를 불활성화시킴으로써, 관심있는 유전자가 기능적 단백질 형태로 발현되지 않도록 의도된다. 그 유전자는 바뀌거나 결실될 수 있다. 특정 예에서, 상기 단백질은 돌연변이되고 우성의(dominant) 음성(negative) 형태로서 활성으로 계속 남을 수 있다. 또다른 특정 예에서, 본 방법의 유전적 변형은 조작할 제공된 세포들에서, 하나의 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 발현에 의존하며, 그리하여 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 특이적으로 하나의 타겟된 유전자 내에서 절단(cleavage)을 촉매화하고, 이로써 상기 타겟된 유전자를 불활성화시킨다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의하여 야기되는 핵산 가닥 손상(breaks)들은 상동(homologous) 재조합(recombination) 또는 비상동(non-homologous) 말단(end) 연결(joining) (NHEJ)의 구별되는 메커니즘들을 통하여 보통 수선된다. 그러나 NHEJ는 절단(cleavage)의 위치(site)에서 DNA 서열에 변화들을 종종 야기하는 불완전한 수선 공정이다. 메커니즘들은 직접적인 재-연결(ligation)을 통한(Critchlow and Jackson 1998), 또는 소위 미세상동성(microhomology)-매개(mediated) 말단(end) 연결(joining) (Ma, Kim et al. 2003)을 통한, 두 개의 DNA 말단들(ends)의 남아있는 것의 재연결(rejoining)을 수반한다. 비상동성(non-homologous) 말단(end) 연결(joining) (NHEJ)을 통한 수선은 가끔 작은 삽입들 또는 결실들을 야기하고, 그리고 특이적 유전자 넉아웃들(knockouts)의 창조에 이용될 수 있다. 상기 변형은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 첨가(addition)일 수 있다. 절단-유도된 돌연변이유발(mutagenesis) 이벤트, 즉, NHEJ 이벤트에 연이은 돌연변이유발(mutagenesis) 이벤트가 발생한 세포들은 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 선택되고 그리고/또는 확인될 수 있다.
특정 예에서, 상기 세포들을 조작하는 방법은 하기 단계들 중 적어도 하나를 포함한다:
(a) 바람직하게는 세포 배양물(culture)로부터 또는 혈액 샘플로부터 T-세포를 제공하는 단계;
(b) 면역 체크포인트 단백질들을 코드하는 적어도 두 개의 유전자들을, 바람직하게는 이중-가닥(strand) 손상(break)에 의하여, DNA 절단(cleavage)에 의하여 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 상기 T-세포 희귀-절단 엔도뉴클레아제들 내로 도입하는 단계, 및
(c) 상기 세포들을 확장하는(expanding) 단계.
면역 체크포인트 단백질들을 코드하는 상기 유전자들은 바람직하게는 전술한 리스트로부터 선택된다.
또다른 예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제(meganuclease), 징크(Zinc) 핑거(finger) 뉴클레아제(nuclease), CRISPR/Cas9 또는 TALE-뉴클레아제(nuclease)일 수 있다. 바람직한 예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다. TALE-뉴클레아제에 의하여 전사(Transcription) 액티베이터(Activator) 유사(Like) 이펙터(Effector) (TALE)로부터 유래된 DNA-결합 도메인 및 핵산 타겟 서열을 절단하기 위한 하나의 뉴클레아제 촉매(catalytic) 도메인으로 구성되는 융합 단백질이 의도된다 (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Cermak, Doyle et al. 2011; Geissler, Scholze et al. 2011; Huang, Xiao et al. 2011; Li, Huang et al. 2011; Mahfouz, Li et al. 2011; Miller, Tan et al. 2011; Morbitzer, Romer et al. 2011; Mussolino, Morbitzer et al. 2011; Sander, Cade et al. 2011; Tesson, Usal et al. 2011; Weber, Gruetzner et al. 2011; Zhang, Cong et al. 2011; Deng, Yan et al. 2012; Li, Piatek et al. 2012; Mahfouz, Li et al. 2012; Mak, Bradley et al. 2012).
본 발명에서 새로운 TALE-뉴클레아제들은 입양 면역요법 전략들을 위하여 관련된 유전자들을 정확하게 타겟팅하기 위하여 디자인되었다. 본 발명에 따라 선호되는 TALE-뉴클레아제들은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 표적 서열을 인식하고 절단하는 것들이다: 서열번호(SEQ ID NO): 77 및 서열번호: 78 (PD1), 서열번호: 74 내지 서열번호: 76 (CTLA-4). 본 발명은 또한 서열번호: 79 내지 서열번호: 88로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 TALE-뉴클레아제 폴리펩타이드들에 대한 것이다.
또다른 예에서, 추가의 촉매 도메인이 타겟인 유전자들을 불활성화시키는 그것들의 능력을 증강시키기 위하여 돌연변이생성(mutagenesis)을 증강시키기 위하여 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제로 세포 내 추가로 도입될 수 있다. 특히, 상기 추가의 촉매 도메인은 DNA 말단(end) 가공(processing) 효소이다. DNA 말단-가공 효소들의 제한되지 않는 예들은 5-3' 엑소뉴클레아제들(exonucleases), 3-5' 엑소뉴클레아제들(exonucleases), 5-3' 알칼라인 엑소뉴클레아제들(exonucleases), 5' 플랩(flap) 엔도뉴클레아제들, 헬리카제들(helicases), 호스파타제(hosphatase), 하이드롤라제들(hydrolases) 및 주형-독립적 DNA 폴리메라제들(polymerases)을 포함한다. 이러한 촉매 도메인의 제한되지 않는 예들은 hExoI (EXO1_HUMAN), 효모(Yeast) ExoI (EXO1_YEAST), 대장균(E.coli) ExoI, 인간 TREX2, 마우스 TREX1, 인간 TREX1, 소(Bovine) TREX1, 래트(Rat) TREX1, TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) 인간 DNA2, 효모 DNA2 (DNA2_YEAST)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질 도메인 또는 단백질 도메인의 촉매적으로 활성인 파생물(derivate)을 포함한다. 바람직한 예에서, 상기 추가의 촉매 도메인은 3'-5'-엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 갖고, 더욱 바람직한 예에서 상기 추가의 촉매 도메인은 TREX이고, 더욱 바람직하게는 TREX2 촉매(catalytic) 도메인 (WO2012/058458)이다. 또다른 바람직한 예에서, 상기 촉매 도메인은 단일 사슬 TREX 폴리펩타이드에 의하여 코드된다 (WO2013/009525). 상기 추가의 촉매 도메인은 펩타이드 링커(linker)에 의하여 선택적으로 본 발명에 따른 뉴클레아제 융합(fusion) 단백질 또는 키메라(chimeric) 단백질에 융합될 수 있다.
엔도뉴클레오리틱(endonucleolytic) 손상들(breaks)은 상동 재조합의 비율을 자극하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 또다른 예에서, 본 방법의 유전적 변형 단계는 타겟 핵산 서열의 부분에 상동인(homologous) 서열을 적어도 포함하여, 상동 재조합이 핵산 서열 및 외인성(exogeneous) 핵산 사이에서 발생하는, 외인성(exogeneous) 핵산을 세포들 내로 도입하는 단계를 더 포함한다. 특정 예들에서, 상기 외인성(exogenous) 핵산은 각각 타겟 핵산 서열의 5' 및 3' 영역에 상동인 첫 번째 및 두 번째 부분들을 포함한다. 이들 예들에서 상기 외인성(exogenous) 핵산은 또한 타겟 핵산 서열의 5' 및 3' 영역들과 상동성(homology)이 없는, 첫 번째 및 두 번째 부분 사이에 위치하는 세 번째 부분을 포함한다. 타겟 핵산 서열의 절단(cleavage) 후, 상동 재조합 이벤트(event)가 타겟 핵산 서열 및 외인성(exogenous) 핵산 사이에서 자극된다. 바람직하게는 적어도 50 bp, 바람직하게는 100 bp보다 많은, 그리고 더욱 바람직하게는 200 bp 보다 많은 상동 서열들이 상기 도너(donor) 매트릭스matrix) 내에 사용된다. 특히, 상동(homologous) 서열은 바람직하게는 200 bp 부터 6000 bp까지, 더욱 바람직하게는 1000 bp 부터 2000 bp 까지이다. 정말, 공유된(shared) 핵산 상동성들(homologies)은 손상(break)의 위치의 다운스트림(downstream) 및 업스트림(upstream)의 측면의 영역들에 위치되고, 도입될 핵산 서열은 두 암들(arms) 사이에 위치되어야 한다.
특히, 상기 외인성(exogenous) 핵산은 상기 절단(cleavage)의 업스트림 서열들에 상동성(homology)의 첫 번째 영역, 면역 체크포인트 유전자들로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 표적된 유전자를 불활성화시키기 위한 서열 및 절단(cleavage)의 다운스트림 서열들에 상동성(homology)의 두 번째 영역을 연속적으로 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드 도입 단계는 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 발현 또는 도입과 동시, 전, 또는 후일 수 있다. 손상(break) 이벤트가 발생하는 타겟 핵산 서열의 위치에 의존하여, 이러한 외인성(exogenous) 핵산은 예컨대, 외인성(exogenous) 핵산이 상기 유전자의 오픈(open) 리딩(reading) 프레임(frame) 내 위치될 때, 유전자를 넉아웃(knock-out)시키는데, 또는 관심있는 유전자들 또는 신규 서열들을 도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 외인성(exogenous) 핵산을 이용한 서열 삽입들은 상기 유전자의 대체(replacement) 또는 수정(correction)(제한되지 않는 예로서 대립형질(allele) 교체(swap))에 의하여 타겟인 기존 유전자를 변형하는데, 또는, 상기 타겟인 유전자 수정(correction) 또는 대체(replacement), 타겟인 유전자의 발현을 상향- 또는 하향-조절하는데(제한되지 않는 것으로서 프로모터 교체(swap)) 사용될 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 추가의 게놈 변형 단계는 하기를 포함하는 불활성화 단계일 수 있다:
(a) 적어도 하나의 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 상기 세포들 내로 도입하여, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제가 상기 세포의 게놈의 하나의 타겟된 서열에서 특이적으로 절단(cleavage)을 촉매화하는 단계.
(b) 상기 절단(cleavage)의 업스트림(upstream) 서열들에 대한 상동성(homology)의 첫 번째 영역(region), 상기 세포의 게놈 내 삽입되는 서열 및 상기 절단(cleavage)의 다운스트림(downstream) 서열들에 대한 상동성(homology)의 두 번째 영역을 연속적으로 포함하는 외인성(exogenous) 핵산을 상기 세포들 내로 선택적으로 도입하는 단계,
이때, 상기 도입되는 외인성(exogenous) 핵산은 유전자를 불활성화시키고, 관심있는 적어도 하나의 재조합 단백질을 코드하는 적어도 하나의 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오타이드 서열을 통합시키는(integrate) 단계. 또다른 예에서, 상기 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오타이드 서열은 면역 체크포인트 유전자들로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자 내에 통합된다.
특정 예에서 세포를 조작하는 상기 방법은 추가의 게놈 변형 단계를 더 포함한다. 추가적인 게놈 변형 단계에 의하여 관심있는 하나의 단백질을 조작하기 위하여 세포들 내로의 도입이 의도될 수 있다. 상기 관심있는 단백질은, 제한되지 않는 예로서, 본 공개에서 기재된 대로, 키메라(Chimeric) 항원(Antigen) 수용체(Receptor) (CAR), 다사슬 CAR, 이중특이성 항체일 수 있다. 세포를 조작하는 상기 방법은, 본 공개에서 기재된 대로, 상기 면역억제(immunosuppressive) 제제(agent), TCR 유전자들,를 위한 타겟을 코드하는 유전자를, DNA 절단(cleavage)에 의하여 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 도입을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 TALE-뉴클레아제들에 대한 것이다. 일반적으로 본 발명은 하기를 포함하는 TALE-뉴클레아제에 대한 것이다:
(a) 면역 체크포인트 유전자들로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자들 내 타겟 서열에 결합하도록 조작된 전사(Transcription) 액티베이터(Activator)-유사(Like) 이펙터(Effector) (TALE) DNA 결합 도메인(domain);
(b) 절단(cleavage) 도메인 또는 절단(cleavage) 반(half)-도메인(domain).
본 발명에 따른 바람직한 TALE-뉴클레아제들은 서열번호: 77 및 서열번호: 78 (PD1) 및 서열번호: 74 내지 서열번호: 76 로 구성되는 군으로부터 선택되는 타겟 서열을 인식하고 절단하는 그것들이다 (CTLA-4).
상기 TALE-뉴클레아제들은 바람직하게는 각각 타겟 서열번호: 74 내지 78을 절단하기 위하여, 서열번호: 79 내지 서열번호: 88 로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 변동성(variability)은 이들 폴리펩타이드들이 유래하는 게놈 데이터로부터 발생될 수 있기 때문에, 또한 활성의 중요한 손실 없이 이들 폴리펩타이드들 내 존재하는 아미노산들 중 일부를 치환하는 가능성을 고려할 때(기능적 변이체들), 본 발명은 이 특허출원에서 제공되는 서열들과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80 %, 더욱 바람직하게는 적어도 90 % 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 95 % 동일성(identity)을 공유하는 상기 폴리펩타이드들의 폴리펩타이드들 변이체들(variants)를 포함한다.
이런 식으로 본 발명은 서열번호: 79 내지 서열번호: 88 로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 서열 동일성(identity)을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드들에 대한 것이다.
본 발명의 범위에는, 또한 본 발명에 따른 상기 전술한 희귀-절단 엔도뉴클레아제들을 코드하는 벡터들, 폴리뉴클레오타이드들이 포함된다.
본 발명의 범위에는 또한, 바람직하게는, CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3 :의 군으로부터 선택되는 유전자들인, 면역 체크포인트 유전자들로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나 유전자가, 더욱 바람직하게는 앞서 리스트된 상기 유전자들 중 두 개가 불활성화된, 특히 T 세포들인, 세포들을 조작하는 상기 방법에 의하여 수득되는 것을 할 수 있는 분리된 세포들 또는 세포주들이 포함된다. 그들 유전자들은 바람직하게는 적어도 하나의 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의하여 불활성화된다. TALE-뉴클레아제들의 사용이 T-세포들에서 이중 불활성화를 달성하는데 특히 유리하다는 것이 본 발명자들에 의하여 보여졌다. 본 발명은 또한 CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3 과 같은, 바람직하게는 면역 체크포인트 단백질들을 코드하는 적어도 두 개의 유전자들로 향하여지는 TALE-뉴클레아제들인, 적어도 첫 번째 및 두 번째 TALE-뉴클레아제들을 코드하는 상기 폴리뉴클레오타이드들인, 적어도 두 개의 폴리뉴클레오타이드들을 포함하는 분리된 T-세포를 포함한다. 또다른 예에서, 상기 분리된 세포는 하나의 추가적인 게놈 변형을 더 포함한다. 또다른 예에서, 상기 추가적인 게놈 변형은 적어도 하나의 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오타이드 서열의 통합(integration)이다.
면역요법을 위한 비( non ) 동종반응성( alloreactive )이고 고활성인 T 세포들
입양 면역요법을 이용한 환자들의 치료를 위한 현재의 프로토콜은 자가(autologous) 세포 이동(transfer)을 기반으로 한다. 자가(autologous) 요법들은 실질적 적용까지 상당한 기술적 및 로지스틱(logistic) 장애물들을 직면하고 있는데, 그것들의 발생(generation)은 비싼(dedicated) 설비들 및 전문 인력을 요구하고, 그것들은 환자의 진단 후 짧은 시간 내에 발생되어야 하고, 그리고 많은 경우들에, 환자의 전치료(pretreatment)는 저하된 면역 작용을 야기하여, 환자의 림프구들이 기능이 나쁘고 매우 낮은 수로 존재할 수 있다. 이상적으로, 동종이형(allogeneic) 치료적 세포들이 미리-제조되고(pre-manufactured), 상세하게 특징되고, 그리고 환자들에의 즉시 투여가 가능한 , 표준화된 치료를 사용할 것이다. 그러나, 숙주 조직을 외래의 것(foreign)으로 인식하는 동종이형(allogeneic) 세포들의 내생(endogenous) TCR 특이성들은 이식편대숙주(graft versus host) 질병(disease) (GvHD)을 야기하는데, 이는 심각한 조직 손상 및 사망으로 이끌 수 있다. 그러므로, 동종이형(allogeneic) 세포들을 효과적으로 이용하기 위하여, TCR알파(alpha) 또는 TCR베타(beta)의 불활성화는, 따라서 GVHD 및 동종항원(alloantigen)의 인식을 방지하는 T 세포들의 표면으로부터 TCR의 제거를 야기할 수 있다.
그러므로, 특정 측면에서, 본 발명은, 특히 면역요법을 위하여 동종이형(allogeneic) T-세포들을 조작하는 방법에 대한 것일 수 있다.
특정 예에서, 본 발명은 하기를 포함한다:
(a) T 세포를 제공하는 단계,
(b) 적어도 하기를 불활성화시킴으로써 T-세포들을 변형시키는 단계:
- 면역 체크포인트 단백질을 코드하는 첫 번째 유전자, 및
- T-세포 수용체 (TCR)의 요소(component)를 코드하는 두 번째 유전자
(c) 상기 세포들을 확장시키는(expanding) 단계.
특정 예에서, 본 방법의 유전적 변형 단계는 CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, TCR 알파 및 TCR 베타로 구성되는 군으로부터 선택되는, 하나의 유전자, 바람직하게는 두 개의 유전자들의 불활성화에 의존한다. 또다른 예에서, 본 방법의 유전적 변형 단계는 CTLA4 및 TCR 알파, CTLA4 및 TCR 베타, PPP2CA 및 TCR 알파, PPP2CB 및 TCR 베타, PTPN6 및 TCR 알파, PTPN6 및 TCR 베타, PTPN22 및 TCR 알파, PTPN22 및 TCR 베타, PDCD1 및 TCR 알파, PDCD1 및 TCR 베타, LAG3 및 TCR 알파, LAG3 및 TCR 베타, HAVCR2 및 TCR 알파, HAVCR2 및 TCR 베타, BTLA 및 TCR 알파, BTLA 및 TCR 베타, CD160 및 TCR 알파, CD160 및 TCR 베타, TIGIT 및 TCR 알파, TIGIT 및 TCR 베타, CD96 및 TCR 알파, CD96 및 TCR 베타, CRTAM 및 TCR 알파, CRTAM 및 TCR 베타, LAIR1 및 TCR 알파, LAIR1 및 TCR 베타, SIGLEC7 및 TCR 알파, SIGLEC7 및 TCR 베타, SIGLEC9 및 TCR 알파, SIGLEC9 및 TCR 베타, CD244 및 TCR 알파, CD244 및 TCR 베타,TNFRSF10B 및 TCR 알파, TNFRSF10B 및 TCR 베타, TNFRSF10A 및 TCR 알파, TNFRSF10A 및 TCR 베타, CASP8 및 TCR 알파, CASP8 및 TCR 베타, CASP10 및 TCR 알파, CASP10 및 TCR 베타, CASP3 및 TCR 알파, CASP3 및 TCR 베타, CASP6 및 TCR 알파, CASP6 및 TCR 베타, CASP7 및 TCR 알파, CASP7 및 TCR 베타, FADD 및 TCR 알파, FADD 및 TCR 베타, FAS 및 TCR 알파, FAS 및 TCR 베타, TGFBRII 및 TCR 알파, TGFBRII 및 TCR 베타, TGFRBRI 및 TCR 알파, TGFRBRI 및 TCR 베타, SMAD2 및 TCR 알파, SMAD2 및 TCR 베타, SMAD3 및 TCR 알파, SMAD3 및 TCR 베타, SMAD4 및 TCR 알파, SMAD4 및 TCR 베타, SMAD10 및 TCR 알파, SMAD10 및 TCR 베타, SKI 및 TCR 알파, SKIL 및 TCR 베타, TGIF1 및 TCR 알파, TGIF1 및 TCR 베타, IL10RA 및 TCR 알파, IL10RA 및 TCR 베타, IL10RB 및 TCR 알파, IL10RB 및 TCR 베타, HMOX2 및 TCR 알파, HMOX2 및 TCR 베타,IL6R 및 TCR 알파, IL6R 및 TCR 베타, IL6ST 및 TCR 알파, IL6ST 및 TCR 베타, EIF2AK4 및 TCR 알파, EIF2AK4 및 TCR 베타, CSK 및 TCR 알파, CSK 및 TCR 베타, PAG1 및 TCR 알파, PAG1 및 TCR 베타, SIT1 및 TCR 알파, SIT1 및 TCR 베타, FOXP3 및 TCR 알파, FOXP3 및 TCR 베타, PRDM1 및 TCR 알파, PRDM1 및 TCR 베타, BATF 및 TCR 알파, BATF 및 TCR 베타, GUCY1A2 및 TCR 알파, GUCY1A2 및 TCR 베타 , GUCY1A3 및 TCR 알파, GUCY1A3 및 TCR 베타, GUCY1B2 및 TCR 알파, GUCY1B2 및 TCR 베타, GUCY1B3 및 TCR 알파, GUCY1B3 및 TCR 베타로 구성되는 군으로부터 선택되는 두 개의 유전자들의 불활성화에 의존한다. 또다른 예에서, 본 방법의 유전적 변형 단계는 둘보다 많은 유전자들의 불활성화에 의존한다. 그 유전적 변형은 바람직하게는 엑스-비보(ex-vivo)에서 작동된다.
특정 예에서, 세포들을 조작하는 상기 방법은 하기 단계들 중 적어도 하나를 포함한다:
(a) 바람직하게는 세포 배양물(culture) 또는 혈액 샘플로부터 T-세포를 제공하는 단계;
(b) DNA 절단(cleavage), 바람직하게는 이중-가닥 손상(break)에 의하여 각각, 하기를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 상기 T-세포 내로 도입시키는 단계:
- 면역 체크포인트 단백질를 코드하는 상기 유전자, 및
- T-세포 수용체 (TCR)의 요소(component)를 코드하는 적어도 하나의 유전자.
(c) 상기 세포들을 확장하는 단계.
더욱 바람직한 예에서, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(a) 바람직하게는 세포 배양물(culture)로부터 또는 혈액 샘플로부터 T-세포를 제공하는 단계;
(b) DNA 절단(cleavage), 바람직하게는 이중-가닥 손상(break)에 의하여 각각 하기를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 코드하는 핵산으로 상기 T 세포를 형질전환(transform) 시키는 단계:
- 면역 체크포인트 단백질을 코드하는 상기 유전자 및
- T-세포 수용체 (TCR)의 요소(component)를 코드하는 적어도 하나의 유전자
(c) 상기 T-세포들 내로 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제들를 발현시키는 단계;
(d) 그것들의 세포 표면에서 TCR을 발현시키지 않는, 형질전환된(transformed) T-세포들을 분류하는 단계;
(e) 상기 세포들을 확장시키는 단계.
특정 예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, TCR 알파 및 TCR 베타: 로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자, 바람직하게는 두 개의 유전자들을 특이적으로 타겟으로 한다. 또다른 예에서, 둘보다 많은 희귀-절단 엔도뉴클레아제들이 둘보다 많은 유전자들을 타겟으로 하고 그리고/또는 불활성화시키기 위하여 조작하기 위하여 세포들 내에서 발현될 수 있다.
또다른 예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제(meganuclease), 징크(Zinc) 핑거(finger) 뉴클레아제 또는 TALE-뉴클레아제일 수 있다. 바람직한 예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다.
본 발명에서, 신규 TALE-뉴클레아제들이 입양 면역요법 전략을을 위한 관련 있는 유전자들을 정확하게 타겟팅하기 위하여 디자인되었다. 본 발명에 따른 선호되는 TALE-뉴클레아제들은 서열번호: 77 및 서열번호: 78 (PD1), 서열번호: 74 내지 서열번호: 76 (CTLA-4), 서열번호: 37, 57 내지 60 (TCR알파(alpha)), 서열번호: 38 또는 39 (TCR베타(beta)):로 구성되는 군으로부터 선택되는 타겟 서열을 인식하고 절단하는 그것들이다. 본 발명은 또한 서열번호: 79 내지 서열번호: 88 및 서열번호: 41 내지 46 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 TALE-뉴클레아제 폴리펩타이드들에 대한 것이다.
본 발명은 또한 서열번호: 79 내지 서열번호: 88로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 서열 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드들에 대한 것이다. 본 발명의 범위에는 또한 본 발명에 따른 전술한 희귀-절단 엔도뉴클레아제들을 코드하는 벡터들, 폴리뉴클레오타이드들이 포함된다. 이 방법은 본 공개에서 기재된 다른 방법들 중 임의의 하나와 연관될 수 있다.
바람직한 예에서, 면역 체크포인트 유전자들, TCR 알파 및 TCR 베타로 구성되는 군으로부터의 유전자들의 불활성화는 특이적 TALE-뉴클레아제에 의하여 타겟되는 정확한 게놈 위치에서 될 수 있고, 이 때, 상기 특이적 TALE-뉴클레아제는 절단(cleavage)을 촉매화하고 그리고 이 때 외인성(exogenous) 핵산은 적어도 상동성(homology)의 한 영역 및 상동 재조합에 의하여 통합되는, 면역 체크포인트 유전자들, TCR 알파 및 TCR 베타로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 타겟된 유전자를 불활성화시키기 위한 서열을 연속적으로 포함한다. 또다른 예에서, 몇몇의 유전자들은, 연속적으로 또는 동시에, 각각 몇몇의 TALE-뉴클레아제들에 의하여 불활성화되고, 특이적 유전자 불활성화를 위하여 몇몇 특이적 폴리뉴클레오타이드들 및 하나의 정의된 유전자를 특이적으로 타겟팅할 수 있다.
추가적인 게놈 변형 단계에 의하여, 면역 체크포인트 유전자들, TCR 알파 및 TCR 베타로 구성되는 군으로부터 선택되는 또다른 유전자의 불활성화가 또한 의도될 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 추가의 게놈 변형 단계는 하기를 포함하는 불활성화 단계일 수 있다:
(a) 상기 세포들 내로 적어도 하나의 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 도입하여, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제가 상기 세포의 게놈의 하나의 타겟된 서열 내 절단(cleavage)을 특이적으로 촉매화하는 단계.
(b) 상기 세포들 내로 상기 절단(cleavage)의 업스트림 서열들에 대한 상동성(homology)의 첫 번째 영역, 상기 세포의 게놈 내 삽입되는 서열 및 상기 절단(cleavage)의 다운스트림 서열들에 대한 상동성(homology)의 두 번째 영역을 연속적으로 포함하는 외인성(exogenous) 핵산을 선택적으로 도입하는 단계,
이 때, 상기 도입되는 외인성(exogenous) 핵산은 유전자를 불활성화시키고 그리고 관심있는 적어도 하나의 재조합 단백질을 코드하는 적어도 하나의 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오타이드 서열을 통합(integrates)한다. 또다른 예에서, 상기 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오타이드 서열은 면역 체크포인트 유전자들, TCR 알파 및 TCR 베타로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자 내에 통합된다.
특정 예에서, 세포를 조작하는 상기 방법은 추가의 게놈 변형 단계를 더 포함한다. 추가의 게놈 변형 단계에 의하여, 관심있는 하나의 단백질을 조작하기 위하여 세포들 내로 도입이 의도될 수 있다. 상기 관심있는 단백질은, 제한되지 않는 예로서, 본 공개에 기재된 바와 같이, pT알파(pTalpha) 또는 그것의 기능적 변이체(variant), 키메라(Chimeric) 항원(Antigen) 수용체(Receptor) (CAR), 다사슬(multi-chain) CAR, 이중특이성(bispecific) 항체일 수 있다. 세포를 조작하는 상기 방법은 또한 본 공개에서 기재된 바와 같이 상기 면역억제제를 위한 타겟을 코드하는 유전자를 DNA 절단(cleavage)에 의하여 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 도입을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 범위에는 또한 본 발명에 따른 전술한 희귀-절단 엔도뉴클레아제들을 코드하는 벡터들, 폴리뉴클레오타이드들이 포함된다.
본 발명의 범위에, CTLA4 및 TCR 알파, CTLA4 및 TCR 베타, PPP2CA 및 TCR 알파, PPP2CB 및 TCR 베타, PTPN6 및 TCR 알파, PTPN6 및 TCR 베타, PTPN22 및 TCR 알파, PTPN22 및 TCR 베타, PDCD1 및 TCR 알파, PDCD1 및 TCR 베타, LAG3 및 TCR 알파, LAG3 및 TCR 베타, HAVCR2 및 TCR 알파, HAVCR2 및 TCR 베타, BTLA 및 TCR 알파, BTLA 및 TCR 베타, CD160 및 TCR 알파, CD160 및 TCR 베타, TIGIT 및 TCR 알파, TIGIT 및 TCR 베타, CD96 및 TCR 알파, CD96 및 TCR 베타, CRTAM 및 TCR 알파, CRTAM 및 TCR 베타, LAIR1 및 TCR 알파, LAIR1 및 TCR 베타, SIGLEC7 및 TCR 알파, SIGLEC7 및 TCR 베타, SIGLEC9 및 TCR 알파, SIGLEC9 및 TCR 베타, CD244 및 TCR 알파, CD244 및 TCR 베타,TNFRSF10B 및 TCR 알파, TNFRSF10B 및 TCR 베타, TNFRSF10A 및 TCR 알파, TNFRSF10A 및 TCR 베타, CASP8 및 TCR 알파, CASP8 및 TCR 베타, CASP10 및 TCR 알파, CASP10 및 TCR 베타, CASP3 및 TCR 알파, CASP3 및 TCR 베타, CASP6 및 TCR 알파, CASP6 및 TCR 베타, CASP7 및 TCR 알파, CASP7 및 TCR 베타, FADD 및 TCR 알파, FADD 및 TCR 베타, FAS 및 TCR 알파, FAS 및 TCR 베타, TGFBRII 및 TCR 알파, TGFBRII 및 TCR 베타, TGFRBRI 및 TCR 알파, TGFRBRI 및 TCR 베타, SMAD2 및 TCR 알파, SMAD2 및 TCR 베타, SMAD3 및 TCR 알파, SMAD3 및 TCR 베타, SMAD4 및 TCR 알파, SMAD4 및 TCR 베타, SMAD10 및 TCR 알파, SMAD10 및 TCR 베타, SKI 및 TCR 알파, SKIL 및 TCR 베타, TGIF1 및 TCR 알파, TGIF1 및 TCR 베타, IL10RA 및 TCR 알파, IL10RA 및 TCR 베타, IL10RB 및 TCR 알파, IL10RB 및 TCR 베타, HMOX2 및 TCR 알파, HMOX2 및 TCR 베타,IL6R 및 TCR 알파, IL6R 및 TCR 베타, IL6ST 및 TCR 알파, IL6ST 및 TCR 베타, EIF2AK4 및 TCR 알파, EIF2AK4 및 TCR 베타, CSK 및 TCR 알파, CSK 및 TCR 베타, PAG1 및 TCR 알파, PAG1 및 TCR 베타, SIT1 및 TCR 알파, SIT1 및 TCR 베타, FOXP3 및 TCR 알파, FOXP3 및 TCR 베타, PRDM1 및 TCR 알파, PRDM1 및 TCR 베타, BATF 및 TCR 알파, BATF 및 TCR 베타, GUCY1A2 및 TCR 알파, GUCY1A2 및 TCR 베타, GUCY1A3 및 TCR 알파, GUCY1A3 및 TCR 베타, GUCY1B2 및 TCR 알파, GUCY1B2 및 TCR 베타, GUCY1B3 및 TCR 알파, GUCY1B3 및 TCR 베타 로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 두 개의 유전자들이 불활성화된, 세포들, 특히 T 세포들을 조작하는 상기 방법에 의하여 수득되는 것이 가능한, 분리된 세포들 또는 세포주들이 또한 포함된다.
본 발명에 따라, 그 유전자들이 바람직하게는 적어도 하나의 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의하여 불활성화된다. 본 발명자들에 의하여, TALE-뉴클레아제들의 이용이 T-세포들에서 이중 불활성화을 달성하는데 특히 유리하였다는 것이 보여졌다. 본 발명은 적어도 두 개의 폴리뉴클레오타이드들을 포함하는 분리된 T-세포를 포함하는데, 적어도 첫 번째 및 두 번째 TALE-뉴클레아제들을 코드하는 상기 폴리뉴클레오타이드들이고, 바람직하게는, TCR을 코드하는 유전자로 향하여 지는 첫 번째 TALE-뉴클레아제 및, CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3 과 같은, 면역 체크포인트 단백질을 코드하는 유전자로 향하여지는 두 번째이다. 또다른 예에서, 상기 분리된 세포는 하나의 추가적인 게놈 변형을 더 포함한다. 또다른 예에서, 상기 추가적인 게놈 변형은 적어도 하나의 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오타이드 서열의 통합(integration)이다.
면역억제제( immunosuppressive ) 내성( resistant ) T 세포들
동종이형(allogeneic) 세포들은 숙주 면역 체계에 의하여 신속히 거부된다. 방사능 처리되지 않은(non-irradiated) 혈액 제품들 내 동종이형(allogeneic) 백혈구들(leukocytes)이 5 내지 6 일(days) 내로 유지될 것이라는 것이 입증되어 왔다(Boni, Muranski et al. 2008). 그러므로, 동종이형(allogeneic) 세포들의 거부를 예방하기 위하여, 숙주의 면역 체계는 어느 정도까지는 보통 억제되어야 한다. 그러나 입양 면역요법(immunotherapy)의 경우, 면역억제(immunosuppressive) 약물들의 이용은 또한 도입된 치료적 T 세포들 상에 해로운 효과를 갖는다. 그러므로 이들 조건들(conditions)에서 입양 면역요법(immunotherapy) 접근을 효과적으로 이용하기 위하여, 도입된 세포들은 또한 면역억제 치료에 내성이어야 한다. 그러므로 특히 예에서, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 면역억제 제제를 위한 타겟을 코드하는 적어도 하나의 유전자을 불활성화시킴으로써, T-세포들을 변형하여 그것들을 면역억제 제제에 내성으로 만드는 단계를 더 포함한다. 면역억제 제제는 작용의 몇몇 메커니즘들 중 하나에 의하여 면역 기능을 억제하는 제제이다. 다시 말해서, 면역억제 제제는 면역 반응의 정도를 줄이는 능력에 의하여 보여지는 화합물에 의하여 되는 역할이다. 제한되지 않는 예로서, 면역억제 제제는 칼시뉴린(calcineurin) 억제제, 라파미신(rapamycin)의 타겟, 인터루킨(interleukin)-2α-사슬(chain) 차단제(blocker), 이노신(inosine) 모노포스페이트(monophosphate) 디하이드로게나제(dehydrogenase)의 억제제, 디하이드로엽산(dihydrofolic acid) 리덕타제(reductase)의 억제제, 코리트코스테로이드(corticosteroid) 또는 면역억제(immunosuppressive) 항대사물질(antimetabolite)일 수 있다. 고전적인 세포독성 면역억제제들(immunosuppressants)은 DNA 합성을 억제함으로써 작용한다. 다른 것들은 T-세포들의 활성화를 통하여 또는 헬퍼(helper) 세포들의 활성화를 억제함으로써 작용할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 T 세포들에서 면역억제 제제의 타겟을 불활성화시킴으로써 면역요법(immunotherapy)을 위하여 T 세포들에 면역억제제(immunosuppressive) 내성을 주는 것을 가능하게 한다. 제한되지 않는 예들로서, 면역억제 제제를 위한 타겟(targets)들은 CD52, 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 수용체 (GR), FKBP 패밀리(family) 유전자 멤버 및 사이클로필린(cyclophilin) 패밀리 유전자 멤버:와 같은, 면역억제 제제를 위한 수용체일 수 있다.
특정 예에서, 본 발명의 유전적 변형은, 조작하기 위하여 제공된 세포들에서, 하나의 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 발현에 의존하여, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제가 하나의 타겟된 유전자에서 특이적으로 절단(cleavage)을 촉매화하고, 이로써 상기 타겟된 유전자를 불활성화시킨다. 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제은 메가뉴클레아제(meganuclease), 징크(Zinc) 핑거(finger) 뉴클레아제 또는 TALE-뉴클레아제일 수 있다. 본 발명에 따른 선호되는 TALE-뉴클레아제들은 서열번호: 1 내지 6 (GR), 및 서열번호: 40, 61 내지 65 (CD52) 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 타겟 서열을 인식하고 절단하는 그것들이다. 상기 TALE-뉴클레아제들은 바람직하게는 서열번호: 7 내지 서열번호: 18 및 서열번호: 47 내지 48 로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
몇몇 변동성(variability)은 이들 폴리펩타이드들이 파생되는 게놈 데이터로부터 일어나기 때문에, 그리고 또한 활성의 중요한 손실 없이 이들 폴리펩타이드들 내 존재하는 아미노산들의 일부를 치환(substitute)하는 능력을 고려할 때(기능적 변이체들), 본 발명은 이 특허 출원에서 제공되는 서열들과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80 %, 더욱 바람직하게는 적어도 90 % 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95 % 동일성(identity)를 공유하는 상기 폴리펩타이드들의 폴리펩타이드들 변이체들(variants)을 포함한다.
그러므로 본 발명은 서열번호: 7 내지 서열번호: 18 및 서열번호: 47 및 서열번호: 48로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 서열 동일성(identity)을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드들에 대한 것이다.
본 발명의 범위 내에, 본 발명에 따른 전술한 희귀-절단 엔도뉴클레아제들을 코드하는 벡터들, 폴리뉴클레오타이드들이 포함된다.
프리 T알파( PreTalpha )
TCR알파(alpha)가 불활성화되는 T 세포들에서, 흉선 발달 동안 프리T알파(preTalpha)와의 짝짓기(pairing)을 통한 TCR베타(beta) 사슬들의 특성 때문에, pT알파(pTalpha) 이식유전자(transgene)의 이종기원(heterologous) 도입은 preTCR의 형성을 야기할 수 있다. 이 pTCR은 비(non)-MHC 의존적인 방식으로 T 세포 활성화 또는 자극의 수단의 역할을 할 수 있고, 그러므로, 예를 들어 TCR알파(alpha) 불활성화 후 알파/베타 T-세포들의 연속된 확장을 허용한다. 중요하게, pTCR 복합체는 관련된 CD3 서브유닛들의 면에서 TCR로서 유사한 생화학적 조성물을 보여준다 (Carrasco, Ramiro et al. 2001). 게다가, TCR과 대조적으로, 프리(pre)-TCR 신호전달(signaling)은 어느 정도는 리간드 독립적 이벤트(event)에 의하여 발생할 수 있다. pTCR 세포외(extracellular) 도메인(domain)의 결정 구조는 pTCR 신호전달의 가능한 리간드-독립의 구조적 기초를 제공하였다. pTCR은 두 개의 pT알파-TCR베타 헤테로다이머들(heterodimers)이 연관되는 머리 내지 꼬리 다이머를 형성하는 것으로 나타나졌다 (Pang, Berry et al. 2010).
또다른 측면에서, 본 발명에 따른 방법은 상기 T-세포 pT알파(pTalpha) (preTCRα으로도 명명됨) 또는 그 기능적 변이체 내로 도입하는 단계 및 선택적으로 CD3 복합체의 자극을 통하여, 상기 세포들을 확장하는 단계를 더 포함한다. 바람직한 예에서, 본 방법은 하기를 포함한다:
a) CD3 표면 발현을 지지하기 위하여 적어도 pT알파(pTalpha)의 단편을 코드하는 핵산으로 상기 세포들을 형질전환(transform)시키는 단계
b) 상기 세포들 내로 상기 pT알파(pTalpha)를 발현시키는 단계
c) 선택적으로 CD3 복합체의 자극을 통하여, 상기 세포들을 확장시키는(expanding) 단계.
본 발명은 또한 T-세포에 대한 확장 방법의 단계들을 포함하는 면역요법을 위한 T-세포들을 제조하는(preparing) 방법에 대한 것이다.
특정 예에서, pT알파(pTalpha) 폴리뉴클레오타이드 서열은 무작위로 또는 달리 상동 재조합을 통하여 도입될 수 있고, 특히, 삽입은 TCR알파 유전자의 불활성화와 관련될 수 있다.
본 발명에 따라, pT알파(pTalpha)의 다른 기능적 변이체들이 사용된다. 펩타이드의 "기능적 변이체"는 전체 펩타이드 또는 그 단편과 상당히 유사한 분자를 나타낸다. 본 발명의 pT알파(pTalpha) 또는 그것의 기능적 변이체(variant)의 "단편"은, 분자의 임의의 서브셋(subset, 즉, 더 짧은 펩타이드를 나타낸다. 선호되는 pT알파(pTalpha) 또는 기능적 변이체들(variants)은 전장(full length) pT알파(pTalpha) 또는 C-말단 잘린(truncated) pT알파(pTalpha) 버젼일 수 있다. C-말단 잘린(truncated) pT알파(pTalpha)는 C-말단 말단(end)된 하나 또는 더 많은 잔기들이 부족하다. 제한되지 않는 예들로서, C-말단 잘린(truncated) pT알파(pTalpha) 버젼은 단백질의 C-말단으로부터 18 , 48, 62, 78, 92, 110 또는 114 잔기들이 부족하다 (서열번호: 107 내지 서열번호: 114). 게다가, 펩타이드의 아미노산 서열 변이체들(variants)은 펩타이드를 코드하는 DNA 내 돌연변이들에 의하여 제조(prepare)될 수 있다. 이러한 기능적 변이체들은, 예를 들어, 아미노산 서열 내 잔기들로부터의 결실들, 또는 잔기들의 삽입들 또는 치환들을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 또한, 최종 구조체가 원하는 활성, 특히 기능적 CD3 복합체의 회복(restoration),을 가지면, 최종 구조체에서 도달하기 위하여 만들어질 수 있다. 바람직한 예에서, 적어도 하나의 돌연변이가 이합체화에 영향을 미치기 위하여 전술한 대로 다른 pT알파(pTalpha) 법젼들에 도입된다. 제한되지 않는 예로서, 돌연변이가 된 잔기들은 적어도 인간 pT알파(pTalpha) 단백질의 W46R, D22A, K24A, R102A 또는 R117A 또는 pT알파(pTalpha) 패밀리 또는 상동 멤버 상에 CLUSTALW을 이용한 정렬된(aligned) 위치들일 수 있다. 바람직하게는 pT알파(pTalpha) 또는 전술한대로 그것의 변이체는 돌연변이된 잔기 W46R (서열번호:123) 또는 돌연변이된 잔기들 D22A, K24A, R102A 및 R117A (서열번호: 124)을 포함한다. 특정 예에서, 상기 pT알파(pTalpha) 또는 변이체들(variants)은 또한 제한되지 않는 예들로서, CD28, OX40, ICOS, CD27, CD137 (4-1BB) 및 CD8 과 같은 단일-형질도입하는(transducing) 도메인에 융합된다 (서열번호: 115 내지 서열번호: 120). 전술한 바와 같이 pT알파(pTalpha) 또는 변이체들의 세포외 도메인은 TCR알파 단백질의 단편, 특히 TCR알파의 막관통 및 세포내(intracellular) 도메인에 융합될 수 있다(서열번호: 122). pT알파(pTalpha) 변이체들은 또한 TCR알파의 세포내 도메인에 융합될 수 있다(서열번호:121 ).
또다른 예에서, 상기 pT알파(pTalpha) 버젼들(versions)들은 세포외 리간드-결합 도메인에 융합되고 그리고 더욱 바람직하게는 pT알파(pTalpha) 또는 그것의 기능적 변이체는 플렉시블 링커에 의하여 연결(join)된 타겟 항원 특이적 단일클론 항체의 가벼운(light) (VL) 그리고 무거운(heavy) (VH) 가변(variable) 단편을 포함하는 단일(single) 사슬(chian) 항체(antibody) 단편(fragment) (scFV)에 융합된다. 제한되지 않는 예로서, pT알파(pTalpha) 또는 그것의 기능적 변이체의 아미노산 서열은 서열번호: 107 내지 서열번호: 124 로 구성되는 군으로부터 선택된다.
몇몇 가변성은 이들 폴리펩타이드들이 유래하는 게놈 데이터로부터 생기기 때문에, 그리고 또한 활성의 중요한 손실 없이 이들 폴리펩타이드들 내 존재하는 아미노산들의 일부를 치환하는 능력을 고려할 때(기능적 변이체들), 본 발명은 이 특허 출원에서 제공되는 서열들과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80 %, 더욱 바람직하게는 적어도 90 % 그리고 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95 % 동일성(identity)을 공유하는 상기 폴리펩타이드들의 폴리펩타이드들 변이체들을 포함한다.
그러므로 본 발명은 서열번호:107 내지 서열번호: 124 로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 서열 동일성(identity)을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드들에 대한 것이다.
TCR 알파 결핍된(deficient) T 세포에 의하여 기능적 TCR 알파 사슬의 발현이 부족한 분리된 T 세포가 의도된다. 이것은, 제한되지 않는 예들로서, T 세포를 조작함으로써, 그것이 그것의 세포 표면 상에 임의의 기능적 TCR 알파를 발현하지 않게 또는 T 세포를 조작함으로써 그것이 그것의 표면 상 극히 조금 기능적인 TCR 알파 사슬을 생산하게 또는 TCR 알파 사슬의 돌연변이된 또는 잘린(truncated) 형태를 발현시키기 위하여 T 세포를 조작함으로써, 다른 수단들에 의하여 달성될 수 있다.
TCR 알파 결핍된(deficient) 세포들은 CD3 복합체(complex)를 통하여 더 이상 확장될 수 없다. 이런 식으로, 이 문제를 극복하기 위하여, 그리고 TCR 알파 결핍된(deficient) 세포들의 증식을 허용하기 위하여, pT알파(pTalpha) 또는 그것의 기능적 변이체가 상기 세포들 내로 도입되고, 이와 같이 기능적 CD3 복합체를 회복하게 한다. 선호되는 예에서, 본 밞영느 T-세포 수용체 (TCR)의 하나의 요소(component)를 코드하는 하나의 유전자의 DNA 절단(cleavage)에 의하여 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제들을 상기 T 세포들 내로 도입하는 단계를 포함한다. 특정 예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제들이다. 제한되지 않는 예들로서, TALE-뉴클레아제는 서열번호: 37 및 서열번호: 57 내지 60 로 구성되는 군으로부터 선택되는 TCR알파의 유전자 타겟 서열들의 하나에 대하여 향해진다. 바람직하게는, TALE-뉴클레아제들은 서열번호: 41 및 서열번호: 42 로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 예에서, TCR 알파 결핍된(deficient) T-세포들의 확장을 위한 상기 방법은 추가의 게놈 변형 단계를 포함한다. 추가의 게놈 변형 단계에 의하여 관심있는 하나의 단백질의 조작을 위하여 세포들 내로 도입이 의도될 수 있다. 상기 관심 있는 단백질은, 제한되지 않는 예들로서, 키메라(Chimeric) 항원(Antigen) 수용체(Receptor) (CAR), 특히 아미노산 서열 서열번호: 73 을 포함하는 CAR, 다사슬(multi-chain) CAR, 특히 아미노산 서열 서열번호: 125를 포함하는 다사슬(multi-chain) CAR , 이중특이성 항체, CTLA-4 또는 PDCD1를 타겟으로 하는, 특히 핵산 서열 서열번호: 74 내지 서열번호: 78을 타겟으로 하는, 희귀-절단 엔도뉴클레아제들, 또는 본 공개에서 기재된 대로 면역억제제를 위한 타겟을 타겟으로 하는 희귀-절단 엔도뉴클레아제일 수 있다.
본 발명에는 또한 pT알파(pTalpha), 특히 전술한 기능적 변이체들을 코드하는 폴리펩타이드들이 포함된다. 선호되는 예에서, 본 발명은 CD28, OX40, ICOS, CD137 및 CD8 과 같은 신호 전달(transducing) 도메인에 융합된 pT알파(pTalpha) 또는 그것의 기능적 변이체에 대한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 서열번호: 107 내지 서열번호: 124로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 pT알파(pTalpha) 기능적 변이체(variant)에 대한 것이다. 본 발명에는 또한 pT알파(pTalpha) 또는 전술한 그것의 기능적 변이체들을 코드하는 벡터들, 폴리뉴클레오타이드들이 포함된다.
본 발명의 범위에는 또한 상기 방법에 의하여 수득될 수 있는 분리된 세포들 또는 세포주들이 포함된다. 특히, 상기 분리된 세포들 또는 세포주들은 CD3 표면 발현을 지지하기 위하여 pT알파(pTalpha) 또는 그것의 기능적 변이체를 상기 세포들 내로 도입함으로써 수득될 수 있다. 선호되는 예에서, 상기 분리된 세포 또는 세포주는 TCR알파 유전자를 불활성화시킴으로써 유전적으로 더 변형된다. 이 유전자는 바람직하게는 적어도 하나의 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의하여 불활성화되고 있다. 선호되는 예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다.
다( multi )-사슬 키메라 ( Chimeric ) 항원( Antigen ) 수용체( Receptor ) ( CAR )
또다른 예에서, 본 발명에 따른 방법은 특히 본 발명의 조작된(engineered) T-세포들의 확장 및 생산에 맞춰진(adapted), 다사슬(multi-chain) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 도입하는 단계를 더 포함한다.
하기 요소들 중 적어도 둘을 포함하는 다사슬(multi-chain) CAR :
a) FcεRI 알파 사슬 및 세포외 리간드-결합 도메인의 막관통(transmembrembrane) 도메인을 포함하는 하나의 폴리펩타이드,
b) FcεRI 베타 사슬의 막관통 도메인 및 N- 및 C- 말단 세포질 꼬리(tail)의 쌍을 포함하는 하나의 폴리펩타이드 및/또는
c) FcεRI 감마(gamma) 사슬의 막관통 도메인 및 세포질내(intracytoplasmic) 꼬리(tail)의 각각의 부분을 포함하는 두 개의 폴리펩타이드들로, 이로써 다른 폴리펩타이드들이 이합체, 삼합체 또는 사합체(tetrameric) CAR를 형성하기 위하여 자발적으로 서로 다합체화한다.
사합체(tetrameric) CAR의 한 예는 도 3에 보여져 있다. 다사슬(multichain) CAR들의 다른 버젼들은 도 4에 나타나 있다. 다사슬(multi-chain) CAR의 한 예는 아미노산 서열 서열번호: 125 을 포함한다. 여기에서 사용된 용어 "의 부분"은 더 짧은 펩타이드인 분자의 임의의 서브셋(subset)을 나타낸다. 대체하여, 폴리펩타이드의 아미노산 서열 기능적 변이체들(variants)은 폴리펩타이드를 코드하는 DNA 내 돌연변이들에 의하여 제조(prepare)될 수 있다. 이러한 기능적 변이체들은 예컨대, 아미노산 서열 내 잔기들로부터의 결실들, 또는 잔기들의 삽입들 또는 치환들을 포함한다. 최종 구조체가, 특히 특이적 항-타겟 세포 면역 활성을 보이는, 원하는 활성을 갖는다면, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합 또한 최종 구조체에 도달하기 위하여 만들어질 수 있다.
바람직한 예에서, 상기 세포외 리간드-결합 도메인은 scFv이다. scFv 외 다른 결합 도메인 또한 제한되지 않는 예들로서 항체 결합 도메인들, 항체 초가변(hypervariable) 루프들(loops) 또는 CDR들, 인테그린(integrin)-결합 펩타이드, 헤레굴린(heregulin), IL-13 뮤테인(mutein) 또는 혈관 내피 성장 인자 폴리펩타이드와 같은 수용체 리간드들, 또는 낙타과(camelid) 단일-도메인 항체 단편들과 같은, 림프구들의 미리 정해진 타겟팅에 사용될 수 있다.
선호되는 예에서 a) 의 상기 폴리펩타이드는 상기 세포외 리간드-결합 도메인 및 상기 막관통 도메인 사이의 스토크(stalk) 영역을 더 포함한다. 여기에서 사용된 용어 "스토크(stalk) 영역"은 세포외 리간드-결합 도메인에 막관통 도메인을 연결(link)하는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩타이드를 보통 의미한다. 특히, 스토크 영역은 세포외 리간드-결합 도메인에 대한 더 많은 유연성(flexibility) 및 접근가능성을 제공하는데 사용된다. 스토크 영역은 300 아미노산들까지, 바람직하게는 10 내지 100 아미노산들 그리고 가장 바람직하게는 25 내지 50 아미노산들을 포함할 수 있다. 스토크 영역은 항체 불변(constant) 영역(region)의 부분 또는 전체로부터 또는 CD8, CD4 또는 CD28의 세포외 영역의 부분 또는 전체로부터와 같은, 자연적으로 발생하는 분자들의 부분 또는 전체로부터 유래될 수 있다. 대체하여 스토크 영역은 자연적으로 발생하는 스토크 영역에 부합하는(correspond) 합성 서열일 수 있고, 또는 완전히 합성 스토크 서열일 수 있다. 바람직한 예에서, a), b) 및/또는 c) 의 상기 폴리펩타이드는 적어도 하나의 신호-전달(transducing) 도메인을 더 포함한다. 가장 선호되는 예에서, 상기 신호-전달(transducing) 도메인은 CD28, OX40, ICOS, CD137 및 CD8 로 구성되는 군으로부터 선택된다.
바람직한 예에서, FcεRI 알파, 베타 및/또는 감마 사슬 단편의 상기 C-말단 세포질 꼬리는 TNFR-관련(associated) 인자(Factor) 2 (TRAF2) 결합 모티프들(motifs)을 더 포함한다. 가장 선호되는 예에서, FcεRI 알파, 베타 및/또는 감마 사슬의 C-말단 세포질 꼬리는 공자극(costimulatory) TNFR 멤버 패밀리의 세포질내 꼬리에 의하여 대체된다. 공자극(costimulatory) TNFR 패밀리 멤버의 세포질(cytoplasmic) 꼬리는 주된 보존(conserved) 모티프(motif) (P/S/A)X(Q/E)E) 또는 마이너한(minor) 모티프(motif) (PXQXXD)로 구성되며, 이때 X는 임의의 아미노산인, TRAF2 결합 모티프들(motifs)를 포함한다. TRAF 단백질들은 수용체 삼합체화(trimerization)에 대한 대응하여 많은 TNFR들의 세포내 꼬리들에 구성된다.
또다른 바람직한 예에서 FcεRI 알파, 베타 및/또는 감마 사슬의 상기 세포질내 도메인은 TCR 제타(zeta) 사슬의 세포질내 도메인(CD3 제타(zeta)로도 명명됨)에 의하여 대체된다. 또다른 바람직한 예에서 FcεRI 알파, 베타 및/또는 감마 사슬의 상기 세포질내 도메인을 적어도 하나의 추가적인 면역수용체(immunoreceptor) 티로신(tyrosine)-기반의(based) 활성화(activation) 모티프(motif) (ITAM)를 포함한다. ITAM들은 syk/zap70 클래스(class) 티로신 키나제들을 위한 결합 부위들로서 작용하는 여러가지 수용체들의 세포질내 꼬리에서 발견되는 잘 정의된 신호 모티프들이다. 본 발명에서 사용되는 ITAM의 예들은 TCR제타(zeta), FCR감마(gamma), FCR베타(beta), CD3감마(gamma), CD3델타(delta), CD3엡실론(epsilon), CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래되는 그것들을 포함한다.
제한되지 않는 예로서, 다사슬(multi-chain) CAR의 다른 버젼들은 도 4에 나타나 있다.
바람직한 예에서 다사슬(multi-chain) CAR는 아미노산 서열 서열번호: 125 을 포함한다. 본 발명은 서열번호: 125 로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 서열 동일성(identity)를 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드들에 대한 것이다.
본 발명의 범위에는 또한 본 발명에 따른 전술한 다사슬(multi-chain) CAR를 코딩하는 벡터들, 폴리뉴클레오타이드들이 포함된다.
포함되는 특정 예에는, 본 발명은 상기 세포들을 확장시키고(expanding) 그리고 상기 다사슬(multi-chain) CAR를 포함하는(composing) 다른 폴리펩타이드들을 상기 T-세포들 내로 도입하는 단계를 포함하는 면역요법을 위한 T-세포들을 제조하는(preparing) 방법에 대한 것이다.
또다른 예에서, 상기 방법은 면역억제제에 대한 타겟 및/또는 TCR의 하나의 요소를 발현시키는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 상기 세포들을 유전적으로 변형하는 단계를 더 포함한다. 바람직한 예에서, 상기 유전자는 TCR알파(alpha), TCR베타(beta), CD52 및 GR로 구성되는 군으로부터 선택된다. 바람직한 예에서 상기 방법은 상기 유전자들을 DNA 절단(cleavage)에 의하여 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제로 상기 T 세포들 내로 도입하는 단계를 더 포함한다. 더 바람직한 예에서 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다. 본 발명에 따른 바람직한 TALE-뉴클레아제들은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 타겟 서열을 인식하고 절단하는 그것들이다: 서열번호: 1 내지 6 (GR), 서열번호: 37, 57 내지 60 (TCR알파(alpha)), 서열번호: 38 또는 39 (TCR베타(beta)), 및 서열번호: 40, 서열번호: 61 내지 서열번호: 65 (CD52).
특정 예에서 상기 방법은 추가의 게놈 변형 단계를 더 포함한다. 추가의 게놈 변형 단계에 의하여, 관심있는 하나의 단백질을 조작하기 위하여 세포들 내로의 도입이 의도될 수 있다. 관심있는 상기 단백질은, 제한되지 않는 예들로서, 이중특이성 항체, CTLA-4 또는 PDCD1 을 타겟팅하는 희귀-절단 엔도뉴클레아제, pT알파(pTalpha) 또는 본 공개에 기재된 그것의 기능적 변이체일 수 있다.
본 발명은 또한 세포들을 조작하기 위하여 상기 방법에 의하여 수득되기 쉬운 분리된 세포들 또는 세포주들에 대한 것이다. 특히 상기 분리된 세포는 상기 다사슬(multi-chain) CAR를 포함하는(composing) 폴리펩타이드들을 코드하는 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오타이드 서열들을 포함한다.
이중특이성 ( bispecific ) 항체들
추가의 예에 따라, 전술한 바와 같이 다른 방법들에 의하여 수득되는 조작된 T 세포들은 이중특이성 항체들로 더 노출(expose)될 수 있다. 상기 T-세포들은 환자에게 투여된 후 인 비보로 또는 환자에게 투여 전 엑스 비보로 이중특이성 항체들에 노출(expose)될 수 있다. 상기 이중특이성 항체들은 타겟 항원에 가깝게 조작된 세포들을 가져오는 것을 허용하는 구별되는(distinct) 항원 특성들을 갖는 두 개의 가변(variable) 영역들을 포함한다. 제한되지 않는 예로서, 상기 이중특이성 항체는 CD3 와 같은 림프구 항원 및 종양 마커(marker)에 대하여(against) 향해지고 그리고 종양에 대항하여 임의의 순환하는(circulating) T 세포들을 활성화시키고 전용하는(redirect) 잠재성을 갖는다.
전달( delivery ) 방법들
전술한 다른 방법들은 세포 내로 희귀 절단 엔도뉴클레아제와 같은 관심있는 단백질을 도입하는 단계를 포함한다. 제한되지 않는 예로서, 관심있는 상기 단백질은 바람직하게는 적어도 하나의 플라스미드 벡터에 의하여 코드되는 이식유전자들(transgenes)로서 도입될 수 있다. 폴리펩타이드들은 세포 내로 상기 폴리펩타이드들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들의 도입의 결과로서 세포에서 인 시츄(in situ)로 합성될 수 있다. 대체하여, 상기 폴리펩타이드들은 세포 밖에서 생산되고 그 다음에 거기로 도입될 수도 있다. 세포들 내로 폴리뉴클레오타이드 구조체를 도입하는 방법들은 당업계에 알려져 있으며, 제한되지 않는 예들로서, 이때 폴리뉴클레오타이드 구조체는 세포의 게놈 내로 통합(integrate)되는 안정적인 형질전환(transformation) 방법들, 폴리뉴클레오타이드 구조체가 세포의 게놈 내로 통합되지 않는 일시적인형질전환(transformation) 방법들, 및 바이러스 매개 방법들을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드들은 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터들 (예컨대 레트로바이러스들(retroviruses), 아데노바이러스들(adenoviruses)), 리포좀(liposome) 등에 의하여 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 일시적인 형질전환(transformation) 방법들은 미세주입(microinjection), 전기천공법(electroporation) 또는 유전자총(particle bombardment)을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드들은 세포들에서 발현되는 관점에서, 벡터들, 더욱 특히 플라스미드들 또는 바이러스 내에 포함될 수 있다. 상기 플라스미드 벡터는 상기 벡터를 받는 세포들의 확인 및/또는 선택을 위하여 제공되는 선택 마커를 포함할 수 있다. 다른 이식유전자들(transgenes)이 하나의 벡터에 포함될 수 있다. 상기 벡터는 2A 펩타이드를 코드하는 서열과 같은, 라이보좀(ribosomal) 스킵(skip) 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 피코르나바이러스들(picornaviruses)의 아프토바이러스(Aphthovirus) 서브그룹(subgroup)에서 확인된 2A 펩타이드들은 코돈들에 의하여 코드되는 두 개의 아미노산들 사이의 펩타이드 결합의 형성 어 없이 한 코돈에서 옆의 것으로 라이보좀 "스킵(skip)"을 야기한다(Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007) 참조). "코돈(codon)"에 의하여 하나의 아미노산 잔기 내로 라이보좀(ribosome)에 의하여 번역되는 mRNA 상 (또는 DNA 분자의 센스(sense) 가닥 상) 세 개의 뉴클레오타이드들이 의미된다. 그러므로 두 개의 폴리펩타이드들은 폴리펩타이드들이 인 프레임(in frame)인 2A 올리고펩타이드 서열에 의하여 분리될 때 mRNA 내에서 단일, 인접한(contiguous) 오픈(open) 리딩(reading) 프레임(frame)으로부터 합성될 수 있다. 이러한 라이보좀(ribosomal) 스킵(skip) 메커니즘들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 단일 메신저(messenger) RNA에 의하여 코드되는 몇몇 단백질들의 발현을 위하여 몇몇 벡터들에 의하여 사용되는 것으로 알려져 있다. 제한되지 않는 예로서, 본 발명에서, 2A 펩타이드들은 DNA 말단(end)-가공(processing) 효소 및 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 세포 내로 발현시키는데 사용되어 왔다.
본 발명의 더욱 바람직한 예, 본 발명에 따른 폴리펩타이드들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들은, 예를 들어 전기천공법(electroporation)에 의하여, 세포들 내로 직접 도입되는 mRNA일 수 있다. 본 발명은 T-세포에서 mRNA 전기천공법(electroporation)을 위한 최적의 조건을 결정하였다.
본 발명자는, 펄스된(pulsed) 전기장들(electric fields)의 사용에 의하여, 세포들 내로의 물질 전달을 위하여 살아있는 세포들을 일시적으로 투과가능하게 하는(permeabilize) 것을 허용하는 사이토펄스(cytoPulse) 기술을 사용하였다. 펄스아질(PulseAgile) (BTX Havard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, MA 01746, USA) 전기천공법(electroporation) 파형들(waveforms)에 기초하여, 그 기술은 펄스 나비(duration), 강도 및 펄스들 사이의 간격(interval)의 정확한 통제를 허락한다(미국특허 6,010,613 및 국제 PCT 출원 WO2004083379). 이들 파라미터들은 모두 최소의 사망(mortality)으로 높은 형질감염(transfection) 효율을 위한 최고의 조건에 도달하기 위하여 변형될 수 있다. 그 다음의 더 낮은 전기장 펄스들이 세포 내로 폴리뉴클레오타이드를 이동시키는 것을 허용하는데 반하여, 기본적으로 첫 번째 높은 전기장 펄스들은 포어(pore) 형성(formation)을 가능하게 한다.
T 세포들의 활성화 및 확장( expansion )
T 세포들의 유전적 변형 전 또는 후에, T 세포들은 기재된 바와 같은 방법들, 예를 들어, 미국 특허들 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허출원 공개번호 20060121005 을 이용하여 일반적으로 활성화되고 확장될 수 있다. T 세포들은 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)로 확장될 수 있다. 일반적으로 본 발명의 T 세포들은, T-세포를 위한 활성화 신호를 만들어내기 위하여 T 세포들의 표면 상에 공-자극(co-stimulatory) 분자 및 CD3 TCR 복합체를 자극하는 제제와의 접촉에 의하여 확장된다. 예를 들어, 칼슘(calcium) 이오노포어(ionophore) A23187, 포르볼(phorbol) 12-미리스테이트(myristate) 13-아세테이트(acetate) (PMA), 또는 미토겐(mitogenic) 렉틴들(lectins) 유사(like) 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin) (PHA)과 같은 케미칼들(chemicals)이 T-세포의 활성화 신호를 만들어내는데 사용될 수 있다. 제한되지 않는 예들로서, T 세포 개체군들(populations)은 항-CD3 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편, 또는 표면 상에 고정화되는 항-CD2 항체와의 접촉에 의하여, 또는 칼슘(calcium) 이오노포어(ionophore)와 함께(conjunction) 단백질 키나제(kinase) C 액티베이터(activator) (예컨대, 브리오스타틴(bryostatin))과의 접촉에 의하여와 같이, 인 비트로에서 자극될 수 있다. T 세포들의 표면 상 악세서리(accessory) 분자의 공자극을 위하여, 악세서리(accessory) 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포들의 개체군(population)은 T 세포들의 증식을 자극하기에 적합한 조건들 하, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포들 또는 CD8+ T 세포들의 증식을 자극하기 위하여, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 제제들이 용액(solution)내에 있거나 또는 표면에 커플링(couple)될 수 있다. 당업자들이 쉽게 인정할 수 있듯이, 입자들의 세포들에 대한 비율은 타겟 세포에 대한 입자 크기에 의존할 수 있다.
T 세포에 적합한 조건들은 혈청 (예컨대, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-g , 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L-15, TGFp, 및 TNF- 또는 당업자에게 알려진 세포들의 성장을 위한 다른 첨가제들을 포함하는, 증식 및 생존능력(viability)에 필요한 인자들을 포함할 수 있는, (예컨대, Minimal Essential Media 또는 RPMI Media 1640 또는, X-vivo 5, (Lonza))인 적절한 배지를 포함한다. 세포들의 성장을 위한 다른 첨가제들은, 계면활성제, 플라스마네이트(plasmanate) 및 2-머캅토에탄올(mercaptoethanoi) 및 N-아세틸(acetyl)-시스테인(cysteine)과 같은 환원제들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배지(media)는 비타민들, 소듐(sodium) 피루베이트(pyruvate) 및 첨가된 아미노산들을 갖는, 혈청-프리이거나 또는, T 세포들의 성장 및 확장에 충분한 사이토카인(들)의 상당량, 및/또는 호르몬들의 규정된 세트 또는 적절한 양의 혈청(또는 혈장)이 보충된, RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1, 및 X-Vivo 20, Optimizer를 포함할 수 있다. 항생물질들, 예컨대, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양에서만 포함되고, 대상(subject) 내로 주입되는(infused) 세포들의 배양에는 포함되지 않는다. 타겟 세포들은 예를 들어, 적절한 온도 (예컨대, 37 ℃) 및 공기(예컨대, 공기 플러스 5% C02)인, 성장을 지지하기에 필요한 조건들 하 유지된다. 다양한 자극 시간들에 노출된 T 세포들은 다른 특성들을 보일 수 있다.
조작( engineered ) 된 T-세포들
본 발명의 범위에, 전술한 방법들 중 임의의 하나에 따라 수득되는 분리된 T 세포가 포함된다. 본 발명에 따른 T-세포는 줄기 세포 유래일 수 있다. 줄기 세포들은 성체 줄기 세포들, 배아 줄기 세포들, 더욱 특히 비-인간 줄기 세포들, 제대혈 줄기 세포들, 간(progenitor) 세포들, 골수 줄기 세포들, 유도(induced) 만능(pluripotent) 줄기 세포들, 전분화(totipotent) 줄기 세포들 또는 조혈모(hematopoietic stem) 세포들일 수 있다. 대표적인 인간 세포들은 CD34+ 세포들이다. 상기 분리된 세포는 또한 수지상(dendritic) 세포, NK-세포, B-세포 또는 염증성(inflammatory) T-림프구들, 세포독성(cytotoxic) T-림프구들, 조절(regulatory) T-림프구들 또는 헬퍼(helper) T-림프구로 구성된 군으로부터 선택되는 T-세포들일 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 CD4+ T-림프구들 및 CD8+ T-림프구들로 구성되는 군으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 세포들의 유전적 변형 및 확장 전에, 세포들의 소스는 여러가지 제한되지 않는 방법들을 통하여 대상으로부터 수득될 수 있다. T 세포들은 말포혈액 잔핵 세포들, 골수, 림프절(node) 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염, 복수들(ascites), 흉수(pleural effusion), 비장(spleen) 조직 및 종양들의 위치로부터의 조직을 포함하는, 제한되지 않는 소스들로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 예들에서, 당업계에 알려지고 이용 가능한 임의의 수의 T 세포주들이 사용될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 건강한 도너로부터, 암으로 진단받은 환자로부터, 또는 감염으로 진단받은 환자로부터 유래될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 다른 표현형(phenotypics) 특성들을 보이는 세포들의 혼합된 개체군(population)의 부분이다. 본 발명의 범위에, 전술한 방법에 따라 형질전환(transform)된 T- 세포로부터 수득된 세포주가 포함된다. 더욱 특이적 예에서, 본 발명은 면역 체크포인트 단백질들을 코드하는 적어도 두 개의 불활성화된 유전자들,더욱 특이적으로, CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3 로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 두 개의 유전자들을 포함하는 분리된 T-세포에 대한 것이다.
또다른 예에서, 본 발명에 따른 상기 분리된 세포은 CD52, GR, TCR 알파 및 TCR 베타로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 불활성화된 유전자를 더 포함할 수 있고, 그리고/또는 CAR, 다사슬 CAR 및/또는 pT알파(pTalpha) 이식유전자(transgene)를 발현시킨다.
치료적 적용들
또다른 예에서, 다른 방법들에 의하여 수득되는 분리된 세포 또는 전술한 바와 같이 상기 분리된 세포로부터 유래되는 세포주는 의약(medicament)으로서 사용될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 의약은 그것을 필요로 하는 환자에게서 감염들 또는 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 또다른 예에서, 본 발명에 따른 상기 분리된 세포 또는 상기 분리된 세포로부터 유래된 세포주는 그것을 필요로 하는 환자에게서 바이러스 감염 또는 암의 치료용 의약의 제조에 사용될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 그것을 필요로 하는 환자들의 치료 방법들, 하기 단계들 중 적어도 하나를 포함하는 상기 방법에 의존한다:
(a) 전술한 방법들 중 임의의 하나에 의하여 수득가능한 T-세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 환자에 상기 형질전환된 T-세포들을 투여하는 단계,
한 예에서, 본 발명의 상기 T 세포들은 인 비보 T 세포 확장에서 로버스트(robust)를 겪을 수 있고, 연장된 시간 동안 지속될 수 있다.
상기 치료는 개선적, 치료적 또는 예방적일 수 있다. 그것은 자가(autologous) 면역요법의 부분 또는 동종이형(allogenic) 면역요법 치료의 부분일 수 있다. 자가(autologous)에 의하여, 환자들의 치료에 사용되는 세포들의 개체군(population), 세포주 또는 세포들이 환자로부터 또는 인간(Human) 백혈구(Leucocyte) 항원(Antigen) (HLA) 호환성(compatible) 도너로부터 기원할 수 있다는 것이 의미된다. 동종이형(allogeneic)에 의하여, 환자들의 치료에 사용되는 세포들의 개체군(population) 또는 세포들이 상기 환자로부터 기원하지 않고 도너로부터 기원한다는 것이 의미된다.
공개된 방법들과 사용될 수 있는 세포들은 전 섹션에서 기재되어 있다. 상기 치료는 암, 바이러스 감염, 자가면역 장애들 또는 이식편대숙주(Graft versus Host) 질환(Disease) (GvHD)로 진단받은 환자들을 치료하는데 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 암들은 혈관발달(vascularized)되지 않은 종양들, 또는 아직 주로 혈관발달(vascularized)되지 않은, 그리고 혈관발달된(vascularized) 종양들을 포함한다. 암들은 (예를 들어, 밸혈병들(leukemias) 및 림프종들(lymphomas)인 혈액 종양들과 같은) 비고형 종양들을 포함할 수 있고 또는 고형(solid) 종양들을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR들로 치료되는 암들의 타입들은 암종(carcinoma), 아세포종(blastoma), 및 육종(sarcoma), 및 특정 백혈병 또는 림프종(lymphoid) 악성종양들(malignancies), 양성(benign) 및 악성(malignant) 종양(tumor)들, 및 악성종양들(malignancies) 예컨대 육종들(sarcomas), 암종들(carcinomas), 및 흑색종들(melanomas)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 성인 종양들/암들 및 소아 종양들/암들 또한 포함된다.
그것은 항체들 요법, 화학 요법, 사이토카인들 요법, 수지상세포(dendritic cell) 요법, 유전자 치료, 호르몬 요법, 레이저광 치료 및 방사선 요법의 군으로부터 선택되는 암에 대항한 하나 또는 그보다 많은 요법들과 조합된 치료일 수 있다.
본 발명에 따른 세포들의 개체군(population) 또는 세포들의 투여는 애어로졸(aerosol) 흡입(inhalation), 주사(injection), 섭취(ingestion), 투입(transfusion), 주입(implantation) 또는 이식(transplantation)을 포함하는, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 여기에 기재된 조성물들은 환자에 피하로(subcutaneously), 피내로(intradermaliy), 종양내로(intratumorally), 절내로(intranodally), 골수내로(intramedullary), 근육내로(intramuscularly), 정맥(intravenous)으로 또는 림프액내(intralymphatic) 주사(injection), 또는 복막내로(intraperitoneally) 투여될 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 바람직하게는 정맥 주사에 의하여 투여된다.
세포들의 개체군(population) 또는 세포들의 투여는 체중 kg 당 104-109 세포들의, 바람직하게는 105 내지 106 세포들/kg 체중으로 그들 범위들 내의 세포 숫자들 중 모든 정수 값들을 포함하는 것의 투여로 구성될 수 있다. 세포들 또는 세포들의 개체군은 하나 또는 그보다 많은 용량(doses)들로 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 세포들의 상기 유효한 양은 단일 용량으로 투여된다. 또다른 예에서, 세포들의 상기 유효한 양은 일정 기간 동안 하나보다 많은 용량(dose)으로 투여된다. 투여 타이밍은 담당의사의 판단 내이며, 환자의 임상 조건에 의존한다. 세포들 또는 세포들의 개체군(population)은 혈액 은행 또는 도너와 같은, 임의의 소스로부터 수득될 수 있다. 개인적 필요들이 다른 반면, 특정 질환 또는 조건들을 위한 정해진 세포 타입의 효과적인 양들의 최적 범위들의 결정은 당업계의 기술 내이다. 효과적인 양은 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 용량(dosage)은 받는 사람의 연령, 건강 및 체중, 동시에 받는 치료의 종류, 만약 있다면 치료의 빈도 및 원하는 효과의 특성에 의존할 것이다.
또다른 예에서, 이들 세포들을 포함하는 조성물 또는 세포들의 상기 효과적인 양은 비경구적으로 투여된다. 상기 투여는 정맥내(intravenous) 투여일 수 있다. 상기 투여는 종양 내로 주사에 의하여 직접 될 수 있다.
본 발명의 특정 예들에서, 세포들은, 항바이러스 요법, 시도포비르(cidofovir) 및 인터루킨-2과 같은 제제들, 시트라빈(Cytarabine) (ARA-C로도 알려짐) 또는 MS 환자들을 위한 나탈리지맙(nataliziimab) 치료 또는 건선(psoriasis) 환자들을 위한 에팔리즈티맙(efaliztimab) 치료 또는 PML 환자들을 위한 다른 치료들을 포함하나 이에 제한되지 않는, 임의의 수의 관련 치료 양식들과 함께 (예컨대, 그 전, 동시에 또는 그 후에) 환자에게 투여된다. 추가의 예들에서, 본 발명의 T 세포들은, 화학요법, 방사선, 사이클로스포린(cyclosporin), 아자티오프린(azathioprine), 메토트렉세이트(methotrexate), 마이코페놀레이트(mycophenolate), 및 FK506 과 같은 면역억제제들, 항체들, 또는 CAMPATH와 같은 다른 면역에의한(immunoablative) 제제들, 항-CD3 항체들 또는 다른 항체 요법들, 사이톡신(cytoxin), 플루다리빈(fludaribine), 사이클로스포린(cyclosporin), FK506, 라파미신(rapamycin), 마이코플리에노익산(mycoplienolic acid), 스테로이드들, FR901228, 사이토카인들, 및 방사선요법(irradiation)과 조합하여 사용될 수 있다. 이들 약들은 칼슘 의존적 포스파타제(phosphatase) 칼시뉴린(calcineurin) (사이클로스포린(cyclosporine) 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장 인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나제를 억제한다(rapamycin) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1 1; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93). 추가의 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 골수 이식, OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체들 또는 플루다라빈(fludarabine), 외부(external)-빔(beam) 방사선(radiation) 요법(therapy) (XRT), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide)와 같은 화학요법 제제들을 이용한 T 세포에 의한(ablative) 요법과 함께(예컨대, 그 전, 동시에 또는 그 후에) 환자에 투여된다. 또다른 예에서,본 발명의 세포 조성물들은 CD20, 예컨대 리툭산(Rituxan)과 반응하는 제제들과 같은 B-세포에 의한(ablative) 요법 후 투여된다. 예를 들어, 한 예에서, 대상은 고용량의 화학요법으로 표준 치료를 받고 그 후에 말초 혈액 줄기 세포 이식을 받을 수 있다. 특정 예들에서, 이식 후, 대상들은 본 발명의 확장된 면역 세포들의 주입(infusion)을 받는다. 추가의 예에서, 확장된 세포들은 수술(surgeiy) 전 또는 후 투여된다.
면역요법을 위한 인간 동종이형 ( allogeneic ) 세포들의 조작 방법의 예
본 발명의 더 나은 이해를 위하여, 면역요법을 위한 인간 동종이형(allogenic) 세포들의 조작 방법의 한 예가 도 5에 나타나 있다. 하기 단계들의 하나 또는 몇몇의 조합을 포함하는 방법:
1. 한 명의 개인 환자로부터의 또는 혈액 은행으로부터의 혈액 샘플로부터 또는 세포 배양물(culture)로부터 T-세포들를 제공하고, 그리고 항-CD3/C28 액티베이터(activator) 비드들을 이용하여 상기 T 세포를 활성화시키는 단계. 비드들은 T 세포들의 활성화 및 확장에 요구되는 일차 및 공-자극 신호들을 제공한다.
2. a) CD3 표면 발현을 지지하기 위하여 pT알파(pTalpha) 또는 그것의 기능적 변이체(variant) 이식유전자(transgene)로 상기 세포들을 형질도입(transducing)하고 CD3 복합체의 자극을 통한 세포 확장을 가능하게 하는 단계. TCR 붕괴(disruption)는 TCR 복합체(complex)의 제거로 예상되고 동종반응(alloreactivity) (GvHD)을 제거하나, CD3 신호전달 요소의 상실 때문에 동종이형(allogenic) 세포들 확장을 바꿀 수 있다. 형질도입된(transduced) 세포들은 pT알파(pTalpha) 사슬 또는 그것의 기능적 변이체(variant)를 발현시킬 것으로 예상된다. 이 pT알파(pTalpha) 사슬은 TCR베타 사슬 및 CD3 신호절달 요소들과 짝을 이뤄 preTCR 복합체(complex)를 형성하고, 그리고 이런 식으로 기능적 CD3 복합체를 회복시키고 그리고 불활성화된 TCR알파 세포들의 자극 또는 활성화를 지지한다. pT알파(pTalpha) 렌티바이러스(lentiviral) 벡터로 T-세포들의 형질도입(transduction)은 TCR알파 불활성화 전 또는 후에 실현될 수 있다.
b) 다사슬(multi-chain) CAR들로 상기 세포들을 형질도입(transducing) 하는 것은 림프종들(lymphomas) 및 고형 종양들을 포함하는 다양한 악성종양들(malignancies)로부터 타겟 세포들의 표면에서 발현되는 항원들에 대하여 T 세포들을 전용시키는(redirect) 것을 허용한다. 공-자극 도메인의 기능을 개선하기 위하여, 발명자들은 전술한 바와 같이 FcεRI로부터 유래된 다사슬(multi-chain) CAR를 디자인하였다. 형질도입은 TCR알파 및 CD52 유전자들과 같은 다른 유전자들의 불활성화 전 또는 후에 실현될 수 있다.
3. 비(non) 동종반응성(alloreactive) 및 면역억제제 저항성 T 세포들을 조작하는 단계:
a) 세포 표면으로부터 TCR을 제거하기 위하여 상기 세포들에서 TCR 알파을 불활성화시키고 동종이형(allogenic)의 TCR 에 의하여 외래의 것으로 숙주 조직을 인식하는 것을 방지하여 이로써 GvHD 를 피하는 것이 가능하다.
b) 이식된 T 세포들에 영향을 미치지 않고 이식편(graft) 거부를 방지하기 위하여 면역억제 처리에 저항성으로 상기 세포들을 만들기(render) 위하여, 면역억제제에 대한 타겟을 코드하는 하나의 유전자를 불활성화시키는 것 또한 가능하다. 이 예에서, 면역억제제의 타겟은 CD52이고 그리고 면역억제제는 인간화된 단일클론 항-CD52 항체이다.
T-세포들 내에서 DSB 이벤트들의 더 높은 비율들을 허용함으로써 TALE-뉴클레아제의 이용은 T-세포들의 상기 이중 불활성화를 달성하는데 특히 유리하다는 것이 발명자들에 의하여 보여졌다. 바람직하게는, TCR알파 및 CD52 유전자들은 상기 유전자들을 타겟팅하는 TALE-뉴클레아제를 코드하는 mRNA로 T 세포들을 전기천공함으로써 불활성화된다. 높은 형질전환(transformation) 비율을 야기하는 mRNA를 이용하는 것이 T-세포들에 덜 해롭고, 그리고 T-세포들을 조작하는 공정에서 매우 중요하다는 것이 본 발명자들에 의하여 발견되었다. 그 다음에 불활성화된 T 세포들이 자성(magnetic) 비드들을 이용하여 분류된다. 예를 들어 CD52를 발현시키는 T 세포들이 고체 표면 상에 고정에 의하여 제거되고, 그리고 불활성화된 세포들이 칼럼을 통하여 통과되는 스트레스에 노출되지 않는다. 이 온화한 방법은 적절하게 조작된 T-세포들의 농도를 증가시킨다.
4. CD3 복합체의 자극을 통한 환자에의 투여 후 인 비보에서 또는 환자에의 투여 전에 조작된 T-세포들의 인 비트로(in vitro)에서의 확장(expansion). 투여 단계 전, 환자들은 CAMPATH1-H, 인간화된 단일클론 항체 항-CD52과 같은, 면역억제 처리가 될 수 있다.
5. 타겟 항원으로 근접한 안으로 조작된 세포들을 가져오기 위하여 환자에의 투여 후 인 비보에서 또는 환자에게 투연 전에 엑스 비보에서 이중특이성 항체들에 선택적으로 노출된 상기 세포들.
다른 정의들
- "여기에서 사용된 대로, "핵산(nucleic acid)" 또는 "폴리뉴클레오타이드들"은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid) (DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid) (RNA), 올리고뉴클레오타이드들(oligonucleotides), 폴리메라제(polymerase) 연쇄(chain) 반응(reaction) (PCR)에 의하여 생성되는 단편들, 및 라이게이션(ligation), 절단(scission), 엔도뉴클레아제 작용, 및 엑소뉴클레아제(exonuclease) 작용 중 임의의 것에 의하여 생성되는 단편들과 같은, 폴리뉴클레오타이드들 및/또는 뉴클레오타이드들을 가리킨다. 핵산 분자들은 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드들 (DNA 및 RNA와 같은), 또는 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드들 (예컨대, 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드들의 거울상이성질체(enantiomeric) 형태들)의 유사체들(analogs) 또는 이 둘의 조합인 모노머들을 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드들은 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티들에서 및/또는 당 모이어티들에서 변화들(alterations)을 가질 수 있다. 당 변화들은 예를 들어, 하나 또는 그보다 많은 하이드록실(hydroxyl)기들의 할로겐들, 알킬기들, 아민들, 및 아지도(azido) 기들로의 대체(replacement)를 포함하고, 또는 당(sugar)들은 에터들(ethers) 또는 에스터들(esters)로서 기능화될 수 있다. 게다가 전체 당 모이어티는 아자(aza)-당들 및 카르복실(carbocyclic) 당(sugar) 유사체들(analogs)과 같은, 입체구조적으로(sterically) 그리고 전자적으로(electronically) 유사한 구조들로 대체될 수 있다. 염기 모이어티 내 변화의 예들은 알킬화된(alkylated) 퓨린들 및 피리미딘들, 아실화된(acylated) 퓨린들 또는 피리미딘들, 또는 다른 잘 알려진 헤테로사이클릭(heterocyclic) 치환기들(substitutes)을 포함한다. 핵산 모노머들은 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합들(bonds) 또는 이러한 연결(linkages)들의 유사체들에 의하여 연결(link)될 수 있다. 핵산들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
- "DNA 타겟", "DNA 타겟 서열", "타겟 DNA 서열", "핵산 타rpt 서열", "타겟 서열" 또는 "가공(processing) 위치(site)"에 의하여, 본 발명에 따른 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의하여 타겟되고 가공될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열이 의도된다. 이들 용어들은 특이적 DNA 위치(location), 바람직하게는 세포에서 게놈 위치를 가리키나, 그러나 또한, 제한되지 않는 예로서, 미토콘드리아와 같은 세포소기관들에서, 또는 트랜스포존들(transposons), 바이러스, 에피솜들(episomes), 플라스미드들과 같은 유전적 물질의 본체에 독립적으로 존재할 수 있는 유전 물질의 부분을 가리킨다. TALE-뉴클레아제 타겟들의 제한되지 않는 예들로서, 타겟이 된 게놈 서열들은 보통 15-bp 스페이서(spacer)에 의하여 분리된 두 개의 17-bp 길이 서열들(반(half) 타겟들로 불림)로 구성된다. 각각의 반(half)-타겟은 EF1-알파 프로모터 또는 T7 프로모터의 통제 하, 플라스미드들 내 코드되는, 제한되지 않는 예들로서, 표 2, 6, 7 및 11 에 리스트된 TALE-뉴클레아제들의 반복들에 의하여 인식된다. 핵산 타겟 서열은 표 1, 5. 6 및 10에서 표시된 바와 같이, 상기 타겟의 한 가닥의 5'에서 3'으로의 서열에 의하여 정의된다.
- 용어 "이식유전자(transgene)"은, 부분적으로 또는 완전히, 그것이 도입되는 숙주 세포에 이종기원(heterologous), 즉, 외래의 것(foreign)이거나, 또는 그것이 도입되는 숙주 세포의 내생(endogenous) 유전자에 상동(homologous)이지만, 그것이 삽입되는 세포의 게놈을 바꾸는(alter) 그러한 방식으로 세포 게놈 내로 삽입되도록 디자인되거나, 또는 삽입될 수 있는(예컨대, 그것은 자연적인(natural) 유전자의 그것과는 다른 위치(location)에서 삽입되거나 또는 그것의 삽입은 넉아웃(knockout)을 야기한다), (예컨대 하나 또는 그보다 많은 폴리펩타이드들을 코드하는) 핵산 서열을 의미한다. 이식유전자(transgene)는 폴리펩타이드를 코드하는 선택된 핵산의 최적의 발현에 필요할 수 있는, 인트론들(introns)과 같은, 하나 또는 그보다 많은 전사 조절 서열들 및 임의의 다른 핵산을 포함할 수 있다. 이식유전자(transgene)에 의하여 코드되는 폴리펩타이드는 이식유전자(transgene)가 삽입되는 세포들에서, 발현되지 않거나 또는 발현되지만 생물학적으로 활성이 아닐 수 있다.
- "게놈(genome)"에 의하여, 핵(nuclear) 게놈, 엽록체(chloroplastic) 게놈, 미토콘드리아(mitochondrial) 게놈과 같은 세포 내 포함되는 전체 유전 물질이 의미된다.
- 키메라 항원 수용체 (CAR)에 의하여 특이적 항-타겟 세포 면역 활성을 보이는 키메라 단백질을 만들기 위하여, 타겟 세포 상 존재하는 요소에 대항한 결합 도메인과, 예를 들어 원하는 항원(예컨대, 종양 항원)에 대한 항체-기반의 특이성, T 세포 수용체-활성(activating) 세포내 도메인을 조합하는 분자가 의도된다. 일반적으로 CAR는 T 세포 항원 수용체 복합체(complex) 제타 사슬 (scFvFc:ζ)의 세포내 신호전달 도메인에 융합되는 세포외 단일 사슬 항체 (scFvFc)로 구성되고 그리고 T 세포들에서 발현될 때, 단일클론 항체의 특이성에 기초한 항원 인식으로 전용하는(redirect) 능력을 갖는다. 본 발명에서 사용되는 CAR의 한 예는 CD19 항원에 대하여 향하는 CAR이고 그리고 제한되지 않는 예로서 아미노산 서열 : 서열번호: 73 를 포함할 수 있다.
- "전달(delivery) 벡터" 또는 "전달 벡터들"에 의하여 제제들/화학품(chemicals)들 및 분자들(단백질들 또는 핵산들)을 세포이하(subcellular) 구획들(compartments)(즉 "도입하는(introducing)") 또는 세포들 내로 전달하기 위하여 또는 세포 구조체(즉, "접촉하는") 내로 넣기 위하여 본 발명에서 사용될 수 있는 임의의 전달 벡터가 의도된다. 그것은 리포좀의(liposomal) 전달 벡터들, 바이러스 전달 벡터들, 약물 전달 벡터들, 화학적(chemical) 담체들(carriers), 폴리머(polymeric) 담체들(carriers), 리포플렉스들(lipoplexes), 폴리플렉스들(polyplexes), 덴드라이머들(dendrimers), 마이크로버블들(microbubbles) (초음파조영제들(ultrasound contrast agent)), 나노입자들, 에멀젼들 또는 다른 적합한 이동(transfer) 벡터들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 전달 벡터들은 분자들, 케미컬들(chemicals), 마크로분자들(유전자들, 단백질들), 또는 Diatos에 의하여 개발된 펩타이드들, 플라스미드들와 같은 다른 벡터들의 전달을 가능하게 한다. 이들 케이스들에서, 전달 벡터들은 분자 담체들(carriers)이다. "전달 벡터" 또는 "전달 벡터들"에 의하여, 형질감염(transfection)을 수행하기 위한 전달 방법들이 의도된다.
- 용어 "벡터" 또는 "벡터들"은 그것이 연결(link)된 또다른 핵산을 수송하는(transport) 것이 가능한 핵산 분자를 가리킨다. 본 발명에서 "벡터"는 바이러스 벡터, 플라스미드, RNA 벡터 또는 선형 또는 원형(circular) DNA 또는 RNA 분자로, 염색체(chromosomal), 비 염색체, 반-합성 또는 합성 핵산들로 구성될 수 있는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 벡터들은 자동(autonomous) 복제(replication) (에피솜(episomal) 벡터) 및/또는 그것들이 연결(link)되는 핵산들의 발현(발현 벡터들)이 가능한 그것들이다. 많은 적합한 벡터들이 당업계에 알려져 있고 상업적으로 이용가능하다.
바이러스 벡터들은 레트로바이러스, 아데노바이러스 파보바이러스(예컨대, 아데노관련(adenoassociated) 바이러스들), 코로나바이러스, 오르소믹소바이러스(orthomyxovirus)와 같은 음성 가닥 RNA 바이러스들 (예컨대 인플루엔자 바이러스), 랩도바이러스(rhabdovirus) 예컨대, 광견병 및 소포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(paramyxovirus) (예컨대, 홍역 및 센다이(Sendai), 알파바이러스(alphavirus) 및 피코르나바이러스(picornavirus)와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스들, 및 헤르페스바이러스(예컨대, 단순포진(Herpes Simplex) 바이러스 타입들 1 및 2, 엡스타인(Epstein)-바(Barr) 바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)), 아데노바이러스를 포함하는 이중-가닥의 DNA 바이러스들, 및 폭스바이러스(poxvirus)(예컨대, 우두(vaccinia), 계두(fowlpox) 및 카나리아두창(canarypox))을 포함한다. 다른 바이러스들은, 예를 들어, 노르웍(Norwalk) 바이러스, 토가바이러스(togavirus), 플라비바이러스(flavivirus), 레오바이러스들(reoviruses), 파포바바이러스(papovavirus), 헤파드나바이러스(hepadnavirus), 및 간염(hepatitis) 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스들의 예들은 하기를 포함한다: 조류(avian) 백혈증(leukosis)-육종(sarcoma), 포유동물(mammalian) C-타입, B-타입 바이러스들, D 타입 바이러스들, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스(lentivirus), 스푸마바이러스(spumavirus) (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
- "렌티바이러스 벡터"에 의하여, 그것들의 상대적으로 큰 포장(packaging) 용량, 감소된 면역원성(immunogenicity) 및 큰 범위의 다른 세포 타입들에 높은 효율로 안정적으로 형질도입(transduce)하는 그것들의 능력 때문에 유전자 전달을 위하여 매우 유망한 HIV-기반의(Based) 렌티바이러스(lentiviral) 벡터들이 의도된다. 렌티바이러스 벡터들은 보통 생산자(producer) 세포들 내로 셋(포장, 껍질(envelope) 및 이동(transfer)) 또는 그보다 많은 플라스미드들의 일시적인(transient) 형질감염(transfection) 후 발생된다. HIV처럼, 렌티바이러스(lentiviral) 벡터들은 세포 표면 상 수용체들로 바이러스 표면 당단백질들과의 상호작용을 통하여 타겟 세포로 들어간다. 들어가면, 바이러스 RNA는 바이러스 역 전사효소(transcriptase) 복합체(complex)에 의하여 매개되는, 역전사를 겪는다. 역전사의 산물은 이중 가닥 선형 바이러스 DNA로, 이것은 감염된 세포들의 DNA에서 바이러스 통합(integration)을 위한 주형이다. "통합하는(integrative) 렌티바이러스(lentiviral) 벡터들 (또는 LV)"에 의하여, 제한되지 않는 예로서, 타겟 세포의 게놈에 통합될 수 있는 이러한 벡터들이 의도된다. "비(non) 통합되는(integrative) 렌티바이러스(lentiviral) 벡터들 (또는 NILV)"에 의하여 대조적으로, 바이러스 인테그라제(integrase)의 작용을 통하여 타겟 세포의 게놈으로 통합되지 않는 효과적인 유전자 전달 벡터들이 의미된다.
- 전달 벡터들 및 벡터들은 소노포레이션(sonoporation) 또는 전기천공법(electroporation) 또는 이들 기술들의 파생물들과 같은 임의의 세포 투과화(permeabilization) 기술들과 관련되거나 또는 조합될 수 있다.
- 세포 또는 세포들에 의하여 인 비트로(in vitro) 배양들을 위한 이들 생물들로부터 유래된 임의의 진핵 살아있는 세포들, 일차(primary) 세포들 및 세포주들이 의도된다.
- "일차(primary) 세포" 또는 "일차 세포들"에 의하여, 연속적인 발암성(tumorigenic) 또는 인공적으로 불멸화된(immortalized) 세포주들과 비교할 때, 매우 적은 개체군(population) 배가들(doublings)을 겪어 왔고, 그러므로, 그것들이 유래된 것으로부터의 조직들의 특성 및 주된 기능적 요소들의 매우 대표적인, 살아 있는 조직 (즉 생체검사(biopsy) 물질)로부터 직접 취해지고 인 비트로에서 성장을 위하여, 확립(established)된 세포들이 의도된다.
제한되지 않는 예들로서 세포주들은 CHO-K1 세포들; HEK293 세포들; Caco2 세포들; U2-OS 세포들; NIH 3T3 세포들; NSO 세포들; SP2 세포들; CHO-S 세포들; DG44 세포들; K-562 세포들, U-937 세포들; MRC5 세포들; IMR90 세포들; Jurkat 세포들; HepG2 세포들; HeLa 세포들; HT-1080 세포들; HCT-116 세포들; Hu-h7 세포들; Huvec 세포들; Molt 4 세포들로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
이들 세포주들 모두는, 관심있는 유전자 또는 a 단백질를 생산하고, 발현시키고, 수량화하고(quantify), 검출하고, 연구하기 위하여 세포주 모델들(models)을 제공하기 위하여 본 발명의 방법에 의하여, 변형될 수 있다: 이들 모델들은 또한 제한되지 않는 예들로서 케미칼, 바이오연료들, 치료법들(therapeutics) 및 농경학(agronomy)과 같은 다양한 영역들 및 생산 및 연구에서 관심있는 생물학적으로 활성인 분자들을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
- "돌연변이"에 의하여 폴리뉴클레오타이드 (cDNA, 유전자) 또는 폴리펩타이드 서열 내 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 스물, 스물다섯, 서른, 마흔, 쉰(fifty) 또는 그보다 많은 뉴클레오타이드들/아미노산들까지의 치환, 결실, 삽입이 의도된다. 돌연변이는 유전자의 코딩(coding) 서열 또는 그것의 조절(regulatory) 서열에 영향을 미칠 수 있다. 그것은 또한 코드되는 mRNA의 구조/안정성 또는 게놈 서열의 구조에 영향을 미칠 수 있다.
- "변이체(들)"에 의하여, 그것은 부모(parent) 분자의 아미노산 서열 내 적어도 하나의 잔기의 돌연변이 또는 대체(replacement)에 의하여 수득되는 폴리펩타이드 변이체(variant), TALE-뉴클레아제 변이체, DNA 결합 변이체, 변이체, 반복 변이체가 의도된다.
- "기능적 변이체"에 의하여, 단백질 또는 단백질 도메인의 촉매반응적으로 활성인 돌연변이체가 의도된다; 이러한 돌연변이체는 그것의 부모 단백질 또는 단백질 도메인 또는 추가의 특성들, 또는 더 높은 또는 더 낮은 활성과 비교할 때 동일한 활성을 가질 수 있다.
- "유전자"에 의하여 특이적 단백질 또는 단백질의 부분(segment)을 코드하는, 염색체(chromosome)를 따라 선형 방식으로 배열되는 DNA의 부분으로 구성되는, 유전(heredity)의 기본 단위가 의미된다. 유전자는 보통 프로모터, 5' 비번역(untranslated) 영역, 하나 또는 그보다 많은 코딩(coding) 서열들 (엑손들(exons)), 선택적으로 인트론들(introns), 3' 비번역(untranslated) 영역을 포함한다. 유전자는 터미네이터(terminator), 인핸서들(enhancers) 및/또는 사일런서들(silencers)을 더 포함할 수 있다.
- 여기에서 사용된 대로, 용어 "위치(locus)"는 유전체 상 DNA 서열 (예컨대 유전자의) 특이적 물리적 위치이다. 용어 "위치(locus)"는 유전체 상 희귀-절단 엔도뉴클레아제 타겟 서열의 특이적 물리적 위치를 가리킬 수 있다. 이러한 위치(locus)는 본 발명에 따른 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의하여 인식 및/또는 절단되는 타겟 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 관심있는 위치(locus)는 세포의 유전적 물질(즉, 유전체 내) 주요 부분(main body) 내 존재하는 핵산 서열 뿐 아니라, 또한 제한되지 않는 예들로서 미토콘드리아와 같은 세포소기관들 내 또는 플라스미드들, 에피좀들(episomes), 바이러스, 트랜스포존들(transposons) 과 같은, 유전적 물질의 상기 주요 부분에 독립적으로 존재할 수 있는 유전적 물질의 부분을 적합하게 할(qualify) 수 있다는 것이 이해된다.
용어 "희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제(endonuclease)"는 DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게는 DNA 분자 내 핵산들 사이의 결합들(bonds)의 가수분해(절단)을 촉매화할 수 있는 변이체(variant) 효소 또는 야생형 효소를 가리킨다. 특히, 상기 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제, 더욱 바람직하게는, 매우 특이적이고, 10 부터 45 염기쌍들(base pairs) (bp)까지 길이의, 보통 10 부터 35 염기쌍들까지 길이의 범위의 핵산 타겟 위치들(sites)을 인식하는 희귀-절단 엔도뉴클레아제일 수 있다. 본 발명에 따른 엔도뉴클레아제는 "타겟 서열"로 더 가리켜지는, 특이적인 폴리뉴클레오타이드 서열들에서 핵산을 인식하고 절단한다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 특이적 폴리뉴클레오타이드들 서열들에서 단일- 또는 이중-가닥 손상(break)을 인식하고 만들어낼 수 있다.
특정 예에서, 본 발명에 따른 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제일 수 있다. 정말, 최근에 타입 II 원핵생물의(prokaryotic) CRISPR (클러스터된(Clustered) 정기적으로(Regularly) 사이에 공간을 남긴(Interspaced) 짧은(Short) 팔린드롬성(palindromic) 반복들(Repeats)) 조정의(adaptive) 면역 체계로부터 RNA-가이드된(guided) Cas9 뉴클레아제에 기초하여(Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013) 신규 게놈 조작 툴(tool)이 발달되어 왔다(리뷰를 위하여 (Sorek, Lawrence et al. 2013) 참조). CRISPR 관련된(Associated) (Cas) 시스템은 박테리아에서 처음 발견되었으며, 외래(foreign) DNA, 바이러스 또는 플라스미드에 대항한 방어로서 기능한다. CRISPR-매개(mediated) 게놈 조작(engineering)은 프로토(proto)-스페이서(spacer) 인접(adjacent) 모티프(motif) (PAM)로 말해지는, 짧은 서열 모티프에 의하여 자주 측면에 배치되는(flanked) 타겟 서열의 선택에 의하여 처음 진행된다. 타겟 서열 선택 후, 이 타겟 서열에 상보적인, 특이적 crRNA가 조작된다. CRISPR 타입 II 시스템들에서 요구되는 전사촉진하는(trans-activating) crRNA (tracrRNA)은 crRNA과 짝을 이루고(pair), 제공된 Cas9 단백질에 결합된다. Cas9는 tracRNA의 cRNA와의 염기짝짓기(base pairing)를 가능하게 하는 분자 앵커(anchor)로서 역할한다(Deltcheva, Chylinski et al. 2011). 이 셋으로 이루어지는(ternary) 복합체에서, 이중(dual) tracrRNA:crRNA 구조는 엔도뉴클레아제 Cas9를 관련있는(cognate) 타겟 서열로 향하게 하는 가이드(guide) RNA로서 역할한다. Cas9-tracrRNA:crRNA 복합체에 의한 타겟 인식은 타겟 서열 및 crRNA 사이의 상동성(homology)을 위하여 타겟 서열을 스캐닝함으로써 개시된다. 타겟 서열-crRNA 상보성(complementarity)에 추가하여, DNA 타겟팅은 프로토스페이서에 인접한 짧은 모티프(프로토스페이서(protospacer) 인접(adjacent) 모티프(motif) - PAM)의 존재를 요구한다. 이중(dual)-RNA 및 타겟 서열 사이의 짝짓기 후, Cas9 는 그 다음에 PAM 모티프의 업스트림 뭉툭한(blunt) 이중 가닥 손상(break) 3 염기들(bases)을 도입한다 (Garneau, Dupuis et al. 2010). 본 발명에서, 가이드 RNA는, 예를 들어, TCR 요소(component)를 코드하는 타겟 유전자에 특이적으로 디자인될 수 있다. 가이드 RNA 및 타겟 서열 사이의 짝짓기 후, Cas9 는 TCR 유전자 내에서 절단(cleavage)을 유도한다.
희귀-절단 엔도뉴클레아제는, 또한 메가뉴클레아제(meganuclease)의 이름 하 알려진, 또한 귀소(homing) 엔도뉴클레아제일 수 있다. 이러한 귀소(homing) 엔도뉴클레아제들은 당업계에 잘 알려져 있다 (Stoddard 2005). 귀소(homing) 엔도뉴클레아제들은 매우 특이적이며, 12 부터 45 염기쌍들(base pairs) (bp)까지 길이의 범위의, 보통 14 부터 40 bp 까지 길이의 범위의, DNA 타겟(target) 위치들(sites)을 인식한다.
본 발명에 따른 귀소(homing) 엔도뉴클레아제는 예를 들어, LAGLIDADG 엔도뉴클레아제에, HNH 엔도뉴클레아제에, 또는 GIY-YIG 엔도뉴클레아제에, 일치할(correspond) 수 있다. 본 발명에 따른 선호되는 귀소(homing) 엔도뉴클레아제는 I-CreI 변이체들(variants)일 수 있다. "변이체(variant)" 엔도뉴클레아제, 즉, 자연에서 자연적으로 존재하지 않고, 유전적 조작에 의하여 또는 무작위(random) 돌연변이생성(mutagenesis)에 의하여 수득되는 엔도뉴클레아제는, 야생형 엔도뉴클레아제들에 의하여 인식되는 그것과는 다른 DNA 서열들에 결합할 수 있다(국제출원 WO2006/097854 참조).
상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 모듈식(modular) DNA 결합 뉴클레아제일 수 있다. 모듈식(modular) DNA 결합 뉴클레아제에 의하여 엔도뉴클레아제의 적어도 하나의 촉매적(catalytic) 도메인 및 핵산 타겟 서열을 특정화하는(specifying) 적어도 하나의 DNA 결합 도메인 또는 단백질을 포함하는 임의의 융합(fusion) 단백질들이 의미된다. DNA 결합 도메인은 일반적으로 이중- 또는 단일-가닥의 DNA를 인식하는 적어도 한의 모티프를 포함하는, 독립적으로 접히는(folded) 폴리펩타이드 단백질 도메인에 의하여 형성되는 RNA 또는 DNA-결합 도메인이다. 많은 이러한 폴리펩타이드들이 특이적 핵산 서열들에 결합하는 능력을 갖는, 당업계에서 기재되어 왔다. 이러한 결합 도메인들은 자주, 제한되지 않는 예들로서, 헬릭스(helix)-턴(turn) 헬릭스(helix) 도메인들, 류신(leucine) 지퍼(zipper) 도메인들, 날개달린(winged) 헬릭스(helix) 도메인들, 헬릭스(helix)-루프(loop)-헬릭스(helix) 도메인들, HMG-박스(box) 도메인들, 이뮤노글로빈(Immunoglobin) 도메인들, B3 도메인 또는 조작된 징크(zinc) 핑거(finger) 도메인을 포함한다.
본 발명의 선호되는 예에 따라, DNA 결합 도메인은, 잔토모나스(Xanthomonas) 또는 랄스토니아(Ralstonia) 박테리아 단백질들에서 비롯되는, 일련의 33-35 아미노산들 반복들(repeats)에 의하여 서열 특이성이 추진되는, 전사(Transcription) 액티베이터(Activator) 유사(like) 이펙터(Effector) (TALE)로부터 유래된다. 이들 반복들은 염기쌍과의 상호작용을 특정화하는(specify) 두 개의 아미노산들 위치들(positions)에 의하여 본질적으로 다르다(Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009). DNA 타겟에서 각각의 염기쌍은 반복의 두 개의 변이체(variant) 아미노산들(소위 반복(repeat) 가변(variable) 디펩타이드(dipeptide), RVD)이 원인인 특이성(specificity)을 갖고, 단일 반복(repeat)에 의하여 접촉된다. TALE 결합 도메인들은 타겟인 서열의 첫 번째 티민(thymine) 염기의 요구에 원인이 있는 N-말단 자리옮김(translocation) 도메인 (T0) 및 핵(nuclear) 위치화(localization) 신호들(signals) (NLS)를 포함하는 C-말단 도메인을 더 포함할 수 있다. TALE 핵산 결합 도메인은 일반적으로, 수많은 TALE 반복(repeat) 서열들, 각각의 반복(repeat)은 TALE 인식 위치(site)의 각각의 뉴클레오타이드들 염기에 특이적인 RVD를 포함하는,을 포함하는 조작된 코어(core) TALE 스캐폴드(scaffold)에 일치한다(correspond). 본 발명에서, 상기 코어(core) 스캐폴드(scaffold)의 각각의 TALE 반복(repeat) 서열은, 등가의(equivalent) 두 개의 매우 중요한 아미노산들이 특히 33 또는 34 아미노산들 길이보다 짧은 TALE 반복(repeat) 서열에서 12 및 13 외 위치들(positions)에 위치될 수 있고; 12 및 13 위치들(positions)에 위치된, 두 개의 매우 중요한 아미노산들(소위 반복(repeat) 가변(variable) 디펩타이드(dipeptide), RVD)이 상기 TALE 결합 위치(site) 서열의 하나의 뉴클레오타이드의 인식을 매개하는, 30 내지 42 아미노산들, 더욱 바람직하게는 33 또는 34 로 만들어진다. 바람직하게는 다른 뉴클레오타이드들의 인식과 관련된 RVD들은 C를 인식하기 위한 HD, T를 인식하기 위한 NG, A를 인식하기 위한 NI, G 또는 A를 인식하기 위한 NN이다. 또다른 예에서, 매우 중요한 아미노산들 12 및 13은 뉴클레오타이드들 A, T, C 및 G를 향한 그것들의 특이성을 조절하고, 그리고 특히 이 특이성을 증강(enhance)시키기 위하여, 다른 아미노산 잔기들을 향하여, 돌연변이될 수 있다. TALE 핵산 결합 도메인은 보통 8 및 30 TALE 반복(repeat) 서열들 사이를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 상기 코어(core) 스캐폴드(scaffold)는 8 및 20 TALE 반복 서열들 사이를; 다시 더욱 바람직하게는 15 TALE 반복(repeat) 서열들을 포함한다. 그것은 또한 TALE 반복(repeat) 서열들의 상기 세트(set)의 C-말단(terminus)에 위치된 20 아미노산들로 만들어진 추가의 단일 잘린(truncated) TALE 반복(repeat) 서열, 즉, 추가의 C-말단 반(half)- TALE 반복(repeat) 서열을 포함한다.
다른 조작된 DNA 결합 도메인들은 모듈식(modular) 염기(base)-당(per)-염기(base) 특이적(specific) 핵산(nucleic acid) 결합(binding) 도메인들(domains) (MBBBD)이다 (PCT/US2013/051783). 상기 MBBBD은 예를 들어, 신규로 확인된 단백질들, 즉, 내생공생생물(endosymbiont) 진균들(fungi) 부르콜데리아(Burkholderia) 리조신디카(Rhizoxinica)의 최근 시퀀싱된 게놈으로부터의, EAV36_BURRH, E5AW43_BURRH, E5AW45_BURRH 및 E5AW46_BURRH 단백질들로부터 조작될 수 있다 (Lackner, Moebius et al. 2011). MBBBD 단백질들은 염기 특이적인 약 31 내지 33 아미노산들의 모듈(modules)을 포함한다. 이들 모듈들(modules)은 잔토모나스(Xanthomonas) TALE 공통의(common) 반복들(repeats)과 40 %보다 적은 서열 동일성(identity)을 보이는 반면, 그것들은 더 많은 폴리펩타이드들 서열 변동성(variability)을 준다(present). 그것들이 서로 조립될 때, 이들 모듈식(modular) 폴리펩타이드들은 잔토모나스(Xanthomonas) TALE-뉴클레아제들과 상당히 유사한 방식으로, 그러나 특이적 핵산 서열들을 타겟으로 할 수 있다. 본 발명의 바람직한 예에 따라, 상기 DNA 결합 도메인은 10 및 30 모듈들(modules) 사이, 바람직하게는 16 및 20 모듈들(modules) 사이를 포함하는, 조작된 MBBBD 결합 도메인이다. 부르콜데리아(Burkholderia) 및 잔토모나스(Xanthomonas)로부터의 상기 단백질들로부터 다른 도메인들은 (모듈들, N 및 C-말단들) 특정 핵산 서열들에 결합 특성을 갖는 신규 단백질들 또는 스캐폴드들(scaffolds)을 조작하는데 유용하다. 특히, 조작된 MBBBD의 추가의 N-말단 및 C-말단 도메인들은, 제한되지 않는 예들로서, 자연의 TALE 유사(like) AvrBs3, PthXo1, AvrHah1, PthA, Tal1c으로부터 유래될 수 있다.
"TALE-뉴클레아제(nuclease)" 또는 "MBBBD-뉴클레아제(nuclease)"는 엔도뉴클레아제 촉매적(catalytic) 도메인과, MBBBD 결합 도메인 또는 전사(Transcription) 액티베이터(Activator) 유사(like) 이펙터(Effector) 단백질들 (TALE)로부터 전형적으로 유래되는 DNA 결합 도메인의 융합(fusion)으로부터 생기는 조작된 단백질들을 가리킨다. 이러한 촉매적(catalytic) 도메인은 바람직하게는 뉴클레아제 도메인이며, 더욱 바람직하게는, 예를 들어 I-TevI, ColE7, NucA 및 Fok-I인, 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 도메인이다. 특정 예에서, 상기 뉴클레아제는 모노머(monomeric) TALE-뉴클레아제(Nuclease) 또는 MBBBD-뉴클레아제이다. 모노머(monomeric) 뉴클레아제(Nuclease)는 WO2012138927에 기재된 I-TevI의 촉매적(catalytic) 도메인과 조작된 DNA 결합 도메인의 융합들과 같은, 특이적 인식 및 절단(cleavage)을 위한 이합체화(dimerization)를 요구하지 않는 뉴클레아제이다. 또다른 특정 예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는, 바람직하게는 FokI에 융합된(fused) DNA 결합 도메인을 포함하는, 다이머(dimeric) TALE-뉴클레아제 또는 MBBBD-뉴클레아제이다. TALE-뉴클레아제는 유전자 타겟팅 및 유전자 변형을 자극하는데 이미 기재되고 사용되어 왔다. 이러한 조작된 TALE-뉴클레아제들은 상표 TALENTM (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France) 하, 상업적으로 이용가능하다.
- 용어 "절단(cleavage)"은 폴리뉴클레오타이드의 공유적(covalent) 백본(backbone)의 파손(breakage)을 가리킨다. 절단은 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나, 이에 제한되지 않는 여러가지 방법들에 의하여 시작될 수 있다. 단일-가닥의 절단(cleavage) 및 이중-가닥의 절단(cleavage) 모두 가능하며, 그리고 이중-가닥의 절단은 두 개의 구별되는(distinct) 단일-가닥의 절단(cleavage) 이벤트들의 결과로서 발생할 수 있다. 이중 가닥의 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 혼성(hybrid) 절단은 뭉툭한(blunt) 말단(ends)들 또는 흔들거리는(staggerred) 말단들의 생산을 야기할 수 있다.
- "융합 단백질"에 의하여 분리된 단백질들 또는 그것들의 부분을 원래 코드하는 둘 또는 그보다 많은 유전자들의 연결(joining)로 구성되는 당업계에 잘 알려진 공정의 결과, 원래 단백질들의 각각으로부터 유래하는 기능적 특성들을 갖는 단일 폴리펩타이드을 야기하는 상기 "융합(fusion) 유전자"의 번역이 의도된다.
- "동일성(identity)"은 두 개의 핵산 분자들 또는 폴리펩타이드들 사이의 서열 동일성(identity)을 가리킨다. 동일성은 비교의 목적으로 정렬될 수 있는 각각의 서열 내 위치(position)을 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교되는 서열 내 위치(position)가 동일한 염기에 의하여 점유될 때, 그 때 분자들은 그 위치에서 동일(identical)하다. 핵산 또는 아미노산 서열들 사이의 유사성(similarity) 또는 동일성(identity) 정도는 핵산 서열들에 의하여 공유되는 위치들에서의 동일하거나(identical) 또는 매칭(matching)되는 뉴클레오타이드들의 수의 작용이다. GCG 서열 분석 패키지의 부분으로서 이용가능한 BLAST 또는 FASTA를 포함하는(University of Wisconsin, Madison, Wis.) 다양한 정렬 알고리즘들 및/또는 프로그램들이 두 서열들 사이의 동일성(identity)을 계산하기 위하여 사용될 수 있고, 예컨대, 디폴트(default) 세팅과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 여기에 기재된 특이적 폴리펩타이드들에 적어도 70%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성(identity)를 갖고, 바람직하게는 상당히 동일한 기능들을 보이는 폴리펩타이드들과 이러한 폴리펩타이드들를 코드하는 폴리뉴클레오타이드가 고려된다.
- "신호전달 도메인" 또는 "공-자극 리간드"는 T-세포 상 유사한(cognate) 공-자극 분자에 특이적으로 결합하여, 예를 들어, 펩타이드가 로딩(load)된 MHC 분자로 TCR/CD3 복합체의 결합에 의하여, 제공되는 일차(primary) 신호에 추가로, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, T 세포 반응을 매개하는, 신호를 제공하는, 항원 제시 세포 상 분자를 가리킨다. 공-자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성(inducible) 공자극(costimulatory) 리간드(igand) (ICOS-L), 세포간(intercellular) 부착(adhesion) 분자 (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, 림포톡신(lymphotoxin) 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, 작용제(agonist) 또는 Toll 리간드 수용체에 결합하는 항체 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 공-자극 리간드는 또한, 그 중에서도, CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능(function)-관련(associated) 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, T 세포 상 존재하는 공-자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
"공-자극 분자"는 공-자극 리간드에 특이적으로 결합하여, 증식과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 세포에 의한 공-자극 반응을 매개하는, T 세포 상 유사한(cognate) 결합 파트너를 가리킨다. 공-자극 분자들은 HC 클래스(class) I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
여기에 기재된 대로 "공-자극 신호"는 TCR/CD3 라이게이션(ligation)과 같은 일차 신호와 조합하여, 주요(key) 분자들의 상향조절 또는 하향조절 및/또는 T 세포 증식을 이끄는 신호를 가리킨다.
- "이중특이성(bispecific) 항체"는 단일 항체 분자 내 두 개의 다른 항원들을 위한 결합 위치(sites)를 갖는 항체를 가리킨다. 기본(canonical) 항체 구조에 추가하여, 다른 분자들은 두 개의 결합 특이성을 갖도록 건설될 수 있다는 것이 당업자에게 인정될 것이다. 나아가, 이중특이성 항체들에 의하여 항원 결합이 동시에 또는 순차적(sequential)일 수 있다는 것이 인정될 것이다. 이중특이성 항체들은 모두 그 자체가 잘 알려진, 화학 기술들(예컨대, Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5807), "폴리도마(polydoma)" 기술에 의하여(U.S. Pat. No. 4,474,893 참조) 또는 재조합 DNA 기술들에 의하여, 생산될 수 있다. 제한되지 않는 예로서, 각각의 결합 도메인은 항체 중(heavy) 사슬로부터 적어도 하나의 가변(variable) 영역 ("VH 또는 H 영역")을 포함하는데, 이때, 첫 번째 결합 도메인의 VH 영역은 CD3와 같은 림프구 마커(marker)에 특이적으로 결합하고, 두 번째 결합 도메인의 VH 영역은 종양 항원에 특이적으로 결합한다.
- 여기에 사용된 용어 "세포외(extracellular) 리간드-결합 도메인"은 리간드에 결합할 수 있는 올리고- 또는 폴리펩타이드로 정의된다. 바람직하게는, 그 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 세포외 리간드-결합 도메인은 특정 질병 상태와 관련된 타겟 세포들 상 세포 표면 마커(marker)로서 작용하는 리간드를 인식하기 위하여 선택될 수 있다. 이런 식으로 리간드들로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커들의 예들은 바이러스, 박테리아 및 기생충(parasitic) 감염들, 자가면역 질환 및 암세포들과 관련된 그것들을 포함한다.
여기에 사용된 용어 "대상(subject)" 또는 "환자"는 비-인간 영장류들 및 인간들을 포함하는 동물 계(kingdom)의 모든 멤버들을 포함한다.
본 발명의 상기 전술한 기재는 그것을 이용하고 만드는 공정 및 방식을 제공하여, 당업자는 원래의 명세서의 부분을 형성하는 첨부된 특허청구범위의 주제를 위하여 특히 제공되는 이 실시가능성(enablement), 동일한 것을 만들고 이용할 수 있다.
수치 한정 또는 범위가 여기에서 언급될 때 그 종점(endpoint)들도 포함된다. 또한 수치 한정 또는 범위 내 모든 값들 및 부분범위(subrange)들은 명확하게 작성된 것처럼 특이적으로 포함된다.
상기 기재는 당업자가 본 발명을 만들고 이용하기 위하여 제시되며, 특정 출원의 내용 및 그것의 요구사항들 내에서 제공된다. 선호되는 예들에 대한 다양한 변형들은 당업자에게 쉽게 분명하며, 여기에 정의된 일반 원칙들은 본 발명의 범위 및 주제로부터 벗어나지 않고 출원들 및 다른 예들에 적용될 수 있을 것이다. 이런 식으로, 이 발명은 보여진 예들에 제한되는 것으로 의도되지 않고, 여기에 공개된 특징들 및 원칙들과 일치하는 가장 넓은 범위에 따를 것이다.
이 발명은 일반적으로 기재하는 것, 추가의 이해는 특정 특이적 실시예들을 참조하여 수득될 것인데, 이는 설명의 목적만으로 여기에 제공되는 것이며, 다르게 특정하지 않는 한 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
실시예들
실시예 1: 인간 GR 유전자를 절단하는 TALE -뉴클레아제들
인간 GR 유전자의 엑손들을 타겟팅하는 6 개의 헤테로다이머인(heterodimeric) TALE-뉴클레아제들이 디자인되고 생산되었다. 하기 표 2는 각각의 TALE-뉴클레아제에 의하여 절단되는 타겟 서열들을 가리킨다. GR TALE-뉴클레아제는 두 개의 독립적인 독립체들(entities) (반(half) TALE-뉴클레아제들이라고 불림)을 포함하는데, 그 각각은 15-bp 스페이서(spacer)에 의하여 분리된 2 개의 17-bp 길이 서열들 (반(half) 타겟들이라고 불림)로 구성되는 GR 타겟 서열들에 결합되고 절단하도록 조작된 반복 서열을 포함한다.
Figure 112015122363153-pct00004
표 2:인간 GR 유전자 내 TALE-뉴클레아제들 타겟 위치들(sites)의 서열들 및 GR TALE-뉴클레아제들의 기재.
반복 및 N-말단, C-말단 도메인들의 아미노산 서열들은 AvrBs3 TALE (참조: GenBank: X16130.1)에 기초한다. C-말단 및 N-말단 도메인들은 두 개의 BsmBI 제한 자리들에 의하여 분리된다. 원하는 서열들 (서열번호: 1 내지 6)을 타겟팅하는 반복(repeat) 어레이들(arrays) (서열번호: 7 내지 18)은 연이은(consecutive) 제한(restriction)/라이게이션(ligation)/세척(washing) 단계들을 포함하는 고체 지지 방법을 이용하여 합성되었다(International PCT application WO2013/017950). 간단히 말해서, 첫 번째 블록(block)(이(di)-반복(repeat)을 코드함)은 비오틴(biotin)/스트렙타비딘(streptavidin) 상호작용을 통하여 고체 지지대 상에 고정되었고, 두 번째 블록(삼(tri)-반복(repeat))은 그 때 첫 번째 것에 라이게이션되었고, SfaNI 소화(digestion) 후 세 번째 블록(삼(tri)-반복(repeat))이 커플링되었다. 그 공정은 원하는 반복 어레이를 얻는데(upon) 삼(tri)- 또는 이(di)-반복(repeat) 블록들(blocks)을 사용하여 반복되었다. 산물은 E. coli에서의 증폭을 위하여 전통적인 pAPG10 클로닝 플라스미드 내에서 그 때 클로닝되었고 시퀀싱되었다. 그러므로 수득된 반복 어레이 서열들이 삽입된 반복 서열을 위하여 플라스미드 및 BbvI 및 SfaNI 를 받기 위하여 타입 IIS 제한 효소들 BsmBI를 이용하여 효모(yeast) 발현 TALE 벡터에서 서브클로닝되었다. FokI 제한 효소의 촉매적 도메인에 융합된 TALE 유래 DNA 결합 도메인을 포함하는, 반(half) TALE-뉴클레아제를 코드하는 DNA는 E. coli에서 증폭되었고, 표준 미니프렙(miniprep) 기술들에 의하여 회수되었고 그리고 삽입물(insert)의 온전성을 평가하기 위하여 시퀀싱되었다.
효모 내 GR TALE -뉴클레아제들의 활성 :
여섯 개의 GR-TALE-뉴클레아제들의 뉴클레아제 활성이, 서열번호: 1 내지 6을 야기하는 15 bp 들의 스페이서(spacer)에 의하여 분리된 DNA 가닥 상 서로 마주보는 두 개의 TALE 타겟 서열들을 포함하는 타겟들 상에서, 전술된 우리의 효모 SSA 어세이에서 37 ℃ 및 30 ℃에서 테스트되었다(International PCT Applications WO 2004/067736 and in (Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006). TALE-뉴클레아제 DNA 타겟 서열들을 포함하는 모든 효모 타겟 리포터(reporter) 플라스미드들이 전술한 바와 같이 건설되었다(International PCT Applications WO 2004/067736 and in (Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006). 타겟들 상 개개의 클론들의, 효모에서의 TALE-뉴클레아제 절단(cleavage) 활성 레벨들이 표 3에 나타나 있다.
Figure 112015122363153-pct00005
값들은 0 및 1 사이에 포함된다. 최대 값은 1이다.
표 3: 효모에서 GR TALE-뉴클레아제들의 절단 활성.
HEK293 세포들에서 GR TALE -뉴클레아제들의 활성:
각각의 TALE-뉴클레아제 구조체(construct)는 pEF1알파(alpha) 길이 프로모터의 통제 하 포유류 발현 벡터에서 제한 효소 소화를 이용하여 서브클로닝되었다.
백만 HEK293 세포들이 형질감염(transfection) 하루 전 시딩(seed)되었다. 제조업자의 지시들에 따라 25μL의 리포펙타민(lipofectamine)(Invitrogen)을 이용하여 EF1알파(alpha) 프로모터의 통제 하 GR 유전자 내 관심있는 두 개의 반(half) 타겟들 게놈 서열들을 인식하는, GRex2, GRex3T2, GRex3T4, GRex5T1, GRex5T2 또는 GRex5T3 TALE-뉴클레아제의 왼쪽 및 오른쪽 반(half)을 코딩하는 두 개의 플라스미드들 각각의 2.5 μg으로 공-형질감염(co-transfected)되었다. 대조군으로서, 세포들은 EF1알파(alpha) 프로모터의 통제 하 T-세포 수용체 알파 불변(constant) 사슬 영역 (TRAC_T01) 타겟 위치 ((TRAC_T01-L 및 -R TALE-뉴클레아제 (서열번호: 41 및 서열번호: 42, TRAC_T01 타겟 위치 (서열번호: 37))를 타겟팅하는 TALE-뉴클레아제들의 왼쪽 및 오른쪽 반(half)을 코드하는 두 개의 플라스미드들 중 각각의 2.5 μg으로 공-형질감염(co-transfected)되었다. GR 코딩 서열 내 TALE-뉴클레아제들에 의하여 생기는 이중 가닥 손상(break)은 비상동(non homologous) 말단(end) 연결(joining) (NHEJ)을 유도하는데, 이는 에러(error)-프론(prone) 메커니즘이다. TALE-뉴클레아제들의 활성은 타겟된 게놈 위치들의 결실 또는 삽입들의 빈도에 의하여 측정된다.
형질감염(transfection) 2 또는 7 일 후, 세포들이 수확되었고, 하기 프라이머들을 이용하여 추출된 게놈 DNA에 위치(locus) 특이적 PCR들이 수행되었다: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3' (포워드(forward) 어댑터(adaptator) 서열)- 10N (TAG)- 위치(locus) 특이적 포워드(forward) 서열 GR 엑손 2를 위하여:5'-GGTTCATTTAACAAGCTGCC-3' (서열번호: 31), GR 엑손 3를 위하여: 5'-GCATTCTGACTATGAAGTGA-3' (서열번호: 32) 및 GR 엑손 5를 위하여: 5'-TCAGCAGGCCACTACAGGAGTCTCACAAG-3' (서열번호: 33) 및 역(reverse) 프라이머 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-3' (역(reverse) 어댑터(adaptor) 서열)- 위치(locus) 특이적 리버스(reverse) 서열 GR 엑손 2를 위하여 : 5'-AGCCAGTGAGGGTGAAGACG-3' (서열번호: 34), GR 엑손 3를 위하여 : 5'-GGGCTTTGCATATAATGGAA-3' (서열번호: 35) 및 GR 엑손 5를 위하여 : 5'-CTGACTCTCCCCTTCATAGTCCCCAGAAC-3' (서열번호: 36).
PCR 산물들은 454 시퀀싱 시스템 (454 Life Sciences)에 의하여 시퀀싱되었다. 거의 10,000 서열들이 PCR 산물 당 수득되었고 그때 위치(site)-특이적 삽입 또는 결실 이벤트들의 존재가 분석되었다. 표 4는 샘플 내 서열들의 총 수 중 TALE-뉴클레아제 타겟 위치에서 삽입들 또는 결실들을 보이는 서열들의 퍼센트를 나타낸다. 표 4에 대표 실험의 결과들인 GRex2, GRex3T2 및 GRex3T4 가 리스트되어 있다.
테스트된 모든 케이스들에서, 돌연변이생성(mutagenesis)의 %는 형질감염(transfection) 2 일 후 샘플의 그것에 비교할 때 7 일에서 유사하였다. 돌연변이유발성(mutagenic) 이벤트들의 특성 또한 분석되었는데, 삽입들에 비교한 모든 케이스들에서 결실들이 가장 많다는 것을 보였다.
Figure 112015122363153-pct00006
표 4: HEK293 세포들에서 내생(endogenous) TALE-뉴클레아제 타겟 위치들에서 타겟된 돌연변이생성(mutagenesis)의 퍼센트.
일차( primary ) T 림프구들 내 GR TALE -뉴클레아제들의 활성:
각각의 TALE-뉴클레아제 구조체는 T7 프로모터의 통제 하 발현 벡터에서 제한 효소 소화를 이용하여 서브클로닝되었다.
GR 게놈 서열들을 절단하는(cleaving) TALE-뉴클레아제들를 코딩하는 mRNA가 T7 프로모터로부터 다운스트림 코딩 서열들을 운반하는 각각의 플라스미드로부터 합성되었다. 말초 혈액으로부터 분리된 T 림프구들이 항-CD3/CD28 액티베이터(activator) 비드들 (Life technologies)을 이용하여 5 일 동안 활성화되었고, 5 백만 세포들이 CytoLVT-P instrument (BTX-Harvard apparatus)을 이용하여 반(half) TALE-뉴클레아제들 둘 다를 코드하는 2 mRNA들 각각의 10 μg으로 전기천공법(electroporation)에 의하여 형질감염(transfect)되었다. CD52 유전자를 타겟팅하는 반(half) TALE-뉴클레아제들 둘 다를 코딩하는 2 mRNA들(CD52_T02-L 및 -R TALEN (서열번호: 55 및 56)의 각각의 10μg로 형질감염(transfect)된 T 세포들, 타겟 서열 CD52_T02 서열번호: 40)은 대조군으로서 이용된다.
형질감염(transfection) 3 및 7 일 후, 게놈 DNA 가 형질감염된 세포들로부터 분리되었고, 전술한 프라이머들을 이용하여 위치(locus) 특이적 PCR들이 수행되었다. PCR 산물들은 454 시퀀싱 시스템 (454 Life Sciences)에 의하여 시퀀싱되었다. 거의 10,000 서열들이 PCR 산물 당 수득되었고, 그때 위치(site)-특이적 삽입 또는 결실 이벤트들의 존재가 분석되었다; 결과들은 표 5에 있다.
Figure 112015122363153-pct00007
표 5: 일차(primary) T 림프구들의 내생(endogenous) TALE-뉴클레아제 타겟 위치(sites)들에서 타겟된 돌연변이생성(mutagenesis)의 퍼센트.
실시예 2: 인간 CD52 유전자, 인간 T-세포 수용체 알파 불변( constant ) 사슬 (TRAC) 및 인간 T-세포 수용체 베타 불변( constant ) 사슬들 1 및 2 ( TRBC )을 절단하는 TALE -뉴클레아제들.
실시예 1에서 기재한 바와 같이, 각각 CD52, TRAC 및 TRBC 유전자들를 타겟팅하는 헤테로다이머인(heterodimeric) TALE-뉴클레아제들이 디자인되었고 생산되었다. 타겟된 게놈 서열들은 11 또는 15-bp 스페이서(spacer)에 의하여 분리된 두 개의 17-bp 길이 서열들 (반(half) 타겟들이라 불림)으로 구성된다. 각각의 반(half)-타겟은 표 6에 리스트된 반(half) TALE-뉴클레아제들의 반복들에 의하여 인식된다. 인간 게놈은 두 개의 기능적 T-세포 수용체 베타 사슬들 (TRBC1 및 TRBC2)을 포함한다. 알파/베타 T 림프구들의 발달 동안, 이들 두 불변(constant) 사슬들 중 하나는 TCR-베타의 가변(variable) 영역으로 이어지고(splice) 기능적 전장 베타 사슬을 형성하기 위하여, 각각의 세포에서 선택된다. 2 TRBC 타겟들은 TRBC1 및 TRBC2 사이의 보존된(conserved) 서열들에서 선택되었고, 그래서 대응하는(corresponding) TALE-뉴클레아제는 동시에 TRBC1 및 TRBC2 둘 다를 절단할 것이다.
Figure 112015122363153-pct00008
표 6: 인간 대응하는 유전자들에서 TALE-뉴클레아제들 타겟 위치(sites)들의 서열들 및 CD52, TRAC 및 TRBC TALE-뉴클레아제들의 기재.
TRAC 및 CD52 유전자들 내 다른 타겟 서열들이 디자인되었는데, 이는 표 7에서 보여진다.
Figure 112015122363153-pct00009
표 7: TRAC 및 CD52 TALE-뉴클레아제들을 위한 추가의 타겟 서열들.
HEK293 세포들에서 CD52 - TALE -뉴클레아제, TRAC - TALE -뉴클레아제 및 TRBC -TALE-뉴클레아제의 활성
각각의 TALE-뉴클레아제 구조체가 pEF1알파(alpha) 길이(long) 프로모터의 통제 하 포유류 발현 벡터에서 제한 효소 소화를 이용하여 서브클로닝되었다. 형질감염(transfection) 하루 전 백만 HEK293 세포들이 시딩(seed)되었다. 세포들은 제조업자의 지시에 따라, 25 μl의 리포펙타민(lipofectamine) (Invitrogen)을 이용하여 5 μg의 콘트롤(control) pUC 벡터 (pCLS0003) 또는 EF1-알파 프로모터의 통제 하 T-세포 수용체 베타 불변(constant) 사슬 영역 (TRBC), T-세포 수용체 알파 불변(constant) 사슬 영역 (TRAC), 또는 CD52 유전자에서 관심있는 게놈 서열 내 두 개의 반(half) 타겟들을 인식하는 TALE-뉴클레아제들를 코드하는 두 개의 플라스미드들의 각각의 2.5 μg으로 공-형질감염(co-transfect)되었다. CD52 또는 TRAC 코딩 서열들 내 TALE-뉴클레아제들에 의하여 만들어지는 이중 가닥의 절단(cleavage)은 비상동(non homologous) 말단(end) 연결(joining) (NHEJ)에 의하여 살아있는 세포들에서 수선되는데, 이는 에러(error)-(prone) 메커니즘이다. 살아있는 세포들에서 TALE-뉴클레아제들의 활성은 타겟된 게놈 위치(locus)에서 삽입들 또는 결실들의 빈도에 의하여 측정된다. 형질감염(transfection) 48 시간 후, 게놈 DNA 이 형질감염된 세포들로부터 분리되었고, 하기 프라이머들을 이용하여 위치(locus) 특이적 PCR들이 수행되었다:5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG (포워드(forward) 어댑터(adaptor) 서열)- 10N (TAG)- 위치(locus) 특이적 포워드(forward) 서열로, CD52을 위하여: 5'-CAGATCTGCAGAAAGGAAGC-3' (서열번호: 66), TRAC을 위하여: 5'-ATCACTGGCATCTGGACTCCA-3' (서열번호: 67), TRBC1를 위하여: 5'-AGAGCCCCTACCAGAACCAGAC-3' (서열번호: 68), 또는 TRBC2를 위하여: 5'- GGACCTAGTAACATAATTGTGC-3' (서열번호: 69), 그리고 역(reverse) 프라이머 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG (역(reverse) 어댑터(adaptor) 서열)- 내생(endogenous) 위치(locus) 특이적 리버스(reverse) 서열로, CD52을 위하여: 5'-CCTGTTGGAGTCCATCTGCTG-3' (서열번호: 70), TRAC을 위하여: 5'-CCTCATGTCTAGCACAGTTT-3' (서열번호: 71), TRBC1 및 TRBC2을 위하여: 5'- ACCAGCTCAGCTCCACGTGGT-3' (서열번호: 72). PCR 산물들은 454 시퀀싱 시스템 (454 Life Sciences)에 의하여 시퀀싱되었다. 거의 10,000 서열들이 PCR 산물 당 수득되었고 그때 위치(site)-특이적 삽입 또는 결실 이벤트들의 존재가 분석되었다; 결과들은 8에 있다.
Figure 112015122363153-pct00010
표 8: CD52_T02, TRAC_T01, TRBC_T01 및 TRBC_T02 타겟들을 타겟팅하는 TALE-뉴클레아제를 위한 삽입-결실들(indels)의 퍼센트들.
일차( primary ) T 림프구들 내 CD52 - TALE -뉴클레아제, TRBC - TALE -뉴클레아제 및 TRAC - TALE -뉴클레아제의 활성
TALE-뉴클레아제 구조체(construct) 각각이 T7 프로모터의 통제 하 포유류 발현 벡터에서 제한 효소 소화를 이용하여 서브클로닝되었다.
CD52 TRAC 및 TRBC 게놈 서열을 절단하는 TALE-뉴클레아제를 코딩하는 mRNA가 T7 프로모터로부터 다운스트림 코딩 서열들을 운반하는 플라스미드로부터 합성되었다. 말초 혈액으로부터 분리된 T 림프구들은 항-CD3/CD28 액티베이터(activator) 비드들 (Life technologies)을 이용하여 5 일동안 활성화되었고 5 백만 세포들이 그 때 CytoLVT-P 도구(instrument)를 이용하여 반(half) TALE-뉴클레아제 둘 다를 코드하는 2 mRNA들 (또는 대조군들로서 코드하지 않는 RNA)의 각각의 10 μg으로 전기천공법(electroporation)에 의하여 형질감염되었다. NHEJ에 의하여 유도되는 삽입들 및 결실들의 결과, CD52 및/또는 TRAC에 대한 코딩 서열은 비-기능적 유전자들을 야기하는 세포들의 부분(fraction)에서 참여하지 않을 것이다(out of frame). 전기천공(electroporation) 5 일 후, 세포들은 그것들의 세포 표면에서 CD52 또는 TCR의 존재를 위하여 유동세포분석법(flow cytometry)에 의하여 플루오로크롬(fluorochrome)-콘쥬게이트된(conjugated) 항-CD52 또는 항-TCR 항체로 표지되었다. 말초 혈액으로부터 확장된(expanded) 모든 T 림프구들이 정상적으로 CD52 및 TCR을 발현시켰기 때문에, CD52-음성 또는 TCR-음성 세포들의 비율은 TALE-뉴클레아제 활성의 직접적인 척도이다. 표 9에 대표 실험의 결과들이 리스트되어 있다. 표 9는 TRBC TALE-뉴클레아제들의 효율을 테스트한 대표 실험의 결과들을 보여준다.
Figure 112015122363153-pct00011
표 9: 대응하는 TALE-뉴클레아제-발현 폴리뉴클레오타이드들의 형질감염(transfection) 후 CD52- 음성, TCR-음성 및 CD52/TCR-이중 음성 T 림프구들의 퍼센트들.
Figure 112015122363153-pct00012
표 10: TRBC TALE-뉴클레아제-발현 폴리뉴클레오타이드들의 형질감염(transfection) 후 TCR-음성 T 림프구들의 퍼센트들.
타겟된 CD52 유전자로 T 세포들의 기능적 분석
CD52 유전자 불활성화의 목표는 T 림프구들을 항-CD52 항체 매개된 면역억제에 저항성으로 만드는 것이다. 전 단락에서 기재한 바와 같이, T 림프구들은 CD52를 절단하는 TALE-뉴클레아제를 코드하는 mRNA로 형질감염(transfect)되었다. 형질감염(transfection) 7 일 후, 세포들은 30% 토끼 보체(complement) (Cedarlane)로, 또는 없이, 50μg/ml 항-CD52 단일클론 항체 (또는 대조군으로서 래트(rat) IgG)로 처리되었다. 37 ℃에서 2 시간 배양된 후, 세포들은 형광(fluorescent) 생존능력(viability) 염료(dye) (eBioscience)와 함께 플루오로크롬-콘쥬게이트된 항-CD52 항체로 표지되었고, 살아있는 세포들 중 CD52-양성 및 CD52-음성 세포들의 빈도를 측정하기 위하여 유동세포분석법(flow cytometry)에 의하여 분석되었다. 도 6은 대표적 실험의 결과를 보여주는데, 이는 CD52-음성 세포들이 보체(complement)-매개 항-CD52 항체 독성에 완전히 저항성이라는 것을 나타낸다.
타겟된 TRAC 유전자로 T 세포들의 기능적 분석
TRAC 유전자 불활성화의 목표는 T 림프구들을 T-세포 수용체 자극에 대하여 무반응으로 만드는 것이다. 전 단락에서 기재한 바와 같이, T 림프구들은 TRAC 또는 CD52를 절단하는 TALE-뉴클레아제를 코드하는 mRNA로 형질감염(transfect)되었다. 형질감염(transfection) 16 일 후, 세포들은 T 세포 수용체를 통하여 작용하는 T-세포 미토겐(mitogen) 인, 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin) (PHA, Sigma-Aldrich) 5μg/ml까지로 처리되었다. 기능적 T-세포 수용체를 갖는 세포들은 PHA 처리 후 사이즈가 증가되어야 한다. 배양 삼 일 후, 세포들은 플루오로크롬-콘쥬게이트된 항-CD52 또는 항-TCR 항체로 표지되었고, TCR-양성 및 TCR-음성 세포들 사이의, 또는 CD52-양성 및 CD52-음성 세포들 사이의 세포 사이즈 분포를 비교하기 위하여, 유동세포분석법(flow cytometry)에 의하여 분석되었다. 도 7은 TCR-양성 세포들이 PHA 처리 후 사이즈가 상당히 증가한 반면, TCR-음성 세포들은 처리되지 않은 세포들과 동일한 사이즈를 갖는다는 것을 보여주는데, 이는 TRAC 불활성화가 TCR-신호전달에 무반응성으로 그것들을 만든다는 것을 가리킨다. 대조적으로, CD52-양성 및 CD52-음성은 동일한 정도로 사이즈가 증가한다.
타겟된 CD52 및 TRAC 유전자들로 T 세포들의 기능적 분석
게놈 조작이 키메라 항원 수용체 (CAR)에 제공될 때, 항-종양 활성을 보이는 T 세포들의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하기 위하여, 우리는 항-CD19 CAR를 코드하는 RNA 10μg 으로(서열번호: 73) TRAC-TALE-뉴클레아제 및 CD52-TALE-뉴클레아제로 처리된 T 세포들을 형질감염시켰다. 24 시간 후, T 세포들은 CD19 발현(expressing) Daudi 세포들과 4 시간 동안 배양되었다. T 림프구들에 의한 세포독성(cytotoxic) 과립(granule) 방출(탈과립(degranulation)이라 불림)의 마커(marker), CD107a의 세포 표면 상향조절이 유동세포분석법(flow cytometry) 분석에 의하여 측정되었다(Betts, Brenchley et al. 2003). 결과들은 도 8에 포함되었고, CD52-음성/TCRαβ-음성 세포들 및 CD52-양성/TCRαβ-양성이 CD19+ Daudi 세포들 또는 PMA /이노마이신(ionomycin) (양성 대조군)에 대한 반응에서 탈과립시키는 동일한 능력을 갖는다는 것을 보여준다. CD107 상향조절은 CD19+의 존재에 의존적이다. 이들 데이터들은 게놈 조작이 통제된 항-종양 반응을 시작하는(mount) T 세포들의 능력에 부정적 영향을 갖지 않는다는 것을 제안한다.
일차( primary ) T 림프구들에서 CD52 - TALE -뉴클레아제 및 TRAC - TALE -뉴클레아제의 게놈 안전성
우리의 구조체들이 뉴클레아제 서브유닛들을 포함하므로, 중요한 질문은 복수의 TALE-뉴클레아제 형질감염(transfection)이 반(half)-TALE-뉴클레아제들의 짝짓기오류(mispairing)에 의하여 또는 타겟 서열들의 '근접(close) 매치(match)'에서 오프(off)-타겟 절단(cleavage) 및 유전독성(genotoxicity)을 이끌 수 있는지 g는 것이다. 세포 게놈들의 온전성(integrity)에 대한 TRAC-TALE-뉴클레아제 및 CD52-TALE-뉴클레아제의 영향을 추정하기 위하여, 우리는 오프(off)-위치(site) 절단(cleavage)을 위한 잠재성을 보이는 인간 게놈에서 서열들을 리스트화하였다. 이 리스트를 만들기 위하여, 우리는 원래의 반(half) 타겟들에 비교하여 4 까지의 치환들로 게놈 내 모든 서열들을 확인하였고 그 때 서로로부터 9 내지 30 bp의 스페이서(spacer)로 머리를 맞댄(head to head) 방향(orientation)으로 잠재적인 반(half) 타겟들의 쌍들을 확인하였다. 이 분석은 하나의 TRAC 반(half)-TALE-뉴클레아제 및 하나의 CD52 반(half) TALE-뉴클레아제에 의하여 형성된 헤테로다이머들 또는 하나의 반(half)-TALE-뉴클레아제 분자의 호모다이머들에 의하여 잠재적으로 타겟되는 위치(site)들을 포함한다. 우리는 치환들의 위치(position)(이때, 미스매치들은 반(half) 타겟의 3' 말단에서 염기들에 더 잘 견딘다) 및 각각의 치환들의 값을 고려하여 특이성 데이터레 기초하여 오프(off)-위치(site) 타겟들의 잠재성에 점수를 매겼다. 우리는 절단(cleavage)이 될 것 같은 추정을 반영한 점수로 173 개의 고유(unique) 서열들을 수득하였다. 우리는 15 개의 높은 점수들을 선택하였고, 동시에 CD52 및 TRAC TALE-뉴클레아제로 형질감염되고 CD52-음성, TCRαβ-음성으로 자성(magnetic) 분리에 의하여 정제되는 T 세포들에서 이들의 위치들(loci)에서 발견되는 돌연변이들의 빈도를 딥(deep) 시쿼싱에 의하여 분석하였다. 결과들은 도 9에 있다. 가장 높은 빈도의 삽입/결실은 7x10-4이다. 이들 결과들은 의도된 타겟들보다 적어도 600 배 돌연변이 덜 될 것 같은, 추정되는 오프사이트(offsite) 타겟을 만든다. 그러므로 이 연구에서 사용된 TALE-뉴클레아제 시약들은 극히 특이적인 것으로 보인다.
실시예 3: 인간 PDCD1 유전자 및 인간 CTLA4 유전자를 절단하는 TALE -뉴클레아제들
실시예 1에서 기재한 바와 같이, 각각 PDCD1 및 CTLA4 유전자들을 타겟팅하는 헤테로다이머인(heterodimeric) TALE-뉴클레아제들이 디자인되고 생산되었다. 타겟된 게놈 서열들은 11 또는 15-bp 스페이서(spacer)에 의하여 분리된 두 개의 17-bp 길이 서열들 (반(half) 타겟들로 불림)으로 구성된다. 각각의 반(half)-타겟은 표 11에 리스트된 반(half) TALE-뉴클레아제들의 반복들에 의하여 인식된다.
Figure 112015122363153-pct00013
표 11: 인간 대응하는 유전자들에서 TALE-뉴클레아제들 타겟 위치(sites)들의 서열들 및 CTLA4 및 PDCD1 TALE-뉴클레아제들의 기재.
HEK293 세포들에서 CTLA4 - TALE -뉴클레아제 및 PDCD1 - TALE -뉴클레아제의 활성
각각의 TALE-뉴클레아제 구조체(construct)가 pEF1알파(alpha) 길이(long) 프로모터의 통제 하 포유류 발현 벡터에서 제한 효소 소화를 이용하여 서브클로닝되었다. 백만 HEK293 세포들이 형질감염(transfection) 하루 전 시딩(seed)되었다. 세포들은 제조업자의 지시에 따라 25 μl 의 리포펙타민(lipofectamine) (Invitrogen)을 이용하여 5 μg 의 콘트롤(control) pUC 벡터 (pCLS0003) 또는 EF1-알파 프로모터의 통제 하 PDCD1 및 CTLA-4 유전자에서 관심있는 게놈 서열 내 두 개의 반(half) 타겟들을 인식하는 TALE-뉴클레아제들를 코드하는 두 개의 플라스미드들 각각의 2.5 μg으로 공-형질감염(co-transfect)되었다.
PDCD1 또는 CTLA-4 코딩 서열들 내 TALE-뉴클레아제들에 의하여 이루어지는 이중 가닥의 절단(cleavage)은 비상동(non homologous) 말단(end) 연결(joining) (NHEJ)에 의하여 살아있는 세포들에서 수선되는데, 이는 에러(error)-프론(prone) 메커니즘이다. 살아있는 세포들 내 TALE-뉴클레아제들의 활성은 타겟된 게놈 위치(locus)에서 삽입들 또는 결실들의 빈도에 의하여 측정된다. 형질감염(transfection) 48 시간 후, 게놈 DNA 가 형질감염된 세포들로부터 분리되었고, 하기 프라이머들을 이용하여 위치(locus) 특이적 PCR들이 수행되었다: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG (포워드(forward) 어댑터(adaptor) 서열)- 10N (TAG)- 위치(locus) 특이적 포워드(forward) 서열로, CTLA4_T01을 위하여: 5'-CTCTACTTCCTGAAGACCTG-3' (서열번호: 99) , CTLA4_T03/T04를 위하여: 5'-ACAGTTGAGAGATGGAGGGG-3' (서열번호: 100), PDCD1_T01를 위하여: 5'-CCACAGAGGTAGGTGCCGC-3' (서열번호: 101) 또는 PDCD1_T03를 위하여: 5'-GACAGAGATGCCGGTCACCA-3' (서열번호: 102) 및 역(reverse) 프라이머 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG (역(reverse) 어댑터(adaptor) 서열)- 내생(endogenous) 위치(locus) 특이적 리버스(reverse) 서열로, CTLA4_T01을 위하여: 5'-TGGAATACAGAGCCAGCCAA-3' (서열번호: 103), CTLA4_T03/T04를 위하여: 5'-GGTGCCCGTGCAGATGGAAT-3' (서열번호: 104), PDCD1_T01를 위하여: 5'-GGCTCTGCAGTGGAGGCCAG-3' (서열번호: 105) 또는 PDCD1_T03를 위하여: 5'-GGACAACGCCACCTTCACCT-3' (서열번호: 106).
PCR 산물들은 T7-엔도뉴클레아제 분석에 의하여 분석되었다: 간단히, PCR 산물의 변성(denaturation) 및 재어닐링(reannealing) 후, T7 엔도뉴클레아제는 야생형 및 돌연변이된 가닥들을 포함하는 미스매치된 DNA를 특이적으로 소화시킬 것이다. 그 소화 산물은 그 때, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의하여 리졸브(resolve)된다. 소화된 산물의 존재는 TALE-뉴클레아제 활성에 의하여 유도되는 돌연변이된 서열들을 나타낸다. 결과들은 도 10에 나타나 있으며, 이때 화살표는 소화된 PCR 산물들을 가리킨다. 그것들은 PDCD1_T1, PDCD1_T3, CTLA4_T1, CTLA4_T3 및 CTLA4_T4 TALE-뉴클레아제들 모두가 그것들의 타겟 위치들에서 돌연변이를 일으키는(mutagenic) 뉴클레아제 활성을 보인다는 것을 입증한다.
일차( primary ) T 세포들 내 CTLA4 불활성화:
인간 일차(primary) T 세포들이 CD3/28 비드들로 활성화되었다. 5 일 후, 5x106 세포들이 대조군으로서 RNA 없이 또는 CTLA4 유전자에 대하여 디자인된 세 TALENTM (T1, T2 및 T3) 중 하나를 코드하는 RNA 20 μg 으로 전기천공되었다. 전기천공법(electroporation) 삼 일 후, CTLA4 발현이 형광성 항체 및 유동세포분석법(flow cytometry) 분석을 이용하여 세포내 염색에 의하여 측정되었다(도 27 및 28).
세 개의 TALENTM 모두 HEK293 세포주들에서 그것들의 효율과 관련된 방식으로 CTLA4 발현의 하향조절을 유도하였다(T1 이 T3 및 T4 보다 더 효과적이었다).
454 technology (Roche)를 이용하여 형질감염된 세포들로부터 분리된 게놈 DNA의 딥(deep) 시퀀싱 분석은 TALEN이 없는 대조군 샘플에서 0.1% 에 비교할 때, 96 %의 CTLA4 대립형질들(alleles)이 TALEN T1-처리된 세포들에서 돌연변이되었다는 것을 드러냈다.
일차( primary ) T 세포들에서 PD1 불활성화:
인간 일차(primary) T 세포들이 CD3/28 비드들로 활성화되었다. 오일 후 5x106 세포들이 대조군으로서 RNA 없이, 또는 인간 PD1 유전자에 특이적인 두 개의 TALEN들 중 하나를 코드하는 RNA 20 μg으로 전기천공되었다. 십일 후, 세포들은 재활성화되었고, 재활성화 후 3 일 후, PD1 발현이 형광성 항체 및 유동세포분석법(flow cytometry) 분석에 의하여 표면 염색에 의하여 측정되었다(도 29).
TALEN들은 둘 다 PD1 발현의 중대한 하향조절을 유도하였다. 454 기술 (Roche) 를 이용하여 각각 TALEN T1 및 TALEN T03 으로 형질감염된(transfect) 세포들로부터 분리된 게놈 DNA의 딥 시퀀싱 분석은 34 % 및 39%의 PD1 대립형질들(alleles)이 각각 돌연변이되었다는 것을 드러냈다(도 30에 결과가 보여짐).
증강된 항-종양 활성 PD1 - TALEN 처리된 세포들:
인간 일차(primary) T 세포들이 CD3/28 비드들로 활성화되었다. 오일 후 5x106 세포들이 대조군인 RNA 없이 또는 인간 PD1 유전자에 특이적인 TALEN를 코드하는 RNA 20 μg 으로 전기천공되었다. 일주일 후, 세포들은 음성 대조군으로서 RNA 없는, 또는 인간 CD19에 특이적인 키메라 항원 수용체를 코드하는 mRNA로 전기천공되었다. 다음 날, 그것들의 항종양 활성이 CD19 발현 벡터로 형질도입된(transduced) PD1리간드(ligand) 1 (PDL1)을 발현시키는 HCT116 세포들 (vs. 대조군으로서 부모(parental) HCT116 세포들) 또는 CD19+ Daudi 세포들 (vs. 대조군으로서 K562)을 이용하여 세포의(cellular) 세포독성 분석에서 측정되었다. 세포독성 활성은 대조군 세포들 및 타겟 세포들의 생존능력을 비교함으로써 결정되었다. 결과들은 도 31의 다이아그램들에 나타나 있다. PD1 TALEN 형질감염(transfection)은 PDL1-발현 HCT116 세포들에 대한 세포독성(cytotoxic) 활성을 회복시켰고 Daudi 세포들에 대한 세포독성(cytotoxic) 활성을 개선하였다.
실시예 4: pT 알파( pTalpha )는 불활성화된 TCR 알파 T 림프구들에서 CD3 표면 발현를 가능하게 한다:
다른 프리 T알파( preTalpha ) 버젼들에서의 기재:
인간 pT알파(pTalpha) 유전자는 세포외 Ig-유사(like) 도메인, 소수성(hydrophobic) 막관통 도메인 및 큰 C-말단 세포질내 꼬리를 포함하는 막관통 당단백질을 코드한다. 인간 pT알파(pTalpha) 당단백질로부터 유래된 다른 버젼들이 디자인되었으며, 표 12에 기재되었고, 도 11에 나타나 있다.
Figure 112015122363153-pct00014
Figure 112015122363153-pct00015

표 12: pT알파(pTalpha) 구조체들의 서브셋(subset)의 기재
테스트된 다른 프리T알파(preTalpha) 구조체들은 하기를 포함한다:
1) pT알파(pTalpha) 결실 돌연변이체들(mutants): 다른 결실들이 (114 아미노산들을 포함하는) 인간 pT알파(pTalpha) 단백질(서열번호: 107)의 세포내 세포질 꼬리에서 만들어진다. 테스트된 구조체들은 18, 48, 62, 78, 92, 110 및 114 아미노산들이 단백질의 C-말단으로부터 결실된, 돌연변이체들(mutants) 및 단백질 (FL)의 전장 버젼을 포함한다(서열번호: 108 내지 서열번호: 114).
2) 세포내 활성화(activation) 도메인들을 포함하는 pT알파(pTalpha) 돌연변이체들(mutants): 그것들의 C-말단에서 CD8, CD28 또는 41BB 세포내 활성화(activation) 도메인들에 융합되는 FL 및 △48 변이체들(variants) (서열번호: 115 내지 서열번호: 120).
3) pTalpha/TCRα 키메라 돌연변이체들(mutants): 구조체들 중 하나에서, TCRα 세포내 도메인 (IC)은 pT알파(pTalpha)의 꼬리 없는 버젼(△114)에 융합된다(서열번호: 121). 두 번째 구조체(construct) 또한 TCRα로부터의 IC 도메인들 및 막관통 (TM)에 pT알파(pTalpha) 세포외 도메인이 융합되는 데서 만들어졌다(서열번호: 122).
4) pT알파(pTalpha) 이합체화 돌연변이체들(mutants): 몇몇 돌연변이들이 preTCR 복합체(complex)의 올리고머화/이합체화 능력을 바꿀 수 있는 것으로 문헌에서 기재되어 왔다. 이들 돌연변이체들(mutants)은 (preTCR 올리고머화에 유도될 것으로 추정되는) 구성요소(constitutive)인 신호전달을 유도하지 않고, 세포 표면에서 preTCR 발현을 가능하게 하도록 제안된다. 돌연변이들은 pTalpha△48 변이체에 도입되어 왔고, 하기이다:
1xMUT: W46R (서열번호: 123)
- 4x MUT: D22A, K24A, R102A, R117A (서열번호: 124)
TRAC 불활성화된 주르카트 ( Jurkat ) 세포들 내 다른 프리 T알파( preTalpha ) 구조체들의 활성:
TCR알파 불활성화된 세포들에서 CD3 표면 발현을 회복시키는 그것들의 능력을 위하여 다른 pT알파(pTalpha) 변이체들(variants)을 스크리닝하기 위하여, TRAC를 타겟팅하는 TALEN을 이용하여 TCR알파 유전자가 붕괴된 세포주가 만들어졌다. 주르카트(Jurkat) 세포들 (T-세포 백혈병 세포주)은 KO 세포들 (TCRα/β NEG; CD3NEG) 및 CytoPulse 전기천공법(electroporation)을 이용하여 TRAC를 절단하는 TALEN를 코드하는 플라스미드들로 형질감염(transfect)되었고, 그때 CD3 자성(magnetic) 비드들을 이용한 음성(negative) 선택에 의하여 정제되었다. KO 개체군(population) (JKT_KOx3 세포들)은 증폭되었고 다른 pT알파(pTalpha) 변이체들의 스크리닝에 사용되었다. 스크리닝은 EF1α 프로모터,의 통제 하 다른 pT알파(pTalpha) 변이체들(variants)를 코드하는 플라스미드 15 μg으로 백만의 JKT_KOx3 세포들의 형질감염(transfection)에 의하여 수행되었으며, 뒤를 이어 형질감염(transfection) 48 시간(h) 후 CD3 세포 표면 발현의 유동세포분석법(flow cytometry)에 의하여 분석이 이루어졌다. 도 12는 유동세포분석법에 의하여 결정되는, CD3+ 세포들의 %에 기초한, JKT_KOx3 세포들의 FL, △18 및 △48 pT알파(pTalpha) 구조체들의 활성 및 형질감염(transfection) 효율들(BFP+ 세포들의 %)의 대표적 예이다. 다른 구조체들로부터의 결과들은 표 13에 그룹으로 되어 있다.
Figure 112015122363153-pct00016
표 13: Jurkat TCR 알파 불활성화된 세포들에서 다른 pT알파(pTalpha) 구조체들의 활성.
다른 프리T알파(preTalpha) 구조체들로 형질감염된 주르카트(jurkat) TCR 알파 불활성화된 세포들에서의 CD3 발현의 유동세포분석법(flow cytometry) 분석에 의하여 활성이 측정되었다.
TCR 알파 불활성화된 일차( primary ) T 림프구들에서 pTalpha - FL 및 pTalpha -△48의 활성:
TCR 알파 불활성화된 T 림프구에서 CD3 표면 발현를 유도하는 pTalpha-FL 및 pTalpha-△48 버젼들의 활성을 테스트하기 위하여, pTalpha-FL 및 pTalpha-△48 코딩 서열들이, SFFV 프로모터 뒤이어 자가 절단 T2A 펩타이드 하 푸른(Blue) 형광(Fluorescent) 단백질 (BFP)를 코드하는, 자가(self)-불활성화(inactivating)인 pLV-SFFV-BFP-2A-PCTRA 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 내로 클로닝되었다(도 13).
말초 혈액으로부터 분리된 T 림프구들이 항-CD3/CD28 액티베이터(activator) 비드들 (Life technologies)을 이용하여 72 시간 동안 활성화되었고, 4.5 백만 세포들이 CytoLVT-S 기구(instrument) (BTX-Harvard Harbour)를 이용하여 TCR 알파 불변(constant) 사슬 영역 (TRAC) 을 타겟팅하는 TALE-뉴클레아제를 코드하는 mRNA 10 μg으로 전기천공법(electroporation)에 의하여 형질감염(transfect)되었다. 전기천공법(electroporation) 2 일 후, T 세포들이 LV-SFFV-BFP-2A- pTalpha-△48 또는 LV-SFFV-BFP-2A-대조군(control) 렌티바이러스(lentiviral) 벡터들로 형질도입(transduce)되었다. CD3 음성 및 CD3low T 세포들은 그 때 항-CD3 자성(magnetic) 비드들 (Miltenyi Biotech)를 이용하여 정제되었다. 이 실험 프로토콜은 도 14A에 나와 있다.
도 14B는 CD3 비드들로 정제 전 및 후에 대조군 BFP 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 (KO/BFP) 또는 BFP-2A-pTalpha△48 (KO/△48)으로 형질도입(transduce)된 TCR알파 inactivated T 세포들 (KO) 상 BFP 발현, CD3 세포 표면 발현, 및 TCR알파/베타의 유동세포분석법(flow cytometry) 분석을 나타낸다. BFP-T2A-pTalpha-△48 벡터 (BFP+ 세포들)로 형질도입된 TCR알파 불활성화된 세포들은 형질도입되지 않은 세포들 (BFP- 세포들)에 비교하여 더 높은 레벨들의 CD3를 보인다. 대조군 BFP 벡터로 형질도입된 세포들 간에는 차이가 관찰되지 않는다. 이들 결과들은 pT알파(pTalpha)가 TCR알파 불활성화된 세포들의 세포 표면에서 CD3 발현의 회복을 매개한다는 것을 가리킨다. 대조적으로, TCR알파/베타 염색은, 예상대로, pTalpha-△48 발현 벡터 없이, 또는 형질도입(transducd) 세포들에서 변하지 않은 상태로 남아 있었다.
pTalpha - 매개된 CD3 발현은 TCR -결핍( deficient ) T-세포들에서 활성화를 지지한다:
세포 활성화(activation) 신호들을 형질도입하는(transduce) pT알파(pTalpha)의 능력을 결정하기 위하여, 초기(early) 및 늦은(later) 활성화(activation) 마커들의 발현이 pTalpha-△48 및 pTalpha-△48.41BB로 형질도입된 TCR 알파 불활성화된 T 세포들에서 분석되었다. pTalpha-△48.41BB 및 pTalpha-△48 으로 형질도입된 TCR 알파 불활성화된 T 세포들은 도 14A 및 앞 부분에서 기재한 바와 같이 일차(primary) 인간 T-세포들로부터 만들어졌다.
CD3를 통한(via) 신호전달을 검출하기 위하여, 세포들은, CD3 비드들로 TCR 알파 불활성화된 T 세포들의 정제 3일 후 항-CD3/CD28-코팅된 비드들을 이용하여 재활성화되었다(도 14A). 세포들은 플루오로크롬-콘쥬게이트된 항-CD69 (초기 활성화(activation) 마커) 및 항-CD25 (늦은(late) 활성화(activation) 마커)로 염색되었고, 각각 재활성화 24 및 48 시간 후, 유동세포분석법(flow cytometry)에 의하여 분석되었다(도 15A-B). 도 15A-B에 나타낸 바와 같이, pTalpha-△48 (KO/pTα-△48) 또는 pTalpha-△48.41BB (KO/pTα-△48.BB) 를 발현하는 TCR 알파 불활성화된 세포들은 TCR알파/베타 expressing 세포들에서 관찰된 그것과 유사한 레벨들로, 활성화 마커들의 상향조절을 보였다(NEP: 비(non) 전공천공된(electroporated) 세포들).
T 세포 활성화(activation)의 또다른 지표는 가끔 "블래스팅(blasting)"이라 가리켜지는 세포 크기의 증가이다. "블래스팅"을 유도하는 preTCR 복합체들의 능력은 항-CD3/CD28- 비드들을 이용한 재활성화 72 시간 후 세포 크기의 유동세포분석법(flow cytometry) 분석에 의하여 측정되었다(도 15C). 항-CD3/CD28 비드들로의 자극은 pTalpha-△48 또는 pTalpha-△48.41BB을 발현시키는 세포들 vs. TCR알파/베타 복합체들을 발현시키는 세포들에서의 세포 크기의 비교할만한(comparable) 증가를 유도하였다. 둘다 종합하면, 이들 결과들은, preTCR 복합체들이 활성화(activation) 마커(marker) 상향조절을 매개하는 메커니즘들에 효과적으로 커플링하는 신호들을 전달할(transduce) 능력이 있다는 것을 제안한다.
pTalpha 매개된 CD3 발현은 자극성 항- CD3 / CD28 항체들을 이용하여 TCR -결핍( deficient ) 일차( primary ) T-세포들의 확장을 지지한다.
장기간 세포 증식을 지지하는 preTCR 복합체들의 능력을 평가하기 위하여, 전술한 대로 만들어지는 세포들의 증식이 측정되었다. 초기 활성화의 10일 후, 세포들은 IL2 (재작용 없음(non-Re-act))에서 또는 항-CD3/CD28 비드들을 갖는 IL2에서 (재작용(Re-act)), 유지되었다. 각 조건을 위하여, 세포들은 카운팅(count)되었고, BFP+ 세포들의 수를 추정하기 위하여 다른 시간점들에서 유동세포분석법(flow cytometry)에 의하여 분석되었다. BFP-T2A-preTCRα-△48 벡터들 또는 BFP로 형질도입된(transduce) TCR알파 불활성화된 세포들 (KO)의 성장이 비교되었고, 이들 세포들의 배수(fold) 유도(induction)가 재활성화 2일 후 수득된 값에 대하여 추정되었다. 도 16은 두 개의 독립적인 도너들로부터 수득된 결과들을 보여준다. 두 케이스들 모두에서, pTalpha-△48을 발현시키는 TCR알파 불활성화된 세포들은 BFP 대조군 벡터만을 발현시키는 TCR 알파 불활성화된 세포들보다 더 큰 확장을 보였다. 두 번째 도너를 위하여, 전장 pT알파(pTalpha) 또는 pTalpha-△48.41BB를 발현시키는 TCR알파 불활성화된 세포들 또한 포함되었고, BFP 대조군 벡터만을 발현시키는 TCR알파 불활성화된 세포들보다 더 큰 확장을 보였다.
실시예 5: 사이토펄스 ( Cytopulse ) 기술을 이용한 T 세포들에서의 mRNA 형질감염( transfection )의 최적화.
최적화된 사이토펄스 ( cytopulse ) 프로그램의 결정
실험들의 첫 번째 세트는 세포들이 형질감염될 수 있는 전압 범위를 결정하기 위하여 불활성화된 PBMC들 상에서 수행되었다. 다섯 개의 다른 프로그램들이 표 14에 기재된 대로 테스트되었다.
Figure 112015122363153-pct00017
표 13: 다른 사이토펄스 프로그램들이 PBMC 유래된 T-세포들에서 전기천공법(electroporation)에 요구되는 최소 전압을 결정하는데 사용되었다.
3 또는 6 백만개의 세포들이 다른 사이토펄스(Cytopulse) 프로그램들을 이용하여 대조군 플라스미드들 pUC 및 GFP를 코드하는 플라스미드들 20 μg으로 0.4 cm 갭(gap) 큐벳(cuvette) (30 또는 15x106 세포들/ml) 에서 전기천공되었다. 전기천공법(electroporation) 24 시간 후, GFP 발현이 형질감염(transfection)의 효율을 결정하기 위하여 유동세포분석법(flow cytometry)에 의하여 전기천공된 세포들에서 분석되었다. 도 17에 보여지는 데이터들은 PBMC 유래된 T 세포들에서 플라스미드 전기천공법(electroporation)에 요구되는 최소 전압을 가리킨다. 이들 결과들은 사이토펄스(cytopulse) 프로그램 3 및 4 가 T 세포들의 효율적인 형질전환(transformation)을 가능하게 한다는 것을 입증한다(EP#3 및 #4).
활성화된 정제된 T세포들의 mRAN 전기천공
T 세포들의 효율적인 DNA 전기천공법(electroporation)을 가능하게 하는 최고의 사이토펄스(cytopulse) 프로그램을 결정한 후, 우리는 이 방법이 mRNA 전기천공법에도 적용가능한지 여부를 테스트하였다.
PHA/IL2로 6 일 미리활성화된(preactivated) 5x106 정제된 T 세포들이 사이토포레이션(cytoporation) 버퍼 T (BTX-Harvard apparatus)에서 재현탁(resupend)되었고, 이전 부분에서 결정된 대로 선호되는 사이토펄스(cytopulse) 프로그램을 이용하여 pUC 또는 GFP를 코드하는 플라스미드들 20μg 또는 GFP를 코드하는 mRNA 10μg으로 0.4 cm 큐벳(cuvettes)에서 전기천공되었다(표 14).
Figure 112015122363153-pct00018
표 15: 정제된 T-세포들을 전기천공하는데 사용되는 사이토펄스(Cytopulse) 프로그램.
형질감염(transfection) 48 시간(h) 후, 세포들이 생존능력(viability) 염료(eFluor-450)로 염색되었고, 세포 생존능력(viability) 및 살아있는(viable) GFP+ 세포들의 %가 유동세포분석법(flow cytometry) 분석에 의하여 결정되었다(도 18).
도 18에 보여지는 데이터들은 여기에서 결정된 최적 조건으로 RNA의 전기천공이 독성이 없으며, 살아있는(viable) 세포들의 95%보다 많은 형질감염(transfection)을 가능하게 한다는 것을 가리킨다.
합성에서, 전체 데이터세트(dataset)는 T-세포들이 DNA 또는 RNA로 효율적으로 형질감염될 수 있다는 것을 보여준다. 특히, RNA 형질감염(transfection)는 세포 생존능력(viability)에 아무 영향이 없으며, 세포 개체군(population)에서 관심있는 형질감염된 유전자의 균일한(uniform) 발현 레벨들을 가능하게 한다.
효율적인 형질감염(transfection)은 사용된 활성화 방법(PHA/IL-2 또는 CD3/CD28-코팅된-비드들)의 독립적으로, 세포 활성화 후 일찍 달성될 수 있다. 본 발명자들은 >95%의 효율들로 활성화(activation) 72 시간(h) 후로부터 세포들을 형질감염시키는데 성공하였다. 게다가 해동(thawing) 및 활성화(activation) 후 T 세포들의 효율적인 형질감염(transfection)은 또한 동일한 전기천공법(electroporation) 프로토콜을 이용하여 수득될 수 있다.
TALE -뉴클레아제 기능적 발현을 위한 일차( primary ) 인간 T 세포들에서의 mRNA 전기천공법( electroporation )
mRNA 전기천공법(electroporation)이 일차(primary) 인간 T 세포들에서 GFP의 효율적인 발현을 가능하게 한다는 것을 입증한 후, 우리는 이 방법이 관심있는 다른 단백질들의 발현에 적용될 수 있는지 여부를 테스트하였다. 전사(Transcription) 액티베이터(activator)-유사(like) 이펙터(effector) 뉴클레아제들 (TALE-nuclease)는 DNA 절단(cleavage) 도메인에 대한 TAL DNA 결합 도메인의 융합에 의하여 만들어지는 위치(site)-특이적 뉴클레아제들이다. 그것들은 강력한 게놈 편집 도구들인데, 이는 그것들이 사실상 임의의 원하는 DNA 서열에서 이중-가닥 손상들(breaks)을 유도하기 때문이다. 이들 이중-가닥 손상들(breaks)은 비상동(Non-homologous) 말단 연결(end-joining) (NHEJ), 에러-프론 DNA 수선 메커니즘을 활성화시키며, 관심있는 임의의 원하는 유전자의 불활성화를 잠재적으로 이끈다. 대체하여, 만약 적절한 수선 주형이 동시에 세포들 내로 도입되면, TALE-뉴클레아제-induced DNA 손상들은 상동 재조합에 의하여 수선될 수 있고, 그러므로 유전자 서열을 마음대?? 변형하는 가능성을 제공한다.
우리는 T 세포 항원 수용체 (TRAC)의 알파 사슬를 코드하는 인간 유전자 내 서열을 특이적으로 절단하기 위하여 디자인된 TALE-뉴클레아제를 발현시키기 위하여 mRNA 전기천공법(electroporation)을 사용하였다. 이 서열에 유도된 돌연변이들은 세포 표면으로부터 TCRαβ 복합체(complex)의 상실 및 유전자 불활성화를 야기할 것으로 기대된다. 대조군으로서 코드하지 않는(non coding) RNA 또는 TRAC TALE-뉴클레아제 RNA가 사이토펄스(Cytopulse) 기술을 이용하여 활성화된 일차(primary) 인간 T 림프구들 내로 형질감염된다(transfect). 전기천공법(electroporation) 서열은 1200 V의 2 펄스들로 구성되었고, 뒤이어 표 15에서 기재된 대로 130 V의 네 개의 펄스들이 이어졌다.
전기천공 7 일 후 TCR 표면 발현의 유동세포분석법(flow cytometry) 분석에 의하여(도 19, 위쪽 패널), 우리는 44% 의 T 세포들이 TCRαβ의 발현을 상실한 것을 관찰하였다. 우리는 TRAC 위치(locus)의 PCR 증폭에 의하여 형질감염된 세포들의 게놈 DNA를 분석하였고, 뒤이어 454 고처리량(high throughput) 시퀀싱이 이어졌다. 시퀀싱된 대립형질들(alleles) 중 33%(2153 중 727)이 TALE-뉴클레아제 절단(cleavage)의 자리(site)에 삽입 또는 결실을 포함하였다. 도 19 (아래 패널)은 돌연변이된 대립형질들의 예들을 보여준다.
이들 데이터들은 사이토펄스(cytopulse) 기술을 이용한 mRNA의 전기천공이 TRAC TALE-뉴클레아제의 기능적 발현을 야기한다는 것을 가리킨다.
항- CD19 단일 사슬 키메라 항원 수용체 ( CAR )를 코드하는 모노시스트론( monocistronic ) mRNA 으로 T 세포들의 전기천공:
IL2 및 항-CD3/CD28 코팅된 비드들로 며칠(3-5) 미리활성화된(preactivated) 5X106 T 세포들이 사이토포레이션(cytoporation) 버퍼 T에서 재현탁되었고(resuspended), 표 15에서 기재한 프로그램을 이용하여 단일 사슬 CAR (서열번호: 73)를 코드하는 mRNA 10μg 또는 mRNA 없이 0.4cm 큐벳(cuvettes)에서 전기천공되었다.
전기천공법(electroporation) 24 시간 후, 세포들은 살아있는(live) 세포들 상 CAR의 세포 표면 발현을 평가하는데 특이적인 PE-콘쥬게이트(conjugated)된 염소 항 마우스 IgG F(ab')2 단편 및 고정가능한 생존능력(viability) 염료 eFluor-780로 염색되었다. 데이터들은 도 20에 보여진다. A 는 전에 기재된 모노시스트론(monocitronic) mRNA로 전기천공된 살아있는 T 세포들의 압도적인 다수가 그것들의 표면에서 CAR를 발현한다는 것을 가리킨다. 전기천공 24 시간 후, T 세포들은 Daudi (CD19+) 세포들과 6 시간 동안 공배양(coculture)되었고 그것들의 표면에서 탈과립화 마커 CD107a의 발현을 검출하기 위하여 유동세포분석법(flow cytometry)에 의하여 분석되었다(Betts, Brenchley et al. 2003).
도 20에 보여지는 데이터는 전에 기재되었던 모노시스트론(monocistronic) mRNA로 전기천공된 세포들의 다수가 CD19를 발현시키는 타겟 세포들의 존재 하 탈과립된다(degranulate)는 것을 가리킨다. 이들 결과들은 전기천공된 T 세포들의 표면에서 발현되는 CAR가 활성(active)이라는 것을 명확히 입증한다.
항- CD19 멀티서브유닛( multisubunit ) 키메라 항원 수용체 ( CAR )를 코드하는 폴리시스트론( polycistronic ) mRNA 로 T 세포들의 전기천공:
IL2 및 항 CD3/CD28 코팅된 비드들로 며칠 (3-5) 미리활성화된(preactivated) 5X106 T 세포들이 사이토포레이션(cytoporation) 버퍼 T에서 전기천공되었고, 표 15에 기재된 대로 프로그램을 이용하여 (서열번호: 125, 서열번호: 126에 의하여 코드됨, 도 21A 및 도 4B (csm4)), 다사슬(multi-chain) CAR를 코드하는 mRNA 45μg 또는 mRNA 없이 0.4cm 큐벳(cuvettes)에서 전기천공되었다.
전기천공 24 시간 후, 세포들은 살아있는(live) 세포들 상 CAR 의 세포 표면 발현을 평가하는데 특이적인, PE-콘쥬게이트된(conjugated) 염소 항 마우스 IgG F(ab')2 단편 및 고정가능한 생존능력(viability) dye eFluor-780으로 염색되었다. 도 21에 보여지는 데이터들은 전에 기재한 폴리시스트론(polycistronic) mRNA로 전기천공된 살아있는 T 세포들의 압도적인 다수가 그것들의 표면에서 CAR를 발현시킨다는 것을 가리킨다.
전기천공 24 시간 후, T 세포들은 6 시간 동안 Daudi (CD19+)와 공배양되었고, 그것들의 표면에서 탈과립화(degranulation) 마커(marker) CD107a의 발현을 검출하기 위하여 유동세포분석법(flow cytometry)에 의하여 분석되었다. 도 21에 보여지는 데이터들은 전에 기재되었던 폴리시스트론(polycistronic) mRNA로 전기천공된 세포들의 다수가 CD19를 발현하는 타겟 세포들의 존재 하 탈과립된다(degranulate)는 것을 가리킨다. 이들 결과들은 전기천공된 T 세포들의 표면에서 발현되는 CAR가 활성(active)이라는 것을 명백히 입증한다.
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TM. IC <400> 122 Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro 20 25 30 Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu 35 40 45 Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser 50 55 60 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 65 70 75 80 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly 100 105 110 Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu 115 120 125 Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro 130 135 140 Gly Gly Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala 145 150 155 160 Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 165 170 <210> 123 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pTalpha.EC-Delta48-1xMUT <400> 123 Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro 20 25 30 Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu 35 40 45 Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Arg Phe Ser 50 55 60 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 65 70 75 80 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly 100 105 110 Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu 115 120 125 Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro 130 135 140 Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu 145 150 155 160 Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala 165 170 175 Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly 180 185 190 Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr 195 200 205 Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro 210 215 220 Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val 225 230 <210> 124 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pTalpha.EC-Delta48-4xMUT <400> 124 Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro 20 25 30 Ile Met Leu Leu Val Ala Gly Ala Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu 35 40 45 Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser 50 55 60 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 65 70 75 80 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly 100 105 110 Ala Glu Gly His Ser Ala Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu 115 120 125 Ala Ser Thr Ala Ala Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro 130 135 140 Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu 145 150 155 160 Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala 165 170 175 Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly 180 185 190 Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr 195 200 205 Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro 210 215 220 Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val 225 230 <210> 125 <211> 848 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Multi-chain CAR <400> 125 Met Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu 1 5 10 15 Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser 20 25 30 Gly Pro Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys 35 40 45 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn 65 70 75 80 Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 85 90 95 Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr 100 105 110 Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Gly Ser Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 130 135 140 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro 165 170 175 Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn 180 185 190 Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln 195 200 205 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 210 215 220 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg 225 230 235 240 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln 245 250 255 His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 260 265 270 Lys Arg Ala Asp Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 275 280 285 Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg 290 295 300 Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys 305 310 315 320 Asp Phe Phe Ile Pro Leu Leu Val Val Ile Leu Phe Ala Val Asp Thr 325 330 335 Gly Leu Phe Ile Ser Thr Gln Gln Gln Val Thr Phe Leu Leu Lys Ile 340 345 350 Lys Arg Thr Arg Lys Gly Phe Arg Leu Leu Asn Pro His Pro Lys Pro 355 360 365 Asn Pro Lys Asn Asn Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys 370 375 380 Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Asp Thr Glu Ser Asn Arg 385 390 395 400 Arg Ala Asn Leu Ala Leu Pro Gln Glu Pro Ser Ser Val Pro Ala Phe 405 410 415 Glu Val Leu Glu Ile Ser Pro Gln Glu Val Ser Ser Gly Arg Leu Leu 420 425 430 Lys Ser Ala Ser Ser Pro Pro Leu His Thr Trp Leu Thr Val Leu Lys 435 440 445 Lys Glu Gln Glu Phe Leu Gly Val Thr Gln Ile Leu Thr Ala Met Ile 450 455 460 Cys Leu Cys Phe Gly Thr Val Val Cys Ser Val Leu Asp Ile Ser His 465 470 475 480 Ile Glu Gly Asp Ile Phe Ser Ser Phe Lys Ala Gly Tyr Pro Phe Trp 485 490 495 Gly Ala Ile Phe Phe Ser Ile Ser Gly Met Leu Ser Ile Ile Ser Glu 500 505 510 Arg Arg Asn Ala Thr Tyr Leu Val Arg Gly Ser Leu Gly Ala Asn Thr 515 520 525 Ala Ser Ser Ile Ala Gly Gly Thr Gly Ile Thr Ile Leu Ile Ile Asn 530 535 540 Leu Lys Lys Ser Leu Ala Tyr Ile His Ile His Ser Cys Gln Lys Phe 545 550 555 560 Phe Glu Thr Lys Cys Phe Met Ala Ser Phe Ser Thr Glu Ile Val Val 565 570 575 Met Met Leu Phe Leu Thr Ile Leu Gly Leu Gly Ser Ala Val Ser Leu 580 585 590 Thr Ile Cys Gly Ala Gly Glu Glu Leu Lys Gly Asn Lys Val Pro Glu 595 600 605 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 610 615 620 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 625 630 635 640 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Ser Gly Val Lys Gln 645 650 655 Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 660 665 670 Pro Gly Pro Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val 675 680 685 Glu Gln Ala Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp 690 695 700 Ala Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg 705 710 715 720 Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser 725 730 735 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 740 745 750 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 755 760 765 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 770 775 780 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 785 790 795 800 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 805 810 815 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 820 825 830 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 835 840 845 <210> 126 <211> 2547 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Multi-chain CAR <400> 126 atggctcctg ccatggaatc ccctactcta ctgtgtgtag ccttactgtt cttcgctcca 60 gatggcgtgt tagcagaggt gcagttgcag cagtcagggc cagagttgat taagcccgga 120 gcctccgtca agatgtcctg caaggccagc gggtacactt tcaccagcta cgtcatgcat 180 tgggtgaagc agaagccagg ccaggggctt gagtggattg ggtacatcaa cccctacaac 240 gacgggacca aatacaacga gaaattcaag ggcaaagcca cactcacctc cgataagtcc 300 tcctctaccg cctacatgga gctcagctcc ctgacctccg aggatagcgc tgtgtattac 360 tgcgcaaggg gcacatacta ctatggctct agggtgttcg actactgggg gcagggcact 420 actctcacag tgagctcagg cggaggaggc agtggcggag ggggaagtgg gggcggcggc 480 agcgatattg tcatgaccca ggcagcccct agtatccctg tgactccagg cgagagcgtg 540 agcatcagct gccggtccag caagagcctg ctgaacagta acggaaacac atacctctac 600 tggtttctgc agaggcccgg ccagagccct cagctgctga tttaccgcat gtcaaatctt 660 gcctctgggg tgcccgatag atttagtggg agcggatccg gcacagcttt tacattgcgg 720 atctccagag tcgaggccga agacgtgggg gtctattact gtatgcaaca cctggaatac 780 ccctttacct tcggagccgg cacaaagctg gagctgaagc gggctgacac cacaaccccc 840 gctccaaggc cccctacccc cgcaccaact attgcctccc agccactctc actgcggcct 900 gaggcctgtc ggcccgctgc tggaggcgca gtgcatacaa ggggcctcga tttcgcctgc 960 gattttttta tcccattgtt ggtggtgatt ctgtttgctg tggacacagg attatttatc 1020 tcaactcagc agcaggtcac atttctcttg aagattaaga gaaccaggaa aggcttcaga 1080 cttctgaacc cacatcctaa gccaaacccc aaaaacaaca gagccgaggg cagaggcagc 1140 ctgctgacct gcggcgacgt ggaggagaac ccaggcccca tggacacaga aagtaatagg 1200 agagcaaatc ttgctctccc acaggagcct tccagtgtgc ctgcatttga agtcttggaa 1260 atatctcccc aggaagtatc ttcaggcaga ctattgaagt cggcctcatc cccaccactg 1320 catacatggc tgacagtttt gaaaaaagag caggagttcc tgggggtaac acaaattctg 1380 actgctatga tatgcctttg ttttggaaca gttgtctgct ctgtacttga tatttcacac 1440 attgagggag acattttttc atcatttaaa gcaggttatc cattctgggg agccatattt 1500 ttttctattt ctggaatgtt gtcaattata tctgaaagga gaaatgcaac atatctggtg 1560 agaggaagcc tgggagcaaa cactgccagc agcatagctg ggggaacggg aattaccatc 1620 ctgatcatca acctgaagaa gagcttggcc tatatccaca tccacagttg ccagaaattt 1680 tttgagacca agtgctttat ggcttccttt tccactgaaa ttgtagtgat gatgctgttt 1740 ctcaccattc tgggacttgg tagtgctgtg tcactcacaa tctgtggagc tggggaagaa 1800 ctcaaaggaa acaaggttcc agagaaacgg ggccggaaga agctcctcta catttttaag 1860 cagcctttca tgcggccagt gcagacaacc caagaggagg atgggtgttc ctgcagattc 1920 cctgaggaag aggaaggcgg gtgcgagctg ggttctggcg tgaaacagac tttgaatttt 1980 gaccttctca agttggcggg agacgtggag tccaacccag ggcccatgat tccagcagtg 2040 gtcttgctct tactcctttt ggttgaacaa gcagcggccc tgggagagcc tcagctctgc 2100 tatatcctgg atgccatcct gtttctgtat ggaattgtcc tcaccctcct ctactgtcga 2160 ctgaagatcc aagtgcgaaa ggcagctata accagctatg agaaatcaag agtgaagttc 2220 tccaggagcg cagatgcccc cgcctatcaa cagggccaga accagctcta caacgagctt 2280 aacctcggga ggcgcgaaga atacgacgtg ttggataaga gaagggggcg ggaccccgag 2340 atgggaggaa agccccggag gaagaaccct caggagggcc tgtacaacga gctgcagaag 2400 gataagatgg ccgaggccta ctcagagatc gggatgaagg gggagcggcg ccgcgggaag 2460 gggcacgatg ggctctacca ggggctgagc acagccacaa aggacacata cgacgccttg 2520 cacatgcagg cccttccacc ccggtga 2547

Claims (27)

  1. 하기를 포함하는 면역요법을 위한 T-세포(들)을 엑스 비보(ex vivo)에서 제조하는 방법:
    (a) - 면역 체크포인트 단백질을 코드하는 하나의 유전자, 및
    - T-세포 수용체 (TCR)의 요소(component)를 코드하는 하나의 유전자
    를 포함하는 적어도 두 개 유전자들을 DNA 절단(cleavage)에 의하여 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀(rare)-절단(cutting) 엔도뉴클레아제들을 상기 T-세포(들) 내로 도입함으로써 T-세포(들)을 변형시키는 단계,
    및
    (b) 상기 T-세포들 내로 CD19 항원에 대하여 향해지는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 도입하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서,
    T-세포들을 엑스 비보(ex vivo)에서 확장(expanding)시키는 단계 (c)를 더 포함하는, 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    면역 체크포인트 단백질을 코드하는 상기 유전자는: CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, CD223, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, 및 GUCY1B3 로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    면역 체크포인트 단백질을 코드하는 상기 유전자는 하기 유전자들로부터 선택되는 방법: PDCD1 및 CTLA-4.
  5. 제 1항에 있어서,
    적어도 하나의 희귀-절단 엔도뉴클레아제가 mRNA에 의하여 코드되는 방법.
  6. RNA 전기천공법의 방법에 의하여 단계 (a)에서 상기 세포 내로 상기 적어도 하나의 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함하는 제 5항의 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    적어도 하나의 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제인 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 TALE-뉴클레아제는 서열번호: 77 및 서열번호: 78로부터 선택되는 PD1의 유전자 타겟 서열들 중 하나에 대하여 향해지는 방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 TALE-뉴클레아제들은 서열번호: 74 및 서열번호: 76로부터 선택되는 CTLA-4의 유전자 타겟 서열들 중 하나에 대하여 향해지는 방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체는 다사슬(multi-chain) 키메라 항원 수용체인 방법.
  11. 제 1항에 있어서,
    단계 a)에서 상기 T-세포(들)은 염증성 T-림프구들, 세포독성 T-림프구들, 조절(regulatory) T-림프구들 또는 헬퍼(helper) T-림프구들로부터 유래되는 방법.
  12. 제 1항에 있어서,
    단계 a)에서 상기 T-세포(들)은 CD8+ T-림프구들 및/또는 CD4+ T-림프구들로부터 유래되는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 수득가능한 분리된 T-세포 또는 세포주 또는 그것의 서브컬쳐(subculture).
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체는 다사슬 키메라 항원 수용체인 분리된 T-세포.
  15. 의약으로서 사용을 위한 제 13항의 분리된 T-세포.
  16. 암, 바이러스 감염 또는 자가-면역(auto-immune) 장애를 치료하기 위한 제 13항의 분리된 T-세포.
  17. 림프종 또는 백혈병을 치료하기 위한 제 13항의 분리된 T-세포.
  18. 제 13항에 따른 적어도 하나의 분리된 T-세포를 포함하는 항-암 약학적 조성물.
  19. 제 13항에 따른 적어도 하나의 분리된 T-세포를 포함하는 항바이러스성 약학적 조성물.
  20. 서열번호 79 내지 서열번호: 88 로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 TALE-뉴클레아제.
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