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KR102386029B1 - 게놈 편집 면역 효과기 세포 - Google Patents

게놈 편집 면역 효과기 세포 Download PDF

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KR102386029B1
KR102386029B1 KR1020187029089A KR20187029089A KR102386029B1 KR 102386029 B1 KR102386029 B1 KR 102386029B1 KR 1020187029089 A KR1020187029089 A KR 1020187029089A KR 20187029089 A KR20187029089 A KR 20187029089A KR 102386029 B1 KR102386029 B1 KR 102386029B1
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cells
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조던 자르주르
알렉산더 아스트라칸
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2세븐티 바이오, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 염증 질환 및 면역결핍증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 수많은 병태의 치료, 예방 또는 개선을 위한 적응 면역 효과기 세포 요법을 위한 개선된 조성물을 제공한다.

Description

게놈 편집 면역 효과기 세포
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 특허법(35 U.S.C. § 119(e)) 하에서 2016년 4월 14일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/322,604호, 및 2016년 3월 11일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/307,245호의 유익을 주장하며, 이들 각각은 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열목록에 관한 언급
본 출원과 관련된 서열목록은 종이 사본 대신 텍스트 형식으로 제공되며, 이에 의하여 본 명세서에 참고로 포함된다. 서열목록을 함유하는 텍스트 파일의 명칭은 BLBD_065_02WO_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 168KB이고, 2017년 3월 9일자로 생성되었으며, 본 명세서의 제출과 동시에 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출 중에 있다.
기술 분야
본 발명은 적응 세포 요법을 위한 개선된 면역 효과기 세포 조성물에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 게놈 편집된 면역 효과기 세포 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
암의 전반적인 부담은 1975과 2000 사이에 두 배로 되었다. 암은 전세계적으로 이환율 및 사망률의 두 번째로 주된 원인이며, 2012년에 대략 1천 4백 10만건의 새로운 사례와 8백 2십만건의 암 관련 사망이 있었다. 가장 통상적인 암은 유방암, 폐 및 기관지 암, 전립선 암, 결장 및 직장암, 방광암, 피부의 흑색종, 비호지킨 림프종, 갑상선암, 신장 및 신우암, 자궁내막암, 백혈병 및 췌장암이다. 새로운 사례의 수는 다음 20년 내에 2천 2백만건까지 상승될 것으로 추정된다.
면역계는 인간암을 검출하고 이와 싸우는 데 중요한 역할을 한다. 대다수의 형질전환 세포는 면역 보초에 의해 빠르게 검출되고, 클론 발현된 T 세포 수용체(T cell receptor: TCR)를 통한 항원-특이적 T 세포의 활성화를 통해 파괴된다. 따라서, 암은 질환을 지속적으로 억제하고 제거하는 필수적인 항-종양 반응을 시작하는 면역계의 부전인 면역 장애로 고려될 수 있다. 암과 더 효과적으로 싸우기 위해, 지난 수 십년에 걸쳐 개발된 특정 면역요법 중재는 T 세포 면역을 향상시키는 데 특별하게 중점을 두었다. 이들 치료는 질환 관해의 단지 산발적 사례만을 얻었으며, 실질적인 전반적 성공은 없었다. T 세포 활성화를 저해하는 분자, 예컨대 CTLA-4 또는 PD-1을 표적화하는 단클론성 항체를 이용하는 더 최근의 요법은 더 실질적인 항-종양 효과를 나타내었지만; 그러나, 이들 치료는 또한 전신 면역 활성화에 기인하는 실질적인 독성과 관련된다.
더 최근에, T 세포의 단리, 변형, 확장 및 재주입에 기반한 적응 세포 면역요법 전략이 연구되었고, 초기 임상 시험에서 시험되었다. T 세포는 종종 그들의 선택적 인식 및 강력한 효과기 메커니즘에 기인하는 암 면역요법을 위한 선택의 효과기 세포였다. 이들 치료는 혼합된 성공률을 나타내었지만, 소수의 환자는 T 세포-기반 암 면역요법을 위한 아직 실현되지 않은 잠재력을 강조하는 지속적인 관해를 경험하였다.
세포용해 T 세포에 의한 종양 세포 관련 항원의 성공적인 인식은 표적화된 종양 용해를 개시하며, 임의의 효과적인 암 면역요법 접근을 뒷받침한다. 종양-침윤성 T 세포(TIL)는 종양-관련 항원과 특이적으로 관련된 TCR을 발현시키지만; 그러나, 실질적인 수의 TIL은 소수의 인간암으로만 제한된다. 조작된 T 세포 수용체(TCR) 및 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)는 다수의 암 및 다른 면역 장애에 대한 T 세포 기반 면역요법의 적용 가능성을 잠재적으로 증가시킨다. 유전자이식 T 세포를 발현시키는 CAR에 의한 고도로 유망한 초기 결과에도 불구하고, CAR T 세포-기반 면역요법의 효능, 안전성 및 확장성은 클론 유래 TCR의 지속적 발현에 의해 제한된다.
추가로, 잔여 TCR 발현은 조작된 T 세포에서의 CAR 신호전달을 방해할 수 있거나 또는 자기- 또는 동종 항원에 대한 표적을 벗어난 그리고 병적 반응을 개시할 수 있다. 그러나, 내인성 TCR 신호전달 성분 및 TCR 발현의 정확한 붕괴를 위한 방법이 부족하다. 결과적으로, CAR-기반 T 세포는 자가 이식물에서만 사용되었다. 그래도, 자가 적응 세포 면역요법의 안전성 및 효능에 관한 잠재적 문제가 있다: 조작된 수용체의 무작위 통합 및 예측 가능하지 않은 발현은 변형된 자가 T 세포의 효능에 영향을 미칠 수 있고, 자기-항원을 인식하는 자가 T 세포는 원치않는 자가면역 반응을 향상시킬 수 있었다.
추가로, 기술 분야의 조작된 T 세포는 암세포, 염증 세포, 기질 세포 및 사이토카인으로 이루어진 복잡한 면역억제 종양 미세환경에 의해 여전히 조절된다. 이들 성분 중에서, 암세포, 염증 세포 및 억제성 사이토카인은 T 세포 표현형 및 기능을 조절한다. 총괄적으로, 종양 미세환경은 T 세포가 기능소실된 T 세포(exhausted T cell)로 종국적으로 분화하도록 유도한다.
T 세포 기능소실은 저해 수용체의 증가된 발현, 또는 증가된 신호전달; 감소된 사이토카인 생산; 및 암을 지속하고 제거하는 감소된 능력에 의해 표시된 만성 환경에서의 T 세포 기능장애 상태이다. 기능소실된 T 세포는 또한 계층적 방식으로 기능상실을 나타낸다: 감소된 IL-2 생산 및 생체밖 사멸 능력은 초기 고갈 시 상실되며, TNF-α 생산은 중기에 상실되고, 그리고 IFN-γ 및 GzmB 생산은 진행된 기능소실 단계에서 상실된다. 종양 미세환경에서 대부분의 T 세포는 기능소실된 T 세포로 분화하며 암을 제거하는 능력을 상실하고, 결국 없어진다.
암은 조작된 T 세포가 효과적인 치료 선택사항을 제공할 수 있는 유일하나 질환이 아니다. T 세포는 면역계 활성을 자극하는 신체 반응에 중요하다. 예를 들어, T 세포 수용체 다양성은 이식편대 숙주질환(GVHD), 특히, 만성 GVHD에서 어떤 역할을 한다. 사실, T 세포 수용체 항체의 투여는 급성 GVHD의 증상을 감소시키는 것으로 나타났다.
따라서, 다양한 형태의 암 및 다른 면역 장애를 치료하기 위한 더 효과적이고, 표적화되며, 안전하고 지속적인 요법에 대한 필요가 있다. 추가로, 고효율로 내인성 TCR 유전자를 정확하게 그리고 재현 가능하게 붕괴시킬 수 있는 방법 및 조성물에 대한 필요가 있다. 대부분의 암에 대한 오늘날의 치료 표준은 이들 기준의 일부 또는 모두에 미치지 못한다.
본 발명은 일반적으로, 부분적으로, 개선된 면역 효과기 세포 조성물 및 게놈 편집을 이용하는 이의 제조 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서 상정된 면역 효과기 세포는 TCR 발현 및 신호전달의 붕괴 및 더 효과적이고 더 안전한 적응 세포요법을 야기하는 하나 이상의 T 세포 수용체 좌위에서의 정확한 붕괴 또는 변형을 포함한다. 조작된 면역 효과기 세포는 적응 세포 면역요법의 효능 및 특이성을 증가시키기 위해 하나 이상의 또는 조작된 항원 수용체를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서 상정된 면역 효과기 세포 조성물은 적응 세포 요법의 효능 및 지속성을 증가시키기 위해 하나 이상의 면역 효능 인핸서 및/또는 면역억제 신호 댐퍼(damper)의 삽입을 추가로 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 하나 이상의 변형된 T 세포 수용체 알파(TCRα) 대립유전자; 및 하나 이상의 변형된 TCRα 대립유전자 내로 삽입되는 면역효능 인핸서를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 포함하는, 세포가 제공된다.
다양한 실시형태에서, 하나 이상의 변형된 T 세포 수용체 알파(TCRα) 대립유전자; 및 하나 이상의 변형된 TCRα 대립유전자 내로 삽입되는 면역억제 신호 댐퍼를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 포함하는, 세포가 제공된다.
다양한 실시형태에서, 하나 이상의 변형된 T 세포 수용체 알파(TCRα) 대립유전자; 및 하나 이상의 변형된 TCRα 대립유전자 내로 삽입되는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 포함하는, 세포가 제공된다.
다양한 실시형태에서, 하나 이상의 변형된 T 세포 수용체 알파(TCRα) 대립유전자; 및 하나 이상의 변형된 TCRα 대립유전자 내로 삽입되는 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼 및 조작된 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 포함하는, 세포가 제공된다.
추가적인 실시형태에서, 변형된 TCRα은 비기능성이거나 또는 실질적으로 감소된 기능을 가진다.
특정 실시형태에서, 핵산은 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼, 또는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 RNA 중합효소 II 프로모터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA 중합효소 II 프로모터는 짧은 EF1α 프로모터, 긴 EF1α 프로모터, 인간 ROSA 26 좌위, 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 거대세포 바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터, β-액틴 프로모터 및 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 결실된 음성 대조군 영역, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 핵산은 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼, 또는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 자기-절단(self-cleaving) 바이러스 펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 자기-절단 바이러스 펩타이드는 2A 펩타이드이다.
추가 실시형태에서, 자기-절단 펩타이드는 구제역바이러스(FMDV) 2A 펩타이드, 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A 펩타이드, 토세아 아시그나 바이러스(Thosea asigna virus: TaV) 2A 펩타이드, 돼지 테스코바이러스-1(PTV-1) 2A 펩타이드, 테일로바이러스 2A 펩타이드, 및 뇌심근염바이러스 2A 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 핵산은 이종성 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다.
추가 실시형태에서, 면역억제 신호 댐퍼는 면역억제 인자에 대응하는 효소 기능을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역억제 신호 댐퍼는 키뉴레니나제 활성을 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역억제 신호 댐퍼는 면역억제 인자에 결합하는 엑소도메인을 포함하되, 선택적으로 엑소도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
특정 실시형태에서, 면역억제 신호 댐퍼는 면역억제 인자에 결합하는 엑소도메인 및 막관통 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역억제 신호 댐퍼는 면역억제 인자에 결합하는 엑소 도메인, 막관통 도메인, 및 세포에 면역억제 신호를 형질도입할 수 없는 변형된 엔도도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 엑소도메인은 면역수용체 타이로신 저해 모티프(ITIM) 및/또는 면역수용체 타이로신 스위치 모티프(ITSM)를 포함하는 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다.
추가 실시형태에서, 엑소도메인은 예정 사멸 리간드 1(programmed death ligand 1: PD-L1), 예정 사멸 리간드 2(PD-L2), 형질전환 성장인자 β(TGFβ), 대식세포 집락 자극 인자 1(M-CSF1), 종양 괴사 인자 관련 세포자멸사 유도 리간드(TRAIL), SiSo 세포 리간드 상에서 발현된 수용체-결합 암 항원(RCAS1), Fas 리간드(FasL), CD47, 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-8(IL-8), 인터류킨-10(IL-10) 및 인터류킨-13(IL-13)으로 이루어진 군으로부터 선택된 면역억제 인자에 결합한다.
특정 실시형태에서, 엑소도메인은 세포예정사 단백질 1(PD-1), 림프구 활성화 유전자 3 단백질(LAG-3), T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 단백질 3(TIM-3), 세포독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4), 밴드 T 림프구 감쇠자(BTLA), T 세포 면역글로불린 및 면역수용체 타이로신-기반 저해 모티프 도메인(TIGIT), 형질전환 성장인자 β 수용체 II(TGFβRII), 포유류 집락 자극 인자 1 수용체(M-CSF1), 인터류킨 4 수용체(IL4R), 인터류킨 6 수용체(IL6R), 케모카인(C-X-C 모티프) 수용체 1(CXCR1), 케모카인(C-X-C 모티프) 수용체 2(CXCR2), 인터류킨 10 수용체 서브유닛 알파(IL10R), 인터류킨 13 수용체 서브유닛 알파 2(IL13Rα2), 종양 괴사 인자 관련 세포자멸사 유도 수용체(TRAILR1), SiSo 세포 상에서 발현된 수용체-결합 암 항원(RCAS1R), 및 Fas 세포 표면 사멸 수용체(FAS)로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다.
추가 실시형태에서, 엑소도메인은 PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, BTLA, TIGIT 및 TGFβRII로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 엑소도메인은 TGFβRII의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역억제 신호 댐퍼는 우성 음성 TGFβRII 수용체이다.
추가 실시형태에서, 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파 또는 베타쇄, CDδ, CD3ε, CDγ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154, 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된다.
특정 실시형태에서, 면역억제 인자는 PD-L1, PD-L2, TGFβ, M-CSF, TRAIL, RCAS1, FasL, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 면역효능 인핸서는 이중특이성 T 세포 관여 분자(BiTE), 면역증강 인자, 및 플립 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 실시형태에서, BiTE는 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 패밀리, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 서비빈, TAG72, TEMs, VEGFR2 및 WT-1; 링커; 및 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, CD134, CD137 및 CD278로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 효과기 세포 상의 항원에 결합하는 제2 결합 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합하는 제1 결합 도메인을 포함한다.
추가 실시형태에서, BiTE는 클래스 I MHC-펩타이드 복합체 및 클래스 II MHC-펩타이드 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합하는 제1 결합 도메인; 링커; 및 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, CD134, CD137 및 CD278로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 효과기 세포 상의 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역증강 인자는 사이토카인, 케모카인, 세포독소, 사이토카인 수용체, 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 사이토카인은 IL-2, 인슐린, IFN-γ, IL-7, IL-21, IL-10, IL-12, IL-15 및 TNF-α로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 케모카인은 MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, MCP-3 및 RANTES로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 실시형태에서, 사이토카인은 퍼포린, 그랜자임 A 및 그랜자임 B로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 사이토카인 수용체는 IL-2 수용체, IL-7 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체 및 IL-21 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 면역증강 인자는 단백질 탈안정화 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 플립 수용체는 면역억제성 사이토카인에 결합하는 엑소도메인; 막관통; 및 엔도도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 플립 수용체는 IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-8 수용체, IL-10 수용체, IL-13 수용체, 또는 TGFβRII; CD4, CD8α, CD27, CD28, CD134, CD137, CD3 폴리펩타이드, IL-2 수용체, IL-7 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, 또는 IL-21 수용체로부터 단리된 막관통 도메인; 및 IL-2 수용체, IL-7 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, 또는 IL-21 수용체로부터 단리된 엔도도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인 수용체의 도메인에 결합하는 세포외 사이토카인을 포함하는 엑소도메인을 포함한다.
추가 실시형태에서, 플립 수용체는 IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 또는 TGFβ; CD4, CD8α, CD27, CD28, CD134, CD137, CD3 폴리펩타이드, IL-2 수용체, IL-7 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, 또는 IL-21 수용체로부터 단리된 막관통 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 도메인을 포함하는 엑소도메인; 및 IL-2 수용체, IL-7 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, 또는 IL-21 수용체로부터 단리된 엔도도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 플립 수용체는 면역억제 인자에 결합하는 엑소도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 공동 자극 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 엑소도메인은 ITIM 및/또는 ITSM을 포함하는 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 엑소도메인은 PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, BTLA, TIGIT, TGFβRII, IL4R, IL6R, CXCR1, CXCR2, IL10R, IL13Rα2, TRAILR1, RCAS1R 및 FAS로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다.
추가 실시형태에서, 엑소도메인은 PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, BTLA, TIGIT 및 TGFβRII로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 엑소도메인은 TGFβRII 또는 PD-1의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파 또는 베타쇄, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 공동 자극 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인은 면역수용체 타이로신 활성 모티프(ITAM)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 공동 자극 신호전달 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인은 CD28, CD134, CD137 및 CD278로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된다.
추가 실시형태에서, 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인은 CD28로부터 단리된다.
추가 실시형태에서, 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인은 CD134로부터 단리된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인은 CD137로부터 단리된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인은 CD278로부터 단리된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 1차 신호전달 도메인은 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 1차 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 단리된다.
특정 실시형태에서, 플립 수용체는 TGFβRII 수용체, IL-2 수용체, IL-7 수용체, IL-12 수용체, 또는 IL-15 수용체 막관통 도메인의 세포외 리간드 결합 도메인; 및 IL-2 수용체, IL-7 수용체, IL-12 수용체, 또는 IL-15 수용체로부터 단리된 엔도도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 플립 수용체는 PD-1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인, PD-1 또는 CD28 막관통 도메인, 및 CD28, CD134, CD137 및 CD278로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포내 공동 자극 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
추가 실시형태에서, 조작된 항원 수용체는 조작된 TCR, CAR, Daric 또는 키메라 사이토카인 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 핵산은 제1 자기-절단 바이러스 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 하나의 변형된 TCRα 대립유전자 내로 통합된 조작된 TCR의 알파쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
추가 실시형태에서, 핵산은 제1 자기-절단 바이러스 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 하나의 변형된 TCRα 대립유전자 내로 통합된 조작된 TCR의 베타쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 핵산은 5'으로부터 3'으로 제1 자기-절단 바이러스 펩타이드, 조작된 TCR의 알파쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 제2 자기-절단 바이러스 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 하나의 변형된 TCRα 대립유전자 내로 통합된 조작된 TCR의 베타쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 변형된 TCRα 대립유전자는 둘 다 비기능성이다.
일부 실시형태에서, 제1 변형된 TCRα 대립유전자는 제1 자기-절단 바이러스 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 조작된 TCR의 알파쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 포함하고, 그리고 제2 변형된 TCRα 대립유전자는 제2 자기-절단 바이러스 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 조작된 TCR의 베타쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 TCR은: 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2)를 포함하는 EGFR 패밀리, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 서비빈, TAG72, TEMs, VEGFR2 및 WT-1로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합한다.
특정 실시형태에서, CAR은 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2를 포함하는 EGFR 패밀리(HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 서비빈, TAG72, TEM, VEGFR2, 및 WT-1로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합하는 세포외도메인; T-세포 수용체의 알파 또는 베타쇄, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된 막관통 도메인; TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된 하나 이상의 세포내 공동자극 신호전달 도메인; 및 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 MHC-펩타이드 복합체, 클래스 I MHC-펩타이드 복합체, 또는 클래스 II MHC-펩타이드 복합체에 결합하는 세포외 도메인; T-세포 수용체의 알파 또는 베타쇄, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된 막관통 도메인; TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된 하나 이상의 세포내 공동자극 신호전달 도메인; 및 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된 신호전달 도메인을 포함한다.
추가 실시형태에서, CAR은 BCMA, CD19, CSPG4, PSCA, ROR1 및 TAG72로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합하는 세포외 도메인; CD4, CD8α, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된 막관통 도메인; CD28, CD134 및 CD137로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된 하나 이상의 세포내 공동자극 신호전달 도메인; 및 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, Daric 수용체는 제1 다량체화 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 공동자극 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 신호전달 폴리펩타이드; 및 결합 도메인, 제2 다량체화 도메인, 및 선택적으로 제2 막관통 도메인을 포함하는 결합 폴리펩타이드를 포함하되; 브릿징 인자는 세포 표면 상에서 신호전달 폴리펩타이드의 다량체화 도메인과 결합 폴리펩타이드 사이에 결합되고 배치된 브릿징 인자와의 Daric 수용체 복합체의 형성을 촉진시킨다.
특정 실시형태에서, 제1 및 제2 다량체화 도메인은 라파마이신 또는 이의 라팔로그, 쿠메르마이신 또는 이의 유도체, 지베렐린 또는 이의 유도체, 아브시스산(ABA) 또는 이의 유도체, 메토트렉세이트 또는 이의 유도체, 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체, FKCsA 또는 이의 유도체, 트라이메토프림(Tmp)-FKBP에 대한 합성 리간드(SLF) 또는 이의 유도체, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 브릿징 인자와 결합된다.
일부 실시형태에서, 제1 및 제2 다량체화 도메인은 FKBP 및 FRB, FKBP 및 칼시네우린, FKBP 및 사이클로필린, FKBP 및 박테리아 DHFR, 칼시네우린 및 사이클로필린, PYL1 및 ABI1, 또는 GIB1 및 GAI, 또는 이들의 변이체로부터 선택된 쌍이다.
특정 실시형태에서, 제1 다량체화 도메인은 FRB T2098L을 포함하고, 제2 다량체화 도메인은 FKBP12를 포함하며, 브릿징 인자는 라팔로그 AP21967이다.
일부 실시형태에서, 제1 다량체화 도메인은 FRB를 포함하고, 제2 다량체화 도메인은 FKBP12를 포함하며, 브릿징 인자는 라파마이신, 템시롤리무스 또는 에베롤리무스이다.
특정 실시형태에서, 브릿징 도메인은 scFv를 포함한다.
추가 실시형태에서, 결합 도메인은 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2를 포함하는 EGFR 패밀리(HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 서비빈, TAG72, TEMs, VEGFR2 및 WT-1로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합하는 scFv를 포함한다.
특정 실시형태에서, 결합 도메인은 MHC-펩타이드 복합체, 클래스 I MHC-펩타이드 복합체, 또는 클래스 II MHC-펩타이드 복합체에 결합하는 sxFv를 포함하고;
특정 실시형태에서, 제1 및 제2 막관통 도메인은 CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된다.
특정 실시형태에서, 제1 및 제2 막관통 도메인은 CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4 및 CD8α로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인은 CD28, CD134, 및 CD137로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 1차 신호 도메인은 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된다.
일부 실시형태에서, 신호전달 폴리펩타이드는 FRB T2098L의 제1 다량체화 도메인, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인, 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함하며; 결합 폴리펩타이드는 CD19에 결합하는 scFv, FKBP12의 제2 다량체화 도메인 및 CD4 막관통 도메인을 포함하고; 그리고 브릿징 인자는 라팔로그 AP21967이다.
특정 실시형태에서, 신호전달 폴리펩타이드는 FRB의 제1 다량체화 도메인, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인, 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함하고; 결합 폴리펩타이드는 CD19에 결합하는 scFv, FKBP12의 제2 다량체화 도메인 및 CD4 막관통 도메인을 포함하며; 그리고 브릿징 인자는 라파마이신, 템시롤리무스 또는 에베롤리무스이다.
특정 실시형태에서, 하나의 변형된 TCRα 대립유전자는 신호전달 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 바이러스 자기-절단 2A 펩타이드, 및 결합 폴리펩타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 사이토카인 수용체는 면역억제성 사이토카인 또는 이의 사이토카인 수용체 결합 변이체, 링커, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 사이토카인 수용체 결합 변이체는 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-8(IL-8), 인터류킨-10(IL-10) 및 인터류킨-13(IL-13)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 링커는 CH2CH3 도메인 또는 힌지 도메인을 포함한다.
추가 실시형태에서, 링커는 IgG1, IgG4 또는 IgD의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
추가 실시형태에서, 링커는 CD8α 또는 CD4 힌지 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파 또는 베타쇄, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된다.
특정 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인 및/또는 공동자극 도메인을 함유하는 ITAM으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된다.
추가 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된다.
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD28, CD137, CD134 및 CD3ζ로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된다.
특정 실시형태에서, TCRα 대립유전자는 둘 다 변형되며; 그리고 본 명세서에 상정된 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼, 또는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 핵산은 하나의 변형된 TCRα 대립유전자 내로 삽입된다.
특정 실시형태에서, TCRα 대립유전자는 둘 다 비기능성이며; 그리고 본 명세서에 상정된 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼, 또는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 핵산은 제1 비-기능성 TCRα 대립유전자 내로 삽입되고; 그리고 세포는 본 명세서에 상정된 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼 또는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하며, 제2 비-기능성 TCRα 대립유전자 내로 삽입된다.
추가 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드와 제2 폴리뉴클레오타이드는 상이하다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 면역효능 인핸서 또는 면역억제 신호 댐퍼를 암호화한다.
특정 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 플립 수용체를 암호화한다.
특정 실시형태에서, TCRα 대립유전자는 둘 다 변형되며; 그리고 본 명세서에 상정된 면역효능 인핸서 또는 면역억제 신호 댐퍼를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 핵산은 하나의 비-기능성 TCRα 대립유전자 내로 삽입되며; 그리고 상기 세포는 조작된 항원 수용체를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 핵산은 저해 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 저해 RNA는 shRNA, miRNA, piRNA, 또는 리보자임이다.
추가 실시형태에서, 핵산은 저해 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 RNA 중합효소 III 프로모터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA 중합효소 III 프로모터는 인간 또는 마우스 U6 snRNA 프로모터, 인간 및 마우스 H1 RNA 프로모터, 또는 인간 tRNA-val 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 세포는 조혈세포이다.
추가 실시형태에서, 세포는 면역 효과기 세포이다.
일부 실시형태에서, 세포는 CD3+, CD4+, CD8+, 또는 이들의 조합이다.
추가 실시형태에서, 세포는 T 세포이다.
특정 실시형태에서, 세포는 세포독성 T 림프구 (CTL), 종양 침윤성 림프구(TIL) 또는 헬퍼 T 세포이다.
특정 실시형태에서, 세포의 공급원은 말초혈액 단핵세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉수, 비장 조직, 또는 종양이다.
일부 실시형태에서, 세포는 PI3K 경로 저해제의 존재 하에 활성화되고, 자극된다.
특정 실시형태에서, 세포는 PI3K 경로 저해제의 존재 하에 활성화되고 자극되고, PI3K 경로 저해제의 부재 하에 활성화되고 자극된 세포에 비해 i) CD62L, CD127, CD197 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 또는 ii) CD62L, CD127, CD197 및 CD38의 마커 모두의 발현이 증가되었다.
특정 실시형태에서, PI3K 저해제의 존재 하에 활성화되고 자극된 세포는 PI3K 경로 저해제의 부재 하에 활성화되고 자극된 세포에 비해 i) CD62L, CD127, CD27 및 CD8로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 또는 ii) 마커 CD62L, CD127, CD27 및 CD8 모두의 발현이 증가되었다.
추가 실시형태에서, PI3K 저해제는 ZSTK474이다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 세포 및 생리적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
다양한 실시형태에서, T 세포 집단을 활성화시키고 T 세포 집단을 자극하여 증폭시키는 단계; 조작된 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA를 T 세포 집단 내로 도입하는 단계; 공여자 수선 주형을 포함하는 하나 이상의 바이러스 벡터를 이용하여 T 세포 집단을 형질도입하는 단계를 포함하는 T 세포 집단에서 TCRα 대립유전자를 편집하는 방법이 제공되되; 조작된 뉴클레아제의 발현은 TCRα 대립유전자 내 표적 부위에서 이중 가닥 파손을 생성하고, 공여자 수선 주형은 이중-가닥 파손(double-strand break: DSB) 부위에서 상동성 관련 수선(homology directed repair: HDR)에 의해 TCRα 대립유전자 내로 혼입된다.
특정 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 DSB의 TCRα 서열 5'에 대해 상동성인 5' 상동성 아암; 본 명세서에 상정된 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼, 또는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 DSB의 TCRα 서열 3'에 대해 상동성인 3' 상동성 아암을 포함한다.
추가 실시형태에서, 5' 및 3' 상동성 아암의 길이는 약 100bp 내지 약 2500bp으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시형태에서, 5' 및 3' 상동성 아암의 길이는 약 600bp 내지 약 1500bp으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시형태에서, 5' 상동성 아암은 약 1500bp이고, 3' 상동성 아암은 약 1000bp이다.
특정 실시형태에서, 5' 상동성 아암은 약 600bp이고, 3' 상동성 아암은 약 600bp이다.
특정 실시형태에서, 바이러스 벡터는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터(rAAV) 또는 레트로바이러스이다.
특정 실시형태에서, rAAV는 AAV2로부터의 하나 이상의 ITR을 가진다.
추가 실시형태에서, rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 AAV10으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형을 가진다.
일부 실시형태에서, rAAV는 AAV6 혈청형을 가진다.
추가 실시형태에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스이다.
특정 실시형태에서, 렌티바이러스는 인테그라제 결핍 렌티바이러스이다.
추가 실시형태에서, 조작된 뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 메가TAL, TALEN, ZFN, 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 메가뉴클레아제는 I-AabMI, I-AaeMI, I-AniI, I-ApaMI, I-CapIII, I-CapIV, I-CkaMI, I-CpaMI, I-CpaMII, I-CpaMIII, I-CpaMIV, I-CpaMV, I-CpaV, I-CraMI, I-EjeMI, I-GpeMI, I-GpiI, I-GzeMI, I-GzeMII, I-GzeMIII, I-HjeMI, I-LtrII, I-LtrI, I-LtrWI, I-MpeMI, I-MveMI, I-NcrII, I-Ncrl, I-NcrMI, I-OheMI, I-OnuI, I-OsoMI, I-OsoMII, I-OsoMIII, I-OsoMIV, I-PanMI, I-PanMII, I-PanMIII, I-PnoMI, I-ScuMI, I-SmaMI, I-SscMI 및 I-Vdi141I로 이루어진 군으로부터 선택된 LAGLIDADG 귀소 엔도뉴클레아제(LHE)로부터 조작된다.
특정 실시형태에서, 메가뉴클레아제는 I-CpaMI, I-HjeMI, I-OnuI, I-PanMI 및 SmaMI로 이루어진 군으로부터 선택된 LHE로부터 선택된다.
추가 실시형태에서, 메가뉴클레아제는 I-OnuI LHE로부터 조작된다.
특정 실시형태에서, 메가TAL은 TALE DNA 결합 도메인 및 조작된 메가뉴클레아제를 포함한다.
추가 실시형태에서, TALE 결합 도메인은 약 9.5개의 TALE 반복 단위 내지 약 11.5개의 TALE 반복 단위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 메가뉴클레아제는 I-AabMI, I-AaeMI, I-AniI, I-ApaMI, I-CapIII, I-CapIV, I-CkaMI, I-CpaMI, I-CpaMII, I-CpaMIII, I-CpaMIV, I-CpaMV, I-CpaV, I-CraMI, I-EjeMI, I-GpeMI, I-GpiI, I-GzeMI, I-GzeMII, I-GzeMIII, I-HjeMI, I-LtrII, I-LtrI, I-LtrWI, I-MpeMI, I-MveMI, I-NcrII, I-Ncrl, I-NcrMI, I-OheMI, I-OnuI, I-OsoMI, I-OsoMII, I-OsoMIII, I-OsoMIV, I-PanMI, I-PanMII, I-PanMIII, I-PnoMI, I-ScuMI, I-SmaMI, I-SscMI 및 I-Vdi141I로 이루어진 군으로부터 선택된 LHE로부터 조작된다.
추가 실시형태에서, 메가뉴클레아제는 I-CpaMI, I-HjeMI, I-OnuI, I-PanMI 및 SmaMI로 이루어진 군으로부터 선택된 LHE로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 메가뉴클레아제는 I-OnuI LHE로부터 조작된다.
일부 실시형태에서, TALEN은 TALE DNA 결합 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인 또는 절반-도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, TALE 결합 도메인은 약 9.5개의 TALE 반복 단위 내지 약 11.5개의 TALE 반복 단위를 포함한다.
특정 실시형태에서, 엔도뉴클레아제 도메인은 II형 제한 엔도뉴클레아제로부터 단리된다.
추가 실시형태에서, 엔도뉴클레아제 도메인은 Aar I, Ace III, Aci I, Alo I, Alw26 I, Bae I, Bbr7 I, Bbv I, Bbv II, BbvC I, Bcc I, Bce83 I, BceA I, Bcef I, Bcg I, BciV I, Bfi I, Bin I, Bmg I, Bpu10 I, BsaX I, Bsb I, BscA I, BscG I, BseR I, BseY I, Bsi I, Bsm I, BsmA I, BsmF I, Bsp24 I, BspG I, BspM I, BspNC I, Bsr I, BsrB I, BsrD I, BstF5 I, Btr I, Bts I, Cdi I, CjeP I, Drd II, EarI, Eci I, Eco31 I, Eco57 I, Eco57M I, Esp3 I, Fau I, Fin I, Fok I, Gdi II ,Gsu I, Hga I, Hin4 II, Hph I, Ksp632 I ,Mbo II, Mly I, Mme I, Mnl I, Pfl1108, I Ple I, Ppi I Psr I, RleA I, Sap I, SfaN I, Sim I, SspD5 I, Sth132 I, Sts I, TspDT I, TspGW I, Tth111 II, UbaP I, Bsa I 및 BsmB I로 이루어진 군으로부터 선택된 II형 제한 엔도뉴클레아제로부터 단리된다.
특정 실시형태에서, 엔도뉴클레아제 도메인은 FokI로부터 단리된다.
특정 실시형태에서, ZFN은 아연 핑거 DNA 결합 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인 또는 절반-도메인을 포함한다.
추가 실시형태에서, 아연 핑거 DNA 결합 도메인은 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아연 핑거 모티프를 포함한다.
특정 실시형태에서, ZFN은 TALE 결합 도메인을 포함한다.
추가 실시형태에서, TALE DNA 결합 도메인은 약 9.5개의 TALE 반복 단위 내지 약 11.5개의 TALE 반복 단위를 포함한다.
특정 실시형태에서, 엔도뉴클레아제 도메인은 II형 제한 엔도뉴클레아제로부터 단리된다.
특정 실시형태에서, 엔도뉴클레아제 도메인은 Aar I, Ace III, Aci I, Alo I, Alw26 I, Bae I, Bbr7 I, Bbv I, Bbv II, BbvC I, Bcc I, Bce83 I, BceA I, Bcef I, Bcg I, BciV I, Bfi I, Bin I, Bmg I, Bpu10 I, BsaX I, Bsb I, BscA I, BscG I, BseR I, BseY I, Bsi I, Bsm I, BsmA I, BsmF I, Bsp24 I, BspG I, BspM I, BspNC I, Bsr I, BsrB I, BsrD I, BstF5 I, Btr I, Bts I, Cdi I, CjeP I, Drd II, EarI, Eci I, Eco31 I, Eco57 I, Eco57M I, Esp3 I, Fau I, Fin I, Fok I, Gdi II ,Gsu I, Hga I, Hin4 II, Hph I, Ksp632 I ,Mbo II, Mly I, Mme I, Mnl I, Pfl1108, I Ple I, Ppi I Psr I, RleA I, Sap I, SfaN I, Sim I, SspD5 I, Sth132 I, Sts I, TspDT I, TspGW I, Tth111 II, UbaP I, Bsa I 및 BsmB I로 이루어진 군으로부터 선택된 II형 제한 엔도뉴클레아제로부터 단리된다.
추가 실시형태에서, 엔도뉴클레아제 도메인은 FokI로부터 단리된다.
일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 mRNA, tracrRNA, 및 TCRα 유전자에서 프로토스페이서(protospacer)를 표적화하는 하나 이상의 crRNA는 T 세포 집단 내로 도입된다.
특정 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 및 TCRα 유전자에서 프로토스페이서를 표적화하는 하나 이상의 sgRNA는 T 세포 집단 내로 도입된다.
추가 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 또는 Cpf1이다.
일부 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 하나 이상의 TALE DNA 결합 도메인을 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, DSB는 TCRα 대립유전자 둘 다에서 생성되고; 그리고 본 명세서에 상정된 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼, 또는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 공여자 주형은 하나의 변형된 TCRα 대립유전자 내로 삽입된다.
추가 실시형태에서, DSB는 TCRα 대립유전자 둘 다에서 생성되고; 그리고 본 명세서에 상정된 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼, 또는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 제1 폴리펩타이드를 포함하는 제1 공여자 주형이 제1 변형된 TCRα 대립유전자 내로 삽입되고; 그리고 본 명세서에 상정된 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼, 또는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 공여자 주형은 제2 변형된 TCRα 대립유전자 내로 삽입된다.
특정 실시형태에서, 제1 공여자 주형 및 제2 주형은 상이한 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 면역효능 인핸서 또는 면역억제 신호 댐퍼를 암호화한다.
추가 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 플립 수용체를 암호화한다.
특정 실시형태에서, DSB는 TCRα 대립유전자 둘 다에서 생성되고; 그리고 본 명세서에 상정된 면역효능 인핸서 또는 면역억제 신호 댐퍼를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 공여자 주형은 하나의 변형된 TCRα 대립유전자 내로 삽입되며; 그리고 세포는 조작된 항원 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 추가로 형질도입된다.
추가 실시형태에서, T 세포는 세포독성 T 림프구(CTL), 종양 침윤성 림프구(TIL), 또는 헬퍼 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 조작된 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA는 바이러스 자기-절단성 2A 펩타이드 및 말단-가공 효소를 추가로 암호화한다.
추가 실시형태에서, 상기 방법은 말단-가공 효소를 암호화하는 mRNA를 T 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 말단-가공 효소는 5-3' 엑소뉴클레아제, 5-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제, 3-5'엑소뉴클레아제, 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 헬리카제 또는 주형-의존적 DNA 중합효소 활성을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 말단-가공 효소는 Trex2 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편을 포함한다.
추가 실시형태에서, 세포는 PI3K 경로 저해제의 존재 하에 활성화되고, 자극된다.
특정 실시형태에서, PI3K 경로 저해제의 존재 하에 활성화되고 자극된 T 세포는 PI3K 경로 저해제의 부재 하에 활성화되고 자극된 T 세포에 비해 i) CD62L, CD127, CD197 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 또는 ii) 마커 CD62L, CD127, CD197 및 CD38 모두의 발현이 증가되었다.
추가 실시형태에서, PI3K 저해제의 존재 하에 활성화되고 자극된 T 세포는 PI3K 경로 저해제의 부재 하에 활성화되고 자극된 T 세포에 비해 i) CD62L, CD127, CD27 및 CD8로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 또는 ii) 마커 CD62L, CD127, CD27 및 CD8 모두의 발현이 증가되었다.
특정 실시형태에서, PI3K 저해제는 ZSTK474이다.
도 1a은 프로모터, 형광 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 및 TCRα 좌위의 불변 영역의 엑손 1 내로 넉인된 폴리아데닐화 신호를 포함하는 이식유전자를 도시한 도면.
도 1b는 메가TAL, AAV 주형, 메가TAL 및 AAV 주형으로 처리된 세포, 또는 대조군 처리 세포에서의 형광 단백질 발현, 및 선택적으로 CD3(TCR 붕괴)의 발현을 도시한 도면. 처리 후 제10일에 유세포분석에 의해 발현을 측정하였다. 메가TAL 및 AAV 주형에 의한 TCRα 좌위의 효율적인 표적화를 형광 단백질 발현과 함께 CD3 발현의 부재 하에 특성규명하였다.
도 1c는 메가TAL, AAV 주형, 메가TAL 및 AAV 주형으로 처리된 세포, 또는 대조군 처리 세포에서의 형광 단백질 발현, 및 선택적으로 CD3(TCR 붕괴)의 발현을 도시한 도면. 처리 후 제5일 및 제10일에 유세포분석에 의해 발현을 측정하였다. 메가TAL 및 AAV 주형에 의한 TCRα 좌위의 효율적인 표적화를 형광 단백질 발현과 함께 CD3 발현의 부재 하에 특성규명하였다.
도 2a은 프로모터, CD19 표적화 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열, 및 TCRα 유전자의 불변 영역의 엑손 1로 넉인된 폴리아데닐화 신호를 포함하는 이식유전자를 도시한 도면.
도 2b는 제8일에 PE-접합된 CD19-Fc를 이용하여 염색함으로써 유세포분석에 의해 분석한 CD19 CAR 발현을 도시한 도면. 메가TAL 및 AAV 주형으로 처리한 세포에서 안정한 이식유전자 발현을 확인하였다.
도 2c는 TCRα 좌위로 표적화된 CD19 CAR이 기능성이라는 것을 도시한 도면. 비형질도입된 또는 메가TAL/AAV-처리된 세포를 CD19+ K562 세포와 함께 1:1 비로 24시간 동안 공동배양시켰다. 메가TAL과 CD19 CAR을 암호화하는 AAV 주형을 둘 다 받은 해당 샘플에서만 효율적인 IFNγ 생성이 관찰되었다.
도 3a은 프로모터, CD19 표적화 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열, 및 TCRα 유전자의 불변 영역의 엑손 1로 넉인된 폴리아데닐화 신호를 포함하는 이식유전자를 도시한 도면. 비교 개략도는 CD19 CAR 발현을 유도하는 이종성 MND 프로모터를 함유하는 렌티바이러스 작제물을 나타낸다.
도 3b는 제8일에 PE-접합된 CD19-Fc를 이용하여 염색함으로써 유세포분석에 의해 분석한 바와 같은 AAV + 메가TAL로 또는 CD19 CAR 렌티바이러스로 처리한 T 세포에서의 CD19 CAR 발현을 도시한 도면. 메가TAL 및 AAV 주형으로 처리한 세포에서 안정한 이식유전자 발현을 확인하였다. CD19 CAR+ T 세포 상에서 CD45RA 및 CD62L의 발현을 나타낸다. 염색 데이터의 개요를 우측에 나타낸다.
도 3c는 TCRα 좌위로 표적화된 CD19 CAR이 표적 세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 도시한 도면. 렌티바이러스 형질도입된 또는 메가TAL/AAV-처리된 세포를 CD19+ K562 세포와 함께 1:1 비로 24시간 동안 공동배양시켰다. 렌티바이러스 벡터를 받거나 또는 메가TAL + AAV로 처리된 샘플 사이의 동등한 세포독성을 관찰하였다.
도 3d는 TCRα 좌위로 표적화된 CD19 CAR이 CD19+ 종양 세포의 인식 시 사이토카인을 분비할 수 있었다는 것을 도시한 도면. 렌티바이러스 형질도입된 또는 메가TAL/AAV-처리된 세포를 CD19+ K562 세포와 함께 1:1 비로 24시간 동안 공동배양시켰다. 렌티바이러스 벡터를 받거나 또는 메가TAL + AAV로 처리된 샘플 사이의 동등한 IFNγ, IL2 및 TNFα 사이토카인 생성을 관찰하였다.
도 3e는 TCRa 좌위에 대한 CD19 CAR 표적화가 T 세포 고갈을 유도하지 않는다는 것을 도시한 도면. 렌티바이러스 형질도입된 또는 메가TAL/AAV-처리된 세포를 CD19+ K562 세포와 함께 1:1 비로 72시간 동안 공동배양시켰다. 고갈 마커 발현(PD1, CTLA4 및 Tim3)을 유세포 분석에 의해 분석하였다.
도 4a는 2-대립유전자 발현을 위해 설계된 2개의 이식유전자를 도시한 도면. 각각의 이식유전자는 TCRα 좌위의 하나의 대립유전자 내로 통합된 별개의 형광 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함한다.
도 4b는 메가TAL에 의해 형질감염되고 후속적으로 단일 AAV(GFP 또는 BFP)에 의해 형질도입되거나, 또는 AAV 둘 다에 의해 이중으로 형질도입된 세포에서의 이식유전자 발현을 도시한 도면. 형질감염/형질도입 10일 후에 유세포분석에 의해 형광 단백질의 발현을 분석하였다. 이중으로 형질도입된 샘플에서, CD3 염색에 의해 측정된 TCR 붕괴를 4개의 사분면 각각에서 평가하여, 단일-이식유전자 및 이중-이식유전자 양성 집단에서의 진행성 붕괴를 확인한다.
도 5a는 TCRα 유전자의 불변 영역의 엑손 1 내로 넉인된 유전자-트랩 이식유전자를 도시한 도면.
도 5b는 메가TAL에 의해 형질감염되고 후속적으로 유전자-트랩 이식유전자를 암호화하는 AAV에 의해 형질도입된 세포에서의 이식유전자 발현 및 TCRα 좌위 붕괴(CD3 염색)를 도시한 도면. 형질감염/형질도입 10일 후에 유세포분석에 의해 발현을 분석하였다. 대조군은 메가TAL 또는 AAV 단독으로 처리한 샘플을 포함하였다.
도 5c는 TCRα 유전자의 불변 영역의 엑손 1 내로 넉인된 유전자-트랩 CD19 CAR 이식유전자를 도시한 도면.
도 5d는 메가TAL로 형질감염되고 후속적으로 CD19 CAR 유전자-트랩 벡터를 암호화하는 AAV로 형질도입된 세포에서의 CD19 CAR 발현을 도시한 도면. 형질감염/형질도입 10일 후에 유세포분석에 의해 발현을 분석하였다. 대조군은 표준 CD19 CAR 렌티바이러스 벡터로 처리한 샘플을 포함한다.
도 5e는 CD19-발현 Nalm6 세포주에 대한 CD19 CAR의 세포독성을 도시한 도면. CD19 CAR 렌티바이러스 형질도입에 의해 그리고 CD19 CAR 유전자 트랩 넉인 벡터를 이용하여 생성된 CAR T 세포에 대해 동등한 세포독성을 나타낸다.
도 6은 게놈 편집 조건의 온도를 변경시키는 대표적인 실험으로부터의 결과를 도시한 도면. TCRα-표적화 메가TAL +/- AAV 주형 암호화 GFP를 이용하여 활성화된 PBMC를 형질도입하였다. 형질감염 후 24시간 동안 30℃ 또는 37℃에서 세포를 배양시켰다. CD3 발현(NHEJ+HR) 또는 GFP 발현(HR 단독)의 상실을 분석함으로써 파손 수선 선택을 결정하였다. 30℃에서 세포 배양물은 TCRα 좌위에서의 NHEJ 사건을 최대화한 반면, 37℃에서 세포 배양물은 HR 속도를 극적으로 변화시키는 일 없이 CD3 붕괴가 감소되었다.
도 7a는 프로모터, CD19 Daric 성분을 암호화하는 핵산 서열, 및 TCRα 좌위의 불변 영역의 엑손 1로 넉인된 폴리아데닐화 신호를 포함하는 Daric 이식유전자를 도시한 도면.
도 7b는 메가TAL로 형질감염되고 후속적으로 Daric 이식유전자를 암호화하는 AAV로 형질도입된 세포에서의 CD19 Daric 이식유전자 발현을 도시한 도면. PE-접합된 재조합 CD19-Fc를 이용하여 염색함으로써 그리고 형질감염/형질도입 10일 후에 유세포 분석을 통해 분석함으로써 발현을 분석하였다. 대조군은 메가TAL 또는 AAV 단독으로 처리한 샘플을 포함하였다.
도 8a는 TCRα 좌위의 불변 영역의 엑손 1로 넉인된 상이한 길이의 상동성 아암, 프로모터, GFP를 암호화하는 핵산 서열, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 이식유전자를 도시한 도면.
도 8b는 메가TAL로 형질감염되고 후속적으로 GFP 이식유전자를 암호화하지만, 상이한 상동성 아암 길이를 갖는 AAV로 형질도입된 세포에서의 GFP 이식유전자 발현을 도시한 도면. 발현을 유세포 분석에 의해 분석하였다. 대조군은 비형질감염 샘플을 포함하였고, 샘플을 메가TAL 단독으로 처리하였다. 요약 막대 그래프 데이터에서 나타내는 바와 같이 모든 샘플에서 동등한 수준의 TCRα 붕괴가 관찰되었다.
도 9a는 24시간 동안 CD19 발현 Nalm-6 세포의 존재 하에 배양된 렌티바이러스 형질도입(LV-CAR T 세포) 또는 상동성 재조합 HR-CAR T 세포)에 의해 생성된 항-CD19 CAR T 세포에 대한 T 세포 고갈 마커의 발현을 도시하는 도면.
도 9b는 72시간 동안 CD19 발현 Nalm-6 세포의 존재 하에 배양된 렌티바이러스 형질도입(LV-CAR T 세포) 또는 상동성 재조합 HR-CAR T 세포)에 의해 생성된 항-CD19 CAR T 세포에 대한 T 세포 고갈 마커의 발현을 도시하는 도면.
도 10a는 프로모터, CAR 및 WPRE을 암호화하는 핵산 서열, 및 TCRα 좌위의 불변 영역의 엑손 1로 넉인된 폴리아데닐화 신호를 포함하는 이식유전자를 도시한 도면.
도 10b는 TCRα 넉인 이식유전자가 WPRE 요소와 조합될 때 개선된 이식유전자를 나타내는 중앙값 형광 강도(MFI)를 사용하는 도면.
도 11a는 TCRα 좌위의 불변 영역의 엑손 1에 넉인된 2개의 이식유전자 설계를 도시한 도면. MND-인트론-CAR-WPRE 이식유전자는 프로모터, 인트론, CAR을 암호화하는 핵산 서열, WPRE 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다. MND-CAR-인트론-WPRE 이식유전자는 프로모터, 인트론, CAR을 암호화하는 핵산 서열, WPRE 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
도 11b는 TCRα 좌위에 넉인된 CAR이 내부 인트론 앞에 있거나 또는 내부 인트론을 가질 때 유사한 또는 감소된 이식유전자 발현을 도시한 도면.
도 12a는 TCRα 좌위의 불변 영역의 엑손 1에 넉인된 2방향성 이식유전자를 도시한 도면. 이식유전자는 우성 음성 TGFβRII를 암호화하는 핵산의 프로모터 유도 발현 및, 반대 배향에서, CAR을 암호화하는 핵산 서열의 프로모터 유도 발현을 포함한다. 대안의 설계는 T2A 리보솜 스킵 요소를 이용하여 우성 음성 TGFβRII 이식유전자와 CD19 CAR 이식유전자를 조합한다.
도 12b는 CD19 CAR 이식유전자 작제물의 발현과 조합된 TGFβRII 우성 음성 수용체의 발현을 도시한 도면. 도 13a는 TCRα 좌위의 불변 영역의 엑손 1에 넉인된 조작된 TCR 및 프로모터를 포함하는 이식유전자를 도시한 도면.
도 13b는 TCRα 좌위의 불변 영역의 엑손 1에 넉인된 TCT 작제물의 이식유전자 발현을 도시한 도면.
도 14는 조작된 TCR의 발현을 재구성하기 위해 2대립유전자 발현을 위해 설계된 2개의 이식유전자를 도시한 도면. 각각의 이식유전자는 TCRα 좌위의 하나의 대립유전자에 통합된 TCR 성분의 발현을 유도하는 프로모터를 포함한다.
도 15는 조작된 TCR의 발현을 재구성하기 위해 2대립유전자 발현을 위해 설계된 2개의 유전자-트랩 이식유전자를 도시한 도면. 각각의 이식유전자는 자기-절단성 2A 펩타이드, TCR의 성분, 및 폴리아데닐화 또는 TCRα 좌위의 하나의 대립유전자에 통합된 2A 펩타이드 서열을 포함한다.
도 16은 TCRα 좌위의 불변 영역의 엑손 1에 넉인된 2A 자기-절단 펩타이드, 플립 수용체 또는 우성 음성 사이토카인 수용체를 포함하는 유전자-트랩 이식유전자를 도시한 도면.
도 17은 TCRα 좌위의 불변 영역의 엑손 1에 넉인된 프로모터, 플립 수용체 또는 우성 음성 사이토카인 수용체를 포함하는 이식유전자를 도시한 도면.
도 18은 조작된 TCR 및 하나 이상의 플립 수용체의 발현을 재구성하기 위해 2대립유전자 발현을 위해 설계된 2개의 이식유전자를 도시한 도면. 각각의 이식유전자는 TCRα 좌위에서 하나의 대립유전자 내로 통합되고, TCR 성분의 발현을 유도하는 프로모터, 자기-절단성 2A 펩타이드, 및 선택적으로 플립 수용체 또는 우성 음성 사이토카인 수용체를 포함한다.
도 19는 조작된 TCR 및 하나 이상의 플립 수용체의 발현을 재구성하기 위해 2대립유전자 발현을 위해 설계된 2개의 유전자-트랩 이식유전자를 도시한 도면. 각각의 이식유전자는 TCRα 좌위에서 하나의 대립유전자에 통합되고, 자기-절단성 2A 펩타이드, TCR의 성분(예를 들어, TCRβ 또는 TCRα), 자기-절단성 2A 펩타이드, 및 선택적으로 플립 수용체 또는 우성 음성 사이토카인 수용체, 및 자기-절단성 2A 펩타이드 또는 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
서열 식별자의 간단한 설명
서열번호 1은 I-OnuI의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 2는 서열번호 1에 의해 암호화된 폴리펩타이드 서열을 제시한다.
서열번호 3 및 4는 게놈 편집을 위한 TCRα 표적 부위의 예시적 예를 제시한다.
서열번호 5 내지 7은 조작된 I-OnuI 변이체의 폴리펩타이드 서열을 제시한다.
서열번호 8은 플라스미드 pBW790의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 9는 플라스미드 pBW851의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 10은 TCRα I-OnuI 메가TAL 표적 부위를 제시한다.
서열번호 11은 TCRα I-OnuI 메가TAL의 예시적 예의 폴리펩타이드 서열을 제시한다.
서열번호 12는 플라스미드 pBW1019의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 13은 플라스미드 pBW1018의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 14는 플라스미드 pBW1020의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 15는 플라스미드 pBW841의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 16은 플라스미드 pBW400의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 17은 플라스미드 pBW1057의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 18은 플라스미드 pBW1058의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 19는 플라스미드 pBW1059의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 20은 플라스미드 pBW1086의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 21은 플라스미드 pBW1087의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 22는 플라스미드 pBW1088의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 23 내지 32는 다양한 예시적인 세포 침투성 펩타이드의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 33 내지 43는 다양한 예시적인 링커의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 34 내지 68은 프로테아제 절단 부위 및 세포-절단성 폴리펩타이드 절단 부위의 아미노산 서열을 제시한다.
A. 개요
본 명세서에 상정된 다양한 실시형태는 일반적으로, 부분적으로 개선된 적응 세포 요법에 관한 것이다. 개선된 적응 세포 요법은 T 세포 수용체(TCR) 발현, 예를 들어, T 세포 수용체 알파(TCRα) 유전자 또는 T 세포 수용체 베타(TCRβ) 유전자와 관련된 좌위의 게놈 편집을 통해 제조된 면역 효과기 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서 상정된 제조된 면역 효과기 세포 조성물은 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 염증 질환 및 면역결핍을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 수많은 병태의 치료 또는 예방에서 유용하다. 게놈 편집된 면역 효과기 세포는 원치않는 자가면역 반응의 감소된 위험에 기인하는 개선된 안전성, 보다 예측 가능한 유전자 발현을 이용하는 정확하게 표적화된 요법, 종양 미세환경에서의 증가된 지속 능력 및 증가된 효능을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 기존의 세포 기반 면역요법에 비해 수많은 이점을 제공한다.
특정 실시형태에서 상정된 게놈 편집 방법은, 부분적으로, T 세포 수용체 알파(TCRα) 유전자의 하나 이상의 대립유전자의 변형을 통해 실현된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 TCRα 대립유전자의 변형은 TCRα 대립유전자(들)의 발현을 제거하거나 또는 실질적으로 제거하고, TCRα 대립유전자(들)의 발현을 감소시키고/시키거나, TCRα 대립유전자(들)의 하나 이상의 기능을 손상시키거나, 실질적으로 손상시키거나 또는 제거하거나, 또는 TCRα 대립유전자(들) 비-기능성의 제공한다. 특정 실시형태에서, TCRα 기능은 세포 표면에 대한 CD3의 동원, MHC 의존적 인식 및 항원의 결합, TCRαβ 신호전달의 활성화를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다양한 실시형태에서 상정된 게놈 편집 방법은 T 세포 수용체 알파(TCRα) 유전자에서 표적 DNA 서열에 결합하고 이를 절단하도록 설계된 조작된 뉴클레아제를 포함한다. 특정 실시형태에서 상정된 조작된 뉴클레아제는 폴리뉴클레오타이드 주형, 예를 들어, 공여자 수선 주형의 부재 하에 비-상동성 말단 결합(NHEJ)에 의해, 또는 상동성 관련 수선(HDR), 즉, 공여자 수선 주형의 존재 하에 상동성 재조합에 의해 수선될 수 있는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에서 이중-가닥 파손을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서 상정된 조작된 뉴클레아제는 공여자 수선 주형의 존재 하에 세포의 염기-절단-수선(BER) 기작 또는 상동성 재조합을 이용하여 수선될 수 있는 단일-가닥 DNA 파손을 생성하는 틈내기효소로서 또한 유전자 조작될 수 있다. NHEJ는 유전자 기능의 작은 삽입 및 결실의 형성을 빈번하게 초래하는 오류 유발 과정이다. 상동성 재조합은 수선을 위한 주형으로서 상동성 DNA를 필요로 하며, 표적 부위에 측접하는 영역에 대해 상동성을 보유하는 서열에 의해 측면 중 하나에 측접하는 표적 부위에서 목적으로 하는 서열을 함유하는 공여자 DNA의 도입에 의해 특정된 변형의 제한없는 다양성을 생성하도록 영향력을 발휘할 수 있다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집 방법은, 부분적으로, 조작된 엔도뉴클레아제 및 말단-가공 효소를 통해 실현된다.
다양한 실시형태에서, DNA 파손은 세포의 TCRα 유전자에서 생성되며, 절단된 게놈 서열 말단의 NHEJ는 정상 TCR 발현, TCR 기능의 상실 또는 획득의 발현을 갖는 세포, 또는 바람직하게는, 기능성 TCR 발현이 없는, 예를 들어, 세포 표면에 대한 CD3의 능력이 없고, TCRαβ 신호전달을 활성화하며, MHC-항원 복합체를 인식하고 이에 결합하는 세포를 초래할 수 있다.
다양한 다른 실시형태에서, 절단된 TCRα 게놈 서열의 수선을 위한 공여자 주형이 제공되며, TCRα 대립유전자는 DNA 파손-부위에서 상동성 재조합에 의해 주형 서열을 이용하여 수선된다. 바람직한 실시형태에서, 수선 주형은 표적화된 게놈 서열과 상이한 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼, 또는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 게놈 편집 세포, 예를 들어, 면역 효과기 세포가 상정된다. 게놈 편집된 세포는 감소된 내인성 TCR 발현 및/또는 신호전달, TCRα 대립유전자 중 하나 또는 둘 다에서 생성된 DNA 파손에서 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼, 또는 조작된 수용체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 삽입 또는 통합을 포함하고, 그리고 선택적으로 렌티바이러스 형질도입을 통해 세포 내로 도입된 다른 면역효능 인핸서 또는 조작된 항원 수용체를 발현시킨다.
따라서, 본 명세서에 상정된 방법 및 조성물은 기존의 적응 세포 요법에 비해 비약적인 개선을 나타낸다.
특정 실시형태의 실행은 반대로 구체적으로 표시되지 않는 한, 기술 분야 내의 화학, 생화학, 유기 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기법, 유전학, 면역학 및 세포 생물학의 통상적인 방법을 사용할 것이며, 이 중 다수는 예시의 목적을 위해 이하에 나타낸다. 이러한 기법은 문헌에서 완전히 설명된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II(IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology];뿐만 아니라 문헌[Advances in Immunology]과 같은 저널의 논문을 참조한다.
B. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 물질은 특정 실시형태에서 사용될 수 있지만, 조성물, 방법 및 물질의 바람직한 실시형태가 본 명세서에 기재되어 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 다음의 용어를 이하에 정의한다.
단수 항목은 물품의 문법적 대상의 하나 이상(즉, 적어도 하나 또는 하나 이상)을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "및/또는"은 대안 중 하나, 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 다른 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% 또는 ± 1%만큼인 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
일 실시형태에서, 범위, 예를 들어, 1 내지 5, 약 1 내지 5, 또는 약 1 내지 약 5는 범위에 의해 포함되는 각각의 수치적 값을 지칭한다. 예를 들어, 하나의 비제한적 그리고 단지 예시적인 실시형태에서, 범위 "1 내지 5"는 표현 1, 2, 3, 4, 5; 또는 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 또는 5.0; 또는 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 또는 5.0과 동등하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 비해 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상인 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, "실질적으로 동일한"은 기준 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 거의 동일한 효과, 예를 들어, 생리적 효과를 생성하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다.
본 명세서 전체적으로 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 단계 또는 요소의 언급된 단계 또는 요소의 포함을 나타내지만, 단계들 또는 요소들의 임의의 다른 단계 또는 요소의 배제를 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다. "이루어진"은 어구 "이루어진"에 따르는 것 무엇이든지 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 것을 의미한다. 따라서, 어구 "이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 또는 의무적이라는 것과, 다른 요소가 존재하지 않을 수도 있다는 것을 나타낸다. "본질적으로 이루어진"은 어구 다음에 열거되고, 열거된 요소에 대한 개시내용에서 구체화된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 또는 이들에 기여하는 다른 요소로 제한된 임의의 요소를 포함하는 것을 의미한다. 따라서, 어구 "본질적으로 이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 또는 의무적이지만, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 실질적으로 영향을 미치는 다른 요소가 존재하지 않는다는 것을 나타낸다.
본 명세서 전체적으로 "일 실시형태", "실시형태", "특정 실시형태", "관련된 실시형태", "특정 실시형태", "추가적인 실시형태" 또는 "추가 실시형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 실시형태와 관련하여 기재된 특정 특징, 구조 또는 특징이 적어도 일 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체적으로 다양한 곳에서 앞서 언급한 어구의 출현은 동일한 실시형태에 관해 모두 필수적이지는 않다. 더 나아가, 특정 특징, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 또한 일 실시형태에서 특징의 긍정적 인용은 특정 실시형태에서 특징을 제외하기 위한 기준으로서 작용한다는 것이 이해된다.
"면역 효과기 세포"는 하나 이상의 효과기 기능(예를 들어, 세포독성 세포 사멸 활성, 사이토카인 분비, ADCC 및/또는 CDC의 유도)을 갖는 면역계의 임의의 세포이다. 특정 실시형태에서 상정된 예시적인 면역 효과기 세포는 T 림프구, 특히 세포독성 T 세포(CTL; CD8+ T 세포), TIL, 및 헬퍼 T 세포(HTL; CD4+ T 세포)이다. 일 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 자연 살해 T(NKT) 세포를 포함한다.
용어 "T 세포" 또는 "T 림프구"는 당업계에 인식되며, 흉선세포, 미경험 T 림프구, 미숙 T 림프구, 성숙 T 림프구, 휴지 T 림프구 또는 활성화된 T 림프구를 포함하는 것으로 의도된다. T 세포는 T 헬퍼(Th) 세포, 예를 들어 T 헬퍼 1(Th1) 또는 T 헬퍼 2(Th2) 세포일 수 있다. T 세포는 헬퍼 T 세포(HTL; CD4+ T 세포) CD4+ T 세포, 세포독성 T 세포(CTL; CD8+ T 세포), 종양 침윤성 세포독성 T 세포(TIL; CD8+ T 세포), CD4+CD8+ T 세포, CD4-CD8- T 세포 또는 T 세포의 임의의 다른 서브세트일 수 있다. 일 실시형태에서, T 세포는 NKT 세포이다. 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 T 세포의 다른 예시적 집단은 미경험 T 세포 및 기억 T 세포를 포함한다.
"강한 T 세포" 및 "젊은 T 세포"는 특정 실시형태에서 상호 호환적으로 사용되고, T 세포 표현형을 지칭하되, T 세포는 증식 및 분화의 동시 감소를 가능하게 한다. 특정 실시형태에서, 젊은 T 세포는 "미경험 T 세포"의 표현형을 가진다. 특정 실시형태에서, 젊은 T 세포는 다음의 생물학적 마커: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197 및 CD38 중 하나 이상 또는 모두를 포함한다. 일 실시형태에서, 젊은 T 세포는 다음의 마커 중 하나 이상 또는 모두를 포함한다: CD62L, CD127, CD197 및 CD38. 일 실시형태에서, 젊은 T 세포는 CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 및 LAG3의 발현이 없다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "증식"은 세포의 대칭 또는 비대칭 분화 중 하나인 세포 분화의 증가를 지칭한다. 특정 실시형태에서, "증식"은 T 세포의 대칭 또는 비대칭 분화를 지칭한다. 비처리 샘플에서의 샘플에 비해 처리 샘플에서의 세포 수 증가가 있는 경우에 "증가된 증식"이 일어난다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "분화"는 세포의 효능 또는 증식을 감소시키거나 또는 더 발생적으로 제한된 상태로 세포를 이동시키는 방법을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 분화된 T 세포는 면역 효과기 세포 기능을 획득한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "T 세포 제조" 또는 "T 세포의 제조 방법" 또는 비슷한 용어는 T 세포의 치료적 조성물을 생산하는 공정을 지칭하며, 이 제조 방법은 다음의 단계들: 채취, 자극, 활성화, 게놈 편집 및 확장 중 하나 이상 또는 모두를 포함할 수 있다.
용어 "생체외"는 일반적으로 유기체 밖에서 일어나는 활동, 예컨대 바람직하게는 천연 조건을 최소로 변경한 유기체 밖의 인공 환경에서 또는 이런 인공 환경 내 살아있는 조직 상에서 행해지는 실험 또는 측정을 지칭한다. 특정 실시형태에서, "생체외" 절차는 보통 멸균 조건 하에서 그리고 전형적으로 몇 시간 내지 약 24시간 동안(그러나 상황에 따라서 48시간 또는 72시간을 포함) 유기체로부터 취한 그리고 실험 장치에서 배양 또는 조절된 살아있는 세포 또는 조직을 수반한다. 특정 실시형태에서, 이러한 조직 또는 세포는 수집 및 냉동될 수 있고, 이후에 생체외 처리를 위해 해동된다. 살아있는 세포 또는 조직을 이용하여 며칠 이상 동안 지속되는 조직 배양 실험 또는 절차는 "시험관내"(특정 실시형태에서, 이 용어는 생체외와 상호 호환적으로 사용될 수 있지만)인 것으로 고려된다.
용어 "생체내"는 일반적으로 유기체 내에서 일어나는 활동, 예컨대 세포 자기-재생 및 세포 증식 또는 확장을 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "생체내 확장"은 생체내 수를 증가시키는 세포 집단의 능력을 지칭한다. 일 실시형태에서, 세포는 생체내에서 조작되거나 또는 변형된다.
용어 "자극"은 자극 분자(예를 들어, TCR/CD3 복합체)와 그의 동족 리간드가 결합됨으로써 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 형질도입을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 신호 형질도입 사건을 매개함으로써 유도되는 1차 반응을 지칭한다.
"자극 분자"는 동족 자극 리간드에 특이적으로 결합하는 T 세포 상의 분자를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "자극 리간드"는 항원 제시 세포(예를 들어, aAPC, 수지상 세포, B-세포 등) 상에 존재할 때 T 세포 상의 동족 결합 상대(본 명세서에서 "자극 분자"로서 지칭됨)에 특이적으로 결합함으로써, 활성화, 면역 반응의 개시, 증식 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 T 세포에 의한 1차 반응을 매개하는 리간드를 의미한다. 자극 리간드는 CD3 리간드, 예를 들어, 항-CD3 항체 및 CD2 리간드, 예를 들어, 항-CD2 항체 및 펩타이드, 예를 들어, CMV, HPV, EBV 펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "활성화"는 검출 가능한 세포 증식을 유도하기 위해 충분히 자극된 T 세포의 상태를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 활성화는 또한 유도된 사이토카인 생성, 및 검출 가능한 효과기 기능과 관련될 수 있다. 용어 "활성화된 T 세포"는 특히, 증식성인 T 세포를 지칭한다. TCR 단독을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하며, 하나 이상의 2차 또는 공동자극 신호가 또한 필요하다. 따라서, T 세포 활성화는 TCR/CD3 복합체 및 하나 이상의 2차 공동자극 신호를 통해 1차 자극 신호를 포함한다. 공동자극은 CD3/TCR 복합체를 통해 또는 CD2를 통해 1차 활성화 신호, 예컨대 자극을 받은 T 세포에 의한 증식 및/또는 사이토카인 생성에 의해 증명될 수 있다.　
"공동자극 신호"는 1차 신호, 예컨대 TCR/CD3 결찰과 조합하여, T 세포 증식, 사이토카인 생성, 및/또는 특정 분자의 상향조절 또는 하향조절(예를 들어, CD28)을 야기하는 신호를 지칭한다.
"공동자극 리간드"는 공동자극 분자에 결합하는 분자를 지칭한다. 공동자극 리간드는 가용성이거나 표면 상에 제공될 수 있다. "공동자극 분자"는 공동자극 리간드(예를 들어, 항-CD28 항체)에 특이적으로 결합하는 T 세포 상의 동종 결합 상대를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "자가 유래"는 공여자와 수용자가 동일한 대상체인 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "동종이계"는 공여자와 수용자 종이 동일하지만, 세포는 유전적으로 상이한 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "동계"는 공여자와 수용자 종이 동일하고, 공여자와 수용자가 상이한 개체이며, 공여자와 수용자 세포가 유전적으로 동일한 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "이종 발생성"은 공여자와 수용자 종이 상이한 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "개체" 및 "대상체"는 종종 상호 호환적으로 사용되며, 본 명세서의 다른 곳에 상정된 유전자 요법 벡터, 세포-기반 치료제, 및 방법을 이용하여 치료될 수 있는 암 또는 다른 면역 장애의 증상을 나타내는 임의의 동물을 지칭한다. 적합한 대상체(예를 들어, 환자)는 실험 동물(예컨대, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니픽), 농장 동물 및 가축 동물 또는 반려동물(예컨대 고양이 또는 개)을 포함한다. 비인간 영장류 및 바람직하게는, 인간 환자가 포함된다. 전형적인 대상체는 암 또는 다른 면역 장애를 갖거나, 또는 이들을 갖는 것으로 진단되거나 또는 가질 위험이 있는 인간 환자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "환자"는 본 명세서의 다른 곳에 개시된 유전자 요법 벡터, 세포-기반 치료제, 및 방법으로 치료될 수 있는 암 또는 다른 면역 장애로 진단된 대상체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "치료" 또는 "치료하는"은 질환 또는 병리적 병태의 증상 또는 병리에 대한 임의의 유리한 또는 바람직한 효과를 포함하고, 그리고 치료 중인 질환 또는 병태, 예를 들어, 암, 자가면역 질환, 면역 장애 등의 하나 이상의 측정 가능한 마커에서 심지어 최소의 감소를 포함할 수 있다. 치료는 선택적으로 질병 또는 병태 진행의 지연을 수반할 수 있다. "치료"는 질환 또는 병태, 또는 이의 관련된 증상의 완전한 근절 또는 치유를 반드시 나타내지 않는다.
본 명세서에서 사용되는, "예방하다" 및 유사한 단어, 예컨대 "예방", 예방된", "예방하는" 등은 질환 또는 병태, 예를 들어, 암, 자가면역 질환, 면역 장애 등의 발생 또는 재발 가능성을 예방하거나, 저해하거나 또는 감소시키기 위한 접근을 나타낸다. 이는 또한 질환 또는 병태의 개시 또는 재발을 지연시키거나 또는 질환 또는 병태의 증상의 발생 또는 재발을 지연시키는 것을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는, "예방" 및 유사한 단어는 또한 질환 또는 병태의 개시 또는 재발 전에 질환 또는 병태의 강도, 효과, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.
"본 명세서에서 사용되는, 어구 "의 적어도 하나의 증상을 개선시키는"은 대상체가 치료 중인 질환 또는 병태, 예를 들어, 예를 들어, 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 염증 질환 및 면역결핍증의 하나 이상의 증상을 감소시키는 것을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 치료 중인 질환 또는 병태는 암이되, 개선된 하나 이상의 증상은 쇠약, 피로, 숨가쁨, 멍이 잘듦 및 출혈, 빈번한 감염, 확장된 림프절, 복부 팽창 및 복부 통증(확장된 복부 기관에 기인), 뼈 또는 관절 통증, 골절, 계획하지 않은 체중 감소, 불량한 식욕, 도한, 지속적 미열, 및 감소된 배뇨(손상된 신장 기능에 기인)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "양"은 임상 결과를 포함하는, 유리한 또는 목적으로 하는 예방적 또는 치료적 결과를 달성하기 위한 게놈 편집된 효과기 세포, 예를 들어, T 세포의 "효과적인 양" 또는 "유효량"을 지칭한다.
"예방적 유효량"은 목적으로 하는 예방적 결과를 달성하는 데 효과적인 유전자 변형된 치료 세포의 양을 지칭한다. 전형적으로, 반드시는 아니지만, 예방적 용량은 질환의 초기 단계 전에 또는 초기에 대상체에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량 미만이다.
유전자 변형된 치료 세포의 "치료적 유효량"은 인자, 예컨대 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 중량, 및 개체에서 목적으로 하는 반응을 유도하는 게놈 편집된 면역 효과기 세포의 능력에 따라 다를 수 있다. 치료적 유효량은 또한 바이러스 또는 형질도입된 치료적 세포의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료적으로 유리한 효과보다 더 큰 것이다. 용어 "치료적 유효량"은 대상체(예를 들어, 환자)를 "치료하는 데" 효과적인 양을 포함한다. 치료적 양이 표시될 때, 투여될 특정 실시형태에서 상정된 조성물의 정확한 양은 본 명세서에 비추어 그리고 환자(대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 및 병태에서의 개개 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다.
"면역 장애"는 면역계로부터 반응을 유발하는 질환을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 용어 "면역 장애"는 암, 자가면역 질환, 또는 면역결핍증을 지칭한다. 일 실시형태에서, 면역 장애는 감염성 질환을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "암"은 일반적으로 비정상 세포가 제어 없이 분할되고 근처의 조직을 침윤할 수 있는 질환 또는 병태의 부류에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "악성"은 종양 세포의 그룹이 비제어 성장(즉, 정상 한계 이상의 분할), 침윤(즉, 인접한 조직 상의 침범 또는 파괴), 및 전이(즉, 림프 또는 혈액을 통해 신체 내 다른 위치로 확산) 중 하나 이상을 나타내는 암을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "전이하다"는 신체의 한 부분으로부터 다른 곳으로의 암의 확산을 지칭한다. 확산된 세포에 의해 형성된 종양은 "전이성 종양" 또는 "전이"로 불린다. 전이성 종양은 본래의(원발성) 종양에서의 세포와 유사한 세포를 함유한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "양성" 또는 "비-악성"은 더 크게 자랄 수 있지만, 신체의 다른 부분으로 확산되지 않는 종양을 지칭한다. 양성 종양은 자기-제한되고, 전형적으로 침윤 또는 전이되지 않는다.
"암 세포" 또는 "종양 세포"는 암성 성장 또는 조직의 개개 세포를 지칭한다. 종양은 일반적으로 양성, 악성 전 또는 악성일 수 있는 세포의 비정상적 성장에 의해 형성되는 팽윤 또는 병변에 관한 것이다. 대부분의 암은 종양을 형성하지만, 일부, 예를 들어, 백혈병은 반드시 종양을 형성하지는 않는다. 종양을 형성하는 해당 암에 대해, 용어 암(세포) 및 종양(세포)은 상호 호환적으로 사용된다. 개체에서 종양의 양은 종양의 수, 용적 또는 중량으로서 측정될 수 있는 "종양 부담"이다.
"자가면역 질환"은 신체가 그 자신의 조직의 일부 구성성분에 대한 면역원성(즉, 면역계) 반응을 생성하는 질환을 지칭한다. 다시 말해서, 면역계는 신체 내에서 "자신"으로서 일부 조직 또는 계를 인식하고 마치 그것이 이물질인 것처럼 표적화하고 공격하는 그의 능력을 상실한다. 자가면역 질환은 우세하게 하나의 기관이 영향받는 것(예를 들어, 용혈성 빈혈 및 자가면역 갑상선염), 및 자가면역 질환 과정이 다수의 조직을 통해 확산되는 것(예를 들어, 전신 홍반성 루푸스)으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 다발성 경화증은 뇌 및 척수의 신경 섬유를 둘러싸는 수초를 공격하는 T 세포에 의해 야기될 것으로 생각된다. 이는 협응의 상실, 쇠약 및 흐린 시력을 초래한다. 자가면역 질환은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 하시모토 갑상선염, 그레이브스씨병, 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 용혈성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 전신 홍반성 루푸스, 셀리악병, 크론병, 대장염, 당뇨병, 피부경화증, 건선 등을 포함한다.
"면역결핍증"은 질환에 의해 또는 화학물질의 투여에 의해 면역계가 손상된 환자의 상태를 의미한다. 이 병태는 이물질을 방어할 필요가 있는 혈액 세포의 수 및 유형이 부족한 시스템을 만든다. 면역결핍 병태 또는 질환은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, AIDS(후천성 면역결핍증 증후군), SCID(중증 복합 면역 결핍증), 선택적 IgA 결핍증, 공통 가변성 면역결핍증, X-연관 무감마글로불린혈증, 만성 육아종증, 고-IgM 증후군 및 당뇨병을 포함한다.
"감염성 질환"은 사람에서 사람에게 또는 유기체에서 유기체에게 전염될 수 있고, 미생물 또는 바이러스 제제에 의해 야기되는 질환(예를 들어, 보통 감기)을 지칭한다. 감염성 질환은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 간염, 성적으로 전염된 질환(예를 들어, 클라미디아, 임질), 결핵, HIV/AIDS, 디프테리아, 간염 B, 간염 C, 콜레라 및 인플루엔자를 포함한다.
"향상시키다" 또는 "촉진시키다" 또는 "증가시키다" 또는 "확장시키다" 또는 "강력하게 하다"는 비히클 또는 대조군 분자/조성물에 비해 더 큰 반응(즉, 생리적 반응)을 생성하거나, 유발하거나 또는 야기하는 본 명세서에 상정된 조성물의 능력을 지칭한다. 측정 가능한 반응은 당업계의 이해 및 본 명세서의 설명으로부터 명백한 것 중에서도 조작된 TCR 또는 CAR 발현의 증가, HR 또는 HDR 효율의 증가, 면역 효과기 세포 확장의 증가, 활성화, 지속성 및/또는 암 세포 사멸 능력의 증가를 포함할 수 있다. "증가된" 또는 "향상된" 양은 전형적으로 "통계학적으로 유의한" 양이고, 그리고 비히클 또는 대조군 조성물에 의해 생성되는 반응에 비해 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들어, 500, 1000배)(그 사이의 그리고 1초과의 모든 정수 및 소수점을 포함, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등)인 증가를 포함한다.
"감소하다" 또는 "저하시키다" 또는 "줄이다" 또는 "감소시키다" 또는 "없애다" 또는 "제거하다" 또는 "저해하다" 또는 "꺾다"는 비히클 또는 대조군 분자/조성물에 비해 더 적은 반응(즉, 생리적 반응)을 생성하거나, 유발하거나 또는 야기하는 본 명세서에 상정된 조성물의 능력을 지칭한다. 측정 가능한 반응은 내인성 TCR 발현 또는 기능의 감소, 면역 효과기 세포 고갈과 관련된 발현의 감소 등을 포함할 수 있다. "감소" 또는 "감소된" 양은 전형적으로 "통계학적으로 유의한" 양이고, 그리고 비히클 또는 대조군 조성물에 의해 생성되는 반응에 비해 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 이상(예를 들어, 500, 1000배)(그 사이의 그리고 1 초과의 모든 정수 및 소수점을 포함, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등)인 감소를 포함한다.
"유지하다" 또는 "보존하다" 또는 "유지" 또는 "변화없음" 또는 "실질적인 변화없음" 또는 "실질적인 감소 없음"은 일반적으로 비히클, 대조군 분자/조성물, 또는 특정 세포 계통에서의 반응 중 하나에 의해 야기되는 반응에 비해 세포에서 실질적으로 유사한 또는 비슷한 생리적 반응(즉, 하류 효과)을 생성하거나, 유발하거나 또는 야기하기 위해 본 명세서에 상정된 조성물의 능력을 지칭한다. 비슷한 반응은 기준 반응과 유의하게 상이하지 않은 또는 측정 가능하게 상이하지 않은 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "특이적 결합 친화도" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합된" 또는 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 표적화하다"는 배경 결합보다 더 큰 결합 친화도에서 하나의 분자의 다른 분자에 대한 결합을 기재한다. 결합 도메인이, 예를 들어, 약 105 M-1 이상의 친화도 또는 Ka(즉, 1/M의 단위로 특정 결합 상호작용의 평형 결합 상수)를 갖는 표적 분자에 결합하거나 또는 회합한다면, 결합 도메인은 표적 분자에 "특이적으로 결합한다". 특정 실시형태에서, 결합 도메인은 약 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1 또는 1013 M-1 이상의 Ka로 표적에 결합한다. "고친화도" 결합 도메인은 적어도 107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 적어도 1013 M-1 이상의 Ka를 갖는 해당 결합 도메인을 지칭한다.
대안적으로, 친화도는 M 단위(예를 들어, 10-5 M 내지 10-13 M 이하)를 갖는 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)로서 정의될 수 있다. 특정 실시형태에서 상정된 결합 도메인 폴리펩타이드 친화도는 통상적인 기법을 이용하여, 예를 들어, 경쟁적 ELISA(효소-결합 면역흡착 분석)에 의해, 또는 결합 회합, 또는 표지 리간드를 이용하는 대체 분석에 의해, 또는 표면-플라즈몬 공명 장치, 예컨대 뉴저지주 피츠카타웨이에 소재한 비아코어 인코포레이티드(Biacore, Inc.)로부터 입수 가능한 비아코어 T100, 또는 광학 바이오센서 기법, 예컨대 각각 코닝(Corning) 및 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)로부터 입수 가능한 EPIC 시스템 또는 EnSpire를 이용하여 용이하게 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660]; 및 미국 특허 제5,283,173호; 제5,468,614호, 또는 동등물).
일 실시형태에서, 특이적 결합의 친화도는 배경 결합보다 약 2배 초과, 배경 결합보다 약 5배 초과, 배경 결합보다 약 10배 초과, 배경 결합보다 약 20배 초과, 배경 결합보다 약 50배 초과, 배경 결합보다 약 100배 초과, 또는 배경 결합보다 약 1000배 초과이다.
"항원(Ag)"은 동물에 주사 또는 흡수된 조성물(예컨대, 종양-특이적 단백질을 포함하는 것)을 포함하여, 동물에서 항체 또는 T 세포 반응의 생성을 자극할 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질, 예를 들어, 지질, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 펩타이드 또는 핵산을 지칭한다. 항원은 이종성 항원, 예컨대 개시된 항원에 의해 유도된 것을 포함하는 특정 체액성 또는 세포성 면역 산물과 반응한다. "표적 항원" 또는 "관심 대상의 표적 항원"은 본 명세서에 상정된 조작된 항원 수용체의 결합 도메인이 결합되도록 설계된 항원이다. 일 실시형태에서, 항원은 MHC-펩타이드 복합체, 예컨대 클래스 I MHC-펩타이드 복합체 또는 클래스 II MHC-펩타이드 복합체이다.
"에피토프" 또는 "항원성 결정소"는 결합 제제가 결합하는 항원의 영역을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는, "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 천연 유래 상태에서 그것이 측접하는 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 단편에 정상적으로 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭한다. "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 또한 상보성 DNA(cDNA), 재조합 DNA 또는 천연에서 존재하지 않고 사람의 손에 의해 만들어진 다른 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "단리된 단백질", "단리된 펩타이드" 또는 "단리된 폴레펩타이드" 등은 세포 환경으로부터의, 그리고 세포의 다른 성분과의 회합으로부터의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 분자의 시험관내 합성, 단리 및/또는 정제를 지칭하며, 즉, 이는 생체내 물질과 유의하게 회합되어 있지 않다.
"단리된 세포"는 생체내 조직 또는 기관으로부터 얻고 세포외 기질이 실질적으로 없는 비 천연 유래 세포, 예를 들어, 천연에서 존재하지 않는 세포, 변형된 세포, 조작된 세포 등을 지칭한다.
"재조합"은 비상동성 말단 결합(non-homologous end joining: NHEJ) 및 상동성 재조합에 의한 공여자 포획을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 두 폴리뉴클레오타이드 사이의 유전자 정보 교환 과정을 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, "상동성 재조합(HR)"은, 예를 들어, 상동성 관련 수선(homology-directed repair: HDR) 메커니즘을 통한 세포 내 이중-가닥 파손의 수선 동안 일어나는 이러한 교환의 전문화된 형태를 지칭한다. 이 과정은 뉴클레오타이드 서열 상동성을 필요로 하며, "표적" 분자(즉, 이중-가닥 파손을 경험한 것)를 수선하기 위한 주형으로서 "공여자" 분자를 사용하고, 다양하게는 "비교차형 유전자 전환" 또는 "짧은 트랙 유전자 전환"으로서 알려져 있는데, 이는 공여자로부터 표적까지 유전자 정보의 전달을 야기하기 때문이다. 임의의 특정 이론에 의해 구속되는 일 없이, 이러한 전달은 파괴된 표적과 공여자 사이에 형성된 이형이중가닥 DNA의 미스매치 정정, 및/또는 공여자가 표적의 부분 및/또는 관련 과정이 되는 유전자 정보를 재합성하기 위해 사용되는 "합성-의존적 가닥 어닐링"을 수반할 수 있다. 이러한 전문화된 HR은 종종 공여자 폴리뉴클레오타이드 서열의 부분 또는 모두가 표적 폴리뉴클레오타이드 내로 혼입되도록 표적 분자 서열의 변경을 초래한다.
"절단"은 DNA 분자의 공유 골격의 파괴를 지칭한다. 절단은 포스포다이에스터 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단과 이중-가닥 절단이 둘 다 가능하다. 이중-가닥 절단은 2개의 별개의 단일-가닥 절단 사건 결과로서 생길 수 있다. DNA 절단은 평활말단 또는 엇갈린 말단 중 하나의 생성을 초래할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 폴리펩타이드는 표적화된 이중 가닥 DNA 절단을 위해 사용된다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합 및/또는 절단이 존재하기에 충분한 조건 하에서 결합 분자가 결합 및/또는 절단되는 핵산의 부분을 정하는 염색체 또는 염색체외 핵산 서열이다.
"외인성" 분자는 세포 내에 정상적으로 존재하지는 않지만, 하나 이상의 유전적, 생화학적 또는 다른 방법에 의해 세포 내로 도입되는 분자이다. 예시적인 외인성 분자는 소 유기 분자, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지방단백질, 다당류, 상기 분자의 임의의 변형된 유도체 또는 상기 분자 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 세포 내로 외인성 분자의 도입을 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 지질-매개 전달(즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포좀), 전기천공법, 직접 주사, 세포 융합, 입자총, 생체중합체 나노입자, 인산칼슘 공동침전, DEAE-덱스트란-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개 전달을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"내인성" 분자는 특정 환경 조건 하에 특정 발생기에서 특정 세포내에 정상적으로 존재하는 것이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아 또는 다른 세포기관의 게놈, 또는 천연 유래 에피솜 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가적인 내인성 분자는 단백질, 예를 들어, 내인성 TCR을 포함할 수 있다.
"유전자"는 이러한 조절 서열이 암호 및/또는 전사 서열에 인접해 있든 아니든 유전자 산물을 암호화하는 DNA 영역뿐만 아니라 유전자 산물의 생성을 조절하는 모든 DNA 영역을 지칭한다. 유전자는 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열, 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 유입 부위, 인핸서, 사일런서, 절연체, 경계 요소, 복제 기점, 기질 부착 부위 및 좌위 제어 영역을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"유전자 발현"은 유전자에 함유된 정부의 유전자 산물로의 전환을 지칭한다. 유전자 산물은 유전자의 직접적인 전사 생성물(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조적 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해 생성되는 단백질일 수 있다. 유전자 산물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 과정에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "게놈 편집"은 유전자 발현을 회복, 수정 및/또는 변형시키고 그리고/또는 하나 이상의 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼 및 조작된 항원 수용체를 발현시키는 목적을 위한 세포의 게놈 내 표적 부위에서의 유전자 물질의 치환, 결실 및/또는 도입을 지칭한다. 특정 실시형태에서 상정된 게놈 편집은 선택적으로 공여자 수선 주형의 존재 하에 세포 게놈에서 DNA 손상을 생성하기 위해 세포 내로 하나 이상의 유전자 조작된 뉴클레아제를 도입하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 조작된" 또는 "유전자 변형된"은 세포 내 총 유전자 물질에 대한 DNA 또는 RNA 형태의 외부 유전자 물질의 염색체 또는 염색체외 첨가를 지칭한다. 유전자 변형은 세포 게놈 내 특정 부위로 표적화되거나 또는 비표적화될 수 있다. 일 실시형태에서, 유전자 변형은 부위 특이적이다. 일 실시형태에서, 유전자 변형은 부위 특이적이지 않다.
C. 뉴클레아제
특정 실시형태에서 상정된 면역 효과기 세포 조성물은 TCR 알파(TCRα) 좌위 및 TCR 베타(TCRβ) 좌위를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 T 세포 수용체(TCR) 신호전달에 기여하는 하나 이상의 좌위를 표적화하는 조작된 뉴클레아제에 의해 달성된 게놈 편집에 의해 생성된다. 임의의 특정 이론에 의해 구속되는 일 없이, 조작된 뉴클레아제는 게놈 편집을 통해 TCR 신호전달 성분을 정확하게 파괴하도록 설계되고, 그리고 일단 뉴클레아제 활성 및 특이성이 입증되면, TCR 발현 및/또는 기능의 예측 가능한 붕괴를 야기함으로써, 더 안전하고 더 효능있는 치료적 면역 효과기 세포 조성물을 제공한다는 것이 상정된다.
특정 실시형태에서 상정된 조작된 뉴클레아제는 표적 서열에서 단일 가닥 DNA 틈 또는 이중-가닥 DNA 파손(DSB)을 생성한다. 더 나아가, DSB는 두 뉴클레아제의 사용에 의해 표적 DNA에서 달성되어 단일 가닥 틈을 생성할 수 있다(틈내기효소). 각각의 틈내기효소는 DNA의 하나의 가닥을 절단하고, 2 이상의 틈내기효소의 사용은 표적 DNA 서열에서 이중 가닥 파손(예를 들어, 엇갈린 이중 가닥 파손)을 생성할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 뉴클레아제는 DSB에서 상동성 재조합을 통해 DNA 파손 부위에서 표적 서열 내로 도입되는 공여자 수선 주형과 조합하여 사용된다.
게놈 편집에 적합한 본 명세서의 특정 실시형태에서 상정된 조작된 뉴클레아제는 하나 이상의 DNA 결합 도메인 및 하나 이상의 DNA 절단 도메인(예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 도메인), 및 선택적으로, 본 명세서에 상정된 하나 이상의 링커를 포함한다. "조작된 뉴클레아제"는 하나 이상의 DNA 결합 도메인 및 하나 이상의 DNA 절단 도메인을 포함하는 뉴클레아제를 지칭하되, 뉴클레아제는 DNA 절단 표적 서열에 인접한 DNA 결합 표적 서열에 결합하도록 설계 및/또는 변형되었다. 조작된 뉴클레아제는 천연 유래 뉴클레아제로부터 또는 이전에 조작된 뉴클레아제로부터 설계 및/또는 변형될 수 있다. 특정 실시형태에서 상정된 조작된 뉴클레아제는 하나 이상의 추가적인 기능성 도메인, 예를 들어, 5-3' 엑소뉴클레아제, 5-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제, 3-5'엑소뉴클레아제(예를 들어, Trex2), 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 헬리카제 또는 주형-의존적 DNA 중합효소 활성을 나타내는 말단-가공 효소의 말단-가공 효소 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
표적 서열에 결합하고 절단하도록 조작될 수 있는 뉴클레아제의 예시적인 예는 귀소 엔도뉴클레아제(메가뉴클레아제), 메가TAL, 전사 활성체-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 및 일정한 간격으로 분포하는 짧은 회문구조 반복부(clustered regularly-interspaced short palindromic repeat: CRISPR)/Cas 뉴클레아제 시스템을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 뉴클레아제는 하나 이상의 이종성 DNA-결합 및 절단 도메인(예를 들어, ZFN, TALEN, 메가TAL)을 포함한다(Boissel et al., 2014; Christian et al., 2010). 다른 실시형태에서, 천연 유래 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 선택된 표적 부위(예를 들어, 동족 결합 부위와 상이한 부위에 결합하도록 조작된 메가뉴클레아제)에 결합하도록 변경될 수 있다. 예를 들어, 메가뉴클레아제는 동족 결합 부위와 상이한 표적 부위에 결합하도록 설계되었다(Boissel et al., 2014). 특정 실시형태에서, 뉴클레아제는 표적 부위에 뉴클레아제를 표적화하기 위한 핵산 서열(예를 들어, CRISPR/Cas)을 필요로 한다.
1. 귀소 엔도뉴클레아제/메가뉴클레아제
다양한 실시형태에서, 귀소 엔도뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제는 TCR 알파(TCRα) 및 TCR 베타(TCRβ) 좌위를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 T 세포 수용체(TCR) 신호전달에 기여하는 하나 이상의 좌위에서 단일-가닥 틈 또는 이중-가닥 파손(DSB)에 결합하도록 그리고 이들을 도입하도록 조작된다. "귀소 엔도뉴클레아제" 및 "메가뉴클레아제"는 상호 호환적으로 사용되며, 12 내지 45개의 염기쌍 절단 부위를 인식하고 통상적으로 서열 및 구조 모티프에 기반한 5개의 패밀리로 그룹화된 천연 유래 뉴클레아제 또는 조작된 메가뉴클레아제를 지칭한다: LAGLIDADG, GIY-YIG, HNH, His-Cys 박스 및 PD-(D/E)XK.
조작된 HE는 천연에서 존재하지 않으며, 재조합 DNA 기법에 의해 또는 무작위 돌연변이유발에 의해 얻을 수 있다. 조작된 HE는 하나 이상의 아미노산 변형을 만드는 것에 의해, 예를 들어, 천연 유래 HE 또는 이전의 조작된 HE에서 하나 이상의 아미노산을 돌연변이, 치환, 첨가 또는 결실시킴으로써 얻을 수 있다. 특정 실시형태에서, 조작된 HE는 DNA 인식 계면에 대한 하나 이상의 아미노산 변경을 포함한다.
특정 실시형태에서 상정된 조작된 HE는 하나 이상의 링커 및/또는 추가적인 기능성 도메인, 예를 들어, 5-3' 엑소뉴클레아제, 5-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제, 3-5'엑소뉴클레아제(예를 들어, Trex2), 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 헬리카제 또는 주형-의존적 DNA 중합효소 활성을 나타내는 말단-가공 효소의 말단-가공 효소 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조작된 HE는 5-3' 엑소뉴클레아제, 5-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제, 3-5'엑소뉴클레아제(예를 들어, Trex2), 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 헬리카제 또는 주형-의존적 DNA 중합효소 활성을 나타내는 말단-가공 효소에 의해 T 세포 내로 도입된다. HE 및 3' 가공 효소는 별개로, 예를 들어, 상이한 벡터 또는 별개의 mRNA에, 또는 함께, 예를 들어, 융합 단백질로서, 또는 바이러스 자기-절단 펩타이드 또는 IRES 요소에 의해 분리되는 다시트론성 작제물에 도입될 수 있다.
"DNA 인식 계면"은 핵산 표적 염기와 상호작용하는 HE 아미노산 잔기뿐만 아니라 인접한 해당 잔기를 지칭한다. 각각의 HE에 대해, DNA 인식 계면은 측쇄-대-측쇄 및 측쇄-대-DNA 작제물의 광범위 네트워크를 포함하며, 이 중 대부분은 반드시 특정 핵산 표적 서열을 인식하는 데 독특하다. 따라서, 특정 핵산 서열에 대응하는 DNA 인식 계면의 아미노산 서열은 상당히 다르며, 임의의 천연 또는 조작된 HE의 특징이다. 비제한적 예로서, 천연 HE(또는 이전에 조작된 HE)의 DNA 인식 계면에서 국소화된 하나 이상의 아미노산 잔기가 변화된 HE 변이체의 라이브러리를 구성함으로써 특정 실시형태에서 상정된 조작된 HE가 유래될 수 있다. 라이브러리는 절단 분석을 이용하여 각각의 예측된 TCRα 좌위 표적 부위에 대한 표적 절단 활성에 대해 선별될 수 있다(예를 들어, 문헌[Jarjour et al., 2009. Nuc. Acids Res. 37(20):6871-6880] 참조).
LAGLIDADG 귀소 엔도뉴클레아제(LHE)는 메가뉴클레아제의 가장 잘 연구된 패밀리이고, 고세균에서 그리고 녹조류 및 진균에서의 세포소기관의 DNA에서 주로 암호화되며, 가장 전반적인 DNA 인식 특이성을 나타낸다. LHE은 단백질 쇄 당 1 또는 2개의 LAGLIDADG 촉매적 모티프를 포함하고, 각각 동종이량체 또는 단일쇄 단량체로서 작용한다. LAGLIDADG 단백질의 구조적 연구는 고도로 보존된 코어 구조를 동정하였고(Stoddard 2005), αββαββα 폴드를 특징으로 하며, LAGLIDADG 모티프는 이 폴드의 제1 나선에 속한다. LHE의 고도로 효율적이고 특이적인 절단은 신규하고, 고도로 특이적인 엔도뉴클레아제를 유도하기 위한 단백질 스캐폴드를 나타낸다. 그러나, 비-천연 또는 비정규 표적 부위에 결합하고 절단하기 위한 LHE의 유전자 조작은 표적 부위 내 염기쌍 위치의 2/3까지에서 그의 DNA 접촉점 및 절단 특이성을 변경시키기 위해 적절한 LHE 스캐폴드의 선택, 표적 좌위의 시험, 추정적 표적 부위의 선택, 및 LHE의 광범위 변경을 필요로 한다.
조작된 LHE로부터 설계될 수 있는 LHE의 예시적 예는 I-AabMI, I-AaeMI, I-AniI, I-ApaMI, I-CapIII, I-CapIV, I-CkaMI, I-CpaMI, I-CpaMII, I-CpaMIII, I-CpaMIV, I-CpaMV, I-CpaV, I-CraMI, I-EjeMI, I-GpeMI, I-GpiI, I-GzeMI, I-GzeMII, I-GzeMIII, I-HjeMI, I-LtrII, I-LtrI, I-LtrWI, I-MpeMI, I-MveMI, I-NcrII, I-Ncrl, I-NcrMI, I-OheMI, I-OnuI, I-OsoMI, I-OsoMII, I-OsoMIII, I-OsoMIV, I-PanMI, I-PanMII, I-PanMIII, I-PnoMI, I-ScuMI, I-SmaMI, I-SscMI 및 I-Vdi141I을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 조작된 LHE는 I-CpaMI, I-HjeMI, I-OnuI, I-PanMI 및 SmaMI으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 조작된 LHE는 I-OnuI이다. 예를 들어, 서열번호 1 및 2를 참조.
일 실시형태에서, 인간 TCRα 유전자를 표적화하는 조작된 I-OnuI LHE는 천연 I-OnuI로부터 생성되었다. 바람직한 실시형태에서, TCRα 유전자를 표적화하는 조작된 I-OnuI LHE는 이전에 조작된 I-OnuI로부터 생성되었다. 일 실시형태에서, 조작된 I-OnuI LHE는 서열번호 3에 제시된 인간 TCRα 유전자 표적 부위에 대해 생성되었다. 일 실시형태에서, 조작된 I-OnuI LHE는 서열번호 4에 제시된 인간 TCRα 유전자 표적 부위에 대해 생성되었다.
특정 실시형태에서, 조작된 I-OnuI LHE는 DNA 인식 계면에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, I-OnuI LHE는 I-OnuI의 DNA 인식 계면(Taekuchi et al. 2011. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 2011 Aug 9; 108(32): 13077-13082) 또는 서열번호 5, 6 또는 7에 제시된 것과 같은 I-OnuI의 조작된 변이체, 또는 이의 조작된 변이체와 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 포함한다.
일 실시형태에서, I-OnuI LHE는 I-OnuI의 DNA 인식 계면(Taekuchi et al. 2011. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 2011 Aug 9; 108(32): 13077-13082) 또는 서열번호 5, 6 또는 7에 제시된 바와 같은 I-OnuI의 조작된 변이체, 또는 이의 추가적인 조작된 변이체와 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 97%, 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 포함한다.
특정 실시형태에서, 조작된 I-OnuI LHE는 DNA 인식 계면에서, 특히 I-OnuI의 위치 24 내지 50, 68 내지 82, 180 내지 203 및 223 내지 240(서열번호 2)에 위치된 서브도메인에서의 하나 이상의 아미노산 치환 또는 변형 또는 서열번호 5, 6 또는 7,에 제시된 I-OnuI의 조작된 변이체 또는 이의 추가적인 조작된 변이체를 포함한다.
일 실시형태에서, 조작된 I-OnuI LHE는 전체 I-OnuI 서열 내의 어디에서나 위치된 추가적인 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환 또는 변형을 포함한다. 치환 및/또는 변형될 수 있는 잔기는 직접적으로 또는 물 분자를 통해 핵산 표적과 접촉되거나 또는 핵산 골격과 또는 뉴클레오타이드 염기와 상호작용하는 아미노산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 하나의 비제한적 예에서, 본 명세서에 상정된 조작된 I-OnuI LHE는 I-OnuI(서열번호 2)의 위치 19, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 68, 70, 72, 75, 76 77, 78, 80, 82, 168, 180, 182, 184, 186, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 223, 225, 227, 229, 231, 232, 234, 236, 238, 240으로 이루어진 위치군으로부터 선택된 적어도 하나의 위치에서 하나 이상의, 바람직하게는 적어도 5, 바람직하게는 적어도 10, 바람직하게는 적어도 15, 더 바람직하게는 적어도 20, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 25개의 치환 및/또는 변형, 또는 서열번호 5, 6 또는 7에 제시된 I-OnuI의 조작된 변이체 또는 이의 추가적인 조작된 변이체를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 조작된 I-OnuI LHE는 L26I, R28D, N32R, K34N, S35E, V37N, G38R, S40R, E42S, G44R, V68K, A70T, N75R, S78M, K80R, L138M, S159P, E178D, C180Y, F182G, I186K, S188V, S190G, K191N, L192A, G193K, Q195Y, Q197G, V199R, T203S, K207R, Y223S, K225W 및 D236E로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 변형을 포함한다.
일 실시형태에서, I-OnuI LHE는 서열번호 5, 6 또는 7에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 추가적인 조작된 변이체를 가진다.
2. 메가TAL
다양한 예시적 실시형태는 TCR 알파(TCRα) 및 TCR 베타(TCRβ) 좌위를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 T 세포 수용체(TCR) 신호전달에 기여하는 좌위의 표적 영역에 결합하고 이를 절단하는 메가TAL 뉴클레아제를 상정한다. "메가TAL"은 조작된 TALE DNA 결합 도메인을 포함하는 조작된 뉴클레아제 및 조작된 메가뉴클레아제를 지칭하며, 선택적으로 하나 이상의 링커 및/또는 추가적인 기능성 도메인, 예를 들어, 5-3' 엑소뉴클레아제, 5-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제, 3-5'엑소뉴클레아제(예를 들어, Trex2), 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 헬리카제 또는 주형-의존적 DNA 중합효소 활성을 나타내는 말단-가공 효소의 말단-가공 효소 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 메가TAL은 5-3' 엑소뉴클레아제, 5-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제, 3-5'엑소뉴클레아제(예를 들어, Trex2), 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 헬리카제 또는 주형-의존적 DNA 중합효소 활성을 나타내는 말단-가공 효소에 의해 T 세포 내로 도입된다. 메가TAL 및 3' 가공 효소는 별개로, 예를 들어, 상이한 벡터 또는 별개의 mRNA에, 또는 함께, 예를 들어, 융합 단백질로서, 또는 바이러스 자기-절단 펩타이드 또는 IRES 요소에 의해 분리되는 다시트론성 작제물에 도입될 수 있다.
"TALE DNA 결합 도메인"은 식물 전사체를 조작하기 위해 식물 전사 활성체를 모방하는 전사 활성체-유사 효과기(TALE 또는 TAL-효과기)의 DNA 결합 부분이다(예를 들어, 문헌[Kay et al., 2007. Science 318:648-651] 참조). 특정 실시형태에서 상정된 TALE DNA 결합 도메인은 드노보이거나 천연 유래 TALE, 예를 들어, 세균성 점무늬 병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria), 잔토모나스 가드네리(Xanthomonas gardneri), 잔토모나스 트란슬루센스(Xanthomonas translucens), 잔토모나스 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis), 잔토모나스 페르포란스(Xanthomonas perforans), 잔토모나스 알팔파(Xanthomonas alfalfa), 잔토모나스 시트리(Xanthomonas citri), 잔토모나스 에우베시카토리아(Xanthomonas euvesicatoria), 및 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae) 및 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanacearum)으로부터의 AvrBs3 및 brg11 및 hpx17로부터 조작된다. DNA 결합 도메인을 유도 및 설계하기 위한 TALE 단백질의 예시적인 예는 미국 특허 제9,017,967호 및 거기에 인용된 참고문헌에 개시되어 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 포함된다.
특정 실시형태에서, 메가TAL은 TALE DNA 결합 도메인의 그의 대응하는 표적 DNA 서열에 대한 결합에 연루된 하나 이상의 반복 단위를 포함하는 TALE DNA 결합 도메인을 포함한다. 단일 "반복 단위"(또한 "반복부"로서 지칭)는 전형적으로 길이가 33 내지 35개의 아미노산이다. 각각의 TALE DNA 결합 도메인 반복부 단위는 전형적으로 반복부의 위치 12 및/또는 13에서 반복부 가변 2-잔기(Repeat Variable Di-Residue: RVD)를 구성하는 1 또는 2개의 DNA-결합 잔기를 포함한다. 이들 TALE DNA 결합 도메인의 DNA 인식을 위한 천연(정규) 암호는 위치 12 및 13에서 HD 서열이 사이토신(C)에 대한 결합을 야기하고, NG가 T에, NI가 A에 결합하며, NN이 G, 또는 A에 결합하고, 그리고 NG가 T에 결합하도록 결정되었다. 특정 실시형태에서, 비-정규(비전형적) RVD가 상정된다.
특정 실시형태에서 상정된 특정 메가TAL에서 사용하기에 적합한 비정규 RVD의 예시적 예는 구아닌(G)에 대한 인식을 위해 HH, KH, NH, NK, NQ, RH, RN, SS, NN, SN, KN; 아데닌(A)의 인식을 위해 NI, KI, RI, HI, SI; 티민(T)의 인식을 위해 NG, HG, KG, RG; 사이토신(C)의 인식을 위해 RD, SD, HD, ND, KD, YG; A 또는 G의 인식을 위해 NV, HN; 그리고 A 또는 T 또는 G 또는 C의 인식을 위해 H*, HA, KA, N*, NA, NC, NS, RA, S*를 포함하지만, 이들로 제한되지 않되, (*)는 위치 13에서 아미노산이 없다는 것을 의미한다. 특정 실시형태에서 상정된 특정 메가TAL에서 사용하기에 적합한 RVD의 추가적인 예시적 예는 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 제8,614,092호에 개시된 것을 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 메가TAL은 3 내지 30개의 반복 단위를 포함하는 TALE DNA 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 메가TAL은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 TALE DNA 결합 도메인 반복 단위를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 메가TAL은 5 내지 13 반복 단위, 더 바람직하게는 7 내지 12 반복 단위, 더 바람직하게는 9 내지 11 반복 단위, 그리고 더 바람직하게는 9, 10 또는 11개의 반복 단위를 포함하는 TALE DNA 결합 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 메가TAL은 3 내지 30개의 반복 단위를 포함하는 TALE DNA 결합 도메인 및 TALE 반복 단위 세트의 C-말단에 위치된 20개의 아미노산을 포함하는 추가적인 단일 절단 TALE 반복부 단위, 즉, 추가적인 C-말단 절반-TALE DNA 결합 도메인 반복부 단위(본 명세서의 다른 곳에 개시된 C-캡의 아미노산 -20 내지 -1, 이하 참조)를 포함한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 메가TAL 본 명세서에 상정된 3.5 내지 30.5개의 반복 단위를 포함하는 TALE DNA 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 메가TAL은 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5, 9.5, 10.5, 11.5, 12.5, 13.5, 14.5, 15.5, 16.5, 17.5, 18.5, 19.5, 20.5, 21.5, 22.5, 23.5, 24.5, 25.5, 26.5, 27.5, 28.5, 29.5 또는 30.5 TALE DNA 결합 도메인 반복 단위를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 메가TAL은 5.5 내지 13.5 반복 단위, 더 바람직하게는 7.5-12.5 반복 단위, 더 바람직하게는 9.5-11.5 반복 단위, 및 더 바람직하게는 9.5, 10.5 또는 11.5 반복 단위를 포함하는 TALE DNA 결합 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 메가TAL은 "N-말단 도메인(NTD)" 폴리펩타이드, 하나 이상의 TALE 반복부 도메인/단위, "C-말단 도메인(CTD)" 폴리펩타이드, 및 조작된 메가뉴클레아제를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "N-말단 도메인(NTD)" 폴리펩타이드는 천연 유래 TALE DNA 결합 도메인의 N-말단 부분 또는 단편에 측접하는 서열을 지칭한다. TALE DNA 결합 도메인 반복 단위가 DNA에 결합하는 능력을 보유한다면, NTD 서열은, 존재한다면, 임의의 길이를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, NTD 폴리펩타이드는 TALE DNA 결합 도메인에 대해 적어도 120 내지 적어도 140개 이상의 아미노산 N-말단을 포함한다(0은 가장 N-말단의 반복부 단위의 아미노산 1이다). 특정 실시형태에서, NTD 폴리펩타이드는 TALE DNA 결합 도메인에 대해 적어도 약 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 또는 적어도 140개의 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 메가TAL은 잔토모나스(Xanthomonas) TALE 단백질의 적어도 약 +1 내지 +137에 대해 적어도 약 아미노산 +1 내지 +122의 NTD 폴리펩타이드를 포함한다(0은 가장 N-말단 반복부 단위의 아미노산 1이다). 특정 실시형태에서, NTD 폴리펩타이드는 잔토모나스 TALE 단백질의 TALE DNA 결합에 대해 적어도 약 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 또는 137개의 아미노산 N-말단을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 메가TAL은 랄스토니아(Ralstonia) TALE 단백질의 적어도 아미노산 +1 내지 +121의 NTD 폴리펩타이드를 포함한다(0은 가장 N-말단의 반복부 단위의 아미노산 1이다). 특정 실시형태에서, NTD 폴리펩타이드는 랄스토니아 TALE 단백질의 TALE DNA 결합에 대해 적어도 약 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 또는 137개의 아미노산 N-말단을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "C-말단 도메인(CTD)" 폴리펩타이드는 천연 유래 TALE DNA 결합 도메인의 C-말단 부분 또는 단편에 측접하는 서열을 지칭한다. TALE DNA 결합 도메인 반복 단위가 DNA에 결합하는 능력을 보유한다면, CTD 서열은, 존재한다면, 임의의 길이를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, CTD 폴리펩타이드는 TALE DNA 결합 도메인의 마지막 전체 반복부에 대해 적어도 20 내지 적어도 85개 이상의 아미노산을 포함한다(처음 20개의 아미노산은 마지막 C-말단의 전체 반복부 단위)에 대해 절반-반복부 단위 C-말단이다. 특정 실시형태에서, CTD 폴리펩타이드는 TALE DNA 결합 도메인의 마지막 전체 반복부에 대해 적어도 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 443, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 또는 적어도 85개의 아미노산 C-말단을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 메가TAL은 잔토모나스 TALE 단백질은 적어도 약 아미노산 -20 내지 -1의 CTD 폴리펩타이드를 포함한다(-20은 마지막 C-말단 전체 반복부 단위에 대해 절반-반복부 단위 C-말단의 아미노산 1임). 특정 실시형태에서, CTD 폴리펩타이드는 잔토모나스 TALE 단백질의 TALE DNA 결합 도메인의 마지막 전체 반복부에 대해 적어도 약 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 C-말단을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 메가TAL은 랄스토니아 TALE 단백질은 적어도 약 아미노산 -20 내지 -1의 CTD 폴리펩타이드를 포함한다(-20은 마지막 C-말단 전체 반복부 단위에 대해 절반-반복부 단위 C-말단의 아미노산 1임). 특정 실시형태에서, CTD 폴리펩타이드는 랄스토니아 TALE 단백질의 TALE DNA 결합 도메인의 마지막 전체 반복부에 대해 적어도 약 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 C-말단을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 메가TAL은 선택적으로 본 명세서의 다른 곳에 상정된 하나 이상의 링커 폴리펩타이드에 결합된 표적 서열에 결합하도록 조작된 TALE DNA 결합 도메인, 표적 서열에 결합하고 절단하도록 조작된 메가뉴클레아제, 및 선택적으로 NTD 및/또는 CTD 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 임의의 특정 이론에 의해 구속되는 일 없이, TALE DNA 결합 도메인, 및 선택적으로 NTD 및/또는 CTD 폴리펩타이드를 포함하는 메가 TAL은 조작된 메가뉴클레아제에 추가로 융합된 링커 폴리펩타이드에 융합된다는 것이 상정된다. 따라서, TALE DNA 결합 도메인은 메가뉴클레아제의 DNA 결합 도메인에 의해 결합된 표적 서열로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 뉴클레오타이드 내인 DNA 표적 서열에 결합한다. 이런 방법으로, 본 명세서에 상정된 메가TAL은 게놈 편집의 특이성 및 효율을 증가시킨다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 메가TAL은 하나 이상의 TALE DNA 결합 반복 단위 및 I-AabMI, I-AaeMI, I-AniI, I-ApaMI, I-CapIII, I-CapIV, I-CkaMI, I-CpaMI, I-CpaMII, I-CpaMIII, I-CpaMIV, I-CpaMV, I-CpaV, I-CraMI, I-EjeMI, I-GpeMI, I-GpiI, I-GzeMI, I-GzeMII, I-GzeMIII, I-HjeMI, I-LtrII, I-LtrI, I-LtrWI, I-MpeMI, I-MveMI, I-NcrII, I-Ncrl, I-NcrMI, I-OheMI, I-OnuI, I-OsoMI, I-OsoMII, I-OsoMIII, I-OsoMIV, I-PanMI, I-PanMII, I-PanMIII, I-PnoMI, I-ScuMI, I-SmaMI, I-SscMI, 및 I-Vdi141I, 또는 바람직하게는 I-CpaMI, I-HjeMI, I-OnuI, I-PanMI, 및 SmaMI, 또는 더 바람직하게는 I-OnuI로 이루어진 군으로부터 선택된 조작된 LHE를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 메가TAL은 NTD, 하나 이상의 TALE DNA 결합 반복 단위, CTD, 및 I-AabMI, I-AaeMI, I-AniI, I-ApaMI, I-CapIII, I-CapIV, I-CkaMI, I-CpaMI, I-CpaMII, I-CpaMIII, I-CpaMIV, I-CpaMV, I-CpaV, I-CraMI, I-EjeMI, I-GpeMI, I-GpiI, I-GzeMI, I-GzeMII, I-GzeMIII, I-HjeMI, I-LtrII, I-LtrI, I-LtrWI, I-MpeMI, I-MveMI, I-NcrII, I-Ncrl, I-NcrMI, I-OheMI, I-OnuI, I-OsoMI, I-OsoMII, I-OsoMIII, I-OsoMIV, I-PanMI, I-PanMII, I-PanMIII, I-PnoMI, I-ScuMI, I-SmaMI, I-SscMI, 및 I-Vdi141I, 또는 바람직하게는 I-CpaMI, I-HjeMI, I-OnuI, I-PanMI 및 SmaMI, 또는 더 바람직하게는 I-OnuI로 이루어진 군으로부터 선택된 조작된 LHE를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 메가TAL은 NTD, 약 9.5 내지 약 11.5개의 TALE DNA 결합 반복 단위, 및 I-AabMI, I-AaeMI, I-AniI, I-ApaMI, I-CapIII, I-CapIV, I-CkaMI, I-CpaMI, I-CpaMII, I-CpaMIII, I-CpaMIV, I-CpaMV, I-CpaV, I-CraMI, I-EjeMI, I-GpeMI, I-GpiI, I-GzeMI, I-GzeMII, I-GzeMIII, I-HjeMI, I-LtrII, I-LtrI, I-LtrWI, I-MpeMI, I-MveMI, I-NcrII, I-Ncrl, I-NcrMI, I-OheMI, I-OnuI, I-OsoMI, I-OsoMII, I-OsoMIII, I-OsoMIV, I-PanMI, I-PanMII, I-PanMIII, I-PnoMI, I-ScuMI, I-SmaMI, I-SscMI 및 I-Vdi141I, 또는 바람직하게는 I-CpaMI, I-HjeMI, I-OnuI, I-PanMI 및 SmaMI, 또는 더 바람직하게는 I-OnuI로 이루어진 군으로부터 선택된 조작된 I-OnuI LHE를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 메가TAL은 약 122개의 아미노산 내지 137개의 아미노산, 약 9.5개, 약 10.5개, 또는 약 11.5개의 결합 반복 단위의 NTD, 약 20개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산의 CTD, 및 I-AabMI, I-AaeMI, I-AniI, I-ApaMI, I-CapIII, I-CapIV, I-CkaMI, I-CpaMI, I-CpaMII, I-CpaMIII, I-CpaMIV, I-CpaMV, I-CpaV, I-CraMI, I-EjeMI, I-GpeMI, I-GpiI, I-GzeMI, I-GzeMII, I-GzeMIII, I-HjeMI, I-LtrII, I-LtrI, I-LtrWI, I-MpeMI, I-MveMI, I-NcrII, I-Ncrl, I-NcrMI, I-OheMI, I-OnuI, I-OsoMI, I-OsoMII, I-OsoMIII, I-OsoMIV, I-PanMI, I-PanMII, I-PanMIII, I-PnoMI, I-ScuMI, I-SmaMI, I-SscMI, 및 I-Vdi141I, 또는 바람직하게는 I-CpaMI, I-HjeMI, I-OnuI, I-PanMI, 및 SmaMI, 또는 더 바람직하게는 I-OnuI로 이루어진 군으로부터 선택된 조작된 I-OnuI LHE를 포함한다.
3. Talen
특정 실시형태에서, TCR 알파(TCRα) 및 TCR 베타 (TCRβ) 좌위를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 T 세포 수용체(TCR) 신호전달에 기여하는 좌위의 표적 영역에 결합하고 이를 절단하는 TALEN이 상정된다. "TALEN"은 본 명세서의 다른 곳에 상정된 조작된 TALE DNA 결합 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인(또는 이의 엔도뉴클레아제 절반-도메인)을 포함하는 조작된 뉴클레아제를 지칭하며, 그리고 선택적으로 하나 이상의 링커 및/또는 추가적인 기능성 도메인, 예를 들어, 5-3' 엑소뉴클레아제, 5-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제, 3-5'엑소뉴클레아제(예를 들어, Trex2), 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 헬리카제 또는 주형-의존적 DNA 중합효소 활성을 나타내는 말단-가공 효소의 말단-가공 효소 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, TALEN은 5-3' 엑소뉴클레아제, 5-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제, 3-5'엑소뉴클레아제(예를 들어, Trex2), 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 헬리카제 또는 주형-의존적 DNA 중합효소 활성을 나타내는 말단-가공 효소에 의해 T 세포 내로 도입된다. TALEN 및 3' 가공 효소는 별개로, 예를 들어, 상이한 벡터 또는 별개의 mRNA에, 또는 함께, 예를 들어, 융합 단백질로서, 또는 바이러스 자기-절단 펩타이드 또는 IRES 요소에 의해 분리되는 다시트론성 작제물에 도입될 수 있다.
일 실시형태에서, 표적화된 이중-가닥 절단은 2개의 TALEN에 의해 달성되며, 엔도뉴클레아제 절반-도메인을 각각 포함하여 촉매적으로 활성인 절단 도메인을 재구성하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 표적화된 이중-가닥 절단은 TALE DNA 결합 도메인 및 2개의 엔도뉴클레아제 절반-도메인을 포함하는 단일 폴리펩타이드를 이용하여 달성된다.
특정 실시형태에서 상정된 TALEN은 NTD, 약 3 내지 30개의 반복 단위, 예를 들어, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 반복 단위, 및 엔도뉴클레아제 도메인 또는 절반-도메인을 포함하는 TALE DNA 결합 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서 상정된 TALEN은 NTD, 약 3.5 내지 30.5 반복 단위, 예를 들어, 약 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5, 9.5, 10.5, 11.5, 12.5, 13.5, 14.5, 15.5, 16.5, 17.5, 18.5, 19.5, 20.5, 21.5, 22.5, 23.5, 24.5, 25.5, 26.5, 27.5, 28.5, 29.5 또는 30.5개의 반복 단위를 포함하는 TALE DNA 결합 도메인, CTD 및 엔도뉴클레아제 도메인 또는 절반-도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서 상정된 TALEN은 본 명세서의 다른 곳에 개시된 바와 같은 약 121개의 아미노산 내지 약 137개의 아미노산의 NTD, 약 9.5 내지 약 11.5 반복 단위를 포함하는 TALE DNA 결합 도메인(즉, 약 9.5, 약 10.5, 또는 약 11.5개의 반복 단위), 약 20개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산의 CTD 및 엔도뉴클레아제 도메인 또는 절반 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, TALEN은 제한 엔도뉴클레아제 유형의 엔도뉴클레아제 도메인을 포함한다. 제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 다수의 종에 존재하며, (인식 부위에서) DNA에 서열 특이적 결합을 할 수 있고, 결합 부위에서 또는 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소(예를 들어, IIS형)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하고, 분리 가능한 결합 및 엔도뉴클레아제 도메인을 가진다. 일 실시형태에서, TALEN은 본 명세서의 다른 곳에 상정된 적어도 하나의 IIS형 제한 효소 및 하나 이상의 TALE DNA-결합 도메인으로부터 엔도뉴클레아제 도메인(또는 엔도뉴클레아제 절반-도메인)을 포함한다.
특정 실시형태에서 상정된 TALEN에서 사용하기에 적합한 IIS형 제한 엔도뉴클레아제 도메인의 예시적 예는 "rebase.neb.com/cgi-bin/sublist?S"에 개시된 적어도 1633 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 엔도뉴클레아제 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서 상정된 TALEN에서 사용하기에 적합한 IIS형 제한 엔도뉴클레아제 도메인의 추가적인 예시적 예는 Aar I, Ace III, Aci I, Alo I, Alw26 I, Bae I, Bbr7 I, Bbv I, Bbv II, BbvC I, Bcc I, Bce83 I, BceA I, Bcef I, Bcg I, BciV I, Bfi I, Bin I, Bmg I, Bpu10 I, BsaX I, Bsb I, BscA I, BscG I, BseR I, BseY I, Bsi I, Bsm I, BsmA I, BsmF I, Bsp24 I, BspG I, BspM I, BspNC I, Bsr I, BsrB I, BsrD I, BstF5 I, Btr I, Bts I, Cdi I, CjeP I, Drd II, EarI, Eci I, Eco31 I, Eco57 I, Eco57M I, Esp3 I, Fau I, Fin I, Fok I, Gdi II ,Gsu I, Hga I, Hin4 II, Hph I, Ksp632 I ,Mbo II, Mly I, Mme I, Mnl I, Pfl1108, I Ple I, Ppi I Psr I, RleA I, Sap I, SfaN I, Sim I, SspD5 I, Sth132 I, Sts I, TspDT I, TspGW I, Tth111 II, UbaP I, Bsa I 및 BsmB I로 이루어진 군으로부터 선택된 엔도뉴클레아제의 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 TALEN은 Fok I IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 엔도뉴클레아제 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 TALEN은 TALE DNA 결합 도메인 및 절단 특이성을 향상시키기 위해 적어도 하나의 IIS형 제한 엔도뉴클레아제로부터의 엔도뉴클레아제 절반-도메인을 포함하되, 선택적으로, 엔도뉴클레아제 절반-도메인은 동종이량체화를 최소화하거나 또는 방지하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시형태에서 상정된 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 절단 절반-도메인의 예시적인 예는 미국 특허 공개 제20050064474호; 제20060188987호, 제20080131962호, 제20090311787호; 제20090305346호; 제20110014616호 및 제20110201055호에 개시된 것을 포함하며, 이들 각각은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
4. 아연 핑거 뉴클레아제
특정 실시형태에서, TCR 알파(TCRα) 및 TCR 베타 (TCRβ) 좌위를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 T 세포 수용체(TCR) 신호전달에 기여하는 좌위의 표적 영역에 결합하고 이를 절단하는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)가 상정된다. "ZFN"은 하나 이상의 아연 핑거 DNA 결합 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인(또는 이의 엔도뉴클레아제 절반-도메인)을 포함하는 조작된 뉴클레아제를 지칭하고, 그리고 선택적으로 하나 이상의 링커 및/또는 추가적인 기능성 도메인, 예를 들어, 5-3' 엑소뉴클레아제, 5-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제, 3-5'엑소뉴클레아제(예를 들어, Trex2), 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 헬리카제 또는 주형-의존적 DNA 중합효소 활성을 나타내는 말단-가공 효소의 말단-가공 효소 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, ZFN은 5-3' 엑소뉴클레아제, 5-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제, 3-5'엑소뉴클레아제(예를 들어, Trex2), 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 헬리카제 또는 주형-의존적 DNA 중합효소 활성을 나타내는 말단-가공 효소에 의해 T 세포 내로 도입된다. ZFN 및 3' 가공 효소는 별개로, 예를 들어, 상이한 벡터 또는 별개의 mRNA에, 또는 함께, 예를 들어, 융합 단백질로서, 또는 바이러스 자기-절단 펩타이드 또는 IRES 요소에 의해 분리되는 다시트론성 작제물에 도입될 수 있다.
일 실시형태에서, 표적화된 이중-가닥 절단은 2개의 ZFN을 이용하여 달성되며, 엔도뉴클레아제 절반-도메인을 각각 포함하여 촉매적으로 활성인 절단 도메인을 재구성하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 표적화된 이중-가닥 절단은 하나 이상의 아연 핑거 DNA 결합 도메인 및 2개의 엔도뉴클레아제 절반-도메인을 포함하는 단일 폴리펩타이드를 이용하여 달성된다.
일 실시형태에서, ZNF는 본 명세서의 다른 곳에 상정된 TALE DNA 결합 도메인, 아연 핑거 DNA 결합 도메인, 및 본 명세서의 다른 곳에 상정된 엔도뉴클레아제 도메인(또는 엔도뉴클레아제 절반-도메인)을 포함한다.
일 실시형태에서, ZNF는 아연 핑거 DNA 결합 도메인, 및 본 명세서의 다른 곳에 상정된 메가뉴클레아제를 포함한다.
특정 실시형태에서, ZFN은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이상의 아연 핑거 모티프 및 엔도뉴클레아제 도메인(또는 엔도뉴클레아제 절반-도메인)을 갖는 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 포함한다. 전형적으로, 단일 아연 핑거 모티프는 길이가 약 30개인 아미노산이다. 아연 핑거 모티프는 정규 C2H2 아연 핑거와 비정규 아연 핑거 둘 다, 예를 들어, C3H 아연 핑거와 C4 아연 핑거를 포함한다.
아연 핑거 결합 도메인은 임의의 DNA 서열에 결합하도록 유전자 조작될 수 있다. 주어진 3 bp DNA 표적 서열에 대한 후보 아연 핑거 DNA 결합 도메인이 동정되었고, 모듈 어셈블리 전략은 대응하는 복합 DNA 표적 서열에 표적화된 다중-핑거 펩타이드 내로 복수의 도메인을 연결하기 위해 고안되었다. 당업계에 공지된 다른 적합한 방법은 또한 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 암호화하는 핵산, 예를 들어, 파지 디스플레이, 무작위 돌연변이유발, 조합 라이브러리, 컴퓨터/합리적 설계, 친화도 선택, PCR, cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터의 클로닝, 합성 구조 등을 설계하고 구성하기 위해 사용될 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 제5,786,538호; 문헌[Wu et al., PNAS 92:344-348(1995); Jamieson et al., Biochemistry 33:5689-5695 (1994); Rebar & Pabo, Science 263:671-673(1994); Choo & Klug, PNAS 91:11163-11167(1994); Choo & Klug, PNAS 91: 11168-11172(1994); Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993); Desjarlais & Berg, PNAS 89:7345-7349 (1992); Pomerantz et al., Science 267:93-96(1995); Pomerantz et al., PNAS 92:9752-9756(1995); Liu et al., PNAS 94:5525-5530 (1997); Griesman & Pabo, Science 275:657-661(1997); Desjarlais & Berg, PNAS 91:11-99-11103(1994)] 참조).
개개 아연 핑거 모티프는 3 또는 4개의 뉴클레오타이드 서열에 결합한다. 아연 핑거 결합 도메인이 결합하는 서열(예를 들어, 표적 서열)의 길이는 조작된 아연 핑거 결합 도메인에서 아연 핑거 모티프 수를 결정할 것이다. 예를 들어, 아연 핑거 모티프가 중복 서브세트에 결합하지 않는 ZFN에 대해, 6개의 뉴클레오타이드 표적 서열은 2-핑거 결합 도메인에 의해 결합되고; 9개-뉴클레오타이드 표적 서열은 3-핑거 결합 도메인에 의해 결합된다. 특정 실시형태에서, 표적 부위에서 개개 아연 핑거 모티프에 대한 DNA 결합 부위는 인접해 있을 필요는 없지만, 다중-핑거 결합 도메인 내 아연 핑거 모티프 사이의 링커 서열의 길이 및 특성에 따라서 하나 또는 몇몇 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 ZNF는 본 명세서의 다른 곳에 상정된 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이상의 아연 핑거 모티프를 포함하는 아연 핑거 DNA 결합 도메인, 및 적어도 하나의 IIS형 제한 효소로부터의 엔도뉴클레아제 도메인 또는 절반-도메인 및 하나 이상의 TALE DNA-결합 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 ZNF는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이상의 아연 핑거 모티프를 포함하는 아연 핑거 DNA 결합 도메인, 및 엔도뉴클레아제 도메인 또는 Aar I, Ace III, Aci I, Alo I, Alw26 I, Bae I, Bbr7 I, Bbv I, Bbv II, BbvC I, Bcc I, Bce83 I, BceA I, Bcef I, Bcg I, BciV I, Bfi I, Bin I, Bmg I, Bpu10 I, BsaX I, Bsb I, BscA I, BscG I, BseR I, BseY I, Bsi I, Bsm I, BsmA I, BsmF I, Bsp24 I, BspG I, BspM I, BspNC I, Bsr I, BsrB I, BsrD I, BstF5 I, Btr I, Bts I, Cdi I, CjeP I, Drd II, EarI, Eci I, Eco31 I, Eco57 I, Eco57M I, Esp3 I, Fau I, Fin I, Fok I, Gdi II ,Gsu I, Hga I, Hin4 II, Hph I, Ksp632 I ,Mbo II, Mly I, Mme I, Mnl I, Pfl1108, I Ple I, Ppi I Psr I, RleA I, Sap I, SfaN I, Sim I, SspD5 I, Sth132 I, Sts I, TspDT I, TspGW I, Tth111 II, UbaP I, Bsa I 및 BsmB I로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 IIS형 제한 효소로부터의 절반-도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 ZNF는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 이상의 아연 핑거 모티프를 포함하는 아연 핑거 DNA 결합 도메인, 및 엔도뉴클레아제 도메인 또는 Fok I IIS형 제한 엔도뉴클레아제로부터의 절반-도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 ZFN은 아연 핑거 DNA 결합 도메인 및 절단 특이성을 향상시키기 위해 적어도 하나의 IIS형 제한 엔도뉴클레아제로부터의 엔도뉴클레아제 절반-도메인을 포함하되, 선택적으로, 엔도뉴클레아제 절반-도메인은 동종이량체화를 최소화하거나 또는 방지하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
5. CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템
다양한 실시형태에서, CRISPR(일정한 간격으로 분포하는 짧은 회문구조 반복부)/Cas(CRISPR 회합) 뉴클레아제 시스템은 TCR 알파(TCRα) 및 TCR 베타(TCRβ) 좌위를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 T 세포 수용체(TCR) 신호전달에 기여하는 하나 이상의 좌위에서 단일-가닥 틈 또는 이중-가닥 파손(DSB)에 결합하도록 그리고 이들을 도입하도록 조작된다. CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 포유류 게놈 유전자 조작을 위해 사용될 수 있는 박테리아 시스템에 기반한 최근에 조작된 뉴클레아제 시스템이다. 예를 들어, 문헌[Jinek et al. (2012) Science 337:816-821; Cong et al. (2013) Science 339:819-823; Mali et al. (2013) Science 339:823-826; Qi et al. (2013) Cell 152:1173-1183; Jinek et al. (2013), eLife 2:e00471; David Segal (2013) eLife 2:e00563; Ran et al. (2013) Nature Protocols 8(11):2281-2308; Zetsche et al. (2015) Cell 163(3):759-771]을 참조하며, 이들 각각은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
일 실시형태에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 Cas 뉴클레아제 및 Cas 뉴클레아제를 표적 부위에 동원하는 하나 이상의 RNA, 예를 들어, 전사활성 cRNA(tracrRNA) 및 CRISPR RNA(crRNA), 또는 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 포함한다. crRNA 및 tracrRNA는 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로서 본 명세서에서 지칭되는 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열로 유전자 조작될 수 있다.
일 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 이중-가닥 DNA 엔도뉴클레아제 또는 틈내기효소 또는 촉매적으로 사멸된 Cas로서 유전자 조작되고, TCRα 또는 TCRβ 좌위 내에 위치된 프로토스페이서 표적 서열의 부위 특이적 DNA 인식 및 부위-특이적 절단을 위해 crRNA 및 tracrRNA, 또는 sgRNA와의 표적 복합체를 형성한다. 프로토스페이서 모티프는 Cas/RNA 복합체를 동원하는 데 어떤 역할을 하는 짧은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 인접한다. Cas 폴리펩타이드는 Cas 폴리펩타이드에 특이적인 PAM 모티프를 인식한다. 따라서, CRISPR/Cas 시스템은 특정 Cas 폴리펩타이드에 특이적인 특정 3' PAM 서열에 측접되는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 가닥 중 하나 또는 둘 다를 표적화하고 절단하기 위해 사용될 수 있다. PAM은 생물정보학을 이용하여 또는 실험 접근을 이용하여 동정될 수 있다. 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Esvelt et al.,2013, Nature Methods. 10(11):1116-1121] 참조.
일 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 하나 이상의 이종성 DNA 결합 도메인, 예를 들어, TALE DNA 결합 도메인 또는 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 포함한다. TALE 또는 아연 핑거 DNA 결합 도메인에 대한 Cas 뉴클레아제의 융합은 DNA 절단 효율 및 특이성을 증가시킨다. 특정 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 선택적으로 하나 이상의 링커 및/또는 추가적인 기능성 도메인, 예를 들어, 5-3' 엑소뉴클레아제, 5-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제, 3-5'엑소뉴클레아제(예를 들어, Trex2), 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 헬리카제 또는 주형-의존적 DNA 중합효소 활성을 나타내는 말단-가공 효소의 말단-가공 효소 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 5-3' 엑소뉴클레아제, 5-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제, 3-5'엑소뉴클레아제(예를 들어, Trex2), 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 헬리카제 또는 주형-의존적 DNA 중합효소 활성을 나타내는 말단-가공 효소에 의해 T 세포 내로 도입된다. Cas 뉴클레아제 및 3' 가공 효소는 별개로, 예를 들어, 상이한 벡터 또는 별개의 mRNA에, 또는 함께, 예를 들어, 융합 단백질로서, 또는 바이러스 자기-절단 펩타이드 또는 IRES 요소에 의해 분리되는 다시트론성 작제물에 도입될 수 있다.
다양한 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 또는 Cpf1이다.
특정 실시형태에서 상정된 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 Cas9 폴리펩타이드의 예시적인 예는 이하를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 박테리아종으로부터 얻을 수 있다: 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 이탈리쿠스(Enterococcus italicus), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 시리게리(Listeria seeligeri), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 안기노서스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 다이스갈락티애(Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코커스 에퀴누스(Streptococcus equinus), 스트렙토코커스 갈로리티쿠스(Streptococcus gallolyticus), 스트렙토코커스 마카카에(Streptococcus macacae), 스트렙토코커스 무탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 슈도포르시누스(Streptococcus pseudoporcinus), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 인판타리우스(Streptococcus infantarius), 스트렙토코커스 마세도니쿠스(Streptococcus macedonicus), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 파스테우리아누스(Streptococcus pasteurianus), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 스트렙토코커스 베스티불라리스(Streptococcus vestibularis), 스트렙토코커스 산구이니스(Streptococcus sanguinis), 스트렙토코커스 도우네이(Streptococcus downei), 네이세리아 바실리포르미스(Neisseria bacilliformis), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 네이세리아 플라베센스(Neisseria flavescens), 네이세리아 락타미카(Neisseria lactamica), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 네이세리아 서브플라바(Neisseria subflava), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 루미니스(Lactobacillus ruminis), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 산프란시센시스(Lactobacillus sanfranciscensis), 코리네박테리움 아콜렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 마트루코티(Corynebacterium matruchotii), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 트레포네마 빈센티(Treponema vincentii), 트레포네마 파게데니스(Treponema phagedenis), 및 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola).
특정 실시형태에서 상정된 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 Cpf1 폴리펩타이드의 예시적인 예는 이하를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 박테리아종으로부터 얻을 수 있다: 특히, 프란시셀라 종(Francisella spp.), 아시다미노코커스 종(Acidaminococcus spp.), 프레보텔라 종(Prevotella spp.), 라크노스피라세애 종(Lachnospiraceae spp.).
Cas9 오솔로그의 보존된 영역은 중앙 HNH 엔도뉴클레아제 도메인 및 분할 RuvC/RNase H 도메인을 포함한다. Cpf1 오솔로그는 RuvC/RNase H 도메인을 갖지만 인식할 수 있는 HNH 도메인을 갖지 않는다. HNH 및 RuvC-유사 도메인은 각각 이중-가닥 DNA 표적 서열의 하나의 가닥을 절단하는 것을 초래한다. Cas9 뉴클레아제 폴리펩타이드의 HNH 도메인은 tracrRNA:crRNA 또는 sgRNA에 상보성인 DNA 가닥을 절단한다. Cas9 뉴클레아제의 RuvC-유사 도메인은 tracrRNA:crRNA 또는 sgRNA에 상보성이 아닌 DNA 가닥을 절단한다. Cpf1은 이량체로서 작용하는 것으로 예측되되, Cpf1의 각각의 RuvC-유사 도메인은 표적 부위의 상보성 또는 비상보성 가닥 중 하나를 절단한다. 특정 실시형태에서, 변이체 도메인의 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 또는 제거하는 HNH 또는 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인에서 하나 이상의 아미노산 첨가, 결실, 돌연변이 또는 치환을 포함하는 Cas9 뉴클레아제 변이체(예를 들어, Cas9 틈내기효소)가 상정된다.
도메인에서 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 또는 제거하는 Cas9 HNH 돌연변이의 예시적 예는 이하를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes)(D10A); 스트렙토코커스 써모필루스(S. thermophilis)(D9A); 트레포네마 덴티콜라(T. denticola)(D13A); 및 네이세리아 메닌기티디스(N. meningitidis)(D16A).
도메인에서 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 또는 제거하는 Cas9 RuvC-유사 도메인 돌연변이의 예시적 예는 이하를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 스트렙토코커스 피오게네스(D839A, H840A 또는 N863A); 스트렙토코커스 써모필루스(D598A, H599A 또는 N622A); 트레포네마 덴티콜라 (D878A, H879A 또는 N902A); 및 네이세리아 메닌기티디스(D587A, H588A 또는 N611A).
D. 공여자 수선 주형
본 명세서의 특정 실시형태에서 상정된 면역 효과기 세포 조성물은 조작된 뉴클레아제에 의한 게놈 편집 및 하나 이상의 공여자 수선 주형의 도입에 의해 생성된다. 임의의 특정 이론에 의해 구속되는 일 없이, 세포 내 하나 이상의 조작된 뉴클레아제의 발현은 표적 부위, 예를 들어, TCRα 유전자에서 단일- 또는 이중 가닥 DNA 파손을 생성한다는 것; 및 공여자 수선 주형의 존재 하에 뉴클레아제 발현 및 파손 생성이 상동성 재조합에 의한 표적 부위에서 주형의 삽입 또는 통합을 야기함으로써 파손을 수선한다는 것을 상정한다.
다양한 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼, 또는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 세포에 상이한 면역억제성 경로를 표적화하는 면역효능 인핸서 및/또는 면역억제 신호 댐퍼를 독립적으로 암호화하는 복수의 공여자 수선 주형의 존재 하에 조작된 뉴클레아제를 제공하는 것은 증가된 치료적 효능 및 지속성을 갖는 게놈 편집된 T 세포를 수득한다는 것이 상정된다. 예를 들어, PD-1, LAG-3, CTLA-4, TIM-3, IL-10R, TIGIT 및 TGFβRII 경로의 조합을 표적화하는 면역효능 인핸서 또는 면역억제성 신호는 특정 실시형태에서 바람직할 수 있다.
특정 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 하나 이상의 상동성 아암을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "상동성 아암"은 표적 부위에서 뉴클레아제에 의해 도입된 DNA 파손에 측접하는 DNA 서열과 동일하거나 또는 거의 동일한 공여자 주형 내 핵산 서열을 지칭한다. 일 실시형태에서, 공여자 주형은 DNA 파손 부위의 DNA 서열 5'과 동일하거나 또는 거의 동일한 핵산을 포함하는 5' 상동성 아암을 포함한다. 일 실시형태에서, 공여자 주형은 DNA 파손 부위의 DNA 서열 3'과 동일하거나 또는 거의 동일한 핵산을 포함하는 3' 상동성 아암을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 공여자 주형은 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암을 포함한다.
특정 실시형태에서 상정된 상동성 아암의 적합한 길이의 예시적 예는 독립적으로 선택될 수 있고, 약 100bp, 약 200bp, 약 300bp, 약 400bp, 약 500bp, 약 600bp, 약 700bp, 약 800bp, 약 900bp, 약 1000bp, 약 1100bp, 약 1200bp, 약 1300bp, 약 1400bp, 약 1500bp, 약 1600bp, 약 1700bp, 약 1800bp, 약 1900bp, 약 2000bp, 약 2100bp, 약 2200bp, 약 2300bp, 약 2400bp, 약 2500bp, 약 2600bp, 약 2700bp, 약 2800bp, 약 2900bp, 또는 약 3000bp, 또는 더 긴 상동성 아암(상동성 아암의 모든 개재 길이를 포함)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 상동성 아암 길이의 추가적인 예시적 예는 약 100bp 내지 약 3000bp, 약 200bp 내지 약 3000bp, 약 300bp 내지 약 3000bp, 약 400bp 내지 약 3000bp, 약 500bp 내지 약 3000bp, 약 500bp 내지 약 2500bp, 약 500bp 내지 약 2000bp, 약 750bp 내지 약 2000bp, 약 750bp 내지 약 1500bp, 또는 약 1000bp 내지 약 1500bp(상동성 아암의 모든 개재 길이를 포함)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 5' 및 3' 상동성 아암의 길이는 약 500bp 내지 약 1500bp로부터 독립적으로 선택된다. 일 실시형태에서, 5' 상동성 아암은 약 1500bp이고, 3' 상동성 아암은 약 1000bp이다. 일 실시형태에서, 5' 상동성 아암은 약 600bp이고, 3' 상동성 아암은 약 600bp이다.
공여자 수선 주형은 본 명세서의 다른 곳에 상정된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 프로모터 및/또는 인핸서, 비번역 영역(untranslated region: UTR), 코작(Kozak) 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosomal entry site: IRES), 재조합효소 인식 부위(예를 들어, LoxP, FRT 및 Att 부위), 종결 코돈, 전사 종결 신호 및 세포-절단성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 에피토프 태그를 추가로 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 5' 상동성 아암, RNA 중합효소 II 프로모터, 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼 또는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 및 3'상동성 아암을 포함한다.
다양한 실시형태에서, TCRα 대립유전자는 5' 상동성 아암, 하나 이상의 세포-절단성 폴리펩타이드, 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼 또는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 3' 상동성 아암을 포함하는 공여자 수선 주형에 의해 변형된다.
1. 면역효능 인핸서
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 면역 효과기 세포는 면역효능 인핸서를 암호화하는 공여자 수선 주형의 존재 하에 TCRα 좌위에서 DSB를 도입함으로써 면역억제 인자에 대해 더 강하고 그리고/또는 저항성으로 만들어진다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역효능 인핸서"는 T 세포 활성화 및/또는 기능, 면역증강 인자, 및 면역억제성 신호를 종양 미세환경으로부터 T 세포 내 면역자극 신호로 전환시키는 비천연 유래 폴리펩타이드를 자극하고/하거나 강력하게 하는 비천연 유래 분자를 지칭한다.
특정 실시형태에서, 면역효능 인핸서는 이중특이성 T 세포 관여(BiTE) 분자; 사이토카인, 케모카인, 세포독소 및/또는 사이토카인 수용체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 면역증강 인자; 및 플립 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 면역효능 인핸서, 면역증강 인자 또는 플립 수용체는 단백질 탈안정화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다.
a. 이중특이성 T 세포 관여(BiTE) 분자
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 면역 효과기 세포는 이중특이성 T 세포 관여자(BiTE) 분자를 암호화하는 공여자 수선 주형의 존재 하에 TCRα 좌위에서 DSB를 도입함으로써 더 강하게 만들어진다. BiTE 분자는 본 명세서의 다른 곳에 상정된 바와 같은 표적 항원, 링커 또는 스페이서에 결합하는 제1 결합 도메인, 및 면역 효과기 세포 상의 자극 또는 공동자극 분자에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이분된(bipartite) 분자이다. 제1 및 제2 결합 도메인은 리간드, 수용체, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 렉틴 및 탄수화물로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
특정 실시형태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 항원 결합 도메인이다.
특정 실시형태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일 실시형태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 단일쇄 가변 단편(scFv)이다.
특정 실시형태에서 제1 결합 도메인에 의해 인식되고 결합될 수 있는 표적 항원의 예시적 예는 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2를 포함하는 EGFR 패밀리 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 서비빈, TAG72, TEM, VEGFR2 및 WT-1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
표적 항원의 다른 예시적 실시형태는 MHC-펩타이드 복합체를 포함하되, 선택적으로 펩타이드는 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2를 포함하는 EGFR 패밀리 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), MAGE1, NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 서비빈, TAG72, TEMs, VEGFR2 및 WT-1로부터 가공된다.
특정 실시형태에서 제2 결합 도메인에 의해 인식되고 결합되는 면역 효과기 상의 자극 또는 공동자극 분자의 예시적 예는 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, CD134, CD137 및 CD278을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, DSB는 조작된 뉴클레아제에 의해 TCRα 대립유전자에 포함되며, 그리고 BiTE를 포함하는 공여자 수선 주형은 세포에 도입되며, TCRα 대립유전자 내로 삽입된다.
b. 면역증강 인자
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 면역 효과기 세포는 게놈 편집된 세포 또는 종양 미세환경 내 세포에서 면역증강 인자를 증가시킴으로써 더 강력하게 된다. 면역증강 인자는 면역 효과기 세포에서 면역 반응을 강력하게 하는 특정 사이토카인, 케모카인, 세포독소, 및 사이토카인 수용체를 지칭한다. 일 실시형태에서, 사이토카인, 케모카인, 세포독소, 또는 사이토카인 수용체를 암호화하는 공여자 수선 주형의 존재 하에 TCRα 좌위에서 DSB를 도입함으로써 T 세포가 조작된다.
특정 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 IL-2, 인슐린, IFN-γ, IL-7, IL-21, IL-10, IL-12, IL-15 및 TNF-α로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 암호화한다.
특정 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, MCP-3 및 RANTES로 이루어진 군으로부터 선택된 케모카인을 암호화한다.
특정 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 퍼포린, 그랜자임 A 및 그랜자임 B으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 암호화한다.
특정 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 IL-2 수용체, IL-7 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체 및 IL-21 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인 수용체를 암호화한다.
c. 플립 수용체
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 면역 효과기 세포는 종양 미세환경에 의해 유발된 면역억제 인자에 의한 면역억제성 신호를 양성 면역자극 신호로 "플립핑(flipping)" 또는 "반전시킴으로써" 고갈에 대해 더 저항성으로 된다. 일 실시형태에서, 플립 수용체를 암호화하는 공여자 수선 주형의 존재 하에 TCRα 좌위에서 DSB를 도입함으로써 T 세포가 조작된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "플립 수용체"는 면역억제성 신호를 종양 미세환경으로부터 T 세포에서의 면역자극 신호로 전환시키는 비천연 유래 폴리펩타이드를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 플립 수용체는 면역억제 인자에 결합하는 엑소도메인, 막관통 도메인, 및 T 세포에 면역자극 신호를 도입하는 엔도도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.
일 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 엑소도메인 또는 면역억제성 사이토카인에 결합하는 세포외 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 면역강화 사이토카인 수용체의 엔도도메인을 포함하는 플립 수용체를 포함한다.
특정 실시형태에서, 플립 수용체는 IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-8 수용체, IL-10 수용체, IL-13 수용체, 또는 TGFβ 수용체의 세포외 사이토카인 결합 도메인인 면역억제성 사이토카인에 결합하는 엑소 도메인; CD4, CD8α, CD27, CD28, CD134, CD137, CD3 폴리펩타이드, IL-2 수용체, IL-7 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, 또는 IL-21 수용체로부터 단리된 막관통; 및 IL-2 수용체, IL-7 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, 또는 IL-21 수용체로부터 단리된 엔도도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 플립 수용체는 IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 또는 TGFβ에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 면역억제성 사이토카인에 결합하는 엑소 도메인; CD4, CD8α, CD27, CD28, CD134, CD137, CD3 폴리펩타이드, IL-2 수용체, IL-7 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, 또는 IL-21 수용체로부터 단리된 막관통; 및 IL-2 수용체, IL-7 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, 또는 IL-21 수용체로부터 단리된 엔도도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 면역억제 인자에 결합하는 엑소도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 공동자극 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 플립 수용체를 포함한다.
특정 실시형태에서 상정된 플립 수용체의 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 엑소도메인의 예시적 예는 ITIM 및/또는 ITSM을 포함하는 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 상정된 플립 수용체의 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 엑소도메인의 추가적인 예시적 예는PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, BTLA, CEACAM1, TIGIT, TGFβRII, IL4R, IL6R, CXCR1, CXCR2, IL10R, IL13Rα2, TRAILR1, RCAS1R 및 FAS의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 엑소도메인은 PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, IL10R, TIGIT 및 TGFβRII로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 면역억제 사이토카인에 결합하는 엑소도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 공동자극 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 플립 수용체를 포함한다.
특정 실시형태에서 상정된 플립 수용체의 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 막관통 도메인의 예시적 예는 다음의 단백질의 막관통 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, IL10R, TIGIT, 및 T-세포 수용체의 TGFβRII 알파 또는 베타쇄, CDδ, CD3ε, CDγ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154. 특정 실시형태에서, 면역자극 신호를 증가시키기 위해 TCR 신호전달 복합체, 예를 들어, CD3과 회합하는 막관통 도메인을 선택하는 것이 바람직할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 플립 수용체는 면역자극 신호를 유발하는 엔도도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "엔도도메인"은 면역수용체 타이로신 활성 모티프(ITAM), 공동자극 신호전달 도메인, 1차 신호전달 도메인, 또는 T 세포에서 면역자극 신호를 유발하는 것과 관련된 다른 세포내 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 면역자극 모티프 또는 도메인을 지칭한다.
특정 실시형태에서 상정된 플립 수용체의 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 엔도도메인의 예시적 예는 ITAM 모티프를 포함하는 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 상정된 플립 수용체의 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 엔도도메인의 추가적인 예시적 예는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM 또는 ZAP70로부터 단리된 공동자극 신호전달 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 상정된 플립 수용체의 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 엔도도메인의 추가적인 예시적 예는 IL-2 수용체, IL-7 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, 또는 IL-21 수용체로부터 단리된 엔도도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 상정된 플립 수용체의 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 엔도도메인의 추가적인 예시적 예는 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 단리된 1차 신호전달 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 플립 수용체는 PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, IL10R, TIGIT 또는 TGFβRII로부터의 세포외 도메인을 포함하는 엑소도메인; CD3 폴리펩타이드, CD4, CD8α, CD28, CD134, CD137, PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, IL10R 및 TGFβRII로부터의 막관통 도메인; 및 CD28, CD134, CD137, CD278 및/또는 CD3ζ로부터의 엔도도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 플립 수용체는 PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, IL10R, TIGIT 또는 TGFβRII로부터의 세포외 도메인을 포함하는 엑소도메인; CD3 폴리펩타이드, CD4, CD8α, CD28, CD134 또는 CD137로부터의 막관통 도메인; 및 CD28, CD134, CD137, CD278 및/또는 CD3ζ로부터의 엔도도메인을 포함한다.
i. PD-1 플립 수용체
PD-1은 종양 미세환경에 존재하는 T 세포 상에서 발현되고, 면역억제 인자에 의한 면역억제가 실시된다. PD-L1 및 PD-L2의 발현은 일부 인간 악성종양에서의 예후와 상관관계가 있다. PD-L1/PD-1 신호전달 경로는 T 세포 고갈의 하나의 중요한 조절 경로이다. PD-L1은 암세포 및 기질 세포에서 흔히 발현되고, 그리고 단클론성 항체를 이용하는 PD-L1/PD-1의 차단은 T 세포 항-종양 기능을 향상시킨다. PD-L2는 또한 PD-1에 결합하고, T 세포 기능을 음성으로 조절한다.
일 실시형태에서, DSB는 조작된 뉴클레아제에 의해 TCRα 대립유전자에 포함되며, 그리고 PD-1 플립 수용체를 포함하는 공여자 수선 주형은 세포에 도입되며, TCRα 대립유전자 내로 삽입된다.
특정 실시형태에서 상정된 PD-1 플립 수용체는 인간 PD-1 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인, PD-1, CD3 폴리펩타이드, CD4, CD8α, CD28, CD134 또는 CD137로부터의 막관통도메인, 및 CD28, CD134, CD137, CD278 및/또는 CD3ζ로부터의 엔도도메인을 포함한다.
ii. LAG-3 플립 수용체
림프구 활성화 유전자-3(LAG-3)은 T 세포 기능에 대해 다양한 생물학적 효과를 갖는 세포-표면 분자이다. LAG-3 신호전달은 자가면역 반응의 CD4+ 조절 T 세포 억제와 관련된다. 추가로, LAG-3 발현은 CD8+ T 세포의 항원 자극 시 증가되며 종양 미세환경에서 T 세포 고갈과 관련된다. LAG-3의 생체내 항체 차단은 항원-특이적 CD8+ T 세포의 증가된 축적 및 효과기 기능과 관련된다. 하나의 그룹은 특정 항종양 백신접종과 조합된 항-LAG-3 항체의 투여가 종양 내 활성화된 CD8+ T 세포 및 종양 실질의 붕괴에서의 상당한 증가를 초래하였다는 것을 나타내었다. Grosso et al. (2007). J Clin Invest. 117(11):3383-3392.
일 실시형태에서, DSB는 조작된 뉴클레아제에 의해 TCRα 대립유전자에 포함되며, 그리고 LAG-3 플립 수용체를 포함하는 공여자 수선 주형은 세포에 도입되며, TCRα 대립유전자 내로 삽입된다.
특정 실시형태에서 상정된 LAG-3 플립 수용체는 인간 LAG-3 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인, LAG-3, CD3 폴리펩타이드, CD4, CD8α, CD28, CD134 또는 CD137로부터의 막관통도메인, 및 CD28, CD134, CD137, CD278 및/또는 CD3ζ로부터의 엔도도메인을 포함한다.
iii. TIM-3 플립 수용체
T 세포 면역글로불린-3(TIM-3)은 음성 조절 분자로서 확인되었고, 면역 관용에서 어떤 역할을 한다. TIM-3 발현은 암에서 그리고 만성 감염동안 기능소실된 T 세포를 동정한다. TIM-3-발현 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 감소된 양의 사이토카인을 생성하거나 또는 항원에 대한 반응이 덜 증식성이다. 증가된 TIM-3 발현은 감소된 T 세포 증식 및 IL-2, TNF 및 IFN-γ의 감소된 생성과 관련된다. TIM-3 신호전달 경로의 차단은 증식을 회복시키며, 항원 특이적 T 세포에서 사이토카인 생성을 향상시킨다.
TIM-3은 공동발현되며 활성화된 T 세포 상에서 발현되고 T-세포 저해에 수반된 다른 잘 공지된 분자인 암매항원 세포 접착 분자 1(CEACAM1)과의 이형이량체를 형성한다. CEACAM1의 존재는 TIM-3에 저해 기능을 부여한다. CEACAM1은 각각의 분자의 고도로 관련된 막-원위 N-말단 도메인을 통해 시스로 이형이량체 상호작용을 형성함으로써 TIM-3의 성숙 및 세포 표면 발현을 용이하게 한다. CEACAM1 및 TIM-3은 또한 그들의 N-말단 도메인을 통해 트랜스로 결합된다.
일 실시형태에서, DSB는 조작된 뉴클레아제에 의해 TCRα 대립유전자에 포함되며, 그리고 TIM-3 플립 수용체를 포함하는 공여자 수선 주형은 세포에 도입되며, TCRα 대립유전자 내로 삽입된다.
특정 실시형태에서 상정된 TIM-3 플립 수용체는 인간 TIM-3 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인, TIM-3, CD3 폴리펩타이드, CD4, CD8α, CD28, CD134 또는 CD137로부터의 막관통도메인, 및 CD28, CD134, CD137, CD278 및/또는 CD3ζ로부터의 엔도도메인을 포함한다.
iv. CTLA-4 플립 수용체
CTLA4는 주로 T 세포 상에서 발현되며, 이는 T 세포 활성화의 초기 단계 진폭을 조절한다. CTLA4는 T 세포 공동자극 수용체인 CD28의 활성에 대응한다. TCR이 동족 항원에 의해 처음 맞물리지 않는 한 CD28은 T 세포 활성화에 영향을 미치지 않는다. 일단 항원 인식이 일어나면, CD28 신호전달은 TCR 신호전달을 강하게 증폭시켜 T 세포를 활성화시킨다. CD28 및 CTLA4는 동일한 리간드(CD80(또한 B7.1로서 알려짐) 및 CD86(또한 B7.2로서 알려짐))를 공유한다. CTLA4는 리간드 둘 다에 대해 훨씬 더 높은 전반적인 친화도를 가지며, CD80 및 CD86에 결합함에 있어서 CD28보다 뛰어난 것에 의해서뿐만 아니라 T 세포에 대한 저해 신호를 적극적으로 전달하는 것에 의해 T 세포의 활성화를 약화시킨다. CTLA4는 또한 CD28 맞물림으로부터 CD80 및 CD86의 격리뿐만 아니라 항원-제시 세포(APC) 표면으로부터 CD80 및 CD86의 적극적 제거를 통해 신호전달 독립적 T 세포 저해를 부여한다.
일 실시형태에서, DSB는 조작된 뉴클레아제에 의해 TCRα 대립유전자에 포함되며, 그리고 CTLA-4 플립 수용체를 포함하는 공여자 수선 주형은 세포에 도입되며, TCRα 대립유전자 내로 삽입된다.
특정 실시형태에서 상정된 CTLA-4 플립 수용체는 인간 CTLA-4 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인, CTLA-4, CD3 폴리펩타이드, CD4, CD8α, CD28, CD134 또는 CD137로부터의 막관통도메인, 및 CD28, CD134, CD137, CD278 및/또는 CD3ζ로부터의 엔도도메인을 포함한다.
v. TIGIT 플립 수용체
T 세포 면역글로불린 및 면역수용체 타이로신-기반 저해 모티프[ITIM] 도메인(TIGIT)는 다중 고체 종양 유형에 걸쳐 일시적으로 고도로 발현되는 것으로 동정된 T 세포 공동저해 수용체이다. TIGIT는 항종양 및 다른 CD8+ T 세포-의존적 만성 면역 반응을 제한한다. TIGIT는 인간 및 뮤린 종양-침윤성 T 세포 상에서 고도로 발현된다. TIGIT의 유전자 제거 또는 항체 차단은 시험관내 및 생체내에서 NK 세포 사멸 및 CD4+ T 세포 프라이밍을 향상시키는 것으로 나타났고 CD4+ T 세포-의존적 자가면역 질환, 예컨대 실험적 자가면역 뇌염의 중증도를 약화시킬 수 있다(Goding et al., 2013, Joller et al., 2011, Levin et al., 2011, Lozano et al., 2012, Stanietsky et al., 2009, Stanietsky et al., 2013, Stengel et al., 2012, Yu et al., 2009). 대조적으로, TIGIT-Fc 융합 단백질 또는 작용성 항-TIGIT 항체의 투여는 시험관내 T 세포 활성화 및 생체내 CD4+ T 세포-의존적 지연-유형 초민감성을 억제하였다(Yu et al., 2009). TIGIT는 그것이 CD155에 대한 결합을 위해 대응 공동자극 수용체 CD226보다 더 뛰어나게 함으로써 그의 면역억제 효과를 발휘할 가능성이 있다.
암과 만성 바이러스 감염 둘 다의 모델에서, TIGIT 및 PD-L1의 항체 공동차단은 CD8+ T 세포 효과기 기능을 상승적으로 그리고 특별하게 향상시켜서, 상당한 종양 및 바이러스 청소율을 각각 초래한다.
일 실시형태에서, DSB는 조작된 뉴클레아제에 의해 TCRα 대립유전자에 포함되며, 그리고 TIGIT 플립 수용체를 포함하는 공여자 수선 주형은 세포에 도입되며, TCRα 대립유전자 내로 삽입된다.
특정 실시형태에서 상정된 TIGIT 플립 수용체는 인간 TIGIT 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인, TIGIT, CD3 폴리펩타이드, CD4, CD8α, CD28, CD134 또는 CD137로부터의 막관통도메인, 및 CD28, CD134, CD137, CD278 및/또는 CD3ζ로부터의 엔도도메인을 포함한다.
vi. TGFβRII 플립 수용체
형질전환 성장인자-β(TGFβ)는 면역계의 다수 아암(arm)을 분극화시킬 수 있는 종양 세포 및 면역 세포에 의해 생성된 면역억제성 사이토카인이다. 종양 세포 및 종양-침윤성 림프구를 포함하는 면역억제성 사이토카인의 과생성은 면역억제성 종양 미세환경에 기여한다. TGFβ는 종양 전이 및 침윤과 빈번하게 관련되어, 암을 갖는 환자에서의 면역 세포의 기능 및 불량한 예후를 저해한다. 종양-특이적 CTL에서 TGFβRII를 통한 TGFβ 신호전달은 종양 내 그들의 기능 및 빈도를 약화시키며, 단클론성 항체를 갖는 CD8+ T 세포에 대한 TGFβ 신호전달 차단은 더 빠른 종양 감시 및 종양 부위에서 다수의 더 많은 CTL의 존재를 초래한다.
일 실시형태에서, DSB는 조작된 뉴클레아제에 의해 TCRα 대립유전자에 포함되며, 그리고 TGFβRII 플립 수용체를 포함하는 공여자 수선 주형은 세포에 도입되며, TCRα 대립유전자 내로 삽입된다.
특정 실시형태에서 상정된 TGFβRII 플립 수용체는 인간 TGFβRII 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인, TGFβRII, CD3 폴리펩타이드, CD4, CD8α, CD28, CD134 또는 CD137로부터의 막관통도메인, 및 CD28, CD134, CD137, CD278 및/또는 CD3ζ로부터의 엔도도메인을 포함한다.
2. 면역억제 신호 댐퍼
기존의 적응 세포 요법을 성가시게 하는 하나의 제한 또는 문제는 종양 미세환경에 의해 매개되는 고갈에 기인하는 면역 효과기 세포의 충분하지 못한 반응이다. 기능소실된 T 세포는 미경험, 효과기 또는 기억 T 세포와 현저하게 별개인 독특한 분자 서명을 가진다. 그들은 감소된 사이토카인 발현 및 효과기 기능을 갖는 T 세포로서 정의된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 면역 효과기 세포는 면역억제 인자에 의한 신호전달의 감소 또는 댐핑에 의해 고갈에 대해 더 저항성으로 된다. 일 실시형태에서, T 세포는 면역억제 신호 댐퍼를 암호화하는 공여자 수선 주형의 존재 하에 TCRα 좌위에서 DSB를 도입함으로써 조작된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역억제 신호 댐퍼"는 종양 미세환경으로부터 T 세포까지 면역억제성 신호의 형질도입을 감소시키는 비천연 유래 폴리펩타이드를 지칭한다. 일 실시형태에서, 면역억제 신호 댐퍼는 면역억제 인자에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 바람직한 실시형태에서, 댐퍼는 면역억제 인자에 결합하는 엑소도메인, 및 선택적으로, 막관통 도메인, 및 선택적으로, 변형된 엔도도메인(예를 들어, 세포내 신호전달 도메인)을 포함하기 때문에 면역억제 신호 댐퍼는 특정 면역억제 인자 또는 신호전달 경로에 대한 억제, 댐프닝 또는 우성 음성 효과를 유발하는 폴리펩타이드를 지칭한다.
특정 실시형태에서, 엑소도메인은 면역억제 인자를 인식하고 이에 결합하는 세포외 결합 도메인이다.
특정 실시형태에서, 변형된 엔도도메인은 면역억제성 신호를 감소시키거나 또는 저해하도록 돌연변이된다. 적합한 돌연변이 전략은 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 돌연변이는 신호전달 도메인을 제거하기 위한 엔도도메인 절단, 모티프 활성을 신호전달하는 데 중요한 잔기를 제거하기 위한 엔도도메인 돌연변이 및 수용체 사이클링을 차단하기 위한 엔도도메인 돌연변이를 추가로 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 엔도도메인은 존재할 때 면역억제성 신호를 형질도입하지 않거나, 또는 신호전달이 실질적으로 감소되었다.
따라서, 일부 실시형태에서, 면역억제 신호 댐퍼는 종양 미세환경으로부터의 하나 이상의 면역억제 인자에 대한 처리 장치로서 작용하며, T 세포 내 대응하는 면역억제성 신호전달 경로를 저해한다.
하나의 면역억제성 신호는 트립토판 이화작용에 의해 매개된다. 암세포 내 인돌아민 2,3-다이옥시게나제(IDO)에 의한 트립토판 이화작용은 종양 미세환경 내 T 세포에 대한 면역억제 효과를 갖는 것으로 나타난 키뉴레닌의 생성을 야기한다. 예를 들어, 문헌[Platten et al. (2012) Cancer Res. 72(21):5435-40] 참조.
일 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 키뉴레니나제 활성을 갖는 효소를 포함한다.
특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 키뉴레니나제 활성을 갖는 효소의 예시적 예는 L-키뉴레닌 가수분해효소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 면역억제 인자에 의해 매개되는 면역억제성 신호전달을 감소시키거나 또는 차단시키는 면역억제 신호 댐퍼를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서 상정된 면역억제 신호 댐퍼에 의해 표적화된 면역억제 인자의 예시적 예는 예정 사멸 리간드 1(PD-L1), 예정 사멸 리간드 2(PD-L2), 형질전환 성장인자 β(TGFβ), 대식세포 집락 자극 인자 1(M-CSF1), 종양 괴사 인자 관련 세포자멸사 유도 리간드(TRAIL), SiSo 세포 리간드 상에서 발현된 수용체-결합 암 항원(RCAS1), Fas 리간드(FasL), CD47, 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-8(IL-8), 인터류킨-10(IL-10) 및 인터류킨-13(IL-13)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다양한 실시형태에서, 면역억제 신호 댐퍼는 면역억제 인자에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
다양한 실시형태에서, 면역억제 신호 댐퍼는 면역억제 인자에 결합하는 엑소도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역억제 신호 댐퍼는 면역억제 인자에 결합하는 엑소도메인 및 막관통 도메인을 포함한다.
다른 실시형태에서, 면역억제 신호 댐퍼는 면역억제 인자에 결합하는 엑소도메인, 막관통 도메인, 및 면역억제 신호를 형질도입하지 않는 또는 면역억제 신호를 형질도입하는 데 실질적으로 감소된 능력을 갖는 변형된 엔도도메인을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "엑소도메인"은 항원 결합 도메인을 지칭한다. 일 실시형태에서, 엑소도메인은 종양 미세환경으로부터 T 세포까지 면역억제성 신호를 형질도입하는 면역억제성 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인이다. 특정 실시형태에서, 엑소도메인은 면역수용체 타이로신 저해 모티프(ITIM) 및/또는 면역수용체 타이로신 스위치 모티프(ITSM)를 포함하는 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인을 지칭한다.
면역억제 신호 댐퍼의 특정 실시형태에서 사용하는 데 적합한 엑소도메인의 예시적 예는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 다음의 폴리펩타이드로부터 선택된 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 세포예정사 단백질 1(PD-1), 림프구 활성화 유전자 3 단백질(LAG-3), T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 단백질 3(TIM-3), 세포독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4), 밴드 T 림프구 감쇠자(BTLA), T 세포 면역글로불린 및 면역수용체 타이로신-기반 저해 모티프 도메인(TIGIT), 형질전환 성장인자 β 수용체 II(TGFβRII), 대식세포 집락 자극 인자 1 수용체(CSF1R), 인터류킨 4 수용체(IL4R), 인터류킨 6 수용체(IL6R), 케모카인(C-X-C 모티프) 수용체 1(CXCR1), 케모카인(C-X-C 모티프) 수용체 2(CXCR2), 인터류킨 10 수용체 서브유닛 알파(IL10R), 인터류킨 13 수용체 서브유닛 알파 2(IL13Rα2), 종양 괴사 인자 관련 세포자멸사 유도 리간드(TRAILR1), SiSo 세포 상에서 발현되는 수용체-결합 암 항원(RCAS1R) 및 Fas 세포 표면 사멸 수용체(FAS).
일 실시형태에서, 엑소도메인은 PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, IL10R, TIGIT, CSF1R 및 TGFβRII로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다.
다수의 막관통 도메인이 특정 실시형태에서 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서 상정된 면역억제 신호 댐퍼의 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 막관통 도메인의 예시적 예는 다음의 단백질의 막관통 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: T-세포 수용체의 알파 또는 베타쇄, CDδ, CD3ε, CDγ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 및 PD-1.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 적응 세포 요법은 TGFβRII를 통해 종양 미세환경으로부터의 면역억제성 TGFβ 신호의 형질도입을 저해하거나 또는 차단하는 면역억제 신호댐퍼를 포함한다. 일 실시형태에서, 면역억제 신호 댐퍼는 TGFβRII 세포외 리간드 결합을 포함하는 엑소도메인, TGFβRII 막관통 도메인, 및 절단된, 비-기능성 TGFβRII 엔도도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 면역억제 신호 댐퍼는 TGFβRII 세포외 리간드 결합을 포함하는 엑소도메인, TGFβRII 막관통 도메인을 포함하고, 엔도도메인은 없다.
3. 조작된 항원 수용체
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 면역 효과기 세포는 조작된 항원 수용체를 포함한다. 일 실시형태에서, T 세포는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 공여자 수선 주형의 존재 하에 하나 이상의 TCRα 대립유전자에서 DSB를 도입함으로써 조작된다.
특정 실시형태에서, 조작된 항원 수용체는 조작된 T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR), Daric 수용체 또는 이의 성분, 또는 키메라 사이토카인 수용체이다.
a. 조작된 TCR
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 면역 효과기 세포는 조작된 TCR을 포함한다. 일 실시형태에서, T 세포는 조작된 TCR를 암호화하는 공여자 수선 주형의 존재 하에 하나 이상의 TCRα 대립유전자에서 DSB를 도입함으로써 조작된다. 특정 실시형태에서, 조작된 TCR은 단일 TCRα 대립유전자 내 DSB에 삽입된다. 다른 실시형태에서, 조작된 TCR의 알파 쇄는 하나의 TCRα 대립유전자 내 DSB에 삽입되고, 조작된 TCR의 베타쇄는 다른 TCRα 대립유전자 내 DSB에 삽입된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 조작된 T 세포는 TCRα 대립유전자에 삽입되지 않은 조작된 TCR을 포함하며, 면역억제 신호 댐퍼, 플립 수용체, 조작된 T 세포 수용체(TCR)의 알파 및/또는 베타 쇄, 키메라 항원 수용체(CAR), Daric 수용체 또는 이의 성분 중 하나 이상, 또는 키메라 사이토카인 수용체는 하나 이상의 TCRα 대립유전자에서 DSB 내로 삽입된다.
천연 유래 T 세포 수용체는 2개의 서브유닛, 즉, 알파 쇄 및 베타 쇄 서브유닛을 포함하며, 이들 각각은 각각의 T 세포 게놈에서 재조합 사건에 의해 생성되는 독특한 단백질이다. TCR의 라이브러리는 특정 표적 항원에 대한 그들의 선택성에 대해 선별될 수 있다. 이런 방식으로, 표적 항원에 대해 높은-아비디티(high-avidity) 및 반응성을 갖는 천연 TCR이 선택되고, 클로닝되며 후속적을 적응 면역요법에 대해 사용되는 T 세포 집단 내로 도입될 수 있다.
일 실시형태에서, T 세포는 하나 이상의 TCRα 대립유전자 내 DSB에서 TCR의 서브유닛을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 공여자 수선 주형을 도입함으로써 변형되되, TCR 서브유닛은 표적 항원을 발현시키는 종양 세포에 대한 T 세포에 특이성을 부여하는 TCR을 형성하는 능력을 가진다. 특정 실시형태에서, 서브유닛이 TCR을 형성하는 능력을 보유하고 형질감염된 T 세포에 표적 세포로 귀소하는 능력을 부여한다면, 서브유닛은 천연 유래 서브유닛에 비해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 변형을 가지며, 그리고 면역학적으로 적절한 사이토카인 신호전달에 참여한다. 조작된 TCR은 바람직하게는 또한 높은 아비디티를 갖는 적절한 종양-관련 펩타이드를 나타내는 표적 세포에 결합하고, 그리고 선택적으로 생체내 적절한 펩타이드를 제시하는 표적 세포의 효율적인 사멸을 매개한다.
조작된 TCR을 암호화하는 핵산은 바람직하게는 T 세포의 (천연 유래) 염색체에서 그들의 천연 상황으로부터 단리되며, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 적합한 벡터 내로 혼입될 수 있다. 특정 실시형태에서, 핵산과 그들을 포함하는 벡터는 둘 다 세포, 바람직하게는 T 세포에 전달될 수 있다. 이어서, 변형된 T 세포는 형질도입된 핵산 또는 핵산들에 의해 암호화된 TCR의 하나 이상의 쇄를 발현시킬 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 조작된 TCR은 외인성 TCR인데, 이것이 특정 TCR을 정상적으로 발현시키지 않는 T 세포 내로 도입되기 때문이다. 조작된 TCR의 본질적 양상은 주조직 적합 유전자 복합체(MHC) 또는 유사한 면역학적 성분에 의해 제시되는 종양 항원에 대해 높은 아비디티를 가진다는 것이다. 조작된 TCR과 대조적으로, CAR은 MHC 독립적 방식으로 표적 항원에 결합하도록 조작된다.
부착된 추가적인 폴리펩타이드가 기능성 T 세포 수용체 및 MHC 의존적 항원 인식을 형성하는 알파쇄 또는 베타쇄의 능력을 방해하지 않는다면, TCR은 TCR의 본 발명의 알파쇄 또는 베타쇄의 아미노-말단 또는 카복실-말단 부분에 부착되는 추가적인 폴리펩타이드에 의해 발현될 수 있다.
특정 실시형태에서 상정된 조작된 TCR에 의해 인식되는 항원은 혈액학적 암과 고형종양 둘 다에 대한 항원을 포함하는 암 항원을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 항원은 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2를 포함하는 EGFR 패밀리(HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 서비빈, TAG72, TEMs, VEGFR2 및 WT-1로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합하는, 세포외 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 RNA 중합효소 II 프로모터 또는 제1 자기-절단 바이러스 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 하나의 변형된 그리고/또는 비-기능성 TCRα 대립유전자 내로 통합된 조작된 TCR의 알파쇄 및/또는 베타쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 RNA 중합효소 II 프로모터 또는 제1 자기-절단 바이러스 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 하나의 변형된 그리고/또는 비-기능성 TCRα 대립유전자 내로 통합된 조작된 TCR의 알파쇄 및 베타쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 5'으로부터 3'으로 제1 자기-절단 바이러스 펩타이드, 조작된 TCR의 알파쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 제2 자기-절단 바이러스 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 하나의 변형된 및/또는 비기능성의 TCRα 대립유전자 내로 통합된 조작된 TCR의 베타쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 경우에, 다른 TCRα 대립유전자는 기능성일 수 있거나 또는 감소된 기능을 가질 수 있거나 또는 DSB에 의한 비-기능성 및 NHEJ에 의한 수선이 제공되었다. 일 실시형태에서, 다른 TCRα 대립유전자는 본 명세서에 상정된 조작된 뉴클레아제에 의해 변형되었고, 기능이 감소될 수 있거나 또는 비-기능성이 제공되었다.
특정 실시형태에서, TCRα 대립유전자는 둘 다 변형되고 감소된 기능을 갖거나 또는 비기능성이다: 제1 변형된 TCRα 대립유전자는 제1 자기-절단 바이러스 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 조작된 TCR의 알파쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 포함하고, 그리고 제2 변형된 TCRα 대립유전자는 제2 자기-절단 바이러스 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 조작된 TCR의 베타쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
b. 키메라 항원 수용체(CAR)
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 조작된 면역 효과기 세포는 하나 이상의 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일 실시형태에서, T 세포는 CAR을 암호화하는 공여자 수선 주형의 존재 하에 하나 이상의 TCRα 대립유전자에서 DSB를 도입함으로써 조작된다. 특정 실시형태에서, CAR은 단일 TCRα 대립유전자 내 DSB에 삽입된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 조작된 T 세포는 TCRα 대립유전자에 삽입되지 않은 CAR을 포함하며, 면역억제 신호 댐퍼, 플립 수용체, 조작된 T 세포 수용체(TCR)의 알파 및/또는 베타 쇄, 키메라 항원 수용체(CAR), Daric 수용체 또는 이의 성분 중 하나 이상, 또는 키메라 사이토카인 수용체는 하나 이상의 TCRα 대립유전자에서 DSB 내로 삽입된다.
다양한 실시형태에서, 게놈 편집된 T 세포는 종양 세포에 대한 세포독성을 재지시하는 CAR을 발현시킨다. CAR은 특이적 항-종양 세포 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하하기 위해 표적 항원(예를 들어, 종양 항원)에 대한 항체-기반 특이성을 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 조합하는 분자이다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "키메라"는 상이한 단백질의 부분 또는 상이한 유래로부터의 DNA로 구성된 것을 기재한다.
다양한 실시형태에서, CAR은 특이적 표적 항원에 결합하는 세포외 도메인(또한 결합 도메인 또는 항원-특이적 결합 도메인으로 지칭됨), 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. CAR의 주된 특징은 면역 효과기 세포 특이성을 재지시함으로써, 증식, 사이토카인 생성, 식세포작용 또는 주조직 적합성(MHC) 독립적 방식으로 표적 항원 발현 세포의 세포사를 매개할 수 있는 분자의 생성을 촉발하고, 단클론성 항체, 가용성 리간드 또는 세포 특이적 공동수용체의 세포 특이적 표적 능력의 이용하는 그들의 능력이다.
특정 실시형태에서, CAR은 종양 세포 상에서 발현된 표적 폴리펩타이드, 예를 들어, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "결합 도메인", "세포외 도메인", "세포외 결합 도메인", "항원 결합 도메인", "항원-특이적 결합 도메인" 및 "세포외 항원 특이적 결합 도메인"은 상호 호환적으로 사용되며, 관심 대상의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 키메라 수용체, 예를 들어, CAR 또는 Daric을 제공한다. 결합 도메인은 생물 분자(예를 들어, 세포 표면 수용체 또는 종양 단백질, 지질, 다당류 또는 다른 세포 표면 표적 분자 또는 이의 성분)에 특이적으로 인식하고 결합하는 능력을 갖는 임의의 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 또는 펩타이드를 포함할 수 있다. 결합 도메인은 관심 대상의 생물 분자에 대한 임의의 천연 유래, 합성, 반합성 또는 재조합적으로 생성된 결합 상대를 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포외 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
"항체"는 항원 결정소, 예컨대 면역 세포에 의해 인식되는 것을 함유하는 표적 항원, 예컨대 펩타이드, 지질, 다당류 또는 핵산의 에피토프를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 적어도 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드인 결합 제제를 지칭한다. 항체는 항원 결합 단편, 예를 들어, Camel Ig(카멜리드 항체 또는 이의 VHH 단편), Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단일쇄 Fv 항체("scFv"), 이중-scFv, (scFv)2, 미니바디, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디, 이황화물 안정화된 Fv 단백질("dsFv") 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디) 또는 이의 다른 항체 단편을 포함한다. 상기 용어는 또한 유전자 조작된 형태, 예컨대 키메라 항체(예를 들어, 인간화된 뮤린 항체), 이형접합체 항체(예컨대, 이중특이성 항체) 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 또한 문헌[Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997] 참조.
하나의 바람직한 실시형태에서, 결합 도메인은 scFv이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 결합 도메인은 카멜리드 항체이다.
특정 실시형태에서, CAR은 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2를 포함하는 EGFR 패밀리(HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 서비빈, TAG72, TEMs, VEGFR2 및 WT-1로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합하는, 세포외 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, CAR은 세포외 결합 도메인, 예를 들어, 항원에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하되, 항원은 MHC-펩타이드 복합체, 예컨대 클래스 I MHC-펩타이드 복합체 또는 클래스 II MHC-펩타이드 복합체이다.
특정 실시형태에서, CAR은 다양한 도메인 사이에 링커 잔기를 포함한다. "가변 영역 연결 서열"은 얻어진 폴리펩타이드가 동일한 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 동일한 표적 분자에 대해 특이적 결합 친화도를 보유하도록 경쇄 가변 영역에 중쇄 가변 영역을 연결하고 2개의 서브-결합 도메인의 상호작용에 적합한 스페이서 기능을 제공하는 아미노산 서열이다. 특정 실시형태에서, CAR은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 링커를 포함한다. 특정 실시형태에서, 링커 길이는 약 1 내지 약 25개의 아미노산, 약 5 내지 약 20개의 아미노산, 또는 약 10 내지 약 20개의 아미노산 또는 아미노산의 임의의 개재 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 아미노산 길이이다.
특정 실시형태에서, CAR의 결합 도메인 다음에 하나 이상의 "스페이서 도메인"이 이어지는 데, 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 효과기 세포로부터 떨어져서 항원 결합 도메인을 이동시키는 영역을 지칭한다(Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419). 스페이서 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원 중 하나일 수 있다. 특정 실시형태에서, 스페이서 도메인은 하나 이상의 중쇄 불변 영역, 예를 들어, CH2 및 CH3을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 면역글로불린의 일부이다. 스페이서 도메인은 천연 유래 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 스페이서 도메인은 IgG1, IgG4 또는 IgD의 CH2 및 CH3을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR의 결합 도메인은 하나 이상의 "힌지 도메인"에 연결되는데, 이는 적절한 세포/세포 접착, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 효과기 세포로부터 떨어져서 항원 결합 도메인을 위치시키는 역할을 한다. CAR은 일반적으로 결합 도메인과 막관통 도메인(TM) 사이에 하나 이상의 힌지 도메인을 포함한다. 힌지 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원 중 하나일 수 있다. 힌지 도메인은 천연 유래 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 CAR에서 사용하기에 적합한 예시적 힌지 도메인은 1형 막 단백질, 예컨대 CD8α 및 CD4의 세포외 영역으로부터 유래된 힌지 영역(이들 분자로부터의 야생형 힌지 영역일 수 있거나 또는 변경될 수 있음)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α 힌지 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 힌지는 PD-1 힌지 또는 CD152 힌지이다.
"막관통 도메인"은 세포외 결합 부분 및 세포내 신호전달 도메인에 융합하고 면역 효과기 세포의 원형질막에 CAR을 고정시키는 CAR의 일부이다. TM 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원 중 하나일 수 있다.
예시적인 TM 도메인은 T-세포 수용체의 알파 또는 베타쇄, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 및 PD-1의 적어도 막관통 영역(들)으로부터 유래될 수 있고, 즉 이들을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, CAR은 CD8α로부터 유래된 TM 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 CAR은 바람직하게는 TM 도메인에 연결되는 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개인 아미노산과 CAR의 세포내 신호전달 도메인 사이의 CD8α 및 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커로부터 유래된 TM 도메인을 포함한다. 글리신-세린 링커는 특히 적합한 링커를 제공한다.
특정 실시형태에서, CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "세포내 신호전달 도메인"은 CAR-결합 표적 세포에 대한 세포독성 인자의 방출, 또는 세포외 CAR 도메인에 대한 항원 결합에 의해 유발된 다른 세포 반응을 포함하는, 효과기 세포 기능, 예를 들어, 활성화, 사이토카인 생성, 증식 및 세포독성 활성을 유발하기 위해 면역 효과기 세포 내부에 표적 항원에 대한 효과적인 CAR의 메시지를 형질도입하는 데 참여하는 CAR의 부분을 지칭한다.
용어 "효과기 기능"은 세포의 전문화된 기능을 지칭한다. T 세포의 효과기 기능은, 예를 들어, 세포용해활성이거나 또는 사이토카인의 분비를 포함하는 활성을 도울 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 형질도입하고 세포로 보내서 전문화된 기능을 수행하는 단백질의 일부이다. 보통 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 다수의 경우에 반드시 전체 도메인을 사용하지는 않는다. 세포내 신호전달 도메인의 절단 부분이 사용되는 정도로, 효과기 기능 신호를 형질도입한다면, 이러한 절단된 부분은 전체 도메인 대신 사용될 수 있다. 용어 세포내 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 형질도입하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단 부분을 포함하는 것을 의미한다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하며, 2차 또는 공동자극 신호가 또한 필요하다는 것은 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포내 신호전달 도메인의 2개의 별개 부류: TCR을 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 1차 신호전달 도메인(예를 들어, TCR/CD3 복합체) 및 2차 또는 공동자극 신호를 제공하기 위한 항원-독립적 방식으로 작용하는 공동자극 신호전달 도메인에 의해 매개되는 것으로 언급될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 "공동자극 신호전달 도메인" 및 "1차 신호전달 도메인"을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
1차 신호전달 도메인은 자극 방법에서 또는 저해 방법에서 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 신호전달 도메인은 면역수용체 타이로신-기반 활성 모티프 또는 ITAM으로서 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
특정 실시형태에서 상정된 CAR에서 사용하기에 적합한 ITAM 함유 1차 신호전달 도메인의 예시적 예는 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 1차 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 1차 신호전달 및 공동자극 신호전달 도메인은 막관통 도메인의 카복실 말단에 일렬로 임의의 순서로 연결될 수 있다.
특정 실시형태에서, CAR은 T 세포 발현 CAR 수용체의 효능 및 확장을 향상시키기 위한 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "공동자극 신호전달 도메인" 또는 "공동자극 도메인"은 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인을 지칭한다.
특정 실시형태에서 상정된 CAR에서 사용하기에 적합한 이러한 공동자극 분자의 예시적 예는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70을 포함한다. 일 실시형태에서, CAR은 CD28, CD137 및 CD134, 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
다양한 실시형태에서, CAR은 BCMA, CD19, CSPG4, PSCA, ROR1 및 TAG72로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합하는 세포외 도메인; CD4, CD8α, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된 막관통 도메인; CD28, CD134 및 CD137로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된 하나 이상의 세포내 공동자극 신호전달 도메인; 및 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된 신호전달 도메인을 포함한다.
c. Daric 수용체
특정 실시형태에서, 조작된 면역 효과기 세포는 하나 이상의 Daric 수용체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "Daric 수용체"는 다중쇄 조작된 항원 수용체를 지칭한다. 일 실시형태에서, T 세포는 Daric의 하나 이상의 성분을 암호화하는 공여자 수선 주형의 존재 하에 하나 이상의 TCRα 대립유전자에서 DSB를 도입함으로써 조작된다. 특정 실시형태에서, Daric 또는 이의 하나 이상의 성분은 단일 TCRα 대립유전자 내 DSB에서 삽입된다.
일 실시형태에서, 조작된 T 세포는 TCRα 대립유전자에 삽입되지 않은 Daric을 포함하며, 면역억제 신호 댐퍼, 플립 수용체, 조작된 T 세포 수용체(TCR)의 알파 및/또는 베타 쇄, 키메라 항원 수용체(CAR), Daric 수용체 또는 이의 성분 중 하나 이상, 또는 키메라 사이토카인 수용체는 하나 이상의 TCRα 대립유전자에서 DSB 내로 삽입된다.
Daric 구조 및 성분의 예시적 예는 국제 특허 출원 공개 WO2015/017214 및 미국 특허 공개 제20150266973호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
일 실시형태에서, 공여자 수선 주형은 다음의 Daric 성분을 포함한다: 제1 다량체화 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 공동자극 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 신호전달 폴리펩타이드; 및 결합 도메인, 제2 다량체화 도메인, 및 선택적으로 제2 막관통 도메인을 포함하는 결합 폴리펩타이드. 기능성 Daric은 세포 표면 상에서 신호전달 폴리펩타이드의 다량체화 도메인과 결합 폴리펩타이드 사이에 결합되고 배치된 브릿징 인자와의 Daric 수용체 복합체의 형성을 촉진시키는 브릿징 인자를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제1 및 제2 다량체화 도메인은 라파마이신 또는 이의 라팔로그, 쿠메르마이신 또는 이의 유도체, 지베렐린 또는 이의 유도체, 아브시스산(ABA) 또는 이의 유도체, 메토트렉세이트 또는 이의 유도체, 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체, FKCsA 또는 이의 유도체, 트라이메토프림(Tmp)-FKBP에 대한 합성 리간드(SLF) 또는 이의 유도체, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 브릿징 인자와 결합된다.
라파마이신 유사체(라팔로그)의 예시적 예는 미국 특허 제6,649,595호에 개시된 것을 포함하며, 라팔로그 구조는 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 특정 실시형태에서, 브릿징 인자는 라파마이신에 비해 실질적으로 감소된 면역억제 효과를 갖는 라팔로그이다. "실질적으로 감소된 면역억제 효과"는 인간 면역억제 활성의 임상적으로 또는 적절한 시험관내(예를 들어, T 세포 증식의 저해) 또는 생체내 대용으로 측정하여 등몰량의 라파마이신에 대해 관찰되거나 또는 예상되는 면역억제 효과의 적어도 0.1 내지 0.005배를 갖는 라팔로그를 지칭한다. 일 실시형태에서, "실질적으로 감소된 면역억제 효과"는 동일한 분석에서 라파마이신에 대해 관찰된 EC50 값보다 적어도 10 내지 250배 더 큰 이러한 시험관내 분석에서 EC50 값을 갖는 라팔로그를 지칭한다.
라팔로그의 다른 예시적 예는 에베롤리무스, 노보리무스, 피메크롤리무스, 리다포롤리무스, 타크롤리무스, 템시롤리무스, 유미롤리무스 및 조타롤리무스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 다량체화 도메인은 라파마이신 또는 이의 라팔로그인 브릿징 인자와 회합될 것이다. 예를 들어, 제1 및 제2 다량체화 도메인은 FKBP 및 FRB로부터 선택된 쌍이다. FRB 도메인은 FKBP 단백질 및 라파마이신 또는 이의 라팔로그와의 3부 복합체를 형성할 수 있는 폴리펩타이드 영역(단백질 "도메인")이다. FRB 도메인은 인간 및 다른 종으로부터의 mTOR 단백질(또한 문헌에서 FRAP, RAPT1, 또는 RAFT로서 지칭됨); Tor1 및 Tor2를 포함하는 효모 단백질; 및 칸디다(Candida) FRAP 상동체를 포함하는, 다수의 천연 유래 단백질에 존재한다. 뉴클레오타이드 서열, 클로닝 및 이들 단백질의 다른 양상에 관한 정보는 당업계에 이미 공지되어 있다. 예를 들어, 인간 mTOR에 대한 단백질 서열 수탁 번호는 젠뱅크(GenBank) 등록 번호 L34075.1이다(Brown et al., Nature 369:756, 1994).
본 명세서에 상정된 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 FRB 도메인은 일반적으로 적어도 약 85 내지 약 100개의 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 융합 단백질에서 사용하기 위한 FRB 아미노산 서열은 젠뱅크 수탁 번호 L34075.1의 아미노산 서열에 기반하여 93개의 아미노산 서열 Ile-2021 내지 Lys-2113 및 T2098L의 돌연변이를 포함할 것이다. 특정 실시형태에서 상정된 Darics에서 사용하기 위한 FRB 도메인은 라파마이신 또는 이의 라팔로그에 결합된 FKBP 단백질의 복합체에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, FRB 도메인의 펩타이드 서열은 (a) 인간 mTOR의 적어도 표시된 93개의 아미노산 영역 또는 상동성 단백질의 대응하는 영역에 걸쳐있는 천연 유래 펩타이드 서열; (b) 천연 유래 펩타이드의 약 10개까지의 아미노산, 또는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 또는 약 1 내지 약 3개의 아미노산, 또는 일부 실시형태에서 단지 하나의 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환된 천연 유래 FRB의 변이체; 또는 (c) 천연 유래 FRB 도메인을 암호화하는 DNA 분자에 선택적으로 혼성화할 수 있는 핵산 분자에 의해 또는 유전자 암호의 축중을 제외하고 천연 유래 FRB 도메인을 암호화하는 DNA 분자에 선택적으로 혼성화할 수 있는 DNA 서열에 의해 암호화된 펩타이드를 포함한다.
FKBP(FK506 결합 단백질)는 마크롤라이드에 대한 사이토졸 수용체, 예컨대 FK506, FK520 및 라파마이신이며, 종 계통에 걸쳐 고도로 보존되어 있다. FKBP은 라파마이신에 또는 이의 라팔로그에 결합할 수 있고 FRB-함유 단백질 또는 융합 단백질과의 3부 복합체를 추가로 형성할 수 있는 단백질 또는 단백질 도메인이다. FKBP 도메인은 또한 "라파마이신 결합 도메인"으로서 지칭될 수 있다. 다양한 FKBP 종의 뉴클레오타이드 서열, 클로닝 및 다른 양상에 관한 정보는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Staendart et al., Nature 346:671, 1990(인간 FKBP12); Kay, Biochem. J. 314:361,1996] 참조). 다른 포유류 종에서, 효모에서 그리고 다른 유기체에서 상동성 FKBP 단백질은 또한 당업계에 공지되어 있고, 본 명세서에 개시된 융합 단백질에서 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서 상정된 FKBP 도메인은 (이러한 결합을 검출하기 위한 직접적 또는 간접적인 임의의 수단에 의해 결정될 수 있는 바와 같이) 라파마이신 또는 이의 라팔로그에 결합할 수 있거나 또는 FRB-함유 단백질과의 3부 복합체에 참여할 수 있다.
특정 실시형태에서 상정된 Daric에서 사용하기에 적합한 FKBP 도메인의 예시적 예는 바람직하게는 인간 FKBP12 단백질로부터 단리된 천연 유래 FKBP 펩타이드 서열(젠뱅크 수탁 번호 AAA58476.1) 또는 그로부터, 다른 인간 FKBP로부터, 뮤린 또는 다른 포유류 FKBP로부터, 또는 일부 다른 동물, 효모 또는 진균 FKBP로부터 단리된 펩타이드 서열; 천연 유래 펩타이드의 약 10개까지의 아미노산, 또는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 또는 약 1 내지 약 3개의 아미노산, 또는 일부 실시형태에서 단지 하나의 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환된 천연 유래 FRB의 변이체; 또는 천연 유래 FKBP를 암호화하는 DNA 분자에 선택적으로 혼성화할 수 있는 핵산 분자에 의해 또는 유전자 암호의 축중을 제외하고 천연 유래 FKBP를 암호화하는 DNA 분자에 선택적으로 혼성화할 수 있는 DNA 서열에 의해 암호화된 펩타이드 서열 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 상정된 Daric에서 사용하기에 적합한 다량체화 도메인 쌍의 다른 예시적 예는 FKBP 및 FRB, FKBP 및 칼시네우린, FKBP 및 사이클로필린, FKBP 및 박테리아 DHFR, 칼시네우린 및 사이클로필린, PYL1 및 ABI1, 또는 GIB1 및 GAI, 또는 이들의 변이체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 항-브릿징 인자는 신호전달 폴리펩타이드 및 결합 폴리펩타이드와 브릿징 인자의 회합을 차단한다. 예를 들어, 사이클로스포린 또는 FK506은 라파마이신을 적정하기 위한 항-브릿징 인자로서 사용될 수 있었고, 따라서 단지 하나의 다량체화 도메인이 결합되기 때문에 신호전달을 중단시킨다. 특정 실시형태에서, 항-브릿징 인자(예를 들어, 사이클로스포린, FK506)는 면역억제제이다. 예를 들어, 면역억제성 항-브릿징 인자는 특정 실시형태에서 상정된 Daric 성분의 기능을 차단하거나 또는 최소화하고 동시에 임상 상황에서 원치않는 또는 병리학적 염증 반응을 저해하거나 또는 차단시키기 위해 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 다량체화 도메인은 FRB T2098L을 포함하고, 제2 다량체화 도메인은 FKBP12를 포함하며, 브릿징 인자는 라팔로그 AP21967이다.
다른 실시형태에서, 제1 다량체화 도메인은 FRB를 포함하고, 제2 다량체화 도메인은 FKBP12를 포함하며, 브릿징 인자는 라파마이신, 템시롤리무스 또는 에베롤리무스이다.
특정 실시형태에서, 신호전달 폴리펩타이드 제1 막관통 도메인 및 결합 폴리펩타이드는 제2 막관통 도메인 또는 GPI 앵커를 포함한다. 예시적 예에서, 제1 및 제2 막관통 도메인은 CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 폴리펩타이드로부터 단리된다.
일 실시형태에서, 신호전달 폴리펩타이드는 하나 이상의 세포내 공동자극 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서 상정된 Daric 신호전달 성분에서 사용하기에 적합한 1차 신호전달 도메인의 예시적 예는 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, Daric 신호전달 성분은 CD3ζ 1차 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 1차 신호전달 및 공동자극 신호전달 도메인은 막관통 도메인의 카복실 말단에 일렬로 임의의 순서로 연결될 수 있다.
특정 실시형태에서 상정된 Daric 신호전달 성분에서 사용하기에 적합한 이러한 공동자극 분자의 예시적 예는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70을 포함한다. 일 실시형태에서, Daric 신호전달 성분은 CD28, CD137 및 CD134, 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, Daric 결합 성분은 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원 결정소, 예컨대 면역 세포에 의해 인식되는 것을 함유하는 표적 항원, 예컨대 펩타이드, 지질, 다당류 또는 핵산의 에피토프를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 적어도 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함한다. 항체는 항원 결합 단편, 예를 들어, Camel Ig(카멜리드 항체 또는 이의 VHH 단편), Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단일쇄 Fv 항체("scFv"), 이중-scFv, (scFv)2, 미니바디, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디, 이황화물 안정화된 Fv 단백질("dsFv") 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디) 또는 이의 다른 항체 단편을 포함한다. 상기 용어는 또한 유전자 조작된 형태, 예컨대 키메라 항체(예를 들어, 인간화된 뮤린 항체), 이형접합체 항체(예컨대, 이중특이성 항체) 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 또한 문헌[Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997] 참조.
하나의 바람직한 실시형태에서, 결합 도메인은 scFv이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 결합 도메인은 카멜리드 항체이다.
특정 실시형태에서, Daric 결합 성분은 알파 엽산 수용체,5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2를 포함하는 EGFR 패밀리(HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 서비빈, TAG72, TEMs, VEGFR2 및 WT-1로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 결합하는, 세포외 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, Daric 결합 성분은 MHC-펩타이드 복합체, 예컨대 클래스 I MHC-펩타이드 복합체 또는 클래스 II MHC-펩타이드 복합체에 결합하는 세포외 도메인, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 Daric 성분은 2개의 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 도메인, 영역 또는 모티프를 연결하는 링커 또는 스페이서를 포함한다. 특정 실시형태에서, 링커는 약 2개 내지 약 35개의 아미노산, 또는 약 4 내지 약 20개의 아미노산 또는 약 8 내지 약 15개의 아미노산 또는 약 15 내지 약 25개의 아미노산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 스페이서는 특정 구조, 예컨대 항체 CH2CH3 도메인, 힌지 도메인 등을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 스페이서는 IgG1, IgG4 또는 IgD의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 Daric 성분은 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 도메인의 위치를 정하는 데 어떤 역할을 하는 하나 이상의 "힌지 도메인"을 포함한다. Daric은 결합 도메인과 다량체화 도메인 및/또는 막관통 도메인(TM) 사이에 또는 다량체화 도메인과 막관통 도메인 사이에 하나 이상의 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 힌지 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원 중 하나일 수 있다. 힌지 도메인은 천연 유래 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 힌지는 CD8α 힌지 또는 CD4 힌지이다.
일 실시형태에서, Daric 신호전달 폴리펩타이드는 FRB T2098L의 제1 다량체화 도메인, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인, 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함하며; 결합 폴리펩타이드는 CD19에 결합하는 scFv, FKBP12의 제2 다량체화 도메인 및 CD4 막관통 도메인을 포함하고; 그리고 브릿징 인자는 라팔로그 AP21967이다.
일 실시형태에서, Daric 신호전달 폴리펩타이드는 FRB의 제1 다량체화 도메인, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인, 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인을 포함하며; 결합 폴리펩타이드는 CD19에 결합하는 scFv, FKBP12의 제2 다량체화 도메인 및 CD4 막관통 도메인을 포함하고; 그리고 브릿징 인자는 라파마이신, 템시롤리무스 또는 에베롤리무스이다.
d. 제타카인
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 조작된 면역 효과기 세포는 하나 이상의 키메라 사이토카인 수용체를 포함한다. 일 실시형태에서, T 세포는 CAR을 암호화하는 공여자 수선 주형의 존재 하에 하나 이상의 TCRα 대립유전자에서 DSB를 도입함으로써 조작된다. 특정 실시형태에서, 키메라 사이토카인 수용체는 단일 TCRα 대립유전자 내 DSB에서 삽입된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 조작된 T 세포는 TCRα 대립유전자에 삽입되지 않은 키메라 사이토카인 수용체를 포함하며, 면역억제 신호 댐퍼, 플립 수용체, 조작된 T 세포 수용체(TCR)의 알파 및/또는 베타 쇄, 키메라 항원 수용체(CAR), Daric 수용체 또는 이의 성분 중 하나 이상, 또는 키메라 사이토카인 수용체는 하나 이상의 TCRα 대립유전자에서 DSB 내로 삽입된다.
다양한 실시형태에서, 게놈 편집된 T 세포는 종양 세포에 대한 세포독성을 재지시하는 키메라 사이토카인 수용체를 발현시킨다. 제타카인은 세포 표면에 세포외 도메인을 테더링할 수 있는 영역을 지지하도록 연결된 가용성 수용체 리간드를 포함하는 세포외 도메인, 막관통 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 막관통 면역수용체이다. 제타카인, T 림프구의 표면 상에서 발현될 때, 가용성 수용체 리간드에 특이적인 수용체를 발현시키는 해당 세포로 T 세포 활성을 향하게 한다. 제타카인 키메라 면역수용체는 다양한 암의 치료에 대한 적용, 특히 인간 악성종양에서 이용되는 자가분비/근거리분비 사이토카인 시스템에 의해 T 세포의 항원 특이성을 전향시킨다.
특정 실시형태에서, 키메라 사이토카인 수용체는 면역억제성 사이토카인 또는 이의 사이토카인 수용체 결합 변이체, 링커, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 사이토카인 또는 이의 사이토카인 수용체 결합 변이체는 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-8(IL-8), 인터류킨-10(IL-10) 및 인터류킨-13(IL-13)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 링커는 CH2CH3 도메인 또는 힌지 도메인 등을 포함한다. 일 실시형태에서, 링커는 IgG1, IgG4 또는 IgD의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 링커는 CD8α 또는 CD4 힌지 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파 또는 베타쇄, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인 및/또는 공동자극 도메인을 함유하는 ITAM으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 키메라 사이토카인 수용체는 CD28, CD137 및 CD134, 및 CD3ζ 1차 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
E. 게놈 편집 세포
특정 실시형태에서 상정된 방법에 의해 제조된 게놈 편집된 세포는 개선된 적응 세포 요법 조성물을 제공한다. 임의의 특정 이론으로 구속되는 일 없이, 특정 실시형태에서 상정된 방법에 의해 제조된 게놈 편집된 면역 효과기 세포는 생체내 증가된 개선된 안전성, 효능 및 지속능력을 포함하는 우수한 특성으로 가득 찬 것으로 여겨진다.
다양한 실시형태에서, 게놈 편집된 세포는 본 명세서에 상정된 조성물 및 방법에 의해 편집된 하나 이상의 TCRα 대립유전자를 갖는 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, T 세포 집단에서 TCRα 대립유전자를 편집하는 방법은 T 세포 집단을 활성화시키고 T 세포 집단을 자극하여 증식시키는 단계; 조작된 뉴클레아제를 T 세포 집단 내로 도입하는 단계; 공여자 수선 주형을 포함하는 하나 이상의 벡터를 이용하여 T 세포 집단을 형질도입하는 단계를 포함하되; 조작된 뉴클레아제의 발현은 TCRα 대립유전자 내 표적 부위에서 이중 가닥 파손을 생성하고, 공여자 수선 주형은 이중-가닥 파손(DSB) 부위에서 상동성 관련 수선(HDR)에 의해 TCRα 대립유전자 내로 혼입된다.
특정 실시형태에서 상정된 게놈 편집된 T 세포는 자가/자율("자기") 또는 비자가("비자기", 예를 들어, 동종이계, 동계 또는 이종)일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "자가"는 동일한 대상체로부터의 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "동종이계"는 비교 시 세포와 유전적으로 상이한 동일한 종의 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "동계"는 비교 시 세포와 유전적으로 동일한 상이한 대상체의 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "이종 발생성"은 비교 시 세포와 상이한 종의 세포를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, T 세포는 포유류 대상체로부터 얻는다. 더 바람직한 실시형태에서, T 세포는 영장류 대상체로부터 얻는다. 가장 바람직한 실시형태에서, T 세포는 인간 대상체로부터 얻는다.
T 세포는 말초혈액 단핵세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉수, 비장 조직 및 종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 당업자에게 공지된 다수의 기법, 예컨대 침강, 예를 들어, FICOLL(상표명) 분리를 이용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 얻을 수 있다.
특정 실시형태에서, T 세포, 예를 들어, PBMC를 포함하는 세포 집단은 본 명세서에 상정된 게놈 편집 조성물 및 방법으로 처리된다. 다른 실시형태에서, 단리된 또는 정제된 T 세포 집단이 사용된다. 세포는 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써, 예를 들어, 퍼콜(PERCOLL)(상표명) 구배를 통한 원심분리에 의해 말초혈액 단핵세포(PBMC)로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, PBMC의 단리 후에, 세포독성과 헬퍼 T 림프구는 둘 다 활성화, 확장 및/또는 유전자 변형 전에 또는 후에 미경험, 기억 및 효과기 T 세포 하위집단으로 분류될 수 있다.
다음의 마커 중 하나 이상(CD3, CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62, CD127 및 HLA-DR)을 발현시키는 특정 하위T 세포 집단은 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 일 실시형태에서, CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197; 또는 CD38 또는 CD62L, CD127, CD197 및 CD38으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상을 발현시키는 특정 하위T 세포 집단은 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리된다. 다양한 실시형태에서, 제조된 T 세포 조성물은 발현되지 않거나 또는 다음의 마커 중 하나 이상을 실질적으로 발현시키지 않는다: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 및 LAG3.
일 실시형태에서, 단리된 또는 정제된 T 세포 집단은 CD3+, CD4+, CD8+, 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 마커 중 하나 이상을 발현시킨다.
특정 실시형태에서, T 세포는 개체로부터 단리되고, 게놈 편집을 받기 전에 처음에 활성화되고 자극되어 증식된다.
T 세포 조성물의 충분한 치료 용량을 달성하기 위해, T 세포는 종종 자극, 활성화 및/또는 확장의 1회 이상의 라운드가 실시된다. T 세포는, 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 및 제6,867,041호에 기재된 방법을 이용하여 일반적으로 활성화되고 확장될 수 있으며, 이들 각각은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 특정 실시형태에서, T 세포는 T 세포 내로 게놈 편집 조성물의 도입 전에 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 3일, 약 2일 내지 약 4일, 약 3일 내지 약 4일, 또는 약 1일, 약 2일, 약 3일, 또는 약 4일 동안 활성화되고 확장된다.
특정 실시형태에서, T 세포 내로 게놈 편집 조성물의 도입 전에 T 세포는 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간 또는 약 24시간 동안 활성화되고 확장된다.
일 실시형태에서, T 세포는 게놈 편집 조성물이 T 세포 내로 도입되는 것과 동시에 활성화된다.
일 실시형태에서, 공동자극 리간드는 T 세포 상의 동족 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 항원 제시 세포 (예를 들어, aAPC, 수지상 세포, B 세포 등) 상에 제시되며, 이에 의해, 예를 들어, TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 제공되는 1차 신호에 추가로, 원하는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공한다. 적합한 공동자극 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), 4-1BBL, OX40L, 유도성 공동자극 리간드(ICOS-L), 세포내 접착 분자 (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, 림포톡신 베타 수용체, ILT3, ILT4, Toll 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체, 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 공동자극 리간드는 CD27, CD28, 4- IBB, OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능 관련 항원- 1(LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 T 세포 상에 존재하는 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
적합한 공동자극 리간드는 가용성 형태로 제공될 수 있고 게놈 편집된 T 세포 상에서 발현된 조작된 항원 수용체에 결합하는 APC 또는 aAPC 상에서 발현되는 표적 항원을 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, T 세포의 게놈을 편집하는 방법은 T 세포를 포함하는 세포 집단을 활성화하고 T 세포 집단을 확장시키는 단계를 포함한다. T 세포 활성화는 T 세포 TCR/CD3 복합체를 통해 1차 자극 신호를 제공함으로써 또는 CD2 표면 단백질의 자극을 통해 그리고 부속 분자, 예를 들어, CD28을 통해 2차 공동자극 신호를 제공함으로써 달성될 수 있다.
TCR/CD3 복합체는 T 세포를 적합한 CD3 결합제, 예를 들어, CD3 리간드 또는 항-CD3 단클론성 항체와 접촉시킴으로써 자극될 수 있다. CD3 항체의 예시적 예는 OKT3, G19-4, BC3 및 64.1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 실시형태에서, CD2 결합제는 T 세포에 1차 자극 신호를 제공하기 위해 사용될 수 있다. CD2 결합제의 예시적 예는 T11.1 또는 T11.2 항체와 조합된 CD2 리간드 및 항-CD2 항체, 예를 들어, T11.3 항체(Meuer, S. C. et al. (1984) Cell 36:897-906) 및 9-1 항체와 조합된 9.6 항체(TI 1.1과 동일한 에피토프를 인식함)(Yang, S. Y. et al. (1986) J. Immunol. 137:1097-1100)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 임의의 상기 기재한 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 다른 항체가 또한 사용될 수 있다. 추가적인 항체, 또는 항체의 조합은 본 명세서의 다른 곳에 개시된 표준 기법에 의해 제조되고 동정될 수 있다.　
TCR/CD3 복합체를 통해, 또는 CD2를 통해 제공된 1차 자극 신호에 추가로, T 세포 반응의 유도는 제2의 공동자극 신호를 필요로 한다. 특정 실시형태에서, CD28 결합제는 공동자극 신호를 제공하기 위해 사용될 수 있다. CD28 결합제의 예시적 예는 천연 CD28 리간드, 예를 들어, CD28에 대한 천연 리간드(예를 들어, 단백질의 B7 패밀리의 구성원, 예컨대 B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86); 및 CD28 분자, 예를 들어, 단클론성 항체 9.3, B-T3, XR-CD28, KOLT-2, 15E8, 248.23.2 및 EX5.3D10에 가교할 수 있는 항-CD28 단클론성 항체 또는 이의 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 1차 자극 신호를 제공하는 분자, 예를 들어 TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통해 자극을 제공하는 분자, 및 공동자극 분자는 동일한 표면에 결합된다.
특정 실시형태에서, 자극 및 공동자극 신호를 제공하는 결합제는 세포 표면 상에서 국소화된다. 이는 세포 표면 상에서 발현에 적합한 형태로 결합제를 암호화하는 핵산을 이용하여 세포를 형질감염 또는 형질도입함으로써 또는 대안적으로 세포 표면에 결합제를 결합시킴으로써 달성될 수 있다.
다른 실시형태에서, 1차 자극 신호를 제공하는 분자, 예를 들어 TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통해 자극을 제공하는 분자, 및 공동자극 분자는 항원 제시 세포 상에서 나타난다.
일 실시형태에서, 1차 자극 신호를 제공하는 분자, 예를 들어 TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통해 자극을 제공하는 분자, 및 공동자극 분자는 별개의 표면 상에서 제공된다.
특정 실시형태에서, 자극 및 공동자극 신호를 제공하는 결합제 중 하나는 가용성(용액 중에서 제공됨)이며, 다른 제제(들)는 하나 이상의 표면 상에서 제공된다.
특정 실시형태에서, 자극 및 공동자극 신호를 제공하는 결합제는 둘 다 (용액 중에서 제공되는) 가용성 형태로 제공된다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 T 세포 게놈 편집 방법은 항-CD3 및 항-CD28 항체를 이용하여 T 세포를 활성화시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 방법에 의해 활성화된 T 세포를 확장시키는 것은 몇 시간(약 3시간) 내지 약 7일 내지 약 28일 또는 임의의 그 사이의 매시간의 정수값 동안 T 세포를 포함하는 세포 집단을 배양시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, T 세포 조성물은 14일 동안 배양될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 약 21일 동안 배양된다. 다른 실시형태에서, T 세포 조성물은 약 2 내지 3일 동안 배양된다. T 세포의 배양 시간이 60일 이상일 수 있도록 몇몇 주기의 자극/활성화/확장이 또한 요망될 수 있다.
특정 실시형태에서, T 세포 배양에 적절한 조건은 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, X-vivo 15, 론자(Lonza)) 및 혈청(예를 들어, 소태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, 및 TNF-α 또는 당업자에게 공지된 세포 성장에 적합한 임의의 다른 첨가제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 증식 및 생존도에 필수적인 하나 이상의 인자를 포함한다.
세포 배양 배지의 추가적인 예시적 예는 무혈청의 또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정해진 세트의 호르몬 및/또는 양의 사이토카인(들)으로 보충한 아미노산, 피루브산나트륨 및 비타민을 첨가한 RPMI 1640, 클릭스(Clicks), AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20, 옵티마이저(Optimizer)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 대상체에 주입될 세포의 배양물에서가 아닌 실험 배양물에서만 포함된다. 표적 세포는 성장을 뒷받침하는 데 필수적인 조건, 예를 들어, 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 분위기(예를 들어, 공기 + 5% C02) 하에 유지된다.
특정 실시형태에서, PBMC 또는 단리된 T 세포는 적절한 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15가 있는 배양 배지에서 비드 또는 다른 표면에 일반적으로 부착되는 자극 제제 및 공동자극 제제, 예컨대 항-CD3 및 항-CD28 항체와 접촉된다.
다른 실시형태에서, 인공 APC(aAPC)는 다양한 공동자극 분자 및 사이토카인의 안정한 발현 및 분비를 지시하는 K562, U937, 721.221, T2 및 C1R 세포를 유전자 조작함으로써 만들어진다. 특정 실시형태에서, K32 또는 U32 aAPC는 AAPC 세포 표면 상에서 하나 이상의 항체-기반 자극 분자의 디스플레이를 지시하기 위해 사용된다. T 세포 집단은 CD137L(4-1BBL), CD134L(OX40L), 및/또는 CD80 또는 CD86을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 공동자극 분자를 발현시키는 APC에 의해 확장될 수 있다. 최종적으로, aAPC는 유전자 변형된 T 세포를 확장시키기 위한 그리고 CD8 T 세포 상에서 CD28 발현을 유지하기 위한 효율적인 플랫폼을 제공한다. WO 03/057171 및 미국 특허 제2003/0147869호에 제공된 aAPC는 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
다양한 실시형태에서, T 세포에서 TCRα 대립유전자를 편집하기 위한 방법은 본 명세서에 상정된 하나 이상의 조작된 뉴클레아제를 T 세포 집단 내로 도입하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 하나 이상의 뉴클레아제는 활성화 및 자극 전에 T 세포 내로 도입된다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 하나 이상의 뉴클레아제는 T 세포가 자극되는 것고 거의 동시에 T 세포 내로 도입된다.
바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 하나 이상의 뉴클레아제는 T 세포 활성화 및 자극 후에, 예를 들어, 약 1, 2, 3 또는 4일 후에 T 세포 내로 도입된다. 특정 실시형태에서 T 세포 내로 도입되는 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 메가뉴클레아제, 메가TAL, TALEN, ZFN, 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제; 및 선택적으로 말단-가공 뉴클레아제 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편, 예를 들어, 5'-3' 엑소뉴클레아제, 5'-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제, 3'-5'엑소뉴클레아제(예를 들어, Trex2), 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 헬리카제 또는 주형-의존적 DNA 중합효소 활성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 엔도뉴클레아제 및 말단 가공 뉴클레아제는 융합 단백질로서 발현될 수 있고, 다시트론성 mRNA로부터 발현될 수 있거나, 또는 하나 이상의 발현 카세트로부터 독립적으로 발현된다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 벡터를 이용하여 T 세포 내로 도입된다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 바람직하게는 mRNA로서 T 세포 내로 도입된다. 뉴클레아제는 미량주사법, 형질감염, 리포펙션, 열충격, 전기천공법, 형질도입, 유전자 총, 미량주사법, DEAE-덱스트란-매개 전달 등에 의해 T 세포 내로 도입될 수 있다.
특정 실시형태에서 상정된 게놈 편집 방법은 표적 부위에서 DSB를 생성하기 위해 본 명세서에 상정된 하나 이상의 조작된 뉴클레아제를 활성화되고 자극된 T 세포의 집단 내로 도입하는 단계 및 후속적으로 상동성 재조합에 의해 DSB 부위에서 세포 게놈 내로 혼입될 T 세포 집단에 하나 이상의 공여자 수선 주형을 도입하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역억제 신호 댐퍼, 플립 수용체, 조작된 T 세포 수용체의 알파 및/또는 베타 쇄(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 Daric 수용체 또는 이들의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 공여자 주형이 T 세포 집단 내로 도입된다. 공여자 주형은 미량주사법, 형질감염, 리포펙션, 열충격, 전기천공법, 형질도입, 유전자 총, 미량주사법, DEAE-덱스트란-매개 전달 등에 의해 T 세포 내로 도입될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 mRNA 전기천공법에 의해 T 세포 내로 도입되고 하나 이상의 공여자 수선 주형은 바이러스 형질도입에 의해 T 세포 내로 도입된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 mRNA 전기천공법에 의해 T 세포 내로 도입되고 하나 이상의 공여자 수선 주형은 AAV 형질도입에 의해 T 세포 내로 도입된다. AAV 벡터는 AAV2로부터의 ITR, 및 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAV10 중 임의의 하나로부터의 혈청형을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, AAV 벡터는 AAV2로부터의 ITR 및 AAV6로부터의 혈청형을 포함할 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 mRNA 전기천공법에 의해 T 세포 내로 도입되고 하나 이상의 공여자 수선 주형은 렌티바이러스 형질도입에 의해 T 세포 내로 도입된다. 렌티바이러스 벡터 골격은 HIV-1, HIV-2, 비스나-메디 바이러스(visna-maedi virus: VMV) 바이러스, 염소-관절염-뇌염 바이러스(caprine arthritis-encephalitis virus: CAEV), 말 전염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus: EIAV), 고양이 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus: FIV), 소 면역 결핍 바이러스(bovine immune deficiency virus: BIV), 또는 유인원 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus: SIV)로부터 유래될 수 있다.
하나 이상의 공여자 수선 주형은 하나 이상의 조작된 뉴클레아제가 세포 내로 도입되기 전에, 동시에 또는 후에 전달될 수 있다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 공여자 수선 주형은 하나 이상의 조작된 뉴클레아제와 동시에 전달된다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 공여자 수선 주형은 하나 이상의 조작된 뉴클레아제 전에, 예를 들어, 하나 이상의 조작된 뉴클레아제 전에 약 1분 내지 약 30분, 약 1분 내지 약 60분, 약 1분 내지 약 90분, 약 1시간 내지 약 24시간 또는 하나 이상의 조작된 뉴클레아제 전에 24시간 초과를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 하나 이상의 공여자 수선 주형의 몇 초 내지 몇 시간 내지 며칠 전에 전달된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 공여자 수선 주형은 뉴클레아제 후에, 바람직하게는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8시간 내에; 더 바람직하게는, 약 1, 2, 3 또는 4시간 내에; 또는 더 바람직하게는, 약 4시간 내에 전달된다.
하나 이상의 공여자 수선 주형은 하나 이상의 조작된 뉴클레아제와 동일한 전달 시스템을 이용하여 전달될 수 있다. 비제한적 예로서, 동시에 전달될 때, 공여자 수선 주형 및 조작된 뉴클레아제는 동일한 벡터, 예를 들어, IDLV 렌티바이러스 벡터 또는 AAV 벡터(예를 들어, AAV6)에 의해 암호화될 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 조작된 뉴클레아제(들)는 mRNA 전기천공법에 의해 전달되고, 그리고 공여자 수선 주형은 AAV 벡터에 의한 형질도입에 의해 전달된다.
특정 실시형태에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템이 T 세포에서 TCRα 대립유전자를 변형시키기 위해 사용되는 경우, Cas 뉴클레아제는 mRNA 전기천공법에 의해 T 세포 내로 도입되고, 게놈 및 공여자 수선 주형에서 편집될 부위 근처에 결합하는 tracrRNA:crRNA 또는 sgRNA를 암호화하는 발현 카세트는 IDLV 렌티바이러스 벡터 또는 AAV 벡터에 의한 형질도입에 의해 전달된다.
특정 실시형태에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템이 T 세포에서 TCRα 대립유전자를 변형시키기 위해 사용되는 경우, Cas 뉴클레아제 및 게놈에서 편집될 부위 근처에 결합하는 tracrRNA:crRNA 또는 sgRNA는 mRNA 전기천공법에 의해 T 세포 내로 도입되고 그리고 공여자 수선 주형은 IDLV 렌티바이러스 벡터 또는 AAV 벡터를 이용하는 형질도입에 의해 전달된다.
일 실시형태에서, tracrRNA:crRNA 또는 sgRNA는 화학적으로 보호된 5 및 3' 말단을 갖는 화학적으로 합성된 RNA이다.
다른 실시형태에서, Cas9는 화학적으로 합성된 tracrRNA:crRNA 또는 sgRNA와 복합체화된 단백질로서 전달된다.
다양한 실시형태에서, 면역 효과기 세포를 편집하는 방법은 세포를 CD3 TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 제제 및 T 세포 표면 상에서 공동자극 분자를 자극하는 리간드와 접촉시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포를 편집하는 방법은 세포를 적절한 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15를 갖는 배양 배지에서 자극제 및 공동자극제, 예컨대 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체, 또는 비드 또는 다른 표면에 부착된 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포를 편집하는 방법은 세포를 적절한 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15 및/또는 PI3K/Akt/mTOR 세포 신호전달 경로를 조절하는 하나 이상의 제제를 갖는 배양 배지에서 자극제 및 공동자극제, 예컨대 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체, 또는 비드 또는 다른 표면에 부착된 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "AKT 저해제"는 AKT의 적어도 하나의 활성을 저해하는 핵산, 펩타이드, 화합물 또는 소분자를 지칭한다. 용어 "mTOR 저해제" 또는 "mTOR을 저해하는 제제"는 mTOR 단백질의 적어도 하나의 활성, 예를 들어, 물질(예를 들어, p70S6 키나제 1, 4E-BP1, AKT/PKB 및 eEF2)의 적어도 하나에 대한 세린/트레오닌 단백질 키나제 활성을 저해하는 핵산, 펩타이드, 화합물 또는 소 유기 분자를 지칭한다.
특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포를 편집하는 방법은 세포를 적절한 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15 및/또는 PI3K 세포 신호전달 경로를 조절하는 하나 이상의 제제를 갖는 배양 배지에서 자극제 및 공동자극제, 예컨대 가용성 항-CD3 및 항-CD28 항체, 또는 비드 또는 다른 표면에 부착된 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "PI3K 저해제"는 PI3K에 결합하고 이의 적어도 하나의 활성을 저해하는 핵산, 펩타이드, 화합물 또는 소분자를 지칭한다. PI3K 단백질은 3개 부류, 즉, 클래스 1 PI3K, 클래스 2 PI3K 및 클래스 3 PI3K로 나누어질 수 있다. 클래스 1 PI3K는 4개의 p110 촉매적 서브유닛(p110α, p110β, p110δ 및 p110γ) 중 하나 및 조절 서브유닛의 2개 패밀리 중 하나로 이루어지니 이형이량체로서 존재한다. 특정 실시형태에서, PI3K 저해제는 클래스 1 PI3K 저해제를 표적화한다. 일 실시형태에서, PI3K 저해제는 클래스 1 PI3K 저해제의 하나 이상의 아이소폼에 대한 선택성(즉, p110α, p110β, p110δ 및 p110γ 또는 p110α, p110β, p110δ 및 p110γ 중 하나 이상에 대한 선택성)을 나타낼 것이다. 다른 양상에서, PI3K 저해제는 아이소폼 선택성을 나타내지 않을 것이며, "pan-PI3K 저해제"로서 고려될 것이다. 일 실시형태에서, PI3K 저해제는 PI3K 촉매적 도메인에 대한 결합에 대해 ATP와 경쟁할 것이다.
특정 실시형태에서, PI3K 저해제는, 예를 들어, PI3K-AKT-mTOR 경로에서 PI3K뿐만 아니라 추가적인 단백질을 표적화할 수 있다. 특정 실시형태에서, mTOR과 PI3K를 둘 다 표적화하는 PI3K 저해제는 mTOR 저해제 또는 PI3K 저해제 중 하나로서 지칭될 수 있다. PI3K만을 표적화하는 PI3K 저해제는 선택적 PI3K 저해제로서 지칭될 수 있다. 일 실시형태에서, 선택적 PI3K 저해제는 경로에서 mTOR 및/또는 다른 단백질에 대해 저해제의 IC50보다 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000배 이상 더 낮은 PI3K에 대해 50% 저해 농도를 나타내는 제제를 지칭하는 것으로 이해될 수 있다.
특정 실시형태에서, 예시적인 PI3K 저해제는 약 200nM 이하, 바람직하게는 약 100㎚ 이하, 훨씬 더 바람직하게는 약 60nM 이하, 약 25nM, 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 100μM, 50μM, 25μM, 10μM, 1μM 이하의 IC50(활성의 50%를 저해하는 농도)로 PI3K를 저해한다. 일 실시형태에서, PI3K 저해제는 약 2nM 내지 약 100㎚, 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 50nM, 훨씬 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 15nM의 IC50으로 PI3K를 저해한다.
특정 실시형태에서 상정된 T 세포 제조 방법에서 사용하기에 적합한 PI3K 저해제의 예시적인 예는 BKM120(클래스 1 PI3K 저해제, 노바티스(Novartis)), XL147(클래스 1 PI3K 저해제, 엑셀릭시스(Exelixis)), (pan-PI3K 저해제, 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)) 및 PX-866(클래스 1 PI3K 저해제; p110α, p110β, 및 p110γ 아이소폼, 온코타이레온)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
선택적 PI3K 저해제의 다른 예시적 예는 BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, ZSTK474 및 IPI-145를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
pan-PI3K 저해제의 추가적인 예시적 예는 BEZ235, LY294002, GSK1059615, TG100713 및 GDC-0941을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
바람직한 실시형태에서, PI3K 저해제는 ZSTK474이다.
일 실시형태에서, i) CD62L, CD127, CD197 및 CD38 또는 ii) CD62L, CD127, CD27 및 CD8로 이루어진 군으로부터 선택된 마커의 하나 이상의 발현은 PI3K 저해제 없이 배양된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배 이상 증가된다. 일 실시형태에서, T 세포는 CD8+ T 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 및 LAG3으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 저해제와 함께 배양된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배 이상 감소된다. 일 실시형태에서, T 세포는 CD8+ T 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 제조 방법은 미경험 또는 발생적으로 강한 T 세포의 하나 이상의 마커를 포함하는 T 세포 수를 증가시킨다. 임의의 특정 이론으로 구속되는 일 없이, 본 발명자들은 하나 이상의 PI3K 저해제와 함께 T 세포를 포함하는 세포 집단을 배양시키는 것이 발생적으로 강한 T 세포 확장의 증가를 초래하며 기존의 T 세포 요법에 비해 더 강하고 효능있는 적응 T 세포 면역요법을 제공하는 것으로 여겨진다.
특정 실시형태에서 상정된 방법을 이용하여 제조된 T 세포에서 증가된 미경험 또는 발생적으로 강한 T 세포 마커의 예시적인 예는 i) CD62L, CD127, CD197 및 CD38 또는 ii) CD62L, CD127, CD27 및 CD8을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 미경험 T 세포는 다음의 마커 중 하나 이상을 발현시키지 않거나 또는 실질적으로 발현시키지 않는다: CD57, CD244, CD160, PD-1, BTLA, CD45RA, CTLA4, TIM3 및 LAG3.
T 세포에 대해, 특정 실시형태에서 상정된 다양한 확장 방법으로부터 초래된 T 세포 집단은 사용되는 조건에 따라서 다양한 특정 표현형 특성을 가질 수 있다. 다양한 실시형태에서, 확장된 T 세포 집단은 다음의 표현형 마커 중 하나 이상을 포함한다: CD62L, CD27, CD127, CD197, CD38, CD8 및 HLA-DR.
일 실시형태에서, 이러한 표현형 마커는 CD62L, CD127, CD197 및 CD38 중 하나 이상 또는 모두의 향상된 발현을 포함한다. 특정 실시형태에서, CD62L, CD127, CD197 및 CD38을 포함하는 미경험 T 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 하는 CD8+ T 림프구는 확장된다.
일 실시형태에서, 이러한 표현형 마커는 CD62L, CD127, CD27 및 CD8 중 하나 이상 또는 모두의 향상된 발현을 포함한다. 특정 실시형태에서, CD62L, CD127, CD27 및 CD8을 포함하는 미경험 T 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 하는 CD8+ T 림프구는 확장된다.
특정 실시형태에서, CD45RO, CD62L, CD127, CD197, 및 CD38을 포함하는 중심 기억 T 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 하고 그랜자임 B에 대해 음성인 T 세포가 확장된다. 일부 실시형태에서, 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포이다.
특정 실시형태에서, CD62L을 포함하는 미경험 CD4+ 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 하고 CD45RA 및/또는 CD45RO의 발현에 대해 음성인 CD4+ T 림프구가 확장된다. 일부 실시형태에서, CD4+ 세포는 CD62L 및 CD45RO 양성을 포함하는 중심 기억 CD4+ 세포의 표현형 마커 발현을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 효과기 CD4+ 세포는 CD62L 양성 및 CD45RO 음성이다.
특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 자극제 및 공동자극제, 예컨대 항-CD3 및 항-CD28 항체 및 PI3K 저해제의 존재 하에 세포를 활성화시키고 자극시킴으로써 편집된다. 활성화 및 자극 후 약 1, 2, 3, 4 또는 5일 후에, 본 명세서에 상정된 하나 이상의 뉴클레아제는 세포 내로 도입된다. 특정 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 뉴클레아제가 세포 내로 도입되고 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8시간 후에 공여자 수선 주형을 암호화하는 벡터를 이용하여 형질도입된다. 특정 실시형태에서, PI3K 저해제는 편집 과정 내내 존재하며, 다른 실시형태에서, PI3K는 활성화, 자극 및 확장 동안 존재한다. 일 실시형태에서, PI2K 저해제는 확장 동안만 존재한다.
F. 폴리펩타이드
메가뉴클레아제, 메가TAL, TALEN, ZFN, Cas 뉴클레아제, 말단-가공 뉴클레아제, 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼, 조작된 항원 수용체, 치료적 폴리펩타이드, 융합 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드를 발현시키는 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 폴리펩타이드가 본 명세서에 상정된다. 바람직한 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 2, 5 내지 7 및 11에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. "폴리펩타이드", "폴리펩타이드 단편", "펩타이드" 및 "단백질"은 달리 반대로 구체화되지 않는 한, 그리고 통상적인 의미에 따라, 즉, 아미노산 서열로서, 상호 호환적으로 사용된다. 일 실시형태에서, "폴리펩타이드"는 융합 폴리펩타이드 및 다른 변이체를 포함한다. 폴리펩타이드는 다양한 잘 공지된 재조합 및/또는 합성 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 폴리펩타이드는 특정 길이로 제한되지 않으며, 예를 들어, 그들은 전장 단백질 서열, 전장 단백질의 단편, 또는 융합 단백질을 포함할 수 있으며, 폴리펩타이드의 번역 후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형, 천연 유래와 비-천연 유래 둘 다를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "단리된 펩타이드" 또는 "단리된 폴레펩타이드" 등은 세포 환경으로부터의, 그리고 세포의 다른 성분과의 회합으로부터의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 분자의 시험관내 단리 및/또는 정제를 지칭하며, 즉, 이는 생체내 물질과 유의하게 회합되어 있지 않다.
특정 실시형태에서 상정된 폴리펩타이드의 예시적 예는 메가뉴클레아제, 메가TAL, TALEN, ZFN, Cas 뉴클레아제, 말단-가공 뉴클레아제, 면역억제 신호 댐퍼, 플립 수용체, 조작된 TCR, CAR, Daric, 치료 폴리펩타이드 및 융합 폴리펩타이드 및 이들의 변이체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
폴리펩타이드는 "폴리펩타이드 변이체"를 포함한다. 폴리펩타이드 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입이 천연 유래 폴리펩타이드와 상이할 수 있다. 이러한 변이체는 천연 유래일 수 있거나 또는, 예를 들어, 상기 폴리펩타이드 서열의 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 합성적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 내로 하나 이상의 치환, 결실, 첨가 및/또는 결실을 도입함으로써 조작된 뉴클레아제, 면역억제 신호 댐퍼, 플립 수용체, 조작된 TCR, CAR, Daric 등의 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 상정된 임의의 기준 서열에 대해 적어도 약 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하되, 전형적으로 변이체는 기준 서열의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다.
폴리펩타이드 변이체는 생물학적으로 활성인 "폴리펩타이드 단편"을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적으로 활성인 단편" 또는 "최소 생물학적으로 활성인 단편"은 천연 유래 폴리펩타이드 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 적어도 30%, 적어도 20%, 적어도 10% 또는 적어도 5%를 보유하는 폴리펩타이드 단편을 지칭한다. 폴리펩타이드 단편은 천연 유래 또는 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산의 아미노-말단 결실, 카복실-말단 결실, 및/또는 내부 결실 또는 치환을 갖는 단량체 또는 다량체일 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 단편은 적어도 5 내지 약 1700개의 아미노산 길이를 갖는 아미노산 쇄를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 단편은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700개 이상의 아미노산 길이라는 것이 인식될 것이다.
폴리펩타이드 단편의 예시적 예는 DNA 결합 도메인, 뉴클레아제 도메인, 항체 단편, 세포외 리간드 결합 도메인, 신호전달 도메인, 막관통 도메인, 다량체화 도메인 등을 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, 폴리펩타이드는 아미노산 치환, 결실, 절단 및 삽입을 포함하는 다양한 방법으로 변경될 수 있다. 이러한 조작을 위한 방법은 일반적으로 당업게에 공지되어 있다. 예를 들어, 기준 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체는 DNA의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 뉴클레오타이드 서열 변경을 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382)], 미국 특허 제4,873,192호, 문헌[Watson, J. D. et al., (Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)] 및 거기에 인용된 참고문헌. 관심 대상의 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 가이드는 문헌[Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)]의 모델에서 찾을 수 있다.
특정 실시형태에서, 변이체는 하나 이상의 보존적 치환을 함유할 것이다. "보존적 치환"은, 펩타이드 화학의 당업자가 실질적으로 변화되지 않을 폴리펩타이드의 2차 구조 및 소수성 특성을 예상하도록, 아미노산이 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환되는 것이다. 변형은 특정 실시형태에서 상정된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 구조에서 만들어질 수 있으며, 폴리펩타이드는 적어도 약 몇 개의 폴리펩타이드를 갖는 폴리펩타이드를 포함하고, 바람직한 특징을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩타이드를 암호화하는 기능성 분자를 여전히 얻는다. 동등물 또는 심지어 개선된 변이체 폴리펩타이드를 생성하기 위해 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변경하도록 요망될 때, 당업자는, 예를 들어, 예를 들어 표 1에 따라 DNA 서열을 암호화하는 코돈 중 하나 이상을 변화시킬 수 있다.
Figure 112018099115031-pct00001
Figure 112018099115031-pct00002
아미노산 잔기가 생물학적 활성을 없애는 일 없이 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 가이드는 당업계에 잘 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 DNASTAR, DNA Strider, Geneious, Mac Vector 또는 Vector NTI 소프트웨어를 이용하여 찾을 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 단백질 변이체의 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉, 유사하게 하전된 또는 비변형 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 그들의 측쇄와 관련된 아미노산 패밀리 중 하나의 치환을 수반한다. 천연 유래 아미노산은 일반적으로 4가지 패밀리로 나누어진다: 산성(아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성(라이신, 알기닌, 히스티딘), 비극성(알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판) 및 비하전 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신) 아미노산. 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 때때로 방향족 아미노산과 공동으로 분류된다. 펩타이드 또는 단백질에서, 아미노산의 적합한 보존적 치환은 당업자에게 공지되어 있고, 일반적으로 얻어진 분자의 생물학적 활성을 변경시키는 일 없이 이루어질 수 있다. 당업자는 일반적으로, 폴리펩타이드의 비필수 영역 내 단일 아미노산 치환은 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인식한다(예를 들어, 문헌[Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co.,p.224] 참조).
이러한 변화를 만드는 데, 아미노산의 소수성 지수가 고려될 수 있다. 단백질에 반복적 생물학적 기능을 부여하는 데 소수성 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다(본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Kyte and Doolittle, 1982]). 각각의 아미노산은 그의 소수성 및 하전 특징에 기반하여 소수성 지수가 부여되었다(Kyte and Doolittle, 1982). 이들 값은 아이소류신(+4.5); 발린 (+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스테인(+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 알기닌(-4.5)이다.
특정 아미노산은 유사한 소수성 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래하며, 즉, 생물학적 기능성이 동등한 단백질을 얻는다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 변화를 만드는 데 있어, 소수성 지수가 2 내인 아미노산의 치환이 바람직하며, 1 내인 것이 특히 바람직하고, 0.5 내인 것은 훨씬 더 특히 바람직하다. 유사 아미노산의 치환은 친수성을 기준으로 더 효과적으로 이루어질 수 있다는 것이 이해된다.
미국 특허 제4,554,101호에서 상술하는 바와 같이, 다음의 친수성 값은 아미노산 잔기: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0);메티오닌(-1.3); 발린(-1.5);류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4)이 부여되었다. 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 생물학적으로 동등한, 그리고 특히 면역학적으로 동등한 단백질을 얻는다는 것이 이해된다. 이러한 변화에서, 친수성 값이 2 내인 아미노산의 치환이 바람직하며, 1 내인 것이 특히 바람직하고, 0.5 내인 것은 훨씬 더 특히 바람직하다.
상기 약술한 바와 같이, 아미노산 치환은 아미노산 측쇄 치환체, 예를 들어, 그들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등의 상대적 유사성에 기반할 수 있다.
폴리펩타이드 변이체는 글리코실화된 형태, 다른 분자와의 응집 접합체 및 비관련 화학 모이어티(예를 들어, 페길화된 분자)와의 공유 접합체를 추가로 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이 아미노산 쇄에서 또는 N- 또는 C-말단 잔기에서 발견되는 기에 작용기를 연결함으로써 공유 변이체가 제조될 수 있다. 변이체는 또한 대립유전자 변이체, 종 변이체 및 뮤테인을 포함한다. 단백질의 기능적 활성에 영향을 미치지 않는 영역의 절단 또는 결실은은 또한 변이체이다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 폴리펩타이드의 발현이 요망되는 경우에, 그들을 암호화하는 폴리펩타이드 서열은 본 명세서의 다른 곳에 개시된 바와 같은 IRES 서열에 의해 분리될 수 있다.
특정 실시형태에서 상정된 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드 및 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 융합 폴리펩타이드 및 융합 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 폴리펩타이드 세그먼트를 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다.
다른 실시형태에서, 2개 이상의 폴리펩타이드는 본 명세서의 다른 곳에 개시된 바와 같은 하나 이상의 세포-절단성 폴리펩타이드 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 융합 단백질은 하나 이상의 DNA 결합 도메인 및 하나 이상의 뉴클레아제, 및 하나 이상의 링커 및/또는 세포-절단성 폴리펩타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 융합 단백질은 하나 이상의 엑소도메인, 세포외 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 또는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 및 선택적으로 하나 이상의 다량체화 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서 상정된 융합 단백질의 예시적 예에서, 폴리펩타이드는 적어도 약 메가TAL, TALEN, ZFN, Cas 뉴클레아제, 말단-가공 뉴클레아제, 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼, 조작된 항원 수용체 및 다른 폴리펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 폴리펩타이드를 포함한다.
융합 폴리펩타이드는 신호 펩타이드, 세포 침투성 펩타이드 도메인(CPP), DNA 결합 도메인, 뉴클레아제 도메인, 크로마틴 리모델링 도메인, 히스톤 변형 도메인, 후성적 변형 도메인, 엑소도메인, 세포외 리간드 결합 도메인, 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 세포내 신호전달 도메인, 다량체화 도메인, 에피토프 태그(예를 들어, 말토스 결합 단백질(maltose binding protein: "MBP"), 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST), HIS6, MYC, FLAG, V5, VSV-G 및 HA), 폴리펩타이드 링커 및 폴리펩타이드 절단 신호를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 폴리펩타이드 도메인 또는 세그먼트를 포함할 수 있다. 융합 폴리펩타이드는 그들이 또한 C-말단 대 C-말단, N-말단 대 N-말단, 또는 N-말단 대 C-말단으로 연결될 수 있지만, 전형적으로는 C-말단 대 N-말단으로 연결된다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질의 폴리펩타이드는 임의의 순서일 수 있다. 융합 폴리펩타이드의 목적으로 하는 활성이 보존되는 한, 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 또한 보존적으로 변형된 변이체, 다형체 변이체, 대립유전자, 돌연변이체, 하위서열 및 종간 상동체를 포함할 수 있다. 융합 폴리펩타이드는 화학적 합성 방법에 의해 또는 두 모이어티 사이의 화학적 결합에 의해 생성될 수 있거나 또는 일반적으로 다른 표준 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 융합 폴리펩타이드를 포함하는 결찰된 DNA 서열은 본 명세서의 다른 곳에 개시된 바와 같은 적합한 전사 또는 번역 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 뉴클레아제는 촉매적으로 비활성인 변이체이며, 번역 인자의 리프레서 도메인, 히스톤 메틸라제 또는 데메틸라제 도메인, 히스톤 아세틸라제 또는 데아세틸라제 도메인, 수모일화(SUMOylation) 도메인, 유비퀴틴일화 도메인 또는 DNA 메틸라제 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 뉴클레아제는 촉매적으로 비활성인 변이체이며, mSin 상호작용 도메인(SID), SID4X, 쿠루펠-결합 박스(Kruppel-associated box: KRAB) 도메인, 또는 아라비돕시스 탈리아나 슈퍼맨(Arabidopsis thaliana SUPERMAN) 단백질로부터의 SRDX 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 리프레스 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 SID 도메인은 몇몇 전사 리프레서 단백질에 존재하는 상호작용 도메인이고, 추가적인 리프레서 도메인 및 공동리프레서에 의해 작용할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 SID4X는 짧은 펩타이드 링커에 의해 함께 4개의 SID 도메인 링커의 연쇄 반복부(tandem repeat)를 가진다. 본 명세서에서 사용되는 KRAB 도메인은 몇몇 아연 핑거 단백질 기반 번역 인자, 예를 들어, KOX1의 N-말단에서 보통 발견되는 도메인이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 뉴클레아제는 촉매적으로 비활성인 변이체이고, KRAB 도메인을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 전사를 억제하는 도메인을 포함하는 본 명세서에 상정된 촉매적으로 비활성인 뉴클레아제 돌연변이체는 전사적으로 넉다운 또는 표적 유전자의 넉아웃 발현으로 유전자를 표적화하는 데 유용할 수 있다.
일 실시형태에서, 융합 상대는 천연 재조합 단백질보다 더 고수율로 단백질(발현 인핸서)를 발현시키는 것을 돕는 서열을 포함한다. 다른 융합 상대는 단백질의 용해도를 증가시키기 위해 또는 단백질이 목적으로 하는 세포내 구획으로 표적화되는 것을 가능하게 하기 위해 또는 세포막을 통한 융합 단백질의 수송을 용이하게 하기 위해 선택될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 하나 이상의 CPP를 포함한다. 폴리펩타이드 화합물의 투여에서 중요한 인자는 폴리펩타이드가 세포의 혈장막, 또는 핵과 같은 세포내 구획의 막을 가로지르는 능력을 가진다는 것을 보장하는 것이다. 세포막은 작은, 비이온성 친유성 화합물에 자유롭게 침투 가능한 지질-단백질 이중증으로 구성되며 극성 화합물, 거대분자 및 치료 또는 진단제에 대해 본래 불침투성이다. 그러나, 세포막을 가로지르는 폴리펩타이드를 전위시키는 능력을 갖는 단백질, 지질 및 다른 화합물이 기재되었다.
단백질 흡수를 용이하게 할 수 있는 펩타이드 서열의 예는 HIV TAT 폴리펩타이드; p16 단백질의 아미노산 84 내지 103에 대응하는 20개의 잔기 펩타이드 서열(문헌[Fahraeus et al., 1996. Curr. Biol. 6:84] 참조); 안테나페디아(Antennapedia)의 60개 아미노산 길이의 호메오도메인의 제3 나선(Derossi et al., 1994. J. Biol. Chem. 269:10444); 신호 펩타이드의 h 영역, 예컨대 카포시 섬유아세포 성장 인자(K-FGF) h 영역; 및 HSV로부터의 VP22 전위 도메인(Elliot et al., 1997. Cell88:223-233)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가로, 클로스트리듐 페르프린게네스(Clostridium perfringens) 아이오타 독소, 디프테리아 독소(DT), 슈도모나스 엑소톡신 A(Pseudomonas exotoxin A)(PE), 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis) 독소(PT), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 독소, 및 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis) 아데닐산 고리화효소(CYA)를 포함하는 몇몇 박테리아 독소는 내부 또는 아미노-말단 융합으로서 세포 사이토졸에 펩타이드를 전달하기 위해 사용되었다. 문헌[Arora et al., 1993. J. Biol. Chem. 268:3334-3341; Perelle et al., 1993. Infect. Immun. 61:5147-5156; Stenmark et al., 1991. J. Cell Biol. 113:1025-1032; Donnelly et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3530-3534; Carbonetti et al., 1995. Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 95:295; Sebo et al., 1995. Infect. Immun. 63:3851-3857; Klimpel et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10277-10281; 및 Novak et al., 1992. J. Biol. Chem. 267:17186-17193].
다른 예시적인 CPP 아미노산 서열은 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: RKKRRQRRR (서열번호 23), KKRRQRRR (서열번호 24), 및 RKKRRQRR (서열번호 25)(HIV TAT 단백질로부터 유래); RRRRRRRRR (서열번호 26); KKKKKKKKK (서열번호 27); RQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호 28) (초파리 Antp 단백질로부터 유래); RQIKIWFQNRRMKSKK (서열번호 29) (초파리 Ftz 단백질로부터 유래); RQIKIWFQNKRAKIKK (서열번호 30) (초파리 Engrailed 단백질로부터 유래); RQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호 31) (인간 Hox-A5 단백질로부터 유래); 및 RVIRVWFQNKRCKDKK (서열번호 32) (인간 Isl-1 단백질로부터 유래). 이러한 하위서열은 세포막에 걸쳐 본 명세서에 상정된 융합 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 전위를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
융합 폴리펩타이드는 선택적으로 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 내의 도메인을 연결하기 위해 사용될 수 있는 링커를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 도메인이 그들의 목적으로 하는 기능을 발휘하는 것을 허용하기 위해 각각의 폴리펩타이드가 적절한 2차 및 3차 구조로 폴딩되는 것을 보장하기에 충분한 거리만큼 임의의 2개 이상의 폴리펩타이드 성분을 분리시키기 위해 펩타이드 링커 서열이 사용될 수 있다. 이러한 펩타이드 링커 서열은 당업계에서 표준 기법을 이용하여 융합 폴리펩타이드 내로 혼입된다. 적합한 펩타이드 링커 서열은 다음의 인자에 기반하여 선택될 수 있다: (1) 유연한 연장된 형태를 채택하는 그들의 능력; (2) 제1 및 제2 폴리펩타이드에 대한 기능성 에피토프와 상호작용할 수 있는 2차 구조를 채택하는 것에 대한 그들의 불능; 및 (3) 폴리펩타이드 기능성 에피토프와 반응하는 소수성 또는 하전된 잔기의 결여. 바람직한 펩타이드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유한다. 다른 근처의 중성 아미노산, 예컨대 Thr 및 Ala은 또한 링커 서열에서 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열은 문헌[Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986]; 미국 특허 제4,935,233호 및 미국 특허 제4,751,180호에 개시된 것을 포함한다. 특정 융합 폴리펩타이드 세그먼트가 기능성 도메인을 분리시키고 입체 방해를 방지하기 위해 사용될 수 있는 비필수 N-말단 아미노산 영역을 함유할 때 링커 서열은 필요하지 않다. 바람직한 링커는 전형적으로 재조합 융합 단백질의 부분으로서 합성되는 유연한 아미노산 하위서열이다. 링커 폴리펩타이드는 길이가 1 내지 200개의 아미노산, 길이가 1 내지 100개의 아미노산 또는 길이가 1 내지 50개의 아미노산(그 사이의 모든 정수값을 포함)일 수 있다.
예시적인 링커는 다음의 아미노산 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 글리신 중합체(G)n; 글리신-세린 중합체(G1-5S1-5)n(여기서, n은 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수임; 글리신-알라닌 중합체; 알라닌-세린 중합체; GGG (서열번호 33); DGGGS (서열번호 34); TGEKP (서열번호 35)(예를 들어, 문헌[Liu et al., PNAS 5525-5530 (1997)] 참조); GGRR(서열번호 36)(Pomerantz et al. 1995, 상기 참조); (GGGGS)n(여기서, n = 1, 2, 3, 4 또는 5임)(서열번호 37) (Kim et al., PNAS 93, 1156-1160 (1996.); EGKSSGSGSESKVD(서열번호 38) (Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD (서열번호 39) (Bird et al., 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS (서열번호 40); LRQRDGERP (서열번호 41); LRQKDGGGSERP (서열번호 42); LRQKD(GGGS)2ERP (서열번호 43). 대안적으로, 유연한 링커는 DNA-결합 부위와 펩타이드 그 자체 둘 다를 모델링할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 이용하여(Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103(1994) 또는 파지 디스플레이 방법에 의해 합리적으로 설계될 수 있다.
융합 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 각각의 폴리펩타이드 도메인 사이에 또는 내인성 오픈 리딩 프레임과 공여자 수선 주형에 의해 암호화된 폴리펩타이드 사이에 폴리펩타이드 절단 신호를 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 폴리펩타이드 절단 부위는 임의의 링커 펩타이드 서열에 더해질 수 있다. 예시적인 폴리펩타이드 절단 신호는 폴리펩타이드 절단 인식 부위, 예컨대 프로테아제 절단 부위, 뉴클레아제 절단 부위(예를 들어, 희귀 제한 효소 인식 부위, 세포-절단성 리보자임 인식 부위), 및 세포-절단성 바이러스 올리고펩타이드를 포함한다(문헌[deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26] 참조).
적합한 프로테아제 절단 부위 및 자기-절단 펩타이드는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Ryan et al., 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5,589-594] 참조). 예시적인 프로테아제 절단 부위는 포티바이러스 NIa 프로테아제(예를 들어, 담배 식각 바이러스 프로테아제), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 P1(P35) 프로테아제, 바이오바이러스 NIa 프로테아제, 바이오바이러스 RNA-2-암호화된 프로테아제, 아프토바이러스 L 프로테아제, 엔테로바이러스 2A 프로테아제, 리노바이러스 2A 프로테아제, 피코르나 3C 프로테아제, 코모바이러스 24K 프로테아제, 네포바이러스 24K 프로테아제, RTSV(벼 퉁그로 구형 바이러스(rice tungro spherical virus)) 3C-유사 프로테아제, PYVF(파스닙 황색 플렉 바이러스(parsnip yellow fleck virus)) 3C-유사 프로테아제, 헤파린, 트롬빈, 인자 Xa 및 엔테로키나제의 절단 부위를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 절단 엄격도 때문에, TEV (담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단 부위는 일 실시형태에서, 예를 들어, EXXYXQ(G/S) (서열번호 44), 예를 들어, ENLYFQG (서열번호 45) 및 ENLYFQS (서열번호 46)가 바람직하되, X는 임의의 아미노산을 나타낸다(Q와 G 또는 Q와 S 사이에 TEV에 의한 절단이 일어남).
특정 실시형태에서, 세포-절단성 폴리펩타이드 부위는 2A 또는 2A-유사 부위, 서열 또는 도메인을 포함한다(Donnelly et al., 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041). 특정 실시형태에서, 바이러스 2A 펩타이드는 아프토바이러스 2A 펩타이드, 포티바이러스 2A 펩타이드, 또는 카디오바이러스 2A 펩타이드이다.
일 실시형태에서, 바이러스 2A 펩타이드는 구제역바이러스(FMDV) 2A 펩타이드, 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A 펩타이드, 토세아 아시그나 바이러스(TaV) 2A 펩타이드, 돼지 테스코바이러스-1(PTV-1) 2A 펩타이드, 테일로바이러스 2A 펩타이드, 및 뇌심근염바이러스 2A 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
2A 부위의 예시적 예는 표 2에서 제공된다.
Figure 112018099115031-pct00003
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드의 발현 또는 안정성은 하나 이상의 단백질 탈안정화 서열 또는 단백질 분해 서열(데그론(degron))에 의해 조절된다. 빠른 프로테아좀 전환을 강제하기 위해 단백질을 탈안정화시키는 몇몇 전략이 본 명세서에 상정된다.
단백질 탈안정화 서열의 예시적 예는 탈안정화 박스(D 박스)(9개의 아미노산은 세포 주기 내에서 순환을 달성하기 위한 빠르고 완전한 유비퀴틴-매개 단백질분해를 겪어야 하는 세포 주기-의존적 단백질에 존재함)(예를 들어, 문헌[Yamano et al. 1998. Embo J 17:5670-8); Cdh1에 의해 표적화된 APC 인식 신호인 KEN 박스(예를 들어, 문헌[Pfleger et al. 2000. Genes Dev 14:655-65]); M기의 마지막에 그리고 Fzr/Cdh1에 의해 활성화된 후기-촉진성 복합체(APC)에 의해 대부분의 G1 내내 분해된 본래의 인식 복합체 단백질 1(ORC1)에 존재하는 모티프인 O 박스(예를 들어, 문헌[Araki et al. 2005. Genes Dev 19(20):2458-2465] 참조); Cdh1에 의한 유사분열 종결 동안 분해된 Aurora-A에 존재하는 모티프인 A-박스(예를 들어, 문헌[Littlepage et al. 2002. Genes Dev 16:2274-2285] 참조); 프롤린(P), 글루탐산(E), 세린(S) 및 트레오닌(T) 잔기가 풍부하고 빠른 프로테아좀 파괴를 위해 단백질을 표적화하는 모티프인 PEST 도메인(Rechsteiner et al. 1996. Trends Biochem Sci. 21(7):267-271); N-말단 규칙 모티프, N-데그론 모티프, 및 유비퀴틴-융합 분해(ubiquitin-fusion degradation: UFD) 모티프(이들은 프로테아좀 파괴를 위해 빠르게 가공됨)(예를 들어, 문헌[Dantuma et al. 2000. Nat Biotechnol 18:538-4] 참조)를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 데그론의 추가적인 예시적 예는 리간드 제어 가능 데그론 및 온도 조절 가능 데그론을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 리간드 제어 가능 데그론의 비제한적 예는 Shield 1에 의해 안정화된 것(예를 들어, 문헌[Bonger et al. 2011. Nat Chem Viol. 7(8):531-537] 참조), 옥신에 의해 탈안정화된 것(예를 들어, 문헌[Nishimura et al. 2009. Nat Methods 6(12):917-922] 참조), 그리고 트리메소프림에 의해 안정화된 것(예를 들어, 문헌[Iwamoto et al., 2010. Chem Biol. 17(9):981-8] 참조)을 포함한다.
온도 조절 가능 데그론의 비제한적 예는 DHFRTS 데그론을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌[Dohmen et al., 1994. Science 263(5151):1273-1276] 참조).
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 폴리펩타이드는 D 박스, O 박스, A 박스, KEN 모티프, PEST 모티프, 사이클린 A 및 UFD 도메인/기질, 리간드 제어 가능 데그론 및 온도 제어 가능 데그론으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 분해 서열을 포함한다.
G. 폴리뉴클레오타이드
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 하나 이상의 메가뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 메가TAL, TALEN, ZFN, Cas 뉴클레아제, 말단-가공 뉴클레아제, 면역억제 신호 댐퍼, 플립 수용체, 조작된 TCR, CAR, Daric, 치료 폴리펩타이드, 융합 폴리펩타이드가 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 DNA/RNA 혼성체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 전-전령 RNA(전(pre)-mRNA), 전령 RNA(mRNA), RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 리보자임, 합성 RNA, 게놈 RNA (gRNA), 플러스 가닥 RNA(RNA (+)), 마이너스 가닥 RNA(RNA (-)), tracrRNA, crRNA, 단일 가이드 RNA(sgRNA), 합성 RNA, 게놈 DNA(gDNA), PCR 증폭 DNA, 상보성 DNA(cDNA), 합성 DNA 또는 재조합 DNA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유형뿐만 아니라 모든 중간 길이 중 하나의 변형된 형태로 길이가 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 5000, 적어도 10000 또는 적어도 15000개 이상의 뉴클레오타이드인 중합체 형태의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 이와 관련하여 "중간 길이"는 인용된 값 사이의 임의의 길이, 예컨대 6, 7, 8, 9 등, 101, 102, 103 등; 151, 152, 153 등; 201, 202, 203 등을 의미한다는 것이 용이하게 이해될 것이다. 특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 변이체는 기준 서열에 대해 적어도 또는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진다.
폴리뉴클레오타이드의 예시적 예는 서열번호 2, 5 내지 7 및 11을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호 1, 3, 4, 8 내지 10 및 12 내지 22에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다양한 예시적 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 폴리뉴클레오타이드는 메가뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 메가TAL, TALEN, ZFN, Cas 뉴클레아제, 말단-가공 뉴클레아제, 면역억제 신호 댐퍼, 플립 수용체, 조작된 TCR, CAR, Daric, 치료 펩타이드 및 발현 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드 변이체" 및 "변이체" 등은 본 명세서에서 이후에 정해진 엄격한 조건 하에 기준 서열과 혼성화하는 기준 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 폴리뉴클레오타이드와 실질적인 서열 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 이들 용어는 또한 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 첨가, 결실, 치환 또는 변형에 의해 기준 폴리뉴클레오타이드와 구별되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 따라서, 용어 "폴리뉴클레오타이드 변이체" 및 "변이체"는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 첨가되거나 또는 결실되거나, 또는 변형되거나, 또는 상이한 뉴클레오타이드로 대체된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이와 관련하여, 돌연변이, 첨가, 결실 및 치환을 포함하는 특정 변경은 기준 폴리뉴클레오타이드에 대해 이루어질 수 있으며 이에 의해 변경된 폴리뉴클레오타이드는 기준 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 기능 또는 활성을 보유한다는 것이 잘 이해된다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 엄격한 조건 하에서 표적 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. "엄격한 조건" 하에 혼성화하는 것은 서로 적어도 60% 동일한 뉴클레오타이드 서열이 혼성화된 채로 남아있는 혼성화 프로토콜을 기재한다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정해진 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 더 낮은 것으로 선택된다. Tm은 표적 서열에 대해 상보성인 프로브의 50%가 평형 상태에서 표적 서열에 혼성화하는 온도(정해진 이온 강도, pH 및 핵산 농도)이다. 표적 서열은 일반적으로 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서, 프로브의 50%는 평형 상태에서 점유된다.
본 명세서에서 사용되는 설명 "서열 동일성" 또는(예를 들어, "에 대해 50% 동일한 서열"을 포함)은 서열이 비교 창에 걸쳐 뉴클레오타이드*뉴클레오타이드 기준 또는 아미노산*아미노산 기준과 동일한 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성 백분율"은 비교창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써, 매칭되는 위치 수를 얻기 위해 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 서열 둘 다에서 생기는 위치의 수를 결정함으로써, 매칭된 위치 수를 비교창(즉, 창 크기)에서의 위치의 총 수로 나눔으로써, 그리고 결과에 100을 곱하여서 서열 동일성의 백분율을 얻음으로써 계산될 수 있다. 전형적으로 폴리펩타이드 변이체가 기준 폴리펩타이드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 경우 본 명세서에 기재된 임의의 기준 서열에 대해 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드가 포함된다.
2 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 사이의 서열 관계를 설명하기 위해 사용되는 용어는 "기준 서열", "기준창", "서열 동일성", "서열 동일성의 백분율" 및 "실질적인 동일성"을 포함한다. "기준 서열"은 길이가 적어도 12이지만, 빈번하게는 15 내지 18이고, 종종 적어도 25개의 단량체 단위(뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기를 포함)이다. 두 폴리뉴클레오타이드는 각각 (1) 두 폴리뉴클레오타이드 사이에 유사한 서열(즉, 단지 완전한 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부), 및 (2) 두 폴리뉴클레오타이드 사이의 분기하는 서열을 각각 포함할 수 있기 때문에, 2(이상의) 폴리펩타이드 사이의 서열 비교는 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교하기 위해 "비교창"에 결쳐 두 폴리뉴클레오타이드의 서열을 비교함으로써 전형적으로 수행된다. "비교창"은 두 서열이 최적으로 정렬된 후에 서열이 동일한 수의 인접한 위치의 기준 서열과 비교되는 적어도 6개의 인접한 위치, 보통 약 50 내지 약 100개, 더 보통으로는 약 100 내지 약 150개의 개념적 세그먼트를 지칭한다. 비교창은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 (첨가 또는 결실을 포함하지 않는) 기준 서열에 비해 약 20% 이하의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교창을 정렬하기 위한 서열의 최적의 정령은 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(위스콘신 제네텍스 소프트웨어 패키지 릴리즈 7.0(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0)에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 미국 위스콘신주 메디슨 사이언스 드라이브 575에 소재한 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))에 의해 또는 선택된 임의의 다양한 방법에 의해 생성된 검사 및 최고의 정렬(즉, 비교창에 걸쳐 가장 높은 상동성 백분율을 초래)에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어 문헌[Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389]에 개시된 바와 같은 프로그램의 BLAST 패밀리가 언급될 수 있다. 서열 분석의 상세한 논의는 문헌[Unit 19.3 of Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994-1998, Chapter 15]에서 찾을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 천연 유래 상태에서 그것이 측접하는 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 단편에 정상적으로 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭한다. 특정 실시형태에서, "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 또한 상보성 DNA(cDNA), 재조합 폴리뉴클레오타이드, 합성 폴리뉴클레오타이드 또는 천연에서 존재하지 않고 사람의 손에 의해 만들어진 다른 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
폴리뉴클레오타이드의 배향을 기재하는 용어는 하기를 포함한다: 5'(정상적으로는 유리 인산염기를 갖는 폴리뉴클레오타이드 말단) 및 3'(정상적으로는 유리 하이드록실(OH) 기를 갖는 폴리뉴클레오타이드 말단). 폴리뉴클레오타이드 서열은 5'에서 3' 배향 또는 3'에서 5' 배향으로 주석을 달 수 있다. DNA 및 mRNA에 대해, 5'에서 3' 가닥은 "센스", "플러스" 또는 "암호" 가닥으로 표기되는데, 그의 서열이 전-전령(전-mRNA)의 서열과 동일하기 때문이다[DNA에서의 티민(T)을 대신하는 RNA에서의 유라실(U)을 제외]. DNA 및 mRNA에 대해, RNA 중합효소에 의해 전사되는 가닥인 상보성 3'에서 5' 가닥은 "주형," "안티센스", "마이너스" 또는 "비-암호" 가닥으로서 표기된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "역배향"은 3'에서 5' 배향으로 기재되는 5'에서 3' 서열 또는 5'에서 3' 배향으로 기재되는 3'에서 5' 서열을 지칭한다.
용어 "상보적" 및 "상보성"은 염기쌍 규칙과 관련된 폴리뉴클레오타이드(즉, 뉴클레오타이드 서열)를 지칭한다. 예를 들어, DNA 서열 5' A G T C A T G 3'의 상보적 가닥은 3' T C A G T A C 5'이다. 후자의 서열은 종종 좌측 상에서 5' 말단 및 우측 상에서 3' 말단, 즉, 5' C A T G A C T 3'과 역상보성으로서 기재된다. 역 상보체와 동일한 서열은 회문구조 서열로 언급된다. 상보성은 일부의 핵산 염기만이 염기쌍 규칙에 따라 매칭되는 "부분적"일 수 있다. 또는, 핵산 사이의 "완전한" 또는 "총" 상보성이 있을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 카세트" 또는 "발현 카세트"는 RNA, 및 후속적으로 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 벡터 내의 유전자 서열을 지칭한다. 일 실시형태에서, 핵산 카세트는 관심 대상의 유전자(들), 예를 들어, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드(들)를 함유한다. 다른 실시형태에서, 핵산 카세트는 하나 이상의 발현 제어 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 폴리(A) 서열 및 관심 대상의 유전자(들), 예를 들어, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드(들)를 함유한다. 벡터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 핵산 카세트를 포함할 수 있다. 핵산 카세트는 카세트 내 핵산이 RNA로 전사되고, 필요할 때, 단백질 또는 폴리펩타이드로 번역되며, 형질전환 세포 내 활성에 필요한 적절한 번역후 변형을 겪고, 그리고 적절한 세포내 구획으로 표적화하거나 또는 세포외 구획 내로의 분비에 의해 생물학적 활성을 위한 적절한 구획으로 전위될 수 있도록 벡터 내에서 위치적으로 그리고 순차적으로 배향된다. 바람직하게는, 카세트는 벡터 내로 용이한 분비에 적합하세 그의 3' 및 5' 말단을 가지고, 예를 들어, 이는 각각의 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 부위를 가진다. 바람직한 실시형태에서, 핵산 카세트는 유전적 장애를 치료하거나, 예방하거나 또는 개선시키기 위해 사용되는 치료 유전자의 서열을 함유한다. 카세트는 제거되거나 또는 단일 단위로서 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내로 삽입될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드(드)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "관심 대상의 폴리뉴클레오타이드"는 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 본 명세서에 상정된 저해 폴리뉴클레오타이드의 전사를 위한 주형으로서 작용하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
게다가, 유전자 암호의 축중의 결과로서, 본 명세서에 상정된 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 단편을 암호화하는 다수의 뉴클레오타이드 서열이 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 일부 이들 폴리뉴클레오타이드는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대해 최소 상동성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈사용빈도의 차이때문에 다른 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 인간 및/또는 영장류 코돈 선택을 위해 최적화된 폴리뉴클레오타이드가 특정 실시형태에서 구체적으로 상정된다. 일 실시형태에서, 특정 대립유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 대립유전자는 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 뉴클레오타이드의 결실, 첨가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내인성 폴리뉴클레오타이드 서열이다.
특정 실시형태에서, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드는 메가뉴클레아제를 암호화하는 공여자 수선 주형, 메가TAL, TALEN, ZFN, Cas 뉴클레아제, 말단-가공 뉴클레아제, 면역억제 신호 댐퍼, 플립 수용체, 조작된 TCR, CAR, Daric, 치료적 폴리펩타이드, 또는 융합 폴리펩타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드는 crRNA, tracrRNA, 단일 가이드 RNA(sgRNA), siRNA, miRNA, shRNA, 리보자임 또는 다른 저해 RNA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 저해 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "siRNA" 또는 "짧은 간섭 RNA"는 동물에서 서열-특이적 번역후 유전자 침묵, 번역 저해, 전사 저해 또는 후성적 RNAi의 가공을 매개하는 짧은 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다(Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Fire et al., 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al., 1999, Science, 286, 950-951; Lin et al., 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13, 139-141; 및 Strauss, 1999, Science, 286, 886). 바람직한 실시형태에서, siRNA는 면역억제성 신호전달 경로의 성분을 암호화하는 mRNA를 표적화한다. 특정 실시형태에서, siRNA는 동일한 수의 뉴클레오사이드를 갖는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하지만; 그러나, 제1 및 제2 가닥 상의 2개의 말단 뉴클레오사이드가 상보성 가닥 상의 잔기와 짝을 짓지 않도록 제1 및 제2 가닥은 오프셋(offset)이다. 특정 예에서, 짝지어지지 않은 2개의 뉴클레오사이드는 티미딘 잔기이다. siRNA는 표적 유전자에 대해 충분한 상동성 영역을 포함하여야 하고, 그리고 siRNA, 또는 이의 단편이 표적 유전자의 하향 조절을 매개할 수 있도록 뉴클레오타이드에 대해 충분한 길이를 가져야 한다. 따라서, siRNA는 표적 RNA에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 영역을 포함한다. siRNA와 표적 사이에 완전한 상보성이 있지만, 표적 RNA의 RNAi 절단에 의하는 것과 같이 서열 특이적 침묵을 지시하기 위해 대응도가 siRNA, 또는 이의 절단 산물을 가능하게 하는 데 충분하여야 한다는 것은 필수적이 아니다. 표적 가닥과의 상보성 또는 상동성 정도는 안티센스 가닥에서 가장 중요하다. 특히 안티센스 가닥에서 완전한 상보성이 종종 요망되지만, 일부 실시형태는 표적 RNA에 대해 하나 이상의, 그러나 바람직하게는 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2개 이하의 미스매치를 포함한다. 미스매치는 최종 영역에서 가장 잘 용인되며, 존재한다면, 바람직하게는 말단 영역 또는 영역들 내에, 예를 들어, 5' 및/또는 3' 말단의 6, 5, 4 또는 3개 뉴클레오타이드 내에 있다. 센스 가닥 필요는 단지 분자의 전체 이중-가닥을 유지하기 위해 안티센스 가닥과 충분히 상보성이다. siRNA의 각각의 가닥은 길이가 30, 25, 24, 23, 22, 21 또는 20개 이하의 뉴클레오타이드일 수 있다. 가닥은 길이가 바람직하게는 적어도 19개의 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 각각의 가닥은 길이가 21 내지 25개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 바람직한 siRNA는 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오타이드 쌍의 이중가닥 영역, 및 2 내지 3개의 뉴클레오타이드의 하나 이상의 돌출부, 바람직하게는 2 내지 3개의 뉴클레오타이드의 1 또는 2개의 3' 돌출부를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "miRNA" 또는 "마이크로RNA"는 전-miRNA로서 알려진 대략 70개 뉴클레오타이드 폴딩-백(fold-back) RNA 전구체 구조로부터 전형적으로 절단된 작은 비-암호 RNA of 20 내지 22개의 뉴클레오타이드를 지칭한다. miRNA는 miRNA와 표적 사이의 상보성 정도에 따라서 2가지의 방법 중 하나에서 그들의 표적을 음으로 조절한다. 바람직한 실시형태에서, miRNA는 면역억제성 신호전달 경로의 성분을 암호화하는 mRNA를 표적화한다. 처음에, 단백질-암호 mRNA 서열에 대해 완전한 또는 거의 완전한 상보성으로 결합하는 miRNA는 RNA-매개 간섭(RNAi) 경로를 유도한다. mRNA 표적의 3' 비번역 영역(UTR) 내의 불완전 상보성 부위에 결합함으로써 그들의 조절 효과를 발휘하는 miRNA는 RNAi 경로를 위해 사용되는 것과 유사하거나 또는 가능하게는 동일한 RISC 복합체를 통해 전사 후에, 분명하게 표적-유전자 발현을 억제한다. 번역 제어와 일치되게, 이 메커니즘을 사용하는 miRNA는 표적 유전자의 단백질 수준을 감소시키지만, 그러나 이들 유전자의 mRNA 수준은 최소로만 영향받는다. miRNA는 천연 유래 miRNA뿐만 아니라 임의의 mRNA 서열을 특이적으로 표적화할 수 있는 인공으로 설계된 miRNA를 둘 다 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 당업자는 인간 miRNA(예를 들어, miR-30 또는 miR-21) 1차 전이체로서 발현되는 짧은 헤어핀 RNA 작제물을 설계할 수 있다. 이 설계는 헤어핀 작제물에 드로샤(Drosha) 가공 부위를 더하며 넉다운 효율을 크게 증가시키는 것으로 나타났다(Pusch et al., 2004). 헤어핀 줄기는 22-nt의 dsRNA(예를 들어, 안티센스는 목적으로 하는 표적에 대해 완전한 상보성을 가짐) 및 인간 miR로부터의 15 내지 19-nt 루프로 이루어진다. 헤어핀 중 하나 또는 둘 다에 대한 서열에 측접하는 miR 루프 및 miR30을 더하는 것은 마이크로RNA가 없는 통상적인 shRNA 설계에 비교할 때 발현된 헤어핀의 드로샤 및 다이서(Dicer) 가공의 10배 초과의 증가를 초래한다. 증가된 드로샤 및 다이서 가공은 발현된 헤어핀에 대해 더 큰 siRNA/miRNA 생성 및 더 큰 효능으로 번역된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "shRNA" 또는 "짧은 헤어핀 RNA"는 단일 자기-상보성 RNA 가닥에 의해 형성되는 이중-가닥 구조를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, shRNA는 면역억제성 신호전달 경로의 성분을 암호화하는 mRNA를 표적화한다. 표적 유전자의 암호- 또는 비-암호 서열의 일부와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 shRNA 작제물이 저해에 대해 바람직하다. 표적 서열에 대해 삽입, 결실 및 단일 점 돌연변이를 갖는 RNA 서열은 또한 저해에 효과적인 것으로 발견되었다. 저해 RNA와 표적 유전자 일부 사이의 90% 초과의 서열 동일성, 또는 심지어 100% 서열 동일성이 바람직하다. 특정 바람직한 실시형태에서, shRNA의 이중가닥-형성 일부의 길이는, 예를 들어, 다이서-의존적 절단에 의해 생성되는 RNA 산물에 대한 크기에 대응하여 길이가 적어도 20, 21 또는 22개의 뉴클레오타이드이다. 특정 실시형태에서, shRNA 작제물은 길이가 적어도 25, 50, 100, 200, 300 또는 400개의 염기이다. 특정 실시형태에서, shRNA 작제물은 길이가 400 내지 800개의 염기이다. shRNA 작제물은 루프 서열 및 루프 크기에서의 변화를 매우 잘 용인한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "리보자임"은 표적 mRNA의 부위-특이적 절단을 가능하게 하는 촉매적으로 활성인 RNA 분자를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 리보자임은 면역억제성 신호전달 경로의 성분을 암호화하는 mRNA를 표적화한다. 몇몇 하위유형, 예를 들어, 해머헤드 및 헤어핀 리보자임이 기재되었다. 리보자임 촉매적 활성 및 안정성은 비촉매 염기에서 데옥시리보뉴클레오타이드를 리보뉴클레오타이드로 치환함으로써 개선될 수 있다. 부위-특이적 인식 서열에서 mRNA를 절단하는 리보자임이 특정 mRNA를 파괴하기 위해 사용될 수 있지만, 해머헤드 리보자임의 사용이 바람직하다. 해머헤드 리보자임은 표적 mRNA와 상보적 염기쌍을 형성하는 영역에 측접함으로써 지시되는 위치에서 mRNA를 절단한다. 유일한 필요는 표적 mRNA가 2개 염기의 다음의 서열을 가진다는 것이다: 5'-UG-3'. 해머헤드 리보자임의 구성 및 생성은 당업계에 잘 공지되어 있다.
일 실시형태에서, 저해 RNA를 포함하는 공여자 수선 주형은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 하나 이상의 조절 서열, 예를 들어, 강한 구성적 pol III, 예를 들어, 인간 또는 마우스 U6 snRNA 프로모터, 인간 및 마우스 H1 RNA 프로모터, 또는 인간 tRNA-val 프로모터, 또는 강한 구성적 pol II 프로모터를 포함한다.
특정 실시형태에서 상정된 폴리뉴클레오타이드는 암호 서열 그 자체와 상관없이, 그들의 전체 길이가 상당히 달라질 수 있도록 본 명세서의 다른 곳에 개시된 바와 같은 또는 당업계에 공지된 바와 같은 다른 DNA 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 인핸서, 비번역 영역(untranslated region: UTR), 코작 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosomal entry sites: IRES), 재조합효소 인식 부위(예를 들어, LoxP, FRT, 및 Att 부위), 종결 코돈, 전사 종결 신호, 번역후 반응 요소 및 세포-절단성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 에피토프 태그와 조합될 수 있다. 따라서 거의 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편이 사용될 수 있으며, 총 길이는 바람직하게는 의도된 재조합 DNA 프로토콜의 용이한 제조 및 용도에 의해 제한된다는 것이 특정 실시형태에서 상정된다.
폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 그리고 이용 가능한 임의의 다양한 잘-확립된 기법을 이용하여 제조되고/되거나, 제작되고/되거나 발현되고/되거나 전달될 수 있다. 목적으로 하는 폴리펩타이드를 발현시키기 위해, 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 적절한 벡터 내로 삽입될 수 있다.
벡터의 예시적 예는 플라스미드, 자체적 복제 서열 및 전위요소, 예를 들어, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty), 피기백(PiggyBac)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
벡터의 추가적인 예시적 예는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome: YAC), 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome: BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체(P1-derived artificial chromosome: PAC), 박테리오파지, 예컨대 람다 파지 또는 M13 파지 및 동물 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
벡터로서 유용한 바이러스의 예시적 예는 레트로바이러스(렌티바이러스를 포함함), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순 포진 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스 및 파포바바이러스(예를 들어, SV40)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
발현 벡터의 예시적 예는 포유류 세포에서 발현을 위한 pClneo 벡터(Promega); 포유류 세포에서 렌티바이러스-매개 유전자 전달 및 발현을 위한 pLenti4/V5-DEST(상표명), pLenti6/V5-DEST(상표명), 및 pLenti6.2/V5-GW/lacZ(인비트로젠)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 암호 서열은 포유류 세포에서 폴리펩타이드의 발현을 위해 이러한 발현 벡터에 결찰될 수 있다.
특정 실시형태에서, 벡터는 에피솜 벡터 또는 염색체외로 유지되는 벡터이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "에피솜"은 숙주 염색체 DNA에 통합 없이 그리고 분할된 숙주 세포로부터 점진적인 손실 없이 복제할 수 있는 벡터를 지칭하는데, 이는 또한 상기 벡터가 염색체외로 또는 에피솜으로 복제하는 것을 의미한다. 벡터는 알파, 베타, 또는 감마 헤르페스바이러스, 아데노바이러스, SV40, 소 유두종 바이러스 또는 효모로부터 DNA 복제 기점 또는 "ori"에 대해 서열 암호를 보유하도록 조작된다. 전형적으로, 숙주 세포는 복제를 활성화시키는 바이러스 복제 트랜스작용인자(transactivator)를 포함한다. 알파 헤르페스바이러스는 상대적으로 짧은 재생 주기, 가변 숙주 범위, 효율적으로 파괴된 감염 세포를 가지고, 주로 감각 신경절에서 잠재적 감염을 확립한다. 알파 헤르페스 바이러스의 예시적 예는 HSV 1, HSV 2 및 VZV를 포함한다. 베타 헤르페스바이러스는 긴 재생성 주기 및 제한된 숙주 범위를 가진다. 감염된 세포는 종종 확장된다. 잠복은 백혈구, 신장, 분비샘 및 다른 조직에서 유지된다. 베타 헤르페스 바이러스의 예시적 예는 CMV, HHV-6 및 HHV-7을 포함한다. 감마-헤르페스바이러스는 T 또는 B 림프구 중 하나에 대해 특이적이고, 잠복은 종종 림프구 조직에서 입증된다. 감마 헤르페스 바이러스의 예시적 예는 EBV 및 HHV-8을 포함한다.
발현 벡터에 존재하는 "발현 제어 서열", "제어 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 해당 비번역 영역-복제 기점, 선택 카세트, 프로모터, 인핸서, 번역 개시 신호(샤인 달가노(Shine Dalgarno) 서열 또는 코작 서열) 인트론, 폴리아데닐화 서열, 5' 및 3' 비번역 영역이다. 이러한 요소는 그들의 강도 및 특이성이 다를 수 있다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라서, 편재하는 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함하는 다수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터 및 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 벡터이고, 외인성, 내인성 또는 이종성 제어 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. "내인성 제어 서열"은 게놈 내 주어진 유전자와 자연적으로 연결되는 것이다. "외인성 제어 서열"은 해당 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록 유전자 조작(즉, 분자 생물학 기법)에 의해 유전자와 나란히 놓이는 것이다. "이종성 제어 서열"은 유전자 조작 중인 세포와 상이한 종인 외인성 서열이다.
"합성" 제어 서열은 하나 이상의 내인성 및/또는 외인성 서열, 및/또는 특정 유전자 요법에 대해 최적의 프로모터 및/또는 인핸서 활성을 제공하는 시험관내에서 또는 인실리코로 결정된 서열의 요소를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터"는 RNA 중합효소가 결합하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)의 인식 부위를 지칭한다. RNA 중합효소는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 개시하고 전사한다. 특정 실시형태에서, 포유류 세포에서 작동하는 프로모터는 전사가 개시되는 부위로부터 상류의 대략 25 내지 30개 염기에 위치된 AT 풍부 영역 및/또는 전사 시작으로부터 상류의 70 내지 80개 염기에서 발견되는 다른 서열, N이 임의의 뉴클레오타이드일 수 있는 CNCAAT 영역을 포함한다.
용어 "인핸서"는 향상된 전사를 제공할 수 있는 서열을 함유하고 일부 예에서 다른 제어 서열에 대해 그들의 배향과 독립적으로 작용할 수 있는 DNA의 세그먼트를 지칭한다. 인핸서는 프로모터 및/또는 다른 인핸서 요소와 협응하여 또는 상가적으로 작용할 수 있다. 용어 "프로모터/인핸서"는 프로모터와 인핸서 기능을 둘 다 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 세그먼트를 지칭한다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 기재된 성분이 그들의 의도된 방식으로 작용하도록 허용하는 관계인, 병렬 배치를 지칭한다. 일 실시형태에서, 상기 용어는 핵산 발현 제어 서열(예컨대 프로모터 및/또는 인핸서)과 제2 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드 사이의 기능적 결합을 지칭하되, 제어 서열의 발현은 제2 서열에 대응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "구성적 발현 제어 서열"은 작동 가능하게 연결된 서열의 전사를 지속적으로 또는 연속적으로 허용하는 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서를 지칭한다. 구성적 발현 제어 서열은 매우 다양한 세포 및 조직 유형에서 발현을 허용하는 "편재하는" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서 또는 제한된 다양한 세포 및 조직 유형에서 각각 발현을 허용하는 "세포 특이적", "세포 유형 특이적", "세포 계통 특이적" 또는 "조직 특이적" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서일 수 있다.
특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 예시적인 편재하는 발현 제어 서열은 거대세포 바이러스(CMV) 급초기 프로모터, 바이러스 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어, 초기 또는 후기), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 단순포진 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터, 백시니아 바이러스로부터의 H5, P7.5 및 P11 프로모터, 짧은 신장 인자 1-알파(EF1a-짧은) 프로모터, 긴 신장 인자 1-알파(EF1a-길이) 프로모터, 초기 성장 반응 1(EGR1), 페리틴 H(FerH), 페리틴 L(FerL), 글리세르알데하이드 3-인산염 탈수소효소(GAPDH), 진핵 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1), 열충격 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열충격 단백질 90kDa 베타, 구성원 1(HSP90B1), 열 충격 단백질 70kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 좌위(Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482(2007)), 유비퀴틴 C 프로모터 (UBC), 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 거대세포 바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터, β-액틴 프로모터 및 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 결실된 음성 대조군 영역, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환(MND) 프로모터 (Challita et al., J Virol. 69(2):748-55(1995))를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 목적으로 하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 세포 유형 특이적, 계통 특이적 또는 조직 특이적 발현을 달성하기 위해(예를 들어, 세포 유형, 세포 계통 또는 조직의 서브세트에서만 또는 특정 발생 단계 동안 폴리펩타이드를 암호화하는 특정 핵산을 발현시키기 위해) 세포, 세포 유형, 세포 계통 또는 조직 특이적 발현 제어 서열을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "조건적 발현"은 유도성 발현; 억제 가능한 발현; 특정 생리적, 생물학적 또는 질환 상태 등을 갖는 세포 또는 조직에서의 발현을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 유형의 조건적 발현을 지칭할 수 있다. 이 정의는 세포 유형 또는 조직 특이적 발현을 제외하는 것으로 의도되지 않는다. 특정 실시형태는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드의 조건적 발현을 제공하며, 예를 들어, 발현은 세포, 조직, 유기체 등에 폴리뉴클레오타이드가 발현되도록 야기하거나 또는 처리 또는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리뉴클레오타이드 발현의 증가 또는 감소를 야기하는 처리 또는 조건을 실시함으로써 제어된다.
유도성 프로모터/시스템의 예시적 예는 스테로이드-유도성 프로모터, 예컨대 글루코코르티코이드 또는 에스트로겐 수용체를 암호화하는 유전자에 대한 프로모터(대응하는 호르몬에 의한 처리에 의해 유도성), 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속에 의한 처리에 의해 유도성), MX-1 프로모터(인터페론에 의해 유도성), "유전자스위치(GeneSwitch)" 미페프리스톤-조절 가능 시스템(Sirin et al., 2003, Gene, 323:67), 큐메이트 유도성 유전자 스위치(WO 2002/088346), 테트라사이클린-의존적 조절 시스템 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
조건적 발현은 또한 부위 특이적 DNA 재조합효소를 이용함으로써 달성될 수 있다. 특정 실시형태에 따르면, 폴리뉴클레오타이드는 부위 특이적 재조합효소에 의해 매개되는 재조합에 대해 적어도 하나의(전형적으로 2개의) 부위(들)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합효소" 또는 "부위 특이적 재조합효소"는 하나 이상의 재조합 부위(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)를 수반하는 재조합 반응에 수반되고, 야생형 단백질(문헌[Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707(1993)] 참조), 또는 돌연변이체, 유도체(예를 들어, 재조합 단백질 서열 또는 이의 단편을 함유하는 융합 단백질), 단편, 및 이들의 변이체일 수 있는 절단성 또는 통합적 단백질, 효소, 보조 요소 또는 관련 단백질을 포함한다. 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 재조합효소의 예시적 예는 Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Tn3 레솔바제(resolvase), TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 및 ParA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
폴리뉴클레오타이드는 임의의 매우 다양한 부위 특이적 재조합효소에 대해 하나 이상의 재조합 부위를 포함할 수 있다. 부위 특이적 재조합효소에 대한 표적 부위는 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터의 통합에 필요한 임의의 부위(들)에 추가된다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 서열", "재조합 부위" 또는 "부위 특이적 재조합 부위"는 재조합효소가 인식하고 결합하는 특정 핵산 서열을 지칭한다.
예를 들어, Cre 재조합효소에 대한 하나의 재조합 부위는 8개의 염기쌍 코어 서열에 측접하는(문헌[Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527(1994)]의 도 1 참조) 13개 염기쌍 역위 반복부(재조합효소 결합 부위로서 작용) 2개를 포함하는 34개 염기쌍 서열인 loxP이다. 다른 예시적인 loxP 부위는 lox511(Hoess et al., 1996; Bethke and Sauer, 1997), lox5171(Lee and Saito, 1998), lox2272(Lee and Saito, 1998), m2(Langer et al., 2002), lox71(Albert et al., 1995) 및 lox66(Albert et al., 1995)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
FLP 재조합효소에 대한 적합한 인식 부위는 FRT (McLeod, et al., 1996), F1, F2, F3(Schlake and Bode, 1994), F4, F5 (Schlake and Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff et al., 1988), FRT(RE) (Senecoff et al., 1988)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
인식 서열의 다른 예는 재조합효소 λ 인테그라제, 예를 들어, 파이(phi)-c31에 의해 인식되는 attB, attP, attL 및 attR 서열이다. φC31 SSR은 이종성 부위 attB(길이가 34 bp)와 attP(길이가 39 bp) 사이에서만 재조합을 매개한다(Groth et al., 2000). 박테리아 및 파지 게놈 상에서 각각 파지 인테그라제에 대한 부착 부위에 대해 지칭되는 attB 및 attP는 둘 다 φC31 동종이량체에 의해 결합될 가능성이 있는 불완전 역위 반복부를 함유한다(Groth et al., 2000). 산물 부위인 attL 및 attR은 추가로 φC31-매개 재조합에 대해 효과적으로 비활성이어서(Belteki et al., 2003), 반응을 비가역적으로 만든다. 삽입을 촉매화하기 위해, attB-보유 DNA는 게놈 attP 부위 내로, 더 용이하게는 attP 부위보다 게놈 attB 부위 내로 삽입된다는 것을 발견하였다(Thyagarajan et al., 2001; Belteki et al., 2003). 따라서, 전형적인 전략은 상동성 재조합에 의해 attP-보유 "도킹 부위(docking site)"를 정해진 좌위에 위치시키는데, 이는 그 다음에, 삽입을 위한 attB-보유 유입 서열과 파트너가 된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 폴리뉴클레오타이드는 재조합효소 인식 부위의 쌍에 의해 측접되는 수선 주형 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 수선 주형 폴리뉴클레오타이드는 LoxP 부위, FRT 부위, 또는 att 부위에 의해 측접된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 각각의 복수의 폴리펩타이드의 효율적인 번역을 달성하기 위해, 폴리뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 IRES 서열 또는 세포-절단성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 분리될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "내부 리보솜 유입 부위" 또는 "IRES"는 시스트론(단백질 암호화 영역)의 개시 코돈, 예컨대 ATG에 대한 직접적인 내부 리보솜 유입을 촉진시킴으로써, 유전자의 캡-독립적 번역을 야기하는 요소를 지칭한다. 예를 들어, 문헌[Jackson et al., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) 및 Jackson and Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000] 참조. 당업자에 의해 일반적으로 사용되는 IRES의 예는 미국 특허 제6,692,736호에 기재된 것을 포함한다. 당업계에 알려진 "IRES"의 추가적인 예는 피코르나바이러스로부터 얻을 수 있는 IRES(Jackson et al., 1990) 및 바이러스 또는 세포의 mRNA 공급원으로부터 얻을 수 있는 IRES, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 결합 단백질(BiP), 혈관 내피 성장 인자(VEGF)(Huez et al. 1998. Mol. Cell. Biol. 18(11):6178-6190), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF-2) 및 인슐린-유사 성장 인자(IGFII), 전사 개시 인자 eIF4G 및 효모 번역 인자 TFIID 및 HAP4, 노바겐(Novagen)으로부터 상업적으로 입수 가능한 뇌심근염바이러스(encephelomycarditis virus: EMCV) (Duke et al., 1992. J. Virol 66(3):1602-9) 및 VEGF IRES(Huez et al., 1998. Mol Cell Biol 18(11):6178-90)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. IRES는 또한 피코르나비리대(Picornaviridae), 디시트로비리대(Dicistroviridae) 및 플라비비리대(Flaviviridae) 종의 바이러스 게놈에서 그리고 HCV, 프로인드 뮤린 백혈병 바이러스(FrMLV) 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV)에서 보고되었다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 폴리뉴클레오타이드에서 사용된 IRES는 EMCV IRES이다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 공통 코작 서열을 갖고 목적으로 하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "코작 서열"은 리보솜의 작은 서브유닛에 mRNA의 초기 개시를 크게 촉진시키고 번역을 증가시키는 짧은 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 공통 코작 서열은 (GCC)RCCATGG (서열번호 69)이며, 여기서 R은 퓨린(A 또는 G)이다(Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92, 및 Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48).
이종성 핵산 전사체의 효율적인 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 요소는 이종성 유전자 발현을 증가시킨다. 전사 종결 신호는 일반적으로 폴리아데닐화 신호 하류에서 발견된다. 특정 실시형태에서, 벡터는 발현될 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 폴리아데닐화 서열 3'을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리A 부위" 또는 "폴리A 서열"은 RNA 중합효소 II의 초기 RNA 전사체의 종결과 폴리아데닐화를 둘 다 지시하는 DNA 서열을 의미한다. 폴리아데닐화 서열은 암호 서열의 3' 말단에 대한 폴리A 꼬리의 첨가에 의해 mRNA 안정성을 촉진시킬 수 있고, 따라서, 증가된 번역 효율에 기여한다. 재조합 전사체의 효율적인 폴리아데닐화는 폴리A 꼬리가 없는 전사체가 불안정하고 빠르게 분해되기 때문에 바람직하다. 벡터에서 사용될 수 있는 폴리A 신호의 예시적 예는 이상적인 폴리A 서열(예를 들어, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), 소 성장 호르몬 폴리A 서열(BGHpA), 토끼 β-글로빈 폴리A 서열(rβgpA), 또는 당업계에 공지된 다른 적합한 이종성 또는 내인성 폴리A 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 보유하는 세포는 직접적인 독성 및/또는 비제어 증식의 위험을 감소시키기 위해 유도성 자살 유전자를 포함하는 자살 유전자를 이용한다. 구체적 실시형태에서, 자살 유전자는 폴리뉴클레오타이드 또는 세포를 보유하는 숙주에 대해 면역원성이 아니다. 사용될 수 있는 자살 유전자의 특정 예는 카스파제-9 또는 카스파제-8 또는 사이토신 데아미나제이다. 카스파제-9는 특정 이량체화 화학적 유도자(chemical inducer of dimerization: CID)를 이용하여 활성화될 수 있다.　
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 생체내에서 음성 선택의 여지가 있는 본 명세서에 상정된 유전자 변형 세포를 야기하는 유전자 세그먼트를 포함한다. "음성 선택"은 개체의 생체내 조건에서의 결과로서 제거될 수 있는 주입 세포를 지칭한다. 음성 선택 가능한 표현형은 투여되는 제제, 예를 들어, 화합물에 대한 선택성을 부여하는 유전자의 삽입으로부터 초래될 수 있다. 음성 선택 유전자는 당업계에 공지되어 있고, 간시클로버 선택성을 부여하는 단순 포진 바이러스 I형 티미딘 키나제(HSV-I TK) 유전자; 세포의 하이포크산틴 포스프리보실트랜스퍼라제(HPRT) 유전자, 세포의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(APRT) 유전자 및 박테리아 사이토신 데아미나제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 유전자 변형 세포는 시험관내에서 음성 선택가능 표현형의 세포 선택을 가능하게 하는 양성 마커를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 양성 선택 가능 마커는 숙주 세포 내로 도입될 때 유전자를 운반하는 세포의 양성 선택을 허용하는 우성 표현형을 발현시키는 유전자일 수 있다. 이 유형의 유전자는 당업계에 공지되어 있고, 하이크로마이신 B에 대해 내성을 부여하는 하이그로마이신-B 포스포트랜스퍼라제 유전자(hph), 항생제 G418에 대한 내성을 암호화하는 Tn5로부터의 아미노 글리코사이드 포스포트랜스퍼라제 유전자(neo 또는 aph), 다이하이드로엽산 환원효소(DHFR) 유전자, 아데노산 탈아미나제 유전자(ADA), 및 다재 약물 내성(multi-drug resistance: MDR) 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 음성 선택 가능 요소의 상실이 필수적으로 양성 선택 가능 마커의 상실을 수반하도록, 양성 선택 가능 마커 및 음성 선택 가능 요소가 연결된다. 특정 실시형태에서, 양성 및 음성 선택 가능 마커는 하나의 상실이 다른 것의 상실을 의무적으로 야기하도록 융합된다. 상기 기재한 목적으로 하는 양성 및 음성 선택 특징을 둘 다 부여하는 폴리펩타이드를 발현 산물로서 수득하는 융합된 폴리뉴클레오타이드의 예는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 티미딘 키나제 융합 유전자(HyTK)이다. 이 유전자의 발현은 시험관내 양성 선택을 위해 하이그로마이신 B 내성을 부여하는 폴리펩타이드, 및 생체내 음성 선택을 위한 간시클로비어 민감성을 수득한다. 또한 우성 양성 선택 가능 마커를 음성 선택 가능 마커와 융합시키는 것으로부터 유도된 2작용성 선택 가능 융합 유전자의 용도를 기재하는 에스. 디. 럽톤(S. D. Lupton)에 의한 PCT US91/08442 및 PCT/US94/05601의 공보를 참조한다.
바람직한 양성 선택 가능 마커는 hph, nco 및 gpt로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터 유래되고, 바람직한 음성 선택 가능 마커는 사이토신 탈아미나제, HSV-I TK, VZV TK, HPRT, APRT 및 gpt로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터 유래된다. 특정 실시형태에서 상정된 예시적인 2작용성 선택가능 융합 유전자는 양성 선택 가능 마커가 hph 또는 neo로부터 유래되고, 음성 선택 가능 마커가 사이토신 탈아미나제 또는 TK 유전자 또는 선택 가능 마커로부터 유래되는 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 메가뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 메가TAL, TALEN, ZFN, Cas 뉴클레아제, 말단-가공 뉴클레아제, 면역억제 신호 댐퍼, 플립 수용체, 조작된 TCR, CAR, Daric, 치료 폴리펩타이드, 융합 폴리펩타이드는 비바이러스와 바이러스 방법 둘 다에 의해 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포에 도입된다. 특정 실시형태에서, 뉴클레아제 및/또는 공여자 수선 주형을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 전달은 동일한 방법에 의해 또는 상이한 방법에 의해, 및/또는 동일한 벡터에 의해 또는 상이한 벡터에 의해 제공될 수 있다.
용어 "벡터"는 본 명세서에서 다른 핵산 분자를 전달하거나 또는 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하기 위해 사용된다. 전달된 핵산은 일반적으로, 예를 들어, 벡터 핵산 분자에 연결되며, 예를 들어, 삽입된다. 벡터는 세포 내 자기 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 또는 숙주 세포 DNA 내로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 비-바이러스 벡터는 T 세포에 본 명세서에 상정된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 전달하기 위해 사용된다.
비-바이러스 벡터의 예시적 예는 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 및 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 상정된 폴리뉴클레오타이드의 비바이러스 전달의 예시적 방법은 전기천공법, 초음파천공법, 리포펙션, 미량주사법, 유전자총법, 바이로좀, 리포좀, 면역리포좀, 나노입자, 다양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, DEAE-덱스트란-매개 전달, 유전자총 및 열충격을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 상정된 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 폴리뉴클레오타이드 전달 시스템의 예시적 예는 아막사 바이오시스템즈(Amaxa Biosystems), 맥스사이트 인코포레이티드(Maxcyte, Inc.), BTX 몰레큘러 딜리버 시스템즈(BTX Molecular Delivery Systems) 및 코페르니쿠스 세라퓨틱스 인코포레이티드(Copernicus Therapeutics Inc.)에 의해 생산된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 리포펙션 시약은 상업적으로 시판되고 있다(예를 들어, 트랜스펙탐(Transfectam)(상표명) 및 리포펙틴(Lipofectin)(상표명)). 폴리펩타이드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 정규 및 중성 지질은 문헌에 기재되었다. 예를 들어, 문헌[Liu et al. (2003) Gene Therapy. 10:180-187; 및 Balazs et al. (2011) Journal of Drug Delivery. 2011:1-12] 참조. 항체-표적화된, 박테리아 유래된, 살아있지 않은 나노세포-기반 전달이 또한 특정 실시형태에서 상정된다.
특정 실시형태에서 상정된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터는 전형적으로 이하에 기재되는 바와 같이 전신 투여(예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 진피하 또는 두개내 주입) 또는 국소 적용에 의해 개개 환자에 대한 투여에 의해 생체내로 전달될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 생체밖 세포, 예컨대 개개 환자로부터 외식된 세포(예를 들어, 이동된 말초혈액, 림프구, 골수 흡입물, 조직 생검 등) 또는 보편적 공여자 조혈 줄기 세포에 전달된 다음에 환자에게 세포가 재이식될 수 있다.
일 실시형태에서, 조작된 뉴클레아제 및/또는 공여자 수선 주형을 포함하는 바이러스 벡터는 생체내 세포의 형질도입을 위해 유기체에 투여된다. 대안적으로, 네이키드 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 혈액 또는 조직 세포와의 궁극적 접촉에 분자를 도입하기 위해 정상적으로 사용되는 임의의 경로에 의한다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법은 이용 가능하며, 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 특정 조성물을 투여하기 위해 하나 초과의 경로가 사용될 수 있지만, 특정 경로는 종종 더 중간의 그리고 다른 경로보다 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
본 명세서에 상정된 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 바이러스 벡터 시스템의 예시적 예는 유전자 전달을 위해 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus: AAV), 레트로바이러스, 단순 포진 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다양한 실시형태에서, 조작된 뉴클레아제 및/또는 공여자 수선 주형을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV)를 이용하여 세포를 형질도입함으로써 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포에 도입된다.
AAV는 작은(~26㎚) 복제-결함, 1차 에피솜, 비외피 바이러스이다. AAV는 분할 세포와 비분할 세포를 둘 다 감염시킬 수 있고, 그의 게놈을 숙주 세포의 게놈에 혼입시킬 수 있다. 재조합 AAV(rAAV)는 전형적으로 최소로 이식유전자 및 그의 조절 서열, 및 5' 및 3' AAV 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR)로 구성된다. ITR 서열은 길이가 약 145bp이다. 특정 실시형태에서, rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAV10로부터 단리된 ITR 및 캡시드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 rAAV는 ITR 서열이 하나의 AAV 혈청형으로부터 단리되고, 캡시드 서열이 상이한 AAV 혈청형으로부터 단리되도록 사용된다. 예를 들어, AAV2로부터 유래된 ITR 서열 및 AAV6으로부터 유래된 캡시드 서열을 갖는 rAAV는 AAV2/AAV6로서 지칭된다. 특정 실시형태에서, rAAV 벡터는 AAV2로부터의 ITR, 및 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAV10 중 임의의 하나로부터의 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, rAAV는 AAV2로부터 유래된 ITR 및 AAV6으로부터 유래된 캡시드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자 조작 및 선택 방법은 관심 대상의 세포를 형질도입할 가능성이 더 크게 만들기 위해 AAV 캡시드에 적용될 수 있다.
rAAV 벡터의 구성, 이의 생성 및 정제는, 예를 들어, 미국 특허 제9,169,494호; 제9,169,492호; 제9,012,224호; 제8,889,641호; 제8,809,058호; 및 제8,784,799호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
다양한 실시형태에서, 조작된 뉴클레아제 및/또는 공여자 수선 주형을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스를 이용하여 세포를 형질도입함으로써 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포에 도입된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "레트로바이러스"는 그의 게놈 RNA를 선형 이중-가닥 DNA 복제물로 역전사시키고, 후속적으로 그의 게놈 DNA를 숙주 게놈에 공유적으로 통합시키는 RNA 바이러스를 지칭한다. 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 예시적 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(M-MuLV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(MoMSV), 하비 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV), 뮤린 유선 종양 바이러스(MuMTV), 깁본 유인원 백혈병 바이러스(GaLV), 고양이 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스, 프렌드 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) 및 라우스 육종 바이러스(RSV)) 및 렌티바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "렌티바이러스"는 복잡한 레트로바이러스의 군(또는 속)을 지칭한다. 예시적인 렌티바이러스는 HIV(인간 면역결핍 바이러스; HIV 1형, 및 HIV 2형을 포함함); 비스나-메디 바이러스(VMV) 바이러스, 염소-관절염-뇌염 바이러스(CAEV), 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 소 면역 결핍 바이러스(BIV), 또는 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, HIV 기반 벡터 골격(즉, HIV 시스-작용성 서열 요소)이 바람직하다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 렌티바이러스 벡터는 하나 이상의 LTR 및 다음의 부속 요소: cPPT/FLAP, 싸이(Ψ) 패키징 신호, 유출 요소, 폴리(A) 서열 중 하나 이상 또는 모두를 포함하고, 선택적으로 본 명세서의 다른 곳에 논의되는 바와 같이 WPRE 또는 HPRE, 절연체 요소, 선택 가능 마커, 및 세포 자살 유전자를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 렌티바이러스 벡터는 통합 또는 비통합 또는 통합 결함 렌티바이러스일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "통합 결함 렌티바이러스"는 바이러스 게놈을 숙주 세포의 게놈 내로 통합하는 능력이 없는 인테그라제를 갖는 렌티바이러스를 지칭한다. 통합-부적합 바이러스 벡터는 본 명세서에서 그의 전문이 참고로 포함되는 미국 특허 출원 WO 2006/010834에 기재되어 있다.
인테그라제 활성을 감소시키는 데 적합한 HIV-1 pol 유전자에서 예시적인 돌연변이는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116N, D1161, D116A, N120G, N1201, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199c, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A 및 K264H.
용어 "긴 말단 반복부(long terminal repeat: LTR)"는 천연 서열과 관련하여 반복을 지시하고 U3, R 및 U5 영역을 함유하는 레트로바이러스 DNA 말단에 위치된 염기쌍의 도메인을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "FLAP 요소" 또는 "cPPT/FLAP"는 서열이 레트로바이러스, 예를 들어, HIV-1 또는 HIV-2의 중심 폴리퓨린관 및 중심 말단 서열을 포함하는 핵산을 지칭한다. 적합한 FLAP 요소는 미국 특허 제6,682,907호에 그리고 문헌[Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173]에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "패키징 신호" 또는 "패키징 서열"은 바이러스 캡시드 또는 입자 내로 바이러스 RNA의 삽입에 필요한 레트로바이러스 게놈 내에 위치된 싸이[Ψ] 서열을 지칭한다, 예를 들어, 문헌[Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101-2109] 참조.
용어 "유출 요소"는 세포의 핵으로부터 세포질까지 RNA 전사체의 수송을 조절하는 시스-작용성 전사후 조절 요소를 지칭한다. RNA 유출 요소의 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) rev 반응 요소(RRE)(예를 들어, 문헌[Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053; 및 문헌[Cullen et al., 1991. Cell 58: 423] 참조), 및 간염 B 바이러스 전사후 조절 요소(HPRE)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 바이러스 벡터에서 이종성 서열의 발현은 전사후 조절 요소, 효율적인 폴리아데닐화 부위, 및 선택적으로, 전사 종결 신호를 벡터 내로 혼입시킴으로써 증가된다. 다양한 전사후 조절 요소는 단백질, 예를 들어, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886); 간염 B 바이러스(HPRE)에 존재하는 전사후 조절 요소(Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864); 등(Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766)에서 이종성 핵산의 발현을 증가시킬 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 바람직하게는 LTR을 변형시키는 것의 결과로서 몇몇 안전선 향상을 함유한다. "자기-비활성화"(SIN) 벡터는, 예를 들어 U3 영역으로서 알려진 우측(3') LTR 인핸서-프로모터 영역이 바이러스 복제의 제1 라운드 뒤에 바이러스 전사를 방지하도록 (예를 들어, 결실 또는 치환에 의해) 변형된 복제-결함 벡터를 지칭한다. 추가적인 안전성 향상은 바이러스 입자의 생성 동안 바이러스 게놈의 전사를 유도하기 위해 5' LTR의 U3 영역을 이종성 프로모터로 대체함으로써 제공된다. 사용될 수 있는 이종성 프로모터의 예는, 예를 들어, 바이러스 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어, 초기 또는 후기), 거대세포 바이러스(CMV)(예를 들어, 급초기), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 라우스 육종 바이러스(RSV) 및 단순 포진 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "위형" 또는 "위형화"는 바이러스 외피 단백질이 다른 바이러스가 갖는 바람직한 특징의 단백질로 치환된 바이러스를 지칭한다. 예를 들어, HIV는 HIV 외피 단백질(env 유전자에 의해 암호화됨)이 CD4+ 제시 세포에 대해 바이러스를 정상적으로 표적화하기 때문에 HIV가 더 다수의 세포를 감염시키도록 허용하는 수포성 구내염 바이러스 G-단백질(VSV-G) 외피 단백질에 의해 위형화될 수 있다.
특정 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 공지된 방법에 따라 생성된다. 예를 들어, 문헌[Kutner et al., BMC Biotechnol. 2009;9:10. doi: 10.1186/1472-6750-9-10; Kutner et al. Nat. Protoc. 2009;4(4):495-505. doi: 10.1038/nprot.2009.22.] 참조.
본 명세서에 상정된 특정 구체적 실시형태에 따르면, 대부분의 또는 모든 바이러스 벡터 골격 서열은 렌티바이러스, 예를 들어, HIV-1로부터 유래된다. 그러나, 레트로바이러스 및/또는 렌티바이러스 서열의 다수의 상이한 공급원이 사용되거나 또는 조합될 수 있고, 특정 렌티바이러스 서열의 수많은 치환 및 변경은 본 명세서에 기재된 기능을 수행하기 위한 전달 벡터의 능력을 손상시키는 일 없이 수용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 다양한 렌티바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있으며, 문헌[Naldini et al., (1996a, 1996b 및 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998], 미국 특허 제6,013,516호; 및 제5,994,136호를 참조하며, 이 중 다수는 본 명세서에 상정된 바이러스 벡터 또는 전달 플라스미드를 생성하기에 적합할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 조작된 뉴클레아제 및/또는 공여자 수선 주형을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 아데노바이러스를 이용하여 세포를 형질도입함으로써 면역 효과기 세포에 도입된다.
아데노바이러스 기반 벡터는 다수의 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율을 가질 수 있으며 세포 분할을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터를 이용하여, 고역가 및 고수준의 발현이 얻어졌다. 이 벡터는 상대적으로 단순한 시스템에서 다량으로 생성될 수 있다. 이식유전자가 Ad E1a, E1b 및/또는 E3 유전자를 대체하고; 후속적으로 복제 결함 벡터가 도중에 결실된 유전자 기능을 공급하는 인간 293 세포에서 증식되도록, 대부분의 아데노바이러스 벡터가 조작된다. Ad 벡터는 비분할, 분화 세포, 예컨대 간, 신장 및 근육에서 발견되는 것을 포함하는 생체내 다중 유형의 조직을 형질도입할 수 있다. 통상적인 Ad 벡터는 거대 운반 능력을 가진다.
복제 결함이 있는 현재의 아데노바이러스 벡터의 생성 및 증식은 Ad5 DNA 단편에 의해 인간 배아 신장 세포로부터 형질도입되고 E1 단백질을 구성적으로 발현시키는 293로 표기되는 독특한 헬퍼 세포주를 이용할 수 있다(Graham et al., 1977). E3 영역은 아데노바이러스 게놈에서 불필요하기 때문에(Jones & Shenk, 1978), 293 세포의 도움으로 현재의 아데노바이러스 벡터는 E1, D3 중 하나 또는 영역 둘 다에서 외래 DNA를 운반한다(Graham & Prevec, 1991 ). 아데노바이러스 벡터는 진핵 유전자 발현(Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) 및 백신 개발(Grunhaus & Horwitz, 1992; Graham & Prevec, 1992)에서 사용되었다. 상이한 조직에 재조합 아데노바이러스를 투여하는 연구는 기관 점적(Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), 근육 주사(Ragot et al., 1993), 말초 정맥 주사(Herz & Gerard, 1993) 및 뇌 내로의 정위 접종(Le Gal La Salle et al., 1993)을 포함한다. 임상 시험에서 Ad 벡터 사용의 예는 근육내 주사에 의해 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오타이드 요법을 수반하였다(Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9(1998)).
다양한 실시형태에서, 조작된 뉴클레아제 및/또는 공여자 수선 주형을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단순 포진 바이러스, 예를 들어, HSV-1, HSV-2를 이용하여 세포를 형질도입함으로써 면역 효과기 세포에 도입된다.
성숙 HSV 비리온은 152kb인 선형 이중-가닥 DNA 분자로 이루어진 바이러스 게놈을 갖는 외피가 있는 20면체 캡시드로 이루어진다. 일 실시형태에서, HSV 기반 바이러스 벡터는 하나 이상의 필수 또는 비필수 HSV 유전자에 결함이 있다. 일 실시형태에서, HSV 기반 바이러스 벡터는 복제 결함이다. 대부분의 복제 결함 HSV 벡터는 복제를 방지하기 위해 하나 이상의 급초기, 초기 또는 후기 HSV 유전자를 제거하도록 결실을 함유한다. 예를 들어, HSV 벡터는 ICP4, ICP22, ICP27, ICP47 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 급초기 유전자에 결함이 있을 수 있다. HSV 벡터의 이점은 장기간 DNA 발현을 초래할 수 있는 잠복 단계에 들어가는 그의 능력 및 25kb까지 외인성 DNA 삽입물을 수용할 수 있는 그의 거대 바이러스 DNA 게놈이다. HSV-기반 벡터는, 예를 들어, 미국 특허 제5,837,532호, 제5,846,782호 및 제5,804,413호, 및 국제 특허 출원 WO 91/02788, WO 96/04394, WO 98/15637 및 WO 99/06583에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함되어 있다.
H. 조성물 및 제형
특정 실시형태에서 상정된 조성물은 본 명세서에 상정된 하나 이상의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터 및 면역 효과기 세포 조성물을 포함할 수 있다. 조성물은 약제학적 조성물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "약제학적 조성물"은 단독으로 또는 한 가지 이상의 다른 치료 양상과 조합하여 세포 또는 동물에 대한 투여를 위해 약제학적으로 허용 가능한 또는 생리적으로 허용 가능한 용액 중에서 제형화된 조성물을 지칭한다. 원한다면, 상기 조성물은 마찬가지로 다른 제제, 예컨대 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 소분자, 화학요법, 프로드러그, 약물, 항체 또는 다른 다양한 약제학적 활성제와 조합하여 투여될 수 있다는 것이 또한 이해될 것이다. 또한 조성물 중에 포함될 수 있는 다른 성분을 사실상 제한하지 않으며, 단, 추가적인 제제는 의도된 요법을 전달하는 조성물의 능력에 유해하게 영향을 미치지 않는다.
어구 "약제학적으로 허용 가능한"은 타당한 의학적 판단의 범주 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 합리적인 유해/유익비에 비례하여 인간 또는 동물의 조직화 접촉하여 사용하기에 적합한 해당 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투약 형태를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 인간 또는 가축에 대해 허용 가능한 것으로 미국 식품 의약 관리국(United States Food and Drug Administration)에 의해 승인된 임의의 보조제, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미 증강제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정제, 등장제, 용매, 계면활성제 또는 유화제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 카복시메틸셀룰로스나트륨, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 탈크; 코코아 버터, 왁스, 동물 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화아연; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스터, 예컨대 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열성 물질 제거수; 등장 식염수; 링거 용액; 에틸 알코올; 인산염 완충제; 및 약제학적 제형에서 사용되는 임의의 다른 적합한 물질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 상정된 방법에 의해 제조된 게놈 편집된 T 세포의 양을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 약제학적 T 세포 조성물은 하나 이상의 변형된 그리고/또는 비-기능성 TCRα 대립유전자를 포함하고 하나 이상의 면역억제 신호 댐퍼, 플립 수용체, 조작된 TCR, CAR, Daric, 또는 다른 치료 폴리펩타이드를 발현시키는 게놈 편집된 T 세포를 포함한다.
일반적으로 특정 실시형태에서 상정된 방법에 의해 제조된 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 약 102 내지 약 1010개의 세포/㎏ 체중, 약 105 내지 약 109개의 세포/㎏ 체중, 약 105 내지 약 108개의 세포/㎏ 체중, 약 105 내지 약 107개의 세포/㎏ 체중, 약 107 내지 약 109개의 세포/㎏ 체중, 또는 약 107 내지 약 108개의 세포/㎏ 체중(해당 범위 내의 모든 정수값을 포함함)의 투약량으로 투여될 수 있다는 것이 언급될 수 있다. 세포 수는 조성물에 포함된 세포 유형으로 의도되는 궁극의 용도에 의존할 것이다. 본 명세서에 제공된 용도에 대해, 세포는 일반적으로 1 리터 이하의 용적이며, 500㎖ 이하, 심지어 250㎖ 또는 100㎖ 이하일 수 있다. 따라서 목적으로 하는 세포의 밀도는 전형적으로 약 106개의 세포/㎖ 초과이고, 일반적으로 약 107개의 세포/㎖ 초과이며, 일반적으로 약 108개의 세포/㎖ 이상이다. 임상적으로 적절한 수의 면역 세포는 약 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 또는 1012개의 세포와 점증적으로 동일하거나 또는 이를 초과하는 다회 주입으로 나누어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 특히 모든 주입 세포는 특정 표적 항원에 전향시킬 수 있기 때문에, 106/킬로그램(106 내지 1011개/환자)의 범위에서 더 적은 수의 세포가 투여될 수 있다. 조작된 TCR, CAR 또는 Daric을 발현시키도록 변형된 T 세포는 이들 범위 내의 투약량으로 다회 투여될 수 있다. 세포는 요법을 받고 있는 환자에 대해 동종이계, 동계, 이종성 또는 자가일 수 있다. 원한다면, 치료는 또한 주입된 T 세포의 생착 및 기능을 향상시키기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같이 미토겐(예를 들어, PHA) 또는 림포카인, 사이토카인, 및/또는 케모카인(예를 들어, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, TNF-알파, IL-18 및 TNF-베타, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1α 등)의 투여를 포함할 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이 활성화되고 확장된 세포를 포함하는 조성물은 면역손상된 개체에서의 질환의 치료 및 예방에서 이용될 수 있다. 특히, 본 명세서에 상정된 방법에 의해 제조된 변형된 T 세포를 포함하는 조성물은 암 치료에서 사용된다. 특정 실시형태에서 상정된 게놈 편집된 T 세포는 단독으로 또는 담체, 희석제, 부형제와 그리고/또는 다른 성분, 예컨대 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 조합한 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 게놈 편집된 T 세포의 양을 포함한다.
특정 실시형태에서 상정된게놈 편집된 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서 상정된 조성물은 바람직하게는 비경구 투여, 예를 들어, 혈관내(정맥내 또는 동맥내), 복강내 또는 근육내 투여용으로 제형화된다.
액체 약제학적 조성물은 그들이 용액, 현탁액이든 또는 다른 유사한 형태이든 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 바람직하게는 생리식염수, 링거용액, 등장성 염화나트륨, 고정유, 예컨대 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노 또는 다이글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항균제, 예컨대 벤질알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염 및 긴장도 조절을 위한 제제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 이루어진 앰플, 일회용 주사 또는 다회 용량 바이알에 동봉될 수 있다. 주사용 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지에서 제형화된다. 이러한 조성물은 인간 대상체에 대한 투여에 적합하다. 특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지는 무혈청 배지이다.　
무혈청 배지는 단순화된 그리고 더 양호한 한정 조성물, 감소된 정도의 오염물질, 감여성 제제의 잠재적 공급원의 제거 및 더 낮은 비용을 포함하는 혈청 함유 배지 이상의 몇몇 이점을 가진다. 다양한 실시형태에서, 무혈청 배지는 무 동물이며, 선택적으로 무 단백질일 수 있다. 선택적으로, 배지는 생약제학적으로 허용 가능한 재조합 단백질을 함유할 수 있다. "무 동물" 배지는 성분이 비동물 공급원으로부터 유래된 배지를 지칭한다. 재조합 단백질은 무 동물 배지에서 미경험 동물 단백질을 대체하며 영양소는 합성, 식물 또는 미생물 공급원으로부터 얻는다. 대조적으로 "무 단백질" 배지는 단백질이 실질적으로 없는 것으로 정의된다.
특정 조성물에서 사용되는 무혈청 배지의 예시적 예는 QBSF-60(퀄러티 바이올로지컬 인코포레이티드(Quality Biological, Inc.)), 스템프로-34(StemPro-34)(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)) 및 X-VIVO 10을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포를 포함하는 조성물은 PlasmaLyte A를 포함하는 용액 중에서 제형화된다.
일 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포를 포함하는 조성물은 동결보존 배지를 포함하는 용액 중에서 제형화된다. 예를 들어, 해동 후 높은 세포 생존도 결과를 유지하기 위해 동결보존제가 있는 동결보존 배지가 사용될 수 있다. 특정 조성물에서 사용되는 동결보존 배지의 예시적 예는 CryoStor CS10, CryoStor CS5, 및 CryoStor CS2를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.　
더 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포를 포함하는 조성물은 PlasmaLyte A 대 CryoStor CS10을 50:50으로 포함하는 용액 중에서 제형화된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 조성물은 유효량의 확장된 게놈 편집된 T 세포 조성물을 단독으로 또는 1종 이상의 치료제와 조합하여 포함한다. 따라서, T 세포 조성물은 단독으로 또는 다른 공지된 암 치료, 예컨대 방사선 요법, 화학요법, 이식, 면역요법, 호르몬 요법, 광역학요법과 조합하여 투여될 수 있다. 조성물은 또한 항생제와 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 치료제는 본 명세서에 기재된 특정 질환, 예컨대 특정 암을 위한 표준 치료로서 당업계에서 허용될 수 있다. 특정 실시형태에서 상정된 예시적인 치료제는 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드, NSAID, DMARD, 항염증제, 화학요법제, 방사선요법, 치료 항체 또는 다른 활성 및 보조제를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 T 세포를 포함하는 조성물은 다수의 화학치료제와 함께 투여될 수 있다. 화학치료제의 예시적 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파마이드(사이톡산(CYTOXAN)(상표명)); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜아민(알트레타민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포르아마이드, 트라이에틸렌티오포스파오르아마이드 및 트라이메틸올로멜라민을 포함); 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 염산염, 멜팔란, 노벰비신, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 유라실 머스터드; 니트로소유레아, 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로유라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라이메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 다이데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예컨대 아미노글루테티마이드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라뷰실; 비산트렌; 에다트라세이트; 데포파민; 데메콜신; 다이아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 질산염; 하이드록시유레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK(등록상표); 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테뉴아존산; 트라이아지쿠온; 2, 2',2"-트라이클로로트라이에틸아민; 유레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 티오테파; 탁소외드, 예를 들어, 파클리탁셀(탁솔(TAXOL)(등록상표)) 및 도세탁셀(탁소텔(TAXOTERE)(등록상표)); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오로메틸로미틴(DMFO); 레티노산 유도체, 예컨대 타그레틴(Targretin)(상표명)(벡사로텐), 판레틴(Panretin)(상표명)(알리트레티노인); ONTAK(상표명)(데니류킨 다이프티톡스); 에스퍼라마이신; 카페시타빈; 및 임의으 상기의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 저해성 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜(파레스톤); 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타마이드, 닐루타마이드, 비칼루타마이드, 류프롤라이드 및 고세렐린; 및 임의의 상기의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함하는, 종양 상에서 호르몬 작용을 조절하거나 저해하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐이 본 정의에 포함된다.
다양한 다른 치료제가 본 명세서에 상정된 조성물과 함께 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, T 세포를 포함하는 조성물은 항염증제와 함께 투여된다. 항염증제 또는 약물은 스테로이드 및 글루코코르티코이드(베타메타손, 부데소나이드, 덱사메타손, 하이드로코티손 아세테이트, 하이드로코티손, 하이드로코티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 프레드니손, 트라이암시놀론을 포함),비스테로이드성 항염증 약물(nonsteroidal anti-inflammatory drug: NSAIDS)(아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 메토트렉세이트, 설파살라진, 레플루노마이드, 항-TNF 의약, 사이클로포스파마이드 및 마이코페놀레이트를 포함)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 예시적인 NSAID는 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 나트륨, Cox-2 저해제, 예컨대 VIOXX(등록상표)(로페콕십) 및 셀레브렉스(CELEBREX)(등록상표)(셀렉콕십) 및 시알릴산염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 진통제는 아세트아미노펜, 옥시코돈, 프로폭시펜 하이드로클로라이드의 트라마돌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 글루코코르티코이드는 코티손, 덱사메타손, 하이드로코티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론 또는 프레드니손으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 생물학적 반응 개질제는 세포 표면 마커와 관련된 분자(예를 들어, CD4, CD5 등), 사이토카인 저해제, 예컨대 TNF 길항제(예를 들어, 에타너셉트(엔브렐(ENBREL)(등록상표)), 아달리무맙(휴미라(HUMIRA)(등록상표)) 및 인플릭시맙(레미케이드(REMICADE)(등록상표)), 케모카인 저해제 및 접착 분자 저해제를 포함한다. 생물학적 반응 개질제는 단클론성 항체뿐만 아니라 분자의 재조합 형태를 포함한다. 예시적인 DMARD는 아자티오프린, 사이클로포스파마이드, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 페니실라민, 레플루노마이드, 설파살라진, 하이드록시클로로퀸, 골드(Gold)(경구 (아우라노핀) 및 근육내) 및 미노사이클린을 포함한다.
특정 실시형태에서 상정된 게놈 편집된 T 세포와 조합하기에 적합한 치료적 항체의 예시적 예는 아바고보맙, 아데카투무맙, 아푸투주맙, 알렘투주맙, 알투모맙, 아마툭시맙, 아나투모맙, 아르시투모맙, 바비툭시맙, 벡투모맙, 베바시주맙, 비바투주맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙, 칸투주맙, 카투막소맙, 세툭시맙, 시타투주맙, 식수투무맙, 클리바투주맙, 코나투무맙, 다라투무맙, 드로지투맙, 둘리고투맙, 두시기투맙, 데투모맙, 다세투주맙, 달로투주맙, 에크로멕시맙, 엘로투주맙, 엔시툭시맙, 에르투막소맙, 에타락시주맙, 파리에투주맙, 피클라투주맙, 피기투무맙, 플란보투맙, 푸툭시맙, 가니투맙, 겜투주맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙, 이브리투모맙, 이고보맙, 임가투주맙, 인다툭시맙, 이노투주맙, 인테투무맙, 이필리무맙, 이라투무맙, 라베투주맙, 렉사투무맙, 린투주맙, 로르보투주맙, 루카투무맙, 마파투무맙, 마투주맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미투모맙, 목세투모맙, 나르나투맙, 나프투모맙, 넥시투무맙, 니모투주맙, 노페투모맙, 오카라투주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오나투주맙, 오포르투주맙, 오레고보맙, 파니투무맙, 파르사투주맙, 파트리투맙, 펨투모맙, 페르투주맙, 핀투모맙, 프리투무맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 릴로투무맙, 리툭시맙, 로바투무맙, 사투모맙, 시브로투주맙, 실툭시맙, 심투주맙, 솔리토맙, 타카투주맙, 타플리투모맙, 테나투모맙, 테프로투무맙, 티가투주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 투코투주맙, 유블리툭시맙, 벨투주맙, 보르세투주맙, 보투무맙, 잘루투무맙, CC49 및 3E8을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 조성물은 사이토카인과 함께 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 "사이토카인"은 세포내 매개체로서 다른 세포 상에서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반적 용어를 의미한다. 이러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인, 케모카인 및 전통적인 폴리펩타이드 호르몬이다. 사이토카인 중에 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 파라갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포자극호르몬(follicle stimulating hormone: FSH), 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone: TSH), 및 황체 형성 호르몬(LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 뮐러리안-저해 물질; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩타이드; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-베타; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장인자(TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, 베타, 및 -감마; 집락 자극 인자(colony stimulating factor: CSF), 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터류킨(IL), 예컨대 IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-알파 또는 TNF-베타; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 다른 폴리펩타이드 인자가 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 사이토카인 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질, 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적으로 활성인 등가물을 포함한다.
특정 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 개시된 PI3K 저해제의 존재 하에 배양되고 다음의 마커: CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127 및 HLA-DR 중 하나 이상을 발현시키는 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포를 포함하고, 이는 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 i) CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197; ii) CD62L, CD127, CD197, CD38; 및 iii) CD62L, CD27, CD127 및 CD8로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상을 발현시키는 특정 하위T 세포 집단을 포함하고, 이는 양성 또는 양성 선택 기법에 의해 추가로 단리된다. 다양한 실시형태에서, 조성물은 다음의 마커 중 하나 이상을 발현시키지 않거나 또는 실질적으로 발현시키지 않는다: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 및 LAG3.
일 실시형태에서, CD62L, CD127, CD197 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 저해제 없이 활성화되고 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배 이상 증가된다.
일 실시형태에서, CD62L, CD127, CD27 및 CD8로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 저해제 없이 활성화되고 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배 이상 증가된다.
일 실시형태에서, CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 및 LAG3으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 저해제와 함께 활성화되고 확장된 T 세포 집단에 비해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배 이상 감소된다.
I. 표적 세포
실시형태에서, 게놈 편집된 면역 효과기 세포가 표적 세포, 예를 들어, 종양 또는 암 세포로 전향시킨다는 것과, 그리고 세포 상에서 표적 항원에 결합하는 결합 도메인을 갖는 조작된 TCR, CAR 또는 Daric을 포함한다는 것이 상정된다. 이러한 게놈 편집된 면역 효과기 세포는 하나 이상의 면역억제 신호 댐퍼, 플립 수용체 또는 다른 치료적 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 T 세포를 포함한다.
일 실시형태에서, 표적 세포는 항원, 예를 들어, 다른 정상의 (목적으로 하는) 세포 표면 상에서 실질적으로 발견되지 않는 표적 항원을 발현시킨다.
일 실시형태에서, 표적 세포는 골세포, 골세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 연골아세포, 근세포, 골격근세포, 근원세포, 근육세포, 평활근세포, 방광세포, 골수 세포, 중추 신경계(central nervous system: CNS) 세포, 말초신경계(peripheral nervous system: PNS) 세포, 신경교세포, 성상세포, 뉴런, 색소 세포, 상피 세포, 피부 세포, 내피세포, 혈관내피세포, 유방세포, 결장 세포, 식도 세포, 위장 세포, 위 세포, 결장 세포, 두부 세포, 경부 세포, 잇몸 세포, 혀 세포, 신장 세포, 간 세포, 폐 세포, 코인두 세포, 난소 세포, 난포세포, 자궁경부 세포, 질 세포, 자궁 세포, 췌장 세포, 췌장 실질 세포, 췌관 세포, 췌장 도세포, 음경 세포, 생식선 세포, 고환 세포, 조혈세포, 림프구 세포 또는 골수성 세포이다.
일 실시형태에서, 표적 세포는 고형암 세포이다.
특정 실시형태에서 상정된 조성물 및 방법에 의해 표적화될 수 있는 세포의 예시적 예는 다음의 고형암의 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 부신암, 부신피질 암종, 항문암, 맹장암, 성상세포종, 비전형적 기형종/간상 종양, 기저 세포 암종, 담관 암, 방광암, 골암, 뇌/CNS 암, 유방암, 기관지 종양, 심장 종양, 자궁경부 암, 담관암종, 연골육종, 척색종, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 유관 상피내암종(DCIS) 자궁내막암, 뇌실막세포종, 식도 암, 감각신경모세포종, 유잉 육종, 두개강외 생식세포 종양, 고환외 생식세포 종양, 눈암, 나팔관 암, 섬유 조직육종, 섬유육종, 담낭, 위암, 위장 유암종, 위장관 기질 종양(GIST), 생식 세포 종양, 신경교종, 교모세포종, 두경부 암, 혈관아세포종, 간세포 암, 하인두 암, 안내속흑색종, 카포시 육종, 신장 암, 후두암, 평활근육종, 입술암, 지방육종, 간암, 폐암, 비소세포폐암, 폐유암종, 악성 중피종, 수질 암종, 수모세포종, 뇌수막종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 정중선 관암종, 구강암, 점액육종, 골수이형성증후군, 골수증식성 신생물, 비강 및 부비동 암, 비인두암, 신경아세포종, 핍지교종, 경구암, 구강암, 구강인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 췌장 소도 세포 종양, 유두 암종, 부신경절종, 부갑상선 암, 음경암, 인두암, 갈색세포종, 송과체부종양, 뇌하수체 종양, 흉막폐아세포종, 원발성 복막암, 전립선암, 직장암, 망막아세포종, 신세포 암종, 신우 및 요관암, 횡문근육종, 침샘암, 피지선 암종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포 암종, 소세포 폐암, 소장암, 위암, 땀샘암종, 활막종, 고환암, 인후암, 흉선암, 갑상선 암, 요도암, 자궁암, 자궁육종, 질암, 혈관암, 외음부암 및 윌름 종양.
일 실시형태에서, 표적 세포는 액상암 또는 혈액학적 암 세포이다.
혈액학적 암의 예시적 예는 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 상정된 조성물 및 방법에 의해 표적화될 수 있는 세포의 예시적 예는 다음의 백혈병 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 골수아구성, 전골수구성, 골수단핵구, 단핵구, 적백혈병, 모발 세포 백혈병(HCL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 및 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 골수단핵구 백혈병(CMML) 및 진성 적혈구 증가증.
특정 실시형태에서 상정된 조성물 및 방법에 의해 표적화될 수 있는 세포의 예시적 예는 다음의 림프종: 호지킨 림프종, 결절성 림프구-우세 호지킨 림프종 및 B-세포 비호지킨 림프종을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 비-호지킨 림프종: 버킷 림프종, 소림프구성 림프종(SLL), 미만성 거대 B-세포 림프종, 소포성 림프종, 면역아세포 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종, 변연부 림프종, 및 맨틀 세포 림프종; 및 T-세포 비-호지킨 림프종: 균상식육종, 역형성 거대세포 림프종, 세자리 증후군, 및 전구체 T-림프아구성 림프종의 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서 상정된 조성물 및 방법에 의해 표적화될 수 있는 세포의 예시적 예는 다음의 다발성 골수종의 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 명백한 다발성 골수종, 무증상 다발성 골수종, 혈장 세포 백혈병, 비분비성 골수종, IgD 골수종, 골경화 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 및 골수외성 형질세포종.
다른 특정 실시형태에서, 표적 세포는 암 세포, 예컨대 암이 있는 환자에서의 세포이다.
일 실시형태에서, 표적 세포는 CMV, HPV 및 EBV를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 바이러스에 의패 감염된 세포, 예를 들어 암세포이다.
일 실시형태에서, 표적 항원은 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2를 포함하는 EGFR 패밀리(HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRα, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 서비빈, TAG72, TEMs, VEGFR2 및 WT-1로의 에피토프이다.
J. 치료 방법
본 명세서에 상정된 조성물 및 방법에 의해 제조된 게놈 편집된 면역 효과기 세포는 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 염증 질환, 및 면역결핍증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 조건의 치료에서 사용하기 위한 개선된 적응 세포 요법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 1차 T 세포의 특이성은 본 명세서에 상정된 조작된 TCR, CAR 또는 Daric을 이용하여 1차 T 세포를 유전자 변형시킴으로써 종양 또는 암세포로 전향된다. 일 실시형태에서, 게놈 편집된 T 세포는 이것이 필요한 수용자에게 주입된다. 주입된 세포는 수용자에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과 달리, 게놈 편집된 T 세포는 생체내에서 복제될 수 있으며; 따라서, 지속되는 암 요법을 야기할 수 있는 장기간 지속성에 장기간 지속성에 기여한다. 게다가, 특정 실시형태에서 상정된 게놈 편집된 T 세포는 더 안전하고 더 효능있는 적응 세포 요법을 제공하는데, 그들이 기능성 내인성 TCR 발현을 실질적으로 결여함으로써, 잠재적 이식 거부를 감소시키고; 종양 미세환경에서 T 세포 지속능력 및 지속성을 증가시키는 하나 이상의 면역억제 신호 댐퍼, 플립 수용체를 포함하기 때문이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포는 강한 생체내 T 세포 확장을 겪을 수 있고 연장된 시간 동안 지속될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포는 임의의 추가적인 종양 형성 또는 성장을 저해하도록 재활성화될 수 있는 특정 기억 T 세포를 진화시킨다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포는 고형 종양 또는 암 치료에서 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포는 부신암, 부신피질 암종, 항문암, 맹장암, 성상세포종, 비전형적 기형종/간상 종양, 기저 세포 암종, 담관 암, 방광암, 골암, 뇌/CNS 암, 유방암, 기관지 종양, 심장 종양, 자궁경부 암, 담관암종, 연골육종, 척색종, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 유관 상피내암종(DCIS) 자궁내막암, 뇌실막세포종, 식도 암, 감각신경모세포종, 유잉 육종, 두개강외 생식세포 종양, 고환외 생식세포 종양, 눈암, 나팔관 암, 섬유 조직육종, 섬유육종, 담낭, 위암, 위장 유암종, 위장관 기질 종양(GIST), 생식 세포 종양, 신경교종, 교모세포종, 두경부 암, 혈관아세포종, 간세포 암, 하인두 암, 안내속흑색종, 카포시 육종, 신장 암, 후두암, 평활근육종, 입술암, 지방육종, 간암, 폐암, 비소세포폐암, 폐유암종, 악성 중피종, 수질 암종, 수모세포종, 뇌수막종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 정중선 관암종, 구강암, 점액육종, 골수이형성증후군, 골수증식성 신생물, 비강 및 부비동 암, 비인두암, 신경아세포종, 핍지교종, 경구암, 구강암, 구강인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 췌장 소도 세포 종양, 유두 암종, 부신경절종, 부갑상선 암, 음경암, 인두암, 갈색세포종, 송과체부종양, 뇌하수체 종양, 흉막폐아세포종, 원발성 복막암, 전립선암, 직장암, 망막아세포종, 신세포 암종, 신우 및 요관암, 횡문근육종, 침샘암, 피지선 암종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포 암종, 소세포 폐암, 소장암, 위암, 땀샘암종, 활막종, 고환암, 인후암, 흉선암, 갑상선 암, 요도암, 자궁암, 자궁육종, 질암, 혈관암, 외음부암 및 윌름 종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 고형 종양 또는 암 치료에서 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포는 간암, 췌장암, 폐암, 유방암, 방광암, 뇌암, 뼈암, 갑상선 암, 신장 암 또는 피부암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 고형 종양 또는 암 치료에서 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포는 췌장, 방광 및 폐를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 암 치료에서 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포는 액상암 또는 혈액학적 암의 치료에서 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포는 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 B-세포 악성종양의 치료에서 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포는 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종: 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 골수아구성, 전골수구성, 골수단핵구, 단핵구, 적백혈병, 모발 세포 백혈병(HCL), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 골수단핵구 백혈병(CMML) 및 진성 적혈구 증가증, 호지킨 림프종, 결절성 림프구-우세 호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소림프구성 림프종(SLL), 미만성 거대 B-세포 림프종, 소포성 림프종, 면역아세포 거대 세포림프종, 전구체 B-림프아구성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 변연부 림프종, 균상식육종, 역형성 거대세포 림프종, 세자리 증후군, 전구체 T-림프아구성 림프종, 다발성 골수종, 명백한 다발성 골수종, 무증상 다발성 골수종, 혈장 세포 백혈병, 비분비성 골수종, IgD 골수종, 골경화 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 및 골수외성 형질세포종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 액상암의 치료에서 사용된다.
특정 실시형태에서, 치료가 필요한 환자에게 치료적 유효량의 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 단독으로 또는 1종 이상의 치료제와 조합하여 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 세포는 암이 발생할 위험에 있는 환자의 치료에서 사용된다. 따라서, 특정 실시형태는 치료 또는 예방 또는 개선이 필요한 대상체에게 치료적 유효량의 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포를 투여하는 단계를 포함하는 적어도 하나의 암 증상의 치료 또는 예방 또는 개방을 포함한다.
일 실시형태에서, 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법은 본 명세서에 상정된 게놈 편집된 T 세포를 포함하는 유효량, 예를 들어, 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 투여량 및 빈도는 적절한 투약량이 임상 시험에 의해 결정될 수도 있지만, 환자의 병태 및 환자 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
일 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 조성물 중의 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포의 양은 적어도 0.1 x 105개의 세포, 적어도 0.5 x 105개의 세포, 적어도 1 x 105 개의 세포, 적어도 5 x 105개의 세포, 적어도 1 x 106개의 세포, 적어도 0.5 x 107개의 세포, 적어도 1 x 107개의 세포, 적어도 0.5 x 108개의 세포, 적어도 1 x 108개의 세포, 적어도 0.5 x 109개의 세포, 적어도 1 x 109개의 세포, 적어도 2 x 109 의 세포, 적어도 3 x 109개의 세포, 적어도 4 x 109개의 세포, 적어도 5 x 109개의 세포 또는 적어도 1 x 1010개의 세포이다.
특정 실시형태에서, 약 1 x 107개의 T 세포 내지 약 1 x 109개의 T 세포, 약 2 x 107개의 T 세포 내지 약 0.9 x 109개의 T 세포, 약 3 x 107개의 T 세포 내지 약 0.8 x 109개의 T 세포, 약 4 x 107개의 T 세포 내지 약 0.7 x 109개의 T 세포, 약 5 x 107개의 T 세포 내지 약 0.6 x 109개의 T 세포 또는 약 5 x 107개의 T 세포 내지 약 0.5 x 109개의 T 세포가 대상체에게 투여된다.
일 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 조성물 중의 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포의 양은 적어도 0.1 x 104개의 세포/체중의 ㎏, 적어도 0.5 x 104개의 세포/체중의 ㎏, 적어도 1 x 104개의 세포/체중의 ㎏, 적어도 5 x 104개의 세포/체중의 ㎏, 적어도 1 x 105개의 세포/체중의 ㎏, 적어도 0.5 x 106개의 세포/체중의 ㎏, 적어도 1 x 106개의 세포/체중의 ㎏, 적어도 0.5 x 107개의 세포/체중의 ㎏, 적어도 1 x 107개의 세포/체중의 ㎏, 적어도 0.5 x 108 세포/체중의 ㎏, 적어도 1 x 108개의 세포/체중의 ㎏, 적어도 2 x 108개의 세포/체중의 ㎏, 적어도 3 x 108개의 세포/체중의 ㎏, 적어도 4 x 108개의 세포/체중의 ㎏, 적어도 5 x 108개의 세포/체중의 ㎏, 또는 적어도 1 x 109개의 세포/체중의 ㎏이다.
특정 실시형태에서, 약 1 x 106 T 세포/체중의 ㎏ 내지 약 1 x 108 T 세포/체중의 ㎏, 약 2 x 106 T 세포/체중의 ㎏ 내지 약 0.9 x 108 T 세포/체중의 ㎏, 약 3 x 106 T 세포/체중의 ㎏ 내지 약 0.8 x 108 T 세포/체중의 ㎏, 약 4 x 106 T 세포/체중의 ㎏ 내지 약 0.7 x 108 T 세포/체중의 ㎏, 약 5 x 106 T 세포/체중의 ㎏ 내지 약 0.6 x 108 T 세포/체중의 ㎏, 또는 약 5 x 106 T 세포/체중의 ㎏ 내지 약 0.5 x 108 T 세포/체중의 ㎏이 대상체에게 투여된다.
당업자는 특정 실시형태에서 상정된 조성물의 다회 투여가 목적으로 하는 요법을 달성하는 데 필요할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 조성물은 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 5,년, 10년 이상의 기간에 걸쳐 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 이상 투여될 수 있다.
특정 실시형태에서, 대상체에 활성화된 T 세포를 투여하고, 이어서 후속적으로 혈액을 다시 채혈하고(또는 혈장교환을 수행함), 그로부터 T 세포를 활성화시키며, 그리고 이들 활성화되고 확장된 T 세포를 환자에게 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이 과정은 몇 주마다 다회 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 10cc 내지 400cc의 채혈로부터 활성화될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc, 100cc, 150cc, 200cc, 250cc, 300cc, 350cc 또는 400cc 이상의 채혈로부터 활성화된다. 이론에 구속되지 않고, 이런 다회 채혈/다회 재주입 프로토콜은 T 세포의 특정 집단을 선택하는 작용을 할 수 있다.
특정 실시형태에서 상정된 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 피하주입 또는 이식에 의하는 것을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 조성물은 비경구로 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 어구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"은 장 이외의 투여 방식 및 보통 주사에 의하는 국소 투여를 지칭하며, 혈관내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 낭내, 안와내, 종양내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절강내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 조성물은 대상체에게 종양, 림프절 또는 감염 부위 내로 직접 주사에 의해 투여된다.
일 실시형태에서, 조성물이 필요한 대상체는 대상체에서의 암에 대해 세포 면역 반응을 증가시키는 유효량의 조성물이 투여된다. 면역 반응은 감염된 세포, 조절 T 세포, 및 헬퍼 T 세포 반응을 사멸시킬 수 있는 세포독성 T 세포에 의해 매개되는 세포 면역 반응을 포함할 수 있다. B 세포를 활성화시키고 이에 의해 항체 생성을 야기할 수 있는 헬퍼 T 세포에 의해 야기되는 체액성 면역 반응이 또한 유도될 수 있다. 당업계에 잘 기재되어 있는(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y]) 조성물에 의해 유도되는 면역 반응 유형을 분석하기 위한 다양한 기법이 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 암으로 진단된 대상체를 치료하는 방법은 대상체로부터 면역 효과기 세포를 제거하는 단계, 상기 면역 효과기 세포의 게놈을 편집하는 단계 및 게놈 편집된 면역 효과기 세포 집단을 생성하는 단계, 및 동일한 대상체에게 게놈 편집된 면역 효과기 세포의 집단을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포를 포함한다.
세포 조성물 특정 실시형태에서 상정된 세포 조성물을 투여하는 방법은 생체외 게놈 편집된 면역 효과기 세포의 재도입 또는 대상체 내로 도입 시 성숙 면역 효과기 세포로 분화되는 면역 효과기 세포의 게놈 편집된 전구체의 재도입을 초래하는 데 효과적인 임의의 방법을 포함한다. 일 방법은 생체외 말초 혈액 T 세포를 게놈 편집하는 단계 및 형질도입 세포를 대상체에 복귀시키는 단계를 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 출원 및 발행된 특허는 각각의 개개 간행물, 특허 출원 또는 발행된 특허가 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타내는 것과 같이 본 명세서에 참고로 포함된다.
앞서 언급한 실시형태는 이해의 명확함의 목적을 위해 예시 및 실시예에 의해 일부 상세하게 기재되었지만, 특정 변화 및 변형은 첨부되는 청구범위의 정신 또는 범주로부터 벗어나는 일 없이 그에 대해 이루어질 수 있다는 본 명세서에 상정된 교시에 비추어 당업자에게 용이하게 분명할 것이다. 다음의 실시예는 단지 예시로서 그리고 제한 방법에 의하지 않고 제공된다. 당업자는 본질적으로 유사한 결과를 얻기 위해 변화 또는 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 매개변수를 용이하게 인식할 것이다.
실시예
실시예 1
T 세포 수용체 알파(TCRα) 좌위 내로의 형광 단백질을 암호화하는 이식유전자의 상동성 재조합
프로모터, 형광 단백질을 암호화하는 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호(서열번호 8 및 9)를 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 플라스미드 함유 이식유전자 카세트를 설계하고 구성하였다. XmaI 분해를 이용하여 AAV ITR 요소의 완전성을 확인하였다. 이식유전자 카세트를 TCRα 유전자의 불변 영역의 엑손 1 내에서 두 상동성 영역 사이에 위치시켜 상동성 재조합(AAV 표적화 벡터)에 의한 표적화를 가능하게 하였다. 5' 및 3' 상동성 영역은 길이가 각각 대략 1500bp 및 대략 1000bp이며, 상동성 영역 중 어떤 것도 완전한 메가TAL 표적 부위(서열번호 10)를 함유하지 않았다. 예시적인 발현 카세트는 짧은 신장 인자 1 알파(sEF1α) 또는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 결실된 음성 대조군 영역, 형광 폴리펩타이드을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 d1587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터, 예를 들어, 청색 형광 단백질(BFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 녹색 형광 단백질(GFP) 등을 함유한다. 도 1a. 발현 카세트는 또한 SV40 후기 폴리아데닐화 신호를 함유한다.
재조합 AAV(rAAV)를 HEK 293T 세포를 필요한 복제, 캡시드 및 아데노바이러스 헬퍼 요소를 제공하는 하나 이상의 플라스미드로 일시적으로 공동형질감염시킴으로써 제조하였다. 이오딕산올-기반 구배에서 초원심분리를 이용하여 공동형질감염시킨 HEK 293T 세포 배양물로부터 rAAV를 정제하였다.
CD3 및 CD28에 의해 활성화되고 IL-2로 보충한 완전 배지에서 배양시킨 1차 인간 T 세포에서 메가TAL-유도 상동성 재조합을 평가하였다. 3일 후에, T 세포를 세척하고 나서, TCRα 표적화 메가TAL을 암호화하는 시험관내 전사된 mRNA(서열번호 11)로 전기천공하고 나서, 후속적으로 sEF1알파-BFP 또는 MND-GFP 이식유전자 카세트 중 하나를 암호화하는 정제된 재조합 AAV를 이용하여 형질도입하였다. 대조군은 메가TAL 또는 rAAV 표적화 벡터를 단독으로 함유하는 T 세포를 포함하였다. 다회 시점에 유세포 분석을 사용하여 형광 단백질을 발현시키는 T 세포 빈도를 측정하고 비 통합 rAAV 표적화 벡터로부터 형광 단백질의 일시적 발현을 분화시켰다. CD3 염색의 상실에 의해 TCRα 유전자의 메가TAL 매개 붕괴를 검출하였다. 도 1b.
메가TAL과 rAAV 표적화 벡터 둘 다로 처리한 T 세포의 20 내지 60%에서 장기간 이식유전자 발현이 관찰되었다. 정량적 PCR 및 사우던 블롯 분석을 이용하여 상동성 재조합을 확인하였다. 대조군 샘플에서, rAAV 처리 단독은 게놈 내로의 통합 결여와 일치되게, 처리된 T 세포에서 가변적 수준의 일시적 형광 단백질 발현(MND-GFP 이식유전자를 이용하여 더 높은 일시적 발현을 관찰함) 및 매우 저수준(<1%)의 장기간 형광 단백질 발현을 생성하였다. TCRα 좌위의 메가TAL 붕괴는 50% 내지 90%의 범위에 있다(CD3 표면 발현의 상실). 메가TAL 활성은 메가TAL과 메가TAL + rAAV 표적화 벡터처리 T 세포 간에 유사하였는데, 이는 HR 매개 이식유전자 카세트 삽입이 비상동성 말단결합(non-homologous end-joining: NHEJ) 유래 삽입/결실 사건을 대체한다는 것을 나타낸다. CD3 음성 구획 내의 GFP+ 세포의 농축은 HR이 기능성과 비-기능성 TCRα 대립유전자 둘 다에서 일어난다는 것을 강하게 시사하였다. 결과는 몇몇 독립적 공여자로부터 단리된 T 세포 상에서 수행된 실험 상에서 확인하였다. 도 1D.
실시예 2
TCRα 좌위 내로 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 이식유전자의 상동성 재조합
프로모터, 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV)(서열번호 12) 플라스미드를 설계하고, 작제하고 나서, 확인하였다. 도 2a. CAR 발현 카세트는 CD8α-유래 신호 펩타이드, CD19 항원을 표적화하는 단일-쇄 가변 단편(scFv), CD8α 유래 힌지 영역 및 막관통 도메인, 세포내 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 CAR에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터를 함유하였다. 더 큰 CAR 이식유전자의 효율적인 rAAV 생성을 가능하게 하기 위해, 5' 및 3' 상동성 영역은 각각 대략 650bp로 감소되었다.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시켰다. TCRα-표적화 메가TAL을 암호화하는 시험관내 전사 mRNA를 이용하여 전기천공한 활성화된 1차 인간 T 세포를 이용하여 TCRα 좌위 내로의 CAR 이식유전자의 메가TAL-유도 HR을 평가하였다. 전기천공된 T 세포를 항-CD19 CAR을 암호화하는 rAAV를 이용하여 형질도입하고 IL2의 존재 하에 37℃에서 배양시켰다. 전기천공법 7일 후에(총 10일 배양) CAR 염색을 수행하였다. 대조군은 T 세포 함유 메가TAL 또는 AAV 치료 단독을 포함하였고, 그리고 T 세포는 항-CD19 CAR 발현 카세트를 포함하는 렌티바이러스(LV) 벡터를 이용하여 형질도입하였다. PE-접합 CD19-Fc를 이용하여 염색함으로써 유세포분석에 의해 항-CD19-CAR 발현을 분석하였다.
메가TAL mRNA 및 rAAV-CAR로 처리한 T 세포는 총 세포의 30 내지 60%에서 항-CD19 CAR 발현을 나타내었다. 비처리, LV-처리(LV-T), 메가TAL-처리와 메가TAL/rAAV CAR-처리 T 세포 간에 T 세포 확장 및 유사한 T 세포 표현형의 유사한 비율을 관찰하였다. 도 2b.
CD19 종양 항원(K562-CD19+)을 안정하게 발현시키는 K562 적백혈병 세포주를 이용하여 기능성 분석을 수행하였다. 1:1 비로 K562-CD19+ 세포와 혼합된 TCRα 좌위에 통합된 항-CD19 CAR을 포함하는 T 세포(HR-CAR+ T 세포)에서 T 세포 세포독성 및 사이토카인 생성을 분석하였다(도 2c). 높은 효과기:표적(E:T) 비로 유사한 세포독성 비율이 관찰되었는데, HR-CAR+ T 세포는 더 낮은 E:T 비의 LV-처리 세포에 비해 약간 감소된 세포독성을 나타낸다. 대조적으로, IFNγ 생성은 LV-처리 세포에 비해 HR-CAR+ T 세포 배양물에서 더 높았다.
실시예 3
TCRα 좌위 내로의 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 이식유전자의 상동성 재조합
프로모터, 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV)(서열번호 12) 플라스미드를 설계하고, 작제하고 나서, 확인하였다. CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 또한 설계하였고, 작제하고 나서, 확인하였다. 도 3a.
CAR 발현 카세트는 CD8α-유래 신호 펩타이드, CD19 항원을 표적화하는 단일-쇄 가변 단편(scFv), CD8α 유래 힌지 영역 및 막관통 도메인, 세포내 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 CAR에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터를 함유하였다. 더 큰 CAR 이식유전자의 효율적인 rAAV 생성을 가능하게 하기 위해, 5' 및 3' 상동성 영역은 각각 대략 650bp로 감소되었다.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시켰다. TCRα-표적화 메가TAL을 암호화하는 시험관내 전사 mRNA를 이용하여 전기천공한 활성화된 1차 인간 T 세포를 이용하여 TCRα 좌위 내로의 CAR 이식유전자의 메가TAL-유도 HR을 평가하였다. 전기천공된 T 세포를 항-CD19 CAR을 암호화하는 rAAV를 이용하여 형질도입하고 IL2의 존재 하에 37℃에서 배양시켰다. 전기천공법 7일 후에(총 10일 배양) CAR 염색을 수행하였다. 대조군은 T 세포 함유 메가TAL 또는 AAV 치료 단독을 포함하였고, 그리고 T 세포는 항-CD19 CAR 발현 카세트를 포함하는 렌티바이러스(LV) 벡터를 이용하여 형질도입하였다. PE-접합 CD19-Fc를 이용하여 염색함으로써 유세포분석에 의해 항-CD19-CAR 발현을 분석하였다.
도 3b는 T 세포에서의 CD19 발현을 나타내며, 여기서 CAR은 TCRα 불변 영역의 엑손 1 내로 HR에 의해 또는 LVV에 의해 도입되었다. CD62L 및 CD45RA의 발현을 또한 나타낸다.
CD19 종양 항원(K562-CD19+)을 안정하게 발현시키는 K562 적백혈병 세포주를 이용하여 기능성 분석을 수행하였다. 1:1 비로 K562-CD19+ 세포와 혼합된 TCRα 좌위에 통합된 항-CD19 CAR을 포함하는 T 세포(HR-CAR+ T 세포)에서 T 세포 세포독성 및 사이토카인 생성을 분석하였다. HR-CAR+와 LV-CAR+ T 세포 샘플 둘 다에 의한 유사한 세포독성 비율을 관찰하였다(도 3c). 사이토카인 생성은 또한 K56-CD19+ 표적 세포와 함께 공동배양시킨 후에 HR-CAR+와 LV-CAR+ T 세포 둘 다와 유사하였다(도 3d). 표적 세포로 공동 배양 후에 PD1, Tim3 및 CTLA4와 같은 고갈 마커의 발현을 위해 T 세포를 표현형화하였다. HR-CAR+ 및 LV-CAR+ T 세포는 K562-CD19+ 표적 세포와 함께 공동배양 후 유사한 발현 고갈 마커 프로파일을 나타내었다. 도 3e.
실시예 4
TCRα 좌위의 두 대립유전자 내로의 독특한 프로모터 이식유전자 카세트의 다중복합 상동성 재조합
프로모터, 형광 리포터 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호(서열번호 8 및 9)를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 분해시키고, 작제하고, 확인하였다. 도 4a. HEK293T 세포를 일시적으로 공동감염시킴으로써 두 상이한 rAAV 벡터 배취를 제조하였다. 첫 번째 rAAV 벡터는 BFP 및 SV40 후기 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 sEF1α 프로모터를 함유하였고, 두 번째 벡터는 GFP 및 SV40 후기 폴리아데닐화 신호에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터를 함유하였다. 벡터는 둘 다 동일한 길이의 TCRα 상동성 아암을 가지고, 실시예 1에 기재한 바와 같은 아이오딕산올 구배를 이용하여 정제하였다. rAAV-sEF1α-BFP 벡터는 상동성 재조합의 부재 하에 최소 BFP 발현을 생성하였다.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시켰다. 1차 인간 T 세포를 활성화시키고 실시예 1에 기재한 바와 같이 TCRα-표적화 메가TAL을 암호화하는 mRNA를 이용하여 전기천공시켰다. rAAV-MND-GFP 표적화 벡터 또는 rAAV-sEF1α-BFP 표적화 벡터 중 하나를 이용하여 전기천공된 T 세포를 형질도입하였다. 대조군은 메가TAL 또는 rAAV 표적화 벡터를 단독으로 함유하는 T 세포를 포함하였다.
장기간 이식유전자 발현에 대해 일시적 이식유전자 발현을 구별하기 위해 형질도입후 다양한 시간에 유세포분석에 의해 상동성 재조합을 분석하였다. 메가TAL과 rAAV 표적화 벡터 둘 다로 처리한 샘플에 비해 메가TAL 또는 rAAV 표적화 벡터를 함유하는 T 세포는 단독으로 장기간 발현의 매우 낮은 수준(<1.5%)을 나타내었다. 메가TAL 그리고 rAAV-sEF1α-BFP 또는 rAAV-MND-GFP 표적화 벡터(HR+ 세포) 중 하나로 처리한 샘플에서 분명하게 정해진 집단(20 내지 30% BFP+ 또는 GFP+)을 관찰하였다. HR+ 세포는 TCRα 대립유전자 중 하나 또는 둘 다에서 HR을 겪고 있는 세포를 포함한다. 도 4b.
메가TAL 및 rAAV-sEF1α-BFP 및 rAAV-MND-GFP 표적화 벡터로 처리한 T 세포는 몇몇 별개의 세포 집단을 생성하였다: GFP+ 양성 세포; BFP+ 세포; GFP+/BFP+ 세포(DP); 및 리포터(DN) 중 어떤 것도 발현시키지 않는 세포. GFP+ 및 BFP+ 세포 집단은 TCRα 대립유전자 중 하나 또는 둘 다에서 상동성 재조합을 겪은 세포를 포함하는 반면, DP 세포는 대립유전자 둘 다에서 HR을 겪었다. 이 관찰과 일치되게, GFP+와 BFP+ 세포 둘 다에서 분명한 (10 내지 15%) CD3+ 집단이 있었다. CD3+ 집단은 하나의 TCRα 대립유전자에서 HR을 겪은 해당 세포를 나타낸다. 특히, DP 세포는 TCRα 대립유전자 둘 다에서 HR과 일치되게 검출 가능한 검출 가능한 CD3+ 세포(<2%)를 거의 나타내지 않았다. 도 4b.
실시예 5
TCRα 좌위 내로 형광 단백질 또는 CAR을 암호화하는 무 프로모터 이식유전자의 상동성 재조합
바이러스 자기-절단 펩타이드, 예를 들어, T2A 펩타이드, 형광 리포터 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호(서열번호 13)를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 플라스미드를 설계하고, 작제하고, 확인하였다. 도 5a. T2A 펩타이드는 내인성 TCRα mRNA에 형광 리포터 이식유전자의 발현을 연결하여, 내인성 TCRα 프로모터의 제어 하에 형광 신호 또는 CAR 발현을 위치시킨다. 상동성 재조합의 부재 하에 이식유전자 발현은 관찰되지 않는다.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시켰다. 시험관내 전사된 메가TAL mRNA를 이용하여 활성화된 1차 인간 T 세포를 전기천공시켰다. T2A-함유 형광 리포터를 함유하는 rAAV를 이용하여 전기천공된 T 세포를 형질도입하였다. 대조군은 메가TAL 또는 rAAV 표적화 벡터를 단독으로 함유하는 T 세포를 포함하였다. 유세포분석에 의한 형질감염 후 다양한 시간에 형광 리포터 발현을 분석하였다. T 세포 함유 메가TAL 또는 rAAV 표적화 벡터 단독에 의해 리포터 발현은 관찰되지 않았다. AAV 형질도입에 의해 또는 이것 없이 유사한 비율의 메가 TAL 활성이 관찰되었다. 그러나, 메가TAL과 상동성-함유 AAV 표적화 벡터를 둘 다 받은 T 세포만이 형광 세포 집단을 생성하였다. 내인성 TCRα 프로모터에 의해 유도된 형광 리포터 발현은 외인성 프로모터-유래 수용체 발현에 비해 실질적으로 더 낮았다(형광 강도의 대략 5배 감소, 실시예 1 참조). 도 5b.
바이러스 자기-절단 펩타이드, 예를 들어, T2A 펩타이드, CD19-CAR 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호(서열번호 20)를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 플라스미드를 설계하고, 작제하고, 확인하였다. 도 5c. 내인성 TCRα mRNA에 CAR을 연결하는 T2A 펩타이드는 CAR 발현이 내인성 TCRα 프로모터에 의해 조절된다는 것을 보장한다. 상동성 재조합의 부재 하에 이식유전자 발현은 관찰되지 않았다.
2A-HDR-CAR 작제물로 처리된 세포에 대한 CD19-CAR 렌티바이러스 벡터로 처리된 세포의 비교는 HDR-CAR-넉인 샘플에서 더 낮은 CAR 발현을 입증하였다(도 5d). 그러나, LV-CAR과 HDR-CAR-넉인 샘플은 둘 다 K562-CD19+ 종양 세포에 대해 유사한 세포독성 비율을 가졌다(도 5e).
실시예 6
형질감염 및 형질도입 프로토콜을 조작하는 것에 의한 비-상동성 말단 결합(NHEJ) 이상의 편향 상동성 재조합(Homologous Recombination: HR) 결과
HR에 대한 NHEJ의 상대적 비율은 재조합 반응의 온도를 달리함으로써 조절할 수 있다. 저온 조건(<37°)에 대한 뉴클레아제-처리 세포의 일시적 노출은 NHEJ 활성을 증가시키는 것으로 나타났지만, T 세포에서 상동성 재조합 온도의 영향은 아직 연구되지 않았고, 불량하게 이해된다. MND-CAR 리포터 이식유전자를 함유하는 rAAV를 설계하고, 작제하고, 확인하였다(서열번호 12).
활성화된 T 세포를 시험관내 전사된 메가TAL mRNA를 이용하여 전기천공 하고 나서, 실시예 1에 기재한 바와 같이 rAAV 표적화 벡터를 이용하여 형질도입하였다. 형질도입된 T 세포를 37℃ 또는 30℃ 중 하나에서 대략 22시간 동안 배양시키고 나서, 형질감염후 다양한 시간에 PE-접합 CD19-Fc를 이용하여 염색함으로써 상동성 재조합/CAR 발현을 분석하였다. TCRα 좌위에서 메가TAL-매개 NHEJ 활성의 지표로서 CD3 염색의 상실을 평가하였다. 도 6.
30℃ 인큐베이션 단계에 대한 메가TAL-처리 T 세포의 일시적 노출은 표준 37℃ 조건에서의 메가TAL-처리 세포 배양에 비해 크게 증가된 NHEJ 활성을 초래하였다. 추가로, 37℃ 대 30℃ 조건에서 배양된 T 세포에서의 CAR 발현에 의해 결정하여 HR 활성의 약한 감소가 있었다. 대조적으로, HR:NHEJ 사건의 상대적 비는 37°에서 배양시킨 세포에 대해 훨씬 더 컸고; 일시적 30℃ 인큐베이션 후에 CD3- 세포의 대략 25%에 비해 CD3- 세포의 거의 50%는 37° 인큐베이션 후에 CAR+였다. 편재는 NHEJ 사건 빈도를 상대적으로 증가시키는 일시적 저체온증과 일치되는 반면, 전반적인 HR 효율에 대해 상대적으로 약한 영향을 가진다.
실시예 7
TCRα 좌위 내로 폴리단백질을 암호화하는 이식유전자의 상동성 재조합
프로모터, 자기-절단성 바이러스 2A 펩타이드에 의해 분리된 2개 단백질(폴리단백질)을 암호화하는 이식유전자, 및 후기 SV40 폴리아데닐화 신호(서열번호 14)를 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 설계하고, 작제하고 확인하였다. 도 7a. 폴리단백질 이식유전자는 약물-조절된 CD19-표적화 키메라 항원 수용체(Daric)(서열번호 15)의 두 의존적 성분을 암호화하였다. 세포-절단성 바이러스 2A 펩타이드는 단일 mRNA 전사체로부터의 두 상이한 단백질의 발현을 가능하게 한다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 이식유전자는 최소 TCRα 상동성 아암에 의해 측접되었다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 rAAV를 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성하였다.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시켰다. 활성화된 T 세포를 시험관내 전사된 메가TAL mRNA를 이용하여 전기천공 하고 나서, 폴리단백질 이식유전자를 암호화하는 rAAV를 이용하여 형질도입하였다. 대조군은 t 세포 함유 메가TAL 또는 AAV 표적화 벡터 단독을 포함하였고, 그리고 동일한 폴리단백질 발현 카세트를 암호화하는 LV를 이용하여 T 세포를 형질도입하였다. PE-접합 CD19-Fc를 이용하여 CD19-Daric발현을 유세포 분석에 의해 분석하였다. 도 7b. 메가TAL과 AAV 표적화 벡터를 둘 다 받은 샘플에서 CD19-Fc 반응성만이 관찰되었다.
실시예 8
HR 효율에 대한 상동성 아암 길이의 효과
상이한 길이의 상동성 아암, 프로모터, GFP를 암호화하는 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 일련의 아데노-관련 바이러스(AAV)를 설계하고, 작제하고, 확인하였다. 도 8a. FL 작제물은 대략 1500bp의 5' 상동성 아암 및 대략 1000bp의 3' 상동성 아암을 가지며; M 작제물은 대략 1000bp의 5' 상동성 아암 및 대략 600bp의 3' 상동성 아암을 가지고; 그리고 S 작제물은 대략 600bp의 5' 상동성 아암 및 대략 600bp의 3´ 상동성 아암을 가진다. 실시예 1에서 기재한 바와 같이 rAAV는 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성되었다.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시켰다. 활성화된 1차 인간 T 세포를 시험관내 전사된 메가TAL mRNA를 이용하여 전기천공시키고 나서, 상동성 아암 길이를 달리하여 GFP를 암호화하는 rAAV 표적화 벡터를 이용하여 형질도입하였다. 대조군은 비형질감염 샘플을 포함하고, 샘플을 메가TAL 단독으로 처리한다. GFP 발현을 유세포 분석에 의해 분석한다.
작제물은 유사한 HR 효율을 나타내었다. 도 8b.
실시예 9
TCRα 좌위 내로 항-CD19 CAR 이식유전자의 상동성 재조합은 T 세포 고갈 마커의 감소된 발현과 관련된다
프로모터, 항-CD19 CAR을 암호화하는 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 설계하고, 작제하고 나서, 확인하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 rAAV를 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성한다.
렌티바이러스 벡터는 CD8α-유래 신호 펩타이드를 포함하는 CAR에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터, 항-CD19 scFv, CD8α 유래 힌지 영역 및 막관통 도메인, 세포내 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 CAR 발현 카세트를 함유하였다. 확립된 프로토콜을 이용하여 렌티바이러스를 준비하였다. 예를 들어, 문헌[Kutner et al., BMC Biotechnol. 2009;9:10. doi: 10.1186/1472-6750-9-10; Kutner et al. Nat. Protoc. 2009;4(4):495-505. doi: 10.1038/nprot.2009.22.] 참조.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시켰다. 활성화된 1차 인간 T 세포를 시험관내 전사된 메가TAL mRNA를 이용하여 전기천공하였고 항-CD19 CAR 이식유전자(HR-CAR T 세포)를 암호화하는 rAAV 표적화 벡터를 이용하여 형질도입하거나; 또는 항-CD19 CAR을 암호화하는 렌티바이러스를 이용하여 활성화된 1차 인간 T 세포를 형질도입하였다(LV-CAR T 세포).
LV-T 및 HR-T 세포를 CD19 발현 Nalm-6 세포와 함께 1:1 효과기(E) 세포 대 표적(T) 세포비로 공동배양시켰다. T 세포 고갈 마커 발현(PD-L1, PD-1 및 Tim-3)을 공동 배양의 24시간 및 72시간에 측정하였다. 24시간에, HR-CAR T 세포는 LV-CAR T 세포에 비해 PD-1 및 PD-L1의 감소된 상향조절을 나타내었다. 도 9a. 72시간에, HR-CAR T 세포는 LV-CAR T 세포에 비해 PD-1 및 Tim-3의 감소된 상향조절을 나타내었다. 도 9b.
실시예 10
TCRα 좌위 내로 CAR 및 WPRE을 암호화하는 이식유전자의 상동성 재조합
프로모터, 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호, 및 WPRE를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV)(서열번호 9) 플라스미드를 설계하고, 작제하고 나서, 확인하였다. 도 10a. 이식유전자는 대략 650bp의 TCRα 상동성 아암에 의해 측접되었다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 rAAV를 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성하였다.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시켰다. 활성화된 1차 인간 T 세포를 시험관내 전사된 메가TAL mRNA를 이용하여 전기천공시키고 나서, 항-CD19 CAR을 암호화하는 rAAV 표적화 벡터를 이용하여 형질도입하였다. 대조군은 메가TAL 또는 rAAV 표적화 벡터 단독을 포함한다. PE-접합 CD19-Fc를 이용하여 염색함으로써 유세포분석에 의해 항-CD19-CAR 발현을 분석하였다. AAV 골격 내로 WPRE 요소의 혼입은 평균 형광 강도(MFI)에 의해 결정하여 CD19 CAR 이식유전자의 발현을 크게 향상시켰다. 도 10b
실시예 11
인트론-함유 CAR을 암호화하는 이식유전자의 그리고 TCRα 좌위 내로의 상동성 재조합
프로모터, 인트론-함유 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 이식유전자 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV)(서열번호 17 및 18) 플라스미드를 설계하고, 작제하고 나서, 확인하였다. 도 11a. 일부 실시형태에서, 인트론을 이식유전자 출발 코돈의 바로 5'에 위치시켰다. 다른 실시형태에서, CAR 이식유전자를 분할하기 위해 그리고 TCRα 좌위에서 내인성 mRNA 스플라이싱을 모방하기 위해 이중 인트론을 사용하였다. 이식유전자는 대략 650bp TCRα 상동성 아암에 의해 측접되었다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 rAAV는 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성되었다.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시켰다. 활성화된 1차 인간 T 세포를 시험관내 전사된 메가TAL mRNA를 이용하여 전기천공시키고 나서, 항-CD19 CAR을 암호화하는 rAAV 표적화 벡터를 이용하여 형질도입하였다. 대조군은 메가TAL 또는 rAAV 표적화 벡터 단독을 포함한다. PE-접합 CD19-Fc를 이용하여 염색함으로써 유세포분석에 의해 항-CD19-CAR 발현을 분석하였다. rAAV 골격 내로 5' 인트론의 혼입은 TCRα 좌위에서 CD19 CAR 이식유전자 발현에 부정적으로 영향을 미쳤다. CD19 CAR 이식유전자 내로 내부 인트론의 혼입은 5' 인트론을 갖거나 또는 인트론을 전체적으로 결여하는 작제물에 비해 발현이 추가로 감소되었다. 도 11b.
실시예 12
TCRα 좌위 내로 이중 프로모터 이식유전자의 상동성 재조합
이중 프로모터, 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 2개의 이식유전자(항-CD19 CAR 및 TGFβR1I-우성 음성 (DN)) 및 2개의 폴리아데닐화 부위(서열번호 19 및 21)를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 플라스미드를 설계하고, 작제하고, 확인하였다. 이식유전자는 대략 650bp의 TCRα 상동성 아암에 의해 측접되었다. 자기-절단성 T2A 링커에 의해 분리되는 CAR과 TGFβRII-DN 이식유전자 둘 다의 발현을 유도하기 위해 변이체는 단일 MND 프로모터를 사용하였다. 도 12a.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시켰다. 활성화된 1차 인간 T 세포를 시험관내 전사된 메가TAL mRNA를 이용하여 전기천공시키고 나서, 항-CD19 CAR을 암호화하는 rAAV 표적화 벡터를 이용하여 형질도입하였다. 대조군은 메가TAL 또는 rAAV 표적화 벡터 단독을 포함한다. PE-접합 CD19-Fc를 이용하여 염색함으로써 유세포분석에 의해 항-CD19-CAR 발현을 분석하였고, TGFβ로 표지된 염색에 의해 TGFβR1-DN 발현을 분석하였다. 이중 프로모터의 혼입은 CAR과 TGFβRII-DN 둘 다의 감소되었지만, 검출 가능한 발현을 초래하였다. 발현은 CD19-CAR을 TGFβRII-DN 이식유전자와 조합하는 T2A 요소를 이용하는 이중 이식 유전자 작제물 또는 단일 프로모터 CAR에 비해 더 낮았다. 도 12b.
실시예 13
TCRα 좌위 내로 T 세포 수용체(TCR)의 상동성 재조합
신규한 표적에 대해 T 세포 특이성의 전향(Redirection)은 게놈 편집 기법의 중요한 이점이다. 프로모터, 윌름 종양 항원 1에 특이적인 T 세포 수용체(WT1-TCR)의 알파 및 베타쇄, 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 플라스미드를 설계하고, 작제하고, 확인하였다, 예를 들어, 서열번호 22. 도 13a. TCR 알파 및 베타쇄의 암호 서열을 자기-절단성 바이러스 2A 펩타이드 서열에 의해 분리시켰다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 rAAV를 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성한다.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시켰다. 활성화된 1차 인간 T 세포를 시험관내 전사된 메가TAL mRNA를 이용하여 전기천공시키고 나서, WT-1 TCR 이식유전자를 암호화하는 rAAV 표적화 벡터를 이용하여 형질도입하였다.
PE-접합 WT-1 사량체를 이용하여 염색함으로써 성공적인 상동성 재조합을 결정하였고, 유세포분석에 의해 분석하였다. 메가TAL 및 AAV WT-1 TCR 이식유전자로 처리한 T 세포(HR+ T 세포)의 기능적 적격을 HR+ T 세포를 인간 백혈구 항원(HLA)-매칭 WT-1+ 표적 세포와 함께 배양시킴으로써 그리고 사이토카인 생성 및 표적 세포 용해를 분석함으로써 결정하였다. WT1 사량체를 이용하여 염색함으로써 WT-1 TCR 이식유전자의 발현을 결정하였다. 모든 WT1-사량체+ 세포는 또한 CD3 발현에 대해 양성이었는데, 이는 WT-1 TCR 이식유전자의 성공적인 HDR에 대한 TCR 발현의 재저장을 입증한다. 도 13b.
실시예 14
TCRα 좌위에서 별개의 대립유전자 내로 이종성으로 조절된 T 세포 수용체(TCR) 성분의 상동성 재조합
2개의 별개의 α/β 쇄의 공동발현에 의해 내인성 T 세포 수용체를 형성한다. 상동성 재조합은 개개 TCRα 대립유전자 내로 α 또는 β 쇄를 전달함으로써 내인성 전사 기작의 정확한 모델링을 가능하게 한다. 프로모터, 윌름 종양 항원 1에 특이적인 T 세포 수용체(WT1-TCR)의 알파 또는 베타쇄, 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 개개 아데노-관련 바이러스(AAV) 플라스미드를 설계하고, 작제하고, 확인하였다. 도 14. 실시예 1에 기재된 바와 같이 rAAV를 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성한다.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시킨다. 시험관내 전사된 메가TAL mRNA를 이용하여 활성화된 1차 인간 T 세포를 전기천공하고 나서, WT-1 TCR 이식유전자의 α 또는 β 쇄 중 하나를 암호화하는 2개의 독특한 rAAV 표적화 벡터를 이용하여 형질도입하였다.
PE-접합 WT-1 사량체를 이용하여 염색함으로써 성공적인 상동성 재조합을 결정하였고, 유세포분석에 의해 분석한다. 메가TAL 및 AAV WT-1 TCR 이식유전자(HR+ T 세포)로 처리한 T 세포의 기능성 적격을 HLA-매칭 WT-1+ 표적 세포와 함께 HR+ T 세포를 배양시키고 사이토카인 생성 및 표적 세포 생성을 분석함으로써 결정한다.
실시예 15
TCRα 좌위에서 별개의 대립유전자 내로 내인성으로 조절된 T 세포 수용체(TCR) 성분의 상동성 재조합
상동성 재조합은 다중-성분 이식유전자의 발현을 위한 세포 전사 기작의 정확한 모델링을 허용한다. 자기-절단성 바이러스 2A 펩타이드 서열, 윌름 종양 항원 1에 특이적인 T 세포 수용체(WT1-TCR)의 알파 또는 베타쇄, 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 개개 아데노-관련 바이러스(AAV) 플라스미드를 설계하고, 작제하고, 확인하였다. 도 15. 실시예 1에 기재된 바와 같이 rAAV를 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성한다.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시킨다. 시험관내 전사된 메가TAL mRNA를 이용하여 활성화된 1차 인간 T 세포를 전기천공하고 나서, WT-1 TCR 이식유전자의 α 또는 β 쇄 중 하나를 암호화하는 2개의 독특한 rAAV 표적화 벡터를 이용하여 형질도입하였다. 성공적인 상동성 재조합 후에, α 또는 β 쇄의 발현을 내인성 TCRα 프로모터에 의해 조절한다.
PE-접합 WT-1 사량체를 이용하여 염색함으로써 성공적인 상동성 재조합을 결정하였고, 유세포분석에 의해 분석한다. 메가TAL 및 AAV WT-1 TCR 이식유전자(HR+ T 세포)로 처리한 T 세포의 기능성 적격을 HLA-매칭 WT-1+ 표적 세포와 함께 HR+ T 세포를 배양시키고 사이토카인 생성 및 표적 세포 생성을 분석함으로써 결정한다.
실시예 16
TCRα 좌위 내로 이종성으로 조절된 PD1 플립 수용체의 상동성 재조합
PD1 플립 수용체의 상동성 재조합은 저해 유입을 양성 공동자극 결과로 전환시킨다. 프로모터, PD1 엑소도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 세포내 신호전달 도메인 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 개개 아데노-관련 바이러스(AAV) 플라스미드를 설계하고, 작제하고, 확인하였다. 도 16. 실시예 1에 기재된 바와 같이 rAAV를 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성한다.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시킨다. 활성화된 1차 인간 T 세포를 시험관내 전사된 메가TAL mRNA를 이용하여 전기천공시키고 나서, PD1-CD28 플립 수용체를 암호화하는 rAAV 표적화 벡터를 이용하여 형질도입하였다.
처리 세포의 분자 분석에 의해 성공적인 상동성 재조합을 결정하였다. 메가TAL 및 AAV PD1-플립 수용체(HR+ T 세포)로 처리한 T 세포의 기능성 적격은 HR+ T 세포를 PD-L1 발현 표적 세포와 함께 배양함으로써 그리고 αCD3 또는 αCD3/αCD28 자극에 의한 처리 후 사이토카인 생성을 분석함으로써 결정한다.
실시예 17
TCRα 좌위 내로 내인성으로 조절된 PD1 플립 수용체의 상동성 재조합
PD1 플립 수용체의 상동성 재조합은 저해 유입을 양성 공동자극 결과로 전환시킨다. 자기-절단성 바이러스 2A 펩타이드 서열, PD1 엑소도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 세포내 신호전달 도메인 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 개개 아데노-관련 바이러스(AAV) 플라스미드를 설계하고, 작제하고, 확인하였다. 도 17. 실시예 1에 기재된 바와 같이 rAAV를 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성한다.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시킨다. 활성화된 1차 인간 T 세포를 시험관내 전사된 메가TAL mRNA를 이용하여 전기천공시키고 나서, PD1-CD28 플립 수용체를 암호화하는 rAAV 표적화 벡터를 이용하여 형질도입하였다. 성공적인 상동성 재조합 후에, PD1-CD28 플립 수용체의 발현을 내인성 TCRα 프로모터에 의해 조절한다.
처리 세포의 분자 분석에 의해 성공적인 상동성 재조합을 결정하였다. 메가TAL 및 AAV PD1-플립 수용체(HR+ T 세포)로 처리한 T 세포의 기능성 적격은 HR+ T 세포를 PD-L1 발현 표적 세포와 함께 배양함으로써 그리고 αCD3 또는 αCD3/αCD28 자극에 의한 처리 후 사이토카인 생성을 분석함으로써 결정한다.
실시예 18
TCRα 좌위의 개개 대립유전자 내로 이종성으로 조절된 2시트론성의 이식유전자 상동성 재조합
상동성 재조합은 표적 좌위의 개개 대립유전자 내로 다중 이식유전자의 전달을 허용한다. 프로모터, 윌름 종양 항원 1에 특이적인 T 세포 수용체(WT1-TCR)의 알파쇄, 자기-절단성 바이러스 2A 펩타이드 서열 PD1-CD28 플립 수용체 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 개개 아데노-관련 바이러스(AAV) 플라스미드를 설계하고, 작제하고, 확인하였다. 추가로, 프로모터, 윌름 종양 항원 1에 특이적인 T 세포 수용체(WT1-TCR)의 베타쇄, 자기-절단성 바이러스 2A 펩타이드 서열, 우성 음성 TGFβRII 엑소도메인 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 플라스미드를 설계하고, 작제하고, 확인하였다. 도 18. 실시예 1에 기재된 바와 같이 rAAV를 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성한다.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시킨다. 시험관내 전사된 메가TAL mRNA를 이용하여 활성화된 1차 인간 T 세포를 전기천공하고 나서, 2차 PD1-CD28 플립 또는 TGFβRII 우성 음성 수용체와 조합한 WT-1 TCR 이식유전자의 α 또는 β 쇄 중 하나를 암호화하는 2개의 독특한 rAAV 표적화 벡터를 이용하여 형질도입하였다.
PE-접합 WT-1 사량체를 이용하여 염색함으로써 성공적인 상동성 재조합을 결정하였고, 유세포분석에 의해 분석한다. 항-TGFβRII 항체를 이용하는 유세포분석에 의해 TGFβRII 우성 음성 수용체의 성공적인 발현을 기록하였다. 분자 분석에 의해 PD1-CD28 플립 수용체의 상동성 재조합을 결정하였다. 메가TAL 및 AAV WT-1 TCR 이식유전자(HR+ T 세포)로 처리한 T 세포의 기능성 적격을 HLA-매칭 WT-1+ 표적 세포와 함께 HR+ T 세포를 배양시키고 사이토카인 생성 및 표적 세포 생성을 분석함으로써 결정한다. 정해진 양의 TGFβ를 첨가함으로써 TGFβRII 우성 음성 성분의 기능성 적격을 결정하였고, HLA-매칭된 WT-1+ 표적 세포의 존재 하에 T 세포 증식 및 사이토카인 생성을 분석하였다. HLA-매칭된, PD-L1+ WT1+ 표적 세포의 존재 하에 T 세포를 배양시킴으로써 그리고 사이토카인 생성 및 표적 세포 용해를 분석함으로써 T PD1-CD28 플립 수용체의 기능성 적격을 결정하였다.
실시예 19
TCRα 좌위의 개개 대립유전자 내로 내인성으로 조절된 2시트론성의 이식유전자 상동성 재조합
상동성 재조합은 표적 좌위의 개개 대립유전자 내로 다중 이식유전자의 전달을 허용한다. 자기-절단성 바이러스 2A 펩타이드 서열, 윌름 종양 항원 1에 특이적인 T 세포 수용체(WT1-TCR)의 알파쇄, 제2의 2A 펩타이드 서열 PD1-CD28 플립 수용체 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 개개 아데노-관련 바이러스(AAV) 플라스미드를 설계하고, 작제하고, 확인하였다. 추가로, 자기-절단성 바이러스 2A 펩타이드 서열, 윌름 종양 항원 1에 특이적인 T 세포 수용체(WT1-TCR)의 베타쇄, 제2의 2A 펩타이드 서열, 우성 음성 TGFβRII 엑소도메인 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 플라스미드를 설계하고, 작제하고, 확인하였다. 도 19. 실시예 1에 기재된 바와 같이 rAAV를 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성한다.
실시예 1에 기재한 바와 같이 CD3 및 CD28을 이용하여 1차 인간 T 세포를 활성화시킨다. 시험관내 전사된 메가TAL mRNA를 이용하여 활성화된 1차 인간 T 세포를 전기천공하고 나서, 2차 PD1-CD28 플립 또는 TGFβRII 우성 음성 수용체와 조합한 WT-1 TCR 이식유전자의 α 또는 β 쇄 중 하나를 암호화하는 2개의 독특한 rAAV 표적화 벡터를 이용하여 형질도입하였다.
PE-접합 WT-1 사량체를 이용하여 염색함으로써 성공적인 상동성 재조합을 결정하였고, 유세포분석에 의해 분석한다. 항-TGFβRII 항체를 이용하는 유세포분석에 의해 TGFβRII 우성 음성 수용체의 성공적인 발현을 기록하였다. 분자 분석에 의해 PD1-CD28 플립 수용체의 상동성 재조합을 결정하였다. 메가TAL 및 AAV WT-1 TCR 이식유전자(HR+ T 세포)로 처리한 T 세포의 기능성 적격을 HLA-매칭 WT-1+ 표적 세포와 함께 HR+ T 세포를 배양시키고 사이토카인 생성 및 표적 세포 생성을 분석함으로써 결정한다. 정해진 양의 TGFβ를 첨가함으로써 TGFβRII 우성 음성 성분의 기능성 적격을 결정하였고, HLA-매칭된 WT-1+ 표적 세포의 존재 하에 T 세포 증식 및 사이토카인 생성을 분석하였다. HLA-매칭된, PD-L1+ WT1+ 표적 세포의 존재 하에 T 세포를 배양시킴으로써 그리고 사이토카인 생성 및 표적 세포 용해를 분석함으로써 T PD1-CD28 플립 수용체의 기능성 적격을 결정하였다.
일반적으로, 다음의 청구범위에서, 사용하는 용어는 청구범위를 명세서 및 청구범위에 개시된 구체적 실시형태로 제한하는 것으로 해석하여서는 안되지만, 이러한 청구범위에 부여하는 동등물의 완전한 범주에 따라 모든 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한하지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> BLUEBIRD BIO, INC. <120> GENOME EDITED IMMUNE EFFECTOR CELLS <130> IPA181058-US <140> PCT/US2017/021951 <141> 2017-03-10 <150> US 62/307,245 <151> 2016-03-11 <150> US 63/322,604 <151> 2016-04-14 <160> 69 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 909 <212> DNA <213> Ophiostoma novo-ulmi <400> 1 atggcataca tgtcgcgcag agagtccatc aacccatgga ttctgactgg tttcgctgat 60 gccgaaggat ccttcttgct gagaatccga aacaataaca agagctccgt gggttactct 120 accgagttgg gctttcaaat cactctgcac aacaaggaca aatcgattct ggagaatatc 180 cagtcgactt ggaaggtcgg cgtgattgct aactcaggcg acaatgccgt cagtctgaaa 240 gttacgcgtt tcgaagattt gaaagtgatt atcgaccact tcgagaaata tccgctgatt 300 acccagaaat tgggcgatta caagttgttt aaacaggcat tcagcgtcat ggagaacaaa 360 gaacatctta aggagaatgg gattaaggag ctcgtacgaa tcaaagctaa gatgaattgg 420 ggtctcactg acgaattgaa aaaagcattt ccagagaaca ttagcaaaga gcgccccctt 480 atcaataaga acattccgaa tttcaaatgg ctggctggat tcacatctgg tgaaggctgc 540 ttctttgtga acttgatcaa gtccaaatct aagctgggtg tacaggttca attggtcttc 600 agcattactc agcacatcag agacaagaac ctgatgaatt cattgataac atacctaggc 660 tgtggttaca tcaaagagaa gaacaagtcc gagttcagtt ggctcgactt tgtggttacc 720 aaattcagcg atatcaacga caagatcatt ccggtattcc aggaaaatac tctgattggc 780 gtcaaactcg aggactttga agattggtgc aaggttgcca aattgatcga agagaagaaa 840 cacctgaccg aatccggttt ggatgagatt aagaaaatca agctgaacat gaacaaaggt 900 cgtgtcttc 909 <210> 2 <211> 303 <212> PRT <213> Ophiostoma novo-ulmi <400> 2 Met Ala Tyr Met Ser Arg Arg Glu Ser Ile Asn Pro Trp Ile Leu Thr 1 5 10 15 Gly Phe Ala Asp Ala Glu Gly Ser Phe Leu Leu Arg Ile Arg Asn Asn 20 25 30 Asn Lys Ser Ser Val Gly Tyr Ser Thr Glu Leu Gly Phe Gln Ile Thr 35 40 45 Leu His Asn Lys Asp Lys Ser Ile Leu Glu Asn Ile Gln Ser Thr Trp 50 55 60 Lys Val Gly Val Ile Ala Asn Ser Gly Asp Asn Ala Val Ser Leu Lys 65 70 75 80 Val Thr Arg Phe Glu Asp Leu Lys Val Ile Ile Asp His Phe Glu Lys 85 90 95 Tyr Pro Leu Ile Thr Gln Lys Leu Gly Asp Tyr Lys Leu Phe Lys Gln 100 105 110 Ala Phe Ser Val Met Glu Asn Lys Glu His Leu Lys Glu Asn Gly Ile 115 120 125 Lys Glu Leu Val Arg Ile Lys Ala Lys Met Asn Trp Gly Leu Asn Asp 130 135 140 Glu Leu Lys Lys Ala Phe Pro Glu Asn Ile Ser Lys Glu Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ile Asn Lys Asn Ile Pro Asn Phe Lys Trp Leu Ala Gly Phe Thr Ser 165 170 175 Gly Glu Gly Cys Phe Phe Val Asn Leu Ile Lys Ser Lys Ser Lys Leu 180 185 190 Gly Val Gln Val Gln Leu Val Phe Ser Ile Thr Gln His Ile Arg Asp 195 200 205 Lys Asn Leu Met Asn Ser Leu Ile Thr Tyr Leu Gly Cys Gly Tyr Ile 210 215 220 Lys Glu Lys Asn Lys Ser Glu Phe Ser Trp Leu Asp Phe Val Val Thr 225 230 235 240 Lys Phe Ser Asp Ile Asn Asp Lys Ile Ile Pro Val Phe Gln Glu Asn 245 250 255 Thr Leu Ile Gly Val Lys Leu Glu Asp Phe Glu Asp Trp Cys Lys Val 260 265 270 Ala Lys Leu Ile Glu Glu Lys Lys His Leu Thr Glu Ser Gly Leu Asp 275 280 285 Glu Ile Lys Lys Ile Lys Leu Asn Met Asn Lys Gly Arg Val Phe 290 295 300 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tgtctgccta ttcaccgatt tt 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ctagcacagt tttgtctgtg at 22 <210> 5 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered I-OnuI variant <400> 5 Met Ala Tyr Met Ser Arg Arg Glu Ser Ile Asn Pro Trp Ile Leu Thr 1 5 10 15 Gly Phe Ala Asp Ala Glu Gly Ser Phe Ile Leu Asp Ile Arg Asn Arg 20 25 30 Asn Asn Glu Ser Asn Arg Tyr Arg Thr Ser Leu Arg Phe Gln Ile Thr 35 40 45 Leu His Asn Lys Asp Lys Ser Ile Leu Glu Asn Ile Gln Ser Thr Trp 50 55 60 Lys Val Gly Lys Ile Thr Asn Ser Gly Asp Arg Ala Val Met Leu Arg 65 70 75 80 Val Thr Arg Phe Glu Asp Leu Lys Val Ile Ile Asp His Phe Glu Lys 85 90 95 Tyr Pro Leu Ile Thr Gln Lys Leu Gly Asp Tyr Lys Leu Phe Lys Gln 100 105 110 Ala Phe Ser Val Met Glu Asn Lys Glu His Leu Lys Glu Asn Gly Ile 115 120 125 Lys Glu Leu Val Arg Ile Lys Ala Lys Met Asn Trp Gly Leu Asn Asp 130 135 140 Glu Leu Lys Lys Ala Phe Pro Glu Asn Ile Ser Lys Glu Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ile Asn Lys Asn Ile Pro Asn Phe Lys Trp Leu Ala Gly Phe Thr Ser 165 170 175 Gly Glu Gly Tyr Phe Gly Val 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Ser Gly Asp Arg Ala Val Met Leu Arg 65 70 75 80 Val Thr Arg Phe Glu Asp Leu Lys Val Ile Ile Asp His Phe Glu Lys 85 90 95 Tyr Pro Leu Ile Thr Gln Lys Leu Gly Asp Tyr Lys Leu Phe Lys Gln 100 105 110 Ala Phe Ser Val Met Glu Asn Lys Glu His Leu Lys Glu Asn Gly Ile 115 120 125 Lys Glu Leu Val Arg Ile Lys Ala Lys Met Asn Trp Gly Leu Asn Asp 130 135 140 Glu Leu Lys Lys Ala Phe Pro Glu Asn Ile Ser Lys Glu Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ile Asn Lys Asn Ile Pro Asn Phe Lys Trp Leu Ala Gly Phe Thr Ser 165 170 175 Gly Glu Gly Tyr Phe Gly Val Asn Leu Lys Lys Val Lys Gly Asn Ala 180 185 190 Lys Val Tyr Val Gly Leu Arg Phe Ser Ile Ser Gln His Ile Arg Asp 195 200 205 Lys Asn Leu Met Asn Ser Leu Ile Thr Tyr Leu Gly Cys Gly Ser Ile 210 215 220 Trp Glu Lys Asn Lys Ser Glu Phe Ser Trp Leu Glu Phe Val Val Thr 225 230 235 240 Lys Phe Ser Asp Ile Asn Asp Lys Ile Ile Pro Val Phe Gln Glu Asn 245 250 255 Thr Leu Ile Gly Val Lys Leu Glu Asp Phe Glu Asp Trp Cys Lys Val 260 265 270 Ala Lys Leu Ile Glu Glu Lys Lys His Leu Thr Glu Ser Gly Leu Asp 275 280 285 Glu Ile Lys Lys Ile Lys Leu Asn Met Asn Lys Gly Arg Val Phe 290 295 300 <210> 7 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered I-OnuI variant <400> 7 Met Ala Tyr Met Ser Arg Arg Glu Ser Ile Asn Pro Trp Ile Leu Thr 1 5 10 15 Gly Phe Ala Asp Ala Glu Gly Ser Phe Ile Leu Asp Ile Arg Asn Arg 20 25 30 Asn Asn Glu Ser Asn Arg Tyr Arg Thr Ser Leu Arg Phe Gln Ile Thr 35 40 45 Leu His Asn Lys Asp Lys Ser Ile Leu Glu Asn Ile Gln Ser Thr Trp 50 55 60 Lys Val Gly Lys Ile Thr Asn Ser Ser Asp Arg Ala Val Met Leu Arg 65 70 75 80 Val Thr Arg Phe Glu Asp Leu Lys Val Ile Ile Asp His Phe Glu Lys 85 90 95 Tyr Pro Leu Ile Thr Gln Lys Leu Gly Asp Tyr Lys Leu Phe Lys Gln 100 105 110 Ala Phe Ser Val Met Glu Asn Lys Glu His Leu Lys Glu Asn Gly Ile 115 120 125 Lys Glu Leu Val Arg Ile Lys Ala Lys Met Asn Trp Gly Leu Asn Asp 130 135 140 Glu Leu Lys Lys Ala Phe Pro Glu Asn Ile Ser Lys Glu Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ile Asn Lys Asn Ile Pro Asn Phe Lys 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ccatattcat tttgcaggtg aaattcctga gatgtaagga gctgctgtga 1860 cttgctcaag gccttatatc aagtaaacgg tagcgctggg gcttagacgc aggtgttctg 1920 atttatagtt caaaacctct atcaatgaga gagcaatctc ctggtaatgt gatagatttc 1980 ccaacttaat gccaacatac cataaacctc ccattctgct aatgcccagc ctaagttggg 2040 gagaccactc cagattccaa gatgtacagt ttgctttgct gggccttttt cccatgcctg 2100 cctttactct gccagagtta tattgctggg gttttgaaga agatcctatt aaataaaaga 2160 ataagcagta ttattaagta gccctgcatt tcaggtttcc ttgagtggca ggccaggcct 2220 ggcgtgaacg ttcactgaaa tcatggcctc ttggccaaga ttgatagctt gtgcctgtcc 2280 ctgagtccca gtccatcacg agcagctggt ttctaagatg ctatttcccg tataaagcat 2340 gagaccgtga cttgccagcc ccacagagcc ccgcccttgt ccatcactgg catctggact 2400 ccagcctggg ttggggcaaa gagggaaatg agatcatgtc ctaaccctga tcctcttgtc 2460 ccacagatat ccagaaccct gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg 2520 acaagtctgt ctgcctatac gcgtaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc 2580 gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaaacggtg cctagagaag 2640 gtggcgcggg 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reporter transgene and a polyadenylation signal <400> 9 gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 60 caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 120 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 180 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 240 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 300 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 360 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 420 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 480 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 540 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 600 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 660 tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 720 tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 780 gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa 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ctgcatgact cactagcact ctatcacggc 1680 catattctgg cagggtcagt ggctccaact aacatttgtt tggtacttta cagtttatta 1740 aatagatgtt tatatggaga agctctcatt tctttctcag aagagcctgg ctaggaaggt 1800 ggatgaggca ccatattcat tttgcaggtg aaattcctga gatgtaagga gctgctgtga 1860 cttgctcaag gccttatatc aagtaaacgg tagcgctggg gcttagacgc aggtgttctg 1920 atttatagtt caaaacctct atcaatgaga gagcaatctc ctggtaatgt gatagatttc 1980 ccaacttaat gccaacatac cataaacctc ccattctgct aatgcccagc ctaagttggg 2040 gagaccactc cagattccaa gatgtacagt ttgctttgct gggccttttt cccatgcctg 2100 cctttactct gccagagtta tattgctggg gttttgaaga agatcctatt aaataaaaga 2160 ataagcagta ttattaagta gccctgcatt tcaggtttcc ttgagtggca ggccaggcct 2220 ggcgtgaacg ttcactgaaa tcatggcctc ttggccaaga ttgatagctt gtgcctgtcc 2280 ctgagtccca gtccatcacg agcagctggt ttctaagatg ctatttcccg tataaagcat 2340 gagaccgtga cttgccagcc ccacagagcc ccgcccttgt ccatcactgg catctggact 2400 ccagcctggg ttggggcaaa gagggaaatg agatcatgtc ctaaccctga tcctcttgtc 2460 ccacagatat ccagaaccct gaccctgccg 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catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 3360 ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca 3420 gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca 3480 gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga 3540 caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca 3600 catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta 3660 caagtaagcg gccgcgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca 3720 ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc 3780 agggggagat gtgggaggtt ttttaaagct caccggtttt gattctcaaa caaatgtgtc 3840 acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact gtgctagaca tgaggtctat 3900 ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa tctgactttg catgtgcaaa 3960 cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc cccagcccag gtaagggcag 4020 ctttggtgcc ttcgcaggct gtttccttgc ttcaggaatg gccaggttct gcccagagct 4080 ctggtcaatg atgtctaaaa ctcctctgat tggtggtctc ggccttatcc attgccacca 4140 aaaccctctt tttactaaga aacagtgagc 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tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 60 caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 120 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 180 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 240 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 300 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 360 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 420 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 480 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 540 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 600 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 660 tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 720 tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 780 gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 840 taatgcagct gcgcgctcgc tcgctcactg 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aacatttgtt tggtacttta cagtttatta 1740 aatagatgtt tatatggaga agctctcatt tctttctcag aagagcctgg ctaggaaggt 1800 ggatgaggca ccatattcat tttgcaggtg aaattcctga gatgtaagga gctgctgtga 1860 cttgctcaag gccttatatc aagtaaacgg tagcgctggg gcttagacgc aggtgttctg 1920 atttatagtt caaaacctct atcaatgaga gagcaatctc ctggtaatgt gatagatttc 1980 ccaacttaat gccaacatac cataaacctc ccattctgct aatgcccagc ctaagttggg 2040 gagaccactc cagattccaa gatgtacagt ttgctttgct gggccttttt cccatgcctg 2100 cctttactct gccagagtta tattgctggg gttttgaaga agatcctatt aaataaaaga 2160 ataagcagta ttattaagta gccctgcatt tcaggtttcc ttgagtggca ggccaggcct 2220 ggcgtgaacg ttcactgaaa tcatggcctc ttggccaaga ttgatagctt gtgcctgtcc 2280 ctgagtccca gtccatcacg agcagctggt ttctaagatg ctatttcccg tataaagcat 2340 gagaccgtga cttgccagcc ccacagagcc ccgcccttgt ccatcactgg catctggact 2400 ccagcctggg ttggggcaaa gagggaaatg agatcatgtc ctaaccctga tcctcttgtc 2460 ccacagatat ccagaaccct gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg 2520 acaagtctgt ctgcctatac ggtgagggca 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gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 60 caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 120 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 180 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 240 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 300 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 360 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 420 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 480 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 540 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 600 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 660 tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 720 tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 780 gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 840 taatgcagct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg 900 cgacctttgg tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact 960 ccatcactag gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtggg 1020 aaattctaat ccccaccctg ctggaaactc tctggtggcc ccaacatgct aatcctccgg 1080 caaacctctg tttcctcctc aaaaggcagg aggtcggaaa gaataaacaa tgagagtcac 1140 attaaaaaca caaaatccta cggaaatact gaagaatgag tctcagcact aaggaaaagc 1200 ctccagcagc tcctgctttc tgagggtgaa ggatagacgc tgtggctctg catgactcac 1260 tagcactcta tcacggccat attctggcag ggtcagtggc tccaactaac atttgtttgg 1320 tactttacag tttattaaat agatgtttat atggagaagc tctcatttct ttctcagaag 1380 agcctggcta ggaaggtgga tgaggcacca tattcatttt gcaggtgaaa ttcctgagat 1440 gtaaggagct gctgtgactt gctcaaggcc ttatatcaag taaacggtag cgctggggct 1500 tagacgcagg tgttctgatt tatagttcaa aacctctatc aatgagagag caatctcctg 1560 gtaatgtgat agatttccca acttaatgcc aacataccat aaacctccca ttctgctaat 1620 gcccagccta agttggggag accactccag attccaagat gtacagtttg ctttgctggg 1680 cctttttccc atgcctgcct ttactctgcc agagttatat tgctggggtt ttgaagaaga 1740 tcctattaaa taaaagaata agcagtatta ttaagtagcc ctgcatttca ggtttccttg 1800 agtggcaggc caggcctggc gtgaacgttc actgaaatca tggcctcttg gccaagattg 1860 atagcttgtg cctgtccctg agtcccagtc catcacgagc agctggtttc taagatgcta 1920 tttcccgtat aaagcatgag accgtgactt gccagcccca cagagccccg cccttgtcca 1980 tcactggcat ctggactcca gcctgggttg gggcaaagag ggaaatgaga tcatgtccta 2040 accctgatcc tcttgtccca cagatatcca gaaccctgac cctgccgtgt accagctgag 2100 agactctaaa tccagtgaca agtctgtctg cctatacgcg taatgaaaga ccccacctgt 2160 aggtttggca agctaggatc aaggttagga acagagagac agcagaatat gggccaaaca 2220 ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc aagaacagtt ggaacagcag 2280 aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca gggccaagaa 2340 cagatggtcc ccagatgcgg tcccgccctc agcagtttct agagaaccat cagatgtttc 2400 cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt tgaactaacc aatcagttcg 2460 cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc cccgagctca ataaaagagc ccacaacccc 2520 tcactcggcg cgattcacct gacgcgtctc gagggccgcc accatggccc tccctgtgac 2580 cgccctgctg ctccccctcg ccctgttgct ccatgctgcc cgacctggat ccatcctttg 2640 gcacgagatg tggcacgagg gactcgaaga agcgtcccgg ctgtacttcg gagagcggaa 2700 cgtgaagggg atgttcgaag tgctggaacc cctgcacgcc atgatggagc ggggtcctca 2760 gacccttaaa gaaacaagct tcaaccaggc gtacgggcgc gacctgatgg aagcccagga 2820 gtggtgccgc aagtacatga agtccggaaa cgtgaaggat ctgacccaag cctgggatct 2880 gtactaccac gtgttcagaa ggatctcaaa ggctagcgcc ggcactggtt cggatatcta 2940 catttgggca ccgctcgccg gcacttgtgg agtgctgttg ctgtccctcg tgatcaccat 3000 gcataagagg ggacggaaga agctgctgta cattttcaag cagccattca tgcggcctgt 3060 gcaaaccacc caggaggagg acgggtgcag ctgccggttc cctgaggaag aggagggcgg 3120 atgcgaactg cgcgtgaagt tcagccggag cgcagatgct cccgcatacc aacagggaca 3180 gaaccagctg tataacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctcgacaa 3240 gcggcgggga cgcgacccag aaatgggagg aaagccccgc cggaagaacc cgcaggaagg 3300 cctgtacaac gagttgcaga aagacaagat ggctgaagct tactcggaga ttggcatgaa 3360 gggggagaga agaagaggga 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gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac 5100 cttcttcccc agcccaggta agggcagctt tggtgccttc gcaggctgtt tccttgcttc 5160 aggaatggcc aggttctgcc cagagctctg gtcaatgatg tctaaaactc ctctgattgg 5220 tggtctcggc cttatccatt gccaccaaaa ccctcttttt actaagaaac agtgagcctt 5280 gttctggcag tccagagaat gacacgggaa aaaagcagat gaagagaagg tggcaggaga 5340 gggcacgtgg cccagcctca gtctctccaa ctgagttcct gcctgcctgc ctttgctcag 5400 actgtttgcc ccttactgct cttctaggcc tcattctaag ccccttctcc aagttgcctc 5460 tccttatttc tccctgtctg ccaaaaaatc tttcccagct cactaagtca gtctcacgca 5520 gtcactcatt aacccaccaa tcactgattg tgccggcaca tgaatgcacc aggtagataa 5580 gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc 5640 ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg 5700 ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgccag ctggcgtaat agcgaagagg 5760 cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgattccgtt 5820 gcaatggctg gcggtaatat tgttctggat attaccagca aggccgatag tttgagttct 5880 tctactcagg caagtgatgt 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gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 1140 gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 1200 ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 1260 gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 1320 gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 1380 caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 1440 cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 1500 ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 1560 taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 1620 tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 1680 gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 1740 agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 1800 aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 1860 gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 1920 gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 1980 tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 2040 agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 2100 cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 2160 gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 2220 gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 2280 ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 2340 cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg 2400 cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcagaccagc cgcgtaacct 2460 ggcaaaatcg gttacggttg agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga 2520 caataaagtc ttaaactgaa caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag 2580 acagaatagt tgtaaactga aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt 2640 tgttatggct aaagcaaact cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga 2700 ggggcgtggc caagggcatg gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac 2760 aactccgcgg ccgggaagcc gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg 2820 tcgatatcaa agtgcatcac ttcttcccgt atgcccaact ttgtatagag agccactgcg 2880 ggatcgtcac cgtaatctgc ttgcacgtag atcacataag caccaagcgc gttggcctca 2940 tgcttgagga gattgatgag cgcggtggca atgccctgcc tccggtgctc gccggagact 3000 gcgagatcat agatatagat ctcactacgc ggctgctcaa acctgggcag aacgtaagcc 3060 gcgagagcgc caacaaccgc ttcttggtcg aaggcagcaa gcgcgatgaa tgtcttacta 3120 cggagcaagt tcccgaggta atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacgtct 3180 ccgaactcac gaccgaaaag atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg 3240 agcctacatg tgcgaatgat gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg 3300 ccctgctgcg taacatcgtt gctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca 3360 tcgacccacg gcgtaacgcg cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa 3420 acagtcataa caagccatga aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa 3480 ggttctggac cagttgcgtg agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca 3540 ggcttatgtc aactgggttc gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac 3600 cttgggcagc agcgaagtcg aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc 3660 ggtctccacg catcgtcagg cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg 3720 cacggatctg ccctggcttc aggagatcgg aagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt 3780 ggtgctgacc ccggatgaag tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg agcatcgttt 3840 gttcgcccag gactctagct atagttctag tggttggcta cattattgaa gcatttatca 3900 gggttattgt ctcagagcat gcctgcaggc agctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 3960 cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag 4020 ggagtggcca actccatcac taggggttcc tgcggccgct acggctgggg cttagacgca 4080 ggtgttctga tttatagttc aaaacctcta tcaatgagag agcaatctcc tggtaatgtg 4140 atagatttcc caacttaatg ccaacatacc ataaacctcc cattctgcta atgcccagcc 4200 taagttgggg agaccactcc agattccaag atgtacagtt tgctttgctg ggcctttttc 4260 ccatgcctgc ctttactctg ccagagttat attgctgggg ttttgaagaa gatcctatta 4320 aataaaagaa taagcagtat tattaagtag ccctgcattt caggtttcct tgagtggcag 4380 gccaggcctg gcgtgaacgt tcactgaaat catggcctct tggccaagat tgatagcttg 4440 tgcctgtccc tgagtcccag tccatcacga 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ggtcaccgtc tcctcaacca cgacgccagc 6180 gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga 6240 ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga 6300 tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggtgat 6360 caccctttac tgcaaacgtg agtacaggag gtggagagtg gccagccctt ctcatgttca 6420 gagaacatgg ttaactggtt aagtcatgtc gtcccacagg gggcagaaag aaactcctgt 6480 atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta 6540 gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga 6600 gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag 6660 gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg 6720 gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga 6780 tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg 6840 atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc 6900 aggccctgcc ccctcgctaa gcggccgcgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct 6960 ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa 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aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 120 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 180 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 240 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 300 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 360 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 420 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 480 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 540 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 600 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 660 tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 720 tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 780 gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 840 taatgcagct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg 900 cgacctttgg tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact 960 ccatcactag gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgctgg 1020 ggcttagacg caggtgttct gatttatagt tcaaaacctc tatcaatgag agagcaatct 1080 cctggtaatg tgatagattt cccaacttaa tgccaacata ccataaacct cccattctgc 1140 taatgcccag cctaagttgg ggagaccact ccagattcca agatgtacag tttgctttgc 1200 tgggcctttt tcccatgcct gcctttactc tgccagagtt atattgctgg ggttttgaag 1260 aagatcctat taaataaaag aataagcagt attattaagt agccctgcat ttcaggtttc 1320 cttgagtggc aggccaggcc tggcgtgaac gttcactgaa atcatggcct cttggccaag 1380 attgatagct tgtgcctgtc cctgagtccc agtccatcac gagcagctgg tttctaagat 1440 gctatttccc gtataaagca tgagaccgtg acttgccagc cccacagagc cccgcccttg 1500 tccatcactg gcatctggac tccagcctgg gttggggcaa agagggaaat gagatcatgt 1560 cctaaccctg atcctcttgt cccacagata tccagaaccc tgaccctgcc gtgtaccagc 1620 tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatc atatgcacac aaaaaaccaa 1680 cacacagatg tctagtagct ctgatctttt attctagcgg ccgcgtagcg ctgctatcag 1740 gagctcagct tctgctgcct gttcacgcgg tagcagtaga agatgatgat cacgctgatc 1800 gccaccccca ggggcggcag gagggaaatg ccagtgactt ggaagatcac gagcagcaga 1860 tcagggttcg aggtattgta ctcctcggaa aagataatgt tgtcgttgca ttcgtcggat 1920 gagcaggaac acatgaagaa cgtttcgccc ggcttctttt tctccttcat gatgcacttg 1980 gggcttgcgg cgtcctccag aatgaagtcg tggtatggaa gcttaggatc gtggcacacg 2040 gtttccaggg tgatgttctc gtcatttttc cgccacacgg ccacacagac ttcctgaggc 2100 ttttcgcaga tagaggtaat ggagcagttg ctcatgcatg acttctggtt gtcgcaagtc 2160 gaaaagcgca cgtcacagaa cttgcagagc tgcgggaact tgacggcacc gttgttatcg 2220 gtcacgatca tgtcgttgtt caccgacttt tgcacgtgcg ggggaatggt ggaagcaatc 2280 cgagtccaaa gcacgatatg cagcggccac aatcctctca acagtcctct tcccatggtg 2340 gcacgcgcct tgctagctag acaaaagtgt tgtggaattg ctccaggcga tctgacggtt 2400 cactaaacga gctctgcttt tataggcgcc caccgtacac gcctagatcc atcgattagt 2460 ccaatttgtt aaagacagga tatcagtggt ccaggctcta gttttgactc aacaatatca 2520 ccagctgaag cctatagagt acgagccata gatagaataa aagattttat ttagtctcca 2580 gaaaaagggg ggaatgaaag accccacctg taggtttggc aagctaggat caaggttagg 2640 aacagagaga cagcagaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc 2700 ggctcagggc caagaacagt tggaacagca gaatatgggc caaacaggat atctgtggta 2760 agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagatggtc cccagatgcg gtcccgccct 2820 cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc 2880 tgtgccttat ttgaactaac caatcagttc gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct 2940 ccccgagctc aataaaagag cccacaaccc ctcactcggc gcgacgcgtc atagccacca 3000 tggccttacc agtgaccgcc ttgctcctgc cgctggcctt gctgctccac gccgccaggc 3060 cggacatcca gatgacacag actacatcct ccctgtctgc ctctctggga gacagagtca 3120 ccatcagttg cagggcaagt caggacatta gtaaatattt aaattggtat cagcagaaac 3180 cagatggaac tgttaaactc ctgatctacc atacatcaag attacactca ggagtcccat 3240 caaggttcag tggcagtggg tctggaacag attattctct caccattagc aacctggagc 3300 aagaagatat tgccacttac ttttgccaac agggtaatac gcttccgtac acgttcggag 3360 gggggaccaa gctggagatc acaggtggcg gtggctccgg cggtggtggg tctggtggcg 3420 gcggaagcga ggtgaaactg 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ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca 6840 acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct 6900 gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 6960 agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt 7020 tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 7080 ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 7140 taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt 7200 tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat 7260 gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag 7320 atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg 7380 ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata 7440 cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat 7500 ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc 7560 aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg 7620 ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac 7680 gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact 7740 ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa 7800 gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct 7860 ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc 7920 tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga 7980 cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac 8040 tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag 8100 atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg 8160 tcagacccc 8169 <210> 20 <211> 8058 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid pBW1086 - An adeno-associated virus (AAV) plasmid containing a viral self-cleaving peptide, e.g., T2A peptide, a CD19-CAR transgene and a polyadenylation signal <400> 20 gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 60 caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 120 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 180 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 240 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 300 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 360 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 420 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 480 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 540 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 600 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 660 tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 720 tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 780 gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 840 taatgcagct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg 900 cgacctttgg tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact 960 ccatcactag gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgctgg 1020 ggcttagacg caggtgttct gatttatagt tcaaaacctc tatcaatgag agagcaatct 1080 cctggtaatg tgatagattt cccaacttaa tgccaacata ccataaacct cccattctgc 1140 taatgcccag cctaagttgg ggagaccact ccagattcca agatgtacag tttgctttgc 1200 tgggcctttt tcccatgcct gcctttactc tgccagagtt atattgctgg ggttttgaag 1260 aagatcctat taaataaaag aataagcagt attattaagt agccctgcat ttcaggtttc 1320 cttgagtggc aggccaggcc tggcgtgaac gttcactgaa atcatggcct cttggccaag 1380 attgatagct tgtgcctgtc cctgagtccc agtccatcac gagcagctgg tttctaagat 1440 gctatttccc gtataaagca tgagaccgtg acttgccagc cccacagagc cccgcccttg 1500 tccatcactg gcatctggac tccagcctgg gttggggcaa agagggaaat gagatcatgt 1560 cctaaccctg atcctcttgt cccacagata tccagaaccc tgaccctgcc gtgtaccagc 1620 tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctata cgcgtgatcc atcgattagt 1680 ccaatttgtt aaagacagga tatcagtggt ccaggctcta gttttgactc aacaatatca 1740 ccagctgaag cctatagagt acgagccata gatagaataa aagattttat 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tctggtggcg 2640 gcggaagcga ggtgaaactg caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc tcacagagcc 2700 tgtccgtcac atgcactgtc tcaggggtct cattacccga ctatggtgta agctggattc 2760 gccagcctcc acgaaagggt ctggagtggc tgggagtaat atggggtagt gaaaccacat 2820 actataattc agctctcaaa tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc aagagccaag 2880 ttttcttaaa aatgaacagt ctgcaaactg atgacacagc catttactac tgtgccaaac 2940 attattacta cggtggtagc tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcggtcaccg 3000 tctcctcaac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc 3060 agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga 3120 gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg 3180 tccttctcct gtcactggtg atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt 3240 atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta 3300 gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga 3360 gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag 3420 gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 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ctggatggag 7680 gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 7740 gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 7800 ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 7860 cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 7920 caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 7980 taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 8040 cactgagcgt cagacccc 8058 <210> 21 <211> 8035 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered plasmid pBW1087 <400> 21 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatcatat gccagcctat ggtgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240 tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300 tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360 tcccatagta 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tgcatgccga cattgattat tgactagtcc ctaagaaacc 7980 attcttatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 8035 <210> 22 <211> 7625 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid pBW1088 - Adeno-associated virus (AAV) plasmids containing a promoter, an alpha and a beta chain of a T cell receptor specific for Wilms Tumor Antigen 1 (WT1-TCR), and a polyadenylation signal <400> 22 gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 60 caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 120 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 180 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 240 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 300 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 360 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 420 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 480 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 540 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 600 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 660 tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 720 tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 780 gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 840 taatgcagct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg 900 cgacctttgg tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact 960 ccatcactag gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgctgg 1020 ggcttagacg caggtgttct gatttatagt tcaaaacctc tatcaatgag agagcaatct 1080 cctggtaatg tgatagattt cccaacttaa tgccaacata ccataaacct cccattctgc 1140 taatgcccag cctaagttgg ggagaccact ccagattcca agatgtacag tttgctttgc 1200 tgggcctttt tcccatgcct gcctttactc tgccagagtt atattgctgg ggttttgaag 1260 aagatcctat taaataaaag aataagcagt attattaagt agccctgcat ttcaggtttc 1320 cttgagtggc aggccaggcc tggcgtgaac gttcactgaa atcatggcct cttggccaag 1380 attgatagct tgtgcctgtc cctgagtccc agtccatcac gagcagctgg tttctaagat 1440 gctatttccc gtataaagca tgagaccgtg acttgccagc cccacagagc cccgcccttg 1500 tccatcactg gcatctggac tccagcctgg gttggggcaa agagggaaat gagatcatgt 1560 cctaaccctg atcctcttgt cccacagata tccagaaccc tgaccctgcc gtgtaccagc 1620 tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctata cgcgtgaaca gagaaacagg 1680 agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag 1740 aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc 1800 cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga 1860 gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga 1920 actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctctata 1980 taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg 2040 acttccatag aaggatctcg agctacgcca ccatgctcct gctgcttgtc cctgtcctgg 2100 aagtcatatt cactctcggc ggaacccgcg cccaatcagt gacgcagctc gactcacacg 2160 tgtccgtgtc ggagggcacc cccgtgctgc tccggtgcaa ttactcctcc 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gaacaacact 5580 caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg 5640 gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt 5700 tacaatttaa atatttgctt atacaatctt cctgtttttg gggcttttct gattatcaac 5760 cggggtacat atgattgaca tgctagtttt acgattaccg ttcatcgatt ctcttgtttg 5820 ctccagactc tcaggcaatg acctgatagc ctttgtagag acctctcaaa aatagctacc 5880 ctctccggca tgaatttatc agctagaacg gttgaatatc atattgatgg tgatttgact 5940 gtctccggcc tttctcaccc gtttgaatct ttacctacac attactcagg cattgcattt 6000 aaaatatatg agggttctaa aaatttttat ccttgcgttg aaataaaggc ttctcccgca 6060 aaagtattac agggtcataa tgtttttggt acaaccgatt tagctttatg ctctgaggct 6120 ttattgctta attttgctaa ttctttgcct tgcctgtatg atttattgga tgttggaatc 6180 gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca 6240 ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac 6300 ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 6360 ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac 6420 gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 6480 agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 6540 aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 6600 attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 6660 cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 6720 aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 6780 ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 6840 gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 6900 attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 6960 tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 7020 tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 7080 atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 7140 agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 7200 aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 7260 caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 7320 ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 7380 gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 7440 tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 7500 atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 7560 tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 7620 acccc 7625 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 23 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 24 Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 25 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered cell permeable peptide <400> 26 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineer cell permeable peptide <400> 27 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 28 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 29 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Ser Lys Lys 1 5 10 15 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 30 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ala Lys Ile Lys Lys 1 5 10 15 <210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 33 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 33 Gly Gly Gly 1 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 34 Asp Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 35 Thr Gly Glu Lys Pro 1 5 <210> 36 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 36 Gly Gly Arg Arg 1 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 37 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 38 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp 1 5 10 <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 39 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 40 Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 41 Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro 1 5 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 42 Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro 1 5 10 <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker sequence <400> 43 Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro 1 5 10 15 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleavage sequence by TEV protease <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = Gly or Ser <400> 44 Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa 1 5 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleavage sequence by TEV protease <400> 45 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleavage sequence by TEV protease <400> 46 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser 1 5 <210> 47 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 47 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 48 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 48 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 49 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 49 Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro 1 5 10 <210> 50 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 50 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 51 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 51 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 52 Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro 1 5 10 <210> 53 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 53 Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 54 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 54 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 55 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 55 Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 1 5 10 <210> 56 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 56 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 57 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 57 Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 58 Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 1 5 10 <210> 59 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 59 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 60 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 60 Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 61 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 61 Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 1 5 10 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 62 Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly 1 5 10 15 Pro <210> 63 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 63 Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 64 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 64 Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 65 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 65 Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro 1 5 10 15 Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys 20 25 30 Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr 35 40 <210> 66 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 66 Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 67 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 67 Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val 1 5 10 15 Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly 20 25 30 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 35 40 <210> 68 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-cleaving polypeptide comprising 2A site <400> 68 Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu 1 5 10 15 Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly 20 25 30 Pro <210> 69 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus Kozak sequence <400> 69 gccrccatgg 10

Claims (162)

  1. T 세포 집단에서 TCRα 대립유전자를 편집하는 방법으로서,
    a) T 세포 집단을 활성화시키고, T 세포 집단을 자극하여 증식시키는 단계;
    b) 메가TAL을 암호화하는 mRNA를 T 세포 집단 내로 도입하는 단계; 및
    c) 공여자 수선 주형을 포함하는 하나 이상의 바이러스 벡터로 T 세포 집단을 형질도입하는 단계를 포함하고,
    여기서 메가TAL의 발현은 TCRα 대립유전자 내 표적 부위에서 이중 가닥 파손(double-strand break: DSB)을 생성하고, 공여자 수선 주형은 이중-가닥 파손 부위에서 상동성 관련 수선(homology directed repair: HDR)에 의해 TCRα 대립유전자 내로 혼입되고,
    공여자 수선 주형이 (1) DSB의 TCRα 서열 5'에 대해 상동성인, 600 bp ± 15%의 5' 상동성 아암(5' homology arm); (2) 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼, 또는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (3) DSB의 TCRα 서열 3'에 대해 상동성인 600 bp ± 15%의 3' 상동성 아암을 포함하는,
    T 세포 집단에서 TCRα 대립유전자를 편집하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 면역효능 인핸서, 면역억제 신호 댐퍼, 또는 조작된 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 RNA 폴리머라제 II 프로모터를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    5' 상동성 아암이 600 bp이고, 3' 상동성 아암이 600 bp인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 바이러스 벡터가 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터(rAAV) 또는 레트로바이러스인, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    (a) rAAV가 AAV2로부터의 하나 이상의 ITR을 갖거나;
    (b) rAAV가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 및 AAV10으로 이루어진 군에서 선택된 혈청형을 갖거나;
    (c) rAAV는 AAV6 혈청형을 갖거나;
    (d) 레트로바이러스가 렌티바이러스이거나; 또는
    (e) 레트로바이러스가 인테그라제 결핍 렌티바이러스인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 메가TAL이 TALE DNA 결합 도메인 및 조작된 메가뉴클레아제를 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, TALE DNA 결합 도메인이 9.5 TALE 반복 단위 내지 11.5 TALE 반복 단위를 포함하는, 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    (a) 메가뉴클레아제가 I-AabMI, I-AaeMI, I-AniI, I-ApaMI, I-CapIII, I-CapIV, I-CkaMI, I-CpaMI, I-CpaMII, I-CpaMIII, I-CpaMIV, I-CpaMV, I-CpaV, I-CraMI, I-EjeMI, I-GpeMI, I-GpiI, I-GzeMI, I-GzeMII, I-GzeMIII, I-HjeMI, I-LtrII, I-LtrI, I-LtrWI, I-MpeMI, I-MveMI, I-NcrII, I-Ncrl, I-NcrMI, I-OheMI, I-OnuI, I-OsoMI, I-OsoMII, I-OsoMIII, I-OsoMIV, I-PanMI, I-PanMII, I-PanMIII, I-PnoMI, I-ScuMI, I-SmaMI, I-SscMI 및 I-Vdi141I로 이루어진 군으로부터 선택되는 LAGLIDADG 귀소 엔도뉴클레아제(LAGLIDADG homing endonuclease: LHE)로부터 조작된 것이거나;
    (b) 메가뉴클레아제가 I-CpaMI, I-HjeMI, I-OnuI, I-PanMI, 및 SmaMI로 이루어진 군으로부터 선택된 LHE로부터 조작된 것이거나; 또는
    (c) 메가뉴클레아제가 I-OnuI LHE로부터 조작된 것인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, DSB가 TCRα 대립유전자 둘 다에서 생성되고; 면역효능 인핸서 또는 면역억제 신호 댐퍼를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 공여자 주형은 하나의 변형된 TCRα 대립유전자 내로 삽입되며; 세포는 조작된 항원 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 추가로 형질도입되는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, T 세포가 세포독성 T 림프구(CTL), 종양 침윤성 림프구(TIL) 또는 헬퍼 T 세포인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 메가TAL을 암호화하는 mRNA가 바이러스 자기-절단성 2A 펩타이드 및 말단-가공 효소를 추가로 암호화하는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 방법이 말단-가공 효소를 암호화하는 mRNA를 상기 T 세포 내로 도입하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 말단-가공 효소가 5-3' 엑소뉴클레아제, 5-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제, 3-5'엑소뉴클레아제, 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 헬리카제 또는 주형-비의존성 DNA 중합효소 활성을 나타내는, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 말단-가공 효소가 Trex2 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편을 포함하는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, T 세포가 PI3K 경로 저해제의 존재 하에 활성화되고 자극되는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 공여자 수선 주형이 키메라 항원 수용제(chimeric antigen receptor: CAR), 조작된 TCR, DARIC, 또는 제타킨(zetakine)으로 이루어진 군에서 선택된 조작된 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
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