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KR102199018B1 - 식물에서 인플루엔자 바이러스-유사 입자 생산 - Google Patents

식물에서 인플루엔자 바이러스-유사 입자 생산 Download PDF

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KR102199018B1
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마논 쿠튀르
마르크-안드레 다우스트
루이스-필리페 베지나
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메디카고 인코포레이티드
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Abstract

변형된 헤마글루티닌을 포함하는 식물에서 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생산하는 방법이 제공된다. 방법은 식물에서 활성이고 변형된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합된 조절 영역을 포함하는 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하는 단계를 포함하며, 변형된 HA 단백질은 변형된 단백질 가수분해 루프를 포함한다. 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양하여, 이로 인해 VLP를 생산하는 단계가 뒤따른다. 변형된 단백질 가수분해 루프는 프로테아제에 의해 감소되거나 폐지된 분열을 나타내는 하나 이상의 프로테아제 분열 부위를 포함할 수도 있다. HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 B HA, C, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, 및 H16으로 구성된 군으로부터 선택될 수도 있다. 또한 방법에 의해 생산된 바이러스 유사 입자 (VLP), 및 VLP를 발현하는 식물이 기술된다. 바이러스 유사 입자 (VLP)는 식물-특이적 N-글리칸, 또는 변형된 N- 글리칸을 포함할 수도 있다.

Description

식물에서 인플루엔자 바이러스-유사 입자 생산{INFLUENZA VIRUS-LIKE PARTICLE PRODUCTION IN PLANTS}
본 발명은 식물에서 바이러스 유사 입자의 생산에 관한 것이다.
인플루엔자는 오쏘믹소비리대(orthomyxoviridae) 과의 RNA 바이러스에 의해 유발된다. 이 바이러스에는 세 가지 타입이 있는데 그것들은 세 가지 다른 타입, 타입 A, B 및 C의 인플루엔자를 유발한다. 인플루엔자 바이러스 타입 A 바이러스는 포유동물 (인간, 돼지, 페릿, 말) 및 조류를 감염시킨다. 이는 인류에게 매우 중요한데, 이것이 전 세계적 유행병을 유발했던 바이러스의 타입이기 때문이다. 인플루엔자 바이러스 타입 B (단순히 인플루엔자 B로도 공지되어 있음)는 인간만을 감염시킨다. 그것은 가끔 독감의 지역 발생을 유발한다. 인플루엔자 C 바이러스 또한 인간만을 감염시킨다. 그것들은 어릴 때 대부분의 사람을 감염시키고 드물게는 심각한 병을 유발한다.
백신 접종은 감염 전에 대상체가 방어를 탑재하도록 유도함으로써 유사한 작용물에 의해 유발된 질병에 대한 보호를 제공한다. 통상적으로, 이는 면역원으로서 생 약독화되거나 전체 비활성화된 형태의 감염원의 사용을 통해 달성되었다. 백신으로서 전체 바이러스 (예를 들어, 죽은 또는 약독화된 바이러스) 사용의 위험을 방지하기 위해서, 재조합 바이러스 단백질, 예를 들어, 서브유닛이 백신으로서 추구되었다. 펩타이드 및 서브유닛 백신 둘 다는 많은 잠재적 제한의 대상이다. 서브유닛 백신은, 부정확한 폴딩(folding) 또는 불량한 항원 제공 때문에, 불량한 면역원성을 나타낼 수도 있다. 주요 문제점은 조작된 단백질의 형태가 자연적 환경에서 항원의 형태를 모방한다는 것을 보장하는 어려움이다. 적합한 보조제 및, 펩타이드의 경우에는, 담체 단백질이 면역 반응을 촉진하는데 사용되어야 한다. 이에 더하여 이 백신은 주로 체액 반응을 유도하고, 따라서 효과적인 면역력을 일으키는데 실패할 수도 있다. 서브유닛 백신은 전체 비활성화된 바이러스가 보호를 제공하는 것으로 입증될 수 있는 질환에 대하여 종종 효과가 없다.
바이러스-유사 입자 (VLP)는 면역원성 조성물에 포함되는 잠재적인 후보물질이다. VLP는 성숙한 비리온과 매우 유사하지만, 그것들은 바이러스 유전 물질을 함유하지 않는다. 그러므로, VLP는 자연에서 복제 불가능한데, 이는 그것들을 백신으로서 투여에 안전하게 만든다. 이에 더하여, VLP는 VLP의 표면 상에서 바이러스 당단백질을 발현하도록 조작될 수 있으며, 이것은 그것들의 가장 고유한 생리학적 구성이다. 더욱이, VLP는 온전한 비리온과 유사하고 다원자가 미립자 구조이기 때문에, VLP는 가용성 외피 단백질 항원보다 항체의 당단백질로의 중화를 유도하는데 더 효과적일 수도 있다.
VLP는 식물에서 (WO2009/009876; WO 2009/076778; WO 2010/003225; WO 2010/003235; WO 2011/03522; WO 2010/148511; 이것들은 본원에 참고로 포함됨), 및 곤충 및 포유동물 시스템에서 생산되었다 (Noad, R. and Roy, P., 2003, Trends Microbiol 11: 438-44; Neumann et al., 2000, J. Virol., 74, 547-551). Latham 및 Galarza (2001, J. Virol., 75, 6154-6165)는 헤마글루티닌 (HA), 뉴라민다제 (NA), M1, 및 M2 유전자를 동시-발현하는 재조합 바큘로바이러스(baculovirus)로 감염된 곤충 세포에서 인플루엔자 VLP의 형성을 보고하였다. 이 연구는 인플루엔자 비리온 단백질이 진핵생물 세포에서 동시-발현 시 자가-조립하고 M1 매트릭스 단백질이 VLP 생산에 필요하다는 것을 입증하였다. Gomez-Puertas et al., (1999, J. Gen. Virol, 80, 1635-1645)은 M2의 과발현이 MDCK 배양물로 CAT RNA 전달을 완벽하게 차단한다는 것을 나타냈다.
인플루엔자 바이러스의 스파이크(spike) 당단백질 헤마글루티닌 (HA)은 숙주 세포에 의한 바이러스 입자의 흡수에 매우 중요하다. 그것은 시알산-함유 세포 수용체에 그것들의 부착의 원인이 되고, 그것은 바이러스 외피의 세포막과의 융합을 통한 바이러스 침투에 수반된다. 융합 활성 및 그 결과, 바이러스 감염성은 HA 전구체 분자, HA0의 이황화-결합된 폴리펩타이드 사슬, HA1 및 HA2로 분열에 의존한다. 분열, 이후의 pH-의존적 형태 변화는 막관통 폴리펩타이드 HA2의 아미노 말단에서 고도로 보존된 소수성 펩타이드의 노출 및 재배치를 초래하며, 막 융합을 중재한다.
HA는 전구체 단백질 HA0로서 합성되며, 이것은 이황화 브릿지(bridge)에 의해 함께 결합된 두 개의 서브유닛 (HA1 및 HA2)으로의 단백질 가수분해 과정을 거친다. 두 개의 구조적 특징은 HA 분열성에 수반된 것으로 생각된다: 제한된 분열성의 HA에서, 링커(linker)는 보통 단일 아르기닌으로 구성되는 반면에, 광범위한 다른 세포 타입에서 분열 가능한 HA는 X는 비염기성 아미노산인, 주요 효소 인식 모티프(motif) Arg-X-Lys/Arg-Arg가 있는 이 위치에서 일련의 다중 염기성 잔기의 삽입을 가진다. 다수의 염기성 분열 부위를 가진 HA는 바이러스 진입 단계에서, 세포 외 공간에서, 또는 WSN 균주에 대하여 나타난 바와 같이, 바이러스 입자에서 활성화되는 일염기 링커를 가진 HA와 달리, 세포 표면 상의 버딩(budding) 부위에 도달하기 전에 세포 외 유출 수송 경로에서 분열된다. HA 분열의 제2 결정요인은 분열 부위의 가까운 부근에 존재하고 프로테아제 접근성을 방해하는 탄수화물 측쇄인 것으로 나타난다. 이 탄수화물의 손실은 향상된 HA 분열성 및 바이러스 병원성을 초래한다.
포유동물 및 비병원성 조류 인플루엔자 바이러스 균주는 HA0 전구체를 세포 밖으로 분열시킬 수 있는 프로테아제를 분비하는 세포의 제한된 범위의 결과로서 해부학적으로 국소화된 감염을 유발한다 (Chen J, et. al. 1998, Cell. Vol 95　: 409-417). 인간의 인플루엔자 감염 시 HA0 분열의 원인이 되는 프로테아제는 기도의 세포에 의해, 또는 박테리아 또는 마이코플라스마를 동시에 감염시킴으로써 분비되거나, 또는 그것들은 감염에 대한 염증 반응에서 생산될 수도 있다. 주요 프로테아제 후보 물질은 세기관지 상피의 클라라 세포에 의해 생산된 트립타제 클라라(Clara)이고, 제한된 조직 분포를 갖는다 (상기도). 프로테아제는 H1, H2, H3, 및 H6의 분열 부위에서 발견된 일염기 서열 Q/E-X-R에 특이적이다. H9의 HA 및 B 균주는 각각 SSR 및 KER 서열과 약간 다른 일염기 분열 부위를 나타낸다. 물새에서 나타나는 장 및 호흡기 감염을 유발하는 대부분의 인플루엔자 바이러스에 대하여 아무 프로테아제도 확인되지 않았다. 대부분의 세포주는 외인성 프로테아제 (보통 트립신)가 추가되지 않으면 다중 주기 복제를 지지하지 않는다.
매우 병원성인 조류 균주에서는, 하지만, HA0은 더 광범위한 세포 내 프로테아제의 과에 의해 분열되며, 전신성 독감 감염을 초래한다. 이 병원성의 차이는 HA0 분열 부위에서의 구조적 차이와 연관성이 있다. 병원성 균주는 일염기 부위 내에, 또는 그 옆에 다염기 아미노산의 삽입물을 갖는다. 이 경우에 분열은 세포 내로 발생하며 수반된 프로테아제는 퓨린, 및 다른 서브틸리신-유사 효소로서 확인되었고, 골지(Golgi)에서 발견되었고 호르몬 및 성장 인자 전구체의 번역 후 과정에 수반된다. 퓨린 인식 서열 R-X-R/K-R은 H5 및 H7의 HA0 분열 부위에서 빈번한 삽입 아미노산이다. 효소의 넓은 조직 분포, 및 세포 내 분열의 효율은 이 바이러스에 의해 유발된 광범위하고 치명적인 전신성 감염에 기여한다.
HA 분열 부위는 바이러스 약독화에 대한 표적인데, 숙주 프로테아제에 의한 HA0 전구체의 HA1 및 HA2 단편으로의 활성화 분열이 모든 인플루엔자 A 및 B 바이러스 균주의 복제 주기의 단계이기 때문이다. 분열된 HA만이 엔도솜 및 비리온 막 사이에서 융합을 중재하는 HA2 단편의 소수성 N 말단을노출하기 위한 수용체-중재된 세포 내 섭취(endocytosis) 후에 엔도솜의 산성 환경에서 형태 변화를 거칠 수 있다.
Horimoto T, et.al. (2006, Vaccine, Vol 24　: 3669-3676)은 H5에서 H5 다염기 분열 부위 (RERRRKKR↓G)의 폐지를 기술한다. 선택된 돌연변이는 마우스의 면역원성 연구에 제출되었는데, 처음 4개의 하전된 아미노산 (RERR)의 결실 및 다염기 분열 부위를 비활성화시키기 위한 변형 (RKKR를 TETR로)을 가진 돌연변이를 포함한다. 분열 부위의 폐지는 돌연변이 H5의 면역원성 특성에 영향을 미치지 않았다. 돌연변이 NIBSC 05/240 NIBSC 인플루엔자 참조 바이러스 NIBG-23을 생산하기 위한 다염기 부위의 폐지 (GERRRKKR↓G는 RETR로 대체됨)가 또한 보고되었다. Hoffman et. al. (2002, 2002, Vaccine, Vol 20　: 3165-3170)은 난세포에서 발현을 촉진하기 위해 H5 HA의 다염기 분열 부위를 H6의 일염기 부위로 대체하였다. 처음 4개의 잔기는 결실되었고 다염기 부위의 마지막 4개의 아미노산은 IETR로 대체되었다 (RERRRKKR↓G의 IETR↓G로의 대체). 이 돌연변이 H5는 숙주 세포에서 바이러스 복제 및 생산에 필요한 낮은 pH에서 높은 발현 수준, 잠재적 단백질 가수분해 및 형태 변화를 나타냈으며, 면역원성 데이터는 보고되지 않았다. 이 연구들은 바이러스 입자의 병독성을 줄이기 위해 이용될 수 있으며 (이 경우에 진짜 바이러스가 복제됨), 바이러스가 숙주 난세포를 죽이지 않고 복제할 수 있게 한다는 것을 나타낸다. 이러한 돌연변이가 없으면, 바이러스는 높은 역가에 도달하기 전에 난세포를 죽인다.
Sirko et al.의 WO2013043067은 변형된 H5 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 암호화하는 cDNA를 함유하는 닭에 대한 DNA 백신을 기술하며, HA 서브유닛 사이에서 단백질 가수분해 분열 부위가 결실된다. Sirko et al.은 이것이 백신의 더 높은 안전성 및 길고, 비-가공된 폴리펩타이드 형태의 "초항원(super antigen)" 발현을 제공한다고 진술한다. Sirko et al.은 HA의 암호화 영역이 조류 세포에서 단백질 생산량이 최대 수율을 달성하는 이러한 방법으로 변형된다고 진술한다. 주요 변형은 닭에 대한 코돈 최적화 및 HA의 단백질 가수분해 감작 영역의 결실이다.
WO 2013/044390은 변형된 헤마글루티닌 (HA)을 가진 식물에서 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생산하는 방법을 기술하며, 변형된 HA 단백질은 변형된 단백질 가수분해 루프를 포함한다. 변형된 HA는 조절 영역 동부 모자이크 바이러스 (Cowpea mosaic virus; CPMV) HT 및 강낭콩 황고병 바이러스 (Bean Yellow Dwarf virus; BeYDV)의 제미니바이러스(geminivirus) 증폭 요소의 존재 하에 발현된다.
Yang et al.의 US 2008/0069821은 백신으로서 인플루엔자 바이러스의 생산에 사용되는 인플루엔자 HA의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 변종을 개시한다. 재조합체 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 HA의 변종으로부터 유래된 상보성 세그먼트와 결합하여, 마스터 인플루엔자 바이러스의 게놈 세그먼트에 해당하는 벡터의 서브세트를 도입함으로써 얻어진다. 전형적으로 마스터 균주는 백신 투여에 적절한 바람직한 특성에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 백신 생산, 예를 들어, 생 약독화 백신의 생산에 대하여, 마스터 기증자 바이러스 균주가 약독화된 표현형, 한랭 적응, 및/또는 온도 감도에 대하여 선택될 수 있다.
요약
본 발명은 식물에서 바이러스 유사 입자 및 변형된 HA 단백질의 생산에 관한 것이다.
식물에서 바이러스 유사 입자 및 HA 단백질의 개선된 생산을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본원에서는, 식물에서 활성인 발현 인핸서(enhancer)를 포함하고 변형된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 변형된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합된 핵산이 기술된다.
더 나아가 본원에서는, 식물에서 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생산하는 방법 (A)이 기술되는데,
a) 식물에서 활성인 발현 인핸서를 포함하고 변형된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 변형된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합된 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하는 단계;
b) 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양하여, 이로 인해 VLP를 생산하는 단계를 포함한다.
이에 더하여, 본원에서는, 식물에서 인플루엔자 바이러스 유사 입자s (VLP)를 생산하는 방법 (B)이 기술되는데,
a) 식물에서 활성인 발현 인핸서를 포함하고 변형된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 변형된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합된 핵산을 포함하는, 식물, 또는 식물의 일부를 제공하는 단계, 및
b) 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양하여, 이로 인해 VLP를 생산하는 단계를 포함한다.
더 나아가 본원에서는, 식물에서 감소되거나 폐지된 분열을 나타내는 하나 이상의 프로테아제 분열 부위를 포함하는 변형된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 변형된 HA 단백질을 생산하는 방법 (C)이 기술되는데,
a) 식물에서 활성인 발현 인핸서를 포함하고 변형된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 변형된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합된 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하는 단계,
b) HA 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양하여, 이로 인해 변형된 HA 단백질을 생산하는 단계,
c) 식물을 수득하고 변형된 HA 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.
상기 기술된 방법 (A), (B) 또는 (C)는
c) 식물을 수득하는 단계, 및
d) VLP를 정제하는 단계로서, VLP는 크기가 80-300 nm의 범위에 있는 단계를 더 포함할 수도 있다.
더 나아가, 본원에서는, 식물에서 HA 단백질의 생산 수율을 증가시키는 방법 (D)이 기술되는데,
a) 식물에서 활성인 발현 인핸서를 포함하고 변형된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 변형된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합된 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하는 단계;
b) HA 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양하여, 이로 인해 변형된 HA 단백질을 생산하는 단계,
c) 식물을 수득하고 HA 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.
발현 인핸서는 CPMVX, CPMVX+또는 CPMV-HT+일 수도 있다. 더 나아가, 뉴클레오타이드 산은 제미니바이러스 증폭 요소를 포함하지 않을 수도 있다. 그러므로 뉴클레오타이드 산은 강낭콩 황고병 바이러스 긴 유전자 간 영역 (BeYDV LIR), 및 BeYDV 짧은 유전자 간 영역 (BeYDV SIR)을 포함하지 않을 수도 있다. 변형된 단백질 가수분해 루프는 프로테아제에 의해 감소되거나 폐지된 분열을 나타내는 하나 이상의 프로테아제 분열 부위를 포함할 수도 있다. 프로테아제는 클라라-유사하거나 또는 퓨린-유사할 수도 있다. 더 나아가 변형된 단백질 가수분해 루프는 링커 서열을 포함할 수도 있고 링커 서열은 아미노산 서열 GG, TETQ 또는 TETR을 가질 수도 있다. 변형된 HA는 고유한 또는 비-고유한 신호 펩타이드를 포함할 수도 있다. 더 나아가 변형된 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 변형된 단백질 가수분해 루프, 인플루엔자 막관통 도메인, 및 세포질 꼬리를 포함하는 변형된 HA 엑토도메인(ectodomain)을, 연속적으로, 암호화하는 키메라 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수도 있으며, 변형된 HA 엑토도메인은 제1 인플루엔자 균주의 것이며 막관통 도메인 및 세포질 꼬리는 제2 인플루엔자 균주의 것이다.
변형된 단백질 가수분해 루프는 프로테아제에 의해 감소되거나 폐지된 분열을 나타내는 하나 이상의 프로테아제 분열 부위를 포함할 수도 있다. 더 나아가, HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 B HA, C, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, 및 H16으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또한 본원에서는, 방법 (A)에 의해 생산된 바이러스 유사 입자 (VLP)가 기술된다. 바이러스 유사 입자 (VLP)는 식물-특이적 N-글리칸, 또는 변형된 N-글리칸을 포함할 수도 있다.
본 개시물은 또한 면역 반응을 유도하는 VLP의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한 본원에서는, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 식물에서 활성인 조절 영역과 작동 가능하게 결합된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 기술되며, HA는 변형된 단백질 가수분해 루프 서열을 포함한다. 핵산은 변형된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 HA를 암호화할 수도 있고, 단백질은 헤마글루티닌 (HA) 활성을 갖는다. 핵산을 포함하는 식물이 또한 제공된다. 또한 식물에서 생산된 바이러스 유사 입자 (VLP), 핵산에 의해 암호화된 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA)을 포함하는 VLP 및 식물로부터 유래된 하나 또는 하나 이상의 지질이 포함된다.
본 발명의 이 요약은 반드시 본 발명의 모든 특징을 기술할 필요는 없다.
본 발명의 이러한 및 다른 특징은 첨부된 도에 대한 참조가 이루어지는 하기 기술으로부터 더 분명해질 것이다.
도 1은 A-2X35S/CPMV-HT/H5 Indonesia/NOS (구조 번호 489)를 제조하는데 사용된 구성요소를 나타낸다. 도 1A는 프라이머 IF-H5A-I-05.s1+3c (서열 번호: 2)를 나타낸다. 도 1B는 프라이머 IF-H5dTm.r (서열 번호: 3)을 나타낸다. 도 1C는 구조 1191의 개략도를 나타낸다. 도 1D는 구조 1191 (서열 번호 4)을 나타낸다. 도 1E는 발현 카세트 번호 489 (서열 번호 5)를 나타낸다. 도 1F는 인플루엔자 A/Indonesia/5/2005 (H5N1)의 H5의 아미노산 서열 (서열 번호: 6)을 나타낸다. 도 1G는 인플루엔자 A/Indonesia/5/2005 (H5N1)의 H5를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 42)을 나타낸다.
도 2는 B-2X35S/CPMV HT/M2 New Caledonia/NOS (구조 번호 1261)를 제조하는데 사용되는 구성요소를 나타낸다. 도 2A는 프라이머 IF-S1-M1+M2ANC.c (서열 번호: 7)을 나타낸다. 도 2B는 프라이머 IF-S1-4-M2ANC.r (서열 번호: 8)을 나타낸다. 도 2C는 합성된 M2 유전자 (Genbank 수납 번호 DQ508860의 715-982에 결합된 nt 1-26에 해당함)에 대한 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 9)을 나타낸다. 도 2D는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 1261을 나타낸다. 인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999 (H1N1)의 M2는 밑줄 그어져 있다. (서열 번호: 10). 도 2E는 인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999 (H1N1)의 M2의 아미노산 서열 (서열 번호: 11)을 나타낸다.
도 3은 C-2X35S/CPMV-HT/M2 Puerto Rico/NOS (구조 번호 859)를 제조하는데 사용된 구성요소를 나타낸다. 도 3A는 합성된 M2 유전자의 뉴클레오타이드 서열 (Genebank 수납 번호 EF467824의 nt 740-1007에 결합된 nt 26-51에 해당함) (서열 번호: 12)을 나타낸다. 도 3B는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 859를 나타낸다. 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)의 M2는 밑줄 그어져 있다. (서열 번호: 13). 도 3C는 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)의 M2의 아미노산 서열 (서열 번호: 14)을 나타낸다.
도 4는 BeYDV+레플리카제 증폭 시스템 내 G-2X35S/CPMV-HT/PDISP/HA B Brisbane/NOS (구조 번호 1008)을 제조하는데 사용된 구성요소를 나타낸다. 도 4A는 구조 1194의 개략도를 나타낸다. 플라스미드 선형화에 사용된 SacII 및 StuI 제한 효소 부위는 도면에 주석이 달린다. 도 4B는 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 구조 1194 (밑줄 그어져 있음)를 나타낸다. 플라스토시아닌-P19-플라스토시아닌 침묵 억제자 발현 카세트가 있는 BeYDV+레플리카제 증폭 시스템 내 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS (서열 번호: 31). 도 4C는 BeYDV 왼쪽 LIR에서 BeYDV 오른쪽 LIR까지의 발현 카세트 번호 1008을 나타낸다. 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA는 밑줄 그어져 있다. (서열 번호: 32).
도 5는 I-2X35S/CPMV-HT/BeYDV+레플리카제 증폭 시스템 내 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Brisbane/NOS (구조 번호 1059)를 제조하는데 사용된 구성요소를 나타낸다. 도 5A는 프라이머 1039+1059.r (서열 번호: 38)을 나타낸다. 도 5B는 프라이머 1039+1059.c (서열 번호: 39)를 나타낸다. 도 5C는 BeYDV 왼쪽 LIR에서 BeYDV 오른쪽 LIR까지의 발현 카세트 번호 1059를 나타낸다. 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA (SEQ ID NO: 40)는 밑줄 그어져 있다. 도 5D는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA의 아미노산 서열 (서열 번호: 41)을 나타낸다. 도 5E는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA의 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO: 43)을 나타낸다.
도 6은 BeYDV(m)+레플리카제 증폭 시스템 내 B-2X35S/CPMV-HT/HA B Wisconsin/NOS (구조 번호 1462)를 제조하는데 사용된 구성요소를 나타낸다. 도 6A는 프라이머 IF-HAB110.S1+3c (서열 번호: 49)를 나타낸다. 도 6B는 프라이머 IF-HAB110.s1-4r (서열 번호: 50)을 나타낸다. 도 6C는 합성된 HA B Wisconsin의 뉴클레오타이드 서열 (Genbank 수납 번호 JN993010) (서열 번호: 51)을 나타낸다. 도 6D는 구조 193의 개략도를 나타낸다. 도 6E은 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 구조 193 (밑줄 그어져 있음)을 나타낸다. 플라스토시아닌-P19-플라스토시아닌 침묵 억제자 발현 카세트가 있는 BeYDV(m)+레플리카제 증폭 시스템 내 2X35S/CPMV-HT/NOS (서열 번호: 52). 도 6F는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 1462의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 HA (서열 번호: 53)는 밑줄 그어져 있다. 도 6G는 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 HA의 아미노산 서열 (서열 번호: 54)을 나타낸다. 도 6H는 구조 1462의 개략도를 나타낸다.
도 7은 BeYDV(m)+레플리카제 증폭 시스템 내 C-2X35S/CPMV-HT/결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 HA B Wisconsin/NOS (구조 번호 1467)을 제조하는데 사용된 구성요소를 나타낸다. 도 7A는 프라이머 HAB110(PrL-).r (서열 번호: 55)을 나타낸다. 도 7B는 프라이머 HAB110(PrL-).c (서열 번호: 56)를 나타낸다. 도 7C는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 1467의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 HA (서열 번호: 57)는 밑줄 그어져 있다. 도 7D는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 아미노산 서열 (서열 번호: 58)을 나타낸다. 도 7E는 구조 1467의 개략도를 나타낸다.
도 8은 A-2X35S/CPMV-HT/결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Brisbane/NOS (구조 번호 1039)을 제조하는데 사용된 구성요소를 나타낸다. 도 8A는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 1039의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 HA (서열 번호: 15)는 밑줄 그어져 있다. 도 8B는 구조 1039의 개략도를 나타낸다.
도 9는 구조 번호 1008의 플라스미드 맵을 나타낸다. 구조 번호 1008은 인플루엔자 균주 B/Brisbane/60/2008의 야생형 HA의 발현을 지시한다. 이 구조는 DNA 증폭을 위해 BeYDV-유래 요소를 포함한다.
도 10은 구조 번호 1059의 플라스미드 맵을 나타낸다. 구조 번호 1059는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 균주 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 발현을 지시한다. 이 구조는 DNA 증폭을 위해 BeYDV-유래 요소를 포함한다.
도 11은 구조 번호 1261의 플라스미드 맵을 나타낸다. 구조 번호 1261은 인플루엔자 균주 A/New Caledonia/20/99 (H1N1)의 야생형 M2의 발현을 지시한다.
도 12는 구조 번호 859의 플라스미드 맵을 나타낸다. 구조 번호 859는 인플루엔자 균주 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)의 야생형 M2의 발현을 지시한다.
도 13A는 아그로필트레이션된(agroinfiltrated) 니코티아나 벤타미아 나(Nicotiana benthamiana ) 잎에서 HA 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. "1008": 증폭 요소 (BeYDV)의 존재 하에 B/Brisbane/60/2008의 야생형 HA의 발현; "1008+1261": A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 증폭 요소 (BeYDV)의 존재 하에 야생형 HA from B/Brisbane/60/2008의 동시-발현; "1059": 증폭 요소 (BeYDV)의 존재 하에 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 발현; "1059+1261": A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 증폭 요소 (BeYDV)의 존재 하에 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 동시-발현. 3번의 별개의 침윤 (A, B 및 C)으로부터 식물이 분석되었다. 비는 동시-발현 실험에서 사용된 아그로박테리움(Agrobacterium) 배양물의 비율이다. 도 13B는 HA-생산 식물의 미가공 단백질 추출물의 헤마글루티닌화 수용량의 비교를 나타낸다.
도 14는 아그로필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 HA 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. "1059": 증폭 요소 (BeYDV)의 존재 하에 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 발현; "1059+1261": A/New Caledonia/20/99와 함께 증폭 요소 (BeYDV)의 존재 하에 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 동시-발현. "1059+859": A/Puerto Rico/8/34의 M2와 함께 증폭 요소 (BeYDV)의 존재 하에 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 동시-발현. 3번의 별개의 침윤 (A, B 및 C)으로부터 식물이 분석되었다. 비는 동시-발현 실험에서 사용된 아그로박테리움 배양물의 비율이다.
도 15는 여러 인플루엔자 균주의 HA의 링커를 둘러싼 영역의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다: H1 New Cal (서열 번호: 22); H1 Brisbane (서열 번호: 23); H1 Sol Islands (서열 번호: 24); H2A Singapore (서열 번호: 25); H3A Brisbane (서열 번호: 26); H3A WCN (서열 번호: 27); H5 Anhui (서열 번호: 28); H5 Indo (서열 번호: 29); H5 Vietnam (서열 번호: 30); H6 Teal HK (서열 번호: 33); H7 Eq Prague (서열 번호: 34); H9A HK (서열 번호: 35); B Florida (서열 번호: 36); B Malaysia (서열 번호: 37). 전구체 HA0의 분열 부위는 화살표로 표시된다.
도 16A는 아그로필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 HA 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. B/Wisconsin/1/2010의 HA는 A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 동시-발현된다. 단백질 추출물 10 마이크로그램이 레인마다 로딩되었다. "C+": 양성 대조군, 영국 국립생물표준통제연구원(National Institute for Biological Standards and Control, United Kingdom)의 반-정제된 B/Wisconsin/1/2010 바이러스; "1462": 증폭 요소 (BeYDV)의 존재 하에 B/Wisconsin/1/2010의 야생형 HA의 발현; "1467": 증폭 요소 (BeYDV)의 존재 하에 B/Wisconsin/1/2010의 돌연변이 HA의 발현; "1462+1261": M2의 함께 증폭 요소 (BeYDV)의 존재 하에 B/Wisconsin/1/2010의 야생형 HA의 동시-발현; "1467+1261": M2와 함께 증폭 요소 (BeYDV)의 존재 하에 B/Wisconsin/1/2010의 돌연변이 HA의 동시-발현. 비는 발현 및 동시-발현 실험에 사용된 각 아그로박테리움에 대한 시각적 밀도를 나타낸다. 도 16B는 AGL1/1462, AGL1/1467, AGL1/1462+AGL1/1261 및 AGL1/1467+AGL1/1261로 형질전환된 식물의 미가공 단백질 추출물의 헤마글루티닌화 수용량의 비교를 나타낸다.
도 17A 및 17B는 아그로필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 HA 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. "1008": 증폭 요소 (BeYDV)의 존재 하에 B/Brisbane/60/2008의 야생형 HA의 발현; "1008+1261": A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 증폭 요소 (BeYDV)의 존재 하에 B/Brisbane/60/2008의 야생형 HA의 동시-발현; "1039": 증폭 요소 (BeYDV)의 부재 시 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 발현. "1039+1261": A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 증폭 요소 (BeYDV)의 부재 시 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 동시-발현. A/Brisbane/59/2007 (H1N1)의 HA. "1059": 증폭 요소 (BeYDV)의 존재 하에 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 발현; "1059+1261": A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 증폭 요소 (BeYDV)의 존재 하에 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 동시-발현.
도 18A는 클라라-유사 및/또는 퓨린 유사 프로테아제에 의한 HA0의 HA1 및 HA2로의 분열의 개략도를 나타낸다. 도 18B는 여러 인플루엔자 균주의 HA의 서열 정렬을 나타낸다: H1 New Cal (서열 번호: 22); H1 Brisbane (서열 번호: 23); H1 Sol Islands (서열 번호: 24); H2A Singapore (서열 번호: 25); H3A Brisbane (서열 번호: 26); H3A WCN (서열 번호: 27); H5 Anhui (서열 번호: 28); H5 Indo (서열 번호: 29); H5 Vietnam (서열 번호: 30); H6 Teal HK (서열 번호: 33); H7 Eq Prague (서열 번호: 34); H9A HK (서열 번호: 35); B Florida (서열 번호: 36); B Malaysia (서열 번호: 37). 도 18C는 H5 균주, A/Anhui/1/2005 (H5N1) 서열 번호: 69, A/Indonesia/5/2005 (H5N1) 서열 번호: 70, A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) 서열 번호: 71, 및 타입 B 균주, B/Florida/4/2006 서열 번호: 72, 및 B/Malaysia/2506/2004 서열 번호: 73에서 분열 부위의 일부의 결실을 나타낸다.
도 19는 H5/Indo에서 분열 부위의 돌연변이를 나타낸다. 고유한 서열 (서열 번호: 44); TETR (서열 번호: 45)을 포함하는 H5/Indo 변형된 분열 부위; TETQ (서열 번호: 46)를 포함하는 H5/Indo 변형된 분열 부위.
도 20은 단백질 가수분해 루프 내에서 돌연변이를 포함하는 다른 변형된 H5/Indo HA의 효소-추출 후에 초기 바이오매스에서 발견된 역가를 나타낸다. H5/Indo 대조군 (구조 489); GG 링커로 대체된 H5/Indo 단백질 가수분해 루프 (구조 928); TETR 링커로 대체된 H5/Indo 단백질 가수분해 루프 (구조 676); TETQ 링커로 대체된 H5/Indo 단백질 가수분해 루프 (구조 766).
도 21은 타입 B HA의 단백질 가수분해 루프를 변형시키기 위한 다양한 접근법을 나타낸다. 도 21A는 고유한 B/Brisbane/60/2008의 아미노산 서열 (서열 번호: 16)을 나타낸다. 밑줄 그어진 부분은 단백질 가수분해 루프 및 HA2 도메인이다. 도 21B는 변형된 단백질 가수분해 루프를 가진 B/Brisbane/60/2008의 아미노산 서열 (서열 번호: 17)을 나타내며, 서열 AKLLKERGFFGAIAGFLEG을 포함하는 19개 아미노산 잔기가 GG 링커 (이탤릭체)로 대체된다. 도 21C는 B/Brisbane/60/2008의 아미노산 서열 (서열 번호: 18)을 나타내며, 서열 PPAKLLKER을 포함하는 9개 아미노산은 -GSSSGSSSG- 링커 (이탤릭체)로 대체되었다. 도 21D는 고유한 H3 A/Perth/16/2009의 아미노산 서열 (서열 번호: 19)을 나타낸다. 도 21E는 GS 링커 (이탤릭체)로 대체된 서열 RNVPEKQTRGIF를 포함하는 12개 아미노산 잔기를 가진 H3 A/Perth/16/2009의 아미노산 서열 (서열 번호: 20)을 나타낸다. 도 21F는 GSSGSSGSS- 링커 (이탤릭체)로 대체된 서열 RNVPEKQTR을 포함하는 9개 아미노산 잔기를 가진 H3 A/Perth/16/2009의 아미노산 서열 (서열 번호: 21)을 나타낸다.
도 22는 아그로필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 HA 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. H5/Indo의 HA. 상단 패널 각 레인에 로딩된 구성요소의 목록; 하단 패널 웨스턴 블롯. C: 재조합 H5 Indonesia/5/05 S-STD-0002; 1차 항체: 항-HA A/Indonesia/05/2005 CBER # S-BIO-0003 1/50 000; 블롯. 레인1 및 2: H5/Indo 대조군 (구조 489); 레인3 및 4 GG 링커로 대체된 H5/Indo 단백질 가수분해 루프 (구조 928); 레인5 및 6 TETR 링커로 대체된 H5/Indo 단백질 가수분해 루프 (구조 676); 레인7 및 8 TETQ 링커로 대체된 H5/Indo 단백질 가수분해 루프 (구조 766); 레인 9 MW 마커; 레인 10 H5 대조군.
도 23은 TETR 분열 부위 돌연변이를 가진 A/Indonesia/5/2005의 B-2X35S/CPMV-HT/H5 (구조 번호 676)를 제조하는데 사용된 구성요소를 나타낸다. 도 23A는 프라이머 서열 MutCleavage-H5(Indo).r (서열 번호: 74)을 나타낸다. 도 23B는 프라이머 서열 MutCleavage-H5(Indo).c (서열 번호: 75)를 나타낸다. 도 23C은 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 676에 대한 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 76)을 나타낸다. 인플루엔자 A/Indonesia/5/2005 (H5N1) TETR 분열 부위 돌연변이의 H5는 밑줄 그어져 있다. 도 23D는 인플루엔자 A/Indonesia/5/2005 (H5N1)의 H5의 TETR 분열 부위 돌연변이의 아미노산 서열 (서열 번호: 77)을 나타낸다. 도 23E는 구조 번호 676의 개략도를 나타낸다.
도 24는 TETQ 분열 부위 돌연변이를 가진 A/Indonesia/5/2005의 B-2X35S/CPMV-HT/H5 (구조 번호 766)를 제조하는데 사용된 구성요소를 나타낸다. 도 24A는 프라이머 서열 H5I505_TETQ.r (서열 번호: 78)을 나타낸다. 도 24B는 프라이머 서열 H5I505_TETQ.c (서열 번호: 79)를 나타낸다. 도 24C는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 766에 대한 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 80)을 나타낸다. 인플루엔자 A/Indonesia/5/2005 (H5N1) TETQ 분열 부위 돌연변이의 H5는 밑줄 그어져 있다. 도 24D는 인플루엔자 A/Indonesia/5/2005 (H5N1)의 H5의 TETQ 분열 부위 돌연변이의 아미노산 서열 (서열 번호: 81)을 나타낸다. 도 24E는 구조 번호 766의 개략도를 나타낸다.
도 25는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 A/Indonesia/5/2005의 B-2X35S/CPMV-HT/H5 (구조 번호 928)를 제조하는데 사용된 구성요소를 나타낸다. 도 25A는 프라이머 서열 H5I505(PrL-).r (서열 번호: 82)을 나타낸다. 도 25B는 프라이머 서열 H5I505(PrL-).c (서열 번호: 83)을 나타낸다. 도 25C는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 928에 대한 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 84)을 나타낸다. 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 A/Indonesia/5/2005 (H5N1)의 H5는 밑줄 그어져 있다. 도 25D는 결실된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 인플루엔자 A/Indonesia/5/2005 (H5N1)의 H5의 돌연변이의 아미노산 서열 (서열 번호: 85)을 나타낸다. 도 25E는 구조 번호 928의 개략도를 나타낸다.
도 26A는 여러 인핸서 서열, CPMVX, 및 CPMVX+(CPMVX, 및 스터퍼(stuffer) 단편을 포함하며, 이 비-제한 예에서, 이것은 다클로닝 부위 및 식물 코자크 서열을 포함함)의 예의 일반적인 개략도를 나타내며, 본원에서 기술된 바와 같다. CPMCX 및 CPMVX+는 각각 그것들의 5' 끝, 및 3' 끝에서, 식물 조절 영역, 연속적으로, 원하는 뉴클레오타이드 서열 (ATG 개시 부위 및 종결 부위), 3'UTR, 및 종결자서열에 작동 가능하게 결합된 것으로 나타난다. 본원에서 기술된 구초 CPMVX의 예는 CPMV160이다. 본원에서 기술된 구조 CPMVX+의 예는 CPMV160+이다. 도 26B는 CPMV-HT 발현 구조, 및 CPMV160+기반 발현 구조를 포함하는 식물에서 생산된 변형된 HA 단백질의 미가공 단백질 추출물에서 상대적인 헤마글루티닌화 역가 (HMG)를 나타낸다. 단백질 가수분해 루프가 결실되고 PDI 신호 펩타이드를 가진 HA B Brisbane/60/08 (구조 번호 1039, 5'UTR: CMPVHT; 및 구조 번호 1937, 5'UTR: CMPV160+; 실시예 5.7 참조), 단백질 가수분해 루프가 결실되고, 막관통 도메인 및 세포질 꼬리가 H1의 그것으로 대체된 B Brisbane/60/08+H1Tm, 단백질 가수분해 루프가 결실되고 PDI 신호 펩타이드를 가진 B Massachusetts/2/2012 2012 (구조 번호 2072, 5'UTR: CMPV HT; 및 구조 번호 2050, 5'UTR: CMPV160+; 실시예 5.14 참조), 단백질 가수분해 루프가 결실되고, 막관통 도메인 및 세포질 꼬리가 H1 A/California/07/2009의 것으로 대체되고 PDI 신호 펩타이드를 가진 B Massachusetts/2/2012+H1Tm (구조 번호 2074, 5'UTR: CMPV HT; 및 구조 번호 2060, 5'UTR: CMPV160+; 실시예 5.15 참조), 단백질 가수분해 루프가 결실되고 고유한 신호 펩타이드를 가진 B Wisconsin/1/2010 (구조 번호 1445, 5'UTR: CMPV HT; 및 구조 번호 1975, 5'UTR: CMPV160+; 실시예 5.16 참조), 및 단백질 가수분해 루프가 결실되고, 막관통 도메인 및 세포질 꼬리가 H1 A/California/07/2009의 것으로 대체되고 고유한 신호 펩타이드를 가진 B Wisconsin/1/2010+H1Tm (구조 번호 1454, 5'UTR: CMPV HT; 및 구조 번호 1893, 5'UTR: CMPV160+; 실시예 5.18 참조)의 발현에 대한 데이터가 나타난다.
도 27A는 원하는 뉴클레오타이드 서열에 융합된 CPMV HT 및 CPMV HT+의 인핸서 서열의 일반적인 개략도를 나타낸다. 이 도면에서 나타난 모든 요소가 인핸서 서열 내에 필요한 것은 아닐 수도 있다. 추가적인 요소는 코모바이러스(comovirus) 3' 비번역 영역 (UTR), 플라스토시아닌 3' UTR, 또는 코모바이러스 3' UTR 및 플라스토시아닌 3' UTR의 조합을 암호화하는 서열을 포함하는, 원하는 뉴클레오타이드 서열 (미도시)의 3' 끝에 포함될 수도 있다. 도 27B는 CPMV-HT 발현 구조, 및 CPMV HT+기반 발현 구조를 포함하고, 원하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합된 식물에서 생산된 단백질의 미가공 단백질 추출물에서 상대적인 헤마글루티닌화 역가를 나타낸다. 단백질 가수분해 루프가 결실되고 PDI 신호 펩타이드를 가진 HA B Brisbane/60/08 (구조 번호 1039: CPMV HT; 실시예 5.7 참조 및 구조 번호 1829: CPMV HT+; 실시예 5.12 참조), 단백질 가수분해 루프가 결실되고, 막관통 도메인 및 세포질 꼬리가 H1 A/California/07/2009의 것으로 대체되고, PDI 신호 펩타이드를 가진 B Brisbane/60/08+H1TM (구조 번호 1067: CPMV HT; 실시예 5.14 참조 및 구조 번호 1875: CPMV HT+; 실시예 5.19 참조), 단백질 가수분해 루프가 결실되고, PDI 신호 펩타이드를 가진 B Massachusetts/2/2012 (구조 번호 2072: CMPV HT; 실시예 5.15 참조 및 구조 번호 2052: CMPV HT+; 실시예 5.20 참조), 단백질 가수분해 루프가 결실되고, 막관통 도메인 및 세포질 꼬리가 H1 A/California/07/2009의 것으로 대체되고 PDI 신호 펩타이드를 가진 B Massachusetts/2/2012+H1Tm (구조 번호 2074: CMPV HT; 실시예 5.16 참조 및 구조 번호 2062: CMPV HT+; 실시예 5.21 참조), 단백질 가수분해 루프가 결실되고 고유한 신호 펩타이드를 가진 B Wisconsin/1/2010 (구조 번호 1445: CMPV HT; 실시예 5.17 참조 및 구조 번호 1839: CMPV HT+; 실시예 5.22 참조), 및 단백질 가수분해 루프가 결실되고, 막관통 도메인 및 세포질 꼬리가 H1 A/California/07/2009의 것으로 대체되고 고유한 신호 펩타이드를 가진 B Wisconsin/1/2010+H1Tm (구조 번호 1454: CMPV HT; 실시예 5.18 참조 및 구조 번호 1860: CMPV HT+; 실시예 5.23 참조)의 발현에 대한 데이터가 나타난다.
도 28A는 아그로필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 H3 Perth 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 레인 1: (2019+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV-HT+)의 존재 하에 H3 Perth-16-09의 고유한 (야생형) HA의 동시-발현; 레인 2: (2139+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV 160+)의 존재 하에 H3 Perth-16-09의 고유한 (야생형) HA의 동시-발현; 레인 3 (2039+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV HT+)의 존재 하에 H3 Perth-16-09의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현; 레인 4: (2159+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV 160+)의 존재 하에 H3 Perth-16-09의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현.
도 28B는 아그로필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 B Malaysia 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 레인 2: (2013+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV-160+)의 존재 하에 B Malaysia 2506-04의 고유한 (야생형) HA의 동시-발현; 레인 2: (2014+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV 160+)의 존재 하에 B Malaysia 2506-04의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현.
도 28C는 아그로필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 H9 Hong Kong 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 레인 1: (1610+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV-HT)의 존재 하에 H9 Hong Kong -1037-99의 고유한 (야생형) HA의 동시-발현; 레인 2: (1630+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV-HT+) 및 증폭 요소 BEYDV의 존재 하에 H9 Hong Kong -1037-99의 고유한 (야생형) HA의 동시-발현; 레인 3: (2244+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV-HT+)의 존재 하에 H9 Hong Kong -1037-99의 고유한 (야생형) HA의 동시-발현; 레인 4: (2226+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV 160+)의 존재 하에 H9 Hong Kong -1037-99의 고유한 (야생형) HA의 동시-발현. 레인 6: (2246+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV-160+) 및 증폭 요소 BeYDV의 존재 하에 H9 Hong Kong -1037-99의 고유한 (야생형) HA의 동시-발현; 레인 7: (2225+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV-HT+)의 존재 하에 H9 Hong Kong -1037-99의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현; 레인 8: (2245+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV HT+) 및 증폭 요소 BeYDV의 존재 하에 H9 Hong Kong -1037-99의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현. 레인 9: (2227+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV 160+)의 존재 하에 H9 Hong Kong -1037-99의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현. 레인 10: (2247+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV 160+) 및 증폭 요소 BeYDV의 존재 하에 H9 Hong Kong -1037-99의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현.
도 28D는 아그로필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 B Massachusetts 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 레인 1: (2070+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV-HT)의 존재 하에 B Massachusetts -2-12의 고유한 (야생형) HA의 동시-발현; 레인 2: (2080+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV-HT+)의 존재 하에 B Massachusetts -2-12의 고유한 (야생형) HA의 동시-발현; 레인 3: (2090+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV-160+)의 존재 하에 B Massachusetts -2-12의 고유한 (야생형) HA의 동시-발현; 레인 4: (2072+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV HT)의 존재 하에 B Massachusetts -2-12의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현; 레인 5: (2052+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV HT+)의 존재 하에 B Massachusetts -2-12의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현; 레인 6: (2050+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV 160+)의 존재 하에 B Massachusetts -2-12의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현.
도 28E는 아그로필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 H2 Sin 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 레인 1: (2220+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV-HT+)의 존재 하에 H2 Singapore -1-57의 고유한 (야생형) HA의 동시-발현; 레인 2: (2222+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV 160+)의 존재 하에 H2 Singapore -1-57의 고유한 (야생형) HA의 동시-발현. 레인 3: (2221+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV-HT+)의 존재 하에 H2 Singapore -1-57의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현; 레인 4: (2223+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV 160+)의 존재 하에 H2 Singapore -1-57의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현.
도 28F는 아그로필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 B/Forida 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 레인 1: (1004+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV-HT)의 존재 하에 B/Florida의 고유한 (야생형) HA의 동시-발현; 레인 2: (1003+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV HT) 및 증폭 요소 BeYDV의 존재 하에 B/Florida의 고유한 (야생형) HA의 동시-발현. 레인 3: (2102+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV-HT+)의 존재 하에 B/Florida의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현; 레인 4: (2104+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV HT+) 및 증폭 요소 BeYDV의 존재 하에 B/Florida의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현. 레인 5: (2106+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV HT+)의 존재 하에 B/Florida+H1 California TMCT의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현. 레인 6: (2108+1261) A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 발현 인핸서 (CPMV HT+) 및 증폭 요소 BeYDV의 존재 하에 B/Florida+H1 California TMCT의 돌연변이 (변형된) HA의 동시-발현.
도 29A는 인핸서 요소 CPMV HT, CPMV HT+또는 CPMV 160+의 존재 하에 발현되는 다양한 인플루엔자 균주의 변형된 HA의 상대적인 HA 역가를 나타낸다. 활성은 같은 인핸서 요소와 함께 발현된 고유한 HA 단백질과 비교된다. H3 A Perth/16/09 (H3 Per1609), H3 Victoria/361/11 (H3 Vic26111), B Brisbane 60/2008 (HB Bris60008), B Malaysia 2506/04 (HB Mal 250604) 및 B Massachusetts 2/12 (Ma212)가 인플루엔자 M2 단백질과 동시-발현되었다.
도 30A는 프라이머 IF-S2+S4-B Bris.c (서열 번호: 86)를 나타낸다. 도 30B는 프라이머 IF-S1a4-B Bris.r (서열 번호: 87)을 나타낸다. 도 30C는 합성된 HA B Brisbane 유전자의 뉴클레오타이드 서열 (Genbank 수납 번호 FJ766840의 nt 34-1791에 해당함) (서열 번호: 88)을 나타낸다. 도 30D는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 1029의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA는 밑줄 그어져 있다. (서열 번호: 89). 도 30E는 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA의 아미노산 서열 (서열 번호: 90)을 나타낸다. 도 30F는 구조 1029의 개략도를 나타낸다. 플라스미드 선형화에 사용된 SacII 및 StuI 제한 효소 부위는 도면에 주석이 달린다.
도 31은 구조 번호 1039 및 1829 (각각 2X35S/CPMV HT PDISP/HA B Brisbane (PrL-) NOS 및 2X35S/CPMV HT+PDISP/HA B Brisbane (PrL-) NOS; 실시예 5.12 참조)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 구조 번호 1039는 선행 업계 CPMV-HT 서열 (불완전 M 단백질을 암호화하는 서열에 융합된 위치 161에서 돌연변이된 시작 코돈을 가진 CMPV 5'UTR)을 통합하고 5'UTR 및 원하는 뉴클레오타이드 서열 (PDISP/HA B Brisbane (PrL-)) 사이에서 이종 기원 코자크 서열을 포함하지 않는다. 구조 번호 1829는 160개 뉴클레오타이드를 포함하는 CPMV 5'UTR, 불완전 M 단백질을 포함하는 스터퍼 단편, 다클로닝 부위, 및 식물 코자크 서열을 포함하며 CPMV HT+기반 구조의 예이다. PDISP: 단백질 이황화 이소머라제 신호 펩타이드; NOS: 노팔린 신타제 종결자; PrL-: 결실된 단백질 가수분해 루프. 도 31A는 PDISP/HA B Brisbane (PrL-)의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 91)을 나타낸다. 도 31B는 PDISP/HA B Brisbane (PrL-)의 아미노산 서열 (서열 번호: 92)을 나타낸다. 도 31C는 구조 번호 1829 (2X35S/CPMV HT+)의 개략도를 나타낸다.
도 32는 구조 번호 1039 및 1937 (각각 2X35S/CPMV HT PDISP/HA B Brisbane (PrL-) NOS 및 2X35S/CPMV160+PDISP/HA B Brisbane (PrL-) NOS; 실시예 5.7 참조)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 구조 번호 1039는 선행 업계 CPV-HT 서열 (불완전 M 단백질을 암호화하는 서열에 융합된 위치 161에서 돌연변이된 시작 코돈을 가진 CMPV 5'UTR)을 통합하고 5'UTR 및 원하는 뉴클레오타이드 서열 (PDISP/HA B Brisbane (PrL-)) 사이에서 이종 기원 코자크 서열을 포함하지 않는다. 구조 번호 1937은 160개 뉴클레오타이드를 포함하는 CPMV 5'UTR, 스터퍼 단편 (다클로닝 부위), 및 식물 코자크 서열을 포함하며 (이 구조는 불완전 M 단백질을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다) CPMV160+(CPMVX+, X=160이면) 기반 구조의 예이다. PDISP: 단백질 이황화 이소머라제 신호 펩타이드; NOS: 노팔린 신타제 종결자; PrL-: 결실된 단백질 가수분해 루프. 도 32A는 구조 번호 1937 (2X35S/CPMV160+; CPMVX+기반 구조, X=160이면)의 개략도를 나타낸다.
도 33은 구조 번호 1067 및 1977 (각각 2X35S/CPMV HT PDISP/HA B Brisbane (Prl-)+H1 California TMCT NOS 및 2X35S/CPMV160+PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT NOS; 실시예 5.14 참조)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 구조 번호 1067는 선행 업계 CPMV-HT 서열 (불완전 M 단백질을 암호화하는 서열에 융합된 위치 161에서 돌연변이된 시작 코돈을 가진 CMPV 5'UTR)을 통합하고 5'UTR 및 원하는 뉴클레오타이드 서열 (PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT) 사이에서 이종 기원 코자크 서열을 포함하지 않는다. 구조 번호 1977은 160개 뉴클레오타이드를 포함하는 CPMV 5'UTR, 스터퍼 단편 (다클로닝 부위), 및 식물 코자크 서열을 포함하며 (이 구조는 불완전 M 단백질을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다) CPMV160+(CPMVX+, X=160이면) 기반 구조의 예이다. PDISP: 단백질 이황화 이소머라제 신호 펩타이드; NOS: 노팔린 신타제 종결자; PrL-: 결실된 단백질 가수분해 루프; TMCT: 막관통 도메인 세포질 꼬리. 도 33A는 PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 95)을 나타낸다. 도 33B는 PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열 (서열 번호: 96)을 나타낸다. 도 33C는 구조 번호 1067 (2X35S/CPMV HT; 참조 구조)의 개략도를 나타낸다. 도 33D는 구조 번호 1977 (2X35S/CPMV160+; CPMVX+기반 구조, X=160이면)의 개략도를 나타낸다.
도 34는 구조 번호 2072 및 2050 (각각 2X35S/CPMV HT PDISP/HA B Massachusetts (PrL-) NOS 및 2X35S/CPMV160+PDISP/HA B Massachusetts (PrL-) NOS; 실시예 5.15 참조)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 구조 번호 2072는 선행 업계 CPMV-HT 서열 (불완전 M 단백질을 암호화하는 서열에 융합된 위치 161에서 돌연변이된 시작 코돈을 가진 CMPV 5'UTR)을 통합하고 5'UTR 및 원하는 뉴클레오타이드 서열 (PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)) 사이에서 이종 기원 코자크 서열을 포함하지 않는다. 구조 번호 2050은 160개 뉴클레오타이드를 포함하는 CPMV 5'UTR, 스터퍼 단편 (다클로닝 부위), 및 식물 코자크 서열 (이 구조는 불완전 M 단백질을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다)을 포함하며 CPMV160+(CPMVX+, X=160이면) 기반 구조의 예이다. PDISP: 단백질 이황화 이소머라제 신호 펩타이드; NOS: 노팔린 신타제 종결자; PrL-: 결실된 단백질 가수분해 루프. 도 34A는 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 97)을 나타낸다. 도 34B는 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)의 아미노산 서열 (서열 번호: 98)을 나타낸다. 도 34C는 구조 번호 2072 (2X35S/CPMV HT; 참조 구조)의 개략도를 나타낸다. 도 34D는 구조 번호 2050 (2X35S/CPMV160+; a CPMVX+기반 구조, X=160이면)의 개략도를 나타낸다.
도 35는 구조 번호 2074 및 2060 (각각 2X35S/CPMV HT PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT NOS 및 2X35S/CPMV160+PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT NOS; 실시예 5.16 참조)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 구조 번호 2074는 선행 업계 CPMV-HT 서열 (불완전 M 단백질을 암호화하는 서열에 융합된 위치 161에서 돌연변이된 시작 코돈을 가진 CMPV 5'UTR)을 통합하고 5'UTR 및 원하는 뉴클레오타이드 서열 (PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT) 사이에서 이종 기원 코자크 서열을 포함하지 않는다. 구조 번호 2060은 160개 뉴클레오타이드를 포함하는 CPMV 5'UTR, 스터퍼 단편 (다클로닝 부위), 및 식물 코자크 서열 (이 구조는 불완전 M 단백질을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다)을 포함하며 CPMV160+(CPMVX+, X=160이면) 기반 구조의 예이다. PDISP: 단백질 이황화 이소머라제 신호 펩타이드; NOS: 노팔린 신타제 종결자; PrL-: 결실된 단백질 가수분해 루프; TMCT: 막관통 도메인 세포질 꼬리. 도 35A는 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 99)을 나타낸다. 도 35B는 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열 (서열 번호: 100)을 나타낸다. 도 35C는 구조 번호 2074 (2X35S/CPMV HT; 참조 구조)의 개략도를 나타낸다. 도 35D는 구조 번호 2060 (2X35S/CPMV160+; a CPMVX+기반 구조, X=160이면)의 개략도를 나타낸다.
도 36은 구조 번호 1445, 1820 및 1975 (각각 2X35S/CPMV HT HA B Wisconsin (PrL-) NOS, 2X35S/CPMV160+HA B Wisconsin (PrL-) NOS 및 2X35S/CPMV160 HA B Wisconsin (PrL-) NOS; 실시예 15.17 참조)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 구조 번호 1445는 선행 업계 CPMV-HT 서열 (불완전 M 단백질을 암호화하는 서열에 융합된 위치 161에서 돌연변이된 시작 코돈을 가진 CMPV 5'UTR)을 통합하고 5'UTR 및 원하는 뉴클레오타이드 서열 (HA B Wisconsin (PrL-)) 사이에서 이종 기원 코자크 서열을 포함하지 않는다. 구조 번호 1820은 160개 뉴클레오타이드를 포함하는 CPMV 5'UTR, 스터퍼 단편 (다클로닝 부위), 및 식물 코자크 서열 (이 구조는 불완전 M 단백질을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다)을 포함하며 CPMV160+(CPMVX+, X=160이면) 기반 구조의 예이다. 구조 번호 1975는 160개 뉴클레오타이드를 포함하는 CPMV 5'UTR를 포함하고, 스터퍼 단편 (다클로닝 부위), 또는 식물 코자크 서열 (이 구조는 또한 불완전 M 단백질을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다)을 포함하지 않으며 "CPMV160" (CPMVX) 기반 구조의 예이다. PrL-: 결실된 단백질 가수분해 루프; NOS: 노팔린 신타제 종결자. 도 36A는 HA B Wisconsin (PrL-)의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 101)을 나타낸다. 도 36B는 HA B Wisconsin (PrL-)의 아미노산 서열 (서열 번호: 102)을 나타낸다. 도 36C는 구조 번호 1445 (2X35S/CPMV HT; 참조 구조)의 개략도를 나타낸다. 도 36D는 구조 번호 1820 (2X35S/CPMV160+; a CPMVX+기반 구조)의 개략도를 나타낸다. 도 36E는 구조 번호 1975 (2X35S/CPMV160; a CPMVX 기반 구조, X=160이면)의 개략도를 나타낸다.
도 37은 구조 번호 1454 및 1893 (각각 2X35S/CPMV HT HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT NOS 및 2X35S/CPMV160+HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT NOS; 실시예 5.18 참조)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 구조 번호 1454는 선행 업계 CPMV-HT 서열 (불완전 M 단백질을 암호화하는 서열에 융합된 위치 161에서 돌연변이된 시작 코돈을 가진 CMPV 5'UTR)을 통합하고 5'UTR 및 원하는 뉴클레오타이드 서열 (HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT) 사이에서 이종 기원 코자크 서열을 포함하지 않는다. 구조 번호 1893은 160개 뉴클레오타이드를 포함하는 CPMV 5'UTR, 스터퍼 단편 (다클로닝 부위), 및 식물 코자크 서열 (이 구조는 불완전 M 단백질을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다)을 포함하며 CPMV160+(CPMVX+, X=160이면) 기반 구조의 예이다. NOS: 노팔린 신타제 종결자; PrL-: 결실된 단백질 가수분해 루프; TMCT: 막관통 도메인 세포질 꼬리. 도 37A는 HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 103)을 나타낸다. 도 37B는 PDISP/HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열 (서열 번호: 104)을 나타낸다. 도 37C는 구조 번호 1454 (2X35S/CPMV HT; 참조 구조)의 개략도를 나타낸다. 도 37D는 구조 번호 1893 (2X35S/CPMV160+; a CPMVX+기반 구조, X=160이면)의 개략도를 나타낸다.
도 38은 구조 번호 1067 및 1875 (각각 2X35S/CPMV HT PDISP/HA B Brisbane (Prl-)+H1 California TMCT NOS 및 2X35S/CPMV HT+PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT NOS; 실시예 5.19 참조)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 구조 번호 1067은 선행 업계 CPMV-HT 서열 (불완전 M 단백질을 암호화하는 서열에 융합된 위치 161에서 돌연변이된 시작 코돈을 가진 CMPV 5'UTR)을 통합하고 5'UTR 및 원하는 뉴클레오타이드 서열 (PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT) 사이에서 이종 기원 코자크 서열을 포함하지 않는다. 구조 번호 1875는 160개 뉴클레오타이드를 포함하는 CPMV 5'UTR, 불완전 M 단백질을 포함하는 스터퍼 단편, 다클로닝 부위, 및 식물 코자크 서열을 포함하며 CPMV HT+기반 구조의 예이다. PDISP: 단백질 이황화 이소머라제 신호 펩타이드; NOS: 노팔린 신타제 종결자; PrL-: 결실된 단백질 가수분해 루프; TMCT: 막관통 도메인 세포질 꼬리. 도 38A는 PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 105)을 나타낸다. 도 38B는 PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열 (서열 번호: 106)을 나타낸다. 도 38C는 구조 번호 1875 (2X35S/CPMV160+)의 개략도를 나타낸다.
도 39는 구조 번호 2072 및 2052 (각각 2X35S/CPMV HT PDISP/HA B Massachusetts (PrL-) NOS 및 2X35S/CPMV HT+PDISP/HA B Massachusetts (PrL-) NOS; 실시예 5.20 참조)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 구조 번호 2072는 선행 업계 CPMV-HT 서열 (불완전 M 단백질을 암호화하는 서열에 융합된 위치 161에서 돌연변이된 시작 코돈을 가진 CMPV 5'UTR)을 통합하고 5'UTR 및 원하는 뉴클레오타이드 서열 (PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)) 사이에서 이종 기원 코자크 서열을 포함하지 않는다. 구조 번호 2052는 160개 뉴클레오타이드를 포함하는 CPMV 5'UTR, 불완전 M 단백질을 포함하는 스터퍼 단편, 다클로닝 부위, 및 식물 코자크 서열을 포함하며 CPMV HT+기반 구조의 예이다. PDISP: 단백질 이황화 이소머라제 신호 펩타이드; NOS: 노팔린 신타제 종결자; PrL-: 결실된 단백질 가수분해 루프. 도 39A는 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 107)을 나타낸다. 도 39B는 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)의 아미노산 서열 (서열 번호: 108)을 나타낸다. 도 39C는 구조 번호 2052 (2X35S/CPMV HT+)의 개략도를 나타낸다.
도 40은 구조 번호 2074 및 2062 (각각 2X35S/CPMV HT PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT NOS 및 2X35S/CPMV HT+PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT NOS; 실시예 5.21 참조)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 구조 번호 2074는 선행 업계 CPMV-HT 서열 (불완전 M 단백질을 암호화하는 서열에 융합된 위치 161에서 돌연변이된 시작 코돈을 가진 CMPV 5'UTR)을 통합하고 5'UTR 및 원하는 뉴클레오타이드 서열 (PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT) 사이에서 이종 기원 코자크 서열을 포함하지 않는다. 구조 번호 2062는 160개 뉴클레오타이드를 포함하는 CPMV 5'UTR, 불완전 M 단백질을 포함하는 스터퍼 단편, 다클로닝 부위, 및 식물 코자크 서열을 포함하며 CPMV HT+기반 구조의 예이다. PDISP: 단백질 이황화 이소머라제 신호 펩타이드; NOS: 노팔린 신타제 종결자; PrL-: 결실된 단백질 가수분해 루프; TMCT: 막관통 도메인 세포질 꼬리. 도 40A는 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 109)을 나타낸다. 도 40B는 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열 (서열 번호: 110)을 나타낸다. 도 40C는 구조 번호 2062 (2X35S/CPMV HT+)의 개략도를 나타낸다.
도 41은 구조 번호 1445 및 1839 (각각 2X35S/CPMV HT HA B Wisconsin (PrL-) NOS, 및 2X35S/CPMV HT+HA B Wisconsin (PrL-) NOS; 실시예 5.22 참조)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 구조 번호 1445는 선행 업계 CPMV-HT 서열 (불완전 M 단백질을 암호화하는 서열에 융합된 위치 161에서 돌연변이된 시작 코돈을 가진 CMPV 5'UTR)을 통합하고 5'UTR 및 원하는 뉴클레오타이드 서열 (HA B Wisconsin (PrL-)) 사이에서 이종 기원 코자크 서열을 포함하지 않는다. 구조 번호 1839는 160개 뉴클레오타이드를 포함하는 CPMV 5'UTR, 불완전 M 단백질을 포함하는 스터퍼 단편, 다클로닝 부위, 및 식물 코자크 서열을 포함하며 CPMV HT+기반 구조의 예이다. PrL-: 결실된 단백질 가수분해 루프; NOS: 노팔린 신타제 종결자. 도 41A는 HA B Wisconsin (PrL-)의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 111)을 나타낸다. 도 41B는 HA B Wisconsin (PrL-)의 아미노산 서열 (서열 번호: 112)을 나타낸다. 도 41C는 구조 번호 1839 (2X35S/CPMV HT+)의 개략도를 나타낸다.
도 42는 구조 번호 1454 및 1860 (각각 2X35S/CPMV HT HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT NOS 및 2X35S/CPMV HT+HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT NOS; 실시예 5.23 참조)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 구조 번호 1454는 선행 업계 CPMV-HT 서열 (불완전 M 단백질을 암호화하는 서열에 융합된 위치 161에서 돌연변이된 시작 코돈을 가진 CMPV 5'UTR)을 통합하고 5'UTR 및 원하는 뉴클레오타이드 서열 (HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT) 사이에서 이종 기원 코자크 서열을 포함하지 않는다. 구조 번호 1860은 160개 뉴클레오타이드를 포함하는 CPMV 5'UTR, 불완전 M 단백질을 포함하는 스터퍼 단편, 다클로닝 부위, 식물 코자크 서열을 포함하며 CPMV HT+기반 구조의 예이다. NOS: 노팔린 신타제 종결자; PrL-: 결실된 단백질 가수분해 루프; TMCT: 막관통 도메인 세포질 꼬리. 도 42A는 HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 113)을 나타낸다. 도 42B는 PDISP/HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열 (서열 번호: 114)을 나타낸다. 도 42C는 구조 번호 1893 (2X35S/CPMV HT+)의 개략도를 나타낸다.
도 43은 구조 번호 489 (2X35S/CPMV HT H5 Indonesia NOS 실시예 5.24 참조)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 구조 번호 489는 CPMV-HT 서열 (불완전 M 단백질을 암호화하는 서열에 융합된 위치 161에서 돌연변이된 시작 코돈을 가진 CMPV 5'UTR)을 통합하고 5'UTR 및 원하는 뉴클레오타이드 서열 (PDISP/H1 California) 사이에서 이종 기원 코자크 서열을 포함하지 않는다. 도 43A는 고유한 H5 Indonesia의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 115)을 나타낸다. 도 43B는 고유한 H5 Indonesia의 아미노산 서열 (서열 번호: 116)을 나타낸다. 도 43C는 구조 번호 489 (2X35S/CPMV HT; 참조 구조)의 개략도를 나타낸다.
도 44는 구조 번호 1800 (A-2X35S CPMV160+PDISP H3Victoria NOS; 실시예 5.25 참조)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 구조 번호 1800은 160개 뉴클레오타이드를 포함하는 CPMV 5'UTR, 스터퍼 단편 (다클로닝 부위), 및 식물 코자크 서열 (이 구조는 불완전 M 단백질을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다)을 포함하며 CPMV160+(CPMVX+, X=160이면) 기반 구조의 예이다. PDISP: 단백질 이황화 이소머라제 신호 펩타이드. NOS: 노팔린 신타제 종결자. 도 44A는 프라이머 서열 IF**(SacII)-PDI.s1+4c (서열 번호: 117)을 나타낸다. 도 44B는 프라이머 서열 IF-H3V36111.s1-4r (서열 번호: 118)을 나타낸다. 도 44C는 PDISP/H3 Victoria의 서열 (서열 번호: 119)을 나타낸다. 도 44D는 구조 2171의 개략도를 나타낸다 (플라스미드 선형화에 사용된 SacII 및 StuI 제한 효소 부위가 표시됨). 도 44E는 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 구조 2171 (밑줄 그어져 있음), 플라스토시아닌-P19-플라스토시아닌 침묵 억제자 발현 카세트, H1 California 막관통 세포질 꼬리, 및 CPMV3'UTR을 가진 2X35S/CPMV160+/NOS (서열 번호: 120)를 나타낸다. 도 44F는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 1800을 나타낸다. PDISP/H3 Victoria 뉴클레오타이드 서열은 밑줄 그어져 있다; 5'UTR은 볼드체로 나타난다; 식물 코자크 서열은 이중으로 밑줄 그어져 있다; 16개 염기쌍의 스터퍼 단편 (다클로닝 부위)은 5'UTR 및 식물 코자크 서열 (서열 번호: 121) 사이에 위치한다. 도 44G는 PDISP/H3 Victoria (서열 번호: 122)의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 44H는 구조 번호 1800 (CPMVX+기반 구조, X=160이면)의 개략도를 나타낸다.
도 45는 구조 번호 1819 (2X35S CPMV-HT+PDISP H3Victoria NOS)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 구조 번호 1819는 CPMV-HT+서열 (불완전 M 단백질을 암호화하는 스터퍼 단편, 다클로닝 부위에 융합된 위치 161에서 돌연변이된 시작 코돈을 가진 CMPV 5'UTR)을 통합하고, 다클로닝 부위 및 원하는 뉴클레오타이드 서열 (PDISP/H3 Victoria)) 사이에서 식물 코자크 서열을 포함한다. PDISP: 단백질 이황화 이소머라제 신호 펩타이드. NOS: 노팔린 신타제 종결자. 도 45A는 프라이머 서열 IF(SacII)-Kozac_PDI.c (서열 번호: 123)을 나타낸다. 도 45B는 프라이머 서열 IF-H3V36111.s1-4r (서열 번호: 124)을 나타낸다. 도 45C는 구조 2181의 개략도를 나타낸다. 도 45D는 구조 2181에 대한 서열을 나타낸다 (왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지, 밑줄 그어져 있음; 플라스토시아닌-P19-플라스토시아닌 침묵 억제자 발현 카세트가 있는 2X35S/CPMV-HT+/NOS; 서열 번호: 126). 도 45E는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 1819를 나타낸다. PDISP/H3 Victoria 뉴클레오타이드 서열은 밑줄 그어져 있다 (서열 번호: 127). 도 45F는 구조 1819의 개략도를 나타낸다.
도 46A는 고유한 H7 Hangzhou HA 및 M2와 동시-발현될 때 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진, 변형된 H7 Hangzhou HA의 상대적인 헤마글루티닌화 활성을 나타낸다. 고유한 및 변형된 H7 Hangzhou HA (구조 #2142 및 2152, 실시예 5.33 및 5.34 참조)는 M2 (구조 #1261 실시예 5.1 참조)의 존재 하에 발현되었고 식물로부터 정제되었다. 도 46B는 고유한 H7 Hangzhou HA (construct #2142) 및 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 변형된 H7 Hangzhou HA (구조 #2152)의 단백질 수율을 나타낸다. 도 46C는 SDS-PAGE를 나타내는데, 레인 2는 단백질 가수분해 루프가 제거된, 정제된 변형된 H7 Hangzhou HA (구조 #2152)를 나타내고 레인 3은 정제된 고유한 H7 Hangzhou HA (구조 #2142)를 나타낸다. 각 레인에 대하여, 총 단백질 2μg이 겔에 로딩되었다. 단백질 프로파일의 순도는 두 구조에서 유사하다.
도 47A는 고유한 HA 단백질과 단백질 가수분해 루프가 GG 링커로 대체된 변형된 HA (prl-), 단백질 가수분해 루프가 TETQ 링커로 대체된 변형된 HA (TETQ) 및 단백질 가수분해 루프가 TETR 링커로 대체된 변형된 HA (TETR) 사이에서 트립신 저항성을 나타낸다. 고유한 (# 489), PRL- (# 928), TETQ (#766) 및 TETR (#676) H5 Indonesia HA VLP 구조가 정제되었다. 각 로트에 대하여, HA VLP의 두 개의 샘플은 pH 7.4에서 150μg/mL의 표적 농도로 버퍼 (100 mM Na/KPO4, 150 mM NaCl, 0.01% TWEEN 80)에서 재현탁되었다. 트립신은 하나의 재현탁된 샘플에 1: 100 단백질 비로 추가되었다. 샘플은 실온에서 30, 60 및 120분 동안 배양되었다. 30μL의 비-소화된 추출물 (대조군) 및 30μL의 소화된 추출물이 SDS-PAGE 겔에 로딩되었으며, 이것은 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색되었다. 도 47B는 2회 투여 후 마우스에서 고유한 H5 VLP 및 그것의 돌연변이 대응물 (prl-, TETQ 및 TETR)의 면역원성 (HI 역가)을 나타낸다. 막대는 고유한 H5 VLP와 각 H5 돌연변이 LP의 상대적인 (%) HI 역가 비교를 나타낸다.
도 48은 구조 번호 2220 (2X35S/CPMV HT+/PDISP/H2 Singapore/NOS; 실시예 5.27 참조)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 도 48A는 프라이머 IF**-H2S157.s1-6r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 127)을 나타낸다. 도 48B는 PDISP/H2 Singapore의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 128)을 나타낸다. 도 48C는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 2220의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. PDISP/H2 Singapore 뉴클레오타이드 서열은 밑줄 그어져 있다. 도 48D는 PDISP/H2 Singapore의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 48E는 구조 번호 2220의 개략도를 나타낸다.
도 49는 구조 번호 2221 (2X35S/CPMV HT+/단백질 가수분해 루프가 결실된 PDISP/H2 Singapore/NOS; 실시예 5.28 참조)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 도 49A는 프라이머 H2S157(Prl-).r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 131)을 나타낸다. 도 49B는 프라이머 H2S157(Prl-).c의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 132)을 나타낸다. 도 49C는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 2221의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. PDISP/H2 Singapore 뉴클레오타이드 서열은 밑줄 그어져 있다 (서열 번호: 133). 도 49D는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H2 Singapore의 아미노산 서열 (서열 번호: 134)을 나타낸다. 도 49E는 구조 번호 2221의 개략도를 나타낸다.
도 50은 구조 번호 2222 (2X35S/CPMV 160+/PDISP/H2 Singapore) 및 2223 (2X35S/CPMV 160+/결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H2 Singapore/NOS) 실시예 5.29 참조)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 도 50A는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 2222의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. PDISP/H2 Singapore 뉴클레오타이드는 서열 밑줄 그어져 있다 (서열 번호: 135). 도 50B는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 2223의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 단백질 가수분해 루프 뉴클레오타이드 서열이 결실된 PDISP/H2 Singapore는 밑줄 그어져 있다 (서열 번호: 136). 도 50C는 구조 번호 2222의 개략도를, 도 50D는 구조 번호 2223의 개략도를 나타낸다.
도 51은 구조 번호 2219 (2X35S/CPMV HT+PDISP/H3 Perth) 및 2139 (2X35S/CPMV 160+/PDISP/H3 Perth; 실시예 5.30 참조)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 도 51A는 PDISP/H3 Perth의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 137)을 나타낸다. 도 51B는 프라이머 IF**-H3P1609.S1-6r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 138)을 나타낸다. 도 51C는 PDISP/H3 Perth (서열 번호: 139)의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 51D는 구조 번호 2219의 개략도를 나타낸다. 도 51E는 구조 번호 2139의 개략도를 나타낸다.
도 52는 구조 번호 2039 (2X35S/CPMV HT+결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Perth) 및 2159 (2X35S/CPMV 160+결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Perth)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 실시예 5.31 참조. 도 52A는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Perth의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 140)을 나타낸다. 도 52B는 프라이머 H3P1609(Prl-)#2.r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 141)을 나타낸다. 도 52C는 프라이머 H3P1609(Prl-)#2.c의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 142). 도 52D는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Perth의 아미노산 서열 (서열 번호: 143)을 나타낸다. 도 52E는 구조 번호 2039의 개략도를 나타낸다. 도 52F는 구조 번호 2159의 개략도를 나타낸다.
도 53은 구조 번호 2230 (2X35S/CPMV HT+결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Victoria ) 및 2250 (2X35S/CPMV 160+결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Victoria )을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 실시예 5.32 참조. 도 53A는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Victoria의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 144)을 나타낸다. 도 53B는 프라이머 H3V36111(Prl-).r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 145)을 나타낸다. 도 53C는 프라이머 H3V36111(Prl-).c의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 146)을 나타낸다. 도 53D는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Victoria의 아미노산 서열 (서열 번호: 147)을 나타낸다. 도 53E는 구조 번호 2230의 개략도를 나타낸다. 도 53F는 구조 번호 2250의 개략도를 나타낸다.
도 54 구조 번호 2142 (2X35S/CPMV HT+/PDISP/H7 Hangzhou/NOS)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 실시예 5.33 참조. 도 54A는 PDISP/H7 Hangzhou의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 148)을 나타낸다. 도 54B는 프라이머 IF*-H7H113.s1-6r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 149)을 나타낸다. 도 54C는 PDISP/H7 Hangzhou의 아미노산 서열 (서열 번호: 150)을 나타낸다. 도 53D는 구조 번호 2142의 개략도를 나타낸다.
도 55는 구조 번호 2152 (2X35S/CPMV HT+/결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H7 Hangzhou/NOS)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 실시예 5.34 참조. 도 55A는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H7 Hangzhou의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 151)을 나타낸다. 도 55B는 프라이머 H7H113(PrL-).r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 152)을 나타낸다. 도 55C는 프라이머 H7H113(PrL-).c의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 153)을 나타낸다. 도 55D는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H7 Hangzhou의 아미노산 서열 (서열 번호: 154)을 나타낸다. 도 53E는 구조 번호 2152의 개략도를 나타낸다.
도 56은 구조 번호 2224 (2X35S/CPMV HT+PDISP/H9 Hong Kong) 및 2226 (2X35S/CPMV 160+PDISP/H9 Hong Kong)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 실시예 5.35 참조. 도 56A는 PDISP/H9 Hong Kong의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 155)을 나타낸다. 도 56B는 프라이머 IF**-H9HK107399.S1-6r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 156)을 나타낸다. 도 56C는 PDISP/H9 Hong Kong의 아미노산 서열 (서열 번호: 157)을 나타낸다. 도 56D는 구조 번호 2224의 개략도를 나타낸다. 도 56E는 구조 번호 2226의 개략도를 나타낸다.
도 57은 구조 번호 2225 (2X35S/CPMV HT+결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H9 Hong Kong) 및 2227 (2X35S/CPMV 160+결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H9 Hong Kong)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 실시예 5.36 참조. 도 57A는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H9 Hong Kong의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 158)을 나타낸다. 도 57B는 프라이머 H9HK107399(Prl-).r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 159)을 나타낸다. 도 57C는 프라이머 H9HK107399(Prl-).c의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 160)을 나타낸다. 도 57D는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H9 Hong Kong의 아미노산 서열 (서열 번호: 161)을 나타낸다. 도 57E는 구조 번호 2225의 개략도를 나타낸다. 도 57F는 구조 번호 2227의 개략도를 나타낸다.
도 58은 구조 번호 2013 (2X35S/CPMV 160+/PDISP/HA B Malaysia/NOS)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 실시예 5.37 참조. 도 58A는 PDISP/HA B Malaysia의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 162)을 나타낸다. 도 58B는 프라이머 IF**-HBM250604.S1-6r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 163)을 나타낸다. 도 58C는 PDISP/HA B Malaysia의 아미노산 서열 (서열 번호: 164)을 나타낸다. 도 58D는 구조 번호 2013의 개략도를 나타낸다.
도 59는 구조 번호 2014 (2X35S/CPMV 160+/결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Malaysia/NOS)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 실시예 5.38 참조. 도 59A는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Malaysia의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 165)을 나타낸다. 도 59B는 프라이머 HBM250604(PrL-).r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 166)을 나타낸다. 도 59C는 프라이머 HBM250604(PrL-).c의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 167)을 나타낸다. 도 59D는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Malaysia의 아미노산 서열 (서열 번호: 168)을 나타낸다. 도 59E는 구조 번호 2014의 개략도를 나타낸다.
도 60은 구조 번호 2070 (2X35S/CPMV HT PDISP/HA B Massachusetts), 2080 (2X35S/CPMV HT+PDISP/HA B Massachusetts) 및 2090 (2X35S/CPMV 160+PDISP/HA B Massachusetts)을 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 실시예 5.39 참조. 도 60A는 PDISP/HA B Massachusetts의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 169)을 나타낸다. 도 60B는 PDISP/HA B Massachusetts의 아미노산 서열 (서열 번호: 170)을 나타낸다. 도 60C는 구조 번호 2070의 개략도를 나타낸다. 도 60D는 구조 번호 2080의 개략도를 나타낸다. 도 60E는 구조 번호 2090의 개략도를 나타낸다.
도 61은 구조 번호 2102 (2X35S/CPMV HT 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Florida) 및 2104 (2X35S/CPMV HT+/BeYDV/결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Florida)를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 실시예 5.40 참조. 도 61A는 프라이머 HBF406(PrL-).r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 190)을 포함한다. 도 61B는 프라이머 HBF406(PrL-).c의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 191)을 포함한다. 도 61C는 프라이머 IF*-HBF406.s1-6r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 192)을 나타낸다. 도 61D는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Florida의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 도 61E는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Florida의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 61F는 발현 카세트 번호 2102의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 도 61G는 구조 번호 2102의 개략도를 나타낸다. 도 61H는 발현 카세트 번호 2104의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 도 61I는 구조 번호 2104의 개략도를 나타낸다.
도 62는 구조 번호 2106 (2X35S/CPMV HT+/결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/B Florida+H1 California TMCT/NOS) 및 2108 (2X35S/CPMV HT+/BeYDV/결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/B Florida+H1 California TMCT/NOS를 제조하는데 사용된 서열 구성요소를 나타낸다. 실시예 5.41 참조. 도 62A는 프라이머 IF-H1cTMCT.S1-4r의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 197)을 나타낸다. 도 62B는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Florida+H1Cal TMCT의 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호: 198)을 나타낸다. 도 62C는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Florida+H1Cal TMCT의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 62D는 발현 카세트 번호 2106의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 도 62E는 구조 번호 2106의 개략도를 나타낸다. 도 62F는 발현 카세트 번호 2108의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 도 62G는 구조 번호 2108의 개략도를 나타낸다.
하기 기술은 바람직한 구체예의 것이다.
본 발명은 바이러스-유사 입자 (VLP) 및 식물에서 그것을 생산하고 VLP 수율, 축적 및 생산량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 부분적으로, 식물, 또는 식물의 일부에서 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생산하는 방법을 제공한다. 방법은 핵산을 식물 또는 식물의 일부로 도입하는 단계를 수반한다. 핵산은 식물에서 활성이고 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합된 조절 영역을 포함한다. HA는 변형된 단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위를 포함한다. 식물 또는 식물의 일부는 핵산의 발현을 허용하여, 이로 인해 VLP를 생산하는 조건 하에 배양된다. 원하면, 식물 또는 식물의 일부가 수득될 수도 있고 VLP가 정제될 수도 있다.
본 발명은 또한 이 방법에 의해 생산된 VLP를 제공한다. VLP는 식물로부터 유래된 하나 또는 하나 이상의 지질을 포함할 수도 있다.
VLP는 면역 반응을 유도하는 VLP의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제조하는데 사용될 수도 있다.
또한 본원에서는 변형된 헤마글루티닌이 제공되는데, 단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위가 변형되어 있다.
본 발명은 또한 상기 기술된 핵산을 발현시킴으로써 생산된 VLP를 포함하는 식물을 제공한다. 식물은 대상체에서 인프룰엔자 바이러스 감염에 대한 면역력을 유도하는데 사용될 수도 있다. 식물은 또한 식품 보조제로서 혼합될 수도 있다.
본 발명의 VLP는 또한 상기 한정된 핵산을 포함하는 식물 또는 식물의 일부를 제공하고, 핵산의 발현을 허용하여, 이로 인해 VLP를 생산하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양함으로써 생산될 수도 있다. VLP는 식물로부터 유래된 하나 또는 하나 이상의 지질을 포함할 수도 있다. VLP는 면역 반응을 유도하는 VLP의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제조하는데 사용될 수도 있다. 본 발명은 또한 제1 및 제2 핵산을 발현시킴으로써 생산된 VLP를 포함하는 식물을 제공한다. 식물은 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역력을 유도하는데 사용될 수도 있다. 식물은 또한 식품 보조제로서 혼합될 수도 있다.
본 발명의 VLP는 하나 이상의 변형된 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)을 포함할 수도 있다. 변형된 HA는 WO 2009/009876; WO 2009/076778; WO 2010/003225; WO 2010/003235; WO 2011/03522 (이것들은 본원에 참고로 포함됨)에서 기술된 바와 같이 어떤 HA, 예를 들어, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 또는 타입 B HA로부터 유래될 수도 있다.
본 발명은 인플루엔자 균주의 HA 서열을 포함하는 VLP를 포함하며, HA 서열은, 예를 들어, 본원에서 기술된 변형을 포함하는, 변형된 다염기 분열 부위를 포함한다.
HA 단백질
용어 "헤마글루티닌" 또는 "HA"는 본원에서 사용된 바와 같이 인플루엔자 바이러스 입자 외부에서 발견된 당단백질을 말한다. HA는 호모트라이머 막 타입 I 당단백질이며, 일반적으로 신호 펩타이드, HA1 도메인, 및 C-말단에서 막-스패닝(spanning) 앵커(anchor) 부위 및 작은 세포질 꼬리를 포함하는 HA2 도메인을 포함한다. HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 잘 알려져 있고 이용 가능한데, 예를 들어, 생물방어 공중 보건 베이스(BioDefence Public Health base) (인플루엔자 바이러스; URL: biohealthbase.org 참조) 또는 미국 국립 생물공학 정보센터(National Center for Biotechnology Information) (URL: ncbi.nlm.nih.gov 참조)을 참고하면 되고, 이들 둘 다는 본원에서 참고로 포함된다. HA는 WO 2009/009876; WO 2009/076778; WO 2010/003225; WO 2010/003235; WO 2011/03522에서 기술된 바와 같이 어떤 HA, 예를 들어, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 또는 타입 B HA도 포함할 수 있고; 이것들은 본원에서 참고로 포함됨). 더 나아가, HA는 하나 이상의 신생 또는 새로 확인된 인플루엔자 바이러스로부터 분리된 헤마글루티닌의 서열을 기반으로 할 수도 있다. 본 발명은 또한 하나 또는 하나 이상의 인플루엔자 서브타입으로부터 얻어진 변형된 HA를 포함하는 VLP를 포함한다.
HA 모노머는 세 개의 기능적 도메인 - 줄기 도메인, 또는 줄기 도메인 다발 (SDC), 구형 머리 도메인, 또는 머리 도메인 다발 (HDC) 및 막관통 도메인 다발 (TDC)으로 세분화될 수도 있다. SDC 및 HDC는 통틀어 '엑토도메인'으로 불릴 수도 있다. Ha et al. 2002의 간행물 (EMBO J. 21: 865-875; 이것은 본원에 참고로 포함됨)은 여러 인플루엔자 서브타입에서 SDC 및 HDC의 다양한 서브도메인의 상대적인 배향을 설명하고, X선 결정학적 구조를 기반으로 한다.
HA 단백질은 약 75 kDa의 전구체 단백질 (HA0)로서 합성되며, 이것은 표면에서 긴 트라이머 단백질로 조립된다. 전구체 단백질은 보존된 활성화 분열 부위에서 이황화 결합에 의해 결합된 2개의 폴리펩타이드 사슬, HA1 및 HA2 (막관통 영역 포함)로 분열된다. 도 15는 여러 HA에 대한 링커 영역의 아미노산 서열의 비제한 예를 제공한다.
용어 "호모트라이머" 또는 "호모트라이머성"은 올리고머가 세 개의 HA 단백질 분자에 의해 형성된다는 것을 나타낸다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, HA 단백질은 약 75 kDa의 모노머 전구체 단백질 (HAO)로서 합성되며, 이것은 표면에서 긴 트라이머 단백질로 조립된다. 트라이머가 발생하기 전에, 전구체 단백질은 보존된 활성화 분열 부위 (융합 펩타이드로도 불림)에서 이황화 결합에 의해 결합된 2개의 폴리펩타이드 사슬, HA1 및 HA2 (막관통 영역 포함)로 분열된다. HA1 세그먼트는 길이가 328개의 아미노산일 수도 있고, HA2 세그먼트는 길이가 221개의 아미노산일 수도 있다.
이 분열은 바이러스 감염성에 중요할 수도 있지만, 단백질의 트라이머화 또는 면역원성에 필수적인 것은 아닐 수도 있다. 숙주 세포의 소포체 (ER) 막 내 HA 삽입, 신호 펩타이드 분열 및 단백질 글리코실화는 동시-번역 이벤트이다. HA의 올바른 리폴딩(refolding)은 단백질의 글리코실화 및 5-6개의 사슬 내 이황화 결합의 형성을 필요로 한다. HA 트라이머는 씨스- 및 트랜스-골지 복합체, 트라이머화 공정에서 역할을 하는 막관통 도메인 내에서 조립된다. 브로멜라인-처리된 HA 단백질의 결정 구조는, 막관통 도메인이 없으며, 인플루엔자 균주 사이에서 고도로 보존된 구조를 나타내고 있다. 또한 HA가 감염 과정 중에 주요 형태 변화를 거친다는 것이 확립되었으며, 이것은 전구체 HAO이 2개의 폴리펩타이드 사슬 HA1 및 HA2로 분열되는 것을 필요로 한다. HA 단백질은 가공될 수도 있거나 (즉, HA1 및 HA2 도메인을 포함), 또는 가공되지 않을 수도 있다 (즉, HAO 도메인을 포함). HA의 가공되지 않은 전구체 단백질은 약 75 kDa의 전구체 단백질 (HAO)로서 합성되며, 이것은 표면에서 긴 트라이머 단백질로 조립된다. 전구체 단백질은 보존된 분열 부위 (단백질 가수분해 루프로도 알려져 있음)에서 이황화 결합에 의해 결합된 2개의 폴리펩타이드 사슬, HA1 및 HA2 (막관통 영역 포함)로 분열된다.
HA 단백질은 본원에서 기술된 바와 같이 추가로 변형된 HA ("돌연변이 HA"로도 불림) 단백질, 예를 들어, 변형된 전구체 단백질 (HAO)일 수도 있으며, 이것에서 단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위가 변형된다.
변형된 HA/분열 부위
HA0의 분열 후에, HA는 H에 민감해지고, 엔도솜의 pH (<pH 6.0)에서 비가역적 형태 변화를 거친다. 전구체 HAO의 형태는 낮은 pH에서 안정하지만, 분열된 HA1-HA2 형태는 준안전적이다 (Bullough PA et. al., 1994, Nature. Vol 371: 37-43). 다른 HA의 형태 변화를 유도하는 pH 한계점은 B 균주에 대해서는 대략 pH 5.8-5.9인 반면에, 타입 A HA에 대해서는 더 산성인, pH 5.1 내지 5.8이다 (Beyer WEP et al, 1986, Archives Virol, vol 90: 173). 분열 후에, HA2의 아미노 말단은 이어서 숙주 세포 막에 걸쳐 스프레이닝하는(spraining) 막관통 도메인이 되는 23개 아미노산의 비극성 서열 (융합 펩타이드로 불림; 도 15)이다. HA의 분열 부위는 HA의 표면에서 돌출된 루프 상에 위치하고, 이 부위는 프로테아제에 의해 접근 가능하다.
난세포에서 백신읫 ODTKS을 최적화하고 활성이지만 약독화된 바이러스를 유지하기 위해, H5의 다염기 분열 부위의 변형 (RERRRKKR↓G)이 연구되어 왔다 (Horimoto T, et. al, 2006, Vaccine, Vol 24: 3669-3676). 원하는 돌연변이는 처음 4개의 하전된 아미노산 (PvEPvPv)의 결실 및 다염기 분열 부위를 비활성화시키는, 아미노산 RKKR의 TETR로의 대체를 함유했지만 TETR 모티프의 아르기닌 잔기를 통해 HAO를 HA1-HA2로 가공할 가능성을 유지한다 (도 19 참조). 약독화된 바이러스를 생산하기 위한 유사한 전략이 난세포를 죽이지 않고 고수율로 A/Turkey/Turkey/1/2005 H5N1 균주의 생산을 허용하는 다염기 부위를 폐지하기 위해 NIBSC에 의해 이용되었다. 다염기 부위 서열 (GERRRKKR↓G)은 그것들의 돌연변이 (NIBSC 05/240 NIBSC 인플루엔자 참조 바이러스 NIBG-23)에서 RETR에 의해 대체된다. H5 HA의 다염기 분열 부위는 또한 난세포에서 발현되는 H6의 일염기 부위에 의해 대체되었다. 이 예에서, 다염기 부위의 처음 4개의 잔기 및 마지막 4개의 아미노산은 IETR에 의해 대체된다 (RERRRKKR↓G의 IETR↓G로의 대체; Hoffman E, et. al., 2002, Vaccine, Vol 20: 3165-3170). 상기 제공된 예 각각에서, 변형은 난세포 내에서 바이러스를 약독화하는 한편 HA의 생산량을 유지하기 위해 수행되었다. 즉, HAO 전구체의 분열은 HA0이 HA1-HA2으로 가공되게 하고 pH 형태 변화를 거쳐서, 숙주 세포에서 바이러스 복제를 허용하기 위해 완전히 비활성화되지 않았다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 헤마글루티닌" 또는 "변형된 HA", "돌연변이된 헤마글루티닌" 또는 "돌연변이된 HA"는 HA가 HA 단백질의 단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위에서 변경된 아미노산 서열을 발생시키는, 변형 또는 돌연변이, 예를 들어, 치환, 삽입, 결실, 또는 이것들의 조합을 가진 HA를 말한다.
A/Hong Kong/68의 HA0의 결정 구조가 결정되었다 (Chen, J., 1998. Cell 95: 409-417; 본원에 참고로 포함됨). 용제에 노출된 잔기는 일반적으로 연장된, 고도로 노출된 표면 루프를 형성하는 분열 부위의 일부인 것으로 생각된다. 공통 서열은 이 선택된 영역, 예를 들어, 제한되는 것은 아니지만, 다음에서 결정될 수도 있다:
A/H3/HA0 공통: NVPEKQTR/GIFGAIAGFIE (서열 번호: 66)
A/H1/HAO 공통: NIPSIQSR/GLFGAIAGFIE (서열 번호: 67)
조류 H5 공통 QRESRRKKR/GLFGAIAGFIEG (서열 번호: 1)
B/HA0 공통: PAKLLKER/GFFGAIAGFLE (서열 번호: 68)
여기에서 HA1 및 HA2 사이의 분열은 "/" (Bianchi et al., 2005, Journal of Virology, 79: 7380-7388 참조; 본원에서 참고로 포함됨), 및 또한 도 15 및 18a에 의해 표시된다.
HA 단백질은 단백질 가수분해 루프 영역에서 변형, 예를 들어, 단백질 가수분해 루프 (분열 부위)의 결실, 삽입, 치환 또는 이것들의 조합을 가진 인플루엔자 타입 B 헤마글루티닌 또는 인플루엔자 타입 A 헤마글루티닌 단백질일 수도 있다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 단백질 가수분해 루프의 변형은 HA 분자가 HA0 전구체로서 유지된다는 것을 보장할 수도 있다. 이로 인해 HA0 단백질을 포함하는 더 균질하고 일정한 VLP를 생산한다.
"단백질 가수분해 루프" 또는 "분열 부위"는 전구체 HA0 분열에 수반된 단백질 가수분해 부위의 공통 서열을 의미한다. "공통" 또는 "공통 서열"은 본원에서 사용된 바와 같이 다수의 서열, 예를 들어, 특정 인플루엔자 HAO 서열의 서브타입의 정렬의 분석에 기초하여 관련된 서열의 서열 가변성을 포함하는 서열 (아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열)을 의미한다. 인플루엔자 HAO 분열 부위의 공통 서열은, 예를 들어, 공통 H1, 공통 H3, 공통 H5, 또는 인플루엔자 B 공통 헤마글루티닌 아미노산 서열, 예를 들어, 제한되는 것은 아니지만, B Florida 및 B Malaysia을 포함하는 인플루엔자 A 공통 헤마글루티닌 아미노산 서열을 포함할 수도 있다. 단백질 가수분해 루프 영역의 서열의 비제한 예는 도 15 및 18B에서 나타난다 (및 Bianchi et al., 2005, Journal of Virology, 79: 7380-7388; 본원에서 참고로 포함됨).
단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위에서 잔기는 돌연변이, 예를 들어, 제한되는 것은 아니지만, 점 돌연변이, 치환, 삽입, 또는 결실될 수도 있다. 용어 "아미노산 돌연변이" 또는 "아미노산 변형"은 본원에서 사용된 바와 같이 아미노산 치환, 결실, 삽입, 및 변형을 포함하는 것을 의미한다. 치환, 결실, 삽입의 어떤 조합, 및 변형은, 최종 구조가 원하는 특성, 예를 들어, 프로테아제에 의한 단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위의 감소된 또는 폐지된 분열을 가지고 있으면, 최종 구조에 도달하기 위해 이루어질 수 있다.
"변형된 단백질 가수분해 루프"는 단백질 가수분해 루프가 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하고, 부분적으로 결실되고, 링커 서열로 부분적으로 대체되고, 링커 서열로 완전히 대체되고, 분열 부위 내 아미노산의 하나 이상의 비-단백질 아미노산, 또는 이것들의 조합으로의 부분적인 또는 완전한 대체를 포함할 수도 있다는 것을 의미한다. 유사하게, "변형된 분열 부위"는 단백질 가수분해 루프 내 분열 부위가 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하고, 링커 서열이 부분적으로 결실되고, 링커 서열이 완전히 결실되고, 링커 서열로 부분적으로 대체되고, 링커 서열로 완전히 대체되고, 분열 부위 내 아미노산의 하나 이상의 비-단백질 아미노산, 또는 이것들의 조합으로의 부분적인 또는 완전한 대체를 포함할 수도 있다는 것을 의미한다. 단백질 가수분해 루프, 분열 부위, 또는 둘 다에 대한 변형은 단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위 서열 외부에, 또는 인접하게 위치한 하나 이상의 아미노산의 결실, 대체, 또는 치환을 수반할 수도 있다. "링커"는 단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위 내로 도입될 수도 있거나, 또는 일부 또는 모든 아미노산을 단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위로 대체할 수도 있는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 의미한다. 링커는 단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위 내 어떤 아미노산 결실도 변형된 HA의 발현 또는 이후의 활성을 방해하지 않는다는 것을 보장하도록 설계될 수도 있다.
단백질 가수분해 루프의 변형 또는 결실에 의해 HA 단백질을 안정화시킴으로써, 식물에서 변형된 HA가 발현될 때, 같은 조건 하에 식물에서 발현된 고유한 HA와 비교하여, 증가된 생성물 또는 단백질 수율이 달성될 수도 있다. 더 나아가, 단백질 가수분해 루프를 변형시키거나 결실시킴으로써, 같은 조건 하에 식물에서 발현된 고유한 HA와 비교하여, 발현된 변형된 HADML 발현의 가변성이 감소되고 생산된 변형된 HA의 일관성이 증가된다.
그러므로, 본 발명은 또한 식물에서 HA 단백질의 생산 수율을 증가시키는 방법을 포함한다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, HA 단백질에서 단백질 가수분해 루프를 변형시키거나 결실시킴으로써 식물에서 단백질 가수분해에 의한 분해에 대하여 개선된 안정성, 골지체 분비 공정에서 HA의 통과 중, 및 정제 공정 중 안정화가 제공된다고 생각된다.
더 나아가, 본 발명은 또한 식물에서 발현된 HA 단백질의 생성물 품질을 증가시키는 방법을 포함한다. 생성물 품질은 예를 들어, 식물에서 발현된 HA의 증가된 생산 수율, 생성물의 안정성, 예를 들어, 식물에서 발현된 HA의 증가된 안정성, 생성물의 일관성, 예를 들어, 균질한 생성물, 예를 들어, HA0 또는 이것의 조합의 생산을 의미한다.
생성물 또는 단백질 수율의 증가는 제거된 단백질 가수분해 루프를 갖지 않는 같은 HA 단백질의 생성물 또는 단백질 수율과 비교하여, 약 20% 내지 약 100%, 또는 업계의 표준 기술을 사용하여 결정된 그 사이의 어떤 양, 예를 들어, 약 40% 내지 약 70% 또는 그 사이의 어떤 값, 예를 들어, 약 20, 22, 24, 25, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 48, 50, 52, 54, 55, 56, 58, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100%, 또는 그 사이의 어떤 값만큼 상대적 단백질 수율의 증가를 의미한다.
도 13A 및 14에서 나타난 바와 같이, B/Brisbane/60/2008의 HA는 아그로필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 불량하게 발현된다 (레인 1008 참조). 하지만, 단백질 가수분해 루프를 제거하도록 변형된 HA 타입 B의 발현 (레인 1059, 도 13A, 도 14 참조)은 증가된 발현을 초래하였다 (레인"1008+1261"; 및 "1059+1261" 참조). A/Puerto Rico/8/34의 M2읠 I와 함께 단백질, 가수분해 루프에서 결실을 포함하는 HA 타입 B의 동시-발현은 또한 증가된 발현 (1059+859; 도 14)을 초래한다.
도 46B에서 더 나타난 바와 같이, 아그로필트레이션된 니코티아나 벤타미아 나에서 발현된 H7 A/Hangzhou/1/13의 HA 단백질의 단백질 수율은 단백질 가수분해 루프를 결실시키거나변형시키도록 변형된 HA에서 증가된다. H7 A/Hangzhou/1/13 A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께 고유한 (야생형) HA의 동시-발현은 100% 상대적 단백질 수율로 이어지는 반면에, A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께, 단백질 가수분해 루프에서 결실을 포함하는 HA H7 A/Hangzhou/1/13의 동시-발현은 182% 상대적 단백질 수율로 이어진다 (도 46B). 하지만, 단백질 가수분해 루프에서 결실을 포함하는 HA의 상대적 단백질 수율의 증가는 M2에 의존적이지 않다. 예를 들어, 도 29A에서 나타난 바와 같이, 단백질 가수분해 루프에서 결실을 포함하는 H7 A/Hangzhou/1/13은 고유한 H7 A/Hangzhou/1/13과 비교하여 증가된 발현 (상대적 HA 역가에 의해 측정됨)을 나타냈다.
여러 전략이 A 및 B 균주 둘 다에 대한 HA0의 분열을 비활성화시키기 위해 평가되었다. 프로테아제에 의해 인식된 공통 서열은 연장된 루프 상에서 둘러싸여 있고, 용매에 노출되고, 단백질에 대한 막 원위부에 대하여 폐쇄된다. B 균주에서, 이 루프는 프로테아제에 의해 인식된 2개의 서열 모티프 및 HA2 도메인의 처음 N-말단 아미노산을 함유한다. HA0 전구체의 분열을 비활성화시키기 위한 점 돌연변이 접근법 (예를 들어, 하기 표 2 참조)은 B 균주 VLP의 축적의 증가 없이, HA0 생산을 초래하였다. 2개 프로테아제 분열 모티프 (7개 아미노산)를 포함하는 서열 모티프의 결실은 B HA의 축적을 폐지한다. B 균주의 HA 단백질로부터 전체 18-아미노산 루프의 제거 및 단백질 구조의 구조적 특징 (베타 가닥)을 보존하기 위한 링커의 삽입은 효과적이었다 (하기 참조; 도 13A, 14, 16A, 17B). A 균주의 HA 단백질에서 단백질 가수분해 루프의 제거 또는 대체가 또한 효과적이었다 (도 20, 22 참조).
아미노산 서열 결실 및 삽입은 아미노산 결실 및 아미노산의 삽입을 포함한다. 인플루엔자 B에서 결실의 비제한 예는 인플루엔자 B Florida 및 B Malaysia에 대하여, 예를 들어, 도 18C에서 나타난 바와 같이, 성숙한 HA 단백질의 위치 340 내지 357의 17개 아미노산 (AKLLKERGFFGAIAGFLE)의 결실이다. 이 결실은, 예를 들어, 제한되는 것은 아니지만, 서열 "GG"를 사용하여, 적절한 발현을 위한 폴리펩타이드 사슬에 결합하도록 적절한 링커에 의해 대체될 수도 있으며, 도 21B에서 나타난 바와 같다 (서열 번호: 17; 변형된 B/Brisbane/60/2008; AKLLKERGFFGAIAGFLEG를 GG로 대체; 예를 들어, 구조 1059, 도 5D, 10; 구조 1039, 도 8B, 또는 구조 1467; 도 7D, 7E). 대안의 대체는 "PPAKLLKER"을 "GSSSGSSSG"로 대체하는 것을 포함하며, 도 21C에서 나타난 바와 같다 (서열 번호: 18). 더 나아가, 서열 "RESRRKKR"은 "TETR" 또는 "TETQ"로 대체될 수도 있으며, 인플루엔자 H5/Indonesia에 대하여 도 19에서 나타난 바와 같다.
A 균주의 HA에 대한 대체 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환, 삽입 및 결실, 예를 들어, 제한되는 것은 아니지만, 아미노산 서열 "RERRRKRGLFGAIAGFIE"의 H5 Anhui의 단백질 가수분해 루프 영역에서 결실, "RESRRKKRGLFGAIAGFIE"를 포함하는 H5 Indo의 단백질 가수분해 루프 영역의 아미노산 서열의 결실 또는 H5 Vietnam "RERRRKKRGLFGAIAGFIE"의 단백질 가수분해 루프의 아미노산의 결실을 포함한다. H3에 대하여, 서열 "RNVPEKQTRGIF"은 결실되고 적절한 링커 서열, 예를 들어, 제한되는 것은 아니지만, 도 21E에서 나타난 "GS" (서열 번호: 20)에 의해 대체될 수도 있다. 대안으로, H3에서 서열 "RNVPEKQTR"은 도 21F에서 나타난 "GSSGSSGSS" (서열 번호: 21; 변형된 H3 A/Perth/16/2009)에 의해 대체될 수도 있다.
더 나아가, 프로테아제에 의한 단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위의 분열을 감소시키거나 폐지하기 위해 HADM1 단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위의 변형 또는 변화는 또한 비-보존적 아미노산 치환, 즉, 하나의 아미노산의 다른 구조적 및/또는 화학적 특성을 가진 또 다른 아미노산으로의 대체를 포함할 수도 있다. 비-단백질 아미노산은 또한 치환에 사용될 수도 있다, 예를 들어, 아미노산 치환은 소수성 아미노산의 친수성 아미노산으로의 대체를 포함할 수도 있다. 아미노산 치환은 비-자연 발생한 아미노산 또는 단백질 아미노산의 자연 발생한 아미노산 유도체에 의한 대체를 포함할 수도 있다.
B 균주 및/또는 A 균주의 HA에 대한 아미노산 돌연변이는 아미노산 결실을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 프로테아제에 의한 단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위의 분열을 감소시키거나 폐지하기 위해서, 하나 이상의 아미노산은 단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위 서열 내 결실 또는 제거이다. 결실은 비제한 예는 고유한 HA H5 단백질의 아미노산 323 내지 341, 예를 들어, H5 Anhui (RERRRKRGLFGAIAGFIE), H5 Indo (RESRRKKRGLFGAIAGFIE), 또는 H5 Vietnam (RERRRKKRGLFGAIAGFIE)의 제거를 포함하며, 도 18C에서 나타난 바와 같다. H3에 대하여, 서열 "RNVPEKQTRGIF"는 "GS" (도 21E; 서열 번호: 20)에 의해 대체될 수도 있거나, 또는 H3 서열 "RNVPEKQTR"은 "GSSGSSGSS" (도 21F; 서열 번호: 21)에 의해 대체될 수도 있다. B 균주에 대하여, 서열 "AKLLKERGFFGAIAGFLE"는 결실되고 및/또는 도 21B에서 나타난 바와 같이 (서열 번호: 17), 서열 "GG"에 의해 대체될 수도 있거나, 서열 "AKLLKERGFFGAIAGFLEG"는 "GG"로 대체될 수도 있거나, 또는 서열 "PPAKLLKER"은 "GSSSGSSSG" (도 21 C; 서열 번호: 18)로 대체될 수도 있다.
아미노산 돌연변이는 업계에 알려져 있는 유전학적 또는 화학적 방법을 사용하여 발생될 수 있다. 유전학적 방법은 부위-관련 돌연변이 돌연변이 생성, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수도 있다. 유전학적 조직 외에 방법, 예를 들어, 화학적 변형에 의해 아미노산의 측쇄 기를 변형시키는 방법이 또한 유용할 수도 있다고 고려된다.
그러므로 본 발명의 헤마글루티닌 (HA) 서열은 변형된 단백질 가수분해 루프 서열 또는 분열 부위를 포함하여, 이로 인해 프로테아제에 의한 단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위의 분열을 감소시키거나 폐지할 수도 있다. 헤마글루티닌 폴리펩타이드 서열은, 예를 들어, 도 5D, 7D, 8A, 18C, 19, 21B, 21C, 21E, 21F, 24D, 25D, 및 26D에서 제시된 바와 같은 변형된 단백질 가수분해 루프 또는 변형된 분열 부위 서열을 포함할 수도 있다. 어떤 인플루엔자 균주의 어떤 헤마글루티닌 폴리펩타이드 서열의 분열 부위도 서열 정렬을 포함하는, 업계에 알려져 있는 많은 방법을 사용하여 결정되거나 예측될 수 있다 (예를 들어, 도 15 참조).
H1, H3 및 B HA의 서열의 분석은 H1이 융합 펩타이드의 바로 앞에 있는 하나의 일염기 단백질 가수분해 부위 (클라라 타입 일염기: Q/EXR)를 가지고 있는 반면에, H3 및 B HA는 2개의 단백질 가수분해 부위를 가지며, 하나는 클라라-유사 프로테아제 (H1에서 발견됨)에 의해 인식되고, 또 다른 부위는 트립신 및 키모트립신-유사 프로테아제 (P-E/A-K)에 의해 인식된다는 것을 나타낸다. 이 HA 들의 분열을 위한 공통 서열은 표 1에서 나타난다.
표 1: 전구체 HA0 분열을 위한 단백질 가수분해 부위의 공통 서열. 클라라 트립타제 또는 트립신/키모트립신에 의해 인식된 서열은 각각 이탤릭체, 및 볼드로 나타난다. 여러 HA 균주들이 다염기 퓨린 타입 분열 부위 (RKKR; 평문, 밑줄 그어짐)를 포함한다.
H1 NIPSI QSR ↓GLF 서열 번호: 47
H3 NVPEK QTR ↓GIF 서열 번호: 48
H5 TGLRNSPQRESRRKKR↓GLF 서열 번호: 60
B PAKLL KER ↓GFF 서열 번호: 59
HA의 HA0 전구체의 잠재적 단백질 가수분해 분열을 방지하기 위해, 단 하나의 단백질 가수분해 부위가 H1의 서열로부터 변형되는 것이 필요할 수도 있는 반면에, H3 및 B의 경우에는, 두 개의 일염기 부위가 변형되는 것이 필요할 수도 있다.
예를 들어, B/Florida 및 B/Brisbane의 HA0의 제1 분열 부위는, 예를 들어, Lys 341 (성숙한 단백질 넘버링(numbering))을 Ile로 대체함으로써 제거될 수도 있다 (표 2 참조). 제2 일염기 부위는 융합 펩타이드, KER (344-346) 전 3개의 아미노산을 NIQ로 대체함으로써 폐지될 수도 있다. HA의 여러 변형된 단백질 가수분해 루프의 서열이 표 2에서 제공된다.
표 2: 전구체 HA0의 분열을 파괴하기 위한 돌연변이의 예의 설명. 일염기 부위는 이탤릭체 (클라라-유사 인식) 및 볼드체 (밑줄 없음: 트립신/키모트립신-유사)로 나타난다. 돌연변이는 볼드체로 나타나고 밑줄 그어져 있다. 화살표는 HA0의 HA1-HA2로의 전환을 위한 분열의 부위를 나타낸다.
균주 자연적 서열 전구체 분열 부위의 폐지
H5/Indo TGLRNSPQ RESRRKKR ↓GLF
서열 번호: 60		 TGLRNSPQ TETR GLF
서열 번호: 61
TGLRNSPQ TETQ GLF
서열 번호: 62
H1/Brisbane NIPSIQSR↓GLF
서열 번호: 47		 NIPSIQS Q GLF
서열 번호: 63
H3/Brisbane NVPEK QTR↓GIF
서열 번호: 48		 NVPE I QT Q GIF
서열 번호: 64
B/Florida,
B/Brisbane		 PAKLLKER↓GFF
서열 번호: 59		 PA I LL NIQ GFF
서열 번호: 65
추가의 예에서, HA0에서 단백질 가수분해 루프를 포함하는 서열은 대체되거나 결실될 수도 있다. 예를 들어, HA1의 C-말단에서 서열 RNVPEKQT의 결실, 이에 더하여 HA2의 N-말단 아미노산 GIFGIA의 결실의 결실을 함유하는 H3 변종이 도 21E에서 제공된다. 짧아진 HA1-HA2는 GS 링커에 의해 결합될 수도 있다.
또 다른 예에서, 루프는, 예를 들어, H3에서 단백질 가수분해 분열 부위를 함유하는데, 유연한 링커에 의해 대체될 수도 있고, HA2 일부는 온전하게 남아있을 수도 있다. (GSS)3 링커는 짧아진 HA1 내지 HA2를 수용하기 위해서 설계될 수도 있다. (도 21F 참조).
또 다른 예에서, 인플루엔자 B의 HA는 HA1의 C-말단에서 서열 ALKLLKER의 결실, 이에 더하여 HA2의 N-말단 아미노산 GFFGAIAGFLEG의 결실을 함유할 수도 있다. 짧아진 HA1-HA2는 GG 링커에 의해 결합될 수도 있다 (예를 들어, 도 21B 참조; 구조 1008). 이 구조의 발현은 도 13A 및 B에서 나타난다.
또 다른 예, 인플루엔자 B의 HA에서, 단백질 가수분해 부위를 함유하는 루프는 유연한 링커에 의해 대체될 수도 있고, HA2는 온전하게 남아있다. 더 긴 GSSS 링커는 짧아진 HA1 내지 H2를 수용하기 위해 설계될 수도 있다 (예를 들어, 도 21 C 참조).
도 13A 및 14에서 나타난 바와 같이, B/Brisbane/60/2008의 HA는 아그로필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 불량하게 발현된다 (레인 1008). 하지만, 단백질 가수분해 루프를 결실시키도록 변형된 HA 타입 B의 발현 (레인 1059, 도 13A, 도 14 참조)은 증가된 발현을 초래하였다.
더 나아가, A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께, HA-타입 B의 동시-발현은 HA 발현의 증가를 초래한다 (레인 "1008+1261"; 및 "1059+1261" 참조). A/Puerto Rico/8/34의 M2와 함께, 단백질 가수분해 루프에서 결실을 포함하는 HA 타입 B의 동시-발현은 또한 증가된 발현을 초래하였다 (1059+859; 도 14).
유사한 방식으로, H5/Indo에서 단백질 가수분해 루프의 결실, 및 "GG" (구조 928; 도 46D 참조), "TETR" (구조 676; 또한 도 19, 24D 참조) 또는 "TETQ" (구조 766; 또한 도 19, 25D 참조) 서열로의 대체는 고유한 H5/Indo로 관찰된 발현의 수준과 일치하거나 이보다 증가된 발현 수준을 초래하였다 (구조 489; 도 20 및 23 참조).
도 13B에서 나타난 바와 같이, HA0의 단백질 가수분해 루프 (도 21B에서 나타난 서열)를 결실시킴으로써, 결과의 HA0 단백질은 그것의 제거된 단백질 가수분해 루프를 갖고 있지 않은 HA 단백질과 비교하여, 더 높은 헤마글루티닌화 수용량에 의해 나타난 바와 같이 증가된 활성을 나타낸다.
활성의 증가는 그것의 제거된 단백질 가수분해 루프를 갖고 있지 않은 같은 HA 단배질의 활성과 비교하여, 약 2% 내지 약 100%, 또는 업계의 표준 기술을 사용하여 결정된 그 사이의 어떤 값, 예를 들어, 약 10% 내지 약 50% 또는 그 사이의 어떤 값, 예를 들어, 약 2, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 48, 50, 52, 54, 55, 56, 58, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100%, 또는 그 사이의 어떤 값만큼 헤마글루티닌화 수용량의 증가를 의미한다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 변형된 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 또는 타입 B HA로부터 변형된 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 엄중 조건 하에 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 또는 타입 B HA에 잡종화하는 어떤 뉴클레오타이드 서열, 또는 엄중 잡종화 조건 하에 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H1 1, H12, H13, H14, H15, H16 또는 타입 B HA의 보체에 잡종화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 뉴클레오타이드 서열은 발현될 때 VLP를 형성하고, VLP는 항체의 생산을 유도하는 헤마글루티닌 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 식물 세포 내에서 뉴클레오타이드 서열의 발현은 VLP를 형성하고, VLP는 B 또는 H3의 성숙한 HA를 포함하는, HA에 결합할 수 있는 항체를 생산하는데 사용될 수도 있다. VLP는, 대상체에 투여될 때, 면역 반응을 유도한다. 바람직하게, VLP는 항체의 생산을 유도하고, VLP는 대상체에 투여될 때, 면역 반응을 유도한다.
예를 들어, 식물 세포 내에서 뉴클레오타이드 서열의 발현은 VLP를 형성하고, VLP는 바이러스 단백질, 예를 들어, 하나 이상의 인플루엔자 타입의 HA0, 결실되거나 변형된 단백질 가수분해 루프를 가진 HA0, 하나 이상의 인플루엔자 타입 또는 서브타입의 HA1 또는 HA2 또는 서브타입, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 서브타입 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, 타입 B HA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 HA에 결합할 수 있는 항체를 생산하는데 사용될 수도 있다. VLP는, 대상체에 투여될 때, 면역 반응을 유도한다.
엄중 잡종화 조건 하에 잡종화는 업계에 알려져 있다 (예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 and supplements; Maniatis et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook and Russell, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition 2001 참조; 이것들 각각은 본원에 참고로 포함됨). 이러한 하나의 엄중 잡종화 조건의 예는 65℃에서 4 X SSC에서 약 16-20시간 잡종화 후 이어서, 1시간 동안 65℃에서 0.1 X SSC에서 세척, 또는 각각 20 또는 30분 동안 65℃에서 0.1 X SSC에서 2번 세척일 수도 있다.
대안으로, 예시적 엄중 잡종화 조건은 42℃에서 4 X SSC에서, 50% 포름아미드 중에서 하룻밤 동안 (16-20시간) 후 이어서, 1시간 동안 65℃에서 0.1 X SSC에서 세척, 또는 각각 20 또는 30분, 또는 하룻밤 (16-20시간) 동안 65℃에서 0.1 X SSC에서 2번 세척, 또는 65℃에서 처치 수성 포스페이트 버퍼(Church aqueous phosphate buffer) (7% SDS; 0.5M NaP04 버퍼 pH 7.2; 10 mM EDTA)에서 잡종화 후, 각각 20 또는 30분 동안 0.1 X SSC, 0.1% SDS에서 50℃에서 2번 세척, 또는 각각 20 또는 30분 동안 2 X SSC, 0.1% SDS에서 65℃에서 2번 세척일 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H1 1, H12, H13, H14, H15, H16 또는 타입 B HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 어떤 값, 서열 동일성, 또는 서열 유사성을 가진 것을 특징으로 하는 뉴클로타이드 서열을 포함하는데, 뉴클레오타이드 서열은 프로테아제에 의한 단백질 가수분해 루프 또는 분열 부위의 분열을 감소시키거나 폐지하는 변형된 단백질 가수분해 루프 서열 또는 분열 부위를 가진 헤마글루티닌 단백질 (변형된 HA)을 암호화한다. 변형된 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 발현될 때 그것은 VLP를 형성하고, VLP는 항체의 생산을 유도한다. 예를 들어, 식물 세포 내에서 뉴클레오타이드 서열의 발현은 VLP를 형성하고, VLP는 미가공된 HA (HA0) 또는 단백질 가수분해 루프가 결실된 미가공된 것을 포함하는, HA에 결합할 수 있는 항체를 생산하는데 사용될 수도 있다. VLP는, 대상체에 투여될 때, 면역 반응을 유도한다.
추가적으로, 본 발명은 서열 번호: 43, 91, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 137, 140, 144, 151, 158, 165의 뉴클레오타이드 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 어떤 값, 서열 동일성, 또는 서열 유사성을 가진 것을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는데, 뉴클레오타이드 서열은 발현될 때 VLP를 형성하는 변형된 HA 단백질을 암호화하고, 및 미가공된 HA (HAO) 또는 단백질 가수분해 루프가 결실되거나 변형된 미가공된 것을 포함하는 HA에 결합할 수 있는 항체의 생산을 유도한다. VLP는, 대상체에 투여될 때, 면역 반응을 유도한다.
더 나아가, 본 발명은 서열 번호: 17, 18, 20, 21, 41, 58, 77, 81, 85, 92, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 134, 143, 147, 154, 161, 168, 194 및 199의 아미노산 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 어떤 값, 서열 동일성, 또는 서열 유사성을 가진 것을 특징으로 하는 아미노산 서열을 포함하는데, 아미노산 서열은 발현될 때 VLP를 형성하는 변형된 HA 단백질을 암호화하고, VLP는 단백질 가수분해 루프가 결실되거나 변형된 미가공된 것을 포함하는 HA에 결합할 수 있는 항체의 생산을 유도한다. VLP는, 대상체에 투여될 때, 면역 반응을 유도한다.
서열 동일성 또는 서열 유사성은 뉴클레오타이드 서열 비교 프로그램, 예를 들어, DNASIS (예를 들어, 다음 파라미터를 사용하지만 이에 제한되지 않음: GAP 패널티 5, 상단 대각선의 # 5, 고정된 GAP 패널티 10, k-투플(tuple) 2, 플로팅 갭(floating gap) 10, 및 창 크기 5) 내에서 제공된 것을 사용하여 결정될 수도 있다. 하지만, 비교되는 서열의 정렬의 다른 방법, 예를 들어, Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2: 482), Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444)의 알고리즘, 및 이 알고리즘의 컴퓨터화된 실행 (예를 들어, GAP, BESTFIT, FASTA, 및 BLAST)., 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의한 것은 업계에 잘 알려져 있다. 인플루엔자의 다른 균주의 HA의 서열 정렬의 예는 도 24에서 발견될 수 있다.
예를 들어, 다음을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 제한되는 것은 아니다:
- 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 41, 서열 번호: 43, 서열 번호: 58, 서열 번호: 96, 서열 번호: 98, 서열 번호: 100, 서열 번호: 102, 서열 번호: 104, 서열 번호: 106, 서열 번호: 108, 서열 번호: 110, 서열 번호: 112, 서열 번호: 114 및 서열 번호: 168에 의해 한정된 변형된 단백질 가수분해 루프를 가진 타입 B HA, 또는 서열 번호: 65, 서열 번호: 72, 서열 번호: 73, 서열 번호: 95, 서열 번호: 97, 서열 번호: 99, 서열 번호: 101, 서열 번호: 103, 서열 번호: 105, 서열 번호: 107, 서열 번호: 109, 서열 번호: 111, 서열 번호: 113 및 서열 번호: 165에서 한정된 변형된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 타입 B HA를 암호화하는 유클레오티드 서열.
- 서열 번호: 63에 의해 한정된 변형된 분열 부위를 포함하는 서열을 포함하는 변형된 단백질 가수분해 루프를 가진 H1.
- 서열 번호: 134에 의해 한정된 변형된 분열 부위를 포함하는 서열을 포함하는 변형된 단백질 가수분해 루프를 가진 H2.
- 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호 143, 서열 번호: 147에 의해 한정된 서열을 포함하거나 서열 번호: 64에 의해 한정된 변형된 분열 부위를 포함하는 변형된 단백질 가수분해 루프를 가진 H3.
- 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 69, 서열 번호: 70, 서열 번호: 71에 의해 한정된 변형된 분열 부위를 포함하는 서열을 포함하는 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 H5.
- 서열 번호: 154에 의해 한정된 변형된 분열 부위를 포함하는 서열 또는 서열 번호: 151에서 한정된 변형된 단잭질 가수분해 루프를 포함하는 타입 H7 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 단백질 가수분해 루프를 가진 H7.
- 서열 번호: 161에 의해 한정된 변형된 분열 부위를 포함하는 서열 또는 서열 번호: 158에 의해 한정된 변형된 단백질 가수분해 루프 영역을 포함하는 타입 H9 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 단백질 가수분해 루프를 가진 H9.
본 발명은 막관통 도메인을 포함하고 HA1 및 HA2 도메인을 포함하는 HA 단백질의 사용에 적용되며, 예를 들어, HA 단백질은 HA0, 또는 HA1 및 HA2를 포함하는 가공된 HA일 수도 있다. HA 단백질은 식물, 또는 식물 세포, 발현 시스템을 사용하여 VLP의 생산 또는 형성에 사용될 수도 있다.
증폭 요소 및 인핸서 요소/조절 요소
또 다른 예에서, 변형된 HA 단백질은 증폭 요소 및/또는 조절 요소 또는 영역 (본원에서 인핸서 요소로도 불림)을 포함하는 발현 시스템에서 발현될 수도 있다. 예를 들어, 제미니바이러스의 증폭 요소, 예를 들어, 강낭콩 황고병 바이러스 (BeYDV)의 증폭 요소는 변형된 HA를 발현시키는데 사용될 수도 있다. BeYDV는 쌍자엽 식물에 적응된 마스트레바이러스(Mastrevirus) 속에 속한다. BeYDV는 단일 가닥 원형 DNA를 가진 단립형이며 롤링 서클(rolling circle) 메커니즘에 의해 매우 높은 카피 수로 복제할 수 있다. BeYDV-유래 DNA 레플리콘 벡터 시스템은 식물에서 신속한 고수율 단백질 생산에 사용되었다.
본원에서 사용된 바와 같이, 구절 "증폭 요소"는 제미니바이러스 게놈의 하나 이상의 긴 유전자 간 영역 (LIR)의 적어도 일부를 포함하는 핵산 세그먼트를 말한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "긴 유전자 간 영역"은 제미니바이러스 Rep 단백질의 절제 및 복제를 중재할 수 있는 rep 결합 부위를 함유하는 긴 유전자 간 영역의 영역을 말한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 LIR을 포함하는 핵산 세그먼트는 제미니 바이러스 게놈의 짧은 유전자 간 영역 (SIR)을 더 포함할 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "짧은 유전자 간 영역"은 상보성 가닥 (마스트레바이러스의 짧은 IR (SIR))을 말한다. 어떤 적합한 제미니바이러스-유래 증폭 요소도 본워에서 사용될 수 있다. 예를 들어, WO2000/20557; WO2010/025285; Zhang X. et al. (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271-279), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. et al.(2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17)을 참고하면 되고; 이것들은 본원에 참고로 포함된다. 하나 이상의 LIR, 예를 들어, 두 개의 LIR이 구조에 사용되면, 이어서 프로모터, CMPV-HT 영역 및 원하는 핵산 서열과 종결자는 두 개의 LIR 각각에 의해 둘러싸인다.
본원에서 기술된 바와 같이, 니코티아나 벤타미아나 잎의 아그로인필트레이션(agroinfiltration)에 의한 강낭콩 황고병 바이러스 (BeYDV)-유래 벡터 및 Rep/RepA-공급 벡터의 동시-전달은 효율적인 레플리콘 증폭 및 강력한 단백질 생산을 초래한다. 제거된 단백질 가수분해 루프가 있거나 없이 (구조에 대하여 도 17A 참조) 및 증폭 요소 BeYDV (구조 번호 1059 및 1039)의 존재 또는 부재 하에 변형된 인플루엔자 B HA (B/Brisbane/60/2008의 것)의 발현을 구동하는 유전자 구조로 형질전환된 식물의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 조절 요소가 CPMV-HT일 때, BeYDV의 부재 하에 인플루엔자 B HA의 축적이 검출될 수 없다는 것을 나타냈다 (도 17B).
도 17B에서 나타난 바와 같이, BeYDV의 부재 하에 단백질 가수분해 루프가 제거된 B/Brisbane/60/2008의 HA의 발현은 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출 가능한 발현으로 이어지지 않는다 (도 17B의 레인 1039 참조). 하지만, 증폭 요소 BeYDV의 존재 하에 단백질 가수분해 루프가 제고된 HA 타입 B의 발현은 증가된 발현을 초래한다 (레인 1059 참조). 유사하게, BeYDV의 부재 하에, A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께, 단백질 가수분해 루프에서 결실을 포함하는 돌연변이 HA-타입 B의 동시-발현은 검출 가능한 HA 발현을 초래하지 않는다 (도 17B에서 레인 "1039+1261"). 반면에, A/New Caledonia/20/99의 M2와 함께, BeYDV의 존재 하에 단백질 가수분해 루프에서 결실을 포함하는 돌연변이 HA 타입 B의 동시-발현은 증가된 발현을 초래하였다 (레인 "1059+1261" 참조; 도 17B).
하지만, BeyDV의 존재는 인핸서 요소가 발현 시스템에 존재할 때 및 인핸서 요소가 CPMV-HT가 아닐 때 필요하지 않다. 예를 들어, 도 29A에서 나타난 바와 같이, 인핸서 요소, 예를 들어, CPMV 160, CPMV 160+또는 CPMV HT+의 제어 하에 다양한 B HA 균주의 발현은 BeYDV의 부재 하에 증가된 헤마글루티닌화 역가 (HMG)를 나타내는 HA 단백질의 생산으로 이어진다.
그러므로, 돌연변이 (변형된) HA 단백질은 제미니바이러스-기반 증폭 요소와 같은 증폭 요소, 예를 들어, BeYDV의 부재 하에, 하지만 인핸서 요소, 예를 들어, CPMV 160, CPMV 160+또는 CPMV HT+의 존재 하에 발현될 수도 있다.
돌연변이 (변형된 HA)는 인핸서 요소, 예를 들어, CPMV 160, CPMV 160+또는 CPMV HT+의 존재 하에, 하지만 증폭 요소, 예를 들어, BeYDV의 부재 또는 존재 하에 발현될 수도 있다. 도 28B, 28C 및 28F에서 나타난 바와 같이 돌연변이 (변형된) HA는 증폭 요소가 있거나 없이, 인핸서 요소의 존재 하에 발현될 수도 있다. 그러므로 본 발명은 또한 인핸서 요소 및 선택적으로 증폭 요소의 존재 하에 돌연변이 (변형된) HA의 발현에 관한 것이다.
인핸서 요소 (CMPV HT+또는 CMPV 160+) 및 GG 링커 (결실된 단백질 가수분해 루프)로 대체된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 HA 구조는 야생형 타입 또는 CPMV HT를 포함하는 HA 구조와 비교하여 증가된 발현을 나타낸다 (도 28A, H3 Per; 도 28B, B Malaysia; 도 28C, H9 HK; 도 29D, B Mass; 도 28E, H2 Sin).
도 29A는 결실된 단백질 가수분해 루프 (GG 링커)를 가진 변형된 HA 또는 고유한 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 결합된 CPMV HT, CPMV HT+, CPMV 160 또는 CPMV 160+, 기반 인핸서 요소를 포함하는 식물에서 생산된 변형된 HA 단백질의 헤마글루티닌화 역가에 대한 요약 데이터를 제공한다. 대부분의 경우에, 발현 (헤마글루티닌화 역가로서 결정됨)은 CPMV HT+, CPMV 160 또는 CPMV 160+기반 구조가 유의한 발현 수준을 입증하는 동안 더 높았다.
인핸서 요소는 변형된 단백질 가수분해 루프를 가진 돌연변이 (변형된) HA 단백질의 높은 수준의 일과성 발현을 달성하는데 사용될 수도 있다. 인핸서 요소는 동부 모자이크 바이러스와 같은 코모바이러스를 포함하는 RNA 식물 바이러스를 기반으로 할 수도 있다 (CPMV; 예를 들어, WO2007/135480; WO2009/087391; US 2010/0287670, Sainsbury F. et al, 2008, Plant Physiology; 148: 121-1218; Sainsbury F. et al, 2008, Plant Biotechnology Journal; 6: 82-92; Sainsbury F. et al, 2009, Plant Biotechnology Journal; 7: 682-693; Sainsbury F. et al. 2009, Methods in Molecular Biology, Recombinant Proteins From Plants, vol. 483: 25-39 참조).
CPMV 160 ( CPMVX ) 및 CPMV 160+( CPMVX +)
한 구체예에서 인핸서 요소는 US 61/925,852에서 기술된 바와 같이 "CPMVX" ("CPMV 160"으로도 불림) 및/또는 "CPMVX+" ("CPMV 160+"로도 불림)이며, 이것은 본원에 참고로 포함된다.
발현 인핸서 "CPMVX"는 코모바이러스 동부 모자이크 바이러스 (CPMV) 5' 비번역 영역 (UTR)을 포함한다. CPMV RNA-2 서열 (서열 번호: 93)의 뉴클레오타이드 1-160의 5'UTR은 전사 시작 부위에서 제1 인 프레임(in frame) 개시 시작 코돈 (위치 161에서)으로 시작하며, 이것은 야생형 코모바이러스 게놈 세그먼트에 의해 암호화된 두 개의 카르복시 양쪽 말단보다 더 긴 것의 생산을 위한 개시 부위의 역할을 한다. 더 나아가 CPMV RNA-2 게놈 서열에서 위치 115에서 (또는 이에 해당하는) '제3' 개시 부위가 또한 돌연변이되거나, 결실되거나 또는 달리 변경될 수도 있다. AUG 115의 제거, 이에 더하여 AUG 161의 제거는 불완전 M 단백질과 결합될 때 발현을 향상시킨다는 것이 나타난다 (Sainsbury and Lomonossoff, 2008, Plant Physiology; 148: 1212-1218; WO 2009/087391; 이것은 본원에서 참고로 포함됨).
CPMVX는 X=서열 번호: 93의 160, 155, 150, 또는 114이면, 서열 번호: 93의 X 뉴클레오타이드, 또는 X=서열 번호: 93의 160, 155, 150, 또는 114이면, CPMVX와 80% 내지 100% 서열 유사성을 포함하는 서열을 포함한다. 이 발현 인핸서는 일반적으로 CPMVX로 불린다 (도 26A 참조).
발현 인핸서 CPMVX는, X=160이면, 서열 번호: 93의 뉴클레오타이드 1-160으로 구성된다:
1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc
61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc
121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca (서열 번호: 93)
CPMVX 인핸서 서열은 스터퍼 서열에 더 융합될 수도 있는데, CMPVX는 X=서열 번호: 93의 160, 155, 150, 또는 114이면, 서열 번호: 1의 X 뉴클레오타이드, 또는 X=서열 번호: 93의 160, 155, 150, 또는 114이면, CPMVX과 80 내지 100% 서열 유사성을 포함하는 서열을 포함하고, 스터퍼 서열은 CMPVX 서열의 3' 끝에 융합된 1-100 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 스터퍼 서열은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 뉴클레오타이드, 또는 그 사이의 많은 뉴클레오타이드를 포함할 수도 있다.
CMPVX 서열이 스터퍼 단편을 포함하면, 이어서 이 발현 인핸서는 CPMVX+로도 불릴 수 있거나 (도 26A 참조), X=서열 번호: 93의 160, 155, 150, 114이면, 그것은 또한 스터퍼 서열을 포함하는 CMPVX로도 불릴 수 있거나, 또는 X=160, 155, 150, 또는 114일 때, 그것은 각각 CPMV160+; CPMV155+; CPMV150+; CPMV114+로도 불릴 수 있다. 스터퍼 서열을 포함하지 않는 CPMVX를 포함하는 구조는 서열 번호: 93의 X=160, 155, 150, 114이고, 스터퍼 서열이 길이가 0 뉴클레오타이드이면, CPMVX+로 불릴 수도 있다.
스터퍼 서열은 뉴클레오타이드 160에 대하여 3'에 위치한 고유한 CMPV5'UTR 서열의 절단, 결실, 또는 대체에 의해 변형될 수도 있다. 변형된 스터퍼 서열은 5'UTP와 결합된 초기 또는 변형되지 않은 (즉 고유한) 스터퍼 서열과 비교하여 제거되거나, 대체되거나, 절단되거나 짧아질 수도 있다 (Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., 2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218에 의해 기술된 바와 같음). 스터퍼 서열은 하나 이상의 제한 부위 (폴리링커, 다클로닝 부위, 하나 이상의 클로닝 부위), 하나 이상의 식물 코자크 서열s, 하나 이상의 링커 서열, 하나 이상의 재조합 부위, 또는 이것들의 조합을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 제한하는 것으로 고려되는 것은 아니지만, 스터퍼 서열은 연속적으로, 식물 코자크 서열에 융합된 원하는 길이의 다클로닝 부위를 포함할 수도 있다. 스터퍼 서열은 고유한 CPMV 5'UTR의 뉴클레오타이드 160, 예를 들어, Sainsbury F., 및 Lomonossoff G.P.의 도 1에서 나타난 뉴클레오타이드 161 내지 512 (2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218; 이것은 본원에 참고로 포함됨), 또는 서열 번호: 4의 뉴클레오타이드 161-509에 대하여 3'에 위치한 고유한 5'UTR 서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다. 즉, 선행 업계 CPMV HT 서열 (도 1; Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., 2008)에 존재하는 불완전 M 단백질은 본 발명에서 5'UTR로부터 제거된다.
식물 코자크 공통 서열은 업계에 알려져 있다 (예를 들어, Rangan et al. Mol. Biotechnol., 2008, July 39(3), pp. 207-213 참조). 자연적으로 발생한 및 합성의 코자크 서열 둘 다는 본원에서 기술된 바와 같이 발현 인핸서에서 사용될 수도 있거나 원하는 뉴클레오타이드 서열에 융합될 수도 있다.
식물 코자크 서열은 다음 식물 공통 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 어떤 알려져 있는 식물 코자크 서열일 수도 있다 (예를 들어, L. Rangan et. al. Mol. Biotechnol.2008 참조):
caA(A/C)a (서열 번호: 174; 식물계)
aaA(A/C)a (서열 번호: 175; 쌍떡잎식물)
aa(A/G)(A/C)a (서열 번호: 176; 애기장대(arabidopsis)).
식물 코자크 서열은 또한 다음 군으로부터 선택될 수도 있다:
AGAAA (서열 번호: 177)
AGACA (서열 번호: 178)
AGGAA (서열 번호: 179)
AAAAA (서열 번호: 180)
AAACA (서열 번호: 181)
AAGCA (서열 번호: 182)
AAGAA (서열 번호: 183)
AAAGAA (서열 번호: 184)
AAAGAA (서열 번호: 185)
(A/-)A(A/G)(A/G)(A/C)A. (서열 번호: 186; 공통 서열).
발현 인핸서 CPMVX, 또는 CPMVX+는 식물 숙주 내에서 원하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 구동하기 위해서 식물에서 활성이고, 발현 인핸서의 3' 끝에서 원하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합된 조절 영역과 인핸서 서열의 5' 끝에서 작동 가능하게 결합될 수도 있다 (도 26A).
CPMV HT+, CPMV HT+[WT115], CPMV HT+[511]
또 다른 구체예에서, 인핸서 요소는 US 61/971,274에서 기술된 "CPMV HT+"이며, 이것은 본원에 참고로 포함된다. 발현 인핸서 "CPMV HT+" (도 27A 참조)는 코모바이러스 5' 비번역 영역 (UTR) 및 변형된, 길어진, 또는 절단된 스터퍼 서열을 포함한다.
조절 영역을 포함하고, 본원에서 기술된 하나 또는 하나 이상의 발현 인핸서에 작동 가능하게 결합된 제1 핵산 서열 (예를 들어, CPMV HT+, CPMV HT+[WT115], CPMV HT+[511]), 및 변형된 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물 발현 시스템이 또한 제공된다. 더 나아가, 프로모터 (조절 영역) 서열, 코모바이러스 5'UTR을 포함하는 발현 인핸서 (예를 들어, CPMV HT+또는 CPMV HT+[WT115]) 및 변형된 HA를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열에 융합된 식물 코자크 서열을 가진 스터퍼 서열을 포함하는 핵산이 기술된다. 핵산은 변형된 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 코모바이러스 3' 비번역 영역 (UTR), 플라스토시아닌 3' UTR, 또는 다른 3'UTR 서열로부터 업스트림에 삽입되도록 코모바이러스 3' 비번역 영역 (UTR), 예를 들어, 플라스토시아닌 3' UTR, 또는 식물에서 활성인 다른 3'UTR, 및 변형된 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 3' 끝에 작동 가능하게 결합된 종결자 서열, 예를 들어, NOS 종결자를 포함하는 서열 (도 27A에서 원하는 뉴클레오타이드로 불림)을 더 포함할 수도 있다.
서열 번호: 173은 선행 업계에 알려져 있는 "CPMV HT" 발현 인핸서 (예를 들어, Sainsbury and Lomonossoff 2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218의 도 1; 이것은 본원에 참고로 포함됨)를 포함한다. CPMV HT는 위치 115 (cgt)에서 변형된 뉴클레오타이드를 가진 서열 번호: 173의 뉴클레오타이드 1-160의 5'UTR, 및 위치 162 (acg)에서 변형된 뉴클레오타이드를 가진 불완전 M 단백질을 포함하고, 식물 코자크 서열 (5'UTR: 뉴클레오타이드 1-160; 밑줄 그어진 불완전 M 단백질, 뉴클레오타이드 161-509)이 없다. 서열 번호: 173은 또한 선행 업계 CPMV HT 서열에 존재하지 않는 다클로닝 부위 (이탤릭체, 뉴클레오타이드 510-528)를 포함한다:
1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc
61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc
121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acg ttttctt tcactgaagc
181 gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc
241 ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc
301 atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt
361 gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa
421 atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt
481 taagcttctg tatattctgc ccaaatttg t cgggccc 서열 번호: 173.
식물 코자크 공통 서열을 가진 CPMV HT+가 서열 번호: 187에서 제공된다 (뉴클레오타이드 1-160, 5'UTR, 위치 115 (GTG)에서 변형된 ATG를 포함, 소문자 볼드체 및 이탤릭체; 밑줄 그어진 불완전 M 단백질을 포함하는 스터퍼 단편, 뉴클레오타이드 161 - 509, 162 (ACG)에서 변형된 뉴클레오타이드를 가짐; 다클로닝 부위, 이탤릭체, 뉴클레오타이드 510-528; 및 공통 식물 코자크 서열, 대문자 및 볼드체, 뉴클레오타이드 529-534)
1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc
61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgc gtg agc
121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acg ttttctt tcactgaagc
181 gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc
241 ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc
301 atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt
361 gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa
421 atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt
481 taagcttctg tatattctgc ccaaatttg t tcgggcccaa taccgcgg( A/-)A(A/G)
서열 번호: 188 ("CPMV HT+511")은 뉴클레오타이드 1-154의 CPMV RNA 2 게놈의 고유한 서열의 세그먼트를 포함한다. 서열 번호: 188의 뉴클레오타이드 1-511의 5'UTR 서열은 위치 115 ("a" 대신에 "g"; 이탤릭체 볼드체) 및 162 ("t" 대신에 "c"; 이탤릭체 볼드체)에서 변형된 "atg" 서열, 및 뉴클레오타이드 161-511의 불완전 M 단백질 (밑줄 그어져 있음)을 포함한다. CPMV HT+511은 고유한 M 단백질 코자크 공통 서열 (뉴클레오타이드 508-511; 볼드체)을 포함한다:
1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc
61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgc gtg agc
121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acg ttttctt tcactgaagc
181 gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc
241 ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc
301 atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt
361 gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa
421 atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt
481 taagcttctg tatattctgc ccaaatt tga a … 서열 번호: 188
CPMV HT+인핸서 서열의 또 다른 비제한 예는 서열 번호: 189 (CPMV HT+[WT115])의 서열에 의해 제공된다. CPMV HT+를 포함하고 서열 번호: 189의 발현 인핸서 서열과 작동 가능하게 결합된 식물 조절 영역, 및 변형된 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 융합된 3' 끝에서 전사 시작 부위 (ATG)를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터는 또한 본 발명의 일부이다.
서열 번호: 189 (CPMV HT+[WT115]) 뉴클레오타이드 1-160, 5'UTR, 위치 115-117에서 ATG를 가짐, 소문자 볼드체; 밑줄 그어진 불완전 M 단백질, 뉴클레오타이드 161 - 509를 포함하는 스터퍼 단편; 위치 161-153에서 ATG가 변형됨, 소문자 볼드체, 및 밑줄 그어진; 다클로닝 부위, 이탤릭체, 뉴클레오타이드 510-528; 및 식물 코자크 서열, 대문자 및 볼드체, 뉴클레오타이드 529-534).
1 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc
61 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgc atg agc
121 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acg ttttctt tcactgaagc
181 gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc
241 ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc
301 atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt
361 gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa
421 atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt
481 taagcttctg tatattctgc ccaaatttg t tcgggcccaa taccgcgg AG AAAA
(서열 번호: 189)
서열 번호: 189의 식물 코자크 서열은 서열 번호: 174-186의 서열 중 하나를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 어떤 식물 코자크 서열일 수도 있다.
" 키메라 단백질"
변형된 HA는 추가로 키메라 단백질일 수도 있다. "키메라 단백질" 또는 "키메라 폴리펩타이드", 또는 "키메라 HA"로도 불리는 "키메라 바이러스 단백질" 또는 "키메라 바이러스 폴리펩타이드"는 단일 폴리펩타이드로서 융합되는 둘 또는 둘 이상의 공급원, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 둘 이상의 인플루엔자 타입 또는 서브타입, 또는 다른 기원의 인플루엔자의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 키메라 단백질 또는 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 또는 단백질의 나머지와 같거나, 또는 이것들과 이종 기원인 신호 펩타이드를 포함할 수도 있다. 키메라 단백질 또는 키메라 폴리펩타이드는 키메라 뉴클레오타이드 서열의 전사물로서 생산될 수도 있고, 합성 후, 및 필요하면, 멀티머 단백질을 형성하도록 결합할 수도 있다. 그러므로, 키메라 단백질 또는 키메라 폴리펩타이드는 또한 이황화 브릿지를 통해 결합된 서브유닛을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드 (즉 멀티머 단백질)를 포함한다. 예를 들어, 둘 또는 둘 이상의 공급원의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 서브유닛으로 가공될 수도 있으며, 서브유닛은 이황화 브릿지를 통해 결합되어 키메라 단백질 또는 키메라 폴리펩타이드를 생산한다. 키메라 HA 단백질은 또한 제1 인플루엔자 바이러스의 항원성 단백질 또는 이것의 단편, 및 막관통 도메인 및 세포질 꼬리 도메인 (TM/CT)을 포함하는, 제2 바이러스 인플루엔자 HA의 막관통 도메인 복합체 (TDC)를 포함할 수도 있다. 폴리펩타이드는 변형된 HA일 수도 있고, 폴리펩타이드를 구성하는 둘 또는 둘 이상의 아미노산 서열 각각은 키메라 HA, 키메라 인플루엔자 HA, 키메라 변형된 HA 또는 키메라 변형된 인플루엔자 HA를 생산하기 위해 다른 HA로부터 얻어질 수도 있다. 키메라 HA는 또한 단백질 합성 후에 또는 도중에 분열되는 이종 기원 신호 펩타이드 (키메라 HA 전구단백질)을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수도 있다. 바람직하게, 키메라 폴리펩타이드, 또는 키메라 인플루엔자 HA는 자연적으로 발생하지 않는다. 키메라 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 "키메라 핵산", 또는 "키메라 뉴클레오타이드 서열"로서 기술될 수도 있다. 예를 들어, 키메라 핵산은, 연속적으로, 변형된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 변형된 HA 엑토도메인, 인플루엔자 막관통 도메인, 및 세포질 꼬리를 암호화하는 키메라 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수도 있으며, 변형된 HA 엑토도메인은 제1 인플루엔자 균주의 것이고 막관통 도메인 및 세포질 꼬리는 제2 인플루엔자 균주의 것이다. 변형된 HA 엑토도메인은 제1 인플루엔자 균주의 것이고 막관통 도메인 및 세포질 꼬리는 제2 인플루엔자 균주의 것인, 키메라 뉴클레오타이드 산의 예는 실시예 5.14, 5.16, 5.18, 5.19, 5.21 및 5.23에서 제공된다. 키메라 HA로 구성된 바이러스-유사 입자는 "키메라 VLP"로서 기술될 수도 있다.
상기 기술된 바와 같이, 키메라 단백질, 키메라 폴리펩타이드, 또는 키메라 HA는 폴리펩타이드 또는 단백질의 나머지와 같거나, 또는 이종 기원인 신호 펩타이드를 포함할 수도 있다. 용어 "신호 펩타이드"는 업계에 잘 알려져 있으며 일반적으로 짧은 (약 5-30 아미노산) 서열의 아미노산을 말하며, 일반적으로 새로 번역된 폴리펩타이드의 특정 세포 기관으로의 위치 이동을 지시하거나, 또는 서로 폴리펩타이드 사슬의 특이적 도메인의 위치 결정을 도울 수도 있는 폴리펩타이드의 N-말단에서 발견된다. 비제한 예로서, 신호 펩타이드는 성숙한 단백질, 예를 들어, 변형된 HA 또는 키메라 변형된 HA의 분열 및 폴딩을 돕기 위해 초기 폴리펩타이드의 막-앵커 도메인에 관하여 단백질의 소포체로의 위치 이동을 표적화하고 및/또는 소포체 N-말단 근위 도메인의 위치 결정을 도울 수도 있다.
HA는 또한 키메라 HA 또는 키메라 변형된 HA일 수도 있으며, HA 또는 변형된 HA의 고유한 막관통 도메인은 이종 기원 막관통 도메인으로 대체된다. HA 단백질의 막관통 도메인은 고도로 보존된다 (예를 들어, WO 2010/148511의 도 1C 참조; 이것은 본원에 참고로 포함됨). 이종 기원 막관통 도메인은 어떤 HA 막관통 도메인, 제한은 아니지만, 예를 들어, H1 California, B/Florida/4/2006 (GenBank 수납 번호 ACA33493.1), B/Malaysia/2506/2004 (GenBank 수납 번호 ABU99194.1), H1/Bri (GenBank 수납 번호 ADE28750.1), H1 A/Solomon Islands/3/2006 (GenBank 수납 번호 ABU99109.1), H1/NC (GenBank 수납 번호 AAP34324.1), H2 A/Singapore/1/1957 (GenBank 수납 번호 AAA64366.1), H3 A/Brisbane/10/2007 (GenBank 수납 번호 ACI26318.1), H3 A/Wisconsin/67/2005 (GenBank 수납 번호 AB037599.1), H5 A/Anhui/1/2005 (GenBank 수납 번호 ABD28180.1), H5 A/Vietnam/1194/2004 (GenBank 수납 번호 ACR48874.1), H5-Indo (GenBank 수납 번호 ABW06108.1)의 막관통 도메인으로부터 얻어질 수도 있다. 막관통 도메인은 또한 다음 공통 아미노산 서열에 의해 한정될 수도 있다:
iLXiYystvAiSslXlXXmlagXsXwmcs (서열 번호: 94).
이종 기원 막관통 도메인을 가진 키메라 HA를 포함하는 구조의 예는 다음을 포함한다: 구조 번호 1875 (결실된 단백질 가수분해 루프+H1TM을 가진 CPMV-HT+B Brisbane/60/08, H1 A/California/07/2009에 의해 대체된 막관통 도메인 및 세포질 꼬리를 가짐; 실시예 5.19 참조), 구조 번호 1977 (결실된 단백질 가수분해 루프+H1TM를 가진 CPMV-160+B Brisbane/60/08, H1 A/California/07/2009에 의해 대체된 막관통 도메인 및 세포질 꼬리를 가짐; 실시예 5.14 참조), 구조 번호 1067 (결실된 단백질 가수분해 루프+H1TM을 가진 CPMV-HT B Brisbane/60/08, H1 A/California/07/2009에 의해 대체된 막관통 도메인 및 세포질 꼬리를 가짐; 실시예 5.14 참조), 구조 번호 2074 (CPMV HT B Massachusetts/2/2012+H1Tm, H1 A/California/07/2009의 것에 의해 대체된 막관통 도메인 및 세포질 꼬리; 실시예 5.16 참조), 구조 번호 2060 (CPMV HT160+Massachusetts/2/2012+H1Tm, H1 A/California/07/2009의 것에 의해 대체된 막관통 도메인 및 세포질 꼬리를 가짐; 실시예 5.16 참조), 구조 번호 2062 (CPMV 160+B Massachusetts/2/2012+H1Tm, H1 A/California/07/2009의 것에 의해 대체된 막관통 도메인 및 세포질 꼬리를 가짐; 실시예 5.21 참조), 구조 번호 1860 (H1 A/California/07/2009의 것에 의해 대체된 막관통 도메인 및 세포질 꼬리를 가진 CPMV HT+B Wisconsin/1/2010+H1Tm; 실시예 5.23 참조), 구조 번호 1454 (H1 A/California/07/2009의 것에 의해 대체된 막관통 도메인 및 세포질 꼬리를 가진 CPMV HT B Wisconsin/1/2010+H1Tm, 실시예 5.18 참조) 및 구조 번호 1893 (H1 A/California/07/2009의 것에 의해 대체된 막관통 도메인 및 세포질 꼬리를 가진 CPMV 160+B Wisconsin/1/2010+H1Tm; 실시예 5.18 참조). 이 키메라 변형된 HA의 활성은 도 26B 및 27B에서 나타난다.
신호 펩타이드
신호 펩타이드 (SP)는 변형된 HA 또는 키메라 변형된 HA에 고유할 수도 있거나, 또는 신호 펩타이드는 발현되는 변형된 HA의 1차 서열에 관하여 이종 기원일 수도 있다. 변형된 HA는 제1 인플루엔자 타입, 서브타입 또는 하나 또는 하나 이상의 다른 인플루엔자 타입, 서브타입 또는 균주의 HA가 균형잡힌 균주의 신호 펩타이드를 포함할 수도 있다. 예를 들어, HA 서브타입 H1, H2, H3, H5, H6, H7, H9 또는 인플루엔자 타입 B의 고유한 신호 펩타이드는 식물 시스템에서 변형된 HA를 발현시키는데 사용될 수도 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, SP는 인플루엔자 타입 B, H1, H3 또는 H5; 또는 서브타입 H1/Bri, H1/NC, H5/Indo, H3/Bri 또는 B/Flo의 것일 수도 있다.
더 나아가, 변형된 HA 또는 키메라 변형된 HA는 고유한, 또는 비-고유한 신호 펩타이드를 포함할 수도 있고; 비-고유한 신호 펩타이드는 식물 기원의 것이거나 동물 또는 박테리아 폴리펩타이드로부터 얻어질 수도 있다. 고유한 신호 펩타이드는 발현되는 HA 또는 변형된 HA의 것과 일치할 수도 있으며, 추가적으로, 신호 펩타이드는 인플루엔자 이외의 바이러스의 구조적 단백질 또는 헤마글루티닌의 것일 수도 있다. 사용될 수도 있는 신호 펩타이드의 비제한 예는 알팔파 단백질 이황화 이소머라제 (PDI SP; 수납 번호 Z11499의 뉴클레오타이드 32-103, 또한 WO 2009/076778; WO 2010/148511, 또는 WO 2010/003235 참조)의 것, 또는 파타틴 신호 펩타이드 (PatA SP; GenBank 수납 번호 A08215의 뉴클레오타이드 1738 - 1806에 위치함)이다. 이 수납 번호에 대한 PatA SP의 뉴클레오타이드 서열은
ATGGCAACTACTAAAACTTTTTTAATTTTATTTTTTATGATATTAGCAACTACTAGTTCAACATGTGCT　 (서열 번호: 171)
이다.
파타틴 A 신호 펩타이드의 아미노산 서열은
MATTKTFLILFFMILATTSSTCA (서열 번호: 172)
이다.
그러므로 본 발명은 고유한, 또는 비-고유한 신호 펩타이드를 포함하는 변형된 HA 또는 키메라 변형된 HA, 및 이러한 키메라 변형된 HA 단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다.
채널 단백질과 동시-발현
돌연변이 (변형된) HA는 채널 단백질, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 양성자 채널 단백질을 암호화하는 제2 핵산과 함께 변형된 HA를 암호화하는 제1 핵산을 동시-발현시킴으로써 식물에서 생산될 수도 있다. 제1 및 제2 핵산은 같은 단계에서 식물로 도입될 수도 있거나, 또는 그것들은 순차적으로 식물로 도입될 수도 있다. 제1 및 제2 핵산은 일과성 방식으로, 또는 안정한 방식으로 식물에서 도입될 수도 있다.
더 나아가, 변형된 HA를 암호화하는 제1 핵산을 발현하는 식물은, 제1 및 제2 핵산 둘 다가 식물에서 동시-발현되도록, 채널 단백질, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 양성자 채널 단백질 (제2 핵산)로 형질전환될 수도 있다. 대안으로, 채널 단백질, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 양성자 채널 단백질 (제2 핵산)을 발현하는 식물은 제1 및 제2 핵산이 식물에서 동시-발현되도록 변형된 HA를 암호화하는 제1 핵산으로 형질전환될 수도 있다. 추가적으로, 변형된 HA를 암호화하는 제1 핵산을 발현하는 제1 식물은 각각 변형된 HA 및 채널 단백질, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 양성자 채널 단백질을 암호화하는 제1 및 제2 핵산을 동시-발현하는 자손 식물을 생산하기 위해서, 채널 단백질, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 양성자 채널 단백질을 암호화하는 제2 핵산을 발현하는 제2 식물과 교배될 수도 있다.
어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 골지체를 포함하여, 변형된 HA를 포함하는 세포 구획의 pH는 HA의 폴딩, 안정성 및/또는 단백질 가수분해에 중요할 수도 있다. 양성자 채널 단백질, 예를 들어, 인플루엔자 M2 및 BM2 단백질은 세포 구획에서 pH를 조절할 수도 있다. 예를 들어, M2는 인플루엔자 바이러스 복제의 말기 및 초기 단계 둘 다에서 세포 내 구획을 완충시킴으로써 막 융합의 강화 작용을 조절한다.
변형된 HA와 함께, 채널 단백질, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 양성자 채널 단백질을 동시-발현시킴으로써, 골지체 내 pH가 증가할 수도 있고, 안정성, 분해의 감소, 또는 이것들의 조합의 증가를 초래하며, 변형된 HA 및/또는 VLP의 발현 수준 및 수율을 증가시킨다.
식물에서 채널 단백질, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 양성자 채널 단백질과 함께 변형된 HA를 동시-발현시킴으로써, 채널 단백질, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 양성자 채널 단백질의 동시-발현 없이 변형된 것을 발현하는 식물과 비교하여 HA 및/또는 VLP의 증가된 수율이 관찰된다 (도 13A 및 14 참조). 예를 들어, 도 13A에서 나타난 바와 같이, 변형된 인플루엔자 B HA와 함께 M2의 동시-발현은 HA 축적 수준을 증가시켰다 (도 13A, 1059 대 1059+1261).
더 나아가, 변형된 인플루엔자 B HA 및 H3의 축적을 증가시키기 위한 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934의 M2의 효능은 인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999의 M2의 그것과 비교되었다. 변형된 인플루엔자 B HA에 대하여, 비교는 구조 1059, 1059+1261 및 1059+859로 형질전환된 식물의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 착수되었다. 얻어진 결과는 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934 (구조 번호 859에 의해 암호화됨)의 M2의 동시-발현이 변형된 인플루엔자 B HA의 축적의 증가에 대하여 인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999 (구조 번호 1261에 의해 암호화됨)의 M2의 동시-발현만큼 효율적이었다는 것을 입증하였다 (도 14).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "M2", "M2 단백질", "M2 서열" 및 "M2 도메인"은 어떤 자연 발생한 또는 인공적으로 생성된 인플루엔자 바이러스 균주 또는 분리물을 기반으로 하거나 또는 이것들에 존재하는 M2 단백질 서열 분리된 형태의 모두 또는 일부를 말한다. 따라서, 용어 M2 등은 바이러스 생활 주기 동안 돌연변이에 의해 생산되거나 선택압 (예를 들어, 약물 치료, 숙주 세포 항성 또는 감염성의 확장, 등)에 반응하여 생산된 자연 발생한 M2 서열 변종, 뿐만 아니라 재조합에 의해 또는 합성에 의해 생산된 M2 서열을 포함한다. 본 발명과 함께 사용될 수도 있는 서열의 비제한 예는 A/Puerto Rico/8/1934의 M2 및 A/New Caledonia/20/1999의 M2를 포함한다.
면역 반응
"면역 반응"은 일반적으로 후천적 면역 시스템의 반응을 말한다. 후천적 면역 시스템은 일반적으로 체액 반응, 및 세포-중재 반응을 포함한다. 체액 반응은 B 림프구 계통의 세포 (B 세포)에서 생산된, 분비된 항체에 의해 중재되는 면역력의 양태이다. 분비된 항체는 미생물 (예를 들어, 바이러스 또는 박테리아)을 침입하는 표면 상에서 항원에 결합하며, 이것은 파괴를 위해 그것들을 플래그(flag) 한다. 체액 면역력은 일반적으로 항체 생산 및 그것을 동반하는 과정, 뿐만 아니라, Th2 세포 활성화 및 시토킨 생산, 기억 세포 발생, 식균 작용의 옵소닌 촉진, 병원체 제거 등을 포함하는, 항체의 반응기 기능을 말하기 위해 사용된다. 용어 "조절하다" 또는 "조절" 등은 일반적으로 알려져 있거나 사용된 여러 검정에 의해 결정된 바와 같이 특정 반응 또는 파라미터의 증가 또는 감소를 말하며, 이것들 중 일부는 본원에서 예시된다.
세포-중재된 반응은 항체를 수반하지 않지만, 대식세포, 자연 살해 세포 (NK), 항원-특이적 세포 독성 T-림프구의 활성화, 및 항원에 반응하여 다양한 시토킨의 방출을 수반하는 면역반응이다. 세포-중재된 면역력은 일반적으로 일부 Th 세포 활성화, Tc 세포 활성화 및 T-세포 중재된 반응을 말하기 위해 사용된다. 세포 중재된 면역력은 바이러스 감염에 반응하는데 있어서 특히 중요하다.
예를 들어, 항원 특이적 CD8 양성 T 림프구의 유도는 ELISPOT 검정을 사용하여 측정될 수도 있고; CD4 양성 T-림프구의 자극은 증식 검정을 사용하여 측정될 수도 있고; 항-인플루엔자 항체 역가는 ELISA 검정을 사용하여 정량화될 수도 있고; 항원-특이적 또는 교차 반응성 항체의 이소타입은 또한 항-이소타입 항체 (예를 들어, 항-IgG, IgA, IgE 또는 IgM)를 사용하여 측정될 수도 있다. 이러한 검정을 수행하기 위한 방법 및 기술은 업계에 잘 알려져 있다.
교차 반응성 HAI 역가는 또한 백신 서브타입에 관련된 바이러스의 다른 균주에 대한 면역 반응의 효능을 입증하기 위해 사용될 수도 있다. 예를 들어, 제1 균주의 백신 조성물 (예를 들어, A/Indonesia 5/05의 VLP)로 면역화된 대상체의 혈청은 전체 바이러스 또는 바이러스 입자의 제2 균주를 이용하여 HAI 검정에서 사용될 수도 있으며, HAI 역가가 결정된다.
시토킨 존재 또는 수준이 또한 정량화될 수도 있다. 예를 들어, T-헬퍼(helper) 세포 반응 (Th1/Th2)은 ELISA를 사용함으로써 IFN-γ 및 IL-4 분비 세포의 측정에 의해 특성화될 것이다 (예를 들어, BD Biosciences OptEIA 키트). 대상체로부터 얻은 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 또는 비장 세포가 배양될 수도 있으며, 상층액이 분석된다. T 림프구는 또한 형광-활성화 세포 분류기 (FACS)에 의해 정량화될 수도 있으며, 업계에서 알려져 있는 마커 특이적 형광 라벨 및 방법을 사용한다.
마이크로중화 검정은 또한 대상체에서 면역 반응을 특성화하기 위해 실행될 수도 있으며, 예를 들어, Rowe et al., 1973의 방법을 참고하면 된다. 바이러스 중화 역가는 여러 방법으로 얻어질 수도 있는데, 1) 세포의 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 고정/착색 후 용해 플라크(plaque)의 열거 (플라크 검정); 2) 배양물에서 세포 용해의 현미경 관찰; 3) NP 바이러스 단백질의 ELISA 및 분광 광도법적 검출 (숙주 세포의 바이러스 감염과 연관됨)을 포함한다.
용어 "바이러스 유사 입자" (VLP), 또는 "바이러스-유사 입자" 또는 "VLP"는 바이러스 단백질, 예를 들어, 인플루엔자 HA 단백질 또는 변형된 HA 단백질, 예를 들어, HA0 단백질을 자가 조립하고 포함하는 구조를 말하며, 단백질 가수분해 루프가 변형되어 있다. VLP는 일반적으로 감염 시 생산된 비리온과 형태적으로 및 항원에 관하여 유사하지만, 복제하기에 충분한 유전 정보가 없고 따라서 비-감염성이다. 일부 예에서, VLP는 단일 단백질 종, 또는 하나 이상의 단백질 종을 포함할 수도 있다. 하나 이상의 단백질 종을 포함하는 VLP에 대하여, 단백질 종은 바이러스의 같은 종의 것일 수도 있거나, 바이러스의 다른 종, 속, 아과 또는 과 (ICTV 명명법)에 의해 지정됨)의 단백질을 포함할 수도 있다. 다른 예에서, VLP를 포함하는 단백질 종 중 하나 이상은 예를 들어, 본원에서 기술된 변형된 HA와 같이, 자연적으로 발생한 서열로부터 변형될 수도 있다. VLP는 식물 및 곤충 숙주 세포를 포함하는 적합한 숙주 세포에서 생산될 수도 있다. 적합한 조건 하에 숙주 세포로부터 추출 후 및 분리 및 추가의 정제 시, VLP는 온전한 구조로 정제될 수도 있다.
더 나아가, HA 서브타입의 조합을 포함하는 VLP가 생산될 수도 있다. 예를 들어, VLP는 하나 또는 하나 이상의 HA 또는 하나 또는 서브타입 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, 서브타입 B HA 또는 이것들의 조합의 하나 이상의 변형된 HA를 포함할 수도 있다. HA 또는 변형된 HA의 조합의 선택은 VLP로부터 제조된 백신의 의도된 사용에 의해 결정될 수도 있다. 예를 들어, 조류에게 접종하는데 사용되는 백신은 HA 서브타입 또는 변형된 HA 서브타입의 어떤 조합도 포함할 수 있는 한편, 인간에게 접종하는데 유용한 VLP는 서브타입 또는 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, 서브타입 B HA의 변형된 서브타입 중 하나 또는 하나 이상의 서브타입을 포함할 수도 있다. 하지만, 다른 HA 서브타입 또는 변형된 HA 서브타입 조합은 VLP의 사용에 따라서 제조될 수도 있다. HA 서브타입 또는 변형된 서브타입의 조합을 포함하는 VLP를 생산하기 위해서, 원하는 HA 서브타입 또는 변형된 HA 서브타입이 같은 세포, 예를 들어, 식물 세포 내에서 동시-발현될 수도 있다.
인플루엔자 유래된 단백질로부터 생산된 VLP는, 본 발명에 따라, M1 단백질을 포함하지 않는다. M1 단백질은 RNA에 결합하는 것으로 알려져 있는데 (Wakefield and Brownlee, 1989) 이것은 VLP 조제물의 오염물질이다. RNA의 존재는 VLP 생성물에 대한 규제 승인을 얻을 때 바람직하지 않으며, 그러므로 RNA가 없는 VLP 조제물이 유익할 수도 있다.
본원에서 기술된 바와 같이 생산된 VLP는 전형적으로 뉴라민다제 (NA)를 포함하지 않는다. 하지만, NA는 HA 및 NA를 포함하는 VLP가 바람직한 경우 HA와 동시-발현될 수도 있다.
본 발명은 VLP 단백질이 발현되는 세포의 원형질막으로부터 지질 외피를 얻는 바이러스 유래된 VLP를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, VLP가 식물-기반 시스템에서 발현되면, VLP는 세포의 원형질막으로부터 지질 외피를 얻을 수도 있다.
일반적으로, 용어 "지질"은 지방-가용성 (친유성), 자연적으로 발생한 분자를 말한다. 용어는 또한 더 구체적으로 지방산 및 그것들의 유도체 (트리-, 디-, 및 모노글리세리드 및 인지질 포함), 뿐만 아니라 다른 지방-가용성 스테롤-함유 대사산물 또는 스테롤을 말하기 위해 사용된다. 인지질은 당지질, 스테롤 및 단백질과 함께 모든 생물학적 막의 주요 구성요소이다. 인지질의 예는 포스파티딜에탄올아민, 포스프티딜콜린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 등을 포함한다. 스테롤의 예는 주스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤) 및 피토스테롤을 포함한다. 200개 이상의 피토스테롤이 다양한 식물 종에서 확인되었으며, 가장 일반적인 것은 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 에르고테롤, 브라시카스테롤, 델타-7-스티그마스테롤, 델타-7-아베나스테롤, 다우노스테롤, 시토스테롤, 24-메틸콜레스테롤, 콜레스테롤 또는 베타-시토스테롤이다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 세포의 원형질막의 지질 조성물은 세포 또는 세포가 얻어지는 유기체의 배양 또는 성장 조건에 따라 다를 수도 있다.
세포 막은 일반적으로 지질 이중층, 뿐만 아니라 다양한 기능을 위한 단백질을 포함한다. 특정 지질의 국소화된 농도는 지질 이중층에서 발견될 수도 있으며, '지질 뗏목(lipid raft)'으로 불린다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 지질 뗏목은 세포 내 및 세포 외 유출, 바이러스 또는 다른 감염원의 진입 또는 배출, 세포 간 신호 변환, 세포 내 및 세포 외 매트릭스와 같은 세포 또는 유기체의 다른 구조적 구성요소와의 상호작용에서 중요한 역할을 가질 수도 있다.
식물에서, 원형질막 인플루엔자 VLP는 원형질막으로부터 버딩하며 그러므로 VLP의 지질 조성물은 그것들의 기원을 반영한다. 본 발명에 따라 생성된 VLP는 인플루엔자의 하나 또는 하나 이상의 타입 또는 서브타입의 HA를 포함하며, 식물 유래된 지질과 복합체를 형성하였다. 식물 지질은 특이적 면역 세포를 자극하고 유도된 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 식물 막은 지질, 포스프티딜콜린 (PC) 및 포스파티딜에탄올아민 (PE)로 만들어져 있고, 또한 글리코스핑고지질, 사포닌, 및 피토스테롤을 함유한다. 추가적으로, 지질 뗏목은 또한 식물 원형질막에서 발견된다 - 이 마이크로도메인은 스핑고지질 및 스테롤이 풍부하다. 식물에서, 다양한 피토스테롤이 발생하는 것으로 알려져 있으며, 스티그마스테롤, 시토스테롤, 24-메틸콜레스테롤 및 콜레스테롤을 포함한다 (Mongrand et al., 2004).
PC 및 PE, 뿐만 아니라 글리코스핑고지질은 항원-제공 세포 (APC) 유사 수지상세포 및 대식세포와 같은 포유동물 면역 세포 및 흉선 및 간에서 B 및 T 림프구를 포함하는 다른 세포에 의해 발현된 CD1 분자에 결합할 수 있다 (Tsuji M,. 2006). CD1 분자는 등급 I의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자와 구조적으로 유사하며 그것들의 역할은 당지질 항원을 NKT 세포 (자연 살해 T 세포)에 제공하는 것이다. 활성화 시, NKT 세포는 NK 세포 및 수지상세포와 같은 선천적 면역 세포를 활성화시키고 또한 항체-생산 B 세포 및 T-세포와 유사한 후천적 면역 세포를 활성화시킨다.
다양한 피토스테롤은 원형질막에서 발견될 수도 있다 - 특이적 보체는 몇 가지 인자를 명명하기 위해서, 종, 성장 조건, 영양소 원천 또는 병원체 상태에 따라 다를 수도 있다. 일반적으로, 베타-시토스테롤은 가장 풍부한 피토스테롤이다.
지질 이중층과 복합체를 형성한 인플루엔자 VLP에 존재하는 피토스테롤, 예를 들어, 원형질막 유래 외피는 유익한 백신 조성물을 제공할 수도 있다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 지질 이중층과 복합체를 형성한, 식물에서 만들어진 VLP, 예를 들어, 원형질막 유래 외피는 다른 발현 시스템에서 만들어진 VLP보다 더 강한 면역 반응을 유도할 수도 있고, 살아있는 또는 약독화된 전체 바이러스 백신에 의해 유도된 면역 반응과 유사할 수도 있다.
본원에서 기술된 VLP는 식물-유래 지질 이중층과 복합체를 형성할 수도 있다. 일부 구체예에서, 식물-유래 지질 이중층은 VLP의 외피를 포함할 수도 있다. 식물 유래된 지질은 VLP가 생산되는 식물의 원형질막의 지질 구성요소를 포함할 수도 있으며, 포스프티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 글리코스핑고지질, 피토스테롤 또는 이것들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 식물-유래 지질은 대안으로 '식물 지질'로도 불릴 수 있다. 피토스테롤의 예는 업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 스티그마스테롤, 시토스테롤, 24-메틸콜레스테롤 및 콜레스테롤을 포함한다 - 예를 들어, Mongrand et al., 2004 참조.
VLP는 예를 들어, 헤마글루티닌화 검정, 전자 현미경법, 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 구조 및 크기에 대하여 평가될 수도 있다.
크기 배제 크로마토그래피를 위해서, 전체 가용성 단백질은 추출 버퍼 중에서 동결-파쇄된 식물 재료, 및 원심분리에 의해 제거된 불용성 재료의 샘플을 균질화함으로써 (Polytron) 식물 조직으로부터 추출될 수도 있다. PEG로의 침강이 사용될 수도 있다. 가용성 단백질은 정량화되고, 추출물은 크기 배제 매트릭스, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, Sephacryl™을 통과하였다. 크로마토그래피 후에, 분획은 분획의 단백질 보체를 결정하기 위해 면역블롯에 의해 더 분석될 수도 있다.
어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 다른 동물의 PvBC에 결합하는 HA의 수용량은 시알산 α2,3 또는 α2,3에 대한 HA의 친화도 및 RBC의 표면 상에 이 시알산의 존재에 의해 지시된다. 인플루엔자 바이러스의 말 및 조류 HA는 칠면조, 닭, 오리, 기니피그, 인간, 양, 말 및 소를 포함하는 여러 종 모두의 적혈구를 응집시키는 반면에, 인간 HA는 칠면조, 닭, 오리, 기니피그, 인간 및 양의 적혈구에 결합할 것이다 (또한 Ito T. et al, 1997, Virology, vol 227, p493-499; 및 Medeiros R et al, 2001, Virology, vol 289 p.74-85 참조).
발현된 바이러스 단백질의 올바른 폴딩은 다른 특성들 중에서, 단백질의 안정성, 멀티머의 형성, VLP의 형성, 바이러스 단백질의 기능 및 항체에 의한 바이러스 단백질의 인식에 중요할 수도 있다. 단백질의 폴딩 및 축적은 단백질의 서열, 단백질의 상대적 풍부함, 세포 내 과밀의 정도, 세포 구획의 pH, 폴딩된 것과 결합하거나 일과성으로 결합될 수도 있는 보조인자의 이용 가능성, 부분적으로 폴딩된 또는 언폴딩된(unfolding) 단백질, 하나 이상의 샤페론(chaperone) 단백질의 존재, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 인자에 의해 영향을 받을 수도 있다.
열 충격 단백질 (Hsp) 또는 스트레스 단백질은 샤페론 단백질의 예이며, 이것들은 단백질 합성, 세포 내 트래피킹(intracellular trafficking), 미스폴딩(misfolding)의 방지, 단백질 응집의 방지, 단백질 복합체의 조립 및 분해, 단백질 폴딩, 및 단백질 분해를 포함하는 다양한 세포적 과정에 참여할 수도 있다. 이러한 샤페론 단백질의 예는 Hsp60, Hsp65, Hsp 70, Hsp90, Hsp1OO, Hsp20-30, Hsp1O, Hsp1OO-200, Hsp1OO, Hsp90, Lon, TF55, FKBP, 시클로필린, ClpP, GrpE, 유비퀴틴, 칼넥신, 및 단백질 이황화 이소머라제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, Macario, A.J.L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25: 59-70. 1995; Parsell, D.A. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27: 437-496 (1993); 미국 특허 번호 5,232,833 참조). 본원에서 기술된 바와 같이, 샤페론 단백질, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, Hsp40 및 Hsp70은 바이러스 단백질의 폴딩을 보장하기 위해 사용될 수도 있다.
Hsp70의 예는 포유동물 세포의 Hsp72 및 Hsc73, 박테리아, 특히 미코박테리아, 예를 들어, 미코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 및 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의 DnaK (예를 들어, 바실-칼메테 구에린(Bacille-Calmette Guerin): 본원에서 Hsp71로 불림), 대장균(Escherichia coli), 이스트 및 다른 원핵생물의 DnaK, 및 진핵생물, 예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나(A. thaliana)의 BiP 및 Grp78을 포함한다 (Lin et al. 2001 (Cell Stress and Chaperones 6: 201-208). Hsp70의 특정 예는 아라비돕시스 탈리아나 Hsp70 (Genbank 참조번호: AY120747.1에 의해 암호화됨)이다. Hsp70은 ATP, 뿐만 아니라 언폴딩된 폴리펩타이드 및 펩타이드에 특이적으로 결합하여, 이로 인해 단백질 폴딩 및 언폴딩, 뿐만 아니라 단백질 복합체의 조립 및 분해에도 참여할 수 있다.
Hsp40의 예는 원핵생물, 예를 들어, 대장균 및 미코박테리아의 DnaJ 및 진핵생물, 예를 들어, 알팔파의 HSJ1, HDJ1 및 Hsp40을 포함한다 (Frugis et al., 1999. Plant Molecular Biology 40: 397-408). Hsp40의 특정 예는 메디카고 사티바(M. sativa) MsJ1이다 (Genbank 참조번호: AJ000995.1). Hsp40은 다른 세포 활성 중에, 단백질 폴딩, 열 내성 및 DNA 복제에서 분자 샤페론의 역할을 한다.
Hsps, Hsp70 및 그것의 보조-샤페론 중에서, Hsp40은 번역의 안정화에 수반되고 합성이 완료되기 전에 및 새로 합성된 폴리펩타이드이다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, Hsp40은 언폴딩된 (초기의 또는 새로 이동된) 폴리펩타이드의 소수성 패치(patch)에 결합하며, 따라서 폴리펩타이드와 Hsp70-ATP 복합체의 상호작용을 용이하게 한다. ATP 가수분해는 폴리펩타이드, Hsp70 및 ADP 사이에서 안정한 복합체의 형성, 및 Hsp40의 방출로 이어진다. 폴리펩타이드의 소수성 패치와 Hsp70-ADP의 결합은 다른 소수성 패치와 그것들의 상호작용을 방지하며, 올바르지 않은 폴딩 및 다른 단백질과의 응집체 형성을 방지한다 (Hartl, FU. 1996. Nature 381: 571-579에서 재검토됨).
고유한 샤페론 단백질은 낮은 수준의 재조합 단백질의 올바른 폴딩을 용이하게 할 수도 있지만, 발현 수준이 증가함에 따라, 고유한 샤페론의 풍부함은 제한 인자가 될 수도 있다. 아그로필트레이션된 잎에서 바이러스 단백질의 높은 수준의 발현은 시토졸에서 바이러스 단백질의 축적으로 이어질 수도 있고, Hsp70, Hsp40 또는 Hsp70 및 Hsp40 둘 다와 같은 하나 또는 하나 이상의 샤페론 단백질의 동시-발현은 미스폴딩된 또는 응집된 단백질의 수준을 감소시킬 수도 있고, 바이러스-유사 입자의 형성을 허용하는 3차 및 4차 구조적 특성을 나타내는 단백질의 수를 증가시킬 수도 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 식물에서 바이러스 단백질 VLP를 생산하는 방법을 제공하는데, 바이러스 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 채널 단백질, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 양성자 채널 단백질을 암호화하는 제2 핵산, 및 샤페론을 암호화하는 제3 핵산과 함께 동시-발현된다. 제1, 제2 및 제3 핵산은 같은 단계에서 식물로 도입될 수도 있거나, 또는 순차적으로 식물로 도입될 수도 있다.
식물 내에서 생산된 VLP는 식물-특이적 N-글리칸을 포함하는 바이러스 단백질을 유도할 수도 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 식물 특이적 N-글리칸을 가진 바이러스 단백질을 포함하는 VLP를 제공한다.
더 나아가, 식물에서 N-글리칸의 변형이 알려져 있고 (예를 들어, WO 2008/151440; WO 2010/006452; 또는 U.S. 60/944,344 참조; 이것들은 본원에 참고로 포함됨) 변형된 N-글리칸을 가진 바이러스 단백질이 생산될 수도 있다.
변형된 글리코실화 패턴을 포함하는, 예를 들어, 푸코실화되거나, 자일로실화되거나, 또는 푸코실화 및 자일로실화된 N-글리칸이 감소된 바이러스 단백질이 얻어질 수도 있거나, 또는 변형된 글리코실화 패턴을 가진 바이러스 단백질이 얻어질 수도 있는데, 단백질은 푸코실화, 자일로실화, 또는 둘 다가 없고, 증가된 갈락토실화를 포함한다. 더 나아가, 번역 후 변형, 예를 들어, 말단 갈락토스의 추가의 조절은 바이러스 단백질을 발현하는 야생형 식물과 비교하여 발현된 바이러스 단백질의 푸코실화 및 자일로실화의 감소를 초래할 수도 있다.
예를 들어, 제한하는 것으로 간주되는 것은 아닌, 변형된 글리코실화 패턴을 가진 바이러스 단백질의 합성은 베타-1.4갈락토실트랜스퍼라제 (GalT), 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 포유동물 GalT, 또는 인간 GalT를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 함께 원하는 단백질을 동시-발현시킴으로써 달성될 수도 있지만 또 다른 공급원의 GalT가 또한 사용될 수도 있다. GalT의 촉매 도메인은 또한 GNT1 -GalT 하이브리드(hybrid) 효소를 생산하기 위해 N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 (GNT1)의 CTS 도메인 (즉 세포질 꼬리, 막관통 도메인, 줄기 영역)에 융합될 수도 있고, 하이브리드 효소는 바이러스 단백질과 동시-발현될 수도 있다. 바이러스 단백질은 또한 N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 III (GnT-III), 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 포유동물 GnT-III 또는 인간 GnT-III를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 함께 동시-발현될 수도 있고, 다른 공급원의 GnT-III도 또한 사용될 수 있다. 추가적으로, GnT-III에 융합된 GNT1의 CTS를 포함하는 GNT1-GnT-III 하이브리드 효소가 또한 사용될 수도 있다.
그러므로 본 발명은 또한 변형된 N-글리칸을 가진 하나 이상의 바이러스 단백질을 포함하는 VLP를 포함한다.
변형된 HA를 생산하기 위해 본 발명과 함께 사용될 수도 있는 서열의 비제한 예는 또한 WO 2009/009876; WO 2009/076778; WO 2010/003225; WO 2010/148511; WO 2010/003235; WO 2010/006452 (이것들은 본원에 참고로 포함되지 않음)에서 기술된 것들, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 다음을 포함한다:
예를 들어, A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/Solomon Islands 3/2006 (H1N1),/PuertoRico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1) 균주의 핵산 분자에 의해 암호화된 H1 단백질;
A/Singapore/1/57 (H2N2) 균주의 것일 수도 있는 핵산 분자에 의해 암호화된 H2 단백질;
A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) 균주, A/Victoria/361/2011 (H3N2) 또는 A/Perth/16/2009 (H3N2)의 것일 수도 있는 핵산 분자에 의해 암호화된 H3 단백질;
A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Indonesia/5/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1)의 것일 수도 있는 핵산 분자에 의해 암호화된 H5 단백질;
A/Teal/HongKong/W312/97 (H6N1) 균주의 것일 수도 있는 핵산 분자에 의해 암호화된 H6 단백질;
A/Hangzhou/1/13 (H7N9), A/Equine/Prague/56 (H7N7) 균주의 것일 수도 있는 핵산 분자에 의해 암호화된 H7 단백질;
A/HongKong/1073/99 (H9N2) 균주의 것일 수도 있는 핵산 분자에 의해 암호화된 H9 단백질;
B/Florida/4/2006, B/Massachusetts/2/12, B/Malaysia/2506/2004, B/Wisconsin/1/2010, 또는 B/Brisbane/60/2008 균주의 것일 수도 있는 핵산에 의해 암호화된 B 서브타입의 HA 단백질.
표 3: 본원에서 설명된 바와 같이 제조된 구조의 예
구조 # 발현 인핸서 증폭 요소 설명 실시예
1261 CPMV-HT A/New Caledonia/20/1999 (H1N1) 실시예 5.1
859 CPMV-HT A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) 실시예 5.2
1008 CPMV-HT BeYDV B/Brisbane/60/2008 실시예 5.3
1059 CPMV-HT BeYDV 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 B/Brisbane/60/2008 실시예 5.4
1462 CPMV-HT BeYDV B/Wisconsin/1/2010 실시예 5.5
1467 CPMV-HT BeYDV 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 B/Wisconsin/1/2010 실시예 5.6
1039 CPMV-HT 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 B/Brisbane/60/2008 실시예 5.7
1029 CPMV-HT B/Brisbane/60/2008 실시예 5.11
1829 CPMV-HT+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 B/Brisbane/60/2008 실시예 5.12
1937 CPMV-160+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 B/Brisbane/60/2008 실시예 5.13
1067 CPMV-HT 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 B/Brisbane/60/2008+H1 California TMCT 실시예 5.14
1977 CPMV-160+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 B/Brisbane/60/2008+H1 California TMCT 실시예 5.14
1875 CPMV-HT+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 B/Brisbane/60/2008+H1 California TMCT 실시예 5.19
676 CPMV-HT TETR 분열 부위를 가진 H5 A/Indonesia/5/2005 실시예 5.8
766 CPMV-HT TETQ 분열 부위를 가진 H5 A/Indonesia/5/2005 실시예 5.9
928 CPMV-HT 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 H5 A/Indonesia/5/2005 실시예 5.10
489 CPMV-HT H5 A/Indonesia/5/2005 (고유한) 실시예 5.24
2220 CPMV-HT+ H2 A/Singapore/1/57 (고유한) 실시예 5.27
2221 CPMV-HT+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 H2 A/Singapore/1/57 실시예 5.28
2222 CPMV-160+ H2 A/Singapore/1/57 (고유한) 실시예5.29
2223 CPMV-160+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 H2 A/Singapore/1/57 실시예5.29
2019 CPMV-HT+ H3 A/Perth/16/09 (고유한) 실시예 5.30
2039 CPMV-HT+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 H3 A/Perth/16/09 실시예 5.31
2139 CPMV-160+ H3 A/Perth/16/09 (고유한) 실시예 5.30
2159 CPMV-160+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 H3 A/Perth/16/09 실시예 5.31
1819 CPMV-HT+ H3 A/Victoria/361/11 (고유한) 실시예 5.26
2230 CPMV-HT+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 H3 A/Victoria/361/11 실시예 5.32
1800 CPMV-160+ H3 A/Victoria/361/11 (고유한) 실시예 5.25
2250 CPMV-160+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 H3 A/Victoria/361/11 실시예 5.32
2142 CPMV-HT+ H7 A/Hangzhou/1/13 (고유한) 실시예 5.33
2152 CPMV-HT+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 H7 A/Hangzhou/1/13 실시예 5.34
2224 CPMV-HT+ H9 A/Hong Kong/1073/99 (고유한) 실시예 5.35
2225 CPMV-HT+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 H9 A/Hong Kong/1073/99 실시예 5.36
2226 CPMV-160+ H9 A/Hong Kong/1073/99 (고유한) 실시예 5.35
2227 CPMV-160+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 H9 A/Hong Kong/1073/99 실시예 5.36
2013 CPMV-160+ B/Malaysia/2506/04 (고유한) 실시예 5.37
2014 CPMV-160+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 B/Malaysia/2506/04 실시예 5.38
2070 CPMV-HT B/Massachusetts/2/12 (고유한) 실시예 5.39
2072 CPMV-HT 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 B/Massachusetts/2/12 실시예 5.15
2080 CPMV-HT+ B/Massachusetts/2/12 (고유한) 실시예 5.39
2052 CPMV-HT+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 B/Massachusetts/2/12 실시예 5.20
2090 CPMV-160+ B/Massachusetts/2/12 (고유한) 실시예 5.39
2050 CPMV-160+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 B/Massachusetts/2/12 실시예 5.15
2074 CPMV HT HA B/Massachusetts/2/12 (PrL-)+H1 California TMCT 실시예 5.16
2060 CPMV-160+ HA B/Massachusetts/2/12 (PrL-)+H1 California TMCT 실시예 5.16
2062 CPMV-HT+ HA B/Massachusetts/2/12 (PrL-)+H1 California TMCT 실시예 5.21
1445 CPMV HT 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) B/Wisconsin/1/2010 실시예 5.17
1839 CPMV-HT+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) B/Wisconsin/1/2010 실시예 5.22
1820 CPMV160+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) B/Wisconsin/1/2010 실시예 5.17
1975 CPMV160 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) B/Wisconsin/1/2010 실시예 5.17
1454 CPMV-HT 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) HA B Wisconsin+H1 California TMCT 실시예 5.18
1893 CPMV-160+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) HA B Wisconsin+H1 California TMCT 실시예 5.18
1860 CPMV-HT+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) HA B Wisconsin+H1 California TMCT 실시예 5.23
2102 CPMV-HT+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) B Florida 실시예 5.40
2104 CPMV-HT+ BeYDV 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) B Florida 실시예 5.40
2016 CPMV-HT+ 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) B Florida+H1 California TMCT 실시예 5.41
2108 CPMV-HT+ BeYDV 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) B Florida+H1 California TMCT 실시예 5.41
표 4: 서열의 설명
서열 번호: 설명 도면
서열 번호: 설명 도면
1 조류 H5 단백질 가수분해 루프 공통 서열 102 HA B Wisconsin (PrL-)의 아미노산 서열. 36B
2 IF-H5A-I-05.s1+3c 1A 103 HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT의 뉴클레오타이드 서열 37A
3 IF-H5dTm.r 1B 104 HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMC의 아미노산 서열 37B
4 구조 1191 1D 105 PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT의 뉴클레오타이드 서열 38A
5 카세트 489 1E 106 PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열 38B
6 아미노산 서열 H5 A/Indonesia/5/2005 (H5N1) 1F 107 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)의 뉴클레오타이드 서열 39A
7 IF-S1-M1+M2ANC.c 2A 108 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)의 아미노산 서열 39B
8 IF-S1-4-M2ANC.r 2B 109 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT의 뉴클레오타이드 서열 40A
9 합성 M2 (DQ508860의 715-982에 결합된 nt 1-26) 2C 110 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열 40B
10 카세트 1261 2D 111 HA B Wisconsin (PrL-)의 뉴클레오타이드 서열 41A
11 M2 from influenza A/New Caledonia/20/1999 (H1N1) 2E 112 HA B Wisconsin (PrL-)의 아미노산 서열 41B
12 합성 M2 (EF467824의 nt 740-1007에 결합된 nt 26-51) 3A 113 HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT의 뉴클레오타이드 서열 42A
13 카세트 859 3B 114 HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMC의 아미노산 서열 42B
14 아미노산 서열 M2 influenza A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) 3C 115 고유한 H5 Indonesia의 뉴클레오타이드 서열 43A
15 카세트 1039 8A 116 고유한 H5 Indonesia의 아미노산 서열 43B
16 B/Brisbane/60/2008 아미노산 서열 21A 117 IF**(SacII)-PDI.s1+4c 44A
17 아미노산 서열 타입 B HA (링커 GG를 가짐)의 델타-단백질 가수분해 루프 21B 118 IF-H3V36111.s1-4r 44B
18 B HA의 분열 부위를 링커로 대체하는 아미노산 서열 21C 119 PDISP/H3 Victoria의 뉴클레오타이드 서열 44C
19 아미노산 서열 H3 A/Perth/16/2009 21D 120 구조 2171 44E
20 아미노산 서열 델타-단백질 가수분해 루프 H3 (링커 GS를 가짐) 21E 121 구조 1800 44F
21 H3의 분열 부위를 링커로 대체하는 아미노산 서열 21F 122 PDISP/H3 Victoria의 아미노산 서열 44G
22 H1 New Cal 링커 영역 15 123 IF(SacII)-Kozac_PDI.c 45A
23 H1 Brisbane 링커 영역 15 124 IF-H3V36111.s1-4r 45B
24 H1 Sol Islands 링커 영역 15 125 구조 2181 45D
25 H2A Singapore 링커 영역 15 126 구조 1819 45E
26 H3A Brisbane 링커 영역 15 127 IF**-H2S157.s1-6r 48A
27 H3A WCN 링커 영역 15 128 PDISP/H2 Singapore의 뉴클레오타이드 서열 48B
28 H5 Anhui 링커 영역 15 129 발현 카세트 번호 2220 48C
29 H5 Indo 링커 영역 15 130 PDISP/H2 Singapore의 아미노산 서열 48D
30 H5 Vietnam 링커 영역 15 131 H2S157(Prl-).r 49A
31 구조 1194 4B 132 H2S157(Prl-).c 49B
32 카세트 1008 4C 133 발현 카세트 번호 2221 49C
33 H6 Teal HK 링커 영역 15 134 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H2 Singapore의 아미노산 서열 49D
34 H7 Eq Prague 링커 영역 15 135 발현 카세트 번호 2222 50A
35 H9A HK 링커 영역 15 136 발현 카세트 번호 2223 50B
36 B Florida 링커 영역 15 137 PDISP/H3 Perth의 뉴클레오타이드 서열 51A
37 B Malaysia 15 138 IF**-H3P1609.S1-6r 51B
38 1039+1059.r 5A 139 PDISP/H3 Perth의 아미노산 서열 51C
39 1039+1059.c 5B 140 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Perth의 뉴클레오타이드 서열 52A
40 카세트 1059 5C 141 H3P1609(Prl-)#2.r 52B
41 아미노산 서열 PDISP/HA influenza B/Brisbane/60/2008 (결실된 단백질 가수분해 루프) 5D 142 H3P1609(Prl-)#2.c 52C
42 뉴클레오타이드 서열 H5 A/Indonesia/5/2005 (H5N1) 1G 143 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Perth의 아미노산 서열 52D
43 뉴클레오타이드 서열 PDISP/HA influenza B/Brisbane/60/2008 (결실된 단백질 가수분해 루프) 5E 144 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Victoria의 뉴클레오타이드 서열
 53A
44 H5/Indo 분열 부위 천연 서열 19 145 H3V36111(Prl-).r 53B
45 H5/Indo 변형된 분열 부위 (TETR) 19 146 H3V36111(Prl-).c 53C
46 H5/Indo 변형된 분열 부위 (TETQ) 19 147 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Victoria의 아미노산 서열 53D
47 H1 분열 부위 표 1 148 PDISP/H7 Hangzhou의 뉴클레오타이드 서열 54A
48 H3 분열 부위 표 1 149 IF*-H7H113.s1-6r 54B
49 IF-HAB110.S1+3c 6A 150 PDISP/H7 Hangzhou의 아미노산 서열 54C
50 IF-HAB110.s1-4r 6B 151 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H7 Hangzhou의 뉴클레오타이드 서열 55A
51 합성 HA B Wisconsin 6C 152 H7H113(PrL-).r 55B
52 구조 193 6E 153 H7H113(PrL-).c 55C
53 카세트 1462 6F 154 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H7 Hangzhou의 아미노산 서열 55D
54 아미노산 서열 HA influenza B/Wisconsin/1/2010 6G 155 PDISP/H9 Hong Kong의 뉴클레오타이드 서열 56A
55 HAB110(PrL-).r 7A 156 IF**-H9HK107399.S1-6r 56B
56 HAB110(PrL-).c 7B 157 PDISP/H9 Hong Kong의 아미노산 서열 56C
57 카세트 1467 7C 158 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H9 Hong Kong의 뉴클레오타이드 서열 57A
58 아미노산 서열 HA influenza B/Wisconsin/1/2010 (결실된 PL) 7D 159 H9HK107399(Prl-).r 57B
59 B 분열 부위 표 1 160 H9HK107399(Prl-).c 57C
60 H5/Indo 분열 부위 표 2 161 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H9 Hong Kong의 아미노산 서열 57D
61 H5/Indo 변형된 분열 부위 표 2 162 PDISP/HA B Malaysia의 뉴클레오타이드 서열 58A
62 H5/Indo 변형된 분열 부위 표 2 163 IF**-HBM250604.S1-6r 58B
63 H1/Brisbane 변형된 분열 부위 표 2 164 PDISP/HA B Malaysia의 아미노산 서열 58C
64 H3/Brisbane 변형된 분열 부위 표 2 165 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Malaysia의 뉴클레오타이드 서열 59A
65 B/Florida, B/Brisbane 변형된 분열 부위 표 2 166 HBM250604(PrL-).r 59B
66 A/H3/HA0 공통 167 HBM250604(PrL-).c 59C
67 A/H1/HA0 공통 168 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Malaysia의 아미노산 서열 59D
68 B/HA0 공통 169 PDISP/HA B Massachusetts의 뉴클레오타이드 서열 60A
69 H5 Anhui 단백질 가수분해 루프 결실 18C 170 PDISP/HA B Massachusetts의 아미노산 서열 60B
70 H5 Indo 단백질 가수분해 루프 결실 18C 171 PatA SP의 뉴클레오타이드 서열
71 H5 Vietnam 단백질 가수분해 루프 결실 18C 172 파타틴 A 신포 펩타이드의 아미노산 서열
72 B Florida 단백질 가수분해 루프 결실 18C 173 CPMV HT 서열
73 B Malaysia 단백질 가수분해 루프 결실 18C 174 식물 공통 코자크 서열 - 식물계
74 MutCleavage-H5(Indo).r 23A 175 식물 공통 코자크 서열- 쌍떡잎식물
75 MutCleavage-H5(Indo).c 23B 176 식물 공통 코자크 서열 -애기장대
76 카세트 676 23C 177 식물 공통 코자크 서열
77 아미노산 서열 인플루엔자 A/Indonesia/5/2005 (H5N1) TETR 분열 부위 돌연변이 23D 178 식물 공통 코자크 서열
78 H5I505_TETQ.r 24A 179 식물 공통 코자크 서열
79 H5I505_TETQ.c 24B 180 식물 공통 코자크 서열
80 카세트 766 25C 181 식물 공통 코자크 서열
81 아미노산 서열 인플루엔자 A/Indonesia/5/2005 (H5N1) TETQ 분열 부위 돌연변이 25D 182 식물 공통 코자크 서열
82 H5I505(PrL-).r 26A 183 식물 공통 코자크 서열
83 H5I505(PrL-).c 26B 184 식물 공통 코자크 서열
84 카세트 928 26C 185 식물 공통 코자크 서열
85 아미노산 서열 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 A/Indonesia/5/2005 (H5N1). 26D 186 코자크 공통 서열
86 IF-S2+S4-B Bris.c 30A 187 CPMV HT+의 뉴클레오타이드 서열
87 IF-S1a4-B Bris.r 30B 188 CPMV HT+511의 뉴클레오타이드 서열
88 합성된 HA B Brisbane 유전자 30C 189 CPMV HT+[WT115]의 뉴클레오타이드 서열
89 구조 1029 30D 190 HBF406(PrL-).r 61A
90 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA의 아미노산 서열
 30E 191 HBF406(PrL-).c 61B
91 PDISP/HA B Brisbane (PrL-)의 뉴클레오타이드 서열 31A 192 IF*-HBF406.s1-6r 61C
92 PDISP/HA B Brisbane (PrL-)의 아미노산 서열 31B 193 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Florida의 뉴클레오타이드 서열 61D
93 CPMVX/CPMVX+의 뉴클레오타이드 서열 194 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Florida의 아미노산 서열 61E
94 막관통 도메인의 공통 아미노산 서열 195 발현 카세트 번호 2102 61F
95 PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT의 뉴클레오타이드 서열 33A 196 발현 카세트 번호 2104 61H
96 PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열 33B 197 IF-H1cTMCT.S1-4r 62A
97 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)의 뉴클레오타이드 서열 34A 198 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Florida+H1Cal TMCT의 뉴클레오타이드 서열 62B
98 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)의 아미노산 서열 34B 199 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Florida+H1Cal TMCT의 아미노산 서열 62C
99 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT의 뉴클레오타이드 서열 35A 200 발현 카세트 번호 2106 62D
100 PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열 35B 201 발현 카세트 번호 2108 62F
101 HA B Wisconsin (PrL-)의 뉴클레오타이드 서열 36A
실시예
실시예 1
아그로박테리움 트랜스펙션
아그로박테리움 균주 AGL1을 D'Aoust et al 2008 (Plant Biotechnology Journal 6: 930-940)에 의해 기술된 방법을 사용하여 DNA 구조로 전기천공법에 의해 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션된 아그로박테리움을 10 mM 2-(N-모폴리노)에탄술폰산 (MES), 20 μM 아세토시린곤, 50 μg/ml 카나마이신 및 25 μg/ml의 카베니실린 pH 5.6으로 보충된 YEB 배지에서 0.6 내지 1.6의 OD600으로 키웠다. 아그로박테리움 현탁액을 사용 전에 원심분리하였고 침윤 배지 (10 mM MgCl2 및 10 mM MES pH 5.6)에서 재현탁하였다.
식물 바이오매스 , 접종원 및 아그로인필트레이션
용어 "바이오매스" 및 "식물"은 본원에서 사용된 바와 같이 식물로부터 유래된 어떤 재료도 반영하는 것을 의미한다. 바이오매스 또는 식물은 전체 식물, 조직, 세포, 또는 이것들의 어떤 분획을 포함할 수도 있다. 이에 더하여, 바이오매스 또는 식물은 세포 내 식물 구성요소, 세포 외 식물 구성요소, 식물의 액체 및 고체 추출물, 또는 이것들의 조합을 포함할 수도 있다. 이에 더하여, 바이오매스 또는 식물은 식물 잎, 줄기, 과실, 뿌리 또는 이것들의 조합의 식물, 식물 세포, 조직, 액체 조성물, 또는 이것들의 조합을 포함할 수도 있다. 식물의 일부는 식물 또는 바이오매스를 포함할 수도 있다.
니코티아나 벤타미아나 식물을 상업적인 피트 모스(peat moss) 기질로 채워진 평판에서 종자로부터 키웠다. 식물을 16/8 광주기 및 25℃ 낮/20℃ 밤의 온도상 하에 온실에서 성장하게 하였다. 파종 후 3주에, 개개의 묘목을 골라서, 화분에 옮겨 심었고 같은 환경 조건 하에 추가적인 3주 동안 온실에서 성장하게 내버려 두었다.
각 구조로 트랜스펙션된 아그로박테리아(agrobacteria)를 그것들이 0.6 내지 1.6의 OD600에 도달할 때까지 10 mM 2-(N-모폴리노)에탄술폰산 (MES), 20 μM 아세토시린곤, 50 μg/ml 카나마이신 및 25 μg/ml의 카베니실린 pH 5.6으로 보충된 YEB 배지에서 키웠다. 아그로박테리움 현탁액을 사용 전에 원심분리하였고 침윤 배지 (10 mM MgCl2 및 10 mM MES pH 5.6)에서 재현탁하였고 4℃에서 하룻밤 동안 저장하였다. 침윤의 날에, 배양 배취(batch)를 2.5 배양 부피로 희석하였고 사용 전에 가온하였다. 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana)의 전체 식물을 2분 동안 20-40 Torr의 진공 하에 밀폐된 스테인레스강 탱크에서 박테리아 현탁액에서 거꾸로 배치하였다. 식물을 수득할 때까지 2-6일 배양 기간 동안 온실로 복귀시켰다.
잎 수득 및 총 단백질 추출
배양 후, 식물의 지상부를 수득하였고, -80℃에서 냉동시켰고 조각으로 파쇄하였다. 총 가용성 단백질을 3배 부피의 차가운 50 mM Tris pH 8.0, 0.5 M NaCl, 0.1% Triton X-100 및 1 mM 페닐메탄술포닐 플루오라이드에서 동결-파쇄된 식물 재료의 각 샘플을 균질화함으로써 (Polytron) 추출하였다. 균질화 후, 슬러리를 4℃에서 10분 동안 10,000 g에서 원심분리하였고 이 정화된 미가공 추출물 (상층액)을 분석을 위해 유지하였다.
단백질 분석 및 면역블롯팅
정화된 미가공 추출물의 총 단백질 함량을 참조 기준으로서 소 혈청 알부민을 사용하여 브래드포드 검정(Bradford assay) (Bio-Rad, Hercules, CA)에 의해 결정하였다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리하였고 면역검출을 위해 폴리비닐렌 디플루오라이드 (PVDF) 막 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)으로 전기이동시켰다. 면역블롯팅 전에, 막을 4℃에서 16-18시간 동안 Tris-완충된 식염수 (TBS-T) 중의 5% 탈지 분유 및 0.1% Tween-20으로 차단하였다.
면역블롯팅을 TBS-Tween 20 0.1% 중의 2% 탈지 분유에서 2 μg/ml의 1차 항체와 함께 1차 배양으로 수행하였다 (표 5는 각 HA의 검출에 사용된 항체 및 조건을 제공한다). 화학 발광 검출에 사용된 2차 항체는 표 4에서 표시된 바와 같았으며, TBS-Tween 20 0.1% 중의 2% 탈지 분유에서 표시된 바와 같이 희석하였다. 면역반응성 복합체를 기질 (Roche Diagnostics Corporation)로서 루미놀을 사용하는 화학 발광에 의해 검출하였다. 인간 IgG 항체의 홀스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제-효소 컨쥬게이션(conjugation)을 EZ-Link Plus® Activated Peroxidase 컨쥬게이션 키트 (Pierce, Rockford, IL)를 사용함으로써 수행하였다.
표 5: 발현된 단백질의 면역블롯팅을 위한 전기영동 조건, 항체, 및 희석 배수
HA 서브타입 인플루엔자 균주 전기영동 조건 1차 항체 희석 배수 2차 항체 희석 배수
B B/Brisbane/60/2008 비-환원성 TGA, AS397 1:20000 토끼 항-양 (JIR 313-035-045) 1:10 000
B B/Wisconsin/1/2010 비-환원성 NIBSC 07/356 1:2000 토끼 항-양 (JIR 313-035-045) 1:10 000
B B/Malaysia/2506/2004 비-환원성 NIBSC 07/184 1:2000 토끼 항-양 (JIR 313-035-045) 1:10 000
H3 A/Perth/16/2009 (H3N2) 비-환원성 TGA, AS400 1:20000 토끼 항-양 (JIR 313-035-045) 1:10 000
H3 A/Victoria/361/2011 비-환원성 TGA, AS400 1:20000 토끼 항-양 (JIR 313-035-045) 1:10 000
H1 A/California/07/2009 (H1N1) 환원성 Sino, 11055-MMO1 1 μg/ml 염소 항-마우스 (JIR 115-035-146) 1:7 500
H5 A/Indonesia/05/2005 (H5N1) 환원성 CBER, S-7858 1:4000 토끼 항-양 (JIR 313-035-045) 1:10 000
JIR: Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA;
CBER: 생물학적 제제 평가 및 연구센터(Center for Biologies Evaluation and Research), Rockville, MD, USA.
Sino: Sino Biological inc., Beijing, China.
TGA: Therapeutic Goods Administration, Australia.
NIBSC: 영국 국립생물표준통제연구원
헤마글루티닌화 검정
헤마글루티닌화 검정은 Nayak 및 Reichl (2004)에 의해 기술된 방법에 기초하였다. 간략히 말해서, 테스트 샘플 (100 μL)의 단계적 두 배 희석이 100 μL PBS를 함유하는 V-바닥 96-웰 미세역가 플레이트에서 이루어졌으며, 웰 당 100 μL의 희석된 샘플을 남겨두었다. 100 마이크로리터의 0.25% 칠면조 적혈구 세포 현탁액 (Bio Link Inc., Syracuse, NY)을 각 웰에 추가하였고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 완전한 헤마글루티닌화를 나타내는 가장 높은 희석 배수의 역수를 HA의 활성으로서 기록하였다. 동시에 재조합 HA 기준 (A/Vietnam 1203/2004 H5N1) (Protein Science Corporation, Meriden, CT)을 PBS에서 희석하였고 각 플레이트에서 대조군으로서 실행하였다.
세포벽 분해에 의한 VLP 추출
잎 조직을 니코티아나 벤타미아나 식물로부터 수거하였고 ~1 cm2 조각으로 잘랐다. 잎 조각을 실온 (RT)에서 30분 동안 500 mM 만니톨에 담가두었다. 만니톨 용액을 이어서 제거하였고 원형질체화(protoplasting) 용액 (500 mM 만니톨, 10mM CaCl2 및 5 mM MES/KOH (pH 5.6)) 중의 효소 혼합물 (트리코더마 비리대(Trichoderma viride)의 셀룰라제 (Onozuka R-10; 3 부피%)의 혼합물 및 리조푸스 종(Rhizopus sp.)의 펙티나제 (MACEROZYME™; 0.75 부피%)의 혼합물; 둘 다 Yakult Pharmaceuticals의 것)로 교환하였다. 사용된 비율은 100 mL 용액 당 20 g 잎 조각이었다. 이 조제물을 얕은 용기 (~11x18 cm)에 골고루 분산시켰고 40 rpm 및 26℃에서 회전 쉐이커(rotary shaker) 상에서 16시간 동안 배양하였다.
대안으로, VLP 추출을 다음과 같이 수행할 수도 있다: 식물을 AGL1/#489, 928, 676 및 766으로 아그로필트레이션하였다. 잎 조직을 침윤 후 제7 일에 니코티아나 벤타미아나 식물로부터 수거하였고 ~1 cm2 조각으로 잘랐다. 펙티나제 162L (Biocatalysts), Multifect CX CG 및 Multifect CX B (Genencor)를 200 mM 만니톨, 75 mM 시트레이트, 0.04% 나트륨 비술파이트 pH 6.0 버퍼; 분해 버퍼에 추가하였다. 바이오매스를 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 실온에서 하룻밤 동안 2배수로 분해시켰다.
효소-지원된 추출 후에, 잎 데브리(debris)를 여과 (250 또는 400 μm 메쉬의 나일론 필터)에 의해 제거하였다. 거칠게 여과된 추출물을 5분 동안 5000 xg에서 원심분리하였다. 상층액을 HA 발현 (헤마글루티닌화 활성)의 검출 (도 20 참조) 및 웨스턴 블롯팅 (도 22 참조)에 제출하였다.
실시예 2:
HA의 축적에 대한 변형된 단백질 가수분해 루프의 효과
도 13A에서 나타난 바와 같이, 고유한 B/Brisbane (구조 번호: 1008)의 발현은 변형된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 B/Brisbane (구조 번호: 1059)의 발현보다 더 낮았다. 고유한 B/Brisbane HA (구조 번호: 1008; 도 13B)와 비교하여 증가된 헤마글루티닌화 활성을 또한 변형된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 B/Brisbane (구조 번호: 1059)로 관찰하였다.
유사한 결과를 변형된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 B/Wisconsin (구조 번호: 1467)의 축적 수준에서 관찰하였는데, 이것은 고유한 B/Wisconsin HA (구조 번호: 1462; 도 16A)에 대하여 관찰된 것보다 더 크다. 고유한 B/Wisconsin HA (구조 번호: 1462; 도 16B)와 비교하여 증가된 헤마글루티닌화 활성을 또한 변형된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 B/Wisconsin (구조 번호: 1467)로 관찰하였는데 돌연변이 단백질보다 더 높은 축적을 나타낸다.
변형된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 H5/Indo의 발현을 GG 링커 (구조 번호: 928; 서열 번호: 85), TETR 링커 (구조 번호: 676; 서열 번호: 77), 또는 TETQ 링커 (구조 번호: 766; 서열 번호: 8; 도 22)를 포함하는 단백질 가수분해 루프를 포함하는 변형으로 관찰하였다.
HA의 축적 수준에 대한 인플루엔자 M2 동시-발현의 효과
M2의 동시-발현을 변형된 인플루엔자 B HA의 축적 수준에 대한 그것의 영향에 대하여 평가하였다. 구조 번호 1059는 단백질 가수분해 루프가 2개의 아미노산 링커에 의해 대체되는 (aa 341-359 대신에 GG) 인플루엔자 B HA를 암호화한다. 도 13A에서 제공된 웨스턴 블롯 분석의 결과는 단백질 가수분해 루프의 제거가 증가된 인플루엔자 B HA 축적 수준을 발생시켰고 (1008을 1059와 비교함) 변형된 인플루엔자 B HA와 함께 M2의 동시-발현은 또한 HA 축적 수준을 증가시켰다는 것을 나타낸다 (도 13A, 1059 대 1059+1261). 변형이 있거나 없이 및 M2의 동시-발현이 있거나 없이 인플루엔자 B HA로 형질전환된 식물의 미가공 단백질 추출물에 대한 헤마글루티닌화 활성의 분석은 고유한 인플루엔자 B HA (도 13B, 1008 대 1008+1261) 및 변형된 인플루엔자 B HA (도 13B, 1059 대 1059+1261)의 축적 수준에 대한 M2 동시-발현의 긍정적인 효과를 확인하였다.
변형된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 타입 A HA과 함께 M2의 동시-발현은 또한 HA 발현을 초래하였다. 예를 들어, M2와 함께 GS 링커 또는 (GSS)3 링커 (도 21E, 21F)로 대체된 단백질 가수분해 루프를 가진 변형된 H3의 동시-발현은 또한 식물에서 HA 축적을 초래할 수도 있다.
변형된 인플루엔자 B HA 및 H3의 축적을 증가시키기 위한 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934의 M2의 효능을 인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999의 M2의 그것과 비교하였다. 변형된 인플루엔자 B HA에 대하여, 비교를 구조 1059, 1059+1261 및 1059+859로 형질전환된 식물의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 착수하였다. 얻어진 결과는 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934 (구조 번호 859에 의해 암호화됨)의 M2의 동시-발현이 변형된 인플루엔자 B HA의 축적을 증가시키기 위해 인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999 (구조 번호 1261에 의해 암호화됨)의 M2의 동시-발현만큼 효율적이었다는 것을 입증하였다 (도 14).
B HA의 다른 균주의 축적 수준에 대한 인플루엔자 M2 동시-발현의 효과
M2-발현 구조 (구조 번호 1261)의 존재 또는 부재 하에 인플루엔자 B HA (B/Wisconsin/1/2010의 것) (구조 번호 1462)의 발현을 구동하는 유전자 구조로 형질전환된 식물의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 M2 동시-발현이 인플루엔자 B HA의 증가된 축적을 초래한다는 것을 나타냈다 (도 16A).
M2의 동시-발현을 또한 변형된 인플루엔자 B HA의 축적 수준에 대한 그것의 영향에 대하여 평가하였다. 구조 번호 1467은 단백질 가수분해 루프가 2개의 아미노산 링커에 의해 대체되는 (aa 341-359 대신에 GG) 인플루엔자 B HA를 암호화한다. 도 16A에서 제공된 웨스턴 블롯 분석의 결과는 단백질 가수분해 루프의 제거가 증가된 인플루엔자 B HA 축적 수준을 초래하였고 (1462를 1467과 비교함) 변형된 인플루엔자 B HA와 함께 M2의 동시-발현이 또한 HA 축적 수준을 증가시켰다는 것을 나타낸다 (도 16A, 1467 대 1467+1261).
변형이 있거나 없이 및 M2의 동시-발현이 있거나 없이 인플루엔자 B HA로 형질전환된 식물의 미가공 단백질 추출물에 대한 헤마글루티닌화 활성의 분석은 고유한 인플루엔자 B HA (도 16B, 1462 대 1462+1261) 및 변형된 인플루엔자 B HA (도 16B, 1467 대 1467+1261)의 축적 수준에 대한 M2 동시-발현의 긍정적인 효과를 확인하였다.
HA의 축적에 대한 증폭 요소 BeYDV 및 변형된 단백질 가수분해 루프의 효과
제거된 단백질 가수분해 루프 (구조에 대하여 도 17A 참조)가 있거나 없이 및 증폭 요소 BeYDV (구조 번호 1059 및 1039)의 존재 또는 부재 하에 변형된 인플루엔자 B HA (B/Brisbane/60/2008의 것)의 발현을 구동하는 유전자 구조로 형질전환된 식물의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 BeYDV의 부재 하에, 조절 요소가 CPMV-HT일 때, 인플루엔자 B HA의 축적이 검출될 수 없다는 것을 나타냈다 (도 17B).
상대적 HA 역가 및 헤마글루티닌화에 대한 변형된 단백질 가수분해 루프의 효과
도 29A에 관하여, 결실된 단백질 가수분해 루프 (GG 링커와 대체됨)를 가진 변형된 HA 또는 고유한 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 결합된 인핸서 요소를 기반으로 한, CPMV HT, CPMV HT+, CPMV 160 또는 CPMV 160+를 포함하는 식물에서 생산된 변형된 HA 단백질의 활성의 비교가 나타난다. 대부분의 경우에, 발현 (헤마글루티닌화 역가 또는 활성으로서 결정됨)은 CPMV HT+, CPMV 160 또는 CPMV 160+기반 구조보다 더 높았다는 것은 상당한 발현 수준을 입증한다.
표 5a: 상대적 HA 역가 (wt HA=1) (도 29A 참조)
Fct = 1
wt PrL-
설명 (n=) GM MD n= GM MD n=
H2 Sin157 (HT+) (n = 2) 1.0 0.4 2 1.2 0.1 2
H2 Sin157 (160+) (n = 2) 1.0 0.3 2 1.9 0.9 2
H3 Per1609 (HT+) (n = 4) 1.0 0.0 4 4.9 4.2 4
H3 Per1609 (160+) (n = 4) 1.0 0.3 4 6.1 3.6 4
H3 Vic36111 (HT+) (n = 6) 1.0 0.3 6 0.9 0.3 6
H3 Vic36111 (160+) (n = 6) 1.0 0.3 6 1.2 0.4 6
H5 Indo505 (HT) (n = 3) 1.0 0.1 3 1.2 0.3 3
H7 Han113 (HT+) (n = 5) 1.0 0.2 5 1.0 0.1 5
H9 HK107399 (HT+) (n = 2) 1.0 0.4 2 1.2 0.2 2
H9 HK107399 (160+) (n = 2) 1.0 0.2 2 0.7 0.1 2
HB Bri6008 (HT) (n = 1) 1.0 0.6 1 0.6 0.1 1
HB Mal250604 (160+) (n = 2) 1.0 0.3 2 8.4 2.4 2
HB Mas212 (HT) (n = 3) 1.0 0.1 3 1.4 1.3 3
HB Mas212 (HT+) (n = 3) 1.0 0.6 3 6.7 3.5 3
HB Mas212 (160+) (n = 2) 1.0 0.8 2 11.5 4.2 2
실시예 3
단백질 가수분해 루프가 제거될 때 ( PrL -) 고유한 구조와 비교하여 증가된 H7 Hangzhou HA VLP 수율
니코티아나 벤타미아나 식물을 AGL1/#2142+1261 및 #2152+1261로 침윤시켰고 잎을 7일 배양 기간 후에 수득하였다. 잎 조직을 수거하여 ~1 cm2 조각으로 잘랐다. 펙티나제 162L 및 펙티나제 444L (Biocatalysts), Multifect CX CG 및 Multifect CX B (Genencor)를 200 mM 만니톨, 125 mM 시트레이트, 0.04% 나트륨 비술파이트 pH 6.0 버퍼에 추가하였다. 바이오매스를 오비탈 쉐이커에서 실온에서 하룻밤 동안 분해시켰다.
분해 후에, 아포플라스트성(apoplastic) 분획을 거칠게 분해되지 않은 식물 조직을 제거하기 위해 400 μm 나일론 필터를 통해 여과시켰다 (시작 바이오매스의 <5%). 여과된 추출물을 이어서 5000xg에서 15분 동안 실온에서 원심분리하여 원형질체 및 세포 내 오염물질 (단백질, DNA, 막, 소낭, 색소, 등)을 제거하였다. 그 다음에, 상층액을 크로마토그래피를 받기 전에, 1.2μm 유리 섬유 필터 (Sartopore GF plus/Sartorius Stedim), 및 0.45/0.2μm 필터 (Sartopore 2/Sartorius Stedim)를 사용하여 심층-여과하였다 (정화를 위해).
정화된 아포플라스트성 분획을 평형화/용출 버퍼 (50 mM NaP04, 100 mM NaCl, 0.005% Tween 80 pH 6.0)로 평형화된 양이온 교환 컬럼 (Poros HS Applied Biosystems)에 로딩하였다. UV가 0으로 돌아오면, 추출물을 증가하는 농도의 NaCl을 함유하는 평형화/용출 버퍼 (500 mM)로 단계-용출시켰다. 정제된 VLP를 TFF에 의해 농축시켰고, 제형화 버퍼 (pH 7.4에서 100 mM P04, 150 mM NaCl, 0.01% Tween 80)에 대하여 정용여과시켰고 (diafiltrate) 0.22μm 필터를 통과시켰다.
H7에 대한 헤마글루티닌화 검정을 Nayak and Reichl (2004)에 의해 기술된 방법에 기초하여 수행하였다. 간략히 말하면, 100 μL PBS를 함유하는 V-바닥 96-웰 미세역가 플레이트에서 테스트 샘플 (100 μL)을 연속적으로 이중 여과하였으며, 웰 당 100 μL의 희석된 샘플을 남겨두었다. 100 마이크로리터의 0.25% 칠면조 적혈구 세포 현탁액 (Bio Link Inc., Syracuse, NY)을 각 웰에 추가하였고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 완전한 헤마글루티닌화를 나타내는 가장 높은 희석 배수의 역수를 헤마글루티닌화 활성으로서 기록하였다.
정화된 미가공 추출물의 총 단백질 함량을 참조 기준으로서 소 혈청 알부민을 사용하여 결정하였다. PrL- 구조를 대조군으로서 사용된 고유한 구조와 비교함으로써 상대적 수율을 얻었다. SDS-PAGE에 의한 분리를 변성 샘플 로딩 버퍼 (0.1M Tris pH 6.8, 0.05% 브로모페놀 블루, 12.5% 글리세롤, 4% SDS 및 5% 베타-메르캅토에탄올)를 이용하여, 환원성 조건 하에 수행하였고 Coomassie Brillant Blue R-250을 단백질 염색에 사용하였다.
도 46A는 식물 추출물에서 헤마글루티닌화 활성이 고유한 구조 (#2142+#1261, 실시예 5.33 참조)와 비교하여 단백질 가수분해 루프가 제거된 H7 Hangzhou 구조 (#2152+#1261, 실시예 5.34 참조)에 대하여 더 크다는 것을 나타낸다.
도 46B는 정제된 VLP에서 상대적인 총 단백질 수율이 고유한 구조 (#2142+#1261)와 비교하여 단백질 가수분해 루프가 제거된 H7 Hangzhou 구조 (#2152+#1261)에 대하여 더 크다는 것을 나타낸다. 이 예는 식물에서 축적된 VLP의 향상 대 완전한 공정을 수행할 때 최종 수율 사이의 양호한 연관성을 입증한다.
도 46C는 SDS-PAGE 분석을 나타내는데, 제거된 단백질 가수분해 루프를 가진 정제된 H7 Hangzhou 구조를 나타내고 레인 3은 정제된 고유한 H7 Hangzhou 구조를 나타낸다. 각 레인에 대하여, 총 단백질 2μg을 겔 상에 로딩하였다. 단백질 프로파일의 순도는 두 구조에 대하여 유사하고 90%보다 더 높다.
실시예 4.1.
단백질 가수분해 루프가 변형되거나 제거된 돌연변이 H5 Indonesia VLP의 트립신 저항성은 고유한 H5 Indonesia보다 더 크다.
니코티아나 벤타미아나 식물을 실시예 1 (상기)에서 기술된 바와 같이 AGL1/#489, #928, #766 및 #676으로 아그로필트레이션하였다. 잎을 침윤 후 7일에 식물로부터 수거하였고, ~1 cm2 조각으로 잘랐다. 펙티나제 162L (Biocatalysts), Multifect CX CG 및 Multifect CX B (Genencor)를 200 mM 만니톨, 75 mM 시트레이트, 0.04% 나트륨 비술파이트 pH 6.0 버퍼에 추가하였다. 바이오매스를 오비탈 쉐이커에서 실온에서 하룻밤 동안 분해시켰다. 분해된 추출물을 실시예 3에서 기술된 바와 같이 거칠게 여과시켰고, 원심분리하였고, 정화하였고 정제하였다 (H7 Hangzhou).
고유한 (# 489), PRL- (# 928), TETQ (# 766) 및 TETR (# 676) H5 Indonesia HA VLP 추출물 각각에 대하여, HA VLP의 두 개의 샘플을 pH 7.4에서 버퍼 (100 mM Na/KP04, 150 mM NaCl, 0.01% TWEEN 80)에서 재현탁하였다. 트립신을 1: 100 단백질 비로 추가하였다. 샘플을 실온에서 배양 후 30, 60 및 120분 후에 그래빙하였고 (grab), 이어서 반응을 중단시키기 위해 샘플 로딩 버퍼에서 끓였다. 분해되지 않은 추출물 (대조군) 및 트립신-분해된 추출물을 실시예 3에서 기술된 바와 같이 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하였다.
도 47A는 트립신-분해된 샘플의 SDS-PAGE 분석을 나타내는데, 분해의 다른 시점 (0, 30, 60, 및 120분)에서 레인 2 내지 5는 고유한 H5 Indonesia VLP (#489)를 나타내고, 레인 6 내지 9는 PrL- H5 Indonesia VLP (#928)를 나타내며, 레인 10 내지 13은 TETQ H5 Indonesia VLP (#766)를 나타내고 레인 14 내지 17은 TETR H5 Indonesia VLP (#676)를 나타낸다. 레인 2의 분해되지 않은 추출물에서 대략 75 kDa에서 검출 가능한 HA0 모노머에 해당하는 밴드를 가진, 고유한 H5 Indonesia VPL를 트립신의 추가를 통해 HA1 및 HA2로 신속하게 가공하였으며, 레인 3 내지 5에서 트립신 분해 중에 각각 대략 50 및 25kDa에서 검출 가능하였다. 단백질 가수분해 부위의 제거 또는 변형에 의해 안정화된 PrL- 및 TETQ H5 Indonesia VLP 둘 다는 HA0 밴드가 HA1 및 HA2 밴드로 분열하지 않은 것으로 트립신 저항성을 나타냈다. TETR H5 Indonesia VLP를 단백질 가수분해 부위의 변형에 의해 부분적으로 안정화시켰고 HA0 모노머를 고유한 H5 Indonesia VLP에서보다 더 느리게 HA1 및 HA2로 분열시켰다.
이 데이터는 단백질 가수분해 루프 (prl-)를 결실시키거나 또는 단백질 가수분해 루프를 링커 서열 (TETQ) 접근으로 대체함으로써 HA1-HA2 내 그것의 단백질 가수분해 부위에서 HA0 단백질의 성공적인 보호를 입증한다.
실시예 4.2. 고유한 H5 Indonesia VLP의 면역원성은 마우스에서 그것의 돌연변이 대응물 ( PrL -, TETQ 및 TETR )과 유사하다.
고유한, PrL-, TETR 및 TETQ H5 Indonesia VLP 추출물을 실시예 4.1 (상기)에서 기술된 바와 같이 정제하였다.
도 47B는 2회 투여 후 마우스에서 고유한 H5 VLP 및 그것의 돌연변이 대응물 (prl-, TETQ 및 TETR)의 면역원성 (HI 역가)를 나타낸다. BALB/c 마우스 (n=8/군)에 그것의 HA 함량에 기초하여 식물 기반 H5 VLP 백신 (고유한, prl-, TETQ 또는 TETR)의 10ug를 21일 간격으로 근육 내로 두 번 주사하였다. HI 역가 분석을 각 동물의 혈청으로부터, 42 dpv (두 번째 투여 후 21일) 실행하였고 H5 VLP A/Indonesia/5/2005 (H5N1)를 항원으로서 사용하였다. 막대는 고유한 H5 VLP와 각 H5 돌연변이 LP의 상대적인 (%) HI 역가 비교를 나타낸다 (HI 역가 GMT의 log2 및 95% CI로 계산됨). 각 용량에 대한 군 사이의 통계적 차이를 일원 ANOVA 후 이어서 칠면조의 Log2-변환된 데이터에 대한 사후 분석을 사용하여 비교하였다 (그것들의 정상 분포를 가정). * p < 0.05는 유의한 것으로 간주되었다. 각 용량에 대하여 군간의 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 5.1: B- 2X35S / CPMV -HT/M2 New Caledonia/NOS (구조 번호 1261)
인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999 (H1N1)의 M2를 암호화하는 서열을 하기 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 클로닝하였다. 완전한 M2 암호화 서열을 함유하는 단편을 주형으로서 합성된 M2 유전자 (GenBank 수납 번호 DQ508860의 nt 715-982에 결합된 nt 1-26에 해당함; 도 2C, 서열 번호: 9)를 사용하여 프라이머 IF-S1-M1+M2ANC.C (도 2A, 서열 번호: 7) 및 IF-S1-4-M2ANC.r (도 2B, 서열 번호: 8)을 사용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현에서 클로닝하였다. 구조 1191 (도 1C)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 1191은 CPMV HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수령체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 2분열 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 서열은 도 1D에서 제공된다 (서열 번호: 4). 결과의 구조는 주어진 번호 1261이다 (도 2D, 서열 번호: 10). 인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999 (H1N1)의 M2의 아미노산 서열은 도 2E에서 제공된다 (서열 번호: 11). 플라스미드 1261의 도면은 도 11에서 제공된다.
실시예 5.2: C- 2X35S / CPMV -HT/M2 Puerto Rico/NOS (구조 번호 859)
인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)의 M2를 암호화하는 서열을 하기 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 세스템으로 클로닝하였다. 완전한 M2 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-S1-M1+M2ANC.C (도 2A, 서열 번호: 7) 및 IF-S1-4-M2ANC.r (도 2B, 서열 번호: 8)을 사용하여 증폭시켰으며, 주형으로서 합성된 M2 유전자 (Genbank 수납 번호 EF467824의 nt 740-1007에 결합된 nt 26-51에 해당함) (도 3A, 서열 번호: 12)를 사용하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템에서 클로닝하였다. 구조 1191 (도 1C)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 1191은 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수령체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 벡터는 pCAMBIA 2분열 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 서열은 도 1D에서 제공된다 (서열 번호: 4). 결과의 구조는 주어진 번호 859이다 (도 3B, 서열 번호: 13). 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)의 M2의 아미노산 서열은 도 3C에서 제공된다 (서열 번호: 14). 플라스미드 859의 도면은 도 17에서 제공된다.
실시예 5.3: BeYDV + 레플리카제 증폭 시스템 내 G- 2X35S / CPMV -HT/ PDISP /HA B Brisbane/NOS (구조 번호 1008)
구조 1008의 조제물은 US 61/541,780에서 기술된다. 간략히 말하면, 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 HA를 암호화하는 서열을 합성된 HA B Brisbane 유전자 (Genbank 수납 번호 FJ766840의 nt 34- 1791에 해당함)를 사용하는 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 BeYDV+레플리카제 증폭 시스템을 포함하는 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS로 클로닝하였다. PCR 생성물을 BeYDV 증폭 시스템 내 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 카세트에서 알팔파 PDI 신호 펩타이드와 함께 인 프레임 클로닝하였다. 구조 1194 (도 4A, 4B 참조)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 조립 반응에 사용하여 구조 번호 1008 (도 4C, 도 9; 서열 번호: 32)을 생산하였다.
구조 번호 1194 (도 4A)는 BeYDV 증폭 시스템 내 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 알팔파 PDI 신호 펩타이드와 함께 원하는 유전자의 인 프레임 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수령체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 2분열 플라스미드이다.
실시예 5.4: BeYDV + 레플리카제 증폭 시스템 내 1- 2X35S / CPMV -HT/결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP -HA B Brisbane (구조 번호 1059)
구조 1059의 조제물은 US 61/541,780에서 기술된다. 간략히 말하면, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 HA를 암호화하는 서열을 PCR-기반 결찰 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 BeYDV+레플리카제 증폭 시스템을 포함하는 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS로 클로닝하였다 (Darveau et al., 1995, Methods in Neuroscience 26: 77-85). PCR의 첫 번째 라운드에서, nt 46에서 nt 1065까지의 서열을 암호화하는 HA B Brisbane을 함유하는 단편을 주형으로서 합성된 HA B Brisbane 유전자 (Genebank 수납 번호 FJ766840의 nt 34-1791에 해당함)를 사용하여 증폭시켰다. nt 1123에서 nt 1758까지의 서열을 암호화하는 HA B Brisbane을 함유하는 두 번째 단편을 주형으로서 합성된 HA B Brisbane 유전자 (Genbank 수납 번호 FJ766840의 nt 34-1791에 해당함)를 사용하여 증폭시켰다. 두 번의 증폭으로부터의 PCR 생성물을 이어서 혼합하였고 증폭의 두 번째 라운드에 대한 주형으로서 사용하였다. 결과의 단편 (단편들 사이에서 GG 링커를 가진 HA B/Brisbane/60/2008 Δa.a. 356-374를 암호화; 도 21B 참조)을 BeYDV 증폭 시스템을 포함하는 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 카세트에서 알팔파 PDI 신호 펩타이드와 함께 인-프레임 클로닝하여 구조 1194 (도 4A, 4B)를 생산하였고, SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 조립 반응에 사용하였다. 결과의 구조는 주어진 번호 1059이다 (도 5C; 서열 번호: 40).
결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP-HA B/Brisbane/60/2008의 아미노산 서열은 도 5D에서 제공된다 (서열 번호: 41).
실시예 5.5: BeYDV (m)+ 레플리카제 증폭 시스템 내 B- 2X35S / CPMV -HT/HA B Wisconsin/NOS (구조 번호 1462)
구조 1462의 조제물은 US 61/541,780에서 기술된다. 간략히 말하면, 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 HA를 암호화하는 서열을 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 BeYDV(m)+레플리카제 증폭 시스템을 포함하는 2X35S/CPMV-HT/NOS로 클로닝하였다. 완전한 HA B Wisconsin 암호화 서열을 함유하는 단편을 주형으로서 합성된 HA B Wisconsin 유전자 (Genbank 수납 번호 JN993010)를 사용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 BeYDV(m) 증폭 시스템 내 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 카세트에서 클로닝하였다. 구조 193 (도 6D)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 조립 반응에 사용하였다.
구조 번호 193 (도 6D, 6E)은 BeYDV(m) 증폭 시스템 내 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수령체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 2분열 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 서열은 도 6E에서 제공된다 (서열 번호: 52). 결과의 구조는 주어진 번호 1462이다 (도 6F, 서열 번호: 53). 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 PDISP/HA의 아미노산 서열은 도 6G에서 제공된다 (서열 번호: 54). 플라스미드 1462의 도면은 도 6H에서 제공된다.
실시예 5.6: BeYDV (m)+ 레플리카제 증폭 시스템 내 C- 2X35S / CPMV -HT/결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 HA B Wisconsin (구조 번호 1467)
구조 1467의 조제물은 US 61/541,780에서 기술된다. 간략히 말하면, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 HA를 암호화하는 서열을 PCR-기반 결찰 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 BeYDV(m)+레플리카제 증폭 시스템을 포함하는 2X35S/CPMV-HT/NOS로 클로닝하였다 (Darveau et al. 1995, Methods in Neuroscience 26: 77-85). PCR의 첫 번째 라운드에서, nt 1에서 nt 1062까지의 HA B Wisconsin 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-HAB110.S1+3c (도 6A, 서열 번호: 49) 및 HAB110(PrL-).r (도 7A, 서열 번호: 55)을 사용하여 증폭시켰으며, 주형으로서 합성된 HA B Wisconsin 유전자 (Genbank 수납 번호 JN993010)를 사용하였다 (도 6C, 서열 번호: 51). nt 1120에서 nt 1755까지의 HA B Wisconsin 암호화 서열을 함유하는 두 번째 단편을 프라이머 HAB110(PrL-).c (도 7B, 서열 번호: 56) 및 IF-HAB110.s1-4r (도 6B, 서열 번호: 50)을 사용하여 증폭시켰으며, 주형으로서 합성된 HA B Wisconsin 유전자 (Genbank 수납 번호 JN993010)를 사용하였다 (도 6C, 서열 번호: 51). 두 번의 증폭으로부터의 PCR 생성물을 이어서 혼합하였고 증폭의 두 번째 라운드에 대한 주형으로서 사용하였으며 프라이머로서 IF-HAB110.S1+3c (도 6A, 서열 번호: 49) 및 IF-HAB110.s1-4r (도 6B, 서열 번호: 50)을 사용하였다. 결과의 단편 (단편들 사이에서 GG 링커를 가진 HA B/Wisconsin/1/2010 Δa.a. 340-358을 암호화)을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 BeYDV(m) 증폭 시스템을 포함하는 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 카세트에서 클로닝하였다. 구조 193 (도 6D)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 193은 BeYDV(m) 증폭 시스템 내 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수령체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 2분열 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 서열은 도 6E에서 제공된다 (서열 번호: 52). 결과의 구조는 주어진 번호 1467이다 (도 7C, 서열 번호: 57). 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 HA의 아미노산 서열은 도 7D에서 제공된다 (서열 번호: 58). 플라스미드 1467의 도면은 도 7E에서 제공된다.
실시예 5.7: A- 2X35S / CPMV -HT/결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP -HA B Brisbane (구조 번호 1039)
구조 1192의 조제물은 US 61/541,780에서 기술된다. 간략히 말하면, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 HA를 암호화하는 서열을 하기 PCR-기반 결찰 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS로 클로닝하였다 (Darveau et al., 1995, Methods in Neuroscience 26: 77-85). PCR의 첫 번째 라운드에서, nt 46에서 nt 1065까지의 HA B Brisbane 암호화 서열을 함유하는 단편을 주형으로서 합성된 HA B Brisbane 유전자 (Genebank 수납 번호 FJ766840의 nt 34-1791에 해당함)를 사용하여 증폭시켰다. nt 1123에서 nt 1758까지의 HA B Brisbane 암호화 서열을 함유하는 두 번째 단편을 주형으로서 합성된 HA B Brisbane 유전자 (Genbank 수납 번호 FJ766840의 nt 34-1791에 해당함)를 사용하여 증폭시켰다. 두 번의 증폭으로부터의 PCR 생성물을 이어서 혼합하였고 증폭의 두 번째 라운드에 대한 주형으로서 사용하였다. 결과의 단편 (단편들 사이에서 GG 링커를 가진 HA B/Brisbane/60/2008 Δa.a. 356-374를 암호화)을 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 카세트에서 알팔파 PDI 신호 펩타이드와 함께 인-프레임 클로닝하였다. 구조 1192를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다.
구조 번호 1192는 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 알팔파 PDI 신호 펩타이드와 함께 원하는 유전자의 인 프레임 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수령체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 2분열 플라스미드이다. 결과의 구조는 주어진 번호 1039이다 (도 8B). 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP-HA B/Brisbane/60/2008의 아미노산 서열은 도 5D에서 제공된다 (서열 번호: 41). 플라스미드 1039의 도면은 도 8A에서 제공된다 (서열 번호: 15).
실시예 5.8: TETR 분열 부위 돌연변이를 가진 A/Indonesia/5/2005의 A-2X35S/CPMV-HT/H5 (구조 번호 676)
TETR 분열 부위 돌연변이를 가진 A/Indonesia/5/2005의 H5를 암호화하는 서열을 하기 PCR-기반 결찰 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 2X35S/CPMV-HT/NOS로 클로닝하였다 (Darveau et al., 1995, Methods in Neuroscience 26: 77-85). PCR의 첫 번째 라운드에서, nt 1에서 nt 1015까지의 A/Indonesia/5/2005 암호화 서열의 H5를 함유하는 단편을 프라이머 IF-H5A-I-05.S1+3c (도 1A, 서열 번호: 2) 및 MutCleavage-H5(Indo).r (도 23A, 서열 번호: 74)을 사용하여 증폭시켰으며, 주형으로서 A/Indonesia/5/2005의 합성된 H5 (도 1G, 서열 번호: 42)를 사용하였다. nt 1038에서 nt 1707까지의 A/Indonesia/5/2005 암호화 서열의 H5를 함유하는 두 번째 단편을 프라이머 MutCleavage- H5(Indo).c (도 23B, 서열 번호: 75) 및 IF-H5dTm.r (도 1B, 서열 번호: 3)을 사용하여 증폭시켰으며, 주형으로서 A/Indonesia/5/2005의 합성된 H5 (도 1G, 서열 번호: 42)를 사용하였다. 두 번의 증폭으로부터의 PCR 생성물을 이어서 혼합하였고 증폭의 두 번째 라운드에 대한 주형으로서 사용하였으며 프라이머로서 IF-H5A-I-05.S1+3c (도 1A, 서열 번호: 2) 및 IF-H5dTm.r (도 1B, 서열 번호: 3)을 사용하였다. 결과의 단편 (단편들 사이에서 TETR 링커를 가진 A/Indonesia/5/2005 Δa.a. 339-346의 H5를 암호화)을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 카세트에서 클로닝하였다. 구조 1191 (도 1D)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 1191은 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 인 프레임 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수령체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 2분열 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 서열은 도 1D (서열 번호: 4)에서 제공된다. 결과의 구조는 주어진 번호 676이다 (도 23C, 서열 번호: 76). A/Indonesia/5/2005 TETR 분열 부위 돌연변이의 H5의 아미노산 서열은 도 23D에서 제공된다 (서열 번호: 77). 플라스미드 676의 개략도는 도 23E에서 제공된다.
실시예 5.9: TETO 분열 부위 돌연변이를 가진 A/Indonesia/5/2005의 B-2X35S/CPMV-HT/H5 (구조 번호 766)
TETQ 분열 부위 돌연변이를 가진 A/Indonesia/5/2005의 H5의 서열을 하기 PCR-기반 결찰 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 2X35S/CPMV-HT/NOS로 클로닝하였다 (Darveau et al., 1995, Methods in Neuroscience 26: 77-85). PCR의 첫 번째 라운드에서, nt 1에서 nt 1015까지의 A/Indonesia/5/2005 암호화 서열의 H5를 함유하는 단편을 프라이머 IF-H5A-I-05.S1+3c (도 1A, 서열 번호: 2) 및 H5I505_TETQ.r (도 24A, 서열 번호: 78)을 사용하여 증폭시켰으며, 주형으로서 A/Indonesia/5/2005의 합성된 H5 (도 1G, 서열 번호: 42)를 사용하였다. nt 1038에서 nt 1707까지의 A/Indonesia/5/2005 암호화 서열의 H5를 함유하는 두 번째 단편을 프라이머 H5I505_TETQ.c (도 24B, 서열 번호: 79) 및 IF-H5dTm.r (도 1B, 서열 번호: 3)을 사용하여 증폭시켰으며, 주형으로서 A/Indonesia/5/2005의 합성된 H5 (도 1G, 서열 번호: 42)를 사용하였다. 두 번의 증폭으로부터의 PCR 생성물을 이어서 혼합하였고 증폭의 두 번째 라운드에 대한 주형으로서 사용하였으며 프라이머로서 IF-H5A-I-05.S1+3c (도 1A, 서열 번호: 2) 및 IF-H5dTm.r (도 1B, 서열 번호: 3)을 사용하였다. 결과의 단편 (단편들 사이에서 TETQ 링커를 가진 A/Indonesia/5/2005 Δa.a. 339-346의 H5를 암호화)을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 카세트에서 클로닝하였다. 구조 1191 (도 1D)은 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 1191은 CPMV- HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 인 프레임 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수령체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 2분열 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 서열은 도 1D에서 제공된다 (서열 번호: 4). 결과의 구조는 주어진 번호 766이다 (도 24C, 서열 번호: 80). A/Indonesia/5/2005 TETQ 분열 부위 돌연변이의 H5의 아미노산 서열은 도 24D에서 제공된다 (서열 번호: 81). 플라스미드 766의 개략도는 도 24E에서 제공된다.
실시예 5.10: C-2X35S/CPMV-HT/결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 A/Indonesia/5/2005의 H5 (구조 번호 928)
결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 A/Indonesia/5/2005의 H5를 암호화하는 서열을 Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995))에 의해 제공된 하기 PCR-기반 결찰 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 2X35S/CPMV-HT/NOS로 클로닝하였다. PCR의 첫 번째 라운드에서, nt 1에서 nt 1011까지의 A/Indonesia/5/2005 암호화 서열의 H5를 함유하는 단편을 프라이머 IF-H5A-I-05.S1+3c (도 1A, 서열 번호: 2) 및 H5I505(PrL-).r (도 25 A, 서열 번호: 82)을 사용하여 증폭시켰으며, 주형으로서 A/Indonesia/5/2005의 합성된 H5 (도 1G, 서열 번호: 42)를 사용하였다. nt 1075에서 nt 1707까지의 A/Indonesia/5/2005의 H5를 함유하는 두 번째 단편을 프라이머 H5I505(PrL-).c (도 25B, 서열 번호: 83) 및 IF-H5dTm.r (도 1B, 서열 번호: 3)를 사용하여 증폭시켰으며, 주형으로서 A/Indonesia/5/2005의 합성된 H5 (도 1G, 서열 번호: 42)를 사용하였다. 두 번의 증폭으로부터의 PCR 생성물을 이어서 혼합하였고 증폭의 두 번째 라운드에 대한 주형으로서 사용하였으며 프라이머로서 IF-H5A-I-05.S1+3c (도 1A, 서열 번호: 2) 및 IF-H5dTm.r (도 1B, 서열 번호: 3)을 사용하였다. 결과의 단편 (단편들 사이에서 GG 링커를 가진 A/Indonesia/5/2005 Δa.a. 338-358의 H5를암호화)을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 카세트에서 클로닝하였다. 구조 1191 (도 1D) SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 1191은 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 인 프레임 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수령체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 2분열 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 서열은 도 1D에서 제공된다 (서열 번호: 4). 결과의 구조는 주어진 번호 928이다 (도 25C, 서열 번호: 84). 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 A/Indonesia/5/2005의 H5의 아미노산 서열은 도 25D에서 제공된다 (서열 번호: 85). 플라스미드 928의 도면은 도 25E에서 제공된다.
실시예 5.11 - F- 2X35S / CPMV -HT/ PDISP /HA B Brisbane/NOS (구조 번호 1029)
인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 HA를 암호화하는 서열은 하기 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. his 야생형 신호 펩타이드가 없는 HA B Brisbane 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-S2+S4-B Bris.c (도 30A, 서열 번호: 86) 및 IF-Sla4-B Bris.r (도 30B, 서열 번호: 87)을 사용하여 증폭시켰으며, 주형으로서 합성된 HA B Brisbane 유전자 (Genbank 수납 번호 FJ766840의 nt 34-1791에 해당함) (도 30C, 서열 번호: 88)를 사용하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템에서 알팔파 PDI 신호 펩타이드와 함께 인-프레임 클로닝하였다. 구조 1192를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 1192는 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 알팔파 PDI 신호 펩타이드와 함께 원하는 유전자의 인 프레임 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수령체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 2분열 플라스미드 및 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 서열이다. 결과의 구조는 주어진 번호 1029이다 (도 30D, 서열 번호: 89). 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA의 아미노산 서열은 도 30E에서 제공된다 (서열 번호: 90). 플라스미드 1029의 도면은 도 30F에서 제공된다.
실시예 5.12 - PDISP /HA B Brisbane ( PrL -)에 대한 2X35S / CPMV HT (구조 번호 1039) 및 HT+(구조 번호 1829)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것으로 대체된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 HA에 해당하는 암호화 서열 (PDISP/HA B Brisbane (PrL-); 도 31 A, 서열 번호: 91)을 실시예 5.7 및 5.11에서 기술된 같은 PCR-기반 방법을 사용하지만, PDISP/HA B Brisbane (PrL-)에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 원래의 HT 및 변형된 HT+로 클로닝하였다. PDISP와 융합된 성숙한 HA B Brisbane (PrL-)의 아미노산 서열은 도 31B에서 제공된다 (서열 번호: 92). 플라스미드 1039 및 1829의 도면은 도 8B 및 31D에서 제공된다.
실시예 5.13 - PDISP /HA B Brisbane ( PrL -)에 대한 2X35S / CPMV HT (구조 번호 1039) 및 2X35S/CPMV160+(구조 번호 1937)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것으로 대체된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 HA에 해당하는 암호화 서열 (추가적인 정보 re: HA 서열에서 결실된 단백질 가수분해 루프 영역에 대하여 2013년 3월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 61/806,227 참조, 이것은 본원에 참고로 포함됨) (PDISP/HA B Brisbane (PrL-)) (도 32A, 서열 번호: 93)을 원래의 HT 및 변형된 HT+로 클로닝하였다. 실시예 5.7 및 5.11에서 기술된 같은 PCR-기반 방법을 사용하지만, PDISP/HA B Brisbane (PrL-)에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 원래의 HT 및 변형된 HT+로 클로닝하였다. PDISP와 융합된 성숙한 HA B Brisbane (PrL-)의 아미노산 서열은 도 31B에서 제공된다 (서열 번호: 92). 플라스미드 1039 및 1937의 도면은 도 8B 및 32C에서 제공된다.
실시예 15.14 - PDISP /HA B Brisbane ( PrL -)+H1 California TMCT에 대한 2X35S/CPMV HT (구조 번호 1067) 및 2X35S/CPMV160+(구조 번호 1977)
인플루엔자 A/California/7/2009의 H1의 막관통 도메인 및 세포질 꼬리 (TMCT)에 융합되고 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 신호 펩타이드를 가진, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) 인플루엔자 B/Brisbane/60/08의 HA의 엑토도메인에 해당하는 키메라 헤마글루티닌 암호화 서열 (추가적인 정보 re: HA 서열에서 결실된 단백질 가수분해 루프 영역에 대하여, 2013년 3월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 61/806,227, 이것은 본원에 참고로 포함됨) (PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT) (도 33A, 서열 번호: 95)을 실시예 5.7 및 5.11에서 기술된 같은 PCR-기반 방법을 사용하지만, PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 원래의 CPMV-HT 및 CPMV160+로 클로닝하였다. PDISP에 융합된 성숙한 HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열은 도 33B에서 제공된다 (서열 번호: 96). 플라스미드 1067 및 1977의 도면은 도 33C 및 도 33D에서 제공된다.
실시예 5.15 - PDISP /HA B Massachusetts ( PrL -)에 대한 2X35S / CPMV HT (구조 번호 2072) 및 2X35S / CPMV160+ (구조 번호 2050)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) 인플루엔자 B/Massachusetts/2/2012의 HA에 해당하는 암호화 서열 (추가적인 정보 re: HA 서열에서 결실된 단백질 가수분해 루프 영역에 대하여 2013년 3월 28일 출원된 미국 가출원 번호 61/806,227 참조, 이것은 본원에 참고로 포함됨) (PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)) (도 34A, 서열 번호: 97)을 실시예 5.7 및 5.11에서 기술된 같은 PCR-기반 방법을 사용하지만, PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 원래의 CPMV-HT 및 CPMV160+로 클로닝하였다. PDISP와 융합된 성숙한 HA B Massachusetts (PrL-)의 아미노산 서열은 도 34B에서 제공된다 (서열 번호: 98). 플라스미드 2072 및 2050의 도면은 도 34C 및 도 34D에서 제공된다.
실시예 5.16 - PDISP /HA B Massachusetts ( PrL -)+H1 California TMCT에 대한 2X35S/CPMV HT (구조 번호 2074) 및 2X35S/CPMV160+(구조 번호 2060)
인플루엔자 A/California/7/2009의 H1의 막관통 도메인 및 세포질 꼬리 (TMCT)에 융합되고 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 신호 펩타이드를 가진, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) 인플루엔자 B/Massachusetts/2/2012의 HA의 엑토도메인에 해당하는 키메라 헤마글루티닌 암호화 서열 (추가적인 정보 re: HA 서열에서 결실된 단백질 가수분해 루프 영역에 대하여 2013년 3월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 61/806,227 참조, 이것은 본원에 참고로 포함됨) (PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT) (도 35A, 서열 번호: 99)을 실시예 5.7 및 5.11에서 기술된 같은 PCR-기반 방법을 사용하지만, PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 원래의 CPMV-HT 및 CPMV160+로 클로닝하였다. PDISP와 융합된 성숙한 HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열은 도 35B에서 제공된다 (서열 번호: 100). 플라스미드 2074 및 2060의 도면은 도 35C 및 35D에서 제공된다.
실시예 5.17 - HA B Wisconsin ( PrL -)에 대한 2X35S / CPMV HT (구조 번호 1445), 2X35S/CPMVHT+(구조 번호 1820) 및 CPMV160+(구조 번호 1975)
his 고유한 신호 펩타이드를 가진, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 HA에 해당하는 암호화 서열 (추가적인 정보 re: HA 서열에서 결실된 단백질 가수분해 루프 영역에 대하여 2013년 3월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 61/806,227 참조, 이것은 본원에 참고로 포함됨) (HA B Wisconsin (PrL-)) (도 36AA, 서열 번호: 101)을 실시예 5.7 및 5.11에서 기술된 같은 PCR-기반 방법을 사용하지만, HA B Wisconsin (PrL-)에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 원래의 CPMV-HT, CPMVHT+, 및 CPMV160으로 클로닝하였다. his 고유한 신호 펩타이드를 가진 HA B Wisconsin (PrL-)의 아미노산 서열은 도 36B에서 제공된다 (서열 번호: 102). 플라스미드 1445, 1820 및 1975의 도면은 각각 도 36C, 36D 및 36E에서 제공된다.
실시예 5.18 - HA B Wisconsin ( PrL -)+H1 California TMCT에 대한 2X35S/CPMV HT (구조 번호 1454) 및 2X35S / CPMV160+ (구조 번호 1893)
인플루엔자 A/California/7/2009의 H1의 막관통 도메인 및 세포질 꼬리 (TMCT)에 융합되고 HA B Wisconsin의 고유한 신호 펩타이드를 가진, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) 인플루엔자 B/Wisconsin/2/2012의 HA의 엑토도메인에 해당하는 키메라 헤마글루티닌 암호화 서열 (추가적인 정보 re: HA 서열에서 결실된 단백질 가수분해 루프 영역에 대하여 2013년 3월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 61/806,227 참조, 이것은 본원에 참고로 포함됨) (HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT) (도 37A, 서열 번호: 103)을 실시예 5.7 및 5.11에서 기술된 같은 PCR-기반 방법을 사용하지만, HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 원래의 CPMV-HT 및 CPMV160+로 클로닝하였다. HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열은 도 37에서 제공된다 (서열 번호: 104). 플라스미드 1454 및 1893의 도면은 도 37C 및 37D에서 제공된다.
실시예 5.19: PDISP /HA B Brisbane ( PrL -)+H1 California TMCT에 대한 2X35S/CPMV HT (구조 번호 1067) 및 HT+(구조 번호 1875)
인플루엔자 A/California/7/2009의 H1의 막관통 도메인 및 세포질 꼬리 (TMCT)에 융합되고 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 신호 펩타이드를 가진, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) 인플루엔자 B/Brisbane/60/08의 HA의 엑토도메인에 해당하는 키메라 헤마글루티닌 암호화 서열 (PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT) (도 38A, 서열 번호: 105)을 실시예 5.26에서 기술된 같은 PCR-기반 방법을 사용하지만, PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 원래의 HT 및 변형된 HT+로 클로닝하였다. PDISP와 융합된 성숙한 HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열은 도 38B에서 제공된다 (서열 번호: 106). 플라스미드 1067 및 1875의 도면은 도 33C 및 39C에서 제공된다.
실시예 5.20: PDISP /HA B Massachusetts ( PrL -)에 대한 2X35S / CPMV HT (구조 번호 2072) 및 HT+(구조 번호 2052)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) 인플루엔자 B/Massachusetts/2/2012의 HA에 해당하는 암호화 서열 (PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)) (도 39A, 서열 번호: 107)을 실시예 5.26에서 기술된 바와 같은 PCR-기반 방법을 사용하지만, PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 원래의 HT 및 변형된 HT+로 클로닝하였다. PDISP와 융합된 성숙한 HA B Massachusetts (PrL-)의 아미노산 서열은 도 39B에서 제공된다 (서열 번호: 108). 플라스미드 2072 및 2052의 도면은 도 34C 및 도 39C에서 제공된다.
실시예 5.21: PDISP /HA B Massachusetts ( PrL -)+H1 California TMCT에 대한 2X35S/CPMV HT (구조 번호 2074) 및 HT+(구조 번호 2062)
인플루엔자 A/California/7/2009의 H1의 막관통 도메인 및 세포질 꼬리 (TMCT)에 융합되고 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 신호 펩타이드를 가진, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) 인플루엔자 B/Massachusetts/2/2012의 HA의 엑토도메인에 해당하는 키메라 헤마글루티닌 암호화 서열 (PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT) (도 40A, 서열 번호: 109)을 실시예 5.26에서 기술된 바와 같은 PCR-기반 방법을 사용하지만, PDISP/HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 원래의 HT 및 변형된 HT+로 클로닝하였다. PDISP와 융합된 성숙한 HA B Massachusetts (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열은 도 40B에서 제공된다 (서열 번호: 110). 플라스미드 2074 및 2062의 도면은 도 35C 및 도 40C에서 제공된다.
실시예 5.22: HA B Wisconsin ( PrL -)에 대한 2X35S / CPMV HT (구조 번호 1445) 및 HT+(구조 번호 1839)
his 고유한 신호 펩타이드를 가지며, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 HA에 해당하는 암호화 서열 (HA B Wisconsin (PrL-)) (도 41 A, 서열 번호: 111)을 실시예 5.26에서 기술된 바와 같은 PCR-기반 방법을 사용하지만, HA B Wisconsin (PrL-)에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 원래의 HT 및 변형된 HT+로 클로닝하였다. his 고유한 신호 펩타이드를 가진 HA B Wisconsin (PrL-)의 아미노산 서열은 도 41B에서 제공된다 (서열 번호: 112). 플라스미드 1445 및 1839의 도면은 도 36C 및 41C에서 제공된다.
실시예 5.23: HA B Wisconsin ( PrL -)+H1 California TMCT에 대한 2X35S / CPMV HT (구조 번호 1454) 및 HT+(구조 번호 1860)
HA B Wisconsin의 고유한 신호 펩타이드를 가진 인플루엔자 A/California/7/2009의 H1의 막관통 도메인 및 세포질 꼬리 (TMCT)에 융합된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 (PrL-) 인플루엔자 B/Wisconsin/2/2012의 HA의 엑토도메인에 해당하는 키메라 헤마글루티닌 암호화 서열 (HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT) (도 42A, 서열 번호: 113)을 실시예 5.26에서 기술된 바와 같은 PCR-기반 방법을 사용하지만 HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 원래의 HT 및 변형된 HT+로 클로닝하였다. HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMCT의 아미노산 서열은 도 42B에서 제공된다 (서열 번호: 114). 플라스미드 1454 및 1860의 도면은 도 37C 및 42C에서 제공된다.
실시예 5.24 - H5 Indonesia에 대한 2X35S / CPMV HT (구조 번호 489). 2X35S/CPMV160+(구조 번호 1880) 및 2X35S / CPMV160 (구조 번호 1885)
인플루엔자 A/Indonesia/5/2005의 고유한 H5에 해당하는 암호화 서열 (도 43A, 서열 번호: 115)을 실시예 5.25에서 기술된 바와 같은 PCR-기반 방법을 사용하지만 H5 Indonesia에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 원래의 CPMV-HT, CPMV160+및 CPMV160으로 클로닝하였다. 인플루엔자 A/Indonesia/5/2005의 고유한 H5의 아미노산 서열은 도 43B에서 제공된다 (서열 번호: 116). 플라스미드 489의 도면은 도 43C에서 제공된다.
실시예 5.25 - 2X35S / CPMV160 +/ PDISP /H3 Victoria/NOS (구조 번호 1800)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된 인플루엔자 A/Victoria/361/2011의 H3을 암호화하는 서열 (PDISP/H3 Victoria)을 하기 PCR-기반 방법을 사용하여 2X35S/CPMV160+/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다 (CPMV160+). PDISP/H3 Victoria 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF**(SacII)-PDI.s1+4c (도 44A, 서열 번호: 117) 및 IF-H3V3611 1.s1-4r (도 44B, 서열 번호: 118)를 사용하여 증폭시켰으며, 주형으로서 PDISP/H3 Victoria 서열 (도 44C, 서열 번호: 119)을 사용한다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV160+/NOS 발현 시스템에서 클로닝하였다. 구조 번호 2171 (도 44D)은 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 2171은 CPMV160+기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수령체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 2분열 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 서열은 도 44E에서 제공된다 (서열 번호: 120). 결과의 구조는 주어진 번호 1800이다 (도 44F, 서열 번호: 121). PDISP와 융합된 인플루엔자 A/Victoria/361/2011의 성숙한 H3의 아미노산 서열은 도 44G에서 제공된다 (서열 번호: 122). 플라스미드 1800의 도면은 도 44H에서 제공된다.
실시예 5.26: 2X35S / CPMV -HT+/ PDISP /H3 Victoria/NOS (구조 번호 1819)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된 인플루엔자 A/Victoria/361/2011의 H3을 암호화하는 서열 (PDISP/H3 Victoria)을 하기 PCR-기반 방법을 사용하여 2X35S-CPMV-HT+/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. PDISP/H3 Victoria 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF(SacII)-Kozac_PDI.c (도 45A, 서열 번호: 123) 및 IF-H3V36111.s1-4r (도 45B, 서열 번호: 124)을 사용하여 증폭시켰으며, 주형으로서 PDISP/H3 Victoria 서열 (도 44C, 서열 번호: 119)을 사용하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT+/NOS 발현 시스템에서 클로닝하였다. 구조 번호 2181 (도 45D)은 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 2181은 CPMV-HT+기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수령체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 2분열 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 서열은 도 45E에서 제공된다 (서열 번호: 125). 결과의 구조는 주어진 번호 1819이다 (도 45E, 서열 번호: 126). PDISP와 융합된 인플루엔자 A/Victoria/361/2011의 성숙한 H3의 아미노산 서열은 도 44G에서 제공된다 (서열 번호: 122). 플라스미드 1819의 도면은 도 45F에서 제공된다.
실시예 5.27 2X35S / CPMV HT+/ PDISP /H2 Singapore/NOS (구조 번호 2220)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된 인플루엔자 A/Singapore/1/1957의 H2를 암호화하는 서열 (PDISP/H2 Singapore)을 하기 PCR-기반 방법을 사용하여 2X35S/CPMV HT+/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. PDISP/H2 Singapore 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF(SacII)-Kozac PDI.c (실시예 5.26에서 구조 1819에 대하여 기술됨) 및 IF**-H2S157.s1-6r (도 48A, 서열 번호: 127)을 사용하여 증폭시켰으며, 주형으로서 PDISP/H2 Singapore 서열 (도 48B, 서열 번호: 128)을 사용하였다. PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV HT+/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. 구조 번호 2181 (실시예 5.26에서 구조 1819에 대하여 기술됨)은 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 2181은 CPMV HT+기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수령체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 2분열 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 서열은 도 45D에서 제공된다. 결과의 구조는 주어진 번호 2220이다 (도 48C, 서열 번호: 129). PDISP에 융합된 인플루엔자 A/Singapore/1/1957의 성숙한 H2의 아미노산 서열은 도 48D에서 제공된다 (서열 번호: 130). 플라스미드 2220의 도면은 도 48E에서 제공된다.
실시예 5.28 2X35S / CPMV HT+/결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP /H2 Singapore/NOS (구조 번호 2221)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 A/Singapore/1/1957의 H2를 암호화하는 서열 (결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H2 Singapore)을 Darveau et al.에 의해 제공된 하기 PCR-기반 결찰 방법을 사용하여 2X35S/CPMV HT+/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다 (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995)). PCR의 첫 번째 라운드에서, nt 1에서 nt 1032까지의 인플루엔자 A/Singapore/1/1957 암호화 서열의 H2를 함유하는 단편을 프라이머 IF(SacII)-Kozac_PDI.c (실시예 5.26에서 구조 1819에 대하여 기술됨) 및 H2S157(Prl-).r (도 49A, 서열 번호: 131)로 증폭시켰으며, 주형으로서 PDISP/H2 Singapore 서열 (도 48B, 서열 번호: 128)을 사용하였다. nt 1084에서 nt 1716까지의 인플루엔자 A/Singapore/1/1957 암호화 서열의 H2를 암호화하는 두 번째 단편을 프라이머 H2S157(Prl-).c (도 49B, 서열 번호: 132) 및 IF**-H2S157.s1-6r (도 48A, 서열 번호: 127)로 증폭시켰으며 주형으로서 PDISP/H2 Singapore 서열 (도 48B, 서열 번호: 128)을 사용하였다. 두 번의 증폭으로부터의 PCR 생성물을 이어서 혼합하였고 증폭의 두 번째 라운드에 대한 주형으로서 사용하였으며 프라이머로서 IF(SacII)-Kozac_PDI.c (실시예 5.26에서 구조 1819에 대하여 기술됨) 및 IF**-H2S157.s1-6r (도 48A, 서열 번호: 127)을 사용하였다. PCR 생성물 (GG 링커에 의해 대체된 aa 321 내지 337을 가진 PDISP/H2 Singapore 암호화 서열 포함)을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV HT+/NOS 발현 시스템에서 클로닝하였다. 구조 번호 2181 (실시예 5.26에서 구조 1819에 대하여 기술됨)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 2181은 CPMV HT+기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수령체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 2분열 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 서열은 도 45D에서 제공된다 (실시예 5.26에서 구조 1819에 대하여 기술됨). 결과의 구조는 주어진 번호 2221이다 (도 49C, 서열 번호: 133). PDISP와 융합된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 A/Singapore/1/1957의 성숙한 H2의 아미노산 서열은 도 49D에서 제공된다 (서열 번호: 134). 플라스미드 2221의 도면은 도 49E에서 제공된다.
실시예 5.29 2X35S / CPMV 160+/NOS 발현 시스템에서 PDISP /H2 Singapore (구조 번호 2222) 및 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP /H2 Singapore (구조 번호 2223)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된, 단백질 가수분해 루프가 있거나 없는 인플루엔자 A/Singapore/1/1957의 H2를 암호화하는 서열 (PDISP/H2 Singapore 및 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H2 Singapore)을 각각 구조 2220 및 2221과 같은 PCR-기반 방법을 사용하지만, 증폭을 위해 변형된 정방향 프라이머 IF**(SacII)-PDI.s1+4c (실시예 5.25에서 구조 1800에 대하여 기술됨) 및 다른 수령체 플라스미드를 사용하여 2X35S/CPMV 160+/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. 결과의 PCR 생성물을 In-Fusion 클로닝 시스템 (Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV 160+/NOS 발현 시스템에서 클로닝하였다. 구조 번호 2171 (실시예 5.25에서 구조 1800에 대하여 기술됨)은 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 In-Fusion 조립 반응에 사용하였다. 구조 번호 2171은 CPMV 160+기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "In Fusion" 클로닝을 위해 의도된 수령체 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 침묵의 TBSV P19 억제자의 동시-발현을 위한 유전자 구조를 포함한다. 백본은 pCAMBIA 2분열 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더까지의 서열이 제공된다 (실시예 5.25에서 구조 1800에 대하여 기술됨). 결과의 구조에 PDISP/H2 Singapore에 대하여 주어진 번호 2222이고 (도 5 OA, 서열 번호: 135) 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H2 Singapore에 대하여 2223이다 (도 50B, 서열 번호: 136). 플라스미드 2222 및 2223의 도면은 각각 도 50C 및 50D에서 제공된다.
실시예 5.30 PDISP /H3 Perth에 대한 2X35S / CPMV HT+(구조 번호 2019) 및 160+(구조 번호 2139)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된 인플루엔자 A/Perth/16/2009 의 H3에 해당하는 암호화 서열 (PDISP/H3 Perth) (도 51 A, 서열 번호: 137)을 각각 구조 2220 및 2222와 같은 In Fusion-기반 접근법을 사용하지만, PDISP/H3 Perth에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 변형된 CPMV HT+및 160+로 클로닝하였다 (도 51B, 서열 번호: 138). PDISP와 융합된 인플루엔자 A/Perth/16/2009의 성숙한 H3의 아미노산 서열은 도 51C에서 제공된다 (서열 번호: 139). 플라스미드 2019 및 2139의 도면은 도 51D 및 도 51E에서 제공된다.
실시예 5.31 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP /H3 Perth에 대한 2X35S/CPMV HT+(구조 번호 2039) 및 160+(구조 번호 2159)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 A/Perth/16/2009의 H3에 해당하는 암호화 서열 (결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Perth) (도 52, 서열 번호: 140)을 각각 구조 2221 및 2223과 같은 In Fusion-기반 접근법을 사용하지만, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Perth에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 변형된 CPMV HT+및 160+로 클로닝하였다 (도 51B (서열 번호: 138), 52B (서열 번호: 141) 및 53C (서열 번호: 142). PDISP와 융합된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 A/Perth/16/2009의 성숙한 H3의 아미노산 서열은 도 52D에서 제공된다 (서열 번호: 143). 플라스미드 2039 및 2159의 도면은 도 52E 및 도 52F에서 제공된다.
실시예 5.32 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP /H3 Victoria에 대한 2X35S/CPMV HT+(구조 번호 2230) 및 160+(구조 번호 2250)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 A/Victoria/361/2011의 H3에 해당하는 암호화 서열 (결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Victoria) (도 53, 서열 번호: 144)을 구조 2221 및 2223 와 같은 In Fusion-기반 접근법을 사용하지만 (실시예 5.28 및 5.29 참조), 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H3 Victoria에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 변형된 CPMV HT+및 160+로 클로닝하였다 (도 53B (서열 번호: 145) 및 53C (서열 번호: 146). PDISP와 융합된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 A/Victoria/361/2011의 성숙한 H3의 아미노산 서열은 도 53D에서 제공된다 (서열 번호: 147). 플라스미드 2230 및 2250의 도면은 도 53E 및 도 53F에서 제공된다.
실시예 5.33 2X35S / CPMV HT+/ PDISP /H7 Hangzhou /NOS (구조 번호 2142)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된 인플루엔자 A/Hangzhou/1/2013의 H7에 해당하는 암호화 서열 (PDISP/H7 Hangzhou) (도 54A, 서열 번호: 148)을 구조 2220과 같은 In Fusion-기반 접근법을 사용하지만 PDISP/H7 Hangzhou에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 변형된 CPMV HT+로 클로닝하였다 (도 54B, 서열 번호: 149). PDISP와 융합된 인플루엔자 A/Hangzhou/1/2013의 성숙한 H7의 아미노산 서열은 도 54C에서 제공된다 (서열 번호: 150). 플라스미드 2142의 도면은 도 54E에서 제공된다.
실시예 5.34 2X35S / CPMV HT+/결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP /H7 Hangzhou/NOS (구조 번호 2152)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 A/Hangzhou/1/2013의 H7에 해당하는 암호화 서열 (결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H7 Hangzhou) (도 55A, 서열 번호: 151)을 구조 2221과 같은 In Fusion-기반 접근법을 사용하지만 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H7 Hangzhou에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 변형된 CPMV HT+로 클로닝하였다 (도 54B (서열 번호: 149), 도 55B (서열 번호: 152) 및 도 55C (서열 번호: 153)). PDISP와 융합된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 A/Hangzhou/1/2013의 성숙한 H7의 아미노산 서열은 도 55D에서 제공된다 (서열 번호: 154). 플라스미드 2152의 도면은 도 55E에서 제공된다.
실시예 5.35 PDISP /H9 Hong Kong에 대한 2X35S / CPMV HT+(구조 번호 2224) 및 160+(구조 번호 2226)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된 인플루엔자 A/Hong Kong/1073/1999의 H9에 해당하는 암호화 서열 (PDISP/H9 Hong Kong) (도 56A, 서열 번호: 155)을 각각 구조 2220 및 2222와 같은 In Fusion-기반 접근법을 사용하지만, PDISP/H9 Hong Kong에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 변형된 CPMV HT+및 160+로 클로닝하였다 (도 56B, 서열 번호: 156). PDISP와 융합된 인플루엔자 A/Hong Kong/1073/1999의 성숙한 H9의 아미노산 서열은 도 56C에서 제공된다 (서열 번호: 157). 플라스미드 2224 및 2226의 도면은 도 56D 및 도 56E에서 제공된다.
실시예 5.36 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP /H9 Hong Kong에 대한 2X35S / CPMV HT+(구조 번호 2225) 및 160+(구조 번호 2227)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 A/Hong Kong/1073/1999의 H9에 해당하는 암호화 서열 (결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H9 Hong Kong) (도 57A, 서열 번호: 158)을 각각 구조 2221 및 2223과 같은 In Fusion-기반 접근법을 사용하지만, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/H9 Hong Kong에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 변형된 CPMV HT+및 160+로 클로닝하였다 (도 56B (서열 번호: 156), 도 57B (서열 번호: 159) 및 도 57C (서열 번호: 160)). PDISP와 융합된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 A/Hong Kong/1073/1999의 성숙한 H9의 아미노산 서열은 도 57D에서 제공된다 (서열 번호: 161). 플라스미드 2225 및 2227의 도면은 도 57E 및 도 57F에서 제공된다.
실시예 5.37 2X35S / CPMV 160+/ PDISP /HA B Malaysia/NOS (구조 번호 2013)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된 인플루엔자 B/Malaysia/2506/2004의 HA에 해당하는 암호화 서열 (PDISP/HA B Malaysia) (도 58A, 서열 번호: 162)를 구조 2222와 같은 In Fusion-기반 접근법을 사용하지만 PDISP/HA B Malaysia에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 변형된 CPMV 160+로 클로닝하였다 (도 58B, 서열 번호: 163). PDISP와 융합된 인플루엔자 B/Malaysia/2506/2004의 성숙한 HA의 아미노산 서열은 도 58C에서 제공된다 (서열 번호: 164). 플라스미드 2013의 도면은 도 58D에서 제공된다.
실시예 5.38 2X35S / CPMV 160+/결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP /HA B Malaysia/NOS (구조 번호 2014)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 B/Malaysia/2506/2004의 HA에 해당하는 암호화 서열 (결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Malaysia) (도 59A, 서열 번호: 165)을 구조 2223과 같은 In Fusion-기반 접근법을 사용하지만 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP/HA B Malaysia에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 변형된 CPMV 160+로 클로닝하였다 (도 58B (서열 번호: 163), 도 59B (서열 번호: 166), 도 59C (서열 번호: 167). PDISP와 융합된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 B/Malaysia/2506/2004의 성숙한 HA의 아미노산 서열은 도 59D에서 제공된다 (서열 번호: 168). 플라스미드 2014의 도면은 도 59E에서 제공된다.
실시예 5.39 PDISP /HA B Massachusetts에 대한 2X35S / CPMV HT (구조 번호 2070), HT+(구조 번호 2080) 및 160+(- Mprot ) (구조 번호 2090)
고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된 인플루엔자 B/Massachusetts/2/2012의 HA에 해당하는 암호화 서열 (PDISP/HA B Massachusetts) (도 60A, 서열 번호: 169)을 각각 구조 2072, 2220 및 2222와 같은 In Fusion-기반 접근법을 사용하지만, PDISP/HA B Massachusetts에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 원래의 HT, 변형된 HT+및 160+으로 클로닝하였다. PDISP와 융합된 인플루엔자 B/Massachusetts/2/2012의 성숙한 HA의 아미노산 서열은 도 60B에서 제공된다 (서열 번호: 170). 플라스미드 2070, 2080 및 2090의 도면은 도 60C, 도 60D 및 도 60E에서 제공된다.
실시예 5.40 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP /HA B Florida에 대한 2X35S/CPMV HT+(구조 번호 2102), BeYDV가 있는 HT+(구조 번호 2104)
단백질 가수분해 루프 결실되고 고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된 인플루엔자 B/Florida의 HA에 해당하는 암호화 서열 (PDISP/HA B Florida) (도 61D, 서열 번호: 193)을 상기 기술된 바와 같은 In Fusion-기반 접근법을 사용하지만, PDISP/HA B/Florida에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 변형된 HT+로 클로닝하였다 (도면 참조 도 61A (서열 번호: 190), 도 61B (서열 번호: 191) 및 도 61C (서열 번호: 192). 결과의 발현 카세트 2102의 뉴클레오타이드 서열은 도 61F에서 주어진다 (서열 번호: 195). 유사하게, 결실된 단백질 가수분해 루프 가지고 고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된 인플루엔자 B/Florida의 HA에 해당하는 암호화 서열을 증폭 요소 BeYDV와 함께 변형된 HT+로 클로닝하였다. 결과의 발현 카세트 2104의 뉴클레오타이드 서열은 도 61F에서 주어진다 (서열 번호: 196). PDISP와 융합된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 B/Florida의 성숙한 HA의 아미노산 서열은 도 61E에서 제공된다 (서열 번호: 194). 플라스미드 2102 및 2104의 도면은 도 61G 및 61I에서 제공된다.
실시예 5.41 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 PDISP /HA B Florida+H1 California TMCT에 대한 2X35S / CPMV HT+(구조 번호 2106), BeYDV가 있는 HT+(구 조 번호 2108)
결실된 단백질 가수분해 루프를 가지고 고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된 인플루엔자 B/Florida+H1 California TMCT의 HA에 해당하는 암호화 서열 (PDISP/HA B Florida+H1 California TMCT) (도 62B, 서열 번호: 198)을 상기 기술된 바와 같은 In Fusion-기반 접근법을 사용하지만, PDISP/HA B/Florida+H1 California TMCT에 대하여 특이적으로 설계된 변형된 PCR 프라이머를 가지고 변형된 HT+로 클로닝하였다 (도면 참조 도 61A (서열 번호: 197). 결과의 발현 카세트 2106의 뉴클레오타이드 서열은 도 62D에서 주어진다 (서열 번호: 200). 유사하게, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가지고 고유한 신호 펩타이드가 알팔파 단백질 이황화 이소머라제의 그것에 의해 대체된 인플루엔자 B/Florida+H1 California TMCT의 HA에 해당하는 암호화 서열을 증폭 요소 BeYDV와 함께 변형된 HT+로 클로닝하였다. 결과의 발현 카세트 2108의 뉴클레오타이드 서열은 도 62F에서 주어진다 (서열 번호: 201). PDISP와 융합된, 결실된 단백질 가수분해 루프를 가진 인플루엔자 B/Florida+H1 California TMCT의 성숙한 HA의 아미노산 서열은 도 62C에서 제공된다 (서열 번호: 199). 플라스미드 2106 및 2108의 도면은 도 62E 및 62G에서 제공된다.
모든 인용문은 본원에서 참고로 포함된다.
본 발명은 하나 이상의 구체예에 관하여 기술되었다. 하지만, 청구범위에서 한정된 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 많은 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> MEDICAGO INC. <120> INFLUENZA VIRUS-LIKE PARTICLE PRODUCTION IN PLANTS <130> V85680WO <140> PCT/CA2014/050326 <141> 2014-03-28 <150> US 61/806,227 <151> 2013-03-28 <150> US 61/971,274 <151> 2014-03-27 <150> US 61/925,852 <151> 2014-01-10 <160> 201 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Avian H5 proteolytic loop consensus sequence <400> 1 Gln Arg Glu Ser Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Gly Phe Ile Glu Gly 20 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer IF-H5A-I-05.s1+3c <400> 2 aaatttgtcg ggcccatgga gaaaatagtg cttcttcttg c 41 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer IF-H5dTm.r <400> 3 actaaagaaa ataggccttt aaatgcaaat tctgcattgt aacgatccat 50 <210> 4 <211> 4903 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Construct 1191 <400> 4 tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60 gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga 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gtgaagatag tggaaaagga 2640 aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc 2700 tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga 2760 cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga 2820 tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca 2880 tttggagagg tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa 2940 ccaaaccttc ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc 3000 ttgcgtgagc gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acgttttctt 3060 tcactgaagc gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg 3120 tgtacttgtc ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct 3180 gttcagcccc atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct 3240 acttctgctt gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt 3300 tctataagaa atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga 3360 gaaagattgt taagcttctg tatattctgc ccaaatttgt cgggcccgcg gatggcgaaa 3420 aacgttgcga ttttcggctt attgttttct cttcttgtgt 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<220> <223> Amino acid sequence Replacing cleavage site of H3 with linker <400> 21 Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp 20 25 30 Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr 35 40 45 Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Lys Asn Cys 50 55 60 Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln 65 70 75 80 Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn 85 90 95 Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val 100 105 110 Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr 115 120 125 Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Lys 130 135 140 Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Asn Phe Lys 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys 165 170 175 Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile 180 185 190 Phe Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg 195 200 205 Ser Gln Gln Thr Val Ser Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Val Arg 210 215 220 Asn Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly 225 230 235 240 Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly 245 250 255 Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala 260 265 270 Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile 275 280 285 Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala 290 295 300 Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met 305 310 315 320 Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala 325 330 335 Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly 340 345 350 Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys 355 360 365 Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu 370 375 380 Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser 385 390 395 400 Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr 405 410 415 Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu 420 425 430 Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe 435 440 445 Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn 450 455 460 Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser 465 470 475 480 Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu 485 490 495 Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys 500 505 510 Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys 515 520 525 Val Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile 530 535 540 Arg Cys Asn Ile Cys Ile 545 550 <210> 22 <211> 31 <212> PRT <213> Influenza H1 New Cal <400> 22 Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 1 5 10 15 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 20 25 30 <210> 23 <211> 31 <212> PRT <213> Influenza H1 Brisbane <400> 23 Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 1 5 10 15 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 20 25 30 <210> 24 <211> 31 <212> PRT <213> Influenza H1 Sol Islands <400> 24 Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 1 5 10 15 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 20 25 30 <210> 25 <211> 31 <212> PRT <213> Influenza H2A Singapore <400> 25 Val Pro Gln Ile Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 1 5 10 15 Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 20 25 30 <210> 26 <211> 31 <212> PRT <213> Influenza H3A Brisbane <400> 26 Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 1 5 10 15 Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe 20 25 30 <210> 27 <211> 31 <212> PRT <213> Influenza H3A WCN <400> 27 Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 1 5 10 15 Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe 20 25 30 <210> 28 <211> 34 <212> PRT <213> Influenza H5 Anhui <400> 28 Ser Pro Leu Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 20 25 30 Gly Tyr <210> 29 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza H5 Indo <400> 29 Ser Pro Gln Arg Glu Ser Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala 1 5 10 15 Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp 20 25 30 Tyr Gly Tyr 35 <210> 30 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza H5 Vietnam <400> 30 Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala 1 5 10 15 Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp 20 25 30 Tyr Gly Tyr 35 <210> 31 <211> 6861 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Construct 1194 <400> 31 tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60 gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga atcccgggct ggtatattta tatgttgtca 120 aataactcaa aaaccataaa agtttaagtt agcaagtgtg tacattttta cttgaacaaa 180 aatattcacc tactactgtt ataaatcatt attaaacatt agagtaaaga aatatggatg 240 ataagaacaa gagtagtgat attttgacaa caattttgtt gcaacatttg agaaaatttt 300 gttgttctct cttttcattg gtcaaaaaca atagagagag aaaaaggaag agggagaata 360 aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420 aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480 taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540 aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600 atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660 taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720 tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780 gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840 acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900 ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960 accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020 gattcccttc aaacacatac aaagagaaga gactaattaa ttaattaatc atcttgagag 1080 aaaatggaac gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140 gatggaggat caggaggtac cacttctccc ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg 1200 actgagtggc ggctacataa cgatgagacg aattcgaatc aagataatcc ccttggtttc 1260 aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta tttaagagat atctcagata cgacaggacg 1320 gaagcttcac tgcacagagt ccttggatct tggacgggag attcggttaa ctatgcagca 1380 tctcgatttt tcggtttcga ccagatcgga tgtacctata gtattcggtt tcgaggagtt 1440 agtatcaccg tttctggagg gtcgcgaact cttcagcatc tctgtgagat ggcaattcgg 1500 tctaagcaag aactgctaca gcttgcccca atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga 1560 tgccctgaag gtactcaaac cttcgaaaaa gaaagcgagt aagttaaaat gcttcttcgt 1620 ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa 1680 tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta attcatttac 1740 ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga agacctgccg 1800 cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac aactttataa 1860 gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt 1920 tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat atcatcccct 1980 ttgataaatg atagtacacc aattaggaag gagcatgctc gcctaggaga ttgtcgtttc 2040 ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2100 cgcgttggga attactagcg cgtgtcgaca cgcgtggcgc gccctagcag aaggcatgtt 2160 gttgtgactc cgaggggttg cctcaaactc tatcttataa ccggcgtgga ggcatggagg 2220 caagggcatt ttggtaattt aagtagttag tggaaaatga cgtcatttac ttaaagacga 2280 agtcttgcga caaggggggc ccacgccgaa ttttaatatt accggcgtgg ccccacctta 2340 tcgcgagtgc tttagcacga gcggtccaga tttaaagtag aaaagttccc gcccactagg 2400 gttaaaggtg ttcacactat aaaagcatat acgatgtgat ggtatttgat aaagcgtata 2460 ttgtatcagg tatttccgtc ggatacgaat tattcgtaca agcttcttaa gccggtcaac 2520 atggtggagc acgacacact tgtctactcc aaaaatatca aagatacagt ctcagaagac 2580 caaagggcaa ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcct cggattccat 2640 tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa aggaaggtgg ctcctacaaa 2700 tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg cctctgccga cagtggtccc 2760 aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct 2820 tcaaagcaag tggattgatg tgataacatg gtggagcacg acacacttgt ctactccaaa 2880 aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta 2940 atatccggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata 3000 gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt 3060 gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg 3120 gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact 3180 gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga 3240 agttcatttc atttggagag gtattaaaat cttaataggt tttgataaaa gcgaacgtgg 3300 ggaaacccga accaaacctt cttctaaact ctctctcatc tctcttaaag caaacttctc 3360 tcttgtcttt cttgcgtgag cgatcttcaa cgttgtcaga tcgtgcttcg gcaccagtac 3420 aacgttttct ttcactgaag cgaaatcaaa gatctctttg tggacacgta gtgcggcgcc 3480 attaaataac gtgtacttgt cctattcttg tcggtgtggt cttgggaaaa gaaagcttgc 3540 tggaggctgc tgttcagccc catacattac ttgttacgat tctgctgact ttcggcgggt 3600 gcaatatctc tacttctgct tgacgaggta ttgttgcctg tacttctttc ttcttcttct 3660 tgctgattgg ttctataaga aatctagtat tttctttgaa acagagtttt cccgtggttt 3720 tcgaacttgg agaaagattg ttaagcttct gtatattctg cccaaatttg tcgggcccat 3780 ggcgaaaaac gttgcgattt tcggcttatt gttttctctt cttgtgttgg ttccttctca 3840 gatcttcgcc gcggctcctc agccaaaacg acacccccat ctgtctatcc actggcccct 3900 ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg accctgggat gcctggtcaa gggctatttc 3960 cctgagccag tgacagtgac ctggaactct ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc 4020 ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc 4080 acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg 4140 gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa 4200 gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag cccaaggatg tgctcaccat tactctgact 4260 cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc 4320 tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc 4380 aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt cccatcatgc accaggactg gctcaatggc 4440 aaggaaggcc tattttcttt agtttgaatt tactgttatt cggtgtgcat ttctatgttt 4500 ggtgagcggt tttctgtgct cagagtgtgt ttattttatg taatttaatt tctttgtgag 4560 ctcctgttta gcaggtcgtc ccttcagcaa ggacacaaaa agattttaat tttattaaaa 4620 aaaaaaaaaa aaaagaccgg gaattcgata tcaagcttat cgacctgcag atcgttcaaa 4680 catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat 4740 ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt 4800 tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa 4860 caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga 4920 tctctagagt ctcaagcttg gcgcggggta ccgagctcga attccgagtg tacttcaagt 4980 cagttggaaa tcaataaaat gattatttta tgaatatatt tcattgtgca agtagataga 5040 aattacatat gttacataac acacgaaata aacaaaaaaa cacaatccaa aacaaacacc 5100 ccaaacaaaa taacactata tatatcctcg tatgaggaga ggcacgttca gtgactcgac 5160 gattcccgag caaaaaaagt ctccccgtca cacatatagt gggtgacgca attatcttca 5220 aagtaatcct tctgttgact tgtcattgat aacatccagt cttcgtcagg attgcaaaga 5280 attatagaag ggatcccacc ttttattttc ttcttttttc catatttagg gttgacagtg 5340 aaatcagact ggcaacctat taattgcttc cacaatggga cgaacttgaa ggggatgtcg 5400 tcgatgatat tataggtggc gtgttcatcg tagttggtga agtcgatggt cccgttccag 5460 tagttgtgtc gcccgagact tctagcccag gtggtctttc cggtacgagt tggtccgcag 5520 atgtagaggc tggggtgtct gaccccagtc cttccctcat cctggttaga tcggccatcc 5580 actcaaggtc agattgtgct tgatcgtagg agacaggatg tatgaaagtg taggcatcga 5640 tgcttacatg atataggtgc gtctctctcc agttgtgcag atcttcgtgg cagcggagat 5700 ctgattctgt gaagggcgac acgtactgct caggttgtgg aggaaataat ttgttggctg 5760 aatattccag ccattgaagc tttgttgccc attcatgagg gaattcttct ttgatcatgt 5820 caagatactc ctccttagac gttgcagtct ggataatagt tcgccatcgt gcgtcagatt 5880 tgcgaggaga gaccttatga tctcggaaat ctcctctggt tttaatatct ccgtcctttg 5940 atatgtaatc aaggacttgt ttagagtttc tagctggctg gatattaggg tgatttcctt 6000 caaaatcgaa aaaagaagga tccctaatac aaggtttttt atcaagctgg ataagagcat 6060 gatagtgggt agtgccatct tgatgaagct cagaagcaac accaaggaag aaaataagaa 6120 aaggtgtgag tttctcccag agaaactgga ataaatcatc tctttgagat gagcacttgg 6180 ggtaggtaag gaaaacatat ttagattgga gtctgaagtt cttgctagca gaaggcatgt 6240 tgttgtgact ccgaggggtt gcctcaaact ctatcttata accggcgtgg aggcatggag 6300 gcaagggcat tttggtaatt taagtagtta gtggaaaatg acgtcattta cttaaagacg 6360 aagtcttgcg acaagggggg cccacgccga attttaatat taccggcgtg gccccacctt 6420 atcgcgagtg ctttagcacg agcggtccag atttaaagta gaaaagttcc cgcccactag 6480 ggttaaaggt gttcacacta taaaagcata tacgatgtga tggtatttga tggagcgtat 6540 attgtatcag gtatttccgt cggatacgaa ttattcgtac ggccggccac tagtggcact 6600 ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct 6660 tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 6720 ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atgctagagc agcttgagct tggatcagat 6780 tgtcgtttcc cgccttcagt ttaaactatc agtgtttgac aggatatatt ggcgggtaaa 6840 cctaagagaa aagagcgttt a 6861 <210> 32 <211> 5555 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cassette 1008 <400> 32 ctagcagaag gcatgttgtt gtgactccga ggggttgcct caaactctat cttataaccg 60 gcgtggaggc atggaggcaa gggcattttg gtaatttaag tagttagtgg aaaatgacgt 120 catttactta aagacgaagt cttgcgacaa ggggggccca cgccgaattt taatattacc 180 ggcgtggccc caccttatcg cgagtgcttt agcacgagcg gtccagattt aaagtagaaa 240 agttcccgcc cactagggtt aaaggtgttc acactataaa agcatatacg atgtgatggt 300 atttgataaa gcgtatattg tatcaggtat ttccgtcgga tacgaattat tcgtacaagc 360 ttcttaagcc ggtcaacatg gtggagcacg acacacttgt ctactccaaa aatatcaaag 420 atacagtctc agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa 480 acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg 540 aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct 600 ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 660 acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca 720 cacttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gcaattgaga 780 cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc 840 actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata 900 aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac 960 ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt 1020 gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc 1080 cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggta ttaaaatctt aataggtttt 1140 gataaaagcg aacgtgggga aacccgaacc aaaccttctt ctaaactctc tctcatctct 1200 cttaaagcaa acttctctct tgtctttctt gcgtgagcga tcttcaacgt tgtcagatcg 1260 tgcttcggca ccagtacaac gttttctttc actgaagcga aatcaaagat ctctttgtgg 1320 acacgtagtg cggcgccatt aaataacgtg tacttgtcct attcttgtcg gtgtggtctt 1380 gggaaaagaa agcttgctgg aggctgctgt tcagccccat acattacttg ttacgattct 1440 gctgactttc ggcgggtgca atatctctac ttctgcttga cgaggtattg ttgcctgtac 1500 ttctttcttc ttcttcttgc tgattggttc tataagaaat ctagtatttt ctttgaaaca 1560 gagttttccc gtggttttcg aacttggaga aagattgtta agcttctgta tattctgccc 1620 aaatttgtcg ggcccatggc gaaaaacgtt gcgattttcg gcttattgtt ttctcttctt 1680 gtgttggttc cttctcagat cttcgccgat cgaatctgca ctggaataac atcgtcaaac 1740 tcaccacatg tcgtcaaaac tgctactcaa ggggaggtca atgtgactgg tgtaatacca 1800 ctgacaacaa cacccaccaa atctcatttt gcaaatctca aaggaacaga aaccaggggg 1860 aaactatgcc caaaatgcct caactgcaca gatctggacg tagccttggg cagaccaaaa 1920 tgcacgggga aaataccctc ggcaagagtt tcaatactcc atgaagtcag acctgttaca 1980 tctgggtgct ttcctataat gcacgacaga acaaaaatta gacagctgcc taaccttctc 2040 cgaggatacg aacatatcag gttatcaacc cataacgtta tcaatgcaga aaatgcacca 2100 ggaggaccct acaaaattgg aacctcaggg tcttgcccta acattaccaa tggaaacgga 2160 tttttcgcaa caatggcttg ggccgtccca aaaaacgaca aaaacaaaac agcaacaaat 2220 ccattaacaa tagaagtacc atacatttgt acagaaggag aagaccaaat taccgtttgg 2280 gggttccact ctgacaacga gacccaaatg gcaaagctct atggggactc aaagccccag 2340 aagttcacct catctgccaa cggagtgacc acacattacg tttcacagat tggtggcttc 2400 ccaaatcaaa cagaagacgg aggactacca caaagtggta gaattgttgt tgattacatg 2460 gtgcaaaaat ctgggaaaac aggaacaatt acctatcaaa ggggtatttt attgcctcaa 2520 aaggtgtggt gcgcaagtgg caggagcaag gtaataaaag gatccttgcc tttaattgga 2580 gaagcagatt gcctccacga aaaatacggt ggattaaaca aaagcaagcc ttactacaca 2640 ggggaacatg caaaggccat aggaaattgc ccaatatggg tgaaaacacc cttgaagctg 2700 gccaatggaa ccaaatatag acctcctgca aaactattaa aggaaagggg tttcttcgga 2760 gctattgctg gtttcttaga aggaggatgg gaaggaatga ttgcaggttg gcacggatac 2820 acatcccatg gggcacatgg agtagcggtg gcagcagacc ttaagagcac tcaagaggcc 2880 ataaacaaga taacaaaaaa tctcaactct ttgagtgagc tggaagtaaa gaatcttcaa 2940 agactaagcg gtgccatgga tgaactccac aacgaaatac tagaactaga tgagaaagtg 3000 gatgatctca gagctgatac aataagctca caaatagaac tcgcagtcct gctttccaat 3060 gaaggaataa taaacagtga agatgaacat ctcttggcgc ttgaaagaaa gctgaagaaa 3120 atgctgggcc cctctgctgt agagataggg aatggatgct ttgaaaccaa acacaagtgc 3180 aaccagacct gtctcgacag aatagctgct ggtacctttg atgcaggaga attttctctc 3240 cccacctttg attcactgaa tattactgct gcatctttaa atgacgatgg attggataat 3300 catactatac tgctttacta ctcaactgct gcctccagtt tggctgtaac actgatgata 3360 gctatctttg ttgtttatat ggtctccaga gacaatgttt cttgctccat ctgtctataa 3420 aggcctattt tctttagttt gaatttactg ttattcggtg tgcatttcta tgtttggtga 3480 gcggttttct gtgctcagag tgtgtttatt ttatgtaatt taatttcttt gtgagctcct 3540 gtttagcagg tcgtcccttc agcaaggaca caaaaagatt ttaattttat taaaaaaaaa 3600 aaaaaaaaag accgggaatt cgatatcaag cttatcgacc tgcagatcgt tcaaacattt 3660 ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat 3720 ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga 3780 gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa 3840 tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatctct 3900 agagtctcaa gcttggcgcg gggtaccgag ctcgaattcc gagtgtactt caagtcagtt 3960 ggaaatcaat aaaatgatta ttttatgaat atatttcatt gtgcaagtag atagaaatta 4020 catatgttac ataacacacg aaataaacaa aaaaacacaa tccaaaacaa acaccccaaa 4080 caaaataaca ctatatatat cctcgtatga ggagaggcac gttcagtgac tcgacgattc 4140 ccgagcaaaa aaagtctccc cgtcacacat atagtgggtg acgcaattat cttcaaagta 4200 atccttctgt tgacttgtca ttgataacat ccagtcttcg tcaggattgc aaagaattat 4260 agaagggatc ccacctttta ttttcttctt ttttccatat ttagggttga cagtgaaatc 4320 agactggcaa cctattaatt gcttccacaa tgggacgaac ttgaagggga tgtcgtcgat 4380 gatattatag gtggcgtgtt catcgtagtt ggtgaagtcg atggtcccgt tccagtagtt 4440 gtgtcgcccg agacttctag cccaggtggt ctttccggta cgagttggtc cgcagatgta 4500 gaggctgggg tgtctgaccc cagtccttcc ctcatcctgg ttagatcggc catccactca 4560 aggtcagatt gtgcttgatc gtaggagaca ggatgtatga aagtgtaggc atcgatgctt 4620 acatgatata ggtgcgtctc tctccagttg tgcagatctt cgtggcagcg gagatctgat 4680 tctgtgaagg gcgacacgta ctgctcaggt tgtggaggaa ataatttgtt ggctgaatat 4740 tccagccatt gaagctttgt tgcccattca tgagggaatt cttctttgat catgtcaaga 4800 tactcctcct tagacgttgc agtctggata atagttcgcc atcgtgcgtc agatttgcga 4860 ggagagacct tatgatctcg gaaatctcct ctggttttaa tatctccgtc ctttgatatg 4920 taatcaagga cttgtttaga gtttctagct ggctggatat tagggtgatt tccttcaaaa 4980 tcgaaaaaag aaggatccct aatacaaggt tttttatcaa gctggataag agcatgatag 5040 tgggtagtgc catcttgatg aagctcagaa gcaacaccaa ggaagaaaat aagaaaaggt 5100 gtgagtttct cccagagaaa ctggaataaa tcatctcttt gagatgagca cttggggtag 5160 gtaaggaaaa catatttaga ttggagtctg aagttcttgc tagcagaagg catgttgttg 5220 tgactccgag gggttgcctc aaactctatc ttataaccgg cgtggaggca tggaggcaag 5280 ggcattttgg taatttaagt agttagtgga aaatgacgtc atttacttaa agacgaagtc 5340 ttgcgacaag gggggcccac gccgaatttt aatattaccg gcgtggcccc accttatcgc 5400 gagtgcttta gcacgagcgg tccagattta aagtagaaaa gttcccgccc actagggtta 5460 aaggtgttca cactataaaa gcatatacga tgtgatggta tttgatggag cgtatattgt 5520 atcaggtatt tccgtcggat acgaattatt cgtac 5555 <210> 33 <211> 31 <212> PRT <213> Influenza H6 Teal HK <400> 33 Val Pro Gln Ile Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 1 5 10 15 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 20 25 30 <210> 34 <211> 42 <212> PRT <213> Influenza H7 Eq Prague <400> 34 Val Pro Glu Ala Pro Ala His Lys Gln Leu Thr His His Met Arg Lys 1 5 10 15 Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp 20 25 30 Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 35 40 <210> 35 <211> 31 <212> PRT <213> Influenza H9A HK <400> 35 Val Pro Ala Arg Ser Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 1 5 10 15 Ile Glu Gly Gly Trp Pro Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe 20 25 30 <210> 36 <211> 43 <212> PRT <213> Influenza B Florida <400> 36 Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu 1 5 10 15 Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly 20 25 30 Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr 35 40 <210> 37 <211> 43 <212> PRT <213> Influenza B Malaysia <400> 37 Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu 1 5 10 15 Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly 20 25 30 Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr 35 40 <210> 38 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Construct 1059 1039 plus 1059.r <400> 38 cttcccatcc tccaccagga ggtctatatt tggttccatt ggccagcttc aa 52 <210> 39 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Construct 1039 plus 1059.c <400> 39 caaatataga cctcctggtg gaggatggga aggaatgatt gcaggttggc ac 52 <210> 40 <211> 5504 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cassette 1059 <400> 40 ctagcagaag gcatgttgtt gtgactccga ggggttgcct caaactctat cttataaccg 60 gcgtggaggc atggaggcaa gggcattttg gtaatttaag tagttagtgg aaaatgacgt 120 catttactta aagacgaagt cttgcgacaa ggggggccca cgccgaattt taatattacc 180 ggcgtggccc caccttatcg cgagtgcttt agcacgagcg gtccagattt aaagtagaaa 240 agttcccgcc cactagggtt aaaggtgttc acactataaa agcatatacg atgtgatggt 300 atttgataaa gcgtatattg tatcaggtat ttccgtcgga tacgaattat tcgtacaagc 360 ttcttaagcc ggtcaacatg gtggagcacg acacacttgt ctactccaaa aatatcaaag 420 atacagtctc agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa 480 acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg 540 aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct 600 ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 660 acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca 720 cacttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gcaattgaga 780 cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc 840 actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata 900 aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac 960 ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt 1020 gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc 1080 cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggta ttaaaatctt aataggtttt 1140 gataaaagcg aacgtgggga aacccgaacc aaaccttctt ctaaactctc tctcatctct 1200 cttaaagcaa acttctctct tgtctttctt gcgtgagcga tcttcaacgt tgtcagatcg 1260 tgcttcggca ccagtacaac gttttctttc actgaagcga aatcaaagat ctctttgtgg 1320 acacgtagtg cggcgccatt aaataacgtg tacttgtcct attcttgtcg gtgtggtctt 1380 gggaaaagaa agcttgctgg aggctgctgt tcagccccat acattacttg ttacgattct 1440 gctgactttc ggcgggtgca atatctctac ttctgcttga cgaggtattg ttgcctgtac 1500 ttctttcttc ttcttcttgc tgattggttc tataagaaat ctagtatttt ctttgaaaca 1560 gagttttccc gtggttttcg aacttggaga aagattgtta agcttctgta tattctgccc 1620 aaatttgtcg ggcccatggc gaaaaacgtt gcgattttcg gcttattgtt ttctcttctt 1680 gtgttggttc cttctcagat cttcgccgat cgaatctgca ctggaataac atcgtcaaac 1740 tcaccacatg tcgtcaaaac tgctactcaa ggggaggtca atgtgactgg tgtaatacca 1800 ctgacaacaa cacccaccaa atctcatttt gcaaatctca aaggaacaga aaccaggggg 1860 aaactatgcc caaaatgcct caactgcaca gatctggacg tagccttggg cagaccaaaa 1920 tgcacgggga aaataccctc ggcaagagtt tcaatactcc atgaagtcag acctgttaca 1980 tctgggtgct ttcctataat gcacgacaga acaaaaatta gacagctgcc taaccttctc 2040 cgaggatacg aacatatcag gttatcaacc cataacgtta tcaatgcaga aaatgcacca 2100 ggaggaccct acaaaattgg aacctcaggg tcttgcccta acattaccaa tggaaacgga 2160 tttttcgcaa caatggcttg ggccgtccca aaaaacgaca aaaacaaaac agcaacaaat 2220 ccattaacaa tagaagtacc atacatttgt acagaaggag aagaccaaat taccgtttgg 2280 gggttccact ctgacaacga gacccaaatg gcaaagctct atggggactc aaagccccag 2340 aagttcacct catctgccaa cggagtgacc acacattacg tttcacagat tggtggcttc 2400 ccaaatcaaa cagaagacgg aggactacca caaagtggta gaattgttgt tgattacatg 2460 gtgcaaaaat ctgggaaaac aggaacaatt acctatcaaa ggggtatttt attgcctcaa 2520 aaggtgtggt gcgcaagtgg caggagcaag gtaataaaag gatccttgcc tttaattgga 2580 gaagcagatt gcctccacga aaaatacggt ggattaaaca aaagcaagcc ttactacaca 2640 ggggaacatg caaaggccat aggaaattgc ccaatatggg tgaaaacacc cttgaagctg 2700 gccaatggaa ccaaatatag acctcctggt ggaggatggg aaggaatgat tgcaggttgg 2760 cacggataca catcccatgg ggcacatgga gtagcggtgg cagcagacct taagagcact 2820 caagaggcca taaacaagat aacaaaaaat ctcaactctt tgagtgagct ggaagtaaag 2880 aatcttcaaa gactaagcgg tgccatggat gaactccaca acgaaatact agaactagat 2940 gagaaagtgg atgatctcag agctgataca ataagctcac aaatagaact cgcagtcctg 3000 ctttccaatg aaggaataat aaacagtgaa gatgaacatc tcttggcgct tgaaagaaag 3060 ctgaagaaaa tgctgggccc ctctgctgta gagataggga atggatgctt tgaaaccaaa 3120 cacaagtgca accagacctg tctcgacaga atagctgctg gtacctttga tgcaggagaa 3180 ttttctctcc ccacctttga ttcactgaat attactgctg catctttaaa tgacgatgga 3240 ttggataatc atactatact gctttactac tcaactgctg cctccagttt ggctgtaaca 3300 ctgatgatag ctatctttgt tgtttatatg gtctccagag acaatgtttc ttgctccatc 3360 tgtctataaa ggcctatttt ctttagtttg aatttactgt tattcggtgt gcatttctat 3420 gtttggtgag cggttttctg tgctcagagt gtgtttattt tatgtaattt aatttctttg 3480 tgagctcctg tttagcaggt cgtcccttca gcaaggacac aaaaagattt taattttatt 3540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaga ccgggaattc gatatcaagc ttatcgacct gcagatcgtt 3600 caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 3660 tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 3720 tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 3780 aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac 3840 tagatctcta gagtctcaag cttggcgcgg ggtaccgagc tcgaattccg agtgtacttc 3900 aagtcagttg gaaatcaata aaatgattat tttatgaata tatttcattg tgcaagtaga 3960 tagaaattac atatgttaca taacacacga aataaacaaa aaaacacaat ccaaaacaaa 4020 caccccaaac aaaataacac tatatatatc ctcgtatgag gagaggcacg ttcagtgact 4080 cgacgattcc cgagcaaaaa aagtctcccc gtcacacata tagtgggtga cgcaattatc 4140 ttcaaagtaa tccttctgtt gacttgtcat tgataacatc cagtcttcgt caggattgca 4200 aagaattata gaagggatcc caccttttat tttcttcttt tttccatatt tagggttgac 4260 agtgaaatca gactggcaac ctattaattg cttccacaat gggacgaact tgaaggggat 4320 gtcgtcgatg atattatagg tggcgtgttc atcgtagttg gtgaagtcga tggtcccgtt 4380 ccagtagttg tgtcgcccga gacttctagc ccaggtggtc tttccggtac gagttggtcc 4440 gcagatgtag aggctggggt gtctgacccc agtccttccc tcatcctggt tagatcggcc 4500 atccactcaa ggtcagattg tgcttgatcg taggagacag gatgtatgaa agtgtaggca 4560 tcgatgctta catgatatag gtgcgtctct ctccagttgt gcagatcttc gtggcagcgg 4620 agatctgatt ctgtgaaggg cgacacgtac tgctcaggtt gtggaggaaa taatttgttg 4680 gctgaatatt ccagccattg aagctttgtt gcccattcat gagggaattc ttctttgatc 4740 atgtcaagat actcctcctt agacgttgca gtctggataa tagttcgcca tcgtgcgtca 4800 gatttgcgag gagagacctt atgatctcgg aaatctcctc tggttttaat atctccgtcc 4860 tttgatatgt aatcaaggac ttgtttagag tttctagctg gctggatatt agggtgattt 4920 ccttcaaaat cgaaaaaaga aggatcccta atacaaggtt ttttatcaag ctggataaga 4980 gcatgatagt gggtagtgcc atcttgatga agctcagaag caacaccaag gaagaaaata 5040 agaaaaggtg tgagtttctc ccagagaaac tggaataaat catctctttg agatgagcac 5100 ttggggtagg taaggaaaac atatttagat tggagtctga agttcttgct agcagaaggc 5160 atgttgttgt gactccgagg ggttgcctca aactctatct tataaccggc gtggaggcat 5220 ggaggcaagg gcattttggt aatttaagta gttagtggaa aatgacgtca tttacttaaa 5280 gacgaagtct tgcgacaagg ggggcccacg ccgaatttta atattaccgg cgtggcccca 5340 ccttatcgcg agtgctttag cacgagcggt ccagatttaa agtagaaaag ttcccgccca 5400 ctagggttaa aggtgttcac actataaaag catatacgat gtgatggtat ttgatggagc 5460 gtatattgta tcaggtattt ccgtcggata cgaattattc gtac 5504 <210> 41 <211> 577 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence PDISP/HA influenza B/Brisbane/60/2008 (deleted proteolytic loop) <400> 41 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Ser Ser 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Leu Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser 450 455 460 Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu 465 470 475 480 Gly Pro Ser Ala Val Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His 485 490 495 Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asp 500 505 510 Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala 515 520 525 Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr 530 535 540 Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Ala Val Thr Leu Met Ile Ala Ile 545 550 555 560 Phe Val Val Tyr Met Val Ser Arg Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys 565 570 575 Leu <210> 42 <211> 1707 <212> DNA <213> Influenza H5 A/Indonesia/5/2005 (H5N1) <400> 42 atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60 attggttacc atgcaaacaa ttcaacagag caggttgaca caatcatgga aaagaacgtt 120 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaagct ctgcgatcta 180 gatggagtga agcctctaat tttaagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcgggaac 240 ccaatgtgtg acgaattcat caatgtaccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat 300 ccaaccaatg acctctgtta cccagggagt ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta 360 ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt caaatcatcc ccaaaagttc ttggtccgat 420 catgaagcct catcaggagt tagctcagca tgtccatacc tgggaagtcc ctcctttttt 480 agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtacatacc caacaataaa gaaaagctac 540 aataatacca accaagagga tcttttggta ctgtggggaa ttcaccatcc taatgatgcg 600 gcagagcaga caaggctata tcaaaaccca accacctata tttccattgg gacatcaaca 660 ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720 aggatggagt tcttctggac aattttaaaa cctaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt 840 atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900 ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960 tatgtgaaat caaacagatt agtccttgca acagggctca gaaatagccc tcaaagagag 1020 agcagaagaa aaaagagagg actatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080 cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtgggtac 1140 gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactca 1200 atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa taacttagaa 1260 aggagaatag agaatttaaa caagaagatg gaagacgggt ttctagatgt ctggacttat 1320 aatgccgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgactcaaat 1380 gttaagaacc tctacgacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440 aacggttgtt tcgagttcta tcacaaatgt gataatgaat gtatggaaag tataagaaac 1500 ggaacgtaca actatccgca gtattcagaa gaagcaagat taaaaagaga ggaaataagt 1560 ggggtaaaat tggaatcaat aggaacttac caaatactgt caatttattc aacagtggcg 1620 agttccctag cactggcaat catgatggct ggtctatctt tatggatgtg ctccaatgga 1680 tcgttacaat gcagaatttg catttaa 1707 <210> 43 <211> 1734 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence PDISP/HA influenza B/Brisbane/60/2008 (deleted proteolytic loop) <400> 43 atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60 cagatcttcg ccgatcgaat ctgcactgga ataacatcgt caaactcacc acatgtcgtc 120 aaaactgcta ctcaagggga ggtcaatgtg actggtgtaa taccactgac aacaacaccc 180 accaaatctc attttgcaaa tctcaaagga acagaaacca gggggaaact atgcccaaaa 240 tgcctcaact gcacagatct ggacgtagcc ttgggcagac caaaatgcac ggggaaaata 300 ccctcggcaa gagtttcaat actccatgaa gtcagacctg ttacatctgg gtgctttcct 360 ataatgcacg acagaacaaa aattagacag ctgcctaacc ttctccgagg atacgaacat 420 atcaggttat caacccataa cgttatcaat gcagaaaatg caccaggagg accctacaaa 480 attggaacct cagggtcttg ccctaacatt accaatggaa acggattttt cgcaacaatg 540 gcttgggccg tcccaaaaaa cgacaaaaac aaaacagcaa caaatccatt aacaatagaa 600 gtaccataca tttgtacaga aggagaagac caaattaccg tttgggggtt ccactctgac 660 aacgagaccc aaatggcaaa gctctatggg gactcaaagc cccagaagtt cacctcatct 720 gccaacggag tgaccacaca ttacgtttca cagattggtg gcttcccaaa tcaaacagaa 780 gacggaggac taccacaaag tggtagaatt gttgttgatt acatggtgca aaaatctggg 840 aaaacaggaa caattaccta tcaaaggggt attttattgc ctcaaaaggt gtggtgcgca 900 agtggcagga gcaaggtaat aaaaggatcc ttgcctttaa ttggagaagc agattgcctc 960 cacgaaaaat acggtggatt aaacaaaagc aagccttact acacagggga acatgcaaag 1020 gccataggaa attgcccaat atgggtgaaa acacccttga agctggccaa tggaaccaaa 1080 tatagacctc ctggtggagg atgggaagga atgattgcag gttggcacgg atacacatcc 1140 catggggcac atggagtagc ggtggcagca gaccttaaga gcactcaaga ggccataaac 1200 aagataacaa aaaatctcaa ctctttgagt gagctggaag taaagaatct tcaaagacta 1260 agcggtgcca tggatgaact ccacaacgaa atactagaac tagatgagaa agtggatgat 1320 ctcagagctg atacaataag ctcacaaata gaactcgcag tcctgctttc caatgaagga 1380 ataataaaca gtgaagatga acatctcttg gcgcttgaaa gaaagctgaa gaaaatgctg 1440 ggcccctctg ctgtagagat agggaatgga tgctttgaaa ccaaacacaa gtgcaaccag 1500 acctgtctcg acagaatagc tgctggtacc tttgatgcag gagaattttc tctccccacc 1560 tttgattcac tgaatattac tgctgcatct ttaaatgacg atggattgga taatcatact 1620 atactgcttt actactcaac tgctgcctcc agtttggctg taacactgat gatagctatc 1680 tttgttgttt atatggtctc cagagacaat gtttcttgct ccatctgtct ataa 1734 <210> 44 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H5/Indo cleavage site natural sequence <400> 44 Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gln Arg Glu Ser Arg Arg Lys Lys Arg 1 5 10 15 Gly Leu Phe <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H5/Indo modified cleavage site (TETR) <400> 45 Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gln Thr Glu Thr Arg Gly Leu Phe 1 5 10 15 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H5/Indo modified cleavage site (TETQ) <400> 46 Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gln Thr Glu Thr Gln Gly Leu Phe 1 5 10 15 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H1 cleavage site <400> 47 Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe 1 5 10 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3 cleavage site <400> 48 Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe 1 5 10 <210> 49 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Construct 1462 IF-HAB110.S1+3c <400> 49 Ala Ala Ala Thr Thr Thr Gly Thr Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Ala 1 5 10 15 Thr Gly Ala Ala Gly Gly Cys Ala Ala Thr Ala Ala Thr Thr Gly Thr 20 25 30 Ala Cys Thr Ala Cys Thr Cys Ala Thr Gly Gly Thr Ala Gly 35 40 45 <210> 50 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Construct No. 1462 IF-HAB110.s1-4r <400> 50 actaaagaaa ataggccttt atagacagat ggagcatgaa acgttgtctc tg 52 <210> 51 <211> 1755 <212> DNA <213> Influenza HA B wisconsin <400> 51 atgaaggcaa taattgtact actcatggta gtaacatcca atgcagatcg aatctgcact 60 gggataacat cttcaaactc acctcatgtg gtcaaaacag ctactcaagg ggaggtcaat 120 gtgactggcg tgataccact gacaacaaca ccaacaaaat cttattttgc aaatctcaaa 180 ggaacaagga ccagagggaa actatgcccg gactgtctca actgtacaga tctggatgtg 240 gccttgggca ggccaatgtg tgtggggacc acaccttctg ctaaagcttc aatactccac 300 gaggtcagac ctgttacatc cgggtgcttt cctataatgc acgacagaac aaaaatcagg 360 caactaccca atcttctcag aggatatgaa aatatcaggt tatcaaccca aaacgttatc 420 gatgcagaaa aagcaccagg aggaccctac agacttggaa cctcaggatc ttgccctaac 480 gctaccagta aaatcggatt ttttgcaaca atggcttggg ctgtcccaaa ggacaactac 540 aaaaatgcaa cgaacccact aacagtagaa gtaccataca tttgtacaga aggggaagac 600 caaattactg tttgggggtt ccattcagat aacaaaaccc aaatgaagag cctctatgga 660 gactcaaatc ctcaaaagtt cacctcatct gctaatggag taaccacaca ttatgtttct 720 cagattggcg acttcccaga tcaaacagaa gacggaggac taccacaaag cggcagaatt 780 gttgttgatt acatgatgca aaaacctggg aaaacaggaa caattgtcta tcaaagaggt 840 gttttgttgc ctcaaaaggt gtggtgcgcg agtggcagga gcaaagtaat aaaagggtca 900 ttgcctttaa ttggtgaagc agattgcctt catgaaaaat acggtggatt aaacaaaagc 960 aagccttact acacaggaga acatgcaaaa gccataggaa attgcccaat atgggtaaaa 1020 acacctttga agcttgccaa tggaaccaaa tatagacctc ctgcaaaact attgaaggaa 1080 aggggtttct tcggagctat tgctggtttc ctagaaggag gatgggaagg aatgattgca 1140 ggttggcacg gatacacatc tcacggagca catggagtgg cagtggcggc agaccttaag 1200 agtacacaag aagctataaa taagataaca aaaaatctca attctttgag tgagctagaa 1260 gtaaagaacc ttcaaagact aagtggtgcc atggatgaac tccacaacga aatactcgag 1320 ctggatgaga aagtggatga tctcagagct gacactataa gctcacaaat agaacttgca 1380 gtcttgcttt ccaacgaagg aataataaac agtgaagacg agcatctatt ggcacttgag 1440 agaaaactaa agaaaatgct gggtccctct gctgtagaca taggaaacgg atgcttcgaa 1500 accaaacaca aatgcaacca gacctgctta gacaggatag ctgctggcac ctttaatgca 1560 ggagaatttt ctctccccac ttttgattca ttgaacatta ctgctgcatc tttaaatgat 1620 gatggattgg ataaccatac tatactgctc tattactcaa ctgctgcttc tagtttggct 1680 gtaacattaa tgctagctat ttttattgtt tatatggtct ccagagacaa cgtttcatgc 1740 tccatctgtc tataa 1755 <210> 52 <211> 6745 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Construct 193 <400> 52 tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60 gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga atcccgggct ggtatattta tatgttgtca 120 aataactcaa aaaccataaa agtttaagtt agcaagtgtg tacattttta cttgaacaaa 180 aatattcacc tactactgtt ataaatcatt attaaacatt agagtaaaga aatatggatg 240 ataagaacaa gagtagtgat attttgacaa caattttgtt gcaacatttg agaaaatttt 300 gttgttctct cttttcattg gtcaaaaaca atagagagag aaaaaggaag agggagaata 360 aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420 aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480 taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540 aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600 atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660 taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720 tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780 gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840 acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900 ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960 accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020 gattcccttc aaacacatac aaagagaaga gactaattaa ttaattaatc atcttgagag 1080 aaaatggaac gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140 gatggaggat caggaggtac cacttctccc ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg 1200 actgagtggc ggctacataa cgatgagacg aattcgaatc aagataatcc ccttggtttc 1260 aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta tttaagagat atctcagata cgacaggacg 1320 gaagcttcac tgcacagagt ccttggatct tggacgggag attcggttaa ctatgcagca 1380 tctcgatttt tcggtttcga ccagatcgga tgtacctata gtattcggtt tcgaggagtt 1440 agtatcaccg tttctggagg gtcgcgaact cttcagcatc tctgtgagat ggcaattcgg 1500 tctaagcaag aactgctaca gcttgcccca atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga 1560 tgccctgaag gtactcaaac cttcgaaaaa gaaagcgagt aagttaaaat gcttcttcgt 1620 ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa 1680 tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta attcatttac 1740 ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga agacctgccg 1800 cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac aactttataa 1860 gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt 1920 tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat atcatcccct 1980 ttgataaatg atagtacacc aattaggaag gagcatgctc gcctaggaga ttgtcgtttc 2040 ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2100 cgcgttggga attactagcg cgtgtcgaga cgcgttgttg ttgtgactcc gaggggttgc 2160 ctcaaactct atcttataac cggcgtggag gcatggaggc aggggtattt tggtcatttt 2220 aatagatagt ggaaaatgac gtggaattta cttaaagacg aagtctttgc gacaaggggg 2280 ggcccacgcc gaatttaata ttaccggcgt ggccccccct tatcgcgagt gctttagcac 2340 gagcggtcca gatttaaagt agaaaatttc ccgcccacta gggttaaagg tgttcacact 2400 ataaaagcat atacgatgtg atggtatttg gtcgacaagc ttgcatgccg gtcaacatgg 2460 tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 2520 gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 2580 cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 2640 atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 2700 atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 2760 agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac tccaaaaata 2820 tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa agggtaatat 2880 ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg 2940 aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag 3000 atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 3060 aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 3120 taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 3180 catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga acgtggggaa 3240 acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa cttctctctt 3300 gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac cagtacaacg 3360 ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc ggcgccatta 3420 aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa gcttgctgga 3480 ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg gcgggtgcaa 3540 tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct tcttcttgct 3600 gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg tggttttcga 3660 acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg gcccgcggat 3720 ggcgaaaaac gttgcgattt tcggcttatt gttttctctt cttgtgttgg ttccttctca 3780 gatcttcgcc tgcaggctcc tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc 3840 ctggatctgc tgcccaaact aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt 3900 tccctgagcc agtgacagtg acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct 3960 tcccagctgt cctgcagtct gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca 4020 gcacctggcc cagcgagacc gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg 4080 tggacaagaa aattgtgccc agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag 4140 aagtatcatc tgtcttcatc ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga 4200 ctcctaaggt cacgtgtgtt gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca 4260 gctggtttgt agatgatgtg gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt 4320 tcaacagcac tttccgctca gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg 4380 gcaaggagcg atcgctcacc atcaccatca ccatcaccat caccattaaa ggcctatttt 4440 ctttagtttg aatttactgt tattcggtgt gcatttctat gtttggtgag cggttttctg 4500 tgctcagagt gtgtttattt tatgtaattt aatttctttg tgagctcctg tttagcaggt 4560 cgtcccttca gcaaggacac aaaaagattt taattttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 4620 ccgggaattc gatatcaagc ttatcgacct gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt 4680 ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat 4740 tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt 4800 atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca 4860 aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatctcta gagtctcaag 4920 cttggcgcgc cataaaatga ttattttatg aatatatttc attgtgcaag tagatagaaa 4980 ttacatatgt tacataacac acgaaataaa caaaaaaaga caatccaaaa acaaacaccc 5040 caaaaaaaat aatcacttta gataaactcg tatgaggaga ggcacgttca gtgactcgac 5100 gattcccgag caaaaaaagt ctccccgtca cacatatagt gggtgacgca attatcttta 5160 aagtaatcct tctgttgact tgtcattgat aacatccagt cttcgtcagg attgcaaaga 5220 attatagaag ggatcccacc ttttattttc ttcttttttc catatttagg gttgacagtg 5280 aaatcagact ggcaacctat taattgcttc cacaatggga cgaacttgaa ggggatgtcg 5340 tcgatgatat tataggtggc gtgttcatcg tagttggtga aatcgatggt accgttccaa 5400 tagttgtgtc gtccgagact tctagcccag gtggtctttc cggtacgagt tggtccgcag 5460 atgtagaggc tggggtgtcg gattccattc cttccattgt cctggttaaa tcggccatcc 5520 attcaaggtc agattgagct tgttggtatg agacaggatg tatgtaagta taagcgtcta 5580 tgcttacatg gtatagatgg gtttccctcc aggagtgtag atcttcgtgg cagcgaagat 5640 ctgattctgt gaagggcgac acatacggtt caggttgtgg agggaataat ttgttggctg 5700 aatattccag ccattgaagt tttgttgccc attcatgagg gaattcttcc ttgatcatgt 5760 caagatattc ctccttagac gttgcagtct ggataatagt tctccatcgt gcgtcagatt 5820 tgcgaggaga gaccttatga tctcggaaat ctcctctggt tttaatatct ccgtcctttg 5880 atatgtaatc aaggacttgt ttagagtttc tagctggctg gatattaggg tgatttcctt 5940 caaaatcgaa aaaagaagga tccctaatac aaggtttttt atcaagctgg agaagagcat 6000 gatagtgggt agtgccatct tgatgaagct cagaagcaac accaaggaag aaaataagaa 6060 aaggtgtgag tttctcccag agaaactgga ataaatcatc tctttgagat gagcacttgg 6120 gataggtaag gaaaacatat ttagattgga gtctgaagtt cttactagca gaaggcatgt 6180 tgttgtgact ccgaggggtt gcctcaaact ctatcttata accggcgtgg aggcatggag 6240 gcaggggtat tttggtcatt ttaatagata gtggaaaatg acgtggaatt tacttaaaga 6300 cgaagtcttt gcgacaaggg ggggcccacg ccgaatttaa tattaccggc gtggcccccc 6360 cttatcgcga gtgctttagc acgagcggtc cagatttaaa gtagaaaatt tcccgcccac 6420 tagggttaaa ggtgttcaca ctataaaagc atatacgatg tgatggtatt tgactagtgg 6480 cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc 6540 gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 6600 gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatgcta gagcagcttg agcttggatc 6660 agattgtcgt ttcccgcctt cagtttaaac tatcagtgtt tgacaggata tattggcggg 6720 taaacctaag agaaaagagc gttta 6745 <210> 53 <211> 3495 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cassette 1462 <400> 53 gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60 gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120 ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180 tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240 ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300 acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360 tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420 agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480 aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540 atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600 atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660 tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720 taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780 acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840 cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900 cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960 ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020 gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080 gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140 tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200 tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260 gcccatgaag gcaataattg tactactcat ggtagtaaca tccaatgcag atcgaatctg 1320 cactgggata acatcttcaa actcacctca tgtggtcaaa acagctactc aaggggaggt 1380 caatgtgact ggcgtgatac cactgacaac aacaccaaca aaatcttatt ttgcaaatct 1440 caaaggaaca aggaccagag ggaaactatg cccggactgt ctcaactgta cagatctgga 1500 tgtggccttg ggcaggccaa tgtgtgtggg gaccacacct tctgctaaag cttcaatact 1560 ccacgaggtc agacctgtta catccgggtg ctttcctata atgcacgaca gaacaaaaat 1620 caggcaacta cccaatcttc tcagaggata tgaaaatatc aggttatcaa cccaaaacgt 1680 tatcgatgca gaaaaagcac caggaggacc ctacagactt ggaacctcag gatcttgccc 1740 taacgctacc agtaaaatcg gattttttgc aacaatggct tgggctgtcc caaaggacaa 1800 ctacaaaaat gcaacgaacc cactaacagt agaagtacca tacatttgta cagaagggga 1860 agaccaaatt actgtttggg ggttccattc agataacaaa acccaaatga agagcctcta 1920 tggagactca aatcctcaaa agttcacctc atctgctaat ggagtaacca cacattatgt 1980 ttctcagatt ggcgacttcc cagatcaaac agaagacgga ggactaccac aaagcggcag 2040 aattgttgtt gattacatga tgcaaaaacc tgggaaaaca ggaacaattg tctatcaaag 2100 aggtgttttg ttgcctcaaa aggtgtggtg cgcgagtggc aggagcaaag taataaaagg 2160 gtcattgcct ttaattggtg aagcagattg ccttcatgaa aaatacggtg gattaaacaa 2220 aagcaagcct tactacacag gagaacatgc aaaagccata ggaaattgcc caatatgggt 2280 aaaaacacct ttgaagcttg ccaatggaac caaatataga cctcctgcaa aactattgaa 2340 ggaaaggggt ttcttcggag ctattgctgg tttcctagaa ggaggatggg aaggaatgat 2400 tgcaggttgg cacggataca catctcacgg agcacatgga gtggcagtgg cggcagacct 2460 taagagtaca caagaagcta taaataagat aacaaaaaat ctcaattctt tgagtgagct 2520 agaagtaaag aaccttcaaa gactaagtgg tgccatggat gaactccaca acgaaatact 2580 cgagctggat gagaaagtgg atgatctcag agctgacact ataagctcac aaatagaact 2640 tgcagtcttg ctttccaacg aaggaataat aaacagtgaa gacgagcatc tattggcact 2700 tgagagaaaa ctaaagaaaa tgctgggtcc ctctgctgta gacataggaa acggatgctt 2760 cgaaaccaaa cacaaatgca accagacctg cttagacagg atagctgctg gcacctttaa 2820 tgcaggagaa ttttctctcc ccacttttga ttcattgaac attactgctg catctttaaa 2880 tgatgatgga ttggataacc atactatact gctctattac tcaactgctg cttctagttt 2940 ggctgtaaca ttaatgctag ctatttttat tgtttatatg gtctccagag acaacgtttc 3000 atgctccatc tgtctataaa ggcctatttt ctttagtttg aatttactgt tattcggtgt 3060 gcatttctat gtttggtgag cggttttctg tgctcagagt gtgtttattt tatgtaattt 3120 aatttctttg tgagctcctg tttagcaggt cgtcccttca gcaaggacac aaaaagattt 3180 taattttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaga ccgggaattc gatatcaagc ttatcgacct 3240 gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt 3300 gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa 3360 tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa 3420 tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca 3480 tctatgttac tagat 3495 <210> 54 <211> 584 <212> PRT <213> Influenza B/Wisconsin/1/2010 <400> 54 Met Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn Ala Asp 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys 20 25 30 Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val 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Construct 1467 <400> 57 gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60 gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120 ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180 tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240 ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300 acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360 tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420 agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480 aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540 atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600 atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660 tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720 taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780 acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840 cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900 cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960 ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020 gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080 gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140 tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200 tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260 gcccatgaag gcaataattg tactactcat ggtagtaaca tccaatgcag atcgaatctg 1320 cactgggata acatcttcaa actcacctca tgtggtcaaa acagctactc aaggggaggt 1380 caatgtgact ggcgtgatac cactgacaac aacaccaaca aaatcttatt ttgcaaatct 1440 caaaggaaca aggaccagag ggaaactatg cccggactgt ctcaactgta cagatctgga 1500 tgtggccttg ggcaggccaa tgtgtgtggg gaccacacct tctgctaaag cttcaatact 1560 ccacgaggtc agacctgtta catccgggtg ctttcctata atgcacgaca gaacaaaaat 1620 caggcaacta cccaatcttc tcagaggata tgaaaatatc aggttatcaa cccaaaacgt 1680 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tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc 3420 gcggtgtcat ctatgttact agat 3444 <210> 58 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence HA influenza B/Wisconsin/1/2010 (deleted PL) <400> 58 Met Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn Ala Asp 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys 20 25 30 Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr 35 40 45 Thr Thr Pro Thr Lys Ser Tyr Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Arg Thr 50 55 60 Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asp Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val 65 70 75 80 Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala 85 90 95 Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile 100 105 110 Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly 115 120 125 Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gln Asn Val Ile Asp Ala Glu Lys 130 135 140 Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn 145 150 155 160 Ala 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sequence <220> <223> B cleavage site <400> 59 Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe 1 5 10 <210> 60 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H5/Indo natural cleavage site <400> 60 Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gln Arg Glu Ser Arg Arg Lys Lys Arg 1 5 10 15 Gly Leu Phe <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H5/Indo modified cleavage site <400> 61 Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gln Thr Glu Thr Arg Gly Leu Phe 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H5/Indo modified cleavage site <400> 62 Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gln Thr Glu Thr Gln Gly Leu Phe 1 5 10 15 <210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H1/Brisbane modified cleavage site <400> 63 Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Gln Gly Leu Phe 1 5 10 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H3/Brisbane modified cleavage site <400> 64 Asn Val Pro Glu Ile Gln Thr Gln Gly Ile Phe 1 5 10 <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> B/Florida, B/Brisbane modified cleavage site <400> 65 Pro Ala Ile Leu Leu Asn Ile Gln Gly Phe Phe 1 5 10 <210> 66 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> A/H3/HA0 Consensus <400> 66 Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly 1 5 10 15 Phe Ile Glu <210> 67 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> A/H1/HA0 Consensus <400> 67 Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 1 5 10 15 Phe Ile Glu <210> 68 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> B/HA0 Consensus <400> 68 Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly 1 5 10 15 Phe Leu Glu <210> 69 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H5 Anhui proteolytic loop deletion <400> 69 Ser Pro Leu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 1 5 10 15 <210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H5 Indo proteolytic loop deletion <400> 70 Ser Pro Gln Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 1 5 10 15 <210> 71 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H5 Vietnam proteolytic loop deletion <400> 71 Ser Pro Gln Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 1 5 10 15 <210> 72 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> B Florida proteolytic loop deletion <400> 72 Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Gly Gly Trp Glu 1 5 10 15 Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr 20 25 <210> 73 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> B Malaysia proteolytic loop deletion <400> 73 Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Gly Gly Trp Glu 1 5 10 15 Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr 20 25 <210> 74 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer MutCleavage-H5(Indo).r <400> 74 tagtcctctt gtctctgttt gagggctatt tctgagccct gttgc 45 <210> 75 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer MutCleavage-H5(Indo).c <400> 75 tagccctcaa acagagacaa gaggactatt tggagctata gcagg 45 <210> 76 <211> 3435 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cassette 676 <400> 76 gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60 gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120 ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180 tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240 ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300 acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360 tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420 agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480 aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540 atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600 atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660 tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720 taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780 acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840 cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900 cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960 ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020 gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080 gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140 tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200 tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260 gcccatggag aaaatagtgc ttcttcttgc aatagtcagt cttgttaaaa gtgatcagat 1320 ttgcattggt taccatgcaa acaattcaac agagcaggtt gacacaatca tggaaaagaa 1380 cgttactgtt acacatgccc aagacatact ggaaaagaca cacaacggga agctctgcga 1440 tctagatgga gtgaagcctc taattttaag agattgtagt gtagctggat ggctcctcgg 1500 gaacccaatg tgtgacgaat tcatcaatgt accggaatgg tcttacatag tggagaaggc 1560 caatccaacc aatgacctct gttacccagg gagtttcaac gactatgaag aactgaaaca 1620 cctattgagc agaataaacc attttgagaa aattcaaatc atccccaaaa gttcttggtc 1680 cgatcatgaa gcctcatcag gagttagctc agcatgtcca tacctgggaa gtccctcctt 1740 ttttagaaat gtggtatggc ttatcaaaaa gaacagtaca tacccaacaa taaagaaaag 1800 ctacaataat accaaccaag aggatctttt ggtactgtgg ggaattcacc atcctaatga 1860 tgcggcagag cagacaaggc tatatcaaaa cccaaccacc tatatttcca ttgggacatc 1920 aacactaaac cagagattgg taccaaaaat agctactaga tccaaagtaa acgggcaaag 1980 tggaaggatg gagttcttct ggacaatttt aaaacctaat gatgcaatca acttcgagag 2040 taatggaaat ttcattgctc cagaatatgc atacaaaatt gtcaagaaag gggactcagc 2100 aattatgaaa agtgaattgg aatatggtaa ctgcaacacc aagtgtcaaa ctccaatggg 2160 ggcgataaac tctagtatgc cattccacaa catacaccct ctcaccatcg gggaatgccc 2220 caaatatgtg aaatcaaaca gattagtcct tgcaacaggg ctcagaaata gccctcaaac 2280 agagacaaga ggactatttg gagctatagc aggttttata gagggaggat ggcagggaat 2340 ggtagatggt tggtatgggt accaccatag caatgagcag gggagtgggt acgctgcaga 2400 caaagaatcc actcaaaagg caatagatgg agtcaccaat aaggtcaact caatcattga 2460 caaaatgaac actcagtttg aggccgttgg aagggaattt aataacttag aaaggagaat 2520 agagaattta aacaagaaga tggaagacgg gtttctagat gtctggactt ataatgccga 2580 acttctggtt ctcatggaaa atgagagaac tctagacttt catgactcaa atgttaagaa 2640 cctctacgac aaggtccgac tacagcttag ggataatgca aaggagctgg gtaacggttg 2700 tttcgagttc tatcacaaat gtgataatga atgtatggaa agtataagaa acggaacgta 2760 caactatccg cagtattcag aagaagcaag attaaaaaga gaggaaataa gtggggtaaa 2820 attggaatca ataggaactt accaaatact gtcaatttat tcaacagtgg cgagttccct 2880 agcactggca atcatgatgg ctggtctatc tttatggatg tgctccaatg gatcgttaca 2940 atgcagaatt tgcatttaaa ggcctatttt ctttagtttg aatttactgt tattcggtgt 3000 gcatttctat gtttggtgag cggttttctg tgctcagagt gtgtttattt tatgtaattt 3060 aatttctttg tgagctcctg tttagcaggt cgtcccttca gcaaggacac aaaaagattt 3120 taattttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaga ccgggaattc gatatcaagc ttatcgacct 3180 gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt 3240 gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa 3300 tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa 3360 tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca 3420 tctatgttac tagat 3435 <210> 77 <211> 564 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence influenza A/Indonesia/5/2005 (H5N1) TETR cleavage site mutant. <400> 77 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 130 135 140 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gln Thr Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 340 345 350 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 355 360 365 Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln 370 375 380 Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys 385 390 395 400 Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu 405 410 415 Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp 420 425 430 Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg 435 440 445 Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val 450 455 460 Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe 465 470 475 480 Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn 485 490 495 Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg 500 505 510 Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile 515 520 525 Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met 530 535 540 Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 545 550 555 560 Arg Ile Cys Ile <210> 78 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer H5I505_TETQ.r <400> 78 tccaaatagt ccttgtgtct ctgtttgagg gctatttctg agccctgt 48 <210> 79 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer H5I505_TETQ.c <400> 79 aaatagccct caaacagaga cacaaggact atttggagct atagcagg 48 <210> 80 <211> 3435 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cassette 766 <400> 80 gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60 gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120 ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180 tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240 ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300 acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360 tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420 agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480 aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540 atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600 atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660 tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720 taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780 acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840 cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900 cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960 ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020 gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080 gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140 tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200 tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260 gcccatggag aaaatagtgc ttcttcttgc aatagtcagt cttgttaaaa gtgatcagat 1320 ttgcattggt taccatgcaa acaattcaac agagcaggtt gacacaatca tggaaaagaa 1380 cgttactgtt acacatgccc aagacatact ggaaaagaca cacaacggga agctctgcga 1440 tctagatgga gtgaagcctc taattttaag agattgtagt gtagctggat ggctcctcgg 1500 gaacccaatg tgtgacgaat tcatcaatgt accggaatgg tcttacatag tggagaaggc 1560 caatccaacc aatgacctct gttacccagg gagtttcaac gactatgaag aactgaaaca 1620 cctattgagc agaataaacc attttgagaa aattcaaatc atccccaaaa gttcttggtc 1680 cgatcatgaa gcctcatcag gagttagctc agcatgtcca tacctgggaa gtccctcctt 1740 ttttagaaat gtggtatggc ttatcaaaaa gaacagtaca tacccaacaa taaagaaaag 1800 ctacaataat accaaccaag aggatctttt ggtactgtgg ggaattcacc atcctaatga 1860 tgcggcagag cagacaaggc tatatcaaaa cccaaccacc tatatttcca ttgggacatc 1920 aacactaaac cagagattgg taccaaaaat agctactaga tccaaagtaa acgggcaaag 1980 tggaaggatg gagttcttct ggacaatttt aaaacctaat gatgcaatca acttcgagag 2040 taatggaaat ttcattgctc cagaatatgc atacaaaatt gtcaagaaag gggactcagc 2100 aattatgaaa agtgaattgg aatatggtaa ctgcaacacc aagtgtcaaa ctccaatggg 2160 ggcgataaac tctagtatgc cattccacaa catacaccct ctcaccatcg gggaatgccc 2220 caaatatgtg aaatcaaaca gattagtcct tgcaacaggg ctcagaaata gccctcaaac 2280 agagacacaa ggactatttg gagctatagc aggttttata gagggaggat ggcagggaat 2340 ggtagatggt tggtatgggt accaccatag caatgagcag gggagtgggt acgctgcaga 2400 caaagaatcc actcaaaagg caatagatgg agtcaccaat aaggtcaact caatcattga 2460 caaaatgaac actcagtttg aggccgttgg aagggaattt aataacttag aaaggagaat 2520 agagaattta aacaagaaga tggaagacgg gtttctagat gtctggactt ataatgccga 2580 acttctggtt ctcatggaaa atgagagaac tctagacttt catgactcaa atgttaagaa 2640 cctctacgac aaggtccgac tacagcttag ggataatgca aaggagctgg gtaacggttg 2700 tttcgagttc tatcacaaat gtgataatga atgtatggaa agtataagaa acggaacgta 2760 caactatccg cagtattcag aagaagcaag attaaaaaga gaggaaataa gtggggtaaa 2820 attggaatca ataggaactt accaaatact gtcaatttat tcaacagtgg cgagttccct 2880 agcactggca atcatgatgg ctggtctatc tttatggatg tgctccaatg gatcgttaca 2940 atgcagaatt tgcatttaaa ggcctatttt ctttagtttg aatttactgt tattcggtgt 3000 gcatttctat gtttggtgag cggttttctg tgctcagagt gtgtttattt tatgtaattt 3060 aatttctttg tgagctcctg tttagcaggt cgtcccttca gcaaggacac aaaaagattt 3120 taattttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaga ccgggaattc gatatcaagc ttatcgacct 3180 gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt 3240 gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa 3300 tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa 3360 tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca 3420 tctatgttac tagat 3435 <210> 81 <211> 564 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence influenza A/Indonesia/5/2005 (H5N1) TETQ cleavage site mutant <400> 81 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 130 135 140 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gln Thr Glu Thr Gln Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 340 345 350 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 355 360 365 Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln 370 375 380 Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys 385 390 395 400 Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu 405 410 415 Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp 420 425 430 Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg 435 440 445 Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val 450 455 460 Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe 465 470 475 480 Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn 485 490 495 Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg 500 505 510 Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile 515 520 525 Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met 530 535 540 Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 545 550 555 560 Arg Ile Cys Ile <210> 82 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer H5I505(PrL-).r <400> 82 ctgccatcct ccgccagggc tatttctgag ccctgttgca aggactaatc 50 <210> 83 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer H5I505(PrL-).c <400> 83 gaaatagccc tggcggagga tggcagggaa tggtagatgg ttggtatggg ta 52 <210> 84 <211> 3390 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cassette 928 <400> 84 gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60 gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120 ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180 tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240 ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300 acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360 tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420 agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480 aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540 atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600 atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660 tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720 taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780 acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840 cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900 cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960 ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020 gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080 gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140 tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200 tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260 gcccatggag aaaatagtgc ttcttcttgc aatagtcagt cttgttaaaa gtgatcagat 1320 ttgcattggt taccatgcaa acaattcaac agagcaggtt gacacaatca tggaaaagaa 1380 cgttactgtt acacatgccc aagacatact ggaaaagaca cacaacggga agctctgcga 1440 tctagatgga gtgaagcctc taattttaag agattgtagt gtagctggat ggctcctcgg 1500 gaacccaatg tgtgacgaat tcatcaatgt accggaatgg tcttacatag tggagaaggc 1560 caatccaacc aatgacctct gttacccagg gagtttcaac gactatgaag aactgaaaca 1620 cctattgagc agaataaacc attttgagaa aattcaaatc atccccaaaa gttcttggtc 1680 cgatcatgaa gcctcatcag gagttagctc agcatgtcca tacctgggaa gtccctcctt 1740 ttttagaaat gtggtatggc ttatcaaaaa gaacagtaca tacccaacaa taaagaaaag 1800 ctacaataat accaaccaag aggatctttt ggtactgtgg ggaattcacc atcctaatga 1860 tgcggcagag cagacaaggc tatatcaaaa cccaaccacc tatatttcca ttgggacatc 1920 aacactaaac cagagattgg taccaaaaat agctactaga tccaaagtaa acgggcaaag 1980 tggaaggatg gagttcttct ggacaatttt aaaacctaat gatgcaatca acttcgagag 2040 taatggaaat ttcattgctc cagaatatgc atacaaaatt gtcaagaaag gggactcagc 2100 aattatgaaa agtgaattgg aatatggtaa ctgcaacacc aagtgtcaaa ctccaatggg 2160 ggcgataaac tctagtatgc cattccacaa catacaccct ctcaccatcg gggaatgccc 2220 caaatatgtg aaatcaaaca gattagtcct tgcaacaggg ctcagaaata gccctggcgg 2280 aggatggcag ggaatggtag atggttggta tgggtaccac catagcaatg agcaggggag 2340 tgggtacgct gcagacaaag aatccactca aaaggcaata gatggagtca ccaataaggt 2400 caactcaatc attgacaaaa tgaacactca gtttgaggcc gttggaaggg aatttaataa 2460 cttagaaagg agaatagaga atttaaacaa gaagatggaa gacgggtttc tagatgtctg 2520 gacttataat gccgaacttc tggttctcat ggaaaatgag agaactctag actttcatga 2580 ctcaaatgtt aagaacctct acgacaaggt ccgactacag cttagggata atgcaaagga 2640 gctgggtaac ggttgtttcg agttctatca caaatgtgat aatgaatgta tggaaagtat 2700 aagaaacgga acgtacaact atccgcagta ttcagaagaa gcaagattaa aaagagagga 2760 aataagtggg gtaaaattgg aatcaatagg aacttaccaa atactgtcaa tttattcaac 2820 agtggcgagt tccctagcac tggcaatcat gatggctggt ctatctttat ggatgtgctc 2880 caatggatcg ttacaatgca gaatttgcat ttaaaggcct attttcttta gtttgaattt 2940 actgttattc ggtgtgcatt tctatgtttg gtgagcggtt ttctgtgctc agagtgtgtt 3000 tattttatgt aatttaattt ctttgtgagc tcctgtttag caggtcgtcc cttcagcaag 3060 gacacaaaaa gattttaatt ttattaaaaa aaaaaaaaaa aaagaccggg aattcgatat 3120 caagcttatc gacctgcaga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat 3180 cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta 3240 ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg 3300 caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta 3360 tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat 3390 <210> 85 <211> 549 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence influenza A/Indonesia/5/2005 (H5N1) with deleted proteolytic loop. <400> 85 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 130 135 140 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gly Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 340 345 350 His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr 355 360 365 Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp 370 375 380 Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu 385 390 395 400 Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu 405 410 415 Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu 420 425 430 Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys 435 440 445 Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys 450 455 460 Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Ile Arg 465 470 475 480 Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys 485 490 495 Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln 500 505 510 Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile 515 520 525 Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln 530 535 540 Cys Arg Ile Cys Ile 545 <210> 86 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Construct 1029 IF-S2+S4-B Bris.c <400> 86 tctcagatct tcgccgatcg aatctgcact ggaataacat 40 <210> 87 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Construct 1029 IF-S1a4-B Bris.r <400> 87 actaaagaaa ataggccttt atagacagat ggagcaagaa aca 43 <210> 88 <211> 1758 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized HA B Brisbane gene <400> 88 atgaaggcaa taattgtact actcatggta gtaacatcca atgcagatcg aatctgcact 60 ggaataacat cgtcaaactc accacatgtc gtcaaaactg ctactcaagg ggaggtcaat 120 gtgactggtg taataccact gacaacaaca cccaccaaat ctcattttgc aaatctcaaa 180 ggaacagaaa ccagggggaa actatgccca aaatgcctca actgcacaga tctggacgta 240 gccttgggca gaccaaaatg cacggggaaa ataccctcgg caagagtttc aatactccat 300 gaagtcagac ctgttacatc tgggtgcttt cctataatgc acgacagaac aaaaattaga 360 cagctgccta accttctccg aggatacgaa catatcaggt tatcaaccca taacgttatc 420 aatgcagaaa atgcaccagg aggaccctac aaaattggaa cctcagggtc ttgccctaac 480 attaccaatg gaaacggatt tttcgcaaca atggcttggg ccgtcccaaa aaacgacaaa 540 aacaaaacag caacaaatcc attaacaata gaagtaccat acatttgtac agaaggagaa 600 gaccaaatta ccgtttgggg gttccactct gacaacgaga cccaaatggc aaagctctat 660 ggggactcaa agccccagaa gttcacctca tctgccaacg gagtgaccac acattacgtt 720 tcacagattg gtggcttccc aaatcaaaca gaagacggag gactaccaca aagtggtaga 780 attgttgttg attacatggt gcaaaaatct gggaaaacag gaacaattac ctatcaaagg 840 ggtattttat tgcctcaaaa ggtgtggtgc gcaagtggca ggagcaaggt aataaaagga 900 tccttgcctt taattggaga agcagattgc ctccacgaaa aatacggtgg attaaacaaa 960 agcaagcctt actacacagg ggaacatgca aaggccatag gaaattgccc aatatgggtg 1020 aaaacaccct tgaagctggc caatggaacc aaatatagac ctcctgcaaa actattaaag 1080 gaaaggggtt tcttcggagc tattgctggt ttcttagaag gaggatggga aggaatgatt 1140 gcaggttggc acggatacac atcccatggg gcacatggag tagcggtggc agcagacctt 1200 aagagcactc aagaggccat aaacaagata acaaaaaatc tcaactcttt gagtgagctg 1260 gaagtaaaga atcttcaaag actaagcggt gccatggatg aactccacaa cgaaatacta 1320 gaactagatg agaaagtgga tgatctcaga gctgatacaa taagctcaca aatagaactc 1380 gcagtcctgc tttccaatga aggaataata aacagtgaag atgaacatct cttggcgctt 1440 gaaagaaagc tgaagaaaat gctgggcccc tctgctgtag agatagggaa tggatgcttt 1500 gaaaccaaac acaagtgcaa ccagacctgt ctcgacagaa tagctgctgg tacctttgat 1560 gcaggagaat tttctctccc cacctttgat tcactgaata ttactgctgc atctttaaat 1620 gacgatggat tggataatca tactatactg ctttactact caactgctgc ctccagtttg 1680 gctgtaacac tgatgatagc tatctttgtt gtttatatgg tctccagaga caatgtttct 1740 tgctccatct gtctataa 1758 <210> 89 <211> 3525 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cassette 1029 <400> 89 gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60 gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120 ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180 tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240 ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300 acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360 tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420 agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480 aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540 atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600 atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660 tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720 taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780 acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840 cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900 cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960 ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020 gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080 gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140 tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200 tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260 gcccatggcg aaaaacgttg cgattttcgg cttattgttt tctcttcttg tgttggttcc 1320 ttctcagatc ttcgccgatc gaatctgcac tggaataaca tcgtcaaact caccacatgt 1380 cgtcaaaact gctactcaag gggaggtcaa tgtgactggt gtaataccac tgacaacaac 1440 acccaccaaa tctcattttg caaatctcaa aggaacagaa accaggggga aactatgccc 1500 aaaatgcctc aactgcacag atctggacgt agccttgggc agaccaaaat gcacggggaa 1560 aataccctcg gcaagagttt caatactcca tgaagtcaga cctgttacat ctgggtgctt 1620 tcctataatg cacgacagaa caaaaattag acagctgcct aaccttctcc gaggatacga 1680 acatatcagg ttatcaaccc ataacgttat caatgcagaa aatgcaccag gaggacccta 1740 caaaattgga acctcagggt cttgccctaa cattaccaat ggaaacggat ttttcgcaac 1800 aatggcttgg gccgtcccaa aaaacgacaa aaacaaaaca gcaacaaatc cattaacaat 1860 agaagtacca tacatttgta cagaaggaga agaccaaatt accgtttggg ggttccactc 1920 tgacaacgag acccaaatgg caaagctcta tggggactca aagccccaga agttcacctc 1980 atctgccaac ggagtgacca cacattacgt ttcacagatt ggtggcttcc caaatcaaac 2040 agaagacgga ggactaccac aaagtggtag aattgttgtt gattacatgg tgcaaaaatc 2100 tgggaaaaca ggaacaatta cctatcaaag gggtatttta ttgcctcaaa aggtgtggtg 2160 cgcaagtggc aggagcaagg taataaaagg atccttgcct ttaattggag aagcagattg 2220 cctccacgaa aaatacggtg gattaaacaa aagcaagcct tactacacag gggaacatgc 2280 aaaggccata ggaaattgcc caatatgggt gaaaacaccc ttgaagctgg ccaatggaac 2340 caaatataga cctcctgcaa aactattaaa ggaaaggggt ttcttcggag ctattgctgg 2400 tttcttagaa ggaggatggg aaggaatgat tgcaggttgg cacggataca catcccatgg 2460 ggcacatgga gtagcggtgg cagcagacct taagagcact caagaggcca taaacaagat 2520 aacaaaaaat ctcaactctt tgagtgagct ggaagtaaag aatcttcaaa gactaagcgg 2580 tgccatggat gaactccaca acgaaatact agaactagat gagaaagtgg atgatctcag 2640 agctgataca ataagctcac aaatagaact cgcagtcctg ctttccaatg aaggaataat 2700 aaacagtgaa gatgaacatc tcttggcgct tgaaagaaag ctgaagaaaa tgctgggccc 2760 ctctgctgta gagataggga atggatgctt tgaaaccaaa cacaagtgca accagacctg 2820 tctcgacaga atagctgctg gtacctttga tgcaggagaa ttttctctcc ccacctttga 2880 ttcactgaat attactgctg catctttaaa tgacgatgga ttggataatc atactatact 2940 gctttactac tcaactgctg cctccagttt ggctgtaaca ctgatgatag ctatctttgt 3000 tgtttatatg gtctccagag acaatgtttc ttgctccatc tgtctataaa ggcctatttt 3060 ctttagtttg aatttactgt tattcggtgt gcatttctat gtttggtgag cggttttctg 3120 tgctcagagt gtgtttattt tatgtaattt aatttctttg tgagctcctg tttagcaggt 3180 cgtcccttca gcaaggacac aaaaagattt taattttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 3240 ccgggaattc gatatcaagc ttatcgacct gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt 3300 ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat 3360 tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt 3420 atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca 3480 aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagat 3525 <210> 90 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of PDISP/HA from influenza B/Brisbane/60/2008 <400> 90 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val 35 40 45 Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His 50 55 60 Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Glu Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Lys 65 70 75 80 Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Lys Cys 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Pro Ser Ala Arg Val Ser Ile Leu His Glu Val Arg 100 105 110 Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile 115 120 125 Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly Tyr Glu His Ile Arg Leu Ser 130 135 140 Thr His Asn Val Ile Asn Ala Glu Asn Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Lys 145 150 155 160 Ile Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn Ile Thr Asn Gly Asn Gly Phe 165 170 175 Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro Lys Asn Asp Lys Asn Lys Thr 180 185 190 Ala Thr Asn Pro Leu Thr Ile Glu Val Pro Tyr Ile Cys Thr Glu Gly 195 200 205 Glu Asp Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe His Ser Asp Asn Glu Thr Gln 210 215 220 Met Ala Lys Leu Tyr Gly Asp Ser Lys Pro Gln Lys Phe Thr Ser Ser 225 230 235 240 Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val Ser Gln Ile Gly Gly Phe Pro 245 250 255 Asn Gln Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro Gln Ser Gly Arg Ile Val Val 260 265 270 Asp Tyr Met Val Gln Lys Ser Gly Lys Thr Gly Thr Ile Thr Tyr Gln 275 280 285 Arg Gly Ile Leu Leu Pro Gln Lys Val Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser 290 295 300 Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu 305 310 315 320 His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly 325 330 335 Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro 340 345 350 Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu 355 360 365 Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly 370 375 380 Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala 385 390 395 400 His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile 405 410 415 Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys 420 425 430 Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met Asp Glu Leu His Asn Glu Ile 435 440 445 Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser 450 455 460 Ser Gln Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn 465 470 475 480 Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met 485 490 495 Leu Gly Pro Ser Ala Val Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys 500 505 510 His Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe 515 520 525 Asp Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr 530 535 540 Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp Asn His Thr Ile Leu Leu 545 550 555 560 Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Ala Val Thr Leu Met Ile Ala 565 570 575 Ile Phe Val Val Tyr Met Val Ser Arg Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile 580 585 590 Cys Leu <210> 91 <211> 1734 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of PDISP/HA B Brisbane (PrL-). <400> 91 atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60 cagatcttcg ccgatcgaat ctgcactgga ataacatcgt caaactcacc acatgtcgtc 120 aaaactgcta ctcaagggga ggtcaatgtg actggtgtaa taccactgac aacaacaccc 180 accaaatctc attttgcaaa tctcaaagga acagaaacca gggggaaact atgcccaaaa 240 tgcctcaact gcacagatct ggacgtagcc ttgggcagac caaaatgcac ggggaaaata 300 ccctcggcaa gagtttcaat actccatgaa gtcagacctg ttacatctgg gtgctttcct 360 ataatgcacg acagaacaaa aattagacag ctgcctaacc ttctccgagg atacgaacat 420 atcaggttat caacccataa cgttatcaat gcagaaaatg caccaggagg accctacaaa 480 attggaacct cagggtcttg ccctaacatt accaatggaa acggattttt cgcaacaatg 540 gcttgggccg tcccaaaaaa cgacaaaaac aaaacagcaa caaatccatt aacaatagaa 600 gtaccataca tttgtacaga aggagaagac caaattaccg tttgggggtt ccactctgac 660 aacgagaccc aaatggcaaa gctctatggg gactcaaagc cccagaagtt cacctcatct 720 gccaacggag tgaccacaca ttacgtttca cagattggtg gcttcccaaa tcaaacagaa 780 gacggaggac taccacaaag tggtagaatt gttgttgatt acatggtgca aaaatctggg 840 aaaacaggaa caattaccta tcaaaggggt attttattgc ctcaaaaggt gtggtgcgca 900 agtggcagga gcaaggtaat aaaaggatcc ttgcctttaa ttggagaagc agattgcctc 960 cacgaaaaat acggtggatt aaacaaaagc aagccttact acacagggga acatgcaaag 1020 gccataggaa attgcccaat atgggtgaaa acacccttga agctggccaa tggaaccaaa 1080 tatagacctc ctggtggagg atgggaagga atgattgcag gttggcacgg atacacatcc 1140 catggggcac atggagtagc ggtggcagca gaccttaaga gcactcaaga ggccataaac 1200 aagataacaa aaaatctcaa ctctttgagt gagctggaag taaagaatct tcaaagacta 1260 agcggtgcca tggatgaact ccacaacgaa atactagaac tagatgagaa agtggatgat 1320 ctcagagctg atacaataag ctcacaaata gaactcgcag tcctgctttc caatgaagga 1380 ataataaaca gtgaagatga acatctcttg gcgcttgaaa gaaagctgaa gaaaatgctg 1440 ggcccctctg ctgtagagat agggaatgga tgctttgaaa ccaaacacaa gtgcaaccag 1500 acctgtctcg acagaatagc tgctggtacc tttgatgcag gagaattttc tctccccacc 1560 tttgattcac tgaatattac tgctgcatct ttaaatgacg atggattgga taatcatact 1620 atactgcttt actactcaac tgctgcctcc agtttggctg taacactgat gatagctatc 1680 tttgttgttt atatggtctc cagagacaat gtttcttgct ccatctgtct ataa 1734 <210> 92 <211> 577 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of PDISP/HA B Brisbane (PrL-) <400> 92 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val 35 40 45 Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His 50 55 60 Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Glu Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Lys 65 70 75 80 Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Lys Cys 85 90 95 Thr Gly 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<221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 94 Ile Leu Xaa Ile Tyr Tyr Ser Thr Val Ala Ile Ser Ser Leu Xaa Leu 1 5 10 15 Xaa Xaa Met Leu Ala Gly Xaa Ser Xaa Trp Met Cys Ser 20 25 <210> 95 <211> 1734 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT. <400> 95 atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60 cagatcttcg ccgatcgaat ctgcactgga ataacatcgt caaactcacc acatgtcgtc 120 aaaactgcta ctcaagggga ggtcaatgtg actggtgtaa taccactgac aacaacaccc 180 accaaatctc attttgcaaa tctcaaagga acagaaacca gggggaaact atgcccaaaa 240 tgcctcaact gcacagatct ggacgtagcc ttgggcagac caaaatgcac ggggaaaata 300 ccctcggcaa gagtttcaat actccatgaa gtcagacctg ttacatctgg gtgctttcct 360 ataatgcacg acagaacaaa aattagacag ctgcctaacc ttctccgagg atacgaacat 420 atcaggttat caacccataa cgttatcaat gcagaaaatg caccaggagg accctacaaa 480 attggaacct cagggtcttg ccctaacatt accaatggaa acggattttt cgcaacaatg 540 gcttgggccg tcccaaaaaa cgacaaaaac aaaacagcaa caaatccatt aacaatagaa 600 gtaccataca tttgtacaga aggagaagac caaattaccg tttgggggtt ccactctgac 660 aacgagaccc aaatggcaaa gctctatggg gactcaaagc cccagaagtt cacctcatct 720 gccaacggag tgaccacaca ttacgtttca cagattggtg gcttcccaaa tcaaacagaa 780 gacggaggac taccacaaag tggtagaatt gttgttgatt acatggtgca aaaatctggg 840 aaaacaggaa caattaccta tcaaaggggt attttattgc ctcaaaaggt gtggtgcgca 900 agtggcagga gcaaggtaat aaaaggatcc ttgcctttaa ttggagaagc agattgcctc 960 cacgaaaaat acggtggatt aaacaaaagc aagccttact acacagggga acatgcaaag 1020 gccataggaa attgcccaat atgggtgaaa acacccttga agctggccaa tggaaccaaa 1080 tatagacctc ctggtggagg atgggaagga atgattgcag gttggcacgg atacacatcc 1140 catggggcac atggagtagc ggtggcagca gaccttaaga gcactcaaga ggccataaac 1200 aagataacaa aaaatctcaa ctctttgagt gagctggaag taaagaatct tcaaagacta 1260 agcggtgcca tggatgaact ccacaacgaa atactagaac tagatgagaa agtggatgat 1320 ctcagagctg atacaataag ctcacaaata gaactcgcag tcctgctttc caatgaagga 1380 ataataaaca gtgaagatga acatctcttg gcgcttgaaa gaaagctgaa gaaaatgctg 1440 ggcccctctg ctgtagagat agggaatgga tgctttgaaa ccaaacacaa gtgcaaccag 1500 acctgtctcg acagaatagc tgctggtacc tttgatgcag gagaattttc tctccccacc 1560 tttgattcac tgaatattac tgctgcatct ttaaatgacg atggattgga taattaccag 1620 attttggcga tctattcaac tgtcgccagt tcattggtac tggtagtctc cctgggggca 1680 atcagtttct ggatgtgctc taatgggtct ctacagtgta gaatatgtat ttaa 1734 <210> 96 <211> 577 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT <400> 96 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val 35 40 45 Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His 50 55 60 Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Glu Thr Arg Gly 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ctagccaatc ttctcagagg atatgaaaat 420 atcaggttat caacccaaaa cgttatcgat gcagaaaagg caccaggagg accctacaga 480 cttggaacct caggatcttg ccctaacgct accagtaaaa gcggattttt cgcaacaatg 540 gcttgggctg tcccaaagga caacaacaaa aatgcaacga acccattaac agtagaagta 600 ccatacattt gtgcagaagg ggaagaccaa attactgttt gggggttcca ttcagataac 660 aaaacccaaa tgaagaacct ctatggagac tcaaatcctc aaaagttcac ctcatctgct 720 aatggagtaa ccacacatta tgtttctcag attggcggct tcccagatca aacagaagac 780 ggaggactac cacaaagcgg cagaattgtc gttgattaca tgatgcaaaa acctgggaaa 840 acaggaacaa ttgtctatca aagaggtgtt ttgttgcctc aaaaggtgtg gtgcgcgagt 900 ggcaggagca aagtaataaa agggtccttg cctttaattg gtgaagcaga ttgccttcat 960 gaaaaatacg gtggattaaa caaaagcaag ccttactaca caggagaaca tgcaaaagcc 1020 ataggaaatt gcccaatatg ggtgaaaaca cctttgaagc ttgccaatgg aaccaaatat 1080 agacctcctg gtggaggatg ggaaggaatg attgcaggtt ggcacggata cacatctcac 1140 ggagcacatg gagtggcagt tgctgcagac cttaagagca cacaagaagc tataaacaag 1200 ataacaaaaa atctcaactc tttgagtgag ctagaagtaa agaatcttca aaggctaagt 1260 ggtgccatgg atgaactcca caacgaaata ctcgagctgg atgagaaagt ggatgacctc 1320 agagctgaca ctataagttc acaaatagaa cttgcagtct tgctttccaa cgaaggaata 1380 ataaacagtg aagacgagca tctattggca cttgagagaa aactaaagaa aatgctgggt 1440 ccctctgctg tagacatagg aaatggatgc ttcgaaacca aacacaaatg caaccagacc 1500 tgcttagaca ggatagctgc tggcaccttt aatgcaggag agttttctct ccccactttt 1560 gattcattga acattactgc tgcatcttta aatgatgatg gattggataa ccatactata 1620 ctgctctatt actcaactgc tgcttctagt ttggctgtaa cattgatgct agctattttt 1680 attgtttata tggtctccag agacaacgtt tcatgctcca tctgtctata a 1731 <210> 98 <211> 576 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of PDISP/HA B Massachussetts (PrL-) <400> 98 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val 35 40 45 Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser 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acttcacgaa gtcagacctg ttacatccgg gtgcttccct 360 ataatgcacg acagaacaaa aatcaggcaa ctagccaatc ttctcagagg atatgaaaat 420 atcaggttat caacccaaaa cgttatcgat gcagaaaagg caccaggagg accctacaga 480 cttggaacct caggatcttg ccctaacgct accagtaaaa gcggattttt cgcaacaatg 540 gcttgggctg tcccaaagga caacaacaaa aatgcaacga acccattaac agtagaagta 600 ccatacattt gtgcagaagg ggaagaccaa attactgttt gggggttcca ttcagataac 660 aaaacccaaa tgaagaacct ctatggagac tcaaatcctc aaaagttcac ctcatctgct 720 aatggagtaa ccacacatta tgtttctcag attggcggct tcccagatca aacagaagac 780 ggaggactac cacaaagcgg cagaattgtc gttgattaca tgatgcaaaa acctgggaaa 840 acaggaacaa ttgtctatca aagaggtgtt ttgttgcctc aaaaggtgtg gtgcgcgagt 900 ggcaggagca aagtaataaa agggtccttg cctttaattg gtgaagcaga ttgccttcat 960 gaaaaatacg gtggattaaa caaaagcaag ccttactaca caggagaaca tgcaaaagcc 1020 ataggaaatt gcccaatatg ggtgaaaaca cctttgaagc ttgccaatgg aaccaaatat 1080 agacctcctg gtggaggatg ggaaggaatg attgcaggtt ggcacggata cacatctcac 1140 ggagcacatg gagtggcagt tgctgcagac cttaagagca cacaagaagc tataaacaag 1200 ataacaaaaa atctcaactc tttgagtgag ctagaagtaa agaatcttca aaggctaagt 1260 ggtgccatgg atgaactcca caacgaaata ctcgagctgg atgagaaagt ggatgacctc 1320 agagctgaca ctataagttc acaaatagaa cttgcagtct tgctttccaa cgaaggaata 1380 ataaacagtg aagacgagca tctattggca cttgagagaa aactaaagaa aatgctgggt 1440 ccctctgctg tagacatagg aaatggatgc ttcgaaacca aacacaaatg caaccagacc 1500 tgcttagaca ggatagctgc tggcaccttt aatgcaggag agttttctct ccccactttt 1560 gattcattga acattactgc tgcatcttta aatgatgatg gattggataa ctaccagatt 1620 ttggcgatct attcaactgt cgccagttca ttggtactgg tagtctccct gggggcaatc 1680 agtttctgga tgtgctctaa tgggtctcta cagtgtagaa tatgtattta a 1731 <210> 100 <211> 576 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of PDISP/HA B Massachussetts (PrL-)+H1 California TMCT <400> 100 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val 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Ile Asn Ser Glu 450 455 460 Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly 465 470 475 480 Pro Ser Ala Val Asp Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys 485 490 495 Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala 500 505 510 Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala 515 520 525 Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp Asn Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr 530 535 540 Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val Val Ser Leu Gly Ala Ile 545 550 555 560 Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 570 575 <210> 101 <211> 1704 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of HA B Wisconsin (PrL-). <400> 101 atgaaggcaa taattgtact actcatggta gtaacatcca atgcagatcg aatctgcact 60 gggataacat cttcaaactc acctcatgtg gtcaaaacag ctactcaagg ggaggtcaat 120 gtgactggcg tgataccact gacaacaaca ccaacaaaat cttattttgc aaatctcaaa 180 ggaacaagga ccagagggaa actatgcccg gactgtctca actgtacaga tctggatgtg 240 gccttgggca ggccaatgtg tgtggggacc acaccttctg ctaaagcttc aatactccac 300 gaggtcagac ctgttacatc cgggtgcttt cctataatgc acgacagaac aaaaatcagg 360 caactaccca atcttctcag aggatatgaa aatatcaggt tatcaaccca aaacgttatc 420 gatgcagaaa aagcaccagg aggaccctac agacttggaa cctcaggatc ttgccctaac 480 gctaccagta aaatcggatt ttttgcaaca atggcttggg ctgtcccaaa ggacaactac 540 aaaaatgcaa cgaacccact aacagtagaa gtaccataca tttgtacaga aggggaagac 600 caaattactg tttgggggtt ccattcagat aacaaaaccc aaatgaagag cctctatgga 660 gactcaaatc ctcaaaagtt cacctcatct gctaatggag taaccacaca ttatgtttct 720 cagattggcg acttcccaga tcaaacagaa gacggaggac taccacaaag cggcagaatt 780 gttgttgatt acatgatgca aaaacctggg aaaacaggaa caattgtcta tcaaagaggt 840 gttttgttgc ctcaaaaggt gtggtgcgcg agtggcagga gcaaagtaat aaaagggtca 900 ttgcctttaa ttggtgaagc agattgcctt catgaaaaat acggtggatt aaacaaaagc 960 aagccttact acacaggaga acatgcaaaa gccataggaa attgcccaat atgggtaaaa 1020 acacctttga agcttgccaa tggaaccaaa tatagacctc ctggtggagg atgggaagga 1080 atgattgcag gttggcacgg atacacatct cacggagcac atggagtggc agtggcggca 1140 gaccttaaga gtacacaaga agctataaat aagataacaa aaaatctcaa ttctttgagt 1200 gagctagaag taaagaacct tcaaagacta agtggtgcca tggatgaact ccacaacgaa 1260 atactcgagc tggatgagaa agtggatgat ctcagagctg acactataag ctcacaaata 1320 gaacttgcag tcttgctttc caacgaagga ataataaaca gtgaagacga gcatctattg 1380 gcacttgaga gaaaactaaa gaaaatgctg ggtccctctg ctgtagacat aggaaacgga 1440 tgcttcgaaa ccaaacacaa atgcaaccag acctgcttag acaggatagc tgctggcacc 1500 tttaatgcag gagaattttc tctccccact tttgattcat tgaacattac tgctgcatct 1560 ttaaatgatg atggattgga taaccatact atactgctct attactcaac tgctgcttct 1620 agtttggctg taacattaat gctagctatt tttattgttt atatggtctc cagagacaac 1680 gtttcatgct ccatctgtct ataa 1704 <210> 102 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of HA B Wisconsin (PrL-) <400> 102 Met Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn Ala Asp 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys 20 25 30 Thr Ala Thr Gln Gly 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acaccttctg ctaaagcttc aatactccac 300 gaggtcagac ctgttacatc cgggtgcttt cctataatgc acgacagaac aaaaatcagg 360 caactaccca atcttctcag aggatatgaa aatatcaggt tatcaaccca aaacgttatc 420 gatgcagaaa aagcaccagg aggaccctac agacttggaa cctcaggatc ttgccctaac 480 gctaccagta aaatcggatt ttttgcaaca atggcttggg ctgtcccaaa ggacaactac 540 aaaaatgcaa cgaacccact aacagtagaa gtaccataca tttgtacaga aggggaagac 600 caaattactg tttgggggtt ccattcagat aacaaaaccc aaatgaagag cctctatgga 660 gactcaaatc ctcaaaagtt cacctcatct gctaatggag taaccacaca ttatgtttct 720 cagattggcg acttcccaga tcaaacagaa gacggaggac taccacaaag cggcagaatt 780 gttgttgatt acatgatgca aaaacctggg aaaacaggaa caattgtcta tcaaagaggt 840 gttttgttgc ctcaaaaggt gtggtgcgcg agtggcagga gcaaagtaat aaaagggtca 900 ttgcctttaa ttggtgaagc agattgcctt catgaaaaat acggtggatt aaacaaaagc 960 aagccttact acacaggaga acatgcaaaa gccataggaa attgcccaat atgggtaaaa 1020 acacctttga agcttgccaa tggaaccaaa tatagacctc ctggtggagg atgggaagga 1080 atgattgcag gttggcacgg atacacatct cacggagcac atggagtggc agtggcggca 1140 gaccttaaga gtacacaaga agctataaat aagataacaa aaaatctcaa ttctttgagt 1200 gagctagaag taaagaacct tcaaagacta agtggtgcca tggatgaact ccacaacgaa 1260 atactcgagc tggatgagaa agtggatgat ctcagagctg acactataag ctcacaaata 1320 gaacttgcag tcttgctttc caacgaagga ataataaaca gtgaagacga gcatctattg 1380 gcacttgaga gaaaactaaa gaaaatgctg ggtccctctg ctgtagacat aggaaacgga 1440 tgcttcgaaa ccaaacacaa atgcaaccag acctgcttag acaggatagc tgctggcacc 1500 tttaatgcag gagaattttc tctccccact tttgattcat tgaacattac tgctgcatct 1560 ttaaatgatg atggattgga taactaccag attttggcga tctattcaac tgtcgccagt 1620 tcattggtac tggtagtctc cctgggggca atcagtttct ggatgtgctc taatgggtct 1680 ctacagtgta gaatatgtat ttaa 1704 <210> 104 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMC <400> 104 Met Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn Ala Asp 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys 20 25 30 Thr Ala Thr 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ggacgtagcc ttgggcagac caaaatgcac ggggaaaata 300 ccctcggcaa gagtttcaat actccatgaa gtcagacctg ttacatctgg gtgctttcct 360 ataatgcacg acagaacaaa aattagacag ctgcctaacc ttctccgagg atacgaacat 420 atcaggttat caacccataa cgttatcaat gcagaaaatg caccaggagg accctacaaa 480 attggaacct cagggtcttg ccctaacatt accaatggaa acggattttt cgcaacaatg 540 gcttgggccg tcccaaaaaa cgacaaaaac aaaacagcaa caaatccatt aacaatagaa 600 gtaccataca tttgtacaga aggagaagac caaattaccg tttgggggtt ccactctgac 660 aacgagaccc aaatggcaaa gctctatggg gactcaaagc cccagaagtt cacctcatct 720 gccaacggag tgaccacaca ttacgtttca cagattggtg gcttcccaaa tcaaacagaa 780 gacggaggac taccacaaag tggtagaatt gttgttgatt acatggtgca aaaatctggg 840 aaaacaggaa caattaccta tcaaaggggt attttattgc ctcaaaaggt gtggtgcgca 900 agtggcagga gcaaggtaat aaaaggatcc ttgcctttaa ttggagaagc agattgcctc 960 cacgaaaaat acggtggatt aaacaaaagc aagccttact acacagggga acatgcaaag 1020 gccataggaa attgcccaat atgggtgaaa acacccttga agctggccaa tggaaccaaa 1080 tatagacctc ctggtggagg atgggaagga atgattgcag gttggcacgg atacacatcc 1140 catggggcac atggagtagc ggtggcagca gaccttaaga gcactcaaga ggccataaac 1200 aagataacaa aaaatctcaa ctctttgagt gagctggaag taaagaatct tcaaagacta 1260 agcggtgcca tggatgaact ccacaacgaa atactagaac tagatgagaa agtggatgat 1320 ctcagagctg atacaataag ctcacaaata gaactcgcag tcctgctttc caatgaagga 1380 ataataaaca gtgaagatga acatctcttg gcgcttgaaa gaaagctgaa gaaaatgctg 1440 ggcccctctg ctgtagagat agggaatgga tgctttgaaa ccaaacacaa gtgcaaccag 1500 acctgtctcg acagaatagc tgctggtacc tttgatgcag gagaattttc tctccccacc 1560 tttgattcac tgaatattac tgctgcatct ttaaatgacg atggattgga taattaccag 1620 attttggcga tctattcaac tgtcgccagt tcattggtac tggtagtctc cctgggggca 1680 atcagtttct ggatgtgctc taatgggtct ctacagtgta gaatatgtat ttaa 1734 <210> 106 <211> 577 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of PDISP/HA B Brisbane (PrL-)+H1 California TMCT <400> 106 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp 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attttgcaaa tctcaaagga acaaagacca gagggaaact atgcccagac 240 tgtctcaact gtacagatct ggatgtggcc ctgggcaggc caatgtgtgt gggaactaca 300 ccttctgcga aagcttcaat acttcacgaa gtcagacctg ttacatccgg gtgcttccct 360 ataatgcacg acagaacaaa aatcaggcaa ctagccaatc ttctcagagg atatgaaaat 420 atcaggttat caacccaaaa cgttatcgat gcagaaaagg caccaggagg accctacaga 480 cttggaacct caggatcttg ccctaacgct accagtaaaa gcggattttt cgcaacaatg 540 gcttgggctg tcccaaagga caacaacaaa aatgcaacga acccattaac agtagaagta 600 ccatacattt gtgcagaagg ggaagaccaa attactgttt gggggttcca ttcagataac 660 aaaacccaaa tgaagaacct ctatggagac tcaaatcctc aaaagttcac ctcatctgct 720 aatggagtaa ccacacatta tgtttctcag attggcggct tcccagatca aacagaagac 780 ggaggactac cacaaagcgg cagaattgtc gttgattaca tgatgcaaaa acctgggaaa 840 acaggaacaa ttgtctatca aagaggtgtt ttgttgcctc aaaaggtgtg gtgcgcgagt 900 ggcaggagca aagtaataaa agggtccttg cctttaattg gtgaagcaga ttgccttcat 960 gaaaaatacg gtggattaaa caaaagcaag ccttactaca caggagaaca tgcaaaagcc 1020 ataggaaatt gcccaatatg ggtgaaaaca cctttgaagc ttgccaatgg aaccaaatat 1080 agacctcctg gtggaggatg ggaaggaatg attgcaggtt ggcacggata cacatctcac 1140 ggagcacatg gagtggcagt tgctgcagac cttaagagca cacaagaagc tataaacaag 1200 ataacaaaaa atctcaactc tttgagtgag ctagaagtaa agaatcttca aaggctaagt 1260 ggtgccatgg atgaactcca caacgaaata ctcgagctgg atgagaaagt ggatgacctc 1320 agagctgaca ctataagttc acaaatagaa cttgcagtct tgctttccaa cgaaggaata 1380 ataaacagtg aagacgagca tctattggca cttgagagaa aactaaagaa aatgctgggt 1440 ccctctgctg tagacatagg aaatggatgc ttcgaaacca aacacaaatg caaccagacc 1500 tgcttagaca ggatagctgc tggcaccttt aatgcaggag agttttctct ccccactttt 1560 gattcattga acattactgc tgcatcttta aatgatgatg gattggataa ccatactata 1620 ctgctctatt actcaactgc tgcttctagt ttggctgtaa cattgatgct agctattttt 1680 attgtttata tggtctccag agacaacgtt tcatgctcca tctgtctata a 1731 <210> 108 <211> 576 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of PDISP/HA B Massachussetts (PrL-) <400> 108 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu 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aaaacagcta ctcaagggga ggtcaatgtg actggtgtga taccactaac aacaacacca 180 acaaaatctt attttgcaaa tctcaaagga acaaagacca gagggaaact atgcccagac 240 tgtctcaact gtacagatct ggatgtggcc ctgggcaggc caatgtgtgt gggaactaca 300 ccttctgcga aagcttcaat acttcacgaa gtcagacctg ttacatccgg gtgcttccct 360 ataatgcacg acagaacaaa aatcaggcaa ctagccaatc ttctcagagg atatgaaaat 420 atcaggttat caacccaaaa cgttatcgat gcagaaaagg caccaggagg accctacaga 480 cttggaacct caggatcttg ccctaacgct accagtaaaa gcggattttt cgcaacaatg 540 gcttgggctg tcccaaagga caacaacaaa aatgcaacga acccattaac agtagaagta 600 ccatacattt gtgcagaagg ggaagaccaa attactgttt gggggttcca ttcagataac 660 aaaacccaaa tgaagaacct ctatggagac tcaaatcctc aaaagttcac ctcatctgct 720 aatggagtaa ccacacatta tgtttctcag attggcggct tcccagatca aacagaagac 780 ggaggactac cacaaagcgg cagaattgtc gttgattaca tgatgcaaaa acctgggaaa 840 acaggaacaa ttgtctatca aagaggtgtt ttgttgcctc aaaaggtgtg gtgcgcgagt 900 ggcaggagca aagtaataaa agggtccttg cctttaattg gtgaagcaga ttgccttcat 960 gaaaaatacg gtggattaaa caaaagcaag ccttactaca caggagaaca tgcaaaagcc 1020 ataggaaatt gcccaatatg ggtgaaaaca cctttgaagc ttgccaatgg aaccaaatat 1080 agacctcctg gtggaggatg ggaaggaatg attgcaggtt ggcacggata cacatctcac 1140 ggagcacatg gagtggcagt tgctgcagac cttaagagca cacaagaagc tataaacaag 1200 ataacaaaaa atctcaactc tttgagtgag ctagaagtaa agaatcttca aaggctaagt 1260 ggtgccatgg atgaactcca caacgaaata ctcgagctgg atgagaaagt ggatgacctc 1320 agagctgaca ctataagttc acaaatagaa cttgcagtct tgctttccaa cgaaggaata 1380 ataaacagtg aagacgagca tctattggca cttgagagaa aactaaagaa aatgctgggt 1440 ccctctgctg tagacatagg aaatggatgc ttcgaaacca aacacaaatg caaccagacc 1500 tgcttagaca ggatagctgc tggcaccttt aatgcaggag agttttctct ccccactttt 1560 gattcattga acattactgc tgcatcttta aatgatgatg gattggataa ctaccagatt 1620 ttggcgatct attcaactgt cgccagttca ttggtactgg tagtctccct gggggcaatc 1680 agtttctgga tgtgctctaa tgggtctcta cagtgtagaa tatgtattta a 1731 <210> 110 <211> 576 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of 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gggataacat cttcaaactc acctcatgtg gtcaaaacag ctactcaagg ggaggtcaat 120 gtgactggcg tgataccact gacaacaaca ccaacaaaat cttattttgc aaatctcaaa 180 ggaacaagga ccagagggaa actatgcccg gactgtctca actgtacaga tctggatgtg 240 gccttgggca ggccaatgtg tgtggggacc acaccttctg ctaaagcttc aatactccac 300 gaggtcagac ctgttacatc cgggtgcttt cctataatgc acgacagaac aaaaatcagg 360 caactaccca atcttctcag aggatatgaa aatatcaggt tatcaaccca aaacgttatc 420 gatgcagaaa aagcaccagg aggaccctac agacttggaa cctcaggatc ttgccctaac 480 gctaccagta aaatcggatt ttttgcaaca atggcttggg ctgtcccaaa ggacaactac 540 aaaaatgcaa cgaacccact aacagtagaa gtaccataca tttgtacaga aggggaagac 600 caaattactg tttgggggtt ccattcagat aacaaaaccc aaatgaagag cctctatgga 660 gactcaaatc ctcaaaagtt cacctcatct gctaatggag taaccacaca ttatgtttct 720 cagattggcg acttcccaga tcaaacagaa gacggaggac taccacaaag cggcagaatt 780 gttgttgatt acatgatgca aaaacctggg aaaacaggaa caattgtcta tcaaagaggt 840 gttttgttgc ctcaaaaggt gtggtgcgcg agtggcagga gcaaagtaat aaaagggtca 900 ttgcctttaa ttggtgaagc agattgcctt catgaaaaat acggtggatt aaacaaaagc 960 aagccttact acacaggaga acatgcaaaa gccataggaa attgcccaat atgggtaaaa 1020 acacctttga agcttgccaa tggaaccaaa tatagacctc ctggtggagg atgggaagga 1080 atgattgcag gttggcacgg atacacatct cacggagcac atggagtggc agtggcggca 1140 gaccttaaga gtacacaaga agctataaat aagataacaa aaaatctcaa ttctttgagt 1200 gagctagaag taaagaacct tcaaagacta agtggtgcca tggatgaact ccacaacgaa 1260 atactcgagc tggatgagaa agtggatgat ctcagagctg acactataag ctcacaaata 1320 gaacttgcag tcttgctttc caacgaagga ataataaaca gtgaagacga gcatctattg 1380 gcacttgaga gaaaactaaa gaaaatgctg ggtccctctg ctgtagacat aggaaacgga 1440 tgcttcgaaa ccaaacacaa atgcaaccag acctgcttag acaggatagc tgctggcacc 1500 tttaatgcag gagaattttc tctccccact tttgattcat tgaacattac tgctgcatct 1560 ttaaatgatg atggattgga taaccatact atactgctct attactcaac tgctgcttct 1620 agtttggctg taacattaat gctagctatt tttattgttt atatggtctc cagagacaac 1680 gtttcatgct ccatctgtct ataa 1704 <210> 112 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of HA B Wisconsin (PrL-) <400> 112 Met Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn Ala Asp 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys 20 25 30 Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr 35 40 45 Thr Thr Pro Thr Lys Ser Tyr Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Arg Thr 50 55 60 Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asp Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val 65 70 75 80 Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala 85 90 95 Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile 100 105 110 Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly 115 120 125 Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gln Asn Val Ile Asp Ala Glu Lys 130 135 140 Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn 145 150 155 160 Ala Thr Ser Lys Ile Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro 165 170 175 Lys Asp Asn Tyr Lys Asn Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu Val Pro 180 185 190 Tyr Ile Cys Thr Glu Gly Glu Asp 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cttcaaactc acctcatgtg gtcaaaacag ctactcaagg ggaggtcaat 120 gtgactggcg tgataccact gacaacaaca ccaacaaaat cttattttgc aaatctcaaa 180 ggaacaagga ccagagggaa actatgcccg gactgtctca actgtacaga tctggatgtg 240 gccttgggca ggccaatgtg tgtggggacc acaccttctg ctaaagcttc aatactccac 300 gaggtcagac ctgttacatc cgggtgcttt cctataatgc acgacagaac aaaaatcagg 360 caactaccca atcttctcag aggatatgaa aatatcaggt tatcaaccca aaacgttatc 420 gatgcagaaa aagcaccagg aggaccctac agacttggaa cctcaggatc ttgccctaac 480 gctaccagta aaatcggatt ttttgcaaca atggcttggg ctgtcccaaa ggacaactac 540 aaaaatgcaa cgaacccact aacagtagaa gtaccataca tttgtacaga aggggaagac 600 caaattactg tttgggggtt ccattcagat aacaaaaccc aaatgaagag cctctatgga 660 gactcaaatc ctcaaaagtt cacctcatct gctaatggag taaccacaca ttatgtttct 720 cagattggcg acttcccaga tcaaacagaa gacggaggac taccacaaag cggcagaatt 780 gttgttgatt acatgatgca aaaacctggg aaaacaggaa caattgtcta tcaaagaggt 840 gttttgttgc ctcaaaaggt gtggtgcgcg agtggcagga gcaaagtaat aaaagggtca 900 ttgcctttaa ttggtgaagc agattgcctt catgaaaaat acggtggatt aaacaaaagc 960 aagccttact acacaggaga acatgcaaaa gccataggaa attgcccaat atgggtaaaa 1020 acacctttga agcttgccaa tggaaccaaa tatagacctc ctggtggagg atgggaagga 1080 atgattgcag gttggcacgg atacacatct cacggagcac atggagtggc agtggcggca 1140 gaccttaaga gtacacaaga agctataaat aagataacaa aaaatctcaa ttctttgagt 1200 gagctagaag taaagaacct tcaaagacta agtggtgcca tggatgaact ccacaacgaa 1260 atactcgagc tggatgagaa agtggatgat ctcagagctg acactataag ctcacaaata 1320 gaacttgcag tcttgctttc caacgaagga ataataaaca gtgaagacga gcatctattg 1380 gcacttgaga gaaaactaaa gaaaatgctg ggtccctctg ctgtagacat aggaaacgga 1440 tgcttcgaaa ccaaacacaa atgcaaccag acctgcttag acaggatagc tgctggcacc 1500 tttaatgcag gagaattttc tctccccact tttgattcat tgaacattac tgctgcatct 1560 ttaaatgatg atggattgga taactaccag attttggcga tctattcaac tgtcgccagt 1620 tcattggtac tggtagtctc cctgggggca atcagtttct ggatgtgctc taatgggtct 1680 ctacagtgta gaatatgtat ttaa 1704 <210> 114 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of HA B Wisconsin (PrL-)+H1 California TMC. <400> 114 Met Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn Ala Asp 1 5 10 15 Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys 20 25 30 Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr 35 40 45 Thr Thr Pro Thr Lys Ser Tyr Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Arg Thr 50 55 60 Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asp Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val 65 70 75 80 Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala 85 90 95 Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile 100 105 110 Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly 115 120 125 Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gln Asn Val Ile Asp Ala Glu Lys 130 135 140 Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn 145 150 155 160 Ala Thr Ser Lys Ile Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro 165 170 175 Lys Asp Asn Tyr Lys Asn Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu Val Pro 180 185 190 Tyr Ile Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe His 195 200 205 Ser Asp Asn Lys Thr Gln Met Lys Ser Leu Tyr Gly Asp Ser Asn Pro 210 215 220 Gln Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val Ser 225 230 235 240 Gln Ile Gly Asp Phe Pro Asp Gln Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro Gln 245 250 255 Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Met Gln Lys Pro Gly Lys Thr 260 265 270 Gly Thr Ile Val Tyr Gln Arg Gly Val Leu Leu Pro Gln Lys Val Trp 275 280 285 Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Ile 290 295 300 Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser 305 310 315 320 Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro 325 330 335 Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg 340 345 350 Pro Pro Gly Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr 355 360 365 Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu Ser 385 390 395 400 Glu Leu Glu Val Lys Asn 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atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaagct ctgcgatcta 180 gatggagtga agcctctaat tttaagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcgggaac 240 ccaatgtgtg acgaattcat caatgtaccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat 300 ccaaccaatg acctctgtta cccagggagt ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta 360 ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt caaatcatcc ccaaaagttc ttggtccgat 420 catgaagcct catcaggagt tagctcagca tgtccatacc tgggaagtcc ctcctttttt 480 agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtacatacc caacaataaa gaaaagctac 540 aataatacca accaagagga tcttttggta ctgtggggaa ttcaccatcc taatgatgcg 600 gcagagcaga caaggctata tcaaaaccca accacctata tttccattgg gacatcaaca 660 ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720 aggatggagt tcttctggac aattttaaaa cctaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt 840 atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900 ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960 tatgtgaaat caaacagatt agtccttgca acagggctca gaaatagccc tcaaagagag 1020 agcagaagaa aaaagagagg actatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080 cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtgggtac 1140 gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactca 1200 atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa taacttagaa 1260 aggagaatag agaatttaaa caagaagatg gaagacgggt ttctagatgt ctggacttat 1320 aatgccgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgactcaaat 1380 gttaagaacc tctacgacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440 aacggttgtt tcgagttcta tcacaaatgt gataatgaat gtatggaaag tataagaaac 1500 ggaacgtaca actatccgca gtattcagaa gaagcaagat taaaaagaga ggaaataagt 1560 ggggtaaaat tggaatcaat aggaacttac caaatactgt caatttattc aacagtggcg 1620 agttccctag cactggcaat catgatggct ggtctatctt tatggatgtg ctccaatgga 1680 tcgttacaat gcagaatttg catttaa 1707 <210> 116 <211> 568 <212> PRT <213> Influenza H5 Indonesia <400> 116 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 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Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gln Arg Glu Ser Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 340 345 350 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 355 360 365 Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 370 375 380 Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser 385 390 395 400 Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe 405 410 415 Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 420 425 430 Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 435 440 445 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 450 455 460 Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 465 470 475 480 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 485 490 495 Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala 500 505 510 Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly 515 520 525 Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala 530 535 540 Leu Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly 545 550 555 560 Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 117 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Construct 1800 IF**(SacII)-PDI.s1+4c <400> 117 acagggccca ataccgcgga gaaaatggcg aaaaacgttg cgattttcgg ct 52 <210> 118 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Construct 1800 IF-H3V36111.s1-4r <400> 118 actaaagaaa ataggccttc aaatgcaaat gttgcaccta atgttgccct t 51 <210> 119 <211> 1725 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of PDISP/H3 Victoria. <400> 119 atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60 cagatcttcg cccaaaaact tcctggaaat gacaacagca cggcaacgct gtgccttggg 120 caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgacca aattgaagtt 180 actaatgcta ctgagctggt tcagaattcc tcaataggtg aaatatgcga cagtcctcat 240 cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 300 gatggcttcc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gaagcaaagc ctacagcaac 360 tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420 acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagt 480 tctgcttgca taaggagatc taataatagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540 ttaaacttca aatacccagc attgaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600 ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgct 660 caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720 atcggatcta gacccagaat aaggaatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780 gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840 tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900 tgcaattctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960 gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020 gcaacaggaa tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatagcg 1080 ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1140 aattctgagg gaagaggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1200 atcaatggga agctgaatcg attgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1260 aaagaattct cagaagtcga agggagaatt caggaccttg agaaatatgt tgaggacact 1320 aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1380 attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactaagg 1440 gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1500 tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacagaga tgaagcatta 1560 aacaaccggt tccagatcaa gggagttgag ctgaagtcag ggtacaaaga ttggatccta 1620 tggatttcct ttgccatatc atgttttttg ctttgtgttg ctttgttggg gttcatcatg 1680 tgggcctgcc aaaagggcaa cattaggtgc aacatttgca tttga 1725 <210> 120 <211> 4644 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Construct 2171 <400> 120 tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60 gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga atcccgggct ggtatattta tatgttgtca 120 aataactcaa aaaccataaa agtttaagtt agcaagtgtg tacattttta cttgaacaaa 180 aatattcacc tactactgtt ataaatcatt attaaacatt agagtaaaga aatatggatg 240 ataagaacaa gagtagtgat attttgacaa caattttgtt gcaacatttg agaaaatttt 300 gttgttctct cttttcattg gtcaaaaaca atagagagag aaaaaggaag agggagaata 360 aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420 aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480 taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540 aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600 atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660 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aactgctaca gcttgcccca atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga 1560 tgccctgaag gtactcaaac cttcgaaaaa gaaagcgagt aagttaaaat gcttcttcgt 1620 ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa 1680 tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta attcatttac 1740 ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga agacctgccg 1800 cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac aactttataa 1860 gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt 1920 tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat atcatcccct 1980 ttgataaatg atagtacacc aattaggaag gagcatgctc gcctaggaga ttgtcgtttc 2040 ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2100 cgcgttggga attactagcg cgtgtcgaca agcttgcatg ccggtcaaca tggtggagca 2160 cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 2220 tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 2280 ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 2340 cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 2400 cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 2460 ggattgatgt gataacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga 2520 tacagtctca gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa 2580 cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga 2640 aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc 2700 tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga 2760 cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga 2820 tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca 2880 tttggagagg tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa 2940 ccaaaccttc ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc 3000 ttgcgtgagc gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca gggcccaata 3060 ccgcggagaa aatggcgaaa aacgttgcga ttttcggctt attgttttct cttcttgtgt 3120 tggttccttc tcagatcttc gcgacgtcac tcctcagcca aaacgacacc cccatctgtc 3180 tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa actaactcca tggtgaccct gggatgcctg 3240 gtcaagggct atttccctga gccagtgaca gtgacctgga actctggatc cctgtccagc 3300 ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag tctgacctct acactctgag cagctcagtg 3360 actgtcccct ccagcacctg gcccagcgag accgtcacct gcaacgttgc ccacccggcc 3420 agcagcacca aggtggacaa gaaaattgtg cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata 3480 tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc 3540 accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc 3600 gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat gtggaggtgc acacagctca gacgcaaccc 3660 cgggaggagc agttcaacag cactttccgc tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag 3720 gactggctca atggcaagga gacgtccaga ttttggcgat ctattcaact gtcgccagtt 3780 cattggtact ggtagtctcc ctgggggcaa tcagtttctg gatgtgctct aatgggtctc 3840 tacagtgtag aatatgtatt taaaggccta ttttctttag tttgaattta ctgttattcg 3900 gtgtgcattt ctatgtttgg tgagcggttt tctgtgctca gagtgtgttt attttatgta 3960 atttaatttc tttgtgagct cctgtttagc aggtcgtccc ttcagcaagg acacaaaaag 4020 attttaattt tattaaaaaa aaaaaaaaaa aagaccggga attcgatatc aagcttatcg 4080 acctgcagat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg 4140 tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat 4200 gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat 4260 ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt 4320 gtcatctatg ttactagatc tctagagtct caagcttggc gcgcccacgt gactagtggc 4380 actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 4440 ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 4500 cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatgctag agcagcttga gcttggatca 4560 gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt gacaggatat attggcgggt 4620 aaacctaaga gaaaagagcg ttta 4644 <210> 121 <211> 3129 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Construct 1800 <400> 121 gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60 gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120 ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180 tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240 ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300 acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360 tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420 agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480 aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540 atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600 atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660 tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720 taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780 acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840 cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900 cagtacaggg cccaataccg cggagaaaat ggcgaaaaac gttgcgattt tcggcttatt 960 gttttctctt cttgtgttgg ttccttctca gatcttcgcc caaaaacttc ctggaaatga 1020 caacagcacg gcaacgctgt gccttgggca ccatgcagta ccaaacggaa cgatagtgaa 1080 aacaatcacg aatgaccaaa ttgaagttac taatgctact gagctggttc agaattcctc 1140 aataggtgaa atatgcgaca gtcctcatca gatccttgat ggagaaaact gcacactaat 1200 agatgctcta ttgggagacc ctcagtgtga tggcttccaa aataagaaat gggacctttt 1260 tgttgaacga agcaaagcct acagcaactg ttacccttat gatgtgccgg attatgcctc 1320 ccttaggtca ctagttgcct catccggcac actggagttt aacaatgaaa gcttcaattg 1380 gactggagtc actcaaaacg gaacaagttc tgcttgcata aggagatcta ataatagttt 1440 ctttagtaga ttaaattggt tgacccactt aaacttcaaa tacccagcat tgaacgtgac 1500 tatgccaaac aatgaacaat ttgacaaatt gtacatttgg ggggttcacc acccgggtac 1560 ggacaaggac caaatcttcc tgtatgctca atcatcagga agaatcacag tatctaccaa 1620 aagaagccaa caagctgtaa tcccgaatat cggatctaga cccagaataa ggaatatccc 1680 tagcagaata agcatctatt ggacaatagt aaaaccggga gacatacttt tgattaacag 1740 cacagggaat ctaattgctc ctaggggtta cttcaaaata cgaagtggga aaagctcaat 1800 aatgagatca gatgcaccca ttggcaaatg caattctgaa tgcatcactc caaatggaag 1860 cattcccaat gacaaaccat tccaaaatgt aaacaggatc acatacgggg cctgtcccag 1920 atatgttaag caaagcactc tgaaattggc aacaggaatg cgaaatgtac cagagaaaca 1980 aactagaggc atatttggcg caatagcggg tttcatagaa aatggttggg agggaatggt 2040 ggatggttgg tacggtttca ggcatcaaaa ttctgaggga agaggacaag cagcagatct 2100 caaaagcact caagcagcaa tcgatcaaat caatgggaag ctgaatcgat tgatcgggaa 2160 aaccaacgag aaattccatc agattgaaaa agaattctca gaagtcgaag ggagaattca 2220 ggaccttgag aaatatgttg aggacactaa aatagatctc tggtcataca acgcggagct 2280 tcttgttgcc ctggagaacc aacatacaat tgatctaact gactcagaaa tgaacaaact 2340 gtttgaaaaa acaaagaagc aactaaggga aaatgctgag gatatgggca atggttgttt 2400 caaaatatac cacaaatgtg acaatgcctg cataggatca atcagaaatg gaacttatga 2460 ccacgatgta tacagagatg aagcattaaa caaccggttc cagatcaagg gagttgagct 2520 gaagtcaggg tacaaagatt ggatcctatg gatttccttt gccatatcat gttttttgct 2580 ttgtgttgct ttgttggggt tcatcatgtg ggcctgccaa aagggcaaca ttaggtgcaa 2640 catttgcatt tgaaggccta ttttctttag tttgaattta ctgttattcg gtgtgcattt 2700 ctatgtttgg tgagcggttt tctgtgctca gagtgtgttt attttatgta atttaatttc 2760 tttgtgagct cctgtttagc aggtcgtccc ttcagcaagg acacaaaaag attttaattt 2820 tattaaaaaa aaaaaaaaaa aagaccggga attcgatatc aagcttatcg acctgcagat 2880 cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg 2940 attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg 3000 acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg 3060 atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg 3120 ttactagat 3129 <210> 122 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of PDISP/H3 Victoria <400> 122 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn 20 25 30 Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr 35 40 45 Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr 50 55 60 Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His 65 70 75 80 Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly 85 90 95 Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val 100 105 110 Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp 115 120 125 Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe 130 135 140 Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser 145 150 155 160 Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Asn Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn 165 170 175 Trp Leu Thr His Leu Asn Phe Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met 180 185 190 Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His 195 200 205 Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly 210 215 220 Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Ala Val Ile Pro Asn 225 230 235 240 Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg Asn Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile 245 250 255 Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr 260 265 270 Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser 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agcaagtgtg tacattttta cttgaacaaa 180 aatattcacc tactactgtt ataaatcatt attaaacatt agagtaaaga aatatggatg 240 ataagaacaa gagtagtgat attttgacaa caattttgtt gcaacatttg agaaaatttt 300 gttgttctct cttttcattg gtcaaaaaca atagagagag aaaaaggaag agggagaata 360 aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420 aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480 taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540 aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600 atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660 taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720 tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780 gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840 acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900 ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960 accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020 gattcccttc aaacacatac aaagagaaga gactaattaa ttaattaatc atcttgagag 1080 aaaatggaac gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140 gatggaggat caggaggtac cacttctccc ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg 1200 actgagtggc ggctacataa cgatgagacg aattcgaatc aagataatcc ccttggtttc 1260 aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta tttaagagat atctcagata cgacaggacg 1320 gaagcttcac tgcacagagt ccttggatct tggacgggag attcggttaa ctatgcagca 1380 tctcgatttt tcggtttcga ccagatcgga tgtacctata gtattcggtt tcgaggagtt 1440 agtatcaccg tttctggagg gtcgcgaact cttcagcatc tctgtgagat ggcaattcgg 1500 tctaagcaag aactgctaca gcttgcccca atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga 1560 tgccctgaag gtactcaaac cttcgaaaaa gaaagcgagt aagttaaaat gcttcttcgt 1620 ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa 1680 tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta attcatttac 1740 ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga agacctgccg 1800 cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac aactttataa 1860 gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt 1920 tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat atcatcccct 1980 ttgataaatg atagtacacc aattaggaag gagcatgctc gcctaggaga ttgtcgtttc 2040 ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2100 cgcgttggga attactagcg cgtgtcgaca agcttgcatg ccggtcaaca tggtggagca 2160 cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 2220 tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 2280 ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 2340 cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 2400 cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 2460 ggattgatgt gataacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga 2520 tacagtctca gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa 2580 cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga 2640 aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc 2700 tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga 2760 cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga 2820 tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca 2880 tttggagagg tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa 2940 ccaaaccttc ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc 3000 ttgcgtgagc gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acgttttctt 3060 tcactgaagc gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg 3120 tgtacttgtc ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct 3180 gttcagcccc atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct 3240 acttctgctt gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt 3300 tctataagaa atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga 3360 gaaagattgt taagcttctg tatattctgc ccaaatttgt cgggcccaat accgcggaga 3420 aaatggcgaa aaacgttgcg attttcggct tattgttttc tcttcttgtg ttggttcctt 3480 ctcagatctt cgcgacgtca ctcctcagcc aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg 3540 gcccctggat ctgctgccca aactaactcc atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc 3600 tatttccctg agccagtgac agtgacctgg aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac 3660 accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc tacactctga gcagctcagt gactgtcccc 3720 tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc 3780 aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc 3840 ccagaagtat catctgtctt catcttcccc ccaaagccca aggatgtgct caccattact 3900 ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag 3960 ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag 4020 cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt gaacttccca tcatgcacca ggactggctc 4080 aatggcaagg agcgatcgct caccatcacc atcaccatca ccatcaccat taaaggccta 4140 ttttctttag tttgaattta ctgttattcg gtgtgcattt ctatgtttgg tgagcggttt 4200 tctgtgctca gagtgtgttt attttatgta atttaatttc tttgtgagct cctgtttagc 4260 aggtcgtccc ttcagcaagg acacaaaaag attttaattt tattaaaaaa aaaaaaaaaa 4320 aagaccggga attcgatatc aagcttatcg acctgcagat cgttcaaaca tttggcaata 4380 aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt 4440 gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt 4500 ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg 4560 cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc tctagagtct 4620 caagcttggc gcgcccacgt gactagtggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 4680 ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 4740 gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg 4800 cgaatgctag agcagcttga gcttggatca gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact 4860 atcagtgttt gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg ttta 4914 <210> 126 <211> 3480 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Construct 1819 <400> 126 gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60 gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120 ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180 tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240 ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300 acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360 tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420 agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480 aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540 atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600 atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660 tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720 taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780 acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840 cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900 cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960 ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020 gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt 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cacccgggta cggacaagga 1920 ccaaatcttc ctgtatgctc aatcatcagg aagaatcaca gtatctacca aaagaagcca 1980 acaagctgta atcccgaata tcggatctag acccagaata aggaatatcc ctagcagaat 2040 aagcatctat tggacaatag taaaaccggg agacatactt ttgattaaca gcacagggaa 2100 tctaattgct cctaggggtt acttcaaaat acgaagtggg aaaagctcaa taatgagatc 2160 agatgcaccc attggcaaat gcaattctga atgcatcact ccaaatggaa gcattcccaa 2220 tgacaaacca ttccaaaatg taaacaggat cacatacggg gcctgtccca gatatgttaa 2280 gcaaagcact ctgaaattgg caacaggaat gcgaaatgta ccagagaaac aaactagagg 2340 catatttggc gcaatagcgg gtttcataga aaatggttgg gagggaatgg tggatggttg 2400 gtacggtttc aggcatcaaa attctgaggg aagaggacaa gcagcagatc tcaaaagcac 2460 tcaagcagca atcgatcaaa tcaatgggaa gctgaatcga ttgatcggga aaaccaacga 2520 gaaattccat cagattgaaa aagaattctc agaagtcgaa gggagaattc aggaccttga 2580 gaaatatgtt gaggacacta aaatagatct ctggtcatac aacgcggagc ttcttgttgc 2640 cctggagaac caacatacaa ttgatctaac tgactcagaa atgaacaaac tgtttgaaaa 2700 aacaaagaag caactaaggg aaaatgctga ggatatgggc aatggttgtt tcaaaatata 2760 ccacaaatgt gacaatgcct gcataggatc aatcagaaat ggaacttatg accacgatgt 2820 atacagagat gaagcattaa acaaccggtt ccagatcaag ggagttgagc tgaagtcagg 2880 gtacaaagat tggatcctat ggatttcctt tgccatatca tgttttttgc tttgtgttgc 2940 tttgttgggg ttcatcatgt gggcctgcca aaagggcaac attaggtgca acatttgcat 3000 ttgaaggcct attttcttta gtttgaattt actgttattc ggtgtgcatt tctatgtttg 3060 gtgagcggtt ttctgtgctc agagtgtgtt tattttatgt aatttaattt ctttgtgagc 3120 tcctgtttag caggtcgtcc cttcagcaag gacacaaaaa gattttaatt ttattaaaaa 3180 aaaaaaaaaa aaagaccggg aattcgatat caagcttatc gacctgcaga tcgttcaaac 3240 atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata 3300 taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt 3360 atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac 3420 aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat 3480 <210> 127 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> IF**-H2S157.sl-6r <400> 127 actaaagaaa ataggccttc atatgcagat cctgcactgc agagacccgt 50 <210> 128 <211> 1716 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of PDISP/H2 Singapore. <400> 128 atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60 cagatcttcg cggaccaaat atgcattgga taccatgcca ataattccac agagaaggtc 120 gacacaattc tagagcggaa cgtcactgtg actcatgcca aggacattct tgagaagacc 180 cataacggaa agttatgcaa actaaacgga atccctccac ttgaactagg ggactgtagc 240 attgccggat ggctccttgg aaatccagaa tgtgataggc ttctaagtgt gccagaatgg 300 tcctatataa tggagaaaga aaacccgaga gacggtttgt gttatccagg cagcttcaat 360 gattatgaag aattgaaaca tctcctcagc agcgtgaaac atttcgagaa agtaaagatt 420 ctgcccaaag atagatggac acagcataca acaactggag gttcacgggc ctgcgcggtg 480 tctggtaatc catcattctt caggaacatg gtctggctga caaagaaaga atcaaattat 540 ccggttgcca aaggatcgta caacaataca agcggagaac aaatgctaat aatttggggg 600 gtgcaccatc ccaatgatga gacagaacaa agaacattgt accagaatgt gggaacctat 660 gtttccgtag gcacatcaac attgaacaaa aggtcaaccc cagacatagc aacaaggcct 720 aaagtgaatg gactaggaag tagaatggag ttctcttgga ccctattgga tatgtgggac 780 accataaatt ttgagagtac tggtaatcta attgcaccag agtatggatt caaaatatcg 840 aaaagaggta gttcagggat catgaaaaca gaaggaacac ttgagaactg tgagaccaaa 900 tgccaaactc ctttgggagc aataaataca acattgcctt ttcacaatgt ccacccactg 960 acaataggtg agtgccccaa atatgtaaaa tcggagaagt tggtcttagc aacaggacta 1020 aggaatgttc cccagattga atcaagagga ttgtttgggg caatagctgg ttttatagaa 1080 ggaggatggc aaggaatggt tgatggttgg tatggatacc atcacagcaa tgaccaggga 1140 tcagggtatg cagcagacaa agaatccact caaaaggcat ttgatggaat caccaacaag 1200 gtaaattctg tgattgaaaa gatgaacacc caatttgaag ctgttgggaa agagttcagt 1260 aacttagaga gaagactgga gaacttgaac aaaaagatgg aagacgggtt tctagatgtg 1320 tggacataca atgctgagct tctagttctg atggaaaatg agaggacact tgactttcat 1380 gattctaatg tcaagaatct gtatgataaa gtcagaatgc agctgagaga caacgtcaaa 1440 gaactaggaa atggatgttt tgaattttat cacaaatgtg atgatgaatg catgaatagt 1500 gtgaaaaacg ggacgtatga ttatcccaag tatgaagaag agtctaaact aaatagaaat 1560 gaaatcaaag gggtaaaatt gagcagcatg ggggtttatc aaatccttgc catttatgct 1620 acagtagcag gttctctgtc actggcaatc atgatggctg ggatctcttt ctggatgtgc 1680 tccaacgggt ctctgcagtg caggatctgc atatga 1716 <210> 129 <211> 3471 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Expression cassette number 2220 <400> 129 gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60 gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120 ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180 tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240 ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300 acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360 tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420 agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480 aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540 atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600 atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660 tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720 taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780 acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840 cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900 cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960 ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020 gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080 gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140 tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200 tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260 gcccaatacc gcggagaaaa tggcgaaaaa cgttgcgatt ttcggcttat tgttttctct 1320 tcttgtgttg gttccttctc agatcttcgc ggaccaaata tgcattggat accatgccaa 1380 taattccaca gagaaggtcg acacaattct agagcggaac gtcactgtga ctcatgccaa 1440 ggacattctt gagaagaccc ataacggaaa gttatgcaaa ctaaacggaa tccctccact 1500 tgaactaggg gactgtagca ttgccggatg gctccttgga aatccagaat gtgataggct 1560 tctaagtgtg ccagaatggt cctatataat ggagaaagaa aacccgagag acggtttgtg 1620 ttatccaggc agcttcaatg attatgaaga attgaaacat ctcctcagca gcgtgaaaca 1680 tttcgagaaa gtaaagattc tgcccaaaga tagatggaca cagcatacaa caactggagg 1740 ttcacgggcc tgcgcggtgt ctggtaatcc atcattcttc aggaacatgg tctggctgac 1800 aaagaaagaa tcaaattatc cggttgccaa aggatcgtac aacaatacaa gcggagaaca 1860 aatgctaata atttgggggg tgcaccatcc caatgatgag acagaacaaa gaacattgta 1920 ccagaatgtg ggaacctatg tttccgtagg cacatcaaca ttgaacaaaa ggtcaacccc 1980 agacatagca acaaggccta aagtgaatgg actaggaagt agaatggagt tctcttggac 2040 cctattggat atgtgggaca ccataaattt tgagagtact ggtaatctaa ttgcaccaga 2100 gtatggattc aaaatatcga aaagaggtag ttcagggatc atgaaaacag aaggaacact 2160 tgagaactgt gagaccaaat gccaaactcc tttgggagca ataaatacaa cattgccttt 2220 tcacaatgtc cacccactga caataggtga gtgccccaaa tatgtaaaat cggagaagtt 2280 ggtcttagca acaggactaa ggaatgttcc ccagattgaa tcaagaggat tgtttggggc 2340 aatagctggt tttatagaag gaggatggca aggaatggtt gatggttggt atggatacca 2400 tcacagcaat gaccagggat cagggtatgc agcagacaaa gaatccactc aaaaggcatt 2460 tgatggaatc accaacaagg taaattctgt gattgaaaag atgaacaccc aatttgaagc 2520 tgttgggaaa gagttcagta acttagagag aagactggag aacttgaaca aaaagatgga 2580 agacgggttt ctagatgtgt ggacatacaa tgctgagctt ctagttctga tggaaaatga 2640 gaggacactt gactttcatg attctaatgt caagaatctg tatgataaag tcagaatgca 2700 gctgagagac aacgtcaaag aactaggaaa tggatgtttt gaattttatc acaaatgtga 2760 tgatgaatgc atgaatagtg tgaaaaacgg gacgtatgat tatcccaagt atgaagaaga 2820 gtctaaacta aatagaaatg aaatcaaagg ggtaaaattg agcagcatgg gggtttatca 2880 aatccttgcc atttatgcta cagtagcagg ttctctgtca ctggcaatca tgatggctgg 2940 gatctctttc tggatgtgct ccaacgggtc tctgcagtgc aggatctgca tatgaaggcc 3000 tattttcttt agtttgaatt tactgttatt cggtgtgcat ttctatgttt ggtgagcggt 3060 tttctgtgct cagagtgtgt ttattttatg taatttaatt tctttgtgag ctcctgttta 3120 gcaggtcgtc ccttcagcaa ggacacaaaa agattttaat tttattaaaa aaaaaaaaaa 3180 aaaagaccgg gaattcgata tcaagcttat cgacctgcag atcgttcaaa catttggcaa 3240 taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg 3300 ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg 3360 gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag 3420 cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga t 3471 <210> 130 <211> 571 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of PDISP/H2 Singapore <400> 130 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His 20 25 30 Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys Val Asp Thr Ile Leu Glu Arg Asn Val 35 40 45 Thr Val Thr His Ala Lys Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys 50 55 60 Leu Cys Lys Leu Asn Gly Ile Pro Pro Leu Glu Leu Gly Asp Cys Ser 65 70 75 80 Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Glu Cys Asp Arg Leu Leu Ser 85 90 95 Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Met Glu Lys Glu 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Val Lys Leu Ser 515 520 525 Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ala Thr Val Ala Gly 530 535 540 Ser Leu Ser Leu Ala Ile Met Met Ala Gly Ile Ser Phe Trp Met Cys 545 550 555 560 Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 570 <210> 131 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> H2S157(Prl-).r <400> 131 tgccatcctc cgccgggaac attccttagt cctgttgcta agaccaac 48 <210> 132 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> H2S157(Prl-).c <400> 132 aggaatgttc ccggcggagg atggcaagga atggttgatg gttggtatgg 50 <210> 133 <211> 3426 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cassette 2221 <400> 133 gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60 gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120 ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180 tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240 ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300 acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360 tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420 agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480 aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540 atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600 atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660 tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720 taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780 acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840 cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900 cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960 ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020 gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080 gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140 tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200 tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260 gcccaatacc gcggagaaaa tggcgaaaaa cgttgcgatt ttcggcttat tgttttctct 1320 tcttgtgttg gttccttctc agatcttcgc ggaccaaata tgcattggat accatgccaa 1380 taattccaca gagaaggtcg acacaattct agagcggaac gtcactgtga ctcatgccaa 1440 ggacattctt gagaagaccc ataacggaaa gttatgcaaa ctaaacggaa tccctccact 1500 tgaactaggg gactgtagca ttgccggatg gctccttgga aatccagaat gtgataggct 1560 tctaagtgtg ccagaatggt cctatataat ggagaaagaa aacccgagag acggtttgtg 1620 ttatccaggc agcttcaatg attatgaaga attgaaacat ctcctcagca gcgtgaaaca 1680 tttcgagaaa gtaaagattc tgcccaaaga tagatggaca cagcatacaa caactggagg 1740 ttcacgggcc tgcgcggtgt ctggtaatcc atcattcttc aggaacatgg tctggctgac 1800 aaagaaagaa tcaaattatc cggttgccaa aggatcgtac aacaatacaa gcggagaaca 1860 aatgctaata atttgggggg tgcaccatcc caatgatgag acagaacaaa gaacattgta 1920 ccagaatgtg ggaacctatg tttccgtagg cacatcaaca ttgaacaaaa ggtcaacccc 1980 agacatagca acaaggccta aagtgaatgg actaggaagt agaatggagt tctcttggac 2040 cctattggat atgtgggaca ccataaattt tgagagtact ggtaatctaa ttgcaccaga 2100 gtatggattc aaaatatcga aaagaggtag ttcagggatc atgaaaacag aaggaacact 2160 tgagaactgt gagaccaaat gccaaactcc tttgggagca ataaatacaa cattgccttt 2220 tcacaatgtc cacccactga caataggtga gtgccccaaa tatgtaaaat cggagaagtt 2280 ggtcttagca acaggactaa ggaatgttcc cggcggagga tggcaaggaa tggttgatgg 2340 ttggtatgga taccatcaca gcaatgacca gggatcaggg tatgcagcag acaaagaatc 2400 cactcaaaag gcatttgatg gaatcaccaa caaggtaaat tctgtgattg aaaagatgaa 2460 cacccaattt gaagctgttg ggaaagagtt cagtaactta gagagaagac tggagaactt 2520 gaacaaaaag atggaagacg ggtttctaga tgtgtggaca tacaatgctg agcttctagt 2580 tctgatggaa aatgagagga cacttgactt tcatgattct aatgtcaaga atctgtatga 2640 taaagtcaga atgcagctga gagacaacgt caaagaacta ggaaatggat gttttgaatt 2700 ttatcacaaa tgtgatgatg aatgcatgaa tagtgtgaaa aacgggacgt atgattatcc 2760 caagtatgaa gaagagtcta aactaaatag aaatgaaatc aaaggggtaa aattgagcag 2820 catgggggtt tatcaaatcc ttgccattta tgctacagta gcaggttctc tgtcactggc 2880 aatcatgatg gctgggatct ctttctggat gtgctccaac gggtctctgc agtgcaggat 2940 ctgcatatga aggcctattt tctttagttt gaatttactg ttattcggtg tgcatttcta 3000 tgtttggtga gcggttttct gtgctcagag tgtgtttatt ttatgtaatt taatttcttt 3060 gtgagctcct gtttagcagg tcgtcccttc agcaaggaca caaaaagatt ttaattttat 3120 taaaaaaaaa aaaaaaaaag accgggaatt cgatatcaag cttatcgacc tgcagatcgt 3180 tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt 3240 atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg 3300 ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata 3360 gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta 3420 ctagat 3426 <210> 134 <211> 556 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of PDISP/H2 Singapore with deleted proteolytic loop <400> 134 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His 20 25 30 Ala Asn Asn 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Ser Arg Met Glu Phe Ser Trp Thr Leu Leu 245 250 255 Asp Met Trp Asp Thr Ile Asn Phe Glu Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala 260 265 270 Pro Glu Tyr Gly Phe Lys Ile Ser Lys Arg Gly Ser Ser Gly Ile Met 275 280 285 Lys Thr Glu Gly Thr Leu Glu Asn Cys Glu Thr Lys Cys Gln Thr Pro 290 295 300 Leu Gly Ala Ile Asn Thr Thr Leu Pro Phe His Asn Val His Pro Leu 305 310 315 320 Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Glu Lys Leu Val Leu 325 330 335 Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Gly Gly Gly Trp Gln Gly Met Val 340 345 350 Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Asp Gln Gly Ser Gly Tyr 355 360 365 Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Phe Asp Gly Ile Thr Asn 370 375 380 Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val 385 390 395 400 Gly Lys Glu Phe Ser Asn Leu Glu Arg Arg Leu Glu Asn Leu Asn Lys 405 410 415 Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu 420 425 430 Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn 435 440 445 Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys 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360 tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420 agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480 aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540 atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600 atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660 tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720 taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780 acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840 cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900 cagtacaggg cccaataccg cggagaaaat ggcgaaaaac gttgcgattt tcggcttatt 960 gttttctctt cttgtgttgg ttccttctca gatcttcgcg gaccaaatat gcattggata 1020 ccatgccaat aattccacag agaaggtcga cacaattcta gagcggaacg tcactgtgac 1080 tcatgccaag gacattcttg agaagaccca taacggaaag ttatgcaaac taaacggaat 1140 ccctccactt gaactagggg actgtagcat tgccggatgg ctccttggaa atccagaatg 1200 tgataggctt ctaagtgtgc cagaatggtc ctatataatg gagaaagaaa acccgagaga 1260 cggtttgtgt tatccaggca gcttcaatga ttatgaagaa ttgaaacatc tcctcagcag 1320 cgtgaaacat ttcgagaaag taaagattct gcccaaagat agatggacac agcatacaac 1380 aactggaggt tcacgggcct gcgcggtgtc tggtaatcca tcattcttca ggaacatggt 1440 ctggctgaca aagaaagaat caaattatcc ggttgccaaa ggatcgtaca acaatacaag 1500 cggagaacaa atgctaataa tttggggggt gcaccatccc aatgatgaga cagaacaaag 1560 aacattgtac cagaatgtgg gaacctatgt ttccgtaggc acatcaacat tgaacaaaag 1620 gtcaacccca gacatagcaa caaggcctaa agtgaatgga ctaggaagta gaatggagtt 1680 ctcttggacc ctattggata tgtgggacac cataaatttt gagagtactg gtaatctaat 1740 tgcaccagag tatggattca aaatatcgaa aagaggtagt tcagggatca tgaaaacaga 1800 aggaacactt gagaactgtg agaccaaatg ccaaactcct ttgggagcaa taaatacaac 1860 attgcctttt cacaatgtcc acccactgac aataggtgag tgccccaaat atgtaaaatc 1920 ggagaagttg gtcttagcaa caggactaag gaatgttccc cagattgaat caagaggatt 1980 gtttggggca atagctggtt ttatagaagg aggatggcaa ggaatggttg atggttggta 2040 tggataccat 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aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata 2940 taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt 3000 atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac 3060 aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat 3120 <210> 136 <211> 3075 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cassette 2223 <400> 136 gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60 gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120 ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180 tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240 ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300 acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360 tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420 agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480 aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540 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tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 420 acactggagt ttaacaatga aagcttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagt 480 tctgcttgca taaggagatc taataatagt ttctttagta gattaaattg gttgacccac 540 ttaaacttca aatacccagc attgaacgtg actatgccaa acaatgaaca atttgacaaa 600 ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaagg accaaatctt cctgtatgct 660 caatcatcag gaagaatcac agtatctacc aaaagaagcc aacaagctgt aatcccgaat 720 atcggatcta gacccagaat aaggaatatc cctagcagaa taagcatcta ttggacaata 780 gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 840 tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 900 tgcaattctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 960 gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaagcac tctgaaattg 1020 gcaacaggaa tgcgaaatgt accaggcgga ggttgggagg gaatggtgga tggttggtac 1080 ggtttcaggc atcaaaattc tgagggaaga ggacaagcag cagatctcaa aagcactcaa 1140 gcagcaatcg atcaaatcaa tgggaagctg aatcgattga tcgggaaaac caacgagaaa 1200 ttccatcaga ttgaaaaaga attctcagaa gtcgaaggga gaattcagga ccttgagaaa 1260 tatgttgagg acactaaaat agatctctgg tcatacaacg cggagcttct tgttgccctg 1320 gagaaccaac atacaattga tctaactgac tcagaaatga acaaactgtt tgaaaaaaca 1380 aagaagcaac taagggaaaa tgctgaggat atgggcaatg gttgtttcaa aatataccac 1440 aaatgtgaca atgcctgcat aggatcaatc agaaatggaa cttatgacca cgatgtatac 1500 agagatgaag cattaaacaa ccggttccag atcaagggag ttgagctgaa gtcagggtac 1560 aaagattgga tcctatggat ttcctttgcc atatcatgtt ttttgctttg tgttgctttg 1620 ttggggttca tcatgtgggc ctgccaaaag ggcaacatta ggtgcaacat ttgcatttga 1680 <210> 145 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> H3V36111(Prl-).r <400> 145 ccctcccaac ctccgcctgg tacatttcgc attcctgttg ccaatttc 48 <210> 146 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> H3V36111(Prl-).c <400> 146 aatgtaccag gcggaggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggt 48 <210> 147 <211> 559 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of PDISP/H3 Victoria with deleted proteolytic loop <400> 147 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn 20 25 30 Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr 35 40 45 Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr 50 55 60 Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His 65 70 75 80 Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly 85 90 95 Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val 100 105 110 Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp 115 120 125 Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe 130 135 140 Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser 145 150 155 160 Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Asn Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn 165 170 175 Trp Leu Thr His Leu Asn Phe Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met 180 185 190 Pro Asn Asn Glu Gln Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His 195 200 205 Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile Phe Leu Tyr Ala 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aggacagttg acctcggtca atgtggactc 240 ctggggacaa tcactggacc acctcaatgt gaccaattcc tagaattttc agccgattta 300 attattgaga ggcgagaagg aagtgatgtc tgttatcctg ggaaattcgt gaatgaagaa 360 gctctgaggc aaattctcag agaatcaggc ggaattgaca aggaagcaat gggattcaca 420 tacagtggaa taagaactaa tggagcaacc agtgcatgta ggagatcagg atcttcattc 480 tatgcagaaa tgaaatggct cctgtcaaac acagataatg ctgcattccc gcagatgact 540 aagtcatata aaaatacaag aaaaagccca gctctaatag tatgggggat ccatcattcc 600 gtatcaactg cagagcaaac caagctatat gggagtggaa acaaactggt gacagttggg 660 agttctaatt atcaacaatc ttttgtaccg agtccaggag cgagaccaca agttaatggt 720 atatctggaa gaattgactt tcattggcta atgctaaatc ccaatgatac agtcactttc 780 agtttcaatg gggctttcat agctccagac cgtgcaagct tcctgagagg aaaatctatg 840 ggaatccaga gtggagtaca ggttgatgcc aattgtgaag gggactgcta tcatagtgga 900 gggacaataa taagtaactt gccatttcag aacatagata gcagggcagt tggaaaatgt 960 ccgagatatg ttaagcaaag gagtctgctg ctagcaacag ggatgaagaa tgttcctgag 1020 attccaaagg gaagaggcct atttggtgct atagcgggtt tcattgaaaa tggatgggaa 1080 ggcctaattg atggttggta tggtttcaga caccagaatg cacagggaga gggaactgct 1140 gcagattaca aaagcactca atcggcaatt gatcaaataa caggaaaatt aaaccggctt 1200 atagaaaaaa ccaaccaaca atttgagttg atcgacaatg aattcaatga ggtagagaag 1260 caaatcggta atgtgataaa ttggaccaga gattctataa cagaagtgtg gtcatacaat 1320 gctgaactct tggtagcaat ggagaaccag catacaattg atctggctga ttcagaaatg 1380 gacaaactgt acgaacgagt gaaaagacag ctgagagaga atgctgaaga agatggcact 1440 ggttgctttg aaatatttca caagtgtgat gatgactgta tggccagtat tagaaataac 1500 acctatgatc acagcaaata cagggaagag gcaatgcaaa atagaataca gattgaccca 1560 gtcaaactaa gcagcggcta caaagatgtg atactttggt ttagcttcgg ggcatcatgt 1620 ttcatacttc tagccattgt aatgggcctt gtcttcatat gtgtaaagaa tggaaacatg 1680 cggtgcacta tttgtatata a 1701 <210> 149 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> IF*-H7H113.s1-6r <400> 149 actaaagaaa ataggccttt atatacaaat agtgcaccgc atgtttccat 50 <210> 150 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of PDISP/H7 Hangzhou <400> 150 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Lys Ile Cys Leu Gly His His 20 25 30 Ala Val Ser Asn Gly Thr Lys Val Asn Thr Leu Thr Glu Arg Gly Val 35 40 45 Glu Val Val Asn Ala Thr Glu Thr Val Glu Arg Thr Asn Ile Pro Arg 50 55 60 Ile Cys Ser Lys Gly Lys Arg Thr Val Asp Leu Gly Gln Cys Gly Leu 65 70 75 80 Leu Gly Thr Ile Thr Gly Pro Pro Gln Cys Asp Gln Phe Leu Glu Phe 85 90 95 Ser Ala Asp Leu Ile Ile Glu Arg Arg Glu Gly Ser Asp Val Cys Tyr 100 105 110 Pro Gly Lys Phe Val Asn Glu Glu Ala Leu Arg Gln Ile Leu Arg Glu 115 120 125 Ser Gly Gly Ile Asp Lys Glu Ala Met Gly Phe Thr Tyr Ser Gly Ile 130 135 140 Arg Thr Asn Gly Ala Thr Ser Ala Cys Arg Arg Ser Gly Ser Ser Phe 145 150 155 160 Tyr Ala Glu Met Lys Trp Leu Leu Ser Asn Thr Asp Asn Ala Ala Phe 165 170 175 Pro Gln Met Thr Lys Ser Tyr Lys Asn Thr Arg Lys Ser Pro Ala Leu 180 185 190 Ile Val Trp Gly Ile His His Ser Val Ser Thr Ala Glu Gln 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catcatgccg tgtcaaacgg aaccaaagta 120 aacacattaa ctgaaagagg agtggaagtc gtcaatgcaa ctgaaacagt ggaacgaaca 180 aacatcccca ggatctgctc aaaagggaaa aggacagttg acctcggtca atgtggactc 240 ctggggacaa tcactggacc acctcaatgt gaccaattcc tagaattttc agccgattta 300 attattgaga ggcgagaagg aagtgatgtc tgttatcctg ggaaattcgt gaatgaagaa 360 gctctgaggc aaattctcag agaatcaggc ggaattgaca aggaagcaat gggattcaca 420 tacagtggaa taagaactaa tggagcaacc agtgcatgta ggagatcagg atcttcattc 480 tatgcagaaa tgaaatggct cctgtcaaac acagataatg ctgcattccc gcagatgact 540 aagtcatata aaaatacaag aaaaagccca gctctaatag tatgggggat ccatcattcc 600 gtatcaactg cagagcaaac caagctatat gggagtggaa acaaactggt gacagttggg 660 agttctaatt atcaacaatc ttttgtaccg agtccaggag cgagaccaca agttaatggt 720 atatctggaa gaattgactt tcattggcta atgctaaatc ccaatgatac agtcactttc 780 agtttcaatg gggctttcat agctccagac cgtgcaagct tcctgagagg aaaatctatg 840 ggaatccaga gtggagtaca ggttgatgcc aattgtgaag gggactgcta tcatagtgga 900 gggacaataa taagtaactt gccatttcag aacatagata gcagggcagt tggaaaatgt 960 ccgagatatg ttaagcaaag gagtctgctg ctagcaacag ggatgaagaa tgttcctggc 1020 ggatgggaag gcctaattga tggttggtat ggtttcagac accagaatgc acagggagag 1080 ggaactgctg cagattacaa aagcactcaa tcggcaattg atcaaataac aggaaaatta 1140 aaccggctta tagaaaaaac caaccaacaa tttgagttga tcgacaatga attcaatgag 1200 gtagagaagc aaatcggtaa tgtgataaat tggaccagag attctataac agaagtgtgg 1260 tcatacaatg ctgaactctt ggtagcaatg gagaaccagc atacaattga tctggctgat 1320 tcagaaatgg acaaactgta cgaacgagtg aaaagacagc tgagagagaa tgctgaagaa 1380 gatggcactg gttgctttga aatatttcac aagtgtgatg atgactgtat ggccagtatt 1440 agaaataaca cctatgatca cagcaaatac agggaagagg caatgcaaaa tagaatacag 1500 attgacccag tcaaactaag cagcggctac aaagatgtga tactttggtt tagcttcggg 1560 gcatcatgtt tcatacttct agccattgta atgggccttg tcttcatatg tgtaaagaat 1620 ggaaacatgc ggtgcactat ttgtatataa 1650 <210> 152 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> H7H113(PrL-).r <400> 152 ccttcccatc cgccaggaac attcttcatc cctgttgcta gcagcagac 49 <210> 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Arg Ser Gly Ser Ser Phe 145 150 155 160 Tyr Ala Glu Met Lys Trp Leu Leu Ser Asn Thr Asp Asn Ala Ala Phe 165 170 175 Pro Gln Met Thr Lys Ser Tyr Lys Asn Thr Arg Lys Ser Pro Ala Leu 180 185 190 Ile Val Trp Gly Ile His His Ser Val Ser Thr Ala Glu Gln Thr Lys 195 200 205 Leu Tyr Gly Ser Gly Asn Lys Leu Val Thr Val Gly Ser Ser Asn Tyr 210 215 220 Gln Gln Ser Phe Val Pro Ser Pro Gly Ala Arg Pro Gln Val Asn Gly 225 230 235 240 Ile Ser Gly Arg Ile Asp Phe His Trp Leu Met Leu Asn Pro Asn Asp 245 250 255 Thr Val Thr Phe Ser Phe Asn Gly Ala Phe Ile Ala Pro Asp Arg Ala 260 265 270 Ser Phe Leu Arg Gly Lys Ser Met Gly Ile Gln Ser Gly Val Gln Val 275 280 285 Asp Ala Asn Cys Glu Gly Asp Cys Tyr His Ser Gly Gly Thr Ile Ile 290 295 300 Ser Asn Leu Pro Phe Gln Asn Ile Asp Ser Arg Ala Val Gly Lys Cys 305 310 315 320 Pro Arg Tyr Val Lys Gln Arg Ser Leu Leu Leu Ala Thr Gly Met Lys 325 330 335 Asn Val Pro Gly Gly Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe 340 345 350 Arg His Gln Asn Ala Gln Gly Glu Gly Thr 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PDISP/H9 Hong Kong <400> 155 atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60 cagatcttcg cggataaaat ctgcatcggc caccagtcaa caaactccac agaaactgtg 120 gacacgctaa cagaaaccaa tgttcctgtg acacatgcca aagaattgct ccacacagag 180 cataatggaa tgctgtgtgc aacaagcctg ggacatcccc tcattctaga cacatgcact 240 attgaaggac tagtctatgg caacccttct tgtgacctgc tgttgggagg aagagaatgg 300 tcctacatcg tcgaaagatc atcagctgta aatggaacgt gttaccctgg gaatgtagaa 360 aacctagagg aactcaggac actttttagt tccgctagtt cctaccaaag aatccaaatc 420 ttcccagaca caacctggaa tgtgacttac actggaacaa gcagagcatg ttcaggttca 480 ttctacagga gtatgagatg gctgactcaa aagagcggtt tttaccctgt tcaagacgcc 540 caatacacaa ataacagggg aaagagcatt cttttcgtgt ggggcataca tcacccaccc 600 acctataccg agcaaacaaa tttgtacata agaaacgaca caacaacaag cgtgacaaca 660 gaagatttga ataggacctt caaaccagtg atagggccaa ggccccttgt caatggtctg 720 cagggaagaa ttgattatta ttggtcggta ctaaaaccag gccaaacatt gcgagtacga 780 tccaatggga atctaattgc tccatggtat ggacacgttc tttcaggagg gagccatgga 840 agaatcctga agactgattt aaaaggtggt aattgtgtag tgcaatgtca gactgaaaaa 900 ggtggcttaa acagtacatt gccattccac aatatcagta aatatgcatt tggaacctgc 960 cccaaatatg taagagttaa tagtctcaaa ctggcagtcg gtctgaggaa cgtgcctgct 1020 agatcaagta gaggactatt tggagccata gctggattca tagaaggagg ttggccagga 1080 ctagtcgctg gctggtatgg tttccagcat tcaaatgatc aaggggttgg tatggctgca 1140 gatagggatt caactcaaaa ggcaattgat aaaataacat ccaaggtgaa taatatagtc 1200 gacaagatga acaagcaata tgaaataatt gatcatgaat ttagtgaggt tgaaactaga 1260 ctcaatatga tcaataataa gattgatgac caaatacaag acgtatgggc atataatgca 1320 gaattgctag tactacttga aaatcaaaaa acactcgatg agcatgatgc gaacgtgaac 1380 aatctatata acaaggtgaa gagggcactg ggctccaatg ctatggaaga tgggaaaggc 1440 tgtttcgagc tataccataa atgtgatgat cagtgcatgg aaacaattcg gaacgggacc 1500 tataatagga gaaagtatag agaggaatca agactagaaa ggcagaaaat agagggggtt 1560 aagctggaat ctgagggaac ttacaaaatc ctcaccattt attcgactgt cgcctcatct 1620 cttgtgcttg caatggggtt tgctgccttc ctgttctggg ccatgtccaa 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caatggtctg 720 cagggaagaa ttgattatta ttggtcggta ctaaaaccag gccaaacatt gcgagtacga 780 tccaatggga atctaattgc tccatggtat ggacacgttc tttcaggagg gagccatgga 840 agaatcctga agactgattt aaaaggtggt aattgtgtag tgcaatgtca gactgaaaaa 900 ggtggcttaa acagtacatt gccattccac aatatcagta aatatgcatt tggaacctgc 960 cccaaatatg taagagttaa tagtctcaaa ctggcagtcg gtctgaggaa cgtgcctggc 1020 ggaggttggc caggactagt cgctggctgg tatggtttcc agcattcaaa tgatcaaggg 1080 gttggtatgg ctgcagatag ggattcaact caaaaggcaa ttgataaaat aacatccaag 1140 gtgaataata tagtcgacaa gatgaacaag caatatgaaa taattgatca tgaatttagt 1200 gaggttgaaa ctagactcaa tatgatcaat aataagattg atgaccaaat acaagacgta 1260 tgggcatata atgcagaatt gctagtacta cttgaaaatc aaaaaacact cgatgagcat 1320 gatgcgaacg tgaacaatct atataacaag gtgaagaggg cactgggctc caatgctatg 1380 gaagatggga aaggctgttt cgagctatac cataaatgtg atgatcagtg catggaaaca 1440 attcggaacg ggacctataa taggagaaag tatagagagg aatcaagact agaaaggcag 1500 aaaatagagg gggttaagct ggaatctgag ggaacttaca aaatcctcac catttattcg 1560 actgtcgcct catctcttgt gcttgcaatg gggtttgctg ccttcctgtt ctgggccatg 1620 tccaatggat cttgcagatg caacatttgt atataa 1656 <210> 159 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> H9HK107399(Prl-).r <400> 159 gtcctggcca acctccgcca ggcacgttcc tcagaccgac tgccagtt 48 <210> 160 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> H9HK107399(Prl-).c <400> 160 ggaacgtgcc tggcggaggt tggccaggac tagtcgctgg ctggtatg 48 <210> 161 <211> 551 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of PDISP/H9 Hong Kong with deleted proteolytic loop <400> 161 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly His Gln 20 25 30 Ser Thr Asn Ser Thr Glu Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Thr Asn Val 35 40 45 Pro Val Thr His Ala Lys Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met 50 55 60 Leu Cys Ala Thr Ser Leu Gly His Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr 65 70 75 80 Ile Glu Gly Leu Val Tyr Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Leu 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<223> Nucleotide sequence of PDISP/HA B Massachusetts <400> 169 atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60 cagatcttcg ccgatcgaat ctgcactggg ataacatctt caaactcacc tcatgtggtc 120 aaaacagcta ctcaagggga ggtcaatgtg actggtgtga taccactaac aacaacacca 180 acaaaatctt attttgcaaa tctcaaagga acaaagacca gagggaaact atgcccagac 240 tgtctcaact gtacagatct ggatgtggcc ctgggcaggc caatgtgtgt gggaactaca 300 ccttctgcga aagcttcaat acttcacgaa gtcagacctg ttacatccgg gtgcttccct 360 ataatgcacg acagaacaaa aatcaggcaa ctagccaatc ttctcagagg atatgaaaat 420 atcaggttat caacccaaaa cgttatcgat gcagaaaagg caccaggagg accctacaga 480 cttggaacct caggatcttg ccctaacgct accagtaaaa gcggattttt cgcaacaatg 540 gcttgggctg tcccaaagga caacaacaaa aatgcaacga acccattaac agtagaagta 600 ccatacattt gtgcagaagg ggaagaccaa attactgttt gggggttcca ttcagataac 660 aaaacccaaa tgaagaacct ctatggagac tcaaatcctc aaaagttcac ctcatctgct 720 aatggagtaa ccacacatta tgtttctcag attggcggct tcccagatca aacagaagac 780 ggaggactac cacaaagcgg cagaattgtc gttgattaca tgatgcaaaa acctgggaaa 840 acaggaacaa ttgtctatca aagaggtgtt ttgttgcctc aaaaggtgtg gtgcgcgagt 900 ggcaggagca aagtaataaa agggtccttg cctttaattg gtgaagcaga ttgccttcat 960 gaaaaatacg gtggattaaa caaaagcaag ccttactaca caggagaaca tgcaaaagcc 1020 ataggaaatt gcccaatatg ggtgaaaaca cctttgaagc ttgccaatgg aaccaaatat 1080 agacctcctg caaaactatt aaaggaaagg ggtttcttcg gagctattgc tggtttccta 1140 gaaggaggat gggaaggaat gattgcaggt tggcacggat acacatctca cggagcacat 1200 ggagtggcag ttgctgcaga ccttaagagc acacaagaag ctataaacaa gataacaaaa 1260 aatctcaact ctttgagtga gctagaagta aagaatcttc aaaggctaag tggtgccatg 1320 gatgaactcc acaacgaaat actcgagctg gatgagaaag tggatgacct cagagctgac 1380 actataagtt cacaaataga acttgcagtc ttgctttcca acgaaggaat aataaacagt 1440 gaagacgagc atctattggc acttgagaga aaactaaaga aaatgctggg tccctctgct 1500 gtagacatag gaaatggatg cttcgaaacc aaacacaaat gcaaccagac ctgcttagac 1560 aggatagctg ctggcacctt taatgcagga gagttttctc tccccacttt tgattcattg 1620 aacattactg ctgcatcttt aaatgatgat ggattggata accatactat actgctctat 1680 tactcaactg ctgcttctag tttggctgta acattgatgc tagctatttt tattgtttat 1740 atggtctcca gagacaacgt ttcatgctcc atctgtctat aa 1782 <210> 170 <211> 593 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of PDISP/HA B Massachusetts <400> 170 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val 35 40 45 Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser Tyr 50 55 60 Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asp 65 70 75 80 Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys 85 90 95 Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Val Arg 100 105 110 Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile 115 120 125 Arg Gln Leu Ala Asn Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser 130 135 140 Thr Gln Asn Val Ile Asp Ala Glu 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atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt 360 gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa 420 atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt 480 taagcttctg tatattctgc ccaaatttgt cgggccc 517 <210> 174 <400> 174 000 <210> 175 <400> 175 000 <210> 176 <400> 176 000 <210> 177 <400> 177 000 <210> 178 <400> 178 000 <210> 179 <400> 179 000 <210> 180 <400> 180 000 <210> 181 <400> 181 000 <210> 182 <400> 182 000 <210> 183 <400> 183 000 <210> 184 <400> 184 000 <210> 185 <400> 185 000 <210> 186 <400> 186 000 <210> 187 <211> 528 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> [00173] CPMV HT+ with a plant kozak consensus sequence <400> 187 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 60 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc 120 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acgttttctt tcactgaagc 180 gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc 240 ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc 300 atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt 360 gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa 420 atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt 480 taagcttctg tatattctgc ccaaatttgt tcgggcccaa taccgcgg 528 <210> 188 <211> 511 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of CPMV HT+ 511 <400> 188 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 60 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc 120 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acgttttctt tcactgaagc 180 gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc 240 ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc 300 atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt 360 gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa 420 atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt 480 taagcttctg tatattctgc ccaaatttga a 511 <210> 189 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of CPMV HT+ [WT115] <400> 189 tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 60 ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcatgagc 120 gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acgttttctt tcactgaagc 180 gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc 240 ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc 300 atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt 360 gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa 420 atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt 480 taagcttctg tatattctgc ccaaatttgt tcgggcccaa taccgcggag aaaa 534 <210> 190 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBF406(PrL-).r (construct 2102 and 2104) <400> 190 tccttcccat cctccaccag gaggtctata tttggttcca ttggcgagct tcaaag 56 <210> 191 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> HBF406(PrL-).c (construct 2102 and 2104) <400> 191 atatagacct cctggtggag gatgggaagg aatgattgca ggctggcacg ga 52 <210> 192 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> IF*-HBF406.s1-6r (construct 2102 and 2104) <400> 192 actaaagaaa ataggccttt atagacagat ggagcatgaa acgttgtctc 50 <210> 193 <211> 1731 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of PDISP/HA B Florida with deleted proteolytic loop (construct 2102 and 2104) <400> 193 atggcgaaaa acgttgcgat tttcggctta ttgttttctc ttcttgtgtt ggttccttct 60 cagatcttcg cggatcgaat ctgcactgga ataacatctt caaactcacc tcatgtggtc 120 aaaacagcca ctcaagggga ggtcaatgtg actggtgtga taccactaac aacaacacca 180 acaaaatctt attttgcaaa tctcaaagga acaaggacca gagggaaact atgcccagac 240 tgtctcaact gcacagatct ggatgtggct ttgggcagac caatgtgtgt ggggaccaca 300 ccttcggcga aggcttcaat actccacgaa gtcaaacctg ttacatccgg gtgctttcct 360 ataatgcacg acagaacaaa aatcaggcaa ctacccaatc ttctcagagg atatgaaaat 420 atcaggctat caacccaaaa cgtcatcgat gcggaaaagg caccaggagg accctacaga 480 cttggaacct caggatcttg ccctaacgct accagtaaga gcggattttt cgcaacaatg 540 gcttgggctg tcccaaagga caacaacaaa aatgcaacga acccactaac agtagaagta 600 ccatacattt gtacagaagg ggaagaccaa atcactgttt gggggttcca ttcagataac 660 aaaacccaaa tgaagaacct ctatggagac tcaaatcctc aaaagttcac ctcatctgct 720 aatggagtaa ccacacacta tgtttctcag attggcagct tcccagatca aacagaagac 780 ggaggactac cacaaagcgg caggattgtt gttgattaca tgatgcaaaa acctgggaaa 840 acaggaacaa ttgtctacca aagaggtgtt ttgttgcctc aaaaggtgtg gtgcgcgagt 900 ggcaggagca aagtaataaa agggtccttg cctttaattg gtgaagcaga ttgccttcat 960 gaaaaatacg gtggattaaa caaaagcaag ccttactaca caggagaaca tgcaaaagcc 1020 ataggaaatt gcccaatatg ggtgaaaaca cctttgaagc tcgccaatgg aaccaaatat 1080 agacctcctg gtggaggatg ggaaggaatg attgcaggct ggcacggata cacatctcac 1140 ggagcacatg gagtggcagt ggcggcggac cttaagagta cgcaagaagc tataaacaag 1200 ataacaaaaa atctcaattc tttgagtgag ctagaagtaa agaatcttca aagactaagt 1260 ggtgccatgg atgaactcca caacgaaata ctcgagctgg atgagaaagt ggatgatctc 1320 agagctgaca ctataagctc gcaaatagaa cttgcagtct tgctttccaa cgaaggaata 1380 ataaacagtg aagatgagca tctattggca cttgagagaa aactaaagaa aatgctgggt 1440 ccctctgctg tagagatagg aaatggatgc ttcgaaacca aacacaagtg caaccagacc 1500 tgcttagaca ggatagctgc tggcaccttt aatgcaggag aattttctct ccccactttt 1560 gattcactga acattactgc tgcatcttta aatgatgatg gattggataa ccatactata 1620 ctgctctatt actcaactgc tgcttctagt ttggctgtaa cattgatgct agctattttt 1680 attgtttata tggtctccag agacaacgtt tcatgctcca tctgtctata a 1731 <210> 194 <211> 576 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of PDISP/HA B Florida with deleted proteolytic loop (construct 2102 and 2104) <400> 194 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val 35 40 45 Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser Tyr 50 55 60 Phe 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aagttcattt catttggaga ggtattaaaa tcttaatagg 1080 ttttgataaa agcgaacgtg gggaaacccg aaccaaacct tcttctaaac tctctctcat 1140 ctctcttaaa gcaaacttct ctcttgtctt tcttgcgtga gcgatcttca acgttgtcag 1200 atcgtgcttc ggcaccagta caacgttttc tttcactgaa gcgaaatcaa agatctcttt 1260 gtggacacgt agtgcggcgc cattaaataa cgtgtacttg tcctattctt gtcggtgtgg 1320 tcttgggaaa agaaagcttg ctggaggctg ctgttcagcc ccatacatta cttgttacga 1380 ttctgctgac tttcggcggg tgcaatatct ctacttctgc ttgacgaggt attgttgcct 1440 gtacttcttt cttcttcttc ttgctgattg gttctataag aaatctagta ttttctttga 1500 aacagagttt tcccgtggtt ttcgaacttg gagaaagatt gttaagcttc tgtatattct 1560 gcccaaattt gtcgggccca ataccgcgga gaaaatggcg aaaaacgttg cgattttcgg 1620 cttattgttt tctcttcttg tgttggttcc ttctcagatc ttcgcggatc gaatctgcac 1680 tggaataaca tcttcaaact cacctcatgt ggtcaaaaca gccactcaag gggaggtcaa 1740 tgtgactggt gtgataccac taacaacaac accaacaaaa tcttattttg caaatctcaa 1800 aggaacaagg accagaggga aactatgccc agactgtctc aactgcacag atctggatgt 1860 ggctttgggc agaccaatgt 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gttaaatcgg ccatccattc aaggtcagat tgagcttgtt 4440 ggtatgagac aggatgtatg taagtataag cgtctatgct tacatggtat agatgggttt 4500 ccctccagga gtgtagatct tcgtggcagc gaagatctga ttctgtgaag ggcgacacat 4560 acggttcagg ttgtggaggg aataatttgt tggctgaata ttccagccat tgaagttttg 4620 ttgcccattc atgagggaat tcttccttga tcatgtcaag atattcctcc ttagacgttg 4680 cagtctggat aatagttctc catcgtgcgt cagatttgcg aggagagacc ttatgatctc 4740 ggaaatctcc tctggtttta atatctccgt cctttgatat gtaatcaagg acttgtttag 4800 agtttctagc tggctggata ttagggtgat ttccttcaaa atcgaaaaaa gaaggatccc 4860 taatacaagg ttttttatca agctggagaa gagcatgata gtgggtagtg ccatcttgat 4920 gaagctcaga agcaacacca aggaagaaaa taagaaaagg tgtgagtttc tcccagagaa 4980 actggaataa atcatctctt tgagatgagc acttgggata ggtaaggaaa acatatttag 5040 attggagtct gaagttctta ctagcagaag gcatgttgtt gtgactccga ggggttgcct 5100 caaactctat cttataaccg gcgtggaggc atggaggcag gggtattttg gtcattttaa 5160 tagatagtgg aaaatgacgt ggaatttact taaagacgaa gtctttgcga caaggggggg 5220 cccacgccga atttaatatt 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470 475 480 Pro Ser Ala Val Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys 485 490 495 Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala 500 505 510 Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala 515 520 525 Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp Asn Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr 530 535 540 Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val Val Ser Leu Gly Ala Ile 545 550 555 560 Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 570 575 <210> 200 <211> 3486 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cassette 2106 <400> 200 gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60 gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120 ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180 tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240 ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300 acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360 tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420 agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480 aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540 atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600 atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660 tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720 taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780 acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840 cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900 cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960 ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020 gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080 gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140 tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200 tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260 gcccaatacc gcggagaaaa tggcgaaaaa cgttgcgatt ttcggcttat tgttttctct 1320 tcttgtgttg gttccttctc agatcttcgc ggatcgaatc tgcactggaa taacatcttc 1380 aaactcacct catgtggtca aaacagccac tcaaggggag gtcaatgtga ctggtgtgat 1440 accactaaca acaacaccaa caaaatctta ttttgcaaat ctcaaaggaa caaggaccag 1500 agggaaacta tgcccagact gtctcaactg cacagatctg gatgtggctt tgggcagacc 1560 aatgtgtgtg gggaccacac cttcggcgaa ggcttcaata ctccacgaag tcaaacctgt 1620 tacatccggg tgctttccta taatgcacga cagaacaaaa atcaggcaac tacccaatct 1680 tctcagagga tatgaaaata tcaggctatc aacccaaaac gtcatcgatg cggaaaaggc 1740 accaggagga ccctacagac ttggaacctc aggatcttgc cctaacgcta ccagtaagag 1800 cggatttttc gcaacaatgg cttgggctgt cccaaaggac aacaacaaaa atgcaacgaa 1860 cccactaaca gtagaagtac catacatttg tacagaaggg gaagaccaaa tcactgtttg 1920 ggggttccat tcagataaca aaacccaaat gaagaacctc tatggagact caaatcctca 1980 aaagttcacc tcatctgcta atggagtaac cacacactat gtttctcaga ttggcagctt 2040 cccagatcaa acagaagacg gaggactacc acaaagcggc aggattgttg ttgattacat 2100 gatgcaaaaa cctgggaaaa caggaacaat tgtctaccaa agaggtgttt tgttgcctca 2160 aaaggtgtgg tgcgcgagtg gcaggagcaa agtaataaaa gggtccttgc ctttaattgg 2220 tgaagcagat tgccttcatg aaaaatacgg tggattaaac aaaagcaagc cttactacac 2280 aggagaacat gcaaaagcca taggaaattg cccaatatgg gtgaaaacac ctttgaagct 2340 cgccaatgga accaaatata gacctcctgg tggaggatgg gaaggaatga ttgcaggctg 2400 gcacggatac acatctcacg gagcacatgg agtggcagtg gcggcggacc ttaagagtac 2460 gcaagaagct ataaacaaga taacaaaaaa tctcaattct ttgagtgagc tagaagtaaa 2520 gaatcttcaa agactaagtg gtgccatgga tgaactccac aacgaaatac tcgagctgga 2580 tgagaaagtg gatgatctca gagctgacac tataagctcg caaatagaac ttgcagtctt 2640 gctttccaac gaaggaataa taaacagtga agatgagcat ctattggcac ttgagagaaa 2700 actaaagaaa atgctgggtc cctctgctgt agagatagga aatggatgct tcgaaaccaa 2760 acacaagtgc aaccagacct gcttagacag gatagctgct ggcaccttta atgcaggaga 2820 attttctctc cccacttttg attcactgaa cattactgct gcatctttaa atgatgatgg 2880 attggataac taccagattt tggcgatcta ttcaactgtc gccagttcat tggtactggt 2940 agtctccctg ggggcaatca gtttctggat gtgctctaat gggtctctac agtgtagaat 3000 atgtatttaa aggcctattt tctttagttt gaatttactg ttattcggtg tgcatttcta 3060 tgtttggtga gcggttttct gtgctcagag tgtgtttatt ttatgtaatt taatttcttt 3120 gtgagctcct gtttagcagg tcgtcccttc agcaaggaca caaaaagatt ttaattttat 3180 taaaaaaaaa aaaaaaaaag accgggaatt cgatatcaag cttatcgacc tgcagatcgt 3240 tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt 3300 atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg 3360 ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata 3420 gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta 3480 ctagat 3486 <210> 201 <211> 5368 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cassette 2108 <400> 201 tgttgttgtg actccgaggg gttgcctcaa actctatctt ataaccggcg tggaggcatg 60 gaggcagggg tattttggtc attttaatag atagtggaaa atgacgtgga atttacttaa 120 agacgaagtc tttgcgacaa gggggggccc acgccgaatt taatattacc ggcgtggccc 180 ccccttatcg cgagtgcttt agcacgagcg gtccagattt aaagtagaaa atttcccgcc 240 cactagggtt aaaggtgttc acactataaa agcatatacg atgtgatggt atttggtcga 300 caagcttgca tgccggtcaa catggtggag cacgacacac ttgtctactc caaaaatatc 360 aaagatacag tctcagaaga ccaaagggca attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcc 420 ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact ttattgtgaa gatagtggaa 480 aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggccat cgttgaagat 540 gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa 600 gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgataacat ggtggagcac 660 gacacacttg tctactccaa aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggcaatt 720 gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg cccagctatc 780 tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc 840 gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc 900 ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg 960 gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa 1020 gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga ggtattaaaa tcttaatagg 1080 ttttgataaa agcgaacgtg gggaaacccg aaccaaacct tcttctaaac tctctctcat 1140 ctctcttaaa gcaaacttct ctcttgtctt tcttgcgtga gcgatcttca acgttgtcag 1200 atcgtgcttc ggcaccagta caacgttttc tttcactgaa gcgaaatcaa agatctcttt 1260 gtggacacgt agtgcggcgc cattaaataa cgtgtacttg tcctattctt gtcggtgtgg 1320 tcttgggaaa agaaagcttg ctggaggctg ctgttcagcc ccatacatta cttgttacga 1380 ttctgctgac tttcggcggg tgcaatatct ctacttctgc ttgacgaggt attgttgcct 1440 gtacttcttt cttcttcttc ttgctgattg gttctataag aaatctagta ttttctttga 1500 aacagagttt tcccgtggtt ttcgaacttg gagaaagatt gttaagcttc tgtatattct 1560 gcccaaattt gtcgggccca ataccgcgga gaaaatggcg aaaaacgttg cgattttcgg 1620 cttattgttt tctcttcttg tgttggttcc ttctcagatc ttcgcggatc gaatctgcac 1680 tggaataaca tcttcaaact cacctcatgt ggtcaaaaca gccactcaag gggaggtcaa 1740 tgtgactggt gtgataccac taacaacaac accaacaaaa tcttattttg caaatctcaa 1800 aggaacaagg accagaggga aactatgccc agactgtctc aactgcacag atctggatgt 1860 ggctttgggc agaccaatgt gtgtggggac cacaccttcg gcgaaggctt caatactcca 1920 cgaagtcaaa cctgttacat ccgggtgctt tcctataatg cacgacagaa caaaaatcag 1980 gcaactaccc aatcttctca gaggatatga aaatatcagg ctatcaaccc aaaacgtcat 2040 cgatgcggaa aaggcaccag gaggacccta cagacttgga acctcaggat cttgccctaa 2100 cgctaccagt aagagcggat ttttcgcaac aatggcttgg gctgtcccaa aggacaacaa 2160 caaaaatgca acgaacccac taacagtaga agtaccatac atttgtacag aaggggaaga 2220 ccaaatcact gtttgggggt tccattcaga taacaaaacc caaatgaaga acctctatgg 2280 agactcaaat cctcaaaagt tcacctcatc tgctaatgga gtaaccacac actatgtttc 2340 tcagattggc agcttcccag atcaaacaga agacggagga ctaccacaaa gcggcaggat 2400 tgttgttgat tacatgatgc aaaaacctgg gaaaacagga acaattgtct accaaagagg 2460 tgttttgttg cctcaaaagg tgtggtgcgc gagtggcagg agcaaagtaa taaaagggtc 2520 cttgccttta attggtgaag cagattgcct tcatgaaaaa tacggtggat taaacaaaag 2580 caagccttac tacacaggag aacatgcaaa agccatagga aattgcccaa tatgggtgaa 2640 aacacctttg aagctcgcca atggaaccaa atatagacct cctggtggag gatgggaagg 2700 aatgattgca ggctggcacg gatacacatc tcacggagca catggagtgg cagtggcggc 2760 ggaccttaag agtacgcaag aagctataaa caagataaca aaaaatctca attctttgag 2820 tgagctagaa gtaaagaatc ttcaaagact aagtggtgcc atggatgaac tccacaacga 2880 aatactcgag ctggatgaga aagtggatga tctcagagct gacactataa gctcgcaaat 2940 agaacttgca gtcttgcttt ccaacgaagg aataataaac agtgaagatg agcatctatt 3000 ggcacttgag agaaaactaa agaaaatgct gggtccctct gctgtagaga taggaaatgg 3060 atgcttcgaa accaaacaca agtgcaacca gacctgctta gacaggatag ctgctggcac 3120 ctttaatgca ggagaatttt ctctccccac ttttgattca ctgaacatta ctgctgcatc 3180 tttaaatgat gatggattgg ataactacca gattttggcg atctattcaa ctgtcgccag 3240 ttcattggta ctggtagtct ccctgggggc aatcagtttc tggatgtgct ctaatgggtc 3300 tctacagtgt agaatatgta tttaaaggcc tattttcttt agtttgaatt tactgttatt 3360 cggtgtgcat ttctatgttt ggtgagcggt tttctgtgct cagagtgtgt ttattttatg 3420 taatttaatt tctttgtgag ctcctgttta gcaggtcgtc ccttcagcaa ggacacaaaa 3480 agattttaat tttattaaaa aaaaaaaaaa aaaagaccgg gaattcgata tcaagcttat 3540 cgacctgcag atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc 3600 ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac 3660 atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac 3720 atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg 3780 gtgtcatcta tgttactaga tctctagagt ctcaagcttg gcgcgccata aaatgattat 3840 tttatgaata tatttcattg tgcaagtaga tagaaattac atatgttaca taacacacga 3900 aataaacaaa aaaagacaat ccaaaaacaa acaccccaaa aaaaataatc actttagata 3960 aactcgtatg aggagaggca cgttcagtga ctcgacgatt cccgagcaaa aaaagtctcc 4020 ccgtcacaca tatagtgggt gacgcaatta tctttaaagt aatccttctg ttgacttgtc 4080 attgataaca tccagtcttc gtcaggattg caaagaatta tagaagggat cccacctttt 4140 attttcttct tttttccata tttagggttg acagtgaaat cagactggca acctattaat 4200 tgcttccaca atgggacgaa cttgaagggg atgtcgtcga tgatattata ggtggcgtgt 4260 tcatcgtagt tggtgaaatc gatggtaccg ttccaatagt tgtgtcgtcc gagacttcta 4320 gcccaggtgg tctttccggt acgagttggt ccgcagatgt agaggctggg gtgtcggatt 4380 ccattccttc cattgtcctg gttaaatcgg ccatccattc aaggtcagat tgagcttgtt 4440 ggtatgagac aggatgtatg taagtataag cgtctatgct tacatggtat agatgggttt 4500 ccctccagga gtgtagatct tcgtggcagc gaagatctga ttctgtgaag ggcgacacat 4560 acggttcagg ttgtggaggg aataatttgt tggctgaata ttccagccat tgaagttttg 4620 ttgcccattc atgagggaat tcttccttga tcatgtcaag atattcctcc ttagacgttg 4680 cagtctggat aatagttctc catcgtgcgt cagatttgcg aggagagacc ttatgatctc 4740 ggaaatctcc tctggtttta atatctccgt cctttgatat gtaatcaagg acttgtttag 4800 agtttctagc tggctggata ttagggtgat ttccttcaaa atcgaaaaaa gaaggatccc 4860 taatacaagg ttttttatca agctggagaa gagcatgata gtgggtagtg ccatcttgat 4920 gaagctcaga agcaacacca aggaagaaaa taagaaaagg tgtgagtttc tcccagagaa 4980 actggaataa atcatctctt tgagatgagc acttgggata ggtaaggaaa acatatttag 5040 attggagtct gaagttctta ctagcagaag gcatgttgtt gtgactccga ggggttgcct 5100 caaactctat cttataaccg gcgtggaggc atggaggcag gggtattttg gtcattttaa 5160 tagatagtgg aaaatgacgt ggaatttact taaagacgaa gtctttgcga caaggggggg 5220 cccacgccga atttaatatt accggcgtgg ccccccctta tcgcgagtgc tttagcacga 5280 gcggtccaga tttaaagtag aaaatttccc gcccactagg gttaaaggtg ttcacactat 5340 aaaagcatat acgatgtgat ggtatttg 5368

Claims (37)

  1. 식물에서 활성인 조절 영역 및 식물에서 활성인 발현 인핸서를 포함하는 핵산으로서, 조절 영역 및 발현 인핸서는 인플루엔자 타입 B HA(헤마글루티닌)와 인플루엔자 타입 A 서브타입 H3 및 H7 HA로부터 선택된 변형된 인플루엔자 헤마글루티닌(HA)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합되고, 인플루엔자 타입 B HA는 B/Brisbane/60/2008 균주(strain)를 포함하지 않고, 변형된 HA는 서브유닛 HA1 및 HA2 사이에 완전히 결실된 단백질 가수분해 루프를 포함하고, 완전히 결실된 단백질 가수분해 루프는 일염기(monobasic) 또는 다염기(multi-basic) 분열 부위를 포함하고, 핵산은 강낭콩 황고병 바이러스(Bean Yellow Dwarf virus: BeYDV) 증폭 요소를 포함하지 않는, 핵산.
  2. 제1 항에 있어서, 발현 인핸서는 CPMVX, CPMVX+, CPMV-HT+, CPMV HT+[WT115] 및 CPMV HT+[511]로 구성된 군으로부터 선택되고,
    CPMVX는 서열 번호: 93의 X 뉴클레오타이드(여기서 X = 서열 번호: 93의 160, 155, 150 또는 114) 또는 CPMVX(여기서 X = 서열 번호: 93의 160, 155, 150 또는 114)와 80% 내지 100% 서열 유사성을 포함하는 서열을 포함하고,
    CPMVX+는 서열 번호: 93의 X 뉴클레오타이드(여기서 X = 서열 번호: 93의 160, 155, 150 또는 114) 또는 CPMVX(여기서 X = 서열 번호: 93의 160, 155, 150 또는 114)와 80% 내지 100% 서열 유사성을 포함하는 서열을 포함하고, 스터퍼(stuffer) 서열은 CMPVX 서열의 3' 끝에 융합된 1 내지 100 뉴클레오타이드를 포함하고,
    CPMV-HT+는 코모바이러스 5' 비번역 영역(UTR), 및 변형되거나 길어지거나 또는 절단된 스터퍼 서열을 포함하고,
    CPMV HT+[WT115]는 서열 번호: 189의 서열을 포함하고, 및
    CPMV HT+ [511]은 서열 번호: 188의 서열을 포함하는
    것을 특징으로 하는 핵산.
  3. 제1 항에 있어서, 발현 인핸서는 CPMV HT가 아닌 것을 특징으로 하는 핵산.
  4. 제1 항에 있어서, 변형된 HA는 HA0 전구체로서 유지되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  5. 제1 항에 있어서, 단백질 가수분해 루프는 링커 서열에 의해 완전히 대체되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  6. 제5 항에 있어서, 링커 서열은 아미노산 서열 GG, TETQ 또는 TETR을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산.
  7. 제1 항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은, 서열 번호: 98 및 100의 아미노산 25 내지 576; 서열 번호: 143의 아미노산 25 내지 559; 서열 번호: 147의 아미노산 25 내지 559; 서열 번호 154의 아미노산 25 내지 549; 서열 번호: 168의 아미노산 25 내지 577; 및 서열 번호: 194 및 199의 아미노산 25 내지 576으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  8. 제1 항에 있어서, 변형된 HA는 고유한 HA 신호 펩타이드 또는 비-고유한 HA 신호 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  9. 제1 항에 있어서, 변형된 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 연속적으로, 완전히 결실된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 변형된 HA 엑토도메인, 인플루엔자 막관통 도메인, 및 세포질 꼬리를 암호화하는 키메라 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 변형된 HA 엑토도메인은 제1 인플루엔자 균주의 것이고 막관통 도메인 및 세포질 꼬리는 제2 인플루엔자 균주의 것임을 특징으로 하는 핵산.
  10. 제1 항에 있어서, 변형된 HA는 인플루엔자 타입 A 서브타입 H3이고, 완전히 결실된 단백질 가수분해 루프는 서열 번호: 48의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  11. 제1 항에 있어서, 변형된 HA는 인플루엔자 타입 B이고, 완전히 결실된 단백질 가수분해 루프는 서열 번호: 59의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  12. 제1 항에 있어서, 변형된 HA는 인플루엔자 타입 A 서브타입 H7이고, 완전히 결실된 단백질 가수분해 루프는 서열 번호: 150의 아미노산 340 내지 357의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  13. 제1 항에 있어서, 일염기 분열 부위는 트립타제 클라라(Clara) 또는 트립신/키모트립신에 의해 인식되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  14. 제1 항에 있어서, 다염기 분열 부위는 퓨린(Furin)에 의해 인식되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  15. 제1 항에 있어서, 분열 부위는 인플루엔자 타입 B HA에 대한 아미노산 서열 KER, PAK 또는 이것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  16. 제1 항에 있어서, 분열 부위는 인플루엔자 타입 A 서브타입 H3 HA에 대한 아미노산 서열 Q/E-X-R, PEK 또는 이것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  17. 제1 항에 있어서, 분열 부위는 인플루엔자 타입 A 서브타입 H7 HA에 대한 아미노산 서열 R-X-R/K-R, RKKR 또는 이것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  18. 식물에서 인플루엔자 바이러스 유사 입자(VLP)를 생산하는 방법으로서,
    a) 핵산을 식물 또는 식물의 일부로 도입하거나 상기 핵산을 포함하는 식물 또는 식물의 일부를 제공하는 단계로서, 상기 핵산은 식물 내에서 활성인 조절 영역 및 식물 내에서 활성인 발현 인핸서를 포함하고, 조절 영역 및 발현 인핸서는 변형된 인플루엔자 타입 A 서브타입 H3 또는 H7 헤마글루티닌(HA)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합되고, 변형된 HA는 서브유닛 HA1 및 HA2 사이에 완전히 결실된 단백질 가수분해 루프를 포함하고, 완전히 결실된 단백질 가수분해 루프는 일염기(monobasic) 또는 다염기(multi-basic) 분열 부위를 포함하고, 상기 핵산은 강낭콩 황고병 바이러스(Bean Yellow Dwarf virus: BeYDV) 증폭 요소를 포함하지 않는, 단계; 및
    b) 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양하여, 이로 인해 VLP를 생산하는 단계
    를 포함하는, 식물에서 인플루엔자 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생산하는 방법.
  19. 제18 항에 있어서, 단계 a)에서 제2 핵산이 식물 또는 식물의 일부로 도입되며, 제2 핵산은 식물에서 활성이고 양성자 채널 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합된 제2 조절 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19 항에 있어서, 양성자 채널 단백질은 인플루엔자 M2 또는 BM2로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제18 항에 있어서,
    c) 식물을 수득하는 단계, 및
    d) VLP를 정제하는 단계로서, VLP는 크기가 80-300 nm의 범위에 있는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제18 항에 있어서, 핵산은 식물에서 일과성(一過性)으로 발현되거나, 핵산은 식물에서 안정하게 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 서브유닛 H1 및 H2 사이에 완전히 결실된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 변형된 HA 단백질을 생산하는 방법으로서, 단백질 가수분해 루프는 식물에서 감소되거나 폐지된 분열을 나타내는 하나 이상의 일염기(monobasic) 또는 다염기(multi-basic) 분열 부위를 포함하고, 상기 방법은
    a) 핵산을 식물 또는 식물의 일부에 도입하는 단계로서, 상기 핵산은 식물 내에서 활성인 조절 영역 및 식물 내에서 활성인 발현 인핸서를 포함하고, 조절 영역 및 발현 인핸서는 변형된 인플루엔자 타입 A 서브타입 H3 또는 H7 HA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 결합되고, 변형된 HA는 서브유닛 HA1 및 HA2 사이에 완전히 결실된 단백질 가수분해 루프를 포함하고, 완전히 결실된 단백질 가수분해 루프는 일염기 또는 다염기 분열 부위를 포함하고, 상기 핵산은 강낭콩 황고병 바이러스(Bean Yellow Dwarf virus: BeYDV) 증폭 요소를 포함하지 않는, 단계;
    b) HA 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양하여, 이로 인해 변형된 HA 단백질을 생산하는 단계, 및
    c) 식물 또는 식물의 일부를 수득하고 변형된 HA 단백질을 정제하는 단계
    를 포함하는, 변형된 HA 단백질을 생산하는 방법.
  24. 제1 항의 핵산을 포함하는 식물.
  25. 서브유닛 HA1 및 HA2 사이에 완전히 결실된 단백질 가수분해 루프를 포함하는 변형된 인플루엔자 타입 B 또는 인플루엔자 타입 A 서브타입 H3 또는 H7 헤마글루티닌(HA)으로서, 완전히 결실된 단백질 가수분해 루프는 일염기(monobasic) 또는 다염기(multi-basic) 분열 부위를 포함하고, 변형된 인플루엔자 타입 B HA는 B/Brisbane/60/2008 균주(strain) 또는 B/Wisconsin/1/2010 균주를 포함하지 않는, 변형된 인플루엔자 HA.
  26. 제25 항에 있어서, 변형된 인플루엔자 HA는 서열 번호: 37의 서열과 90-100% 서열 동일성을 포함하는 변형되지 않은 인플루엔자 타입 B HA로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 변형된 인플루엔자 HA.
  27. 제25 항에 있어서, 변형된 인플루엔자 HA는 서열 번호: 19; 서열 번호: 122의 아미노산 25 내지 574; 또는 서열 번호: 139의 아미노산 25 내지 274의 서열과 90-100% 서열 동일성을 포함하는 변형되지 않은 인플루엔자 타입 A 서브타입 H7 HA로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 변형된 인플루엔자 HA.
  28. 제25 항에 있어서, 변형된 인플루엔자 HA는 서열 번호: 150의 아미노산 25 내지 566의 서열과 90-100% 서열 동일성을 포함하는 변형되지 않은 인플루엔자 타입 A 서브타입 H7 HA로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 변형된 인플루엔자 HA.
  29. 제25 항에 따른 변형된 인플루엔자 HA를 포함하는 VLP.
  30. 제29 항에 있어서, 식물에서 유래된 하나 이상의 지질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 VLP.
  31. 제30 항에 있어서, 변형된 인플루엔자 HA는 식물-특이적 N-글리칸 또는 변형된 N-글리칸을 포함하는 것을 특징으로 하는 VLP.
  32. 면역 반응을 유도하기 위한 제29 항의 VLP의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  33. 면역 반응을 유도하기 위한 제29 항의 VLP의 유효량을 포함하는 백신.
  34. 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역력을 유도하기 위한, 제30 항의 VLP를 포함하는 면역원성 조성물.
  35. 제34 항에 있어서, 면역원성 조성물은 대상체에게 경구로, 피내로, 비강 내로, 근육 내로, 복강 내로, 정맥 내로, 또는 피하로 투여하기 위한 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  36. 식물에서 발현된 HA 단백질의 생성물 품질을 증가시키는 방법으로서,
    a) 제1 항의 핵산을 식물로 도입하는 단계;
    b) HA 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양하여, 이로 인해 변형된 HA 단백질을 생산하는 단계, 및
    c) 식물을 수득하고 변형된 HA 단백질을 정제하는 단계로서, 변형된 HA 단백질은 고유한 HA와 비교하여 생성물 품질을 증가시키는 단계를 포함하는 방법.
  37. 제36 항에 있어서, 품질은 증가된 생산 수율, 생성물의 안정성, 생성물의 일관성 또는 이것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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