KR102196527B1 - 적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 배양을 지속적으로 유지하면서도 다양한 세포 혼합물로부터 적혈구를 수거하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법에 따라, 세포 배양을 유지하는 중에 먼저 생산되어 나오는 성숙 적혈구를 분리하게 되면, 성숙 적혈구에 적합한 배양/저장 조건의 제공에 의해 성숙 적혈구의 생존율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 연속 배양 공정 중에 성숙 적혈구를 배양기로부터 분리해 냄으로써, 배지 및 배양 공간의 효율성을 꾀할 수 있게 된다. 따라서, 본 발명에 따른 성숙 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법은 체외 배양 적혈구의 최종 수득률을 높일 수 있다.

Description

적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 시스템 및 방법{A system and a method for harvesting red blood cells during culturing erythroid cells}

본 발명은 세포 배양을 지속적으로 유지하면서도 다양한 세포 혼합물로부터 적혈구를 수거하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.

수혈용 혈액 부족으로 인해 체외에서 줄기세포로부터 적혈구를 생산하는 기술에 대한 수요가 크다. 우리나라에서는 연간 약 210만 유닛(unit)의 적혈구 제제가 사용되고 있는데, 한 유닛 당 2×10¹² 적혈구가 있다고 계산하면 연간 약 4×10¹⁸ 이상의 적혈구가 필요하다. 따라서, 적혈구의 체외 배양 기술이 상용화되기 위해서는 적혈구의 대량 생산이 가능해야 할 뿐만 아니라, 얻어진 적혈구의 성숙도와 생존율이 우수하여야 한다.

체외에서 줄기세포로부터 적혈구를 생산할 때, 세포성숙단계를 거치면서 배양중에는 미성숙 혹은 성숙 적혈구계 세포들이 섞여 있게 된다. 따라서 최종 산물로부터 탈핵 적혈구, 즉 망상 적혈구(enucleated reticulocyte) 및 적혈구(red blood cell, RBC)를 분리 및 수집하기 위한 자동화된 간단하면서도 고효율적인 방법이 세포의 생존율을 높이고 생산 단가를 낮추는 데 필수적이다. 그러나 적혈구의 체외 배양법 자체가 아직 개발중인 상태에서 여러 성숙단계의 적혈구계 세포 혼합물로부터 적혈구를 수거하는 기술은 체외 생산 혈액제제의 상품화에 큰 걸림돌로 지적되어 왔다.

적혈구를 생산하기 위해 적혈구 전구체를 배양시, 배양을 유지하면서 동시에, 배양기 안에 있는 다른 lineage의 세포라든가 다양한 성숙단계에 걸쳐있는 적혈구계 세포들, 즉 이질적인 세포 집단으로부터 자동 혹은 연속적으로 외부환경으로부터 닫힌 시스템(closed system) 안에서 무균상태를 유지하며 외부환경에의 노출이 없도록 성숙 적혈구를 분리하는 방법은 보고된 바 없었다. 기존 보고된 성숙 적혈구의 분리 방법은 세포의 배양 종료 후 전체 세포를 수거하거나, 말초혈액(peripheral whole blood)으로부터 일부 유핵적혈구(주로 말초혈액에 간혹 보일 수 있는 탈핵 직전의 유핵적혈구(orthochromatic erythroblast))를 농축시켜 분석에 이용하거나, 전통적으로 실험실 내에서 이루어지는 여러가지 세포 분리 방법(flow cytometry sorter, filter 등)으로 원하는 세포를 수거하거나, 세포에서 나온 목표 최종 산출물인 항체 같은 분비 산물을 여러가지 방법으로 채집하는 것으로 모두 원심분리 후 세포가 들어있는 용기(예컨대, 보틀)를 꺼내 내부에 있는 세포 중 원하는 부분을 외부환경에 노출시켜 분리할 수밖에 없었다.

그러나 임상적용을 위한, 예컨대, 사람에게 혈관 투여되기 위한 혈액제제로 혹은 시약 생산용 적혈구 생산을 위한 배양인 경우 적혈구 분리에 있어서 다음과 같은 한계점이 있다.

1) 배양액 안에 성숙 단계가 조금씩 다른 적혈구계 세포들이 섞여 있다(빨리 탈핵하는 세포들과 나중에 탈핵하는 세포들 사이에 시간적인 편차가 있다).

2) 계속 배양을 해도 모든 세포가 일제히 성숙적혈구로 되는 시점은 찾기 힘들다.

3) 탈핵한 적혈구의 경우는 배양기 내 조건과 다른 보관 조건이 필요하여 성숙 후 빨리 분리해 주어야 한다.

4) 전체 세포에서 유핵세포를 필터링 할 경우(백혈구 필터를 이용하면 적혈구 전구체는 걸러지고 적혈구만 수거할 수 있음) 세포 손실이 너무 많은 문제가 있다.

5) 임상적용을 위해서는 전 배양 및 분리, 수거(harvest) 과정이 모두 닫힌 시스템(closed system)에서 자동화 기기 내에서 진행되어야 한다.

6) 대량생산이 가능하며, 외부환경 노출에 의한 감염 우려가 없으며, 자동화를 가능하게 해 비용절감 및 공정의 인증(qualification of process)이 가능해야 한다.

따라서, 세포 배양을 유지하는 중에 먼저 생산되어 나오는 탈핵 적혈구를 연속적이며 자동으로 분리해 낼 수 있고, 이러한 적혈구의 수거가 닫힌 시스템 내에서 수행될 수 있다면,

1) 전체 배양세포들의 배양환경에 맞추어 배양을 계속하는 한편,

2) 다른 배양/보관조건을 요구하는 적혈구를 최대한 빨리 분리하여 생존율을 높이고(기존에는 탈핵이 되어도 배양조건이 맞지 않아 금방 깨져서, 최종배양일까지 살지 못해 최종배양일의 적혈구 수득률이 낮았다),

3) 닫힌 시스템 내에서 분리한 것이므로 외부환경으로부터 오염/감염의 위험 없이 적혈구는 최종 산물로 수거해 치료에 이용할 수 있으며 유핵세포는 다시 연속적으로 배양기로 보내 배양을 계속할 수 있고,

4) 적혈구를 전체 배양 공간에서 제거하게 되면서 배지 및 배양공간 절약하게 되어 배양효율을 높이며,

5) 따라서 전체적으로 적혈구의 최종 수득률을 높일 수 있다.

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공개특허 10-2006-0030861 공개특허 10-2013-0137574

본 발명은 세포 배양을 지속적으로 유지하면서도 다양한 세포 혼합물로부터 적혈구를 수거하기 위한 시스템 및 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 세포 대량배양시 사용하기 어려운 기존의 세포분리법(flowcytometry cell sorting, 필터법, 배양물을 수거해 원심분리기에 따로 넣고 분리하는 방법 등)의 한계를 극복한 적혈구를 수거하기 위한 시스템 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 세포 배양을 지속적으로 유지하면서도 다양한 세포 혼합물로부터 적혈구를 수거하고, 미성숙 세포는 다시 배양에 이용할 수 있는 적혈구 수거 시스템 및 방법을 제공한다.

이를 위해, 본 발명은

적혈구계 세포의 체외 배양을 위한 세포 배양기;

원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기;

성숙 적혈구 저장부; 및

이들을 무균적으로 연결해 주는 연결부를 포함하고,

세포 배양을 유지하면서 동시에 성숙 적혈구를 수거하며,

적혈구계 세포의 배양, 분리, 및 성숙 적혈구의 수거가 닫힌 시스템(closed system) 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는,

적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 시스템을 제공한다.

본 발명은 또한 줄기세포, 조혈모세포, 또는 적혈구 전구세포를 세포 배양기에서 적혈구계 세포로 배양하는 단계;

상기 적혈구계 세포의 연속적인 배양 과정 중에 상기 배양된 적혈구계 세포의 일부를 원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기로 이송하는 단계;

상기 적혈구계 세포들을 세포 분리기 내에서 원심분리를 통해 적혈구계 세포들을 성숙도에 따라 분리하는 단계;

성숙 적혈구를 성숙 적혈구 저장부로 이송하는 단계를 포함하며,

상기 세포 배양기, 세포 분리기 및 성숙 적혈구 저장부는 이들을 무균적으로 연결해 주는 연결부를 통해 연결되어 있고,

닫힌 시스템 내에서 구현되는 것을 특징으로 하는,

적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 방법을 제공한다.

도 1은 본 발명에 따른 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법의 원리를 예시적으로 도시한 도면이다.

도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 시스템은 적혈구계 세포의 체외 배양을 위한 세포 배양기, 원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기, 성숙 적혈구 저장부; 및 이들을 무균적으로 연결해 주는 연결부를 포함한다.

본 발명의 시스템에는 세포 배양기, 세포 분리기, 성숙 적혈구 저장부 및 연결부 외에도, 선택적으로 세포 잔해물이나 대식세포를 모으는 폐기물 저장부 및/또는 미성숙 세포를 그의 성숙도에 따라 추가로 배양하기 위한 제2, 제3, 제4의 세포 배양기 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 세포 배양기는 적혈구계 세포의 체외 배양을 위한 챔버 또는 장치, 예컨대, 바이오리액터를 의미한다. 상기 세포 배양기는 세포 공급부 및 세포 배출부를 포함하며, 교반기, 배양 조건 모니터링 장치 및 배양 조건 조절 장치, 공기 유입부, 공기 배출부 등을 포함할 수 있다. 배양 조건 조절 장치의 일예로 세포, 공기 등의 유출입을 조절하는 부분에는 세포 배양기 내의 이들의 양을 감지하는 센서(배양 조건 모니터링 장치의 일예)의 작동에 의해 필요에 따라 세포, 공기 등의 유출입을 자동적으로 조절하는 개폐 장치 또는 밸브 등이 존재한다.

적혈구계 세포 배양을 위한 원천으로서 줄기세포, 조혈모세포, 또는 적혈구 전구세포를 세포 배양기에 공급하고, 적절한 배양 조건 하에서 적혈구계 세포로 배양할 수 있다.

본 발명에서 말하는 적혈구는 크게 유핵 적혈구와 탈핵 적혈구로 구분될 수 있으며, 체외 배양 과정을 거쳐 최종적으로 수거하고자 하는 적혈구는 탈핵 적혈구를 의미한다. 탈핵 적혈구는 망상적혈구(reticulocyte)와 적혈구(red blood cell, RBC)를 포함하는 개념이다. 핵이 빠져 나온 직후의 적혈구계 세포를 망상적혈구(reticulocyte)라고 하며 여기에 잔존해 있던 RNA 및 소기관(micro-organelles)가 없어지고 biconcave shape이 되면 성숙한 적혈구가 된다. 이러한 적혈구의 체외 배양을 위해서는 줄기세포, 조혈모세포, 적혈구 전구세포 등이 이용된다. 이들 세포들은 배양 플레이트, 바이오리액터 등의 배양 공간에서 체외 배양되며, 체외 배양 중인 세포들은 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이 여러 성숙 단계의 크고 작은 적혈구계 세포들이 혼합되어 있다.

본 발명은 세포 배양기 내에 존재하는 이러한 이질적인 세포 집단의 일부 세포를 연속적인 배양 과정 중에 자동 또는 반자동적으로 세포 분리기로 이송하고, 원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기를 통해 이들 세포들의 밀도 차이를 이용하여 다층으로 분리하는 기술을 제시한다.

이를 위해, 본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템은 세포 배양기, 세포 분리기, 성숙 적혈구 저장부; 및 이들을 무균적으로 연결해 주는 연결부 외에 이러한 기술을 구현하기 위한 제어부 및 조작부를 포함한다.

제어부에는 조작부를 통해 사용자가 입력한 지시에 따라 작동되는 프로그램이 존재한다. 조작부에서 사용자가 원심분리의 속도 및 시간 등과 연관된 팩터들을 입력하여 원심분리를 시작시키면 분리 모드가 가동된다. 원심분리 동안 또는 원심분리 후 성숙도에 따라 분리된 적혈구계 세포들은 세포 배출부를 통해 배출되어 이송 배관을 통해 제1, 제2 또는 제3의 세포 배양기, 또는 성숙 적혈구 저장부, 또는 폐기물 저장부 등으로 이송된다. 본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템은 세포의 분리와 세포의 이송이 연속적으로 이루어지게 작동시킬 수도 있고, 다르게는, 필요에 따라, 분리 모드와 이송 모드로 나누어 작동될 수도 있다. 예를 들어, 분리 모드에서는 원심분리 장치의 원심분리 처리 챔버 내로 적혈구계 세포들이 유입되고, 원심분리 되어 성숙도에 따라 분리된다. 이송 모드는 분리 모드의 작동 완료 후 자동적으로 또는 사용자가 입력한 지시에 따라 가동되어 성숙도에 따라 분리된 적혈구계 세포들을 적절한 곳으로 이송시킨다.

본 발명에 따른 세포 배양기는 적혈구의 체외 배양을 위해 사용되는 줄기세포, 조혈모세포, 적혈구 전구세포 등이 공급될 수 있는 세포 공급부를 포함한다. 세포 공급부는 세포뿐만 아니라 세포 배양을 위한 배지 등의 성분이 공급될 수도 있다.

상기 세포 배양기는 세포 분리기로 배양 중인 세포의 일부를 보내기 위한 세포 배출부를 포함한다. 또한, 세포 분리기로의 세포의 이동을 자동적으로 혹은 수동적으로 수행하기 위해 펌프를 포함할 수 있다. 적혈구계 세포의 연속적인 배양 과정 중에 상기 배양된 적혈구 세포의 일부를 세포 배양기로부터 세포 분리기로의 이송하는 과정은 자동적으로 혹은 수동적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 바이오리액터에서 배양 중인 세포의 일부를 세포 배출부를 통해 소정의 시간 간격을 두고 정기적으로 또는 비정기적으로 펌프를 이용하여 세포 분리기로 이송할 수 있다.

상기 세포 배양기는 세포 배양액을 교반할 수 있는 교반기, 온도 및 산소 등의배양 조건을 모니터링하는 장치 및 모니터링 결과에 따라 배양 조건을 제어 및 조절하는 장치, 산소 등의 공기를 유입시킬 수 있는 공기 유입부, 불필요한 공기를 배출하는 공기 배출부 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 시스템은 세포 배양을 유지하면서 동시에 성숙 적혈구를 분리하며, 적혈구계 세포의 배양, 분리, 및 성숙 적혈구의 수거가 닫힌 시스템(closed system) 내에서 수행되는 것을 특징으로 한다. 여기에서, 닫힌 시스템 내에서 수행된다는 것은 다시 말해 적혈구계 세포의 배양, 분리, 및 성숙 적혈구의 수거를 위한 전 공정이 외부환경에의 노출 없이 무균 상태의 닫힌 공간 내에서 수행됨을 의미한다.

앞서 설명한 바와 같이, 세포 배양기 내에서 배양된 적혈구계 세포들은 성숙도가 각기 다르며, 이들 모두가 성숙 적혈구가 되는 시점을 찾기 힘들고, 이들 세포의 성숙도에 따라 적절한 배양 조건은 제각기 다르다. 따라서, 성숙된 적혈구를 수거하는 것과 동시에, 성숙도가 각기 다른 적혈구계 세포들 중에서, 아직 탈핵되지 않은 미성숙 세포는 다시 성숙 적혈구가 될 때까지 추가로 배양할 필요가 있다.

이를 위해, 상기 세포 배양기는 세포 분리기로부터 탈핵되지 않은 미성숙 세포를 다시 받아들일 수 있는 미성숙 세포 유입부를 포함할 수 있다. 이러한 미성숙 세포 유입부는 세포 배양기의 세포 공급부와 동일한 것일 수도 있고 별도로 존재할 수도 있다. 예를 들어, 세포 배양기의 세포 공급부로 들어가는 이송 배관에 미성숙 세포 유입을 위한 이송 배관이 연결부를 통해 연결될 수 있다.

다르게는 세포 배양기의 공급부와는 별도로 미성숙 세포 유입부가 존재하여, 세포 분리기의 세포 배출부를 통해 배출된 미성숙 세포가 이송 배관을 통해 미성숙 세포 유입부로 이동될 수 있다.

한편, 세포 배양기 또는 본 발명의 시스템은 세포 분리기로부터 세포 배양기로의 미성숙 세포의 재유입을 자동적 혹은 수동적으로 수행하기 위해 펌프를 포함할 수 있다.

다르게는, 상기 시스템은 원심분리 후 탈핵되지 않은 미성숙 적혈구계 세포의 추가의 성숙을 위한 별도의 세포 배양기를 추가로 포함할 수 있다. 적혈구의 체외 배양을 위해 초기에 세포 배양기로 공급되는 줄기세포, 조혈모세포, 적혈구 전구세포 등에 비해, 탈핵되지 않은 미성숙 적혈구계 세포는 추가의 배양 시간이 짧고, 적절한 배양 조건이 이들 초기 공급 세포와는 상이할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 시스템은 적혈구계 세포의 체외 배양을 위한 세포 배양기를 복수 개 포함할 수 있다. 즉, 초기에 공급되는 줄기세포, 조혈모세포, 적혈구 전구세포 등을 배양하는 세포 배양기를 제1 세포 배양기라 한다면, 미성숙 적혈구계 세포의 추가의 성숙을 위한 별도의 세포 배양기를 성숙도 별로 나누어 제2 세포 배양기, 제3 세포 배양기, 제4 세포 배양기라고 할 수 있다. 제2, 제3, 제4의 세포 배양기는 미성숙 적혈구계 세포를 세부적으로 분리하여 배양할 필요가 있는 경우 적절한 수로 둘 수 있다. 세포 분리기와 이들 세포 배양기는 무균적으로 연결해 주는 연결부에 의해 연결되어 있으며, 제2, 제3, 제4 세포 배양기는 제1 세포 배양기와 마찬가지로 세포 공급부(혹은 세포 유입부), 세포 배출부, 세포 배양액을 교반할 수 있는 교반기, 온도 및 산소 등의 배양 조건을 모니터링하는 장치 및 모니터링 결과에 따라 배양 조건을 제어 및 조절하는 장치, 산소 등의 공기를 유입시킬 수 있는 공기 유입부, 불필요한 공기를 배출하는 공기 배출부 등을 포함할 수 있다.

한편, 적혈구계 세포의 연속 배양 과정 중에 상기 배양된 적혈구계 세포의 일부는 원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기로 이송된다. 상기 적혈구계 세포들을 세포 분리기 내에서 원심분리를 통해 적혈구계 세포들을 성숙도에 따라 분리된다.

상기 세포 분리기는 세포 배양기로부터 보내진 세포를 받아들일 수 있는 세포 유입부를 포함한다. 또한, 세포 배양기로부터의 세포의 이동 또는 세포 분리기로부터 성숙 적혈구 저장부 또는 폐기물 저장부 등으로의 세포의 이동을 자동적으로 혹은 수동적으로 수행하기 위해 펌프를 포함할 수 있다. 세포 분리기의 세포 유입부와 세포 배출부, 원심분리 장치 등에는 유입 또는 배출되는 세포의 양 또는 부피 등을 감지하는 센서, 원심분리의 속도 등의 작동 조건을 감지하는 센서 등이 존재한다. 또한, 이들 센서의 작동에 의해 필요에 따라 세포 등의 유출입을 자동적으로 조절하는 개폐 장치 또는 밸브 등이 존재한다. 본 발명에 있어서, 센서나 자동 조절 개폐 장치 또는 밸브 등은 사용자가 조작부에 입력한 지시에 따라 혹은 미리 시스템에 입력된 소정의 조건에 따라 제어부에 의해 자동 또는 수동으로 조절된다.

본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템에서 사용되는 세포 분리기는 원심분리 장치를 포함한다.

본 발명에서 사용되는 세포 분리기는 특별히 제한되지 않으나, 세포를 계속적으로 원심분리 장치로 유입시켜서 세포들을 분류시키면서 동시에 상층과 하층을 분리시켜 세포를 수거하는 과정이 자동적 그리고 연속적으로 이루어 질 수 있는 기기를 이용한다.

이러한 세포 분리기로는 예를 들어, 연속류 원심분리 성분채집 시스템(continuous-flow centrifugal apheresis system)일 수 있다. 상기 연속류 원심분리 성분채집 시스템은, 예컨대, 환자 치료용 혈액성분분리기(blood component separator) 혹은 혈장교환용 기기(Therapeutic Plasma Exchange System) 등의 용도로 활용되고 있다. 이러한 기기들은 본래 비교적 원심력만으로 분리가 용이한 말초혈액을 대상으로 개발된 것으로, 사람 혈관에서 전혈(whole blood)을 뽑아서 또는 이미 채취된 전혈을 원심분리기로 보내고 이를 원심분리하여 혈장, 백혈구층 혹은 성숙 적혈구를 분리하기 위해 만들어진 것이다. 종래에는 적혈구계 세포의 체외 배양이 연속적으로 이루어지고 있는 세포 배양기와 연속류 원심분리 성분 채집 시스템을 연결하여, 세포 배양을 유지하면서 동시에 성숙 적혈구를 수거하며, 적혈구계 세포의 배양, 분리, 및 성숙 적혈구의 수거가 닫힌 시스템(closed system) 내에서 수행하고자 한 적은 없었다.

원심분리 장치는 회전하는 로터(rotor), 로터와 연결된 회전 디스크, 회전 디스크에 수용되는 원심분리 처리 챔버 등을 포함한다. 세포 배양기로부터 이동한 적혈구계 세포들은 세포 분리기의 원심분리 장치 내 원심분리 처리 챔버로 보내지며, 혈액 세포의 성숙도에 따라 밀도가 다르기 때문에 원심분리 후에는 성숙도에 따른 세포 집단과 세포 잔해물로 세포층이 분리된다. 예를 들어, 세포 집단들이 위치하는 층들 중 하층에는 가장 무거운 세포인 탈핵 적혈구가 배치되며 상층에 유핵 세포가 배치되게 된다.

또한, 상기 세포 분리기는 원심분리 후 다층으로 분리된 세포들을 배출하는 세포 배출부를 포함한다.

세포 분리기에서, 세포 배출부는 하나 또는 복수로 구비될 수 있다. 세포 배출부에는 배출을 원하는 세포층을 이동시키기 용이하도록 튜브 또는 파이프가 연결되어 있을 수 있다.

세포 배출부가 복수 개일 경우, 예를 들어, 탈핵되지 않은 미성숙 세포를 다시 본래의 세포 배양기(제1 세포 배양기) 또는 추가의 성숙 배양을 위한 세포 배양기(제2, 제3의 세포 배양기)로 보낼 수 있는 미성숙 세포 배출부, 성숙 적혈구를 성숙 적혈구 저장부(별도의 저장 용기나 혈액백)로 이동시킬 수 있는 성숙 세포 배출부, 세포 잔해물과 대식세포 등을 폐기 공간으로 이동시킬 수 있는 폐기물 세포 배출부를 포함할 수 있다. 이 경우 복수 개의 세포 배출부는 상기 세포 배양기, 성숙 적혈구 저장부, 폐기물 저장부 등과 연결부를 통해 연결되어 있을 수 있다.

다르게는, 세포 배출부는 하나이되 시간차를 두고 순차적으로 분리하거나 제1, 제2 또는 제3의 세포 배양기, 또는 성숙 적혈구 저장부, 또는 폐기물 저장부와 연결되는 복수 개의 배관 라인을 통해 선별적으로 분리하여, 배출하는 것도 가능하다. 또한, 이러한 세포 배출을 자동적 혹은 수동적으로 수행하기 위해 펌프를 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 탈핵되지 않은 미성숙 세포를 세포 분리 전에 배양되던 본래의 세포 배양기('제1 세포 배양기'라고도 한다)로 돌려보내지 않고, 미성숙 세포의 추가의 성숙을 위한 별도의 세포 배양기('제2 세포 배양기'라고 한다)로 보낼 수 있다.

즉, 본 발명에 있어서 세포 배양기는 복수 개로 존재할 수 있으며, 세포 배양에 따른 세포의 성숙 상태에 따라, 제2, 제3, 제4 등의 세포 배양기를 둘 수 있다. 제1 배양기와 세포 분리기가 연결부를 통해 연결되어 있는 것처럼, 제2, 제3, 제4의 세포 배양기 또한 세포 분리기와 연결부를 통해 무균적으로 연결된다.

세포의 성숙 단계에 따라 교반 속도, 온도 조건, 산소 농도 등의 배양 조건, 배양 배지는 모두 달리 적용될 수 있으며, 세포 성숙 단계에 따른 이들 조건은 당업자에 의해 적절히 변경될 수 있다.

또한 세포들을 원심분리 장치로 이동시킬 때 소정의 밀도를 갖는 하나 또는 복수개의 밀도 구배 시약을 추가하게 되면, 원심분리되면서 밀도구배에 의해 이질적인 세포들이 미성숙 적혈구계 세포, 탈핵된 망상적혈구, 성숙 적혈구 등의 성숙 단계별 세포 집단과 세포잔해물(debris) 등으로 분리되어, 이들 각각은 서로 다른 여러 개의 층에 위치하게 되어 더 정밀한 분리도 가능하다.

이처럼 세포층의 정밀한 세분화가 필요할 경우에는 Ficoll (Ficoll-Hypaque plus, Sigma)나 Percoll 시약을 이용해 밀도 구배(density gradient)법에 따라 적혈구 전구세포와 탈핵 적혈구/ 적혈구 층을 더 정확하게 분리할 수 있다.

이에 제한되는 것은 아니나, 1회의 원심분리에 하나 또는 복수개의 밀도 구배 시약을 사용할 수 있으며, 이러한 원심분리 단계는 1회 이상 수행될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 한 구체예에서, 밀도 구배 시약을 이용한 원심분리 단계는 다양한 밀도 구배 시약을 이용하여 한번의 원심분리를 통해 세포들을 분리할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 밀도 구배 시약을 이용한 원심분리 단계는 단계적으로 수행될 수도 있다. 예를 들어, Ficoll을 사용후 Percoll을 이용하여 원심분리하던가, 적혈구의 성숙 정도에 따라 일부 층만 분리한 후, 추가적으로 밀도 구배 시약을 이용하여 더 미세하게 세포들을 분리할 수도 있다.

본 발명에서 밀도구배법을 적용하기 위해 사용할 수 있는 구동용액으로는 밀도구배를 위해 사용되고 있는 통상의 구동용액이면 어떠한 것이든 사용가능하며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 밀도구배를 위한 구동용액으로는 다음과 같은 것을 사용할 수 있다.

1) Percoll: a specific gravity 1.130 g/ml

2) Ficoll-Hypaque is a mixture of Ficoll (polysucrose) and Hypaque (sodium diatrizoate).　Ficoll-Hypaque Plus Product No. 10771 is a mixture of polysucrose and sodium diatrizoate at a density of 1.077 g/ml.

3) Histopaque-1077 is a sterile, endotoxin tested solution of polysucrose and sodium diatrizoate, adjusted to a density of 1.077g/mL.

혈액 세포들의 밀도는 잘 알려져 있으므로 당업자라면 밀도 구배를 설정하기 위해, 각기 종류가 다른 용액들을 조합하여 다양한 밀도 구배를 설정할 수도 있고, 다르게는 한 종류의 용액을 다양한 농도로 희석하여 원하는 세포 분리에 적합하도록 다양한 밀도 구배를 설정할 수 있다.

예를 들어, 비중이 1.090 보다 가벼우면 (비중 <1.090) 성숙적혈구 외의 유핵적혈구와 다른 계열 세포들(leukocytes)가 분리되며, 비중이 1.090보다 무거우면 (>1.090) 적혈구가 거의 순수하게 분리된다. 적혈구층에 일부 섞일 수 있는 과립구 (중성구, neutrophil; 호산구, eosinophils)는 백혈구제거필터(leukoreducing filter)를 이용하면 99.9% 이상 제거되므로, 최종적으로 순도 높은 적혈구를 수거(harvest)할 수 있다.

혼합되어 있는 세포 종류에 따라 밀도구배를 이용한 원심분리 단계는 1회 이상 수행될 수 있으며, 이 때 사용되는 구동 용액을 달리 설정할 수 있다. 예를 들어, 적혈구계 세포(erythroid cell)가 아닌 다른 lineage의 세포들, 예컨대, 백혈구 (예를 들어 과립구, 단핵구(monocyte), 대식세포(macrophages))가 세포 배양물 내에 다량으로 섞여 있는 경우, Ficoll-Hypaque를 처리하고 원심분리하여 먼저 leukocyte 를 분리 후 percoll을 처리하여 원심분리하여 적혈구계 세포들을 재분리하는 과정을 수행하거나, 한번에 여러 밀도 구배를 갖는 구동용액들을 사용하여 원심분리할 수도 있다.

한편, 본 발명에 따른 세포 분리기는 여러 층으로 분리될 수 있는 세포 집단과 세포 잔해물들을 분리 및 수거할 수 있도록 해 준다.

원심분리에 의해 분리된 각각의 층 내에서 원하는 세포들만을 분리, 수거하는 기술은 잘 알려져 있으며, 특정 기술에 국한되지 않는다. 예를 들어, 세포 분리기의 세포 배출부에 연결된 튜브의 길이나 세포 배출부의 위치 차이를 이용하여 각각의 층으로부터 원심분리되고 있는 세포들을 각 튜브(배관)을 통해원하는 곳으로 보낼 수도 있고, 원심분리된 층들을 차례대로 올려 보내거나 내려 보내면서 순서대로 나오는 것을 분리할 수도 있다. 또한, 각각의 층의 색을 인지하여 원하는 층만 분리해 낼 수도 있다. 세포 분리기는 이러한 기술을 구현하기 위한 제어부 및 조작부를 포함한다. 예를 들어, 세포 분리기의 원심분리 장치의 세포 배출부와 인접한 곳에 자동적 혹은 사람이 입력한 비율이나 배출 배관 내 용액 색상에 따라 원심분리된 세포층의 일부분이 자동적으로 연결부를 통해 배출될 수 있도록 해 주는 센서가 구비될 수 있다.

예컨대, 상기 센서는 세포 배출부와 연결될 배출 배관을 통해 배출되는 적혈구계 세포들을 포함하는 용액의 부피 또는 색상을 감지하는 센서일 수 있다. 일예로, 광학 센서는 원심분리된 세포들이 배출되는 세포 배출부와 연결된 배출 배관 색상을 감지하고, 이러한 색상 정보를 제어부로 보낸다. 제어부는 배출 배관의 색상 정보에 따라 복수 개의 이송 배관 중 색상 정보와 매치되는 이송 배관을 세포 분리기의 세포 배출부와 연결시킨다. 이러한 이송 배관의 이동은 제어부와 연결된 모터에 의해 구동될 수 있다. 또한, 상기 배출 배관 또는 이송 배관은 제어부에 의해 자동적으로 제어가능한 밸브를 통해 열리거나 차단될 수 있다.

하기 실시예에서 사용된 'TERUMO BCT spectra Optia Asheresis System'는 원심분리된 각각의 층의 색을 인지하여 각 층에 포함된 성분을 분리해 주는 기능을 갖고 있다.

본 발명의 적혈구 수거 시스템은 최종적으로 수거해야 하는 대상인 탈핵 적혈구계 세포, 즉 탈핵 망상세포 및 적혈구는 정제, 농축 및 보관을 위해 따로 성숙 적혈구 저장부로 이동시키고, 여러 층 중 세포잔해물이나 백혈구와 같은 다른 계열(lineage)의 세포는 폐기를 위해 폐기물 저장부로 이동시키고, 미성숙 적혈구계 세포들을 다시 본래의 세포 배양기로 돌려보내거나 제2, 제3 등의 추가의 세포 배양기로 보내 배양을 계속할 수 있다. 이렇게 되면, 탈핵 적혈구계 세포를 최종 수거 공간(성숙 적혈구 저장부)으로 보내 신속히 분리함으로써, 탈핵 적혈구를 위한 배양 조건에서 별도 저장할 수 있어 체외 배양 적혈구의 최종 수득률을 높일 수 있다.

성숙 적혈구 저장부는 용기 또는 혈액백일 수 있다. 탈핵 적혈구계 세포의 집단으로부터 백혈구 등의 추가의 세포 분리가 필요한 경우에는 용기 형태의 성숙 적혈구 저장부에 일단 저장한 후 다시 백혈구 필터 등을 이용하여 최종 정제 산물을 얻을 수 있다. 만일 탈핵 적혈구계 세포 집단의 순도가 높아 추가의 세포 분리가 불필요하다면 성숙 적혈구 저장부로서 혈액백을 사용할 수 있다. 성숙 적혈구를 수용하는 혈액백은 무균 연결장치 또는 무균 연결부를 통해 세포 분리기의 세포 배출부와 연결된다. 상기 혈액백은 사전에 항응고보존제가 충전되어 있을 수 있다.

본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템은 앞서 설명한 세포 배양기와 세포 분리기 등의 본 발명의 시스템 내의 각 부를 연결해 주는 연결부를 포함한다. 앞서 설명한 배출 배관 또는 이송 배관 또한 이러한 연결부에 포함되는 개념이다.

본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템에서 상기 연결부의 형태는 특별히 제한되지 않는다. 튜브 또는 파이프와 같은 형태일 수도 있고, 튜브와 튜브 사이에 연결 장치가 포함되어 있어도 무방하다. 연속류 원심분리 성분채집 시스템과 같은 종래의 기술에서 이미 이용되고 있는, 각 튜브를 무균적으로 연결해 주는 SCD (sterile connecting device)를 사용할 수도 있다. 도 1은 세포 배양기의 세포 배출부에 연결된 튜브와 세포 분리기의 세포 유입부에 연결된 튜브를 무균 연결 장치로 연결한 시스템을 도시하였다.

앞서 설명한 바와 같이, 세포 배양기와 세포 분리기를 무균적으로 연결하여, 닫힌 시스템 내에서 유핵 적혈구와 탈핵 적혈구를 구분하는 것은 체외 배양 적혈구의 임상 적용을 위해 매우 중요한 의미를 갖는다. 추가로, 본 발명에 따른 시스템 및 방법은 상기 분리된 탈핵 적혈구계 세포를 다시 탈핵 망상세포와 적혈구로 분리하는 것을 포함할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 탈핵 망상세포와 적혈구가 높은 순도로 존재하는 세포 배양물의 경우에는 밀도구배 시약을 사용하지 않고도 원심분리를 수행하면 상대적으로 가벼운 탈핵 망상세포를 순도는 높지 않지만 대략적으로 분리해 낼 수 있다. 이 경우 적혈구는 바로 냉장온도에 저장할 수 있는 저장공간으로 이동시키고, 탈핵 망상세포는 추가 성숙 공정을 위한 공간으로 이동시켜 별도로 성숙시키는 과정을 자동, 연속적으로 구현할 수 있다.

본 발명의 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법에 따라, 세포 배양을 유지하는 중에 먼저 생산되어 나오는 탈핵 적혈구계 세포를 분리하게 되면, 탈핵 적혈구계에 적합한 배양/저장 조건의 제공에 의해 적혈구의 생존율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 연속 배양 공정 중에 탈핵 적혈구계 세포를 배양기로부터 분리해 냄으로써, 배지 및 배양 공간의 효율성을 꾀할 수 있게 된다. 또한, 세포 배양기와 세포 분리기가 연결부를 통해 연결된 닫힌 시스템 내에서 적혈구의 수거가 가능하기 때문에, 오염이나 감염 없이 최종 생산물을 임상에 이용할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법은 체외 배양 적혈구의 최종 수득률을 높이며 안전성을 보장해 사람에게 투여할 수 있는 시스템을 제공한다.

도 1는 본 발명에 따른 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법을 예시적으로 도시한 도면이다.
도 2는 각각 다른 케이스의 적혈구계 세포 배양시 Wright-Giemsa 염색을 한 결과를 보여주는 사진으로, 각 케이스마다 다른 비율로 미성숙 적혈구계 세포들과 탈핵된 적혈구 세포가 섞여 있음을 보여준다.
도 3 내지 6 은 분리 전 섞여 있는 세포들의 종류별로 밀도구배 및 원심분리 후의 다층 분리된 세포들을 분리 및 수거하는 과정 및 세포가 분리된 결과를 보여주는 사진이다.
도 7는 구동용액을 이용한 세포 분리 후 세포 안전성 확인한 결과를 보여준다.
도 8 및 도 9는 구배용액을 이용한 세포주와 적혈구계 세포의 분리 결과를 보여주는 사진이다.
도 10은 교반강도의 조절을 통한 적혈구계 세포의 분리가 가능함을 보여주는 결과이다.
도 11 및 12는 연속류 원심분리 성분채집 시스템의 하나인 'spectra optia apheresis system'을 본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템에 적용하여 실험의 개략도와 실험 결과를 보여준다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[실시예]

[실시예 1] 본 발명에 따른 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법

도 1은 본 발명에 따른 적혈구의 수거를 위한 시스템 및 방법을 개략한 도면이다. 본 발명의 시스템은 세포 배양 공간, 예컨대, 바이오리액터와 원심분리기기가 무균적으로 하나의 tubing으로 연결되어 있다. 도 1 및 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 배양 중인 세포 집단에는 미성숙 적혈구계 세포, 탈핵된 망상적혈구 및 성숙 적혈구들이 섞여 있다. 본 발명은 세포 배양 공간 내에 존재하는 이러한 이질적인 세포 집단의 일부 세포를 연속적인 배양 과정 중에 자동 또는 반자동적으로 세포 분리기로 보내고, 세포 분리기를 통해 이들 세포들을 다양한 밀도 차이를 이용하여 다층으로 분리하는 기술을 제시한다. 세포 배양 공간에서 이동한 세포들은 세포 분리기 내의 원심분리 장치 안으로 보내지며, 원심분리 결과 하층에 가장 무거운 세포인 성숙 적혈구가 배치되며 상층에 유핵세포가 배치되게 된다. 이들은 이 기기에서 자동/반자동으로 상층 세포를 다시 배양기로 돌려보내게 되며 하층은 최종적으로 성숙 적혈구 저장부(적혈구 채집백)으로 보내지게 된다.

[실시예 2] 체외 배양 중인 적혈구계 세포 내의 이질적 세포 집단 확인

각각 다른 샘플의 제대혈로부터 CD34+ 세포를 분리하여 무혈청 배양 배지에서 적혈구로 성숙시키며 배양시켰다. 도 2은 이렇게 체외 배양한 적혈구계 세포에 대해 Wright-Giemsa 염색한 결과를 보여주는 사진으로, 매 배양 시마다 다양한 정도로 구성되는 적혈구계 세포들의 분포를 보여준다. 세포가 클수록 미성숙한 적혈구임을 나타내며, 빨간 화살표는 탈핵한 적혈구를 나타낸다.

[실시예 3] 구배용액을 이용한 세분화된 적혈구계 세포의 분리 1

70% isotonic Percoll, 45% isotonic Percoll을 아래 표와 같이 준비한다.

Isotonic percoll : 원액 100% Percpll과 10X PBS를 9:1 비율로 혼합PBS (phosphate buffered saline)

도 3은 적혈구계 세포 배양 중 두 가지 구배용액을 이용한 세분화된 세포 분리 예를 보여준다. 제대혈 조혈모세포(CD34+ cell)를 약 8일간 배양하면 거의 균일한 호염기성 적아구(basophilic erythroblast)가 되고(A), 이를 일주일 더 배양하면 다염성 적아구(polychromatic erythroblast)와 탈핵 직전 유핵세포인 정염성 적아구(orthochromatic erythroblast)가 대부분을 차지하게 된다(B). 이를 70% Percoll과 45% Percoll 두 가지 비중의 구동용액 위에 얹은 후(C) 원심분리하면(D) 상층(top)에 하얀색의 죽은 세포(debris) 혹은 대식세포가 분리되고(E), 빨간색 중간(middle) 층에 미성숙 적혈구계세포가 분리되며(F), 제일 하층(bottom)에 정염성 적아구가 90% 넘는 순도로 분리된다(G). 도 3에서 세포 사진은 Wright-Giemsa 염색 사진을 나타낸다.

[실시예 4] 구배용액을 이용한 세분화된 적혈구계 세포의 분리 2

70% isotonic Percoll, 45% isotonic Percoll을 아래 표와 같이 준비한다.

Isotonic percoll : 원액 100% Percpll과 10X PBS를 9:1 비율로 혼합PBS (phosphate buffered saline)

제대혈 CD34+ cell로부터 약 8일간 배양하면 거의 균일한 basophilic erythroblast가 되고(도 4A), 이를 일주일 더 배양한 세포 혼합물(도 4B) 을 기본배지(IMDM) 3ml 에 넣고 70% isotonic Percoll 3ml 위에, 45% isotonic Percoll 3ml을 얹고 세포 혼합물을 맨 위에 올린다. 이것을 1200 g에서 원심분리를 15분간 수행하였다. 그 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 밀도구배에 의해 다층으로 분리된 세포들을 얻을 수 있었다. 40% Percoll 용액 윗층에는 죽은 세포들과 찌꺼기 및 대식세포가 분리되었으며(도 4C), 40%와 70% Percoll 중간층에는 일부 미성숙세포가 분리되었다(도 4D). 70% isotonic Percoll (0.791 g/ml) 아랫층에는 polychromatic- 또는 orthochromatic- erythroblast (탈핵 전 유핵적혈구)가 분리된다. 도 4E는 정염성 적아구의 모습을 나타낸 사진으로, 95% 이상의 순도로 수득되었으며 생존도도 99.4%였다. 분리 전 세포구성에 따라 각 원심분리 조건은 유동적으로 적용시킬 수 있다.

유핵적혈구는 media flow (agitation, pipetting, stirring) 등의 자극이 필요하므로, 이들을 따로 교반 탱크형 생물반응기(stirred tank bioreactor) 등으로 보내어 탈핵시킬 수 있다.

[실시예 5] 구배용액을 이용한 세분화된 적혈구계 세포의 분리 3

도 5는 미성숙 세포가 많은 세포 혼합물로부터 구배용액을 이용하여 분리한 예를 보여준다.

도 4와 같은 방법으로 미성숙세포가 좀 더 많은 세포혼합물을 구배용액을 통해 분리시, 중간 층에는 호염기성 적아구 및 다염색성 적아구가 주로 분리되고(왼쪽 사진), 하단에는 오른쪽 사진의 정염성 적아구가 분리됨을 알 수 있다.

[실시예 6] 구배용액을 이용한 세분화된 적혈구계 세포의 분리 4

도 6은 망상적혈구와 적혈구가 많은 세포혼합물로부터 구배용액을 이용해 분리한 예를 나타낸다. 망상적혈구와 적혈구가 많은 세포혼합물로부터 구배용액을 이용해 1200g로 15분 동안 원심분리하고, Isotonic percoll 45%와 70% 사이의 층에서 망상 적혈구(reticulocyte) 층을 분리하여 brilliant cresyl blue (BCB) 염색 후 세포를 확인한 결과, 망상적혈구(파란 침착물이 보이는 세포)가 순도 높게 분리된다.

[실시예 7] 구동용액을 이용한 세포 분리 후 세포 안전성 측정

추가의 배양이 필요한 미성숙 적혈구계 세포는 다시 배양공간으로 돌려 보내어 탈핵 적혈구계 세포가 될 때까지 배양할 수 있다.

본 발명자들의 실험 결과, 이러한 미성숙 적혈구계 세포를 다시 배양액으로 이동시켜 배양하더라도 viability 의 손상 없이 다시 배양 가능하다는 것이 확인되었다.

도 7은 구동용액을 이용하여 세포를 분리한 후 세포의 안전성을 측정한 결과를 도시한 것이다. 세포 배양기로부터 적혈구계 세포(3 cases)를 모은 후 Percoll 구동용액 위에 얹은 후 원심분리하였다. 도 7A 및 7B는 적혈구계 세포 Case1 (4x10⁸), case 2(2x10⁸), case 3(2x10^⁷) 의 체외 배양 후 구동용액으로 1200g, 15min 원심분리한 결과 및 이들 세포의 Wright-Giemsa 염색결과를 나타낸다. 원심분리된 세포들을 수거하여 분리된 Orthochromatic erythroblast의 세포수를 계수하고 트리판 블루 염색하여 생존도(viability)((살아있는 세포수/전체 세포수)*100)를 측정한 결과, 도 7C 및 7D에서 확인할 수 있는 바와 같이, 세포생존도가 대부분 높아서 구동용액이 세포에 위해가 되지 않음을 확인하였다(도 7C: 최종세포수 = 세포수 X 세포 생존도(%), 도 7D: 생존도 = (살아있는 세포수/전체 세포수)*100). 또한 애초 세포 배양에 사용되었던 조혈모세포(CD34+ cell)도 Percoll 용액을 통해 분리 후 배양한 것이어서 구동용액이 세포의 분리 및 재배양에 안전함을 보여준다.

[실시예 8] 구배용액을 이용한 세분화된 세포주 및 적혈구계 세포의 분리 1

미성숙 적혈구 세포와 세포밀도가 비슷한 세포를 찾기 위해 Hela 세포주, K562 세포주, Adult RBC, 및 Young RBC를 각각의 튜브에서 구배용액을 이용해 분리층을 먼저 확인하였다. 각각의 세포주 및 적혈구계 세포들을 구배용액을 이용하여 400g로 30분 동안 원심분리한 결과, 도 8A에서 볼 수 있는 바와 같이, 45%와 70% Percoll 중간층에는 Hela 세포주 와 K562 세포주가 분리되었고, Young RBC와 Adult RBC는 70%와 93% Percoll 사이에서 확인되었다. Young RBC가 Adult RBC보다 약간 위쪽에 분포되는 것을 확인되었다. 도 8B의 세포 사진은 Wright-Giemsa 염색 사진을 나타낸다.

[실시예 9] 구배용액을 이용한 세분화된 세포주 및 적혈구계 세포의 분리 2

세포주 및 적혈구계 세포들, 그리고 이들의 혼합물을 각각의 시험관에 넣고 구배용액을 이용하여 400g로 30분 동안 원심분리한 결과, 도 9A에서 볼 수 있는 바와 같이, K562 세포주와 미성숙한 적혈구계 세포들과 탈핵 전 유핵적혈구(orthochromatic- erythroblast)와 성숙 RBC가 분리되는 것을 확인하였다. 그러나 일부 탈핵 전 유핵적혈구가 다른 세포층에 섞여 있는 것을 확인되었다. 도 9B의 세포 사진은 Wright-Giemsa 염색 사진을 나타낸다.

실시예 8 및 9의 결과는 교반강도의 조절을 통해 유핵 적혈구를 성숙시기에 따라 최적으로 분리할 수 있음을 확인하기 위해, 세포층 분리를 가시화시켜 분리된 세포들을 용이하게 분리해 낼 수 있게 해 주는 구배용액을 이용하여 적절한 조건을 찾을 수 있음을 보여준다.

[실시예 10] 교반강도의 조절을 통한 적혈구계 세포의 분리

세포 분리에 적합하도록 다양한 밀도 구배를 설정하기 위해 교반강도와 시간을 조절하여 분리를 진행하였다. 도 10은 400g에서 30분(도 10A) 또는 1200g에서 15분(도 10B) 동안 각각 원심분리를 진행하여 탈핵 전 유핵적혈구(orthochromatic- erythroblast)와 성숙 적혈구 분리하였다. 400g에서 30분 동안 원심분리한 세포는 두 층으로 분리되어 위층에 일부 죽은 세포와 orthochromatic erythroblast, 아래층에 orthochromatic erythroblast와 RBC가 관찰되었다(도 10A). 1200g에서 15분 동안 원심분리된 세포는 세 층으로 분리되어, 위층에 일부 터져 죽은(apoptotic or necrotic 단계의) 세포와 orthochromatic erythroblast, 중간층에 대부분의 orthochromatic erythroblast와 일부 RBC, 아래층에는 일부 orthochromatic erythroblast와 대다수의 RBC 세포가 관찰되었다(도 10B). 높은 교반강도를 적용시켰을 때 세포의 분리가 명확히 갈리는 것이 확인되었다. 도 10의 세포 사진은 Wright-Giemsa 염색 결과를 나타낸다.

기존 문헌과 달리 orthochromatic erythroblast는 전 층에 걸쳐 나오기 때문에 단순 비중 차이로 잘 분리되지 않음을 알 수 있으며, 적절한 원심분리힘 (specific gravity) 에 의해서 적혈구와 층이 분리되는 정도가 다름을 알 수 있었다.

[실시예 11] 성분채집 시스템을 이용한 적혈구계 세포의 분리

연속류 원심분리 성분채집 시스템의 하나인 'spectra optia apheresis system'을 본 발명에 따른 세포 분리기의 일례로 사용하였다. 도 11 및 12는 연속류 원심분리 성분채집 시스템의 하나인 'spectra optia apheresis system'을 본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템에 적용하여 실험의 개략도와 실험 결과를 보여준다.

연속류 원심분리 성분채집 시스템을 세포 분리기로서 본 발명에 따른 적혈구 수거 시스템에 적용할 수 있다는 점을 보이기 위한 실험이나, 'spectra optia apheresis system'을 적절히 구동하기 위해서는 세포 배양기로부터 공급되는 적혈구계 세포의 양이 상당히 많이 준비되어야 하는 현실적 문제가 있다. 따라서, 본 실시예에서는 충분한 양의 세포로 적절한 실험을 하기 위해 전혈 400ml과 함께 유핵세포로서 4.2X10⁸의 CD34- 세포와, 6.7X10⁷의 K562 세포를 혼합하여 사용하였다. 세포 배양기에 상기 세포들과 함께, 생리식염수 1L, 및 항응고보존제인 ACDA 용액을 넣었다. 세포 배양기의 세포 배출부를 튜브를 통해 세포 분리기, 즉 'spectra optia apheresis system'의 세포 유입부와 SCD (sterile connecting device)를 사용하여 무균적으로 연결시켰다(closed system으로 연결됨). 펌프를 통해 세포 배양기 내의 세포들을 'spectra optia apheresis system'의 세포 유입부를 통해 'spectra optia apheresis system' 내의 원심분리 장치로 이동시켰다.

'spectra optia apheresis system'의 Packing factor 값(PF)을 달리하여 수거백에 탈핵전 유핵세포를 채집할 수 있는 최적값을 찾고 마지막 원심분리 채널 및 return tube에서 순수 RBC만 수거하고자 하였다. 이를 위해 실험차수에 따라 PF값을 조절하여 수거백이나 return tube의 혈액을 수집하고 채집된 세포를 분석하였다. 1^st product에서 3^rd product까지는 PF를 증가시켜 세포를 분리하였고, 4^th product는 다시 P.F값을 시작값과 동일하게 낮추어 세포를 분리하였다. Collection reference(CP)를 참고하여 세포를 분리하였다. Packing factor(PF)는 원심분리 장치의 rpm 및 세포 유입부로 유입되는 세포 부피와 연관된 값으로, 원심분리 rpm 및 G-force 값과도 관련되어 있다.

표 1은 실험차수별 일반 혈액 검사 (Complete blood cell count, CBC)의 결과를 보여준다.

[표 1]

실험 결과, P.F 값이 증가 할수록 WBC(백혈구)와 PLT(혈소판)수가 줄고 RBC수가 다소 증가되었다. 도 12의 염색 사진에 볼 수 있는 바와 같이, P.F 14 (3^rd product)에서 탈핵전 유핵세포를 관찰할 수 있었다.

비중을 원리로 연속적으로 세포를 분리하는 세포 분리기에서 낮은 g-force(P.F1.6)에서 원심분리하며 상층분리시 미성숙 세포를 농축해 분리 가능하며(1^st product), 좀 더 높은 g-force (PF 4.5 및 PF 14)로 원심분리시 상층에서 탈핵 전의 유핵적혈구를 농축 분리 가능함을(2^nd 보다 3th product에서 ortho 더 많이 관찰됨) 확인하였다. 낮은 g-force에서 원심분리하며 1st return tubing 에서 얻은 적혈구 product (1^st return) 및 2^nd return product(2^nd return)에서도 적혈구가 순수하게 수거 되었음을 확인하였다.

실시예 11의 결과, 세포의 연속 배양 중에 세포 분리기를 통해 탈핵 적혈구계 세포를 오염이나 감염 없이 분리할 수 있는 시스템의 적용이 가능함을 확인하였다.

Claims (7)

1. 적혈구계 세포의 체외 배양을 위한 세포 배양기;
   원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기;
   성숙 적혈구 저장부; 및
   이들을 무균적으로 연결해 주는 연결부를 포함하는 시스템으로,
   상기 세포 배양기는 원심분리 후 탈핵되지 않은 미성숙 적혈구계 세포를 다시 받아들일 수 있는 미성숙 세포 유입부를 포함하거나,
   상기 시스템은 원심분리 후 탈핵되지 않은 미성숙 적혈구계 세포의 추가의 성숙을 위한 별도의 세포 배양기를 추가로 포함하는 것이고,
   세포 배양을 유지하면서 동시에 성숙 적혈구를 수거하며,
   적혈구계 세포의 배양, 분리, 및 성숙 적혈구의 수거가 닫힌 시스템(closed
   system) 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는,
   적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 시스템.
2. 제1항에 있어서,
   상기 세포 배양기는 세포 공급부 및 세포 배출부를 포함하며,
   교반기, 배양 조건 모니터링 장치, 배양 조건 조절 장치, 공기 유입부 및 공기 배출부를 포함하는 것인,
   적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 시스템.
3. 제1항에 있어서,
   상기 원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기는 연속류 원심분리 성분채집 시스템(continuous-flow centrifugal apheresis system)인,
   적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 시스템.
4. 제1항에 있어서,
   상기 세포 분리기는 원심분리 후 다층으로 분리된 세포들을 배출하는 세포 배출부를 하나 또는 복수 개 구비한 것인
   적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 시스템.
5. 제1항에 있어서,
   상기 시스템은 추가로 폐기물 저장부 및/또는 미성숙 세포를 추가로 배양하기 위한 제2 세포 배양기를 포함하는 것인,
   적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 시스템.
6. 줄기세포, 조혈모세포, 또는 적혈구 전구세포를 세포 배양기에서 적혈구계 세포로 배양하는 단계;
   상기 적혈구계 세포의 연속적인 배양 과정 중에 상기 배양된 적혈구계 세포의 일부를 원심분리 장치를 포함하는 세포 분리기로 이송하는 단계;
   상기 적혈구계 세포들은 세포 분리기 내에서 원심분리를 통해 적혈구계 세포들을 성숙도에 따라 분리하는 단계;
   성숙 적혈구를 성숙 적혈구 저장부로 이송하는 단계를 포함하며,
   상기 세포 배양기, 세포 분리기 및 성숙 적혈구 저장부는 이들을 무균적으로 연결해 주는 연결부를 통해 연결되어 있고,
   상기 세포 배양기는 원심분리 후 탈핵되지 않은 미성숙 적혈구계 세포를 다시 받아들일 수 있는 미성숙 세포 유입부가 연결되어 있거나,
   상기 세포 분리기는 원심분리 후 탈핵되지 않은 미성숙 적혈구계 세포의 추가의 성숙을 위한 별도의 세포 배양기가 추가로 연결되어 있는 것이고,
   닫힌 시스템 내에서 구현되는 것을 특징으로 하는,
   적혈구계 세포 배양 중 적혈구를 수거하기 위한 방법.
7. 삭제

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