KR102177224B1 - 중추 신경계 염증성 질환 환자에서 MOG-IgG를 검출하기 위한 세포 기반 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) MOG(myelin oligodendrocyte glycoprotein)를 코딩하는 핵산을 형광 단백질 발현 벡터에 클로닝하는 단계; (b) MOG가 클로닝된 상기 발현 벡터를 세포에 형질 감염(transfection)시키는 단계; (c) 상기 형질 감염된 세포를 선별 시약(selection drug)이 포함된 배지에서 배양하여 안정한 형질 감염 세포주를 선별하는 단계; (d) 상기 선별된 세포주와 MOG-IgG를 포함하는 것으로 예상되는 시료를 함께 인큐베이션하는 단계; (e) 인큐베이션이 완료된 시료에 형광-결합된 2차 항체를 첨가하여 MOG-IgG 및 2차 항체 결합체를 형성시키는 단계; 및 (f)상기 MOG-IgG 및 2차 항체 결합체로부터 형광을 검출 또는 분석하는 단계를 포함하는, MOG-IgG를 검출하기 위한 방법; MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법; 및 MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 MOG-IgG에 특이적으로 결합하는 2차 항체로서 형광-결합된 IgG (H+L)을 사용하는 경우 CBA-IF 및 CBA-FACS 결과 사이에 강한 양의 상관 관계가 있고, 기존의 IgG1 (Oxford) CBA-IF와 비교하여서도 약 98 %의 높은 일치율을 나타냄을 확인하였으며, 특히 본 발명의 방법은 MOG를 발현하는 안정한 세포주(stable cell line)를 제작함으로써 반복적인 형질 감염(transfection)이 요구되지 않으며, 2차 항체 IgM과 교차반응(cross reaction)을 나타내지 않아 특이도가 높고 보다 명확한 형광 신호를 얻을 수 있는 장점이 있다.
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Description
본 발명은 시료로부터 MOG-IgG를 검출하기 위한 방법으로서, (a) MOG(myelin oligodendrocyte glycoprotein)를 코딩하는 핵산을 형광 단백질 발현 벡터에 클로닝하는 단계; (b) MOG가 클로닝된 상기 발현 벡터를 세포에 형질 감염(transfection)시키는 단계; (c) 상기 형질 감염된 세포를 선별 시약(selection drug)이 포함된 배지에서 배양하여 안정한 형질 감염 세포주를 선별하는 단계; (d) 상기 선별된 세포주와 MOG-IgG를 포함하는 것으로 예상되는 시료를 함께 인큐베이션하는 단계; (e) 인큐베이션이 완료된 시료에 형광-결합된 2차 항체를 첨가하여 MOG-IgG 및 2차 항체 결합체를 형성시키는 단계; 및 (f) 상기 MOG-IgG 및 2차 항체 결합체로부터 형광을 검출 또는 분석하는 단계를 포함하는 방법; MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법; 및 MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
자가 항체의 혈청 상태(Serostatus)는 자가면역 질환을 비롯한 광범위한 신경계 질환에서 중요한 진단 기준이다. 수초 희소돌기아교세포 당 단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG)을 기질로 사용한 세포 기반 분석(cell-based assay, CBA)의 개발은 다양한 탈수초성 표현형을 갖는 MOG-IgG 양성 환자를 확인하였다. 소아 및 성인의 급성 파종성 뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis, ADEM), 발작, 뇌염(Encephalitis), 아쿠아포린 4(aquaporin 4, AQP4)-IgG 음성 시신경척수염범주질환(NMOSD), 시신경염(optic neuritis, ON), 척수염 및 뇌간 뇌염에서는 MOG-IgG가 존재하였다. 한편 MOG-IgG는 다발성경화증(multiple sclerosis, MS) 환자에게는 존재하지 않았으므로, 다발성경화증과 비-MS 중추 신경계(CNS) 탈수초성 장애를 구별하는 것으로 생각되었다. 또한, MS와 MOG-IgG 관련 질환의 환자들 사이에는 임상적, 방사선학적, 병리학적 및 예후적으로 차이가 있다. 최근 연구에 따르면, MOG-IgG의 지속적인 양성은 면역 요법에도 불구하고 임상적 재발과 관련이 있는 반면, 혈청 음성으로의 전환은 임상적 재발을 초래하지 않았다. 게다가, 혈청학적 소견 및 다른 실험적 접근들은 MOG-IgG가 병원성일 수 있음을 제안하였다. 그럼에도 불구하고, 아직까지 MOG-IgG 관련 질병의 스펙트럼은 완전히 정의되지 않은 상태이다. 따라서, 특정 자가항체를 식별하기 위한 민감하고 매우 특이적인 분석법의 개발은 임상 표현형, 질병 코스 및 예후를 정확하게 정의하여 MOG-IgG 관련 질병의 전체 스펙트럼을 기술하는데 있어 중요하다.
본 발명의 하나의 목적은, MOG를 발현하는 안정한 형질 감염 세포주를 구축하고 이를 MOG-IgG를 포함할 것으로 예상되는 중추 신경계(CNS) 염증성 질환 환자로부터 분리된 시료와 반응시킨 후, MOG-IgG 특이적으로 결합하는 형광-결합된 2차 항체를 첨가하여 이로부터 형광을 검출 또는 분석함으로써, 혈액 또는 혈청 등 시료로부터 MOG-IgG를 검출하고 나아가 MOG-IgG 관련 질병의 전체 스펙트럼을 밝히기 위함이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하기 위함으로, 상기 MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환은 AQP4-IgG 음성 시신경척수염범주질환(NMOSD), 급성 파종성 뇌척수염(ADEM), 척수염(Myelitis), 뇌염(Encephalitis) 또는 시신경염(ON)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) MOG를 코딩하는 핵산을 형광 단백질 발현 벡터에 클로닝하는 단계; (b) MOG가 클로닝된 상기 발현 벡터를 세포에 형질 감염시키는 단계; 및 (c) 상기 형질 감염된 세포를 선별 시약이 포함된 배지에서 배양하는 단계에 의해 제조되는, MOG를 발현하는 안정한 형질 감염 세포주를 포함하는 MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환의 진단용 조성물을 제공하기 위함이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 시료로부터 MOG-IgG를 검출하기 위한 방법으로서, MOG(myelin oligodendrocyte glycoprotein)를 코딩하는 핵산을 형광 단백질 발현 벡터에 클로닝하는 단계; MOG가 클로닝된 상기 발현 벡터를 세포에 형질 감염(transfection)시키는 단계; 상기 형질 감염된 세포를 선별 시약(selection drug)이 포함된 배지에서 배양하여 MOG를 발현하는 안정한 형질 감염 세포주를 선별하는 단계; 상기 선별된 세포주와 MOG-IgG를 포함하는 것으로 예상되는 시료를 함께 인큐베이션하는 단계; 인큐베이션이 완료된 시료에 형광-결합된 2차 항체를 첨가하여 MOG-IgG 및 2차 항체 결합체를 형성시키는 단계; 및 상기 MOG-IgG 및 2차 항체 결합체로부터 형광을 검출 또는 분석하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 “MOG(myelin oligodendrocyte glycoprotein)”는 중추 신경계(CNS)에서 신경의 수초화에 중요한 역할을 하며, 이는 미엘린초(myelin sheath)의 표면과 희소돌기아교세포의 형질막에 분포하는 당단백질이다. MOG를 기질로 하는 세포 기반 분석(cell-based assay, CBA)의 발달에 따라 다양한 중추 신경계(CNS) 염증성 질환에서 MOG-면역글로불린 G(immunoglobulin G antibody, IgG), 즉 MOG-IgG가 관련이 있음이 알려져 있다. 본 발명에서의 MOG는 전장 인간 MOG (Full-length MOG, FL-MOG)로, 본 발명에서 상기 MOG를 코딩하는 핵산은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 “안정한 형질 감염 세포주”는 상기 FL-MOG를 발현하는 안정한 세포주(stable cell line)을 의미하는 것으로, MOG를 코딩하는 핵산을 형광 단백질 발현 벡터에 클로닝하는 단계; MOG가 클로닝된 상기 발현 벡터를 세포에 형질 감염(transfection)시키는 단계; 상기 형질 감염된 세포를 선별 시약(selection drug)이 포함된 배지에서 배양하여 MOG를 발현하는 안정한 형질 감염 세포주(MOG-HEK293)를 선별하는 단계를 통해 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 형광 단백질은 EGFP, GFP, YFP, DsRed2, Tdtomato 또는 mCherry일 수 있고, 상기 발현 벡터는 pIRES2-EGFP 또는 pIRES-DsRed2 벡터일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 MOG가 클로닝된 발현 벡터는 pIRES2-EGFP 벡터에 서열번호 1로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 전장 인간 MOG (FL-MOG)가 클로닝된 것일 수 있다. 또한, 상기 형질 감염의 대상이 되는 세포는 mammalian cell, 즉 HEK(human embryonic kidney) 293, HeLa, CHO (chinese hamster ovary) 또는 NIH3T3 세포일 수 있으며, 상기 선별 시약은 히그로마이신(Hygromycin), 푸로마이신(puromycin), 블라스티사이딘(blasticidi), 또는 G418(geneticin)일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 본 발명의 일 실시예에서는, FL-MOG/pIRES2-DsRed2 플라스미드로부터 전장 인간 MOG (Full-length MOG, FL-MOG) cDNA를 분리하고, 이를 pIRES2-EGFP 벡터의 XhoI 및 SmaI 부위로 클로닝한 후 이를 Lipofectamine 2000 시약을 사용하여 HEK293 세포에 형질감염시켰으며, 이후 선별 시약으로 G418을 함유하는 배지를 통해 안정한 형질 감염 세포주를 선별하였으며, 여기서 FL-MOG cDNA를 추출 또는 분리하고 발현 벡터에 클로닝하는 과정은 통상의 기술자가 당업계에 알려진 방법을 적절히 선택하여 수행할 수 있다.
한편, 상기 FL-MOG를 발현하는 안정한 세포주는 시료 내 MOG-IgG를 검출하고 나아가 MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환을 진단하기 위한 것으로, 본 발명에서 상기 “시료”는 MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환 환자로부터 분리되었거나, MOG-IgG를 포함하는 것으로 예상되는 환자로부터 분리된 척수액, 혈액 또는 혈청을 의미할 수 있으며, 보다 바람직하게는 혈액 또는 혈청을 의미할 수 있다. 상기 시료는 당업계의 통상의 기술자가 필요에 따라 적절한 비율로 희석하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 “MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환”은 다양한 탈수초성 표현형을 갖는 MOG-IgG 양성 환자에서 나타날 수 있으며, 구체적으로는 AQP4-IgG 음성 시신경척수염범주질환(neuromyelitis optica spectrum disorder, NMOSD), 급성 파종성 뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis, ADEM), 척수염(Myelitis), 뇌염(Encephalitis) 또는 시신경염(optic neuritis, ON)을 의미하는 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 FL-MOG를 발현하는 안정한 세포주를 상기 분리된 혈액 또는 혈청과 함께 인큐베이이션 한 후, 인큐베이션이 완료된 시료에 형광-결합된 2차 항체를 첨가함으로써 MOG-IgG 및 2차 항체 결합체를 형성시킨다. 본 발명에서 상기 “형광-결합된 2차 항체”는 MOG 또는 MOG-IgG에 대한 세포 기반 분석(CBA)을 위한 것으로, 상기 2차 항체는 특히 항-인간 IgG (H+L)일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 MOG-IgG에 특이적으로 결합하는 2차 항체로서 형광-결합된 IgG (H+L)을 사용하는 경우 CBA-IF 및 CBA-FACS 결과 사이에 강한 양의 상관 관계가 있고, 기존의 IgG1 (Oxford) CBA-IF와 비교하여서도 약 98 %의 높은 일치율을 나타냄을 확인하였으며, 특히 형광-결합된 IgG (H+L)을 사용하는 경우 IgM과 교차반응(cross reaction)을 나타내지 않아 보다 특이도가 높고 명확한 형광 신호를 얻을 수 있는 장점이 있음을 확인하였다.
본 발명에서 “형광을 검출 또는 분석”하는 단계는, 이에 특별히 제한되는 것은 아니나, 면역 형광법(immunofluorescence assay, IF) 또는 유세포 분석(flow cytometry assay, FACS)을 수행하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, MOG-HEK293 세포에 대해 3개의 상이한 2차 항체, Alexa Fluor-594 결합된 염소 항-인간 IgG (H+L), Alexa Fluor-594 결합된 염소 항-인간 IgG1-Fc, Alexa Fluor-594 결합된 염소 항-인간 IgM를 사용하여 CBA-IF (NCC-CBA)를 수행하였으며, CBA-FACS를 통해 3개의 상이한 2차 항체(항-인간 IgG (H+L), IgG1-Fc 및 IgM)의 MOG에 대한 특이도 및 민감도를 측정하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, MOG를 코딩하는 핵산을 형광 단백질 발현 벡터에 클로닝하는 단계; MOG가 클로닝된 상기 발현 벡터를 세포에 형질 감염시키는 단계; 상기 형질 감염된 세포를 선별 시약이 포함된 배지에서 배양하여 MOG를 발현하는 안정한 형질 감염 세포주를 선별하는 단계; 상기 선별된 세포주와 MOG-IgG를 포함하는 것으로 예상되는 시료를 함께 인큐베이션하는 단계; 인큐베이션이 완료된 시료에 형광-결합된 2차 항체를 첨가하여 MOG-IgG 및 2차 항체 결합체를 형성시키는 단계; 및 상기 MOG-IgG 및 2차 항체 결합체로부터 형광을 검출 또는 분석하는 단계를 포함하는, MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 용어 'MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환'은 전술한 바와 같다.
다양한 탈수초성 표현형을 갖는 MOG-IgG 양성 환자에게서 시신경척수염범주질환(NMOSD), 급성 파종성 뇌척수염(ADEM), 척수염(Myelitis), 뇌염(Encephalitis) 또는 시신경염(ON)을 비롯한 MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환이 나타날 수 있는바, 상기 방법을 통해 시료 내 MOG-IgG의 존재 여부 및 수준 등을 확인함으로써 MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다. 구체적으로, 상기 FL-MOG를 발현하는 안정한 세포주와, MOG-IgG를 포함할 것으로 예상되는 시료를 함께 인큐베이션하고 MOG-IgG에 특이적으로 결합하는 2차 항체를 첨가할 시, MOG-IgG가 시료 내 존재할 경우 FL-MOG 및 MOG-IgG 결합에 의해 세포막 주변에 적색 형광이 관찰되며, 시료 내 MOG-IgG가 존재하지 않을 경우 적색 형광이 관찰되지 않는 것을 통해 시료 내 MOG-IgG의 유무를 확인할 수 있으며, 나아가 MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환을 갖는 환자 집단의 MOG-IgG 발현 수준 및 임상 표현형, 질병 코스, 예후를 분석하고 환자군의 분류 등에 활용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는, MOG를 코딩하는 핵산을 형광 단백질 발현 벡터에 클로닝하는 단계; MOG가 클로닝된 상기 발현 벡터를 세포에 형질 감염시키는 단계; 및 상기 형질 감염된 세포를 선별 시약이 포함된 배지에서 배양하는 단계에 의해 제조되는, MOG를 발현하는 안정한 형질 감염 세포주를 포함하는 MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환의 진단용 조성물을 제공한다. 상기 용어 'MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환'은 전술한 바와 같다.
본 발명에서는 MOG-IgG에 특이적으로 결합하는 2차 항체로서 형광-결합된 IgG (H+L)을 사용하는 경우 CBA-IF 및 CBA-FACS 결과 사이에 강한 양의 상관 관계가 있고, 기존의 IgG1 (Oxford) CBA-IF와 비교하여서도 약 98 %의 높은 일치율을 나타냄을 확인하였으며, 특히 본 발명의 방법은 MOG를 발현하는 안정한 세포주(stable cell line)를 제작함으로써 반복적인 형질 감염(transfection)이 요구되지 않으며, 2차 항체 IgM과 교차반응(cross reaction)을 나타내지 않아 특이도가 높고 보다 명확한 형광 신호를 얻을 수 있는 장점이 있다.
도 1의 A 및 B는 각각 FL-MOG로 형질 감염된 hMOG-HEK293 세포주에 대해 웨스턴 블롯 및 유세포 분석법으로 형질 감염 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이며, 도 1의 C 내지 E는 각각 대조군(HC), MOG-IGg 음성 및 양성 환자 혈청에 대해 2차 항체로 IgG (H+L), IgG1-Fc 및 IgM를 처리한 경우 형광 신호를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 2의 A는 CNS 염증성 질환 환자 및 대조군(HC)의 혈청에 대해 각각 2차 항체 IgG (H+L), IgG1-Fc 및 IgM를 사용하여 CBA-FACS를 수행한 결과를 나타내며, 도 2의 B는 IgG (H+L), IgG1-Fc에 대한 각각의 ROC 곡선 및 MFI 비율에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 다양한 CNS 염증성 질환 환자에 대해 ROC 곡선에서 최적의 컷오프를 계산하고, 각 질환별 MFI 비율의 분포를 나타낸 것이다.
도 4는 40명의 MOG-IgG 혈청 양성 환자의 IF 점수 및 MFI 비율로부터 CBA-IF 점수와 CBA-FACS의 상관 관계를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 A 및 B는 각각 FL-MOG로 형질 감염된 FL-MOG + HEK293 세포주 및 EV-형질 감염된 HEK293 세포주에서 형광 신호를 관찰한 결과, 및 2차 항체 IgG (H+L), IgG1-Fc 및 IgM를 사용하여 CBA-FACS를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 2의 A는 CNS 염증성 질환 환자 및 대조군(HC)의 혈청에 대해 각각 2차 항체 IgG (H+L), IgG1-Fc 및 IgM를 사용하여 CBA-FACS를 수행한 결과를 나타내며, 도 2의 B는 IgG (H+L), IgG1-Fc에 대한 각각의 ROC 곡선 및 MFI 비율에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 다양한 CNS 염증성 질환 환자에 대해 ROC 곡선에서 최적의 컷오프를 계산하고, 각 질환별 MFI 비율의 분포를 나타낸 것이다.
도 4는 40명의 MOG-IgG 혈청 양성 환자의 IF 점수 및 MFI 비율로부터 CBA-IF 점수와 CBA-FACS의 상관 관계를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 A 및 B는 각각 FL-MOG로 형질 감염된 FL-MOG + HEK293 세포주 및 EV-형질 감염된 HEK293 세포주에서 형광 신호를 관찰한 결과, 및 2차 항체 IgG (H+L), IgG1-Fc 및 IgM를 사용하여 CBA-FACS를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험방법
1-1: 환자군
국립암센터(NCC)에서 CNS 염증성 질환으로 진단된 355명의 환자 및 대조군(HC)으로 25명의 건강한 사람의 혈청을 사용하였다. 환자군 355명의 인구 통계는 표 1에 나타내었으며, 이들의 혈청 상태는 in-house CBA에 의해 평가되었다. 환자군에는 CNS 염증성 질환을 앓고 NCC에서 치료받은 환자들 중 무작위로 선정된 333명과, IgG1 Oxford CBA(Oxford-CBA)에 의해 이전에 MOG-IgG 양성으로 확인된 22명의 환자가 포함되었다.
| 최종 추시 진단 | 환자수 | 남성:여성 |
샘플링 시
평균 연령 |
샘플링 시
평균 유병 기간 |
MOG-IgG 양성 환자 수 |
| AQP4 양성 NMOSD |
65 | 11:54 | 37 (13-67) | 43 (14-73) | 0/65 (0%) |
| AQP4 음성 NMOSD |
37 | 9:28 | 41 (12-72) | 29 (0-351) | 4/37 (10.8%) |
| 다발성경화증 |
111 | 34:77 | 32 (16-65) | 24 (0-286) | 0/111 (0%) |
| 단일 또는 재발성 척수염 |
52 | 32:20 | 40 (14-74) | 18 (0-196) | 7/52 (13.5%) |
| 단일 또는 재발성 시신경염 |
16 | 6:10 | 34 (15-63) | 2 (0-87) | 6/16 (37.5%) |
| 종양성 탈수초화 또는 ADEM-유사 증상을 포함한 다른 탈수초성 질환 |
55 | 23:32 | 34 (7-61) | 7 (0-325) | 24/55 (43.6%) |
| 다른 신경계 질환 |
19 | 11:8 | 49 (21-68) | 6 (0-212) | 0/19 (0%) |
105명의 환자에서 3개의 상이한 2차 항체(항-인간 IgG (H+L), IgG1-Fc 및 IgM)의 특이도 및 민감도를 유세포 분석으로 평가하였고, 2차 항체의 특이도 및 민감도는 10명의 환자에서 CBA-IF에 의해 확인되었다. NCC CBA-IF(NCC-CBA) 및 Oxford-CBA-IF의 일치는 125명의 환자(22명의 MOG-IgG 혈청 양성 환자 포함)에서 평가되었다. 모든 참가자로부터 수집된 혈청은 -80℃에 저장하였으며, NMOSD 및 MS의 진단은 각각 2015년 국제 NMOSD 진단 패널 기준 및 2010년 맥도날드 기준을 기반으로 하였다.
1-2: MOG-HEK 293 세포 제작
전장 인간 MOG (Full-length MOG, FL-MOG) cDNA를 FL-MOG/pIRES2-DsRed2 플라스미드로부터 분리하고 pIRES2-EGFP 벡터(Clontech, Mountain View, CA, USA)의 XhoI 및 SmaI 부위로 클로닝 하였다. 모든 서열은 자동 시퀀싱에 의해 확인되었다. 이후 클로닝된 FL-MOG 플라스미드 또는 빈 벡터 플라스미드를 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen, Waltham, MA, USA)을 사용하여 Human Embryonic Kidney 293(HEK293) 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)에 형질 감염시켰다. 48시간 후, 세포를 2 mg/mL G418(Invitrogen)을 함유하는 배지로 나누고, 2주 후에 G418-내성 세포를 분리한 후 한계 희석법에 의해 추가로 클로닝 하였다. 각각의 안정한 형질 감염체 클론을 유세포 분석을 사용하여 녹색 형광 단백질(GFP) 발현에 대해 스크리닝 하였다. GFP-양성 세포에서 FL-MOG 단백질 발현은 항-MOG 항체(Santacruz, Dallas, TEXAS, USA)를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다.
1-3: MOG-IgG 세포 기반 간접 면역 형광 분석 (CBA-IF)
CBA-IF는 MOG-HEK293 세포에 대해 3개의 상이한 2차 항체, Alexa Fluor-594 결합된 염소 항-인간 IgG (H+L) (PBS로 1:2000으로 희석됨), Alexa Fluor-594 결합된 염소 항-인간 IgG (FCγ 단편 특이적, PBS로 1:750으로 희석됨), Alexa Fluor-594 결합된 염소 항-인간 IgM (PBS로 1:750으로 희석됨)를 사용하여 수행하였다. 비특이적 백그라운드 염색을 배제하기 위해 빈 벡터(EV)로 안정적으로 형질 감염된 HEK293 세포를 대조군으로 사용하였다. 각 실험은 이중으로 수행되었으며, 혈청 양성(seropositivity)은 환자의 임상적, 실험적 정보 및 서로의 결과에 대해 알지 못하는 2명의 연구자에 의해 결정되었다. 표면 면역 형광의 강도를 아래 표 2와 같이 점수를 매겼고, 최종 점수는 2명 또는 3명의 연구자로부터의 판독값의 중간값이다. 1 이상의 IF 점수는 양성으로 간주되었으며 점수 0.5는 경계선으로 간주되었다.
| IF 점수 | 설명 |
| 0 | 세포막 주위에 결합이 없거나 염색이 고리 형태로 세포막을 둘러싸지 않음 |
| 0.5 |
세포막 주위에 약한 결합이 있으나, 가시 세포 ~ 50 %의 전체 막을 둘러싸지 않음 |
| 1 |
가시 세포 > 50 %에서 고리 형태로 전체 막을 둘러싸는, 선명하지만 약한 결합 |
| 2 |
가시 세포 > 75 %에서 전체 막을 둘러싸는, 선명하고 적당한 밝기를 나타냄 |
| 3 |
가시 세포 > 90 %에서 양성 대조군의 밝기와 유사한, 선명하고 밝은 결합 |
| 4 |
가시 세포 > 90 %에서 양성 대조군보다 강한, 매우 밝은 결합 |
1-4: 세포 기반 유세포 분석 (CBA-FACS)
HEK293 세포를 수확하고 염색 버퍼(0.5 % 소 혈청 알부민이 보충된 2 mM EDTA-1X PBS)에서 세척하였다. 2×105 세포를 얼음상의 96웰 U-bottom 플레이트(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)에서 30분 동안 환자 혈청(염색 버퍼로 1:40으로 희석됨, 200 ㎕)과 배양하였다. 이어서, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 알로피코시아닌(allophycocyanin) 결합된 염소 항-인간 IgG (H+L) (Jackson Immunology, PA, USA; PBS로 1:2000으로 희석됨) 또는 피코에리트린(phycoerythrin) 결합된 마우스 항-인간 IgG1 Fc (SouthernBiotech, 미국 버밍엄; PBS로 1:1000으로 희석됨) 또는 blue-violet 421 결합된 마우스 항-인간 IgM (BD Bioscience, CA, USA; PBS로 1:50으로 희석됨)과 함께 얼음 상에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 세척하고 400 ㎕의 차가운 PBS에 재현 탁시킨 후, 획득 전에 viability dye 7-AAD(BD Biosciences, CA, USA; 샘플 당 5 ㎕)를 세포에 첨가하여 죽은 세포를 배제시켰다. FACSVerse에서 총 10,000개의 세포를 획득하고, Flow Jo 소프트웨어(TreeStar, Ashland, OR, USA)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 결합은 평균 형광 강도(MFI)로 표현하였으며, MFI 비율은 MOG-형질 감염된 HEK293 세포의 MFI를 EV-형질 감염된 HEK293 세포의 MFI로 나눈 값에 의해 결정하였다.
CBA-IF를 기준 표준으로 사용하여, MOG-IgG 혈청 양성 반응을 결정하기 위한 MFI 비율의 유용성을 결정하기 위해 ROC(Receiver-operating characteristic) 곡선 분석을 사용하였다. ROC 곡선 분석을 통해 가장 높은 특이도 및 민감도의 최적 컷오프를 결정하였다. 특이도는 [(AQP4-IgG 양성 NMOSD, MS 및 기타 신경계 질환 (OND) 환자 중 MOG-IgG 음성의 수) / 총 AQP4-IgG 양성 NMOSD, MS 및 OND 환자의 수] x 100으로 계산되었다.
실시예 2: 실험결과
2-1: In-house MOG-IgG CBA-IF
In-house CBA-IF를 구축하기 위해 FL-MOG로 안정적으로 형질 감염된 HEK293 세포를 사용하였고, 웨스턴 블롯 및 유세포 분석법에 의해 성공적인 형질 감염을 확인하였으며, 형광 수준은 형광 현미경에 의해 측정되었다(도 1의 A 및 B).
이전의 연구에서는 특히 MS 환자 샘플에서 IgG 항체와 IgM 항체의 교차 반응성으로 인해, MOG-IgG를 검출하기 위한 항-인간 IgG (H+L) 2차 항체의 사용 시 낮은 특이도에 대한 우려가 있었다. 한편, IgG Fc 또는 IgM 2차 항체는 제한된 수의 샘플(n = 10; AQP4-IgG 음성 NMOSD 1명, 단일 또는 재발성 척수염 2명, 종양성 탈수초화 또는 ADEM-유사 증상(ODD)을 포함한 다른 탈수초성 질환 4명, 및 및 건강한 대조군 3명)과 함께 CBA-IF에 사용되었다.
그 결과, IgG (H+L)와 IgG Fc 사이의 형광에는 차이가 없었으며, 특히 IgM 2차 항체가 사용될 때 형광 신호가 보이지 않음을 확인하였다(도 1의 C 내지 E). 구체적으로, MOG-형질 감염된 세포의 세포질(cytosol)에서 녹색 형광이 관찰되었고, MOG-IgG를 포함하는 환자 혈청이 첨가되었을 때 MOG-IgG가 FL-MOG에 결합됨으로써 세포막 주위에서 적색 형광이 관찰되었다(도 1의 E). 한편, 환자 혈청에 MOG-IgG가 포함되어 있지 않은 경우 적색 형광이 관찰되지 않음을 확인하였다(도 1의 C 및 D).
2-2: MOG-IgG 혈청 상태
CNS 염증성 질환 집단으로부터 25명의 HC 및 355명의 환자(AQP4-IgG 양성 NMOSD 65명, AQP4-IgG 음성 NMOSD 37명, MS 111명, 단일 또는 재발성 척수염 52명, 단일 또는 재발성 시신경염(ON) 16명, ODD 55명, OND 7명)의 혈청 상태를 평가하였다. 환자 355 명의 특성 및 MOG-IgG 혈청 양성은 표 1에 나타내었다. 총 355명의 환자 중, 41/355명 (11.5%)이 혈청 양성 반응을 나타내었는데, AQP4-IgG 음성 NMOSD 환자 4/37명 (10.8 %), 단일 또는 재발성 척수염 환자 7/52명 (13.5 %), 단일 또는 재발성 ON 6/16명 (37.5 %) ODD 환자 24/55명 (43.6 %)가 혈청에 MOG-IgG를 갖는 것으로 확인되었다. 또한, AQP4-IgG 양성 NMOSD, MS, OND 환자 183명 및 건강한 대조군 샘플 중 어느 것도 MOG-IgG에 대해 양성이 아니었으며, MOG-IgG에 대해 양성인 41명의 환자들은 모두 MOG-IgG 관련 질환의 알려진 임상 스펙트럼 내의 임상 표현형을 나타내었다.
여성 대 남성의 비율은 28:13 이었으며, 질병 발병 시의 평균 연령은 28세(범위: 3 내지 60세)였다. 발병 시 임상 표현형에는 시신경염(37%), 척수염(29%), 뇌의 염증병변(brain attacks, 24%) 및 다 구역 침범(poly-regional involvement, 10%)이 포함되었다. 평균 유병 기간인 78개월(범위: 3 내지 298개월) 동안, 10명의 환자는 단발성(monophasic)이었고, 31명의 환자는 재발하였다: 26/41명(63 %)의 환자는 적어도 한번의 뇌침범(brain attack)을 경험하였으며, 23/41명(56 %)의 환자는 적어도 하나의 시신경염 attack, 20/41명(49 %)의 환자는 적어도 하나의 척수염 attack을 경험하였다. 뇌의 염증병변(brain attacks) 환자 26명 중 17명(65 %)은 ADEM 유사 병변이 있었고, 7명(27 %)의 환자가 플러피(fluffy)한 뇌간 병변이 있었으며, 2명(8 %)의 환자는 피질 병변이 있었다. 척수염 환자 20명 중 13명(65 %)에서 종단광범위 횡단성척수염(longitudinally extensive transverse myelitis)이 관찰되었으며, 시신경염 환자 23명 중 8명(35 %)이 양측성 침범(bilateral involvement)을 보였다. 마지막 추적 관찰에서, 25/41명(61 %)의 환자에서 동시 또는 연속적인 다 구역 침범이 관찰되었다. 이 환자들에서 가장 흔한 임상적 증상은 시신경염과 뇌의 염증병변(brain attacks)의 조합(12/25명, 48 %)에 이어 척수염과 뇌의 염증병변의 조합(7/25명, 28 %), 시신경염과 척수염(3/25명, 12 %)의 조합으로 나타났다. 3명(12 %)의 환자는 시신경염, 척수염 및 뇌의 염증병변을 나타내었으며, 나머지 16명의 환자는 isolated 척수염(n=7), 시신경염 (n=5) 및 뇌의 염증병변(n=4)과 같은 단독 임상적 증후군(isolated clinical syndrome)을 경험하였다.
2-3: CBA-FACS에 의한 혈청 양성의 측정
FL-MOG 안정한 세포주(stable cell line)에서 IgG (H+L)의 유용성을 추가로 확인하기 위해, CNS 염증성 질환 환자 총 105/355명(65/105명의 환자가 무작위로 선택되었고, 40명은 MOG-IgG 혈청 양성 환자) 및 HC 25명의 혈청에 대해 CBA-FACS를 사용하여 실험하였으며, 3개의 다른 2차 항체 IgG (H+L), IgG1-Fc 및 IgM이 사용되었다(도 2의 A). CBA-IF에 의해 발견된 105명의 환자의 혈청 상태는 MOG-IgG 혈청 양성 및 혈청 음성으로 분류되었고, 각 환자의 MFI 비율은 CBA-FACS에 의해 결정되었다. ROC 곡선 분석을 사용하여, IgG (H+L)의 MFI 비율에 대한 곡선 아래 면적은 1.00이고 IgG1-Fc는 0.97이었다(도 2의 B).
105명의 CNS 염증성 질환 환자의 혈청 양성을 검출하기 위해 ROC 곡선에서 최적의 컷오프를 계산하였으며, 항-인간 IgG (H+L) 및 IgG1-Fc 2차 항체에 대한 최적 컷오프는 각각 3.4 및 2.3이었다. 환자 105명의 최종 추시 진단(diagnosis at last follow-up) 및 각 환자군의 혈청 양성이 결정되었다(도 3). AQP4-IgG 양성 NMOSD, MS 및 OND를 가진 모든 환자는 MOG-IgG 음성이었다. 한편 항-인간 IgG1-Fc 2차 항체는 AQP4-IgG 혈청 양성 NMOSD 환자 1명 및 MS 환자 2명에서 MOG-IgG를 검출하였다(특이도 = 95%). HC 25명 모두의 혈청의 MFI 비율은 IgG (H+L) 및 IgG1-Fc 항체 모두에 대해 컷오프 미만이었으며, IgM 항체에 결합된 샘플은 없었다.
2-4: CBA-IF 점수와 CBA-FACS의 상관 관계
CBA-IF 점수는 전술한 바와 같이 결정되었고, CBA-IF 점수와 CBA-FACS 결과 사이의 상관 관계 또한 결정되었다. 40명의 MOG-IgG 혈청 양성 환자의 IF 점수는 다음과 같았다: 10명의 환자는 1점, 13명은 2점, 10명은 3점, 7명은 4 점이었다. 항-인간 IgG (H+L) 2차 항체는 IgG1-Fc 2차 항체보다 CBA-IF 점수와 더 강한 양의 상관 관계를 나타내었다(도 4). (IgG (H+L): r=0.87, p <0.0001 vs IgG1-Fc: r=0.81, p <0.0001)
2-5: Oxford CBA-IF와 NCC CBA-IF의 높은 일치율
분석 결과를 보다 더 검증하기 위해, 환자 125명(AQP4-IgG 양성 NMOSD를 가진 36명, AQP4-IgG 음성 NMOSD를 가진 13명, MS를 가진 27명, 단일 또는 재발성 척수염을 가진 21명, 단일 또는 재발성 시신경염을 가진 6명 및 ODD를 가진 22명)의 혈청 상태를 IgG1 (Oxford) CBA-IF와 비교하였다. 항-인간 IgG (H+L) 이차 항체를 (NCC) CBA-IF에 사용하였다. 그 결과, 두 가지 방법 모두 122/125명(98 %)의 샘플(κ = 0.919, p <0.0001)에 대해 일치하는 결과를 보였으며, 두 방법에서 모두 21/125명의 환자가 MOG-IgG 양성, 101/125명의 환자가 MOG-IgG 음성으로 확인되었다. 3/125명(2 %)의 환자는 오직 하나의 분석, (NCC) CBA-IF에서 2명, 그리고 (Oxford) CBA-IF에서 1명(표 3)에 대해서만 양성이었다. (NCC) CBA-IF에 의해서만 MOG-IgG 양성인 2명의 환자는 AQP4-IgG 음성 NMOSD 환자였다. 다른 하나의 샘플(환자 5)은 AQP4-IgG에 대해 강한 양성, (Oxford) CBA-IF에 의한 MOG-IgG에 대해 경계선 양성인 반면, AQP4-IgG에 대해서는 양성이고 (NCC) CBA IF에 의한 MOG-IgG에 대해서는 음성이었다.
| NCC-CBA | 합계 |
|||
| 양성 | 음성 | |||
| Oxford-CBA | 양성 | 21 | 1 | 22 |
| 음성 | 2 | 101 | 103 | |
| 합계 | 23 | 102 | 125 | |
(κ = 0.919, p <0.0001)
또한, 본 발명자들은 MOG-형질 감염된 세포뿐만 아니라 (NCC) CBA-IF 및 CBA-FACS에 의해 EV-형질 감염된 세포에서도 양성 결합을 발견 하였다(도 5의 A 및 B). MOG-IgG 양성 결합은 항-인간 IgG (H+L) 및 IgG-Fc 2차 항체 모두에서 관찰되었다. MOG-IgG MFI 비율은 3가지 2차 항체(항-인간 IgG (H+L), IgG1-Fc 및 IgM) 모두에서 컷오프보다 낮았다(도 5의 B).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> NATIONAL CANCER CENTER
<120> Method for cell-based assay to detect MOG-IgG in patients with
central nervous system inflammatory diseases
<130> KPA01438
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 744
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggcaagct tatcaagacc ctctctgccc agctgcctct gctccttcct cctcctcctc 60
ctcctccaag tgtcttccag ctatgcaggg cagttcagag tgataggacc aagacaccct 120
atccgggctc tggtcgggga tgaagtggaa ttgccatgtc gcatatctcc tgggaagaac 180
gctacaggca tggaggtggg gtggtaccgc ccccccttct ctagggtggt tcatctctac 240
agaaatggca aggaccaaga tggagaccag gcacctgaat atcggggccg gacagagctg 300
ctgaaagatg ctattggtga gggaaaggtg actctcagga tccggaatgt aaggttctca 360
gatgaaggag gtttcacctg cttcttccga gatcattctt accaagagga ggcagcaatg 420
gaattgaaag tagaagatcc tttctactgg gtgagccctg gagtgctggt tctcctcgcg 480
gtgctgcctg tgctcctcct gcagatcact gttggcctcg tcttcctctg cctgcagtac 540
agactgagag gaaaacttcg agcagagata gagaatctcc accggacttt tgatccccac 600
tttctgaggg tgccctgctg gaagataacc ctgtttgtaa ttgtgccggt tcttggaccc 660
ttggttgcct tgatcatctg ctacaactgg ctacatcgaa gactagcagg gcaattcctt 720
gaagagctac gaaatccctt ctga 744
Claims (15)
- 시료로부터 MOG-IgG를 검출하기 위한 방법으로서,
(a) MOG(myelin oligodendrocyte glycoprotein)를 코딩하는 핵산을 형광 단백질 발현 벡터에 클로닝하는 단계;
(b) MOG가 클로닝된 상기 발현 벡터를 세포에 형질 감염(transfection)시키는 단계;
(c) 상기 형질 감염된 세포를 선별 시약(selection drug)이 포함된 배지에서 배양하여 MOG를 발현하는 안정한 형질 감염 세포주를 선별하는 단계;
(d) 상기 선별된 세포주와 MOG-IgG를 포함하는 것으로 예상되는 시료를 함께 인큐베이션하는 단계;
(e) 인큐베이션이 완료된 시료에 형광-결합된 2차 항체를 첨가하여 MOG-IgG 및 2차 항체 결합체를 형성시키는 단계; 및
(f) 상기 MOG-IgG 및 2차 항체 결합체로부터 형광을 검출 또는 분석하는 단계를 포함하고, 상기 2차 항체는 항-인간 IgG (H+L)이며, 상기 2차 항체는 MOG-IgG에 대해 IgM과 교차반응(cross reaction)을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 MOG를 코딩하는 핵산은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것인, 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 형광 단백질은 EGFP, GFP, YFP, DsRed2, Tdtomato 또는 mCherry인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포는 HEK(human embryonic kidney) 293, HeLa, CHO (chinese hamster ovary) 또는 NIH3T3 세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 선별 시약은 히그로마이신(Hygromycin), 푸로마이신(puromycin), 블라스티사이딘(blasticidi), 또는 G418인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 시료는 MOG-IgG 관련 중추 신경계(CNS) 염증성 질환 환자로부터 분리된 척수액, 혈액 또는 혈청인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (f)는 면역 형광법(immunofluorescence assay) 또는 유세포 분석(flow cytometry assay)을 수행하는 것인, 방법.
- MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환의 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
(a) MOG를 코딩하는 핵산을 형광 단백질 발현 벡터에 클로닝하는 단계;
(b) MOG가 클로닝된 상기 발현 벡터를 세포에 형질 감염시키는 단계;
(c) 상기 형질 감염된 세포를 선별 시약이 포함된 배지에서 배양하여 MOG를 발현하는 안정한 형질 감염 세포주를 선별하는 단계;
(d) 상기 선별된 세포주와 MOG-IgG를 포함하는 것으로 예상되는 시료를 함께 인큐베이션하는 단계;
(e) 인큐베이션이 완료된 시료에 형광-결합된 2차 항체를 첨가하여 MOG-IgG 및 2차 항체 결합체를 형성시키는 단계; 및
(f) 상기 MOG-IgG 및 2차 항체 결합체로부터 형광을 검출 또는 분석하는 단계를 포함하고, 상기 2차 항체는 항-인간 IgG (H+L)이며, 상기 2차 항체는 MOG-IgG에 대해 IgM과 교차반응(cross reaction)을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 MOG를 코딩하는 핵산은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것인, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 MOG-IgG 관련 중추 신경계 염증성 질환은 AQP4-IgG 음성 시신경척수염범주질환(neuromyelitis optica spectrum disorder, NMOSD), 급성 파종성 뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis, ADEM), 척수염(Myelitis), 뇌염(Encephalitis) 또는 시신경염(optic neuritis, ON)인, 방법.
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Yeseul Kim et al., ‘Large-Scale in-House Cell-Based Assay for Evaluating the Serostatus in Patients with Neuromyelitis Optica Spectrum Disorder Based on New Diagnostic Criteria’, J Clin Neurol., 2017,* * |
| Yeseul Kim et al., ‘Refining cell-based assay to detect MOG-IgG in patients with central nervous system inflammatory diseases’, Multiple Sclerosis and Related Disorders, (2020.01.), Vol. 40, pp 1-9. 1* * |
| YING PENG et al., ‘Diagnostic implications of MOG/AQP4 antibodies in recurrent optic neuritis’, EXPERIMENTAL AND THERAPEUTIC MEDICINE, 2018, Vol. 16, pp 950-958. 1부.* * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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