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CN118638228A - 与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白结合的抗体 - Google Patents

与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白结合的抗体 Download PDF

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CN118638228A
CN118638228A CN202410660372.0A CN202410660372A CN118638228A CN 118638228 A CN118638228 A CN 118638228A CN 202410660372 A CN202410660372 A CN 202410660372A CN 118638228 A CN118638228 A CN 118638228A
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CN
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amino acid
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set forth
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CN202410660372.0A
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高桥信明
中野了辅
前田彩夏
伊东祐二
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Kagoshima University NUC
Kyowa Kirin Co Ltd
Original Assignee
Kagoshima University NUC
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
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Publication date
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Abstract

本发明涉及与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein；MOG)结合的抗体或该抗体片段、产生该抗体或该抗体片段的杂交瘤、包含编码该抗体或该抗体片段的碱基序列的核酸、含有包含该核酸的载体的转化细胞、该抗体或该抗体片段的制造方法、包含该抗体或该抗体片段的组合物、以及使用该抗体或该抗体片段检测或测定存在于脑中的抗原的方法、诊断或治疗脑疾病的方法、提高抗体的脑滞留性的方法和增加脑内的抗体量的方法。

Description

与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白结合的抗体
本申请是申请日为2017年12月25日、申请号为201780081320.6(国际申请号为PCT/JP2017/046445)、发明名称为“与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白结合的抗体”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyteglycoprotein；MOG)结合的抗体或该抗体片段、产生该抗体或该抗体片段的杂交瘤、包含编码该抗体或该抗体片段的碱基序列的核酸、含有包含该核酸的载体的转化细胞、该抗体或该抗体片段的制造方法、包含该抗体或该抗体片段的组合物、以及使用该抗体或该抗体片段检测或测定存在于脑中的抗原的方法、诊断或治疗脑疾病的方法、提高抗体的脑滞留性的方法和增加脑内的抗体量的方法。
背景技术
自1986年小鼠抗CD3抗体、莫罗单抗(muromonab)-CD3(OKT3)作为最初的抗体药品由FDA获得批准以来，已经开发出了数量众多的抗体药品。为了降低小鼠抗体所具有的抗原性而将小鼠抗体的可变区与人抗体的恒定区连接而成的嵌合抗体阿昔单抗(abciximab)在1994年获得了批准。
为了进一步降低抗原性，开发了将小鼠抗体的可变区的对抗原结合发挥重要作用的互补决定区(complementarity determining region、以下记为CDR)移植至人抗体的框架区(frame work region、以下记为FR)中的人源化抗体技术，人源化抗CD20抗体达利珠单抗(dacizumab)在1997年获得了批准。
另外，使用人的抗体序列文库的噬菌体展示技术得到应用，作为在噬菌体展示技术中获得的最初的抗体，完全人抗TNFα抗体阿达木单抗(adalimumab)在2002年获得了批准。以CD20、CD52、TNFα、HER2、EGFR等作为靶抗原的抗体药品已经有60个以上的品种获得了批准(非专利文献1)。
这样，抗体已成为广为人知的药品形式。到目前为止被批准的抗体药品中大部分以癌症、免疫疾病为对象，占整体的约75％以上。
在中枢神经疾病的治疗中，抗体等生物制剂的重要性也在提高，在动物模型中报道了：针对β-淀粉样蛋白的单克隆抗体在阿尔茨海默病中进行了研究；具有神经保护作用的各种神经营养因子(脑源性神经营养因子，brain-derived neurotrophic factor、BDNF；胶质细胞源性神经营养因子，glial-derived neurotrophic factor、GDNF)在中枢神经疾病中显示出神经保护作用(非专利文献2)。
但是，在外周给药抗体的情况下，在中枢神经系统中的送达量比其他器官低，据报道抗体迁移率(脑脊液(cerebrospinal fluid；CSF)中浓度与血清浓度之比)为0.1-0.3％(非专利文献3-5)。
作为在包括脑和脊髓的中枢神经系统中药剂送达量降低的原因，可以列举被称为血脑屏障(Blood Brain Barrier；BBB)的限制血液与脑的组织液间的物质转运的机制。血脑屏障具有基于血管内皮细胞的细胞间连接的物理性的非特异性控制机制和基于外排转运体的底物特异性外排机制，保护中枢神经系统免受异物或药物的影响，对于维持稳态性发挥重要的作用。
但是，由于血脑屏障的存在，在中枢神经系统中难以得到药剂给药时的有效浓度，药剂开发变得困难。例如，通过针对贺勒氏综合征(粘多糖贮积症I型)的α-L-艾杜糖醛酸酶、针对亨特综合征(粘多糖贮积症II型)的艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶的静脉内给药实行了酶补充疗法，但由于酶的分子量大、无法通过血脑屏障，因此未确认到对中枢神经症状的有效性(非专利文献6-9)。另外报道了：由于定期地持续给药一定量的重组酶而表现出中和抗体产生等副作用(非专利文献10)。
另外，为了提高脑内浓度，还进行了将生物制剂直接给药至髓腔内或脑内的尝试。例如，报道了为了防止亨特综合征(粘多糖贮积症II型)的患者的脑损伤的发展而将艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶给药至患者脑内的方法(专利文献1)。但是，向髓腔内或脑内的直接给药的侵袭性高(非专利文献11)。
因此，为了提高生物制剂这样的高分子物质的脑内浓度，研究了各种递送技术。例如，报道了多种与表达在脑血管内皮细胞上的膜蛋白质结合而形成高分子物质与膜蛋白质的复合体、通过胞吞作用使其通过血脑屏障的方法。
已报道的技术大多数利用的是受体介导的转胞吞作用(receptor-mediatedtranscytosis、以下记为RMT)，作为成为标靶的脑血管内皮表达受体，例如有转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体和低密度脂蛋白受体家族(LDLRf)。
通过制作抗转铁蛋白受体抗体与神经生长因子的融合蛋白质，报道了转铁蛋白受体介导的血脑屏障通过技术。作为使用抗转铁蛋白受体抗体的技术，报道了抗转铁蛋白受体抗体与抗β分泌酶(BACE1)抗体的双特异性抗体(专利文献2和3以及非专利文献12和13)、在抗淀粉样蛋白β抗体的羧基末端侧融合抗转铁蛋白受体的一价抗体而成的融合抗体(专利文献4、非专利文献14)。
关于抗转铁蛋白受体抗体与抗BACE1抗体的双特异性抗体的脑递送，报道了在小鼠中以20mg/kg体重给药抗体时脑内的抗体摄取量增加至对照的约4倍(非专利文献13)。
另外，报道了通过在表面具有抗转铁蛋白受体抗体的脂质体中内包药剂而使药剂通过血脑屏障的技术。据报道，利用抗大鼠转铁蛋白受体抗体与免疫胶束的融合体，大鼠脑内的摄取量增加至约2～5倍(非专利文献9)。
另外，通过制作在抗胰岛素受体抗体的羧基末端侧融合神经营养因子、酶或抗淀粉样蛋白抗体而成的融合蛋白质，报道了胰岛素受体介导的血脑屏障通过技术(非专利文献16-19)。
据报道，在恒河猴中，标记抗人胰岛素受体抗体与GDNF的融合抗体给药2小时后的脑内的摄取量与GDNF相比变为约15倍(非专利文献17)。
但是，转铁蛋白受体、胰岛素受体不仅表达在脑血管内皮细胞中，在肝脏等全身都有表达，因此，这些技术中，在增大向中枢神经系统的药剂递送量的同时对肝脏等也进行药剂递送(非专利文献20)。此外，由于抗原在全身进行表达，因此抗体的血中半衰期短(非专利文献12)。
另外，报道了针对脑血管内皮膜表达抗原TMEM30A的抗体(Fc5)显示出RMT样的活性(专利文献5以及非专利文献21和22)。Fc5是来源于美洲驼的单结构域的重链抗体的重链可变区(Variabledomain of Heavy chain of Heavy chain antibody、以下记为VHH)抗体，在体外BBB模型和大鼠体内模型中显示出Fc5与人Fc的融合体的脑递送与对照IgG相比增加。
据报道，Fc5来源的单链抗体(single chain antibody；scFv)与代谢型谷氨酸受体I型(metabotropic glutamate receptor type I、以下记为mGluRI)抗体的融合体相较于对照单链抗体与mGluRI抗体的融合体在大鼠模型中的CSF暴露提高，增加量为约5倍(非专利文献23)。
另外，报道了IgG抗体利用新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor；FcRn)从脑内向循环血液方向快速排出(非专利文献24和25)，例如大鼠中的IgG的脑内给药后的脑内半衰期短至48分钟(非专利文献24)。
MOG是属于免疫球蛋白超家族的蛋白质，其构成髓鞘。人MOG全长由218个氨基酸构成，在中枢神经系统中表达在髓鞘的最外层，在细胞粘附和细胞表面相互作用中发挥作用(非专利文献26-28)。
在多发性硬化症(multiple sclerosis；MS)这样的中枢神经的胶质细胞因自身免疫而受到攻击的炎症性疾病中，认为MOG为自身抗原候补(非专利文献29和30)。据报道，MS患者中，血清中的抗MOG抗体的浓度低，但在中枢神经内也检测到抗MOG抗体(非专利文献29)。
作为其原因，有如下报道：在MS这样的病态时，由于体液因子的漏出和炎症性细胞的侵入而使血脑屏障被破坏，抗体容易迁移至中枢神经系统中(非专利文献30和31)。此外还报道了，通过浸润至中枢神经系统中的B细胞和浆细胞，在中枢神经系统内局部产生了自身抗体(非专利文献30、32和33)。
实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis；EAE)与MS有很多共有的病态，因此是在MS的病态研究中使用的模型。报道了：通过将MOG蛋白或肽免疫于动物，能够诱导EAE(非专利文献34)。
另外，有通过对诱导了EAE的动物给药抗MOG抗体而使EAE评分恶化的报道(非专利文献29和35)，但在抗体给药后1-2天后(非专利文献29)或4天后(非专利文献35)显示出EAE评分的峰值，是瞬时性的。另一方面，报道了：对正常动物即使仅给药抗MOG抗体，也不发生EAE(非专利文献36和37)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2012/023623号
专利文献2：国际公开第2016/081640号
专利文献3：国际公开第2016/081643号
专利文献4：国际公开第2014/033074号
专利文献5：加拿大专利第2623841号说明书
非专利文献
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发明内容
发明所要解决的问题
非专利文献29、35记载了对EAE模型给药抗MOG抗体时，在脑内检测到该抗体，但没有报道在正常动物的外周给药抗MOG抗体时能够检测到在脑内的存在的抗MOG抗体。
本发明涉及与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyteglycoprotein；MOG)结合的MOG结合分子和使用该分子的方法。具体而言，本发明的目的在于提供与MOG结合的抗体或该抗体片段、产生该抗体或该抗体片段的杂交瘤、包含编码该抗体或该抗体片段的碱基序列的核酸、含有包含该核酸的载体的转化细胞、该抗体或该抗体片段的制造方法、包含该抗体或该抗体片段的组合物、以及使用该抗体或该抗体片段检测或测定存在于脑中的抗原的方法、诊断或治疗脑疾病的方法、提高抗体的脑滞留性的方法和增加脑内的抗体量的方法。
用于解决问题的方法
作为用于解决上述问题的方法，本发明提供与MOG结合的MOG结合分子和使用该分子的方法，具体而言，提供抗体或该抗体片段。
即，本发明涉及下述(1)～(22)项。
(1)一种抗体或该抗体片段，其与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(以下记载为MOG)结合。
(2)如(1)所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体具有脑滞留性。
(3)如(1)或(2)所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为选自由下述(a)～(r)组成的组中的一种。
(a)重链可变区(以下记载为VH)的互补决定区(以下记载为CDR)1～3的氨基酸序列分别包含序列号4、5和6中记载的氨基酸序列、并且轻链可变区(VL)的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号10、11和12中记载的氨基酸序列的抗体；
(b)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号16、17和18中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号22、23和24中记载的氨基酸序列的抗体；
(c)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号28、29和30中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号34、35和36中记载的氨基酸序列的抗体；
(d)重链抗体的重链可变区(以下记载为VHH)的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号40、41和42中记载的氨基酸序列的抗体片段；
(e)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号153、154和155中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号158、159和160中记载的氨基酸序列的抗体；
(f)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号163、164和165中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号168、169和170中记载的氨基酸序列的抗体；
(g)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号173、174和175中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号178、179和180中记载的氨基酸序列的抗体；
(h)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号183、184和185中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号188、189和190中记载的氨基酸序列的抗体；
(i)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号193、194和195中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号198、199和200中记载的氨基酸序列的抗体；
(j)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号203、204和205中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号208、209和210中记载的氨基酸序列的抗体；
(k)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号213、214和215中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号218、219和220中记载的氨基酸序列的抗体；
(l)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号223、224和225中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号228、229和230中记载的氨基酸序列的抗体；
(m)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号233、234和235中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号238、239和240中记载的氨基酸序列的抗体；
(n)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号243、244和245中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号248、249和250中记载的氨基酸序列的抗体；
(o)与上述(a)～(n)中记载的至少一种抗体竞争性地与MOG结合的抗体；
(p)与包含上述(a)～(n)中记载的任意一种抗体所结合的表位的表位结合的抗体；
(q)与和上述(a)～(n)中记载的任意一种抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体；和
(r)包含与上述(a)～(n)中记载的任意一种抗体的氨基酸序列具有85％以上的同源性的氨基酸序列的抗体。
(4)如(1)～(3)中任一项所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体为选自由下述(a)～(n)、(o1)～(o22)和(p)组成的组中的一种。
(a)VH的氨基酸序列包含序列号3中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号9中记载的氨基酸序列的抗体；
(b)VH的氨基酸序列包含序列号15中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号21中记载的氨基酸序列的抗体；
(c)VH的氨基酸序列包含序列号27中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号33中记载的氨基酸序列的抗体；
(d)VHH的氨基酸序列包含序列号39中记载的氨基酸序列的抗体片段；
(e)VH的氨基酸序列包含序列号152中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号157中记载的氨基酸序列的抗体；
(f)VH的氨基酸序列包含序列号162中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号167中记载的氨基酸序列的抗体；
(g)VH的氨基酸序列包含序列号172中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号177中记载的氨基酸序列的抗体；
(h)VH的氨基酸序列包含序列号182中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号187中记载的氨基酸序列的抗体；
(i)VH的氨基酸序列包含序列号192中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号197中记载的氨基酸序列的抗体；
(j)VH的氨基酸序列包含序列号202中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号207中记载的氨基酸序列的抗体；
(k)VH的氨基酸序列包含序列号212中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号217中记载的氨基酸序列的抗体；
(l)VH的氨基酸序列包含序列号222中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号227中记载的氨基酸序列的抗体；
(m)VH的氨基酸序列包含序列号232中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号237中记载的氨基酸序列的抗体；
(n)VH的氨基酸序列包含序列号242中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号247中记载的氨基酸序列的抗体；
(o1)VH的氨基酸序列包含序列号252中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号254中记载的氨基酸序列的抗体；
(o2)VH的氨基酸序列包含序列号256中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号258中记载的氨基酸序列的抗体；
(o3)VH的氨基酸序列包含序列号260中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号262中记载的氨基酸序列的抗体；
(o4)VH的氨基酸序列包含序列号264中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号266中记载的氨基酸序列的抗体；
(o5)VH的氨基酸序列包含序列号268中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号270中记载的氨基酸序列的抗体；
(o6)VH的氨基酸序列包含序列号272中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号274中记载的氨基酸序列的抗体；
(o7)VH的氨基酸序列包含序列号276中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号278中记载的氨基酸序列的抗体；
(o8)VH的氨基酸序列包含序列号280中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号282中记载的氨基酸序列的抗体；
(o9)VH的氨基酸序列包含序列号284中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号286中记载的氨基酸序列的抗体；
(o10)VH的氨基酸序列包含序列号288中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号290中记载的氨基酸序列的抗体；
(o11)VH的氨基酸序列包含序列号292中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号294中记载的氨基酸序列的抗体；
(o12)VH的氨基酸序列包含序列号296中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号298中记载的氨基酸序列的抗体；
(o13)VH的氨基酸序列包含序列号300中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号302中记载的氨基酸序列的抗体；
(o14)VH的氨基酸序列包含序列号304中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号306中记载的氨基酸序列的抗体；
(o15)VH的氨基酸序列包含序列号308中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号310中记载的氨基酸序列的抗体；
(o16)VH的氨基酸序列包含序列号312中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号314中记载的氨基酸序列的抗体；
(o17)VH的氨基酸序列包含序列号316中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号318中记载的氨基酸序列的抗体；
(o18)VH的氨基酸序列包含序列号320中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号322中记载的氨基酸序列的抗体；
(o19)VH的氨基酸序列包含序列号324中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号326中记载的氨基酸序列的抗体；
(o20)VH的氨基酸序列包含序列号328中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号330中记载的氨基酸序列的抗体；
(o21)VH的氨基酸序列包含序列号332中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号334中记载的氨基酸序列的抗体；
(o22)VH的氨基酸序列包含序列号336中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号338中记载的氨基酸序列的抗体；
(p)包含与上述(a)～(n)和(ο1)～(ο22)中记载的任意一种抗体的氨基酸序列具有85％以上的同源性的氨基酸序列的抗体。
(5)如(1)～(4)中任一项所述的抗体或该抗体片段，其中，抗体或该抗体片段为双特异性抗体。
(6)如(5)所述的双特异性抗体，其中，双特异性抗体与MOG和存在于脑中的抗原结合。
(7)如(5)或(6)所述的双特异性抗体，其中，双特异性抗体包含与MOG结合的抗原结合位点、以及与存在于脑中的抗原结合的抗原结合位点。
(8)如(1)～(7)中任一项所述的抗体片段，其中，抗体片段为选自由Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(双链抗体(diabody))、二硫键稳定的V区(dsFv)、VHH和包含CDR的肽组成的组中的一种。
(9)如(1)～(8)中任一项所述的抗体和该抗体片段，其中，抗体为基因重组抗体。
(10)如(1)～(9)中任一项所述的抗体和该抗体片段，其中，抗体为选自由小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、羊驼抗体、骆驼抗体、美洲驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体组成的组中的一种。
(11)一种融合抗体或融合抗体片段，其是使选自由下述(a)～(c)组成的组中的至少一者与(1)～(10)中任一项所述的与MOG结合的抗体或该抗体片段结合而成的。
(a)亲水性高分子、
(b)两亲性高分子、和
(c)功能性分子。
(12)一种杂交瘤，其产生(1)～(11)中任一项所述的抗体。
(13)一种核酸，其包含编码(1)～(11)中任一项所述的抗体的碱基序列。
(14)一种转化细胞，其含有包含(13)所述的核酸的载体。
(15)(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段的制造方法，其包括：对(12)所述的杂交瘤或(14)所述的转化细胞进行培养，从培养液中收集(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段。
(16)一种组合物，其包含(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段。
(17)如(16)所述的组合物，其为用于检测或测定存在于脑中的抗原的组合物。
(18)如(16)所述的组合物，其为用于诊断或治疗脑疾病的组合物。
(19)一种检测或测定存在于脑中的抗原的方法，其中，使用(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段、或者(16)所述的组合物，对存在于脑中的抗原进行检测或测定。
(20)一种诊断或治疗脑疾病的方法，其中，使用(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段、或者(16)所述的组合物，对脑疾病进行诊断或治疗。
(21)一种提高抗体或该抗体片段或者融合抗体或融合抗体片段的脑滞留性的方法，其中，使用(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段或者融合抗体或融合抗体片段、或者(16)所述的组合物来提高抗体或该抗体片段或者融合抗体或融合抗体片段的脑滞留性。
(22)一种增加脑内的抗体量或该抗体片段量或者融合抗体量或融合抗体片段量的方法，其中，使用(1)～(11)中任一项所述的抗体或该抗体片段或者融合抗体或融合抗体片段、或者(16)所述的组合物来增加脑内的抗体量或该抗体片段量或者融合抗体量或融合抗体片段量。
发明效果
本发明的MOG结合分子不仅能够通过与MOG特异性结合而增加结合分子本身的脑滞留性，还能够通过在MOG结合分子上修饰其他分子而使其向脑内转运并滞留，由此能够应用于脑疾病的治疗。作为本发明的具体的MOG结合分子，可以列举抗体。本发明的抗体或该抗体片段是通过与脑内的MOG结合而具有脑滞留性的抗体。因此，本发明的抗体或该抗体片段能够用作用于检测或测定存在于脑中的抗原(MOG、或者MOG和存在于脑中的其他抗原)的组合物、用于诊断脑疾病的组合物和用于治疗脑疾病的药物组合物。
附图说明
图1是利用ELISA分析与MOG结合的scFv展示噬菌体克隆对rMOG-FLAG_Fc的结合性的结果。纵轴表示对rMOG-FLAG_Fc的吸光度，横轴表示各噬菌体克隆所展示的scFv抗体的名称。
图2是利用流式细胞仪分析各抗MOG抗体对HEK细胞、大鼠MOG/HEK细胞、小鼠MOG/HEK细胞、食蟹猴MOG/HEK细胞或人MOG/HEK细胞的结合性的结果。纵轴表示细胞数，横轴表示荧光强度。虚线的直方图示出用作阴性对照的抗AVM抗体的结合性，实线的直方图示出各MOG抗体的结合性。
图3(A)和(B)是抗MOG抗体的大鼠脑迁移性评价的结果。图3(A)示出对大鼠给药抗体4天后的血清中的抗体浓度。纵轴表示抗体浓度(ng/mL)，横轴表示给药的抗体。图3(B)示出对大鼠给药抗体4天后的脑组织中的抗体浓度。纵轴表示每单位脑重量的抗体量(ng/g脑)，横轴表示给药的抗体。在任意一个图中，白色棒图均表示用作阴性对照的抗AVM抗体，黑色棒图均表示抗MOG抗体。
图4(A)和(B)是抗MOG抗体的大鼠脑迁移性评价的结果。图4(A)示出对大鼠给药抗体4天后和10天后的血清中的抗体浓度。纵轴表示抗体浓度(ng/mL)，横轴表示给药抗体后的天数(天)。图4(B)示出对大鼠给药抗体4天后和10天后的脑组织中的抗体浓度。纵轴表示每单位脑重量的抗体量(ng/g脑)，横轴表示给药抗体后的天数(天)。在任意一个图中，白色菱形均表示用作阴性对照的抗AVM抗体，白色四边形均表示抗转铁蛋白受体抗体OX26抗体，黑色三角形均表示抗MOG抗体MOG01抗体。
图5是利用流式细胞仪分析各种双特异性抗体对HEK293F细胞、大鼠MOG/HEK293F细胞或人MOG/HEK293F细胞的结合性的结果。纵轴表示细胞数，横轴表示荧光强度。虚线的直方图示出用作阴性对照的抗AVM抗体的结合性，实线的直方图示出各双特异性抗体的结合性。
图6是利用流式细胞仪分析各种双特异性抗体对人乳腺癌细胞株SK-BR-3的结合性的结果。纵轴表示细胞数，横轴表示荧光强度。虚线的直方图示出用作阴性对照的抗AVM抗体的结合性，实线的直方图示出各双特异性抗体的结合性。
图7(A)和(B)是与MOG结合的双特异性抗体的大鼠脑迁移性评价的结果。图7(A)示出对大鼠给药抗体10天后的血清中的抗体浓度。纵轴表示抗体浓度(ng/mL)，横轴表示使用的双特异性抗体。图7(B)示出对大鼠给药抗体10天后的脑组织中的抗体浓度。纵轴表示每单位脑重量的抗体量(ng/g脑)，横轴表示使用的双特异性抗体。
图8(A)和(B)是抗MOG01抗体的小鼠脑迁移性评价的结果。图8(A)示出对小鼠给药抗体3、6、10、14、21、28天后的血清中的抗体浓度。纵轴表示抗体浓度(ng/mL)，横轴表示时间(天)。图8(B)示出对小鼠给药抗体3、6、10、14、21、28天后的脑组织中的抗体浓度。纵轴表示抗体浓度(ng/g脑)，横轴表示时间(天)。在任意一个图中，白色圆形均表示用作阴性对照的抗AVM抗体，黑色四边形均表示MOG01scFv-hG4PE。
图9(A)～(C)是抗MOG01抗体的小鼠脑迁移性成像评价的结果。图9(A)是对小鼠给药作为阴性对照的Alexa FluorR 488标记抗AVM抗体和Alexa FluorR 488标记抗MOG01抗体6天后的脑的荧光强度测定数据，图9(B)是14天后的脑的荧光强度测定数据。图9(C)是用给药抗体的荧光强度对6天后和14天后的脑中荧光量进行校正后的值。纵轴表示脑中荧光量/给药抗体的荧光量(％)，横轴表示给药的抗体。
图10(A)～(C)示出与AVM和MOG结合的各种双特异性抗体的结构。图10(A)示出AVM-MOG01 IgG4PE(R409K)抗体的结构，图10(B)示出AVM IgG4PE(R409K)_MOG01 Fab抗体的结构，图10(C)示出AVM IgG4PE(R409K)_MOG01sscFv抗体的结构。
图11(A)和(B)示出与AVM和MOG结合的各种双特异性抗体的结构。图11(A)示出AVMIgG4PE(R409K)_MOG01dscFv抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv2抗体和AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv4抗体的结构，图11(B)示出AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv3抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv5抗体～AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv11抗体的结构。
图12(A)～(C)是利用流式细胞仪分析各种双特异性抗体对人MOG/L929细胞的结合性的结果。纵轴表示平均荧光强度，横轴表示抗体浓度。图12(A)中，白色圆形表示AVMIgG4PE(R409K)抗体(阴性对照)，黑色四边形表示AVM-MOG01 IgG4PE(R409K)抗体。图12(B)中，白色圆形表示AVM IgG4PE(R409K)_AVMsscFv抗体(阴性对照)，黑色四边形表示AVMIgG4PE(R409K)_MOG01sscFv抗体。图12(C)中，白色圆形表示AVM IgG4PE(R409K)_AVM Fab抗体(阴性对照)，黑色四边形表示AVM IgG4PE(R409K)_MOG01 Fab抗体。
图13(A)和(B)是利用流式细胞仪分析各种双特异性抗体对人MOG/L929细胞的结合性的结果。纵轴表示平均荧光强度，横轴表示抗体浓度。图13(A)中，白色四边形表示AVMIgG4PE(R409K)_MOG01dscFv抗体，白色圆形表示AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv2抗体，白色三角形表示AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv4抗体。图13(B)中，白色菱形表示AVMIgG4PE(R409K)_MOG01dscFv3抗体，黑色菱形表示AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv5抗体，白色圆形表示AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv6抗体，黑色圆形表示AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv7抗体，白色三角形表示AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv8抗体，黑色三角形表示AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv9抗体，白色四边形表示AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv10抗体，黑色四边形表示AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv11抗体。
图14(A)和(B)是各种双特异性抗体的小鼠脑迁移性评价的结果。纵轴表示抗体浓度，横轴表示使用的双特异性抗体。图14(A)和(B)分别示出给药AVM IgG4PE(R409K)抗体(阴性对照)和AVM-MOG01IgG4PE(R409K)抗体10天后的血清中和脑组织中的抗体浓度。
图15(A)和(B)是各种双特异性抗体的小鼠脑迁移性评价的结果。纵轴表示抗体浓度，横轴表示使用的双特异性抗体。图15(A)和(B)分别示出给药AVM IgG4PE(R409K)_AVMsscFv抗体(阴性对照)和AVM IgG4PE(R409K)_MOG01sscFv抗体10天后的血清中和脑组织中的抗体浓度。
图16(A)和(B)是各种双特异性抗体的小鼠脑迁移性评价的结果。纵轴表示抗体浓度，横轴表示使用的双特异性抗体。图16(A)和(B)分别示出给药AVM IgG4PE(R409K)_AVMFab抗体(阴性对照)和AVM IgG4PE(R409K)_MOG01 Fab抗体10天后的血清中和脑组织中的抗体浓度。
图17(A)～(D)是各种双特异性抗体的小鼠脑迁移性评价的结果。纵轴表示抗体浓度，横轴表示使用的双特异性抗体。与AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv抗体对应的阴性对照为AVM IgG4PE(R409K)_AVMdscFv抗体，与AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv3抗体对应的阴性对照为AVM IgG4PE(R409K)_AVMdscFv3抗体，与AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv5抗体对应的阴性对照为AVM IgG4PE(R409K)_AVMdscFv5抗体。图17(A)示出抗体给药10天后的血清中的抗体浓度。图17(B)示出抗体给药10天后的脑组织中的抗体浓度。图17(C)示出抗体给药28天后的血清中的抗体浓度。图17(D)示出抗体给药28天后的脑组织中的抗体浓度。
图18是MOG抗体的相似克隆的scFv的氨基酸序列，示出MOG301抗体的相似克隆。
图19是MOG抗体的相似克隆的scFv的氨基酸序列，示出MOG303抗体的相似克隆。
图20是MOG抗体的相似克隆的scFv的氨基酸序列，示出MOG307抗体的相似克隆。
图21是MOG抗体的相似克隆的scFv的氨基酸序列，示出MOG310抗体的相似克隆。
图22(A)和(B)是MOG抗体的相似克隆的scFv的氨基酸序列。图22(A)示出MOG329抗体的相似克隆，图22(B)示出MOG456抗体的相似克隆。
图23是利用流式细胞仪分析抗MOG抗体对Expi293F细胞的结合性的结果。纵轴表示细胞数，横轴表示荧光强度。虚线的直方图示出用作阴性对照的抗AVM抗体的结合性，实线的直方图示出各MOG抗体的结合性。
图24是利用流式细胞仪分析抗MOG抗体对小鼠MOG/Expi293F细胞的结合性的结果。纵轴表示细胞数，横轴表示荧光强度。虚线的直方图示出用作阴性对照的抗AVM抗体的结合性，实线的直方图示出各MOG抗体的结合性。
图25是利用流式细胞仪分析抗MOG抗体对人MOG/Expi293F细胞的结合性的结果。纵轴表示细胞数，横轴表示荧光强度。虚线的直方图示出用作阴性对照的抗AVM抗体的结合性，实线的直方图示出各MOG抗体的结合性。
图26是利用流式细胞仪分析酶融合抗体MOG01IgG4PE(R409K)-ASM对人MOG/L929细胞的结合性的结果。纵轴表示平均荧光强度，横轴表示抗体浓度。
图27是利用ELISA法分析抗ASM抗体(LSBio公司制造)对MOG01 IgG4PE(R409K)-ASM和AVM IgG4PE(R409K)-ASM的结合性的结果。纵轴表示吸光度，横轴表示固相化的抗体名。作为阴性对照，使用MOG01 IgG4PE和AVM IgG4PE。细斜线的棒图示出抗ASM抗体5μg/mL的数据，粗斜线的棒图示出抗ASM抗体1μg/mL的数据，白色的棒图示出抗ASM抗体0.2μg/mL的数据。
图28(A)和(B)是酶融合抗体MOG01 IgG4PE(R409K)-ASM和AVM IgG4PE(R409K)-ASM的小鼠脑迁移性评价的结果。纵轴表示抗体浓度，横轴表示使用的酶融合抗体。图28(A)示出抗体给药10天后的血清中的抗体浓度。图28(B)示出抗体给药10天后的脑组织中的抗体浓度。
具体实施方式
本发明涉及与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(Myelin-oligodendrocyteglycoprotein、以下记载为MOG)结合的抗原结合分子。更具体而言，本发明涉及与MOG结合的抗体或该抗体片段。
作为本发明的MOG结合分子，只要是与MOG特异性结合且该分子滞留在脑内的分子，则可以为任意的分子形态，可以为蛋白质、核酸、有机合成的低分子化合物/高分子化合物等任意一种分子。具体而言，可以为重组蛋白质、抗体、适配体、低分子筛选中得到的低分子化合物等任意一种分子，优选列举抗体和该抗体片段。MOG结合分子优选为与MOG的胞外区结合的分子。
MOG是属于免疫球蛋白超家族的蛋白质，其构成髓鞘。例如，人MOG全长由218个氨基酸构成，在中枢神经系统中表达在髓鞘的最外层，在细胞粘附和细胞表面相互作用中发挥作用。
本发明的MOG结合分子所结合的MOG的动物种类可以列举小鼠、大鼠、食蟹猴和/或人等，但并不特别限定于这些种类，可以根据抗体的用途选择适当的动物种类。例如，在人的药物用途中使用本发明的抗体的情况下，该抗体优选为至少与人的MOG结合的抗体。
本发明中，作为人MOG，可以列举：包含序列号78中记载的氨基酸序列或NCBI登录号AAB08088的氨基酸序列的多肽；由在序列号78中记载的氨基酸序列或NCBI登录号AAB08088的氨基酸序列中一个以上的氨基酸发生缺失、置换或添加而得到的氨基酸序列构成且具有人MOG的功能的多肽；或者由与序列号78中记载的氨基酸序列或NCBI登录号AAB08088的氨基酸序列具有60％以上、优选80％以上、进一步优选90％以上、最优选95％以上的同源性的氨基酸序列构成且具有人MOG的功能的多肽等。
具有在序列号78中记载的氨基酸序列或NCBI登录号AAB08088所表示的氨基酸序列中一个以上的氨基酸发生缺失、置换或添加而得到的氨基酸序列的多肽可以通过使用定点诱变法[Molecular Cloning、ALaboratory Manual、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols in Molecular Biology、约翰威利父子出版社(1987-1997)；Nucleic acids Research,10,6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)；Gene,34,315(1985)；Nucleic Acids Research,13,4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)]等，在例如编码包含序列号78的氨基酸序列的多肽的DNA中导入定点突变而得到。
缺失、置换或添加的氨基酸的数目没有特别限定，优选为1个～几十个、例如为1～20个，更优选为1个～几个、例如为1～5个氨基酸。
对于小鼠MOG的氨基酸序列[序列号74、NCBI登录号NP_034944]、大鼠MOG的氨基酸序列[序列号68、NCBI登录号AAA41628]和食蟹猴MOG的氨基酸序列[序列号76、NCBI登录号NP_001271785]也是同样。
作为编码人MOG的基因，可以列举序列号77中记载的碱基序列和NCBI登录号U64564的碱基序列。本发明中，包含由在序列号77中记载的碱基序列或NCBI登录号U64564的碱基序列中一个以上的碱基发生缺失、置换或添加而得到的碱基序列构成且编码具有MOG的功能的多肽的DNA的基因、包含由与序列号77中记载的碱基序列或NCBI登录号U64564的碱基序列具有至少60％以上的同源性的碱基序列、优选具有80％以上的同源性的碱基序列、进一步优选具有95％以上的同源性的碱基序列构成且编码具有MOG的功能的多肽的DNA的基因或者由在严格条件下与包含序列号77中记载的碱基序列或NCBI登录号U64564的碱基序列的DNA杂交的DNA构成且编码具有MOG的功能的多肽的基因等也包含在编码MOG的基因中。
作为在严格条件下杂交的DNA，是指通过使用包含序列号77中记载的碱基序列或NCBI登录号U64564的碱基序列的DNA作为探针的菌落杂交法、噬菌斑杂交法、Southern印迹杂交法或DNA微阵列法等得到的能够杂交的DNA。
具体而言，可以列举能够通过如下方法进行鉴定的DNA：使用固定有来源于杂交的菌落或噬菌斑的DNA、或者具有该序列的PCR产物或寡聚DNA的滤膜或载玻片，在0.7～1.0mol/L的氯化钠存在下在65℃下进行杂交[Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols in Molecular Biology、约翰威利父子出版社(1987-1997)；DNA Cloning 1：Core Techniques、A Practical Approach(DNA克隆1：核心技术实用方法)、第二版、牛津大学出版社(1995)]后，使用0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成由150mmol/L氯化钠、15mmol/L柠檬酸钠构成)在65℃条件下对滤膜或载玻片进行清洗。
作为能够杂交的DNA，可以列举与序列号77中记载的碱基序列或NCBI登录号U64564的碱基序列具有至少60％以上的同源性的DNA、优选具有80％以上的同源性的DNA、进一步优选具有95％以上的同源性的DNA。
对于小鼠MOG的碱基序列[序列号73、NCBI登录号NM_010814]、大鼠MOG的碱基序列[序列号67、NCBI登录号M99485]和食蟹猴MOG的碱基序列[序列号75、NCBI登录号NM_001284856]也是同样。
作为MOG的功能，可以列举参与髓鞘上的细胞粘附和细胞表面相互作用等。
真核生物的编码蛋白质的基因的碱基序列常常可以确认到基因的多态性。在本发明中使用的基因内由于这种多态性使碱基序列产生小规模突变而得到的基因也包含在本发明的编码MOG的基因中。
除了特别说明的情况以外，本发明中的同源性的数值可以是使用本领域技术人员公知的同源性检索程序算出的数值，对于碱基序列，可以列举使用BLAST[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]中默认的参数算出的数值等，对于氨基酸序列，可以列举使用BLAST2[Nucleic Acids Res.,25,3389(1997)；Genome Res.,7,649(1997)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.htmL]中默认的参数算出的数值等。
作为默认的参数，G(起始空位罚分，Cost to open gap)在碱基序列的情况下为5、在氨基酸序列的情况下为11；-E(空位延伸罚分，Cost to extend gap)在碱基序列的情况下为2、在氨基酸序列的情况下为l；-q(核苷酸错配罚分，Penalty for nucleotidemismatch)为-3；-r(核苷酸匹配得分，reward for nucleotide match)为1；-e(期望值，expect value)为10；-W(字长大小，wordsize)在碱基序列的情况下为11个残基、在氨基酸序列的情况下为3个残基；-y[非空位延伸下降的阈值，Dropoff(X)for blast extensionsin bits]在blastn的情况下为20、在blastn以外的程序中为7；-X(空位比对的下降阈值，Xdropoff value for gapped alignment in bits)为15；-Z(最终空位比对的下降值，finalX dropoff value for gapped alignment in bits)在blastn的情况下为50、在blastn以外的程序中为25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/htmL/blastcgihelp.htmL)。
包含上述各种MOG的氨基酸序列的部分序列的多肽可以通过本领域技术人员公知的方法来制作。具体而言，可以通过使编码上述各种MOG的氨基酸序列的DNA的一部分缺失并对导入有包含上述DNA的表达载体的转化体进行培养来制作。另外，可以利用与上述同样的方法，得到具有在各种MOG的氨基酸序列中一个以上的氨基酸发生缺失、置换或添加而得到的氨基酸序列的多肽。
此外，包含各种MOG的氨基酸序列的多肽、或者具有在各种MOG的氨基酸序列中一个以上的氨基酸发生缺失、置换或添加而得到的氨基酸序列的多肽也可以通过芴甲氧羰基(Fmoc)法、叔丁氧羰基(tBoc)法等化学合成法来制造。
本发明中，人MOG的胞外区是指序列号78或NCBI登录号AAB08088中记载的氨基酸序列中第30位至第154位或者第232位至第247位的氨基酸序列，优选为第30位至第154位的氨基酸序列。
小鼠MOG的胞外区是指序列号74或NCBI登录号NP_034944中记载的氨基酸序列中第30位至第157位或者第232位至第247位的氨基酸序列，优选为第30位至第157位的氨基酸序列。大鼠MOG的胞外区是指序列号68或NCBI登录号AAA41628中记载的氨基酸序列中第28位至第155位或者第230位至第245位的氨基酸序列，优选为第28位至第155位的氨基酸序列。
食蟹猴MOG的胞外区是指序列号76或NCBI登录号NP_001271785中记载的氨基酸序列中第30位至第154位或者第232位至第247位的氨基酸序列，优选为第30位至第154位的氨基酸序列。
本发明的抗体与MOG的胞外区结合这一点可以通过使用ELISA、流式细胞术和表面等离子体共振法等测定本发明的抗体对MOG表达细胞或重组MOG蛋白的结合性来进行确认。另外，也可以将公知的免疫学检测法[Monoclonal Antibodies-Principles andpractice,第三版,学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual,冷泉港实验室(1988)；单克隆抗体实验手册、讲谈社Scientific(1987)]等组合来进行确认。
本发明的MOG结合分子是通过与脑内的MOG特异性结合而具有脑滞留性的分子，例如抗体是通过与脑内的MOG结合而具有脑滞留性的抗体。另外，本发明的抗体是通过在给药至动物的外周时从外周透过脑的血脑屏障而迁移至脑内、并与脑内的MOG结合而具有脑滞留性的抗体。本发明的抗体优选为脑滞留性优良的抗体或脑滞留性提高的抗体。
本发明中，脑滞留性是指对被测动物给药对象物时该对象物停留在脑内的性质。即，是指通过选自向脑内的迁移的增加、向脑内的蓄积的增加、从脑内向脑外的迁移的减少、从脑内向脑外的排出的减少和脑内分解的减少中的至少任意一种情况而使该对象物的脑内浓度(或脑内量)增加、或者以能够检测的程度存在一定浓度。
本发明中，脑滞留性优良、脑滞留性高或脑滞留性提高是指，在将对象物给药于被测动物时，与对照相比，从给药起经过相同天数后的该对象物的脑内浓度(或脑内量)增加，或者该对象物在脑内长期以能够检测的程度存在一定浓度(量)。
这些现象是通过与对照相比该对象物向脑内的迁移的增加、向脑内的蓄积的增加、从脑内向脑外的迁移的减少、从脑内向脑外的排出的减少和脑内分解的减少中的至少一种情况而产生的。
本发明中，脑滞留性优良、脑滞留性高或脑滞留性提高可以列举例如：对被测动物给药该对象物时，与对照相比，给药后1～10天、优选给药后2～10天、3～10天、更优选4～10天的该对象物的脑内浓度(量)高；或者该对象物的脑内浓度(或脑内量)的峰值为给药后第4天以后、优选为给药后第5天以后、第6天以后、第7天以后、第8天以后、第9天以后、更优选为第10天以后；等等。
脑滞留性优良的抗体、脑滞留性高的抗体或脑滞留性提高的抗体只要是与对照抗体相比在脑内的抗体浓度(抗体量)高的抗体、或者具有能够在脑内长期存在的特征的抗体，则可以为任意一种抗体。
可以列举例如具有与对照抗体相比，向脑内的迁移性和/或脑内蓄积性高的特征、从脑内向脑外的迁移性、排出性和/或脑内分解性低的特征、以及向脑内的迁移性和/或脑内蓄积性高于从脑内向脑外的迁移性、排出性和/或脑内分解性的特征等的抗体。
因此，作为本发明的抗体或该抗体片段，可以列举：在将抗体或该抗体片段给药于动物的情况下，与对照抗体相比，从给药起经过相同天数后的脑内的抗体浓度(或抗体量)高的抗体或该抗体片段；或者能够在脑内长期存在的抗体或该抗体片段等。
脑内的抗体浓度(或抗体量)的变化可以为任意的变化，可以列举例如：在测定期间中脑内的抗体浓度先达到峰值、然后抗体浓度缓慢降低的情况；脑内的抗体浓度达到峰值后、持续维持该抗体浓度的情况；或者在抗体给药后脑内的抗体浓度持续增加的情况；等等。
作为本发明的抗体或该抗体片段，是指例如：在对大鼠给药后第4天或第10天，脑内的抗体浓度或抗体量高于对照抗体的抗体；在对大鼠给药后第4天至第10天的期间内，脑内的抗体浓度或抗体量得到维持或增加的抗体；或者在对大鼠给药后第10天以后也能够明确地确认到在脑内存在的抗体；等等，但不限定于这些。
作为对照抗体，只要是与被测抗体相同的种或亚类的抗体，则可以为任意一种抗体，可以使用例如抗阿维菌素(AVM)抗体等。
本发明中，作为脑内，可以列举例如脑实质、脑室内、脑脊液中等，但不限定于这些。
本发明中，作为将抗体给药于动物的方法，可以列举例如静脉给药或脑室内给药、腹腔内给药、皮下给药、皮内给药、经鼻给药、髓腔内给药等，但不限定于这些方法。
本发明中，作为测定抗体的脑滞留性的方法，可以列举例如：将抗体给药于动物后经过几天后，回收脑组织，将其匀浆化，测定离心分离后的上清中的抗体浓度，算出每单位脑重量的抗体量的方法；使用回收的脑组织，利用公知的免疫学方法测定抗体的存在的方法；或者将实施了标记的抗体给药于动物，利用体内成像系统经时地检测该抗体的存在的方法；等等。
作为本发明的抗体，可以列举选自由下述(a)～(q)组成的组中的一种抗体。
(a)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别为序列号4、5和6中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号10、11和12中记载的氨基酸序列的抗体；
(b)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别为序列号16、17和18中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号22、23和24中记载的氨基酸序列的抗体；
(c)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别为序列号28、29和30中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号34、35和36中记载的氨基酸序列的抗体；
(d)VHH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号40、41和42中记载的氨基酸序列的抗体片段；
(e)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号153、154和155中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号158、159和160中记载的氨基酸序列的抗体；
(f)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号163、164和165中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号168、169和170中记载的氨基酸序列的抗体；
(g)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号173、174和175中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号178、179和180中记载的氨基酸序列的抗体；
(h)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号183、184和185中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号188、189和190中记载的氨基酸序列的抗体；
(i)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号193、194和195中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号198、199和200中记载的氨基酸序列的抗体；
(j)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号203、204和205中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号208、209和210中记载的氨基酸序列的抗体；
(k)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号213、214和215中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号218、219和220中记载的氨基酸序列的抗体；
(l)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号223、224和225中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号228、229和230中记载的氨基酸序列的抗体；
(m)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号233、234和235中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号238、239和240中记载的氨基酸序列的抗体；
(n)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号243、244和245中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别包含序列号248、249和250中记载的氨基酸序列的抗体；
(o)与上述(a)～(n)中记载的至少一种抗体竞争性地与MOG结合的抗体；
(p)与包含上述(a)～(n)中记载的任意一种抗体所结合的表位的表位结合的抗体；和
(q)与和上述(a)～(n)中记载的任意一种抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体。
作为本发明的抗体，包括具有与上述(a)～(n)中记载的任意一种抗体的VH的CDR1～3和VL的CDR1～3的氨基酸序列分别显示出85％以上、优选90％以上的同源性的抗体的VH的CDR1～3和VL的CDR1～3的氨基酸序列的抗体。作为90％以上的同源性，更优选列举91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的同源性等。
本发明中，作为上述(a)～(n)中记载的抗体的一个方式，可以分别列举人抗MOG单克隆抗体MOG01抗体、MOG09抗体、MOG14抗体和羊驼抗MOG单克隆VHH抗体iMOG-3Rim1-S32抗体。此外，还可以列举iMOG-3Rim1-S32的人型嵌合抗体和iMOG-3Rim1-S32的人源化抗体等。
本发明中，上述(o)的抗体是指，在将上述(a)～(n)中记载的抗体作为第一抗体时抑制该第一抗体与MOG的结合的第二抗体。
本发明中，上述(p)的抗体是指，在将上述(a)～(n)中记载的抗体作为第一抗体、并将第一抗体所结合的表位作为第一表位的情况下，与包含该第一表位的第二表位结合的第二抗体。
另外，本发明的上述(q)的抗体是指，在将上述(a)～(n)中记载的抗体作为第一抗体、并将第一抗体所结合的表位作为第一表位的情况下，与该第一表位结合的第二抗体。
另外，作为本发明的抗体，具体而言，还可以列举选自由下述(a)～(n)、(o1)～(o22)组成的组中的一种抗体。
(a)VH的氨基酸序列为序列号3中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号9中记载的氨基酸序列的抗体；
(b)VH的氨基酸序列为序列号15中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号21中记载的氨基酸序列的抗体；
(c)VH的氨基酸序列为序列号27中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号33中记载的氨基酸序列的抗体；
(d)VHH的氨基酸序列包含序列号39中记载的氨基酸序列的抗体片段；
(e)VH的氨基酸序列包含序列号152中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号157中记载的氨基酸序列的抗体；
(f)VH的氨基酸序列包含序列号162中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号167中记载的氨基酸序列的抗体；
(g)VH的氨基酸序列包含序列号172中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号177中记载的氨基酸序列的抗体；
(h)VH的氨基酸序列包含序列号182中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号187中记载的氨基酸序列的抗体；
(i)VH的氨基酸序列包含序列号192中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号197中记载的氨基酸序列的抗体；
(j)VH的氨基酸序列包含序列号202中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号207中记载的氨基酸序列的抗体；
(k)VH的氨基酸序列包含序列号212中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号217中记载的氨基酸序列的抗体；
(l)VH的氨基酸序列包含序列号222中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号227中记载的氨基酸序列的抗体；
(m)VH的氨基酸序列包含序列号232中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号237中记载的氨基酸序列的抗体；
(n)VH的氨基酸序列包含序列号242中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号247中记载的氨基酸序列的抗体；
(o1)VH的氨基酸序列包含序列号252中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号254中记载的氨基酸序列的抗体；
(o2)VH的氨基酸序列包含序列号256中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号258中记载的氨基酸序列的抗体；
(o3)VH的氨基酸序列包含序列号260中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号262中记载的氨基酸序列的抗体；
(o4)VH的氨基酸序列包含序列号264中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号266中记载的氨基酸序列的抗体；
(o5)VH的氨基酸序列包含序列号268中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号270中记载的氨基酸序列的抗体；
(o6)VH的氨基酸序列包含序列号272中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号274中记载的氨基酸序列的抗体；
(o7)VH的氨基酸序列包含序列号276中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号278中记载的氨基酸序列的抗体；
(o8)VH的氨基酸序列包含序列号280中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号282中记载的氨基酸序列的抗体；
(o9)VH的氨基酸序列包含序列号284中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号286中记载的氨基酸序列的抗体；
(o10)VH的氨基酸序列包含序列号288中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号290中记载的氨基酸序列的抗体；
(o11)VH的氨基酸序列包含序列号292中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号294中记载的氨基酸序列的抗体；
(o12)VH的氨基酸序列包含序列号296中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号298中记载的氨基酸序列的抗体；
(o13)VH的氨基酸序列包含序列号300中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号302中记载的氨基酸序列的抗体；
(o14)VH的氨基酸序列包含序列号304中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号306中记载的氨基酸序列的抗体；
(o15)VH的氨基酸序列包含序列号308中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号310中记载的氨基酸序列的抗体；
(o16)VH的氨基酸序列包含序列号312中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号314中记载的氨基酸序列的抗体；
(o17)VH的氨基酸序列包含序列号316中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号318中记载的氨基酸序列的抗体；
(o18)VH的氨基酸序列包含序列号320中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号322中记载的氨基酸序列的抗体；
(o19)VH的氨基酸序列包含序列号324中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号326中记载的氨基酸序列的抗体；
(o20)VH的氨基酸序列包含序列号328中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号330中记载的氨基酸序列的抗体；
(o21)VH的氨基酸序列包含序列号332中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号334中记载的氨基酸序列的抗体；和
(o22)VH的氨基酸序列包含序列号336中记载的氨基酸序列、并且VL的氨基酸序列包含序列号338中记载的氨基酸序列的抗体。
作为本发明的抗体，包括具有与上述(a)～(n)、(o1)～(o22)中记载的任意一种抗体的VH和VL的氨基酸序列分别显示出85％以上、优选90％以上的同源性的抗体的VH和VL的氨基酸序列的抗体。作为90％以上的同源性，更优选列举91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的同源性等。
本发明中，作为上述(a)～(n)、(o1)～(o22)中记载的抗体的一个方式，可以分别列举人抗MOG单克隆抗体MOG01抗体、MOG09抗体、MOG14抗体和羊驼抗MOG单克隆VHH抗体iMOG-3Rim1-S32抗体。此外，还可以列举iMOG-3Rim1-S32人型嵌合抗体和iMOG-3Rim1-S32人源化抗体等。
本发明中，EU索引是指免疫相关蛋白序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)第5版(1991)中所示的氨基酸残基的位置。以下所示的氨基酸残基的位置在没有特别记载的情况下全部表示EU索引中记载的氨基酸残基的位置。
抗体分子也被称为免疫球蛋白(以下记载为Ig)，其基本结构是具有分别各为两条的被称为重链(Heavy chain、以下记为H链)和轻链(Light chain、以下记为L链)的多肽的四聚体。
另外，H链从N末端侧起由H链可变区(也表示为VH)、H链恒定区(也表示为CH)各区域构成，L链从N末端侧起由L链可变区(也表示为VL)、L链恒定区(也表示为CL)各区域构成。
CH按各亚类分别已知有α、δ、ε、γ和μ链。此外，CH从N末端侧起由CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域各结构域构成。
结构域是指构成抗体分子的各多肽的功能性结构单元。另外，将CH2结构域和CH3结构域合并称为Fc区(可结晶片段，Fragment crystallizable)或仅称为Fc。CL已知有Cλ链和Cκ链。
CH为α、δ、ε、γ和μ链的抗体的亚类分别称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。各抗体的亚类根据动物的不同而有时存在同种型，对于人而言，IgA存在IgA1和IgA2的同种型、IgG存在IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的同种型。
本发明中的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域、CH3结构域和Fc区可以根据EU索引利用自N末端起的氨基酸残基的序号来确定。
具体而言，CH1被确定为EU索引118～215位的氨基酸序列，铰链被确定为EU索引216～230位的氨基酸序列，CH2被确定为EU索引231～340位的氨基酸序列，CH3被确定为EU索引341～447位的氨基酸序列，Fc区被确定为EU索引231～447位的氨基酸序列。
作为本发明的抗体，也包含多克隆抗体、单克隆抗体和寡克隆抗体中的任意一种抗体。多克隆抗体是指不同克隆的抗体产生细胞所分泌的抗体分子群。单克隆抗体是指单一克隆的抗体产生细胞所分泌的抗体，其是识别唯一的表位(也称为抗原决定簇)、构成单克隆抗体的氨基酸序列(一级序列)全都相同的抗体。寡克隆抗体是指将多种不同的单克隆抗体混合而得到的抗体分子群。
作为本发明中的单克隆抗体，可以列举由杂交瘤产生的抗体、或者由利用包含抗体基因的表达载体进行了转化的转化体产生的基因重组抗体。
表位可以列举单克隆抗体所识别、结合的单一的氨基酸序列、由氨基酸序列构成的立体结构、经翻译后修饰的氨基酸序列、和由经翻译后修饰的氨基酸序列构成的立体结构等。
作为经翻译后修饰的氨基酸序列，可以列举糖链键合于具有OH取代基的Tyr和Ser上的O键合型糖链、糖链键合于具有NH2取代基的Gln和Asn上的N键合型糖链、以及硫酸分子键合于具有OH取代基的Tyr上而经酪氨酸硫酸化的氨基酸序列。
本发明的抗体所结合的MOG的表位可以通过使用使MOG的一部分结构域缺失而得到的缺陷体、将MOG的一部分结构域置换为其他蛋白质来源的结构域而得到的突变体和MOG的部分肽片段等进行抗体的结合实验来确定。另外，也可以使用上述缺陷体或突变体的表达细胞来进行抗体的结合实验。
或者，本发明的抗体所结合的MOG的表位也可以通过在利用蛋白质分解酶消化后的MOG的肽片段中添加本发明的抗体并使用已知的质谱分析法进行表位定位(epitopemapping)来确定。
作为本发明的抗体，也包含小鼠抗体、大鼠抗体、仓鼠抗体、兔抗体、美洲驼抗体、骆驼抗体、羊驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体(也称为“互补决定区(ComplementarityDetermining Region；CDR)移植抗体”)和人抗体等基因重组抗体。
本发明中，嵌合抗体是指VH和VL与CH和CL来源于不同的动物种的抗体。由人以外的动物(非人动物)的抗体的VH和VL与人抗体的CH和CL构成的抗体称为人型嵌合抗体，由小鼠以外的动物的抗体的VH和VL与小鼠抗体的CH和CL构成的抗体称为小鼠型嵌合抗体，其他嵌合抗体也用同样的方法命名。
作为非人动物，只要是能够制作杂交瘤或者能够制作抗体噬菌体文库的动物，则可以使用小鼠、大鼠、仓鼠、兔、美洲驼、骆驼、羊驼等任何动物。
杂交瘤是指使将抗原免疫于非人动物而获得的B细胞与来源于小鼠等的骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到的、产生具有所期望的抗原特异性的单克隆抗体的细胞。
抗体噬菌体文库是指将免疫球蛋白可变区的基因克隆化至噬菌体中、使其表面表达抗原结合分子而制作的文库。所使用的噬菌体可以列举M13噬菌体等，没有特别限定。
展示在噬菌体上的抗原结合分子可以为任何形态，优选为scFv、Fab、VHH等抗体片段。
本发明中，抗体噬菌体文库可以为免疫文库、天然文库和合成文库中的任意一种文库。
免疫文库是指基于来源于用抗原进行了免疫的动物或患者的淋巴细胞的抗体基因而构建的抗体噬菌体文库。天然文库是指基于来源于正常动物或健康人的淋巴细胞的抗体基因而构建的抗体噬菌体文库。合成文库是指将基因组DNA中的V基因或再构建的功能性V基因的CDR用编码适当长度的随机氨基酸序列的寡核苷酸置换而得到的文库。
作为嵌合抗体的制作方法，以下记载人型嵌合抗体的制作方法。对于其他嵌合抗体，也可以利用同样的方法进行制作。
人型嵌合抗体可以通过下述方法来制造：由生产单克隆抗体的非人动物细胞来源的杂交瘤获得编码VH和VL的cDNA，分别插入至具有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体中，构建人型嵌合抗体表达载体，导入至动物细胞中，由此使其进行表达。
另外，也可以通过下述方法来制造：由来源于非人动物的抗体噬菌体文库克隆出编码VH和VL的基因，分别插入至具有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体中，构建人型嵌合抗体表达载体，导入至动物细胞中，由此使其进行表达。
人源化抗体是指将非人动物抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植至人抗体的VH和VL的对应的CDR处而得到的抗体。VH和VL的CDR以外的区域被称为框架区(以下记为FR)。
人源化抗体可以通过下述方法来制造：构建编码由非人动物抗体的VH的CDR的氨基酸序列和任意的人抗体的VH的FR的氨基酸序列构成的VH的氨基酸序列的cDNA、以及编码由非人动物抗体的VL的CDR的氨基酸序列和任意的人抗体的VL的FR的氨基酸序列构成的VL的氨基酸序列的cDNA，分别插入至具有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体中，构建人源化抗体表达载体，导入至动物细胞中，由此使其进行表达。
人抗体原本是指天然存在于人体内的抗体，但也包含由人抗体噬菌体文库和人抗体产生转基因动物得到的抗体等。
人抗体可以通过将所期望的抗原免疫于保有人免疫球蛋白基因的小鼠(TomizukaK.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.97,722-7,2000.)而获得。另外，通过使用由人来源的B细胞对抗体基因进行扩增而得到的噬菌体展示文库来选择具有所期望的结合活性的人抗体，可以在不进行免疫的情况下获得人抗体(Winter G.et al.,Annu Rev Immunol.12:433-55.1994)。
此外，可以通过使用EB病毒使人B细胞永生化而制作出生产具有所期望的结合活性的人抗体的细胞，获得人抗体(Rosen A.et al.,Nature 267,52-54.1977)。
人抗体噬菌体文库是通过将由人(健康人或患者)的淋巴细胞制备的抗体基因插入至噬菌体基因中而使Fab、scFv和VHH等抗体片段表达在表面的噬菌体的文库。可以从该文库中回收以对固定有抗原的底物的结合活性作为指标表达具有所期望的抗原结合活性的抗体片段的噬菌体。该抗体片段还可以进一步利用基因工程方法转换成由两条完整的H链和两条完整的L链构成的人抗体分子。
人抗体产生转基因动物是指人抗体基因整合至宿主动物的染色体内的动物。具体而言，可以通过向小鼠ES细胞中导入人抗体基因、将该ES细胞移植至其他小鼠的早期胚胎中后使其发育来制作人抗体产生转基因动物。
由人抗体产生转基因动物制作人抗体的操作可以通过下述方法进行：对利用通常的在人以外的哺乳动物中进行的杂交瘤制作方法得到的人抗体产生杂交瘤进行培养，使人抗体在培养物中产生蓄积，从该培养物中纯化出抗体。
本发明的抗体包含仅由重链构成的重链抗体。重链抗体是指由美洲驼、骆驼、羊驼等骆驼科的动物获得的抗体、以及基于该抗体制作的基因重组抗体。
本发明中，抗体片段是指作为抗体的片段且具有抗原结合活性的物质。可以列举例如Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、双链抗体、dsFv、包含多个CDR的肽和VHH等。另外，本发明的抗体片段中，只要是包含抗体的部分片段且具有MOG结合活性的抗体片段，则可以包含使抗体的恒定区或Fc的全长或一部分与该抗体片段融合而得到的抗体片段、包含恒定区或Fc的抗体片段等中的任意一种抗体片段。
Fab是将IgG抗体用作为蛋白质分解酶的木瓜蛋白酶进行处理而得到的片段中(在H链的第224位的氨基酸残基处被切断)H链的N末端侧约一半与L链整体以二硫键(S-S键)结合而成的、分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。
F(ab’)2是将IgG用作为蛋白质分解酶的胃蛋白酶进行处理而得到的片段中(在H链的第234位的氨基酸残基处被切断)比Fab藉由铰链区的S-S键结合而成的片段稍大的、分子量约10万的具有抗原结合活性的抗体片段。
Fab’是将上述F(ab’)2的铰链区的S-S键切断而得到的、分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。
scFv是使用将由4个Gly和1个Ser残基构成的接头(G4S)以任意个数连接而成的连接肽等适当的肽接头(P)将一条VH与一条VL连接而得到的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，是具有抗原结合活性的抗体片段。
双链抗体是抗原结合特异性相同或不同的scFv形成二聚体而得到的抗体片段，是具有针对相同抗原的二价的抗原结合活性或者针对不同抗原的特异性抗原结合活性的抗体片段。
dsFv是指将VH和VL中的各一个氨基酸残基置换为半胱氨酸残基、使所得的多肽藉由该半胱氨酸残基间的S-S键进行结合而成的片段。
包含CDR的肽含有VH或VL的CDR中的至少一个区域以上而构成。包含多个CDR的肽可以使CDR彼此直接或藉由适当的肽接头进行结合。
包含CDR的肽可以通过下述方法来制造：构建编码本发明的抗体的VH和VL的CDR的DNA，将该DNA插入至原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该表达载体导入至原核生物或真核生物中，由此使其进行表达。另外，包含CDR的肽也可以利用Fmoc法或tBoc法等化学合成法来制造。
VHH是重链抗体的可变区，也称为纳米抗体(nanobody)。
本发明的抗体片段只要是包含上述任意一种抗体片段或该部分片段且具有MOG结合活性的抗体片段，则可以包含任何抗体片段。
本发明中，将具有一个抗原结合位点的抗体或该抗体片段称为一价抗体。作为一价抗体的形式，可以列举国际公开第2014/054804号、国际公开第2011/090754号、国际公开第2007/048037号和国际公开第2012/116927号等中记载的、具有一个抗原结合位点的抗体或该抗体片段的形式等。
本发明中，将与三种以上不同的抗原或表位结合的一分子的抗体或该抗体片段称为多特异性抗体。另外，本发明中，将与两种不同的抗原或表位结合的一分子的抗体或该抗体片段称为双特异性抗体。
作为多特异性抗体或双特异性抗体的形式，可以列举国际公开第2009/131239号、国际公开第2014/054804号、国际公开第01/077342号、美国专利申请公开2007/0071675号说明书、国际公开2007/024715号、Wu et al.,[Nature Biotechnology,2007,25(11),p.1290-1297]、Labrijn etal.,[PNAS2013,vol.110,no.13,p5145-5150]、Jong et al.,[http://dx.doi.org/10.1371/journal.pbio.1002344]、Kontermann et al.,[mAbs2012,vol.4,issue2,p182-197]、Spiess et al.,[Molecular Immunology 67(2015)95-106]、Ridgway et al.,[Protein engineering,1996vol.9no.7pp617-621、国际公开第2009/080251号、国际公开第2010/151792号和国际公开第2014/033074号等中记载的形式等。
作为双特异性抗体，具体而言，可以列举以下记载的双特异性抗体等。
(1)抗体的两条重链中对一条重链(重链A)的CH3施加S354C/T366W的氨基酸改变、对另一条重链(重链B)的CH3施加Y349C/T366S/L368A/Y407V的氨基酸改变而得到的双特异性抗体。
(2)使抗体片段融合在抗体的C末端而得到的双特异性抗体。
(3)使抗体片段融合在抗体的N末端而得到的双特异性抗体。
上述(1)中记载的双特异性抗体可以是包含重链A的VH的抗原结合位点与MOG结合、包含重链B的VH的抗原结合位点与存在于脑中的抗原结合的双特异性抗体，也可以反过来。
上述(2)中记载的双特异性抗体可以是在构成抗体的两条重链中的一者的C末端上结合有抗体片段的双特异性抗体、以及在两条重链中的两者上结合有抗体片段的双特异性抗体中的任意一种双特异性抗体。另外，在抗体的重链的C末端与抗体片段之间可以存在适当的接头。
上述(2)中记载的双特异性抗体所具有的抗体片段优选scFv、Fab和VHH等，但并不特别限定于这些。
上述(2)中记载的双特异性抗体可以是N末端的抗原结合位点与MOG结合、C末端的抗原结合位点与存在于脑中的抗原结合的双特异性抗体，也可以反过来。
上述(3)中记载的双特异性抗体是指在构成抗体的两条重链或轻链中的至少任意一条的N末端上结合有抗体片段的双特异性抗体。另外，在抗体的重链和/或轻链的N末端与抗体片段之间可以存在适当的接头。上述(3)中记载的双特异性抗体所具有的抗体片段优选scFv、Fab和VHH等，但并不特别限定于这些。
另外，作为上述(3)中记载的双特异性抗体，可以列举从重链的N末端起具有VH1-CH1-VH2-CH1-铰链-CH2-CH3这样的结构的双特异性抗体、以及具有上述重链结构且VH1和VH2分别与VL形成抗原结合位点的双特异性抗体等。与VH1和VH2形成抗原结合位点的VL可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。
本发明中，多特异性抗体或双特异性抗体只要是与MOG结合的多特异性抗体和双特异性抗体，则可以为任何抗体。其中，优选与MOG和存在于脑中的抗原结合的多特异性抗体或双特异性抗体，更优选包含与MOG结合的抗原结合位点和与存在于脑中的抗原结合的抗原结合位点的多特异性抗体或双特异性抗体。
本发明中，存在于脑中的抗原可以列举蛋白质、糖链和脂质等，其中优选为蛋白质。
作为存在于脑中的蛋白质，可以列举例如MOG、朊病毒(Prion)、5T4、AFP、ADAM-10、ADAM-12、ADAM17、AFP、AXL、BSG、C5、C5R、CA9、CA72-4、CCL11、CCL2、CCR1、CCR4、CCR5、CCR6、CD2、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD18、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD29、CD30、CD32B、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40LG、CD44、CD47、CD52、CD55SC1、CD56、CD66E、CD71、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD95、CD98、CD137、CD147、CD138、CD168、CD200、CD248、CD254、CD257、CDH3、CEA、CEACAM1、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM8、紧密连接蛋白3(Claudin3)、紧密连接蛋白4(Claudin4)、c-Met、CS-1、CSF2RA、CSPG-4、CTLA4、CRF-1、表皮生长因子相关肽(Cripto)、CXCR4、CXCR5、DLL4、DR4、DR5、ED-B、EFNA2、EGFR、EGFRvIII、ETBR、ENPP3、EPCAM、EphA2、ERBB2、ERBB3、ERBB4、FAPα、FAS、FcγRI、FCER2、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT1、FOLH1、FOLR1、GDF2、GFR、GLP1R、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3)、GPNMB、GRP78、HB-EGF、HGF、HLA-DRβ、ICAM1、IFNA1、IFNA1、IgE、IgE-Fc、IGF1R、IL10、IL12B、IL13、IL15、IL17A、IL1A、IL1B、IL2RA、IL4、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL9、IL2Rα、IL2Rβ、IL2Rγ、INSR、ITGA2、ITGA2B2、ITGB3、ITGA4、ITGB7、ITGA5、ITGAL、ITGAV、ITGB3、ITGB2、KDR、L1CAM、间皮素(mesothelin)、MMP14、MMP15、MST1R、MSTN、MUC1、MUC4、MUC16、MUC5AC、肌肉生长抑制素(myostatin)、NECTIN4、NGF、NOTCH、NRG1、NRP、OX40、OX40L、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PD1、PDL1、PSCA、SLAM7、SLC44A4、TAG-72、TCR、TGFB1、TGFB2、TGFBR、TNF、TNFR、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF12A、TNFSF13、TNFSF14、TNFSF2、TNFSF7、TRAILR2、TRKA、TRKB、TRKC、VEGF、VEGFR、VLA-4、CGRP、α-突触核蛋白(alpha-synuclein)、TDP-43、Tau、FUS、β-淀粉样蛋白(Amyloid-beta、Aβ)、APP、BACE1、早老素(Presenilin)、LINGO-1、Nogo、多聚谷氨酰胺(polyQ)、雄激素受体(androgen receptor)、亨廷顿蛋白(huntingtin)、脊髓小脑共济失调I型蛋白(ataxin 1)、脊髓小脑共济失调II型蛋白(ataxin 2)、RGMA、磷酸化Tau(Phospho-Tau)或磷酸化α-突触核蛋白(Phospho-alpha-synuclein)等，但不限定于这些蛋白质。
作为存在于脑中的糖链，可以列举例如Lewis-x、Lewis-y或CD15等，但不限定于这些糖链。
作为存在于脑中的脂质，可以列举例如GD1a、GD2、GD3、GM1、GM2、GM3或磷脂酰丝氨酸等，但不限定于这些脂质。
本发明的抗体或该抗体片段也包含含有经翻译后修饰的任何氨基酸的抗体。作为翻译后修饰，可以列举例如H链的C末端的赖氨酸残基的缺失[赖氨酸剪切(lysineclipping)]、以及多肽的N末端的谷氨酰胺残基向焦谷氨酰胺(puroGlu)的转换等[Beck etal,Analytical Chemistry,85,715-736(2013)]。
本发明的抗体或该抗体片段可以进行Fc区的氨基酸改变。作为Fc区的氨基酸改变，可以列举例如用于使抗体稳定化或者用于控制血中半衰期的氨基酸改变等。作为Fc区的氨基酸改变，具体而言，可以列举例如国际公开第2006/033386号、国际公开第2006/075668号、国际公开第2011/122011号和国际公开第2009/125825号等。
本发明的抗体或该抗体片段也包含抗体或该抗体片段经修饰而成的融合抗体或该融合抗体片段。修饰抗体的方法没有特别限定，只要能够修饰所期望的氨基酸残基和糖链，则可以使用任意一种方法。
可以列举例如利用化学反应的化学修饰[抗体工程入门、地人书馆(1994)；Kolbet al.,Angew Chem Int Ed Engl.40.2004-21,2001]、通过利用基因重组技术将重组蛋白质表达载体导入至适当的宿主细胞中进行表达的基因工程方法进行的修饰等。
本发明中，作为对抗体或该抗体片段进行修饰的分子，可以列举例如亲水性高分子、两亲性高分子和功能性分子等。作为上述亲水性高分子、两亲性高分子，可以列举例如聚氧化烯、包含多元醇或多糖的分子等。
作为聚氧化烯，可以列举例如由直链或支链构成的聚乙二醇(polyethyleneglycol、以下记载为PEG)、聚丙二醇、聚丙烯乙二醇等。
作为包含多元醇或多糖的分子，可以列举例如由直链或支链构成的聚甘油所形成的直链淀粉、葡聚糖、普鲁兰多糖或糖原等的同多糖或杂多糖类等。
包含亲水性高分子或两亲性高分子的分子的分子量没有特别限定，优选为100Da以上，例如优选为100Da～100kDa。
作为功能性分子，可以列举例如抗原结合分子及其片段、药物、生理活性肽、生理活性蛋白质、核酸、放射性标记化合物、糖链、脂质或荧光化合物等。利用功能性分子对抗原结合分子等进行修饰的结果，具有双重特异性的分子为双特异性抗体。
作为抗原结合分子，可以列举例如抗体、受体和配体等。
作为抗原结合分子的片段，只要是上述抗原结合分子的片段且具有抗原结合活性，则可以为任何片段。
作为药物，可以列举例如烷化剂、亚硝基脲剂、代谢拮抗剂、抗病毒剂、抗生素、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白聚合抑制剂、激素疗法剂、激素拮抗剂、芳香化酶抑制剂、P糖蛋白抑制剂、铂络合物衍生物、M期抑制剂或激酶抑制剂等抗癌剂[临床肿瘤学、癌症与化学疗法出版社(1996)]、氢化可的松、泼尼松龙等甾体剂、阿司匹林、吲哚美辛等非甾体剂、硫代苹果酸金、青霉胺等免疫调节剂、环磷酰胺、硫唑嘌呤等免疫抑制剂、或者马来酸氯苯那敏或氯马斯汀之类的抗组胺剂等抗炎剂[炎症与抗炎疗法、医齿药出版株式会社(1982)]等。
作为抗癌剂，可以列举例如美坦新(mertansine)、安坦辛(emtansine)、阿米福汀(氨磷汀)、顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、链脲霉素、环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、吉西他滨(健择)、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、道诺霉素、培洛霉素、雌莫司汀、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(多西他奇)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、克拉屈滨、喜树碱、10-羟基-7-乙基喜树碱(SN38)、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、伊达比星、美司那、依立替康(CPT-11)、拓扑替康、米托蒽醌、托泊替康、亮脯利特(leuprolide)、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、羟基脲、普卡霉素、密妥坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、链脲霉素、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林(leuprorelin)、氟他胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、乌拉莫司汀、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、氢化可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、长春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他滨、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奥沙利铂、吉非替尼(易瑞沙)、伊马替尼(STI571)、厄洛替尼、FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3；Flt3)抑制剂、血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂、特罗凯等表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、根赤壳菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、雷帕霉素、安吖啶、全反式维甲酸、沙利度胺、来那度胺、阿那曲唑、法曲唑、来曲唑、依西美坦、硫代苹果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立宾、环孢素、雷帕霉素、氢化可的松、蓓萨罗丁(塔革雷汀)、他莫昔芬、地寒米松、孕激素类、雌激素类、阿那曲唑(瑞宁德)、利普安、阿司匹林、吲哚美辛、塞来昔布、硫唑嘌呤、青霉胺、硫代苹果酸金、马来酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯马斯汀、维甲酸、蓓萨罗丁、砷、硼替佐米、别嘌呤醇、卡奇霉素、替伊莫单抗、塔革雷汀、奥唑米星、克拉霉素、瘤可维、酮康唑、氨鲁米特、苏拉明、甲氨蝶呤、美登醇或其衍生物等。
作为使药物与抗体或该抗体片段结合的方法，除了上述方法以外，还可以列举借助戊二醛使药物与抗体的氨基间结合的方法、或者借助水溶性碳二亚胺使药物的氨基与抗体的羧基结合的方法等。
作为生理活性肽或生理活性蛋白质，可以列举例如干扰素(以下记为IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(以下记为IL)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒细胞菌落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)或巨噬细胞菌落刺激因子(M-CSF)等使NK细胞、巨噬细胞或中性粒细胞等免疫活性细胞活化的细胞因子或增殖因子、水解酶、裂解酶和异构酶等蛋白质分解酶、酸性鞘磷脂酶等酶、蓖麻毒素、白喉毒素或ONTAK等细菌毒素和植物毒素等毒素、具有细胞膜毒活性的抗菌肽、具有细胞膜结合性或细胞膜透过性的肽以及它们的衍生物等。
作为核酸，只要是核苷酸或与该核苷酸具有同等功能的分子聚合而成的分子，则可以为任何分子，可以列举例如siRNA、微小RNA(microRNA)、反义RNA、DNA适配体等。
作为放射性标记化合物，只要是在诊断用或治疗用的用途中使用的核种即可，可以列举例如3H、14C、32P、33P、35S、51Cr、57CO、18F、153Gd、159Gd、64Cu、68Ge、166Ho、115In、113In、112In、111In、131I、125I、123I、121I、140La、177Lu、54Mn、99Mo、103Pd、142Pr、149Pm、186Re、188Re、211At、105Rh、97Ru、153Sm、47Sc、75Se、85Sr、99Tc、201Ti、113Sn、117Sn、133Xe、169Yb、175Yb、90Y和65Zn等或包含上述核种的化合物。
放射性标记化合物可以利用氯胺T法等直接结合于抗体上。另外，也可以使对放射性标记化合物进行螯合的物质结合于抗体上。作为螯合剂，可以列举例如DOTA、PA-DOTA、TRITA和DTPA等，利用螯合剂进行了修饰的抗体、藉由螯合剂标记有放射性标记化合物的修饰化抗体也包含在本发明的抗体中。
作为糖链，可以列举例如包含岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、阿洛糖、醛糖(aldose)、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、赤藓糖(erythose)、赤藓糖(erythrose)、苏糖、纤维二糖、麦芽糖、异麦芽糖、乳糖、脂阿拉伯甘露聚糖、路易斯X三糖和唾液酸路易斯X四糖等的单糖、二糖类或寡糖等。另外，也可以为包含作为免疫佐剂而已知的糖链的天然物，可以列举β(1→3)葡聚糖(香菇多糖、西佐糖)或α-半乳糖神经酰胺(KRN7000)等。
作为脂质，可以列举例如作为脂肪酸与各种醇的酯及其类似物的单纯脂质(中性脂质)。可以列举例如油脂(例如三酰甘油)、蜡(例如高级脂肪醇的脂肪酸酯)；固醇酯、胆固醇酯、维生素的脂肪酸酯等除脂肪酸和醇以外还具有磷酸、糖、硫酸、胺等极性基团的复合脂质、例如磷脂(例如甘油磷脂和鞘磷脂等)和糖脂(例如甘油糖脂和鞘糖脂等)；通过单纯脂质和复合脂质的水解生成的化合物中具有脂溶性的衍生脂质、例如脂肪酸、高级脂肪醇、脂溶性维生素、类固醇、烃等。
作为荧光化合物，可以列举例如异硫氰酸荧光素(FITC)等荧光素系列、罗丹明系列、Cy3、Cy5、曙红系列、Alexa Fluor系列和NBD系列等荧光色素、吖啶酯或罗芬(rofin)等发光物质以及绿色荧光蛋白(GFP)等荧光性蛋白质等。
本发明的抗体或该抗体片段可以直接或藉由适当的接头结合上述的亲水性高分子或两亲性高分子和功能性分子。作为接头，可以列举例如酯、二硫化物、腙和二肽等。
在利用基因工程方法对本发明的抗体或该抗体片段进行修饰而制作融合抗体或融合抗体片段的情况下，可以在编码抗体的cDNA上连接编码蛋白质的cDNA，构建编码融合抗体或融合抗体片段的DNA，将该DNA插入至原核生物或真核生物用表达载体中，将该表达载体导入至原核生物或真核生物中，使其表达融合抗体或融合抗体片段，由此制作融合抗体或融合抗体片段。
本发明的组合物只要是含有本发明的抗体或该抗体片段的组合物，则可以为任何组合物。该组合物除了含有抗体或该抗体片段以外，还可以含有适当的载体、稳定剂等添加剂。
作为本发明的组合物，可以列举例如包含本发明的抗体或该抗体片段的检测用或测定用的组合物等。作为本发明的组合物，可以列举例如含有本发明的抗体或该抗体片段作为有效成分的药物组合物(治疗剂)等，与药理学上可接受的载体一起制剂化成所期望的剂型。
本发明中，检测用或测定用的组合物只要包含本发明的抗体或该抗体片段且能够检测或测定本发明的抗体或该抗体片段所特异性结合的抗原，则可以为任何组合物。作为本发明的抗体或该抗体片段所特异性结合的抗原，可以列举MOG、或者MOG和存在于脑中的抗原等。
本发明的抗体或该抗体片段具有在给药于动物时与脑内的MOG结合、滞留在脑内的性质。因此，通过使用包含该抗体或该抗体片段的检测用或测定用的组合物，能够使该抗体在脑内维持、或者提高脑内的抗体浓度，还能够长时间检测或测定MOG、或者MOG和存在于脑中的抗原，和/或能够高灵敏度地检测或测定MOG、或者MOG和存在于脑中的抗原。
例如，检测用或测定用的组合物为包含与MOG和存在于脑中的抗原结合的双特异性抗体的组合物时，能够长时间检测或测定该双特异性抗体所结合的MOG和存在于脑中的抗原；和/或能够高灵敏度地检测或测定MOG和存在于脑中的抗原。
另外，例如在检测用或测定用的组合物为包含用放射性标记化合物或荧光色素标记的、与MOG结合的融合抗体或融合抗体片段的组合物时，能够长时间检测或测定MOG；和/或能够高灵敏度地检测或测定MOG。
含有本发明的抗体的药物组合物(治疗剂)可以是表达本发明的抗体或该抗体片段所特异性结合的抗原的疾病中的任何一种疾病的治疗剂，优选脑疾病的治疗剂。
作为脑疾病，可以列举例如阿尔茨海默病、先兆阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、脑肿瘤、多发性硬化症、肌营养不良症、肌萎缩性侧索硬化症、多系统萎缩症、进行性核上性麻痹、黑质纹状体变性症、橄榄体脑桥小脑萎缩症、脊髓延髓性肌肉萎缩症、脊髓小脑变性症、脑血管病变、癫痫、偏头痛、多动性障碍、克雅病、皮质基底节变性、溶酶体贮积症、抑郁症和肌张力障碍等。
本发明的抗体具有在给药于动物时与脑内的MOG结合、滞留于脑内的性质。因此，通过使用含有该抗体或该抗体片段的治疗剂，能够使该抗体或该抗体片段长时间在脑内维持、能够提高脑内的抗体浓度，能够对上述疾病显示出治疗效果。
例如，治疗剂为包含与MOG和存在于脑中的抗原结合的双特异性抗体的治疗剂时，能够对与该双特异性抗体所结合的存在于脑中的抗原相关的脑疾病显示出治疗效果。
另外，例如，治疗剂为用低分子药剂进行了修饰的与MOG结合的融合抗体或融合抗体片段时，该低分子药剂能够对作为标靶的脑疾病显示出治疗效果。此时，与单独使用该低分子药剂时相比，使用本发明的治疗剂时治疗效果更高，因而优选。
含有本发明的抗体或该抗体片段的治疗剂可以仅含有作为有效成分的该抗体或该抗体片段，但通常优选以与药理学上可接受的一种以上的载体一起混合、利用制剂学技术领域中公知的任意方法制造而成的药物制剂的形式提供。
给药途径优选使用治疗时最有效的途径，可以列举例如经口给药或口腔内、呼吸道内、直肠内、皮下、皮内、肌肉内、脑室内、髓腔内、鼻腔内、腹腔内或静脉内等非经口给药，特别优选列举静脉内或脑室内给药等。作为给药形态，可以列举例如喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏或贴片剂等。
给药量或给药次数根据目标治疗效果、给药方法、治疗期间、年龄和体重等而有所不同，通常成人每一天为10μg/kg～20mg/kg。
另外，本发明还包含使用本发明的抗体或该抗体片段使抗体滞留于脑内的方法、提高抗体的脑滞留性的方法、以及提高脑内的抗体浓度(或抗体量)的方法。
另外，本发明涉及与MOG结合的肽、包含编码该肽的碱基序列的核酸、含有包含该核酸的载体的转化细胞、包括对该转化细胞进行培养并从培养液中收集上述肽的上述肽的制造方法、包含上述肽的组合物、或者使用上述肽或上述组合物来检测或测定存在于脑中的抗原的方法、诊断或治疗脑疾病的方法、提高肽的脑滞留性的方法、或者使脑内的肽量增加的方法。
本发明的肽包含对肽进行修饰而得到的融合肽。
关于与MOG结合的肽的各种术语的定义等，只要没有特别记载，则使用与在上述的与MOG结合的抗体中记载的术语的定义等相同的定义等。
以下，具体地对本发明的抗体或该抗体片段的制造方法、疾病的治疗方法和疾病的诊断方法等进行说明。
1.抗体的制造方法
(1)抗原的制备
作为抗原的MOG或MOG表达细胞可以通过将包含编码全长或部分长度的MOG的cDNA的表达载体导入至大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞等中而得到。另外，MOG也可以通过从大量表达MOG的各种动物细胞株、动物细胞和动物组织等中纯化MOG而得到。
另外，也可以直接使用这些动物细胞株、动物细胞和动物组织等作为抗原。此外，也可以利用Fmoc法或tBoc法等化学合成法制备具有MOG的部分序列的合成肽，将其用作抗原。
可以在MOG或具有MOG的部分序列的合成肽的C末端或N末端附加有FLAG或His等公知的标签。
本发明中使用的MOG可以通过使用Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第二版,冷泉港实验室出版社(1989)或Current Protocols In Molecular Biology,约翰威利父子出版社(1987-1997)等中记载的方法等，利用例如下述方法使编码MOG的DNA在宿主细胞中进行表达来制造。
首先，将包含编码MOG的部分的全长cDNA插入至适当的表达载体的启动子的下游，由此制作重组载体。代替上述全长cDNA，也可以使用基于全长cDNA而制备的、包含编码多肽的部分的适当长度的DNA片段。接着，将所得到的该重组载体导入至适合于该表达载体的宿主细胞中，由此能够得到生产多肽的转化体。
作为表达载体，只要是能够在所使用的宿主细胞中自主复制或能够整合到染色体中、并且在能够对编码多肽的DNA进行转录的位置含有适当的启动子的表达载体，则均可以使用。作为宿主细胞，只要是大肠杆菌等属于埃希氏菌属等的微生物、酵母、昆虫细胞或动物细胞等能够表达目的基因的宿主细胞，则均可以使用。
在使用大肠杆菌等原核生物作为宿主细胞的情况下，表达载体优选为能够在原核生物中自主复制、并且包含启动子、核糖体结合序列、包含编码人MOG的部分的DNA和转录终止序列的载体。另外，该表达载体中未必需要具有转录终止序列，但优选在紧挨结构基因的下游配置转录终止序列。此外，该重组载体可以含有控制启动子的基因。
作为该表达载体，优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺序列(也称为SD序列)与起始密码子之间调节为适当的距离(例如6～18个碱基)的质粒。
另外，作为编码MOG的DNA的碱基序列，可以对碱基进行置换以形成最适于在宿主内表达的密码子，由此能够提高作为目标的MOG的生产率。
作为表达载体，只要能够在所使用的宿主细胞中发挥功能，则均可以使用，可以列举例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上为罗氏诊断公司制造)、pKK233-2(法玛西亚公司制造)、pSE280(Invitrogen公司制造)、pGEMEX-1(普洛麦格公司制造)、pQE-8(Qiagen公司制造)、pKYP10(日本特开昭58-110600号公报)、pKYP200[Agricultural BiologicalChemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制造)、pTrs30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[由大肠杆菌IGHA2(FERM BP-400)制备、日本特开昭60-221091号公报]、pGKA2[由大肠杆菌IGKA2(FERM BP-6798)制备、日本特开昭60-221091号公报]、pTerm2(美国专利第4686191号说明书、美国专利第4939094号说明书、美国专利第160735号说明书)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(法玛西亚公司制造)、pET系统(Novagen公司制造)或pME18SFL3等。
作为启动子，只要能够在所使用的宿主细胞中发挥功能，则可以为任何启动子。可以列举例如trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子或T7启动子等来源于大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，还可以列举例如将两个Ptrp串联而成的串联启动子、tac启动子、lacT7启动子或let I启动子等进行了人工设计改变的启动子等。
作为宿主细胞，可以列举例如大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49或大肠杆菌DH5α等。
作为将重组载体导入至宿主细胞中的方法，只要是将DNA导入至所使用的宿主细胞中的方法，则均可以使用，可以列举例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)；Gene,17,107(1982)；Molecular&General Genetics,168,111(1979)]。
在使用动物细胞作为宿主的情况下，作为表达载体，只要是能够在动物细胞中发挥功能的表达载体，则均可以使用，可以列举例如pcDNAI、pCDM8(Funakoshi公司制造)、pAGE107[日本特开平3-22979号公报；Cytotechnology,3,133(1990)]、pAS3-3(日本特开平2-227075号公报)、pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制造)、pcDNA3.1(Invitrogen公司制造)、pREP4(Invitrogen公司制造)、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93(国际公开第97/10354号)、N5KG1val(美国专利第6001358号说明书)、INPEP4(Biogen-IDEC公司制造)、pCI(Promega公司制造)和转座子载体(国际公开第2010/143698号)等。
作为启动子，只要是能够在动物细胞中发挥功能的启动子，则均可以使用，可以列举例如巨细胞病毒(CMV)的即刻早期(IE)基因的启动子、SV40的早期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子或莫洛尼小鼠白血病病毒的启动子或增强子。另外，也可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。
作为宿主细胞，可以列举例如人白血病细胞那马瓦(Namalwa)细胞、猴细胞COS细胞、中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞[Journal of Experimental Medicine,108,945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,60,1275(1968)；Genetics,55,513(1968)；Chromosoma,41,129(1973)；Methods in Cell Science,18,115(1996)；Radiation Research,148,260(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.,60,1275(1968)；Cell,6,121(1975)；Molecular Cell Genetics,Appendix I,II(pp.883-900)]；二氢叶酸还原酶基因(以下记为dhfr)缺陷的CHO细胞(CHO/DG44细胞)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]、CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUkXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies、Cat#11619)、Pro-3、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NS0、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14、叙利亚仓鼠细胞BHK或HBT5637(日本特开昭63-000299号公报)等。
作为将表达载体导入至宿主细胞中的方法，只要是将DNA导入至动物细胞中的方法，则均可以使用，可以列举例如电穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸钙法(日本特开平2-227075号公报)或脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
将如上得到的来源于包含整合有编码MOG的DNA的表达载体的微生物或动物细胞等的转化体在培养基中进行培养，使该MOG在培养液中生成并蓄积，从该培养液中收集，由此能够制造MOG。将该转化体在培养基中进行培养的方法可以按照宿主培养中使用的通常的方法来进行。
在来源于真核生物的细胞中进行表达的情况下，能够得到附加有糖或糖链的MOG。
在对利用使用了诱导性启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以根据需要向培养基中添加诱导剂。在对利用使用了lac启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养的情况下，可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等，在对利用使用了trp启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养的情况下，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。
作为对以动物细胞为宿主而得到的转化体进行培养的培养基，可以列举例如通常使用的RPMI1640培养基[The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)]、伊格尔(Eagle)的MEM培养基[Science,122,501(1952)]、杜氏改良MEM培养基[Virology,8,396(1959)]、199培养基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1(1950)]或伊思考夫(Iscove)改良的杜氏培养基(IMDM)或者在这些培养基中添加胎牛血清(FBS)等而得到的培养基等。培养通常在pH6～8、30～40℃、5％CO2存在下等条件下进行1～7天。另外，培养中可以根据需要向培养基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
作为编码MOG的基因的表达方法，除了例如直接表达以外，还可以列举分泌生产或融合蛋白质表达等方法[Molecular Cloning、ALaboratory Manual、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)]。
作为MOG的生产方法，可以列举例如被生产于宿主细胞内的方法、被分泌至宿主细胞外的方法、或者被生产于宿主细胞外膜上的方法，可以通过改变所使用的宿主细胞或所生产的MOG的结构来选择适当的方法。
在MOG被生产于宿主细胞内或宿主细胞外膜上的情况下，通过使用鲍尔森等人的方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、罗等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)；Genes Develop.,4,1288(1990)]、日本特开平05-336963号公报或国际公开第94/23021号等中记载的方法，能够使MOG主动地分泌至宿主细胞外。另外，也可以利用使用了二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增系统(日本特开平2-227075号公报)来提高MOG的生产量。
所得到的MOG例如可以如下进行分离、纯化。在MOG以溶解状态表达于细胞内的情况下，在培养结束后通过离心分离回收细胞，悬浮于水系缓冲液中，然后，利用超声波破碎机、法式压滤壶、曼通-高林(MANTON-GAULIN)匀浆器或戴诺磨机等将细胞破碎，得到无细胞提取液。从通过将该无细胞提取液进行离心分离而得到的上清中，利用通常的蛋白质分离纯化法，即，单独使用或组合使用溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、DIAION HPA-75(三菱化学公司制造)等树脂的阴离子交换层析法、使用S-琼脂糖FF(法玛西亚公司制造)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、聚焦层析法或等电点电泳等电泳法等方法，能够得到纯化制备品。
在MOG形成不溶体而表达于细胞内的情况下，与上述同样地回收细胞后将其破碎，进行离心分离，由此以沉淀级分的形式回收该MOG的不溶体。将回收的该MOG的不溶体用蛋白质变性剂进行可溶化。对该可溶化液进行稀释或透析，由此使该MOG恢复至正常的立体结构，然后，利用与上述同样的分离纯化法，能够得到多肽的纯化制备品。
在MOG或其糖修饰体等衍生物被分泌至细胞外的情况下，可以在培养上清中回收该MOG或其糖修饰体等衍生物。与上述同样地使用离心分离等方法对该培养物进行处理，由此获取可溶性级分，使用与上述同样的分离纯化法，能够从该可溶性级分中得到纯化制备品。
另外，本发明中使用的MOG也可以利用Fmoc法或tBoc法等化学合成法来制造。另外，也可以利用Advanced ChemTech公司制造、珀金埃尔默公司制造、法玛西亚公司制造、Protein Technology Instrument公司制造、Synthecell-Vega公司制造、Perceptive公司制造或岛津制作所公司制造等的肽合成仪进行化学合成。
(2)动物的免疫和融合用抗体产生细胞的制备
对3～20周龄的小鼠、大鼠、兔或仓鼠等动物进行(1)中得到的抗原的免疫，采集该动物的脾脏、淋巴结、外周血中的抗体产生细胞。另外，作为被免疫动物，也可以使用美洲驼、羊驼、骆驼等动物。
免疫通过将抗原与例如完全弗氏佐剂、或者氢氧化铝凝胶与百日咳菌疫苗等适当的佐剂一起给药于动物的皮下、静脉内或腹腔内来进行。在抗原为部分肽的情况下，与BSA(牛血清白蛋白)或钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet hemocyanin，KLH)等载体蛋白制作结合体，将其用作免疫原。
对小鼠或大鼠进行免疫时，关于抗原的给药，在第一次给药后每隔1～2周进行5～10次。在各给药后第3～7天，从眼底静脉丛采血，使用酶联免疫测定法[Antibodies-ALaboratory Manual、冷泉港实验室(1988)]等测定其血清的抗体效价。将其血清对免疫所用的抗原显示出充分的抗体效价的动物作为融合用抗体产生细胞的供给源。
在抗原的最终给药后第3～7天，从免疫后的动物摘除脾脏等包含抗体产生细胞的组织，采集抗体产生细胞。在使用脾脏细胞的情况下，将脾脏细切、打散后离心分离，进而除去红细胞，从而获得融合用抗体产生细胞。
对于其他被免疫动物，也利用同样的方法进行免疫，能够获得抗体产生细胞。免疫间隔、从最后的免疫至组织摘除为止的期间可以根据被免疫动物的动物种类选择适当的条件。
(3)骨髓瘤细胞的制备
作为骨髓瘤细胞，使用由小鼠得到的细胞株，例如8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠(来源于BALB/c)骨髓瘤细胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology andImmunology,18,1(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J.Immunology,6,511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]或P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。
该骨髓瘤细胞在正常培养基[添加有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素、FBS和8-氮杂鸟嘌呤的RPMI1640培养基]中传代，在细胞融合的3～4天前传代于正常培养基中，在融合当天确保2×107个以上的细胞数。
(4)细胞融合和单克隆抗体产生杂交瘤的制备
将(2)中得到的融合用抗体产生细胞和(3)中得到的骨髓瘤细胞用最低必需培养基(Minimum Essential Medium，MEM)或PBS(磷酸氢二钠1.83g、磷酸二氢钾0.21g、氯化钠7.65g、蒸馏水1升、pH7.2)充分清洗，按照细胞数为融合用抗体产生细胞:骨髓瘤细胞＝5～10:1的方式混合，离心分离后，除去上清。
将沉淀的细胞群充分打散后，在37℃下一边搅拌一边加入聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培养基和二甲亚砜的混合液。进一步，每1～2分钟添加MEM培养基1～2mL，添加数次后，加入MEM培养基而使总量为50mL。
离心分离后，除去上清。将沉淀的细胞群轻轻打散后，将细胞轻柔地悬浮于HAT培养基[添加有次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷和氨基蝶呤的正常培养基]中。将该悬浮液在5％CO2温箱中在37℃下培养7～14天。
培养后，抽取一部分培养上清，利用后述的结合分析等杂交瘤的选择方法，选择出与MOG反应、不与非MOG的抗原反应的细胞群。接着，利用有限稀释法进行克隆化，选择出稳定确认到强抗体效价的细胞作为单克隆抗体产生杂交瘤。
(5)纯化单克隆抗体的制备
对姥鲛烷处理[腹腔内给药2,6,10,14-四甲基十五碳烷(Pristane)0.5mL，饲养2周]后的8～10周龄的小鼠或裸鼠腹腔内注射(4)中得到的单克隆抗体产生杂交瘤。在10～21天，杂交瘤形成癌性腹水。
从该小鼠采集腹水，离心分离除去固体成分后，用40～50％硫酸铵进行盐析，利用辛酸沉淀法、DEAE-琼脂糖柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱进行纯化，收集IgG或IgM级分，作为纯化单克隆抗体。
另外，将(4)中得到的单克隆抗体产生杂交瘤在添加有10％FBS的RPMI1640培养基等中进行培养后，通过离心分离除去上清，悬浮于杂交瘤SFM培养基中，培养3～7天。
对所得到的细胞悬浮液进行离心分离，利用蛋白A柱或蛋白G柱从所得到的上清中进行纯化，收集IgG级分，也能够得到纯化单克隆抗体。需要说明的是，也可以在杂交瘤SFM培养基中添加5％的Daigo’sGF21。
抗体亚类的确定使用亚类分型试剂盒通过酶联免疫测定法来进行。蛋白量的定量可以利用劳里法或由280nm下的吸光度算出。
(6)抗体的选择
抗体的选择如下所示，通过利用流式细胞术测定抗体对MOG表达细胞的结合性等来进行。MOG表达细胞只要在细胞表面上表达MOG，则可以为任何细胞，可以列举例如动物细胞、动物细胞株和(1)中得到的MOG强制表达细胞株等。
将MOG表达细胞分注至96孔板等板中后，分注血清、杂交瘤的培养上清或纯化抗体等被测物质作为第一抗体，使其进行反应。将反应后的细胞用含有1～10％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(以下记为BSA-PBS)等充分清洗后，分注用荧光试剂等进行了标记的抗免疫球蛋白抗体作为第二抗体，使其进行反应。用BSA-PBS等充分清洗后，使用流式细胞仪对标记化抗体的荧光量进行测定，由此选择出与MOG表达细胞特异性地反应的抗体。
另外，抗体的选择也可以通过使用以下记载的ELISA或表面等离子体共振测定单克隆抗体对MOG表达细胞或MOG蛋白等的结合性来进行。MOG蛋白可以为由MOG的一部分结构域构成的蛋白质，也可以为附加有GST等标签的蛋白质。
ELISA中，将MOG表达细胞或MOG蛋白分注至96孔板等板中后，利用BSA-PBS进行封闭，分注血清、杂交瘤的培养上清或纯化抗体等被测物质作为第一抗体，使其进行反应。接着，用PBS等充分清洗后，分注用荧光试剂等进行了标记的抗免疫球蛋白抗体作为第二抗体，使其进行反应。
然后，用PBS等充分清洗后，添加显色试剂。最后用反应终止液终止显色反应，利用酶标仪测定各孔中的吸光度，由此选择出与MOG表达细胞或MOG蛋白特异性地反应的抗体。
表面等离子体共振可以通过使用公知的操作规程将抗体固相化于适当的传感芯片上，以MOG蛋白作为分析物来测定与MOG结合的抗体的亲和性。
根据所得到的抗体的亲和性，能够选择出对MOG蛋白具有所期望的亲和性的抗体。另外，也可以将MOG蛋白固相化于传感芯片上，以抗体作为分析物来测定与MOG结合的抗体的亲和性。
另外，与本发明的抗体竞争性地与MOG结合的抗体可以通过将被测抗体添加至上述的使用流式细胞术或ELISA的测定系统中使其进行反应而获得。即，通过筛选在添加有被测抗体时抑制本发明的抗体与MOG的结合的抗体，能够获得在与MOG的氨基酸序列或其立体结构的结合中与本发明的抗体竞争的抗体。
另外，与包含本发明的抗体所结合的表位的表位结合的抗体可以通过下述方法获得：利用公知的方法对通过上述筛选方法获得的抗体的表位进行鉴定，制作包含所鉴定出的表位的合成肽或模拟表位的立体结构的合成肽等，进行免疫。
此外，与和本发明的抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体可以通过下述方法获得：对利用上述的筛选方法获得的抗体的表位进行鉴定，制作包含所鉴定出的表位的部分的合成肽或模拟成表位的立体结构的合成肽等，进行免疫。
(7)利用噬菌体展示法的抗体的获得
(7-1)抗体噬菌体文库的制作方法
本发明中，抗体噬菌体文库可以使用免疫文库、天然文库和合成文库。以下记载各文库的制作方法。
对于免疫文库，采集来源于利用与上述(1)同样的方法进行了免疫的动物或患者的淋巴细胞，对于天然文库，采集来源于正常动物或健康人的淋巴细胞，提取RNA，通过逆转录反应合成cDNA。
以该cDNA作为模板，利用PCR进行扩增，将扩增出的抗体基因片段插入至噬菌粒载体中，利用该噬菌粒载体对大肠杆菌进行转化。使辅助噬菌体感染于所得到的转化体时，能够得到抗体基因被文库化的抗体噬菌体文库。
另外，对于合成文库，将基因组DNA中的V基因或再构建的功能性V基因的CDR用编码适当长度的随机氨基酸序列的寡核苷酸置换，利用插入有该V基因的噬菌粒载体对大肠杆菌进行转化。使辅助噬菌体感染于所得到的转化体时，能够得到抗体噬菌体文库。
来源于淋巴细胞的cDNA、抗体噬菌体文库也可以使用市售品。
噬菌粒载体可以使用pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia公司)、pUC118/pUC119载体(TaKaRa公司)、pBlueScript II噬菌粒载体(Agilent Technologies公司)和pKSTV-02(Miyazaki et al,J.Biochem.2015；1)等。
辅助噬菌体可以使用M13KO7辅助噬菌体(Invitrogen公司)、VCSM13抗干扰辅助噬菌体(Agilent Technologies公司)、R408抗干扰辅助噬菌体(Agilent Technologies公司)等。
噬菌体展示也可以使用噬菌体载体。有以纤维状噬菌体的g3p作为展示分子的肽噬菌体文库(New England Biolabs公司制等)和以g7p、g8p、g9p作为展示分子的方法等。
另外，也可以采用使用T7噬菌体的噬菌体展示。T7噬菌体上的展示系统有T7Select载体(Novagen公司)等。
(7-2)抗体噬菌体克隆的选择
从(7-1)中制作的抗体噬菌体文库中选择抗体噬菌体克隆可以使用以下所示的ELISA法进行。
将MOG固相化于免疫管(Immuno tube)上，利用封闭缓冲液对管进行封闭。在管的各孔中添加上述(7-1)中制作的抗体噬菌体文库，使其进行反应。接着，对孔进行清洗，添加荧光标记的抗噬菌体抗体使其进行反应后，再次对孔进行清洗，添加显色液。然后，用反应终止液终止显色反应，利用酶标仪测定各孔中的吸光度。由此，选择出与MOG结合的抗体噬菌体克隆。
2.基因重组抗体的制作
作为基因重组抗体的制作例，以下示出人型嵌合抗体和人源化抗体的制作方法。基因重组的小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、仓鼠抗体、骆驼抗体、美洲驼抗体、羊驼抗体、人抗体、各种嵌合抗体、以及重链抗体等也可以利用同样的方法制作。
(1)基因重组抗体表达用载体的构建
基因重组抗体表达用载体是整合有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体，可以通过将编码人抗体的CH和CL的DNA分别克隆至动物细胞用表达载体中来构建。
人抗体的C区可以使用任意的人抗体的CH和CL。例如使用人抗体的γ1亚类的CH和κ类的CL等。编码人抗体的CH和CL的DNA使用cDNA，但也可以使用由外显子和内含子构成的染色体DNA。
动物细胞用表达载体只要能够整合编码人抗体的C区的基因并进行表达，则可以使用任何表达载体。例如使用pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]或pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.,13,79(1993)]等。
动物细胞用表达载体中的启动子和增强子可以列举SV40的早期启动子[J.Biochem.,101,1307(1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)]或免疫球蛋白H链的启动子[Cell,41,479(1985)]和增强子[Cell,33,717(1983)]等。
从基因重组抗体表达载体的构建的容易度、向动物细胞中导入的容易度、抗体H链和L链在动物细胞内的表达量的平衡达到均衡等观点出发，基因重组抗体表达用载体使用抗体H链和L链存在于同一载体上的类型(串联型)的基因重组抗体表达用载体[J.Immunol.Methods,167,271(1994)]，但也可以使用抗体H链和L链存在于分开的载体上的类型。串联型的基因重组抗体表达用载体使用pKANTEX93(国际公开第97/10354号)、pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]等。
(2)编码来源于人以外的动物的抗体的V区的cDNA的获得和氨基酸序列的分析
编码非人抗体的VH和VL的cDNA的获得和氨基酸序列的分析可以如下进行。
(2-1)利用杂交瘤法获得抗体的情况
由产生非人抗体的杂交瘤细胞提取mRNA，合成cDNA。将所合成的cDNA克隆至噬菌体或质粒等载体中，制作cDNA文库。
使用编码非人抗体的C区部分或V区部分的DNA作为探针，从上述文库中分别分离出具有编码VH或VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。分别确定重组噬菌体或重组质粒上的作为目标的非人抗体的VH或VL的全部碱基序列，由碱基序列分别推定VH或VL的全部氨基酸序列。
制作产生非人抗体的杂交瘤细胞的人以外的动物使用小鼠、大鼠、仓鼠、兔、美洲驼、骆驼或羊驼等，但只要能够制作杂交瘤细胞，则可以使用任何动物。
由杂交瘤细胞制备总RNA时，使用异硫氰酸胍-三氟乙酸铯法[Methods inEnzymol.,154,3(1987)]或RNA easy试剂盒(Qiagen公司制造)等试剂盒等。
由总RNA制备mRNA时，使用寡聚(dT)固定化纤维素柱法[Molecular Cloning、ALaboratory Manual、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)]或Oligo-dT30<Super>(注册商标)mRNA纯化试剂盒(宝生物公司制造)等试剂盒等。另外，也可以使用Fast Track(注册商标)mRNA分离试剂盒(Invitrogen公司制造)或QuickPrep(注册商标)mRNA纯化试剂盒(法玛西亚公司制造)等试剂盒由杂交瘤细胞制备mRNA。
cDNA的合成和cDNA文库的制作使用公知的方法[Molecular Cloning、ALaboratory Manual、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols inMolecular Biology、附录1、约翰威利父子出版社(1987-1997)]；或者用于cDNA合成和质粒克隆的SuperScript质粒系统(Invitrogen公司制造)或ZAP-cDNA(注册商标)合成试剂盒(Stratagene公司制造)等试剂盒等。
制作cDNA文库时，整合入以由杂交瘤细胞提取的mRNA为模板而合成的cDNA的载体，只要是可整合入该cDNA的载体，则可以使用任何载体。例如使用ZAP Express[Strategies,5,58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(Stratagene公司制造)、λgt10、λgt11[DNA Cloning:A PracticalApproach(DNA克隆实用方法),I,49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech公司制造)、λExCell、pT7T3-18U(法玛西亚公司制造)、pCD2[Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)]或pUC18[Gene,33,103(1985)]等。
导入利用噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌，只要能够导入、表达和维持该cDNA文库，则可以使用任何大肠杆菌。例如使用XL1-Blue MRF’[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,440(1954)]、Y1088、Y1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.,166,1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.,16,118(1966)]或JM105[Gene,38,275(1985)]等。
从cDNA文库中选择编码非人抗体的VH或VL的cDNA克隆时，使用利用了同位素或荧光标记的探针的菌落杂交法或噬菌斑杂交法[Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)]等。
另外，也可以制备引物，以由mRNA合成的cDNA或cDNA文库作为模板，进行聚合酶链式反应法[以下记为PCR法；Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols in Molecular Biology、附录1、约翰威利父子出版社(1987-1997)]，由此制备编码VH或VL的cDNA。
将所选择的cDNA用适当的限制酶等切断后，克隆至pBluescript SK(-)(Stratagene公司制造)等质粒中，利用通常使用的碱基序列分析方法等确定该cDNA的碱基序列。作为碱基序列分析方法，例如在进行双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)]等反应后，使用ABIPRISM3700(PE生物系统公司制造)或A.L.F.DNA测序仪(法玛西亚公司制造)等碱基序列自动分析装置等。
(2-2)利用噬菌体展示法获得抗体的情况
使用编码载体部分或V区部分的DNA作为探针，从所选择的噬菌体克隆的质粒载体中分别确定VH或VL的全部碱基序列，由碱基序列分别推定VH或VL的全部氨基酸序列。
在杂交瘤法或噬菌体展示法中的任意一种方法中，均由所确定的碱基序列分别推定VH和VL的全部氨基酸序列，与已知抗体的VH和VL的全部氨基酸序列[Sequences ofProteins of Immunological Interest,USDept.Health and Human Services(1991)]进行比较，由此分别确认所获得的cDNA是否编码包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列。
关于包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列，通过与已知抗体的VH和VL的全部氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDept.Health and Human Services(1991)]进行比较，能够推定分泌信号序列的长度和N末端氨基酸序列，进而能够知晓它们所属的亚类。
另外，对于VH和VL的各CDR的氨基酸序列，也可以通过与已知抗体的VH和VL的氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDept.Health andHuman Services(1991)]进行比较来找出。
另外，使用所得到的VH和VL的完整氨基酸序列，对例如SWISS-PROT或PIR-Protein等任意的数据库进行BLAST法[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]等的同源性检索，能够确认VH和VL的完整氨基酸序列是否为新序列。
(3)人型嵌合抗体表达载体的构建
将分别编码非人抗体的VH或VL的cDNA分别克隆至(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，由此能够构建人型嵌合抗体表达载体。
为了将编码非人抗体的VH或VL的cDNA的3’末端侧与人抗体的CH或CL的5’末端侧连接，制作以连接部分的碱基序列编码适当的氨基酸且成为适当的限制酶识别序列的方式设计出的VH和VL的cDNA。
将所制作的VH和VL的cDNA分别克隆至(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达，从而构建人型嵌合抗体表达载体。
另外，也可以使用在两端具有适当的限制酶的识别序列的合成DNA，利用PCR法对编码非人抗体VH或VL的cDNA分别进行扩增，将它们克隆至(1)中得到的基因重组抗体表达用载体中。
(4)编码人源化抗体的V区的cDNA的构建
编码人源化抗体的VH或VL的cDNA可以如下构建。
分别选择出用于移植非人抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列。所选择的FR的氨基酸序列只要是来源于人抗体的FR的氨基酸序列，则可以使用任何氨基酸序列。
例如使用蛋白数据库(Protein Data Bank)等数据库中登记的人抗体的FR的氨基酸序列、或人抗体的FR的各亚类的共有氨基酸序列[Sequences of Proteins ofImmunological Interest,USDept.Health and Human Services(1991)]等。为了抑制抗体的结合活性的降低，选择与原抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列具有尽量高的同源性(至少60％以上)的FR的氨基酸序列。
接着，向所选择的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列中分别移植原抗体的CDR的氨基酸序列，分别设计出人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列。考虑在抗体基因的碱基序列中出现的密码子的使用频率[Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDept.Health and Human Services(1991)]而将所设计的氨基酸序列转换成DNA序列，分别设计出编码人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。
基于所设计的DNA序列，合成多条由约100个碱基的长度构成的合成DNA，使用这些合成DNA进行PCR反应。这种情况下，从PCR反应中的反应效率和能够合成的DNA的长度考虑，优选对于VH、VL分别设计各6条合成DNA。
此外，通过在位于两端的合成DNA的5’末端或3’末端导入适当的限制酶的识别序列，能够容易地将编码人源化抗体的VH或VL的cDNA克隆至(1)中得到的基因重组抗体表达用载体中。
PCR反应后，将扩增产物分别克隆至pBluescript SK(-)(Stratagene公司制造)等质粒中，通过与(2)中记载的方法同样的方法确定碱基序列，从而获得具有所期望的编码人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列的质粒。
或者，也可以使用基于所设计的DNA序列以各一条长链DNA的形式合成全长VH和全长VL而得到的DNA来代替上述PCR扩增产物。进一步，通过在合成长链DNA的两端导入适当的限制酶的识别序列，能够容易地将编码人源化抗体的VH或VL的cDNA克隆至(1)中得到的基因重组抗体表达用载体中。
(5)人源化抗体的V区的氨基酸序列的改变
对于人源化抗体而言，仅将非人抗体的VH和VL的CDR移植至人抗体的VH和VL的FR中时，其抗原结合活性与原来的非人抗体相比降低[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。
在人源化抗体中，鉴定出人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列中直接与抗原的结合相关的氨基酸残基、与CDR的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基、以及维持抗体的立体结构而间接与抗原的结合相关的氨基酸残基，并将这些氨基酸残基置换为原来的非人抗体的氨基酸残基，由此能够使降低的抗原结合活性升高。
为了鉴定出与抗原结合活性相关的FR的氨基酸残基，可以通过使用X射线晶体分析[J.Mol.Biol.,112,535(1977)]或计算机建模[Protein Engineering,7,1501(1994)]等进行抗体的立体结构的构建和分析。另外，针对各个抗体制作多种改变体并反复研究与各自的抗原结合活性的相关性来进行各种尝试，由此，能够获得具有所需要的抗原结合活性的人源化抗体。
人抗体的VH和VL的FR的氨基酸残基可以通过使用改变用合成DNA进行(4)中记载的PCR反应来进行改变。对于PCR反应后的扩增产物，通过(2)中记载的方法来确定碱基序列，从而确认已实施了目标改变。
(6)人源化抗体表达载体的构建
将所构建的编码基因重组抗体的VH或VL的cDNA分别克隆至(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，能够构建人源化抗体表达载体。
例如，通过向(4)和(5)中得到的构建人源化抗体的VH或VL时使用的合成DNA中位于两端的合成DNA的5’末端或3’末端导入适当的限制酶的识别序列，分别克隆至(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达。
(7)基因重组抗体的瞬时性表达
使用(3)和(6)中得到的基因重组抗体表达载体或者对它们进行改变而得到的表达载体，进行基因重组抗体的瞬时性表达，能够高效地对所制作的多种人型嵌合抗体、人源化抗体的抗原结合活性进行评价。
导入表达载体的宿主细胞只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞，则可以使用任何细胞，例如使用COS-7细胞[美国典型培养物保藏中心(ATCC)编号：CRL1651][Methodsin Nucleic Acids Res.、CRC出版社、283(1991)]。
向COS-7细胞中导入表达载体时，使用DEAE-右旋糖酐法[Methods in NucleicAcids Res.、CRC Press(1991)]或脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
导入表达载体后，使用酶免疫抗体法[Monoclonal Antibodies-Principles andpractice、第三版、学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual、冷泉港实验室(1988)；单克隆抗体实验手册、讲谈社Scientific(1987)]等测定培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性。
(8)稳定表达基因重组抗体的转化株的获得和基因重组抗体的制备
通过将(3)和(6)中得到的基因重组抗体表达载体导入至适当的宿主细胞中，能够得到稳定表达基因重组抗体的转化株。
表达载体向宿主细胞中的导入使用电穿孔法[日本特开平2-257891号公报；Cytotechnology,3,133(1990)]等。
导入基因重组抗体表达载体的宿主细胞只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞，则可以使用任何细胞。例如使用CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies、Cat#11619)、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(ATCC编号：CRL1662、或者也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NS0、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14(ATCC编号：CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC编号：CRL1580)、二氢叶酸还原酶基因(Dihydrofolate Reductase、以下记为dhfr)缺陷的CHO细胞(CHO/DG44细胞)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]等。
另外，也可以使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶等蛋白质、与在N-糖苷键复合型糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺的6位上以α键结合岩藻糖的1位的糖链修饰相关的酶等蛋白质、或者与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的宿主细胞，例如α1,6-岩藻糖转移酶基因缺陷的CHO细胞(国际公开第2005/035586号、国际公开第02/31140号)、获得了凝集素抗性的Lec13[Somatic Celland Molecular genetics,12,55(1986)]等。
导入表达载体后，将稳定表达基因重组抗体的转化株在含有G418硫酸盐(以下记为G418)等药剂的动物细胞培养用培养基中进行培养，由此进行选择(日本特开平2-257891号公报)。
动物细胞培养用培养基使用RPMI1640培养基(Invitrogen公司制造)、GIT培养基(日本制药公司制造)、EX-CELL301培养基(JRH公司制造)、IMDM培养基(Invitrogen公司制造)或杂交瘤-SFM培养基(Invitrogen公司制造)、或者在这些培养基中添加有FBS等各种添加物的培养基等。
通过将所得到的转化株在培养基中进行培养，使基因重组抗体在培养上清中表达并蓄积。培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性可以利用ELISA法等进行测定。另外，可以利用dhfr基因扩增系统(日本特开平2-257891号公报)等使转化株所产生的基因重组抗体的表达量升高。
基因重组抗体可以使用蛋白A柱从转化株的培养上清中进行纯化[MonoclonalAntibodies-Principles and practice、第三版、学术出版社(1996)；Antibodies-ALaboratory Manual、冷泉港实验室(1988)]。另外，也可以将凝胶过滤、离子交换层析和超滤等蛋白质的纯化中使用的方法组合来进行纯化。
纯化后的基因重组抗体的H链、L链或整个抗体分子的分子量可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法[Nature,227,680(1970)]或蛋白免疫印迹法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice、第三版、学术出版社(1996)；Antibodies-A LaboratoryManual、冷泉港实验室(1988)]等进行测定。
(9)抗体片段的制作方法
本发明的抗体片段可以按照公知的方法进行制作。本发明的抗体片段可以通过利用酶等将按照上述(1)～(8)中记载的方法制作的抗体切断来制作，也可以制备编码所期望的抗体片段的碱基序列并利用基因工程方法来制作。
(10)一价抗体的制作方法
本发明中，一价抗体可以利用国际公开第2014/054804号、国际公开第2011/090754号、国际公开第2007/048037号和国际公开第2012/116927号等中记载的方法等来制作。
(11)双特异性抗体或多特异性抗体的制造方法
本发明的双特异性抗体或多特异性抗体可以依照上述的抗体的制造方法来制作。可以使用例如国际公开第2009/131239号、国际公开第2014/054804号、国际公开第01/077342号、美国专利申请公开第2007/0071675号说明书、国际公开第2007/024715、Wu etal.,[Nature Biotechnology,2007,25(11),p.1290-1297]、Labrijn et al.,[PNAS2013,vol.110,no.13,p5145-5150]、Jong et al.,[http://dx.doi.org/10.1371/journal.pbio.1002344]、Kontermann et al.,[mAbs 2012,vol.4,issue2,p182-197]、Spiess et al.,[Molecular Immunology 67(2015)95-106]、Ridgway et al.,[Proteinengineering,1996vol.9no.7pp617-621、国际公开第2009/080251、国际公开第2010/151792和国际公开第2014/033074等中记载的方法来制作。
例如在与存在于脑中的抗原结合的IgG抗体的C末端融合与MOG结合的scFv而成的双特异性抗体的表达载体可以利用以下记载的方法来制作，可以依照上述的抗体的表达方法和抗体的纯化方法制作该双特异性抗体。另外，其他在抗体的C末端融合抗体片段而成的双特异性抗体也可以利用同样的方法来制作。
以与存在于脑中的抗原结合的IgG抗体的重链恒定区的合成基因作为模板，利用PCR法扩增CH1-铰链-CH2-CH3-接头区的基因片段。接着，以与MOG结合的抗体的碱基序列作为模板，使用PCR法等制备将该抗体的VH和VL利用适当的接头结合而成的scFv区的碱基序列。利用PCR法等使上述两个区域结合，将所得到的基因片段插入至pCI载体等适当的载体中。
另外，分别通过使用适当模板的PCR法扩增出与存在于脑中的抗原结合的IgG抗体的轻链区(VL和CL)的基因片段和该抗体的VH的基因片段，插入至上述载体的适当位置。
另外，本发明的双特异性抗体也可以通过利用化学方法使包含抗体片段的抗原结合位点与IgG抗体结合而制作。
3.抗体或该抗体片段的活性评价
本发明中，抗体或该抗体片段的活性评价可以如下进行。
(1)对MOG的结合活性
本发明的抗体或该抗体片段对MOG的结合活性使用上述1-(6)中记载的流式细胞术、ELISA和表面等离子体共振检测等进行测定。另外，也可以使用荧光抗体法[CancerImmunol.Immunother.,36,373(1993)]进行测定。
在本发明的抗体或该抗体片段为与MOG结合的一价抗体的情况下，也可以利用同样的方法测定该一价抗体对MOG的结合活性。在本发明的抗体或该抗体片段为与MOG和存在于脑中的抗原结合的双特异性抗体或多特异性抗体的情况下，也可以利用同样的方法测定该双特异性抗体或多特异性抗体对MOG或存在于脑中的抗原的结合活性。
(2)脑滞留性的测定方法
本发明的抗体或该抗体片段的脑滞留性可以利用以下记载的方法进行测定。
可以列举：将抗体或该抗体片段给药于动物后经过几天后，回收脑组织，将其匀浆化，测定离心分离后的上清中的抗体或该抗体片段的浓度，算出每单位脑重量的抗体或该抗体片段的量的方法；或者使用回收的脑组织，利用公知的免疫学方法检测抗体或该抗体片段的存在的方法；等等。另外，可以列举：将实施了药理学上可接受的标记的抗体或该抗体片段给药于动物，利用体内成像系统经时地检测该抗体或该抗体片段的存在的方法等。
所使用的动物可以选择与本发明的抗体或该抗体片段的用途相适应的适当的动物。
(3)ADCC、CDC的测定方法
本发明的抗体或该抗体片段对人MOG表达细胞或者表达MOG和存在于脑中的抗原的细胞的CDC或ADCC可以利用公知的测定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)；Current protocols in Immunology,Chapter7.Immunologic studies inhumans,Editor,John E,Coligan et al.,约翰威利父子出版社公司(1993)]进行测定。
4.控制抗体或抗体片段的效应子活性的方法
作为控制本发明的抗体或该抗体片段的效应子活性的方法，已知有：对以α1,6键结合于与抗体或包含Fc的该抗体片段的Fc区的第297位的天冬酰胺(Asn)结合的N结合复合型糖链的还原末端存在的N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)上的岩藻糖(也称为核心岩藻糖)的量进行控制的方法(国际公开第2005/035586号、国际公开第2002/31140号、国际公开第00/61739号)；或者通过改变抗体或该抗体片段的Fc区的氨基酸残基而进行控制的方法等。对本发明的抗体或该抗体片段使用任意一种方法，均能够控制效应子活性。
效应子活性是指藉由抗体或该抗体片段的Fc区所引起的抗体依赖性活性，已知有ADCC活性、CDC活性、或者由巨噬细胞或树突细胞等吞噬细胞产生的抗体依赖性吞噬活性(Antibody-dependent phagocytosis、ADP活性)等。
作为效应子活性的测定法，例如，可以将靶细胞、作为效应细胞的人外周血单核细胞(PBMC)、以及靶细胞特异性的抗体或该抗体片段混合，温育约4小时后，测定作为细胞损伤指标的游离出来的乳酸脱氢酶(LDH)。此外，也可以利用游离51Cr法或流式细胞术法等测定效应子活性。
通过控制抗体的Fc的N结合复合型糖链的核心岩藻糖的含量，能够增加或降低抗体或包含Fc的抗体片段的效应子活性。作为降低与结合在抗体或该抗体片段的Fc上的N结合复合型糖链结合的岩藻糖的含量的方法，可以通过使用α1,6-岩藻糖转移酶基因缺陷的CHO细胞表达抗体或该抗体片段而获得未结合岩藻糖的抗体或该抗体片段。未结合岩藻糖的抗体或该抗体片段具有高的ADCC活性。
另一方面，作为增加与结合在抗体或该抗体片段的Fc上的N结合复合型糖链结合的岩藻糖的含量的方法，可以通过使用导入有α1,6-岩藻糖转移酶基因的宿主细胞表达抗体或该抗体片段而获得结合有岩藻糖的抗体或该抗体片段。结合有岩藻糖的抗体或该抗体片段具有比未结合岩藻糖的抗体或该抗体片段低的ADCC活性。
另外，可以通过改变抗体或该抗体片段的Fc区的氨基酸残基来增加或降低ADCC活性或CDC活性。例如，通过使用美国专利申请公开第2007/0148165号说明书中记载的Fc区的氨基酸序列，能够增加抗体或该抗体片段的CDC活性。
另外，通过进行美国专利第6737056号说明书、美国专利第7297775号说明书或美国专利第7317091号说明书中记载的氨基酸改变，既可以增加ADCC活性或CDC活性，也可以降低ADCC活性或CDC活性。
另外，本发明的抗体或该抗体片段也包含通过配合上述的抗体或该抗体片段所含的恒定区中的氨基酸改变或糖链改变来进行例如日本特开第2013-165716号公报或日本特开第2012-021004号公报等中记载的氨基酸改变而控制对Fc受体的反应性，由此控制了血中半衰期的抗体或该抗体片段。
此外，通过将上述方法组合而用于一种抗体或该抗体片段，能够获得控制了效应子活性、血中半衰期的抗体或该抗体片段。
5.使用本发明的抗体或该抗体片段的疾病的治疗方法
本发明的抗体或该抗体片段能够用于在脑内表达MOG的动物的脑疾病的治疗。
作为脑疾病，可以列举例如阿尔茨海默病、先兆阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、脑肿瘤、多发性硬化症、肌营养不良症、肌萎缩性侧索硬化症、多系统萎缩症、进行性核上性麻痹、黑质纹状体变性症、橄榄体脑桥小脑萎缩症、脊髓延髓性肌肉萎缩症、脊髓小脑变性症、脑血管病变、癫痫、偏头痛、多动性障碍、克雅病、皮质基底节变性、溶酶体贮积症、抑郁症、肌张力障碍等。
本发明的抗体或该抗体片段能够治疗的脑疾病根据本发明的抗体或该抗体片段所结合的抗原、以及利用本发明的融合抗体或融合抗体片段对抗体或该抗体片段进行修饰的分子的种类等而有所不同。
含有本发明的抗体或该抗体片段的治疗剂可以仅含有作为有效成分的该抗体或该抗体片段，但通常优选以与药理学上可接受的一种以上的载体一起混合、利用制剂学技术领域中公知的方法制造而成的药物制剂的形式提供。
作为给药途径，可以列举例如经口给药、或者口腔内、呼吸道内、直肠内、皮下、肌肉内、脑室内、腹腔内给药、皮内给药、经鼻给药、髓腔内给药或静脉内等非经口给药。作为给药形态，可以列举例如喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏或贴片剂等。
作为适合于经口给药的制剂，可以列举乳剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等。
乳剂或糖浆剂这样的液体制备物使用水、蔗糖、山梨醇或果糖等糖类、聚乙二醇或聚丙二醇等二醇类、芝麻油、橄榄油或大豆油等油类、对羟基苯甲酸酯类等防腐剂、或者草莓香料或薄荷等香料类等作为添加剂来制造。
胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等使用乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇等赋形剂、淀粉或海藻酸钠等崩解剂、硬脂酸镁或滑石等润滑剂、聚乙烯醇、羟丙基纤维素或明胶等粘结剂、脂肪酸酯等表面活性剂或甘油等增塑剂等作为添加剂来制造。
作为适合于非经口给药的制剂，为注射剂、栓剂或喷雾剂等。注射剂使用由盐溶液、葡萄糖溶液或该两者的混合物构成的载体等来制造。栓剂使用可可脂、氢化脂肪或羧酸等载体来制造。
喷雾剂使用不刺激接受者的口腔和呼吸道粘膜并且使本发明的抗体或该抗体片段以微细粒子的形式分散从而容易吸收的载体等来制造。作为载体，使用例如乳糖或甘油等。另外，也可以以气溶胶或干粉的形式制造。此外，上述非经口剂中，也可以添加在适合于经口给药的制剂中作为添加剂所例示的成分。
6.使用本发明的抗体或该抗体片段的、存在于脑中的抗原的检测或测定方法或者疾病的诊断方法
通过使用本发明的抗体或该抗体片段，能够检测或测定MOG、或者MOG和存在于脑中的抗原。另外，通过检测或测定MOG、或者MOG和存在于脑中的抗原，能够对在脑内表达MOG的动物的脑疾病进行诊断。
作为脑疾病，可以列举例如阿尔茨海默病、先兆阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、脑肿瘤、多发性硬化症、肌营养不良症、肌萎缩性侧索硬化症、多系统萎缩症、进行性核上性麻痹、黑质纹状体变性症、橄榄体脑桥小脑萎缩症、脊髓延髓性肌肉萎缩症、脊髓小脑变性症、脑血管病变、癫痫、偏头痛、多动性障碍、克雅病、皮质基底节变性、溶酶体贮积症、抑郁症、肌张力障碍等，本发明的抗体或该抗体片段能够诊断的脑疾病根据本发明的抗体或该抗体片段所结合的抗原、以及利用本发明的融合抗体或融合抗体片段对抗体或该抗体片段进行修饰的分子的种类等而有所不同。
在脑内表达MOG的动物的脑疾病的诊断例如可以通过利用免疫学方法检测或测定存在于患者或患病动物的脑内的MOG来进行。另外，可以通过使用流式细胞术等免疫学方法检测表达或存在于患者或患病动物的脑内的细胞上的MOG来进行诊断。
使用与MOG结合的一价抗体作为本发明的抗体或该抗体片段时，可以利用与上述同样的方法测定脑内的MOG。使用与MOG和存在于脑中的抗原结合的双特异性抗体或多特异性抗体作为本发明的抗体或该抗体片段时，可以利用与上述同样的方法检测或测定脑内的MOG或存在于脑中的抗原。
免疫学方法是指使用实施了标记的抗原或抗体等对抗体量或抗原量进行检测或测定的方法。例如使用放射性物质标记免疫抗体法、酶联免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法、蛋白免疫印迹法或物理化学方法等。
放射性物质标记免疫抗体法例如是使本发明的抗体或该抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等反应，进一步使实施了放射线标记的抗免疫球蛋白抗体或该抗体片段进行反应，然后利用闪烁计数仪等进行测定。
酶联免疫测定法例如是使本发明的抗体或该抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等反应，进一步使利用酶等实施了标记的抗免疫球蛋白抗体或该抗体片段进行反应，然后添加底物并利用吸光光度计测定反应液的吸光度。例如使用夹心ELISA法等。作为酶联免疫测定法中使用的标记物，可以使用公知[酶联免疫测定法、医学书院(1987)]的酶标记。
例如使用碱性磷酸酶标记、过氧化物酶标记、荧光素酶标记或生物素标记等。夹心ELISA法是使抗体结合于固相上后、使其捕获作为检测或测定对象的抗原并使第二抗体与被捕获的抗原反应的方法。
上述ELISA法中，准备对要检测或测定的抗原进行识别的、抗原识别位点不同的两种抗体，预先使其中的第一抗体吸附至板(例如96孔板)上，接着将第二抗体预先用FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶或生物素等进行标记。
在上述吸附有第一抗体的板上使从生物体内分离出来的细胞或其破碎液、组织或其破碎液、细胞培养上清、血清、胸水、腹水或眼液等进行反应，然后使第二抗体进行反应，并进行与标记物质对应的检测反应。利用将浓度已知的抗原进行连续稀释而制作的标准曲线，算出被测样品中的抗原浓度。
作为夹心ELISA法中使用的抗体，可以使用多克隆抗体或单克隆抗体中的任意一种。另外，代替抗体，也可以使用Fab、Fab’或F(ab)2等抗体片段。作为夹心ELISA法中使用的两种抗体的组合，可以是识别不同表位的单克隆抗体或该抗体片段的组合，也可以是多克隆抗体与单克隆抗体或这些抗体的抗体片段的组合。
荧光免疫测定法利用文献[Monoclonal Antibodies-Principles and practice、第三版、学术出版社(1996)；单克隆抗体实验手册、讲谈社Scientific(1987)]等中记载的方法进行测定。作为荧光免疫测定法中使用的标记物，可以使用公知[荧光抗体法、SoftScience公司(1983)]的荧光标记。例如使用FITC或RITC等。
发光免疫测定法利用文献[生物发光与化学发光临床检查42、广川书店(1998)]等中记载的方法进行测定。作为发光免疫测定法中使用的标记物，可以列举公知的发光物标记，使用吖啶酯或洛酚碱等。
蛋白免疫印迹法中，将抗原或表达抗原的细胞等利用SDS(十二烷基硫酸钠)-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)[Antibodies-A Laboratory Manual、冷泉港实验室(1988)]进行分级后，将该凝胶印迹至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或硝酸纤维素膜上，使识别抗原的抗体或该抗体片段与该膜进行反应，进而使实施了FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶标记或生物素标记等的抗小鼠IgG抗体或结合片段进行反应，然后使该标记可见化，由此进行测定。以下示出一例。
将表达具有MOG的氨基酸序列的多肽的细胞或组织溶解，在还原条件下使每个泳道的蛋白量为0.1～30μg，利用SDS-PAGE法进行电泳。将电泳后的蛋白质转移至PVDF膜上，在含有1～10％BSA的PBS(以下记为BSA-PBS)中在室温下反应30分钟，进行封闭操作。
在此，使本发明的抗体或该抗体片段进行反应，用含有0.05～0.1％的Tween-20的PBS(以下记为Tween-PBS)进行清洗，并使过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG在室温下反应2小时。
用Tween-PBS进行清洗，使用ECL蛋白免疫印迹检测试剂(安玛西亚公司制造)等对结合有本发明的抗体或该抗体片段的条带进行检测，由此对具有MOG的氨基酸序列的多肽进行检测。
作为利用蛋白免疫印迹法的检测中使用的抗体或该抗体片段，使用能够与未保持天然型立体结构的多肽结合的抗体或该抗体片段。
物理化学方法例如通过使作为抗原的MOG与本发明的抗体或该抗体片段结合而形成聚集体并检测该聚集体来进行。作为其他物理化学方法，还可以列举毛细管法、单向免疫扩散法、免疫比浊法或胶乳免疫比浊法[临床检查法提要、金原出版(1998)]等。
胶乳免疫比浊法中，使用以抗体或抗原致敏的粒径约0.1μm～约1μm的聚苯乙烯胶乳等载体，利用对应的抗原或抗体引起抗原抗体反应时，反应液中的散射光增加，透射光减少。以吸光度或积分球浊度的形式检测该变化，由此测定被测样品中的抗原浓度等。
表达MOG的细胞的检测或测定可以使用公知的免疫学检测法，其中优选使用免疫沉淀法、免疫细胞染色法、免疫组织染色法或荧光抗体染色法等。
免疫沉淀法中，使表达MOG的细胞等与本发明的抗体或该抗体片段反应后，加入蛋白G-琼脂糖等对免疫球蛋白具有特异性结合能力的载体，使抗原抗体复合物沉淀。或者也可以利用下述方法进行。
使上述本发明的抗体或该抗体片段固相化于ELISA用96孔板上，然后利用BSA-PBS进行封闭。在抗体为例如杂交瘤培养上清等未进行纯化的状态的情况下，使抗小鼠免疫球蛋白、抗大鼠免疫球蛋白、蛋白A或蛋白G等预先固相化于ELISA用96孔板上，利用BSA-PBS进行封闭后，分注杂交瘤培养上清使其进行结合。
接着，弃去BSA-PBS并用PBS充分清洗后，使表达人MOG的细胞或组织的溶解液进行反应。利用SDS-PAGE用样品缓冲液从充分清洗后的板上提取免疫沉淀物，通过上述蛋白免疫印迹法进行检测。
免疫细胞染色法或免疫组织染色法为下述方法：将表达抗原的细胞或组织等根据情况用表面活性剂或甲醇等进行处理以使抗体的透过性良好，然后与本发明的抗体进行反应，进而与实施了FITC等荧光标记、过氧化物酶等酶标记或生物素标记等的抗免疫球蛋白抗体或其结合片段进行反应，然后使该标记可见化并利用显微镜进行显微观察。
另外，可以通过使细胞与荧光标记的抗体反应并利用流式细胞仪进行分析的荧光抗体染色法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice、第三版、学术出版社(1996)；单克隆抗体实验手册、讲谈社Scientific(1987)]来进行检测。特别地，本发明的抗体或该抗体片段可以利用荧光抗体染色法对保持天然型立体结构而表达的细胞进行检测。
另外，荧光抗体染色法中，在使用FMAT8100HTS系统(应用生物系统公司制造)等的情况下，可以在不对所形成的抗体-抗原复合物与未参与抗体-抗原复合物形成的游离抗体或抗原进行分离的情况下测定抗原量或抗体量。
以下，利用实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明不受下述实施例的限定。
实施例
[实施例1]抗MOG抗体的获得
(1)利用人抗体噬菌体文库的抗体的获得
利用PCR从来源于人PBMC的cDNA扩增出VH基因片段、VL基因片段。将VH基因片段和VL基因片段分别插入至噬菌粒载体pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia公司制造)中，对大肠杆菌TG1(Lucigen公司制造)进行转化而得到质粒。
使所得到的质粒感染M13KO7辅助噬菌体(Invitrogen公司制造)，由此得到将VH基因、VL基因文库化而成的人抗体M13噬菌体文库。
使用该人抗体M13噬菌体文库，利用下述的噬菌体展示法获得抗大鼠MOG(rMOG)单克隆抗体。将后述实施例4的rMOG-FLAG_Fc固相化于MAXISORP STARTUBE(NUNC公司制造)上，使用SuperBlock封闭缓冲液(SuperBlock Blocking Buffer)(Thermo公司制造)对未结合rMOG-FLAG_Fc的部位进行封闭。
使人抗体M13噬菌体文库在室温下在该管中反应1小时，利用PBS或含有0.1％Tween20的PBS(以下记载为PBS-T)进行清洗后，使用0.1M的Gly-HCl(pH2.2)将噬菌体洗脱。洗脱液通过加入Tris-HCl(pH8.5)来进行中和。使洗脱的噬菌体感染于TG1感受态细胞，使噬菌体扩增。
然后，再次与固相化于MAXISORP STARTUBE上的rMOG-FLAG_Fc进行反应，并实施清洗和洗脱。重复该操作，将展示出与rMOG-FLAG_Fc特异性结合的scFv的噬菌体浓缩。将浓缩后的噬菌体单克隆化，利用ELISA选择出对rMOG-FLAG_Fc具有结合性的3个克隆。
ELISA中，将rMOG-FLAG_Fc固相化于MAXISORP(NUNC公司制造)上，使用SuperBlock封闭缓冲液(SuperBlock Blocking Buffer)(Thermo公司制造)对未结合rMOG-FLAG_Fc的部位进行封闭。作为阴性对照，还准备了固相化有FLAG_Fc的板。
向各孔中添加各噬菌体克隆，在室温下反应30分钟后，用PBS-T清洗各孔。接着，用含有10％ Block Ace(大日本制药株式会社制造)的PBS-T对以辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体(GE Healthcare公司制造)进行稀释，将所得溶液添加到各孔中，在室温下温育30分钟。
用PBS-T将微孔板清洗3次后，加入TMB显色底物液(DAKO公司制造)，在室温下温育。向各孔中加入0.5M硫酸，使显色反应终止，利用酶标仪(Molecular Devices公司制造)测定波长450nm(参比波长570nm)下的吸光度。将所得到的结果示于图1。
如图1所示，可以确认：3种噬菌体克隆均与rMOG-FLAG Fc结合。另一方面，任意一种噬菌体克隆均不与FLAG Fc结合(数据未显示)。
对于与rMOG-FLAG_Fc结合的克隆进行序列分析，获得抗MOG抗体噬菌粒载体pCANTAB_MOG01、pCANTAB_MOG09和pCANTAB_MOG14。
在下文中，将使用pCANTAB_MOG01、pCANTAB_MOG09和pCANTAB_MOG14进行表达的噬菌体所展示的抗MOG scFv抗体的名称分别记载为MOG01抗体、MOG09抗体和MOG14抗体。将编码各种抗MOG scFv抗体的VH或VL的碱基序列、由该碱基序列推定的氨基酸序列示于表1。
[表1]
抗MOG scFv抗体(MOG01抗体、MOG09抗体和MOG14抗体)的序列信息
克隆名称 MOG01 MOG09 MOG14
编码VH(包含信号序列)的碱基序列 序列号1 序列号13 序列号25
VH(包含信号序列)的氨基酸序列 序列号2 序列号14 序列号26
VH(不包含信号序列)的氨基酸序列 序列号3 序列号15 序列号27
HCDR1的氨基酸序列 序列号4 序列号16 序列号28
HCDR2的氨基酸序列 序列号5 序列号17 序列号29
HCDR3的氨基酸序列 序列号6 序列号18 序列号30
编码VL(包含信号序列)的碱基序列 序列号7 序列号19 序列号31
VL(包含信号序列)的氨基酸序列 序列号8 序列号20 序列号32
VL(不包含信号序列)的氨基酸序列 序列号9 序列号21 序列号33
LCDR1的氨基酸序列 序列号10 序列号22 序列号34
LCDR2的氨基酸序列 序列号11 序列号23 序列号35
LCDR3的氨基酸序列 序列号12 序列号24 序列号36
(2)利用羊驼抗体文库的抗体的获得
作为免疫原，在第一次免疫制作rMOG-FLAG_Fc与完全佐剂的乳液，在第二次和第三次免疫制作rMOG-FLAG_Fc与不完全佐剂的乳液，对羊驼进行免疫。
从免疫后的羊驼的血液(50mL)中采集淋巴细胞(2×107个细胞)，使用RNAIsoPlus(TAKARA公司制造)从所得到的细胞中提取RNA。进而，使用RT-PC用SuperScript(注册商标)III第一链合成系统(Invitrogen公司制造)通过逆转录反应合成cDNA，然后使用对羊驼IgG2(短铰链重链抗体，Short hinge-heavy chain antibody)、IgG3(长铰链重链抗体，Long hinge-heavy chain antibody)呈特异性的引物，进行VHH基因的扩增。
将VHH基因片段插入至噬菌粒载体pKSTV-02(记载于Miyazaki et al,J.Biochem.2015；1)中，通过使用MicroPulser电穿孔仪(BioRad公司制造)的电穿孔对大肠杆菌TG1进行转化(转化体的滴度对于IgG2为2.6×107、对于IgG3为3.2×107)。
使所得到的转化体感染M13KO7辅助噬菌体(Invitrogen公司制造)，由此得到将VHH基因文库化而成的羊驼抗体M13噬菌体文库。
使用该羊驼抗体M13噬菌体文库，利用下述的生物淘选(biopanning)方法获得抗MOG抗体。将rMOG-GST(4μg/2mL)固相化于免疫管中，使用0.5％BSA对未结合rMOG-GST的部位进行封闭。
使羊驼抗体M13噬菌体文库在室温下在该管中反应1小时，用PBS-T清洗后用0.1M的Gly-HCl(pH2.7)将噬菌体洗脱。洗脱液通过加入Tris-HCl(pH9.1)来进行中和。使洗脱的噬菌体感染于大肠杆菌TG1后，使噬菌体扩增。然后，再次与固相化于免疫管中的rMOG-GST反应，实施清洗和洗脱。
将该操作在IgG2的情况下重复3次、在IgG3的情况下重复2次，将展示出与rMOG-GST特异性结合的VHH的噬菌体浓缩。从浓缩后的噬菌体中分别进行96个展示出IgG2和IgG3的VHH的噬菌体克隆的单克隆化，利用ELISA选择出对rMOG-GST具有结合性的克隆。
ELISA中，将rMOG-GST固相化(50ng/50μL)于MAXISORP(NUNC公司制造)上，使用0.5％BSA对未结合rMOG-GST的部位进行封闭。在各孔中添加各噬菌体克隆，在室温下反应1小时后，将各孔用PBS-T清洗5次。
接着，在各孔中加入生物素化抗M13噬菌体抗体(Abcam公司制造)和用辣根过氧化物酶标记的链亲和素(Vector公司制造)50μL，在室温下温育1小时。
用PBS-T清洗微孔板后，在各孔中加入TMB显色底物液(CALBIOCHEM公司制造)，在室温下温育。在各孔中加入1M的盐酸，使显色反应终止，利用酶标仪(Model 680XR、BioRad公司制造)测定波长450nm(参比波长570nm)下的吸光度。
对于与rMOG-GST结合的克隆进行序列分析，获得抗MOG VHH抗体iMOG-3Rim1-S32抗体。将编码iMOG-3Rim1-S32抗体的VHH的碱基序列、由该碱基序列推定的氨基酸序列示于表2。
[表2]
抗MOG VHH抗体(iMOG-3Rim1-S32抗体)的序列信息
克隆名称 iMOG-3Rim1-S32抗体
编码VHH(包含信号序列)的碱基序列 序列号37
VHH(包含信号序列)的氨基酸序列 序列号38
VHH(不包含信号序列)的氨基酸序列 序列号39
CDR1的氨基酸序列 序列号40
CDR2的氨基酸序列 序列号41
CDR3的氨基酸序列 序列号42
[实施例2]抗体表达载体的构建
(1)抗MOG抗体的表达载体的构建
为了制作人IgG型的抗MOG抗体，利用以下记载的方法制作在编码人IgG抗体恒定区的氨基酸序列的碱基序列中整合有编码来源于实施例1中获得的人抗体噬菌体文库的抗MOG scFv抗体的各可变区的氨基酸序列的DNA序列的各种抗MOG抗体的表达载体。
合成编码人IgG的λ链恒定区的碱基序列，插入至N5KG4PE载体(记载于国际公开第2002/088186号中)的BglII-EcoRI位点，制作N5LG4PE载体。
将在N5LG4PE中插入编码MOG01抗体和MOG09抗体的各VH、VL的氨基酸序列的碱基序列而成的表达载体分别命名为N5LG4PE_MOG01、N5LG4PE_MOG09。另外，将在N5KG4PE载体中插入编码MOG14抗体的VH、VL的氨基酸序列的碱基序列而成的表达载体命名为N5KG4PE_MOG14。
(1-1)MOG01抗体表达载体N5LG4PE_MOG01
以噬菌粒载体pCANTAB_MOG01作为模板，使用引物1(序列号43)和引物2(序列号44)以及KOD plus DNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR对VL区的基因片段进行扩增。PCR中，将由94℃下30秒、58℃下30秒、68℃下45秒构成的反应实施30个循环。只要没有特别记载，实施例2中记载的PCR在上述条件下进行。
以PCR产物作为模板，使用引物3(序列号45)和引物2(序列号44)以及KOD plusDNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR在VL区的基因片段上附加信号序列。
将所得到的基因片段插入至N5LG4PE载体的BglII-BlpI位点，得到N5LG4PE_MOG01VL。接着，以pCANTAB_MOG01作为模板，使用引物4(序列号46)和引物5(序列号47)以及KOD plus DNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR对VH区的基因片段进行扩增。
以PCR产物作为模板，使用引物6(序列号48)和引物5(序列号47)以及KOD plusDNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR在VH区的基因片段上附加信号序列。将所得到的基因片段插入至N5LG4PE_MOG01VL载体的SalI-NheI位点，得到N5LG4PE_MOG01。
(1-2)MOG09抗体表达载体N5LG4PE_MOG09
利用与上述(1-1)同样的方法制作N5LG4PE_MOG09。以噬菌粒载体pCANTAB_MOG09作为模板，为了扩增VL区的基因片段，使用引物7(序列号49)和引物8(序列号50)，在VL区的基因片段上附加信号序列时，使用引物3(序列号45)和引物8(序列号50)，为了扩增VH区的基因片段，使用引物9(序列号51)和引物10(序列号52)，在VH区的基因片段上附加信号序列时，使用引物6(序列号48)和引物10(序列号52)。
(1-3)MOG14抗体表达载体N5KG4PE_MOG14
利用与上述(1-1)同样的方法制作N5KG4PE_MOG14。以噬菌粒载体pCANTAB_MOG14作为模板，为了扩增VL区的基因片段，使用引物11(序列号53)和引物12(序列号54)，在VL区的基因片段上附加信号序列时，使用引物3(序列号45)和引物12(序列号54)。将所得到的附加有信号序列的VL区的基因片段插入至N5KG4PE载体的BglII-BsiWI位点，得到N5KG4PE_MOG14VL。
接着，以pCANTAB_MOG14作为模板，为了扩增VH区的基因片段，使用引物13(序列号55)和引物14(序列号56)，在VH区的基因片段上附加信号序列时，使用引物6(序列号48)和引物14(序列号56)。将所得到的附加有信号序列的VH区的基因片段插入至N5KG4PE_MOG14VL的SalI-NheI位点，得到N5KG4PE_MOG14。
(1-4)iMOG-3Rim1-S32抗体表达载体N5G4PEFc_iMOG-3Rim1-S32
合成在编码人IgG4PE的Fc区的基因上附加有信号序列的序列，使用引物25(序列号79)和引物26(序列号80)以及KOD plus DNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR对人Fc区的基因片段进行扩增。
PCR中，将由94℃下30秒、58℃下30秒、68℃下60秒构成的反应实施30个循环。将所得到的Fc基因片段插入至N5KG4PE载体的BglII-BamHI位点，制作N5G4PEFc载体。
将在N5G4PEFc中插入编码iMOG-3Rim1-S32的VHH的氨基酸序列的碱基序列而成的表达载体命名为N5G4PEFc_iMOG-3Rim1-S32。利用以下记载的方法制作VHH-Fc表达载体。
合成iMOG-3Rim1-S32的VHH的碱基序列，使用引物15(序列号57)和引物16(序列号58)以及KOD plus DNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR对VHH区的基因片段进行扩增。PCR中，将由94℃下30秒、58℃下30秒、68℃下60秒构成的反应实施30个循环。将所得到的VHH基因片段插入至N5G4PEFc载体的EcoRI-BglII位点，得到N5G4PEFc_iMOG-3Rim1-S32。
(2)抗阿维菌素抗体的表达载体N5LG4PE_AVM
利用与上述(1-1)同样的方法制作作为阴性对照抗体的嵌合抗阿维菌素(Avermectin、AVM)抗体。将在N5LG4PE中插入编码AVM抗体的VH、VL的氨基酸序列的碱基序列而成的表达载体命名为N5LG4PE_AVM。
将AVM免疫于SD大鼠，利用通常的方法建立抗AVM抗体产生杂交瘤。以来源于该杂交瘤的抗AVM抗体的可变区作为模板，为了扩增VL区的基因片段，使用引物29(序列号83)和引物30(序列号84)，在VL区的基因片段上附加信号序列时，使用引物3(序列号45)和引物30(序列号84)。
为了扩增VH区的基因片段，使用引物31(序列号85)和引物32(序列号86)，在VH区的基因片段上附加信号序列时，使用引物6(序列号48)和引物32(序列号86)。
(3)抗大鼠转铁蛋白受体抗体OX26抗体的表达载体N5KG4PE(R409K)_OX26
作为抗大鼠转铁蛋白受体抗体的阳性对照抗体，制作[Protein Engineering,12,787-796,1999]中记载的抗大鼠转铁蛋白受体抗体OX26抗体。利用与上述(1-1)同样的方法制作在N5KG4PE(R409K)(记载于国际公开第2002/088186号)中插入编码OX26抗体的VH、VL的氨基酸序列的碱基序列而成的表达载体，命名为N5KG4PE(R409K)_OX26。
合成编码OX26抗体的VL的氨基酸序列的基因作为模板，为了扩增VL区的基因片段，使用引物40(序列号94)和引物41(序列号95)，为了扩增VH区的基因片段，使用引物42(序列号96)和引物43(序列号97)。
[实施例3]双特异性抗体的表达载体的构建
(1)与Her2和MOG结合的双特异性抗体的表达载体的制作
利用下述方法制作与HER2和MOG结合的双特异性抗体的表达载体pCI-Trastuzumab(曲妥珠单抗)-hKG4PE(R409K)_MOG01scFv。该双特异性抗体是在抗HER2抗体的IgG的两条H链的C末端融合抗MOG抗体的scFv而成的。
以重链恒定区的合成基因作为模板，使用引物17(序列号59)和引物18(序列号60)以及KOD plus DNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR对CH1-铰链-CH2-CH3-接头区的基因片段进行扩增。
PCR中，将由94℃下30秒、58℃下30秒、68℃下2分钟构成的反应实施30个循环。以噬菌粒载体pCANTAB_MOG01作为模板，使用引物19(序列号61)和引物20(序列号62)以及KODplus DNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR对scFv区(以下记载为MOG01scFv)的基因片段进行扩增。
PCR中，将由94℃下30秒、58℃下30秒、68℃下90秒构成的反应实施30个循环。接着，以上述的CH1-铰链-CH2-CH3区和MOG01scFv区作为模板，使用引物17(序列号59)和引物20(序列号62)以及KOD plus DNA聚合酶(东洋纺公司制造)，对CH1-铰链-CH2-CH3-MOG01scFv进行扩增。
PCR中，将由94℃下30秒、58℃下30秒、68℃下2分钟构成的反应实施30个循环。将所得到的基因片段插入至pCI载体(Promega公司制造)中，制作pCI-hG4PE(R409K)_MOG01scFv载体。
合成编码抗HER2抗体(曲妥珠单抗、Trastuzumab)(记载于国际公开第1999/57134号中)的VL的氨基酸序列的基因作为模板，使用引物21(序列号63)和引物22(序列号64)以及KOD plus DNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR对VL区的基因片段进行扩增。
PCR中，将由94℃下30秒、58℃下30秒、68℃下45秒构成的反应实施30个循环。以N5KG4PE载体(记载于国际公开第2002/088186号中)作为模板，使用引物27(序列号81)和引物28(序列号82)以及KOD plus DNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR对CL区的基因片段进行扩增。
PCR中，将由94℃下30秒、58℃下30秒、68℃下45秒构成的反应实施30个循环。以所得到的基因片段VL和CL作为模板，使用引物21(序列号63)和引物28(序列号82)以及KODplus DNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR对基因片段进行扩增。
PCR中，将由94℃下30秒、58℃下30秒、68℃下90秒构成的反应实施30个循环。将所得到的基因片段插入至pCI-hG4PE(R409K)_MOG01scFv中，得到pCI-TrastuzumabVL-hKG4PE(R409K)_MOG01scFv。
接着，合成编码曲妥珠单抗的VH的氨基酸序列的基因作为模板，使用引物23(序列号65)和引物24(序列号66)以及KOD plus DNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR对VH区的基因片段进行扩增。PCR中，将由94℃下30秒、58℃下30秒、68℃下45秒构成的反应实施30个循环。
将所得到的基因片段插入至pCI-TrastuzumabVL-hKG4PE(R409K)_MOG01scFv中，得到pCI-Trastuzumab-hKG4PE(R409K)_MOG01scFv。
(2)与AVM和MOG结合的双特异性抗体的表达载体的制作
另外，利用以下记载的方法制作与AVM和MOG结合的双特异性抗体的表达载体pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv。该双特异性抗体是在抗AVM抗体的IgG的C末端融合抗MOG抗体的scFv而成的。
以N5LG4PE_AVM作为模板，使用引物33(序列号87)和引物34(序列号88)以及KODplus DNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR对AVM轻链区的基因片段进行扩增。PCR中，将由94℃下30秒、58℃下30秒、68℃下60秒构成的反应实施30个循环。
以N5LG4PE_AVM作为模板，使用引物35(序列号89)和引物32(序列号86)以及KODplus DNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR对AVM VH区的基因片段进行扩增。
PCR中，将由94℃下30秒、58℃下30秒、68℃下45秒构成的反应实施30个循环。将所得到的基因片段插入至上述制作的pCI-hG4PE(R409K)_MOG01scFv中，得到pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv。
(3)在抗AVM抗体的IgG的C末端融合抗AVM抗体的scFv而成的抗体的表达载体的制作
将作为阴性对照抗体的、在抗AVM抗体的IgG的C末端融合抗AVM抗体的scFv而成的抗体的表达载体命名为pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVM scFv。
以重链恒定区的合成基因作为模板，使用引物36(序列号90)和引物37(序列号91)以及KOD plus DNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR对CH1-铰链-CH2-CH3-接头区的基因片段进行扩增。
PCR中，将由94℃下30秒、58℃下30秒、68℃下2分钟构成的反应实施30个循环。以AVM scFv的合成基因作为模板，使用引物38(序列号92)和引物39(序列号93)以及KOD plusDNA聚合酶(东洋纺公司制造)，通过PCR对scFv区的基因片段进行扩增。
PCR中，将由94℃下30秒、58℃下30秒、68℃下90秒构成的反应实施30个循环。接着，以上述的CH1-铰链-CH2-CH3区和AVM scFv区作为模板，使用引物36(序列号90)和引物39(序列号93)以及KOD plus DNA聚合酶(东洋纺公司制造)，对CH1-铰链-CH2-CH3-AVMscFv进行扩增。PCR中，将由94℃下30秒、58℃下30秒、68℃下2分钟构成的反应实施30个循环。
将所得到的基因片段插入至上述pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv的NheI-BamHI位点，得到pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVM scFv。
[实施例4]
可溶型MOG抗原、可溶型HER2抗原的制作
(1)结合有FLAG-Fc的大鼠MOG的胞外域蛋白的制作
利用以下记载的方法制作作为大鼠MOG的可溶性抗原的、在C末端附加有FLAG-Fc的MOG的胞外域蛋白。将编码rMOG的碱基序列示于序列号67，将由该碱基序列推定的氨基酸序列示于序列号68。
合成MOG的胞外域的基因序列，插入至插入有FLAG-Fc的INPEP4(IDEC公司制造)载体的BglII-XbaI位点，由此制作表达在C末端侧附加有FLAG-Fc的MOG的胞外域的质粒载体INPEP4_rMOG-FLAG-Fc。将rMOG-FLAG-Fc的碱基序列示于序列号69，将由该碱基序列推定的氨基酸序列示于序列号70。
使用Expi293(商标)表达系统(Thermo Fisher Scientific公司制造)将INPEP4_rMOG-FLAG-Fc导入至悬浮性293细胞中并进行培养，在瞬时性表达系统中使蛋白质进行表达。载体导入4天后，回收培养上清，用孔径0.22μm的膜滤器(MILLIPORE公司制造)进行过滤。
使用蛋白A树脂(MabSelect SuRe、GE Healthcare Bioscience公司制造)对该培养上清中的MOG-FLAG-Fc蛋白进行亲和纯化。作为清洗液，使用磷酸缓冲液。
利用20mM柠檬酸钠、50mM NaCl缓冲液(pH3.4)将吸附在蛋白A上的蛋白质洗脱，回收至含有1M Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)的管中。
接着，利用使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司制造)的超滤和NAP柱(GEHealthcare Bioscience公司制造)将洗脱液的溶剂置换为PBS后，用孔径0.22μm的膜滤器(Millex-GV、MILLIPORE公司制造)进行过滤灭菌。溶液中的纯化后的各MOG-FLAG-Fc蛋白的浓度通过280nm的吸光度进行测定。
(2)结合有GST的MOG的胞外域蛋白的制作
利用以下记载的方法制作作为大鼠MOG的可溶性抗原的、在C末端附加有GST的MOG的胞外域蛋白。
合成MOG的胞外域的基因序列，插入至插入有GST的N5载体(IDEC公司制造)的BglII-KpnI位点，由此制作表达在C末端侧附加有GST的MOG的胞外域的质粒载体N5_rMOG-GST。将rMOG-GST的碱基序列示于序列号71，将由该碱基序列推定的氨基酸序列示于序列号72。
利用以下记载的方法制作作为人HER2的可溶性抗原的、在C末端附加有GST的HER2的胞外域蛋白。合成HER2的胞外域的基因序列，插入至插入有GST的N5载体(IDEC公司制造)的BglII-KpnI位点，由此制作表达在C末端侧附加有GST的HER2的胞外域的质粒载体N5_hHER2-GST。将hHER2-GST的碱基序列示于序列号71，将由该碱基序列推定的氨基酸序列示于序列号72。
使用Expi293(商标)表达系统(Thermo Fisher Scientific公司制造)，将N5_rMOG-GST、N5_hHER2-GST导入至悬浮性293细胞中并进行培养，在瞬时性表达系统中使蛋白质进行表达。载体导入4天后，回收培养上清，用孔径0.22μm的膜滤器(MILLIPORE公司制造)进行过滤。
使用谷胱甘肽琼脂糖4B(GE Healthcare Bioscience公司制造)对该培养上清中的蛋白质进行亲和纯化。作为清洗液，使用磷酸缓冲液。利用50mM Tris-HCl、10mM还原谷胱甘肽(pH8.0)将吸附在谷胱甘肽琼脂糖4B上的蛋白质洗脱。
接着，利用使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司制造)的超滤和NAP柱(GEHealthcare Bioscience公司制造)将溶液中的溶剂置换为PBS后，用孔径0.22μm的膜滤器(Millex-GV、MILLIPORE公司制造)进行过滤灭菌。溶液中的纯化后的rMOG-GST蛋白、hHER2-GST蛋白的浓度通过280nm的吸光度进行测定。
[实施例5]膜型MOG抗原表达载体的制作
合成大鼠MOG(rMOG)、小鼠MOG(mMOG)、猴MOG(cMOG)和人MOG(hMOG)的全长基因序列，将各个基因序列插入至pEF6/V5-His(Thermo Fisher Scientific公司制造)载体的BamHI-NotI位点，由此制作各种MOG的膜表达用质粒载体pEF6_rMOG、pEF6_mMOG、pEF6_cMOG和pEF6_hMOG。
将编码mMOG的碱基序列示于序列号73，将由该碱基序列推定的氨基酸序列示于序列号74。将编码cMOG的碱基序列示于序列号75，将由该碱基序列推定的氨基酸序列示于序列号76。将编码hMOG的碱基序列示于序列号77，将由该碱基序列推定的氨基酸序列示于序列号78。
[实施例6]各种抗体的制备
使用Expi293TM表达系统(Thermo Fisher Scientific公司制造)将实施例2和实施例3中制作的抗体表达质粒载体导入至悬浮性293细胞中并进行培养，在瞬时性表达系统中使抗体进行表达。
载体导入4天后，回收培养上清，用孔径0.22μm的膜滤器(MILLIPORE公司制造)进行过滤。使用蛋白A树脂(MabSelect SuRe、GE Healthcare Bioscience公司制造)对该培养上清中的蛋白质进行亲和纯化。作为清洗液，使用磷酸缓冲液。利用20mM柠檬酸钠、50mMNaCl缓冲液(pH3.4)将吸附在蛋白A上的抗体洗脱，回收至含有1M Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)的管中。
接着，利用使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司制造)的超滤和NAP柱(GEHealthcare Bioscience公司制造)将洗脱液的溶剂置换为PBS后，用孔径0.22μm的膜滤器(Millex-GV、MILLIPORE公司制造)进行过滤灭菌。测定抗体溶液的280nm的吸光度，将浓度1mg/mL换算成1.40光密度，由此算出纯化抗体的浓度。
将使用实施例2中记载的抗MOG抗体的表达载体N5LG4PE_MOG01、N5LG4PE_MOG09、N5KG4PE_MOG14和N5G4PEFc_iMOG-3Rim1-S32进行表达后的抗MOG人IgG抗体分别记载为MOG01抗体、MOG09抗体、MOG14抗体和iMOG-3Rim1-S32抗体。
将使实施例3中制作的各种双特异性抗体表达载体pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVMscFv、pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv和pCI-Trastuzumab-hKG4PE(R409K)_MOG01scFv进行表达而得到的抗体分别命名为AVM IgG4PE(R409K)_AVM dscFv抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv抗体和Trastuzumab IgG4PE(R409K)_MOG01scFv抗体。
[实施例7]利用流式细胞仪进行的抗MOG抗体对MOG的结合性的评价
按照下述步骤，利用荧光激活细胞分选(fluorescence activated cellsorting；FACS)法评价实施例6中得到的抗MOG抗体MOG01抗体、MOG09抗体、MOG14抗体和iMOG-3Rim1-S32抗体对MOG的结合。
使用FreeStyle(商标)293表达系统(Thermo Fisher Scientific公司制造)将实施例5中制作的各种膜型MOG抗原表达载体导入至悬浮性293细胞中并进行培养，在瞬时性表达系统中使膜型抗原进行表达。使用上述细胞，利用以下记载的方法分析抗MOG抗体的反应性。
将rMOG/HEK293F、mMOG/HEK293F、cMOG/HEK293和hMOG/HEK293细胞分别以5×105个细胞/mL的浓度悬浮于含有0.1％NaN3、1％FBS的PBS的染色缓冲液(SB)中，分注至96孔圆底板(BD公司制造)中。
离心分离(2000rpm、4℃、2分钟)后，除去上清，向团块中加入实施例6中得到的10μg/mL的各抗体并悬浮后，在冰温下静置30分钟。进一步离心分离(2000rpm、4℃、2分钟)，除去上清，用SB清洗团块后，加入1μg/mL的RPE荧光标记山羊抗人抗体(Southern Bioblot公司制造)，在冰温下温育30分钟。
用SB清洗后，悬浮于SB中，利用流式细胞仪FACS CANTO II(BD公司制造)测定各细胞的荧光强度。将所得到的结果示于图2。需要说明的是，作为阴性对照，使用抗AVM抗体。
如图2中所记载，作为抗MOG抗体的MOG01抗体、MOG09抗体、MOG14抗体和iMOG-3Rim1-S32抗体对rMOG/HEK293F细胞和mMOG/HEK293F细胞均显示出结合活性。另外，MOG01抗体和MOG14抗体对cMOG/HEK293细胞和hMOG/HEK293细胞也均显示出结合活性。
因此表明，抗MOG人IgG抗体MOG01和MOG14不仅识别并结合大鼠、小鼠MOG，还识别并结合食蟹猴和人MOG全部MOG。
[实施例8]利用表面等离子体共振检测进行的抗MOG抗体对MOG的结合性的评价
使用Biacore T-100(GE Healthcare)测定实施例6中得到的抗MOG抗体MOG01抗体、MOG09抗体、MOG14抗体和iMOG-3Rim1-S32抗体对大鼠MOG的亲和性。
使用人抗体捕获试剂盒将各抗体固定化于CM5传感芯片上，以实施例4中制作的rMOG-GST作为分析物来评价结合能力。对于所得到的传感图，利用BIA评估软件进行分析，由此算出解离常数(KD值)。将所得到的结果示于表3。
[表3]
如表3所示，各抗MOG抗体的解离常数(KD值)为2.1×1011(M)～4.0×10-8(M)，表明任意一种抗体均显示出良好的亲和性。对于MOG09抗体，解离速率常数kd在设备测定范围之外，无法唯一地确定KD值。
[实施例9]抗MOG抗体的大鼠脑迁移性评价
将抗体尾静脉(i.v.)给药于大鼠后，进行尾静脉采血。在采血的同一天在戊巴比妥麻醉下全身灌流后，回收脑组织，测定其重量。另外，在回收的脑组织中加入缓冲溶液，匀浆化并离心分离后，回收溶出于上清中的抗体溶液。测定其容量，并且利用AlphaLISA(PerkinElmer公司制造)测定抗体浓度，算出每单位脑重量的抗体量。
对于抗MOG抗体MOG01抗体、MOG14抗体、iMOG-3Rim1-S32抗体以及阴性对照抗AVM抗体，将MOG01抗体和MOG14抗体以1mg/kg体重进行抗体给药，将iMOG-3Rim1-S32抗体以5mg/kg体重的量进行抗体给药，将4天后的血清中的抗体浓度和脑组织中的每单位脑重量的抗体量示于图3(A)和(B)。
如图3(A)和(B)所示，显示出与阴性对照(AVM)相比，抗MOG抗体的任意一种抗体的血清中的抗体浓度均未发生变化，但脑内的抗体量均增加至5-10倍。
对于抗MOG抗体MOG01抗体、抗转铁蛋白受体抗体OX26抗体和阴性对照的抗AVM抗体，以5mg/kg体重的量进行抗体给药，将4天后和10天后的血清中的抗体浓度和脑组织中的每单位脑重量的抗体量示于图4(A)和(B)。
如图4(A)所示，OX26抗体的情况下，4天后的血清中的抗体浓度在所评价的抗体中最低，10天后达到检测灵敏度以下等，抗体的血中动态差。在作为抗MOG抗体的MOG01抗体的情况下，给药4天后、10天后的血清中的抗体浓度没有大的变化，为与阴性对照同等程度的抗体浓度。由此可以说，MOG01抗体的血中半衰期与阴性对照为同等程度。
另外，如图4(B)所示，关于脑内的抗体量，阴性对照在给药起4天后的时刻在所评价的抗体中为最低的抗体量，在10天后抗体量进一步略微减少。
OX26抗体在给药4天后至10天后之间抗体量快速减少，给药10天后的抗体量达到阴性对照以下，与此相对，MOG01抗体的情况下，在给药4天后至10天后之间抗体量增加，给药4天后的抗体量达到阴性对照的约2.5倍、给药10天后的抗体量达到阴性对照的约10倍。
由以上显示，抗MOG抗体MOG01抗体在血清中显示出与阴性对照同等程度的抗体浓度，但脑内的抗体量在给药4天后提高至阴性对照的约2.5倍、在给药10天后提高至阴性对照和OX26抗体的约10倍。
[实施例10]利用流式细胞仪进行的MOG的双特异性抗体对MOG或HER2的结合性的评价
按照下述步骤，利用荧光激活细胞分选(fluorescence activated cellsorting；FACS)法评价实施例6中得到的与MOG和Her2结合的双特异性抗体TrastuzumabIgG4PE(R409K)_MOG01 dscFv抗体、与MOG和AVM结合的双特异性抗体AVM IgG4PE(R409K)_MOG01 dscFv抗体、以及与AVM结合的抗体AVM IgG4PE(R409K)_AVM dscFv抗体对MOG或HER2的结合。
使用FreeStyle(商标)293表达系统(Thermo Fisher Scientific公司制造)将实施例5中制作的膜型MOG抗原表达载体导入至悬浮性293细胞中并进行培养，在瞬时性表达系统中使膜型抗原进行表达。
将HEK293F细胞、rMOG/HEK293F细胞、hMOG/HEK293F细胞和人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞分别以5×105个细胞/mL的浓度悬浮于含有0.1％NaN3、1％FBS的PBS的染色缓冲液(SB)中，分注至96孔圆底板(BD公司制造)中。
离心分离(2000rpm、4℃、2分钟)后，除去上清，向团块中加入实施例6中得到的10μg/mL的各抗体并悬浮后，在冰温下静置30分钟。进一步离心分离(2000rpm、4℃、2分钟)，除去上清，用SB清洗团块后，加入1μg/mL的RPE荧光标记山羊抗人抗体(Southern Bioblot公司制造)，在冰温下温育30分钟。
用SB清洗后，悬浮于SB中，利用流式细胞仪FACS CANTO II(BD公司制造)测定各细胞的荧光强度。需要说明的是，作为阴性对照，使用10μg/mL的抗AVM抗体。将对HEK293F细胞、rMOG/HEK293F细胞和hMOG/HEK293细胞的结合性分析的结果示于图5。
根据图5，对于AVM IgG4PE(R409K)_MOG01 dscFv抗体、Trastuzumab IgG4PE(R409K)_MOG01 dscFv抗体而言，观察到与rMOG/HEK293F细胞、hMOG/HEK293细胞的结合，由此显示出，即使为双特异性抗体的形态，也保持对大鼠MOG和人MOG的结合性。
将对人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞的结合性分析的结果示于图6。已知在该细胞上表达HER2。
由图6显示出，Trastuzumab IgG4PE(R409K)_MOG01 dscFv抗体即使为双特异性抗体的形态，也保持对HER2的结合性。
[实施例11]利用表面等离子体共振检测进行的MOG的双特异性抗体对MOG的结合性的评价
利用与实施例8同样的方法测定MOG的双特异性抗体对MOG的亲和性，将结果示于表4。
[表4]
如表4所示，各双特异性抗体的解离常数(KD值)在AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv抗体的情况下为2.0×10-7(M)、在Trastuzumab IgG4PE(R409K)_MOG01 dscFv抗体的情况下为1.0×10-7(M)，表明任意一种MOG的双特异性抗体均显示出良好的亲和性。
Trastuzumab IgG4PE(R409K)_MOG01 dscFv抗体的情况下，结合速率常数ka和解离速率常数kd为设备测定范围之外，无法唯一地确定KD值。
[实施例12]利用表面等离子体共振检测进行的MOG的双特异性抗体对HER2的结合性的评价
使用Biacore T-100(GE Healthcare)测定与MOG和HER2结合的双特异性抗体Trastuzumab IgG4PE(R409K)_MOG01 dscFv抗体对HER2的亲和性。
使用人抗体捕获试剂盒将各抗体固定化于CM5传感芯片上，以实施例4中制作的HER2-GST作为分析物，评价MOG-Her2双特异性抗体的结合能力。对于所得到的传感图，利用BIA评估软件进行分析，由此算出解离常数(KD值)。将结果示于表5。
[表5]
如表5所示，Trastuzumab IgG4PE(R409K)_MOG01 dscFv抗体对HER2的解离常数(KD值)为3.7×10-9(M)，表明其为显示出良好亲和性的抗体。
[实施例13]MOG的双特异性抗体的大鼠脑迁移性评价
利用与实施例9同样的方法评价各双特异性抗体AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv抗体、Trastuzumab IgG4PE(R409K)_MOG01 dscFv抗体和AVM IgG4PE(R409K)_AVMdscFv抗体在大鼠中的脑迁移性。以5mg/kg体重的量进行抗体给药，将10天后的血清中的抗体浓度和脑组织中的每单位脑重量的抗体量示于图7(A)和(B)。
如图7(A)所示，AVM IgG4PE(R409K)_MOG01 dscFv抗体、Trastuzumab IgG4PE(R409K)_MOG01 dscFv抗体的血清中的抗体浓度与作为双特异性抗体的阴性对照的AVMIgG4PE(R409K)_AVM dscFv抗体相比没有差异。
另一方面，如图7(B)所示，显示出与作为双特异性抗体的阴性对照的AVM IgG4PE(R409K)_AVM dscFv抗体相比，AVM IgG4PE(R409K)_MOG01 dscFv抗体、TrastuzumabIgG4PE(R409K)_MOG01 dscFv抗体的脑内的抗体量提高至约10倍。
由以上显示，和不与MOG结合的双特异性抗体相比，与MOG结合的双特异性抗体能够将脑内的抗体量提高约10倍，另一方面，血中半衰期不发生变化。
[实施例14]抗MOG01抗体的小鼠脑迁移性评价
(1)抗体量测定
将抗体以35nmol/kg尾静脉(i.v.)给药于小鼠，几天后进行尾静脉采血。在采血的同一天在戊巴比妥麻醉下全身灌流后，回收脑组织，测定其重量。另外，在回收的脑组织中加入缓冲溶液，匀浆化并离心分离后，回收溶出于上清中的抗体溶液。测定其容量，并且利用AlphaLISA(PerkinElmer公司制造)测定抗体浓度，算出每单位脑重量的抗体量。
对于抗MOG01人IgG抗体以及阴性对照抗AVM人IgG抗体，将抗体给药3、6、10、14、21、28天后的血清中的抗体浓度和脑组织中的每单位脑重量的抗体量分别示于图8(A)和(B)。
如图8(A)所示，抗MOG01人IgG抗体的血清中的抗体浓度与阴性对照相比没有差异。另一方面，如图8(B)所示，显示出在28天期间将脑内的抗体量提高至数十倍。
(2)成像分析
对于抗MOG01人IgG抗体以及阴性对照抗AVM人IgG抗体，利用Alexa FluorR 488蛋白标记试剂盒(Molecular Probes公司制造)进行标记。将标记后的抗体作为AF488-MOG01IgG4PE抗体、AF488-AVM IgG4PE抗体。
将标记后的抗体以10mg/kg尾静脉(i.v.)给药于小鼠，几天后进行番茄凝集素给药，并进行脸颊采血。采血后，在戊巴比妥麻醉下全身灌流，然后回收脑组织，利用IVISSpectrum(珀金埃尔默公司制造)测定荧光强度。将6天后的脑成像图像示于图9(A)，将14天后的脑成像图像示于图9(B)。将用给药抗体的荧光强度进行校正后的脑中荧光量示于图9(C)。
如图9(A)～(C)所示，显示出与阴性对照相比，抗MOG01抗体的抗体量在脑内全部范围内提高至数十倍。
[实施例15]各种双特异性抗体表达载体的构建
利用下述方法制作具有图10(A)～(C)以及图11(A)和(B)中记载的结构的与AVM和MOG结合的双特异性抗体表达载体。将该双特异性抗体的名称和抗体表达载体的名称示于表6，将抗体表达载体的名称和抗体的碱基序列、由该碱基序列推定的氨基酸序列示于表7。
[表6]
[表7]
(1)与图10(A)的结构相关的双特异性抗体表达载体的构建
(1-1)pCI-AVM-hLG4PE(R409K/S354C/T366W)-FLAG标签载体的构建
以合成基因作为模板，通过PCR对CH1-铰链-CH2-CH3(R409K/S354C/T366W)区的基因片段进行扩增，插入至pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVMscFv的NheI-BamHI位点，制作pCI-AVM-hLG4PE(R409K/S354C/T366W)-FLAG标签载体。
(1-2)pCI-MOG01-hLG4PE(R409K/Y349C/T366S/L368A/Y407V)-His标签载体的构建
以合成基因作为模板，通过PCR对CH1-铰链-CH2-CH3(R409K/Y349C/T366S/L368A/Y407V)-His标签区的基因片段进行扩增。另外，以N5LG4PE_MOG01作为模板，通过PCR对MOG01轻链区的基因片段和MOG01 VH区的基因片段进行扩增。将所得到的基因片段插入至pCI载体(Promega公司制造)中，制作pCI-MOG01-hLG4PE(R409K/Y349C/T366S/L368A/Y407V)-His标签载体。
(2)与图10(B)的结构相关的双特异性抗体表达载体的构建
(2-1)pCI-AVM-hLG4PE(R409K)-接头-MOG01VL-CL载体的构建
以合成基因作为模板，通过PCR对CH1-铰链-CH2-CH3-接头-MOG01VL-CL区的基因片段进行扩增，插入至pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVMscFv的NheI-BamHI位点，制作pCI-AVM-hLG4PE(R409K)-接头-MOG01VL-CL载体。
(2-2)pCI-MOG01VH-CH载体的构建
以合成基因作为模板，通过PCR对MOG01VH-CH区的基因片段进行扩增，插入至pCI载体(Promega公司制造)中，制作pCI-MOG01VH-CH载体。
(3)与图10(C)的结构相关的双特异性抗体表达载体的构建
(3-1)pCI-AVM-hLG4PE(R409K/S354C/T366W)-接头-MOG01scFv-FLAG标签载体的构建
以合成基因作为模板，通过PCR对CH1-铰链-CH2-CH3(R409K/S354C/T366W)-接头区的基因片段进行扩增。另外，以MOG01scFv作为模板，通过PCR对接头-MOG01scFv区的基因片段进行扩增。进而以上述的PCR产物作为模板，通过PCR对接头-MOG01scFv-FLAG标签区的基因片段进行扩增。将CH1-铰链-CH2-CH3(R409K/S354C/T366W)-接头区和接头-MOG01scFv-FLAG标签区的基因片段插入至pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVM scFv的NheI-BamHI位点，制作pCI-AVM-hLG4PE(R409K/S354C/T366W)-接头-MOG01scFv-FLAG标签载体。
(3-2)pCI-AVM-hLG4PE(R409K/Y349C/T366S/L368A/Y407V)-His标签载体的构建
以合成基因作为模板，通过PCR对CH1-铰链-CH2-CH3(R409K/Y349C/T366S/L368A/Y407V)-His标签区的基因片段进行扩增，插入至pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVMscFv的NheI-BamHI位点，制作pCI-AVM-hLG4PE(R409K/Y349C/T366S/L368A/Y407V)-His标签载体。
(4)具有图11(A)和(B)的结构的双特异性抗体表达载体的构建
(4-1)pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv载体的构建
以合成基因作为模板，通过PCR对CH1-铰链-CH2-CH3-接头区的基因片段进行扩增。另外，以MOG01scFv作为模板，通过PCR对MOG01的VH区、VL区的基因片段进行扩增。将CH1-铰链-CH2-CH3-接头区的基因片段和MOG01的VH区、VL区的基因片段插入至pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVMscFv的NheI-BamHI位点，制作pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv2载体。
同样地制作pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv3载体、pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv4载体、pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv5载体、pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv6载体、pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv7载体、pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv8载体、pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv9载体、pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv10载体和pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv11载体。
(5)作为阴性对照的抗体的表达载体的构建
利用下述方法制作作为阴性对照的抗体。将该抗体的名称和抗体表达载体的名称示于表8，将抗体表达载体的名称和抗体的碱基序列、由该碱基序列推定的氨基酸序列示于表9。
[表8]
[表9]
(2-1)pCI-AVM-hLG4PE(R409K)载体的制作
以合成基因作为模板，通过PCR对AVM的VH区、VL区以及抗体恒定区的基因片段进行扩增，插入至pCI载体(Promega公司制造)中，制作pCI-AVM-hLG4PE(R409K)载体。
(2-2)pCI-AVM-hLG4PE(R409K)-接头-AVMVL-CL载体的制作
以合成基因作为模板，通过PCR对CH1-铰链-CH2-CH3-接头-AVMVL-CL区的基因片段进行扩增，插入至pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVM scFv的NheI-BamHI位点，制作pCI-AVM-hLG4PE(R409K)-接头-AVMVL-CL载体。
(2-3)pCI-AVMVH-CH载体的构建
以合成基因作为模板，通过PCR对AVMVH-CH区的基因片段进行扩增，插入至pCI载体(Promega公司制造)中，制作pCI-AVMVH-CH载体。
(2-4)pCI-AVM-hLG4PE(R409K/S354C/T366W)-接头-AVMscFv-FLAG标签载体的构建
以合成基因作为模板，通过PCR对CH1-铰链-CH2-CH3(R409K/S354C/T366W)-接头区的基因片段进行扩增。另外，以N5LG4PE_AVM作为模板，通过PCR对接头-AVMscFv-FLAG标签区的基因片段进行扩增。将CH1-铰链-CH2-CH3(R409K/S354C/T366W)-接头区和接头-AVMscFv-FLAG标签区的基因片段插入至pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVM scFv的NheI-BamHI位点，制作pCI-AVM-hLG4PE(R409K/S354C/T366W)-接头-AVMscFv-FLAG标签载体。
(2-5)pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVMscFv载体的构建
以合成基因作为模板，通过PCR对CH1-铰链-CH2-CH3-接头区的基因片段进行扩增。另外，以N5LG4PE_AVM作为模板，通过PCR对AVM的VH区、VL区的基因片段进行扩增。将CH1-铰链-CH2-CH3-接头区的基因片段和AVM的VH区、VL区的基因片段插入至pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVMscFv的NheI-BamHI位点，制作pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVMscFv3载体和pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVMscFv5载体。
[实施例16]各种双特异性抗体的制备
利用实施例6中记载的方法，制备AVM IgG4PE(R409K)_MOG01Fab抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv2抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv3抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv4抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv5抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv6抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv7抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv8抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv9抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv10抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv11抗体、AVM IgG4PE(R409K)_AVM Fab抗体、AVM IgG4PE(R409K)_AVMdscFv3抗体和AVM IgG4PE(R409K)_AVMdscFv5抗体。
AVM-MOG01 IgG4PE(R409K)抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01sscFv抗体和AVMIgG4PE(R409K)_AVMsscFv抗体利用下述记载的方法进行制备。使用Expi293(商标)表达系统(Thermo Fisher Scientific公司制造)将抗体表达质粒载体导入至悬浮性293细胞中并进行培养，在瞬时性表达系统中使抗体进行表达。
载体导入4天后，回收培养上清，用孔径0.22μm的膜滤器(MILLIPORE公司制造)进行过滤。使用Ni琼脂糖树脂(GE Healthcare Bioscience公司制造)对该培养上清中的蛋白质进行利用His标签的亲和纯化。作为清洗液，使用20mM咪唑-磷酸缓冲液。
利用500mM咪唑-磷酸缓冲液将吸附在Ni琼脂糖树脂上的抗体洗脱。接着，利用使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司制造)的超滤和NAP柱(GE Healthcare Bioscience公司制造)将洗脱液的溶剂置换为PBS。
使用FLAG抗体亲和凝胶(Sigma-Aldrich公司制造)对该His标签纯化后的蛋白质进行亲和纯化。作为清洗液，使用磷酸缓冲液。利用20mM柠檬酸钠、50mM NaCl缓冲液(pH3.4)将吸附在FLAG抗体亲和凝胶上的抗体洗脱，回收至含有1M Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)的管中。
接着，利用使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司制造)的超滤和NAP柱(GEHealthcare Bioscience公司制造)将洗脱液的溶剂置换为PBS后，用孔径0.22μm的膜滤器(Millex-GV、MILLIPORE公司制造)进行过滤灭菌。测定抗体溶液的280nm的吸光度，算出纯化抗体的浓度。
[实施例17]利用流式细胞仪进行的各种双特异性抗体对MOG的结合性的评价
按照下述步骤，利用荧光激活细胞分选(fluorescence activated cellsorting；FACS)法评价实施例6和实施例16中得到的各种双特异性抗体和阴性对照抗体对MOG的结合。
使用HilyMax(同仁化学公司制造)将实施例5中得到的pEF6_hMOG导入至来源于小鼠结缔组织的成纤维细胞L929[美国典型培养物保藏中心(ATCC)编号：CCL-1]中。利用作为抗生素的杀稻瘟菌素(Invitrogen公司制造)对基因导入后的细胞进行筛选后，利用有限稀释法进行克隆化，使用在细胞表面表达hMOG的L929细胞(以下简记为hMOG/L929)，利用以下记载的方法对各种双特异性抗体的反应性进行分析。
将hMOG/L929悬浮于含有0.1％NaN3、1％FBS的PBS的染色缓冲液(SB)中，分注至96孔圆底板(BD公司制造)中。离心分离(2000rpm、4℃、2分钟)后，除去上清，向团块中加入实施例6和实施例16中得到的各种MOG01双特异性抗体并悬浮后，在冰温下静置30分钟。进一步离心分离(2000rpm、4℃、2分钟)，除去上清，用SB清洗团块后，加入1μg/mL的RPE荧光标记山羊抗人抗体(Southern Biotech公司制造)，在冰温下温育30分钟。用SB清洗后，悬浮于SB中，利用流式细胞仪FACS CANTO II(BD公司制造)测定各细胞的荧光强度。将结果示于图12(A)～(C)以及图13(A)和(B)。
如图12(A)～(C)以及图13(A)和(B)所示，确认到各种双特异性抗体均具有对MOG的结合性。并且表明，特别是在AVM IgG4PE(R409K)_MOG01Fab抗体[图10(B)、图12(C)]、AVMIgG4PE(R409K)_MOG01dscFv3抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv5抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv6抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv7抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv8抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv9抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv10抗体和AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv11抗体[图11(B)、图13(B)]的情况下结合性高。
[实施例18]利用表面等离子体共振检测进行的各种双特异性抗体对MOG的结合性的评价
利用与实施例8同样的方法评价实施例6和实施例16中得到的各种双特异性抗体对MOG的结合。将所得到的结果示于表10和表11。
[表10]
[表11]
如表10和表11所示，各MOG的双特异性抗体的解离常数(KD值)为1.2×10-8(M)～2.0×10-7(M)，表明任意一种抗体均显示出良好的亲和性。
并且表明，特别是在AVM-MOG01 IgG4PE(R409K)抗体[图10(A)]、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01Fab抗体[图10(B)]、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv3抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv5抗体[图11(B)]的情况下结合性高。
[实施例19]各种双特异性抗体的小鼠脑迁移性评价
利用实施例14的方法评价实施例6和实施例16中得到的各种双特异性抗体和阴性对照抗体的小鼠脑迁移性。
对于AVM-MOG01 IgG4PE(R409K)抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01sscFv抗体和AVMIgG4PE(R409K)_MOG01Fab抗体，以5mg/kg进行抗体给药，将10天后的血清中抗体浓度和脑组织中的每单位脑重量的抗体量示于图14(A)～图16(B)。
如图14(A)、图15(A)和图16(A)所示，显示出任意一种MOG01改变抗体的血清中的抗体浓度与阴性对照相比均没有差异。另一方面，如图14(B)、图15(B)和图16(B)所示，与阴性对照相比，脑内的抗体量在AVM-MOG01 IgG4PE(R409K)抗体的情况下提高至约8倍、在AVMIgG4PE(R409K)_MOG01sscFv抗体的情况下提高至约12倍、在AVM IgG4PE(R409K)_MOG01Fab抗体的情况下提高至约30倍。
由以上显示，和不与MOG结合的阴性对照抗体相比，与MOG结合的各种双特异性抗体能够提高脑内的抗体量，另一方面，血中半衰期没有变化。
对于AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv3抗体和AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv5抗体，以5mg/kg进行抗体给药，将10天后和28天后的血清中抗体浓度和脑组织中的每单位脑重量的抗体量示于图17(A)～(D)。
如图17(A)和(C)所示，任意一种双特异性抗体的血清中的抗体浓度与阴性对照抗体相比均没有差异。另一方面，如图17(B)和(D)所示，AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv抗体、AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv3抗体和AVM IgG4PE(R409K)_MOG01dscFv5抗体的情况下，在28天期间将脑内的抗体量提高至数十倍。另外，如图17(D)所示，28天后的脑内的抗体量高的双特异性抗体对MOG的结合性也高(表11)，表明MOG结合活性与脑内抗体量相关。
[实施例20]显示出比抗MOG01抗体更强的对MOG的结合性的新型MOG抗体的获得
(1)结合有FLAG-Fc的可溶型人MOG抗原和可溶型小鼠MOG抗原的胞外域蛋白的制作
利用实施例4中记载的方法制作表达作为人MOG和小鼠MOG的可溶性抗原的、在C末端附加有FLAG-Fc的MOG的胞外域蛋白的质粒载体INPEP4_hMOG-FLAG-Fc和INPEP4_mMOG-FLAG-Fc。将hMOG-FLAG-Fc的碱基序列示于序列号100，将由该碱基序列推定的氨基酸序列示于序列号101，将mMOG-FLAG-Fc的碱基序列示于序列号102，将由该碱基序列推定的氨基酸序列示于序列号103。结合有FLAG-Fc的MOG的胞外域蛋白通过利用实施例4中记载的方法进行瞬时性表达、进行纯化而获得。
(2)结合有GST的MOG的胞外域蛋白的制作
利用实施例4中记载的方法制作表达作为人MOG和小鼠MOG的可溶性抗原的、在C末端附加有GST的MOG的胞外域蛋白的质粒载体N5_hMOG-GST和N5_mMOG-GST。将hMOG-GST的碱基序列示于序列号104，将由该碱基序列推定的氨基酸序列示于序列号105，将mMOG-GST的碱基序列示于序列号106，将由该碱基序列推定的氨基酸序列示于序列号107。结合有GST的MOG的胞外域蛋白通过利用实施例4中记载的方法进行瞬时性表达、进行纯化而获得。
(3)来自人抗体产生小鼠的抗MOG抗体的获得
将hMOG-GST和mMOG-GST与百日咳疫苗和阿拉伯胶混合，腹腔内或皮内给药于人抗体产生小鼠(Ishida&Lonberg,IBC’s 11th Antibody Engineering,Abstract 2000；Ishida,I.et al.,Cloning&Stem Cells 4,85-96(2002)；石田功(2002)实验医学20,6,846-851)。
初次免疫以后，进行3次hMOG-GST和mMOG-GST的免疫。在最终免疫起4天后，从进行腹腔内给药的个体中解剖采集脾脏，利用红细胞除去试剂(SIGMA公司制造)除去红细胞后，冻结在CELLBANKER 1(日本全药工业株式会社制造)中。从进行皮内给药的个体中，通过解剖采集腋下淋巴结，利用红细胞除去试剂除去红细胞后，冻结在CELLBANKER 1中。使用RNeasy Plus小量提取试剂盒(QIAGEN公司制造)从所得到的脾脏细胞和腋下淋巴结的细胞中提取RNA，利用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech公司制造)合成cDNA。使用所合成的cDNA，利用实施例1中记载的方法制作来源于人抗体产生小鼠的噬菌体文库。
使用该来源于人抗体产生小鼠的噬菌体文库，利用噬菌体展示法获得抗人MOG单克隆抗体。噬菌体展示法和克隆化ELISA使用hMOG-FLAG_Fc和mMOG-FLAG_Fc利用实施例1中记载的方法进行。
对于与hMOG-FLAG_Fc、mMOG-FLAG_Fc和hMOG/Expi293F细胞结合的克隆进行序列分析，获得抗MOG抗体噬菌粒载体pCANTAB_MOG301、pCANTAB_MOG303、pCANTAB_MOG307、pCANTAB_MOG310、pCANTAB_MOG312、pCANTAB_MOG326、pCANTAB_MOG329、pCANTAB_MOG446、pCANTAB_MOG456和pCANTAB_MOG473。
下文中，将使用pCANTAB_MOG301、pCANTAB_MOG303、pCANTAB_MOG307、pCANTAB_MOG310、pCANTAB_MOG312、pCANTAB_MOG326、pCANTAB_MOG329、pCANTAB_MOG446、pCANTAB_MOG456和pCANTAB_MOG473进行表达后的噬菌体所展示的抗MOG scFv抗体的名称分别记载为MOG301抗体、MOG303抗体、MOG307抗体、MOG310抗体、MOG312抗体、MOG326抗体、MOG329抗体、MOG446抗体、MOG456抗体和MOG473抗体。
将编码各种抗MOG抗体的VH或VL的碱基序列、由该碱基序列推定的氨基酸序列示于表12。
另外，通过以MOG结合性为指标的噬菌体展示法分别得到与MOG301抗体的同源性为91～93％的相似序列克隆(MOG426、MOG428)、与MOG303抗体的同源性为85～95％的相似序列克隆(MOG313、MOG314、MOG315、MOG331、MOG357、MOG476)、与MOG307抗体的同源性为97～99％的相似序列克隆(MOG323、MOG341、MOG354、MOG355)、与MOG310抗体的同源性为85～98％的相似序列克隆(MOG308、MOG316、MOG319、MOG320、MOG338、MOG352、MOG359、MOG478)、与MOG329抗体的同源性为85％的相似序列克隆(MOG470)、以及与MOG456抗体的同源性为84％的相似序列克隆(MOG418)。确认了这些相似克隆与hMOG-FLAG_Fc、mMOG-FLAG_Fc和hMOG/Expi293F细胞结合，因此表明，与各抗体克隆的氨基酸序列的同源性高的抗体克隆也是同样具有MOG结合活性的抗体。
将编码相似克隆的VH或VL的碱基序列、由该碱基序列推定的氨基酸序列示于表13，将相似克隆的氨基酸序列的比较示于图18～图22(B)。
[实施例21]抗MOG scFv-Fc抗体的制作
以噬菌粒载体pCANTAB_MOG01作为模板，通过PCR对scFv区的基因片段进行扩增。以重链恒定区的合成基因作为模板，通过PCR对铰链-CH2-CH3区的基因片段进行扩增。将所得到的基因片段插入至N5KG4PE载体(记载于国际公开第2002/088186号)中，制作N5-MOG01scFv-hG4PE载体。
以噬菌粒载体pCANTAB_MOG301作为模板，通过PCR对scFv区的基因片段进行扩增。以重链恒定区的合成基因作为模板，通过PCR对铰链-CH2-CH3区的基因片段进行扩增。将所得到的基因片段插入至pCI载体(Promega公司制造)中，制作pCI-MOG301 scFv-hG4PE(R409K)载体。
利用同样的方法制作插入有表12所示的各种抗MOG抗体的scFv区的基因片段的抗体表达载体，分别命名为pCI-MOG303scFv-hG4PE(R409K)、pCI-MOG307 scFv-hG4PE(R409K)、pCI-MOG310scFv-hG4PE(R409K)、pCI-MOG312 scFv-hG4PE(R409K)、pCI-MOG326scFv-hG4PE(R409K)、pCI-MOG329 scFv-hG4PE(R409K)、pCI-MOG446scFv-hG4PE(R409K)、pCI-MOG456 scFv-hG4PE(R409K)和pCI-MOG473 scFv-hG4PE(R409K)。
利用实施例6中记载的方法对所制作的抗MOG抗体的表达载体进行制备。使抗MOG抗体的表达载体pCI-MOG301scFv-hG4PE(R409K)、pCI-MOG303 scFv-hG4PE(R409K)、pCI-MOG307scFv-hG4PE(R409K)、pCI-MOG310 scFv-hG4PE(R409K)、pCI-MOG312scFv-hG4PE(R409K)、pCI-MOG326 scFv-hG4PE(R409K)、pCI-MOG329scFv-hG4PE(R409K)、pCI-MOG446scFv-hG4PE(R409K)、pCI-MOG456scFv-hG4PE(R409K)和pCI-MOG473 scFv-hG4PE(R409K)进行表达，分别获得MOG301 scFv-hG4PE(R409K)抗体、MOG303scFv-hG4PE(R409K)抗体、MOG307 scFv-hG4PE(R409K)抗体、MOG310scFv-hG4PE(R409K)抗体、MOG312 scFv-hG4PE(R409K)抗体、MOG326scFv-hG4PE(R409K)抗体、MOG329 scFv-hG4PE(R409K)抗体、MOG446scFv-hG4PE(R409K)抗体、MOG456 scFv-hG4PE(R409K)抗体和MOG473 scFv-hG4PE(R409K)抗体。
[实施例22]利用流式细胞仪进行的抗MOG抗体对MOG的结合性的评价
利用与实施例7同样的方法评价实施例21中得到的抗MOG抗体对MOG的结合。将结果示于图23～25。
如图23～25所示，MOG01 scFv-hG4PE、MOG301scFv-hG4PE(R409K)、MOG303 scFv-hG4PE(R409K)、MOG307scFv-hG4PE(R409K)、MOG310 scFv-hG4PE(R409K)、MOG312scFv-hG4PE(R409K)、MOG326 scFv-hG4PE(R409K)、MOG329scFv-hG4PE(R409K)、MOG446 scFv-hG4PE(R409K)、MOG456scFv-hG4PE(R409K)和MOG473 scFv-hG4PE(R409K)均对hMOG/Expi293F细胞和mMOG/Expi293F细胞显示出结合活性。
[实施例23]利用表面等离子体共振检测进行的抗MOG抗体对MOG的结合性的评价
利用与实施例8同样的方法评价实施例21中得到的MOG01scFv-hG4PE、MOG301scFv-hG4PE(R409K)、MOG303scFv-hG4PE(R409K)、MOG307 scFv-hG4PE(R409K)、MOG329scFv-hG4PE(R409K)、MOG446 scFv-hG4PE(R409K)、MOG456scFv-hG4PE(R409K)和MOG473 scFv-hG4PE(R409K)对人MOG和小鼠MOG的结合。分析物使用hMOG-GST和mMOG-GST。将对人MOG的结合性评价的结果示于表14，将对小鼠MOG的结合性评价的结果示于表15。
[表14]
对人MOG的反应性
MOG01的ka为测定范围之外
[表15]
对小鼠MOG的反应性
如表14和表15所示，各抗MOG抗体对人MOG的解离常数(KD值)为1.0×10-10(M)～3.6×10-9(M)、对小鼠MOG的解离常数(KD值)为1.9×10-10(M)～6.9×10-9(M)，表明任意一种抗体均显示出良好的亲和性。MOG01 scFv-hG4PE的情况下，结合速率常数ka为设备测定范围之外，无法唯一地确定KD值。
[实施例24]酶融合抗体的制作
利用以下记载的方法制作在抗MOG01IgG抗体和抗AVMIgG抗体的C末端融合有酸性鞘磷脂酶(Acid Sphingomyelinase；ASM)的酶融合抗体。将在抗MOG01IgG抗体的C末端融合有ASM的抗体的表达载体命名为pCI-MOG01-hLG4PE(R409K)_ASM，将在抗AVMIgG抗体的C末端融合有ASM的抗体的表达载体命名为pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_ASM。
以序列号150所示的ASM的合成基因作为模板，通过PCR对接头-ASM区的基因片段进行扩增。另外，以合成基因作为模板，通过PCR合成CH1-铰链-CH2-CH3(R409K)区的基因片段。以N5LG4PE_MOG01作为模板，通过PCR对MOG01轻链区的基因片段和MOG01 VH区的基因片段进行扩增。
将所得到的基因片段插入至pCI载体(Promega公司制造)中，制作pCI-MOG01-hLG4PE(R409K)_ASM载体。以合成基因作为模板，通过PCR对CH2-CH3区的基因片段进行扩增。将CH2-CH3区和接头-ASM区的基因片段插入至pCI-AVM-hLG4PE(R409K)载体的PmlI-BamHI位点，制作pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_ASM。
利用实施例6所示的方法表达、纯化pCI-MOG01-hLG4PE(R409K)_ASM和pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_ASM。将使pCI-MOG01-hLG4PE(R409K)_ASM进行表达而得到的抗体命名为MOG01 IgG4PE(R409K)-ASM，将使pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_ASM进行表达而得到的抗体命名为AVM IgG4PE(R409K)-ASM。
[实施例25]酶融合抗体的活性评价
利用与实施例23同样的方法确认MOG01 IgG4PE(R409K)-ASM对MOG表达细胞的结合性，将结果示于图26。另外，利用与实施例8同样的方法确认对MOG可溶性抗原的结合性，结果，MOG01IgG4PE(R409K)-ASM的解离常数(KD值)为2.9×10-9(M)，显示出良好的亲和性。
利用以下所示的ELISA法对抗ASM抗体(LSBio公司制造)与所制作的MOG01 IgG4PE(R409K)-ASM和AVM IgG4PE(R409K)-ASM的结合进行确认。
ELISA中，将MOG01 IgG4PE(R409K)-ASM和AVM IgG4PE(R409K)-ASM固相化(100ng/50μL)于MAXISORP(NUNC公司制造)上，使用SuperBlock封闭缓冲液(SuperBlock BlockingBuffer)(Thermo公司制造)对未结合MOG01 IgG4PE(R409K)-ASM和AVM IgG4PE(R409K)-ASM的部位进行封闭。作为阴性对照，还准备了固相化(50ng/50μL)有抗MOG01IgG抗体和抗AVMIgG抗体的板。在各孔中加入用PBS-T稀释至0.2、1、5μg/mL的浓度的抗ASM抗体，在室温下反应1小时后，用PBS-T清洗各孔。
接着，在各孔中加入将以辣根过氧化物酶标记的抗小鼠免疫球蛋白抗体(Dako公司制造)用PBS-T稀释而成的溶液，在室温下反应1小时。加入TMB显色底物液(DAKO公司制造)，在室温下温育。在各孔中加入2M盐酸，使显色反应终止，测定波长450nm(参比波长570nm)下的吸光度。将所得到的结果示于图27。
如图27所示，显示出所制作的ASM融合抗体被抗ASM抗体所识别并结合。另外，使用鞘磷脂酶活性测定试剂盒(Echelon Biosciences公司制造)测定所制作的MOG01 IgG4PE(R409K)-ASM和AVM IgG4PE(R409K)-ASM的鞘磷脂酶活性，结果确认到所制作的ASM融合抗体具有酶活性。
由以上结果确认，使酶与MOG抗体融合而成的酶融合抗体的抗原结合活性、酶活性均得到了保持。
[实施例26]酶融合抗体的小鼠脑迁移性评价
利用与实施例14同样的方法评价实施例24中得到的ASM融合抗体的小鼠脑迁移性。将ASM融合抗体以5mg/kg进行给药，将10天后的血清中抗体浓度和脑组织中的每单位脑重量的抗体量示于图28。
如图28所示，MOG01 IgG4PE(R409K)-ASM与AVM IgG4PE(R409K)-ASM相比，血清中的抗体浓度没有差异。另一方面显示出，MOG01 IgG4PE(R409K)-ASM的情况下，与AVMIgG4PE(R409K)-ASM相比，脑内的抗体量提高至约58倍。
使用特定的方式详细地对本发明进行了说明，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以在不脱离本发明的意图和范围的情况下进行各种变更和变形。需要说明的是，本申请基于2016年12月26日提交的日本专利申请(日本特愿2016-251106号)，通过引用将其全部内容援引于此。
序列表自由文本
序列号3-人工序列的说明：不包含信号序列的MOG01的VH的氨基酸序列
序列号4-人工序列的说明：MOG01的HCDR1的氨基酸序列
序列号5-人工序列的说明：MOG01的HCDR2的氨基酸序列
序列号6-人工序列的说明：MOG01的HCDR3的氨基酸序列
序列号9-人工序列的说明：不包含信号序列的MOG01的VL的氨基酸序列
序列号10-人工序列的说明：MOG01的LCDR1的氨基酸序列
序列号11-人工序列的说明：MOG01的LCDR2的氨基酸序列
序列号12-人工序列的说明：MOG01的LCDR3的氨基酸序列
序列号15-人工序列的说明：不包含信号序列的MOG09的VH的氨基酸序列
序列号16-人工序列的说明：MOG09的HCDR1的氨基酸序列序列号17-人工序列的说明：MOG09的HCDR2的氨基酸序列序列号18-人工序列的说明：MOG09的HCDR3的氨基酸序列
序列号21-人工序列的说明：不包含信号序列的MOG09的VL的氨基酸序列
序列号22-人工序列的说明：MOG09的LCDR1的氨基酸序列
序列号23-人工序列的说明：MOG09的LCDR2的氨基酸序列
序列号24-人工序列的说明：MOG09的LCDR3的氨基酸序列
序列号27-人工序列的说明：不包含信号序列的MOG14的VH的氨基酸序列
序列号28-人工序列的说明：MOG14的HCDR1的氨基酸序列序列号29-人工序列的说明：MOG14的HCDR2的氨基酸序列序列号30-人工序列的说明：MOG14的HCDR3的氨基酸序列
序列号33-人工序列的说明：不包含信号序列的MOG14的VL的氨基酸序列
序列号34-人工序列的说明：MOG14的LCDR1的氨基酸序列
序列号35-人工序列的说明：MOG14的LCDR2的氨基酸序列
序列号36-人工序列的说明：MOG14的LCDR3的氨基酸序列
序列号37-人工序列的说明：包含信号序列的iMOG_3Rim1_S32的VHH的碱基序列
序列号38-人工序列的说明：合成构建体的氨基酸序列
序列号39-人工序列的说明：不包含信号序列的iMOG_3Rim1_S32的VHH的氨基酸序列
序列号40-人工序列的说明：iMOG_3Rim1_S32的CDR1的氨基酸序列
序列号41-人工序列的说明：iMOG_3Rim1_S32的CDR2的氨基酸序列
序列号42-人工序列的说明：iMOG_3Rim1_S32的CDR3的氨基酸序列
序列号43-人工序列的说明：引物1的碱基序列
序列号44-人工序列的说明：引物2的碱基序列
序列号45-人工序列的说明：引物3的碱基序列
序列号46-人工序列的说明：引物4的碱基序列
序列号47-人工序列的说明：引物5的碱基序列
序列号48-人工序列的说明：引物6的碱基序列
序列号49-人工序列的说明：引物7的碱基序列序列号50-人工序列的说明：引物8的碱基序列序列号51-人工序列的说明：引物9的碱基序列序列号52-人工序列的说明：引物10的碱基序列序列号53-人工序列的说明：引物11的碱基序列序列号54-人工序列的说明：引物12的碱基序列序列号55-人工序列的说明：引物13的碱基序列序列号56-人工序列的说明：引物14的碱基序列序列号57-人工序列的说明：引物15的碱基序列序列号58-人工序列的说明：引物16的碱基序列序列号59-人工序列的说明：引物17的碱基序列序列号60-人工序列的说明：引物18的碱基序列序列号61-人工序列的说明：引物19的碱基序列序列号62-人工序列的说明：引物20的碱基序列序列号63-人工序列的说明：引物21的碱基序列序列号64-人工序列的说明：引物22的碱基序列序列号65-人工序列的说明：引物23的碱基序列序列号66-人工序列的说明：引物24的碱基序列序列号69-人工序列的说明：rMOG-FLAG-Fc的碱基序列序列号70-人工序列的说明：合成构建体的氨基酸序列序列号71-人工序列的说明：rMOG-GST的碱基序列序列号72-人工序列的说明：合成构建体的氨基酸序列序列号79-人工序列的说明：引物25的碱基序列序列号80-人工序列的说明：引物26的碱基序列序列号81-人工序列的说明：引物27的碱基序列序列号82-人工序列的说明：引物28的碱基序列序列号83-人工序列的说明：引物29的碱基序列序列号84-人工序列的说明：引物30的碱基序列序列号85-人工序列的说明：引物31的碱基序列序列号86-人工序列的说明：引物32的碱基序列
序列号87-人工序列的说明：引物33的碱基序列
序列号88-人工序列的说明：引物34的碱基序列
序列号89-人工序列的说明：引物35的碱基序列
序列号90-人工序列的说明：引物36的碱基序列
序列号91-人工序列的说明：引物37的碱基序列
序列号92-人工序列的说明：引物38的碱基序列
序列号93-人工序列的说明：引物39的碱基序列
序列号94-人工序列的说明：引物40的碱基序列
序列号95-人工序列的说明：引物41的碱基序列
序列号96-人工序列的说明：引物42的碱基序列
序列号97-人工序列的说明：引物43的碱基序列
序列号98-人工序列的说明：hHER2-GST的碱基序列
序列号99-人工序列的说明：合成构建体的氨基酸序列
序列号100-人工序列的说明：hMOG-FLAG-Fc的碱基序列(包含信号序列)
序列号101-人工序列的说明：hMOG-FLAG-Fc的氨基酸序列(包含信号序列)
序列号102-人工序列的说明：mMOG-FLAG-Fc的碱基序列(包含信号序列)
序列号103-人工序列的说明：mMOG-FLAG-Fc的氨基酸序列(包含信号序列)
序列号104-人工序列的说明：hMOG-GST的碱基序列(包含信号序列)
序列号105-人工序列的说明：hMOG-GST的氨基酸序列(包含信号序列)
序列号106-人工序列的说明：mMOG-GST的碱基序列(包含信号序列)
序列号107-人工序列的说明：mMOG-GST的氨基酸序列(包含信号序列)
序列号108-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K/S354C/T366W)-FLAG标签的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号109-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K/S354C/T366W)-FLAG标签的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号110-人工序列的说明：pCI-MOG01-hLG4PE(R409K/Y349C/T366S/L368A/Y407V)-His标签的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号111-人工序列的说明：pCI-MOG01-hLG4PE(R409K/Y349C/T366S/L368A/Y407V)-His标签的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号112-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)-接头-MOG01VL-CL的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号113-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)-接头-MOG01VL-CL的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号114-人工序列的说明：pCI-MOG01VH-CH的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号115-人工序列的说明：pCI-MOG01VH-CH的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号116-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K/S354C/T366W)-接头-MOG01scFv-FLAG标签的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号117-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K/S354C/T366W)-接头-MOG01scFv-FLAG标签的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号118-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K/Y349C/T366S/L368A/Y407V)-His标签的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号119-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K/Y349C/T366S/L368A/Y407V)-His标签的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号120-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv2的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号121-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv2的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号122-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv3的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号123-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv3的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号124-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv4的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号125-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv4的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号126-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv5的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号127-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv5的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号128-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv6的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号129-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv6的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号130-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv7的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号131-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv7的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号132-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv8的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号133-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv8的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号134-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv9的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号135-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv9的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号136-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv10的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号137-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv10的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号138-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv11的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号139-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_MOG01scFv11的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号140-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)-接头-AVMVL-CL的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号141-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)-接头-AVMVL-CL的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号142-人工序列的说明：pCI-AVMVH-CH的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号143-人工序列的说明：pCI-AVMVH-CH的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号144-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K/S354C/T366W)-接头-AVMscFv-FLAG标签的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号145-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K/S354C/T366W)-接头-AVMscFv-FLAG标签的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号146-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVMscFv3的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号147-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVMscFv3的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号148-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVMscFv5的抗体序列的碱基序列(不包含信号序列)
序列号149-人工序列的说明：pCI-AVM-hLG4PE(R409K)_AVMscFv5的抗体序列的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号150-人工序列的说明：酸性鞘磷脂酶(ASM)的碱基序列
序列号151-人工序列的说明：编码MOG301的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号152-人工序列的说明：MOG301的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号153-人工序列的说明：MOG301的HCDR1的氨基酸序列序列号154-人工序列的说明：MOG301的HCDR2的氨基酸序列序列号155-人工序列的说明：MOG301的HCDR3的氨基酸序列
序列号156-人工序列的说明：编码MOG301的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号157-人工序列的说明：MOG301的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号158-人工序列的说明：MOG301的LCDR1的氨基酸序列序列号159-人工序列的说明：MOG301的LCDR2的氨基酸序列序列号160-人工序列的说明：MOG301的LCDR3的氨基酸序列
序列号161-人工序列的说明：编码MOG303的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号162-人工序列的说明：MOG303的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号163-人工序列的说明：MOG303的HCDR1的氨基酸序列序列号164-人工序列的说明：MOG303的HCDR2的氨基酸序列序列号165-人工序列的说明：MOG303的HCDR3的氨基酸序列
序列号166-人工序列的说明：编码MOG303的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号167-人工序列的说明：MOG303的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号168-人工序列的说明：MOG303的LCDR1的氨基酸序列序列号169-人工序列的说明：MOG303的LCDR2的氨基酸序列序列号170-人工序列的说明：MOG303的LCDR3的氨基酸序列
序列号171-人工序列的说明：编码MOG307的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号172-人工序列的说明：MOG307的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号173-人工序列的说明：MOG307的HCDR1的氨基酸序列序列号174-人工序列的说明：MOG307的HCDR2的氨基酸序列序列号175-人工序列的说明：MOG307的HCDR3的氨基酸序列
序列号176-人工序列的说明：编码MOG307的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号177-人工序列的说明：MOG307的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号178-人工序列的说明：MOG307的LCDR1的氨基酸序列序列号179-人工序列的说明：MOG307的LCDR2的氨基酸序列序列号180-人工序列的说明：MOG307的LCDR3的氨基酸序列
序列号181-人工序列的说明：编码MOG310的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号182-人工序列的说明：MOG310的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号183-人工序列的说明：MOG310的HCDR1的氨基酸序列序列号184-人工序列的说明：MOG310的HCDR2的氨基酸序列序列号185-人工序列的说明：MOG310的HCDR3的氨基酸序列
序列号186-人工序列的说明：编码MOG310的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号187-人工序列的说明：MOG310的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号188-人工序列的说明：MOG310的LCDR1的氨基酸序列序列号189-人工序列的说明：MOG310的LCDR2的氨基酸序列序列号190-人工序列的说明：MOG310的LCDR3的氨基酸序列
序列号191-人工序列的说明：编码MOG312的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号192-人工序列的说明：MOG312的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号193-人工序列的说明：MOG312的HCDR1的氨基酸序列序列号194-人工序列的说明：MOG312的HCDR2的氨基酸序列序列号195-人工序列的说明：MOG312的HCDR3的氨基酸序列
序列号196-人工序列的说明：编码MOG312的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号197-人工序列的说明：MOG312的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号198-人工序列的说明：MOG312的LCDR1的氨基酸序列序列号199-人工序列的说明：MOG312的LCDR2的氨基酸序列序列号200-人工序列的说明：MOG312的LCDR3的氨基酸序列
序列号201-人工序列的说明：编码MOG326的VH(不包含信号序列)的碱基序列
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序列号203-人工序列的说明：MOG326的HCDR1的氨基酸序列序列号204-人工序列的说明：MOG326的HCDR2的氨基酸序列序列号205-人工序列的说明：MOG326的HCDR3的氨基酸序列
序列号206-人工序列的说明：编码MOG326的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号207-人工序列的说明：MOG326的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号208-人工序列的说明：MOG326的LCDR1的氨基酸序列序列号209-人工序列的说明：MOG326的LCDR2的氨基酸序列序列号210-人工序列的说明：MOG326的LCDR3的氨基酸序列
序列号211-人工序列的说明：编码MOG329的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号212-人工序列的说明：MOG329的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号213-人工序列的说明：MOG329的HCDR1的氨基酸序列序列号214-人工序列的说明：MOG329的HCDR2的氨基酸序列序列号215-人工序列的说明：MOG329的HCDR3的氨基酸序列
序列号216-人工序列的说明：编码MOG329的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号217-人工序列的说明：MOG329的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号218-人工序列的说明：MOG329的LCDR1的氨基酸序列序列号219-人工序列的说明：MOG329的LCDR2的氨基酸序列序列号220-人工序列的说明：MOG329的LCDR3的氨基酸序列
序列号221-人工序列的说明：编码MOG446的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号222-人工序列的说明：MOG446的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号223-人工序列的说明：MOG446的HCDR1的氨基酸序列序列号224-人工序列的说明：MOG446的HCDR2的氨基酸序列序列号225-人工序列的说明：MOG446的HCDR3的氨基酸序列
序列号226-人工序列的说明：编码MOG446的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号227-人工序列的说明：MOG446的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号228-人工序列的说明：MOG446的LCDR1的氨基酸序列序列号229-人工序列的说明：MOG446的LCDR2的氨基酸序列序列号230-人工序列的说明：MOG446的LCDR3的氨基酸序列
序列号231-人工序列的说明：编码MOG456的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号232-人工序列的说明：MOG456的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号233-人工序列的说明：MOG456的HCDR1的氨基酸序列序列号234-人工序列的说明：MOG456的HCDR2的氨基酸序列序列号235-人工序列的说明：MOG456的HCDR3的氨基酸序列
序列号236-人工序列的说明：编码MOG456的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号237-人工序列的说明：MOG456的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号238-人工序列的说明：MOG456的LCDR1的氨基酸序列序列号239-人工序列的说明：MOG456的LCDR2的氨基酸序列序列号240-人工序列的说明：MOG456的LCDR3的氨基酸序列
序列号241-人工序列的说明：编码MOG473的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号242-人工序列的说明：MOG473的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号243-人工序列的说明：MOG473的HCDR1的氨基酸序列序列号244-人工序列的说明：MOG473的HCDR2的氨基酸序列序列号245-人工序列的说明：MOG473的HCDR3的氨基酸序列
序列号246-人工序列的说明：编码MOG473的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号247-人工序列的说明：MOG473的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号248-人工序列的说明：MOG473的LCDR1的氨基酸序列序列号249-人工序列的说明：MOG473的LCDR2的氨基酸序列序列号250-人工序列的说明：MOG473的LCDR3的氨基酸序列
序列号251-人工序列的说明：编码MOG426的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号252-人工序列的说明：MOG426的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号253-人工序列的说明：编码MOG426的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号254-人工序列的说明：MOG426的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号255-人工序列的说明：编码MOG428的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号256-人工序列的说明：MOG428的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号257-人工序列的说明：编码MOG428的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号258-人工序列的说明：MOG428的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号259-人工序列的说明：编码MOG313的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号260-人工序列的说明：MOG313的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号261-人工序列的说明：编码MOG313的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号262-人工序列的说明：MOG313的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号263-人工序列的说明：编码MOG314的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号264-人工序列的说明：MOG314的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号265-人工序列的说明：编码MOG314的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号266-人工序列的说明：MOG314的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号267-人工序列的说明：编码MOG315的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号268-人工序列的说明：MOG315的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号269-人工序列的说明：编码MOG315的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号270-人工序列的说明：MOG315的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号271-人工序列的说明：编码MOG331的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号272-人工序列的说明：MOG331的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号273-人工序列的说明：编码MOG331的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号274-人工序列的说明：MOG331的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号275-人工序列的说明：编码MOG357的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号276-人工序列的说明：MOG357的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号277-人工序列的说明：编码MOG357的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号278-人工序列的说明：MOG357的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号279-人工序列的说明：编码MOG476的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号280-人工序列的说明：MOG476的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号281-人工序列的说明：编码MOG476的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号282-人工序列的说明：MOG476的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号283-人工序列的说明：编码MOG323的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号284-人工序列的说明：MOG323的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号285-人工序列的说明：编码MOG323的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号286-人工序列的说明：MOG323的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号287-人工序列的说明：编码MOG341的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号288-人工序列的说明：MOG341的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号289-人工序列的说明：编码MOG341的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号290-人工序列的说明：MOG341的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号291-人工序列的说明：编码MOG354的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号292-人工序列的说明：MOG354的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号293-人工序列的说明：编码MOG354的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号294-人工序列的说明：MOG354的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号295-人工序列的说明：编码MOG355的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号296-人工序列的说明：MOG355的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号297-人工序列的说明：编码MOG355的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号298-人工序列的说明：MOG355的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号299-人工序列的说明：编码MOG308的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号300-人工序列的说明：MOG308的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号301-人工序列的说明：编码MOG308的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号302-人工序列的说明：MOG308的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号303-人工序列的说明：编码MOG316的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号304-人工序列的说明：MOG316的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号305-人工序列的说明：编码MOG316的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号306-人工序列的说明：MOG316的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号307-人工序列的说明：编码MOG319的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号308-人工序列的说明：MOG319的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号309-人工序列的说明：编码MOG319的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号310-人工序列的说明：MOG319的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号311-人工序列的说明：编码MOG320的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号312-人工序列的说明：MOG320的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号313-人工序列的说明：编码MOG320的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号314-人工序列的说明：MOG320的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号315-人工序列的说明：编码MOG338的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号316-人工序列的说明：MOG338的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号317-人工序列的说明：编码MOG338的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号318-人工序列的说明：MOG338的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号319-人工序列的说明：编码MOG352的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号320-人工序列的说明：MOG352的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号321-人工序列的说明：编码MOG352的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号322-人工序列的说明：MOG352的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号323-人工序列的说明：编码MOG359的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号324-人工序列的说明：MOG359的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号325-人工序列的说明：编码MOG359的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号326-人工序列的说明：MOG359的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号327-人工序列的说明：编码MOG478的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号328-人工序列的说明：MOG478的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号329-人工序列的说明：编码MOG478的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号330-人工序列的说明：MOG478的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号331-人工序列的说明：编码MOG470的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号332-人工序列的说明：MOG470的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号333-人工序列的说明：编码MOG470的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号334-人工序列的说明：MOG470的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号335-人工序列的说明：编码MOG418的VH(不包含信号序列)的碱基序列
序列号336-人工序列的说明：MOG418的VH(不包含信号序列)的氨基酸序列
序列号337-人工序列的说明：编码MOG418的VL(不包含信号序列)的碱基序列
序列号338-人工序列的说明：MOG418的VL(不包含信号序列)的氨基酸序列

Claims (18)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG结合，并且，抗体为选自由下述(b)～(n)组成的组中的一种：
(b)重链可变区即VH的互补决定区即CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号16、17和18中记载的氨基酸序列构成、并且轻链可变区即VL的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号22、23和24中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(c)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号28、29和30中记载的氨基酸序列构成、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号34、35和36中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(d)重链抗体的重链可变区即VHH的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号40、41和42中记载的氨基酸序列构成的重链抗体；
(e)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号153、154和155中记载的氨基酸序列构成、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号158、159和160中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(f)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号163、164和165中记载的氨基酸序列构成、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号168、169和170中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(g)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号173、174和175中记载的氨基酸序列构成、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号178、179和180中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(h)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号183、184和185中记载的氨基酸序列构成、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号188、189和190中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(i)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号193、194和195中记载的氨基酸序列构成、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号198、199和200中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(j)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号203、204和205中记载的氨基酸序列构成、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号208、209和210中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(k)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号213、214和215中记载的氨基酸序列构成、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号218、219和220中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(l)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号223、224和225中记载的氨基酸序列构成、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号228、229和230中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(m)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号233、234和235中记载的氨基酸序列构成、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号238、239和240中记载的氨基酸序列构成的抗体；和
(n)VH的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号243、244和245中记载的氨基酸序列构成、并且VL的CDR1～3的氨基酸序列分别由序列号248、249和250中记载的氨基酸序列构成的抗体。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体具有脑滞留性。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体为选自由下述(b)～(n)和(o1)～(o22)组成的组中的一种：
(b)VH的氨基酸序列由序列号15中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号21中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(c)VH的氨基酸序列由序列号27中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号33中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(d)VHH的氨基酸序列由序列号39中记载的氨基酸序列构成的重链抗体；
(e)VH的氨基酸序列由序列号152中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号157中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(f)VH的氨基酸序列由序列号162中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号167中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(g)VH的氨基酸序列由序列号172中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号177中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(h)VH的氨基酸序列由序列号182中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号187中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(i)VH的氨基酸序列由序列号192中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号197中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(j)VH的氨基酸序列由序列号202中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号207中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(k)VH的氨基酸序列由序列号212中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号217中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(l)VH的氨基酸序列由序列号222中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号227中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(m)VH的氨基酸序列由序列号232中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号237中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(n)VH的氨基酸序列由序列号242中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号247中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o1)VH的氨基酸序列由序列号252中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号254中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o2)VH的氨基酸序列由序列号256中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号258中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o3)VH的氨基酸序列由序列号260中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号262中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o4)VH的氨基酸序列由序列号264中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号266中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o5)VH的氨基酸序列由序列号268中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号270中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o6)VH的氨基酸序列由序列号272中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号274中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o7)VH的氨基酸序列由序列号276中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号278中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o8)VH的氨基酸序列由序列号280中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号282中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o9)VH的氨基酸序列由序列号284中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号286中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o10)VH的氨基酸序列由序列号288中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号290中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o11)VH的氨基酸序列由序列号292中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号294中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o12)VH的氨基酸序列由序列号296中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号298中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o13)VH的氨基酸序列由序列号300中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号302中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o14)VH的氨基酸序列由序列号304中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号306中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o15)VH的氨基酸序列由序列号308中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号310中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o16)VH的氨基酸序列由序列号312中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号314中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o17)VH的氨基酸序列由序列号316中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号318中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o18)VH的氨基酸序列由序列号320中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号322中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o19)VH的氨基酸序列由序列号324中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号326中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o20)VH的氨基酸序列由序列号328中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号330中记载的氨基酸序列构成的抗体；
(o21)VH的氨基酸序列由序列号332中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号334中记载的氨基酸序列构成的抗体；和
(o22)VH的氨基酸序列由序列号336中记载的氨基酸序列构成、并且VL的氨基酸序列由序列号338中记载的氨基酸序列构成的抗体。
4.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体为双特异性抗体。
5.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中，双特异性抗体与MOG和存在于脑中的抗原结合。
6.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中，双特异性抗体包含与MOG结合的抗原结合位点、以及与存在于脑中的抗原结合的抗原结合位点。
7.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段为选自由Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体即scFv、二聚体化V区即双链抗体、二硫键稳定的V区即dsFv、VHH和包含CDR的肽组成的组中的一种。
8.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体为基因重组抗体。
9.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体为选自由小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、羊驼抗体、骆驼抗体、美洲驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体组成的组中的一种。
10.一种融合抗体或融合抗体片段，其是使选自由下述(a)～(c)组成的组中的至少一者与权利要求1～9中任一项所述的与MOG结合的抗体或其抗原结合片段结合而成的，
(a)亲水性高分子、
(b)两亲性高分子、以及
(c)功能性分子。
11.一种细胞，其产生权利要求1～9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或者权利要求10所述的融合抗体或融合抗体片段。
12.一种核酸，其包含编码权利要求1～9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或者权利要求10所述的融合抗体或融合抗体片段的碱基序列。
13.一种转化细胞，其含有包含权利要求12所述的核酸的载体。
14.权利要求1～9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或者权利要求10所述的融合抗体或融合抗体片段的制造方法，其包括：对权利要求11所述的细胞或权利要求13所述的转化细胞进行培养，从培养液中收集权利要求1～9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或者权利要求10所述的融合抗体或融合抗体片段。
15.一种组合物，其包含权利要求1～9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或者权利要求10所述的融合抗体或融合抗体片段。
16.如权利要求15所述的组合物，其为用于检测或测定存在于脑中的抗原的组合物。
17.如权利要求15所述的组合物，其为用于诊断或治疗脑疾病的组合物。
18.权利要求1～9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求10所述的融合抗体或融合抗体片段或者权利要求15所述的组合物在制备脑疾病的诊断用组合物或用于治疗脑疾病的药物组合物中的应用。
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