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KR102128560B1 - 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 항균 효과 및 높은 포자 형성 능력을 갖는 항생제 민감성 바실러스 균주 - Google Patents

대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 항균 효과 및 높은 포자 형성 능력을 갖는 항생제 민감성 바실러스 균주 Download PDF

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KR102128560B1
KR102128560B1 KR1020147031931A KR20147031931A KR102128560B1 KR 102128560 B1 KR102128560 B1 KR 102128560B1 KR 1020147031931 A KR1020147031931 A KR 1020147031931A KR 20147031931 A KR20147031931 A KR 20147031931A KR 102128560 B1 KR102128560 B1 KR 102128560B1
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메테 디네스 칸토르
비르기테 스투에르-라우리드센
파트리크 데르큭스
에릭 조한센
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시에이치알. 한센 에이/에스
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Abstract

(i) 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대한 민감성; (ii) 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 항균 활성; 및 (iii) 배양 2일 후 측정시 적어도 80의 포자 형성 비율을 특징으로 하는 바실러스 속 균주.
본 발명은 또한 그와 같은 균주를 선별하는 방법과 관련된다. 본 발명에 따라 동정된 많은 균주는 바실러스 아밀로리쿼페이션스 종에 속한다. 바실러스 아밀로리쿼페이션스의 몇몇은 바실러스 아밀로리쿼페이션스 아종 아밀로리쿼페이션스으로 추가 동정된 반면, 다른 것들은 아밀로리쿼페이션스 아종 플란타룸으로 동정되었다.
본 발명의 바실러스 균주는 동물 사료에 식품 첨가제로서 사용될 수 있는데, 여기서 프로바이오틱 효과를 나타낸다.

Description

대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 항균 효과 및 높은 포자 형성 능력을 갖는 항생제 민감성 바실러스 균주{ANTIBIOTIC SENSITIVE BACILLUS STRAINS HAVING ANTIMICROBIAL EFFECT AGAINST E. COLI AND CLOSTRIDIUM PERFRINGENS AND HAVING HIGH SPORULATION CAPACITY}
바실러스 종(Bacillus spp)은 동물 사료 산업에서 프로바이오틱 용액에 사용되며, 생산 동물의 생산성 및 건강에 대한 바실러스계 프로바이오틱의 긍정적인 영향은 잘 알려져 있다(Spiehs et al., 2008; Cutting, 2011). 그들의 용법은 동물 사료 산업에서 성장 촉진제로서 사용되고 있는 항생제 사용을 대체하거나 감소시킬 수 있는 바실러스의 능력과 관련이 있다.
그러나, 인간에 대하여 흔히 사용되는 항생제에 대하여 저항성을 가지지 않는 바실러스 균주에 대한 충족되지 않은 요구가 존재한다. 본 발명은 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대한 민감성을 특징으로 하고, 또한 대장균(E. coli) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)와 같은 주요 병원균에 대하여 항미생물 활성을 갖는 분리된 바이러스 균주를 제공한다. 또한, 제 2일에 측정하였을 때, 균주는 적어도 80 퍼센트의 포자 형성을 가지며 동물 사료 생산을 위하여 안전하고 유용한 바실러스 포자를 효과적으로 생산할 수 있게 한다.
본 발명은 또한 동물 사료 첨가제, 특히 돼지 및 가금류를 위한 제품의 생산을 위한 본 발명의 바실러스 균주 포자의 사용과 관련이 있는데, 여기서 균주는 프로바이오틱(건강, 사료 이용 및 성장 촉진) 효과를 갖는다.
돼지, 특히 새끼 돼지는 대장균(E. coli)과 클로스트리디움 퍼프린젠스 A 및 C형(Clostridium perfringens)과 같은 세균에 의하여 발생된 설사증(scours), 즉 설사로 고통받는다. 설사증을 치료하지 않고 방치시 폐사 손실 및 체중 감소와 같은 심각한 생산성 손실을 가져올 수 있다.
대장균은 새끼 돼지에게 설사를 일으키는 주요 원인이고 농장에서 사용되는 항생제의 50-75%가 주로 대장균에 의하여 야기되는 이유 설사를 방지하기 위하여 사용된다. 설사는 이유기 및 성장기 개체(40 kg까지)에 있어 가장 큰 문제가 되며, 대장균은 설사를 일으키는 가장 중요한 병원균이다(Klose et al., 2010).
돼지의 클로스트리디움성 장내 감염은 주로 이유기 이전에 발생하지만, 성장 마무리 기간에 있는 돼지에게 발생하는 장 출혈성 증후군과도 관련이 있다. 클로스트리디움 퍼프린젠스 C형에 대한 면역화가 이유기 전 폐사율을 현저하게 감소시켰지만, 클로스트리디움 퍼프린젠스 A형에 대한 상업적으로 이용가능한 백신은 현재 존재하지 않는다. 이제 이유기 전 돼지의 클로스트리디움 퍼프린젠스 A형 감염은 그 빈도가 증가하는 것으로 인식되고 있으며, 진단 및 예방을 위한 접근법은 C형 감염에 대한 것과는 상이할 뿐만 아니라 또한 더 복잡하다.
가금류의 몇몇 감염증 및 질병은 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스를 포함하는 병원성 세균에 의하여 발생한다. 병원균에 의한 감염증 및 질병은 증가된 폐사율, 감소된 활동성 및 생산 비용의 증가를 야기한다. 또한 이들 병원균의 다수는 인간에게 전염될 수도 있다. 조류 대장균증(Avian colibacillosis)은 대장균에 의하여 발생하는 전신 감염이며 어린 육계 및 가금류에게 가장 빈번하게 발생한다.
프로바이오틱은 클로스트리디움 및 대장균과 같은 해로운 박테리아의 감소와 유산균 종(Lactobacillus spp.) 및 비피더스균(Bifidobacterium)과 같은 유익한 박테리아의 증가를 포함하는, 건강한 장 미생물 군을 유지하기 위한 동물 건강 응용법에 사용된다. 프로바이오틱은 병원균과 유익한 박테리아 사이의 건강한 균형을 유지하기에 매우 적합한데, 이는 항생제와는 달리 이들은 박테리아를 무차별적으로 파괴하거나 항생제에 저항성인 병원균 균주의 발생을 야기하지 않기 때문이다. 프로바이오틱이 건강한 장 미생물 군을 유지한다고 생각되는 메카니즘이 다수 존재하는데: 병원성 박테리아의 경쟁적 배제, 항생 물질의 생산을 통한 병원균의 감소, 유익한 장 미생물 군의 성장 및 생존율의 증진 및 동물의 전신 면역 반응의 유도가 있다.
상기 관점에서, 돼지 및 가금류의 대장균 및/또는 클로스트리디움 감염으로 인한 질병을 치료 또는 예방하기 위하여 1 이상의 바실러스 균주를 갖는 것이 바람직할 것이다.
구오 등(Guo et al., 2006)은 잠재적 프로바이오틱으로서의 바실러스 균주의 스크리닝 및 돼지 내 바실러스 서브틸리스 MA139의 시험에 대하여 기술하고 있으며, 육계, 돼지, 토양, 발효 식품 및 중국 허브로부터 124개 시료를 채집하였다. 이들 시료로부터 750개의 호기성 포자-형성 균주를 분리하였다. 대장균 K88 및 K99, 살모넬라 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 억제 활성을 디스크 플레이트 확산 분석법을 사용하여 시험하였다. 최상의 활성을 갖는 6개의 바실러스에 대하여 모의 GIT 환경(pH 2 및 0.3% 담즙산염) 에서 그들의 생존을 시험하였다. B. 서브틸리스 MA139가 가장 우수한 후보자였으며, 이를 90마리 새끼 돼지에 대한 28일 사양 시험에서 새끼 돼지에 대하여 생체 시험하였다. ADG 및 사료 이용률이 개선되었다. 젖산균이 증가되었고, 배설물 내 대장균이 감소하였다. 그러나, 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 항균 활성 및 항생제에 대한 민감성은 시험되지 않았다.
바르보사 등(Barbosa et al., 2005)은 유기농으로(토양과 접촉하여) 사육된 육계의 배설물로부터 237개의 바실러스를 분리하는 것을 기술하고 있다. 31개 분리체가 특징화되었다. 이들 중에 B. 서브틸리스 및 B. 리체포미스(licheniformis)가 있었다. 몇몇 B. 서브틸리스 균주는 C. 퍼프린젠스 및 S. 아우레스(aureus)에 대한 억제를 나타내었다. B. 리체포미스 또한 C. 퍼프린젠스에 대한 효과를 나타내었다. 그러나 선별된 바실러스 분리체 중 그 무엇도 본 출원에서 정의된 바와 같은 대장균에 대한 항균 활성을 나타내지 못하였다. 선별된 바실러스 분리체 중 하나는 성장 강도의 감소를 보이지만 대장균 균주 O78:K80에 대한 완전한 억제를 나타내지 d않았으며, 시험된 다른 대장균 균주에 대해서도 효과가 없었다(표 5 참조). 배양 2일 후 포자 형성 비율에 대한 데이터 또는 반코마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신 및 클린다마이신에 대한 민감성에 대한 데이터는 제공되어 있지 않다.
카이야완 등(Chaiyawan et al., 2010)은 의학적 치료에서 널리 사용되는 항생제에 민감하고 C. 퍼프린젠스 ATCC 15191.에 대한 항균 활성을 나타내는 바실러스 균주 sp. T3-1를 개시하고 있다. 그 균주는 대장균 O157에 대한 항균 활성은 가지고 있지 않다. 배양 2일 후 포자 형성 비율에 대한 데이터는 제공되지 않았다.
베니테즈 등(Benitez et al., 2011)은 최근 온전한 또는 불활성화된 대장균의 존재가 바실러스　아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) LBM 5006 균주에 의한 항균 펩타이드의 합성을 증진시켰다고 기술하였다.
미국특허 제7,754,469호는 가금류를 처리하는 미생물 및 방법에 관한 것이고, 미국특허 제8,021,654호는 바실러스 균주로 돼지를 처리하는 방법에 관한 것이다.
그러나 이들 문헌 또는 특허 그 어디에도, 인간에게 흔히 사용되는 항생제에 대하여 민감하고, 클로스트리디움 퍼프린젠스 및 대장균 모두에 대하여 항균 활성을 가지며, 효율적인 포자 형성과 그로 인한 바실러스 프로바이오틱 생산에 유용한 균주를 만들기 위하여 높은 포자 형성 비율을 가지는 바실러스 균주를 선별하기 위한 기술 또는 암시가 기재되어 있지 않다.
선행 문헌, 예컨대 바르보사 등(Barbosa et al., 2005), 카이야완 등(Chaiyawan et al., 2010) 및 구오 등(Guo et al., 2006) 중 그 무엇도 인간에게 흔히 사용되는 항생제에 대한 민감성, 클로스트리디움 퍼프린젠스 및 대장균 둘 모두에 대한 성장 억제의 관점에서 항균 활성 및 높은 포자 형성 비율을 갖는 균주를 개시하고 있지 않다.
요컨대, 바실러스 균주의 스크리닝에 관한 선행 기술은 본 발명의 뚜렷한 3가지 특징, 즉 인간에게 흔히 사용되는 항생제에 대한 민감성, 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 항균 활성 및 높은 포자 형성 비율에 대한 정보를 제공하고 있지 아니하다. 선행 기술은 이러한 세 가지 기준을 만족하는 바실러스 균주를 제공하고 있지 아니하다.
본 발명에 의하여 해결하고자 하는 과제는 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대한 민감성; 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 항균 활성; 및 제 2일에 측정시 적어도 80 퍼센트의 포자 형성 비율을 가지는 것을 특징으로 하는 바실러스 균주를 제공하는 것이다.
해결 수단은 이러한 개선된 특성을 갖는 개선된 바실러스 균주의 동정을 위하여 본 발명자들이 개발한 선별 방법에 기반하고 있다.
선별 방법의 첫 번째 필수적 단계는 인간에게 흔히 사용되는 항생제에 민감한 바실러스 균주를 특이적으로 스크리닝 하는 것이다. 보다 구체적으로는, 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대한 민감성에 대하여 균주를 스크리닝한다.
또한, 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 항균 활성 및 제 2일에 측정시 적어도 80 퍼센트의 포자 형성 비율을 갖는 균주를 스크리닝한다.
본 발명자들에 의하여 연구된, 토양 및 배설물 및 식품 원료로부터 유래한 261종의 분리체 중에서, 161종의 분리체가 본 발명의 실시예에 기술된 사전-스크리닝 테스트에서 항생제 저항성이었다. 항생제에 민감한 100종의 분리체 중 56종이 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 항균 효과를 가졌고, 오직 22종 만이 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 둘 모두에 대한 효과를 가졌다. 이들 중 12종의 분리체가 바실러스 아밀로리쿼페이션스 종으로부터 유래한 것이었다. 다른 대표적인 균주는 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 모자벤시스로부터 유래한 것이었다. 표 2 및 3에 Chr. 한센 전매 균주의 결과를 요약해 놓았다(제2차 스크리닝에 대하여 선별된 32종의 균주 중 22종).
선별 과정은 (i) 안전성, (ii) 효능 및 (iii) 생산에 적합한 배지 중에서의 높은 포자 형성에 초점을 두었다. 안전성 관점은 항생제 저항성 결여에 주로 근거한 것인데, 이는 인간 내 저항성 박테리아가 있는 경우가 증가함에 따라 중요하다. 이러한 박테리아는 병원균 박테리아가 저항성이 됨에 따라, 더 이상 항생제로 치료할 수 없는 잘 알려진 질병을 야기하였다.
바실러스가 항균 활성을 가질 수 있는 물질, 즉 박테리오신(bacteriocins), 박테리아 분해 효소(bacteriolytic enzymes) 또는 표면활성물질(surfactins)과 같은 물질을 생산할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 두 번째 선별 기준인 대장균과 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 효과는, 두 병원균이 돼지 및 가금류에서 설사의 주요 원인이기 때문에 중요하다. 효과는 대장균 3종의 균주 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 A형에 대하여 시험되었지만, 그 결과는 대장균에 대한 일반적인 효과와 또한 클로스트리디움 퍼프린젠스 C형과 같은 다른 종류의 클로스트리디움에 대한 효과를 나타내는 것으로 여겨진다.
세 번째 선별 기준은 프로바이오틱의 생산을 위하여 중요하다. 생산 과정은 바실러스가 성장하는 발효기 내에서 이루어지며, 과정의 마지막에 고도의 생산 효율을 위하여 고도의 포자 형성 비율이 필요하다. 바실러스의 포자 형성 과정은 수년간 연구되었지만, 여전히 많은 의문점이 존재한다. 그리하여, 바실러스의 생산 및 공정 개발에서 일하고 있는 본 기술 분야의 숙련된 자들 사이에, 몇몇 바실러스 균주는 대단히 낮은 포자 형성 비율을 갖는다는 것이 잘 알려져 있다. 바실러스는 특화된 세포의 하부 개체군, 즉 포자 형성 군집, 영양소 복합체 분해를 위한 효소를 생산하는 군집 및 사멸하는 군집으로 분화한다는 것이 암시되어 왔다(Lopez and Kolter, 2010). 이러한 분화는 세포 외부적 신호에 의하여 조절되는 것으로 보이는데, 이들 대부분은 바실러스 자신에 의하여 생산되는 것이다. 그리하여, 효소 또는 항균 물질의 높은 생산은 낮은 포자 형성 능력을 야기할 수 있다는 것이 가설로 제안되어 왔다. 따라서, 바실러스 균주가 항균 활성과 높은 포자 형성 비율 모두를 갖는다는 것은 본 분야에서 통상의 기술을 가진자에게 이례적이고 놀라운 것이다.
도 1은 261종의 바실러스 균주의 항균 활성을 개략적으로 나타낸 것이다. 다수의 바실러스 아밀로리쿼페이션스 균주가 항균 효과를 갖는다는 것이 놀랍다.
2006년에 유럽 연합에서의 항생 성장 촉진제 단계적 폐지는 높은 효율을 갖는 비용-효과적인 사료 첨가제에 대한 요구 및 그에 따른 신규한 프로바이오틱에 대한 요구를 증가시켰다. 바실러스계 프로바이오틱 사료 첨가제의 돼지 및 가금류의 건강 및 생산성에 미치는 긍정적인 영향이 잘 알려져 있다. 포자가 열 안정성이고 90-95℃까지의 온도에서의 펠레타이징 공정에서도 생존할 수 있기 때문에, 이러한 제품은 사료 산업에 적절하다.
돼지를 위한 프로바이오틱은 동물, 인간 및 환경에 대하여 안전할 필요가 있으며, 동물의 성장 및 사료 이용률을 증가시켜야 한다. 본 발명의 목적은 상이한 원천으로부터 유래한 호기성 내포자 형성 박테리아(AEB)의 넓은 범위를 3 단계 내에 돼지에 대한 프로바이오틱 효과에 대하여 스크리닝하는 것이었다. AEB는 발효 식품(Kantong 및 Gergoush 일차 스타터), 돼지 배설물, 토양 및 다른 배양 수집물로부터 분리되었다. 261 AEB 분리체는 16S rDNA 유전자의 시퀀싱에 의하여 동정이 되었고, 수개의 관련 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 측정하는 것에 의하여 관련 항생제 저항성이 연구되었다.
추가적인 분석은 담즙 및 산 내성, 병원균 억제, 다른 배지에서의 성장, 포자 형성뿐만 아니라 장내 시스템 내 타이트 정션에 대한 긍정적 효과의 가능성을 평가하기 위한 동물 세포주와의 상호작용을 포함하였다. 그 결과는 종 및 균주 모두에서 높은 차이를 보여준다. 분리된 종들은 주로 바실러스 속의 것이었는데, 여기에는 음식 재료로부터 유래한 B. 아밀로리쿼페이션스, B. 서브틸리스 및 B. 사펜시스, 배설물로부터 유래한 B. 서브틸리스, B. 퓨밀러스, B. 아밀로리쿼페이션스, B. 리체니포미스, B. 메가테리움 및 토양으로부터 유래한 B. 리체니포미스 및 B. 심플렉스가 포함된다.
다수의 분리체는 EFSA에 의하여 정의되는 브레이크 포인트 위의 바람직하지 않은 항생제 저항성을 나타내었고, 안전성 염려로 인하여 폐기되었다. 빌 인퓨전 브로스 내에서 밤새 배양한 경우 대부분의 균주에 대하여 좋은 성장이 관찰된 반면에, 16%는 발효에 적합한 배지 중에서 만족스럽지 않은 성장을 나타내었다. 스크리닝 과정의 2단계에서, 항생제 저항성이 없는 32종의 선별된 균주가 gyrB 유전자의 시퀀싱 및 PFGE 핑거프린팅에 의하여 동정되었다. 또한 그들의 선별된 병원균에 대항 항균 효과를 시험하였고, 분리체 간에 상당한 차이가 관찰되었다. 분리체 중 몇몇은 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 억제를 나타낸 반면에, 오직 소수의 분리체만이 대장균을 억제하였다. 따라서 본 발명의 결과는 클로스트리디움 퍼프린젠스 및 대장균 둘 모두의 성장을 억제하는 것은 드물게 조합된다는 것을 확인시켜 준다. 스크리닝 과정의 3단계는 고도의 병원균 억제를 갖는 10종의 균주와 관련되었으며, 포자의 열 안정성의 측정, 게놈 시퀀싱 및 타이트 정션에 대한 효과를 보여주는 추가적인 시험관 연구를 포함하였다.
본 발명은 (i) 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대한 민감성을 특징으로 하는 바실러스 균주를 제공한다.
용어 "앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대한 민감성"이란, 특정 항생제에 민감한 것으로 여겨지는 균주는 표 1에 개요된 EFSA(EFSA, 2008)에 의하여 주어지는 브레이크 포인트 레벨에서 성장해서는 안된다는 것을 의미한다.
표 1에 개요된 MIC 값은 인간 및 수의학적으로 중요한 항생제에 대한 박테리아 저항성 평가에 사용되는 기준이 갱신된 EFSA (Technical guidance prepared by the Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP)에 의하여 발행된 가이드라인에 근거한 것이다. 문헌(The EFSA Journal (2008) 732, 1-15)은 바실러스 속을 위한 항생제의 리스트 및 허용가능한 컷 오프 값을 제공한다. 바실러스의 경우, 앰피실린에 대하여 EFSA가 제공한 브레이크 포인트가 존재하지 않지만, 몇몇 다른 박테리아, 즉 락토바실러스 종에 대해서는 브레이크 포인트가 존재한다. 그리하여, 앰피실린에 대한 바실러스 균주의 이러한 민감성은 본 발명의 브레이크 포인트로서 선택되었다.
표 1은 인간에 대하여 흔히 사용되는 다양한 항생제에 대한 EFSA 브레이크 포인트이다.
항생제 타입 항생제 EFSA 브레이크 포인트
mg/L
β-락탐 앰피실린 4
글라이코펩타이드 반코마이신 4
아미노글리코시드 젠타마이신 4
카나마이신 8
스트렙토마이신 8
매크롤라이드 에리트로마이신 4
린코사미드 클린다마이신 4
테트라사이클린 테트라사이클린 8
클로로암페니콜 클로람페니콜 8
본 발명의 범위에 속하기 위하여, 균주는 상기 항생제 모두에 대하여 민감하여야 한다. 실제로, 이는 미세 희석 기법(minimum inhibitory concentration (MIC))에 의하여 시험되는 경우에, 브레이크 포인트에서 균주의 성장이 관찰되지 않음을 의미한다.
본 발명에 따라, MIC는 다음과 같이 수행된 CLSI(임상 및 실험 기준 인스티튜트 M07-A8 및 M45-A2)의 기준에 의하여 개요된 바와 같은 브로스 미세 희석 기법에 의하여 측정된다:
시험 대상 균주의 밤새 성장 현탁액을, 시험 대상 항생제의 2배 일련 희석(총 부피: 100 ㎕/웰) 중에 대략 105 cfu/ml(콜로니-형성 유닛/ml)의 농도로, 마이크로틸터 플레이트 중의 ISO-SENSITEST 브로스(Oxoid CM0473) 중으로 접종하고, 37oC에서 호기성으로 20-24 시간 동안 배양한다. 항생제 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜을 포함하는 사전 제작된 패널 VetMIC Lact-1 & Lact-2을 사용할 수 있다. 24시간 후의 결과를 시각적 성장을 억제하는 항생제의 최소 농도로 기록한다.
본 발명의 관점 (ii)의 첫 번째 부분은 대장균에 대하여 항균 활성을 나타내는 바실러스 균주와 관련된다. 본 발명에 따라 이는 다음과 같이 수행된 대장균 아가 스폿 시험에 의하여 측정된다;
빌 인퓨전 브로스(VIB) 9 ml에 시험 대상 바실러스 배양물을 접종하고 37℃ 및 175 rpm에서 밤새 배양한다. 이와 동시에, 뇌 심장 인퓨전(BHI) 브로스 9 ml에 대장균 O149 (O149:k91,k88a), 대장균 O147 (O147:K89 F4) 및 대장균 O101 (O101, F5)로부터 선택된 대장균 균주를 접종하고 37℃에서 밤새 배양한다.
대장균 밤새 배양물 2 ml 부피를 50℃에서 액상 VIB 아가 200 ml에 각각 첨가하고, 각각의 생분석 접시로 붓는다. 살균 벤치에서 접시를 건조시킨다. 시험 대상 바실러스 밤새 배양물을 대장균이 혼합된 VIB 아가의 표면 위로 스폿시키고, 37℃에서 2일 간 배양한다. 스폿 주변의 억제 영역의 반경 및 스폿 직경을 기록한다.
바실러스 균주는 만일 억제 영역이 적어도 1.5 mm이라면, 대장균에 대한 항균 활성을 나타내는 것으로 여겨진다. 좋기로는 억제 영역은 적어도 2.0 mm, 예컨대 적어도 2.5 mm, 더 좋기로는 적어도 3 mm, 가장 좋기로는 적어도 3.5 mm 그리고 더욱 더 좋기로는 적어도 4 mm이다. 억제 영역은 다양한 대장균 균주에 따라 상이할 수 있다. 본 발명에 따라 균주가 대장균에 대한 항균 활성을 나타내는 것으로 간주되기 위해서는, 시험된 모든 대장균 균주에 대하여 적어도 1.5 mm의 억제 영역을 나타내어야 한다. 좋기로는, 2종 또는 심지어 그 이상의 억제 영역, 좋기로는 대장균 균주 3종 모두의 억제 영역이 적어도 2 mm이다. 본 발명의 바실러스는 대장균 성장 억제, 특히 시험된 종들의 성장을 억제하는 것을 특징으로 한다. 선행 기술에 의하여 입증되고, 본 발명에 의하여 확인된 바와 같이, 하나의 대장균 종의 성장을 억제하지 못하는 것은 또 다른 대장균 종의 성장을 억제하지 못하는 것과 종종 조합되며(표 5, Barbosa et al., 2005), 그 역도 마찬가지인데, 즉 하나의 대장균 종에 대한 억제 활성은 다른 대장균 종들에 대한 억제 효과와 종종 조합된다(표 1, Guo et al., 2006).
본 발명의 관점 (ii)의 두 번째 부분은 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 항균 활성을 나타내는 바실러스 균주와 관련된다. 본 발명에 따라 이는 다음과 같이 클로스트리디움 퍼프린젠스 아가 스폿 시험에 의하여 측정된다:
VIB 9 ml에 시험 대상 바실러스 배양물을 접종하고, 37℃ 및 175 rpm에서 밤새 배양한다. 그와 동시에 BHI 브로스 9 ml에 클로스트리디움 퍼프린젠스 A형, DSM 756을 접종하고, 혐기성 단지 내 37℃에서 밤새 배양한다.
바실러스 배양물을 페트리 디쉬 내 VIB 아가의 표면에 스폿하고 37℃에서 밤새 배양한다. C. 퍼프린젠스 밤새 배양물 2 ml의 부피를 액상 BHI 아가 200 ml와 혼합하고, 성장한 바실러스 스폿을 갖는 VIB 아가 위로 붓는다. 접시를 37℃에서 1일 동안 혐기성으로 배양한다. 스폿을 둘러싼 깨끗해진 억제 영역의 반경을 측정한다.
만일 억제 영역이 5 mm 이상이라면, 바실러스 균주는 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 항균 활성을 나타내는 것으로 여겨진다. 좋기로는 억제 영역은 6 mm이고, 더 좋기로는 적어도 7 mm이다. 본 발명의 바실러스 균주는 클로스트리디움 퍼프린젠스의 성장 억제, 특히 시험된 종의 성장 억제를 특징으로 한다. 본 분야에서 숙련된 자에게 알려져 있는 바와 같이, 하나의 종의 성장을 억제하지 못하는 것은 다른 클로스트리디움 퍼프린젠스 종들의 성장도 억제하지 못하는 것과 종종 조합되고, 그 역도 그러한데, 즉 하나의 클로스트리디움 퍼프린젠스 종의 성장 억제는 다른 클로스트리디움 퍼프린젠스 종들의 성장 억제와 종종 조합된다.
바실러스 세포는 바실러스 포자 세포와 바실러스 영양 세포로서 존재한다. 본 명세서에서 바실러스 세포가 언급될 때, 이는 둘 모두와 관련된다.
바실러스 포자 세포와 관련하여 용어 "바실러스 포자"는, 여기서 본 기술 분야에 따라 바실러스 박테리아가 생산하는 휴면기의, 강인한, 비생식 구조를 특징으로 하는 포자와 관련이 있다. 포자의 1차적 기능은 일반적으로 환경적 스트레스 기간 동안에 박테리아의 생존을 확보하기 위한 것이다. 그러므로, 그들은 자외선, 감마선, 건조, 리소자임, 온도, 굶주림 및 화학적 살균제에 대하여 저항성을 가진다. 포자는 토양 및 물에서 흔하게 발견되는데, 여기서 그들은 오랜 시간 동안 생존할 수 있다. 포자의 껍데기는 다수의 독성 물질이 투과할 수 없고 발아와 관련된 효소들을 또한 포함하고 있을 수 있다. 중심은 DNA 및 리보솜과 같은 정상적인 세포 구조를 가지고 있지만, 대사적으로 불활성이다. 박테리아가 바람직하지 않게 되는 환경 조건을 감지하면 포자 형성의 과정을 개시하는데, 이는 약 8시간이 걸린다.
용어 "바실러스 영양 세포"는 바실러스의 기능적 영양 세포와 관련되는데, 이는 더 많은 영양 세포를 생산하기 위하여 분열할 수 있다.
관점 (iii)에서, 본 발명은 제 2일에 측정한 경우 적어도 80 퍼센트의 포자 형성 비율을 나타내는 바실러스 균주와 관련된다. 본 발명에 따라, 포자 형성 비율은 다음과 같이 분석된다;
시험 대상 바실러스 균주 50 ㎕ 부피를 딥 웰(DW) 플레이트 내의 VIB 700 ㎕에 첨가하고, 37 ℃ 및 175 rpm에서 밤새 배양한다. 바실러스 밤새 배양액 50 ㎕ 부피를 DW 플레이트 내 (w/w) 95% 물; 1.5% 질소원(즉, 효모); 3% 수크로오스; 0.06% 마이크로미네랄; 디포타슘하이드로겐포스페이트 0.1%를 포함하는 포자 형성 배지 700 ㎕로 이전시킨다. 플레이트를 37℃ 및 175 rpm에서 3일 동안 배양한다. 배양 1일(24시간), 2일(48시간) 및 3일(72시간) 후에, 포자 형성을 현미경적으로 추적하고 포자 비율(총 바실러스 세포 수와 비교한 포자의 수)를 시각적 평가에 의하여 측정한다.
용어 "제 2일에 측정한 경우 적어도 80 퍼센트의 포자 형성 비율을 갖는"은 세포 배양 2일 후 적어도 80%가 포자를 형성하였음을 의미한다. 포자 형성 비율은 좋기로는 더 높을 수도 있는데, 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%일 수 있다. 본 발명의 중요한 목적은 동물 사료 생산에 유용한 균주를 제조하기 위하여, 높은 포자 형성 비율을 갖는 세포를 구비한 바실러스 균주를 선별하는 것에 있다. 높은 포자 형성 비율로도 지칭할 수도 있는 높은 포자 형성 비율은 앞서 기술한 바와 같이 높은 생산 효율을 위하여 필요하다.
앞서 기술한 바와 같이, 선행 기술은 바실러스 균주를 선별하는 방법을 기술하였지만, 선행 기술의 스크리닝 방법은 포자 형성 비율에는 초점을 맞추지 않았다. 그에 따라, 선행 기술에 의하여 선별된 바실러스 균주는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 포자 형성 비율을 만족시킬 정도로 충분한 포자를 형성하지 않을 확률이 높다.
높은 성장 특성 및 포자 형성, 항생제 비저항성 및 높은 항균 활성의 조합된 능력을 갖는 3가지 균주가 선별되고 기탁되었다. 그러나 다른 균주들, 특히 바실러스 아밀로리쿼페이션스 종의 균주들(표 2 및 3의 균주 D-J 참조) 또한 청구항에 기술된 기준을 만족하며, 따라서 본 발명의 범주 내에 포함된다.
특히 도 1에서 입증된 바와 같이, 바실러스 아밀로리쿼페이션스 종의 많은 균주가 본 발명의 범주 내에 속한다. 지금까지 바실러스 속의 항균 효과는 균주-특이적이고 종과 관련된 것이 아니라고 여겨져 왔기 때문에, 많은 바실러스 아밀로리쿼페이션스 균주가 항균 효과를 갖는다는 것은 놀라운 사실이다.
상세한 분석법 기술에 근거하여, 본 분야에서 통상의 기술을 가진자는, 특정 바실러스 균주가 본 발명의 다양한 관점이 갖는 항목 (i)의 민감성, 항목 (ii)의 항균 활성 및 항목 (iii)의 포자 형성 비율을 만족시키는지 여부를 판단하기 위하여, 이들 분석법을 반복할 수 있다. 이러한 방법으로 본 분야에서 통상의 기술을 가진자는 언급된 특성들을 가지는 균주를 끊임없이 생산할 수 있을 것이다. 선별 방법은 또한 우선, (iv) pH 4에서 영양 세포가 갖는 민감성을 분석하는 단계 및 (v) 균주가 장내 트랙에서 충분한 정도로 생존할 수 있게 보장하기 위하여 담즙 저항성을 분석하는 단계를 포함할 수 있을 것이다. 명백하게 이들 분석법은 임의의 순서로 수행될 수 있을 것이며, 몇몇 균주는 그들이 기준을 충족하지 못한다면 과정 중에 배제될 수 있다.
문헌에 따르면 담즙은 동물의 GIT 내에서 바실러스 포자 세포가 생존 및 발아 및 영양 세포로 성장하는 것에 대해 몇 가지 부정적인 영향을 미친다는 것으로 알려져 있다. 그러므로 일반적으로 프로바이오틱 박테리아는, 동물 사료에 첨가하기 위한 프로바이오틱 바실러스 조성물로서 사용하기 위하여, 낮은 pH를 견딜 수 있고 담즙염에 저항할 능력을 가지어 동물의 장내에서 생존하고 증식할 수 있어야 할 것이다. 실시예들은 이와 관련하여 유용한 시험관 시험을 제공한다. 낮은 pH(모의 위장 환경)에 대한 민감성 시험은 pH 4에 대한 영양 세포의 저항성에 초점을 맞춘다. 포자는 2-3의 pH 값에 저항성을 갖고 영양 세포는 pH 2에서 사멸한다는 것은 잘 알려져 있다. 그러나, 위장의 pH는 특히 사양 조건에서는 4까지 증가된 pH 값을 가질 수 있다. 이는 포자의 발아를 야기할 수 있으며, 따라서 pH 4에서 영양 세포의 민감성을 시험하는 것이 적절하다. 선별된 균주는 좋기로는 pH 4에 저항성이어야 한다. 선별된 균주들의 결과는 표 2에 나타내었다.
본 발명의 균주는 바실러스 속에 속하는데, 좋기로는 바실러스 아밀로리쿼페이션스 종의 것 중의 하나로, 예컨대 바실러스 아밀로리쿼페이션스 아종 아밀로리쿼페이션스 또는 바실러스 아밀로리쿼페이션스 아종 플란타룸, 바실러스 심플렉스, 바실러스 린체니포미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 모자벤시스, 바실러스 푸밀러스, 바실러스 사펜시스, 바실러스 심플렉스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아트로페어스, 바실러스 메틸로트로피쿠스, 바실러스 시아멘시스, 바실러스 발리스모르티스 또는 바실러스 테퀼렌시스가 있다.
261개의 균주를 동정한 초기 방법은 16S에 기반한 것이었다. 이 방법은 밀접하게 관련된 몇몇 바실러스 종들을 구분하지 못한다. 그리하여 하나의 균주는 바실러스 아밀로리쿼페이션스/애트로패우스/메틸로트로피쿠스/시아멘시스/발리스모르티스 종으로 구성된 군, 또는 바실러스 모자벤시스/서브틸리스/테퀼렌시스 종으로 구성된 군과 관련된 것으로서 동정될 수 있다. 두 군 모두 본 발명의 기준을 만족시키는 많은 균주를 포함하고, 따라서 이들 군은 본 발명의 중요한 구현예를 대표한다.
적절한 것으로 인정된 경우, 균주는 더 자세한 방법(gyr B)에 의하여 추가로 동정되었다. 표 2 및 3에 기재된 데이터는 주로 바실러스 아밀로리쿼페이션스(gyr B에 의하여 동정됨)에 근거한 것이다. 선별된 바실러스 아밀로리쿼페이션스 분리체들은 RNA 폴리머라제 베타 서브유닛(rpo B) 유전자 서열 분석에 의하여 추가로 동정되었으며, 밝혀진 아종들은 표 4, 5 및 6에 나타내었다.
균주는 열 안정성을 나타내는 것이 바람직하다. 선별된 균주들에 대한 결과는 표 4에 나타내었다. 99.5℃에서의 열 안정성은 시간 0과의 관계에서 2, 5 및 10분 후 감소로서 cfu로 측정된다(log/log). 2 미만의 감소는 통상적인 상업적 바실러스 포자 형성에서 얻어진다. 본 발명의 범주 내에 속하는 균주들의 경우, 감소는 좋기로는 2분 후에 0.5 또는 그 미만, 더 좋기로는 0.25 또는 그 미만, 가장 좋기로는 0.05 또는 그 미만이어야 한다. 바람직한 구현예에서 5분 후의 감소는 좋기로는 2.5 또는 그 미만, 더 좋기로는 1 또는 그 미만, 가장 좋기로는 0.5 또는 그 미만이어야 하고, 또한 10분 후의 감소는 좋기로는 2.5 또는 그 미만, 더 좋기로는 1 또는 그 미만, 가장 좋기로는 0.5 또는 그 미만이어야 한다. 표에 있는 모든 균주들이 적절한 열 안정성을 나타낸다. 표에서 입증되는 바와 같이, 균주 B, D 및 F는 심지어 10분 후에도 대단히 높은 열 안정성을 갖는다. B 및 F 둘 다 바실러스 아밀로리쿼페이션스 아종 아밀로리쿼페이션스 균주들로서 이 아종들을 본 발명의 바람직한 구현예로 만들고 있다는 것이 주목할 만하다.
효소 생산은 실시예 4에서 연구되었다. 본 발견은 모든 연구된 균주에 대하여 셀룰라아제 활성이 50 mU/ml 이상임을 보여준다. 이와 같은 활성은 본 발명의 바실러스 균주의 유용한 특성이 될 것으로 여겨진다. 특정 구현예에서, 균주는 심지어 더 높은 셀룰라아제 활성을 갖는 것이 선호될 수 있는데, 예컨대 아종으로서 본 발명의 바람직한 구현예를 구성하는 B. 아밀로리쿼페이션스 아종 플란타룸 균주에서 발견되는 바와 같이, 100 mU/ml 또는 그 이상 일 수 있다. 본 발명의 범주 내에 속하는 균주들의 경우, 셀룰라아제 활성이 좋기로는 50 mU/ml 또는 그 이상, 더 좋기로는 100 mU/ml 또는 그 이상, 가장 좋기로는 250 mU/ml 또는 그 이상, 더 더욱 좋기로는 400 mU/ml 또는 그 이상이어야 한다.
몇몇 균주는 70 mU/ml 이상의 높은 자일라나제 활성을 나타낸다. 표 5는 연구된 균주들의 경우 높은 셀룰라아제 활성이 반드시 40000 RFU/OD 이상으로 정의되는 높은 자일라나제 또는 높은 프로테아제 활성과 결합되는 것은 아니라는 것을 보여준다. 모두 B. 아밀로리쿼페이션스 아종 플란타룸인 균주 G, I 및 J는 세 효소 모두에 대해 높은 활성을 나타내는 균주의 예이다.
바람직한 구현예에서, 바실러스 균주는 바실러스 서브틸리스, 바실러스 모자벤시스 또는 바실러스 아밀로리쿼페이션스이다. 가장 바람직하게, 균주는 (a) 수탁번호 DSM 25839를 갖는 바실러스 모자벤시스 균주 CHCC 15510; (b) 수탁번호 DSM 25840, 수탁번호 DSM 27032 및 수탁번호 DSM 27033를 갖는 바실러스 아밀로리쿼페이션스 균주들; (c) 수탁번호 DSM 25841를 갖는 바실러스 서브틸리스 균주; 및 이들의 돌연변이 균주로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 관점은
(a) 수탁번호 DSM 25839를 갖는 바실러스 모자벤시스 균주;
(b) 수탁번호 DSM 25840, 수탁번호 DSM 27032 및 수탁번호 DSM 27033를 갖는 바실러스 아밀로리쿼페이션스 균주들, 또는
(c) 수탁번호 DSM 25841를 갖는 바실러스 서브틸리스 균주의 돌연변이 균주를 취득하는 방법에 관한 것이다.
이 방법은 균주에 임의로 돌연변이 처리를 하는 단계 및 다음의 특성을 갖는 돌연변이 균주를 선별하는 단계를 포함한다:
(i) 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대한 민감성;
(ii) 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 항균 활성; 및
(iii) 2일에 측정시 적어도 80의 포자 형성 비율.
돌연변이 균주를 얻기 위하여 아래에서 더욱 상세하게 기술되는 돌연변이 처리를 균주에 가할 수 있으며, 그 다음에 선별 과정이 수행된다. 아니면, 선별은 돌연변이체를 발생시킴과 동시에 수행된다.
돌연변이 균주를 얻는 방법은 또한 (iv) pH 4에서 영양 세포가 갖는 민감성을 분석하는 단계, 및 (v) 장내 관에서 충분한 정도로 생존할 수 있는 균주의 능력을 보장하기 위하여 담즙 저항성을 분석하는 단계를 포함할 수도 있다. 명백하게 이들 분석법은 임의의 순서로 수행될 수 있으며, 몇몇의 균주는 만일 그들이 기준을 충족시키지 못한다면 과정 중에서 배제될 수 있다.
여기서 사용되는 박테리아 "균주"는 성장 또는 분열시킬 때 유전적으로 변함없이 남아있는 박테리아를 의미한다. 동일한 박테리아의 다수가 포함된다.
"야생형 균주"는 자연에서 발견되는 바와 같이 박테리아의 변이되지 않은 형태를 의미한다.
"돌연변이 박테리아" 또는 "돌연변이 균주"는 그것의 게놈(DNA) 내에 야생형 DNA에는 존재하지 아니하는 1 이상의 변이를 포함하는, 자연적(자발적으로, 자연발생적으로) 돌연변이 박테리아 또는 유도된 돌연변이 박테리아를 의미한다. "유도된 돌연변이"는 변이가 화학적 돌연변이 유발원으로 처리하는 것을 포함하여 돌연변이화 처리에 통상적으로 사용되는 처리법과 같이, 인간 처리에 의하여 유도된 박테리아를 말하는데, 여기서 화학적 돌연변이 유발원이란 예컨대 (i) 염기 유사체와 같이, DNA와 관련 또는 DNA 속으로 혼입되는 돌연변이 유발원, 예컨대 2-아미노퓨린 또는 ICR-191과 같은 인터킬레이트제, (ii) 알킬화제를 포함하는 DNA와 반응하는 돌연변이 유발원, 예컨대 니트로소구아니딘 또는 하이드록시아민, 또는 에탄 메틸 설포네이트(EMS) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘(NTG), UV- 또는 감마 방사선 등으로부터 선택되는 것 등이 있다. 이와 대조적으로 "자발적 변이체" 또는 "자연 발생적 변이체"는 인간에 의하여 돌연변이화 되지 않았다.
돌연변이체는 수개의 돌연변이 처리에 처해 질 수도 있는데(단일의 처리란 스크리닝/선별 단계가 뒤따르는 하나의 돌연변이화 단계로 이해되어야 한다), 20을 초과 또는 10을 초과 또는 5를 초과하는 처리(또는 스크리닝/선별 단계)는 수행되지 않는 것이 현재 바람직하다. 현재 바람직한 변이체에서, 모체 균주와 비교하여 박테리아 게놈 내 뉴클레오타이드의 1% 미만, 0.1 미만, 0.01 미만, 0.001% 미만 또는 심지어 0.0001% 미만이 다른 뉴클레오타이드로 교체되거나 결실되었다.
상기에서 기술된 변이 박테리아는 GMO가 아닌데, 즉 DNA 재조합 기술에 의하여 변형된 것이 아니다. 무작위 돌연변이화에 의하여 변이체를 제공하는 상기 바람직한 방법의 대안으로서, 부위-특이적 돌연변이 유도에 의하여 그와 같은 변이체를 제공하는 것이 또한 가능한데, 예컨대 적절하게 디자인된 PCR 기법을 사용하거나 또는 박테리아 레플리콘 내에 통합시킬 수 있는 수송가능한 요소의 사용에 의할 수 있다.
변이체가 자발적으로 발생하는 변이체로서 제공되는 때에는, 그 어떠한 선행하는 돌연변이 처리없이, 상기 야생형 균주를 선별의 단계에 둔다.
몇몇의 바실러스 종은 GRAS 상태를 갖는데, 즉 그들은 일반적으로 안전한 것으로 인식된다. 모든 바실러스 서브틸리스 균주는 GRAS이다. 본 명세서에 기술되는 바실러스 균주들은 호기성이고 조건적 포자 형성자이다. 바실러스 종은 GRAS로 여겨지는 유일한 포자 형성자이다. GRAS 상태를 가지는 미생물을 가축에 급여하는 것은 생산자, 수의사 및 축산업의 다른 종사자들 사이에서 허용되는 관습이다.
이에 따라, 본 발명의 다른 관점은 본 발명의 바실러스 균주의 세포를 포함하는 바실러스 조성물과 관련된다. 상기 조성물은 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종. 또는 심지어 그보다 많은, 본 발명의 적어도 하나의 균주로부터 선택된 바실러스 균주를 포함할 수 있다. 좋기로는 바실러스 조성물의 세포는 포자 세포이다.
조성물의 적절한 바실러스 균주는, 통상의 기술자에게 알려진 상업적으로 적절한 형태로 존재할 수도 있다. 이에 따라 일 구현예에서, 조성물의 바실러스 균주는 건조(예컨대 분무 건조)된 세포 또는 동결 세포로서 존재한다. 조성물은 액상, 슬러리, 분말 또는 펠렛의 형태와 같은 임의의 적당한 형태로서 제공될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 바실러스 조성물은 105 내지 1012 CFU/g, 더 좋기로는 106 내지 1012 CFU/g, 및 가장 좋기로는 107 내지 1012 CFU/g를 포함한다.
용어 "CFU/g"는 조성물의 그램 중량, 예컨대 조성물 내 존재하는 적절하고 관련있는 첨가제를 포함하여 관련된다. 통상의 기술자에게 알려진 바와 같이, 상업적으로 적절한 박테리아 조성물은 일반적으로 다른 적절한 첨가제를 또한 포함하는데, 예컨대 유청, 유청막투과액, 칼슘 카보네이트/석회 및 고화방지제, 예컨대 알루이늄 실리케이트 및 키셀구르(규조토)에 속하는 군의 1종의 캐리어/성분과 같은 것을 포함한다. 이는 바실러스 조성물을 포장하기 위하여 사용되는 적절한 용기의 무게는 포함하는 것이 아니다. 일 구현예는 적절한 용기 중으로 포장된 조성물과 관련된다.
본 발명의 조성물은 돌연변이체를 포함하는 본 발명의 바실러스 균주, 및 본 조성물을 동물의 사양에 적합하게 하기 위한 식품 첨가제 또는 음용수 첨가제로서 캐리어를 포함할 수 있다. 또는 돌연변이체를 포함하는 본 발명의 바실러스 균주는, 단백질 사료 및/또는 탄수화물 사료를 포함하는 동물 사료 성분과 함께 조제될 수도 있다. 그와 같은 조합은 표준 펠렛화 공정을 통하여 사출된 펠렛의 형태일 수도 있다.
본 명세서에 기술된 바실러스 조성물은 동물 사료에 프로바이오틱 첨가제로서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 동물 사료에 본 발명의 바실러스 조성물을 첨가하는 것을 포함하는 동물 사료 또는 프리믹스를 제조하는 방법을 제공한다.
여기서 사용되는 용어 "프리믹스"는 프리믹스를 만들기 위하여 캐리어에 첨가된 바실러스 균주를 의미하는데, 그 다음 이는 원하는 혼입 속도로 사료에 첨가되고 동물에게 급여된다.
본 발명의 다른 관점은 본 발명의 바실러스 조성물 또는 본 발명에 따라 생산된 동물 사료 또는 프리믹스를 동물에게 투여하는 것을 포함하는 동물 사양 방법과 관련된다.
실시예 5는 균주 B 및 C를 이용한 사양 실험을 기술하고 있고, 젖먹이 사료에 보충된 바실러스 균주 프로바이오틱 제품 두 가지 모두, 음성적 대조군과 비교하여 수치적으로 향상된 생산 성능을 나타냄을 보여준다. 생산 파라미터에 대한 현저한 효과가 실험 동안에 관찰될 수 있었다. 두 바실러스 그룹과 두 실험 모두에서 치사율이 감소하였다.
장소 중 하나에서, 심각한 설사를 극복하기 위하여 엔로플락신으로 처리된 축사 당 처리된 동물의 수는, 바실러스를 급여한 동물들보다 대조군 사료를 급여한 동물들 중에서 현저하게 많았다(P>0.05).
따라서, 이러한 실시예는 본 발명의 바실러스 조성물의 투여가, 예컨대 대장균 및 클로스트리디움과 같은 병원균을 억제하는 것에 의하여, 동물의 질병을 치료 및 예방하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 바실러스 조성물은 복합 생균제(direct-fed microbial) 또는 동물 사료에의 첨가제로서 급여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 클로스트리디움 및 대장균과 같은 병원성 박테리아의 동물 장 내 성장을 감소시키기에 효과적인 양으로 동물에게 투여되거나 급여될 수 있다.
동물은 가금류, 반추 동물, 소, 돼지, 토끼, 말, 어류 및 애완동물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 동물은 예컨대, 소비를 위하여 사육되는 것으로 돼지와 같은 것, 식품 생산자로서 사육되는 육계 및 산란계와 같은 것과 같은 농장의 동물이다.
본 발명의 1종 이상의 바실러스 균주를 새끼 돼지에게 투여하는 방법이 또한 제공된다. 이와 같은 방법은 본 발명의 바실러스 균주 1종 이상을 새끼 돼지의 모체에게 급여하는 것을 포함할 수 있다. 균주(들)은 임신, 수유 및 둘 모두의 기간 동안에 급여될 수 있다. 바실러스 균주 1종 이상은 또한 젖먹이 돼지 및 성장이 완료된 돼지에게 급여될 수도 있다.
용어 "하나" 및 "단일" 및 "그것" 및 본 발명을 기술하는 문맥(특히 아래의 청구항의 문맥에서)에서 유사한 지시대상의 사용은, 본 명세서에서 다르게 지시되거나 또는 문맥에 의하여 명백하게 모순되는 것이 아닌 한, 단수 및 복수 둘 모두를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", "함유하는" 및 "들어있는"는, 다르게 지시되지 않은 한, 말미가 열린 용어(즉, "포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌"을 의미하는 것)로서 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값의 범위의 언급은, 본 명세서에 다르게 지시되지 않은 한, 범위에 속하는 각각의 분리된 값을 개별적으로 언급하는 단지 속기법으로서 기능하기 위하여 의도된 것이고, 각각의 분리된 값은 마치 그것이 개별적으로 본 명세서에 언급된 것과 같이 본 명세서에 통합된다. 본 명세서에 기술된 모든 방법은, 본 명세서에 다르게 지시되거나 문맥에 의하여 명백하게 모순되는 것이 아닌 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 임의의 및 모든 실시예, 또는 예시적인 언어(예컨대, "와 같은")의 사용은, 단지 본 발명을 더 잘 기술하기 위한 것이고, 다르게 청구되지 않은 한, 본 발명의 범주에 제한을 가하는 것이 아니다. 그 어떠한 언어도 청구되지 않은 임의의 요소가 본 발명의 실시에 필수적인 것을 지시하는 것으로 해석되어져서는 아니된다.
기탁된 균주들
바실러스 모자벤시스(Bacillus mojavensis) 균주 CHCC 15510가, 덴마크의 Chr. 한센 A/S에 의하여, 2012년 4월 3일에 수탁번호 DSM 25839 하에서 DSMZ(도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 f쿨투렌 게엠베하, 인호펜슈트라세 7베 데-38124 브라운쉬바이크)에 기탁되었다. 기탁은 특허 절차 목적을 위하여 미생물 기탁의 국제적 인식을 위한 부다페스트 조약의 조건 하에서 이루어졌다.
바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 CHCC 15516가 덴마크의 Chr. 한센 A/S에 의하여, 2012년 4월 3일에 수탁번호 DSM 25840 하에서 DSMZ(도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 f쿨투렌 게엠베하, 인호펜슈트라세 7베 데-38124 브라운쉬바이크)에 기탁되었다. 기탁은 특허 절차 목적을 위하여 미생물 기탁의 국제적 인식을 위한 부다페스트 조약의 조건 하에서 이루어졌다.
바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 CHCC 15536가 덴마크의 Chr. 한센 A/S에 의하여, 2013년 3월 21일에 수탁번호 DSM 27032 하에서 DSMZ(도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 f쿨투렌 게엠베하, 인호펜슈트라세 7베 데-38124 브라운쉬바이크)에 기탁되었다. 기탁은 특허 절차 목적을 위하여 미생물 기탁의 국제적 인식을 위한 부다페스트 조약의 조건 하에서 이루어졌다.
바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 CHCC 15539가 덴마크의 Chr. 한센 A/S에 의하여, 2013년 3월 21일에 수탁번호 DSM 27033 하에서 DSMZ(도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 f쿨투렌 게엠베하, 인호펜슈트라세 7베 데-38124 브라운쉬바이크)에 기탁되었다. 기탁은 특허 절차 목적을 위하여 미생물 기탁의 국제적 인식을 위한 부다페스트 조약의 조건 하에서 이루어졌다.
바실러스 서브틸리스(The Bacillus subtilis) 균주 CHCC 15541가 덴마크의 Chr. 한센 A/S에 의하여, 2012년 4월 3일에 수탁번호 DSM 25841 하에서 DSMZ(도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 f쿨투렌 게엠베하, 인호펜슈트라세 7베 데-38124 브라운쉬바이크)에 기탁되었다. 기탁은 특허 절차 목적을 위하여 미생물 기탁의 국제적 인식을 위한 부다페스트 조약의 조건 하에서 이루어졌다.
상기 언급된 기탁된 미생물 모두에 대하여 다음의 추가적 지시가 적용된다:
지정된 개별 국가의 개별 특허청에 관하여, 출원인은 상기 언급된 기탁된 미생물 시료가, 특허가 수여되는 날 또는 본 출원이 거절 또는 철회되는 날 또는 철회 간주 되는 날까지, 오직 요청자에 의하여 지명된 전문가에게만 이용가능하도록 할 것을 요청한다.
본 발명의 구현예는 비제한적인 실시예로서 아래 기술된 바와 같다.
실시예
실험재료:
빌 인퓨전 브로스(VIB) (Difco, 234420)
빌 인퓨전 브로스(VIB) 아가(VIB + 1.5% 아가 박테리오로지칼(아가 넘버 1), 옥소이드 LP0011)
T3 아가 플레이트(리터 당: 트립톤 3 g, 트립토스 2 g, 효모 추출액 1.5 g, 0.05 M 소듐 디하이드로겐 포스페이트 및 MnCl2 [pH 6.8] 0.005 g, 및 아가 15 g)
로라 베르타니(LB) 브로스(g/L: 박토 트립톤 10 (Difco 0123), 효모 추출액 5 (옥소이드 L21), NaCl 10 (머크 nr. 106404))
뇌 심장 인퓨전(BHI) 브로스(옥소이드 CM225)
뇌 심장 인퓨전(BHI) 아가(옥소이드 CM375)
담즙염(담즙 추출물, 돼지; 시그마 B8631)
바이오에세이 디쉬(Nunc 240845)
페트리 디쉬(프로쿠단 140096, 립을 구비한 페트리 디쉬)
포자 형성 배지: %(w/w) 95% 물; 1.5% 질소원(즉, 효모); 3% 당류; 0.06 % 마이크로미네랄; 디포타슘하이드로겐포스페이트 0.1%.
펩톤을 구비한 생리 식염수(0.9% 염화나트륨, 1% 펩톤) FKP
VetMIC Lact-1 & Lact-2 (SVA, 웁살라, 스웨덴)
ISO-SENSITEST 브로스 (옥소이드 CM0473)
배양:
바실러스 균주를 배설물, 토양, 식품 재료로부터 분리하고 균주 뱅크 콜렉션으로부터 수집하고, -80℃에서 MTP 마스터 접시 중 20% 글리세롤을 구비한 VIB 내에 유지 배양하였다.
항생제:
앰피실린(시그마, A9518-5G)
반코마이신(시그마, V1764-250MG)
젠타마이신(시그마, G1264-50MG)
카나마이신(시그마, K1377-1G)
스트렙토마이신(시그마, S6501-5G)
에리트로마이신(시그마 E-5389)
클린다마이신(시그마, C2569-10MG)
테트라사이클린(시그마 T-7660)
클로람페니콜(시그마, C0378-5G)
병원균:
대장균 O101 F5 (스테이트 세럼 인스티튜트, 코펜하겐, 덴마크)
대장균 O147:K89 F4 (스테이트 세럼 인스티튜트, 코펜하겐, 덴마크)
대장균 O149:k91,k88a (NCTC 10650) National Collection of Type Cultures
대장균 균주를 -80℃에서 MTP 마스터 접시 중 20% 글리세롤을 구비한 LB 내에서 유지 배양하였다.
클로스트리디움 퍼프린젠스 A 형, DSM 756을 -80℃에서 20% 글리세롤을 구비한 BHI내에서 유지 배양하였다.
실시예 1: 사전-스크리닝
토양 및 배설물과 식품 재료로부터 유래한 261개 분리체에 대하여, 항생제 민감성, 병원균 억제, 담즙 저항성 및 낮은 pH에 대한 민감성에 대하여 사전 스크리닝을 행하였다.
1.1 항생제 민감성
MTP 마스터 플레이트로부터 바실러스 균주 50 ㎕ 부피를 DW 플레이트 내 VIB 700 ㎕ 속으로 첨가하고, 37 ℃ 및 175 rpm에서 밤새 배양하였다. 표 1에 열거된 항생제를 2가지 농도로 보충한 ISO 시험 시료 및 항생제가 없는 ISO 대조군을 180 ㎕의 부피로 MTP 플레이트에 첨가하였다. 바실러스의 밤새 배양물을 10배로 희석하고 20 ㎕의 분량으로 ISO 시험 시료 및 대조군으로 전달하였다. MTP 플레이트를 37℃에서 배양하였다. 620 nm에서 광학밀도(OD)를, 배양 24시간 및 48시간 후에 접종원 및 MTP 시험 플레이트 중에서 측정하였다. 박테리아의 항생제 민감성을 ISO 대조군 중의 OD에 대한 ISO 시험 시료의 OD값의 퍼센트로서 측정하였다.
1.2 병원균 억제를 위한 바실러스 균주의 스크리닝
MTP 마스터 플레이트로부터 바실러스 균주 50 ㎕ 부피를 DW 플레이트 내 VIB 700 ㎕ 속으로 첨가하고, 37℃ 및 175 rpm에서 밤새 배양하였다. 분석 전에 대장균 균주를 30℃ LB 중에서 밤새 성장시켰다. C. 퍼프린젠스 CHCC14372를 37℃ 혐기성 단지 내 BHI 중에서 밤새 성장시켰다.
1.2.1 아가 스폿 테스트에 의한 대장균 억제
대장균 밤새 배양물 2 ml를 50℃에서 액상의 VIB 아가 200 ml와 혼합하고, 각각의 생분석 접시 속으로 부었다. 살균 벤치 중에서 접시를 건조시켰다. 바실러스 밤새 배양물을 각각 2 ㎕씩, 대장균과 혼합된 VIB 아가의 표면 위에 스폿시키고 37℃에서 2일간 배양하였다. 스폿을 둘러싼 깨끗해진 억제 영역의 반경을 측정하고 2 mm보다 큰 반경을 "높음", 0.5 - 2 mm 사이의 반경을 "중간", 0.5 mm보다 적은 반경을 "낮음"으로 기록하였다.
1.2.2 아가 스폿 테스트에 의한 C. 퍼프린젠스 억제
VIB 아가를 생분석 접시에 붓고(접시 당 200 ml), 살균 벤치 내에서 완전히 건조시켰다. 바실러스 밤새 배양물을 각각 2 ㎕씩, VIB 아가 접시의 표면 위에 스폿시키고 37℃에서 밤새 배양하였다. C. 퍼프린젠스 A형 CHCC14372를 2 ml의 부피로 액상 BHI 아가 200 ml 속으로 첨가하고, 혼합하고, 바실러스 스폿이 있는 생분석 접시 속으로 부드럽게 덧입혔다. 접시를 37 ℃ 혐기성으로 1일간 배양하였다. 스폿을 둘러싼 깨끗해진 억제 영역의 반경을 측정하고 2 mm보다 큰 반경을 "높음", 1 - 2 mm 사이의 반경을 "중간", 1 mm보다 적은 반경을 "낮음"으로 기록하였다.
1.2.3 웰 확산 테스트에 의한 C. 퍼프린젠스 억제
C. 퍼프린젠스 CHCC14372 밤새 배양물 2 ml를 액상 BHI 아가 200 ml와 혼합하고, 각각의 생분석 디쉬 속으로 부었다. 고형화한 후에 살균 송곳으로 BHI 아가 중에 10 mm 웰을 만들고, 바실러스 밤새 배양물 80 ㎕를 각각의 웰로 이전시켰다. 접시를 37℃에서 혐기성으로 1일간 배양하였다. 웰을 둘러싼 깨끗해진 억제 영역의 반경을 측정하고 2 mm보다 큰 반경을 "높음", 0.5 - 2 mm 사이의 반경을 "중간", 0.5 mm보다 적은 반경을 "낮음"으로 기록하였다.
1.3 담즙 저항성 실험
MTP 마스터 플레이트로부터 바실러스 균주 50 ㎕ 부피를 DW 플레이트 내 VIB 700 ㎕ 속으로 첨가하고, 37℃ 및 175 rpm에서 밤새 배양하였다. 바실러스 밤새 배양물을 50 ㎕ 부피로, DW 플레이트 내 0.3% 담즙염으로 보충된 VIP 800 ㎕(시험 시료) 및 담즙이 없는 VIB(대조군)로 이전시켰다. 플레이트를 37℃ 및 175 rpm에서 배양하였다. 담즙이 있는 VIB 중에서 0, 6 및 24 시간 시점에 620 nm에서의 광학 밀도(OD620)를 측정하고, VIB 대조군 내 대응하는 OD620 값으로부터 차감하였다. OD620 값의 차이에 따라 배양을 A (OD < 0.1), B (OD= 0.1-0.4) 및 C (OD > 0.4) 그룹으로 순위를 매겼다. 그룹 A 내의 균주는 담즙염에 가장 저항성인 것으로 여겨졌다. 선별된 균주는 그룹 A 또는 B에 있어야 한다. 선별된 균주의 결과를 표 2에 나타내었다.
1.4 낮은 pH에 대한 민감성(모의 위장 환경)
1.0 M 염산으로 pH4로 조절한 VIB 분량 800 ㎕ 및 VIB 대조군(pH7)을 DW 플레이트 내에 분산시켰다. MTP 마스터 플레이트로부터 바실러스 균주 50 ㎕ 부피를 DW 플레이트 속으로 첨가하고, 37℃ 및 175 rpm에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 0 및 24 시간 시점에 200 ㎕ 세포 현탁액 중에서 광학 밀도(OD620)를 측정하였다. pH4에서의 박테리아의 성장은, 배양 후 상응하는 OD620 값으로부터 배양 전 OD620 값을 차감하는 것에 의하여 정의되었다. 0.1 보다 더 큰 OD620 값의 증가를 나타낸 배양물은 pH4에 저항성인 것으로 여겨진 반면에(표 2에 R로 표시됨), 0.1 보다 더 작은 OD620 값(성장 없음 또는 음의 값)을 갖는 배양물은 pH4에 민감한 것으로 여겨졌다(표 2에 S로 표시됨).
1.5 사전-스크리닝 결과:
사전-스크리닝 테스트에 기초하여 제2차 스크리닝을 위한 32개 균주를 선별하였다. 선별된 균주는 기술된 항생제에 민감하고 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 둘 모두에 대하여 항생 효과를 나타내어야 하며, 다른 수행된 테스트에서 합리적으로 수행한다.
토양 및 배설물로부터 분리된 261개 분리체 중에서 161개 분리체가 사전-스크리닝 테스트에서 항생제 저항성이었다. 항생제에 대하여 민감한 100개 분리체 중에서 56개가 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 항균 효과를 가지며, 오직 22개만이 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 둘 모두에 대한 효과를 가졌다. 이들 중 12개 분리체는 B. 아밀로리쿼페이션스 종으로부터 유래한 것이었다. 다른 대표적인 균주는 B. 서브틸리스 및 B. 모자벤시스로부터 유래한 것이었다. 표 2 및 3은 Chr. 한센 전매 균주의 결과를 요약한 것이다(32개 균주 중 제2차 스크리닝을 위하여 선별된 22개).
실시예 2: 제2차 스크리닝
제1차 스크리닝의 결과에 기초하여 40개의 선별된 분리체 및 참조 균주를, 아가 스폿 테스트를 반복하여 병원균 억제에 대하여, 그리고 포자 형성에 대하여 시험하였다. 32개 균주는 또한 MIC 테스트에 의한 항생제 민감성에 대하여 시험하였다.
2.1 병원균 억제에 대한 바실러스 균주의 스크리닝
분석 전에 VIB 9 ml에 바실러스 배양물을 접종하고 37℃ 및 175 rpm에서 밤새 배양하였다. 동시에, BHI 브로스 9 ml에 대장균 균주를 접종하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 동일한 조건의 혐기성 단지 중에서 클로스트리디움 퍼프린젠스를 성장시켰다.
2.1.1 아가 스폿 시험에 의한 대장균 억제:
병원균 밤새 배양액을 각각 2 ml의 부피로 50℃에서 액상 VIB 아가 200 ml에 첨가하고, 각각 생분석 접시로 부었다. 접시를 살균 벤치에서 건조시켰다. 바실러스 밤새 배양물을 병원균이 혼합된 VIB 아가의 표면 위에 스폿시키고 37℃에서 2일간 배양하였다. 스폿 주위의 억제 영역의 반경 및 스폿 직경을 기록하였다.
2.1.2 아가 스폿 시험에 의한 C. 퍼프린젠스의 억제
바실러스 배양액을 페트리 디쉬의 VIB 아가 표면 위에 스폿시키고 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 2 ml 부피의 C. 퍼프린젠스 밤새 배양물을 액상 BHI 아가 200 ml와 혼합하고 성장한 바실러스 스폿이 있는 VIB 아가로 부었다. 접시를 혐기성으로 37℃에서 1일간 배양하였다. 스폿 주변의 깨끗해진 억제 영역의 반경을 측정하였다.
2.2 VIB 및 포자 형성 배지 중의 성장
50 ㎕ 부피의 바실러스 균주를 MTP 마스터 플레이트로부터 DW 플레이트의 VIB 또는 포자 형성 배지 700 ㎕에 첨가하고 37℃ 및 175 rpm에서 24시간 동안 배양하였다. 박테리아 성장은 200 ㎕ 현탁액 중에서 620 nm 광학 밀도(OD620)에 의하여 측정하였다. 포자 형성 배지의 높은 탁도와 웰 간 차이 때문에, 배양 전 OD620 값을 배양 후 대응하는 웰 내 OD620 값으로부터 차감하였다. 0.4 보다 더 큰 OD620 값을 나타낸 배양액을 그룹 A(높은 성장)으로 분류하고, 0.4 보다 적은 OD620 값을 그룹 B(낮은 성장)으로 분류하였다.
2.3 포자 형성 배지 중의 포자 형성
50 ㎕ 부피의 바실러스 균주를 MTP 마스터 플레이트로부터 DW 플레이트의 VIB 700 ㎕에 첨가하고 37℃ 및 175 rpm에서 밤새 배양하였다. 바실러스 밤새 배양물을 50 ㎕의 부피로, DW 플레이트의 포자 형성 배지(SM) 700 ㎕으로 이전시켰다. 플레이트를 37℃ 및 175 rpm에서 3일간 배양하였다. 배양 1일(24시간), 2일(48시간) 및 3일(72시간) 후에, 포자 형성을 현미경적으로 추적하고 포자 비율(총 세포에 대한 포자의 수)을 시각적 평가에 의하여 측정하였다.
2.4 MIC 에 의하여 측정한 항생제 민감성
다수개의 항생제에 대한 최소 억제 농도(MIC)를 측정하는 것에 의하여 균주의 항생제 민감성㎕을 분석하였다. 사용된 방법은 CLSI(임상 및 실험 표준 인스티튜트 M07-A8 및 M45-A2) 표준에 의하여 개요된 것과 같은 브로스 미세희석(microdilution) 기법이었다.
시험 대상 균주의 밤새 성장 현탁액을, 시험 대상 항생제의 2배 일련 희석(총 부피: 100 ㎕/웰) 중에 대략 105 cfu/ml(콜로니-형성 유닛/ml)의 농도로, 마이크로틸터 플레이트 중의 ISO-SENSITEST 브로스(Oxoid CM0473) 중으로 접종하고, 37oC에서 호기성으로 20-24 시간 동안 배양하였다. 항생제 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜을 포함하는 사전 제작된 패널 VetMIC Lact-1 & Lact-2을 사용할 수 있다. 24시간 후의 결과를 시각적 성장을 억제하는 항생제의 최소 농도로 기록하였다. 시험은 독립적인 생물학적 복제물로서 2회 수행하였다.
2.5 실험 결과
32개의 선별된 균주로부터의 결과는 바실러스 아밀로리쿼페이션스가 항생제 민감성, 항생 효과 및 포자 형성의 가장 최상의 조합된 특성을 갖는 것을 보여주었다(표 2 참조). Chr. 한센 전매 균주(32 균주 중 22개)와 관련된 데이터만 포함되어 있다.
표 2는 다음과 같다:
선별된 바실러스 균주에 대한 기본 데이터
원천, gyrB에 의한 종, VIB 및 포자 형성 배지 중 성장 및 포자 형성 비율
균주 A=15510; 균주 B=15516; 균주 C=15541; 균주 H=15536; 균주 I 15539
성장 포자 형성, %
균주 원천 종 항생제 저항성 VIB SM 1일 2일 3일
A 배설물 B. 모자벤시스 민감성 A B 5 95 90
B 배설물 B. 아밀로리쿼페이션스 민감성 A A 10 99 99
C 배설물 B. 서브틸리스 민감성 B A 0 80 95
D 배설물 B. 아밀로리쿼페이션스 민감성 B A 40 99 99
E 배설물 B. 아밀로리쿼페이션스 민감성 B A 20 99 99
F 배설물 B. 아밀로리쿼페이션스 민감성 B A 50 99 99
G 배설물 B. 아밀로리쿼페이션스 민감성 B A 95 95 95
H 배설물 B. 아밀로리쿼페이션스 민감성 A A 99 99 99
I 배설물 B. 아밀로리쿼페이션스 민감성 B A 80 99 99
J 배설물 B. 아밀로리쿼페이션스 민감성 B A 50 99 99
K LMG B. 아밀로리쿼페이션스 민감성 A A 2 99 99
L 배설물 B. 리체니포미스 민감성 B A 90 99 NA
M 토양 B. 리체니포미스 저항성 B A 0 1 80
N 토양 B. 메가테리움 저항성 B A 0 0 0
O 배설물 B. 서브틸리스 민감성 A B 0 60 10
P 배설물 B. 프밀러스 저항성 A A 0 10 99
Q 배설물 B. 리체니포미스 저항성 A A 0 1 5
R 배설물 B. 리체니포미스 저항성 A A 0 몇몇 40
S 배설물 B. 프밀러스 민감 A A 0 10 95
T 토양 B. 메가테리움 저항성 B A 0 0 0
U 토양 B. 리체니포미스 저항성 A A 0 몇몇 70
V 배설물 B. 서브틸리스 저항성 A B 95 99 90
표 3은 다음과 같다:
대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스의 억제(mm) 및 선별된 바실러스 균주에 의한 담즙 및 산에 대한 저항성
균주 A=CHCC15510; 균주 B=15516; 균주 C=15541; 균주 H=15536; 균주 I=15539
O149, O147 및 O101는 병원균 아래에 언급된 대장균 돼지 병원균이다.
담즙 대장균 mm 억제 Cl . 퍼프린젠스, mm
균주 종 6 h 24 h Acid O149 O147 O101 Mm
A B. 모자벤시스 C A S 1.5 1.7 2.3 7
B B. 아밀로리쿼페이션스 A A S 2.5 2.3 3.5 8
C B. 서브틸리스 A B R 1.8 1.5 2.7 7
D B. 아밀로리쿼페이션스 A A R 2 1.7 2.5 6
E B. 아밀로리쿼페이션스 B A S 3 3 3.5 6
F B. 아밀로리쿼페이션스 B A S 2.5 2.5 3.3 7
G B. 아밀로리쿼페이션스 B B R 2 1.7 2 7
H B. 아밀로리쿼페이션스 A A R 3.5 3 4.5 7
I B. 아밀로리쿼페이션스 B A R 2 2 2 8
J B. 아밀로리쿼페이션스 B A S 2 2.5 2.5 8
K B. 아밀로리쿼페이션스 B A S 0.3 <1 1 4
L B. 리체니포미스 A B S < 1 <1 1.3 8
M B. 리체니포미스 B A S 0 0 0 4
N B. 메가테리움 B A S 0 0 0 0
O B. 서브틸리스 B A S 1 <1 1.3 7
P B. 프밀러스 A A R 1 0 1.7 8
Q B. 리체니포미스 B B S 0 0 0 2
R B. 리체니포미스 B B S 0 0 0 2
S B. 프밀러스 A A R <1 0 <1 6
T B. 메가테리움 A A S 0 0 0 0
U B. 리체니포미스 B B S 0 0 0 3
V B. 서브틸리스 C A S 2.5 1 2.5 10
실시예 3: 열 안정성
3. 1 열 안정성 시험을 위한 방법
바실러스 균주를 VIB 내에서 37 ℃ 및 220 rpm에서 성장시켰다. 밤새 배양물을 T3 아가 플레이트(105 -106 희석 100 ㎕) 위에 바르고, 포자 형성이 완결될 때까지 37℃에서 1-2일간 배양하였다. 플레이트로부터 포자를 채집하고, FKP 용액 중에 현탁시키고, 영양 세포를 불활성화하기 위하여 80℃에서 15분간 배양하였다. 가열 즉시 포자 현택액을 얼음 위에 두었다. FKP로 포자 준비물을 2번 세척하고 20% 글리세롤이 있는 FKP에 재현탁시키고, 사용 전에 80℃에서 보관하였다. 박테리아 포자의 열 저항성은 FKP 중의 포자 현탁액 500 ㎕(웰당 대략 1×106 CFU의 농도)가 있는 에펜도르프 튜브를 99.5℃에서 2, 5 및 10분간 두는 것에 의하여 산정하였다. CFU 카운트는 37℃에서 밤새 배양한 후 VIB 아가 위에 둔 가열된 현탁액의 희석액 중에서 측정하였다.
3. 2 열 안정성 실험 결과
열 안정성 데이터는 표 4와 같다.
표 4 선별된 바실러스 균주의 99.5℃에서의 열 안정성: 시점 0과의 관계에서 2, 5 및 10분 후에 cfu로서 측정됨(log/log).
균주 B=15516; 균주 C=15541, 균주 H=15536
균주 종 시점 이후 cfu 감소
2 분 5 분 10 분
B B. 아밀로리쿼페이션스 아종 아밀로리쿼페이션스 0.05 0 0
C B. 서브틸리스 0.25 2.5 3.8
D B. 아밀로리쿼페이션스 /시아멘시스 관련 0 0 0.05
E B. 아밀로리쿼페이션스 아종 플란타룸 0.34 3.8 5.3
F B. 아밀로리쿼페이션스 아종 아밀로리쿼페이션스 0 0 0
H B. 아밀로리쿼페이션스 아종 플란타룸 0.19 2.5 5
일반적으로 시점 0과 관련하여 2분 후 2(log/log) cfu 보다 적은 감소는, 포자가 펠레타이징을 위하여 사료에 첨가되기에 적합한 것이고, 2 이하 결과는 통상적인 상업적 바실러스 포자 제조물에 대하여 얻어진다. 따라서 실험되고 표 4에 보여진 모든 균주는 모두가 좋은 열 안정성을 갖는다. 몇몇 균주는 5분 및 10분 후에도 좋은 열 안정성을 또한 나타내었는데, 즉 균주 B 및 균주 F이다. 둘 모두 cfu 감소를 나타내지 않은 B. 아밀로리쿼페이션스 아종 아밀로리쿼페이션스이다.
실시예 4: 효소 생성
4.1 셀룰라아제 분석을 위한 방법
바실러스 균주를 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC) 배지(Abou-Taleb et al. 2009) (l 당: 10.0 g 카르복시메틸 셀룰로오스(C9481), 2.0 g 박토 트립톤(cat. 211705, 벡톤 디킨슨 A/S, 덴마크), 4 g KH2PO4, 4.0 g Na2HPO4, 0.2 g MgSO4 .7H2O, 0.001 g CaCl2 . 2H2O, 0.004 g FeSO4 .7H2O, pH 7) 내에서, 37℃ 및 격렬한 마그네틱 교반 하 24시간 동안 배양하였다. 제조사 지시에 따라 EnzChek 셀룰라아제 서브스트라트 키트(cat. E33953, 라이프 테크놀로지)를 사용하여 셀룰라아제 생산을 측정하였다. 간단히 말해, 원심분리하여 배양 상등액을 수집하고, 일련 희석 중의 MTPs(웰 당 200 ㎕) 내에 분산시켰다. 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)(C1184)로부터 유래한 셀룰라아제를 사용하여 2 U ml-1로부터 출발하는 표준 커브를 구성하였다. EnzChek 기질 용액을 Nunc 96 웰 블랙 FluoroNunc 플레이트(cat. 237105, 써모 피셔 사이언티픽, NUNC Inc.) 중의 배양 상등액에 첨가하였다. 30분 배양 이후에 여기 360 nm/발광 420 nm에서 형광을 기록하였다(Enspire 2300 멀티라벨 리더, Perkin Elmer Inc.). 두 개의 독립된 실험에서 표준 커브로부터 셀룰라아제 활성을 계산하고 평균(U ml-1)으로 표시하였다.
4.2 자일라나제 분석 방법
바실러스 균주를 너도밤나무(beech wood) 자일란을 함유하는 배지(Cordeiro et al. 2002) (l 당: 5.0 g xylan (X4252), 2.0 g 효모 추출액(cat. 288620, 벡톤 디킨슨 A/S, 덴마크), 5.0 g 박토 펩톤(cat. 211677, 벡톤 디킨슨 A/S, 덴마크), 0.5 g NaCl, 0.5 g MgSO4 . 7H2O, 0.15 g CaCl2 . 2H2O, pH 7.5)에서, 37℃ 및 격렬한 마그네틱 교반 하 24시간 동안 배양하였다. 제조사 지시에 따라 EnzChek 울트라 자일라나제 분석 키트(cat. E33650, 라이프 테크놀로지)를 사용하여 자일라나제 분석을 수행하였다. 간단히 말해, 원심분리하여 배양 상등액을 수집하고, 일련의 희석 중 MTPs(웰 당 200 ㎕) 내에 분산시키고, 자일라나제 기질 워킹 용액을 첨가하였다. 배양 30분 후에, 배양 상등액 내 형광을 여기 360 nm/발광 420 nm에서 측정하였다(Enspire 2300 멀티라벨 리더, Perkin Elmer Inc.). 써모마이세스 라누기노서스(Thermomyces lanuginosis)(X2753)를 표준 효소로 사용하였고, 25 mU ml-1로부터 출발하는 일련 희석 중의 MTPs에 첨가하였다. 표준 커브로부터 바실러스 균주의 자일라나제 활성을 계산하고 두 개의 독립적 분석의 평균(mU ml-1)으로 표시하였다.
4.3 프로테아제 분석 방법
바실러스 밤새 배양물(37 ℃에서 VIB 내 배양)을 기질로서 형광 이소티오시아네이트-카세인(FITC-C)(Sigma C3777)이 있는 반응 혼합물로 이전시키고, 37 ℃에서 3시간 동안 배양하였다. 침전 후 가용성 펩타이드의 양을 여기 497 nm, 발광 515 nm.에서 형광을 사용하여 측정하였다. 이 방법은 넓은 범위의 프로테아제를 탐지한다(세란, 아스파틱, 시스테인 및 메탈로프로테아제).
4.4 바이오필름 생성 방법
바실러스 균주를 VIB (약 107 CFU ml-1)에 첨가하고, 폴리프로필렌(PP) MTPs (96 웰 코니칼 Btm PP Plt 내추럴; NUNC Inc., 덴마크)로 분배하고, 교반 없이 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 620 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하여 성장을 조절하였다. 바이오필름 형성은 종전 문헌(Auger et al. 2009)에 기술된 바에 따라 크리스탈 바이올렛 염색에 의하여 평가하였다. 간략히 말해, 증류수로 웰을 세척한 후, 크리스탈 바이올렛 용액 0.1%(w v-1)를 PP-MTPs로 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 배양하였다. 그 다음 세척 과정을 반복하고 에탄올 96%(v v-1)를 플레이트에 첨가하였다. 15분 배양 후에 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다(Wallac Victor2 스펙트로포토미터, Perkin Elmer Inc.). 바실러스 종 균주를 높은(Abs570 nm > 2.0), 중간(Abs570 nm = 1.0 - 2.0) 또는 낮은(Abs570 nm < 1.0) 바이오필름 형성자로 분류하였다. 분석은 2중으로 2회 수행하였다.
4.5. 효소 분석 결과
표 5 효소 생산 및 바이오필름
(RFU= 상대적 형광 단위)
균주 A=15510; 균주 B=15516; 균주 C=15541; 균주 H=15536; 균주 I=15539
균주 종 셀룰라아제,
mU / ml 		자일라나제 ,
mU / ml 		프로테아제,
RFU / OD 		바이오필름
A B.모자벤시스 1734 50 142117 +
B B.아밀로리쿼페이션스 아종 아밀로리쿼페이션스 67 47 599919 +
C B. 서브틸리스 1037 24 445091 +
D B. 아밀로리쿼페이션스/시아멘시스 관련 2196 70 291908 +++
E B. 아밀로리쿼페이션스 아종 플란타룸 612 28 381459 +++
F B. 아밀로리쿼페이션스 아종 아밀로리쿼페이션스 54 57 400456 +++
G B. 아밀로리쿼페이션스 아종 플란타룸 371 71 453158 +++
H B. 아밀로리쿼페이션스 아종 플란타룸 631 30 252377 ++
I B. 아밀로리쿼페이션스 아종 플란타룸 466 121 411206 +++
J B. 아밀로리쿼페이션스 아종 플란타룸 469 72 421338 +++
표는 B. 아밀로리쿼페이션스 아종 플란타룸인 균주 E, G, H, I 및 J 모두가 높은 셀룰라아제 활성을 가지는 반면에, B. 아밀로리쿼페이션스 아종 아밀로리쿼페이션스인 균주 B 및 F는 낮은 셀룰라아제 활성을 가짐을 보여준다.
실시예 5: 새끼 돼지 실험
이유-이후 새끼 돼지의 성장 성능 및 치사율에 대한 영향을 평가하기 위하여, 2개의 선별된 바실러스 균주(균주 B 또는 C)를 젖먹이 사료에 첨가하였다. 대장균이 젖먹이 기간 동안에 생산 파라미터 및 치사율에 가장 큰 영향을 갖는 주요 병원균 중의 하나이기 때문에, 이 실험은 동물 중 대장균 억제의 영향에 대한 정보를 줄 수 있다. 실험은 2개의 다른 장소에서 수행되었다: 장소 1은 연구실 농장이었고, 장소 2는 대학이었다. 실험 셋업은 두 장소에서 유사하였다.
표 6은 새끼 돼지 시험에 사용된 장소의 개요이다.
총 돼지 개체수 복제 개체수 무게 시험일
장소 1 576 96 28, 35, 42, 63 35
장소 2 720 24 28, 35, 49, 63 35
5.1.1 장소 1의 실험 셋업
이유식 날, 실험실 농장으로부터 유래한 보존적 이유식 배치(각각 288 마리 새끼 돼지)로부터의 576 마리 새끼 돼지(28일령)를 실험에 사용하였다. 새끼 돼지는 교배종 새끼 돼지였다(ACMC x 피에트레인). 선별된 돼지는 일반적으로 좋은 양상을 갖는 건강한 것이었고, 보육 단계에서 그 어떠한 백신도 접종하지 않았다. 실험실 농장은 돼지번식호흡장애증후군에 대하여 양성이었지만 통제되고 있었고, 이유식 이후 단계에서 대장균증의 몇몇 문제를 가지고 있었다. 체중에 따라 새끼 돼지를 분류하고 두 이유식 배치에 48개 축사로 나누어(총 96개 축사) 각각의 축사 블록이 두 처리군 모두에서 유사한 체중을 갖는 전체 수컷 3마리 및 암컷 3마리의 총 6마리를 포함하도록 하였다. 처리군은 블록에 의하여 가벼운 새끼 돼지 및 무거운 새끼 돼지의 축사로 나누어, 각각의 처리군이 6마리 새끼 돼지의 24개 축사에 적용되도록 하였다(처리군 및 방 당 6개 축사: 처리군 및 이유식 배치 당 12 축사). 바실러스 생산물을 400 g/사료톤 또는 1.28 *10 7 CFU g/사료의 양으로 사료에 첨가하였다.
평균 매일 체중 증가(ADWG)를 계산하기 위하여, 28일(0일; 이유식 날), 35일, 42일 및 63일의 연령에서 돼지의 체중을 개별적으로 측정하였다. 평균 매일 사료 섭취(ADFI) 및 사료 보존율(FCR)을 동일한 기간(28-35; 35-42; 42-63) 내에 그리고 주요 기간(프리스타터: 28-42일령; 스타터: 42-63일령; 및 총 젖먹이 기간) 동안에 축사에 따라 측정하였다. 적용된 개별 항생제 처리의 등록을 포함하여 치사율 및 병원균 발생을 매일 통제하였다.
표 7은 다음과 같다.
장소 1에서의 파라미터 생산
대조군과 비교한 P-값(A: P=< 0.1; a =<0.05)
균주 B= 15516; 균주 C=15541
SE= 표준 에러
체중, kg 28-42일령
(시험 14 일 ) 		42-63일령 합계 (28- 63 일 )
28d 63d ADG ADFI FCR ADG ADFI FCR ADG ADFI FCR
대조군 7,7 20,7 179 254 1,43 493 697 1,42 371 522 1,40
균주 B 7,7 21,1 196A 264 1,37A 513 723A 1,41 383 535 1,40
균주 C 7,8 21,0 199a 267A 1,37A 501 710 1,42 380 532 1,40
SE 0,150 0,254 0,007 0,006 0,024 0,010 0,010 0,008 0,007 0,007 0,009
5.1.2 실험 결과
젖먹이 사료에 첨가된 바실러스 균주 프로바이오틱 제품은 두 가지 모두가, 그들 간에 차이점을 보이지 않고, 음성적 대조군과 비교하여 수치적으로 생산 성능을 개선시켰다. 프리스타터 기간(28-42 일령)에 ADG 및 FU 둘 모두에 대한 현저한 효과가 관찰되었다. 두 바실러스 그룹 모두에서 치사율 퍼센트가 감소하였다(치사율 %: 대조군(3.47), 균주 B (1.39%), 균주 C (2.08))
5.2.1 장소 2에서의 실험 셋업
이유기 직후에, 선별된 모든 새끼 돼지를 각 축사 마다 30마리의 동물이 있는 24개 축사의 이유식 방에 두었다. 방은 중앙 난방 시설 및 쿨링 시스템에 의한 강제 환기 및 완벽하게 나무 조각을 댄 바닥을 구비한 것이다. 각각의 축사는 3마리 동물을 동시에 먹이는 용량을 가진 임의 섭식 및 자유 물 접근을 보장하기 위하여 상업적인 양면 습식-건식 피더를 구비한 것이다. 전체 실험 기간에 걸쳐서 사료는 임의로 급여되었다.
총 720마리의 상업적 교배 젖뗀 새끼 돼지 [Pietrain x (Landrace x Large White)]를 사용하였다. 동물은 이유식 날에 동일한 농장의 돼지로부터 얻었고, 실험 설비로 이동시켰다(운송 없이). BW가 7.0 kg SD=1.64 kg인 26일령의 수컷 및 암컷 새끼 돼지를 사용하였다. 동물의 넘버가 적힌 플라스틱 귀 식별 태그를 사용하였다. 동물들은 초기 체중에 따라 3개 블록으로 분배되었다. 각각의 블록 내에 새끼 돼지는 균형잡힌 체중 분포를 위하여 축사 내에 분배되었다. 그러므로, 각각의 블록은, 실험 사료가 임의로 할당되는 30마리 동물의 8개 축사로 이루어졌다.
이루어진 각각의 블록이 임의로 할당되었다.
시험은 28일령 이유기에서 시작하였다. 시험 0 및 7일에 동물을 개별적으로 체중을 달고, 21 및 35일에 그룹의 체중을 달았다. 각각의 호퍼로부터의 사료 소실을 실험에 걸쳐 측정하였다. 매일 평균 사료 섭취(ADFI), 매일 평균 획득(ADG) 및 총 사료 섭취에 따른 사료:획득 비율(FCR)을 그에 따라 계산하였다. 새끼 돼지의 건강 상태를 정규적으로 평가하였고, 그 어떠한 비정상적 징후 또는 주어진 약품을 기록하였다. 치사율 및 도태 퍼센트 또한 계산하였다.
표 8은 다음과 같다:
장소 2에서 생산 파라미터
부화 차순(least square means), 대조군과 비교한 P-값(A: P=< 0.1)
균주 B= 15516; 균주 C=15541
28-35일령 49-63일령 합계 (28-63일)
ADG ADFI FCR ADG ADFI FCR ADG ADFI FCR
대조군 73.8 157 2.26 345 602 1.76 227 388 1.72
균주 B 80.9 174 2.26 375A 584 1.58A 235 383 1.64
균주 C 87.1 166 1.96 379 586 1.60 232 389 1.69
SE 0.010 0.008 0.0002 0.019 0.025 0.0001 0.0091 0.0066 0.00065
5.2.2 실험 결과
젖먹이 사료에 보충된 두 바실러스 균주 모두, 둘 사이에 차이점을 보이지 않고, 음성적 대조군과 비교하여 생산 성능을 수치적으로 개선하였다. 실험 기간에 ADG 및 FU 둘 모두에 대한 현저한 효과가 관찰될 수 있었다.
심각한 설사 극복을 위하여 엔로플락신으로 처리된 축사 당 동물의 수는, 이유식 후 첫주 동안에 바실러스를 먹인 동물들보다 대조군 사료를 먹인 동물들에서 더 현저하게 높았다. 동일한 결과(P<0.05)가 전체 실험 기간(이유식 이후 0 내지 35일) 동안에 관찰되었다. 두 바실러스 그룹 모두에서 치사율 퍼센트가 감소하였다(치사율 %: 대조군(4.17), 균주 B (0.04%), 균주 C (2.65)).
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Claims (15)

  1. 다음의 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 바실러스 균주:
    (a) 수탁번호 DSM 25839를 갖는 바실러스 모자벤시스 균주 CHCC 15510;
    (b) 수탁번호 DSM 25840를 갖는 바실러스 아밀로리쿼페이션스 균주 CHCC 15516, 수탁번호 DSM 27032를 갖는 바실러스 아밀로리쿼페이션스 균주 CHCC 15536 및 수탁번호 DSM 27033를 갖는 바실러스 아밀로리쿼페이션스 균주 CHCC 15539; 및
    (c) 수탁번호 DSM 25841를 갖는 바실러스 서브틸리스 균주 CHCC 15541.
  2. (i) 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대한 민감성;
    (ii) 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 성장 억제; 및
    (iii) 배양 2일 후 측정시 적어도 80 퍼센트의 포자 형성 비율을 갖는 바실러스 균주를 선별하는 방법으로서,
    다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 바실러스 균주 풀(pool)로부터 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 민감한 바실러스 균주를 선별 및 분리하는 단계;
    (ii) 바실러스 균주 풀로부터 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 성장 억제를 갖는 바실러스 균주를 선별 및 분리하는 단계;
    (iii) 바실러스 균주 풀로부터 배양 2일 후 측정시 적어도 80 퍼센트인 포자 형성 비율을 갖는 바실러스 균주를 선별 및 분리하는 단계;
    (iv) pH 4에서 영양 세포가 갖는 민감성에 대하여 바실러스 균주의 풀을 분석하는 단계; 및
    (v) 담즙 저항성에 대하여 바실러스 균주의 풀을 분석하는 단계.
  3. (a) 수탁번호 DSM 25839를 갖는 바실러스 모자벤시스 균주 CHCC 15510;
    (b) 수탁번호 DSM 25840를 갖는 바실러스 아밀로리쿼페이션스 균주 CHCC 15516, 수탁번호 DSM 27032를 갖는 CHCC 15536 및 수탁번호 DSM 27033를 갖는 CHCC 15539; 또는
    (c) 수탁번호 DSM 25841를 갖는 바실러스 서브틸리스 균주 CHCC 15541
    의 돌연변이 균주를 취득하는 방법으로서,
    다음의 특성을 갖는 (a), (b) 또는 (c)의 돌연변이 균주를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 앰피실린, 반코마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린 및 클로람페니콜에 대한 민감성;
    (ii) 대장균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 대한 성장 억제; 및
    (iii) 배양 2일 후 측정시 적어도 80 퍼센트의 포자 형성 비율.
  4. 제3항에 있어서, (a), (b) 또는 (c)의 균주에 돌연변이 처리를 하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 따른 적어도 1종의 바실러스 균주 세포를 포함하는 것인 바실러스 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 제1항에 따른 적어도 2종의 균주 세포를 포함하는 것인 바실러스 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 제1항에 따른 적어도 3종의 균주 세포를 포함하는 것인 바실러스 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 바실러스 균주 또는 균주들의 세포는 포자인 것인 바실러스 조성물.
  9. 제5항에 따른 바실러스 조성물을 동물 사료에 첨가하는 것을 포함하는, 동물 사료 또는 프리믹스를 생산하는 방법.
  10. 제6항에 있어서, 바실러스 균주 또는 균주들의 세포는 포자인 것인 바실러스 조성물.
  11. 제6항에 따른 바실러스 조성물을 동물 사료에 첨가하는 것을 포함하는, 동물 사료 또는 프리믹스를 생산하는 방법.
  12. 제5항 내지 제8항 및 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 바실러스 조성물 또는 제9항 또는 제11항의 방법에 따라 생산된 동물 사료 또는 프리믹스를 인간을 제외한 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물 사양 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 동물은 가금류, 반추 동물, 소, 돼지, 토끼, 말 및 어류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 동물 사양 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
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